(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物からの抽出液に含まれる、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子である、タンパク質を検出し、前記タンパク質の発現の有無に基づいて、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を有する植物を選抜する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、或いは、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
【請求項２】
植物からの抽出液に含まれる、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子である、タンパク質をコードする遺伝子、或いは、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれか一つのＤＮＡからなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であるタンパク質をコードする遺伝子を検出し、前記遺伝子の発現の有無に基づいて、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を有する植物を選抜する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、或いは、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が９５％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、或いは、
（ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項３】
配列番号５で表されるＲＮＡｉ誘導性核酸を発現可能であることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクターを宿主に導入してなることを特徴とする形質転換体。
【請求項５】
請求項３に記載の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクターを植物に導入する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法。
【請求項６】
請求項３に記載の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクターを備えていることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物。
【請求項７】
請求項３に記載の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクターを備えていることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の鉄欠乏耐性の向上及び可食部への鉄・亜鉛蓄積の促進に関するものである。詳細には、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を制御する働きを有するタンパク質、遺伝子、ベクター、形質転換体、遺伝子破壊株、抗体、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット、並びに、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法に関するものである。  
本願は、２０１２年７月２６日に、日本に出願された特願２０１２−１６６２３３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
植物が成育し、炭素固定と物質生産を行うためには、鉄と亜鉛が必要である。植物は、土壌中の鉄及び亜鉛を吸収することにより、これらを利用する。
しかしながら、世界の土壌のおよそ３０％を占めている石灰質アルカリ土壌では、可溶化した鉄及び亜鉛が少なく、中でも可溶化した鉄が極めて少ない。よって、石灰質アルカリ土壌での植物の生育において、鉄欠乏が主要な制限要因となっている。
そのため、石灰質アルカリ土壌をはじめとする不良土壌においても良好に生育する植物の取得が急務である。【０００３】
また、土壌から鉄及び亜鉛を吸収した植物は、ヒトの主要なミネラル供給源である。鉄欠乏症及び亜鉛欠乏症は、世界中の人々、特に子供や女性にとって深刻な問題となっているため、可食部に多くの鉄及び亜鉛を含む植物の取得が望まれている。【０００４】
近年、鉄及び亜鉛（特に鉄）の吸収と利用に関与する遺伝子の同定及び解析が進んでいる。その遺伝子を改変して植物に導入することにより、鉄及び亜鉛の欠乏耐性が向上した植物、又は、可食部に多くの鉄及び亜鉛を蓄積する植物が取得されている（例えば、非特許文献１〜１１参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Takahashi, M., et. al., Nature Biotech., (2001) vol.19, pp.466-469.
【非特許文献２】Ishimaru, Y., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2007) vol.104, pp.7373-7378.
【非特許文献３】Suzuki, M., et. al., Soil Sci. Plant Nutr., (2008) vol.54, pp.77-85.
【非特許文献４】Ogo, Y., et. al., Plant Mol. Biol., (2011) vol.75, pp.593-605.
【非特許文献５】Goto, F., et .al., Nature Biotech., (1999) vol.17, pp.282-286.
【非特許文献６】Uauy, C., et. al., Science, (2006) vol.314, pp.1298-1301.
【非特許文献７】Masuda, H., et. al., Rice, (2008) vol.1, pp.100-108.
【非特許文献８】Masuda, H., et. al., Rice, (2009) vol.2, pp.155-166.
【非特許文献９】Lee, S., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2009) vol.106, pp.22014-22019.
【非特許文献１０】Wirth, J., et .al., Plant Biotech. J., (2009) vol.7, pp.1-14.
【非特許文献１１】Ishimaru, Y., et .al., Plant J., (2010) vol.62, pp.379-390.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、石灰質土壌において、優良土壌における生育と同程度かそれ以上の生育を示す植物は取得されていない。また、石灰質土壌及び優良土壌の双方において、鉄及び／又は亜鉛を多量に（例えば、従来の２倍量以上）蓄積できる植物は取得されていない。
従って、このような性質を有する植物を取得するという点では未だ改良の余地があった。【０００７】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、石灰質土壌において、通常の植物よりも優れた生育を示し、石灰質土壌及び優良土壌の双方において、鉄及び亜鉛を可食部に多量に蓄積できる形質転換体及び遺伝子破壊株、並びに、これらを作出するために用いられる遺伝子、ベクター、タンパク質、抗体、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット、並びに、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法を提供する。可食部とは、例えば植物の種子、地上部、茎葉、根などが挙げられるが、食用、飼料用として可食である部分であれば、必ずしもこれらの部分に限定されない。なお前記植物が稲である場合、種子に相当する部分として玄米や、これを精米した胚芽米、分づき米、白米などが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、植物の鉄欠乏応答を抑制する働きを有するタンパク質を見出した。そのタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制した植物を作出することにより、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を向上できることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、下記の特徴を有するタンパク質、遺伝子、ベクター、形質転換体、遺伝子破壊株、抗体、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット、並びに、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法を提供するものである。【００１０】
（１）植物からの抽出液に含まれる、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子である、タンパク質を検出し、前記タンパク質の発現の有無に基づいて、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を有する植物を選抜する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、或いは、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上であるアミノ酸配列
