(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法であって、
（ａ）凍結した藻類細胞を加温して解凍し、得られた細胞懸濁液に培地を加えて希釈する、解凍ステップと、
（ｂ）解凍ステップ（ａ）で得た藻類細胞を１〜２時間培養して藻類細胞を凍結及び解凍の影響から回復させる、回復培養ステップと、
（ｃ）回復培養ステップ（ｂ）後の藻類細胞を一部採取し、培地を加えて希釈し、藻類細胞の遅延発光を測定し、得られた発光量を初期値データとする、確認ステップと、
（ｄ）確認ステップ（ｃ）後の藻類細胞と被検物質を含む溶液とを混ぜて暴露試料を作製し、暴露試料を培養する、暴露ステップと、
（ｅ）暴露ステップ（ｄ）後の暴露試料の遅延発光を測定し、得られた発光量を暴露データとする、計測ステップと、
（ｆ）初期値データ及び暴露データに基づいて評価値を算出し、評価値に基づいて被検物質の毒性を評価する、評価ステップと、
を備える方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、
確認ステップ（ｃ）で得られた初期値データが所定の値に達するまで回復培養ステップ（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す、方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法であって、
暴露ステップ（ｄ）において、さらに、確認ステップ（ｃ）後の藻類細胞と被検物質溶液の溶媒とを混ぜて対照試料を作製し、対照試料を培養し、
計測ステップ（ｅ）において、さらに、対照試料の遅延発光を測定し、対照データとし、
評価ステップ（ｆ）において、初期値データ、暴露データ及び対照データに基づいて評価値を算出し、評価値に基づいて被検物質の毒性を評価する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
藻類を用いた化学物質の毒性を評価する場合、液体培養や寒天培地等で維持されている細胞をもとに初代培養及び継代培養を行って藻類細胞を調製し、調製した藻類細胞に被検物質を添加して試験を行う必要がある。しかし、藻類細胞を維持することや、試験のたびに継代培養を行うことは、煩雑で不便である。【０００３】
この煩雑さを解消するため、凍結した藻類細胞（非特許文献１及び２など）を利用することが可能である。試験の直前に、凍結した藻類細胞を解凍し、解凍した藻類細胞を利用することで、藻類細胞を継代培養することなく、迅速に試験に供することが可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０６２０２７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】桑野和可、２００２年「藻類の凍結保存」、堀輝三・大野正夫・堀口健雄編「２１世紀初頭の藻学の現況」、日本藻類学会、山形、１０８−１１１頁
【非特許文献２】森史ら、「国立環境研究所微生物系統保存施設の藍藻と緑藻の凍結保存」、Microbiol. Cult. Coll., June 2002, p.45-55
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法において、経済協力開発機構（ＯＥＣＤ）テストガイドラインＴＧ２０１に規定されている増殖阻害試験よりも迅速且つ簡便な方法として、藻類の遅延発光を利用した方法を既に開発している（特許文献１）。しかしながら、凍結した細胞を解凍した直後に、その遅延発光を測定すると、非凍結細胞の遅延発光とは発光パターンが異なり、発光量も減少することを本発明者らは見出した。したがって、凍結した藻類細胞を使用すると、凍結しない藻類細胞を使用した場合と同等の毒性評価を行うことが出来ないという問題点がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記問題点を解決するために鋭意検討を重ねたところ、藻類細胞を解凍した後に、藻類細胞を培養して藻類細胞を凍結の影響から回復させる回復培養を行うことで、凍結しない藻類細胞と同じ発光パターンが得られ、発光量も低下しないことを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法であって、
（ａ）凍結した藻類細胞を加温して解凍し、得られた細胞懸濁液に培地を加えて希釈する、解凍ステップと
（ｂ）解凍ステップ（ａ）で得た藻類細胞を培養して藻類細胞を凍結及び解凍の影響から回復させる、回復培養ステップと、
