(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体排泄物試料および／または生体組織試料中の、高い毒性を有する、ＬＣＴを製造する変異したＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するための方法において、以下の工程：
（ａ）生体排泄物試料および／または生体組織試料を、グループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グループＶおよびグループＶＩの少なくとも３種の抗体グループからのそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させ、その際、
グループＩは以下の抗体：モノクローナル抗体２ＣＶ（ＤＳＭ  ＡＣＣ２３２１）、モノクローナル抗体ＴＧＣ３５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１８）およびＴＧＣ３５および／または２ＣＶと機能的および作用的に同一のその他のｐａｎ−ＴｃｄＢ抗体、を含み、
グループＩＩは以下の抗体：モノクローナル抗体ＴＧＣ２３（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１７）およびその他のトキシンＴｃｄＢ−１０４６３およびＴｃｄＢ−０１７と反応するが、トキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０２７とは反応しない抗体、を含み、
グループＩＩＩは以下の抗体：モノクローナル抗体ＴＧＣ４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１９）およびその他のＴｃｄＢ−１０４６３と反応するが、トキシンＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄＢ−０２７とは反応しない抗体、を含み、
グループＩＶは以下の抗体：モノクローナル抗体ＴＧＣ１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１５）およびその他のトキシンＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄＢ−０２７と反応するが、トキシンＴｃｄＢ−１０４６３とは反応しない抗体、を含み、
グループＶは以下の抗体：モノクローナル抗体ＴＧＣ１９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１６）およびその他のトキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０２７と反応するが、トキシンＴｃｄＢ−１０４６３およびＴｃｄＢ−０１７とは反応しない抗体、を含み、
グループＶＩは以下の抗体：モノクローナル抗体ＴＴＣ８（ＤＳＭ  ＡＣＣ２３２２）およびＴＴＣ８と機能的および／または作用的に同一のその他のｐａｎ−ＴｃｄＡ抗体、
を含み、その際、
ＴｃｄＢ−１０４６３は、Ｃ．ディフィシル菌株ＶＰＩ−１０４６３のトキシンＢを意味し、
ＴｃｄＢ−８８６４は、Ｃ．ディフィシル菌株８８６４のトキシンＢを意味し、
ＴｃｄＢ−０１７は、リボタイプ０１７を有するＣ．ディフィシル菌株のトキシンＢを意味し、
ＴｃｄＢ−０２７は、リボタイプ０２７を有するＣ．ディフィシル菌株のトキシンＢを意味し、
（ｂ）抗体反応を検出し、かつ反応パターンを作成し、その際、それぞれ抗体グループＩ〜ＶＩのそれぞれ（ａ）で使用された抗体を、検出された陽性抗体反応に関してはプラスの符号および検出された陰性抗体反応に関してはマイナスの符号に分類し、かつ、
（ｃ）（ｂ）で得られた反応パターンと参考パターンとを比較し、この場合、この参考パターンは、技術水準において公知であり、かつ検出試験において存在について試験すべきＣ．ディフィシル菌株Ｒｘ１、Ｒｘ２、Ｒｘｉからのそれぞれの大クロストリジウム毒素（ＬＣＴ）ＬＣＴ−Ｒｘ１、ＬＣＴ−Ｒｘ２、ＬＣＴ−Ｒｘｉの少なくとも１種を、抗体グループＩ〜ＶＩの少なくとも３種からなる工程（ａ）で選択された抗体との反応試験中で使用し、かつそれぞれのＬＣＴおよび抗体グループＩ〜ＶＩの少なくとも３種に関して得られた反応結果を、それぞれの抗体グループが、検出された陽性抗体反応の場合にはプラスの符号であるか、検出された陰性抗体反応の場合にはマイナスの符号に分類されるようにしてパターン状に記録することにより得られたものであり、
（ｄ）（ｂ）で得られた反応パターンと参考パターンとの間の一致を、前記試料中において該当する参考パターンのＣ．ディフィシル菌株が存在することに関する指標として評価する、ことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
グループＩＶからの少なくとも１種の抗体が、モノクローナル抗体ＴＧＣ１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１５）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グループＶからの少なくとも１種の抗体が、モノクローナル抗体ＴＧＣ１９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１６）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
グループＶＩからの少なくとも１種の抗体が、モノクローナル抗体ＴＴＣ８（ＤＳＭ  ＡＣＣ２３２２）である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
グループＩからの少なくとも１種の抗体が、モノクローナル抗体２ＣＶ（ＤＳＭ  ＡＣＣ２３２１）またはモノクローナル抗体ＴＧＣ３５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１８）である、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
グループＩＩからの少なくとも１種の抗体が、モノクローナル抗体ＴＧＣ２３（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１７）である、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
グループＩＩＩからの少なくとも１種の抗体が、モノクローナル抗体ＴＧＣ４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１９）である、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）において、試料を、それぞれグループＩ、ＩＶおよびＶＩからのそれぞれ１種の抗体と接触させ、かつ、工程（ｃ）において、グループＩ、ＩＶおよびＶＩからの抗体の陽性反応が、高い毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株の存在を示す、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）において、試料を、グループＩＩ、グループＩＶおよびグループＶＩのそれぞれの抗体グループからのそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させ、かつ、
工程（ｃ）において、グループＩＶおよびグループＶＩからの抗体の陽性反応、ならびにグループＩＩからの１種またはそれ以上の抗体の陰性反応が、高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩの存在を示す、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｂ）において、試料をさらに抗体グループＩおよび／または抗体グループＩＩＩおよび／または抗体グループＶのそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させ、かつ、工程（ｃ）においてさらに、グループＩおよびグループＶからの１種またはそれ以上の抗体の陽性反応、ならびにグループＩＩＩからの１種またはそれ以上の抗体の陰性反応が、高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩＩの存在を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）において、試料を、それぞれ抗体グループＩＩ、グループＩＶおよびグループＶＩからのそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させ、かつ、工程（ｃ）において、グループＩＩおよびグループＩＶからの抗体の陽性反応、ならびにグループＶＩからの１種またはそれ以上の抗体の陰性反応が、高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦの存在を示す、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）において、試料をさらに抗体グループＩおよび／または抗体グループＩＩＩおよび／または抗体グループＶのそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させ、かつ、工程（ｃ）においてさらにグループＩからの１種またはそれ以上の抗体の陽性反応、ならびにグループＩＩＩおよびグループＶからの抗体の陰性反応が、高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦの存在を示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｃ．ディフィシル菌株リボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩＩを検出および同定するために請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法において使用するための、ＤＳＭＺ（Braunschweig, Deutschland）にＤＳＭ  ＡＣＣ２９１６（ＴＧＣ１９）の名称で寄託されたハイブリドーマ細胞系から製造されるモノクローナル抗体。