（２）植物からの抽出液に含まれる、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子である、タンパク質をコードする遺伝子、或いは、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれか一つのＤＮＡからなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であるタンパク質をコードする遺伝子を検出し、前記遺伝子の発現の有無に基づいて、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を有する植物を選抜する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、或いは、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上であるアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が９５％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、或いは、
（ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ
（３）配列番号５で表されるＲＮＡｉ誘導性核酸を発現可能であることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクター。
（４）前記（３）に記載の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクターを宿主に導入してなることを特徴とする形質転換体。
（５）前記（３）に記載の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクターを植物に導入する工程を含むことを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法。
（６）前記（３）に記載の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクターを備えていることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物。
（７）前記（３）に記載の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物作出用ベクターを備えていることを特徴とする鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、石灰質土壌において、通常の植物よりも優れた生育を示し、石灰質土壌及び優良土壌の双方において、鉄及び亜鉛を多量に蓄積できる形質転換体及び遺伝子破壊株を作出することができる。
更に、本発明によれば、不良土壌における炭酸固定・物質生産、及び、ヒトの鉄・亜鉛欠乏症の緩和に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明のＯｓＨＲＺ１タンパク質及びＯｓＨＲＺ２タンパク質の領域構造を示す。
【図２】図２は、本発明の遺伝子破壊株におけるゲノム構造を示す。
【図３】図３は、ヘムエリスリン領域を有するタンパク質の系統樹及び領域構造を示す。
【図４】図４は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いたＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルの解析結果を示す。
【図５】図５は、作製した組換えタンパク質の領域構造を示す。
【図６】図６は、野生型及び変異型ＯｓＨＲＺタンパク質における金属との結合能の解析結果を示す。
【図７】図７は、各組換えタンパク質溶解液を含んだチューブの写真を示す。
【図８】図８は、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株における定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いたＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルの解析結果を示す。
【図９】図９は、鉄欠乏栽培条件下でのＯｓＨＲＺ２発現抑制株の最新葉におけるクロロフィル含量の定量結果を示す。
【図１０】図１０は、石灰質土壌長期栽培下でのＯｓＨＲＺ２発現抑制株の最新葉におけるクロロフィル含量の定量結果を示す。
【図１１】図１１は、石灰質土壌２８日間栽培下での未処理（ＮＴ）のイネ及びＯｓＨＲＺ２発現抑制株の苗丈の写真を示す。
【図１２】図１２は、ＯｓＨＲＺ破壊株におけるゲノムＰＣＲの結果を示す。
【図１３】図１３は、鉄欠乏栽培条件下でのＯｓＨＲＺ破壊株の最新葉におけるクロロフィル含量の定量結果を示す。
【図１４】図１４は、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下で７日間水耕栽培をしたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の葉における蓄積鉄濃度を示す。
【図１５】図１５は、石灰質土壌中及び通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の稲わらにおける蓄積鉄濃度を示す。
【図１６】図１６は、石灰質土壌中及び通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子における蓄積鉄濃度を示す。
【図１７】図１７は、隔離圃場内の通常土壌で栽培したＯｓＨＲＺ２発現抑制株の玄米及び白米における蓄積鉄濃度を示す。
【図１８】図１８は、石灰質土壌中及び通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子における蓄積亜鉛濃度を示す。
【図１９】図１９は、隔離圃場内の通常土壌で栽培したＯｓＨＲＺ２発現抑制株の玄米及び白米における蓄積亜鉛濃度を示す。
【図２０】図２０は、通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ破壊株の種子における蓄積鉄濃度を示す。
【図２１】図２１は、通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ破壊株の種子における蓄積亜鉛濃度を示す。
【図２２】図２２は、通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらにおける蓄積鉄濃度を示す。
【図２３】図２３は、通常の土壌中でポット栽培をしたＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらにおける蓄積亜鉛濃度を示す。
【図２４】図２４は、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下で水耕栽培されたＯｓＨＲＺ２発現抑制株の根での、４４Ｋマイクロアレイを用いた、遺伝子発現プロファイルの解析結果を示す。
【図２５】図２５は、マイクロアレイ解析により、鉄十分条件下のＯｓＨＲＺ２発現抑制株の根において発現上昇が認められた遺伝子について、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて検証した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜ＯｓＨＲＺタンパク質＞
本発明のタンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）いずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子である。
（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列。
【００１４】
前記（ａ）のアミノ酸配列は、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列である。
本発明者は、配列番号１及び２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を、それぞれ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｈｅｍｅｒｙｔｈｒｉｎ  ｍｏｔｉｆ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｒｅａｌｌｙ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅ  （ＲＩＮＧ)−  ａｎｄ  Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＯｓＨＲＺという）１及びＯｓＨＲＺ２と名付けた。
図１に示すように、ＯｓＨＲＺ１は、Ｎ末端側からＣ末端側にかけて、三つの推定上のヘムエリスリン（ＨＨＥとしても知られている）領域と、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される二つのＺｎフィンガー領域（ＣＨＹ様Ｚｎフィンガー領域及びＣＴＣＨＹ様Ｚｎフィンガー領域）と、Ｅ３リガーゼとして機能してタンパク質分解制御に関与するＲＩＮＧ−Ｚｎフィンガー領域と、電子伝達の為に鉄硫黄クラスターを形成すると推定されるＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフと、を含んでいる。
また、図１に示すように、ＯｓＨＲＺ２は、Ｎ末端側からＣ末端側にかけて、一つのヘムエリスリン領域と、三つのＺｎフィンガー領域（ＣＨＹ様Ｚｎフィンガー領域、ＣＴＣＨＹ様Ｚｎフィンガー領域及びＲＩＮＧ−Ｚｎフィンガー領域）と、Ｒｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフと、を含んでいる。
鉄欠乏条件の栽培下、これらＯｓＨＲＺタンパク質をコードする遺伝子は、発現誘導される。
植物中で合成されたＯｓＨＲＺタンパク質は、ヘムエリスリン領域を介して鉄及び亜鉛と結合し、植物細胞内の鉄と他の金属との濃度比を検出する鉄センサーとして機能すると考えられる。
更に、ＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２タンパク質は、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される上記三つのＺｎフィンガー領域を介して、鉄取り込み関連遺伝子及び鉄移行関連遺伝子の発現を主に鉄十分条件の栽培下で抑制している。
