(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオン耐性を有するウレアーゼ産生微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−７９１）。
【請求項２】
ウレアーゼ産生微生物により尿素を加水分解する反応を利用して炭酸塩を生成する炭酸塩の生成方法であって、ウレアーゼ産生微生物として請求項１に記載のスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株と、尿素と、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の金属イオンと、を反応液中で反応させて炭酸塩を生成することを特徴とする炭酸塩の生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規微生物及び炭酸塩の生成方法に関し、より詳細には、強いウレアーゼ活性を有し、且つカルシウムイオン耐性に優れるのみならず、アルカリ条件下で培養可能である新規微生物及びこの新規微生物のウレアーゼ活性を利用した炭酸塩の生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、例えば、特許文献１に記載されているように、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉ（バチラス・パステウリ）などがウレアーゼ活性を有することが知られている。また、ウレアーゼ活性による尿素の加水分解反応は、反応液が酸性であるか、アルカリ性であるかによって、反応式が異なり、炭酸塩を生成する場合には、アルカリ条件下において、下記反応式によって発生する炭酸イオン（ＣＯ３２−）と金属イオンとが反応して炭酸塩が生成される。
（ＮＨ２）２ＣＯ  ＋  ２Ｈ２Ｏ  →  ＣＯ３２−  ＋  ２ＮＨ３
【０００３】
しかしながら、このように微生物のウレアーゼ活性を利用して、例えば、炭酸カルシウムを生成しようとした場合、従来のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉｉ（バチラス・パステウリ）などは、カルシウムイオンの存在によって、そのウレアーゼ活性が変動し、安定した炭酸カルシウム生成をすることが困難となったりする可能性があった。また、微生物を上記の反応系において生存させた状態で炭酸塩を継続的に生成させるには、その微生物がアルカリ条件下で培養可能であることが望ましい。更に、微生物のウレアーゼ活性を利用した炭酸塩の生成を種々の分野において実用化するに当たっては、強いウレアーゼ活性を有する微生物の開発が望まれていた。また、一般に微生物の生育温度の最適温度は、例えば、３０℃以上というようにやや高温であることが多いが、炭酸塩の生成を実用化する分野によっては、例えば、２０℃程度の比較的低温で炭酸塩を生成する必要が生じる場合もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２３０６２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、カルシウムイオン耐性に優れるのみならず、アルカリ条件下で培養可能であり、比較的低温でも好適に生育し、且つ強ウレアーゼ活性を有する新規微生物及びこのような微生物を利用した炭酸塩の生成方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成するため、強ウレアーゼ活性を有する微生物を自然界より広く検索した結果、土壌から強いウレアーゼ活性を有するバクテリアが抽出され、更に、そのバクテリアからより強いウレアーゼ活性を有するのみならず、カルシウムイオンに対する耐性にも優れるバクテリアを発現させるに至り、そのバクテリアがアルカリ条件下で培養可能であり、比較的低温でも好適に生育し得ることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００７】
即ち、本発明は、（１）カルシウムイオン耐性を有するウレアーゼ産生微生物であるスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ａ１０株（受託番号  ＮＩＴＥ  Ｐ−７９１）及び（２）ウレアーゼ産生微生物により尿素を加水分解する反応を利用して炭酸塩を生成する炭酸塩の生成方法であって、ウレアーゼ産生微生物として上記（１）に記載のスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株と、尿素と、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の金属イオンと、を反応液中で反応させて炭酸塩を生成することを特徴とする炭酸塩の生成方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、カルシウムイオン耐性に優れるのみならず、アルカリ条件下で培養可能であり、比較的低温でも好適に生育し、且つ強ウレアーゼ活性を有する新規微生物が得られ、その微生物を利用することにより、炭酸塩を効率的に生成することができるのみならず、例えば、安定した炭酸カルシウム生成をしたり、アルカリ条件下、比較的低温条件下であっても、好適に炭酸塩を生成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＥＤＣ培地を使用したスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株及びスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株の培養曲線である。
【図２】本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ部分配列解析による塩基配列を示す図面である。
