(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病を診断する目的で、血液、血清又は血漿中のケマリン濃度を測定する方法。
【請求項２】
ケマリン濃度の測定が、免疫学的方法による測定である請求項１記載の測定方法。
【請求項３】
糖尿病が２型糖尿病である請求項１又は２記載の測定方法。
【請求項４】
糖尿病の診断が、糖尿病自体の診断及び／又は糖尿病治療経過の診断である請求項１〜３のいずれか１項記載の測定方法。
【請求項５】
血液、血清又は血漿中のケマリン濃度測定試薬を含有する糖尿病診断剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の新たな診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、糖代謝異常疾患であり、その患者数は全世界で２億人に達すると予想されている。糖尿病は、大きく１型と２型に分類されている。１型糖尿病はインスリン依存型糖尿病ともいい、膵臓のランゲルハンス島でインスリンを分泌しているβ細胞が死滅するために、インスリンの分泌が低下するために血中の糖が異常に増加する疾患である。１型糖尿病の治療は、インスリンの補充により行われる。【０００３】
一方２型糖尿病は、インスリン非依存型であり、インスリン分泌低下とインスリン感受性低下を原因とする。２型糖尿病の発症には、肥満、過食、運動不足、ストレス等が大きく関与するといわれており、一般食事療法と運動療法が基本となる。しかし、２型糖尿病の発症原因は未だ完全に解明されているとはいえないため、早期発見、早期治療が重要であるが、早期発見ができないのが現状である。【０００４】
このような現状から、糖尿病、特に２型糖尿病の診断は重要であり、新たな診断手段の開発が望まれている。【０００５】
一方、ケマリン（Ｃｈｅｍｅｒｉｎ）は、１９９７年にＴＩＧ２（Ｔａｚａｒｏｔｅｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｇｅｎｅ２）として線維芽細胞において、レチノイン酸によって誘導されてくる遺伝子として報告されたが、その機能や構造の詳細については不明であった。その後、Ｏｒｐｈａｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒとしてクローニングされていたＣｈｅｍＲ２３がＴＩＧ２をリガンドとしていることが報告された。ＴＩＧ２は２１〜１５７アミノ酸残基に活性を持ち、この活性部分がケマリンと命名された（非特許文献１〜３）。
しかし、このケマリンと糖尿病との関連性についての報告はない。
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９７；１０９（１）：９１−９５
【非特許文献２】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００３；１９８（７）：９７７−９８５
【非特許文献３】ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００３；５５５（３）：４９５−４９９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、新たな糖尿病診断手段、特に２型糖尿病の診断手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者等は、機能が明確になっていないケマリンの血中濃度を測定し、種々の疾患との関係について検討したところ、ケマリン濃度と２型糖尿病とが有意な相関関係を有し、ケマリン濃度を測定すれば、糖尿病が診断できることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、試料中のケマリン濃度を測定することを特徴とする糖尿病の診断方法を提供するものである。
また本発明は、ケマリン濃度測定試薬を含有する糖尿病診断剤を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、糖尿病、特に２型糖尿病の診断又は判定が可能になる。従って、２型糖尿病の早期発見により、早期治療が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】３Ｔ３Ｌ１細胞におけるケマリンの発現（ノザンブロッティング）を示す。ＡＣがケマリンである。
【図２】マウス組織におけるノザンブロッティング結果を示す。ＡＣがケマリンである。
【図３】３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞培養上清中の抗ケマリン抗体によるイムノブロッティング結果を示す。図３中、ｍＡＣ１はマウスケマリンであり、ｒｈＡＣ１はリコンビナントヒトケマリンである。
【図４】固相抗体としてＤ０１０１を用い、標識抗体としてＰｏＡｂ及びＤ０１０２をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ系にて、血清を測定した結果を示す。
【図５】固相抗体としてＤ０１０１を用い、標識抗体としてＰｏＡｂ及びＤ０１０２をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ系にて、血漿を測定した結果を示す。
【図６】ゲル濾過精製した血清におけるＥＬＩＳＡ結果（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  Φ１．０ｃｍ×６０ｃｍ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、脂肪細胞を用いて脂肪分化とともに発現が増強する分泌蛋白をコードする遺伝子としてケマリンを同定した。ケマリンは、ノザンブロッティングにより脂肪分化とともに強く発現することを見出した。また、ケマリンは肝臓及び脂肪組織で強く発現しており、脂肪細胞の培養上清中に分泌されていることから、脂肪細胞から分泌されるアディポカインのひとつであることを明らかにした。
【００１２】
本発明において測定とは、定量的又は非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、単にケマリンが存在するか否かの測定、ケマリンが一定の量以上存在するか否かの測定、ケマリンの量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができる。定量的な測定としては、ケマリンの濃度の測定、ケマリンの量の測定などを挙げることができる。
【００１３】
試料とは、ケマリンが含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、腸組織などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。
【００１４】
患者より試料を採取し、試料のケマリン濃度を測定し、健常人のケマリン濃度の分布より求められた基準値と比較して高値であれば糖尿病と診断できる。
【００１５】
