(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の抗体モノマーを、高分子量凝集体を含む抗体調製物から精製するための方法であって、前記抗体調製物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付す工程を含み、前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、抗体調製物をカラム中のヒドロキシアパタイト樹脂と接触させ、そして精製抗体を、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭおよびＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含む少なくとも一種の溶出緩衝液で前記樹脂から溶出させる工程を含む、精製方法。
【請求項２】
前記抗体調製物を、（ａ）プロテインＡ親和クロマトグラフィー、および（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロテインＡ親和クロマトグラフィーが、先ず行われ、そして前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが最後に行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一種の抗体モノマーを、不純物を含む抗体調製物から精製するための方法であって、前記抗体調製物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付す工程を含み、前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、抗体調製物をカラム中のヒドロキシアパタイト樹脂と接触させ、そして精製抗体を、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭおよびＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含む少なくとも一種の溶出緩衝液で前記樹脂から溶出させる工程を含む、精製方法。
【請求項５】
前記抗体調製物を、プロテインＡ親和クロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記不純物が、ＤＮＡまたは宿主細胞タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記精製抗体は、高分子量凝集体５％未満を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記精製抗体は、高分子量凝集体１％未満を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記溶出緩衝液は、ｐＨ６．４〜７．６を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶出緩衝液は、リン酸ナトリウム３ｍＭまたは５ｍＭを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶出緩衝液は、ＮａＣｌ  １Ｍまたは０．３５Ｍを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、またはそれらの断片である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体は、抗ＩＬ−２１レセプター、抗ＧＤＦ−８、抗Ａｂｅｔａ、抗ＣＤ２２、抗ルイスＹ、抗ＩＬ−１３、または抗ＩＬ−２２抗体である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体は、塩基性ｐＩを有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイトのタイプＩまたはタイプＩＩである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも一種の抗体モノマーを、高分子量凝集体を含む抗体調製物から精製するための方法であって、前記抗体調製物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付す工程を含み、前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭおよびＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含む負荷緩衝液中で抗体調製物をカラム中のヒドロキシアパタイト樹脂と接触させ、そして精製抗体に前記カラムを通過させる工程を含む、精製方法。
【請求項１９】
前記抗体調製物を、（ａ）プロテインＡ親和クロマトグラフィー、および（ｂ）イオン交換クロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロテインＡ親和クロマトグラフィーが、先ず行われ、そして前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが最後に行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記負荷緩衝液は、ｐＨ６．４〜７．６を有する、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記負荷緩衝液は、リン酸ナトリウム３ｍＭまたは５ｍＭを含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記負荷緩衝液は、ＮａＣｌ  １Ｍまたは０．３５Ｍを含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記負荷緩衝液は、ｐＨ６．８または７．２を有する、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、またはそれらの断片である、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体は、抗ＩＬ−２１レセプター、抗ＧＤＦ−８、抗Ａｂｅｔａ、抗ＣＤ２２、抗ルイスＹ、抗ＩＬ−１３、または抗ＩＬ−２２抗体である、請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体は、塩基性ｐＩを有する、請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記樹脂は、セラミックヒドロキシアパタイトのタイプＩまたはタイプＩＩである、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記カラムが洗浄され、さらなる精製抗体が前記カラムを通過させられる工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも一種の抗体モノマーを、不純物を含む抗体調製物から精製するための方法であって、前記抗体調製物をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付す工程を含み、前記ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭおよびＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含む負荷緩衝液中で抗体調製物をカラム中のヒドロキシアパタイト樹脂と接触させ、そして精製抗体に前記カラムを通過させる工程を含む、精製方法。
【請求項３３】
前記抗体調製物を、プロテインＡ親和クロマトグラフィーに付す工程をさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記不純物がＤＮＡである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記不純物が宿主細胞タンパク質である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６０／５２３，３３５号（２００３年１１月２０日出願）およびに米国仮特許出願第６０／５１４，０１８号（２００３年１０月２７日出願）に対する優先権の利益を主張するものである。この開示は、その全てが参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
この発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて、高分子量凝集体を抗体調製物から除去する方法に関する。この発明のある実施形態においては、最終調製物中に存在する高分子量凝集体の量は、実質的に、例えば４０％から１％未満に低減されるであろう。
【０００３】
（従来技術）
タンパク質の生物学的活性を破壊しないか、またはそれを実質的に低減しない有用なタンパク質精製方法を明らかにすることが望ましい。汚染物は、診断用途、治療用途、応用細胞生物学、および機能研究で用いられるであろう前に、抗体調製物から除去されなければならない。ハイブリドーマ細胞系から採取された抗体調製物は、例えば、しばしば、細胞系によって産生された抗体の高分子量凝集体（ＨＭＷＡ）などの好ましくない成分を含む。凝集体のこの形成は、投与時に、補体の活性またはアナフィラキシーをもたらすことによって、産物の安全性に有害な影響を及ぼすであろう。さらに、凝集体の形成は、産物収率の低減、ピークの広がり、および活性の損失をもたらすことによって、製造プロセスを阻害するであろう。
【０００４】
最も一般的なタンパク質精製方法は、サイズ、充填量、および精製されるべきタンパク質および汚染物の間の溶解性の相違に関して述べられる。これらのパラメーターに基づくプロトコルには、親和クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーが含まれる。これらのクロマトグラフ方法は、しかし、しばしば、抗体の凝集または多重結合種の分離という技術的問題点をもたらす。イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの技術は、例えば、溶出中のタンパク質濃度の増大、または緩衝液濃度および／またはｐＨの必要な変動により、凝集体の形成を誘導するであろう。さらに、いくつかの場合には、抗体は、等電点の相違を示す。この相違は、非常に小さいので、イオン交換クロマトグラフィーによってそれらの分離が不可能である。非特許文献１。サイズ排除クロマトグラフィーは煩雑であり、産物の実質的な希釈をもたらす。これは、大規模な、効率ベースの製造プロセスにおいては障害である。親和クロマトグラフィーカラムからのリガンドの漏出がまた、生じるであろう。これは、溶出された産物の望ましくない汚染をもたらす。非特許文献２。出願人は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、および疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて、ＨＭＷＡを、抗ＧＤＦ−８抗体調製物から除去することを試みた。しかし、これらの方法は全て、ＨＭＷＡを、抗ＧＤＦ−８抗体調製物から実質的に除去することができなかった。
