(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造を区別して認識することができる、ヒト化モノクローナル抗体、または、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、並びにペプチドアプタマーから選択されるその抗体断片であって、
Ａ）配列番号７９のアミノ酸配列を有する重鎖可変部、および
Ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部を含む、前記ヒト化モノクローナル抗体またはその抗体断片を、薬学的に許容し得る担体との混合物において含む、Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を阻害するための医薬組成物。
【請求項２】
ヒト化モノクローナル抗体が、
Ｃ）配列番号２５４で表される定常部
をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を阻害するための医薬の製造における、１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造を区別して認識することができる、ヒト化モノクローナル抗体、または、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、並びにペプチドアプタマーから選択されるその抗体断片であって、
Ａ）配列番号７９のアミノ酸配列を有する重鎖可変部、および
Ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部を含む、前記ヒト化モノクローナル抗体またはその抗体断片の使用であって、ニューロンと接触させて、Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を阻害するようにすることを含む、前記使用。
【請求項４】
ヒト化モノクローナル抗体が、
Ｃ）配列番号２５４で表される定常部
をさらに含む、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造を区別して認識することができる、ヒト化モノクローナル抗体、または、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、並びにペプチドアプタマーから選択されるその抗体断片であって、
Ａ）配列番号７９のアミノ酸配列を有する重鎖可変部、
Ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部、および
Ｃ）配列番号２５４で表される定常部
を含む、前記ヒト化モノクローナル抗体またはその抗体断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
導入
本出願は、２００４年１０月２５日出願の米国暫定特許出願通番第60/621,776号、２００５年２月１４日出願の同第60/652,538号、２００５年６月３０日出願の同第60/695,526号および２００５年６月３０日出願の同第60/695,528号からの優先権の利益を請求し、これらの内容は、これらの全体において参照により本出願中に導入される。
【０００２】
本発明は、部分的に国立衛生研究所により出資された研究の過程でなされた（認可番号NIH RO1-AG18877およびNIH RO1-AG22547）。米国政府は、本発明においてある権利を有し得る。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アルツハイマー病は、進行性の、および変性の認知症である（Terryら(1991)、Ann. Neurol. 30:572-580; Coyle (1987)、Encyclopedia of Neuroscience, Adelman（編）、Birkhaeuser, Boston-Basel-Stuttgart, ２９〜３１頁中）。この初期段階において、アルツハイマー病は、報告されたところではアミロイドベータ（Ａβ）から由来する神経毒のために、主に新たな記憶を形成する深刻な無能として現れる(Selkoe (2002)、Science 298:789-791)。Ａβは、存在量が突然変異およびアルツハイマー病に関連する危険因子により増大する両親媒性ペプチドである。Ａβから形成する原繊維は、アミロイドプラークの核を構成し、これは、アルツハイマー病の脳の特徴である。インビトロで発生した類似する原繊維は、培養した脳ニューロンに対して致命的である。これらの発見により、記憶喪失が、原繊維状Ａβにより生じたニューロン死の結果であることが、示される。
【０００４】
原繊維状Ａβおよび記憶喪失についての強力な実験的支持にもかかわらず、認知症とアミロイドプラーク負担との間には、関連性は乏しい(Katzman (1988)、Ann. Neurol. 23:138-144)。さらに、年齢依存性アミロイドプラークおよび最も重要なことには年齢依存性記憶障害を発生するトランスジェニックｈＡＰＰマウス(Dodartら(2002)、Nat. Neurosci. 5:452-457; Kotilinekら(2002)、J. Neurosci. 22:6331-6335)は、Ａβに対するモノクローナル抗体をワクチン接種してから２４時間以内に、記憶喪失がプラークレベルの変化を伴わずに逆行し得ることを示す。このような発見は、アミロイド原繊維により生じたニューロン死に依存する記憶喪失についての機構と整合しない。
【０００５】
Ａβ自己構築により生成した追加の神経学的に活性な分子が、示唆された。これらの分子は、Ａβ由来拡散性リガンドまたはＡＤＤＬとも呼ばれる可溶性Ａβオリゴマーを含む。オリゴマーは、準安定であり、低い濃度のＡβ１−４２において生成する(Lambertら(1998)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6448-6453)。Ａβオリゴマーは、長期間増強（ＬＴＰ）、即ち記憶およびシナプスの柔軟性についての古典的な実験的パラダイムを迅速に阻害する。このように、記憶喪失は、ニューロン死および原繊維ではなくＡβオリゴマーによるシナプス不全以前に、シナプス不全から起因する(HardyおよびSelkoe (2002)、Science 297:353-356)。可溶性オリゴマーは、脳組織において見出され、アルツハイマー病において(Kayedら(2003)、Science 300:486-489; Gongら(2003)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10417-10422)、およびｈＡＰＰトランスジェニックマウスアルツハイマー病モデルにおいて(Kotilinekら(2002)、J. Neurosci. 22:6331-6335; Changら(2003)、J. Mol. Neurosci. 20:305-313)顕著に上昇している。
【０００６】
種々のアルツハイマー病処置の選択肢が、示唆されている。ワクチン臨床的試験により、ワクチンに対する活発な免疫応答を備えているヒトが認知の利益を示すことが、明らかになった(Hockら(2003)、Neuron 38:547-554)；しかし、ＣＮＳ炎症の頻発により、試験の一部の早期の終了が生じた(BirminghamおよびFrantz (2002)、Nat. Med. 8: 199-200)。ワクチンに対する代替として、結合単量体または原繊維を伴わずにＡＤＤＬを標的する治療的抗体が、示唆された(Klein (2002)、Neurochem. Int. 41:345-352)。ＡＤＤＬは、高度に抗原性であり、〜５０μｇ／ｍＬの濃度でウサギにおいてオリゴマー選択性ポリクローナル抗体を発生する(Lambertら(2001)、J. Neurochem. 79:595-605)。トランスジェニックマウスモデルからの結果はまた、抗体が、記憶の低下に成功に逆行し得ることを示唆する(Dodartら(2002)、Nat. Neurosci. 5:452-457)。従って、当該分野において、アルツハイマー病の予防および処置のためのＡＤＤＬ選択性治療的抗体に対する必要性がある。本発明は、この必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造を区別して認識することができる、単離された抗体またはこの断片である。特定の態様において、本発明の抗体は、薬学的に許容し得る担体との混合物においてである。他の態様において、本発明の抗体は、キットにおいてである。
【０００８】
１種または２種以上のＡβ由来拡散性リガンドの多次元立体構造に結合する抗体または抗体断片を用いる、Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を防止する方法、Ａβ由来拡散性リガンドの構築を阻害する方法およびタウタンパク質のリン酸化をＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５において遮断する方法もまた、提供する。
【０００９】
本発明はさらに、本発明の抗体を用いた、Ａβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を予防的に、または治療的に処置する方法を包含する。本発明の抗体の投与により、Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合が防止され得、これによりＡβ由来拡散性リガンドと関連する疾患が防止または処置される。
【００１０】
本発明はまた、Ａβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を防止する治療剤を同定する方法である。本発明のこの方法は、ニューロンをＡβ由来拡散性リガンドと、剤の存在下で、また本発明の抗体を用いて接触させて、当該剤の存在下でのＡβ由来拡散性リガンドのニューロンへの結合を決定することを含む。
【００１１】
本発明はまた、試料中のＡβ由来拡散性リガンドを検出する方法およびＡβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を診断する方法を包含する。このような方法は、試料を本発明の抗体と接触させて、Ａβ由来拡散性リガンドを検出することができ、またＡβ由来拡散性リガンドと関連する疾患を診断することができるようにすることを含む。
【００１２】
発明の詳細な説明
Ａβ由来拡散性リガンド（即ちＡＤＤＬ）の多次元立体構造を区別して認識するモノクローナル抗体が、ここで創出された。有利なことに、このモノクローナル抗体は、アルツハイマー病と対照のヒト脳抽出物とを区別することができ、アルツハイマー病脳スライスにおける、および培養した海馬細胞における内因性オリゴマーを同定する。さらに、この抗体は、溶液中の内因性および合成ＡＤＤＬを中和する。いわゆる「合成」ＡＤＤＬは、精製したアミロイドβ１−４２を、ＡＤＤＬを発生する条件の下で混合することにより、インビトロで生成する。米国特許第6,218,506号を参照。本明細書中に開示した特定の抗体は、単量体Ａβペプチドの最小の検出を伴って、３〜２４量体に対する高度な選択性を示す。さらに、本発明の選択された抗体によるＡＤＤＬの認識は、Ａβ１−４２またはＡβ１−４０の直線状配列を包含する短いペプチドによっては遮断されない。しかし、結合は、Ａβ１−２８により遮断され、これは、立体構造的に独特の構造に基づくエピトープがまたＡβ１−２８において見出されることを示す。
【００１３】
この抗体のエピトープの描写は、これらの抗体が、ＥＬＩＳＡにより測定して同様の親和性および特異性の特徴を有する同様の核直線状配列を認識することを示した。さらに、この抗体は、ＡＤＤＬ含有製剤がラット海馬ニューロンおよび不死化神経芽細胞腫細胞系の一次培養物に結合する能力を区別して遮断し、またＡＤＤＬ構築を遮断する。この発見により、これらの抗体が、同様の直線状配列認識および親和性にもかかわらず、ＡＤＤＬの多次元立体構造を認識する区別された能力を有することが、例証される。ＡＤＤＬは、ニューロンのサブセットと関連し、正常なニューロン機能を破壊することが知られているため、本発明の１つの使用は、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を防止する抗体の開発および／または同定である。このような抗体は、アルツハイマー病を含むＡＤＤＬ関連疾患の処置において有用である。この使用の改良は、これらの抗体のヒト化および／または親和性成熟(affinity-matured)様式を、ＡＤＤＬがニューロンおよびＡＤＤＬの構築物に結合するのを防止するために特定的に用いることである。
【００１４】
従って、本発明は、ＡＤＤＬの１種または２種以上の多次元立体構造を区別して認識する、単離された抗体である。本発明の抗体は、これが、同一のタイプの他の生物学的巨大分子の実質的な不存在において存在する場合に、単離されたと言われる。従って、「単離された抗体」は、他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する；しかし、分子は、抗体の基本的な特徴（例えば結合特異性、中和活性など）に有害に影響しない数種の追加の剤または部分を含んでもよい。
【００１５】
ＡＤＤＬの１種または２種以上の多次元立体構造に特異的に結合することができる抗体は、Ａβ１−４２のオリゴマー化から由来する特定のＡＤＤＬに結合するが、本明細書中に開示したようにウエスタンブロット分析により決定されたように、他のＡβペプチド、即ちＡβ１−１２、Ａβ１−２８、Ａβ１−４０およびＡβ１２−２８と交差反応せず；優先的に溶液中でＡＤＤＬに結合する（例えば例２１を参照）。２つの実体間の特異的な結合は、一般的に、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１の親和性を表す。１０８Ｍ−１より大きい親和性が、特定の結合を達成するために望ましい。
【００１６】
特定の態様において、１種または２種以上のＡＤＤＬの多次元立体構造に特異的に結合することができる抗体をまた、ＡＤＤＬの多次元立体構造に対して産生させる（即ち、動物をこれで免疫する）。他の態様において、１種または２種以上のＡＤＤＬの多次元立体構造に特異的に結合することができる抗体を、低いｎ量体生成ペプチド、例えばＡβ１−４２［Ｎｌｅ３５−Ｄｐｒｏ３７］に対して産生させる。
【００１７】
用語「エピトープ」は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位または抗体が産生される、および／または抗体が結合する分子上の部位を意味する。例えば、エピトープを、該エピトープを定義する抗体により認識することができる。
【００１８】
直線状エピトープは、アミノ酸一次配列が認識されたエピトープを含むエピトープである。直線状エピトープは、典型的には、少なくとも３つ、および最も普通には少なくとも５つ、例えば約８〜約１０個のアミノ酸を独特の配列において含む。
【００１９】
立体構造エピトープは、直線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されたエピトープの単一の規定成分ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が、必ずしもエピトープを規定する抗体により認識されないエピトープ）である。典型的に、立体構造エピトープは、直線状エピトープに対して増大した数のアミノ酸を包含する。立体構造エピトープの認識に関して、抗体は、ペプチドまたはタンパク質の三次元構造を認識する。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成する場合には、立体構造エピトープを形成するあるアミノ酸および／またはポリペプチド主鎖は、並列となり、抗体がエピトープを認識するのを可能にする。エピトープの立体構造を決定する方法には、例えばＸ線結晶学、二次元核磁気共鳴分光学並びに部位特異的なスピン標識および電磁常磁性共鳴分光学が含まれるが、これらには限定されない。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996)、第６６巻、Morris（編）を参照。
【００２０】
Ａβ由来拡散性リガンド、即ちＡＤＤＬは、望ましくは８つまたは９つより少ないアミロイドβ１−４２ペプチドの凝集体から構成されており、アルツハイマー病と関連すると見出されているアミロイドβ１−４２の可溶性オリゴマーを意味する。これは、高分子量凝集中間体とは対照的であり、これは原繊維形成をもたらすミセルの針を形成する。
【００２１】
本明細書中に例示するように、この抗体は、ＡＤＤＬの少なくとも１つの多次元立体構造に結合するかまたはこれを認識する（例えば図３を参照）。特定の態様において、この抗体は、ＡＤＤＬの少なくとも２つ、少なくとも３つまたは少なくとも４つの多次元立体構造に結合する。ＡＤＤＬの多次元立体構造は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析により定義したように、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、九量体、十量体などを包含することを意図する。三量体、四量体などの指定が、用いるアッセイ方法に伴って変化し得るため（例えばBitanら(2005)、Amyloid 12:88-95を参照）、本明細書中で用いる三量体、四量体などの定義は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による。
【００２２】
この抗体の区別して結合する能力を例示するために、ある抗体が、１つの多次元立体構造、例えばＡＤＤＬの四量体（即ち抗体２Ｄ６または４Ｅ２）を認識し、一方他の抗体が、いくつかの多次元立体構造、例えばＡＤＤＬの三量体および四量体（例えば抗体２Ａ１０、２Ｂ４、５Ｆ１０または２０Ｃ２）を認識することが、見出された。このように、本発明の抗体は、オリゴマー特異性特性を有する。特定の態様において、ＡＤＤＬの多次元立体構造は、本発明の抗体により認識される立体構造エピトープを生じる特定のポリペプチド構造と関連する。他の態様において、本発明の抗体は、＞５０ｋＤａを超える分子量を有する、ほぼ三量体または四量体の大きさの範囲を有する多次元立体構造ＡＤＤＬに特異的に結合する。
【００２３】
ある態様において、多次元立体構造への結合に加えて、この抗体は、アミロイドβ１−４２の選択された直線状エピトープに結合する。ＡＤＤＬの直線状エピトープは、アミロイドβ１−４２のＮ末端１０、１１、１２、１５または２０のアミノ酸残基に位置する４つ、５つ、６つまたは７つ以上のアミノ酸残基ペプチドとして意図される。特定の態様において、本発明の抗体は、アミロイドβ１−４２の残基１〜１０、１〜８、３〜１０または３〜８内の直線状エピトープに特異的に結合する。アミロイドβ１−４２の例示的な直線状エピトープには、アミノ酸残基ＥＦＲＨＤＳ（配列番号１７７）；ＤＡＥＦＲＨＤＳ（配列番号１７８）、およびＥＦＲＨＤＳＧＹ（配列番号１７９）が含まれるが、これらには限定されない。
【００２４】
本発明の抗体が、同様の直線状エピトープを有し得る一方、このような直線状エピトープは、この抗体の結合特性（即ち、ニューロンに結合するＡＤＤＬを遮断し、タウリン酸化を防止し、ＡＤＤＬ構築を阻害する能力）を完全には示さない。その理由は、当業者に十分知られているように、直線状エピトープが、抗原のエピトープの一部に相当し得るに過ぎないからである（例えば、BreitlingおよびDuebel (1999)、Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pg. 115中を参照）。例えば、２０Ｃ２は、２０Ｃ２についての直線状エピトープ（即ちアミノ酸残基３〜８）を欠いており、Ａβの残基７〜１６に相当する全く異なった配列を含む、電荷が反転した切断されたＡβ７−４２ペプチドの構築物に結合することが、見出された。
【００２５】
従って、２０Ｃ２は、Ａβの残基１７〜４２内からの要素に依存する立体構造エピトープに結合するが、これは多次元立体構造における場合のみである。本発明の抗体を、当該分野のものと、多次元ＡＤＤＬを区別して認識し、従ってニューロンに結合するＡＤＤＬを区別して遮断し、タウリン酸化を区別して防止し、ＡＤＤＬ構築を区別して阻害することができるものとして区別することができる。
【００２６】
本発明において用いられる抗体には、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、およびキメラ、ヒト（例えばＢ細胞から単離された）、ヒト化、中和、二重特異性またはこの一本鎖抗体が含まれるが、これらには限定されない。１つの態様において、本発明の抗体は、モノクローナルである。抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、ラット、マウス、ヒトおよび他のものを含む種々の宿主を、合成または天然ＡＤＤＬでの注射により免疫することができる。抗体を産生する方法は、当該分野において十分知られている。例えば、KohlerおよびMilstein ((1975) Nature 256:495-497)並びにHarlowおよびLane (Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988))を参照。
【００２７】
宿主種に依存して、種々のアジュバントを用いて、免疫学的応答を増大させることができる。本発明において用いられるアジュバントは、望ましくは、応答の定性的形態に影響する免疫原の立体構造的変化を生じずに、ＡＤＤＬに対する固有の応答を増大する。特に好適なアジュバントには、随意に免疫刺激物質、例えばモノホスホリルリピドＡ（Stouteら(1997)、N. Engl. J. Med. 336:86-91を参照）、ムラミルペプチド（例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（Ｅ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ））と組み合わせての、３脱Ｏアシル化モノホスホリルリピドＡ（MPL（登録商標）; RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT;GB 2220211を参照）および水中油エマルジョン、例えばスクアレンもしくはピーナッツ油、または他の細菌細胞壁成分が含まれる。
【００２８】
水中油エマルジョンの特定の例には、５％スクアレン、０．５％TWEEN（登録商標）８０および０．５％ＳＰＡＮ  ８５を含み（随意に種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）、微小流動化装置(microfluidizer)、例えばモデル１１０Ｙ微小流動化装置(Microfluidics, Newton, MA)を用いてサブミクロン粒子に処方されたＭＦ５９(WO 90/14837)；１０％スクアレン、０．４％TWEEN（登録商標）８０、５％PLURONIC（登録商標）遮断ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、サブミクロンエマルジョン中に微小流動化されたか、またはボルテックスされて、一層大きい粒子の大きさのエマルジョンを発生するＳＡＦ；並びに２％スクアレン、０．２％TWEEN（登録商標）８０および１種または２種以上の細菌細胞壁成分、例えばモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート（trehalose dimycolate）（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含むRIBI（登録商標）アジュバント系（ＲＡＳ）(Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT)が含まれる。
【００２９】
他の群のアジュバントは、サポニンアジュバント、例えばSTIMULON（登録商標）(QS-21, Aquila, Framingham, MA)またはこれから発生した粒子、例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびISCOMATRIX（登録商標）(CSL Ltd., Parkville, Australia)である。他の好適なアジュバントには、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、および界面活性物質、例えばリソレシチン、PLURONIC（登録商標）ポリオール類、ポリアニオン類、ペプチド類、ＣｐＧ(WO 98/40100)、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびサイトカイン類、例えばインターロイキン類（ＩＬ−１、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、並びに腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が含まれる。ヒトにおいて用いられるアジュバントの中で、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびCorynebacterium parvumが、特に好適である。
【００３０】
