(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５４〜５８及び６０〜６４からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球によって免疫学的に認識される、癌ペプチド。
【請求項２】
ＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬ（配列番号５５）、ＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡ（配列番号５６）、ＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱ（配列番号５７）、又はＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰ（配列番号５８）からなる、請求項１に記載の癌ペプチド。
【請求項３】
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号５４）からなる、請求項１に記載の癌ペプチド。
【請求項４】
配列番号６３又は６４からなる、請求項１に記載の癌ペプチド。
【請求項５】
ＨＬＡ−ＤＰＢ１*０４０１−０４０２拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球によって免疫学的に認識される、請求項１又は３に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項７】
更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を含む、請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項８】
請求項６又は７に記載の核酸に相補的な核酸からなるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項６又は７に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項１０】
少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞癌ペプチドをコードする核酸を更に含み、任意で、該ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞癌ペプチドが、以下：
ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）；
ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴ（配列番号６５）；
ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号６６）；及び
それらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１１】
少なくとも１つの単離されたＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチドをコードする核酸を更に含み、任意で、該ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチドが、以下：
Ｘａａ1Ｘａａ2Ｘａａ3ＧＰＧＧＧＡＰＸａａ4（配列番号２２）
（式中、Ｘａａ1は、アミノ酸ではないか、又は１乃至２０個の天然に存在するアミノ酸であり；
Ｘａａ2は、Ａｌｅ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ3は、Ｓｅｒ又は保存的置換であり；
Ｘａａ4は、Ａｒｇ又はＬｙｓである）
及びそれらの誘導体を含む、請求項１０に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１２】
核酸が、ＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ（配列番号２３）をコードする、請求項１１に記載の組換え発現ベクター。
【請求項１３】
（ａ）請求項９〜１２のいずれか１項に記載のベクター、又は
（ｂ）請求項６又は７に記載の核酸
を含む組換えウイルス。
【請求項１４】
ワクシニア、鶏痘、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、アンカラウイルス、及びレプリカーゼ−ベース−アルファウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載の組換えウイルス。
【請求項１５】
（ａ）ＨＬＡ−ＤＰ分子をコードする核酸、又は
（ｂ）免疫刺激分子、任意で、ＨＬＡクラスＩＩ分子をコードする少なくとも１つの遺伝子
を更に含む、請求項１３又は１４に記載の組換えウイルス。
【請求項１６】
（ａ）請求項９〜１２のいずれか１項に記載のベクター、又は
（ｂ）請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のウイルス
によって形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドと結合する、単離された抗体又はその抗原結合部分。
【請求項１８】
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド；
（ｂ）請求項９〜１２のいずれか１項に記載の組換え発現ベクター；
（ｃ）請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えウイルス；
（ｄ）請求項６又は７に記載の核酸；又は
（ｅ）請求項１７に記載の抗体；及び
医薬として許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
免疫刺激分子を更に含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
免疫刺激分子が、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、サイトカイン又はそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
（ｉ）ＨＬＡ−クラスＩＩ分子又はＨＬＡ−クラスＩＩ分子を発現している細胞、及び／又は
（ｉｉ）少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞癌ペプチド、及び／又は
（ｉｉｉ）少なくとも１つの単離されたＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡクラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチド
を更に含む、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞癌ペプチドが、以下：
ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）；
ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴ（配列番号６５）；
ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号６６）；及び
それらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−クラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチドが、以下：
Ｘａａ1Ｘａａ2Ｘａａ3ＧＰＧＧＧＡＰＸａａ4（配列番号２２）
（式中、Ｘａａ1は、アミノ酸ではないか、又は１乃至２０個の天然に存在するアミノ酸であり；
Ｘａａ2は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｒｇであり；
Ｘａａ3は、Ｓｅｒ又は保存的置換であり；
Ｘａａ4は、Ａｒｇ又はＬｙｓである）及びそれらの誘導体を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡクラスＩ拘束Ｔ細胞癌ペプチドは、ＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ（配列番号２３）を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球を誘発する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌ペプチドを含む免疫原。
【請求項２６】
更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含む、請求項２５に記載の免疫原。
【請求項２７】
ＭＨＣクラスＩＩ拘束癌ペプチドとＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープがペプチド結合により一緒に結合している、請求項２６に記載の免疫原。
【請求項２８】
抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を誘発する、請求項２５に記載の免疫原。
【請求項２９】
イムノアッセイ試薬を必要に応じて更に含む、請求項１７に記載の抗体を含むキット。
【請求項３０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１の組換え癌ペプチドの製造方法であって、以下：
（ａ）請求項６又は７に記載の核酸を、発現ベクターに挿入すること；
（ｂ）発現ベクターを宿主細胞に移すこと；
（ｃ）癌ペプチドの発現のために適切な条件下で宿主細胞を培養すること；及び
（ｄ）組換え癌ペプチドを取得すること；
を含む、方法。
【請求項３１】
工程（ａ）において、ＨＬＡクラスＩＩ分子又はその部分をコードするヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入することを更に含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
癌ペプチドを発現するベクターの製造方法であって、プロモーターと機能可能に連結した、請求項６又は７に記載の単離された核酸を組み込むことを含む、方法。
【請求項３３】
哺乳動物における癌又は前癌の存在の検出方法であって、以下：
（ａ）請求項６又は７に記載の核酸と、哺乳動物から採取したｍＲＮＡの試験用生物学的サンプルとを、該配列と該ｍＲＮＡとの間で複合体が形成される条件下で接触させること；
（ｂ）複合体を検出すること；及び
（ｃ）試験用サンプル中のｍＲＮＡ量を、既知の正常な生物学的サンプルからのｍＲＮＡ量と比較することであって、試験用サンプルからのｍＲＮＡ量の増大が癌又は前癌の指標となること；
を含む、方法。
【請求項３４】
哺乳動物における癌又は前癌の存在の検出方法であって、以下：
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌ペプチドを、該哺乳動物から得たリンパ球の試験用生物学的サンプルと接触させること；
（ｂ）該癌ペプチドと免疫応答性のＣＤ４＋Ｔリンパ球を検出することであって、陰性コントロールサンプルと比較した、該癌ペプチドと免疫反応性のＣＤ４＋Ｔリンパ球の数の増大が癌又は前癌の指標となること；
を含む方法。
【請求項３５】
生物学的サンプルにおけるＭＨＣクラスＩＩ拘束癌ペプチドの検出方法であって、以下：
（ａ）サンプルを、請求項１７に記載の抗体又はその抗原結合部分と、該抗体と該ペプチドとの間で免疫複合体が形成される条件下で接触させること；及び
（ｂ）免疫複合体の存在を検出することであって、その存在が、生物学的サンプルにおけるペプチドの指標となること；
を含む、方法。
【請求項３６】
癌がメラノーマである、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３７】
哺乳動物における癌の予防、治療又は阻害における使用の為の、
（ａ）単独の、又はＨＬＡ−ＤＰ分子と組み合わせた、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌ペプチド、
あるいは
（ｂ）単独の、又は外因性の免疫刺激分子と組み合わせた、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項３８】
ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープの使用を更に含む、請求項３７に記載のペプチド。
【請求項３９】
ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする核酸を更に含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【請求項４０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している腫瘍の増殖の阻害における使用の為の、
（ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌ペプチド、又は
（ｂ）請求項６又は７に記載の核酸。
【請求項４１】
インビトロで、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌ペプチドに単独で、あるいはＨＬＡ−ＤＰ分子と組み合わせて、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔリンパ球を誘発する十分な時間、曝された、
哺乳動物におけるメラノーマを治療、阻害又は予防する為に使用される、Ｔリンパ球。
【請求項４２】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌ペプチドと免疫応答性である癌抗原特異的ヒトＣＤ４+Ｔリンパ球。
【請求項４３】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌ペプチドと結合した標的抗原又はその標的エピトープを含む、標的抗原−癌ペプチドキャリア結合体。
【請求項４４】
標的抗原が、ＴＲＰ２、ＧＰ−１００、ＴＲＰ１、ＨＩＶ抗原、ｇｐ１２０、マラリア抗原及びそれらのエピトープからなる群から選択される、請求項４３に記載の標的抗原−癌ペプチドキャリア結合体。
【請求項４５】
請求項４３又は４４に記載の標的抗原−癌ペプチドキャリア結合体をコードする核酸ワクチン構築物。
【請求項４６】
ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している細胞の増殖の阻害における使用の為の、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えウイルス、又は請求項６又は７に記載の核酸。
【請求項４７】
ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現している腫瘍細胞の増殖の阻害における使用の為の、請求項６又は７に記載の核酸、又は請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組換えウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌診断及び癌ワクチンを含む癌治療の領域に関する。より詳細には、本発明は、癌ペプチドＮＹ−ＥＳＯ−１由来の新規なヒトＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ及びそのアナログ並びにＭＨＣＩＩクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその部分をコードするＤＮＡ配列の単離と精製に関する。特に、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープに関する。本発明は更に、個体における癌及び前癌の検出、診断及び治療の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｔ細胞は、腫瘍増殖を制御し、腫瘍退行を媒介するのに重要な役割を果たす。Ｔ細胞媒介抗腫瘍免疫の分子的基盤を理解するために、ＣＤ８+Ｔ細胞によって認識される多くの腫瘍抗原が、メラノーマや他の種類の癌で同定されてきた（１〜３）。これらの研究は、分子的に明確な腫瘍抗原由来のペプチドを用いる幾つかの臨床試験に至った（４〜７）。ｇｐ１００由来の修飾ペプチドを用いる臨床試験は、転移性メラノーマの患者の治療に対し治療的効力の幾分かの証拠をもたらしたが（４）、これらの研究は主にＣＤ８+Ｔ細胞の使用に焦点をあてていた。ヒト及び動物研究の両方からの証拠の増大は、最適の癌ワクチンがＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の両方の参加を必要とすることを示した（８，９）。更に、腫瘍特異的ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ陰性腫瘍細胞に対する防御免疫を産生するのに必要とされる（１０，１１）。それ故、このような抗原の同定は、癌ワクチンの開発及びＣＤ４+Ｔ細胞が宿主免疫応答を制御する機構を我々が理解するために重要である。
【０００３】
今までに、ほんの限られた数のＭＨＣクラスＩＩ拘束腫瘍抗原が同定された。チロシナーゼ、ｇｐ１００及びＭＡＧＥ−３などの幾つかの公知のＭＨＣクラスＩ拘束腫瘍抗原は、ＣＤ４+Ｔ細胞によって認識されるＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープを含むことが示された（１２〜１５）。腫瘍特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を用いて、未知のＭＨＣクラスＩＩ拘束腫瘍抗原を同定するために、最近、遺伝的アプローチが開発された。これは、ＣＤＣ２７、ＴＰＩ及びＬＤＦＰを含む幾つかの変異腫瘍抗原の同定に至った（１６，１７）。それらのうち、ＴＰＩは、生化学的アプローチによって独立に同定された変異抗原である（１８）。
【０００４】
ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子は、抗体スクリーニングによって以前に同定され（１９）、最近、ＭＨＣクラスＩ拘束腫瘍抗原としても同定された（２０，２１）。ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する高力価の抗体がまた、癌患者から検出された（２２）。ＮＹ−ＥＳＯ−１  ｃＤＮＡは、２つの重複するオープンリーディングフレーム由来の２つの遺伝子産物をコードしていた（２０）。正常精巣での発現を除くその厳密な腫瘍特異的発現パターン、並びにメラノーマ、乳癌、前立腺癌、肺癌及び他の癌を含む多くの腫瘍での高頻度の発現（１８，２０，２３）の故に、ＮＹ−ＥＳＯ−１は、種々の癌タイプに対する免疫治療の開発のための重要な免疫標的の可能性がある（２４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＴＬ及び抗体免疫応答の両方が癌患者で示されたが、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質におけるＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは報告されなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
本発明の１つの目的は、ＣＤ４+Ｔリンパ球によってＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープとして認識される新規ペプチド及びその部分を提供することである。本発明の抗原性癌ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１（本明細書ではＣＡＧ−３と交換可能に使用される用語）遺伝子（配列番号１）（Genbank登録番号 AF038567; 8:9）内もしくは部分によって、又はその変異体もしくはホモログ（例えば、ＬＡＧＥ遺伝子）（Genbank登録番号 AJ223040, AJ223041及びAJ223093）内もしくは部分によってコードされる。
【０００７】
本発明の１局面は、癌の進展及び転移からレシピエントを防御するＣＤ４+Ｔリンパ球を誘発できる癌ワクチンとして有用である、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子によってコードされるＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体である。本発明はまた、癌の阻害又は予防のために、あるいはＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子産物を発現している細胞の増殖を阻害するために、有効量の癌ワクチンを投与する方法に関する。
【０００８】
本発明の１局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子によってコードされるＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ、又はその変異体及びホモログである。これらは、ＣＤ４+Ｔリンパ球及び抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体応答を誘発でき、次いで、癌の進展からレシピエントに防御及び／又は治療的利益を提供し、かつ転移からの防御を提供する免疫原及び癌ワクチンとして有用である。本発明はまた、癌を阻害又は予防し、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子産物を発現している細胞の増殖を阻害し、かつ転移を阻害するために、有効量の癌ワクチンを投与する方法に関する。
【０００９】
本発明の別の局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体を単独で、又は１つ以上の免疫刺激分子と組み合わせて含む医薬組成物である。医薬組成物は、腫瘍及び癌に対する免疫応答を誘発するために、少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含むか、又はＮＹ−ＥＳＯ−１抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を刺激するエピトープの組み合わせを含む。医薬組成物は、ＣＤ８+Ｔリンパ球の産生のために、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の１つ以上のＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープを更に含んでもよい。ＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープとＮＹ−ＥＳＯ−１ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープは各々、別のエピトープとして提供されてもよいし、又は一緒に結合されて、マルチマーの形態で提供されてもよい。癌エピトープ又はその変異体は、癌の予防又は治療のために、免疫原又はワクチンとして提供されてもよい。医薬組成物は、哺乳動物の癌を治療又は予防する方法に有用である。治療方法において、医薬組成物は、哺乳動物の癌を予防又は阻害する有効な量において哺乳動物に投与される。
【００１０】
本発明の別の局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＨＬＡ−ＤＲ及び／又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体を単独で、又は１つ以上の免疫刺激分子と組み合わせて含む医薬組成物である。医薬組成物は、腫瘍及び癌に対する免疫原反応を誘発するために、少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ又は少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ、又はＮＹ−ＥＳＯ−１抗原特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を刺激するＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの組み合わせを含む。医薬組成物は、ＣＤ８+Ｔリンパ球の産生のために、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の１つ以上のＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープを更に含んでもよい。ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ又はＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ、及びＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープは各々、別個のエピトープとして提供されてもよいし、一緒に結合されてもよい。癌エピトープ又はその変異体は、癌の予防又は治療のために、免疫原又はワクチンとして提供されてもよい。医薬組成物は、哺乳動物における癌の治療又は予防の方法において有用である。治療方法において、医薬組成物は、哺乳動物の癌の予防又は阻害のためにＣＤ４+Ｔ細胞及び／又は抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体応答を誘発するのに有効な量において哺乳動物に投与される。
