(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−ＤＮＡポリメラーゼ
−デオキシヌクレオチド
−少なくとも一つのプライマーオリゴヌクレオチド
−ピレン又はスチルベンでの修飾を含むことを特徴とする、ランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチド、ここで、該修飾は、該ランダム化されたオリゴヌクレオチドの５'末端に位置する、
を含む組成物。
【請求項２】
−ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性であること、及び
−組成物が増幅プライマーのペアを含むこと、
を特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
標的核酸試料をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
−ＤＮＡポリメラーゼ、及び
−ピレン又はスチルベンでの修飾を含むことを特徴とする、ランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチド、ここで、該修飾は、該ランダム化されたオリゴヌクレオチドの５'末端に位置する、
を含むキット。
【請求項５】
該ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性であることを特徴とし、増幅プライマーのペアをさらに含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
−標的核酸を含むとされる試料を提供する工程、
−請求項１または２に記載の組成物を添加する工程、及び
−少なくとも第一のプライマー伸長反応を実施する工程
を含む、特定の標的核酸を増幅するための方法。
【請求項７】
該組成物が請求項２に記載の組成物であり、
核酸増幅反応を実施する工程をさらに含む、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該核酸増幅反応が、リアルタイムでモニターされるポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該増幅によって生成する増幅産物を融解曲線分析に供することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テンプレート依存性ポリメラーゼ触媒プライマー伸長反応の分野に関する。特に、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによる核酸増幅のための新規方法を提供する。より正確には、本発明は、不特定なプライマーダイマー増幅を回避することを特徴とする、ホットスタートＰＣＲを行うための新規方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術
核酸増幅およびより正確にはＰＣＲに関する主な問題は、不特定な増幅産物の生成である。多くの場合、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが周囲温度でも中程度に活性であるので、これは、実際の熱サイクリング手順自体の前の不特定なオリゴヌクレオチドプライミングおよびその後のプライマー伸長事象による。例えば、プライマーダイマー化が結局偶然生じ、その後、伸長することによる増幅産物が、頻繁に観察される。この問題を克服するために、増幅反応に必須の１つの成分を、反応混合物から分離するか、または反応混合物の温度を初めて上げるまで不活性状態に維持するかのいずれかである、いわゆる「ホットスタート」ＰＣＲを行うことは、周知である。ポリメラーゼが、これらの条件下では機能し得ないので、プライマーが非特異的に結合し得る期間の間、プライマー伸長は起きない。この効果を達成するために、いくつかの方法が適用される：
【０００３】
ａ）ＤＮＡポリメラーゼの物理的分離
物理的分離は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを含む区画を他の試薬の大部分を含む区画から分離する固体ワックスの障壁によって得られ得る。第１の加熱工程の間、次いで、ワックスは、自動的に溶解し、流体区画が混合される（非特許文献１、特許文献１）。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼが増幅反応の前に固体支持体に親和性固定され、熱媒介遊離によってのみ反応混合物中に遊離される（非特許文献２）。しかし、両方の方法は、時間を浪費し、実施するのが不便である。
【０００４】
ｂ）ＤＮＡポリメラーゼの化学修飾
この型のホットスタートＰＣＲのために、ＤＮＡポリメラーゼは、化学修飾の結果、可逆的に不活性化される。より正確には、熱に不安定なブロッキング基がＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに導入され、そのことによって、酵素が室温で不活性になる（特許文献２）。これらのブロッキング基は、プレＰＣＲ工程の間に高温で除去され、その結果、酵素が活性になる。例えば、かかる熱に不安定な修飾は、酵素のリジン残基にシトラコン酸無水物またはアコニット酸無水物を結合することによって得られ得る（特許文献３）。一方、かかる修飾を保持する酵素は、Amplitaq Gold（非特許文献３）またはFastStart DNAポリメラーゼ（Roche Molecular Biochemicals）として市販されている。しかし、ブロッキング基の導入は、酵素の立体的に利用できる全てのリジン残基上で任意に生じる。従って、化学修飾された酵素調製物の再現性および質は変わり得、ほとんど制御され得ない。
【０００５】
ｃ）ＤＮＡポリメラーゼの組換え改変
Ｔａｑポリメラーゼの冷感受性変異体が、遺伝子工学によって調製された。これらの変異体は、野生型酵素と、Ｎ末端を欠く点において異なる（特許文献４）。ネイティブまたは野生型組換えＴａｑポリメラーゼとは対照的に、これらの変異体は、３５℃未満で完全に不活性であり、従って、いくつかの場合においてホットスタートＰＣＲを行うために使用され得る。しかし、Ｎ末端短縮化冷感受性変異体型は、低塩バッファ条件を必要とし、野生型酵素と比較して、より低いプロセッシビティーを有し、従って、短い標的核酸の増幅のためにしか使用され得ない。さらに、短縮型形態は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損しているので、ＴａｑＭａｎ検出フォーマットに基づくリアルタイムＰＣＲ実験のために使用され得ない。
【０００６】
ｄ）核酸添加物によるＤＮＡポリメラーゼ阻害
非特異的にアニーリングしたプライマーの伸長は、短い二本鎖のＤＮＡ断片の添加によって阻害されることが示された（非特許文献４）。この場合、プライマー伸長は、短い二本鎖ＤＮＡ断片の融解点未満の温度で阻害されるが、競合体ＤＮＡそれ自体の配列には依存しない。しかし、過剰の競合体ＤＮＡが、どの程度、核酸増幅反応の収率に影響するかは知られていない。
【０００７】
あるいは、所定の二次構造を生じる特定の配列を有するオリゴヌクレオチドアプタマーが使用され得る。かかるアプタマーは、ＤＮＡポリメラーゼに対する非常に高い親和性についてＳＥＬＥＸ技術を使用して選択された（特許文献５及び非特許文献５）。実際の熱サイクリング過程自体の前に増幅混合物内にかかるアプタマーが存在すると、ＤＮＡポリメラーゼに対して高い親和性で結合し、その後、熱に不安定なその活性の阻害が生じる（特許文献６）。しかし、選択過程のために、これまでに入手可能な全てのアプタマーは、１つの特定の種のＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせでのみ使用され得る。
【０００８】
ｅ）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ抗体
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの熱に不安定な阻害を達成するための代替的なアプローチは、精製されたこの酵素に対して惹起されたモノクローナル抗体の添加である（非特許文献６、非特許文献７）。オリゴヌクレオチドアプタマーのように、この抗体は、周囲温度で高い親和性でＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに阻害様式で結合する（特許文献７）。複合体は、熱サイクリング過程自体の前のプレ加熱工程において、分離する。特に、迅速熱サイクリングのためのプロトコルが適用される場合、これは、全体として実質的な増幅の時間浪費的延長を導く（特許文献８）。
