(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質−核酸複合体の製造方法であって、
核酸の３’末端にヌクレオチドを付加する３’末端付加酵素を用いて、核酸の３’末端に、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を少なくとも１つ付加する３’末端付加工程と、
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基にリシン（Ｌｙｓ）残基を有し標識部分を含むタンパク質を結合するタンパク質結合工程と、
を含み、
前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（１）で示されることを特徴とするタンパク質−核酸複合体の製造方法。
【化１】
0005509440.tif 000011
（式（１）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｃは水素原子またはヒドロキシル基を表す。ｍは０または１である。）
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質−核酸複合体の製造方法であって、
前記３’末端付加酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｆａｍｉｌｙ  Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ、およびポリＡ  ＲＮＡポリメラーゼのうち少なくとも１つであることを特徴とするタンパク質−核酸複合体の製造方法。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質−核酸複合体の製造方法であって、
前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることを特徴とするタンパク質−核酸複合体の製造方法。
【請求項４】
標的物の検出方法であって、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質−核酸複合体の製造方法により得られるタンパク質−核酸複合体と、対象物中に存在する標的物とを核酸部分により結合させ、結合している前記タンパク質−核酸複合体を、前記標識部分により検出することを特徴とする標的物の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質−核酸複合体の製造方法および標的物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
何らかの標識が施されたＲＮＡプローブ、ＤＮＡプローブなどの核酸プローブを用い、細胞レベルにおけるＤＮＡやＲＮＡの発現パターンを検出、可視化することによって、生命現象に関する数多くの疑問点を解明することが可能となる。この際に使用されるプローブの標識法は大別して、「放射性同位体標識法」、「蛍光抗体標識法」、「酵素抗体標識法」に分類される。歴史的には、放射性同位体を取り込ませた核酸プローブが先に確立したが、近年その取り扱いが制限されてきたこともあって、放射性同位体元素を用いない蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法が注目されている。
【０００３】
近年、有機小分子やタンパク質等の生体高分子等に対して結合特異性を有するアプタマーが、検出用リガンドとして注目されている。核酸アプタマーは、その高次構造により、幅広い標的物と高い親和性、特異性で結合するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。
【０００４】
核酸アプタマー等の核酸に酵素等の標識部分を導入する方法としては、通常、化学結合法が用いられる。しかし、化学反応により、核酸アプタマー等の標的物の認識能力が低下したり、標識部分の性能が低下することがある。特に、標識部分が酵素の場合は、酵素の性能が低下しやすい。したがって、核酸アプタマー等の認識能力および標識部分双方の機能を維持したままで核酸アプタマー等の核酸を修飾する方法が望まれている。すなわち、核酸アプタマー等および標識部分両者の機能性保持のためには、核酸アプタマー等の標的物認識部位、標識酵素等の活性部位への影響を極力抑えた修飾法、つまり部位特異的な修飾法が望まれている。
【０００５】
一方、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、ＴＧａｓｅが認識可能なリシン（Ｌｙｓ）残基または第一級アミンを有するペプチドまたはタンパク質へ、アニオン性であり、かつＴＧａｓｅが認識可能なグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有する外来分子を部位特異的に連結する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−５４６５８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、良好な感度で標的物を検出可能なタンパク質−核酸複合体の製造方法および標的物の検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、タンパク質−核酸複合体の製造方法であって、核酸の３’末端にヌクレオチドを付加する３’末端付加酵素を用いて、核酸の３’末端に、グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を少なくとも１つ付加する３’末端付加工程と、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基にリシン（Ｌｙｓ）残基を有し標識部分を含むタンパク質を結合するタンパク質結合工程と、を含み、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（１）で示されることを特徴とするタンパク質−核酸複合体の製造方法である。
【０００９】
また、前記タンパク質−核酸複合体の製造方法において、前記３’末端付加酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｆａｍｉｌｙ  Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ、およびポリＡ  ＲＮＡポリメラーゼのうち少なくとも１つであることが好ましい。
【００１０】
【化１】
0005509440.tif 000002
（式（１）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して、エテニレン基、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ここで、ｎ＝２，４，８，１２，２４）基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基であり、Ｚは、ジニトロフェニル基またはＬ−３，４−ジヒドロキシフェニル基で置換されていてもよい、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基である。また、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｃは水素原子またはヒドロキシル基を表す。ｍは０または１である。）
【００１１】
また、前記タンパク質−核酸複合体の製造方法において、前記Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であり、Ｚはベンジルオキシ基であることが好ましい。
【００１２】
また、本発明は、標的物の検出方法であって、前記タンパク質−核酸複合体の製造方法により得られるタンパク質−核酸複合体と、対象物中に存在する標的物とを核酸部分により結合させ、結合している前記タンパク質−核酸複合体を、前記標識部分により検出する標的物の検出方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明では、３’末端付加酵素を用いて、核酸の３’末端に、グルタミン（Ｇｌｎ）残基等を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を少なくとも１つ付加した後、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、グルタミン（Ｇｌｎ）残基等にリシン（Ｌｙｓ）残基等を有し標識部分を含む標識化合物を結合することにより、良好な感度で標的物を検出可能なタンパク質−核酸複合体の製造方法を提供することができる。
【００１４】
また、本発明では、そのタンパク質−核酸複合体を用いることにより、良好な感度で標的物を検出可能な標的物の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施形態に係るヌクレオチド誘導体の一例であるＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成方法の一例を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係るヌクレオチド誘導体の一例であるＺ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰの合成方法の一例を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係るタンパク質−核酸複合体の調製方法の一例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施形態に係るタンパク質−核酸複合体の調製方法の一例を示す概略図である。
【図５】本発明の実施形態に係るタンパク質−核酸複合体の調製方法の一例を示す概略図である。
【図６】実施例１において、ＴｄＴを用いて伸長反応を行った際のアガロースゲル電気泳動装置による電気泳動の結果を示す図である。
【図７】実施例１において、ＭＴＧを用いてＰｆｕＡＰラベル化を行った際のアガロースゲル電気泳動装置による電気泳動の結果を示す図である。
【図８】実施例１において、核酸プローブを用いたドットブロットの結果を示す図である。
【図９】実施例２において、ＴｄＴ反応の経時変化の電気泳動の結果を示す図である。
【図１０】実施例２において、ＴｄＴ反応によるＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰと各種未修飾ヌクレオチドの導入の電気泳動の結果を示す図である。
【図１１】実施例２において、ＴｄＴ反応における基質混合比の変化の電気泳動の結果を示す図である。
【図１２】実施例２において、ＭＴＧ反応における基質混合比の変化の電気泳動の結果を示す図である。
【図１３】実施例２におけるトロンビン検出の手順の一例を示す概略図である。
【図１４】実施例２において、（ＢＡＰ）ｎ−アプタマーによるトロンビン結合能力およびシグナル増幅の比較を示す図である。
【図１５】実施例２において、ＭＴＧ反応における基質の違いによる電気泳動の結果を示す図である。
【図１６】実施例２において、基質の違いによるトロンビン結合能力およびシグナル増幅の比較を示す図である。
【図１７】本発明の実施例１において得られたＺ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰの逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図１８】本発明の実施例１において得られたＺ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１９】本発明の実施例４において得られたＺ−ＱＧ−ＰＥＯ−ｄｄＵＴＰの逆相ＨＰＬＣの結果を示す図である。
【図２０】本発明の実施例４において得られたＺ−ＱＧ−ＰＥＯ−ｄｄＵＴＰのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図２１】実施例３において、ＴｄＴ反応後、ＭＴＧ反応後における電気泳動の結果を示す図である。
【図２２】（ａ）実施例３において、（ＢＡＰ）−アプタマーのトロンビン検出限界の結果を示す図であり、（ｂ）用量応答曲線を示す図である。
【図２３】実施例４において、ＴｄＴ反応後、ＭＴＧ反応後における電気泳動の結果を示す図である。
【図２４】（ａ）実施例４において、（ＢＡＰ）ｎ−（ＰＥＧ）３−アプタマーのトロンビン検出限界の結果を図２２に示す図であり、（ｂ）用量応答曲線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００１７】