【００１１】
本発明の別の目的は、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子、その部分又はホモログに由来するＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体をコードしているＤＮＡ配列の翻訳によって、同上を製造する方法である。
【００１２】
本発明の別の目的は、ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子、その部分又はホモログに由来するＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープもしくはＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体又は誘導体をコードしているＤＮＡ配列の翻訳によって、同上を製造する方法である。
【００１３】
本発明の更なる局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体をコードする単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列、及びそれらの相補配列、並びにワクチンとしての該ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の使用、及びＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体の製造方法における該ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の使用である。本発明は更に、プローブ、プライマー又はアンチセンスとしての使用のために、該ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１４】
本発明の更なる局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ、ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ、又はそれらの変異体及びそれらの組み合わせをコードする単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ配列、並びにＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ、ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ、又はそれらの変異体及びそれらの組み合わせの製造方法における該ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の使用である。本発明は更に、プローブ、プライマー又はアンチセンスとしての使用のために、該ＤＮＡ又はＲＮＡ配列のオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明は更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体をコードする核酸配列のみを含むか、又は少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列を組み合わせて含むベクターを提供する。
【００１６】
本発明は更に、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束細胞エピトープ又は少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体若しくは組み合わせをコードする核酸配列のみを含むか、又は少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列を組み合わせて含むベクターを提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束細胞エピトープ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列のみを含むか、又は少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列を組み合わせて含むベクターによってトランスフェクトされた、又は形質導入された宿主細胞を提供する。ベクター及び宿主細胞は、ワクチンとして役立ちうる。ワクチンにおいて、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの発現により、ワクチンで免疫化した哺乳動物において腫瘍抗原特異的ＣＤ４+Ｔリンパ球の刺激が生ずる。
【００１８】
本発明はまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束細胞エピトープ又は少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体若しくは組み合わせをコードするＤＮＡ配列のみを含むか、又は少なくとも１つの免疫刺激分子をコードする第２のＤＮＡ配列を組み合わせて含むベクターによってトランスフェクトされた、又は形質導入された宿主細胞を提供する。ベクター及び宿主細胞は、ワクチンとして役立ちうる。ワクチンにおいて、ＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ及び／又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープの発現により、ワクチンで免疫化した哺乳動物において腫瘍抗原特異的ＣＤ４+Ｔリンパ球の刺激が生ずる。
【００１９】
本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体の検出により、哺乳動物における癌又は前癌の診断方法を提供する。
【００２０】
本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ及び／又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体の検出により、哺乳動物における癌又は前癌の診断方法を提供する。
【００２１】
ヒト前腫瘍性及び腫瘍性細胞及び組織の診断方法を提供することは、本発明の更に別の目的である。本発明によれば、この方法は、ヒトから細胞、組織、又はその抽出物を単離し、そしてＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はそれらの部分を検出するか、又はＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列によって発現されたエピトープ若しくはその変異体を検出することを含む。ここで、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列又は発現産物の増大の検出／増大は、前腫瘍及び腫瘍の指標となる。
【００２２】
ヒト前腫瘍性及び腫瘍性細胞及び組織の診断方法を提供することは、本発明の更に別の目的である。本発明によれば、この方法は、ヒトから細胞、組織、又はその抽出物を単離し、そしてＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体をコードするＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はその部分を検出するか、又はそれらのＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列によって発現されたエピトープ若しくはその変異体若しくは組み合わせを検出することを含む。ここで、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列又は発現産物の増大の検出／増大は、前腫瘍及び腫瘍の指標となる。
【００２３】
本発明の別の目的は、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体をコードするＤＮＡ配列の１つ以上のコピーをそのゲノムに組み込んだトランスジェニック動物を提供することである。ＤＮＡ配列の組み込みにより、エピトープの発現又は過剰発現が生じる。このようなトランスジェニック動物は、癌の治療に有用な治療薬のスクリーニングのために有用である。
【００２４】
本発明の更に別の目的は、ＮＹ−ＥＳＯ−１の少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ又は少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ又はそれらの変異体又は組み合わせをコードするＤＮＡ配列の１つ以上のコピーをそのゲノムに組み込んだトランスジェニック動物を提供することである。ＤＮＡ配列の組み込みにより、エピトープの発現又は過剰発現が生じる。このようなトランスジェニック動物は、癌の治療に有用な治療薬のスクリーニングのために有用である。
【００２５】
本発明の更に別の局面は、治療薬としての使用に関する、並びに診断及び検出アッセイにおける使用に関する、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ又はその変異体と反応性のあるモノクローナル、ポリクローナル及び組換え抗体である。モノクローナル及びポリクローナル抗体は、単独でキットの形態で、又は診断及び検出アッセイで通常使用される他の試薬と一緒にキットの形態で提供されてもよい。
【００２６】
本発明の更に別の局面は、治療薬としての使用に関する、並びに診断及び検出アッセイにおける使用に関する、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔ細胞エピトープ又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープと反応性のあるか、あるいはＨＬＡ−ＤＰ分子との組み合わせにおいてＨＬＡ−ＤＰエピトープと、又はＨＬＡ−ＤＲ分子との組み合わせにおいてＨＬＡ−ＤＲエピトープと反応性のあるか、あるいはそれらの変異体と反応性のあるモノクローナル、ポリクローナル及び組換え抗体である。モノクローナル及びポリクローナル抗体は、単独でキットの形態で、又は診断及び検出アッセイで通常使用される他の試薬と一緒にキットの形態で提供されてもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明は、ＣＤ４+Ｔ細胞によって認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１由来の新規なＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの同定と単離である。本発明の癌エピトープは、哺乳動物において癌を阻害又は予防する免疫原及びワクチンとして有用であり、癌又は前癌を検出する診断薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１−Ａ】ＮＹ−ＥＳＯ−１のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。ＮＹ−ＥＳＯ−１のヌクレオチド配列の番号付けは、５’非翻訳領域の最初のヌクレオチドから始まる。
【図１−Ｂ】ＮＹ−ＥＳＯ−１のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。ＮＹ−ＥＳＯ−１のヌクレオチド配列の番号付けは、５’非翻訳領域の最初のヌクレオチドから始まる。
【図２−Ａ】（２Ａ）Ｎｉ2+クロマトグラフィーカラムを用いる完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の精製。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルは、ｐＥＴ２８ベクター（レーン１）、ｐＮＹ−ＥＳＯ−１（レーン２）を担うＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）からの粗抽出物、精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質（レーン３）、トランケートＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする細菌抽出物（レーン４）、及び精製されたトランケートＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質であるＥＳＯ１−７４（レーン５）を示した。
【図２−Ｂ】（２Ｂ）ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体の特異性を確認するためのウエスタンブロット。２人の代表的な患者からの１／２０００希釈の血清（１つは、ＥＬＩＳＡによって検出できるＮＹ−ＥＳＯ−１抗体をもつもの（レーン１、２及び３）及び１つは、該抗体無しのもの（レーン４、５及び６））を、ベクターだけをコードする細菌抽出物（レーン１、４）、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードする細菌抽出物（レーン２、５）及び精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質（レーン３、６）に対して用いた。
【図２−Ｃ】（２Ｃ）患者ＴＥは、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に対して抗体を有するメラノーマ患者の1人であった。ＮＹ−ＥＳＯ−１（コントロールタンパク質としてＢＳＡ）に対する抗体の存在について８８人の患者からの血清を用いてＥＬＩＳＡを行った。血清希釈の１：２５、１：２５０、１：２５００でのＯ．Ｄ．４５０の値をプロットした。正常ドナーからの血清をコントロールとして用いた。それらの平均ＯＤ値もプロットした（ＮＤ）。
【図３】ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質で免疫化したＨＬＡ−ＤＲ４−Ｔｇマウスを用いる推定ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの試験。ＨＬＡ−ＤＲ４に対する予測された結合アフィニティに基づく８つのペプチドを、免疫化マウスからのリンパ球のインビトロ感作のために用いた。マウスリンパ球を、培地だけ、１３５９ＥＢＶ  Ｂ（ＨＬＡ  ＤＲ４+）細胞だけ、又はインビトロ刺激のために使用されたペプチドでパルスした１３５９ＥＢＶ  Ｂ細胞に対しＩＦＮ産生について試験した。
【図４−Ａ】ＴＥ４−１  ＣＤ４+Ｔ細胞株の特徴付け。（４Ａ）ＴＥ４−１は、ＥＳＯｐ１１６−１３５ペプチド又は精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質でパルスした１０８８ＥＢＶ  Ｂ細胞（ＨＬＡ−ＤＲ+）を特異的に認識したが、推定エピトープを欠くＥＳＯ１−７４タンパク質を認識しなかった。
【図４−Ｂ】ＴＥ４−１  ＣＤ４+Ｔ細胞株の特徴付け。（４Ｂ）ＨＬＡ  ＤＲ拘束は、ＴＥ４−１によるＮＹ−ＥＳＯ−１の認識のために必要であった。２９３ＩＭＤＲ細胞にパルスしたとき、２つの重複するペプチドＥＳＯｐ１１１−１３０とｐ１１６−１３５は、認識された。ＧＭ−ＣＳＦ分泌を測定する前に、１×１０5標的細胞を、４×１０4のＴＥ４−１細胞と一晩共培養した。
【図４−Ｃ】ＴＥ４−１  ＣＤ４+Ｔ細胞株の特徴付け。（４Ｃ）ＥＳＯｐ１１６−１３５ペプチドでパルスした２９３ＩＭＤＲの認識は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＨＢ５５）によって特異的に阻害されたが、抗クラスＩ抗体（ＨＢ９５）によっては阻害されなかった。抗体の非存在下でＴＥ４−１によって分泌されたＧＭ−ＣＳＦの量を参照として用い、この参照に対し、抗体存在下のＧＭ−ＣＳＦ放出のパーセントを計算した。コントロール（マウスＩｇＧ２ａ）と抗ＭＨＣ−クラスＩ抗体（ＨＢ９５）による阻害は殆ど効果を有しなかった。
【図４−Ｄ】ＴＥ４−１  ＣＤ４+Ｔ細胞株の特徴付け。ＣＴＬＣ３Ｇ１（Ｃ．Ｍａｃａｌｌｉの好意）は、６２４．３８ｍｅｌを認識するｇｐ１００特異的ＣＤ８+Ｔ細胞株であり、ＨＢ９５の活性についてのコントロールとして使用した（図４Ｄ）。
【図４−Ｅ】ＴＥ４−１  ＣＤ４+Ｔ細胞株の特徴付け。Ｔ３−８０は、１３６２ｍｅｌを認識するＣＤ４+Ｔ細胞株であり、ＨＢ５５の活性についてのコントロールとして使用した（図４Ｅ）。
【図５】ＣＤ４+Ｔ細胞株ＴＥ４−１による腫瘍細胞の認識。ＴＥ４−１の標的として使用した全てのメラノーマ株は、ＦＡＣＳとＲＴ−ＰＣＲによってそれぞれ、ＨＬＡ−ＤＲ４とＮＹ−ＥＳＯ−１の発現について分析された。ＴＥ４−１は、ＨＬＡ−ＤＲ４分子を構成的に発現しているＮＹ−ＥＳＯ−１+腫瘍株（１３５９ｍｅｌ及びＦ０４９ｍｅｌ）を認識できた。ＤＲ１及びＮＹ−ＥＳＯ−１を発現しているＦ０５０ｍｅｌもＴ細胞によって認識された。コントロール標的５２６ｍｅｌ（ＤＲ４陽性及びＮＹ−ＥＳＯ−１陰性）、３９７ｍｅｌ、６２４．３８ｍｅｌ（ＤＲ陰性及びＮＹ−ＥＳＯ−１陽性）、又は１３００ｍｅｌ（ＤＲ１陽性及びＮＹ−ＥＳＯ−１弱陽性）のいずれに対しても反応性は無かった。
【図６−Ａ】ＴＥ４−１によって認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドエピトープの特徴付け。（６Ａ）ＨＬＡ  ＤＲ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのアンカー位置の決定。１０８８ＥＢＶ  Ｂ細胞を記載されたペプチド２０Ｍでパルスした。ＧＭ−ＣＳＦを測定する前に、ＴＥ４−１細胞を一晩、標的細胞と共培養した。
【図６−Ｂ】ＴＥ４−１によって認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドエピトープの特徴付け。（６Ｂ）ＥＳＯｐ１１９−１３０を用いるペプチド力価測定実験。ＥＳＯｐ１１９−１３０は、図６Ａに示すように、その認識に基づいて選択された。記載された濃度で希釈したＥＳＯｐ１１９−１３０を、１０８８ＥＢＶ  Ｂ細胞上にパルスした。この１０８８ＥＢＶ  Ｂ細胞は、ＴＥ４−１による認識のための標的として用いられた。コントロールペプチドＥＳＯｐ９１−１１０の認識は、３３Ｍの最高濃度でのみ測定された。
【図７−Ａ】（７Ａ）ＡＰＣとしてＤＲ１＋ＥＢＶＢを用いる、ＴＥ４−１によるＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質とＥＳＯｐ１１６−１３５の認識。ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質（５μｇ／ｍｌ）とペプチド（３３μＭ）を、５８６ＥＢＶ  Ｂ（ＤＲ１＋）上にパルスし、２度洗浄した。次いで、ＧＭ−ＣＳＦをアッセイする前に、ＴＥ４−１  Ｔ細胞を加え、一晩共培養した。
【図７−Ｂ】（７Ｂ）ＥＳＯｐ１１６−１３５（３３μＭ）でパルスした５８６ＥＢＶ  Ｂを用いて、ブロッキング抗体の存在下及び非存在下でＴＥ−４を刺激した。ＩＩＤ９５（抗クラスＩ抗体）、ＩＩＢ５５（抗ＤＲ抗体）及びアイソタイプコントロール抗体を用いた。
【図８−Ａ】合成ペプチドによるインビトロ刺激後のＰＢＭＣからのＣＤ４+Ｔ細胞の産生。（図８Ａ）３回のインビトロ刺激後、特異的ペプチド反応性をマルチプルウェルで検出した。９６ウェルプレートで各々２．５×１０5ＰＢＭＣを含む合計２４ウェルを３週間弱く刺激した。２４ウェルの１５ウェルは、顕著な増殖を示し、そして比活性について試験した。各ウェルからのＴ細胞を、１０８８ＥＢＶＢ細胞、及びＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ細胞とそれぞれインキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦ放出を上清から測定した。
【図８−Ｂ】合成ペプチドによるインビトロ刺激後のＰＢＭＣからのＣＤ４+Ｔ細胞の産生。（図８Ｂ）ＴＥ４−２  Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチド及びタンパク質と特異的に反応した。重複するペプチドＥＳＯｐ１６１−１８０とＥＳＯｐ１５６−１７５を、２０μｇ／ｍｌで９０分間、１０８８（ＤＲ４+）と５８６ＥＢＶＢ（ＤＲ１+）細胞にパルスした。ＥＳＯｐ９１−１１０をパルスについての無関係ペプチドとして用いた。精製ＮＹ−ＥＳＯ−１とＥＳＯ１−７５タンパク質を、同じモル比を維持するために、それぞれ５μｇ／ｍｌと２μｇ／ｍｌで一晩パルスした。３度の洗浄後、ＴＥ４−２  Ｔ細胞を加え、一晩インキュベートした。ＧＭ−ＣＳＦ放出を測定した。
【図８−Ｃ】合成ペプチドによるインビトロ刺激後のＰＢＭＣからのＣＤ４+Ｔ細胞の産生。（図８Ｃ）ＥＳＯｐ１６１−１８０でパルスしたＥＢＶＢ細胞のパネルを、ＴＥ４−２  ＣＤ４+Ｔ細胞の標的として用いた。これらのＥＢＶＢ株は、異なるＨＬＡ  ＤＲ及びＤＱ対立遺伝子を発現することが知られていた。それらのＨＬＡ  ＤＰ対立遺伝子を、本研究では分子的にタイプ分けした（表２）。
【図９−Ａ】抗ＤＰ抗体によるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのＴ細胞認識のブロッキング。２０μｇ／ｍｌ  ＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ細胞を、異なるブロッキング抗体存在下、標的細胞として使用した。使用した抗体の特異性は次のようであった：抗ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ  Ａ，Ｂ，Ｃ）抗体（Ｗ６／３２）、抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ  ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ）抗体（ＩＶＡ１２）、抗ＨＬＡ  ＤＰ抗体（Ｂ４／２１）、抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体（Ｌ２４３）及び抗ＨＬＡ  ＤＱ抗体（Ｇｅｎｏｘ３．５３（抗ＤＱｗ１）及びＩＶＤ１２（抗ＤＱｗ３）の混合物）。全ての抗体を、各々、最終濃度２０μｇ／ｍｌで用いた。（図９Ａ）ＣＫ３Ｈ６  Ｔ細胞は、ＨＬＡ  Ａ２の状況においてｇｐ１００ｐ２０９−２１８ペプチドを特異的に認識し、そして抗ＭＨＣクラスＩ抗体のための特異性コントロールとして用いた（図９Ｂ）。ｇｐ１００ｐ２０９−２１８ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ（Ａ２+）を標的として用いた。ＣＤ４+Ｔ細胞株（Ｔ３−８０）は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束様式で１３６２ｍｅｌを認識し、そして抗ＭＨＣクラスＩＩ及び抗ＤＲ抗体のための特異性コントロールとして用いた（図９Ｃ）。