【０００９】
特許文献９では、不特定のプライマーダイマー中間体を消化するために、Ｔａｑポリメラーゼ以外に、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のエキソヌクレアーゼＩＩＩが、増幅混合物へのサプリメントとして添加される、ホットスタート抗体を使用するＰＣＲを実施するための特定の態様が開示される。上記に開示されるように、エキソヌクレアーゼＩＩＩは、例えば、標的／プライマー−ハイブリッドまたは標的／プライマー伸長産物ハイブリッド等の二本鎖ＤＮＡを基質として認識する。消化は、３’末端のデオキシヌクレオチド残基の５’位のリン酸ジエステル結合の切断によって起こる。従って、この型のエキソヌクレアーゼが周囲温度で活性なので、全ての不特定にアニーリングしたプライマーおよびプライマー伸長産物が消化される。このことは、いくつかの態様において、増幅産物の増大した特異性さえ生じる。さらに、プレインキュベーション時間の継続時間に依存する不特定にアニーリングしたプライマーの消化は、実質的かつ制御できないプライマー濃度の減少を導き得、これは、次いで、増幅反応自体に影響し得る。
【００１０】
ｆ）単独またはエキソヌクレアーゼと組み合わせての修飾プライマーの使用
特許文献１０および特許文献１１は、３’でブロックされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲ反応への添加を開示する。３’ブロックのために、これらのオリゴヌクレオチドは、プライマーとして作用し得ない。このブロックされたオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーと競合／相互作用するように設計され、このことは、非特異的産物の減少を生じる。
【００１１】
別の選択肢は、ＰＣＲ反応混合物中での、エキソヌクレアーゼＩＩＩと組み合わせてのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの使用である（特許文献１２）。この場合、通常、二本鎖ＤＮＡ基質および一本鎖ＤＮＡ基質を受容する３’エキソヌクレアーゼは、プライマーダイマーおよび持ち越しアンプリコン等の二本鎖アーティファクトを分解し、分解されていない一本鎖増幅プライマーを残す。同様に、塩基修飾された３’末端を有するプライマーおよび大腸菌エンドヌクレアーゼＩＶによるテンプレート依存性除去を使用することが示唆された（特許文献１３）。
【００１２】
一般的な概念の特定の態様は、特許文献１４に見出される。その明細書は、(i)熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼ、(ii)熱安定性３’−５’エキソヌクレアーゼ、および(iii)修飾された３’末端残基を有し、当該熱安定性ＤＮＡ−ポリメラーゼで伸長されない、核酸増幅のための少なくとも１つのプライマーを含む、核酸増幅反応を実施するための組成物、ならびにこの組成物を使用するＰＣＲ反応を実施する方法を開示する。
【００１３】
しかし、各ＰＣＲ反応について、修飾されたプライマーを必要とし、各個々のアッセイに対する費用の増大に関して、要件の増大を導くことが、開示された選択肢の主な欠点である。
【００１４】
ｇ）他のＰＣＲ添加物
ＤＭＳＯ、ベタイン、およびホルムアミド（特許文献１５、非特許文献８、非特許文献９）等の当該分野で公知の他の有機添加物は、プライマーダイマー形成の阻害より、ＧＣリッチ配列の増幅の改善を生じる。同様に、ヘパリンは、染色体ＤＮＡに接近可能にするために、ヒストン等のタンパク質をおそらく除去することによって、インビトロランオン（run-on）転写を刺激し得る（非特許文献１０）
【００１５】
一本鎖結合タンパク質（特許文献１６）またはｔＲＮＡ（非特許文献１１）の添加が、これらの添加物のプライマーへの非共有結合を生じさせることはまた、公知である。これらの添加物は、ＰＣＲの間に加熱されると破壊される。ＤＮＡへリカーゼの添加は、プライマーのランダムアニーリングを阻害することもまた見出された（非特許文献１２）。さらに、いくつかの場合、ポリ−グルタミン酸（特許文献１７）が、低温でポリメラーゼ活性を阻害するために、使用され得る。
【００１６】
さらに、ポリアニオン性ポリメラーゼインヒビターが、適用されたインキュベーション温度に依存して熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を制御し得ることは公知である。特許文献１８は、不活性なポリメラーゼ−インヒビター複合体が、４０℃未満の温度で形成されることを特徴とするホットスタート態様を開示する。４０℃〜５５℃で、インヒビターは、Ｔａｑポリメラーゼへの結合についてテンプレートＤＮＡと競合し、一方で、５５℃を超える温度で、インヒビターは、ポリメラーゼ活性部位から外れる。さらに、低いアニーリング温度を有するプライマーが使用される場合、インヒビターは、得られ得る生成物の収率を減少させる傾向にある。
【００１７】
ｈ）マグネシウム封鎖
熱安定性ポリメラーゼは、Ｍｇ2+カチオンの存在下のみで活性であると長い間公知であるので、熱サイクリングプロトコルの開始前のマグネシウムの封鎖は、プライマー伸長のミスプライミングおよび不特定化を避けるために試みられてきた。特許文献１９に開示されるように、Ｍｇ2+は、沈殿の形態で存在し得、従って、増幅反応の開始時に使用できないことがあり得る。第１回の熱サイクリングの間の温度上昇の際、この沈殿は溶解し、Ｍｇ2+は、最初の３サイクル以内に完全に使用可能になる。かかる解法は、かなり適用可能であり、良好なホットスタート結果を提供し得ることが示されてきた。他方、かかる解法は、核酸増幅反応を実施するのに必要なプライマーおよび標的核酸以外の全ての試薬を含むマスターミックスの調製を可能にしない。結果として、アッセイ間データ再現性およびデータ比較が複雑である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】US 5,411,876
【特許文献２】US 5,773,258
【特許文献３】US 5,677,152
【特許文献４】US 6,241,557
【特許文献５】US 5,693,502
【特許文献６】US 6,020,130
【特許文献７】US 5,338,671
【特許文献８】WO 97/46706
【特許文献９】US 5,985,619
【特許文献１０】EP 0 799 888
【特許文献１１】GB 2293238
【特許文献１２】EP 0 744 470
【特許文献１３】US 5,792,607
【特許文献１４】EP 1 275 735
【特許文献１５】WO 99/46400
【特許文献１６】US 5,449,603
【特許文献１７】WO 00/68411
【特許文献１８】US 6,667,165
【特許文献１９】US 6,403,341
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Chou, Q., et al., Nucleic Acids Res 20 (1992) 1717-23
【非特許文献２】Nilsson, J., et al., Biotechniques 22 (1997) 744-51
【非特許文献３】Moretti, T., et al., Biotechniques 25 (1998) 716-22
【非特許文献４】Kainz, P., et al., Biotechniques 28 (2000) 278-82
【非特許文献５】Lin, Y., and Jayasena, S. D., J Mol Biol 271 (1997) 100-11
【非特許文献６】Kellogg, D. E., et al., Biotechniques 16 (1994) 1134-7
【非特許文献７】Sharkey, D. J., et al., Biotechnology (N Y) 12 (1994) 506-9
【非特許文献８】Hengen, P. N., Trends Biochem Sci 22 (1997) 225-6
【非特許文献９】Chakrabarti, R., and Schutt, C. E., Nucleic Acids Res 29 (2001) 2377-81