（ｃ）回復培養ステップ（ｂ）後の藻類細胞を一部採取し、培地を加えて希釈し、藻類細胞の遅延発光を測定し、得られた発光量を初期値データとする、確認ステップと、
（ｄ）確認ステップ（ｃ）後の藻類細胞と被検物質を含む溶液とを混ぜて暴露試料を作製し、暴露試料を培養する、暴露ステップと、
（ｅ）暴露ステップ（ｄ）後の暴露試料の遅延発光を測定し、得られた発光量を暴露データとする、計測ステップと、
（ｆ）初期値データ及び暴露データに基づいて評価値を算出し、評価値に基づいて被検物質の毒性を評価する、評価ステップと、
を備える方法、を提供する。【０００９】
上記方法において、より正確な評価を行うために、確認ステップ（ｃ）で得られた初期値データが所定の値に達するまで回復培養ステップ（ｂ）及び確認ステップ（ｃ）を繰り返すことが好ましい。【００１０】
また、上記方法において、より正確な評価を行うために、暴露ステップ（ｄ）において、さらに、確認ステップ（ｃ）後の藻類細胞と被検物質溶液の溶媒とを混ぜて対照試料を作製し、対照試料を培養し、計測ステップ（ｅ）において、さらに、対照試料の遅延発光を測定し、対照データとし、評価ステップ（ｆ）において、初期値データ、暴露データ及び対照データに基づいて評価値を算出し、評価値に基づいて被検物質の毒性を評価することが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法によれば、凍結した藻類細胞を使用して迅速に毒性評価を行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】凍結・解凍した緑藻（比較例）及び凍結していない緑藻の粒子数を表すグラフである。
【図２】凍結・解凍した緑藻（比較例）及び凍結していない緑藻のコロニー生残率を表すグラフである。
【図３】凍結・解凍した緑藻（比較例）及び凍結していない緑藻の遅延発光の発光パターンを表したグラフである。
【図４】凍結・解凍した緑藻（比較例）及び凍結していない緑藻の発光量（積算値）を表したグラフである。
【図５】凍結・解凍した緑藻（実施例）及び凍結していない緑藻の遅延発光の発光パターンを表したグラフである。
【図６】凍結・解凍した緑藻（実施例）及び凍結していない緑藻の発光量（積算値）を表したグラフである。
【図７】比較例に係る藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法を説明するフローチャートである。
【図８】実施例に係る藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。
【００１４】
図８は、本実施形態に係る藻類を用いた化学物質の毒性を評価する方法を説明するフローチャートである。本実施形態は、解凍ステップ（ａ）、回復培養ステップ（ｂ）、確認ステップ（ｃ）、暴露ステップ（ｄ）、計測ステップ（ｅ）及び評価ステップ（ｆ）を備える。
【００１５】
解凍ステップ（ａ）では、凍結した藻類細胞を加温して解凍し、解凍により得られた細胞懸濁液に培地を加えて希釈する。
【００１６】
使用する凍結藻類細胞は、一般的な藻類細胞の凍結方法で凍結された藻類細胞を使用することができる。解凍は、例えば、３７℃のウォーターバス中にて、１２０〜１５０秒程度、凍結細胞を含むクライオチューブをゆっくり振ることで、行うことができる。
【００１７】
次に、解凍した細胞懸濁液に培地を加えて希釈を行う。凍結した細胞懸濁液には、通常、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍害保護剤が含まれており、凍害保護剤の細胞毒性を緩和するために、解凍後すみやかに希釈を行う必要がある。希釈は、例えば、ＯＥＣＤ培地を用いて１０倍に希釈することができる。浸透圧の急激な変化を防ぐために、１分程度の時間をかけてゆっくりと培地を添加する。
【００１８】
回復培養ステップ（ｂ）では、解凍ステップ（ａ）で得た藻類細胞を培養して藻類細胞を凍結及び解凍の影響から回復させる。後述の比較例で示すように、回復培養ステップを行わないと、藻類細胞が凍結及び解凍のダメージから十分回復せず、凍結していない藻類細胞と比較して遅延発光の発光パターンが変化し、発光量が低下する。凍結・解凍した藻類細胞でも、凍結していない藻類細胞と同じ発光パターン・発光量を示されなければ、化学物質の毒性を適正に評価することができなくなる。後述の実施例で示すように、解凍ステップ（ａ）に回復培養ステップ（ｂ）を行うと、凍結・解凍した藻類細胞が、凍結していない藻類細胞と同じ発光パターン・発光量を示すようになり、この問題点を解消することができる。回復培養は、例えば、温度２５±０．５℃、照度５０〜５５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の条件で１〜２時間培養する。
