(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域と配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｂ）配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域と配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域
を含んでなる、単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号２のＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、又はＴｈｒ２０８、或いはこれらの任意の組み合わせを含むエピトープに結合する、請求項１に記載の単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
【請求項３】
ヒトＮＫＧ２Ｄ（ｈＮＫＧ２Ｄ）への結合でＭＩＣＡと競合する、請求項１又は２に記載の抗体、又はその抗原結合断片であって、
（ａ）ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を低減する特性、
（ｂ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上におけるＮＫＧ２Ｄの量を低減する特性、
（ｃ）固定化すると、ＣＤ３によってトリガーされる抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を有意に同時刺激しなくなる特性、
（ｄ）カニクイザル及びアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合する特性、及び
（ｅ）１ｎＭ以下のＫＤでｈＮＫＧ２Ｄに結合する特性
のうちの１又は複数を有する抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
特性（ａ）から（ｃ）までを有する、請求項３に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
配列番号４４のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８又はＡｓｐ９９、或いは配列番号４５のＴｙｒ３３又はＴｒｐ９７、又はこれらの任意の組み合わせに対応する残基を含むパラトープを含んでなる、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合媒体。
【請求項６】
（ａ）配列番号４８の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４９の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５０の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
と、随意で
（ｄ）配列番号５１の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号５３の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
とを含んでなる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
（ａ）配列番号５４の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５５の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５６の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
と、随意で
（ｄ）配列番号５７の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号５８の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号５９の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、又はその抗原結合断片の生産方法であって、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合断片をコードする核酸を含む宿主細胞を、適切な条件下で培養し、そこから前記抗体又は抗原結合断片を回収する方法。
【請求項９】
請求項１ないし７のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含んでなる、炎症性疾患又は自己免疫疾患に罹患しているか、又は罹患する危険のあるヒト対象者の炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療するための医薬。
【請求項１０】
炎症性疾患又は自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、セリアック病、潰瘍性大腸炎、クローン病、移植片拒絶、又は移植片対宿主病である、請求項９に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＮＫＧ２Ｄに対する抗体、及びヒトの疾患及び障害の治療又は予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫レセプターＮＫＧ２Ｄは、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞に発現する。ヒトＮＫＧ２Ｄ（ｈＮＫＧ２Ｄ）ホモ二量体レセプターは、前もって活性化させたＣＤ８＋細胞上において、そのＤＡＰ１０会合を介したＴＣＲとＣＤ２８＋ＴＣＲシグナル伝達の同時刺激装置として機能し、ＮＫ細胞においては直接的活性化因子として機能する。ｈＮＫＧ２Ｄの種々のリガンドが同定されて特徴付けられており、これにはＭＨＣクラスＩ関連リガンドであるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ、ＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリー、及びレチノイン酸初期トランスクリプト１（ＲＡＥＴ１）ファミリーが含まれる。
関節リウマチのような慢性自己免疫疾患では、ｈＮＫＧ２Ｄは、ＣＤ４＋ＣＤ２８−Ｔ細胞のサブセットに発現し、それら細胞の増殖及びＩＦＮγ生成の刺激に関与しており、ＭＩＣ発現は上方制御されている（Grohら、PNAS 2003;100:9452）。クローン病において、ＣＤ４＋ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＴ細胞は、ＭＩＣＡ相互作用により炎症性及び細胞障害性の応答を媒介する（Allezら、Gastroenterology 2007;132:2346-2358）。ＮＫＧ２Ｄが自己免疫性炎症の必須ドライバーであるとする当初の示唆は、マウスＮＫＧ２Ｄ（ＣＸ５）に結合してこれを遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、糖尿病のマウスモデル（ＮＯＤマウス）において糖尿病を引き起こす炎症を予防及び治療する（Ogasawaraら、Immunity 2004; 20:757-767）ことに由来しており、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の治療への応用を示唆するものである。このような使用例は、例えば、米国特許出願公開第２００５０１５８３０７号、国際公開第２００５０９７１６０号、同２００５１１５５１７号、及び同２００６０２４３６７号に記載されている。
ヒトＮＫＧ２Ｄに対するマウスｍＡｂｓは開示されている（例えば、Pendeら、Eur J Immunol 2001;31:1076-86, 国際公開第０２０６８６１５号、Bauerら、Science 1999:285:727-9; Castriconiら、PNAS 2003;100:4120-25; 及びAndreら、Eur J Immunol 2004;34:1-11を参照）か、或いは市販されている（例えば、R&D Systemsの抗体149810（米国ミネソタ州）及びBeckman Coulter Inc.のON72）が、これらは免疫原性である。文献に報告されている唯一の完全なヒト抗ＮＫＧ２Ｄ  ｍＡｂは、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達に対し、アゴニスト効果とアンタゴニスト効果の両方を持つと報告されており（Kwongら、J Mol Biol 2008;384:1143-1156）、このために炎症性及び／又は自己免疫性疾患の治療剤としての適性が低い。
したがって、炎症性及び／又は自己免疫性疾患及び障害の治療的使用に最適な特性を有する抗ｈＮＫＧ２Ｄ  ｍＡｂｓに対する需要が存在する。本発明は、これらの需要及び他の需要に対応して、複数の追加的利点を提供する。これについては本明細書の残りの部分に説明する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、ヒトへの治療的応用に有用な、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体を提供する。通常、抗体は、患者に投与されたときに、当該抗体に対する免疫応答の危険を最小限に抑えるため、完全なヒト抗体又はヒト化抗体である。このような抗体から、例えば、抗原結合抗体断片、抗体誘導体、及び多選択性の分子といった他の抗原結合分子を設計又は誘導することができる。
一態様において、抗体は、一又は複数の機能的特性により、又は機能的特性の組み合わせにより特徴付けられる。例示的な特性には、例えば、ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性活性を阻害すること、ｈＮＫＧ２Ｄへの結合において、少なくとも１つの天然ｈＮＫＧ２Ｄリガンド、又は複数のリガンドと競合すること、ｈＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ細胞又はＴ細胞の表面におけるｈＮＫＧ２Ｄの量を低減させること、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄにも結合すること、１つのｈＮＫＧ２Ｄ二量体につき抗体分子が１つだけ結合すること、ｈＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ及び／又はＴ細胞に添加されたとき、３以上のｈＮＫＧ２Ｄ二量体に架橋しないこと、結合時にｈＮＫＧ２Ｄシグナル伝達に対して有意なアゴニスト効果を有さないこと、及び／又は１ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）でｈＮＫＧ２Ｄに結合することなどが含まれる。本発明の特定の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、更に又は或いは、抗体ＭＳ及び２１Ｆ２を含む、本明細書に開示される一又は複数の特定のヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体とほぼ同じエピトープと競合してこのエピトープに結合するか、或いは本明細書に開示される一又は複数の特定のヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体と同じか又はそれよりも強い親和性で結合することができる。例えば、一実施態様では、抗体は、更に又は或いは、既知のマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体（例えば、上記に記載の抗体）より高いＭＳ及び／又は２１Ｆ２との競合能、或いはＭＳ及び／又は２１Ｆ２の遮断能を有する。一実施態様では、抗体はＭＳ及び／又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄエピトープに結合する。別の実施態様では、抗体は、更に又は或いは、ＭＳと同じエピトープに結合する。当業者であれば、本発明の一実施態様によって提供される抗体又は本発明の一実施態様において使用される抗体が、３、４、又は５以上の上記特徴を呈しうることが分かるであろう。
【０００４】
別の態様では、抗体は、更に又は或いは、本明細書に記載のＭＳ又は２１Ｆ２のパラトープ及び／又は抗原結合配列と同一又は類似の一又は複数のパラトープ及び／又は抗原結合配列を含む。
他の態様では、本発明は、本発明の抗体をコードする核酸、そのような核酸を含む発現ベクター、そのような核酸を含む宿主細胞、本発明の抗体を生成する宿主細胞、及びそのような宿主細胞を適切な条件下で培養することにより抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を生成する方法を提供する。
このような抗体の抗体結合断片、並びに、例えば遺伝子操作した抗体断片、抗体誘導体、二重特異性抗体及びその他多選択性分子を含むそのような抗原結合断片を含む分子も提供される。そのような抗体或いは他の分子を含む製薬的組成物及びキット或いはその他の物品も提供される。
更には、そのような抗体、分子、及び組成物を用いた、ｈＮＫＧ２Ｄ活性、ｈＮＫＧ２Ｄシグナル伝達、或いはｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の活性を低下させる又は阻害する方法、炎症を低減する方法、並びに自己免疫性及び／又は炎症性疾患又は障害（限定しないが、関節リウマチ、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、乾癬性関節炎、多発性硬化症、セリアック病、ウイルス性疾患（例えばウイルス肝炎）、及び種々の器官及び組織の移植片拒絶（限定しないが、心臓及び骨髄を含む）を含む）の治療又は予防方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ＫＭマウス（登録商標）系のｈＮＫＧ２Ｄ免疫化マウス由来の例示的血清の分析を示す。ＮＫＧ２Ｄ発現ＢＡＦ／３細胞又はコントロール細胞に対する様々な時点でのフローサイトメトリー分析により、１μｌの血清中のＮＫＧ２Ｄ選択性結合により抗体の力価が増大することが判明した（Ａ）。６回目の免疫化後に採取した血清（１μｌ）を用いたプレインキュベーションには、ＮＫＧ２Ｄに対するＭＩＣＡ−Ｆｃの結合を防ぐことができる抗体が含まれていた（Ｂ）。
【図２】ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（Ａ）に特異的に結合するが、ＮＫＧ２Ｄを発現しない同じ細胞株（Ｂ）には結合しないハイブリドーマの上清の形態のヒト抗体の一実施例を示す。ハイブリドーマの上清の形態の細胞に抗体を添加した。直接標識されたポジティブコントロール細胞である、マウス抗ＮＫＧ２Ｄ抗体１４９８１０の、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞（Ｃ）及び非発現細胞（Ｄ）に対する結合を示す。黒のアウトラインはバックグラウンド染色を示し、実線のピークは特異的な染色を示す。
【図３】市販のマウス抗体（ＯＮ７２及び１４９８１０）と比較した場合の、組換えで発現されて精製された完全なヒトＩｇＧ４抗体（１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２）のＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合の用量反応を示す。
【図４Ａ】ヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体１６Ｆ１６、及び１６Ｆ３１（Ａ）と、ＩｇＧ４アイソタイプのＭＳ及び２１Ｆ２（Ｂ）との重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）のアミノ酸配列を示しており、可変領域（太字）及びＣＤＲ領域（下線）が強調されている。アミノ酸配列及び種々の強調部分に対応する配列識別子は表１に示されている。
【図４Ｂ】ヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体１６Ｆ１６、及び１６Ｆ３１（Ａ）と、ＩｇＧ４アイソタイプのＭＳ及び２１Ｆ２（Ｂ）との重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）のアミノ酸配列を示しており、可変領域（太字）及びＣＤＲ領域（下線）が強調されている。アミノ酸配列及び種々の強調部分に対応する配列識別子は表１に示されている。
【図５Ａ】対応する組換え生殖系列配列とのＶＨ及びＶＬ配列のアラインメントを示す。ＣＤＲ領域は太字のカバット（Ｋａｂａｔ）数で示されており、体細胞突然変異は太字且つ下線で示す文字で示されている。（Ａ）１６Ｆ１６  ＩｇＧ４重鎖；（Ｂ）１６Ｆ１６  ＩｇＧ４軽鎖；（Ｃ）１６Ｆ３１  ＩｇＧ４重鎖；（Ｄ）１６Ｆ３１  ＩｇＧ４軽鎖。配列番号２７〜３０は、それぞれ組換えＶＨ３＿２１／Ｄ３−９／ＪＨ４、ＶＫＩ＿Ｌ１５／ＪＫ２、ＶＨ３＿２０／Ｄ３−１０／ＪＨ６、及びＶＫＩＩＩ＿Ａ２７／ＪＫ３に対応している。
【図５Ｂ】対応する組換え生殖系列配列とのＶＨ及びＶＬ配列のアラインメントを示す。ＣＤＲ領域は太字のカバット（Ｋａｂａｔ）数で示されており、体細胞突然変異は太字且つ下線で示す文字で示されている。（Ｅ）ＭＳ  ＩｇＧ４重鎖；（Ｆ）ＭＳ  ＩｇＧ４軽鎖；（Ｇ）２１Ｆ２  ＩｇＧ４重鎖；（Ｈ）２１Ｆ２  ＩｇＧ４軽鎖。配列番号６０〜６３は、それぞれ組換えＶＨ４＿５９／ＪＨ３、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７／ＪＫ１、ＶＨ５＿５１／Ｄ３＿１０＿Ｒ３／ＪＨ４、及びＶＫＩＩＩ＿Ｌ６／ＪＫ１に対応している。
【図６】例示的ヒト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によるリガンド−（ＭＩＣＡ−）結合の遮断を示しており、これは、ハイブリドーマの上清中での抗体を用いたプレインキュベーションによるリガンド結合の遮断によって示されている。アウトラインはバックグラウンドを示し、グレーの部分はプレインキュベーション無しのリガンド結合を示し、点線を伴う黒い部分はプレインキュベーションによるリガンド結合を示す。
【図７】組換えで発現されて精製された完全なヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体（１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２；ＩｇＧ４アイソタイプ）の種々の濃度を分析する際に得られた用量反応曲線を示し、１μｇのＭＩＣＡ−ｍＦｃ結合の完全な遮断を行うのに必要なＩＣ５０及び用量を示している。
【図８】ＮＫＧ２Ｄに対するＯＮ７２のＮＫＧ２Ｄ結合が、１６Ｆ１６を含むハイブリドーマの上清を用いたプレインキュベーションによって完全に遮断されたことを示している。アウトラインはバックグラウンドを示し、グレーの部分はプレインキュベーション無しのＯＮ７２結合を示し、黒い点線はプレインキュベーションによるＯＮ７２結合を示す。
【図９】完全なヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の、ＮＫＧ２Ｄに対するマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体のその後の結合又は逆の結合の遮断能を示している。（Ａ）１６Ｆ１６：組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６（０．３μｇ；ＩｇＧ４アイソタイプ）を用いたプレインキュベーションにより、ＮＫＧ２Ｄに対するＯＮ７２（０．３μｇ）の結合が阻止された。インキュベーションの順番を逆にした場合、ＯＮ７２（０．３μｇ）を用いたプレインキュベーションによる、組換えで発現されて精製されたＩｇＧ４アイソタイプ（０．３μｇ）１６Ｆ１６の結合阻止は８５％に過ぎず、完全ヒト抗体による結合に用いられるＮＫＧ２Ｄがいくらか残存していることが示された。これは、ＯＮ７２によって結合されるものに対する少なくとも部分的に異なるエピトープを示唆している。抗体１４９８１０は、１４９８１０対１６Ｆ１６の抗体濃度をそれぞれ１：１（０．３μｇ、０．３μｇ）、及び３：１（１μｇ、０．３μｇ）として試験したとき、組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６（ＩｇＧ４アイソトープ）の交差抑制を約５０％しか示さなかった。このことも、ＮＫＧ２Ｄに対する結合エピトープの差異を示す。以下のようなインキュベーション及び検出の組み合わせを使用した：１６Ｆ１６プレインキュベーションを行った場合（ａ）又は行わない場合（ｂ）のＯＮ７２検出；ＯＮ７２のプレインキュベーションを行った場合（ｃ）又は行わない場合（ｄ）の１６Ｆ１６検出；１６Ｆ１６（０．３μｇ）のプレインキュベーションを行った場合（ｅ）又は行わない場合（ｆ）の１４９８１０検出；１４９８１０（１．０μｇ）のプレインキュベーションを行った場合（ｇ）又は行わない場合（ｈ）の１６Ｆ１６検出；１６Ｆ１６のプレインキュベーション（０．３μｇ）を行った場合（ｉ）又は行わない場合（ｊ）の１４９８１０検出；１４９８１０のプレインキュベーション（１．０μｇ）を行った場合（ｋ）又は行わない場合（ｌ）の１６Ｆ１６（０．３μｇ）の検出；１６Ｆ１６の検出（０．３μｇ）。（Ｂ）ＭＳ：０．１μｇのマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を、０．１μｇのＭＳ抗体を用いたプレインキュベーションを行って、又は行わずに、インキュベートし、その後フローサイトメトリーを使用して抗マウス抗体により検出した。ＭＳによるプレインキュベーションを行わない０．１μｇのＯＮ７２、１Ｄ１１、又は１４９８１０によるインキュベーションを、１００％に正規化してそれぞれ（ａ）、（ｃ）、及び（ｅ）に示した。０．１μｇのＭＳによるインキュベーションを３０分に亘って行った後、ＯＮ７２、１Ｄ１１、又は１４９８１０のインキュベーション及び検出を行った結果をそれぞれ（ｂ）、（ｄ）、及び（ｆ）に示す。ＭＳによるプレインキュベーションは、ＯＮ７２、１Ｄ１１、及び１４９８１０のＮＫＧ２Ｄ結合をそれぞれ９８％、８８％、及び９６．５％抑制し、少なくとも幾つかの抗体に類似のエピトープを示唆した。（Ｃ）２１Ｆ２：２１Ｆ２によるプレインキュベーションを行った場合（ａ）又は行わない場合（ｂ）のＯＮ７２結合の検出；２１Ｆ２によるプレインキュベーションを行った場合（ｃ）又は行わない場合（ｄ）の１Ｄ１１結合の検出、及び２１Ｆ２：２１Ｆ２を用いた（ｅ）又は用いない（ｆ）１４９８１０結合の検出（すべての抗体は０．１μｇ）。
【図１０】元のハイブリドーマから精製されたＯＮ７２及び１６Ｆ１６抗体によるアカゲザル又はカニクイザル（ｃｙｎｏ）細胞の染色を示す。（Ａ）ｃｙｎｏ  ＮＫ細胞、（Ｂ）ｃｙｎｏ  ＣＤ８＋Ｔ細胞、（Ｃ）アカゲザルＮＫ細胞、及び（Ｄ）アカゲザルＣＤ８＋Ｔ細胞。提示された値は、結合の平均蛍光強度（ＭＦＩ）であり、二次抗体の結合のＭＦＩのみを抽出したものである。いずれの種においても、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する結合は観察されなかった。
【図１１】異なる抗体濃度での精製された抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるヒト又はカニクイザルＣＤ８陽性細胞に対するヒト抗体ＭＳの結合を示し、これは、ヒトとカニクイザルＮＫＧ２Ｄに対する親和性が類似していることを示唆している。
【図１２】５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、リガンド遮断抗体（ＯＮ７２又は組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６（ＩｇＧ４アイソタイプ））の添加により、ＭＩＣＡを発現する標的細胞のＮＫ媒介性の死滅が、用量に依存して遮断されたことを示す。
【図１３】組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６及び１６Ｆ３１（共にＩｇＧ４アイソタイプ）が、用量に依存してＮＫ９２細胞によるＭＩＣＡを有する標的細胞（ＢａＦ／３）（Ａ）及びＵＬＢＰ３を有する標的細胞（ＢａＦ／３）（Ｂ）両方の殺傷を抑制することができ、０．８μｇ／ｍｌの１６Ｆ１６により両方のリガンドについてほぼ完全にブロックすることができ、試験した最高用量である２０μｇ／ｍｌの１６Ｆ３１により、両方のリガンドについて一部遮断することができたことを示す。
【図１４】組換えで発現されて精製されたＭＳ、２１Ｆ２、及び１６Ｆ１６（すべてＩｇＧ４アイソタイプ）が、リガンドを発現する標的細胞のＮＫ媒介性の殺傷を抑制することができたことを示す。（Ａ）ＭＳ又は２１Ｆ２による、ＮＫ−９２細胞のＵＬＢＰ３−ＢａＦ／３細胞殺傷の抑制。（Ｂ）ＭＳ又は１６Ｆ１６による、ＢａＦ／３−ＭＩＣＡ細胞を死滅させるＮＫＬ細胞の抑制。
【図１５】ＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を形質移入したＢａＦ／３細胞を用いた、細胞表面のＮＫＧ２Ｄの抗体誘導性の減少を示す。図は、コントロール（抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を用いずに一晩インキュベートした後の細胞表面ＮＫＧ２Ｄレセプター＝１００％）と比較した場合の、ＯＮ７２（１μｇ）又は組換えで発現されて精製されたヒト抗体１６Ｆ１６（１μｇ；ＩｇＧ４アイソタイプ）又は１６Ｆ３１（３μｇ；ＩｇＧ４アイソタイプ）を用いて一晩インキュベートした後に細胞表面に残ったＮＫＧ２Ｄレセプターの割合（％）を示す。
【図１６】（図１５の場合と同様に）ＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を形質移入したＢａＦ／３細胞（Ａ）、又は抹消血から調製された新鮮なヒトＮＫ細胞を用いた、細胞表面のＮＫＧ２Ｄの抗体誘導性の減少を示す。（Ｂ）では、ＩｇＧｓが存在する血液中の状況を模倣するためにヒト血清の存在下で、且つＭＳ抗体の濃度を変化させて、ヒトＮＫ細胞を一晩インキュベートした。最も低い濃度においてさえ、最大の発現低下が達成され、それは、ＮＫＧ２Ｄ＋  ＮＫ細胞で同様の条件下における結合アッセイにおいて測定された約６０％のレセプター飽和に相当するものであった。
【図１７】図示の各濃度で２１Ｆ２抗体を一晩インキュベーションした後でのヒトＮＫ細胞の細胞表面ＮＫＧ２Ｄの減少割合を示す。
【図１８】各時点における、ヒト血液試料中の異なる種類の細胞の表面に提示されるＮＫＧ２Ｄに対する、ＯＮ７２、ＭＳ、及び２１Ｆ２の影響を示す。各抗体の濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。理論に拘束されずに述べると、実験において表面に提示されるＮＫＧ２Ｄは、ＮＫＧ２Ｄの内部移行を表わしていると考えられる。図（Ａ）〜（Ｃ）は、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びδγＴ細胞それぞれの抗体誘導性ＮＫＧ２Ｄ内部移行を示している。ＭＳ及び２１Ｆ２による表面関連ＮＫＧ２Ｄの減少は、ＯＮ７２より少なかった。
【図１９】同時刺激を可能にするＣＤ３の２つの異なる最適以下の用量を用いて、Ｔ細胞増殖に対する固定化ＭＳ及びＯＮ７２のアゴニスト作用を試験するアッセイの結果を示している。（Ａ）[ＣＤ３]＝０．１ｎｇ／ｍｌｍｌ；（Ｂ）[ＣＤ３]＝０．３ｎｇ／ｍｌ。図示のように、４日間に亘るＩＬ−２刺激後３日間に亘って固定化抗体により刺激したＰＢＭＣ集団におけるＣＦＳＥ希釈によりＴ細胞の増殖を評価した。ＣＤ２８刺激が同時刺激のポジティブコントロールとして含まれている。ＭＳについては有意なアゴニスト作用は検出されなかったが、ＯＮ７２はＴ細胞増殖に対し、小さいものの有意な作用を有していた。
【図２０Ａ】抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＭＳ又はｈｚＯＮ７２）のＦａｂ断片、又はＭＩＣＡリガンドと複合したｈＮＫＧ２Ｄ二量体の３次元重複表示を示す。ｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体（「ＮＫＧ２Ｄ」）が表面図に示されており、単量体の１つが他よりも暗い色で示されている。Ｆａｂ断片（それぞれ「ＭＳ」及び「ｈｚＯＮ７２」）が、黒のチューブで示されており、ＭＩＣＡ（「ＭＩＣＡ」が明るい色の概略的二次構造表現で示されている。（Ａ）では、ｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ  Ｆａｂ及びｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡ結晶複合構造が重ね合わせて示されている（Ｌｉ等、Nat Immunol 2001;2:443-451; PDBコード1HYR、テンプレートとして共通のｈＮＫＧ２Ｄ分子のＣアルファ原子を使用）。ＭＩＣＡ及びＭＳは共にＮＫＧ２Ｄニ量体に非対称に結合し、ＮＫＧ２Ｄ二量体に結合したときの、２つのリガンド分子の可能な相対的結合方向が示されている。この方向について、ｈＮＫＧ２Ｄに対する重ね合わせの計算値においてＭＩＣＡとＭＳ  Ｆａｂとの間には大きな重複があり、これはＭＳ  Ｆａｂが、ＭＩＣＡのｈＮＫＧ２Ｄレセプターへの結合を遮断する能力を有することを示すものであった。実施例１１を参照。
【図２０Ｂ】抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＭＳ又はｈｚＯＮ７２）のＦａｂ断片、又はＭＩＣＡリガンドと複合したｈＮＫＧ２Ｄ二量体の３次元重複表示を示す。ｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体（「ＮＫＧ２Ｄ」）が表面図に示されており、単量体の１つが他よりも暗い色で示されている。Ｆａｂ断片（それぞれ「ＭＳ」及び「ｈｚＯＮ７２」）が、黒のチューブで示されており、ＭＩＣＡ（「ＭＩＣＡ」が明るい色の概略的二次構造表現で示されている。（Ｂ）では、ｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ  Ｆａｂ及びｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡ結晶複合構造が重ね合わせて示されている（Ｌｉ等、Nat Immunol 2001;2:443-451; PDBコード1HYR、テンプレートとして共通のｈＮＫＧ２Ｄ分子のＣアルファ原子を使用）。ＭＩＣＡ及びＭＳは共にＮＫＧ２Ｄニ量体に非対称に結合し、ＮＫＧ２Ｄ二量体に結合したときの、２つのリガンド分子の可能な相対的結合方向を示す。この方向について、ｈＮＫＧ２Ｄに対する重ね合わせの計算値においてＭＩＣＡとＭＳ  Ｆａｂとの間には大きな重複があり、これはＭＳ  Ｆａｂが、ＭＩＣＡのｈＮＫＧ２Ｄレセプターへの結合を遮断する能力を有することを示すものであった。実施例１１を参照。
【図２０Ｃ】抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（ＭＳ又はｈｚＯＮ７２）のＦａｂ断片、又はＭＩＣＡリガンドと複合したｈＮＫＧ２Ｄ二量体の３次元重複表示を示す。ｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体（「ＮＫＧ２Ｄ」）が表面図に示されており、単量体の１つが他よりも暗い色で示されている。Ｆａｂ断片（それぞれ「ＭＳ」及び「ｈｚＯＮ７２」）が、黒のチューブで示されており、ＭＩＣＡ（「ＭＩＣＡ」が明るい色の概略的二次構造表現で示されている。（Ｃ）では、ｈＮＫＧ２Ｄ／ｈｚＯＮ７２  Ｆａｂ及びｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＩＣＡの複合結晶構造が重ね合わせて示されている。ｈＮＫＧ２Ｄの各単量体には、ｈｚＯＮ７２Ｆａｂが結合する。ｈＮＫＧ２Ｄに対する重ね合わせの計算値において、ｈｚＯＮ７２抗体もＭＩＣＡ結合部位と大きく重複しており、ｈｚＯＮ７２がｈＮＫＧ２Ｄに対するＭＩＣＡの結合を遮断できることを示している。実施例１２を参照。
【図２１Ａ】２つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）中の、ＭＳ  ＦａｂのｈＮＫＧ２Ｄニ量体のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）におけるエピトープ残基を示す。結晶構造リガンド原子から４．０Å以内のＮＫＧ２Ｄは結合エピトープの一部と考え、下線で示す。二重下線で示す残基は、リガンドに対する水素結合に関与していた。Ａは、ｈＮＫＧ２Ｄニ量体におけるｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１及び２上の単独のＭＳ  Ｆａｂの結合エピトープである。結晶学的モノマーＮ及びＣがＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１に組み込まれており、結晶学的モノマーＭ及びＤがＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット２に組み込まれている。単量体ユニット２では、Ｌｙｓ１５０側鎖原子Ｎζだけが、２つの結晶学的に独立の複合体の１つにおける水素結合に関与していた。表９〜１２も参照のこと。
【図２１Ｂ】２つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）中の、ＭＳ  ＦａｂのｈＮＫＧ２Ｄニ量体のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）におけるエピトープ残基を示す。結晶構造リガンド原子から４．０Å以内のＮＫＧ２Ｄは結合エピトープの一部と考え、下線で示す。二重下線で示す残基は、リガンドに対する水素結合に関与していた。Ｂは、ｈＮＫＧ２ｄ単量体ユニット１及び２に同時に結合した２ｈｚＯＮ７２  Ｆａｂの各結合エピトープである。Ｔｒｐ１６６は、結晶学的に独立の分子複合体（１のｈＮＫＧ２Ｄ単量体と複合した１のｈｚＯＮ７２  Ｆａｂ分子）の１つにおける水素結合に関与していたが、他方における水素結合には距離が離れすぎていた。表１４〜１５を参照。
【図２１Ｃ】２つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）中の、ＭＳ  ＦａｂのｈＮＫＧ２Ｄニ量体のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの配列（配列番号２）におけるエピトープ残基を示す。結晶構造リガンド原子から４．０Å以内のＮＫＧ２Ｄは結合エピトープの一部と考え、下線で示す。二重下線で示す残基は、リガンドに対する水素結合に関与していた。Ｃは、ｈＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１及び２上のＭＩＣＡ分子の結合エピトープである。ＭＩＣＡは、ｈＮＫＧ２Ｄニ量体に対して非対称な結合を示し、したがってＭＳ−Ｆａｂに対して２つの方向に結合する。ＭＩＣＡの第２の方向は、２つの単量体ユニットの発現量を単純に交換することにより得られる。
【図２２】ｈＮＫＧ２Ｄ分子を、表面図において他よりやや暗い色で示している。それぞれの結晶構造ＭＳ／ｈｚＯＮ７２／ＭＩＣＡ  Ｆａｂ原子から４．０Å以内のＮＫＧ２Ｄ原子を黒色で示しており、（Ａ）はＭＳ  Ｆａｂを、（Ｂ）は２つのｈｚＯＮ７２  Ｆａｂを、（Ｃ）及び（Ｄ）はＭＩＣＡを示している。ＭＩＣＡ及びＭＳ  Ｆａｂは、共にＮＫＧ２Ｄニ量体に非対称に結合するので、ＮＫＧ２Ｄに対する結合方向は異なる場合がある。これは、ＭＳに対するＭＩＣＡの２つの可能な相対的結合方向を示す図（Ｃ）及び（Ｄ）に示されている。表９〜１２及び１４〜１５も参照。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
（定義）
本明細書で使用する「ｈＮＫＧ２Ｄ」という用語と、更には特に断らない限り「ＮＫＧ２Ｄ」という用語は、「ＮＫＧ２−Ｄ」、「ＣＤ３１４」、「Ｄ１２Ｓ２４８９Ｅ」、「ＫＬＲＫ１」、「キラー細胞レクチン様レセプターサブファミリーＫ、メンバー１」、及び「ＫＬＲＫ１」としても知られ、ヒトキラー細胞活性化レセプター遺伝子、そのｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００７３６０；配列識別番号１）、及びその遺伝子産物（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０３１３８６；配列識別番号２）、又はその自然発生変異体を指す。ＮＫ及びＴ細胞では、ｈＮＫＧ２Ｄレセプターのリガンド結合形態はホモ二量体である（Li等、Nat Immunol 2001;2:443-451）。ｈＮＫＧ２Ｄレセプターは、通常、ＤＡＰ１０との複合体で表面に現れ（Wu等、J Exp Med 2000;192:1059以下参照：ＮＣＢＩ受け入れ番号ＡＡＧ２９４２５、ＡＡＤ５０２９３）、更に高次の複合体も形成することが示唆されている。本明細書でｈＮＫＧ２Ｄによるものとされるあらゆる活性、例えば、細胞活性化、抗体認識等は、複合体の形態のｈＮＫＧ２Ｄ、又はＤＡＰ１０及び／又はその他の構成要素との更に高次の複合体にも帰することができる。
本明細書中の「抗体」なる用語は、最も広義の意味で用いられ、特に、所望の生物学的活性を表す限り、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、特に断らない限り、抗原結合断片、抗体変異体、及びそれらの多特異性分子を包含する。一般に、完全長抗体は、間をジスルフィド結合又はその抗原結合タンパク質により接続された、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではＶＨと略す）及び重鎖定常領域とからなっている。重鎖定常領域は、３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなっている。各軽鎖は軽鎖可変領域（ここではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域からなっている。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、即ちＣＬからなっている。ＶＨ及びＶＬ領域は更に、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる高頻度可変領域に小分割されており、そこにはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるそれよりも保存度の高い領域が散在している。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番で配置されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体分子構造と、抗体作製に関連する種々の技術との一般的な原理は、例えば、Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)に提供されている。
【０００７】
抗体の「抗原結合断片」は、抗原に対して検出可能に結合することができる完全長抗体の一部であり、一般に少なくともＶＨ領域の一又は複数の部分を含んでいる。抗原結合断片は、抗体の、１、２、３、又は４以上の抗原結合部分を含む多価の分子と、ＶＬ及びＶＨ領域、又はその選択された部分が合成リンカーによって、又は組換え方法によって接合されて機能的な抗原結合分子を形成する一本鎖構造とを包含する。抗体の一部の抗原結合断片は大きな抗体分子を断片化（例えば、酵素的切断）して得られるが、多くは通常組換え技術により作製される。
本明細書では、用語「抗体誘導体」と「イムノコンジュゲート」とは、交換可能に使用され、完全長抗体又はその抗原結合断片を意味するもので、この場合、例えば第二の分子に抗体を連結させるために、例えばアルキル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成などによって一又は複数のアミノ酸が化学的に修飾されているものである。例示的な修飾には、ペグ化抗体（例えばシステイン-ペグ化）、ビオチン化、放射標識、及び第２薬剤（細胞障害性剤）との抱合が含まれる。
【０００８】
「多選択性分子」は、抗体又はその抗原結合断片を含み、これは少なくとも１つの他の機能的分子に関連又は連結していることにより、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する分子を形成する。例示的な多選択性分子には、二重特異性抗体、及び可溶性レセプター断片又はリガンドに連結された抗体が包含される。
本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域が共にヒトの生殖系列の免疫グロブリン配列に由来している（即ち、同一又はほぼ同一である）可変領域を有する抗体を包含する。更に、この抗体が定常領域を含む場合、この定常領域もヒトの生殖系列の免疫グロブリン配列に「由来」している。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含みうる（例えば、無作為又はin vitroでの部位特異性の変異原生によって、或いはin vivoでの体細胞突然変異によって導入された突然変異）。しかしながら、本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語は、マウスのような別の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植されている抗体は含まない。
【０００９】
「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むヒト／非ヒトのキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又は実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又は実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列の残基である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体はまた、場合によって免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。詳しくは、例えばJones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；及び、Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)、国際公報９２／０２１９０、米国特許公開２００６００７３１３７及び米国特許第６７５０３２５号、同第６６３２９２７号、同第６６３９０５５号、同第６５４８６４０号、同第６４０７２１３号、同第６１８０３７０号、同第６０５４２９７号、同第５９２９２１２号、同第５８９５２０５号、同第５８８６１５２号、同第５８７７２９３号、同第５８６９６１９号、同第５８２１３３７号、同第５８２１１２３号、同第５７７０１９６号、同第５７７７０８５号、同第５７６６８８６号、同第５７１４３５０号、同第５６９３７６２号、同第５６９３７６１号、同第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号及び同第５２２５５３９号を参照のこと。
【００１０】
本明細書中で用いられる「高頻度可変領域」なる用語は抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；（Kabat等, （1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ出版番号91-3242)及び／又は「高度可変ループ」の残基(軽鎖可変ドメインにおいては残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインにおいては２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３);Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。一般的に、この領域のアミノ酸残基の番号付けは、上掲のカバット等において記述される方法によって行われる。本明細書中の「カバット位置」、「カバットに記載の可変ドメイン残基番号付け」、及び「カバットによると」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインのためのこの番号付けシステムを指す。カバット番号付けシステムを用いて、実際の直鎖状のペプチドのアミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又は挿入に応じてアミノ酸が減っていても又は増えていてもよい。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸挿入(カバットによると残基５２ａ)を含んでいてもよいし、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによると残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)を含んでいてもよい。残基のカバット番号付けは、抗体の配列の相同領域に「標準の」カバット番号付けした配列と整列させて所定の抗体について決定してもよい。
【００１１】
本明細書において定められるように、「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基はＣＤＲ以外のＶＨ又はＶＬ残基である。
「エピトープ」又は「結合部位」とは、抗原結合ペプチド（例えば抗体）が特異的に結合する抗原上の１のエリア又は領域である。タンパク質のエピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優勢成分とも呼ばれる）と、結合に直接的には関与しないアミノ酸残基、例えば特異的に抗原に結合するペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基（つまり、このアミノ酸残基は、特異的に抗原に結合するペプチドの「溶媒排除表面」及び／又は「フットプリント」内に位置する）とを含むことができる。本明細書のエピトープという用語は、特に断らない限り、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体、又は本発明による他のｈＮＫＧ２Ｄ特異性薬剤に特に結合するｈＮＫＧ２Ｄの任意の特定の領域内の両方の種類のアミノ酸結合部位を包含する（例えば、文脈によっては、本発明は特定のアミノ酸残基に直接結合する抗体に関する）。ＮＫＧ２Ｄは、多数の異なるエピトープを含むことができ、これには、限定しないが、（１）直鎖ペプチド抗原決定基、（２）成熟ＮＫＧ２Ｄ立体構造中において互いに近接する一又は複数の非隣接アミノ酸からなる立体構造抗原決定基、及び（３）全体又は一部が、ＮＫＧ２Ｄに共有結合的に付着した分子構造からなる翻訳後抗原決定基、例えば炭水化物基が含まれる。特に断らず、文脈上矛盾しない限り、立体構造抗原決定基は、抗原結合ペプチドの原子から約４Åの距離内にＮＫＧ２Ｄアミノ酸残基を含む。
【００１２】
「溶媒排除表面」とは、コンピュータの演算において、例えば分子のリガンドへの結合により、どのような水分子も到達し得ない分子の領域である（Lee及びRichards, J Mol Biol 1971;55:379-400、参照により本明細書に包含する）。
対象とする抗体（例えば、ＭＳ又は２１Ｆ２）と「ほぼ同じエピトープ又は決定基に結合する」という表現は、抗体が、対象とする抗体が特異的に結合するＮＫＧ２Ｄ分子について、対象とする抗体と「競合する」ことを意味する。
【００１３】
「パラトープ」とは、抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合部の一エリア又は領域である。特に断らず、文脈上明らかに矛盾しない限り、パラトープは、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基であって、うち幾つかは通常ＣＤＲ内にあるアミノ酸残基と、結合に直接関与しないアミノ酸残基、例えば特異的に結合した抗原によって効果的に遮断されるアミノ酸残基とを含むことができる（即ち、アミノ酸残基は、特異的に結合した抗原の「溶媒排除表面」及び／又は「フットプリント」内にある）。
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の、天然ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えばＭＩＣＡ）に対するＮＫＧ２Ｄ分子の結合を「遮断」する能力は、この抗体が、可溶性の又は細胞表面に関連するＮＫＧ２Ｄ及びリガンド分子を用いたアッセイにおいて、用量に依存して、リガンドに対するＮＫＧ２Ｄ分子の結合を検出可能に低減することができることを意味し、この場合、ＮＫＧ２Ｄ分子は抗体の不在下においてリガンドに検出可能に結合する。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体がＭＩＣＡ結合を遮断できるかどうかを決定するための例示的アッセイが実施例３において提供される。同じアッセイを使用して、他のＮＫＧ２Ｄリガンドの抗体媒介性の結合を試験することができる。
【００１４】
ポリペプチドの「変異体」は、参照ポリペプチド、一般的に天然又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、天然のアミノ酸配列内の特定の位置に一又は複数のアミノ酸置換、欠失及び／又は挿入を、及び／又は一方又は両方の末端に追加を有してもよい。
２つのアミノ酸配列の関係において「実質的に同一の」なる用語は、例えば初期設定のギャップ加重(default gap weights)を用いたプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって、場合によって整列させた場合に、配列が、少なくともおよそ５０パーセントの配列同一性を共有することを意味する。通常、実質的に同一の配列は、少なくともおよそ６０、少なくともおよそ７０、少なくともおよそ８０、少なくともおよそ９０、少なくともおよそ９５、少なくともおよそ９８又は少なくともおよそ９９パーセントの配列同一性を示す。
【００１５】
２つの実質的に同一のアミノ酸配列の「対応する」アミノ酸位は、本明細書中で言及したいずれかのタンパク質分析ソフトウェアを用いて整列したものである。
他の核酸配列と機能的な関係にある場合、核酸配列は、別の核酸配列（又は要素）と「作用可能に連結して」いる。例えば、プレシーケンス(presequence)又は分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関わる前駆体タンパク質として発現する場合、そのポリペプチドのＤＮＡ（即ち、その発現をコードする）と作用可能に結合している。プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響する場合はコード配列と作用可能に連結している。或いは、リボソーム結合部は、それが翻訳を促す位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したＤＮＡ配列が近接していること、分泌リーダーの場合は近接して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーのような幾つかの要素は、作用可能に連結するためにコード配列と近接する必要はない。連結は、都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
【００１６】
