(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る化合物のスクリーニング方法：
（１）肝疾患に伴う浮腫を患っている非ヒト哺乳動物に候補化合物を投与すること、
（２）該候補化合物を投与した非ヒト哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率をＨＰＬＣ又は質量分析を用いて定量すること、
（３）該非ヒト哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を、候補化合物を投与していない対照哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率と比較すること、及び
（４）比較結果に基づき、酸化型アルブミン比率を低下させた化合物を肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る化合物として選択すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝疾患に伴う浮腫の判定方法、肝疾患に伴う浮腫の判定キット及び肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る化合物のスクリーニング方法、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
腹水等の浮腫症状は肝硬変や肝細胞癌、細菌性腹膜炎、うっ血性心疾患、ネフローゼ症候群、腹腔内諸臓器の炎症性病変、腹膜炎によって出現する。特に肝硬変での浮腫の出現は非代償期に入った徴候であり、予後を左右する極めて重要な症状としても重視されている。【０００３】
従来、浮腫に関連する臨床検査上の検査項目として血清アルブミン量が用いられている（非特許文献１）。血清アルブミン値がおよそ２．５〜２．０ｇ/ｄｌ以下に低下するとコロイド浸透圧は低下し、腹水が発生すると考えられ、これを指標にして治療効果のモニタリングが行われていた。また、血清と腹水のアルブミン濃度差が１．１ｇ/ｄｌを上回れば漏出液、それ以下であれば滲出液との鑑別も腹水治療方法の選択に用いられていた。【０００４】
しかし、肝硬変患者の浮腫を適切に治療するためには、血清アルブミン値の測定のみならず、合併症の有無、血清電解質の変動そして腎機能や各Ｎａ貯留又は排泄因子の変動を把握するなど多岐にわたる臨床検査情報を把握して適切な治療を選択する必要がある。特に腹水が認められる肝硬変患者の５〜１０％にあたる難治性腹水については、肝内門脈大循環短絡術の施行も検討しなければならず、また治療予後の予測が重要である。そのため、肝疾患患者における浮腫の程度を的確に反映し、定量性にも優れた血清中のマーカーを特定することが切望されていた。【０００５】
アルブミンは生体内で最も多く存在するタンパク質である。アルブミンの生理機能としては、膠質浸透圧の維持、物質の輸送、アミノ酸の供給、pH緩衝作用、酸化還元緩衝作用等が知られている。近年、翻訳後修飾によるミクロヘテロジェニティーがアルブミンに存在することが明らかとなり、アルブミンの量ではなく質の違いと機能の違いとの関連性が議論されるようになってきた。【０００６】
血清アルブミンは、N末端から34番目に存在するシステイン残基のSH基が遊離の状態の還元型アルブミンと、血中のシステインやグルタチオンなどとジスルフィド（S-S）結合した状態の酸化型アルブミンとの混合物として存在している。正常ヒト血清では還元型が約75%、酸化型が約25%の割合で存在するが、肝硬変患者（非特許文献２）、慢性腎不全患者、糖尿病患者や麻酔又は手術時の患者では酸化型アルブミンの割合が増加していると報告されている（非特許文献３）。【０００７】
血液透析によって慢性腎不全患者の酸化型アルブミンが低下して還元型アルブミンが増加するとの報告（非特許文献４）がある。また、肝硬変患者の低アルブミン血症の改善を効能効果とするBCAA顆粒製剤がアルブミンの量のみならず、酸化型/還元型アルブミン比をも改善することが報告されたことから（特許文献１）、アルブミンの質の改善が病態にどのような作用を及ぼすかが注目されている。しかし、酸化型アルブミンレベルと肝疾患における浮腫（体水貯留）との関連については全く知られていない。【０００８】
質量分析又は液体クロマトグラフィーを用いて試料液体中の酸化型アルブミンと還元型アルブミンの存在量及びそれらの存在比率を精度よく安定に分析する方法が知られている（特許文献２）。
【特許文献１】ＷＯ２００７／０１５５８５
【特許文献２】ＷＯ２００７／０１３６７９
【非特許文献１】福井博  治療学  vol.41, No.4, p.45-48, 2007
【非特許文献２】Watanabe, A. Nutrition 20:351, 2004
【非特許文献３】恵良聖一  臨床検査  48:501-511, 2004
【非特許文献４】Sogami,M. Int.J.Peptide Protein Res 25:398, 1985
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、肝疾患に伴う浮腫の程度を的確に反映し、定量性にも優れた血清中のマーカーを提供することを目的とする。また、本発明は肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療に有用なアルブミン製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、肝硬変患者の酸化型/還元型アルブミン比を検討する過程で、同程度の低アルブミン血症であるにもかかわらず、腹水の顕著な患者とそうでない患者がいることに注目した。そして、肝硬変患者の血清中酸化型/還元型アルブミン比と浮腫（水分貯留）を評価したところ、酸化型/還元型アルブミン比はアルブミン量と比較して、浮腫との間に高い相関を示した。これらの結果から、酸化型アルブミン値は肝硬変患者の腹水の判定に有効なマーカーであり、治療効果のモニタリングに適した最適の治療方法採用の指標として臨床上意義の大きなマーカーであること、肝硬変に伴う浮腫を患っている患者に還元型アルブミンを投与し酸化型アルブミン比率を積極的に減少させると、酸化型アルブミンを含有する通常のアルブミンを投与した場合よりも効果的に浮腫を改善し得ることを見出し、本発明を完成させた。【００１１】
即ち、本発明は以下のものを提供する：
［１］被験者から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を定量することを含む、肝疾患に伴う浮腫の判定方法。
［２］酸化型アルブミン比率と浮腫の程度との間の正の相関に基づき浮腫の程度の判定が行われる、［１］記載の方法。
［３］生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を定量するための試薬を含む、肝疾患に伴う浮腫の判定キット。
［４］以下の工程を含む、肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る化合物のスクリーニング方法：
（１）肝疾患に伴う浮腫を患っている非ヒト哺乳動物に候補化合物を投与すること、
（２）該候補化合物を投与した非ヒト哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を定量すること、
（３）該非ヒト哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を、候補化合物を投与していない対照哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率と比較すること、及び
