(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサート及び
フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサート
を含むｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミドと、
１又は２以上の必要に応じたワクチンアジュバントと
を含むワクチン組成物。
【請求項２】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサート、及びフューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートを含むｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミド、並びに１又は２以上の必要に応じたワクチンアジュバントを含む、癌の症状を予防、治療及び／又は寛解するための自家細胞ワクチン。
【請求項３】
１又は２以上の癌細胞におけるトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ又はＴＧＦ−β）及びＧＭ−ＣＳＦのレベルを測定することにより療法の進行をモニターするステップであって、ＴＧＦ−βレベルの低下及びＧＭ−ＣＳＦレベルの上昇が療法の成功を示すステップと、
前記ＴＧＦ−β及びＧＭ−ＣＳＦのレベルに基づき自家細胞ワクチンの投与を変更するステップと
を含む方法に用いる、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
癌が、メラノーマ、非小細胞肺癌、胆嚢癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、肝癌転移及びユーイング肉腫からなる群から選択される、請求項２又は３に記載のワクチン。
【請求項５】
患者から無菌的に収集した１又は２以上の癌細胞を無菌容器内の抗生物質溶液中に置くステップと、
前記収集した溶液から細胞懸濁液を生成するステップであって、前記細胞懸濁液の生成が酵素による解体、機械的脱凝集又は両者によって達成されるステップと、
前記細胞懸濁液を電気穿孔することによって前記細胞を遺伝的に改変し、ＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサート、及びフューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートを含むｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミドを有するワクチンを作製するステップと、
前記ワクチンを収集するステップと、
前記ワクチンに放射線照射するステップと、
前記ワクチンを凍結するステップと
を含む、フューリンノックダウン及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）増強（ＦＡＮＧ）癌ワクチンを作製する方法。
【請求項６】
遺伝的に改変された細胞が、放射線照射によって増殖能力のない状態にされている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
遺伝的に改変された細胞が自家細胞、異種移植片増幅細胞、同種異系細胞、又は樹立細胞系である同種異系細胞である、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝的に改変された細胞が、月に１回を最大１２用量まで対象に投与される、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
遺伝的に改変された細胞の投与が、追加的な治療薬との併用療法の一部であり、前記併用療法に用いられる追加的な治療薬がγＩＦＮである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサートと、
フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートと
を含むｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミドを含むワクチン組成物であって、以下のステップを含む、癌を治療する方法に用いるための前記ワクチン組成物。
治療を必要とする対象を同定するステップ；
前記対象から癌組織試料を収集するステップ；
前記収集された癌試料における癌細胞を、前記ｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクターを前記細胞にトランスフェクトすることによって、遺伝的に改変するステップ；
癌の症状の治療又は寛解に十分な量で、前記対象に治療上有効用量の前記遺伝的に改変された細胞を投与するステップ；
【請求項１１】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサート、並びに
ＲＮＡ干渉の切断及び隔離機構両方のための単一の標的部位を提供する１又は２以上の二機能性低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡフューリン）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートであって、二機能性ｓｈＲＮＡフューリンが、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる、完全に相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む第一のステム−ループ構造並びに前記ガイド鎖の１又は２以上の塩基対ミスマッチを含む第二のステム−ループ構造を含む第二の核酸インサート
を含むｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミドと、
１又は２以上の必要に応じたワクチンアジュバントと
を含む、ＲＮＡ干渉を介したフューリン発現の阻害による癌治療のための自家細胞ワクチン組成物。
【請求項１２】
第二のステム−ループ構造が、３塩基対ミスマッチを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
標的細胞を選択するステップと、
前記標的細胞に、１又は２以上のＧＭ−ＣＳＦと、完全に相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む第一のステム−ループ構造並びに前記パッセンジャー鎖の１又は２以上の塩基対ミスマッチを含む第二のステム−ループ構造を含み、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害する二機能性低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）フューリンとを含むコンストラクトをトランスフェクトするステップと
を含む、標的細胞においてＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害する方法に用いる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子と、
完全に相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を含む第一のステム−ループ構造並びに前記ガイド鎖の１又は２以上の塩基対ミスマッチを含む第二のステム−ループ構造を含み、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害するフューリンに対する二機能性低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）と
を含むコンストラクトを含むワクチン組成物であって、以下のステップを含む、フューリン発現を阻害する方法に用いるための前記ワクチン組成物。
標的細胞を選択するステップ；
前記標的細胞に、前記コンストラクトをトランスフェクトするステップ；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ワクチン開発の分野に関し、特に、フューリンノックダウン及びＧＭ−ＣＳＦ発現のために、遺伝的に改変された自家癌ワクチンを作製及び使用するための組成物及び方法の開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、その背景を、遺伝的に改変されたホールセル癌ワクチンの開発に関連して説明する。より具体的には、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子の発現により腫瘍抗原発現、提示及びプロセシングを増強し、フューリン二機能性ｓｈＲＮＡ導入遺伝子誘導性ノックダウンを介してＴＧＦ−βの分泌性免疫抑制活性を減衰することができるワクチンに関する。
【０００３】
癌ワクチンに対する免疫寛容に関して広く知られた仮説として、腫瘍細胞の免疫原性の低さ、プロフェッショナル抗原提示細胞による適切な提示の欠如、抗原欠損バリアントの免疫選択、腫瘍誘導性免疫抑制及び腫瘍誘導性免疫特権部位が挙げられる。ホール癌細胞ワクチンは、定義済み及び未定義両方の腫瘍抗原に対する広範囲の多価免疫応答を潜在的に引き起こすことができ、これにより下方制御及び／又は抗原欠損バリアントの選択による腫瘍抵抗性の可能性に取り組むことができる。
【０００４】
多くの場合ＧＭ−ＣＳＦと省略される顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor）は、マクロファージ、Ｔ細胞、マスト細胞、内皮細胞及び線維芽細胞によって分泌されるタンパク質である。サイトカイン導入遺伝子として組み込まれると、ＧＭ−ＣＳＦは、自家患者腫瘍細胞又は樹立同種異系腫瘍細胞系いずれかに由来する癌ワクチンペプチド、腫瘍細胞ライセート又はホール腫瘍細胞の提示を強化する。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞の分化を誘導し、これをワクチン接種部位へと誘引する。ＧＭ−ＣＳＦはまた、樹状細胞成熟化及び活性化プロセスのアジュバントとして機能する。しかし、ＧＭ−ＣＳＦ介在性免疫感作は、腫瘍細胞によって産生及び／又は分泌されるトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β, transforming growth factor beta）の様々なアイソフォームによって抑制され得る。多機能タンパク質のＴＧＦ−βファミリーは、よく知られた免疫抑制活性を保持する。３種の公知のＴＧＦ−βリガンド（ＴＧＦ−β１、β２及びβ３）は、ヒトの癌において偏在性である。ＴＧＦ−β過剰発現は、腫瘍進行及び予後不良と相関する。腫瘍微小環境内におけるＴＧＦ−βレベルの上昇は、反応不顕性腫瘍応答とリンクする。ＴＧＦ−βは、ＧＭ−ＣＳＦ誘導性樹状細胞成熟化並びにそのＭＨＣクラスII及び共刺激分子の発現を直接的及び間接的に阻害する。ＧＭ−ＣＳＦ介在性免疫活性化におけるＴＧＦ−βのこのような負の影響は、ＧＭ−ＣＳＦに基づく癌細胞ワクチンにおけるＴＧＦ−β分泌を欠乏させることの理論的根拠を支持する。
【０００５】
ＴＧＦ−βの全成熟型アイソフォームは、適正な活性のためにフューリン介在性のタンパク質限定切断を必要とする。カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼであるフューリンは、スブチリシン様プロプロテイン変換酵素ファミリーのメンバーである。フューリンは、対応する免疫調節性波及効果を有するＴＧＦ−βの機能活性化のために最もよく知られている。以前に記載された腫瘍分泌性ＴＧＦ−βの免疫抑制活性とは別に、Ｔリンパ球における内在性発現フューリンのコンディショナルな欠失は、正常Ｔ細胞の発生には許容されるが、調節性及びエフェクターＴ細胞の機能を損ない、これらはＴＧＦ−β１の産生が少なかったことが見出された。Ｔ細胞によるフューリン発現は、末梢性免疫寛容の維持に不可欠であると考えられ、これは、少なくとも一部には、ＴＧＦ−β１産生調節におけるその非重複性必須機能によるものである。
【０００６】
事実上あらゆる癌株において、高レベルのフューリンが立証された。本発明者ら及び他の発明者らは、ヒト結腸直腸癌、肺癌及びメラノーマ細胞により最大１０倍高レベルのＴＧＦ−β１が産生され得ること、より大規模に免疫寛容状態に影響を与える可能性があることを見出した。腫瘍細胞におけるフューリンの存在は、腫瘍指向型ＴＧＦ−β介在性末梢性免疫寛容の維持に有意に貢献する可能性がある。そのためフューリンノックダウンは、ＧＭ−ＣＳＦ介在性免疫感作を最適化するための新規の興味を引くアプローチを表す。
【０００７】
インターフェロン−ガンマ（γＩＦＮ, interferon-gamma）は、宿主の自然及び獲得免疫応答並びに腫瘍管理において決定的な役割を果たす主要な免疫調節性サイトカインである。II型インターフェロンとしても知られるγＩＦＮは、その発現が複数のレベルで調節されるシングルコピー遺伝子である。γＩＦＮは、免疫学的関連遺伝子の転写調節によって、多様な一連の細胞プログラムを協調させる。当初、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞１型（Ｔｈ１, T helper cell type 1）リンパ球、ＣＤ８＋細胞傷害性リンパ球及びＮＫ細胞が、γＩＦＮを独占的に産生すると考えられていた。しかし、現在、Ｂ細胞、ＮＫＴ細胞及びプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ, antigen-presenting cell）等、他の細胞が、γＩＦＮを分泌するとの証拠がある。局所的に作用するプロフェッショナルＡＰＣ［単球／マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ, dendritic cell）］によるγＩＦＮ産生は、細胞の自己活性化及び近隣の細胞の活性化において重要となり得る。ＮＫ細胞と、場合によりプロフェッショナルＡＰＣによるγＩＦＮ分泌は、感染症に対する初期の宿主防御において重要となる可能性があり、一方、Ｔリンパ球は、獲得免疫応答における主たるγＩＦＮ源となる。さらに、原発性及び移植腫瘍の発達の予防におけるγＩＦＮの役割が同定された。γＩＦＮ産生は、ＡＰＣによって分泌されるサイトカイン、中でも注目すべきはインターロイキン（ＩＬ）−１２及びＩＬ−１８により制御される。γＩＦＮ産生の負の調節因子として、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、グルココルチコイド及びＴＧＦ−βが挙げられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はまた、ｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭ−ＣＳＦ発現ベクターを有する細胞を治療上有効量含む、自家（即ち、患者特異的）癌ワクチン組成物（ＦＡＮＧワクチン）を提供する。このベクターは、ヒトＧＭ−ＣＳＦであってよいＧＭ−ＣＳＦをコードする第一の核酸と、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする第二の核酸インサートとを含む。どちらの核酸インサートも、プロモーターに作動可能に連結する。ｓｈＲＮＡは、（切断依存的）ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ, RNA induced silencing complex）フォーマット型）ｓｉＲＮＡ（切断依存的）及び（切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型）ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様いずれかのモチーフの両方を同時に組み入れた、二機能性となり得る。本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、ＲＩＳＣ切断依存的及びＲＩＳＣ切断非依存的両方のフューリン発現阻害因子である。さらに、発現ベクターは、第一及び第二の核酸インサート間にインターカレートしたピコルナウイルス２Ａリボソームスキップペプチドを含有することができ、プロモーターは、エンハンサー配列及びイントロンを含有し得るＣＭＶ哺乳類プロモーターとなることができる。二機能性ｓｈＲＮＡの標的となるｍＲＮＡ配列は、コード配列に限定されない。一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、フューリンｍＲＮＡ転写産物の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）配列を標的とすることができ、一実施形態において、フューリンｍＲＮＡ転写産物のコード配列及び３’ＵＴＲ配列の両方を同時に標的とすることができる。ワクチン作製に用いた細胞は、自家腫瘍細胞となることができるが、異種移植片増幅（expanded）自家腫瘍細胞、同種異系腫瘍細胞、異種移植片増幅同種異系腫瘍細胞又はそれらの組合せを用いてもよい。患者に投与したワクチン投薬量は、１×１０７細胞〜２．５×１０７細胞を含有する。ＦＡＮＧワクチンは、治療上有効量のγＩＦＮ（ガンマインターフェロン）と併せて与えることができる。γＩＦＮの投薬量範囲は、５０又は１００μｇ／ｍ２となり得る。
【０００９】
本発明は、ｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミドと、１又は２以上の必要に応じたワクチンとを含む自家細胞ワクチン組成物について記載する。ベクタープラスミドは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサートと、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートとを含む。一態様において、ＧＭ−ＣＳＦはヒトのものである。別の一態様において、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型）及びｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様のいずれか（切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型）のモチーフを組み入れている。本明細書に記載されているｓｈＲＮＡは、切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型及び切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型両方のフューリン発現阻害因子であり、二機能性ｓｈＲＮＡとしてさらに定義される。
【００１０】
別の一態様において、ピコルナウイルス２Ａリボソームスキップペプチドは、第一及び第二の核酸インサート間にインターカレートされている。さらにまた別の一態様において、プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ  ５’ＵＴＲエンハンサー配列及びＣＭＶ  ＩＥイントロンＡを含有するＣＭＶ哺乳類プロモーターである。関係する一態様において、ＣＭＶ哺乳類プロモーター。他の態様において、ｓｈＲＮＡの標的となる領域は、フューリンｍＲＮＡ転写産物の３’ＵＴＲ領域配列であり、ｓｈＲＮＡの標的となる領域は、フューリンｍＲＮＡ転写産物のコード領域である。
