(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応系において検体核酸の標的配列を増幅する際、前記反応系の増幅性能を示すコントロールを検出する方法であって、
前記コントロールが、反応系で増幅反応が起きることを示す陽性コントロールおよび反応系への不要な核酸の混入を示す陰性コントロールであり、
前記反応系は、プライマー、検出用プローブおよびコントロール用鋳型核酸を含み、
前記プライマーは、前記標的配列を増幅可能なプライマーであり、
前記検出用プローブは、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブであり、前記検体核酸の標的配列を検出するための検出用プローブと同じ配列のプローブであり、
前記コントロール用鋳型核酸は、１種類のコントロール用鋳型核酸であり、前記プライマーによって増幅可能であり、
前記プライマーによる前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域は、前記検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）に対しＴｍＣ＞ＴｍＡの条件を満たし、
下記（ａ１）〜（ａ３）工程を含み、
前記陽性コントロールおよび前記陰性コントロールを、１つの反応系で検出することを特徴とするコントロール検出方法。
（ａ１）前記反応系において、前記プライマーを用いて、前記コントロール用鋳型核酸の増幅を行う増幅工程
（ａ２）前記（ａ１）工程の前記反応系を用いて、前記検出用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程
（ａ３）前記融解曲線におけるピークによって、前記陽性コントロールおよび前記陰性コントロールが、それぞれ陽性であるか陰性であるかを判断する判断工程
【請求項２】
前記（ａ３）工程が、
前記融解曲線において、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）にピークが存在する場合、前記陽性コントロールが陽性と判断し、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）にピークが存在しない場合、前記陽性コントロールが陰性と判断し、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）以外にピークが存在しない場合、前記陰性コントロールが陰性と判断し、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）以外にピークが存在する場合、前記陰性コントロールが陽性と判断する工程である、請求項１記載のコントロール検出方法。
【請求項３】
前記コントロール用鋳型核酸は、その増幅領域における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域の長さが、前記標的配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域の長さより長い、請求項１または２記載のコントロール検出方法。
【請求項４】
前記検出用プローブは、前記標的配列に部分的に相補的な塩基配列であり、
前記コントロール用鋳型核酸は、その増幅領域に、前記検出用プローブに相補的な塩基配列を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のコントロール検出方法。
【請求項５】
前記コントロール用鋳型核酸は、その増幅領域に、前記標的配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域と同じ塩基配列、ならびに、それに隣接して、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域の５’側および３’側の少なくとも一方に隣接する領域とは異なる塩基配列を有する、請求項４記載のコントロール検出方法。
【請求項６】
前記標的配列が、多型を示す標的部位を含み、
前記検出用プローブが、前記標的配列における前記標的部位を含む領域に相補的な塩基配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のコントロール検出方法。
【請求項７】
前記検出用プローブは、前記標的配列における変異型の前記標的部位を含む領域に相補的な塩基配列を含む、または、前記標的配列における野生型の前記標的部位を含む領域に相補的な塩基配列を含む、請求項６記載のコントロール検出方法。
【請求項８】
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）と、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）との差が、１〜５０℃である、請求項１から７のいずれか一項に記載のコントロール検出方法。
【請求項９】
前記検出用プローブが、標識物質を有する標識プローブである、請求項１から８のいずれか一項に記載のコントロール検出方法。
【請求項１０】
前記標識物質が、蛍光物質である、請求項９記載のコントロール検出方法。
【請求項１１】
反応系において検体核酸の標的配列を増幅する方法であって、
下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含むことを特徴とする増幅方法。
（Ａ）請求項１から１０のいずれか一項に記載のコントロール検出方法により、前記コントロール用鋳型核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系について、増幅性能を示すコントロールを検出する検出工程
（Ｂ）下記（ｂ１）工程を含む、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程
（ｂ１）前記検体核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系において、前記プライマーを用いて、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程
【請求項１２】
前記（Ａ）工程における下記（ａ１）工程と、前記（Ｂ）工程における前記（ｂ１）工程とを、同時に行う、請求項１１記載の増幅方法。
（ａ１）前記反応系において、前記プライマーを用いて、前記コントロール用鋳型核酸の増幅を行う増幅工程
【請求項１３】
検体核酸を含む反応系の融解曲線解析方法であって、
下記（Ａ）工程および（Ｃ）工程を含むことを特徴とする融解曲線解析方法。
（Ａ）請求項１から１０のいずれか一項に記載のコントロール検出方法により、前記コントロール用鋳型核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系について、増幅性能を示すコントロールを検出する検出工程
（Ｃ）下記（ｃ１）および（ｃ２）工程を含む、融解曲線解析を行う解析工程
（ｃ１）前記検体核酸、前記（Ａ）工程と同じ前記プライマーおよび前記（Ａ）工程と同じ前記検出用プローブを含む反応系において、前記プライマーを用いて、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程
（ｃ２）前記（ｃ１）工程の前記反応系を用いて、前記検出用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程
【請求項１４】
前記検体核酸の標的配列が、多型を示す目的の標的部位を含み、
前記検出用プローブが、前記標的配列における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブであり、
前記（Ｃ）工程が、さらに、下記（ｃ３）工程を有する、請求項１３記載の融解曲線解析方法。
（ｃ３）前記融解曲線におけるピークによって、前記多型を検出する検出工程
【請求項１５】
前記（Ａ）工程における下記（ａ１）工程と前記（ｃ１）工程とを、同時に行い、前記（Ａ）工程における下記（ａ２）工程と前記（ｃ２）工程とを、同時に行う、請求項１３または１４記載の融解曲線解析方法。
（ａ１）前記反応系において、前記プライマーを用いて、前記コントロール用鋳型核酸の増幅を行う増幅工程
（ａ２）前記（ａ１）工程の前記反応系を用いて、前記検出用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程
【請求項１６】
前記（Ａ）工程における下記（ａ３）工程で、陽性コントロールが陽性且つ陰性コントロールが陰性と判断した場合に、前記（ｃ３）工程の判断を行う、請求項１４または１５記載の融解曲線解析方法。
（ａ３）前記融解曲線におけるピークによって、前記陽性コントロールおよび前記陰性コントロールが、それぞれ陽性であるか陰性であるかを判断する判断工程
【請求項１７】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のコントロール検出方法に使用するためのコントロール検出用試薬であって、
コントロール用鋳型核酸を含み、
前記コントロール用鋳型核酸は、目的の標的配列を増幅可能なプライマーによって増幅可能であり、
前記プライマーによる前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域には、前記標的配列の検出に使用する前記標的配列にハイブリダイズ可能な検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）に対しＴｍＣ＞ＴｍＡの条件を満たすことを特徴とするコントロール検出用試薬。
【請求項１８】
さらに、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む、請求項１７記載のコントロール検出用試薬。
【請求項１９】
請求項１３から１６のいずれか一項に記載の融解曲線解析方法に使用するための解析用試薬であって、
請求項１７または１８記載のコントロール検出用試薬と、
前記コントロール検出用試薬と同じ前記プライマーおよび前記コントロール検出用試薬と同じ前記検出用プローブを含む検体核酸用の増幅反応用試薬とを備えることを特徴とする解析用試薬。
【請求項２０】
検体核酸の標的配列を増幅する際、反応系の増幅性能を示すコントロールを検出するためのコントロール用鋳型核酸の設計方法であって、
前記コントロール用鋳型核酸は、反応系で増幅反応が起きることを示す陽性コントロールおよび反応系への不要な核酸の混入を示す陰性コントロールの両方を検出可能な鋳型核酸であり、
前記コントロール用鋳型核酸の塩基配列を、
前記標的配列の検出に使用する前記標的配列を増幅可能なプライマーにより増幅可能であり、
前記プライマーによる増幅領域が、前記標的配列の検出に使用する前記標的配列にハイブリダイズ可能な検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、且つ、
前記増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）が、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）に対しＴｍＣ＞ＴｍＡの条件を満たす塩基配列に設定することを特徴とする設計方法。
【請求項２１】
検体核酸の標的配列を増幅する際、反応系の増幅性能を示すコントロールを検出するためのコントロール用鋳型核酸の使用であり、
前記コントロール用鋳型核酸は、
前記標的配列の検出に使用する前記標的配列を増幅可能なプライマーにより増幅可能であり、
前記プライマーによる増幅領域が、前記標的配列の検出に使用する前記標的配列にハイブリダイズ可能な検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、且つ、
前記増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）が、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）に対しＴｍＣ＞ＴｍＡの条件を満たす塩基配列からなり、
反応系で増幅反応が起きることを示す陽性コントロールと反応系への不要な核酸の混入を示す陰性コントロールとを、１つの反応系において、あわせて検出するためのコントロール用鋳型核酸として使用することを特徴とするコントロール用鋳型核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体核酸の標的配列を増幅させる際に、反応系の増幅性能を示すコントロールを検出する方法およびその用途に関する。具体的には、前記コントロールの検出方法を用いた核酸増幅方法および融解曲線解析方法、ならびに、それに用いるコントロール検出用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子解析において、標的配列とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を解析する方法が実用化されている。この方法は、例えば、Ｔｍ解析、または、前記二本鎖の融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析と呼ばれている。この方法によれば、例えば、標的配列の増幅の有無、前記標的配列内における目的の多型の検出が可能となる。【０００３】
前記増幅の有無は、例えば、以下のようにして検出できる。まず、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブの存在下、検体核酸における前記標的配列の増幅を行った後、前記標的配列の増幅産物と前記プローブとのハイブリッドを形成させる。そして、このハイブリッド形成体に加熱処理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離（融解）を、吸光度等のシグナル値として検出し、大きなシグナル変動を示すＴｍ値（測定値）を測定する。他方、前記標的配列と前記プローブとのハイブリッド形成体について、予めＴｍ値（評価基準値）を求めておく。そして、測定値が評価基準値と同程度であれば、前記標的配列が増幅したと判断でき、Ｔｍ値が測定できなかった場合には、前記標的配列が増幅されていないと判断できる。また、多型は、例えば、以下のように検出できる。まず、目的の標的部位が変異型である標的配列にハイブリダイズ可能なプローブの存在下、検体核酸における標的配列の増幅を行い、前述と同様にして、シグナル変動の検出からＴｍ値を測定する。Ｔｍ値は、ハイブリッド形成体の相補性が高い程高く、相補性が低い程低くなる。このため、前記標的部位が変異型である標的配列と前記プローブとのハイブリッド形成体について予めＴｍ値（評価基準値）を求めておき、前述の測定したＴｍ値と比較する。この測定値が評価基準値と同程度であれば、マッチ、すなわち検体核酸の標的部位が変異型と判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ、すなわち検体核酸の標的部位が野生型と判断できる。【０００４】
このような融解曲線解析を利用して遺伝子解析を行う場合、検体核酸の増幅の検出とは別に、陽性コントロールおよび陰性コントロールの検出が行われている（特許文献１参照）。前記陽性コントロールは、一般に、反応系において増幅反応が起きているか否かを示すコントロールである。前記陰性コントロールは、反応系に不要な核酸が混入しているか否かを示すコントロールである。まず、陽性コントロールは、以下の理由から必要とされている。核酸増幅において、標的配列の増幅が検出されなかった場合、前記検体核酸に前記標的配列が存在しないことが原因であるか、反応系において増幅反応自体が起きていないことが原因であるか、不明である。このため、検体核酸を増幅するための検体用反応系とは別に、陽性コントロール用の反応系を用いて、同様にして、核酸の増幅およびＴｍ値の解析が行われる。前記陽性コントロール用の反応系は、検体核酸を無添加とし、前記標的配列を含む鋳型核酸（陽性コントロール用鋳型核酸）を添加した以外は、前記検体用反応系と同条件である。その結果、前記陽性コントロール用の反応系で、評価基準と同程度のＴｍ値が確認できれば、陽性コントロール（＋）であり、増幅反応は起こっていると判断できる。このため、前記検体用反応系で増幅が検出されなかった場合は、前記検体核酸に標的配列が存在しないと判断できる。また、前記陽性コントロール用の反応系で、Ｔｍ値が確認できなければ、陽性コントロール（−）であり、増幅反応自体が起こっていないと判断できる。つぎに、陰性コントロールは、以下の理由から必要とされている。反応系には、例えば、実験者の細胞等の混入により、検体核酸以外の核酸が混入し、その結果、前記混入した不要な核酸から増幅が生じる場合がある。そうすると、評価基準のＴｍ値でシグナル変動が確認されても、検体核酸由来の増幅であるか、混入した核酸由来の増幅であるかが不明である。このため、検体用反応系および陽性コントロール用の反応系とは別に、さらに、陰性コントロール用の反応系を用いて、同様にして、核酸の増幅およびＴｍ値の解析が行われる。前記陰性コントロール用の反応液は、検体核酸を無添加とした以外は、前記検体用反応系と同条件である。その結果、陰性コントロール用の反応系において、Ｔｍ値が確認できなかった場合には、陰性コントロール（＋）であり、不要な核酸の混入はないと判断し、Ｔｍ値が確認された場合は、陰性コントロール（−）であり、不要な核酸の混入により増幅が生じたと判断して、再度、解析をやりなおすこととなる。【０００５】
このように、検体核酸の解析を行う場合、検体用反応系とは別に、必ず、陽性コントロール用の反応系と陰性コントロール用の反応系を、それぞれ１つずつ準備しなければならない。しかしながら、解析機器等において、測定部の個数は限られており、例えば、前記測定部が４個の場合、同時に解析できる反応系の数は４個である。このため、一度の解析においては、半分がコントロールで占められることとなる。また、解析の度に、陽性コントロール用の反応系と陰性コントロール用の反応系とが必要となる。また、１検体のみの解析であっても、２種類のコントロール用反応系が必要となる。そして、コントロール用の反応系の数が増えるほど、試薬等のコストも増加する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３３３１１７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、１つの反応系で簡便に、増幅反応が起きることを示す陽性コントロールおよび不要な核酸が反応系に混入していることを示す陰性コントロールを同時に検出可能な、コントロール検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を達成するために、本発明のコントロール検出方法は、反応系において検体核酸の標的配列を増幅する際、前記反応系の増幅性能を示すコントロールを検出する方法であって、
前記コントロールが、反応系で増幅反応が起きることを示す陽性コントロールおよび反応系への不要な核酸の混入を示す陰性コントロールであり、
前記反応系は、プライマー、検出用プローブおよびコントロール用鋳型核酸を含み、
前記プライマーは、前記標的配列を増幅可能なプライマーであり、
前記検出用プローブは、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブであり、
前記コントロール用鋳型核酸は、前記プライマーによって増幅可能であり、
前記プライマーによる前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域は、前記検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と異なる値であり、
下記（ａ１）〜（ａ３）工程を含み、
前記陽性コントロールおよび前記陰性コントロールを、１つの反応系で検出することを特徴とする。
（ａ１）前記反応系において、前記プライマーを用いて、前記コントロール用鋳型核酸の増幅を行う増幅工程
（ａ２）前記（ａ１）工程の前記反応系を用いて、前記検出用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程
（ａ３）前記融解曲線におけるピークによって、前記陽性コントロールおよび前記陰性コントロールが、それぞれ陽性であるか陰性であるかを判断する判断工程【０００９】
本発明の核酸増幅方法は、反応系において検体核酸の標的配列を増幅する方法であって、
下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記本発明のコントロール検出方法により、前記コントロール用鋳型核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系について、増幅性能を示すコントロールを検出する検出工程
（Ｂ）下記（ｂ１）工程を含む、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程