【非特許文献１０】Hildebrand, C. E., et al., Biochimica et Biophysica Acta 477 (1977) 295-311
【非特許文献１１】Sturzenbaum, S. R., Biotechniques 27 (1999) 50-2
【非特許文献１２】Kaboev, O. K., et al., Bioorg Khim 25 (1999) 398-400
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
概略を述べた先行技術を考慮して、増幅過程自体の前だけでなく、熱サイクリング過程の間にも、不特定なプライミングおよびプライマー伸長の阻害を可能にするホットスタートＰＣＲのための改善された代替的組成物および方法を提供することが本発明の課題であった。より正確には、非特異的にアニーリングしたプライマーの伸長が起こらない、ホットスタートＰＣＲのための代替的組成物および方法を提供することが本発明の課題であった。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
即ち、本発明の要旨は、
〔１〕    −ＤＮＡポリメラーゼ
−デオキシヌクレオチド
−少なくとも一つのプライマーオリゴヌクレオチド
−有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とする、ランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチド
を含む組成物；
〔２〕    当該修飾が、当該ランダム化されたオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する、前記〔１〕に記載の組成物；
〔３〕    当該部分がピレン又はスチルベンのいずれか一方である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の組成物；
〔４〕      −ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性であること、及び
−組成物が増幅プライマーのペアを含むこと、
を特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の組成物；
〔５〕    標的核酸試料をさらに含む、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の組成物；
〔６〕    −ＤＮＡポリメラーゼ、及び
−有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とする、ランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチド、
を含むキット；
〔７〕    当該ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性であって、増幅プライマーのペアをさらに含むことを特徴とする、前記〔６〕に記載のキット；
〔８〕    −標的核酸を含むとされる試料を提供する工程
−前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の組成物を添加する工程
−少なくとも一つの第一のプライマー伸長反応を実施する工程
を含む、特定の標的核酸を増幅するための方法；
〔９〕    当該組成物が前記〔４〕に記載の組成物であって、
核酸増幅反応を実施する工程をさらに含む、
前記〔８〕に記載の方法；
〔１０〕    当該核酸増幅反応が、リアルタイムでモニターされるポリメラーゼ連鎖反応であることを特徴とする、前記〔９〕に記載の方法；並びに
〔１１〕    当該増幅によって生成する増幅産物を融解曲線分析に供することを特徴とする、前記〔７〕又は〔８〕に記載の方法；に関するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、特異性の増大したプライマー伸長反応を実施するための新規かつ改善された解法を提供する。特に、本発明は、特異性の改善した核酸増幅反応を実施するための新規かつ改善された開放を提供する。いわゆるホットスタート効果は、所望されないプライマー伸長の効果的な阻害を生じる。所望されないプライマー伸長は、核酸標的の実際のプライマー結合部位と異なる核酸試料中の任意の配列に、プライマーが少なくとも部分的にハイブリダイズする偶然のハイブリダイゼーション事象から生じる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１によるピレンでキャップされたヘキサマーの存在下でのゲノムＤＮＡの増幅。レーン１：添加物を伴わないＰＣＲ、５０ｎｇのＤＮＡレーン２：添加物を伴わないＰＣＲ、２５ｎｇのＤＮＡレーン３：添加物を伴わないＰＣＲ、１０ｎｇのＤＮＡレーン４：添加物を伴わないＰＣＲ、５ｎｇのＤＮＡレーン５：添加物を伴わないＰＣＲ、１ｎｇのＤＮＡレーン６：添加物を伴わないＰＣＲ、鋳型コントロールなしレーン７：添加物を伴うＰＣＲ、５０ｎｇのＤＮＡレーン８：添加物を伴うＰＣＲ、２５ｎｇのＤＮＡレーン９：添加物を伴うＰＣＲ、１０ｎｇのＤＮＡレーン１０：添加物を伴うＰＣＲ、５ｎｇのＤＮＡレーン１１：添加物を伴うＰＣＲ、１ｎｇのＤＮＡレーン１２：添加物を伴うＰＣＲ、鋳型コントロールなし
【図２】実施例２によるピレンでキャップされたヘキサマーの存在下でのゲノムＤＮＡの増幅。レーン１：Ｔａｑポリメラーゼ、３０ｎｇのＤＮＡレーン２：Ｔａｑポリメラーゼ、３ｎｇのＤＮＡレーン３：Ｔａｑポリメラーゼ、０．３ｎｇのＤＮＡレーン４：Ｔａｑポリメラーゼ、ピレンでキャップされたヘキサマー、３０ｎｇのＤＮＡレーン５：Ｔａｑポリメラーゼ、ピレンでキャップされたヘキサマー、３ｎｇのＤＮＡレーン６：Ｔａｑポリメラーゼ、ピレンでキャップされたヘキサマー、０．３ｎｇのＤＮＡ
【図３】実施例４によるピレン−又はスチルベンでキャップされたオクタマーの存在下での増幅。レーン１〜６：５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ及び０ｎｇのヒトＤＮＡをそれぞれ伴う、添加物の非存在下で形成されたＰＣＲ産物。レーン７〜１２：５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ及び０ｎｇのヒトＤＮＡをそれぞれ伴う、１００μＭのピレンでキャップされたオクタマーの存在下で形成されたＰＣＲ産物。レーン１３〜１８：５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ及び０ｎｇのヒトＤＮＡをそれぞれ伴う、１００μＭスチルベンでキャップされたオクタマーの存在下で形成されたＰＣＲ産物。
【図４】実施例７によるリアルタイムＰＣＲ融解曲線分析。図４ａ  種々の量のゲノムＤＮＡ上でのＰＣＲ及びピレンでキャップされたヘキサマー非存在下での融解曲線分析。図４ｂ  種々の量のゲノムＤＮＡ上でのＰＣＲ及びピレンでキャップされたヘキサマー存在下での融解曲線分析。
【図５】実施例９によるリアルタイムＲＴ  ＰＣＲ。５ａ：キャップされたヘキサマー存在下での第一鎖ｃＤＮＡ合成、及びそれに続くキャップされたヘキサマー非存在下でのＰＣＲ、５ｂ：キャップされたヘキサマー存在下での第一鎖ｃＤＮＡ合成、及びそれに続くキャップされたヘキサマー存在下でのＰＣＲ、５ｃ：キャップされたヘキサマー非存在下での第一鎖ｃＤＮＡ合成、及びそれに続くキャップされたヘキサマー非存在下でのＰＣＲ、５ｄ：キャップされたヘキサマー非存在下での第一鎖ｃＤＮＡ合成、及びそれに続くキャップされたヘキサマー存在下でのＰＣＲ。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の簡単な説明
従って、第１の局面において、本発明は、
−ＤＮＡポリメラーゼ
−デオキシヌクレオチド
−少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド、および
−有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とする、ランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチド
を含む組成物を提供する。
【００２５】
プライマーダイマー等のアーティファクトの増幅産物の形成が回避されるので、かかる組成物は、ＰＣＲ増幅反応の性能のために特に有用である。