【００１１】
本発明は、癌の症状の予防、治療及び／又は寛解を必要とする患者を同定するステップと、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサート及びフューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートとを含むｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミド並びに１又は２以上の必要に応じたワクチンアジュバントを含む自家細胞ワクチンを投与するステップとを含むことにより、患者における癌の症状を予防、治療及び／又は寛解させる方法を提供する。
【００１２】
本方法は、１又は２以上の癌細胞におけるトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ又はＴＧＦ−β）及びＧＭ−ＣＳＦのレベルを測定することによって、療法の進行をモニターするステップであって、ＴＧＦ−βレベルの低下及びＧＭ−ＣＳＦレベルの上昇が療法の成功を示すステップと、前記ＴＧＦ−β及びＧＭ−ＣＳＦのレベルに基づき自家細胞ワクチンの投与を変更するステップとをさらに含む。本発明の方法により、ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ−β３のうち少なくとも１種類から選択される。一態様において、癌は、メラノーマ、非小細胞肺癌、胆嚢癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、肝癌転移及びユーイング肉腫並びに他の患者由来のＴＧＦ−β産生癌からなる群から選択される。別の一態様において、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型）及びｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様のいずれか（切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型）のモチーフを組み入れ、ｓｈＲＮＡは、切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型及び切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型両方のフューリン発現の阻害因子である。さらにまた別の一態様において、ｓｈＲＮＡは、二機能性ｓｈＲＮＡとしてさらに定義される。
【００１３】
別の一実施形態において、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサート及びフューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートを含むｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミドと、１又は２以上の必要に応じたワクチンアジュバントとを含む、自家フューリンノックダウン及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）増強（ＦＡＮＧ, furin-knockdown and Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) augmented）癌ワクチン組成物を開示する。本発明の組成物は、メラノーマ、非小細胞肺癌、胆嚢癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、肝癌転移及びユーイング肉腫並びに他の患者由来のＴＧＦ−β産生癌からなる群から選択される癌の症状の予防、治療及び／又は寛解に用いられる。
【００１４】
さらにまた別の一実施形態において、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ, non small cell lung cancer）の症状の予防、治療及び／又は寛解を必要とする患者を同定するステップと、ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサート及びフューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートを含むｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミド並びに１又は２以上の必要に応じたワクチンアジュバントを含むＦＡＮＧワクチンを投与するステップとを含む、フューリンノックダウン及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）増強（ＦＡＮＧ）癌ワクチンの投与により患者におけるＮＳＣＬＣの症状を治療、予防及び／又は寛解させる方法である。本発明の方法は、１又は２以上のＮＳＣＬＣ細胞におけるトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ又はＴＧＦ−β）及びＧＭ−ＣＳＦのレベルを測定することによって療法の進行をモニターするステップであって、ＴＧＦ−βレベルの低下及びＧＭ−ＣＳＦレベルの上昇が療法の成功を示すステップと、前記ＴＧＦ−β及びＧＭ−ＣＳＦのレベルに基づき自家細胞ワクチンの投与を変更するステップとをさらに含む。本発明の一態様において、ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２又はＴＧＦ−β３のうち少なくとも１種類から選択される。
【００１５】
さらなる一実施形態において、本発明は、（ｉ）１又は２以上の癌細胞を患者から無菌的に収集するステップと、（ii）前記収集した細胞を無菌容器内の抗生物質溶液中に置くステップと、（iii）前記収集した溶液から細胞懸濁液を生成するステップであって、前記細胞（iv）懸濁液の生成が酵素による解体（enzymatic dissection）、機械的脱凝集又は両者によって達成されるステップと、（ｖ）前記細胞懸濁液を電気穿孔することによって前記細胞を遺伝的に改変し、ＧＭ−ＣＳＦ  ｃＤＮＡをコードする、プロモーターに作動可能に連結した第一の核酸インサート及びフューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする、前記プロモーターに作動可能に連結した第二の核酸インサートを含む、ｂｉｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミドを有するワクチンを作製するステップと、（vi）前記ワクチンを収集するステップと、（vii）前記ワクチンに放射線照射するステップと、（viii）前記ワクチンを凍結するステップとを含む、フューリンノックダウン及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）増強（ＦＡＮＧ）癌ワクチンを作製する方法について記載する。
【００１６】
本方法の一態様において、１又は２以上の癌細胞は、メラノーマ、非小細胞肺癌、胆嚢癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、肝癌転移及びユーイング肉腫並びに他の患者由来のＴＧＦ−β産生癌からなる群から選択される癌を患う患者から収集される。別の一態様において、遺伝的に改変された細胞は、放射線照射によって増殖能力のない状態にされている。さらにまた別の一態様において、遺伝的に改変された細胞は、自家、同種異系又は異種移植片増幅細胞である。
【００１７】
一態様において、同種異系細胞は樹立細胞系である。別の一態様において、遺伝的に改変された細胞は、月に１回を最大１２用量まで対象に投与され、対象に投与される遺伝的に改変された細胞の用量は、１×１０７細胞／注射〜５×１０７細胞／注射であり、遺伝的に改変された細胞の投与は、追加的な治療薬との併用療法の一部である。さらにまた別の一態様において、併用療法に用いられる追加的な治療薬はγＩＦＮであり、併用療法において対象に投与されるγＩＦＮの用量は５０又は１００μｇ／ｍ２である。本発明の方法は、トランスフェクション後に、遺伝的に改変された細胞をγＩＦＮとインキュベートするステップをさらに含み、トランスフェクション後に、遺伝的に改変された細胞に適用されるγＩＦＮの用量は、約２５０Ｕ／ｍｌ（２４時間に亘り５００Ｕ／ｍｌ〜４８時間に亘り１００Ｕ／ｍｌ）である。
【００１８】
本発明の別の一実施形態は、フューリンノックダウンを介してトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）の発現を阻害するためのｓｉＲＮＡを介在した方法である。本方法は、標的細胞を選択するステップと、前記標的細胞に、プロモーター及び前記プロモーターに作動可能に連結した核酸インサートを含む発現ベクターをトランスフェクトするステップとを含む。インサートは、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、その結果ＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。ｓｈＲＮＡは二機能性となることができ、即ち、ｓｉＲＮＡ（切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型）及びｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様のいずれか（切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型）のモチーフを同時に組み入れることができ、切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型及び切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型様式の両方でフューリン発現を阻害することができる。その上、発現ベクターは、フューリンｍＲＮＡ転写産物のコード領域を標的としても、フューリンｍＲＮＡ転写産物の３’ＵＴＲ領域配列を標的としてもよく、或いは、フューリンｍＲＮＡ転写産物のコード配列及び３’ＵＴＲ配列の両方を同時に標的としてもよい。
【００１９】
本発明はまた、標的細胞における抗原発現、提示及びプロセシングを増強するため並びにトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ又はＴＧＦ−β）の分泌性免疫抑制活性を減衰させるための方法を提供する。本方法は、標的細胞を選択するステップと、前記標的細胞に、２種のインサートを含む発現ベクターをトランスフェクトするステップとを含む。標的細胞のトランスフェクトに用いた技法は、プラスミドベクター電気穿孔となることができる。第一の核酸インサートは、ＧＭ−ＣＳＦをコードし、一方、第二のインサートは、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。どちらのインサートも、プロモーターに作動可能に連結する。フューリン発現をノックダウンすることによってその活性化が防止され得るＴＧＦ−βアイソフォームは、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２及びＴＧＦ−β−３を包含する。標的細胞は、樹立ヒト細胞系であってよい自家又は同種異系細胞を包含することができる。
【００２０】
本発明はまた、ＦＡＮＧワクチンを患者に投与することにより癌の症状を予防、治療及び／又は寛解させる方法を包含する。本方法は、（ｉ）治療を必要とする対象を同定するステップと、（ii）前記対象から癌組織試料を収集するステップと、（iii）前記収集した癌試料における癌細胞を遺伝的に改変するステップと、（iv）治療上有効用量の遺伝的に改変された細胞を前記対象に投与するステップとを含む。細胞のトランスフェクトに用いた発現ベクターは、２種の核酸インサートを含む。第一の核酸インサートは、ＧＭ−ＣＳＦをコードし、プロモーターに作動可能に連結する。第二の核酸インサートも該プロモーターに作動可能に連結し、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。本発明の一実施形態において、治療の標的となる癌は、ヒトメラノーマ又は非小細胞肺癌である。遺伝的に改変された細胞を増殖能力のない状態にするため、放射線照射してよい。ＦＡＮＧワクチンにおける遺伝的に改変された細胞は、自家細胞、同種異系細胞、異種移植片増幅細胞、樹立ヒト細胞系又はこれらの細胞型の組合せとなることができる。ワクチン接種のため、細胞は、月に１回を最大１２用量、各回１×１０７細胞〜２．５×１０７細胞含有で対象に投与される。５×１０７までの用量増加は、安全であることが示された。
【００２１】
遺伝的に改変された細胞は、独立型療法として投与することができるが、併用療法の一部として投与してもよい。本発明のこの実施形態において、ＦＡＮＧワクチンは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及び／又はγＩＦＮ等、別の治療薬［複数可］と組み合わせることができるが、これらに限定されない。ＦＡＮＧワクチンによる治療にγＩＦＮを包含する場合、方法は、トランスフェクション後に、遺伝的に改変された細胞をそれぞれ約１００Ｕ／ｍｌのγＩＦＮと４８時間、或いは５００Ｕ／ｍｌと２４時間インキュベートするさらに別のステップを含む。併用療法のため、細胞は、月に１回を最大１２用量、各回通常１×１０７細胞〜２．５×１０７細胞（最大５×１０７の用量が安全であると示されたが）含有で、５０又は１００μｇ／ｍ２のγＩＦＮ用量と共に対象に投与される。方法は、トランスフェクション後に、遺伝的に改変された細胞をγＩＦＮとインキュベートするステップをさらに含み、トランスフェクション後に、遺伝的に改変された細胞に適用されるγＩＦＮの用量は、約２５０Ｕ／ｍｌである。
【００２２】
本発明は、全ＴＧＦ−βアイソフォームの機能的プロセシングに決定的に関与するプロプロテイン変換酵素であるフューリンを用いたＲＮＡ干渉により、ＴＧＦ−βを阻害する独自の方法を包含する。ＦＡＮＧベクターは、フューリンのノックダウンに特異的な二機能性低分子ヘアピンコンストラクト（ｓｈＲＮＡフューリン）を独自に組み入れる。本発明の二機能性ｓｈＲＮＡフューリンは、ｍｉＲ−３０ａ骨格を有する２種のステム−ループ構造を含む。第一のステム−ループ構造はｓｉＲＮＡ前駆体成分であるが、第二のステム−ループ構造はｍｉＲＮＡ様前駆体成分である。この実施形態において、戦略として、ＲＮＡ干渉の切断及び隔離機構両方のための単一の標的部位を用いる。一実施形態において、戦略として、それぞれ一方がｍＲＮＡ転写産物のコード領域及びｍＲＮＡ転写産物の３’ＵＴＲ領域からなるがこれらに限定されない成分の切断のため、もう一方が隔離のための２種の異なる標的部位を用いる。この実施形態において、二機能性ｓｈＲＮＡフューリンは、ｍｉＲ−３０ａ骨格を有する２種のステム−ループ構造からなる。第一のステム−ループ構造は、完全に相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を有するが、第二のステム−ループ構造は、パッセンジャー鎖のポジション９〜１１に３塩基対（ｂｐ）ミスマッチを有する。一実施形態において、二機能性ｓｈＲＮＡフューリンは、ｍｉＲ−３０ａ骨格を有する２種のステム−ループ構造からなる。第一のステム−ループ構造は、完全に相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を有するが、第二のステム−ループ構造は、ガイド鎖のポジション９〜１１に３塩基対（ｂｐ）ミスマッチを有する。他の実施形態において、塩基対（ｂｐ）ミスマッチは、Ａｇｏ２介在性切断を防ぐポジションを占め、パッセンジャー鎖離脱に熱力学的に有利となるであろう。他の実施形態において、塩基対ミスマッチは、ガイド鎖のポジションを占めるであろう。ＦＡＮＧコンストラクトは、カセット全体を駆動する哺乳類プロモーター（ＣＭＶ）制御下のＧＭ−ＣＳＦ及び二機能性ｓｈＲＮＡフューリン転写産物を含有する。このコンストラクトは、フューリンノックダウン及びＧＭ−ＣＳＦ発現のために遺伝的に改変された自家（即ち、患者特異的）癌ワクチンの作製に用いられる。
【００２３】
本発明におけるＦＡＮＧワクチンの作製に用いたコンストラクトは、２種の核酸インサートを含む二機能性ｓｈＲＮＡフューリン／ＧＭＣＳＦ発現ベクタープラスミドを包含する。第一の核酸インサートは、プロモーターに作動可能に連結し、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ｃＤＮＡをコードする。第二の核酸インサートも該プロモーターに作動可能に連結し、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。本発明の二機能性ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの２種の作用機構経路を有する。よって、本発明の二機能性ｓｈＲＮＡは、従来のｓｈＲＮＡ、即ち、ｓｉＲＮＡ作用機構によって作用するＤＮＡ転写由来のＲＮＡとも、或いはそれぞれ２種の異なる遺伝子の発現に対し作用するが従来のｓｉＲＮＡモードである２種のｓｈＲＮＡを意味する「ダブレット（doublet）ｓｈＲＮＡ」とも異なる。本発明の一実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦは、ヒトのものである。ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型）及びｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ様のいずれか（切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型）のモチーフ両方を同時に組み入れた二機能性である。本発明の一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型及び切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型両方のフューリン発現の阻害因子である。発現ベクターは、第一及び第二の核酸インサート間にインターカレートしたピコルナウイルス２Ａリボソームスキップペプチドを含有することができ、プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ  ５’ＵＴＲエンハンサー配列及びＣＭＶ  ＩＥイントロンＡを含有し得るＣＭＶ哺乳類プロモーターとなることができる。二機能性ｓｈＲＮＡの標的となるｍＲＮＡ配列は、コード配列に限定されない。一実施形態において、ｓｈＲＮＡは、フューリンｍＲＮＡ転写産物の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列を標的とすることができ、一実施形態において、フューリンｍＲＮＡ転写産物のコード配列及び３’ＵＴＲ配列の両方を同時に標的とする。
【００２４】