【００１５】
前記（ｂ）としては、例えば、ヘムエリスリン領域以外の部位に変異（欠失、挿入、置換、又は付加）を有するタンパク質、又はヘムエリスリン領域における変異であって鉄・亜鉛結合活性を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
また、前記（ｂ）としては、例えば、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される上記三つのＺｎフィンガー領域以外の部位に変異を有するタンパク質、又は上記Ｚｎフィンガー領域における変異であって鉄取り込み関連遺伝子及び鉄移行関連遺伝子の発現抑制能を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよいアミノ酸の数としては、１ 〜１０個が好ましく、１〜７個がより好ましく、１ 〜 ５個がさらにより好ましく、１〜３個が特に好ましく、１〜２個が最も好ましい。
本発明のタンパク質を構成するアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸に変異を導入することは、周知技術を使用して容易に行われる。
例えば、公知の点変異導入法に従えば、タンパク質をコードする遺伝子中の任意の塩基を変異させることができる。また、タンパク質をコードする遺伝子中の任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【００１６】
前記（ｃ）としては、例えば、ヘムエリスリン領域以外の部位に変異（欠失、挿入、置換、又は付加）を有するタンパク質、又はヘムエリスリン領域における変異であって鉄・亜鉛結合活性を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
また、前記（ｃ）としては、例えば、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される上記三つのＺｎフィンガー領域以外の部位に変異を有するタンパク質、又は上記Ｚｎフィンガー領域における変異であって鉄取り込み関連遺伝子及び鉄移行関連遺伝子の発現抑制能を保持している変異を有するタンパク質が挙げられる。
ここで、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列との相同性（アミノ酸配列の同一性）としては、８０％以上が好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９８％以上が最も好ましい。
【００１７】
本発明のタンパク質を発現させる為に用いられる発現ベクターとしては、宿主細胞に本発明のタンパク質を発現させる細胞系ベクターと、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系において本発明のタンパク質を発現させる、無細胞系ベクターが挙げられる。
細胞系ベクターとしては、宿主細胞に適した公知の発現ベクターが用いられる。例えば、大腸菌においてはｐＢＲ３２２誘導体に代表されるＣｏｌＥＩ系プラスミド、ｐ１５Ａオリジンを持つｐＡＣＹＣ系プラスミド、ｐＳＣ系プラスミド、Ｂａｃ系等のＦ因子由来ミニＦプラスミドが挙げられる。その他、ｔｒｃやｔａｃ等のトリプトファンプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等を有する発現ベクターも挙げられる。
無細胞系ベクターとしては、細胞系ベクターにおいて挙げられたＴ７プロモーターを有する発現ベクターやＴ３プロモーターを有する発現ベクター；ＳＰ６プロモーター又はＴ７プロモーターを有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
【００１８】
無細胞系ベクターを用いたタンパク質合成においては、先ず、転写系を用いてｃＤＮＡを転写して、ｍＲＮＡを合成する。係る転写系としては、ＲＮＡポリメラーゼにより転写させる従来公知のものが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴ７ＲＮＡポリメラーゼが挙げられる。
次いで、翻訳系である無細胞タンパク質合成系を用いてｍＲＮＡを翻訳し、タンパク質を合成する。この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な要素が含まれている。このようなタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。
更に、上記翻訳に必要な要素が独立に精製された因子のみからなる再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。
細胞系ベクター又は無細胞系ベクターを用いて合成されたタンパク質を、細胞素抽出液中で用いることもできるが、精製して用いることもできる。精製方法としては、塩析法や各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。発現ベクターが目的タンパク質のＮ末端又はＣ末端にヒスチジンタグ等のタグ配列を発現するように設計されている場合には、ニッケルやコバルト等、このタグに親和性を有する物質を用いたアフィニティーカラムによる精製方法が挙げられる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等、適宜組み合わせて精製することにより、本発明のタンパク質の純度を高めることができる。
【００１９】
＜ＯｓＨＲＺ遺伝子＞
本発明の遺伝子は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であるタンパク質をコードする。
また、本発明の遺伝子は、以下の（ｄ）〜（ｇ）のいずれか一つのＤＮＡからなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であるタンパク質をコードする。
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換又は付加されている塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｆ）配列番号３又は４で表される塩基配列と相同性（塩基配列の同一性）が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上である塩基配列からなるＤＮＡ、又は、
（ｇ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列からなるＤＮＡ。
【００２０】
ここで、欠失、置換、又は付加されてもよい塩基の数としては、１ 〜３０個が好ましく、１〜２０個がより好ましく、１ 〜１５個がさらに好ましく、１ 〜１０個が特に好ましく、１ 〜 ５個が最も好ましい。
【００２１】
本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム,０．３Ｍ クエン酸溶液,ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００２２】
＜ＯｓＨＲＺ遺伝子発現抑制ベクター＞
本発明のベクターは、上述した本発明の遺伝子の発現を抑制し得るものである。前記遺伝子の発現をｍＲＮＡレベルで抑制し得るＲＮＡｉ誘導性核酸を発現可能であることが好ましい。
ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、植物細胞内に導入されることによりＲＮＡ干渉を誘導し得る核酸を意味する。ＲＮＡ干渉とは、ｍＲＮＡ（又はその部分配列）に相補する塩基配列を含むＲＮＡが、そのｍＲＮＡの発現を抑制する効果をいう。
ＲＮＡｉ誘導性核酸が標的とするｍＲＮＡは、コーディング領域であっても、ノンコーディング領域であってもよい。前記ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、配列番号５で表される塩基配列であることが好ましく、このＲＮＡｉ誘導性核酸は、ＯｓＨＲＺの３’ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）全長およびコーディング領域の一部を標的とする。
また、ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡやｍｉＲＮＡが挙げられる。植物細胞内に導入され、ｓｉＲＮＡ と同様にＲＮＡｉを引き起こすベクターとしては、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ／ｓｍａｌｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）発現ベクターが挙げられる。
本発明のベクターによれば、植物の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積を向上させることができる。
ここで、「植物の鉄欠乏耐性」とは、可溶化した鉄分の少ない土壌でも生育できる特性を意味し、例えば、アルカリ土壌においてクロローシス（クロロフィルの欠陥による黄色化）と称される鉄欠乏症を起こしにくい等の特性を意味する。
また、「鉄・亜鉛蓄積」とは、イネの地上部、特に可食部である種子中に高濃度の鉄及び亜鉛を蓄積できる特性を意味する。例えば、前記ベクターを用いて作出された形質転換体を隔離圃場（所定の手続きに基づいて設けられた遺伝子組換え用の隔離圃場を意味する。）内の通常土壌で栽培して得られた種子は、未処理のイネの種子と比較して、約３．８倍量の鉄を含有し、約１．２倍量の亜鉛を含有する。
本発明のベクターは、周知の遺伝子組換え技術により作製してもよい。
【００２３】
＜形質転換体、並びに、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法＞
本発明の形質転換体（発現抑制株ということもある。）は、本発明のベクターを宿主に導入してなるものである。上述したように、本発明のベクターは、宿主である植物の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積を向上させることができるものである。よって、本発明の形質転換体は、鉄欠乏耐性に優れ、かつ、とりわけ可食部に高濃度の鉄・亜鉛を蓄積することができる。
