(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド、ウエストナイルウイルス由来のｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする塩基配列からなる核酸であって、該核酸の５’末端に翻訳開始コドンが導入された核酸を含む、ウエストナイルウイルス様粒子発現ベクター。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０〜２５で示されるアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１１〜２５で示されるアミノ酸配列
【請求項２】
請求項１記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項３】
請求項２記載の形質転換体を培養し、培地に分泌されたウイルス様粒子を回収することを特徴とする、ウエストナイルウイルス様粒子の製造方法。
【請求項４】
請求項１記載のベクターを有効成分として含有する、ウエストナイルウイルスのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウエストナイルウイルスのウイルス様粒子の高分泌発現を可能にする人工的シグナルペプチド、該シグナルペプチドを含むウエストナイルウイルス由来蛋白質をコードする核酸を含む組換え発現ベクター、該ベクターが導入された形質転換体、該形質転換体を用いたウエストナイルウイルスのウイルス様粒子の製造方法、該方法により得られるウイルス様粒子を含むウエストナイルウイルスワクチン等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウエストナイル熱（西ナイル熱）は、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）感染による全身性の急性発熱疾患であるが、時にウイルスが中枢神経系に侵入・増殖して致死的な脳髄膜炎を引き起こす。ＷＮＶの分布は、アフリカ、中東、ヨーロッパの一部、ロシア、インド、およびインドネシアなど広範に亘るが、このウイルスは、ベクターとしてのイエカ(Culex species)と増幅動物としての鳥類(野生及び飼育)との間の感染環によって維持・伝播されている。その過程において、ヒト、ウマおよび家畜が偶成宿主となる。
１９９９年の夏、ＷＮＶは米国のニューヨークに侵入・土着してその後も、継続的に拡大しており、昨年度（２００７年）も９月末時点において、２３００人を超える感染者が米国全土で確認され、公衆衛生上の重大な問題となっている。現在までに、ヒト用のＷＮＶワクチンは世界中に存在していない。【０００３】
このような状況の下、日本を含むアジア諸国への伝播も危惧されており、一日も早いヒト用ワクチンの実用化が望まれている。現在、培養Vero細胞由来ウイルスの不活化ワクチンが緊急に開発されつつあるものの、製造工程においてバイオセイフティーレベル３のウイルスを使用しない、製造上安全で安価なサブユニットワクチン開発への社会的ニーズが高まっている。【０００４】
ＷＮＶは、１９３７年にアフリカのウガンダ、ウエストナイル地方において最初に分離された、フラビウイルス科フラビウイルス属に分類されるウイルスである（非特許文献１）。ウイルス粒子の構造として、一本の（+）鎖ＲＮＡのウイルス遺伝子にカプシド蛋白質（Ｃ蛋白質）が結合した球状の構造物をさらに脂質の二重膜が包む構造をしており、この脂質膜にはエンベロープ蛋白質（Ｅ蛋白質）およびメンブレン蛋白質（Ｍ蛋白質）の二種類の蛋白質が含まれる。Ｍ蛋白質は前駆体であるｐｒＭ蛋白質として産生された後、フリンと呼ばれるプロテアーゼで切断されて、成熟蛋白質となる。【０００５】
本発明者らは以前、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）のｐｒＭ蛋白質とＥ蛋白質とをコードするｃＤＮＡ断片を含む発現ベクターを動物細胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養して、培地中に分泌されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）を回収することによる、ＪＥＶのＶＬＰの製造方法を報告した（特許文献１）。しかしながら、ＷＮＶのサブユニットワクチン製造に関する報告はこれまでになされていない。
【特許文献１】特開２００４−６５１１８公報
【非特許文献１】Agrawal,A.G., L.R.Petersen, J. Infect. Dis., 188:1-4 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、安全かつ安価なＷＮＶワクチン成分として有用なＷＮＶのＶＬＰの高分泌生産方法を提供し、以ってＷＮＶワクチンの開発・安定供給を可能ならしめることである。また、本発明の別の目的は、前記ＶＬＰを動物体内で産生し得るＷＮＶのＤＮＡワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＷＮＶのｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードするＤＮＡ断片を含む発現ベクターを動物細胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養することにより、その培地中にＶＬＰを効率よく分泌させることに成功した。さらに、本発明者らは、ｐｒＭ蛋白質の上流に位置するシグナルペプチドを改変することにより、意外にも、ＷＮＶのネイティブな完全長シグナル配列と比較してＶＬＰの形成・分泌効率を顕著に向上させ得ることを見出した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明は、
[１]以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなるシグナルペプチド
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１１〜２５で示されるアミノ酸配列を含む配列;
[２] 上記[１]のシグナルペプチドをコードする塩基配列から実質的になる、単離された核酸;
[３] 上記[１]記載のシグナルペプチド、ウエストナイルウイルス由来のｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする塩基配列からなる核酸を含む、ウエストナイルウイルス様粒子発現ベクター;
[４] 上記[３]記載のベクターで形質転換された形質転換体;
[５] 上記[４]記載の形質転換体を培養し、培地に分泌されたウイルス様粒子を回収することを特徴とする、ウエストナイルウイルス様粒子の製造方法;
[６] 上記[５]記載の方法により得られるウエストナイルウイルス様粒子;