【請求項１４】
Ｃ．ディフィシル菌株リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦを検出および同定するために請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法において使用するための、ＤＳＭＺ（Braunschweig, Deutschland）にＤＳＭ  ＡＣＣ２９１７（ＴＧＣ２３）の名称で寄託されたハイブリドーマ細胞系から製造されるモノクローナル抗体。
【請求項１５】
リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦ、および／またはリボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩＩを有するＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するために請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法において使用するための、ＤＳＭＺ（Braunschweig, Deutschland）にＤＳＭ  ＡＣＣ２９１５（ＴＧＣ１６）の名称で寄託されたハイブリドーマ細胞系から製造されるモノクローナル抗体。
【請求項１６】
リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦ、および／またはリボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩＩを有するＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するために請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法において使用するための、ＤＳＭＺ（Braunschweig, Deutschland）にＤＳＭ  ＡＣＣ２９１８（ＴＧＣ３５）の名称で寄託されたハイブリドーマ細胞系から製造されるモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
クリストリジウムディフィシルは、３〜６μｍの長さおよび約０．５μｍの幅を有する、偏性嫌気性のグラム陽性桿菌である。クロストリジウム属は、バチルス科に属する。抗生物質関連大腸炎の重要な病原菌としてのＣ．ディフィシルの発見は、７０年代の終わり頃である。Ｃ．ディフィシルの名称は、培養におけるゆっくりとした増殖および細菌の困難な単離に由来する。捕足血液寒天培地上で、大きく、灰色半透明のコロニーが溶血現象なく増殖する。すべてのクロストリジウムのように、Ｃ．ディフィシルは芽胞形成能を有する。この方法で、この細菌は極端な環境条件下であっても生存することができる。
【０００２】
健康な成人は、胃腸管中に２〜７％だけのＣ．ディフィシルを有する。抗生物質治療の間に、生理的寄生菌の保護作用が阻害され、かつ腸においてＣ．ディフィシルで覆われる。このようにして生じるクロストリジウムディフィシル関連疾患（ＣＤＡＤ）は、存在するＣ．ディフィシル菌株の毒性に依存して、その深刻度に関しては様々である。臨床的所見は、軽度の下痢から発熱および痙攣様の腹痛を伴う深刻な偽膜性大腸炎および深刻な合併症、たとえば大腸穿孔、敗血症および中毒性巨大結腸に亘る。毒性の要因として、先ず、エンテロトキシン（トキシンＡ）およびサイトトキシン（トキシンＢ）が挙げられる。これらの毒素は、大型クロストリジウム毒素（ＬＣＴ、大クロストリジウム毒素）のファミリーに属し、かつ、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する。その上いくつかの菌株は、さらなる毒性の要因として議論されている２成分毒素ＣＤＴ（ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ）のための遺伝子を有する。
【０００３】
Ｃ．ディフィシル菌株は、いわゆる標準菌株とその変異体との間で区別される。標準Ｃ．ディフィシル菌株は、一般にトキシノタイプ０の菌株と呼称される。これに関して、種々のリボタイプ、たとえば００１、００３および０１２を有する菌株が含まれる。トキシノタイプ０の菌株の菌株は、トキシンＡおよびＢ双方の遺伝子の存在、その代わりに２成分毒素の遺伝子の欠失によって特徴付けられる。
【０００４】
近年、標準Ｃ．ディフィシル菌株以外の数多くの異なるＣ．ディフィシル変異株が、次第に増大する臨床的重要性を有し、かつさらにペット（特にイヌ、ネコ）および家畜（特にウシおよびブタ）で検出されていることが示された。
【０００５】
そうこうするうちに２００３年以来、カナダ、米国、イギリスおよび他の多くの欧州の国々で、その土地でしばしば発生する、Ｃ．ディフィシル菌株による深刻な感染症が観察された。
【０００６】
これらの深刻な感染症との関係で単離されたＣ．ディフィシル変異株は、トキシンＡに関する遺伝子（ｔｃｄＡ）およびＢ（ｔｃｄＢ）と同様にＣＤＴに関する遺伝子を有し、かつ、その調節遺伝子ｔｃｄＣにおける部分的欠失を示す。
【０００７】
ＰＣＲ−リポタイプ０２７、トキシノタイプＩＩＩ、ＲＥＡ−Ｂ１およびＰＦＧＥ  ＮＡＰ１由来のこれらの高い毒性のＣ．ディフィシル菌株は、調節遺伝子ｔｃｄＣ中で１８ｂｐの欠失および１１７位でのフレームシフトを有し、この場合、これは、そのｉｎ ｖｉｔｒｏで証明された増加した毒素産生の要因として、かつその増加した毒性の原因として推測される。これらの菌株は、さらに通常のＣ．ディフィシル菌株と比較して変化した表面タンパク質およびヒト腸上皮細胞に対する増加した付着性を示すことにより特徴付けられる。さらにこれらの菌株は、ｇｒｙＡ／Ｂに関する遺伝子および２３ｓＲＮＡにおける変異に基づいて、フロロキノロンの作用物質クラスの抗生物質に対して、ならびに抗生物質エリスロマイシンに対して耐性であることが推測される。
【０００８】
以下、これらの高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株を「Ｃ．ｄ．−０２７−ｈｖ」と略す。
【０００９】
これまでＣ．ディフィシルによる感染の多くの患者は６０歳以上であったが、Ｃ．ｄ．−０２７−ｈｖはさらに若い患者において、かつさらに病院以外では従来少ないリスクを有する患者においても検出される。その死亡率は、従来検出されたＣ．ディフィシル菌株に対して５倍程度増加する。
【００１０】
臨床的に関連するＣ．ディシル菌株の他の群は、リボタイプ０１７、トキシンタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦとしてクラス分けされる。これらの菌株は、ｔｃｄＡ遺伝子中で１．７ｋＢの大きな欠失を示し、かつ早期の停止コドンに基づいてトキシンＡを発現しないことによって基本的には特徴付けられる。この菌株は、クリンダマイシンおよびフルオロキノロンに対する抗生物質耐性を示し、これは２成分毒素ＣＤＴに関する遺伝子を欠失しており、かつさらに調節遺伝子ｔｃｄＣの欠失を示す。このような菌株の発生は、特に米国、日本、イスラエル、アイルランドおよびオランダにより報告されている。このような感染症の患者の死亡率は、標準菌株の死亡率を１４〜６６％上回る。
【００１１】
以下、これらの高い毒性を有するＣ．ディフィシル変異株を「Ｃ．ｄ．−０１７−ｈｖ」と略す。
【００１２】
Ｃ．ディフィシルの診断学的検出は、通常、トキシンＡの検出により実施され、ヒトの場合にはさらにトキシンＡとＢとの組合せ検出を実施する。Ｃ．ディフィシル変異株の検出はこの方法では可能ではない。変異菌株は、全く検出されないか（トキシンＡ陰性菌株）あるいは個々には検出されない。
【００１３】
変異したＣ．ディフィシル変異株の同定および特徴付けのために、これらを類型化することは必要不可欠である。Ｃ．ディフィシルを類型化するための方法は、技術水準から知られており、たとえばトキシノタイプ、セロタイプ、リボタイプによる類型化であるか、あるいはＰＲＧＥまたはＲＥＡによる類型化である。しかしながらこれらすべての方法は、手間と時間がかかり、特定の実験室においてのみ実施されるものであって、あらかじめ、対象となるＣ．ディフィシル菌株のコストのかかる単離を必要とする。
【００１４】
特定のＣ．ディフィシル菌株を正確に同定するために、さらに、大抵においてなおもさらなる試験が要求され、これはたとえばＣ．ｄ．−０２７−ｈｖの場合には、抗生物質耐性およびｔｃｄＣ遺伝子における欠失の検出である。
【００１５】
したがって、実験室内の実施における、たとえばＣ．ｄ．−０２７−ｈｖの存在についての試験は、たとえば以下の方法である：
１．Ｃ．ディフィシルの検出を、一般にイムノアッセイによる患者の糞便におけるトキシンＡおよび／またはＢの検出により実施し、
２．陽性である場合：試験材料からのＣ．ディフィシル細菌を培養し、
