(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド前駆体タンパク質における配列番号３７で示される領域を認識するｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
【請求項２】
（１）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
（２）配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を有するｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
【請求項３】
（１）下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ＣＤＲ１としてＤＹＷＭＨ（配列番号２２）、ＣＤＲ２としてＦＩＮＰＲＳＧＳＴＴＹＮＱＫＦＲＤ（配列番号２３）、およびＣＤＲ３としてＰＤＦＤＹＦＤＹ（配列番号２４）ならびに
（２）下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ＣＤＲ１としてＲＳＳＱＳＩＶＱＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号２５）、ＣＤＲ２としてＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２６）、およびＣＤＲ３としてＦＱＡＳＨＶＰＬＴ（配列番号２７）、を有するｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いたｓＡＰＰβの測定方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いたｓＡＰＰβが関与する疾患の患者由来の生体試料の選別方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いて測定したｓＡＰＰβの含有量を指標とする、ＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓＡＰＰβを測定するための抗体およびこれらを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（以下、ＡＤとも称する）は、高齢者を侵す最も典型的な神経変性疾患である。本疾患の主な特徴としては、進行性の記憶障害、言語や空間などの認知機能の低下が挙げられる。これら認知機能低下の主たる原因は、脳実質にアミロイドβペプチド（以下、Ａβとも称する）が蓄積した結果、アミロイド斑が形成され神経細胞の変性を引き起こすことが考えられている（非特許文献２、３）。【０００３】
特にＡβの中でも、３９−４３個のアミノ酸の長さのＡβの蓄積が、ＡＤの原因であると考えられている（非特許文献１）。Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質（以下、ＡＰＰとも称する）が、β−アミロイドタンパク質切断酵素であるβ−セクレターゼ（以下、ＢＡＣＥ１とも称する）及びγ−セクレターゼの２つのプロテアーゼによって切断されて脳内で産生され蓄積する。【０００４】
ＡＤ患者の脳内や脳脊髄液でこのＢＡＣＥ１活性が上昇していることが最近報告されている（非特許文献４、５）。これは、ＢＡＣＥ１がＡＤの治療薬の標的として有望であることおよびＡＤの診断指標にできる可能性があることを意味する。【０００５】
また可溶性ＡＰＰβ（ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  β：以下、ｓＡＰＰβとも称する）の生成は、ＢＡＣＥ１の活性と関与していることから、ＡＤの治療薬の探索の指標とされている。さらにｓＡＰＰβがアルツハイマー病の指標とする報告もある（非特許文献６）。そのため、ｓＡＰＰβの量を正確かつ高感度に定量する測定方法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、第２８３巻、２９６１５ページ
【非特許文献２】Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅ、２００６年、第３巻、Ａ３４
【非特許文献３】Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １９９１年、第１巻、２１３ページ
【非特許文献４】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２００３年、第９巻、３ページ
【非特許文献５】Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２００８年、第６５巻、１１０２ページ
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  ２０１２年、第９０巻、２２４７ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ｓＡＰＰβの量を正確かつ高感度に測定する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、血漿や脳脊髄液などの試料中のｓＡＰＰβが、全長体だけではなく断片体としても多量に存在している事実を初めて見出した。本発明は、この発見に基づくものであり、本発明を用いることによって上記の目的が達成される。
すなわち本発明は、
［１］ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体を認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［２］前記ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体が配列番号２８から配列番号３６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるものである、上記［１］記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［３］アミロイド前駆体タンパク質における配列番号２８で示される領域を認識するｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［４］アミロイド前駆体タンパク質における配列番号３７で示される領域を認識するｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［５］（１）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、あるいは配列番号１４のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域；および
