(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの肝臓組織由来の細胞からなるインビトロ細胞培養物であって、該培養物中の該細胞は、
ａ．ＣＤ１１７＋、ＣＤ３４＋、Ｌｉｎ−、ＣＫ１９−、アルブミン−およびＣＤ４５−であり；
ｂ．培養物中で増殖し得；そして
ｃ．インビトロで肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へ分化し得る、
細胞であり、ここで、該培養物は、付着培養物である、培養物。
【請求項２】
請求項１に記載の培養物であって、前記培養物は、少なくとも６回、倍加し得る、培養物。
【請求項３】
請求項１に記載の培養物であって、前記培養物は、少なくとも１２回、倍加し得る、培養物。
【請求項４】
ヒトの肝類洞細胞をインビトロで生成する方法であって、該方法は、
ａ．請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養物からの細胞からなる細胞懸濁物を提供する工程；
ｂ．該細胞懸濁液を培養する工程；ならびに
ｃ．血管内皮成長因子を含有する培地中で該細胞の子孫を分化させる工程
を包含する、方法。
【請求項５】
前記ヒト肝類洞細胞が、Ｆｌｋ−１＋、ＣＤ３１−およびＣＤ１４４−である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ヒトの肝臓の肝細胞または胆管細胞をインビトロで生成する方法であって、該方法は、
ａ．請求項１〜３のいずれかに記載の細胞培養物からの細胞からなる細胞懸濁物を提供する工程；
ｂ．該細胞懸濁液を培養する工程；ならびに
ｃ．ＥＧＦおよびＨＧＦを含有する培地中で該細胞の子孫を分化させる工程
を包含する、方法。
【請求項７】
前記ヒトの肝臓の肝細胞および胆管細胞がｃ−Ｍｅｔ＋である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肝細胞、または胆管細胞または類洞細胞へインビボで分化する、ヒトの肝臓前駆細胞の集団を生成する方法であって、ＣＤ１１７＋、ＣＤ３４＋、Ｌｉｎ−、ＣＫ１９−、アルブミン−およびＣＤ４５−である細胞を、ヒトの肝臓由来細胞の集団から選択する工程を包含し、ここで、培養物は、付着培養物である、方法。
【請求項９】
肝細胞の増殖、分化、または生存をもたらす化合物についてスクリーニングする方法であって、該方法は、
ａ．請求項１〜３のいずれかに記載のインビトロ細胞培養物を提供する工程；
ｂ．該培養物を該試験化合物に接触させる工程；ならびに
ｃ．該化合物が、肝細胞の増殖、分化、または生存をもたらすかどうかを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、該方法は、工程ｂを実施する前に、前記培養物の分化を誘導する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
試験化合物の代謝産物を決定するインビトロでの方法であって、該方法は、
ａ．請求項１〜３のいずれかに記載のインビトロ細胞培養物を提供する工程；
ｂ．該培養物を試験化合物に接触させる工程；ならびに
ｃ．該培養物とインキュベーションした後に、該試験化合物由来の代謝産物を同定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、工程ｂを実施する前に、前記培養物の分化を誘導する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１３】
試験化合物の抗ウィルス活性を決定するインビトロでの方法であって、該方法は、
ａ．請求項１〜３のいずれかに記載のインビトロ細胞培養物を提供する工程；
ｂ．該培養物をウィルスおよび試験化合物に接触させる工程；ならびに
ｃ．該培養物の生存率をコントロール細胞培養物と比較する工程；
を包含し、該コントロール培養物と比較された該培養物の生存率の増加が、該試験化合物の抗ウィルス活性を示している、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、該方法は、工程ｂを実施する前に、前記培養物の分化を誘導する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、前記ウィルスは、肝臓栄養性ウィルスである、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、前記肝臓栄養性ウィルスは、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、またはＣ型肝炎ウィルスである、方法。
【請求項１７】
ウィルスの感染性を決定するインビトロでの方法であって、該方法は、
ａ．請求項１〜３のいずれかに記載のインビトロ細胞培養物を提供する工程；
ｂ．該培養物をウィルスに接触させる工程；ならびに
ｃ．該ウィルスが、該細胞培養物中の該細胞の増殖または生存に対する効果を有するかどうかを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、該方法は、工程ｂを実施する前に、前記培養物の分化を誘導する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１７に記載の方法であって、前記ウィルスは、肝臓栄養性ウィルスである、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記肝臓栄養性ウィルスは、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、またはＣ型肝炎ウィルスである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、前駆細胞に関する。  
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
急性肝不全は、依然として高い死亡率を有する重大な問題である。肝機能障害および肝不全を生じる疾患の発症率が高いにもかかわらず、内科的治療における主な進歩は、現在、特定の形態のウィルス性肝炎の予防および処置に限られている。急性および慢性の肝疾患は、治療的なアプローチよりも対症的なアプローチで、依然として処置されている。同所性肝移植は、今までのところ、末期の肝疾患を有する患者のための唯一利用可能な治療である。残念なことに、ドナーの臓器のアベイラビリティは制限されているので、多くの患者が、肝臓移植を待ちながら毎年亡くなっている。最近では、正常肝細胞を罹患した肝臓へと移植することが、代替治療として用いられている。しかし、臓器ドナーの不足が、肝細胞移植の臨床適用を制限している。
【０００３】
幹細胞およびそれらの子孫細胞を用いた細胞治療は、肝疾患を有する患者のための、大部分が未対処の医学的必要性に対する有望な新しいアプローチである。多くの研究が、実験的に誘導した急性肝不全において、（肝外肝臓組織および肝内肝臓組織から得られた）幹／前駆細胞の移植の可能性を調べている。成人の臓器由来の幹／前駆細胞は、機能性の肝細胞を産出し得るが、このような細胞は、稀である。遺伝性疾患および後天性疾患を回復するための肝臓前駆細胞移植に関する臨床治療プロトコルは、完全に発達した機能を依然として保持したままの細胞を大量に生じる能力に、大いに恩恵を受ける。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、機能性の肝細胞へと分化し得る肝臓前駆細胞の供給源に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、肝臓前駆細胞の発見に基づいている。前駆細胞は、多分化能細胞である。前駆細胞は、（例えば、インビボまたはインビトロで）肝細胞（例えば、肝細胞、胆管細胞、または肝臓内皮細胞（すなわち、類洞細胞））へと分化することが可能である。従って、本発明は、肝臓前駆細胞培養物（例えば、インビトロ培養物）を特色とする。この培養物は、付着培養物である。あるいは、培養物中の細胞は、懸濁液中にある。この細胞は、肝臓組織（例えば、胎児肝臓組織）由来である。上記組織は、哺乳動物（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ）由来である。上記細胞は、ＣＤ１１７およびＣＤ３４に対して免疫反応性であり、Ｌｉｎには免疫反応しない。上記細胞は、インビトロで増殖する。上記細胞は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１５回、２０回、２５回またはそれ以上倍加することが可能であり、そして肝細胞、胆管細胞、または肝臓内皮細胞へと分化する能力を保持する。
【０００６】
さらに提供されるものは、１つ以上の分化因子を含有する培養培地中で肝臓前駆細胞培養物を分化させることにより、肝細胞、胆管細胞、または肝臓内皮細胞を生成する方法である。分化因子としては、例えば、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）および表皮成長因子（ＥＧＦ）が挙げられる。
【０００７】
本発明はさらに、ＣＤ１１７＋、ＣＤ３４＋、およびＬｉｎ−のヒト肝臓前駆細胞を提供し、そしてその細胞を宿主へ移植することにより、（例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタのような哺乳動物である）宿主中に、前駆細胞または前駆細胞の子孫を移植する方法を、特徴とする。必要に応じて、肝臓の間質細胞または間葉細胞は、宿主中に共移植される。宿主は、前駆細胞の前、後、または同時に肝細胞増殖因子を投与される。宿主は、肝臓障害または肝臓組織損傷に罹患している。例えば、被験体は、肝炎、肝硬変、肝臓癌、脂肪肝疾患、ライ症候群、糖原病、肝嚢腫、またはウィルソン病を罹患している。移植は、臨床上の利益（例えば、特定の肝臓障害の１つ以上の症状を軽減すること）を与える。肝臓障害は、当該分野で公知の方法を使用して、医師によって診断される。
【０００８】
肝細胞の増殖、分化、または生存をもたらす化合物は、肝臓前駆細胞培養物を試験化合物に接触させ、そして、その化合物が肝臓前駆細胞の増殖、分化、または生存に対する効果を有するかどうかを決定することによって、同定される。同様に、試験化合物の代謝産物が決定される。代謝産物は、培養物を試験化合物に接触させた後、培養培地をスクリーニングすることにより同定される。代謝産物は、当該分野で公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ、質量分析、またはゲル電気泳動）によって同定される。試験化合物の抗ウィルス活性は、試験化合物の存在下または非存在下で、ウィルスを前駆細胞培養物へと導入し、その細胞の生存率を決定することによって決定される。試験化合物の非存在下と比較した、試験化合物の存在下における生存率の増加は、この試験化合物が抗ウィルス活性を有することを示す。ウィルスの感染性は、前駆細胞培養物をウィルスに接触させ、そしてこの細胞における増殖または生存の効果を決定することによって決定される。ウィルスと接触させなかった細胞培養物と比較した、生存または増殖の減少は、このウィルスが肝細胞に感染し得ることを示す。その一方、ウィルスと接触させなかった細胞培養物と比較した、生存または増殖における類似性は、このウィルスが肝細胞に感染しないことを示す。