本発明はまた、標的細胞におけるフューリン発現の特異的なノックダウンに用いることのできるベクターを包含する。このｓｈＲＮＡフューリン発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結した核酸インサートを含む。このようなインサートは、フューリンをコードするｍＲＮＡ転写産物の領域とハイブリダイズして、これによりＲＮＡ干渉を介してフューリン発現を阻害できる１又は２以上の低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする。二機能性ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ（切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型）及びｍｉＲＮＡ又はｍｉ−ＲＮＡ様のいずれか（切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型）のモチーフを同時に組み入れることができ、切断依存的ＲＩＳＣフォーマット型及び切断非依存的ＲＩＳＣフォーマット型様式の両方でフューリン発現を阻害することができる。その上、発現ベクターは、フューリンｍＲＮＡ転写産物のコード領域を標的としても、フューリンｍＲＮＡ転写産物の３’ＵＴＲ領域配列を標的としてもよく、或いはフューリンｍＲＮＡ転写産物のコード配列及び３’ＵＴＲ配列の両方を同時に標的としてもよい。
【００２５】
次に、本発明の特色及び利点をより完全に理解するために、本発明の詳細な説明について次の添付の図面と共に記述する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ−１Ｃ】ＦＡＮＧプラスミドトランスフェクション前及び後の（１Ａ）ＴＧＦ−β１、（１Ｂ）−β２及び（１Ｃ）ＧＭＣＳＦタンパク質産生の概要を示すプロットである。製造された自家癌細胞におけるサイトカイン産生の１４日間の定量の４日目から得られたＥＬＩＳＡ値である。データは、ＦＡＮＧプロセシングを経た１０名の患者から非依存的に作製された自家ワクチンを表す（ＦＡＮＧ００１〜０１０）。
【図２Ａ−２Ｆ】ＦＡＮＧ  ｃＧＭＰプラスミドトランスフェクション前及び後のＦＡＮＧ−００４腫瘍細胞における（２Ａ）ＴＧＦ−β１、（２Ｂ）ＴＧＦ−β２及び（２Ｃ）ＧＭＣＳＦ発現並びにＴＡＧ  ｃＧＭＰプラスミドトランスフェクション前及び後のＴＡＧ−００４腫瘍細胞における（２Ｄ）ＴＧＦ−β１、（２Ｅ）ＴＧＦ−β２及び（２Ｆ）ＧＭＣＳＦ発現を示すプロットである。比較発現プロファイルの立証として、ＦＡＮＧ−００４及びＴＡＧ−００４は、同一の腫瘍から得られ、順次同じ２日間に処理される。
【図３Ａ−３Ｃ】患者腫瘍細胞におけるＦＡＮＧプラスミド（ｃＧＭＰワクチン製造プロセス）対ＴＡＧプラスミドの電気穿孔の並列対照（side-by-side）比較により、（３Ｃ）ＧＭＣＳＦタンパク質産生と、それに付随した（３Ａ）ＦＡＮＧによるＴＧＦ−β１発現ノックダウン、ＴＡＧによるノックダウンなし、（３Ｂ）ＦＡＮＧ及びＴＡＧ両方によるＴＧＦ−β２ノックダウン（線が一致）が立証されたことを示すプロットである。
【図４Ａ】ｍｉＲ−３０ａ骨格を有する２種のステム−ループ構造（配列番号１）を含むｂｉ−ｓｈＲＮＡフューリンを示す模式図であり、第一のステム−ループ構造は、完全に相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を有するが、第二のステム−ループ構造は、パッセンジャー鎖のポジション９〜１１に３塩基対（ｂｐ）ミスマッチを有する。
【図４Ｂ】フューリンｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ標的領域を示す図である。フューリンｍＲＮＡの３’−ＵＴＲ及びコード化領域において予想されるｓｉＲＮＡ標的領域並びに各ｓｉＲＮＡによって標的とされる配列。
【図５】有意な応答を立証する、ＴＡＧ後の患者におけるＰＥＴ  ＣＴ１１サイクルを示す画像である。ＭＲＩ走査及び生検によりＬ２における残渣取込みを経過観察したところ、悪性度がないことが明らかとなった。
【図６Ａ−６Ｃ】ＧＭＣＳＦ発現並びにＴＧＦ−β１及び−β２ノックダウンの評価を示す図である。概要：ＦＡＮＧ又はＴＡＧ（ＴＡＧ００４）プラスミドトランスフェクション前後の（６Ａ）ＴＧＦ−β１、（６Ｂ）ＴＧＦ−β２及び（６Ｃ）ＧＭ−ＣＳＦタンパク質産生である。数値は、ＦＡＮＧをトランスフェクトした収集自家癌細胞におけるサイトカイン産生のＥＬＩＳＡ決定を表す。データは、ＦＡＮＧプロセシングを経た９名の患者から非依存的に作製された自家ワクチン（ＦＡＮＧ００１〜００９）を表す。１名の患者は、ＦＡＮＧ（青）及びＴＡＧワクチン（赤）の両方の構築に十分な組織を有していた（ＦＡＮＧ００４／ＴＡＧ００４）。
【図７】ＦＡＮＧトランスフェクト前及び後／放射線照射の腫瘍細胞における、ＲＴ−ｑＰＣＲによるＧＭＣＳＦ  ｍＲＮＡを示す図である。一部のレーンにバンドがないのは、ＲＮＡ分解によるものである（ＦＡＮＧ−００９における余分のバンドは、０日目の試料を２回ローディングした）。
【図８】トランスフェクション前及びトランスフェクション後／放射線照射の、患者から得られたＦＡＮＧワクチン細胞のｍＲＮＡをＰＣＲにより示す図である。前及び後の試料においてＴＧＦ−β２のシグナルは検出されなかった。
【図９】トランスフェクション前及びトランスフェクション後／放射線照射のＦＡＮＧ−００９ワクチン細胞のｍＲＮＡをＰＣＲにより示す図である。
【図１０】進行期患者に対するコホート１対コホート２及び３の全生存を示す図である（ｎ＝６１；Ｐ＝．０１８６）。
【図１１】ＧＭ−ＣＳＦ−ＴＧＦ−β２アンチセンス（ＴＡＧ）プラスミドの模式図を示す図である。
【図１２】ｐＵＭＶＣ３−ＧＭ−ＣＳＦ−２Ａ−ＴＧＦ−β２アンチセンスベクターを含有するＮＣＩ−Ｈ−４６０扁平細胞及びＮＣＩ−Ｈ−５２０、大細胞（ＮＳＣＬＣ）におけるＧＭ−ＣＳＦのインビトロでの発現を示す図である。
【図１３】ＴＧＦ−β２レベルが、ｐＵＭＶＣ３−ＧＭ−ＣＳＦ−２Ａ−ＴＧＦ−β２アンチセンス（ＴＡＧ）ベクターを有するＮＣＩ−Ｈ−４６０扁平細胞及びＮＣＩ−Ｈ−５２０、大細胞（ＮＳＣＬＣ）において低下することを示す図である。
【図１４】２５１塩基対プローブが、ＮＣＩ−Ｈ−４６０及びＮＣＩ−Ｈ−５２０細胞（レーン６及び１０）においてインビトロで発現するＧＭ−ＣＳＦ−２Ａ−ＴＧＦ−β２（ＴＡＧ）転写産物を特異的に検出することを示す図である。
【図１５】ＴＡＧワクチンにおけるＧＭ−ＣＳＦ発現を示す図である。
【図１６】ＴＡＧワクチンにおけるＴＧＦ−β１発現を示す図である。
【図１７】ＴＡＧワクチンにおけるＴＧＦ−β２発現を示す図である。
【図１８Ａ−１８Ｂ】ｓｉＲＮＡフューリンノックダウン後のヒト癌株における（１４Ａ）ＴＧＦ−β１及び（１４Ｂ）ＴＧＦ−β２の発現を示す図である。
【図１９】ＦＡＮＧのプラスミドコンストラクトを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の様々な実施形態の実施及び使用を詳細に後述するが、本発明が、多種多様な特定の文脈において具体化され得る多くの適用可能な発明思想を提供することを理解されたい。本明細書に記されている特定の実施形態は、単に本発明を実施及び使用するための特定の仕方を説明するものであり、本発明の範囲の限界を定めるものではない。
【００２８】
本発明の理解を容易にするため、多くの用語を下に定義する。本明細書に定義されている用語は、本発明の関連分野の当業者によって通常理解されている通りの意義を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」などの語は、単数の実体のみを意味することを目的とせず、特定の具体例を説明に用いることのできるその一般のクラスを包含する。本明細書における用語法は、本発明の特定の実施形態の記載に用いられるが、その使用は、特許請求の範囲に概要が述べられている場合を除き、本発明の限界を定めるものではない。
【００２９】
本明細書に記されているいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、キット、試薬又は組成物に対しても実行できることが企図されており、その逆もまた同様である。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。
【００３０】
【表１】
0005553906.tif 000002
0005553906.tif 000003
【００３１】
フューリンは、スブチリシン様プロプロテイン変換酵素ファミリーのメンバーである（ヒトフューリン受託番号ＮＭ＿００２５６９）。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をその生物活性産物へとプロセシングするプロプロテイン変換酵素（ＰＣ）である。カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼであるフューリンは、前駆体タンパク質をその対となる塩基性アミノ酸プロセシング部位において、−ＲＸＸＲ−が最小切断部位を構成するコンセンサス配列−Ａｒｇ−Ｘ−Ｋ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＲＸＫ／ＲＲ）により効率的に切断する。多くの他のプロテアーゼと同様に、ＰＣは、Ｎ末端プロセグメント（prosegment）が伸長した不活性型酵素原として合成され、この末端は小胞体において自己触媒的に除去されて機能性が得られる。
【００３２】
事実上全癌株において高レベルのフューリンが立証された。ヒト結腸直腸、肺癌及びメラノーマ細胞によって１０倍高レベルのＴＧＦ−β１が産生され、より大規模に免疫寛容状態に影響を与える可能性がある。トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、よく知られた免疫抑制活性を有する多機能タンパク質のファミリーである。３種の公知のＴＧＦ−βリガンド（ＴＧＦ−β１〜３、それぞれ受託番号ＮＭ＿０００６６０、ＮＭ＿００３２３８、ＮＭ＿００３２３９．２）は、ヒト癌において偏在性である。ＴＧＦ−β過剰発現は、腫瘍進行及び予後不良と相関する。腫瘍微小環境内のＴＧＦ−βレベル上昇は、反応不顕性抗腫瘍応答とリンクする。腫瘍細胞におけるフューリンの存在は、腫瘍指向型ＴＧＦ−β１介在性末梢性免疫寛容の維持に有意に貢献する可能性がある。そのため、フューリンノックダウンは、免疫感作を最適化するための新規の興味を引くアプローチを表す。
【００３３】
ヒトメラノーマ及び肺癌のためのフューリンノックダウン及びＧＭ−ＣＳＦ増強（ＦＡＮＧ）自家癌ワクチン：ＦＡＮＧは、全ＴＧＦ−βアイソフォームの機能的プロセシングに決定的に関与するプロプロテイン変換酵素であるフューリンのノックダウンに特異的な、二機能性低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）コンストラクトを独自に組み入れる。本発明者らによる以前の研究は、ヒト癌株におけるＧＭ−ＣＳＦ発現並びにＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２欠乏の達成におけるＦＡＮＧの有効性を立証した。ｈＧＭ−ＣＳＦと組み合わせた二機能性ｓｈＲＮＡフューリンの自家細胞ワクチンへの組み入れは、免疫応答の感作誘導経路（affererent limb）におけるその効果に基づき免疫応答を促進及び強化することが本明細書において立証されている。
【００３４】
本明細書において、用語「二機能性」は、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ（ｍＲＮＡ転写産物と非相補的なガイド鎖）又はｍｉＲＮＡ様（ｍＲＮＡ転写産物と相補的なガイド鎖）の２種の作用機構経路を有するｓｈＲＮＡを意味する。用語「従来の」ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ作用機構によって作用するＤＮＡ転写由来のＲＮＡを意味する。用語「ダブレット」ｓｈＲＮＡは、それぞれ２種の異なる遺伝子の発現に対するが「従来の」ｓｉＲＮＡモードで作用する、２種のｓｈＲＮＡを意味する。
【００３５】
男女共に関連する最も多く見られる癌である進行ＮＳＣＬＣ患者の生存は、第二次化学療法による治療後に７カ月以下である。通例、限られた生存利益並びに癌及び治療に関する毒性のため、患者は更なる治療法を断念する。本明細書に記載されている本発明の新規成熟技術を用いた「標的化」免疫刺激及び内在性免疫阻害の抑制に関する劇的な応答の例等、安全性及び広範な臨床妥当性の立証は、安全且つ潜在的に有効な臨床評価の機会を提供する。本発明のＲＮＡ干渉技術及びワクチン製造の商業的な拡大は、ＮＳＣＬＣ並びに恐らく他の固形腫瘍、とりわけ、メラノーマ、卵巣、前立腺癌、結腸癌及び乳癌の管理への入り口となる機会を提供するであろう。
【００３６】
癌ワクチンによる免疫寛容の克服は、有望だが困難な探求である。主として動物試験に基づく免疫寛容に関する広く知られた仮説として、腫瘍細胞の免疫原性の低さ、プロフェッショナル抗原提示細胞による適切な提示の欠如、抗原欠損腫瘍バリアントの免疫選択、腫瘍誘導性免疫抑制及び腫瘍誘導性免疫特権部位が挙げられる（Murphy, K., Travers, P., Walport, M., ed. Janeway's Immunobiology. 7th ed. 2008, Garland Science: New York. 674-687）。そうであるにもかかわらず、導入遺伝子発現ホール癌細胞ワクチンに基づく近年の臨床試験は、有望な結果をもたらした（Fakhrai, H., et al., Phase I clinical trial of a TGF-beta antisense-modified tumor cell vaccine in patients with advanced glioma. Cancer Gene Ther, 2006. 13(12): p. 1052-60、Nemunaitis, J., GVAX (GMCSF gene modified tumor vaccine) in advanced stage non small cell lung cancer. J Control Release, 2003. 91(1-2): p. 225-31、Nemunaitis, J., et al., Phase 1/2 trial of autologous tumor mixed with an allogeneic GVAX vaccine in advanced-stage non-small-cell lung cancer. Cancer Gene Ther, 2006. 13(6): p. 555-62、Nemunaitis, J. and J. Nemunaitis, A review of vaccine clinical trials for non-small cell lung cancer. Expert Opin Biol Ther, 2007. 7(1): p. 89-102）。ホール癌細胞ワクチンは、定義済み及び未定義両方の腫瘍抗原に対し広範囲の多価免疫応答を潜在的に誘発し、これにより下方制御及び／又は抗原欠損バリアントの選択による腫瘍抵抗性の可能性に取り組むことができる（Ahmad, M., R.C. Rees, and S.A. Ali, Escape from immunotherapy: possible mechanisms that influence tumor regression/progression. Cancer Immunol Immunother, 2004. 53(10): p. 844-54、Hege, K.M., K. Jooss, and D. Pardoll, GM-CSF gene-modifed cancer cell immunotherapies: of mice and men. Int Rev Immunol, 2006. 25(5-6): p. 321-52）。
【００３７】
Dranoff及びJaffeeは、動物モデルにおいて、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するように遺伝的に改変された腫瘍細胞が、他のサイトカインと比較して最も強力な抗腫瘍免疫の誘導を一貫して立証したことを示した（Dranoff, G., et al., Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(8): p. 3539-43）。サイトカイン導入遺伝子として組み込まれると、ＧＭ−ＣＳＦは、自家又は樹立同種異系腫瘍細胞系のいずれかから得られた癌ワクチンペプチド、腫瘍細胞ライセート又はホール腫瘍細胞の提示を強化する（Hege, K.M. and D.P. Carbone, Lung cancer vaccines and gene therapy. Lung Cancer, 2003. 41 Suppl 1: p. S103-13）。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞のプロフェッショナル抗原提示（ＡＰＣ）樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導し、それをワクチン接種部位へと誘引する（Dranoff, G., et al., Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(8): p. 3539-43、Huang, A.Y., et al., Role of bone marrow-derived cells in presenting MHC class I-restricted tumor antigens. Science, 1994. 264(5161): p. 961-5）。ＧＭ−ＣＳＦは、ＤＣ成熟化並びに腫瘍抗原捕捉、プロセシング及び提示の活性化プロセスのアジュバントとしても機能し、それらの共刺激分子の発現並びにＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１ｄ制限インバリアントナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及び抗体産生Ｂ細胞の活性化のための二次リンパ組織への遊走能を上方調節する（Banchereau, J., et al., Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol, 2000. 18: p. 767-811）。
【００３８】
近年、Hodi（Hodi, F.S., et al., Immunologic and clinical effects of antibody blockade of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 in previously vaccinated cancer patients. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(8): p. 3005-10）は、エフェクター及びＴ調節性細胞機能を変調するためのＧＶＡＸワクチン接種とそれに続く抗ＣＴＬＡ−４抗体の定期的な注入が、大多数の転移性メラノーマ患者において臨床上有意義な抗腫瘍免疫を生じ得ることを報告した。これらの知見は、ＧＭ−ＣＳＦ増強自家癌ワクチンのワクチン接種が、特にＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇｓ活性を欠乏させ、腫瘍のＭＨＣクラスＩＡ鎖（ＭＩＣＡ）発現を強化してこれによりナチュラルキラー（ＮＫ）及びＴ細胞を活性化し、セントラルメモリーＴ細胞ＣＤ４＋及びＣＤ８＋応答を強化するアジュバント治療と併せた場合、免疫介在性腫瘍破壊の生成に成功したとの論文と一貫した。
【００３９】