（２）配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、あるいは配列番号１５のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域、
を有する、ｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［６］（１）配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；および
（２）配列番号１５のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、
を有する、ｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［７］（１）下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ＤＹＷＭＨ（配列番号２２）、ＦＩＮＰＲＳＧＳＴＴＹＮＱＫＦＲＤ（配列番号２３）、およびＰＤＦＤＹＦＤＹ（配列番号２４）、および
（２）下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ＲＳＳＱＳＩＶＱＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号２５）、ＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２６）、およびＦＱＡＳＨＶＰＬＴ（配列番号２７）
を有する、ｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［８］上記［１］〜［７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いた、ｓＡＰＰβの測定方法、
［９］さらに、ｓＡＰＰβのネオエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片を組み合わせて用いることを特徴とする、上記［８］の測定方法、
［１０］上記［１］〜［７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いて生体試料中のｓＡＰＰβを測定する工程を含む、ｓＡＰＰβが関与する疾患の患者由来の生体試料の選別方法、
［１１］さらに、ｓＡＰＰβのネオエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片を組み合わせて用いることを特徴とする、上記［１０］の選別方法、
［１２］上記［１］〜［７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いて測定したｓＡＰＰβの含有量を指標とする、ＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法、
［１３］さらに、ｓＡＰＰβのネオエピトープを特異的に認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片を組み合わせて用いることを特徴とする、上記［１２］のスクリーニング方法、
［１４］上記［１］〜［７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を含むことを特徴とするキット、
［１５］上記［１］〜［７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗体断片を用いたｓＡＰＰβが関与する疾患の診断方法、
［１６］（１）配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、あるいは配列番号１２のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する重鎖可変領域および
（２）配列番号１３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、あるいは配列番号１３のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸を有する軽鎖可変領域、
を有する、ｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［１７］（１）下記アミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
ＮＹＡＭＳ（配列番号１６）、ＳＩＧＲＧＧＳＴＦＹＰＤＳＶＫＧ（配列番号１７）、およびＩＹＳＱＳＩＳＦＤＹ（配列番号１８）、あるいは、これらの３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲ、および
（２）下記アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ＫＳＲＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＨ（配列番号１９）、ＬＶＳＫＬＤＳ（配列番号２０）、およびＷＱＧＴＨＦＰＦＴ（配列番号２１）、あるいは、これらの３つのＣＤＲのうちの１つ以上のＣＤＲにおいて１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる３つのＣＤＲ、
を有する、ｓＡＰＰβに対するモノクローナル抗体またはその抗体断片、
［１８］ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体、および