多次元立体構造ＡＤＤＬに対する抗体は、動物をＡＤＤＬで免疫することにより発生する。一般的に、ＡＤＤＬを、合成的に、または組換え断片発現および精製により発生させることができる。合成ＡＤＤＬを、本明細書中に開示したように、または米国特許第6,218,506号に、もしくは同時係属出願USSN 60/621,776、60/652,538、60/695,526および60/695,528に開示されている方法に従って、調製することができる。さらに、ＡＤＤＬを、他のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニンと融合させて、キメラ分子に対する抗体を発生させることができる。ＡＤＤＬを、立体構造的に拘束して、本明細書中に記載したように有用なエピトープを形成することができ、さらに表面と会合させ、例えば表面に物理的に付着させるか、または化学的に結合させて、本発明の抗体により認識される立体構造の形成を可能にするようにすることができる。
【００３１】
ＡＤＤＬの多次元立体構造に対するモノクローナル抗体を、培養物中の連続的な細胞系により抗体分子の生成をもたらすすべての手法を用いて、調製することができる。これらには、ハイブリドーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法およびＥＢＶ−ハイブリドーマ手法(Kohlerら(1975)、Nature 256:495-497; Kozborら(1985)、J. Immunol. Methods 81:31-42; Coteら(1983)、Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-2030; Coleら(1984)、Mol. Cell Biol. 62:109-120)が含まれるが、これらには限定されない。例示的なモノクローナル抗体には、２Ａ１０、４Ｃ２、２Ｄ６、４Ｅ２、２０Ｃ２、２Ｂ４、５Ｆ１０、２Ｈ４、２Ｅ１２、１Ｆ６、１Ｆ４、３Ｂ３、５Ｇ１２、６Ｂ７、６Ｂ１１、１１Ｂ４、１１Ｂ５、１４Ａ１１、１５Ｇ６、１７Ｇ４、２０Ｃ２、３Ｂ７、１Ｅ３、１Ａ９、１Ｇ３、１Ａ７および１Ｅ５と指定されるマウス抗体が含まれる。
【００３２】
さらに、ヒト化およびキメラ抗体を、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に対してスプライスして、適切な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得ることにより、産生することができる（Morrisonら(1984)、Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855; Neubergerら(1984)、Nature 312:604-608; Takedaら(1985)、Nature 314:452-454; Queenら(1989)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033; WO 90/07861を参照）。例えば、マウス抗体は、ファージ選択ベクター中でＦｖまたはＦａｂ断片として発現される。軽鎖についての遺伝子（および平行した実験において、重鎖についての遺伝子）を、ヒト抗体遺伝子のライブラリーについて交換する。次に、尚抗原に結合するファージ抗体を、同定する。一般的に鎖混合として知られているこの方法により、これが由来するマウス抗体と同一のエピトープに結合するべきである、ヒト化された抗体が得られた(Jespersら(1994)、Biotechnology NY 12:899-903)。代替として、鎖混合を、タンパク質レベルで行うことができる（Figiniら(1994)、J. Mol. Biol. 239:68-78を参照）。
【００３３】
ヒト抗体をまた、ファージディスプレイ方法を用いて得ることができる。例えば、WO 91/17271およびWO 92/01047を参照。これらの方法において、要素がこれらの外面上で異なる抗体を表示するファージのライブラリーを、作成する。抗体は、通常ＦｖまたはＦａｂ断片として表示される。所望の特異性を有する抗体を表示するファージを、ＡＤＤＬに対するアフィニティー濃縮により、選択する。ＡＤＤＬに対するヒト抗体をまた、少なくともヒト免疫グロブリン座および不活性化された内因性免疫グロブリン座のセグメントをコードするトランスジーンを有する非ヒトトランスジェニック哺乳類から産生することができる。例えば、WO 93/12227およびWO 91/10741を参照。各々を、参照により本明細書中に導入する。ヒト抗体を、競合的結合実験または他の方法により、特定のマウス抗体と同一のエピトープ特異性を有するように、選択することができる。このような抗体は、特にマウス抗体の有用な機能的特性を共有する傾向がある。ヒトポリクローナル抗体をまた、免疫原性剤で免疫したヒトからの血清の形態で、提供することができる。随意に、このようなポリクローナル抗体を、アフィニティー試薬としてＡＤＤＬを用いて、アフィニティー精製により濃縮することができる。
【００３４】
ヒト化抗体をまた、マウス抗体を化粧張り(veneering)するかまたは新たな表面を形成することにより、産生することができる。化粧張りは、マウス重および軽可変部における表面固定された領域のアミノ酸のみを、相同的なヒト抗体配列のもので置換することを含む。マウス表面アミノ酸を相同的なヒト配列からの同一の位置におけるヒト残基で置換することは、マウス抗体の免疫原性を低減する一方、このリガンド結合を保存すると示された。外部残基の置換は、一般的に、内部ドメインに対して、またはドメイン間接触に対して、影響をほとんどまたは全く有しない。（例えば米国特許第6,797,492号を参照）。
【００３５】
ヒトまたはヒト化された抗体を、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇＥ定常部並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むすべてのアイソタイプを有するように、設計することができる。特定の態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧもしくはＩｇＭまたはこれらの組み合わせである。特定の組み合わせは、ヒトＩｇＧ４配列を標準的なヒトＩｇＧ２定常部中に選択的に導入することにより形成した定常部を包含する。例示的な変異体ＩｇＧ２Ｆｃは、本明細書中に配列番号２５４として述べるＩｇＧ２ｍ４である。抗体を、別個の重鎖および軽鎖として、または重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーにより結合している一本鎖抗体として、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体として、表すことができる。一本鎖抗体を産生するための手法は、当該分野において十分知られている。
【００３６】
ＣＤＲ移植および化粧張りにより産生された例示的なヒト化抗体を、本明細書中に、４Ｅ２、２６Ｄ６、２０Ｃ２、３Ｂ３、２Ｈ４および１Ｆ６と指定された抗体について開示する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ｍ４重鎖可変部並びに、ＣＤＲ移植および化粧張りにより産生されたヒト化４Ｅ２、２６Ｄ６、２０Ｃ２、３Ｂ３、２Ｈ４および１Ｆ６についてのカッパ軽鎖可変部についてのアミノ酸配列を、図１１Ａ〜１１Ｙに示し、本明細書中に配列番号１５２〜１７６として述べる。
【００３７】
二重特異性抗体もまた、意図する。二重特異性抗体は、結合する抗体の結合ドメイン（重鎖と軽鎖との両方）を単離し、同一のポリペプチド鎖上の重鎖および軽鎖に接合するかまたは作動可能に(operably)結合する結合部分を供給し、これにより結合機能を保存することにより調製された、操作された抗体構造物を意味する（Holligerら(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444; Poljak (1994)、Structure 2:1121-1123を参照）。これは、本質的に、抗原に結合するのに必要な可変ドメインのみを有する根本的に短縮された抗体を形成する。同一の鎖上で２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインを、他の鎖の相補的なドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を作成させる。これらの二量体抗体断片または二重特異性抗体は、２価であり、二重特異性である。当業者は、二重特異性抗体を作成するすべての方法を用いることができることを認識する。好適な方法は、Holligerら(1993)、上記、Poljak (1994)、上記、Zhuら(1996)、Biotechnology 14:192-196および米国特許第6,492,123号により記載されており、これらを参照により本明細書中に導入する。
【００３８】
本発明の単離された抗体の断片はまた、本発明により明確に包含される。断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片、二重特異性ｓｃＦｖ断片、Ｆｄ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより産生された断片、並びにペプチドアプタマーを含むことを意図する。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、本発明の抗体分子のペプシン消化により産生され、一方Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより産生される。あるいはまた、Ｆａｂ発現ライブラリーを、所望の特異性を伴ってモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にするように構成することができる（Huseら(1989)、Science 254:1275-1281を参照）。特定の態様において、本発明の抗体断片は、可変部結合部位を維持する中和抗体の断片である。例示的なものは、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）断片およびＦａｂ断片である。一般的に、Immunology: Basic Processes (1985)、第２版、J. Bellanti（編）、９５〜９７頁を参照。
【００３９】
ＡＤＤＬの多次元立体構造を区別して認識するペプチドアプタマーを、アプタマーのライブラリー（例えばAptanomics SA, Lyon, Franceにより提供される）について合理的に設計するかまたは選別することができる。一般的に、ペプチドアプタマーは、設計が抗体の構造に基づいている合成認識分子である。ペプチドアプタマーは、両方の末端においてタンパク質骨格に結合した可変ペプチドループからなる。この二重の構造的束縛により、ペプチドアプタマーの結合親和性が抗体の結合親和性（ナノモル範囲）に匹敵するレベルに大幅に増大する。
【００４０】
本発明の抗体および抗体断片を産生するにあたり用いるための重鎖および軽鎖可変部をコードする例示的な核酸配列を、本明細書中で、図６および１０（即ち配列番号１〜２４および配列番号１３２〜１５１）に開示する。当業者に理解されるように、本明細書中に開示した重鎖可変部を、本明細書中に開示した軽鎖可変部のいずれか１つと組み合わせて用いて、改良された親和性、解離定数、エピトープなどを有する抗体を産生することができる。例えば、２Ｈ４（配列番号１２によりコードされる）の軽鎖可変部を２Ａ１０（配列番号１３によりコードされる）の重鎖可変部と組み合わせることにより、一層大きい直線状エピトープの認識をもたらすことができる。
【００４１】
本発明の抗体または抗体断片を産生するにあたり用いるための例示的な重鎖および軽鎖ＣＤＲを、図７Ａ〜７Ｆに開示し、これは、配列番号２５、２６および２８（重鎖ＣＤＲ１）；配列番号２９、３０、３１、３３、３４、３５および３６（重鎖ＣＤＲ２）；配列番号３８、３９、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７および４８（重鎖ＣＤＲ３）；配列番号４９、５０、５１および５３（軽鎖ＣＤＲ１）；配列番号５４、５５、５６および５８（軽鎖ＣＤＲ２）；並びに配列番号５９、６０、６１、６２、６３、６４および６６（軽鎖ＣＤＲ３）において述べたアミノ酸配列を有する。本発明の抗体または抗体断片の重鎖および軽鎖の特定の態様は、以下の通りである。
【００４２】
Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｈｉｓ（配列番号２８）またはＴｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘａａ（配列番号２７）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、ここでＸａａは、側鎖を有しないかまたは小さい側鎖を有するアミノ酸（例えばＳｅｒ、ＧｌｙまたはＡｌａ）である。Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｘａａ１−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号３２）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ここでＸａａ１は、芳香族側鎖基を有するアミノ酸（例えばＰｈｅ、ＴｙｒもしくはＴｒｐ）であり、Ｘａａ２は、Ｓｅｒ、ＡｒｇもしくはＴｙｒである；またはＴｙｒ−Ｉｌｅ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｓｅｒ−Ｘａａ４−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号３７）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、ここでＸａａ１およびＸａａ２は、極性側鎖基を有するアミノ酸（例えばＡｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓもしくはＨｉｓ）であり；Ｘａａ３は、ＧｌｙもしくはＶａｌであり；Ｘａａ４は、極性であり、帯電していない側基を有するアミノ酸（例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎもしくはＧｌｎ）である。Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｘａａ５−Ｔｙｒ（配列番号４２）のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、ここでＸａａ１は、極性であり、帯電していない側基を有するアミノ酸（例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎ）であり；Ｘａａ２は、ヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸（例えばＳｅｒまたはＴｈｒ）であり；Ｘａａ３およびＸａａ４は、脂肪族側鎖基を有するアミノ酸（例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｒｏ）であり；Ｘａａ５は、ＡｓｐまたはＡｌａである。
【００４３】
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ３（配列番号５２）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、ここでＸａａ１およびＸａａ２は、脂肪族側鎖基を有するアミノ酸（例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｒｏ）であり、Ｘａａ３は、帯電した側鎖基を有するアミノ酸（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＬｙｓ）である。Ｌｙｓ−Ｘａａ１−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｘａａ２（配列番号５７）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、ここでＸａａ１は、脂肪族側鎖基を有するアミノ酸（例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｒｏ）であり、Ｘａａ２は、ＳｅｒまたはＰｈｅである。Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｘａａ５−Ｔｈｒ（配列番号６５）のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、ここでＸａａ１は、ＳｅｒまたはＰｈｅであり；Ｘａａ２は、側鎖を有しないアミノ酸（例えばｇｌｙ）またはヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸（例えばＳｅｒもしくはＴｈｒ）であり；Ｘａａ３は、ヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸（例えばＳｅｒまたはＴｈｒ）であり；Ｘａａ４は、Ｈｉｓ、ＴｙｒまたはＬｅｕであり；Ｘａａ５は、脂肪族側鎖基を有するアミノ酸（例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｒｏ）である。
【００４４】
当業者により理解されるように、抗体の重鎖および軽鎖可変部内のＣＤＲの１つまたは２つ以上を、他の抗体からの１つまたは２つ以上のＣＤＲで置換して、完全に新規な抗体または抗体断片を産生することができる。例えば、５Ｆ１０の重鎖のＣＤＲ３を４Ｅ２からの重鎖のＣＤＲ３（配列番号４１）で置換することにより、ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合を遮断する５Ｆ１０の当該能力を増強することができる。
【００４５】
特定の特性を有する抗体を、意図する。１つの態様において、Ａβ１−４２の３〜８個のアミノ酸エピトープに結合する抗体は、Ｘａａが側鎖を有しないかもしくは小さい側鎖を有するアミノ酸（例えばＳｅｒ、ＧｌｙもしくはＡｌａ）である、Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｘａａ（配列番号２７）の重鎖ＣＤＲ１アミノ酸配列；またはＸａａ１が芳香族側鎖基を有するアミノ酸（例えばＰｈｅ、ＴｙｒもしくはＴｒｐ）であり、Ｘａａ２がＳｅｒ、ＡｒｇもしくはＴｙｒである、Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｘａａ１−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｘａａ２−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（配列番号３２）の重鎖ＣＤＲ２アミノ酸配列を有する。
【００４６】
他の態様において、小さい（＜３０ｋＤａ）凝集体にまさる大きい（＞５０ｋＤａ）ＡＤＤＬ凝集体への適度な親和性を有する抗体（即ちそれぞれＳＥＣピーク１およびピーク２）は、Ｘａａ１が極性であり、帯電していない側基を有するアミノ酸（例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎ）であり；Ｘａａ２がヒドロキシル側鎖基を有するアミノ酸（例えばＳｅｒまたはＴｈｒ）であり、Ｘａａ３およびＸａａ４が脂肪族側鎖基を有するアミノ酸（例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＰｒｏ）であり；Ｘａａ５がＡｓｐまたはＡｌａである、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｘａａ５−Ｔｙｒ（配列番号４２）の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する。
【００４７】
本発明の抗体または抗体断片は、これに結合した追加の部分を有することができる。例えば、米国特許第4,493,825号に記載されているように、細粒または微小粒子を、抗体または抗体断片に結合させることができ、この開示を、参照により本明細書中に導入する。
【００４８】
さらに、本発明の抗体または抗体断片を突然変異させ、増大した抗原親和性、中和活性（即ち、ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合を遮断する能力もしくはＡＤＤＬ構築を遮断する能力）、または改良された解離定数について、選択することができる。大腸菌のミューテーター菌株(Lowら(1996)、J. Mol. Biol. 260:359-368)、鎖混合(Figiniら(1994)、上記)およびＰＣＲ変異原性は、抗体をコードする核酸分子を突然変異させるための確立された方法である。例示により、増大した親和性を、多数のファージ抗体を少量のビオチン化された抗原と接触させ、従って抗体が結合について競合するようにすることにより、選択することができる。
【００４９】
この場合において、抗原分子の数は、ファージ抗体の数を超えているはずであるが、抗原の濃度は、解離定数よりもいくらか低いはずである。従って、増大した親和性を有する優性に突然変異したファージ抗体は、ビオチン化された抗原に結合し、一方比較的弱い親和性のファージ抗体の比較的大きい部分は、未結合のままである。次に、ストレプトアビジンは、一層高い親和性の突然変異したファージ抗体の混合物からの濃縮を補助し得る(Schierら(1996)、J. Mol. Biol. 255:28-43)。例示的な親和性成熟軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を、本明細書中に開示し（表１１および１２を参照）、特定の態様は、Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号３１６）の軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列を包含し、ここでＸａａ１は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘａａ２は、ＡｌａまたはＴｈｒである。
【００５０】
いくつかの治療的用途のために、抗体の抗原からの解離を低減することが、望ましい場合がある。これを達成するために、ファージ抗体を、ビオチン化された抗原に結合させ、過剰のビオチン化されていない抗原を加える。ある期間の後に、主に一層低い解離定数を有するファージ抗体を、ストレプトアビジンと共に収穫することができる(Hawkinsら(1992)、J. Mol. Biol. 226:889-96)。
【００５１】
本明細書中に開示されたものを含む種々のイムノアッセイを、ＡＤＤＬの多次元立体構造に対する所望の特異性を有する抗体またはこの断片を同定するための選別のために、用いることができる。競合的結合（例えばＥＬＩＳＡ）、ラテックス凝集アッセイ、免疫放射線測定法、ポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体またはこの断片のいずれかを用いる動力学（例えばBIACORE（登録商標）分析）についての多数のプロトコルは、当該分野において十分知られている。このようなイムノアッセイは、典型的に、特定の抗体とこの同族の抗原との間の複合体結合の測定を含む。２つの非干渉性エピトープに対して反応性のモノクローナル抗体を用いる、２つの部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが好適であるが、競合的結合アッセイもまた、用いることができる。このようなアッセイをまた、試料中のＡＤＤＬの多次元立体構造の検出において用いることができる。
【００５２】
抗体または抗体断片にまた、他の生物学的活性アッセイ、例えばニューロンもしくは培養した海馬細胞に結合するＡＤＤＬの置換またはＡＤＤＬ構築の遮断を施して、中和または薬理学的活性および予防または治療剤としての可能性のある効能を評価することができる。このようなアッセイは、本明細書中に記載されており、当該分野において十分知られている。
【００５３】
抗体および抗体の断片を、ハイブリドーマとして産生および維持するか、または、あるいはまた、大腸菌、酵母（例えばSaccharomyces種およびPichia種）、バキュロウイルス、哺乳類細胞（例えば骨髄腫、ＣＨＯ、ＣＯＳ）、植物またはトランスジェニック動物を含むがこれらには限定されない、すべての十分確立された発現系において組換え的に産生することができる（BreitlingおよびDuebel (1999)、Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY,１１９〜１３２頁中）。ＣＤＲ移植および化粧張りにより産生された、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｍ４重鎖可変部並びにヒト化４Ｅ２、２６Ｄ６、２０Ｃ２、３Ｂ３、２Ｈ４および１Ｆ６についてのカッパ軽鎖可変部の例示的な核酸配列を、図１０Ａ〜１０Ｔに示し、本明細書中に配列番号１３２〜１５１として述べる。抗体および抗体の断片について、アフィニティークロマトグラフィー、免疫グロブリン結合分子（例えばプロテインＡ、Ｌ、ＧまたはＨ）、抗体または抗体断片に作動可能に結合したタグ（例えばＨｉｓタグ、FLAG（登録商標）タグ、Strepタグ、ｃ−ｍｙｃタグ）などが含まれるがこれらには限定されない、すべての適切な方法を用いて、単離することができる。BreitlingおよびDuebel (1999)、上記を参照。