「単離される」分子は、属する分子の種類に関して見られる組成物中の主な種である分子である(すなわち、それは、組成物中の分子の種類の少なくともおよそ５０％を占め、一般的に組成物中の分子、例えばペプチドの種類の少なくともおよそ７０％、少なくともおよそ８０％、少なくともおよそ８５％、少なくともおよそ９０％、少なくともおよそ９５％又はより多くを占める)。一般に、抗体分子の組成物は、組成物中に存在するすべてのペプチド種類の関係において、又は、少なくとも提案された使用の関係において実質的に活性なペプチド種類に関して、抗体分子の９８％、９８％又は９９％の均一性を表すであろう。
本発明の前後関係において、前後関係によって否定されない限り、「処置」又は「治療する」は、疾患又は障害の一又は複数の症状又は臨床的に関連する徴候を予防するか、緩和するか、管理するか、治癒するか、又は低減することを指す。例えば、症状又は疾患ないし障害の臨床的に関連する兆候が同定されていない患者の「処置」は予防又は防止的な治療であるのに対して、症状又は疾患ないし障害の臨床的に関連する兆候が同定されている患者の臨床的、治療的、又は対症的な「処置」は一般的に予防又は防止的な治療を成さない。処置の各形態は、本発明の個別の態様と考えることができる。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、例えば、自己免疫性及び炎症性の疾患及び障害など、ＮＫＧ２Ｄに関係する状態に罹患したヒト患者を治療するのに適する特性を有する、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体に部分的に基づく。本発明の抗体は、典型的には、患者自身の免疫系による、該抗体に対する免疫応答の危険性を最小化するために、完全なヒト抗体であるか又はヒト化抗体であり、その活性形態におけるｈＮＫＧ２Ｄ、すなわち、細胞の表面上にあり、ＤＡＰ１０と会合するホモ二量体に結合する。
本発明の抗体は、典型的には、ＮＫＧ２Ｄ活性を低下させるべき状態の治療に有用である。このような抗体は、例えば、ＮＫＧ２Ｄに対する結合について１又は複数の種類の内因性ＮＫＧ２Ｄリガンドと競合するか、又はこれらを遮断すること、結合時に細胞表面のＮＫＧ２Ｄ量を発現低下するか又は他の形でこれを低減すること、及び／又は細胞に対するＡＤＣＣ反応又はＣＤＣ反応を誘発することにより、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞及び／又はＴ細胞の活性化を低下させるか又は阻害することができる。
【００１８】
一態様において、本発明の抗体はアンタゴニストであり、ヒトＮＫＧ２Ｄに対する結合について、ＭＩＣＡなど、１又は複数の種類の天然リガンドと競合し、これにより、リガンド誘導性のＮＫＧ２Ｄ活性を低下させる。ＭＩＣＡ分子は炎症性疾患に関係していることが明らかであり、実施例３で示すように、細胞表面のＮＫＧ２Ｄ、特に、ＭＳ及び２１Ｆ２に対するＭＩＣＡ結合の遮断において、数種のヒト抗体が有効であり、エピトープの決定により、ＭＳ  ＦａｂがＭＩＣＡの結合を妨害することが示された（実施例１１、図２０）。ＭＳ及び２１Ｆ２は共に、ＮＫ細胞を介する細胞障害性の遮断において高度に効果的であった（実施例６）。このように、これらの結果は、本発明が、このような特性を有する抗体を提供することを実証する。
より特殊な態様では、本発明の抗体は効率的なアンタゴニストであるが、ｈＮＫＧ２Ｄのシグナル伝達に対するアゴニスト効果は有意でなく、このため、ＮＫＧ２Ｄにより駆動される炎症には寄与しない。例えば、図１９に示すように、ＣＤ３抗原によりトリガーされるＰＢＭＣの増殖に対する固定化ＭＳによる同時刺激が検出できなかったのに対し、固定化ＯＮ７２では、わずかではあるが有意な同時刺激が結果としてもたらされた。理論に拘束されずに述べると、この違いは、図２０〜２２に示すエピトープの違いに少なくとも部分的に起因する可能性がある。２価ＭＳ抗体の抗原結合部分は、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体複合体内の１つの単量体に強く結合するが、該第２の単量体に対する第２のＭＳ抗体（又は同じ抗体の第２の抗原結合部分）の結合を遮断する。これに対して、２価ｈｚＯＮ７２抗体の抗原結合部分がｈＮＫＧ２Ｄ二量体内の第１の単量体に結合する場合、これは該第２の単量体に対する第２のｈｚＯＮ７２抗体（又は同じ抗体の第２の抗原結合部分）の結合を遮断しない。
【００１９】
一実施態様において、本発明は、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞に添加されると、２つ以下のｈＮＫＧ２Ｄ二量体を架橋するヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。このような抗体は２価であることが好ましい。１つのＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットに対して抗原結合部分が結合すると、第２のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットに対するそのさらなる結合が遮断される２価抗体（例えば、ＭＳなど）は、２つまでのｈＮＫＧ２Ｄ二量体を架橋できる。これに対して、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体内における第２のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットに対する結合を遮断することなく、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体内におけるＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットに結合できる２価抗体は、任意の数のｈＮＫＧ２Ｄ二量体に対する架橋を結果としてもたらすことができる。表面受容体のクラスター形成は、受容体の活性化において生じることが通例である。
一実施態様において、本発明は、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞に添加されると、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体複合体内の１つの単量体だけに強く結合するヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。理論に拘束されずに述べると、該二量体の両方の単量体に対する強い結合は、ＮＫＧ２Ｄ受容体活性化の前提条件でありうる。ＭＩＣＡ及びｈｚＯＮ７２は、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体内における両方の単量体ユニットに対して強く結合する。しかし、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体に対するＭＳの結合では、該単量体ユニットの１つに対する結合が優越する一方、第２の単量体ユニットに対する結合は弱く非特異的であり、該第２のｈＮＫＧ２Ｄ単量体上における溶媒排除表面積は減少する（実施例１１）。個別の具体的な好ましい実施態様では、本発明の抗体の結合による、第１及び第２のＮＫＧ２Ｄ単量体ユニットの溶媒排除表面積比は、約１：１より大きく、少なくとも約２：１、又は少なくとも約３：１である。
【００２０】
一実施態様において、本発明は、ＭＳと本質的に同じエピトープに結合するヒト又はヒト化抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。理論に拘束されずに述べると、ｈＮＫＧ２Ｄ二量体上における特殊な残基又は残基の組合せとリガンドが相互作用すると、アゴニスト活性が回避又は最小化されうる。個別且つ特定の実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）からなる群から選択される少なくとも１の残基、同群から選択される少なくとも３の残基、同群から選択される少なくとも５の残基、同群から選択される少なくとも８の残基、同群から選択される少なくとも１０の残基、同群から選択される少なくとも１２の残基、又は同群から選択されるすべての残基を含む。
一態様において、本発明は、ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞によるＮＫＧ２Ｄ媒介性の細胞障害性を有効に阻止し；ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合に対して少なくともＭＩＣＡと競合し；例えば、ｈＮＫＧ２Ｄの発現低下、ｈＮＫＧ２Ｄの内部移行、及び／又はｈＮＫＧ２Ｄの再出現の阻止により、結合時において、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を低減し；ｈＮＫＧ２Ｄに対する親和性が１０ｎＭ以下であって、カニクイザルＮＫＧ２Ｄ及び／又はアカゲザルＮＫＧ２Ｄと交差反応し；例えば、ＩｇＧ４アイソタイプを有することにより、非枯渇性である、完全ヒト抗体又はその抗原結合断片を提供する。特殊な実施態様において、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプの非枯渇性完全ヒト抗体であり、ｈＮＫＧ２Ｄに対する親和性が１ｎＭ以下、好ましくは３００ｐＭ以下であり、内因性ｈＮＫＧ２Ｄ−リガンド結合の少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも９０％を遮断し、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を少なくとも１０％、少なくとも３０％、又は少なくとも５０％低減する。別の特殊な実施態様において、抗体は、ＩｇＧ４アイソタイプの２価非枯渇性完全ヒト抗体であり、１００ｐＭ未満の親和性を有し、細胞表面と会合したＮＫＧ２Ｄに対する飽和用量のＭＩＣＡ−Ｆｃの結合に対する遮断のＥＣ５０濃度が０．０１ｎｇ／ｍｌ未満であり、結合時において、細胞表面のＮＫＧ２Ｄ量を少なくとも７５％低減する能力を有し、場合によっては、リガンドに誘導されるＮＫ細胞による細胞障害性の軽減に関するＥＣ５０濃度が、細胞表面と会合したＮＫＧ２Ｄに対する結合に必要とされるＥＣ５０濃度よりも低い。抗体は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞を用いるアッセイにおいて、ｈＮＫＧ２Ｄ受容体を飽和させに必要な濃度（すなわち、飽和用量）よりも低濃度で、最高レベルのｈＮＫＧ２Ｄ発現低下を達成する能力をさらに有することが可能である。
【００２１】
ｈＮＫＧ２Ｄに特異的に結合し、これらの特性の一部又は全部を有する抗体の作製、特徴付け、及び使用については、実施例を含む以下の節においてより詳細に説明される。
【００２２】
抗ＮＫＧ２Ｄ抗体
本発明の抗体は、特殊な機能及び／又は構造的な特徴もしくは特性を特徴とする。抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の機能活性を評価するアッセイについては実施例で詳細に説明され、例えば、アミノ酸配列などの構造的な特性については以下で説明される。
【００２３】
機能的特性
本発明の抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する。一実施態様において、本発明の抗体は、高い親和性で、例えば、１０−７Ｍ以下のＫＤ、１０−８Ｍ以下のＫＤ、１ｎＭ以下のＫＤ、０．３ｎＭ以下のＫＤ、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は０．０１ｎＭ以下のＫＤでｈＮＫＧ２Ｄに結合する。特殊な実施態様において、抗体は、０．１ｎＭ以下の親和性でｈＮＫＧ２Ｄに結合する。
一態様において、本発明は、また、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、ＮＣＢＩ受託番号第ＡＪ４２６４２９号）及びアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ、ＮＣＢＩ受託番号第ＡＪ５５４３０２号）などのサルにおける１又は複数の種類のＮＫＧ２Ｄ相同分子種、及び／又はｈＮＫＧ２Ｄホモ二量体、正確にフォールディングされた単量体完全長ｈＮＫＧ２Ｄ、ｈＮＫＧ２Ｄの細胞外部分を含むｈＮＫＧ２Ｄ断片、変性ｈＮＫＧ２Ｄ、もしくは前出のＮＫＧ２Ｄ形態の任意の組合せにも結合する抗体を提供する。例えば、実施例５で実証されるように、具体的なカニクイザル細胞型に対するヒト抗体２１Ｆ２及びＭＳの結合は、対応するＥＣ５０（すなわち、最大有効濃度の１／２）値で、同じヒト細胞型に対するそれらの結合の、それぞれ約６５％及び約７５％を超えた。したがって、一実施態様において、本発明の抗体は、それがｈＮＫＧ２Ｄに結合する場合と同様の親和性又は有効性で、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合する。例えば、抗体は、ＮＫＧ２Ｄを発現するヒトＮＫ細胞又はヒトＴ細胞の対応する集団のＥＣ５０の約５０％以上、約６５％以上、又は約７５％以上のＥＣ５０で、ＮＫＧ２Ｄを発現するカニクイザル又はアカゲザルのＮＫ細胞又はＴ細胞に結合できる。またないし或いは、抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄに対する親和性の約３０％以上、約５０％以上、約６５％以上、又は約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、もしくは約９０％以上の親和性で、カニクイザル又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合できる。このような抗体は、ヒトにおいて使用する前に、最も適する動物モデル（又は複数のモデル）における毒性試験が可能であるという利点を有する。
【００２４】
特定の一態様において、本発明の抗体はまた、ＯＮ７２など、公知のマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が結合しないＮＫＧ２Ｄの形態にも結合する。具体的には、実施例３で説明するように、ＯＮ７２によるプレインキュベーションでは、その後添加したヒト１６Ｆ１６のｈＮＫＧ２Ｄに対する結合の遮断が約８２％に過ぎなかったのに対し、１６Ｆ１６によるプレインキュベーションでは、その後添加したＯＮ７２のｈＮＫＧ２Ｄに対する結合の遮断は約９５％であった。
その上、本発明の抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄ媒介性のＮＫ細胞又はＴ細胞の活性化を低下させるか又は阻害することができ、すなわち、ｈＮＫＧ２Ｄ受容体をアンタゴナイズできる。これは、例えば、本明細書で説明されるか又は当技術分野で公知の１又は複数の種類の細胞障害性アッセイにおいて調べることができる。例えば、ある抗体が、任意の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の不在下又は非特異的なコントロール抗体の存在下における標的細胞の殺傷と比較して、ＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する標的細胞のＮＫ細胞又はＴ細胞媒介性の殺傷を少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％阻害する場合、該抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄ媒介性のＮＫ細胞又はＴ細胞の活性化を阻害する。
【００２５】
ｈＮＫＧ２Ｄアンタゴニストである本発明の抗体は、アゴニスト活性を全く有さないか又は同活性が低い。このような抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体であることが好ましい。アゴニスト活性は、本明細書で説明されるアッセイ又は当技術分野で公知のアッセイのうち１種において調べることができる。例えば、アッセイの１種は、固定化された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在又は不在下において、低レベルのＣＤ３抗原により刺激された末梢血リンパ球（ＰＢＭＣ）の増殖を測定する同時刺激アッセイである（実施例１０を参照されたい）。このようなアッセイにおいて、本発明の抗体の存在下における増殖は、抗体の不在下における増殖の３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下であるか、又はこれよりも顕著に高度ではない。本発明の抗体の存在下における増殖は、抗体の不在下における増殖よりも顕著に高度ではないことが好ましい。追加的又は代替的な実施態様において、本発明の抗体のｈＮＫＧ２Ｄアゴニスト活性は、コントロール値の３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下であるか、又はこれよりも顕著に高度ではない。コントロールは、例えば、抗体の不在下、細胞もしくは別の試薬の不在下、及び／又は非対象抗体の存在下などにあるネガティブコントロールであることが好ましい。本発明の抗体のアゴニスト活性は、コントロール値よりも顕著に高度ではないことが好ましい。
本発明の別の態様では、ＮＫ細胞又はＴ細胞の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０濃度よりも、リガンドに誘導される細胞障害性の遮断のＥＣ５０濃度の方が低く、好ましくは実質的に低い抗体を提供する。例えば、ＯＮ７２の場合、ＢａＦ／３細胞上に発現する細胞表面ＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０濃度（０．０６２μｇ／ｍｌ）が、リガンド（ＵＬＢＰ３）を発現する標的細胞に対するＮＫ細胞媒介性の殺傷の遮断のＥＣ５０濃度（０．０６５μｇ／ｍｌ）と同様であったのに対し、細胞表面のＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０（２１Ｆ２：０．０３３μｇ／ｍｌ；ＭＳ：０．０３２ｇ／ｍｌ）よりも、細胞障害性の遮断のＥＣ５０（２１Ｆ２：０．０２１μｇ／ｍｌ；ＭＳ：０．０１２μｇ／ｍｌ）の方が、２１Ｆ２では低く、ＭＳでは実質的に低かった（実施例６及び９を参照されたい）。さらに、ＭＳは、２１Ｆ２及び１６Ｆ１６（これらは、飽和濃度に対応するか又はそれ以上の濃度であった、図３）よりも低い濃度（細胞と会合するＮＫＧ２Ｄ受容体の約８０％のみの飽和に対応する濃度、図３）で、細胞障害性に対する最大の遮断を達成した。こうして、一実施態様において、本発明は、ＮＫ細胞又はＴ細胞の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０濃度よりも、リガンドに誘導される細胞障害性に対する遮断のＥＣ５０濃度の方が低い抗体、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体を提供する。細胞株又は適切な他の調製物のＮＫ細胞又はＴ細胞による細胞障害性の遮断のＥＣ５０は、同じ細胞株又は調製物の細胞表面ＮＫＧ２Ｄに対する結合のＥＣ５０に対して、例えば、約９５％以下、約９０％以下、約８５％以下、約８０％以下、約７０％以下、約５０％以下、又は約４０％以下でありうる。試験用の例示的な細胞株は、ＮＫ−９２細胞及びＮＫＬ細胞を含む。
【００２６】
別の実施態様において、本発明は、結合可能なｈＮＫＧ２Ｄ受容体を飽和させるのに必要な濃度よりも低い濃度で、ＮＫ細胞による細胞障害性の最大の遮断を達成する抗体を提供する。具体的な実施態様において、該抗体はまた、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合においてＭＳとも競合する。別の特定の実施態様において、このような抗体は、ＭＳと本質的に同じｈＮＫＧ２Ｄエピトープに結合する。
該抗体は、例えば、１又は複数の種類の内因性ｈＮＫＧ２ＤリガンドによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合に干渉することにより、ＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を低下させるか又は阻害することが可能である。該抗体は、例えば、ＭＩＣＡ；又はＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ；又はＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３；又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及びＵＬＢＰ３；又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ならびにＵＬＢＰ１、同２、同３、及び同４；又はＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及び１又は複数の種類のＲＡＥＴ１ファミリーメンバーによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を低下させるか又は阻害することにより、例えば、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ４、及び／又はＲＡＥＴ１ファミリーメンバーによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を低下させるか又は阻害することが可能である。内因性ＮＫＧ２ＤリガンドによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を阻害する抗体の能力は、本明細書で説明される結合アッセイ又は競合アッセイを用いて評価することができる。一実施態様において、本発明の抗体は、少なくとも３０％のリガンド結合、又は少なくとも５０％のリガンド結合、又は少なくとも７０％のリガンド結合、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％のリガンド結合を阻害する能力を有する。別の実施態様において、本発明の抗体が１μｇのＭＩＣＡ−ｍＦｃによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を阻害する場合のＩＣ５０は、１ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は０．０２ｎＭ以下、０．０１ｎＭ以下、０．００５以下、又は０．００２以下である。別の実施態様において、１μｇのＭＩＣＡ−ｍＦｃによる結合に対する完全な遮断は、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下、又は０．２ｎＭ以下、０．１ｎＭ以下、０．０５ｎＭ以下、又は約０．０２ｎＭ以下の抗体濃度で達成される。一実施態様において、本発明は、例えば、ＭＩＣＡによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合など、リガンドによるｈＮＫＧ２Ｄに対する結合を低下させるか又は阻害するために、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのいずれかと同程度に効果的であるか又はこれよりも効果的な抗体、とりわけ、ヒト抗体を提供する。
【００２７】
またないし或いは、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、結合時（すなわち、結合後）に、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を低減する能力を有しうる。抗体結合時における、細胞表面と会合したｈＮＫＧ２Ｄの低減は、これにより、リガンド結合及びその後の活性化に用いられるｈＮＫＧ２Ｄ受容体数が低減されるため、有利な特徴でありうる。理論に拘束されずに述べると、この低減は、ＮＫＧ２Ｄの発現低下、内部移行、又は他の機構により引き起こされる可能性がある。本明細書で示すように、ヒト抗体など、ヒトＦｃ領域を有する抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を有効に低減する能力を有する。例えば、ヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体である１６Ｆ１６、ＭＳ、及び２１Ｆ２はすべて、血清不在下における一晩に亘るインキュベーション後において、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ量を約７５％以上低減したが、ＭＳが最も有効であり、低濃度で７５〜９０％の発現低下を達成した（図１５〜１７）。血清存在下においても、ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＢａＦ／３細胞上における飽和濃度未満に対応するＭｓ濃度で、最大の発現低下が達成された（図１６Ｂ）。したがって、一実施態様において、本発明は、飽和濃度未満でｈＮＫＧ２Ｄに対する最大の発現低下を達成できる、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する抗体を提供する。別の実施態様において、このような抗体はまた、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、ＭＳとも競合する。別の実施態様では、このような抗体も、ＭＳと本質的に同じｈＮＫＧ２Ｄエピトープに結合する。本発明の抗体は、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の不在下又は非特異的なコントロール抗体の存在下において、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄと比較して、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、又は少なくとも９０％低減する能力を有しうる。該抗体は、細胞表面のＮＫＧ２Ｄに対する低減を達成する一方で、ＮＫＧ２Ｄ受容体のシグナル伝達に対する活性化を全く又はほとんど引き起こさない、すなわちアゴニスト活性を全く又はほとんど有さないことが好ましい。本明細書で、細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄ及び抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体のアゴニスト活性を評価する例示的なアッセイが説明される。一実施態様において、本発明は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０から選択されるコントロール抗体よりも高度の発現低下能力を有する抗体、特に、ヒト抗体を提供する。別の実施態様において、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、飽和濃度よりも低濃度で、細胞又は細胞株により発現される細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄに対する最大の発現低下を達成する能力を有しうる。
別の実施態様において、本発明は、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び／又は２１Ｆ２、より好ましくはＭＳ及び／又は２１Ｆ２と競合し、且つ／又はこれらと同じｈＮＫＧ２Ｄ上のエピトープに結合する抗体を提供する。このような抗体は、本明細書で説明される標準的なｈＮＫＧ２Ｄ結合アッセイにおいて、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と交差競合するそれらの能力に基づき同定することができる。ｈＮＫＧ２Ｄに対する１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２の結合を阻害する試験抗体の能力により、該試験抗体が、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合について、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と競合でき、このため、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄ上におけるエピトープに結合できることが裏付けられる。好ましい実施態様において、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と同じｈＮＫＧ２Ｄ上のエピトープに結合する抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。このようなヒトモノクローナル抗体は、実施例で説明されるように調製及び単離することができる。
【００２８】
別の好ましい実施態様において、該抗体は、マウスモノクローナル抗体であるＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのうちのいずれとも異なるエピトープに結合し、列挙されたマウスモノクローナル抗体のいずれよりも、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と強く交差競合する。
一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から選択される１つ又は複数の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から選択される５つ以上の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から選択される８、１０、１２以上の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄの残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄの残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から本質的になる。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）から選択される１つ又は複数の残基からなる。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２Ｄの残基Ｌｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７、及びＴｈｒ２０８（配列番号２）からなる。
【００２９】
一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７（配列番号２）から選択される、水素結合に関与する１つ又は複数の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７（配列番号２）から選択される、水素結合に関与する５つ以上の残基を含む。一実施態様において、本発明の抗体のエピトープは、ｈＮＫＧ２ＤのＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｉｌｅ１８１、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｙｓ１９７、Ｔｈｒ２０５、及びＡｓｎ２０７（配列番号２）を含む。
本発明の好ましい抗体は、以下の特性、すなわち：（ａ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を、場合によって、該細胞に対する結合のＥＣ５０よりも低い、リガンド誘導性の細胞障害性の低減のＥＣ５０により阻止すること；（ｂ）ＮＫＧ２Ｄに対する結合において少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドと、好ましくは、少なくともＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３と競合すること；（ｃ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上のｈＮＫＧ２Ｄ量を、好ましくは少なくとも７５％低減すること；（ｄ）好ましくは、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合の親和性の５０％以上の親和性で、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合すること；（ｅ）ＮＫＧ２Ｄの複数の形態又は立体構造に結合すること；（ｆ）１ｎＭ以下、好ましくは０．１ｎＭ以下のＫｄでＮＫＧ２Ｄに結合すること；（ｇ）ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のうちのうちの１つ又は複数と競合すること；（ｈ）ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのいずれよりも、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と強く競合すること；（ｉ）細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄに対する１６Ｆ１６、ＭＳ、又は２１Ｆ２の結合を、９０％を超えて遮断すること；（ｊ）アゴニスト活性が有意ではないこと；ならびに（ｋ）１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び／又は２１Ｆ２のうちのうちのいずれかと本質的に同じエピトープ、好ましくは、ＭＳ及び／又は２１Ｆ２と本質的に同じエピトープに結合することのうち、少なくとも１つ、より好ましくは２つ、３つ、４つ、５つ以上を呈する。本発明の抗体は、上記で説明した機能的特徴、及び／又は実施例で説明される機能的特徴のあらゆる組合せを呈示することができる。
【００３０】
構造的特性
本発明の好ましい抗体は、実施例で説明される通りに作製され、単離され、構造的に、また機能的に特徴付けされる、ヒトモノクローナル抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２である。これらの抗体の完全長配列、可変配列、及びＣＤＲ配列を、表１に記載する。
表１
１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２の完全長アミノ酸配列、可変アミノ酸配列、及びＣＤＲアミノ酸配列
0005591712.tif 000002
【００３１】
本発明の特定の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＭＳと同じであるか又は類似のパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ  Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）のうちの１又は複数、及び／又はＭＳ  Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）のうちの１又は複数に対応する残基を含むパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ  Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）、及び／又はＭＳ  Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）のうちの３、５、７、１０以上に対応する残基を含むパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ  Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）、ならびにＭＳ  Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）に対応する残基を含むパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ  Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）、ならびにＭＳ  Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）に対応する残基から本質的になるパラトープを有する。一実施態様において、該抗体は、ＭＳ  Ｌ鎖のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１）、ならびにＭＳ  Ｈ鎖のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８、及びＡｓｐ９９（配列番号４０）に対応する残基からなるパラトープを有する。
１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、２１Ｆ２、及びＭＳのすべてがｈＮＫＧ２Ｄに結合できることを踏まえると、これらの抗体それぞれのＶＨ配列及びＶＬ配列を「混合して調和させて」、本発明の他の抗ｈＮＫＧ２Ｄ結合分子を作成できる場合がある。このように「混合して調和させた」抗体のｈＮＫＧ２Ｄに対する結合は、本明細書で説明される結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ）及び／又は本明細書で説明される細胞障害性アッセイを用いて調べることができる。ＶＨ鎖とＶＬ鎖とを混合して調和させる場合は、特殊なＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＨ配列を、構造的に類似するＶＨ配列により置換することが好ましい。同様に、特殊なＶＨ／ＶＬ対に由来するＶＬ配列を、構造的に類似するＶＬ配列により置換することが好ましい。
【００３２】
したがって、一態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、（ａ）配列番号１１、１３、４４、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、（ｂ）配列番号１２、１４、４５、及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域とを含み、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する単離されたモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。好ましい重鎖及び軽鎖の組合せは、（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、及び（ｂ）配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；（ａ）配列番号４５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
別の態様において、本発明は、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３、或いはこれらの組合せを含む抗体を提供する。該ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔら（１９９１年）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、米国保健福祉省、ＮＩＨ刊行物第９１−３２４２号）を用いて表わされる。例えば、図４及び５を参照されたい。これらの抗体の各々がｈＮＫＧ２Ｄに結合でき、抗原結合特異性が主に、ＣＤＲ１、２、及び３領域によりもたらされることを踏まえると、ＶＨのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列ならびにＶＬのＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を「混合して調和させ」て（すなわち、各抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１、２、及び３ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、２、及び３を含有しうるが、異なる抗体に由来するＣＤＲを混合して調和させることができる）、本発明の他の抗ｈＮＫＧ２Ｄ結合分子を作成することができる。このような「混合して調和させた」抗体のｈＮＫＧ２Ｄに対する結合は、上記及び実施例で説明される結合アッセイ（例えば、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ）を用いて調べることができる。ＶＨ  ＣＤＲ配列を混合して調和させる場合は、特殊なＶＨ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列を、構造的に類似する（１又は複数の種類の）ＣＤＲ配列により置換することが好ましい。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列を混合して調和させる場合は、特殊なＶＬ配列に由来するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列を、構造的に類似する（１又は複数の種類の）ＣＤＲ配列により置換することが好ましい。例えば、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２のＶＬ  ＣＤＲ１及び３と、ＭＳ及び２１Ｆ２のＶＬ  ＣＤＲ２配列とは、ある構造的な類似性を共有し、そのために、混合して調和させるのに適する。１又は複数の種類のＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２について本明細書で開示されるＣＤＲ配列に由来する構造的に類似する配列により置換することにより、新規のＶＨ配列及びＶＬ配列を作成できることは、当業者には容易に明らかであろう。
【００３３】
したがって、別の態様において、本発明は、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合部分であって、（ａ）配列番号１５、２１、４８、及び５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号１６、２２、４９、及び５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号１７、２３、５０、及び５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号１８、２４、５１、及び５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号１９、２５、５２、及び５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２０、２６、５３、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３とを含み、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号１５を含むＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号１６を含むＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号１７を含むＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号１８を含むＶＬ  ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号１９を含むＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２０を含むＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
【００３４】
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号２１を含むＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号２２を含むＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号２３を含むＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号２４を含むＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号２５を含むＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２６を含むＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号４８を含むＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４９を含むＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５０を含むＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５１を含むＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５２を含むＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５３を含むＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
【００３５】
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号５４を含むＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号５５を含むＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５６を含むＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５７を含むＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５８を含むＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５９を含むＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号１５からなるＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号１６からなるＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号１７からなるＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号１８からなるＶＬ  ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号１９からなるＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２０からなるＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
【００３６】
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号２１からなるＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号２２からなるＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号２３からなるＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号２４からなるＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号２５からなるＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号２６からなるＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号４８からなるＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４９からなるＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５０からなるＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５１からなるＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５２からなるＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５３からなるＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
【００３７】
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号４８からなるＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号４９からなるＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５０からなるＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５１からなるＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５２からなるＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５３、ならびにＭＳ  Ｈ鎖中のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、及びＡｓｐ２７（配列番号４０）のうちの１つ、２つ、又はすべてに対応する残基からなるＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
別の好ましい実施態様において、該抗体は、（ａ）配列番号５４からなるＶＨ  ＣＤＲ１と、（ｂ）配列番号５５からなるＶＨ  ＣＤＲ２と、（ｃ）配列番号５６からなるＶＨ  ＣＤＲ３と、（ｄ）配列番号５７からなるＶＬ領域ＣＤＲ１と、（ｅ）配列番号５８からなるＶＬ  ＣＤＲ２と、（ｆ）配列番号５９からなるＶＬ  ＣＤＲ３とを含む。
【００３８】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、特殊な生殖細胞系列のＨ鎖免疫グロブリン遺伝子、もしくは複数の特殊な生殖細胞系列のＨ鎖免疫グロブリン遺伝子の組合せに由来するＶＨ領域；及び／又は特殊な生殖細胞系列のＬ鎖免疫グロブリン遺伝子、もしくは複数の特殊な生殖細胞系列のＬ鎖免疫グロブリン遺伝子の組合せに由来するＶＬ領域を含む。このような組合せは、例えば、Ｂ細胞内における体細胞組換えによりｉｎ  ｖｉｖｏにおいて得ることができる。
例えば、一実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、（ａ）ヒトＤ３〜９遺伝子、同Ｄ３〜１０遺伝子、又は同Ｄ３＿１０＿Ｒ３遺伝子、及び同ＪＨ３遺伝子、同ＪＨ４遺伝子、又は同ＪＨ６遺伝子により組み換えられたヒトＶＨ３＿２１遺伝子、同ＶＨ３＿２０遺伝子、同ＶＨ４＿５９遺伝子、又は同ＶＨ５＿５１遺伝子に由来するＶＨ領域を含み、（ｂ）ヒトＪＫ１遺伝子、同ＪＫ２遺伝子、又は同ＪＫ３遺伝子により組み換えられたヒトＶＫＩ＿Ｌ１５遺伝子、又は同ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７遺伝子、又は同ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６遺伝子に由来するＶＬ領域を含み、また（ｃ）ｈＮＫＧ２Ｄに結合する単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００３９】