【００２６】
好ましくは、当該修飾は、当該ランダム化されたオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。また、好ましくは、当該修飾の当該有機疎水性部分は、ピレンまたはスチルベンのいずれかである。
【００２７】
１つの特定の態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。そうである場合、組成物は、１つのプライマーのみを含むのではなく、少なくとも１対の増幅プライマーを含み得る。
【００２８】
さらに、上記に定義される組成物のいずれかが標的核酸試料をさらに含む場合、それはまた、本発明の範囲内である。
【００２９】
第２の局面において、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ、および有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とするランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。好ましくは、当該修飾は、当該ランダム化されたオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する（キャップされたランダマー）。また、好ましくは、当該修飾の当該有機疎水性部分は、ピレンまたはスチルベンのいずれかである。
【００３０】
特定の態様において、当該キットは、当該ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。そうである場合、キットは、１つのプライマーのみを含むのではなく、少なくとも１対の増幅プライマーを含み得る。
【００３１】
第３の局面において、本発明は、特定の標的核酸上でプライマーを伸長するための方法を提供し、当該方法は、
−当該標的核酸を含むとされる試料を提供する工程
−上記に開示される組成物のいずれかを添加する工程、および
−少なくとも第１のプライマー伸長反応を実施する工程
を含む。
【００３２】
特に、本発明は、特定の標的核酸の増幅のための方法を提供し、当該方法は、
−当該標的核酸を含むとされる試料を提供する工程
−熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび１対の増幅プライマーを含む、上記に開示される組成物を添加する工程、ならびに
−核酸増幅反応を実施する工程
を含む。
【００３３】
好ましくは、当該核酸増幅反応は、リアルタイムでモニターされるポリメラーゼ連鎖反応である。特定の態様において、当該増幅によって生成された増幅産物は、その後、融解曲線分析に供される。
【００３４】
発明の詳細な説明
本発明は、特異性の増大したプライマー伸長反応を実施するための新規かつ改善された解法を提供する。特に、本発明は、特異性の改善した核酸増幅反応を実施するための新規かつ改善された開放を提供する。いわゆるホットスタート効果は、所望されないプライマー伸長の効果的な阻害を生じる。所望されないプライマー伸長は、核酸標的の実際のプライマー結合部位と異なる核酸試料中の任意の配列に、プライマーが少なくとも部分的にハイブリダイズする偶然のハイブリダイゼーション事象から生じる。
【００３５】
従って、本発明は、
−ＤＮＡポリメラーゼ
−デオキシヌクレオチド
−少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド、および
−有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とする、ランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチド
を含む。
【００３６】
ＤＮＡポリメラーゼは、一般的に、テンプレート依存性プライマー伸長反応を実施し得る任意の酵素であり得る。かかるテンプレート依存性プライマー伸長反応は、遊離３’ヒドロキシ基を有するプライマー核酸が一本鎖５’突出を有するテンプレート核酸とハイブリダイズすることを特徴とする、全ての部分的二本鎖核酸ハイブリッド上で起こり得る。次いで、テンプレート依存性ポリメラーゼは、テンプレート鎖内の向かい側の位置のヌクレオチドにいつも相補的なヌクレオチド残基を組み込むことによって、プライマーの３’末端の伸長を触媒する。反応は、基質として、ｄＮＴＰを使用し、ピロリン酸の放出を生じる。
【００３７】
１つの態様において、当該ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡテンプレート依存性ポリメラーゼであるか、またはその任意の修飾体である。かかる酵素は、通常、逆転写酵素と呼ばれる。例は、ＡＭＶ逆転写酵素またはＭＭＬＶ逆転写酵素である。特に、Transcriptor Reverse Transcriptase (Roche Applied Science cat. No: 03 531 317 001)は、本発明の文脈に適用できる酵素である。かかるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む本発明の組成物は、調製的および分析的ｃＤＮＡ合成の全ての種類および適用、ならびに、特に、２−ステップＲＴ−ＰＣＲに特に有用である。
【００３８】
別の態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはその任意の変異体もしくは修飾体である。１つの顕著な例は、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼ（Roche Applied Science Cat. No. 11 008 404 001）である。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼまたはその任意の変異体もしくは修飾体である。典型的な例は、サーマス  アクアティカス（Thermus aquaticus）由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Roche Applied Science Cat. No: 11 647 679 001）である。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、Pwo Polymerase (Roche Applied Science Cat. No: 11 644 947 001)のような３’−５’校正活性を有してもよいし、有さなくてもよい。さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼ成分は、Expand High Fidelity system (Roche Applied Science Cat. No: 11 732 641 001)等の校正活性を有する酵素および有さない酵素の混合物であり得る。任意の種類の熱安定性ポリメラーゼを含む本発明の組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の種々の調製的または分析的態様を実施するために有用である。
【００３９】
さらなる態様において、本発明のＤＮＡポリメラーゼ成分は、サーマス  アクアティカス由来のポリメラーゼ（Roche Applied Science Cat. No: 11 480 014 001）等のさらなるＲＮＡテンプレート依存性逆転写酵素活性を有する熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、逆転写酵素）および熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの混合物である。かかる成分を含む本発明の組成物は、ワンステップＲＴ−ＰＣＲの分析的性能に特に有用である。
【００４０】
デオキシヌクレオチド−トリホスフェート（ｄＮＴＰ）は、通常、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの混合物であるが、いくつかの特定の例において、３以下のみの異なる種類のｄＮＴＰが使用され得る。さらに、当該ビルディングブロック（修飾されたｄＮＴＰ）が、ポリメラーゼによって、生成されつつあるポリヌクレオチド鎖になお組み込まれ得る限り、かかるｄＮＴＰは、任意の方法で化学的に修飾され得る。例えば、当該修飾ヌクレオチド化合物は、それぞれの塩基部分にビオチンまたは蛍光化合物修飾体を保持し得る。
