(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１表面（３）と、第２表面（４）とを備える本体（２）を含む懸滴プレート（１）であって、前記第２表面（４）は、前記第１表面（３）に平行であり、かつその中で細胞を培養する、または分子凝集体を製造するための液体（６）を付着して受け取る少なくとも一つの液滴接触区域（５）を含み、前記少なくとも一つの液滴接触区域（５）は、前記液体（６）が前記本体（２）の前記第２表面（４）上で広がるのを防止するレリーフ構造（８）または選択的な疎水性塗料（２１）によって、周辺区域（７）から区別されている懸滴プレート（１）において、
前記本体（２）が、同本体（２）の前記第１表面（３）の方向から少なくとも一つの液滴接触区域（５）へと通じる少なくとも一本の導管（９）をさらに含み、前記導管（９）は、前記本体（２）の前記第２表面（４）に近接した位置にあり、かつ前記液滴接触区域（５）の少なくとも一部を含む培養区画（１７）、を含むことを特徴とする、懸滴プレート（１）。
【請求項２】
前記培養区画（１７）が円筒状、円錐状または双曲面状からなる群より選択される形状を有することを特徴とする、請求項１に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項３】
前記培養区画（１７）が、直線状の、または湾曲した壁を有するロート形状の凹部であり、前記導管（９）が前記本体（２）の前記第１表面（３）に近接した位置にある入口区画（１２）を含み、かつ同入口区画（１２）が、前記本体（２）内部の前記導管（９）の拡張部位（１３）として、前記本体（２）の前記第１表面（３）上のカップ（１４）として、または該拡張部位（１３）およびカップ（１４）の組合せとして形成されることを特徴とする、請求項１に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項４】
前記培養区画（１７）が、１０μｌから１００μｌの間の体積を有することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項５】
前記導管（９）が、円筒／円錐または双曲面形状であることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項６】
前記導管（９）が、１０μｍから５００μｍの間の直径の毛細管部位（１８）を含むことを特徴とする、請求項５に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項７】
前記導管（９）の円筒または双曲面状毛細管部位（１８）の長さが、０．１ｍｍから３０ｍｍの間であることを特徴とする、請求項６に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項８】
前記レリーフ構造（８）が、リム、ふくらみ、凹部、隆起およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され、かつ前記第２表面（４）中または前記第２表面（４）上に設置されることを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項９】
前記導管（９）が、前記第１表面（３）から前記第２表面（４）に垂直方向に、前記本体（２）全体を貫通することを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項１０】
前記導管（９）が、前記第１および第２表面（３，４）に対し垂直に伸びる分岐していないチャネルとして形成され、前記導管（９）の全ての部位は同軸方向に整列されていることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項１１】
前記導管（９）が、前記第１および第２表面（３，４）に対し垂直に伸びるチャネル部（１９）と、前記第２表面（４）と平行に伸びる分岐部（２０）と、を含む分岐チャネルとして形成されることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項１２】
前記液滴接触区域（５）が、親水性塗料で選択的に塗布されていることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項１３】
前記液滴接触区域（５）が、ポリペプチド類およびポリヌクレオチド類からなる群から選択される生物学的に活性な化合物で選択的に塗布されていることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項１４】
懸滴プレート（１）が、標準のマイクロプレートの形状を有し、かつ前記液滴接触区域（５）が、４×６、８×１２または１６×２４液滴接触区域（５）の配列に配置されていることを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項１５】
請求項１に記載の懸滴プレート（１）の液滴接触区域（５）に付着する少なくとも一つの液体（６）中で細胞を培養するための、または分子凝集体を製造するための方法であって、液体（６）を、前記本体（２）の前記第１表面（３）の方向から液滴接触区域（５）へと通じる導管（９）を介して、液滴接触区域（５）に加えることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
少なくとも一種の細胞型の多数の細胞または多数の細胞微細凝集体を、
−液に懸濁することと、
−液体（６）とともに前記懸滴プレート（１）の導管（９）を介して移動させることと、
−前記液体（６）内で培養することと、
微小組織が、前記液体（６）内で培養された細胞から形成されることと、を特徴とする、請求項１５に記載の細胞を培養するための方法。
