(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡからなる群より選択される何れか一つ以上と、配列番号１のアミノ酸配列からなるミオスタチン由来Ｍｙｏ−２ペプチドが２〜８個重合されているＭｙｏ−２ペプチド重合体をコードする塩基配列及びミオスタチン成熟蛋白質をコードする遺伝子が作動可能に連結している細胞表面発現ベクターで形質転換された組換え微生物。
【請求項２】
前記ミオスタチンは哺乳動物または鳥類由来であることを特徴とする請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記組換え微生物は、大腸菌、サルモネラチフィ、サルモネラチフィリウム、ビブリオコレラ、マイコバクテリウムボビス、シゲラ、バシラス、乳酸菌、ブドウ球菌、コリネバクテリア、リステリアモノサイトゲネス及びレンサ球菌からなる群より選択されるいずれか１つであることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
前記微生物は、乳酸菌であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
次のステップを含むミオスタチン由来ペプチド（Ｍｙｏ−２）重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を製造する方法：
（ａ）請求項１〜４のいずれか一項に記載の形質転換された微生物を培養して、ミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質を微生物表面に発現するステップ；及び 
（ｂ）前記ミオスタチン成熟蛋白質が表面発現された微生物を回収するステップ。
【請求項６】
請求項５に記載の方法で製造されたミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する動物の筋肉成長促進または増体率向上用飼料添加剤。
【請求項７】
請求項５に記載の方法で製造されたミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する動物の筋肉成長促進または増体率向上用組成物。
【請求項８】
請求項５に記載の方法で製造されたミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する筋消耗性疾患または退行性疾患の予防または治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はミオスタチン由来抗原性ペプチドであるＭｙｏ−２の重合体とミオスタチン成熟蛋白質が融合した融合蛋白質、前記融合蛋白質の表面発現ベクター、前記ベクターによって形質転換された微生物、及び前記微生物を有効成分として含有する飼料添加剤または医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格筋の成長を選択的に負に制御（negative-regulation）する調節因子としてミオスタチン［ｍｙｏｓｔａｔｉｎ、またはＧＤＦ−８（Growth and Differentioation Factor-8）という］が１９９７年発見された（McPherron et al., Nature, 387:83, 1997）。過去１９０年の間、筋肉質量が高くてやわらかい肉で、品質が良い牛の品種であるベルギーブルー（Belgian Blue）とピエモンテ（Piedmontese）の筋肉発達の原因がミオスタチンをコードする遺伝子配列上の突然変異に起因して（MaPherron and Lee, PNAS 94:12457, 1997）、このような「筋肉肥大（double muscling）」現象を示す種の動物は普通動物より２０〜２５％増加した平均筋肉質量を有する。
【０００３】
実験的にミオスタチンがノックアウト（knockout）されたマウスも骨格筋量が増加し、ミオスタチン陰性マウスから分離した筋肉はワイルドマウスの筋肉より約２〜３倍の重さを示した。ノックアウトマウスはワイルドマウスより約３５％高い総体重を有し、ミオスタチン遺伝子が欠乏したマウスは正常マウスと比べて、８０％以上の筋繊維を有すると報告されており、このようなノックアウトマウスにおいて観察された多量の骨格筋増大は筋繊維の数の増加だけでなく顕著な筋繊維の肥大に起因する。
【０００４】
前記のように骨格筋の成長を選択的に負に制御（negative regulator）する調節因子であるミオスタチンはＴＧＦ−αスーパーファミリーに属し、３７５個のアミノ酸前駆体で構成されており、約１０９個のアミノ酸残基のＣ−末端断片はマウス、ラット、ヒト、豚、ニワトリ及び七面鳥において１００％同一であり、サル、牛、羊においてはＣ−末端領域おいて３つのアミノ酸残基だけが異なる。このようなＣ−末端領域はミオスタチンの生理的な活性部分を含むと予測される。ミオスタチンは進化過程において多様な種に対し高い保存率を示しており、これはミオスタチンが筋肉の生物学的調節過程において必須要素であることを示唆する（McPherron and Lee, PNAS, 94:12457, 1997）。
【０００５】
ミオスタチンは骨格筋に限定して発現され、脂肪組織においては低いレベルで発現する。ミオスタチンは骨格筋の成長に対する特異的な負の調節因子として機能すると見られるが、成人個体におけるミオスタチンの生理的な役割は知られていない。ミオスタチンの生理的な役割に対する研究は、筋肉損傷後に誘発される実際の肥大または再生上の重要な機能に集中しているが、脂肪組織の成長を抑制することも知られている。また、ミオスタチンが動物の発育において局所的または全身的に働くのかについては未だに知られていない。
【０００６】
一方、骨格筋の負の調節の役割を発揮するミオスタチン遺伝子を不活性化又はミオスタチン蛋白質の作用を抑制する研究が行われている。筋ジストロフィーまたは筋萎縮症のような筋消耗性疾患又はＡＩＤＳ、癌などによる筋消失などの疾病治療に適用するための研究、良い肉質の家畜を生産するための飼料添加剤として開発しようとする研究、及び脂肪蓄積を阻害して、肥満治療に使用するための研究などが進められている。
【０００７】
ミオスタチンの作用を抑制させて、筋肉成長を誘導する方法としては、代表的に二つの研究が進められている。一つ目は、ミオスタチンの活性を妨害して、その機能を抑制する多くの蛋白質（フォリスタチン（follistatin）、変異アクチビンタイプＩＩ受容体（mutant activin typeII receptor）、ミオスタチンペプチドなど）の発見及び利用が挙げられる。二つ目は、ミオスタチンポリペプチド、その部分配列（subsequence）及び突然変異部分配列を利用した動物の免疫化によってミオスタチンポリペプチドに対抗する抗体の生産である。
【０００８】
脊椎動物におけるミオスタチン免疫原に対する抗体の産生は、脊椎動物内において内因性ミオスタチン活性を減少させて、体重の増加、筋肉の増加、筋細胞数の増加、筋細胞サイズの増加、体脂肪量の減少、筋肉強度の増加などの生物学的効果を示すことができる。しかし、筋繊維の数と種類は胚芽期に決定されるため、成長した飼育用動物においてミオスタチン活性減少によって筋繊維の数を増加させることはないはずである。これは肉の品質、品種の特性、及び脂肪比に否定的な影響を与えられるが、ミオスタチンの活性が減少した動物における筋肉肥大によって得られる成長率及び体重増加は、牛、豚、及び家禽類から肉を生産するに当たり有用な方法を提供する。
【０００９】
しかし、前記のようなアプローチ法は現在までミオスタチンポリペプチドまたはその部分配列を人工的に合成したり、大腸菌で発現させて精製し、これを適用しようとする研究がほとんどであり、実際に産業への適用は経済的な観点から困難であるのが実情である。
【００１０】
畜産産業において、飼料効率の促進によって動物の成長率を増加させるための、多様な飼育方法が開発及び改善されつつある。その中で、医学的なアプローチとしては、抗生物質または抗生物質類似化合物を飼育動物に投与したり、成長ホルモンのようなホルモンを投与するアプローチ法がある。しかし、このような抗生物質及び抗生物質類似化合物を飼育動物に投与するのはヒトの抗生作用に対する交差耐性を誘発する問題を引き起こすため、法的に禁止される傾向にある。また、飼育動物に成長ホルモンを利用する場合、費用が高く、成長ホルモンの短い半減期のため短期間で処置を繰り返す必要があり、処理された動物から得られた肉に残留する成長ホルモンが消費者の健康に問題を引き起こす恐れがある。このような医学的なアプローチの困難さにより、動物の成長率を増加させるための代案として、飼料効率の増大による飼育プログラムが持続的に開発されている。
