(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
全血サンプルの成分を測定する膜濃縮アッセイ方法であって、
前記成分は、Ｃ反応性タンパク質、コバラミン、トランスコバラミン、ホロトランスコバラミン、ホモシステイン、葉酸、葉酸受容体及びその組み合わせからなる群から選択される全血の成分であり、
細胞溶解を引き起こす条件下で前記サンプルを処理すること、及びこれにより生成された溶解サンプルを核酸分子の切断を引き起こす条件に供することを含み、
前記膜濃縮アッセイの膜が、１０μｍ以下の孔サイズであり、前記成分に対する特異的結合リガンドが固定化されているものである、アッセイ方法。
【請求項２】
核酸分子の切断を引き起こす条件が、物理的条件、放射性条件、化学的条件及び生物学的条件からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的条件が、ミクロコッカスヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、及びヌクレアーゼＢＡＬ  ３１からなる群から選択されるヌクレアーゼの存在を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼが乾燥した形態で提供される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
細胞溶解が、界面活性剤溶解、低張性溶解、高張性溶解又はカオトロピック溶解である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記溶解が、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤から選択される界面活性剤によって提供される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｃ反応性タンパク質、コバラミン、トランスコバラミン、ホロトランスコバラミン、ホモシステイン、葉酸、葉酸受容体及びその組み合わせからなる群から選択される全血成分のアッセイのためのアッセイ装置であって、
全血を受け入れるためのチャンバー、及び孔サイズが１０μｍ以下である少なくとも１つの膜を含み、
前記膜は、前記成分に対する特異的結合リガンドが固定化されているものであり、
前記装置は核酸を切断するための化学的試薬及び生物学的試薬の少なくとも一方を備える、アッセイ装置。
【請求項８】
前記装置がヌクレアーゼを含む、請求項７記載の装置。
【請求項９】
前記ヌクレアーゼが乾燥した形態である、請求項８記載の装置。
【請求項１０】
前記装置が界面活性剤を含む、請求項７から９のいずれかに記載の装置。
【請求項１１】
Ｃ反応性タンパク質、コバラミン、トランスコバラミン、ホロトランスコバラミン、ホモシステイン、葉酸、葉酸受容体及びその組み合わせからなる群から選択される全血成分のアッセイのためのキットであって、
１０μｍ以下の孔サイズであり前記成分に対する特異的結合リガンドが固定化されている膜と、
ミクロコッカスヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、及びヌクレアーゼＢＡＬからなる群から選択される核酸切断のための少なくとも１つの生物学的手段とを含むキット。
【請求項１２】
さらに、下記から選択される少なくとも１つを含む請求項１１に記載のキット；
ｉ）細胞溶解を引き起こすための試薬、又は
ｉｉ）前記サンプルの成分又は潜在的成分、すなわちＣ反応性タンパク質、コバラミン、トランスコバラミン、ホロトランスコバラミン、ホモシステイン、葉酸、葉酸受容体又はその組み合わせへの結合剤を含む試薬。
【請求項１３】
請求項７から１０のいずれかに記載の装置を含む、請求項１１又は１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、身体サンプル（body samples）に対して行われるアッセイの正確性、信頼性及び／又は速度を改良する方法に関する。特に、本発明は、とりわけ細胞又は細胞残屑を含むサンプルに対して、小さな孔サイズ（例えば１μｍ未満）の膜又はフィルターを使用して行われる高速アッセイに関する。最も特に、本発明は、溶解（例えば界面活性剤溶解）を介した膜濃縮アッセイ、並びに対応するアッセイキット及び装置を改良する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
迅速な診断アッセイは、ポイントオブケア（ＰｏＣ−例えば医学的専門家との協議の時）、又は小さな若しくは回転の速い医学的診断ラボにおける使用のためにますます重要になっている。とりわけＰｏＣの使用のためのそのような検査は、典型的には、装置の部品とサンプルの特異的な相互作用を可能にする液体経路を加えた、サンプルを受け入れるための容積、及び／又はさらなる試薬を含む、使い捨てのチューブ、スティック、カートリッジ及びローターなどのような少なくとも１つの「装置」を利用する。典型的には０．２〜５μｍの比較的小さな孔サイズを有する膜（例えばニトロセルロース）は、迅速な診断アッセイ（例えば、免疫学的アッセイ）のために一般に用いられている構成要素である。そのような膜はアッセイの固相として使用されてもいいし、また、ミクロ粒子及び沈殿した生物学的物質の回収のためにも使用される。
【０００３】
血液中の血漿タンパク質のアッセイのような細胞含有サンプル中の成分の迅速なアッセイに使用することができる一般的方法は２つある。液体（例えば血漿）から細胞を分離するか、又は膜を通過させるために細胞を破壊するかのいずれかを行なうことができる。分離方法では、細胞は分析前の分離の過程で、又は試験装置自体の中のフィルターを使用することによってのいずれかで除去される。細胞破壊方法では、細胞（例えば血球）膜は、例えば界面活性剤の使用によって、断片化され、典型的には可溶化され、それにより材料が膜の孔を通過することが可能になる。
【０００４】
迅速な試験、特にポイントオブケアの状況又は合理化されたラボの状況で使用される試験は、通常は少数の（好ましくは単純な）工程及び数分の継続時間のみに限定されるべきである。このことは、細胞分離工程の使用を実用的でないものとし、また、液体（例えば血漿）分離が装置内の統合された事象の部分として行わなければならないか、又はサンプルがフィルター膜の孔を通過することを可能にするように界面活性剤のような溶解剤又は条件を使用して細胞壁及び核膜を破壊／溶解しなければならないことを意味する。とりわけ定量的アッセイのための膜フロースルー形式では、この形式により効率的な血球分離を設計するのが困難であるので、溶解方法は有益である。
【０００５】
ポイントオブケアで使用するためのアッセイにおいて、速度、感度及び正確性はすべて非常に望まれる因子であるが、アッセイの状況においては、ある因子（例えば、速度）において許容可能な性能を与えるために、別の因子（例えば、感度）における可能な改善を犠牲にする「トレードオフ」を行なうことが必要な場合がしばしばある。全体的なより高い性能のレベルでバランスをとることができるように、これらの特性がともに改良され得る方法を提供することは非常に価値があるだろう。