【００１９】
確認ステップ（ｃ）では、回復培養ステップ（ｂ）後の藻類細胞を一部採取し、培地を加えて希釈し、藻類細胞の遅延発光を測定し、得られた発光量を初期値データとする。このステップにおいて、回復培養ステップ（ｂ）により藻類細胞が凍結及び解凍の影響から十分回復したことを確認するとともに、後の毒性評価の際に使用する初期値データを取得する。
【００２０】
藻類細胞をさらに培地で希釈するのは、凍害保護剤の毒性を緩和するためである。凍害保護剤は、通常、凍結した細胞懸濁液に５〜１０％程度含まれている。解凍ステップ（ａ）で、１０倍程度の希釈を行うと、凍害保護剤の濃度は０．５〜１％程度となるが、この濃度の凍害保護剤存在下でも回復ステップが可能であることを見出している。しかし、化学物質毒性評価に影響を及ぼさないために、培養後さらに１０倍希釈を行い、凍害保護剤の濃度を低下させる必要がある。
【００２１】
遅延発光の測定は、公知の装置及び方法、例えば、国際公開第２００５／０６２０２７号に記載の装置及び方法により、行うことができる。
【００２２】
確認ステップ（ｃ）で測定した発光量が所定の値であった場合は、その数値を初期値データとして、次の暴露ステップ（ｄ）に進むことができる。この判断基準となる所定の値は、あらかじめ設定された値を利用したり、凍結細胞に個別に設定された値を利用したりすることができる。例えば、凍結細胞の製造時に製造者が値を設定することができる。所定の値とは、例えば、凍結していない藻類細胞の発光量の９０％以上の値である。この値以下では発光量が不十分であり、藻類細胞が十分回復していないと判断できる。
【００２３】
確認ステップ（ｃ）で測定した発光量が所定の値に達しない場合は、回復培養ステップ（ｂ）を継続し、所定の時間（例えば、３０分）経過後に、再び確認ステップを行い、所定の値に達しているか否かを確認する。
【００２４】
暴露ステップ（ｄ）では、確認ステップ（ｃ）により凍結及び解凍の影響から十分回復したことを確認できた藻類細胞に、被検物質を含む溶液と混ぜて暴露試料を作製し、暴露試料を培養する。
【００２５】
暴露試料の作製は、例えば、藻類細胞１容量に対して、被検物質を含む溶液９容量を加える。この操作により藻類細胞は１０倍に希釈されるが、上述の通り、凍害保護剤の化学物質毒性評価への影響を回避するためである。また、被検物質を含む溶液を多量に添加することができるため、水に溶け難い化学物質でも評価することができる。被検物質の濃度を様々にし、複数の暴露試料を調製してもよい。また、被検物質を溶かした溶媒のみと藻類細胞を混ぜることで、対照試料を作製しても良い。対照試料を用いて対照データを測定し、評価値を算出することで、より正確に被検物質の毒性を評価することができる。
【００２６】
暴露試料の培養は、例えば、温度２５±０．５℃、照度５０〜５５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１の条件で行う。培養時間は、被検物質が藻類細胞に影響を及ぼす程度の時間であれば特に限定されないが、例えば、８時間、好ましくは２４時間である。遅延発光の測定を容易にするために、暴露試料の培養容器として、遅延発光の測定にそのまま使用できる試験管を使用することができる。この場合、試験管ごとの照度のばらつきを最小限にし、撹拌効率を上げ、藻類の細胞増殖率を上げるために、ローテーター及びオービタルシェーカーを併用した回転培養を行うことが好ましい。
【００２７】
計測ステップ（ｅ）では、暴露ステップ（ｄ）後の暴露試料の遅延発光を測定し、得られた発光量を暴露データとする。上述の通り、遅延発光の測定は、公知の装置及び方法、例えば、国際公開第２００５／０６２０２７号に記載の装置及び方法により、行うことができる。より具体的には、試料に対して励起光（６８０ｎｍ、２０μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）を１秒照射した後に、試料から検出される遅延発光を光電子増倍管により検出し、該遅延発光量を励起完了後から６０秒間１００ミリ秒間隔で記録し、励起完了後１．１秒から６０秒までの該遅延発光量の総和を暴露データとする。
【００２８】
評価ステップ（ｆ）では、初期値データ及び暴露データに基づいて評価値を算出し、評価値に基づいて被検物質の毒性を評価する。遅延発光は、藻類細胞の生長阻害と相関して発光量が低下することが知られている。暴露データが初期値データよりも低下している場合、被検物質に毒性があると評価することが可能である。より具体的には、暴露試料として評価対象となる有害物質を含む試料（Ａ）と、有害物質を含まない試料（Ｂ）について計測を行い、それぞれの下式１より算出される増加速度を算出し、Ａの増加速度とＢの増加速度を比較し、Ｂに対するＡの低下量を下式２により算出して毒性の指標とする。