［１９］配列番号２８から配列番号３６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗体断片は、全長ｓＡＰＰβだけでなく、生体内に存在しているその断片体も測定できるので生体試料中のｓＡＰＰβの量を正確に測定することができる。したがって、本発明に係るモノクローナル抗体またはその抗体断片は、ＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニングやｓＡＰＰβが関与する疾患の診断にも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）の異化経路を示す。
【図２】各種動物のアミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）の部分配列、および抗体作成に使用した免疫原配列を示す。Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  １は抗ネオエピトープ抗体４Ｇ４用の免疫原配列、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  ２は抗内部構造抗体５Ｈ１０用の免疫原配列を示す。
【図３】抗ネオエピトープ抗体４Ｇ４の、各種ｓＡＰＰ関連基質（免疫原ペプチド、短鎖ペプチド、長鎖ペプチド、ｓＡＰＰβ、ｓＡＰＰα）に対する親和性、特異性をＥＬＩＳＡにより評価した結果を示す。
【図４】抗ネオエピトープ抗体４Ｇ４のｓＡＰＰβに対する親和性を、ＳＰＲ法により評価した結果を示す。
【図５】抗内部構造抗体５Ｈ１０の免疫原ペプチドおよびその部分ペプチド４種に対する親和性をＥＬＩＳＡにより評価した結果を示す。
【図６】抗内部構造抗体５Ｈ１０のｓＡＰＰβに対する親和性をＥＬＩＳＡにより評価した結果を示す。
【図７】抗内部構造抗体５Ｈ１０のｓＡＰＰβに対する親和性をＳＰＲ法により評価した結果を示す。
【図８】４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡの標準曲線を示す。
【図９】４Ｇ４／５Ｈ１０のｓＡＰＰαに対する交差反応性をサンドイッチＥＬＩＳＡにより評価した結果を示す。
【図１０】細胞におけるｓＡＰＰβ（ａ）及びＡβ（ｂ）産生抑制作用を、４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。
【図１１】ＢＡＣＥ１阻害剤投与ラット血漿、脳脊髄液中のｓＡＰＰβを、４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。
【図１２】ＢＡＣＥ１阻害剤投与イヌ血漿、脳脊髄液中のｓＡＰＰβを、４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す。
【図１３】４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡとＩＢＬ社ｓＡＰＰβＥＬＩＳＡキットの標準曲線を比較した結果を示す。
【図１４】血漿（ａ）及び脳脊髄液（ｂ）中のｓＡＰＰβをゲルろ過により分子量分画した結果を示す。
【図１５】４Ｇ４抗体および５Ｈ１０抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す。下線部はＣＤＲ領域を示す。
【図１６】ＣＳＦより４Ｇ４抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィにより得られた精製物の逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）分画。各フラクションのｓＡＰＰβ  ＥＬＩＳＡ測定値を示す。横軸は逆相クロマトの保持時間（ＲＴ）、縦軸はＥＬＩＳＡによるｓＡＰＰβ濃度、反応性画分を溶出順にｐｅａｋ１−６と呼称する。
【図１７】ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ解析により構造決定されたｓＡＰＰβ断片体のアミノ酸配列を示す。
【図１８】ＡＤ患者ＣＳＦを用いたｓＡＰＰβ  ＥＬＩＳＡ測定値の他社キットとの比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（用語の定義）
本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、本発明の属する分野の当業者によって通常理解される意味で用いられる。
【００１２】
本明細書において、「βセクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）」とは、アミロイド前駆体タンパク（Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＡＰＰ）をβ部位で切断する酵素をいう。ＢＡＣＥ１は、例えばアミロイド前駆体タンパクのβ部位と呼ばれる部位を切断する。そのアミノ酸配列は既に公知となっており公開されている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＡＨ３６０８４）。
【００１３】
アミロイド前駆体タンパク（ＡＰＰ）には複数のバリアントが存在することが知られており、それぞれＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１またはＡＰＰ７７０と称されている。本明細書において「アミロイド前駆体タンパク」および「ＡＰＰ」には、これらのバリアントを全て含んでいる。このＡＰＰがＢＡＣＥ１によって切断されて生じる二つの断片のうち、ＡＰＰのＮ末側を含む断片はｓＡＰＰβと呼ばれている。また、ＢＡＣＥ１により切断された際に新たに生じるｓＡＰＰβのＣ末端部分は「ネオエピトープ」と呼ばれている。アミロイド前駆体タンパクがＡＰＰ７７０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｐ０５０６７）であれば、このｓＡＰＰβは、その１８位から６７１位の領域が該当する。また、最近ではアルツハイマー病や軽度認知症（Ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ、ＭＣＩ）の患者では、このｓＡＰＰβの血中濃度が上昇することが報告された（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  ２０１２年、第９０巻、２２４７ページ）。
【００１４】
