(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＲＮＡの少なくとも５０％が５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであり、かつＲＮＡの少なくとも２０％が細胞壁画分と関連したままである条件下で、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に自己消化を受けさせることと、
ｂ）自己消化物に固体／液体分離を受けさせ、ＲＮＡ含有細胞壁画分を回収することと、
ｃ）回収された前記ＲＮＡ含有細胞壁画分中のＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに転換することと、
を含み、
ａ）における自己消化が、サッカロミセス・セレビシエの細胞壁の損傷および／または部分的破壊によって開始され、
前記５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままのＲＮＡは、無傷のＲＮＡと、オリゴヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドとの混合物であり、
前記細胞壁画分と関連したままのＲＮＡは、損傷された細胞内にある、および／または細胞壁またはその断片に結合したままのＲＮＡであり、
ａ）における自己消化の第一相は、ｐＨが５．５〜９であり、温度が５０〜６５℃の条件において実行され、第一相の後は、ｐＨは４〜１０に保持され、温度は４０℃〜７０℃に保持され、第一相を含む自己消化工程の持続時間は、２４時間以下であり、
ｃ）において、ＲＮＡが、５’−Ｆｄａｓｅによって、または５’−Ｆｄａｓｅおよびデアミナーゼによって、５’−リボヌクレオチドに酵素的に転換される、
５’−リボヌクレオチドを含有する組成物の製造方法。
【請求項２】
ｄ）５’−リボヌクレオチドを含有する画分を前記細胞壁画分から分離することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）においてサッカロミセス・セレビシエの細胞壁を損傷および／または部分的に破壊するために、前記サッカロミセス・セレビシエを化学的、機械的または酵素的に処理する請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サッカロミセス・セレビシエの細胞壁の損傷および／または部分的破壊が、酵素的に実行される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
自己消化工程の最後に、そしてステップｂ）よりも前に、サッカロミセス・セレビシエの細胞壁の損傷および／または部分的破壊のために使用された化学物質、ならびに／あるいは、天然のサッカロミセス・セレビシエ酵素および任意で添加された外因性酵素は、中和および／または不活性化される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ａ）において、少なくとも７０％のＲＮＡが、５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままである請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ａ）において、少なくとも４０％のＲＮＡが、前記細胞壁画分と関連したままである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｂ）において、前記ＲＮＡ含有細胞壁画分が、遠心分離またはろ過によって回収される請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ｂ）において、前記自己消化物が限外ろ過を受け、それにより、ＲＮＡ含有細胞壁画分と、サッカロミセス・セレビシエの可溶性画分から得られるＲＮＡとの混合物が回収される請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｃ）において、ＲＮＡ含有細胞壁画分と、サッカロミセス・セレビシエの可溶性画分から得られる回収ＲＮＡとの前記回収混合物中のＲＮＡが、５’−リボヌクレオチドに転換される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法によって得られた５’−リボヌクレオチドを含有する組成物が、組成物の塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいて、少なくとも１５％ｗ／ｗおよび５５％ｗ／ｗ未満の量の５’−リボヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
５’−ＡＭＰおよび５’−ＩＭＰの合計量よりも多量の５’−ＧＭＰ（組成物の塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づく）を含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法によって得られた組成物が、グルタメートを更に含み、５’−リボヌクレオチドに対するグルタメートの比率が０．１以下である請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法によって得られた組成物が、食品または飼料として使用される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法によって得られた組成物が、減脂肪または低脂肪食品の風味および／または芳香および／または口あたりにおける脂肪感を改善するために使用される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法によって得られた組成物が、食品における人工甘味料の付随的な味またはあと味を隠すために使用される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法によって得られた組成物が、飲料の風味および／または芳香および／または口あたりにおける特有の野菜感および／または果実感および／またはアルコール感を改善するために使用される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法によって得られた組成物が、５’−リボヌクレオチドを含む酵母抽出物の調製に使用される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’−リボヌクレオチドを含有する組成物の製造方法に関する。本発明は、更に、５’−リボヌクレオチドを含有する組成物と、前記組成物の食品または飼料における使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
自己消化酵母抽出物は、細胞の破壊および高分子酵母材料の消化（溶解）の後に酵母から得られる可溶性材料の濃縮物である。細胞破壊の後に培地に放出される活性酵母酵素は、溶解に寄与する。自己消化工程の間に、天然ＲＮＡは５’−リボヌクレオチドに分解できない形で分解または修飾されるので、これらのタイプの酵母抽出物はアミノ酸を多量に含み、一般に、５’−リボヌクレオチドを含まない。これらは、基本的な風味を供給するものとして、食品産業において使用される。酵母抽出物中に存在するアミノ酸は、食品にブイヨンタイプのブロス風味を付加する。
【０００３】