【請求項１７】
少なくとも一種の細胞型の多数の細胞または多数の細胞性微細凝集体を、
−前記懸滴プレート（１）の導管（９）を介して液体（６）に移動させることと、
−前記液体（６）内で培養することと、
微小組織が、前記液体（６）内で培養された細胞から形成されることと、を特徴とする、請求項１５に記載の細胞を培養するための方法。
【請求項１８】
前記液体（６）中の一部の液が、前記液滴接触区域（５）専用の前記懸滴プレート（１）のそれぞれの前記導管（９）を介して回収されることを特徴とする、請求項１５乃至１７のいずれか一項に記載の細胞を培養するための、または分子凝集体を製造するための方法。
【請求項１９】
回収された液の少なくとも一部を、液滴接触区域（５）専用の懸滴プレート（１）のそれぞれの導管（９）を介して送達された液によって置き換えられることを特徴とする、請求項１８に記載の細胞を培養するための、または分子凝集体を製造するための方法。
【請求項２０】
薬物システムのスクリーニング、細胞毒性試験、または細胞再凝集体またはタンパク質結晶の大量生産における、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の懸滴プレート（１）の使用。
【請求項２１】
前記培養区画（１７）が、１０μｌから５０μｌの間の体積を有することを特徴とする、請求項４に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項２２】
前記導管（９）が、５０μｍから２００μｍの間の直径の毛細管部位（１８）を含むことを特徴とする、請求項６に記載の懸滴プレート（１）。
【請求項２３】
前記導管（９）の円筒または双曲面状毛細管部位（１８）の長さが、０．５ｍｍから２ｍｍの間であることを特徴とする、請求項７に記載の懸滴プレート（１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
独立請求項１の一般的部分によれば、本発明は懸滴プレートに関する。この懸滴プレートは、第１表面と、該第１表面に本質的に平行な第２表面とを備える本体を含む。第２表面は、液体を付着して受け取る少なくとも一つの液滴接触区域を含む。この液体中で、細胞が培養され、または分子凝集体が製造されうる。この液滴接触区域は、懸滴プレート本体の第２表面上で液体が広がるのを防止するレリーフ構造によって、周辺区域から区別される。
【背景技術】
【０００２】
３Ｄ構造で培養される細胞は、従来の単層培養での細胞より生理学的により重要であることは一般的に認められている（たとえば、非特許文献１、非特許文献２を参照）。細胞をうまく三次元にすることは、典型的な設計の問題である。現在の技術は、殆どが、スカフォード材料を使用すること、あるいは単層を積み重ねてセルを形成することのいずれかに基づいている。しかしながら、生物学的に利益があるにもかかわらず、細胞培養プロセスがより複雑で、時間がかかり、生体材料の追加を必要とすることを考慮すると、薬物発見または毒性アッセイのような適用に関して、実験室において日常作業でもなく、工業的規模においても使用されていないのが現在の技術現状である。細胞の再凝集は、細胞をうまく三次元にする代替的アプローチである。しかしながら、現在の再凝集技術では、大部分が、腫瘍細胞株でしかうまくいかず、共培養を管理する能力に欠けている。懸滴（ＨＤ）技術は、腫瘍細胞および初代細胞を用いる３Ｄ細胞培養を可能にする普遍的な方法であることが示されている（非特許文献３参照）。懸濁細胞を有する細胞培養培地の液滴を細胞培養液表面に置き、プレートを反転させる。細胞が付着することができる利用可能な基質が存在しないので、細胞は、液滴の底部に蓄積し、微小組織を形成する。
【０００３】
表面で垂れ下がる液滴中で細胞を培養することは、当業者に周知である。たとえば、特許文献１により、ピペットを用いて、ペトリ皿カバーの内側表面上に、栄養培地中の細胞懸濁液の液滴を堆積させる通常の方法が知られている。次いで、該ペトリ皿カバーは反転させなければならず、適切なペトリ皿ベースプレート上に置かなければならない。このように閉鎖したペトリ皿において、液滴がカバー表面から垂れ下がる。該ペトリ皿は、懸滴を乾燥から防止する湿潤環境を同懸滴に与えるために、湿らせたろ紙を含むことが多い。この従来の懸滴技術の最も重要なステップの一つは、液滴が付いているプレートを反転させることであり、したがって、この極めて重要なステップは、熟練した科学者によって手動で行わなければならないことが非常に多い。
【０００４】
特許文献２により、幹細胞の培養およびタンパク質結晶の製造のための懸滴技術の用途が知られている。懸滴技術の利点として、被検物が、イオン、分化因子、毒性物質などのような必要な因子の全てを与える栄養培地に完全に取り囲まれているという事実が挙げられる。さらに、固体表面に触れることなく、細胞が出会い、クラスタ（たとえば、胚体）を形成する液滴の頂部に、細胞が下がり、細胞（たとえば幹細胞）の凝集が促進される。液滴の表面張力により、細胞および細胞凝集体が液滴表面へ侵入するのを防止する。しかしながら、正しい位置を与えて懸滴を形成するために表面を反転する間、液滴が表面上で移動するかもしれないので、ピペットで加えられる液滴は、少ない体積しか含まれないこともある。同じ寸法を有するより大きな液滴を提供し、したがって同じ培養および反応環境を可能にするために、特定の表面上で液滴接触区域を制限する鋭利な端部を有するレリーフ構造が提案されている。
【０００５】