【０００５】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウム［Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２］を用いるタンパク質精製方法である。これは、母材およびリガンドの両者を形成する。官能基は、陽荷電カルシウムイオン（Ｃ−部位）および陰荷電ホスフェート基（Ｐ−部位）クラスターの対からなる。ヒドロキシアパタイトおよびタンパク質の間の相互作用は、複雑であり、多様である。相互作用の一方法においては、しかし、タンパク質の陽荷電アミノ基は、Ｃ−部位へ配位錯化することによって、陰荷電Ｐ−部位およびタンパク質カルボキシル基と結合する。非特許文献３。
【０００６】
結晶質ヒドロキシアパタイトは、クロマトグラフィーで用いられる第一のタイプのヒドロキシアパタイトであった。しかし、それは、構造的な問題によって制限された。セラミックヒドロキシアパタイト（ｃＨＡ）クロマトグラフィーは、結晶質ヒドロキシアパタイトに付随するいくつかの問題点（流速の制限など）を克服するのに開発された。セラミックヒドロキシアパタイトは、高い耐久性、良好なタンパク質結合能力を有し、結晶質ヒドロキシアパタイトより高い流速および圧力で用いられるであろう。非特許文献４。
【０００７】
ヒドロキシアパタイトは、タンパク質、核酸、および抗体のクロマトグラフ分離で用いられてきた。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいては、カラムは、通常、低濃度のホスフェート緩衝液中で平衡にされ、試料が適用され、吸着されたタンパク質は、次いで濃度勾配のホスフェート緩衝液に溶出される。非特許文献５。しばしば、低勾配のリン酸ナトリウムは、成功裡に、タンパク質を溶出するのに用いられ、一方他の場合には、リン酸ナトリウム４００ｍＭまでの濃度勾配が、成功裡に用いられた。例えば、非特許文献６（リン酸ナトリウム溶出勾配１０ｍＭ〜３０ｍＭ）、非特許文献３（リン酸ナトリウム溶出勾配１０ｍＭ〜７４ｍＭ）、非特許文献７（リン酸ナトリウム溶出勾配１０ｍＭ〜３５０ｍＭ）を参照されたい。ＮａＣｌなどの塩が、結合緩衝液中に組込まれて、抗体が、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて精製された（非特許文献５）一方、ＮａＣｌおよび（ＮＨ４）２ＳＯ４などの塩は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいてタンパク質の溶出に影響を及ぼすことが知られなかった。非特許文献８。
【０００８】
いくつかの場合には、研究者は、抗体をヒドロキシアパタイトから選択的に溶出することができなかったか、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが十分に純粋な産物をもたらさなかったことを見出した。非特許文献９および非特許文献５。出願人は、残念ながら、先行技術の教示に基づくセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびリン酸ナトリウム溶出を用いて、高分子量凝集体を抗体調製物から分離することを試みた（図１）。さらに、過酷な溶出条件は、タンパク質と母材の強固な結合を分解する試みで用いられる場合には、タンパク質の生物学的活性を破壊することが知られる。したがって、高分子量凝集体などの不純物を、抗体調製物から除去する効率的な方法（抗体の生物学的活性を破壊しない）に対する必要性が存在する。
【非特許文献１】Tarditi, J. Immunol. Methods 599:13-20(1992)
【非特許文献２】Steindl, J. Immunol. Methods 235:61-69(2000)
【非特許文献３】Shepard, J. of Chromatography 891:93-98(2000)
【非特許文献４】Vola et al., BioTechniques 14:650-655 (1993)
【非特許文献５】Giovannini, Biotechnology and Bioengineering73:522-529 (2000)
【非特許文献６】Stanker, J. Immunological Methods 76:157-169(1985)
【非特許文献７】Tarditi, J. Chromatography 599:13-20 (1992)
【非特許文献８】Karlsson et al., Ion ExchangeChromatography, in Protein Purification, VCH Publishers, Inc. (Janson and Rydeneds., 1989)
【非特許文献９】Junbauer, J. Chromatography 476:257-268(1989)
【０００９】
（発明の開示）
出願人は、驚くべきことに、異なる原料から免疫グロブリンを精製し、かつＨＭＷＡを除去するための新規ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー方法にＮａＣｌを用いることができることを見出した（図２）。したがって、本発明は、抗体調製物をヒドロキシアパタイト樹脂と接触させ、抗体を樹脂から選択的に溶出することよって、高分子量凝集体を該調製物から除去する方法に関する。あるいは、抗体調製物は、平衡緩衝液中に緩衝液交換され、次いでヒドロキシアパタイト樹脂に通されるであろう。これらの結合／フロースルーヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー方法の組合せはまた、抗体調製物を精製するのに用いられるであろう。
【００１０】
本発明は、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭおよびＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含む溶出緩衝液または負荷緩衝液を特徴とする。ここで、溶出緩衝液または負荷緩衝液は、ｐＨ  ６．４〜７．６を有する。
【００１１】
結合／フロースルー組合せ方式においては、本発明は、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．０１〜２．０Ｍ、アルギニン０〜２００ｍＭ、およびＨＥＰＥＳ  ０〜２００ｍＭを含む平衡緩衝液および洗浄緩衝液を特徴とする。ここで、平衡緩衝液および洗浄緩衝液は、ｐＨ  ６．２〜８．０を有する。
【００１２】
一実施形態においては、精製抗体は、高分子量凝集体５％未満を含む。
【００１３】
さらなる実施形態においては、精製抗体は、高分子量凝集体１％未満を含む。
【００１４】
さらなる実施形態においては、抗体調製物は、少なくとも一種のＩｇＧ抗体を含む。より詳しくは、抗体調製物は、抗ＩＬ−２１レセプター、抗ＧＤＦ−８、抗Ａｂｅｔａ、抗ＣＤ２２、抗ルイスＹ、抗ＩＬ−１３、または抗ＩＬ−２２から選択される少なくとも一種の抗体を含む。
【００１５】
少なくとも一種の精製方法が、本発明のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとの組合せで用いられるであろう。用いられるであろう多種の精製方法には、限定されることなく、プロテインＡクロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属親和クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過透析、限外ろ過、ウィルス除去ろ過、アニオン交換クロマトグラフィー、および／またはカチオン交換クロマトグラフィーが含まれるであろう。
【００１６】
一実施形態においては、アニオン交換およびプロテインＡクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとの組合せで用いられる。アニオン交換およびプロテインＡクロマトグラフィーは、例えば、抗体調製物をプロテインＡ基体と接触させる工程、抗体を基体に吸着させる工程、基体および吸着された抗体を少なくとも一種のプロテインＡ洗浄緩衝液で洗浄する工程、吸着された抗体を少なくとも一種のプロテインＡ溶出緩衝液で溶出する工程、調製物をイオン交換基体と接触させる工程、抗体を基体に通す工程、基体を少なくとも一種のイオン交換洗浄緩衝液で洗浄する工程、イオン交換フロースルーをヒドロキシアパタイト樹脂と接触させる工程、フロースルーを樹脂に吸着させる工程、樹脂を少なくとも一種のヒドロキシアパタイト洗浄緩衝液で洗浄する工程、および精製抗体を少なくとも一種のヒドロキシアパタイト溶出緩衝液で樹脂から溶出する工程によって、組合せで用いられるであろう。
【００１７】
さらなる実施形態においては、アニオン交換およびプロテインＡクロマトグラフィーは、例えば、調製物をプロテインＡ基体と接触させる工程、抗体をプロテインＡ基体に吸着させる工程、プロテインＡ基体および吸着された抗体を少なくとも一種のプロテインＡ洗浄緩衝液で洗浄する工程、吸着された抗体を少なくとも一種のプロテインＡ溶出緩衝液で溶出する工程、プロテインＡ溶出物をイオン交換基体と接触させる工程、抗体をイオン交換基体に通す工程、イオン交換基体を少なくとも一種のイオン交換洗浄緩衝液で洗浄する工程、イオン交換フロースルーをリン酸ナトリウム１〜２０ｍＭおよびＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含む負荷緩衝液中に交換する工程、イオン交換フロースルーをヒドロキシアパタイト樹脂と接触させる工程、抗体をヒドロキシアパタイト樹脂に通す工程、およびヒドロキシアパタイト樹脂を少なくとも一種のヒドロキシアパタイト洗浄緩衝液で洗浄する工程によって、組合せで用いられるであろう。
【００１８】