これに反して、加水分解酵母抽出物は、細胞の破壊、消化（溶解）、ならびに溶解中の酵母懸濁液へのプロテアーゼおよび／またはペプチダーゼ、そして特にヌクレアーゼの添加の後に酵母から得られる可溶性材料の濃縮物である。天然酵母酵素は、溶解の前に不活性化される。この工程の間に、グアニン（５’−グアニン一リン酸塩、５’−ＧＭＰ）、ウラシル（５’−ウラシル一リン酸塩、５’−ＵＭＰ）、シトシン（５’−シトシン一リン酸塩、５’−ＣＭＰ）およびアデニン（５’−アデニン一リン酸塩、５’−ＡＭＰ）の５’−リボヌクレオチドが形成される。アデニリックデアミナーゼが混合物に添加されると、５’−ＡＭＰは５’−イノシン一リン酸塩（５’−ＩＭＰ）に変換される。そのため、この方法で得られる加水分解酵母抽出物は、５’−リボヌクレオチドを多量に含み、特に、５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰを多量に含む。酵母抽出物は、グルタミン酸モノナトリウム（ＭＳＧ）も多量に含むことが多い。５’−ＩＭＰ、５’−ＧＭＰおよびＭＳＧは、そのフレーバー増強特性で知られている。これらは、特定の種類の食品において、香味のよいおいしい風味を高めることができる。この現象は、「口あたり」またはうまみと説明される。
【０００４】
５’−リボヌクレオチドを多量に含み、任意でＭＳＧも多量に含む酵母抽出物は、通常、スープ、ソース、マリネおよび調味料に添加される。
【０００５】
５’−リボヌクレオチドを多量に含む酵母抽出物は、これまで、高ＲＮＡ含量を有する酵母株を用いて、かつ／または細胞内容物の部分的な抽出によって製造されている。
【０００６】
風味を増強するこの種類の加水分解酵母抽出物の不都合は、アミノ酸および短鎖ペプチドならびにその他の酵母成分の存在のために、風味が純粋であることが必要な用途にはあまり適さないことである。
【０００７】
米国特許第４，３０３，６８０号明細書は、細胞内ＲＮＡが部分的に分解されるだけで、自己消化した細胞に結合したままである条件下における自己消化工程を用いた、５’−リボヌクレオチドを含有する酵母抽出物の製造について記載している。細胞のタンパク質内容物は、オリゴペプチドおよびアミノ酸において加水分解される。熱処理によって自己消化した細胞からＲＮＡが溶液中に放出された後でのみ、ＲＮＡは５’−リボヌクレオチドに酵素的に変換される。この方法では、アミノ酸、オリゴペプチド、ならびに炭水化物、ミネラル、脂質およびビタミンのようなその他の成分を多量に含む酵母抽出物が得られる。これらの成分の存在は、この酵母抽出物に、いくつかの食品用途では望ましくないブイヨンのようなブロス風味を付与する。更なる不都合は、酵母抽出物が、比較的少量の５’−リボヌクレオチドを含むことである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、微生物の自己消化に基づく５’−リボヌクレオチドを含有する組成物の製造方法を提供することであり、得られる組成物は、少なくとも１５％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含み、前記組成物は風味が純粋である。該方法は、非常に簡単であると共に費用効果が高く、従って、商業的に非常に魅力的である。本発明のもう１つの目的は、上記の特性を有する５’−リボヌクレオチドを含有し、組成物の塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいて少なくとも１５％ｗ／ｗおよび５５％ｗ／ｗ未満の量の５’−リボヌクレオチドを含む組成物を提供することである。本発明の更なる目的は、食品、飲料および飼料における本発明の組成物の使用を提供することである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
第１の態様では、本発明は、
ａ）ＲＮＡの実質的な部分が５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであり、そしてＲＮＡの実質的な部分が細胞壁画分と関連したままである条件下で、微生物に自己消化を受けさせることと、
ｂ）自己消化物に固体／液体分離を受けさせ、ＲＮＡ含有細胞壁画分を回収することと、
ｃ）回収されたＲＮＡ含有細胞壁画分中のＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに転換することと、
を含む、５’−リボヌクレオチドを含有する組成物の製造方法を提供する。
【００１０】
「５’−リボヌクレオチド」という用語により、本明細書中では、５’−ＧＭＰ、５’−ＣＭＰ、５’−ＵＭＰ、そして更に５’−ＡＭＰおよび／または５’−ＩＭＰの混合物が意図され、前記５’−ＡＭＰは、部分的または完全に５’−ＩＭＰに転換され得る。
【００１１】
「５’−リボヌクレオチド」という用語は、遊離５’−リボヌクレオチドおよびその塩を包含する。
【００１２】
本発明との関連では、微生物の自己消化は、微生物細胞および高分子微生物材料の分解が、少なくとも部分的に、微生物細胞壁の（部分的な）損傷および／または破壊の後に培地に放出される活性天然微生物酵素によって生じる工程であると定義される。
【００１３】
本発明の方法では、ＲＮＡの自然源として、どんな微生物が使用されてもよい。食品および飼料用途に適した微生物などの細菌および真菌微生物が好ましい。好ましい微生物は、食品グレードの状態を有するもの、およびヒトが食べる食品において安全に適用することができるものである。高ＲＮＡ含量（すなわち、通常６〜１５％のＲＮＡ含量）を有する細菌または真菌株は、多量の５’−リボヌクレオチドを有する組成物の製造を可能にする。しかしながら、本発明の方法の利点は、比較的少量のＲＮＡ含量を有する細菌または真菌株も使用できることである。これらの株は、出発株のＲＮＡ含量に基づいて予期されるよりも高い５’−リボヌクレオチド含量を有する組成物を調製するために、有利に使用することができる。
【００１４】
好ましい微生物の例としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの糸状菌類、ならびにサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）などの酵母が挙げられる。サッカロミセス属に属する株、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種に属する株が最も好ましい。
【００１５】
適切な細菌微生物の例は、乳酸菌、例えばラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）である。
【００１６】
本発明の方法で使用される微生物は、当該技術分野において知られる適切な発酵方法によって調製することができる。微生物バイオマスは、本発明の方法における使用の前に、例えば遠心分離またはろ過によって濃縮されてもよい。例えば、クリーム酵母（１５〜２７％ｗ／ｗに濃縮されたパン酵母）が使用されてもよい。任意で、醸造用酵母または醸造所から生じる残渣酵母（使用済みの醸造用酵母）を含む発酵ブロスが使用されてもよい。
【００１７】
本発明は、５’−リボヌクレオチドを含有する組成物の大規模な製造に特に適した方法を提供する。大規模とは、発酵が１０ｍ３よりも大きい発酵槽で行われることを意味する。
【００１８】
自己消化工程は、微生物細胞壁を損傷および／または部分的に破壊することによって開始される。このように細胞が部分的に開放され、そして細胞内容物の少なくともいくらかが放出される。微生物細胞壁を損傷および／または部分的に破壊するために、細胞は、当業者には既知の方法を用いて、化学的、機械的または酵素的に処理される。
【００１９】
機械的な処理には、均質化技法が含まれる。この目的では、高圧ホモジナイザーの使用が可能である。その他の均質化技法としては、粒子、例えば砂および／またはガラスビーズとの混合、もしくはミリング装置（例えば、ビードミル）の使用があり得る。
【００２０】