【００５４】
本発明の抗体および抗体断片は、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患の診断、ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合の遮断または阻害、ＡＤＤＬ構築の遮断、ＡＤＤＬと関連する疾患を予防的に、または治療的に処置すること、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を防止する治療剤の同定、およびＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化の防止を含む種々の使用を有する。
【００５５】
本発明の抗体および抗体断片はまた、ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合を遮断または阻害する方法において、有用である。本発明のこの方法を、ニューロンを本発明の抗体または抗体断片とインビトロまたはインビボで接触させて、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断するようにすることにより、行う。特定の態様において、本発明の抗体または抗体断片は、抗体または抗体断片の不存在におけるＡＤＤＬの結合と比較して、ＡＤＤＬの結合の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９７％の減少を達成する。抗体がＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断することができる程度を、本明細書中に開示した方法、即ち免疫細胞化学または細胞に基づくアルカリホスファターゼアッセイまたはすべての他の好適なアッセイに従って、決定することができる。ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合を減少させるのに特に有用な抗体には、例示的な２０Ｃ２、３Ｂ３、１Ｆ４、１Ｆ６、４Ｅ２、２Ｂ４、２Ｄ６および２Ｈ４モノクローナル抗体が含まれる。
【００５６】
本発明の抗体および抗体断片は、さらに、ＡＤＤＬの構築を遮断または阻害する方法において有用である。この方法は、アミロイドβ１−４２ペプチドを含む試料を本発明の抗体または抗体断片と接触させて、ＡＤＤＬの構築を阻害することを含む。抗体がＡＤＤＬの構築を遮断することができる程度を、本明細書中に開示した方法、即ちＦＲＥＴまたは蛍光偏光またはすべての他の好適なアッセイに従って、決定することができる。ＡＤＤＬの構築を遮断するのに特に有用な抗体には、例示的な１Ｆ４、２０Ｃ２、４Ｃ２、１Ｆ６、２Ｂ４、５Ｆ１０、２Ａ１０および２Ｄ６抗体が含まれる。
【００５７】
本明細書中に開示した抗体はまた、タウタンパク質のリン酸化をＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５において防止する方法において有用である。この方法は、タウタンパク質を含む試料を本発明の抗体または抗体断片と接触させて、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断し、これによりタウタンパク質のリン酸化を防止することを含む。抗体がタウタンパク質のリン酸化をＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５において防止することができる程度を、本明細書中に開示した方法またはすべての他の好適なアッセイに従って、決定することができる。
【００５８】
ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断するかまたは低減すること、ＡＤＤＬの構築を阻害することおよびＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５におけるタウタンパク質のリン酸化を防止することはすべて、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患を予防的に、または治療的に処置する方法において、用途が見出されている。従って、本発明はまた、本発明の抗体または抗体断片を用いて、ＡＤＤＬの蓄積に関連する疾患（例えばアルツハイマー病または同様の記憶関連障害）を防止または処置することを包含する。処置の影響を受けやすい患者には、疾患の危険にあるが症状を示さない個体、および現在症状を示している患者が含まれる。アルツハイマー病の場合において、十分長く生存している場合には、事実上誰もが、アルツハイマー病を罹患する危険にある。
【００５９】
従って、本発明の抗体または抗体断片を、被検患者の危険の評価を何ら必要とせずに、一般的集団に予防的に投与することができる。この方法は、アルツハイマー病の既知の遺伝的な危険を有する個体に特に有用である。このような個体には、疾患を有すると診断された親類を有する個体、および危険が遺伝的または生化学的マーカーの分析により決定される個体が含まれる。アルツハイマー病についての危険の遺伝的マーカーには、ＡＰＰ遺伝子における突然変異、特にそれぞれHardy突然変異およびSwedish突然変異と呼ばれる、位置７１７並びに位置６７０および６７１における突然変異が含まれる。
【００６０】
危険の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子ＰＳ１およびＰＳ２、並びにＡｐｏＥ４における突然変異、アルツハイマー病の家族歴、高コレステロール血症またはアテローム硬化症である。現在アルツハイマー病を罹患している個体を、特徴的な認知症および上記の危険因子の存在から認識することができる。さらに、多くの診断試験が、アルツハイマー病を有する個体を同定するために有用である。これらには、ＣＳＦタウおよびＡβ１−４２レベルの測定が含まれる。アルツハイマー病を罹患している個体をまた、ＡＤＲＤＡ基準または本明細書中に開示した方法により、診断することができる。
【００６１】
無症候性の患者において、処置を、すべての年齢（例えば１０歳、２０歳、３０歳の年齢）において開始することができる。しかし、通常、患者が４０歳、５０歳、６０歳または７０歳の年齢に達するまで処置を開始する必要はない。処置は、典型的に、ある期間にわたる複数の調剤を必要とする。処置を、ＡＤＤＬの存在について長期間にわたりアッセイすることにより、モニタリングすることができる。
【００６２】
治療的用途において、本発明の抗体または抗体断片を含む医薬組成物または医薬を、ＡＤＤＬの蓄積に関連するこのような疾患が疑われる、またはすでに当該疾患に罹患している患者に、この合併症および当該疾患の発生における中間的な病理学的表現型を含む当該疾患の症状（生化学的、組織学的および／または行動性）を治癒させるかまたは少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で、投与する。予防的用途において、本発明の抗体または抗体断片を含む医薬組成物または医薬を、ＡＤＤＬの蓄積に関連する疾患が疑われるか、または他の方法でこの危険にある患者に、当該患者における受動的な免疫性を達成するのに十分な量で投与し、これにより当該危険を解消するかもしくは減少させ、重篤度を低下させ、または当該疾患の生化学的、組織学的および／または行動性症状、この合併症および当該疾患の発生の間提示される中間的な病理学的表現型を含む疾患の発生を遅延させる。
【００６３】
いくつかの方法において、剤の投与により、特徴的なアルツハイマー病の病理を未だ発生していない患者における筋認知性(myocognitive)機能障害が低下するかまたは解消する。特定の態様において、本発明の抗体または抗体断片の有効量は、処置の不存在におけるＡＤＤＬの結合と比較して、ＡＤＤＬの患者におけるニューロンへの結合の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９７％の減少を達成する量である。このように、長期間の増強／記憶形成の機能障害が、低減される。
【００６４】
上記の状態の処置のための本発明の組成物の有効な用量は、投与の手段、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬物、および処置が予防的であるか治療的であるかを含む、多くの種々の要因に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳類、例えばイヌまたはトランスジェニック哺乳類もまた、処置することができる。
【００６５】
処置投与量は、一般的に、安全性および効能を最適化するように用量設定される。抗体または抗体断片での受動的免疫化のために、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、および一層通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの投与量範囲が、好適である。例えば、投与量を、１ｍｇ／体重１ｋｇもしくは１０ｍｇ／体重１ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内とすることができる。例示的な処置型は、２週間おきに１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月おきに１回の投与を必要とする。いくつかの方法において、種々の結合特性を有する本発明の２種または３種以上の抗体を、同時に投与し、この場合において、投与される各々の抗体の投与量は、示した範囲内にある。抗体を、通常複数の機会において投与し、ここで単一の調剤間の間隔は、毎週、毎月または毎年とすることができる。間隔をまた、患者中のＡＤＤＬに対する抗体の血中レベルを測定することにより示されるように、不規則とすることができる。いくつかの方法において、投与量を、１〜１０００μｇ／ｍＬおよびいくつかの方法においては２５〜３００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するように、調整する。
【００６６】
あるいはまた、抗体または抗体断片を、持続放出処方物として投与することができ、この場合において、比較的低い頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者中の抗体の半減期に依存して変化する。一般的に、ヒトおよびヒト化された抗体は、キメラ抗体および非ヒト抗体よりも長い半減期を有する。前に示したように、投与量および投与の頻度を、処置が予防的であるか治療的であるかに依存して、変化させることができる。予防的適用において、比較的低い投与量を、比較的低い頻度の間隔で、長期間にわたり投与する。数人の患者は、当該患者の生命の残りの間、処置を受け続ける。治療的適用において、比較的短い間隔における比較的高い投与量が、時々疾患の進行が低減されるかまたは終了するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的な、または完全な回復を示すまで、必要である。その後、患者に、予防的型を投与することができる。
【００６７】
本発明の抗体および抗体断片を、医薬組成物または医薬の成分として投与することができる。医薬組成物または医薬は、一般的に、活性治療剤および種々の他の薬学的に許容し得る成分を含む。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro編、第２０版、Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000を参照。好ましい形態は、投与の意図された方式および治療的適用に依存する。医薬組成物は、所望の処方に依存して、一般的に動物またはヒトへの投与のための医薬組成物を処方するために用いられるビヒクルとして定義される、薬学的に許容し得る無毒性担体または希釈剤を含むことができる。希釈剤を、組み合わせの生物学的活性に影響しないように、選択する。このような希釈剤の例は、蒸留水、生理学的リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液である。
【００６８】
医薬組成物はまた、大きいゆっくりと代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖類、例えばキトサン、ポリ乳酸類、ポリグリコール酸類およびコポリマー類（例えばラテックス官能化SEPHAROSE（登録商標）、アガロース、セルロースなど）、重合体アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば油小滴またはリポソーム）を含むことができる。
【００６９】
本発明の医薬組成物または医薬の投与を、種々の経路により行うことができ、これには、経口、局所的、肺、直腸、皮下、皮内、鼻腔内、頭蓋内、筋肉内、眼内または関節内注射などが含まれるが、これらには限定されない。投与の最も典型的な経路は、静脈内、続いて皮下であるが、他の経路が、同等に有効であり得る。筋肉内注射をまた、腕または脚筋肉において行うことができる。いくつかの方法において、剤を、沈着物が蓄積している特定の組織中に直接注射し、これは例えば頭蓋内注射である。いくつかの態様において、抗体または抗体断片を、頭蓋中に直接注射する。他の態様において、抗体または抗体断片を、持続放出組成物またはデバイス、例えばMEDIPAD（登録商標）デバイスとして投与する。
【００７０】
非経口投与について、本発明の抗体または抗体断片を、無菌の液体、例えば水、油、生理食塩水、グリセロールまたはエタノールであってもよい薬学的担体での生理学的に許容し得る希釈剤中の当該物質の溶液または懸濁液の注射可能な調剤として、投与することができる。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などを、組成物中に存在させることができる。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油および鉱油である。一般的に、グリコール類、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが、特に注射可能な溶液に適する液体担体である。抗体を、活性成分の持続された放出を可能にするように処方することができるデポー注射または移植製剤の形態で、投与することができる。例示的な組成物は、５０ｍＭのＬ−ヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌから構成された水性緩衝液中に処方され、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整された、５ｍｇ／ｍＬにおける抗体を含む。
【００７１】
典型的には、組成物を、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製する；液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適する固体形態をまた、注射前に調製することができる。製剤をまた、増強された送達のために、乳化させるか、またはリポソームもしくは微小粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコリドもしくはコポリマー中にカプセル封入することができる。
【００７２】
坐剤について、結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコール類またはトリグリセリド類が含まれる；このような坐剤を、活性成分を０．５％〜１０％、または一層望ましくは１％〜２％の範囲内で含む混合物から、形成することができる。
【００７３】
経口処方物は、賦形剤、例えば医薬階級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウムを含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続放出処方物または散剤の形態を採り、１０％〜９５％、または一層好適には２５％〜７０％の活性成分を含む。
【００７４】
局所的な適用により、経皮的または皮内送達をもたらすことができる。局所的な投与を、当該剤をコレラ毒素または解毒した誘導体もしくはこのサブユニット、または他の同様の細菌性毒素と同時投与することにより、促進することができる（Glennら(1998)、Nature 391:851を参照）。同時投与を、当該成分を混合物として、または融合タンパク質として化学的架橋もしくは発現により得られた結合分子として用いることにより、達成することができる。
【００７５】
あるいはまた、経皮的送達を、皮膚経路を用いて、またはトランスフェロソーム(transferosome)を用いて、達成することができる(Paulら(1995)、Eur. J. Immunol. 25:3521-24; Cevcら(1998)、Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15)。
【００７６】
本発明の抗体または抗体断片を、随意に、アミロイド形成的疾患の処置において少なくとも部分的に有効である他の剤と組み合わせて、投与することができる。
【００７７】
本発明の抗体および抗体断片はまた、ＡＤＤＬのニューロン（例えば海馬細胞）への結合を防止し、これによりＡＤＤＬに帰する下流の事象を防止する治療剤の同定において、用途が見出されている。このようなアッセイを、当該剤の存在下でニューロンをＡＤＤＬと接触させ、本発明の抗体または抗体断片を用いて、当該剤の存在下でのニューロンへのＡＤＤＬの結合を決定することにより、行う。当業者により理解されるように、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断する剤は、ニューロンに結合するＡＤＤＬの量；本発明の抗体または抗体断片を用いるイムノアッセイにおいて検出可能な量を、当該剤と接触していないニューロンと比較して減少させる。ニューロン結合ＡＤＤＬを検出するのに適するイムノアッセイを、本明細書中に開示する。
【００７８】
本明細書中に示した方法を用いて選別することができる剤には、種々の化学的階級が包含されるが、典型的には、これらは有機分子、好ましくは１００ダルトンより大きく、約２，５００ダルトンより小さい分子量を有する小さい有機化合物である。剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、典型的に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルまたはカルボキシル基、好ましくは官能化学基の少なくとも２つを含む。当該剤はしばしば、上記の官能基の１個または２個以上で置換された環式炭素または複素環式構造および／または芳香族または多環芳香族構造を含む。剤をまた、ペプチド類、抗体、サッカリド類、脂肪酸類、ステロイド類、プリン類、ピリミジン類、誘導体、構造的相同体またはこれらの組み合わせを含む生体分子の中に見出すことができる。剤を、天然または合成化合物のライブラリーを含む広範囲の供給源から得る。
【００７９】
種々の他の試薬、例えば塩および中性タンパク質を、選別アッセイ中に包含させることができる。また、他の方法でアッセイの効率を改善する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などを、用いることができる。成分の混合物を、所要の結合をもたらすすべての順序で、加えることができる。
【００８０】
本発明の選別アッセイにより同定される剤は、アミロイド形成的疾患および／またはタウオパチーの処置のために有益である。さらに、これらの概念を例示するために用いられる実験系は、タウリン酸化のアミロイドベータ誘発に関連する新規な薬剤標的を評価、同定および選別するための研究手段を表すことを、意図する。
【００８１】
本発明はまた、本発明の抗体または抗体断片を用いて、ＡＤＤＬを検出し、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患を診断する方法を提供する。ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患は、ＡＤＤＬの蓄積の結果、長期間の増強／記憶形成の生理学的機能障害がもたらされるすべての疾患を含むことを意図する。このタイプの疾患には、アルツハイマー病および同様の記憶関連障害が含まれるが、これらには限定されない。
【００８２】
これらの方法に従って、患者からの試料を、本発明の抗体または抗体断片と接触させ、抗体または抗体断片の試料への結合は、試料中のＡＤＤＬの存在を示す。本発明の文脈において用いる試料は、イムノアッセイを用いた分析の影響を受けやすいすべての体液または組織を意味することを意図する。本発明の方法により分析することができる好適な試料には、患者（例えば哺乳類、例えばヒト）からの脳の組織診試料および流体試料が含まれるが、これらには限定されない。インビトロ目的（例えばオリゴマー生成をモニタリングするアッセイ）のために、試料を、ニューロン細胞系または組織試料とすることができる。診断的目的のために、試料を、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患を有することが疑われる個体から、またはＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患を有する危険にある個体、例えば個体をＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患に罹患させる家族歴を有する個体からとすることができることを、意図する。
【００８３】
試料における抗体または抗体断片のＡＤＤＬへの結合の検出を、すべての標準的なイムノアッセイ（例えば本明細書中に開示した）を用いて行うことができ、または、あるいはまた、抗体断片が例えばペプチドアプタマーである場合には、結合を、例えばアプタマーに融合した検出可能なマーカータンパク質（例えばβ−カラクトシダーゼ、ＧＦＰもしくはルシフェラーゼ）により、直接検出することができる。その後、ＡＤＤＬ−抗体複合体の存在または不存在を、それぞれ試料中のＡＤＤＬの存在または不存在および従ってそれぞれＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患の存在または不存在と相関させる。本発明の１種または２種以上の抗体または抗体断片を、現行の非侵襲性の免疫に基づくイメージング手法と組み合わせて用いて、ＡＤＤＬの蓄積と関連する疾患の検出および早期の診断を大幅に増強することができることを、意図する。
【００８４】
診断を促進するために、本発明はまた、本発明の抗体または抗体断片を含むためのキットに関する。キットは、ＡＤＤＬの多次元立体構造を認識する１種または２種以上の抗体または抗体断片を保持する容器並びに、ＡＤＤＬに結合して抗体−抗原複合体を生成する目的のために抗体を用い、抗体−抗原複合体の生成を検出し、抗体−抗原複合体の存在または不存在を試料中のＡＤＤＬの存在または不存在と相関させるようにするための説明書を含む。容器の例には、複数の試料中のＡＤＤＬの同時の検出を可能にするマルチウェル(multiwell)プレートが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】アルカリホスファターゼアッセイからの結果を示す図であり、ここで、抗ＡＤＤＬ抗体は、ニューロンを区別して遮断する。
【図２】Ｂ１０３細胞を抗ＡＤＤＬ抗体と共にプレインキュベートした際の、ｂＡＤＤＬ結合の概要を示す図である。
【図３】ＡＤＤＬの多次元立体構造を区別して認識することができる抗体の結合特性の概要を示す図である。
【図４】本明細書中に開示した抗体のＡＤＤＬ構築阻害の概要を示す図である。
【図５】Ｎ２Ａ結合：κＡＤＤＬ相関プロットを示す図である。
【００８６】
【図６Ａ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｂ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｃ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体５Ｆ１０についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００８７】
【図６Ｄ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体５Ｆ１０についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｅ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ｄ６についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｆ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ｄ６についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００８８】