別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＶＨ３＿２１遺伝子、同Ｄ３〜９遺伝子、及び同ＪＨ４遺伝子の組換えにより得られるＶＨ領域と、ヒトＶＫＩ＿Ｌ１５遺伝子及び同ＪＫ２遺伝子の組換えにより得られるＶＬ領域とを含む、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＶＨ３＿２０遺伝子、同Ｄ３〜１０遺伝子、及び同ＪＨ６遺伝子の組換えにより得られるＶＨ領域と、ヒトＶＫＩＩＩ＿Ａ２７遺伝子及び同ＪＫ３遺伝子の組換えにより得られるＶＬ領域とを含む、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４０】
別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＶＨ４＿５９遺伝子、同Ｄ遺伝子、及び同ＪＨ３遺伝子の組換えにより得られるＶＨ領域と、ヒトＶＫＩＩＩ＿Ａ２７遺伝子及び同ＪＫ１遺伝子の組換えにより得られるＶＬ領域とを含む、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片であって、ヒトＶＨ５＿５１遺伝子、同Ｄ３＿１０＿Ｒ３遺伝子、及び同ＪＨ４遺伝子の組換えにより得られるＶＨ領域と、ヒトＶＫＩＩＩ＿Ｌ６遺伝子及び同ＪＫ１遺伝子の組換えにより得られるＶＬ領域とを含む、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４１】
個別且つ特定の実施態様において、本発明は、上記で説明された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体のＶＨ領域及び／又はＶＬ領域において、１つ、２つ、３つ、４つ以上のアミノ酸置換及び／又は体細胞超変異を導入することにより得られる単離された抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。
本明細書で用いられるヒト抗体が、特殊な生殖細胞系列配列「の」重鎖可変領域もしくは軽鎖可変領域、又は同配列「に由来する」同領域を含むか、又は同配列「の産物」である同領域を含むのは、該抗体の該可変領域が、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子を用いる系（以下で説明される）から得られる場合である。このような「系」は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを対象抗原で免疫化すること、又はファージ上において表面提示されるヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーを対象抗原によりスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の」ヒト抗体、又は同配列「に由来する」同抗体、又は同配列「の産物」である同抗体は、該ヒト抗体のアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、該ヒト抗体の配列に配列内で最も近接する（すなわち、最大の％同一性）ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列を選択することにより、そのようなものとして同定することができる。特殊なヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の」ヒト抗体、又は同配列「に由来する」同抗体、又は同配列「の産物」である同抗体は、例えば、天然の体細胞突然変異又は（１カ所又は複数カ所の）部位特異的突然変異（置換の選択でありうる）の意図的な導入に起因して、該生殖細胞系列の配列と比較されるアミノ酸の違いを含有する可能性がある。
【００４２】
しかしながら、ヒト抗体は、典型的には、組換え生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有し、通常、他の動物種の生殖細胞系列の免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列の配列）と比較した場合にヒト抗体であると同定することができる。特定の場合において、ヒト抗体は、組換え生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％、又はさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する可能性がある。
特殊なヒト生殖細胞系列の配列に由来するヒト抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と１０アミノ酸以下の相違を示す。特定の場合において、該ヒト抗体は、組換え生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列と８つ以下、５つ以下又はさらに４つ、３つ、２つ、又は１つ以下のアミノ酸の相違を示す場合がある。
【００４３】
さらに別の実施態様において、本発明の抗体は、本明細書で説明される好ましい抗体のアミノ酸配列に対して相同的なアミノ酸配列を含み、該抗体が、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の所望の機能的特性を保持する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。例えば、本発明は、単離された抗体又はその抗原結合断片であって、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、（ａ）該ＶＨ領域が、配列番号１１、１３、４４、及び４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、（ｂ）該ＶＬ領域が、配列番号１２、１４、４５、及び４７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含み、（ｃ）ｈＮＫＧ２Ｄに結合し、本明細書で説明される機能的特性のうちの少なくとも１つ、好ましくは、本明細書で説明される機能的特性のうちのいくつかを呈示する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
他の実施態様において、ＶＨ及び／又はＶＬのアミノ酸配列は、上記の配列と８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一の可能性がある。上記の配列のＶＨ領域及びＶＬ領域と高度の（すなわち、８０％以上の）同一性を有するＶＨ領域及びＶＬ領域を有する抗体は、配列番号１１〜１４又は同４４〜４７をコードする核酸分子に対する突然変異誘発（例えば、部位特異的な突然変異誘発又はＰＣＲを介する突然変異誘発）に続き、本明細書で説明される機能アッセイを用いて機能（例えば、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合親和性、ｈＮＫＧ２Ｄ−リガンド間の遮断、ｈＮＫＧ２Ｄの発現低下、又はＮＫ細胞もしくはＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性化の低減）の保持についてコードされた改変抗体を調べることにより得ることができる。
【００４４】
２つの配列間における百分率による同一性とは、該配列により共有される同一位置数の関数（すなわち、％同一性＝同一位置数／総位置数×１００）であり、該２つの配列を最適な形で整列するのに導入する必要があるギャップ数、及び各ギャップ長を考慮に入れている。２つの配列間における配列の比較及び百分率による同一性の決定は、配列解析ソフトウェア中の数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む各種の置換、欠失、及び他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を用いて類似の配列を整合させる。
２つのアミノ酸配列間における百分率による同一性は、例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップの重み及び１、２、３、４、５、又は６の全長の重みを用いるＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内に組み込まれた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）によるアルゴリズムを用いて決定することができる。
【００４５】
デフォルト又は推奨のパラメータを適用するＦＡＳＴＡプログラムを用いて、ポリペプチド配列も比較することができる。ＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．１、ＦＡＳＴＡ中のプログラム（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）では、問い合わせ配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域に対するアライメント及び百分率による配列同一性が提供される（Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98; Pearson, Methods Mol. Biol. 2000;132:185-219）。
２つのアミノ酸配列間における百分率による同一性はまた、ＰＡＭ１２０の重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２、及びギャップペナルティー４を用いるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）内に組み込まれた、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Comput. Appl. Biosci., 1988;11-17）によるアルゴリズムを用いて決定することもできる。
【００４６】
ある配列をデータベース内に包含される他の配列と比較する別のアルゴリズムは、コンピュータプログラムであるＢＬＡＳＴ、とりわけ、デフォルトパラメータを用いるｂｌａｓｔｐである。例えば、Altschul等、J. Mol. Biol. 1990;215:403-410; Altschul等、Nucleic Acids Res. 1997;25:3389-402 (1997)（各々が出典明示によりここに援用される）を参照されたい。該プログラムでは、本発明のタンパク質配列を「問い合わせ配列」として用いて公開されたデータベースに対する検索を実施し、例えば、関連の配列を同定することができる。このような検索は、Altschul等、1990年（前掲）によるＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実施することができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３によりＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明の抗体分子と相同的なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップアライメントを得るためには、Altschul等、1997年（前掲）において説明されるようにして、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域ならびにＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域であって、これらのＣＤＲ配列の１つ又は複数が、本明細書で説明される好ましい抗体である１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２に基づく指定のアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によっては、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有し、該抗体が、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の所望の機能的特性を保持する、ＶＨ領域及びＶＨ領域を含む。したがって、本発明は、単離された抗体又はその抗原結合断片であって、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域とを含み、（ａ）該ＶＨ領域のＣＤＲ３配列が、配列番号１７、２３、５０、及び５６のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｂ）該ＶＬ領域のＣＤＲ３配列が、配列番号２０、２６、５３、及び５９のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、（ｃ）１つ又は複数のＣＤＲが、場合によって、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸置換を含有し、（ｄ）ｈＮＫＧ２Ｄに結合し、本発明で説明される機能的特性のうちの少なくとも１つ、より好ましくは、本明細書で説明される機能的特性のうちのいくつかを呈示する、単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。
【００４７】
さらなる実施態様では、ＶＨ領域のＣＤＲ２配列が配列番号１６、２２、４９、及び５５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域のＣＤＲ２配列が配列番号１９、２５、５２、及び５８のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によって、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有する。
さらなる実施態様では、ＶＨ領域のＣＤＲ１配列が配列番号１５、２１、４８、及び５４のアミノ酸配列ならびにこれらの保存的修飾からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＶＬ領域のＣＤＲ１配列が配列番号１８、２４、５１、及び５７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、１つ又は複数のＣＤＲが、場合によっては、１カ所又は複数カ所の保存的アミノ酸修飾を含有する。
【００４８】
本明細書で用いられる「保存的アミノ酸修飾」という用語は、該アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に著明な影響を及ぼすか又はこれを顕著に改変することのないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾は、アミノ酸の置換、付加、及び欠失を含む。修飾は、例えば、部位特異的な突然変異誘発及びＰＣＲを介する突然変異誘発など、当技術分野で公知の標準的な技法により、本発明の抗体内に導入することができる。親抗体と比較されるアミノ酸修飾を含む抗体配列は、典型的には、該親抗体内における対応するアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、好ましくは少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一であり、かつ／又は該親抗体配列と比較して最大で１０カ所、好ましくは最大で５カ所、４カ所、３カ所、２カ所のアミノ酸修飾を含む。
「保存的」アミノ酸置換とは、典型的には、アミノ酸残基が、類似の物理化学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。
【００４９】
こうして、本発明の抗体のＣＤＲ領域内における１つ又は複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基により置換することができ、本明細書で説明される機能アッセイを用いて、改変抗体を、機能（すなわち、上記の（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）に記載の機能）の保持について調べることができる。
【００５０】
抗原結合断片
本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、完全長抗体又はそれらの抗原結合断片として調製することができる。抗原結合断片の例は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）３断片、Ｆｖ（典型的には、抗体の１本のアームのＶＬドメイン及びＶＨドメイン）断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；例えば、Bird等、Science 1988;242:423-426;及びHuston等、PNAS 1988;85:5879-5883を参照されたい）断片、ｄｓＦｖ断片、Ｆｄ（典型的には、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン）断片、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶｈＨドメイン、及びＶ−ＮＡＲドメイン；１本のＶＨ鎖及び１本のＶＬ鎖を含む１価分子；ミニボディー、ダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、及びカッパボディー（例えば、Ill等、Protein Eng 1997;10:949-57を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲのほか；単離ＣＤＲ又は抗原結合残基もしくは抗原結合ポリペプチドが、機能的な抗体断片を形成するように共に会合するか又は連結されうる、１又は複数の単離ＣＤＲ又は機能的パラトープを含む。例えば、Holliger及びHudson, Nat Biotechnol  2005;23:1126-1136;国際公開第２００５０４０２１９号；ならびに米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号及び同第２００２０１６１２０１号では、各種の抗体断片が説明又は総説されている。
抗体断片は、従来の組換え法又はタンパク質の操作法を用いて得ることができ、該断片は、完全抗体と同じ方法で、抗原結合機能又は他の機能についてスクリーニングすることができる。
【００５１】
抗体断片の作製には、各種の技法が開発されている。従来、これらの断片は、完全長抗体に対するタンパク質分解的な消化により誘導された（例えば、Morimoto等、Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992);及びBrennan等、Science, 229:81 (1985)を参照されたい）。しかし、今日、これらの断片は、組換え宿主細胞により直接作製することができる。代替的に、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に連結して、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Carter等、Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）。別の手法によれば、組換え宿主細胞培養物から直接にＦ（ａｂ’）２断片を単離することもできる。他の実施態様において、最適の抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。国際公開第１９９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照されたい。抗体断片はまた、例えば、米国特許第５６４１８７０号で説明される「直鎖抗体」でもありうる。このような直鎖抗体断片は、単特異性又は二重特異性でありうる。
【００５２】
多重特異性分子
別の態様において、本発明は、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はその抗原結合断片を含む多重特異性分子を対象とする。このような多重特異性分子は、ｈＮＫＧ２Ｄに対する少なくとも１つの第１の結合特異性及び第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。
二重特異性分子の１つの種類は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体とは、少なくとも２種の異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野において公知であり、在来の全長二重特異性抗体の作製は、通常、２本の鎖が異なる特異性を有する２本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の共発現に基づく（Millstein等、Nature, 305: 537-539 (1983)）。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）又は本明細書で説明される他の任意の抗原結合断片として調製することができる。
【００５３】
本発明による二重特異性抗体では、少なくとも１つの結合エピトープが、ｈＮＫＧ２Ｄタンパク質上にある。炎症促進性のｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞に対する細胞防御機構に焦点を絞るよう、抗ｈＮＫＧ２Ｄ結合部分を、炎症促進性白血球、例えば、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、又はＣＤ８）上における分子に結合する第２の部分と組み合わせることができる。この実施態様では、二重特異性抗体を用いて、例えば、ＮＫＧ２Ｄを発現する炎症促進細胞に対して細胞障害性剤を方向づけることもでき、ＡＤＣＣ／ＣＤＣによる同細胞に対する攻撃を方向づけることもできる。細胞障害性剤ならば、例えば、サポリン、抗インターフェロン−アルファ剤、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート、又は放射性同位体でありうる。
別の実施態様において、第２の部分は、癌、ウイルス感染など、正常時にはエフェクターリンパ球により調節される疾患状態と関連する細胞により提示又は発現される、細胞関連標的に結合する。こうして、例えば、典型的な標的は、ＭＩＣ分子（例えば、ＭＩＣ−Ａ又はＭＩＣ−Ｂ）もしくはＵＬＢＰ（例えば、Ｒａｅ−１、Ｈ−６０、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＨＣＭＶ  ＵＬ１８、又はＲａｅ−１β）などの細胞ストレス関連分子又はウイルスヘマグルチニンなどの病原体関連分子でありうる。
【００５４】
他の多重特異性分子は、１又は複数の種類の他の非抗体タンパク質に対するｈＮＫＧ２Ｄ結合抗体の融合から作製される分子を含む。このような多重特異性タンパク質、及びこれらを構築する方法については、当技術分野で説明されている。例えば、Dreier等、(Bioconjug. Chem. 9(4): 482-489 (1998)); 米国特許第６０４６３１０号；米国特許出願公開第２００３０１０３９８４号；欧州特許出願公開第１４１３３１６号；米国特許出願公開第２００４００３８３３９号；von Strandmann等、Blood (2006;107:1955-1962)；及び国際公開第２００４０５６８７３号を参照されたい。本発明によるならば、非抗体タンパク質は、例えば、前節で説明した「第２の部分」に対する抗原のうちのいずれかに適するリガンド、例えば、Ｔ細胞もしくはＦｃ受容体、又はＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、ＵＬＢＰなどの細胞ストレス分子、又はウイルスヘマグルチニンなどの病原体関連分子に対するリガンドでありうる。
２価以上の多重特異性分子もまた検討される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Tutt等、J. Immunol, 147: 60 (1991)）。
【００５５】
本発明の多重特異性抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて、構成要素の結合特異性分子をコンジュゲートすることにより調製することができる。例えば、多重特異性分子の各結合特異性分子を個別に発生させ、次いで、互いに対してコンジュゲートさせることができる。結合特異性分子がタンパク質又はペプチドである場合、各種の連結剤又は架橋剤を、共有結合によるコンジュゲーションに用いることができる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えば、Karpovsky等(1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA等(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648を参照されたい）。他の方法は、Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan等(1985) Science 229:81-83), 及びGlennie等(1987) J. Immunol. 139: 2367-2375)において説明される方法を含む。好ましいコンジュゲーション形成剤は、Pierce Chemical社（イリノイ州、ロックフォード）製のＳＡＴＡ及びスルホＳＭＣＣである。
結合特異性分子が抗体である場合、それらは、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によりコンジュゲートすることができる。特定の好ましい実施態様において、該ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１つのスルフヒドリル残基を含有するように修飾される。
【００５６】
代替的には、両方の結合特異性分子ともに、同じベクター内でコードし、同じ宿主細胞内で発現させて組み立てることもできる。この方法は、該二重特異性分子が、ｍＡｂ×ｍＡｂ融合タンパク質、ｍＡｂ×Ｆａｂ融合タンパク質、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２融合タンパク質、又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１本の単鎖抗体及び結合決定基を含む単鎖分子でもありえ、２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子でもありうる。二重特異性分子は、少なくとも２つの単鎖分子を含みうる。二重特異性分子を調製する方法は、例えば、米国特許第５２６０２０３号；米国特許第５４５５０３０号；米国特許第４８８１１７５号；米国特許第５１３２４０５号；米国特許第５０９１５１３号；米国特許第５４７６７８６号；米国特許第５０１３６５３号；米国特許第５２５８４９８号；米国特許第５４８２８５８号；米国特許出願公開第２００３００７８３８５号；Kontermann等、(2005) Acta Pharmacological Sinica 26(1):1-9; Kostelny等、(1992) J. Immunol. 148(5):1547-1553; Hollinger等、(1993) PNAS (USA) 90:6444-6448;及びGruber等(1994) J. Immunol. 152: 5368に説明又は総説されている。
【００５７】
抗体変異体
本明細書で開示される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列を有する抗体を、該親抗体から特性が改変される可能性がある修飾抗体又は抗体「変異体」を操作するための出発材料として用いて、本発明の抗体をさらに調製することもできる。一方又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば、１又は複数のＣＤＲ領域内及び／又は１又は複数のフレームワーク領域内における１つ又は複数の残基を修飾することにより、抗体を操作することができる。またないし或いは、（１つ又は複数の）定常領域内における残基を修飾することによって抗体を操作して、例えば、該抗体の（１つ又は複数の）エフェクター機能を改変することができる。さらに、抗体の抗原結合部分からは、抗原結合断片、抗体誘導体、免疫コンジュゲート、及び多重特異性分子など、他の構築物も調製することができる。
標準的な生物学的技法を用いて、改変された抗体配列を調製し、発現させることができる。
【００５８】
抗体の変異体又は誘導体は、典型的には、「親」抗体と比較して改変された少なくとも１つの特性を有するが、該抗体の変異体又は誘導体は、本明細書で説明される抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的特性の１つ、一部、又は大半を保持することができ、これらの機能的特性は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を、場合によっては、該細胞に対する結合のＥＣ５０よりも低い、リガンドに誘導される細胞障害性のＥＣ５０により阻止すること；（ｂ）ＮＫＧ２Ｄに対する結合において少なくとも１種のＮＫＧ２Ｄリガンドと、好ましくは、少なくともＭＩＣＡ及びＵＬＢＰ３と競合すること；（ｃ）ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上におけるＮＫＧ２Ｄ量を、好ましくは少なくとも７５％低減すること；（ｄ）好ましくは、実質的に同様の効果又は親和性で、カニクイザル及び／又はアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合すること；（ｅ）ＮＫＧ２Ｄの複数の形態又は立体構造に結合すること；（ｆ）１ｎＭ以下、好ましくは０．１ｎＭ以下のＫｄでＮＫＧ２Ｄに結合すること；（ｇ）１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のうちのうちの１つ又は複数と競合すること；（ｈ）ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのいずれとよりも、１６Ｆ１６、ＭＳ、又は２１Ｆ２とより強く競合すること；（ｉ）細胞表面のｈＮＫＧ２Ｄに対する１６Ｆ１６、ＭＳ、又は２１Ｆ２の結合を、９０％を超えて遮断すること；（ｊ）ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、ＥＣＭ２１７、及び１４９８１０のうちのいずれかよりもアゴニスト活性が低いことを含むがこれらに限定されない。上記で説明した機能的特徴、及び／又は実施例で説明される機能的特徴の任意の組合せを、本発明の抗体により呈示することが可能である。
抗体の変異体及び誘導体の機能的特性は、当技術分野において用いられ、かつ／又は本明細書で説明される標準的なアッセイを用いて評価することができる。例えば、実施例で記載されるアッセイなど、標準的な結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ）を用いて、ｈＮＫＧ２Ｄに対する抗体の結合能を決定することができる。
【００５９】
可変領域の修飾
可変領域に対して実施できる操作の１つの種類は、ＣＤＲ移植である。抗体は、主として、６本の重鎖及び軽鎖による相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と接触する。この理由で、ＣＤＲ内におけるアミノ酸配列は、ＣＤＲ以外の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列が大半の抗体−抗原間相互作用の一因をなすため、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列上に移植された、特異的な天然抗体に由来するＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特異的な天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Riechmann, L.等(1998) Nature 332:323-327; Jones, P.等(1986) Nature 321:522-525; Queen, C. 等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:10029-10033；Winter米国特許第５２２５５３９号；ならびにQueen等による米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照されたい）。したがって、本発明の別の実施態様は、単離抗体又はその抗原結合部分であって、それぞれ、配列番号１５、２１、４８、及び５４；配列番号１６、２２、４９、及び５５；ならびに配列番号１７、２３、５０、及び５６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ領域と、それぞれ、配列番号１８、２４、５１、及び５７；配列番号１９、２５、５２、及び５８；ならびに配列番号２０、２６、５３、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ領域とを含む単離された抗体又はその抗原結合部分に関係する。こうして、このような抗体は、抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のＶＨ  ＣＤＲ配列及びＶＬ  ＣＤＲ配列を含有するが、これらの抗体とは異なるフレームワーク配列も含有する可能性がある。
本発明はまた、ｈＮＫＧ２Ｄに結合するマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体もしくはその抗原結合部位のキメラ又はヒト化バージョン、及びこのような抗体の使用（例えば、哺乳動物宿主におけるｈＮＫＧ２Ｄ媒介性の生理学的過程の調節における）も提供する。一実施態様において、該マウス抗体は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、１４９８１０、及びＥＣＭ２１７のうちの１つである。別の実施態様において、該マウス抗体は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、１４９８１０、及びＥＣＭ２１７のうちの１つではない。こうして、このような抗体は、ＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、１４９８１０、又はＥＣＭ２１７のＶＨ  ＣＤＲ配列及びＶＬ  ＣＤＲ配列、又はＯＮ７２、ＢＡＴ２２１、５Ｃ６、１Ｄ１１、１４９８１０、ＥＣＭ２１７とは異なるマウスモノクローナル抗体、或いはこれらの抗体とは異なるフレームワーク配列を含有する。一実施態様において、ヒト化抗体は、ＯＮ７２のヒト化バージョンであり、例えば、それぞれ配列番号７０及び７１の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を含む。
【００６０】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列の抗体遺伝子配列を含む、公開されているＤＮＡデータベース又は公表された参考文献から得ることができる。例えば、ヒト重鎖可変領域遺伝子及び同軽鎖可変領域遺伝子のための生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ｄＢａｓｅ」と称するヒト生殖細胞系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅにおいてインターネット上でアクセス可能）のほか、各々の内容が出典明示によりここに援用される、Kabat, E. A.,等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., 等(1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; 及びCox, J. P. L. 等(1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836において見出すことができる。
本発明の抗体において用いるのに好ましいフレームワーク配列は、本発明の選択された抗体により用いられるフレームワーク配列に構造的に類似する配列、例えば、１６Ｆ１６抗体、１６Ｆ３１抗体、ＭＳ抗体、及び２１Ｆ２抗体により用いられる、ＶＨ３＿２１、Ｄ３〜９、ＪＨ４、ＶＫＩ＿Ｌ１５、及びＪＫ２、又はＶＨ３＿２０、Ｄ３〜１０、ＪＨ６、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７、及びＪＫ３、又はＶＨ４＿５９、ＪＨ３、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７、及びＪＫ１、又はＶＨ５＿５１、Ｄ３＿１０＿Ｒ３、ＪＨ４、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６、及びＪＫ１のフレームワーク配列に類似する配列である。１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のＶＨ  ＣＤＲ１配列、同ＣＤＲ２配列、及び同ＣＤＲ３配列と、１６Ｆ６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２のＶＬ  ＣＤＲ１配列、同ＣＤＲ２配列、及び同ＣＤＲ３配列とを、該フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列の免疫グロブリン遺伝子内で見出される配列と同じ配列を有するフレームワーク領域上に移植することもでき、又は該ＣＤＲ配列を、該生殖細胞系列の配列と比較して１カ所又は複数カ所の突然変異を含有するフレームワーク領域上に移植することもできる。例えば、特定の場合には、該フレームワーク領域内の残基を突然変異させて、該抗体の抗原結合能を維持又は増強することが有益であることが分かっている（例えば、Queen等による米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照されたい）。
【００６１】
本発明の別の態様では、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体、例えば、１６Ｆ１６及び１６Ｆ３１の構造的特徴を用いて、ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合など、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持した構造的関連性を有する抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が作成される。例えば、１６Ｆ１６もしくは１６Ｆ３１の１又は複数のＣＤＲ領域、又はこれらの変異体を、組換え法により公知のフレームワーク領域及び／又は他のＣＤＲと組み合わせて、組換え法により操作された本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体をさらに作成することができる。操作法のための出発材料は、本明細書で提供される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列、或いはこれらの１つ又は複数のＣＤＲ領域である。操作された抗体を作成するには、本明細書で提供される１又は複数の種類のＶＨ配列及び／又はＶＬ配列、或いはこれらの１つ又は複数のＣＤＲ領域を実際に調製する（すなわち、タンパク質として発現させる）必要はない。そうではなく、（１又は複数の種類の）配列内に含有される情報を出発材料として用いて、（１又は複数の種類の）元の配列に由来する（１又は複数の種類の）「第２世代の」配列を作成し、次いで、（１又は複数の種類の）該「第２世代の」配列を、タンパク質として調製し、発現させる。
したがって、別の実施態様において、本発明は、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を調製する方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号１５、２１、４８、及び５４から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１６、２２、４９、及び５５から選択されるＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号１７、２３、５０、及び５６から選択されるＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域の抗体配列と、（ｉｉ）配列番号１８、２４、５１、及び５７から選択されるＣＤＲ１配列、配列番号１９、２５、５２、及び５９から選択されるＣＤＲ２配列、及び／又は配列番号２０、２６、５３、及び５９から選択されるＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域の抗体配列とを供給するステップと、（ｂ）該第１の抗体配列及び／又は該第２の抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、少なくとも１種の改変された抗体配列を作成するステップと、（ｃ）該改変された抗体配列を調製するステップと、（ｄ）該改変された抗体配列をタンパク質として発現させるステップとを含む方法を提供する。
【００６２】
可変領域修飾の別の種類は、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域、及び／又はＣＤＲ３領域内におけるアミノ酸残基を突然変異させ、これにより、対象抗体の１つ又は複数の結合特性（例えば、親和性）を改良する修飾である。部位特異的な突然変異誘発又はＰＣＲを介する突然変異誘発を実施して（１カ所又は複数カ所の）突然変異を導入し、抗体結合に対する効果又は他の対象となる機能的特性を、本明細書で説明され、実施例において提供されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイにおいて評価することができる。保存的修飾（上記で論じた）を導入することが好ましい。該突然変異は、アミノ酸置換の場合もあり、同付加の場合もあり、同欠失の場合もある。さらに、単一のＣＤＲ領域内では、典型的には８つ以下、より典型的には５つ以下の残基が改変される。
したがって、別の実施態様において、本発明は、単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体であって、（ａ）配列番号１５、２１、４８、及び５４から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１５、２１、４８、及び５４から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１領域と、（ｂ）配列番号１６、２２、４９、及び５５から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１６、２２、４９、及び５５から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２領域と、（ｃ）配列番号１７、２３、５０、及び５６から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１７、２３、５０、及び５６から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３領域とを含む重鎖可変領域と、（ｄ）配列番号１８、２４、５１、及び５７から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１８、２４、５１、及び５７から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１領域と、（ｅ）配列番号１９、２５、５２、及び５８からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号１９、２５、５２、及び５８からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２領域と、（ｆ）配列番号２０、２６、５３、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は配列番号２０、２６、５３、及び５９からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、５カ所、６カ所、７カ所、もしくは８カ所のアミノ酸の置換、欠失、もしくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３領域とを含む単離された抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を提供する。
【００６３】
本発明の操作された抗体は、例えば、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に対して該抗体の特性を改良する修飾が行われた抗体を含む。このようなフレームワーク修飾は、典型的には、該抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、１つの手法では、１つ又は複数のフレームワーク残基を、対応する生殖細胞系列の配列へと「復帰突然変異」させる。具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、該抗体が由来する生殖細胞系列の配列とは異なるフレームワーク残基を含有する可能性がある。このような残基は、該抗体フレームワーク配列を、該抗体が由来する生殖細胞系列の配列と比較することによって同定することができる。
例えば、１６Ｆ１６の場合、ＶＨのアミノ酸残基Ｒ１１１（Ｋａｂａｔ残基１０３；ＦＲ４内）がアルギニンであるのに対し、対応する生殖細胞系列の配列中におけるこの残基はトリプトファンである（図５Ａを参照されたい）。該フレームワーク領域の配列を、それらの生殖細胞系列の構成へと復帰させるために、例えば、部位特異的な突然変異誘発又はＰＣＲを介する突然変異誘発により、体細胞突然変異の一部又は全部を、生殖細胞系列の配列へと「復帰突然変異」させることができる（例えば、１６Ｆ１６のＶＨの残基１１１を、トレオニンからアラニンへと「復帰突然変異」させることができる）。別の例としては、１６Ｆ３１の場合、ＶＨ領域のアミノ酸残基Ｙ９５（ＦＲ３内）がチロシンであるのに対し、対応する生殖細胞系列の配列中におけるこの残基はヒスチジンである（図５Ｃを参照されたい）。該フレームワーク領域の配列を、それらの生殖細胞系列の構成へと復帰させるために、体細胞突然変異をチロシンからヒスチジンへと「復帰突然変異」させることができる。別の例として、ＭＳの場合、ＶＨ領域のＫａｂａｔ残基３、６、及び７が、それぞれ、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）、及びＤであるのに対し、対応する生殖細胞系列の配列中におけるこれらの残基は、それぞれ、グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、及びＧである（図５Ｅを参照されたい）。２１Ｆ２の場合、Ｋａｂａｔ残基１３、２４、７６、及び９３が、それぞれ、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、Ｎ、及びＧであるのに対し、対応する生殖細胞系列の配列中におけるこれらの残基は、それぞれ、リシン（Ｋ）、Ｇ、セリン（Ｓ）、及びアラニン（Ａ）である。該フレームワーク領域の配列を、それらの生殖細胞系列の構成へと復帰させるために、該体細胞突然変異を同様に「復帰突然変異」させることができる。このような「復帰突然変異」した抗体も、本発明に包含される。
【００６４】
別の種類のフレームワーク修飾は、該フレームワーク領域内、又はさらに１又は複数のＣＤＲ領域内における１つ又は複数の残基を突然変異させてＴ細胞エピトープを除去し、これにより、該抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを伴う。この手法は「脱免疫化」とも称し、Ｃａｒｒらによる米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に説明されている。
【００６５】
Ｆｃ修飾
フレームワーク領域又はＣＤＲ領域内において行われた修飾に加えて、又はこれらの代替として、Ｆｃ領域内における修飾を含むように、典型的には、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、タンパク質の安定性、及び／又は抗原依存性細胞障害性もしくはその欠如などの、本発明の抗体の１つ又は複数の機能的特性を改変するように、該抗体を操作する場合がある。その上、本発明の抗体は、化学修飾（例えば、１つ又は複数の化学的部分を抗体に付着させることができる）する場合もあり、そのグリコシル化を改変し、さらには該抗体の１つ又は複数の機能的特性を改変するように修飾する場合もある。これらの実施態様のそれぞれについて後述でさらに詳細に説明する。Ｆｃ領域内における残基は、Ｋａｂａｔにより番号付けされている。
必要に応じて、公知の技法により、抗体のクラスを「スイッチ」することができる。このような技法は、例えば、直接的な組換え法（例えば、米国特許第４８１６３９７号を参照されたい）、及び細胞間融合法（例えば、米国特許第５９１６７７１号を参照されたい）の使用を含む。例えば、元はＩｇＭ分子として作製された抗体を、ＩｇＧ抗体へとクラススイッチすることができる。クラススイッチ法はまた、１つのＩｇＧサブクラスから別のサブクラスへ、例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２へと転換させるのにも用いられる場合がある。こうして、各種の治療的使用に応じて、例えば、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、又はＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチングにより、本発明の抗体のエフェクター機能を変化させることができる。定常領域に対応する例示的なｃＤＮＡ配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ及び他の公開のウェブサイトによりアクセス可能）により入手可能であり、出典明示により全体がここに援用されるその各々は：
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２２８号
ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２３０号
ヒトＩｇＧ３重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｘ０４６４６号
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｋ０１３１６号
ヒトカッパ軽鎖定常領域：ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第Ｊ００２４１号
である。
【００６６】
一実施態様では、ヒンジ領域内におけるシステイン残基数が改変される、例えば、増加又は減少するように、ＣＨ１のヒンジ領域を修飾する。この手法は、Bodmerらによる米国特許第５６７７４２５号においてさらに説明されている。例えば、軽鎖及び重鎖のアセンブリーを容易とするか、又は抗体の安定性を上昇もしくは低下させるように、ＣＨ１のヒンジ領域内におけるシステイン残基数を改変する。