本発明のＦＡＮＧアプローチは、１０名の患者の自家ワクチンにおける本発明者らの知見によって支持され、これは、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２低下並びにＧＭ−ＣＳＦレベルの上昇を一貫して立証する（図１Ａ〜１Ｃ及び図２Ａ〜２Ｆ）。フューリン欠乏アプローチの健全性は、原理的証拠文献の証拠である、癌細胞系（ＣＣＬ−２４７結腸直腸、ＣＲＬ−１５８５メラノーマ系統）におけるフューリン阻害因子デカノイル−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＣＭＫ（Ｄｅｃ−ＲＶＫＲ−ＣＭＫ）によって確認された。Ｄｅｃ−ＲＶＫＲ−ＣＭＫは、フューリンの触媒部位に不可逆的に結合して、その活性を遮断するペプチジルクロロメチルケトンである（Henrich, S., et al., The crystal structure of the proprotein processing proteinase furin explains its stringent specificity. Nat Struct Biol, 2003. 10(7): p. 520-6）。Ｄｅｃ−ＲＶＫＲ−ＣＭＫは、フューリン基質ＢＡＳＥ（β−部位ＡＰＰ切断酵素）、ＭＴ５−ＭＭＰ及びＢｏｃ−ＲＶＲＲ−ＡＭＣの活性を完全に又は部分的にのいずれかで低下させる（Pearton, D.J., et al., Proprotein convertase expression and localization in epidermis: evidence for multiple roles and substrates. Exp Dermatol, 2001. 10(3): p. 193-203）。本発明者らは、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２両方の活性が、ＣＣＬ−２４７及びＣＲＬ−１５８５癌株において有意に低下することを特異的イムノアッセイによって見出し、ＴＧＦ−βアイソフォーム発現におけるフューリン遮断の有効性を確認した。
【００４０】
自家細胞のトランスフェクトに用いたＦＡＮＧプラスミド（図１９）は、そのヒトＴＧＦβ２アンチセンス配列をｂｉ−ｓｈＲＮＡフューリンＤＮＡ配列に置き換えたＴＡＧプラスミド（Kumar, P.J., C. Oxendine, I Nemunaitis, J. Maples, P., TAG Xenograft Vaccine: Xenograft-Expanded Autologous Tumor Vaccine Genetically Modified to Express GM-CSF and Block Production of TGFβ2. BioProcessing Journal, 2009(Spring 2009): p. 30-36）に由来する。それ以外の点において、これら２種のプラスミドは同一である（ＤＮＡ配列決定により確認）。ｍｉＲ−３０ａ骨格を有する２種のステム−ループ構造からなるｂｉ−ｓｈＲＮＡフューリン；第一のステム−ループ構造は、完全に相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を有するが、第二のステム−ループ構造は、パッセンジャー鎖のポジション９〜１１に３ｂｐミスマッチを有する（図４Ａ）。本発明者らは、切断及び隔離両方のために単一の標的部位を用いる戦略を採用した。コードするｓｈＲＮＡは、成熟ｓｈＲＮＡを２種類以上のＲＩＳＣへと積み込むことができる（Azuma-Mukai, A., et al., Characterization of endogenous human Argonautes and their miRNA partners in RNA silencing. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(23): p. 7964-9）。単一部位に焦点を置くことの理論的根拠は、多部位標的化が、「シード（seed）配列」誘導オフターゲット効果の確率を増加させ得ることである（Jackson, S.A., S. Koduvayur, and S.A. Woodson, Self-splicing of a group I intron reveals partitioning of native and misfolded RNA populations in yeast. RNA, 2006. 12(12): p. 2149-59）。２種のステム−ループ二本鎖ＤＮＡ配列を、ＤＮＡライゲーションにより１０ピースの合成補完及び相互接続オリゴヌクレオチドと組み合わせて構築した。両端にBam HI部位を有する完成した２４１塩基対のＤＮＡを、ＴＡＧ発現ベクターのBam HI部位に、ＴＧＦβ２アンチセンス配列に代わって挿入した。ｓｈＲＮＡインサート及び配向性のスクリーニング用に設計したＰＣＲプライマー対により、挿入ＤＮＡの配向性をスクリーニングした。ＦＡＮＧコンストラクトは、カセット全体を駆動する単一の哺乳類プロモーター（ＣＭＶ）を有し、ＧＭ−ＣＳＦ及びフューリン二機能性ｓｈＲＮＡ転写産物の間に２Ａリボソームスキップペプチドが介入し、ウサギポリＡテールが続く。ＧＭ−ＣＳＦ転写産物の終端に終止コドンが配置される。ｍＲＮＡへのピコルナウイルス２Ａ配列の挿入により、リボソームは、２Ａ及び下流配列の接合部においてペプチド結合の形成をスキップし、単一のオープンリーディングフレームから２種のタンパク質を産生させる（Funston, G.M., et al., Expression of heterologous genes in oncolytic adenoviruses using picornaviral 2A sequences that trigger ribosome skipping. J Gen Virol, 2008. 89(Pt 2): p. 389-96）。しかし、ｓｈＲＮＡ又はアンチセンスが（具体例として）第二の転写産物として発現している場合、第一の転写産物のみ翻訳される。本発明者らは、２Ａリンカーが、ＴＡＧワクチンによるほぼ等レベルのＧＭ−ＣＳＦ及び抗ＴＦＧ−β転写産物の作製に有効であることを見出し、これを選出してＦＡＮＧの同一設計を用いた。
【００４１】
本発明者らは、ヒトＴＧＦ−βアイソフォーム発現の阻害に対するｓｉＲＮＡ介在性フューリンノックダウンの適用性を検証した。発表されたTuschl及び同僚らの推奨するところ並びにヒト及びマウスゲノムデータベースのＢＬＡＳＴ検索を統合する追加的な選択パラメータにより、フューリンｍＲＮＡ配列における予想されるｓｉＲＮＡ標的部位（図４Ｂ）を決定した（http:jura.wi. mit.edu/bioc/ siRNAext）。適格なコード及び３’ＵＴＲ部位を標的とするｓｉＲＮＡ（図４Ｂ）を検査した。ＣＣＬ−２４７、ＣＲＬ−１５８５  Ｕ８７及びＨ４６０細胞のリポフェクションに続き、６種のｓｉＲＮＡフューリンコンストラクトのそれぞれは、細胞生存に悪影響を及ぼすことなく培養上清におけるＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２レベルを著しく低下させることを示した。よって、ｓｉＲＮＡ介在性フューリンノックダウンは、ＴＧＦ−β１及び−β２アイソフォームを欠乏させるのに有効である。
【００４２】
本発明者らは、細胞系における内在性フューリンタンパク質のウエスタンブロット及びフローサイトメトリーによる検出を試みた。５種類の異なる商業用抗体をウエスタンブロットのためにスクリーニングし、１種類の前標識抗体をフローサイトメトリーのためにスクリーニングした。全試験は陰性結果を生じた。市販の抗体のさらに別の試験において、フューリンタンパク質の断片（又はペプチド）に対し全イディオタイプを開発した。ウエスタンブロット試験は、スクリーニングした５抗体のうち４抗体において６０ｋＤａバリアントが優先的に検出されたことを立証した。最後の抗体は、検査したウエスタンブロット条件下ではフューリンタンパク質を検出しなかった。民間のベンダーによって提供された対照ライセートは、自社内（in-house）細胞系試料と同様の結果を生じた。フローサイトメトリー用の前標識抗体は、フューリン染色における有意な変化を立証しなかった（即ち、陽性フューリン集団は同定されず）。従って、フローサイトメトリーは、フューリンノックダウンの立証に用いることはできなかった。
【００４３】
フューリンタンパク質検出の代替法として、本発明者らは、試料のフューリン酵素活性もスクリーニングした。蛍光定量に基づくアッセイを用いて、フューリンによる基質（Ｐｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）の変換とそれによるフルオロフォア（ＡＭＣ）の放出に関して細胞系をスクリーニングした。しかし、検出された放出ＡＭＣシグナルは、フューリン酵素活性の有意なノックダウンを正確に立証するには弱過ぎた。アッセイの第二の障壁は、スブチリシン様プロホルモン変換酵素（ＰＣ）ファミリーの全セリンプロテアーゼによって基質が切断されてしまうことである。従って、本出願人らのＦＡＮＧ  ｓｈＲＮＡ産物の標的とならない類似のプロテアーゼは、依然として活性を保持し続け、アッセイにおいて蛍光発生基質を切断し、よってフューリンノックダウン検出能力を低下させることになるであろう。
【００４４】
二機能性ｓｈＲＮＡフューリンの他の適用として、次のものが挙げられる。（１）免疫応答の効果発現経路（efferent limb）を強化するための、腫瘍（±腫瘍細胞外マトリックス（ＥＣＭ））選択的装飾（標的）ステルス２層陥入リポソーム（stealthed bilamellar invaginated liposome）（ＢＩＶ）を介した全身送達、（２）ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＤＧＦ  Ａ及び一部の腫瘍型の場合はＭＴ１−ＭＭＰを包含するが、これらに限定されないフューリン標的分子の腫瘍促進／維持効果を直接的に壊滅させるための、腫瘍選択的装飾（標的）ステルス型２層陥入リポソーム（ＢＩＶ）を介した全身送達、（３）推定癌幹細胞におけるＮＯＴＣＨ／ｐ３００経路を直接的に壊滅させるための、腫瘍選択的装飾（標的）ステルス型２層陥入リポソーム（ＢＩＶ）を介した全身送達、（４）炭疽、志賀（Shiga）、ジフテリア、破傷風、ボツリヌス症並びにエボラ及びマールブルグウイルスに関連する毒素の活性化を阻害するための、腫瘍選択的装飾（標的）ステルス型２層陥入リポソーム（ＢＩＶ）を介した全身送達及び／又は（５）シュードモナス（Pseudomonas）介在性罹患率及び死亡率のリスクが高まった疾患、例えば嚢胞性線維症の患者における抗生物質療法の補助としてのシュードモナス外毒素Ａ産生を阻害するための、２層陥入リポソーム（ＢＩＶ）（±装飾及び可逆的マスキング／ステルス化）の全身性及び／又は吸入送達。
【００４５】
ＴＧＦ−βノックダウン：トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、よく知られた免疫抑制活性を有する多機能タンパク質のファミリーである（Wick, W., U. Naumann, and M. Weller, Transforming growth factor-beta: a molecular target for the future therapy of glioblastoma. Curr Pharm Des, 2006. 12(3): p. 341-9）。３種の公知のＴＧＦ−βリガンド（ＴＧＦ−β１、β２及びβ３）は、ヒト癌において偏在性である。ＴＧＦ−β過剰発現は、腫瘍進行及び予後不良と相関する（Bierie, B. and H.L. Moses, Tumour microenvironment: TGFbeta: the molecular Jekyll and Hyde of cancer. Nat Rev Cancer, 2006. 6(7): p. 506-20、Levy, L. and C.S. Hill, Alterations in components of the TGF-beta superfamily signaling pathways in human cancer. Cytokine Growth Factor Rev, 2006. 17(1-2): p. 41-58）。腫瘍微小環境内におけるＴＧＦ−βレベルの上昇は、反応不顕性抗腫瘍応答とリンクしている（Bierie, B. and H.L. Moses, Tumour microenvironment: TGFbeta: the molecular Jekyll and Hyde of cancer. Nat Rev Cancer, 2006. 6(7): p. 506-20、Sporn, M.B., et al., Transforming growth factor-beta: biological function and chemical structure. Science, 1986. 233(4763): p. 532-4、Massague, J., The TGF-beta family of growth and differentiation factors. Cell, 1987. 49(4): p. 437-8、Bodmer, S., et al., Immunosuppression and transforming growth factor-beta in glioblastoma. Preferential production of transforming growth factor-beta 2. J Immunol, 1989. 143(10): p. 3222-9、Border, W.A. and E. Ruoslahti, Transforming growth factor-beta in disease: the dark side of tissue repair. J Clin Invest, 1992. 90(1): p. 1-7、Chen, T.C., et al., TGF-B2 and soluble p55 TNFR modulate VCAM-1 expression in glioma cells and brain derived endothelial cells. J Neuroimmunol, 1997. 73(1-2): p. 155-61、Li, M.O., et al., Transforming growth factor-beta regulation of immune responses. Annu Rev Immunol, 2006. 24: p. 99-146）。ＴＧＦ−βは、ＧＭ−ＣＳＦの誘導するＤＣ成熟化（Yamaguchi, Y., et al., Contrasting effects of TGF-beta 1 and TNF-alpha on the development of dendritic cells from progenitors in mouse bone marrow. Stem Cells, 1997. 15(2): p. 144-53）並びにそれらのＭＨＣクラスII及び共刺激分子発現（Geissmann, F., et al., TGF-beta 1 prevents the noncognate maturation of human dendritic Langerhans cells. J Immunol, 1999. 162(8): p. 4567-75）を阻害する。Ardeshna（Ardeshna, K.M., et al., The PI3 kinase, p38 SAP kinase, and NF-kappaB signal transduction pathways are involved in the survival and maturation of lipopolysaccharide-stimulated human monocyte-derived dendritic cells. Blood, 2000. 96(3): p. 1039-46）は、リポ多糖（ＬＰＳ, lipopolysaccharide）の誘導する単球由来ＤＣの成熟化が、ｐ３８ストレス活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８ＳＡＰＫ, p38 stress-activated protein kinase）、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ＥＲＫ, extracellular signal-regulated protein kinase）、ホスホイノシチド３−ＯＨ−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ, phosphoinositide 3-OH-kinase）／Ａｋｔ及び核内因子（ＮＦ, nuclear factor）−κＢ経路の活性化に関与することを示した。ＧＭ−ＣＳＦは、ＭＡＰキナーゼ１／２及びＥＲＫ１／２の迅速な一過性リン酸化により骨髄性造血細胞及び白血病細胞系増殖を刺激する平行活性を発揮することができ、一方、ＴＧＦ−βは、ＰＩ３−キナーゼ−Ａｋｔ経路阻害を介してＧＭ−ＣＳＦの誘導するＥＲＫシグナル伝達をオフにする（Montenegro, D.E., et al., TGFbeta inhibits GM-CSF-induced phosphorylation of ERK and MEK in human myeloid leukaemia cell lines via inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-k). Cell Prolif, 2009. 42(1): p. 1-9 ）。
【００４６】