本発明者らは、血漿や脳脊髄液などの試料中のｓＡＰＰβが、全長体だけではなく断片体としても多量に存在している事実を初めて見出した。より詳しくは、ＢＡＣＥ１切断により生成、遊離された後、さらにｓＡＰＰβのＮ末端側が何等かの作用によって削られてＣ末端部分が保持された断片体（以下、ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体ともいう）が存在することを確認した。なお、本明細書中において、「ｓＡＰＰβ」には全長ｓＡＰＰβのほか、このｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体も含んだ意味でも用いられる場合がある。
【００１５】
脳脊髄液中に、ＡＰＰのＮ末端部分（１０１残基〜１０８残基）が存在しているという報告（Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．  ２０１０  Ｊｕｎ；２２３（２）：３５１−８）、ＡＰＰの一部（２５残基）とＡβの一部（１５残基）からなるペプチドが存在しているという報告（Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ  Ｄｉｓ．  ２００９；６（３）：８７−９４）がある。しかし、これらの断片はｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体とは関係がなく、またＢＡＣＥ１の活性を示すものではない。
【００１６】
最近、生体内のＡＰＰのＮ末端側の断片がメタロプロテアーゼの１種であるメプリンβ（ｍｅｐｒｉｎ  β）の作用によって生成される可能性を示す報告がされた（Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ．  ２０１１  Ａｕｇ  ５；２８６（３１）：２７７４１−５０）。しかし、この事実もｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体の存在を示すものではない。
【００１７】
これまでにも、α―セクレターゼの作用により生じるｓＡＰＰαを測定するためのモノクローナル抗体が報告されている。米国公開公報２００３／０１６６０１９や特開平９−１７８７４３に使用されているモノクローナル抗体は、Ａβの一部を認識する。
【００１８】
ｓＡＰＰβの測定は、ＢＡＣＥ１切断により生成する末端構造であるネオエピトープ領域を認識する抗体および全長ｓＡＰＰβのＮ末端領域を認識するモノクローナル抗体を組み合わせて行われている（国際公報２００８／００８６４３号、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  ２０１２年、第９０巻、２２４７ページ、および同、２０１１年、第８９巻、８２２ページ）。
【００１９】
現在、ｓＡＰＰβを測定するために用いられるＥＬＩＳＡキットが、Ｃｏｖａｎｃｅ、ＩＢＬ、およびＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）から市販されている。ＣｏｖａｎｃｅおよびＭＳＤのキットには、全長ｓＡＰＰβのＮ末端領域を認識する抗体が含まれている（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１１年、第６巻、ｅ２３６００参照）。また、ＩＢＬのキットについても、全長ｓＡＰＰβのＮ末端領域を認識している抗体が使用されることが本発明者らによって確認されている（実施例参照）。
【００２０】
これらの公知の抗体では、血漿もしくは脳脊髄液に多量に存在しているｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体の測定は不可能である。したがって、ＢＡＣＥ１切断後の２次的なプロテアーゼ消化による影響を受けて、ＢＡＣＥ１活性指標としてのｓＡＰＰβの含量を誤って見積もっている可能性が高い。
【００２１】
本発明のモノクローナル抗体は、ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体を特異的に認識できることを特徴とするモノクローナル抗体をさす。ここで、「ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体」とは、ＢＡＣＥ１の作用により生成された全長ｓＡＰＰβが、さらにペプチダーゼなどの作用により生成した断片のうちＣ末端側の断片体の総称をさす。このような断片体の例としては、例えば、配列番号２８から３６に示すアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【００２２】
また、本発明のモノクローナル抗体には、アミロイド前駆体タンパク質における配列番号２８で示される領域を認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片も含まれる。この領域は、アミロイド前駆体タンパク質がＡＰＰ７７０の場合であれば６４７位から６７１位、ＡＰＰ６９５の場合であれば５７２位から５９６位、そしてＡＰＰ７５１の場合であれば６２８位から６５２位の領域が該当する。このような抗体は、全長ｓＡＰＰβおよび、配列番号２８から３６に示すアミノ酸配列を有するｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体のいずれも捕捉することができるため、ｓＡＰＰβの量の正確な測定に有用といえる。
【００２３】
本発明のモノクローナル抗体には、アミロイド前駆体タンパク質における配列番号３７で示される領域を認識するモノクローナル抗体またはその抗体断片も含まれる。この領域は、アミロイド前駆体タンパク質がＡＰＰ７７０の場合であれば６４７位から６６２位、ＡＰＰ６９５の場合であれば５７２位から５８７位、そしてＡＰＰ７５１の場合であれば６２８位から６４３位の領域が該当する。このような抗体は、配列番号１で示されるネオエピトープ領域（ＡＰＰ７７０の６６３位から６７１位に該当）を認識するモノクローナル抗体（例えば、実施例に示す４Ｇ４）と組み合わせることによって、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチアッセイが可能になる。
【００２４】
本発明のモノクローナル抗体の例としては、実施例に示す５Ｈ１０が挙げられる。このモノクローナル抗体は、配列番号３７で示されるアミノ酸配列に含まれる一部の領域（ＡＰＰ７７０の場合であれば６５１位から６６０位；配列番号１１）を認識する。