（４）比較結果に基づき、酸化型アルブミン比率を低下させた化合物を肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る化合物として選択すること。
［５］酸化型アルブミン比率が６０％未満のアルブミンを含有する、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療用アルブミン製剤。
［６］酸化型アルブミン比率が２５％未満のアルブミンを含有する、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療用アルブミン製剤。
［７］酸化型アルブミン比率が実質的に０％である、［６］記載のアルブミン製剤。
［８］更に酸化防止剤を含む、［５］〜［７］のいずれか１つに記載のアルブミン製剤。
［９］以下の工程を含む、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療用アルブミン製剤の製造方法：
（１）酸化型アルブミン比率が６０％未満のアルブミンを提供すること、及び
（２）（１）のアルブミンを水性溶媒に溶解することにより、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療用アルブミン製剤を得ること。
［１０］以下の工程を含む、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療用アルブミン製剤の製造方法：
（１）酸化型アルブミン比率が２５％未満のアルブミンを提供すること、及び
（２）（１）のアルブミンを水性溶媒に溶解することにより、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療用アルブミン製剤を得ること。
［１１］工程（１）がアルブミンを還元化処理に付すことにより行われる、［９］又は［１０］記載の製造方法。
［１２］還元化処理においてシステインが還元化剤として用いられる、［１１］記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、対象から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を測定することにより、肝疾患に伴う浮腫の程度の判定、例えば治療モニタリング、予後予測等を迅速且つ正確に行うことができ、更には肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る化合物のスクリーニングを行うことができる。また、本発明のアルブミン製剤を用いると、患者における酸化型アルブミン比率を積極的に低下させ、従来のアルブミン製剤を用いた場合よりもより効果的に肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】慢性肝疾患患者における血清中の酸化型アルブミン比率（％）（横軸, O-Alb）と浮腫（縦軸, Edema;ＥＣＷ／ＴＢＷ）との相関を示す。回帰直線：ECW/TBW=0.317+0.001* O-Alb、R2=0.482。
【図２】慢性肝疾患患者における血清中のアルブミンレベル（単位：g/dL）（横軸, Alb）と浮腫（縦軸, Edema;ＥＣＷ／ＴＢＷ）との相関を示す。回帰直線：ECW/TBW=0.374-0.008* Alb、R2=0.277。
【図３】慢性肝疾患患者における血清中の酸化型アルブミン比率（％）（横軸, O-Alb）とＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア（上側のパネル; 縦軸, CP score）及びＭＥＬＤスコア（下側のパネル; 縦軸, MELD）との相関を示す。回帰直線：Child-Pughスコア=3.013+0.132* O-Alb、R2=0.268。MELD=2+0.316* O-Alb、R2=0.066。
【図４】血清アルブミン製剤のシステイン処理による還元を示す。横軸に質量電荷比（ｍ／ｚ）、縦軸に相対存在量を示す。質量電荷比が1387.6及び1389.5付近のピークは酸化型アルブミンを、1385.2及び1383.7付近のピークは還元型アルブミンをそれぞれ示す。上段：コントロール（システイン非添加、室温、９０分）、中断：システイン非添加、３７℃、９０分、下段：システイン添加、３７℃、９０分。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、肝疾患に伴う浮腫の判定方法を提供する。本発明の判定方法は、被験者から得た生体試料中のアルブミン（好ましくは血清アルブミン）の酸化型アルブミン比率を定量することを含む。【００１５】
実施例において示されるように、血清アルブミンの酸化型アルブミン比率は、肝疾患に伴う浮腫の程度と正の相関を示し、酸化型アルブミン比率が高いほど、肝疾患に伴う浮腫の程度も大きくなる。従って、本発明の判定方法においては、酸化型アルブミン比率と浮腫の程度との間の正の相関に基づき浮腫の程度の判定が行われる。【００１６】
肝疾患には、浮腫を併発し得るすべての肝疾患が含まれる。肝疾患としては、肝硬変、肝炎（ウイルス性肝炎（Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎等）、アルコール性肝炎、非アルコール性肝炎等）等を挙げることが出来る。【００１７】
浮腫とは、細胞間質に体液が過剰に貯留する状態（水分貯留）をいう。肝疾患に伴う浮腫は、主に腹水の症状として表出する。【００１８】
本発明の判定方法の被験者としては、肝疾患の患者及び肝疾患の罹患が疑われる健常者を挙げることが出来る。また、ここでいう患者は、ヒトに限定されるものではなく、ヒト以外の哺乳動物（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜；イヌ、ネコ等のペット；サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等）も本発明の対象となる。【００１９】
本発明の判定方法に用いられる生体試料としては、通常体液が用いられる。体液としては、血清、血漿、血液、腹水、リンパ液、尿、骨髄液等を挙げることが出来る。体液は好ましくは、血清、血漿、血液又は腹水である。【００２０】
酸化型アルブミン比率とは、総アルブミン（酸化型アルブミンと還元型アルブミンの総和）に占める酸化型アルブミンの比率をいう。酸化型アルブミンとは、Ｎ末端から３４番目に存在するシステイン残基にアルブミン以外の生体内のチオール化合物（システインやグルタチオン等）がジスルフィド結合を介して結合したアルブミンをいう。還元型アルブミンとは、Ｎ末端から３４番目に存在するシステイン残基のＳＨ基が遊離状態にあるアルブミンをいう。【００２１】
生体試料中の酸化型アルブミン比率を定量する方法は、特に限定されず、自体公知の方法を用いることができる。例えば、以下の方法を用いることが出来る：
（Ｉ）ブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）とブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）を利用した色素結合法。ＢＣＰ法は、還元型アルブミンと酸化型アルブミンに対する反応性が異なるため、ＢＣＰ法とＢＣＧ法で求めたアルブミン定量値の差から、酸化型アルブミン比率を算出することが出来る。
（ＩＩ）エルマン試薬などの遊離ＳＨ基定量試薬を用いて、還元型アルブミン由来のＳＨ基を定量する方法（Ｓｏｇａｍｉ  Ｍ，  Ｉｎｔ．  Ｐｅｐｔ.  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  ２４（２），  ９６−１０３，  １９８４）。