【図３】本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株（実施例１〜５）と、この新規微生物を発現した菌株であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株（実験例１、２）の炭酸カルシウム生成能（ウレアーゼ活性）を示すグラフである。
【図４】本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を利用して１時間後に生成された炭酸塩（実施例３により生成された炭酸カルシウム）の電子顕微鏡写真である。
【図５】上記実施例３により７２時間後に生成された炭酸カルシウムの電子顕微鏡写真である。
【図６】実施例６及び実施例７の結果を示すグラフである。
【図７】本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を利用して生成された炭酸塩（ドロマイト）の電子顕微鏡写真である。
【図８】本発明の実施例８〜１７の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明につき更に詳細に説明する。本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、以下のようにして得られたものである。本発明者らは、炭酸塩を生成させるための強いウレアーゼ活性を有するバクテリアを次のように抽出、また新株を開発した。中国地方、関越地方、東海地方の複数のサイトにおいて、ボーリングを行って土壌サンプルを採取した。サンプリング深さはおおよそ０〜６．５ｍであった。このほか、静岡県において露頭の土壌サンプルを採取した。ボーリングで得たコアサンプルを観察しながら、１ｍごとに約１０ｇの土壌をガラス瓶に取り、それぞれ約２０ｍＬの石灰水（Ｃａ（ＯＨ）２）および濃度の異なる（０．５〜２０ｇ／リットル）ＣａＣｌ２溶液を加えて２日間放置した。これは炭酸塩の生成に使用するカルシウムイオンの耐性バクテリアを抽出するためである。これらのガラス瓶中で生存しているバクテリアを抽出し、そのうちで特に培養速度の速いバクテリアをコロニーの大きさで判断し、１サンプルから１０株の菌を得た。この段階でおよそ１５０株が得られた。それぞれの菌株を２０ミリリットルのペプトン液（濃度１０ｇ／リットル）で培養し、それを遠心分離してバクテリアを採取した。得られたバクテリアを試験管に移し、その中に１Ｍの尿素２０ミリリットルを入れてウレアーゼ活性を次の簡易方法によって調べた。菌がウレアーゼ活性を示す場合には、尿素の加水分解に伴うアンモニア発生によってｐＨが上昇する。従って、ｐＨが上昇するかどうかを調べることによってウレアーゼ活性が起こるかどうか調べることが可能である。ｐＨが上昇したものについては、１ＭのＣａＣｌ２溶液を加えて炭酸塩が生成されるか（白濁するか）調べた。
【００１１】
その結果、全く沈殿が発生しないもの、またウレアーゼ活性が起こる結果として白濁が沈殿するものに分かれ、いずれもグラム陽性菌である３つの菌株が顕著なウレアーゼ活性を起こすことが分かった。これらの菌を再度培養して、それに１Ｍの尿素と１Ｍの塩化カルシウムを混合した液を加えて、実際に炭酸塩が生成するかどうかを調べた。さらに、これら３つの菌株について、白濁の量を目視により観察して、その結果から最も炭酸塩を多く沈殿させた菌株としてスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株（中国地方から採取）の優位性が分かった。酸性土壌の場合、炭酸塩は生成しないので、アルカリ条件で反応時のｐＨを一定に保つため緩衝液（１００ｍＭの水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム溶液、ｐＨ９．２５に調整）を１０分の１に薄めて使用した。それらを用いて、１．０Ｍ尿素と１．０Ｍ塩化カルシウム溶液を１０ｍＭアンモニウムバッファーでｐＨを９．２前後に上げてウレアーゼ活性（炭酸塩の沈殿）を調べたところ、短時間（３０分ほど）で沈殿が起こる試験管があり、これからスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株菌が再分離できた。このようにして、極めてスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株とは異なる強いウレアーゼ活性を示すような、菌の変質が起こりアルカリ条件で培養可能な菌株として、本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株が現れた。本発明のスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に２００９年８月６日付けで受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７９１（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｓｐ．  ＮＯ−Ａ１０）として寄託されており、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０も同様に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−７９２（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｓｐ．  ＮＯ−Ｎ１０株）として寄託されている。なお、バクテリアの培養に一般的に使われるペプトンやポリペプトンは高価で、大量の菌を生産するには不適である。