また、本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法とは、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物体を作製するための方法を意味する。本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法は、本発明のベクターを植物体内に導入する工程を含んでいれば特に限定されない。
【００２４】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられるべきベクターは、その植物内で本発明の遺伝子の発現を抑制させることが可能なベクターであれば特に限定されない。
このようなベクターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター等の植物細胞内で遺伝子を構成的に発現させるプロモーターを有するベクター；外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【００２５】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、篩部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、もしくは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルス等のいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されないが、イネ科植物であることが好ましく、イネ、オオムギ、コムギまたはトウモロコシであることがさらに好ましい。
【００２６】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等）が用いられ、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法とに大別される。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）等に従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得る方法が用いられ得る。
また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，（１９９０）ｖｏｌ．６７， ｐｐ３２５）が用いられ得る。この方法は、先ず、発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓ． Ｂ． Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクター（例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）が使用され得る。
【００２７】
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法等が挙げられる。遺伝子銃を用いる場合は、遺伝子を導入する対象として、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００２８】
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。選択マーカーとしては、ハイグロマイシン耐性に限定されず、例えば、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコールなどに対する薬剤耐性が挙げられる。
【００２９】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。これらの方法によって組換えベクターが培養細胞に導入されて形質転換される。形質転換の結果として得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能である。これらは従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【００３０】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、当業者に公知の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液などによって染色する。そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【００３１】
本発明のベクターがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、その植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、前記植物体またはその子孫、もしくはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に前記植物体を量産することができる。
従って、本発明の形質転換体には、本発明のベクターが発現可能に導入された植物体、若しくは、その植物体と同一の性質を有する前記植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【００３２】
＜遺伝子破壊株＞
本発明の遺伝子破壊株は、挿入配列が組み込まれることにより、本発明の遺伝子が破壊されているゲノムＤＮＡを有する。例えば、図２に示されるように、相同組換えによりゲノムＤＮＡにＴ−ＤＮＡ（ｈｒｚ１−１）を挿入させることにより、またはトランスポゾン（ｈｒｚ２−１）の転移により、ゲノムＤＮＡ上に存在する本発明の遺伝子が破壊され、その発現が抑制される。
本発明の遺伝子破壊株によれば、本発明の遺伝子及びタンパク質の発現が抑制されている。よって、鉄取り込み関連遺伝子や鉄移行関連遺伝子の恒常的な発現抑制が解除され、植物中の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積を向上させることができる。
本発明の遺伝子破壊株としては、Ｔｏｓ１７挿入株ＮＤ６０５９ ( イネゲノムリソースセンター) が好ましい。この挿入株は、形質転換植物ではないため、一般圃場ですぐに生育可能である点で優れている。
本発明の形質転換体及び遺伝子破壊株は、上述した様に、可食部への顕著な鉄・亜鉛蓄積の向上に加えて、優れた鉄欠乏耐性を兼ね備えている。よって、半乾燥地帯や石灰質土壌等の潜在的に鉄欠乏に陥りやすい栽培条件において安定的に鉄富化食物を生産するのに特に有用である。
【００３３】
＜鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、並びに、作出用キット＞
本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物は、本発明のベクターを含んでいる。また、本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キットは、本発明のベクターを備えている。ここで、「組成物」とは、各種成分が一物質中に含有されている形態を意味する。「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態を意味する。
また、「鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物」は、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物体を作製するために用いる組成物である。「鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キット」は、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物を作製するために用いるキットである。
【００３４】
本発明の形質転換体は、本発明のベクターが宿主（植物）に導入してなるものである。これにより本発明の遺伝子が発現抑制され、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上され得る。そして、上述したように、本発明のベクターを用いれば植物体に本発明のベクターを導入し得る。従って、本発明のベクターを備えている組成物、またはベクターを備えているキットは、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物を作出するために好適に用いられる。
即ち、本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物、又は、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キットは、上述した本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法におけるベクターの供給源として用い得る。
【００３５】
本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用組成物は、本発明のベクターの他、溶媒、分散媒、試薬等を備えていてもよい。
また、本発明の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出用キットは、本発明のベクターの他、溶媒、分散媒、試薬、それらを使用するための指示書などを備えていてもよい。ここで、本発明のキットにおいて、指示書を除く、溶媒等を「備えている」とは、キットを構成する個々の容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）のいずれかの中に内包されている状態を意味する。
また、本発明のキットは、例えば、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。また、本発明のキットは、希釈剤、溶媒、洗浄液、その他の試薬を内包した容器を備え得ていてもよい。
【００３６】
＜抗体＞