本発明の実施形態に係るタンパク質−核酸複合体の製造方法は、核酸の３’末端にヌクレオチドを付加する３’末端付加酵素を用いて、核酸の３’末端に、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を少なくとも１つ付加する３’末端付加工程と、トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）を用いて、前記グルタミン（Ｇｌｎ）残基にリシン（Ｌｙｓ）残基を有し標識部分を含む標識化合物を結合する、または、前記リシン（Ｌｙｓ）残基にグルタミン（Ｇｌｎ）残基を有し標識部分を含む標識化合物を結合する標識化合物結合工程と、を含む。
【００１８】
本発明者らは、核酸の高次構造形成配列を維持するために核酸の３’末端にヌクレオチドを付加する手法として、ＴｄＴ等の３’末端付加酵素による部位特異的な修飾法に着目した。ＴｄＴ等の３’末端付加酵素は、核酸の３’末端にランダムにデオキシヌクレオチドを付加する酵素であり、非鋳型依存的にホモポリマーを生成することができる。ＴｄＴ等は基質認識が甘く、化学修飾ヌクレオチドも取り込み可能とされている。そのため、標識化合物導入用の反応点を修飾したヌクレオチドを取り込ませて、ＴｄＴ等により核酸の伸長および反応点の導入を行う。また、ＴｄＴ等は非鋳型依存的に３’末端にホモポリマーを生成するので、核酸の高次構造形成配列にほとんど影響を与えないため、伸長用および反応点導入酵素として着目した。
【００１９】
また、伸長および反応点の導入を行った反応点導入核酸に標識化合物を共有結合的に導入する手法として、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）などのトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）が有する部位特異的なタンパク質修飾能に着目した。ＴＧａｓｅはアシル転移反応を触媒する酵素であり、例えば、タンパク質中の特定のＧｌｎ残基（Ｑ）のγ−カルボキシアミド基と、Ｌｙｓ残基（Ｋ）のε−アミノ基や各種一級アミンとの共有結合を触媒する酵素である。このＴＧａｓｅを用いて、標識酵素などの標識部分を導入したタンパク質−核酸複合体の創製を行う。ＭＴＧ等は基質認識特性が高いため、伸長および反応点の導入を行った反応点導入核酸の反応点と検出用酵素等の反応タグ部分を選択的に架橋することができ、標識酵素等の活性をほとんど低下させずに導入できる。
【００２０】
具体的には、例えば、図１に示すように、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）に、ＴＧａｓｅが認識するＧｌｎ（ＭＴＧ認識Ｇｌｎ）を有するＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体であるＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成し、図３に示すように、ＴｄＴ等を用いて鋳型核酸（鋳型ＤＮＡ等）の３’末端の伸長反応を行いＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰを取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが導入された（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡ（反応点導入核酸）を調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させることによって、核酸と標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは１以上の整数）であるタンパク質−核酸複合体を創製することができる。
【００２１】
また、図４に示すように、ＴｄＴ等を用いて鋳型核酸（鋳型ＤＮＡ等）の３’末端の伸長反応を行う際にｄＮＴＰとともにＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰを取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが導入された（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡ（反応点導入核酸）を調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させることによって、核酸と標識酵素などの標識部分が１：ｎ（ｎは１以上の整数）であるタンパク質−核酸複合体を創製することができる。
【００２２】
また、例えば、図２に示すように、ジデオキシウリジン三リン酸（ｄｉｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄｄＵＴＰ）に、Ｚ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体であるＺ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰを合成し、図５に示すように、ＴｄＴ等を用いて鋳型核酸（鋳型ＤＮＡ等）の３’末端にＺ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰを取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎが導入された（Ｚ−ＱＧ）−ＤＮＡ（反応点導入核酸）を調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＬｙｓなどのＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓを導入した標識酵素などの標識化合物を結合させることによって、核酸と標識酵素などの標識部分が１：１であるタンパク質−核酸複合体を創製することができる。
【００２３】
このタンパク質−核酸複合体は、ターゲットとなる標的物に結合した後、直ちに検出反応を行うことができるため、既存の手法と比較して、操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、バルク酵素である微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）を用いることによるコストの抑制などが見込まれる。
【００２４】
なお、図３，４，５において、（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡ（反応点導入核酸）におけるＧｌｎ残基と、標識化合物におけるＬｙｓ残基とは逆であってもよい。すなわち、ＴＧａｓｅが認識するＬｙｓ（ＭＴＧ認識Ｌｙｓ）を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を合成し、ＴｄＴ等を用いて鋳型核酸の３’末端の伸長反応を行う際に取り込ませることによって、ＴＧａｓｅ認識Ｌｙｓが導入された反応点導入核酸を調製する。その後、ＭＴＧなどのＴＧａｓｅを用いて、ＭＴＧ認識ＧｌｎなどのＴＧａｓｅ認識Ｇｌｎを導入した標識化合物を結合させることによって、核酸と標識部分が１：ｎ（ｎは１以上の整数）であるタンパク質−核酸複合体を創製してもよい。
【００２５】
このようにして、鋳型核酸の標的物認識部位、標識酵素等の標識部分の活性部位への影響を抑制し、鋳型核酸に部位特異的に標識部分を含む標識化合物を導入することができる。
【００２６】
３’末端付加酵素としては、鋳型核酸の３’末端にヌクレオチドを付加することができる酵素であればよく、特に制限はないが、例えば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、Ｆａｍｉｌｙ  Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ、ポリＡ  ＲＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。これらのうち、反応効率等の点から、ＴｄＴが好ましい。ＴｄＴは、鋳型非依存的に核酸の３’末端に対して、ランダムにデオキシヌクレオチドを導入する酵素である。Ｆａｍｉｌｙ  Ａ型ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型非依存的にＤＮＡの３’末端にｄＡＴＰを導入する酵素であり、ポリＡ  ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型非依存的にＲＮＡの３’末端にＡＴＰを導入する酵素である。ＴｄＴ等を用いた伸長反応は、公知の方法を用いればよい。
【００２７】
３’末端の伸長反応を行う鋳型核酸としては、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。鋳型核酸の配列および長さには特に制限はない。長さに関しては、ＴｄＴ等が結合するために、少なくとも３ｍｅｒ以上であればよい。これらのうち、核酸の配列特異的に検出する観点からは、標的核酸に相補的な配列を有するＤＮＡ、ＰＮＡ、ＲＮＡからなる核酸プローブが望ましく、核酸以外の分子を検出する観点からは、ＤＮＡやＲＮＡからななる核酸アプタマーが望ましい。核酸アプタマーは、その高次構造により、幅広い標的物と高い親和性、特異性で結合するオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。核酸アプタマーは、有機小分子やタンパク質等の生体高分子等に対して結合特異性を有する。
【００２８】
核酸アプタマーの検出対象としては、例えば、無機物（亜鉛イオン、ニッケルイオン等）、有機小分子（ＡＴＰ等）、補酵素（ＮＡＤ等）、糖（セルビオース等）、タンパク質（トロンビン、インターフェロンガンマ等）等が挙げられる。
【００２９】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する。グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体としては、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）誘導体、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）誘導体、グアノシン三リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴＰ）誘導体、シチジン三リン酸（ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＣＴＰ）誘導体、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）誘導体、デオキシアデノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＡＴＰ）誘導体、デオキシグアノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＧＴＰ）誘導体、デオキシシチジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＣＴＰ）誘導体などが挙げられる。本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体において、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基は、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
【００３０】
これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはそれらの各種誘導体から得ることができる。
【００３１】
また、これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ウリジン、ウリジンの一リン酸（ＵＭＰ）および二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン、アデノシンの一リン酸（ＡＭＰ）および二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン、グアノシンの一リン酸（ＧＭＰ）および二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン、シチジンの一リン酸（ＣＭＰ）および二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンの一リン酸（ｄＵＭＰ）および二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシアデノシン、デオキシアデノシンの一リン酸（ｄＡＭＰ）および二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン、デオキシグアノシンの一リン酸（ｄＧＭＰ）および二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンの一リン酸（ｄＣＭＰ）および二リン酸（ｄＣＤＰ）ならびにそれらの各種誘導体から得てもよい。