そこで安価なＥＤＣ（ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｄｏｎｏｒ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）が使用可能かどうか調べたところ、スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株は問題なく、また、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株についても培養可能であることが分かった。図１に、ＥＤＣ培地（ＥＤＣ  １０ｇ/リットル，ｐＨ８．２（緩衝液で調整））を使用してスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株及びスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株を２０〜２３℃で培養した場合の培養曲線を示す。図１において、横軸は時間、縦軸はバクテリア濃度を調べるため波長６００ｎｍを使用したｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）で表してある。
【００１２】
スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の同定を細菌  １６Ｓ  ｒＲＮＡ部分配列解析により行った。即ち、菌体サンプルを０．５ｍｌの滅菌水に懸濁し、ビーズビーディング法により破砕処理し、タンパク質を除去した後、磁性ビーズを用いて精製を行い、５０μｌのＤＮＡを得た。この精製ＤＮＡをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして用いた。ＰＣＲ増幅のＰＣＲ反応条件は、反応液組成は、１０Ｆ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、８００Ｒ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、×１０  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）５μｌ、２ｍＭ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｉｘ  ＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ）５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４（ＴＯＹＯＢＯ）２μｌ、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ）１μｌ、（Ｔｅｍｐｌａｔｅ  １μｌ）、滅菌ｍｉｌｌｉＱ水３４μｌ、計５０μｌ、反応温度サイクルは、９４℃２分  １サイクル、９４℃１５秒  ６２℃３０秒  ７２℃５０秒  ２５サイクル、７２℃５分  １サイクルとした。ＰＣＲプライマー配列は、１０Ｆ（５’−ＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡ−３’、配列番号１）、８００Ｒ（５’−ＴＡＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ−３’、配列番号２）であり、使用装置は、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）である。
【００１３】
そして、下記の試薬及び機器を使用して、精製・シークエンス解析を行った。
＜ＰＣＲ産物精製＞
Ｍｏｎｔａｇｅ  ＰＣＲ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）
＜シークエンス試薬＞
ＢｉｏＤｙｅＲ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ  ｖｌ．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
＜シークエンス反応物精製＞
ｉｌｌｕｓｔｒａＴＭ  ＡｕｔｏＳｅｑ  Ｇ−５０  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
＜シークエンサー＞
ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
＜シークエンスプライマー＞
ＰＣＲプライマーをシークエンスプライマーとして用いて両鎖解析した。
【００１４】
得られたＤＮＡ配列を公共のデーターベースと照合して相同性検索（Ｂｌａｓｔ検索）を行い、近縁種を予測した。その結果、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属に分類されるが、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属に属する他の菌種とは配列を異にし、これらの新菌種に最も近縁な種は、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｇｉｎｓｅｎｇｉｓｏｉｌであるが、塩基配列の一部を異にすることが認められた。なお、図２にＳｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ａ１０の塩基配列（配列番号３）、下記表１に相同性検索結果上位データを示す。
【００１５】
【表１】
0005509471.tif 000002
【００１６】
以下、本発明の新規微生物であるスポロサルシナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）属ＮＯ−Ａ１０の菌学的性質を詳述する。
【００１７】
＜分類学中の位置＞
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｓｐ．ＮＯ−Ａ１０株（１６Ｓ  ｒＲＮＡ部分塩基配列解析）