つい最近では（たとえば、非特許文献３または非特許文献４を参照）、懸滴中での細胞培養は、重力強制細胞集合体を使用するマイクロスケール組織工学と呼ばれている。これによって、Ｋｈａｄｅｍｈｏｓｓｅｉｎｉらは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）マイクロウェル中で、テンプレートベースの細胞集合体を使用するマイクロスケール組織工学を支持するようである。ＫｅｌｍおよびＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒは、マルチウェルのウェルまたはＴｅｒａｓａｋｉプレートに、懸滴技術を適用する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ドイツ特許公報ＤＥ１０３６２００２Ｂ４号明細書
【特許文献２】国際公開第０３／０７８７００Ａ１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＹａｍａｄａおよびＣｕｋｉｅｒｍａｎｎ，Ｃｅｌｌ，２００７
【非特許文献２】Ｐａｍｐｌｏｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７
【非特許文献３】ＫｅｌｍおよびＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第２２巻，Ｎｏ．４：１９５−２０２
【非特許文献４】Ｋｅｌｍら，２００４またはＫｈａｄｅｍｈｏｓｓｅｉｎｉら，２００６，ＰＮＡＳ第１０３巻，Ｎｏ．８：２４８０−２４８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの文献は全て、液滴を懸滴として正しく提供するために、液滴が付着する基質を反転する必要性を報告している。反転させた後、基質は、水平に置かれるか、あるいは水平方向に対して最大９０°の角度を有する面を含むと報告されている（特許文献２を参照）。そのような反転は、手動で扱うことが難しく、ロボットで行えばさらに難しくなる。したがって、プレートの手動反転が必要とされることが、大量生産および自動化適合性を遅らせている。したがって、本発明の目的は、液滴が付着する基質を反転する必要がないようにする懸滴プレートを提供することである。本発明の別の目的は、微小組織の吸引および／または損失のリスクが最小限である培地交換を繰り返して行えるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
これらの目的は、独立請求項１の特徴を有する懸滴プレートで達成される。最初に紹介したように、本発明のこの懸滴プレートは、本体が、さらに、本体の第１表面の方向から少なくとも一つの液滴接触区域に通じる少なくとも一本の導管を含むことを特徴とする。追加の発明的な好ましい特徴が、従属請求項から派生する。
【００１０】
本発明の懸滴プレートおよび懸滴技術には、以下の利点がある。
−スカフォードを必要としない。
−少量の液体および少数の細胞に適用可能である。
−細胞凝集体のサイズ調整を提供する。
−肝微小組織（たとえば、ＨｅｐＧ２）、心筋球状体および微小軟骨のような様々な種類の細胞／組織型に適合可能である。
−たとえば線維芽細胞の核を包む外側内皮層のような、規定された多細胞型系を提供することが可能である。
−求められる細胞凝集体を、短時間で生成することができる。
−３Ｄ細胞培養技術を現在の２Ｄ細胞培養プロセスと同じくらい簡便にする、プラットフォーム技術が提供される。
−該システムは、たとえば９６または３８４ウェルを有する複数ウェルプレートに合うＨＤプレートフォーマットを含む。
−懸滴は、たとえば、自動マルチチャネル・ピペッティング・ロボットを使用して、頂上投入により生成される。
−細胞シーディングおよび／または培地交換は、自動ピペッターにより行うことができる。
【００１１】
以下、本発明の懸滴プレートを、概略図に示す、選択された代表的な実施形態に基づいてさらに詳細に記載する。これらは、好ましい実施形態を説明するものであり、本発明の範囲を定めるものではない。本発明の懸滴プレートは、以下の図に示される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１実施形態による、円筒／円錐形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セルの正面図および上面図、ならびに３Ｄ図。
【図２】第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セルの正面図および上面図、ならびに３Ｄ図。
【図３】第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セルの線状配列の正面図および上面図。
【図４】第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セルの二次元配列の正面図、側面図および上面図、ならびに３Ｄ図。
【図５】頂部および底部カバープレートと組み合わせた、第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セルの二次元配列の正面図および側面図。
【図６】図５のカバープレートの正面図、側面図および上面図、ならびに３Ｄ図。
【図７】第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレートの液滴接触区域で垂れ下がる培養培地滴の写真像。導管は、本質的に培養培地で満たされている。
【図８】図７の写真像の概略断面図。
【図９Ａ】懸滴プレートの第１および第２実施形態の代替の変形体であって、本体の第２表面上での液体の広がりを防止する二種類の代替レリーフ構造を示す。
【図９Ｂ】懸滴プレートの第１および第２実施形態の代替の変形体であって、本体の第２表面上での液体の広がりを防止する二種類の異なる表面処理を示す。
【図９Ｃ】懸滴プレートの第１および第２実施形態の代替の変形体であって、液滴の体積の最小化または最大化を付加的にもたらす二種類の代替のレリーフ構造を示す。