【００４１】
少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチドは、通常、標的核酸の特定の領域に完全にまたはほぼ完全に相補的なデオキシ−オリゴヌクレオチドである。さらに、当該プライマー部分は、遊離３’ヒドロキシル基を有しているに違いないので、それは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長可能である。特定の目的のために、かかるプライマーは、例えば、その３’末端で化学的に修飾され得る。頻繁に使用される修飾に関する例は、ビオチン標識、ジゴキシゲニン標識、および蛍光標識である。
【００４２】
熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＰＣＲ反応について設計される場合、本発明の組成物は、通常、増幅されることになっている標的配列の近傍で、標的核酸の向かい合っている鎖に反対向きにハイブリダイズする２つのプライマーオリゴヌクレオチドを含む。本発明の組成物が、マルチプレックスＰＣＲ増幅のための多数の対のオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを含むことも可能である。
【００４３】
本発明の組成物と当該分野で現在使用されている組成物とを区別する重要な化合物は、有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とするランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチドの添加である。より正確には、用語「ランダム化されたオリゴヌクレオチド」は、その配列が、４つの異なるヌクレオチド残基の全ての可能な組み合わせを事実上等しく示すオリゴヌクレオチドのプールをいう。５マーの添加および８マーの添加は、所望のホットスタート効果を有することが示されているが、ランダム化されたヘキサマーオリゴヌクレオチドが使用される場合、特別の利点を有することが明らかになった。当該ランダム化されたオリゴヌクレオチドは、１０μＭ〜１ｍＭ、好ましくは２５μＭ〜４００μＭの濃度範囲、最も好ましくは約１００μＭの濃度で、プライマー伸長反応またはＰＣＲ反応に添加され得る。ランダム化されたオリゴヌクレオチドが、例えば、リン酸部分によってブロックされ得る伸長可能でない３’末端を有する場合、特別な利点を有することがまた示された。これは、試料核酸の任意の領域でのいずれかのオリゴヌクレオチドの偶然のハイブリダイゼーションが生じた場合に、ポリメラーゼによる所望されない伸長を回避する。
【００４４】
ランダム化されたオリゴヌクレオチドは、有機疎水性部分で化学的に修飾される。当該部分は、通常、いずれの型のプライマー伸長反応にも干渉しない。例えば、かかる有機疎水性部分は、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、ピレン、アントラキノン類、カルバゾールフェナントロリン類、キノリン類等のような縮合重合芳香環および芳香族複素環からなる、部分の群、またはスチルベン、またはコレステロール等のステロイドから選択され得る。かかる疎水性部分は、シアノ、メトキシ、メチル、ニトロ、およびハロゲン等の大きくない置換基によって置換され得、末端塩基対を安定化するためのいわゆる「キャップ」として作用することが一部で知られている。Narayanan, S., et al., Nucleic Acids Research 32(9) (2004) 2901-2911; Dogan, Z., et al., Journal of the American Chemical Society 126(15) (2004) 4762-4763。
【００４５】
最も好ましくは、かかる有機疎水性部分は、任意に置換されたピレンまたは任意に置換されたスチルベンのいずれかであり、これらは、以下の化学構造：
【化１】
0005457055.tif 000002
を有する。
【００４６】
最も好ましくは、かかるピレンまたはスチルベンは、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの５’末端に結合され、かかるオリゴヌクレオチドの５’末端は、以下の構造：
【化２】
0005457055.tif 000003
または
【化３】
0005457055.tif 000004
を有する。
【００４７】
有機疎水性部分は、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの任意の部分に位置し得る。しかし、好ましくは、当該修飾は、ランダム化されたオリゴヌクレオチドの５’末端に導入される。理由は、かかる５’修飾は、当該分野で周知である標準的な方法に従って適切な末端ホスホロアミダイトを用いたホスホロアミダイト化学を使用してオリゴヌクレオチドに導入し得るからであり、ピレンおよびスチルベンホスホロアミダイトは、市販されているからである。
【００４８】
ランダム化されたオリゴヌクレオチドは、７デアザｄＧ等の７デアザアナログ、７ブロモ７デアザ８アザ２アミノｄＡ等の７デアザ８アザアナログ等の修飾された塩基、もしくはプロピニルＵ、プロピニルＣ等の置換塩基を有する核酸塩基アナログ、または２’メトキシリボース等の修飾された糖もしくはＬＮＡ中等のロックされた糖を有するアナログ、またはヘキシトールおよびアルトリトールなどのリボースアナログを含み得る。ユニバーサル塩基はランダマーの一つの位置にのみ用いられることが好ましいのに対して、ランダム化に代えて、ニトロインドールまたはＮ８リボシル化−７デアザ８アザｄＡのようなユニバーサル塩基が用いられる。ヌクレオシド間リン酸は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートまたはホスホロアミダイト等のリン酸模倣物によって置換され得る。ランダム化されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは、１つの疎水性部分を有するが、他の疎水性部分によってさらに置換され得、一方、疎水性部分は、互いに対して独立して選択される。
【００４９】
ＤＮＡ依存性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１対の増幅プライマーと共に、有機疎水性部分で化学的に修飾されたランダム化されたオリゴヌクレオチドを含むこれらの組成物は、ＰＣＲ増幅反応の性能に特に有用である。理由は、当該ランダム化され、かつ修飾されたオリゴヌクレオチドの存在が、それぞれの増幅プライマーの、アニーリング温度未満の温度でのプライマーダイマー等のアーティファクトの増幅産物の形成を阻害し、それによって、ホットスタート効果を生じるからである。
【００５０】
上記される組成物のいずれかが、標的核酸試料をさらに含む場合、それはまた、本発明の範囲内である。試料は、通常、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと共にゲノムＤＮＡもしくは断片化ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼと共に全細胞ＲＮＡもしくはポリ−Ａ＋ＲＮＡを含み得る。
【００５１】
１つの特定の態様において、本発明はまた、上記に詳細に開示される組成物を調製するためのキットを提供する。従って、本発明はまた、少なくともＤＮＡポリメラーゼおよび有機疎水性部分での修飾を有することを特徴とするランダム化された５〜８マーオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。好ましくは、当該修飾は、上記に開示される例のいずれかであり、当該ランダム化されたオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。さらに、キットは、それぞれのプライマー伸長反応を実施するのに有用な、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）および適切なバッファならびに他の試薬添加物等のさらなる成分を含み得る。さらに、パラメーター特異的キットは、少なくとも１つの標的特異的プライマーオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００５２】