【００１８】
＜科学的性質＞
・好気性
・グラム陽性の桿菌
・芽胞形成
・白色の光沢コロニーを形成する。
・強いウレアーゼ活性を有する。ウレアーゼ活性については、後述する実施例において詳述する。
・カタラーゼ陽性
・オキシターゼ陰性
・ＯＦテスト陰性
・カルシウムイオン耐性
・尿素耐性
【００１９】
＜培地条件＞
・普通寒天培地
・普通寒天培地をオートクレイブした後、濾過滅菌した１／１０量の１００ｍＭのアンモニウムバファー（ＮＨ４ＯＨとＮＨ４Ｃｌを最終濃度１０ｍＭ）を無菌的に加えｐＨを８．２に調整して培養する。
・温度は１４〜３７℃で生育（至適温度２５〜３２℃）
・至適ｐＨは８〜９
＜培地の組成＞
市販の普通寒天培地
（培地１０００ｍｌあたり）
肉エキス            ５ｇ
ペプトン          １０ｇ
塩化ナトリウム      ５ｇ
寒天              １５ｇ
【００２０】
なお、本発明の新規微生物を発現した菌株であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株の菌株の菌学的性質は、以下の通りである。
【００２１】
＜分類学中の位置＞
Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ  ｓｐ．ＮＯ−Ｎ１０株（１６Ｓ  ｒＲＮＡ部分塩基配列解析）
【００２２】
＜科学的性質＞
・好気性
・グラム陽性の桿菌
・芽胞形成
・白色の光沢コロニーを形成する。
・ウレアーゼ活性を有する。ウレアーゼ活性については、後述する実施例において詳述する。
・スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株と同種
・カタラーゼ陽性
・オキシターゼ陰性
・ＯＦテスト陰性
【００２３】
＜培地条件＞
・普通寒天培地
・普通寒天培地で温度１４〜３２℃で生育（至適温度２０〜２８℃）
・至適ｐＨは６．５〜８
＜培地の組成＞
市販の普通寒天培地
（培地１０００ｍｌあたり）
肉エキス            ５ｇ
ペプトン          １０ｇ
塩化ナトリウム      ５ｇ
寒天              １５ｇ
【００２４】
本発明の炭酸塩の生成方法は、上述したように、ウレアーゼ産生微生物により尿素を加水分解する反応を利用して炭酸塩を生成するに当たり、上記スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株をウレアーゼ産生微生物として利用するものであり、より具体的には、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株と、尿素と、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン及びストロンチウムイオンから選ばれる１種又は２種以上の金属イオンと、を反応液中で反応させて炭酸塩を生成するものである。このほか、銅や鉛イオンなどの炭酸塩を生成できるので、それらのイオンが多く含まれている土壌中では、金属イオンを除いた反応液を浸透させることによって、炭酸銅や炭酸鉛などを生成させることができ、銅イオンや鉛イオンなどを固定（不動化）できる。ここで、本発明の炭酸塩の生成方法における反応液とは、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株による尿素の加水分解反応、該加水分解反応によって発生した炭酸イオンと金属イオンとの反応による炭酸塩の生成反応という一連の反応が行われる反応系（液）であり、より具体的には、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、尿素、金属イオン、必要に応じて使用される適宜緩衝液、更に、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を培養液中で培養した状態で配合する場合は培養液、尿素を水溶液又は懸濁液として配合する場合は尿素水溶液又は懸濁液、金属イオンを金属塩の水溶液として配合する場合は金属塩水溶液からなるものである。
【００２５】
本発明の炭酸塩の生成方法において、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の配合割合は、特に制限されるものではないが、例えば、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を培養液中で培養した状態又は懸濁液とした状態で反応系に配合する場合、該培養液（又は懸濁液）を反応液全量に対して５０％（体積比）となる標準状態に配合するのであれば、培養液濃度０．４Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上が好ましく、より好適には培養液濃度０．６Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上、更に好適には培養液濃度０．８Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以上である。スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の配合割合が小さすぎると、ウレアーゼ産生が少なすぎる場合がある。なお、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の配合割合の上限は、特に制限されるものではないが、大きすぎると１個体当たりのウレアーゼ活性が低くなる場合があることを考慮すれば、１．６Ｏ．Ｄ．６００（ｎｍ）以下であることが望ましい。
【００２６】