【図６Ｇ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ｂ４についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｈ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ｂ４についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｉ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体４Ｅ２についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００８９】
【図６Ｊ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体４Ｅ２についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｋ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ｈ４についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｌ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ｈ４についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００９０】
【図６Ｍ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ａ１０についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｎ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ａ１０についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｏ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００９１】
【図６Ｐ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｑ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体１Ｆ６についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｒ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体１Ｆ６についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００９２】
【図６Ｓ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体１Ｆ４についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｔ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体１Ｆ４についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｕ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ｅ１２についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００９３】
【図６Ｖ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体２Ｅ１２についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｗ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体４Ｃ２についての重鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【図６Ｘ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体４Ｃ２についての軽鎖可変部についての核酸配列を示す図である。小文字は、抗体リーダー配列を示し、大文字は、抗体可変部配列を示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチドに、下線を付す。
【００９４】
【図７Ａ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部についてのＣＤＲ１配列の比較を示す図である。
【図７Ｂ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部についてのＣＤＲ２配列の比較を示す図である。
【図７Ｃ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部についてのＣＤＲ３配列の比較を示す図である。
【図７Ｄ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部についてのＣＤＲ１配列の比較を示す図である。
【図７Ｅ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部についてのＣＤＲ２配列の比較を示す図である。
【図７Ｆ】マウス抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部についてのＣＤＲ３配列の比較を示す図である。
【００９５】
【図８Ａ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２についての重鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。２０Ｃ２重鎖について、位置２４において１つのアミノ酸により異なる２種のヒト化された配列が発生した（ＨＣＶＲＡおよびＨＣＶＲＢ）。２０Ｃ２ＨＣＶＲＡにおいて、ヒトアミノ酸を用い、２０Ｃ２ＨＣＶＲＢにおいて、マウスアミノ酸を用いた。
【００９６】
【図８Ｂ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２についての軽鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【００９７】
【図８Ｃ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２６Ｄ６についての重鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【００９８】
【図８Ｄ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２６Ｄ６についての軽鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【００９９】
【図８Ｅ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体４Ｅ２についての重鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【０１００】
【図８Ｆ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体４Ｅ２についての軽鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【０１０１】
【図８Ｇ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３についての重鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【０１０２】
【図８Ｈ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体３Ｂ３についての軽鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【０１０３】
【図８Ｉ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２Ｈ４についての重鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【０１０４】
【図８Ｊ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２Ｈ４についての軽鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【０１０５】
【図８Ｋ】ＣＤＲ移植により作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体１Ｆ６についての重鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、＊で示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、＃で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。１Ｆ６について、軽鎖を設計しなかった。その理由は、これは、４Ｅ２についての軽鎖の配列と同一の配列を有するからである。
【０１０６】
【図９Ａ】化粧張りにより作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２についての重鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、アスタリスクで示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、ポンド記号で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。２０Ｃ２重鎖について、位置８１において１つのアミノ酸により異なる２種のヒト化された配列が発生した（ＨＣＶＲＶｅｎＡおよびＨＣＶＲＶｅｎＢ）。２０Ｃ２ＨＣＶＲＶｅｎＡにおいて、マウスアミノ酸を用い、２０Ｃ２ＨＣＶＲＶｅｎＢにおいて、ヒトアミノ酸を用いた。
【０１０７】
【図９Ｂ】化粧張りにより作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２０Ｃ２についての軽鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、アスタリスクで示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、ポンド記号で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。
【０１０８】
【図９Ｃ】化粧張りにより作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２６Ｄ６についての重鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、アスタリスクで示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、ポンド記号で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。２６Ｄ６重鎖について、アミノ酸１１、２３、１５、８１、８９および１１８において異なる３種のヒト化された配列を、化粧張りに基づいて設計した（ＨＣＶＲ  Ｖｅｎ１、Ｖｅｎ２およびＶｅｎ３）。ＨＣＶＲ  Ｖｅｎ１において、マウスアミノ酸を、すべての位置において用いた。Ｖｅｎ２において、マウスアミノ酸を、残基８１および１１８について用い、ヒトアミノ酸を、残基１１、１３、１５および８９について用いた。Ｖｅｎ３において、ヒトアミノ酸を、すべての位置において用いた。
【０１０９】
【図９Ｄ】化粧張りにより作成された、ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体２６Ｄ６についての軽鎖可変部についてのアミノ酸配列を示す図である。配列を、マウス配列、ＮＣＢＩタンパク質データベースから得られた最も相同的なヒト配列、最も相同的なヒトゲノム配列およびヒト化された配列の間の比較として示す。ヒト化された配列とは異なるマウス、ヒトおよびヒトゲノム配列におけるアミノ酸を、太字とする。ＣＤＲに下線を付す。ＣＤＲループ立体構造の維持に重要な残基を、アスタリスクで示す。ＶＬ／ＶＨ界面において見出される保存された残基を、ポンド記号で示す。可能性のあるグリコシル化部位を、イタリックにより示す。２６Ｄ６軽鎖について、アミノ酸８８および１０５において異なる２種の化粧張りしたヒト化された配列を、設計した（ＬＣＶＲ  Ｖｅｎ１およびＶｅｎ２）。ＬＣＶＲ  Ｖｅｎ１において、マウスアミノ酸を、両方の位置において用い、Ｖｅｎ２において、ヒトアミノ酸を用いた。
【０１１０】
【図１０Ａ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２０Ｃ２についてのＣＤＲ移植ＨＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｂ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２０Ｃ２についてのＣＤＲ移植ＨＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｃ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２０Ｃ２についてのＣＤＲ移植ＬＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【０１１１】
【図１０Ｄ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２６Ｄ６についてのＣＤＲ移植ＬＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｅ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。４Ｅ２についてのＣＤＲ移植ＨＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【０１１２】
【図１０Ｆ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。４Ｅ２についてのＣＤＲ移植ＬＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｇ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。３Ｂ３についてのＣＤＲ移植ＨＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｈ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。３Ｂ３についてのＣＤＲ移植ＬＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【０１１３】
【図１０Ｉ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２Ｈ４についてのＣＤＲ移植ＨＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｊ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２Ｈ４についてのＣＤＲ移植ＬＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｋ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。１Ｆ６についてのＣＤＲ移植ＨＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【０１１４】
【図１０Ｌ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２０Ｃ２についての化粧張りしたＨＣＶＲ（ＶｅｎＡ）を示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｍ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２０Ｃ２についての化粧張りしたＨＣＶＲ（ＶｅｎＢ）を示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｎ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２０Ｃ２についての化粧張りしたＬＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【０１１５】
【図１０Ｏ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２６Ｄ６についての化粧張りしたＨＣＶＲ（Ｖｅｎ１）を示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｐ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２６Ｄ６についての化粧張りしたＨＣＶＲ（Ｖｅｎ２）を示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｑ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２６Ｄ６についての化粧張りしたＨＣＶＲ（Ｖｅｎ３）を示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【０１１６】
【図１０Ｒ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２６Ｄ６についての化粧張りしたＬＣＶＲ（Ｖｅｎ１）を示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｓ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての軽鎖可変部（ＬＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２６Ｄ６についての化粧張りしたＬＣＶＲ（Ｖｅｎ２）を示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【図１０Ｔ】ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体についての重鎖可変部（ＨＣＶＲ）についての核酸配列を示す図である。２６Ｄ６についてのＣＤＲ移植ＨＣＶＲを示す。大文字は、抗体可変部配列を示す。ＣＤＲに下線を付す。可変部配列を、完全な重鎖および軽鎖抗体発現ベクター中にクローン化した。
【０１１７】
【図１１Ａ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２０Ｃ２ＨＣＶＲＡＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｂ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２０Ｃ２  ＨＣＶＲＢ  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｃ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２０Ｃ２  ＨＣＶＲＡ  ＩｇＧ２ｍ４についての完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｄ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２０Ｃ２  ＨＣＶＲＢ  ＩｇＧ２ｍ４についての完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【０１１８】
【図１１Ｅ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２０Ｃ２  ＬＣＶＲ  カッパについての完全なヒト化カッパ軽鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｆ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２６Ｄ６  ＨＣＶＲ  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｇ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２６Ｄ６  ＨＣＶＲ  ＩｇＧ２ｍ４についての完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【０１１９】
【図１１Ｈ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２６Ｄ６  ＬＣＶＲ  カッパについての完全なヒト化カッパ軽鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｉ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植４Ｅ２  ＨＣＶＲ  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｊ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植４Ｅ２  ＬＣＶＲ  カッパについての完全なヒト化カッパ軽鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【０１２０】
【図１１Ｋ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植３Ｂ３  ＨＣＶＲ  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｌ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植３Ｂ３  ＬＣＶＲ  カッパについての完全なヒト化カッパ軽鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｍ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２Ｈ４  ＨＣＶＲ  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【０１２１】
【図１１Ｎ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植２Ｈ４  ＬＣＶＲ  カッパについての完全なヒト化カッパ軽鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｏ】抗ＡＤＤＬ抗体ＣＤＲ移植１Ｆ６  ＨＣＶＲ  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｐ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２０Ｃ２  ＨＣＶＲ  ＶｅｎＡ  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【０１２２】
【図１１Ｑ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２０Ｃ２  ＨＣＶＲ  ＶｅｎＢ  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｒ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２０Ｃ２  ＨＣＶＲ  ＶｅｎＡ  ＩｇＧ２ｍ４についての完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｓ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２０Ｃ２  ＨＣＶＲ  ＶｅｎＢ  ＩｇＧ２ｍ４についての完全なＩｇＧ２ｍ４ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【０１２３】
【図１１Ｔ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２０Ｃ２  ＬＣＶＲ  カッパについての完全なヒト化カッパ軽鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｕ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２６Ｄ６  ＨＣＶＲ  Ｖｅｎ１  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｖ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２６Ｄ６  ＨＣＶＲ  Ｖｅｎ２  ＩｇＧ１についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【０１２４】