第１の特定の態様において、キットは、ｃＤＮＡ合成のために設計され、上記に開示されるように逆転写酵素を含む。プライマー成分として、キットは、特異的ｃＤＮＡの増幅のためのパラメーター特異的プライマーを含み得る。
【００５３】
第２の特定の態様において、キットは、ＰＣＲを実施するために設計され、ＤＮＡ依存性熱安定性ポリメラーゼ、またはＤＮＡ依存性熱安定性ポリメラーゼの混合物を含む。その上、キットは、例えば、ｄＮＴＰおよび／またはバッファ溶液および／または少なくとも１つもしくは複数の対の増幅プライマーをさらに含む。より具体的には、キットが、ワンステップＲＴ−ＰＣＲのために設計される場合、酵素成分は、逆転写酵素活性をさらに含むＤＮＡ依存性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。
【００５４】
第３の特定の態様において、キットは、２−ステップＲＴ−ＰＣＲのために設計され、上記に開示される第１および第２の態様の成分から選択される成分の種々の組み合わせを含み得る。
【００５５】
さらに、第２および第３の特定の態様によるキットは、ＰＣＲ増幅産物の検出に有用な成分を含み得る。例えば、キットが、リアルタイムＰＣＲ（＝ｑＰＣＲ）のために設計される場合、かかるキットは、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（Roche Applied Science Cat. No: 04 707 516 001）またはＬＣ４８０  ＲｅｓｏＬＩｇｈｔ色素（Roche Applied Science Cat. No: 04 909 640 001）等の二本鎖ＤＮＡ結合色素成分をさらに含み得る。あるいは、かかるキットは、ＴａｑＭａｎプローブ（US 5,804,375）、分子ビーコン（US 5,118,801）、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ（US 6,174,670）、またはシンプルプローブ（Simple Probe）（WO 02/14555）等の蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブをさらに含み得る。
【００５６】
本発明は、組成物及びキットのみに関するのではなく、一般的にはプライマー伸長反応を実施する方法及び特にＰＣＲ反応又は逆転写反応を実施する方法にも関する。従って、その最も広い意味において、本発明による方法は、
−当該標的核酸を含むとされる試料を提供する工程、
−上記に開示されたような組成物のいずれかを添加する工程、及び
−少なくとも一つの第一のプライマー伸長反応を実施する工程、
を含む。
【００５７】
より正確には、本発明による方法は、
−当該標的核酸を含むとされる試料を提供する工程、
−次のものを添加する工程、
−ＤＮＡポリメラーゼ
−デオキシヌクレオチド
−少なくとも一つのプライマーオリゴヌクレオチド、及び
−有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とする、ランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチド、
−少なくとも一つの第一のプライマー伸長反応を実施する工程、
を含む。
【００５８】
第一の態様においては、試料はトータルＲＮＡ又はポリＡ＋ＲＮＡのいずれか一方であり、ＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素であり、そしてプライマーオリゴヌクレオチドは特定のタイプのｃＤＮＡに相補的な特異的プライマーである。
【００５９】
第二の態様においては、試料はゲノムＤＮＡに由来し、ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ又は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの混合物であり、増幅プライマーの少なくとも一つのペア又は複数のペアがＰＣＲ増幅反応の前に添加される。好ましくは、当該核酸増幅反応は、当該技術分野で公知の標準的な方法によりリアルタイムでモニターされるポリメラーゼ連鎖反応である（例えば、US 5,210,015、US 5,338,848、US 5,487,972、WO 97/46707、WO 97/46712、WO 97/46714を参照）。
【００６０】
特定の態様においては、生成される増幅産物は、増幅産物を経時的な温度勾配に供することによって融解曲線分析(US 6,174,670, US6,569,627)に供される。このタイプの実験において、蛍光強度がモニターされ、これは、それぞれに標識されたハイブリダイゼーションプローブの結合か、又はＤＮＡ結合色素に由来する蛍光のいずれか一方に起因する。次いで、ハイブリダイゼーションプローブ又はアンプリコンの二本の鎖のそれぞれの融解による蛍光強度の低下の一次導関数が、温度勾配に対してプロットされる。実施例に示されるように、次の増幅プロセスの間に有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とするランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチドの存在は、より質の高い融解曲線の結果を提供する。
【００６１】
要約すれば、本発明の方法が、当該分野で既に開示された方法を超えるいくつかの利点を有することを記載することができる。逆転写若しくはＰＣＲ又はRT-ＰＣＲ等のプライマー伸長反応の間に有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とするランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチドの存在は、それぞれの反応の特異性を高めるという結果を明確に与える。
【００６２】
現在までのところ、本発明者らはこの肯定的な効果についての一つ又は複数の理由を完全に理解しているわけではない。一つのあり得る力学上の説明は、低温では、ランダム化されたオリゴヌクレオチド分子の集団の一部が、たとえより長い実質的に相補的な核酸分子に既にアニーリングしたとしても、プライマーが伸長され得ない程度まで、プライマーと相互作用し得るということであり得る。
【００６３】
本発明の一つの主要な利点は、使用の容易さ及び低温でのポリメラーゼの阻害を解消するための活性化時間の短さである。単に、有機疎水性部分での修飾を含むことを特徴とするランダム化された５〜８マーのオリゴヌクレオチドは、設定されたＰＣＲ反応に添加されることが必要である。ＰＣＲ熱サイクルの間に、通常二本鎖ＤＮＡ鋳型を一本鎖に分離することが要求される最初のサイクルの前の変性時間は、コンジュゲート化したランダマーとＰＣＲプライマーとの間の相互作用を解消するのに十分である。
【００６４】
さらに、当該技術分野で十分に確立された標準的なホスホルアミデート化学の方法により、ランダム・ヘキサマー(random hexamer)を合成することができる。さらに、標準的な方法によって非常に容易にそれぞれ修飾された末端ホスホルアミデートを用いるホスホルアミデート化学を利用して、５’修飾体をオリゴヌクレオチドに導入することもできる。従って、その他のホットスタートの解法と比較すると、本発明のＰＣＲ添加物のための生産コストは極めて低い。
【００６５】
さらに、調製され、増幅され、検出され又は分析されるべき具体的な標的核酸配列が何であるかに関わらず、本発明の方法、組成物及びキットをあらゆる種類のプライマー伸長反応、逆転写又はＰＣＲ増幅に一般的に用いることができる。
【００６６】
以下の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順において改変がなされ得ることが理解される。
【実施例】
【００６７】
実施例
固体支持体としての市販のホスフェートCPG（2-[2-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシ)エチルスルホニル]エチル-2-スクシノイル)-長鎖アルキルアミノ-CPG）及び標準的なdA(bz)、dT、dG(iBu)、dC(Bz)ホスホルアミデートの等モル濃度（総濃度０．１ｍｏｌ）混合物を用い、トリチルオフモード(trityl off mode)にて、ABI394シンセサイザー上での標準的な方法によって、ランダム化されたオリゴヌクレオチドを１０マイクロモルスケールで合成し、アンモニア又はＮａＯＨを用いた標準的な条件下で脱保護を行い、そして透析によって産物を脱塩した。