３．細菌を適切に単離する場合：Ｅ−テスト中で、エリスロマイシン耐性およびモキシフロキサシン耐性の存在について試験し、
４．陽性の耐性検出の場合：リボタイプ０２７の存在について、ＤＮＡ調製およびリボゾームＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増殖により試験し（リボタイプ類型化）（図１）、
５．リボタイプ０２７が陽性検出である場合：トキシン遺伝子ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢの双方、２成分毒素ＣＤＴのための遺伝子ｃｄｔＡ／Ｂおよび調節遺伝子ｔｃｄＣにおける欠失を検出するために、部分的遺伝子型の類型化を行い、
６．試験された抗生物質耐性の双方および特徴付けされた遺伝子型パターンのすべての特徴が存在する場合：高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０２７（Ｃ．ｄ．−０２７−ｈｖ）の診断を行う。
【００１６】
他の変異株および高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株のための類似する一連のものである、この従来の実験室内の実施における欠点は、特に、これは極めて時間消費的であることからなる：病原菌の単離および培養、抗生物質耐性の測定およびリボタイプ類型化のために７〜１０日間の期間が必要である。
【００１７】
医原性感染（院内感染）を回避し、かつ感染発生を制御する目的での最適な感染の監視のために、さらに患者および医療従事者を保護すると同時にコスト削減の理由から、この同定方法は特に迅速かつ可能な限り正確でなければならない。
【００１８】
したがって本発明は、試料、特に患者試料（ヒトまたは動物の患者の試料）中における変異したＣ．ディフィシル菌株の迅速かつ安全な検出および同定のための方法を提供することに基づく。
【００１９】
問題を解決するためのこの一連の課題は、特に（ｉ）種々のＣ．ディフィシル菌株の毒素が、無類の領域により異なるものではないこと、（ｉｉ）特定のＣ．ディフィシル菌株のＬＣＴｓに対する特異的抗体を製造することは並大抵のことであること（ＥＵは、たとえば特定の研究プログラムＮｏ．３７８７０、頭文字"ＥＡＣＣＡＤ"に資金提供し、この場合、これはＣ．ｄ．−０２７−ｈｖ菌株の研究を取り扱うものであって、かつ特にＣ．ｄ．−０２７−ｈｖ菌株由来のＬＣＴｓに対するこのような抗体の産生を目的としている）、（ｉｉｉ）２成分毒素ＣＤＴは、さらに他のＣ．ディフィシル菌株から形成されること、および（ｉｖ）特定の遺伝子、たとえばｔｃｄＣにおける変異は、一般には糞便試料中で免疫学的に検出されるものではないこと、からなる。
【００２０】
これらの課題は、以下の工程により特徴付けられる方法を提供することにより解決される：
（ａ）ヒトまたは動物の患者の生体排泄物試料および／または生体組織試料を獲得し、
（ｂ）この試料を、グループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グリープＶおよびグループＶＩの少なくとも３種の抗体グループからのそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させ、その際、
グループＩは以下の抗体：ｐａｎ−ＴｃｄＢ抗体、を含み、
グループＩＩは以下の抗体：トキシンＴｃｄＢ−１０４６３およびＴｃｄＢ−０１７と反応するが、トキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０２７とは反応しない抗体、を含み、
グループＩＩＩは以下の抗体：ＴｃｄＢ−１０４６３とは反応するが、トキシンＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄＢ−０２７とは反応しない抗体、を含み、
グループＩＶは以下の抗体：トキシンＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄＢ−０２７とは反応するが、トキシンＴｃｄＢ−１０４６３とは反応しない抗体、を含み、
グループＶは以下の抗体：トキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０２７と反応するが、トキシンＴｃｄＢ−１０４６３およびＴｃｄＢ−０１７とは反応しない抗体、を含み、
グループＶＩは以下の抗体：ｐａｎ−ＴｃｄＡ抗体、を含み、
（ｃ）抗体反応を検出し、かつ反応パターンを作成し、その際、それぞれ抗体グループＩ〜ＶＩのそれぞれ（ｂ）で使用された抗体を、検出された陽性抗体反応に関しては正の符号（たとえば"＋"）および検出された陰性抗体反応に関しては負の符号（たとえば"−"）に分類し、かつ、
（ｄ）（ｃ）で得られた反応パターンと参考試料とを比較し、この場合、この参考試料は、技術水準において公知であり、かつ検出試験においてその存在を試験すべきＣ．ディフィシル菌株Ｒｘ１、Ｒｘ２、Ｒｘｉからのそれぞれの大クロストリジウム毒素（ＬＣＴ）ＬＣＴ−Ｒｘ１、ＬＣＴ−Ｒｘ２、ＬＣＴ−Ｒｘｉの少なくとも１種を、抗体グループＩ〜ＶＩの少なくとも３種からなる工程（ｂ）で選択された抗体との反応試験中で使用し、かつそれぞれのＬＣＴおよび抗体グループＩ〜ＶＩの少なくとも３種に関して得られた反応結果を、それぞれの抗体グループが、検出された陽性抗体反応の場合には正の符号（たとえば"＋"）であるか、検出された陰性抗体反応の場合には負の符号（たとえば"−"）に分類されるようにしてパターン状に記録することにより得られたものであり、
（ｅ）（ｃ）で得られた反応パターンと参考パターンとの間の一致を、試料中において該当する参考パターンのＣ．ディフィシル菌株が存在することに関する指標として評価する、ことにより特徴付けられる。
【００２１】
これに関してかつ以降において、次の意味を有する：
ＬＣＴ：大クロストリジウム毒素、すなわちＣ．ディフィシル由来のトキシンＡおよび／またはＢ、
ＴｃｄＢ−１０４６３：Ｃ．ディフィシル菌株ＶＰＩ−１０５６３のトキシンＢ（＝「標準−トキシン」）
ＴｃｄＢ−８８６４：Ｃ．ディフィシル菌株８８６４のトキシンＢ
ＴｃｄＢ−１４７０：Ｃ．ディフィシル菌株１４７０のトキシンＢ
ＴｃｄＢ−７００２／８：Ｃ．ディフィシル菌株７００２／８のトキシンＢ
ＴｃｄＢ−０１７：リボタイプ０１７を有するＣ．ディフィシル菌株のトキシンＢ
ＴｃｄＢ−０２７：リボタイプ０２７を有するＣ．ディフィシル菌株のトキシンＢ
ｐａｎ−ＴｃｄＡ−抗体：すべての病原菌Ｃ．ディフィシル菌株のＴｃｄＡ−タンパク質を認識する抗体（たとえばＴＴＣ８）
ｐａｎ−ＴｃｄＢ−抗体：すべての病原菌Ｃ．ディフィシル菌株のＴｃｄＢ−タンパク質を認識する抗体（たとえば２ＣＶ、ＴＧＣ３５）。
【００２２】
本発明による方法の教示は、
（１．）Ｃ．ディフィシル由来のＬＣＴｓに対して、すなわち、トキシンＡまたはトキシンＢに対して調製された抗体を６個のグループに分類できるといった驚くべき発見に基づくものであり、これらのグループは、以下のような特徴を有する：
グループＩ＝ｐａｎ−ＴｃｄＢ抗体ＴＧＣ３５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１８）および２ＣＶ（ＤＳＭ  ＡＣＣ２３２１）、ならびにＴＧＣ３５および／または２ＣＶと機能的および作用的に同一の抗体、
グループＩＩ＝標準−トキシンＴｃｄＢ−１０４６３および変異したＴｃｄＢ−０１７と反応するが、変異したトキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０２７とは反応しない抗体、特に抗体ＴＧＣ２３（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１７）およびこれと機能的および作用的に同一の抗体、
グループＩＩＩ＝標準−トキシンＴｃｄＢ−１０４６３と反応するが、変異したトキシンＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄＢ−０２７と反応しない抗体、特に抗体ＴＧＣ４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１９）およびこれと機能的および作用的に同一の抗体、
グループＩＶ＝変異したトキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０１７ならびにＴｃｄＢ−０２７とは反応するが、標準−トキシンＴｃｄＢ−１０４６３とは反応しない抗体、特に抗体ＴＧＣ１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１５）およびこれと機能的および作用的に同一の抗体；
グループＶ＝変異したトキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０２７とは反応するが、標準−トキシンＴｃｄＢ−１０４６３および変異したＴｃｄＢ−０１７とは反応しない抗体、特に抗体ＴＧＣ１９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１６）およびこれと機能的および作用的に同一の抗体、
グループＶＩ＝すべての病原菌Ｃ．ディフィシル菌株のＴｃｄＡ−タンパク質と反応するｐａｎ−ＴｃｄＡ抗体、特に抗体ＴＴＣ８（ＤＳＭ  ＡＣＣ２３２２）およびこれと機能的および作用的に同一の抗体（たとえばＵＳ４８７９２１８中に記載された抗体ＰＣＧ４）；
及び