（ＩＩＩ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる方法（Ｓｏｇａｍｉ  Ｍ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，  ３３２，  １９−２７，  １９８５；特開昭６１−１５５３９７；特公平２−４８６３；Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ２４：９６；  １９８４）。還元型アルブミンと酸化型アルブミンとを分離して検出し、分離したクロマトグラム上におけるピーク面積比から、酸化型アルブミン比率を求めることができる。
（ＩＶ）質量分析計を用いたアルブミンの分析方法（安川恵子，  臨床検査，  ４４（８），  ９０７−９１０，  ２０００）。酸化型アルブミンは、付加した化合物（例えばシステイン）の質量分だけ、還元型アルブミンよりも重くなる。従って、十分な質量分解能を有する質量分析計で測定することにより、還元型アルブミンと酸化型アルブミンを分離して検出することが可能となる。
（Ｖ）試料溶液のｐＨを特定範囲（ｐＨ４〜９、好ましくは５．８〜６．２）に調整することにより改良された、ＨＰＬＣ又は質量分析を用いる方法（ＷＯ２００７／０１３６７９）。試料溶液のｐＨを特定範囲に調整し、好ましくは試料を特定範囲の割合で希釈した希釈溶液とするかあるいはクロマトグラフィー手段や限外ろ過などにより低分子物質を除去することにより、試料溶液中の還元型アルブミンの酸化が著しく抑制され、極めて安定で精度の高いアルブミン測定が可能となる。【００２２】
分析精度の安定性や高さを考慮すると、生体試料中の酸化型アルブミン比率は、好ましくは上記の（ＩＩＩ）〜（Ｖ）のいずれかの方法により定量される。【００２３】
生体試料中の酸化型アルブミン比率の定量は、好ましくは生体外において行われる。【００２４】
そして、測定された酸化型アルブミン比率を用いて、肝疾患に伴う浮腫の程度が判定される。当該判定は、酸化型アルブミン比率と浮腫の程度との間の正の相関に基づき行われる。【００２５】
例えば、一定レベルの浮腫を併発していることが判明している肝疾患患者（ポジティブコントロール）及び、健常人（ネガティブコントロール）から生体試料を調製し、被験者の生体試料における酸化型アルブミン比率が、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較される。ポジティブコントロール及びネガティブコントロールにおいては、好ましくは被験者と同じ採取方法により生体試料を得て、被験者と同じ測定方法により酸化型アルブミン比率を測定することが、データの精度向上の点から好ましい。あるいは、酸化型アルブミン比率と浮腫の程度との相関図をあらかじめ作成しておき、被験者の酸化型アルブミン比率をその相関図と比較してもよい。酸化型アルブミン比率の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。【００２６】
そして、酸化型アルブミン比率の比較結果より、被験者の酸化型アルブミン比率が相対的に高い場合には、浮腫の程度が相対的に高い（あるいは、被験者の酸化型アルブミン比率が相対的に低い場合には、浮腫の程度が相対的に低い）と判定することができる。【００２７】
また、酸化型アルブミン比率のカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定された酸化型アルブミン比率とこのカットオフ値とを比較することによって行うこともできる。例えば、測定された酸化型アルブミン比率が前記カットオフ値以上である場合には、浮腫の程度が相対的に高いと判定し、前記カットオフ値より下である場合には、浮腫の程度が相対的に低いと判定することができる。カットオフ値は、例えば、酸化型アルブミン比率と浮腫の程度との相関曲線に基づき、所望の浮腫の程度を与える酸化型アルブミン比率とすることが出来る。【００２８】
或いは、本発明の判定の方法において、治療中の被験者から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率と、治療前及び／又は治療後の同一被験者から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率とを比較してもよい。治療中とは、薬物投与等の処置を患者に施している期間をいう。治療前、治療中及び／又は治療後の各々において少なくとも１回患者から生体試料を得る。好ましくは、治療前、治療中そして治療後の各々において数回、適当な時間間隔をおいて患者から試料をサンプリングする。そうすることにより、肝疾患に伴う浮腫を患う患者の生体試料中の酸化型アルブミン比率の経時的変化をより詳細に調べることができ、浮腫の程度を更に詳細に解析することが出来る。例えば、治療に対する患者の応答の有無、程度、あるいは患者がいずれの治療段階にあるのか等の状況を更に詳細に調べることができ、浮腫の程度の変化を高い精度で予測することが出来る。【００２９】
従って、本発明の判定方法は、肝疾患に伴う浮腫の治療モニタリング及び予後の予測にも用いることが出来る。【００３０】
さらに本発明は、肝疾患に伴う浮腫の判定用キットを提供する。該キットは、上記の本発明の判定方法において、生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を定量するための試薬を含む。酸化型アルブミン比率の定量方法は上述のごとく種々のものが公知であり、適宜選択して用いることが出来る。例えば、酸化型アルブミン比率が上記（Ｉ）の方法により定量される場合には、本発明のキットは、ブロムクレゾールグリーン（ＢＣＧ）及びブロムクレゾールパープル（ＢＣＰ）を含む。酸化型アルブミン比率が上記（ＩＩ）の方法により測定される場合には、本発明のキットは、エルマン試薬などの遊離ＳＨ基定量試薬を含む。酸化型アルブミン比率が上記（Ｖ）の方法により定量される場合には、本発明のキットは、試料を希釈するためのｐＨ４〜９（好ましくは５．８〜６．２）の緩衝液を含む。またこの場合、本発明のキットは更に低分子物質を除去するための限外ろ過膜又はカラムを含んでいてもよい。本発明のキットを用いれば、上記本発明の判定方法を用いて、容易に肝疾患に伴う浮腫を判定することが可能である。【００３１】
さらに本発明は、肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る化合物のスクリーニング方法を提供する。該方法は以下の方法を含む：
（１）肝疾患に伴う浮腫を患っている非ヒト哺乳動物に候補化合物を投与すること、
（２）該候補化合物を投与した非ヒト哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を定量すること、
（３）該非ヒト哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を、候補化合物を投与していない対照哺乳動物から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率と比較すること、及び
（４）比較結果に基づき、酸化型アルブミン比率を低下させた化合物を肝疾患に伴う浮腫を治療し得る化合物として選択すること。【００３２】
本発明のスクリーニング方法に供される候補化合物は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。【００３３】
非ヒト哺乳動物としては、本発明の判定方法における被験者の例として列挙した哺乳動物を用いることが出来る。肝疾患に伴う浮腫を患っている非ヒト哺乳動物としては、公知の肝疾患（肝硬変、肝炎等）モデル動物を用いることが出来る。【００３４】
（２）における酸化型アルブミン比率の定量は、本発明の判定方法において列挙した方法を用いて行うことが出来る。【００３５】