本発明の抗体は、本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体であれば限定されず、前記タンパク質に対するポリクローナル抗体等でもよいが、前記タンパク質に対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすく、その産生細胞をハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する点で優れている。
【００３７】
本発明の抗体としては、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、及びこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）が挙げられ、具体的には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体等が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
尚、本発明の抗体は、種々の公知の方法に従い作製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、この分野において公知の技術（例えば、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ４９５−４９７ （１９７５））、トリオーマ法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４，７２ （１９８３））およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， ７７−９６ （１９８５））等参照）を用いることにより、作製され得る。
【００３９】
また、ペプチド抗体は、この分野に公知の方法（例えば、Ｃｈｏｗ， Ｍ．，ｅｔ． ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ （１９８５） ｖｏｌ．８２， ｐｐ．９１０−９１４； Ｂｉｔｔｌｅ， Ｆ． Ｊ．ｅｔ． ａｌ．，  Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． （１９８５）  ｖｏｌ．６６， ｐｐ２３４７−２３５４）に従うことにより作製され得る。
【００４０】
本発明の抗体は、上述したようにＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメント等のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用して、抗体をタンパク質分解することにより産生され得る。
または、このようなフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。
【００４１】
＜育種方法＞
［第一実施形態］
本実施形態の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法は、植物からの抽出物に含まれる本発明のタンパク質を検出する工程を含む。
本実施形態の鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法は、植物体内で本発明のタンパク質の発現が抑制されているかどうかを判別するために、本発明のタンパク質を検出する工程を含んでいればよい。本発明のタンパク質の発現の有無に基づいて、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積を有する植物を選抜する。
【００４２】
上述したように、本発明のタンパク質は、植物が土壌から鉄を獲得する際に重要な働きを有する遺伝子の発現を抑制する。従って、上記タンパク質の発現が抑制された植物は鉄を獲得する能力が高く、鉄欠乏耐性及び鉄・亜鉛蓄積が向上している。
なお、本実施形態の方法に従って育種された植物体は、天然の植物体であっても形質転換体であってもよい。
【００４３】
植物からの抽出物は、液体窒素を用いた凍結破砕法や、市販の抽出キットを用いて取得することができるが、これらに限定されない。また、「抽出物」は、粗精製物であってもいくつかの精製工程を経た精製標品であってもよい。
【００４４】
本実施形態の育種方法において、上記植物からの抽出物に含まれる本発明のタンパク質を検出する工程としては、その植物からの抽出物を本発明の抗体と反応させることにより本発明のタンパク質を検出する工程が挙げられる。上述したように上記抗体は、本発明のタンパク質と特異的に結合して免疫複合体を形成するので、その複合体の形成を検出することにより植物体内において発現されている上記タンパク質を容易に検出することができる。
上記複合体の形成は、例えば、上記抗体を予め同位体などで標識する方法、又は、上記抗体に対する２次抗体を用いる方法等を用いて検出される。具体的には、周知のウェスタンブロット法、プロテインチップ法等が用いられ得る。
【００４５】
また、本発明の抗体は、本実施形態の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の育種方法に好適に用いられる。従って、本発明の抗体を含んでいる組成物または前記抗体を備えているキットは、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物を育種するために好適に用いられる。
【００４６】
［第二実施形態］
本実施形態の植物の育種方法は、植物からの抽出物に含まれる本発明の遺伝子を検出する工程を含む。
【００４７】
上記植物からの抽出物に含まれる本発明の遺伝子を検出する工程は、本発明の遺伝子のフラグメント、又はその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを、前記植物からの抽出物とインキュベートする工程を含むことが好ましく、植物からの抽出物を目的の植物由来のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡに対するｃＤＮＡとハイブリダイズさせる工程を含むことがより好ましい。
【００４８】
本実施形態の育種方法を用いてハイブリダイズした標的遺伝子を検出することによって、本発明の遺伝子の発現が抑制された植物体を容易に検出することができる。
さらに、上述したように、本発明のタンパク質は、鉄欠乏に対する植物体の応答において重要な働きをする。そのため、上記タンパク質のアミノ酸配列の細かな変異が、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積に影響を及ぼし得る。ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法等の周知慣用の技術を用いることにより遺伝子の１塩基単位の変異を検出し得るため、これらの技術により、前記遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の細かな変異を検出し得ることができる。
したがって、本実施形態の植物の育種方法を用いることにより、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積に影響を及ぼす上記タンパク質のアミノ酸配列の細かな変異に基づいて、植物の鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物を育種することもできる。
【００４９】
本実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドが数個ないし数十個または数百個結合したものを意味する。
本実施形態の育種方法において用いられるオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子またはそのフラグメントを得るためのＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
本実施形態に用いられるオリゴヌクレオチドの長さとしては、７塩基以上が好ましく、１５塩基以上がより好ましく、２０塩基以上が更に好ましく、４０塩基以上が最も好ましい。これらのオリゴヌクレオチドは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ ９４４０４）３９２型シンセサイザー等によって合成される。
【００５０】
このように、本実施形態の育種方法において用いられるオリゴヌクレオチドを、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を検出するハイブリダイゼーションプローブ、または前記遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することによって、本発明の遺伝子の発現が抑制された植物体または組織を容易に検出することができる。
【実施例】
【００５１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５２】
[イネ由来新規鉄結合タンパク質の同定]
本発明者らは、鉄欠乏誘導性遺伝子群について、マイクロアレイを用いて解析した（Ｏｇｏ， Ｙ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ． （２００６） ｖｏｌ．５７， ｐｐ．２８６７−２８７８）。これら遺伝子群の中で、鉄センサーとして一つの候補遺伝子ＡＫ０６８０２８(ＮＣＢＩのアクセッション番号：配列番号４）に着目した。上述したように、この遺伝子は、推定上のヘムエリスリン（ＨＨＥとしても知られている）領域をコードする遺伝子を含んでいる（図１参照）。ヘムエリスリン領域は、無脊椎動物、バクテリア、及び哺乳類まで保存されており、二価鉄及び分子状酸素と結合することが知られている。
無脊椎動物において、ヘムエリスリン領域を有するタンパク質は酸素を輸送するタンパク質として機能している。
一方、ヒトにおいては、ヘムエリスリン領域を有するタンパク質としてヒトＦＢＸＬ５タンパク質が知られている（図３参照）。ヒトＦＢＸＬ５タンパク質においてヘムエリスリン領域は鉄センサーとして働き、ＦＢＸＬ５はユビキチン−プロテアソーム系のＥ３リガーゼとして機能するＦ−ボックス領域を介して、鉄制御タンパク質２（Ｉｒｏｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２；以下、ＩＲＰ２という。）を認識して分解することが知られている（Ｒｏｕａｕｌｔ， Ｔ． Ａ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ｖｏｌ．３２６， ｐｐ．６７６−６７７； Ｖａｓｈｉｓｈｔ， Ａ．，ｅｔ． ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ｖｏｌ．３２６， ｐｐ．７１８−７２１； Ｓａｌａｈｕｄｅｅｎ， Ａ． Ａ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （２００９） ｖｏｌ．３２６， ｐｐ．７２２−７２６）。
興味深いことに、配列番号４で表される遺伝子がコードするタンパク質は、Ｆ−ボックス領域を含んでいなかったが、Ｆ−ボックス領域と同様にＥ３リガーゼとして機能するＲＩＮＧ−Ｚｎフィンガー領域を含んでいる（図１参照）。配列番号４で表される遺伝子がコードするタンパク質は転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される二つの他のＺｎフィンガー領域と、電子伝達の為に鉄硫黄クラスターを形成すると推定されるＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフと、を含んでいる（図１参照）。
データベースサーチにより、ヘムエリスリン領域をコードする遺伝子を含む遺伝子を、イネにおいて更に２つ見出し（図３参照；ＯｓＨＯＲＺ１及び後述するＯｓＨＲＺ１）、シロイヌナズナにおいて４つ見出した（図３参照；ＢＴＳ， Ａｔ３ｇ５４２９０， Ａｔ１ｇ７４７７０， Ａｔ１ｇ１８９１０）。これらのうち、ＡＫ２８８３９４ (ＮＣＢＩのアクセッション番号：配列番号３）がコードするタンパク質は、配列番号４で表される遺伝子がコードするタンパク質が有する全ての領域構造を含有しており、更に２つのヘムエリスリン領域を有している（図１参照）。
よって、本発明者は、配列番号３及び４で表される遺伝子がコードするタンパク質を、それぞれ、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｈｅｍｅｒｙｔｈｒｉｎ  ｍｏｔｉｆ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｒｅａｌｌｙ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔｉｎｇ  Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅ  （ＲＩＮＧ)−  ａｎｄ  Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＯｓＨＲＺという）１及びＯｓＨＲＺ２と名付けた。
ＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のｃＤＮＡをイネ栽培品種「月の光」のｃＤＮＡプールからＰＣＲを用いて増幅し、この増幅産物をｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒに挿入し、塩基配列を確認した。【００５３】
[鉄欠乏栽培条件に応答したＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２の発現レベルの変化]
イネ品種「日本晴」の葉及び根における、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下でのＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルの変化を、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した。
詳細には、水耕栽培したイネの根又は葉身から抽出したＲＮＡサンプルを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（マッハライ・ナーゲル社製）及びＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、又は、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ(キアゲン社製) 及びＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ ｑＲＴ−ＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｒｅｍｏｖｅｒ （ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＤＮａｓｅＩを用いて処理し、逆転写反応に供した。次いで、逆転写反応により合成したｃＤＮＡを用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標） Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ (アプライドバイオシステムズ社製)により、リアルタイムＰＣＲを行った。試薬として、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ及びＥｘＴａｑ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ−ＰＣＲ  ｖｅｒｓｉｏｎ（ＴａＫａＲａ社製) 、又は、 ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社製)を用いた。標的とする転写産物の量を、イネα−２チューブリンの転写レベルで補正し、１μｇの全ＲＮＡ当たりのコピー数として表した。
結果を図４に示す。図４のグラフ横軸は、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下での栽培日数を示す。＋７ｄは、鉄十分条件下、７日栽培後のイネ由来のサンプルを表し、−１ｄは、鉄欠乏条件下、１日栽培後のイネ由来のサンプルを表し、−７ｄは、鉄欠乏条件下、７日栽培後のイネ由来のサンプルを表す。図４のグラフ縦軸は、ＲＮＡ１μｇ当たりのＯｓＨＲＺ１又はＯｓＨＲＺ２のコピー数を表す。図４（ａ）は、根における発現レベルを表したグラフであり、図４（ｂ）は、葉における発現レベルを表したグラフである。図４左は、ＯｓＨＲＺ１における発現レベルを表したグラフであり、図４右は、ＯｓＨＲＺ２における発現レベルを表したグラフである。また、以降の実施例において、有意差については、ｔ検定により検定を行った。以降の図中、＊はＰ＜０．０５を示し、＊＊はＰ＜０．０１を示す。
図４に示すように、葉及び根の両方において、鉄欠乏条件下でＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルの上昇が確認された。【００５４】
[組換えＯｓＨＲＺ１タンパク質及びＯｓＨＲＺ２タンパク質の鉄結合能の評価]
植物由来のヘムエリスリン領域が鉄との結合能を有するかどうかについては知られていない。発明者は、先ず、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子の下流に、全長ＨＲＺ遺伝子又はＨＲＺ欠失変異遺伝子を繋いだものをｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）に挿入した発現ベクターを作製した。
次いで、これらマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）融合ＯｓＨＲＺ組換えタンパク質の複数の欠失変異体を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに発現させて作製した。組換えタンパク質の発現精製については、ＭＢＰフュージョンシステム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いた。大腸菌を２２℃〜２５℃で培養しカラムバッファーからＥＤＴＡを除いた以外は、マニュアルに従った。組換えタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して分離した後、クマシー・ブリリアント・ブルー染色により組換えタンパク質の純度を確認した。発現させた組換えタンパク質を、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて脱塩した後、陰イオン交換カラム（Ｑ−セファロース；ＧＥヘルスケア社製）を用いて精製した。作製した組換えタンパク質の領域構造を図５に示す。
図５中、ＯｓＨＲＺ１  ＦＬは、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長を表し、ＯｓＨＲＺ１  
ΔＲＺは、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長から、Ｃ末端側にある３番目のヘムエリスリン領域と、転写制御・転写後制御・タンパク質分解制御等に関与すると推定される三つのＺｎフィンガー領域と、電子伝達の為に鉄硫黄クラスターを形成すると推定されるＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフと、を含むＣ末端領域を欠失させたものを表す。ＯｓＨＲＺ１  ΔＨは、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長から、三つのヘムエリスリン領域全てを含むＮ末端領域を欠失させたものを表す。ＯｓＨＲＺ１  ΔＨＲＺは、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長から、Ｎ末端側にある２つのヘムエリスリン領域全てを含むＮ末端領域と、Ｃ末端側にある３番目のヘムエリスリン領域と三つのＺｎフィンガー領域とＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフとを含むＣ末端領域を欠失させたものを表す。
図５中、ＯｓＨＲＺ２  ＦＬは、ＯｓＨＲＺ２タンパク質全長を表し、ＯｓＨＲＺ１  