[７] 上記[６]記載のウイルス様粒子を有効成分として含有する、ウエストナイルウイルスのワクチン;
[８] 上記[３]記載のベクターを有効成分として含有する、ウエストナイルウイルスのワクチン
等を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のシグナルペプチドをＷＮＶのｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質からなるポリプロテインに連結することにより、宿主細胞におけるＶＬＰの形成および細胞外への分泌効率を向上させることができる。したがって、該シグナルペプチド、ｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする核酸を含む分泌発現ベクターはＷＮＶのＶＬＰ高分泌生産細胞株の作製に有用であるほか、それ自体をＷＮＶのＤＮＡワクチンとして用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】組換え発現ベクター（pWPME1〜pWPME14）によってコードされるポリペプチドの図である。
【図２】組換え発現ベクター（pWPME1〜pWPME14）を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現・分泌したＷＮＶ  Ｅ蛋白質のウエスタンブロットの結果を示す図である。左図は細胞を可溶化して得られた蛋白質、右図は培養液中に分泌された蛋白質のウエスタンブロットの結果である。左図および右図（上）には抗日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）抗体、左図および右図（下）には抗Ｍ蛋白質ポリクローナル抗体を一次抗体として用いた。図中、Ｅ、ｐｒＭ、ＭはそれぞれＥ蛋白質、ｐｒＭ蛋白質、Ｍ蛋白質の位置を示す。
【図３】組換え発現ベクター（pWPME1〜pWPME14）を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から培養液中に分泌されたＥ蛋白質をサンドイッチELISA法により、定量比較した結果を示す図である。一次抗体として、４０２モノクローナル抗体を用いている。
【図４】組換え発現ベクター（pWPME1、7、9、12、pWPME388A、pWPME406A）を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現したＷＮＶ  Ｅ蛋白質のウエスタンブロットの結果を示す図である。一次抗体として抗日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）抗体を用いた。図中、Ｅ、ｐｒＭはそれぞれＥ蛋白質、ｐｒＭ蛋白質の位置を示す。
【図５】組換え発現ベクター（pWPME1、7、9、12、pWPME388A、pWPME406A）を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から培養液中に分泌されたＥ蛋白質をサンドイッチELISA法により、定量比較した結果を示す図である。一次抗体として、４０２モノクローナル抗体を用いている。
【図６】組換え発現ベクター（pWPME12）を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から培養液中に分泌された蛋白質をショ糖密度勾配遠心分離し、各試料画分中のＥ蛋白質量をサンドイッチELISA法により、定量した結果を示す図である。
【図７】組換え発現ベクター（pWPME12）を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から培養液中に分泌されたＷＮＶ様粒子の電子顕微鏡像を示す図である。左図は密度１．１６の試料画分に含まれるウイルス様粒子像、右図は密度１．１１の試料画分に含まれるウイルス様粒子像を示す。
【図８】組換え発現ベクター（pWPME12）を導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から培養液中に分泌された蛋白質をショ糖密度勾配遠心分離し、各試料画分中のＥ蛋白質量をサンドイッチELISA法により、定量した結果を示す図である。Ａは、捕獲用抗体としてＷＮＹ-１１、検出用抗体としてＷＮＹ-１１を用いた場合の結果である。Ｂは、捕獲用抗体としてＷＮＹ-１１抗体、検出用抗体として４０２抗体を用いた場合の結果である。Ｃは、捕獲用抗体として４０２抗体、検出用抗体として４０２抗体を用いた場合の結果である。Ｄは、捕獲用抗体として４０２抗体、検出用抗体としてＷＮＹ-１１抗体を用いた場合の結果である。Ｅは、各試料画分の密度を表している。
【図９】ＷＮＶ様粒子で免疫されたマウスの血清を用いて、ＷＮＶに対するプラーク減少アッセイを行った結果を示した図である。血清は希釈したものを用い、プラーク数は３ウェルの合計を示す。
【図１０】親株であるCHO-K1及び無血清培地に馴化させた各クローンを培養して、培養液中に分泌された蛋白質をショ糖密度勾配遠心分離し、ウエスタンブロットによりＷＮＶ様粒子の発現量を比較した図である。一次抗体として抗日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）抗体を用いた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明はＷＮＶのＶＬＰ高分泌生産のためのシグナルペプチドを提供する。該シグナルペプチドは、
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列であって、少なくともアミノ酸番号１１〜２５で示されるアミノ酸配列を含む配列；あるいは
（ｃ）上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列からなる。【００１２】
ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、上記（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列において、１〜数（２、３、４もしくは５）個のアミノ酸が置換、欠失、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列であって、ＷＮＶのネイティブなシグナル配列と比較して、有意に高いＷＮＶのＶＬＰの分泌能力を有するアミノ酸配列を意味する。【００１３】