さらに他の実施形態においては、アニオン交換およびプロテインＡクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとの組合せで用いられるであろう。アニオン交換およびプロテインＡクロマトグラフィーは、例えば、抗体調製物をプロテインＡ基体と接触させる工程、抗体を基体に吸着させる工程、基体および吸着された抗体を少なくとも一種のプロテインＡ洗浄緩衝液で洗浄する工程、吸着された抗体を少なくとも一種のプロテインＡ溶出緩衝液で溶出する工程、調製物をイオン交換基体と接触させる工程、抗体を基体に通す工程、基体を少なくとも一種のイオン交換洗浄緩衝液で洗浄する工程、イオン交換フロースルーをヒドロキシアパタイト樹脂と接触させる工程、フロースルーを樹脂に吸着させる工程、ＨＭＷＡを抗体モノマーより強固に結合させ、負荷が継続するにつれて、結合モノマーをＨＭＷＡによって置換させる工程、ヒドロキシアパタイト樹脂を少なくとも一種のヒドロキシアパタイト洗浄緩衝液で洗浄する工程、および置換された抗体モノマーを収集する工程によって、組合せで用いられるであろう。
【００１９】
本発明のさらなる目的および利点は、一部分が、次の説明で示されるであろう。一部分は、説明から自明であるか、または本発明を実施することによって学習されるであろう。本発明の目的および利点は、添付される特許請求の範囲に特に指摘される要件および組合せによって、実現され、達成されるであろう。
【００２０】
前述の全般説明および次の詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明のためのものであり、請求されるように本発明を限定するものでない。
【００２１】
添付の図面は、この明細書に組込まれ、その部分を構成するが、これは、説明と一体に、本発明の原理を説明するのに資する。
【００２２】
（発明の詳細な記載）
Ａ．定義
本発明がより容易に理解されるであろうために、いくつかの用語を、先ず定義する。さらなる定義は、詳細な説明の中で随時示される。
【００２３】
用語「抗体」は、いかなる免疫グロブリンまたはその断片をも云い、これには、抗原結合部位を含むいかなるポリペプチドも包含される。用語には、限定されることなく、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異、多特異、非特異、ヒト化、ヒト、単鎖、キメラ、合成、組換え型、混成、突然変異、グラフト化、およびインビトロ産生抗体が含まれる。用語「抗体」にはまた、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および抗原結合機能を保持する他の抗体断片などの抗体断片が含まれる。典型的には、これらの断片は、抗原結合ドメインを含むであろう。
【００２４】
本発明によってまた精製されるであろう抗体には、ＰＥＧ処理などによって化学修飾された形態、および免疫グロブリン部分を含む融合タンパク質が含まれる。抗体またはその断片は、既知の抗体イソタイプおよびそれらの立体配座のいかなるものからも選択されるであろう。例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭモノマー、ＩｇＡダイマー、ＩｇＡトリマー、またはＩｇＭペンタマーである。
【００２５】
用語「抗体調製物」は、抗体および／または好ましくない成分（これらの抗体の高分子量凝集体など）を含むいかなる組成物をも云う。
【００２６】
「セラミックヒドロキシアパタイト」または「ｃＨＡ」は、式［Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２］の不溶性ヒドロキシル化リン酸カルシウムを云う。これは、高温で、球状のマクロ細孔質セラミック形態に焼結されている。用語「ｃＨＡ」には、限定されることなく、タイプＩおよびタイプＩＩセラミックヒドロキシアパタイトが包含される。明記されない限り、「ｃＨＡ」は、限定されることなく、２０、４０、および８０μｍを含むいかなる粒度をも云う。
【００２７】
用語「高分子量凝集体」または「ＨＭＷＡ」は、少なくとも二種の抗体の結合物を云う。該結合物は、限定されることなく、共有、非共有、二硫化物、または非還元性架橋を含むいかなる方法によっても生じるであろう。少なくとも二種の抗体が、同じか、または異なる抗原に結合するであろう。少なくとも二種の抗体は、抗体、または抗体断片の形態、もしくは上記の「抗体」の定義で記載される他の形態であろう。
【００２８】
用語「フロースルー方式」は、抗体調製物の分離技術を云う。ここで、調製物に含まれる少なくとも一種の抗体は、クロマトグラフ樹脂または基体に通すものであり、一方少なくとも一種の潜在的汚染物または不純物は、クロマトグラフ樹脂または基体に結合する。フロースルー方式は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーで用いられるであろう。
【００２９】
「結合方式」は、抗体調製物の分離技術を云う。ここで、調製物に含まれる少なくとも一種の抗体は、クロマトグラフ樹脂または基体に結合し、一方少なくとも一種の汚染物または不純物は、通過する。結合方式は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーで用いられるであろう。
【００３０】
Ｂ．方法の説明
本発明は、高分子量凝集体（ＨＭＷＡ）を、結合方式、フロースルー方式、またはその組合せのヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて、抗体調製物から除去するための方法を提供する。本発明は、抗体調製物の大規模精製に適用される。
【００３１】
結合方式においては、該方法は、中性のｐＨおよび低いイオン強度で、ホスフェートで充填されたヒドロキシアパタイト基体を用いて、抗体およびＨＭＷＡの両者を結合する。カラムは、次いで、ホスフェート緩衝液で洗浄されて、緩く結合された不純物が除去される。次に、抗体は、高いイオン強度のホスフェート緩衝液（弱酸性〜弱塩基性のｐＨで、ＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含む）を用いて、選択的に溶出される。ＨＭＷＡは、任意に、続いて、さらにより高いイオン強度およびより高いホスフェート濃度の緩衝液を中性のｐＨで用いて、樹脂を完全に洗浄される。最後に、樹脂は、任意に、水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウム溶液を用いて再生される。
【００３２】
フロースルー方式においては、抗体調製物は、ＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含む負荷緩衝液中に、弱酸性〜弱塩基性のｐＨで緩衝液交換される。抗体調製物は、次いで、ヒドロキシアパタイトカラムに通され、一方ＨＭＷＡなどの不純物は、カラムに結合する。カラムは、任意に、続いて洗浄されて、さらなる精製抗体が、カラムに通される。最後に、カラムは、任意にストリッピングされ、次いで水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウム溶液を用いて再生されるであろう。
【００３３】
結合／フロースルー組合せ方式においては、抗体調製物は、ヒドロキシアパタイトカラムに通され、抗体モノマーおよびＨＭＷＡの両者が最初に結合する。しかし、負荷が継続するにつれて、流入するＨＭＷＡは、抗体モノマーより強固に結合可能であり、したがって結合モノマーを置換する。したがって、置換されたモノマーを、カラムに通す。カラムは、任意に、続いて、洗浄されて、さらなる置換抗体をカラムに通す。最後に、カラムは、任意に、高い塩（高いホスフェート）溶液でストリッピングされ、次いで水酸化ナトリウムおよびリン酸カリウム溶液を用いて再生されるであろう。
【００３４】
本発明の一実施形態においては、精製抗体は、ＨＭＷＡ  ５％未満、一実施形態においてはＨＭＷＡ  ３％未満、他の実施形態においてはＨＭＷＡ  １％未満を含む。
【００３５】
１．抗体
本発明の抗体調製物は、限定されることなく、免疫動物の血清、腹水液、ハイブリドーマまたは骨髄腫の上澄み、ならびに組換え細胞系（抗体分子を発現する）の培養、および抗体産生細胞の全細胞抽出液から誘導される調節培地を含む多数の素材から単離されるであろう。本発明の一実施形態においては、種々の抗体産生組換え細胞系の調節細胞培養培地からの抗体が精製される。本明細書の開示に基づいて、細胞系から細胞系への、および種々の抗体産物において、いくらかの変化が予測されるであろうものの、本明細書の本発明を、抗体タンパク質および産生細胞系の特定の組合せに適合させることは、十分に当業者の技術の範囲内にある。
【００３６】
あくまで例示を目的として、本発明は、ＩｇＧイソタイプおよび塩基性ｐｌのいくつかの抗体の精製に適用された。より詳しくは、本発明は、米国仮特許出願第６０／４１９，９６４号明細書によって記載されるＧＤＦ−８に対するモノクローナル抗体（以下「Ｍｙｏ−２９」）、米国特許出願第１０／４２８，８９４号明細書によって記載されるＣＤ２２抗原と特に反応性のあるモノクローナル抗体（以下「抗ＣＤ２２」）、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／４６５８７号パンフレットによって記載されるＡｂｅｔａ抗原に対するモノクローナル抗体（以下「抗Ａｂｅｔａ」）に適用された。Ｍｙｏ−２９ならびにＣＤ２２およびＡｂｅｔａ抗体を産生するための組換え系の構造は、上記される出願に詳述される。
【００３７】
２．ヒドロキシアパタイト樹脂
種々のヒドロキシアパタイトクロマトグラフ樹脂が、商業的に入手可能であり、物質のいかなる利用可能な形態も、この発明を実施するに際して用いられるであろう。本発明の一実施形態においては、ヒドロキシアパタイトは、結晶質形態である。この発明で用いるためのヒドロキシアパタイトは、凝集されて粒子を形成し、高温で、安定な多孔質セラミック塊に焼結されるものであろう。
【００３８】
ヒドロキシアパタイトの粒度は、幅広く変動してもよい。しかし、典型的な粒度は、直径１μｍ〜１，０００μｍの範囲であり、１０μｍ〜１００μｍであろう。本発明の一実施形態においては、粒度は２０μｍである。本発明の他の実施形態においては、粒度は４０μｍである。本発明のさらに他の実施形態においては、粒度は８０μｍである。
【００３９】