【図１０Ａ】互いに接続された上部および下部を含む本体を備える懸滴プレートの概略断面図であり、液ラインを導管に固定する側面入口を備える変形体を示す。
【図１０Ｂ】互いに接続された上部および下部を含む本体を備える懸滴プレートの概略断面図であり、３８４液滴配列に９６チップ・ディスペンサ・ヘッドから分配される液を供給するための２個以上の導管に流体接続された頂部開口型口区画を備える変形体を示す。
【図１１】図７による懸滴プレートで製造された新生ラット心筋細胞の顕微鏡画像。
【図１２Ａ】ヒト肝細胞癌細胞の顕微鏡画像であり、１滴当たり１００個の細胞を示す。
【図１２Ｂ】ヒト肝細胞癌細胞の顕微鏡画像であり、１滴当たり２５０個の細胞を示す。
【図１３Ａ】播種後、異なる時点でのラット膵島細胞の顕微鏡画像であり、インキュベーション３時間後の細胞を示す。
【図１３Ｂ】播種後、異なる時点でのラット膵島細胞の顕微鏡画像であり、インキュベーション２４時間後の細胞を示す。
【図１３Ｃ】播種後、異なる時点でのラット膵島細胞の顕微鏡画像であり、インキュベーション９６時後の微小組織を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
図１は、第１実施形態による、円筒／円錐形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セル（第１円錐台と、円筒と、第２円錐台とを含む）の正面図および上面図、ならびに３Ｄ図を示す。懸滴プレート１は、第１表面３と、第１表面３に本質的に平行な第２表面４とを備える本体２を含む。第２表面４は、その中で細胞を培養する、または分子凝集体を製造するための液体６（ｌｉｑｕｉｄ  ｖｏｌｕｍｅ）を付着して受け取る（図７および８参照）、少なくとも一つの液滴接触区域５を含む。前記少なくとも一つの液滴接触区域５は、液体６が本体２の第２表面４上に広がるのを防止するレリーフ構造８によって周辺区域７から区別されている。本体２は、本体２の第１表面３の方向から少なくとも一つの液滴接触区域５に通じる少なくとも一本の導管９を更に含む。
【００１４】
この場合のレリーフ構造８は円形リムとして形成され、導管９は、第１表面３から第２表面４へ本質的に垂直方向に本体２全体を貫通する。導管９は、本体２の第１表面３に近接した位置にある入口区画１２を含む。ここで、入口区画１２は本体２内部の導管９の拡張部位１３として形成され、一個の一体的構成要素として形成されている。導管９は、本体２の第２表面３に近接した位置にあり、かつ液滴接触区域５の少なくとも一部を含む培養区画１７を含む。この実施形態では、培養区画１７は、直線状の壁を有するロート形状のくぼみとして形成されている。導管９は、直径が、少なくとも１０μｍ、好ましくは１０μｍから５００μｍの間、最も好ましくは５０μｍから２００μｍの間である毛細管部位１８を含む。導管９の円筒毛細管部位１８の長さは、０．１ｍｍから３０ｍｍの間、好ましくは０．５ｍｍから２ｍｍの間である。図１から明らかなように、導管９は、第１および第２表面３、４に対し本質的に垂直に伸びる分岐していないチャネルとして形成され、導管９の部位は全て、同軸方向に整列させられている。
【００１５】
図２は、第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セルの正面図および上面図、ならびに３Ｄ図を示す。第１実施形態について述べたことの大部分が、ここでも適用される。しかしながら、この実施形態では、培養区画１７は、湾曲した壁を有するロート形状のくぼみとして形成されている。導管９は、直径が、少なくとも１０μｍ、好ましくは１０μｍから５００μｍの間、最も好ましくは５０μｍから２００μｍの間である毛細管部位１８を含む。ここでは、導管９の円筒毛細管部位１８の長さは０ｍｍであり、再び、導管９は第１および第２表面３、４に対し本質的に垂直に伸びる分岐していないチャネルとして形成され、導管９の部位は全て、同軸方向に整列させられている。なお、図２の表示から逸脱するが、導管９の円筒毛細管部位１８の長さは、３０ｍｍまでであれば可能である。
【００１６】
図３は、第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレート（図２参照）の単位セルの線状配列の正面図および上面図を示す。複数の単位セルの軸と軸の間隔は、軸方向距離２３で反復し、該軸方向距離は、２４、９６または３８４ウェルを有する周知の標準的なマイクロプレートの軸方向距離によれば、好ましくは、１８ｍｍ、９ｍｍ、または４．５ｍｍである（マイクロプレートの発表されている標準寸法Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：ＡＮＳＩ／ＳＢＳ１−２００４，ＡＮＳＩ／ＳＢＳ２−２００４，ＡＮＳＩ／ＳＢＳ３−２００４，ＡＮＳＩ／ＳＢＳ４−２００４を参照）。
【００１７】
図４は、第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セルの二次元配列の二つの正面図および上面図、ならびに３Ｄ図を示す。好ましい寸法が図に示され、これらは、標準マイクロプレートの寸法に非常に近似している。実際、ここでは、３８４個の液滴接触区域５および導管９の二次元配列が示されている。したがって、ＡＮＳＩ／ＳＢＳ標準を満たし、３８４個の液滴接触区域５および導管９の配列を少なくとも標準マイクロプレートの寸法に近似した寸法を有する懸滴プレート１に組込めるようにするためには、軸方向距離は、４．５ｍｍが好ましい。一方、懸滴プレート１の単位セルは、互いに密着するのが好ましく（図３にも示すように）、これらの単位セルの配列は、水平板２４に取り囲まれているのが好ましい。水平板２４それ自体は、下側ウェブ２６および上側凹部２７を示す垂直方向リム２５に取り囲まれているのが好ましい。ウェブ２６および凹部２７の寸法は、懸滴プレート１をぎっしり積み重ね、積み重ねられたプレートを所定の場所に安全に保持するための積み重ね手段として作用するような寸法である。図４からわかるように、ウェブ２６および凹部２７の高さは、それぞれ、約２ｍｍが好ましい。