「実質的に同一のアミノ酸配列」がアミノ酸の置換を含む場合、もとのアミノ酸と物理化学的性質において類似したアミノ酸であることが望ましい。例えば、芳香族アミノ酸（Phe、Trp、Tyr）、脂肪族アミノ酸（Ala、Leu、Ile、Val）、極性アミノ酸（Gln、Asn）、塩基性アミノ酸（Lys、Arg、His）、酸性アミノ酸（Glu、Asp）、水酸基を有するアミノ酸（Ser、Thr）、側鎖の小さいアミノ酸（Gly、Ala、Ser、Thr、Met）などの同じグループに分類されるアミノ酸同士の置換が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowieら，Science, 247：1306-1310 (1990)を参照）。アミノ酸（配列）が置換、欠失または挿入されている場合、その置換、欠失または挿入の位置は、もとのシグナルペプチドにおけるＷＮＶのＶＬＰ分泌能力が実質的に保持される限り、特に限定されない。「実質的に保持される」とは、少なくともＷＮＶのネイティブなシグナル配列と比較して、有意に高い分泌能力を保持していることを意味する。【００１４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ウエストナイルウイルスNY99-flamingo382-99株（Lanciotti, R.S.ら, Science, 286: 2333-2337, 1999）(GenBank Accession No. AF196835)のポリプロテイン前駆体（GenBank Accession No. AAF20092.2）の９９位〜１２３位（即ち、ｐｒＭ蛋白質のＮ末の直前のアミノ酸から上流２５アミノ酸残基まで）のアミノ酸配列に相当する。ＷＮＶにはこれまで多くのバリアントが報告されており、今後も新たな変異ウイルス株が続々と見出されるだろう。したがって、そのような他の変異ＷＮＶ株における、NY99-flamingo382-99株の上記特定配列に対応するアミノ酸配列もまた、本発明のシグナルペプチドにおける「実質的に同一のアミノ酸配列」に包含される。NY99-flamingo382-99株以外の変異ＷＮＶ株としては、例えば、Ebel, G.D.ら, Am. J. Trop. Med. Hyg., 71(4): 493-500, 2004の「Table I」に記載のもの等が挙げられ、該表中に示される各Accession No.の配列を入手して、対応する領域を決定することにより、容易に上記「実質的に同一のアミノ酸配列」を取得することができる。【００１５】
本発明のシグナルペプチドのアミノ酸配列長は、最短で１５アミノ酸、最長で２５アミノ酸であることが望ましい。また、２０アミノ酸以外の長さであることが好ましい。より好ましくは、該シグナルペプチドのアミノ酸配列長は、１５〜１９または２１〜２５アミノ酸であり、さらに好ましくは１５〜１８アミノ酸である。
したがって、「実質的に同一のアミノ酸配列」がアミノ酸の欠失、付加もしくは挿入を含む場合、その数は、改変後に上記の好ましい全長を与える範囲内であることが望ましい。尚、アミノ酸を付加もしくは挿入する場合、付加もしくは挿入後の全長が上記の好ましい範囲となる限り、付加もしくは挿入されるアミノ酸の種類に特に制限はない。【００１６】
本発明のシグナルペプチドは、そのアミノ酸配列情報に基づいて、公知のペプチド合成法、例えば、固相合成法や液相合成法によって製造することもできるが、ＷＮＶのＶＬＰを宿主細胞から効率よく分泌させるという該ペプチドの用途に鑑みれば、該ペプチドは、それをコードする塩基配列からなる核酸を、目的のＶＬＰを構成するｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする核酸に機能的に連結した、ポリプロテイン前駆体をコードする核酸を含む発現ベクターを導入した形質転換体を培養して、該前駆体を生成せしめることにより、該前駆体のＮ末端部分として提供される。
したがって、本発明はまた、上記本発明のシグナルペプチドをコードする塩基配列から実質的になる、単離された核酸を提供する。ここで「から実質的になる」とは、該核酸がＷＮＶのｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする核酸に機能的に連結、さらに適当な発現ベクター中に挿入されて、適当な宿主細胞に導入された際に、生成するポリプロテイン前駆体のｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質以外のＮ末端部分に、本発明のシグナルペプチドのアミノ酸配列以外のアミノ酸（但し、開始メチオニン残基を除く）が含まれないことを意味する。したがって、本発明のシグナルペプチドをコードする塩基配列以外に、該核酸に含まれ得る配列としては、例えば、開始ＡＴＧコドンや、該核酸を発現ベクターのプロモーター配列の下流、あるいはＷＮＶのｐｒＭ蛋白質をコードする核酸の上流に連結することを容易ならしめるための制限酵素認識配列などが挙げられる。
該核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖DNA、二本鎖RNAまたはDNA:RNAのハイブリッドでもよい。【００１７】
上記本発明のシグナルペプチドをコードする塩基配列としては、翻訳された結果、上記本発明のシグナルペプチドのいずれかのアミノ酸配列を生じるものであれば特に制限はないが、目的とするシグナルペプチドがいずれかの入手可能なＷＮＶ株のポリプロテイン前駆体配列の一部と完全同一の場合には、該ウイルス株のゲノムＲＮＡから調製されるｃＤＮＡを鋳型として、該アミノ酸配列をコードする塩基配列部分を、ＰＣＲ法などにより取得することができる。かかる方法は、シグナルペプチドだけでなく、ＷＮＶのｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする塩基配列を一括して取得できる点で有利である。プライマー配列の選択によって、アミノ酸配列長の異なるシグナルペプチドをコードする核酸を容易に調製することができる。【００１８】
一方、宿主細胞での発現効率を考慮すれば、用いる宿主細胞で使用頻度の高いコドンを選択することが一般的には好ましい。種々の生物種におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）から入手することができる。宿主細胞のコドン使用頻度に合わせた塩基配列の変換は、シグナルペプチドをコードする核酸の全配列をＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機を用いて化学合成するか、あるいは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより実施することができる。【００１９】
本発明はまた、上記本発明のシグナルペプチド、ＷＮＶ由来のｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする塩基配列からなる核酸を含む、ＷＮＶのＶＬＰ発現ベクターを提供する。
ここで「ＷＮＶのｐｒＭ蛋白質をコードする塩基配列」とは、配列番号３に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列を意味し、「ＷＮＶのＥ蛋白質をコードする塩基配列」とは、配列番号５に示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする塩基配列を意味する。【００２０】