多数のクロマトグラフ基体が、ｃＨＡカラムを調製する際に用いられるであろう。最も広範には、タイプＩおよびタイプＩＩのヒドロキシアパタイトが用いられる。タイプＩは、高いタンパク質結合能力、および酸性タンパク質に対するより良好な能力を有する。タイプＩＩは、しかし、より低いタンパク質結合能力を有するが、核酸およびあるタンパク質のより良好な分解能を有する。タイプＩＩ物質はまた、アルブミンに対して非常に低い親和性を有し、特に、多くの種および類の免疫グロブリンを精製するのに適切である。特定のヒドロキシアパタイトタイプの選択は、当業者によって決定されるであろう。
【００４０】
この発明は、カラム中に、または連続環状クロマトグラフ中に緩く充填されたヒドロキシアパタイト樹脂と共に用いられるであろう。本発明の一実施形態においては、セラミックヒドロキシアパタイト樹脂が、カラム中に充填される。カラム寸法の選択は、当業者によって決定されるであろう。本発明の一実施形態においては、床高さ約２０ｃｍのカラム直径少なくとも０．５ｃｍが、小規模精製に用いられるであろう。本発明のさらなる実施形態においては、カラム直径約３５ｃｍ〜約６０ｃｍが用いられるであろう。本発明のさらに他の実施形態においては、カラム直径６０ｃｍ〜８５ｃｍが用いられるであろう。本発明のある実施形態においては、Ｎａ２ＨＰＯ４溶液２００ｍＭ中のセラミックヒドロキシアパタイト樹脂のスラリー（ｐＨ９．０）が用いられて、カラムが、一定流速約４ｃｍ／分で、または重力で充填されるであろう。
【００４１】
２．緩衝液組成および負荷条件
ヒドロキシアパタイト樹脂を抗体調製物と接触させる前に、パラメーター（ｐＨ、イオン強度、および温度、ならびにいくつかの場合においては、異なる種類の物質の添加など）を調整することが必要であろう。したがって、ヒドロキシアパタイト母材を、それを溶液（例えば、ｐＨ、イオン強度等を調整するための緩衝液、または洗浄剤を導入するためのもの）（抗体調製物を精製するのに必要な特性をもたらす）で洗浄することによって平衡させることは、任意工程である。
【００４２】
結合／フロースルー組合せ方式のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにおいては、ヒドロキシアパタイト母材は、溶液と平衡され、それで洗浄され、それにより抗体調製物を精製するのに必要な特性がもたらされる。本発明の一実施形態においては、母材は、ＮａＣｌ  ０．０１〜２．０Ｍを、弱塩基性〜弱酸性のｐＨで含む溶液を用いて平衡されるであろう。例えば、平衡緩衝液は、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、リン酸ナトリウム１〜１０ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、リン酸ナトリウム２〜５ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、リン酸ナトリウム２ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはリン酸ナトリウム５ｍＭを含むであろう。平衡緩衝液は、ＮａＣｌ  ０．０１〜２．０Ｍを含むであろうし、一実施形態においてはＮａＣｌ  ０．０２５〜０．５Ｍ、他の実施形態においてはＮａＣｌ  ０．０５Ｍ、他の実施形態においてはＮａＣｌ  ０．１Ｍであろう。負荷緩衝液のｐＨは、６．２〜８．０の範囲であろう。一実施形態においては、ｐＨは６．６〜７．７であろうし、他の実施形態においてはｐＨは７．３であろう。平衡緩衝液は、アルギニン０〜２００ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、アルギニン１２０ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、アルギニン１００ｍＭを含むであろう。平衡緩衝液は、ＨＥＰＥＳ  ０〜２００ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、ＨＥＰＥＳ  １００ｍＭを含むであろう。
【００４３】
抗体調製物はまた、フロースルー方式のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを調製するに際して、適切な緩衝液または負荷緩衝液中に緩衝液交換されるであろう。本発明の一実施形態においては、抗体調製物は、ＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを、弱酸性〜弱塩基性のｐＨで負荷緩衝液中に緩衝液交換されるであろう。例えば、負荷緩衝液は、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、リン酸ナトリウム２〜８ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、リン酸ナトリウム３〜７ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはリン酸ナトリウム５ｍＭを含むであろう。負荷緩衝液は、ＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含むであろうし、一実施形態においてはＮａＣｌ  ０．２〜１．５Ｍ、他の実施形態においてはＮａＣｌ  ０．３〜１．０Ｍ、他の実施形態においてはＮａＣｌ  ３５０ｍＭであろう。負荷緩衝液のｐＨは、６．４〜７．６の範囲であろう。一実施形態においては、ｐＨは６．５〜７．０であろうし、他の実施形態においてはｐＨは６．８であろう。
【００４４】
結合方式、フロースルー方式、またはそれらの組合せのいずれにおいても、抗体調製物とヒドロキシアパタイト樹脂との接触は、充填床カラム、流動／膨張床カラム（固相母材を含む）、および／または単一バッチ運転（固相母材は、溶液とある時間混合される）において、行われるであろう。
【００４５】
ヒドロキシアパタイト樹脂を抗体調製物と接触させた後、任意に、洗浄処理が行われる。しかし、非常に高純度の免疫グロブリンが不可欠ではないか、またはさらなるフロースルー抗体が必要とされないいくつかの場合においては、洗浄処理は、省略され、処理工程、および洗浄溶液が省略されるであろう。用いられる洗浄緩衝液は、ヒドロキシアパタイト樹脂の性質、用いられるヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの方式によるであろうし、したがって当業者によって決定されるであろう。フロースルー方式および結合／フロースルー組合せ方式においては、任意のカラム洗浄後に得られる精製抗体フロースルーは、他の精製抗体画分と共にプールされるであろう。
【００４６】
結合方式においては、抗体は、任意の洗浄処理後、カラムから溶出されるであろう。抗体をカラムから溶出するためには、この発明は、ＮａＣｌ約０．２〜２．５Ｍを弱酸性〜弱塩基性のｐＨで含む高イオン強度のホスフェート緩衝液を用いる。例えば、溶出緩衝液は、リン酸ナトリウム１〜２０ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、リン酸ナトリウム２〜８ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはそれは、リン酸ナトリウム２〜６ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはリン酸ナトリウム３ｍＭを含むであろうし、他の実施形態においてはリン酸ナトリウム５ｍＭを含むであろう。溶出緩衝液は、ＮａＣｌ  ０．２〜２．５Ｍを含むであろうし、一実施形態においてはＮａＣｌ  ０．２〜１．５Ｍ、他の実施形態においてはＮａＣｌ  ０．３〜１．１Ｍ、他の実施形態においてはＮａＣｌ  ０．１Ｍ、他の実施形態においてはＮａＣｌ  ０．３５Ｍであろう。溶出緩衝液のｐＨは、６．４〜７．６の範囲であろう。一実施形態においては、ｐＨは６．５〜７．３であろうし、他の実施形態においてはｐＨは７．２であろうし、他の実施形態においてはｐＨは６．８であろう。溶出緩衝液は、抗体を、連続または段階勾配でカラムからの溶出するために変えられるであろう。
【００４７】
結合、およびフロースルーの両方式、ならびにそれらの組合せにおいては、固相母材は、任意に、抗体の溶出またはフロースルー後に清浄化される、すなわちストリッピングされ、再生されるであろう。この処理は、典型的には、定期的に行われて、固相の表面上への不純物の蓄積が最少にされるか、および／または母材が滅菌されて、産物の微生物による汚染が防止される。
【００４８】
緩衝液成分は、当業者の知識にしたがって調整されるであろう。結合方式、フロースルー方式、および結合／フロースルー組合せ方式について、試料緩衝液組成の範囲および実施例が、それぞれ、表１、表２、および表３に示される。全ての緩衝液または工程は、必ずしも必要ではないが、あくまで例示のために示される。例えば、二つの別個の平衡工程を有する必要はないであろうし、ヒドロキシアパタイト樹脂をストリッピング、再生、または保管する必要はないであろう。実施例１１に記載される高処理量スクリーンは、ｃＨＡカラムクロマトグラフィーの緩衝液条件を効率的に最適化するのに用いられるであろう。
【００４９】
【表１】
0005490156.tif 000002
【００５０】
【表２】
0005490156.tif 000003
【００５１】
【表３】
0005490156.tif 000004
【００５２】
本発明の一実施形態においては、ｃＨＡ樹脂上への負荷は、例えば、負荷投与≦２０ｍｇ／ｍｌであり、負荷時の開始凝集体レベル≦ＨＭＷＡ  ４０％であろう。本発明のある実施形態においては、負荷投与１．８〜１０．４ｍｇ／ｍｌが、負荷時の開始凝集体レベル約１５％と共に用いられるであろう。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態においては、ｃＨＡ樹脂は、負荷投与少なくとも２０ｍｇ／ｍｌ、および負荷時の開始凝集体レベル≦ＨＭＷＡ  ４０％で負荷される。本発明のある実施形態においては、負荷投与３０〜４０ｍｇ／ｍｌが、負荷時の開始凝集体レベル約２７％と共に用いられるであろう。
【００５４】
３．さらなる任意工程
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、単独で用いられて、上記されるように、モノマーＩｇＧが凝集体から分離されるであろうことが発見されたものの、本発明の精製方法は、他のタンパク質精製技術との組合せで用いられるであろう。本発明の一実施形態においては、ヒドロキシアパタイト工程に先行する一つ以上の工程が、汚染物または不純物の負荷投与を低減するのに望ましいであろう。本発明の他の実施形態においては、ヒドロキシアパタイト工程に続く一つ以上の精製工程が、さらなる汚染物または不純物を除去するのに望ましいであろう。
