(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓疾患、大腸疾患及び心臓疾患からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患に対する指標としてナルディライジンを用いる方法であって、体液中の該ナルディライジンを定量的に測定することを特徴とするナルディライジンの免疫測定法。
【請求項２】
ナルディライジンに対するモノクローナル抗体を用いる請求項１記載の免疫測定法。
【請求項３】
酵素免疫測定法である請求項１又は２記載の免疫測定法。
【請求項４】
体液が血液である請求項１〜３何れか記載の免疫測定法。  
【請求項５】
ナルディライジンが急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌、クローン病、潰瘍性大腸
炎及び急性心筋梗塞からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患に対する指標であるナルディライジンである請求項１〜４のいずれか記載の免疫測定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナルディライジン（ｎａｒｄｉｌｙｓｉｎ）の測定に関するものである。更に詳しくは、体液中のナルディライジンを測定する免疫測定に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ナルディライジンは、Ｎ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｉｂａｓｉｃ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ（ＮＲＤｃ)とも呼ばれる酵素で細胞質及び細胞表面に存在するメタロエンドペプチダーゼである（例えば、非特許文献１参照）。更にナルディライジンは、増殖因子の新規結合タンパク質としても働き、ＴＮＦ−αｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＴＡＣＥ；ＡＤＡＭ１７）等ＡＤＡＭプロテアーゼの活性化を介して膜タンパク質の細胞外ドメインシェディングを増強すること等が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。また、ナルディライジンは生体内の多くの組織で発現していることが知られている（例えば、非特許文献３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｐｒｏ.  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９１，ｐｐ．６０７８−６０８２，１９９４
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ.  Ｒｅｓ.  Ｃｏｍｍｕｎ．３７０（１）：１５４−１５８，２００８
【非特許文献３】Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．，４７（２）：２３８−２４５，１９９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来、ナルディライジンを認識する抗体はウサギポリクローナル抗体があるのみで、ウェスタンブロット、組織染色等によるナルディライジンの定性的検出は可能であったが、ナルディライジンを定量的に測定する方法は存在しなかった。従って、血液等の体液中の微量なナルディライジンを測定することができないばかりか、血液等体液中にナルディライジンが存在することも知られていなかった。更に、これまでナルディライジンと特定の疾患の関係は明らかにされていない。本発明の目的は、血液等の体液中の微量なナルディライジンの測定を可能とし、特定の疾患と関連のあるナルディライジンを定量的に測定することにより疾患の指標となるデータを収集する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、肝臓疾患、大腸疾患及び心臓疾患からなる群から選ばれる少なくとも１種の疾患に対する指標としてナルディライジンを用いる方法であって、体液中の該ナルディライジンを定量的に測定することを特徴とするナルディライジンの免疫測定法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、体液中のナルディライジンを測定できる高感度な免疫測定法により、疾患の指標となるデータの新たな収集方法を提供するものであり、疾患に対する従来の指標よりも高い特異性（陽性率等）を示すことで、疾患の判別に有用であり、更に従来の収集方法では見逃されていた疾患の指標となる、或いは従来の収集方法と組み合わせることにより疾患指標としての精度が高まるという効果がある。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明において、ナルディライジン自体は従来公知のものであり、細胞質及び細胞表面に存在するメタロエンドペプチダーゼとして知られているものである。しかしながら、血液等の体液中に存在するナルディライジンの存在はこれまで知られておらず、本発明により初めて明確にされたものである。
ナルディライジンはラット及びヒト等の種々の動物に存在するが、本発明の方法により収集されたデータを疾患の検査に役立てる効果が大きいと言う観点からヒトのナルディライジンが好ましい。
【０００８】
本発明における体液としては、血液、尿、髄液、唾液、リンパ液、胸水及び腹水等が挙げられる。これらの内、採取の容易さ及び含まれるナルディライジンの濃度等の観点から好ましいのは血液、髄液、リンパ液、胸水及び腹水であり、更に好ましいのは血液である。血液としては、全血、血清及び血漿が挙げられ、特に好ましいのは血清及び血漿である。