【００３２】
例えば、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのリン酸化酵素などによるリン酸化（例えば、生物工学会誌，８５（９），ｐ３９７−３９９（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７（６），ｐ．７３２−７３８（１９９９）など参照）や、プロトンスポンジ存在下でのオキシ塩化リンなどによるリン酸化（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（３６），ｐ．４５２５−４５２８（１９８８）など参照）などによって、それらの三リン酸体を得ることができる。
【００３３】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（２）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するウリジン三リン酸誘導体である。
【化２】
0005509440.tif 000003
（式（２）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｃは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００３４】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（３）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するアデノシン三リン酸誘導体である。
【化３】
0005509440.tif 000004
（式（３）中、Ａ１およびＡ２のうち少なくとも１つは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｃは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００３５】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（４）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するシチジン三リン酸誘導体である。
【化４】
0005509440.tif 000005
（式（４）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｃは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００３６】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（５）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するグアノシン三リン酸誘導体である。
【化５】
0005509440.tif 000006
（式（５）中、Ａは、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基、Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｃは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００３７】
Ａで表されるグルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する置換基としては、特に制限はないが、例えば、グルタミン（Ｇｌｎ）残基またはリシン（Ｌｙｓ）残基を有する直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。
【００３８】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（１）で示され、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基またはＬｙｓ残基を有するＴＧａｓｅ基質修飾ヌクレオチド誘導体であることが好ましい。
【化６】
0005509440.tif 000007
（式（１）中、ＸおよびＹは、それぞれ独立して２価の連結基を表し、Ｚは、置換基を表す。Ｂは水素原子またはヒドロキシル基を表し、Ｃは水素原子またはヒドロキシル基を表す。ｍは０または１である。）
【００３９】
ＸおよびＹで表される２価の連結基としては、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基などの炭素数２〜４８のアルケニレン基などが挙げられる。これらのうち、Ｘ，Ｙは、それぞれ独立して炭素数１〜４８のアルキレン基または炭素数２〜４８のアルケニレン基、炭素数１〜４８のアルコキシ基であることが好ましく、Ｘはエテニレン基、Ｙはメチレン基であることがより好ましい。Ｘ，Ｙはさらにエテニレン基、オキシアルキレン基、例えば−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ｎは繰り返し数でありｎ＝２，４，８，１２，２４）基などで置換されていてもよい。Ｙとしては、例えば、−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−Ｃ２Ｈ４−が挙げられる。
【００４０】
Ｚで表される置換基としては、メチル基、エチル基、プロピル基などの炭素数１〜４８のアルキル基、メトキシ基、エトキシ基、プロピオキシ基などの炭素数１〜４８のアルコキシ基、フェニル基、ナフチル基などの炭素数６〜４８のアリール基、フェニルオキシ基などの炭素数６〜４８のアリールオキシ基、ベンジル基などの炭素数７〜４８のアリールアルキル基、ベンジルオキシ基などの炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基などが挙げられる。これらのうち、Ｚは、炭素数１〜４８のアルキル基、炭素数１〜４８のアルコキシ基、炭素数６〜４８のアリール基、炭素数６〜４８のアリールオキシ基、炭素数７〜４８のアリールアルキル基または炭素数７〜４８のアリールアルキルオキシ基であることが好ましく、Ｚはベンジルオキシ基であることがより好ましい。Ｚはさらにジニトロフェニル基、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニル基などで置換されていてもよい。また、上述したＹで表される置換との組み合わせで、Ｙ，Ｚは独立してＬｙｓ以外のアミノ酸により少なくとも一方が置換されていてもよい。
【００４１】
Ｘ，Ｙを適宜選択することにより、Ｚ−ＱＧとＵＴＰとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、酵素などのアクセスを向上することができる。また、Ｙ，Ｚを適宜選択することにより、基質ペプチド配列を最適化し、例えば酵素などの親和性を向上することができる。
【００４２】
微生物由来ＴＧａｓｅ（ＭＴＧ）を用いる場合、ＭＴＧが認識可能なＧｌｎ残基は、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）として存在することが好ましい。Ｚ−ＱＧは、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などよりも分子サイズが小さいため好ましい。式（１）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体において、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基、Ｂが水素原子、Ｃがヒドロキシル基であるヌクレオチド誘導体が、ｄＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰである。式（１）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体において、Ｘがエテニレン基、Ｙがメチレン基、Ｚがベンジルオキシ基、Ｂ，Ｃが水素原子であるヌクレオチド誘導体が、ｄｄＵＴＰにＺ−ＱＧを結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰである。式（１）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体において、Ｘがエテニレン基、Ｙが−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）４−Ｃ２Ｈ４−、Ｚがベンジルオキシ基、Ｂ，Ｃが水素原子、ｍ＝１であるヌクレオチド誘導体が、ｄｄＵＴＰにＺ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−を結合させたヌクレオチド誘導体Ｚ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−ｄｄＵＴＰである。また、ヌクレオシド三リン酸誘導体中には、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基とＬｙｓ残基または第一級アミンとが共存しないようなものを選択することが好ましい。共存する場合には、ＴＧａｓｅにより、自己架橋する可能性があり、目的のタンパク質−核酸複合体の収率に好ましくない影響を与える場合があるからである。
【００４３】
また、微生物由来ＴＧａｓｅの良基質として、ＬＬＱＧ（配列番号：１）、ＬＡＱＧ（配列番号：２）、ＬＧＱＧ（配列番号：３）、ＰＬＡＱＳＨ（配列番号：４）、ＦＥＲＱＨＭＤＳ（配列番号：５）、もしくはＴＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号：６）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＬＧＱＧＧＧ（配列番号：７）、ＧＦＧＱＧＧＧ（配列番号：８）、ＧＶＧＱＧＧＧ（配列番号：９）、もしくはＧＧＬＱＧＧＧ（配列番号：１０）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。また、ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｌｉｖｅｒ由来のＴＧａｓｅの良基質として、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルフェニルアラニン（Ｚ−ＱＦ）、またはＥＡＱＱＩＶＭ（配列番号：１１）のアミノ酸配列からなるペプチド、またはＧＧＧＱＬＧＧ（配列番号：１２）、ＧＧＧＱＶＧＧ（配列番号：１３）、ＧＧＧＱＲＧＧ（配列番号：１４）、ＧＱＱＱＬＧ（配列番号：１５）、ＰＮＰＱＬＰＦ（配列番号：１６）もしくはＰＫＰＱＱＦＭ（配列番号：１７）のアミノ酸配列からなるペプチドが知られている。ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基は、用いるＴＧａｓｅの種類に応じ、このようなペプチドとして存在してもよい。
【００４４】
なお、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドは、Ｎ末端アミノ基がＴＧａｓｅの基質になりうるため、自己架橋による副産物が生じうる。したがって、Ｎ末端がグリシン（Ｇ）である基質ペプチドについては、Ｎ末端アミノ基の水素を適切な基で置換することによりＴＧａｓｅの基質とはならないように保護して、所望の連結を行うことができるようにするとよい。なお、本明細書において「Ｎ末端保護」というときは、特別な場合を除き、このような意味で用いている。そして、Ｎ末端保護の手段により、反応性が異なることが知られている。詳細には、ほ乳類由来ＴＧａｓｅに関して、ＧＱＱＱＬＧのＮ末端アセチル化による保護（すなわち、Ａｃ−ＧＱＱＱＬＧ）、またＮ末端アミノ酸をＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）にする（すなわち、ＤＯＰＡ−ＧＱＱＱＬＧ）と反応性が向上することが知られている。このような保護の例を、本実施形態においても利用することができる。
【００４５】
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの調製方法を図１に示す。これは、本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。
【００４６】