【図９−Ｂ】抗ＤＰ抗体によるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのＴ細胞認識のブロッキング。２０μｇ／ｍｌ  ＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ細胞を、異なるブロッキング抗体存在下、標的細胞として使用した。使用した抗体の特異性は次のようであった：抗ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ  Ａ，Ｂ，Ｃ）抗体（Ｗ６／３２）、抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ  ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ）抗体（ＩＶＡ１２）、抗ＨＬＡ  ＤＰ抗体（Ｂ４／２１）、抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体（Ｌ２４３）及び抗ＨＬＡ  ＤＱ抗体（Ｇｅｎｏｘ３．５３（抗ＤＱｗ１）及びＩＶＤ１２（抗ＤＱｗ３）の混合物）。全ての抗体を、各々、最終濃度２０μｇ／ｍｌで用いた。（図９Ａ）ＣＫ３Ｈ６  Ｔ細胞は、ＨＬＡ  Ａ２の状況においてｇｐ１００ｐ２０９−２１８ペプチドを特異的に認識し、そして抗ＭＨＣクラスＩ抗体のための特異性コントロールとして用いた（図９Ｂ）。ｇｐ１００ｐ２０９−２１８ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ（Ａ２+）を標的として用いた。ＣＤ４+Ｔ細胞株（Ｔ３−８０）は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束様式で１３６２ｍｅｌを認識し、そして抗ＭＨＣクラスＩＩ及び抗ＤＲ抗体のための特異性コントロールとして用いた（図９Ｃ）。
【図９−Ｃ】抗ＤＰ抗体によるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのＴ細胞認識のブロッキング。２０μｇ／ｍｌ  ＥＳＯｐ１６１−１８０ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ細胞を、異なるブロッキング抗体存在下、標的細胞として使用した。使用した抗体の特異性は次のようであった：抗ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ  Ａ，Ｂ，Ｃ）抗体（Ｗ６／３２）、抗ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ  ＤＰ，ＤＱ，ＤＲ）抗体（ＩＶＡ１２）、抗ＨＬＡ  ＤＰ抗体（Ｂ４／２１）、抗ＨＬＡ  ＤＲ抗体（Ｌ２４３）及び抗ＨＬＡ  ＤＱ抗体（Ｇｅｎｏｘ３．５３（抗ＤＱｗ１）及びＩＶＤ１２（抗ＤＱｗ３）の混合物）。全ての抗体を、各々、最終濃度２０μｇ／ｍｌで用いた。（図９Ａ）ＣＫ３Ｈ６  Ｔ細胞は、ＨＬＡ  Ａ２の状況においてｇｐ１００ｐ２０９−２１８ペプチドを特異的に認識し、そして抗ＭＨＣクラスＩ抗体のための特異性コントロールとして用いた（図９Ｂ）。ｇｐ１００ｐ２０９−２１８ペプチドでパルスした１０８８ＥＢＶＢ（Ａ２+）を標的として用いた。ＣＤ４+Ｔ細胞株（Ｔ３−８０）は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束様式で１３６２ｍｅｌを認識し、そして抗ＭＨＣクラスＩＩ及び抗ＤＲ抗体のための特異性コントロールとして用いた（図９Ｃ）。
【図１０−Ａ】ＴＥ４−２  ＣＤ４+Ｔ細胞による腫瘍細胞と２９３ＣＩＩＴＡ／ＮＹ−ＥＳＯ−１の認識。（図１０Ａ）ＴＥ４−２は、ＮＹ−ＥＳＯ−１とＤＰ４の両方を発現しているメラノーマ株を認識した。公知のＮＹ−ＥＳＯ−１発現（ＲＴ−ＰＣＲによって）とＨＬＡ  ＤＰタイプ（ＲＴ−ＰＣＲと配列決定によって決定）をもつメラノーマ株を、標的として使用した。この実験で、ＭＨＣクラスＩＩ発現をアップレギュレートするために、一晩のＩＦＮ−γ処理（５００ユニット／ｍｌ）を、Ｆ０２６ｍｅｌ、５２６ｍｅｌ、及び３９７ｍｅｌについて行った。サイトカイン放出を測定する前に、ＴＥ４−２  Ｔ細胞を腫瘍細胞と一晩共培養した。
【図１０−Ｂ】ＴＥ４−２  ＣＤ４+Ｔ細胞による腫瘍細胞と２９３ＣＩＩＴＡ／ＮＹ−ＥＳＯ−１の認識。（図１０Ｂ）ＴＥ４−２  ＣＤ４+Ｔ細胞株は、インバリアント鎖（Ｉｉ）ターゲティング配列の存在下又は非存在下においてＮＹ−ＥＳＯ−１でトランスフェクトされた２９３ＣＩＩＴＡを認識した。親の２９３細胞と２９３ＣＩＩＴＡ細胞を、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ｐＥＳＯ）、Ｉｉ−ＮＹ−ＥＳＯ−１（ｐＩｉ−ＥＳＯ）、又はＧＦＰ（ｐＧＦＰ）をそれぞれコードするプラスミドでトランスフェクトした。サイトカイン放出をアッセイする前に、ＴＥ４−２  Ｔ細胞を、トランスフェクタントと共に一晩、共培養した。
【図１１−Ａ】ＴＥ４−２によって認識されるＴ細胞エピトープの特徴付け。（図１１Ａ）Ｔ細胞認識のためのＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのアンカー残基と最小長さの決定。Ｎ又はＣ末端にアミノ酸欠失を有する合成ペプチドを用いて、４０μｇ／ｍｌで１０８８ＥＢＶＢ細胞をパルスした。次いで、ＥＢＶＢ細胞を徹底的に洗浄し、ＴＥ４−２  Ｔ細胞を刺激するために、標的細胞として用いた。２つの別々の実験を行い、この図の上のパネルと下のパネルとして示した。
【図１１−Ｂ】ＴＥ４−２によって認識されるＴ細胞エピトープの特徴付け。（図１１Ｂ）Ｔ細胞認識に必要な最小ペプチド濃度の決定。ＥＳＯｐ１５７−１７０ペプチドを用いて、種々の濃度で１０８８ＥＢＶＢ細胞をパルスした。次いで、ペプチドをパルスされた細胞を洗浄し、ＴＥ４−２株を刺激するために、標的として用いた。コントロールペプチドＥＳＯｐ９１−１１０を、最高濃度３３μＭでのみ用いた。
【図１１−Ｃ】ＴＥ４−２によって認識されるＴ細胞エピトープの特徴付け。（図１１Ｃ）ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ８+Ｔ細胞によるＤＰＢ１*０４０１−拘束ＣＤ４+Ｔ細胞エピトープの認識。ＴＥ８−１細胞株を、ＥＳＯｐ１５７−１６７ペプチドによるインビトロ刺激によって、親ＴＥのＰＢＭＣから作製した。Ｌ０２３ＥＢＶＢ細胞（ＨＬＡ−Ａ２+，ＤＰ４-）を、無血清培地において、ＤＰＢ１*０４０１エピトープ領域をカバーするペプチドでパルスし、洗浄し、ＴＥ８−１  Ｔ細胞を刺激するために用いた。
【図１２−Ａ】ＴＥ４−２  ＣＤ４+Ｔ細胞とＴＥ８−１  ＣＤ８+Ｔ細胞による認識についてのペプチドの力価測定（図１２Ａ）５８６ＥＢＶＢ細胞（Ａ２−，ＤＰ４＋）を抗原提示細胞として用い、種々の濃度で、記載されたペプチドでパルスした。細胞を洗浄し、次いで、サイトカイン放出をアッセイする前に、ＴＥ４−２  ＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベートした。
【図１２−Ｂ】ＴＥ４−２  ＣＤ４+Ｔ細胞とＴＥ８−１  ＣＤ８+Ｔ細胞による認識についてのペプチドの力価測定（図１２Ｂ）Ｌ０２３ＥＢＶＢ細胞（Ａ２＋，ＤＰ４−）を抗原提示細胞として用い、種々の濃度で、記載されたペプチドでパルスした。細胞を洗浄し、次いで、サイトカイン放出をアッセイする前に、ＴＥ４−２  ＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベートした。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、免疫系のＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球によって免疫学的に認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１の癌エピトープ、その部分、誘導体又は変異体を包含する。本発明の癌エピトープは、免疫系のＣＤ４+Ｔ細胞との相互作用によって、体液性媒介免疫応答を特異的に引き起こす。抗原性癌エピトープとＣＤ４+Ｔ細胞とのこの相互作用は、ヒトを含む哺乳動物における癌の予防、除去、又は減少において、ＣＤ４+Ｔ細胞が抗原性癌エピトープに反応し、免疫系の他の細胞をリクルートすることを引き起こす。
【００３０】
本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、原発性もしくは転移性メラノーマ、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎癌、頭部及び頚部癌、神経芽腫及び腺癌（例えば、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵癌、甲状腺癌など）を含むが、それらに限定されない癌の一部を形成するか、又はそれらの癌に由来する。
【００３１】
メラノーマという用語は、メラノーマ、転移性メラノーマ、メラノサイト又はメラノサイト関連母斑細胞由来のメラノーマ、悪性メラノーマ、黒色上皮腫、黒色肉腫、インサイチュメラノーマ（melanoma in situ）、表在拡大型メラノーマ、結節型（nodular）メラノーマ、悪性ほくろ性メラノーマ、末端性ほくろ性メラノーマ、浸潤性メラノーマ又は家族性非定型奇胎及びメラノーマ（familial atypical mole and melanoma）（ＦＡＭ−Ｍ）症候群を含むが、それらに限定されない。
【００３２】
癌、特にメラノーマの患者の自己ＣＤ４+Ｔリンパ球によって認識される癌エピトープ又はその誘導体は特に興味深い。ＭＨＣ（又はＨＬＡ）クラスＩＩ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球、特にＨＬＡ−ＤＲ拘束Ｔリンパ球及び／又はＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔリンパ球によって認識される癌エピトープ又はその誘導体は更に興味深い。一実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ癌エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲ分子の状況においてＣＤ４＋Ｔリンパ球によって認識される。別の実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ癌エピトープは、ＨＬＡ−ＤＰ分子の状況においてＣＤ４＋Ｔリンパ球によって認識される。
【００３３】
本発明の「癌エピトープ」は、ＨＬＡ−ＤＲ拘束及びＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔリンパ球などのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔリンパ球を誘発するＮＹ−ＥＳＯ−１の部分又は変異体部分を包含する。このようなリンパ球は、腫瘍細胞に由来する完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ、及び天然でプロセスされた抗原と特異的に反応しうる。
【００３４】
本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、サイズにおいて約９アミノ酸乃至約３０アミノ酸、好ましくは、長さにおいて約１０乃至約１５アミノ酸に変わりうる。
【００３５】
好適な実施態様では、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、長さにおいて約９乃至１０アミノ酸である。
【００３６】
一実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列：Ｘａａ1ＫＥＦＴＶＳＸａａ2（配列番号４）及びその変異体又は誘導体を含む、長さにおいて少なくとも約１０アミノ酸のペプチドである。Ｘａａ1及びＸａａ2のアミノ酸、及びＮ末端及びＣ末端でのこれらの位置におけるアミノ酸数は、エピトープが、ＣＤ４+Ｔリンパ球に結合し、刺激する能力を保持するかぎり、変わりうる。エピトープは、約１０乃至約３０アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸未満、より好ましくは約１０乃至約１５アミノ酸を含みうる。
【００３７】
本発明の別の実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、式：Ｘａａ1ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＸａａ2（配列番号５）（式中、Ｘａａ1はアミノ酸ではないか、又は１乃至約１０個の天然のアミノ酸であり、好ましくは１乃至約５個のアミノ酸である；Ｘａａ2はアミノ酸ではないか、又は長さにおいて１乃至約７個のアミノ酸である）によって表されることができる。
【００３８】
本発明の別の実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列：ＱＤＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号６）又はそのフラグメント若しくは誘導体を含む。
【００３９】
また、本発明の範囲には、配列番号４、５又は６と部分配列相同性を有する癌ペプチド又はその部分が包含される。部分アミノ酸配列相同性とは、配列番号４、５又は６と少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性又はそれ以上を有し、かつＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束特異的ＣＤ４+Ｔリンパ球を刺激するという生物学的機能を有するペプチドを意味する。哺乳動物ホモログは、霊長類及びマウスホモログを含むがそれらに限定されない本発明の範囲に含まれる。
【００４０】
一実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列：
ＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号７）；
ＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳ（配列番号８）；
ＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶ（配列番号９）；
ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）；
ＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１１）；
ＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１２）；
ＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１３）；
ＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１４）；
ＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲ（配列番号１５）；
ＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号１６）；
ＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬ（配列番号１７）；
ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩ（配列番号１８）；
又はそれらの変異体若しくは誘導体を含む。
【００４１】
好適な実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープはアミノ酸配列：
【００４２】
【数１】
0005588363.tif 000002
【００４３】
及びその変異体若しくは誘導体を含む。
【００４４】
上記配列内に置換を有するエピトープは、本発明に包含される。置換アミノ酸により、配列番号１９と比較して等価な又は増大した結合が生じるならば、天然に存在するアミノ酸の置換は、１個以上のアンカー位置でありうる。配列番号１９のアンカー位置は、位置１−Ｌｅｕ、位置４−Ｇｌｕ、位置６−Ｔｈｒ、位置７−Ｖａｌであると予測される。一実施態様では、アラニンは、位置１でロイシンの代わりに置換される。
【００４５】
本発明の別の実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列：ＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳ  ＳＣＬＱＱＬＳＬＬＭ（配列番号２０）、又はその部分、変異体及び誘導体を含む。一実施態様において、配列番号２０の部分はアミノ酸配列：
ＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳ  ＳＣＬＱＱＬＳ（配列番号２９）；
ＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳ  ＳＣＬＱ（配列番号３０）；
ＱＬＱＬＳＩＳ  ＳＣＬＱＱＬ（配列番号３１）
又はそれらの変異体及び誘導体を含む。
【００４６】
本発明の別の実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列：
ＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ  ＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ（配列番号２１）
その部分、変異体及び誘導体を含む。一実施態様では、配列番号２１の部分は、アミノ酸配列：
ＱＣＦＬＰＶＦ  ＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ（配列番号３２）；
ＬＰＶＦ        ＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ（配列番号３３）；
ＣＦＬＰＶＦ    ＬＡＱＰＰＳＧＱ（配列番号３４）；
又はそれらの変異体及び誘導体を含む。
【００４７】
ＮＹ−ＥＳＯ−１癌エピトープ及びその誘導体は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球によって認識される。ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープと組み合わせて認識されるクラスＩＩ分子としては、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４及びクラスＩＩペプチド結合の縮重のために機能する他のクラスＩＩ分子などの少なくとも１つのＨＬＡ−ＤＲが挙げられるが、それに限定されない。一実施態様では、癌ペプチドによって認識されるＨＬＡサブタイプは、ＨＬＡ−ＤＲ４サブタイプである。別の実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１癌エピトープは、ＨＬＡ−ＤＲ１及びＨＬＡ−ＤＲ４と結合する。
【００４８】
別の実施態様では、エピトープは、以下：
Ｘａａ1ＩＴＱＸａａ2ＦＸａａ3ＰＸａａ4（配列番号５１）
（式中、Ｘａａ1は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ2は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ3は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ4は、少なくとも１つの天然に存在するアミノ酸、好ましくは、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸である）の一般的なアミノ酸モチーフを含む、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープである。
【００４９】
また、配列番号５１と部分配列相同性を共有する癌ペプチド又はその部分は、本発明の範囲に包含される。部分アミノ酸配列相同性とは、配列番号５１と少なくとも８５％の配列相同性、好ましくは、少なくとも９５％の配列相同性又はそれ以上を有し、かつＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束特異的ＣＤ４+Ｔリンパ球、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔリンパ球を刺激するという生物学的機能を有するペプチドを意味する。哺乳動物ホモログは、霊長類及びマウスホモログを含むがそれらに限定されない本発明の範囲に含まれる。ホモログはまた、ＬＡＧＥ遺伝子などのＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子以外の遺伝子によってコードされうる配列番号５１と配列相同性を有するペプチドを含む。
【００５０】
上記配列内に置換を有するエピトープは、本発明に包含される。置換アミノ酸により、配列番号５１と比較して等価な又は増大した結合が生じるならば、天然に存在するアミノ酸の置換は、１個以上のアンカー位置でありうる。配列番号５１のアンカー位置は、位置１、７、及び９、即ち、それぞれＷ、Ｌ、及びＶ残基であると推定される。これらのアンカー残基の置換は、「Ｗ」残基の代わりにＦ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ及びＡ；「Ｌ」残基の代わりにＦ、Ｙ、Ｍ、Ｖ、Ｉ及びＡ；「Ｖ」残基の代わりにＹ、Ｉ、Ａ、Ｌ及びＰでありうるが、それらに限定されない。別の置換は、配列番号１の５位としてＣ残基を含みうるが、それは、残基Ｓ、Ｖ、Ａ及びＴでありうるが、それらに限定されない。
【００５１】
一実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列：Ｘａａ1ＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＸａａ2（配列番号５２）及びその変異体又は誘導体を含む、長さで少なくとも約１０アミノ酸のペプチドである。Ｘａａ1及びＸａａ2は、アミノ酸ではないか、又は１つ以上の同じ、又は種々の天然に存在するアミノ酸でありうる。エピトープがＣＤ４+Ｔリンパ球、特にＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球と結合／及びそれらを刺激する能力を保持するかぎりは、Ｎ末端及びＣ末端でのこれらの位置でのアミノ酸の数は変りうる。エピトープは、約１０乃至約３０アミノ酸、好ましくは２０アミノ酸未満、より好ましくは約１０乃至約１５アミノ酸を含みうる。
【００５２】
一実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープは、アミノ酸配列：
151-SCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSG-177（配列番号５３）；
SLLMWITQCFLPVF（配列番号５４）；
LLMWITQCFLPVFL（配列番号５５）；
LMWITWCFLPVFLA（配列番号５６）；
MWITQCFLPVFLAQ（配列番号５７）；
WITQCFLPVFLAQP（配列番号５８）；
ITQCFLPVFLAQPP（配列番号５９）；
QQLSLLMWITQCFL（配列番号６０）；
QLSLLMWITQCFLP（配列番号６１）；
LSLLMWITQCFLPV（配列番号６２）；及び
それらの誘導体を含む。
【００５３】
ＮＹ−ＥＳＯ−１癌エピトープ及びその誘導体は、ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球、及びその誘導体、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ４拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球によって認識される。ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープと組み合わせて認識されるクラスＩＩ分子としては、ＨＬＡ−ＤＰ及びクラスＩＩペプチド結合の縮重のために機能するクラスＩＩ分子を含む。癌ペプチドによって認識される好適なＨＬＡサブタイプは、ＨＬＡ−ＤＰＢ１*０４０１−０４０２対立遺伝子及び機能縮重のために、該ペプチドに結合しうる他の対立遺伝子である。
【００５４】
本発明の別の実施態様は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球を誘発するように有効に作用するために、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープに十分な相同性を有する該エピトープの誘導体及び変異体を包含する。このようなペプチドは、１つ以上の位置、特にアンカー位置で保存的アミノ酸変化を有しうる。保存的アミノ酸変化とは、特定の位置での、元々存在した同じタイプのアミノ酸でのアミノ酸の変化、即ち、疎水性アミノ酸の代わりに交換された疎水性アミノ酸、塩基性アミノ酸の代わりに塩基性アミノ酸などを意味する。このようなアミノ酸変化は、ペプチドの全体の電荷やコンフィギュレーションを有意には変えず、それ故、このような変異体は、癌ペプチドの抗癌活性を維持するか、又は増大させる。このような保存的変化の例は、当業者に周知であり、本発明の範囲内である。
【００５５】