（ｂ１）前記検体核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系において、前記プライマーを用いて、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程【００１０】
本発明の融解曲線解析方法は、検体核酸を含む反応系の融解曲線解析方法であって、
下記（Ａ）工程および（Ｃ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記本発明のコントロール検出方法により、前記コントロール用鋳型核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系について、増幅性能を示すコントロールを検出する検出工程
（Ｃ）下記（ｃ１）および（ｃ２）工程を含む、融解曲線解析を行う解析工程
（ｃ１）前記検体核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系において、前記プライマーを用いて、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程
（ｃ２）前記（ｃ１）工程の前記反応系を用いて、前記検出用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程【００１１】
本発明の試薬は、本発明のコントロール検出方法に使用するためのコントロール検出用試薬であって、
コントロール用鋳型核酸を含み、
前記コントロール用鋳型核酸は、目的の標的配列を増幅可能なプライマーによって増幅可能であり、
前記プライマーによる前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域には、前記標的配列にハイブリダイズ可能な検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と異なる値であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、前述のようなコントロール用鋳型核酸を使用することによって、従来は別個に行う必要があった陽性コントロールと陰性コントロールの検出を、１つの反応系で行うことが可能である。このように、陽性コントロールと陰性コントロールとを１つの反応系で検出することにより、例えば、操作が簡便となり、試薬等のコストも低下できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の一実施形態における、プローブと、標的配列およびコントロール用鋳型核酸とのハイブリダイズを示す模式図である。
【図２】図２は、本発明のその他の実施形態における、融解曲線の模式図である。
【図３】図３は、本発明のその他の実施形態における、プローブと、標的配列およびコントロール用鋳型核酸とのハイブリダイズを示す模式図である。
【図４】図４は、本発明のその他の実施形態における、プローブと、標的配列およびコントロール用鋳型核酸とのハイブリダイズを示す模式図である。
【図５】図５は、本発明のその他の実施形態における、プローブと、標的配列およびコントロール用鋳型核酸とのハイブリダイズを示す模式図である。
【図６】図６は、本発明の実施例Ａ１における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例Ａ２における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例Ａ２における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例Ａ３における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例Ａ３における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明の実施例Ａ４における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、本発明の実施例Ａ４における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例Ｂ１における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例Ｂ１における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例Ｂ１における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例Ｂ２における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の実施例Ｂ２における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明の実施例Ｂ２における、Ｔｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、「標的配列」とは、検体核酸における増幅目的の領域であり、前記プライマーによって増幅する配列を意味する。本発明において、「標的部位」とは、前記検体核酸の前記標的配列において、目的の多型が発生する塩基部位を意味し、多型が変異型の場合、「変異型の標的部位」、多型が野生型の場合、「野生型の標的部位」ともいう。前記野生型は、正常型ということもできる。野生型の標的部位を有する標的配列を、「野生型標的配列」、変異型の標的部位を有する標的配列を、「変異型標的配列」ともいう。プライマーにより増幅する前記コントロール用鋳型核酸の領域を、「前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域」ともいう。前記検体核酸の標的配列および前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域において、前記検出用プローブがハイブリダイズ可能な領域を、それぞれ、以下、「ハイブリダイズ領域」ともいう。本発明において、ハイブリダイズ領域とは、例えば、全体として二本鎖を形成している領域を意味する。前記ハイブリダイズ領域は、例えば、前記領域内の全塩基が水素結合による塩基対を形成してもよいし、前記領域の内部において、塩基対を形成していないミスマッチの塩基を含んでもよい。前記ミスマッチとは、例えば、アデニンとシトシンとの組み合わせのように、対応する塩基が水素結合しない形態でもよいし、配列間において対応する部位の塩基が欠失している形態であってもよい。また、本発明において、前記ハイブリダイズ領域以外の領域を、例えば、「非ハイブリダイズ領域」ともいう。本発明において、コントロール用鋳型核酸を増幅するための反応系を、「コントロール用反応系」、検体核酸の標的配列を増幅するための反応系を、「検体用反応系」ともいう。本発明において、以下、陽性コントロールおよび陰性コントロールを検出するための「コントロール用鋳型核酸」を、「コントロール用鋳型」ともいう。
【００１５】
本発明において、「陽性コントロール」は、反応系で増幅反応が起きることを示すコントロールであることから、「増幅コントロール」ともいう。陽性コントロールが陽性（＋）とは、増幅反応が起きていることを意味し、陽性コントロールが陰性（−）とは、増幅反応が起きていないことを意味する。本発明において、「陰性コントロール」は、反応系に不要な核酸が混入して、前記不要な核酸の増幅産物が生成されていることを示すコントロールであることから、「混入コントロール」ともいう。陰性コントロールが陽性（＋）とは、前記不要な核酸が混入して、前記不要な核酸の増幅産物が生成されていることを意味し、陰性コントロールが陰性（−）とは、前記不要な核酸が混入していない、または、前記不要な核酸が混入したとしても、前記混入した不要な核酸から問題となる増幅産物は生成されていないことを意味する。
【００１６】
＜コントロール検出方法＞
本発明のコントロール検出方法は、前述のように、反応系において検体核酸の標的配列を増幅する際、前記反応系の増幅性能を示すコントロールを検出する方法であって、
前記コントロールが、反応系で増幅反応が起きることを示す陽性コントロールおよび反応系への不要な核酸の混入を示す陰性コントロールであり、
前記反応系は、プライマー、検出用プローブおよびコントロール用鋳型核酸を含み、
前記プライマーは、前記標的配列を増幅可能なプライマーであり、
前記検出用プローブは、前記標的配列にハイブリダイズ可能なプローブであり、
前記コントロール用鋳型核酸は、前記プライマーによって増幅可能であり、
前記プライマーによる前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域は、前記検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と異なる値であり、
下記（ａ１）〜（ａ３）工程を含み、
前記陽性コントロールおよび前記陰性コントロールを、１つの反応系で検出することを特徴とする。
（ａ１）前記反応系において、前記プライマーを用いて、前記コントロール用鋳型核酸の増幅を行う増幅工程
（ａ２）前記（ａ１）工程の前記反応系を用いて、前記検出用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程
（ａ３）前記融解曲線におけるピークによって、前記陽性コントロールおよび前記陰性コントロールが、それぞれ陽性であるか陰性であるかを判断する判断工程
【００１７】
本発明のコントロール検出方法によれば、前述のように、目的の検体核酸の増幅を行う際、反応系において、増幅反応が正常に起きているか否か、および、不要な核酸の混入が原因となる増幅が生じているか否かを、前記検体核酸を増幅するための反応系とは別のコントロール用反応系で判断できる。使用する反応系における増幅性能の判断は、前述のように、目的の検体核酸を増幅させる際、増幅の有無をより優れた精度で判断するために重要である。このため、本発明のコントロール検出方法において、前記コントロール用鋳型を増幅させる前記（ａ１）工程は、例えば、前記検体用反応系を用いた検体核酸の増幅工程に先立って、並行して、または、その後、同一条件下で行うことが好ましい。中でも、例えば、増幅反応の時間、温度等の条件を略同一とできることから、前記コントロール用鋳型を増幅させる前記（ａ１）工程と、前記検体核酸の増幅工程とは、並行して同時に行うことが好ましい。具体的には、複数の測定部を備える機器（例えば、増幅装置）を用いて、各測定部で、前記コントロール用反応系および前記検体用反応系について、それぞれの増幅反応を同時に行うことが好ましい。なお、この点は、本発明の増幅方法において、詳細に説明する。
【００１８】
前記（ａ１）工程におけるコントロール用反応系は、陽性コントロールと陰性コントロールとを検出するための反応系である。前記コントロール用反応系は、増幅の鋳型として、検体核酸を含まず、コントロール用鋳型を含む。前記コントロール用鋳型の増幅に使用する前記コントロール用反応系と、前記検体核酸の増幅に使用する前記検体用反応系とは、前者が前記コントロール用鋳型を含み、後者が検体核酸を含む以外は、同様の条件であることが好ましい。なお、前記コントロール用鋳型および前記検体核酸のうち、前記コントロール用反応系は、前記コントロール用鋳型を含み、検体核酸を含まないが、前記検体用反応系は、例えば、前記検体核酸を含み、且つ、前記コントロール用鋳型を含まなくてもよいし、含んでもよい。
【００１９】
前記コントロール用鋳型は、例えば、一本鎖でもよいし、二本鎖であってもよい。前記コントロール用鋳型が二本鎖の場合、例えば、前記二本鎖を構成する２つの一本鎖のうち、いずれを核酸増幅の鋳型としてもよいが、増幅効率の点から、両方を鋳型とすることが好ましい。前記二本鎖を構成する２つの一本鎖は、いずれがセンス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
【００２０】
本発明のコントロール検出方法において、前記プライマーおよび検出用プローブは、検体核酸を増幅するための検体用反応系で使用する検出用プローブおよびプライマーと同じものを使用する。このため、前記コントロール用鋳型は、前記検体核酸の標的配列を増幅可能なプライマーによって増幅可能であること、前記検体核酸の標的配列にハイブリダイズ可能な前記検出用プローブがハイブリダイズ可能であることが必須である。これらの条件は、例えば、前記コントロール用鋳型を、３’側に前記プライマーと相補的な配列を有し、且つ、前記配列よりも５’側に前記検出用プローブとハイブリダイズ可能な配列を有する塩基配列に設計することで達成できる。「プライマーと相補的な配列」とは、例えば、前記プライマーがアニーリングして伸長が開始できればよく、例えば、相補性の程度は、特に制限されないが、例えば、５０％以上であり、８０％以上が好ましく、より好ましくは１００％である。「検出用プローブとハイブリダイズ可能な配列」とは、例えば、後述するように、前記検出用プローブの全体に相補的な配列でもよいし、前記検出用プローブの部分領域に相補的な配列であってもよく、後述するＴｍ値との関係等に応じて適宜設定できる。
【００２１】
前記コントロール用鋳型は、さらに、その増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）が、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と、異なる値であることが必須である。この条件は、例えば、前記コントロール用鋳型における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域と、前記標的配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域とを、異なる条件にすることで達成できる。具体的には、例えば、前記両者のハイブリダイズ領域の長さを変えること、または、前記両者のハイブリダイズ領域の相同性を変えること等により達成できる。なお、前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記標的配列とは、例えば、前記検出用プローブのハイブリダイズ領域の一部を除き、同じ配列であることが好ましい。
【００２２】
まず、前者のハイブリダイズ領域の長さを変える方法について説明する。Ｔｍは、例えば、ハイブリダイズ領域が相対的に長いほど、高く、ハイブリダイズ領域が相対的に短いほど、低くなる。したがって、同じ検出用プローブを使用する場合、例えば、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域の長さと、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域の長さとを変えることで、両者のＴｍ値を異なる値に設定できる。つまり、この形態において、前記コントロール用鋳型は、前記コントロール用鋳型における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域の長さが、前記標的配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域の長さとは異なる長さである。この場合、例えば、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域が、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域より長くてもよいし、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域が、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域より長くてもよい。前記コントロール用鋳型のハイブリダイズ領域と前記標的配列のハイブリダイズ領域との関係について、以下に、具体例をあげて説明する。
【００２３】
まず、第一の形態として、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域が、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域より長い形態について例示する。この場合、前記検出用プローブとして、例えば、前記標的配列の所定領域に相補的な塩基配列からなるプローブを使用することが好ましく、具体的には、１００％相補的な塩基配列であることが好ましい。そして、前記コントロール用鋳型は、例えば、その増幅領域に、前記検出用プローブが部分的にハイブリダイズ可能な塩基配列を有することが好ましい。この形態によれば、例えば、前記検出用プローブは、その全体が、前記標的配列に対してハイブリダイズ可能であるのに対して、前記検出用プローブは、部分的に前記コントロール用鋳型に対してハイブリダイズ可能となる。このため、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域が、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域よりも長くなる。なお、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域と、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域とで、前記検出用プローブがハイブリダイズ可能な共通の領域を、共通領域または共通塩基配列ともいう。
【００２４】
前記コントロール用鋳型は、例えば、その増幅領域に、前記標的配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域とは５’側および３’側の少なくとも一方が異なる塩基配列を有することが好ましい。また、前記コントロール用鋳型は、例えば、その増幅領域に、前記検出用プローブの塩基配列において５’領域および３’領域の少なくとも一方が異なる配列に相補的な塩基配列を有することが好ましい、ということもできる。前記コントロール用鋳型をこのように設計することで、例えば、前記プローブは、その５’領域および３’領域の一方が、前記コントロール用鋳型にハイブリダイズし、他方が、前記コントロール用鋳型にハイブリダイズしない状態となる。
【００２５】
前記第一の形態の具体例を、図１を用いて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。図１において、左図は、前記検出用プローブが前記標的配列にハイブリダイズした状態を示す概略図であり、右図は、前記検出用プローブが前記コントロール用鋳型の増幅領域にハイブリダイズした状態を示す概略図である。左図に示すように、前記検出用プローブは、その全体が前記標的配列の所定領域にハイブリダイズする。他方、右図に示すように、前記コントロール用鋳型は、その増幅領域に、前記検出用プローブの塩基配列において３’領域が異なる配列に相補的な塩基配列を有する。つまり、右図の前記コントロール用鋳型は、左図の標的配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域とは、５’領域が異なる塩基配列（図において×印）を有している。このため、前記コントロール用鋳型に対して、前記検出用プローブの３’領域がハイブリダイズしない状態となる。すなわち、前記検出用プローブの３’領域は、非ハイブリダイズ領域となる。このように、同じ検出用プローブを使用しても、前記検出用プローブの全体がハイブリダイズした二本鎖と、前記検出用プローブの部分領域がハイブリダイズした二本鎖とでは、前者の方が後者よりも高いＴｍ値となる（ＴｍＡ＞ＴｍＣ）。
【００２６】
図１においては、前記コントロール用鋳型に対して、前記検出用プローブの３’領域がハイブリダイズしない例を示したが、これには制限されず、前記検出用プローブの５’領域がハイブリダイズしない形態であってもよい。
【００２７】
前記検出用プローブの長さは、特に制限されないが、例えば、５〜５０塩基長であり、好ましくは、１０〜３０塩基長である。前記検出用プローブにおいて、前記コントロール用鋳型とハイブリダイズする塩基配列の長さは、例えば、５〜４０塩基長が好ましく、より好ましくは、１０〜３０塩基長であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基長である。この長さは、例えば、前記コントロール用鋳型の増幅領域における、前記検出用プローブが部分的にハイブリダイズ可能な塩基配列の長さに相当し、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域と、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域との共通配列の長さともいえる。また、前記検出用プローブにおいて、前記コントロール用鋳型とハイブリダイズしない非ハイブリダイズ領域の塩基配列の長さは、例えば、１〜４０塩基長が好ましく、より好ましくは、３〜２０塩基長であり、さらに好ましくは、５〜１０塩基長である。この長さは、例えば、前記コントロール用鋳型の増幅領域において、前記標的配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域とは異なる５’側および３’側の少なくとも一方の配列の長さに相当し、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域の内、前記コントロール用型核酸におけるハイブリダイズ領域との共通配列以外の配列（非共通配列）の長さともいえる。図１の右図においては、例えば、前記検出用プローブがハイブリダイズしない非ハイブリダイズ領域（図において×印の領域）の長さに相当する。また、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域の長さを１００％とした場合、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域の長さは、例えば、その５０〜９５％であることが好ましく、より好ましくは７５〜９０％である。