まず、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミルグリシン（Ｚ−ＱＧ）にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておく（ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ）。そして、アミノアリルＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するｄＵＴＰと、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧとを縮合することにより、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを得ることができる。同様にして図２に示すようにしてＺ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰを調製することができる。
【００４７】
また、Ｃ末端のカルボキシル基を活性エステル化する上述の方法に加えて、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するペプチドをｄＵＴＰに導入する方法として、アミノ基と反応性の高い官能基をペプチドに導入する方法がある。例えば、アルデヒド化、アシルアジド化、スルフォニルクロライド化、エポキシ化、イソシアネート化、またはイソチオシアネート化した基質ペプチドを調製できれば、これをアミノ化ｄＵＴＰと反応させることにより、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有するｄＵＴＰを調製することができる。ただし、これらの反応性官能基は、基質ペプチドにおいてＴＧａｓｅ認識に影響がない部分に導入する必要がある。したがって、上述のように、Ｇｌｎ残基とは離れたＣ末端のカルボキシル基を活性化する方法は、この目的において最も優れたものの一つである。
【００４８】
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）などにより行うことができる。また、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの同定は、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲなどにより行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。
【００４９】
タンパク質−核酸複合体において、核酸と標識酵素などの標識部分との比率ｎは、１以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができるが、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、標的物とのハイブリダイゼーション等の結合の効率が低下する場合がある。
【００５０】
また、例えば、以下の方法により、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のタンパク質−核酸複合体を調製することができる。
（１）ＴＧａｓｅの由来を変える。
（２）ＴＧａｓｅの基質特異性を変える。
【００５１】
（１）の方法では、例えば、用いるＴＧａｓｅの種類に応じて、異なる基質ペプチドで修飾されたＵＴＰなどを調製すればよい。
【００５２】
（２）の方法では、例えば、ＴＧａｓｅに、タンパク質工学的にアミノ酸変異を導入して基質特異性を変えればよい。例えば、ＭＴＧを大腸菌で調製し（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｋ．  Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ．  Ｈｅｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｕｓ  Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４０，Ｉｓｓｕｅ  ６，２  Ｍａｙ  ２００７，ｐ．１５４３−１５５０，”Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏ−ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”参照）、さらに変異体ライブラリーを作って耐熱性の向上したＭＴＧを取得することができる（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｋ．  Ｍａｒｘ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ．  Ｈｅｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｕｓ  Ｐｉｅｔｚｓｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １３６，Ｉｓｓｕｅｓ  ３−４，１０  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００８，ｐ．１５６−１６２，”Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  ｈｅａｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ”参照）。
【００５３】
本明細書において、「ＴＧａｓｅにより結合する」というときは、特別な場合を除き、得られる連結部は、Ｌｙｓ残基とＧｌｎ残基とが、ε（γ−グルタミル）リシン結合を形成することにより構成されている。
【００５４】
本実施形態においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基は、第一級アミンであってもよい。本明細書では、Ｌｙｓ残基を例に説明するが、その説明は、特別な場合を除き、第一級アミンにも当てはまる。
【００５５】
グルタミン（Ｇｌｎ）残基を有し標識部分を含む標識化合物、リシン（Ｌｙｓ）残基を有し標識部分を含む標識化合物としては、特に制限はない。
【００５６】
標識部分としては、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、熱的に検出可能な標識（例えば、温度応答性高分子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）などが挙げられ、検出感度、取り扱い性などの点から、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つが好ましい。
【００５７】
蛍光色素としては、選択された波長の紫外光、可視光などの放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体などが挙げられる。
【００５８】
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。
【００５９】
ＴＧａｓｅに対し、Ｌｙｓ残基供与体となる基質は、Ｇｌｎ残基供与体となる基質に比較して構造的な制約が少ないと考えられる。したがって、修飾しようとする標識酵素が、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を元来有している場合もあり、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むタグを酵素に付加する場合もある。
【００６０】
ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基（Ｋ）は、ＭＫＨＫＧＳ（配列番号：１８）、ＭＲＨＫＧＳ（配列番号：２３）、ＭＲＲＫＧＳ（配列番号：２４）、ＭＨＲＫＧＳ（配列番号：２５）のアミノ酸配列を有するペプチドとして存在してもよい。このようなＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドによるタグ化は、標識酵素を、タンパク質の所望の部位、例えばＣ末端またはＮ末端に連結する目的で用いることができる。ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含む他のペプチドまたはそのアミノ酸配列の例としては、改変型Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＧＭＫＥＴＡＡＡＲＦＥＲＡＨＭＤＳＧＳ（配列番号：１９））、ＭＧＧＳＴＫＨＫＩＰＧＧＳ（配列番号：２０）、Ｎ末端グリシン（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＧＧ、Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＧＧＧＧＧ（配列番号：２１））、Ｎ末端ＭＫＨＫＧＳと対象タンパク質間のリンカー部位を伸ばしたＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳ（配列番号：２２）などが挙げられる。
【００６１】
Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を含むペプチドを付加した標識酵素は、遺伝子工学的な手法を用いて、組換えタンパク質として調製することができる。Ｃ末端またはＮ末端にＴＧａｓｅの基質ペプチドタグが導入された当該組換えタンパク質の精製は、それぞれＮ末端またはＣ末端に付加した精製用ペプチドタグ（例えば、（Ｈｉｓ）６−ｔａｇ（ヘキサヒスチジンタグ））を利用し（ＴＧａｓｅの反応性の低下を回避するために、基質ペプチドタグを入れた末端とは異なる末端に精製用ペプチドタグを入れるようにデザインするとよい。）、ゲル濾過クロマトグラフィなどにより行うことができ、またアミノ酸配列の確認は当該タンパク質をコードするプラスミドベクターの遺伝子配列をＤＮＡシーケンサにて確認するか、Ｎ末端に導入された基質ペプチドについてはＮ末端分析により直接同定することができる。タンパク質の精製の確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどで行うことができる。
【００６２】
標識酵素としては、発色反応などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。ペプチドタグが容易に導入可能との観点からは、遺伝子工学的に製造可能なタンパク質が好ましい。
【００６３】
タンパク質−核酸複合体を核酸プローブとして用いて核酸プローブと標的物との間でハイブリダイズさせる場合、より厳密に塩基配列特異的な二本鎖形成を行うためには、比較的高温（例えば、７０℃以上）の条件下で行うことがあるため、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。その場合は、標的酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）が好ましい。
【００６４】
超好熱菌由来の酵素は、一般的に有機溶媒や熱に対して高い安定性を示すことが知られているため好ましく（例えば、Ｈ．Ａｔｏｍｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９，ｐ．１６６−１７３（２００５）参照）、さらに、大腸菌を宿主とした大量調製が比較的容易に行うことができる点においても好ましい。大腸菌を宿主として耐熱性酵素を調製する場合、細胞破砕液を高温処理（例えば、８０℃で３０分温置）することで、大腸菌由来の共雑タンパク質のほとんどを沈殿させ、粗精製を容易に行うことができる。
【００６５】
超好熱菌は一般の生物がほとんど生育できない極限環境で生育することができる微生物であるため、超好熱菌由来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有している。さらに、熱に対する耐性だけでなく、一般的に、変性剤、有機溶媒、ｐＨなどに対する耐性も常温菌由来酵素に比べて極めて高いことから、ＰｆｕＡＰを使用することによって、酵素の失活を伴わない厳密な二本鎖形成を達成することができると考えられる。
【００６６】