（３）における酸化型アルブミン比率の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、対照哺乳動物における酸化型アルブミン比率は、候補化合物を投与した哺乳動物における酸化型アルブミン比率の定量に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。【００３６】
そして、比較の結果得られた、酸化型アルブミン比率を低下させた化合物が、肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る物質として選択される。【００３７】
更に、本発明はアルブミン製剤を提供する。本発明のアルブミン製剤は、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療用であり得る。本発明のアルブミン製剤を肝疾患に伴う浮腫を罹患するおそれのある患者又は肝疾患に伴う浮腫を罹患した患者に投与することにより、該患者における浮腫を予防又は治療することができる。【００３８】
本発明のアルブミン製剤に含有されるアルブミンは、酸化型アルブミン比率が２５％未満であることを特徴とする。生体内における血清アルブミンの酸化型と還元型の存在比率は、正常時においては、およそ２５：７５であるとされている。上述のように肝疾患に伴う浮腫を罹患している患者においては酸化型アルブミンの比率が増加している。従って、本発明のアルブミン製剤を投与することによって、肝疾患に伴う浮腫を罹患している患者における酸化型アルブミン比率を積極的に低下させ、正常時の比率にまで改善し、又はそれに近づけることにより、従来のアルブミン製剤よりも効率的に肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療することが出来る。【００３９】
患者における酸化型アルブミン比率を低下させる効果を強化するため、本発明のアルブミン製剤に含有されるアルブミンにおける酸化型アルブミン比率は低いほど好ましい。従って該酸化型アルブミン比率は、通常２５％未満、好ましくは１５％未満、より好ましくは５％未満、更に好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満（例えば実質的に０％）である。酸化型アルブミン比率が実質的に０％であるとは、含有されるアルブミンの実質的に全てが還元型であることを意味する。本発明のアルブミン製剤に含有されるアルブミンにおける酸化型アルブミン比率は、HPLC法（Int. J. Peptide Protein Res. 24:96; 1984参照）により決定することが出来る。【００４０】
新たな局面において、本発明のアルブミン製剤に含有されるアルブミンは、酸化型アルブミン比率が通常６０％未満、好ましくは５１％未満、より好ましくは２５％未満、更に好ましくは１５％未満、より更に好ましくは５％未満、なお尚一層好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満（例えば実質的に０％）である。上述のように、生体内における血清アルブミンの酸化型と還元型の存在比率は、正常時においては、およそ２５：７５であるとされているが、驚くべきことに、アルブミン中の酸化型アルブミン比率が６０％未満（好ましくは５１％未満）であれば、該アルブミンは肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る。酸化型アルブミン比率が２５％以上のアルブミンを投与することにより、肝疾患に伴う浮腫を改善する正確なメカニズムは不明である。本発明のアルブミン製剤に含有されるアルブミンにおける酸化型アルブミン比率は、HPLC法（Int. J. Peptide Protein Res. 24:96; 1984参照）により決定することが出来る。【００４１】
尚、本明細書において、酸化型アルブミン比率の数値は、特に断りのない場合、HPLC法（Int. J. Peptide Protein Res. 24:96; 1984参照）により決定された数値を意味する。【００４２】
本発明のアルブミン製剤に含まれるアルブミンは、通常上記哺乳動物（好ましくはヒト）の血清アルブミンである。ヒト血清アルブミンとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを例示することが出来る。本発明のアルブミン製剤に含まれるアルブミンは、血清から単離又は精製されたアルブミン又は遺伝子組み換え技術により製造された組み換え型アルブミンのいずれであってもよい。【００４３】
本発明のアルブミン製剤に用いることのできるアルブミンとして、特開２００２−１２５５３号に開示された以下のアルブミンを挙げることが出来る。【００４４】
［１］遺伝子操作により調製したヒト血清アルブミン産生宿主を培養してヒト血清アルブミンを発現させる際に、陰イオン交換体、疎水性担体および活性炭からなる群より選ばれた少なくとも一つを添加した培養液中で当該宿主を培養することにより、ヒト血清アルブミンと着色成分とが結合する前に当該ヒト血清アルブミンと当該着色成分とを分離することを特徴とする、ヒト血清アルブミンの着色抑制方法により得られる、着色成分が結合していない、遺伝子操作により発現されるヒト血清アルブミン。該アルブミンを含有する組成物を本発明のアルブミン製剤として使用した場合、該製剤の着色度は、好ましくは、Ａ350nm／Ａ280nmの吸光度比で０.００３５〜０.０１６３であり、Ａ405nm／Ａ280nmの吸光度比で０.００１８〜０.０１７９である。【００４５】
また、アルブミンと他のタンパク質との融合タンパク質も、本発明のアルブミン製剤に用いられるアルブミンに包含される。該融合タンパク質としては、特表２００７−５２２８０６号、特表２００４−５０６４０７号、特表２００３−５３０８３８号、特表２００３−５３０８３９号、特表２００３−５３０８４６号、特表２００３−５３０８４７号、特表２００３−５３０８５２号及び特表２００３−５３１５９０号に開示された以下のアルブミン融合蛋白質を挙げることができる。【００４６】
［２］−１  （ａ）治療用蛋白質：Ｘと、配列番号：１のアミノ酸配列を含むアルブミン；
（ｂ）治療用蛋白質：Ｘと、アルブミン活性を有する配列番号：１のアミノ酸配列の断片もしくは変異体；
（ｃ）治療用蛋白質：Ｘと、非融合状態の治療用蛋白質：Ｘの貯蔵寿命と比べて治療用蛋白質：Ｘの貯蔵寿命を延長し得るアルブミン活性をさらに有する、配列番号：１のアミノ酸配列の断片もしくは変異体；
（ｄ）治療用蛋白質：Ｘと、アルブミン活性を有し、さらに配列番号：１のアミノ酸１〜３８７のアミノ酸配列を含む、配列番号：１のアミノ酸配列の断片もしくは変異体；
（ｅ）治療用蛋白質：Ｘの生物活性を有する治療用蛋白質：Ｘの断片もしくは変異体と、配列番号：１のアミノ酸配列を含むアルブミン；
（ｆ）治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体と、（ａ）〜（ｅ）のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、該治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体は、アルブミンのＮ−末端またはアルブミンの断片もしくは変異体のＮ−末端に融合されている；
（ｇ）治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体と、（ａ）〜（ｅ）のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、該治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体は、アルブミンのＣ−末端またはアルブミンの断片もしくは変異体のＣ−末端に融合されている；