化学的な処理には、塩、アルカリおよび／もしくは１つまたは複数の界面活性剤または洗浄剤の使用が含まれる。化学的な処理は、特にアルカリが使用される場合には、ＲＮＡの部分的な分解をもたらし、その結果、２’−リボヌクレオチドおよび３’−リボヌクレオチドが形成されることがあるので、あまり好ましくない。
【００２１】
好ましくは、微生物細胞壁の損傷および／または部分的破壊は、酵素的に行われる。何故なら、それにより工程のより良い制御が達成可能であり、この方法は大規模で使用されるのに特に適するからである。セルラーゼ、グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、キチナーゼ、プロテアーゼおよび／またはペクチナーゼのようないくつかの酵素調製物を使用することができる。好ましくは、プロテアーゼが使用され、より好ましくは、エンドプロテアーゼが使用される。自己消化工程を開始させるために使用される条件は、使用される酵素の種類に依存し、当業者により容易に決定され得る。一般に、微生物細胞壁を酵素的に損傷および／または破壊するために使用される条件は、微生物の自己消化の間に適用される条件と一致するであろう。
【００２２】
微生物の自己消化は、少なくとも部分的に、微生物細胞壁を（部分的に）損傷および／または破壊した後に溶液中で放出される活性天然微生物酵素によって生じ、微生物細胞壁を損傷および／または破壊するために添加された化学物質、またはより好ましくは酵素は、微生物細胞および高分子微生物材料の分解に寄与し得る。
【００２３】
本発明の方法では、自己消化工程において使用される条件は、ＲＮＡの実質的な部分が５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであるような条件である。これに関連して、「ＲＮＡの実質的な部分」とは、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％を意味する。従って、ＲＮＡは、自己消化工程の間、完全に無傷のままである必要はないが、少なくとも、ＲＮＡの実質的な部分は、５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままでなければならない。一般に、１００％までのＲＮＡが５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであり得る。５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態であるとは、ＲＮＡが、適切な酵素による５’−リボヌクレオチドへの転換を可能にする形態でなければならないことを意味する。好ましくは、適切な酵素は、５’−ホスホジエステラーゼ（５’−Ｆｄａｓｅ）である。
【００２４】
５’−リボヌクレオチドに分解可能なＲＮＡの形態は、少なくとも２つのリボヌクレオチド単位を含有するオリゴヌクレオチドを含む。従って、５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のＲＮＡは、無傷のＲＮＡと、様々な長さのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとを含む混合物からなることができる。本発明との関連では、オリゴヌクレオチドは２〜１０個のリボヌクレオチド単位を含み、ポリヌクレオチドは１０個よりも多いリボヌクレオチド単位を含む。
【００２５】
本発明の方法では、自己消化工程で使用される条件は、自己消化の間、ＲＮＡの実質的な部分が細胞壁画分と関連したままである、すなわち、損傷された細胞内にある、および／または細胞壁またはその断片に結合したままであるような条件である。これに関連して、「ＲＮＡの実質的な部分」とは、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、最も好ましくは少なくとも４０％を意味する。一般に９０％までのＲＮＡが、細胞壁画分と関連したままであり得る。
【００２６】
自己消化工程の間、５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであるＲＮＡの百分率は、ａ）自己消化およびＲＮＡの５’−リボヌクレオチドへの転換に関与する酵素の不活性化の後、自己消化物中で測定される５’−ＧＭＰの重量パーセント（その二ナトリウム七水和物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｈｅｐｔａｈｙｄｒａｔｅ）として、塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいて計算される）と、ｂ）ＲＮＡの完全なアルカリ加水分解の後、出発材料中で測定されるＧＭＰの重量パーセント（その二ナトリウム七水和物として、塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいて計算される）との間の比率（×１００）で定義される。アルカリ加水分解後に出発材料中で測定されるＧＭＰの重量パーセント（その二ナトリウム七水和物として、塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいて計算される）は、対応する遊離ＧＭＰの重量パーセント（塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づく）から、それと係数１．４７とを乗じることによって決定することができる。自己消化物中の５’−ＧＭＰの量および塩基性加水分解後のＧＭＰの量を決定するための方法は、実施例１に記載されている。５’−ＧＭＰの量を決定するために使用される方法は、必要であれば、十分に当業者の知識の範囲内であるいくらかの変更を用いて、５’−ＩＭＰ、５’−ＡＭＰ、５’−ＣＭＰおよび５’−ＵＭＰの量を決定するためにも使用することができる。
【００２７】
細胞壁画分と関連したままであるＲＮＡの百分率は、ａ）一定量の出発材料から得られる自己消化物の細胞壁画分中のＲＮＡの量（グラム）と、ｂ）同じ一定量の出発材料中に存在するＲＮＡの量（グラム）との間の比率（×１００）で定義される。細胞壁画分中および出発材料中のＲＮＡの量を決定するための方法は、実施例１に記載されている。
【００２８】
ＲＮＡの実質的な部分が５−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであることと、ＲＮＡの実質的な部分が細胞壁画分と関連したままであることとを保証するために自己消化において適用される条件は、一般に、使用される微生物に依存するであろう。これらの条件は、自己消化の間の温度および／またはｐＨ、ならびに／もしくは特定の温度および／またはｐＨが保持される時間のような工程パラメータを変更し、続いてこのような工程パラメータが、５−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままである、および／または細胞壁画分と関連したままであるＲＮＡの量に与える効果を決定することによって、当業者により容易に決定され得る。
【００２９】
特に、自己消化の第一相は、特定の温度と組み合わせて特定のｐＨ範囲において実行される。
【００３０】
例えば、サッカロミセス・セレビシエの自己消化において、ＲＮＡの実質的な部分が５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであることと、ＲＮＡの実質的な部分が細胞壁画分と関連したままであることとを保証するために適用される条件は、自己消化の第一相におけるｐＨが４．５〜９であり、かつ／または温度が５０〜６５℃であるような条件である。好ましくは、まず８時間の自己消化、より好ましくはまず４時間の自己消化が、４．５〜５．５のｐＨおよび５７〜６５℃の温度、あるいはｐＨ５．５〜９および５０〜６５℃の温度で実行される。
【００３１】