効果発現（efferent）レベルにおいて、未熟ＤＣによる抗原提示は、Ｔ細胞免疫反応不顕性に寄与する（Steinman, R.M., et al., Dendritic cell function in vivo during the steady state: a role in peripheral tolerance. Ann N Y Acad Sci, 2003. 987: p. 15-25）。ＴＧＦ−βも同様に、マクロファージ活性化（Ashcroft, G.S., Bidirectional regulation of macrophage function by TGF-beta. Microbes Infect, 1999. 1(15): p. 1275-82）及びその抗原提示機能（Du, C. and S. Sriram, Mechanism of inhibition of LPS-induced IL-12p40 production by IL-10 and TGF-beta in ANA-1 cells. J Leukoc Biol, 1998. 64(1): p. 92-7、Takeuchi, M., P. Alard, and J.W. Streilein, TGF-beta promotes immune deviation by altering accessory signals of antigen-presenting cells. J Immunol, 1998. 160(4): p. 1589-97）を阻害する。ＴＧＦ−βは、高親和性のＩＬ−２受容体発現及び機能を損なうことにより、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を阻害する（Ruffini, P.A., et al., Factors, including transforming growth factor beta, released in the glioblastoma residual cavity, impair activity of adherent lymphokine-activated killer cells. Cancer Immunol Immunother, 1993. 36(6): p. 409-16、Fakhrai, H., et al., Eradication of established intracranial rat gliomas by transforming growth factor beta antisense gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(7): p. 2909-14）。ＴＧＦ−β２はまた、転写因子ＦＯＸＰ３の誘導によりナイーブＴ細胞を調節性Ｔ細胞（Treg cell）へと変換し（Fantini, M.C., et al., Cutting edge: TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3 induction and down-regulation of Smad7. J Immunol, 2004. 172(9): p. 5149-53）、Ｔｒｅｇの出現は免疫活性化シャットダウンをもたらす（Thomas, D.A. and J. Massague, TGF-beta directly targets cytotoxic T cell functions during tumor evasion of immune surveillance. Cancer Cell, 2005. 8(5): p. 369-80）。Polak（Polak, M.E., et al., Mechanisms of local immunosuppression in cutaneous melanoma. Br J Cancer, 2007. 96(12): p. 1879-87）によると、メラノーマの全ステージにおいて免疫寛容誘発ＤＣ及び抑制因子Ｔリンパ球が存在する。これらの免疫細胞型は、ＴＧＦ−β受容体Ｉを発現し、免疫寛容誘発活性は、ＴＧＦ−β１又は−β２結合依存的であった。
【００４７】
自然免疫応答レベルにおいて、ＴＧＦ−βは、ＮＫ細胞においてアンタゴニスト的であり、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞誘導及び増殖を下方制御する（Ruffini, P.A., et al., Factors, including transforming growth factor beta, released in the glioblastoma residual cavity, impair activity of adherent lymphokine-activated killer cells. Cancer Immunol Immunother, 1993. 36(6): p. 409-16、Rook, A.H., et al., Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol, 1986. 136(10): p. 3916-20、Kasid, A., G.I. Bell, and E.P. Director, Effects of transforming growth factor-beta on human lymphokine-activated killer cell precursors. Autocrine inhibition of cellular proliferation and differentiation to immune killer cells. J Immunol, 1988. 141(2): p. 690-8、Tsunawaki, S., et al., Deactivation of macrophages by transforming growth factor-beta. Nature, 1988. 334(6179): p. 260-2、Hirte, H. and D.A. Clark, Generation of lymphokine-activated killer cells in human ovarian carcinoma ascitic fluid: identification of transforming growth factor-beta as a suppressive factor. Cancer Immunol Immunother, 1991. 32(5): p. 296-302、Naganuma, H., et al., Transforming growth factor-beta inhibits interferon-gamma secretion by lymphokine-activated killer cells stimulated with tumor cells. Neurol Med Chir (Tokyo), 1996. 36(11): p. 789-95）。Penafuerte（Penafuerte, C. and J. Galipeau, TGF beta secreted by B16 melanoma antagonizes cancer gene immunotherapy bystander effect. Cancer Immunol Immunother, 2008. 57(8): p. 1197-206）は、近年、腫瘍分泌ＴＧＦ−βが、免疫担当性Ｂ１６メラノーマモデルにおいてＮＫ細胞のＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ２（ＧＩＦＴ２）介在性免疫感作を抑制したことを示した。ＴＧＦ−βのＢ１６産生のインビボ遮断は、遮断しなければ非ＧＩＦＴ２発現バイスタンダー腫瘍の成長によって危険にさらされる生存を改善した。これらの知見は、ＴＧＦ−βのＧＭ−ＣＳＦ介在性免疫活性化における負の影響をインビボでさらに検証し、拡大解釈すれば、ＧＭ−ＣＳＦに基づく癌細胞ワクチンにおいてＴＧＦ−β分泌を欠乏させることの理論的根拠を支持する。
【００４８】
本発明者らによって、非小細胞肺癌患者においてＴＧＦ−β２ノックダウン活性を有する腫瘍細胞ワクチン（ベラゲンプマツセル−Ｌ）を利用しつつ行われた治験は、無作為化した対照患者及び病歴経験（historical experience）に応じた許容される安全性及び用量関連生存改善を立証した。後期（IIIＢ／ＩＶ）患者の２年間の生存は、２．５×１０７細胞／注射を超える投与を受けた患者に対し５２％であり、これは、２年間で１０％未満の生存である類似の患者病歴データと有利に比較される。試験患者はまた、サイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ｐ＝０．００６；ＩＬ−６、ｐ＝０．００４；ＩＬ４、ｐ＝０．００７）及びワクチンＨＬＡ抗原に対する抗体価（ｐ＝０．０１４）の有意な上昇を提示し、この結果は免疫活性化治療成績を示唆した（Nemunaitis, J., et al., Phase II trial of Belagenpumatucel-L, a TGF-beta2 antisense gene modified allogeneic tumor vaccine in advanced non small cell lung cancer (NSCLC) patients. Cancer Gene Ther, 2009. 16(8): p. 620-4）。
【００４９】
ＴＧＦ−βノックダウン及びＧＭ−ＣＳＦ発現癌細胞ワクチン（ＴＡＧ）：ＴＡＧワクチンのため、３６名の患者を収集した。ＧＭ−ＣＳＦ発現及びＴＧＦ−β２ノックダウンは、産物放出判定基準を満たした。３名（全員、管腔アクセスした胃腸腫瘍）は、汚染細菌を有し、放出することができなかった。１名は、細胞が不十分であった。１９名の進行性不応性癌患者を治療した（Maples PB, K.P., Oxendine I, Jay C, Yu Y, Kuhn J, Nemunaitis J, TAG Vaccine: Autologous Tumor Vaccine Genetically Modified to Express GM-CSF and Block Production of TGFB2. BioProcessing Journal, 2009. 8(2)、Nemunaitis, J., Kumar, P., Senzer, N., Yu, Y., Oxendine, I., Tong, A.W., Maples, P.B., A phase I trial of GMCSF gene-TGFbeta antisense gene autologous tumor cell (TAG) vaccine in advanced cancer. Mol Therapy, 2009. 17 (Suppl 1): p. S206、Maples, P.B., et al. Autologous Tumor Cell Vaccine Genetically Modified To Express GM-CSF and Block Expression of TGFb2 (Abstract # 553). in The Twelfth Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy. 2009. San Diego, California）。療法に関しグレード３毒性効果は観察されなかった。１７名評定可能な患者のうち１１名（６５％）は、安定的な疾患を少なくとも３カ月間維持した。１名の患者は、イメージング判定基準によりＣＲを達成した（図４；メラノーマ）。よって、ＴＡＧワクチンは安全であると思われ、臨床有効性の証拠を有する。
【００５０】
しかし、ＴＧＦ−βリガンドの全３種の公知のアイソフォーム（ＴＧＦ−β１、−β２及び−β３）が、ヒト癌において偏在的に産生されるのであれば、ＴＡＧワクチンの潜在的な限界は、ＴＧＦ−β２に対する特異性の制限である。特に、ヒト結腸直腸、肺癌及びメラノーマ細胞によって、最大１０倍高レベルのＴＧＦ−β１が産生され得る。抗原提示樹状細胞（ＤＣ）及び調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）におけるＴＧＦ−β１の免疫寛容誘発の役割は十分に確立されており、この活性は、ＴＧＦ−β２アンチセンス処置によって影響されない。
【００５１】
フューリン：ＴＧＦ−βの全成熟型アイソフォームは、適正な活性のためにタンパク質限定切断を必要とする。ＴＧＦ−βのタンパク質分解による活性化の必須機能は、フューリンによって介在される。フューリンは、スブチリシン様プロプロテイン変換酵素ファミリーのメンバーである。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をその生物活性産物へとプロセシングするプロプロテイン変換酵素（ＰＣ）である。カルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼであるフューリンは、前駆体タンパク質をその対となる塩基性アミノ酸プロセシング部位において、−ＲＸＸＲ−が最小切断部位を構成するコンセンサス配列−Ａｒｇ−Ｘ−Ｋ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（ＲＸＫ／ＲＲ）により効率的に切断する（Thomas, G., Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002. 3(10): p. 753-66）。多くの他のプロテアーゼと同様に、ＰＣは、Ｎ末端プロセグメントが伸長した不活性型酵素原として合成され、このセグメントは小胞体において自己触媒的に除去されて機能性を得る（Khatib, A.M., et al., Proprotein convertases in tumor progression and malignancy: novel targets in cancer therapy. Am J Pathol, 2002. 160(6): p. 1921-35）。
【００５２】
フューリンは、対応する免疫調節性波及効果を有するＴＧＦ−βの機能活性化に関して最もよく知られている（Pesu, M., et al., T-cell-expressed proprotein convertase furin is essential for maintenance of peripheral immune tolerance. Nature, 2008. 455(7210): p. 246-50、Pesu, M., et al., Proprotein convertase furin is preferentially expressed in T helper 1 cells and regulates interferon gamma. Blood, 2006. 108(3): p. 983-5）。以前に記載された腫瘍分泌性ＴＧＦ−βの免疫抑制活性とは別に、Ｔリンパ球における内在性発現フューリンのコンディショナルな欠失は、正常なＴ細胞を発達させるが、調節性及びエフェクターＴ細胞の機能を損ない、これらはＴＧＦ−β１の産生が少なかったことが見出された。フューリン欠損Ｔｒｅｇは、Ｔ細胞伝達結腸炎モデルにおいて保護性が低く、正常なＴ細胞においてＦｏｘｐ３を誘導できない。その上、フューリン欠損エフェクター細胞は、本質的に過活動（over-active）であり、野生型調節性Ｔ細胞（Treg cell）の抑制活性に対し抵抗性である。ＡＰＣにおいて、トランスゴルジ区画における細胞傷害性Ｔリンパ球感受性エピトープは、フューリン及び頻度が低いＴＡＰ非依存的経路によってプロセシングされる（Lu, J., et al., TAP-independent presentation of CTL epitopes by Trojan  antigens. J Immunol, 2001. 166(12): p. 7063-71）。よって、Ｔ細胞によるフューリン発現は、末梢性免疫寛容の維持に不可欠であると思われ、これは、少なくとも一部には、ＴＧＦ−β１産生調節におけるその非重複性必須機能のためである。
【００５３】
事実上全癌株において高レベルのフューリンが立証された（Page, R.E., et al., Increased expression of the pro-protein convertase furin predicts decreased survival in ovarian cancer. Cell Oncol, 2007. 29(4): p. 289-99、Schalken, J.A., et al., fur gene expression as a discriminating marker for small cell and nonsmall cell lung carcinomas. J Clin Invest, 1987. 80(6): p. 1545-9、Mbikay, M., et al., Comparative analysis of expression of the proprotein convertases furin, PACE4, PC1 and PC2 in human lung tumours. Br J Cancer, 1997. 75(10): p. 1509-14、Cheng, M., et al., Pro-protein convertase gene expression in human breast cancer.  Int J Cancer, 1997. 71(6): p. 966-71、Bassi, D.E., H. Mahloogi, and A.J. Klein-Szanto, The proprotein convertases  furin and PACE4 play a significant role in tumor progression. Mol Carcinog, 2000. 28(2): p. 63-9、Bassi, D.E., et al., Elevated furin expression in aggressive human head and neck tumors and tumor cell lines. Mol Carcinog, 2001. 31(4): p. 224-32、Lopez de Cicco, R., et al., Human carcinoma cell growth and invasiveness is impaired by the propeptide of the ubiquitous proprotein convertase furin. Cancer Res, 2005. 65(10): p. 4162-71、Khatib, A.M., et al., Proprotein convertases in tumor progression and malignancy: novel targets in cancer therapy. Am J Pathol, 2002. 160(6): p. 1921-35）。本発明者ら及び他の発明者らは、最大１０倍高レベルのＴＧＦ−β１が、ヒト結腸直腸、肺癌及びメラノーマ細胞によって産生され得ること、より大規模に免疫寛容状態に影響を与える可能性があることを見出した（Polak, M.E., et al., Mechanisms of local immunosuppression in cutaneous melanoma. Br J Cancer, 2007. 96(12): p. 1879-87、Fogel-Petrovic, M., et al., Physiological concentrations of transforming growth factor beta1 selectively inhibit human dendritic cell function. Int Immunopharmacol, 2007. 7(14): p. 1924-33、Bommireddy, R. and T. Doetschman, TGFbeta1 and Treg cells: alliance for tolerance. Trends Mol Med, 2007. 13(11): p. 492-501）。腫瘍細胞におけるフューリンの存在は、腫瘍指向型ＴＧＦ−β１介在性末梢性免疫寛容の維持に有意に貢献する可能性がある（Pesu, M., et al., T-cell-expressed proprotein convertase furin is essential for maintenance of peripheral immune tolerance. Nature, 2008. 455(7210): p. 246-50）。そのためフューリンノックダウンは、免疫感作を最適化するための新規の興味を引くアプローチを表す。
【００５４】
ＦＡＮＧ（フューリンｓｈＲＮＡ及びＧＭＣＳＦ）ワクチン：本発明者らは、ＦＡＮＧと命名した次世代ワクチンを構築した。ＦＡＮＧワクチンの新規性は、自家腫瘍抗原感作において組み入れたＧＭ−ＣＳＦ導入遺伝子の免疫強化効果を最大限に高めるための、フューリンノックダウンによる複数の免疫抑制ＴＧＦ−βアイソフォーム欠乏のアプローチの組合せにある。
【００５５】