【０００６】
免疫濃縮アッセイとも呼ばれる膜フロースルーアッセイ形式は、抗体、受容体、抗体フラグメントなどのような特異的結合部分が付着する、小さな孔サイズ、典型的には０．４５μｍの膜を使用する。この形式はできるだけ粒子のないサンプルを必要とする。というのは、膜の孔サイズ付近又は孔サイズを上回る大きさを有する粒子（例えば細胞残屑）はどんなに少数でも、膜の液体フロースルーを効率的に低下させるからである。最悪の場合では、これにより、膜を通る液体輸送が完全に停止する場合がある。軽微な膜フローの阻害でさえフローの問題及び／又はアッセイの信頼性の悪化を引き起こす場合がある。したがって、膜フロースルーアッセイを開発する場合の重大な点は、アッセイの期間を通して効率的な孔サイズ及び膜のフロー特性を変化させることなく、任意の細胞含有サンプルが膜を通るように処理することである。
【０００７】
上記に加えて、ヘマトクリット補正は、溶解(とりわけ界面活性剤溶解)方法の使用によって取り組まれ得る、全血に基づいた定量的アッセイに関連するもう１つの問題である。具体的には、細胞溶解を用いることによって、簡便な溶解物のヘモグロビン測定により、ヘマトクリット補正が可能になる。
【０００８】
全血又は他の細胞含有サンプルの（とりわけ界面活性剤による）溶解における主要な目標は、装置、とりわけフィルター又は膜の通過を可能にするように細胞膜及び核膜を分解することである。
【０００９】
例えば、界面活性剤は膜に侵入し、ミセル及びタンパク質−界面活性剤複合体を産生する。ミセルの大きさは、典型的な０．４５μｍの孔サイズ膜を通過させることができるほど、一般に低分子である。同様に、カオトロピック溶解剤は、膜の中に維持されるタンパク質の構造を破壊し、したがって膜の構造を破壊する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
膜タイプアッセイにおける（例えば、界面活性剤による）溶解方法の多くの利点にもかかわらず、この方法を特に自動化アッセイシステムのために使用する市販のアッセイはほとんどない。この理由の１つは、ミセルへの細胞膜の完全な溶解が期待される状況で膜目詰まり（blockage）及びフローの制限が時に生じることがあるということかもしれない。この挙動は、以前は人為的なものとして片付けられたか、又は単に理解されなかった。というのは、溶解アッセイにおける膜の輸送についての律速因子は、以前はサンプルの細胞周囲の膜及び細胞内の膜の破壊であると考えられたからである。血液サンプルでは、以前は、例えば、細胞膜又は白血球核膜の不十分な可溶化が、膜目詰まりの主要な原因として考えられていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、溶解された細胞サンプルの以前に理解されていた挙動とは異なって、非常に少量においてでさえ細胞の核酸、とりわけＤＮＡが、律速的膜目詰まり及び高いバックグラウンドアッセイシグナルを引き起こす場合があることを予想外に確立した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
したがって本発明は、第１の態様において、細胞含有身体サンプルのアッセイ方法であって、細胞溶解を引き起こす条件下で該サンプルを処理すること、及びこれにより生成された溶解サンプルを核酸分子、とりわけＤＮＡ分子の切断を引き起こす条件に供することを含む方法を提供する。好ましくは、細胞溶解を引き起こす条件は、界面活性剤のような細胞を溶解する薬剤の添加を含む。本方法は、好ましくは膜アッセイ方法、より好ましくは下記に述べるような「膜捕捉」アッセイ方法である。本方法は、任意で好ましくは（サンプルの膜の通過に続いて）前記サンプル中の少なくとも１つの成分又は潜在的成分について、サンプル（例えば膜を通過するサンプルの一部分、又は好ましくは膜上に若しくは膜によって保持されたサンプルの一部分）をアッセイすること、及び／又は任意で好ましくはアッセイ値（assayed value）を細胞含有身体サンプルにおけるアッセイ成分（assayed component）の定性的含有量、半定量的含有量又は定量的含有量に関連づけること、及び／又は任意で好ましくはアッセイ成分を少なくとも１つの医学的条件又は生物学的条件に関連づけることを含んでもよい。
【００１３】
本発明者は、アッセイ装置中の膜目詰まりの原因は脂質成分の不十分な溶解性よりむしろ核酸であることを確立することで、小さな孔サイズの膜がサンプル中の成分の濃縮に使用される場合における、そのような膜のフロースルーの改良、及びバックグラウンドシグナルの減少という双方の必要性に取り組む。改良されたフローは、次には、アッセイがより迅速に行われることを可能にし、かつ／又はより大きな容量のサンプルが同時に処理されることを可能にし、大きな容量からの検体の濃縮、及び結果として感度及び正確性の改善を可能にする。
【００１４】
したがって本発明は、さらなる態様において、溶解された細胞含有身体サンプルの１０μｍ以下の孔サイズの膜のフロースルーを含むアッセイ方法における核酸切断条件の使用を提供する。この使用はアッセイの性能の改良であり、１つ又は複数の形態を採用してもよく、又は特性の全体的なバランスの改善であってもよい。好ましくはこの使用は、膜濃縮アッセイにおいて、膜の液体フロースルーを促進すること、及び／又は膜上のバックグラウンドシグナルを減少させること、及び／又はアッセイの速度を向上することにおける使用である。
【００１５】
なおさらなる態様において、本発明は、細胞含有体液を受け入れるためのチャンバー及び１０μｍ以下の孔サイズの少なくとも１つの膜を内蔵するアッセイ装置もまた提供し、アッセイ装置は使用中に核酸切断条件を提供する。好ましくは、本装置は、本明細書において以下に記述されるもののような核酸切断のための少なくとも１つの化学的手段及び／又は生物学的手段を含んでいる。そして、核酸切断の条件は、装置の使用によって提供され得る。
【００１６】
まだなおさらなる態様において、本発明は、細胞含有体液のアッセイのためのキットであって、約１０μｍ未満の孔サイズの膜を含む装置と、核酸切断のための少なくとも１つの化学的手段及び／又は生物学的手段を含むキットを提供する。任意で好ましくは、キットは、界面活性剤のような細胞溶解の少なくとも１つの手段、及び／又は前記サンプルの成分若しくは潜在的成分のアッセイのための少なくとも１つの試薬を含み得る。さらに任意であるが、好ましくは、キットは前記細胞の溶解（例えば界面活性剤を介した溶解）、続いてこれにより放出された核酸分子の切断、続いて結果として生じる少なくとも一部のサンプルの膜の通過を含む方法における使用のための説明書を含み得る。最も好ましくは、この方法は本明細書において記述されるような本発明の方法である。
【００１７】