【００６８】
実施例１
５’ピレンでキャップされたヘキサマーをＤＮＡ増幅において分析した。５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ及び０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰのそれぞれ、０．４μＭのプライマー（配列番号：１  ATT AGA GAA CCA TGT TAA CAC TAC CG及び配列番号：２  GAG GTG AAT GAC CAC TGT TTA TTT TC）並びに２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む５０μＬの反応液内で、１００μＭのピレンでキャップされたヘキサマーの存在下又は非存在下でＰＣＲ反応を実施した。以下のサイクル条件を用いた：９４℃で４分間の初期変性、及び９４℃で２０秒間の変性、６２℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の伸長を伴う３５サイクル、及び７２℃で７分間の最終伸長工程。アガロースゲル上で増幅産物を分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。
【００６９】
図１に描かれた結果から、ピレンでキャップされたヘキサマー存在下で増幅特異性が明確に改善されたことが示される。
【００７０】
実施例２
５’ピレンでキャップされたヘキサマーをリアルタイムＰＣＲにおいて分析した。３０ｎｇ、３ｎｇ又は０．３ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６、０．２ｍＭのＣＨＡＰＳ、１ｍＭのＢｉｇＣｈａｐ、２０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．４μＭのプライマー（配列番号：３  GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GC及び配列番号：４  GAA TCT CCA TTC ATT CTC AAA AGG ACT）、０．２ｍＭのデオキシヌクレオチド、並びに２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む２０μＬの反応液内で、ピレンでキャップされたヘキサマーの存在下又は非存在下でのＰＣＲ反応を実施した。以下のサイクル条件を用いてLightCycler（登録商標）480装置でＰＣＲを実施した：９５℃で２分間の初期変性並びに９５℃で１秒間の変性、６５℃で１０秒間のアニーリング及び７２℃で１０秒間の伸長を伴う４５サイクル。アガロースゲル上で増幅産物を分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した（図２）。この結果から、ピレンでキャップされたヘキサマーにより、増幅特異性が明確に改善されることが示される。
【００７１】
実施例３
実施例２に記載されたものと同じ実験の設定にて、５’ピレンでキャップされたペンタマーを分析した。試験された最終濃度は、５０μＭ、１００μＭ、１５０μＭおよび２００μＭであった。コントロール反応（添加物の非存在下）において種々のＰＣＲ産物が形成され、その一方、漸増量のピレンでキャップされたペンタマーの存在下、所望の産物が収量の増加を伴って形成された。特異性及び感度は、添加物非存在下のコントロール実験よりも有意に高かった（示さず）。
【００７２】
実施例４
実施例１に記載されたものと同じＰＣＲ緩衝液を用いて、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ及び０ｎｇのヒトＤＮＡを用いるヒトコラーゲンの遺伝子断片の増幅において、５’ピレンでキャップされたオクタマー及びスチルベンでキャップされたオクタマーを１００μＭの最終濃度にて試験した。ＰＣＲプライマー（配列番号：５  TAA AGG GTC ACC GTG GCT TC及び配列番号：６  CGA ACC ACA TTG GCA TCA TC）を０．４μＭの濃度で用いた。総反応体積は５０μＬであった。９４℃で４分間の初期変性、９４℃で２０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で４分間を伴う３５サイクル、及び７２℃で７分間の最終伸長工程によるＰＣＲのサイクルを、ブロックサイクラー(block cycler)で実施した。
【００７３】
結果は図３に描かれる。添加物の非存在下で、約５５０ｂｐの不特定な産物が形成される。この不特定な産物は、キャップされたオリゴヌクレオチドの存在下では観察されない。スチルベンでキャップされたオクタマーが、ゲルの底部での強い蛍光をもたらす。
【００７４】
実施例５
５’ピレンでキャップされたモノマーをリアルタイムＰＣＲにおいて分析した。ピレンでキャップされたモノマー（４００μＭまで）又はピレンでキャップされたヘキサマー（４００μＭまで）の存在下又は非存在下におけるＰＣＲ反応を、３０ｎｇ、３ｎｇ、０．３ｎｇ、０．０３ｎｇ、０．０１ｎｇ及び０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６、０．２ｍＭのＣＨＡＰＳ、１ｍＭのＢｉｇＣｈａｐ、２０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．４μＭのプライマー（配列番号：７  CAC CCC GTG CTG CTG ACC GA及び配列番号：８  AGG GAG GCG GCC ACC AGA AG）、０．２ｍＭのデオキシヌクレオチド、並びに２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む２０μＬの反応液内で実施した。以下のサイクル条件を用いてLightCycler（登録商標）480装置でＰＣＲを実施した：９５℃で２分間の初期変性並びに９５℃で１秒間の変性、６５℃で１５秒間のアニーリング及び７２℃で５秒間の伸長を伴う４５サイクル。アガロースゲル上で増幅産物を分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。この結果から、ピレンでキャップされたヘキサマーにより増幅特異性が明確に改善されることが示されるが、コントロール反応と比較して、ピレンでキャップされたモノマーによる特異性の上昇が無いこと（示さず）が示される。
【００７５】
実施例６
５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ及び０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡを用いるヒトコラーゲンの遺伝子断片の増幅において、実施例１で示されたものと同じＰＣＲ緩衝液を用いて、５’末端に有機分子を伴わない３’リン酸化ヘキサマーを２００μＭまでの最終濃度で試験した。ＰＣＲプライマー（配列番号：５  TAA AGG GTC ACC GTG GCT TC及び配列番号：６  CGA ACC ACA TTG GCA TCA TC）を０．４μＭの最終濃度で用いた。総反応体積は５０μＬであった。９４℃で４分間の初期変性、９４℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で４分間を伴う３５サイクル並びに７２℃で７分間の最終伸長工程によるＰＣＲサイクルを、ブロックサイクラーで実施した。アガロースゲル上で増幅産物を分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。この結果から、たとえヘキサマーが存在していようと又は存在していまいとに関わらず、ＰＣＲ産物の組成物に相違がないこと（示さず）が示される。
【００７６】
実施例７