ＴＧＦ−βの全成熟型アイソフォームは、フューリンによるタンパク質分解による活性化を必要とする。数種類の癌細胞系（Ｈ４６０、ＣＣＬ−２４７、ＣＲＬ−１５８５、Ｕ８７）における付随する複数のＴＧＦ−βアイソフォーム活性の欠乏の達成の実現可能性を、フューリンノックダウンを用いて決定し、本発明者らは、９名の癌患者（乳−１；結腸−２；メラノーマ−４；胆嚢−１；ＮＳＣＬＣ−１）におけるＦＡＮＧワクチンのＧＭＰ製造の完成に成功した。ＧＭＣＳＦ発現並びにＴＧＦ−β１及び−β２ノックダウンの評価を図１Ａ〜１Ｃ及び図２Ａ〜２Ｆに示す。
【００５６】
ＦＡＮＧプラスミドの患者腫瘍細胞への電気穿孔は、予測通りＧＭＣＳＦタンパク質産生並びに付随するＴＧＦ−β１及び−β２ノックダウンを立証した。図３Ａ〜３Ｃは、ＦＡＮＧトランスフェクトしたＮＳＣＬＣ腫瘍の発現プロファイル（ＦＡＮＧ−００４）対、ｃＧＭＰ  ＴＡＧワクチン法で処理した同一腫瘍由来の組織（ＴＡＧ−００４と表記）の７日目のアッセイデータを表示する。ＴＧＦβ２（図３Ｂ；同時発生的データのため線１本が示されている）において同様の低下が見られ、ＧＭＣＳＦ（図３Ｃ）発現において同様の増加が見られる。しかし、ＴＧＦβ１発現はＦＡＮＧによって完全に阻害されたが、ＴＧＦβ２アンチセンスはＴＧＦβ１発現を遮断できないため、これはＴＡＧによる影響を受けない（図３Ａ）。
【００５７】
図５は、有意な臨床反応を立証する、１１ＴＡＧワクチン治療後の進行メラノーマ患者のＰＥＴ  ＣＴ画像である。ＭＲＩ走査及び生検によりＬ２における残渣取込みを経過観察したところ、悪性度がないことが明らかとなった。その結果患者は、７カ月を超える間完全寛解（疾患の証拠なし）となった。ＴＧＦ−β１及び−β２両方をノックダウンするＦＡＮＧの能力は、ワクチン構築を行った最初の９名の患者における知見によって支持される（図６Ａ〜６Ｃ）。全９種のワクチン標本は、ＧＭ−ＣＳＦレベルの有意な上昇を立証した（培養４日目に８０〜１８７０ｐｇ／ｍｌ、中央値７３９ｐｇ／ｍｌ）。全９名の患者は、ＴＧＦ−β２の５０％を超える低下を立証し、１００ｐｇを超える内在性ＴＧＦ−β１を産生する７名の患者のうち６名も、このサイトカインの５０％を超える低下を立証した。ＦＡＮＧの標的有効性拡大は、自家ワクチンのＴＡＧ（ＴＡＧ−００４Ａ）及びＦＡＮＧ（ＦＡＮＧ−００４）バージョンの両方の作製に妥当な腫瘍組織を有する１名の患者（ＮＳＣＬＣ）において最も良く立証され、ＦＡＮＧ標本（ＦＡＮＧ−００４）を用いて初濃度１８４０ｐｇ／ｍｌから検出可能レベルを下回るようにＴＧＦ−β１（とＴＧＦ−β２）を欠乏させ、一方、ＴＧＦ−β２欠乏が予想されたにもかかわらず、ＴＡＧ標本（ＴＡＧ−００４）によりこの高レベルのＴＧＦ−β１は変化しなかった。これらの知見は、ＦＡＮＧワクチン標本の潜在的な利点を支持する。
【００５８】
個別化ｃＧＭＰ  ＦＡＮＧワクチンの生物活性の検証：遺伝子改変は、ＧＭ−ＣＳＦ及びフューリンノックダウンに最適化した二機能性低分子ヘアピン（ｂｉ−ｓｈ）ＲＮＡをコードするプラスミドベクターの使用によって達成されるであろう。癌患者自家ＦＡＮＧワクチンは、進行固形癌患者の臨床試験のためのｃＧＭＰ条件下にて既に作製されている。品質保証プロセスの一部として、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β１、−β２及び−β３  ｍＲＮＡ並びにタンパク質発現を測定した。以前の研究において本発明者らに利用されたＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−β依存的細胞系における成長治療成績により、ＦＡＮＧ改変後のサイトカイン生物活性を決定した。処理したワクチンは、ＦＡＮＧ改変後の抗原完全性を証明するため、プロテオゲノミクススクリーニングが行われるであろう。
【００５９】
ＣＴＬＡ−４遮断の増強効果の特性評価：ＦＡＮＧ免疫化のみが感作誘導（afferent）免疫感作プロセスに影響を与えるのであれば、腫瘍特異的免疫エフェクター応答を促進する追加的なアプローチは、抗腫瘍治療成績をさらに促進することができる。細胞傷害性Ｔリンパ球−４（ＣＴＬＡ−４）機能の遮断によるＴｒｅｇ抑制の崩壊及び／又はＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）の強化は、ＦＡＮＧワクチンの臨床成功の尤度を強化することができる。
【００６０】
１０種のＦＡＮＧワクチン試料（ＦＡＮＧ−００３は解析に妥当なｍＲＮＡを持たない）においてＲＴ−ｑＰＣＲ解析を行った。電気穿孔前及び電気穿孔後、放射線照射後の試料を最大１４日間培養した。様々な時点の各試料から全ＲＮＡを抽出し、逆転写（ＲＴ）によりｃＤＮＡに変換した。各時点の各試料に存在する鋳型の量を評価するため、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。フューリン、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２  ｑＰＣＲ試料を内在性ＧａｐＤＨに対し正規化して、相対的なサイクル数の閾値（Ｃｔ）を得た。ＧＭＣＳＦを外部標準曲線に対し定量化して、標準曲線と比べて絶対Ｃｔ値を得た。ＧＭＣＳＦ  ｍＲＮＡ検出を図７に示す。トランスフェクション後、全ワクチンにおいてＧＭＣＳＦ  ｍＲＮＡを検出したが、数値は持続的な問題であるｍＲＮＡ品質に応じて可変的である。表１は、２種のＦＡＮＧワクチンから得られた代表的なデータを例示する（図８及び９）。全試料を、正規化電気穿孔前Ｃｔ値マイナス正規化電気穿孔後放射線照射後Ｃｔ値として算出して（前−後）、デルタＣｔ（ΔＣｔ）を算出した。算出された０．００未満のΔＣｔは鋳型ＤＮＡの減少を表し、算出された０．００を超えるΔＣｔは鋳型ＤＮＡの増加を表す。ΔＣｔ値を用いて、発現のパーセント変化を推算する（％発現）。１００％未満の数値はＤＮＡの（前から後の）減少を表し、１００％を超える数値はＤＮＡの（前から後の）増加を表す。ｓｈＲＮＡ／ｓｉＲＮＡサイレンシングの性質は、鋳型ＤＮＡを最適に９０％低下させることができ、これはΔＣｔ＝−３．３に相当する。（ΔＣｔ＝−１．０は、５０％ノックダウンに相当する。）従って、下のデータは、ＦＡＮＧプラスミドＤＮＡが、内在性フューリンを８０〜２６％（平均＝４８％）下に低下させることができ、下流標的のＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２が、９８〜３０％（平均＝７５％）下に低下されることを立証する。フューリン二機能性ｓｈＲＮＡの作用機構は、転写後及び翻訳レベルでフューリンタンパク質産生を遮断することである。フューリンタンパク質のレベル低下も、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２  ｍＲＮＡの発現、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２タンパク質プロ型（proform）のそれらそれぞれのタンパク質の成熟（活性）型への変換に影響を与え（フィードバック調節により）（Burghardt, I., et al., Pirfenidone inhibits TGF-beta expression in malignant glioma cells. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 354(2): p. 542-7）、ＴＧＦβ→フューリン増幅ループに干渉することにより、フューリン自体の発現をさらに鈍らせる（McMahon, S., M.H. Laprise, and C.M. Dubois, Alternative pathway for the role of furin in tumor cell invasion process. Enhanced MMP-2 levels through bioactive TGFbeta. Exp Cell Res, 2003. 291(2): p. 326-39）。ＴＧＦタンパク質プロ型の蓄積が、そのＴＧＦ遺伝子の転写をフィードバック阻害し得る可能性もある。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
９名の患者の自家ワクチンでＦＡＮＧシステムを用いたところ、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２低下並びにＧＭ−ＣＳＦレベル上昇を一貫して立証した（図６Ａ〜６Ｃ）。特異的イムノアッセイにより、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２両方の活性も、これらの癌株において有意に低下したことが立証され、ＴＧＦ−βアイソフォーム発現におけるフューリン遮断効果を確認した。本発明者らは、ＴＧＦ−βアイソフォーム発現を阻害するためのｓｉＲＮＡ介在性フューリン−ノックダウンの適用性を検証した。発表されたTuschl及び同僚らの推奨するところ並びにヒト及びマウスゲノムデータベース（jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext）のＢＬＡＳＴ検索を統合した追加的な選択パラメータにより、フューリンｍＲＮＡ配列において予想されるｓｉＲＮＡ標的部位（図４Ｂ）を決定した。適格な翻訳及び３’ＵＴＲ部位を標的とするｓｉＲＮＡ（図４Ｂ）を検査した。フューリンｍＲＮＡのＦＡＮＧプラスミドＤＮＡノックダウンの立証を図８及び９に示す。これはワクチンのうち２種しか検出できないが、その理由としては、容易に検出可能なフューリンｍＲＮＡはトランスフェクション前のこれら２種の腫瘍のみに存在したためである。ｂｉ−ｓｈＲＮＡフューリンの作用機構は、転写後及び翻訳レベルにおけるフューリンタンパク質産生の遮断である。フューリンタンパク質のレベル低下も、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２  ｍＲＮＡの発現、プロ型ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２タンパク質のそれらそれぞれのタンパク質の成熟（活性）型への変換に影響を与え（フィードバック調節により）（Burghardt, I., et al., Pirfenidone inhibits TGF-beta expression in malignant glioma cells. Biochem Biophys Res Commun, 2007. 354(2): p. 542-7）、ＴＧＦ−β→フューリンループに干渉することにより、フューリン自体の発現をさらに鈍らせる（McMahon, S., M.H. Laprise, and C.M. Dubois, Alternative pathway for the role of furin in tumor cell invasion process. Enhanced MMP-2 levels through bioactive TGFbeta. Exp Cell Res, 2003. 291(2): p. 326-39）。ＴＧＦタンパク質のプロ型の蓄積がそのＴＧＦ遺伝子の転写をフィードバック及び阻害し得る可能性は、決して本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。ＦＡＮＧの標的有効性の拡大は、自家ワクチンのＴＡＧ（ＴＡＧ−００４）及びＦＡＮＧ（ＦＡＮＧ−００４）両方のバージョンの作製に妥当な腫瘍組織を有する１名の患者（ＮＳＣＬＣ）において最もよく立証される。ＦＡＮＧ標本（ＦＡＮＧ−００４）を用いて、初濃度１８４０ｐｇ／ｍｌから検出可能レベルを下回るようにＴＧＦ−β１（とＴＧＦ−β２）を欠乏させた。ＴＧＦ−β２欠乏が予想されるにもかかわらず、この高レベルのＴＧＦ−β１は、ＴＡＧ標本（ＴＡＧ−００４）によって変化しなかった（図１Ａ〜１Ｃ及び図２Ａ〜２Ｆ）。これらの知見は、ＦＡＮＧワクチン標本の機構的利点を支持する。
【００６３】
ＣＣＬ−２４７、ＣＲＬ−１５８５  Ｕ８７及びＨ４６０細胞のリポフェクション後に、６種のｓｉＲＮＡフューリンコンストラクトのそれぞれは、細胞生存に悪影響を及ぼすことなく培養上清においてＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２レベルを著しく低下させることを示した。よって、ｓｉＲＮＡ介在性フューリンノックダウンは、ＴＧＦ−β１及び−β２アイソフォームの欠乏に有効である。
【００６４】
ＦＡＮＧの設計及び構築：遺伝子ノックダウンを最適化するためのｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ様機能的成分両方を組み入れる「二機能性」ベクターを用いた（Rao, D., Maples, P.B., Senzer, N., Kumar, P., Wang, Z., papper, B.O., Yu, Y., Haddock, C., Tong, A., Nemunaitis, J., Bi-functional  shRNA: A novel approach of RNA interference. (submitted), 2009）。ｓｉＲＮＡ成分は、ヘアピンとしてコードされ、パッセンジャー及びガイド鎖の完全にマッチする配列を網羅する。ＲＮａｓｅ  Ｈ様活性を有するエンドヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）のアルゴノート−２（Ａｇｏ２）によるパッセンジャー鎖の切断後、ガイド鎖は、相補的標的ｍＲＮＡ配列と結合し、切断する。区別すると、「二機能性」ベクターのｍｉＲＮＡ様成分は、より低い熱力学的安定性を達成するため、コードｓｈＲＮＡヘアピン内のパッセンジャー及びガイド鎖間にミスマッチが組み入れられている。この立体配置は、Ａｇｏ２非依存的に切断なし（切断非依存的プロセス）でＲＩＳＣからパッセンジャー鎖を解離させ（Matranga, C., et al., Passenger-strand cleavage facilitates assembly of siRNA into Ago2-containing RNAi enzyme complexes. Cell, 2005. 123(4): p. 607-20、Leuschner, P.J., et al., Cleavage of the siRNA passenger strand during RISC assembly in human cells. EMBO Rep, 2006. 7(3): p. 314-20）、翻訳阻止、ｍＲＮＡ分解及び部分的に相補的な標的ｍＲＮＡの細胞質プロセシングボディ（Ｐ−ボディ）における隔離により、ｍｉＲＮＡガイド成分にその標的を下方制御させる。
【００６５】
本発明者らは、以前に、細胞骨格の迅速な微小管リモデリングを調節するタンパク質であり、高比率の固形癌患者において上方調節されることが見出されたスタスミン（ＳＴＭＮ１；オンコプロテイン１８）をノックダウンするための二機能性ｓｈＲＮＡの有効性強化を立証した（Rana, S., et al., Stathmin 1: a novel therapeutic target for anticancer activity. Expert Rev Anticancer Ther, 2008. 8(9): p. 1461-70）。ＳＴＭＮ−１に対し有効なノックダウンを達成した二機能性ｓｈＲＮＡコンストラクトは、同一遺伝子標的に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して５−ｌｏｇ用量強化された腫瘍細胞殺傷効力をもたらした。
【００６６】
同様に設計された二機能性ｓｈＲＮＡを用いてフューリンノックダウンを達成した。ｍｉＲ−３０ａ骨格を有する２種のステム−ループ構造からなるｂｉ−ｓｈ−フューリン；第一のステム−ループ構造は、完全に相補的なガイド鎖及びパッセンジャー鎖を有するが、第二のステム−ループ構造は、パッセンジャー鎖のポジション９〜１１に３ｂｐミスマッチを有する。本発明者らは、切断及び隔離両プロセスのために単一標的部位を用いる戦略を採用した。コードｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡを成熟させて、２種類以上のＲＩＳＣに積み込むことが提案されている（Azuma-Mukai, A., et al., Characterization of endogenous human Argonautes and their miRNA partners in RNA silencing. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(23): p. 7964-9）。多部位標的化は、「シード配列」誘導オフターゲット効果の確率を増加させ得るため、本発明者らは単一部位に焦点を置く（Jackson, S.A., S. Koduvayur, and S.A. Woodson, Self-splicing of a group I intron reveals partitioning of native and misfolded RNA populations in yeast. RNA, 2006. 12(12): p. 2149-59）。
【００６７】
ＤＮＡライゲーションにより、２種のステム−ループ構造を１０ピースの補完的及び相互接続的オリゴヌクレオチドと組み立てる。ｓｈＲＮＡインサート及び配向性をスクリーニングするように設計されたＰＣＲプライマー対により、挿入ＤＮＡの配向性をスクリーニングした。陽性クローンを選択し、SeqWright社（テキサス州ヒューストン）にて配列を確認した。ｓｉＲＮＡの知見に基づき、３種の二機能性ｓｈＲＮＡを構築した。最適な標的配列を同定した。
【００６８】
ＦＡＮＧコンストラクトは、カセット全体を駆動する単一の哺乳類プロモーター（ＣＭＶ）を有し、２ＡリボソームスキップペプチドがＧＭ−ＣＳＦ及びフューリン二機能性ｓｈＲＮＡ転写産物間に介入し、ウサギポリＡテールが続く。ＧＭ−ＣＳＦ転写産物終端に終止コドンが置かれる。
【００６９】
ピコルナウイルス２Ａ配列をｍＲＮＡへと挿入すると、リボソームは２Ａ及び下流配列の接合部のペプチド結合のスキップ形成を生じ、単一のオープンリーディングフレームから２種のタンパク質の産生をもたらす（Funston, G.M., et al., Expression of heterologous genes in oncolytic adenoviruses using picornaviral 2A sequences that trigger ribosome skipping. J Gen Virol, 2008. 89(Pt 2): p. 389-96）。本発明者らは、２Ａリンカーが、ＴＡＧワクチンによるほぼ等レベルのＧＭ−ＣＳＦ及び抗ＴＧＦ−β転写産物の作製に有効となることを見出し、ＦＡＮＧに同じ設計を用いるために選出した。
【００７０】
ＦＡＮＧワクチン製造：患者の腫瘍を手術分野において無菌的に捕集し、無菌検体容器内のゲンタマイシン生理食塩水溶液中に置き、ｃＧＭＰ製造施設への配送のために湿氷（wet ice）上に梱包した。検体を製造一式に投入し、酵素的に解体し、機械的に脱凝集させて細胞懸濁液を生成し、次に洗浄してデブリを除去した。腫瘍細胞を計数した後、ＱＣアリコートを採取して残りの細胞にＦＡＮＧプラスミドを電気穿孔し、一晩インキュベートしてベクター導入遺伝子を発現させる。細胞を収集し、ガンマ線照射して細胞成長を停止させ、次に最後のＱＣアリコートの除去及びワクチン管理率凍結前に計数した。２日間の製造プロセスに続き、ほぼ３週間のＱＣ検査フェーズを行い、その後、患者治療のためにワクチンを解禁する前に全ワクチンアッセイデータを評定する。ＦＡＮＧ製造を行った９名の最初の患者は全員、全ＱＣ検査判定基準を満たした。