【００２５】
この５Ｈ１０の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した結果（図１５）、重鎖の可変領域は配列番号１４、軽鎖の可変領域は配列番号１５であった。また、ＣＤＲ（相補性決定領域）を決定したところ、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ１はＤＹＷＭＨ（配列番号２２）ＣＤＲ２はＦＩＮＰＲＳＧＳＴＴＹＮＱＫＦＲＤ（配列番号２３）ＣＤＲ３はＰＤＦＤＹＦＤＹ（配列番号２４）、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ１は、ＲＳＳＱＳＩＶＱＳＮＧＮＴＹＬＥ（配列番号２５）、ＣＤＲ２はＫＶＳＮＲＦＳ（配列番号２６）、ＣＤＲ３はＦＱＡＳＨＶＰＬＴ（配列番号２７）であった。
【００２６】
本発明のモノクローナル抗体には、この５Ｈ１０と実質的に同一の抗体も含まれる。具体的には、本発明の所望する生物学的活性（例えば、アミロイド前駆体タンパク質における配列番号２８で示される領域を認識できる）が保持される範囲内で、重鎖および軽鎖の可変領域（配列番号１４または１５）において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された改変体が挙げられる。同様に、ＣＤＲ（相補性決定領域）についても本発明の所望する生物学的活性（たとえば、アミロイド前駆体タンパク質における配列番号２８で示される領域を認識できる）が保持される範囲内で、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された改変体が挙げられる。
【００２７】
本発明のモノクローナル抗体の作製に用いられる免疫原は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトトリープレス）等に記載されている方法により作製することができる。
【００２８】
免疫方法は一般的方法により、例えば免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。より具体的には、例えば免疫原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、生理食塩水などで適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜３週間間隔で数回投与する。マウスを用いる場合は、一回の投与量を一匹あたり５０〜１００μｇ程度とする。ここで前記アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質をいう。通常用いられるアジュバントとしては、百日咳ワクチン、フロインドアジュバントなどを例示できる。最終免疫後３〜１０日目に哺乳動物の採血を行うことによって、抗血清を得ることができる。
【００２９】
モノクローナル抗体の製造方法は、免疫原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞）との融合細胞（ハイブリドーマ）を作製し、これより所望の５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを認識するモノクロ−ナル抗体を産生するクローンを選択し、該クローンを培養することにより実施できる。このモノクロ−ナル抗体の製造は、基本的には常法に従うことができる。
【００３０】
該方法において、免疫原で免疫される哺乳動物は、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが望ましく、マウス、ラットなどが用いられる。免疫方法についてはポリクローナル抗体の作製の場合と同様とする。但し最終免疫後３〜１０日目に免疫動物から脾臓細胞を採取する。
【００３１】
得られた免疫細胞からハイブリドーマを得るには、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂  堀江武一ら  １９９４年発行）等に記載されている方法により、継代培養可能な細胞とすることを目的として、例えば、センダイウイルスやポリエチレングリコール存在下、形質細胞腫細胞と抗体を産生する免疫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることができる。ここで用いられる形質細胞腫細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来の形質細胞腫細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。形質細胞腫細胞はｐ３ｘ６３−Ａｇ８．ＵＩなどの公知のものを利用できる。
【００３２】
ハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択し、コロニーが確認された段階で、培養上清に分泌される抗体と抗原との結合を調べる（スクリーニングする）ことにより目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００３３】
スクリーニングする方法としては、例えば、スポット法、凝集反応法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの一般に抗体の検出に用いられている種々の方法が挙げられるが、好ましくは、例えば後記実施例に詳述するように、ハイブリドーマの培養上清について、Ｃ末端ネオエピトープ構造の上流部分との反応性を指標とするＥＬＩＳＡ法に従って実施される。このスクリーニングによって、Ｃ末端ネオエピトープ構造の上流部分と特異的に反応する目的抗体産生株をスクリーニングすることができる。このプロセスに基づいて、得られたクローンとして、クローン５Ｈ１０を例示する。
【００３４】