自己消化の第一相の後に保持すべき条件は、あまり重要ではない。第一相の後、ｐＨは通常４〜１０に保持され、温度は通常４０℃〜７０℃に保持される。一般に、第一相を含む自己消化工程の持続時間は、２４時間以下である。
【００３２】
本発明は、ステップａ）において、ＲＮＡの実質的な部分が５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであり、そしてＲＮＡの実質的な部分が細胞壁画分と関連したままである条件下で、微生物が加水分解を受ける方法も包含することができる。本発明との関連では、微生物の加水分解は、天然微生物酵素が不活性化されており、適切な外因性酵素が微生物バイオマスに添加されて微生物細胞および高分子微生物材料の分解がもたらされる工程であると定義される。
【００３３】
自己消化の後、微生物細胞壁画分と、実質的な部分が５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態にあり、そして実質的な部分が細胞壁画分と関連しているＲＮＡと、可溶性細胞成分（例えば、タンパク質、炭水化物、その他種々のもの）とを含む懸濁液（自己消化物）が得られる。細胞壁画分は、不溶性細胞残渣、特に細胞壁またはその断片を含む。
【００３４】
自己消化工程の最後に、そしてステップｂ）よりも前に、微生物細胞壁の損傷および／または部分的破壊のために使用された化学物質、ならびに／もしくは自己消化工程に関与した酵素は、好ましくは、中和および／または不活性化されるべきである。自己消化に関与した酵素は、自己消化工程を開始するために使用された天然微生物酵素、および任意で添加された外因性酵素である。化学物質および／または酵素の中和および／または不活性化は、ＲＮＡの実質的な部分が５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであり、そしてＲＮＡの実質的な部分が細胞壁画分と関連したままである条件下で生じなければならない。自己消化に関与した酵素の不活性化は、ｐＨ処理によって、あるいは好ましくは熱処理によって行うことができ、これにより酵素が不活性化され、ＲＮＡの実質的な部分は、５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであり、ＲＮＡの実質的な部分は細胞壁画分と関連したままである。酵素は、例えば、混合物を６５℃〜９５℃の温度で５分〜１時間で加熱することによって、より好ましくは６５℃〜７５℃の温度で３０分〜１時間加熱することによって熱処理により不活性化することができ、通常、より高い反応温度ではより短い反応時間を用いることができる。例えば、混合物を６５℃で１時間、または７５℃で３０分間の加熱は酵素を不活性化させるのに十分であり、これにより、ＲＮＡの実質的な部分は、５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであり、そしてＲＮＡの実質的な部分は細胞壁画分と関連したままである。
【００３５】
本発明の方法のステップｂ）では、自己消化物は固体／液体分離を受け、ＲＮＡ含有細胞壁画分が回収される。
【００３６】
ＲＮＡ含有細胞壁画分は、一般的な固体−液体分離法、好ましくは遠心分離またはろ過によって回収されるのが好ましい。遠心分離またはろ過の使用は、特に、方法が大規模で実行される場合には経済的に有利である。
【００３７】
５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態である回収ＲＮＡの量を増大させるために、自己消化物は、遠心分離またはろ過のような一般的な固体−液体分離法の代わりに、限外ろ過（ＵＦ）を受けることができる。このようにして、ＲＮＡ含有細胞壁画分と、微生物の可溶性画分から得られるＲＮＡとの混合物が回収される。従って、細胞壁画分と関連しているＲＮＡだけでなく、自己消化の間に溶液中に放出されたＲＮＡも、微生物の可溶性画分から分離される。ＲＮＡを回収するためにＵＦが使用される場合には、好ましくは、１０〜５０ｋＤ、または好ましくは２０〜５０ｋＤの分子量カットオフを有する膜が使用され得る。一般に、より大きい分子量カットオフは、膜を通るより高い流速を可能にするが、より大きい損失および／またはより純度の低い生成物を生じさせるかもしれない。使用される固体−液体分離のタイプおよび前記固体−液体分離の効率は、いくつかの因子の中でも特に、本発明の組成物中で得られる５’−リボヌクレオチドの量に影響を与え得る。
【００３８】
回収された画分中のＲＮＡは、５’−リボヌクレオチドに転換される。これは、ＵＦで得られる微生物の可溶性画分から得られるＲＮＡと任意で混合されたＲＮＡ含有細胞壁画分を酵素的に処理することによって実行される。
【００３９】
好ましくは、５’−ホスホジエステラーゼ（５’−Ｆｄａｓｅ）を用いて、ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに転換する。５’−ホスホジエステラーゼは、微生物または植物源（例えば、麦芽根抽出物）から得ることができる。市販の微生物５’−Ｆｄａｓｅの一例は、天野（Ａｍａｎｏ）（日本）により製造される酵素ＲＰ−１である。
【００４０】
任意で、５’−ＡＭＰは、デアミナーゼ、例えばアデニルデアミナーゼにより５’−ＩＭＰに転換される。市販のデアミナーゼの一例は、天野（Ａｍａｎｏ）（日本）により製造されるデアミナーゼ５００である。
【００４１】
５’−ＦｄａｓｅおよびデアミナーゼによるＲＮＡの処理は、二段階または一段階の方法で実行することができる。
【００４２】
ＲＮＡの５’−リボヌクレオチドへの転換後、５’−リボヌクレオチドを含有する画分は、好ましくは、細胞壁画分から分離される。前記分離は、遠心分離またはろ過によって、あるいは固体／液体分離を達成するのに適する他の方法によって達成され得る。
【００４３】
実施形態では、５’−リボヌクレオチドを含有する画分は、５’−リボヌクレオチドよりもより高い分子量を有する成分から、限外ろ過により精製される。精製の程度は、使用される限外ろ過膜の分子量カットオフに依存する。例えば上記のような限外ろ過膜を使用することができる。
【００４４】
本発明との関連では、「ＲＮＡを回収する」または「ＲＮＡを転換する」のような表現がそれぞれ、必ずしも全てのＲＮＡが回収されるまたは転換されることを意味するわけではないことは理解されるであろう。回収されるＲＮＡの量が、使用される分離法のタイプに依存し得ることは、当業者には明らかであろう。転換されるＲＮＡの量がいくつかの因子に依存し、その１つは、細胞壁の不溶性画分と関連しているＲＮＡがこのステップで使用される酵素に到達しやすいことであることも明らかであろう。
【００４５】
本発明は、ＲＮＡの大規模の分離に特に有用で、食品および飼料用途で使用するために商業的に魅力的な大規模で５’−リボヌクレオチドを含有する組成物の製造を可能にする方法を提供する。本発明は、５’−リボヌクレオチドを含有する良好な純度の組成物をもたらし、損失がかなり少ない方法を提供する。
【００４６】
第２の態様では、本発明は、組成物の塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいて、少なくとも１５％ｗ／ｗおよび５５％ｗ／ｗ未満、好ましくは少なくとも３０％ｗ／ｗおよび５５％ｗ／ｗ未満、より好ましくは少なくとも４０％ｗ／ｗおよび５５％ｗ／ｗ未満の量の５’−リボヌクレオチドを含む、第１の態様の方法により得ることができる５’−リボヌクレオチドを含有する組成物を提供する。この組成物は、高い５’−リボヌクレオチド含量を有し、風味が純粋であり、そして食品または飼料におけるいくつかの用途を有する。
【００４７】