本発明方法においては、ケマリン濃度の測定は、抗ケマリン抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。以下、抗ケマリン抗体を用いた測定法について詳細に説明する。
【００１６】
本発明で用いられる抗ケマリン抗体はケマリンに特異的に結合すればよい。抗体の由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）及び形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１７】
また、免疫学的測定法において支持体に固定される抗ケマリン抗体と標識物質で標識される抗ケマリン抗体はケマリン分子の同じエピトープを認識してもよいし、異なるエピトープを認識してもよい。
【００１８】
本発明で使用される抗ケマリン抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ケマリン抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
【００１９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ケマリンを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
【００２０】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるケマリンを、入手可能な細胞の培養上清から精製して得る。
次に、この精製ケマリンを感作抗原として用いる。
【００２１】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、その他、ウサギ、サル等が使用される。
【００２２】
感作抗原の動物への免疫は公知の方法に従って行うことができる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
【００２３】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００２４】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
【００２５】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
【００２６】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
【００２７】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
【００２８】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）溶液を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
【００２９】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行う。
【００３０】
目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
【００３１】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。当該ハイブリドーマの例としては、Ｄ０１０１及びＤ０１０２が挙げられる。これらのハイブリドーマは、２００８年１２月９日に（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、Ｄ０１０１をＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０６９として、Ｄ０１０２をＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０７０としてそれぞれ寄託した。
【００３２】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
【００３３】
また、これらの抗体は、ケマリン遺伝子によってコードされる蛋白質の全長又は一部を認識する特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、ペプシンやパパインによりＩｇＧのＦｃ部分を消化する方法や、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
【００３４】
前記のように産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
【００３５】
試料に含まれるケマリンの検出方法は特に限定されないが、抗ケマリン抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
【００３６】
これらの免疫学的測定にあたっては、固相化抗体及び標識抗体の両方又はいずれか一方にモノクローナル抗体を用いるのが好ましい。両方にモノクローナル抗体を用いる場合は、それぞれ異なる部位を認識するモノクローナル抗体を組み合せて用いるのが望ましい。一方にモノクローナル抗体を使用し、他方にポリクローナル抗体を使用することもできる。このような測定系に用いられるモノクローナル抗体としては、前記ハイブリドーマＤ０１０１又はＤ０１０２が産生するモノクローナル抗体が特に好ましい。さらに固相化抗体としてＤ０１０１又はポリクローナル抗体を用い、標識抗体としてＤ０１０２を用いた測定系は、検出感度が高く特に好ましい。
【００３７】
抗ケマリン抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ケマリン抗体を支持体に固定し、ここに試料を加え、インキュベートを行い抗ケマリン抗体とケマリンを結合させた後に洗浄して、抗ケマリン抗体を介して支持体に結合したケマリンを検出することにより、試料中のケマリンの検出を行う方法を挙げることができる。
【００３８】
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコーン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ケマリン抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
【００３９】
抗ケマリン抗体とケマリンとの結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ケマリンと抗ケマリン抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
【００４０】