【００１１】
微生物の細胞表面に望む蛋白質を付着して発現させる技術を細胞表面発現（cell surface display）技術という。細胞表面発現技術はバクテリアや酵母など微生物の表面蛋白質を表面発現母体（surface anchoring motif）として使用して、外来蛋白質を表面に発現させる技術であり、組換え体ワクチンの生産、ペプチド／抗体ライブラリー作製及びスクリーニング、全細胞吸着剤（whole cell absorbent）、全細胞生物転換触媒など多様な応用範囲を有する技術であり、どのような蛋白質を細胞表面に発現させるのかによりその応用範囲が決定され、従って、細胞表面発現技術を利用した産業的応用潜在力は相当なものがあると言える。
【００１２】
細胞表面発現技術の成功のためには、表面発現母体が最も重要である。言い換えると、この技術の核心は外来蛋白質を効果的に細胞表面に発現させられる母体の選定または開発にある。従って、表面発現母体は外来蛋白質を細胞表面まで送るために細胞内膜を通過できるように助ける分泌信号がまず必要であり、二つ目は、細胞外膜表面に安定的に外来蛋白質が付着できるように助ける標的信号が必要であり、三つ目は、細胞表面に多量発現するが細胞の成長にほとんど影響を及ぼさず、四つ目は、外来蛋白質の３次元構造の変化の原因となることなく、蛋白質のサイズに係わらず安定的に発現されなければならない。しかし、前記条件を全て満足させる表面発現母体は未だに開発されていない状態である。
【００１３】
今まで使用された周知の表面発現母体としては、細胞外膜蛋白質、脂質蛋白質（lipoprotein）、分泌蛋白質（secretory protein）、鞭毛蛋白質のような表面蛋白質など大きく４種類ある。グラム陰性菌（Gram negative bacteria）の場合、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ（Charbit et al., J. Immunol., 139:1658, 1987; Agterberg et al., Vaccine, 8:85, 1990）、及びＯｍｐＡなどの細胞外膜に存在する蛋白質を主に利用されてきた。更に、脂質蛋白質であるＴｒａＴ（Felici et al., J. Mol. Biol., 222:301, 1991）、ＰＡＬ（peptidoglycan associated lipoprotein, Fuchs et al., Bio/Technology, 9:1369, 1991）、そしてＬｐｐ（Francisco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 489:2713, 1992）が利用されていた。ＦｉｍＡ、１型（type 1）線毛（fimbriae）のＦｉｍＨアドへシン（adhesin）などの線毛蛋白質（Hedegaard et al., Gene, 85:115, 1989）、ＰａｐＡピル（pilu）サブユニットなどのピリ（pili）蛋白質などを細胞表面発現母体として利用して、外来蛋白質の発現が試みられて来た。その他にも氷核蛋白質（Jung et al., Nat. Biotech nol., 16:576, 1998; Jung et al., Enzyme Microb. Technol., 22:348, 1998; Leeet al., Nat. Biotechnol., 18:645, 2000）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）のプルラナーセ（Kornacker et al., Mol. Microl., 4:1101, 1990）、ナイセリア（Neisseria）のＩｇＡプロテアーセ゛（Klauser et al., EMBO J., 9:1991, 1990）、大腸菌のアドヘシン（adhesion）であるＡＩＤＡ−１、シゲラ（shigella）のＶｉｒＧ蛋白質、ＬｐｐとＯｍｐＡの融合（fusion）蛋白質などを表面発現母体として使用できるとの報告がある。
【００１４】
グラム陽性菌（Gram positive bacteria）を利用する場合には、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のプロテインＡ及びＦｎＢＰＢ蛋白質を表面発現母体として使用してマラリア抗原を効果的に発現させたとの報告があり、また、乳酸バクテリアの表面コート（coat）蛋白質を利用して、表面発現に利用したという報告、並びに化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogene）由来のＭ６蛋白質（Medaglini, D et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 92:6868, 1995）、炭疽菌（Bacillus anthracis）のＳ−ｌａｙｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＥＡ１、枯草菌（Bacillus subtilis）ＣｏｔＢなどグラム陽性菌の表面蛋白質を母体として利用したという報告がある。
【００１５】
一方、本発明者はバシラス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を新しい表面発現母体として活用して、外来蛋白質を微生物の表面に効果的に発現させる新しいベクターと、前記ベクターで形質転換された微生物の表面に外来蛋白質を多量発現させる方法を開発した（韓国登録特許第４６９８００号）。
【００１６】
前記で紹介された表面発現母体を利用して、病原体の抗原または抗原決定基を遺伝工学的手法を利用して、大量生産が可能な細菌において安定的に発現させようとする研究が試みられた。特に非病原性の細菌表面に外来免疫原を発現させて生きている状態で経口投与する場合、従来の弱毒化された病原性細菌やウイルスを利用したワクチンよりさらに持続的かつ強い免疫反応を誘導することができることが報告された。このような免疫反応誘導は生きている状態の菌に対する体内の免疫反応によるもので、細菌の表面構造物が表面発現した外来蛋白質の抗原性（antigenicity）を増加させる補助剤（adjuvant）として作用するためであると知られている。このような表面発現システムを利用した非病原性細菌の組換え生ワクチンの開発は注目に値する。
【００１７】
そこで、本発明者はミオスタチンに対する高い抗原性を示し得るミオスタチン融合蛋白質を細菌表面に効果的に発現させられる方法を開発しようと鋭意努力した結果、バシラス属菌株由来のポリ−γ−グルタミン酸の合成複合体遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）を表面発現母体として活用してＭｙｏ−２ペプチド重合体とミオスタチンの融合蛋白質を乳酸菌に発現させる場合、前記融合蛋白質が効果的に表面発現され、前記融合蛋白質が表面発現された乳酸菌を動物への経口投与する場合、血中抗体産生が増加し、体重及び筋肉量が増加することを確認して本発明の完成に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】韓国登録特許第４６９８００号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の目的は、ミオスタチン由来Ｍｙｏ−２ペプチド及び前記Ｍｙｏ−２ペプチドの重合体を提供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は前記Ｍｙｏ−２ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質が融合した融合蛋白質を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに他の目的は、前記融合蛋白質をコードしている遺伝子を含む表面発現用ベクター及び前記ベクターで形質転換された微生物を提供することである。