【０００９】
本発明においてナルディライジンに対するモノクローナル抗体は、従来公知の方法で調製し使用することができ、例えば細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した公知の方法［Ｅｕｒ．Ｊ  ｉｍｍｕｎｏｌ，６，５１１（１９７６）］によって産生されたもの等が使用できる。
【００１０】
本発明において免疫測定は上記のナルディライジンに対するモノクローナル抗体を使用すること以外に特に限定はなく従来公知のものが使用できるが、測定感度の優れた免疫測定法が好ましい。好ましい免疫測定法としては、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）及び免疫クロマト法等が挙げられる。これらの内、測定感度の観点から更に好ましいのは、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及び発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）であり、特に好ましいのは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）である。酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の中でも、酵素の基質に化学発光物質を用いた化学発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）が最も好ましい。
【００１１】
本発明は、体液中のナルディライジンを測定することで、疾患の指標となるデータの収集方法を提供するが、対象となる疾患は、健常人群から得たナルディライジンの測定濃度値と特定の疾患を有する患者群から得たナルディライジンの測定濃度値に優位に差がある場合に選択できる。
【００１２】
好ましい疾患の例としては、肝臓疾患、大腸疾患及び心臓疾患が挙げられる。肝臓疾患としては、例えば急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌が好ましいものとして挙げられる。大腸疾患としては、クローン病及び海洋性大腸炎が好ましい例として挙げられる。心臓疾患としては、急性心筋梗塞が好ましい例として挙げられる。
【実施例】
【００１３】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
[実施例１]
本実施例は、抗ナルディライジンモノクローナル抗体の作製と免疫測定に使用する抗体の選択例を示したものである。
＜抗ナルディライジンモノクローナル抗体の作製＞
文献［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．；２８１（４１）：３１１６４−７２，２００６］に記載の通り、バキュロウィルス−昆虫細胞系を用いてヒト全長ナルディライジン組み替えタンパク質を作製した。即ち、ヒトナルディライジンｃＤＮＡ（Ｍｅｔ50−Ｌｙｓ1150）を組み込んだプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ１−ｈＮＲＤｃ−ＦＬＡＧを作製し、このプラスミドをＢａｃ−ｔｏＢａｃバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）によりＳｆ９細胞に導入した。この細胞を培養後、細胞抽出液を調製し、抗ＦＬＡＧ抗体結合カラムに吸着させ、ＦＬＡＧペプチドにより溶出し、精製したヒト全長ナルディライジン組み替えタンパク質を得た。
【００１４】
これを抗体作製の免疫抗原として用い、マウスの免疫及び細胞融合によるモノクローナル抗体の作製は常法に従い実施した。即ち、免疫抗原１００μｇを含む０．８５重量％塩化ナトリウム水溶液１ｇをＦｒｅｕｎｄの完全アジュバント（ディフコ社製）でホモジナイザーで混合・乳化し、この乳化液０．１ｇをＢＡＬＢ／ｃマウスの皮下に投与し、その後２週間間隔で４回追加免疫を行い、更に細胞融合３日前に尾静脈に免疫原を含む生理食塩水を注射した。マウスの脾臓を摘出して脾細胞２×１０8個を採取し、ＲＰＭＩ１６４０培地１５ｍＬで４回洗浄した後、この洗浄後の脾臓細胞と骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）２×１０7個とを融合した後、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、１０重量％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地）に懸濁し、９６穴マイクロプレートに分注し培養することによりハイブリドーマを選択培養した。
【００１５】
細胞融合後、１０日目に上記９６穴マイクロプレート中の培養液上清の抗体活性をＥＬＩＳＡにより測定した。即ち、免疫原を１μｇ／ｍＬの濃度で含む０．８５％塩化ナトリウム含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製、Ｎｕｎｃ  ｗｈｉｔｅプレート ｃａｔ．４３６１１０）の各穴に５０μＬずつ加え、４℃で１夜静置した。洗浄後、ブロックエース［雪印乳業（株）製］を用いてブロッキングし、抗原を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレートを得た。このプレートの各ウエルに、融合細胞の培養上清５０μＬを添加し、室温で１時間反応後、洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（ＨＬ鎖）を添加した。