本明細書において言及されるような核酸鎖の切断を引き起こすための条件は、物理的条件（振盪、混合、ボルテックスによる撹拌等）、放射性条件（紫外線、Ｘ線又はγ線放射線のような電磁放射による処理等）、化学的条件（ｐＨ及び／又は酸化還元条件の制御等）及び／又は生物学的条件（酵素による処理及び／又はヌクレアーゼのような核酸溶解特性がある内在性の酵素の活性化等）であってもよい。核酸切断を引き起こすための好ましい条件は、放射性条件、化学的条件及び生物学的条件、とりわけ少なくとも１つの付加的な酵素及び／又は内在性の酵素による処理である。
【００１８】
本発明者は、界面活性剤により溶解された細胞含有サンプル（とりわけ血液）の小さな孔の膜のフロースルーを含むアッセイにおける膜目詰まりの原因を広汎に検討した。関連技術分野における他の当業者と同様に、膜フローが、典型的には界面活性剤が仲介する膜のミセルへの変換によって制御されるという仮定から始まった。サンプル（とりわけ血液サンプル）中のＤＮＡの非常に少量の相対的質量が、とりわけ膜の目詰まりにおいて何らかの顕著な物理的な影響を有することは、本発明者にとっては大変な驚きであった。
【００１９】
正常なヒト血液は、１０００個の赤血球当たりについて約１つの白血球を含む。赤血球は核もＤＮＡも含まないが、白血球は有核でありＤＮＡを含む。典型的な哺乳類の細胞は、７０％の水、３％のリン脂質、１．１％のＲＮＡ及び０．２５％のＤＮＡなどをその他の構成成分中に含む。典型的な哺乳類の細胞膜は、約５０％リン脂質及び５０％膜結合タンパク質を含む。これは、０．８％のＤＮＡと比較して、細胞膜が哺乳類の細胞の乾重量のおよそ２０％を構成することを意味する。白血球のみを見ると、膜：ＤＮＡの質量比は約２５：１である。膜を有するがＤＮＡのない赤血球を考慮に入れると、すべての血球についての膜：ＤＮＡの質量比は、合計すればおそらく約１０００：１である。
【００２０】
当初は、激しい剪断力が使用されるアッセイは手動で行われた。このアッセイは、膜目詰まり又は高いバックグラウンドシグナルに関する問題を示さなかった。手動のアッセイにおいて、全血は指先穿刺（finger stick）から得られ、続いて界面活性剤であるデオキシコレートを含む液体中に希釈し数秒間の激しい振盪によって溶解した。溶解された血液は、次の工程において抗体により覆われた膜を通してろ過され、これにより検体を捕捉した。金連結抗体、次いで洗浄溶液を加え、金粒子から発生した赤色のシグナルを測定した。
【００２１】
続いて本発明者は、上に記載された手動操作アッセイの自動化バージョンを開発した。この機械化したアッセイにおいて、血液は、機器に含まれるポンプによって希釈液と穏やかに混合される。この機器により血液サンプルをアッセイする場合、いくつかのサンプルはニトロセルロース膜のフロースルーについて通常とは異なるフロー特性を示した。ある場合においてフローは遅延し、少数の場合において膜の液体フロースルーは完全に停止するようになった。なお、希釈液は、非常に多数の赤血球（ヘマトクリット８０％）を含む血液サンプルの完全な溶解のために必要とされるよりも多量の界面活性剤を含んでいた。フロー速度の減少した血液サンプルは、同じサンプルからの血漿を基準として使用した検体濃縮について非常な過大評価を一貫して与えた。
【００２２】
ヒトゲノムからのＤＮＡは最大５ｃｍと非常に長く、これらの鎖は剪断力に対して非常に弱い。手動で調製されたサンプルにおいて、振盪はＤＮＡを破壊すると仮定された。一方、機器中では血液サンプルは非常に緩やかな方法で希釈液体と混合され、ＤＮＡ構造が保存され、ＤＮＡが膜の目詰まりを起こした。本発明者は、穏やかに混合されただけの手動で調製されたサンプルを調製し、ここでも膜の目詰まりが生じることを見出した。同様に、機器中での処理前のサンプルの力強い振盪は、膜目詰まりのない正常化されたフロー速度及び血漿検体濃縮の正確な測定をもたらした。白血球（ＤＮＡを含む）が高い比率であるサンプルは、正常なサンプル又は赤血球（ＤＮＡを含まない）が高い比率であるサンプルよりも膜目詰まりをもたらす可能性がありそうなことがわかった。
【００２３】
これらの観察はともに、白血球の核に含まれるＤＮＡがフロー問題の原因であるという本発明者の仮説を支持した。次にこのことは、核酸消化の化学的方法及び特に生物学的方法の実験によってさらに確認された。これらの実験は、核酸の長い鎖が膜目詰まりを引き起こすことに加えて、膜フロースルーアッセイにおいて非常に高いバックグラウンドシグナルもまたもたらすかもしれないこと、その結果として偽陽性の結果又は単に不正確な結果を引き起こすこともまた示した。
【００２４】
本発明のアッセイ方法において、細胞含有サンプルは、細胞及び核膜を破壊するように適切な条件下での処理によって溶解される。好ましい実施形態において、サンプルは少なくとも１つの界面活性剤により処理して細胞溶解及び膜溶解をもたらし、次いで核酸分子を破壊する。
【００２５】
本明細書において示されるような「界面活性剤」は、リン脂質膜から小さな孔の膜（本明細書において記述するようなもの）を通過することができるミセル及び／又は小胞のような小構造への変換を容易にすることができる任意の両親媒性分子であってもよい。適切な界面活性剤は、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤であるが、特に陰イオン性界面活性剤を含む。特定の例としては、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）を含むコール酸塩界面活性剤と、トリトン、ツイーン、ゲナポール（Genapol）、ルブロール（Lubrol）、テシット（Thesit）、ブリジ（Brij ）及びルブロールのような界面活性剤のシリーズのポリオキシエチレンと、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド及びオクチル−β−Ｄ−グルコシド、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、ラウリルジメチルアミン酸化物（ＬＤＡＯ）、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）及びビス（２−エチルヘキシル）スルホサクシネートナトリウム塩を含む他の界面活性剤とを含む。ナトリウム塩が挙げられているが、明らかにカリウム、マグネシウムなどのような他の金属の塩も同様に効果的だろう。最も好ましい界面活性剤は、デオキシコール酸ナトリウムである。
【００２６】
界面活性剤の使用は本発明で使用される細胞溶解の好ましい方法であるが、本発明は、同様に低張性溶解又は高張性溶解、カオトロピック溶解などを含む細胞溶解の他の多くの方法での使用に適している。そのような方法における使用のために適切な試薬は、当該技術分野における当業者に公知であり、脱イオン化された水（低張性溶解用）と、高張性溶解用には、ナトリウム塩、マグネシウム塩及びカリウム塩（例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ）を含む塩のような張性調整剤と、クロロホルム、フェノール、又はグアニジウムイソチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）又は尿素を含むカオトロピック塩のようなカオトロピック剤などがある。
【００２７】