【００２２】
本発明のさらに他の目的は前記融合蛋白質が表面発現された微生物の製造方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらに他の目的は、前記融合蛋白質または前記融合蛋白質が表面発現された微生物を含有する飼料添加剤を提供することである。
【００２４】
本発明のさらに他の目的は、前記融合蛋白質または前記融合蛋白質が表面発現された微生物を含有する医薬組成物を提供することである。
【課題を達成するための手段】
【００２５】
前記目的を達成するために、本発明は配列番号１のアミノ酸配列を有するミオスタチン由来Ｍｙｏ−２ペプチド及び前記Ｍｙｏ−２ペプチドが２〜８個重合されているＭｙｏ−２ペプチド重合体を提供する。
【００２６】
さらに本発明は、前記Ｍｙｏ−２ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質が融合した融合蛋白質を提供する。
【００２７】
さらに本発明は、前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡで構成された群から選択される何れか一つ以上と、前記Ｍｙｏ−２ペプチド重合体をコードする塩基配列及びミオスタチン成熟蛋白質をコードする遺伝子が作動可能に連結している細胞表面発現ベクター及び前記発現ベクターで形質転換された組換え微生物を提供する。
【００２８】
さらに本発明は、（ａ）前記形質転換された微生物を培養して、ミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質を微生物表面に発現するステップ；及び（ｂ）前記ミオスタチン成熟蛋白質が表面発現された微生物を回収するステップを含むミオスタチン由来ペプチド（Ｍｙｏ−２）重合体に融合したミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を製造する方法を提供する。
【００２９】
さらに本発明は、前記融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する動物の筋肉成長促進または増体率向上用飼料添加剤を提供する。
【００３０】
さらに本発明は、前記融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する動物の筋肉成長促進または増体率向上用組成物を提供する。
【００３１】
さらに本発明は、前記融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する筋消耗性疾患または退行性疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００３２】
さらに本発明は、前記融合蛋白質を有効成分として含有する動物の筋肉成長促進または増体率向上用飼料添加剤を提供する。
【００３３】
さらに本発明は、前記融合蛋白質を有効成分として含有する動物の筋肉成長促進または増体率向上用組成物を提供する。
【００３４】
さらに本発明は、前記融合蛋白質を有効成分として含有する筋消耗性疾患、または退行性疾患の予防または治療用医薬組成物を提供する。
【００３５】
さらに本発明は、前記飼料添加剤または医薬組成物を動物に投与することを特徴とする動物の筋細胞の数または筋細胞のサイズを増加させる方法を提供する。
【００３６】
本発明の他の特徴及び具現例は次の詳細な説明及び添付された特許請求範囲からより一層明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明によるニワトリのミオスタチン成熟蛋白質の予測３次構造と抗原性ペプチド部位（Ｍｙｏ−１、Ｍｙｏ−２）を示す。
【図２】本発明によるニワトリのミオスタチン成熟蛋白質と抗原性ペプチドを使用して、免疫されたブロイラ種鶏の卵から孵化した雛の体重増加率を示す。
【図３】本発明によるＭｙｏ−２ペプチド重合体構築のための単位体の構造を示す。
【図４ａ】本発明によるニワトリのミオスタチンの抗原性ペプチド重合体（４ｘＭｙｏ−２）とミオスタチン成熟蛋白質の融合体を発現する表面発現ベクターのｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍの遺伝子地図を示し、
【図４ｂ】ニワトリのミオスタチン成熟蛋白質を発現する表面発現ベクターのｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍの遺伝子地図を示す。
【図５】本発明によるｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍで形質転換された乳酸菌を培養して、取得された細胞をｐｇｓＡに対する特異抗体でウェスタンブロット解析結果を示す。
【図６ａ】本発明によるｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍで形質転換された乳酸菌を経口投与したマウスの血清内で４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ抗原に対するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked Immunosorbent assay）方法で測定した結果を示し、
【図６ｂ】経口投与したマウスにおける体重変化を測定した結果を示す（ＡはｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍで形質転換された乳酸菌投与群であり、ＢはｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍで形質転換された乳酸菌投与群であり、Ｃは対照群で一般乳酸菌投与群である）。
【図７】本発明によるｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍで形質転換された乳酸菌を経口投与したマウスの血清内に存在する抗体の筋細胞での信号伝達阻害効果を示す（Ａ：４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質を表面発現する乳酸菌投与群、Ｂ：ＣＭｙｏｍ蛋白質を表面発現する乳酸菌投与群、Ｃ：一般乳酸菌投与群）。
【図８】本発明によるｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍで形質転換されて、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを表面発現する乳酸菌を飼料と共に経口投与した雛の血清内においてニワトリミオスタチン成熟（mature）抗原に対するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ方法で測定した結果を示す。
【図９ａ】本発明によるｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍで形質転換されて、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを表面発現する乳酸菌を飼料と共に経口投与した雛の体重変化を測定した結果で、
【図９ｂ】実験終了（６週）時雛体重の平均を比較して示す。
【図１０】本発明によるｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍで形質転換されて、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを表面発現する乳酸菌を飼料と共に経口投与した雛における飼料効率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は一側面において、配列番号１のアミノ酸配列を有するミオスタチン由来Ｍｙｏ−２ペプチド、前記Ｍｙｏ−２ペプチドが２〜８個重合されているＭｙｏ−２ペプチド重合体、及び前記Ｍｙｏ−２ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質が融合した融合蛋白質に関する。
【００３９】