【０００９】
必要に応じて、培養物は、その培養物を試験化合物に接触させる前に、分化する。増殖および／または生存は、当該分野で公知の方法（例えば、ＢｒｄＵアッセイ）によって決定される。分化は、肝細胞表面マーカーを形態学的かまたは組織学的に決定することによって決定される。ウィルスは、肝臓栄養性ウィルス（例えば、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、またはＣ型肝炎ウィルス）である。
【００１０】
他に規定されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるような同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたはそれらと同等である方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が、以下に記載される。本明細書中で言及された他のすべての刊行物、特許出願、特許、および参考文献は、その全体が参考して援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が統制する。さらに、材料、方法、実施例は、例示するのみであり、限定されることを意図しない。
【００１１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および上記特許請求の範囲から明かである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（詳細な説明）
本発明は、数世代の間インビトロで拡張しかつ祖先の表現型を維持する、ヒト胎児肝臓内の非造血性前駆細胞の規定された集団における予想外の発見に基づいている。これらの細胞は、急性肝損傷を有する動物へと移植される際に、肝細胞、胆管細胞、および類洞細胞への機能的な分化を示した。
【００１３】
肝臓疾患としては、世界的にみて顕著な罹患率および死亡率に関連する、広範囲にわたる急性的な状態および慢性的な状態の両方が挙げられる。肝細胞移植は、肝臓疾患の処置において強大な治療的潜在能力を有するが、肝細胞移植の臨床的使用は、ドナー組織の不足によって阻まれている。成人または胎児の肝細胞前駆体からのインビトロでの肝細胞の生成、または成熟肝細胞をインビボで生成し得る前駆体集団の同定は、この問題を解決する。本明細書中に記載されたデータは、ヒト胎児肝臓からの規定された細胞集団の同定を実証する。このヒト胎児肝臓は、エキソビボで数世代の間、首尾よく拡張され、そして急性肝損傷を有する動物へと移植される際に、肝細胞、胆管細胞、および類洞細胞への機能的な分化を示す。肝臓前駆細胞のインビトロで成功した拡張および分化は、肝細胞移植、候補治療薬の代謝試験および毒性試験、ならびに遺伝子治療のビヒクルに有用である。
【００１４】
本発明は、インビトロまたはインビボ（すなわち、インサイチュ）で増殖させるためにヒト胎児肝臓組織からの多分化能肝臓前駆細胞を誘導して、肝細胞、胆管細胞、および類洞細胞へと分化することが可能な多分化能ヒト前駆細胞の子孫を大量に生成するための方法を提供する。ヒト肝臓前駆細胞の子孫を分化するための方法もまた、提供される。
【００１５】
（ヒト肝臓前駆細胞）
本発明は、ヒト肝臓前駆細胞（本明細書中でＬＰＣと呼ばれる）を提供する。ＬＰＣ細胞は、本発明の方法を用いて増殖させるために誘導され得る未分化細胞である。ＬＰＣは、各細胞分裂において、少なくとも１つの娘細胞がまたＬＰＣ細胞であるように、自己保持することが可能である。ＬＰＣは、１００倍、２５０倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍以上、拡張されることが可能である。
【００１６】
ＬＰＣの表現型決定は、これらの細胞が、どの関係付けられた（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）肝細胞マーカーも発現しないが、この細胞が幹細胞マーカーを発現することを明らかにする。例えば、ＬＰＣは、ＣＤ１１７およびＣＤ３４の両方に対して免疫反応性であり、そして系統表面抗原（Ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）（Ｌｉｎ）に対しては非免疫反応性である。ＬＰＣは、多分化能前駆細胞である。多分化能前駆細胞とは、この細胞が１つより多くの細胞型へと分化することが可能であることを意味する。例えば、その細胞は、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へと分化することが可能である。
【００１７】
ＣＤ１１７はまた、ｃ−ｋｉｔ（造血幹細胞因子（ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ）レセプターまたは幹細胞因子レセプター）としても公知である。ＣＤ１１７は、ＩＩＩクラスレセプターチロシンキナーゼファミリーに属する、１４５ｋＤの細胞表面糖タンパク質である。これは、多分化能造血性幹細胞を含む大多数の造血前駆細胞上で発現され、同様に関係付けられた骨髄性前駆細胞、赤血球系前駆細胞、およびリンパ系前駆細胞上でも発現される。ＣＤ１１７はまた、わずかな成熟造血性細胞（例えば、肥満細胞）上で発現される。ＣＤ３４は、ヒトのリンパ系造血性前駆細胞および骨髄性造血性前駆細胞上で発現された１１０ｋＤの単鎖膜貫通糖タンパク質である。系統表面抗原とは、異なる１４個の細胞表面タンパク質のうちの１３個が成熟血液細胞系統のマーカーである場合の混合物である。
【００１８】
ＬＰＣは、胎児の肝臓組織から得られる。肝臓組織は、肝臓組織を有する任意の動物（例えば、魚、爬虫類、鳥、両生類、および哺乳動物（例えば、好ましくは、マウスのようなげっ歯類およびヒト））から入手され得る。この組織は、少なくとも４週齢、５週齢、６週齢、７週齢、８週齢、９週齢、１０週齢以上の胎児から得られる。ＬＰＣは、全体の胎児肝臓のうちのおよそ０．５〜０．７％に相当する。
【００１９】
ＬＰＣは、インビトロの長期培養において維持され得る。ＬＰＣは、培養中で２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回以上継代されることが可能である。
【００２０】
移植の前には、新たに単離されたＬＰＣ（ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞）は、アルブミンおよびＣＫ１９を発現しなかった。しかし、移植後には、これらの細胞は、成熟肝細胞および胆管細胞へと分化された。このことは、ヒトのアルブミン、ＣＫ１９、Ｇ−６−Ｐ、ＧＧＴ、ＤＰＰＩＶ、およびグリコーゲンの発現によって決定され、そして、これらの細胞は高い増殖能力を有していた。肝臓前駆細胞は、２つの造血性関連マーカー（ｃ−ｋｉｔおよびＣＤ３４）を発現したが、非造血性細胞から造血性細胞を区別するマーカーであるＣＤ４５は、発現しなかった。従って、本明細書中に記載される大規模な増殖能力を有するＬＰＣは、造血性起源ではない。さらに、インビトロで成人造血性幹細胞を拡張する限定された能力とは異なり、胎児肝臓からの肝臓前駆体は、高い増殖能力を有する。単離されたＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／ｌｉｎ−細胞のすべてが、インビトロでの培養の間に、培養プレートに付着し、そして肝細胞へと分化するわけではなかったという観察は、これらの細胞の部分集団のみが肝細胞の前駆体であることを示す。ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／ｌｉｎ−細胞は、ＨＧＦおよびＥＧＦを含有する培地中で培養した場合、４タイプの細胞（ＡＬＢ−ＣＫ１９−肝細胞、ＡＬＢ＋ＣＫ１９＋肝細胞、ＡＬＢ＋ＣＫ１９−肝細胞、およびＡＬＢ−ＣＫ１９＋胆管細胞）を生じた。ダブルネガティブ細胞を除いてすべての他の部分集団は、増殖細胞（ＢｒｄＵ＋）を高い比率で有した。ＡＬＢ−ＣＫ１９−細胞の部分セットは、インビトロで非常に静止状態であったが、インビボでのＰ０継代において移植された細胞数の１０倍の増加は、これらの細胞が、高い増殖能力を有し得ることを示す。肝臓前駆細胞の高い増殖能力にもかかわらず、腫瘍は、ヒトの細胞移植の４週間後にインビボで観察されなかった。興味深いことに、早期胎児肝臓からのＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞は、ＶＥＧＦを含有する倍地中で培養した場合、肝細胞および胆管細胞へと分化しただけでなくまた、類洞内皮細胞へ、分化した。
【００２１】
（培養条件）
ＬＰＣは、本明細書中に記載された方法を用いて増殖される。細胞は、ドナー組織の連結している細胞外マトリクスから個々の細胞を分離することによって、その組織から入手される。胎児からの組織は、滅菌手順を用いて除去され、そして細胞は、酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼなど）を用いる処置を含む当該分野で公知の任意の方法を用いてか、または例えば鈍器もしくはホモジナイザーを用いる物理的な分離方法を用いて、分離される。胎児細胞の分離は、組織培養培地中で行われ得る。
【００２２】
例えば、細胞の分離は、０．１％トリプシンおよび０．０５％ＤＮａｓｅを含むＤＭＥＭ中で行われ得る。分離された細胞は、２００〜２０００ｒｐｍの間（通常は４００〜８００ｒｐｍの間）の低速で遠心分離され、そして次いで、培養培地中に再懸濁される。肝細胞は、懸濁液中かまたは固定された基質上で培養され得る。分離された細胞懸濁液は、細胞を支持することが可能な任意の容器中（具体的には、培養フラスコ、培養プレート、またはローラー瓶、そしてより具代的には、２５ｃｍ２培養フラスコのような小さな培養フラスコ中）に播種される。懸濁液中で培養された細胞は、およそ５×１０４〜２×１０５（細胞／ｍｌ）（例えば、１×１０５（細胞／ｍｌ））で再懸濁される。固定された基質上にプレートされた細胞は、およそ２〜３×１０３（細胞／ｃｍ３）でプレートされる。必要に応じて、培養プレートは、コラーゲンのようなマトリクスタンパク質で被覆される。分離された肝細胞は、細胞増殖を支持することが可能な任意の公知の培養培地（ＨＥＭ、ＤＭＥＭ、ＰＲＭＩ、Ｆ−１２などを含む）へと配置され得る。この培地は、細胞代謝に必要な補充物（例えば、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネラル、およびトランスフェリンのようなタンパク質など）を含有する。培養培地はまた、酵母、細菌、および真菌類による汚染を防ぐための抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンなど）を含み得る。培養培地は、ウシ、ウマ、ニワトリなどに由来する血清を含み得る。
【００２３】