（ｈ）治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体と、（ａ）〜（ｅ）のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、該治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体は、アルブミンのＮ−末端およびＣ−末端またはアルブミンの断片もしくは変異体のＮ−末端およびＣ−末端に融合されている；
（ｉ）第一の治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体、および第二の治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体を含み、第一の治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体は第二の治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体と異なるものである、治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体と、（ａ）〜（ｅ）のアルブミンまたはその断片もしくは変異体；
（ｊ）治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体と、（ａ）〜（ｉ）のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、該治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体はリンカーによりアルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体から分離されている；および
（ｋ）治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体と、（ａ）〜（ｊ）のアルブミンまたはその断片もしくは変異体、ここで、アルブミン融合蛋白質は、以下の式：
Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１
を有し、さらに、Ｒ１は治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体であり、Ｌはペプチドリンカーであり、およびＲ２は配列番号：１のアミノ酸配列を含むアルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体である；
からなる群より選択されるメンバーを含む、アルブミン融合蛋白質（特表２００７−５２２８０６）。【００４７】
［２］−２  配列番号：１のアミノ酸配列またはその断片もしくは変異体を含むアルブミンまたはその断片もしくは変異体に挿入された治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体を含む、アルブミン融合蛋白質（特表２００７−５２２８０６）。【００４８】
［２］−３  （ａ）配列番号：１のアミノ酸５４〜６１；
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸７６〜８９；
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸９２〜１００；
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸１７０〜１７６；
（ｅ）配列番号：１のアミノ酸２４７〜２５２；
（ｆ）配列番号：１のアミノ酸２６６〜２７７；
（ｇ）配列番号：１のアミノ酸２８０〜２８８；
（ｈ）配列番号：１のアミノ酸３６２〜３６８；
（ｉ）配列番号：１のアミノ酸４３９〜４４７；
（ｊ）配列番号：１のアミノ酸４６２〜４７５；
（ｋ）配列番号：１のアミノ酸４７８〜４８６；および
（１）配列番号：１のアミノ酸５６０〜５６６：
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むアルブミンまたはその断片もしくは変異体に挿入された治療用蛋白質：Ｘまたはその断片もしくは変異体を含む、アルブミン融合蛋白質（特表２００７−５２２８０６）。【００４９】
上記［２］−１〜［２］−３のアルブミン融合蛋白質は、グリコシル化されていなくてもよい。
上記［２］−１〜［２］−３のアルブミン融合蛋白質は、酵母（グリコシル化欠損の酵母；グリコシル化およびプロテアーゼ欠損の酵母等）において発現され得る。
上記［２］−１〜［２］−３のアルブミン融合蛋白質は、哺乳類細胞により発現され得る。該哺乳類細胞は、培養下の哺乳類細胞であり得る。
上記［２］−１〜［２］−３のアルブミン融合蛋白質は、分泌リーダー配列をさらに含み得る。【００５０】
上記［２］−１〜［２］−３のアルブミン融合蛋白質において用いられる治療用蛋白質は、１またはそれ以上の治療活性および／または生物活性を有する蛋白質、ポリペプチド、抗体、ペプチドまたはその断片もしくは変異体を言う。本発明に包含される治療用蛋白質は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生物製剤（ペプチド、蛋白質、およびポリペプチドなる用語は本明細書中、同義的に用いられる）を含むが、これらに限定されない。用語「治療用蛋白質」が抗体およびその断片および変異体を含むことが特に熟慮される。故に、本発明の蛋白質は、治療用蛋白質の少なくとも１つの断片もしくは変異体および／または抗体の少なくとも１つの断片もしくは変異体を含んでもよい。さらに、用語「治療用蛋白質」は、治療用蛋白質の内在性または天然に存在する対応物に言及してもよい。【００５１】
「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療上活性」のある蛋白質により、本明細書中に記載されているまたは当該技術分野において知られている１またはそれ以上の治療用蛋白質のごとき治療用蛋白質に関連する１またはそれ以上の知られている生物活性および／または治療活性を有するポリペプチドが意味される。例えば、「治療用蛋白質」は、疾患、状態または障害の処置、予防または改善に有用な蛋白質であるが、これらに限定されない。非限定的な例として、「治療用蛋白質」は、特定の細胞型（正常な（例えばリンパ球）または異常な（例えば癌細胞））に特異的に結合してもよく、それ故に、化合物（薬剤または細胞傷害性剤）をその細胞型へ特異的にターゲッティングするために用いてもよい。【００５２】
上記［２］−１〜［２］−３のアルブミン融合蛋白質において用いられる治療用蛋白質としては、ＧＬＰ−Ｉ、ＧＬＰ−２、ＰＡＣＡＰ−２７、ＰＡＣＡＰ−２８、ＶＩＰ、ＣＤ４Ｍ３３、セクレチン、グリセンチン、オキシントモジュリン、ＰＨＭ、ＩＦＮａ、ＩＦＮｐ、ＡＮＰ、ＢＮＰ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−アルファ、ソマトスタチン、ＩＧＦ−１、ＩＬ−２可溶性受容体、ＩＬ−２受容体アンタゴニスト、ＣＴＬＬ−２、カルシトニン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、ＧＭＣＳＦ、ＥＰＯ、ＧＣＳＦ、インシュリン、免疫グロブリン、血清コリンエステラーゼ、α−１アンチトリプシン、アプロチニン、前駆体形態および活性形態にある凝固因子（フォン・ビルブラント因子、フィブリノーゲン、第ＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、活性第ＶＩＩＡ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩＩ因子、ｃ１インアクチベーター、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンビン、プロトロンビン、アポ−リポタンパク質、ｃ−反応性タンパク質およびプロテインＣなどが含まれるがこれらに限定されない）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、一本鎖抗体、自己分泌運動因子、分散因子、ラミニン、ヒルジン、アプラギン（applaggin）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ／ＭＣＡＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、オステオポンチン、血小板第４因子、テネイシン、ビトロネクチン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、レプチン、酵素（例えば、ウロキナーゼ、Ｂグルコセレブロシダーゼ（Ｂ−glucocerebrosidase）等）、ＴＮＦ受容体、成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ−１等）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、インターロイキン受容体（例えば、ＩＬ−４受容体等）、インターフェロン（例えば、インターフェロンガンマ、インターフェロンオメガ等）、トランスフォーミング成長因子（例えば、ＴＧＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ−１、ＴＧＦ−ベータ−３）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−アルファ）、ホルモン（例えば、ゴナドトロピン、ヒト黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン等）、ＤＮａｓｅ、デコリン、オステオプロテグリン、Ｔｉｅ−２、ｔ−ＰＡ等を挙げることができるが、これらに限定されない。治療用蛋白質は、モノマー又はタンデム融合物の態様で用いられ得る。【００５３】
インターフェロンハイブリッドも治療用蛋白質として用いることが出来る。インターフェロンハイブリッドには、インターフェロンアルファ−インターフェロンアルファハイブリッド（本明細書中、アルファ−アルファハイブリッドと言う）が含まれる。一態様において、アルファ−アルファハイブリッドは、インターフェロンアルファＤに融合されたインターフェロンアルファＡからなる或いはそれを含み得る（Ａ／Ｄハイブリッド）。別の態様において、アルファ−アルファハイブリッドは、インターフェロンアルファＦに融合されたインターフェロンアルファＡからなる或いはそれを含む（Ａ／Ｆハイブリッド）。さらなる一態様において、アルファ−アルファハイブリッド部分は、インターフェロンアルファＢに融合されたインターフェロンアルファＡからなる或いはそれを含む（Ａ／Ｂハイブリッド）。これらのハイブリッドは米国特許第４，４１４，５１０号にさらに記載されており該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。【００５４】
インターフェロンハイブリッドには、インターフェロンベータ−インターフェロンアルファハイブリッド（本明細書中、ベータ−アルファハイブリッドと言う）が含まれる。一態様において、ベータ−アルファハイブリッドは、インターフェロンアルファＤ（インターフェロンアルファ−１とも言う）に融合されたインターフェロンベータ−１からなる或いはそれを含む（ベータ−１／アルファＤハイブリッド）。これらのハイブリッドは米国特許第４，７５８，４２８号にさらに記載されており、該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。【００５５】
インターフェロンハイブリッドには、インターフェロンアルファ−インターフェロンベータハイブリッド（本明細書中、アルファ−ベータハイブリッドと言う）が含まれる。一態様において、アルファ−ベータハイブリッドは、インターフェロンベータ−１に融合されたインターフェロンアルファＤ（インターフェロンアルファ−１とも言う）からなる或いはそれを含む（アルファＤ／ベータ−１ハイブリッド）。これらのハイブリッドは米国特許第４，７５８，４２８号にさらに記載されており、該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。【００５６】
さらなる治療用蛋白質としては、特表２００７−５２２８０６号、特表２００４−５０６４０７号、特表２００３−５３０８３８号、特表２００３−５３０８３９号、特表２００３−５３０８４６号、特表２００３−５３０８４７号、特表２００３−５３０８５２号及び特表２００３−５３１５９０号の表１の「治療用蛋白質Ｘ」の欄（欄１）に開示される１またはそれ以上の治療用蛋白質またはペプチドまたは断片または可変体を含むが、これらに限定されない。【００５７】
本発明のアルブミン製剤に含まれるアルブミンは、既存のアルブミンを還元化処理に付すことにより製造することが出来る。還元化処理の方法としては、還元化剤による方法（例えば特開2007-197394に記載された方法）と電解還元による方法がある。より具体的な還元化剤としては、β−メルカプトエタノール、β−メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール（DTT）、ジチオエリスリトール（DTE）、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH4）、システイン、第三級ホスフィン（Tris（2-carboxyethyl）phosphine、Tris (hydroxymethyl)phosphine、tri-n-buthyl phosphine)の塩等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。
システインとしては、Ｌ−システイン、Ｄ−システイン、ＤＬ−システインが挙げられるが、好ましくはＬ−システインである。例えば、アルブミンを含む水溶液に、最終濃度で５〜５０ｍｇ／ｍｌ（例、１２ｍｇ／ｍｌ）のＬ−システインを添加し、３０〜４０℃（例、３７℃）でインキュベートすることにより、酸化型アルブミンを還元することが出来る。
未反応の還元化剤や、還元化剤の分解物は限外濾過工程やクロマトグラフィーなどの方法で除去することができる。還元化剤の添加量は、原料あるいは反応系中に含まれるジスルフィド結合を還元する量であればよく、またこれらのジスルフィド結合の量に対して過剰であってもよい。
還元型アルブミンの還元状態を維持するために、例えばＬ-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、エリソルビン酸（イソアスコルビン酸）、カテキン、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、トコフェロール（ビタミンＥ、Ｖ．Ｅ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、グアヤク脂、クエン酸イソプロピル、次亜硫酸ナトリウム、Ｌ−システイン又はその塩（例、Ｌ−システイン塩酸塩）、二酸化硫黄、ピロ亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピルのような酸化防止剤で処理することができる。
還元化処理を行った後に、得られたアルブミンにおける酸化型アルブミン比率を測定することにより、その還元化の程度を確認することが出来る。【００５８】