（２．）従来公知の毒性の変異したＣ．ディフィシル菌株またはそのＬＣＴｓがこれら６個のグループの抗体により、特にそのトキシンＢをＩ〜Ｖの５種のグループの抗体により、それぞれ特徴的な反応パターンを示すといった驚くべき発見に基づくものであり、この場合、この反応パターンは、他の（高い）毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株の毒素の反応パターンならびに標準Ｃ．ディフィシル菌株の毒素の反応パターンとは異なる。たとえば、高い毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株Ｃ．ｄ−０２７−ｈｖが、グループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩの順序での反応パターン"＋−−＋＋＋"により特徴付けられる一方で、同様に高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株Ｃ．ｄ−０１７−ｈｖは、反応パターン"＋＋−＋−−"（同様にグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩの順序による）により特徴付けられる。
【００２３】
現在知られており、かつ診断的に相当する毒性を有する変異した種々のＣ．ディフィシル菌株を同定および検出するために、一般には、異なる少なくとも３種の抗体グループからそれぞれ少なくとも１種の抗体が必要不可欠であり、かつ十分である。たとえば、通常の相当する変異したＣ．ディフィシル菌株由来のＣ．ディフィシル菌株Ｃ．ｄ−０２７−ｈｖと、標準−Ｃ．ディフィシル菌株を区別するために、３種のグループＩＩ、ＩＶおよびＶＩの反応パターン、すなわち"−＋＋"（グループＩＩ、ＩＶ、ＶＩの順序による）が十分であり、Ｃ．ディフィシル菌株Ｃ．ｄ−０１７−ｈｖの識別または同定のために、３種のグループＩＩ、ＩＶおよびＶＩの反応パターン、すなわち"＋＋−"（同様にグループＩＩ、ＩＶ、ＶＩの順序による）が十分である。
【００２４】
本発明による方法を用いた場合には、特に以下の利点を伴う：
直接、糞便試料に基づいて、簡単な試験により、かつ数時間内に、定められた高い毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株が存在するか否かについて確認することができる。Ｗｉｒｄらは、たとえばＣ．ｄ−０２７−ｈｖの存在について試験し、かつ、抗体グループＩ、ＩＶ、Ｖおよび／またはＶＩの少なくとも１種からなる１の抗体に対して陽性反応が示されない抗原−抗体反応パターンが得られる場合には、Ｃ．ｄ−０２７−ｈｖ型の菌株が存在しないと間違いなく診断することができる。４種の抗体グループＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩのすべてに対する抗原−抗体反応パターンが陽性反応を示す場合には、極めて高い可能性で、Ｃ．ｄ−０２７−ｈｖ菌株での感染が存在する。疑惑診断を確認するためにはその後に、抗生物質耐性、リボタイプ類型化および／または遺伝子分析（トキシン遺伝子ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢおよびｔｃｄＡ／Ｂの検出ならびに特徴的欠失およびフレームシフトによるレギュレータ遺伝子ｔｃｄＣの検出）の、時間およびコストのかかる特別な分析を実施することができ、またこれを実施すべきである。いいかえれば：本発明による方法は、従来の試験方法における最初の３個の工程（トキシン検出、細菌培養、抗生物質耐性）を置換し、かつ本質的に短縮された時間で、すなわち、従来数日かかるところを数時間で、試験すべき変異されたＣ．ディフィシル菌株、たとえばＣ．ｄ．−０２７−ｈｖによる感染が存在しない場合を、少なくとも間違いなく排除する診断が可能である。本発明による方法は、試験すべき変異したＣ．ディフィシル菌株、たとえばＣ．ｄ．−０２７−ｈｖまたはＣ．ｄ−０１７−ｈｖの存在を示される場合にはじめて、従来の試験方法において要求される時間およびコストのかかるさらなる工程（４、５および６）を実施する。
【００２５】
さらに、たとえば予防的措置、たとえば分離、隔離、厳しい衛生的措置は、Ｃ．ｄ．−０２７−ｈｖ感染またはＣ．ｄ−０１７−ｈｖ感染のリスクが、本発明による検出試験の結果に基づいて実際に高いレベルで示される場合には、その後に集中的に使用することができる。
【００２６】
グループＩ〜ＶＩの抗体は、特にモノクローナル抗体である。原則として、本発明による方法のための抗体としてさらに当業者に公知の、天然の生物工学的に製造されたか、あるいは遺伝子光学的に製造された抗体代替物のすべて、たとえばキメラ抗体（Nanobodies）、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、アンチカリン、システイン−ノットミニタンパク質を考慮することができる。
【００２７】
本発明の一の実施形態において、その実施において極めて良好であると証明されるのは、グループＩからの少なくとも１種の抗体がモノクローナル抗体２ＣＶ（ＤＳＭ  ＡＣＣ２３２１）またはモノクローナル抗体ＴＧＣ３５（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１８）であること、および／またはグループＩＩからの少なくも１種の抗体がモノクローナル抗体ＴＧＣ２３（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１７）であること、および／またはグループＩＩＩからの少なくとも１種の抗体がモノクローナル抗体ＴＧＣ４１（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１９）であること、および／またはグループＩＶからの少なくとも１種の抗体がモノクローナル抗体ＴＧＣ１６（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１６）であること、および／またはグループＶからの少なくとも１種の抗体がモノクローナル抗体ＴＧＣ１９（ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１６）であること、および／またはグループＶＩからの少なくとも１種の抗体がモノクローナル抗体ＴＴＣ８（ＤＳＭ  ＡＣＣ２３２２）であることである。
【００２８】
生体排泄物試料は、その実施において特に糞便試料であり、かつ生体組織試料は特に血液試料である。
【００２９】
変異したＣ．ディフィシル菌株の迅速かつ確実な検出が可能であることからその実施において特に適した方法のさらなる実施形態は、工程（ｂ）中で、試料をそれぞれグループＩ、ＩＶおよびＶＩからなるそれぞれ１種の抗体と接触させ、かつ工程（ｃ）中で、グループＩ、ＩＶおよびＶＩからの抗体の陽性反応が、高い毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株の存在を示すことにより特徴付けられる。
【００３０】
高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩＩの迅速かつ信頼性の高い検出を可能にし、かつそれによってＣ．ｄ．−０２７−ｈｖ試験の疑惑を低減させる方法の、実施のために特に適した実施形態は、工程（ｂ）において、試料を、それぞれ抗体グループＩＩ、グループＩＶおよびグループＶＩからなるそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させ、かつ工程（ｃ）において、グループＩＶおよびグループＶＩからの抗体の陽性反応、ならびにグループＩＩからの１種またはそれ以上の抗体の陰性反応が、リボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１、トキシノタイプＩＩＩの型の高い毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株の存在を示すことにより特徴付けられる。この実施形態はなおも、工程（ｂ）において試料を、抗体グループＩおよび／または抗体グループＩＩＩおよび／または抗体グループＶのそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させることにより、かつ工程（ｃ）中でさらにグループＩおよびグループＶからの１種またはそれ以上の抗体との陽性反応、ならびにグループＩＩＩからの１種またはそれ以上の抗体との陰性反応により、リボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１、トキシノタイプＩＩＩの高い毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株の存在を示すことにより拡張することができる。
【００３１】
高い毒性を有するＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦの迅速かつ信頼性の高い検出を可能にし、かつそれによってＣ．ｄ．−０１７−ｈｖ試験の疑惑を低減させる方法の、実施のために同様に特に適したさらなる実施形態は、工程（ｂ）中で、試料をそれぞれグループＩＩ、グループＩＶおよびグループＶＩの抗体グループからの少なくとも１種の抗体と接触させ、かつ工程（ｃ）中でグループＩＩおよびグループＩＶからの抗体との陽性反応、ならびにグループＶＩからの１種またはそれ以上の抗体との陰性反応が、リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦの型の高い毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株の存在を示すことにより特徴付けられる。この実施形態はなおも、工程（ｂ）において試料を、抗体グループＩおよび／または抗体グループＩＩＩおよび／または抗体グループＶのそれぞれ少なくとも１種の抗体と接触させることにより、かつ工程（ｃ）中でさらにグループＩからの１種またはそれ以上の抗体との陽性反応、ならびにグループＩＩＩおよびグループＶからの抗体との陰性反応により、リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦの高い毒性を有する変異したＣ．ディフィシル菌株の存在を示すことにより拡張することができる。