本発明においてはミオスタチン成熟蛋白質の予測３次構造を基にｍｙｏ−２ペプチドを選定し、前記ｍｙｏ−２ペプチドをブロイラ種鶏に投与して、前記ブロイラ種鶏が産卵した卵から孵化した雛が高い増体量を示すことを確認した。
【００４０】
本発明によるミオスタチン由来Ｍｙｏ−２ペプチドは生体内のミオスタチン蛋白質に対して抗原性を示し、Ｍｙｏ−２で免疫された個体に対して体重増加効果を示し、前記Ｍｙｏ−２ペプチド重合体はＭｙｏ−２ペプチドのミオスタチンに対する抗原性を増加させるために、２〜８個のＭｙｏ−２ペプチドを重合させたものであり、前記Ｍｙｏ−２ペプチド重合体をミオスタチン成熟蛋白質と融合させた融合蛋白質はミオスタチンに対して非常に高い抗原性を示して、筋肉の増体量を増加させる。
【００４１】
本発明によるＭｙｏ−２ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質が融合した融合蛋白質を微生物に表面発現された形態で取得するために、本発明においては前記Ｍｙｏ−２ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質が融合した融合蛋白質及びポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体を融合させた融合蛋白質を作製した。
【００４２】
本発明において前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体はｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡ遺伝子によってコーディングされる細胞外膜蛋白質であり、アミノ酸１次配列構造及びその特性により、外来蛋白質を細胞表面に発現させる表面発現母体としての多くの長所を有する。第１にポリ−γ−グルタミン酸の合成及び細胞外への分泌のために細胞表面に多量に発現可能であり、第２に、発現したポリ−γ−グルタミン酸の合成に係わる細胞外膜蛋白質は細胞周期上休止期においても安定的に維持され、第３に、構造的に特にｐｇｓＡの場合、細胞表面に突出しており、第４にポリ−γ−グルタミン酸の合成に係わる細胞外膜蛋白質（ｐｇｓＢＣＡ）は、その起原が、グラム陽性細菌の表面に多様なグラム陽性細菌だけでなくグラム陰性細菌の表面において安定的に発現することができる長所がある。
【００４３】
本発明において前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子（ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡ）を含有する細胞表面発現ベクターとして、ポリ−γ−グルタミン酸を生産する全てのバシラス属菌株からｐｇｓＢＣＡを取得することによって製造された細胞表面ベクターを使用でき、望ましくは枯草菌チョングッチャン（Bacillus subtilis var. chungkookjang，ＫＣＴＣ  ０６９７ＢＰ）由来のポリ−γ−グルタミン酸合成に係わる細胞外膜蛋白質の遺伝子を含有する細胞表面発現ベクターを使用できるが、これに限定されるのではない。例えば、枯草菌チョングッチャンに存在するｐｇｓＢＣＡ遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有する他菌株由来のｐｇｓＢＣＡ遺伝子を使用して製造された発現ベクターを利用することも本発明の範囲に含まれる。
【００４４】
本発明は他の側面において、ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体をコードする遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡで構成された群から選択されるいずれか一つ以上と、前記Ｍｙｏ−２ペプチド重合体をコードする塩基配列及びミオスタチン成熟蛋白質をコードする遺伝子が作動可能に連結している細胞表面発現ベクター及び前記細胞表面発現ベクターで形質転換された組換え微生物に関する。
【００４５】
本発明において、前記ミオスタチンは哺乳動物または鳥類（家禽類）由来であることを特徴とし、前記組換え微生物は、大腸菌、サルモネラチフィ、サルモネラチフィリウム、ビブリオコレラ、マイコバクテリウムボビス、シゲラ、バシラス、乳酸菌、ブドウ球菌、コリネバクテリア、リステリアモノサイトゲネス及びレンサ球菌からなる群から選択されたいずれか一つであるのが望ましく、さらに望ましくは前記組換え微生物は乳酸菌である。
【００４６】
本発明のミオスタチンは骨格筋の成長を選択的に負に制御（negative-regulation）する調節因子として、ＴＧＦ−α（transforming growth factor-α）スーパーファミリーに属し、３７５個のアミノ酸前駆体で構成されており、本発明において、ミオスタチン蛋白質の成熟ドメインは、前記アミノ酸前駆体から分泌シグナルとプロドメインを削除することによって得られ、それはミオスタチンの活性を示す部位である。
【００４７】
本発明において、前記ミオスタチンは哺乳動物、鳥類または魚類由来であることを特徴とする。ミオスタチンは進化過程において多様な種に対して高い保存率を示しており、特に、ミオスタチンの約１０９個のアミノ酸残基のＣ−末端断片はマウス、ラット、ヒト、豚、ニワトリ及び七面鳥において１００％同一であり、サル、牛、羊においてはＣ−末端領域において三つのアミノ酸残基だけ異なる。このようなＣ−末端領域はミオスタチンの生理的な活性部分を含むと予測される。
【００４８】
さらに本発明は他の側面において、（ａ）前記形質転換された微生物を培養して、ミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質を微生物表面に発現するステップ；及び（ｂ）前記ミオスタチン成熟蛋白質が表面発現された微生物を回収するステップを含むミオスタチン由来ペプチド（Ｍｙｏ−２）重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を製造する方法に関する。
【００４９】
本発明の融合蛋白質は発現ベクターに含まれていたポリ−γ−グルタミン酸合成酵素複合体のｐｇｓＢ、ｐｇｓＣまたはｐｇｓＡがコードするポリ−γ−グルタミン酸合成酵素蛋白質と融合した形態で発現し、前記融合蛋白質は前記ポリ−γ−グルタミン酸合成酵素蛋白質によって微生物の表面に移動して、位置するようになる。
【００５０】
前記融合蛋白質はその機能を失うことなく、微生物の表面に発現するため、微生物に表面発現された状態で使用されることができ、微生物に表面発現されたまま動物に投与されて、動物体内においてミオスタチンに対する免疫反応を誘導することもできる。
【００５１】
本発明により、ミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物は、マウスに経口投与した時、前記融合蛋白質に対する抗体を効果的に産生し、融合蛋白質が表面発現されない微生物を投与した対照群と比較して、体重が増加した。また、筋細胞内におけるミオスタチン信号伝達に対して高い阻害効果を示した。
【００５２】
さらに、本発明によるミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を投与したブロイラにおいてニワトリミオスタチンに対する高い抗体価を示すと共に、対照群と比べて高い増体量を示した。
【００５３】
さらに本発明は他の側面において、前記方法で製造されたミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する動物の筋肉成長促進または増体率向上用飼料添加剤に関する。
【００５４】
さらに本発明は他の側面において、前記方法で製造されたミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する動物の筋肉成長促進または増体率向上用組成物に関する。
【００５５】
さらに本発明は他の側面において、前記方法で製造されたミオスタチン由来ペプチド重合体とミオスタチン成熟蛋白質の融合蛋白質が表面発現された微生物を有効成分として含有する筋消耗性疾患または退行性疾患の予防または治療用医薬組成物に関する。
【００５６】
さらに本発明は他の側面において、前記飼料添加剤または組成物を動物に投与することを特徴とする動物の筋細胞の数または筋細胞のサイズを増加させる方法に関する。本発明において、前記投与は経口投与であることを特徴とする。