本発明はまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの機能的に等価な変異体に関する。「機能的に等価な変異体」としては、部分配列相同性を有するペプチド、１つ以上の特異的な保存及び／又は非保存的アミノ酸変化を有するペプチド、ペプチド結合体、キメラタンパク質、融合タンパク質及びペプチドが挙げられる。
【００５６】
本発明の別の局面は、ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞及びＨＬＡクラスＩ拘束ＣＤ８+Ｔリンパ球の両方、特にＨＬＡ−Ａ拘束Ｔリンパ球、好ましくはＨＬＡ−Ａ２拘束Ｔリンパ球のためのエピトープとして機能するＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドである。一実施態様では、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束及びＨＬＡクラスＩ拘束エピトープとしては、アミノ酸配列：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号５４）並びにその変異体及びホモログが挙げられる。変異体としては、ＲＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶ（配列番号６３）を含むＥＳＯｐ１５６Ｒ−１６９及びＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＲ（配列番号６４）を含むＥＳＯｐ１５７−１７０Ｒを含むがそれらに限定されない、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号５４）における１つ以上の置換を有するペプチドが挙げられるがそれらに限定されない。このような置換は、ネイティブ配列の免疫学的機能活性を保持しつつ、ペプチドを水溶液により可溶性にする。高度に水溶性のペプチドは９０％超の純度まで容易に精製されうる。
【００５７】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、初代（primary）臨床単離体、細胞株などからのような天然源から精製単離できる。ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、少なくとも９０％純粋、好ましくは少なくとも９５％純粋及びほぼ１００％純粋である。エピトープは、当業界公知の化学合成又は組換えＤＮＡ技術によっても得ることができる。化学合成の技術は、J.M.Steward and J.D.Young, “Solid Phase Peptide Synthesis”, W.H.Freeman & Co., San Francisco, 1969； M.Bodansky et al “Peptide Synthesis”, John Wiley & Sons, Second Edition, 1976，及びJ.Meienhofer, “Hormonal Proteins and Peptides”, Vol.2, p.46, Academic Press, New York, 1983 及びE.Schroder and K.Kubke, “The Peptides", Vol.1, Academic Press, New York, 1965に記載されている。
【００５８】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、当業界公知の方法によって、医薬として許容できる担体と共に医薬組成物へと製剤化できる。本組成物は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を誘発するために免疫原として有用であり、そして抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を誘発するのに有用でありうる。本組成物はまた、癌を予防又は治療するためのワクチンとして有用である。本組成物は更に、少なくとも１つの免疫刺激分子を含みうる。ＭＨＣクラスＩＩ特異的Ｔ細胞応答を刺激するために、癌エピトープ又はその部分と一緒に使用される免疫刺激分子としては、１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子、又はＭＨＣクラスＩＩ分子を発現している細胞が挙げられるがそれらに限定されない。本組成物は、免疫増強のために、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２など、並びにＩＬ−１〜ＩＬ−１５、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＦＮα、ＣＴＡＰＩＩＩ、ＥＮＡ−７８、ＧＲＯ、Ｉ−３０９、ＰＦ−４、ＩＰ−１０、ＬＤ−７８、ＭＧＳＡ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、又はそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されないサイトカインなどを含む他の刺激分子を更に含んでもよい。
【００５９】
刺激分子は、物理的に分離した実体として提供され得るか、又はＢ細胞、マクロファージ若しくは樹状細胞などの抗原提示細胞の膜中に提供され得るか、リポソームの膜中に提供され得るか、又は形質導入若しくはトランスフェクトされた細胞の表面上に発現され得る。ＭＨＣクラスＩＩ免疫刺激分子のＤＮＡ配列は、GenBankなどから入手できる。ＨＬＡ−ＤＰ免疫刺激分子のＤＮＡ配列は、GenBank/EMBL/DNA Data Bank of Japan(DDBJ) at GenBank, National Center for Biotechnology Information, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894 USA 又はそのウエブサイトから入手できる。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＲ又はそのＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞癌ペプチドに加えて、ＮＹ−ＥＳＯ−１からの幾つかの異なるＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含んでもよい。これらには、ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１０）、ＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴ（配列番号６５）、ＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬ（配列番号６６）、及びそれらの組み合わせなどのＨＬＡ−ＤＲ拘束エピトープ及びその変異体が挙げられるがそれらに限定されない。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球を誘発することに加えて、ＭＨＣクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球を誘発するために、ＭＨＣクラスＩ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１癌ペプチドを必要に応じて含んでもよい。ＭＨＣクラスＩ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１癌ペプチドとしては、式：
Ｘａａ1Ｘａａ2Ｘａａ3ＧＰＧＧＧＡＰＸａａ4（配列番号２２）
（式中、Ｘａａ1は、アミノ酸ではないか、又は１乃至約２０個の天然のアミノ酸、好ましくは１乃至５個のアミノ酸であり；
Ｘａａ2は、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｒｇであり；
Ｘａａ3は、Ｓｅｒ、又はＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒなどの保存的置換であり；
Ｘａａ4は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、好ましくはＡｒｇ）並びにそれらのフラグメント及び誘導体によって表される癌ペプチドが挙げられるがそれらに限定されない。一実施態様では、医薬組成物で使用されるＭＨＣクラスＩ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１癌ペプチドとしては、アミノ酸配列：ＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ（配列番号２３）が挙げられる。
【００６２】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ及びＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープは各々、別個のエピトープとして提供されてもよいし、単一ペプチドとして一緒に結合されてもよい。エピトープは、当業界公知の方法によって、一緒に結合されてもよいし、化学的に合成されてもよい。化学リンカー、ペプチドリンカー、ペプチド結合などは、エピトープを結合するために使用できる。一実施態様では、ＭＨＣクラスＩＩエピトープのＣ末端は、ペプチド結合により、ＭＨＣクラスＩエピトープのＮ末端に直接結合される。
【００６３】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、癌の予防又は治療方法において有用であり、そしてヒトを含む哺乳動物における癌又は前癌を検出するための診断アッセイにおいて有用である。診断アッセイにおいて、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープペプチド、その変異体及び誘導体は、腫瘍抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するヘルパー免疫応答を検出するのに有用である。ＮＹ−ＥＳＯ−１は腫瘍細胞（免疫が特別免除された部位である正常精巣を除く）に専ら発現されるので、該タンパク質に対する免疫応答は、患者において早期の癌の検出のための指標として使用できる。ヘルパーＴ細胞応答の発展は、該タンパク質に対して検出できる抗体の発展よりも早い出来事でありうるので、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープペプチドに対するヘルパーＴ細胞応答の検出は、早期の癌の検出に有用である。ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するヘルパーＴ細胞応答の検出方法において、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープペプチドは、基板又は固体支持体に適用される。患者からのリンパ球は、インフルエンザウイルス由来のペプチドなどのコントロールペプチドと並行して、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープペプチドの存在下で生育される。次いで、ＥＬＩＳＰＯＴ及びＥＬＩＳＡなどの技術を用いて、特異的なサイトカイン放出を測定する。陰性コントロールと比較した、ヘルパーＴ細胞免疫応答の増大の検出は、患者における前癌又は早期の癌の指標となる。
【００６４】
本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束結合ペプチドは、任意の一定の標的抗原及び／又はハプテンに対する抗体及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答の産生を増大させるために使用できる。詳細には、これらのペプチドは、抗体及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答が意図される標的抗原ペプチド、タンパク質又は任意の他のハプテンに対して結合又は共有結合することができる。任意の標的ハプテン又はタンパク質とのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープペプチドの結合は、破傷風トキソイド、アルブミンなどの通常のＴ細胞癌タンパク質と同様に、任意の標的抗原、ハプテン、又はタンパク質の免疫原性の増大において、免疫学的Ｔ細胞キャリアペプチドとして作用するはずである。増大は、標的ハプテン又はタンパク質に対するより高力価の抗体、ＩｇＭからＩｇＧ又はＩｇＡ抗体へのイムノグロブリンクラススイッチング、及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘発において明白でありうる。このような標的抗原、ハプテン又はタンパク質の例としては、ＴＲＰ２、ＧＰ１００、ＴＲＰ１、ｇｐ１２０及び他のＨＩＶ抗原、マラリア抗原、それらのエピトープなどが挙げられるがそれらに限定されない。同様に、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープをコードする核酸配列は、標的抗原又はそのエピトープへの免疫原性を増大させるために、標的抗原又はそのエピトープをコードする核酸配列と共に、操作されたワクチン構築物に組み込まれることができる。この局面に関する例としては、クラスＩＩエピトープの核酸配列を、標的遺伝子とフレームを合わせて、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルスなどの形態の任意のワクチン構築物に組み込むことが挙げられる。例えば、プラスミドワクチンの形態のＴＲＰ２抗原の免疫原性を増大させるために、ＮＹ−ＥＳＯ−１  クラスＩＩエピトープの核酸配列は、ＴＲＰ２遺伝子と同じオープンリーディングフレームにおいて融合されることができる。次いで、ＴＲＰ２のみをコードするプラスミドを用いる代わりに、患者を免疫化するためにハイブリッドプラスミドが使用される。
【００６５】
癌エピトープ又はその変異体は、放射性標識、ビオチン、フルオレセインなどの他の成分が結合している誘導体の形態でありうる。特異的な器官、腫瘍、又は細胞型への特異的ターゲティングを可能とするターゲティング剤をエピトープに結合させることもできる。このようなターゲティング剤は、ホルモン、サイトカイン、細胞レセプターなどでありうる。エピトープは、単独で、又は他の試薬と組み合わせて、キットの形態で製造できる。
【００６６】
本発明の別の局面は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープを用いて、癌に対する腫瘍特異的体液性媒介免疫を誘導するのに有用な免疫原又はワクチンである。免疫原及びワクチンは、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球及び抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を誘発する。必要に応じて、免疫原及びワクチンは、ＣＤ８+Ｔリンパ球を誘発するために、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩ拘束エピトープを含んでもよい。
【００６７】
癌免疫治療へのアプローチは、能動又は受動カテゴリーに分けることができる。能動免疫治療は、腫瘍に対する免疫応答を増大させる試みにおいて、癌患者に対する癌抗原による直接的な免疫化を含む。受動免疫治療は、直接的に抗腫瘍応答を媒介するという目標をもって、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞又は抗体などの免疫試薬の投与を指す。
【００６８】
能動免疫治療における大部分の従来の試みは、免疫応答を刺激できる量と形態で腫瘍抗原を含むという期待をもって、完全な癌細胞又は癌細胞抽出物のいずれかを用いた。しかし、癌抗原とエピトープの分子的同定は、ヒト癌の治療に関する免疫治療を開発するための新しい可能性を有する。これらのアプローチの幾つかの要約を表１に示す。
【００６９】
【表１】
0005588363.tif 000003
【００７０】
少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ特異的Ｔ細胞エピトープをコードする遺伝子の、E.coli、酵母又はバキュロウイルスなどの高効率発現系への挿入は、免疫化において使用するための精製腫瘍エピトープを大量に得る機会を提供する。あるいは、イムノドミナントエピトープは、インビトロで容易に合成でき、そして免疫化のために、単独で、又はアジュバントとの組み合わせ、脂質／リポソームもしくはヘルパーペプチドとの結合などの免疫原性を増大させるために意図された形態で大量に精製でき、あるいは、抗原提示細胞にパルスすることもできる。ＭＨＣクラスＩＩ抗原への結合効率を増大させるための、イムノドミナントペプチドの個々のアミノ酸の修飾は、ネイティブタンパク質と比較して、免疫原性を増大させる可能性を有しうる。
【００７１】
筋肉内又は皮膚内に直接注射される「裸の」ＤＮＡを用いる最近の技術は、コードされた抗原に対し細胞免疫応答と体液性免疫応答の両方を生じさせることが示されている（Cooney,E.L., A.C.Collier, P.D.Greenberg, R.W.Coombs, J.Zarling, D.E.Arditti, M.C.Hoffman, S.L.Hu, 及び L.Correy, 1991, Lancet 337:567； Wolff,J.A., R.W.Malone, P.Williams, W.Chong, G.Acsadi, A.Jani, 及び P.L.Felgner, Science 247:1465； Davis,H.L., R.G.Whalen, 及び B.A.Demeniex, 1993, Hum.Gene.Ther. 4:151；Yang,N.S., J.Burkholder, B.Roberts, B.Martinelli, 及びD.McCabe, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:9568；Williams,R.S., S.A.Johnston, M.Riedy, M.J.DeVit, S.G.McElligott, 及び J.C.Sanford, 1991,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:2726； Fynan,E.R., Webster, D.H.Fuller, J.R.Haynes, J.C.Santoro, 及び H.L.Robinson, 1995, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:11478； Eisenbraum,M.D., D.H.Fuller, 及び J.R.Haynes, 1993, DNA and Cell Bio. 12:791； Fuller,D.H. 及び J.R.Haynes, 1994, AIDS Res.Hum.Retrovir. 10(11):1433； Acsadi,G., G.Dickson, D.R.Love, A.Jani, F.S.Walsh, A.Gurusinghe, J.A.Wolff, 及び K.E.Davies, 1991, Nature 352:815）。非生存ＤＮＡベクターを用いる技術は、製造の容易さと投与の安全性という利点を有する。本発明の核酸配列は、癌に対する免疫原として、及びＤＮＡワクチンとして有用である。ＮＹ-ＥＳＯ-１  ＭＨＣクラスＩＩ特異的Ｔ細胞エピトープの本発明の核酸配列、又は１つ以上の変異体ＮＹ-ＥＳＯ-１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを有する完全長ＮＹ-ＥＳＯ-１タンパク質をコードする核酸配列は、癌細胞に対する体液性反応を誘発させる量で、遺伝子銃を用いて投与できる。ナノグラム量がこのような目的のために有用である。
【００７２】
免疫化の有効な形態は、免疫原性分子をコードする遺伝子の、ＢＣＧ、サルモネラ又はリステリアなどの組換え細菌への、又はワクシニア、鶏痘、又はアデノウイルスなどの組換えウイルスへの組み込みを含む。ＮＹ-ＥＳＯ-１  ＭＨＣクラスＩＩ特異的Ｔ細胞エピトープをコードする遺伝子は、単独で、又は免疫刺激分子をコードする遺伝子もしくは感染後に免疫応答を増大させることができる他の遺伝子と組み合わせて発現させることができる。構築物は、更なるＮＹ-ＥＳＯ-１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ及び／又は少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩ特異的Ｔ細胞エピトープをコードする遺伝子を更に含んでもよい。
【００７３】
マウスモデルでのモデル腫瘍抗原についての研究は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はＢ．７．１の遺伝子の組み込みが、モデル腫瘍エピトープの免疫原性を増大でき、これらのエピトープを担う樹立された肺転移の退行を媒介さえできることを示した。能動免疫治療、次いでＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２又はＩＬ−１５などの免疫刺激サイトカインの外来性投与はまた、免疫応答を改善するために使用できる。
【００７４】
ヒト腫瘍抗原を認識できる遺伝子的に修飾された免疫細胞による受動免疫治療（通常、養子免疫治療と言われる）は、転移性メラノーマの選択された患者における癌の退行を媒介するのに有効である。抗原提示細胞上に存在する腫瘍抗原イムノドミナントエピトープに対しヒトリンパ球をインビトロで感作するインビトロ技術が開発された。反復性のインビトロ刺激によって、ヒト腫瘍抗原をコードする遺伝子をクローンするために使用されたＴＩＬよりも、これらの抗原を認識するずっと大きな能力をもった細胞が得られる。このように、癌ペプチドによる反復性のインビトロ感作によって、ＴＩＬの５０乃至１００倍の能力をもったリンパ球を得ることができる。これらの細胞の養子移転（adoptive transfer）は、従来の増殖したＴＩＬよりも、インビボで腫瘍退行を媒介するのに有効でありうる。
【００７５】
一実施態様において、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、ＤＲ４−ＩＥトランスジェニックマウスの免疫化後、同定された幾つかの候補ＤＲＢ１*０４０１ペプチドで刺激された。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞は、合成ペプチドＥＳＯｐ１６１−１８０によるインビトロ感作で産生された。このＣＤ４+Ｔ細胞株は、ＨＬＡ  ＤＰ４（コーカソイドの約４３〜７０％に存在する優勢なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（５２））によって提示されるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを認識した。更に、ＨＬＡ  ＤＰ４ハプロタイプは、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対し高力価のＡｂを産生するメラノーマ患者の９１％（１１人のうち１０人）が有していたが、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性腫瘍を有し、検出可能なＡｂをプロセシングしない３人の患者では発現されなかった。インビトロ刺激の結果は、ＨＬＡ  ＤＰ−４拘束Ｔ細胞が、ＮＹ−ＥＳＯ−１  Ａｂを有する６人の患者のうち５人の患者から産生できることを示した。これらの結果は、ＤＰ４の状況において、ＣＤ４+Ｔ細胞によるＮＹ−ＥＳＯ−１の認識は、この抗原に対し抗体応答を開始するこれらの患者の能力と関連しうることを示唆した。
【００７６】
癌の予防又は阻害の方法において、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、腹腔内、クモ膜下、胸膜腔内、子宮内、直腸、膣、局所、腫瘍内などを含むがそれらに限定されない幾つかの経路の１つを介し投与できる。
【００７７】
投与は、経粘膜又は経皮膚手段によってされてもよい。経粘膜又は経皮膚投与のために、透過すべきバリアに適切な浸透剤が製剤において使用される。このような浸透剤は一般的に当業界公知であり、例えば、経粘膜のための胆汁塩及びフシジン酸誘導体が挙げられる。更に、界面活性剤が透過を容易にするために使用されうる。経粘膜投与は、例えば、鼻腔スプレー、又は坐剤によってされ得る。経口投与の場合、癌ペプチド、腫瘍抗原、その部分又は変異体が、カプセル、錠剤及びトニック（tonic）などの通常の経口投与形態に製剤化される。
【００７８】