【００２８】
つぎに、第二の形態として、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域が、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域より長い形態について例示する。この場合、前記検出用プローブとして、例えば、前記標的配列に部分的に相補的な塩基配列からなるプローブを使用する。つまり、前記検出用プローブとしては、前記標的配列に対するハイブリダイズ領域と非ハイブリダイズ領域とを有するプローブを使用する。そして、前記コントロール用鋳型は、例えば、その増幅領域内に、前記標的配列における前記検出用プローブのハイブリダイズ領域と同じ塩基配列、ならびに、それに隣接して、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域の５’側および３’側の少なくとも一方に隣接する領域とは異なる塩基配列を有することが好ましい。具体的に、前記異なる塩基配列は、前記同じ塩基配列の５’側および３’側の少なくとも一方、より詳細には、５’末端および３’末端の少なくとも一方に隣接していることが好ましい。また、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域の５’側および３’側の少なくとも一方に隣接する領域とは、例えば、前記標的配列と前記検出用プローブとをアライメントした際に、前記検出用プローブと対応する領域であって、前記検出用プローブの部分領域がハイブリダイズしない領域、すなわち非ハイブリダイズ領域である。この形態によれば、例えば、前記検出用プローブは、その全体が、前記コントロール用鋳型に対してハイブリダイズ可能であるのに対して、前記検出用プローブは、部分的に前記標的配列に対してハイブリダイズ可能となる。このため、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域が、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域よりも長くなる。なお、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域と、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域とで、前記検出用プローブがハイブリダイズ可能な共通の領域を、共通領域または共通塩基配列ともいう。
【００２９】
この第二の形態の具体例を、図３を用いて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。図３において、左図は、前記検出用プローブが前記標的配列にハイブリダイズした状態を示す模式図であり、右図は、前記検出用プローブが前記コントロール用鋳型にハイブリダイズした状態を示す模式図である。左図に示すように、前記検出用プローブは、その３’領域を除き、前記標的配列の所定領域に相補的な塩基配列とする。このため、前記標的配列に対しては、前記検出用プローブの３’領域がハイブリダイズしない状態となる。すなわち、前記検出用プローブの３’領域は、非ハイブリダイズ領域となる。他方、右図の前記コントロール用鋳型は、左図の標的配列における前記検出用プローブの非ハイブリダイズ領域とは、５’領域が異なる塩基配列（図において×印）を有している。つまり、前記コントロール用鋳型は、前記検出用プローブ全体と相補的な塩基配列を有する。このため、前記コントロール用鋳型に対しては、前記検出用プローブの全体がハイブリダイズする状態となり、前記標的配列に対しては、前記検出用プローブの３’領域がハイブリダイズしない状態となる。このように、同じ検出用プローブをハイブリダイズさせた際、前記検出用プローブの全体がハイブリダイズした二本鎖と、前記検出用プローブの部分領域がハイブリダイズした二本鎖とでは、前者の方が後者よりも高いＴｍ値となる（ＴｍＣ＞ＴｍＡ）。
【００３０】
図３においては、標的配列に対して、検出用プローブの３’領域がハイブリダイズしない例を示したが、これには制限されず、検出用プローブの５’領域がハイブリダイズしない形態であってもよい。
【００３１】
前記検出用プローブは、前述のように、前記標的配列に部分的に相補的な塩基配列からなることが好ましい。前記検出用プローブにおいて、前記標的配列とハイブリダイズする塩基配列の長さは、例えば、５〜４０塩基長が好ましく、より好ましくは、１０〜３０塩基長であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基長である。この長さは、例えば、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域のうち、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域と共通する塩基配列の長さに相当し、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域と、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域との共通配列の長さともいえる。また、前記検出用プローブにおいて、前記標的配列とハイブリダイズしない非ハイブリダイズ領域の塩基配列の長さは、例えば、１〜４０塩基長が好ましく、より好ましくは、３〜２０塩基長であり、さらに好ましくは、５〜１０塩基長である。この長さは、例えば、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域のうち、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域と異なる塩基配列の長さに相当し、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域の内、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域との共通配列以外の配列（非共通配列）の長さともいえる。図３の右図においては、例えば、前記コントロール用鋳型に対して、前記検出用プローブが、前記共通配列以外でハイブリダイズする領域（図において×印の領域）の長さに相当する。また、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域の長さを１００％とした場合、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域の長さは、例えば、その５０〜９５％であることが好ましく、より好ましくは、７５〜９０％である。
【００３２】
つぎに、前述した、後者の、ハイブリダイズ領域の相同性を変える方法について説明する。Ｔｍは、例えば、検出用プローブとのハイブリダイズ領域において、前記検出用プローブに対する相補性が相対的に高いほど、高く、前記検出用プローブに対する相補性が低いほど、低くなる。このため、同じ検出用プローブを使用する場合、例えば、前記コントロール用鋳型の前記ハイブリダイズ領域と、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域の塩基配列との相同性を、１００％未満とする。これによって、前記コントロール用鋳型における前記ハイブリダイズ領域の前記検出用プローブに対する相補性と、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域の前記検出用プローブに対する相補性とを、異なる値に設定でき、結果的に、両者のＴｍ値を異なる値に設定できる。この場合、例えば、前記標的配列の前記検出用プローブに対する相補性を、前記コントロール用鋳型の前記検出用プローブに対する相補性より高くしてもよいし、前記コントロール用鋳型の前記検出用プローブに対する相補性を、前記標的配列の前記検出用プローブに対する相補性より高く設定してもよい。この形態において、ハイブリダイズ領域の長さは、例えば、前記標的配列と前記コントロール用鋳型とにおいて、同じであってもよい。前記コントロール用鋳型のハイブリダイズ領域と前記標的配列のハイブリダイズ領域との関係について、以下に、具体例をあげて説明する。
【００３３】
前記ハイブリダイズ領域の相同性は、例えば、１００％未満が好ましく、より好ましくは９５％未満であり、さらに好ましくは９０％未満である。前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域と、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域とにおいて、異なる塩基の数は、特に制限されないが、例えば、１〜２０塩基であることが好ましく、より好ましくは、１〜１０塩基であり、さらに好ましくは、１〜５塩基である。前記異なる塩基は、例えば、ハイブリダイズ領域において、連続してもよいし、非連続であってもよい。また、前記コントロール用鋳型の前記ハイブリダイズ領域の前記検出用プローブに対する相補性と、前記標的配列における前記ハイブリダイズ領域の前記検出用プローブに対する相補性とは、例えば、一方の相補性が、他方の相補性よりも高ければよい。具体的には、相対的に高い相補性は、例えば、９０〜１００％であり、好ましくは１００％であり、相対的に低い相補性は、前記相対的に高い相補性よりも、例えば、５〜１０％程度低いことが好ましい。
【００３４】
まず、第一の形態として、前記標的配列の前記検出用プローブに対する相補性が、前記コントロール用鋳型の前記検出用プローブに対する相補性より高い形態について、図４を用いて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。
【００３５】
図４は、前記標的配列の所定領域に１００％相補的な塩基配列からなる検出用プローブを使用し、前記コントロール用鋳型におけるハイブリダイズ領域の塩基配列を、前記検出用プローブとの相補性が１００％未満となる配列に設定した例である。図４において、左図は、前記検出用プローブが前記標的配列にハイブリダイズした状態を示す概略図であり、右図は、前記検出用プローブが前記コントロール用鋳型の増幅領域にハイブリダイズした状態を示す概略図である。前記検出用プローブは、前述のように、前記標的配列の所定領域に１００％相補的な配列である。このため、左図に示すように、前記検出用プローブは、その全体が、前記標的配列の所定領域にハイブリダイズし、且つ、そのハイブリダイズ領域において、全ての塩基が塩基対を形成している。他方、前記コントロール用鋳型は、前記検出用プローブとの相補性が１００％未満となる配列であり、具体的には、前記検出用プローブと、右図の×印において、非相補的なミスマッチの塩基を有している。つまり、前記コントロール用鋳型は、前記標的核酸の所定領域（ハイブリダイズ領域）とは、異なる相同性の配列を有している。このため、右図に示すように、前記検出用プローブは、その全体が、前記コントロール用鋳型にハイブリダイズするが、そのハイブリダイズ領域の内部において、塩基対を形成しないミスマッチ（図において×印）が生じる。このため、前記コントロール用鋳型の前記検出用プローブに対する相補性は、前記標的配列の前記検出用プローブに対する相補性よりも低くなる。したがって、同じ検出用プローブを使用しても前記ハイブリダイズ領域の全体が塩基対を形成した二本鎖と、前記ハイブリダイズ領域の内部において、塩基対を形成しないミスマッチを有する二本鎖とでは、前者の方が後者よりも高いＴｍ値となる（ＴｍＡ＞ＴｍＣ）。なお、図４では、前記プローブを、前記標的配列の所定領域に１００％相補的な配列としたが、前記所定領域とミスマッチを有する配列であってもよい。この場合、例えば、前記標的配列に対するミスマッチの数よりも、前記コントロール用鋳型に対するミスマッチの数が多ければ、同様のこととなる。
【００３６】
つぎに、第二の形態として、前記コントロール用鋳型の前記検出用プローブに対する相補性が、前記標的配列の前記検出用プローブに対する相補性より高い形態について、図５を用いて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。
【００３７】
図５は、前記コントロール用鋳型の所定領域に１００％相補的な塩基配列からなる検出用プローブを使用し、前記標的配列におけるハイブリダイズ領域の塩基配列を、前記検出用プローブとの相補性が１００％未満となる配列に設定した例である。図５において、左図は、前記検出用プローブが前記標的配列にハイブリダイズした状態を示す概略図であり、右図は、前記検出用プローブが前記コントロール用鋳型の増幅領域にハイブリダイズした状態を示す概略図である。前記検出用プローブは、前述のように、前記コントロール用鋳型の所定領域に１００％相補的な配列である。このため、右図に示すように、前記検出用プローブは、その全体が、前記コントロール用鋳型の所定領域にハイブリダイズし、且つ、そのハイブリダイズ領域において、全ての塩基が塩基対を形成している。他方、前記標的配列は、前記検出用プローブとの相補性が１００％未満となる配列であり、具体的には、前記検出用プローブと、左図の×印において、非相補的なミスマッチの塩基を有している。つまり、前記標的配列は、前記コントロール用鋳型の所定領域（ハイブリダイズ領域）とは、異なる相同性の配列を有している。このため、左図に示すように、前記検出用プローブは、その全体が、前記標的配列にハイブリダイズするが、そのハイブリダイズ領域の内部において、塩基対を形成しないミスマッチ（図において×印）が生じる。このため、前記標的配列の前記検出用プローブに対する相補性は、前記コントロール用鋳型の前記検出用プローブに対する相補性よりも低くなる。したがって、同じ検出用プローブを使用しても前記ハイブリダイズ領域の全体が塩基対を形成した二本鎖と、前記ハイブリダイズ領域の内部において、塩基対を形成しないミスマッチを有する二本鎖とでは、前者の方が後者よりも高いＴｍ値となる（ＴｍＣ＞ＴｍＡ）。なお、図５では、前記プローブを、前記コントロール用鋳型の所定領域に１００％相補的な配列としたが、前記所定領域とミスマッチを有する配列であってもよい。この場合、例えば、前記コントロール用鋳型に対するミスマッチの数よりも、前記標的配列に対するミスマッチの数が多ければ、同様のこととなる。
【００３８】
前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）が、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と異なる値にする方法としては、以上の方法には制限されない。例えば、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ、ペプチド核酸であるＰＮＡ、架橋化核酸であるＢＮＡ等の人工核酸を使用することで、Ｔｍ値を調整することもできる。具体例としては、例えば、前記コントロール用鋳型の前記ハイブリダイズ領域、前記検出用プローブにおける、前記標的配列およびコントロール用鋳型のいずれか一方のみとハイブリダイズする部位に、前述の人工核酸等を含ませることで、Ｔｍ値を調整することもできる。
【００３９】
前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）と、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）との差は、特に制限されないが、例えば、１〜５０℃が好ましく、より好ましくは３〜３０℃であり、特に好ましくは５〜１０℃である。
【００４０】
前記コントロール用鋳型の長さは、特に制限されず、例えば、前記標的配列に応じて適宜決定できる。前記コントロール用鋳型の長さは、例えば、標的配列よりも０〜１,０００,０００塩基長い配列が好ましく、より好ましくは、１００〜１００,０００塩基長い配列、さらに好ましくは１,０００〜１０,０００塩基長い配列である。具体例としては、例えば、１００〜１,０００,０００塩基が好ましく、より好ましくは、５００〜１００,０００塩基、さらに好ましくは１,０００〜１０,０００塩基である。また、前記コントロール用鋳型の増幅領域は、特に制限されず、例えば、２０〜１００,０００塩基が好ましく、より好ましくは、５０〜１０,０００塩基、さらに好ましくは１００〜１,０００塩基である。
【００４１】
本発明において、前記プライマーの種類は、特に制限されず、例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖のいずれか一方のみを増幅するプライマーを使用することもできるが、増幅効率の点から、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を増幅する二種類以上のプライマーを使用することが好ましい。
【００４２】
前記プライマーの長さは、特に制限されず、一般的に、例えば、１０〜５０塩基であり、１５〜４０塩基、さらに好ましくは、１６〜３５塩基である。
【００４３】
本発明において、前記検出用プローブは、例えば、センス鎖にハイブリダイズするように設計されてもよいし、アンチセンス鎖にハイブリダイズするように設計されてもよい。本発明において、「標的配列にハイブリダイズ可能」とは、標的配列にハイブリダイズ可能でもよいし、標的配列の相補鎖にハイブリダイズ可能であってもよい。
【００４４】
前記検出用プローブは、前記標的配列にハイブリダイズ可能であればよく、前記標的配列のいずれの領域にハイブリダイズするように設計されてもよい。また、後述するように、本発明は、融解曲線解析による多型の検出においても有効に利用できる。この場合、前記検出用プローブは、前記標的配列における目的の多型が生じる塩基部位を含む領域にハイブリダイズ可能なように設計されることが好ましい。なお、多型の検出については、後述する。
【００４５】
前記検出用プローブの長さは、特に制限されず、一般的に、例えば、５〜５０塩基であり、好ましくは１０〜３０塩基である。
【００４６】
前記検出用プローブは、例えば、標識物質を有さない未標識プローブでもよいし、標識物質を有する標識プローブでもよい。前記標識プローブは、例えば、前記標的配列にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドが、前記標識物質で標識化（修飾）されていることが好ましい。前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される部位は、特に制限されないが、例えば、５’末端領域または３’末端領域であることが好ましく、より好ましくは５’末端または３’末端である。また、後述するように、前記オリゴヌクレオチドにおいて、前記標識物質により標識化される塩基は、例えば、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。なお、前記標識物質は、例えば、塩基を直接標識化してもよいし、前記塩基を含むヌクレオチド残基のいずれかの部位を標識することによって、前記塩基を間接的に標識化してもよい。前記標識物質は、例えば、前記検出用プローブの３’側および５’側のいずれに結合させてもよい。また、前記検出用プローブは、例えば、核酸増幅反応におけるプローブ自体の伸長を予防するために、その３’末端に、さらに、リン酸基または前述のような標識物質が付加されてもよい。
【００４７】
前記標識物質は、特に制限されないが、例えば、前記標識プローブが単独であるか、ハイブリッドを形成しているかによって、シグナルを発するものが好ましい。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、蛍光、呈色または発色等があげられる。前記シグナルが蛍光の場合、シグナル値としては、例えば、蛍光強度があげられる。前記シグナルが呈色または発色の場合、前記シグナル値としては、例えば、反射率、吸光度、透過率等があげられる。また、前記シグナルは、例えば、前記標識物質から直接発せられてもよいし、間接的に発せられてもよい。
【００４８】