【００１８】
図４の表示から逸脱するが、ウェブ２６および凹部２７の位置は、積み重ね手段としての機能が失われない限り、入れ替えることができる。また、水平板２４および垂直方向リム２５の寸法は、本発明の精神から逸脱しない限り、変更することができる。しかしながら、垂直方向リム２５が、懸滴プレート１の第１表面３を超え、かつ第２表面４の下側に、突出している場合が好ましい。垂直方向リム２５も、懸滴プレート１の第２表面４上のレリーフ構造８の下に突出している（図４参照）のが特に好ましい。その上、このように突出している垂直方向リム２５は、懸滴プレート１の第１表面３および第２表面４を、破損または接触からも保護する。また、これらの二つの表面の汚染の危険性は、垂直方向リム２５によって大きく軽減する。
【００１９】
図５は、頂部および底部カバープレートと組み合わせた、第２実施形態による、双曲面形状を示す導管を備える懸滴プレートの単位セルの二次元配列の正面および側面図を示す。図４のように、ここでは、３８４個の液滴接触区域５および導管９の二次元配列を示す。再び、これらの単位セルの配列は、水平板２４で囲まれているのが好ましく、下側ウェブ２６および上側凹部２７を示す垂直方向リム２５で囲まれているのが好ましい。ウェブ２６および凹部２７の寸法は、懸滴プレート１をぎっしり積み重ね、積み重ねられたプレートを所定の場所に安全に保持するための積み重ね手段として作用するような寸法である。カバープレート２２も、懸滴プレート１の下側ウェブおよび上側凹部に対応する、下側ウェブ２６および上側凹部２７を示すのが特に好ましい。場合によっては、底部および／または頂部カバープレートとして使用されるように形成されたカバープレート２２が特に好ましい。これは、同じカバープレート２２を、懸滴プレート１の底のシェルとして、あるいは該プレートの頂部のキャップとして使用することができるという利点を有する。
【００２０】
とりわけ、懸滴プレート１の液滴接触区域５に付着する少なくとも一つの液体６中で細胞を培養するまたは分子凝集体を製造する過程での培養またはインキュベーション時では、液体６または導管９中の液の許されない蒸発を避けるため、懸滴プレート１の頂部および底部側を覆うのが好ましい。好ましくは、カバープレート２２を、第１懸滴プレート１の底に、底部シェルプレートとして置く。この第１懸滴プレート１は、ここでキャップとして使用されている第２カバープレート２２で覆うことができる。二枚のカバープレート２２とそれらの間の一枚の懸滴プレート１とのこのような「サンドイッチ構造」は、懸滴プレートが、液体および細胞および／または分子の有無（図５参照）に関わらず、該プレートの収納、培養またはインキュベーション、および安全な輸送のために好ましく形成される最も小さいユニットである。
【００２１】
温度管理されている装置におけるインキュベーションまたは培養のために、数枚の懸滴プレート１は、互いの頂部を直接積み重ね、最も上の懸滴プレート１および最も下の懸滴プレート１の頂部および底部だけをカバープレート２２で覆うことができる。これは、全ての懸滴プレートの積み重ねを、交互汚染の恐れが全くないように、同じ試料を充填する場合に特に好ましい。しかしながら、異なる試料を充填する場合（同じまたは異なる懸滴プレート１の積み重ねの中で）、懸滴プレート１を、それぞれの懸滴プレート１の間で、中間に置かれたカバープレート２２によって分離するのが好ましい。
【００２２】
無論、独立した懸滴プレート１（図４参照）および別々のカバープレート２２（図６参照）を製造することが可能であり、下側ウェブ２６および上側凹部２７は、それぞれ、同じ寸法を有するのがまさに好ましい。しかしながら、細胞を培養するまたは分子凝集体を製造するための最も好ましいセットとしては、一枚の懸滴プレート１と、二枚のカバープレート２２とを含むことが好ましい。
【００２３】
図７は、第２実施形態による、双曲面形状を示す導管９を備える懸滴プレート１の液滴接触区域５で垂れ下がる培養培地滴の写真像を示す。導管９は、本質的に培養培地で満たされていることは明らかである。液滴接触区域５での液滴（すなわち、液体６）のこの保持は、異なる要素の組合せ作用によって起こる。
【００２４】
ａ）導管９の毛管力が、液滴を引き付ける、重力および導管９における静水圧荷重および液体６に反して作用する。
ｂ）液滴接触区域５中の最終的に存在する選択的親水性塗料が、液体６の付着を支持し、静水圧荷重および重力に反して作用する。
【００２５】
ｃ）レリーフ構造８（ここでは、リムとして形成されている）が液体６を安定化し、液体の実際の内容物の明確化（ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）を助ける。
ｄ）液滴の表面張力が、さらに、液体６を安定化する。
【００２６】
ｅ）懸滴プレート１の周辺区域７に塗布された選択的疎水性塗料２１が、さらに、液体６を安定化するかもしれない。
実際、画像は、第２実施形態による、双曲面形状を示す導管９を備える懸滴プレート１の単位セルの線状配列（図２および３参照）のひな型から撮影した。底部シェルとして使用されたペトリ皿中にひな型を置くために、同ひな型は、水平板２４、垂直方向リム２５およびスタンドプレート２８を備え、これらは全て、懸滴プレート１の単位セルを取り囲む。したがって、単位セル、ひな型懸滴プレート１の水平板２４および垂直方向リム２５と、下のペトリ皿（ここでは示されていない）との間には、実際は、閉鎖空間が形成され、これにより、それぞれの液滴接触区域５に位置する液体６の周りを飽和湿度雰囲気に保つことを可能にした。
【００２７】