【００５５】
記載されるｃＨＡ精製処理は、限定されることなく、プロテインＡクロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、固定化金属親和クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ろ過透析、限外ろ過、ウィルス除去ろ過、および／またはイオン交換クロマトグラフィーを含む他の精製工程と任意に組合わされるであろう。
【００５６】
一実施形態においては、ｃＨＡ精製工程に先立って、採取培地は、任意に、プロテインＡクロマトグラフィー工程によって最初に精製されるであろう。例えば、ＰＲＯＳＥＰ−Ａ（商標）（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ、Ｕ．Ｋ．）（制御された細孔ガラスに共有結合されたプロテインＡからなる）が、有用に用いられるであろう。他の有用なプロテインＡ処方物には、プロテインＡセファロースＦＡＳＴ  ＦＬＯＷ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）６５０ＭプロテインＡ（ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｃｏ．、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）、およびＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）が含まれる。
【００５７】
ｃＨＡ精製に先行する任意工程として、イオン交換クロマトグラフィーが用いられるであろう。この点に関して、種々のアニオンまたはカチオン置換基が、クロマトグラフィーのアニオンまたはカチオン基体を形成するために、母材に付与されるであろう。アニオン交換置換基には、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、トリメチルアミノエチルアクリルアミド（ＴＭＡＥ）、第四アミノエチル（ＱＡＥ）、および第四アミン（Ｑ）基が含まれる。カチオン交換置換基には、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホエチル（ＳＥ）、スルホプロピル（ＳＰ）、ホスフェート（Ｐ）、およびスルホネート（Ｓ）が含まれる。セルロースイオン交換樹脂（ＤＥ２３、ＤＥ３２、ＤＥ５２、ＣＭ−２３、ＣＭ−３２、およびＣＭ−５２など）は、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｌｔｄ．（Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、Ｋｅｎｔ、Ｕ．Ｋ）から入手可能である。セファデックスベースの架橋イオン交換体がまた、知られる。例えば、ＤＥＡＥ−、ＱＡＥ−、ＣＭ−、およびＳＰ−セファデックス、ＤＥＡＥ−、Ｑ−、ＣＭ−、およびＳ−セファロース、ならびにセファロースは全て、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手可能である。さらに、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＤＥＡＥ−６５０ＳまたはＭ、およびＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（商標）ＣＭ−６５０ＳまたはＭなどのＤＥＡＥおよびＣＭ誘導の両エチレングリコール−メタクリレートコポリマーは、Ｔｏｓｏ  Ｈａａｓ  Ｃｏ．（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から入手可能である。
【００５８】
本発明の一実施形態においては、イオン交換クロマトグラフィーは、結合方式またはフロースルー方式で用いられるであろう。
【００５９】
ある実施形態においては、プロテインＡクロマトグラフィー工程が最初に行われ、アニオン交換工程が次に行われ、ｃＨＡ工程が三番目に行われる。
【００６０】
４．さらなる不純物の除去
ＨＭＷＡの除去に加えて、ｃＨＡクロマトグラフィーが、他の不純物を抗体調製物から除去するのに有用であると示された。本発明のｃＨＡクロマトグラフィー方法によって除去されるであろう他の不純物には、限定されることなく、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質、偶性ウィルス、および先行精製工程からのプロテインＡ汚染物が含まれる。
【００６１】
本発明の一実施形態においては、本発明は、プロテインＡを抗体調製物から除去可能である。本発明のある実施形態においては、最終調製物中に存在するプロテインＡの量は、実質的に（例えば３００ｐｐｍから１ｐｐｍ未満に）低減されるであろう。
【実施例】
【００６２】
次の実施例は、あくまで例示を目的として示される。
【００６３】
実施例１：抗ＧＤＦ−８抗体の精製
次に概略的に述べられる精製処理を、抗ＧＤＦ−８モノクローナル抗体（本明細書には「Ｍｙｏ−２９」として引用される）に対して開発した。Ｍｙｏ−２９抗体は、ＩｇＧ１亜型抗体であり、ｐｌ約８．１を有する。精製プロセスは、三種のクロマトグラフ工程（プロテインＡ親和、アニオン交換、およびヒドロキシアパタイト）、ウィルス不活性化工程、および限外ろ過／ろ過透析工程からなって、産物が、最終緩衝液中に濃縮および交換された。全ての工程を、１８〜２５℃で行った。但し、プロテインＡクロマトグラフィー工程は、２〜８℃で実施された。
【００６４】
精製処理は、いかなる規模に対しても標準化されるであろう。記載される線形流速は、カラム直径には無関係であり、負荷比は、質量／単位容積である。プロテインＡクロマトグラフィー工程は、バッチ毎に多数回循環されて、採取バイオリアクターにおける細胞培養力価の変動が配慮されるであろう。各サイクルは、別個の単位操作と見なされ、溶出物プールは、次の工程に備えられる。プロテインＡ工程は、Ｍｙｏ−２９約３５ｇ／ＭａｂＳｅｌｅｃｔリットルの能力を有する。プロセスの下流工程（例えば、アニオンクロマトグラフィーおよびセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）は、Ｍｙｏ−２９約１５ｇ／アニオン交換樹脂リットル、およびＭｙｏ−２９約１０ｇ／セラミックヒドロキシアパタイト樹脂リットルを配慮する規模である。
【００６５】
１．培養物からの細胞の除去
Ｍｙｏ−２９抗体は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞中に発現される。これを、攪拌２５００Ｌタンクバイオリアクターで培養した。培養流体を採取するために、細胞を、Ｐｒｏｓｔａｋマイクロフィルトレーション装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いて除去した。浄化された調節培地（ＣＣＭ）を、最初のクロマトグラフ工程（プロテインＡクロマトグラフィー）のために収集した。
【００６６】
２．プロテインＡ親和クロマトグラフィー精製工程
組替え型プロテインＡ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の１７．７Ｌ（直径３０ｃｍ×高さ２５ｃｍ）ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラムを、平衡緩衝液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ７．５）５カラム容と平衡させた。ＣＣＭを、流速２．５ｃｍ／分および負荷投与Ｍｙｏ−２９  ３５ｇ／樹脂リットルでカラムに付した。カラムに負荷した後、それを、高塩洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ７．５）５カラム容で、次いで低塩洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ７．５）１０カラム容で洗浄した。Ｍｙｏ−２９を、溶出緩衝液（アルギニン１００ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ３．０）６カラム容を加えることによって溶出した。溶出物プールを、次いで、病気予防手段としてｐＨ３．６±０．５で１．５±０．５時間保持して、潜在的な偶性ウィルス汚染物の不活性化を促進した。溶出物プールを、次いで、２Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）でｐＨ７．３に中和して、Ｍｙｏ−２９の酸不安定種の劣化が防止された。
【００６７】
カラム流出物を、溶出物プール濃度のために、数種のパラメーター（ＵＶ吸光度および導電率クロマトグラフプロフィルの目視検査を含む）、および産物回収（負荷力価および２８０ｎｍにおける吸光度に対するプロテインＡ  ＨＰＬＣを用いる）によって監視した。
【００６８】
カラムを、６ＭグアニジンＨＣｌでストリッピングし、次いでストリッピング洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄した。カラムを、１６％エタノール中に保管した。
【００６９】
３．アニオン交換クロマトグラフィー精製工程
プロテインＡカラム溶出物を、さらに、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ  ＦＦ樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）の７５Ｌカラム（直径８０ｃｍ×長さ１５ｃｍ）のアニオン交換クロマトグラフィーによって精製した。カラムを、第一の平衡緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １０００ｍＭ、ｐＨ７．３）５カラム容で、次いで第二の平衡緩衝液（アルギニン１００ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １００ｍＭ、ｐＨ７．３）５カラム容で平衡させた。プロテインＡカラム溶出物を、流速２．５ｃｍ／分および負荷比Ｍｙｏ−２９  １５ｇ／樹脂リットルで平衡カラムに加えた。負荷した後、カラムを、第二の平衡緩衝液５カラム容で洗浄した。アニオン交換カラムフロースルーを収集した。
【００７０】
収集されたカラムフロースルーを、数種のパラメーター（ＵＶ吸光度および導電率クロマトグラフプロフィルの目視検査を含む）、および産物回収（２８０ｎｍにおける吸光度を用いる）によって監視した。