また、タンパク質−核酸複合体において、酵素が有機溶媒や熱に対して安定な酵素であってもよい。このような安定性の高い酵素は、自然界からのスクリーニング（例えば、化学と工業，ｖｏｌ．６１（Ｎｏ．６），ｐ．５７１−５７５（２００８）、内山拓，宮崎健太郎，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．５），ｐ．２３４−２３９（２００８）、道久則之，バイオサイエンスとインダストリー，ｖｏｌ．６６（Ｎｏ．１２），ｐ．６６７−６７０（２００８））や、タンパク質工学的手法により安定性を高める技術（例えば、荻野博康，ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．１６−２３（２００８）、宮崎健太郎，ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ，ｖｏｌ．２５（Ｎｏ．７），ｐ．５２−５８（２００８））により得ることができる。これらの手法により、常温菌由来の酵素であっても、有機溶媒耐性や耐熱性を有する酵素へと変換することができる。
【００６７】
蛍光色素部分を導入した、リシン（Ｌｙｓ）残基を有する標識化合物は、例えば、カルボキシル基にジアミンを導入する方法で調製することができる（例えば、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ（１９９６），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １,Ｓｅｃｔｉｏｎ  ４．３，ｐ．１００−１０４，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ．を参照）。
【００６８】
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）としては、種々のものを用いることができる。現在、ＴＧａｓｅとして、哺乳類（ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ、ヒト）、無脊椎動物（昆虫、カブトガニ、ウニ）、植物、菌類、原生生物（粘菌）由来のものが知られており、またヒトの場合については、８種類のアイソザイムが見つかっている。本実施形態において用いることのできるＴＧａｓｅの好ましい例は、安定性、ハンドリングの容易さ、バルク生産が可能などの点から微生物由来微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）である。
【００６９】
本実施形態においてＭＴＧを用いた場合、予想されているＭＴＧの触媒反応から、Ｌｙｓ残基を有する標識酵素などの標識部分を含む標識化合物と（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡとの連結反応は、ＭＴＧ活性中心であるシステイン（Ｃｙｓ）残基の、（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡのＧｌｎへの求核置換反応によるアシル−酵素複合体の形成と、続いて起こる標識化合物のＬｙｓによるアシル−酵素複合体への求核置換反応によるＭＴＧの脱離、の２段階で進行すると予想される。
【００７０】
本実施形態の好ましい態様においては、ＴＧａｓｅが認識可能なＧｌｎ残基を有する（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡに対する、ＴＧａｓｅが認識可能なＬｙｓ残基を有する標識化合物のモル濃度比は、好ましくは２以上であり、より好ましくは５以上である。なお、本明細書で単に「濃度比」というときは、特別な場合を除き、モル濃度による比を指す。例えば、（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡに対するＮＫ１４−ＰｆｕＡＰのモル濃度比は、[ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ]／[（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡ]と表すこともできる。
【００７１】
［ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの調製］
ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰとは、ＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳの配列を有するアミノ酸１４残基からなる付加配列を遺伝子工学的にＰｆｕＡＰのＮ末端に、精製用タグをＣ末端に導入したものである。ＰｆｕＡＰの発現ベクターは香川大学櫻庭春彦教授より委譲頂いた。ＰＣＲによりＰｆｕＡＰをコードする領域を増幅する際、それぞれのタグが導入されるようにタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ  ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００７２】
また、ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの大腸菌での発現量の向上のため、大腸菌のコドン使用頻度に合わせて塩基配列が改変されたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰの発現ベクター（アクセッション番号：ＡＢ４７９３８３、配列番号：２６）を用いてもよい。この発現ベクターは、CodonDevices社（http：／／www．codondevices．com）に受託合成して得た。ＮＫ１４−ＰｆｕＡＰをコードする遺伝子領域の両端に適切な制限酵素サイトを導入しておき、これらを利用することでタンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、得られたＮＫ１４−ＰｆｕＡＰ発現ベクターにより大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、２５ｍＭ  ＴＢＳで２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。超高熱菌由来のＰｆｕＡＰは高温条件下でも安定であるので、得られた無細胞抽出液を８０℃で３０分処理し、他のタンパク質を沈殿させることによって粗精製を行った。粗精製後、遠心分離・フィルター濾過によって上澄みを回収し、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムによって精製した。精製後、限外濾過による濃縮を行い、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００７３】
［ＮＫ１４−ＢＡＰの調製］
ＮＫ１４−ＢＡＰとは、ＭＫＨＫＧＧＧＳＧＧＧＳＧＳの配列を有するアミノ酸１４残基からなる付加配列を遺伝子工学的に大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）のＮ末端に、精製用タグをＣ末端に導入したものである。ＢＡＰのプラスミドベクターは東京大学上田宏准教授より委譲頂いた。ＰＣＲによりＢＡＰをコードする領域を増幅する際にそれぞれのタグが導入されるようして、タンパク質発現用ベクターｐＥＴ２２に組換え、大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ培地にて前培養、本培養を経て、得られた形質転換体を遠心分離により収菌し、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で２回洗浄した。得られた菌体を凍結・融解させた後、超音波処理により細胞を粉砕し、遠心分離により可溶性画分を回収した。可溶性画分をフィルター濾過した後、Ｈｉｓ−ｔａｇカラムおよびサイズ排除カラムクロマトグラフィによって精製した。精製後、ＰＤ−１０カラムを用いて溶媒を５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へと置換し、実験に供するまで凍結保存した。
【００７４】
ＴＧａｓｅとしてＭＴＧを用いて連結反応を行う場合には、上述のようにモル濃度比が適切な範囲となるようにすることに加えて、ｐＨ５．５〜８．０、温度４〜５０℃（例えば、室温（例えば、１８℃〜２２℃））の条件で行うことが好ましい。このようにすれば、１２時間以内、好ましくは６時間以内、より好ましくは３時間以内に、充分に高い反応率が達成可能である。
【００７５】
＜標的物の検出方法＞
本実施形態に係る標的物の検出方法は、上記タンパク質−核酸複合体と、対象物中に存在する標的物とを核酸部分により結合させ、結合しているタンパク質−核酸複合体を、標識部分により検出する方法である。
【００７６】
本実施形態に係るタンパク質−核酸複合体を、核酸プローブとして用いて標的物と核酸部分により結合させる方法としては、タンパク質−核酸複合体の核酸部分と対象物中に存在する標的核酸とを相補的に結合させるハイブリダイゼーション法があり、核酸アプタマーとして用いるには、タンパク質−核酸複合体の核酸部分がとる高次構造を利用して標的物の立体構造を認識して結合する方法がある。これらの結合反応のための条件は、当業者であれば適宜設定できる。
【００７７】
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、標的物の定性、定量、識別、染色、局在化の調査などの目的で用いることができる。
【００７８】
標的物としては、核酸、有機色素、アミノ酸、抗体、抗生物質、ペプチド、タンパク質、ビタミン類等が挙げられる。
【００７９】
本実施形態に係る標的物の検出方法において、異なる標識酵素、異なる蛍光色素などの異なる標識部分を有する複数のタンパク質−核酸複合体を準備して、同時に複数の標的物を検出してもよい。
【００８０】
＜タンパク質−核酸複合体のその他の利用方法＞
本実施形態に係るタンパク質−核酸複合体は、下記方法に利用することができる。例えば、薬理活性を有するタンパク質とアプタマーを結合する方法であって、上記タンパク質−核酸複合体において、薬理活性を示すタンパク質と、病変部位に指向性を有する核酸アプタマーを組み合わせることで、当該タンパク質を病変部位に送達し、薬効を高める方法に利用することができる。
【００８１】
また、タンパク質と合成分子を結合する方法であって、上記タンパク質−核酸複合体と、合成分子に導入した相補的核酸部分とを結合させ、タンパク質と合成分子を非共有結合的にハイブリッド化する方法に利用することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００８３】
［実施例１］
＜Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成・精製＞
まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中にて、１００ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ  Ｚ−ＱＧを、室温（調製した日は１８〜２２℃程度）で２０時間反応させることによって、ＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ（５０ｍＭ）を調製した。一方、５０ｍＭ  ５−（３−ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）−ｄＵＴＰ（以下、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰと略記、ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液（Ａｍｂｉｏｎ製）１６μＬと２００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）４０μＬ、滅菌水１６μＬとを混合し、１０ｍＭ  ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰ溶液を８０μＬ調製した。この溶液に対して、上記で調製したＮＨＳ化Ｚ−ＱＧ溶液を８０μＬ添加し、２５℃で一晩反応させた。反応終了後、サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑで１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製、高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ  ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって、表１に示す条件で精製を行った。生成物の同定はＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ（ＢＲＵＫＥＲ  ＤＡＬＴＯＮＩＣＳ製、ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＩＩＩ）によって行った。この際、３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）をマトリックスとして使用した。
【００８４】
【表１】