一般的に、レシピエントに、レシピエントの体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｎｇ、好ましくは体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たり少なくとも約１０ｍｇ又はそれ以上のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの投与量を提供することが望ましい。体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ乃至約１００ｍｇの範囲が好適であるが、より低い又はより高い投与量も投与できる。投与量は、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ特異的ＣＤ４+Ｔリンパ球のクローナル増殖（clonal expansion）をプライムし、刺激し、及び／又は引き起こすのに有効であり、次いで、それは、レシピエントの癌の予防又は阻害をすることができる。
【００７９】
投与は、少なくとも１回行われ、またボーラス又は連続的投与として与えられることができる。数週間乃至数ヶ月の期間での複数回の投与は好ましくありうる。その後の投与は、示されたように投与されうる。
【００８０】
治療方法において、ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含むワクチンは、哺乳動物において癌を予防するのに有効な量、又は局所的な癌を有する哺乳動物において転移を予防するのに有効な量で哺乳動物に投与される。必要に応じて、ワクチンは、細胞傷害性Ｔリンパ球を刺激するために、複数の異なるＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ及び／又はＮＹ−ＥＳＯ−１  クラスＩ拘束癌ペプチド又はエピトープを含みうる。
【００８１】
腫瘍を有する動物における腫瘍負荷を減少させる方法において、本方法は、腫瘍負荷の部位にＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの有効量を投与することを含み、該量は、該部位で腫瘍のサイズを減少させるのに有効であり、かつ腫瘍部位からの転移を阻害しうる。
【００８２】
治療方法の別の実施態様において、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープを含む免疫原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４+Ｔリンパ球と抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を誘発するのに有効な量で哺乳動物に投与される。免疫原は、単独で、又はアジュバント、免疫調節剤などと組み合わせて提供されうる。
【００８３】
治療の別の方法において、自己リンパ球又は腫瘍浸潤リンパ球が、癌患者から得られうる。リンパ球は、培養で増殖され、そして癌エピトープ特異的ＣＤ４+リンパ球は、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープ単独の存在下で、又はサイトカインの少なくとも１つの免疫刺激分子と組み合わせての存在下で、培養することによって増殖される。次いで、エピトープ特異的ＣＤ４+リンパ球は、患者の癌を減少又は除去するのに有効な量において、単独で、又はエピトープと組み合わされて、注入によって患者に戻される。
【００８４】
免疫化後、ワクチンの効力は、抗体力価、特異的な溶解活性、特異的サイトカイン産生、腫瘍退行、又はこれらの組み合わせによって評価されるように、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ  Ｔ細胞エピトープを認識する免疫細胞の産生によって評価されうる。免疫化される哺乳動物が既に癌又は転移性癌に罹患しているならば、ワクチンは、免疫調節剤（例えばＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、インターフェロン、腫瘍壊死因子など）、シスプラチナムなどの化学療法剤、ガンシクロビルなどの抗ウイルス剤、アンホテリシンＢ、抗生物質などのような他の治療と共に投与されうる。
【００８５】
本発明の別の局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００８６】
一実施態様では、ＤＮＡ配列は、ＣＤ４+Ｔリンパ球によって認識されるＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする配列番号１又は２の部分及びその機能的に等価な配列変異体を含む。また、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする配列番号１又は２の部分と相補的な核酸配列及び反相補的な核酸配列も本発明に包含される。
【００８７】
一実施態様では、ＤＮＡ配列は、配列番号４〜２１又は２９〜３４の少なくとも１つを含むＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする。
【００８８】
別の実施態様では、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列は、以下：
ＣＡＧ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＧＴＧ
ＣＣＡ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＴＣ
ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＡＴＡ  ＣＴＧ  ＡＣＴ
ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＣＴＣ（配列番号２４）又はその機能性部分又は変異体
を含む。
【００８９】
別の実施態様では、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列は、以下：
ＡＧＡ  ＣＣＡ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ
ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  ＧＣＡ
ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＣＣＴ  ＧＴＴ  ＧＡＴ（配列番号２５）又はその機能性部分又は変異体を含む。
【００９０】
別の実施態様では、ＤＮＡ配列は、以下：
ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＣＴＧ  ＣＣＣ
ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＣ
ＴＣＡ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＧＣ（配列番号２６）又はその機能性部分又は変異体を含む。
【００９１】
本発明の別の局面は、ＮＹ−ＥＳＯ−１のＨＬＡ−ＤＰ拘束ＣＤ４+Ｔ細胞エピトープをコードするＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子のＤＮＡ配列である。
【００９２】
一実施態様では、ＤＮＡ配列は、ＣＤ４+Ｔリンパ球によって認識されるＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする１つ以上の配列番号５１〜６４及びその機能性等価配列変異体をコードする核酸配列を含む。ＨＬＡ−ＤＰ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする核酸配列と相補的及び反相補的な核酸配列も本発明に包含される。
【００９３】
包括的な暗号（generic code）の縮重に起因して、ＤＮＡ配列の変異により、等価なＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの翻訳がなされよう。結果として、置換によって、ＮＹ−ＥＳＯ−１癌抗原ＨＬＡ−クラスＩＩ拘束ＣＤ４+Ｔ細胞によって認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの発現が生じる限り、置換は本発明の範囲に含まれる。
【００９４】
ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子に由来するオープンリーディングフレームＤＮＡ配列の全て又は部分は、他の哺乳動物種におけるＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープのホモログを同定、単離するために、プローブとして使用できる。一実施態様では、ヒトｃＤＮＡ配列は、マウスホモログ核酸配列のために哺乳動物ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用される。陽性クローンを選択し、配列決定する。ｃＤＮＡライブラリーが合成できる組織源の例としては、真皮、表皮、固形腫瘍、メラノーマ、メラノサイトなどが挙げられるがそれらに限定されない。当業者は、ホモログを検出するのに使用される適切なハイブリダイゼーション条件を理解しよう。ライブラリーの核酸ハイブリダイゼーション構築のための通常の方法及びクローニング技術は、Sambrook et al, (eds)(1989)“Molecular Cloning. A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Press, Plainview, New York； Ausubel al(eds) “Current Protocols in Molecular Biology”(1987), John Wiley and Sons, New York, New Yorkに記載されている。
【００９５】
本発明の別の局面は、癌を有する哺乳動物から単離された生物学的サンプルにおける本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを転写するＲＮＡの検出と定量のための核酸プローブである。コントロールＲＮＡサンプルに対するＲＮＡレベルの変化は、哺乳動物における該疾病の診断や予後に有用である。
【００９６】
一実施態様では、ｍＲＮＡは、癌又は前癌を有すると疑われる患者の組織から得られ、そして健康なコントロール患者由来のｍＲＮＡと比較される。コントロールと比較した場合、患者における本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするｍＲＮＡの定量的及び／又は定性的増大は、患者における癌又は前癌の指標となる。ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡとハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプローブを用いて検出できる。
【００９７】
本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド対の組み合わせは、選択されたＲＮＡ配列を増大させる逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）方法を用いて、生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡを検出するためのＰＣＲプライマーとして使用できる。本発明はまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡとＲＮＡの検出のためのインサイチュＰＣＲとインサイチュＲＴ−ＰＣＲを包含する。標的核酸のコピー数が非常に小さいとき、又は核酸の異なる形態を区別しなければならないとき、該技術は好適である。該方法は、正常細胞から前癌細胞及び癌細胞を検出し、区別するのに特に有用である。
【００９８】
本発明はまた、ｍＲＮＡ上のある相補（「センス」）領域と結合し、ＮＹ−ＥＳＯ−１の合成阻害に至るアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約１２乃至約２５モノヌクレオチドの１本鎖核酸であり、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードする配列に対しアンチセンスである。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Molecular Biology and Biotechnology R.A.Meyers（編 VCH Publishers,Inc., New   York, NY, 1995, pp.38-44のUhlmann,E.ら, Antisense oligonucleotides, structure and function に記載のように、当業界公知の方法によって製造できる。
【００９９】
本発明はまた、少なくとも１つ以上のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列を含むベクターを包含する。ベクターは、１つ以上の変異体ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを有する完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含みうる。必要に応じて、ベクターはまた、少なくとも１つの免疫刺激分子をコードするＤＮＡ配列を含んでもよい。ベクターはまた、少なくとも１つ以上のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列を含んでもよい。ベクターはまた、細胞や組織におけるＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの局在を検出するのに使用される緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。
【０１００】
真核発現ベクターとしては、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、鶏痘ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、ヒトパピローマウイルスベクター、ウマ脳炎ベクター、インフルエンザウイルスベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０１】
本発明は、遺伝子、そのフラグメント又は変異体のオープンリーディングフレーム核酸配列によってコードされた少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを発現する新規組換えウイルスを包含する。組換えウイルスはまた、少なくとも１つの免疫刺激分子を発現してもよい。組換えウイルスは、哺乳動物、特にヒトにおける癌の予防又は治療の目的のために、哺乳動物において体液性免疫応答を誘発又はアップレギュレートできる。
【０１０２】
組換えウイルスに感染した宿主細胞は、１つ以上のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを単独で、又は少なくとも１つの免疫刺激分子と組み合わせて発現する。宿主細胞はまた、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現する組換えウイルスに感染されてもよい。
【０１０３】
組換えワクシニアウイルスベクターから外因性遺伝子産物を構築、発現する方法は、Perkusら Science 229:981-984, 1985； Kaufmanら Int.J.Cancer 48:900-907,1991； Moss Science 252:1662,1991； Smith及びMoss Bio Techniques Nov/Dec, p.306-312,1984；並びに米国特許第4,738,846号に開示されている。Sutter及びMoss（Proc.Nat'l Acad Sci. U.S.A. 89:10847-10851,1992）及びSutterら（Virology 1994）は、本発明でウイルスベクターとして使用できる非複製組換えアンカラウイルス（ＭＶＡ，修飾ワクシニアアンカラ）のベクターとしての構築と使用を開示する。Baxby及びPaoletti（Vaccine 10:8-9, 1992）は、本発明のウイルスベクターとして使用のための、カナリア痘ウイルス、鶏痘ウイルス及び他のトリ種を含む非複製ポックスウイルスのベクターとしての構築と使用を開示する。
【０１０４】
本発明のベクターは、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの発現のために適切な宿主細胞中に置かれうる。真核宿主細胞株としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、昆虫細胞、樹状細胞などの抗原提示細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。必要に応じて、宿主細胞はまた、刺激分子を発現してもよい。宿主細胞が、少なくとも１つのＭＨＣ（又はＨＬＡ）クラスＩＩ分子と組み合わせてＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの両方を発現する場合、真核発現系は、適切なグリコシル化を可能にするように使用されるのが好ましい。宿主細胞による癌エピトープと免疫刺激分子の両方の発現は、抗原認識、及び抗原特異的Ｔ細胞の増殖又はクローナル増殖において助けとなるように、特異的Ｔ細胞に必要なＭＨＣクラスＩＩ拘束ペプチドを提供し、Ｔ細胞に適切なシグナルを提供する。全体としての結果は、免疫系のアップレギュレーションである。免疫応答のアップレギュレーションは、癌又は前癌細胞の増殖の阻害のための、癌抗原特異的ＣＤ４+リンパ球の増加及び体液性免疫の他のエフェクター細胞の増加によって明白となる。
【０１０５】
ＤＮＡは、当業界公知の方法によるトランスフェクション、形質導入、リポソームなどによって宿主細胞に挿入できる（Sambrook et al, 1989, “Molecular Cloning A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor press, Plainview, New York）。リポソームの場合、Nabel,E.G.et al, 1992, Hum.Gene.Ther. ３:367-275；  Nabel,G.J. et al, 1992, Hum.Gene.Ther. 3:649-656；  Stewart,M.J. et al 1992, Hum.Gene.Ther. ３:399-410；  Nabel,G.J. et al 1993 Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:11307-11311；及びHarrison,G.S. et al 1995 Bio Techniques
19:816-823に開示のように、カチオン性脂質が好ましく、例えば、中性リン脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）と複合した、ポリカチオン性脂質であるジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）が好ましい。
【０１０６】
宿主細胞によって発現される組換えＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープは、当業界公知の標準的タンパク質精製方法によって細胞溶解液又は細胞上清から精製できる。これらとしては、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、等電点フォーカシング、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣなどが挙げられるがそれらに限定されない（Ausubel et al, 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY）。イムノアフィニティクロマトグラフィーも、イムノアフィニティ剤として、本明細書記載の抗癌タンパク質抗体又はその抗原結合フラグメントを用いて精製のために使用できる。
【０１０７】
組換えウイルスはまた、治療薬又はワクチンとして使用できる。このような使用において、より低い、又はより高い投与量も投与できるが、レシピエントに、哺乳動物１ｍｇ当たり約１０5乃至約１０10プラーク形成ユニットの範囲における組換えウイルスの投与量を提供することが望ましい。
【０１０８】
組換えウイルスベクターは、メラノーマなどの癌の如何なる証拠の前に、又はメラノーマなどの癌に罹患した哺乳動物における該疾病の退行を媒介するために、哺乳動物に導入できる。哺乳動物にウイルスベクターを投与する方法の例としては、エキソビボで細胞を組換えウイルスに曝すこと、又は冒された組織内に組換えウイルスを注入すること、又はウイルスの静脈内、皮下、皮内、筋肉内などへの投与が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、組換えウイルスベクター又は組換えウイルスベクターの組み合わせは、癌病巣中への直接的注入、又は適切な医薬として許容できる担体中での局所適用によって、局所投与されることができる。問題の核酸配列を担持する組換えウイルスベクターの量は、ウイルス粒子の力価に基づく。免疫化のための好適な範囲は、哺乳動物、好ましくはヒト当たり約１０5乃至１０10ウイルス粒子である。
【０１０９】
本発明は、少なくとも１つのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープをコードするＤＮＡ配列の１つ以上のコピーをゲノム中に組み込まれたトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物作出の一般的方法は、Krimpenfortら，米国特許第5,175,384号、Leder ら，米国特許第5,175,383号、Wagnerら，米国特許第5,175,385号、Evansら，米国特許第4,870,009号、及びBernsら，米国特許第5,174,986号に記載されている。遺伝子の組み込みにより、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの過剰発現、発現の変化、又はＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープのマルチプル形態もしくは変異体の発現が生じる。得られるトランスジェニック動物は、癌の進行又は本発明の腫瘍抗原の研究において有用である。動物モデルは、癌治療のためのワクチンや化学療法剤をスクリーニングするのに有用である。トランスジェニック動物はまた、癌の進行の研究において有用である。
【０１１０】
本発明は更に、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープによる免疫化によって誘発される抗体又は抗原結合部分を含む。ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープがほんの数個のアミノ酸からなる場合、エピトープは、抗体応答を誘発するために、キャリアタンパク質に結合されてもよい。ＫＬＨ、破傷風トキソイド、アルブミンなどのキャリアタンパク質及び結合方法は、当業界公知である。抗体は、インタクトなＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質及びＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の天然のプロセスされた形態と同様に、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープに対する特異性を有し、それらと反応もしくは結合する。
【０１１１】
典型的な抗体分子は、インタクトなイムノグロブリン分子、実質的にインタクトなイムノグロブリン分子、又は抗原結合部位を含むイムノグロブリン分子のこれらの部分（Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、ヒト化キメラ抗体、及びＦ（ｖ）のような当業界公知のイムノグロブリン分子の部分を含む）である。ポリクローナル又はモノクローナル抗体は、当業界公知の方法によって製造できる（Kohler and Milstein (1975) Nature 256,495-497； Burdonら（編）(1985) “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology”, Vol.13, Elsevier Science Publishers, アムステルダム中のCambell “Monoclonal Antibody Technology, the Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas”）。抗体又は抗原結合フラグメントはまた、遺伝子工学によって製造できる。重鎖及び軽鎖遺伝子両方の発現のための技術は、ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ ９０１４４３、ＷＯ ９０１４４２４、Huse et al(1989)Science 246:1275-1281及び米国特許第4,946,778号の主題である。１つ以上の相補的決定領域を有するヒト化イムノグロブリン及び該抗体の製造方法は、米国特許第５，５８５，０８９号及び第５，５３０，１０１号に開示されている。