室温で１時間反応後洗浄し、基質液（ｏ−フェニレンジアミン）を各ウエルに５０μＬずつ添加し、４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。免疫原に反応する抗体を産生するハイブリドーマクローンを計約３５０クローン選択し、ハイブリドーマ上清によるウェスタンブロット（ＨｅＬａ細胞の細胞抽出液中のナルディライジンを検出できるかどうか）を用いてスクリーニングを行った。この段階で選択した約２０クローンは、更に限界希釈法により３回クローニングを行い、最終的に７クローン選択し、クローニング後のハイブリドーマを１週間前にプリスタン腹腔内注射済みのＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注射し、１０日後に腹水を採取した。最終的に、腹水中のＩｇＧは硫安塩析後ｐｒｏｔｅｉｎ Ａにて常法に従い精製し、表１に記載した７種の抗ナルディライジンモノクローナル抗体を得た。
【００１６】
更に、７種の抗ナルディライジンモノクローナル抗体について、文献［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．；２８１（４１）：３１１６４−７２，２００６］に記載の方法に従って、ナルディライジンに対するウエスタンブロット、免疫沈降及び組織染色における有用性を確認した。また、ナルディライジンの部分配列を有するペプチドを用いて、各モノクローナル抗体が認識するナルディライジンの部位を決定した。結果を表１にまとめた。
【００１７】
【表１】
0005610256.tif 000002
【００１８】
＜ナルディライジン測定用モノクローナル抗体の選択＞
１．モノクローナル抗体固相化プレートの作製
抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク社製、Ｎｕｎｃ  ｗｈｉｔｅプレート ｃａｔ．４３６１１０）の各穴に５０μＬずつ加え、４℃で１夜静置した。洗浄後、ブロックエース［雪印乳業（株）製］を用いてブロッキングをし、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２３を得た。
抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３１、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２４６、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２５６、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０４、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０７及び抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３１４についても同様に操作し、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２３１、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２４６、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２５６、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３０４、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３０７及びモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３１４を得た。
【００１９】
２．ビオチン化モノクローナル抗体の作製
抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３  ０．１ｍｇとビオチニル−Ｎ−ヒドキシサクシニミドエステル０．０２ｍｇを０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ ８．０）に溶解し、室温で４時間静置し、抗体のビオチン化を行った。更に反応液をＰＢＳ  ２Ｌ対して４℃で一夜透析し、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２３を得た。
抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３１、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２４６、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２５６、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０４、抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０７及び抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３１４についても同様に操作し、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２３１、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２４６、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２５６、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３０４、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３０７及びビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３１４を得た。