培養条件は、生理学的条件に近いべきである。培養培地のｐＨは、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８の間、ｐＨ約７〜７．８の間、またはｐＨ７．４）に近いべきである。生理学的温度の範囲は、約３０℃〜４０℃の間である。ＬＰＣは、約３２℃〜約３８℃の間（例えば、約３５℃〜約３７℃の間）の温度にて培養される。
【００２４】
必要に応じて、培養培地は、少なくとも１つの増殖誘導（「マイトジェン」）成長因子を補充される。「成長因子」とは、ＬＰＣに対する成長効果、増殖誘導効果、分化誘導効果、または栄養効果を有する、タンパク質、ペプチド、または他の分子である。「増殖誘導成長因子」は、ＬＰＣを増殖させることを可能にする栄養因子であり、細胞の表面上のレセプターと結合して、細胞に栄養効果または成長誘導効果を与える任意の分子を含む。増殖誘導成長因子としては、ＥＧＦ、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦまたはＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦまたはＦＧＦ−２）、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、ＶＥＧＦおよびこれらの組み合わせが挙げられる。成長因子は、通常、約１ｆｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの間の範囲の濃度で培養培地へと加えられる。約１〜１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で、通常は十分である。簡単な滴定アッセイは、特定の成長因子の最適濃度を決定するために容易に実施され得る。
【００２５】
成長因子および栄養因子の生物学的効果は、一般に、細胞表面のレセプターとの結合を介して仲介される。これら多くの因子に対するレセプターは、同定されてきており、そして特定のレセプターに対する抗体および分子プローブが、利用可能である。ＬＰＣは、分化のすべての段階において成長因子レセプターの存在について分析され得る。多くの場合、特定のレセプターの同定は、外因性成長因子または栄養因子の付加を伴う、特定の発生経路に沿ったさらなる細胞の分化における使用のためのストラテジーについての手引きを提供する。
【００２６】
一般に、インビトロで約３〜１０日後に、培地を吸引し、そして培養フラスコへ新鮮な培地を加えることによって、ＬＰＣを増殖する。必要に応じて、吸引された培地は、収集され、フィルタ処理され、そして次に続くＬＰＣの継代のための条件培地として使用される。例えば、１０％、２０％、３０％、４０％以上の条件培地が使用される。
【００２７】
ＬＰＣ細胞培養物は、増殖を再開するために用意に継代され得る。例えば、インビトロで約３〜７日後に、培養フラスコは、十分に振盪され、そして次いで、ＬＰＣは、５０ｍｌ遠心管へと移され、低速で遠心される。この培地は吸引され、ＬＰＣは、少量の培養培地中に再懸濁される。次いで細胞は、カウントされ、そして増殖を再開するために所望の密度にて再度プレートされる。この手順は、毎週繰り返され、各継代における生存可能な細胞数の対数的な増加をもたらし得る。この手順は、所望の数のＬＰＣが入手されるまで続けられる。
【００２８】
ＬＰＣおよびＬＰＣの子孫は、それらが必要とされるまで、当該分野における任意の公知の方法によって凍結保存され得る（例えば、米国特許出願第５，０７１，７４１号、ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９３／１４１９１号、同ＷＯ９５／０７６１１号、同ＷＯ９６／２７２８７号、同ＷＯ９６／２９８６２号、および同ＷＯ９８／１４０５８号、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、６５  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊ．２５２４−２５３６（１９９３）を参照のこと）。ＬＰＣは、等張液中、好ましくは、特定の凍結保存剤（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｎｔ）を含有する細胞培養培地中に懸濁され得る。このような凍結保存剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールなどが挙げられる。これらの凍結保存剤は、５〜５％（例えば、８〜１０％）の濃度で使用される。細胞は、−１０℃〜−１５０℃（例えば、−２０℃〜−１００℃、または−７０℃〜−８０℃）の温度まで徐々に凍結される。
（ヒト肝臓前駆細胞の分化）
培養条件に依存して、ＬＰＣは、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へと分化され得る。
【００２９】
ＬＰＣは、ＨＧＦおよびＥＧＦを有する培養培地中の固定された基質上でＬＰＣを培養することによって、肝細胞、または胆管細胞へと分化され得る。あるいは、ＬＰＣは、ＶＥＧＦを有する培養培地中の固定された基質上でＬＰＣを培養することによって、類洞細胞へと分化され得る。
【００３０】
ＬＰＣの分化はまた、成長を引き起こす生物学的事象のカスケードを活性化する当該分野で公知の任意の方法によって誘導され得る。この生物学的事象としては、イノシトール三リン酸塩および細胞内のＣａ２＋の遊離、ジアシルグリセロールの遊離、ならびにプロテインキナーゼＣおよび他の細胞キナーゼの活性化などが挙げられる。ホルボールエステル、分化誘導成長因子、および他の化学シグナルによる処置は、分化を誘導し得る。ＬＰＣの増殖のための増殖誘導成長因子（上記参照）の代わりに、分化誘導成長因子は、ＬＰＣの分化に影響を与えるために培養培地に加えられ得る。成長因子を誘導する他の分化としては、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、トランスホーミング成長因子β（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）などが挙げられる。
【００３１】
分化した肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞は、当該分野で公知の免疫細胞化学的技術を用いて検出される。免疫細胞化学（例えば、二重標識免疫蛍光法および免疫ペルオキシダーゼ法）は、肝細胞の細胞特徴または表現型特性を区別するために、細胞タンパク質を検出する抗体を使用する。肝細胞および胆管細胞に対する細胞マーカーとしては、アルブミンおよびＣＫ１０が挙げられ、一方で類洞細胞に対する細胞マーカーとしては、Ｆｌｋが挙げられる。他の適切なマーカーとしては、グルコース６ホスファターゼ、グリコーゲン、ジペピジルペプチダーゼＩＶ、γグルタリルトランスペプチダーゼが挙げられる。
【００３２】
免疫細胞化学はまた、例えば、アルブミン、α１−抗トリプシン、ＣＫ−１９、α胎児タンパク質、またはヒト第ＶＩＩＩ因子のような肝臓機能を担う肝臓遺伝子の発現を検出することによって、肝細胞を同定するために使用され得る。
【００３３】
インサイチュハイブリダイゼーション組織化学はまた、肝臓遺伝子のｍＲＮＡに特異的なｃＤＮＡプローブまたはＲＮＡプローブを用いて行われ得る。これらの技術は、特定の表現型の同定を増強するための免疫細胞化学的方法と組み合わされ得る。必要であれば、上で議論された抗体および分子プローブは、ウェスタンブロット手順およびノーザンブロット手順（それぞれが細胞の同定に役立つ）に適用され得る。
【００３４】
（ヒト肝臓前駆細胞の移植）
新しい細胞の損傷した肝臓への移植は、損傷した肝臓組織を修復し、それによって肝臓機能を回復する可能性を有する。必要に応じて胎児間質細胞および／またはＨＧＦは、ＬＰＣとともに共移植される。しかし、移植目的に適する細胞の欠如は、この手順が満たすべき最大の可能性を妨げている。「適切な」細胞とは、以下の基準：（１）大量に入手され得ること；（２）必要に応じて、遺伝物質の挿入を可能とするためにインビトロで増殖され得ること；（３）無制限に生存することが可能であり、肝臓における移植に対する肝臓修復を促進することが可能であること；そして（４）非免疫原性であり、好ましくは、患者自身の組織からかまたは適合し得るドナーから入手されることを、満たす細胞である。
【００３５】
胎児の肝臓組織から入手可能なＬＰＣ（これは、本明細書中に記載された培養条件を用いてインビトロで維持される場合に、長期間にわたって分裂することが可能である）は、肝臓移植目的に適する細胞の望ましい必要条件のすべてを満たし、かつ不死化されていない細胞として特に適切な細胞株であり、かつ腫瘍形成の発生源ではない。肝臓障害の処置におけるＬＰＣの使用は、動物モデルの使用によって実証され得る。
【００３６】
ＬＰＣは、異常な肝臓または肝不全症状を有する任意の動物に投与される。ＬＰＣは、宿主に対して異種であるドナー組織から調製され得る。異種移植を成功させるために、移植された組織に対する免疫応答を低減させるか排除する何らかの方法が、通常、利用される。従って、ＬＰＣレシピエントは、免疫抑制薬物（例えば、シクロスポリン）の使用を介してか、または局所的に適用された免疫抑制剤を利用する局所的免疫抑制ストラテジーを介して、免疫抑制され得る。局所的免疫抑制は、Ｇｒｕｂｅｒ、５４  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １−１１（１９９２）によって開示される。米国特許第５，０２６，３６５号は、局所的免疫抑制に適切なカプセル化方法を開示する。
【００３７】
免疫抑制技術の利用の代替として、胎児幹細胞における相同組み換えを用いる遺伝子置換法または遺伝子ノックアウト法（Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、３１７  Ｎａｔｕｒｅ  ２３０−２３４（１９８５）によって教示され、細胞株における遺伝子置換または遺伝子ノックアウトまで拡張された（Ｚｈｅｎｇら、８８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０６７−８０７１（１９９１））が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子の切除のために、ＬＰＣに適用され得る。ＭＨＣ発現を欠くＬＰＣは、同種異系を越えて濃縮された肝細胞集団の移植を可能にし、そしておそらくレシピエントを免疫抑制する必要なく異種間の組織適合性の障壁を越えて濃縮された肝細胞集団の移植でさえも可能にする。レシピエントを免疫抑制する必要なく組織適合性の障壁をなくす。ドナー細胞の抗原性を低減させるための組み換え方法の使用についての一般的な総説および引用はまた、Ｇｒｕｂｅｒ、５４  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １−１１（１９９２）によって開示される。表面修飾によって移植片の免疫原性を低減する例示的なアプローチは、ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９２／０４０３３号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４６３０号によって開示される。あるいは、移植片の免疫原性は、ＭＨＣ抗原を変化させたかまたは欠失させたトランスジェニック動物からＬＰＣを調製することによって低減され得る。