該画像の理解を助けるために、図８に、図７の写真像の概略断面図を示す。全ての図において、同じ参照番号は、たとえそれぞれの場合で詳しく言及されていなくても、同じまたは類似のものを示す。
【００２８】
図９は、懸滴プレートの第１および第２実施形態の代替の変形体を示す。懸滴プレート１のレイアウトは、図７および８で示したひな型による。しかしながら、標準マイクロプレートと近似する形状および寸法を有する、単一単位セルまたは懸滴プレート１全体も、本明細書で示す変形体による単位セルでありうる。
【００２９】
図９Ａは、本発明による懸滴プレート１の本体２の第２表面４上での液体６の広がりを防止する二種類の代替レリーフ構造８を示す。レリーフ構造８（リムである代わりに）は、環状凹部（左側を参照）または環状隆起（右側を参照）として形成されてもよい。いずれの場合も、レリーフ構造８の輪郭における方向の急激な変化が、液体６または液滴の境界を安全に定めている。
【００３０】
図９Ｂは、本発明による懸滴プレート１の本体２の第２表面４での液体６の広がりを防止する二種類の異なる表面処理を示す。左側では、液滴接触区域５が、生物学的に活性な化合物で選択的に被覆され、該化合物は、ポリペプチド類（抗体、成長因子、酵素）およびポリヌクレオチド類（ＲＮＡ、ＤＮＡ一重鎖または二重鎖）からなる群から選択される。右側では、周辺区域７が、疎水性塗料２１で選択的に被覆されている。なお、これらの二種類の処理の組合せは、特に好ましい。疎水性塗料２１の利用により、第２表面４でリムまたは凹部を追加する形態でレリーフ構造を組み込む必要性がなくて済むかもしれない。したがって、ここで示されている端部２９は、レリーフ構造８として十分である。
【００３１】
図９Ｃは、液滴の体積の最小化または最大化を付加的にもたらす二種類の代替のレリーフ構造を示す。左側では、端部２９を有する凹部が形成されている。ここでは、液滴の体積が最大限にされる。右側では、端部２９を有する隆起が形成され、したがって、液滴の体積は最小限にされる。さらに、ここでは、懸滴プレート１が示され、該プレートの導管９は、本体２の第１表面３に近接した位置にある入口区画１２を含む。好ましくは、入口区画１２は、ここで示すように、本体２内部の導管９の拡張部位１３（たとえば、図９Ａおよび９Ｂを参照）、または本体２の第１表面３上のカップ１４として形成されている。このような拡張部位１３およびカップ１４の組合せも実施可能である（図示せず）。
【００３２】
ここで、図に示されたおよび／または明細書中に記載された特徴のいかなる組合せも使用することができ、これらは本発明の精神を構成することに留意することが重要である。
図１０は、本体２を備える懸滴プレート１の概略断面図を示し、該本体は、互いに接続された上部１５および下部１６を含む。少なくとも一つの液滴接触区域５の領域において本質的に垂直方向に本体２を部分的に貫通し、懸滴プレート１の第２表面４に本質的に平行に部分的に伸びる導管９を備える代替の懸滴プレート１の製造は、この二部分配置によって大きく促進される。
【００３３】
図１０Ａは、液ラインを導管に固定する側面入口を備える変形体を示す。ここで、導管９は、本体２の前側側面１１に位置する入口接続部１０を含む。好ましくは、液が、一本以上のピペットまたはピペッティングロボットで懸滴プレート１の導管９に送達される、図１から８に示される実施形態と異なり、ライン３０を、懸滴プレート１に直接接続することができる。該ライン３０を介して、液および細胞または分子を、懸滴プレート１の液体６にいつでも送達することができる。したがって、液体６中の緩衝液または洗浄液のような液の交換が容易になる。
【００３４】
図１０Ｂは、３８４液滴配列に９６チップ・ディスペンサ・ヘッドから分配される液を供給するための二本以上の導管に流体接続された頂部開口型入口区画を備える変形体を示す。ここで、さらに、導管９は、本体２の第１表面３を本質的に垂直方向に貫通し、導管９は、第１および第２表面３、４に対し本質的に垂直に伸びるチャネル部１９と、第２表面４に本質的に平行に伸びる分岐部２０とを含む分岐チャネルとして形成されている。一方、液滴接触区域５は、４．５ｍｍの軸方向距離２３の間隔があり、好ましくは、頂部開口型入口区画１２は、９ｍｍまたは２倍の軸方向距離２３の間隔がある。線状配列懸滴プレート１では、（図３と比べて）二つの分岐部２０は、共通チャネル部１９に接合する。２Ｄ配列懸滴プレート１では、（図４と比べて）四個の分岐部２０が、共通チャネル部１９に接合する。したがって、９６チップ・ディスペンサ・ヘッドを含むロボットを使用して、３８４液滴配列を有する懸滴プレート１に、液および／または細胞または分子を一度に供給することができる。
【００３５】
液滴の形状および位置の補足的な制御は、培養区画１７の内側面、うね８および周辺プレート７を選択的に塗布することによって得ることができ、親水性および疎水性領域を獲得する。また、区画１２、１７および導管９の内側面に、細胞の該表面への付着を防止する表面膜を被膜することができる。あるいは、表面を、付着を阻止するマイクロおよびナノマシンニング技術を使用して、直接パターン化することができる。
【００３６】
懸滴プレート１は、ハイ・スループット・システムと適合する標準外側寸法（ＡＮＳＩ／ＳＢＳ１−２００４）の組織培養プレートが好ましい。このように、懸滴プレート１のセットは、二つの要素、
ａ）懸滴ウェルまたは液滴接触区域５を備える懸滴プレート１と、
ｂ）該懸滴プレート１を支持するカバー２２と、
から構成されているのが好ましい。
【００３７】