本明細書において使用される用語「核酸」は、純粋な形、及びより一般的にはポリペプチド／タンパク質のような高分子を含む他の分子との複合体中での天然の形の両方において、リボ核酸（ＲＮＡ）及び／又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の巨大分子の鎖を示すように意図されている。特に、哺乳類のサンプルからのゲノムＤＮＡは、一般にクロマチン又は結合タンパク質のような他の因子と組み合わさってヌクレオソーム及びリンカー領域の複合体として存在するだろう。好ましくは、本明細書において言及される核酸は、ＤＮＡ及び特にゲノムＤＮＡである。
【００２８】
本発明のすべての態様において上記の本明細書で示されるように、核酸の切断を引き起こすのに適切な条件は、典型的には物理的条件、放射性条件、化学的条件及び／又は生物学的条件である。好ましい条件は、核酸鎖切断を引き起こすための化学的条件及び／又は生物学的条件である。ＤＮＡの化学的切断は、エポキシド、イミン、活性化されたシクロプロパン、ヘテロ環Ｎ−酸化物、キニーネなどのような様々な周知のＤＮＡ損傷性のある薬剤を含む任意の適切な試薬によって引き起こされる場合がある。好ましくは、これらの「化学的なヌクレアーゼ」は酸化経路によってＤＮＡを切断する、酸化還元活性配位錯体であろう。好ましい例は、銅フェナントロリンとそれに続く酸化剤、ジアゾニウム塩、金属錯体を使用する光切断、及び鉄／ＥＤＴＡシステムを含む。
【００２９】
核酸切断の「生物学的」方法は、一般には穏やかな条件の下で任意の適切なヌクレアーゼにより行われてもよい。本発明で使用するために適切なヌクレアーゼは、核酸のヌクレオチドサブユニットの間のフォスフォジエステル結合を切断することができる酵素である。遺伝子操作実験におけるＤＮＡ断片の生成のための一般的に使用される「制限酵素」を含む、異なる活性、金属依存性及び特異性の多くのタイプのヌクレアーゼが公知である。これらはマグネシウム及びカルシウムのようなイオンに依存するヌクレアーゼを含む。マグネシウム依存性ヌクレアーゼと同様、カルシウム依存性ヌクレアーゼは本発明で使用される１つの好ましいグループである。中程度の長さの断片への核酸鎖の切断でさえ、一般にはサンプルの膜を通した無制限の通過を可能にするのに十分であるので、これらのヌクレアーゼのいずれでも適切である。
【００３０】
ヌクレアーゼの一般的な例は、ミクロコッカスヌクレアーゼ（Ｓ７ヌクレアーゼ）、Ｓ１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ヌクレアーゼＢＡＬ  ３１ベンゾナーゼ（商標）を含む。特に適切な１つのヌクレアーゼは、１１ｎｍの直径のヌクレオソーム間のリンカー領域内のＤＮＡを優先的に切断するＣａ2+依存性エンドヌクレアーゼである、ミクロコッカスヌクレアーゼ（ミクロコッカス（球菌属）ピロゲネス（Micrococcus pyrogenes）に由来するので、ミクロコッカスヌクレアーゼとも呼ばれる）である。ＤＮＡの分解に続き、未切断のＤＮＡの非常に粘性のある溶液の粘性が減少し得る。
【００３１】
下記の実施例において、０．１〜０．５Ｕ／ｍｌのミクロコッカスヌクレアーゼを１ｍＭ  ＣａＣｌ2と共に、界面活性剤により溶解した血液サンプルに加え、膜フロースルーアッセイの前に３０秒間インキュベートした。液体フロースルー速度及びアッセイ結果は、高い（３５×１０9／Ｌ）白血球数を有する血液サンプルに対して均一に正規化された。同様に、Ｃａ2+の省略は、ヌクレアーゼを加えない対照と同様のフローの遅延及び誤った高いアッセイ測定を与えた。
【００３２】
ヌクレアーゼのようなほとんどの生体物質は、本質的には水溶液中で不安定である。したがって、ヌクレアーゼが本発明の装置及び／又はキットの一部として長期間保存されてもよいようにヌクレアーゼを安定させることができるならば有利である。本発明の１つの実施形態において、したがってヌクレアーゼは乾燥した形で提供され、したがって酵素は診断アッセイ装置又はキットへの組み込みの前に乾燥される。
【００３３】
ヌクレアーゼを乾燥する好ましい方法は、標準の凍結乾燥を使用することであるが、試薬を乾燥する他の方法（例えば噴霧乾燥又は減圧乾燥など）は、当業者によって容易に採用され得る。
【００３４】
１つの実施形態において、ヌクレアーゼは、チャンバー又は容器の内部の表面の少なくとも一部の上のような、例えば反応ウェル上に乾燥され、単一のアッセイユニットとして乾燥される。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼ試薬は、少なくとも１つの乾燥された（例えば、凍結乾燥された）試薬粒子（例えばビーズ又はスフェア）として提供される。球状の凍結乾燥された粒子は、Price et al.（米国特許第３，６５５，８３８号）に公知である。開示された球状のビーズは、免疫反応の材料を含んでおり、一般的にはリオスフェア（lyospheres）と呼ばれる。特定の材料のリオスフェアは米国特許第３，９３２，９４３号に例えば公知であり、公知の方法は当技術分野における当業者によって本発明で使用されるヌクレアーゼへ容易に適用されてもよい。リオスフェアの産生について、例えば、ワイズマン、ウイィアム・ハワード（Wiseman, William Howard）、１９５８年１月学位論文（Ｐｈ．Ｄ）−紙化学研究所（Institute of Paper Chemistry）及び１９５８年及び米国特許第３，６５５，８３８号を参照。これら及び本明細書において引用されたすべての参照文献は、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００３５】
凍結乾燥のような乾燥方法が使用される場合には、標準の凍結保護促進剤、溶解保護促進剤及び／又は再水和促進剤を、乾燥された試薬の特性を促進するために使用しもよい。典型的な薬剤は、塩及び糖、特にトレハロース、ラクトース、ショ糖、プロリン、マンニトール、ラフィノース、及び乳酸ナトリウムを含む。トレハロースは特に効果的である。
【００３６】
本発明の方法は、サンプルの少なくとも１つの成分又は潜在的成分について溶解及び（核酸鎖を破壊するように）処理したサンプルをアッセイすることをさらに含み得る。アッセイする適切な成分は、低分子（アミノ酸等）、ビタミン、オリゴペプチド及びポリペプチド（抗体、タンパク質及びタンパク質複合体を含む）、ペプチドホルモン及び非ペプチドホルモンを含む様々な生物学的マーカー及び他の多くのもののいずれかを含む。本アッセイは一般に界面活性剤を介した細胞溶解アッセイであるので、受容体のような膜結合型の成分もまたアッセイされてもよい。血漿中のタンパク質、ビタミン、アミノ酸及び／又は子ファクターのアッセイは、本方法により特に促進される。具体例としては、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、コバラミン、トランスコバラミン（とりわけホロトランスコバラミン）、ホモシステイン、葉酸、葉酸受容体及びその組み合わせなどがある。ＣＲＰのような急性期マーカーが特に適切である。
【００３７】