【図１１Ｗ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２６Ｄ６  ＨＣＶＲ  Ｖｅｎ３についての完全なＩｇＧ１ヒト化重鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｘ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２６Ｄ６  ＬＣＶＲ  Ｖｅｎ１  カッパについての完全なヒト化カッパ軽鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【図１１Ｙ】抗ＡＤＤＬ抗体化粧張り２６Ｄ６  ＬＣＶＲ  Ｖｅｎ２  カッパについての完全なヒト化カッパ軽鎖についてのアミノ酸配列を示す図である。下線は、可変部配列を示し、ＣＤＲに相当するアミノ酸に、二重下線を付す。残りのアミノ酸配列は、定常部配列である。
【０１２５】
【図１２】ヒト抗体定常部のアミノ酸配列とＩｇＧ２ｍ４の配列との比較を示す図である。アスタリスクは、Ａｓｎ２９７におけるグリコシル化部位を示す。ＦｃＲｎ結合の領域を示す。ＩｇＧ２ｍ４がＩｇＧ２と異なる配列に、下線を付す。
【０１２６】
【図１３Ａ】ＦａｂファージディスプレイベクターｐＦａｂ３ｄにおける２０Ｃ２ヒト化抗体の重鎖についての注釈付きのアミノ酸配列を示す図である。
【図１３Ｂ】ＦａｂファージディスプレイベクターｐＦａｂ３ｄにおける２０Ｃ２ヒト化抗体の軽鎖についての注釈付きのアミノ酸配列を示す図である。
【０１２７】
【図１４】親和性成熟２０Ｃ２軽鎖ＣＤＲ３を発生させるための、２種のＬＣ−ＣＤＲ３ライブラリー、即ちＬＣ３−１およびＬＣ３−２を作成するにあたり用いられる設計およびプライマーを示す図である。クローニングのために用いられる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を、イタリックで示す。大文字は、抗体可変部配列をコードする核酸を示す。ＣＤＲをコードする核酸に、下線を付す。
【０１２８】
本発明を、以下の非限定的例により、一層詳細に記載する。
【０１２９】
例１：一般的な材料および方法
ＡＤＤＬ調製。Ｆ１２培地(Biosource, Camarillo, CA)中のＡＤＤＬを、確立された方法（Lambertら(2001)、上記）により、Ａβ１−４２から調製した。要するに、Ａβ１−４２ペプチド(American Peptide Co., Sunnyvale, CAまたはCalifornia Peptide Research, Inc., Napa, CA)を、秤量し、ＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）の十分な量を保持することができるガラスバイアル中に配置して、１０ｍｇ／ｍＬのペプチド濃度を達成した。ＨＦＩＰを、乾燥ペプチドに加え、バイアルを覆い、温和に回転させて混合し、ペプチド／ＨＦＩＰ溶液を、室温で少なくとも１時間貯蔵した。ペプチド溶液のアリコート（それぞれ５０または１００μＬ、０．５または１．０ｍｇ）を、一連の１．５ｍＬの円錐形遠心管中に分配した。この管を、スピードバック(speedvac)中に一晩配置して、ＨＦＩＰを除去した。乾燥ペプチドフィルムを含む管を覆い、乾燥剤を有する密閉した容器中で−７０℃で貯蔵した。
【０１３０】
使用前に、Ａβ１−４２ペプチドフィルムを、−７０℃貯蔵から取り出し、室温まで放置して加温した。新鮮なＤＭＳＯ（４４μＬ／ｍｇのペプチドフィルム；５ｍＭ）を加え、ペプチド／ＤＭＳＯ混合物を、ボルテックスミキサー上で可能な最低の速度で１０分間インキュベートした。Ｆ１２培地（２ｍＬ／ｍｇペプチド）を、ＤＭＳＯ／ペプチドの各々の管中に分配し、この管を覆い、反転により混合した。１００μＭの調製物を、２〜８℃において１８〜２４時間貯蔵した。試料を、１４，０００×ｇにおいて１０分間２〜８℃で遠心分離した。上清を、新鮮な管に移送し、用いるまで２〜８℃で貯蔵した。
【０１３１】
ビオチン化したＡＤＤＬ調製物（ｂＡＤＤＬ）を、ＡＤＤＬ調製について前に記載したのと同一の方法で、１００％Ｎ末端ビオチン化アミロイドベータペプチド(American Peptide Company, Sunnyvale, CA)を用いて調製した。
【０１３２】
ＡＤＤＬ原繊維の調製。室温のＡＤＤＬペプチドフィルムに、ペプチド１ｍｇあたり２ｍＬの１０ｍＭの塩酸を加えた。溶液を、ボルテックスミキサー上で可能な最低の速度で５〜１０分間混合し、得られた調製物を、使用前に３７℃で１８〜２４時間貯蔵した。
【０１３３】
単量体の調製。アミロイドベータ（１−４０）ペプチド（Ａβ１−４０）のＨＦＩＰ乾燥調製物を、Ａβ（１−４２）ペプチドについて概説したように調製した。ペプチドフィルムを、ペプチド１ｍｇあたり２ｍＬの２５ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解し、アリコートに分割し、用いるまで−７０℃で凍結した。
【０１３４】
ヒト原繊維の調製。凍結したヒト皮質から得た試料を、プロテアーゼ阻害剤を含む２０×低温Ｆ１２培地(COMPLETE（登録商標）、Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)中で１分間ホモジナイズした。次に試料を、１０，０００×ｇで１時間４℃で遠心分離した。Ｆ１２で２回洗浄した後に、ペレットを、２％ＳＤＳ／Ｆ１２中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベートした。その後、試料を、２２０，０００×ｇで１時間４℃で遠心分離した。ペレットを、低温のＦ１２中に再懸濁させ、１５秒の突発波中で１分間超音波処理した。タンパク質を、COOMASSIE PLUS（登録商標）キット(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)を用いて決定した。
【０１３５】
免疫化。本明細書中で「合成」ＡＤＤＬと呼ぶ、得られた可溶性Ａβオリゴマーを、フロイント完全アジュバント（第１の、および第２のワクチン接種）またはフロイント不完全アジュバント（その後のすべてのワクチン接種）と１：１で混合し、３匹のマウス中に皮下に（最初の２回のワクチン接種）または腹腔内に、〜１ｍＬ／マウスの合計の容量で注射した。各々の注射は、１９４±２５μｇの合計タンパク質と同等の精製ＡＤＤＬからなっていた。マウスに、ほぼ３週間おきに注射した。６回の注射の後に、１匹のマウスが死亡し、この脾臓を凍結した。次に、最も高い滴定量の血清を有するマウスからの脾臓を、ポリエチレングリコールの存在下でＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合させ、６つの９６ウェルプレート中に蒔いた。
【０１３６】
細胞を、３７℃で５％のＣＯ２と共に１０日間、２００μＬのＨＡＴ選択培地中で培養し、これは、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１μｇ／ｍＬのHYBRIMAX（登録商標）（アザセリン−ヒポキサンチン；Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）を補足したＩＳＣＯＶ培地およびＳＰ２／０細胞培養物から採集した３０％の条件培地から構成されている。この培養物に、１０％のＦＢＳを補足したＩＳＣＯＶ培地を１０日目に１回供給し、培養物上清を、１４日目に除去して、ＥＬＩＳＡにおいて陽性のウェルを選別した。陽性の培養物を、さらに希釈をウェルあたり０．３の細胞の確率で限定することにより、クローン化した。陽性のクローンを、ＥＬＩＳＡにおいて確認し、さらに発展させた。
【０１３７】
上清の選別は、５種のアッセイを含んでいた：ドットブロットおよびウエスタンイムノブロット（Lambertら(2001)、上記）、合成ＡＤＤＬを用いたネイティブなイムノブロット、並びにヒト組織から得られた内因性原繊維を用いたドットブロットおよびウエスタンブロット。これらのアッセイにより、抗体のＡＤＤＬへの結合を試験し（ドットブロット）、最大の親和性を有するオリゴマー（１種または２種以上）を同定した（ウエスタン）。すべての抗体を、５ｐｍｏｌのＡＤＤＬ（第１の融合において５７６種の上清および第２の融合において１９２０種の上清）を用いたドットブロットにおいて試験した。次に、陽性を試験したこれらの上清を、さらに１０〜２０ｐｍｏｌのＡＤＤＬにおいてウエスタンブロットを用いて選別した。選別を繰り返して、低い陽性または偽陽性を同定した。１０個のウェルの上清を、第１のマウスについて発展させ、４５個のウェルを、第２のマウスについて発展させた。次に、発展させた細胞を、凍結させたかまたはサブクローニングした。
【０１３８】
モノクローナル抗体を含む腹水を、雌のｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、標準的なプロトコル(Current Protocol of Molecular Biology)を用いて産生した。要するに、マウスを、０．５ｍＬのプリスタンの腹腔内注射により刺激した。刺激の１週間後、マウスに、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の約５×１０６個のハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した。腹水を、１０〜１４日後に採集した。ＩｇＧ精製を、BIO-RAD（登録商標）AFFI-GEL（登録商標）Protein A MAPS（登録商標）ＩＩキットを製造者のプロトコルに従って用いることにより行った。各々の試行について、３ｍＬの腹水を、脱塩カラムに通じ、４ｍＬの結合緩衝液中で溶出させることにより脱塩した。次に、試料を、プロテインＡカラムに適用した。４０ｍＬの結合緩衝液で洗浄した後に、カラムを、溶出緩衝液で溶出させ、５ｍＬの画分を採集した。試料を、６０μＬの１０ＮのＮａＯＨを加えることにより中和した。緩衝液をＰＢＳと交換するために、試料を、第２の脱塩カラムに適用し、ＰＢＳで溶出させた。
【０１３９】
対照抗体。ポリクローナル抗体Ｍ７１／２およびＭ９０／１を、Bethyl Laboratories, Inc. (Montgomery, TX)から得た。抗Ａβモノクローナル抗体６Ｅ１０（残基１〜１７に対して産生した）および４Ｇ８（残基１７〜２４に対して産生した）を、Signet Labs (Dedham, MA)から得た。モノクローナル抗体ＷＯ−２は、ウエスタンブロット分析により１−４０と１−４２との両方を認識するこの能力について、当該分野において知られている(Idaら(1996)、J. Biol. Chem. 271: 22908-22914)。モノクローナル抗体ＢＡＭ−１０（Ａβ１−４０に対して産生した）を、ABCAM（登録商標）(Cambridge, MA)から得た。モノクローナル抗体２６Ｄ６は、Ａβ配列のアミノ酸１〜１２を認識するこの能力について、当該分野において十分知られている(Luら(2000)、Nat. Med. 6:397-404)。
【０１４０】
イムノブロット分析。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、１０〜２０％Tris-Tricineゲル(BIO-RAD（登録商標）、Hercules, CA)を用い、分離を１２０Ｖにおいて行った以外は、確立された方法（Lambertら(2001)、上記）を用いて行った。ゲルを、標準的な方法に従って移送し、二次抗体を、１：４０，０００の希釈において常習的に用いた。
【０１４１】
最初の選別のために、〜１６〜２０ｐｍｏｌ／レーンと同等の２．７μｇのＡＤＤＬを、２次元（２Ｄ）４〜２０％ゲル上で分離させた。電気泳動および移送を、上記のようにした。追跡用色素を案内として用いて、ニトロセルロースを、Surf-blot装置(Idea Scientific, Minneapolis, MN)中に配置し、TWEEN（登録商標）２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ；Lambertら(2001)、上記）中の５％脱脂乾燥乳から構成された遮断緩衝液と混合した２００μＬのハイブリドーマ上清を、２０〜２１個のウェルの各々に加えた。室温で１．５時間振動させながらインキュベートした後、上清を除去し、ウェルを、２００μＬの遮断緩衝液で洗浄した。次に、膜を、Surf-blot装置から取り外し、３×１５分間ＴＢＳ−Ｔ中で洗浄した。次に、二次抗体（抗マウス、ＩｇＧ結合ＨＲＰ、１：４０，０００；Molecular Probes, Eugene, OR）を、膜と共に１時間室温でインキュベートした。洗浄（３×１５分間）後、オリゴマーを、半強度(half-strength)SUPERSIGNAL（登録商標）(Pierce, Rockland, IL)で視覚化した。ヒト原繊維を用いたウエスタンイムノブロットを、各々の２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥイムノブロットにおいて約６４μｇのヒト原繊維組織を用いて、同様にして行った。
【０１４２】
ネイティブなポリアクリルアミドゲル電気泳動を、分離を１２０Ｖにおいて行った以外は、確立された方法(Chromyら(2003)、Biochemistry 42:12749-12760)により行った。
【０１４３】
ウエスタンブロット。分離したタンパク質を、ニトロセルロースに移送した。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（０．１％のTWEEN（登録商標）２０を含むＴＢＳ）中の５％の脱脂乾燥乳または１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で一晩遮断し、一次抗体（１種または２種以上）と共に１．５時間インキュベートし、洗浄し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体(Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)と共に１時間インキュベートした。最終的な洗浄の後に、タンパク質を、West Femto化学発光キット(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)およびKODAK（登録商標）Image Station 440 CFで、またはフィルム(HYPERFILM（登録商標）、Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)で視覚化した。
【０１４４】
海馬培養物。培養物を、Ｅ１８胚から、標準的な方法(Brewer (1997) J. Neurosci. Methods 71:143-155; Stevensら(1996)、J. Neurosci. Res. 46:445-455)に従って調製した。生存細胞を計数し、ポリリシン（２００μｇ／ｍＬ）で被覆したカバーガラス上に、１．５×１０４〜１０６個の細胞／ｃｍ２の密度で蒔いた。培地を、培地の半分を除去し、これを補足したNEUROBASAL（登録商標）培地で置換することにより、交換した。
【０１４５】
一次ニューロン。一次海馬培養物を、凍結した分離した新生児ラット海馬細胞(Cambrex, Corp., East Rutherford, NJ)から調製し、これを融解させ、ウェルあたり２０，０００個の細胞の濃度で９６ウェルCOSTAR（登録商標）プレート中に蒔いた。細胞を、Ｌ−グルタミン(GIBCO-BRL（登録商標）、Gaithersburg, MD)を含まない、およびＢ２７(GIBCO-BRL（登録商標）、Gaithersburg, MD)を補足したNEUROBASAL（登録商標）培地中に、２週間維持し、次に結合研究のために用いた。
【０１４６】
Ｂ１０３細胞。Ｂ１０３神経芽細胞腫細胞系(SchubertおよびBehl (1993)、Brain Res. 629:275-82)を、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ(GIBCO-BRL（登録商標）、Gaithersburg, MD)中で、１０％ＦＢＳ(Hyclone, Logan, UT)および１％Pen-Strep (GIBCO-BRL（登録商標）、Gaithersburg, MD)の存在下で増殖させた。指数関数的に増殖するＢ１０３細胞を、分離し、９６ウェルCORNING（登録商標）プレート中に５，０００個の細胞／ウェルの濃度で蒔いた。蒔いた２４時間後に、細胞を用いて、ＡＤＤＬおよびｂＡＤＤＬ結合を評価し、市販の、および新規な抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体を特徴づけした。
【０１４７】
ドットブロット分析。ドットブロットを、Lambertら（(2001)、上記）に従って、ＡＤＤＬ（５ｐｍｏｌ／ドット）または原繊維のいずれかをニトロセルロースに適用して行った。後者のドットブロットについて、ＡＤＤＬを、乾燥ニトロセルロースに２つ１組で、種々のピコモル濃度で０．５μＬで、Ｓｕｒｆ−ｂｌｏｔ装置から由来する鋳型を用いて適用した。次に、試料を、１５分間乾燥し、遮断緩衝液で１時間遮断し、ペプチドを加えたか、または除去した抗体と共に１．５時間インキュベートし、これは、室温で少なくとも１時間プレインキュベートしたものであった。溶液を、Ｓｕｒｆ−ｂｌｏｔ装置から除去し、ウェルを、遮断緩衝液で洗浄し、膜を、装置から除去した。ニトロセルロースを洗浄し、二次抗体で処理し、前に示したように視覚化した。
【０１４８】
免疫細胞化学。免疫細胞化学を、二次抗体をALEXAFLUOR（登録商標）588 (Molecular Probes, Eugene, OR)に結合させた以外は、確立された方法（Lambertら(2001)、上記）に従って行った。抗体およびＡＤＤＬを、１時間室温で、１：４の抗体：ＡＤＤＬのモル比でプレインキュベートし、その後２１日間の海馬細胞培養に適用した。内因性ＡＤＤＬについて、ヒト脳タンパク質（Lambertら(2001)、上記におけるように調製した）を、細胞と共に１時間インキュベートし、その後上記のように細胞を洗浄し、固定し、視覚化した。
【０１４９】
アルツハイマー病の、および対照の海馬からのわずかに固定した凍結切片（４％パラホルムアルデヒドで４℃で３０時間、また４０μｍのスクロース中で凍結保護した）を、抗体（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１：１０００）と共に、一晩４℃でインキュベートした。抗体を除去した後、切片を、ＰＢＳで３回洗浄し、室温で二次抗体と共にインキュベートした。次に、結合を、ＤＡＢ(SIGMA（登録商標）、St. Louis, MO)で視覚化した。次に、切片を、ヘマトキシリンで対比染色し、封入し、NIKON（登録商標）ECLIPSE（登録商標）E600光学顕微鏡上でSPOT（登録商標）INSIGHT（登録商標）デジタルビデオカメラ（バージョン３．２）を用いてイメージングした。
【０１５０】
定量的免疫細胞化学。培養した海馬細胞を、５００ｎＭのＡＤＤＬと共に、１時間３７℃でインキュベートした。ＡＤＤＬを、洗浄により除去し、細胞を、３．７％ホルムアルデヒドで固定した。細胞を、ＰＢＳ−ＮＧＳ（１０％正常ヤギ血清を含むＰＢＳ）中の０．１％TRITON（登録商標）Ｘ−１００と共に、３０分間インキュベートし、１回洗浄し、所望の一次抗体（１種または２種以上）（ＰＢＳ−ＮＧＳで希釈した）と共に、一晩４℃でインキュベートした。試料を洗浄し、適切な二次抗体（１種または２種以上）、例えばALEXAFLUOR（登録商標）４８８または５９４抗マウスおよび抗ウサギＩｇＧ(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)と共に、２時間３７℃でインキュベートした。カバーガラスを洗浄し、PROLONG（登録商標）フェード防止(anti-fade)封入剤(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)中に封入し、LEICA（登録商標）ＴＣＳ  ＳＰ２共焦点Scanner DMRXE7顕微鏡を用いてイメージングした。
【０１５１】
ＥＬＩＳＡ。ポリクローナル抗ＡＤＤＬＩｇＧ（Ｍ９０／１；Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX）を、０．２５ｍｇ／ウェルにおいて、IMMULON（登録商標）3 REMOVAWELL（登録商標）ストリップ(Dynatech Labs, Chantilly, VA)上に、２時間室温で蒔き、ウェルを、ＴＢＳ中の２％ＢＳＡで遮断した。Ｆ１２中の１％ＢＳＡで希釈した試料を、ウェルに加え、２時間４℃で放置して結合させ、室温でＢＳＡ／ＴＢＳで３回洗浄した。ＢＳＡ／ＴＢＳで希釈したモノクローナル抗体を、９０分間室温でインキュベートし、マウスＩｇＧに対してVECTASTAIN（登録商標）ABCキットで検出した。ＨＲＰ標識を、BIO-RAD（登録商標）ペルオキシダーゼ基質で視覚化し、４０５ｎｍにおいてDynex MRX-TCマイクロプレートリーダー上で読み取った。
【０１５２】
例２：抗ＡＤＤＬ抗体の発生および特徴づけ
３匹のマウスに、ＡＤＤＬ（１９４±２５μｇのタンパク質／注射）を３週間おきに、合計で６回の接種で接種した。これらのマウス脾臓のＳＰ２細胞との融合から作成されたハイブリドーマを、９６ウェルプレート中で増殖させた。これらのウェルからの上清を、合成ＡＤＤＬでのドットブロットにおいて選別して、陽性のクローンを同定し、これを、内因性原繊維のドットブロットと比較して、差異を確認した。合成ＡＤＤＬのみに結合し、内因性原繊維に結合しないハイブリドーマを、求めた。ハイブリドーマの生成物が何に結合したか、およびいかなる条件の下で結合が発生したかをさらに絞り込むために、各々の陽性のクローンの３種のウエスタンブロットを、行った：ＡＤＤＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＡＤＤＬのネイティブなゲル、および内因性原繊維を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ。約４０種のクローンを、さらなる試験のために選択した。各々のクローンを、可溶性アルツハイマー病脳抽出物の認識について、培養した海馬細胞に結合したＡＤＤＬの同定について、および種々の条件の下でのＡＤＤＬ結合を遮断する能力について、試験した。選択された抗体を、培養培地から採集し、プロテインＧ  SEPHAROSE（登録商標）を用いてさらに精製した。
【０１５３】
毎回、ハイブリドーマの組を、ドットブロットにより選別し、約〜３０％が、陽性の上清を生成した。これらの中で、１種または２種のハイブリドーマのみが、合成ＡＤＤＬに結合し、内因性原繊維には結合しなかった。最初の数のクローンの約２％が低いＡＤＤＬ濃度において、合成ＡＤＤＬに結合し、単量体に結合せず、これは、ウエスタンブロット分析により決定された通りである。ウエスタンブロットにおいて合成ＡＤＤＬに結合し、原繊維には結合しないクローン３Ｂ７を、さらなる分析のために保持した。
【０１５４】
一層高分子量の物質（１２〜２４量体）に三量体／四量体オリゴマーよりも良好に結合した１〜２種のクローンを、同定した。ネイティブな条件の下でネイティブなＡＤＤＬに結合することができるが、ＳＤＳの存在下でＡＤＤＬに結合しない２〜３種のクローンを、同定した。
【０１５５】
この分析の結果は、ＡＤＤＬが、マウスにおける良好な抗原であり、単量体よりもはるかに高い親和性で合成ＡＤＤＬに結合するモノクローナル抗体を発生させることができることを、示した。
【０１５６】
例３：培養した海馬細胞に結合した内因性および合成ＡＤＤＬの免疫組織化学的分析
培養した海馬細胞をまた、分析して、アルツハイマー病の、および対照の脳抽出物を区別するモノクローナル抗体が、培養した細胞に結合したＡＤＤＬ（内因性または合成のいずれか）を同定することができるか否かを決定した。海馬培養物を、確立されたプロトコルに従って調製し、３〜４週間放置して増殖させた。合成ＡＤＤＬを、標準的なプロトコル（例えば米国特許第6,218,506号）に従って調製した。内因性ＡＤＤＬを、Gongら（(2003)、上記）に従ってアルツハイマー病の脳から抽出した。ＡＤＤＬ（Ｆ１２中１００ｎＭまたはＦ１２中２ｍｇの合計タンパク質）を、細胞と共に１時間インキュベートし、次に標準的な方法に従って洗浄し、固定した。洗浄に続いて、細胞を、２０Ｃ２、３Ｂ７、Ｍ９４、２Ａ１０、４Ｅ２、２Ｄ６、４Ｃ２、２Ｂ４、５Ｆ１０または５Ｇ１２モノクローナル抗体と共に、その後ALEXAFLUOR（登録商標）488に結合した抗マウス二次抗体と共にインキュベートした。イメージを、NIKON（登録商標）DIAPHOT（登録商標）落射蛍光顕微鏡上でCOOLSNAP（登録商標）HQカメラで撮影し、METAMORPH（登録商標）ソフトウエア(Universal Imaging, Downingtown, PA)を用いて分析した。
【０１５７】
内因性の、および合成のＡＤＤＬの両方が、２０Ｃ２により視覚化した際に、培養した細胞における標準的なホットスポットパターンを示した。従って、モノクローナル抗体２０Ｃ２により、培養した海馬細胞に結合した合成の、および内因性のＡＤＤＬの両方が同定される。３Ｂ７が原繊維、一層高分子量のオリゴマーおよび単量体に結合しなかったため、３Ｂ７によるＡＤＤＬのホットスポット結合は、オリゴマーＡＤＤＬに帰していた。他の抗体は、プロセス（Ｍ９４、２Ａ１０）上のホットスポットから細胞体特異性付着（４Ｅ２）および（２Ｄ６、４Ｃ２、２Ｂ４、５Ｆ１０、５Ｇ１２）の間における他の状態までの範囲内の、細胞に結合したＡＤＤＬ上の種々のエピトープを認識すると見られた。