【００３２】
本発明の基礎となる課題は、ＤＳＭＺ（Braunschweig, Deutschland）に２００８年６月５日付けで寄託された名称ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１６（ＴＧＣ１９）のハイブリドーマ細胞系から製造され、かつ本発明による方法において変異したＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するために、特に、Ｃ．ディフィシル菌株リボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩＩを検出および同定するための変法に適しており、かつこのような使用が予定される、モノクローナル抗体を調製することにより解決される。
【００３３】
上記課題はさらに、ＤＳＭＺ（Braunschweig, Deutschland）に２００８年６月５日付けで寄託された名称ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１７（ＴＧＣ２３）のハイブリドーマ細胞系から製造され、かつ本発明による方法において変異したＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するために、特にＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦを検出および同定するための変法に適しており、かつこのような使用が予定される、モノクローナル抗体を調製することにより解決される。
【００３４】
上記課題はさらに、ＤＳＭＺ（Braunschweig, Deutschland）に名称ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１５（ＴＧＣ１６）として寄託されたハイブリドーマ細胞系から製造され、かつ試料中において、変異したＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するための方法において、特にリボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦを有するＣ．ディフィシル菌株、および／またはリボタイプ０２７、ＰＦＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩＩを有するＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するための変法における使用に適しており、かつこのような使用が予定される、モノクローナル抗体を提供することにより解決される。
【００３５】
上記課題はさらに、ＤＳＭＺ（Braunschweig, Deutschland）に名称ＤＳＭ  ＡＣＣ２９１８（ＴＧＣ３５）として寄託されたハイブリドーマ細胞系から製造され、かつ試料中において、変異したＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するための方法、特にリボタイプ０１７、トキシノタイプＶＩＩＩおよびセロタイプＦを有するＣ．ディフィシル菌株、および／またはリボタイプ０２７、ＰＥＧＥ−ＮＡＰ１、ＲＥＡ−Ｂ１およびトキシノタイプＩＩＩを有するＣ．ディフィシル菌株を検出および同定するための変法における使用に適しており、かつこのような使用が予定される、モノクローナル抗体を提供することにより解決される。
【００３６】
本発明を次に実施例に基づき詳細に説明する：
実施例中に挙げられた図を以下に示す：
図１：使用された菌株のリボタイプの類型化
菌株はStubbsらの方法によりリボタイプの類型化を実施し、かつ参考菌株との調整により種々のリボタイプに分類した。これに関して、菌株ＶＰＩ−１０４６３および菌株８８６４は、従来知られていないリボタイプであり、かつ菌株１４７０はリボタイプ０１７に、かつ菌株７００２／８はリボタイプ０２７に分類した。マーカーバンドは、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐおよび３００ｂｐ（上から）で流した。
【００３７】
図２：精製されたトキシンＢ変異体
種々のトキシン１３個の変異体を、クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で示す。それぞれのトキシンを１レーンあたり２５０〜４００ｎｇ使用する。
【００３８】
図３：モノクローナル抗トキシンＢ抗体の特異性の検出
種々のトキシンＤ変異体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に導入し、ナイロン膜上にブロットし、引き続いて相当する抗体により発現させた。モノクローナル抗体ＴＧＣ３５（図３Ａ）、ＴＧＣ１６（図３Ｂ）、ＴＧＣ４１（図３Ｃ）、ＴＧＣ２３（図３Ｄ）およびＴＧＣ１９（図３Ｅ）の特異性が示される。
【００３９】
図４：モノクローナル抗体の結合領域
図４Ａは、トキシンＢの構造を図示したものである。図４Ｂは、トキシンＢ内部の抗体の結合領域を表したものである。図４Ｃはモノクローナル抗体の反応性を示す。
【００４０】
図５：Ｃ．ディフィシル菌株の参考パターン
４種の異なるＣ．ディフィシル菌株の培養上清中におけるトキシンＡおよびトキシンＢ発現は、抗体グループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶＩからの捕捉抗体の使用下で、サンドウィッチＥＬＩＳＡ法により試験した。捕捉抗体として、グループＩ：ＴＧＣ３５、グループＩＩ：ＴＧＣ２３、グループＩＶ：ＴＧＣ１６、グループＶＩ：ＴＴＣ８からのものを使用した。Ｃ．ディフィシル菌株の認識パターンは、ＶＰＩ−１０４６３（図５Ａ）、８８６４（図５Ｂ）、１４７０リボタイプ０１７（図５Ｃ）および７００２／８リボタイプ０２７（図５Ｄ）を示す。
【００４１】
図６：捕捉ＥＬＩＳＡ法中の種々のＣ．ディフィシル菌株の反応パターン
同定抗体として、グループＩからＴＧＣ３５、グループＩＩからＴＧＣ２３、グループＩＶからＴＧＣ１６およびグループＶＩからＴＴＣ８を使用した。図６Ａにおいて、種々のＣ．ディフィシル菌株の結果および図６Ｂにおいて、さらなるＣ．ディフィシル菌株の結果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】使用された菌株のリボタイプを示す図
【図２】精製されたトキシンＢ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる図
【図３】特異的モノクローナル抗トキシンＢ抗体の検出を示す図
【図４】モノクローナル抗体の結合領域を示す図（Ａ：トキシンＢの構造を示す図、Ｂ：トキシンＢの内部構造を示す図、Ｃ：モノクローナル抗体の反応性を示す図）
【図５Ａ】Ｃ．ディフィシル菌株ＶＰＩ−１０４６３の培養上清中でのトキシンＡおよびＢの発現を示す図
【図５Ｂ】Ｃ．ディフィシル菌株８８６４の培養上清中でのトキシンＡおよびＢの発現を示す図
【図５Ｃ】Ｃ．ディフィシル菌株１４７０の培養上清中でのトキシンＡおよびＢの発現を示す図
【図５Ｄ】Ｃ．ディフィシル菌株７００２／８の培養上清中でのトキシンＡおよびＢの発現を示す図
【図６Ａ】種々のＣ．ディフィシル菌株の捕捉ＥＬＩＳＡ法における結果を示す図
【図６Ｂ】種々のＣ．ディフィシル菌株の捕捉ＥＬＩＳＡ法における結果を示す図
【実施例】
【００４３】
例１：Ｃ．ディフィシル由来のトキシンＢと特異的に反応するモノクローナル抗体の製造
（Ａ）種々のＣ．ディフィシル菌株からの精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢの獲得
以下のＣ．ディフィシル菌株を使用した：
ＶＰＩ−１０４６３（ＡＴＣＣ４３２５５）、
８８６４（ＣＣＵＧ２０３０９）、
１４７０（ＡＴＣＣ４３５９８）、および
７００２／８（患者試料からのヒト単離物）
【００４４】
菌株を、Stubbsら（１９９９年）によるリボタイプ類型化法により、リボタイプを類型化した。これに関する結果は、図１に示す。これにより、菌株１４７０がリボタイプ０１７に、かつ菌株７００２／８がリボタイプ０２７に相当する一方、菌株ＶＰＩ−１０４６３および８８６４は従来知られていないリボタイプに分類されることが示された。
【００４５】
菌株ＶＰＩ−１０４６３由来の発現したトキシンＢ（ＴｃｄＢ−１０４６３）は、技術水準において一般に標準−トキシンと呼称される。
【００４６】
菌株８８６４は、特に標準−トキシンとはＣ−末端レセプター結合ドメインにおいて異なるこれらトキシンの変異体（ＴｃｄＢ−８８６４）を製造する（Soehnetら、１９９８年）。
【００４７】
菌株１４７０は、特に標準−トキシンＢとはＮ−末端酵素ドメインにおいて異なるトキシンＢ（ＴｃｄＢ−１４７０）を発現する（Eichel-Streiberら、１９９５年）。
【００４８】