【００３８】
ＬＰＣは、マイクロカプセル化（例えば、本明細書中で参考として援用される、米国特許出願第４，３５２，８８３号；同第４，３５３，８８８号；および同第５，０８４，３５０号を参照のこと）、およびマクロカプセル化（例えば、それぞれが本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，２８４，７６１号；同第５，１５８，８８１号、同第４，９７６，８５９号、および同第４，９６８，７３３号、ならびにＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９２／１９１９５号および同第ＷＯ９５／０５４５２号を参照のこと）を含む、公知のカプセル化技術に従って、因子を宿主へと送達するためにカプセル化され得、かつ使用され得る。マクロカプセル化は、米国特許第５，２８４，７６１号；同第５，１５８，８８１号；同第４，９７６，８５９号；同第４，９６８，７３３号；同第５，８００，８２８号およびＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９５／０５４５２号において開示され、それぞれが本明細書中で参考として援用される。デバイス中の細胞数は、変動され得る；好ましくは、各デバイスは、１０３〜１０９の間の細胞を含む（例えば、１０５〜１０７の細胞）。複数のマクロカプセル化デバイスが、宿主中に移植され得る。
【００３９】
レシピエントの組織と同種異系である組織から調製されたＬＰＣは、レシピエントの組織適合性型とほぼ一致させるように、周知の組織型決定方法によって使用のために試験される。
【００４０】
ＬＰＣは時折、レシピエント自身の肝臓から調製され得る（例えば、腫瘍除去生検の場合）。このような場合、ＬＰＣは、分離された組織から生成され得、そして上述の方法を用いてインビトロで増殖され得る。適切な細胞数が増殖された際に、ＬＰＣは、収集され得、必要に応じて遺伝的に改変され得、そしてレシピエントの肝臓へと直接注入するために整えられ得る。
ＬＰＣは、肝臓移植片を形成し得る肝臓領域に投与され、その結果、その細胞は、隣接する肝細胞との通常の結合を形成し、移植されたかまたは既存の肝細胞との接触を維持する。従って、移植されたＬＰＣは、疾患および加齢が原因で損傷している肝臓組織を再構築する。
【００４１】
宿主の肝臓組織への移植片の機能的な組み込みは、種々の機能を回復することに関して移植片の有効性を検査することによって評価され得る。この検査としては、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスフォターゼ（ＡＬＰ）、アルブミン、総タンパク質、ならびに総ビリルビンおよび直接ビリルビンについての血液検査が挙げられる。
【００４２】
移植における使用のためにインビトロでＬＰＣを拡張する能力はまた、エキソビボの遺伝子治療にも有用である。従って、ＬＰＣは、エキソビボでの遺伝子治療試行におけるビヒクルとしての使用のために、肝臓細胞を回収および拡張するさらなる方法を提供する。
【００４３】
（肝臓前駆細胞の遺伝子改変）
ＬＰＣは、形質転換されてない初代細胞であるが、それらは、連続的な細胞株の特徴を保有する。未分化の状態において、ＬＰＣは、連続的に分裂し、そしてそれ故に、遺伝子改変の標的となる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞は、上述の任意の方法によって、肝細胞、胆管細胞、または類洞細胞へと分化されるように誘導される。
【００４４】
用語「遺伝子改変」とは、外来ＤＮＡの意図的な導入によって、ＬＰＣの遺伝子型を、安定にかまたは一時的に変更することをいう。ＤＮＡは、合成ＤＮＡまたは天然に由来するＤＮＡであり得、そして遺伝子、遺伝子部分、または他の有用なＤＮＡ配列を含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「遺伝子改変」とは、天然に起こる変化（例えば、天然のウィルス活性、天然の遺伝子組み換えなどを介して起こる変化）を含むことを意図しない。
【００４５】
細胞の有用な遺伝子改変のいずれもが、本発明の範囲内にある。例えば、ＬＰＣは、
生物学的に活性な物質（例えば、成長因子など）を生成するか、または生成を増加させるために改変され得る。一実施形態では、生物学的に活性な物質は、転写因子（例えば、遺伝的分化を調節する転写因子）である。代替的な実施形態では、生物学的に活性な物質は、非分裂促進的な増殖因子（例えば、ｖ−ｍｙｃ、ＳＶ−４０ラージＴ、またはテロメアーゼ）である。
【００４６】
遺伝的改変は、ウィルスベクター（レトロウィルス、改変されたヘルペスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルスなど）を用いる感染によってか、または、当該分野において公知の方法を使用するトランスフェクション（リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーションなど）のいずれかによって行われる（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８２）を参照のこと）。例えば、キメラ遺伝子構築物は、ウィルス（例えば、レトロウィルス）の末端反復配列（ＬＴＲ）、サルウィルス４０（ＳＶ４０）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）；または哺乳動物細胞特異的プロモーター（例えば、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ；ドーパミン細胞についてのマーカー））、ＤＢＨ、フェニルエタノールアミンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＮＭＴ）、ＣｈＡＴ、ＧＦＡＰ、ＮＳＥ、所望のタンパク質をコードする構造遺伝子の発現を指示するＮＦタンパク質（ＮＥ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、ＮＦ−Ｈなど）を含み得る。加えて、ベクターは、薬物選択マーカー（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉアミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ遺伝子）を含み得、これは、試験遺伝子とともに共感染（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）される際に、タンパク質合成インヒビターであるジェネテシン（Ｇ４１８）に対する耐性を与える。
【００４７】
ＬＰＣは、発現ベクターによるトランスフェクションを使用して遺伝子的に改変され得る。１つのプロトコルでは、遺伝子を含むベクターＤＮＡを、０．１×ＴＥ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で４０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈する。２２μｌのＤＮＡを、使い捨ての滅菌５ｍｌプラスチックチューブ中の、２５０μｌの２×ＨＢＳ（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭブドウ糖、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に加える。３１μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ２をゆっくりと加え、そして混合物を、室温にて３０分間インキュベートする。この３０分のインキュベーションの間に、細胞を、８００ｇで５分間、４℃にて遠心分離する。細胞を、２０容量の氷冷されたＰＢＳ中に再懸濁し、そして１×１０７の細胞のアリコートに分ける。これらを再度、遠心分離する。細胞のアリコートの各々を、１ｍｌのＤＮＡ−ＣａＣｌ２懸濁液中に再懸濁し、そして室温にて２０分間インキュベートする。次いで、細胞を成長培地中で希釈し、そして５％〜７％のＣＯ２で３７℃にて６〜２４時間、インキュベートする。この細胞を再度、遠心分離し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして１０ｍｌの成長培地へ４８時間の間、戻す。
【００４８】
ＬＰＣはまた、リン酸カルシウムトランスフェクション技術を用いて遺伝子的に改変される。標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションでは、細胞を、単一の細胞の懸濁液へと機械的に分離し、そして、５０％のコンフルーエンス（５０，０００〜７５，０００（細胞／ｃｍ２））で組織培養用に処理されたシャーレ上にプレートし、一晩付着させる。１つのプロトコルでは、改変されたリン酸カルシウムトランスフェクション手順を、以下のように行う：ＴＥで４４０μｌまで希釈した滅菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中のＤＮＡ（１５〜２５μｇ）、および６０μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ２（１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ５．８まで）を、ＤＮＡ／ＴＥ緩衝液へと加える。合計５００μｌの２×ＨｅＢＳ（ＨＥＰＥＳで緩衝化した生理食塩水；２７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２ｍＭブドウ糖、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝粉末、ｐＨ６．９２）をこの混合物へ一滴ずつ加える。この混合物を室温にて２０分間、静置する。細胞を１×ＨｅＢＳで簡単に洗浄し、そして１ｍｌのリン酸カルシウムで沈殿したＤＮＡの溶液を、各プレートへと加え、そしてその細胞を３７℃で２０分間インキュベートする。このインキュベーションの後に、１０ｍｌの培地を、細胞に加え、そしてプレートを、さらに３〜６時間、インキュベーター（３７℃、９．５％ＣＯ２）中に配置する。ＤＮＡおよび培地を、インキュベーション期間の最後に、吸引によって除去し、細胞を３回洗浄し、そしてインキュベーターに戻す。
【００４９】
遺伝子改変が生物学的に活性な物質の生成のためである場合、その物質は、所与の肝臓障害の処置に有用な物質であり得る。ＬＰＣは、生物学的に活性な因子（例えば、成長因子、成長因子レセプター）を発現するために遺伝子的に改変される。例えば、細胞が増殖誘導成長因子または分化誘導成長因子を分泌するように、細胞を遺伝子的に改変することが望ましくあり得る。肝臓障害の処置において有用な成長因子産物としては、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、およびインターロイキンが挙げられる。