サンプル成分のアッセイにおける任意であるが好ましい工程は、当技術分野において周知である多くの形式のいずれかで行なわれてもよい。しかしながら本発明において特に利点であるのは、膜アッセイ、とりわけ膜濃縮アッセイによるサンプル成分のアッセイである。このタイプのアッセイにおいて、抗体、受容体、又は抗体フラグメント、抗体複合体又は抗体誘導体（例えば単一鎖の抗体）のような特異的結合リガンドは、膜上で固定化され、対象となる検体を捕捉し濃縮する役目を果たす。この捕捉された検体は次に、直接検出されてもよく、又はより一般的には、シグナル形成部分へ今度は結合又は連結する、さらなる（特異的又は非特異的）結合物（抗体等）により結合され得る。そのようなシグナル形成部分は、放射性、有色、蛍光性、化学発光性若しくは生物発光性であってもよく、又は任意の検出可能なシグナルを生成するために基質を反応させるか、又は処理することができるものでもよい。次にアッセイは、典型的には検出可能なシグナルを検出すること、及び、任意には、もとのサンプル中で対象となる成分の濃度を決定するために（定性的方法、半定量的方法、又は定量的方法で）、シグナルを前もって定義した値又は基準と比較することを含んでいる。
【００３８】
本発明の特に好ましい形態は、任意の必要な金属又はコファクター（Ｍｇ2+又はＣａ2+等）の存在下での界面活性剤（例えばＤＯＣ）及び生物学的又は化学的な「ヌクレアーゼ」（ミクロコッカスヌクレアーゼ等）といった溶解条件に、細胞含有身体サンプル（好ましくは全血サンプル）を接触させることを含む。次に結果として生じるサンプルを、１０μｍ以下の、好ましくは２μｍ以下（例えば約０．４５μｍ）の孔を有し、サンプルの成分（ＣＲＰ等）に対して特異的に結合するリガンド（抗体等）をその上に固定した膜と接触させる。一旦サンプルが膜をフロースルーすると、次に膜又は支持体は、シグナル生成部分（金複合体等）をサンプル成分に結合させるためのさらなる結合剤（さらなる抗体等）により処理される。次にシグナル生成部分は（例えば比色定量により）検出され、細胞含有サンプル中の成分の濃縮の値又は表示（例えば、低い、正常な、わずかに増加、又は非常に増加のうちの任意の組み合わせ）を生ずる。そのようなアッセイは、全細胞数又は特異的な細胞タイプの細胞数を評価し、任意にはこの細胞数により測定値を修正するか、又は、任意にはその数に関係づける付加的な工程を含んでいてもよい。例えば、赤血球数（ヘマトクリット）値及び所望するならば補正を、標準方法を使用するヘモグロビンの比色測定によって、血液サンプルに対して適用してもよい。
【００３９】
本発明の方法のいずれにおいても、核酸切断は、好ましくは分離膜とサンプルとの接触の前に行われるであろうが、あるいはサンプルがそのような膜に適用された後に行なわれてもよい。この後者の場合において、核酸は、典型的には膜へのサンプルの適用の後に、適切な化学的薬剤又は生物学的薬剤（本明細書に記載のもの等）を加えることによって膜上で切断される。あるいは切断試薬は、膜上に、膜中に、膜付近に及び／又は膜の近くに置かれてもよい。これは、乾燥した塗膜又は粒子の形態であってもよい。
【００４０】
明らかに、例えば、空間的な分離（異なる膜又は膜領域上での存在）、又は異なる分離可能なシグナル（例えば異なる励起波長及び／又は発光波長を備えた２つの蛍光色素分子）の使用によって、異なる成分からのシグナルが同定されるのであれば、サンプル中の１つ以上の成分は１つ以上の膜及び／又は１つ以上の固定された特異的な結合剤によってアッセイされてもよい。
【００４１】
サンプルの少なくとも１つの成分についてアッセイした場合、次に、任意には、生成された定性的な値又は（半）定量的な値を、特異的な生物学的症状又は疾患に関連させ、又は疾患又は生物学的症状の診断における意味付け又は有力な因子として使用してもよい。例えば高いＣＲＰは、急性炎症、炎症性のリウマチ性疾患、及び／又はそのような症状の治療の必要性又は有効性に関連し得る。
【００４２】
本発明は、界面活性剤により溶解された細胞含有サンプルの、孔サイズ１０μｍ以下（好ましくは２μｍ以下）の膜のフロースルーを含むアッセイ方法において、膜目詰まりを減少させる核酸切断条件の使用を提供する。一般に、２つの相互関係がある改善が容易になり、いずれか一方又は両方が任意の特定のアッセイにおいて重要であるかもしれない。本質的には、核酸切断は膜目詰まりを減少させ、この改善は２つの主要な結果を有している。膜の液体フロースルーは促進され、及び／又は、サンプルからの成分の非特異的吸着は減少する。次にこれらの各々は、よりよいフローがより速い及び／又はより確実なアッセイを提供するという点でさらなる利点を有し、減少した非特異的結合は、アッセイにおいてより低いバックグラウンドシグナル、より高い感度及びより差のある識別を可能にする。明らかに、本発明によって提供される「使用」は本明細書において記述される方法のいずれかにおける使用であってもよく、化学的試薬若しくは生物学的試薬のいずれか、又は本明細書における他の部分で記述される他の技術を用いて核酸切断条件を生成してもよい。ヌクレアーゼを介した切断が特に好まれる。
【００４３】
本明細書において言及される「膜」は、文脈上許容される場合には、１０μｍ以下、好ましくは５μｍ以下（例えば１μｍ以下）及び好ましくは０．５μｍ以下の孔サイズを有する多孔質膜である。０．４５μｍ孔サイズ付近の膜が、特に適切である。膜の最小の孔サイズは、十分なフローの要求及び適切な成分が膜を通過する必要性によってのみ限定されるが、典型的な最小の孔サイズは少なくとも５０ｎｍ、好ましくは少なくとも１００ｎｍ、より好ましくは少なくとも２００ｎｍであろう。膜材料は、一般的には水性であるが必要に応じて付加的な溶媒を含んでもよい適切なサンプルの通過に対して、安定している任意の材料であってもよい。ニトロセルロース膜は、ガラス膜、ポリエチレン膜、ポリプロピレン膜、フッ素ポリマー（例えばＰＴＦＥ又はＰＴＦＥ混合物若しくはＰＴＦＥコポリマー）膜、ポリアミド膜並びにこれらの混合物及びコポリマーの膜と同様に、特に適切である。ニトロセルロースが最も好ましい。
【００４４】
本明細書における本発明のすべての態様で言及されるサンプルは、文脈上許容される場合には、細胞含有サンプル又はこれから派生したサンプルである。細胞含有サンプルは、任意のタイプの組織であってもよく、任意のタイプの細胞を含んでもよい。しかしながら最も典型的には、これらは液体サンプルであり、そのうちで血液及び精液が好ましい細胞含有サンプルである。全血は、貯蔵性の改良及び／又は凝固の減少のための添加剤の有無に関わらず、好ましい細胞含有サンプルであり、本明細書において例示のものとして使用される。明らかに、アッセイの実行のために必要に応じてそのような血液サンプルは処理されてもよいが（例えばアッセイのために結合された成分の遊離又は競合する検体の抽出）、可能な場合には、所要時間及び操作を最小限にするために、最大数の工程を装置内で実行するのがよい。
【００４５】