リアルタイムＰＣＲで、５’ピレンでキャップされたヘキサマーを分析した。ピレンでキャップされたヘキサマーの存在下又は非存在下におけるＰＣＲ反応を、３０ｎｇ、３ｎｇ、０．３ｎｇ、０．０３ｎｇ、０、０１ｎｇ及び０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６、０．２ｍＭのＣＨＡＰＳ、１ｍＭのＢｉｇＣｈａｐ、２０ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ2、０．４μＭのプライマー（配列番号：３  GGA AGT ACA GCT CAG AGT TCT GC及び配列番号：４  GAA TCT CCA TTC ATT CTC AAA AGG ACT）、０．２ｍＭのデオキシヌクレオチド、及び２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ並びにSYBR Green(1:40000)を含む２０μＬの反応液内で実施した。以下のサイクル条件を用いてLightCycler（登録商標）480装置でＰＣＲを実施した：９５℃で２分間の初期変性並びに９５℃で１秒間の変性、６５℃で１０秒間のアニーリング及び７２℃で１０秒間の伸長を伴う４５サイクル。特異的産物及び不特定な産物の相対的な定量化のために、LightCycler（登録商標）480に推奨されたプロトコルに従って、融解曲線分析を実施した。結果を図４に示す。添加物の非存在下（図４Ａ）では多量の不特定な産物が形成され、添加物の存在下（図４Ｂ）では不特定な産物は強く減少する。
【００７７】
実施例８
５’ピレンでキャップされたヘキサマーもＲＴ−ＰＣＲに使用可能かどうかを試験する目的で、別のＤＮＡポリメラーゼと共に添加物がＰＣＲ反応のｃｐ値に与える影響を調べた。従って、本出願人は、Ｔｔｈポリメラーゼに基づくLightCycler（登録商標）480 RNA Master Hydrolysis Probes（Roche Applied Science社、カタログ番号04991885001）を用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。２０μＬの反応混合物は、それぞれ１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、０．１ｐｇ及び０ｐｇのヒト肝細胞由来のトータルＲＮＡ、７．４μＬのＲＮＡマスター、３．２５ｍＭの酢酸マンガン、０．５μＭの各プライマー（配列番号：９  TGCAGCCTCCATAACCATGAG及び配列番号：１０  GATGCCTGCCATTGGACCTA）並びに０．２５μＭの加水分解プローブ（配列番号：１１  FAM-GATGCCTGCCATTGGACCTA-TAMRA）を含有した。ピレンでキャップされたヘキサマーの非存在下か、又は５０μＭ、１００μＭ若しくは２００μＭのピレンでキャップされたヘキサマーを用いて、反応を実施した。製造業者により推奨されたプロトコルに従って、LightCycler（登録商標）480装置でＲＴ−ＰＣＲを実施した。ｃｐ値を表１に示す。ピレンでキャップされたヘキサマーは、交点に影響を与えなかった。増幅シグナルの遅延又は感度の低下もない。
【００７８】
【表１】
0005457055.tif 000005
【００７９】
実施例９
特異性の上昇がｃＤＮＡ合成においても観察され得るかどうかを評価する目的で、本出願人は、ワンステップＲＴ−ＰＣＲの条件に近い反応設定がされたツーステップＲＴ−ＰＣＲ実験を実施した。並行して四つの反応を実施した：
(a)キャップされたランダム・ヘキサマーを伴わない第一鎖ｃＤＮＡ合成、それに続くキャップされたランダム・ヘキサマー存在下でのＰＣＲ、
(b)５’キャップされたランダム・ヘキサマーを伴わない第一鎖ｃＤＮＡ合成、それに続くキャップされたランダム・ヘキサマー非存在下でのＰＣＲ、
(c)５’キャップされたランダム・ヘキサマー存在下での第一鎖ｃＤＮＡ合成、それに続くキャップされたランダム・ヘキサマー非存在下でのＰＣＲ、
(d)５’キャップされたランダム・ヘキサマー存在下での第一鎖ｃＤＮＡ合成、それに続くキャップされたランダム・ヘキサマー存在下でのＰＣＲ。
【００８０】
ＲＴ−ＰＣＲ反応において少量のＲＮＡが存在する場合に不特定な産物の形成を引き起こすプライマーペアを選択した：G6PDH forw（配列番号：１２  GCA AAC AGA GTG AGC CCT TC）及びG6PDH rev（配列番号：１３  GGG CAA AGA AGT CCT CCA G）プライマー。０．５μＭのプライマー、０．６単位のTranscriptor（Roche Applied Sciences社、カタログ番号：03531317001）、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６；３ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、２０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＣＨＡＰＳＯ、１ｍＭのＢｉｇＣｈａｐ、１２５ｎｇ／ｍＬのＴ４遺伝子３２タンパク質、最終希釈率が1:20000のSYBR Green及び１０ｐｇのＨｅＬａ細胞由来のトータルＲＮＡを含む２０μＬの反応液中でｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成のための二つの試料を調製し、一方は１００μＭのピレンでキャップされたヘキサマーを伴い、他方はピレンでキャップされたヘキサマーを伴わなかった。反応液を５０℃で１０分間、９５℃で２分間インキュベートし、氷上で冷却した。ｃＤＮＡ反応混合物について記載されたものと同じ緩衝液にて、２μＬのｃＤＮＡ反応混合物、０．５μＭのプライマー、１．２単位のＴａｑポリメラーゼを用い、１００μＭの最終濃度で追加のピレンでキャップされたヘキサマーの存在下又は非存在下で、２０μＬの反応体積でＰＣＲを実施した。LightCycler（登録商標）480装置で反応液を、９５℃で２分間及び９５℃／１０秒間、６０℃／１０秒間、７２℃／１３秒間の４５サイクルでインキュベートした。増幅産物の融解プロフィールを、図５ａ〜ｄに示す。ｃＤＮＡ合成の間にピレンでキャップされたヘキサマーが存在した場合の反応液において（５ａ及び５ｂ）、予想された融点を伴った一つの産物が形成された。ピレンでキャップされたヘキサマーの非存在下でｃＤＮＡ合成を実施した場合（５ｃ及び５ｄ）、特異的産物の融点とは異なる融点を有するいくつかの産物が生成された。この結果から、ＲＮＡの逆転写の間に、ピレンでキャップされたヘキサマーが不特定な産物の形成を抑制し得ることが示される。
【００８１】
実施例１０
プライマーのうちの一つ（ピレン-CGGTAG-3'ホスフェート）の３’末端と６塩基対の重複を伴う１００μＭの５’ピレンでキャップされたヘキサマーを、ＤＮＡ増幅においてプライマー（ピレン-CTTTTA-3'ホスフェート）と非相補的な１００μＭの５’ピレンでキャップされたヘキサマーと並行して分析した。５０μＬの反応液において、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ及び０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ、３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．６、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、５０ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのｄＮＴＰのそれぞれ、０．４μＭのプライマー（配列番号：１  ATT AGA GAA CCA TGT TAA CAC TAC CG及び配列番号：２  GAG GTG AAT GAC CAC TGT TTA TTT TC）並びに２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。ブロックサイクラーで、以下のサイクル条件を用いてＰＣＲを実施した：９４℃で４分間の初期変性、及び９４℃で２０秒間の変性、６２℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の伸長を伴う３５サイクル、及び７２℃で７分間の最終伸長工程。アガロースゲル上で増幅産物を分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。添加物非存在下のコントロール反応を並行して実施した。ピレン-CGGTAG-3ホスフェートの存在下では、ＰＣＲ産物は検出され得なかった。非相補的なピレン-CTTTTA-ホスフェートを含む試料では、類似の産物が生じ、（あらゆる添加物の非存在下の）コントロール反応のような感度が達成された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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