ΔＨは、ＯｓＨＲＺ２タンパク質全長から、ヘムエリスリン領域を含むＮ末端領域を欠失させたものを表す。ＢＴＳ  ＦＬは、ＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２のシロイヌナズナホモログのタンパク質全長を表す（図３参照）。
これらのタンパク質に結合している金属濃度を、誘導結合発光分光により測定した。詳細には、精製したタンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）を用いて定量し、ＭａｒｓＸｐｒｅｓｓオーブン（ＣＥＭ社製）を用いて０．１〜１ｍｇの精製タンパク質溶解液を１３．４Ｍ  ＨＮＯ３２ｍＬで２２０℃２０分処理し、湿式灰化した。鉄及び亜鉛のモル濃度を、ＩＣＰ発光分析装置（ＩＣＰＳ−８１００；島津製作所製）を用いて測定した。結果を図６に示す。
図６中、グラフ横軸は、用いた組換えタンパク質の種類を示し、グラフ縦軸は、タンパク質１モルに結合している鉄又は亜鉛のモル数を示す。図６に示すように、ＯｓＨＲＺ１タンパク質全長及びＯｓＨＲＺ２タンパク質全長は、約２倍モル前後の量の鉄及び亜鉛を含んでおり、この結合能はヘムエリスリン領域を欠失させることにより約０．５倍モル以下にまで減少した。一方、三つのＺｎフィンガー領域とＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフとを欠失させても、タンパク質１モル当たりの鉄及び亜鉛結合量は顕著に減少しなかった。
このことは、図７に示すように、ヘムエリスリン領域を含むＯｓＨＲＺ１  ＦＬタンパク質の濃縮溶解液が、ヘムエリスリン領域を含まないＯｓＨＲＺ１  ΔＨタンパク質の濃縮溶解液と比較して、鉄由来の赤茶色を呈していることからも明らかである。
これらのことから、ＯｓＨＲＺタンパク質において、鉄及び亜鉛は、Ｚｎフィンガー領域やＲｕｂｒｅｄｏｘｉｎ様モチーフよりも、ヘムエリスリン領域に主に結合することが確認された。また、シロイヌナズナのＢＴＳタンパク質も、ＯｓＨＲＺ１タンパク質及びＯｓＨＲＺ２タンパク質と同様に、鉄及び亜鉛との結合を示したことから、ヘムエリスリン様の鉄・亜鉛結合性タンパク質が植物種間で保存されていることが見出された。【００５５】
[ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネにおける鉄欠乏耐性能の確認]
ＯｓＨＲＺの機能を調べるため、ＲＮＡｉ法によりＯｓＨＲＺの発現を抑制した形質転換イネを作製した。具体的には、ＯｓＨＲＺ２の３’ＵＴＲ全長およびコーディング領域の一部に相当する３３５ｂｐの断片（配列番号５で表される塩基配列）を増幅し、この増幅産物をｐＥＮＴＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）ｖｅｃｔｏｒに挿入した。次いで、ＬＲクロナーゼ反応により、この断片をデスティネーションベクターｐＩＧ１２１−ＲＮＡｉ−ＤＥＳＴ（Ｏｇｏ， Ｙ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｐｌａｎｔ  Ｊ． （２００７） ｖｏｌ．５１， ｐｐ．３６６−３７７）に、正逆両方向に１コピーずつリンカー配列を介して挿入して、発現ベクターを作製した。
次いで、定法に従い、ＯｓＨＲＺ２の発現が抑制された３つの形質転換体（２ｉ−１〜２ｉ−３）を作出した（Ｈｉｅｉ， Ｙ．，ｅｔ． ａｌ．， Ｐｌａｎｔ   Ｊ． （１９９４） ｖｏｌ．６， ｐｐ．２７１−２８２； Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｐｌａｎｔａ （２００１） ｖｏｌ．２１２， ｐｐ．８６４−８７１）。
作出した形質転換体を鉄欠乏条件下７日間栽培し、上述した定量ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて各形質転換体におけるＯｓＨＲＺ２のｍＲＮＡの発現レベルを調べた。
図８に示すように、これらの形質転換体においては、ＯｓＨＲＺ２の発現抑制が確認された。更に、これらの形質転換体は、通常の栽培条件下で、顕著な表現型を示すことなく健全に生長することが確認された。
また、鉄欠乏栽培条件が、これらの形質転換体に与える影響を調べるために、鉄欠乏栽培条件下での最新葉におけるクロロフィル含量を定量した。結果を図９に示す。図９中、縦軸は、最新葉中のクロロフィル（ＳＰＡＤ値）を示し、横軸は、鉄欠乏栽培条件下での栽培日数を示す。図９に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の葉は、未処理（ＮＴ）のイネの葉と比較して、鉄欠乏条件下においても高いクロロフィル含量を示した。このことから、形質転換体は鉄欠乏栽培条件に対して耐性を示すことが確認された。【００５６】
更に、有効鉄含有量の少ない特殊土壌におけるこれらの形質転換体の生育状態を評価すべく、本発明者は石灰質土壌におけるこれらの形質転換体の長期試験を行った。結果を図１０に示す。図１０中、縦軸は最新葉中のクロロフィル量（ＳＰＡＤ値）を示し、横軸は移植後の栽培日数を示す。
図１０に示すように、移植後２０日以内に、葉中のクロロフィル量の減少は、すべてのイネにおいて観察された。しかしながら、この減少の度合いは、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の方が未処理のイネよりも少ないことが確認された。更に、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の葉中のクロロフィル量は、移植後２２日以降徐々に回復した。図１１に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の苗丈が鉄欠乏耐性を反映している。収穫期において、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株は未処理（ＮＴ）のイネと比較して、高い稲わらの資源量及び穀物の収穫量を示すことが確認された。【００５７】
更に、発明者は、イネのゲノム遺伝子に、Ｔ−ＤＮＡを挿入させたＯｓＨＲＺ１破壊株、及び、Ｔｏｓ１７を挿入させたＯｓＨＲＺ２破壊株を取得して解析した。ＯｓＨＲＺ１破壊株は、韓国ＰＯＳＴＥＣＨ（Ｐｏｈａｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）より取得した３Ａ−０６０６６株である。ＯｓＨＲＺ２破壊株は、イネゲノムリソースセンターより取得したＮＤ６０５９株である。図２は、ＯｓＨＲＺ１破壊株及びＯｓＨＲＺ２破壊株における、挿入配列（ｈｒｚ１−１，ｈｒｚ２−１）のゲノムへの挿入状態を示す。
ＯｓＨＲＺ１破壊株及びＯｓＨＲＺ２破壊株の約０．１ｃｍ２の葉断片から、１００μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）・０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡをＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、ＰＣＲに供した。結果を図１２に示す。
図１２中、矢印は、用いたプライマーを示し、図２において示されるゲノムＤＮＡ上にアニールするプライマーに対応する。
図１２に示すように、ｈｒｚ１−１及びｈｒｚ２−１は、それぞれＯｓＨＲＺ１及びＯｓＨＲＺ２に特異的に遺伝子断片の挿入が起こっていることが確認された。
これらの破壊株を鉄欠乏条件下で水耕栽培し、最新葉中のクロロフィル量を定量した。結果を図１３に示す。図１３中、縦軸は最新葉中のクロロフィル量（ＳＰＡＤ値）を示し、横軸は鉄欠乏条件下の栽培日数を示す。図１３（ａ）は未処理（野生株：ＷＴ）のイネとＯｓＨＲＺ１破壊株における最新葉中のクロロフィル量を示し、図１３（ｂ）は未処理（野生株：ＷＴ）のイネとＯｓＨＲＺ２破壊株における最新葉中のクロロフィル量を示す。図１３に示すように、ＯｓＨＲＺ１破壊株は、未処理のイネよりもわずかに高いクロロフィル量を保持していた。また、ＯｓＨＲＺ２破壊株は、未処理のイネよりも明確に高いクロロフィル量を保持しており、鉄欠乏栽培条件に対して耐性を示すことが確認された。【００５８】
[ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの葉における鉄蓄積の確認]
ＯｓＨＲＺ発現抑制株の鉄欠乏栽培条件に対する耐性機構を調べるため、７日間水耕栽培をしたイネの葉における金属濃度を定量した。結果を図１４に示す。図１４中、横軸は用いたイネの種類を示し、縦軸は葉中の鉄含有量を示す。図１４に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の葉は未処理株の葉と比較して、鉄十分条件下（図１４（ａ））及び鉄欠乏条件下（図１４（ｂ））のどちらにおいても高濃度の鉄を蓄積していることが確認された。【００５９】
[ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの稲わら及び種子における鉄と亜鉛の蓄積の確認]
ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの可食部における鉄の蓄積を調べるため、ポット栽培をしたイネの稲わら及び種子における鉄濃度を定量した。
稲わらにおける鉄蓄積の結果を図１５に示し、種子における鉄蓄積の結果を図１６に示す。図１５及び図１６中、横軸は用いたイネの種類を示し、縦軸は稲わら又は種子中の鉄含有量を示す。図１５（ａ）及び図１６（ａ）は、石灰質土壌を用いた鉄欠乏条件下における結果を示し、図１５（ｂ）及び図１６（ｂ）は、通常の土壌を用いた鉄十分条件下における結果を示す。
図１５及び図１６に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の稲わら及び種子は、未処理株の稲わら及び種子と比較して、鉄十分条件下（図１５（ｂ）及び図１６（ｂ））及び鉄欠乏条件下（図１５（ａ）及び図１６（ａ））のどちらにおいても、高濃度の鉄を蓄積していることが確認された。この結果から、稲わらは可食部ではないが、本発明を葉菜類等の鉄富化に適応可能であると考えられる。【００６０】
同様に、隔離圃場内の通常土壌で栽培された玄米及び白米における鉄の蓄積を調べた。