本発明の装置は、少なくとも１つの細胞含有身体サンプル（又は任意でしかしそれよりも好ましさが劣る、界面活性剤で溶解された細胞含有サンプル）を受け入れるためのチャンバーを含み、本明細書に記載の少なくとも１つの膜を含んでいる。装置は、細胞溶解を生じさせるために、任意には、界面活性剤のような少なくとも１つの溶解剤と共にあらかじめローディングされてもよいし、又はそのような薬剤が加えられるチャンバーを含んでもよい。細胞溶解は膜を通す前に実行され、装置は、任意で好ましくは細胞溶解と同時又は直後に起こり得る核酸切断の条件を提供する。
【００４６】
本明細書において記述されるように、好ましくは本装置は核酸切断を引き起こすための少なくとも１つの生物学的試薬及び／又は化学的試薬を含むか、又はそのような試薬の添加を受け入れるためのチャンバーを含み得る。本装置は、好ましくは、サンプルの少なくとも１つの成分の濃縮のための特異的な結合剤、濃縮成分に結合するための第２の（特異的か非特異的）結合剤、及び対象となる成分の存在、非存在又は濃度に対応するシグナルを生成させるための、少なくとも１つのシグナル生成部分もまた、含むか又は受け入れるだろう。これらの実体はすべて本明細書において記述され、生物学的アッセイにおける当業者に周知である。本発明の装置中に含まれる膜は、好ましくは予定されるサンプルの少なくとも１つの成分又は潜在成分のための少なくとも１つの特異的結合リガンドを固定化する役目をしてもよい。適切な結合剤は本明細書において記述される。あるいは特異的結合リガンドは、ビーズ又は不溶性粒子のような支持体上に固定化されてもよく、これはそして膜の作用によって保持される。
【００４７】
１つの好ましい装置は、血液サンプルを受け入れるためのチャンバーと、界面活性剤（ＤＯＣ等）、ヌクレアーゼ（ミクロコッカスヌクレアーゼ等）及び任意の金属又はコファクター（Ｃａ2+等）を含む希釈剤を受け入れるためのチャンバーと、１０μｍ、好ましくは２μｍ以下（例えば約０．４５μｍ）の孔を有し、少なくとも１つの検体（例えばＣＲＰ、ホロＴＣ、ＳＡＨ）のための特異的結合リガンド（例えば及び抗体又はその断片、構成物又は誘導体）を固定化した膜と、少なくとも１つの付加的な結合剤及び任意にはシグナル生成部分を含む溶液を受け入れるためのチャンバーとを含む。装置は、さらに、シグナル生成部分から生成されたシグナルを評価し、かつ、対象となる成分の存在、非存在又は濃度に（直接的又は間接的に）対応する領域、キュベット又はウィンドウを含んでもよい。
【００４８】
関連するさらに好ましい装置において、本装置は、血液サンプルを受け入れるためのチャンバー、界面活性剤を含む又は界面活性剤の受け入れのために適切なチャンバー、並びに公知の方法及び／又は本明細書において記述された方法に従って乾燥されたヌクレアーゼを含むチャンバーを含む。これらは３つの独立したチャンバーであってもよく、又は好ましくは１つ又は２つのチャンバーであり、例えば、１つのチャンバーは界面活性剤含み、第２のチャンバーは乾燥ヌクレアーゼを含み得る。本装置は上に記述されるような他の特徴を含み得る。
【００４９】
チューブ、ローター、カートリッジ、バイアル、スライド、スティックなどの多数の形式（format）が本発明の装置に適している。多くのこのような形式が周知であるが、本発明の装置の重要な特徴を提供できる限り、形式の性質は重大ではない。装置の液体通過の促進のための圧力が容易に提供され得るので、ローター及びカートリッジの形式は非常に適切である。本発明の装置のいずれも、装置の操作において生成されたシグナルの評価のための領域、キュベット又はウィンドウを含んでもよい。
【００５０】
本発明のキットは、しばしば本発明の少なくとも１つの装置を含み、少なくとも、キットは膜及び核酸切断のための手段（本明細書において記述されたものを含む化学的試薬又は生物学的試薬等）を含むだろう。典型的には、本明細書において記述される方法のいずれかにおけるキットの使用のための試薬及び／又は説明書と同様に、膜脂質の細胞溶解及び小さなミセル／小胞への変換のための界面活性剤が提供され得る。
【００５１】
本発明のキット及び装置は、最も好ましくは自動分析装置における使用、又は自動分析装置との使用に適切である。最も適切には、これは「ポイントオブケア」の自動分析装置であろう。
【００５２】
１つの好ましいキットは、血液サンプルを得るための任意の手段と、該血液サンプルと界面活性剤（ＤＯＣ等）、ヌクレアーゼ（ミクロコッカスヌクレアーゼ等）、任意の金属又はコファクター（Ｃａ2+等）及び任意には緩衝液を含む希釈剤とを受け入れるための容器と、２μｍ以下（例えば約０．４５μｍ）の孔を有し、少なくとも１つの検体（例えばＣＲＰ及びホロＴＣ、ＳＡＨ）のための特異的結合リガンド（例えば及び抗体又はその断片、構成物又は誘導体）を固定化した膜と、少なくとも１つの付加的な結合剤及び任意にはシグナル生成部分を含む溶液を受け入れるための容器又はチャンバーを含む。本キットは、任意にはさらに使用、アッセイ結果の評価及び／又は生物学的条件に対する結果の相関性のための説明書を含んでもよい。
【００５３】
特に好ましいキットは、血液サンプルを得るための任意の手段と、該血液サンプル及び界面活性剤（ＤＯＣ等）を含む希釈剤を受け入れるための容器を含む。容器、又はキット中の第２の容器は、乾燥した形態でヌクレアーゼ（ミクロコッカスヌクレアーゼ等）、及び任意の必要な金属又はコファクター（Ｃａ2+等）もまた含むだろう。キットは、２μｍ以下（例えば約０．４５μｍ）の孔を有し、少なくとも１つの検体（例えばＣＲＰ、ホロＴＣ、ＳＡＨ）のための特異的結合リガンド（例えば及び抗体又はその断片、構成物又は誘導体）を固定化した膜と、並びに少なくとも１つの付加的な結合剤及び任意にはシグナル生成部分を含む溶液を受け入れるための容器又はチャンバーもまた含むだろう。キットは、任意にはさらに使用、アッセイ結果の評価及び／又は生物学的条件に対する結果の相関性のための説明書を含み、乾燥形態又は溶液形態で任意には緩衝液もまた含んでもよい。
【００５４】
以下の非限定的実施例を参照して本発明を以下に説明する。
【実施例１】
【００５５】
実施例１
健康なドナーからの全血を、密度勾配媒質ポリモルフォプレップ（Polymorphprep）（商標）（アキシスシールド社（Axis-Shield PoC）、ＡＳ、オスロ、ノルウェー）上で、生産者によって記述されるように遠心分離した。全白血球及び全赤血球を２つの独立したフラクション中に回収した。白血球をカウントした。白血球の数を７×１０9／Ｌから３０×１０9／Ｌへ増加させるために、白血球を全血に加えた。濃縮された血液の１２．５μｌを、１ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む１ｍｌの希釈液体（デオキシコール酸ナトリウムを含む緩衝液）に加えた。この溶液を５００μｌの２つのアリコート（aliquot）に分割し、続いてこれらの１つに２．５μｌ（０．２５Ｕ）のミクロコッカスヌクレアーゼを加えた。５０μｌの対照溶液及びヌクレアーゼを含む溶液のアリコートを、０．４５μｍ孔サイズのニトロセルロース膜を含む膜フロースルー装置（ニコカード・テスト・デバイス（NycoCard Test Device））に適用した。ヌクレアーゼの添加後、０秒、６０秒及び１２０秒で、アリコートを適用した。血球溶解物をフロースルーさせるように膜に染み込ませた後、５０μｌの金連結抗体、その後５０μｌの洗浄溶液を加えた。なお、膜に結合した抗体及び連結抗体は、異なるタンパク質に対して向けられたものである。すなわち、サンドイッチは形成され得ることはなく、この実験は、単に金連結抗体の膜への非特異的結合を示す。膜上に保持された抗体の赤い色を、反射率計（ニコカード・リーダー（NycoCard Reader））を使用して測定した。この機器は、膜の上に吸着された金標識抗体量に比例するＫ／Ｓとして色の密度を表わす。白色の膜はおよそ０．０５のＫ／Ｓを生じ、その一方で非常に濃く深い赤色は、約５のＫ／Ｓを生じ得る。