本発明のケマリン測定方法においては、ケマリンを検出したい試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ケマリンを含まない陰性コントロール試料やケマリンを含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ケマリンを含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ケマリンを含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、試料中のケマリンを検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、試料の数値から標準曲線に基づいて、試料に含まれるケマリンを定量的に検出することも可能である。
【００４１】
抗ケマリン抗体を介して支持体に結合したケマリンの測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ケマリン抗体を用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された抗ケマリン抗体に試料を接触させ、洗浄後に、ケマリンを特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
【００４２】
抗ケマリン抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ケマリン抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
【００４３】
抗体の酵素標識法としては、ヒンジ法とノンヒンジ法の２つが挙げられるがこれに限定しない。ヒンジ法は、抗体ＩｇＧの抗原結合能を有するＦ（ａｂ’）２部分との間のヒンジ部と呼ばれる部分にあるジルスフィド結合を還元して生成するチオール基を利用してＦａｂ’と酵素分子を結合する方法である。一方、ノンヒンジ法は、抗体のいずれの反応基を利用するかは特定しないが、多くの場合、抗体のアミノ基を利用して抗体分子と酵素分子を結合する方法である。
【００４４】
具体的には、抗ケマリン抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ケマリン抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ケマリン抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ケマリン抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
【００４５】
本発明のケマリン測定方法の特に好ましい態様として、抗体ＩｇＧの抗原結合能とは関係のないＦｃ部分を除去し、一般的な酵素標識法記載の方法で標識をした抗体を用いる方法を挙げることができる。
【００４６】
具体的には、抗ケマリン抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ケマリン抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ペルオキシダーゼ直接標識抗ケマリン抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にケマリンを検出する。
【００４７】
本発明のケマリン測定方法の他の態様として、ケマリンを特異的に認識する一次抗体を一種類以上、及び該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
【００４８】
本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
【００４９】
本発明の診断剤は、ケマリン測定試薬を含む。ケマリン測定試薬は、前記ケマリン測定方法に必要な成分、例えば抗ケマリン抗体が含まれる。ここで診断剤には、キットも含まれる。該診断剤がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。【００５１】
参考例１
３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を用いて脂肪分化とともに発現が増強する分泌蛋白をコードする遺伝子としてディファレンシャルディスプレー法を用いて検索しケマリンを同定した。【００５２】
分化誘導開始時、誘導２日後、６日後、９日後の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞よりＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ  １５μｇを電気泳動し、マウスケマリン特異的プローブを用いてノザンブロッティングを行ったところ、脂肪分化とともに強い発現増強を認めた（図１）。【００５３】
マウス組織より抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  １５μｇを電気泳動し、マウスケマリン特異的プローブを用いてノザンブロッティングによって解析したところ、肝臓に加えて脂肪組織で強い発現を認めた（図２）。【００５４】
３Ｔ３−Ｌ１培養上清  １０μＬ及びリコンビナントヒトケマリン１５ｎｇを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ヒトケマリン特異的ポリクローナル抗体でイミュノブロッティングを行った。ケマリンは３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞培養上清中に分泌されており（図３）、脂肪細胞より分泌されるアディポカインのひとつであることが明らかになった。【００５５】
実施例１
（１）リコンビナントヒトケマリン作成方法
ヒト脂肪組織ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）よりＰＣＲ法によりヒトケマリン遺伝子を増幅し、発現ベクターｐＥＴ１４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングした。ヒトケマリン遺伝子をクローニングしたｐＥＴ１４ｂベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（タカラバイオ社製）に、形質転換し、リコンビナントヒトケマリンを発現する大腸菌を得た。この大腸菌を培養し、その抽出液をＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス社製）を用いて精製し、リコンビナントヒトケマリンを得た。【００５６】
（２）マウス抗リコンビナントヒトケマリンモノクローナル抗体作成法
このリコンビナントヒトケマリンをＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｐｒｏ（ＴｉｔｅｒＭａｘ社）と混合し、乳化後、マウスに１４日毎に５回皮下投与した。
このマウスから脾臓を取り出し脾臓中の免疫細胞とマウスミエローマ細胞  Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１と細胞融合した。