【００２０】
３．モノクローナル抗体固相化プレート／ビオチン化モノクローナル抗体の組み合わせ試験
抗原（ヒト全長ナルディライジン組み替えタンパク質）を検体希釈液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）にて０〜１００ｎｇ／ｍＬ（濃度ポイントは、０、５、２５、５０及び１００ｎｇ／ｍＬ）の濃度に調整し、標準液を作製した。その標準液をモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２３の各穴に５０μＬずつ添加し、室温で６０分間反応させた。洗浄後、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２３  ０．２μｇ／ｍＬを５０μＬずつ添加し、室温で６０分間反応させた。洗浄後、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅを添加し、室温で３０分間反応させ、洗浄後、基質液（ｏ−フェニレンジアミン）を５０μＬずつ添加し、室温で３０分間反応させた後、各ウエルに１Ｎ硫酸を５０μＬずつ添加し、４９２ｎｍの吸光度を測定した。同様にして、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２３、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２３１、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２４６、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２５６、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３０４、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３０７及びモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．３１４から選んだ１種類とビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２３、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２３１、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２４６、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．２５６、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３０４、ビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３０７及びビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３１４から選んだ１種類を組み合わせて測定を行い、測定吸光度を比較した。標準液１００ｎｇ／ｍＬの測定吸光度が高く、かつ標準液０ｎｇ／ｍＬの測定吸光度が相対的に低い組み合わせを選択した。その結果、モノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２３１とビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３０４の組み合わせを選択した。
以上から、ナルディライジンの免疫測定に使用可能な抗体の組み合わせ、Ｎｏ．２３１とＮｏ．３０４を選択できた。
【００２１】
[実施例２]
本実施例は、マイクロプレートを用いた化学発光酵素免疫測定用法によるナルディライジンの測定例である。
＜測定用試薬＞
１．モノクローナル抗体固相化プレート
実施例１で作製したモノクローナル抗体固相化プレートＮｏ．２３１を使用した。
２．ビオチン化モノクローナル抗体液
実施例１で作製したビオチン化モノクローナル抗体Ｎｏ．３０４を検体希釈液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で抗体濃度として０．２μｇ／ｍＬに希釈して用いた。
３．ストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼ液
ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＭＡＢＴＥＣＨ社製、ｃｏｄｅ３３１０−８）を検体希釈液（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）で１０００倍希釈して用いた。
４．発光試薬
ルミホス５３０［和光純薬工業（株）製］をそのまま使用した。
５．標準液
実施例１と同様に標準液を調製した。但し濃度範囲は０〜１０００ｐｇ／ｍＬ（濃度ポイントは、０，６２．５，１２５，２５０，５００及び１０００ｐｇ／ｍＬ）とした。
【００２２】
＜測定操作＞
１．検量線の作成
モノクローナル抗体固相化プレートのブロッキング液を捨て、検体希釈液にて上記各濃度の標準液を２倍希釈した液を５０μＬずつ各ウエルに分注し、室温で６０分反応させた。