スクリーニングの結果得た目的の抗体を産生できる株のクローニングは、通常の限界希釈法、軟寒天法などにより実施できる。クローニングされたハイブリドーマは、必要に応じて、血清培地または無血清培地で大量培養することができる。この培養によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、ハイブリドーマと適合性のある哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔に、ハイブリドーマを接種して、所望抗体をマウス腹水として大量に回収することもできる。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを含有する培養上清およびマウスの腹水は、精製あるいは修飾することなく粗製抗体液として用いることができる。また
モノクローナル抗体の単離、精製は、上述の培養上清あるいは腹水を、飽和硫酸アンモニウム、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム等のアフィニティカラムクロマトグラフィーに供すること等により行うことができる。
【００３６】
また本発明のモノクローナル抗体として、抗体遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、Ｃａｒｌら、ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、１９９０年発行）。
【００３７】
具体的には、目的とする抗体（例えば、５Ｈ１０）の可変領域（例えば、５Ｈ１０であれば配列番号１４および１５）をコードするｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥＫｉｔ（クローンテック製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８年、第８５巻、  ８９９８ページなど）を使用することができる。得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、デオキシ法により確認する。
【００３８】
目的とする抗体のＶ領域をコードするＤＮＡが得られれば、これを所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、抗体Ｃ領域のＤＮＡを含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー／プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる。
【００３９】
抗体遺伝子の発現は、抗体の重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）を別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３参照）。
【００４０】
抗体を用いて下記に述べるイムノアッセイ（免疫学的測定法）などを行うにあたって、通常は抗体の挙動を検出可能とするため抗体そのものが種々の物質で標識されうる。本発明のモノクローナル抗体の好ましい態様としては、標識したモノクローナル抗体が挙げられる。抗体を標識するには、例えば「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂  堀江武一ら１９９４年）等に記載されている常法を用いることにより行うことができる。種々の物質としては化学発光物質、酵素、蛍光物質、着色ビーズ、放射性同位元素、元素、金属類、ビオチンが挙げられる。以下に具体例を示すがこれらに限定されるものではない。化学発光物質とは例えばルミノールやアクリジニウムエステルなどをさす。酵素とは例えばβ−ガラクトシダーゼやアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼなどをさす。蛍光物質とは例えばユウロピウムクリプテートやＦＩＴＣやＲＩＴＣ（などをさす。着色ビーズとは例えばプロテインＡビーズ、ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＷＧＡ）ビーズ、ストレプトアビジンビーズなどをさす。放射性同位元素とは例えば１４Ｃや１２５Ｉや３Ｈなどをさす。元素とは例えばユウロピウムなどのランタニド元素をさす。金属類とは例えばフェリチンや金コロイドなどをさす。
【００４１】
本明細書において、「モノクローナル抗体断片」とは、前述する本発明のモノクローナル抗体の一部であって、当該モノクローナル抗体と同様にｓＡＰＰβに特異的な結合性を有する領域を意味する。
【００４２】
具体的には、前述するｓＡＰＰβに対して特異的結合性を有するＦａｂ  （ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体  （ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ；  以下、ｓｃＦｖと表記する）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ；  以下、ｄｓＦｖと表記する）、２量化体Ｖ領域断片  （以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する）、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１〜４５６頁、１９９６年）。
【００４３】
本発明の別の態様としては、本発明のモノクローナル抗体またはその抗体断片（以下、本発明のモノクローナル抗体等、とも記す）を用いたｓＡＰＰβの測定方法が挙げられる。本発明のモノクローナル抗体等は、特にイムノアッセイ（免疫学的測定法）に有用である。本発明のモノクローナル抗体を用いたイムノアッセイとしては競合的な測定でも非競合的な測定でも良い。また、ホモジニアスアッセイ法（均一系による測定）でもヘテロジニアスアッセイ法（不均一系による測定）でもよい。具体的には、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定（ＴＲ−ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法、イムノブロット法、ウエスタンブロット法、免疫染色法、ＳＰＡ法、蛍光偏光測定法（ＦＰ）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）などが挙げられる。
【００４４】