本発明の組成物中の５’−ＧＭＰ、５’−ＡＭＰおよび５’−ＩＭＰなどの５’−リボヌクレオチドの量は、組成物の塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づく重量百分率（％ｗ／ｗ）で与えられる。５’−リボヌクレオチドの重量百分率は、他に指定されない限りは、その二ナトリウム塩七水和物に基づいて計算される。塩化ナトリウムを含まないとは、本発明の組成物が塩化ナトリウムを含有するはずがないことを意味するのではなく、重量百分率の計算では、塩化ナトリウムの重量が組成物から排除されることを意味する。組成物中の塩化ナトリウムの測定および上記の計算は、当業者には既知の方法で実行することができる。
【００４８】
好ましくは、本発明の組成物は、５’−ＡＭＰおよび５’−ＩＭＰの合計量よりも多量の５’−ＧＭＰを含む。５’−ＧＭＰはフレーバー増強に関して５’−ＩＭＰよりも機能的であり、５’−ＡＭＰはフレーバー増強に寄与しないので、これは有利である（Ｔ．ナゴダウィサナ（Ｎａｇｏｄａｗｉｔｈａｎａ）、香味のよいフレーバー（Ｓａｖｏｕｒｙ  Ｆｌａｖｏｕｒｓ）、（１９９５年）、米国ウィスコンシン州のエスティーケイ・アソシエーツ社（Ｅｓｔｅｅｋａｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）編、３０２頁）。
【００４９】
５’−リボヌクレオチドを含む市販の酵母抽出物は全て、５’−ＩＭＰおよび５’−ＡＭＰの合計量よりも少量の５’−ＧＭＰを含有する。従って、本発明の組成物は、現在市販されている酵母抽出物よりも強いフレーバー増強を有する。
【００５０】
本発明の組成物は、好ましくは、グルタメートを含み、５’−リボヌクレオチドに対するグルタメートの比率は、好ましくは、０．１以下、より好ましくは０．０５以下、最も好ましくは０．０１以下である。グルタメート／５’−リボヌクレオチド比の下限は、通常０．００１である。本発明の組成物のグルタメート含量は、組成物の塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいて、０．０１〜１０％ｗ／ｗ、好ましくは０．０５〜５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．１〜２％ｗ／ｗのグルタメートの範囲で変化し得る。
【００５１】
組成物中のグルタメートの量は、遊離グルタミン酸の重量百分率（％ｗ／ｗ）で与えられ、組成物の塩化ナトリウムを含まない乾燥物を基準とする。
【００５２】
本発明の第２の態様の組成物は、一般に、組成物の乾燥物に基づいて、１０％ｗ／ｗ未満、好ましくは５％ｗ／ｗ以下、より好ましくは２％ｗ／ｗ以下、更により好ましくは、１％ｗ／ｗ以下の塩化ナトリウムを含む。
【００５３】
本発明に従う５’−リボヌクレオチドを含有する組成物は、高い５’−リボヌクレオチド含量を有し、風味が純粋であり、そして食品または飼料におけるいくつかの用途を有する。本明細書全体にわたって、「風味が純粋」という表現は、本発明の組成物が適切な量で食品または飼料に添加されたときに、組成物をもたらす微生物に特有の特定の風味および／または感じ、もしくは組成物から発生されるブイヨンのようなブロス風味および／または感じが、前記食品または飼料中では最小限であるか、あるいは存在しないことを意味する。好ましくは、微生物に特有の特定の風味および／または匂いおよび／または感じは、本発明の組成物中において最小限であるか、または存在しない。例えば、出発材料としてサッカロミセスが使用された場合に、組成物は「酵母」風味または匂いを有さない、あるいは出発材料としてカンジダが使用された場合に、甘い風味を有さないであろう。
【００５４】
本発明に従う５’−リボヌクレオチドを含有する組成物は、食料品または飼料品において使用することができる。本発明との関連では、「食品」という単語は、固体形態にある栄養分または飲料のいずれかを意味する。
【００５５】
本発明の実施形態によると、本発明に従う５’−リボヌクレオチドを含有する組成物は、所望される量で従来の酵母抽出物に添加することができる。このことは、所望の５’−リボヌクレオチド含量を有する酵母抽出物の調製を可能にする。本発明の組成物は、自然源、すなわち好ましくは食品グレードである微生物に由来する。このことにより、組成物は食品または飼料に添加するのに非常に適切であるとされる。
【００５６】
本発明の第２の態様の組成物は、いくつかの種類の食品の風味および／または芳香を改善および／または増強するために使用することができる。前記組成物を添加することができる典型的な種類の食品としては、乳製品、ベーカリー食品、野菜、果実、食肉、菓子類、飲料またはこれらから派生される加工食品が挙げられる。
【００５７】
本発明の第２の態様の組成物は、減脂肪または低脂肪の食品において適切な用途を見出す。本発明との関連では、減脂肪または低脂肪の食品は、一般に、対応する全脂肪食品から、そこに含まれる脂肪の低下、および／または脂肪代替物による前記脂肪の置換をもたらす加工、変質、調合または再調合によって得られる。前記方法および前記脂肪代替物は、当該技術分野において知られている。本発明との関連における脂肪は、「総脂肪」、すなわち飽和および不飽和脂肪酸の両方を含有する脂肪を意味する。「減脂肪」および「低脂肪」という用語は、栄養学用語において一般に使用される食品表示である。またこれらは、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって米国連邦規則集（ＵＳ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、タイトル２１、Ｖｏｌ．２、パート１０１「食品の表示付け（Ｆｏｏｄ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ）」、Ｓｅｃ．１０１．６２（ｂ）（２００２年４月１日に改訂）（２１ＣＦＲ１０１．６２（ｂ）と略される）において定義される。
【００５８】
減脂肪または低脂肪の食品の明らかな不都合は、この種類の食品には、対応する全脂肪食品のフレーバーの豊かさが欠けていることである。この不都合は、本発明の第２の態様の組成物を用いて、減脂肪または低脂肪の食品の風味および／または芳香および／または口あたりにおける脂肪感を改善することによって克服することができる。このことは、組成物を含む前記減脂肪または低脂肪食品が、減脂肪食品または低脂肪食品そのものと比較して、対応する全脂肪食品の風味および／または芳香および／または口あたりにより類似している風味および／または芳香および／または口あたりを有することを意味する。
【００５９】
本発明の第２の態様の組成物は、人工甘味料を含む食品においてもう１つの適切な用途を見出す。人工甘味料の使用に関連する明らかな不都合は、人工的に風味をつけられた食料における付随的な味またはあと味、例えば苦味の存在または発生である。単独または組み合わせて使用されたときに上記の問題を示す最も一般的な人工甘味料は、アセスルファーム−Ｋ、アリテーム、アスパルテーム、シクラメート、ネオテーム、ネオヘスペリジン、サッカリン、ステビオシド、スクラロース、およびタウマチンである。この不都合は、本発明の第２の態様の組成物を用いて、食品中の人工甘味料の付随的な味またはあと味を隠すことによって克服することができる。本発明は、人工甘味料および第２の態様の組成物を含む組成物も包含する。
【００６０】
本発明の第２の態様の組成物は、飲料の風味および／または芳香および／または口あたりを改善するため、より具体的に言うと、特に、飲料の風味および／または芳香において特有の野菜感および／または果実感および／またはアルコール感を改善するために使用することができる。例えば、これらは、野菜ジュースの特有の野菜風味および／または野菜芳香、果実ジュースの特有の果実風味および／または果実芳香、もしくはワインおよびビールのようなアルコール飲料、特に、低アルコール含量または減アルコール含量のアルコール飲料の特有のアルコール風味および／またはアルコール芳香を改善するために使用することができる。