結果を図１７に示す。図１７（ａ）は、玄米における結果を示し、図１７（ｂ）は、白米における結果を示す。図１７（ａ）及び図１７（ｂ）のどちらにおいてもＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子は、未処理株の種子と比較して高濃度の鉄を蓄積していたことから、ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの可食部における高濃度の鉄の蓄積が確認された。【００６１】
また、ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの可食部における亜鉛の蓄積を調べるため、ポット栽培をしたイネの種子における亜鉛濃度を定量した。図１８（ａ）は、石灰質土壌を用いた鉄欠乏条件下における結果を示し、図１８（ｂ）は、通常の土壌を用いた鉄十分条件下における結果を示す。図１８に示すように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子は未処理株の種子と比較して、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下（図１８（ａ）及び図１８（ｂ））のどちらにおいても、高濃度の亜鉛を蓄積していることが確認された。
同様のイネについて、隔離圃場内の通常土壌で栽培された玄米及び白米における亜鉛の蓄積を調べた。結果を図１９に示す。図１９（ａ）は、玄米における結果を示し、図１９（ｂ）は、白米における結果を示す。図１９（ａ）及び図１９（ｂ）のどちらにおいても、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の種子は未処理株の種子と比較して、高濃度の亜鉛を蓄積していたことから、ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの可食部における高濃度の亜鉛の蓄積が確認された。【００６２】
更に、上記と同様の通常の土壌を用いたポット試験を、ＯｓＨＲＺ１破壊株（ｈｒｚ１−１）及びＯｓＨＲＺ２破壊株（ｈｒｚ２−１）を用いて行った。結果を図２０に示す。
図２０（ａ）は、ＯｓＨＲＺ１破壊株（ｈｒｚ１−１）の種子における鉄蓄積の結果を示し、図２０（ｂ）は、ＯｓＨＲＺ２破壊株（ｈｒｚ２−１）の種子における鉄蓄積の結果を示す。図２０（ａ）及び図２０（ｂ）のどちらにおいても、未処理のイネ（野生株：ＷＴ）の種子と比較してＯｓＨＲＺ破壊株の種子が高濃度の鉄を蓄積していた。このことから、ＯｓＨＲＺ破壊株の可食部における高濃度の鉄の蓄積が確認された。
また、同様の栽培条件でＯｓＨＲＺ破壊株の種子における亜鉛の蓄積を調べた。結果を図２１に示す。図２１（ａ）は、ＯｓＨＲＺ１破壊株（ｈｒｚ１−１）の種子における亜鉛蓄積の結果を示し、図２１（ｂ）は、ＯｓＨＲＺ２破壊株（ｈｒｚ２−１）の種子における亜鉛蓄積の結果を示す。図２１（ａ）及び図２１（ｂ）のどちらにおいても、未処理のイネ（野生株：ＷＴ）の種子と比較して、ＯｓＨＲＺ破壊株の種子が高濃度の亜鉛を蓄積していた。このことから、ＯｓＨＲＺ破壊株の可食部における高濃度の亜鉛の蓄積が確認された。【００６３】
また、同様の栽培条件でＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらにおける鉄及び亜鉛の蓄積を調べた。結果を図２２及び図２３に示す。図２２は、ＯｓＨＲＺ破壊株（ｈｒｚ１−１及びｈｒｚ２−１）の稲わらにおける鉄蓄積の結果を示し、図２３は、ＯｓＨＲＺ破壊株（ｈｒｚ１−１及びｈｒｚ２−１）の稲わらにおける亜鉛蓄積の結果を示す。図２２及び図２３のどちらにおいても、未処理のイネ（野生株：ＷＴ）の稲わらと比較してＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらが高濃度の鉄・亜鉛を蓄積していた。このことから、ＯｓＨＲＺ破壊株の稲わらにおける高濃度の鉄・亜鉛の蓄積が確認された。【００６４】
以上、ＯｓＨＲＺの発現を抑制した形質転換イネ及びＯｓＨＲＺ破壊株の両方で同じ表現型を示したことから、ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制することにより、イネの可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上することが確認された。【００６５】
[ＯｓＨＲＺ遺伝子の発現を抑制したイネの根における鉄取り込み関連遺伝子や鉄移行関連遺伝子の発現増強の確認]
発明者は、４４Ｋマイクロアレイ解析を行い、鉄十分条件下及び鉄欠乏条件下で水耕栽培されたＯｓＨＲＺ２発現抑制株（２ｉ−１〜２ｉ−３）の遺伝子発現プロファイルを調べた。イネ４４Ｋマイクロアレイ（アジレントテクノロジーズ社製）は、イネ全長ｃＤＮＡプロジェクトから得られた配列情報に基づいて、４３１４４種類の６０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを含んでいる。水耕栽培したＯｓＨＲＺ２発現抑制株の根から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）を用いて全ＲＮＡを調製した。マイクロアレイハイブリダイゼーション、データ取り込み、及びデータ解析を以前報告した内容に沿って行い（Ｏｇｏ， Ｙ．， ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ． （２００６） ｖｏｌ．５７， ｐｐ．２８６７−２８７８）、発現比を（ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の平均シグナル値）／（未処理（ＮＴ）のイネの平均シグナル値）として算出した。結果を図２４に示す。【００６６】
図２４は、各種遺伝子の発現プロファイルを示した図である。図２４に示されるように、ＯｓＨＲＺ２発現抑制株の根において、特に鉄十分条件下で、多種の鉄取り込み関連遺伝子や鉄移行関連遺伝子の発現増強が示された。
さらに、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、鉄十分条件下におけるマイクロアレイ解析の結果を検証した。結果を図２５に示す。図２５中、横軸は用いたイネを示し、縦軸は各遺伝子（ＯｓＩＲＯ２，ＯｓＮＡＳ２，ＯｓＹＳＬ２）のｍＲＮＡの発現強度を示す。図２５に示すように、各遺伝子の発現変化は、マイクロアレイ解析の結果と一致していることが確認された。
これらのことから、ＯｓＨＲＺタンパク質は、鉄欠乏に応答する負の制御因子であり、ＯｓＨＲＺタンパク質の発現を抑制することにより、主に鉄十分条件下における鉄取り込み関連遺伝子や鉄移行関連遺伝子の発現抑制を解除できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、鉄欠乏耐性が向上した植物を取得することができるので、可溶化した鉄分が少ないアルカリ性の土壌等でも生育可能な作物を取得することができる。
さらに、本発明によれば、可食部に鉄と亜鉛、とりわけ鉄を顕著に蓄積する植物を取得することができるので、鉄欠乏症及び亜鉛欠乏症を軽減する作物を取得することができる。
特に、本発明によれば、上記の鉄欠乏耐性と可食部への鉄・亜鉛蓄積を同時に兼ね備えた形質が得られるので、半乾燥地帯や石灰質傾向土壌などの潜在的に鉄欠乏に陥りやすい栽培条件において安定的に鉄富化食物を生産するのにきわめて有利であると考えられる。
したがって、本発明は「新規鉄・亜鉛結合性制御因子と、その発現調節による植物の鉄欠乏耐性向上及び可食部への鉄・亜鉛蓄積の促進技術」に好適に利用でき、産業上極めて有用である。
【要約】
本発明により、石灰質土壌において通常の植物よりも優れた生育を示し、石灰質土壌及び優良土壌の双方において鉄及び亜鉛を多量に蓄積できる形質転換体及び遺伝子破壊株、並びに、これらを作出するために用いられる遺伝子、ベクター、タンパク質、抗体、鉄欠乏耐性及び可食部への鉄・亜鉛蓄積が向上した植物の作出方法・作出用組成物・作出用キット・育種方法が提供される。本発明のタンパク質は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか一つのアミノ酸配列からなり、かつ鉄・亜鉛結合性制御因子であることを特徴とする。（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列、（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されているアミノ酸配列、（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と同一性が８０％以上であるアミノ酸配列。【図１】
0005553324.tif 000002
【図２】
0005553324.tif 000003
【図３】
0005553324.tif 000004
【図４】
0005553324.tif 000005
【図５】
0005553324.tif 000006
【図６】
0005553324.tif 000007
【図８】
0005553324.tif 000008
【図９】
0005553324.tif 000009
【図１０】
0005553324.tif 000010
【図１３】
0005553324.tif 000011
【図１４】
0005553324.tif 000012
【図１５】
0005553324.tif 000013
【図１６】
0005553324.tif 000014
【図１７】
0005553324.tif 000015
【図１８】
0005553324.tif 000016
【図１９】
0005553324.tif 000017
【図２０】
0005553324.tif 000018
【図２１】
0005553324.tif 000019
【図２２】
0005553324.tif 000020
【図２３】
0005553324.tif 000021
【図２４】
0005553324.tif 000022
【図２５】
0005553324.tif 000023
【図７】
0005553324.tif 000024
【図１１】
0005553324.tif 000025
【図１２】
0005553324.tif 000026
【配列表】
0005553324000001.app