【００５６】
【表１】
0005448449.tif 000002
【００５７】
この表は、対照ではインキュベーション期間にわたり増加する高い非特異的バックグラウンドがあるが、３０秒未満のインキュベーションの第１のアリコートでさえ、正常な低レベル（血漿に基づいたアッセイと同じくらい低い）までバックグラウンドが低下していることを示す。
【００５８】
実施例２
この実験において、全血は、実施例１で行われたような密度勾配媒質遠心分離を使用せずに白血球が濃縮された。健康なドナーからの全血を、２５００×ｇで１５分間遠心分離機にかけた。血漿をピペットで採取し、続いてバフィーコート及び赤血球フラクションの一部をピペットで採取した。バフィーコートフラクションは、白血球が濃縮された赤血球を含んでいた。最終的に純粋な赤血球はチューブの底から得られた。全血と同様なヘマトクリットを生ずるために、白血球を濃縮したフラクション及び赤血球フラクションを血漿に加え、白血球を３つのフラクションすべてにおいてカウントした。ヘモグロビンを蒸留水中で２００倍希釈し、島津製作所（Shimadzu）の分光光度計を使用して、分光光度法により５７５ｎｍで測定した。
【００５９】
【表２】
0005448449.tif 000003
【００６０】
今後これらの３つのフラクションをＣ（全血）、Ｗ（白血球を濃縮した血液）及びＲ（赤血球フラクション）と呼ぶ。
【００６１】
５μｌのＣ、Ｗ及びＲのそれぞれを、４００μｌの希釈液と穏やかに混合し、各々の溶液の５０μｌ、続いて５０μｌの金連結抗体及び５０μｌの洗浄溶液をニコカード・テスト・デバイスへ適用した。実施例１に記述されるように、連結抗体及び膜に結合した抗体は異なるタンパク質に向けられたものである。言いかえれば、この実験は非特異的バックグラウンドのみを示す。次にＣ、Ｗ及びＲの溶解された希釈物を、１０秒間力強く振盪し、各々の５０μｌを上に記述されるような膜試験装置中で処理した。連結物のバックグラウンドを、ニコカード・リーダーを使用して、両方のシリーズについて測定した。
【００６２】
【表３】
0005448449.tif 000004
【００６３】
この表は、純粋な赤血球フラクション（Ｒ）で得られたバックグラウンドと比較して、Ｗの場合には非特異的バックグラウンドが非常に上昇し、Ｃではわずかに上昇したことを示す。振盪により、Ｃ及びＷのバックグラウンドはＲと同様なレベルになった。
【００６４】
次の実験において、５μｌのＣ、Ｗ及びＲを、１ｍＭ  ＣａＣｌ2及び０．４Ｕミクロコッカスヌクレアーゼを含む４００μｌの希釈液と穏やかに混合し、上に記述されるような試験装置中で処理した。
【００６５】
【表４】
0005448449.tif 000005
【００６６】
この表から、サンプルのヌクレアーゼ消化により「振盪レベル」までバックグラウンドが減少することがわかった。同様に有利な低バックグラウンドは、剪断力又はＤＮＡの酵素的な消化のいずれかによりＤＮＡを破壊することで得られた。ヌクレアーゼ消化されたサンプルを振盪しても、バックグラウンドはさらに低下しなかった。（図示せず）。
【００６７】
実施例１及び２は、界面活性剤で可溶化した全血のヌクレアーゼ消化が、膜フロースルー試験装置における非特異的バックグラウンドを、血漿に基づいたアッセイで得られるバックグラウンドと同じ低レベルまで減少させることを実証した。次の２つの実施例は、希釈し溶解された血液サンプルが、実施例１及び２に記述される手動操作試験装置と同じ膜フロースルーシステムに基づく本発明者による自動化アナライザ中で、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）について分析された場合のヌクレアーゼ処理の影響を示す。なお、このアッセイ器は、希釈液（２００μｌ）と指先穿刺から得られた少容量の全血（１．５μｌ）とを、非常に緩やかな方法で混合する。言いかえれば、溶解された白血球核から遊離されたＤＮＡを分解する剪断力は、存在しないか又はあまりにも小さいため、効率的に作用しない。
【００６８】
実施例３
実施例２に記述された血液サンプルＣ、Ｗ及びＲを、自動化アナライザを使用して分析した。血液を、通常の希釈液、又は５ｍＭのＣａＣｌ2及び０．２Ｕミクロコッカスヌクレアーゼを含む希釈液中で溶解した。
【００６９】
【表５】
0005448449.tif 000006
【００７０】
この表から、血液サンプルにおいてＣＲＰ濃度は約１ｍｇ／Ｌであることがわかる（血漿に基づいた測定）。これは健康な人についての典型的な値である。血液を使用しているので、ヘモグロビンの赤い色のためにバックグラウンドのわずかな上昇が予想されるに違いない。このことは、サンプルＲ（赤血球であり白血球は含まれない）についてのＣＲＰ値が、ＣＲＰについてのベースライン又は目標値であることを意味する。対照希釈液で得られた結果から考えて、ＣＲＰの結果は、通常の全血について４５％及び白血球が濃縮した調製品について５１２％増加したと思われる。ヌクレアーゼを有する希釈液を使用すると、ＣＲＰ増加は全血では観察されず、白血球を濃縮した調製品では４０％の増加が見出された。通常の希釈液がサンプルＷ（白血球数が多い）の希釈に使用された場合、ＣＲＰが有意に過大評価されたという結論が得られた。ヌクレアーゼを使用する場合にもまた、このサンプルがわずかに過大評価されたように思われる。このことは、より高い濃度のヌクレアーゼがこの実験において使用されるべきだったことを示す。ＨＣＴ（ヘマトクリット）測定は、これらが３つのサンプルすべてについて類似していたことを示す。
【００７１】
実施例４
ＣＲＰの低血漿濃度、中血漿濃度及び高血漿濃度の３つの血液サンプルを、機器で分析した。３つのサンプルはすべて高白血球数を有していた。正常細胞数は約７×１０9である。
【００７２】
【表６】
0005448449.tif 000007
【００７３】
サンプルを、通常の希釈液又は５ｍＭのＣａＣｌ2及び０．５Ｕミクロコッカスヌクレアーゼを含んでいる希釈液を使用してアッセイした。実施例３の結論に基づいて、この実験においては、ヌクレアーゼの濃度を０．２Ｕ（実施例３）から０．５Ｕに増加した。変動係数（ＣＶ）もまた、４〜６の比較物に基づいて決定した。ＣＲＰの値が非常に低かったために、サンプル１についてはＣＶを計算しなかった。
【００７４】
【表７】
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【００７５】