菌株７００２／８リボタイプ０２７のトキシンＢの配列は知られていない。これとは対照的にＴｃｄＢ−０２７の配列は、２種の他のＣ．ｄ．−０２７−ｈｖ菌株において測定した（菌株ＱＣＤ−３２ｇ５８、ジーンバンク−Ａｃｃ．番号ＮＺ_ＡＭＬ００００００００、菌株Ｒ２０２９１、www.sanger.ac.uk）。これらのＴｃｄＢ−０２７配列と標準−トキシンＢおよび他の変異したＴｃｄＢ−トキシンとの比較は、このＴｃｄＢ−０２７が、Ｎ−末端酵素ドメイン中で標準−トキシンＴｃｄＢ−１０４６３に類似するが、しかしながらＣ−末端ドメインにおいては変異したトキシンＴｃｄＢ−８８６４に類似することが示す。
【００４９】
トキシンの精製のために、細菌を脳心臓浸出物栄養培地（Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland）中で嫌気性に導いた。引き続いてトキシンＡおよびＢをこれら培養物の上清から、Ｍｏｏｓら（２０００年）で記載されたようにして精製した。トキシンの純度はクマシーゲル中で試験した（図２参照）。
【００５０】
Ｃ．ディフィシル菌株ＶＰＩ−１０４６３、８８６４および１４７０の単離および精製されたＴｃｄＢは、技術水準で知られ、かつ一般に使用された方法を用いて不活性化され、かつ不活性化の成果を細胞毒性試験中で検査した。
【００５１】
（Ｂ）（Ａ）からのトキシンＢ−変異体に対するモノクローナル抗体の獲得
一連のバッチにおいて、それぞれ不活性化されたトキシンＢ変異体ＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−１４７０ならびに標準−トキシンＴｃｄＢ−１０１６３を用いてそれぞれ複数のマウスを基礎免疫し、引き続いて２回の追加免疫を行った。免疫原に対する動物のタイターを測定し、かつ有意なタイターが発見された場合には脾臓を摘出した。単離された脾臓細胞は、技術水準から公知であって、かつ一般的に使用された方法を用いて、マウス−ミエローマ細胞系Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）と融合させ、かつこの融合細胞を引き続いて選択し、かつクローニングした。このようにして得られたハイブリドーマ−クローンを、免疫化に使用すべきトキシンＢに対して特異的なモノクローナル抗体の製造において免疫的にスクリーニングした。
【００５２】
全部で１５個の融合を実施し、かつ最終的には２１個の異なるハイブリドーマ細胞系を単離し、この場合、この細胞系は、トキシンＢ特異的抗体を発現するものである。
【００５３】
さらなる試験のために、細胞培養上清からの抗体を精製した。このために、ハイブリドーマ細胞系を、血清不含の培地ＩＳＦ−１（Biochrom, Berlin, Deutschland）中に導入し、かつ引き続いて２５０ｍｌの容積中で、スピンナーシステム（Belico, Vineland, USA）中で、５０ｒｐｍで、培養物のバイタル値（Vitalitat）が３０％を下回るまで培養した。培養上清をプロテインＡカラム（HiTrap MabSelect SuRe, GE Healthcare, Freiburg, Deutschland）を用いて精製した。精製した抗体の濃度は１〜２ｍｇ／ｍｌであり、その純度はクマシーゲル中で試験した。
【００５４】
例２：抗トキシンＢ−抗体の特徴付け
例１で生成された抗体の特徴付けのために、これらの抗体を、ウェスタンブロットにおいて試験した。
【００５５】
さらに、先ずそれぞれ２５０〜４００ｎｇの標準−トキシンＢ−１０４６３およびトキシンＢ変異体ＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄＢ−０２７を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中に導入し、かつ引き続いてセミドライブロット法でナイロン膜上にブロッティングした。検出は、技術水準において公知の方法にしたがって実施した。トキシンの検出のために、例１で製造したモノクローナル抗体を使用した。
【００５６】
ＴＧＣ１６、ＴＧＣ１９、ＴＧＣ２３、ＴＧＣ３５およびＴＧＣ４１（それぞれ実験室における名称）を有する抗体に関する結果は、図３にまとめる：
この結果は、製造された抗体の大部分が種々のトキシンＢ変異体の亜群を識別し、かつ、特定のトキシン変異体のみが単一特異性でないことを示す。
【００５７】
全部で１１個の種々の抗体を同定し、この場合、これは標準−トキシンＢおよびすべてのトキシンＢ変異体と結合する。これらのいわゆるｐａｎ−ＴｃｄＢ抗体の特徴付けられた典型例は抗体ＴＧＣ３５である。このＴＧＣ３５を製造するハイブリドーマ細胞系は、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zeilkulturen, Braunschweig, Deutschland）に２００８年６月５日付けでＤＳＭ  ＡＣＣ２９１８の名称で寄託されている。
【００５８】
いくつかの抗体は、標準トキシンと同様にトキシンＴｃｄＢ−０７と反応する。これら抗体グループの特徴的な典型例は、抗体ＴＧＣ２３である。このＴＧＣ２３を製造するハイブリドーマ細胞系は、ＤＳＭＺに２００８年６月５日付けでＤＳＭ  ＡＣＣ２９１７の名称で寄託されている。
【００５９】
いくつかの抗体は、標準−トキシンＴｃｄＢ−１０４６３と特異的に反応する。この抗体グループの特異的な典型例は、抗体ＴＧＣ４１である。このＴＧＣ４２を製造するハイブリドーマ細胞系は、ＤＳＭＺに２００８年６月５日付けでＤＳＭＡＣＣ２９１９の名称で寄託されている。
【００６０】
驚くべきことに、さらに２種の抗体を製造することができ、この場合、この抗体は、１種またはそれ以上のトキシンＢ変異体とは反応するが、標準−トキシンＢとは反応しない。
【００６１】
抗体ＴＧＣ１６は、標準トキシンＢとは結合しないが、しかしながら変異したトキシンＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄＢ−０２７とは良好に結合する。このＴＧＣ１６を製造するハイブリドーマ細胞系は、ＤＳＭＺに２００８年６月５日付けでＤＳＭ  ＡＣＣ２９１５の名称で寄託されている。
【００６２】
抗体ＴＧＣ１９は、標準トキシンＢまたは変異したトキシンＴｃｄＢ−０１７とは結合しないが、しかしながら変異したトキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０２７とは良好に結合する。このＴＧＣ１９を製造するハイブリドーマ細胞系は、ＤＳＭＺに２００８年６月５日付けでＤＳＭ  ＡＣＣ２９１６の名称で寄託されている。
【００６３】
抗体は、捕捉ＥＬＩＳＡ中でその抗原検出限界について試験した。これに関して、ＥＬＩＳＡプレートは１ウェルあたり５０μｌのコーティングバッファー（５０ｍＭ、Ｎａ２ＣＯ３、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）および２５０ｎｇの各抗体を用いて、３時間に亘って室温でインキュベートし、かつ、その際、抗体はＥＬＩＳＡプレートに堆積する。非特異的な結合部分は、２００μｌの５×ＷＡＰＵ（１２．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ１００、６２．５ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６２．５ｍｌの２０％濃度のゼラチン溶液、Ｈ２Ｏで５００ｍｌまでにする）を用いて、３０分に亘ってブロッキングした。引き続き、種々の濃度の抗原を、すなわち、ＴＧＣ１６およびＴＧＣ１９の場合には抗原ＴｃｄＢ−０２７を、ＴＧＣ２３およびＴＧＣ３５の場合には抗原ＴｃｄＢ−０１７を適用する。検出は、ポリクローナル血清で実施した（２６６ｎｇ／ｍｌ）。反応結果（ここには示していない）は、抗体ＴＧＣ１６およびＴＧＣ２３に関して、それぞれのトキシンＢに関する検出限界を＜３００ｐｇ／ｍｌであり、抗体ＴＧＣ３５に関しては１ｎｇ／ｍｌを下回り、かつ抗体ＴＧＣ１９に関しては１ｎｇ／ｍｌを下回ることを示す。
【００６４】
抗体ＴＧＣ１６、ＴＧＣ１９、ＴＧＣ２３、ＴＧＣ３５およびＴＧＣ４１は、トキシンＢに対するその結合位置に関して試験した。トキシンＢのタンパク質溶解による消化であるか、あるいはＥ．Ｃｏｌｉ中の組み換えトキシンＢ部分フラグメントのクローニングおよび発現によって、トキシンＢのタンパク質フラグメントを製造した。このトキシンＢ部分フラグメントは、ウェスタンブロット試験中で分離し、かつこのブロットを引き続いて抗体ＴＧＣ１６、ＴＧＣ１９、ＴＧＣ２３、ＴＧＣ３５およびＴＧＣ４１を用いてインキュベートした。この消化結果は図４に図示し、かつ個々の抗体がトキシンＢ分子の種々の領域を認識するか、あるいは結合することを示す：すべてのアミノ酸位置の記載は、標準−トキシンＴｃｄＢ−１０４６３中の相当する位置に関して示す。
【００６５】
ＴＧＣ１６はＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄ−０２７と、それぞれグリコシルトランスフェラーゼドメインの範囲内で結合し、かつここでアミノ酸位置１２２〜２６１の範囲内である。
【００６６】
ＴＣＧ１９はＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄ−０２７と、それぞれ、アミノ酸位置５４３〜２３６６の間のグリコシルトランスフェラーゼドメインの向こう側の範囲内で結合する。
【００６７】
ＴＧＣ２３は、標準−トキシンおよびＴｃｄＢ−０１７と、それぞれ、アミノ酸位置１６９２〜２１１３の間でＣ−末端から離れてリガンドドメイン中で結合する。
【００６８】