（式１）増加速度＝（ｌｎ（暴露データ）−ｌｎ（初期値データ））÷（培養時間）
（式２）低下率＝（Ｂの増加速度−Ａの増加速度）÷Ｂの増加速度×１００
【実施例】
【００２９】
（比較例）
標準的な手順により、凍害保護剤（５％ＤＭＳＯ）を含み、細胞密度２０００×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、体積６５０μＬの条件で凍結された緑藻（Ｐｓｅｕｄｏｋｉｒｃｈｎｅｒｉｅｌｌａ  ｓｕｂｃａｐｉｔａｔａ）を使用し、以下の方法により、遅延発光を測定した。希釈液にはＯＥＣＤ培地を用いた。【００３０】
（ａ）解凍ステップ
（ａ−１）加温ステップ
３７℃ウォーターバスで、凍結した緑藻の入ったクライオチューブをゆっくり振りながら、１２０〜１５０秒程度で完全に解凍した。クリーンベンチ内にて、先太ピペットで軽くピペッティングして６２０μＬの細胞懸濁液をガラスチューブに取出した。
（ａ−２）希釈ステップ
５５８０μＬ（１０倍希釈）のＯＥＣＤ培地をガラスチューブ内にゆっくり入れた。浸透圧の急激な変化を防ぐため、１分程度時間をかけて少しずつ添加した。培地添加後、５〜１０分程度ベンチ内で静置した。【００３１】
（ｃ）確認ステップ
（ａ−２）の希釈ステップが完了した試料の一部を採取し、１０倍に希釈して初期値サンプルを調製した。初期値サンプルの遅延発光を測定した。また、粒子計測により細胞数を計測した。さらに、コロニー法による生存細胞の計数を行った。他方、凍結していない緑藻を用いて、遅延発光の測定、粒子数の計測及びコロニー生残率の計測を行った。【００３２】
図１は、凍結・解凍した緑藻及び凍結していない緑藻の粒子数を表すグラフであり、図２は、凍結・解凍した緑藻及び凍結していない緑藻のコロニー生残率を表すグラフである。図１及び図２から明らかなように、（ｃ）の確認ステップにおける、凍結・解凍した緑藻の粒子数及びコロニー生残率は、凍結していない緑藻のそれらとほとんど差が無く、凍結・解凍の影響から適正な状態に回復したように見える。【００３３】
しかしながら、遅延発光の発光パターンを表したグラフである図３から、凍結・解凍した緑藻と凍結していない緑藻とでは、発光パターンが異なることが分かる。発光パターンが異なると、その後の化学物質の毒性評価を行った場合、凍結していない藻類と同等の評価を行うことができない。図４は、励起光消灯後１．１秒から６０秒までの発光量（積算値）を表したグラフであるが、凍結した緑藻の発光量は凍結していない緑藻の発光量と比べて低下しており、約７７％であった。遅延発光は、藻類の生長阻害と相関して発光量が低下することが知られているため、凍結・解凍によりすでに凍結前よりも発光量が低下している藻類細胞は、既に生長阻害が起きていることが予想され、評価対象となる化学物質を暴露しても毒性を適正に評価できない。したがって、上記比較例の方法は、藻類の遅延発光を利用した化学物質の評価方法には適していない。【００３４】
（実施例）
（ａ）解凍ステップは、比較例と同様の方法で行った。【００３５】
（ｂ）回復培養ステップ
（ａ）解凍ステップで調製した試料を、温度２５±０．５℃、照度５０〜５５μｍｏｌ・ｍ−２・ｓ−１）にて、１時間又は２時間培養した。【００３６】
（ｃ）確認ステップ
（ｂ）の回復培養ステップが完了した試料の一部を採取し、希釈して初期値サンプルを調製した。初期値サンプルの遅延発光を測定した。他方、凍結していない緑藻を用いて、遅延発光の測定を行った。【００３７】
図５は、遅延発光の発光パターンを表したグラフである。比較のために、凍結していない緑藻の遅延発光及び実施例の方法で得た初期値サンプルの遅延発光に加えて、比較例の方法で得た初期値サンプルの遅延発光も含めている。図５から明らかなように、１時間又は２時間の回復培養を行うことで、凍結していない緑藻の遅延発光と同じ発光パターンとなることが分かった。図６は、発光量を表したグラフである。１時間又は２時間の回復培養を行うことで、凍結していない緑藻の発光量の約９３％、約１１２％となり、十分な発光量が得られた。したがって、上記実施例の方法は、凍結していない緑藻を使用した場合と同等の評価を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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