【００７１】
アニオン交換カラムを、ストリッピング緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １Ｍ、ｐＨ７．３）でストリッピングし、再生緩衝液（ＮａＯＨ  ５００ｍＭ、ＮａＣｌ  １Ｍ、ｐＨ１３．３）で再生した。カラムを、０．０１Ｍ  ＮａＯＨ中に保管した。
【００７２】
４．ウィルス保持ろ過
この任意工程の目的は、ＣＨＯ細胞培養物中に存在するであろうレトロウィルス様粒子の除去であり、潜在的な偶性ウィルス汚染物を除去することによるさらなる安全性を提供することであった。アニオン交換カラムフロースルーは、収集され、３５ｎｍ  Ｐｌａｎｏｖａ単使用フィルター（Ａｓａｈｉ−Ｋａｓｅｉ  Ｃｏｒｐ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）を通して送られた。モジュール中の残り産物を、アニオン交換カラム洗浄緩衝液（アルギニン１００ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １００ｍＭ、ｐＨ７．３）を装置に通すことによって回収した。
【００７３】
ウィルス保持ろ過後の産物回収を、履歴性能データとの比較で、吸光度（２８０ｎｍ）、およびＰｌａｎｏｖａプールのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価した。
【００７４】
５．ｃＨＡクロマトグラフィー精製工程
ウィルスろ過溶液を、さらに、ｃＨＡタイプＩＩ樹脂（粒度４０μＭ）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を充填されたヒドロキシアパタイトカラム（６０ｃｍ×２０ｃｍ）で精製した。カラムを、平衡緩衝液１（リン酸ナトリウム０．３Ｍ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）３カラム容で平衡させた。第二の平衡工程を、平衡緩衝液２（リン酸ナトリウム５ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．２）４カラム容で行った。部分精製培地を、負荷緩衝液１：１（ｖ／ｖ）（リン酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ７．２）中、流速２．５ｃｍ／分で樹脂上に負荷した。ｃＨＡカラムを、洗浄緩衝液（リン酸ナトリウム５ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．２）３カラム容で洗浄した。Ｍｙｏ−２９抗体を、溶出緩衝液（リン酸ナトリウム５ｍＭ、ＮａＣｌ  ３５０ｍＭ、ｐＨ６．８）６カラム容を用いて、ｃＨＡ樹脂から溶出した。
【００７５】
ｃＨＡ精製工程を、ＵＶ吸光度および導電率クロマトグラフプロフィルの目視検査、吸光度（２８０ｎｍ）による産物回収、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によって決定されるＨＭＷＡ除去、および拮抗酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）によって決定されるプロテインＡ除去によって監視した。
【００７６】
ｃＨＡカラムを、ストリッピング緩衝液（リン酸ナトリウム０．３Ｍ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）でストリッピングし、再生緩衝液（リン酸カリウム０．５Ｍ、ＮａＯＨ  １．０Ｍ、ｐＨ１３．３）で再生した。カラムを、０．０２Ｍ  ＮａＯＨ中に保管した。表４には、ｃＨＡクロマトグラフィーが、効果的に、ＨＭＷＡ不純物を抗体調製物から除去することが示される。さらに、ｃＨＡクロマトグラフィーは、他の不純物（プロテインＡなど）を除去可能である。
【００７７】
【表４】
0005490156.tif 000005
【００７８】
６．限外ろ過／ろ過透析および最終ろ過
ｃＨＡ溶出物プールを、３０，０００名目分子量限界を有する複合再生セルロース膜からなるＰＬＣＴＫ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  カセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を用いる接線流限外ろ過システムを通して送った。この工程の目的は、ｃＨＡ産物プールを濃縮し、それを処方緩衝液中に緩衝液交換することであった。ｃＨＡ産物プールを、５０％スクロース溶液で割って（ｗ／ｖ）、スクロースの濃度を２％にした。Ｍｙｏ−２９抗体を、約２０ｇＬ−１に濃縮し、次いで処方緩衝液（Ｌ−ヒスチジン０．０１Ｍ、スクロース２％、ｐＨ６．０）≧約９洗浄容でろ過透析した。ろ過透析が完了した際に、産物を、さらに、約６０ｇＬ−１に濃縮し、重力滴下および空気吹き出しによって、および引続く処方緩衝液による保持物通路のフラッシングによって装置から回収した。薬剤物質Ｍｙｏ−２９の濃度目標は、≧３５ｇ／Ｌである。
【００７９】
Ｍｙｏ−２９薬剤物質を、最終的に、０．２２ミクロンフィルターを通してろ過し、処方緩衝液（Ｌ−ヒスチジン０．０１Ｍ、スクロース２％、ｐＨ６．０）と平衡させ、ボトルに等分し、次いで−８０℃で保管した。
【００８０】
実施例２：タイプＩ樹脂を用いる抗ＧＤＦ−８抗体調製物のｃＨＡ精製
Ｍｙｏ−２９抗体はまた、成功裡に、３．１Ｌカラム中に充填されたタイプＩｃＨＡ樹脂（４０μＭ粒度）を用いて精製された。カラムを、平衡緩衝液１（リン酸ナトリウム０．３Ｍ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）３カラム容で平衡させた。第二の平衡工程を、平衡緩衝液２（リン酸ナトリウム５ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．２）４カラム容で行った。アニオン交換精製工程からの部分精製培地を、負荷投与３５ｍｇ／ｍｌおよび流速１．５ｃｍ／分で樹脂上に負荷した。ｃＨＡカラムを、洗浄緩衝液（リン酸ナトリウム５ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ７．２）３カラム容で洗浄した。Ｍｙｏ−２９抗体を、溶出緩衝液（リン酸ナトリウム３ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ７．２）６カラム容を用いて、ｃＨＡ樹脂から溶出した。
【００８１】
ｃＨＡカラムを、ストリッピング緩衝液（リン酸ナトリウム０．３Ｍ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）でストリッピングし、再生緩衝液（リン酸カリウム０．５Ｍ、ＮａＯＨ  １．０Ｍ、ｐＨ１３．３）で再生した。カラムを、０．０２Ｍ  ＮａＯＨ中に保管した。
【００８２】
ｃＨＡ精製工程を、ＵＶ吸光度および導電率クロマトグラフプロフィルの目視検査、吸光度（２８０ｎｍ）による産物回収、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析によって決定されるＨＭＷＡ除去、および拮抗酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）によって決定されるプロテインＡ除去によって監視した。表５に示されるように、タイプＩ樹脂を用いるｃＨＡ精製は、ＨＭＷＡの百分率を、第一のサイクルで２７％から０．９％へ低減可能であり、さらにＨＭＷＡ百分率を第二のサイクルで０．６％へ低減可能であった。加えて、タイプＩ樹脂は、タイプＩＩ樹脂のそれより高い負荷投与に適合し、一方依然として、十分なモノマー収率をもたらした。最終的に、タイプＩ樹脂を用いるｃＨＡ精製は、プロテインＡ不純物の量を減少可能である。
【００８３】
【表５】
0005490156.tif 000006
【００８４】
実施例３：タイプＩ樹脂を用いる抗ＣＤ２２抗体調製物および抗Ａｂｅｔａ抗体調製物のｃＨＡ精製
実施例２に記載されるｃＨＡ精製処理はまた、ＨＭＷＡを抗ＣＤ２２および抗Ａｂｅｔａの両抗体調製物から十分に除去可能であった。用いられた処理は、精製抗体モノマーが、溶出緩衝液（リン酸ナトリウム３ｍＭ、ＮａＣｌ  １．５Ｍ、ｐＨ７．２）１５カラム容で勾配溶出されたことを除いて、実施例２に記載されたものと類似であった。
【００８５】
表６に示されるように、タイプＩ樹脂を用いるｃＨＡ精製は、抗ＣＤ２２抗体調製物中のＨＭＷＡを、０．５％へ、抗Ａｂｅｔａ抗体調製物中については検知限界未満へ低減可能であった。さらに、ｃＨＡ精製工程は、プロテインＡ汚染物を、抗体調製物から除去可能であった。
【００８６】
【表６】
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【００８７】
実施例４：抗ＧＤＦ−８抗体のフロースルー方式ｃＨＡ精製
Ｍｙｏ−２９抗体はまた、成功裡に、フロースルー方式のｃＨＡ精製プロトコルを用いて精製された。１．６×２０ｃｍのＶａｎｔａｇｅカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（粒度４０μｍの樹脂）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、２００ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基、ｐＨ９．０）中で充填した。カラムを、平衡緩衝液１（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）３カラム容、および平衡緩衝液２（ＮａＣｌ  ３５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）３カラム容で平衡させた。Ｍｙｏ−２９抗体調製物を、負荷緩衝液（ＮａＣｌ  ３５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）中に緩衝液交換し、次いでｃＨＡカラムに負荷した。カラムを、洗浄緩衝液（ＮａＣｌ  ３５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）で洗浄し、ストリッピング緩衝液（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）でストリッピングし、次いで再生緩衝液（リン酸カリウム５００ｍＭ、ＮａＯＨ  １．０Ｍ、ｐＨ１３．３）で再生した。全流速を、２．５〜３ｃｍ／分で保持した。カラム流出物を、ＨＰＬＣシステムを用いるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００８８】