【０１５８】
例４：マウス抗ＡＤＤＬ抗体を用いたニューロンへのＡＤＤＬ結合の阻害
アルツハイマー病の、および対照の脳抽出物を区別するモノクローナル抗体がまた、ＡＤＤＬの培養した細胞への結合を遮断することができるか否かを決定するために、培養した海馬細胞を、２０Ｃ２抗体と共にプレインキュベートし、ＡＤＤＬ結合を、免疫細胞化学により決定した。海馬培養物を、確立された方法に従って調製し、３〜４週間放置して増殖させた。合成のＡＤＤＬを、標準的なプロトコルに従って調製した（例えば、米国特許第6,218,506号などを参照）。内因性ＡＤＤＬを、Gongら（(2003)、上記）に従ってアルツハイマー病の脳から抽出した。ＡＤＤＬ（Ｆ１２中１００ｎＭまたはＦ１２中２ｍｇの合計タンパク質）を、２０Ｃ２抗体と共に１時間プレインキュベートし、その後１時間３７℃で細胞に加えた。細胞を洗浄し、固定し、ALEXAFLUOR（登録商標）488に結合した抗マウス二次抗体と共にインキュベートした。
【０１５９】
培養した細胞に結合する内因性の、および合成のＡＤＤＬの両方を、２０Ｃ２とのプレインキュベーションにより遮断した。ビヒクルおよび二次でない抗体対照イメージは、黒色であった。
【０１６０】
例５：ビオチン化されたＡＤＤＬを用いた、ニューロンに結合するＡＤＤＬの検出
ＡＤＤＬまたはｂＡＤＤＬ（ビオチン化されたＡＤＤＬ）のニューロンへの結合を、標準的な免疫蛍光手順を用いて検出した。一次海馬ニューロン（１４日間培養した）またはＢ１０３細胞（２４時間蒔いた）を、５〜２５μｍのＡＤＤＬまたはｂＡＤＤＬと共に、１時間３７℃でインキュベートし、その後細胞を、温かい培養培地で３〜４回洗浄して、結合していないＡＤＤＬまたはｂＡＤＤＬを除去した。次に、細胞を、１０分間室温で、１６％パラホルムアルデヒド(Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)からＰＢＳで希釈して調製した４％パラホルムアルデヒドで固定した。その後、溶液を除去し、新鮮な固定液を、室温でさらに１０分間加えた。細胞を、１０分間透過性にし（０．１％TRITON（登録商標）Ｘ１００；SIGMA, St. Louis, MOを含む４％パラホルムアルデヒド溶液）、ＰＢＳで６回洗浄し、１時間３７℃で遮断緩衝液（１０％ＢＳＡ；Sigma, St. Louis, MOを含むＰＢＳ）と共にインキュベートした。
【０１６１】
この時点において、結合したＡＤＤＬおよびｂＡＤＤＬの検出のためのプロトコルは、分化する。ＡＤＤＬ結合を検出するために、細胞を、一晩３７℃で、４Ｇ８（１％ＢＳＡ；Signet Labs, Dedham, MAを含むＰＢＳ中１：１，０００に希釈した）、６Ｅ１０（１：１，０００；Signet Labs, Dedham, MA）または本明細書中に開示した抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体の１種（１：１，０００に希釈した）と共にインキュベートした。さらに、タウ（１：１，０００；Sigma, St. Louis, MO）に対して産生したポリクローナル抗血清を用いて、細胞過程を視覚化した。翌日、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、１時間室温で、ALEXA（登録商標）５９４で標識した抗マウス二次抗体（１％ＢＳＡ；Molecular Probes, Eugene, ORを含むＰＢＳで１：５００に希釈した）およびALEXA（登録商標）４８８で標識した抗ウサギ二次抗体（１：１，０００に希釈；Molecular Probes, Eugene, OR）と共にインキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、結合を、蛍光能力を有する顕微鏡を用いて観察した。
【０１６２】
ｂＡＤＤＬ結合の検出のために、細胞を、タウ抗体と共に一晩インキュベートした。その後、細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、１時間室温でALEXA（登録商標）４８８で標識した抗ウサギ二次抗体（上記の通り）およびALEXA（登録商標）５９４で標識したストレプトアビジン、１：５００の希釈(Molecular Probes, Eugene, OR)と共にインキュベートし、ＰＢＳで５〜６回洗浄し、結合を、蛍光顕微鏡で視覚化した。細胞核の染色が望ましい場合には、核を、標準的なプロトコルに従って、ＤＡＰＩ（１：１０００）で標識した。
【０１６３】
ＡＤＤＬ特異性モノクローナル抗体を用いたＡＤＤＬの免疫細胞化学的分析のために、細胞を、ＡＤＤＬと共にインキュベートした後に洗浄し、固定し、透過性にし、遮断した。結合したｂＡＤＤＬをモノクローナル抗体で検出するために、細胞を、４Ｇ８、６Ｅ１０または本発明における抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体の１種と共に一晩インキュベートし、その後免疫反応性を、ALEXA（登録商標）４８８で標識した抗マウス二次抗体で検出した。結合したｂＡＤＤＬを、ALEXA（登録商標）５９４で標識したストレプトアビジンで視覚化し、核を、ＤＡＰＩで染色した。染色の後、ｂＡＤＤＬ結合とＡＤＤＬ免疫反応性との共存を、蛍光顕微鏡で検出した。
【０１６４】
ＡＤＤＬと共にインキュベートした一次海馬細胞との特異的な免疫反応性は、評価したモノクローナル抗体（即ち２０Ｃ２、２Ｈ４、２Ｂ４および２Ａ１０）の各々について見られた。結合したＡＤＤＬは、ニューロン的過程および細胞体に沿って点状の染色として出現した。このパターンは、ニューロンのサブセット上に見られたに過ぎず、これは、市販の、および市販でない抗体の両方を用いて一次抗体に結合するＡＤＤＬを記載する以前の報告と整合するパターンである。染色のパターンおよび多くの対照研究の結果により、これらの抗体の特異性が例証された。
【０１６５】
ｂＡＤＤＬを用いることにより、結合したＡＤＤＬを検出し、モノクローナル抗体とのＡＤＤＬ結合の遮断を評価するための単純化された方法が提供された。ｂＡＤＤＬを、一次海馬細胞に加え、結合を、蛍光標識したストレプトアビジンで評価した場合には、特異的な結合が、培養物中の細胞のサブセットのニューロン的過程に沿って見られた。次に、細胞を固定し、免疫細胞化学のために加工し、結合を視覚化するために抗ＡＤＤＬ抗体を用いた場合には、染色の同様のパターンが観察された。さらに、これらの染色パターンを重ね合わすことにより、抗体染色および結合したｂＡＤＤＬの完全な重複が明らかになり、従ってｂＡＤＤＬおよびＡＤＤＬが機能的に同等であることおよびｂＡＤＤＬの結合アッセイへの使用が例証された。
【０１６６】
例６：ニューロンに結合するｂＡＤＤＬのマウス抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体区別置換の検出および測定
抗体がＡＤＤＬまたはｂＡＤＤＬのニューロン培養物（一次ニューロンまたはＢ１０３細胞）への結合を遮断する能力を、少数の改変を加えて本明細書中に記載した免疫細胞化学方法を用いて特徴づけした。モノクローナル抗体を、１〜１０μｍのｂＡＤＤＬと、１：１、１：５または１：１０（抗体：ｂＡＤＤＬ）のモル比で混合し、シリコン処理した微小遠心管中で１時間３７℃で低速ローテータ(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)上でインキュベートした。その後、抗体／ｂＡＤＤＬ混合物を、細胞に加え、さらに放置して１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、固定し、透過性にし、遮断し、タウに対して産生したポリクローナル抗血清と共に一晩インキュベートして、細胞過程を視覚化した。翌日、細胞を洗浄し、ALEXA（登録商標）４８８で標識した抗ウサギ二次抗体およびALEXA（登録商標）５９４で標識したストレプトアビジンと共にインキュベートし、細胞を、ＤＡＰＩで染色して、核の検出を可能にした。染色した後に、結合の程度を、蛍光顕微鏡で視覚的に評価した。
【０１６７】
ｂＡＤＤＬ結合の程度および抗ＡＤＤＬ抗体がこの相互作用を弱める能力を定量的に評価するために、細胞に基づくアルカリホスファターゼアッセイを開発した。モノクローナル抗体またはＰＢＳを、１：１（Ｂ１０３細胞）または１：５（一次ニューロン）のモル比において、２．５〜１０μｍ（最終濃度）のｂＡＤＤＬと混合し、１時間３７℃で低速ローテータ上でインキュベートした。プレインキュベーションの後、抗体／ｂＡＤＤＬ調製物を、Ｂ１０３または一次ニューロン培養物に加え、さらに１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、ｂＡＤＤＬ／抗体混合物を除去し、プレートを、６回培地で洗浄した。
【０１６８】
細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間室温で固定し、溶液を除去し、新鮮な固定液を加え、細胞を、さらに１０分間固定した。細胞を、０．１％TRITON（登録商標）Ｘ−１００を含む４％パラホルムアルデヒドで透過性にし（２回、各々室温で１０分間）、ＰＢＳで６回洗浄し、ＰＢＳ中の１０％ＢＳＡで１時間３７℃で処理した。アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（１％ＢＳＡ中１：１，５００；Molecular Probes, Eugene, OR）を、細胞に１時間室温において加えた。細胞を、ＰＢＳで６回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質（SAPPHIRE-II（登録商標）を含むCDP-STAR（登録商標）；Applied Biosystems, Foster City, CA）を、細胞に加え、３０分間インキュベートし、その後ＬＪＬ照度計(Analyst AD; LJL BioSystems, Sunnyvale, CA)上でルミネセンスを決定した。
【０１６９】
ｂＡＤＤＬのニューロンへの結合を評価した際には、染色の抗体依存性パターンが観察された。調査した抗体の数種は、ｂＡＤＤＬの結合が顕著に低減し、一方他のものは、比較的有効でなかった。予測されなかったことに、第３の群の抗体は、ｂＡＤＤＬのニューロンへの結合を増強したと見られる。これらの研究の結果が、本質的に定性的であり、定量的ではなかった一方、これらは、抗体がニューロンへのｂＡＤＤＬ結合を区別して遮断することを示した。定量的評価により、同様の傾向が例証された（図１）。即ち、数種の抗体は、ｂＡＤＤＬのニューロンへの結合を弱め、数種は、弱い効果を有していたか、または効果をほとんど有しておらず、数種（即ち５Ｆ１０および４Ｃ２）は、結合を増強した。さらに、マウスＦａｂは、ｂＡＤＤＬの結合を遮断することができず、これはさらに、このアッセイにおけるモノクローナル抗体の特異性を例証している。
【０１７０】
神経芽細胞腫細胞系Ｂ１０３におけるモノクローナル抗体でのｂＡＤＤＬ結合および遮断の分析により、Ｂ１０３細胞への、しかし卵巣細胞系（ＣＨＯ）へのではない特異的なｂＡＤＤＬ結合が例証された。さらに、結合は、Ｂ１０３細胞に加える前にｂＡＤＤＬを抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体と共にプレインキュベートした場合には、劇的に減衰した。Ｂ１０３細胞へのｂＡＤＤＬ結合の遮断のモノクローナル抗体での定量的評価は、モノクローナル抗体が細胞へのｂＡＤＤＬ結合を遮断するこれらの能力において、同等ではないことを示した（図２）。一次海馬細胞について明らかであるように、数種の抗体は、結合を極めて良好に遮断し、一方他のものは、比較的有効ではなかった。さらに、抗体４Ｃ２はまた、ｂＡＤＤＬが培養物中のＢ１０３細胞に結合する能力を増強した。
【０１７１】
ｂＡＤＤＬもまた学習および記憶に関与する海馬の領域に結合することを示すために、一連の結合研究を、ラット海馬スライス培養物を用いて行った。結合研究により、海馬のＣＡ１−３および歯状回領域におけるニューロンが、ｂＡＤＤＬに結合することができる一方、他の領域におけるニューロンは結合しないことが、示された。ｂＡＤＤＬを抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体と共にプレインキュベートした場合には、ｂＡＤＤＬ結合の程度は、用量依存性方式で減衰した。これらの結果は、モノクローナル抗体がまた、ｂＡＤＤＬの海馬ニューロン、即ち学習および記憶のために臨界的に重要なニューロンのサブセットへの結合を弱め得ることを示した。
【０１７２】
例７：アルツハイマー病の、および対照の脳からの内因性ＡＤＤＬへの抗ＡＤＤＬ抗体の結合
本明細書中に開示したモノクローナル抗体をさらに特徴づけするために、モノクローナル抗体が、ヒトのアルツハイマー病の脳の可溶性抽出物からのＡＤＤＬ（内因性ＡＤＤＬ）を同定し、対照の脳の抽出物からのものを区別することができるか否かを決定した。Ｆ１２中に調製した合成ＡＤＤＬおよびヒト脳抽出物を、Ｆ１２で希釈し、乾燥HYBOND（登録商標）ECL（登録商標）ニトロセルロース上に２つ１組で斑点を形成した（１ｐｍｏｌのＡＤＤＬ；０．５μｇの脳抽出物）。対応するＣＥＲＡＤ階級(Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease)およびＢｒａａｋ段階を有する脳組織を、NU Brain Bank Coreから得た。ブロットを、２０分間放置して乾燥し、次にＴＢＳ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．８％のＮａＣｌ）中の３％Ｈ２Ｏ２中で２０分間室温でインキュベートした。ブロットを、ストリップに切断し、ＴＢＳ−Ｔ（ＴＢＳ中の０．１％TWEEN（登録商標）−２０）中の５％ミルクで１時間室温で遮断した。
【０１７３】
ウサギポリクローナル抗体Ｍ７１／２（１：２５００、０．４μｇ；Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX）；モノクローナル抗体６Ｅ１０（１：５００、３μｇ；Signet Labs, Dedham, MA）；並びに本明細書中に開示したモノクローナル抗体２０Ｃ２（１．５２ｍｇ／ｍＬ、５μｇ）、１１Ｂ５（２．５４ｍｇ／ｍｌ、５μｇ）、２Ｂ４（１．７１ｍｇ／ｍＬ、５μｇ）、および２Ａ１０（１．９３ｍｇ／ｍＬ、７．５μｇ）（図３）を、１．５ｍＬのミルク／ＴＢＳ−Ｔで希釈し、１時間室温でインキュベートした。ブロットを、３×１０分間ＴＢＳ−Ｔで洗浄した。ブロットを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体（ミルク／ＴＢＳ−Ｔ中１：４０，０００；Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL）と共に１時間室温でインキュベートした。ブロットを、３×１０分間ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ｄＨ２Ｏで３回洗浄し、SUPERSIGNAL（登録商標）基質（ｄｄＨ２Ｏでの１：１希釈；Pierce, Rockland, IL）で展開し、HYPERFILM（登録商標）ECL（登録商標）(Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL)に曝露した。
【０１７４】
比較的高いタンパク質濃度において試験したにもかかわらず比較的弱い結合を有していた２Ａ１０を除いて、試験したすべての抗体は、強固な結合を伴う合成ＡＤＤＬを同定した。ポリクローナル抗体Ｍ７１／２並びにモノクローナル抗体２０Ｃ２および１１Ｂ５は、両方のアルツハイマー病試料に強力に結合したが、対照の脳においては、背景と同様の極めて弱い(faint)結合を示したに過ぎない。対照的に、モノクローナル抗体６Ｅ１０、２Ｂ４および２Ａ１０は、アルツハイマー病の脳への弱い結合を示した。
【０１７５】
本分析の結果は、試験したモノクローナル抗体の２種は、アルツハイマー病の脳と対照の脳との間で区別され得、ここで内因性オリゴマーへの結合は、高い程度の特異性を伴うことを示した。さらに、これらのデータは、検出を、アルツハイマー病の早期の段階で達成することができることを示す。
【０１７６】
例８：アルツハイマー病の、および対照の脳スライスの免疫組織化学的分析
本明細書中に開示したモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的分析を行って、ＡＤＤＬが、脳スライスにおいて、アルツハイマー病の脳抽出物と対照の脳抽出物とを区別するモノクローナル抗体を用いて視覚化することができるか否かを決定し、ＡＤＤＬ標識の性質（例えば広汎性の、ニューロン周囲の、プラーク様など）およびヒト組織中でのこの分布を例証した。固定したアルツハイマー病の脳および対照の脳の切片（４０μｍ）を、標準的な方法に従って調製した。スライスを、数種のモノクローナル抗体および１種のポリクローナル抗体で標識し、その後ヘマトキシリンで対比染色して、細胞核を確認した。イメージを、NIKON（登録商標）ECLIPSE（登録商標）E600光学顕微鏡を用いて、SPOT（登録商標）INSIGHT（登録商標）デジタルビデオカメラ（バージョン３．２）で得た。
【０１７７】
免疫組織化学的分析により、ＡＤＤＬ染色が、海馬、嗅内皮質および中前頭回におけるアルツハイマー病の脳において明白であることが示された。重篤なアルツハイマー病の症例において、主にプラークタイプの分布の外見を呈するものにおいて豊富な軽いＡＤＤＬ染色があった。ある程度の軽いＡＤＤＬ染色が、１つのアルツハイマー病の症例において、ニューロン周囲であると観察された。対照的に、対照試料のすべての領域におけるいずれの抗体を用いても、染色はなく、ドット状免疫染色により包囲されるまれなニューロンでさえない。
【０１７８】
これらのデータは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いて、固定されたヒト組織におけるＡＤＤＬを同定することができることを示し、ここで標識は変化し、プラーク様領域、血管領域および個別の細胞およびいくつかのクラスターのニューロン周囲標識からなる。さらに、アルツハイマー病の脳における、しかし対照の脳においてではないＡＤＤＬの標識は、少なくとも３つの脳領域において観察された：海馬、嗅内皮質および中前頭回。
【０１７９】
例９：Ａβ１−４０単量体様対照の免疫染色
Ａβ１−４０は、ＡＤＤＬと比較して、ＤＭＳＯ／Ｆ１２においてゆっくりとオリゴマー化する。従って、Ａβ１−４０が単量体様対照として作用し得るか否かを決定した。ＡＤＤＬを、SUPERDEX（登録商標）７５カラム（ＡＤＤＬ０６３）上でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）に供し、これは２つのピークに分割された。Ａβ１−４０を、ＤＭＳＯ／Ｆ１２（４５．５ｍＭ）中で調製し、凍結し、融解した。試料を、Ｆ１２で希釈し、Tricine試料緩衝液(BIO-RAD（登録商標）、Waltham, MA)で〜２：１で混合した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、１０〜２０％のTris-Tricineゲル(BIO-RAD（登録商標）、Waltham, MA)上で、Tris/Tricine/SDS緩衝液(BIO-RAD（登録商標）、Waltham, MA)を用いて、１２０Ｖにおいて室温で８０分間行った。ゲルを、SILVERXPRESS（登録商標）(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)で銀染色した（６０ｐｍｏｌのＡβ１−４０またはＡＤＤＬ；４０ｐｍｏｌのピーク１または２）。あるいはまた、ゲル（２０ｐｍｏｌのＡβ１−４０またはＡＤＤＬ；３０ｐｍｏｌのピーク１または２）を、HYBOND（登録商標）ECL（登録商標）ニトロセルロース上に、２５ｍＭのTris−１９２ｍＭのグリシン、２０％ｖ／ｖメタノール、ｐＨ８．３、０．０２％ＳＤＳを用いて、１００Ｖで１時間８℃でエレクトロブロットした(electroblotted)。
【０１８０】
ブロットを、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭのTris−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中の０．１％TWEEN（登録商標）−２０、０．８％ＮａＣｌ）中の５％ミルクで、一晩８℃で遮断した。モノクローナル抗体６Ｅ１０（１：２０００；Signet Labs, Dedham, MA）、モノクローナル抗体２０Ｃ２（１．５２ｍｇ／ｍＬ、１：２０００；図３）またはポリクローナル抗体Ｍ７１／２（１：４０００、Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX)を、ミルク／ＴＢＳ−Ｔで希釈し、ブロットと共に９０分間室温でインキュベートした。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔで３×１０分間洗浄し、その後ＨＲＰ結合二次抗体（ＴＢＳ−Ｔ中１：４０，０００；Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL）と共に１時間室温でインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔで３回、１回の洗浄あたり１０分間洗浄した後、ブロットを、ｄＨ２Ｏで３回洗浄し、SUPERSIGNAL（登録商標）West Femto Maximum Sensitivity基質（ｄｄＨ２Ｏでの１：１希釈；Pierce, Rockland, IL）で展開し、HYPERFILM（登録商標）ECL（登録商標）(Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL)に曝露した。
【０１８１】
銀染色分析により、Ａβ１−４０が、重単量体バンドとして示された。対照的に、ＡＤＤＬおよびピーク１は、単量体、三量体および四量体を示したが、四量体は比較的少量であった。ピーク２の銀染色分析により、重単量体が、比較的軽い三量体および極めて軽い四量体バンドと共に示された。
【０１８２】
Ａβ１−４０の６Ｅ１０での免疫染色により、軽単量体バンドのみが示された。ＡＤＤＬおよびピーク１の６Ｅ１０での免疫染色により、単量体、三量体、四量体および１２〜２４量体が示された。ピーク２は、６Ｅ１０での重単量体染色並びにある軽三量体および四量体を示し、１２〜２４量体を示さなかった。２０Ｃ２またはＭ７１／２でのＡβ１−４０の単量体染色はなかった。２０Ｃ２およびＭ７１／２の両方が、ＡＤＤＬおよびピーク１の最小の単量体染色を示したかまたはこれを示さなかった一方、これらの試料は、２０Ｃ２およびＭ７１／２での三量体、四量体および１２〜２４量体染色を有していた。２０Ｃ２およびＭ７１／２でのピーク２免疫染色により、軽単量体、三量体および四量体が示され、１２〜２４量体は観察されなかった。Ａβ１−４０は、一層重い銀染色にもかかわらず、ＡＤＤＬ単量体よりも軽く６Ｅ１０で免疫染色された。
【０１８３】
これらの結果は、単量体の良好な認識を示す６Ｅ１０抗体とは対照的に、移動緩衝液中の０．０２％ＳＤＳで移動させたゲルがオリゴマー特異性抗体での最小の単量体検出を示すことを示した。ＳＥＣ画分の免疫染色により、ほとんど単量体で構成され、少量の三量体および四量体を含み、１２〜２４量体を含まないピーク２が示され、一方ピーク１は、単量体、三量体、四量体および１２〜２４量体を有する。
【０１８４】
モノクローナル抗体をピーク１およびピーク２への結合に関してさらに特徴づけするために、捕獲抗体としてＡＤＤＬに対するポリクローナル抗体Ｍ９０を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡを、開発した。本明細書中で言及するＳＥＣピーク１およびピーク２画分は、SEPHADEX（登録商標）７５カラム上で分別されて、潜在的に生物活性であるオリゴマーと不活性であるオリゴマーとを区別したＡＤＤＬの２つの主要なピークである。非変性ゲル電気泳動により、３７℃で安定である大きい（＞５０ｋＤａ）および小さい（＜３０ｋＤａ）凝集体への分離が確認された。これらのピークを、クローン上清のための検出物質として、別個に用いた。結合を、VECTASTAIN（登録商標）キットで視覚化した。２つのピークの認識間の差異を、すべての抗体について観察した。例えば、抗体２Ｂ４および２０Ｃ２についてのピーク１対ピーク２の比率を比較のこと（図３）。１つのみの抗体が、ピーク２についての対照抗体（６Ｅ１０）優先度を反映する。
【０１８５】
例１０：Ａβ１−４２からのＡＤＤＬ産生の検出