【０１１２】
一実施態様において、本発明の抗体は、生物学的サンプルにおけるＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを含むＮＹ-ＥＳＯ-１ペプチド又は部分を検出するイムノアッセイで使用される。抗体又はその抗原結合フラグメントは、癌に冒された哺乳動物からの組織生検サンプル中で、癌ペプチドを検出するために使用されることができる。病気の組織内でのＮＹ−ＥＳＯ−１  ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの評価は、哺乳動物での病気の悪化を予測するために使用できるか、又は治療の効力を診断しうる。イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイなどであり得、そしてインビトロ、インビボ、又はインサイチュで行うことができる。ＥＬＩＳＡについて当業界公知の標準的技術は、“Methods in Immunodiagnosis”（第２版）, Rose及びBigazzi（編）, John Wiley & Sons, 1980； Campbellら，“Methods and Immunology”, W.A.Benjamin, Inc., 1964；及びOellerich,M. 1984, J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 22:895-904に記載されている。免疫組織化学の通常の方法は、Harlow及びLane(編)(1988) “Antibodies A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York； Ausbelら(編)(1987) Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons (New York, NY)に記載されている。このような検出アッセイのために適切な生物学的サンプルとしては、細胞、組織生検材料、全血、血漿、血清、痰、脳脊髄液、胸膜液、尿などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１３】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントはまた、免疫治療でも使用できる。抗体又はその抗原結合フラグメントは、癌の重篤度、程度又は持続時間を防止、軽減又は減衰させるために十分な量で哺乳動物に提供される。
【０１１４】
引用された全ての論文及び特許は、引用により本明細書に含まれるものとする。
【０１１５】
本発明を、ある特定の実施態様に関し上に記載するが、多数のバリエーションが可能で、代わりの材料や試薬を、本発明を逸脱すること無しに使用できることが理解されよう。幾つかの場合に、このようなバリエーション及び置換は何らかの実験を必要とするかも知れないが、慣用的な試験のみを含むであろう。
【０１１６】
特定の実施態様の上の記載は、本発明の一般的な性質を十分に示し、他の者は、現在の知識を適用することによって、種々の適用のために、一般的概念を逸脱すること無しに、このような特定の実施態様を容易に改変し、及び／又は採用できる。それ故、このような改変や修飾は、開示された実施態様の等価物の意味内と範囲内に包含されるように意図される。
【実施例】
【０１１７】
実施例１
材料および方法
組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質の生成および解析：完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子をコードする細菌発現ベクターを構築するために、本発明者らは一対のプライマー、ＮｄｅＩ部位を含むＥＳＯ−５ｐ（５’ＧＣＴＣＣＧＧＡＣＡＴＡＴＧＣＡＧＧＣＣＧ  ＡＡＧＧＣＣＧＧＧＧ）（配列番号３５）およびＸｈｏＩ部位を含むＥＳＯ−３ｐ（５’ＡＡＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＣＴ  ＧＧＧＣＴＴＡＧＣＧＣＣＴＣＴ）（配列番号３６）を用いて、ＰＣＲフラグメントを作製した。ＰＣＲ産物の制限酵素による消化およびゲル精製の後、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするＤＮＡフラグメントをポリヒスチジンペプチドをコードするＤＮＡとｐＥＴ−２８（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，マジソン，ＷＩ）内でインフレームに融合させた。同様のストラテジーを、最初の７４のアミノ酸残基のみを含むトランケートＮＹ−ＥＳＯ−１であるＥＳＯ１−７４の発現ベクターを構築するのにも使用した。正確なプラスミド構築物を保持するＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）を３７℃で対数期まで増殖させ、次いで、イソプロピル−ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．５ｍＭまで添加し３時間振盪することによってタンパク質産生を誘導した。細菌抽出物の可溶性画分を得た。またＮＹ−ＥＳＯ−１をＮｉ2+アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精製タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を先の報告（２５）のように行った。精製タンパク質のＮ末端配列を自動Ｅｄｍａｎ分解により決定した。
【０１１８】
血清およびＰＢＭＣ：転移性メラノーマの患者由来の血清を−８０℃で保存した。正常ドナーの血清をＮＩＨのクリニカルセンターの血液バンクから得た。転移性メラノーマの患者ＴＥのＭＨＣクラスＩＩ遺伝子型はＨＬＡ−ＤＲ１*０４０１，１*１５０１であった。この患者をｇｐ１００：２０９−２１７（２１０Ｍ）ペプチド＋高用量のＩＬ−２で処置し、目的である腫瘍退行の実験に付した。
【０１１９】
ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に対する抗体の検出：５０  ｌのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝化生理食塩水）に希釈した約５０ｎｇの精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を９６ウェルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，デンマーク）の各ウェルに室温で終夜吸着させた。コントロールプレートは１ウェルあたり１５０ｎｇのＢＳＡでコートした。プレートをＰＢＳＴ中５％ドライミルクで少なくとも２時間ブロックし、洗浄し、そして１００  ｌの希釈血清サンプルをロードした。全ての血清サンプルはＰＢＳＴ中３％ドライミルクを用いて１：２５、１：２５０、および１：２５００に希釈した。この３つの異なる希釈の各サンプルをＮＹ−ＥＳＯ−１コートしたプレートおよびＢＳＡコートしたプレート上にロードした。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、ＰＢＳＴ中１％ドライミルクで希釈した二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼを結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．，セントルイス，ＭＯ）をロードした。プレートを０．５時間インキュベーションした後発色させ、４５０ｎｍでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ，シャンティイー，ＶＡ）を用いて読み取った。陽性反応を、１：２５と１：２５０の両方の血清希釈で、正常ドナーの平均Ｏ．Ｄ．値＋標準偏差の３倍を超えるＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＯ．Ｄ．値として定義した。ウエスタンブロットを（２４）の記載のように行い、いくつかの代表的血清サンプルにおける抗体の特異性を確認した。
【０１２０】
細胞株および抗体：メラノーマ株Ｆ０４９およびＦ０５０は、ＮＣＩの外科のＡｄａｍ  Ｒｉｋｅｒから提供された細針状アスパレート（ａｓｐａｒａｔｅ）サンプルの初期培養物であった。他の全てのメラノーマ株およびＥＢＶ  Ｂ株は１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｆｌｕｉｄ，Ｉｎｃ．，ゲーサーズバーグ，ＭＤ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ロックヴィル，ＭＤ）で作製し維持した。２９３ＩＭＤＲ１および２９３ＩＭＤＲ４をヒトインバリアント鎖であるＤＭＡ、ＤＭＢおよびＤＲ分子を発現するよう遺伝子組換えし、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ１６４０で培養した（１５）。マウスリンパ球の培養培地は、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｉｎｃ．（ローガン，ＵＴ）より供給される、０．０５ｍＭメルカプトエタノール、５ＣＵ／ｍｌ  ＩＬ−２および１０％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０だった。ヒトＴ細胞培養に用いた培地は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．（セントルイス，ＭＯ）により供給される、０．０５ｍＭメルカプトエタノール、５０ＣＵ／ｍｌ  ＩＬ−２および１０％ヒトＡＢ血清を含むＲＰＭＩ１６４０だった。抗体ブロッキング実験を先の記載（１５）のように行った。ハイブリドーマＨＢ５５およびＨＢ９５はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ，マナッサス，ＶＡ）から得た。コントロール抗体はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｉｎｔ．（サンディエゴ，ＣＡ）から購入した。
【０１２１】
トランスジェニック動物および免疫手順：ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニック（ＤＲ４−Ｔｇ）マウスはマウスクラスＩＩ欠損であり、ＨＬＡ−ＤＲ−ＩＥ−およびＨＬＡ−ＤＲ１*０４０１−ＩＥ−キメラ分子を発現した（２６）。初代マウスはＣａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＰａｕｌ  Ｌｅｈｍａｎｎを通じて得た。マウスは近交系であり、Ｂｉｏｃｏｎ  Ｉｎｃ．（ロックビル，ＭＤ）で維持された。６〜１０週齢の雌性マウスを完全長組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質で免疫した。精製タンパク質（約５０μｇ）を完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）中に懸濁し、均等に分け、後肢足蹠および尾の付け根に皮下注射して各マウスに投与した。注射１１日後、マウスを屠殺し、そして両方の後肢膝窩および鼠径部リンパ節を採取した。単一の細胞懸濁液を２匹の免疫動物のリンパ節から得、インビトロ刺激を行った。
【０１２２】
ペプチド合成：本研究で使用した合成ペプチドはＮＣＩの外科のペプチド合成機（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏ．  Ｉｎｃ．，ワージントン，ＯＨ）で固相法を用いて作製した。各ペプチドの純度は質量分析（Ｂｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｎｃ．，ルイスヴィル，ＴＸ）により評価した。
【０１２３】
インビトロ感作（ＩＶＳ）手順およびサイトカイン放出アッセイ：サイトカイン放出アッセイを行う前１週間、終濃度１０Ｍのペプチドを２．５×１０5マウスリンパ球と混合した。ヒトＰＢＭＣのＩＶＳのために、２．５×１０5細胞を１０Ｍ濃度のペプチドでパルスし、平底９６ウェルプレートの各ウェル中でインキュベートした。２回のインビトロ刺激の後、細胞を様々な標的に対して試験し、上清をサイトカイン放出アッセイのために収集した。ヒトＴ細胞の急速な増殖およびクローニングは記載（２０）のように行った。
【０１２４】
終濃度１０Ｍのペプチドまたは終濃度５ｇ／ｍｌのタンパク質を標的細胞にパルスした。４時間のインキュベーション後、細胞を無血清ＲＰＭＩ培地中で洗浄し、およそ３×１０4の標的細胞を同数のＴＥ４−１細胞とともに終夜インキュベーションし、サイトカイン放出をヒトについてはＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス，ＭＮ）、またはマウスについてはＩＦＮキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ，  Ｉｎｃ．  ウォバーン，ＭＡ）を用いて測定した。ヒトＩＦＮ−，ＩＬ−１０，ＴＮＦ−，およびＩＬ−４等の他のサイトカインは、製造業者の説明書に従って、Ｅｎｄｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．またはＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【０１２５】
実施例２
組換えＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質およびＮＹ−ＥＳＯ−１反応性抗体の検出
ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性抗体およびＣＴＬは、癌の患者において報告されている（１９〜２２）。従って、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞がＮＹ−ＥＳＯ−１抗原に対する抗体の発生およびＣＴＬの調整に関与しているかもしれないようである。しかし、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＣＤ４+Ｔ細胞エピトープはこれまで報告されていない。ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４+Ｔ細胞エピトープを同定するために、本発明者らは、細菌発現系からＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を出発物質として精製することから始めた。ＮＹ−ＥＳＯ−１発現およびタンパク質精製を促進するため、ＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするｃＤＮＡフラグメントを、ｐＥＴ２８発現ベクターのＮ末端に位置するポリヒスチジンタグにインフレームで融合し、組換えタンパク質の高レベル産生を得た。数ミリグラムのＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質をＮｉ2+荷電アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用して精製した。精製タンパク質はＳＤＳポリアクリルアミドゲル上およそ２６ｋＤａの見かけの分子量を示した（図２Ａ）。精製タンパク質の同定を確認するために、タンパク質のＮ末端マイクロシークエンシングを自動Ｅｄｍａｎ分解により行った。Ｅｄｍａｎ分解により得られた２５アミノ酸残基すべては予測したアミノ酸配列と一致した（データ示さず）。最初の７４アミノ酸残基を含む短い形のＮＹ−ＥＳＯ−１（ＥＳＯ１−７４）もまた同じアプローチにより精製した（図２Ａ）。
【０１２６】
メラノーマ患者がＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に対する抗体を生じたかどうかを決定するために、ＮＣＩの外科において癌ワクチン治療プロトコルに登録された８８人の転移性メラノーマ患者由来の血清をスクリーニングした。８人の正常ドナー由来の血清をスクリーニングのコントロールとして使用した。８８人の患者のうち１１人（１３％）が、高力価のＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を持っていることが分かった（図２Ｃ）。このデータは他の群により得られた結果と一致した（２２）。患者の血清が精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に存在するわずかな夾雑物と反応する可能性を除去するため、代表的な血清サンプルを用いてウエスタンブロットを行った。図２Ｂは、患者由来のＮＹ−ＥＳＯ−１反応性の血清が、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現細菌の細胞溶解物および精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質だけと反応し、コントロールベクターを含む細菌由来の抽出物とは反応しなかったことを示した。非反応性の血清サンプルもまた試験した（図２Ｂ、レーン４，５，６）。
【０１２７】
実施例３
ＨＬＡ−ＤＲ４−トランスジェニックマウス由来の推定ＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープの同定
ＣＤ４+Ｔ細胞エピトープを同定するために、ＤＲ４トランスジェニックマウスをＣＦＡ中およそ５０ｇの完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質で、尾の付け根および後肢足蹠に免疫した。注射後１１日目に、２匹の免疫したマウスの両後肢膝窩および鼠径部リンパ節から得た単一の細胞懸濁液を調製し、ＨＬＡ−ＤＲ４分子の推定ペプチド結合能に基づくＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質由来合成ペプチドでのインビトロ感作に使用した（２７）。
【０１２８】
ＨＬＡ−ＤＲ４に結合することが予測されるアミノ酸配列セグメントを含む８つの高結合ペプチドをインビトロ感作実験に使用した。最初のインビトロ感作後６日目に、マウスリンパ球を、ヒトＨＬＡ−ＤＲ４陽性１３５９ＥＢＶ  Ｂ細胞のみおよび刺激に使用した対応するペプチドでパルスした１３５９ＥＢＶ  Ｂに対するサイトカイン放出について試験した。３つのペプチドは、Ｔ細胞からのサイトカイン分泌に基づきマウスＴ細胞により認識されたが、他の５つのペプチドは認識を示さなかった（図３）。ＥＳＯ  ｐ１１６−１３５は陽性ペプチドのうちで最も強い活性を示した。これは、このペプチドが、Ｔ細胞認識のためにＨＬＡ−ＤＲ４分子により提示されるエピトープを含んでいるかもしれないことを示唆している。従って、このペプチドをさらなる解析のために選択した。
【０１２９】
実施例４
ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的なヒトＣＤ４+Ｔ細胞の作製
ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する高力価の抗体を持っていた患者ＴＥ（図２Ｃ）由来のＰＢＭＣを、ＥＳＯ  ｐ１１６−１３５ペプチドを用いたインビトロ刺激に使用した。インビトロ刺激の１週間後、患者ＴＥ由来のＰＢＭＣは著しい増殖を示した。ＩＬ−２を刺激の２週目に添加した。このように樹立した細胞株をＴＥ４−１と命名し、これを２０  ＣＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、２週間超、増殖させ続けた。ＴＥ４−１  Ｔ細胞は、ＦＡＣＳ解析に基づくと、９０％ＣＤ４+Ｔ細胞であった。ＴＥ４−１はＴｈ１型ＣＤ４+Ｔ細胞を含んでいた。というのは、それらがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−およびＴＮＦを分泌し、ＩＬ−１０またはＩＬ−４を分泌しなかったからである（データ示さず）。ＣＤ８+Ｔ細胞を数％減少させた後、ＣＤ４+Ｔ細胞の精製集団は依然その反応性を保持していた。ＴＥ４−１細胞株由来のＴ細胞クローンにもＥＳＯ  ｐ１１６−１３５ペプチドを認識することを示すものもあった（データ示さず）。
【０１３０】
ＴＥ４−１は、ＨＬＡ−ＤＲ４との関連で完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質およびＥＳＯ  ｐ１１６−１３５ペプチドでパルスしたＥＢＶ  Ｂ細胞は認識したが、最初の７４アミノ酸を含むトランケートＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質でパルスしたＥＢＶ  Ｂ細胞を認識しなかった（図４Ａ）。ＴＥ４−１細胞株もまたＮＹ−ＥＳＯ−１をコードするアデノウイルスに感染させたＤＲ４陽性樹状細胞とは特異的に反応性であったが、緑色蛍光タンパク質をコードするアデノウイルスに感染させたＤＲ４陽性樹状細胞とは特異的に反応性ではなかった（データ示さず）。
【０１３１】
ＴＥ４−１により認識されるＴ細胞がＨＬＡ−ＤＲ４により拘束されるかどうかを試験するため、２つの重複するペプチド（ＥＳＯ  ｐ１１６−１３５およびＥＳＯ  ｐ１１１−１３０）ならびにコントロールペプチド（ＥＳＯ  ｐ９１−１１０）を無血清培地中２９３ＩＭＤＲ１および２９３ＩＭＤＲ４細胞にパルスした。細胞を洗浄し続いてＴＥ４−１細胞と終夜インキュベートした。図４Ｂに示されるように、ペプチド１１６−１３５およびペプチド１１１−１３０の両方がＨＬＡ−ＤＲ４との関連でＴＥ４−１により認識された。興味深いことに、ペプチド１１６−１３５もまた、２９３ＩＭＤＲ１細胞にパルスしたとき、Ｔ細胞からのサイトカイン分泌を刺激することができた。コントロールＥＳＯ  ｐ９１−１１０ペプチドでパルスした２９３ＩＭＤＲ４では活性は検出されなかった（図４Ｂ）。ＥＳＯ−ｐ１１６−１３５パルス２９３ＩＭＤＲ４の認識は抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＨＢ５５）により完全に阻害されたが、コントロールおよび抗ＨＬＡクラスＩ抗体（ＨＢ９５）では阻害されなかった（図４Ｃ）。ｇｐ１００特異的ＣＤ８+Ｔ細胞株（ＣＴＬ−Ｃ３Ｇ１）およびＨＬＡ−ＤＲ１拘束ＣＤ４+Ｔ細胞株（Ｔ３−８０）を抗体ブロッキングの特異性コントロールとして使用した。
【０１３２】
実施例５
ＴＥ４−１による腫瘍細胞の認識
ペプチド特異的ＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞活性は推定腫瘍抗原に対してしばしば生じ得たが、多くの場合には、腫瘍反応性は、Ｔ細胞の低親和性または腫瘍細胞表面上で天然にプロセシングされるペプチドの提示の失敗のいずれかに起因して示され得なかった（３）。ＴＥ４−１が腫瘍細胞により天然にプロセシングされ提示されるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープを認識することができたかどうかを試験するために、いくつかのメラノーマ株を標的として使用した。各株におけるＮＹ−ＥＳＯ−１の発現はＲＴ−ＰＣＲにより決定し、ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の発現はＦＡＣＳ解析により決定した（データ示さず）。図５に示されるように、ＴＥ４−１はＮＹ−ＥＳＯ−１／ＨＬＡ−ＤＲ４陽性腫瘍（１３５９ｍｅｌおよびＦ０４９ｍｅｌ）を認識することができたが、腫瘍細胞株３９７ｍｅｌおよび６２４．３８ｍｅｌ（ＮＹ−ＥＳＯ−１+／ＨＬＡ−ＤＲ-）、ならびに５２６ｍｅｌ（ＮＹ−ＥＳＯ−１-／ＨＬＡ−ＤＲ４+）は認識することができなかった。興味深いことに、ＴＥ４−１もまたＦ０５０ｍｅｌ（ＤＲ１+／ＮＹ−ＥＳＯ−１+）を認識したが、ＤＲ１および低レベルのＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する１３００ｍｅｌは認識しなかった。１つの可能な説明は、ＣＤ４+Ｔ細胞が異なるＤＲ分子により提示される同一のペプチドを認識するかもしれないということである。Ｆ０４９ｍｅｌの認識は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の存在下特異的にブロックされ得るが、抗ＭＨＣクラスＩ抗体の存在下にはされない（データ示さず）。これらの研究は、ＴＥ４−１細胞株が腫瘍細胞表面で天然にプロセシングされたペプチドを認識することを示唆した。