【００５０】
遺伝子改変されたＬＰＣは、細胞治療または遺伝子治療のために、遺伝子的に改変された細胞によって生成された生物学的に活性な分子を必要としているレシピエントのＣＮＳへと、移植され得る。移植技術は、以下に記述される。
【００５１】
あるいは、遺伝子的に改変されたＬＰＣは、移植の前に、インビトロでの種々の分化プロトコルに供され得る。一旦、細胞が分化されると、細胞は、所望のタンパク質の発現のために再度アッセイされる。所望の表現型を有する細胞は、単離され得、そして、遺伝子的に改変された細胞によって発現された、タンパク質または生物学的に活性な分子を必要としているレシピエントへと移植され得る。
【００５２】
（肝臓前駆細胞への薬物の効果をスクリーニングするための方法）
ＬＰＣ培養物は、潜在的な治療組成物のスクリーニングのために使用され得る。例えば、ＬＰＣは、肝臓細胞の増殖、分化、または生存をもたらす化合物を同定するために使用される。加えて、ＬＰＣは、抗ウィルス化合物を同定しウィルスの感染性を決定するためか、または、試験化合物の代謝産物を同定するために、使用される。これらの試験組成物は、種々の投与量で培養物中の細胞に適用され得る。そして細胞の応答が、種々の期間、モニタリングされる。細胞の物理的特徴は、顕微鏡を用いて細胞の成長および形態を観察することによって分析され得る。タンパク質（例えば、酵素、レセプター、および他の細胞表面分子）または神経伝達物質、アミノ酸、神経ペプチド、および生体アミンの新たな発現レベルまたは増加した発現レベルの誘導は、このような分子のレベルの変化を同定し得る当該分野で公知の任意の技術を用いて、分析され得る。このような技術としては、このような分子に対する抗体を使用する免疫組織化学、または生化学的分析が挙げられる。このような生化学的分析としては、タンパク質アッセイ、酵素的アッセイ、レセプター結合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動分析、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による分析、ウェスタンブロット、および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。核酸分析（例えば、ノーザンブロット）は、これらの分子またはこれらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを検査するために使用され得る。
【００５３】
ＬＰＣは、肝細胞への生物学的因子の効果を決定する方法において使用され得る。用語「生物学的因子」とは、任意の因子（例えば、ウィルス、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、核酸、ヌクレオチド、薬物、プロドラッグ、または、神経細胞への効果（このような効果が有害であっても、有益であっても、またはその他でも）を有し得る他の因子）をいう。肝細胞に有益である生物学的因子は、本明細書中で「肝臓因子」と呼ばれる。この用語は、肝細胞の増殖、分化もしくは機能、または肝臓疾患もしくは肝臓障害の処置について潜在的に有用であると証明され得る、生物学的または薬学的に活性な任意の物質を含む用語である。
【００５４】
ＬＰＣの培養物からの肝細胞への潜在的な生物学的因子の効果の決定は、肝臓組織からかまたは、代わりに、肝臓疾患もしくは肝臓障害に罹患している宿主から得られ得る。培養条件の選択は、試験される特定の因子、そして実験者が達成することを望む効果に依存する。一旦、細胞が所望のドナー組織から入手されると、その細胞は、インビトロで増殖される。
【００５５】
移植目的のために大量の細胞を生成するのに有用である、ＬＰＣの増殖能力を増加する生物学的因子についてスクリーニングすることが可能である。ＬＰＣの増殖を阻害する生物学的因子についてスクリーニングすることもまた可能である。ＬＰＣは、対象となる生物学的因子の存在下でプレートされ、そして増殖が起こる程度についてアッセイされる。ＬＰＣおよびＬＰＣの子孫の分化および生存への、生物学的因子または生物学的因子の組み合わせの効果が、決定され得る。
【００５６】
スクリーニングの前に、分化するよう既に誘導されているＬＰＣをスクリーニングすることが可能である。分化の前に、生物学的因子をＬＰＣに適用することによって、分化プロセスへのその生物学的因子の効果を決定することもまた可能である。一般に、生物学的因子は、可溶化され得、そして種々の濃度にて培養培地に添加されて、各用量におけるこの因子の効果を決定し得る。培養培地は、因子の濃度をある程度一定に保つための量で、数日毎に生物学的因子を補充され得る。
【００５７】
増殖における変化は、細胞数における増加または減少によって観察される。「制御因子」は、ＬＰＣの増殖への制御効果を有する生物学的因子である。例えば、生物学的因子は、増殖誘導成長因子（例えば、ＥＧＦ）に応答してインビトロで増殖するＬＰＣの数を増加させるかまたは減少させる場合、「制御因子」とみなされる。あるいは、増殖誘導成長因子に応答するＬＰＣの数は同じままであり得るが、制御因子の追加が、ＬＰＣの増殖速度に影響を与える。増殖誘導成長因子は、別の増殖誘導成長因子と組合わせて使用される場合に制御因子として作用し得る。
【００５８】
このようなスクリーニング方法を使用すると、当業者は、肝細胞の増殖および分化、または分化した肝細胞の生存または機能への生物学的因子の効果について試験することによって、肝細胞への薬物の潜在的な副作用についてスクリーニングし得る。増殖されたＬＰＣは、代表的には、約５〜１０×１０６細胞／ｍｌの密度でプレートされる。分化した特定の細胞型または所与の細胞の組み合わせへの生物学的因子の効果を試験することが望ましい場合、分化の後に得られた肝細胞と胆管細胞との比は、異なる型の細胞と隔てることによって処理され得る。
【００５９】
生物学的因子の効果は、コントロール培養物に対する有意差に基づいて同定される。これは、発現された表現型の比、細胞の生存度、および遺伝子発現における変化のような基準に関しての差である。細胞の物理的な特徴は、顕微鏡で細胞の形態および成長を観察することによって分析され得る。タンパク質（例えば、酵素、レセプター、および他の細胞表面分子）の新たな発現レベルまたは増加した発現レベルの誘導は、このような分子のレベルの変化を同定し得る当該分野で公知の任意の技術を用いて、分析され得る。このような技術としては、このような分子に対する抗体を使用する免疫組織化学、または生化学的分析が挙げられる。このような生化学的分析としては、タンパク質アッセイ、酵素的アッセイ、レセプター結合アッセイ、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動分析、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による分析、ウェスタンブロット、および放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。核酸分析（例えば、ノーザンブロットおよびＰＣＲ）は、これらの分子またはこれらの分子を合成する酵素をコードするｍＲＮＡのレベルを検査するために使用され得る。
【００６０】
ＬＰＣの増殖、およびＬＰＣの子孫の増殖、分化および生存に関与する因子、ならびに生物学的因子に対するそれらの応答は、当該分野で公知の技術を用いて、ＬＰＣの発生の異なる段階におけるＬＰＣまたはＬＰＣの子孫から、ｃＤＮＡライブラリーを構築することによって単離され得る。ある発生段階における細胞からのライブラリーは、発生の異なる段階における細胞のライブラリーと比較されて、発生の間の遺伝子発現の順序を決定し、そして種々の生物学的因子の効果を明らかにするか、または肝臓細胞における遺伝子発現を変化させる新たな生物学的因子を明らかにする。ライブラリーが機能不全組織から調製される場合、機能不全組織からのライブラリーと正常組織からのライブラリーとを比較することによって、原因として機能不全を引き起こすために役割を果たす遺伝因子が同定され得る。この情報は、障害を処置するために治療設計において使用され得る。加えて、プローブが、種々の遺伝障害の診断における使用のためか、または発生における特定の段階で肝細胞を同定することに使用するために同定され得る。
【００６１】
本発明は、以下の実施例によってさらに示されるが、それらに限定はされない。
【実施例】
【００６２】
（実施例１：一般的な方法）
（ヒト胎児肝細胞の単離）
本研究の許可は、Ｈｕｄｄｉｎｇｅ大学病院にある現地の倫理委員会から認可された。ヒトＦＬ組織を、スウェーデンの手引きに従って、妊娠の６〜９．５週間目に中絶された胎児から入手した。研究プロトコルは、現地の倫理委員会によって認可された。改変された吸引掻爬術を行った（３３）。在胎齢を、妊娠期間の１２週間未満の胎児においては特有の解剖学的マーカー（３４）に従って推定し、そしてそれより後の胎児においては、超音波大横径測定によって推定した（３５）。妊娠齢は、最終月経から算出した妊娠期間として与えられる。中絶を、明らかな異常がない妊娠において行った（つまり、異常がある胎児を含まなかった）。ＦＬを、解体し、そしてＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．ＵＫ）を含む滅菌チューブ中に配置した。次いで、肝臓を、７０μｍの金属メッシュを通すことによって、単一の細胞の懸濁液へと分解した。単一の細胞の懸濁液を、２００ｇで１０分間遠心して、細胞をペレットにした。胎児組織を提供するすべての女性は、梅毒、トキソプラスマ症、風疹、ＨＩＶ−１、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎、パロウィルス、ならびに１型単純ヘルペスおよび２型単純ヘルペスについて血清学的にスクリーニングされている。
【００６３】
（磁気細胞分類による細胞の単離およびインビトロでの培養）