前記標識物質は、特に制限されないが、例えば、蛍光団等の蛍光物質等があげられる。前記蛍光物質としては、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光物質としては、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商標名、モレキュラープローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（商標名、ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（商品名、アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＭＲＡ（商標名、モレキュラープローブ社製）等があげられる。前記蛍光物質の検出条件は、特に制限されず、例えば、使用する蛍光物質の種類により適宜決定できるが、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅは、検出波長４５０〜４８０ｎｍ、ＴＡＭＲＡは、検出波長５８５〜７００ｎｍ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬは、検出波長５１５〜５５５ｎｍで検出できる。このような検出用プローブを使用すれば、例えば、シグナルとして蛍光を検出し、シグナル値として蛍光強度を測定することにより、蛍光強度の変動から、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００４９】
前記標識プローブは、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブであることが好ましい。前記標識物質が蛍光物質の場合、前記標識プローブは、例えば、前記蛍光物質で標識化され、単独で蛍光を示し、且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような現象は、一般に、蛍光消光現象（Quenching  phenomenon）と呼ばれる。この現象を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記蛍光消光プローブとしては、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端が前記蛍光物質で標識化されていることが好ましく、標識化される前記末端の塩基は、シトシン（ｃ）またはグアニン（ｇ）であることが好ましい。前記末端の塩基がシトシン（ｃ）の場合、前記蛍光消光プローブは、例えば、前記コントロール用鋳型または検体核酸とハイブリッドを形成した際、前記コントロール用鋳型または検体核酸における、標識化された末端のシトシン（ｃ）と対をなす塩基または前記対をなす塩基から１〜３塩基離れた塩基がグアニン（ｇ）となるように、前記蛍光消光プローブの塩基配列を設計することが好ましい。前記対をなす塩基から一塩基離れた塩基とは、前記対をなす塩基の隣の塩基を意味する。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが前記検体核酸にハイブリダイズすると、例えば、前記蛍光物質で標識化された末端のシトシン（ｃ）が、前記コントロール用鋳型または検体核酸におけるグアニン（ｇ）に近づくことによって、前記蛍光物質の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このようなプローブを使用すれば、蛍光強度の変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
【００５０】
前記検出用プローブは、例えば、３’末端にリン酸基が付加されてもよい。後述するように、前記コントロール用鋳型および検体核酸は、例えば、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって調製でき、この際、前記検出用プローブを増幅反応の反応系に共存させることができる。このような場合、前記検出用プローブの３’末端にリン酸基を付加させておけば、前記プローブ自体が前記増幅反応によって伸長することを十分に防止できる。また、３’末端に前述のような標識物質を付加することによっても、同様の効果が得られる。
【００５１】
前記プライマー、検出用プローブおよび前記コントロール用鋳型は、例えば、デオキシリボヌクレオチドやリボヌクレオチド等のヌクレオチドから構成されてもよいし、ＲＮＡアナログであるＬＮＡ、ペプチド核酸であるＰＮＡ、架橋化核酸であるＢＮＡ等を含んでもよい。
【００５２】
前記（ａ１）工程において、核酸の増幅方法としては、特に制限されず、例えば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられ、中でも、ＰＣＲ法が好ましい。なお、前記核酸増幅法の条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５３】
前記（ａ２）工程は、前述のように融解曲線解析を行う解析工程であり、例えば、いわゆるＴｍ解析を行うことが好ましい。ここで、Ｔｍ解析におけるＴｍ値について説明する。例えば、二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍとは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のMELTCALCソフトウエア（http://www.meltcalc.com/）や最近接塩基対法（Nearest  Neighbor  Method）によって決定することもでき、実際の測定により決定することもできる。
【００５４】
前記（ａ２）工程において、前記融解曲線解析は、例えば、以下のように行うことができる。すなわち、前記（ａ２）工程は、例えば、前記検出用プローブの存在下、前記コントロール用鋳型の増幅産物を含む前記（ａ１）工程の前記反応系の温度を変化させ、前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程である。
【００５５】
前記（ａ２）工程において、前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナルの測定は、前述した、２６０ｎｍにおける吸光度測定でもよいが、標識物質のシグナル測定であってもよい。具体的には、前記検出用プローブとして、前述したように、前記標識物質で標識化された標識プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが好ましい。前記標識プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し、且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず、且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、前記増幅産物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱により前記増幅産物から前記プローブが解離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、前記増幅産物とハイブリッド（二本鎖ＤＮＡ）を形成することによってシグナルを示し、加熱により前記増幅産物から前記プローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、前記標識物質のシグナルを検出することによって、前記２６０ｎｍにおける吸光度測定と同様に、ハイブリッド形成体の融解の進行ならびにＴｍ値の決定等を行うことができる。前記標識物質のシグナル検出は、例えば、前記標識物質のシグナルに特有の条件で検出すればよく、前記条件としては、例えば、励起波長、検出波長等があげられる。なお、前記標識プローブならびに前記標識物質については、前述のとおりである。
【００５６】
前記検出用プローブの添加のタイミングは、特に制限されず、例えば、前記（ａ２）工程の前であればよく、前記（ａ１）の増幅工程の前、途中または後に添加できる。中でも、例えば、添加のために前記反応系を外部環境に露出する必要がなく、また、前記（ａ１）工程の増幅反応と前記（ａ２）工程の融解曲線解析とを、連続的に行うことが可能であるため、前記（ａ１）工程の増幅反応前に、前記反応系に添加することが好ましい。この場合、前記検出用プローブは、前述のように、その３’末端が標識物質またはリン酸基で修飾されていることが好ましい。
【００５７】
前記（ａ３）工程において、前記陽性コントロールおよび前記陰性コントロールが、それぞれ陽性であるか陰性であるかは、例えば、以下のように判断できる。すなわち、前記（ａ３）工程は、例えば、前記融解曲線において、
前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）にピークが存在する場合、陽性コントロールが陽性（＋）と判断し、
前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）にピークが存在しない場合、陽性コントロールが陰性（−）と判断し、
前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）以外にピークが存在しない場合、陰性コントロールが陰性（−）と判断し、
前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）以外にピークが存在する場合、陰性コントロールが陽性（＋）と判断する。
【００５８】
つぎに、本発明のコントロール検出方法について、図１に示すコントロール用鋳型ならびに検出用プローブを使用し、ＰＣＲ法により核酸増幅を行う例をあげて説明する。なお、本発明は、これには制限されない。また、ＰＣＲの条件は、特に制限されず、従来公知の方法により行うことができる。
【００５９】
まず、前記コントロール用鋳型、プライマーおよび検出用プローブを含む反応液を準備する。
【００６０】
前記反応液における前記コントロール用鋳型の添加割合は、特に制限されないが、例えば、１０−１２〜１０−７μｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは１０−１１〜１０−８μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは１０−１０〜１０−９μｍｏｌ／Ｌである。
【００６１】
前記反応液におけるプライマーの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１０μｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは０．０５〜５μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜１μｍｏｌ／Ｌである。また、プライマーの種類は、特に制限されず、前述のように、二種類以上を用いることが好ましく、それぞれ前述の範囲で添加することが好ましい。
【００６２】
前記反応系における検出用プローブの添加割合は、特に制限されないが、例えば、１０〜４００ｎｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは２０〜２００ｎｍｏｌ／Ｌである。
【００６３】
前記反応液における他の成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげられ、その割合も特に制限されない。前記成分としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼ、ヌクレオチド（ヌクレオシド三リン酸）および溶媒等があげられる。
【００６４】
前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第４，８８９，８１８号および同第５，０７９，３５２号）（商品名Ｔａｑポリメラーゼ）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９１／０９９５０）（rTth  DNA  polymerase）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ  ９２／９６８９）（Pfu  DNA  polymerase：Stratagenes社製）、テルモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）由来ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰ−Ａ  ４５５  ４３０）（商標Vent： New  England  Biolabs社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。
【００６５】
前記反応液中のＤＮＡポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１００Ｕ／ｍＬであり、好ましくは５〜５０Ｕ／ｍＬであり、より好ましくは２０〜３０Ｕ／ｍＬである。なお、ＤＮＡポリメラーゼの活性単位（Ｕ）は、一般に、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型プライマーとして、活性測定用反応液中、７４℃で、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性が１Ｕである。前記活性測定用反応液の組成は、例えば、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴＡＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ９．３、２５℃）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭメルカプトエタノール、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＡＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＧＴＰ、２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＴＴＰ、１００μｍｏｌ／Ｌ［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ、０．２５ｍｇ／ｍＬ活性化サケ精子ＤＮＡである。
【００６６】
前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および、ｄＴＴＰまたはｄＵＴＰ）があげられる。前記反応液中のｄＮＴＰの添加割合は、特に制限されないが、例えば、０．０１〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、０．１〜０．３ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００６７】
前記溶媒としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＣＡＰＳ等があげられ、市販のＰＣＲ用緩衝液や市販のＰＣＲキットの緩衝液等が使用できる。
【００６８】
また、前記反応液は、さらに、ヘパリン、ベタイン、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、グリセロール等を含んでもよく、これらの添加割合は、例えば、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で設定すればよい。
【００６９】
前記反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器（サーマルサイクラー）等に応じて適宜決定できるが、通常、１〜５００μＬであり、好ましくは１０〜１００μＬである。
【００７０】
つぎに、前記反応液を用いて、ＰＣＲにより、前記コントロール用鋳型の増幅を行う。ＰＣＲは、例えば、（１）二本鎖核酸の一本鎖核酸への解離、（２）プライマーのアニーリング、（３）プライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）の３つの工程を含む。各工程の条件は、特に制限されないが、前記（１）工程は、例えば、９０〜９９℃、１〜１２０秒が好ましく、より好ましくは、９２〜９５℃、１〜６０秒であり、前記（２）工程は、例えば、４０〜７０℃、１〜３００秒が好ましく、より好ましくは、５０〜７０℃、５〜６０秒であり、前記（３）工程は、例えば、５０〜８０℃、１〜３００秒が好ましく、より好ましくは、５０〜７５℃、５〜６０秒である。また、サイクル数も特に制限されず、前記（１）〜（３）の３工程を１サイクルとして、例えば、３０サイクル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計１００サイクル以下、好ましくは７０サイクル以下、さらに好ましくは５０サイクル以下である。各ステップの温度変化は、例えば、サーマルサイクラー等を用いて自動的に制御すればよい。
【００７１】
そして、前記増幅反応後の反応系を用いて、融解曲線解析を行う。
【００７２】
前記融解曲線解析は、例えば、前記増幅工程後の前記反応系の温度を変化させ、前記増幅工程で得られた前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定し、温度変化に伴う前記シグナル値の変動を解析する。その結果、大きなシグナル値変動を示す温度が、前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体のＴｍ値であり、その温度にシグナル値変動のピークが存在すると判断できる。また、大きなシグナル値変動を示す温度が存在しない場合には、シグナル値変動のピークは存在しないと判断できる。このピークの有無と、ピークを示す温度（Ｔｍ値）の結果に基づいて、後述する前記（ａ３）の判断工程において、コントロールの判断を行う。
【００７３】
前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成は、例えば、前記検出用プローブの存在下、前記反応液の温度を変化させることで行える。この場合、前述のように、予め前記検出用プローブを添加した前記反応液について、増幅反応を行った後、前記反応液を温度変化させることが好ましい。
【００７４】
前記ハイブリッド形成は、例えば、まず、二本鎖ＤＮＡである前記増幅産物を一本鎖ＤＮＡに解離し、そして、前記一本鎖ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリダイズを行う。
【００７５】
前記増幅産物の解離は、例えば、前記反応液を加熱することで行える。加熱温度は、前記増幅産物を解離できる温度であれば、特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
【００７６】
解離した一本鎖ＤＮＡと前記検出用プローブとのハイブリダイズは、例えば、前記解離のための加熱処理後、その加熱温度を降下させることで、つまり、前記反応液の温度を降下させることで、行うことができる。温度条件としては、例えば、４０〜５０℃である。また、前記温度での処理時間は、特に制限されないが、例えば、１〜６００秒である。
【００７７】
続いて、前述のように、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記検出用プローブとのハイブリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、前記反応液（前記ハイブリッド形成体）を加熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。
【００７８】
シグナル値の測定は、前述のように、前記未標識プローブを用いて、２６０ｎｍの吸光度を測定してもよいが、前記標識プローブを用いて、各標識物質のシグナルを測定することが好ましい。前記標識プローブとしては、前述のように、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識プローブがあげられる。前者のプローブであれば、ハイブリッド（二本鎖核酸）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。したがって、このようなプローブを使用する場合は、例えば、蛍光が減少（または消光）しているハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。前者のプローブとしては、前述のようなグアニン消光プローブ等があげられる。また、後者のプローブであれば、ハイブリッド（二本鎖核酸）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。したがって、このようなプローブを使用する場合は、反対に、ハイブリッド形成体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。
【００７９】
シグナル値の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．３〜５℃／秒である。