0005509440.tif 000008
【００８５】
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行ったところ、ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ−ｄＵＴＰの場合と比較して、疎水側に新たなピークが出現しており、このピークがＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰであると推測された。そこで、保持時間１９．１分のピークを回収してＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析を行ったところ、８４１．４６のピークが確認され、理論分子量の８４２．１３と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの合成が示された。
【００８６】
＜（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡの調製＞
ＤＩＧ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロッシュ製、＃３  ３５３  ５８３）を使用して、ＴｄＴによる３’末端の伸長反応を行った。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ（１ｍＭ）  １μＬ、ｄＡＴＰ（１０ｍＭ）  １μＬ、ＤＮＡ（ＳｈｈＰＣＲ増幅産物（３００ｂｐ）、配列番号：２７）  １μｇ、ＴｄＴ（４００Ｕ／μＬ）  １μＬ、５×反応バッファ  ４μＬ、ＣｏＣｌ２（２５ｍＭ）  ４μＬ、滅菌水を混合して合計２０μＬとし、３７℃で３０分間インキュベートした。０．２M  ＥＤＴＡ  ２μＬを添加し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製した後、ＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ  ３０μＬで溶出し、（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡを得た。電気泳動によりＴｄＴ反応のチェックを行った（泳動条件：１×ＴＡＥ、Ａｇａｒｏｓｅ  ４％  （ＫＡＮＴＯ  ＨＣ）、ＥｔＢｒ後染め、泳動１００Ｖ、４０ｍｉｎ）。結果を図６（ａ）に示す。
【００８７】
図６（ａ）からわかるように、ＴｄＴ反応後、スメア状に大きく高分子側にシフトした。これにより、複数個のＧｌｎがＤＮＡの３’末端に導入されたと考えられる。
【００８８】
＜（ＰｆｕＡＰ）ｎ−ＤＮＡの調製＞
ＬａｂｅｌｌｉｎｇＯＮＥ  アルカリホスファターゼ標識キット（日立アロカメディカル製、ＡＬＲ−１０３）を用いて、アルカリホスファターゼによる標識化を行った。上記（Ｚ−ＱＧ）ｍ−ＤＮＡ（推定２７ｎｇ／μＬ）  ７．４μＬ、１０×反応バッファ  ４μＬ、滅菌水８．６μＬを混合して、９５℃５分間で熱変性した。急冷後、ＰｆｕＡＰ（８ｍｇ／ｍＬ）  １μＬ、ＭＴＧ  １μＬを添加し、４０℃で３時間インキュベート後、２μＬのＳｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、反応を停止させ、（ＰｆｕＡＰ）ｎ−ＤＮＡを得た。電気泳動により反応のチェックを行った（泳動条件：１×ＴＡＥ、Ａｇａｒｏｓｅ  １．５％  （ＫＡＮＴＯ  ＬＥ）、ＥｔＢｒ後染め、泳動１００Ｖ、３０ｍｉｎ）。結果を図７に示す。
【００８９】
図７からわかるように、反応後、高分子側にシフトした。これにより、アルカリホスフォターゼにより標識されたと考えられる。
【００９０】
＜Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰ＞
Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰとしては、ジーンアクト社にて合成したものを用いた。
【００９１】
Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰについて、逆相ＨＰＬＣ（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ−１８ＭＳＩＩ，１５０×４．６ｍｍ、Ｂｕｆｆｅｒ：３７％メタノール  ｉｎ  ２０ｍＭ  りん酸二水素カリウム，５ｍＭ  テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム硫酸水素塩（ｐＨ５．０）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ）を行った結果を図１７に示す。保持時間１１．４５分のピークの成分についてＥＳＩ−ＭＳ分析を行った。その結果、図１８に示すように、４１２．０７（（Ｍ−２Ｈ）２−）のピーク（２価イオンピーク（分子量×１／２−Ｈ）として検出）が確認され、理論分子量の８２６．１４と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰであることが示された。
【００９２】
＜（Ｚ−ＱＧ）−ＤＮＡの調製＞
ＤＩＧ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ロッシュ製）を使用して、ＴｄＴによる３’末端の伸長反応を行った。Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰ（１ｍＭ）  １μＬ、ＤＮＡ（Ｓｈｈ（３００）ＰＣＲ増幅産物（３００ｂｐ））  １μｇ、ＴｄＴ（４００Ｕ／μＬ）  １μＬ、５×反応バッファ  ４μＬ、ＣｏＣｌ２（２５ｍＭ）  ４μＬ、滅菌水を混合して合計２０μＬとし、３７℃で３０分間インキュベートした。０．２Ｍ  ＥＤＴＡ  ２μＬを添加し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）により精製した後、ＥＢ  ｂｕｆｆｅｒ  ３０μＬで溶出し、（Ｚ−ＱＧ）−ＤＮＡを得た。電気泳動によりＴｄＴ反応のチェックを行った（泳動条件：１×ＴＡＥ、Ａｇａｒｏｓｅ  ４％  （ＫＡＮＴＯ  ＨＣ）、ＥｔＢｒ後染め、泳動１００Ｖ、５０ｍｉｎ）。結果を図６（ｂ）に示す。
【００９３】
図６（ｂ）からわかるように、ＴｄＴ反応後、わずかに高分子側にシフトした。これにより、１個のＧｌｎがＤＮＡの３’末端に導入されたと考えられる。
【００９４】
＜（ＰｆｕＡＰ）−ＤＮＡの調製＞
ＬａｂｅｌｌｉｎｇＯＮＥ  アルカリホスファターゼ標識キット（日立アロカメディカル製、ＡＬＲ−１０３）を用いて、アルカリホスファターゼによる標識化を行った。上記（Ｚ−ＱＧ）−ＤＮＡ（推定２７ｎｇ／μＬ）  ７．４μＬ、１０×反応バッファ  ４μＬ、滅菌水９．１μＬを混合して、９５℃５分間で熱変性した。急冷後、ＰｆｕＡＰ（８ｍｇ／ｍＬ）  ０．５μＬ、ＭＴＧ  １μＬを添加し、４０℃で３時間インキュベート後、２μＬのＳｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、反応を停止させ、（ＰｆｕＡＰ）ｎ−ＤＮＡを得た。電気泳動により反応のチェックを行った（泳動条件：１×ＴＡＥ、Ａｇａｒｏｓｅ  １．５％  （ＫＡＮＴＯ  ＬＥ）、ＥｔＢｒ後染め、泳動１００Ｖ、３０ｍｉｎ）。結果を図７に示す。
【００９５】
図７からわかるように、反応後、高分子側にシフトした。これにより、アルカリホスフォターゼにより標識されたと考えられる。
【００９６】
＜ドットブロットによる検出感度の評価＞
それぞれ調製したＰｆｕＡＰラベル化核酸プローブの検出感度の評価をドットブロットで行った。なお、ハイブリダイゼーション時の各種組成およびプロトコールは、以下の通りとした。ターゲットＤＮＡとして、Ｓｈｈ（配列番号：２７）を用いた。また、ネガティブコントロールとして、Ｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ（配列番号：２８）を用いた。
【００９７】
それぞれのターゲットＤＮＡを滅菌水を用いて段階希釈し、それぞれを１μＬずつメンブレン（ＧＥヘルスケア製、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋）にスポットし、ＵＶにてクロスリンクすることでＤＮＡをメンブレンに固定した。その後、ハイブリダイゼーションバッファ（２Ｍ  Ｕｒｅａ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１ｍｇ／ｍＬ  Ｔｏｒｕｌａ  ＲＮＡ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、３％  Ｃａｓｅｉｎ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、４％  Ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）１．５ｍＬにメンブレンを移し、５５℃で３０分間、プレハイブリダイゼーションを行った。そして、実施例１，２で調製した核酸プローブ（（ＰｆｕＡＰ）ｎ−ＤＮＡ、（ＰｆｕＡＰ）−ＤＮＡ）をハイブリダイゼーションバッファ２ｍＬ（ｐｒｏｂｅ濃度  １０ｎｇ／ｍＬ）に添加して、５５℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００９８】
ハイブリダイゼーション後、メンブレンをＷａｓｈ  Ｉバッファ（２Ｍ  Ｕｒｅａ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００））５０ｍＬでリンスを１回行い、Ｗａｓｈ  Ｉバッファ  ５０ｍＬに移し、５５℃で震盪しながら３０分間洗浄した。この操作を２回繰り返した。その後、２５℃でＷａｓｈ  ＩＩバッファ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  ＣＨＡＰＳ）５０ｍＬにて５分間洗浄した。この操作を２回繰り返した。
【００９９】
発光基質としてＣＤＰ−ＳＴＡＲ（ロッシュ製）を用いて、２５℃で２時間、化学発光させ、その様子を画像撮影システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製  ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋）にて撮影した。結果を図８に示す。
【０１００】
図８からわかるように、（ＰｆｕＡＰ）ｎ−ＤＮＡ（図８（ａ））、（ＰｆｕＡＰ）−ＤＮＡ（図８（ｂ））の核酸プローブを用いた場合、ドットのシグナルが検出されていることから、核酸プローブとしての検出能を有していることが示された。（ＰｆｕＡＰ）ｎ−ＤＮＡの核酸プローブは、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰを用いたＰＣＲによる通常の標識方法（比較例１、図８（ｃ））と同程度（１００ｆｇ程度）のシグナル感度が得られた。（ＰｆｕＡＰ）−ＤＮＡの核酸プローブは、３１６ｆｇ程度のシグナル感度が得られた。
【０１０１】
［実施例２］
＜（Ｚ−ＱＧ）ｍ−アプタマーの調製＞
（ＴｄＴによるＤＮＡアプタマーへのＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ導入）
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ（終濃度０．５ｍＭ）、鋳型ＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー、5’-FITC-GGTTGGTGTGGTTGGTTTTTTTTTTTTTTT-3’、３０ｍｅｒ、蛍光標識により反応を追跡）、配列番号２９）（終濃度１μＭ）、ＴｄＴ（終濃度４０Ｕ／μＬ）、ＴｄＴ反応バッファ（ｐＨ６．６、組成：２００ｍＭ  カコジル酸カリウム、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．２５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）、ＣｏＣｌ２（終濃度５ｍＭ）、滅菌水を混合して、３７℃で６０分間インキュベートした。５、１０、２０、３０、６０分ごとに採取し、終濃度０．５ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加して各溶液の反応を停止させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりＴｄＴ反応の時間変化を評価した（泳動条件：１５％変性ポリアクリルアミドゲル（尿素７Ｍ含有）、２８０Ｖ、４０ｍＡ、６０ｍｉｎ、ＴＢＥバッファ）。結果を図９に示す。
【０１０２】