本発明の炭酸塩の生成方法において使用する尿素としては、市販の尿素を使用することができる。尿素の反応液中における濃度は、特に制限されるものではないが、０．５〜２２００ｍＭが好適であり、より好ましくは５０〜１５００ｍＭ、更に好ましくは５００〜１０００ｍＭである。尿素の反応液中における濃度が低すぎると、加水分解が不足し、ｐＨが減少したり、炭酸イオンが不足したりする場合があり、高すぎるとアンモニアが過剰に発生してアンモニア臭が出る場合がある。
【００２７】
本発明の炭酸塩の生成方法は金属イオンとして、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、ストロンチウムイオンを１種単独で又は２種以上を適宜組み合わせて添加するものである。これらの中でも、特に、各金属イオン単独、カルシウムイオンとマグネシウムイオンとの併用がより好適である。これらの金属イオンは、それぞれ、これらの金属イオンを含む金属イオン源を後述するように液中に配合することによって好適に供給される。このような金属イオン源は、その種類が特に制限されるものではないが、例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、ストロンチウムの酸化物、水酸化物および塩化物で、特に塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
【００２８】
本発明の反応液中における金属イオンの配合割合は、特に制限されるものではないが、０．５〜２２００ｍＭが好適であり、より好ましくは５０〜１５００ｍＭ、更に好ましくは５００〜１０００ｍＭである。金属イオンの反応液中における濃度が低すぎると生成炭酸塩の量が不足する場合があり、高すぎるとスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の失活が起き易くなる場合がある。
【００２９】
本発明の炭酸塩の生成方法において、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、尿素、金属イオンを反応液中に添加する手段、手順は、特に制限されないが、例えば、尿素、金属イオンを所定の濃度になるように適宜緩衝液に加え、それに培養液（懸濁液）から遠心分離したスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を加えて反応させる方法が挙げられる。なお、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を培養液（懸濁液）から遠心分離せずにスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の培養液（懸濁液）を加える場合には、培養液（懸濁液）の分を加えても尿素、金属イオンが所期の濃度になるように計算した量を予め加えておく。又は、一度にすべてを混合して反応させてもよい。但し、本発明の場合、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株と尿素との混合によって、反応が開始することを考慮すると、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の配合は、尿素と金属イオンとの混合後、又は同時とすることが好ましい。
【００３０】
本発明において炭酸塩を生成する際の反応条件は、温度及びｐＨに制限されるが、ｐＨは緩衝剤（例えば、アンモニア緩衝液（初期ｐＨ９．０、１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム））によって管理することができる。なお、金属イオンとしてカルシウムのみが存在する場合、ｐＨが７以上、カルシウムイオン以外またはカルシウムイオンとそれ以外の金属イオンが混在する場合はｐＨ８以上が望ましい。また、反応温度も特に制限されないが、本発明の場合、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株が反応系の中で生存している限り、尿素の供給量に合わせて経時的に炭酸イオンが生成されることを考慮すれば、上述したスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株の生育温度、より好ましくは至適温度、至適ｐＨで反応させると、より効果的である。また、なお、上述したように、一般に微生物の生存の適温はやや高温であることが多いが、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、およそ少なくとも１４℃〜３７℃の範囲では培養可能で、約２５〜３２℃が適温であるので、比較的低温の条件下で炭酸塩を生成する場合に、特に効果的である。
【実施例】
【００３１】
以下、実施例を示し、本発明をより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１〜５及び実験例１、２］
本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株のウレアーゼ活性を以下のように調べた。また、本発明の微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株のウレアーゼ活性を他のウレアーゼ産生微生物と比較するために、上述したように多数の土壌菌の中で特に顕著なウレアーゼ活性を示す３つの菌株の中で最も炭酸塩を多く沈殿させた菌株として優位性を示し、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を発現させた菌株であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株についても同様にウレアーゼ活性を調べた。ウレアーゼ活性を調べるには尿素の加水分解のみでことは足りるが、ウレアーゼ産生微生物の中にはカルシウムイオンによってウレアーゼ活性が阻害されるものも少なくないので、本発明では尿素と同じモル濃度の塩化カルシウムの存在下でウレアーゼ活性を調べた。