【０１３３】
実施例６
ＴＥ４−１により認識されるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープの特徴付け
２つの反応性ペプチドが１５アミノ酸（ＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ）（配列番号１０）を共有するので、ペプチドの最小長を一連のＮ−およびＣ−末端トランケートペプチドを試験することによって決定した。ペプチドをＤＲ４+１０８８ＥＢＶ  Ｂ細胞にパルスし、ＴＥ４−１細胞を刺激するその能力を試験した。１２８位のバリン残基がＴ細胞認識に重要であることが見出された（図６Ａ）。１２３位のロイシン残基までのＮ末端欠失を有するペプチドは、Ｔ細胞認識に影響を与えなかったが、さらに欠失を有するペプチドはＴ細胞を刺激するその能力を一部失った。Ｐ１、Ｐ４、Ｐ６およびＰ７残基がＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド結合に寄与したので、１２３位のロイシン残基はＰ１アンカー残基であり得る。さらなる欠失が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するための重要な残基を決定するために必要である。
【０１３４】
欠失実験に基づいて本発明者らは、短い形のペプチドＥＳＯ  ｐ１１９−１３０を用いて、ＴＥ４−１により認識されるペプチドの結合親和性を決定した。異なるペプチド濃度で標的として１０８８ＥＢＶ  Ｂ細胞（ＨＬＡ−ＤＲ４+）にペプチドをパルスした。図５Ｂに示されるように、３３ｎＭ以下のＥＳＯ  ｐ１１９−１３０ペプチド濃度では全くまたはほとんどＴ細胞活性は観察されず、０．３３Ｍのペプチド濃度で高い活性が検出され、Ｔ細胞活性は３３Ｍのペプチド濃度でプラトーに達しなかった。コントロールペプチドは３３Ｍのペプチド濃度でさえＴＥ４−１により認識されなかった。
【０１３５】
実施例７
本発明者らは、Ｔ４−１  ＣＤ４＋Ｔ細胞株がＤＲ４およびおそらくＤＲ１にもまた関連してＥＳＯ  ｐ１１６−１３５を認識することを示した。ここで、ＴＥ４−１がＨＬＡ−ＤＲ１に関連してペプチドだけでなくタンパク質も認識できることが示される。認識は抗ＤＲ抗体によりブロックされる（図７Ａおよび７Ｂ）。この結果は、ＥＳＯ  ｐ１１６−１３５が雑多なペプチドであり得、ＤＲ４およびＤＲ１に結合できることを示す。従って、このペプチドワクチンの適用可能な集団は非常に大きい。
【０１３６】
実施例８
ＨＬＡ−ＤＰ研究の材料および方法
研究に使用した細胞株、組織培養試薬、および抗体
２９３ＣＩＩＴＡは、ＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーターをコードするレトロウイルスを有する２９３細胞の形質導入により作製した細胞株である（５３）（このレトロウイルスプラスミドはｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｏｕｔｈ  Ｆｌｏｒｉｄａ，  タンパ，  ＦＬのＤｒ．  Ｇｅｏｒｇｅ  Ｂｌａｎｃの好意である）。すべてのメラノーマ株およびＥＢＶＢ株を、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｆｌｕｉｄ，  Ｉｎｃ．，ゲーサーズバーグ，ＭＤ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ロックビル，ＭＤ）中で作製し維持した。リンパ球の培養培地は、０．０５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、５０ＣＵ／ｍｌ  ＩＬ−２＋１０％ヒト男性ＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（ウィンチェスター，ＶＡ）により供給された）を含むＲＰＭＩ１６４０であった。ブロッキングアッセイに使用した抗体は以下の供給源から得た：Ｗ６／３２（ＨＬＡクラスＩ）およびＬ２４３（ＨＬＡ  ＤＲ）はＬｏｆｔｓｔｒａｎｄ  Ｌａｂｓ  Ｌｔ．（ゲーサーズバーグ，ＭＤ）により精製されたハイブリドーマ上清であった；抗体クローンＩＶＡ１２（ＨＬＡクラスＩＩ）、Ｂ７／２１（ＨＬＡ  ＤＰ）、Ｇｅｎｏｘ３．５３およびＩＶＤ１２（両方ともＨＬＡ  ＤＱ）はＢｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（サンノゼ，ＣＡ）から購入した。
【０１３７】
プラスミドの構築
ｐＥＳＯプラスミドは、先の記載（４５）のようにＣＭＶプロモーターにより駆動されるＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡを含む発現ベクターであった。ｐＩｉ−ＥＳＯプラスミドを、全ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡのＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ消化ＰＣＲ産物を同じ酵素で消化したｐＴｉ８０ベクターに挿入することで構築した（５４）。ＮＹ−ＥＳＯ−１ｃＤＮＡを、インバリアント鎖（Ｉｉ）リーダー配列の最初の８０アミノ酸残基とそのＮ末端でインフレームに融合した。ＮＹ−ＥＳＯ−１の増幅に使用したＰＣＲプライマーは以下の通りであった：ＮｈｅＩ部位を含むフォワードプライマー５’ｃａｔｔｇｃｔａｇｃＡＴＧ  ＣＡＧ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＧＧＣ  Ａ３’（配列番号７３）およびＮｏｔＩ部位を含むリバースプライマー５’ａａｇｇｃｔａｃａｔｔＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＧＣＧ  ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＣＣＣ  ＴＧＡ  Ｇ３’（配列番号７４）。
【０１３８】
ペプチドおよびＣＤ４+Ｔ細胞の産生
本研究に使用した合成ペプチドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ベセズダ，ＭＤの外科のペプチド合成機（Ｇｉｌｓｏｎ  Ｃｏ．  Ｉｎｃ．，ワージントン，ＯＨ）において、固相法を用いて作製した。脱保護後、各ペプチドの純度を、質量分析（Ｂｉｏ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｉｎｃ．，ルイスヴィル，ＴＸ）により評価した。合成ペプチドを凍結乾燥し、２０ｍｇ／ｍｌでＤＭＳＯ中再構築し、そして示した濃度まで希釈した。
【０１３９】
インビトロ感作手順を先の記載（５０）のように行った。簡潔にいうと、およそ２．５×１０5ＰＢＭＣを２０μｇ／ｍｌのペプチド存在下９６ウェル平底プレートにプレートした。７日目と１４日目に、１×１０5非照射ＰＢＭＣを２０μｇ／ｍｌのペプチドでパルスし、２回洗浄し、各ウェルに加え、そして２０ＣＵ／ｍｌのＩＬ−２を８日目、１１日目、１５日目、１８日目に加えた。２１日目、細胞を回収し、標的細胞と終夜インキュベートし、その後、上清をサイトカイン放出アッセイのために採取した。
【０１４０】
特異的活性を有するウェル由来のＴ細胞をプールし、ＯＫＴ−３急速増殖法（ＯＫＴ−３  ｒａｐ１ｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて増殖させた（５５）。増殖後、ＣＤ８+Ｔ細胞を磁気ビーズ選択（Ｄｙｎａｌ  Ｉｎｃ，レイクサクセス，ＮＹ）により培養物から枯渇させ、引き続いて細胞株をＣＤ４+およびＣＤ８+発現に関してフローサイトメトリーにより解析した。
【０１４１】
サイトカイン放出アッセイ
タンパク質またはペプチドをパルスした標的を調製するために、ペプチドは終濃度２０μｇ／ｍｌで使用し、タンパク質は終濃度１０μｍｇ／ｍｌで使用した。細胞を無血清ＲＰＭＩ培地で洗浄し、４時間血清の不在下３７Ｃでパルスし、２回洗浄した。明記しない限り、およそ３×１０4標的細胞を同数のＴ細胞と少なくとも１６時間インキュベートし、その後、サイトカイン放出アッセイを行った。サイトカイン分泌はＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス，ＭＮ）を用いて測定した。
【０１４２】
ヒトＩＬ−４、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βレベルの定量をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得たサイトカインキットを使用して行い、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキットをＥｎｄｏｇｅｎ  Ｉｎｃ（ウォバーン，ＭＡ）から購入した。アッセイは製造業者の説明書に従って行った。
【０１４３】
ＨＬＡ  ＤＰ分子の分子タイピング
トータルＲＮＡをＥＢＶＢ細胞、ＣＤ４０リガンド刺激Ｂ細胞、ＣＤ４+Ｔ細胞、またはＭＨＣクラスＩＩ陽性メラノーマ株からタイピングのために得た。トータルＲＮＡはＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）を使用して精製し、１００ｎｇ〜１μｇのＲＮＡをオリゴｄＴプライム第一鎖ｃＤＮＡ合成に使用した。ｃＤＮＡ産物の１／１０を使用し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト，ＣＡ）のアドバンテージＰＣＲ系を用いてＰＣＲ増幅を行った。以下のプライマー対をＨＬＡ  ＤＰ−ＡおよびＤＰ  ＢＰＣＲに使用した：ＤＰＡフォワードプライマー５’ＡＴＧ  ＣＧＣ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  Ｔ  ３’（配列番号７５）、ＤＰＡリバースプライマー５’ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＣＣＧ  ＧＧＧ  ＧＡ３’（配列番号７６）、ＤＰＢフォワードプライマー５’ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＣＴ  Ｇ３’（配列番号７７）、およびＤＰＢリバースプライマー５’ＴＴＡ  ＴＧＣ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  Ｃ３’（配列番号７８）。引き続いて、ＰＣＲ産物を精製し、ＰＣＲを行うために使用した同一プライマーを用いてシークエンシングした。単一の配列がＰＣＲ産物から得られたので、多数の患者が非常に一般的なＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１遺伝子産物にホモ接合性であると思われた。ヘテロ接合性の患者の場合、ＰＣＲ産物をまずｐＣＲ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カールズバッド，ＣＡ）にクローニングし、ベクター配列に相補的な５’および３’プライマーを用いてシークエンシングした。最終配列をＩＭＧＴ−ＨＬＡデータベースでサーチしてＨＬＡ  ＤＰであることを確認した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ）。
【０１４４】
実施例９
ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＤ４+Ｔ細胞株ＴＥ４−２の作製
最初の研究をＨＬＡ  ＤＲ４対立遺伝子により拘束されたＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープを同定するために行った。予測される９マーのＤＲ４結合モチーフを含む８つの２０マーのペプチドを、ＮＹ−ＥＳＯ−１組換えタンパク質で免疫しインビトロで刺激したＨＬＡ−ＤＲ４−ＩＥトランスジェニックマウス由来のリンパ球による認識について試験した（５０）。３つの２０マーのペプチドがこれらの実験に陽性であることが分かった。これらのうちの一つはＤＲＢ１*０４０１とＤＲＢ１*０１０１との夾雑エピトープとして特徴付けされた（５０）。他の２つのペプチド（ＥＳＯ  ｐ１６１−１８０およびＥＳＯ  ｐ１４１−１６０）をさらに特徴付けするために、本発明者らはそれらを使用して、高力価の抗体を有するＤＲＢ１*０４０１患者（ＴＥ）由来のＰＢＭＣならびにＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞を刺激した（５０）。２４ミクロ培養ウェル全体を各ペプチドについて使用した。弱い刺激を３回した後、２４ウェルのうち１５ウェルがＥＳＯ  ｐ１６１−１８０で刺激されたＰＢＭＣ由来の顕著な増殖を示した。試験した１５ウェルの増殖が陽性であるウェルのうち９ウェルが、ペプチドパルスＤＲＢ１*０４０１発現１０８８ＥＢＶＢ細胞に対する特異的サイトカイン放出を示した（図８Ａ）。特異的ＣＤ４+Ｔ細胞もまた、ＥＳＯ  ｐ１４１−１６０で刺激したＰＢＭＣから作製したが、本研究では述べない（データ示さず）。
【０１４５】
次いで、ＥＳＯ  ｐ１６１−１８０ペプチド刺激に特異的に応答した培養物由来のＴ細胞を合わせ、先の記載（５５）のプロトコルを使用して増殖させた。ＣＤ８+Ｔ細胞の枯渇後、この培養物（ＴＥ４−２と命名する）は、ＦＡＣＳ解析により評価したところ、９５％を超えるＣＤ４+Ｔ細胞を含んだ（データ示さず）。
【０１４６】
ＴＥ４−２のサイトカイン分泌プロファイルの分析によりこのＴ細胞株がペプチドパルス標的に応答してＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを分泌しＴＧＦ−βを分泌しなかったことが示された（データ示さず）。従って、ＣＤ４+Ｔ細胞のＴｈ１およびＴｈ２型の両方がこの細胞株に存在するかもしれない。あるいは、Ｔｈ０表現型の細胞がこの培養物に存在するかもしれない。
【０１４７】
実施例１０
ＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１−０４０２に関連するＴＥ４−２によるＮＹ−ＥＳＯ−１の認識
ＥＳＯ  ｐ１６１−１８０、重複ペプチドであるＥＳＯ  ｐ１５６−１７５、および完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質それぞれでパルスしたＤＲ４発現標的細胞に対する応答について、ＴＥ４−２  Ｔ細胞を試験した。ＤＲ１を発現するがＤＲ４を発現しない５８６ＥＢＶＢ細胞もまたＡＰＣとして使用した。無関係なペプチド、ＥＳＯ  ｐ９１−１１０、および精製トランケート組換えタンパク質（ＥＳＯ１−７４；アミノ酸１〜７４を含む）（５０）をコントロールとして使用した。ＴＥ４−２  Ｔ細胞は、完全長ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質でパルスした場合ＤＲ４+１０８８ＥＢＶＢ株を特異的に認識したが、トランケートＥＳＯ１−７４タンパク質でパルスした場合認識しなかった（図８Ｂ）。ＥＳＯ  ｐ１６１−１８０およびｐ１５６−１７５の両方がＴＥ４−２により認識され、これは最小ペプチドエピトープがアミノ酸１６１と１７５との間にあることを示している。対照的に、最初予測したＤＲ４結合モチーフはアミノ酸１６７と１７５との間にある。予測しなかったことに、ＴＥ４−２  Ｔ細胞株は、５８６ＥＢＶＢ細胞にパルスしたペプチドおよびタンパク質（これらはＤＲＢ１*０１０１を発現するがＤＲＢ１*０４０１を発現しない）に同じくらい良好に応答するようであった。この結果は、類似のペプチドが複数のＭＨＣクラスＩＩ拘束エレメントによって提示されたか、またはＴＥ４−２  Ｔ細胞に対してペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ拘束エレメントを共有する１０８８および５８６ＥＢＶＢ細胞株によって提示されたかのいずれかであったことを示唆していた。これらの可能性を試験するために、公知のＨＬＡ  ＤＲおよびＤＱ型を含む多数の他のＥＢＶＢ細胞もまた、ＴＥ４−２  Ｔ細胞により利用される拘束エレメントを同定するためにＡＰＣとして使用した。試験したＥＢＶＢ細胞株のうち一つを除く全てがＴＥ４−２に対してＥＳＯ  ｐ１６１−１８０ペプチドを提示することができた（図８Ｃ）。
【０１４８】
次いで、ペプチドのＴ細胞認識を、異なるＭＨＣ拘束エレメントによって拘束されたペプチドの認識をブロックする特異的抗体の存在下で行った。図９Ａ〜９Ｃの結果は、すべてのＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子（ＩＶＡ１２）をブロックする抗体および全てのＨＬＡ  ＤＰ対立遺伝子（Ｂ４／２１）をブロックする特異性を有する抗体が、ＴＥ４−２  Ｔ細胞がＥＳＯ  ｐ１６１−１８０を認識する能力を無効としたことを示した。ＨＬＡ−Ａ、ＢおよびＣ対立遺伝子（Ｗ６／３２）に対する抗体ならびにＭＨＣクラスＩＩＤＲ（Ｌ２４３）およびＤＱ（Ｇｅｎｏｘ３．５３およびＩＶＤ１２のミックス）対立遺伝子に対する抗体は、ＴＥ４−２  Ｔ細胞の刺激に対してほとんどまたは全く影響しない。従って、これらの結果は、ＴＥ４−２  Ｔ細胞が本研究で使用したＥＢＶＢ細胞株により共有される非常に一般的なＨＬＡ  ＤＰ対立遺伝子に関してＥＳＯ  ｐ１６１−１８０を認識したことを示唆していた。
【０１４９】
次いで、ＨＬＡ−ＤＰ対立遺伝子を分子的にクローニングし、図８Ｃで使用した細胞株に対してシークエンシングした。これらの研究は、１０８８および５８６ＥＢＶＢ株がともに、ＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１遺伝子産物、患者ＴＥが発現したＤＰＢ１*０４０１ならびに未知のＤＰ対立遺伝子にホモ接合性であったことを示していた（表２）。Ｌ０２３ＥＢＶＢ細胞株（これはＴＥ４−２に対してＥＳＯ  ｐ１６１−１８０ペプチを提示しなかった）はＨＬＡ  ＤＰ対立遺伝子（これはＤＰＢ１*０４０１および０４０２とは異なる）にホモ接合性として型を決められた。
【０１５０】
１３６３、１０８８、８３６およびＬ００７  ＥＢＶＢ細胞株はすべてＤＰＢ１*０４０１を発現したが、Ｌ０４１ＥＢＶＢ細胞株はＤＰＢ１*０４０２（８４位と８５位の２つのアミノ酸残基がＤＰＢ１*０４０１分子と異なる）を発現した。従って、ＤＰＢ１*０４０１とＤＰＢ１*０４０２の両方がＴＥ４−２  ＣＤ４+Ｔ細胞に対するＥＳＯ  ｐ１６１−１８０エピトープを提示することができるようであった。
【０１５１】
【表２】
0005588363.tif 000004
【０１５２】
特異的ＤＰＡ鎖がＴＥ４−２  Ｔ細胞に対するエピトープを提示するのに必要であるかどうかを決定するために、ＤＰＢ１*０４０１−０４０２を発現するＥＢＶＢ細胞中のＨＬＡ  ＤＰＡ分子もまた解析した。図８Ｃで使用したＤＰＢ１*０４０１−０４０２を発現するＥＢＶＢ細胞は１タイプ超のＨＬＡ  ＤＰＡ分子（データ示さず）を持っていたが、すべてがＴＥ４−２  Ｔ細胞にＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープを同じように良好に提示することが可能であった。
【０１５３】
実施例１１
腫瘍細胞上の天然にプロセシングされたＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープのＴＥ４−２による認識
ＴＥ４−２により認識されるＴ細胞エピトープが腫瘍細胞の表面で天然にプロセシングされ提示されるかどうかを調べるために、ＮＹ−ＥＳＯ−１およびＤＰＢ１*０４０１を発現した腫瘍株を標的として用いた。ＴＥ４−２  Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１とＤＰＢ１*０４０１の両方を発現する複数の腫瘍株を認識したが、ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現するがＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１および０４０２対立遺伝子のいずれも発現しない腫瘍株（１３６２ｍｅｌ）は認識しなかった（図１０Ａ）。さらに、ＴＥ４−２  Ｔ細胞はＤＰＢ１*０４０１陰性およびＮＹ−ＥＳＯ−１陰性の腫瘍（５２６ｍｅｌ）を認識しなかった。ＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１を発現するがＮＹ−ＥＳＯ−１を発現しない１つのメラノーマ株（１１０２ｍｅｌ）はまた、ＴＥ４−２  Ｔ細胞により認識された。ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果は、１１０２ｍｅｌがＬＡＧＥ−１遺伝子（ＮＹ  ＥＳＯ−１に対しておよそ９０％のアミノ酸類似性を有する癌／精巣抗原）を発現したことを示していた（５７）。ＥＳＯ  ｐ１６１−１７５と同一の配列はまた、ＬＡＧＥ−１タンパク質にも存在した。これらの結果は、ＴＥ４−２により認識されるエピトープが腫瘍細胞表面に存在し、ＮＹ−ＥＳＯ−１と、密接に関連した腫瘍抗原ＬＡＧＥ−１との間で共有されていることを示唆した。
【０１５４】
ＮＹ−ＥＳＯ−１発現メラノーマ株に加えて、ＴＥ４−２  Ｔ細胞もまた、ＮＹ−ＥＳＯ−１トランスフェクト２９３ＣＩＩＴＡ細胞の認識について試験した。２９３細胞にＭＨＣクラスＩＩトランスアクチベーター遺伝子（ＣＩＩＴＡ）を発現するレトロウイルスを用いて形質導入し、２９３ＣＩＩＴＡ細胞株を作製した（５３）。ＲＴ−ＰＣＲにより決定されたように、２９３ＣＩＩＴＡ細胞はホモ接合性のＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１分子を発現したが、親の２９３細胞は発現しなかった（データ示さず）。ＴＥ４−２  Ｔ細胞は、ＮＹ−ＥＳＯ−１トランスフェクト２９３ＣＩＩＴＡ細胞と特異的に反応した（図１０Ｂ）。対照的に、ＴＥ４−２  Ｔ細胞はｐＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした２９３ＣＩＩＴＡ細胞またはＩｉ−ＮＹ−ＥＳＯ−１をトランスフェクトした親の２９３細胞のいずれも認識しなかった。Ｉｉターゲッテイング配列はＮＹ−ＥＳＯ−１のプロセシングおよび認識に必要ではなかったが、Ｔ細胞認識をわずかに増強した（図１０Ｂ）。これらの結果はＴＥ４−２  Ｔ細胞が天然にプロセシングされたＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープを認識したことをさらに示していた。
【０１５５】
実施例１２
ＨＬＡ−Ａ２拘束エピトープと重複するＨＬＡ  ＤＰ４拘束エピトープ
２つの重複するペプチド（ＥＳＯ  ｐ１６１−１８０およびｐ１５６−１７５）でパルスした標的細胞は、ＴＥ４−２  Ｔ細胞により同じように良好に認識された。これは、最小Ｔ細胞エピトープがアミノ酸１６１から１７５までの範囲の領域に位置していることを示していた（図８Ｂ）。
【０１５６】
アミノ酸１６１と１７５との間にあるアンカー残基を同定するために、重複１３マーペプチドの１シリーズを１０８８ＥＢＶＢ細胞をパルスするのに使用し、ＴＥ４−２  Ｔ細胞を刺激するその能力を試験した。図１１Ａに示すように、１６１位のＷ残基を除去したときに活性の部分的損失を観察し、１６２位のＩ残基を除去したときに活性の完全な損失を観察した。１６７位のＣ末端Ｌ残基の欠失もまた、ＴＥ４−２  Ｔ細胞によるペプチド認識を取り除いた。さらに、１６９位の残基Ｖも、この残基の欠失がペプチド刺激活性を２倍減少させたので、重要であると思われた。これらの結果は、１６１位のＷ残基がＰ１アンカーであり得、１６７位のＬ残基がＰ７アンカーの代表であることを示した。１６９位のＶ残基もまた、ペプチドエピトープの刺激性能に寄与しているようであり、それがＰ９アンカー残基を示し得ることを示している。これらの推定アンカー残基は先に記載されたコンセンサスＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１結合モチーフ（５７）に非常に一致している。
【０１５７】
３つすべてのアンカー残基を含むＥＳＯ  ｐ１５７−１７０ペプチドを力価測定実験に使用して、ペプチドに対する最小刺激濃度を決定した。その結果は、ＥＳＯ  ｐ１５７−１７０が、３ｎＭと３３ｎＭとの間の最小濃度でＴＥ４−２  Ｔ細胞からの著しいサイトカイン放出を刺激することができることを示していた（図１１Ｂ）。これらの結果は、ＴＥ４−２  Ｔ細胞が高い親和性でＥＳＯ  ｐ１５７−１７０を認識することを示していた。この見かけの親和性は非変異ペプチド（例えば、ｇｐ１００（５８）、チロシナーゼ（５９）、およびＣＤＣ−２７（５４）由来のもの）由来の最もよく知られた公知のＭＨＣクラスＩＩ結合エピトープよりも優れている。同じ領域にわたる他のペプチド（例えば、ＥＳＯ  ｐ１６１−１８０およびｐ１５６−１７５）もまた、ＴＥ４−２  Ｔ細胞に関して同様な最小刺激濃度を有した（データ示さず）。