両要素（懸滴プレート１およびカバー２２）とも、生体適合性プラスチック材料（たとえば、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスチレンまたはポリプロピレン）で作られているか、または少なくともそれらのそれぞれの表面は前記材料を含む。両要素（懸滴プレート１、カバー２２）は、測光読取り器（頂部および底部からの読取り、好ましくは底部読取り）と適合する。懸滴プレート１は、９６または３８４単位の懸滴ウェルを含むことが好ましい。懸滴プレート１は、カバーとは独立したロボット処理のために、垂直方向リム２５を備えることが好ましい。カバー２２は、懸滴プレート１の各単一ユニット内での液滴形成のための十分な空間を提供する。懸滴プレート１は、互いに積み重ねられて設計される。カバー２２は、液滴の蒸発を最小限にするため、狭チャネルシステムを備えることができ、あるいは水／食塩水で満たされているベースの内側に沿って、該チャネルシステムを備えることができる。蒸発を最小限にし、汚染から保護するために、カバー２２を、懸滴プレート１の下側および上側シェルの両方のために使用することができる。
【００３８】
懸滴は、手動式または自動式により、標準の単一チャネルまたはマルチチャネル・ピペットを使用し、入口区画１２への液の頂上投入によって生成することができる。懸滴ウェルの設計により、入口区画１２を介して繰返しの液交換が可能になる。
【００３９】
本発明は、人為的な基質−細胞相互交換なしで、細胞をうまく三次元化し、培養する装置を提供する。該装置は、二つの区画（入口区画１２および培養区画１７）を備える微小流体システムを含む。入口区画１２の体積は、５μｌから５０μｌの間が好ましく、１０μｌから３０μｌの間が最も好ましい。培養区画１７の体積は、１０μｌから１００μｌの間が好ましく、１０μｌから５０μｌの間が最も好ましい。入口区画１２および培養区画１７の形状は、円筒、円錐または双曲面状が可能である。単一ユニットの各培養物は、独立した液滴を安定化し、分離するために、培養区画底部から突出しているリング８につながっているのが好ましい。うねの形態の液滴分離リングまたはレリーフ構造８の高さは、０．１ｍｍから５ｍｍの間が好ましく、１ｍｍから２ｍｍの間が最も好ましい。
【００４０】
本発明による懸滴プレート１は、射出成型によって直接的に、またはレプリカ成型によって間接的に製造することができる。代替の製造方法は、マイクロミリング技術および／または懸滴プレート１の部品を一緒に接合接着または溶接することを含む。
【００４１】
次に、本発明による懸滴プレート１のひな型を使用した場合の材料および方法、ならびに達成される結果を簡単に記載する。
懸滴培養の製造のための代表的なプロトコルは、以下の通りである。
【００４２】
ａ）従来の２Ｄ培養から、標準トリプシン処理により細胞を採取する。
ｂ）通常の細胞培養培地で細胞を洗浄する。
ｃ）適当量の通常の細胞培養培地に、試験の必要条件に応じて、それぞれ、１００〜１０，０００個の細胞／３０μｌの液滴または液体６に対応する３，３３３〜３３３，３３３個の細胞／ｍｌの密度で、細胞を取り上げる。
【００４３】
ｄ）細胞を含むフラスコを軽く回転させ、３０μｌの細胞懸濁液の液滴を、頂上投入によって、懸滴プレート１の入口区画１２に分配する。
ｅ）通常の細胞培養インキュベータ中の加湿箱に懸滴プレート１を置く。
【００４４】
ｆ）細胞の種類に応じて、１〜３日以内に、細胞が凝集し、微小組織が形成する。
ｇ）長期インキュベーションまたは実験的プロトコルでは、最終的に、培地の取替えが必要である。これは、単に、２５μｌの古い培地を懸滴プレート１の頂部側上の入口区画１２から吸引し、入口区画１２にピペットで入れられた同じくらいの量の新しい培地で置き換えることによって行われる。
【００４５】
ｈ）液滴接触区域５を、懸滴プレート１の頂部側上の入口区画１２に送達された培地５０〜１００μｌで濯ぎ、したがって、該微小組織を採取装置（すなわち、９６または３８４ウェルのペトリ皿またはマイクロプレート）に濯ぎ入れることによって、微小組織を採取する。
【００４６】
実施例Ｉ
新生ラットから新しく単離された心筋細胞を、２Ｄ培養から採取する細胞を含まない上記のプロトコルにしたがって製造した（プロトコルでは、ａ点）。１０，０００個の細胞／液滴から製造された、得られた微小組織は、直径約２５０μｍの微小組織寸法に対応する。これは、図７による懸滴プレートによって製造された、ラット心筋細胞で構成された微小組織の顕微鏡画像を示す図１１で実証されている。
【００４７】
実施例ＩＩ
ヒト肝細胞癌細胞（ＨｅｐＧ２）を、前記プロトコルに従って処置した。図１２は、１００個の細胞／液滴（図１２Ａ）、および２５０個の細胞／液滴（図１２Ｂ）で播種して、４８時間後のヒト肝細胞癌微小組織の顕微鏡画像を示す。これらの細胞密度は、それぞれ、直径１００μｍおよび２００μｍの微小組織という結果となった。
【００４８】
実施例ＩＩＩ
ラット膵島細胞（２５０個の細胞／液滴）を、前記プロトコルに従って処理し、それを、播種後、異なる時点でのラット膵島細胞の顕微鏡画像を示す図１３において実証する。ラット膵島微小組織の形成は追跡することができ、インキュベーションの３時間後では実際には、単一細胞だけが存在している（図１３Ａ参照）。インキュベーションの２４時間後では実際には、全ての細胞が凝集した（図１３Ｂ参照）。インキュベーションの９６時間後では直径が約１００μｍの球状ラット膵島微小組織が形成されていた（図１３Ｃ参照）。
【００４９】
したがって、本発明は、図１から１０に基づいて記載した懸滴プレート１の液滴接触区域５に付着する少なくとも一つの液体６中で、細胞を培養するまたは分子凝集体を製造する方法を含む。懸滴プレート１は、第１表面３と、第１表面３に本質的に平行であり、かつその中で少なくとも一つの液体６を付着して受け取る少なくとも一つの液滴接触区域５を含む第２表面４とを備える本体２を含む。前記少なくとも一つの液滴接触区域５は、本体２の第２表面４上で液体６が広がるのを防止するレリーフ構造８によって周辺区域７から区別されている。本発明の方法は、液体６を、本体２の第１表面３の方向から液滴接触区域５に通じる導管９を介して液滴接触区域５に加えることを特徴とする。