【００３３】
なお、カルシウムによる失活が無い場合、１Ｍの尿素が加水分解されると１Ｍの炭酸カルシウムが生成するので、炭酸カルシウム（カルサイト）の生成量がウレアーゼ活性を示すことになる。例えば、アンモニア緩衝液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）をベースに尿素と塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を同じモル濃度になるように加えて２００ミリリットルとして、それを薄めて所定の濃度にする（実施例１及び実験例１：各０．４Ｍ、実施例２：各０．６Ｍ、実施例３及び実験例２：各１．０Ｍ、実施例４：各１．２Ｍ，実施例５：各１．５Ｍ）。また、培養微生物については、２００ミリリットルのＥＤＣ培養液（ＥＤＣ  １０ｇ／リットル）で培養した微生物を遠心分離（５０ミリリットルずつ容器に分け、４５００ｒｐｍ、１５分間）して、上澄み液を取り除き、その中にそれぞれ５％ＮａＣｌ溶液５０ミリリットルを加える。反応液を作ってからは反応が進むので、測定時間を考慮して量を決めて、最終的に所定の濃度になるように、（尿素＋金属イオン）液と微生物液を混合した。これをピペットで５ミリリットルをとり検体とした。試験管は約２０℃で振盪させて、所定の時間に炭酸塩の沈殿量を測定した。なお、以下の実施例及び実験例では、全実験を通してウレアーゼ産生微生物は最終溶液の半分の体積の培養液で培養した量を使った。
【００３４】
なお、この場合の実験では、試験管に入れたバクテリア培養液とそれと同等体積の反応液を入れたものを複数本準備しておいて、所定の時間になったとき、液体中の炭酸塩をろ紙で濾し、ろ過された炭酸塩を測った。また、ガラス壁面に着いたものは、試験管を炉乾燥（１１０℃）させた後に質量を測定して、予め測定しておいた試験管質量をそれより差し引いて求めた。なお、時間が経つほど、液体中には炭酸塩は含まれておらず、試験管壁面に付着および底へ沈殿した。
【００３５】
結果を下記表２及び図３に示す。表２は、各反応時間における実験例１、２と実施例１〜５の炭酸カルシウムの沈殿量（Ｍ）を記載したものである。図３のグラフの横軸は時間、縦軸は生成した炭酸塩の質量から変換した濃度を示している。なお、表２の濃度及び図３に示した凡例中の濃度は加えた塩化カルシウムの濃度を示す。すなわち、１Ｍの塩化カルシウム液を使用した場合、最終的には縦軸（炭酸カルシウム）が約１Ｍになるまで反応が進んでいる（反応式で１ＭのＣａＣｌ２から１ＭのＣａＣＯ３が生成）。この実験から明らかなように加えた尿素の全てが加水分解され、尿素の分解によって生成されたＣＯ３は、加えたＣａ全てと反応していることが分かる。その反応が終了するには、実施例１〜５（スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株）ではおよそ１０〜２５時間、実験例１、２（スポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株）では１２５時間以上要すると思われる。また、実施例５のように塩化カルシウム、尿素の濃度が１．５Ｍというように、高濃度の塩化カルシウム、尿素の存在下においても反応が短期間に起こるのは、炭酸塩生成時間の短縮化においてきわめて優位であると言える。更に、上記実施例１〜５と実験例１、２の結果によれば、本発明のスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ属ＮＯ−Ｎ１０株と比較しても、格段に強いウレアーゼ活性を有することが認められた。そして、上記実験例１、２に使用したスポロサルシナ属ＮＯ−Ｎ１０株は、上述したように、サンプリングした多数の土壌菌の中で特に顕著なウレアーゼ活性を起こす３つの菌株の中で最も炭酸塩を多く沈殿させた菌株として優位性を示したものである。従って、本発明のスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株は、従来のウレアーゼ産生微生物と比較すると、格段に強いウレアーゼ活性を有することが認められる。また、本発明のスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株によれば、炭酸カルシウムを少なくとも１．５Ｍまでの炭酸塩濃度まで失活が無く、速くしかも効率よく生成できることが認められた。なお、実施例３（スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、尿素、塩化カルシウム１．０Ｍ）において、反応時間１時間後に生成された炭酸カルシウムの電子顕微鏡写真を図４に、反応時間７２時間後に生成された炭酸カルシウムの電子顕微鏡写真を図５に示す。
【００３６】
【表２】
0005509471.tif 000003
【００３７】
［実施例６及び実施例７］
上記実施例３において、１Ｍの塩化カルシウム液に代えて、０．５Ｍの塩化カルシウム液と０．５Ｍの塩化マグネシウム液を加えた以外は、実施例３と同様にして本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を利用して炭酸塩（カルシウムイオンとマグネシウムイオンの併用）を生成して、実施例６とした。また、上記実施例１において、尿素液を０．５Ｍ、塩化マグネシウム液を０．５Ｍとした以外は、実施例１と同様にして本発明の新規微生物であるスポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株を利用して炭酸塩（炭酸マグネシウム）を生成して、実施例７とした。これらの生成量を実施例１と同様にして調べた。また、各時間における反応液のｐＨを測定した。これらの結果を下記表３及び図６に示す。実施例６の場合、およそ２０時間後には加えた量の約６５％の沈殿が生成した。その後徐々に沈殿量は増えて最終的には８０％程度まで増加すると思われる。このとき（約９時間後）の電子顕微鏡写真を図７に示す。