ウエルを洗浄後、ビオチン化モノクローナル抗体液を５０μＬ分注し、室温で６０分反応させた。ウエルを洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリフォスファターゼ液を５０μＬ分注し、室温で３０分反応させた。ウエルを洗浄液で洗浄後、発光試薬５０μＬを分注し、室温で３０分反応させた。反応後、Ｗａｌｌａｃ１４２０（パーキンエルマーライフサイエンス社製発光計測器）にて発光量を測定した。
２．同時再現性の確認
濃度１３０ｐｇ／ｍＬ、１８０ｐｇ／ｍＬ及び２９０ｐｇ／ｍＬの標準液について上記検量線の作成における操作と同様にして発光量を各１０回測定した。
３．検出感度の設定
濃度０、５０、１００及び２００ｐｇ／ｍＬの標準液について各１５回発光量を測定した。各濃度の測定発光の平均値及び標準偏差（ＳＤ）を算出し、測定発光量平均値±３ＳＤの範囲が、濃度０ｐｇ／ｍＬの標準液を使用した場合の測定発光量平均値±３ＳＤの範囲と重ならない最低の濃度を検出感度とした。
【００２３】
＜測定結果＞
１．検量線
結果を図１に示した。０〜１０００ｐｇ／ｍＬの範囲でほぼ直線となる良好な検量線が得られた。
２．同時再現性
同一サンプルを１０回測定した場合の各測定値、平均値、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ）を表２に示した。いずれのサンプルもＣＶ１０％以下と再現性が良好であった。
３．検出感度試験
検出感度試験の結果を図２に示した。各濃度の標準液を使用した場合の発光量平均値±３ＳＤの範囲をバーで示した。測定発光量平均値±３ＳＤの範囲が、濃度０ｐｇ／ｍＬの発光量の平均値±３ＳＤの範囲と重ならない最低濃度５０ｐｇ／ｍＬを検出感度とした。
【００２４】
【表２】
0005610256.tif 000003
【００２５】
[実施例３]
本実施例は、血清中のナルディライジンの安定性を確認した測定例である。
＜血清中ナルディライジンの安定性＞
血清中でのナルディライジンの安定性を調べるため、採血後、遠心分離した血清１０検体を冷蔵８日間保存し、冷蔵前（採血し、血清を分離した直後）並びに冷蔵後２日目、３日目、４日目、５日目及び８日目にナルディライジン測定した。ナルディライジンの測定は実施例２記載の測定操作で標準液の代わりに血清検体を用いる以外は同様に測定した。１０検体の保存率（冷蔵前のナルディライジンの値に対する各冷蔵期間後のナルディライジンの値の割合を百分率で表した値）の平均を図３に示した。１０検体の保存率の平均は、冷蔵８日間までほぼ９０％以上を示し、安定であった。
【００２６】
[実施例４]
本実施例は、健常人から得た血清中のナルディライジンを測定した例である。
＜健常人血清中のナルディライジン測定＞
健常人（健康診断受診者２５５名、平均年齢３９．２才）から採取した血清中のナルディライジンを測定した。ナルディライジンの濃度は、実施例２に記載の測定操作で標準液の代わりに血清検体を用いる以外は同様に操作して発光量を測定し、実施例２に記載の検量線を用いて算出した。
＜測定結果＞
健常人から得た血清中のナルディライジン濃度は、平均値±標準偏差で２６３．８±２１８．０ｐｇ／ｍＬ（最大値１５２２．７、中間値１８３．３、最小値５６．５）という結果であった。分布度数を図４に示した。
【００２７】
[実施例５]
本実施例は、急性心筋梗塞患者血清中のナルディライジンを測定した例である。
＜急性心筋梗塞患者血清中のナルディライジン測定＞
急性心筋梗塞患者７７名の急性期に採取した血清中のナルディライジンを測定した。ナルディライジンの濃度は、実施例２に記載の測定操作で標準液の代わりに血清検体を用いる以外は同様に操作して発光量を測定し、実施例２に記載の検量線を用いて算出した。
＜測定結果＞
測定値の分布度数を図５に示した。
急性心筋梗塞患者から得た血清中のナルディライジン濃度は平均値±標準偏差で７９４±２２３．７ｐｇ／ｍＬ（最大値１９０５９．２、中間値３１６．２、最小値４１．１）であり、実施例４で得た健常人のナルディライジン濃度に比較して明らかな高値を示した。
実施例４で得た平均値及び標準偏差から、仮に平均値＋３ＳＤの値（９１７．８ｐｇ／ｍＬ）を疾患である判断基準の値として設定すると、健常人群では陽性率１．５７％（４／２５５）、急性心筋梗塞群では陽性率１６．９％（１３／７７）となり、明らかに急性心筋梗塞群の陽性率が高かった。
【００２８】
[実施例６]
本実施例は全自動化学発光酵素免疫測定装置スフィアライト１８０［オリンパス（株）製］を用いてナルディライジンを高感度かつ短時間で測定し、予め測定した健常人と疾患患者のナルディライジン濃度を比較した例である。
＜試薬の調製＞
１．抗体ビーズの作製
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶にガラスビーズ１０００個を加え、２５℃で１時間反応させ、反応液をアスピレーターで吸引除去した。
【００２９】
次いで脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
次いで、この洗浄後のガラスビーズ１０００個を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水２０ｍＬを加えて蓋をし、ポリエチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、液をアスピレーターで吸引除去してガラスビーズを洗浄した。この洗浄操作を３回行った。
更にこの洗浄後のガラスビーズ１０００個を抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．２３１を２０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。
【００３０】