【００８０】
つぎに、測定したシグナル値から、温度変化に伴うシグナル値の変動を解析し、大きな変動（ピーク）を示すＴｍ値を決定する。シグナル値の変動は、例えば、単位時間（ｔ）あたりのシグナル値（Ｆ）の変化量を算出することで解析できる。ハイブリッド形成体の融解（一本鎖化）によりシグナル値が増加する場合は、例えば、得られたシグナル値から、各温度における単位時間（ｔ）当たりのシグナル値（Ｆ）の増加量またはその負の微分値（−ｄＦ増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間（ｔ）当たりのシグナル値（Ｆ）の増加量またはその微分値（ｄＦ増加量／ｄｔ）が最も高い値を示す温度をＴｍ値として決定することもできる。他方、ハイブリッド形成体の融解（一本鎖化）によりシグナル値が減少する場合には、例えば、反対に、単位時間（ｔ）あたりシグナル値（Ｆ）の減少量を算出することにより、Ｔｍ値を決定することもできる。
【００８１】
なお、前述のように、前記反応液の温度を上昇させて、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル値を測定し、その変動を解析してもよい。すなわち、前記反応系の温度を降下させてハイブリッド形成体を形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル値の変動を解析してもよい。
【００８２】
前記シグナル値の変動の解析は、例えば、温度とシグナル値の変動との関係をプロットしたグラフを作成して解析することも可能であるが、前記融解曲線解析工程において、前記グラフの作成は必須ではない。
【００８３】
続いて、前記融解曲線解析の結果に基づいて、陽性コントロールおよび陰性コントロールの判断を行う。
【００８４】
前記融解曲線解析で得られたピークの温度が、前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）である場合、反応液において核酸増幅が起こっていることがわかる。つまり、陽性コントロールは陽性（＋）であると判断できる。他方、前記融解曲線解析においてピークが検出されなかった場合には、反応系において核酸増幅が起こっていないことがわかる。つまり、陽性コントロールは陰性（−）であると判断できる。また、前記融解曲線解析において、前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）以外にもピークが検出された場合は、反応系に不要な核酸が混入し、それを鋳型とした核酸増幅が起こっていることがわかる。つまり、陰性コントロールが陽性（＋）と判断できる。他方、前記融解曲線解析において、前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）以外にピークが検出されなかった場合は、反応系に不要な核酸が混入していないことがわかる。つまり、陰性コントロールが陰性（−）と判断できる。これらの結果から、例えば、陽性コントロールが陽性（＋）且つ陰性コントロールが陰性（−）と判断した際には、別途、検体核酸を用いて増幅反応を行った反応液について、増幅の有無等、目的の解析を行えばよい。他方、陽性コントロールが陰性（−）または陰性コントロールが陽性（＋）と判断した際には、検体核酸の反応系は、解析不可と判断し、再測定を行えばよい。
【００８５】
図２に、図１の示すコントロール用鋳型ならびに検出用プローブを使用した融解曲線解析において、前記シグナル値の変動（−ｄＦ／ｄｔ）と温度との関係をプロットしたグラフの一例を示す。なお、このグラフは例示であって、本発明はこれには何ら制限されない。前記検出用プローブとしては、二本鎖形成でシグナルが抑制され、解離によってシグナルを発するプローブを例にあげる。図２において、横軸は、温度（℃）を示し、縦軸は、シグナル値の変動を示し、単位は、シグナル変化量の微分値である「−ｄシグナル変化量／ｄｔ」（-ｄＦ/ｄｔ）とする。同図（Ａ）は、前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）のみにピークが検出されることから、増幅が起こっている、つまり陽性コントロールが陽性（＋）と判断できる。また、前記ピーク以外に、ピークが検出されないことから、反応系に不要な核酸は混入していない、つまり、陰性コントロールが陰性（−）と判断できる。同図（Ｂ）は、いずれの温度にもピークが検出されないことから、増幅が起こっていない、つまり陽性コントロールが陰性（−）と判断できる。同図（Ｃ）は、前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）だけでなく、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）にもピークが検出されたことから、反応系に不要な核酸が混入した、つまり陰性コントロールが陽性（＋）と判断できる。
【００８６】
なお、図２（Ｃ）に示すように、陰性コントロール（＋）の場合、陽性コントロール（＋）とは異なる温度にピークが見られる。このため、以下の理由から、反応系におけるコントロール用鋳型の添加割合を最小に抑えることが好ましい。この条件で解析を行った場合、例えば、陽性コントロール（＋）を示すＴｍＣにおけるピークより、陰性コントロール（＋）を示すＴｍＡにおけるピークが小さければ、不要な核酸の混入は解析に影響を与えないとして、陰性コントロール（＋）に伴う再測定を省略できる。この場合、前記反応系における前記コントロール用鋳型の添加割合は、例えば、１０−１２〜１０−７μｍｏｌ／Ｌが好ましく、より好ましくは１０−１１〜１０−８μｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは１０−１０〜１０−９μｍｏｌ／Ｌである。
【００８７】
また、本発明は、前記（ａ２）工程において、例えば、前記検出用プローブ、コントロール用オリゴヌクレオチドおよび前記コントロール用オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなる前記コントロール用プローブの存在下、前記融解曲線解析を行ってもよい。前記コントロール用オリゴヌクレオチドと前記コントロール用プローブとは、例えば、Ｔｍ値が既知であり、また、反応系におけるシグナル強度が既知である。
【００８８】
融解曲線解析は、一般に、温度制御ユニットおよびシグナル検出ユニットを備える装置を用いて行われる。しかしながら、前記装置は、前記温度制御ユニットが正確に温度を制御できないことや、前記シグナル検出ユニットが正確にシグナルを検出できないことがある。このため、前者の場合、実際の温度とは異なる温度にシグナルのピークが検出されるおそれがあり、後者の場合、実際とは異なる大きさのピークが検出されるおそれがある。このような理由から、装置において、温度制御ユニットおよびシグナル検出ユニットが、正確に機能しているか否かを確認することが重要となる。そこで、前記（ａ２）工程において、前記コントロール用オリゴヌクレオチドとコントロール用プローブとを共存させれば、前記コントロール用オリゴヌクレオチドと前記コントロール用プローブとがハイブリッドを形成するため、これらについても、同じ反応系を用いて、融解曲線解析を行うことができる。そして、前記コントロール用オリゴヌクレオチドと前記コントロール用プローブとのＴｍ値は、前述のように既知であることから、前記反応系について、前記既知のＴｍ値にシグナルのピークがあるか否かで、温度制御ユニットが正常に機能しているか否かを判断できる。つまり、例えば、既知Ｔｍ値が６０℃の場合に、装置が示す６０℃付近でピークが確認されれば、前記温度制御ユニットは正常に機能していると判断でき、装置が示す６０℃付近でピークが確認されず、他の温度でピークが確認されれば、前記温度制御ユニットは正常に機能していないと判断できる。また、コントロール用オリゴヌクレオチドとコントロール用プローブとの融解曲線解析を行うことで、例えば、シグナル検出ユニットが正常に機能しているか否かを判断できる。つまり、例えば、前記コントロール用オリゴヌクレオチドとコントロール用プローブとの融解曲線解析において、ノイズの有無を確認することにより、目的のピークが、シグナル検出の異常によるものか否かを判断できるため、誤判定を防止できる。本発明において、以下、前記コントロール用オリゴヌクレオチドを「Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチド」、前記コントロール用プローブを「Ｔｍコントロール用プローブ」ともいう。
【００８９】
前記Ｔｍコントロール用プローブは、例えば、標識物質を有する標識プローブであることが好ましい。また、前記反応系において、前記検出用プローブと前記Ｔｍコントロール用プローブと共存させることから、前記検出用プローブと前記Ｔｍコントロール用プローブとは、異なる標識物質で標識化されていることが好ましい。前記標識物質としては、例えば、前述のようなものがあげられる。
【００９０】
前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよびＴｍコントロール用プローブの添加のタイミングは、特に制限されないが、例えば、前記検出用プローブと同様であり、例えば、前記（ａ１）工程に先立って、前記反応系に添加することが好ましい。
【００９１】
前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよびＴｍコントロール用プローブの存在下で、前記（ａ１）工程の増幅反応を行う場合、前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよび前記Ｔｍコントロール用プローブの自身からの伸長を防止するために、その３’末端に、さらに、リン酸基が付加されてもよい。また、前記Ｔｍコントロール用プローブは、その３’末端に標識物質を有してもよい。これによっても、前記Ｔｍコントロール用プローブ自身の伸長を防止できる。
【００９２】
前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドと前記Ｔｍコントロール用プローブとの相補性は、例えば、９０％以上が好ましく、より好ましくは１００％である。前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドと前記Ｔｍコントロール用プローブの長さは、同じであることが好ましく、例えば、５〜４０塩基長が好ましく、より好ましくは１０〜３０塩基長であり、さらに好ましくは１５〜２５塩基長である。
【００９３】
前記Ｔｍコントロール用プローブは、前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるため、例えば、反応系に存在するその他の核酸配列に対するよりも、前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドに対する相補性が高いことが好ましい。また、前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドは、前記Ｔｍコントロール用プローブとハイブリダイズさせるため、例えば、反応系に存在するその他の核酸配列に対するよりも、前記Ｔｍコントロール用プローブに対する相補性が高いことが好ましい。前記Ｔｍコントロール用プローブおよび前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドは、それぞれ、例えば、前記その他の核酸配列にハイブリダイズし難いことが好ましく、さらに、前記その他の核酸配列にハイブリダイズしないことが好ましい。前記その他の核酸配列としては、例えば、前記検出用プローブ、前記検体核酸およびその標的配列、前記コントロール鋳型核酸およびその増幅領域、前記プライマー等があげられる。このようなＴｍコントロール用プローブおよびＴｍコントロール用オリゴヌクレオチドは、それぞれ、例えば、前記その他の核酸配列に対する相補性が、例えば、３０％以下であることが好ましく、より好ましくは２０％以下である。
【００９４】
前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドと前記Ｔｍコントロール用プローブとのＴｍ値（Ｔｍｔ）は、例えば、前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）と異なる値であることが好ましい。また、前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドと前記Ｔｍコントロール用プローブとのＴｍ値（Ｔｍｔ）は、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）とも異なる値であることが好ましい。
【００９５】
前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドと前記Ｔｍコントロール用プローブとを併用する場合、前記（ａ３）工程は、さらに、前記融解曲線におけるピークによって、前記（ａ２）工程における温度制御が正確か否かを判断することが好ましい。
【００９６】
＜増幅方法＞
本発明の増幅方法は、前述のように、反応系において検体核酸の標的配列を増幅する方法であって、下記（Ａ）工程および（Ｂ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記本発明のコントロール検出方法により、前記コントロール用鋳型核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系について、増幅性能を示すコントロールを検出する検出工程
（Ｂ）下記（ｂ１）工程を含む、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程
（ｂ１）前記検体核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系において、前記プライマーを用いて、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程
【００９７】
本発明の増幅方法は、本発明のコントロール検出方法によりコントロールを確認することが特徴であって、それ以外の工程や条件等は特に制限されない。また、特に示さない限り、前記本発明のコントロール検出方法は、前述の通りであって、本発明の増幅方法に適用できる。前記（Ａ）工程は、例えば、本発明のコントロール検出方法における前記（ａ１）〜（ａ３）工程を含む。
【００９８】
前記（ｂ１）工程において使用する検体用反応系は、目的の検体核酸を含む以外は、特に制限されず、前記コントロール用反応系と同じ条件であることが好ましい。前記検体用反応系は、例えば、前記コントロール用鋳型を含んでもよいし、含まなくてもよい。また、前記（ｂ１）工程は、前述のように、前記（ａ１）工程と同様に行うことが好ましい。
【００９９】
前記（Ｂ）工程は、さらに、下記（ｂ２）工程および（ｂ３）工程を有することが好ましい。下記（ｂ２）工程は、前記（ａ２）工程と同様に行うことができる。
（ｂ２）前記（ｂ１）工程の前記反応系を用いて、前記検出用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程
（ｂ３）前記融解曲線におけるピークによって、前記検体核酸の標的配列の増幅の有無を判断する判断工程
【０１００】
前記（ｂ３）工程は、例えば、前記（Ａ）工程の前記（ａ３）工程において、陽性コントロール（＋）且つ陰性コントロール（−）と判断した場合に、行うことが好ましい。前記（ａ３）工程において、陽性コントロール（−）または陰性コントロール（＋）と判断した場合には、省略して、再測定を行うことが好ましい。
【０１０１】
前記（ｂ３）工程においては、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）にピークが存在する場合、前記検体核酸の標的配列が増幅したと判断し、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）にピークが存在しない場合、前記検体核酸の標的配列が未増幅であると判断できる。
【０１０２】
前記コントロール用反応系についての前記（Ａ）工程と、前記検体用反応系についての前記（Ｂ）工程は、同条件で、同時に行うことが好ましく、具体的には、（ａ１）工程と（ｂ１）工程、（ａ２）工程と（ｂ２）工程とを、同条件で、同時に行うことが好ましい。
【０１０３】
前記検体核酸としては、特に制限されず、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよい。前記検体核酸としては、例えば、ＤＮＡや、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ等があげられる。また、前記検体核酸は、例えば、生体試料等の試料に含まれる核酸があげられる。前記試料中の検体核酸は、例えば、生体試料中に元来含まれている核酸でもよいが、例えば、前記生体試料中の核酸を鋳型として核酸増幅法により増幅させた増幅産物等であってもよい。具体例としては、例えば、前記生体試料に元来含まれているＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物や、前記生体試料に元来含まれているＲＮＡから逆転写反応（RT-PCR：Reverse  Transcription  PCR）により生成させたｃＤＮＡ、前記ｃＤＮＡを鋳型として、核酸増幅法により増幅させた増幅産物等があげられる。前記増幅産物の長さは、特に制限されないが、例えば、５０〜１０００塩基であり、好ましくは８０〜２００塩基である。
【０１０４】
前記検体核酸を含む試料としては、特に制限されないが、例えば、全血、血球、血漿、血清、口腔粘膜等の口腔内細胞、爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液、胃洗浄液等や、それらの懸濁液等があげられる。
【０１０５】
前記反応系における検体核酸の添加割合は、特に制限されないが、例えば、１〜１,０００,０００μｇ／Ｌが好ましく、より好ましくは１０〜１００,０００μｇ／Ｌであり、特に好ましくは１００〜１０,０００μｇ／Ｌである。
【０１０６】
また、本発明は、前記（ｂ２）工程において、検体核酸を増幅するための前記反応系を用いて、例えば、前記検出用プローブ、前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよび前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなる前記Ｔｍコントロール用プローブの存在下、前記融解曲線解析を行ってもよい。前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよび前記Ｔｍコントロール用プローブは、前述の通りである。これらについても、融解曲線解析を行うことで、例えば、前述のように、温度調節が正常であるか否かを判断できる。
【０１０７】
＜融解曲線解析方法＞
本発明の融解曲線解析方法は、前述のように、検体核酸を含む反応系の融解曲線解析方法であって、
下記（Ａ）工程および（Ｃ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）前記本発明のコントロール検出方法により、前記コントロール用鋳型核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系について、増幅性能を示すコントロールを検出する検出工程
（Ｃ）下記（ｃ１）および（ｃ２）工程を含む、融解曲線解析を行う解析工程
（ｃ１）前記検体核酸、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む反応系において、前記プライマーを用いて、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程
（ｃ２）前記（ｃ１）工程の前記反応系を用いて、前記検出用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程
【０１０８】
本発明の融解曲線解析方法は、本発明のコントロール検出方法によりコントロールを確認することが特徴であって、それ以外の工程や条件等は特に制限されない。前記（Ａ）工程は、例えば、本発明のコントロール検出方法における前記（ａ１）〜（ａ３）工程を含む。
【０１０９】
本発明の融解曲線解析方法は、例えば、多型検出方法に利用することが好ましい。このため、本発明の融解曲線解析方法は、例えば、多型検出方法ということもできる。本発明の融解曲線解析方法を、例えば、前記多型検出方法とする場合、前記検体核酸の標的配列が、多型を示す目的の標的部位を含み、前記検出用プローブが、前記標的配列における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブであり、前記（Ｃ）工程が、さらに、下記（ｃ３）工程を有することが好ましい。
（ｃ３）前記融解曲線におけるピークによって、前記多型を検出する検出工程
