(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが封入され、且つ表面がカチオニックキトサンにより正電荷修飾された、乳酸・グリコール酸共重合体で形成されたナノ粒子を、無水マレイン酸−メチルビニルエーテルコポリマーのコーティングにより負電荷修飾された拡張可能部分の表面にコーティングすることにより、ナノ粒子同士が互いに接触した状態で積層されて成るナノ粒子層が形成された拡張可能な薬剤溶出型カテーテル。
【請求項２】
請求項１に記載の薬剤溶出型カテーテルにおいて、
前記ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２または配列番号３から選ばれた１種である。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の薬剤溶出型カテーテルが、血管内カテーテルである。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の薬剤溶出型カテーテルにおいて、
前記拡張可能部分としてバルーンを有するバルーンカテーテルである。
【請求項５】
請求項４に記載の薬剤溶出型カテーテルにおいて、
前記バルーンの表面に窪みが形成されている。
【請求項６】
請求項５に記載の薬剤溶出型カテーテルにおいて、
前記窪みが円形或いは楕円形である。
【請求項７】
血管狭窄または透析用シャント内狭窄の治療に用いる、請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の薬剤溶出型カテーテル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管等の生体内の管腔に挿入して狭窄部若しくは閉塞部を開放状態に維持する拡張型カテーテルに関し、特に生理活性物質を封入した生体適合性ナノ粒子がコーティングされた薬剤溶出型カテーテル及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活習慣の欧米化並びに高齢化に伴い、我が国においても心筋梗塞、狭心症、脳卒中、末梢血管疾患等の動脈硬化性疾患が益々増加している。このような動脈硬化性疾患に対する確実な治療法として、例えば心臓の冠状動脈における経皮的冠動脈形成術に代表されるような、血管の狭窄部或いは閉塞部を外科的に開大させる経皮的血管形成術（Percutaneous  Transluminal  Angioplasty；以下ＰＴＡという）が広く用いられている。【０００３】
ＰＴＡとは、先端にバルーン（風船）が付いた細いチューブ（バルーンカテーテル）を血管内の狭窄部に通した後、先端のバルーンを膨らませ、狭窄した血管を押し拡げることで、血流を回復させる手技である。これにより、病変部の血管内腔は拡張され、それにより血管内腔を通る血流は増加する。このＰＴＡは、動脈硬化性疾患の他、血液透析患者の腕に形成したシャント血管の狭窄治療等にも用いられる。【０００４】
一般に、ＰＴＡを行った血管部位は、内皮細胞の剥離あるいは弾性板損傷等の傷害を受けており、血管壁の治癒反応である血管内膜の増殖が起こり、ＰＴＡにより狭窄病変部の開大に成功したうちの約３０〜４０％に再狭窄が生じる。【０００５】
より詳細には、ヒトにおける再狭窄の成因は、主としてＰＴＡの１〜３日後に生じる単球の接着・浸潤に見られる炎症過程と、約４５日後に最も増殖性がピークとなる平滑筋細胞による内膜肥厚形成過程が考えられている。再狭窄が生じた場合は再びＰＴＡを行う必要があるため、その予防法、治療法の確立が急務となっている。【０００６】
そこで、金属や高分子材料で形成されたステントやバルーンカテーテルの表面に、抗炎症剤や平滑筋細胞の増殖抑制剤を担持させた薬剤溶出型デバイスを用いることにより、管腔内の留置部位で長期にわたって局所的に薬剤を放出させ、再狭窄率の低減化を図る試みが盛んに提案されている。例えば特許文献１、２には、カテーテルの拡張部分（バルーンにポリマーコーティングし、ポリマーコーティングに核酸薬剤等の治療薬を組み込んだ薬剤溶出型のカテーテルが提案されている。【０００７】
ここで、平滑筋細胞増殖は再狭窄の主因であるため、病理所見より内膜に平滑筋細胞の増殖が確認される３０日から増殖ピークを迎える４５日の間で平滑筋細胞の増殖抑制処理を行うのが最も効果的であると判断される。従って、少なくとも炎症過程を抑制する１０日以内と平滑筋細胞増殖を抑制する３０〜６０日の両期間に薬剤の放出量のピークを持ち、それぞれに薬効を示すのに必要な量の薬剤が万遍なく放出されるよう設計するのが最も効果的であると考えられる。【０００８】
しかし、特許文献１、２の方法では、生体内でポリマー層が分解された後に薬剤が放出されるため、カテーテルの留置初期における薬剤放出量が十分でなく、留置後１〜３日間に生じる炎症過程を効果的に抑制することができなかった。また、特許文献１のようにヒドロゲルポリマーを用いた場合、デコイオリゴヌクレオチドのような水溶性の薬剤は短時間で溶出するため、薬剤放出速度のコントロールも容易ではなかった。【０００９】
また、特許文献３には、ステント表面に形成されたポリマー層中に第１の生理活性物質を含有させ、さらに第２の生理活性物質が封入された生分解性のナノ又はマイクロカプセルを含有させることにより、第１の生理活性物質を初期放出させた後、カプセル内の第２の生理活性物質を徐放させることのできる薬剤溶出型ステント（Drug-Eluting  Stent：以下、ＤＥＳと略す）が開示されている。特許文献３の方法によれば、ステント本体にナノ粒子の懸濁液を噴霧或いは塗布したり、ステント本体をナノ粒子の懸濁液に浸漬したりすることにより、ステント本体にナノ粒子を付着させているが、これらの方法では十分な量のナノ粒子を均一に付着させることが困難であった。【００１０】
ここで、従来の生体適合性ナノ粒子の構造を図１９に示す。生体適合性ナノ粒子（以下、単にナノ粒子という）１の表面はポリビニルアルコール２で被覆され、内部には生理活性物質３が封入されており、一般的に表面は負に帯電している。しかし、生体内の細胞壁は負に帯電しているため、図１９に示すようなナノ粒子では電気的反発力により細胞接着性が悪くなるという問題点があり、封入された生理活性物質を狭窄部等の病変部位へ局所的且つ効率的に取り込ませるためには、ナノ粒子の細胞内への移行性をより一層高める必要性があった。【００１１】
さらに、一般に生体適合性ポリマーは疎水性（脂溶性）であり、ナノ粒子内に高い封入率で封入できる生理活性物質は脂溶性ものに限られるため、特許文献３の方法では核酸や遺伝子等の親水性（水溶性）の生理活性物質をステント表面に十分にコーティングすることが困難であった。【００１２】
上記の問題点を解決するため、特許文献４には、表面が正電荷修飾された生体適合性ナノ粒子をステント本体に電気的に付着させたＤＥＳが開示されており、電気泳動法や超音波ミスト法等を用いて通電状態のステント本体にナノ粒子を付着させるＤＥＳの製造方法も記載されている。また、特許文献５には、治療薬、磁性又は常磁性材料及び高分子電解質多層殻からなるナノカプセル（ナノ粒子）を有する医療装置が開示されており、医療装置の例としてカテーテルが記載されている。
【特許文献１】特表平９−５００５６１号公報
【特許文献２】特表２００３−５２１２７５号公報
【特許文献３】特開２００４−３５７９８６公報
【特許文献４】特開２００７−２１５６２０号公報
【特許文献５】特表２００６−５１８７３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、特許文献４の方法では、ステント本体を金属等の導電性材料で形成しておく必要があり、拡張可能部分（バルーン部）が導電性の小さい樹脂製であるバルーンカテーテルには適用が困難であった。また、特許文献５では、単に封入された薬物の放出を制御するために分解可能な高分子電界質を用いてナノ粒子を形成する旨が記載されているのみであり、表面が正電荷修飾された生体適合性ナノ粒子をコーティングした薬剤溶出型カテーテルの実施例、即ち、実際にどのような構成のナノ粒子が製造されるか、及びどの程度の細胞接着性或いは細胞内への取り込み性が認められるかについては何ら記載されていなかった。【００１４】
本発明は、上記問題点に鑑み、脂溶性又は水溶性の生理活性物質が高い封入率で封入され細胞内移行性にも優れた生体適合性ナノ粒子をコーティングすることにより、生理活性物質を細胞内へ効率良く到達させることができ、取り扱い性にも優れた拡張可能な薬剤溶出型カテーテル及びその簡便且つ安価な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記目的を達成するために本発明は、ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドが封入され、且つ表面がカチオニックキトサンにより正電荷修飾された、乳酸・グリコール酸共重合体で形成されたナノ粒子を、無水マレイン酸−メチルビニルエーテルコポリマーのコーティングにより負電荷修飾された拡張可能部分の表面にコーティングすることにより、ナノ粒子同士が互いに接触した状態で積層されて成るナノ粒子層が形成された拡張可能な薬剤溶出型カテーテルである。
【００１６】
この構成によれば、樹脂製の拡張可能部分にも表面が正に帯電したナノ粒子を付着させることができる。また、拡張可能部分にコーティングされるナノ粒子が正に帯電しているので、負帯電の細胞壁に対するナノ粒子の細胞接着性が高まり、内部に封入された生理活性物質の細胞内への到達効率を向上させた薬剤溶出型カテーテルとなる。さらに、例えば生体適合性ナノ粒子を構成するポリマー材料が脂溶性の場合、脂溶性の生理活性物質の封入率が高くなるが、これに加えてナノ粒子表面が正に帯電しているため、水溶性且つアニオン性の生理活性物質を高い封入率で封入することができ、拡張可能部分へのコーティングが可能な生理活性物質の選択範囲も広くなる。【００１７】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記拡張可能部分が、ポリカルボン酸若しくはポリカルボン酸誘導体により負電荷修飾されていることとした。【００１８】
この構成によれば、拡張可能部分の表面を容易に負帯電させることができる。【００１９】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記ポリカルボン酸が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸のポリマー、デンプン、セルロース若しくはポリビニルアルコールのカルボキシメチル誘導体、アルギン酸、ペクチンから選ばれた１種以上であることとした。【００２０】