本発明のアルブミン製剤中のアルブミンの含有量は、特に限定はされないが、通常０．０１〜３０ｗ／ｖ％であり、好ましくは、０．１〜２５ｗ／ｖ％である。アルブミン含有量が０．０１ｗ／ｖ％未満であると、肝疾患に伴う浮腫に対して予防又は治療効果が十分に増強されない場合がある。また、血清アルブミン含有量が３０ｗ／ｖ％を超えると製剤が不安定化する可能性がある。【００５９】
本発明のアルブミン製剤は、上記アルブミンを含有する水溶液または用時溶解可能である固形剤であり、無菌水溶液の形態で調製される。通常、注射用蒸留水にこれらの成分を溶解する。したがって、該製剤は、ヒト体液のｐＨを考慮して、ｐＨは、５．０〜７．４、好ましくはｐＨ６．０〜７．４である。ｐＨ調整剤としては、塩酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸などの酸を使用する。【００６０】
本発明のアルブミン製剤には、必要量のビタミン、例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、葉酸などのビタミン類およびビタミン様化合物、ナトリウム、カリウム、カルシウム、クロル、リンなどの電解質、ならびに鉄、亜鉛、マンガン、銅、ヨウ素、セレンなどの微量元素を添加することができる。【００６１】
さらに糖、例えばマルトース、フルクトース、キシリトールなど、ならびに脂質、例えば、大豆油、綿実油、ゴマ油などの栄養素を添加することができる。その他、亜硫酸水素ナトリウムなどの安定化剤など、または人体に投与可能な他の物質を添加することができる。【００６２】
また、本発明のアルブミン製剤には、還元型アルブミンの還元状態を維持するために、例えばＬ-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸ステアリン酸エステル、エリソルビン酸（イソアスコルビン酸）、カテキン、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、トコフェロール（ビタミンＥ、Ｖ．Ｅ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸カルシウム二ナトリウム、グアヤク脂、クエン酸イソプロピル、次亜硫酸ナトリウム、Ｌ−システイン又はその塩（例、Ｌ−システイン塩酸塩）、二酸化硫黄、ピロ亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピルのような酸化防止剤を添加することができる。【００６３】
酸化防止剤の添加量は、酸化防止剤の種類により異なり、適宜設定することが出来る。Ｌ−システイン又はその塩を酸化防止剤として使用する場合、その添加量は、Ｌ−システインとして０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌが適当である。【００６４】
本発明のアルブミン製剤は、自体公知の方法により製造することが出来る。例えば、以下の工程により、本発明のアルブミン製剤を製造することが出来る：
（１）酸化型アルブミン比率が６０％未満（好ましくは２５％未満）のアルブミンを提供すること、及び
（２）（１）のアルブミンを水性溶媒に溶解することにより、肝疾患に伴う浮腫の予防又は治療用アルブミン製剤を得ること。【００６５】
工程（１）においては、公知のアルブミンが所望する酸化型アルブミン比率を有する場合には、そのアルブミンがそのまま本発明のために提供され得る。一方、公知のアルブミンが所望する酸化型アルブミン比率よりも高い場合には、上述のように該アルブミンを還元化処理に付すことにより工程（１）が行われ得る。【００６６】
工程（２）において使用される水性溶媒としては、滅菌水、生理食塩水、生理的な緩衝液等を挙げることが出来る。アルブミンと供に、医薬上許容される添加剤（例えば上述のビタミン類、電解質、微量元素、栄養素、安定化剤、酸化防止剤等）を溶解してもよい。【００６７】
具体的には、酸化型アルブミン比率が６０％未満であるアルブミン及び適切な添加剤を滅菌水に溶解することにより本発明のアルブミン製剤を製造することができる。好ましい態様において、酸化型アルブミン比率が２５％未満であるアルブミン及び適切な添加剤を滅菌水に溶解することにより本発明のアルブミン製剤を製造することができる。【００６８】
本発明のアルブミン製剤の製造方法においては、特に遺伝子組み換え技術により製造された組み換え型アルブミンを用いた製造において、酸化型アルブミン比率を測定することによって適切な製造条件の選択、工程の維持又は管理が行える。さらに、製品試験の品質規格として酸化型アルブミン比率を用いることによって、アルブミン製剤の適正な品質管理を行うことができる。【００６９】
工程（１）において、システイン（Ｌ−システイン等）を還元剤として使用し、酸化型アルブミン比率が６０％未満（好ましくは、２５％未満）であるアルブミンを製造する場合、好ましくは、還元反応後の混合物から未反応のシステインやシスチンを含む低分子化合物（例えば、分子量１０００Ｄａ以下の化合物）を除去することにより、酸化型アルブミン比率が６０％未満であるアルブミンを精製する。そして、工程（２）において、精製したアルブミンを水性溶媒に溶解し、１００ｍl当たり１０〜５０ｍｇのシステイン（Ｌ−システイン等）を還元維持剤として添加するのが好ましい。【００７０】
本発明のアルブミン製剤は滅菌されていることが好ましい。滅菌の方法としては、通常の高圧蒸気滅菌法、低温加熱滅菌法、濾過滅菌法などを単独であるいは組み合わせて用いることができる。【００７１】
本発明のアルブミン製剤は、末梢静脈内または中心静脈内等へ経静脈内投与され、一般には、１日、成人１人当たり、約１００〜２０００ｍｌ、好ましくは約５００〜１０００ｍｌを目安として、これを１日当たり１〜２回に分けて、投与すべき患者の病態、栄養状態、年齢、体重等を考慮して、適宜、増減させて使用する。【００７２】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７３】
（実施例１）
患者及び方法
４０名の慢性肝疾患患者（Ｃ型肝炎ウイルス；ｎ＝３１、Ｂ型肝炎ウイルス；ｎ＝３、アルコール；ｎ＝５、非アルコール性脂肪性肝炎；ｎ＝１）を解析した。いずれの患者も肝硬変の状態であった。この試験においては慢性腎不全の患者は解析から除外した。血清中の酸化型アルブミン/還元型アルブミン比を、高速液体クロマトグラフィーにより測定した。該測定は、ＷＯ２００７／０１３６７９に記載された方法に準じて行った。水分保持率（浮腫）をアルブミンの機能として用いた。水分保持率の程度は、直接分節型多重生体電気インピーダンスアナライザー（direct segmental multifrequency-bioelectrical impedance analyzer）（InBody 3.2, BIOSPACE, Tokyo, Japan）により評価し、細胞外水／全体内水（ＥＣＷ／ＴＢＷ）で表した。慢性肝疾患の重症度はＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア又は終段階肝疾患のモデル（model for end-stage liver disease, ＭＥＬＤ）スコアにより評価した。Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア及びＭＥＬＤスコアは肝予備能の指標である。酸化型アルブミンとＥＣＷ／ＴＢＷ、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア又はＭＥＬＤスコアとの相関を調べた。【００７４】
結果