【０１１０】
前記コントロール用反応系についての前記（Ａ）工程と、前記検体用反応系についての前記（Ｃ）工程は、同時に行うことが好ましく、具体的には、（ａ１）工程と（ｃ１）工程、（ａ２）工程と（ｃ２）工程とを同時に行うことが好ましい。前記（Ｃ）工程において、前記（ｃ１）工程は、本発明の増幅方法における前記（ｂ１）工程と同じであり、前記（ｃ２）工程は、本発明の増幅方法における前記（ｂ２）工程と同じである。
【０１１１】
本発明において、前記検出用プローブは、例えば、前記標的部位の多型を野生型（正常型）として設計してもよいし、変異型として設定してもよい。すなわち、前記検出用プローブは、例えば、前記標的部位と対応する塩基を、野生型の塩基に相補的な塩基としてもよいし、変異型の塩基に相補的な塩基としてもよい。前者の場合、前記野生型の標的部位とマッチし、前記変異型の標的部位とミスマッチする。また、後者の場合、前記野生型の標的部位とミスマッチし、前記変異型の変異部位とマッチする。このように、前記標的部位が野生型か変異型かによって、前記標的部位において、前記標的配列と前記検出用プローブとの間に塩基の違いが生じるため、前記標的部位の多型を検出し分けることが可能である。前記検出用プローブにおける前記標的配列に対するハイブリッド領域と、前記標的配列における前記検出用プローブのハイブリッド領域とは、前記標的配列を除いて、９０〜１００％の相補性であることが好ましく、より好ましくは１００％である。
【０１１２】
融解曲線解析においては、例えば、完全に相補であるハイブリッド（パーフェクトマッチ）は、一塩基または二塩基以上が異なるハイブリッド（ミスマッチ）よりも、解離を示すＴｍ値が高くなるという結果が得られる。したがって、予め、前記検出用プローブについて、完全に相補であるハイブリッドのＴｍ値と、一塩基または二塩基以上が異なるハイブリッドのＴｍ値とを決定しておくことにより、前記標的部位における多型を決定できる。
【０１１３】
前記検出用プローブが、例えば、前記標的配列における変異型の前記塩基部位を含む領域に相補的なプローブの場合、例えば、前記（ｃ３）工程において、以下のように多型を判断できる。すなわち、例えば、前記塩基部位が変異型である標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＭＴ）にピークが存在する場合、前記検体核酸の前記塩基部位が変異型と判断し、前記塩基部位が野生型である標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＷＴ）にピークが存在する場合、前記検体核酸の前記塩基部位が野生型と判断できる。この場合、ＴｍＭＴは、ＴｍＷＴよりも高い温度となる。
【０１１４】
また、前記検出用プローブが、前記標的配列における野生型の前記塩基部位を含む領域に相補的なプローブの場合、前記（ｃ３）工程において、以下のように多型を判断できる。すなわち、例えば、前記塩基部位が野生型である標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＷＴ）にピークが存在する場合、前記検体核酸の前記塩基部位が野生型と判断し、前記塩基部位が変異型である標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＭＴ）にピークが存在する場合、前記検体核酸の前記塩基部位が変異型と判断できる。この場合、ＴｍＷＴは、ＴｍＭＴよりも高い温度となる。
【０１１５】
また、本発明は、前記（ｃ２）工程において、検体核酸を増幅するための前記反応系を用いて、例えば、前記検出用プローブ、前記コントロール用オリゴヌクレオチドおよび前記コントロール用オリゴヌクレオチドに相補的な塩基配列からなる前記コントロール用プローブの存在下、前記融解曲線解析を行ってもよい。前記コントロール用オリゴヌクレオチドおよび前記コントロール用プローブは、前述の通りである。これらについても、融解曲線解析を行うことで、例えば、前述のように、温度調節が正常であるか否かを判断できる。
【０１１６】
＜コントロール検出用試薬＞
本発明のコントロール検出用試薬は、本発明のコントロール検出方法に使用するためのコントロール検出用試薬であって、
コントロール用鋳型核酸を含み、
前記コントロール用鋳型核酸は、目的の標的配列を増幅可能なプライマーによって増幅可能であり、
前記プライマーによる前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域には、前記標的配列にハイブリダイズ可能な検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、
前記コントロール用鋳型核酸の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と異なる値であることを特徴とする。
【０１１７】
本発明のコントロール用試薬は、前述のコントロール用鋳型を含むことを特徴とし、その他の構成については何ら制限されない。
【０１１８】
本発明のコントロール検出用試薬は、例えば、前記コントロール用鋳型の他に、例えば、プライマーおよび検出用プローブを含んでもよい。本発明のコントロール検出用試薬が、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む場合、前記コントロール検出用試薬は、前記プライマーおよび前記検出用プローブを含むことから、例えば、前記検体核酸の増幅ならびに前記検体核酸の融解曲線解析に使用することもできる。この場合、前記検体核酸を含む検体用反応系は、例えば、結果的に、前記コントロール用鋳型を含んでもよい。前記検体用反応系に前記コントロール用鋳型が含まれても、前述のように、前記検体核酸の標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）は、前記コントロール用鋳型の増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）と異なるため、前記検体用反応系の増幅ならびに融解曲線解析は、前記検体用反応系に前記コントロール用鋳型が含まれない場合と同様に、行うことができる。
【０１１９】
本発明のコントロール検出用試薬は、さらに、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ等、前述した各種成分を適宜含んでもよい。また、本発明のコントロール検出用試薬は、例えば、各成分がそれぞれ別個の容器に収容された、本発明のコントロール検出方法に使用するためのキットであってもよい。前記キットは、使用説明書を含むことが好ましい。
【０１２０】
＜解析用試薬＞
本発明の解析用試薬は、本発明の融解曲線解析方法に使用するための解析用試薬であって、前記本発明のコントロール検出用試薬と、
前記プライマーおよび前記検出用プローブを含む検体核酸用の増幅反応用試薬とを備えることを特徴とする。本発明の解析用試薬は、例えば、各成分がそれぞれ別個の容器に収容された、本発明の融解曲線解析方法に使用するためのキットであってもよい。また、前記コントロール検出用試薬と、前記増幅反応用試薬とが、それぞれ別個の容器に収容された、キットであってもよい。前記キットは、例えば、使用説明書を含むことが好ましい。
【０１２１】
＜設計方法＞
また、本発明は、検体核酸の標的配列を増幅する際、反応系の増幅性能を示すコントロールを検出するためのコントロール用鋳型核酸の設計方法であって、
前記コントロール用鋳型核酸は、反応系で増幅反応が起きることを示す陽性コントロールおよび反応系への不要な核酸の混入を示す陰性コントロールの両方を検出可能な鋳型核酸であり、
前記コントロール用鋳型核酸の塩基配列を、
前記標的配列を増幅可能なプライマーにより増幅可能であり、
前記プライマーによる増幅領域が、前記標的配列にハイブリダイズ可能な検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、且つ、
前記増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）が、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と、異なる値を示す塩基配列に設定することを特徴とする。
【０１２２】
＜使用＞
本発明は、検体核酸の標的配列を増幅する際、反応系の増幅性能を示すコントロールを検出するためのコントロール用鋳型核酸の使用方法であり、
前記コントロール用鋳型核酸は、
前記標的配列を増幅可能なプライマーにより増幅可能であり、
前記プライマーによる増幅領域が、前記標的配列にハイブリダイズ可能な検出用プローブがハイブリダイズ可能であり、且つ、
前記増幅領域と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）が、前記標的配列と前記検出用プローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）と、異なる値を示す塩基配列からなり、
反応系で増幅反応が起きることを示す陽性コントロールと反応系への不要な核酸の混入を示す陰性コントロールとを、１つの反応系において、あわせて検出するためのコントロール用鋳型核酸として使用することを特徴とする。
【０１２３】
＜融解曲線解析方法＞
本発明の融解曲線解析方法は、検体核酸を含む反応系の融解曲線解析方法であって、
前記検体核酸を含む反応系について、検出用プローブ、コントロール用オリゴヌクレオチドおよびコントロール用プローブの存在下、融解曲線解析を行う解析工程を含み、
前記検出用プローブは、前記検体核酸の標的配列にハイブリダイズ可能なプローブであり、
前記コントロール用プローブは、前記コントロール用オリゴヌクレオチドに相補的な配列であることを特徴とする。
【０１２４】
本発明によれば、前述のように、前記検体核酸と前記検出用プローブとの解析だけでなく、温度制御およびシグナル検出が正常であるか否かを判断することも、同一反応系において可能となる。なお、特に示さない限り、前記検出用プローブ、前記コントロール用オリゴヌクレオチドおよび前記コントロール用プローブは、例えば、前述と同様であり、融解曲線解析等も同様である。
【０１２５】
本発明は、前記解析工程に先立って、例えば、前記検体核酸の標的配列を増幅する増幅工程を有してもよい。前記検体核酸の増幅工程は、例えば、前述と同様に行うことができる。
【０１２６】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。
【実施例】
【０１２７】
［実施例Ａ１］
ＨＰＶ陽性パネル血漿を、核酸精製キット（商品名ＱＩＡａｍｐ）を用いてＴＥ液で溶出することにより精製した。精製溶液をさらに２０００倍に希釈して、血漿由来の核酸試料とした。他方、配列番号１に表されるポリヌクレオチドをインサート配列としてｐＴ７プラスミドベクターに挿入し、組換えプラスミドを作製した。前記組換えプラスミドは、ＴＥ液で希釈し、これをプラスミド溶液とした。【０１２８】
インサート配列（配列番号１）
5’-tcacctctgcctaatcatctcattttcatgtcctatgttcaatcttccaagctgtgccttgggtggctttgTTgcatTgacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagttactctcttttttgccttctgacttctttcc-3’【０１２９】
そして、前記血漿由来の核酸試料１μＬを、下記反応液４９μＬに添加し、サーマルサイクラー（商品名Mastercycler  ep  gradient  S、eppendorf社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、５０℃で２分、９５℃で２分処理した後、９５℃１０秒、５４℃１０秒および７２℃３０秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。さらに、ＰＣＲ反応液が入ったチューブを、iCycler（商品名、Bio-Rad  Laboratories社製）に移し、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、昇温速度１℃／１秒で、４０℃から８０℃まで上昇させた。昇温の間、各温度における蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。なお、検出対象は下記プローブ１であり、励起光は３７０−４１５ｎｍとし、検出は４４５−４８０ｎｍとした。また、前記核酸試料に代えて蒸留水１μＬを前記下記反応液４９μＬに添加して、同様にしてＰＣＲならびにＴｍ解析を行った。下記反応液において、Ｆプライマーは、フォワードプライマー、Ｒプライマーは、リバースプライマーである（以下、同様）。【０１３０】
【表１】
0005509075.tif 000002
【０１３１】
Ｆプライマー１（配列番号２）
５’-cataagaggactcttggact-３’
Ｒプライマー３（配列番号３）
５’-atttatgcctacagcctcc-３’
Ｆプライマー３（配列番号４）
５’-tcacctctgcctaatcatctc-３’
Ｒプライマー２（配列番号５）
５’-ggaaagaagtcagaaggcaa-３’
プローブ１（配列番号６）
５’−atgtccatgccccaaagccacc-(Pacific  Blue)−３’
プローブ２（配列番号７）
５’−atgtccatgTccTaaagccacc-(BODIPY  FL)−３’
プローブ３（配列番号８）
５’−aTcAttaacctaatctcctccc-(TAMRA)−３’
阻害用オリゴヌクレオチド（配列番号９）
５’−aggcttgaacagtaggacatgaacaAgagatga-P−３’【０１３２】
前記血漿由来の核酸試料は、配列番号１０（ggtggctttgGGgcatGgacat）で表わされる配列を有し、前記ＰＣＲにおいては、この配列を含む領域を増幅させた。前記配列は、前記プローブ１と完全に相補的である（パーフェクトマッチ）。他方、前記組換えプラスミドは、配列番号１の下線部で示される配列、すなわち、配列番号４５（ggtggctttgTTgcatTgacat）で表わされる配列を有し、前記ＰＣＲにおいては、この配列を含む領域を増幅させた。前記配列において、大文字で示す３つの塩基（Ｔ）は、前記配列番号１０の塩基配列と異なる塩基であって、前記配列は、前記プローブ１と部分的に非相補的である（ミスマッチ）。【０１３３】
これらの結果を図６に示す。図６は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、同図（Ａ）が、プラスミド溶液と血漿由来核酸サンプルの両方を添加した反応液の結果であり、同図（Ｂ）が、プラスミド溶液のみを添加した反応液の結果である。同図において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。なお、予め設定した各Ｔｍ値は、以下の通りである。【０１３４】
同図（Ａ）の血漿由来核酸サンプルを添加した反応液では、７３℃付近と４８℃付近にピークが見られ、同図（Ｂ）のプラスミド溶液のみを添加した反応液では、４８℃付近でピークが見られた。このように、同じプローブ１を使用しても、プローブに対する相補性を変えることで、異なるＴｍ値にピークを設定できることがわかる。【０１３５】
［実施例Ａ２］
（実施例Ａ２−１）
検体核酸を含む反応系とともに、コントロール用鋳型を含む反応系について、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行い、前記反応系の増幅性能を確認した。本例では、後述するように、前記プローブおよびコントロール用鋳型を、前述の図５に示す形態（ＴｍＡ＜ＴｍＣ）に設定した。【０１３６】
【表２】
0005509075.tif 000003
【０１３７】
前記検体核酸およびコントロール用鋳型の配列において、四角で囲んだ配列は、ＦプライマーおよびＲプライマーと相補的な配列であり、下線部は、プローブと相補的な配列を示す。前記プローブおよびコントロール用鋳型は、前述の図５に示す形態に設定した。すなわち、前記プローブは、前記コントロール用鋳型に対して、完全に相補的であり、前記検体核酸に対して、部分的に非相補的な配列とした。なお、予め求めた、検体核酸の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）は、５３℃であり、コントロール用鋳型の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、６４℃であった。【０１３８】
【表３】
0005509075.tif 000004
【０１３９】
前記検体核酸１μＬまたはコントロール鋳型核酸１μＬ、前記第１試薬２３μＬ、前記第２試薬１３μＬ、前記第３試薬１０μＬおよび蒸留水３μＬを混合し、さらに、ミネラルオイル（商品名Ｍｉｎｅｒａｌ  ｏｉｌ、ナカライテスク社製）３０μＬを添加して、反応液を調製した。前記検体核酸を含む反応液を、検体反応液、前記コントロール鋳型核酸を含む反応液を、コントロール反応液とした。前記各反応液を、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ  ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および５８℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、昇温速度１℃／３秒で、４０℃から８５℃まで上昇させた。昇温の間、各温度における蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。なお、蛍光強度の検出は、波長５８５〜７００ｎｍ（蛍光物質ＴＡＭＲＡ）とした。【０１４０】
これらの結果を図７に示す。図７は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図７において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。図７において、（Ａ）が、コントロール用鋳型を含む反応液、（Ｂ）が、検体核酸を含む反応液の結果である。【０１４１】
図７（Ａ）に示すように、コントロール用鋳型を含む反応液は、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）６４℃付近のみでピークが確認され、図７（Ｂ）に示すように、検体核酸を含む反応液は、検体核酸とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）５３℃付近のみでピークが確認された。この結果から、以下のことがわかる。まず、コントロール用反応液において、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）でのピークの発生は、コントロール用鋳型が正常に増幅されていることを示す。同図（Ａ）では、Ｔｍ値６４℃付近でピークが生じていることから、コントロール用鋳型を含む反応液は、陽性コントロール（＋）、つまり、正常な増幅反応が起こっていることが証明された。そして、コントロール用鋳型の増幅に使用した反応液は、コントロール用鋳型に代えて検体核酸を含む以外、同じ組成であり、コントロール用反応液の反応条件と、検体反応液の反応条件も同条件である。このことから、検体反応液におけるピークの発生は、正常な増幅によるもとであることが、間接的に証明できた。さらに、コントロール用反応液において、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）以外でのピークの発生は、反応液にコントロール用鋳型以外の不要な核酸が混入し、不要な核酸の増幅が生じたことを示す。同図（Ａ）では、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）６４℃付近以外で、ピークは生じていないことから、コントロール用反応液は、陰性コントロール（−）、つまり、不要な核酸の混入ならびに増幅は起こっていないことが証明された。そして、検体用反応液は、コントロール用反応液と同様に調製して、反応を行っている。このことから、検体反応液における、検体核酸とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）５３℃付近のピークは、不要な核酸の混入による増幅ではなく、前記検体核酸の増幅によるピークであることが、間接的に証明できた。【０１４２】
（実施例Ａ２−２）
コントロール用鋳型を用いて、不要な核酸が混入した反応液について、陰性コントロールの確認を行った。なお、特に示さない限り、前記実施例Ａ２−１と同様とした。【０１４３】