この構成によれば、生体への影響が少なく、安全面において優れた薬剤溶出型カテーテルとなる。【００２１】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記ポリカルボン酸誘導体が、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸のポリマーの酸無水物誘導体若しくはエステル誘導体であることとした。【００２２】
この構成によれば、表面が正に帯電したナノ粒子を強固に付着させるとともに、生体への刺激や毒性も少ない負電荷修飾が可能となる。【００２３】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記ポリカルボン酸誘導体が、無水マレイン酸のコポリマーであることとした。【００２４】
この構成によれば、高い安全性を有する薬剤溶出型カテーテルとなり、負電荷修飾時における取り扱いも容易となる。【００２５】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記無水マレイン酸のコポリマーが、無水マレイン酸−メチルビニルエーテルコポリマー、無水マレイン酸−スチレンコポリマー、無水マレイン酸−エチレンコポリマーから選ばれた１種以上であることとした。【００２６】
この構成によれば、特に入手が容易で取り扱い性に優れた無水マレイン酸のコポリマーを用いて、高い安全性を有する薬剤溶出型カテーテルを簡単に且つ低コストで製造可能となる。【００２７】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記生体適合性ナノ粒子は、表面にカチオン性高分子を付着させることにより正電荷修飾されていることとした。【００２８】
この構成によれば、ナノ粒子表面を容易に正帯電させることができる。【００２９】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記カチオン性高分子が、キトサンであることとした。【００３０】
この構成によれば、生体への影響がなく、安全性の高い薬剤溶出型カテーテルとなる。【００３１】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記生体適合性ナノ粒子が、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、若しくは乳酸・アスパラギン酸共重合体のいずれかで構成されることとした。【００３２】
この構成によれば、生体への刺激・毒性が低く、且つ生体適合性高分子の分解により生理活性物質の徐放が可能な薬剤溶出型カテーテルとなる。【００３３】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記生理活性物質が、核酸化合物であることとした。【００３４】
この構成によれば、病変部位に安全且つ効率的に核酸化合物を導入して核酸レベルで治療することができ、例えば血管中の狭窄部に適用する場合に再狭窄の可能性の少ない薬剤溶出型カテーテルを容易に製造できる。【００３５】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記核酸化合物が、プラスミドＤＮＡ、遺伝子、デコイ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマーから選ばれた１種以上であることとした。【００３６】
この構成によれば、核酸化合物治療用ツールとして特に好適な薬剤溶出型カテーテルを提供可能となる。【００３７】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記核酸化合物が、ＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチドであることとした。【００３８】
この構成によれば、ＮＦκＢに結合して炎症を引き起こすサイトカイン等の生成を阻害し、ＰＴＡ施行時の急性期炎症反応を抑制して再狭窄を効果的に防止できる薬剤溶出型カテーテルを提供可能となる。【００３９】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルを血管内カテーテルとして用いることとした。【００４０】
この構成によれば、ＰＴＡを行った血管部位の再狭窄防止に優れた効果を発揮する。【００４１】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記拡張可能部分としてバルーンを有するバルーンカテーテルであることとした。【００４２】
この構成によれば、カテーテルを血管内の狭窄部まで挿入した後、バルーンを膨らませて狭窄部を容易に拡張することができる。【００４３】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記バルーンの表面に窪みを形成することとした。【００４４】
この構成によれば、窪み内に生体適合性ナノ粒子を多量に担持するとともに、バルーンの膨張に伴い窪みを消失させて窪み内の生体適合性ナノ粒子を押し出し、狭窄部の血管壁に効率良く付着させることができる。【００４５】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルにおいて、前記窪みが円形或いは楕円形であることとした。【００４６】
この構成によれば、バルーンを膨張させて窪みを容易に変形、消失させることができる。【００４７】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルを用いた、血管狭窄または透析用シャント内狭窄の治療方法である。【００４８】
この構成によれば、ＰＴＡを行った血管部位の再狭窄や、血液透析患者の腕に形成したシャント血管の狭窄を効果的に治療することができる。【００４９】
また本発明は、少なくともカチオン性高分子を溶解させた水溶液に、少なくとも生理活性物質の溶液と生体適合性高分子を有機溶媒に溶解させた溶液との混合液を加えて、前記生理活性物質が前記生体適合性高分子中に封入され、且つ粒子表面が正電荷修飾された生体適合性ナノ粒子の懸濁液を生成するナノ粒子形成工程と、カテーテル本体の拡張可能部分を負電荷修飾する負電荷修飾工程と、前記生体適合性ナノ粒子を負電荷修飾された前記拡張可能部分に付着させてナノ粒子層を形成するナノ粒子付着工程と、前記ナノ粒子層を乾燥させる乾燥工程と、を有する薬剤溶出型カテーテルの製造方法である。【００５０】
この方法によれば、拡張可能部分に均一なナノ粒子層が強固に形成されるため、生理活性物質を細胞内へ効率良く送達可能で取り扱い性にも優れた拡張可能な薬剤溶出型カテーテルを簡便且つ低コストで製造することができる。【００５１】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルの製造方法において、前記負電荷修飾工程は、前記拡張可能部分のポリカルボン酸若しくはポリカルボン酸誘導体の溶液中へのディッピングにより行われることとした。【００５２】
この方法によれば、簡便な方法で均一な負帯電性の樹脂層を効率良く形成することができる。【００５３】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルの製造方法において、前記生体適合性ナノ粒子の懸濁液に、さらにアニオン性の生理活性物質を添加することとした。【００５４】
この方法によれば、ナノ粒子表面の正電荷によりアニオン性の生理活性物質が静電気的に担持された状態で負電荷修飾された拡張可能部分へ引き付けられて付着するため、コーティングが困難であった核酸、遺伝子等のアニオン性の生理活性物質を拡張可能部分へ高濃度に付着させた薬剤溶出型カテーテルを製造することができる。【００５５】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルの製造方法において、前記ナノ粒子付着工程を複数回繰り返すことにより、前記拡張可能部分に形成された前記ナノ粒子層の上にさらにナノ粒子層を積層することとした。【００５６】
この方法によれば、コーティングされるナノ粒子量を増大するとともに、拡張可能部分のナノ粒子層全体を均一にすることができる。【００５７】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルの製造方法において、前記ナノ粒子付着工程を複数回繰り返すことにより、異なる生理活性物質が封入された生体適合性ナノ粒子から成る前記ナノ粒子層を、積層状又はモザイク状に形成することとした。【００５８】
この方法によれば、生体内への留置後短時間で溶出させる生理活性物質が封入されたナノ粒子は外層に、長時間経過後に溶出させる生理活性物質が封入されたナノ粒子は内層に付着させておけば、２種類以上の生理活性物質の溶出時間を計画的に制御できる薬剤溶出型カテーテルを製造可能となる。【００５９】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルの製造方法において、前記ナノ粒子層に生分解性高分子の溶液を含浸させる含浸工程を含むこととした。【００６０】
この方法によれば、拡張可能部分からのナノ粒子の溶出速度を制御可能となり、さらにナノ粒子同士が凝集して不溶性の皮膜となるのを防止できる。【００６１】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルの製造方法において、前記含浸工程において、前記生分解性高分子の溶液中にさらに生理活性物質を添加することとした。【００６２】
この方法によれば、ナノ粒子外部の生分解性高分子層中に封入された生理活性物質を即効的に作用させるとともに、ナノ粒子内部に封入された生理活性物質を遅効的且つ持続的に作用させることができる。【００６３】
また本発明は、上記構成の薬剤溶出型カテーテルの製造方法において、前記含浸工程においてナノ粒子層に含浸させる生分解性高分子は、前記生体適合性ナノ粒子を形成する生体適合性高分子より生体内での分解速度が速いこととした。【００６４】
この方法によれば、生分解性高分子の分解により拡張可能部分からナノ粒子が溶出し、細胞内に移行した後にナノ粒子を形成する生体適合性高分子の分解により生理活性物質が徐放されるため、細胞内への生理活性物質の導入効率を高めるとともに、生理活性物質の導入タイミングの制御も容易な薬剤溶出型カテーテルを製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明の薬剤溶出型カテーテルに用いられる、粒子表面が正電荷修飾され生理活性物質が粒子内部に封入されたナノスフェアの構造を示す模式図