別の実施態様では、抗体の生物学的半減期を短縮するように、該抗体のＦｃヒンジ領域を突然変異させる。より具体的に述べると、天然のＦｃヒンジドメインにおけるブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｙｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合と比べて該抗体のＳｐＡ結合が損なわれるように、Ｆｃヒンジ断片のＣＨ２ドメイン−ＣＨ３ドメイン間のインターフェース領域内に１カ所又は複数カ所のアミノ酸突然変異が導入される。この手法は、Ward等による米国特許第６１６５７４５号においてさらに説明されている。別の実施態様では、その生物学的半減期を延長するように抗体が修飾される。各種の手法が可能である。例えば、Wardによる米国特許第６２７７３７５号において説明される通り、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、及びＴ２５６Ｆのうちの１つ又は複数を導入することができる。代替的に、Presta等による米国特許第５８６９０４６号及び同第６１２１０２２号において説明される通り、生物学的半減期を延長するため、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから採取されたサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、ＣＨ１領域又はＣＬ領域内において抗体を改変することができる。さらに他の実施態様では、抗体の（１つ又は複数の）エフェクター機能を改変するように、少なくとも１つのアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基により置換することにより、Ｆｃ領域を改変する。例えば、エフェクターリガンドに対する抗体の親和性は改変するが、親抗体の抗原結合能は保持するように、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０、及び３２２から選択される１つ又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基により置換することができる。それに対する親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体、又は補体のＣ１成分でありうる。この手法は、いずれもがWinter等による米国特許第５６２４８２１号及び同第５６４８２６０号においてさらに詳細に説明されている。別の例では、抗体のＣ１ｑ結合を改変し、かつ／又は補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を低下又は消失させるように、アミノ酸残基３２９、３３１、及び３２２から選択される１つ又は複数のアミノ酸を、異なるアミノ酸残基により置換することができる。この手法は、Idusogie等による米国特許第６１９４５５１号においてさらに説明されている。別の例では、アミノ酸の位置２３１及び２３９内における１つ又は複数のアミノ酸残基を改変し、これにより、抗体の補体結合能を改変する。この手法は、Bodmer等による国際公開第９４／２９３５１号においてさらに説明されている。さらに別の例では、以下の位置：２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０��４３４、４３５、４３７、４３８、又は４３９における１つ又は複数のアミノ酸を修飾することにより、抗体が抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力を増大させ、かつ／又はＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増大させるように、Ｆｃ領域を修飾する。この手法は、Prestaによる国際公開第００／４２０７２号においてさらに説明されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１上の結合部位もマップされ、結合が改良された変異体も説明されている（Shields, R.L.等(2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604）。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４、及び３３９における具体的な突然変異は、ＦｃＲＩＩＩに対する結合を改良することが示された。加えて、以下の組合せ突然変異：Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４Ａ、及びＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａも、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合を改良することが示された。
【００６７】
抗体を安定化させる、例えば、２価抗体が２つの１価ＶＨ−ＶＬ断片へと分離する危険性を低下させるように、定常領域をさらに修飾する場合がある。例えば、ＩｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２４１をプロリン（Ｐ）へと突然変異させて、ヒンジにおける完全なジスルフィド架橋形成を可能とする場合がある（例えば、Angal等、Mol Immunol. 1993;30:105-8を参照されたい）。
【００６８】
グリコシル化の修飾
さらに別の実施態様では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化された抗体（すなわち、グリコシル化を欠く抗体）を作製することができる。例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大させるように、グリコシル化を改変することができる。このような炭水化物の修飾は、例えば、抗体配列内における１つ又は複数のグリコシル化部位を改変することによって達成することができる。例えば、１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去を結果としてもたらす、１カ所又は複数カ所のアミノ酸置換を作製し、これにより、その部位におけるグリコシル化を除去することができる。このような非グリコシル化により、抗原に対する抗体の親和性を増大させることができる。このような手法は、Ｃｏらによる米国特許第５７１４３５０号及び同第６３５０８６１号においてさらに詳細に説明されている。またないし或いは、少量のフコース残基を有する低フコシル化抗体又はＧｌｃＮａｃの二分構造を増大させる抗体など、グリコシル化の種類が改変された抗体も作製することができる。このようなグリコシル化パターンの改変は、抗体のＡＤＣＣ能を上昇させることが実証されている。炭水化物のこのような修飾は、例えば、グリコシル化「機構」が改変された宿主細胞内において抗体を発現させることにより達成することができる。このような改変を伴う細胞は当技術分野で開示されており、本発明の組換え抗体を発現させることにより、グリコシル化が改変された抗体を作製するための宿主細胞として用いることができる。例えば、Hanai等によるＥＰ１１７６１９５は、そこに発現する抗体が低フコシル化を呈するように、フコシルトランスフェラーゼをコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を伴う細胞株について説明している。Prestaによる国際公開第０３／０３５８３５号は、Ａｓｎ（２９７）を連結した炭水化物へとフコースを付着させる能力を低下させ、また、その結果として、その宿主細胞に発現する抗体の低フコシル化ももたらす変異体ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃｌ３細胞についても説明している（Shields, R.L.等(2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照されたい）。Umana等による国際公開第９９／５４３４２号は、操作された細胞株に発現する抗体が、該抗体のＡＤＣＣ活性の上昇を結果としてもたらすＧｌｃＮａｃの二分構造の増大を呈するよう、糖タンパク質を修飾するグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ベータ（ｌ，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株について説明している（Umana等(1999) Nat. Biotech. 7:176 180も参照されたい）。
【００６９】
本発明の抗体を操作する方法に関する特定の実施態様では、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体をコードする配列（例えば、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２をコードする配列）の全部又は一部に沿って無作為に又は選択的に突然変異を導入することができ、本明細書で説明されるように、結合活性及び／又は他の機能的特性について、結果としてもたらされる修飾抗体をスクリーニングすることができる。突然変異法は、当技術分野において説明されている。例えば、Shortによる国際公開第０２／０９２７８０号は、飽和突然変異誘発、合成ライゲーションアセンブリー、又はこれらの組合せを用いる抗体突然変異を作成及びスクリーニングする方法について説明している。
代替的に、Lazarらによる国際公開第０３／０７４６７９号は、抗体の物理化学的特性を最適化する、コンピュータによるスクリーニング法を用いる方法についても説明している。
【００７０】
抗体誘導体
本発明の範囲内の抗体誘導体（又はイムノコンジュゲート）には、第二薬剤にコンジュゲートさせた又は共有結合させた抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が含まれる。
例えば、一態様では、本発明は、細胞障害性剤にコンジュゲートさせた又は共有結合させた抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。本明細書中で用いる「細胞障害性剤」なる用語は、表面上にｈＮＫＧ２Ｄレセプターを有する細胞を殺傷することができる分子である。細胞障害作用又は細胞抑制作用を有する任意の種類の部分は、本発明の抗体にコンジュゲートさせて、本発明の細胞障害性コンジュゲートを形成させ、特定のＮＫレセプター発現細胞を阻害ないしは殺傷させることができ、治療用放射性同位体、毒性タンパク質、毒性小分子、例えば薬剤、毒素、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、治療用放射性核種、血管形成阻害剤、化学療法剤、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、エピドフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ-２阻害剤、ＳＮ-３８、抗有糸分裂剤、抗血管形成及びアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキセート、タキソール、ＣＰＴ-１１、カンプトテカン、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、緑膿菌外毒素、リシン、アブリン、５-フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ(ＲＮアーゼ)、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン-Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン(gelonin)、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、及び緑膿菌内毒素及び他のものが含まれる(例として、Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co. 1995)；Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001)；Pastan等 (1986) Cell 47:641；Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43；米国特許第6077499号；その全ての開示が出典明示によりここに援用される)。毒素は、動物、植物、真菌又は微生物由来のものであってよく、又は化学合成により新たに作製することもできると解されるであろう。
【００７１】
他の実施態様では、抗体は、放射性同位体、例えば治療用放射性核種又は検出目的のために適切な放射性核種によって誘導体化される。多くの適切な放射性同位体の任意のものを使用することができ、限定されるものではないが、インジウム-１１１、ルテチウム-１７１、ビスマス-２１２、ビスマス-２１３、アスタチン-２１１、銅-６２、銅-６４、銅-６７、イットリウム-９０、ヨード-１２５、ヨード-１３１、リン-３２、リン-３３、スカンジウム-４７、銀-１１１、ガリウム-６７、プラセオジミウム-１４２、サマリウム-１５３、テルビウム-１６１、ジスプロシウム-１６６、ホルミウム-１６６、レニウム-１８６、レニウム-１８８、レニウム-１８９、鉛-２１２、ラジウム-２２３、アクチニウム-２２５、鉄-５９、セレン-７５、ヒ素-７７、ストロンチウム-８９、モリブデン-９９、ロジウム-１０５、パラジウム-１０９、プラセオジミウム-１４３、プロメチウム-１４９、エルビウム-１６９、イリジウム-１９４、金-１９８、金-１９９、及び鉛-２１１が含まれる。一般的に、放射性核種は、オージェエミッターで好ましくは２０〜６０００ＫｅＶの範囲、好ましくは６０〜２００ＫｅＶの範囲、ベータエミッターで１００〜２５００ＫｅＶ、アルファエミッターで４０００〜６０００ＫｅＶの崩壊エネルギーを有する。また、アルファ粒子の生成を伴い、実質的に崩壊する放射性核種が好ましい。
【００７２】
本発明の抗体抱合体を使用することにより、所定の生物学的応答を修正することができ、この場合、薬剤成分は、古典的な化学的治療剤に限定されない。例えば、薬剤成分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドとすることができる。このようなタンパク質には、例えば、酵素的に活性な毒素、又はその活性な断片、例えば脳、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素、タンパク質、例えば腫瘍壊死因子、又はインターフェロンｙ、或いは生物学的応答モディファイヤー、例えば、リンホカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、又はその他の増殖因子が含まれる。
第ニ薬剤は、可能な多数の方法のうちのいずれかを使用して、抗体に対して直接的に又は間接的に連結することができる。例えば、１の薬剤を、Ｎ−サクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）等の架橋結合を用いることにより、ジスルフィド結合の形成を介して、或いは、抗体のＦｃ領域の糖鎖を介して、縮小した抗体成分のヒンジ領域に付着させることができる（例えば、Yu等、(1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong、 Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis等、"Modification of Antibodies by Chemical Methods、" in Monoclonal antibodies: principles and applications、 Birch等(編)、187-230頁(Wiley-Liss、 Inc. 1995); Price、 "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies、" in Monoclonal antibodies: Production、 engineering and clinical application、Ritter等(編)、60-84頁(Cambridge University Press 1995)、 Cattel等(1989) Chemistry today 7:51-58、 Delprino等(1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco等(1997) Bioconjugate Chernistry 8:3; Reisfeld等(1989) Antihody、 Immunicon. Radiopharrn. 2:217; the entire disclosures of each of which are herein incorporated by reference).。更には、例えば、Arnon等、"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"、 in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、 Reisfeld等(編)、243-56頁(Alan R. Liss、 Inc. 1985); Hellstrom等、"Antibodies For Drug Delivery"、 in Controlled Drug Delivery (第２版)、Robinson等(編)、623-53頁(Marcel Dekker、 Inc. 1987); Thorpe、 "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review"、 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications、 Pinchera等(編)、475-506頁(1985); "Analysis、 Results、 And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"、 in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、 Baldwin et a/. (編)、303-16頁(Academic Press 1985)、 and Thorpe et a/.、 "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates"、 Immunol. Rev.、 62:119-58 (1982)等も参照されたい。
治療剤を抗体にコンジュゲートさせるための細胞毒、リンカー、及び方法の種類に関する更なる説明については、Saito, G.等、(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A.等、(2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J. (2001)Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264も参照されたい。
【００７３】
他の実施の形態では、第二薬剤は検出可能な部分であり、それは量的ないしは質的に観察されるか又は測定されうる任意の分子であってもよい。本発明のコンジュゲート抗体に有用な検出可能なマーカーの例は、放射性同位体、蛍光色素、又は相補的に結合する対のいずれか、例えば抗原／抗体(ＮＫＧ２Ｄに対する抗体以外)、レクチン／糖質；アビジン／ビオチン；レセプター／リガンド；又は、分子的にインプリントされたポリマー／プリント分子システムのいずれか１のメンバーである。
またないしは或いは、第二薬剤は、例えば、抗体の循環半減期を増やすことを目的とするポリマーであってもよい。例示的なポリマー及び、該ポリマーをペプチドに接着させる方法は、例えば米国特許第４７６６１０６号；同第４１７９３３７号；同第４４９５２８５号；及び同第４６０９５４６号に例示される。更なる例示的なポリマーには、ポリオキシエチラート化ポリオール及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)部分が含まれる。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質の誘導体化に使用されているＰＥＧのあらゆる形態、例えば、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール、或いはポリエチレングリコール−マレイミドを包含する。例えば、完全長抗体ないし抗体断片は、およそ１０００〜およそ４００００、例えばおよそ２０００〜およそ２００００、例としておよそ３０００〜１２０００の間の分子量を有する一又は複数のＰＥＧ分子にコンジュゲートさせてもよい。抗体又はその断片をペグ化するために、通常、抗体又はその断片を、一又は複数のポリエチレングリコール基が抗体又は抗体断片に付着する条件下において、ＰＥＧのアルデヒド誘導体又は反応性エステルといったポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性のＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して起こる。特定の実施態様では、ペグ化対象の抗体は、グリコシル化抗体である。複数のタンパク質のペグ化方法が従来技術に既知であり、本発明の抗体に適用可能である。例えば、Nishimura等によるＥＰ１５４３１６、Ishikawa等による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ０４／１１４９４、及びＥＰ４０１３８４を参照されたい。
【００７４】
核酸
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関係する。該核酸は、全細胞、細胞溶解物、又は部分的に精製された形態もしくは実質的な純粋形態において存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ分染、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他の方法を含む標準的な技法により他の細胞内成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞内核酸又は細胞内タンパク質から精製される場合に、「単離」されるか又は「実質的に純粋」となる。F. Ausubel等編 (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡでありえ、イントロン配列を含有する場合も、そうでない場合もある。好ましい実施態様において、核酸はｃＤＮＡ分子である。以下の段落ではＤＮＡ配列又はこれらの使用に言及するが、同じ方法又は原理は一般に、ｍＲＮＡ配列にも適用することができる。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学の技法を用いて得ることができる。ハイブリドーマにより発現する抗体（例えば、以下でさらに説明される、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保有するトランスジェニックマウスから調製されるハイブリドーマ）の場合、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅法又はｃＤＮＡクローニング法により得ることができる。免疫グロブリンの遺伝子ライブラリーから得られる（例えば、ファージディスプレイ法を用いる）抗体の場合、該抗体をコードする核酸は、該ライブラリーから回収することができる。
【００７５】
本発明の好ましい核酸分子は、ＩｇＧ４アイソタイプの１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２抗体のＨ鎖配列及びＬ鎖配列をコードする（又はこれらをコードする核酸配列を含む）核酸分子である。１６Ｆ１６のＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号３及び４に示される。１６Ｆ３１のＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号５及び６に示される。ＭＳのＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号４４及び４５をコードする配列である。２１Ｆ２のＶＨ配列及びＶＬ配列をコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号４６及び４７をコードする配列である。
ＶＨセグメント及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片を標準的な組換えＤＮＡ法によりさらに操作して、例えば、該可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、又はｓｃＦｖ遺伝子へと転換させることができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体の定常領域又は可撓性リンカーなど、別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作用可能に連結される。この文脈で用いられる「作用可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がフレーム内にとどまるよう、該２つのＤＮＡ断片を接合することを意味する。
【００７６】
ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長重鎖遺伝子へと転換させることができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において既知であり（例えば、Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健福祉省、NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はＩｇＤの定常領域でありうるが、ＩｇＧ４の定常領域であることが最も好ましい。Ｆａｂ断片による重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域だけをコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することができる。
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域であるＣＬをコードする別のＤＮＡ分子へと作用可能に連結することにより、ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡを全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）へと転換させることができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において知られており（例えば、Kabat, E. A.等(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健福祉省、NIH Publication No. 91-3242を参照されたい）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパ定常領域又はラムダ定常領域でありうるが、カッパ定常領域であることが最も好ましい。
【００７７】
ｓｃＦｖ遺伝子を作成するには、ＶＬ領域及びＶＨ領域が可撓性リンカーにより接合される形で、ＶＨ配列及びＶＬ配列が隣接する単鎖タンパク質として発現されうるように、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片が、可撓性リンカーをコードする別の断片、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片へと作用可能に連結される（例えば、Bird等(1988) Science 242:423-426; Huston等、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty等、(1990) Nature 348:552-554を参照されたい）。
【００７８】
抗体の作製
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）、Kohler及びMilstein (1975) Nature 256: 495による標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む各種技法により作製することができる。原則としては、体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、モノクローナル抗体を作製する他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルス又は癌遺伝子による形質転換も用いることができる。
ハイブリドーマを調製するのに好ましい１つの動物系は、マウス系である。融合のために免疫化された脾臓細胞を単離するための免疫化のプロトコール及び技法は、融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順と同様、当技術分野で既知である。確立された技法を用いると、本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体も、マウスモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。例えば、重鎖免疫グロブリン及び軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象のマウスハイブリドーマから得ることができ、標準的な分子生物学の技法を用いて、非マウス（例えば、ヒト）の免疫グロブリン配列を含有するように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作成するためには、当技術分野で公知の方法を用いて、マウス可変領域をヒト定常領域へと連結することができる（例えば、Cabilly等による米国特許第４８１６５６７号を参照されたい）。ヒト化抗体を作成するためには、当技術分野で公知の方法を用いて、マウスＣＤＲ領域をヒトフレームワーク内へと挿入することができる（例えば、Winterによる米国特許第５２２５５３９号；ならびにQueenらによる米国特許第５５３０１０１号、同第５５８５０８９号、同第５６９３７６２号、及び同第６１８０３７０号を参照されたい）。
【００７９】
好ましい実施態様において、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ｈＮＫＧ２Ｄを対象とするこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の一部を保有するトランスジェニックマウス又は導入染色体マウスを用いて発生させることができる。これらのトランスジェニックマウス又は導入染色体マウスは、本明細書でそれぞれＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスと称するマウスを含め、本明細書では「ヒトＩｇマウス」と総称される。ＨｕＭＡｂマウス（Medarex社製）は、内因性のｕ鎖及びＫ鎖の遺伝子座を不活化する標的となる突然変異と共に、位置変えされないヒト重（ｐ及びｙ）鎖及びＫ軽鎖の免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子のミニ遺伝子座を含有する（例えば、Lonberg等、(1994) Nature 368: 856-859を参照されたい）。したがって、該マウスは、マウスＩｇＭ又は同Ｋ鎖の発現低下を示し、免疫化に対する反応では、導入されたヒト重鎖及び軽鎖の導入遺伝子がクラススイッチング及び体細胞突然変異を受けて、高親和性のヒトＩｇＧＫモノクローナルを発生させる（Lonberg N等、(1994)、前掲；Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N.及びHuszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93、及びHarding, F.及びLonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546において総括されている)。ＨｕＭＡｂマウスの調製及び使用、ならびにこのようなマウスにより保有されるゲノム修飾は、それらすべての全体を出典明記によりここに援用される、Taylor, L.等 (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. 等 (1993)International Immunology 5: 647-656; Tuaillon等 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi等 (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. 等 (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon等 (1994) J. Immunol. 152:2912 2920; Taylor, L.等 (1994) International immunology 6: 579-591; 及びFishwild, D. 等 (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851においてさらに説明されている。さらに、すべてLonberg及びKayによる米国特許第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５７８９６５０号、同第５８７７３９７号、同第５６６１０１６号、同第５８１４３１８号、同第５８７４２９９号、及び同第５７７０４２９号；Suraniらによる米国特許第５５４５８０７号；すべてLonberg及びKayによる国際公開第９２／０３９１８号、同第９３／１２２２７号、同第９４／２５５８５号、同第９７／１３８５２号、同第９８／２４８８４号、及び同第９９／４５９６２号；ならびにKorman等による国際公開第０１／１４４２４号を参照されたい。別の実施態様では、ヒト重鎖導入遺伝子及びヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスなど、導入遺伝子及び導入染色体上においてヒト免疫グロブリン配列を保有するマウスを用いて、本発明のヒト抗体を生成することができる。本明細書では「ＫＭマウス」と称するこのようなマウスは、Ishida等による国際公開第０２／４３４７８号において詳細に説明されている。またさらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的なトランスジェニック動物系も用いられており、これらを用いて本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を生成することができる。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ社製）と称する代替的なトランスジェニック系も用いることができ、このようなマウスは、例えば、Kucherlapati等による米国特許第５９３９５９８号；同第６０７５１８１号；同第６１１４５９８号；同第６１５０５８４号；及び同第６１６２９６３号において説明されている。さらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替的な導入染色体動物系も用いられており、これらを用いて本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を生成することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称する、ヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体を保有するマウスも用いることができ、このようなマウスは、例えば、Tomizuka等（2000）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727において説明されている。その上、当技術分野ではヒト重鎖導入染色体及びヒト軽鎖導入染色体を保有するウシも説明されており（Kuroiwa等（2002）、Nature Biotechnology 20:889-894）、これらを用いて本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を生成することができる。
【００８０】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするファージディスプレイ法を用いて調製することもできる。ヒト抗体を単離するこのようなファージディスプレイ法は、当技術分野で確立されている。例えば、Ladner等による米国特許第５２２３４０９号、同第５４０３４８４号、及び同第５５７１６９８号；Dower等による米国特許第５４２７９０８号及び同第５５８０７１７号；McCafferty等による米国特許第５９６９１０８号及び同第６１７２１９７号；ならびにGriffiths等による米国特許第５８８５７９３号、同第６５２１４０４号、同第６５４４７３１号、同第６５５５３１３号、同第６５８２９１５号、及び同第６５９３０８１号を参照されたい。本発明のヒトモノクローナル抗体は、免疫化時にヒト抗体反応を発生させうるように、その中へとヒト免疫細胞を再構成したＳＣＩＤマウスを用いて調製することもできる。このようなマウスは、例えば、Wilson等による米国特許第５４７６９９６号及び同第５６９８７６７号において説明されている。
ヒトＩｇマウスを用いて本発明のヒト抗体を生成する場合、Lonberg, N.等 (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D.等 (1996) NatureBiotechnolo,gy 14: 845-851；及び国際公開第９８／２４８８４号及び同第０１／１４４２４号により説明される通り、精製又は濃縮されたｈＮＫＧ２Ｄ抗原の調製物、及び／又はｈＮＫＧ２Ｄを発現する細胞により、このようなマウスを免疫化することができる。初回の注入時において、マウスは６〜１６週齢であることが好ましい。例えば、精製又は濃縮されたｈＮＫＧ２Ｄ抗原の調製物（５〜５０μｇ）を用いて、腹腔内を介してヒトＩｇマウスを免疫化することができる。精製又は濃縮されたｈＮＫＧ２Ｄ抗原の調製物を用いる免疫化の結果として抗体が得られない場合は、ｈＮＫＧ２Ｄを発現する細胞、例えば、ヒトＮＫ細胞株もしくはＴ細胞株、又は、ＤＡＰ１０を伴う場合であれ、そうでない場合であれ、組換えｈＮＫＧ２Ｄを発現する哺乳動物細胞によりマウスを免疫化して免疫応答を促進することもできる。
【００８１】
ｈＮＫＧ２Ｄに対する完全ヒトモノクローナル抗体を発生させる詳細な手順は、以下の実施例１で説明される。投与される抗原の形態及び量（例えば、ｈＮＫＧ２Ｄポリペプチド又はｈＮＫＧ２Ｄを発現する細胞）のほか、投与スケジュール、また、例えば、完全フロイントアジュバント又は不完全フロイントアジュバントなど、アジュバントの可能な使用も、当技術分野で確立された方法により、典型的には各抗原マウス系に応じて最適化される。
後眼窩血を介して得られる血漿試料により免疫化プロトコールの経過に亘って免疫応答をモニタリングすることができ、ＥＬＩＳＡ（以下で説明される）により該血漿及び血清をスクリーニングすることができ、十分な力価の抗ｈＮＫＧ２Ｄヒト免疫グロブリンを伴うマウスを融合に用いることができる。屠殺及び脾臓摘出の３日前に、静脈内を介してマウスに抗原を追加投与することができる。各免疫化につき、２〜３回ずつの融合を実施することが必要な場合があると予測される。
【００８２】
本発明のヒトモノクローナル抗体を作製するハイブリドーマを発生させるために、免疫化したマウスに由来する脾臓細胞及び／又はリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株へと融合することができる。結果として得られるハイブリドーマは、抗原特異的抗体の作製についてスクリーニングすることができる。例えば、免疫化されたマウスに由来する脾臓リンパ球の単細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧにより、１／６の個数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌性マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）と融合させることができる。代替的に、該細胞は、電気融合により融合することもできる。平底マイクロ滴定プレート内に約２×１０５個の細胞を播種した後、２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」馴化培地、５％オリゲン（ＩＧＥＮ社製）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１倍濃度のＨＡＴを含有する選択培地（Ｓｉｇｍａ社製、融合の２４時間後にＨＡＴを添加する）中で２週間に亘りインキュベートする。約２週間後には、ＨＴによりＨＡＴを置換した培地中で細胞を培養することができる。次いで、ヒトモノクローナルＩｇＭ抗体及び同ＩｇＧ抗体について、ＥＬＩＳＡにより個々のウェルをスクリーニングすることができる。大規模なハイブリドーマ増殖が生じたら、通常、１０〜１４日後に培地を観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマは、再播種し、再度スクリーニングすることができ、ヒトＩｇＧについて依然として陽性である場合、制限的な希釈により、少なくとも２回に亘ってモノクローナル抗体をサブクローニングすることができる。次いで、安定的なサブクローンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して、組織培地中に少量の抗体を発生させ、特徴付けすることができる。ヒトモノクローナル抗体を精製するには、２リットル容量のスピナーフラスコ内で選択されたハイブリドーマを増殖させ、モノクローナル抗体を精製することができる。上清を濾過及び濃縮した後で、プロテインＡ−セファロース（ニュージャージー州、ピスケータウェイ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）によるアフィニティークロマトグラフィーを行うことができる。ゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーにより溶出したＩｇＧを検査して純度を確認することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、分光光度法により濃度を決定することができる。モノクローナル抗体をアリコートし、−８０℃で保存することができる。
本発明の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ法及び遺伝子形質移入法の組合せを用いて、宿主細胞の形質移入ーマ内において作製することもできる（例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202）。
【００８３】
例えば、抗体を発現させるには、標準的な分子生物学的技法（例えば、対象抗体を発現するハイブリドーマを用いるＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング）により、部分又は完全長の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを得ることができ、該遺伝子が転写及び翻訳の制御配列へと作用可能に連結され、該抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する目的の機能を果たすことが可能であるように、該ＤＮＡを発現ベクター内に挿入することができる。
発現ベクター及び発現制御配列は、用いられる発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子及び抗体の重鎖遺伝子は、個別のベクターに挿入することもでき、より典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することもできる。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子の断片及びベクター上における相補的な制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合は、平滑末端のライゲーション）により発現ベクターに挿入することができる。ベクター内における１つ又は複数のＣＨセグメントにＶＨセグメントが作用可能に連結され、ベクター内におけるＣＬセグメントにＶＬセグメントが作用可能に連結されるように、本明細書で説明される抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を用いて、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を予めコードする発現ベクターにこれらを挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製することができる。またないし或いは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドもコードできる。シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端へとフレーム内で連結されるよう、抗体鎖遺伝子をベクター内にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドでもありえ、異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）でもありうる。
【００８４】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を保有する。「制御配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。このような制御配列は、例えば、Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990))において説明されている。
当業者であれば、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの因子に依存する場合があることを理解するであろう。哺乳動物の宿主細胞発現に好ましい制御配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーなど、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメントを含む。代替的に、ユビキチンプロモーター又はｐ−グロビンプロモーターなど、ウイルス以外の制御配列も用いる場合がある。またさらに、調節エレメントは、ＳＶ４０初期プロモーターに由来する配列及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含有するＳＲａプロモーターシステム（Takebe, Y.等 (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472）など、異なる供給源に由来する配列からもなる。
【００８５】
抗体鎖遺伝子及び制御配列に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内におけるベクターの複製（例えば、複製起点）を調節する配列、及び選択マーカー遺伝子など、さらなる配列を保有する場合がある。選択マーカー遺伝子は、その中にベクターが導入された宿主細胞の選択を容易とする（例えば、すべてAxel等による米国特許第４３９９２１６号、同第４６３４６６５号、及び同第５１７９０１７号を参照されたい）。例えば、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対し、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサートによる選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞において用いられる）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８による選択用）を含む。
軽鎖及び重鎖を発現するには、標準的な技法により、重鎖及び軽鎖をコードする（１種又は複数種の）発現ベクターを、宿主細胞内に形質移入する。「形質移入」という用語の各種の形態は、外因性ＤＮＡを原核宿主細胞又は真核宿主細胞内へと導入するのに用いられることが通例である多種多様な技法、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストラン形質移入などを包含する。本発明の抗体の発現は、原核宿主細胞又は真核宿主細胞のどちらにおいても理論的には可能であるが、真核細胞、また特に、哺乳動物細胞の方が、原核細胞よりも、適正に折りたたまれて免疫学的に活性な抗体を組み立てて分泌する可能性が高いので、このような真核細胞における抗体の発現、また哺乳動物細胞宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。抗体遺伝子の原核細胞による発現は、高収量の活性抗体の作製には有効でないことが報告されている（Boss, M. A.及びWood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13）。
【００８６】
本発明の組換え抗体を発現するのに好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（例えば、R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621において説明されるＤＨＦＲ選択マーカーと共に用いられる、Urlaub及びChasin, (1980) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 77:4216-4220において説明されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞と共に用いる場合、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、同第８９／０１０３６号、及びＥＰ３３８８４１において開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する場合、該宿主細胞内における該抗体の発現、又はより好ましくは、その中で該宿主細胞が増殖する培地内への抗体の分泌を可能とするのに十分な時間に亘って宿主細胞を培養することにより、該抗体を作製する。標準的なタンパク質精製法を用いて、培地から抗体を回収することができる。
【００８７】
抗体の特徴付け
製造又は精製後、或いはスクリーニング又は選択手順の一部として、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の機能的特徴を調査することができる。対象の機能的特性には、例えば、ｈＮＫＧ２Ｄに対する抗体結合特異性、抗体のｈＮＫＧ２Ｄリンガドとの競合、抗体の、標準抗体（例えば、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ及び２１Ｆ２）との競合、抗体が結合するエピトープ、抗体−抗原相互作用の親和性、及び抗体のアンタゴニスト／アゴニスト特性が含まれる。
以下に、抗体の特徴の例示的アッセイについて簡単に説明する。幾つかについては、後述のセクションで更に説明し、及び／又は実施例に記載する。
【００８８】
（１）モノクローナル抗体（又は、動物スクリーニング手順の一部としてのポリクローナル抗体を含む血清）を確認することにより、ｈＮＫＧ２Ｄに特異的な抗体を評価することができる。ＮＫＧ２Ｄを含む細胞株又はＮＫＧ２Ｄを含まない細胞株を、抗体を用いてインキュベートした後、直接標識された第２抗体を用いてインキュベートし、例えばフローサイトメトリーにより可視化する。