この表は、通常の希釈液が使用された場合に３つの血液サンプルすべてについてＣＲＰ濃度が過大評価されることを示す。ＣＲＰ濃度が低いほど、血液対血漿を使用する測定間の不一致が生じた。血漿を使用する測定は正確な値と見なされる。とりわけ大きいものは、ＣＲＰが低濃度であるサンプルの不一致である。サンプル１は１８００％、サンプル２は１８５％及びサンプル３は１１７％過大評価された。３つのサンプルのすべてに同様な一定の非特異的バックグラウンドの寄与を想定すれば、このことは予想されていた。ヌクレアーゼを含む希釈液を使用すると、状況は全く異なっていた。３つのサンプルすべてについての全血測定は血漿値に類似していた。さらに、ヌクレアーゼが希釈液に含まれていた場合は、測定のＣＶは有意に低かった。
【００７６】
結論として、溶解された血液サンプルのヌクレアーゼを介したＤＮＡ分解は、自動化ＣＲＰアッセイの質を著しく改良した。
【００７７】
実施例５
実施例２に記述されるように、健康なドナーからの全血が処理された。全血（Ｃ）、白血球が濃縮された血液（Ｗ）及び赤血球（Ｒ）は、同様のヘマトクリットを示した。白血球数はそれぞれ５．９×１０9、１６．９×１０9及び０×１０9／Ｌであった。２５μｌの「血液」サンプルを、１Ｕヌクレアーゼをともなう、又はヌクレアーゼをともなわない２ｍＭ  ＭｇＣｌ2を含む４００μｌの界面活性剤を含む緩衝液に加えた。血液は、剪断力を最小にするために溶解溶液と非常に穏やかに混合された。この溶液の５０μｌを膜フロースルー装置（膜面積９．４ｍｍ2）に加え、フロー時間を記録した。膜を抗ＣＲＰ抗体でコートした。次に５０μｌの金連結抗ＣＲＰ抗体、続いて５０μｌの洗浄溶液を加えた。膜の色を反射率計（ニコカード・リーダー）を使用して、最終的に測定した。この実施例において、膜上の赤い色は、多少量の非特異的バックグラウンドシグナルに加えて真のＣＲＰシグナルを表わしうる。
【００７８】
【表８】
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【００７９】
この表は、全血（Ｃ）がヌクレアーゼ処理されたサンプルと比較して、フロー時間において有意な増加を与えることを示す。サンプルＷでは、フロー時間は劇的に増加し（８倍）、液体フロースルーは金結合物の適用中に完全に停止した。ヌクレアーゼが加えられた場合、サンプルはすべて同様に約２３秒という良好なフローを示した。これは、ヌクレアーゼなしの血漿及び赤血球フラクションと同じようなフロー時間であった。シグナルに関しては、ヌクレアーゼなしの全血はＣＲＰの非常に有意な過大評価をもたらしたであろう。Ｗでは、フローはＤＮＡを介した膜の目詰りのために完全に停止した。
【００８０】
ヌクレアーゼ処理により、３つのサンプルはすべて、目標値として見なされるべき血漿で得られたシグナル（０．３２２）に近い、約０．３１の非常に類似したＣＲＰシグナルを示した。この低いシグナルは、ＣＲＰを含まないサンプルで得られていたであろうバックグラウンド値を表わす、関連性がない抗体でコートされた膜で得られた色（０．０９３）を十分上回っていた。したがってこの０．３１は、低いが有意なシグナルであり、健康な献血者の低ＣＲＰレベルと一致している。
【００８１】
実施例６
低濃度血液検体をアッセイする場合、低濃度を補い、判読可能なシグナルを得るためにも、できるだけ多くの血液を処理することが有利である。この実験は、界面活性剤を介した血液の溶解に際して０．４５μｍニトロセルロース膜（フロー領域９．４ｍｍ2）を通して処理できる血液をできるだけ多くの量について測定できるように設計された。
【００８２】
この実験の部分で使用される大量の血液のために、界面活性剤の不足によりフローが低下しないことを保証するために、高濃度の界面活性剤を使用しなければならなかった。
【００８３】
健康なドナーからの血液（白血球数６．５×１０9／Ｌ）を、１Ｕヌクレアーゼをともなう、又はヌクレアーゼをともなわない界面活性剤を含む緩衝液で希釈し、３０秒間室温でインキュベートした（インキュベーション容量２００μｌ）。１．５〜２５μｌの全血を含む１００μｌのこの溶液、続いて５０μｌの金連結抗ＣＲＰ抗体及び５０μｌの洗浄溶液を、フロースルー装置に添加した。全アッセイ時間（サンプル適用の開始から洗浄溶液の終了まで）を測定した。
【００８４】
【表９】
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【００８５】
この表は、ＤＮＡのヌクレアーゼ消化がすべてのレベルの血液ローディングにおいて改良されたフローをもたらしたことを示す。アッセイ時間から見て、ヌクレアーゼ消化を行なった１２．５μｌの血液が、ヌクレアーゼなしの約８分の１量の１．５μｌの血液とほぼ同じアッセイ時間を示したことが分かる。他の角度からの結果から見て、迅速試験のための全アッセイ時間が４分未満であることが要求されれば、このシステムは、ヌクレアーゼなしの１．５μｌの血液、及び１６．７倍量のヌクレアーゼ消化ありの２５μｌを許容する。大まかに言って、ＤＮＡのヌクレアーゼを介した消化は、少なくとも１０倍多い血液をこの免疫濃縮試験の装置において処理されることを可能にする。
【００８６】
実施例７
ヌクレアーゼ凍結乾燥手順：
ベンゾナーゼ（商標）を、１２％トレハロース、０．１％ＢＳＡ、ｌｍＭ  ＭｇＣ１2、２５ｍＭトリスｐＨ７．４を含む緩衝液において４０Ｕ／ｍｌの濃度で調製した。このベンゾナーゼ（商標）溶液のアリコートを冷凍し、次にそれ自体公知の方法にて−３０℃で凍結乾燥した。
【００８７】
実施例８
凍結乾燥されたヌクレアーゼの使用：
冷凍され凍結乾燥されたベンゾナーゼ（商標）ビーズ（実施例７で調製のもの）を、アフィニオン（Afinion）（商標）アナライザＣＲＰカートリッジに置き、増加した白血球を含む血液サンプルをアフィニオン（商標）アナライザを使用して処理した。ベンゾナーゼ（商標）の相対活性を正規化されたＣＲＰ値の使用によって計算し、パーセンテージとして表わした。
【００８８】
アフィニオン（商標）ＣＲＰアッセイにおける相対的なヌクレアーゼ活性：
Ａ．  ベンゾナーゼ（商標）を、増加した白血球を含む血液サンプルのアッセイの前に、２２℃で１８時間までの様々な時間にわたってアフィニオン（商標）ＣＲＰ溶解緩衝液中に４０Ｕ／ｍｌで再懸濁した。
【００８９】
【表１０】
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【００９０】
ベンゾナーゼ（商標）が１日未満の間、水性懸濁液中で安定あることが実証される。活性の減少は１２０分後に顕著である。
【００９１】
Ｂ．  実施例７でのように調製され、上に記述されるようにアフィニオン（商標）ＣＲＰカートリッジに置かれた冷凍され凍結乾燥されたベンゾナーゼ（商標）ビーズを、増加した白血球を含む血液サンプルのアッセイの前に、様々な時間にわたって４℃、２２℃又は３７℃で最大２か月にわたってインキュベートした。
【００９２】
【表１１】
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【００９３】
ベンゾナーゼ（商標）は、冷凍され凍結乾燥されたビーズとして何か月も安定しているようである。