【００６１】
上記の用途において食品に添加される５’−リボヌクレオチド組成物の量は、食品の種類および用途に依存するであろう。５’−リボヌクレオチド組成物の量は、食品または飲料に関して、例えば０．０００１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗの間で変化し得る。
【００６２】
本発明は、いくつかの実施例によってこれから説明されるが、これらは限定されることを意図しない。
【実施例】
【００６３】
実施例１
自己消化工程を用いる５’−リボヌクレオチドを含む組成物の調製
サッカロミセス・セレビシエからのクリーム酵母２ｌを６０℃に暖めた。続いて、０．４ｍｌのペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）（オランダのＤＳＭ  Ｎ．Ｖ．から市販されているセリンプロテアーゼ）を添加し、混合物をｐＨ６．０および６０℃で４時間インキュベートした。条件をｐＨ５．１および５１．５℃に調整し、更に２ｍｌのペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）を反応混合物に添加した。混合物をｐＨ５．１、５１．５℃において２０時間インキュベートした。次に、混合物または自己消化物を６５℃で１時間加熱し、全ての酵素活性を不活性化した。抽出物（可溶性画分）を遠心分離によって不溶性細胞壁から分離した。
【００６４】
得られた細胞壁画分を５’−ホスホジエステラーゼで処理し、６５℃の温度および５．３のｐＨで、ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに加水分解した。次に、５５℃の温度およびｐＨ５．１において酵素デアミナーゼにより５’−ＡＭＰを５’−ＩＭＰに転換した。最後に、遠心分離によって５’−リボヌクレオチドを不溶性細胞壁画分から分離した。
【００６５】
出発のクリーム酵母と、自己消化物と、第１の遠心分離後の上澄みと、細胞壁画分と、第２の遠心分離の後、すなわち５’−Ｆｄａｓｅおよびデアミナーゼ処理の後の上澄みとのサンプルを、ＲＮＡ含量および／または５’−リボヌクレオチド含量について、以下の方法に従ってＨＰＬＣにより分析した。サンプル中のＲＮＡをアルカリ処理の間に加水分解した。標準物として５’−ＧＭＰを用い、ワットマン・パーティシル（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐａｒｔｉｓｉｌ）１０−ＳＡＸカラム、溶離液としてｐＨ３．３５のリン酸緩衝液、およびＵＶ検出を用いて、ＧＭＰ（すなわち、ＲＮＡの加水分解から誘導される２’−ＧＭＰおよび３’−ＧＭＰ）をＨＰＬＣによって定量した。塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づくＲＮＡ含量の重量百分率は、塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づく遊離ＧＭＰの重量百分率の〜４倍に相当する。
【００６６】
またいくつかのサンプルは、サンプル中に存在するＲＮＡが５’−リボヌクレオチドに転換されるかどうか（すなわち、ＲＮＡが例えば、５’−Ｆｄａｓｅにより５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態にあるかどうか）を立証するために、５’−Ｆｄａｓｅと共にインキュベートし、これらのサンプルのうちのいくつかは、５’−ＡＭＰを５’−ＩＭＰに転換するためにデアミナーゼによっても処理した。続いて、サンプル中の５’−ＧＭＰ、５’−ＡＭＰおよび５’−ＩＭＰの量（塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいてその二ナトリウム七水和物の重量百分率で表される）を、以下の方法に従ってＨＰＬＣにより決定した。ワットマン・パーティシル（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｐａｒｔｉｓｉｌ）１０−ＳＡＸカラム、溶離液としてｐＨ３．３５のリン酸緩衝液、およびＵＶ検出を用いて、酵母抽出物中の５’−ＧＭＰ、５’−ＡＭＰおよび５’−ＩＭＰをＨＰＬＣによって定量した。５’−ＧＭＰ、５’−ＩＭＰおよび５’−ＡＭＰ標準物に基づいて濃度を計算した。ジェンウェイ（Ｊｅｎｗａｙ）塩化物測定器ＰＣＬＭ３（英国エセックス州のジェンウェイ（Ｊｅｎｗａｙ，Ｅｓｓｅｘ，Ｅｎｇｌａｎｄ））によりサンプル中の塩化物イオンを測定し、対応する塩化ナトリウムの量を計算することによって塩化ナトリウムを決定した。
【００６７】
ＲＮＡおよび５’−リボヌクレオチドのデータは表１に与えられる。
【００６８】
【表１】
0005588960.tif 000002
【００６９】
この実施例において本発明の方法で得られる５’−リボヌクレオチドを含有する組成物は、約５０％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含む。
【００７０】
上記の実施例で得られた結果は、以下の結論を導く。
・  結果は、クリーム酵母中に存在するほとんど全てのＲＮＡが、自己消化工程の間、５’−Ｆｄａｓｅにより５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであったことを明白に示す。
・  ＲＮＡの実質的な部分は、自己消化酵母の細胞壁画分と関連したままであった。
・  可溶性画分の除去によって、ＲＮＡを多量に含む画分が得られた。
・  ＲＮＡを多量に含む画分中のＲＮＡの主要部分は、５’−リボヌクレオチドに加水分解された。これらの５’−リボヌクレオチドは、遠心分離またはその他の適切な固体／液体分離によって不溶性細胞壁画分から容易に分離された。
・  この方法は、例えば、酵母抽出物マキサロム・プラス（Ｍａｘａｒｏｍｅ  Ｐｌｕｓ）（登録商標）（６％の５’−ＧＭＰ＋５’−ＩＭＰ、１２％の５’−リボヌクレオチド）（オランダのＤＳＭ  Ｎ．Ｖ．）のようないくつかの従来の５’−リボヌクレオチド含有酵母抽出物と比べて、５’−リボヌクレオチド、特に５’−ＧＭＰおよび５’−ＩＭＰが比較的高濃度である組成物の製造を可能にする。
【００７１】
５’−リボヌクレオチドを含有するこの種類の組成物の顕著な特性は、組成物中の５’−ＧＭＰの量が組成物中の５’−ＡＭＰおよび５’−ＩＭＰの合計量よりも多いという事実である。これは、５’−ＩＭＰにも転換され得るＡＴＰから誘導される量の５’−ＡＭＰも含有する通常の５’−リボヌクレオチド含有酵母抽出物とは異なる。
【００７２】
この実施例で小規模において適用されたような条件が、任意で、十分に当業者の技能および知識の範囲であるいくらかの調整をすることにより、より大きい規模においても適用可能であることは、当業者には明らかであろう。
【００７３】
実施例２
自己消化工程の間の天然酵母酵素の寄与の実証
サッカロミセス・セレビシエからのクリーム酵母の２リットル部分を９５℃で１０分間加熱処理して、全ての天然酵母酵素を不活性化し（対照部分）、第２の部分は以下の抽出方法においてそのまま使用した。
【００７４】
サッカロミセス・セレビシエからのクリーム酵母の２ｌの両方の部分を６０℃まで急速に加熱した。それぞれの部分に、０．４ｍｌのペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）（オランダのＤＳＭ  Ｎ．Ｖ．から市販されているセリンプロテアーゼ）を添加し、混合物をｐＨ６．０および６０℃で４時間インキュベートした。条件をｐＨ５．１および５１．５℃に調整し、更に２ｍｌのペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）を各反応混合物に添加した。混合物をｐＨ５．１、５１．５℃において２０時間インキュベートした。最後に、両方の部分を６５℃で１時間加熱し、全ての酵素活性を不活性化した。両方のインキュベーションの抽出物（可溶性画分）を遠心分離によって不溶性細胞壁から分離した。