図９からわかるように、経時変化に伴いＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー）のバンドが高分子量側へとシフトし、ＴｄＴ反応は鋳型ＤＮＡ  １μＭ／Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  ０．５ｍＭの比では約６０分で飽和すると考えられる。ＴｄＴは溶液中のヌクレオチドが消失するまでＤＮＡに導入する。これはＴｄＴがモノヌクレオチドを分配法でテンプレートに付加していき、逆反応が生じないためであり、ＴｄＴ反応による生成物の鎖長は、テンプレートに対する仕込みヌクレオチド比に対応する。図９の結果では、鋳型ＤＮＡのバンドがほとんど消失していることからも、全てのＤＮＡにほぼ等しくＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰが付加され、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰが消失したために反応が飽和したと考えられる。
【０１０３】
（未修飾ヌクレオチドとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ混合下でのＴｄＴ反応）
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰのみで伸長反応を行うと、疎水的なＺ−ＱＧを有する分子であるＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰが連続して存在し、疎水性相互作用により３’末端で凝集し、ＴｄＴがアクセスしにくくなる可能性がある。そこで、未修飾ヌクレオチドとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰを混合して反応させることにより、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの導入率を高められるか検討した。核酸を構成する基本的なヌクレオチドである未修飾ヌクレオチドとしてｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰを選択してＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰと同時にＴｄＴによる伸長反応を行った。
【０１０４】
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ（終濃度０．１２５ｍＭ）、各未修飾ｄＮＴＰ（終濃度０．３７５ｍＭ）、鋳型ＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー、実施例３と同様）（終濃度１μＭ）、ＴｄＴ（終濃度４０Ｕ／μＬ）、ＴｄＴ反応バッファ（ｐＨ６．６）、ＣｏＣｌ２（終濃度５ｍＭ）、滅菌水を混合して、３７℃で６０分間インキュベートした。終濃度０．２ｍＭとなるようにＥＤＴＡを添加して各溶液の反応を停止させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によりＴｄＴ反応の評価を行った（泳動条件：１５％変性ポリアクリルアミドゲル（尿素７Ｍ含有）、２８０Ｖ、４０ｍＡ、６０ｍｉｎ、ＴＢＥバッファ）。結果を図１０に示す。
【０１０５】
図１０からわかるように、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ（２５％）＋（ｄＡＴＰまたはｄＴＴＰ（７５％））で反応させたＤＮＡアプタマーがよく伸長されていた。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ（２５％）＋（ｄＣＴＰまたはｄＧＴＰ（７５％））はｄＡＴＰまたはｄＴＴＰに比べて伸長が少なく、Ｚ−ＱＧ（１００％）−アプタマーより伸長していないように見える。このようにヌクレオチドの種類に応じて、新たなバンドが観測され、ＴｄＴの基質の取込み効率が異なることが確認された。ＴｄＴ反応における基質取り込み効率は、ｄＡＴＰ≧ｄＴＴＰ＞＞ｄＣＴＰ＞ｄＧＴＰであった。ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰの取り込み効率が低下しているのは、ＣおよびＧの一本鎖が相互作用により高次構造を組みやすく、ＴｄＴの３’末端へのアクセスを阻害するため伸長反応が停止しやすくなっていると考えられる。
【０１０６】
（ＴｄＴ反応における基質混合比の変化）
上記（未修飾ヌクレオチドとＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ混合下でのＴｄＴ反応）と同じ条件で、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰとｄＮＴＰｓ（ｄＴＴＰまたはｄＡＴＰ）との混合比を変化させてＴｄＴ反応を行った。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの割合を０，２５，５０，７５，１００％まで変化させ、伸長反応の変化をＰＡＧＥで評価した（泳動条件：１５％変性ポリアクリルアミドゲル（尿素７Ｍ含有）、２８０Ｖ、４０ｍＡ、６０ｍｉｎ、ＴＢＥバッファ）。結果を図１１に示す。
【０１０７】
図１１からわかるように、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＮＴＰの混合比率を変化させたところ、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＴＴＰの組み合わせでは、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの割合が低いほど高分子量側にバンドがシフトしており、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰがＴｄＴで取り込まれにくいことが示唆された。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＡＴＰの組み合わせでは、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの割合が低くても高分子量側にシフトしておらず、ほぼ同じ鎖長のＤＮＡアプタマーが生成している。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＡＴＰの組み合わせでは、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの取り込み効率が低下しにくいことが考えられる。
【０１０８】
＜（ＢＡＰ）ｍ−アプタマーの調製１＞
ＴｄＴ反応により調製した（Ｚ−ＱＧ）m−アプタマーをＭＴＧ反応によりアルカリホスファターゼによる標識化を行った。上記（Ｚ−ＱＧ）ｍ−アプタマー（終濃度０．５μＭ）、ＮＫ１４−ＢＡＰ（アミノ酸配列  配列番号：３０、塩基配列  配列番号：３１）（終濃度５．０μＭ）、ＭＴＧ（終濃度０．０１Ｕ／ｍＬ）の条件で、２００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）の緩衝液中にて、４℃で１時間反応させた。反応の評価はＰＡＧＥにより行った（泳動条件：アトー社製プレキャストゲル（１５％ポリアクリルアミドゲル）、２５０Ｖ、２０ｍＡ、８０ｍｉｎ、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｓｉｎバッファ）。結果を図１２に示す。
【０１０９】
図１２からわかるように、ＭＴＧを添加したレーンにおいて、新たに高分子量側に生成物が確認された。さらにＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ  １００％およびＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ＋ｄＴＴＰに関しては、元のバンドがほとんど消失していた。したがって、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰが取り込まれたＤＮＡアプタマーに対して、ＭＴＧによりＺ−ＱＧとＮＫ１４−ＢＡＰが架橋され、（ＢＡＰ）ｎ−アプタマーの複合体が生成されたことが確認された。
【０１１０】
＜（ＢＡＰ）ｍ−アプタマーによるトロンビン検出能力評価＞
（リンカー部位塩基による効果）
Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ（２５％）＋各種未修飾ヌクレオチド（７５％）で伸長したＤＮＡアプタマーを、それぞれＭＴＧでＢＡＰを架橋した（ＢＡＰ）ｍ−アプタマーを用いて表２に準じた操作で、トロンビン検出を行った。実験操作手順を、図１３、表２に示す。バッファ組成の詳細は以下の通りである。結果を図１４に示す。
【０１１１】
【表２】
0005509440.tif 000009
【０１１２】
Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ：  ５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）
ＢｕｆｆｅｒＢ：  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ  ０．１％  ＢＳＡ（ｐＨ７．４）
ＮＴＭ  Ｂｕｆｆｅｒ：  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．５）
【０１１３】
図１４からわかるように、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰと各種未修飾ヌクレオチドを混合させてＢＡＰをラベル化したＤＮＡアプタマーは、いずれもＦＩＴＣラベルのみより高い蛍光強度を示している。これは、ＤＮＡアプタマーを酵素ラベルしてもトロンビン結合能がほとんど低下せずに、トロンビンと結合し、酵素によるシグナル増幅が機能していることを示す。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰと混合してラベル化したＤＮＡアプタマーは、ＢＡＰの非特異吸着が比較的存在するが、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰと混合してラベル化したものはＢＡＰの非特異吸着がほとんど見られない。特にｄＧＴＰと混合したものは、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰのみと混合したものより高いシグナルを示している。
【０１１４】
このような結果となった原因として、グアニンはＤＮＡアプタマーのトロンビン結合部位、すなわちグアニン四重鎖を組む配列とほとんど相互作用しないためと考えられる。ｄＴＴＰも同じようにグアニン四重鎖とほとんど相互作用しないが、ｄＴＴＰはよく伸長し、スペーサが長くなりすぎてＤＮＡアプタマーの結合能力が低下し、ｄＧＴＰと混合したものほどシグナル増幅が見られなかったと考えられる。
【０１１５】
＜（ＢＡＰ）ｍ−アプタマーの調製２＞
上記（（ＢＡＰ）ｍ−アプタマーの調製１）と同様にして、ＴｄＴ反応により調製した（Ｚ−ＱＧ）m−アプタマーをＭＴＧ反応によりアルカリホスファターゼによる標識化を行った。ＭＴＧ反応後のＤＮＡアプタマーのＰＡＧＥ結果を図１５に示す。図１５において、ＭＴＧ（−）：ＴｄＴ反応後、ＭＴＧ（＋）：ＴｄＴ反応後さらにＭＴＧ反応させたＤＮＡアプタマーとなっている。ＭＴＧ（＋）のレーンでは、全ての各種ＤＮＡアプタマーが高分子側へとシフトしており、ＢＡＰラベル化による高分子量化されたと考えられる。また、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＧＴＰ以外の組み合わせでＴｄＴ反応させて伸長させたものは、全て低分子量側のＴｄＴ反応生成物（（Ｚ−ＱＧ）ｍ−アプタマー）がほとんど消失しており、ほぼ１００％に近い反応率で、ＭＴＧによりＢＡＰが架橋されていると考えられる。６００ｂｐ付近のバンドはゲルのバックグラウンドであるので、ＦＩＴＣ−ＤＮＡが存在したために現れているバンドではない。以上より、全てのＤＮＡアプタマーがＢＡＰラベル化したことを確認できた。
【０１１６】
また、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰおよびＺ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰのＭＴＧ反応後のレーンを比較すると、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰの方がより高分子量側であることから、Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰで伸長させたＤＮＡアプタマーには複数のＢＡＰが架橋されていることが考えられる。同様の考え方で、他の各種未修飾ヌクレオチド混合下で修飾したＤＮＡアプタマーも複数のＢＡＰが架橋されたと考えられる。