【００５７】
本発明による筋消耗性疾患及び退行性疾患の予防または治療用医薬組成物は人体用の経口ワクチンであり、筋肉に係わる疾病である筋ジストロフィー、及び筋萎縮症などの筋消耗性疾患及び退行性疾患の治療及び予防に利用される。
【００５８】
本発明による医薬組成物はヒトを含んだ動物に経口用に投与されてもよく、または食用で摂取してもよく、皮下または腹腔に注射してもよく、また鼻腔投与してもよい。
【００５９】
本発明のミオスタチン融合蛋白質を利用したミオスタチンの抗体誘導、及びこれによって、ミオスタチンの活性を減少させる方法は病原性の微生物において交差耐性と係わる問題が発生することなく、他のＴＧＦ−αファミリーとミオスタチンの配列同一性はアミノ酸レベルにおいて３０〜４０％と低いため、生体内において内因性ミオスタチン（ＧＤＦ−８）に対する抗体の交差反応性に関する問題を引き起こすことはない。
【００６０】
また、動物から得られた食肉中に外的に投与された成長ホルモンが残存する可能性はない。その上ベルギーブルー及びピエモンテのような牛の品種は生産に伴う倫理的な問題点（帝王切開によって多くの子牛が生まれて、それ以外の器官はサイズが減少する）を、出生後、成人期の期間までにだけ動物内ミオスタチンを下降調節（負に制御）することによって完全に解消できる。実際に筋肉質量を増加させた動物が出産しなければならない必要はなく、従って屠畜用に育てられたこれら動物に対する処置を留保することができる。
【００６１】
本発明において医薬組成物は、各々通常の方法により散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアゾールなどの経口剤形、外用剤、座薬及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。組成物に含まれる担体、賦形剤及び希釈剤としてはラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレート、及び鉱物油を挙げられる。
【００６２】
製剤化する場合には普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤、または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は前記組成物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（calcium carbonate）、スクロース（sucrose）またはラクトース（lactose）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単なる賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤としは懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤としては滅菌された水溶液、非水生溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としてはプロピレングリコール（propylene glycol）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなど使用される。坐剤の基剤としてはウィテプソル（witepsol）、マクロゴール、ツイーン（tween）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロールゼラチンなどが使用される。
【００６３】
本発明の医薬組成物の投与量は患者の状態及び体重、疾病の程度、薬品形態、投与経路及び期間により異なるが、当業者によって適切に選択される。しかし、望ましい効果のために、本発明の医薬組成物は１日１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、望ましく５０〜３００ｍｇ／ｋｇ投与した方が良い。投与は１日１回投与してもよく、数回に分けて投与してもよい。前記投与量はいかなる面においても本発明の範囲を限定するものではない。
【００６４】
本発明の組成物はラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路を介して投与される。投与する全ての方式は予想され、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、子宮内膜または脳血管内注射によって投与され得る。
【実施例】
【００６５】
以下本発明を実施例によって、より一層詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは当業界において通常の知識を有する者には自明であろう。
特に、下記実施例においては融合蛋白質に使用されるミオスタチン蛋白質遺伝子として、成熟（mature）型のミオスタチン蛋白質の遺伝子を適用したが、成熟（mature）ミオスタチン蛋白質に対する免疫性を増加させる蛋白質の遺伝子と組み合わせて使用してもよい。
【００６６】
また、下記実施例においては枯草菌チョングッチャン（Bacillus subtilis var. chungkookjang，ＫＣＴＣ  ０６９７ＢＰ）からポリ−γ−グルタミン酸合成に係わる細胞外膜蛋白質の遺伝子中ｐｇｓＢＣＡを取得して利用したが、ポリ−γ−グルタミン酸を生産する全てのバシラス属菌株から取得したｐｇｓＢＣＡ遺伝子で作製されたベクター、またはこのベクターを利用した形質転換された微生物なども本発明の範囲に含まれると言える。例えば、枯草菌チョングッチャンに存在するｐｇｓＢＣＡ遺伝子の塩基配列と８０％以上の相同性を有する他菌株由来のｐｇｓＢＣＡ遺伝子を使用するワクチン用ベクターを作製したり、これを利用するのも本発明の範囲に含まれる。
【００６７】
また、下記実施例においてはｐｇｓＢＣＡ遺伝子中からｐｇｓＡ遺伝子だけを活用して表面発現用ベクターを作製したが、ｐｇｓＢＣＡ遺伝子全部または一部だけを使用してワクチン用ベクターを作製するのも本発明の範囲に含まれる。
【００６８】
また、下記実施例においては、前記ベクターに対する宿主として、ラクトバシラスだけを使用したが、この細菌以外にいかなるグラム陰性菌またはグラム陽性菌も本発明による方法で形質転換させると、同様の結果が得られるという事実も当業者には自明であろう。
【００６９】
また、下記実施例においては、ワクチン用ベクターで形質転換された微生物自体をマウス、ニワトリ及び豚の生体に適用した例だけが提示されている。しかし、動物用飼料添加剤及びワクチン関連技術分野の知識の観点から見て、前記微生物から抽出されたミオスタチン成熟（mature）蛋白質、または精製された発現蛋白質を生体に適用しても同一または類似の結果が得られることは当業者には自明な事実であろう。
【００７０】
［実施例１］ミオスタチンの抗原性ペプチド部位選定
ミオスタチンの免疫誘導効能を増強させるために、ミオスタチン成熟蛋白質の予測３次構造を基に選定された二つの抗原性ペプチド部位（Ｍｙｏ−１及びＭｙｏ−２）とミオスタチン成熟蛋白質を各々精製して、肉用ブロイラ種鶏に経皮投与し、免疫されたブロイラ種鶏の卵を孵化させて、雛の成長促進誘導効能を比較した。
【００７１】
図１に示したようなミオスタチン成熟蛋白質の予測３次構造を参考として、Ｍｙｏ−１（配列番号２）及びＭｙｏ−２（配列番号１）を抗原性ペプチド部位として選定した。実験群は精製されたミオスタチン成熟蛋白質投与群（ｍＡＶ group）、Ｍｙｏ−１投与群、Ｍｙｏ−２ペプチド投与群の三つの群、及び対照群に分けて、各群当たり雌（female）ブロイラ種鶏４羽、雄（male）ブロイラ種鶏１羽ずつ計５羽ずつ実験モデルとして選定した。
【００７２】
１次経皮投与はニワトリのミオスタチン遺伝子（配列番号４）を大腸菌において発現させて、可溶性精製されたミオスタチン成熟蛋白質と担体蛋白（carrier protein）でＫＬＨが接合されたＭｙｏ−１ペプチド及びＭｙｏ−２ペプチドを合成して（Anygen、韓国）、各々１ｍｇずつ完全フロイントアジュバント（complete Freund’s adjuvant）と１：１の割合で混ぜて雌ブロイラ種鶏に経皮投与し、３週間後２次経皮投与時には各々の蛋白質と不完全フロイントアジュバントを各々１：１割合で混ぜて雌ブロイラ種鶏に経皮投与し、さらに３週経過後２次投与と同様の方法で３次経皮投与した。各実験群毎に免疫されたブロイラ種鶏の卵を孵化させた後、孵化した雛を２８日まで飼育し増体量を測定した。