【図２】本発明の薬剤溶出型カテーテルに用いられる、粒子表面が正電荷修飾され生理活性物質が粒子内部に封入され粒子表面にも担持されたナノスフェアの構造を示す模式図
【図３】本発明の薬剤溶出型カテーテルに用いられるバルーンカテーテル本体の一例を示す側面図
【図４】カテーテル本体のバルーン部にナノ粒子層を形成した状態を示す断面拡大図
【図５】ナノ粒子層が形成されたバルーン部に生分解性高分子層を形成した状態を示す断面拡大図
【図６Ａ】窪みが形成されたバルーン部に負帯電性樹脂層及びナノ粒子層を積層した状態を示す断面拡大図
【図６Ｂ】バルーン部を膨張させた状態を示す断面拡大図
【図７Ａ】実施例５におけるバルーン部の切開方法を示す図
【図７Ｂ】実施例５におけるバルーン部の観察箇所を示す図
【図８Ａ】生理食塩水へ浸漬する前のバルーン部（図７ＢのＬ）の蛍光顕微鏡写真
【図８Ｂ】生理食塩水へ浸漬する前のバルーン部（図７ＢのＣ）の蛍光顕微鏡写真
【図８Ｃ】生理食塩水へ浸漬する前のバルーン部（図７ＢのＲ）の蛍光顕微鏡写真
【図９Ａ】生理食塩水へ６０分間浸漬した後のバルーン部（図７ＢのＬ）の蛍光顕微鏡写真
【図９Ｂ】生理食塩水へ６０分間浸漬した後のバルーン部（図７ＢのＣ）の蛍光顕微鏡写真
【図９Ｃ】生理食塩水へ６０分間浸漬した後のバルーン部（図７ＢのＲ）の蛍光顕微鏡写真
【図１０Ａ】生理食塩水へ６０分間浸漬し、さらにアセトニトリルへ１０分間浸漬した後のバルーン部（図７ＢのＬ）の蛍光顕微鏡写真
【図１０Ｂ】生理食塩水へ６０分間浸漬し、さらにアセトニトリルへ１０分間浸漬した後のバルーン部（図７ＢのＣ）の蛍光顕微鏡写真
【図１０Ｃ】生理食塩水へ６０分間浸漬し、さらにアセトニトリルへ１０分間浸漬した後のバルーン部（図７ＢのＲ）の蛍光顕微鏡写真
【図１１Ａ】バルーン部（図７ＢのＬ）を６０分間浸漬した生理食塩水をろ過したメンブランフィルターの蛍光顕微鏡写真
【図１１Ｂ】バルーン部（図７ＢのＣ）を６０分間浸漬した生理食塩水をろ過したメンブランフィルターの蛍光顕微鏡写真
【図１１Ｃ】バルーン部（図７ＢのＲ）を６０分間浸漬した生理食塩水をろ過したメンブランフィルターの蛍光顕微鏡写真
【図１２Ａ】実施例６に用いた表面に窪みが形成されたバルーン部の側面図
【図１２Ｂ】図１２Ａにおけるバルーン部のＡ−Ａ′断面図
【図１２Ｃ】図１２Ａにおけるバルーン部のＢ−Ｂ′断面図
【図１３Ａ】実施例６におけるバルーン部の加圧前の蛍光顕微鏡写真
【図１３Ｂ】実施例６におけるバルーン部の１０ａｔｍ加圧後の蛍光顕微鏡写真
【図１３Ｃ】実施例６におけるバルーン部の２０ａｔｍ加圧後の蛍光顕微鏡写真
【図１４】実施例７における血管内皮を損傷させなかったウサギの正常腹部大動脈の断面を示す顕微鏡写真（撮影倍率：４０倍）
【図１５】実施例７におけるＮＦκＢデコイ非含有ＰＬＧＡナノスフェアでコーティングしたＰＴＡバルーンカテーテルで血管内皮を擦過した、ウサギの腹部大動脈の断面[ＮＦκＢデコイ（−）]を示す顕微鏡写真（撮影倍率：４０倍）
【図１６】実施例７におけるＮＦκＢデコイ含有ＰＬＧＡナノスフェアでコーティングしたＰＴＡバルーンカテーテルで血管内皮を擦過した、ウサギの腹部大動脈の断面[ＮＦκＢデコイ（＋）]を示す顕微鏡写真（撮影倍率：４０倍）
【図１７Ａ】実施例７におけるＮＦκＢデコイ（＋）群及びＮＦκＢデコイ（−）群で、腹部大動脈の内膜面積（ｍｍ２）を比較したグラフ
【図１７Ｂ】実施例７におけるＮＦκＢデコイ（＋）群及びＮＦκＢデコイ（−）群で、腹部大動脈の中膜面積（ｍｍ２）を比較したグラフ
【図１７Ｃ】実施例７におけるＮＦκＢデコイ（＋）群及びＮＦκＢデコイ（−）群で、腹部大動脈の内膜／中膜の面積比（Ｉ／Ｍ）を比較したグラフ
【図１８Ａ】実施例８におけるコントロール群、ＮＦκＢデコイ（＋）群、及びＮＦκＢデコイ（−）群で、頚動脈の内膜面積（ｍｍ２）を比較したグラフ
【図１８Ｂ】実施例８におけるコントロール群、ＮＦκＢデコイ（＋）群、及びＮＦκＢデコイ（−）群で、頚動脈の中膜面積（ｍｍ２）を比較したグラフ
【図１８Ｃ】実施例８におけるコントロール群、ＮＦκＢデコイ（＋）群、及びＮＦκＢデコイ（−）群で、頚動脈の内膜／中膜の面積比（Ｉ／Ｍ）を比較したグラフ
【図１９】従来のナノ粒子の構造を示す模式図
【発明を実施するための最良の形態】
【００６６】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら詳細に説明する。本発明の薬剤溶出型カテーテルの製造方法は、脂溶性、或いは親水性の生理活性物質を封入し、且つ表面を正に帯電させた（正電荷修飾した）生体適合性ナノ粒子を形成する工程と、カテーテル本体の拡張可能部分を負に帯電させる（負電荷修飾する）負電荷修飾工程と、ナノ粒子を負電荷修飾された拡張可能部分に付着させてナノ粒子層を形成するナノ粒子付着工程と、ナノ粒子層を乾燥させる乾燥工程とを含むものである。【００６７】
一般に、液体中に分散された粒子の多くは正又は負に帯電しており、逆の電荷を有するイオンが粒子表面に強く引き寄せられ固定された層（固定層）と、その外側に存在する層（拡散層）とで、いわゆる拡散電気二重層が形成されており、拡散層の内側の一部と固定層とが粒子と共に移動するものと推定される。【００６８】
ゼータ電位は、粒子から十分に離れた電気的に中性な領域の電位を基準とした場合の、上記移動が生じる面（滑り面）の電位である。ゼータ電位の絶対値が増加すれば、粒子間の反発力が強くなって粒子の安定性は高くなり、逆にゼータ電位が０に近づくにつれて粒子は凝集を起こしやすくなる。そのため、ゼータ電位は粒子の分散状態の指標として用いられている。【００６９】
従って、負帯電の細胞壁に対する接着性を増大させてナノ粒子を細胞内へ効率良く移行させるためには、ナノ粒子表面が正のゼータ電位を有するように帯電させることが好ましい。本発明においては、ナノ粒子形成工程（後述）においてカチオン性高分子を貧溶媒中に添加する。これにより、形成されたナノ粒子の表面がカチオン性高分子により修飾（被覆）され、粒子表面のゼータ電位が正となる。【００７０】
また、ナノ粒子表面を正に帯電させることにより、カテーテル本体の負電荷修飾された拡張可能部分にナノ粒子を能動的に付着させることができ、ナノ粒子の付着効率を高めるとともに、一旦付着したナノ粒子は拡張可能部分に強固に固着するため、製造工程中や生体内への挿入及び拡張時におけるナノ粒子の脱離を防止できる。以下、ナノ粒子内部への生理活性物質の封入工程から拡張可能部分への付着工程までを順を追って説明する。【００７１】
（ナノ粒子形成工程）
本発明に用いられる生体適合性ナノ粒子は、生理活性物質及び生体適合性高分子を１，０００ｎｍ未満の平均粒径を有するナノ単位の大きさの粒子（ナノスフェア）に加工することができる球形晶析法を用いて、ナノ粒子の内部に生理活性物質を封入することにより製造される。球形晶析法は高剪断力を発生しない粒子調製法であるため、特に、生理活性物質が外部応力に弱い核酸化合物等の場合にも好適に用いることができる。【００７２】
球形晶析法は、化合物合成の最終プロセスにおける結晶の生成・成長プロセスを制御することで、球状の結晶粒子を設計し、その物性を直接制御して加工することができる方法である。この球形晶析法の一つに、エマルジョン溶媒拡散法（ＥＳＤ法）がある。【００７３】
ＥＳＤ法は、次に示すような原理によって、ナノスフェアを製造する技術である。本法には、生理活性物質を封入する基剤ポリマーとなるＰＬＧＡ（乳酸・グリコール酸共重合体）等を溶解できる良溶媒と、これとは逆にＰＬＧＡを溶解しない貧溶媒の二種類の溶媒が用いられる。この良溶媒には、ＰＬＧＡを溶解し、且つ貧溶媒へ混和するアセトン等の有機溶媒を用いる。そして、貧溶媒には、通常、ポリビニルアルコール水溶液等を用いる。【００７４】
操作手順としては、まず、良溶媒中にＰＬＧＡを溶解後、このＰＬＧＡが析出しないように、生理活性物質の溶解液を良溶媒中へ添加混合する。このＰＬＧＡと生理活性物質の混合液を、貧溶媒中に攪拌下、滴下すると、混合液中の良溶媒（有機溶媒）が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の自己乳化が起き、サブミクロンサイズの良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散していくので、エマルジョン滴内のＰＬＧＡ並びに生理活性物質の溶解度が低下し、最終的に、生理活性物質を包含した球形結晶粒子のＰＬＧＡナノスフェアが生成する。【００７５】
上記球形晶析法では、物理化学的な手法でナノ粒子を形成でき、しかも得られるナノ粒子が略球形であるため、均質なナノ粒子を、触媒や原料化合物の残留といった問題を考慮する必要がなく、容易に形成することができる。さらに、本発明においては貧溶媒中にカチオン性高分子を添加してナノ粒子表面をカチオン性高分子で被覆することにより、粒子表面を正に帯電させている。このようなナノ粒子の構造を図１に示す。ナノ粒子１の表面はポリビニルアルコール２で被覆され、内部に生理活性物質３が内包されている。さらにポリビニルアルコール２の外表面はカチオン性高分子４で被覆されており、カチオン性高分子４により正のゼータ電位を有している。【００７６】
また、生体内の細胞壁は負に帯電しているが、従来の球形晶析法で製造されたナノ粒子の表面は、一般的に負のゼータ電位を有しているため（図１９参照）、電気的反発力によりナノ粒子の細胞接着性が悪くなるという問題点があった。従って、本発明のようにカチオン性高分子を用いてナノ粒子表面が正のゼータ電位を有するように帯電させることは、負帯電の細胞壁に対するナノ粒子の接着性を増大させ、生理活性物質の細胞内移行性を向上させる観点からも好ましい。【００７７】
カチオン性高分子としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）等が挙げられるが、特にキトサン或いはその誘導体が好適に用いられる。【００７８】
キトサンは、エビやカニ、昆虫の外殻に含まれる、アミノ基を有する糖の１種であるグルコサミンが多数結合したカチオン性の天然高分子であり、乳化安定性、保形性、生分解性、生体適合性、抗菌性等の特徴を有するため、化粧品や食品、衣料品、医薬品等の原料として広く用いられている。このキトサンを貧溶媒中に添加することにより、生体への影響がなく、安全性の高いナノ粒子を製造することができる。【００７９】