細胞融合は、ミエローマ細胞に対して、前記免疫細胞を５倍量となるようにＲＰＭＩ１６４０培養液中でよく混合し、予め３７℃に加温した平均分子量１５００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を５０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成した。
ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養した。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングを行った。
目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、以下に示す方法で行った。９６ウェルのマイクロタイタープレートに免疫抗原として用いたリコンビナントヒトケマリンを結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応させることにより、培養上清中にヒトケマリンと反応する抗体が含まれるかどうか決定した。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングした。
このハイブリドーマを、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、３７℃、５％二酸化炭素下で培養し、培養上清を回収した。この培養上清を硫酸アンモニウムによる塩析法により濃縮した。濃縮した溶液をリン酸緩衝生理食塩水で溶液交換した後、プロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、マウス抗ヒトケマリンモノクローナル抗体を精製した。
ここで得られたハイブリドーマは、Ｄ０１０１又はＤ０１０２と命名し、２００８年１２月９日に（独）産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、Ｄ０１０１をＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０６９として、Ｄ０１０２をＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１１０７０としてそれぞれ寄託した。【００５７】
（３）ウサギ抗ヒトケマリンポリクローナル抗体作成法
リコンビナントヒトケマリンをフロイント完全アジュバントと混合し、乳化後、ウサギに１４日毎に５回皮下投与した。９６ウェルのマイクロタイタープレートに免疫抗原として用いたリコンビナントヒトケマリンを結合させ、免疫感作したウサギから採取した抗血清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させることにより、抗血清中にヒトケマリンと反応する抗体が含まれることを確認した。このように血清中に抗ヒトケマリン抗体レベルが上昇するのを確認した後に、ウサギ血清を採取しプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いてウサギ抗ヒトケマリンポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）を精製した。【００５８】
（４）ケマリン濃度の測定
患者等から採取した血清を、緩衝液を用いて１００倍に希釈し、希釈検体溶液とした。マウス抗ヒトケマリンモノクローナル抗体Ｄ０１０２を固相した９６ウェルのマイクロタイタープレートに、この希釈検体溶液と予め濃度を定めたリコンビナントヒトケマリンを含む標準液を添加した後、２時間静置し溶液中のケマリンをウェル上のマウス抗ヒトケマリンモノクローナル抗体に結合させた。ウェルを洗浄後、ビオチン標識抗ヒトケマリンポリクローナル抗体液を添加した後、１時間静置した。ウェルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液を添加した後、１時間静置した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンシジン及び過酸化水素を含む基質液を加えて１０分間発色させ、その吸光度を４５０ｎｍで測定し、同時に測定した標準液の吸光度から検体中のヒトケマリン濃度を算出した。【００５９】
健常者１７２例、２型糖尿病患者１７０例についての血中ケマリン濃度の測定結果を表１に示した。【００６０】
【表１】
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【００６１】
表１に示したように、糖尿病患者の血中ケマリン濃度は、健常者と比較して統計的に有意に低値を示した。このことから、血中ケマリン濃度を測定することは、糖尿病診断の指標として有用である。【００６２】
実施例２
ウサギ抗ヒトケマリンポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）及びマウス抗ヒトケマリンモノクローナル抗体（Ｄ０１０１又はＤ０１０２）の３種類の抗体から２種類をそれぞれ組み合せて、サンドイッチＥＬＩＳＡ測定系を構築し、リコンビナントヒトケマリンを標準品として、検出感度を比較した。
すなわち、１次反応としてリコンビナントヒトケマリンを５０００ｐｇ／ｍＬから２倍段階希釈し、あらかじめ抗体を固相したプレートに２５℃、２時間静置にて反応させた。次いで、２次反応としてビオチン標識した各抗体１ｕｇ／ｍＬとなるように調製し、２５℃、２時間静置にて反応させた。次に３次反応として、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンをブランクにおける吸光度が０．０５以下となるように調製し、２５℃、１時間静置にて反応させた。【００６３】
【表２】
0005593502.tif 000003
【００６４】
その結果、表２に示すように、いずれの組み合せでもケマリンの測定が可能であった。このうち、標識抗体としてＤ０１０２を用いた測定系は、ポリクローナル抗体を標識抗体とした場合に比べて１００倍程度高感度であった。【００６５】
実施例３
固相抗体としてＤ０１０１を用い、標識抗体としてＰｏＡｂ及びＤ０１０２をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ測定系にて、ヒト血漿又は血清２０例をそれぞれ測定した。その結果、Ｒ≧０．６以上の良好な相関を示した（図４及び図５）。
モノクローナル抗体測定系／評価キットの回帰直線の傾きが１．７７〜２．０４となり、モノクローナル抗体測定系において高値になる傾向が見られた。【００６６】
固相抗体としてＤ０１０１を用い、標識抗体としてＰｏＡｂ及びＤ０１０２をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡ測定系にて、ヒトＰｏｏｌ血清をゲル濾過したフラクションを測定した結果、両測定系は、ほぼ同一のフラクションを認識していることが判明した（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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