反応後、抗ナルディライジンモノクローナル抗体含有リン酸緩衝液を除去し、ガラスビーズを０．１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２０ｍＬに８時間浸漬し、この液を除去した後、ビーズを２０重量％ショ糖含有０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）２０ｍＬに浸漬した。２時間浸漬後、液を除去してビーズを濾紙上で風乾してビーズ表面をショ糖でコーティングし、抗体ビーズを得た。
【００３１】
２．免疫反応用緩衝液の作製
０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍＬに、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１ｇ、塩化ナトリウム０．８５ｇ及び界面活性剤としてのツイーン８０  ０．５ｇを添加し、免疫反応用緩衝液を作製した。
【００３２】
３．酵素標識抗体液の作製
抗ナルディライジンモノクローナル抗体Ｎｏ．３０４及び西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ナルディライジン抗体を調製し、冷凍（−３０℃）保存した。
上記で作製したＰＯＤ標識抗ナルディライジン抗体を免疫反応用緩衝液で抗体濃度として５μｇ／ｍＬとなるように希釈し、酵素標識抗体液を作製した。
【００３３】
４．基質液の作製
ルミノールナトリウム［シグマアルドリッチジャパン（株）製］０．２８ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール［三新化学工業（株）製］０．０６ｇを、グッド緩衝液（０．１ＭのＥＰＰＥＳ、ｐＨ８．５）１００ｍＬに溶解し、基質液を作製した。
【００３４】
５．過酸化水素液の調製
３５重量％過酸化水素水［和光純薬工業（株）製］を脱イオン水で１８００倍に希釈し、過酸化水素液とした。
【００３５】
６．測定用試薬の調製
測定用カートリッジ[オリンパス（株）製]に抗体ビーズ１個、免疫反応用緩衝液２００μＬ、酵素標識抗体液２４０μL、基質液１４０μＬ及び過酸化水素液１４０μＬを入れ、アルミシールで密閉し測定用試薬とした。測定まで２〜１０℃で冷蔵保存した。
【００３６】
＜測定操作＞
全自動化学発光酵素免疫分析装置スフィアライト１８０［オリンパス（株）製］を用いて測定を実施した。本装置は検体の分注から測定値の出力まで自動的に行う。測定の概要は次の通りである。
測定用試薬及び検体を所定の位置にセットする。測定用試薬のアルミシールを開封し、抗体ビーズが１個入った反応槽に免疫反応用緩衝液８０μＬ及び検体６０μＬを加え、３７℃で１４分間免疫反応する。１回当たり５００μＬの洗浄液（リン酸緩衝液）で６回洗浄してＢ／Ｆ分離を行った後、酵素標識抗体液２４０μＬを加え、３７℃で１４分間免疫反応する。同様にＢ／Ｆ分離を行った後、基質液７０μＬ及び過酸化水素液７０μＬを加え、３７℃で１分間反応させた後、発光量を計測する。予め測定した既知検体の発光量で検量線を作成し、検体の発光量から濃度を算出する。
【００３７】
＜検体＞
検体として、標準液（上記操作中に記載の既知検体として使用）は実施例２で調製した標準液、肝臓疾患患者及び大腸疾患患者から得た血清を用いた。患者の内訳は、肝臓疾患患者として、急性肝炎患者３名、慢性肝炎患者８０名、肝硬変患者１１６名及び肝細胞癌患者３１２名であり、大腸疾患患者として、クローン病患者８名及び潰瘍性大腸炎患者３９名であった。
【００３８】
＜結果＞
結果を図６に示した。各疾患患者の平均値±標準偏差は、急性肝炎７５７４．９±２３９８．９ｐｇ／ｍＬ、慢性肝炎１５０４．０±３９１．７ｐｇ／ｍＬ、肝硬変１４４９．４±７８２．５ｐｇ／ｍＬ、肝細胞癌１７８４．２±８１９．３ｐｇ／ｍＬ、クローン病１８２９．７±８１９．３ｐｇ／ｍＬ、潰瘍性大腸炎１８０６．６±８０２．６ｐｇ／ｍＬであった。
健常人のナルディライジン濃度に比較して、肝臓疾患（急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変又は肝細胞癌）患者及び大腸疾患（クローン病又は潰瘍性大腸炎）患者では明らかに高い濃度値を示し、実施例４で得た健常人の平均値及び標準偏差から、仮に平均値＋３ＳＤの値（９１７．８ｐｇ／ｍＬ）を疾患である判断基準の値として設定すると、各疾患の陽性率は、急性肝炎１００％（３／３）、慢性肝炎９６％（７７／８０）、肝硬変８７％（１０１／１１６）、肝細胞癌９０％（２８０／３１２）、クローン病１００％（８／８）、潰瘍性大腸炎９２％（３６／３９）であり、ナルディシンの測定はこれら疾患の検査に有用であることが判った。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は臨床検査、特に肝臓疾患や大腸疾患等の疾患を検査する臨床検査に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】標準液のナルディライジン濃度と発光量の関係を表した検量線のグラフである。
【図２】検出感度試験の結果を表したグラフである。
【図３】各冷蔵期間後の保存率（冷蔵前のナルディライジンの値に対する各冷蔵期間後のナルディライジンの値の割合を百分率で表した値）を表したグラフである。
【図４】健常人の血清中のナルディライジン濃度の度数分布を表したグラフである。
【図５】急性心筋梗塞患者の血清中のナルディライジン濃度の度数分布を表したグラフである。
【図６】急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌クローン病又は潰瘍性大腸炎の各疾患患者の血清中のナルディライジン濃度を表したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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