実施例Ａ２−１のコントロール用鋳型０．１μＬ、前記第１試薬２３μＬ、前記第２試薬１３μＬ、前記第３試薬１０μＬおよび蒸留水３μＬを混合した後、以下に示す混入核酸０．９μＬを混入させ、さらに、前記ミネラルオイル３０μＬを添加して、コントロール用反応液を調製した。そして、前記実施例Ａ２−１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。下記混入核酸は、各プライマーがアニーリング可能であり、前記実施例Ａ２−１のプローブがハイブリダイズ可能な配列とした。下記配列において、四角で囲んだ配列は、ＦプライマーおよびＲプライマーと相補的な配列であり、下線部は、プローブと相補的な配列を示す。なお、予め求めた、コントロール用鋳型の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、６４℃であり、混入核酸の増幅領域とプローブとのＴｍ値は、５３℃であった。【０１４４】
【表４】
0005509075.tif 000005
【０１４５】
この結果を図８（Ａ）に示す。図８（Ａ）は、コントロール用反応液について、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図８（Ａ）において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。【０１４６】
図８（Ａ）に示すように、コントロール用反応液は、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）６４℃付近および混入核酸とプローブとのＴｍ値５３℃付近の両方でピークが確認された。前者のＴｍ値（ＴｍＣ）６４℃付近でピークが生じていることから、コントロール用鋳型を含む反応液は、陽性コントロール（＋）、つまり、正常な増幅反応が起こっているが、後者のＴｍ値５３℃付近でもピークが生じていることから、陰性コントロール（＋）、つまり、不要な核酸の混入ならびに増幅が起こっていることが証明された。このように、コントロール用反応液における、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値以外でのピークの有無によって、不要な核酸の混入による増幅を確認することが可能である。【０１４７】
（実施例Ａ２−３）
コントロール用鋳型を用いて、増幅反応を阻害するＳＤＳが添加された反応液について、陽性コントロールの確認を行った。なお、特に示さない限り、前記実施例Ａ２−２と同様とした。【０１４８】
実施例Ａ２−２のコントロール用反応系について、蒸留水３μＬに代えて、１０ｖ/ｖ％  ＳＤＳ  ３μＬを混合した以外は、前記実施例Ａ２−２と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１４９】
この結果を図８（Ｂ）に示す。図８（Ｂ）は、コントロール用反応液について、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図８（Ｂ）において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。【０１５０】
図８（Ｂ）に示すように、コントロール用反応液は、いずれの温度でもピークは確認されなかった。このことから、正常な増幅反応が起こっていないことが証明された。このように、コントロール用反応液における、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値でのピークの有無によって、正常な増幅反応が起こっているか否かを確認することが可能である。【０１５１】
［実施例Ａ３］
（実施例Ａ３−１）
検体核酸を含む反応系とともに、コントロール用鋳型を含む反応系について、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行い、前記反応系の増幅性能を確認した。本例では、後述するように、前記プローブおよびコントロール用鋳型を、前述の図４に示す形態（ＴｍＡ＞ＴｍＣ）に設定した。【０１５２】
【表５】
0005509075.tif 000006
【０１５３】
前記検体核酸およびコントロール用鋳型の配列において、四角で囲んだ配列は、ＦプライマーおよびＲプライマーと相補的な配列であり、下線部は、プローブと相補的な配列を示す。前記プローブおよびコントロール用鋳型は、前述の図４に示す形態に設定した。すなわち、前記プローブは、前記検体核酸に対して、完全に相補的であり、前記コントロール用鋳型に対して、部分的に非相補的な配列とした。なお、予め求めた、検体核酸の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）は、６４℃であり、コントロール用鋳型の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、５３℃であった。【０１５４】
１μＬの前記検体核酸または１μＬのコントロール鋳型核酸を使用した以外は、前記実施例Ａ２−１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１５５】
これらの結果を図９に示す。図９は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図９において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。図９において、（Ａ）が、コントロール用鋳型を含む反応液、（Ｂ）が、検体核酸を含む反応液の結果である。【０１５６】
図９（Ａ）に示すように、コントロール用鋳型を含む反応液は、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）５３℃付近のみでピークが確認され、図９（Ｂ）に示すように、検体核酸を含む反応液は、検体核酸とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）６４℃付近のみでピークが確認された。このように、コントロール用反応液では、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）５３℃付近のみでピークが確認されたことから、前記実施例Ａ２−１と同様に、陽性コントロール（＋）および陰性コントロール（−）であることがわかった。このため、検体用反応液におけるピークの発生は、正常な増幅によるものであり、且つ、検体核酸とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）６４℃付近のピークは、不要な核酸の混入による増幅ではなく、前記検体核酸の増幅によるピークであることが、間接的に証明できた。【０１５７】
（実施例Ａ３−２）
コントロール用鋳型を用いて、不要な核酸が混入した反応液について、陰性コントロールの確認を行った。なお、特に示さない限り、前記実施例Ａ３−１と同様とした。【０１５８】
実施例Ａ３−１のコントロール用鋳型０．９μＬ、前記第１試薬２３μＬ、前記第２試薬１３μＬ、前記第３試薬１０μＬおよび蒸留水３μＬを混合した後、以下に示す混入核酸０．１μＬを混入させ、さらに、前記ミネラルオイル３０μＬを添加して、コントロール用反応液を調製した。そして、前記実施例Ａ３−１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。下記混入核酸は、各プライマーがアニーリング可能であり、前記実施例Ａ３−１のプローブがハイブリダイズ可能な配列とした。下記配列において、四角で囲んだ配列は、ＦプライマーおよびＲプライマーと相補的な配列であり、下線部は、プローブと相補的な配列を示す。なお、予め求めた、コントロール用鋳型の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、５３℃であり、混入核酸の増幅領域とプローブとのＴｍ値は、６４℃であった。【０１５９】
【表６】
0005509075.tif 000007
【０１６０】
この結果を図１０（Ａ）に示す。図１０（Ａ）は、コントロール用反応液について、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１０（Ａ）において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。【０１６１】
図１０（Ａ）に示すように、コントロール用反応液は、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）５３℃付近および混入核酸とプローブとのＴｍ値６４℃付近の両方でピークが確認された。前者のＴｍ値５３℃付近でピークが生じていることから、コントロール用鋳型を含む反応液は、陽性コントロール（＋）、つまり、正常な増幅反応が起こっているが、後者のＴｍ値６４℃付近でもピークが生じていることから、陰性コントロール（＋）、つまり、不要な核酸の混入ならびに増幅が起こっていることが証明された。このように、コントロール用反応液における、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値以外でのピークの有無によって、不要な核酸の混入による増幅を確認することが可能である。【０１６２】
（実施例Ａ３−３）
コントロール用鋳型を用いて、増幅反応を阻害するＳＤＳが添加された反応液について、陽性コントロールの確認を行った。なお、特に示さない限り、前記実施例Ａ３−２と同様とした。【０１６３】
実施例Ａ３−２のコントロール用反応系について、３μＬの蒸留水に代えて、３μＬの１０ｖ/ｖ％  ＳＤＳを混合した以外は、前記実施例Ａ３−２と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１６４】
この結果を図１０（Ｂ）に示す。図１０（Ｂ）は、コントロール用反応液について、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１０（Ｂ）において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。【０１６５】
図１０（Ｂ）に示すように、コントロール用反応液は、いずれの温度でもピークは確認されなかった。このことから、正常な増幅反応が起こっていないことが証明された。このように、コントロール用反応液における、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値でのピークの有無によって、正常な増幅反応が起こっているか否かを確認することが可能である。【０１６６】
［実施例Ａ４］
（実施例Ａ４−１）
検体核酸を含む反応系とともに、コントロール用鋳型を含む反応系について、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行い、前記反応系の増幅性能を確認した。本例では、後述するように、前記プローブおよびコントロール用鋳型を、前述の図５に示す形態（ＴｍＡ＜ＴｍＣ）に設定した。【０１６７】
【表７】
0005509075.tif 000008
【０１６８】
前記検体核酸およびコントロール用鋳型の配列において、四角で囲んだ配列は、ＦプライマーおよびＲプライマーと相補的な配列であり、下線部は、プローブと相補的な配列を示す。前記プローブおよびコントロール用鋳型は、前述の図５に示す形態に設定した。すなわち、前記プローブは、前記コントロール用鋳型に対して、完全に相補的であり、前記検体核酸に対して、部分的に非相補的な配列とした。なお、予め求めた、検体核酸の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）は、７１℃であり、コントロール用鋳型の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、７９℃であった。【０１６９】
【表８】
0005509075.tif 000009
【０１７０】
前記コントロール用鋳型（１０６コピー／μＬ）１μＬ、前記第１試薬２３μＬ、前記第２試薬１３μＬ、前記第４試薬９μＬおよび蒸留水４μＬを混合し、さらに、前記ミネラルオイル３０μＬを添加して、反応液を調製した。前記コントロール用鋳型を含む反応液を、コントロール反応液とした。また、前記検体核酸（３０コピー／μＬ）１μＬ、前記第１試薬２３μＬ、前記第２試薬１３μＬ、前記第４試薬９μＬおよび蒸留水４μＬを混合し、さらに、前記ミネラルオイル３０μＬを添加して、反応液を調製した。前記検体核酸を含む反応液を、検体反応液とした。前記各反応液を、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ  ＩＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６０℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。さらに、９５℃で１秒、５５℃で６０秒処理した後、昇温速度１℃／３秒で、６２℃から８５℃まで上昇させた。昇温の間、各温度における蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。なお、蛍光強度の検出は、波長５８５〜７００ｎｍ（蛍光物質ＴＡＭＲＡ）とした。【０１７１】
これらの結果を図１１に示す。図１１は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１１において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。図１１において、（Ａ）が、コントロール用鋳型を含む反応液、（Ｂ）が、検体核酸を含む反応液の結果である。【０１７２】
図１１（Ａ）に示すように、コントロール用鋳型を含む反応液は、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）７９℃付近のみでピークが確認され、図１１（Ｂ）に示すように、検体核酸を含む反応液は、検体核酸とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）７１℃付近のみでピークが確認された。このように、コントロール用反応液では、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）７９℃付近のみでピークが確認されたことから、前記実施例Ａ２−１と同様に、陽性コントロール（＋）および陰性コントロール（−）であることがわかった。このため、検体用反応液におけるピークの発生は、正常な増幅によるものであり、且つ、検体核酸とプローブとのＴｍ値（ＴｍＡ）７１℃付近のピークは、不要な核酸の混入による増幅ではなく、前記検体核酸の増幅によるピークであることが、間接的に証明できた。【０１７３】
（実施例Ａ４−２）
コントロール用鋳型を用いて、不要な核酸が混入した反応液について、陰性コントロールの確認を行った。なお、特に示さない限り、前記実施例Ａ４−１と同様とした。【０１７４】
実施例Ａ４−１のコントロール用鋳型１μＬ、前記第１試薬２３μＬ、前記第２試薬１３μＬ、前記第４試薬９μＬおよび蒸留水３μＬを混合した後、以下に示す配列を有するプラスミドを混入核酸として１μＬ（３０コピー/μＬ）を混入させ、さらに、前記ミネラルオイル３０μＬを添加して、コントロール用反応液を調製した。そして、前記実施例Ａ４−１と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。下記混入核酸は、各プライマーがアニーリング可能であり、前記実施例Ａ４−１のプローブがハイブリダイズ可能な配列とした。下記配列において、四角で囲んだ配列は、ＦプライマーおよびＲプライマーと相補的な配列であり、下線部は、プローブと相補的な配列を示す。なお、予め求めた、コントロール用鋳型の増幅領域とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）は、７９℃であり、混入核酸の増幅領域とプローブとのＴｍ値は、６５℃であった。【０１７５】
【表９】
0005509075.tif 000010
【０１７６】
これらの結果を図１２（Ａ）に示す。図１２（Ａ）は、コントロール用反応液について、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１２（Ａ）において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。【０１７７】
図１２（Ａ）に示すように、コントロール用反応液は、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値（ＴｍＣ）７９℃付近および混入核酸とプローブとのＴｍ値６５℃付近の両方でピークが確認された。前者のＴｍ値７９℃付近でピークが生じていることから、コントロール用鋳型を含む反応液は、陽性コントロール（＋）、つまり、正常な増幅反応が起こっているが、後者のＴｍ値６５℃付近でもピークが生じていることから、陰性コントロール（＋）、つまり、不要な核酸の混入ならびに増幅が起こっていることが証明された。このように、コントロール用反応液における、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値以外でのピークの有無によって、不要な核酸の混入による増幅を確認することが可能である。【０１７８】
（実施例Ａ４−３）
コントロール用鋳型を用いて、増幅反応を阻害するＳＤＳが添加された反応液について、陽性コントロールの確認を行った。なお、特に示さない限り、前記実施例Ａ４−２と同様とした。【０１７９】
実施例Ａ４−１のコントロール用鋳型１μＬ、前記第１試薬２３μＬ、前記第３試薬１３μＬ、前記第４試薬９μＬ、検体核酸として、ヒトゲノムＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ、ロシュ社製）４μＬおよび１０ｖ／ｖ％  ＳＤＳ  １μＬを混合して、反応液を調製した以外は、前記実施例Ａ４−２と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。なお、反応液における前記ヒトゲノムＤＮＡの最終濃度は、１０３コピー／μＬとした。【０１８０】
これらの結果を図１２（Ｂ）に示す。図１２（Ｂ）は、コントロール用反応液について、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。図１２（Ｂ）において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。【０１８１】
図１２（Ｂ）に示すように、コントロール用反応液は、いずれの温度でもピークは確認されなかった。このことから、正常な増幅反応が起こっていないことが証明された。このように、コントロール用反応液における、コントロール用鋳型とプローブとのＴｍ値でのピークの有無によって、正常な増幅反応が起こっているか否かを確認することが可能である。【０１８２】
［実施例Ｂ１］
本例では、コントロール用オリゴヌクレオチドとコントロール用プローブとを用いて、温度制御およびシグナル検出が正常であるか否かを確認すると共に、種々の核酸試料について、Ｔｍ解析により、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の標的部位における多型（ＣＹＰ２Ｃ１９＊２およびＣＹＰ２Ｃ１９＊３）を検出した。ＣＹＰ２Ｃ１９＊２は、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子のエキソン５の６８１位の多型であり、野生型がグアニン、変異型がアデニンである。また、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３は、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子のエキソン４の６３６位の多型であり、野生型がグアニン、変異型がアデニンである。【０１８３】
【表１０】
0005509075.tif 000011
【０１８４】
（ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用）
Ｆプライマー（配列番号１１）
5'-taaattattgttttctcttagatatgcaataattttccca-3'
Ｒプライマー（配列番号１２）
5'-cccgagggttgttgatgtccatc-3'
プローブ（配列番号１３）
5'-tcccaggaacccataac-(BODIPY  FL)-3'
（ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用）
Ｆプライマー（配列番号１４）
5'-tgatggaaaaattgaatgaaaacatcaggattgta-3'
Ｒプライマー（配列番号１５）
5'-tcaaaaatgtacttcagggcttggtcaata-3'
プローブ（配列番号１６）
5'-(TAMRA)-ccctgaatccaggtaag-P-3'
（Ｔｍコントロール用試薬）
Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチド（配列番号１７）
5'-gcatggcttccattggg-P-3'
Ｔｍコントロール用プローブ（配列番号１８）
5'-(Pacific Blue)-cccaatggaagccatgc-P-3'【０１８５】