（２）ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞を、抗体又はハイブリドーマを用いて又は用いずにインキュベートした後、リガンド−ｍＦｃタンパク質及びリガンドに特異的な第２抗体を用いてインキュベートして、リガンド結合及びその遮断レベルをフローサイトメトリーにより決定することにより、リガンド結合の遮断を評価することができる。遮断は、プレインキュベーションを行わない場合に対するプレインキュベーションを行った場合のリガンド結合の割合（％）として計算することができ、プレインキュベーションを行った場合の方に低い結合が見られる。
（３）同様にして、一又は複数の標準抗ＮＫＧ２Ｄ抗体によって使用される結合部位の競合を評価することができる。但し、この場合は、本発明の抗体又は標準抗体（例えば、ＯＮ７２又は１４９８１０）によりプレインキュベーションを行った後で、後で追加した抗体を用いたインキュベーションと当該抗体の検出とを行うことができる。
（４）Ｂｉａｃｏｒｅマシンで、on-rate及びoff-rateを含む抗体の親和性パラメータを決定することができる。例えば、ｈＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をチップ上に固定化し、抗体をチップに通してからon-rateとoff-rateとを決定し、ＫＤを計算する。
【００８９】
（５）抗体を用いて又は抗体を用いずに、ｈＮＫＧ２Ｄを発現する細胞を一晩インキュベートした後、抗体を再度追加し、フローサイトメトリーにおいてＮＫＧ２Ｄのレベル（例えば、結合した抗体のレベル）を検出することにより、抗体によるＮＫＧ２Ｄの内部移行の誘導を測定することができる。
（６）例えば、５１Ｃｒを充填したＮＫＧ２Ｄリガンド、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はＵＬＢＰ１−４を発現する標的細胞を殺傷するエフェクター細胞としてＮＫ細胞株のＮＫ９２又はＮＫＬを使用して、ｈＮＫＧ２Ｄリガンド媒介性の殺傷を遮断する抗体の能力を評価することができる。
（７）ＰＢＭＣの異なる細胞種類のマーカーと共にｈＮＫＧ２Ｄ抗体及び第二抗体を用いてサル及びヒトのＰＢＭＳのインキュベーションを行い、種々のサブセットのＮＫＧ２Ｄ染色を分析した後で、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヒトと同じような）ではなく、サルＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞とヒト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体との交差反応性を示すことができる。
（８）事前に刺激を行った場合と行わなかった場合との、Ｔ細胞レセプター、ＣＤ２８及び／又はＮＫＧ２Ｄにより刺激したＰＢＭＣ集団において誘導されたＣＤ８＋細胞の細胞増殖として、抗体結合時のＮＫＧ２Ｄの活性化を測定することができる。
【００９０】
結合アッセイ
本発明は、ｈＮＫＧ２Ｄに結合する抗体、並びに抗原結合断片及びそのイムノコンジュゲートを提供する。多岐に亘るアッセイのいずれかを使用して、ｈＮＫＧ２Ｄに対する抗体の結合を評価することができる。特にＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、ＢＩＡＣＯＲＥ、及びその他競合アッセイに基づくプロトコールが使用に適しており、これらは従来技術に既知である。更に、競合アッセイを含む幾つかの結合アッセイを実施例に記載する。
例えば、単純な結合アッセイを使用することができる。このアッセイでは、標的タンパク質又はエピトープ（例えば、ＮＫＧ２Ｄ又はその一部）の存在下で試験抗体をインキュベートし、結合しなかった抗体を洗浄して、例えば放射標識、質量分析のような物理的方法、或いは、例えば細胞蛍光測定法による分析（例えばＦＡＣＳｃａｎ）を用いて検出される直接的又は間接的蛍光標識を用いることにより、結合した抗体の存在を評価する。このような方法は当業者には周知である。コントロールである非特異的抗体に見られる量を上回る結合量は、抗体が標的に特異的に結合することを示すものである。
【００９１】
このようなアッセイでは、標的細胞又はヒトＮＫＧ２Ｄに対する試験抗体の結合能を、コントロールタンパク質、例えば構造的に関連性の無い抗原に対して産生させた抗体、或いは非Ｉｇペプチド又はタンパク質の、同じ標的に対する結合能と比較することができる。任意の適切なアッセイによりコントロールタンパク質と比較した場合に２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％又はそれよも大きな親和性で標的細胞又はＮＫＧ２Ｄに結合する抗体又は断片は、標的と「特異的に結合する」又は「特異的に相互作用する」と言われ、以下の治療方法に使用するのに適している。ＮＫＧ２Ｄに対する（ポジティブ）コントロール抗体、例えば、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２の、結合に作用する試験抗体の能力も評価することができる。
一態様では、本発明は、生物学的特徴及び／又は実質的なＶＨ及び／又はＶＬ配列同一性を１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２と共有している抗ｈＮＫＧ２Ｄを提供する。ある例示的な生物学的特徴は、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２エピトープ、すなわち１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２抗体が結合するｈＮＫＧ２Ｄの、細胞外ドメインの対応する領域への結合である。１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２エピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、例えばAntibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のような常法の交差ブロックアッセイを行うことができる。
【００９２】
例示的な交差ブロックないし競合アッセイでは、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２(コントロール)抗体と試験抗体は混合され(又は予め吸着され)、ＮＫＧ２Ｄを含む試料にアプライされる。特定の実施態様では、ＮＫＧ２Ｄ含有試料にアプライする前の一定時間、コントロール抗体を様々な量の試験抗体(例えば１：１０又は１：１００)と混合してもよい。他の実施態様では、コントロールと様々な量の試験抗体は、抗原／標的試料への曝露の間に単に混合されてもよい。遊離した抗体と結合した抗体(例えば、分離法又は洗浄技術を用いて結合していない抗体を取り除くことによって)、そして、コントロール抗体と試験抗体(例えば、種-ないしはアイソタイプ-特異的な二次抗体を用いることによって、コントロール抗体を検出可能な標識にて特異的に標識することによって、又は、異なる化合物を区別するための質量分析のような物理的な方法を用いることによって)を区別することができる限りにおいて、試験抗体が抗原へのコントロール抗体の結合を低減するかどうかを決定することができ、この場合に該試験抗体はコントロールと実質的に同じエピトープを認識することが示されるであろう。このアッセイにおいて、完全に無関係な抗体がある場合で(標識した)コントロール抗体が結合すると、コントロール値は高い。低いコントロール値は、標識した(ポジティブ)コントロール抗体を標識していないコントロール抗体とインキュベートし、このとき競合が生じて標識した抗体の結合が低減することによって得られる。
試験アッセイにおいて、試験抗体の存在下で、標識した抗体の反応が有意に低減した場合、試験抗体が同じエピトープを認識する、すなわち標識したコントロール抗体と「交差反応する」ことを表す。およそ１：１０からおよそ１：１００の間のコントロール：試験抗体ないし化合物のいずれかの比率で、抗原／標的への標識したコントロールの結合を少なくとも５０％又はより好ましくは７０％低減する任意の試験抗体ないし化合物は、コントロールと実質的に同じエピトープないしは決定基に結合する抗体ないし化合物であると考えられる。好ましくは、このような試験抗体ないし化合物は、抗原／標的へのコントロールの結合を少なくとも９０％低減するであろう。にもかかわらず、コントロール抗体ないし化合物の結合を測定可能な程度に低減する任意の化合物ないし抗体が、本発明で用いられてもよい。
【００９３】
一実施態様では、フローサイトメトリー試験により競合を評価することができる。ｈＮＫＧ２Ｄを有する細胞を、まず、このレセプター（例えば、ｈＮＫＧ２Ｄ又は組換えでｈＮＫＧ２Ｄ及び１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２抗体を発現するＢａｆ／３細胞）に特異的に結合することが既知であるＴ又はＮＫ細胞コントロール抗体と共にインキュベートし、次いで、例えば蛍光クロム又はビオチンにより標識できる試験抗体と共にインキュベートする。飽和量のコントロール抗体を用いたプレインキュベーションにより得られる結合が、コントロールを用いたプレインキュベーションをしない抗体により得られる結合（蛍光の平均）の８０％、好ましくは５０％、４０％、又はそれ未満である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言える。或いは、飽和量の抗体を用いてプレインキュベートした細胞上の標識したコントロール（蛍光クロム又はビオチン）により得られた結合が、抗体を用いたプレインキュベーションを行わない場合に得られる結合の８０％、５０％、４０％、又はそれ未満である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言える。例示的抗体の競合アッセイについては実施例５を参照されたい。
また、類似の交差ブロックアッセイを用いて、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２をｈＮＫＧ２Ｄ−リガンドの適切な形態と単純に交換して、試験(ヒト化)抗体が、ヒトＮＫＧ２Ｄの天然のリガンドであるＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、又はＲＡＥＴ１ファミリーへの結合に影響するか否かを評価することができる。実施例に記載の１の適切な形態は、抗体のＦｃ部分を有するリガンド（例えば、ＭＩＣＡ）の融合タンパク質である。リガンドがＦｃ領域にコンジュゲートしていることにより、例えば、マウスのＦｃ領域を検出するためのヤギ抗マウス抗体を使用して、Ｆｃ領域が得られた動物種に特異的な抗体による融合タンパク質の検出が可能である。
【００９４】
一実施態様では細胞アッセイを使用する。このアッセイでは、ｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞、例えば関節リウマチ患者由来のＣＤ４＋ＣＤ２８−細胞（又は別の自己免疫疾患又は炎症性疾患由来の等価な細胞）を、例えば、Ｆｃ融合タンパク質の形態の、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はＵＬＢＰタンパク質といったＮＫＧ２Ｄリガンド、或いはこれらのリガンドのいずれかを発現する細胞と共にインキュベートして、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はその他分子の細胞の活性を遮断する能力を評価する。別のアッセイでは、リガンドの不在下におけるＮＫＧ２Ｄレセプターの活性のベースラインレベルを取得し、抗体又は化合物の、ベースライン活性レベルを低下させる能力を検出する。１の種類の実施態様では、ハイスループットスクリーニング方式を使用して、レセプターの活性を遮断するか又はそうでない場合に発現低下することができる化合物を同定する。例示的なリガンド競合アッセイについては実施例３を参照されたい。
好ましくは、ＮＫＧ２Ｄエピトープを認識するモノクローナル抗体は、関節リウマチ患者において有意な割合のＣＤ４＋Ｔ細胞、特にＣＤ４＋ＣＤ２８−  Ｔ細胞上に存在するエピトープと反応するが、他の細胞、即ちＮＫＧ２Ｄを発現しない免疫細胞又は非免疫細胞とは反応しない。したがって、ＮＫ細胞又はＴ細胞上のｈＮＫＧ２Ｄを特異的に認識した抗体は、関節リウマチ等の自己免疫疾患又は炎症性疾患を有する患者由来のＴ細胞への結合能について試験することができる。レセプターを発現する細胞の種類（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞等）に関係なく、ＮＫＧ２Ｄ活性が疾患の病理学に関連しているあらゆる疾患の治療に本発明を使用することができ、特定の疾患に関連しているあらゆる細胞種類を使用して、レセプターへの結合能について抗体を試験することができることを理解されたい。例えば、特定の疾患が、ＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ細胞の過剰活性又は増殖と関連していることが観察される場合、同じレセプターを発現するＮＫ細胞を用いて抗体を育てて試験することができる。
【００９５】
一実施態様では、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞、例えば関節リウマチ患者から採取したＣＤ４＋ＣＤ２８−  Ｔ細胞に対する結合能を試験するイムノアッセイにおいて抗体を検証する。例えば、抹消血リンパ球（ＰＢＬ）を複数の患者から採取して、例えば関連する抗体を用いたフローサイトメトリーにより、このＰＢＬからＣＤ４＋、好ましくはＣＤ４＋  ＣＤ２８−細胞を濃縮する。次いで、当業者に周知の標準的な方法を用いて、この細胞に対する所定の抗体の結合能を評価する。有意な割合（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％又はそれ以上）の患者に由来する、ＮＫＧ２Ｄを発現することが既知である細胞、例えばＮＫ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、ＲＡ患者由来のＣＤ４  Ｔ細胞等の実質的な割合（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれ以上）に結合することが示される抗体は、本発明において、患者の細胞中のＮＫＧ２Ｄレセプターの発現を決定する診断的目的と、本明細書に記載の治療方法、例えばヒトに適した遮断抗体、又は細胞障害性抗体としての使用の両方に適しているとみなすことができる。細胞に対する抗体の結合を評価するため、抗体を直接的又は間接的に標識することができる。関節的に標識する場合、通常、二次的な、標識した抗体を追加する。このようにして、例えば細胞蛍光測定法による分析（例えばＦＡＣＳ）を用いて、細胞に対する抗体の結合を検出することができる。このような方法は従来技術に周知である。
【００９６】
ＮＫＧ２Ｄ発現細胞を殺傷することを望まないなどの本発明のある態様では、本発明の抗体は、Ｆｃレセプターに対して実質的に特異的な結合を示さないことが好ましい。このような抗体は、Ｆｃレセプターを結合しないことが分かっている様々な重鎖の定常領域を含んでもよい。ＩｇＧ4定常領域がその一例である。或いは、定常領域を含まない抗体断片、例えばＦａｂ又はＦ(ａｂ')２断片を、Ｆｃレセプター結合を避けるために用いてもよい。Ｆｃレセプター結合は、例えばＢＩＡＣＯＲＥアッセイでのＦｃレセプタータンパク質に対する抗体の結合を試験することを含む当分野で公知の方法に従って評価されてもよい。また、Ｆｃ部分がＦｃレセプターへの結合を最小化する又は避けるように修飾されているいずれかの他の抗体タイプも用いられてよい(例として国際公開０３１０１４８５を参照、その開示内容は出典明記によってここに援用される)。例えばＦｃレセプター結合を評価するための細胞ベースのアッセイなどのアッセイは当分野で周知であり、例えば、国際公開０３１０１４８５において記述される。
【００９７】
機能的アッセイ
ＮＫＧ２Ｄの活性を反映する何らかの適切な生理学的変化を使用して、試験化合物又は抗体の有用性を評価することができる。例えば、細胞ベースのアッセイ等のアッセイにおいて、遺伝子発現、サイトカイン産生、シグナル伝達分子リン酸化、細胞成長、細胞増殖、ｐＨ、Ｃａ２＋、ＩＰ３、ｃＧＭＰ、又はｃＡＭＰといった細胞内第２メッセンジャー、或いは細胞障害性活性又は他のＴ細胞の活性化能といった活性の変化のような様々な影響を測定することができる。例えば、ＣＤ２５、ＩＦＮ−γ、又はＴＮＦ−α（例えば、Groh等、(2003) PNAS 100: 9452-9457; Andre等、(2004) Eur. J. Immunol 34: 1-11参照）といったＮＫＧ２Ｄ応答性遺伝子の発現を検出することにより、レセプターの活性を評価することができる。或いは、リガンドの存在下でＣＤ４＋ＣＤ２８−ＮＫＧ２Ｄ＋細胞をインキュベートすることにより、又は抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、並びに抗ＣＤ３抗体を活性化することにより、ＮＫＧ２Ｄの活性を評価して、化合物又は試験抗体の、Ｔ細胞によりＴＮＦ−α又はＩＦＮ−γの放出を阻害する能力を測ることができる。或いは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２、ＵＬＢＰ−３等のリガンドか、又は自己ＭＩＣ＋ＲＡ滑膜細胞等のリガンド産生細胞の存在下でＣＤ４＋ＣＤ２８−ＮＫＧ２Ｄ＋Ｔ細胞をインキュベートし、試験抗体又は化合物の、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γ又はＴＮＦ−α）、又はＴ細胞増殖の阻害能を評価することができる。
in vitroアッセイは、随意で、ＲＡのような自己免疫疾患又は炎症性疾患患者由来の細胞、例えば、ＲＡ患者から採取したＮＫＧ２Ｄを発現するＣＤ４＋ＣＤ２８−細胞（又はそれから得られる細胞株）を使用することができる。しかし、一般にはあらゆるＮＫＧ２Ｄ発現細胞を使用することができる。例えば、レセプターの発現が検出可能に細胞の活性を変化させ、例えばＮＫＧ２Ｄリガンドにより活性可能になるなどする限り、非ＲＡ免疫細胞株、例えばＴ細胞株を、ＮＫＧ２Ｄコード化導入遺伝子を形質移入して、本アッセイに使用することができる。例えば、ＲＡ患者由来のＣＤ４＋ＣＤ２８−ＮＫＧ２Ｄ＋細胞、例えば滑膜組織から単離されたＰＢＬ又はＴ細胞を用いて、細胞株を樹立することができる。このような細胞をＩＬ−１５の存在下で培養することにより、ＮＫＧ２Ｄの発現を確実に持続させることができる（例えば、Groh等、(2003) PNAS 100: 9452-9457参照、その開示内容は出典明記によってここに援用される）。
【００９８】
抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体が、ＮＫＧ２Ｄと一又は複数のそのリガンドとの相互作用を低下させる又は遮断するか、或いはｈＮＫＧ２Ｄリガンド相互作用を遮断することが知られている抗体と競合する場合、この抗体はＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を低下させるために有用でありえる。これは、一般的な細胞障害性アッセイによって評価することができる。実施例６は、例示的な細胞障害性アッセイである、標的細胞のＮＫＧ２Ｄ−リガンド媒介性殺傷について記載している。この場合、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の、ＭＩＣＡを形質移入したＢａＦ／３のＮＫ細胞媒介性殺傷を低下させる又は阻害する能力は、５１Ｃｒの標的細胞放出を測定することにより評価される。
他の態様では、本発明の抗体が実質的なアゴニスト活性を欠くことを確認することが望ましい。
【００９９】
１のアッセイでは、健常なボランティア又はＩＢＤ患者由来のＰＢＭＣの、抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体と組み合わせた、可溶性の抗体又はプレートに結合させた抗体により活性化した後の、増殖及びサイトカイン産生を評価することができる。この方法では、健常者又は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者由来のＰＢＭＣを従来の方法により精製する。細胞をＣＦＳＥで（分子プローブ、カタログ番号Ｃ３４５５４）染色する。（０．５ｍｌの２％ＦＣＳ  ＰＢＳ中）１０７個の細胞に対し、１μｌのＣＦＳＥ（０．５ｍＭ）を添加し、３７℃で４０分間に亘り細胞をインキュベートする。次いで、２ｍｌのＦＣＳを添加し、室温で１分間混合物を放置する。次いで、ＲＰＭＩ−１６４０培地（１２ｍｌ）を用いた遠心分離により細胞を３回に亘って洗浄する。洗浄後、細胞を１ｍｌの２％ＦＣＳの培地（例えばＲＰＭＩ−１６４０）中に再度懸濁する。
９６ウェルプレートに、室温で２時間に亘り３０μｌの抗マウスＦｃ（Jackson - Immuno Resarch 115-006-008）をコーティングし、次いでＰＢＳにより洗浄する。以下のスキームに従って、抗体（抗ＣＤ３  Biosceinceカタログ番号１４−００３７−８２、抗ＣＤ２８  カタログ番号３４８０４６  Becton Dickison）を添加し、ウェル内に残す。
ＣＤ３  ０．１又は０．３ｎｇ／ｍｌ
ＣＤ３  ０．１又は０．３ｎｇ／ｍｌ＋ＣＤ２８  ０．２μｇ／ｍｌ
ＣＤ３  ０．１又は０．３ｎｇ／ｍｌ＋ＣＤ２８  ０．２μｇ／ｍｌ＋抗ＮＫＧ２Ｄ  ０．２μｇ／ｍｌ
ＣＤ３  ０．１又は０．３ｎｇ／ｍｌ＋抗ＮＫＧ２Ｄ  ０．２μｇ／ｍｌ
【０１００】
次に、１００．０００ＣＦＳＥで標識したＰＢＭＣを添加して３日間放置する。次いで上清を回収してサイトカインの分析を行い、増殖のために抗ＣＤ５６、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及びＣＦＳＥ標識を用いてリンパ球の種類に関してＰＢＭＣをフローサイトメトリーにより分析する。
別のアッセイでは、ＮＫＧ２Ｄリガンドを欠く標的細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞障害性能への影響を試験する。結合により、細胞の細胞障害性能が高まる場合、アゴニスト活性が存在している。簡潔に説明すると、ＭＩＣＡを発現するｐ８１５細胞、又は形質移入していないｐ８１５細胞と抗ＣＤ３抗体、（ｐ８１５細胞上のＦｃレセプターに結合することにより殺傷の方向転換を招く）、及びＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞を用いて、健常者由来のＩＬ−２により刺激したＰＢＭＣをインキュベートする。次いで、ｐ８１５細胞に結合しない抗ＮＫＧ２Ｄ抗体（例えば、ヒトＩｇＧ４アイソタイプの抗体）が、ＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断するかどうか、及び／又は抗体がＣＤ３−ｐ８１５の方向を変えた結合を促進するかどうかを分析する。このようにして、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性が、抗ＣＤ８抗体と追加的な抗ＮＫＧ２Ｄ抗体とを用いてｐ８１５細胞をインキュベートすることにより亢進されないことが示されるが、同じ抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が、同じＰＢＭＣ集団のｐ８１５誘導性殺傷におけるＮＫ−ＭＩＣＡ相互作用を遮断することを示すことで、この抗体が機能性であることを示すことができる。
【０１０１】
別のアッセイでは、ＮＫＧ２Ｄシグナル伝達経路及びＮＫＧ２Ｄ分子が、一又は複数の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の添加により活性化されるかどうかを調査することができる。ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ細胞又はＮＫ−９２細胞）、或いは、抹消血から単離されたヒトＮＫ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞を使用することができる。例えば、Ｆｃ−ＭＩＣａか、又はコントロールとして照射したＭＩＣＡ発現細胞を結合させたプレート、或いは溶液中において、ヒト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を用いて、ＮＫＬ細胞をインキュベートした。適切な時間に亘るインキュベーションの後（例えば、５、１０、３０分）、プロテアーゼ及びホスファターゼインヒビターの存在下において氷上で細胞を溶解し、ＮＫＧ２Ｄの刺激の下流にあることが既知である一又は複数のリン酸化シグナル伝達分子のレベルについて、標準的なウェスタンブロッティング技術により当該細胞を分析する。
アニマルベースのアッセイでは、動物の体内細胞のＮＫＧ２Ｄ活性のあらゆる生理学的又は病理学的結果を使用して、抗体又は試験化合物の活性を評価することができる。
【０１０２】
例えば、ＭＩＣＡ産生滑膜細胞等のリガンド産生細胞を同時投与して又は同時投与せずに、ＣＤ４＋ＣＤ２８−ＮｋＧ２Ｄ＋細胞を動物モデルの関節に導入することができ、炎症又は組織の損傷を評価する。次いで試験化合物又は抗体を導入し、炎症又は組織損傷を抑制するか、遅延させるか、逆転させるか、或いは炎症又は組織損傷に何らかの影響を与える能力を検出する。
関節リウマチ（ＲＡ）滑膜外植片を用いた実験を実行して、炎症促進性サイトカインの自然放出に対するＮＫＧ２Ｄ遮断の影響を研究することもできる（例えば、Brennan ら、Lancet 1989; 2 (8657);244-247参照）。このようなアッセイでは、ヒト又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を、ＲＡ滑膜培養物上で試験し、リガンド結合及びＮＫＧ２Ｄの機能の遮断に有用であることが示されている濃度においてマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体等と比較する。ＲＡ滑膜細胞を、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又はアイソタイプコントロール抗体の存在下又は不在下において、４８時間に亘って培養する。既知の抗炎症剤をポジティブコントロールとして使用することができる。まず、６のＲＡ滑膜上において、３０μｇ／ｍｌを上限とする濃度で抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の効果を試験する。生存細胞を染色するアッセイ（例えばＭＴＴアッセイ）において細胞の生存率を分析することにより、添加した試薬が何らかの細胞障害性を有するかどうかを決定する。次いでＥＬＩＳＡを使用して、培養液の上清中における、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６等のサイトカインのレベルを検出する。
【０１０３】
或いは、本発明の抗体は、例えば乾癬又は潰瘍性大腸炎といった実験モデルにおいて試験することができる。乾癬に罹患した皮膚サンプルを、患者自身のＰＢＭＣと共にＳＣＩＤマウス上に移植することができ、試験化合物導入の効果と、炎症又は組織損傷を抑制する、遅らせる、逆行させる、又は炎症又は組織損傷に何らかの影響を与えるそれらの能力を検出することができる。Kjellev等(Eur J Immunol 2008;37:1397-1406)及びIto等(Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008;294:G199-G207)には、抗マウスＮＫＧ２Ｄ抗体を用いた潰瘍性大腸炎の治療の評価用の実験用モデルが記載されている。
【０１０４】
製剤
一実施態様では、本発明は、一又は複数の担体とともに本明細書中に記載の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を含有してなる薬学的組成物又は製剤を提供する。
したがって、本発明の１の例示的態様は、前記の抗体を、１ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在しているものを含有する薬学的製剤を提供することであり、該製剤は２．０〜１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存料(類)、等張化剤(類)、キレート剤(類)、安定剤及び／又は界面活性剤を更に含有する。一実施態様では、薬学的製剤は水性製剤、すなわち水分を含有する製剤である。このような製剤は典型的には溶液又は懸濁液である。本発明のさらなる実施態様では、薬学的製剤は水溶液である。「水性製剤」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している製剤として定義される。同様に、「水溶液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している溶液として定義され、「水性懸濁液」なる用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水分を含有している懸濁液として定義される。
【０１０５】
他の実施態様では、薬学的製剤は凍結乾燥製剤であり、これに医師又は患者が投与前に溶剤及び／又は希釈液を添加することができる。
他の実施態様では、薬学的製剤は、何ら事前溶解させることのない使用準備が整った乾燥製剤(例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥されたもの)である。
更なる態様では、薬学的製剤は前記抗体の水溶液とバッファーを含み、該抗体は１ｍｇ／ｍｌ又はそれ以上の濃度で存在し、該製剤は約２．０〜約１０．０のｐＨを有する。
他の実施態様では、製剤のｐＨは、およそ２．０からおよそ１０．０、およそ３．０からおよそ９．０、およそ４．０からおよそ８．５、およそ５．０からおよそ８．０、及びおよそ５．５からおよそ７．５からなる列挙から選択される範囲である。
更なる実施態様では、製剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シトレート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシネート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はそれらの混合物から選択されるバッファーを含む。これらの特定のバッファーがそれぞれ別の態様を構成する。
【０１０６】
更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いは製薬的に許容可能な保存料を含有可能である。保存料は、例えばフェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３ｐ-クロルフェノキシプロパン-１,２-ジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ；５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ；又は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の保存料の各一が、本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１０７】
更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いは等張化剤を含有しうる。等張化剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択してよい。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用することができる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも１の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、本発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、固定された限界値があるものではない。糖又は糖アルコールの濃度は、例えば約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。等張化剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ；１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌ；８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌ；又は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在してよい。これらの特定の等張化剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に等張化剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１０８】
更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いはキレート剤も含有しうる。キレート剤は、例えばエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、クエン酸、及びアスパラギン酸の塩、及びそれらの混合物から選択されうる。キレート剤は例えば０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ；０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ；又は２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。これらの特定のキレート剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物にキレート剤を使用することは当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１０９】
本発明の更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いは安定剤を含有しうる。製薬用組成物に安定剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。より具体的には、本発明の組成物は安定した液状製薬用組成物であり、その治療的活性化合物は、液状薬学的製剤の保存中に、凝集体の形成を示す可能性のあるポリペプチドを含む。「凝集体形成」とは、オリゴマーを形成するポリペプチド分子間の物理的相互作用を意図しており、これは、可溶性か、又は溶液から沈殿する大きな可視できる凝集体として残る。「保存中」とは、液状製薬用組成物又は調製されて直ぐの製剤が、被験者に直ぐ投与されるものではないことを意図している。むしろ、調製後に、液状の形態、凍結状態、液状形態に後で再構成される乾燥した形態、又は被験者への投与に適した他の形態で、包装又は保存されている。「乾燥した形態」とは、液状製薬用組成物又は製剤が、フリーズドライ(すなわち凍結乾燥；例えばWilliams及びPolli(1984)J. Parenteral Sci. Technol. 38：48-59を参照)、噴霧乾燥(Masters(1991) Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp.491-676；Broadheadら, (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18：1169-1206；及びMumenthalerら, (1994) Pharm. Res. 11：12-20)、又は空気乾燥(Carpenter及びCrowe (1988) Cryobiology 25：459-470；及びRoser (1991) Biopharm. 4：47-53)により乾燥されることを意図している。液状製薬用組成物の保存中におけるポリペプチドによる凝集体形成は、ポリペプチドの生物活性に悪影響を及ぼすおそれがあり、製薬用組成物の治療効果が損なわれる。更に凝集体形成は、例えばチューブ、膜、又はポリペプチド含有製薬用組成物が注入システムを使用して投与される場合はポンプの閉塞のような、他の問題を生じさせうる。
【０１１０】
本発明の製薬用組成物は、更にないし或いは、組成物の保存中、ポリペプチドによる凝集体形成を低減させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含有しうる。「アミノ酸塩基」とは、アミノ酸又はアミノ酸の組合せを意図しており、任意の与えられたアミノ酸が、その遊離塩基の形態又はその塩の形態の何れかで存在している。アミノ酸の組合せを使用する場合、全てのアミノ酸が遊離塩基の形態で存在していてもよく、全てが塩の形態で存在していてもよく、又は幾つかが遊離塩基の形態で存在していてもよく、残りが塩の形態で存在していてもよい。一実施態様では、本発明の組成物の調製に使用されるアミノ酸は、帯電側鎖を担持しているもの、例えばアルギニン、リジン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸である。特定のアミノ酸(例えば、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン及びそれらの混合物)の任意の立体異性体(すなわち、Ｌ、Ｄ、又はそれらの混合物)、又はこれらの立体異性体の組合せが、該特定のアミノ酸が遊離塩基の形態又は塩の形態の何れかで存在している限り、本発明の製薬用組成物中に存在していてもよい。一実施態様では、Ｌ-立体異性体が使用される。また本発明の組成物は、これらのアミノ酸の類似体と共に製剤化されてもよい。「アミノ酸類似体」とは、本発明の液状製薬用組成物の保存中に、ポリペプチドによる凝集体形成を低減させるという所望の効果をもたらす天然に生じるアミノ酸の誘導体を意図している。適切なアルギニン類似体は、例えばアミノグアニジン、オルニチン及びＮ-モノエチル-Ｌ-アルギニンを含み、適切なメチオニン類似体はエチオニン及びブチオニンを含み、適切なシステイン類似体はＳ-メチル-Ｌ-システインを含む。他のアミノ酸と同様、アミノ酸類似体は、遊離塩基の形態又は塩の形態の何れかで組成物中に導入される。本発明の更なる実施態様では、アミノ酸又はアミノ酸類似体は、タンパク質の凝集を阻止し又は遅延化させるのに十分な濃度で使用される。
【０１１１】
本発明の更なる実施態様では、メチオニン(又は他の硫黄含有アミノ酸又はアミノ酸類似体)は、治療剤として作用するポリペプチドが酸化を受けやすい少なくとも１のメチオニン残基を有するポリペプチドである場合、メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を阻害するために添加されうる。本明細書において「阻害する」という用語は、経時的なメチオニン酸化種の蓄積を最小にすることを意味している。メチオニン酸化を阻害すると、適切な分子形態でのポリペプチドの保持が更に高まる。メチオニン(Ｌ又はＤ)の任意の立体異性体又はそれらの任意の組合せを使用することができる。添加される量は、メチオニンスルホキシドの量が規制機関にとって許容可能であるような、メチオニン残基の酸化を阻害するのに十分な量とするべきである。典型的には、これは、組成物が約１０％〜約３０％を越えるメチオニンスルホキシドを含まないことを意味する。一般的に、これは、メチオニン残基に添加されるメチオニンの比率が、約１：１〜約１０００：１、例えば１０：１〜約１００：１の範囲になるようにメチオニンを添加することで、達成することができる。
【０１１２】
更なる実施態様では、本発明の製剤は、更にないし或いは、高分子量ポリマー又は低分子量化合物の群から選択される安定剤を含有する。本発明の更なる実施態様では、安定剤は、ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ３３５０)、ポリビニルアルコール(ＰＶＡ)、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-/ヒドロキシセルロース又はそれらの誘導体(例えばＨＰＣ、ＨＰＣ-ＳＬ、ＨＰＣ-Ｌ及びＨＰＭＣ)、シクロデキストリン類、硫黄含有物質、例えばモノチオグリセロール、チオグリコール酸及び２-メチルチオエタノール、及び異なった塩(例えば塩化ナトリウム)から選択される。これらの特定の安定剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
【０１１３】
製薬用組成物は、その中の治療的に活性なポリペプチドの安定性を更に高める、付加的な安定剤を、更にないし或いは含有しうる。本発明にとって特に関心のある安定剤は、限定されるものではないが、メチオニンの酸化に対してポリペプチドを保護するＥＤＴＡ及びメチオニン、及び凍結-解凍又は機械的剪断に関連する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含む。
【０１１４】
更なる実施態様では、製剤は、更にないし或いは、界面活性剤を含有しうる。界面活性剤は、例えば、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンのブロックポリマー(例えばポロキサマー、例えばプルロニック(Pluronic)(登録商標)Ｆ６８、ポロキサマー１８８及び４０７、トリトンＸ-１００)、ポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン及びポリエチレンの誘導体、例えばアルキル化されアルコキシル化された誘導体(トゥイーン類(tweens)、例えばトゥイーン-２０、トゥイーン-４０、トゥイーン８０及びビリジ(Brij)-３５)、モノグリセリド類又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド類又はそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レシチン及びリン脂質(例えば、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール及びスフィンゴミエリン)、リン脂質の誘導体(例えばホスファチジン酸ジパルミトイル)及びリゾリン脂質(例えばパルミトイル-リゾホスファチジル-Ｌ-セリン、及びエタノールアミン、コリン、セリン又はスレオニンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスファートエステル)、及びリゾホスファチジル及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル(アルキルエステル)、アルコキシ(アルキルエーテル)-誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン及び極性頭部基の修飾体、コリン類、エタノールアミン類、ホスファチジン酸、セリン類、スレオニン類、グリセロール、イノシトール、及び正に帯電したＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン、及びリゾホスファチジルスレオニン、及びグリセロリン脂質(例えばセファリン類)、グリセロ糖脂質(例えばガラクトピラノシド)、スフィンゴ糖脂質(例えばセラミド類、ガングリオシド類)、ドデシルホスホコリン、鶏卵リゾレシチン、フシジン酸誘導体-(例えばタウロ-ジヒドロフジシン酸ナトリウム等)、長鎖脂肪酸及びそれらのＣ６-Ｃ１２塩(例えばオレイン酸及びカプリル酸)、アシルカルニチン類及び誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンと中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含有するジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と２つの帯電したアミノ酸の任意の組合せを含有するトリペプチドのＮα-アシル化誘導体、ＤＳＳ(ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号[５７７-１１-７])、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号[１２８-４９-４])、ドキュセートカリウム、ＣＡＳ登録番号[７４９１-０９-０])、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム)、カプリル酸ナトリウム、コール酸又はその誘導体、胆汁酸及びその塩、及びグリシン又はタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-ア��モニオ-１-プロパンスルホナート、アニオン性(アルキル-アリール-スルホナート類)の一価の界面活性剤、双性イオン性界面活性剤(例えば、Ｎ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、３-コールアミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホナート、カチオン性界面活性剤(第４級アンモニウム塩基)(例えばセチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド)、非イオン性界面活性剤(例えば、ドデシル-β-Ｄ-グルコピラノシド)、ポロキサミン類(例えばテトロニックス(Tetronic's))で、エチレンジアミンにプロピレンオキシド及びエチレンオキシドを逐次付加することにより誘導された四官能性ブロックコポリマーから選択され、又は界面活性剤は、イミダゾリン誘導体又はそれらの混合物の群から選択されてもよい。これらの特定の界面活性剤の各一が本発明の別の実施態様を構成する。
製薬用組成物に界面活性剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１１５】
更なる実施態様では、製剤は、プロテアーゼインヒビター、例えばＥＤＴＡ(エチレンジアミン四酢酸)及びベンズアミジンＨＣｌを、更にないし或いは含有し、他の商業的に入手可能なプロテアーゼインヒビターを使用することもできる。プロテアーゼインヒビターを使用することは、自己触媒を阻害するため、プロテアーゼのチモーゲンを含有する製薬用組成物に特に有用である。
更にないし或いは他の成分が本発明のペプチド薬学的製剤中に存在していてもよい。このような付加的な成分は、湿潤剤、乳化剤、酸化防止剤、増量剤、張力修正剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質)及び双性イオン(例えばアミノ酸、特にベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジン)を含みうる。もちろん、このような付加的な成分は、本発明の薬学的製剤の全体的な安定性に悪影響がないようにすべきである。
【０１１６】
本発明の一又は複数の抗体を含む製薬用組成物は、幾つかの部位、例えば局所的部位、特に皮膚及び粘膜部位、動脈、静脈、心臓への投与等、バイパス吸収がなされる部位、例えば皮膚、皮下、粘膜又は腹部への投与等、吸収に関連する部位において、このような治療が必要とされる患者に投与されうる。
本発明の製薬用組成物は、幾つかの投与経路、例えば、舌、舌下、頬、口、経口、胃、及び腸、鼻、肺を介して、例えば細気管支及び肺胞及び／又はそれらを組合せたもの、表皮、真皮、経皮、膣、直腸、眼球を介して、例えば結膜、尿管、及び非経口を介して、このような治療を必要としている患者に投与されうる。
本発明の組成物は、幾つかの投与形態、例えば溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、多相エマルション、フォーム、膏薬、ペースト、プラスター、軟膏、錠剤、被覆錠剤、リンス、カプセル、例えば硬質ゼラチンカプセル及び軟質ゼラチンカプセル、坐薬、直腸用カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、パウダー、エアゾール、吸入剤、点眼剤、眼球用軟膏、眼球用リンス、膣用ペッサリー、膣用リング、膣用軟膏、注入溶液、インサイツ形質転換溶液、例えばインサイツゲル化、インサイツセット用、インサイツ沈殿化、インサイツ結晶化のもの、注入液、及び移植片として投与されうる。
【０１１７】
本発明の組成物は、更に、抗体の安定性を更に高め、生物学的利用能を増加させ、溶解度を高め、副作用を低減させ、当業者によく知られている時間療法を達成し、患者のコンプライアンスを高め、又はそれらの任意の組合せのために、例えば共有的、疎水的及び静電気的相互作用を介して、薬剤担体、薬剤送達系、及び進化した薬剤送達系において配合し、又は付加させてもよい。担体、薬剤送達系及び進化した薬剤送達系の例は、限定されるものではないが、ポリマー、例えばセルロース及び誘導体、多糖類、例えばデキストラン及び誘導体、デンプン及び誘導体、ポリ(ビニルアルコール)、アクリラート及びメタクリラートポリマー、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、及びそれらのブロックコ-ポリマー、ポリエチレングリコール、担体タンパク質、例えばアルブミン、ゲル、例えば熱ゲル化系、例えば当業者によく知られているブロックコポリマー系、ミセル、リポソーム、ミクロスフィア、ナノ粒子、液晶、及びそれらの分散液、Ｌ２相、及び脂質-水系における相挙動が当業者によく知られているそこでの分散液、ポリマー性ミセル、多相エマルション、自己乳化剤、自己-マイクロ乳化剤、シクロデキストリン及びそれらの誘導体、及びデンドリマーを含む。
本発明の組成物は、全て当業者によく知られたデバイスである、定量吸入器、乾燥パウダー吸入器、及び噴霧器等を使用し、抗体を肺に投与するための、固形、半固形、パウダー及び溶液の製剤に有用である。
【０１１８】
本発明の組成物はまた、制御、徐放性、持続性、遅延性及び低速放出性の薬剤送達系の製剤に特に有用である。特に限定されるものではないが、組成物は、当業者によく知られている非経口用の制御放出性及び徐放性系(双方の系とも、投与の数が何倍も低下する)製剤に有用である。更に好ましいのは、皮下投与される制御放出性及び徐放性系のものである。本発明の範囲を限定することなく、有用な制御放出性及び組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマー性ミセル、ミクロスフィア、ナノ粒子である。
本発明の組成物に有用な制御放出性系の作製方法は、限定されるものではないが、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧ホモジナイズ、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフィアを製造するための溶媒蒸発、押出及び超臨界流体プロセスを含む。一般的には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L.編. Marcel Dekker, New York, 2000)及びDrug and the Pharmaceutical Sciences vol.99：Protein Formulation and Delivery(MacNally, E.J.編. Marcel Dekker, New York, 2000)を参照。
【０１１９】
非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン様シリンジにより、皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射によって実施されうる。或いは、非経口投与は、注入ポンプにより実施することもできる。更なる選択肢は、鼻用又は肺用スプレーの形態で抗体化合物を投与するための溶液又は懸濁液であってよい組成物にある。更なる選択肢としては、本発明の抗体を含む製薬用組成物を、例えば針のない注射、又はイオン導入パッチであってよいパッチによる経皮投与用、又は頬等の経粘膜投与用に適合させることもできる。