ポリクローナル抗体を、ドットブロットにおいて用いて、Ａβ１−４２からの時間依存性ＡＤＤＬ産生を示した。従って、オリゴマーに優先的に結合するモノクローナル２０Ｃ２抗体がまた、ＡＤＤＬがＡβ１−４２から生成するに伴って時間と共に増大した信号を示し得ることが、例証された。〜７５０ｐｍｏｌのＨＦＩＰフィルムのＡβ１−４２を、１．５ｍＬのＤＭＳＯ（０．５ｍＭ）に溶解し、２μＬのアリコートを、Ｆ１２（１０ｎＭ）で１００μＬの最終容積に希釈し、氷上でインキュベートした。２μＬ（２０ｆｍｏｌ）の反応混合物を、乾燥HYBOND（登録商標）ECL（登録商標）ニトロセルロース(Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL)上に、特定の時点において斑点形成した。ニトロセルロースを、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭのTris−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．８％のＮａＣｌ、０．１％のTWEEN（登録商標）−２０）中の５％脱脂乾燥乳で、１時間室温で遮断した。
【０１８６】
ポリクローナル抗体Ｍ９０／１(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX)またはモノクローナル抗体２０Ｃ２（１．５２ｍｇ／ｍＬ）を、ミルク／ＴＢＳ−Ｔで１：２０００に希釈し、ブロットと共に９０分間室温でインキュベートし、続いてＴＢＳ−Ｔで３×１０分間洗浄した。ＨＲＰ結合二次抗体(Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL)を、ミルク／ＴＢＳ−Ｔで１：４０，０００に希釈し、ブロットを、６０分間室温でインキュベートし、続いて上記のように洗浄した。ｄＨ２Ｏで短時間洗浄した後、ブロットを、SUPERSIGNAL（登録商標）West Femto Maximum Sensitivity基質（ｄｄＨ２Ｏで１：１に希釈した；Pierce, Rockland, IL）と共に６０秒間インキュベートし、HYPERFILM（登録商標）ECL（登録商標）(Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL)に曝露した。ドットブロットを走査し、スポットの強度を、ADOBE（登録商標）PHOTOSHOP（登録商標）で決定した。
【０１８７】
両方の抗体は、Ａβ１−４２からの時間依存性ＡＤＤＬ産生を検出し、ここで、２０Ｃ２についての結果は、一層良好な信号および整合性を示した。いずれの抗体も、Ａβ１−４０を、ＡＤＤＬと同等の濃度において検出することはできなかった。単量体が常に存在し、オリゴマーが時間に伴って生成するため、これらのデータはさらに、この抗体のオリゴマー特異性を例証する。さらに、Ｍ９０／１と２０Ｃ２は共に、ＡＤＤＬよりも１００倍高い濃度においても、Ａβ１−４０単量体の最小の認識を示した。
【０１８８】
例１１：競合ドットブロットアッセイ
本明細書中に開示したモノクローナル抗体が単量体に結合することができるか否かを決定するために、競合ドットブロットアッセイを、合成ＡＤＤＬ、２０Ｃ２およびＡβ１−４０と共に行った。ＡＤＤＬを、１０ｐｍｏｌ／０．５μＬにおいて乾燥ニトロセルロースに適用した。ニトロセルロースを５％ＮＤＭ／ＴＢＳ−Ｔ中で１時間遮断した一方、種々の濃度でのＡＤＤＬおよび新鮮なＡβ１−４０を、５％ＮＤＭ／ＴＢＳ−Ｔ中で１時間、各々２００μＬの２０Ｃ２（１．５μｇ／ｍＬの最終濃度）と共にインキュベートした。次に、これらの溶液を、ＳＵＲＦ−ＢＬＯＴ装置を用いてニトロセルロースに適用し、室温で１．５時間振動しながらインキュベートした。その後、ブロットを、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰおよび化学発光で視覚化した。定量を、KODAK（登録商標）IMAGESTATION（登録商標）440およびEXCEL（登録商標）を用いて行った。
【０１８９】
この分析の結果は、溶液中の合成ＡＤＤＬが、ニトロセルロース上に固定されたＡＤＤＬに結合する２０Ｃ２を、ＡＤＤＬについて＜５０ｎＭにおいて観察される半最大阻害で有効かつ特異的に遮断することができることを示した。対照的に、溶液中のＡβ１−４０は、２０Ｃ２の固定されたＡＤＤＬへの結合を遮断しなかった。
【０１９０】
いずれの部分がＡβ１−４２分子の結合エピトープを構成するかを決定するために、競合ドットブロットアッセイを、ＡＤＤＬ、２０Ｃ２およびペプチドを用いて行った。ＡＤＤＬを、ニトロセルロース上に、各々０．５μＬ中の４種の濃度（１、０．５、０．２５および０．１２５ｐｍｏｌ）において斑形成した。ニトロセルロースを５％ＮＤＭ／ＴＢＳ−Ｔ中で２時間遮断した一方、５０、１００および２００ｐｍｏｌにおけるペプチドを、２００μＬの２０Ｃ２（１．５２μｇ／ｍＬの最終濃度＝１．９ｐｍｏｌ、５％ＮＤＭ／ＴＢＳ−Ｔ中）に加え、室温で振動させた。その後、溶液を、ニトロセルロースと共に、ＳＵＲＦ−ＢＬＯＴ装置を用いて１．５時間室温でインキュベートした。結合を、化学発光を用いて抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰで視覚化した。
【０１９１】
この分析の結果は、ＡＤＤＬへの結合が、ＡＤＤＬ自体により、およびＡβ１−２８により遮断されるが、ペプチドの他の組み合わせでは遮断されないことを示した。従って、結合エピトープは、Ａβ１−２８が達成することができるが、Ａβ１−１２およびＡβ１２−２８またはこれらの組み合わせにおいては有効ではないある立体構造を必要とした。あるいはまた、Ａβ１−２８は、立体障害によりＡＤＤＬの結合を遮断する二量体を形成する。
【０１９２】
Ａβ１−２８が凝集するか（Ａβ１−４２と同様に）、これが２０Ｃ２についての結合エピトープを遮断するように折りたたまれるかを決定するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを銀染色し、ウエスタンブロット分析を行った。ＡＤＤＬおよびＡβ１−２８（各々６０ｐｍｏｌの２つのレーンを、銀染色のために用い、２０ｐｍｏｌを、他のものに用いた）を、１０〜２０％のTris-TricineＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。６０ｐｍｏｌのレーンを切り取り、SILVERXPRESS（登録商標）(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)で染色した；あるいはまた、ゲル（２０ｐｍｏｌのＡＤＤＬおよびＡβ１−２８）を、HYBOND（登録商標）ECL（登録商標）ニトロセルロース上に、２５ｍＭのTris−１９２ｍＭのグリシン、２０％ｖ／ｖのメタノール、ｐＨ８．３、０．０２％のＳＤＳを用いて、１００Ｖで１時間８℃においてエレクトロブロットした。ブロットを、ＴＢＳ−Ｔ中の５％ミルク（２０ｍＭのTris−ＨＣｌ中の０．１％TWEEN（登録商標）−２０、ｐＨ７．５、０．８％ＮａＣｌ）で遮断した。試料を、２０Ｃ２（１：１０００、１．５２ｍｇ／ｍＬ）または２０Ｃ２＋Ａβ１−２８（２ｎｍｏｌ、２時間プレインキュベートした）と共に１．５時間室温で、上記の遮断緩衝液中でインキュベートした。結合を、抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＴＢＳ−Ｔ中１：４０，０００）および化学発光で視覚化した。
【０１９３】
銀染色は、ＡＤＤＬレーンにおいて単量体、三量体および四量体を示し、一方Ａβ１−２８レーンは、ほぼ二量体において走行した１つの種を有していた。ＡＤＤＬは、２０Ｃ２により視覚化されたが、Ａβ１−２８は視覚化されず、２０Ｃ２によるすべてのＡＤＤＬ種への結合は、Ａβ１−２８により遮断された。さらに、２０Ｃ２結合エピトープがＡβ１−２８により遮断される一方、２０Ｃ２は、ウエスタンブロットにおいてＡβ１−２８ペプチドを認識しない。
【０１９４】
例１２：抗ＡＤＤＬ抗体のアイソタイプ分析
本明細書中に開示したモノクローナル抗体をさらに特徴づけするために、アイソタイプ分析を、SIGMA IMMUNOTYPE（登録商標）キットをマウスモノクローナル抗体アイソタイピング試薬(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents)と共に用いて、製造者(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO)の指示に従って行った。この分析の結果を、図３に示す。
【０１９５】
例１３：抗ＡＤＤＬ抗体の核直線状エピトープマッピング
抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体のアミロイドベータペプチドとの特異的な相互作用を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて検出した。要するに、合成ペプチドまたはいくつかの場合においてはＡＤＤＬもしくは原繊維を、抗原として用いて、NUNC（登録商標）MAXISORB（登録商標）プレート上に４μｇ／ｍＬ（約８００〜１２００ｎＭ）の濃度において塗布した。特定しない限り、ペプチドを、５ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中で、一晩４℃で塗布した。プレートを、０．０５％のTWEEN（登録商標）２０および３％（ｗ／ｖ）の脱脂乾燥乳を含むＰＢＳで１時間遮断した後に、モノクローナル抗体を、遮断緩衝液中で所定の濃度において滴定し、プレートを、１時間周囲温度において温和に振動させながらインキュベートした。洗浄した後、遮断緩衝液で希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を、プレートに加えた。比色基質であるＴＭＢを、大規模に洗浄した後にプレートに加えて、結合していないＨＲＰ結合体を除去した。吸光度を、４５０ｎｍの波長において、プレートリーダー上で測定した。
【０１９６】
抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体についての核直線状エピトープをマッピングするために、１つの群の重複する１０個のアミノ酸ペプチドを合成して、Ａβ１−４２を包含した（表１）。Ａβ１−４２の逆転されたアミノ酸配列を有する１４個のアミノ酸の３つのペプチドをまた、非特異性対照ペプチドとして合成した。
【０１９７】
【表１】
0005634975.tif 000002
【０１９８】
すべてのペプチドを、ＤＭＳＯに、約４００〜５００μＭ（１ｍｇ／ｍＬ）において溶解し、−２０℃で複数のアリコートにおいて貯蔵した。ペプチドを、抗ＡＤＤＬモノクローナル抗体の核エピトープの決定のために、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて用いた。各々のモノクローナル抗体を、Ｎ末端ペプチド群（残基１〜２５から）またはＣ末端ペプチド群（残基１７〜４２から）のいずれかに対して、対照ペプチドと共に、４通りの濃度（３、１、０．３および０．１μｇ／ｍＬ）において試験した。モノクローナル抗体のパネルについての核直線状エピトープを、表２に列挙する。数種の市販のモノクローナル抗体（６Ｅ１０、ＢＡＭ−１０、４Ｇ８およびＷＯ−２）を、実験中に包含させて、アッセイ様式を認証し、結果により、刊行された文献において報告されたように、これらの核直線状エピトープが確認された。
【０１９９】
【表２】
0005634975.tif 000003
【０２００】
評価した１２種のＡＤＤＬ特異性モノクローナル抗体のうち９種を、Ａβ１−４２のＮ末端領域に対してマッピングし、これらのうち７種を、アミノ酸残基３〜８に対してマッピングした。２種のモノクローナル抗体２Ｈ４および２Ｅ１２は、わずかに比較的大きいエピトープを優先する。３種のモノクローナル抗体１Ｆ４、１Ｆ６および３Ｂ３は、３μｇ／ｍＬの高い濃度においてさえも重複するペプチド群に結合しなかったが、これらのエピトープは、これらがＡβ１−２０ペプチドに結合することができたため、Ａβ１−４２のＮ末端に位置すると推定され、これを、当該実験において陽性対照として用いた。
【０２０１】
例１４：マウス抗ＡＤＤＬ抗体の親和性および特異性
溶液に基づいた結合アッセイを開発して、種々のアミロイドベータペプチド調製物（ＡＤＤＬ、原繊維、Ａβ１−４０、Ａβ１−２０）に対する抗ＡＤＤＬ抗体の特異性および親和性を決定した。NUNC（登録商標）プレート上に塗布したＡＤＤＬに対するモノクローナル抗体の用量応答の直線的な範囲を記録することができる、定量的ＥＬＩＳＡを確立した。この情報に基づいて、ＥＬＩＳＡにおいて、アッセイノイズ（０．２〜０．５の周囲のＯＤ４５０ｎｍの読み取り）よりもわずかに高い一貫したＯＤ信号を提供することができる固定された濃度のモノクローナル抗体を、選択した。
【０２０２】
次に、ＩｇＧを、この固定された濃度において、種々のアミロイドベータペプチド基質（ＡＤＤＬ、原繊維、Ａβ１−４０、Ａβ１−２０）と共に、溶液中での２０の時点での滴定において室温で一晩インキュベートして、平衡に到達させた。混合物内の遊離のＩｇＧの量を、翌日、定型的なＥＬＩＳＡプレート上での１時間のインキュベーションを伴う定量的ＥＬＩＳＡにおいて決定した。結合したＩｇＧの割合を、計算し、結合したＩｇＧの遊離のリガンド（基質）の滴定に対する相関を用いて、ＫＤを誘導し、これにはGraFitプログラム(Erithacus Software、Surrey、UK)を用いた。従って、種々のアミロイドベータペプチド調製物に対する各々の抗体についての基質の優先度を、固有の親和性値（ＫＤ）として表した。
【０２０３】
このアッセイ様式を用いるいくつかの利点があった。第１に、抗体および基質の相互作用は、溶液相においてであり、従って、定型的なＥＬＩＳＡアッセイまたはBIACORE（登録商標）実験におけるようなすべての固体表面からの束縛はなく、ここでＥＬＩＳＡプレートまたはセンサーチップからの固体表面の、モノクローナル抗体に対する可能性のある影響および基質相互作用を、データの解釈のために考慮しなければならない。第２に、相互作用は、放置して平衡に到達した。従って、ＩｇＧおよび基質の相互作用は、両方の成分の限定的な濃度において発生し、高い実験的濃度によるＩｇＧの沈殿または追加的なアミロイドベータペプチドのオリゴマー化についての懸念を伴わなかった。
【０２０４】
第３に、アッセイの読み取りは、溶液中の抗原とは独立であった；従って、異なるペプチド調製物（例えばＡＤＤＬまたは原繊維）におけるアミロイドベータのいかなる異種構造も、データの解釈および数学モデル化に干渉しない。アッセイの感受性は、ＥＬＩＳＡアッセイ検出限界に限定され、これにより、このアッセイが、ナノモル範囲におけるＫＤ値を有するモノクローナル抗体を評価することが可能になった。代替の基質、例えば蛍光試薬は、感受性範囲を改善することが意図される。免疫性複合体は、１時間のインキュベーションの間に最小限に分裂して、遊離のＩｇＧを定量的なＥＬＩＳＡにおいて記録したと、考えられる。
【０２０５】
遊離のＩｇＧの量を、標準曲線により決定し、種々の基質の滴定に対してプロットした。種々の基質との結合ＩｇＧの量をプロットし、情報を、適切な数学モデルと適合する曲線について、GraFitにおいて用いた。本明細書中に開示されたモノクローナル抗体のパネルについての、ｎＭ範囲で表されたＫＤの概要を、表３に示す。
【０２０６】
【表３】
0005634975.tif 000004
【０２０７】
例１５：タウリン酸化の検出および測定
過剰リン酸化されたタウ（ｐＴａｕ）は、アルツハイマー病の特徴であるが、この過剰リン酸化を生じる事象については、ほとんど知られていない。あらゆる理論により束縛されることを望まず、ＡＤＤＬは、このリン酸化事象において作用を奏し得ると、考えられる。これを調査するために、ニューロン培養物（一次ニューロンおよびＢ１０３細胞）を、上記のように増殖させ、１μｍのｂＡＤＤＬまたはビヒクルを、培地に加え、培養物を、さらに１時間、６時間または２４時間維持した。各々のインキュベーションの終了時に、細胞を洗浄し、固定し、透過性にし、遮断し、ｐＴａｕに対して産生したモノクローナル抗血清（ＡＴ８、１：５００；Pierce, Rockland, IL）と共に一晩インキュベートした。翌日、細胞を洗浄し、ALEXA（登録商標）４８８で標識した抗マウス二次抗体およびALEXA（登録商標）５９４で標識したストレプトアビジンと共にインキュベートし、細胞を、ＤＡＰＩで染色して、核の検出を可能にした。次に、細胞を、蛍光顕微鏡を用いて評価し、ｐＴａｕ染色の程度およびｂＡＤＤＬ結合との相関関係を、各々の時点において記録した。
【０２０８】
この分析の結果は、Ｂ１０３細胞へのｂＡＤＤＬ結合が、ビヒクルで処理した細胞と比較した場合に、細胞過程におけるｐＴａｕのレベルを増大させることを示した。同様の変化がまた、一次海馬細胞において記録された。細胞をｂＡＤＤＬに６時間曝露した場合には、ｐＴａｕ染色における増大が、細胞、即ちまたｂＡＤＤＬに結合する細胞の亜集団において観察された。Ｂ１０３細胞での時間経過研究により、さらにｂＡＤＤＬによるｐＴａｕの調節を検査した。ｂＡＤＤＬを加えた結果、１時間においてｐＴａｕのわずかな増大がもたらされた。しかし、ｐＴａｕ染色は、ｂＡＤＤＬを加えてから６時間後に劇的に増大し、２４時間後まで上昇されて維持された。従って、これらのデータは、ニューロンへのＡＤＤＬ結合が、タウの過剰リン酸化、神経原線維変化の蓄積および最終的な細胞死をもたらす細胞内事象のカスケードを開始し得ることを示す。このために、当業者は、ＡＤＤＬのニューロンへの結合を遮断することにより、次にこのような下流の事象が防止され、アミロイド形成的疾患および／またはタウオパシーの処置に有益であることを認識することができる。さらに、ＡＤＤＬ結合により誘発される信号伝達事象およびｐＴａｕ産生における結果の一層良好な理解により、また、新規な治療の開発のための好適な標的である追加的な経路が明らかになり得る。
【０２０９】
例１６：Ａβペプチド／ＡＤＤＬ−抗体相互作用および構築阻害
本明細書中に開示した選択されたモノクローナル抗体の存在下での、ＡＤＤＬ構築動力学およびオリゴマーの大きさの変化を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）および蛍光分極（ＦＰ）により、フルオレセイン標識Ａβ１−４２単量体対ネイティブなペプチド単量体の１：４の混合物を用いて、観察した。ＡＤＤＬ中への単量体導入によるフルオレセイン発光の自己消光の結果、ＦＲＥＴによる短時間の時間規模にわたる蛍光強度の３倍〜５倍の減少がもたらされる。さらに、単量体をオリゴマーＡＤＤＬ種中に構築した際の大きさの増大の結果、２倍のＦＰ増大がもたらされる。種々の新規な、および市販の抗ＡＤＤＬおよび抗Ａβペプチド抗体の存在下での、ＡＤＤＬ構築物のＦＲＥＴおよびＦＰ動力学進行曲線は、抗体が、ＡＤＤＬ構築を阻害し、かつ／またはペプチドオリゴマーに結合する能力における差異を示した（図４）。
【０２１０】
アッセイを、３８４ウェルのCORNING（登録商標）Non-Binding Surface黒色不透明マイクロタイタープレートにおいて行った。アッセイ緩衝液は、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭのMOPS-Tris（ｐＨ８．０）から構成されていた。アッセイ容積は、０．２μＭのＦＩＴＣ−Ａβ１−４２および０．８μＭのＡβ１−４２を含んで５０μＬであり、アッセイ温度は３７℃であった。ＡＤＤＬ構築を、４８５ｎｍの波長において励起し、５１５ｎｍの波長において発光を検出して、Tecan GENios Proプレートリーダーでモニタリングした。動力学的記録を、蛍光強度および分極読み取りを５分おきに６時間の時間経過にわたり記録することにより、採集した。この時間の間にＡＤＤＬ中に感知可能な程度に構築されなかった陰性対照の反応は、ＭｇＣｌ２を欠いていたが、すべての他の緩衝液およびペプチド成分を含んでいた。陽性対照の反応は、加えられたモノクローナル抗体試薬の不存在下で、すべての緩衝液成分を含んでいた。ＡＤＤＬ結合および構築阻害について試験するために、抗体を、５００ｎＭから５ｎＭに減少させた８通りの濃度において、ペプチド混合物と共にインキュベートした。
【０２１１】
このアッセイは、ＡＤＤＬ結合挙動およびＡＤＤＬ構築阻害の種々のプロフィールを分類するために、有用であった。ＡＤＤＬ特異性および／または立体構造的エピトープとの相互作用による、比較的大きいＡＤＤＬ種の結合および中和は、実行可能な治療的方策として作用する。さらに、遷移性であり、中間的なＡＤＤＬ構築種（非単量体）中に存在するＡＤＤＬ特異性および／または立体構造的エピトープに結合することによる、大きいＡＤＤＬ中へのオリゴマー化の阻害により、抗ＡＤＤＬ療法のための代替的な方策が得られる。抗体間の顕著な差異を例証するＦＰ進行曲線は、このような中間的な、または安定な種の結合を示す。モノクローナル抗体のＦＰ／ＦＲＥＴ挙動を他の機能的な、細胞的な、およびインビボの効果と相関させることにより、作用の所望の免疫療法方式の選択が可能になる。
【０２１２】
本明細書中に開示した分析の結果は、１Ｆ６、２Ａ１０、５Ｆ１０、２Ｄ６および２Ｂ４が、有効な構築阻害を示す一方、２０Ｃ２、１Ｆ４および４Ｃ２は、中間の構築阻害を示し、２Ｈ４、３Ｂ３および４Ｅ２は、弱い構築阻害を示すことを示している（図４）。表４に要約し、図５に例示するように、２０Ｃ２、４Ｅ２、３Ｂ３および５Ｆ１０は、種々の生化学的挙動を示す。
【０２１３】
【表４】
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【０２１４】
さらに、低ｎ量体生成ペプチドＡβ１−４２［Ｎｌｅ３５−Ｄｐｒｏ３７］に対して発生した、５種の精製した抗体（即ち１Ａ９、１Ｅ３、１Ｇ３、１Ａ７および１Ｅ５）の１種である抗体１Ａ９は、この構築阻害およびＦＰ挙動の観点において、５Ｆ１０と共に分離する。
【０２１５】
さらに、２０Ｃ２は、ＳＥＣ／ＩＣＣにより決定されて、電荷が反転した、切断されたＡβ７−４２ペプチド構築物の構築物に結合すると見出され、これは、Ａβの残基７〜１６に相当する全く異なった配列、即ちＡβ（７−４２）［Ｏｒｎ７Ｏｒｎ１１Ｄ１３Ｄ１４Ｅ１６Ｎｌｅ３５］を有する、Ａβ７−４２電荷反転ペプチドに結合する慣用の直線状エピトープの欠如を示している。従って、２０Ｃ２は、Ａβの残基１７〜４２内からの要素に依存する立体構造的エピトープに結合するが、構築された場合のみである。
【０２１６】
例１７：マウス抗体可変部配列の単離
マウス抗体の可変ドメインをコードするｃＤＮＡを、クローン化し、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）に従って、マウス定常部の５’末端に、およびＶ部の上流のマウスリーダー配列にハイブリダイズする特別に設計されたプライマーを用いて配列決定した。これにより、得られたマウス可変部配列が、完全であり、正確であることが確実になった。要するに、ｍＲＮＡを、マウスハイブリドーマ細胞系から、QIAGEN（登録商標）OLIGOTEX（登録商標）Direct mRNA Mini Kitを用いて抽出し、その後一本鎖(first-strand)ｃＤＮＡ合成キットを用いてｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応における鋳型として用いて、抗体可変部配列を得た。
【０２１７】
軽鎖可変部配列を得るために、１１の独立したＰＣＲ反応を、１１種の軽鎖５’ＰＣＲプライマー（ＭＫＶ−１〜ＭＫＶ−１１）および３’ＰＣＲプライマーＭＫＣ−１の各々を用いて、企画した（表５）。
【０２１８】
【表５】
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【０２１９】
重鎖可変部配列を得るために、１２の独立したＰＣＲ反応を、１２種の重鎖５’ＰＣＲプライマー（ＭＨＶ−１〜ＭＨＶ−１２）および適切なアイソタイプ特異性３’プライマー（ＭＨＣＧ−１、ＭＨＣＧ−２Ａ、ＭＨＣＧ−２Ｂ、ＭＨＣＧ−３）の各々を用いて、企画した（表６）。
【０２２０】
【表６】
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【０２２１】
軽鎖ＰＣＲ反応の各々は、４６μＬのINVITROGEN（登録商標）PLATINUM（登録商標）PCR Super Mix、１．０μＬの１００μＭの５’プライマー（ＭＫＶ−１〜ＭＫＶ−１１）の１種、１．０μＬの１００μＭの３’プライマー（ＭＫＣ−１）および２．０μＬのハイブリドーマｃＤＮＡを含んでいた。同様のＰＣＲ反応を用いて、マウス重鎖可変部配列をクローン化した。反応を、ＤＮＡ熱サイクラー中に配置し、９７℃での２．０分間の初期変性段階の後に：９５℃で３０秒間、５５℃で４５秒間、および７２℃で９０秒間のサイクルを３０回施した。最後のサイクルの後に、７２℃で１０分間の最終的な拡張段階を用いた。
【０２２２】
いずれのＰＣＲ反応により生成物が得られたかを決定するために、各々の反応からの５μＬのアリコートを、０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを含む１．５％（ｗ／ｖ）アガロース／１Ｘ  ＴＡＥ緩衝液ゲル上で分離した。次に、予測された大きさ（４２０〜５００ｂｐ）の断片を生成した反応からのＰＣＲ生成物を、ゲル精製し、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化し、プラスミドｐＮＥＢ１９３(New England Biolabs, Beverly, MA)の多重クローニング領域中のＸｂａＩおよびＳａｃＩ部位中に連結した。あるいはまた、ＰＣＲ生成物を、プラスミドｐＣＲ（登録商標）２．１中に、INVITROGEN（登録商標）TA CLONING（登録商標）キットを用いて直接連結した。次に、連結生成物を、ＸＬ−１細胞に形質転換し、形質転換した大腸菌のアリコートを、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上に蒔き、４０μＬのＸ−Ｇａｌストック（５０ｍｇ／ｍＬ）および４０μＬのＩＰＴＧ（１００ｍＭ）溶液で、青色／白色選択のために被覆した。