「配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列」としては、配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列と約80％以上、好ましくは約90％以上、さらに好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、本発明のシグナルペプチドについて前記したと同様の分類において、もとのアミノ酸と同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。【００２１】
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム（version 2.0）に組み込まれている（Altschulら, Nucleic Acids Res., 25： 3389-3402 (1997)）］、Needlemanら, J. Mol. Biol., 48： 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、MyersおよびMiller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（version 2.0）に組み込まれている］、Pearsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。【００２２】
より好ましくは、配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とは、配列番号３（または配列番号５）で表されるアミノ酸配列と約80％以上、好ましくは約90％以上、さらに好ましくは約95％以上、特に好ましくは約97％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。【００２３】
「配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」とは、前記の配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号３（または配列番号５）で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質を意味する。
「実質的に同質の活性」とは、ｐｒＭ蛋白質については、Ｍ蛋白質として成熟した際にＥ蛋白質のコンフォーメーション変化を引き起こす活性などが挙げられ、Ｅ蛋白質については、感染宿主細胞への吸着および赤血球凝集活性などが挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に同じであることを意味する。したがって、上記の各活性は同等（例えば、約0.5〜約2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。【００２４】
また、本発明で用いられるｐｒＭ蛋白質（Ｅ蛋白質）には、例えば、(1)配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列のうち1または2個以上（好ましくは1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、いっそう好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2) 配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列に1または2個以上（好ましくは1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、いっそう好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(3) 配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列に1または2個以上（好ましくは1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、いっそう好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4) 配列番号３（または配列番号５）に示されるアミノ酸配列のうち1または2個以上（好ましくは1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、いっそう好ましくは1〜数（2、3、4もしくは5）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置は、蛋白質の活性が保持される限り特に限定されない。【００２５】
ＷＮＶのｐｒＭ蛋白質（またはＥ蛋白質）をコードするＤＮＡは、ＷＮＶのウイルスストックより調製したＲＮＡを鋳型として用い、Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction（以下、「RT-PCR法」と略称する）によって直接増幅することができる。ｐｒＭ蛋白質とＥ蛋白質はＷＮＶゲノム中に連続してコードされており、両者のコード領域をカバーする塩基配列を増幅し得るプライマーを設計することにより、ｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードするＤＮＡを一括調製することができる。さらに、該ＷＮＶゲノム中の配列を本発明のシグナルペプチドをコードする塩基配列として利用する場合、該シグナルペプチドコード領域はｐｒＭ蛋白質のコード領域の直前に位置するので、三者を一括調製することも可能である。【００２６】
ｐｒＭ蛋白質（またはＥ蛋白質）をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号２（または配列番号４）に示される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号２（または配列番号４）に示される塩基配列の相補鎖配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記したｐｒＭ蛋白質（またはＥ蛋白質）と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号２（または配列番号４）に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号２（または配列番号４）に示される塩基配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、特に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。【００２７】