【００７３】
前記のように孵化した雛を出荷時点である２８日まで飼育し増体率を分析した結果、図２に示されたように、精製されたミオスタチン成熟蛋白質投与群（ｍＡＶ group）の体重は対照群と比べて約１０％の体重増加率（増体率）を示し、Ｍｙｏ−２ペプチド投与群は約１３％の増体率と最も高い増体率を示し、Ｍｙｏ−１ペプチド投与群は対照群と比べて、体重増加がないことが示された。従って、精製されたミオスタチン成熟蛋白質とＭｙｏ−２ペプチドを母体に投与しても母体移行抗体作用でその後代雛にも高い増体量を示すことが確認された。
【００７４】
［実施例２］４Ｍｙｏ−２ペプチド重合体（４ｘＭｙｏ−２）製造及び表面発現用ベクター（ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ）製造
ミオスタチン由来ペプチド及び成熟ミオスタチンが投与された母鶏から得られた雛において最も高い増体量を示したニワトリのＭｙｏ−２ペプチドをコードする遺伝子を単位体として使用して、４回繰り返し重合体（４ｘＭｙｏ−２）を製造してＣ−末端部位にニワトリミオスタチン成熟蛋白質（ＣＭｙｏｍ）をコードする遺伝子を融合させて、表面発現できるベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを製造した。
【００７５】
４Ｍｙｏ−２ペプチド重合体を作るための単位体を合成するために、配列番号５及び６の塩基配列を有するプライマーを各々１０ｐＭ／μＬで希釈して、同量の体積を混合した後３７℃で１時間反応させて、図３のように両側に制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩで切断された形態のＭｙｏ−２単位体を形成させて、前記Ｍｙｏ−２単位体をｐＲＳＥＴ（Ａ）ベクター（Invitrogen, USA）のＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ制限酵素の位置に挿入してｐＲＳＥＴ（Ａ）：Ｍｙｏ−２を製造した。
【００７６】
配列番号５：５’−ｇａｔｃｃｇｔｔｔｔｔｃｔｔｃａａａａｇｔａｔｃｃａｃａｔａｃａｃａｔｃｔｔｇｔｔｃａｔｃａａｇｃｔｇｇｔｇｇｔｔｃａａｇａｔｃｔｇｇｔａｃ−３’
配列番号６：５’−ｃａｇａｔｃｔｔｇａａｃｃａｃｃａｇｃｔｔｇａｔｇａａｃａａｇａｔｇｔｇｔａｔｇｔｇｇａｔａｃｔｔｔｔｇａａｇａａａａａｃｇ−３’
【００７７】
ｐＣＲ  Ｔ７／ＮＴ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）にクローニングされている約１．３ｋｂニワトリミオスタチン遺伝子を鋳型として使用し配列番号７及び８の塩基配列を有するプライマーを使用してＰＣＲ法で、ニワトリのミオスタチン成熟蛋白質をコードする遺伝子を増幅させた後、制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＫｐｎＩで切断した断片を前記製造されたｐＲＳＥＴ（Ａ）：Ｍｙｏ−２ベクターのＢｇｌＩＩ、ＫｐｎＩ制限酵素の位置に挿入してｐＲＳＥＴ（Ａ）：Ｍｙｏ−２−ＣＭｙｏｍベクターを製造した。
【００７８】
配列番号７：５’−ａｇａｔｃｔｇｔｃｇａｃｇａｇｇｔｃａｇａｇｔｔａｃａｇａｃ−３’
配列番号８：５’−ｇｇｔａｃｃｔｃｔａｇａｔｔａｔｔａｇｔｃｇａｃｔｃａｔｇａｇｃａｃｃｃｇｃａａｃｇ−３’
【００７９】
前記ｐＲＳＥＴ（Ａ）：Ｍｙｏ−２−ＣＭｙｏｍベクターをＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ制限酵素で切断して得られたＤＮＡ断片とｐＲＳＥＴ（Ａ）：Ｍｙｏ−２−ＣＭｙｏｍをＢｇｌＩＩ、ＫｐｎＩ制限酵素で切断してベクターを得た後、Ｔ４  ｌｉｇａｓｅでｌｉｇａｔｉｏｎさせて、二つのＭｙｏ−２ペプチドをコードする遺伝子が繰り返し連結されたｐＲＳＥＴ（Ａ）：２ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍベクターを製造した。
【００８０】
同様の方法でｐＲＳＥＴ（Ａ）：２ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍをＢｇｌＩＩとＫｐｎＩ制限酵素の位置に２ＸＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを繰り返し挿入する工程を経てｐＲＳＥＴ（Ａ）：４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを製造した。
【００８１】
バシラス属菌株から由来したポリ−γ−グルタミン酸合成に係わる細胞外膜蛋白質の遺伝子（ｐｇｓＢＣＡ）中ｐｇｓＡを利用してグラム陰性微生物及びクラム陽性微生物を宿主として、ニワトリのミオスタチン４ｘＭｙｏ−２とミオスタチンの成熟（mature）蛋白質を融合した目的蛋白質をコードする遺伝子、及びミオスタチン成熟蛋白質だけを表面発現できるｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ（図４ａ）、及びｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍ（図４ｂ）ベクターを製造した。
【００８２】
前記製造されたｐＲＳＥＴ（Ａ）：４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍをＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ制限酵素で切断して４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを取得し、ｐＣＲ  Ｔ７／ＮＴ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）でＰＣＲを通してＣＭｙｏｍを取得した後、表面発現用ベクターであるｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶＬ１（ＫＣＴＣ  １０３４９ＢＰ：ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＨＰＶＬ１で形質転換された大腸菌）のＨＰＶＬ１部分がＢａｍＨＩとＸｂａＩ制限酵素サイトを利用して除去されたｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡのポリ−γ−グルタミン酸合成に係わる細胞外膜蛋白質の遺伝子ｐｇｓＡのＣ−末端部位に解読コドンを合わせて、各々連結してｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍを製造した。
【００８３】
［実施例３］ｐｇｓＡ：４ｘＭｙｏ−２−ＣｍｙｏｍとｐｇｓＡ：ＣＭｙｏｍの細胞表面発現
実施例２において製造されたミオスタチン融合蛋白質の表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍで形質転換されたラクトバシラスとミオスタチン成熟蛋白質の表面発現用ベクターｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍで形質転換されたラクトバシラスでｐｇｓＡと融合した４ｘＭｙｏ−２重合体と成熟蛋白質（ｐｇｓＡ：４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ）融合体の発現及び成熟蛋白質（ｐｇｓＡ：ＣＭｙｏｍ）の発現の有無を調べた。
【００８４】