抗体は、肺薬剤送達系に適した任意の既知のタイプのデバイスを使用し、ビヒクル、例えば溶液、懸濁液又は乾燥パウダーとして、肺経路を介して投与することができる。これらの例には、限定されるものではないが、肺薬剤送達用の３種類のエアゾール発生の一般的タイプが含まれ、ジェット又は超音波噴霧器、定量吸入器、又は乾燥パウダー吸入器が含まれうる(Yu J, Chien YW. Pulmonary drug delivery：Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453を参照)。
【０１２０】
標準化された試験法に基づき、粒子の空気動力学的直径(ｄａ)を、単位密度(１ｇ／ｃｍ３)の参照基準球形粒子の幾何学的相当直径として定義する。最も単純な場合、球形粒子に対して、ｄａは：
0005591712.tif 000003
に記載されるような密度比の平方根の関数として、参照直径(ｄ)に関連している。
【０１２１】
この関係は非球形粒子に対しては修正される(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。「ＭＭＡＤ」及び「ＭＭＥＡＤ」なる用語は、詳しく記載されており、当該分野で知られている(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R、及び空気動力学的粒子径分布の中央値の測定値を表す。Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385を参照)。空気動力学的中央粒子径(ＭＭＡＤ)及び有効空気動力学的中央粒子径(ＭＭＥＡＤ)(mass median effective aerodynamic diameter)は、交換可能に使用され、統計パラメータであり、実際の形状、サイズ又は密度に無関係に、肺中に沈着するそれらの可能性に関連して、エアゾール粒子のサイズが経験的に記載されている(Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。通常、ＭＭＡＤは、空気中における粒子の慣性挙動を測定する装置、衝突体を用いてなされる測定から算出される。
【０１２２】
更なる実施態様では、製剤は、１０μｍ、好ましくは１−５μｍ、最も好ましくは１−３μｍ未満のエアゾール粒子のＭＭＡＤを達成するために、任意の既知のエアゾール化技術、例えばネブライゼーションによりエアゾール化することができる。好ましい粒子径は、肺の奥深くまで薬剤を送達せしめるのに最も効果的なサイズに基づいており、タンパク質が最適に吸収されるようになされる (例えば、Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2)(1998)379-385を参照)。
抗体を含有する肺用製剤を肺の奥深くに付着させることは、吸入技術、例えば限定されるものではないが：低吸入速度(例えば３０Ｌ／分)、呼吸停止及び作動のタイミングを修正して最適化されうる。
【０１２３】
「安定化された製剤」なる用語は、物理的安定性が増した、化学的安定性が増した、又は物理的及び化学的安定性が増した製剤を意味する。
ここで使用される場合、タンパク質製剤の「物理的安定性」なる用語は、抗体が熱-機械的ストレスに暴露され、及び／又は不安定な表面及び界面、例えば疎水性表面及び界面と相互作用する結果として、生物学的に不活性な及び／又は不溶性の凝集体を形成するという抗体の傾向を意味する。水性抗体製剤の物理的安定性は、適切な容器(例えばカートリッジ又はバイアル)に充填された製剤を、様々な時間、異なる温度で機械的／物理的ストレス(例えば攪拌)に暴露した後に、視覚検査及び／又は濁度測定することで評価される。製剤の視覚検査は、暗色背景で、鋭く集光されたライト下において実施される。製剤の濁度は、例えば０〜３のスケールで、濁りの程度をランク付けする視覚スコア(濁りのない製剤は視覚スコア０に相当し、日光下で視覚的に濁りのある製剤は視覚スコア３に相当する)により特徴付ける。製剤は、日光下で視覚的濁りを示す場合に、抗体会合に関して物理的に不安定であると分類される。また製剤の濁度は、当業者によく知られている簡単な濁度測定法により評価することもできる。また水性抗体製剤の物理的安定性は、抗体の構造状態のプローブ又は分光剤を使用して評価することもできる。プローブは、好ましくは抗体の非天然配座異性体に結合する小分子である。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例はチオフラビンＴである。チオフラビンＴは、アミロイド原繊維の検出に広範囲に使用されている蛍光染料である。原繊維、おそらく他のタンパク質立体配置が存在すると、チオフラビンＴが約４５０ｎｍで新たな励起極大を引き起こし、原繊維タンパク質形態に結合した時に、約４８２ｎｍで増強発光する。未結合のチオフラビンＴは、本質的にはその波長で非蛍光性である。
【０１２４】
天然から非天然状態までのタンパク質構造における変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の暴露された疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。疎水性パッチは、その天然状態にあるタンパク質の３次構造内に一般的に埋められているが、タンパク質の展開及び変性が始まると、暴露されるようになる。これらの小分子の例、分光プローブは、芳香族の疎水性染料、例えばアントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光プローブは金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸、例えばフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、及びバリン等のコバルト金属錯体である。
【０１２５】
ここで使用される場合、抗体製剤の「化学的安定性」なる用語は、天然の抗体構造と比較して、免疫原性の潜在的増加及び／又は生物学的有効性の潜在的低下を伴う、化学的な分解産物の形成に至る抗体構造における化学的共有変化を意味する。種々の化学的な分解産物は、天然抗体の性質及び種類、及び抗体が暴露される環境に応じて形成されうる。化学的分解の排除は、多くの場合、完全に回避することはできず、当業者によく知られているように、抗体製剤の保存及び使用中に、化学的な分解産物の量の増加が見られる。殆どのタンパク質は、脱アミド化する傾向にあり、グルタミニル又はアスパラギニル残基の側鎖アミド基が加水分解されて、遊離カルボン酸を形成する。他の分解経路は高分子量の形質転換産物の形成に関与しており、２又はそれ以上のタンパク質分子は、アミド転移及び／又はジスルフィド相互作用を介して互いに共有結合し、共有結合した二量体、オリゴマー及びポリマーの分解産物の形成に至る(Stability of Protein Phramaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。(例えばメチオニン残基の)酸化も、化学的分解の他の変形例として挙げることができる。抗体製剤の化学的安定性は、異なる環境条件に暴露させた後、種々の時点での化学的な分解産物の量を測定することにより評価することができる(分解産物の形成は、多くの場合、例えば温度上昇により促進される)。個々の分解産物の各々の量は、多くの場合、様々なクロマトグラフィー技術(例えばＳＥＣ-ＨＰＬＣ及び／又はＲＰ-ＨＰＬＣ)を使用し、分子サイズ及び／又は電荷に応じて、分解産物を分離することにより測定される。
【０１２６】
よって、上に概要を述べたように、「安定化された製剤」とは、物理的安定性が増加、化学的安定性が増加、又は物理的及び化学的安定性が増加した製剤を意味する。一般的に、製剤は、有効期限に到達するまで、使用及び保存中に(推奨される用途及び保存条件で)安定していなければならない。
【０１２７】
本発明の一実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、６週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の他の実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、４週間以上の使用と、３年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、抗体を含有する薬学的製剤は、４週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
本発明の更なる実施態様では、該化合物を含有する製剤組成物は、２週間以上の使用と、２年以上の保存に対して安定している。
【０１２８】
適した抗体製剤は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体の場合の経験を調べることによってまた決定できる。例えばリツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾレア（オマリズマブ）、ベキサール（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリム、ヒュミラ及び類似の製剤のような数種のモノクローナル抗体が臨床現場で効果的なことが証明されており、同様の製剤を本発明の抗体について使用することができる。例えば、モノクローナル抗体は、塩化ナトリウム９．０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム二水和物７．３５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート０．７ｍｇ／ｍＬ、注射用滅菌水に静脈内投与用に処方された１００ｍｇ（１０ｍＬ）又は５００ｍｇ（５０ｍＬ）の使い捨てバイアルの何れかで１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供されうる。ｐＨは６．５に調整される。他の実施態様では、抗体は、ヒスチジン、スクロース、及びポリソルベート８０を含有する溶液中において処方することができる。
【０１２９】
診断用途
本発明のｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、非治療的用途も有している。例えば、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、例えば特定の細胞、組織、又は結成中の発現を検出する、ＮＫＧ２Ｄタンパク質の診断アッセイにおいても有用である。例えば、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を、抗ｈＮＫＧ２Ｄ治療のための患者を選択するアッセイに使用することもできた。そのような目的のために、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を使用して、血清又は組織標本中のｈＮＫＧ２Ｄの存在について分析すること、ＮＫＧ２Ｄを発現するＣＤ４＋Ｔ細胞の存在について試験すること、又はＮＫＧ２Ｄ細胞を発現する細胞（例えば、ＮＫ又はＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞）を促進する疾病の存在について試験することができた。このような分析は、例えば、血中の可溶性ＭＩＣＡのレベルを試験する分析と組み合わせることができた（例えば、Ｓｐｉｅｓ等による国際公開第２００３０８９６１６号参照）。
【０１３０】
診断用の使用のために、一般的に抗体を検出可能な成分で標識するであろう。多くの標識が利用可能であり、通常、以下のカテゴリに分類することができる：
（ａ）ラジオアイソトープ、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ。抗体は例えばImmunology, Volumes 1 and 2, Coligen等, Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を用いて放射性同位体にて標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
（ｂ）希有土類キレート（ユウロピウムキレート）又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、フィコエリトリン及びテキサス赤のような蛍光性の標識が利用できる。蛍光標識は、例えば、上記のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
（ｃ）様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４,２７５,１４９号にはこの概説がある。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。或いは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる（例えばｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いて）か、又はエネルギーを蛍光受容基に与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４,７３７,４５６号）、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸酵素、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環のオキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivanら., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。
【０１３１】
酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
（ｉ）基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆（例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン（ＯＰＤ）又は3,3',5,5'テトラメチルのベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する；
（ｉｉ）色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び
（ｉｉｉ）色素生産性基質（例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生基質４-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-ｐ-β-ガラクトシダーゼを有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）。
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４２７５１４９号及び４３１８９８０を参照。
【０１３２】
標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は当分野の技術者に公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな３つの分類のうちの何れかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。或いは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテン（例えばジゴキシン）とコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）とコンジュゲートさせる。したがって、抗体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる。
本発明の他の実施態様において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は標識する必要がなく、その存在をＮＫＧ２Ｄ抗体と結合する標識した二次抗体を用いて検出することができる。
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接的及び間接的なサンドイッチアッセイ及び免疫沈降アッセイに用いられうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)。
免疫組織化学において、組織サンプルは新鮮なものでも、凍結されたものでも、パラフィン包埋されていても、防腐剤、例えばホルマリンなどで固定されていてもよい。
【０１３３】
また、抗体はインビボ診断用アッセイにも使用されてよい。一般に、抗体は、例えば核磁気共鳴法ないしは当分野で公知の他の方法によって検出可能な放射性核種ないしは非放射性活性の指標にて標識される。好ましくは、標識は、例えば１２５Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、９９ｍＴｃ又は１１１Ｉｎなどの放射性標識である。標識された抗体は、好ましくは血流を介して宿主に投与され、宿主中の標識した抗体の存在や位置がアッセイされる。腫瘍の検出、ステージ分類及び治療には画像技術が好適に用いられる。放射性同位体は、金属キレート化合物ないしはラクトペルオキシダーゼ、又はヨウ素化のためのｉｏｄｏｇｅｎ技術を含む任意の手段によってタンパク質にコンジュゲートされる。
【０１３４】
便宜上、本発明の抗体は、キット、すなわち診断検査法を実行するための指示書とともに予め定められた総計でパッケージされ組み合わされた試薬で提供することができる。抗体を酵素で標識する場合、キットには、基質と、酵素に必要な補助因子（例えば検出可能な発色基又は蛍光体を提供する基質前駆）が含まれるであろう。加えて、安定剤、緩衝液（例えばブロックバッファー又は溶解緩衝液）などの他の添加物が含まれうる。様々な試薬の相対量は、実質的にアッセイの感受性を最適化する試薬の溶液濃度が得られるように、広範囲に変化していてもよい。特に、溶解して好適な濃度の試薬溶液が得られる賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥として試薬が提供されうる。
【０１３５】
治療的用途
本明細書で説明されるヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を用いて患者を治療する方法も、本発明により提供される。一実施態様において、本発明は、ヒト患者に対して投与される医薬組成物の調製に、本明細書で説明されるヒト抗体又はヒト化抗体の使用を提供する。患者は、自己免疫性又は炎症性の疾患又は障害に罹患しているか、又は罹患する危険を有している。
例えば、一態様において、本発明は、それを必要とする患者におけるＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を低下させるか又は阻害する方法であって、ヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を該患者に投与するステップを含み、該抗体により、ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドを介する活性化が低下するか又は阻止される方法を提供する。一実施態様において、本方法は、自己免疫疾患又は障害或いは炎症性状態など、増加したＮＫ細胞又はＴ細胞の活性が有害であるか、ＮＫ細胞又はＴ細胞による溶解の影響を受ける細胞を伴うか、これらが罹患するか、これらにより引き起こされるか、又はＮＫ細胞活性及び／又はＴ細胞活性の上昇により引き起こされるか、もしくはこれを特徴とする疾患を有する患者におけるこのようなリンパ球の活性を低下させることを目的とする。一態様において、本発明は、患者における慢性炎症を軽減する方法を提供する。
【０１３６】
本発明のポリペプチド、抗体、及び他の化合物により治療される例示的な状態又は障害は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、若年性関節炎、乾癬性関節炎、骨関節炎、脊髄関節炎（強直性脊椎炎）、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症性筋疾患（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、血管炎、全身性血管炎、側頭動脈炎、動脈硬化症、サルコイドーシス、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿症）、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑、免疫媒介性血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、糖尿病、免疫媒介性腎疾患（糸球体腎症、尿細管間質性腎症）、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性ブドウ膜炎、抗リン脂質症候群；多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害など、中枢神経系及び末梢神経系の脱髄性疾患；感染性肝炎（Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、及び他の非肝臓指向性ウイルス）、自己免疫性慢性活動性肝炎、ウイルス性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、ウェゲナー肉芽腫、ベーチェット病、及び硬化性胆管炎などの肝胆汁性疾患；潰瘍性大腸炎又はクローン病、セリアック病、グルテン過敏性腸疾患、及びホイップル病などの炎症性腸疾患；水泡性皮膚疾患、多形性紅斑、及び接触性皮膚炎を含む自己免疫性皮膚疾患又は免疫媒介性皮膚疾患；疱疹状皮膚炎、乾癬、尋常性天疱瘡、尋常性白斑（白斑）；喘息、アレルギー性肺炎、アトピー性皮膚炎、食品過敏症、及び蕁麻疹などのアレルギー性疾患；好酸球性肺炎、特発性肺線維症、及び過敏性肺炎など、肺の免疫疾患；慢性閉塞性肺疾患、ならびに移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患を含むがこれらに限定されない。
【０１３７】
例えば、一態様において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、限定されないが、鎮痛剤、免疫抑制剤（例えばＢ細胞枯渇剤及びＴ細胞阻害剤などのＢ細胞アンタゴニスト又はＴ細胞アンタゴニスト；補体阻害剤）、コルチコステロイド、及び抗ＴＮＦアルファ剤、又は他の抗サイトカイン剤もしくは抗サイトカイン受容体剤、ならびに抗血管新生剤を含む１種又は複数種の抗炎症剤と組み合わせて用いられる。具体的な例として、メトトレキサート、ＴＳＧ−６、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）又は他のＢ細胞療法、抗ＩＬ１２（ｐ４０）抗体、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ融合タンパク質、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−１抗体、ＩＬ−１５抗体、ＩＬ−１８抗体、及び抗ＩＬ６Ｒ抗体を挙げることができる。組合せ治療のさらなる例は、後述する。
本療法と組み合わせて１種又は複数種の他の薬剤又は手法を用いる場合、組合せによる結果が、各治療が個別に行われる場合に観察される効果に対して相加的であるという要件はない。少なくとも相加的な効果が一般には望ましいが、ＮＫＧ２Ｄ活性の任意の低下又は単独療法の１つを上回る他の有益な効果があれば有利であろう。また、相乗効果が確かに可能であり、有利ではあるが、組合せ治療が相乗効果を呈することも特に必要でない。ＮＫＧ２Ｄベースの治療は、例えば、数分間〜数週間及び数カ月の間隔で、他の治療に先行又は後続しうる。抗ＮＫＧ２Ｄ組成物又は他の薬剤の複数回の投与を用いることも想定される。薬剤は、隔日又は隔週で交互に投与する場合もあり、抗ＮＫＧ２Ｄ治療のサイクルを施した後で、他の薬剤療法のサイクルを施す場合もある。いずれの場合においても、必要なのは、投与回数にかかわらず、治療的に有益な効果を及ぼすのに有効な組合せ量で両方の薬剤を送達することのみである。
【０１３８】
後述では、本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を治療剤として用いうる一部の選択された炎症性及び／又は自己免疫性の疾患又は障害について説明する。好ましくは、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、完全長２価のＭＳ又は２１Ｆ２、或いはその抗原結合断片、変異体、もしくは誘導体である。
【０１３９】
関節リウマチ
関節リウマチ（ＲＡ）とは、多くの場合、複数の関節滑膜に及び、関節軟骨に対する傷害を結果としてもたらす慢性全身性の炎症性自己免疫疾患である。発症機序はＴリンパ球依存的であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の産生と関連し、関節液及び血液中において高レベルに達する免疫複合体の形成を結果としてもたらす。関節内におけるこれらの複合体は、滑膜内へのリンパ球及び単球による顕著な浸潤物、及びその後の顕著な滑膜変化を誘導する場合があり、関節腔にも、多数の好中球の付加を伴う類似の細胞が浸潤する。病理学的なＴ細胞は、他の細胞の誘引及び活性化、ならびに組織の破壊を増大させるサイトカイン及び他の可溶性因子を産生する。罹患する組織は、主に関節であり、対称的なパターンであることが多い。一方、関節外疾患もまた、２つの主要な形態において生じる。１つの形態は、進行中の進行性関節疾患、ならびに肺線維症、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外病変の発達である。関節外疾患の第２の形態は、関節疾患が鎮静した後の一時期である、ＲＡの疾患経過の後期に生じ、好中球減少症、血小板減少症、及び脾腫の存在を伴ういわゆるフェルティー症候群である。これは、梗塞、皮膚潰瘍、及び壊疽の形成を伴う多臓器における血管炎を随伴しうる。患者はまた、罹患した関節を覆う皮下組織内におけるリウマチ結節を発達させることも多く、後期における該結節は、混合された炎症性細胞浸潤物により取り囲まれた壊死性の中心部を有する。ＲＡにおいて生じうる他の症状は、心膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ結節を含む。
したがって、一態様において、本発明は、関節リウマチ（ＲＡ）を治療及び／又は予防する方法を提供する。該方法は、ＲＡが治療又は予防されるように、ＲＡを有するか、又はＲＡを発症する実質的な危険性を示すと同定／診断される患者に、有効量の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を送達するステップを含む。一態様において、抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体は、米国特許第６４１４２１８号及び米国特許出願公開第２００３０００５４６９号において説明されるモデル（関連の原理及びモデルは、Wooley, P. H., Animal Models of Arthritis, eds. J. H. Klippel及びP. A. Dieppe, Mosby Publishers (London), 1998; Erning等、Arthritis Res, 4 Suppl 3:S 133-40, 2002; Holmdahl等、Ageing Res Rev, 1(1): 135-47, 2002; Anthony等、Clin Exp Rheumatol, 17(2) :240-4,1999; Durie等、Clin Immunol Immunopathol, 73(1):11-8, 1994; ならびに Muller-Ladner等、Drugs Today (Bare), 35(4-5):379-88, 1999)）など、ＲＡの許容可能なモデルにおいてＲＡを改善するのに有効であることが実証されている。さらなる態様において、該抗体は、リガンドに誘導されるＮＫＧ２Ｄによる、ＮＫＧ２Ｄを発現する白血球の活性化を検出可能に低下させ、かつ／又はＮＫＧ２Ｄ＋のＴ細胞又はＮＫ細胞の拡大を検出可能に損なう（例えば、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大及び／又は機能を損なう）（例えば、米国特許出願公開第２００４０１１５１９８号において説明される抗体の少なくとも一部とは対照的に）能力を、このような細胞を著明に枯渇させる（例えば、好適なコントロールと比較して、このような細胞の約１０％以下の減少を引き起こす）ことなしに有する。一態様において、該方法は、ＲＡの治療又は予防（適応の場合）と符合する形での１種又は複数種のバイオマーカー（例えば、血清ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＶＥＧＦ、ＴＩＦＦ  Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ４エピトープ、ＣＤ８エピトープ、及び／又はＣ反応性タンパク質）の調節を結果としてもたらす。別の態様では、該方法の実践の結果、患者／宿主の末梢関節における滑膜炎症の検出可能な軽減がもたらされる。一態様では、該方法の結果、例えば、患者もしくは宿主におけるＸ線撮影での進行の軽減、関節の腫脹及び圧痛の軽減（許容される解析基準により判定される）、及び／又は生活の質の著明な向上（例えば、ＲＡ健康評価質問票における身体障害スコアの低下により判定される）により呈示される、患者又は宿主におけるＸ線撮影での増悪の防止及び身体機能の向上がもたらされる。該抗体は、単独で、又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害剤、鎮痛剤、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）、金、免疫抑制剤（例えば、メトトレキサート）、Ｂ細胞枯渇剤（例えば、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、Ｂ細胞アゴニスト（例えば、ＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ−Ｂ（登録商標））、及び抗ＴＮＦアルファ剤（例えば、Ｅｍｂｒｅｌ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、及びＲｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、抗ＩＬ１受容体アンタゴニスト（例えば、Ｋｉｎｅｒｅｔ（登録商標））、抗ＩＬ−１５抗体、又は疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）などの、１種又は複数種の他の抗ＲＡ剤と組み合わせて用いることができる。
【０１４０】
脱髄性疾患
多発性硬化症（ＭＳ）；特発性脱髄性多発神経障害又はギラン−バレー症候群；及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害を含む中枢神経系及び末梢神経系の脱髄性疾患は、基本的に自己免疫性であると考えられ、希突起膠細胞又はミエリンに対して直接に引き起こされる損傷の結果として、神経の脱髄をもたらす。ＭＳでは、疾患の誘導及び進行がＴリンパ球に依存することを示唆する証拠が存在する。ＭＳは、Ｔリンパ球依存性であり、再発−寛解経過又は慢性進行経過を有する脱髄性疾患である。病因は未知であるが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境、及び自己免疫性のすべてが寄与する。病変は、主としてＴリンパ球を介するマイクログリア細胞の浸潤物、及び浸潤性マクロファージを含有し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球が、病変における主たる細胞型である。
こうして、別の態様において、本発明は、ＭＳを治療及び／又は予防する方法を提供する。該方法は、患者又は宿主においてＭＳが治療又は予防されるように、ＭＳを有するか、又はＭＳを発症する実質的な危険性を示すと同定／診断されるヒト患者に、有効量の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を送達するステップを含む。特殊な態様において、該抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体は、リガンドに誘導されるＮＫＧ２ＤによるＮＫＧ２Ｄ発現白血球の活性を検出可能に低下させ、かつ／又はＮＫＧ２Ｄ＋のＴ細胞又はＮＫ細胞の拡大を検出可能に損なう能力を、このような細胞を著明に枯渇させることなしに有する。該抗体は、単独で、又はＴｙｚａｂｒｉ（登録商標）など、他の抗ＭＳ剤との組合せで用いることができる。
【０１４１】
炎症性腸疾患
腸内のＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＮＫＧ２Ｄは、ＣＤ２８−細胞の共刺激因子として作用する（Roberts等、J Immunol 2001;167:5527-30）。さらに、腸の炎症（セリアック病）では、ＮＫＧ２Ｄが上方制御され、ＮＫＧ２Ｄにより腸の上皮リンパ球が刺激されて、サイトカインの死傷及び産生を行う（Hue等、Immunity 2004;21:367-77; Meresse等、Immunity 2004;21:357-66）。加えて、腸炎症時に見出されることが多いＩＬ−１５により、腸上皮のリンパ球上におけるＮＫＧ２Ｄが上方制御される（Roberts等、J Immunology 2001;167:5527-30）。その上、腸炎症時には、ＮＫＧ２ＤのリガンドであるＭＩＣＡが上方制御される（Meresse等、前掲、Hue等、前掲）。ＮＫＧ２Ｄは、クローン病患者の炎症促進性リンパ球上においても上方制御される（(Allez等、第１６回欧州免疫学大会（ＥＣＩ２００６）における発表、2006年9月6〜9日、フランス国パリ）。
こうして、別の態様において、本発明は、クローン病又は潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療及び／又は予防する方法を提供する。Kjellevによって示されるように（Eur J Immunol 2008;37:1397-1406）、早期の抗体療法によるＮＫＧ２Ｄ受容体機能の阻害は、大腸炎の動物モデルであるＳＣＩＤマウスにおける移入誘発性大腸炎を緩和した。
【０１４２】
炎症性腸疾患を治療する方法は、患者においてＩＢＤが治療又は予防されるように、ＩＢＤを有するか、又はＩＢＤを発症する実質的な危険性を示すと同定／診断されるヒト患者に、有効量の抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を送達するステップを含む。特殊な態様において、本発明によるＩＢＤ治療／予防の方法は、リガンドに誘導されるＮＫＧ２ＤによるＮＫＧ２Ｄ発現白血球の活性を検出可能に低下させ、かつ／又はＮＫＧ２Ｄ＋のＴ細胞又はＮＫ細胞の拡大を検出可能に損なう能力を、このような細胞を著明に枯渇させることなしに有する抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体を用いて実践される。該抗体は、単独で、又はメサラミン（スルファラジン、ならびに、オルサラジン及びバルサラジドなどの、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）を含有する他の薬剤を含む）、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ハイドロコルチゾン）、ＴＮＦ阻害剤（アジリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、及びインフリキシマブ（Ｒｅｍｉｄａｄｅ（登録商標））を含む）、抗ＩＬ１２抗体、免疫抑制剤（６−メルカプトプリン、アザチオプリン、及びシクロスポリンＡなど）、及び抗生剤を含有する薬剤などの、他の抗ＩＢＤ剤との組合せで用いることができる。
【０１４３】
乾癬
乾癬は、Ｔリンパ球媒介性の炎症性疾患である。病変は、Ｔリンパ球、マクロファージ、及び抗原処理細胞、ならびに一部の好中球の浸潤物を含有する。
こうして、別の態様において、本発明は、乾癬を治療及び／又は予防する方法を提供する。本方法は、患者において乾癬が治療又は予防されるように、乾癬を有するか、又は乾癬を発症する実質的な危険性を示すと同定／診断されたヒト患者に対し、有効量の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を送達するステップを含む。特殊な態様では、該薬剤は、ＮＫＧ２Ｄを発現する白血球の、リガンドに誘導されるＮＫＧ２Ｄ活性を検出可能に低下させ、かつ／又はＮＫＧ２Ｄ＋のＴ細胞又はＮＫ細胞の拡大を検出可能に損なう能力を、このような細胞を著明に枯渇させることなしに有する抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体である。該抗体は、単独で、又は光療法、局所療法（例えば、タール、局所用グルココルチコイド）、又は全身療法（例えば、メトトレキサート、合成レチノイド、シクロスポリン）、抗ＴＮＦアルファ剤（例えば、Ｅｍｂｒｅｌ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））、Ｔ細胞阻害剤（例えば、Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標））、ビタミンＤ類似体、ｐ３８ミトゲン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）阻害剤のほか、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）などの生物学的薬剤など、１つ又は複数の他の抗乾癬治療との組合せで用いることができる。
【０１４４】
乾癬性関節炎
乾癬性関節炎は、皮膚、関節；腱、靭帯、及び筋膜の挿入部位が罹患する慢性の炎症性関節炎状態であり、乾癬と関連することが通例である（乾癬患者の約７％が乾癬性関節炎を発症する）。Ｔ細胞媒介過程により、乾癬性関節炎の病態生理が駆動されることが、多くの証拠によって示唆されている。乾癬性関節炎には単球も関与しており、乾癬性関節炎患者の関節において破壊的な変化を媒介しうるマトリックスメタロプロテイナーゼの産生の一因となっている。さらに、罹患した関節にはＮＫ細胞もまた見出されることから、該疾患の病理における役割が示唆される。
こうして、別の態様において、本発明は、乾癬性関節炎を治療及び／又は予防する方法を提供する。該方法は、患者において乾癬性関節炎が治療又は予防されるように、乾癬性関節炎を有するか、又は乾癬性関節炎を発症する実質的な危険性を示すと同定／診断されるヒト患者に対し、有効量の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を送達するステップを含む。特殊な態様において、該薬剤は、ＮＫＧ２Ｄ発現白血球の、リガンド誘導性のＮＫＧ２Ｄ活性を検出可能に低下させ、かつ／又はＮＫＧ２Ｄ＋のＴ細胞又はＮＫ細胞の拡大を検出可能に損なう能力を、このような細胞を著明に枯渇させることなしに有する抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体である。該抗体は、単独で、又は非ステロイド性抗炎症薬（アスピリン、イブプロフェン）、メトトレキサート、合成レチノイド、シクロスポリン、コルチコステロイド、抗ＴＮＦアルファ剤（例えば、Ｅｍｂｒｅｌ（登録商標）、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））などの、１つ又は複数の他の抗乾癬性関節炎治療との組合せで用いることができる。
【０１４５】
全身性エリテマトーデス
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）において、疾患の中心的なメディエーターは、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産生、及びその後の免疫を介する炎症の発生である。抗体は、組織傷害を直接的又は間接的に媒介する。Ｔリンパ球が組織損傷に直接的に関与することは示されていないが、自己反応性抗体の発達にはＴリンパ球が必要とされる。このように、該疾患の発生はＴリンパ球依存性である。腎臓、肺、筋骨格系、粘膜皮膚、眼、中枢神経系、心血管系、消化管、骨髄、及び血液を含む多数の臓器及び系が臨床的に罹患する。
こうして、別の態様において、本発明は、ＳＬＥを治療及び／又は予防する方法を提供する。該方法は、患者においてＳＬＥが治療又は予防されるように、ＳＬＥを有するか、又はＳＬＥを発症する実質的な危険性を示すと同定／診断されるヒト患者に対し、有効量の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を送達するステップを含む。特殊な態様において、該薬剤は、ＮＫＧ２Ｄ発現白血球の、リガンド誘導性のＮＫＧ２Ｄ活性を検出可能に低下させ、かつ／又はＮＫＧ２Ｄ＋のＴ細胞又はＮＫ細胞の拡大を検出可能に損なう能力を、このような細胞を著明に枯渇させることなしに有する抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体である。該抗体は、単独で、又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛剤、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ハイドロコルチゾン）、免疫抑制剤（シクロホスファミド、アザチオプリン、及びメトトレキサートなど）、抗マラリア剤（ヒドロキシクロロキンなど）、及びｄｓＤＮＡ抗体の産生を阻害する生物学的薬剤（例えば、ＬＩＰ  ３９４）などの、他の抗ＳＬＥ剤との組合せで用いることができる。
【０１４６】
糖尿病
Ｉ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は、膵島Ｂ細胞の自己免疫性破壊であり、この破壊は、自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。インスリン又はインスリン受容体に対する抗体は、インスリン非応答性の表現型も産生することができる。
こうして、別の態様では、Ｉ型糖尿病を患うか、又はこれを発症する実質的な危険性を示す患者に対して、該患者の状態を治療又は予防するのに十分な量及び条件下において、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体が送達される。該抗体は、単独で、或いはインスリン、又はベータ細胞増殖因子もしくはベータ細胞生存因子、又は抗ＣＤ３抗体などの免疫調節性抗体などの、他の抗糖尿病剤との組合せで用いることができる。
【０１４７】
移植
移植片拒絶及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む移植関連疾患は、Ｔリンパ球依存性であり、Ｔリンパ球機能の阻害が改善をもたらす。
こうして、別の態様において、本発明は、移植拒絶の可能性を低下させる（又は移植拒絶類縁状態の重症度を軽減するか、又はその発症時点を延期する、すなわち、異種移植片の存続を延長する）方法を提供する。該方法は、移植拒絶の可能性が検出可能に低下するように、（例えば、コントロールと比較した場合）組織／臓器移植のレシピエントになろうとするか、同レシピエントであるか、又は最近同レシピエントとなったヒト患者に対し、有効量の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を送達するステップを含む。特殊な態様において、該抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、ＮＫＧ２Ｄ発現白血球の、リガンド誘導性のＮＫＧ２Ｄ活性を検出可能に低下させ、かつ／又はＮＫＧ２Ｄ＋のＴ細胞又はＮＫ細胞の拡大を検出可能に損なう能力を、このような細胞を著明に枯渇させることなしに有する。治療できる組織移植の例は、肝臓、肺、腎臓、心臓、小腸、及び膵島細胞のほか、骨髄移植における組織、及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療における組織も含むが、これらに限定されない。該抗体は、単独で、又は免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、マイコフェノール酸モフェチル、シリリムス、ラパマイシン、タクロリムス）、抗感染剤（例えば、アシクロビル、クロトリマゾール、ガンシクロビル、ニスタチン、トリメトプリムスルファメトキサゾール）、利尿剤（例えば、ブメタニド、フロセミド、メトラゾン）、及び潰瘍治療薬（例えば、シメチジン、ファモチジン、ランソプラゾール、オメプラゾール、ラニチジン、スクラルフェート）などの、移植拒絶を阻害する他の薬剤との組合せで用いることができる。造血臓器移植の場合、補助療法として、（１種又は複数種の）造血成長因子（例えば、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−１１、トロンボポエチンなど）、又は（１種又は複数種の）抗微生物剤（例えば、抗生剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤）を投与する場合がある。
【０１４８】
他の自己免疫疾患又は炎症性疾患
他の別個の態様において、本発明は、他の自己免疫性又は炎症性の疾患もしくは障害を治療及び／又は予防する方法であって、以下で説明される疾患又は障害である該疾患又は障害が患者において治療又は予防されるように、該疾患又は障害を有するか、又は該疾患又は障害を発症する実質的な危険性を示すと同定／診断されるヒト患者に対し、有効量の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を送達するステップを含む方法を提供する。特殊な態様において、該薬剤は、ＮＫＧ２Ｄを発現する白血球の、リガンド誘導性のＮＫＧ２Ｄ活性を検出可能に低下させ、かつ／又はＮＫＧ２Ｄ＋のＴ細胞又はＮＫ細胞の拡大を検出可能に損なう能力を、このような細胞を著明に枯渇させることなしに有する抗ＮＫＧ２Ｄモノクローナル抗体である。該抗体は、単独で、又は該疾患もしくは障害を治療するのに用いられる１つ又は複数の他の治療剤との組合せで用いることができる。
若年性慢性関節炎は、１６歳未満に発病することの多い慢性特発性炎症性疾患である。その表現型は、ＲＡと何らかの類似性を有し、リウマチ因子陽性の一部の患者は、若年性関節リウマチと分類される。該疾患は、３つの主要な類型：小関節性、多関節性、及び全身性に下位分類される。該関節炎は重症でありえ、破壊的となり、関節強直及び発育遅延をもたらすことが典型的である。他の症状は、慢性前部ブドウ膜炎及び全身性アミロイドーシスを含みうる。
【０１４９】
脊椎関節症は、ＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子産物の発現と共通する一部の臨床的特徴及びこれと共通の関連を伴う障害群である。該障害は、強直性脊椎炎、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性腸疾患と関連する関節炎、乾癬と関連する脊椎炎、若年発症脊椎関節症、及び鑑別不能な脊椎関節症を含む。際立つ特徴には、脊椎炎を伴う場合も伴わない場合もある仙腸骨炎、炎症性非対称性関節炎、ＨＬＡ−Ｂ２７との関連（クラスＩ  ＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の血清学的に規定される対立遺伝子）、眼炎症、及び他のリウマチ疾患と関連する自己抗体の不在が含まれる。該疾患の誘導への鍵として最も強く含意される細胞は、クラスＩ  ＭＨＣ分子により提示される抗原を標的とする細胞であるＣＤ８＋Ｔリンパ球である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、あたかもそれがＭＨＣクラスＩ分子により発現された外来ペプチドであるかのように、クラスＩ  ＭＨＣの対立遺伝子であるＨＬＡ−Ｂ２７に対して反応する場合がある。ＨＬＡ−Ｂ２７のエピトープが、細菌又は他の微生物による抗原エピトープを模倣し、このため、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する可能性があると仮定されている。
全身性硬化症（強皮症）の病因は未知である。該疾患の顕著な特徴は皮膚の硬結であり、これは、活動性の炎症過程により誘発される可能性が高い。強皮症は限局性又は全身性であり、血管病変が通例であり、微小血管系における内皮細胞傷害が、全身性硬化症の発症における早期の重要な事象であり、血管傷害は免疫媒介性である場合がある。皮膚病変内における単核細胞浸潤物の存在、及び多くの患者における抗核抗体の存在により、免疫学的ベースを有することが示唆される。皮膚病変内における線維芽細胞の細胞表面においてＩＣＡＭ−１がしばしば調節不能となることにより、これらの細胞とＴ細胞との相互作用が、該疾患の発症機序に参画する可能性が示唆される。関与する他の臓器は、消化管：異常な蠕動／運動性を結果としてもたらす平滑筋の萎縮及び線維症；腎臓：弓状動脈及び小葉間動脈が求心性内皮下内膜増殖に罹患する結果として腎皮質の血流が低下し、この結果、タンパク尿、高窒素血、及び高血圧が生じる；骨格筋：萎縮、間質性線維症、炎症；肺：間質性肺炎及び間質性線維症；ならびに心臓：収縮体の壊死、瘢痕形成／線維症を含む。
【０１５０】
皮膚筋炎、多発筋炎、及び他の筋疾患を含む特発性炎症性筋疾患は、結果として筋衰弱をもたらす未知の病因による慢性筋炎症性の障害である。筋傷害／炎症は、全身性及び進行性であることが多い。自己抗体が大半の形態と関連する。これらの筋炎特異的な自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分、タンパク質、及びＲＮＡに対して産生されて、これらの機能を阻害する。
シェーグレン症候群は、免疫媒介性の炎症、ならびにその後の涙腺及び唾液腺の機能的破壊に起因する。該疾患は、炎症性結合組織疾患と関連するか、又はこれらを伴う。該疾患は、いずれも小型のＲＮＡ−タンパク質複合体である、Ｒｏ抗原及びＬａ抗原に対する自己抗体の産生と関連する。病変の結果、乾性角結膜炎、口内乾燥が生じ、胆汁性肝硬変、末梢神経障害又は感覚性神経障害、及び触知可能な紫斑を含む他の症状又は関連状態が生じる。
【０１５１】
全身性血管炎は、炎症及び血管に対するその後の損傷を原発病変とする疾患であり、この結果、罹患した血管により組織に虚血／壊死／変性がもたらされ、場合によっては末端臓器の最終的な機能不全が生じる。血管炎はまた、特に、免疫複合体の形成とも関連する疾患において、関節リウマチ、全身性硬化症など、他の免疫炎症を介する疾患に対する続発病変又は続発症としても生じうる。原発性全身性血管炎群中の疾患は、全身性壊死性血管炎；結節性多発動脈炎、アレルギー性血管炎及びアレルギー性肉芽腫症、多発血管炎；ウェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症；ならびに巨細胞性動脈炎を含む。その他の血管炎は、皮膚粘膜リンパ節症候群（ＭＬＮＳ又は川崎病）、孤発性ＣＮＳ血管炎、ベーチェット病、閉塞性血栓性血管炎（ビュルガー病）、及び皮膚壊死性血管炎を含む。列挙された大半の種類の血管炎の発症機構は、主に、血管壁内における免疫グロブリン複合体の沈着、及びＡＤＣＣ、補体活性、又はこれらの両方によるその後の炎症反応の誘導に起因すると考えられる。
サルコイドーシスは、体内のほぼすべての組織における類上皮肉芽腫の存在を特徴とする未知の病因による状態であり、肺への波及が最も通例である。発症機序は、疾患部位における活性化したマクロファージ及びリンパ球の遷延を伴い、これらの細胞型により放出される局所的及び全身的な活性産物の放出から生じるその後の慢性続発症を伴う。
【０１５２】
自己免疫性溶血性貧血症、免疫性汎血球減少症及び発作性夜間血色素尿症を含む自己免疫性溶血性貧血症は、赤血球（場合によっては、血小板を含めた他の血球）の表面上において発現する抗原と反応する抗体が産生される結果として生じ、補体媒介性の溶解、及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ受容体媒介性の機序によるこれらの抗体に被覆された細胞の除去を反映している。