【００７１】
ｃＧＭＰ  ＦＡＮＧワクチン：臨床試験における使用のため、ｃＧＭＰ条件下で癌患者自家ＦＡＮＧワクチンを作製した。ＦＡＮＧ改変前後にＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β１、−β２及び−β３  ｍＲＮＡ並びにタンパク質発現を測定し、本出願人らが以前に特徴づけたＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−β依存的ヒト細胞系における成長治療成績によりサイトカイン生物活性を決定した。各患者の処理ワクチンは、ＦＡＮＧ改変後に抗原完全性を証明するため、プロテオゲノミクススクリーニングを行うことになる。
【００７２】
ＦＡＮＧのｃＧＭＰ産生：樹立ヒト細胞系のプラスミドベクター電気穿孔によりＦＡＮＧワクチンを作製した。選択されたＦＡＮＧプラスミドベクターは、最適なＴＧＦ−β下方制御のために前検証（prevalidate）したフューリンｓｈＲＮＡを含有するコンストラクトを表す。
【００７３】
患者に注射する前に、凍結バイアル（用量）を室温で解凍し、バイオセイフティーフード内で処理した。細胞懸濁液は、蓋をした１ｍＬシリンジにおいて送達されるであろう。調製したワクチンは、注射当り１×１０７又は２．５×１０７細胞の用量で患者に皮内注射されるであろう。
【００７４】
２種のフルスケール前臨床製造プロセス及び８種の臨床製造プロセスを用意し、本発明者らにより試験した。表２は、処理した腫瘍の種類を表示する（腫瘍３〜１０は臨床ワクチンである）。
【００７５】
【表３】
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【００７６】
処理した腫瘍のサイズ範囲及び種類並びにその結果生じた生細胞収量は、表３に示す通り大きく変動する。全ワクチンは、製造２日目の総生細胞数に応じて１．０×１０７細胞（用量コホート１）又は２．５×１０７細胞（用量コホート２）のいずれかをバイアルに入れた。複数の腫瘍を収集した患者は、バイアルを組み合わせて最小臨床用量要件を認定させた。コホート２用量レベルの最大１２用量は、患者治療に利用できるようになるであろう。腫瘍細胞収量は、腫瘍質量、細胞充実性及びプロセシング適合性により非常に可変的なため、最小用量数及び低用量コホート（コホート１）が包含される。
【００７７】
【表４】
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【００７８】
処理した１０種の腫瘍の４日目の発現プロファイルを図１Ａ〜１Ｃに表示する。ｙ軸目盛りが、全３種のサイトカイン毎に異なることに留意されたし。これらのデータは、１４日間アッセイの代表である（残りのデータは図示せず）。平均トランスフェクション前ＴＧＦβ１は、１２５１±１５４４ｐｇ／１×１０６細胞／ｍｌ、中央値７７８ｐｇである。平均トランスフェクション後ＴＧＦβ１は、１９１±４５５ｐｇ／１×１０６細胞／ｍｌ、中央値１３ｐｇである。ＴＧＦβ１の平均パーセントノックダウンは８５％であった。平均トランスフェクション前ＴＧＦβ２は、２３２±１６４ｐｇ／１×１０６細胞／ｍｌ、中央値２２５ｐｇである。平均トランスフェクション後ＴＧＦβ２は、１３１９ｐｇ／１×１０６細胞／ｍｌ、中央値５ｐｇである。ＴＧＦβ２の平均パーセントノックダウンは、９４％であった。トランスフェクション後の平均ＧＭ−ＣＳＦ発現は、５４３±５４０ｐｇ／１×１０６細胞／ｍｌ、中央値４００ｐｇである。これらのデータは、ＧＭＣＳＦ発現が、ＴＧＦβ２ノックダウンのようにＴＡＧワクチンと一致することを示す。対照的に、ＦＡＮＧワクチンは、５倍を超えてＴＧＦβ１発現を低下させた。ＴＧＦβ１の最小検出可能含量は、約４．６ｐｇ／ｍｌである（R&D Systems社製、QuantikineヒトＴＧＦβ１）。ＴＧＦβ２の最小検出可能含量は、約７ｐｇ／ｍｌである（R&D Systems社製、QuantikineヒトＴＧＦβ２）。ＧＭＣＳＦの最小検出可能含量は、約３ｐｇ／ｍｌである（R&D Systems社製、QuantikineヒトＧＭＣＳＦ）。
【００７９】
ＧＭＣＳＦ、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２発現を検査するための自家腫瘍細胞ワクチンのトランスフェクション前及び後の培養物を設定するためのプロトコールは、以前に記載されている（Maples, P.B., et al. Autologous Tumor Cell Vaccine Genetically Modified To Express GM-CSF and Block Expression of TGFb2 (Abstract # 553). in The Twelfth Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy. 2009. San Diego, California）。簡潔に言うと、ＧＭＣＳＦ、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２発現を市販のＥＬＩＳＡキット（R&D Systems社）により決定した。メーカーの説明書に従ってＥＬＩＳＡアッセイを行った。トランスフェクション前試料（４×１０６細胞）を１日目に採取した。製造が完成した後、細胞培養物をＥＬＩＳＡ用試料の作製に設定できるように製造施設から試料を移動した。２日目に、トランスフェクション後、放射線照射後、凍結前試料（４×１０６細胞）を採取した。製造が完成した後、細胞培養物をＥＬＩＳＡ用試料の作製に設定できるように製造施設から試料を移動した。
【００８０】
前臨床認定プロセスの一部として１０種のワクチン（ＦＡＮＧ−００１から−０１０）を製造した。これらのワクチンは、トランスフェクション前、放射線照射前試料と比較したトランスフェクション後、放射線照射後試料を用いて、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＧＦβ１及びＴＧＦｂ２  ｍＲＮＡ並びにタンパク質発現に関して評定した（ＦＤＡレビューによる、ＴＡＧワクチン、ＢＢ−ＩＮＤ１３６５０）。加えて、数通りの方法によりフューリンタンパク質検出を試みた。ｑＲＴ−ＰＣＲによりフューリンｍＲＮＡを検出した。
【００８１】
本発明者らは、ウエスタンブロット及びフローサイトメトリーにより細胞系における内在性フューリンタンパク質を検出した。５種類の異なる抗体（３社の異なるベンダーから入手）をウエスタンブロットのためにスクリーニングし、１種類の前標識抗体をフローサイトメトリーのためにスクリーニングした。全実験は陰性結果を生じた（データは図示せず）。
【００８２】
全製造プロセスの全ＥＬＩＳＡデータの概要（表４）は、ＧＭＣＳＦ発現の中央値レベルがおよそ４００ピコグラム／ｍｌであり、平均が５４３ピコグラム／ｍｌであることを示す。さらに、ＧＭＣＳＦレベルは、経時的に増加する傾向がある。発現レベルは製造プロセス（腫瘍種類）間で可変性であるが、全製品においてＧＭＣＳＦ発現が観察される。１）ウイルスベクターではなくプラスミドの使用は、誘発された抗ウイルス中和抗体の不明瞭化（obfuscating）効果を取り除き、２）プラスミドの使用は同様に、長期遺伝子発現に干渉する誘発された抗体の発達を予防し、３）同時に発生するフューリン、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の抑制は、ＧＭＣＳＦ誘導樹状細胞成熟化の腫瘍関連阻害を最小化し得るため、記述されている製造プロセス間のＧＭＣＳＦ発現レベルの可変性に加えて、ＦＡＮＧワクチンにより達成された発現レベルは、臨床的に関連性があると判断される（Montenegro, D.E., et al., TGFbeta inhibits GM-CSF-induced phosphorylation of ERK and MEK in human myeloid leukaemia cell lines via inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-k). Cell Prolif, 2009. 42(1): p. 1-9 ）。
【００８３】
【表５】
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【００８４】
ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−β発現の定量化：サイトカイン特異的比色分析アッセイによりＧＭ−ＣＳＦ並びにＴＧＦ−β１及び−β２発現を決定した（Tong, A.W., et al., Intratumoral injection of INGN 241, a nonreplicating adenovector expressing the melanoma-differentiation associated gene-7 (mda-7/IL24): biologic outcome in advanced cancer patients. Mol Ther, 2005. 11(1): p. 160-72）。
【００８５】
生物活性の検証：骨髄性造血細胞と同様に、ＭＡＰキナーゼ１／２及びＥＲＫ１／２の迅速な一過性リン酸化によって介在されるように、骨髄性白血病細胞系においてＧＭ−ＣＳＦ誘導性増殖活性が観察された。それに対し、ＴＧＦ−βは、ＰＩ３−キナーゼ−Ａｋｔ経路の阻害によるＧＭ−ＣＳＦ介在性ＥＲＫシグナル伝達をオフにする（Montenegro, D.E., et al., TGFbeta inhibits GM-CSF-induced phosphorylation of ERK and MEK in human myeloid leukaemia cell lines via inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-k). Cell Prolif, 2009. 42(1): p. 1-9 ）。骨髄性白血病性細胞におけるＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−βの成長調節効果をインビトロ代用モデルとして用いて、ＦＡＮＧワクチン培養上清の調製におけるサイトカイン生物活性を検証した。
【００８６】
赤白血病ＣＤ３４＋ＴＦ−１ａ細胞による共培養試験により、ＦＡＮＧ（又は対照トランスフェクト）ワクチン培養上清におけるサイトカイン活性を検証し（Hu, X., et al., Characterization of a unique factor-independent variant derived from human factor-dependent TF-1 cells: a transformed event. Leuk Res, 1998. 22(9): p. 817-26）、必要であれば、混合型（biphenotypic）Ｂ骨髄単球性白血病性ＣＤ１０＋ＣＤ１５＋ＭＶ４−１１細胞により確認した（Santoli, D., et al., Synergistic and antagonistic effects of recombinant human interleukin (IL) 3, IL-1 alpha, granulocyte and macrophage colony-stimulating factors (G-CSF and M-CSF) on the growth of GM-CSF-dependent leukemic cell lines. J Immunol, 1987. 139(10): p. 3348-54）（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）。これらの細胞系は両者共に、ｎｇ／ｍｌ量におけるＧＭ−ＣＳＦの正の増殖効果及びＴＧＦ−βの負の阻害活性に対する応答を示した（Montenegro, D.E., et al., TGFbeta inhibits GM-CSF-induced phosphorylation of ERK and MEK in human myeloid leukaemia cell lines via inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-k). Cell Prolif, 2009. 42(1): p. 1-9 ）。増殖活性は、Easycount Viasureアッセイ（Immunicon社）及びＭＴＴアッセイにより決定されるであろう（Tong, A.W., et al., Intratumoral injection of INGN 241, a nonreplicating adenovector expressing the melanoma-differentiation associated gene-7 (mda-7/IL24): biologic outcome in advanced cancer patients. Mol Ther, 2005. 11(1): p. 160-72）。
【００８７】
ＦＡＮＧ改変の表現型プロファイル解析：フューリンノックダウンは、ＴＧＦ−β下方制御と共に、標的配列を有する他のタンパク質基質の発現に影響を与える可能性がある（Lopez de Cicco, R., et al., Human carcinoma cell growth and invasiveness is impaired by the propeptide of the ubiquitous proprotein convertase furin. Cancer Res, 2005. 65(10): p. 4162-71）。この情報が、ワクチン接種患者におけるいかなるディファレンシャル臨床治療成績の理解に対し有用となり得る場合には、ＦＡＮＧ処理した自家ワクチンの抗原プロファイルを癌患者から決定した。
【００８８】
ハイスループット遺伝子プロファイリングを用いて、癌患者の個別化療法を開発した。ＦＡＮＧトランスフェクトｖｓ対照ベクタートランスフェクト癌細胞のディファレンシャル遺伝子発現プロファイルを比較するため、ハイスループット遺伝子発現アレイ解析を行った。
【００８９】
ディファレンシャルに標識したＦＡＮＧ及び対照標本を組み合わせ、強い陽イオン交換カラム（ＳＣＸ）及び２次元ＲＰナノカラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（Dionex社）によって分画した。Applied Biosystems 4800 MALDI TOF/TOF（商標）分析器を用いた質量分析解析のための調製において、Opti-TOF（商標）LC/MALDI挿入（１２３×８１ｍｍ）プレート（Applied Biosystems社）上に画分をスポットした。次に、GeneGo、MetaCoreソフトウェア一式によりタンパク質及び遺伝子発現データの両方を評定した。
【００９０】
ＦＡＮＧプロセス前後の自家癌ワクチンの抗原レパートリーを決定するため、プロテオゲノミクス解析を行った。フューリンノックダウンの検証に加えて、１）フューリン基質タンパク質のベースライン及びディファレンシャル発現、２）ランドマーク腫瘍関連抗原（ＴＡＡ；メラノーマのためのｇｐ１００、Ｍａｒｔ１、ＭＡＧＥ−１、チロシナーゼ、非小細胞肺癌のためのＭＡＧＥ−３、ＭＵＣ−１等）（Romero, P., Current state of vaccine therapies in non-small-cell lung cancer. Clin Lung Cancer, 2008. 9 Suppl 1: p. S28-36、Robinson, J., et al., The European searchable tumour line database. Cancer Immunol Immunother, 2009）及び他の報告されたＴＡＡの発現、３）ＨＬＡ抗原及び共刺激分子（ＣＤ８０／８６）発現、４）ＦＡＮＧトランスフェクション後に２倍以上ディファレンシャルに発現する上述のカテゴリーとは無関係のタンパク質に特に注意を払った。
【００９１】
図１０は、進行期患者のコホート１対コホート２及び３に対する全生存を示す（ｎ＝６１；Ｐ＝．０１８６）。ＧＭ−ＣＳＦ−ＴＧＦ−β２アンチセンスプラスミドの模式図を図１１に示す。ｐＵＭＶＣ３−ＧＭ−ＣＳＦ−２Ａ−ＴＧＦ−β２アンチセンスベクターを含有するＮＣＩ−Ｈ−４６０扁平細胞及びＮＣＩ−Ｈ−５２０大細胞（ＮＳＣＬＣ）におけるＧＭ−ＣＳＦのインビトロでの発現を図１２に表示する。ｐＵＭＶＣ３−ＧＭ−ＣＳＦ−２Ａ−ＴＧＦ−β２アンチセンスベクターを有するＮＣＩ−Ｈ−４６０扁平細胞及びＮＣＩ−Ｈ−５２０大細胞（ＮＳＣＬＣ）においてＴＧＦ−β２レベルは低下する。この低下は、図１３に提示されているデータにおいて観察される。図１４は、２５１塩基対プローブが、ＮＣＩ−Ｈ−４６０及びＮＣＩ−Ｈ−５２０細胞（レーン６及び１０）においてインビトロで発現するＧＭ−ＣＳＦ−２Ａ−ＴＧＦ−β２転写産物を特異的に検出することを示す。ＴＡＧワクチンにおけるＧＭ−ＣＳＦ及びＴＧＦ−β２発現をそれぞれ図１２及び１３に示す。ｓｉＲＮＡフューリンノックダウン後のヒト癌株におけるＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の発現を図１８Ａ及び１８Ｂに示す。最後に、図１９は、ＦＡＮＧのプラスミドコンストラクトの模式図である。
【００９２】