全ての患者について、平均年齢は６８．８±９．７歳であった。酸化型アルブミン百分率、ＥＣＷ／ＴＢＷ、Ｃｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア及びＭＥＬＤスコアは、それぞれ、２０．７〜５９．３％、０．３２７〜０．３７６、５〜１１及び６〜６６の範囲内であった。図１は縦軸をEdema （ＥＣＷ／ＴＢＷ）、横軸を酸化型アルブミン百分率とし、プロットした結果である。酸化型アルブミン百分率とＥＣＷ／ＴＢＷとの間には有意な正の相関が認められた（σ=0.68；p<0.0001）（図１）。図２は縦軸をEdema （ＥＣＷ／ＴＢＷ）、横軸を従来より測定されている血清アルブミンレベルとし、プロットした結果である。血清アルブミンレベルとＥＣＷ／ＴＢＷとの間の相関（σ=-0.49；p=0.002）にも統計学的な有意性を認めるが（図２）、酸化型アルブミン百分率とＥＣＷ／ＴＢＷとの相関の方がより有意であった。これらの結果から酸化型アルブミン百分率は浮腫の優れた指標であることが明らかになった。同時に、還元型アルブミンは酸化型アルブミンに比べ膠質浸透圧保持機能に優れていることが明らかとなった。更に、酸化型アルブミン百分率と肝臓の予備能力との関連を調べるために縦軸をＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスコアもしくはＭＥＬＤスコア、横軸を酸化型アルブミン百分率とし、プロットした。結果は図３に示す如く酸化型アルブミン百分率はＣｈｉｌｄ−Ｐｕｇｈスコア、ＭＥＬＤスコアとも有意な正の相関を示した（それぞれ、σ=0.51；p=0.013、σ=0.44；p=0.006）（図３）。これらの結果は酸化型アルブミン百分率が肝硬変患者の予後を予測しうる事を示している。【００７５】
以上より、酸化型アルブミン百分率は水分保持率の程度及び慢性肝疾患の重症度の両方と関連した。酸化型アルブミンはアルブミンの機能及び慢性肝疾患の患者の重症度を評価する新たなマーカーとして有用であることが示された。【００７６】
（実施例２）
アルブミン製剤中の酸化型／還元型アルブミン比が、アルブミン投与による治療後の病態に及ぼす影響を見ることを目的に以下の試験を行なった。
市販のアルブミン製剤を生理食塩水で5%に希釈し、全血サンプルと同様に、安定化剤入りのマイクロチューブに0.9mlをサンプリングし、転倒混和して冷蔵保存後、酸化還元アルブミン比を測定した。
酸化型／還元型アルブミン比はHPLC法（Int. J. Peptide Protein Res. 24:96;1984）により測定した。
その結果、以下の値を得た。
(1) 化血研アルブミン  酸化型アルブミン62.7%, 還元型アルブミン37.3%
(2) ブミネート        酸化型アルブミン61.5%, 還元型アルブミン38.5%
(3) アルブミナー      酸化型アルブミン49.2%, 還元型アルブミン50.8%
(4) 三菱アルブミン    酸化型アルブミン50.7%, 還元型アルブミン49.3%  【００７７】
これらのアルブミン製剤を25g/日の用量で3日間肝硬変患者に投与し、投与前後の体重、BMI、BUN、クレアチニン、Na、空腹時血糖、血清浸透圧、浮腫改善度、血清中アルブミン、ECF/TBF、総たんぱく質、リンパ球数、プロトロンビン時間、総ビリルビン及びChild−Pugh・スコアを比較した。ECF/TBFは体成分分析装置（InBody）にて測定した。結果は、投与したアルブミン製剤の酸化型アルブミン比が60%以上の群（アルブミン製剤（１）及び（２））と51%以下の群（アルブミン製剤（３）及び（４））で分け表記した。TBF＝total body fluid  生体の水分量を表し、ECF＝extracellular fluid  細胞外液を表す。【００７８】
各アルブミン製剤投与前の患者背景について表１に示した。【００７９】
【表１】
0005476538.tif 000002
【００８０】
どの項目においても有意差を認めなかった。【００８１】
次にアルブミン製剤投与前後における各評価項目の結果を表２に示した。【００８２】
【表２】
0005476538.tif 000003
【００８３】
その結果、酸化型アルブミン比が51%以下の群においてのみ、投与前後で体重、BMI、ECF/TBFにおいて有意な改善が認められた。【００８４】
ECF/TBFは浮腫の指標としてよく用いられており値が大きいほど悪化を表すが、酸化型アルブミン比が51%以下の群においてのみ、ECF/TBFが有意に低下したことより、酸化型アルブミン含有量が低いアルブミン製剤ほど浮腫改善効果が高いことが示された。【００８５】
（実施例３）
システイン処理によるアルブミン製剤中の酸化型アルブミンの比率の低下
血清アルブミン製剤（化血研；ヒト血清アルブミン濃度２５％）１ｍｌに１２ｍｇのＬ−システインを添加し、混合物を３７℃で９０分間インキュベーションした。コントロールとして、血清アルブミン製剤にＬ−システインを添加せずに、室温又は３７℃で９０分間インキュベーションした。
固相抽出により、反応液からアルブミンを精製した。固相抽出の条件は以下の通りである（ＷＯ２００７／０１３６７９参照）。
固相抽出カラム  Varian Bond Elut C18 EWP 50mg/1ml
(1) 洗浄  0.1%ギ酸−90％アセトニトリル  水溶液  2ml
(2) 平衡化  純水    2ml
(3) サンプルアプライ  500μｌ（反応液10μLをリン酸バッファーで50倍希釈した全量）
(4) 洗浄  0.1%ギ酸−10％アセトニトリル  水溶液  1.5ml
(5) 溶出  0.1%ギ酸−90％アセトニトリル  水溶液  100μｌ
溶出画分を連続注入法によりESI-TOFMSで解析した（流速2μL/分)。【００８６】
マススペクトル解析の結果、Ｌ−システインの添加により、酸化型アルブミンのピークの減少と還元型アルブミンのピークの増加が観測された（図４）。
尚、処理前の酸化／還元アルブミン比は、室温、９０分処理群と同一であった。【００８７】
以上の結果から、Ｌ−システインを還元化剤として利用することにより、アルブミン製剤中の酸化型アルブミンの比率を低下し得ることが示された。【００８８】
（製剤例１）
（５０ｍｌ水溶液中）
還元剤処理アルブミン                     12.5g
アセチルトリプトファンナトリウム       268.3mg
カプリル酸ナトリウム                   166.2mg
Ｌ−システイン                            15mg
等化剤（塩化ナトリウム）・ｐＨ調節剤      適量
ｐＨ６．２〜７．６【００８９】
（製剤例２）
（５０ｍｌ水溶液中）
還元剤処理アルブミン                     12.5g
アセチルトリプトファン                 246.3mg
カプリル酸                             144.2mg
ｐＨ調節剤（水酸化ナトリウム）            適量
ｐＨ調節剤（炭酸水素ナトリウム）          適量
ｐＨ調節剤（氷酢酸）                      適量
塩化ナトリウム                            適量
Ｌ−システイン塩酸塩                      20mg
ｐＨ６．４〜７．４
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、対象から得た生体試料中のアルブミンの酸化型アルブミン比率を測定することにより、肝疾患に伴う浮腫の程度の判定、例えば治療モニタリング、予後予測等を迅速且つ正確に行うことができ、更には肝疾患に伴う浮腫を予防又は治療し得る化合物のスクリーニングを行うことができる。
本出願は日本で出願された特願２００８−０９０５４４（出願日：２００８年３月３１日）及び特願２００８−３０６８０５（出願日：２００８年１２月１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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