血小板減少性紫斑を含む自己免疫性血小板減少症、及び他の臨床状況における免疫媒介性の血小板減少症では、血小板に対する抗体又は補体の付着、及び補体による溶解、ＡＤＣＣもしくはＦｃ受容体媒介性の機序によってその後血小板が除去される結果として、血小板の破壊／除去が生じる。
【０１５３】
グレーブス病、橋本甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、及び萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺抗原に対する自己免疫応答の結果であり、甲状腺内に存在し、これに特異的であることが多いタンパク質と反応する抗体の産生を伴う。自発性モデル：ラット（ＢＵＦラット及びＢＢラット）モデル及びニワトリ（肥満ニワトリ株）モデル；誘導モデル：サイログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）のどちらかによる動物の免疫感作を含む実験モデルが存在する。
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む、免疫媒介性の腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体もしくはＴ細胞の産生の直接の結果として、又は他の腎臓以外の抗原に対して反応性である抗体及び／又は免疫複合体の腎臓における沈着の間接的な結果としての、腎組織に対する抗体又はＴリンパ球媒介性の傷害の結果である。こうして、免疫複合体の形成を結果としてもたらす、免疫媒介性の他の疾患は、間接的な続発症として免疫媒介性の腎疾患も誘導しうる。直接的免疫機構及び間接的免疫機構の両方の結果として、腎組織における病変の発達をもたらす／誘導する炎症反応が生じ、この結果として臓器機能障害が生じ、場合によっては腎不全へと進行する。体液性免疫機構及び細胞性免疫機構の両方が、病変の発症機序に関与しうる。
【０１５４】
好酸球増多性肺炎、特発性肺線維症、及び過敏性肺炎を含む炎症性肺疾患及び線維性肺疾患は、免疫−炎症反応の調節不全を伴う場合がある。この反応を阻害すれば、治療的に有益であろう。
水泡性皮膚疾患、多形性紅斑、及び接触性皮膚炎を含む自己免疫性皮膚疾患又は免疫媒介性皮膚疾患は、その発生がＴリンパ球依存性である自己抗体を介する。
【０１５５】
喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食品過敏症、及び蕁麻疹を含むアレルギー性疾患は、Ｔリンパ球依存性である。これらの疾患は、Ｔリンパ球に誘導される炎症、ＩｇＥを介する炎症、又は両者の組合せを主として介する。
国際公開２００７１３０６４２号において、また、Chen等 (Hepatology, Vol. 46 (3) pp. 706-715 (2007)) により示されるように、ヒト抗ＮＫＧ２Ｄ抗体による治療に適する別の疾患は、ウイルス性肝炎である。
【０１５６】
有効量のＮＫＧ２Ｄ調節剤のほか、全体的な投与計画も、疾患及び患者の臨床状態により変化する可能性があり、疾患及び患者の臨床状態は、臨床的に許容される疾患スコアなど、１種又は複数種の臨床パラメータに反映される可能性があることが理解されよう。例えば、関節リウマチの場合、疾患の重症度及び／又は治療の転帰は、関節の腫脹、疼痛、運動性、及び／又は公式の疾患スコアであるＡＣＲ  ２０／５０又は７０の数値をモニタリングすることにより評価可能である。１型糖尿病の場合、疾患の重症度及び／又は治療の転帰は、血中グルコースレベルもしくはこれらの変化、ＨｂｌＣレベル、必要なインスリン量などを測定することによって評価可能である。多発性硬化症の場合、脳の走査による脳炎症によって評価可能である。造血臓器の移植拒絶の場合、疾患の重症度（移植の失敗）及び／又は治療の転帰は、骨髄破壊的移植前治療を受けた患者では、好中球減少症、血小板減少症、及び赤血球輸血依存の遷延の証拠により評価可能であり、非骨髄破壊的移植前治療を受けた患者では、キメラ現象を観察できないことにより評価可能である。一般に、本発明の方法及び組成物を用いることによる、治療転帰に対する検出可能な効果は、他の治療に対する必要性の低下（例えば、他の医薬又は治療の量及び／又は持続の減少及び／又は短縮を含む）、病院滞在の回数及び／又は持続の減少及び／又は短縮、病気に起因する勤務日数喪失の減少などを含む。該有効量は、日常的な実験を介して当業者が値のマトリックスを構築し、該マトリックス中における異なる地点を調べることにより決定可能であることがさらに理解されよう。
【０１５７】
用量
抗体を投与する場合、用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／宿主体重ｋｇ、さらに一般的には０．０１〜５ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲である。例えば、用量は、約０．３ｍｇ／体重ｋｇ、約１ｍｇ／体重ｋｇ、約３ｍｇ／体重ｋｇ、約５ｍｇ／体重ｋｇ、もしくは約１０ｍｇ／体重ｋｇ、又は１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内でありうる。例示的な治療の投与計画では、毎週２回、毎週１回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、１カ月ごとに１回、３カ月ごとに１回、又は３〜６カ月ごとに１回の投与を課す。本発明の抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体に好ましい投与計画は、静脈内投与又は皮下注射による約１、３、又は１０ｍｇ／体重ｋｇを含め、該抗体は、以下の投与スケジュール：（ｉ）１〜３週間ごと２〜４回にわたる初期投与、次いで、２カ月ごと；（ｉｉ）４週間ごと；（ｉｉｉ）毎週、又は他の任意の最適な投与のうちの１つを用いて施される。一部の方法では、異なる結合特異性を伴う２種以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の用量は、表示された範囲内に収まる。抗体は通常、複数回投与される。各回の投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月ごと、又は毎年とすることができる。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することにより表示されるように、不規則でもよい。一部の方法では、用量が、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を実現するように調整され、また一部の方法では、約２５〜３００μｇ／ｍｌに調整される。代替的に、抗体は、持続放出製剤として投与することもでき、この場合、必要とされる頻度は低下する。用量及び頻度は、患者における抗体の半減期に応じて変化する。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、これに、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び非ヒト抗体が続く。投与の用量及び頻度は、治療が予防的であるか、又は非予防的（例えば、緩和的又は治癒的）であるかに応じて変化しうる。予防的適用の場合、長期間にわたり、比較的低頻度の間隔で比較的低い用量が投与される。一部の患者は、彼らの残りの生涯にわたって治療を受け続ける。緩和的又は治癒的な適用の場合、疾患の進行が軽減されるか又は終結するまで、好ましくは、患者が、疾患症候の部分的又は完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量が必要とされることもある。その後、患者には、予防的投与計画を行うことができる。
抗炎症剤の適切な用量は、抗炎症剤が単独で、又は他の薬剤との組合せで投与される臨床療法において既に用いられる用量とほぼ同量である。治療される状態に応じて、用量の変化が生じる可能性が高い。治療を管理する医師は、個々の対象に適切な用量を決定することができる。
【０１５８】
製品
本発明の別の実施態様では、上記で説明した障害の治療に有用な物質を含有する製品が提供される。例えば、該製品は、ヒトにおける自己免疫性又は炎症性の疾患又は障害などの障害を、有効量の抗体により治療するように指示する指示書と共に、本明細書で説明されるヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体又はヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体を含有する容器を含みうる。典型的に、該製品は、容器と、該容器上の又は容器に添付されるラベル又は添付文書とを含む。好適な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどを含む。該容器は、ガラス又はプラスチックなど、各種の材料により形成可能である。該容器は、状態を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌のアクセスポート（例えば、該容器は、皮下注射針により穿刺可能な栓を有する静脈内溶液用のバッグ又はバイアルの場合もある）。組成物中における少なくとも１種の活性薬剤は、本明細書のヒト抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体もしくはヒト化抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体、又はこのような抗体を含む抗原結合断片もしくは抗体誘導体（例えば、免疫コンジュゲート）である。ラベル又は添付文書は、該組成物が、例えば、関節リウマチなど、最適の状態を治療するのに用いられることを表示する。
さらに、該製品は、（ａ）本明細書のヒト抗体又はヒト化抗体を含む組成物をその中に含有する第１の容器と、（ｂ）該ヒト抗体又は該ヒト化抗体以外の治療剤を含む組成物をその中に含有する第２の容器とを含む場合がある。本発明のこの実施態様における製品は、該第１及び第２の組成物を組み合わせて用いて、自己免疫性又は炎症性の疾患又は障害を治療可能であることを表示する添付文書をさらに含む場合がある。このような治療剤は、前出の節で説明した補助療法のうちのいずれかでありうる。またないし或いは、該製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩液、リンゲル液、及びデキストロース液など、薬学的に許容される緩衝液を収容する第２（又は第３）の容器をさらに含む場合がある。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、及びシリンジを含む、商品としての観点及び使用者の観点から望ましい他の材料もさらに含む場合がある。
【実施例】
【０１５９】
本発明の更なる詳細は、以下の非限定的な実施例により例示される。
【０１６０】
実施例１−ｈＮＫＧ２Ｄに対するヒトモノクローナル抗体の生成と最初のスクリーニング
材料及び方法
抗原。可溶性ＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃ融合タンパク質（R&D、カタログ：１２９９−NK）又は細胞（ＮＫ、ＢＡＦ、又はＣＨＯ）の表面上に発現したＮＫＧ２Ｄを免疫化のための抗原として使用した。ＢＡＦ細胞に完全長ＮＫＧ２Ｄ及びＤＡＰ１０を同時形質移入した。ＣＨＯ細胞に、ＤＡＰ１０無しで細胞表面に輸送するＮＫＧ２Ｄの点変異体を形質移入した（Wu 等、Science 1999;385:730-2）。ＮＫ細胞は、天然にＮＫＧ２Ｄを発現する一次のＮＫ細胞であった。
マウス。ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスのＫＭマウスＴＭ系において、ＮＫＧ２Ｄに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製した（Ishida等による国際公開第０２／４３４７８号）。このマウス系では、内因性のカッパ軽鎖遺伝子が、Chen等 (1993) EMBO J. 12:811-820に記載されているようにホモ接合性に分裂しており、内因性マウス重鎖が、Humabマウスに関する国際公開０１／０９１８７号の実施例１に記載されているようにホモ接合性に分裂している。マウス系は、Fishwild等 (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載されているように、ヒトカッパ軽鎖導入遺伝子を有している。マウス系は、国際公開第０２４３４７８号に記載されているように、ヒト重鎖導入染色体、ＳＣ２０も有している。
【０１６１】
免疫化。第１の免疫化手順において、ＮＫＧ２Ｄを形質移入したＢＡＦ細胞とＮＫＧ２Ｄを形質移入したＣＨＯ細胞とを交互に注射することにより、或いは一次ヒトＮＫ細胞を何らかのアジュバントと共に又はアジュバント無しで注射することにより、腹腔内において免疫化した。各マウスは、毎週又は一週おきに（合計６回）５×１０６個の細胞を用いて免疫化したＩＰであった。マウスは、屠殺して脾臓を摘出する３及び２日前に、静脈内に５×１０６個のＮＫＧ２Ｄ形質移入ＢＡＦ細胞を用いて追加免疫した。この動物実験は、オランダ国家研究会議のガイドラインに従って実行した。
第２の免疫化手順では、異なるアジュバントと共にＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃを用いて、腹腔内で及び足経路で動物を免疫化した。各マウスは、屠殺及び脾臓摘出の３及び２日前に、７×２５ｕｇのＮＫＧ２Ｆ−ｈＦｃ／Ｒｉｂｉ／ｉｐ／ｓｃ、１×２５ｕｇのＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃ／ＣＦＡ／ｉｐ／ｓｃ、１×２５ｕｇのＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃ／ＩＦＡ／ｉｐ／ｓｃ、１×３０ｕｇ抗ＣＴＬＡ４＋４０ｕｇのＮＫＧ２Ｄ−ＨＦｃ／ＩＦＡ／ｉｐ／ｓｃ、１×２５ｕｇのＮＫＧ２Ｄ−ｈＦｃ／Ｒｉｂｉ／ｉｐ／ｓｃ及び追加免疫した２×３０ｕｇ／ＰＢＳ／ｉｐ／ｉｖにより免疫化した。この動物実験は、米国国家研究会議のガイドラインに従って実行した。
【０１６２】
マウス血清のスクリーニング。免疫化したマウス由来の血清を、ＮＫＧ２Ｄ特異性についてフローサイトメトリー分析によりスクリーニングし、選択した血清を、ＭＩＣＡリガンドの結合を中和する能力についても試験した。これについては実施例３に記載する。ＮＫＧ２Ｄに特異的に結合してＮＩＣＡ結合を中和する力価の高い抗体を有するマウスを、ハイブリドーマ作製のために選択した。
【０１６３】
ハイブリドーマの作製。選択された免疫化マウスの脾臓をホモジナイズし、脾細胞の単一の細胞懸濁液を、Ｘ６１  Ａｇ８６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）への融合のために使用した。このような融合は、先述のように（Harlow and Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988))ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５００と、The Cyto PulseTM CEEF-50 Electrofusion System (Cyto Pulse Sciences, Inc.)を用いた電気融合を使用して行った。
まず、融合させた細胞を、選択的ＤＭＥＭ  ＨＡＴ培地の９６ウェル組織培養プレートに播種し、１０％のＦＢＳ及び５％のオリジン（ハイブリドーマクローニングファクター、BioVeris）を補った。１〜２回に亘り、５％のＦＢＳ及び０．７％のオリジンをそれぞれ補ったＤＭＥＭ  ＨＴ培地と取り替えてプレートを１０〜１４日間インキュベートし、その後上清を回収してスクリーニングした。安定なクローンが生成されるまで希釈を制限することにより、試験によりポジティブであったクローンを拡大させてサブクローニングした。選択されたクローンは、ＦＡＣＳ分析により、抗ＮＫＧ２Ｄ特異性抗体の存在について、並びにＭＩＣＡ結合を中和する能力について、引き続きスクリーニングした。
【０１６４】
ハイブリドーマ上清のスクリーニング。直接ＥＬＩＳＡ又はフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）を用いて、免疫化の第１の手順により得られたハイブリドーマ上清の一次スクリーングを行い、抗ＮＫＧ２Ｄ特異性抗体の存在について試験した。簡単に説明すると、４℃のＰＢＳ中において一晩、０．４μｇ／ｍｌのｍＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ  ５０μｌ（マウスＦｃに融合し、ＣＨＯ細胞に発現したＮＫＧ２Ｄの細胞外部分を含む）でｍａｘｉｓｏｒｐプレートをコーティングした後、室温で１５分間に亘り、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で遮断することにより、ＥＬＩＳＡを行った。その後、５０μｌのハイブリドーマ上清を用いてプレートをインキュベートし、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγ断片特異性（Jackson社抗体, 109-036-098）を用いてＮＫＧ２Ｄ特異性抗体を検出した。このようなインキュベーションは室温で１時間行い、各段回の間に、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０によりプレートを洗浄した。１００μｌのＴＭＢ基質（Kem-En-Tec）を用いて結合した抗体を可視化し、４Ｍ  Ｈ３ＰＯ４により停止させた。４５０及び６２０ｎｍでプレートの読み取りを行った。ＦＡＣＳのために、５００００個の細胞１０μｌと、９０μｌのハイブリドーマ上清を３０分に亘り４℃でインキュベーションした後、２％ＦＡＣＳのＰＢＳで洗浄し、その後二次的なヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγ断片特異性（Jackson社抗体, 109-036-098）を用いてインキュベートすることにより、ＮＫＧ２Ｄを発現するＢａＦ／３細胞及びＮＫＧ２Ｄを発現していないコントロールＢａＦ３細胞に対する結合を分析した。次いで、Ｂ＆Ｄ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ (BD Biosciences)で分析を行った。ＮＫＧ２Ｄを発現するＢａＦ／３細胞のみを染色し、コントロール細胞を染色しなかった抗体を、ＮＫＧ２Ｄ−特異性とみなした。
免疫化の第２の手順の一次スクリーニングは、直接ＥＬＩＳＡにより抗ＮＫＧ２Ｄ特異性抗体の存在を試験することであった。簡単に説明すると、４℃のＰＢＳ中において一晩、１〜２ｍｇ／ｍｌのｈＦｃ−ＮＫＧ２Ｄ（R&D Systems）によりｍａｘｉｓｏｒｐプレートをコーティングした後、室温で３０〜６０分間に亘り、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、５％のニワトリ血清で遮断することにより、ＥＬＩＳＡを行った。その後、５０μｌのハイブリドーマ上清と、５０μｌの遮断バッファーとを用いてプレートをインキュベートし、遮断バッファー中において抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（Bethyl, A80-115P）を用いてＮＫＧ２Ｄ特異性抗体を検出した。このようなインキュベーションは、室温で１時間行い、各段回の間に、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０によりプレートを洗浄した。ＡＢＴＳ基質（Moss Inc, 製品：ABTS-1000）を用いて結合した抗体を可視化した。プレートの読み取りは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓソフトウェアにより４１５ｎｍで行った。
【０１６５】
ＥＬＩＳＡ一次スクリーニングから選択されたハイブリドーマに対し、上述のように、二次スクリーニングを行った。
市販のマウス抗体（１４９８１０及びＯＮ７２）をコントロールとして使用した。
【０１６６】
結果
免疫化したマウス由来の高度に選択性の血清を、ＮＫＧ２Ｄ結合及びリガンド結合能により同定し（例示的な結果を図１Ａ及び１Ｂに示す）、選択したマウスを融合及びハイブリドーマ作製に使用した。ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによって約２５００のハイブリドーマのスクリーニングを行い、ＮＫＧ２Ｄ特異性のクローンを同定した。図２は、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞に結合するがＮＫＧ２Ｄネガティブな細胞には結合しないハイブリドーマ上清中のヒト抗体を、市販の抗体（１４９８１０）との対比で示す。免疫化の第１の手順により得られた３つのハイブリドーマ（１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、及び２１Ｆ２）由来の抗体と、免疫化の第２の手順により得られた複数の抗体（ＭＳを含む）とを、組換え生成及び更なる試験のために選択した。
【０１６７】
実施例２−組換えの生成とスクリーニング
別個に行った免疫化により、ヒト抗体を発現する融合マウス脾臓由来の数百のハイブリドーマからなる第２バッチを得た。ＮＫＧ２Ｄ特異性について、実施例１の記載と同様にしてＦＡＣＳを用いることによりこれらのスクリーニングを行った。１のハイブリドーマ由来の抗体であるＭＳを、組換え生成とその後の試験のために選択した。
抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を、当該ハイブリドーマ由来のｍＲＮＡの、単離された生成物のＰＣＲとその後の配列決定により同定した。
【０１６８】
材料及び方法
ＲＮＡの精製。製造者の指示に従って、Qiagen社のRNeasyを用いて全ＲＮＡを精製した。但し、βメルカプトエタノールを手順から省略した。分光法（２６０／２８０ｎｍ、１．８＜比＜２．０）によりＲＮＡの品質をチェックし、バイオ分析機器を用いて適宜ＲＮＡ劣化を評価した。
ＲＴ−ＰＣＲ。ＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥ（Clonetechのキット）により完全長ｃＤＮＡを合成した。
【０１６９】
ＰＣＲ。Clonetech社のＨＦＩＩポリメラーゼを用いてＰＣＲを実施した。保存された配列にアニールされた５’プライマー（ＥｃｏＲＩと共に）をＳＭＡＲＴ−ＲＡＣＥの間に導入した。ＩｇＧ（ＶＨ）及びカッパ鎖（ＶＬ）それぞれの保存された領域にアニールする２つの３’プライマーが設計された。３’プライマー（ＢｓｉＷＩ（ＶＬ）及びＮｈｅＩ（ＶＨ））には制限酵素部位も存在していた。ＰＣＲは、（ＰＣＲ導入変異体をチェックするため）全てのＶＨ及びＶＬ増殖について二重に行った。ＰＣＲ反応に失敗した場合は、Novagenの縮重５’プライマー混合物を用いてＶＬ及びＶＨを増殖した。
ＰＣＲ産物の精製。ＰＣＲ産物を、１％のアガロースゲル上で分離し、励起し、ＧＦＸカラム（Amersham）で精製し、ＤＮＡｓｅを含まない水に溶出した。
【０１７０】
連結。適切な制限酵素を用いてＰＣＲ産物及び発現ベクター（アンピシリン耐性）を切断した（ＶＨ、ＥｃｏＲＩ＋ＮｈｅＩ及びＶＬ、ＥｃｏＲＩ＋ＢｓｉＷＩ）。アイソタイプ指示ベクター（ＮＫＧ２ＤのＩｇＧ４）中への可変ドメインの連結は、Ｔ４−リガーゼ（Roche）によって触媒された。使用したプラスミドはｐＴＴ５であった（Durocher等、Nucleic Acids Res 2002;30(2):e9; Pham等、Biotechnol Bioeng 2003;84(3):332-42）。
発現ベクターへの挿入のチェック（コロニーＰＣＲ）。一晩をかけて、形質転換受容性の大腸菌(Ｔｏｐ１０)を、連結混合物を用いて形質転換し、アンピシリン耐性クローンを選択した。合計で、ＶＨ及びＶＬ両方について８のポジティブなクローンが選ばれた。コロニーＰＣＲとゲル電気泳動（１％アガロース）により、挿入物が予想の大きさと適合しているかどうかについて全てのコロニーをチェックした。
【０１７１】
配列決定／ミニプレップ。全てのポジティブなコロニーＰＣＲから得られた一定分量を調製し、配列決定を行った（ＥｘｏＳＡＰｉｔを使用）。合計で、各クローンに３２のＰＣＲ産物が配列決定された（（８×ＶＨ＋８×ＶＬ）×２（二重ＰＣＲ））。（ＶｅｃｔｏｒＮＴＩを用いて）配列を分析し、クローニングされたＶＨ及びＶＬに対応するポジティブな細菌クローンを拡大し（ミニ／マキシプレップ）、ＨＥＫ２９３／６Ｅ形質移入のためにＤＮＡを精製した（ＧＦＸカラム）。２以上のＶＨ及びＶＬ配列が同定された場合、全ての可能なＶＬ及びＶＨの組み合わせがＨＥＫ２９３／６Ｅ細胞に発現された。
組換えの生成。同定された重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ重鎖及び軽鎖ヒトＩｇＧ４フレームワークに挿入され、ＨＥＫ２９３細胞の２つのベクターから高いレベルで発現された。抗体はタンパク質Ａカラムで精製された。
【０１７２】
ＨＥＫ２９３／６Ｅ細胞における抗体発現。ＧｉｂｃｏのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３倍地にＨＥＫ２９３細胞を通した。形質移入の日に、細胞を１００万個／ｍｌの濃度まで希釈した。３０ｍｌを形質移入するために、１５μｇの重鎖ベクターと１５μｇの軽鎖ベクターとを２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ及び４０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎと混合した（次いで総用量が３０ｍｌとなるまでＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地を混合した）。６日間のインキュベーションの後、遠心分離（１０００ｒｐｍで１０分間）により細胞をペレット状にし、上清をタンパク質Ａの精製のために回収した。
精製。組換えで発現されたヒト抗体のＩｇＧ４変異体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔTM ＳｕＲｅタンパク質Ａカラムで精製した。抗体にカラムを適用した後、カラムを１０カラム用量のＰＢＳバッファーで洗浄し、１００ｍＭのグリシン、１００ｍＭのＮａＣｌバッファー（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した後、Ｈｉｇｈ  ＴｒａｐTM脱塩カラムを用いてＰＢＳバッファー内へのバッファー交換を行った。全ての手順は、GE Healthcare Amersham Biosciences ABのAktaxpressシステムにより制御した。
精製された抗体の通常の遠心分離範囲は１０〜１３０ｍｇ／ｌ（０．３〜３．３ｍｇ／３０ｍｌ）であった。
【０１７３】
結果
１６Ｆ１６（ＩｇＧ４）Ｈ鎖、１６Ｆ１６Ｌ鎖、１６Ｆ３１（ＩｇＧ４）Ｈ鎖、及び１６Ｆ３１Ｌ鎖をコードするｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号３〜６で示し、１６Ｆ１６（ＩｇＧ４）、１６Ｆ３１（ＩｇＧ４）、ＭＳ（ＩｇＧ４）、及び２１Ｆ２（ＩｇＧ４）の完全長、可変及びＣＤＲアミノ酸配列の各配列識別子を表１に示す。図４は、可変領域（太字）及びＣＤＲ領域（太下線）を強調した、ＩｇＧ４アイソタイプの１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２のアミノ酸配列を示す。
ＩｇＨ接合成分のＪｏｉｎｔＭＬｃアルゴリズムと、Ohm-Laursen等、(Immunology 2006;119:265-77)に記載されているＤ分類とを用いて、１６Ｆ１６及び１６Ｆ３１について、可変領域の以下の生殖系列配列を識別した。
１６Ｆ１６ ＶＨ：ＶＨ３＿２１／Ｄ３−９／ＪＨ４（それぞれ配列番号３１／３２／３３）
１６Ｆ１６ ＶL：ＶKI＿L１５／ＪK２（それぞれ配列番号３４／３５）
１６Ｆ３１ ＶＨ：ＶＨ３＿２０／Ｄ３−１０／ＪＨ６（それぞれ配列番号３６／（EL）／３７）
１６Ｆ３１ ＶL：ＶKIII＿A２７／ＪK３（それぞれ配列番号３８／３９）
ＭＳ  ＶＨ：ＶＨ４＿５９／Ｄ３＿２７＿R３／ＪＨ３（それぞれ配列番号６４／（ＮＷＧ）／６５）
ＭＳ  ＶL：ＶKIII＿A２７／ＪＫ１（それぞれ配列番号３８／６６）
２１Ｆ２  ＶＨ：ＶＨ５＿５１／Ｄ３＿１０＿Ｒ３／ＪＨ４（それぞれ配列番号６７／６８／３３）
２１Ｆ２  ＶL：ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６／ＪＫ１（それぞれ配列番号６９／６６）
ＶＨ及びＶＬ配列と、対応する組換え生殖系列配列との整列（配列番号２７〜３０は、組み換えＶＨ３＿２１／Ｄ３−９／ＪＨ４、ＶＫＩ＿Ｌ１５／ＪＫ２、ＶＨ３＿２０／Ｄ３−１０／ＪＨ６、及びＶＩＫＫＫ＿Ａ２７／ＪＫ３にそれぞれ対応しており、配列番号６０〜６３は、組換えＶＨ４＿５９／Ｄ７＿２７＿３／ＪＨ３、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７／ＪＫ１、ＶＨ５＿５１／Ｄ３＿１０＿Ｒ３／ＪＨ４、及びＶＫＩＩＩ＿Ｌ６／ＪＫ１にそれぞれ対応している）により示された体細胞突然変異を図５Ａ〜５Ｈに示す。
【０１７４】
実施例３−ＭＩＣＡの遮断実験
材料及び方法
フローサイトメトリーアッセイ−ＭＩＣＡ遮断。リガンド結合の遮断を分析するために、５００００個のＮＫＧ２Ｄ／ＤＡＰ１０発現ＢａＦ／３細胞を、様々に量を変化させたハイブリドーマ上清又は精製した抗体を用いて合計１００μｌ（ｐＨ７．４の２％ＦＢＳを有するＰＢＳ）とし、１６℃で１時間に亘りインキュベートした後、ｍＦｃ−ＭＩＣＡ（ヒト抗体用）又はｈＦｃ−ＭＩＣＡ（ＯＮ７２用）（１μｇ）を用いて４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、二次的ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγ断片特異性、Jackson社抗体（109-036-151）を加えることにより、ＭＩＣＡ−ｍＦｃ結合の検出を行った。次いで細胞をＢ＆Ｄ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙフローサイトメトリーで分析した。プレインキュベーションによるＭＩＣＡ結合の低減度を、プレインキュベーションしない場合のＭＩＣＡの結合に対するプレインキュベーションによる結合の割合（％）のＭＦＩ（平均蛍光強度）として分析した。
更に詳細な用量反応曲線も実施され、１μｇのＭＩＣＡ−ｍＦｃ結合の５０％の阻害（ＩＣ５０）と完全な遮断とに必要な、組換えで発現されて精製された抗体の濃度が分析された。
【０１７５】
結果
リガンド結合を遮断する能力について抗体を分析した。図６は、ハイブリドーマ上清を用いたプレインキュベーションが、実質的にリガンドＭＩＣＡの全ての結合を遮断したことを示している。組換えで発現された抗体を用いて用量反応曲線を実施した。これにより、０．０１７及び０．２ｎＭで１６Ｆ１６に、０．１６及び０．７ｎＭで１６Ｆ３１に結合するＭＩＣＡ−ｍＦｃのＮＫＧ２Ｄ飽和用量（１μｇ）のＩＣ５０及び完全遮断が示された（図７）。これに対応するＯＮ７２の結果は、１μｇのＭＩＣＡ−ＦｃのＩＣ５０及び完全遮断について、それぞれ０．０２及び０．２４であった。詳細な結果を表２に示す。ＭＳ及び２１Ｆ２のＩＣ５０は最低であり、それぞれ０．００１６ｎＭ及び０．００４８ｎＭであった。
表２
0005591712.tif 000004
【０１７６】
実施例４−マウス抗体との競合
材料及び方法
フローサイトメトリアッセイ−マウス抗体との競合。市販のマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体の遮断を分析するために、５００００個のＮＫＧ２Ｄ発現細胞を、最終的に１００μｌ（ｐＨ７．４の２％ＦＢＳを有するＰＢＳ）の、ハイブリドーマ上清又は精製して組換えで発現させた抗体（０．３μｇ又は別途記載）を用いて、１６℃で１時間に亘りインキュベートし、その後マウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体（ＯＮ７２，１４９８１０、１Ｄ１１、又は５Ｃ６（１Ｄ１１及び５Ｃ６については、例えばBauer等、Science 1999:285:727-9及び WO02068615参照）；０．３μｇ又は別途記載）を用いて４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、二次的ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγ断片特異性、Jackson社抗体（109-036-151）を加えることにより、マウス抗体の結合の検出を行った。細胞をＢ＆Ｄ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙで分析した。このような設定は、検出のために二次的ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγ断片特異性のJackson社抗体（109-036-098）を使用して、マウス抗体に続いてハイブリドーマ上清又は精製ヒト抗体を用いてインキュベーションすることによっても実施した。プレインキュベーションによる結合の低減度を、プレインキュベーションしない場合の結合に対するプレインキュベーションによる結合の割合（％）のＭＦＩとして分析した。
【０１７７】
結果
ハイブリドーマ上清を用いて細胞のプレインキュベーションを行った後にＯＮ７２を用いたインキュベーションを行ったところ、ＯＮ７２結合の９５％が遮断されたことが示された（図８）。組換えで発現された１６Ｆ１６抗体を用いた同じ種類のアッセイを実施したところ、１６Ｆ１６が９５％のＯＮ７２を遮断したが、ＯＮ７２によるプレインキュベーションが、その後の１６Ｆ１６結合の８２％しか遮断しないことが示された（図９Ａ）。同様に、１４９８１０及び１６Ｆ１６については、インキュベーションの順序又は相対的抗体濃度に関係なく、いずれの抗体によっても約５０％の遮断しか観察されなかった（図９Ａ）。入手可能な他のマウス抗ｈＮＫＧ２Ｄ抗体については、表２に交差阻害が示されており、これは、１Ｄ１１及び５Ｃ６によるＯＮ７２のほぼ完全な遮断と、１４９８１０による約８５％の遮断を示している。組換えで発現したＭＳを用いた同種のアッセイを実施することにより、ＭＳによるプレインキュベーションがＯＮ７２結合の９８％と、１Ｄ１１結合の８８％と、１４９８１０結合の９６．５％とを阻害したことが示された（図９Ｂ）。
表３
0005591712.tif 000005
【０１７８】
実施例５−サルＮＫＧ２Ｄとの血液細胞の結合及び交差反応性
材料及び方法
フローサイトメトリアッセイ−ヒト及びサルのＰＢＭＣ。ヒト、或いはカニクイザル又はアカゲザルから抹消血単核細胞（ＰＭＢＣ）を単離した。動物に関する作業は全て、オランダ国の国家研究会議のガイドラインに従って行った。各ＰＢＭＣサンプルを、異なる細胞サブセットについてマーカーで標識した（ＮＫ、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、及びγδＴ細胞、並びにＮＫＧ２Ｄについては、ＯＮ７２又は組換えで発現されて精製された１６Ｆ１６で標識した）。細胞を洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ(BD Biosource)上において、２つの抗体によるＮＫＧ２Ｄの細胞サブセットの染色について分析した。個々の抗体について染色のＭＦＩを算出した。
個別の実験では、両方のＰＢＭＣ標本と、健常なボランティア又はカニクイザル由来の全血とに対するＭＳ及び２１Ｆ２の結合を、全用量範囲のＭＳ又は２１Ｆ２を添加した後で抗ヒトＩｇＧ４抗体を検出することにより試験し、ＥＣ５０の値を算出した。簡単に説明すると、抗体を用いたインキュベーションを４℃で３０分間行なった後、洗浄し、次いで直接標識した二次的抗ｈＩｇＧ４抗体を添加して、ＣＤ８、ＣＤ４、ＮＫ、及びγδ−Ｔ細胞といった対象とする種々の細胞集団に特異的な抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、その後、２％ＦＣＳのＰＢＳ中で細胞を２回洗浄し、赤血球を溶解させた。次いでフローサイトメトリーにより細胞を分析し、異なる細胞集団に対する結合を評価した。
【０１７９】
結果
１６Ｆ１６とＯＮ７２との結果を図１０Ａ〜１０Ｄに示す。カニクイザル又はアカゲザルのＰＭＢＣにおいて、全てのＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞はＮＫＧ２Ｄにポジティブに染色されたが、ポジティブに染色されたＣＤ４＋Ｔ細胞は無かった。平行して実験が行われたヒトＰＢＭＣについても得られた同じ結果が得られた。この結果は文献と一致するもので、即ち、ヒトにおいて、ＮＫＧ２Ｄは通常ＮＫ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞に発現されるが、ＣＤ４＋Ｔ細胞には発現されない。
カニクイザル及びアカゲザル由来のＰＢＭＣのＯＮ７２又は１６Ｆ１６による染色は、これら２つの抗体が、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞には同じ様に結合するが、ＣＤ４＋Ｔ細胞には結合しないことを示すものであった。このような結果は、２つのサル系統が毒性試験に適切な種であることを確認するものであった。
【０１８０】
市販の抗体にも、１６Ｆ１６又は１６Ｆ３１のいずれにも、マウス、ラット、イヌ、又はブタＮＫＧ２Ｄに対する交差応答性は観察されなかった。
ヒト及びカニクイザルＣＤ８  Ｔ細胞に対するＭＳの結合の結果をそれぞれ図１１Ａ及び１１Ｂに、ＭＳ及び２１Ｆ２のＰＢＭＣ標本に対する結合のＥＣ５０値と、ヒト細胞に対するカニクイザル細胞のＥＣ５０値の比（％）とを表４に示す。これは、ＭＳ及び２１Ｆ２が共に、ヒト及びカニクイザルのＮＫＧ２Ｄに対して非常に類似性の高い親和性を有していることを示すものである。
表４
0005591712.tif 000006
【０１８１】
実施例６−バイオアッセイ
完全なヒト抗体がＮＫＧ２Ｄの活性を実際に遮断することを試験するため、ＮＫＧ２Ｄリガンドにより駆動される細胞障害性アッセイを開発した。５１Ｃｒ放出アッセイを使用した。このアッセイでは、標的細胞に放射性染料を充填し、細胞のＮＫ殺傷の結果としてその放出を測定する。
材料及び方法
ＮＫＧ２Ｄ−ＭＩＣＡ相互作用により媒介される殺傷アッセイ。ＮＫＧ２Ｄ−リガンド媒介性の標的細胞の殺傷を測定するための生物学的アッセイは、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の試験に適している。ＮＫ細胞株ＮＫ９２又はＮＫＬ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２４０７、Robertson等、Exp Hematol 1996;24:406-15）は共に、ＭＩＣＡを形質移入したＢａＦ／３細胞を、ＮＫＧ２Ｄに依存して殺傷し、ＮＫＧ２Ｄ−リガンド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ又はＵＬＢＰ１〜４）を発現する５１Ｃｒ充填標的細胞を殺傷するエフェクター細胞として使用することができる。
【０１８２】
第１のアッセイでは、５１Ｃｒを充填したＭＩＣＡ発現ＢａＦ／３細胞を１０：１の比で用いて、ＯＮ７２又はＩｇＧ４アイソタイプの組換えで発現された１６Ｆ１６を１又は５μｇ用いて又は用いずに、ＮＫＬ細胞を４時間インキュベートした。インキュベーション後、上清をマイクロタイタプレートに移し、シンチラントを添加して、Ｔｏｐｃｏｕｎｔｅｒ(Wallach)において標的細胞の殺傷の結果として５１Ｃｒの放出を測定した。５１Ｃｒの放出の低減を、添加した抗体による殺傷の阻害の指標とし、殺傷された細胞の割合（％）を算出した。
第２のアッセイでは、５１Ｃｒで標識したＭＩＣＡ又はＵＬＢＰ３発現ＢａＦ／３細部を用いてＮＫ９２細胞をインキュベートし、組換えで発現されて精製されたＩｇＧ４アイソタイプの１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２１の濃度を増大させながら添加することにより、殺傷の低減を測定した。結果を殺傷の阻害割合（％）として示す。
【０１８３】
結果
ＯＮ７２又は１６Ｆ１６を使用したリガンド遮断抗体の添加により、用量依存的様式で、殺傷阻害割合（％）で示したＮＫＬ細胞によるＮＩＣＡ保持細胞の殺傷が阻害された（図１２参照）。ＭＩＣＡを発現していないコントロール細胞は、ＮＫＬ細胞によって殺傷されなかった。
１６Ｆ１６も、ＭＩＣＡを保持するＢａＦ／３標的細胞及びＵＬＢＰを保持する同細胞両方のＮＫ９２細胞による殺傷を、用量依存性様式で阻害した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。細胞の殺傷は、０．８μｇ／ｍｌのＭＩＣＡ−ＮＫＧ２Ｄ及びＵＬＢＰ−ＮＫＧ２Ｄにより誘導される殺傷のほぼ完全な遮断に対する、殺傷の阻害割合（％）で示された。１６Ｆ３１（ＩｇＧ４）は、試験した最高用量において約７５％の殺傷を阻害した（２０μｇ／ｍｌ；図１３Ａ及び１３Ｂ）。
【０１８４】
図１４Ａに示すように、ＭＳ及び２１Ｆ２は共に、５１Ｃｒ−放出アッセイにおいて、ＮＫ９２細胞によるＵＬＢＰ３保持細胞の殺傷を阻害した。図１４Ａでは、細胞障害性の遮断が阻害割合（％）として示されており、０は２つの細胞が抗体を添加せずに一緒にインキュベートされていることを示し、ＭＳの方が効率的であることが示されている。図１４Ｂに示すように、５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＮＫＬ細胞によるリガンド−（ＭＩＣＡ−）保持細胞の殺傷は、非常に低い濃度（０．０１μｇ／ｍｌ）のＭＳにより最大に阻害され、試験した最大濃度の１６Ｆ１６（０．１μｇ／ｍｌ）は、約４０％しか阻害しなかった。ＩＣ５０データを表５にまとめる。
表５
0005591712.tif 000007
【０１８５】
実施例７−抗体誘導性のＮＫＧ２Ｄ発現低下
抗体を用いてｈＮＫＧ２Ｄ発現細胞をインキュベートしたとき、例えば内部移行によるＮＫＧ２Ｄの発現低下が、マウスモデルにおいて特定の抗ｍＮＫＧ２Ｄ抗体について上述したものと同様に起こることが示された。これは、抗体の異なる作用モードと、場合によっては効果時間の延長に繋がるであろう。ここでは、抗体を用いて一晩インキュベーションを行った後、どの程度ＮＫＧ２Ｄのレベルが低下するかを測定することにより、発現低下を分析した。
材料及び方法
フローサイトメトリアッセイ−発現低下。ＯＮ７２、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、又は２１Ｆ２を用いて一晩インキュベートすることにより、異なる種類のＮＫＧ２Ｄ発現細胞においてＮＫＧ２Ｄの抗体媒介性の発現低下を分析した。理論に拘束されずに述べると、発現低下の差異は、抗原の相互作用、例えばエピトープの差異を反映している可能性がある。ヒト抗体はＩｇＧ４アイソタイプとして組み換えで発現され、このアイソタイプは低い親和性でＦｃレセプターに結合する。
【０１８６】
第１の実験では、１μｇのＯＮ７２又は１６Ｆ１６、３μｇの１６Ｆ３１、０．１μｇのＭＳ、或いは０．３又は１μｇの２１Ｆ２を含む１ｍＬを、ＮＫＧ２Ｄ発現細胞及びＤＡＰ１０発現細胞に添加した。
第２の実験では、新しく調製したＮＫ細胞を異なる量のＭＳ（０、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１μｇ）又は２１Ｆ２（０．１μｇ）を用いて、全血状態を模倣するための１０％のヒト血清と、Ｆｃレセプターに対して高い親和性を有するＩｇＧとの存在下において、ＮＫ細胞をインキュベートした。
【０１８７】
第３の実験では、０．１μｇ／ｍｌのＭＳ、ＯＮ７２、又は２１Ｆ２を、ＮＫ、ＣＤ８＋、及びγδ  Ｔ細胞を含む全血に添加した。インキュベーションの後、抗ＣＤ８、抗ＣＤ５６（ＮＫ細胞）、抗γδ、及び抗ヒト抗体を用いた染色により、種々のサブタイプに対する結合を確認した。
上記実験におけるコントロールとして、細胞を処理せずに３７℃で一晩放置した。翌日、未処理の細胞及び抗体で処理した細胞の両方を、０．１μｇの前処理抗体を用いてインキュベートした後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγ断片特異性のJackson社抗体(109-036-151)を用いてＯＮ７２を検出するか、或いはヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ  Ｆｃγ断片特異性のJackson社抗体(109-036-098)を用いてヒト抗体を検出した。次いで細胞を洗浄し、Ｂ＆Ｄ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ上で分析した。未処理の場合と、抗体で処理した場合との間の染色レベルの差異を、ＮＫＧ２Ｄの発現低下の指標として分析し、残存する細胞表面ＮＫＧ２Ｄの割合（％）を、未処理細胞の染色に対する前処理後の染色の割合（％）として算出した。
【０１８８】
結果
図１５に示すように、ＯＮ７２、１６Ｆ１６、及び１６Ｆ３１は全て、ＮＫＧ２Ｄ発現ＢＡＦ／３細胞において、ＮＫＧ２Ｄの発現低下を誘導した。１６Ｆ１６を使用した場合に約７５％の発現低下が生じるのに対し、ＯＮ７２及び１６Ｆ３１の場合、約５５％の発現低下が観察された。これは、発現低下の誘導において、１６Ｆ１６が、ＯＮ７２のＫｄ値と同じようなＫｄ値を持つとき、他より高い効率を有することを示す。理論に拘束されずに述べると、これは異なる結合エピトープによるものでありうる。ＭＳを用いたインキュベーションの後では、表面ＮＫＧ２Ｄに約９５％の低減があった（図１６Ａ）。新しく単離したＮＫ細胞において、飽和（０．０３μｇ／ｍｌ）の約６０％にしか相当しないＭＳ濃度は、血清の存在下において、細胞表面ＮＫＧ２Ｄに最大の内部移行を誘導した。この場合、抗体を用いて一晩インキュベートした後では、結合のために残存していたＮＫＧ２Ｄは約３５％のみであった（図１６Ｂ）。２１Ｆ２の場合、血清の不在下において、１μｇ／ｍＬの濃度により、ＮＫＧ２Ｄの７８％の発現低下が誘導された（図１７）。
全血中の３つの異なるＮＫＧ２Ｄ＋リンパ球の集団において、ＭＳ及び２１Ｆ２では、２４時間で約８０％の内部移行が観察された。一方、ＯＮ７２はほぼ１００％の内部移行を誘導した（図１８）。加えて、ＯＮ７２は、ＭＳ及び２１Ｆ２より迅速に内部移行を誘導し（図１８）、その速度は１時間で５０〜７５％に達するものであった。
【０１８９】
実施例８−ヒト抗体の非枯渇ＩｇＧ４バージョン
血中の抗体架橋結合細胞は、抗体結合細胞の枯渇を誘導する場合がある。しかしながら、活性化Ｆｃレセプターに対するＩｇＧ４抗体の親和性はＩｇＧ１の同親和性と比較して非常に低いので、ＩｇＧ４抗体は枯渇を招かない。
材料及び方法
全血細胞枯渇アッセイ。ＮＫＧ２Ｄ発現細胞の非枯渇を示すために、ヒト抗体のＩｇＧ４バージョン１μｇを用いてヒト全血を４時間インキュベートし、ＮＫＧ２Ｄポジティブ及びＮＫＧ２Ｄネガティブ細胞の相対的な分布を分析し、抗体の不在下でインキュベートしたヒト全血と比較した。このとき、実施例４に記載の分析を使用して評価を行うことができた。
【０１９０】
実施例９−親和性の決定
２５℃において、Ｂｉａｃｏｒｅ１０００アップグレード装置(Biacore GE Healthcare; Biacore Upgrade CA0396で表面プラスモン共鳴の測定を行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験において、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（Biacore GE Healthcare; BR-1001-88）を流動バッファーとして機能させ、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアによりセンサーグラムの分析を行った。
タンパク質固定化。組換えＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質を、R&D systemsから取得するか、又は組換えにより作製した。組換えＵＬＢＰ０−１、２、３、ＭＩＣＢ及びＮＫＧ２Ｄ−ＦｃをR&D systemsより購入した。組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質を、センサーチップＣＭ５（Biacore GE Healthcare; BR-1000-14）上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合的に固定化した。ＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドハイドロクロライド及びＮ−ヒドロキシサクシニミド（Biacore GE Healthcare; BR-1000-50)）を用いてセンサーチップの表面を活性化した。カップリングバッファー（１０ｍＭの酢酸、ｐＨ５．２）中において１０μｇ／ｍｌとなるまでタンパク質を希釈し、適切な固定化レベル（即ち５００〜１０００ＲＵ）が達成されるまで注入した。１００ｍＭのエタノールアミンｐＨ８（Biacore GE Healthcare; BR-1000-50）を用いて、残存する活性化基の不活性化を行った。
【０１９１】
親和性の測定。全てＩｇＧ４アイソタイプとして組換えで発現されるヒト抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２を、マウス抗体ＯＮ７２と比較した。動力学的実験のために、可溶性抗体の段階希釈（０．３〜３０ナノＭ）を、２分間に亘って４０μｌ／分の一定流量で、固定化したＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質（５００〜１０００ＲＵ）を含むデクストラン層上に注入し、３分間解離させてから、５００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＮａＯＨバッファーを８秒間注入することにより再生させた。結果として得られたセンサーグラムを、ラングミュアモデルを用いた包括的フィッティングにより分析した。解離定数（ＫＤ）は、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａとして算出した。
細胞膜上に位置するＮＫＧ２Ｄに対する親和性。ＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に対する抗体の結合について完全な用量反応曲線を実行し、天然に発生するレセプターに対する結合親和性を分析した。
【０１９２】
結果
Ｂｉａｃｏｒｅ内のチップ上において２つの異なるＮＫＧ２Ｄ密度で行った１６Ｆ１６の親和性決定の結果を表６Ａに示す。この表は、高い親和性（ＫＤ１．７２Ｅ−１０Ｍ）と、低いOff-rate（ｋｄ３．７  Ｅ−５／秒）を示している。ＯＮ７２も同様であり、ｋａ＝９．６Ｅ５／（Ｍ×秒）、ｋｄ＝１．１Ｅ−４／秒、及びＤＫ＝１．７Ｅ−１０Ｍであった。しかしながら、ＭＳ及び２１Ｆ２は共に高い親和性を有しており（それぞれ、ＫＤ２．５２Ｅ−１２Ｍ及び７．７９Ｅ−１１Ｍ）、ＭＳのoff-rateは低かった（ｋｄ１．４５Ｅ−０．５／秒（表６Ｂ）。
図３は、フローサイトメトリーを使用した場合の、組換えで生成されて精製されたヒト抗体１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、及び２１Ｆ２の、ＮＫＧ２Ｄ発現及びＤＡＰ１０発現ＢａＦ／３細胞に対する用量依存性のＮＫＧ２Ｄ結合を、市販のマウス抗体（ＯＮ７２及び１４９８１０）との比較で示す。結合のＥＣ５０値は以下の通りである。
１６F１６：  ０.０５１μｇ／ｍｌ（０.０３４ｎＭ）
１６F３１：  ０.３１μｇ／ｍｌ（０.２１ｎＭ）
MS：  ０.０３２μｇ／ｍｌ（０.０２１ｎＭ）
２１F２：  ０.０３３μｇ／ｍｌ（０.０２３ｎＭ）
ON7２：  ０.０６２μｇ／ｍｌ（０.０４８ｎＭ）
１４９８１０：  ０.０６３μｇ／ｍｌ（０.０４２ｎＭ）.