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。【００２８】
ｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードするＤＮＡは、上記のようにＷＮＶゲノムより取得することができるが、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、ｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質の全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、上述の通り、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。【００２９】
上記のようにしてクローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、ｐｒＭ蛋白質をコードするＤＮＡ、Ｅ蛋白質をコードするＤＮＡを、別個にクローン化した場合には、適当な制限酵素、リンカー、リガーゼ等を用いて、それらを上記の順序で連結する。【００３０】
次いで、得られた「シグナルペプチド−ｐｒＭ蛋白質−Ｅ蛋白質」ポリプロテイン前駆体をコードするＤＮＡは、必要に応じて、その5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGをそれぞれ導入し、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結される。翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することができる。あるいは、予めＰＣＲを利用してシグナルペプチドをコードする塩基配列の5’側、およびＥ蛋白質をコードする塩基配列の3’側に、それぞれ導入しておいてもよい。【００３１】
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pCAGGS 、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、CAGプロモーター、β-アクチンプロモーター、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CAGプロモーターが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。【００３２】
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製起点（以下、SV40 oriと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと略称する場合がある、メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、amprと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、neorと略称する場合がある、G418耐性）等が挙げられる。特に、dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によって目的遺伝子を選択することもできる。【００３３】
本発明のシグナルペプチド、ｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、ＷＮＶのＶＬＰを製造することができる。
宿主としては、例えば、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、動物などの分泌発現に適したものが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114，バチルス・サブチルス207-21などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913，NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。【００３４】
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる。【００３５】
動物細胞としては、例えば、COS-7、Vero、CHO、CHO(dhfr-)、CHO-K1、L、AtT-20、GH3、FL、HEK293、NIH3T3、Balb3T3、FM3A、L929、SP2/0、P3U1、B16、P388などの細胞が用いられる。好ましくは、HEK293またはCHO-K1などが用いられるが、それらに限定されない。
動物としては、トランスジェニック系の確立した哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ）もしくはニワトリなどが挙げられる。【００３６】
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168巻，111 (1979)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology，194巻，182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75巻，1929 (1978)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology, 6巻，47-55 (1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、Virology，52巻，456 (1973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
動物は、例えば、トランスジェニック動物の開発（シーエムシー出版）, (2001) に記載の方法に従って形質転換することができる。【００３７】
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。形質転換体の培養は、通常約30〜約40℃で、約6〜約24時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20〜約35℃で、約24〜約72時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Mediumに非働化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で、約3〜約5日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM），ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM），RPMI 1640培地，199培地などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30〜約40℃で、約15〜約60時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物である場合、遺伝子導入した受精卵から、常法に従ってトランスジェニック動物を得、通常の飼育条件下で飼育、哺乳動物の乳やニワトリの卵を採取すればよい。