単一の細胞の懸濁液を、妊娠７〜９週目における胎児肝細胞から調製した。細胞をヒト原始前駆細胞濃縮単離キット（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、その後に、磁気活性化細胞分離磁気ビーズシステム（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって単離した。この方法は、この集団のネガティブ選択に基づいている。この選択には、１２個の系統特異的な細胞表面抗原に対する抗体（抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２４、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ４５ＲＡ、抗ＣＤ５６、抗ＣＤ６６ｂ、抗グリコホリンＡ）を含む枯渇カクテル（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を使用する。この手順を、販売元によって説明されているように実行した。すべての場合において、回収した前駆細胞を、直ちにフローサイトメトリーによって分析し、ｌｉｎ＋細胞の汚染が存在しないことを確かめ、かつ細胞の前駆体の表現型（ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／ｌｉｎ−）を確認した。手順の最後に、回収された前駆細胞を生存度について試験した。この後で、この細胞を、Ｉ型コラーゲンで被覆されたプラスチックのペトリ皿（Ｂｉｏｃｏａｔ，Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ）に播種した。そして、１０％不活化胎児子ウシ血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン、５％Ｌ−グルタミン、５％最小必須アミノ酸、５０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、および１０ｎｇ／ｍｌの塩基性繊維芽細胞成長因子（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）中で培養した。三日ごとに毎回、培地を回収し、遠心分離し、滅菌ろ過処理し、そして条件培地（ＣＭ）として使用した。その後の全ての継代培養を、２０％ＣＭを使用して行った。いくつかの実験において、前駆細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、および５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含有するＤＭＥＭ培地中で成長させ、そして培養物中で分裂させた。増殖を検出するために、培養物中の細胞を、チミジンアナログＢｒｄＵ（３０ｍＭ）とともに３０分間、インキュベートした。細胞を洗浄し、そして、ヒトのアルブミンに対するＦＩＴＣ結合ヤギ抗体（Ｎａｔｕｔｅｃ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、非結合抗ヒトサイトケラチン１９（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒ，ＵＳＡ）、および非結合抗ＢｒｄＵ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、アルブミン、サイトケラチン１９、およびＢｒｄＵ（３０ｍＭ）で染色した。表現型決定のために使用された他の抗体は、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１１７、抗ＣＤ３４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ）、抗Ｆｌｋ−１（ＲｅｌｉａＴｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ならびに二次サブクラス特異的抗体であるヤギ抗マウスＩｇＧ１（ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）およびヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）であった。フ��ーサイトメトリーおよび免疫細胞化学を、前駆細胞を表現型決定するために使用した。この手順を記載されているように行った（３６）。
【００６４】
新たに単離された前駆細胞（Ｐ０）、および第６継代（Ｐ６）および第１２継代（Ｐ１２）においてインビトロで拡張された細胞を、移植研究のために使用した。
【００６５】
（マウス）
動物を世話し、Ｈｕｄｄｉｎｇｅ病院にあるＴｈｅ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅが認可した動物プロトコルを使用する。肝障害を、部分的な肝切除の２４時間前に、体重１ｋｇあたり０．７ｇの腹腔内への、ＧａｌＮ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）の投与によって、Ｃ５７ブラック／ヌードマウス（ｎ＝１６）に誘導した。ＧａｌＮを、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に、１００ｍｇ／ｍｌにて溶解した。部分的な肝切除（ＰＨ）を、以前に説明されたように行った（３７）。ＧａｌＮの投与を、ＰＨの後、１０日間続けた。
【００６６】
肝臓前駆細胞を、これらの動物の脾臓へと移植した。動物を、エーテル下で麻酔し、そして代表的には、２００μｌのＤＭＥＭ培地中に懸濁された１×１０５の新たに単離された細胞（Ｐ０）、および第６と第１２継代における１×１０６の細胞を、およそ１０〜１５秒にわたって脾臓へと注入した。４匹のマウスを、ＤＭＥＭ培地のみで偽移植した。止血を確実にした後、腹腔切開を閉じ、そして動物を回復に近づくまでモニタリングした。
【００６７】
（肝臓の調製および凍結切片における蛍光分析）
マウスを、移植の４週間後に殺し、そして肝臓、脾臓および肺を切除した。約２ｍｍ２の肝臓の各々から２つか３つの生検を、液体窒素中でショック凍結し、そしてＲＴ−ＰＣＲ分析を行うためのＲＮＡの単離のために使用した。残りの肝臓組織を、蛍光分析および免疫組織化学的分析のためにショック凍結した。５μｍの厚さの凍結切片を風乾し、そして、メタノール中で１０分間、冷３０％アセトンで固定し、そして免疫組織化学によってさらに分析した。
【００６８】
（免疫組織化学）
本発明者らはまず、マウスの実質中のヒト細胞の検出のために２つの方法を試験した；ａ）ジゴキシゲニン標識総ヒトＤＮＡプローブ（Ｃｙｔｏｃｅｌｌ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ  ＵＫ）を使用するインサイチュハブリダイゼーション技術（３８）、およびｂ）マウス抗ヒト核モノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）の後に、ビオチン化ウマ抗マウス二次抗体で染色する。免疫ペルオキシダーゼ手順を、製造元によって説明されているように、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣキット（ＩｍｍｕｎＫｅｍｉ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して行った。ジアミノベンジジン三塩酸塩（ＤＡＢ）−ニッケル基質キットを、色展開剤として使用した。二重染色について、ＤＡＢ（茶色に染色する）および／またはＤＡＢ−Ｎｉ（黒）および／またはＶｅｃｔｏｒ  ＮｏｖａＲｅｄキットの組み合わせを使用した。使用した他の一次抗体は、ヒトのアルブミンに対する（マウスとは交差反応しない）ＦＩＴＣ結合ヤギ抗体（Ｎａｔｕｔｅｃ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、非結合抗ヒトサイトケラチン１９（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒ，ＵＳＡ）、および（ジペプチジルペプチダーゼＩＶを検出する）非結合マウス抗ヒトＣＤ２６（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＵＳＡ）であった。ＧＧＴ、Ｇ−６−Ｐおよびグリコーゲンを、以前に説明されたようにインサイチュで示した（３９，４０）。切片をヘマトキシリンで対比染色し、マウント培地（ＩｍｍｕｎＫｅｍｉ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）中でマウントした。
【００６９】
（形態計測分析）
各マウスの肝臓の６０枚の連続切片を、ＤＡＢ−Ｎｉ−ポジティブなヒト細胞についてスクリーニングした。移植された細胞の数を、３つのサイズのクラスター（すなわち、単独で配置する細胞、または２以上〜２０の細胞のクラスターまたは２０より多い細胞のクラスター）で決定した。本発明者らは、移植された動物の全て由来の組織において最低限１００の高倍率視野で分析した。
【００７０】
（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
全ＲＮＡを、４匹のヒト−マウスキメラマウスの肝臓組織から、および1匹の正常マウスの肝臓組織から、Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ  ＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、抽出した。本発明者らは、マウスの肝臓における、ヒトのアルブミン、ＣＫ１９、α−フェトプロテインおよびα１−抗トリプシンの発現を検出するために、ヒト特異的プライマーを使用した。プライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア  バージョン２．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することにより、ＣＫ−１９、α−フェトプロテイン、アルブミン、抗トリプシン、およびグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）について選択した。プライマーセットの各々を、ＤＮＡで汚染されずに、ｃＤＮＡのみを標的とするために設計した。プライマーセットは、ＣｙｂｅｒＧｅｎｅ（Ｈｕｄｄｉｎｇｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって商業的に合成された。
【００７１】
【化１】
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ＰＣＲ反応を、９６ウェル光学プレートに総容量２５μｌで、二つ組で行った。各反応物は、２．５μＬのｃＤＮＡ、１２．５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および５００ｎＭの各プライマーを含んだ。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを、全ての実行において含んだ。熱サイクル条件は、製造元によって推奨されているように、最初に５０℃で２分間、そして９５℃で１０分間であった。サイクル条件は、９５℃で１５秒間、そして６０℃で１分間の４０サイクルであった。ハウスキーピング遺伝子であるＧ６ＰＤを、内部標準コントロールとして含んだ。これは、ＲＮＡの単離および逆転写の成功、ならびに全てのサンプルにおけるＲＮＡの総量を確認するために使用した。ＲＴ−ＰＣＲからの結果を可視化するために、本発明者らは、使用できる状態の１２．５％の非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動システム上でＰＣＲ産物を泳動し、そしてそのバンドを、自動化された銀染色（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって染色した。
【００７２】
（統計方法）
データを、平均値±ＳＤのように示す。差異の有意性を、スチューデントｔ検定および分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。０．０５未満のｐ値は、有意であるとみなした。