なお、カチオン性高分子の中でもカチオン性のより強いものを用いることにより、ゼータ電位がより大きな正の値となるため、後述するナノ粒子付着工程での電気的吸着力が増大するとともに、粒子間の反発力が強くなって懸濁液中での粒子の安定性も高くなる。例えば、元来カチオン性であるキトサンの一部を第四級化することで、さらにカチオン性を高めた塩化Ｎ−［２−ヒドロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］キトサン等のキトサン誘導体（カチオニックキトサン）を用いることが好ましい。【００８０】
なお、ナノ粒子内に封入される生理活性物質がアニオン性（水溶液中で負の電荷を持つアニオン分子として存在する）であるときは、貧溶媒にカチオン性高分子を添加すると、ナノ粒子内部への生理活性物質の封入率を高めることができる。通常、封入される生理活性物質が親水性（水溶性）の場合、良溶媒中に分散混合した生理活性物質が貧溶媒中に漏出、溶解してしまい、ナノ粒子を形成する高分子だけが沈積するため、生理活性物質がほとんど封入されないが、カチオン性高分子を貧溶媒中に添加した場合は、ナノ粒子表面に吸着したカチオン性高分子がエマルジョン滴表面に存在するアニオン性の生理活性物質と相互作用し、貧溶媒中への生理活性物質の漏出を抑制できるものと考えられる。
【００８１】
また、良溶媒中におけるアニオン性の生理活性物質の親和性及び分散安定性を向上させるため、良溶媒中にＤＯＴＡＰ（N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium  salts）等のカチオン性脂質を添加し、アニオン性の生理活性物質と複合体を形成させても良い。但し、細胞内において放出されたカチオン性脂質により細胞障害性を示すおそれがあるため、添加量には注意が必要である。【００８２】
さらに、生理活性物質がアニオン性である場合、凍結乾燥によりナノ粒子を複合化する際に生理活性物質を添加することにより、水溶液中で負の電荷を持つアニオン分子となった生理活性物質が静電気的相互効果によりナノ粒子表面に所定量担持される。このようなナノ粒子の構造を図２に示す。生体適合性ナノ粒子１の表面はポリビニルアルコール２で被覆され、さらにその外表面がカチオン性高分子４で被覆されており、カチオン性高分子４により正のゼータ電位を有している。生理活性物質３は、ナノ粒子１に内包されるとともにナノ粒子１の表面にも静電気的に担持されている。【００８３】
従って、脂溶性（疎水性）のナノ粒子内部への封入が極めて困難であるアニオン性の生理活性物質についても、ナノ粒子内部及び表面を合わせたトータルの含有率を高めることができる。また、投与直後にナノ粒子の表面から溶け出す生理活性物質とは別に、ナノ粒子内部から徐放的に放出される生理活性物質を作用させることで、医薬製剤に即効性と持続性の両方を付与することができる。【００８４】
なお、凍結乾燥の前に、遠心分離等により余剰のポリビニルアルコールを除去する除去工程を設ける場合は、ポリビニルアルコールと共に粒子表面のカチオン性高分子も一部除去されてしまう可能性がある。そのため、除去工程の後に再度ナノ粒子をカチオン性高分子溶液に浸漬する工程を設けることが好ましい。【００８５】
上記球形晶析法で用いられる良溶媒および貧溶媒の種類は、ナノ粒子内に封入される生理活性物質の種類等に応じて決定されるものであり、特に限定されるものではないが、生体適合性ナノ粒子は、人体内へ挿入される薬剤溶出型カテーテルの材料として用いられるため、人体に対して安全性が高く、且つ環境負荷の少ないものを用いる必要がある。【００８６】
このような貧溶媒としては、水、或いは界面活性剤を添加した水が挙げられるが、例えば界面活性剤としてポリビニルアルコールを添加したポリビニルアルコール水溶液が好適に用いられる。ポリビニルアルコール以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。【００８７】
良溶媒としては、低沸点の有機溶媒であるハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等が挙げられるが、例えば環境や人体に対する影響が少ないアセトン、若しくはアセトンとエタノールの混合液が好適に用いられる。【００８８】
ポリビニルアルコール水溶液の濃度、或いはアセトンとエタノールの混合比や、結晶析出時の条件も特に限定されるものではなく、目的となる生理活性物質の種類や、球形造粒結晶の粒径（本発明の場合ナノオーダー）等に応じて適宜決定すればよいが、ポリビニルアルコール水溶液の濃度が高いほどナノ粒子表面へのポリビニルアルコールの付着が良好となり、乾燥後の水への再分散性が向上する反面、ポリビニルアルコール水溶液の濃度が所定以上になると、貧溶媒の粘度が上昇して良溶媒の拡散性に影響を与える。【００８９】
そのため、ポリビニルアルコールの重合度やけん化度によっても異なるが、ナノ粒子形成後に有機溶媒を留去し、さらに凍結乾燥等により一旦粉末化する場合は、ポリビニルアルコール水溶液の濃度として０．１重量％以上１０重量％以下が好ましく、２％程度がより好ましい。なお、ナノ粒子形成後の懸濁液から有機溶媒を留去し、そのままナノ粒子付着工程に用いる場合は０．５重量％以下とすることが好ましく、０．１重量％程度が特に好ましい。【００９０】
本発明に用いられる生体適合性高分子は、生体への刺激・毒性が低く、生体適合性で、投与後分解して代謝される生体内分解性のものが望ましい。また、内包する生理活性物質を持続して徐々に放出する粒子であることが好ましい。このような素材としては、特にＰＬＧＡを好適に用いることができる。【００９１】
ＰＬＧＡの分子量は、５，０００〜２００，０００の範囲内であることが好ましく、１５，０００〜２５，０００の範囲内であることがより好ましい。乳酸とグリコール酸との組成比は１：９９〜９９：１であればよいが、乳酸１に対しグリコール酸０．３３３であることが好ましい。また、乳酸およびグリコール酸の含有量が２５重量％〜６５重量％の範囲内であるＰＬＧＡは、非晶質であり、且つアセトン等の有機溶媒に可溶であるから、好適に使用される。【００９２】
生体内分解性の生体適合性高分子としては、ほかに、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアスパラギン酸等が挙げられる。また、これらのコポリマーであるアスパラギン酸・乳酸共重合体（ＰＡＬ）やアスパラギン酸・乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＡＬＧ）を用いても良く、アミノ酸のような荷電基あるいは官能基化し得る基を有していてもよい。【００９３】
なお、封入される生理活性物質が親水性（水溶性）の場合、ＰＬＧＡの表面をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾したものを用いると、親水性の生理活性物質とＰＬＧＡとの親和性が向上し、封入が容易になるため好ましい。【００９４】
上記以外の生体適合性高分子としては、ポリエチレン、ポリプロピレンのようなポリアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテルおよびポリビニルエステルのようなポリビニル化合物、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンテレフタレート、アクリル酸とメタクリル酸とのポリマー、セルロースおよび他の多糖類、ならびにペプチドまたはタンパク質、あるいはそれらのコポリマーまたは混合物が挙げられる。【００９５】
その後、得られたナノ粒子の懸濁液をそのまま、或いは必要に応じて良溶媒である有機溶媒を減圧留去し（溶媒留去工程）、さらに必要に応じて凍結乾燥等によりナノ粒子を一旦粉末化させた後、再度水に分散させて次のナノ粒子付着工程に用いる。ナノ粒子を懸濁液のまま次工程に用いる場合は、凍結乾燥等を行う必要がなくなり、製造工程が簡略化できるとともに、貧溶媒中へのポリビニルアルコールの添加量も低減できるため好ましい。【００９６】
なお、ナノ粒子を一旦粉末化する場合、結合剤（例えばトレハロース等）と共に再分散可能な凝集粒子に複合化して複合粒子としておけば、使用前まではナノ粒子が集まった、取り扱いやすい凝集粒子となっており、使用時に水分に触れることで結合剤が溶解して再分散可能なナノ粒子に復元できるため好ましい。【００９７】
本発明に用いられる生体適合性ナノ粒子は、１，０００ｎｍ未満の平均粒子径を有するものであれば特に制限はないが、カテーテルが留置される狭窄部に生理活性物質を導入するためナノ粒子を細胞内に取り込ませる必要がある。標的細胞内への浸透効果を高めるためには、ナノ粒子の平均粒子径を５００ｎｍ以下とすることが好ましい。【００９８】
生体適合性ナノ粒子に封入される生理活性物質としては、アスピリン、ジピリダモール、ヘパリン、抗トロンビン製剤、魚油等の抗血小板薬、低分子ヘパリン、アンギオテンシン変換酵素阻害薬等の平滑筋増殖抑制薬、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンデシン、塩酸イリノテカン、パクリタキセル、ドセタキセル水和物、メトトレキサート、シクロフォスファミド等の抗がん剤、マイトマイシンＣ等の抗生物質、シロリムス、タクロリムス水和物等の免疫抑制剤、ステロイド等の抗炎症薬、アトルバスタチンカルシウム、ロバスタチン等の脂質改善薬、プラスミドＤＮＡ、遺伝子、ｓｉＲＮＡ、囮型核酸医薬（デコイ）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、インターロイキン、細胞間情報伝達物質（サイトカイン）、グリベックやＰＴＫ７８７等が挙げられるが、これらの物質に限定されるものではない。なお、上記生理活性物質のうち何れか１種のみを封入しても良いが、効能や作用機序の異なる成分を複数種封入しておけば、各成分の相乗効果により薬効の促進が期待できる。
【００９９】
特に、核酸化合物が封入されたナノ粒子を付着させた場合、カテーテルを利用して狭窄部に安全且つ効率的に核酸化合物を導入可能となるため、狭窄部を核酸レベルで治療する再発可能性の少ない有効な治療法となる。核酸化合物としては、プラスミドＤＮＡ、遺伝子、デコイ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマーが特に好ましい。ナノ粒子内部への生理活性物質の封入量は、ナノ粒子形成時に添加する生理活性物質の量やカチオン性高分子の種類及び添加量の調整、ナノ粒子を形成する生体適合性高分子の種類により調整可能である。【０１００】