以上のようにして、形質転換体の培地もしくは細胞外にＷＮＶのＶＬＰを分泌生産せしめることができる。【００３８】
また、本発明においては、上記の如く胎児ウシ血清を含む培地で形質転換体を培養してもよいが、胎児ウシ血清に混入して細胞汚染の原因となるウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）等のリスク因子の排除、ＷＮＶのＶＬＰ精製工程の簡略化を目的とするウシ由来タンパク質等の不純物の排除、及び経済性の観点から、形質転換体を無血清に馴化させて培養する方法も好ましく用いられる。また、後述する実施例にも記載されるように、無血清培地に馴化させることにより、付着性細胞から浮遊細胞化することも、形質転換体の維持・継代および大量培養が容易となるという点で好ましい。【００３９】
培地中（細胞外）に分泌されたＶＬＰの精製については、自体公知の方法に従って行うことができる。例えば、回収した培地（細胞外液）をフィルター処理して低分子量蛋白質を除去した後、ショ糖密度勾配遠心分離することによってＶＬＰを調製することができる。【００４０】
本発明のＷＮＶのワクチンは、ＷＮＶのＶＬＰを有効成分として免疫を奏する量含有する。具体的には、ＷＮＶのワクチンは、例えば以下のようにして製造することができるが、これに限定されない。
抗原として精製した本発明のＶＬＰを、等張の塩類溶液、緩衝液、組織培養液などの溶媒、例えばＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）に浮遊し、ワクチン原液を調製する。必要であれば、ワクチン抗原を常用の固定化剤で固定することにより、その立体構造を固定化することもできる。固定化剤としては、例えば、ホルマリン、フェノール、グルタルジアルデヒド、β‐プロピオラクトン等があげられる。固定化剤は、ワクチン原液を調製する前に抗原に添加するか、またはワクチン原液に添加することができる。【００４１】
次に、ワクチン原液を希釈して、ワクチン溶液を調製する。ワクチン原液は、例えば、ＰＢＳを用いて、ワクチン中の抗原量が、抗体産生を誘導して免疫を奏するのに必要な量、例えば蛋白質含量で１〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌとなるように希釈する。ワクチン溶液を調製する際に、ワクチンの耐熱性を増強する安定化剤や、免疫原性を高める補助剤としてのアジュバントを添加混合してもよい。安定化剤としては、糖類やアミノ酸類が挙げられ、アジュバントとしては、鉱物油、植物油、ミョウバン、アルミニウム化合物、ベントナイト、シリカ、ムラミルジペプチド誘導体、サイモシン、インターロイキン等が挙げられる。【００４２】
ワクチン溶液を適当な容量の容器、例えば約０．５〜２０ｍｌ容のバイアルに分注し、密栓・密封した後に、ワクチンとして使用に供する。かかるワクチンは、液状のみならず、分注後に凍結乾燥を行うことにより、乾燥製剤として使用に供することもできる。【００４３】
本発明のワクチンは、通常のワクチンと同様に被接種者に接種すればよい。例えば、１ドーズ約０．２〜０．５ｍｌのワクチンを、約１〜４週間隔で１〜３回皮下接種すればよい。尚、乾燥製剤は接種前に滅菌蒸留水などで溶解してもとの体積に戻して使用する。【００４４】
上記した本発明のシグナルペプチド、ＷＮＶのｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質をコードする塩基配列からなる核酸を含む発現ベクター（非ウイルスベクターおよびウイルスベクター）は、それ自体をヒトに投与することにより、該ヒト体内で効率よくＷＮＶのＶＬＰを分泌させ得るので、いわゆるＤＮＡワクチンとして用いることができる。
これらの非ウイルスベクターおよびウイルスベクターの好ましい調製法、投与法などは当業者に公知であり、例えば、別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、1997；日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、1999などが参考とされる。ＤＮＡワクチンに適した非ウイルスベクターとしては、例えばpcDNA3.1、pZeoSV、pBK-CMV（Invitrogen社、Stratagene社）やpCAGGS（Gene 108,193-200(1991)）などが挙げられるが、それらに限定されない。ウイルスベクターとしては、組換えアデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターが代表的なものである。具体的には、例えば、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを挙げることができる。【００４５】
本発明のＤＮＡワクチンをヒトへ導入する方法としては、ＤＮＡワクチンを直接体内に導入するin vivo法やヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡワクチンを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すex vivo法などがある（日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。in vivo法としては、例えば本発明のＤＮＡワクチンを適当な溶剤（ＰＢＳ等の緩衝液、生理食塩水、滅菌水等）に溶解した後、必要に応じてフィルター等で濾過滅菌し、次いで無菌的な容器に充填して注射剤を調製して、ヒトへ注射することにより投与される。注射剤には必要に応じて慣用の担体等を加えてもよい。また、脂質二重膜で作られたリポソーム中にＤＮＡワクチンを封入し、さらにこのリポソームと不活化したセンダイウイルス（Hemagglutinating virus of Japan : HVJ）とを融合させたHVJ−リポソームとして投与することもできる（実験医学別冊、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、1994)。本発明のＤＮＡワクチンは、筋肉、皮膚、鼻腔内等に投与することができる。ex vivo法としては、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、DEAE−デキストラン法、微小ガラス管などを用いて細胞内へDNAワクチンを直接注入する方法などが挙げられる。【００４６】