抗体調製物からのＭｙｏ−２９回収およびＨＭＷＡ除去の概要を表７に示す。調製物は、初期には、ＨＭＷＡ（負荷）１４．４％を含んだ。これは、本発明のｃＨＡ精製方法を用いて、ＨＭＷＡ（フロースルー）０．２％へ低減された。
【００８９】
【表７】
0005490156.tif 000008
【００９０】
実施例５：タイプＩ樹脂を用いる抗ＧＤＦ−８抗体のフロースルー方式ｃＨＡ精製
１．１×２１ｃｍのＶａｎｔａｇｅカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ（粒度４０μｍの樹脂）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、２００ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基、ｐＨ９．０）中で充填した。カラムを、平衡緩衝液１（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）３カラム容、および平衡緩衝液２（ＮａＣｌ  １．０Ｍ、リン酸ナトリウム３ｍＭ、ｐＨ７．２）３カラム容で平衡させた。Ｍｙｏ−２９抗体調製物を、負荷緩衝液（ＮａＣｌ  １．０Ｍ、リン酸ナトリウム３ｍＭ、ｐＨ７．２）中に緩衝液交換し、次いで負荷投与２６ｍｇ／ｍｌでｃＨＡカラムに負荷した。カラムを、洗浄緩衝液（ＮａＣｌ  １．０Ｍ、リン酸ナトリウム３ｍＭ、ｐＨ７．２）で洗浄し、ストリッピング緩衝液（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）でストリッピングし、次いで再生緩衝液（リン酸カリウム５００ｍＭ、ＮａＯＨ  １．０Ｍ、ｐＨ１３．３）５カラム容で再生した。流速を、負荷および洗浄に対しては９０ｃｍ／時間未満で、精製処理の残りに対しては２４０ｃｍ／時間未満で保持した。カラム流出物を、ＨＰＬＣシステムを用いるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００９１】
抗体調製物は、初期には、ＨＭＷＡ（負荷）２７．２％を含んだ。これは、ＨＭＷＡ（フロースルー）６．１％へ低減された。さらに、抗体モノマーの回収は、７２％であった。
【００９２】
実施例６：抗ＣＤ２２抗体調製物のｃＨＡ精製
セラミックＨＡクロマトグラフィー精製はまた、抗ＣＤ２２抗体調製物を精製する際に有用であると示された。１．６×２０ｃｍのＶａｎｔａｇｅカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（粒度４０μｍの樹脂）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、ｐＨ９．０で２００ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基）中で充填した。カラムを、平衡緩衝液１（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）３カラム容、および平衡緩衝液２（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）３カラム容で平衡させた。抗ＣＤ２２抗体調製物を、（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）中に緩衝液交換し、次いでｃＨＡカラムに負荷した。カラムを、洗浄緩衝液（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）３カラム容で洗浄し、次いで（リン酸ナトリウム５ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）１５カラム容で勾配溶出した。カラムを、ストリッピング緩衝液（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）でストリッピングし、次いで再生緩衝液（リン酸カリウム５００ｍＭ、ＮａＯＨ  １．０Ｍ）で再生した。全流速を、２．５〜３ｃｍ／分で保持した。カラム流出物を、ＨＰＬＣシステムを用いるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００９３】
図３に示されるように、ｃＨＡ精製は、成功裡に、ＨＭＷＡを抗ＣＤ２２抗体調製物から除去した。負荷物中の％ＨＭＷＡは、１．７％であり、一方ｃＨＡ溶出物中の％ＨＭＷＡは、０．０％であった。
【００９４】
実施例７：抗Ａｂｅｔａ抗体のｃＨＡ精製
セラミックＨＡクロマトグラフィー精製はまた、抗Ａｂｅｔａ抗体調製物を精製する際に有用であると示された。１．６×２０ｃｍのＶａｎｔａｇｅカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（粒度４０μｍの樹脂）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、ｐＨ９．０で２００ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基）中で充填した。カラムを、平衡緩衝液１（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）３カラム容、および平衡緩衝液２（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）５カラム容で平衡させた。抗Ａｂｅｔａ抗体調製物を、（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）中に緩衝液交換し、次いでカラムに負荷した。カラムを、洗浄緩衝液（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、リン酸ナトリウム５ｍＭ、ｐＨ６．８）５カラム容で洗浄し、次いで５ｍＭ（リン酸ナトリウム５ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）１５カラム容で勾配溶出した。カラムを、ストリッピング緩衝液（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）でストリッピングし、次いで再生緩衝液（リン酸カリウム５００ｍＭ、ＮａＯＨ  １．０Ｍ）で再生した。全流速を、２．５〜３ｃｍ／分で保持した。カラム流出物を、ＨＰＬＣシステムを用いるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【００９５】
図４に示されるように、ｃＨＡ精製は、成功裡に、ＨＭＷＡを抗Ａｂｅｔａ抗体調製物から除去した。負荷物中の％ＨＭＷＡは、２．６％であり、一方ｃＨＡ溶出物中の％ＨＭＷＡは、０．０％であった。
【００９６】
実施例８：精製Ｍｙｏ−２９抗体の活性評価
実施例１に記載された方法にしたがって精製された抗ＧＤＦ−８抗体（Ｍｙｏ−２９）を、拮抗酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬＩＳＡ）を用いて、結合活性について検定した。拮抗ＥＬＩＳＡは、他の精製抗体の結合活性を試験するのに用いられるであろう。Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), 1988, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい。ＧＤＦ−８レセプター（ＡｃｔＲｌｌβ．Ｆｃ）（２μｇ／ｍｌ）を、容積１００μｌ／ウェルの９６ウェル微小力価プレート上に吸着した。プレートを、次いで、２〜８℃で終夜培養した。プレートを、洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％）で二回洗浄し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の４％溶液でブロックして、非特定結合が最少にされた。プレートを、室温で１．５〜３．０時間培養し、洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．０５％）で二回洗浄した。
【００９７】
Ｍｙｏ−２９抗体参照標準を、連続的に、４倍に検定希釈剤（ＢＳＡ  ０．５％、ＮａＣｌ  １３７ｍＭ、ＫＣｌ  ２．７ｍＭ）中に希釈し、全８標準点を得た。試験試料は、プロテインＡクロマトグラフィー工程によって精製されたＭｙｏ−２９抗体画分、およびさらなるｃＨＡ精製工程後に精製された画分を含んだ。これらの試験試料をまた、連続的に、２倍に検定希釈剤に希釈して、標準曲線の範囲内に入る８点を得た。標準および試験試料を、適切な検定ウェルに５０μｌ／ウェルで加えた。ビオチン化拮抗物（ビオチン標識ＧＤＦ８）（５０ｎｇ／ｍＬ）を、次いで、各ウェルに５０μｌ／ウェルで加えた。プレートを、プレート振盪機上で、室温で終夜培養した。
【００９８】
プレートを、洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．０５％）で４回洗浄し、結合ビオチン標識ＧＤＦ−８を、ストレプタビジン結合ワサビダイコンペルオキシダーゼ（１：５０００、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、Ａｌａｂａｍａ）１００μｌ／ウェルを添加することにより検知した。プレートを、プレート振盪機上で、５０〜７０分間室温で培養し、次いで３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＢｉｏＦＸ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）１００μｌ／ウェルを加えることによって展開した。各ウェルの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて４５０ｎｍで決定する。試験試料中の活性Ｍｙｏ−２９の量は、間接的に、検定で生じた信号に比例する。反応を、０．１８Ｍ  Ｈ２ＳＯ４  １００μｌ／ウェルを添加することによって停止した。
【００９９】
試験試料中のビオチン化ＧＤＦ−８を結合可能なＭｙｏ−２９の濃度を、４変数のロジスティック等式を用いて適合された標準曲線から内挿した。試験試料の生物学的活性値（％活性タンパク質）を、次いで、活性タンパク質濃度（ＥＬＩＳＡによって決定される）を全タンパク質濃度（Ａ２８０によって決定される）で除算し、さらにこの比率を１００倍することによって計算した。同じ試料が別個のバッチで精製される場合には、生物学的活性値の平均が計算された。生物学的活性値を表８に報告する。