（希釈液１）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ
０．３ｖ／ｖ％  ＳＤＳ
０．０５ｗ／ｖ％  アジ化ナトリウム
（希釈液２）
１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ
０．０５ｗ／ｖ％  アジ化ナトリウム【０１８６】
（精製ヒトゲノム）
精製ヒトゲノム試料は、核酸精製キット（商品名Ｑ１Ａａｍｐ，Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて調製した。この精製ヒトゲノム試料の多型は、予め、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２およびＣＹＰ２Ｃ１９＊３共に、野生型と変異型のヘテロ（Ｈｔ）であることを確認した。１μＬの前記精製ヒトゲノム試料（０．３ｎｇ/μＬ）を、前記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加し、全自動ＳＮＰｓ検査装置（商品名ｉ−ｄｅｎｓｙ  ＬＳ−５３１０、アークレイ社製）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９０℃で６０秒処理した後、９５℃１秒および６４℃１５秒を１サイクルとして５０サイクル繰り返した。さらに、９５℃で１秒、４０℃で６０秒処理した後、昇温速度１℃／３秒で、４０℃から７５℃まで上昇させた。昇温の間、各温度における蛍光強度の変化を測定し、Ｔｍ解析を行った。なお、蛍光強度の検出は、波長４５０〜４８０ｎｍ（蛍光物質Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、波長５１５〜５５５ｎｍ（蛍光物質ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）および波長５８５〜７００ｎｍ（蛍光物質ＴＡＭＲＡ）とした。【０１８７】
（プラスミド）
ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の部分配列として、野生型ＣＹＰ２Ｃ１９＊２のオリゴヌクレオチド（配列番号２７）が挿入された野生型プラスミド（ＷＴ＊２）、野生型ＣＹＰ２Ｃ１９＊３のオリゴヌクレオチド（配列番号２９）が挿入された野生型プラスミド（ＷＴ＊３）、変異型ＣＹＰ２Ｃ１９＊２のオリゴヌクレオチド（配列番号２８）が挿入された変異型プラスミド（ｍｔ＊２）、変異型ＣＹＰ２Ｃ１９＊３のオリゴヌクレオチド（配列番号３０）が挿入された変異型プラスミド（ｍｔ＊３）を調製した。つぎに、各プラスミドが４００コピー／μＬとなるように、野生型プラスミド（ＷＴ＊２）と野生型プラスミド（ＷＴ＊３）とを混合し、プラスミド試料（ＷＴ）を調製した。また、各プラスミドが４００コピー／μＬとなるように、変異型プラスミド（ｍｔ＊２）と変異型プラスミド（ｍｔ＊３）とを混合し、プラスミド試料（ｍｔ）を調製した。そして、前記プラスミド試料１０μＬと、７０μＬの前記希釈液１とを混合し、この混合液１０μＬを、さらに、７０μＬの前記希釈液２と混合した。そして、得られた混合液１７μＬを、９５℃で１０分間処理し、前記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加し、前記精製ヒトゲノムと同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１８８】
（血液）
ＥＤＴＡ採血管により血液を採取した。この血液試料の多型は、予め、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２およびＣＹＰ２Ｃ１９＊３共に、野生型と変異型のヘテロ（Ｈｔ）であることを確認した。前記採血した血液１０μＬと、７０μＬの前記希釈液１とを混合し、この混合液１０μＬを、さらに、７０μＬの前記希釈液２と混合した。そして、得られた混合液１７μＬを、９５℃で１０分間処理し、前記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加し、前記精製ヒトゲノムと同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１８９】
（コントロール）
１７μＬの前記希釈液２を９５℃で１０分間処理し、前記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加し、前記精製ヒトゲノムと同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１９０】
前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドとＴｍコントロール用プローブとのＴｍ値は、６２℃である。したがって、Ｔｍ解析において、６２℃にピークが見られた場合、Ｔｍ解析装置の温度制御ユニットおよびシグナル検出ユニットが正常に機能していると判断できる。なお、正常な温度条件下におけるＴｍ値は、以下の通りである。
（１）Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドとＴｍコントロール用プローブとのＴｍ値：６２℃
（２）野生型ＣＹＰ２Ｃ１９＊２とＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブとのＴｍ値：５１℃
（３）変異型ＣＹＰ２Ｃ１９＊２とＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブとのＴｍ値：５９℃
（４）野生型ＣＹＰ２Ｃ１９＊３とＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブとのＴｍ値：５０℃
（５）変異型ＣＹＰ２Ｃ１９＊３とＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブとのＴｍ値：５９℃【０１９１】
これらの結果を図１３〜図１５に示す。図１３〜図１５は、それぞれ、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。各図において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。図１３（Ａ）が、コントロール、図１３（Ｂ）が、精製ヒトゲノム、図１４（Ａ）が、野生型プラスミド（ＷＴ）、図１４（Ｂ）が、変異型プラスミド（ｍｔ）、図１５が、血液の結果であり、各図において、上段が、Ｔｍコントロール用プローブに基づく蛍光変化を示すグラフ（Ｔｍコントロール）、中段が、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブに基づく蛍光変化を示すグラフ（ＣＹＰ２Ｃ１９＊２）、下段が、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブに基づく蛍光変化を示すグラフ（ＣＹＰ２Ｃ１９＊３）である。【０１９２】
図１３（Ａ）に示すように、コントロールでは、Ｔｍコントロール用プローブについて、６２℃付近のみでピークが確認され、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブおよびＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブについて、ピークは確認されなかった。図１３（Ｂ）では、Ｔｍコントロール用プローブについて６２℃付近、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブについて５１℃付近および５９℃付近、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３プローブについて５０℃付近および５９℃付近で、それぞれピークが確認された。図１４（Ａ）では、Ｔｍコントロール用プローブについて６２℃付近、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブについて５１℃付近、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３プローブについて５０℃付近で、それぞれピークが確認された。図１４（Ｂ）では、Ｔｍコントロール用プローブについて６２℃付近、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブについて５９℃付近、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３プローブについて５９℃で、それぞれピークが確認された。図１５では、Ｔｍコントロール用プローブについて６２℃付近、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブについて５１℃付近および５９℃付近、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３プローブについて５０℃付近および５９℃付近で、それぞれピークが確認された。このように、いずれの反応液についても、Ｔｍコントロール用プローブについて６２℃付近でピークが見られたことから、Ｔｍ解析装置の温度制御が正常に行われていることが確認できた。また、Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよびＴｍコントロール用プローブの共存下で、ＰＣＲとＴｍ解析を行っているが、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２用プローブおよびＣＹＰ２Ｃ１９＊３用プローブについて、前述したＴｍ値以外でのピークは見られなかった。このことから、Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよびＴｍコントロール用プローブを共存させても、目的の多型の検出には影響を与えないことがわかった。以上の結果から、本発明によれば、Ｔｍ解析装置の温度制御ならびにシグナル検出が正常に行われているか否かを確認しつつ、多型の検出を行えることから、より信頼性に優れた多型解析が可能となる。【０１９３】
［実施例Ｂ２］
本例では、コントロール用オリゴヌクレオチドとコントロール用プローブとを用いて、温度制御およびシグナル検出が正常であるか否かを確認すると共に、種々の核酸試料について、Ｔｍ解析により、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の標的部位における多型（ＵＧＴ１Ａ１＊６およびＵＧＴ１Ａ１＊２８）を検出した。ＵＧＴ１Ａ１＊６は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子遺伝子のエキソン１の２１１番目の多型であり、野生型がグアニン、変異型がアデニンである。また、ＵＧＴ１Ａ１＊２８は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のプロモーター領域における多型であり、６回のＴＡリピートおよび７回のＴＡリピートである。【０１９４】
【表１１】
0005509075.tif 000012
【０１９５】
（ＵＧＴ１Ａ１＊６用）
Ｆプライマー（配列番号１９）
5'-tgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3'
Ｒプライマー（配列番号２０）
5'-caaaagactctttcacatcctccctttgg-3'
プローブ（配列番号２１）
5'-gagacagagcattttacac-(TAMRA)-3'
（ＵＧＴ１Ａ１＊２８用）
Ｆプライマー（配列番号２２）
5'-agctttttatagtcacgtgacacagtcaaac-3'
Ｒプライマー（配列番号２３）
5'-cgcctttgctcctgccagag-3'
プローブ（配列番号２４）
5'-(BODIPY  FL)-ccatatatatatatatataagtaggagag-P-3'
（Ｔｍコントロール用試薬）
Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチド（配列番号２５）
5'-gcatggcttccattggg-P-3'
Ｔｍコントロール用プローブ（配列番号２６）
5'-(Pacific  Blue)-cccaatggaagccatgc-P-3'【０１９６】
（精製ヒトゲノム）
精製ヒトゲノム試料は、前記実施例Ｂ１と同様にして調製した。この精製ヒトゲノム試料の多型は、予め、ＵＧＴ１Ａ１＊２８およびＵＧＴ１Ａ１＊６共に、野生型と変異型のヘテロ（Ｈｔ）であることを確認した。この精製試料と前記表１１に示すＰＣＲ反応液を使用した以外は、前記実施例Ｂ１における精製ヒトゲノムと同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１９７】
（プラスミド）
ＵＧＴ１Ａ１遺伝子の部分配列として、野生型ＵＧＴ１Ａ１＊２８のオリゴヌクレオチド（配列番号３１）が挿入された野生型プラスミド（ＷＴ＊２８）、野生型ＵＧＴ１Ａ１＊６のオリゴヌクレオチド（配列番号３３）が挿入された野生型プラスミド（ＷＴ＊６）、変異型ＵＧＴ１Ａ１＊２８のオリゴヌクレオチド（配列番号３２）が挿入された変異型プラスミド（ｍｔ＊２８）、変異型ＵＧＴ１Ａ１＊６のオリゴヌクレオチド（配列番号３４）が挿入された変異型プラスミド（ｍｔ＊６）を調製した。つぎに、各プラスミドが４００コピー／μＬとなるように、野生型プラスミド（ＷＴ＊２８）と野生型プラスミド（ＷＴ＊６）とを混合し、プラスミド試料（ＷＴ）を調製した。また、各プラスミドが４００コピー／μＬとなるように、変異型プラスミド（ｍｔ＊２８）と変異型プラスミド（ｍｔ＊６）とを混合し、プラスミド試料（ｍｔ）を調製した。そして、前記プラスミド試料と前記表１１に示すＰＣＲ反応液を使用した以外は、前記実施例Ｂ１におけるプラスミドと同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１９８】
（血液）
ＥＤＴＡ採血管により血液を採取した。この血液試料の多型は、予め、ＵＧＴ１Ａ１＊２８およびＵＧＴ１Ａ１＊６共に、野生型と変異型のヘテロ（Ｈｔ）であることを確認した。前記採血した血液と前記表１１に示すＰＣＲ反応液を使用した以外は、前記実施例Ｂ１における血液試料と同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０１９９】
（コントロール）
１７μＬの前記希釈液２を９５℃で１０分間処理し、前記ＰＣＲ反応液４６μＬに添加し、前記実施例Ｂ１におけるコントロールと同様にして、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。【０２００】
前記Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドとＴｍコントロール用プローブとのＴｍ値は、５７℃である。したがって、Ｔｍ解析において、５７℃にピークが見られた場合、Ｔｍ解析装置の温度制御ユニットおよびシグナル検出ユニットが正常に機能していると判断できる。なお、正常な温度条件下におけるＴｍ値は、以下の通りである。
（１）Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドとＴｍコントロール用プローブとのＴｍ値：５７℃
（２）野生型ＵＧＴ１Ａ１＊６とＵＧＴ１Ａ１＊６用プローブとのＴｍ値：４７℃
（３）変異型ＵＧＴ１Ａ１＊６とＵＧＴ１Ａ１＊６用プローブとのＴｍ値：５５℃
（４）野生型ＵＧＴ１Ａ１＊２８とＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブとのＴｍ値：４７℃
（５）変異型ＵＧＴ１Ａ１＊２８とＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブとのＴｍ値：５２℃【０２０１】
これらの結果を図１６〜図１８に示す。図１６〜１８は、それぞれ、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフである。各図において、横軸は、測定時の温度（℃）を示し、縦軸は、蛍光強度の変化を示し、単位は、蛍光強度変化量の微分値である「ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」（ｄＦ/ｄｔ）とした。図１６（Ａ）が、コントロール、図１６（Ｂ）が、精製ヒトゲノム、図１７（Ａ）が、野生型プラスミド（ＷＴ）、図１７（Ｂ）が、変異型プラスミド（ｍｔ）、図１８が、血液の結果であり、各図において、上段が、Ｔｍコントロール用プローブに基づく蛍光変化を示すグラフ（Ｔｍコントロール）、中段が、ＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブに基づく蛍光変化を示すグラフ（ＵＧＴ１Ａ１＊２８）、下段が、ＵＧＴ１Ａ１＊６用プローブに基づく蛍光変化を示すグラフ（ＵＧＴ１Ａ１＊６）である。【０２０２】
図１６（Ａ）に示すように、コントロールでは、Ｔｍコントロール用プローブについて、５７℃付近のみでピークが確認され、ＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブおよびＵＧＴ１Ａ１＊６用プローブについて、ピークは確認されなかった。図１６（Ｂ）では、Ｔｍコントロール用プローブについて５７℃付近、ＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブについて４７℃付近および５２℃付近、ＵＧＴ１Ａ１＊６プローブについて４７℃付近および５５℃付近で、それぞれピークが確認された。図１７（Ａ）では、Ｔｍコントロール用プローブについて５７℃付近、ＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブについて４７℃付近、ＵＧＴ１Ａ１＊６プローブについて４７℃付近で、それぞれピークが確認された。図１７（Ｂ）では、Ｔｍコントロール用プローブについて５７℃付近、ＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブについて５２℃付近、ＵＧＴ１Ａ１＊６プローブについて５５℃付近で、それぞれピークが確認された。図１８では、Ｔｍコントロール用プローブについて５７℃付近、ＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブについて４７℃付近および５２℃付近、ＵＧＴ１Ａ１＊６プローブについて４７℃付近および５５℃付近で、それぞれピークが確認された。このように、いずれの反応液についても、Ｔｍコントロール用プローブについて５７℃付近でピークが見られたことから、Ｔｍ解析装置の温度制御が正常に行われていることが確認できた。また、Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよびＴｍコントロール用プローブの共存下で、ＰＣＲとＴｍ解析を行っているが、ＵＧＴ１Ａ１＊２８用プローブおよびＵＧＴ１Ａ１＊６用プローブについて、前述したＴｍ値以外でのピークは見られなかった。このことから、Ｔｍコントロール用オリゴヌクレオチドおよびＴｍコントロール用プローブを共存させても、目的の多型の検出には影響を与えないことがわかった。以上の結果から、本発明によれば、Ｔｍ解析装置の温度制御ならびにシグナル検出が正常に行われているか否かを確認しつつ、多型の検出を行えることから、より信頼性に優れた多型解析が可能となる。
【産業上の利用可能性】
【０２０３】
以上のように、本発明によれば、前述のようなコントロール用鋳型を使用することによって、従来は別個に行う必要があった陽性コントロールと陰性コントロールの検出を、１つの反応系で行うことが可能である。このように、陽性コントロールと陰性コントロールとを１つの反応系で検出することにより、例えば、操作が簡便となり、試薬等のコストも低下できる。
【図１】
0005509075.tif 000013
【図２】
0005509075.tif 000014
【図３】
0005509075.tif 000015
【図４】
0005509075.tif 000016
【図５】
0005509075.tif 000017
【図６】
0005509075.tif 000018
【図７】
0005509075.tif 000019
【図８】
0005509075.tif 000020
【図９】
0005509075.tif 000021
【図１０】
0005509075.tif 000022
【図１１】
0005509075.tif 000023
【図１２】
0005509075.tif 000024
【図１３】
0005509075.tif 000025
【図１４】
0005509075.tif 000026
【図１５】
0005509075.tif 000027
【図１６】
0005509075.tif 000028
【図１７】
0005509075.tif 000029
【図１８】
0005509075.tif 000030
【配列表】
0005509075000001.app