【０１１７】
＜（ＢＡＰ）ｍ−アプタマーによるトロンビン検出能力評価＞
上記（（ＢＡＰ）ｍ−アプタマーの調製２）で調製した（ＢＡＰ）ｍ−アプタマーによるトロンビン検出結果を図１６に示す。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰおよびＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＴＴＰでＴｄＴ反応を行い、ラベル化したＤＮＡアプタマーが、シングルラベル（Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰ）ＤＮＡアプタマーより高感度な検出を達成している。まずは、この結果からマルチラベル効果による検出感度向上が確認された。ネガティブコントロールについて考察すると、トロンビン無（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ（−））およびトロンビンの代わりに同濃度のＢＳＡを入れた（ＢＳＡ（＋））を比較すると、非特異吸着が一定量あった。これについてさらに考えると、検出用ＤＮＡアプタマーのみ（今回はＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰで伸長したものをラベル化したもの）では、ある程度の蛍光が検出されたことから、ラベル化ＤＮＡアプタマーの非特異吸着によりバックグラウンドが出ていると思われる。
【０１１８】
図１５のＰＡＧＥ結果との相関性は、高分子量側にバンドが表れたＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰおよびＺ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＴＴＰが高感度検出を達成している結果から、高分子化するほどラベル化が進み、検出感度が向上していると考えられる。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＡＴＰの検出感度が低いのは、チミンリンカー部位とアデニン伸長部位が相補鎖を形成し、ＤＮＡアプタマーの結合能力を低下させているためと考えられる。Ｚ−ＱＧ−ｄＵＴＰ／ｄＧＴＰはＰＡＧＥ結果で短いことが示されており、さらにＭＴＧ反応効率の低さからＢＡＰが十分にラベル化されておらず、検出感度が低下している。このように反応効率が低下しているのは、おそらくグアニン四重鎖の形成によりＭＴＧおよびＴｄＴの基質認識を阻害したために起こった可能性がある。
【０１１９】
［実施例３］
＜（Ｚ−ＱＧ）−アプタマーの調製＞
（ＴｄＴによるアプタマーへのＺ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰ導入）
Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰ（終濃度０．０５ｍＭ）、鋳型ＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー、実施例３と同様）（終濃度５μＭ）、ＴｄＴ（終濃度４０Ｕ／μＬ）、ＴｄＴ反応バッファ（ｐＨ６．６）、ＣｏＣｌ２（終濃度５ｍＭ）、滅菌水を混合して、３７℃で６０分間インキュベートした。反応完了後、９４℃で１５分間熱処理を施し、急冷し、溶液の反応を停止させた。反応液をＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓにより精製し、未反応Ｚ−ＱＧ−ｄｄＵＴＰを除去した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の結果を図２１に示す（泳動条件：１５％変性ポリアクリルアミドゲル（尿素７Ｍ含有）、２８０Ｖ、４０ｍＡ、６０ｍｉｎ、ＴＢＥバッファ）。
【０１２０】
＜（ＢＡＰ）−アプタマーの調製＞
ＴｄＴ反応により調製した（Ｚ−ＱＧ）−アプタマーをＭＴＧ反応によりアルカリホスファターゼによる標識化を行った。上記（Ｚ−ＱＧ）−アプタマー（終濃度０．５μＭ）、ＮＫ１４−ＢＡＰ（終濃度５．０μＭ）、ＭＴＧ（終濃度０．１Ｕ／ｍＬ）の条件で、２００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）（終濃度２０ｍＭ）の緩衝液中にて、４℃で３時間反応させた。反応完了後、１ｍＭとなるようにＮＥＭを添加し、ＭＴＧを失活させた。反応の評価はＰＡＧＥにより行った。結果を図２１に示す。
【０１２１】
図２１において、ＭＴＧ（−）のレーンがＴｄＴ反応後、ＭＴＧ（＋）のレーンがＴｄＴ反応後さらにＭＴＧ反応させたＤＮＡアプタマーとなっている。テンプレート  ＤＮＡアプタマーおよびＴｄＴ反応生成物はゲルを流れきって見えないが、ＭＴＧ（＋）のレーンでは、高分子側へバンドが現れており、ＢＡＰラベル化による高分子量化を確認した。
【０１２２】
＜（ＢＡＰ）−アプタマーによるトロンビン検出能力評価＞
ＢＡＰシングルラベル化ＤＮＡアプタマー（（ＢＡＰ）−アプタマー）のトロンビン検出能力について評価するため、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｐｔａｍｅｒ  ａｓｓａｙ（ＥＬＡＡ）法によるトロンビン検出を行った。ＥＬＡＡ法では、ビオチン化ＤＮＡアプタマーを固定化リガンド、（ＢＡＰ）−アプタマーを検出リガンドとして、ストレプトアビジン被覆ブラックプレート（以下プレートと略す）上でトロンビンを検出した。
【０１２３】
（（ＢＡＰ）−アプタマーのトロンビン検出限界）
ビオチン化ＤＮＡアプタマー（２００ｎＭ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ、トロンビンの希釈系列（１００ｎＭ，５０ｎＭ，１０ｎＭ，１ｎＭ，０．１ｎＭ，０ｎＭ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ、（ＢＡＰ）−アプタマー（５０ｎＭ）を１００μＬ／ｗｅｌｌとし、ＥＬＡＡ法によるトロンビン検出を行った。実験操作は表３に従って行い、トロンビン検出限界を算出した。（ＢＡＰ）−アプタマーのトロンビン検出限界の結果を図２２に示す。
【０１２４】
【表３】
0005509440.tif 000010
【０１２５】
ＴＢＳＴ  ｂｕｆｆｅｒ：  ＴＢＳ＋０．１０％  Ｔｗｅｅｎ２０
ＮＴＭ  Ｂｕｆｆｅｒ：  １００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ９．５）
【０１２６】
図２２（ａ）から、トロンビンの検出限界は５ｎＭを示しており、用量応答曲線（図２２（ｂ））からは、５ｎＭ付近まで定量性があることが示唆される。シングルラベルＤＮＡアプタマーとしては十分な検出感度であると考えられる。
【０１２７】
［実施例４］
＜Ｚ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−ｄｄＵＴＰの合成・精製＞
Ｚ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−ｄｄＵＴＰとしては、ジーンアクト社にて合成したものを用いた。
【０１２８】
Ｚ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−ｄｄＵＴＰについて、逆相ＨＰＬＣ（カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ−１８ＭＳＩＩ，１５０×４．６ｍｍ、Ｂｕｆｆｅｒ：３７％メタノール  ｉｎ  ２０ｍＭ  りん酸二水素カリウム，５ｍＭ  テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム硫酸水素塩（ｐＨ５．０）、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ）を行った結果を図１９に示す。保持時間１６．３８分のピークの成分についてＥＳＩ−ＭＳ分析を行った。その結果、図２０に示すように、１０７２．２８（（Ｍ−Ｈ）−）のピークが確認され、理論分子量の１０７３．２８（Ｃ３８Ｈ５８Ｎ７Ｏ２３Ｐ３）と良く一致した結果が得られたため、Ｚ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−ｄｄＵＴＰであることが示された。
【０１２９】
＜（Ｚ−ＱＧ）−（ＰＥＧ）３−アプタマーの調製＞
（ＴｄＴによるＤＮＡアプタマーへのＺ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−ｄｄＵＴＰ導入）
Ｚ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−ｄｄＵＴＰ（終濃度０．０５ｍＭ）、鋳型ＤＮＡ（ＤＮＡアプタマー、実施例３と同様）（終濃度５μＭ）、ＴｄＴ（終濃度４０Ｕ／μＬ）、ＴｄＴ反応バッファ（ｐＨ６．６）、ＣｏＣｌ２（終濃度５ｍＭ）、滅菌水を混合して、３７℃で６０分間インキュベートした。反応完了後、９４℃で１５分間熱処理を施し、急冷し、溶液の反応を停止させた。反応液をＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓにより精製し、未反応Ｚ−ＱＧ−（ＰＥＧ）３−ｄｄＵＴＰを除去した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の結果を図２３に示す（泳動条件：１５％変性ポリアクリルアミドゲル（尿素７Ｍ含有）、２８０Ｖ、４０ｍＡ、６０ｍｉｎ、ＴＢＥバッファ）。
【０１３０】
＜（ＢＡＰ）−（ＰＥＧ）３−アプタマーの調製＞
ＴｄＴ反応により調製した（Ｚ−ＱＧ）−（ＰＥＧ）３−アプタマーをＭＴＧ反応によりアルカリホスファターゼによる標識化を行った。上記（Ｚ−ＱＧ）−（ＰＥＧ）３−アプタマー（終濃度０．５μＭ）、ＮＫ１４−ＢＡＰ（終濃度５．０μＭ）、ＭＴＧ（終濃度０．１Ｕ／ｍＬ）の条件で、２００ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）（終濃度２０ｍＭ）の緩衝液中にて、４℃で３時間反応させた。反応完了後、１ｍＭとなるようにＮＥＭを添加し、ＭＴＧを失活させた。反応の評価はＰＡＧＥにより行った。結果を図２３に示す。
【０１３１】
図２３において、ＭＴＧ（−）のレーンがＴｄＴ反応後、ＭＴＧ（＋）のレーンがＴｄＴ反応後さらにＭＴＧ反応させたＤＮＡアプタマーとなっている。テンプレート  ＤＮＡアプタマーおよびＴｄＴ反応生成物のレーンと比較して、ＭＴＧ（＋）のレーンでは、高分子側へバンドが現れており、ＢＡＰラベル化による高分子量化を確認した。
【０１３２】
＜（ＢＡＰ）−（ＰＥＧ）３−アプタマーによるトロンビン検出能力評価＞
（（ＢＡＰ）−（ＰＥＧ）３−アプタマーのトロンビン検出限界）
ビオチン化ＤＮＡアプタマー（２００ｎＭ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ、トロンビンの希釈系列（１００ｎＭ，５０ｎＭ，１０ｎＭ，１ｎＭ，０．１ｎＭ，０ｎＭ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ、（ＢＡＰ）−（ＰＥＧ）３−アプタマー（５０ｎＭ）を１００μＬ／ｗｅｌｌとし、ＥＬＡＡ法によるトロンビン検出を行った。実験操作は表３に従って行い、トロンビン検出限界を算出した。（ＢＡＰ）−（ＰＥＧ）３−アプタマーのトロンビン検出限界の結果を図２４に示す。
【０１３３】
図２４（ａ）から、トロンビンの検出限界は５ｎＭを示しており、用量応答曲線（図２４（ｂ））からは、１ｎＭ付近まで定量性があることが示唆される。シングルラベルの検出限界としては、（ＢＡＰ）−アプタマーと比較して定量性範囲が増大しており、検出限界は１ｎＭ付近まで行うと、ＰＥＧリンカーなしのＤＮＡアプタマーより高いことが示唆される。このように検出限界が高くなると予想される原因としては、ＰＥＧリンカーによるＤＮＡ同士の静電反発の緩和で、検出ＤＮＡアプタマーがトロンビンと結合しやすくなったことなどが原因として考えられる。
【０１３４】
以上のように、良好な感度で標的物を検出可能なタンパク質−核酸複合体を創製することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図２１】
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【図２３】
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【配列表】
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