【００３８】
【表３】
0005509471.tif 000004
【００３９】
［実施例８〜実施例１７］
次に、Ｃａイオン／Ｍｇイオン（モル比）の割合を表４及び表５に示すように変えて、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株、尿素を加えて炭酸塩を以下のように生成し、得られた炭酸塩の量を以下の実験方法、評価方法によって評価した。結果を下記表４及び表５に併記すると共に、図８に示す。
【００４０】
【表４】
0005509471.tif 000005
【００４１】
【表５】
0005509471.tif 000006
【００４２】
＜実験方法＞
緩衝溶液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）をベースに１ＭＣａＣｌ２と１Ｍ尿素を加えて溶液２００ミリリットル（Ｃａ液）を準備した。また、緩衝溶液（１０ｍＭ水酸化アンモニウム＋塩化アンモニウム）に１Ｍ  ＭｇＣｌ２と１Ｍ尿素を加えた溶液２００ミリリットル（Ｍｇ液）を準備した。Ｃａ液とＭｇ液を所定の割合で混ぜて１０ミリリットルに分取した。その割合はＭｇ／Ｃａ比で１０：０，９：１，８：２，７：３，５：５，４：６，３：７，２：８，１：９，０：１０である。また、培養した菌体溶液２００ミリリットルを５０ミリリットルずつ分けて、４５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した後、上澄み液を除き、沈殿した菌体に０．５％ＮａＣｌ溶液をそれぞれ５０ミリリットル加えた。これらから１０ミリリットルをメスピペットで取り、Ｃａ液とＭｇ液との混合液１０ミリリットルに加えた。これから５ミリリットルをメスピペットで取り分け検体とした。その後、約２０℃で振盪させて、７２時間及び１週間後に沈殿物の質量を測った。沈殿物は溶液中と試験管ガラス壁に付着したものに分けて測定した。溶液中の沈殿はろ過して乾燥質量を、試験管に付着したものは乾燥して試験管と沈殿物の質量を測定した。ろ紙および試験管の質量をそれぞれの測定値から差し引いて、それらを加えたものを全沈殿物とした。
【００４３】
Ｍｇ／Ｃａモル比ではなく、Ｃａ／(Ｃａ＋Ｍｇ）を考えれば、（Ｃａ＋Ｍｇ）は１Ｍとしたので分母を１とでき、図８のように使用したＭｇのモル濃度で表すことができる。図８でＭｇが１（すなわちＣａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＝０）の場合、Ｃａの沈殿量はゼロでなければならない。一方、Ｍｇが０Ｍ（すなわちＣａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＝１）の場合、Ｃａの沈殿量は１Ｍである。従って、０＜Ｍｇ＜１Ｍ（即ち、０＜Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＜１）において、カルシウムの沈殿がＭｇに優先すると仮定すれば、Ｃａの沈殿は、Ｃａ（Ｍ）＝Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）×１（Ｍ）で表せる。従って、Ｍｇの沈殿量は、次のようになる。Ｍｇ（Ｍ）＝測定値−Ｃａ（Ｍ）。従って、図８から、次のことがわかる。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）が０．２以下の場合、炭酸マグネシウム（マグネサイト）又は炭酸マグネシウム又はＣａ−炭酸マグネシウムが生成し、７２時間以降も沈殿が起こり続ける。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＝０．３のとき、沈殿は７２時間で終了していると思われ、そのときの沈殿物のＭｇ／Ｃａ比は１：１である。沈殿速度の点からは安定していると考えられる。Ｃａ／（Ｃａ＋Ｍｇ）＝０．５のとき、１週間後に沈殿物のＭｇ／Ｃａ比は０．５となっている。上記実施例８〜１７では沈殿量を時間で示してあるが、この場合も１６９時間後に０．７４３Ｍの沈殿が起こっており、この結果と一致する。沈殿速度は比較的速く、７２時間でほぼ安定している。
【００４４】
また、下記表６に、スポロサルシナ属ＮＯ−Ａ１０株による反応終了までのカルサイト生成速度を示す。
【００４５】
【表６】
0005509471.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００４６】
炭酸塩は自然界で岩盤、岩石、ノジュールなどとして形成されているように、硬い固体物質である。したがって、砂などのような集合体や多孔体などの間隙で形成されると粒子を結合して岩化を起こすので、土木工学における地盤の強度不足の解消に応用できる。具体的には、地すべり、地盤の崩壊、土石流、液状化、などの対策工事に応用できるばかりでなく、構造物の基礎の安定化（破壊や沈下）にも対策として適用できる。また間隙中やクラック内で炭酸塩を生成させることにより、止水効果が得られる。この応用は、地中止水壁の構築、アースダムのコアの止水性の向上、廃棄物処分場からの漏れの防止などに利用できる。さらには、地盤環境工学において、重金属を取り込んだ炭酸塩の形成によって、汚染土壌内における有害物質の不動化が可能である。
【図１】
0005509471.tif 000008
【図２】
0005509471.tif 000009
【図３】
0005509471.tif 000010
【図４】
0005509471.tif 000011
【図５】
0005509471.tif 000012
【図６】
0005509471.tif 000013
【図７】
0005509471.tif 000014
【図８】
0005509471.tif 000015
【配列表】
0005509471000001.app