核酸化合物の中でも、ＮＦκＢに結合して炎症を引き起こすサイトカイン等の生成を抑制するＮＦκＢデコイオリゴヌクレオチド（ＮＦκＢ  Decoy  Oligodeoxynucleotides、以下、ＮＦκＢデコイという）をナノ粒子内部に封入することにより、ＰＴＡ施行時の急性期炎症反応を抑制して再狭窄を効果的に防止することができる。【０１０１】
本明細書中において「デコイ」とは、本来転写因子が結合すべきゲノム上の結合領域に似せた構造を有する、いわゆる「おとり分子」を指す。デコイの共存下では、転写因子の一部は、本来結合すべきゲノム上の結合領域に結合せず、結合領域の「おとり」として機能するデコイに結合する。このため、本来の結合領域に結合する転写因子の分子数が減少し、転写因子の活性が低下することになる。【０１０２】
デコイとしては、結合配列の両端に任意のヌクレオチドが連結されたオリゴヌクレオチドが一般的である。この結合配列両端のヌクレオチド部分は付加配列とも呼ばれ、１以上の塩基から成り、好ましくは１〜２０ヌクレオチド、より好ましくは１〜１０ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜７ヌクレオチドから成る。またデコイの全鎖長は限定されず通常は１５〜３５ヌクレオチドであるが、好ましくは１６〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１７〜２５ヌクレオチドである。【０１０３】
またＮＦκＢデコイは、ＮＦκＢの結合配列を１つ以上含む二本鎖オリゴヌクレオチドであり、この二本鎖は完全に相補的な配列であることが好ましい。即ち、５′−５′末端付加配列−結合配列−３′末端付加配列−３′という構成のセンス鎖オリゴヌクレオチドと、それに相補的なアンチセンス鎖から成る二本鎖オリゴヌクレオチドが典型的なＮＦκＢデコイの構成として挙げられる。【０１０４】
なお、１以上（通常は１又は２組）の非相補的な塩基対を含んでいても、ＮＦκＢと結合し得る限り本明細書中のＮＦκＢデコイに包含される。さらに、５′末端付加配列と３′末端付加配列との間に複数の結合配列がタンデムに直接、または１〜数個のヌクレオチドを挟んで連結されている複数の転写因子結合部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドも、他のＮＦκＢデコイの構成として挙げられる。【０１０５】
さらにまた、一本鎖のオリゴヌクレオチドであっても、分子内に結合配列とその相補的配列とを有し、これらが分子内で二本鎖を形成しているような、いわゆるリボン型デコイ又はステイプル型デコイと呼ばれるものも、ＮＦκＢが結合する限り本明細書にいうＮＦκＢデコイに含まれる。【０１０６】
ここでＮＦκＢデコイの具体例としては、例えばCurrent  Drug  Targets.  2003  Nov;4(8):603-8.等の記載に基づいて新たに分子設計することもできるし、Circ  Res.  2001  Nov  9;89(10):899-906.に開示されている配列番号１、FASEB  J.  2000  Apr;14(5):815-22.に開示されている配列番号２、Journal  Invest  Dermatol.  2006  Aug;126(8):1792-803.に開示されている配列番号３等の公知のＮＦκＢデコイを用いることもできる。【０１０７】
本発明で用いられるＮＦκＢデコイの製造方法としては、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法を用いることができ、例えばＤＮＡ合成装置を用いて直接合成しても良いし、オリゴヌクレオチド又はその一部を合成した後、ＰＣＲ法又はクローニングベクター法等を用いて増幅しても良い。さらに、これらの方法により得られたオリゴヌクレオチドを、制限酵素等を用いて切断するか、或いはＤＮＡリガーゼ等を用いて結合等を行い、ＮＦκＢデコイを製造しても良い。【０１０８】
また、本発明に用いられるＮＦκＢデコイは１つ以上の修飾された結合や核酸を含有していても良い。このような修飾された結合としては、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、メトキシエチルホスホエート等を、修飾された核酸としてはペプチド核酸（peptide nucleic acid：ＰＮＡ）、ロックド核酸（locked nucleic acid：ＬＮＡ）、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）化およびＯ−メチル化等で修飾された塩基を有する核酸等が挙げられる。前記結合の中でもホスホロチオエートがより好ましい。
【０１０９】
ＤＮＰ化およびＯ−メチル化等は、通常はリボヌクレオシド（ＲＮＡ）に対する修飾であるが、本発明においては、オリゴヌクレオチド中の修飾するデオキシリボヌクレオシド（ＤＮＡ）を、ＲＮＡの場合と同様にしてオリゴヌクレオチドを合成し、該塩基を修飾することが可能である。【０１１０】
また、デコイ又はデコイ候補となるオリゴヌクレオチドが転写因子に結合するか否かは結合活性試験により確認することができる。ＮＦκＢデコイの場合、ＮＦκＢに対する結合活性試験は、例えば、TransAM  ＮＦκＢ  p65  Transcription  Factor  Assay  Kit（商品名、ACTIVE  MOTIF  社）を用いて、当該キットに添付の資料に基づいて、又は当業者が日常的に行う程度のプロトコルの改変により、容易に実施することができる。【０１１１】
（負電荷修飾工程）
次に、カテーテル本体のバルーン部を負電荷修飾する方法について説明する。図３は、本発明に用いられるカテーテル本体の一例を示す側面図である。カテーテル本体５は、アウターチューブ６と、アウターチューブ６に内挿されるインナーチューブ７とから成る可撓性のカテーテルシャフト８と、カテーテルシャフト８の一端に付設されたバルーン部（拡張可能部分）９とで構成されている。カテーテルシャフト８の他端には血液の流出を防止する止血弁を備えたカテーテルハブ１０が付設されている。【０１１２】
カテーテル本体５は、患者の手や足に穿刺された管（シース）を介して血管内に導入され、カテーテルハブ１０からインナーチューブ７内に挿通されたガイドワイヤー（図示せず）により血管内の狭窄部まで挿入される。そして、アウターチューブ６とインナーチューブ７の隙間から所定の圧力で空気または膨張液を送り込むことにより、バルーン部９を膨らませて狭窄部を正常な血管径に近づける。【０１１３】
カテーテルシャフト８、バルーン部９及びカテーテルハブ１０の材質としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレン共重合体、エチレン−酢酸ビニル共重合体、架橋型エチレン−プロピレン共重合体、架橋型エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル等の熱可塑性樹脂や、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアリレーンサルファイド等が用いられる。中でも、成形が容易で適度な弾力性があり、破損しにくいポリアミドが好適に用いられる。なお、Ｘ線透過性素材で形成されたバルーン部９に造影剤を注入して膨らませることにより、血管内におけるカテーテル本体５の位置やバルーン部９の膨張状態をモニターにより確認可能となる。【０１１４】
先のナノ粒子形成工程で説明したように、本発明で用いられるナノ粒子表面は正に帯電しているため、バルーン部９を予め負電荷修飾しておき、ナノ粒子を電気的に付着させることにより、バルーン部９にナノ粒子を強固且つ均一にコーティング可能となる。バルーン部９を負電荷修飾する方法としては、バルーン部９の表面にポリカルボン酸若しくはポリカルボン酸誘導体のような負帯電性の樹脂を用いて負帯電性樹脂層を形成する方法が好ましい。【０１１５】
本発明に用いられるポリカルボン酸としては、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸のポリマー、デンプン、セルロース若しくはポリビニルアルコールのカルボキシメチル誘導体、アルギン酸、ペクチン等が挙げられ、これらのうち１種または２種以上が混合して用いられる。【０１１６】
また、ポリカルボン酸誘導体としては、上記のポリカルボン酸の酸無水物若しくはエステル誘導体が挙げられる。中でも、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸のポリマーの酸無水物誘導体若しくはエステル誘導体を用いることにより、生体への刺激や毒性が少ない負電荷修飾が可能となる。好ましいポリカルボン酸誘導体としては、入手が容易で取り扱い性にも優れた無水マレイン酸−メチルビニルエーテルコポリマー、無水マレイン酸−スチレンコポリマー、無水マレイン酸−エチレンコポリマーのような無水マレイン酸のコポリマー（共重合体）が挙げられ、無水マレイン酸−メチルビニルエーテルコポリマーが特に好適に用いられる。【０１１７】
負帯電性樹脂層をコーティングする方法としては、負帯電性樹脂の溶液中にカテーテル本体５のバルーン部９を浸漬（ディッピング）する方法、超音波ミスト法、スプレー法、エアーブラシ法等により負帯電性樹脂溶液の微細な液滴をバルーン部９の表面に吹き付ける方法、ワイピング法により負帯電性樹脂溶液をバルーン部９の表面に塗布する方法等が挙げられる。【０１１８】
（ナノ粒子付着工程）
次に、生理活性物質が封入された生体適合性ナノ粒子を負電荷修飾されたバルーン部に付着させてナノ粒子層を形成する方法について説明する。ナノ粒子を付着させる方法としては、負帯電性樹脂層が形成されたカテーテル本体５のバルーン部９をナノ粒子の懸濁液中に浸漬（ディッピング）する方法や、超音波ミスト法、スプレー法、エアーブラシ法等によりバルーン部９にナノ粒子含有液滴を付着させる方法等が挙げられる。【０１１９】
図４は、カテーテル本体のバルーン部にナノ粒子が付着した状態を示す断面拡大図である。バルーン部９の表面は負帯電性樹脂層１１によって負電荷修飾されており、負帯電性樹脂層１１の表面は正に帯電したナノ粒子１により完全に被覆され、ナノ粒子層１２が形成されている。【０１２０】
そのため、後の製造工程や生体器官内への挿入時及びカテーテル拡張時における、バルーン部分からのナノ粒子層１２の剥離を防止することができる。ナノ粒子層１２の負帯電性樹脂層１１への付着力が増大する原因としては、ナノ粒子１間に作用するファンデルワールス力等によるものと考えられる。【０１２１】