【００５０】
細胞、好ましくは、少なくとも一種の細胞型の多数の細胞または細胞微細凝集体を培養する方法を実施する場合は、
−液に懸濁させ、
−液体６とともに、懸滴プレート１の導管９を介して移動させ、
−液体６内で培養し、
微小組織は、液体６内で培養された細胞から形成される。
【００５１】
あるいは、細胞、少なくとも一種の細胞型の多数の細胞または細胞微細凝集体を培養する方法を実施する場合は、
−懸滴プレート１の導管９を介して液体６へ移動させ、
−液体６内で培養し、
微小組織は、液体６内で培養された細胞から形成される。
【００５２】
分子凝集体、好ましくは多数の分子または分子微細凝集体を製造する方法を実施する場合は、
−液に懸濁させ、
−液体６とともに懸滴プレート１の導管９を介して移動させ、
−液体６内でインキュベートし、
分子凝集体は、液体６内でインキュベートされた分子または分子微細凝集体から形成される。
【００５３】
細胞を培養する、または分子凝集体を製造する方法を実施する場合、液体６中の一部の液を、液滴接触区域５専用の懸滴プレート１のそれぞれの導管９を介して回収するのが好ましい。次に、回収された液体の少なくとも一部を、液滴接触区域５専用の懸滴プレート１のそれぞれの導管９を介して送達される液によって置き換えられるのが好ましい。
【００５４】
本発明の懸滴プレート１の用途として、以下が特に関心のあるものである。
ａ）薬物スクリーニングおよび薬物の開発：該懸滴プレートは、組織特異性機能が改善された生物模倣３Ｄ細胞性凝集体すなわち微小組織を、手動（低容量）または自動（高容量）で生成するためのプラットフォームを提供する。ロボット・リキッド・ハンドリングシステムに完全に適合させることにより、細胞をさらに通過させる必要なく、再凝集プロセスの後、鉛同定および最適化のための高処理量化合物スクリーニングが可能になるだろう。従来の２Ｄ細胞アッセイと同様に、顕微鏡測定、光度測定、蛍光測定および／またはルミノメトリー測定（底部の読み）および／またはさらにダウンストリーム・ティシュー・プロセシング（組織学的分析）による終点決定を用い、微小組織アッセイを通常の方法で行うことができる。
【００５５】
ｂ）細胞毒性試験（ＡＤＭＥ／ｔｏｘ）：該懸滴プレートは、組織特異性機能が改善された３Ｄ細胞凝集体すなわち微小組織を、手動または自動で生成するためのプラットフォームを提供する。ロボット・リキッド・ハンドリングシステムに完全に適合させることにより、吸収、代謝、排泄および毒性の面に関与する可能性のある薬物候補の高処理量試験を可能にするだろう。従来の２Ｄ細胞アッセイと同様に、顕微鏡測定、光度測定、蛍光測定および／またはルミノメトリー測定（底部の読み）および／またはさらにダウンストリーム・ティシュー・プロセシング（組織学的分析）による終点決定を用い、微小組織アッセイを通常の方法で行うことができる。
【００５６】
ｃ）細胞治療：微小組織は、単一細胞治療に比べて、細胞治療に対していくつもの利点を示し、該利点として、（ｉ）より高い機能性、（ｉｉ）細胞外マトリックスが前もって形作れること、（ｉｉｉ）血管内皮増殖因子のような血管新生促進因子の分泌、および単一細胞のようなより低い運動性が含まれる。したがって、微小組織は、心筋梗塞または糖尿病のような種々の器質的障害の治療のための組織の再生／修復により高い潜在能力を有する。細胞治療において、大量生産は、それらを使用するための不可欠な前提条件である。該懸滴プレートは、先に述べたように、以下の特徴により、大量生産への適合性を提供する。
【００５７】
１．必要な培養物体積が少ない。
２．３８４までのチャネルを備えるディスペンサによる、同時頂上投入または回収。
３．１ディスペンサ・チャネル毎に二滴以上の液滴を供給する、二本以上の導管に流体接続された入口区画。
【００５８】
４．懸滴プレートを積み重ねることができる。
さらに、該懸滴プレートは、全能性または多能性前駆細胞から組織特異的機能性を有する、高度に分化した細胞凝集体への変換のための繰返し媒体変化に関与する拡大および後続の時間依存性分化プロトコルのような複雑な手順の適用を容易にする。
ｄ）タンパク質の結晶化：タンパク質の機能を研究するためには、三次元構造の理解が必須である。タンパク質の結晶は、蒸発方法により、特定の液の懸滴中でタンパク質の濃度をゆっくり上げることにより生成される。該懸滴プレートは、タンパク質／分子結晶の播種、成長および採取をロボット適合させることができる。
【符号の説明】
【００５９】
１…懸滴プレート、２…本体、３…第１表面、４…第２表面、５…液滴接触区域、６…液体、７…周辺区域、８…レリーフ構造、９…導管、１０…入口接続部、１１…本体の前側側面、１２…入口区画、１３…拡張部位、１４…カップ、１５…本体の上部、１６…本体の下部、１７…培養区画、１８…毛細管部位、１９…チャネル部、２０…分岐部、２１…疎水性塗料、２２…カバープレート、２３…軸方向距離、２４…水平板、２５…垂直方向リム、２６…下側ウェブ、２７…上側凹部、２８…スタンドプレート、２９…端部、３０…ライン。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
0005490803.tif 000010
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
0005490803.tif 000012
【図１０Ａ】
0005490803.tif 000013
【図１０Ｂ】
0005490803.tif 000014
【図１１】
0005490803.tif 000015
【図１２Ａ−１２Ｂ】
0005490803.tif 000016
【図１３Ａ−１３Ｃ】
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