【０１００】
【表８】
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【０１０１】
表８に示されるように、Ｍｙｏ−２９は、実施例１に記載される処理によって精製された後にも、ＧＤＦ−８を結合する能力が残る。精製Ｍｙｏ−２９の結合活性は、プロテインＡ精製からのピーク溶出画分において、いくらかより低い。しかし、結合活性は、実施例１に記載されるさらなるｃＨＡ精製工程後には、参照Ｍｙｏ−２９抗体を超える。
【０１０２】
実施例９：抗ＧＤＦ−８抗体の結合／フロースルー組合せ方式ｃＨＡ精製
結合／フロースルー組合せ方式のセラミックＨＡクロマトグラフィー精製はまた、抗ＧＤＦ−８抗体調製物を精製するのに有用であると示された。次に詳述される実験を、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）で実施した。１．１×２１ｃｍのＶａｎｔａｇｅカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ（粒度４０μｍの樹脂）（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、ｐＨ９．０で２００ｍＭリン酸ナトリウム（二塩基）中で充填した。カラムを、平衡緩衝液１（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）３カラム容、および平衡緩衝液２（ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、リン酸ナトリウム２．０ｍＭ、アルギニン１００ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １００ｍＭ、ｐＨ７．３）５カラム容で平衡させた。抗ＧＤＦ−８抗体調製物を、負荷投与２０ｍｇ／ｍｌでカラム上に負荷した。カラムを、洗浄緩衝液２で洗浄し、ストリッピング緩衝液（リン酸ナトリウム３００ｍＭ、ＮａＣｌ  １．０Ｍ、ｐＨ６．８）でストリッピングし、次いで再生緩衝液（リン酸カリウム５００ｍＭ、ＮａＯＨ  １．０Ｍ、ｐＨ１３．３）で再生した。負荷および洗浄に対する流速は、１．５ｃｍ／分であった。精製処理の残りに対する流速を、２．５〜３．０ｃｍ／分で保持した。カラム流出物を、ＨＰＬＣシステムを用いるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０１０３】
結果は、結合／フロースルー組合せ方式のｃＨＡタイプＩＩ樹脂の操作が、ＨＭＷＡを抗体調製物から除去するのに効果的であることを示した。調製物は、当初、ＨＭＷＡ（負荷）２７％を含んだ。これは、本発明のｃＨＡ精製方法を用いて、ＨＭＷＡ（フロースルー）１．１％へ低減された。
【０１０４】
実施例１０：タイプＩ樹脂を用いる抗ＧＤＦ−８抗体の結合／フロースルー組合せ方式ｃＨＡ精製
実施例９に記載される手順を、タイプＩＩｃＨＡ樹脂の代わりにタイプＩｃＨＡ樹脂を用いて繰返した。緩衝液条件は、平衡緩衝液２が、ｐＨ７．３で、リン酸ナトリウム５．０ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、アルギニン１２０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭからなっていることを除いて、実施例９で用いられたものと同じであった。
【０１０５】
表９に示されるように、結合／フロースルー組合せ方式におけるｃＨＡタイプＩ樹脂の操作は、ＨＭＷＡを抗体調製物から除去し、一方抗体モノマーの収率を維持するのに効果的である。さらに、結合／フロースルー組合せ方式は、プロテインＡ不純物を除去するのに効果的である。最終的に、タイプＩｃＨＡ樹脂は、負荷投与を５５ｍｇ／ｍｌ増大させた。
【０１０６】
【表９】
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【０１０７】
実施例１１：ｃＨＡ緩衝液条件の高処理量スクリーン
高処理量スクリーンを、緩衝液条件（ｃＨＡ−タイプＩ樹脂を用いて、Ｍｙｏ−０２９抗体調製物を精製するのに用いられる）を最適化するために行った。スクリーンは、ｃＨＡ−タイプＩ樹脂上のリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、アルギニン、およびＭｙｏ−０２９のレベルを変動させ、Ｍｙｏ−０２９および高分子量凝集体（ＨＭＷＡ）の樹脂への結合程度を決定した。
【０１０８】
ｃＨＡタイプＩ樹脂（５０μｌ）を、９６ウェルフィルタープレートの各ウェルに加えた。各ウェル（表１０〜１２にＡ１、Ａ２・・・Ｈ１１、Ｈ１２と標識付けされる）を、ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ｐＨ７．２、ならびにホスフェート（表１０）、塩化ナトリウム（表１１）、およびアルギニン（表１２）の独特の組合せからなる平衡緩衝液中で平衡させた。
【０１０９】
【表１０】
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【０１１０】
【表１１】
0005490156.tif 000012
【０１１１】
【表１２】
0005490156.tif 000013
【０１１２】
独特の平衡緩衝液を各ウェルに添加した後、Ｍｙｏ−０２９および凝集体の混合物を、各ウェルに加えた。負荷投与中の凝集体レベルは、２５％であった。緩衝液の成分は、平衡中、同じレベルで保持された。物質を、２０分間振盪し、平衡に達するようにした。上澄みを、フィルタープレートの各ウェルから除去した。抗体調製物添加の他の段階を行い、プレートを振盪し、上澄みを除去した。７段階まで行った。各段階で結合しなかったタンパク質を、分析して、全タンパク質濃度を決定した（Ａ２８０ｎｍにおける吸光度による）。モノマーおよび凝集体の量を、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定した。凝集体のいかなる減少も、精製につながる条件を示した。表１３および１４は、最初の４段階のプールにおいて、ウェル毎の凝集体およびモノマーの百分率を示す。
【０１１３】
【表１３】
0005490156.tif 000014
【０１１４】
【表１４】
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【０１１５】
高処理量スクリーンは、カラム精製スキームにおけるモノマー回収およびＨＭＷＡ除去を定量的に予測可能であった。例えば、ウェルＣ８（ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ホスフェート１ｍＭ、ＮａＣｌ  １７５０ｍＭ、アルギニン１２ｍＭ、ｐＨ７．２）からの条件は、ｃＨＡタイプＩ樹脂を充填されたカラムで試験された。凝集体レベルは、２．５％へ減少され、モノマー収率は、カラム精製後に７２％であった。ウェルＤ５（ＨＥＰＥＳ  ２０ｍＭ、ホスフェート５ｍＭ、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、アルギニン１２０ｍＭ、ｐＨ７．２）からの条件はまた、ｃＨＡ−１樹脂を充填されたカラムで試験された。凝集体レベルは、０．７％へ減少され、モノマー収率は、カラム精製後に７３％であった。最後に、ウェルＣ３（ＨＥＰＥＳ  １００ｍＭ、ホスフェート１ｍＭ、ＮａＣｌ  １２０ｍＭ、アルギニン２００ｍＭ、ｐＨ７．２、この場合高レベルのＨＥＰＥＳは、ＮａＣｌに類似のイオン強度を与える）に同等の条件は、ｃＨＡ−１樹脂を充填されたカラムで試験された。凝集体レベルは、４％へ減少され、モノマー回収は、カラム精製後に６９％であった。これらの結果は、高処理量スクリーニングは、モノマー回収およびＨＭＷＡ除去の両者によって測定された際に、カラム性能を過少に評価することを示す。しかし、高処理量スクリーニングは、収率および純度の両者を定量的に予測可能である。
【０１１６】
本明細書に挙げられた全ての参照文献は、各個々の出版物、もしくは特許または特許出願が、本質的かつ個別に、全ての目的に対してその全体が参照により援用されることを示すと同程度に、全ての目的に対してかつそれらの全てが参照により本明細書に援用される。参照により援用される出版物、および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示に矛盾する場合、本明細書は、これらの矛盾する項目に優先するものである。
【０１１７】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる成分の量、反応条件などを表す数字は、全ての場合に、用語「約」によって変更されるものと理解されるべきである。したがって、別段の指示がない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に挙げられる数字パラメーターは、近似である。これは、本発明によって得られることを求められる所望の特性により変動するであろう。少なくとも、かつ特許請求の範囲に均等論を適用することを限定するものでなく、各数字パラメーターは、実質的な桁数および通常の四捨五入法に照らして解釈されるであろう。
【０１１８】
この発明の多くの修正および変更形態が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく為されるであろうことは、当業者には自明であろう。本明細書に記載される特定の実施形態は、例としてのみ提供され、いかなる意味においても限定することを意味しない。本明細書および実施例は、具体例としてのみ見なされ、本発明の真の範囲および精神は、特許請求の範囲によって示されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】ＨＭＷＡを抗ＧＤＦ−８抗体調製物から分離するための先行技術ホスフェート傾斜溶出の不適格性を示す。
【図２】ＮａＣｌ傾斜溶出の使用により、大部分のＨＭＷＡが、抗ＧＤＦ−８抗体調製物から分離されることを示す。
【図３】ｃＨＡクロマトグラフィーを用いる抗ＣＤ２２抗体調製物からのＨＭＷＡの分離を示す。
【図４】ｃＨＡクロマトグラフィーを用いる抗Ａｂｅｔａ抗体調製物からのＨＭＷＡの分離を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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