【０２２３】
プレートを、３７℃で一晩インキュベートし、可能性のあるクローンを、白色コロニーとして同定した。各々のＰＣＲ生成物についての少なくとも２４種の独立したクローンからのＤＮＡを、両方のらせんについて、ｐＮＥＢ１９３およびｐＣＲ（登録商標）２．１についての普遍的な順方向および逆方向プライマーを用いて配列決定した。次に、得られた配列を、コンティグ中に構築して、各々の抗体軽鎖および重鎖可変部についてコンセンサス配列を発生させた。この方法を用いて、配列を、ハイブリドーマ２０Ｃ２、５Ｆ１０、２Ｄ６、２Ｂ４、４Ｅ２、２Ｈ４、２Ａ１０、３Ｂ３、１Ｆ６、１Ｆ４、２Ｅ１２および４Ｃ２の軽および重抗体可変部について決定した（図６Ａ〜６Ｘ）。
【０２２４】
図６Ａ〜６Ｘにおいて、抗原に相補的な構造を形成する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に、下線を付した。ＣＤＲおよび対応する抗原エピトープ（表２）の分析により、配列の類似性が観察された。Ａβ１−４２の３−８アミノ酸エピトープを共有する抗体（即ち２Ａ１０、４Ｃ２、２Ｄ６、４Ｅ２、２０Ｃ２、２Ｂ４および５Ｆ１０）は、重鎖の高度に相同性のＣＤＲ１（図７Ａ）およびＣＤＲ２（図７Ｂ）配列を共有していた。Ａβ１−４２の１−８アミノ酸エピトープを認識すると見出された抗体２Ｈ４は、重鎖の独特なＣＤＲ３（図７Ｃ）配列並びに軽鎖の独特なＣＤＲ１（図７Ｄ）、ＣＤＲ２（図７Ｅ）およびＣＤＲ３（図７Ｆ）配列を有すると見られた。
【０２２５】
同様に、Ａβ１−４２の３−１０アミノ酸エピトープを認識すると見出された抗体２Ｅ１２は、重鎖の独特なＣＤＲ３配列（図７Ｃ）を有していた。さらに、ＳＥＣピーク１およびピーク２ＡＤＤＬに対する同様の親和性を有する抗体２Ａ１０、２Ｂ４、４Ｃ２および４Ｅ２（図３を参照）は、重鎖の高度に相同性のＣＤＲ３配列を共有していた（図７Ｃ）。さらに、抗体４Ｅ２の重鎖のＣＤＲ３におけるアミノ酸置換は、４Ｅ２が抗体２Ｄ６よりも、ニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断するにあたり有効であるため、ＡＤＤＬのニューロン細胞への結合の遮断を増強すると見られ、４Ｅ２および２Ｄ６の重鎖および軽鎖の配列は、重鎖のＣＤＲ３の３個のアミノ酸残基を除いて同一であった；それぞれ２Ｄ６および４Ｅ２についてＳｅｒ対Ａｓｎ、Ｔｈｒ対ＳｅｒおよびＩｌｅ対Ｖａｌ（図７Ｃ）。
【０２２６】
例１８：マウス抗ＡＤＤＬ抗体可変部配列のヒト化
マウスハイブリドーマ細胞系２０Ｃ２、２６Ｄ６、４Ｅ２、３Ｂ３、２Ｈ４および１Ｆ６から得られたマウス抗体重および軽可変ドメイン核酸を、ＣＤＲ移植方法並びに２０Ｃ２および２６Ｄ６の場合においては化粧張り方策を用いてヒト化した。当業者は、マウス抗体配列のヒト化は、この血清半減期およびＦｃエフェクター機能を改善し、これにより抗グロブリン応答を低減することにより、抗体の治療的効力を最大化することができることを、理解する。
【０２２７】
ＣＤＲ移植によるヒト化を、マウス可変ドメインに対する最高の相同性を有するＮＣＢＩタンパク質データベースからヒト軽鎖および重鎖可変部を選択することにより、行った。マウス可変部配列を、データベース中のすべてのヒト可変部配列と、タンパク質−タンパク質Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）を用いて比較した。その後、マウスＣＤＲを、ヒトフレームワーク領域に接合し、先行するアミノ酸配列を分析した。フレームワーク領域におけるマウス配列とヒト配列との間のすべての差異を、特にこれらがループ構造についての基準の配列の一部であったかまたはＶＬ／ＶＨ界面に位置する残基であった場合に、評価した（O'BrienおよびJones (2001)、Antibody Engineering、Kontermann and Dubel（編）、Springer Laboratory Manuals中）。
【０２２８】
フレームワーク領域をまた、ヒト亜群についての、および可能性のあるグリコシル化部位についてのコンセンサス配列に対する比較において、普通ではない、またはまれなアミノ酸について走査した。アミノ酸配列の差異が、基準の配列に関与するとは見出されていないマウスおよびヒトフレームワーク領域配列の間に存在したか、またはＶＬ／ＶＨ界面に位置した場合において、ヒト残基を、当該位置において選択した。重要な残基の差異が存在した場合において、可変部配列の２つの方式を、評価のために発生させた。ＣＤＲ移植方策により、ヒトフレームワーク領域に最小数の変化がなされ、従って良好な抗原結合が達成された一方、天然のヒト抗体からの配列と密接に整合するヒトフレームワーク領域が維持された。ＣＤＲ移植を用いた、ヒト化されたアミノ酸配列の設計を、図８に示す。
【０２２９】
２０Ｃ２および２６Ｄ６についてのヒト化された配列をまた、化粧張り方策を用いて設計した（例えば米国特許第6,797,492号を参照）。ヒト化を、マウス可変ドメインおよび最も近いヒト抗体生殖系列族（１または２以上）に対する最高の相同性を有するＮＣＢＩタンパク質データベースからヒト軽鎖および重鎖可変部を選択することにより、行った（Kabatら(1991)、Sequences of proteins of immunological interest、第５版、U.S. Dept. Health and Human Services、NIH、Washington DCを参照）。マウス可変部配列を、データベース中のすべてのヒト可変部配列に対して、タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴを用いて比較した。
【０２３０】
マウス可変配列およびこれらの最も近いヒト相同体を、当該分野において行われているコンピューターモデル化により決定したように、最も近い結晶化されたヒト抗体に対してモデル化した。マウスＶＨおよびＶＬ配列のモデルから、表面領域マップを構成し、これは、マウス重および軽可変部におけるアミノ酸の溶媒接触性に影響した。モデル化を確認するために、これらの露出した残基を、既知の表面接触性残基と、位置どうしで比較した（例えば、Padlan (1994) Mol. Immunol. 31(3):169-217を参照）。記録を、確立された方法に従って、これを指定する配列における各々の残基について、露出している、ほとんど露出している、部分的に包埋されている、ほとんど包埋されている、および包埋されていると割り当てた（米国特許第6,797,492号を参照）。露出している、またはほとんど露出していると記録され、相同的なヒト配列と異なるマウスフレームワーク残基を、当該位置において、ヒト残基と交換した。
【０２３１】
設計された化粧張りされた配列は、マウスＣＤＲ、ＣＤＲに隣接する残基、基準の配列に関与すると知られている残基、ＶＬ／ＶＨ界面に位置する残基、並びにマウス重鎖および軽鎖のＮ末端配列における残基を維持した。Ｎ末端配列は、ＣＤＲ表面と近接すると知られており、リガンド結合に有効に関与している。同様に、Ｐｒｏ、Ｇｌｙまたは帯電した残基における変化を限定するように、注意した。化粧張りした配列を仕上げた後に、これらを、再びモデル化して、すべての可能性のある明らかな構造的問題点を探索した。いくつかの例において、１つより多い化粧張りした配列を、分析のために発生させた。ヒト化されたアミノ酸配列の、化粧張り方法を用いた設計を、図９に示す。
【０２３２】
ヒト化されたアミノ酸配列を選択した後に、配列を、逆翻訳して、対応するＤＮＡ配列を得た。ＤＮＡ配列を、当該分野で確立されている方法(Lathe (1985)、J. Mol. Biol. 183(1):1-12)を用いて、コドン最適化し、ヒト抗体発現ベクター中にクローン化するために、フランキング制限酵素部位を用いて設計した。合成したＤＮＡ配列を、図１０Ａ〜１０Ｔに示す。ＣＤＲ移植および化粧張りにより設計された２０Ｃ２ヒト化抗体について、ヒトＩｇＧ１／カッパおよびＩｇＧ２ｍ４／カッパ様式の両方を構成し、ここでＩｇＧ２ｍ４は、ヒトＩｇＧ４配列の標準的なヒトＩｇＧ２定常部中への選択的導入を表す。ＩｇＧ１／カッパおよびＩｇＧ２ｍ４／カッパ様式をまた、２６Ｄ６ＣＤＲ移植した抗体について作成した。すべての他の抗体について、ＩｇＧ１／カッパ様式のみを作成した。得られた抗体の完全なアミノ酸配列を、図１１Ａ〜１１Ｙに示す。
【０２３３】
抗体を、別個の軽鎖および重鎖発現プラスミドを２９３ＥＢＮＡ細胞中に同時一過性導入(co-transient transfection)することにより、発現させた。１つより多いヒト化された重鎖または軽鎖配列を所定の抗体について設計した場合には、重鎖および軽鎖のすべての組み合わせを混ぜ合わせて、対応する抗体を発生させた。抗体を、培養上清から、形質導入の７〜１０日後にプロテインＡカラムを用いて精製し、その後の分析において用いた。
【０２３４】
例１９：ＩｇＧ２ｍ４抗体の発生
ＩｇＧ２ｍ４抗体誘導体を調製して、Ｆｃレセプター会合、Ｃ１ｑ結合、不所望な細胞毒性または免疫複合体生成を低減し、同時に典型的なヒト抗体の長い半減期および薬物動態学的特性を共に維持した。ＩｇＧ２ｍ４の基本的な抗体様式は、ＩｇＧ２のものであり、これは、実験的モデルにおいて優れた半減期を有すると示されている(Zuckierら(1994)、Cancer Suppl. 73:794-799)。ＩｇＧ４配列の選択的な導入により、ＩｇＧ２の構造を改変して、Ｃ１ｑ結合を解消し、一方典型的な低レベルのＦｃγＲ結合を維持した(CanfieldおよびMorrison (1991)、J. Exp. Med. 173:1483-1491)。これは、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４の配列が同一である交差点を用いることにより、達成され、これにより、すべての人工的な突然変異配列よりもむしろ、天然のＦｃ配列を含む抗体が得られた。
【０２３５】
ヒト抗体定常部のＩｇＧ２ｍ４形態を、図１２に示すように、ヒトＩｇＧ４配列を標準的なヒトＩｇＧ２定常部中に選択的に導入することにより、形成した。概念的に、ＩｇＧ２ｍ４は、図１２に示すように、ＣＨ２ドメイン内の１対の鎖交換から得られた。４つの単一の突然変異を、ＩｇＧ４からの配列に対応して生じさせた。ＩｇＧ２において突然変異したＦｃ残基は、Ｈｉｓ２６８Ｇｌｎ、Ｖａｌ３０９Ｌｅｕ、Ａｌａ３３０ＳｅｒおよびＰｒｏ３３１Ｓｅｒを含んでおり、これにより、ネオエピトープ(neoepitope)についての効能が最小になった。ＩｇＧ２定常部中に配置された特定のＩｇＧ４アミノ酸残基を、基本的構造からの他の代替と共に、表７に示す。
【０２３６】
【表７】
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【０２３７】
例２０：ヒト化された抗ＡＤＤＬ抗体の結合親和性
ヒト化された抗体のＡＤＤＬ結合親和性を評価するために、滴定ＥＬＩＳＡを、本明細書中に開示したように行った。ストレプトアビジンを塗布した９６ウェルマイクロタイタープレート(Sigma, St. Louis, MO)に、１０％ビオチン化ＡＤＤＬ抗原（１μＭ）を塗布した。５００ｎｇ／ｍＬで開始した、精製した抗体の一連の２倍希釈を、ＡＤＤＬ捕獲プレートに加え、プレートを、２時間２５℃でインキュベートした。プレート洗浄機(Bio-Tek, Winooski, VA)を用いてＰＢＳ溶液で５回洗浄した後に、ポリクローナルヤギ抗ヒトカッパ軽鎖抗体(Biomeda, Foster City, CA)を、３％脱脂乳ブロッカーでの１／２０００の希釈において加え、室温で１時間インキュベートした。次に、ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ結合(Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX)検出抗体を、遮断溶液での１／２０００の希釈において加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰ基質、３，３’，５’，５−テトラメチルベンジジン（使用可能な状態のＴＭＢ；Sigma, St. Louis, MO）を加え、反応を、１０分後に０．５ＮのＨ２ＳＯ４で停止した。４５０ｎｍの波長における吸光度を、プレートリーダー（モデルVICTOR V; Perkin Elmer, Boston, MA）において読み取り、データを、EXCEL（登録商標）ワークシートを用いて加工した。プレート間のアッセイ変動は、２０％以内であると推定された。
【０２３８】
ヒト化された抗体の種々の群を、種々の実験において比較した。ＣＤＲ移植によりヒト化されたＩｇＧ１抗体２０Ｃ２Ａ、２０Ｃ２Ｂ、３Ｂ３、４Ｅ２、１Ｆ６および２Ｈ４の比較により、すべての抗体がＡＤＤＬに結合することができ、ここで１Ｆ６との結合は、大多数よりも弱く、２０Ｃ２が最強であったことが、示された。２０Ｃ２  ＩｇＧ１抗体の４種の異なるヒト化様式（２種のＣＤＲ移植様式および２種の化粧張り様式）をまた比較し、極めて類似したＡＤＤＬ結合曲線を示し、すべての結合は、キメラ２０Ｃ２抗体よりもわずかに良好であったことが、見出された。２６Ｄ６  ＩｇＧ１の７種の異なるヒト化様式（１種のＣＤＲ移植様式および６種の化粧張り様式）をまた比較した。すべて、２６Ｄ６のキメラ形態に類似したＡＤＤＬ結合曲線を有すると、見出された。ＣＤＲ移植によりヒト化された２種の２０Ｃ２様式についてのＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｍ４抗体をまた、分析し、ＣＤＲ移植によりヒト化された２６Ｄ６のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ｍ４アイソタイプと同様に、同程度の結合曲線を有すると見出された。
【０２３９】
例２１：ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体を用いたニューロンへのＡＤＤＬ結合の阻害
ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体をさらに、一次海馬ニューロンへのＡＤＤＬ結合を遮断するこれらの能力について、本明細書中に開示した方法を用いて評価した。関連する抗体または対照としてのＰＢＳを、１：１（Ｂ１０３神経芽細胞腫細胞）または１：５（一次海馬ニューロン）のモル比で、２．５〜１０μｍ（最終濃度）のｂＡＤＤＬと混合し、低速ローテータ上で１時間３７℃でインキュベートした。プレインキュベーションの後、抗体／ｂＡＤＤＬ調製物を、Ｂ１０３または一次ニューロン培養物に加え、さらに１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、ｂＡＤＤＬ／抗体混合物を除去し、プレートを、培地で６回洗浄した。次に、細胞を、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間室温で固定し、溶液を除去し、新鮮な固定液を加え、細胞を、さらに１０分間固定した。
【０２４０】
細胞を、０．１％TRITON（登録商標）Ｘ−１００を含む４％パラホルムアルデヒドで透過性にし（２回、各々室温で１０分間）、ＰＢＳで６回洗浄し、次にＰＢＳ中の１０％ＢＳＡで１時間３７℃で処理した。次に、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（１％ＢＳＡ中１：１，５００；Molecular Probes, Eugene, OR)を、細胞に１時間室温で加えた。細胞を、ＰＢＳで６回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質（SAPPHIRE-II（登録商標）を含むCDP-STAR（登録商標）；Applied Biosystems, Foster City, CA）を、細胞に加え、３０分間インキュベートし、その後ＬＪＬ照度計(Analyst AD; LJL Biosystems, Sunnyvale, CA)上でルミネセンスを決定した。マウス抗体について、２６Ｄ６、２０Ｃ２、４Ｅ２、３Ｂ３、２Ｈ４および１Ｆ６のヒト化様式は、ＡＤＤＬ調製物のＢ１０３神経芽細胞腫細胞への、および一次ニューロンへの結合を阻害することができた。
【０２４１】
例２２：ヒト化抗ＡＤＤＬ抗体の親和性成熟
ヒト化２０Ｃ２様式Ａ可変重鎖のみ、軽鎖のみ、または重鎖および軽鎖を一緒にコードする核酸分子を、ＦａｂファージディスプレイベクターｐＦａｂ３ｄ中でクローン化した。核酸配列分析により、ｐＦａｂ３ｄにおける配列および配向が確認された。ｐＦａｂ３ｄ中の注釈付きの２０Ｃ２  Ｆａｂ配列を、図１３に示し、本明細書中で重鎖について配列番号２５５として、および軽鎖について配列番号２５６として述べる。３種の構造体を、当該分野において確立されたファージディスプレイＦａｂライブラリー法を用いて、２０Ｃ２成熟プログラムにおいて用いた。
【０２４２】
要するに、２種のライブラリーを設計して、２０Ｃ２の軽（カッパ）鎖のＣＤＲ３の９種の野生型アミノ酸（即ち、Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ；配列番号６０）を突然変異させた。これらのライブラリーを、ＬＣ３−１およびＬＣ３−２と指定し、これらはそれぞれ、Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号２５７）およびＰｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ（配列番号２５８）の軽鎖ＣＤＲ３配列を表す。ビオチン化逆方向プライマーである２０Ｃ２ＬＣ３−１（配列番号２５９）および２０Ｃ２ＬＣ３−２（配列番号２６０）を、順方向プライマーである２０Ｃ２ＬＣ３Ｆ（配列番号２６１）と組み合わせて用いて、ＬＣ３−１およびＬＣ３−２ライブラリーを発生させた（図１４を参照）。プライマーを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、一方ベクターＤＮＡを、ゲル電気泳動および電子溶出(electroelution)により精製した。２種の軽鎖ライブラリーを設計して、無秩序に突然変異させた。３種の１０Ｇ５Ｈ６  ＬＣ３ライブラリーの最終的な相違は、それぞれ４．７６×１０８および７．４５×１０８であった（表８）。ライブラリーからの約１００種のクローンの配列分析により、設計されたアミノ酸位置における突然変異クローンの１００％の相違が示された。
【０２４３】
【表８】
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【０２４４】
高分子量ｂＡＤＤＬに対する２種の２０Ｃ２軽鎖ライブラリーの可溶性パニングを、完了した。要するに、４巡のパニングを、ビオチン化高分子量ＡＤＤＬ（ｂＡＤＤＬ）を用いて行った。最初の３巡を、約１．５μＭの抗原濃度（投与量＝１×１０１０〜１×１０１１）を用いて行った。第３巡の完了の際に、２種のライブラリーの産出を組み合わせ、１０ｎＭ、１００ｎＭおよび約１．５μＭの抗原での分析のために３つの群に分けて、パニングの厳密性を増大させた。このように、合計５８個の産出プレート、即ち第１巡においてライブラリーあたり２つのプレート（合計で４つのプレート）、第２巡においてライブラリーあたり６つのプレート（合計で１２個のプレート）、第３巡においてＬＣ３−１ライブラリーについて８つのプレートおよびＬＣ３−２ライブラリーについて１０個のプレート（合計で１８個のプレート）並びに第４巡において各々の抗原濃度について８つのプレート（合計で２４個のプレート）を、ファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験した。
【０２４５】
パニングの結果１０００個のヒットが得られ、このうち４３６個を配列決定した（表９）。
【０２４６】
【表９】
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【０２４７】
高度に富化されたクローンの配列および頻度を、表１０に示す。
【０２４８】
【表１０】
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【表１１】
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【０２４９】
富化頻度に基づく１０個の最上部のクローンからのＦａｂ断片を調製し、合計１５個のクローンを、ＩｇＧ１ヒト化Ａ様式に変換し、２個のクローン、即ち２０Ｃ２−６および２０Ｃ２−８を、ＩｇＧ１ヒト化Ｂ様式に変換した。これらのクローンについてのＫＤ値を、BIACORE（登録商標）により、ビオチン−Ａβ１−２０（表１１）およびｂＡＤＤＬ（表１２）を抗原として用いて測定した。親和性における劇的な改善が、親のヒト化２０Ｃ２Ａおよび２０Ｃ２Ｂ並びにマウス２０Ｃ２抗体と比較して観察された。特に、低ナノモルないしピコモル未満のＫＤが、配列Ｘａａ１−Ｇｌｎ−Ｘａａ２−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ（配列番号３１８）の軽鎖ＣＤＲ３で達成され、ここで、Ｘａａ１は、ＰｈｅまたはＬｅｕであり、Ｘａａ２は、ＡｌａまたはＴｈｒである。さらに、ビオチン−Ａβ１−２０およびｂＡＤＤＬを用いてBIACORE（登録商標）で得られたＫＤ値間の比較により、抗ＡＤＤＬ抗体、例えば２０Ｃ２が、ＡＤＤＬの多次元立体構造に、単量体Ａβペプチドよりも優先的に結合することが、さらに例証される。
【０２５０】
【表１２】
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【０２５１】
【表１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
0005634975.tif 000027
【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
0005634975.tif 000033
【図６Ｏ】
0005634975.tif 000034
【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
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【図６Ｔ】
0005634975.tif 000039
【図６Ｕ】
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【図６Ｖ】
0005634975.tif 000041
【図６Ｗ】
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【図６Ｘ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１０Ｐ】
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【図１０Ｑ】
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【図１０Ｒ】
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【図１０Ｓ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１１Ｍ】
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【図１１Ｎ】
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【図１１Ｏ】
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【図１１Ｐ】
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【図１１Ｑ】
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【図１１Ｒ】
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【図１１Ｓ】
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【図１１Ｔ】
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【図１１Ｕ】
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【図１１Ｖ】
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【図１１Ｗ】
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【図１１Ｘ】
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【図１１Ｙ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１０Ｔ】
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【配列表】
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