【００７５】
得られた抽出物を分析して、可溶化率（ｓｏｌｕｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｙｉｅｌｄ）およびタンパク質画分の加水分解の程度を決定した。可溶化率は、本明細書では、抽出物の乾燥物の量と出発材料の乾燥物の量との間の比率と定義される。
【００７６】
結果は表２に記載される。
【００７７】
【表２】
0005588960.tif 000003
【００７８】
遊離アミノ酸％は、本明細書では、存在するアミノ酸の総量、すなわち、遊離アミノ酸と、タンパク質およびペプチド内に結合されたアミノ酸との合計に関する遊離アミノ酸％と定義される。この百分率は、当業者には知られているＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）法によって、ＨＰＬＣにより決定することができる。
【００７９】
結果は、実験１および実施例１で使用される自己消化条件を適用することによって、天然酵母酵素が細胞内容物の可溶化に寄与することを示す。特に、天然酵母酵素は、酵母タンパク質画分をペプチドおよび遊離アミノ酸に加水分解することにおいて活性である。
【００８０】
実施例３
ＲＮＡの５’−リボヌクレオチドへの転換と、可溶性画分および細胞壁画分間のＲＮＡの分配とに対する自己消化条件の効果
サッカロミセス・セレビシエからのクリーム酵母の第１の２００ｍｌの部分（実験１）を、４０μｌのペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）（ＤＳＭフード・スペシャルティーズ（ＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ）から市販されているセリンプロテアーゼ）の存在下、ｐＨ６．０および６０．０℃で４時間インキュベートした。サッカロミセス・セレビシエからのクリーム酵母の２００ｍｌの第２の部分（実験２）を、４０μｌのペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）の存在下、ｐＨ５．１および５１．５℃で４時間インキュベートした。次に、両方のインキュベーション混合物の条件をｐＨ５．１および５１．５℃に調整し、更に０．２ｍｌのペスカラーゼ（Ｐｅｓｃａｌａｓｅ）を反応混合物に添加した。混合物をｐＨ５．１、５１．５℃で２０時間インキュベートした。続いて、自己消化物を６５℃で１時間加熱することによって、酵素を不活性化した。自己消化物中および出発クリーム酵母中のＲＮＡ含量を、実施例１で記載したようにＨＰＬＣによって測定した。
【００８１】
自己消化物中のＲＮＡが５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態であるかどうかを決定するために、各反応混合物の半分を酵素５’−Ｆｄａｓｅと共に更にインキュベートした。実施例１で説明したように５’−ＧＭＰ含量を分析した。
【００８２】
反応混合物のもう半分を遠心分離して、細胞壁画分と関連しているＲＮＡの量を決定した。
【００８３】
遠心分離から得られた細胞壁画分を５’−Ｆｄａｓｅと共にインキュベートし、ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに加水分解した。５’−リボヌクレオチドを含む可溶性画分を遠心分離によって細胞壁不溶性画分から分離した。５’−リボヌクレオチド含量およびグルタメート含量について上澄みを分析した。食料中のＬ−グルタミン酸を決定するためのＬ−グルタミン酸比色法およびその他の材料試験キットによって、グルタミン酸の量を決定した（ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）／Ｒ−バイオファーム（Ｂｉｏｐｈａｒｍ）、酵素バイオ分析／食品分析（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ＢｉｏＡｎａｌｙｓｉｓ／Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）、カタログＮｏ．１０１３９０９２０３５、カタログ２００４年、独国ダルムシュタッドのＲ−バイオファーム社（Ｒ−ＢＩＯＰＨＡＲＭ  ＡＧ，Ｄａｒｍｓｔａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。グルタメートの量は、当該技術分野において既知の方法、例えば、ＨＰＬＣ分析によって測定することもできる。
【００８４】
分析の結果は、表３で与えられる。
【００８５】
出発材料中のＲＮＡレベルは、塩化ナトリウムを含まない乾燥物に関して７．７％ｗ／ｗである。ＲＮＡのこの量は、最大限で、５’−Ｆｄａｓｅ処理後の自己消化物中に２．８％ｗ／ｗの５’−ＧＭＰ（二ナトリウム七水和物塩として測定）をもたらすことができる（１００％の転換）。それは、実験１では５’−リボヌクレオチドに分解可能なＲＮＡの％が７８％であり、実験２では２１％であることを意味する。
【００８６】
上記の実験において得られた結果は、以下の結論を導く。
・  ＲＮＡ分析は、実験２では自己消化の間の高度のＲＮＡ残存を示唆する。しかしながら、このＲＮＡの主要部分は、５’−リボヌクレオチドに分解されないであろう。
・  実験１では、５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のＲＮＡがほとんど８０％である。
・  実験１では、微生物中にもともと存在するＲＮＡの４６％が細胞壁画分と関連したままである。実験２では、この割合はわずか１２％であった。
・  実験１におけるグルタミン酸／５’−リボヌクレオチドの比は、約０．０２である。
【００８７】
【表３】
0005588960.tif 000004
【００８８】
上記を要約すると、自己消化工程の第一相で適用される条件は、５’−リボヌクレオチドに分解可能な形態のままであるＲＮＡの量の決定において重要であると結論される。更に、条件は、細胞壁画分と関連したままであるＲＮＡの量の決定においても重要である。
【００８９】
実施例４
大規模の自己消化工程を用いる５’−リボヌクレオチドを含む組成物の調製
実施例１で記載した条件を適用することによって、自己消化酵母抽出物を大規模で製造した。自己消化物中で測定される５’−リボヌクレオチドに分解可能なＲＮＡの量は、８３％ｗ／ｗ（塩化ナトリウムを含まない乾燥物に関して測定される）であった。遠心分離により得られる残りの細胞壁画分を、これも実施例１に記載される条件下において、更に５’−Ｆｄａｓｅおよびデアミナーゼで処理し、ＲＮＡを５’−リボヌクレオチドに転換し、放出された５’−ＡＭＰを５’−ＩＭＰに転換した。１００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いて５’−リボヌクレオチドを限外ろ過により固体（細胞壁）から分離し、組成物は透過物中に回収された。透過物を真空下で蒸発によって濃縮した。
【００９０】
工程データは表４に与えられる。
【００９１】
【表４】
0005588960.tif 000005
【００９２】
示された結果は、以下の結論を導く。
・  表４に与えられるデータは、記載された経路による５’−リボヌクレオチドの大規模製造が実行可能であることを明白に実証する。
・  微生物中にもともと存在するＲＮＡの４６％が細胞壁画分と関連したままであり、遠心分離によって可溶性画分から分離され得る。
・  ５’−Ｆｄａｓｅおよびデアミナーゼによる細胞壁の処理後に得られる５’−リボヌクレオチド組成物は、限外ろ過により固体（例えば、細胞壁）から回収され得る。