カテーテル本体の形状としては、図３に示したものの他、従来公知の種々の形状を用いることができる。また、カテーテル本体の大きさも適用箇所に応じて適宜選択すれば良い。例えば心臓の冠状動脈に用いる場合は、通常、拡張前における外径は１．０〜３．０ｍｍ、長さは５．０〜５０ｍｍ程度が好ましい。【０１２２】
また、ナノ粒子内に封入される生理活性物質がアニオン性である場合、負帯電性樹脂層１１の表面にナノ粒子層１２を形成する際に、ナノ粒子１の懸濁液中に生理活性物質をさらに添加すれば、ナノ粒子表面の正電荷により生理活性物質が静電気的に担持された状態で負帯電性樹脂層１１へ引き付けられて付着する。従って、バルーン部９への高濃度のコーティングが極めて困難であった核酸、遺伝子等のアニオン性の生理活性物質を一層効率良く付着させることができる。【０１２３】
上述したようなディッピング法や超音波ミスト法、スプレー法、エアーブラシ法等を複数回繰り返して行うことにより、ナノ粒子層の上にさらにナノ粒子層を積層することもできる。これにより、負帯電性樹脂層１１を介してバルーン部９の表面に形成された均一なナノ粒子層１２に沿って新たなナノ粒子層が積層されるため、単位時間当たりのナノ粒子付着量を多くしても所望の層厚を有するナノ粒子層を均一に且つ効率的に形成することができる。【０１２４】
また、封入される生理活性物質の種類が異なる複数種のナノ粒子を作製し、それぞれのナノ粒子を層状に或いはモザイク状に付着させても良い。このとき、カテーテル留置後短時間で溶出させたい生理活性物質が封入されたナノ粒子は外層に、外層の崩壊後に溶出させたい生理活性物質が封入されたナノ粒子は内層に付着させておけば、２種類以上の生理活性物質のバルーン部からの溶出時間を計画的に制御できる。また、２種類以上の生理活性物質を、生体適合性高分子の種類や分子量の異なるナノ粒子中に封入して溶出時間を制御しても良い。【０１２５】
なお、バルーン部９の表面に形成されたナノ粒子層１２は、そのままでは生体内に留置された後、比較的短時間で溶出してしまい、薬効の持続性のコントロールが困難となる場合も考えられる。また、ナノ粒子層１２を完全に乾燥させると、ナノ粒子同士がますます強固に凝集してナノ粒子層１２が不溶性の皮膜となり、ナノ粒子１がバルーン部９の表面から溶出せず細胞内に取り込まれなくなるおそれもある。そこで、上記ナノ粒子付着工程によりナノ粒子層１２を形成した後、ナノ粒子層が完全に乾燥する前に、必要に応じて生分解性高分子の溶液を含浸させ（含浸工程）、その後生分解性高分子を乾燥させてナノ粒子層１２を固化する（乾燥工程）ようにしても良い。【０１２６】
ナノ粒子層が形成されたバルーン部（図４参照）に含浸工程及び乾燥工程により生分解性高分子層を形成した状態を図５に示す。負帯電性樹脂層１１の表面に形成されたナノ粒子層１２が完全に乾燥する前に生分解性高分子の溶液を含浸させると、ナノ粒子層１２を形成する各ナノ粒子１の隙間に生分解性高分子の溶液が浸透する。そして、生分解性高分子の溶解に用いた溶媒及びナノ粒子層１２に残存していた水分を乾燥させることで生分解性高分子層１３が形成される。これにより、個々のナノ粒子１は生分解性高分子によって凝集することなく保持されることとなり、カテーテル本体を生体内に留置した後、生分解性高分子層１３の分解によりナノ粒子１が徐々に溶出し、例えば血管壁細胞内へ取り込まれる。【０１２７】
生分解性高分子としては、例えばポリヒドロキシブチレート、ポリヒドロキシバリレート等の微生物産生系の高分子や、コラーゲン、酢酸セルロース、バクテリアセルロース、ハイアミロースコーンスターチ、澱粉、キトサン等の天然高分子等が挙げられる。中でも、ナノ粒子の形成に用いられるＰＬＧＡ等の生体適合性高分子よりも生体内分解速度が速いコラーゲン等を用いることが好ましい。これらの生分解性高分子の種類や分子量等を適宜選択することにより、バルーン部の表面に付着させたナノ粒子の溶出速度を制御可能となる。なお、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＡＬ等の、ナノ粒子の形成に用いられる生体適合性高分子を用いて生分解性高分子層を形成することも可能であるが、その場合はナノ粒子の分解速度よりも速くなるように分子量の小さいものを使用すれば良い。【０１２８】
さらに、ナノ粒子層に含浸させる生分解性高分子の溶液中にも生理活性物質を添加することにより、ナノ粒子外部の生分解性高分子層中に封入された生理活性物質を即効的に作用させるとともに、ナノ粒子内部に封入された生理活性物質を遅効的且つ持続的に作用させることができる。生理活性物質の種類及び封入量は、生理活性物質の作用機序や、要求される即効性、持続性の程度等により適宜設定することができる。【０１２９】
即ち、投与後長期間に亘る効果の持続性が要求される生理活性物質の場合はナノ粒子内部へ封入すれば良く、投与直後より効果の発現が要求される生理活性物質の場合はナノ粒子外部の生分解性高分子層中へ封入すれば良い。生分解性高分子層中へ封入される生理活性物質としては、ナノ粒子内部に封入される生理活性物質として例示した種々の生理活性物質を用いることができる。【０１３０】
また、バルーン部９（図３参照）の表面に微細な窪みを形成しておくと、バルーン部９の膨張に伴い窪みが徐々に浅くなり、バルーン部９が完全に膨張した状態では窪みが消失してバルーン部９の表面がフラットな状態となる。そこで、図６Ａに示すように、窪み１５が形成されたバルーン部９の表面に負帯電性樹脂層１１及びナノ粒子層１２を積層しておけば、窪み１５内には他の部分よりも多量のナノ粒子１が担持される。負帯電性樹脂層１１及びナノ粒子層１２の形成方法は窪み１５のないバルーン部９と同様である。【０１３１】
そして、カテーテルを血管内の狭窄部に挿入した後、バルーン部９を膨張させることで窪み１５は徐々に浅くなり、５〜３０ａｔｍまで加圧してバルーン部９が完全に膨張した状態では、図６Ｂに示すように窪み１５は消失し、窪み１５内のナノ粒子１が押し出されて狭窄部の血管壁に押し付けられる。これにより、ナノ粒子１を血管壁に多量に且つ効率的に付着させることができる。【０１３２】
窪み１５の形状としては、バルーン部９の膨張により窪みが変形、消失し易い円形若しくは楕円形が好ましい。窪みの大きさは、窪みが円形の場合は直径０．５〜５ｍｍ、楕円形の場合は短径０．５〜５ｍｍ、長径／短径＝１〜５が好ましい。また、窪み１５の深さは０．１〜１ｍｍ、窪み間の間隔は１〜５ｍｍとし、バルーン部９に１０〜１００個程度設けることが好ましい。【０１３３】
以上のようにして得られた薬剤溶出型カテーテルは、バルーン部に付着しているナノ粒子の表面が正に帯電しているため、バルーン部の表面から溶出されたナノ粒子の細胞接着性が増大する。これにより、従来の薬剤溶出型カテーテルに比べてカテーテルが留置される狭窄部位細胞へのナノ粒子の導入効率を高めることができる。【０１３４】
その他、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、上記各実施形態においては、血管内に挿入して開放状態を維持するバルーンカテーテルについてのみ説明したが、本発明は、生体内における血管以外の他の管腔に挿入される拡張型カテーテルにも同様に適用できるのはもちろんである。以下、ＮＦκＢデコイを封入し表面を正電荷修飾したＰＬＧＡナノスフェアの調製及びそれをコーティングした薬剤溶出型バルーンカテーテルの作製、並びにバルーン表面からのＮＦκＢデコイの溶出挙動について、実施例に沿って具体的に説明する。
［ＮＦκＢデコイ含有ＰＬＧＡナノスフェアの調製］
【実施例１】
【０１３５】
配列番号１で示されるＮＦκＢデコイ５０ｍｇを精製水６ｍＬに溶解させた。生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：和光純薬工業（株）製ＰＬＧＡ７５２０（商品名）、分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸モル比＝７５／２５）１ｇをその良溶媒であるアセトン４３ｍＬに溶解してポリマー溶液とした後、前記ＮＦκＢデコイの水溶液を添加、混合し混合液とした。また、２重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ：クラレ社製ポバール４０３（商品名）、重合度約３００、けん化度約８０ｍｏｌ％）水溶液２５ｍＬ中に２重量％カチオニックキトサン（モイスコートＰＸ（商品名）、片倉チッカリン社製）水溶液５ｇを混合し貧溶媒とした。この貧溶媒中に前記混合液を４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を得た。【０１３６】
続いて、減圧下アセトンを留去した後、遠心分離操作（２０，０００ｒｐｍ、２０分）により余剰のポリビニルアルコールを除去し、−４５℃で凍結乾燥し粉末化して、水への再分散性の良好なＮＦκＢデコイ内包型ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。
【実施例２】
【０１３７】
配列番号１で示されるＮＦκＢデコイ５０ｍｇを精製水６ｍＬに溶解させた。生体適合性高分子である乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ：和光純薬工業（株）製ＰＬＧＡ７５２０（商品名））１ｇをその良溶媒であるアセトン４３ｍＬに溶解してポリマー溶液とした後、前記ＮＦκＢデコイの水溶液を添加、混合し混合液とした。また、２重量％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ：クラレ社製ポバール４０３（商品名））水溶液２５ｍＬ中に２重量％カチオニックキトサン（モイスコートＰＸ（商品名）、片倉チッカリン社製）水溶液５ｇを混合し貧溶媒とした。この貧溶媒中に前記混合液を４０℃、４００ｒｐｍで攪拌下、一定速度（４ｍＬ／分）で滴下し、良溶媒の貧溶媒中への拡散によってＰＬＧＡナノスフェアの懸濁液を得た。【０１３８】
続いて、減圧下アセトンを留去した後、得られたナノスフェアの懸濁液にＮＦκＢデコイ２０ｍｇをさらに添加し、−４５℃で凍結乾燥し粉末化して、ナノスフェア表面にＮＦκＢデコイが担持され、ナノスフェア内部にＮＦκＢデコイが封入された水への再分散性の良好なＮＦκＢデコイ内包／表面担持型ＰＬＧＡナノスフェア粉末を得た。【０１３９】