【０１９３】
表６Ａ：  １６Ｆ１６  ＮＫＧ２Ｄ結合のＢｉａｃｏｒｅ分析
0005591712.tif 000008
表６Ｂ：  ＭＳ及び２１Ｆ２  ＮＫＧ２Ｄ結合のＢｉａｃｏｒｅ分析
0005591712.tif 000009
【０１９４】
実施例１０−固定化した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体のアゴニスト活性
抗体のアゴニスト活性を分析するために、低レベルのＣＤ３で刺激した抹消血リンパ球（ＰＢＭＣ）の増殖を、ＣＤ２８をコントロールとして使用して、固定化した抗ＮＫＧ２Ｄ抗体の存在下又は不在下において評価した。刺激は、ＮＫＧ２Ｄが同時刺激分子として作用することが示されており（Mashoo et al, Immunol. 2005;174;4480-4484）、慢性の炎症性病態化と同様の炎症促進サイトカインの存在下でＮＫＧ２Ｄのトリガーを反映すると考えられる状況下で行われた。このアッセイでは、表面結合抗体を用いてＰＢＭＣを３日間に亘って刺激した後、４日間に亘るＩＬ−２刺激を行い、全リンパ球、ＣＤ８＋、又はＣＤ４＋Ｔ細胞のいずれかにおいてＣＦＳＥ希釈により増殖を評価した。
材料及び方法
ＰＢＭＣ増殖アッセイ。勾配遠心分離法によりＰＢＭＣを精製した。９６ウェルMaxisorpプレートを抗Ｆｃ抗体を用いてコーティングし（Jackson - Immuno Resarch 115-006-008）、次いで洗浄した後抗ＣＤ３（０．１又は０．３ｎｇ／ｍｌ、Bioscienceカタログ＃14-0037-82）、抗ＮＫＧ２Ｄ（ＭＳ又はＯＮ７２、０．２μｇ／ｍｌ）、及び／又は抗ＣＤ２８抗体（０．２μｇ／ｍｌ、Becton Dickison カタログ# 348040）を添加した。各ウェルに１５０，０００個のＰＢＭＣを加え、細胞を３７℃で３日間インキュベートした。その後細胞をＣＦＳＥ（分子プローブカタログ＃C34554）で標識した。１０００万個の細胞を、０．５ｍｌの１μＭ  ＣＦＳＥで１０分間に亘り３７℃でインキュベートした後洗浄し、１ウェル当たり１５０，０００個のＰＢＭＣを含む６０ウェルプレートを、ＩＬ０２（１０Ｕ／ｍｌ）を用いて４日間インキュベートした。最後に、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ４抗体を用いて細胞を染色し、全リンパ球（合計を図１９に示す）、又はＣＤ８＋、又はＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣＦＳＥ希釈により増殖を測定した（同様の結果が得られた）。
【０１９５】
結果
図１９に示すように、ＭＳは、０．１又は０．３ｎｇ／ｍｌのＣＤ３による刺激のいずれにおいてもリンパ球の増殖を有意に同時刺激することは無かった。一方、ＯＮ７２は、両方のＣＤ３濃度において少量であるが、有意な同時刺激を示した。表７を参照されたい。いずれの場合も、コントロールである抗ＣＤ２８は強い同時刺激をもたらし、抗ＮＫＧ２Ｄがこれに有意な刺激を追加することはなかった。これにより、２つの抗体の結合モードには差異があることが示された。即ち、固定化したＯＮ７２は検出可能なアゴニスト活性を有しており、ＭＳはそれよりも純度の高いアンタゴニストである。
表７：  ＰＢＭＣ増殖アッセイの結果
0005591712.tif 000010
【０１９６】
実施例１１−ＭＳ−Ｆａｂと複合した可溶性ｈＮＫＧ２Ｄの結晶構造
ヒトモノクローナル抗体ＭＳのＦａｂ断片と複合したｈＮＫＧ２Ｄの可溶性断片の結晶構造を解析し、Ｘ線結晶学により１．７Åの解像度に精密化した。この結果により、当該抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄに結合するとＭＩＣＡ分子の結合を遮断することが確認された（図２０〜２２）。また、各ｈＮＫＧ２Ｄ二量体が１つのＭＳ  Ｆａｂ断片にしか結合しないことが示された。ＭＳのＦａｂ部分は、一次的に２つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体の一方（「ＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１」に結合したが、他方の単量体（「ＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット２」）とはわずかに相互作用したものの、それ以上のＭＳ  Ｆａｂの単量体ユニット２への結合は遮断された。
本実施例に言及する文献のリストを実施例１２において提示する。
【０１９７】
材料及び方法
可溶性のｈＮＫＧ２Ｄ（配列番号２の残基８９〜２１６）と、ＭＳ  Ｆａｂ（配列番号４１に対応する軽鎖と、配列番号４０の残基１〜２１３に対応する重鎖断片とを含む）とを、モル濃度がやや超過したｈＮＫＧ２Ｄと混合し、複合体をゲルろ過カラムで精製した。次いで複合体を約９．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。１７％のＰＥＧ３３５０、２００ｍＭのマロン酸ナトリウム、及び１００ｍＭのビス−トリス−プロパンバッファー結晶（ｐＨ７．５）中において懸滴法を用いて結晶を成長させた。結晶を、７５％の沈殿剤溶液と、２５％のグリセロールを含むクリオ溶液に移した。結晶を約１５秒間浸漬した。次いで結晶を、液体Ｎ２中で急速冷凍し、データ収集の間低温貯蔵Ｎ２ガス流により１００Ｋに維持した。結晶学的データの回収は、はじめ、Ｒｉｇａｋｕ００７ＨＦ回転アノード源において２．４Åの解像度まで、その後、新規結晶を使用して、MAX-lab（Lund, Sweden）においてビームラインＢＬ９１１−３で１．７Åの解像度まで行った（２）。データの空間群の決定、統合、及びスケーリングを、ＸＤＳソフトウェアパッケージで行った（３）。シンクロトロンデータの細胞パラメータは、それぞれ８２．１、５４．２、１６９．４Å、９０°、１０２．６２°及び９０°と決定された。ＣＣＰ４スイート（７）のＭＯＬＲＥＰ（４）及びＰＨＡＳＥＲソフトウェアプログラム（５、６）を用いた分子置換（４）、ＰＤＢ堆積（８）構造１Ｌ７１（９）由来のＦａｂ分子、及び堆積した１ＭＰＵ構造（１０）由来のｈＮＫＧ２Ｄ分子を用いて構造決定を行った。Ｆａｂ分子は２つのドメイン、即ち可変ドメインと定常ドメインとに分割され、ＮＫＧ２Ｄのために、分子置換算出のサーチモデルとして単量体を使用した。ＲＥＦＭＡＣ５ソフトウェアプログラム（１１）を用いた結晶学的精密化の後、電子密度マップのコンピュータグラフィック検査と、モデルの修正と、Ｃｏｏｔソフトウェアプログラム（１２）を使用した構築を行った。モデルにそれ以上有意な修正を行えなくなるまでこの手順を繰り返した。構造は最初、回転アノードデータを用いてＣ２空間群において解釈した。しかし、シンクロトロンデータでは、ＸＤＳ（３）により示される非中心単斜空間群は無く、データは空間群Ｐ２において統合され、その後Ｐ２１に変更された。Ｃにセンタリングされた斜方晶細胞も高いスコアを示した。また、シンクロトロンデータを試験する際には、ＰＩＮＴＬＥＳＳソフトウェア（１３）によりＰ２１を正確な空間群として処理した。ＰＨＡＳＥＲソフトウェアプログラムを使用して、分子置換の新しい回を行い、このときＣ２空間群における第１回目の分子置換で調製された予備のモデルを使用した。分子置換は成功裏に行われたが、精密化の間にＲ値及び無Ｒ値（モデルから得られた算出データと観察された実験データとの比較）は予想通りに低下せず（Ｒ値０．３５及び無Ｒ値０．４３）、電子密度マップは妥当であるにも関わらず、データ及び精密化の更なる調査を開始した。Ｐ１を含む異なる空間群を試験したが、精密化を改善することはできなかった。その代わり、相晶形成に関してデータを点検し、データをＳＨＥＬＸＬ精密化ソフトウェアプログラム（１４）に移した。（ｈ，ｋ，ｌ）−＞（ｈ，ｋ，−ｈ−ｌ）の相晶関係を使用することで、全データのＲ及び無Ｒは０．３４及び０．４０から０．３０及び０．３４へそれぞれ低下し、精密化した相晶因子ＢＡＳＦは０．２５であった。ＣＯＯＴグラフィックソフトウェアプログラムを用いてモデルに対する手動修正を行った。ＳＨＥＬＸＬコンピュータプログラムにおいて精密化を実行した。１４回の手作業とそれに続く精密化の後、カットオフ無しの全データの最終的なＲ及び無Ｒは、それぞれ０．２７７及び０．３２０であり、モデルは理想の結合長である０．００８Å（表８）からの二乗平均偏差（ＲＭＳＤ）を示した。精密化された相晶因子はＳＨＥＬＸＬにより０．２６と算出された。
【０１９８】
結果
図２０Ａ、２０Ｂ、２１Ａ、及び２１Ｃに示すように、ＭＳ−Ｆａｂは、ｈＮＫＧ２Ｄニ量体の両方の単量体に対するＭＩＣＡの結合を効果的に遮断する。しかしながら、ＭＩＣＡ分子がＮＫＧ２Ｄニ量体（１）の両方の単量体に結合したのに対し、ＭＳ  Ｆａｂは一次的に２つの単量体の一方に結合した。ここでこの一方の単量体を「ＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１」と呼ぶ（図２１Ａ及び２１Ｃ）。ＭＳとＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット２との間の相互作用に見られる特異性は低く（例えば、水素結合が全く又は殆ど無かった）、ＭＳ  Ｆａｂ／ＮＫＧ２Ｄ複合体を一緒に維持する重要性は低かった。
対の相互作用において排除された平均面積のＣＣＰ４プログラムスイート（７）のソフトウェアプログラムＡＲＥＡＩＭＯＬによる計算は、結晶構造が決定された２つの独立した可溶性ｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ−Ｆａｂ分子複合体に対して、それぞれ９０９及び８７６Å２を算出した。ＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット１とＭＳ  Ｆａｂとの間の対の相互作用において排除された平均面積は、２つの独立した複合体について、それぞれ７１０及び７３６Å２と算出された。他方の単量体（「ＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット２」について排除された面積はそれよりも実質的に小さく、それぞれ２２７及び１５８Å２であった。
【０１９９】
ＭＳ−ＦａｂとｈＮＫＧ２Ｄ分子の間のカットオフ距離に４．０Åを使用して、ＣＣＰ４プログラムスイートのＣＯＮＴＡＣＴＳソフトウェア（７）を実行することにより、ｈＮＫＧ２ＤとＭＳ  Ｆａｂとの間の直接の接触を確認した。結晶構造の２つの独立した可溶性のｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ−Ｆａｂ複合体分子を表９〜１２に示す。結果として得られたＭＳのｈＮＫＧ２Ｄエピトープは、以下のｈＮＫＧ２Ｄの残基を含むことが判明した（配列番号２）。Ｌｙｓ1５０、Ｓｅｒ1５1、Ｔｙｒ1５２、Ｔｈｒ1８０、Ｉｌｅ1８1、Ｉｌｅ1８２、Ｇｌｕ1８３、Ｍｅｔ1８４、Ｇｌｎ1８５、Ｌｅｕ1９1、Ｌｙｓ1９７、Ｔｙｒ1９９、Ｇｌｕ２０1、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８（図２１Ａ）。ＮＫＧ２Ｄ単量体ユニット２では、判明した相互作用は５つに過ぎず、結晶学的に独立の複合体の両方に存在する残基は１つのみ（Ｔｙｒ１５２）であった。更に、Ｌｙｓ１５０側鎖原子Ｎζは複合体の一方の水素結合に関与しているのみであり、残りの相互作用の極性及び疎水性は弱いものであった。
ＭＳ  ｈＮＫＧ２Ｄエピトープは、βストランドβ３’（１）の直前及び開始部分のループに位置する残基Ｌｙｓ１５０−Ｔｈｒ１５２と、β５’及びその後のループに位置するＴｈｒ１８０−Ｇｌｎ１８５と、β５に位置するＬｅｕ１９１と、β６に位置するＬｙｓ１９７、Ｔｙｒ１９９及びＧｌｕ２０１と、β７ストランドに先行するループ及びβ７ストランドに位置するＴｈｒ２０５−Ｔｈｒ２０８とを含んでいた。これらの接触領域は、ｈＮＫＧ２Ｄ上のＭＩＣＡの結合部位として報告されているものとの一致度が非常に高かった（１）。ＭＩＣＡはＮＫＧ２Ｄの対称なホモ二量体に対して非対称的に結合する（１０）。これは、ｈＮＫＧ２Ｄに結合するＭＳ  Ｆａｂの場合も同様である。したがって、ＭＳ  ＦａｂのＮＫＧ２Ｄへの結合には、ＭＩＣＡに対して２つの可能な方向がある。これは図２０Ａ、Ｂ及び図２２に示されており、図中、ＭＳ  ＦａｂによってＭＩＣＡにたいする可能な結合方向のいずれもが遮断されることが明確に示されている。
【０２００】
ｈＮＫＧ２ＤのＭＳパラトープには、ＭＳ軽（Ｌ）鎖の残基Ｔｙｒ３３及びＴｒｐ９７（配列番号４１、表９〜１２）と、重（Ｈ）鎖の残基Ｇｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８及びＡｓｐ９９（配列番号４０、表９〜１２）とが含まれていた。ｈＮＫＧ２Ｄエピトープと、水素結合に関与する残基は、図２１ＡのｈＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列にも示されている。
【０２０１】
実施例１２−ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂと複合した可溶性ｈＮＫＧ２Ｄの結晶構造
ＯＮ７２Ｆａｂ断片（ｈｚＯＮ７２）のヒト化バージョンと複合した可溶性ｈＮＫＧ２Ｄの結晶構造を解析し、Ｘ線結晶学により３．１５Åの解像度に精密化した。この結果により、当該抗体は、ｈＮＫＧ２Ｄに結合するとｈＮＫＧ２Ｄに対するＭＩＣＡ分子の結合を遮断できることが確認された（図２０〜２２）。また、各ｈＮＫＧ２Ｄ二量体が２つのｈｚＯＮ７２Ｆａｂ部分に同時に結合できることが示された。
本実施例において参照される文献リストを実施例の後に記載する。
【０２０２】
材料及び方法
可溶性のｈＮＫＧ２Ｄ断片（配列番号２の残基８１〜２１６に対応）と、ｈｚＯＮ７２  Ｆａｂ（配列番号７０及び７１、それぞれ重鎖断片及び軽鎖）とを、モル濃度がやや超過したｈＮＫＧ２Ｄと混合し、複合体をゲルろ過カラムで精製した。次いで複合体を約７．５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。１ＭのＬｉＳＯ４及び１００ｍＭのＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）中において懸滴法を用いて結晶を成長させた。結晶を、７５％の沈殿剤溶液と、２５％のグリセロールを含むクリオ溶液に移した。結晶を約１５秒間浸漬した。次いで結晶を、液体Ｎ２中で急速冷凍し、データ収集の間低温貯蔵Ｎ２ガス流により１００Ｋに維持した。３．１５Åまでの結晶学的データは、スウェーデン、ルンドのＭＡＸラボでビームラインＢＬ９１１−５（２）を使用して回収した。データの空間群の決定、統合、及びスケーリングを、ＸＤＳソフトウェアパッケージで行った（３）。細胞パラメータは、それぞれ６５．７、９３．３、１２８．９Å、９０°、９３．８°及び９０°と決定された。非対称ユニットにおいて、１つのＮＫＧ２Ｄ二量体と２つのｈｚＯＮ７２Ｆａｂ分子とを有する空間について、空間群はＰ２１と決定された。ＣＣＰ４スイート（７）のＭＯＬＲＥＰ（４）ソフトウェアプログラムとＰＤＢ堆積（８）構造１ＵＪ３（１５）のＦａｂ分子とを使用した分子置換、及び堆積した１ＭＰＵ構造（１０）のｈＮＫＧ２Ｄ二量体を用いて構造決定を行った。Ｆａｂ分子はまず、肘の角度を様々に変えて回転機能の実行を試験し、それに基づいて最もスコアの高いＦａｂを選択した。分子置換計算値におけるニ量体としてＮＫＧ２Ｄを検索した。２つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体間と、２つのＦａｂ分子間との非結晶学的制約を用いた結晶学的精密化を、ＣＣＰ４プログラムスイート（７）のＲＥＦＭＡＣ５ソフトウェアプログラム（１１）で行った。このような結晶学的精密化の後、電子密度マップのコンピュータグラフィック検査と、モデルの修正と、Ｃｏｏｔソフトウェアプログラム（１２）を使用した構築を行った。モデルにそれ以上有意な修正を行えなくなるまでこの手順を繰り返した。全データの最終的なＲ及び無Ｒは、それぞれ０．２１６及び０．２６８であり、モデルは理想の結合長である０．０１２Å（表１３）からの二乗平均偏差（ＲＭＳＤ）を示した。
【０２０３】
結果
ＭＩＣＡ分子はＮＫＧ２Ｄ（１）の両方の単量体に対して強く結合するが、その代わりｈＮＫＧ２Ｄ単量体の各々に独立して結合した２つのｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ分子は、ＮＫＧ２Ｄ二量体に対するＭＩＣＡの結合を効果的に遮断する（図２０Ｃ、２１Ｂ、Ｃ、及び２２）。対の相互作用において排除された平均面積のＣＣＰ４プログラムスイート（７）のソフトウェアプログラムＡＲＥＡＩＭＯＬによる計算により、決定された結晶構造中の２つの結晶学的に独立の可溶性ｈＮＫＧ２Ｄ／ｈｚＯＮ７２Ｆａｂ分子複合体（１つのｈＮＫＧ２Ｄ単量体と複合された１つのｈｚＯＮ７２Ｆａｂ分子）について、それぞれ合計７９１及び８０１Å２が算出された。２つの結晶学的に独立した複合体について、可溶性ｈＮＫＧ２Ｄ単量体とｈｚＯＮ７２−Ｆａｂの重鎖との間の対の相互作用において排除された平均面積は、それぞれ６４２及び６３１Å２であり、軽鎖についてはそれぞれ２０８及び２４２Å２であった。
ｈｚＯＮ７２−ＦａｂとｈＮＫＧ２Ｄ分子の間のカットオフ距離に４．０Åを使用して、ＣＣＰ４プログラムスイートのＣＯＮＴＡＣＴＳソフトウェアを実行することにより、ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂに対するｈｚＮＫＧ２Ｄの直接の接触を確認した。結晶構造の２つの独立した可溶性ｈＮＫＧ２Ｄ／ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ分子を表１４〜１５に示す。結果として得られたｈｚＯＮ７２のｈＮＫＧ２Ｄエピトープは、以下のｈＮＫＧ２Ｄの残基を含むことが判明した（配列番号２）。Ｓｅｒ１６５、Ｔｒｐ１６６、Ｌｅｕ１７４、Ｓｅｒ１７５、Ｐｒｏ１７６、Ａｓｎ１７７、Ｌｅｕ１７９、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｌｙｓ１８６、Ａｌａ１９３、Ｓｅｒ１９４、Ｓｅｒ１９５、Ｌｙｓ１９７、及びＴｙｒ１９９。ｈＮＫＧ２ＤのｈｚＯＮ７２パラトープは、ｈｚＯＮ７２軽（Ｌ）鎖の残基Ｔｙｒ１、Ｌｙｓ９２、Ｔｈｒ９３、及びＬｅｕ９４（配列番号７１、表１４〜１５）と、ｈｚＯＮ７２の重（Ｈ）鎖の残基Ｔｒｐ３３、Ａｓｐ５２、Ａｓｐ５５、Ｔｙｒ５７、Ａｓｎ５９、Ｔｈｙ６０、Ｔｙｒ１０１、Ａｓｐ１０２、Ｇｌｙ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｔｙｒ１０５、及びＶａｌ１０６（配列番号７０）を含んでいた。図２１ＢのｈＮＫＧ２Ｄのアミノ酸配列には、ｈｚＯＮ７２のｈＮＫＧ２Ｄエピトープ、及び水素結合に関与する残基も示された。
【０２０４】
ｈＮＫＧ２Ｄエピトープは、βストランドβ４（１）の開始部分に位置する残基Ｓｅｒ１６５−Ｔ４ｐ１６６と、β５’の前のループに位置するＬｅｕ１７４−Ａｓｎ１７７と、β５’ストランドとその後のループに位置するＬｅｕ１７９−Ｌｙｓと、β６の前のループに位置するＡｌａ１９３−Ｓｅｒ１９５と、β６ストランドに位置するＬｙｓ１９７及びＴｙｒ１９９から構成されていた。これらの接触領域は、ｈＮＫＧ２Ｄ上のＭＩＣＡの結合部位として報告されているものとの一致度が非常に高く（１）、ｈｚＯＮ７２抗体がＭＩＣＡ結合を遮断できることが明らかであった。これは図２０Ｃ、２１Ｂ、Ｃ及び２２に示されている。
【０２０５】
表８−ソフトウェアプログラムＳＨＥＬＸＬ（１４）によるＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ−Ｆａｂ複合体の観察データに対するＸ線モデル精密化の結果
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【０２０６】
表９
ｈＮＫＧ２Ｄ単量体「Ｎ」（配列番号２）の、「Ｈ」、ＭＳ−Ｆａｂ重鎖（配列番号４０）及び「Ｌ」、ＭＳ−Ｆａｂ軽鎖（配列番号４１）との相互作用を示す。これは、結晶中の結晶学的に独立のｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ−Ｆａｂ複合体分子の１つ目である。カットオフとして４．０Åを使用した。接触は、ＣＣＰ４スイート（７）のＣＯＮＴＡＣＴコンピュータプログラムにより確認した。最後の列の「＊＊＊」は、ＣＯＮＴＡＣＴによって算出されたこの接触において水素結合の可能性が強いことを示し（距離＜３．３Å）、「＊」は、同可能性が弱いことを示す（距離＞３．３Å）。空欄は、そこで考慮されるプログラムが水素結合の可能性の無いものであることを示す。水素結合は、ドナーとアクセプターとの間に特異的であり、通常は強く、且つ容易に確認可能である。
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【０２０７】
表１０
ｈＮＫＧ２Ｄ単量体「Ｃ」（配列番号２）の、「Ｂ」、ＭＳ−Ｆａｂ重鎖（配列番号４０）及び「Ａ」、ＭＳ−Ｆａｂ軽鎖（配列番号４１）との相互作用を示す。これは、結晶中の結晶学的に独立のｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ−Ｆａｂ複合体分子の２つ目である。カットオフとして４．０Åを使用した。接触は、ＣＣＰ４スイート（７）のＣＯＮＴＡＣＴコンピュータプログラムにより確認した。最後の列の「＊＊＊」は、ＣＯＮＴＡＣＴによって算出されたこの接触において水素結合の可能性が強いことを示し（距離＜３．３Å）、「＊」は、同可能性が弱いことを示す（距離＞３．３Å）。空欄は、そこで考慮されるプログラムが水素結合の可能性の無いものであることを示す。
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【０２０８】
表１１
ｈＮＫＧ２Ｄ単量体「Ｍ」（配列番号２）の、「Ｈ」、ＭＳ−Ｆａｂ重鎖（配列番号４０）及び「Ｌ」、ＭＳ−Ｆａｂ軽鎖（配列番号４１）との相互作用を示す。これは、結晶中の結晶学的に独立のｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ−Ｆａｂ複合体分子の１つ目である。カットオフとして４．０Åを使用した。接触は、ＣＣＰ４スイート（７）のＣＯＮＴＡＣＴコンピュータプログラムにより確認した。最後の列の「＊＊＊」は、ＣＯＮＴＡＣＴによって算出されたこの接触において水素結合の可能性が強いことを示し（距離＜３．３Å）、「＊」は、同可能性が弱いことを示す（距離＞３．３Å）。空欄は、そこで考慮されるプログラムが水素結合の可能性の無いものであることを示す。
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【０２０９】
表１２
ｈＮＫＧ２Ｄ単量体「Ｄ」（配列番号２）の、「Ｂ」、ＭＳ−Ｆａｂ重鎖（配列番号４０）及び「Ａ」、ＭＳ−Ｆａｂ軽鎖（配列番号４１）との相互作用を示す。これは、結晶中の結晶学的に独立のｈＮＫＧ２Ｄ／ＭＳ−Ｆａｂ複合体分子の２つ目である。カットオフとして４．０Åを使用した。接触は、ＣＣＰ４スイート（７）のＣＯＮＴＡＣＴコンピュータプログラムにより確認した。最後の列の「＊＊＊」は、ＣＯＮＴＡＣＴによって算出されたこの接触において水素結合の可能性が強いことを示し（距離＜３．３Å）、「＊」は、同可能性が弱いことを示す（距離＞３．３Å）。空欄は、そこで考慮されるプログラムが水素結合の可能性の無いものであることを示す。
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【０２１０】
表１３−ＲＥＦＭＡＣ５ソフトウェアプログラム（１１）によるｈＮＫＧ２Ｄ／ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ複合体の観察データのＸ線モデル精密化の結果
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【０２１１】
表１４
ｈＮＫＧ２Ｄ単量体「Ｎ」（配列番号２）の、「Ｈ」、ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ重鎖（配列番号７０）及び「Ｌ」、ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ軽鎖（配列番号７１）との相互作用を示す。これは、結晶中の結晶学的に独立のｈＮＫＧ２Ｄ／ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ複合体分子の１つ目である。カットオフとして４．０Åを使用した。接触は、ＣＣＰ４スイート（７）のＣＯＮＴＡＣＴコンピュータプログラムにより確認した。最後の列の「＊＊＊」は、ＣＯＮＴＡＣＴによって算出されたこの接触において水素結合の可能性が強いことを示し（距離＜３．３Å）、「＊」は、同可能性が弱いことを示す（距離＞３．３Å）。空欄は、そこで考慮されるプログラムが水素結合の可能性の無いものであることを示す。
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【０２１２】
表１５
ｈＮＫＧ２Ｄ単量体「Ｃ」（配列番号２）の、「Ｂ」、ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ重鎖（配列番号７０）及び「Ａ」、ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ軽鎖（配列番号７１）との相互作用を示す。これは、結晶中の結晶学的に独立のｈＮＫＧ２Ｄ／ｈｚＯＮ７２−Ｆａｂ複合体分子の２つ目である。カットオフとして４．０Åを使用した。接触は、ＣＣＰ４スイート（７）のＣＯＮＴＡＣＴコンピュータプログラムにより確認した。最後の列の「＊＊＊」は、ＣＯＮＴＡＣＴによって算出されたこの接触において水素結合の可能性が強いことを示し（距離＜３．３Å）、「＊」は、同可能性が弱いことを示す（距離＞３．３Å）。空欄は、そこで考慮されるプログラムが水素結合の可能性の無いものであることを示す。
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【０２１３】
文献リスト
１．Li, P., Morris, D. L., Willcox, B. E., Steinle, A., Spies, T., 及びStrong, R. K. (2001) Nature Immunology 2, 443-451
２．Ursby, T., Mammen, C. B., Cerenius, Y., Svensson, C., Sommarin, B., Fodje, M. N., Kvick, Å., Logan, D. T., Als-Nielsen, J., Thunnissen, M. M. G. M., Larsen, S., and Liljas, A. (2004) The New Macromolecular Crystallography Stations At MAX-lab: The MAD Station
３．Kabsch, W. (1993) J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800
４．Vagin, A.及びTeplyakov, A. (1997) J. Appl. Crystallogr. 30, 1022-1025
５．Mccoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Storoni, L. C.,及びRead, R. J. (2005) Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 61, 458-464
６．Mccoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., and Read, R. J. (2007) J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674
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９．Vajdos, F. F., Adams, C. W., Breece, T. N., Presta, L. G., de Vos, A. M., 及びSidhu, S. S. (2002) Journal of Molecular Biology 320, 415-428
１０．McFarland, B. J., Kortemme, T., Yu, S. F., Baker, D., 及びStrong, R. K. (2003) Structure (Cambridge) 11, 411-422
１１．Murshudov, G. N., Vagin, A. A., 及びDodson, E. J. (1997) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 53, 240-255
１２．Emsley, P. 及びCowtan, K. (2004) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132
１３．Evans, P. (1962) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2006. Jan. 72-82
１４．Sheldrick, G. (2008) Act Cryst a 64, 112-122
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【０２１４】
例示的実施態様
以下は、本発明の例示的な実施態様である。
１．ヒトＮＫＧ２Ｄ（ｈＮＫＧ２Ｄ）に結合する単離されたヒト又はヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合断片。
２．ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性活性を低減する、実施態様１に記載の抗体又は抗原結合断片。
３．ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、少なくとも１つのｈＮＫＧ２Ｄリガンドと競合する、実施態様１又は２に記載の抗体又は抗原結合断片。
４．リガンドがＭＩＣＡである、実施態様３に記載の抗体又は抗原結合断片。
５．ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上のＮＫＧ２Ｄの量を低減する、実施態様１ないし４のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
６．固定化すると、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）のＣＤ３にトリガーされた増殖を有意に同時刺激しなくなる、実施態様１ないし５のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
７．固定化すると、ｈＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のｈＮＫＧ２Ｄ媒介性活性に対する有意なアゴニスト効果を持たなくなる、実施態様１ないし６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
８．カニクイザル及びアカゲザルのＮＫＧ２Ｄに結合する、実施態様１ないし７のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
９．１ｎＭ以下のＫＤでｈＮＫＧ２Ｄに結合する、実施態様１ないし８のいずれか１つに記載の抗体。
１０．０．１ｎＭ以下のＫＤでｈＮＫＧ２Ｄに結合する、実施態様１ないし９のいずれか１つに記載の抗体。
１１．ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞に添加されると、２つ以下のｈＮＫＧ２Ｄ二量体に架橋結合する、実施態様１ないし１０のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
１２．ｈＮＫＧ２Ｄ二量体中の第１のｈＮＫＧ２Ｄ単量体にのみ強力に結合する、実施態様１ないし１１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
１３．第１のｈＮＫＧ２Ｄ単量体に結合すると、第２のｈＮＫＧ２Ｄ単量体への抗体又は抗原結合断片の結合を遮断する、実施態様１２に記載の抗体又は抗原結合断片。
１４．ｈＭＬＧ２Ｄニ量体の第１のｈＮＫＧ２Ｄの単量体と第２のｈＮＫＧ２Ｄの単量体との溶媒排除面積の比が約２．１以上である、実施態様１ないし１３のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
１５．比が約３．１以上である実施態様１４に記載の抗体又は抗原結合断片。
１６．ＮＫＧ２Ｄへの結合において標準抗体と競合し、標準抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、
（ｂ）配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、
（ｃ）配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、及び
（ｄ）配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体
からなる群より選択される、実施態様１ないし１５のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
１７．標準抗体と同じＮＫＧ２Ｄのエピトープに結合し、標準抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、
（ｂ）配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、
（ｃ）配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、及び
（ｄ）配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体
からなる群より選択される、実施態様１ないし１６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
１８．標準抗体と実質的に同じＫＤでＮＫＧ２Ｄに結合し、標準抗体が、
（ａ）配列番号１１の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、
（ｂ）配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、
（ｃ）配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる抗体、及び
（ｄ）配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域とからなる抗体
からなる群より選択される、実施態様１ないし１７のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
１９．標準抗体が、配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様１６ないし１８のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
２０．配列番号２のＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ １９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及び／又はＴｈｒ２０８を含むエピトープに結合する、実施態様１９に記載の抗体又は抗原断片。
２１．配列番号２のＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ １９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８から選択された５つ以上の残基を含むエピトープに結合する、実施態様２０に記載の抗体又は抗原結合断片。
２２．配列番号２のＬｙｓ１５０、Ｓｅｒ１５１、Ｔｙｒ１５２、Ｔｈｒ１８０、Ｉｌｅ１８１、Ｉｌｅ１８２、Ｇｌｕ１８３、Ｍｅｔ１８４、Ｇｌｎ１８５、Ｌｅｕ１９１、Ｌｙｓ １９７、Ｔｙｒ１９９、Ｇｌｕ２０１、Ｔｈｒ２０５、Ｐｒｏ２０６、Ａｓｎ２０７及びＴｈｒ２０８を含むエピトープに結合する、実施態様２１に記載の抗体又は抗原断片。
２３．標準抗体が、配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様１６ないし１８のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
２４．（ａ）ＶＨ３＿２１、Ｄ３−９、及びＪＨ４遺伝子、
（ｂ）ＶＨ３＿２０、D３−１０、及びＪＨ６遺伝子、
（ｃ）ＶＨ４＿５９、Ｄ７＿２７＿Ｒ３、及びＪＨ３遺伝子、又は
（ｄ）ＶＨ５＿５１、Ｄ３＿１０＿Ｒ３及びＪＨ４遺伝子
を含む一組のヒト遺伝子の産物であるか、又はそのような一組のヒト遺伝子から得られた重鎖可変領域を含んでなる、実施態様１ないし２３のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
２５．（ａ）ＶＫＩ＿Ｌ１５及びＪＫ２遺伝子、
（ｂ）ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７及びＪＫ３遺伝子、
（ｃ）ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７及びＪＫ１遺伝子、又は
（ｄ）ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６及びＪＫ１遺伝子
を含む一組のヒト遺伝子の産物であるか、又はそのような一組の遺伝子から得られた軽鎖可変領域を含んでなる、実施態様１ないし２４のいずれか１つに記載の抗体又は抗原断片。
２６．ＶＨ４＿５９、Ｄ７＿２７＿Ｒ３、及びＪＨ３遺伝子を含む一組のヒト遺伝子の産物であるか、又はそのような一組の遺伝子から得られた重鎖可変領域と、ＶＫＩＩＩ＿Ａ２７及びＪＫ１遺伝子を含む一組のヒト遺伝子の産物であるか、又はそのような一組の遺伝子から得られた軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様１ないし２５のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
２７．配列番号４４のＡｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８又はＡｓｐ９９、或いは配列番号４５のＴｙｒ３３又はＴｒｐ９７、或いはそれらの任意の組み合わせに対応する残基を含むパラトープを含んでなる、実施態様１ないし２６のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
２８．配列番号４４のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８又はＡｓｐ９９、或いは配列番号４５のＴｙｒ３３又はＴｒｐ９７、或いはそれらの任意の組み合わせに対応する残基から選択された少なくとも５つの残基を含むパラトープを含んでなる、実施態様２７に記載の抗体又は抗原結合断片。
２９．配列番号４４のＧｌｎ１、Ａｓｐ２６、Ａｓｐ２７、Ｓｅｒ３０、Ｓｅｒ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ３３、Ｈｉｓ５０、Ｓｅｒ５２、Ｔｙｒ５３、Ｓｅｒ５４、Ｓｅｒ５６、Ａｌａ５７、Ａｓｎ５８、Ｔｒｐ９８及びＡｓｐ９９と、配列番号４５のＴｙｒ３３及びＴｒｐ９７とに対応する残基を含むパラトープを含んでなる、実施態様２８に記載の抗体又は抗原結合断片。
３０．（ａ）配列番号４８の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４９の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５０の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様１ないし２９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
３１．（ａ）配列番号５１の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５３の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様３０の抗体又は抗原結合断片
３２．配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様１ないし３１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
３３．ＶＨ５＿５１、Ｄ３＿１０＿Ｒ３及びＪＨ４遺伝子を含む一組のヒト遺伝子の産物であるか、又はそのような一組の遺伝子から得られた重鎖可変領域と、ＶＫＩＩＩ＿Ｌ６及びＪＫ１遺伝子を含む一組のヒト遺伝子の産物であるか、又はそのような一組の遺伝子から得られた軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様１ないし２５のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
３４．（ａ）配列番号５４の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５５の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５６の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様３３に記載の抗体又は抗原結合断片。
３５．（ａ）配列番号５７の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５８の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５９の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様３４に記載の抗体又は抗原結合断片。
３６．配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様３５に記載の抗体又は抗原結合断片。
３７．（ａ）配列番号１５の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１６の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号１７の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様１に記載の抗体又は抗原結合断片。
３８．（ａ）配列番号１８の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１９の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号２０の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様３７に記載の抗体又は抗原結合断片。
３９．配列番号１１の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１２の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様３８に記載の抗体又は抗原結合断片。
４０．（ａ）配列番号２１の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２２の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号２３の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様１に記載の抗体又は抗原結合断片。
４１．（ａ）配列番号２４の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号２５の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号２６の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様４０に記載の抗体又は抗原結合断片。
４２．配列番号１３の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１４の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様４１に記載の抗体又は抗原結合断片。
４３．（ａ）配列番号４８の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４９の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５０の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様１に記載の抗体又は抗原結合断片。
４４．（ａ）配列番号５１の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５３の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様４３に記載の抗体又は抗原結合断片。
４５．配列番号４４の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４５の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様１に記載の抗体又は抗原結合断片。
４６．（ａ）配列番号５４の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５５の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５６の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様１に記載の抗体又は抗原結合断片。
４７．（ａ）配列番号５７の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５８の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５９の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様４６に記載の抗体又は抗原結合断片。
４８．配列番号４６の配列を含む重鎖可変領域と、配列番号４７の配列を含む軽鎖可変領域とを含んでなる、実施態様４７に記載の抗体又は抗原結合断片。
４９．（ａ）配列番号１５、２１、４８、又は５４の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号１６、２２、４９、又は５５の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、
（ｃ）配列番号１７、２３、５０、又は５６の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１８、２４、５１、又は５７の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｅ）配列番号１９、２５、５２、又は５８の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｆ）配列番号２０、２６、５３、又は５９の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなり、８以下の保存的アミノ酸置換を有する、実施態様１に記載の抗体又は抗原結合断片。
５０．５以下のアミノ酸置換を含む、実施態様４９に記載の抗体又は抗原結合断片。
５１．ヒト抗体である、実施態様１ないし５０のいずれか１つに記載の抗体。
５２．二価である、実施態様１ないし５１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
５３．ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、実施態様５２に記載の抗体。
５４．ＩｇＧ４抗体である、実施態様５３に記載の抗体。
５５．ＶＨ鎖にＳ２４１Ｐ変異を含んでなる、実施態様１ないし５４のいずれか１つに記載の抗体。
５６．配列番号７の配列を含む重鎖配列と、配列番号８の配列を含む軽鎖配列とを含んでなる、単離された抗体。
５７．配列番号９の配列を含む重鎖配列と、配列番号１０の配列を含む軽鎖配列とを含んでなる、単離された抗体。
５８．配列番号４０の配列を含む重鎖配列と、配列番号４１の配列を含む軽鎖配列とを含んでなる、単離された抗体。
５９．配列番号４２の配列を含む重鎖配列と、配列番号４３の配列を含む軽鎖配列とを含んでなる、単離された抗体。
６０．ｈＮＫＧ２Ｄに対する結合において、ON７２、BAT２２１、５C６、１D１１、ECM２１７、又は１４９８１０よりも、１６F１６、１６F３１、MS、又は２１F２と競合し、ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を阻止する、単離された抗体。
６１．ON７２、BAT２２１、５C６、１D１１、ECM２１７、又は１４９８１０よりも、ＭＳと競合する、実施態様６０に記載の単離された抗体。
６２．ON７２、BAT２２１、５C６、１D１１、ECM２１７、又は１４９８１０よりも、２１F２と競合する、実施態様６０に記載の単離された抗体。
６３．第１の半最大有効濃度（ＥＣ５０）でＮＫ細胞標本上の細胞表面関連ｈＮＫＧ２Ｄに結合し、第２のＥＣ５０でＮＫ細胞標本により媒介されるＮＫＧ２Ｄ−リガンド発現標的細胞の殺傷を低減し、この場合第２のＥＣ５０が第１のＥＣ５０よりも実質的に低い、単離された抗体。
６４．ＮＫ細胞標本がＮＫ−９２又はＮＫＬ細胞である、実施態様６３に記載の抗体。
６５．リガンドがＵＬＢＰ−３又はＭＩＣＡである、実施態様６４に記載の抗体。
６６．第２のＥＣ５０が第１のＥＣ５０の８０％以下である、実施態様６５に記載の抗体。
６７．第２のＥＣ５０が第１のＥＣ５０の５０％以下である、実施態様６６に記載の抗体。
６８．ｈＮＫＧ２Ｄに結合する単離された抗体であって、細胞表面に関連するＮＫＧ２Ｄを実質的に飽和させる濃度より低い濃度で、リガンドを発現する標的細胞のＮＫ細胞媒介性の殺傷を最大に低減させる抗体。
６９．ｈＮＫＧ２Ｄに結合する単離された抗体であって、ＮＫＧ２Ｄ発現ＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性活性を阻止し、細胞表面関連ＮＫＧ２Ｄの７０％を上回る発現低下が可能な抗体。
７０．ＮＫ細胞の細胞表面関連ＮＫＧ２Ｄの９０％未満の発現低下が可能な、実施態様６９に記載の抗体。
７１．ｈＮＫＧ２Ｄに結合し、且つヒト及びカニクイザルＮＫＧ２Ｄ発現細胞に低い親和性で結合する単離された抗体。
７２．ＰＢＭＣ標本中のカニクイザルＣＤ８＋Ｔ細胞への結合のＥＣ５０が、ＰＢＭＣ標本中のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞への結合のＥＣ５０の少なくとも５０％である、実施態様７１に記載の抗体。
７３．ＰＢＭＣ標本中のカニクイザルＣＤ８＋Ｔ細胞への結合のＥＣ５０が、ＰＢＭＣ標本中のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞への結合のＥＣ５０の少なくとも６５％である、実施態様７２に記載の抗体。
７４．ヒトＮＫＧ２Ｄに対する親和性が０．１ｎＭ以下である、実施態様１ないし７３のいずれか１つに記載の単離された抗体。
７５．ヒトＮＫＧ２Ｄに対する親和性が１０ｐＭ以下である、実施態様１ないし７４のいずれか１つに記載の単離された抗体。
７６．（ａ）配列番号４８又は５４の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号４９又は５５の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５０又は５６の配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様６０ないし７５のいずれか１つに記載の抗体。
７７．（ａ）配列番号５１又は５７の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
（ｂ）配列番号５２又は５８の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、及び
（ｃ）配列番号５３又は５９の配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
を含んでなる、実施態様７６に記載の抗体。
７８．ヒト抗体である、実施態様６０ないし７７のいずれか１つに記載の抗体。
７９．実施態様６０ないし７８のいずれか１つに記載の抗体の抗原結合断片。
８０．実施態様１ないし７９の抗体又は抗原結合断片の可変重鎖又は可変軽鎖をコードする核酸。
８１．実施態様８０の核酸を含んでなる発現ベクター。
８２．実施態様８１の発現ベクターを含んでなる宿主細胞。
８３．実施態様１ないし７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片を産生する宿主細胞。
８４．ＣＨＯ細胞である、実施態様８２又は８３に記載の宿主細胞。
８５．抗ＮＫＧ２Ｄ抗体又は抗原結合断片の生産方法であって、実施態様８２ないし８４のいずれか１つに記載の宿主細胞を適切な条件下で培養し、前記抗体又はその抗原結合断片を回収する方法。
８６．変異抗ＮＫＧ２Ｄ抗体、又はその抗原結合断片の生産方法であって、
（ａ）配列番号１５、２１、４８、及び５４から選択されたＣＤＲ１配列と、配列番号１６、２２、４９、及び５５から選択されたＣＤＲ２配列と、配列番号１７、２３、５０、及び５６から選択されたＣＤＲ３配列とを含む重鎖可変領域を供給し、
（ｂ）配列番号１８、２４、５１、及び５７から選択されたＣＤＲ１配列と、配列番号１９、２５、５２、及び５８から選択されたＣＤＲ２配列と、配列番号２０、２６、５３、及び５９から選択されたＣＤＲ３配列とを含む軽鎖可変領域を供給し、
（ｃ）重鎖及び軽鎖可変領域の各々において８以下のアミノ酸配列を変更して、変更済み重鎖及び軽鎖可変領域を生成し、
（ｄ）宿主細胞中に変更済み重鎖及び軽鎖可変領域を含む変異抗ＮＫＧ２Ｄ抗体を発現させる
方法。
８７．治療剤に連結させた、実施態様１ないし７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片を含んでなるイムノコンジュゲート。
８８．抗体とは異なる結合特異性を有する第２の成分に連結した、実施態様１ないし７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片を含んでなる多選択性分子。
８９．第２成分が第２の抗体であるか、又はその抗原結合断片である、実施態様８８に記載の多選択性分子。
９０．実施態様１ないし７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片と、製薬的に許容可能な担体とを含んでなる組成物。
９１．ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞のＮＫＧ２Ｄ媒介性の活性を阻止する方法であって、ＮＫ細胞又はＴ細胞を、実施態様１ないし７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片に接触させることを含み、ＮＫＧ２Ｄに対する結合において、抗体又は抗原結合断片が、少なくとも１つのＮＫＧ２Ｄリガンドと競合する方法。
９２．ＮＫＧ２ＤリガンドがＭＩＣＡである、実施態様９１に記載の方法。
９３．ＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞又はＴ細胞の表面上におけるＮＫＧ２Ｄの量を低減する方法であって、ＮＫ細胞又はＴ細胞を、実施態様１ないし７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合媒体と接触させることを含み、ヒトＮＫＧ２Ｄに対する結合において、抗体又は抗原結合断片が少なくとも１つのＮＫＧ２Ｄリガンドと競合する方法。
９４．炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療法であって、実施態様９０に記載の組成物を、炎症性疾患又は自己免疫疾患に罹患しているか、或いは罹患する危険のあるヒト対象者に対して投与する方法。
９５．患者が自己免疫疾患に罹患しているか、又は罹患する危険がある、実施態様９４に記載の方法。
９６．自己免疫疾患が関節リウマチである、実施態様９５に記載の方法。
９７．疾患が多発性硬化症である、実施態様９５に記載の方法。
９８．疾患が全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）である、実施態様９５に記載の方法。
９９．疾患が乾癬である、実施態様９５に記載の方法。
１００．疾患がセリアック病である、実施態様９５に記載の方法。
１０１．疾患が炎症性腸疾患である、実施態様９５に記載の方法。
１０２．炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、実施態様１０１に記載の方法。
１０３．炎症性腸疾患がクローン病である、実施態様１０１に記載の方法。
１０４．ヒト対象者が移植片拒絶又は移植片対宿主病に罹患しているか、或いは罹患する危険がある、実施態様９４に記載の方法。
１０５．移植が心臓移植又は骨髄移植である、実施態様１０４に記載の方法。
１０６．第２の抗炎症剤を投与する、実施態様９４ないし１０５のいずれか１つに記載の方法。
１０７．第２の抗炎症剤が、免疫抑制剤、鎮痛剤、血管新生阻害剤、副腎皮質ステロイド剤、Ｂ細胞枯渇剤、Ｂ細胞アンタゴニスト、Ｔ細胞アンタゴニスト、補体阻害剤、抗サイトカイン剤、抗サイトカインレセプター剤、及びこれらの組み合わせから選択される、実施態様１０６に記載の方法。
１０８．第２の抗炎症剤がＴＮＦ−α活性のアンタゴニストである、実施態様１０６又は１０７に記載の方法。
１０９．炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療法であって、実施態様９０に記載の組成物を、炎症性疾患又は自己免疫疾患の危険を有するヒト対象者に対して投与する方法。
１１０．ヒト対象者が移植片拒絶又は移植片対宿主病の危険を有する、実施態様１０９に記載の方法。
１１１．ヒト対象者の炎症性疾患又は自己免疫疾患を治療するための投薬の前処理としての、実施態様１ないし７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片の使用。
１１２．ヒト対象者の炎症性疾患又は自己免疫疾患の治療に使用するための、実施態様１ないし７９のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合断片。
【０２１５】
ここに引用した刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が個々にかつ特に出典明示により援用され、その全体がここに記載されているのと同じ程度に、出典明示によりここに援用される。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的にのみ使用されており、決して本発明を限定するものとは解してはならない。
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、すべての考えられる変更において上記の要素のいずれの組み合わせも本発明に包含される。
【０２１６】
発明を記述する際に使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」なる用語及び同様の指示対象は、ここで別の記載がなされていないか、文脈上はっきりと矛盾していない限りは、単数形及び複数形の双方をカバーしていると解されるものである。
本明細書中の値の記載は単に、その範囲内にあるそれぞれ別々の値を個々に示す方法を短縮して示すことを意図しているだけであって、本明細書中で明記されない限り、それぞれ別々の値は、個別に挙げられているものとして本明細書中に組み込まれている。特に示さない限り、ここで提供される全ての正確な値は、対応する近似値の代表例である(例えば、特定の因子又は測定に対して提供される全ての正確な例示的値は、適切な場合は、「約」により修飾される、対応する近似測定値を提供するとみなすことができる)。
本明細書中で特段明記又は明らかに矛盾しない限り、本明細書中に記載のすべての方法は任意の好適な順序で行われうる。
【０２１７】
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に別段の記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も、明示的に記載していない限り、如何なる要素も本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
他に言及しない又は前後関係ではっきりと矛盾していない限りは、要素又は要素群に関して、「含有する」、「有する」、「含む」又は「含んでいる」等の用語を使用する本発明の任意の態様又は実施態様のここでの記載は、その特定の要素又は要素群「からなる」、「本質的になる」、又は「実質的に含む」本発明の類似した態様又は実施態様をサポートすることを意図したものである(例えば、特定の要素を含むものとしてここに記載されている組成物は、他に言及しない限り又は前後関係ではっきりと矛盾していないならば、その要素からなる組成物をまた記載しているものと理解すべきである)。
本発明は、適用される法律によって許容される最大の範囲で、ここに提示された態様又は特許請求の範囲に記載された主題事項のあらゆる変形例及び均等物を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【配列表】
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