・  塩化ナトリウムを含まない乾燥物に基づいて５３％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含有する組成物が得られた。
・  組成物中の５’−ＧＭＰ／（５’−ＩＭＰ＋５’−ＡＭＰ）比は、１．１４であった（この比は、従来のヌクレオチド含有酵母抽出物中ではほとんど約０．９である）。
【００９３】
実施例５
人工甘味コカ・コーラ（Ｃｏｃａ  Ｃｏｌａ（登録商標））または通常のファンタ（Ｆａｎｔａ（登録商標））における５’−リボヌクレオチドを含有する組成物の使用の効果
本発明に従う５’−リボヌクレオチドを含有する組成物を人工甘味コカ（登録商標）（コカ・コーラ・ライト（登録商標）−コカ・コーラ・カンパニー（Ｃｏｃａ  Ｃｏｌａ  Ｃｏｍｐａｎｙ）−ロッテルダム（Ｒｏｔｔｅｒｄａｍ））または通常のファンタ（登録商標）（ファンタ・オレンジ（Ｆａｎｔａ  Ｏｒａｎｇｅ（登録商標））、コカ・コーラ・カンパニー−ロッテルダム）に添加することの効果を研究した。
【００９４】
組成物は、塩を含まない乾燥物に関して１０．１％ｗ／ｗの５’−ＧＭＰ、８．７％ｗ／ｗの５’−ＩＭＰ、（〜４０％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチド）および０．９６％ｗ／ｗのグルタミン酸を含有した。塩化ナトリウム含量は、乾燥物に関して＜１％であった。飲料１リットルあたり１００ｍｇの用量の組成物を使用した。
【００９５】
組成物を含む飲料の風味および／または芳香を、食品テイスティングにおける専門家集団によって分析し（実験１および２）、飲料そのものの風味と比較した。コカ・コーラ・ライト（登録商標）の場合には、組成物を含む飲料の風味を通常のコカ・コーラ（登録商標）（コカ・コーラ・カンパニー−ロッテルダム）の風味とも比較した。
【００９６】
結果はそれぞれ、表５（コカ・コーラ・ライト（登録商標））および表６（ファンタ（登録商標））に示される。
【００９７】
【表５】
0005588960.tif 000006
【００９８】
【表６】
0005588960.tif 000007
【００９９】
結果は、コカ・コーラ・ライト（登録商標）またはファンタ（登録商標）の風味および／または芳香および／または口あたりに対する本発明の組成物の肯定的な効果を明白に示す。組成物を含むコカ・コーラ・ライト（登録商標）では、飲料中の人工甘味料（アスパルテーム、ナトリウムシクラメートおよびアセスルファーム）の存在によるあと味が隠される。組成物を含むファンタ（登録商標）では、全体的な風味、そして特にその中の果実感が改善される。
【０１００】
更に、従来の酵母抽出物を使用した場合には通常そうであるように飲料に導入される酵母感（ｙｅａｓｔｙ  ｎｏｔｅ）はなかった。これは、本発明に従う組成物が、風味が純粋であり、酵母抽出物または組成物に由来する酵母風味の存在があまり望ましくない飲料用途に特に適することを実証する。
【０１０１】
実施例６
プロセスチーズにおける５’−リボヌクレオチドを含有する組成物の使用の効果
実施例５の組成物を、チーズスプレッド１００ｇあたり１００ｍｇの用量で、低脂肪チーズスプレッド（オランダのＥＲＵ−ウールデン（ＥＲＵ−Ｗｏｅｒｄｅｎ−Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）により製造されるスリムクイプジェ（Ｓｌｉｍｋｕｉｐｊｅ）（登録商標）ナチュレル１５＋、５％ｗ／ｗの脂肪、１４％ｗ／ｗのタンパク質、４％ｗ／ｗの炭水化物を含む）に添加した。組成物を含むチーズスプレッドの風味および／または芳香（実験１）を、食品テイスティングにおける専門家集団によって分析し、チーズスプレッドそのもの（低脂肪）の風味、および対応する全脂肪製品（全脂肪）（オランダのＥＲＵ−ウールデンにより製造されるゴウドクイプジェ（Ｇｏｕｄｋｕｉｐｊｅ）（登録商標）ナチュレル４８＋、２１％ｗ／ｗの脂肪、１２％ｗ／ｗのタンパク質、２％ｗ／ｗの炭水化物を含む）の風味と比較した。
【０１０２】
結果は表７に示される。
【０１０３】
【表７】
0005588960.tif 000008
【０１０４】
結果は、低脂肪のプロセスチーズの風味および／または芳香および／または口あたりに対する本発明の組成物の効果を明白に示す。特に、組成物を含む低脂肪スプレッドチーズの風味および／または芳香および／または口あたりは、全脂肪スプレッドチーズの風味および／または芳香および／または口あたりにより類似している。
【０１０５】
更に、食品内に導入される組成物に由来する酵母感はなかった。
【０１０６】
実施例７
酵母抽出物の調製における本発明の５’−リボヌクレオチド組成物の使用
実施例４で得られる５’−リボヌクレオチド組成物を、従来の自己消化酵母抽出物（オランダのＤＳＭ  Ｎ．Ｖ．により製造されるギステックス（Ｇｉｓｔｅｘ）ＬＳ（登録商標）、６５％ｗ／ｗのタンパク質、全アミノ酸含量に基づいて４０％の遊離アミノ酸、〜０％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含む）と混合し、塩化ナトリウムを含まない乾燥物に関して１９．１％ｗ／ｗの５’−ＧＭＰ＋５’−ＩＭＰ（〜４０％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチド）を含む酵母抽出物をもたらした（ＹＥ１）。いくつかの種類の食料品の風味に対する前記酵母抽出物の添加の効果を、ほぼ同じ量の５’−リボヌクレオチドおよび５’−ＧＭＰ＋５’−ＩＭＰ（アロマイルド（Ａｒｏｍｉｌｄ）、日本のコージン（Ｋｏｈｊｉｎ，Ｊａｐａｎ）、２１％ｗ／ｗの５’−ＧＭＰ＋５’−ＩＭＰおよび４２％ｗ／ｗの５’−リボヌクレオチドを含む（いずれも塩化ナトリウムを含まない乾燥物に関して））を含む市販の酵母抽出物の添加の効果と比較した（ＹＥ２）。
【０１０７】
０．１％ｗ／ｗの濃度で以下の種類の食品において、そして０．０５％ｗ／ｗの濃度で水中において、ＹＥ１およびＹＥ２を試験した。
・  スキムミルク（０％脂肪）
・  オプティメル・ビフィット（Ｏｐｔｉｍｅｌ  Ｖｉｆｉｔ）（登録商標）「フランボワーズ（Ｆｒａｍｂｏｏｓ）」（オランダ、ウールデンのキャンピナ（Ｃａｍｐｉｎａ，Ｗｏｅｒｄｅｎ−Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（果実風味のプロバイオティック乳飲料、組成：タンパク質：３．０ｇ／１００ｍｌ、糖質：４．５ｇ／１００ｍｌ、脂肪：０．０ｇ／１００ｍｌ、カルシウム：１２０ｍｇ／１００ｍｌ、ビタミンＢ２：０．３２ｍｇ／１００ｍｌ、ビタミンＢ６：０．４０ｍｇ／１００ｍｌ、ビタミンＣ：１２ｍｇ／１００ｍｌ）
・  スリムクイプジェ（Ｓｌｉｍｋｕｉｐｊｅ（登録商標））（低脂肪スプレッドチーズ、実施例６を参照）
・  ゴウドクイプジェ（Ｇｏｕｄｋｕｉｐｊｅ（登録商標））（スプレッドチーズ、実施例６を参照）
・  ファンタ・オレンジ（登録商標）（実施例５を参照）
【０１０８】
結果は、表８に示される。
【０１０９】
【表８】
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【０１１０】
結論として、本発明の組成物から調製された酵母抽出物そのもの（水中）は、純粋な風味を有し、同じ量の５’−リボヌクレオチドを含む市販の酵母抽出物（アロマイルド（Ａｒｏｍｉｌｄ（登録商標）））と比較してあと味がない。食品用途において、ＹＥ１は風味が純粋であり、ＹＥ２（アロマイルド（Ａｒｏｍｉｌｄ（登録商標）））と比較してあと味を加えることなく、食品の全体的なフレーバーを改善する。
【０１１１】
この実施例は、本発明に従う組成物を用いて調製された酵母抽出物が、同じ量の５’−リボヌクレオチドを含む市販の酵母抽出物よりも風味が更により純粋であることを実証する。