【００７３】
（実施例２  ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／ＬＩＮ−肝臓前駆細胞は、インビトロで肝細胞および胆管細胞へと分化し得る）
原始造血前駆体を単離するために設計されたキットを使用して、ヒト胎児肝臓由来の細胞集団（ｇｗ６〜９）を、任意の関係付けられた造血マーカーを発現しなかった集団から得た。この集団のさらなる表現型決定は、幹細胞マーカーＣＤ１１７およびＣＤ３４の発現を示したが、肝臓マーカー（例えば、アルブミン（肝臓マーカー）およびＣＫ１９（胆管細胞マーカー））の発現は示さなかった。Ｔｈｙ−１（ＣＤ９０）もＣＤ４５もまた発現しなかった（図１ａ）。この集団は、妊娠６〜９週目における全体の胎児
肝臓の約０．５％〜０．７％を表す。ＣＤ４５およびＣＤ９０の発現は、細胞の継代培養の間には観察されなかった。培養の際に、これらの細胞が、付着性の集団（約８５％）（図１ｂ）と非付着性集団（約１５％）の両方の混合物であることを見出した。非付着性集団は、以下で与えられた培養条件の下で、さらに拡張され得なかった。ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞およびそれらの子孫は、コロニー中で成長する傾向がある（図１ｂ）。培養物中で２日後に付着前駆細胞によって発現される最初のマーカーは、ｃ−Ｍｅｔ（肝細胞成長因子レセプター）であった（図１ｂ）。肝細胞成長因子（ＨＧＦ）および上皮成長因子（ＥＧＦ）を含有する培養培地中で２週間、これらの細胞をインビトロで培養することは、４つタイプの細胞の存在を示した：ｉ）アルブミンおよびＣＫ１９を発現する約８５％のダブルポジティブ細胞、ｉｉ）約４％のダブルネガティブ細胞、ｉｉｉ）アルブミンのみを発現する約６％のシングルポジティブ細胞、ｉｖ）約５％のＣＫ１９のみを発現するシングルポジティブ細胞（図１ｃ）。この表現型は、培養の間、数継代にわたって維持された（図１ｃ）。しかし、Ｐ１１以降から、ダブルポジティブ細胞（約６０％）およびタブルネガティブ（約３％）の数においてわずかな減少があった。一方で、アルブミンまたはＣＫ１９についてのシングルポジティブ細胞は増加した。これらのデータは、発生早期の肝臓由来の非造血性原始前駆細胞がインビトロで肝細胞および胆管細胞へと分化し得ることを実証する。
（実施例３  ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／ＬＩＮ−肝臓前駆細胞は、血管内皮成長因子の存在下で肝臓類洞内皮細胞へと分化する）
興味深いことに、付着性ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞を、５０ｎｇ／ｍｌの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を含有する培養培地中で分化させた場合、本発明者らは、内皮様の形態を有する細胞の大きな集団を観察した。胎児肝臓内皮前駆体に発現されることが公知であるＦｌｋ−１を含む肝細胞マーカーを使用する、この細胞集団のさらなる特徴付けは、４つの集団を明らかにした：ａ）レセプターＦｌｋ−１を発現する内皮細胞（約５０％）、ｂ）肝細胞（約１３％）、ｃ）胆管細胞（約１７％）（図１ｄ）、および、ｄ）これらのマーカーのうちのいずれも発現しなかった細胞集団（約２０％）（データは示さず）。Ｆｌｋ−１＋細胞の類洞表現型を、抗体の大きなパネルを使用して確認した（表１）。ヒト臍静脈内皮細胞を、血管内皮細胞と類洞内皮細胞との間の表現型の差を実証するために使用した（表１）。電子顕微鏡分析は、類洞内皮細胞に特徴的な窓（ｆｅｎｅｓｔｒｎｅ）の存在、およびの基底膜の欠如を明らかにした（データは示さず）。これらのデータは、発生早期の肝臓由来の非造血性原始前駆細胞が、肝細胞、胆管細胞、および内皮細胞へとインビトロで分化し得ることを示す。
【００７４】
【表１】
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（実施例４  肝臓前駆細胞は、インビトロで広範に継代され得る）
肝臓前駆体の増殖は、培養の間、２０％の条件培地（ＣＭ）の恒常的な使用に依存した。２０％のＣＭを使用すると、これらの細胞を、少なくとも１２継代まで継代し得る。ＣＭを除去すると、得られる細胞継代の数が有意に減少した（ｐ＜０．００１；図２ａ）。このことは、細胞の増殖における減少を反映する。高い増殖能力が、ＢｒｄＵの取り込みによって検出されたように、ダブルポジティブ細胞（ＡＬＢ＋ＣＫ１９＋）およびアルブミンのシングルポジティブ（ＡＬＢ＋ＣＫ１９−）において観察されたことが見出された（図２ｂおよび図２ｃ）。この細胞は、安定な表現型を長期間の間、維持され得る。すべてのＦＬが、急速に増殖し、そして数継代の間、培養物中で維持され得る細胞を生成したわけでないことを言及することは重要である（表２）。長期間、増殖の成功は、得られたＦＬ組織の質に依存した。しかし、試験されたすべてのＦＬから単離されたＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／ＬＩＮ−細胞が肝細胞へと分化したことを見出した。インビトロ研究からのデータは、ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／ＬＩＮ−細胞およびそれらの子孫が、広範な複製能力を有し、そして安定な表現型で長期間の間維持され得ることを実証した。
【００７５】
【表２】
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（実施例５：拡張されたヒト胎児前駆細胞は、ＧａｌＮ処置マウスの肝臓中で成熟肝細胞、成熟胆管細胞、および成熟類洞へと首尾よく移植され、分化する）
新たに単離されたＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞（Ｐ０）、および培養物中で拡張された細胞（Ｐ６およびＰ１２）が、分化する可能性を有しインビボで機能するかどうかを試験するために、これらの細胞を、最初に部分的に肝切除されたマウスへと移植し、次いでＤガラアクトサミン（ＧａｌＮ）で処置して急性肝損傷を誘導した。このプロトコルは、急性肝損傷を誘導し、肝臓再分化を促進させる（２１）。コントロールの２匹マウスおよび試験グループの２匹は、処置の２４時間後に死亡した。細胞移植の４週間後にマウスが生存していた結果が示される。脾臓内の移植の後、初代Ｐ０細胞、ならびにＰ６およびＰ１２継代培養細胞は、ＧａｌＮ処置マウスの肝臓において生存した。移植された細胞を位置決めするための、ヒトのセントロメアプローブおよび抗ヒト核抗体を使用して得られた結果を比較する実験は、同様の結果を示した。ヒトＤＮＡプローブの種特異性（図３ａおよび図３ｂ）および抗ヒト核抗体は、ヒト肝臓によるポジティブな結果（図３ｃ）、およびヌードマウスからの偽移植された肝臓によるネガティブな免疫組織化学（図３ｄ）によって実証される。新たに単離されたＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞は、移植した場合、移植の４週間後にて、肝細胞（図３ｅ）、胆管細胞（図３ｆ）、および形成された胆管（図３ｇ）へと分化した。Ｐ６およびＰ１２における肝臓前駆細胞は、移植した場合、移植され、そして急性的に損傷した肝臓を再構成した（図３ｈ−ｊ）。移植された細胞を、マウスの肝臓中で見出したが（図３ｋ）、例えば、脾臓（図３ｌ）および肺（図３ｍ）のような他の組織において、そして偽移植された動物（図３ｎ）においては見出されなかった。移植されたヒト細胞は、肝臓マーカー（例えば、グルコース６リン酸（Ｇ−６−Ｐ）（図４ａ）およびグリコーゲン（図４ｂ））、ならびに胆管マーカー（例えば、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）（図４ｃ）およびγグルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）（図４ｄ））を発現した。３匹のマウスでは、ヒト肝細胞によって９０％再増殖した、再分化する組織の切片が見出された（図４ｅ）。ヒト前駆体によって完全に再増殖したヒト胆管の透明な領域もまた、観察された。これらの細胞は、ＣＫ１９およびそして抗ヒト核抗体に対してポジティブに染色した（図４ｆ）。マウスのアルブミンとは交差反応しないヒトのアルブミンに対するモノクローナル抗体を、移植された細胞におけるヒトのアルブミンの発現を検査するために使用した。ヌードマウスからの偽移植された肝臓によるネガティブな免疫組織化学（図４ｇ）は、抗体の種特異性を示した。移植されたマウス１０匹すべてにおいて、いくつかのアルブミンポジティブ構造（図４ｈ−ｊ）が見出されたが、偽移植されたマウス（ｎ＝２）においてヒトのアルブミン発現する病巣は、同一の条件を使用しても観察されなかった。ヒトのアルブミンは、マウスの肝臓中のみで検出され、しかし脾臓または肺においては観察されなかった。興味深く注目するものとしては、分析されたマウスのいずれにおいても、腫瘍の形成が観察されなかったことである。
【００７６】
肝臓の移植が、Ｐ０、ｐ６、およびｐ１２におけるヒト肝臓前駆体の間で匹敵する状態であったかどうかを決定するために、マウス肝臓の各々の６０枚の連続切片を、ＤＡＢ−Ｎｉ−ポジティブなヒト細胞についてスクリーニングした。移植された細胞の数を、３つのサイズのクラスター（すなわち、単独で配置する細胞、または５以上〜２０の細胞のクラスター、または２０より多い細胞のクラスター）で決定した。この分析は、Ｐ０、Ｐ６およびＰ１２細胞を受容する動物の間で、単独で配置する移植された細胞の数において、または２〜２０以上の細胞のクラスターにおいて、有意差が存在しなかったことを示した。２０より多い細胞のクラスターは、Ｐ０細胞を移植されたマウスにおいては何も観察されなかったが、Ｐ６およびＰ１２における細胞を受容したマウスにおいては観察された（表３）（ｐ＜０．００１；ＡＮＯＶＡ）。Ｐ０細胞を移植されたマウスにおいて、本発明者らは、ヒトの移植された細胞の数における１０倍の増加を検出し、一方で、Ｐ６細胞およびＰ１２細胞を注入されたマウスにおいては、６倍の増加を検出した（表３）。これらのデータは、新たに単離されたＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／ＬＩＮ−細胞が、首尾よく増殖し、そしてインビボで成熟肝細胞、成熟胆管細胞、および成熟類洞内皮細胞へと分化することを実証する。加えて、インビトロで拡張されたＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞およびそれらの子孫は、インビボで増殖し、そして、損傷したマウス肝臓を首尾よく再構築する。
【００７７】
【表３】
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（実施例６：ヒト肝臓前駆細胞を移植したマウスにおけるヒト肝臓特異的遺伝子の転写）