本発明のＤＮＡワクチンの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、通常成人１人当たり遺伝子として約500μｇから約50ｍｇの範囲、好ましくは約500μｇから約1ｍｇの範囲である。【００４７】
以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４８】
実施例１  ＷＮＶ由来変異シグナルペプチド配列、ｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質を発現する組換え発現ベクターの作製
ＷＮＶ（ＷＮ−ＮＹ９９）からポリアデニル化ＲＮＡを抽出し、それを鋳型として１５ヌクレオチドポリ（ｄＴ）プライマーを用いて、SuperScript RNase H‐ reverse transcriptase (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)で逆転写反応を行った。得られたＷＮＶｃＤＮＡのコード領域を、相補的なプライマーセット（配列番号６及び配列番号７に示される塩基配列）を用いてＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにサブクローニングした。得られたプラスミドを鋳型として、アミノ末端側から一アミノ酸ずつ欠失させたシグナル配列をコードするような塩基配列に相補的なプライマーセット（配列番号８〜２１からなる群から選択される１つの塩基配列及び配列番号２２に示される塩基配列）を用いて、ＰＣＲでＤＮＡ断片を増幅した。増幅断片を哺乳類発現ベクター(pCAGGS)にサブクローニングして、特定の長さのシグナル配列、ｐｒＭ蛋白質およびＥ蛋白質を発現するような１４種類の組換え発現ベクターを得た（pWPME1〜pWPME14）。得られたＰＣＲ産物にコードされるポリペプチドの構造を図１に示す。【００４９】
実施例２  分泌に適した範囲の長さのシグナルペプチド配列の検討
実施例１で得られた各種組換え発現ベクター(0.5μg)をFugene 6(Roche Diagnostic, Basel, Switzerland)を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞(2×105)に導入した。４８時間後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、50mM Tris-HCl(pH6.8), 100mM ditiothreitol, 2% sodium dodecyl sulfate(SDS), 0.1% bromophenol blue, 10% glycerolを含む可溶化液を用いて可溶化した。一方、培養液上清を濾過し（0.45μｍポアサイズ、Millipore, Bedford, MA）、40,000×gで３０分間超遠心処理した後、残渣を前記可溶化液で可溶化した。【００５０】
上記により得られたＷＮＶ様粒子を定法に従って、SDS-PAGEし、膜転写し、抗体を用いてウエスタンブロットした。具体的には、蛋白質を10%PAGEにより分離し、polyvinyl difluoride(PDVF)メンブレンフィルター(Millipore)に分離した蛋白質を転写した。一次抗体としてＷＮＶと交叉する抗日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）抗体および抗Ｍ蛋白質ポリクローナル抗体（IMGENEX, San Diego, CA）を、二次抗体として西洋わさびペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗ウサギＩｇＧ（Pierce, Rockford, IL）を用いた。発光にはＥＣＬ試薬（Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて、LAS1000イメージングシステム（Fujifilm, Tokyo, Japan）で発光を検出した。各種組換え発現ベクター間のＷＮＶ様粒子の発現を図２に示す。【００５１】
また、Kojima,A., A.Yasuda, H.Asanuma, T.Ishikawa, K.Yasui, T.Kurata. J.Viorl 77:8745-55 (2003)に記載の方法に従って、Ｅ蛋白質抗原に対するモノクローナル抗体（402）を用いたサンドイッチELISA法により、上記各組換え発現ベクター間の培養液中に分泌されたＥ蛋白質抗原を比較した。
具体的には、402抗体でコートしたマイクロプレート（Corning Incorporated Life Sciences, Acton, MA）を用いて、Ｅ蛋白質抗原を結合させた。結合させたＥ蛋白質抗原を、基質として西洋わさびペルオキシダーゼをコンジュゲートした402抗体（TMB; DAKO Corp., Carpinteria, CA）を用いて検出した。各種組換え発現ベクター間のＷＮＶ様粒子の分泌量の比較を図３に示す。【００５２】
また、組換え発現ベクターpWPME1およびpWPME7において、開始アミノ酸の直後にアラニンが追加されるような組換え発現ベクターを作製し（pWPME388A、pWPME406A）、上記の方法により各組換え発現ベクター間の発現程度の比較を行った。結果を図４、５に示す。これらの結果から、シグナル配列の長さがＷＮＶ様粒子の発現・分泌に大きな影響を与えていることが分かった。【００５３】
実施例３  電子顕微鏡によるＷＮＶ様粒子観察像
実施例１で得られた組換え発現ベクターpWPME12をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、４８時間後に培地を回収した。回収した培地をフィルター処理（0.45μm, Millipore）し、精製（Biomax-100 メンブレンフィルター, Millipore）を行い、分子量100kDa未満の蛋白質小分子を除去して得られたＷＮＶ様粒子を、10-45%(w/w)のショ糖密度勾配遠心分離した（150,000×g, 14時間）。１〜１７の試料画分の密度およびＥ蛋白質抗原量を上記ELISA法に従って測定した。その結果、密度１．１１である試料画分９および密度１．１６である試料画分４の２つにＥ蛋白質抗原のピークが観察された（図６）。【００５４】