ポリ−γ−グルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ−末端とそれぞれ融合した、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ蛋白質及びＣＭｙｏｍ蛋白質の表面発現のために、ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍで形質転換されたラクトバシラス・カゼイとｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍで形質転換されたラクトバシラス・カゼイとをＭＲＳ培地（Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA）において、３０℃で静置培養して誘導した後、培養細胞を利用したＳＤＳ−ポリアクリルアミドミドゲル電気泳動及びｐｇｓＡに対する特異抗体を利用したウェスタンブロッティングを行って、前記融合蛋白質の発現を確認した。
【００８５】
具体的には、発現が誘導されたラクトバシラス・カゼイ全細胞を同様の細胞濃度で得た蛋白質で変性（denature）させて試料を準備して、これをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した後、分画された蛋白質をＰＶＤＦ（polyvinylidene-difluoride membranes, Bio-Rad）メンブレンにトランスファーした。蛋白質がトランスファーされたＰＶＤＦメンブレンをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭトリス塩酸、５％スキムミルク（skim milk）、ｐＨ８．０）で１時間動揺させてブロッキングさせた後、ｐｇｓＡに対するウサギ由来のポリクロン１次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍に希釈して１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄してＨＲＰが標識されたウサギに対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液に１００００倍に希釈して１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは緩衝溶液で洗浄し、洗浄されたメンブレンに基質（lumigen PS-3 acridan, H202）を添加して、約１分間発色させてＣＣＤカメラでｐｇｓＡに対する特異抗体と前記融合蛋白質との間の特異的な結合を確認した（図５）。
【００８６】
図５でコントロール（control）は形質転換されないラクトバシラス・カゼイであり、ＣＭｙｏｍはラクトバシラス・カゼイ／ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍであり、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍはラクトバシラス・カゼイ／ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−Ｃｍｙｏｍである。図５に示したように、各々の乳酸菌全細胞において特異融合蛋白質（約５５．５ｋＤａ）のｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍと約６６．９ｋＤＡ特異融合蛋白質であるｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−Ｃｍｙｏｍが確認できた。ｐｇｓＡが約４２ｋＤａで、ＣＭｙｏｍ蛋白質が約１３．５ｋＤａで、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ蛋白質が約２４．９ｋＤａであるため、図５の５５．５ｋＤａと６６．９ｋＤａを示すバンドは各々ｐｇｓＡとＣＭｙｏｍ融合蛋白質と、ｐｇｓＡと４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質であることが分かる。
【００８７】
［実施例４］４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質を表面発現するラクトバシラスによるマウスにおける免疫反応誘導及びそれによる体重変化の調査
実施例３と同様の方法で発現誘導されたラクトバシラスをマウスに経口投与し、ｐｇｓＡと融合した表面発現４Ｍｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質及びｐｇｓＡと融合したＣＭｙｏｍ蛋白質の免疫反応誘導及び体重変化を調べた。
【００８８】
具体的には、ラクトバシラス・カゼイ／ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−ＣＭｙｏｍとラクトバシラス・カゼイ／ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを培養して回収した後、全細胞を緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄して、抗原が表面発現されたラクトバシラスを６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに経口投与した。この時、実験群は４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍとＣＭｙｏｍが表面発現されたラクトバシラスを処理する二つの群（１０匹／群）であり、経口投与で１日おきに５回、１週間後再び１日おきに５回投与し、１回投与時、１匹当たり５×１０９の抗原表面発現ラクトバシラスを投与した。尚、対照群として同じ数のＣ５７ＢＬ／６マウスに乳酸菌だけ培養させた培養液を同様に投与した。
【００８９】
最初経口投与後３週目に各々のマウス群の血清を採取して、血清内４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質に対するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ方法で測定した。図６ａはマウス血清内４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質に対するＩｇＧ抗体価を示したもので、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを表面発現するラクトバシラスを食べさせた実験群（Ａ）、ＣＭｙｏｍを表面発現するラクトバシラスを食べさせた実験群（Ｂ）、及び普通のラクトバシラスを食べさせた対照群（Ｃ）を示した。
【００９０】
精製された４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質抗原を０．１Ｍ炭酸バッファー（bicarbonate(NaHCO3) buffer）（ｐＨ９．６）で１００ｎｇ／１００μＬの濃度に希釈した後、ＥＬＩＳＡ用プレートにウェル当たり１００μＬずつ添加して、４℃で一晩中反応させた。ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を３００μＬ／ウェルずつ添加しながら、３回洗浄した後、５％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ  ３００μＬを全ウェルに添加して、常温で３時間反応させる。前記のような洗浄方法で３回洗浄した後、スタンダード及び検体（1st Ab）を５％スキムミルクに１：１０〜１：６４００の割合で希釈し各ウェル当たり１００μＬずつ添加した後、常温で３時間反応させる。前記のような洗浄方法で５回洗浄した後、５％スキムミルクに１：５０００の割合で複合体（２次抗体（2nd Ab））を希釈して、常温で１時間反応させ、前記のような洗浄方法で５回洗浄した後ＴＭＢ発色溶液で３０分反応させた後５０μＬの静止溶液で発色を固定させた。そして、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーで測定して、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質に対する抗体産生の有無を確認した。
【００９１】