ＴＧＣ３５は、標準−トキシン、ＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄ−０２７と、それぞれ、トキシンのＮ−末端のグリコシルトランスフェラーゼドメインとＣ−末端のリガンドドメインとの間のトランスロケーションドメインの範囲内でアミノ酸位置５４３〜１６９２の間で結合する。
【００６９】
ＴＧＣ４１は、標準−トキシンとＴＧＣ１６と同様に結合し、これは、グリコシルトランスフェラーゼドメインの範囲内であり、かつそこではアミノ酸位置１２２〜２６１の範囲であることを意味する。
【００７０】
ＴＧＣ１６およびＴＧＣ４１は、同じトキシンＢ領域中、すなわち、グリコシルトランスフェラーゼ領域中で結合するが、しかしながら異なるトキシンＢ変異体、すなわち、一方において標準−トキシン（ＴＧＣ４１）と結合し、かつ他方においてＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄ−０２７（ＴＧＣ１６）と結合する。したがって、標準トキシンＢであるＴｃｄＢ−１０４６３と変異したトキシンＴｃｄＢ−８８６４、ＴｃｄＢ−０１７およびＴｃｄ−０２７との間で特異的識別が可能なトキシンＢ中での領域を初めて同定した。驚くべきことに、この領域はまさに、トキシンＢの酵素活性を介在するグリコシルトランスフェラーゼドメインである。この酵素活性は、原則、すべてのトキシンＢにおいて同一である。
【００７１】
一連の本発明による新たに製造された抗体は、抗体（抗体グループ／抗体クラス）とは異なるグループ（クラス）を作成し、この場合、これは、標準−トキシンＢとの反応性および種々のトキシンＢ変異体との反応性に関して互いに異なっている。
【００７２】
ｐａｎ−ＴｃｄＢ−抗体のグループは、以下グループＩと呼称する。このグループの典型例は、モノクローナル抗体ＴＧＣ３５および２ＣＶである（ＥＰ  ０９９４９０４から知られている）。
【００７３】
標準−トキシンおよびトキシンＴｃｄＢ−０１７と反応するが、しかしながら変異したトキシンＴｃｄＢ−０２７およびＴｃｄＢ８８６４とは反応しない、これら抗体のグループは、以下グループＩＩとして呼称する。このグループの典型例は、モノクローナル抗体ＴＧＣ２３である。
【００７４】
標準トキシンＴｃｄＢ−１０４６３と反応するが、しかしながら変異したトキシンＴｃｄＢ−０２７、ＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−１４７０とは反応しない、これら抗体のグループは、以下グループＩＩＩとして呼称する。このグループの典型例は、モノクローナル抗体ＴＧＣ４１である。
【００７５】
標準トキシンＢとは反応しないが、しかしながらトキシンＴｃｄＢ−８８６４、Ｔｃｄ−０１７およびＴｃｄＢ−０２７と良好に反応するこれら抗体のグループは、以下グループＩＶと呼称する。このグループの典型的な例は、モノクローナル抗体ＴＧＣ１６である。
【００７６】
標準トキシンＢまたはトキシンＴｃｄＢ−０１７とは反応しないが、しかしながらトキシンＴｃｄＢ−８８６４およびＴｃｄＢ−０２７とは良好に反応するこれら抗体のグループは、以下グループＶと呼称する。このグループの典型例は、モノクローナル抗体ＴＧＣ１９である。
【００７７】
文献からｐａｎ−ＴｃｄＡ特異的抗体のグループ以外のものが知られており、これは以下グループＶＩと呼称する。このグループの典型例は、モノクローナル抗体ＴＴＣ８である（ＥＰ０９９４９０４から知られている）。
【００７８】
例３：捕捉ＥＬＩＳＡ中でのＬｃｔｓの検出−抗体グループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶＩの使用下で公知の種々のＣ．ディフィシル菌株のための抗原抗体−参考パターンの作成
原則として、抗原抗体−参考パターンの作成を以下のようにして実施する：技術水準から公知であって、かつ検出試験中でその存在について試験すべきＣ．ディフィシル菌株Ｒｘ１、Ｒｘ２、ＲＸｉから、それぞれ少なくともトキシンＢ、特に双方の大クロストリジウムトキシン（ＬＣＴｓ）を獲得する（培養上清または精製トキシンの形で）。これら公知のトキシンＬＣＴ−Ｒｘ１、ＬＣＴ−Ｒｘ２、ＬＣＴ−Ｒｘｉを用いて、特にそれぞれ抗体グループＩ〜ＶＩからのそれぞれ少なくとも１種の抗体を用いて反応試験を実施する。それぞれのＬＣＴ（ＬＣＴ−Ｒｘ１、ＬＣＴ−Ｒｘ２、ＬＣＴ−Ｒｘｉ）および使用された抗体グループに関して得られた反応結果は、それぞれの抗体グループが、検出された陽性抗体反応の場合には正の符号（たとえば"＋"）であるか、あるいは検出された陰性抗体反応の場合には負の符号（たとえば"−"）に分類されるように記録する。
【００７９】
前記例では、具体的に以下のように実施した：
ＥＬＩＳＡプレートに、例２で記載した精製した抗体ＴＧＣ３５（グループＩ）、ＴＧＣ２３（グループＩＩ）、ＴＧＣ１６（グループＩＶ）およびＴＴＣ８（グループＶＩ）を以下のようにして添加した：１ウェルあたり、２５０ｎｇの各抗体を含む、５０μｌのコーティングバッファー（５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）を３時間に亘って室温でインキュベートし、かつ、その際、抗体は、ＥＬＩＳＡプレートに堆積した。引き続いて、非特異的な結合部分を、２００μｌの５×ＷＡＰＵ（１２．５ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ１００、６２．５ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６２．５ｍｌの２０％濃度のゼラチン溶液、Ｈ２Ｏで５００ｍｌまでにする）を用いて、３０分に亘ってブロッキングした。
【００８０】
Ｃ．ディフィシル菌株１０４６３、８８６４、１４７０および７００２／８は、例１に記載するようにして調製し、かつ培養上清の５０μｌのアリコートを、抗体で被覆されたマイクロタイタープレート上に提供した。非特異的に結合したタンパク質を、ＴＢＳＴ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）を用いて、３回の洗浄により除去した。引き続いて、場合によりそれぞれの抗体と結合したトキシンを、捕捉ＥＬＩＳＡ中で、５０μｌのポリクローナル抗トキシンＢ血清（２６６ｎｇ／ｍｌ）で検出した。検出を、標準的な方法で、アルカリホスファターゼを用いて実施した。
【００８１】
これらＥＬＩＳＡの結果は、図５に図示する。図５から、４種の異なるＣ．ディフィシル菌株のそれぞれが４種の使用された抗体を用いて、他の菌株の反応パターン異なるいくつかのその特異的な反応パターンを示すことが明らかである。
【００８２】
菌株ＶＰＩ−１０４６３の上清は、抗体ＴＧＣ３５／グループＩ、ＴＧＣ２３／グループＩＩおよびＴＴＣ８／グループＶＩと陽性に反応し、かつＴＧＣ１６／グループＩＶと陰性に反応する（図５Ａ参照）。
【００８３】
菌株８８６４の上清は、抗体ＴＧＣ３５／グループＩおよびＴＧＣ１６／グループＩＶと陽性に反応し、かつＴＧＣ２３／グループＩＩおよびＴＴＣ８／グループＶＩと陰性に反応する（図５Ｂ参照）。
【００８４】
菌株１４７０（リボタイプ０１７）の上清は、抗体ＴＧＣ３５／グループＩ、ＴＧＣ２３／グループＩＩおよびＴＧＣ１６／グループＩＶと陽性に反応し、かつ、ＴＴＣ８／グループＶＩと陰性に反応する（図５Ｃ参照）。
【００８５】
菌株７００２／８（リボタイプ０２７）の上清は、抗体ＴＧＣ３５／グループＩ、ＴＧＣ１６／グループＩＶおよびＴＴＣ８／グループＶＩと陽性に反応し、かつＴＧＣ２３／グループＩＩと陰性に反応する（図５Ｄ参照）。
【００８６】
リボタイプ０２７のＣ．ディフィシル菌株のトキシンＢと、抗体グループＩ〜ＶＩの抗体の種々の組合せとの平行試験におけるこれらの結果を検討することにより、ＴｃｄＢ−０２７とグループＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩの抗体とは常に陽性であり、かつグループＩＩおよびＩＩＩの抗体とは常に陰性に反応することが確認される。
【００８７】
いいかえれば：グループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グループＶ、グループＶＩの順序で６種の抗体グループの抗体との、公知ではないＣ．ディフィシル菌株のトキシンＢの反応パターン"＋−−＋＋＋"は、この公知ではないＣ．ディフィシル菌株がリボタイプ−０２７であり、さらにこれに関して高い毒性を有する菌株Ｃ．ｄ．−０２７ｈｖが含まれるとの推論を可能にする。
【００８８】
リボタイプ０１７のＣ．ディフィシル菌株のトキシンＢと、抗体グループＩ〜ＶＩの抗体の種々の組合せとの平行試験におけるこれらの結果を検討することにより、ＴｃｄＢ−０１７とグループＩ、ＩＩおよびＩＶの抗体とは常に陽性であり、かつグループＩＩＩ、ＶおよびＶＩの抗体とは常に陰性に反応することが確認される。
【００８９】
いいかえれば：グループＩ、グループＩＩ、グループＩＩＩ、グループＩＶ、グループＶ、グループＶＩの順序で６個の抗体グループの抗体との、公知ではないＣ．ディフィシル菌株のトキシンＢの反応パターン"＋＋−＋−−"は、公知ではないＣ．ディフィシル菌株がリボタイプ−０１７であり、さらにこれに関して高い毒性を有する菌株Ｃ．ｄ．−０１７ｈｖが含まれるとの推論を可能にする。
【００９０】
例４：抗原抗体反応−参考パターンに基づくＣ．ディフィシルリボタイプの同定
抗原抗体反応−参考パターンを作成するために、例３に記載されたようにして実施する。
【００９１】
試料−特異的反応パターンを作成するために、以下のようにして実施する：