上記で得られた２つの試料画分４および９に含有されるＥ蛋白質抗原からSephadex G-25 カラム(Hiprep; Amersham Pharmacia Bioteck)クロマトグラフィーにより、低分子量混合物を除去した後、リン酸緩衝生理食塩水に溶出して４℃保存した。得られた精製抗原を銅ホルムバール被膜したグリッドを用いて、リンタングステン酸ナトリウムでネガティブ染色した。標本はJOEL 1200 Ex 電子顕微鏡（Hitachi, Tokyo, Japan）で観察した。その結果、試料画分９には、直径約30nmの球状構造の粒子が多数確認できた（図７右側）。一方、試料画分４には、染色溶液に覆われた一様ではない形状の粒子（直径約25nm）が散見された（図７左側）。【００５５】
実施例４  ＷＮＶ様粒子の中和抗体誘導のためのエピトープ解析
実施例１で得られた組換え発現ベクターpWPME12をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、得られたＥ蛋白質抗原をショ糖密度勾配遠心分離することにより、１〜１１の試料画分を得た(図８Ｅ)。上記ELISA法に従って、ＷＮＶ中和抗体であるＷＮＹ-１１抗体および非中和抗体である402抗体を捕獲用抗体または検出用抗体に用いて、中和エピトープを有するＥ蛋白質抗原量の多い試料画分を見出した。その結果、ＷＮＹ-１１抗体を捕獲用抗体および検出用抗体に用いた場合は、試料画分３（密度1.16）と試料画分５（密度1.1１）にピークを確認できた（図８Ａ）。一方、ＷＮＹ-１１抗体および402抗体を捕獲用抗体および/または検出用抗体に用いた場合は、試料画分５のＥ蛋白質抗原量が、ＷＮＹ-１１抗体のみを用いた場合と比較して減少した（図８Ｂ−Ｄ）。試料画分３におけるＷＮＹ-１１によって認識される中和エピトープは試料画分５におけるそれよりも少ないようである。【００５６】
実施例５  中和抗体の誘導性の検討
実施例４において調製された試料画分３および５を含む複数の画分を用いて、マウスに対して中和抗体誘導できるか否かを検討した。具体的には、アジュバントをコンジュゲートしたＷＮＶ様粒子約300ng(ヒトに対する日本脳炎ワクチンの処方量の１６分の１)を７日間のインターバルを置いて、BALB/cマウスに二度腹腔内免疫した。二度目の免疫後３週間で免疫マウスの中和抗体価をプラーク減少アッセイで試験した。その結果、精製ＷＮＶ様粒子で免疫されたマウスは、高水準の中和抗体を発現した（図９）。【００５７】
実施例６  形質転換細胞の樹立【００５８】
（１）付着性形質転換細胞の樹立
７回継代した単層CHO-K1細胞を、トランスフェクション前日に、φ60 mmディッシュに1:5, 1:10, 1:20のスプリットで播き、翌日30〜40%コンフリュエンスとなった細胞に5 μgのpWPME12を導入した。単層を形成するまで2日間培養した後、細胞を1:5, 1:10, 1:20にスプリットして、φ100 mmディッシュにブラストサイジンS（BS）10 μg/mlを含む選択培地中で8日間培養した（途中培地交換を1回行った）。選択培地中で増殖してきたコロニーをペニシリンカップ法で24個採取し、24穴プレートに移して選択培地（以降はBSを含む選択培地）で更に培養を続けた。以降、24穴プレート、６穴プレート及びφ100 mmディッシュへ継代して順次細胞を増殖させ、得られた細胞を凍結保存した。24穴プレート及び６穴プレート培養時の培地中のWNV E蛋白質量をELISAで測定し、最高の産生量を示したコロニー#22を選択した。その後、定法に従い限界稀釈法でコロニー#22細胞をクローニング・サブクローニングし、ELISAで最高のWNV E蛋白質産生値を示す、クローン#22.6細胞、サブクローン#22.6.6細胞を選抜した。図１０に親細胞及び各クローン間のＥタンパク質抗原の発現・分泌をウエスタンブロットにより比較した結果を示す。【００５９】
（２）付着性形質転換細胞の無血清培地への馴化
上記（１）で凍結保存していた付着性クローン#22.6細胞或いはサブクローン#22.6.6細胞を、10 μg/ml BS、10%FBSを含むF12K培地（GIBCO）に戻し、3〜4代継代して増殖を確認した後、10 μg/ml BS及び10%FBSを含むF12K培地と、10 μg/ml BSを含むCHO-S-SFM ＩＩ培地とを等量混合した培地（最終的に5% のFBSを含む）で２代継代することによって無血培地への馴化を開始した。以降、10 μg/ml BSを含むCHO-S-SFM II培地（GIBCO）を等量混合した培地で２代以上継代し、順次FBS濃度及びF12K培地の比率を1/2ずつ低下させていった。
トリプシン-EDTA液を添加せずとも、PBS(-)によるピペッティングで細胞が培養フラスコから遊離する状態になった時点で、CHO-S-SFM II培地のみでの継代を継続した。細胞の増殖が良好（1〜2 × 105/mlの継代で5〜10 × 105/ml程度に増殖し、かつ生細胞が95%以上）で、培地中でのピペッティングにより継代できる状態になったら無血清培地に馴化したと判定した。更に継代を続け、3回以上連続して1 × 106/mlの増殖を示した状態を完全馴化(Full-Adapt)細胞、10回連続して1 × 106/ml以上の増殖を示した状態を最良馴化(Best-Adapt)細胞として凍結保存した（#22.6S及び#22.6.6S細胞）。
また、無血清培地への馴化過程で付着性CHO細胞は浮遊細胞化という大きな性状変化を示すため、この過程で抗原蛋白質産生量の低下をもたらしている可能性があった。従って、馴化浮遊細胞#22.6Sのクローニング・リクローニングを実施した。クローニングの方法は定法に従ったが、馴化浮遊細胞の増殖は細胞密度依存性が高くなっていたため、1ウェル当りの撒き込み細胞数を3, 10, 30, 100個で行った。増殖してきた各クローンは、撒き込み細胞数の少ないウェルから優先的に選別し、ELISA、IFAによりタンパク質産生量を検討したが、選別した複数のクローン・サブクローン間に顕著な差を認めなかった。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、ＷＮＶのＶＬＰを効率よく分泌生産することができ、該ＶＬＰを有効成分とするＷＮＶのサブユニットワクチンを安価かつ安全に、安定供給することが可能となる。また、本発明のＷＮＶ  ＶＬＰ分泌発現ベクターは、それ自体、ＷＮＶのＤＮＡワクチンとして用いることができる。
本出願は、日本で出願された特願２００７−２９０１６９（出願日：平成１９年１１月７日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図２】
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【図４】
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【図７】
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【図１０】
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【配列表】
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