その結果、図６ａに示したように、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質を表面発現するラクトバシラスを投与したＣ５７ＢＬ／６マウス群の血清において４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質に対するＩｇＧ抗体価が対照群と比べて、顕著に高いことが確認できた。従って、本発明による４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質が表面発現された微生物は４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質に対する抗体を効果的に産生できることを確認した。
また、最初経口投与後、毎週Ｃ５７Ｂ／６マウスの体重を測定して、各群の体重差を比較分析した。その結果、図６ｂに示されたように、約４週目から４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍがｐｇｓＡで表面発現されたラクトバシラスを投与したＣ５７ＢＬ／６実験群の体重がＣＭｙｏｍ実験群及び対照群と比べて、顕著に高く、時間経過に伴って継続的に差が見られた。このような向上した体重増加現象は、本発明によるラクトバシラスに表面発現された４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質に対する抗体が作用して、その効果を示したと言える。
【００９２】
［実施例５］マウスにおける４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質を表面発現する乳酸菌によって誘導された抗体による筋細胞における信号伝達阻害効果
実施例４と同様の方法で、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質とＣＭｙｏｍ蛋白質を表面発現する乳酸菌をマウスに経口投与した後、筋細胞における信号伝達阻害効果を調べるためにマウス内から誘導された抗体を使用してＡ−２０４細胞におけるミオスタチンに対する中和能を濃度毎に測定した。
【００９３】
具体的には、９６ウェルプレートにＡ−２０４細胞を１×１０５／ウェルに分注して、２４時間ＣＯ２培養器で培養した後、０．２μｇのｐＧＬ（ＣＡＧＡ）１２ＤＮＡとリポフェクトアミン２０００（lipofectamine 2000, Invitrogen, USA）トランスフェクション試薬（transfection reagent）０．５μｇを各々のＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地５０μｇに薄めて、５分後に二つのチューブに含まれた培地を混ぜて、２０分間放置する。その後、Ａ−２０４細胞が入っている９６ウェルプレートにｐＧＬ（ＣＡＧＡ）１２ＤＮＡとリポフェクトアミン２０００複合体を１００μＬずつムラなく分注し、４〜６時間後に９６ウェルプレートの培地を捨てた後、新しいＤＭＥＭ培地に変える。２４時間後に血清を添加しない培地で６時間３７℃、５％ＣＯ２培養器で培養させた後、ミオスタチン（ｍＧＤＦ−８，Ｒ＆Ｄ System）１０ｎｇ／ｍＬとミオスタチン蛋白質に対するマウス抗体を濃度毎に希釈して氷上で一時間反応させて、９６ウェルプレートに分注して６時間培養した後、上澄み液でルシフェラーゼアッセイシステム（Promega, USA）を利用してＡ−２０４細胞内に抗体と反応して残ったミオスタチン蛋白質による信号伝達によって発現するルシフェラーゼ活性を測定することによってＡ−２０４細胞におけるミオスタチン蛋白質に対する中和能を測定した。
【００９４】
図７はマウス血清内のミオスタチン蛋白質に対する筋細胞における信号伝達阻害効果をルシフェラーゼ活性で示したもので、Ａは４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質を表面発現する乳酸菌投与群であり、ＢはＣＭｙｏｍ蛋白質を表面発現する乳酸菌投与群であり、Ｃは一般乳酸菌を投与した対照群を示しており、その結果、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質投与群が最も抗体を多く誘発して、筋細胞におけるミオスタチンによる信号伝達阻害効果が顕著であることが確認できた。
【００９５】
［実施例６］ブロイラにおける４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質を表面発現するラクトバシラスによる免疫反応誘導及び体重変化率調査
ラクトバシラス・カゼイ／ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍを利用して、ブロイラにおける４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質に対する免疫反応誘導及び体重変化率を調べた。
【００９６】
具体的には、ラクトバシラス・カゼイ／ｐＨＣＥ２ＬＢ：ｐｇｓＡ−４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍをコブ（Cobb）のブロイラに一般的に与える配合飼料に混ぜて、実験を行った。形質転換された乳酸菌を培養して回収した後、全細胞を緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で洗浄した乳酸菌を凍結乾燥した状態で配合飼料に混ぜて実験を行った。
【００９７】
実験群としては雌のコブブロイラ７２匹、対照群として７２匹を使用して実験を行い、合わせて６週間飼育した。実験群は１、２、３週目は４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質を表面発現された乳酸菌凍結乾燥粉末（８．１×１０５ｃｅｌｌ／ｇ）を配合飼料に０．２％添加して食べさせた後、４、５、６週目は配合飼料だけ食べさせ、対照群は１週目〜６週目まで配合飼料だけ食べさせた。
【００９８】
実験開始から６週間後に実験群及び対照群の雛血清を採取して、血清中のニワトリミオスタチン成熟蛋白質に対するＩｇＧ抗体価をＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００９９】
その結果、図８に示したように、配合飼料だけ食べさせた対照群の抗体価と比べて、実験群で抗体価が高く示されることを確認した。従って、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質が表面発現された乳酸菌はミオスタチン成熟蛋白質に対する抗体を雛でも効果的に産生できることが分かった。
【０１００】
また、４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍが表面発現された乳酸菌を食べさせた実験群及び普通の乳酸菌を食べさせた対照群の雛の体重を毎週測定して、各群の体重差を比較分析した。
【０１０１】
その結果、図９ａに示されたように、対照群及び実験群の体重変化を示したグラフから毎週体重差が増加することが確認できた。それと共に、６週間後に実験群及び対照群における各々の体重平均を比較分析した結果、図９ｂに示されたように、実験群が対照群と比べて、平均体重が６．６％増加することが確認できた。このような体重増加現象は４ｘＭｙｏ−２−ＣＭｙｏｍ融合蛋白質が表面発現された乳酸菌によって産生誘導されたミオスタチン成熟蛋白質に対する抗体が働いてその効果が現れたと言える。
【０１０２】
さらに、実験群及び対照群の飼料効率を測定し、摂取した飼料の総量を雛の体重で割り算した値をグラフで示した。その結果、図１０に示されたように、対照群と比べて、前記実験群の飼料効率が７．４％改善されたことを確認した。
【産業上利用の可能性】
【０１０３】
以上詳細に記述したように、本発明による飼料添加剤、または医薬組成物は家畜と家禽類などの筋肉発達及び調節のために活用できるだけでなく、筋ジストロフィー、筋萎縮症のようなヒトの筋消耗性疾患及び退行性疾患の予防及び治療用として使用可能で、形質転換菌株は、培養して菌体のまま使用しても効果を現わすため、非常に経済的である。
【０１０４】
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者は、このような具体的技術は単に望ましい実施形態に過ぎず、これによって、本発明の範囲が制限されるのではない点は明白である。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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