試験すべきＣ．ディフィシル菌株を公知の方法で調製し、かつその上清または精製したトキシンを試験する。このためにグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩの少なくとも２種、特に３種または４種からなるそれぞれ少なくとも１種の抗体、たとえば抗体ＴＧＣ１６、ＴＧＣ１９、ＴＧＣ２３、ＴＧＣ４１、ＴＧＣ３５およびＴＴＣ８１を、当業者に公知であって、かつ一般的に使用されている方法で、適した表面、たとえば膜上に適用する。
【００９２】
引き続いて試料をこれら抗体（以下、同定抗体とする）と接触させる。これに関して適した方法は、当業者に知られており、たとえばＥＬＩＳＡまたはEP 1143248に記載されているようないわゆる「側方流（lateral flow）」法である。
【００９３】
工程特異的な反応時間の終了時において、それぞれのバッチから非結合試料材料を除去する（洗浄）。
【００９４】
いずれの同定抗体が試料との抗原抗体−反応を示し、かついずれが反応していないのか検出するために、検出抗体を使用する。検出抗体として、トキシンＡおよびトキシンＢに対するポリクローナル血清（単一特異性または交差反応性）を使用するか、あるいはさらにグループＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶまたはＶＩの１種またはそれ以上からなる抗体を使用する。検出抗体の選択に際して、その目的とするエピトープが、同定抗体の目的とするエピトープと異なるか、あるいは原則としてそれぞれのトキシン中で数倍存在することを考慮すべきであり、それにより、検出抗体は、トキシンとの複合体の形で同定抗体に結合することができる。検出抗体は、適したマーカー、たとえばコロイダルコールド、炭素粒子またはラテックス粒子であるか、あるいは酵素マーカー、たとえばＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）またはアルカリホスファターゼを用いて標識する。
【００９５】
検出抗体は、試料の適用前であるか、試料と一緒に、あるいは、同定抗体と試料との工程特異的な反応時間の終了後に、バッチに添加する。
【００９６】
工程特異的な反応時間の終了時に、同定抗体と結合していない試料−トキシンおよび試料中に同時に存在する汚染物であるタンパク質を除去し（洗浄除去）、同定抗体、試料−トキシンおよび検出抗体からなる複合体（Komplex）が形成される場合には、マーカーシグナル（正のシグナル"＋"）のみが生じる。
【００９７】
それぞれの同定抗体に関して得られるマーカーシグナル"＋"または"−"を、反応パターンの形でまとめる。このような反応パターンは、たとえば図５Ａのようにして表すことができる。この場合において、参考パターンとの比較は、Ｃ．ディフィシル菌株ＶＰＩ−１０４６３が存在するという結果（または疑惑診断）を導く。
【００９８】
反応パターンが、たとえば図５Ｂのようにして表される場合には、参考パターンとの比較はＣ．ディフィシル菌株８８６４が存在するという結果（疑惑診断）を導く。反応パターンがたとえば図５Ｂのようにして表される場合には、参考パターンとの比較は、Ｃ．ディフィシル菌株８８６４が存在するという結果（疑惑診断）を導く。反応パターンがたとえば図５Ｃのようにして表される場合には、参考パターンとの比較は、Ｃ．ディフィシル菌株１４７０またはＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０１７が存在するといった結果（疑惑診断）を導く。反応パターンが、たとえば図５Ｄのようにして表される場合には、参考パターンとの比較は、Ｃ．ディフィシル菌株７００２／８またはＣ．ディフィシル菌株リボタイプ０２７が存在するといった結果（疑惑診断）を導く。
【００９９】
例５：種々のＣ．ディフィシル菌株のグループＩ、ＩＩ、ＩＶ、ＶＩの抗体での分析
以下の試験において、種々のＣ．ディフィシル菌株を同定および検出するための本発明による方法を、公知のリボタイプを有する一連の菌株、すなわち、リボタイプ０２７（Lumc-1、Lumc-2、Lumc-3、Lumc-4、Lumc-5、Lumc-6、Lumc-8、Lumc-9、Lumc-10、Lumc-11、Lumc-12、Lumc-13、Lumc-14、Lumc-16、Lumc-17、Lumc-19、Lumc-20、Lumc-21、7002-42）の１９種の菌株、リボタイプ０１７の４種の菌株（Lumc-22、Lumc-23、Lumc-40、Lumc-41）、リボタイプ００１の２種の菌株（7002-29、7002-43）およびリボタイプ０１４の１種の菌株（Lumc-31）に基づいて実施した。参考菌株として、菌株ＶＰＩ−１０４６３、８８６４および７００２／８を使用した。グループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶＩの抗体は、捕捉ＥＬＩＳＡ中で使用し、かつ得られた反応パターンと作成された反応パターンとを比較した（例３参照）。
【０１００】
種々のＣ．ディフィシル菌株は例１に記載するようにして調製し、かつその上清を引き続いての試験において使用した。同定抗体として、抗体ＴＧＣ３５（グループＩ）、ＴＧＣ２３（グループＩＩ）、ＴＧＣ１６（グループＶＩ）を例３で記載したようにしてＥＬＩＳＡプレートに添加した。これに関してそれぞれ２５０ｎｇ／ウェルでＴＧＣ２３、１２８ｎｇ／ウェルでＴＧＣ１６およびＴＧＣ３５、ならびに１μｇ／ウェルでＴＴＣ８を使用し、かつこのプレートを引き続いてＰＢＳ中で洗浄した。
【０１０１】
ＥＬＩＳＡｓを実施するために、プレートの非特異的結合部分を先ずＰＢＳ＋３％ＢＳＡ中で、３７℃でインキュベートすることによりブロッキングした。引き続いてＣ．ディフィシル培養の上清５０μｌ／ウェルを適用し、かつこのプレートを再度３７℃で１時間に亘ってインキュベートした。非結合タンパク質を、ＰＢＳ＋３％ＢＳＡの３回の洗浄により除去した。検出抗体として、ＴＧＣ３５、ＴＧＣ１６およびＴＧＣ２３の場合には、ビオチン標識化ポリクローナル抗トキシンＢ血清（０．３２μｇ／ｍｌ）を使用した。トキシンＡ検出の場合には、ビオチン化された形での抗体ＴＴＣ８をさらに検出抗体として使用した。ＰＢＳ＋３％ＢＳＡでの再度の洗浄後に、１ウェルあたり５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（０．１μｇ／ｍｌ、Pierce, Rockford, USA）を添加し、かつこのプレートを３７℃で１時間に亘ってインキュベートした。引き続いてこのプレートをＰＢＳで洗浄し、かつ検出のために、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ（1-Step Ultra TMB、Pierce, Rockford, USA）を使用した。このプレートを室温で暗室下で３０分に亘ってインキュベートし、引き続いてこの反応を１００μｌ／ウェルの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４により停止した。評価はＯＤ４５０により空値に対して実施した。カットオフ値を０．５と定めた。
【０１０２】
この試験結果は、図６Ａおよび図６Ｂに模式図的に表す：
−  １９個の種々の菌株において、グループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶＩの順序で反応パターン"＋−＋＋"を検出した。
【０１０３】
−  ４個の種々のＣ．ｄ−０１７−ｈｖ菌株において、グループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶＩの順序で反応パターン"＋＋＋−"を検出した。０１７菌株の分析は、この菌株がｉｎ ｖｉｔｒｏで総じて相対的に少ない毒素を製造することを示す（さらにＴＧＣ３５シグナルも比較的弱いものである）。しかしながら、この菌株においてのみ、抗体ＴＧＣ２３（ＤＳＭＡＣＣ２９１７）とトキシンＢ−０１７との特異的反応が生じることが明らかである。すべての他の上清（すなわち、Ｃ．ｄ．−０２７−ｈｖ菌株ならびにすべての試験されたリボタイプ００１菌株）の場合における検出抗体ＴＧＣ２３の使用の再には、値が０．４を上回ることがないのに対してＣ．ｄ．−０１７−ｈｖ菌株は、それぞれカットオフ値０．５を顕著に上回る吸収値を示す。
【０１０４】
グループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶＩの順序での抗原−抗体反応パターン"＋−＋＋"は、試験された菌株がＣ．ｄ．−０２７−ｈｖ菌株であるといった結果を導き、かつグループＩ、ＩＩ、ＩＶおよびＶＩの順序での反応パターン"＋＋＋−"である場合には、Ｃ．ｄ．−０１７−ｈｖ菌株が存在することが結論付けられなければならない。
【０１０５】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ）】
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【図３Ｂ）】
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【図３Ｃ）】
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【図３Ｄ）】
0005591332.tif 000008
【図３Ｅ）】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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