実施例１及び２で得られたＰＬＧＡナノスフェアを水中へ再分散させた際の平均粒子径を動的光散乱法（測定装置：ＭＩＣＲＯＴＲＡＣ  ＵＰＡ（商品名）、HONEYWELL社製）により測定した。また、凍結乾燥後の粒子表面のゼータ電位をゼータ電位計（ＺＥＴＡＳＩＺＥＲ  Ｎａｎｏ−Ｚ（商品名）、Malvern  Instruments  社製）を用いて測定した。さらに、紫外可視分光光度計（Ｖ−５３０（商品名）、日本分光社製、測定波長２６０ｎｍ）を用いて粒子中のＮＦκＢデコイ含有率（ＰＬＧＡナノスフェアに対するＮＦκＢデコイの重量比）を定量した。測定結果を表１に示す。なお、実施例１及び２で得られたナノスフェアの構造は図１及び図２で示される。【０１４０】
【表１】
0005591103.tif 000002
含有率の理論値（％）＝ＰＬＧＡナノスフェアに対するＮＦκＢデコイの仕込み量×１００を（内包＋表面担持）に分けて示した。
［溶出試験用バルーンカテーテル検体の作製］
【実施例３】
【０１４１】
（バルーンカテーテル本体の組立）
ポリアミド製バルーンの接着部分にヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を塗布して溶融し、カテーテルシャフトの先端に接着した。そして、ナノスフェア分散液の浸入を防ぐためにカテーテル先端から芯線を挿入し、溶融封止して図３に示したようなカテーテル本体を作製した。【０１４２】
（バルーン部への無水マレイン酸ポリマーのコーティング）
作製したカテーテル本体のバルーン部をエタノール（９９．５％）に５秒間浸漬した後、エタノールを含浸させたキムワイプ（商品名）で表面を拭き取り、乾燥器内で真空乾燥（５５℃、２時間）した。その後、コーティングを容易にするための前処理として、ヘキサメチレン−１，６−ジイソシアネート（ＨＭＤＩ）の４重量％メチルエチルケトン溶液に１時間浸漬し、さらに乾燥器内で真空乾燥（５５℃、２時間）した。【０１４３】
無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体９０重量％、及びメタクリル酸メチル−ＣＨ２＝Ｃ（ＣＨ３）ＣＯＯＣＨ２（ＣＦ２）６ＣＦ３−スチレン−ポリウレタン−トリメトキシリール共重合体１０重量％から成る樹脂組成物３ｇを、テトラヒドロフランとメチルエチルケトンの混合溶媒（容量比１：１）１００ｍＬに溶解して無水マレイン酸ポリマーコーティング液を調製した。【０１４４】
この無水マレイン酸ポリマーコーティング液にバルーン部を５秒間浸漬し、乾燥器内で真空乾燥（５５℃、８時間）した。乾燥後、負電荷を持つカルボキシル基を発現させるために０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に２０分間浸漬し、イオン交換水で洗浄して余剰の水酸化ナトリウムを除去した。乾燥器内で真空乾燥（５５℃、３時間）して、バルーン部に無水マレイン酸ポリマー層（負帯電性樹脂層）がコーティングされたバルーンカテーテルを作製した。【０１４５】
（バルーン部へのＰＬＧＡナノスフェアのコーティング）
無水マレイン酸ポリマー層がコーティングされたバルーン部のデッドスペース（図３におけるバルーン部両端の円錐形部分）を予めパラフィルム（商品名）でマスキングした。次に、実施例１または実施例２で得られたＮＦκＢデコイ含有ＰＬＧＡナノスフェアの１０重量％分散液を調製し、バルーン部を１０分間浸漬した後、乾燥器内で真空乾燥（４０℃、３時間）した。パラフィルム（商品名）を剥離した乾燥後の重量を測定し、重量増加分からＰＬＧＡナノスフェアの総付着量を算出し、粒子中のＮＦκＢデコイ含有率（表１参照）を用いてＮＦκＢデコイの総付着量を算出した。ＮＦκＢデコイの総吸着量が目標値（０．１ｍｇ／個以上）に到達するまでバルーン部の浸漬及び真空乾燥を複数回（実施例１のナノスフェア分散液では２回、実施例２のナノスフェア分散液では３回）繰り返して、バルーン部にナノ粒子層がコーティングされた溶出試験用バルーンカテーテル検体を作製した。なお、実施例１または実施例２のＰＬＧＡナノスフェアのナノスフェアがコーティングされたものを各５検体ずつ作製した。
［バルーンカテーテルからのＮＦκＢデコイ溶出試験］
【実施例４】
【０１４６】
直径１０ｍｍ、長さ９０ｍｍの試験管を５本（Ｎｏ．１〜５）準備し、それぞれに生理食塩水（日本薬局方；ｐＨ６．４）を３ｍＬずつ入れた。実施例３で作製したバルーンカテーテル検体を、試験管１〜５の生理食塩水内に表２に示す所定時間ずつ逐次浸漬した。【０１４７】
【表２】
0005591103.tif 000003
【０１４８】
先端にメンブランフィルター（ポリテトラフルオロエチレン製；０．２μｍ）を接続したシリンジを準備し、プランジャーを抜いて試験管１内の浸漬後の液をバレル内に加え、プランジャーを押し込むことでろ過した。プランジャーを抜いてバレル内にアセトニトリル１．２ｍＬを加え、フィルターを通過した液がシリンジ先端から排出される手前までプランジャーを挿入してフィルターにアセトニトリルを浸潤させてから再びプランジャーを抜いて１０分間放置した。１０分後、再びプランジャーを挿入してシリンジ内のアセトニトリルをろ過し、新たな試験管（直径１５ｍｍ、長さ１５０ｍｍ）内に回収した。【０１４９】
次に、プランジャーを抜いてバレル内に３．３Ｍの塩化ナトリウム／水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１２、以下ＮａＣｌ／ＮａＯＨ水溶液と略す）４．８ｍＬを加え、フィルターを通過した液がシリンジ先端から排出される手前までプランジャーを挿入してフィルターにＮａＣｌ／ＮａＯＨ水溶液を浸潤させてから再びプランジャーを抜いて１０分間放置した。１０分後、再びプランジャーを挿入してシリンジ内のＮａＣｌ／ＮａＯＨ水溶液をろ過し、アセトニトリルを回収したものと同じ試験管内に回収した。その後、アセトニトリル及びＮａＣｌ／ＮａＯＨ水溶液を回収した試験管をミニシェーカーで２分間撹拌した。このとき、試験管内の液が試験管の内壁面に沿って撹拌されるようにした。なお、試験管２〜５についても同様の操作を行った。【０１５０】
撹拌後の溶液の吸光度を、紫外可視分光光度計（Ｖ−５３０（商品名）、日本分光社製）により測定波長２６０ｎｍ、走査速度１００ｎｍ／ｍｉｎ、データ取り込み間隔１ｎｍ、光路長２０ｎｍの石英セルを用いて測定し、検量線法（アセトニトリル：ＮａＣｌ／ＮａＯＨ水溶液＝１：４の混合液を溶媒としたもの）により浸漬時間毎のＮＦκＢデコイの溶出量を定量した。また、実施例３で算出したＮＦκＢデコイの総付着量に基づいて浸漬２分後におけるＮＦκＢデコイの溶出率を算出した。実施例１のＰＬＧＡナノスフェアを付着させた場合の結果を表３に、実施例２のＰＬＧＡナノスフェアを付着させた場合の結果を表４にそれぞれ示す。【０１５１】
【表３】
0005591103.tif 000004
【０１５２】
【表４】
0005591103.tif 000005
【０１５３】
表３及び表４から明らかなように、実施例１のナノスフェアを付着させたバルーンカテーテル検体では、５検体全てにおいて生理食塩水へ６０分間浸漬してもＮＦκＢデコイの溶出は認められなかった。また、実施例２のナノスフェアを付着させたバルーンカテーテル検体では、５検体中２検体において生理食塩水への浸漬直後からＮＦκＢデコイの溶出が認められたが、浸漬２分後の溶出率は３．０％及び４．４％であり、２０％以下を達成していた。また、残り３検体中１検体においても生理食塩水へ１０分間浸漬後からＮＦκＢデコイの溶出が認められたが、溶出が認められた３検体の６０分間浸漬後における溶出量はいずれも１５％以下であった。【０１５４】
この結果より、実施例１及び２のいずれのナノスフェアを付着させた場合でも、カテーテルを生体内に挿入後、直ちにＮＦκＢデコイが放出されるという問題点は解消され、バルーン部から長時間に亘ってＮＦκＢデコイを徐放できることが確認された。なお、実施例２のナノスフェアを用いた場合にＮＦκＢデコイの若干の溶出が認められた理由としては、実施例２のナノスフェアはＮＦκＢデコイ内包／表面担持型のナノスフェアであるため、ナノスフェアの表面に担持されたＮＦκＢデコイが優先的に溶出したものと推認される。【０１５５】
なお、本実施例では短期間で効果を発現させるため、生分解性高分子の溶液を含浸させる含浸工程を設けず、バルーン部に無水マレイン酸ポリマー層を介してナノ粒子を付着後、そのまま乾燥させてナノ粒子層を形成したカテーテル検体を用いて試験を行ったが、含浸工程によりナノ粒子層の上に生分解性高分子層を設けた場合についても同等以上の溶出抑制結果が期待できる。また、ここではナノ粒子内部（または表面）にＮＦκＢデコイを封入（または担持）し、生体内への溶出効果について調査したが、ＮＦκＢデコイ以外の種々の生理活性物質を封入（または担持）した場合についても同様の結果が得られるものと推認される。
［バルーン部表面の蛍光顕微鏡による観察］
【実施例５】
【０１５６】
ナノスフェアの懸濁液にＮＦκＢデコイに代えて蛍光色素ＦＩＴＣ（fluorescein  isothiocyanate）結合ＮＦκＢデコイを加える以外は実施例２と同様の方法により、表面にＦＩＴＣが結合したＮＦκＢデコイ内包型ＰＬＧＡナノスフェアを作製した。このＦＩＴＣ結合ＮＦκＢデコイ内包型ＰＬＧＡナノスフェアの１０重量％分散液を調製し、実施例３と同様の方法によりバルーンカテーテル検体を作製した。【０１５７】
得られた検体のバルーン部に、図７Ａに示すように水平方向から見てＨ字状の切り込みを入れて切開し、スライドガラスに挟み込み、浸漬前の状態として図７Ｂに示すＬ（左）、Ｃ（中央）、Ｒ（右）の３箇所を蛍光顕微鏡により観察した。また、観察後の検体を生理食塩水（日本薬局方；ｐＨ６．４）３ｍＬに１時間浸漬した後、乾燥器に入れて真空乾燥し、浸漬後の状態としてＬ、Ｃ、Ｒの３箇所を蛍光顕微鏡により観察した。さらに、この検体をアセトニトリル２ｍＬに１０分間浸漬し、ナノスフェアを強制的に脱落させた状態として左、中央、右の３箇所を蛍光顕微鏡により観察した。【０１５８】
一方、浸漬後の生理食塩水をシリンジに接続されたメンブランフィルター（ポリテトラフルオロエチレン製；０．２μｍ）でろ過し、さらにアセトニトリル１．２ｍＬをバレル内に入れてフィルター部分に注入し、１０分後にプランジャーを完全に押し込んで試験管に回収した。さらに３．３ＭのＮａＣｌ／ＮａＯＨ水溶液４．８ｍＬをバレル内に入れてフィルター部分に注入し、１０分後にプランジャーを完全に押し込んでアセトニトリルと同じ試験管に回収した。そして、メンブランフィルターを破壊してフィルター部分のみを取り出し、Ｌ、Ｃ、Ｒの３箇所を蛍光顕微鏡により観察した。【０１５９】