植え付けられた細胞の移植は、移植されたマウスにおけるヒト遺伝子の発現を決定することによって確認した。屠殺したマウス肝臓を、ヒト肝臓特異的遺伝子（アルブミン、α１−抗トリプシン、ＣＫ１９、およびＡＦＰを含む）について特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト胎児肝臓前駆細胞の移植の１ヵ月後に、分析した。偽移植されたヌードマウスの肝臓からのＲＮＡは、ＲＮＡの完全性のためのコントロールとして使用されたＧ６ＰＤについて増幅を結果としてもたらした。ＣＫ１９、アルブミン、およびＡＦＰプライマーは、プライマーが個々のマウス遺伝子を増幅しなかったので、ヒトに特異的な種であった。しかし、α１−抗トリプシンが種特異的であることは見出されなかった（図４ｋ）。これらの結果は、新たに単離された（Ｐ０）細胞、および種々の継代（Ｐ６およびＰ１２）における細胞の両方が、損傷したマウス肝臓に移植することを示す。
【００７８】
（実施例７：肝臓前駆細胞を移植されたマウスにおけるヒト第ＶＩＩＩ因子の保護）
ヒト第ＶＩＩＩ因子のレベルは、化学的に肝臓を損傷したマウスおよび肝切除したマウスにおいては極僅かであり、同様に、同じ様式で処置された、そしてさらに成長因子ＨＧＦおよび／または間質細胞を受容したマウスにおいても、同様に極僅かである。しかし、ヒト肝臓前駆細胞のみ、またはＨＧＦ＋間質細胞＋前駆細胞の組み合わせを受容する化学的に肝臓を損傷したマウスおよび肝切除したマウスは、それらの血漿においてヒト第ＶＩＩＩ因子の高いレベルを実証した（図６）。
【００７９】
（他の実施形態）
特定の実施形態が本明細書中で詳細に開示されているが、これは、例示目的のために例として開示されており、前に添付された特許請求の範囲に関して限定することは意図されていない。具体的には、種々の置換、変更、および修正が、請求項に規定されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対して行われ得ることが、本発明者らによって企図される。核酸の出発物質、所定のクローン、またはライブラリーのタイプの選択が、本明細書中に記載された実施形態の知識を有する当業者にとって、日常的なことであると考えられる。他の局面、利益、および修正は、上述の特許請求の範囲内にあるとみなした。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１Ａ】図１は、ヒト肝臓前駆細胞の特徴づけを示す、一連のＦＡＣＳ分析および写真である。図１Ａは、単離の直後に磁気によって分類したＦＬ細胞を、ＣＤ１１７およびＣＤ３４については二重染色したが、ＣＤ９０、ＣＤ４５、アルブミン、およびサイトケラチン１９（ＣＫ１９）については染色しなかった。
【図１Ｂ】図１は、ヒト肝臓前駆細胞の特徴づけを示す、一連のＦＡＣＳ分析および写真である。図１Ｂは、ＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−細胞は、培養される際にコロニー内で成長し、そして発現される第１マーカーは、肝細胞成長因子レセプター（ｃ−Ｍｅｔ）であった（拡大率：４０倍）。
【図１Ｃ】図１は、ヒト肝臓前駆細胞の特徴づけを示す、一連のＦＡＣＳ分析および写真である。図１Ｃは、種々の継代において新たに単離し膨張させた細胞は、ＡＬＢ−ＣＫ１９−（白矢印）、ＡＬＢ＋（緑）、ＣＫ１９＋（赤）、ＡＬＢ＋ＣＫ１９−（緑；肝細胞）およびＡＬＢ−ＣＫ１９＋（赤；胆管細胞）を生じた（拡大率：６０倍）。
【図１Ｄ】図１は、ヒト肝臓前駆細胞の特徴づけを示す、一連のＦＡＣＳ分析および写真である。図１Ｄは、血管内皮成長因子を含有する培養培地中で成長させた際の、磁気によって分類したＣＤ１１７＋／ＣＤ３４＋／Ｌｉｎ−付着細胞は、Ｆｌｋ−１＋内皮細胞（約５０％）、ＣＫ１９＋胆管細胞（約１３％）およびアルブミン＋肝細胞（約１７％）へと分化した。およそ２０％の細胞は、これらのマーカーのうちのいずれも発現しなかった。
【図２Ａ】図２Ａは、肝臓前駆体およびそれらの子孫の増殖を示す棒グラフである。２０％に調製された培地（ＣＭ）の使用は、肝臓前駆細胞の増殖を有意に増加し、そしてＣＭを使用しないものと比較して数回継代され得る（ｐ＜０．００１；スチューデントｔ検定）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、フローサイトメトリー分析の結果を示す棒グラフである。このグラフは、高い増殖度（ＢｒｄＵ＋細胞）が、アルブミンＣＫ１９＋、アルブミン＋ＣＫ１９−、およびアルブミン−ＣＫ１９＋細胞において観察されたが、その一方で、両方ともネガティブな（アルブミン−ＣＫ１９−）細胞は、より静止状態であったことを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、種々の継代における肝臓前駆細胞を示す一連の写真であり、アルブミン（緑）およびＣＫ１９（赤）については、蛍光染色され、そして、ＢｒｄＵの取り込みの検出については酵素学的に染色した。これらは、種々の部分集団において増殖能力を示した（拡大率：４０倍）。
【図３】図３Ａ−３Ｎは、マウス肝臓中のヒト肝臓前駆細胞の局在化の一連の写真である。ａ−ｂ；ヒト肝臓（ＤＡＢ）において核シグナルを示すが、マウス肝臓においては示さない、ヒト動原体プローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション。ｃ−ｄ：免疫組織化学を使用し、抗ヒト核抗体（ＤＡＢ−Ｎｉ）で同様の結果を得た。ｅ−ｊ；新たに単離した細胞（ｅ−ｇ）である、第６継代および第１２継代細胞が、Ｄ−ガラクトサミン処置（ＧａｌＮ）マウスへ移植される際に、肝細胞、胆管細胞、および内皮細胞への分化を示した（ＤＡＢ−Ｎｉ；矢印の先端）。ｋ；移植された細胞は、肝臓中で観察されたが、ｌ−ｍ；ＧａｌＮ処置マウスの脾臓、肺では、観察されなかった。ｎ；偽移植されたマウスの肝臓を、コントロールとして用いた（拡大率：６０倍）。
【図４】図４Ａ−Ｊは、ヒト肝臓前駆細胞のインビボでの発生運命を示す一連の写真である。ａ−ｄ；ＧａｌＮ処置マウスへの移植の１ヶ月後のヒト肝臓前駆細胞は、グルコース−６−リン酸（茶）、グリコーゲン（ピンク）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（赤茶）、γグルタミルトランスペプチダーゼ（茶）を含んだ。抗ヒト核抗体（ＤＡＢ−Ｎｉ；矢印の先端）による二重染色は、ヒト核（黒）を視覚化した。ｅ；ヒト肝臓前駆体（核；黒矢印の先端）によるマウス組織切片全体の再生。ｆ；サイトケラチン１９（赤茶）の発現および、ｇ−ｊ；ヒトアルブミン（緑）は、偽移植したマウスでは観察されなかったが、新たに単離した、第６〜第１２継代のヒト肝臓前駆細胞を移植した、ＧａｌＮ処置マウスの肝臓中で観察された（矢印の先端）。ａ−ｊ；（拡大率：６０倍）。ｆ；（拡大率：２００倍）。
【図４Ｋ】図４Ｋは、マウス肝臓におけるヒト肝臓特異的遺伝子の転写を示す写真である。ヒトサイトケラチン１９、αフェトプロテイン、およびアルブミンは、ヒト肝臓前駆細胞を受容したＧａｌＮ処置マウスの肝臓では検出されたが、偽移植されたマウスの肝臓では検出されなかった。しかし、α１アンチトリプシンは、コントロール中でもまたわずかに増幅した。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを、ハウスキーピング遺伝子として使用した。
【図５】図５は、胎児肝臓間質参謀および胎児肝臓前駆細胞の共移植の効果を示す一連の写真である。Ａ；抗ヒト核抗体で染色した正常ヒト肝臓切片は、陽性染色を示す（黒／茶）。Ｂ；正常マウス肝臓切片では、同じ抗体による陽性染色が見られなかったが、抗体の特異性を示した。Ｃ；レトロルシン（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置し、部分的に肝切除し、そして肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を皮下注入して、そして胎児肝臓前駆細胞を移植した後のマウスは、高い細胞移植度をもたらさなかった。Ｄ；レトロルシン（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置し、部分的に肝切除し、そして胎児肝臓から単離された間質細胞を注入した後のマウスは、高い細胞移植度をもたらさなかった。Ｅ−Ｈ；レトロルシン（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置し、部分的に肝切除し、そして胎児肝臓間質細胞と前駆／幹細胞との混合物を移植した後のマウスは、高い肝細胞移植度をもたらした。Ｉ−Ｋ；レトロルシン（３０ｍｇ／ｋｇ）で処置し、部分的に肝切除し、そして肝細胞成長因子（ＨＧＦ）を皮下注入して、そして胎児肝臓間質細胞および肝臓前駆細胞を移植した後のマウスは、高い細胞移植度をもたらした。
【図６】図６は、種々の方法で処置した正常ヌードＣ５７ブラックマウスおよびＣ５７ブラックマウスにおける、ヒト第ＶＩＩＩ因子の検出レベルを示すチャートである。
【図７】図７は、胎児肝臓および成人肝臓に対する、種々の造血細胞、肝細胞、および脾臓細胞の表面マーカーの発現を示すチャートである。
【図８】図８は、ヒトの胎児肝臓および成人肝臓における肝臓マーカーを示す一連の写真である。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒト肝臓前駆細胞の特徴づけを示す一連のＦＡＣＳ分析である。
【図９Ｂ−Ｆ】図９Ｂ−Ｆは、異なるマトリックス上のヒト肝臓前駆細胞の形態を示す一連の写真である。
【図１０】図１０の上図は、ヒト肝臓前駆細胞における肝臓マーカーの遺伝子発現を示すノーザンブロットの写真である。図１０の下図は、ヒト肝臓前駆細胞における肝臓マーカーの遺伝子発現を示すチャートである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
0005588587.tif 000012
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
0005588587.tif 000016
【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
0005588587.tif 000022
【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
0005588587.tif 000040
【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図５Ｊ】
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【図５Ｋ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−Ｆ】
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【図１０】
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【配列表】
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