ＴＡＧワクチン製造データ（ｎ＝３３ワクチン；７日目の数値、ワクチン製造後のＴＧＦβ１アッセイ）から得られたＴＧＦβ１発現データ（図１６）は、ＴＡＧがＴＧＦβ１発現に干渉しないことを明らかに立証する。ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２（図１７）並びにＴＧＦβ３（データ図示せず）遮断の臨床意義は、これらが、腫瘍により発現する有意な負の免疫調節物質であると仮定されていることである。ＴＡＧワクチンにおけるＧＭ−ＣＳＦ発現を図１５に示す。これらのＴＧＦβアイソフォームは偏在性であり、大多数の腫瘍において発現する（Arteaga, C.L., Inhibition of TGFbeta signaling in cancer therapy. Curr Opin Genet Dev, 2006. 16(1): p. 30-7）。乳、結腸、食道、胃、肝細胞、膵臓、ＳＣＬＣ及びＮＳＣＬＣ等、多くの腫瘍は、高レベルの１又は２以上の活性ＴＧＦβアイソフォームを産生する（Constam, D.B., et al., Differential expression of transforming growth factor-beta 1, -beta 2, and -beta 3 by glioblastoma cells, astrocytes, and microglia. J Immunol, 1992. 148(5): p. 1404-10、Bierie, B. and H.L. Moses, Tumour microenvironment: TGFbeta: the molecular Jekyll and Hyde of cancer. Nat Rev Cancer, 2006. 6(7): p. 506-20、Levy, L. and C.S. Hill, Alterations in components of the TGF-beta superfamily signaling pathways in human cancer. Cytokine Growth Factor Rev, 2006. 17(1-2): p. 41-58、Eastham, J.A., et al., Transforming growth factor-beta 1: comparative immunohistochemical localization in human primary and metastatic prostate cancer. Lab Invest, 1995. 73(5): p. 628-35、Friedman, E., et al., High levels of transforming growth factor beta 1 correlate with disease progression in human colon cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 1995. 4(5): p. 549-54、Jakowlew, S.B., et al., Expression of transforming growth factor beta ligand and receptor messenger RNAs in lung cancer cell lines. Cell Growth Differ, 1995. 6(4): p. 465-76、Kong, F.M., et al., Elevated plasma transforming growth factor-beta 1 levels in breast cancer patients decrease after surgical removal of the tumor. Ann Surg, 1995. 222(2): p. 155-62、Yamada, N., et al., Enhanced expression of transforming growth factor-beta and its type-I and type-II receptors in human glioblastoma. Int J Cancer, 1995. 62(4): p. 386-92、Eder, I.E., et al., Transforming growth factors-beta 1 and beta 2 in serum and urine from patients with bladder carcinoma. J Urol, 1996. 156(3): p. 953-7）。さらに、ＴＧＦβの過剰発現は、腫瘍進行及び予後不良と相関してきた（Bierie, B. and H.L. Moses, Tumour microenvironment: TGFbeta: the molecular Jekyll and Hyde of cancer. Nat Rev Cancer, 2006. 6(7): p. 506-20、Levy, L. and C.S. Hill, Alterations in components of the TGF-beta superfamily signaling pathways in human cancer. Cytokine Growth Factor Rev, 2006. 17(1-2): p. 41-58）。ＴＧＦβレベルの上昇もまた、感作誘導及び効果発現経路の両方における免疫抑制とリンクしてきた（Bierie, B. and H.L. Moses, Tumour microenvironment: TGFbeta: the molecular Jekyll and Hyde of cancer. Nat Rev Cancer, 2006. 6(7): p. 506-20、Sporn, M.B., et al., Transforming growth factor-beta: biological function and chemical structure. Science, 1986. 233(4763): p. 532-4、Massague, J., The TGF-beta family of growth and differentiation factors. Cell, 1987. 49(4): p. 437-8、Bodmer, S., et al., Immunosuppression and transforming growth factor-beta in glioblastoma. Preferential production of transforming growth factor-beta 2. J Immunol, 1989. 143(10): p. 3222-9、Border, W.A. and E. Ruoslahti, Transforming growth factor-beta in disease: the dark side of tissue repair. J Clin Invest, 1992. 90(1): p. 1-7、Chen, T.C., et al., TGF-B2 and soluble p55 TNFR modulate VCAM-1 expression in glioma cells and brain derived endothelial cells. J Neuroimmunol, 1997. 73(1-2): p. 155-61、Li, M.O., et al., Transforming growth factor-beta regulation of immune responses. Annu Rev Immunol, 2006. 24: p. 99-146）。その上、ＴＧＦβは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるアンタゴニスト効果を有し、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を誘導及び増殖する（Ruffini, P.A., et al., Factors, including transforming growth factor beta, released in the glioblastoma residual cavity, impair activity of adherent lymphokine-activated killer cells. Cancer Immunol Immunother, 1993. 36(6): p. 409-16、Rook, A.H., et al., Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol, 1986. 136(10): p. 3916-20、Kasid, A., G.I. Bell, and E.P. Director, Effects of transforming growth factor-beta on human lymphokine-activated killer cell precursors. Autocrine inhibition of cellular proliferation and differentiation to immune killer cells. J Immunol, 1988. 141(2): p. 690-8、Tsunawaki, S., et al., Deactivation of macrophages by transforming growth factor-beta. Nature, 1988. 334(6179): p. 260-2、Hirte, H. and D.A. Clark, Generation of lymphokine-activated killer cells in human ovarian carcinoma ascitic fluid: identification of transforming growth factor-beta as a suppressive factor. Cancer Immunol Immunother, 1991. 32(5): p. 296-302、Naganuma, H., et al., Transforming growth factor-beta inhibits interferon-gamma secretion by lymphokine-activated killer cells stimulated with tumor cells. Neurol Med Chir (Tokyo), 1996. 36(11): p. 789-95）。
【００９３】
従って、ＴＧＦβの免疫抑制因子機能は、癌細胞ワクチンの有効性の変調において主要な役割を果たす可能性がある。ＴＧＦβは、ＧＭＣＳＦの誘導する骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）成熟化（Yamaguchi, Y., et al., Contrasting effects of TGF-beta 1 and TNF-alpha on the development of dendritic cells from progenitors in mouse bone marrow. Stem Cells, 1997. 15(2): p. 144-53）並びにＭＨＣクラスII及び共刺激分子の発現（Geissmann, F., et al., TGF-beta 1 prevents the noncognate maturation of human dendritic Langerhans cells. J Immunol, 1999. 162(8): p. 4567-75）を阻害する。未熟ＤＣによる抗原提示が、Ｔ細胞無応答性をもたらすことが示された（Steinman, R.M., et al., Dendritic cell function in vivo during the steady state: a role in peripheral tolerance. Ann N Y Acad Sci, 2003. 987: p. 15-25）。ＴＧＦβもまた、その抗原提示機能（Du, C. and S.  Sriram, Mechanism of inhibition of LPS-induced IL-12p40 production by IL-10 and TGF-beta in ANA-1 cells. J Leukoc Biol, 1998. 64(1): p. 92-7、Takeuchi, M., P. Alard, and J.W. Streilein, TGF-beta promotes immune deviation by altering accessory signals of antigen-presenting cells. J Immunol, 1998. 160(4): p. 1589-97）等、マクロファージ活性化（Ashcroft, G.S., Bidirectional regulation of macrophage function by TGF-beta. Microbes Infect, 1999. 1(15): p. 1275-82）を阻害する。そのため、発現遍在性及びＴＧＦβのＧＭＣＳＦ免疫調節性機能における阻害効果の両方が、本発明の自家癌ワクチン治療アプローチにおける全腫瘍ＴＧＦβ発現のノックダウンを支持する。
【００９４】
従って、ＴＧＦβの免疫抑制因子機能は、癌細胞ワクチンの有効性の変調において主要な役割を果たす可能性がある。ＴＧＦβは、ＧＭＣＳＦの誘導する骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）の成熟化（Montenegro, D.E., et al., TGFbeta inhibits GM-CSF-induced phosphorylation of ERK and MEK in human myeloid leukaemia cell lines via inhibition of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-k). Cell Prolif, 2009. 42(1): p. 1-9 ）並びにＭＨＣクラスII及び共刺激分子の発現（Steinman, R.M., et al., Dendritic cell function in vivo during the steady state: a role in peripheral tolerance. Ann N Y Acad Sci, 2003. 987: p. 15-25）を阻害する。未熟ＤＣによる抗原提示が、Ｔ細胞無応答性をもたらすことが示された（Ashcroft, G.S., Bidirectional regulation of macrophage function by TGF-beta. Microbes Infect, 1999. 1(15): p. 1275-82）。ＴＧＦβもまた、その抗原提示機能（Takeuchi, M., P. Alard, and J.W. Streilein, TGF-beta promotes immune deviation by altering accessory signals of antigen-presenting cells. J Immunol, 1998. 160(4): p. 1589-97、Ruffini, P.A., et al., Factors, including transforming growth factor beta, released in the glioblastoma residual cavity, impair activity of adherent lymphokine-activated killer cells. Cancer Immunol Immunother, 1993. 36(6): p. 409-16）等、マクロファージ活性化（Du, C. and S. Sriram, Mechanism of inhibition of LPS-induced IL-12p40 production by IL-10 and TGF-beta in ANA-1 cells. J Leukoc Biol, 1998. 64(1): p. 92-7）を阻害する。そのため、発現の遍在性及びＧＭＣＳＦ免疫調節性機能におけるＴＧＦβの阻害効果の両方が、この自家癌ワクチン治療アプローチにおける全腫瘍ＴＧＦβ発現のノックダウンを支持する。
【００９５】
本明細書に記載されている特定の実施形態は、説明のために示されており、本発明を限定するものではないことが理解されるであろう。本発明の主要な特色は、本発明の範囲から逸脱することなく様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、本明細書に記載されている特定の手順の多数の均等物を認識するであろう、或いは単なるルーチン実験法を用いて解明することができる。このような均等物は、本発明の範囲内と考えられ、特許請求の範囲により保護されている。
【００９６】
本明細書において言及されているあらゆる刊行物及び特許出願は、本発明に属す当業者の技能レベルを示す。あらゆる刊行物及び特許出願は、あたかも各刊行物又は特許出願それぞれが、それぞれ特に参照により援用されていることが示されているのと同じ程度まで本明細書に参照により援用する。
【００９７】
単数形の単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は本明細書において用語「含む」と併せて用いた場合、「１」を指すことができるが、これは、「１又は２以上の」、「少なくとも１」及び「１又は１を超える」の意義とも一致する。特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、他の事柄のみを意味することが明示されている、或いは他の事柄が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を指すよう用いられる。なお、本開示は、他の事柄のみ及び「及び／又は」を意味する定義を支持する。本出願を通じて、用語「およそ」は、数値がデバイスの固有の誤差変動を包含すること、方法が数値又は試験対象間に存在する変動の決定に用いられることを指し示すよう用いられる。
【００９８】
本明細書及び請求項（複数化）において用いられている通り、単語「含む」（及び含んでいるや「含んだ」等、「含む」のあらゆる形態）、「有する」（及び有しているや「有した」等、「有する」のあらゆる形態）、「包含する」（及び包含しているや「包含する」等、「包含する」のあらゆる形態）又は「含有する」（及び含有しているや「含有した」等、「含有する」のあらゆる形態）は、包括的又はオープンエンドであり、追加的な列挙されていない要素又は方法ステップを排除しない。
【００９９】
本明細書における用語「又はそれらの組合せ」は、該用語に先行する羅列した物品のあらゆる並べ替え及び組合せを意味する。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ又はそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣ、特定の文脈において順序が重要な場合は、さらにＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢのうち少なくとも１種を包含することを目的とする。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＭＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢその他等、１又は２以上の物品又は用語の繰り返しを含有する組合せが明らかに包含される。当業者であれば、通常、文脈からそうでないことが明らかでない限り、いかなる組合せにおいても物品又は用語の数には限界がないことを理解するであろう。
【０１００】
本明細書において、「およそ」、「実質的」又は「実質的に」等、これらに限定されない近似の単語は、このように修飾された場合、必ずしも絶対的又は完璧ではないが、提示されている通りの条件の指定を保証するのに当業者にとって十分に近いものであると考えられると理解される条件を意味する。記述が変動し得る範囲は、設定することのできる変化の大きさに依存し、依然として、修飾された特色を依然として修飾されていない特色に要求された特徴及び能力を有するものとして当業者に認識させる。一般に、だが先行する記述に鑑み、「およそ」等、近似の単語によって修飾された本明細書における数値は、記載の数値から少なくとも±１、２、３、４、５、６、７、１０、１２又は１５％変動し得る。
【０１０１】
本明細書において開示及び請求されているあらゆる組成物及び／又は方法は、本開示を踏まえて必要以上の実験法なしで作製及び実施することができる。好ましい実施形態に関して本発明の組成物及び方法を記載してきたが、当業者であれば、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法及び本明細書に記載されている方法のステップ又はステップの並び方を変化させてよいことが明らかであろう。当業者にとって明らかなこのような類似の代用物及び修正は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念の内にあると判断される。
【０１０２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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