なお、観察用機器として、倒立型研究用顕微鏡（オリンパス社製ＩＸ７０）、倒立型落射蛍光観察装置（オリンパス社製ＩＸ−ＦＬＡ）、及びカメラ（オリンパス社製Ｃ−５０６０−ＡＤＵ）を用いた。観察条件は、倍率４０倍、励起キューブＵＭＮＩＢＡ（４７０ｎｍ〜４９０ｎｍ）、レーザー減衰フィルター９４％、シャッタースピード２秒とした。観察結果を図８〜図１１に示す。【０１６０】
図８〜図１０は浸漬前、浸漬後、ナノスフェアの強制脱落後におけるバルーン部の蛍光顕微鏡写真、図１１はメンブランフィルターの蛍光顕微鏡写真である。なお、各図においてＡは図７ＢのＬ部分、Ｂは図７ＢのＣ部分、Ｃは図７ＢのＲ部分をそれぞれ示している。図８と図１０の比較から明らかなように、浸漬前のバルーン部にはＦＩＴＣの強い蛍光（図の白色部分）が認められ、ＰＬＧＡナノスフェアが均一に付着していることが確認され、図８と図９の比較から明らかなように、ナノスフェアは生理食塩水へ１時間浸漬した後も強固に付着していることが確認された。一方、図１１から明らかなように、検体浸漬後の生理食塩水をろ過したフィルターにはＦＩＴＣの蛍光が殆ど認められず、バルーン部からナノスフェアが離脱していないことが確認された。
【実施例６】
【０１６１】
有効長２０ｍｍ、直径３ｍｍのバルーン部の表面に、直径２ｍｍ、深さ０．３ｍｍの窪み１５が３ｍｍ間隔で３９個形成されたカテーテル本体を作製した。バルーン部の構成を図１２に示す。図１２Ａはバルーン部の側面図、図１２Ｂはバルーン部のＡＡ′断面図、図１２Ｃはバルーン部のＢＢ′断面図である。このカテーテル本体を用いて、実施例５と同様の方法によりバルーンカテーテル検体を作製した。得られた検体のバルーン部に圧縮空気を導入して徐々に膨張させ、窪みの形状の変化を蛍光顕微鏡により観察した。観察用機器及び観察条件は実施例５と同様とした。観察結果を図１３に示す。【０１６２】
バルーン部に圧縮空気を導入する前、即ち大気圧（≒１ａｔｍ）と釣り合う状態では、図１３Ａに示すように窪み内にＦＩＴＣの強い蛍光が観察され、ＰＬＧＡナノスフェアが多量に担持されていることが確認された。この状態からバルーン部を１０ａｔｍまで加圧すると、図１３Ｂに示すように窪みが浅くなるとともにＦＩＴＣの蛍光が弱くなり、２０ａｔｍまで加圧した状態では、図１３Ｃに示すように窪みが消失し、バルーン部表面はフラットになった。また、ＦＩＴＣの蛍光もほとんど観察されず、窪み内からナノスフェアが押し出されたことが確認された。
［ＰＴＡバルーンカテーテルを用いた新生内膜形成抑制試験］
【実施例７】
【０１６３】
雄性ウサギの腹部大動脈を擦過することにより血管内皮を損傷させ、その直後にＮＦκＢデコイ含有ＰＬＧＡナノスフェアがバルーン部にコーティングされたＰＴＡバルーンカテーテル（以下、ＮＦκＢデコイ（＋）カテーテル）または未コーティングのＰＴＡバルーンカテーテル（以下、ＮＦκＢデコイ（−）カテーテル）を傷害部位に挿入し、バルーンを１分間拡張した（各群につきｎ＝６）。ＰＴＡバルーンカテーテル処置４週間後に大動脈を摘出し、エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ）染色標本を作製して、内膜面積（ｍｍ2）、中膜面積（ｍｍ2）を計測し、平均値（Ｍｅａｎ）、標準偏差（ＳＤ）、及び内膜／中膜の面積比（Ｉ／Ｍ）を算出した。結果を表５及び図１７Ａ〜図１７Ｃに示す。また、血管内皮を損傷させなかったウサギ、ＮＦκＢデコイ（−）カテーテル群のウサギ、及びＮＦκＢデコイ（＋）カテーテル群のウサギの、腹部大動脈の断面を示す顕微鏡写真をそれぞれ図１４〜図１６に示す。【０１６４】
【表５】
0005591103.tif 000006
【０１６５】
図１４〜図１６から明らかなように、血管内皮を損傷させなかったウサギの腹部大動脈（図１４）に比べ、ＮＦκＢデコイ（−）カテーテル群のウサギの腹部大動脈（図１５）は内膜面積が大幅に増加したのに対し、ＮＦκＢデコイ（＋）カテーテル群のウサギの腹部大動脈（図１６）は内膜面積の増加が少なかった。また、表５及び図１７Ａ〜図１７Ｃから明らかなように、ＮＦκＢデコイ（＋）カテーテル群では、ＮＦκＢデコイ（−）カテーテル群と比較して腹部大動脈の内膜面積及び内膜／中膜面積比の有意な低下がみられ、内膜傷害後の新生内膜形成の有意な抑制が認められた。
【実施例８】
【０１６６】
雄性ウサギの頚動脈を擦過することにより血管内皮を損傷させ、４週間後にＮＦκＢデコイ（＋）カテーテルまたはＮＦκＢデコイ（−）カテーテルを狭窄部位に挿入し、バルーンを１分間拡張した。また、対照区としてＰＴＡバルーンカテーテルを挿入しないコントロール群を設けた（各群につきｎ＝９）。ＰＴＡバルーンカテーテル処置４週間後に頚動脈を摘出し、エラスチカ・ワンギーソン（ＥＶＧ）染色標本を作製して、内膜面積（ｍｍ2）、中膜面積（ｍｍ2）を計測し、平均値（Ｍｅａｎ）、標準偏差（ＳＤ）、及び内膜／中膜の面積比（Ｉ／Ｍ）を算出した。結果を表６及び図１８Ａ〜図１８Ｃに示す。【０１６７】
【表６】
0005591103.tif 000007
【０１６８】
表６及び図１８Ａ〜図１８Ｃから明らかなように、ＮＦκＢデコイ（＋）カテーテル群では、ＮＦκＢデコイ（−）カテーテル群及びコントロール群と比較して頚動脈の内膜面積及び内膜／中膜面積比の有意な低下がみられ、内膜傷害後の新生内膜形成の有意な抑制が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明の薬剤溶出型カテーテルは、カチオン性高分子により表面が正電荷修飾された生体適合性ナノ粒子がポリカルボン酸若しくはポリカルボン酸誘導体により負電荷修飾された拡張可能部分にコーティングされているので、生体内で溶出されるナノ粒子の細胞接着性が高まり、細胞内への移行性も向上する。また、カチオン性高分子としてキトサンを用い、さらに、生体適合性高分子としてポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ、若しくはＰＡＬのいずれかを用いることにより、安全性が高く、安定性、徐放性にも優れた薬剤溶出型カテーテルを提供することができる。【０１７０】
また、ナノ粒子内部に核酸化合物を封入することにより、病変部に安全且つ効率的に核酸化合物を導入して遺伝子レベルで治療するための薬剤溶出型カテーテルとなる。核酸化合物としてプラスミドＤＮＡ、遺伝子、デコイ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー等を用いた場合、特に好適な遺伝子治療用ツールとなる。核酸化合物の中でも、ＮＦκＢに結合して炎症を引き起こすサイトカイン等の生成を抑制するＮＦκＢデコイを封入することで、ＰＴＡ施行時の急性期炎症反応を抑制して再狭窄を効果的に防止できる。【０１７１】
また、本発明の薬剤溶出型カテーテルは、血管内カテーテルとして特に優れた効果を発揮する。血管内カテーテルとしては、拡張可能部分としてバルーンを有するバルーンカテーテルが好適に用いられる。このとき、バルーン表面に円形若しくは楕円形の微細な窪みを形成しておけば、バルーンの膨張によってナノ粒子を能動的に放出可能な薬剤溶出型カテーテルとなる。【０１７２】
また、本発明の薬剤溶出型カテーテルの製造方法によれば、表面が正電荷修飾されたナノ粒子を負電荷修飾されたカテーテルの拡張可能部分に付着させることにより、樹脂製の拡張可能部分に付着させることが困難であった脂溶性及び水溶性の生理活性物質を効率良く付着させたカテーテルを簡便且つ低コストで製造することができる。さらに、ナノ粒子の付着を複数回繰り返すことで、所望の層厚のナノ粒子層を均一に且つ効率良く形成することができる。【０１７３】
また、ナノ粒子層に生分解性高分子を含浸して乾燥させることにより、ナノ粒子層が不溶性の皮膜となるのを防止するとともに、生分解性高分子の分解に伴い拡張可能部分からナノ粒子が徐放されるため、取り扱いが容易で生理活性物質の放出速度も制御できる薬剤溶出型カテーテルの簡便且つ安価な製造方法となる。【０１７４】
また、異なる生理活性物質が封入されたナノ粒子層を層状又はモザイク状に形成したり、ナノ粒子層に含浸される生分解性高分子層に生理活性物質を封入したり、或いは要求されるナノ粒子の放出速度に応じて生分解性高分子の種類を選択することにより、生理活性物質の計画的な放出が可能な薬剤溶出型カテーテルを製造できる。
【図１】
0005591103.tif 000008
【図２】
0005591103.tif 000009
【図３】
0005591103.tif 000010
【図４】
0005591103.tif 000011
【図５】
0005591103.tif 000012
【図６Ａ】
0005591103.tif 000013
【図６Ｂ】
0005591103.tif 000014
【図７Ａ】
0005591103.tif 000015
【図７Ｂ】
0005591103.tif 000016
【図１７Ａ】
0005591103.tif 000017
【図１７Ｂ】
0005591103.tif 000018
【図１７Ｃ】
0005591103.tif 000019
【図１８Ａ】
0005591103.tif 000020
【図１８Ｂ】
0005591103.tif 000021
【図１８Ｃ】
0005591103.tif 000022
【図１９】
0005591103.tif 000023
【図８Ａ】
0005591103.tif 000024
【図８Ｂ】
0005591103.tif 000025
【図８Ｃ】
0005591103.tif 000026
【図９Ａ】
0005591103.tif 000027
【図９Ｂ】
0005591103.tif 000028
【図９Ｃ】
0005591103.tif 000029
【図１０Ａ】
0005591103.tif 000030
【図１０Ｂ】
0005591103.tif 000031
【図１０Ｃ】
0005591103.tif 000032
【図１１Ａ】
0005591103.tif 000033
【図１１Ｂ】
0005591103.tif 000034
【図１１Ｃ】
0005591103.tif 000035
【図１２Ａ】
0005591103.tif 000036
【図１２Ｂ】
0005591103.tif 000037
【図１２Ｃ】
0005591103.tif 000038
【図１３Ａ】
0005591103.tif 000039
【図１３Ｂ】
0005591103.tif 000040
【図１３Ｃ】
0005591103.tif 000041
【図１４】
0005591103.tif 000042
【図１５】
0005591103.tif 000043
【図１６】
0005591103.tif 000044
【配列表】
0005591103000001.app