【０１５８】
興味深いことに、先に同定されたＨＬＡ−Ａ２エピトープ、ＥＳＯ  ｐ１５７−１６７（４７）は、ＤＰＢ１*０４０１−０４０２エピトープ、ＥＳＯ  ｐ１５７−１７０内に含まれた。ＨＬＡ−ＤＰエピトープがＨＬＡ−Ａ２により提示されＣＤ８+Ｔ細胞と交差反応し得るかどうかを判断するために、ＥＳＯ  ｐ１５７−１７０をＴＥ８−１による認識について試験した（ＣＤ８+Ｔ細胞株はＨＬＡ−Ａ２エピトープＥＳＯ  ｐ１５７−１６７を特異的に認識する）。Ｌ０２３  ＥＢＶＢ細胞（これは、ＨＬＡ−Ａ２を発現するがＤＰＢ１*０４０１−０４０２対立遺伝子を発現しない）にパルスした時、ＥＳＯ  ｐ１５７−１７０はＴＥ８−１  Ｔ細胞からの顕著なサイトカイン放出を刺激することができた（図１１Ｃ）。この実験は、ＥＳＯ  ｐ１５７−１７０エピトープがＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ２つの特異性を持っており、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質を認識するＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞両方を刺激することができることを示していた。従って、ＥＳＯ  ｐ１５７−１７０は、腫瘍細胞を特異的に認識するＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞両方を誘発することを目的とする癌ワクチンの興味深い候補物であり得た。
【０１５９】
実施例１３
ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体産生とＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１−０４０２との関連性
ＨＬＡ  ＤＰＢ１*０４０１−０４０２は、白人の大部分（別の人種を含めた集団調査では４３％〜７０％）に存在する主要なＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子である（５２）。先の研究（４８、５０）は、正常ドナーおよびＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を有さない癌患者がＮＹ−ＥＳＯ−１に対する抗体を生じないことを示している。対照的に、ＮＹ  ＥＳＯ−１発現腫瘍を有する患者の５０％は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ａｂを生じた。血清サンプルを試験した８８人のメラノーマ患者のパネルのうち、１１人の患者が高力価のＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有することが見出された（５０）。多くの患者がＤＲ４対立遺伝子を全く発現しなかったことから、先に同定したＤＲ４拘束ＣＤ４+Ｔ細胞ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ａｂの産生を説明できなかった（表２）。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＤＰ４拘束ＣＤ４+Ｔ細胞がこれらのメラノーマ患者におけるＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ａｂの産生と関連しているかどうかをさらに調査するため、本発明者らはまずこれらのＨＬＡ  ＤＰサブタイプを解析した。ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有する１１人の患者のうち１０人がＤＰＢ１*０４０１および／または０４０２を発現したが、主要なＤＱまたはＤＲ拘束エレメントはこの患者のグループでは同定できなかった（表２）。公知のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を有しているが検出可能な抗体を有さないこのパネルの３人の患者はＤＰＢ１*０４０１−０４０２対立遺伝子を発現しなかった。残りの７４人の患者由来の腫瘍細胞株はこれらの患者由来のＮＹ  ＥＳＯ−１発現を評価するためには入手できなかったので、そのＨＬＡ  ＤＰ型を同定するためのさらなる研究は行わなかった。０．０１１のｐ値をフィッシャーの直接確率検定により得、これは抗体応答とＨＬＡ−ＤＰＢ１*０４０１−０４０２発現との関係の重要さを示していた。ＮＹ−ＥＳＯ−１は２５〜３０％の腫瘍細胞株で発現され、ＤＰ４は集団の４３〜７０％で発現されるので、ＮＹ−ＥＳＯ−１とＤＰ４の両方を発現し、かつ抗体応答を生じる可能性のある患者の割合は、１０〜２１％の範囲である。この仮説的予想はＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有する患者の観察された１０〜１３％の頻度と非常に近い。
【０１６０】
ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体応答とＤＰＢ１*０４０１−０４０２発現との関連に関する更なる証拠を手に入れるため、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有する１１人の患者のうち６人からのＰＢＭＣを、ＥＳＯ  ｐ１６１−１８０ペプチドによるインビトロ刺激に用いた。インビトロ感作もまた検出可能なＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有さない２人のＤＰＢＩ*０４０１+患者からのＰＢＭＣを用いて行った。２または３回のインビトロ刺激の後、ＥＳＯ  ｐ１６１−１８０ペプチドでパルスした２９３ＣＩＩＴＡ細胞に対するその応答について、Ｔ細胞を試験した。ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有する６人の患者のうち５人（ＴＥを含む）由来のＴ細胞は、２９３ＣＩＩＴＡ細胞により提示されるＥＳＯ  ｐ１６１−１８０エピトープ（ＤＰ４+およびＨＬＡ−Ａ２-）の特異的認識を示した（表３）。患者ＣＴおよびＢＬ由来の複数のウェルは、ペプチドをパルスした標的と反応するようであった。これらの２人の患者由来の感作したＰＢＭＣもまた、ＣＤ４+Ｔ細胞のさらなる濃縮なしにＤＰＢＩ*０４０１+およびＮＹ−ＥＳＯ−ｌ+メラノーマ株の顕著な腫瘍認識を示した（データ示さず）。対照的に、ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性Ｔ細胞は、３回の刺激後検出可能なＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を有さない２人の患者（ＷＣおよびＥＷ）由来のＰＢＭＣを用いて作製されなかった。これらの結果は、抗ＮＹ−ＥＳＯ−１抗体を生じた患者もまた、比較的高い前駆体頻度のＤＰＢ１*０４０１拘束エピトープと反応性のＴ細胞を含んでいたことを示唆していた。これらのＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４+Ｔ細胞はＮＹ−ＥＳＯ−１癌／精巣抗原に対する抗体応答の発生に寄与していたかもしれない。
【０１６１】
【表３】
0005588363.tif 000005
【０１６２】
実施例１４
野生型ＨＬＡ  ＤＰ４ペプチドの１つに改変を施した。この改変は、ペプチドをより可溶性にし９０％超の均質性（これはペプチド臨床試験に関してＦＤＡにより求められている）まで精製し得るようにするためのものであった。野生型および改変ペプチドは以下の通りである：
【０１６３】
野生型ＥＳＯｐ１５７−１７０；ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号５４）；
野生型ＥＳＯｐ１５７−１６７；ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ  （配列番号７９）；ＥＳＯｐ１５６Ｒ−１６９；ＲＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶ（配列番号６３）；および
ＥＳＯｐ１５７−１７０Ｒ；ＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＲ（配列番号６４）。
【０１６４】
これらの改変ペプチドがＴ細胞により同じように良好に認識されるかどうかを試験するために実験を行った。ＥＳＯ  ｐ１５７−１７０がＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−ＤＰ４  ２つの結合特異性を示したので、ＴＥ４−２  ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴＥ８−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞それぞれによるＤＰ４（図１２Ａ）およびＡ２（図１２Ｂ）両方の拘束様式における認識を測定した。
【０１６５】
結果は、これらの改変ペプチドがＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞により野生型として同じように良好に認識されたことを示していた。
【０１６６】
実施例１５
ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープ特異的ＣＤ４+Ｔリンパ球免疫療法
メラノーマ抗原に対して前感作したＴリンパ球は、メラノーマに罹患した哺乳動物を治療処置するのに有効であり得る。Ｔリンパ球を末梢血またはメラノーマの腫瘍懸濁液から単離し、インビトロで培養する（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．ら、１９８８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：２１８３−２１９１）。
【０１６７】
Ｔリンパ球をエピトープＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧ（配列番号１９）またはエピトープＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号８０）に濃度１μｇ／ｍｌのみまたはＩＬ−２の存在下で暴露し、前感作し、そして培養液中で増殖させる。エピトープに暴露したＣＤ４+Ｔリンパ球を１哺乳動物あたり約１０9〜１０12リンパ球で哺乳動物に投与する。このリンパ球を、静脈内、腹腔内、または病巣内のいずれかで投与する。この処置は、サイトカイン、メラノーマ病変の外科的切除および化学療法剤等の他の治療処置と同時に投与してもよい。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ８+Ｔリンパ球はＣＤ４+Ｔリンパ球と同時に投与してもよい。
【０１６８】
実施例１６
転移性メラノーマを有する患者の処置
このプロトコルでは、進行メラノーマの患者を抗原性癌エピトープで免疫する。
【０１６９】
試験にふさわしい患者は、標準的な有効治療が失敗した測定可能または評価可能な転移性メラノーマの徴候を持っていなければならない。患者は、腫瘍細胞ＲＮＡのＰＣＲまたはノザンブロット解析により立証されるようなＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を発現する腫瘍を有さなければならない。
【０１７０】
患者に、体重１ｋｇあたり１ｎｇ、１μｇ、１ｍｇまたは５００ｍｇいずれかのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを、０日、７日、１４日に単独で、またはＩＬ２および／または免疫刺激分子とともに、静脈内に投与する。患者を、毒性、免疫効果および治療有効性について評価する。患者に、ＮＹ−ＥＳＯ−１クラスＩ拘束Ｔ細胞エピトープをさらに投与してもよい。
【０１７１】
処置患者から採取したリンパ球を、ＮＹ−ＥＳＯ−１癌抗原またはＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープに対する特異的応答について試験する。
【０１７２】
完全な応答を、少なくとも４週間続く疾患の全臨床的徴候の消失と定義する。部分的応答は、新たな病変またはいずれの病変における増加の出現なしに、少なくとも４週間すべての測定可能な病変の垂直直径の積の合計における５０％以上の減少である。軽微な応答は、新たな病変の出現およびいずれの病変における増加なしに、すべての測定可能な病変の垂直直径の積の合計における２５〜４９％の減少として定義する。部分応答未満のいずれの患者をも非応答者と考える。新たな病変の出現あるいは部分的または完全な応答後の先の病変の垂直直径の積における２５％超の増加を再発と考える。
【０１７３】
考察
ＮＹ−ＥＳＯ−１は、体液性および細胞性両方の免疫応答を引き起こすので、重要な免疫標的である（１９〜２１）。その発現パターンはＭＡＧＥ遺伝子ファミリーの抗原と類似しているが、ＮＹ−ＥＳＯ−１はＭＡＧＥファミリーのいずれのものよりも乳癌、前立腺癌、肺癌で頻繁に発現される（１９、２０、２３）。さらに興味深いことに、非常に低い割合の患者がＭＡＧＥ抗原または分化抗原（例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２）に対する高力価の抗体を生じた（データ示さず、（２２））にもかかわらず、高力価のＮＹ−ＥＳＯ−１反応性抗体は、癌の患者においてしばしば検出された（図２Ｂおよび２Ｃ）。これらの研究は、ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性ＣＤ４+Ｔ細胞が抗体産生およびＣＴＬ増殖に関わっているかもしれないことを示唆する。本研究で、本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲ４トランスジェニックマウスおよび候補ペプチドを用いたヒトＰＢＭＣのインビトロ刺激を使用して、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＨＬＡ−ＤＲ４拘束Ｔ細胞エピトープを同定した。我々の知る限りでは、これは、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来Ｔ細胞エピトープがＣＤ４+Ｔ細胞に対してＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されることを示した最初の証明である。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的抗体およびＣＴＬは異なるＨＬＡ遺伝子型を持つ患者において検出されたので、ＨＬＡ−ＤＲ４以外のＨＬＡクラスＩＩ分子により提示される他のＣＤ４+Ｔ細胞エピトープは本発明において同定された。
【０１７４】
最近、２つのグループが、公知のＭＨＣクラスＩ拘束腫瘍抗原であるＭＡＧＥ−３からのＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープの同定を報告した。精製ＭＡＧＥ−３タンパク質でパルスされたＤＣで刺激されたＰＢＭＣから作製したＣＤ４+Ｔ細胞クローンは、ＨＬＡ−ＤＲ１３適合ＥＢＶ  Ｂ細胞にパルスされたペプチドまたはタンパク質を認識したが、ＭＡＧＥ−３+／ＤＲ１３+腫瘍細胞にパルスされたものを認識しなかった（１４）。しかし、別の研究では、コンピューターを使ったアルゴリズムによって予測されるペプチドで刺激したＰＭＢＣから作製したＣＤ４+Ｔ細胞は、ＥＢＶ  Ｂ細胞およびＭＡＧＥ−３+／ＤＲ１１+腫瘍細胞両方にパルスしたペプチドを認識することができた（１５）。ＮＹ−ＥＳＯ−１の場合、本発明者らはここに、ＣＤ４+Ｔ細胞がＤＲ４マッチＥＢＶ  Ｂ細胞にパルスしたＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質またはペプチドおよびＮＹ−ＥＳＯ−１を発現する腫瘍細胞を認識できることを示している（図４および５）。ＨＬＡ−ＤＲトランスジェニックマウスの利用は、免疫したトランスジェニックマウスが特異的反応性Ｔ細胞の高い前駆体頻度をおそらく有しているので、推定ペプチドの同定において利点を有し得る。候補ペプチドを一旦同定すれば、ＣＤ４+Ｔ細胞を合成候補ペプチドで刺激したＰＢＭＣから作製できる。従って、全タンパク質で免疫し、コンピューターを使用したアルゴリズムにより予測したペプチドで刺激したトランスジェニックマウスの組み合わせ使用は、多数のペプチドおよび複数回のインビトロ刺激でヒトＰＢＭＣを刺激する必要性を回避し得る。さらに、免疫したトランスジェニックマウスにより同定される候補ペプチドは、天然にプロセシングされ細胞表面上に提示されるペプチドであるようである。これは、ペプチド特異的ＣＤ４+Ｔ細胞が腫瘍細胞も同様に認識することができる可能性を上昇させ得る。最後に、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する高力価の抗体および高前駆体頻度のＣＴＬを生じた患者（ＴＥ）由来のＰＢＭＣの使用は、抗体産生およびＣＴＬの両方がＣＤ４+Ｔ細胞の助けを必要とするので、腫瘍特異的ＣＤ４+Ｔ細胞を作製するのをより容易にし得る。このアプローチは、自己免疫疾患に関与する公知の自己抗原から多数のＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープを同定するのに使用されている（２８）。従って、本研究で使用するストラテジーは多くの他の公知のＭＨＣクラスＩ拘束腫瘍抗原に適用可能であり得つつ、直接遺伝子クローニングアプローチ等他のストラテジーが未知のＭＨＣクラスＩＩ拘束腫瘍抗原の同定を容易にし得る。
【０１７５】
ｇｐ１００等組織特異的分化抗原由来のペプチドを使用する臨床試験は、メラノーマの患者の処置において治療有効性のいくらかの証拠を示した（４）。顕著な毒性の副作用は改変ｇｐ１００ペプチドで処置した患者において観察されていないが、白斑または色素脱失は、治療に反応を示した患者においてしばしば見られた（２９）。このことは、自己抗原による免疫によって誘導された抗腫瘍免疫が自己免疫を生じ得ることを示唆している。ＴＲＰ−１を免疫標的として使用した動物研究では、類似の結果（抗腫瘍免疫および毛の色素脱失）も得られた（３０〜３２）。興味深いことに、ｇｐ７５／ＴＲＰ−１に媒介される抗腫瘍免疫および自己免疫はＣＤ４+Ｔ細胞および抗体を伴っているようであった（３３）。ｍＴＲＰ−２（３５）ではなくｈＴＲＰ−２（３４）でのマウスの免疫は、自己抗原ならびにＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞の両方の関与を必要とする抗腫瘍免疫に対する耐性を壊した（３３）。これらの研究は、抗腫瘍免疫が抗体またはＣＤ８+Ｔ細胞のいずれかにより媒介され得るが、両方ともＣＤ４+Ｔ細胞の決定的な助けを必要とし得ることを示唆していた（２４、３３）。
【０１７６】
本研究で同定したＭＨＣクラスＩＩ拘束ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対するＣＴＬおよび抗体が癌の患者において検出されたので、臨床用途に有用であり得る。ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ拘束ペプチドまたは精製ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質での免疫は、ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＣＤ４+、ＣＤ８+Ｔ細胞および抗体を誘導し得る。あるいは、患者は、クラスＩおよびＩＩの両ペプチドをロードするかまたはＮＹ−ＥＳＯ−１遺伝子をコードする組換えウイルスを感染させた樹状細胞で免疫され得る。精巣生殖細胞はＭＨＣクラスＩおよびＩＩの分子を発現しないので（３６）、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する免疫応答は腫瘍細胞に特異的であるはずであり、従って、ほとんどまたは全く自己免疫応答を生じない。ＭＡＧＥ−３のＭＨＣクラスＩ拘束ペプチドまたは樹状細胞にパルスしたペプチドを使用した同様の研究は、抗腫瘍免疫（ＣＴＬ応答）および緩慢な腫瘍の退行が示されたにもかかわらず、色素脱失／白斑または他の顕著な副作用が観察されなかったことを示した（６、７）。抗腫瘍免疫は、腫瘍特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の助けを提供することによって向上され得る。
【０１７７】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【０１７８】
本発明のこれらの及び他の目的、性質及び付随の利点の多くは、以上の詳細な説明を読む際に、添付された図面と関連づけて考えると、より良く理解されよう。
【図１−Ａ】
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【図１−Ｂ】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図２−Ｃ】
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【図３】
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【図４−Ａ】
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【図４−Ｂ】
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【図４−Ｃ】
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【図４−Ｄ】
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【図４−Ｅ】
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【図５】
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【図６−Ａ】
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【図６−Ｂ】
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【図７−Ａ】
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【図７−Ｂ】
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【図８−Ａ】
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【図８−Ｂ】
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【図８−Ｃ】
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【図９−Ａ】
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【図９−Ｂ】
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【図９−Ｃ】
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【図１０−Ａ】
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【図１０−Ｂ】
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【図１１−Ａ】
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【図１１−Ｂ】
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【図１１−Ｃ】
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【図１２−Ａ】
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【図１２−Ｂ】
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【配列表】
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