好ましい態様としては、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法とは、酵素で標識された抗体または抗原を用い、抗体または抗原の量を標識酵素の活性度により定量する方法である。酵素で標識された抗原抗体結合物と遊離型の標識抗原、または抗体を分離するのに固相化された抗体や抗原が用いられる。固相はアガロース、マイクロタイタープレートの内面、ラテックス粒子等が利用できる。ＥＬＩＳＡ法として具体的には競合法イムノアッセイやサンドイッチイムノアッセイなどが挙げられる。また標識酵素としては西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰともいう）やアルカリフォスファターゼ等が挙げられる。
【００４５】
ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ（免疫学的測定法）では通常２つの抗体を組み合わせて用いる。本発明のモノクローナル抗体等と組み合わせて使用する別の抗体としては、ｓＡＰＰβのＣ末端ネオエピトープ構造（例えばＡＰＰ６９５であれば５８８〜５９６位、配列番号１）を特異的に認識する抗体（例えば４Ｇ４抗体）が好ましい。
【００４６】
本発明者らは、上記の抗体、ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体を特異的に認識する抗体（例えば５Ｈ１０抗体）とＣ末端ネオエピトープ構造を特異的に認識する抗体（例えば４Ｇ４抗体）を組合せたＥＬＩＳＡ法によって従来のＥＬＩＳＡ法を用いたキットでは検出できなかったｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体も測定することを可能とした（実施例１０参照）。この事実は、本発明の抗体を用いた測定法によれば全長ｓＡＰＰβだけでなく、その分解物も含めて検出することができるので生体試料液中に含まれているｓＡＰＰβの量を正確に反映していることを示す。
【００４７】
一方、既存のｓＡＰＰβ定量キットは、使用される抗体のエピトープがｓＡＰＰβのＮ末端の近傍であるため、Ｎ末端部分が欠失したｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体を検出できなかった。従ってｓＡＰＰβの一部を検出しているに過ぎず、正確なｓＡＰＰβ量の測定、およびＢＡＣＥ１活性を評価できているとは言えなかった。
【００４８】
本発明の測定方法を用いれば、ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体を定量することができるので、既存のｓＡＰＰβ定量キットや定量用抗体に比べてＢＡＣＥ１活性を正確に評価することができる。よって後述するようなＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法や、アルツハイマーなどＢＡＣＥ１が関連する疾患患者由来の生体試料の選別方法、およびアルツハイマーなどＢＡＣＥ１が関連する疾患の診断に有用である。
【００４９】
本発明の測定方法の一態様としては、ＢＡＣＥ１阻害剤のスクリーニング方法を挙げることができる。即ち、例えば酵素としてのＢＡＣＥ１、基質でとしてのＡＰＰに被験物質を接触させてから、ｓＡＰＰβの量を測定し、被験物質が非存在下のｓＡＰＰβの量と比べてその値が低い場合、被験物質がＢＡＣＥ１阻害剤であると判定することができる。
【００５０】
またＢＡＣＥ１およびＡＰＰを発現する細胞に、被験物質を接触させ、被験物質存在下の細胞抽出液または細胞培養上清中のｓＡＰＰβの量が、被験物質非存在下の細胞抽出液または細胞培養上清中のｓＡＰＰβの量と比べて低い場合、被験物質がＢＡＣＥ１阻害剤であると判定することができる。
【００５１】
本発明の測定方法の一態様としては、ヒトの臨床試験や診断に用いることができる。
【００５２】
例えば、被験物質をアルツハイマーに罹患した患者に投与した後、被験者から生体試料を採取してそのｓＡＰＰβ量を測定する。このとき、被験者由来の生体試料中のｓＡＰＰβの量が減少している場合、該被験物質がアルツハイマーに対して薬効を示していることの指標にできる。
【００５３】
また被験者から生体試料を採取し、そのｓＡＰＰβ量を測定することによって、該被験者がアルツハイマーや軽度認知障害（ＭＣＩ）などＢＡＣＥ１が関与する疾患に罹患の患者かどうか、もしくは将来罹患する可能性を判断することができる。
【００５４】
ここで「生体試料」とは、哺乳動物由来の任意の生物学的液体をいう。例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ、ＣＳＦ）、尿、唾液、および汗などの体液、並びに細胞および／または組織の抽出物および上清を含む。
【００５５】
本発明のさらなる別の態様としては、本発明のモノクローナル抗体等を含むキットが挙げられる。このようなキットには、通常一般的にアッセイを実行するために必要な１つ以上の構成要素を含む。構成要素は、標準品、試薬（希釈液、緩衝液など）、容器および／または装置であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体に特異的な配列に結合するモノクローナル抗体またはその抗体断片を含み得る。このような抗体は、当業者に公知の任意の支持材料（例えば、マイクロタイタープレートにおけるウェルやニトロセルロースなどの適切な膜）に付着されて提供され得る。さらには、アッセイにおいて使用されるべき構成要素（例えば、試薬または緩衝液）を含み得る。このようなキットはまた、あるいは、抗体結合の直接的検出または間接的検出に適切な上記の物質により標識され得る。
【００５６】
実施例
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、抗体作製手法として、特に断らない限り、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉａｔｉｏｎｓ）に記載されている方法を用いた。また、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている方法を用いた。
【実施例１】
【００５７】
ｓＡＰＰβネオエピトープ抗体の調製【００５８】
抗原の選定：
β−セクレターゼによるＡＰＰの分解を検出するために、その切断点であるＣ末端のネオエピトープ構造を特異的に認識する抗体を作製することにした。
ＡＰＰのネオエピトープ部分配列を図２に示した。ネオエピトープ部分の９アミノ酸残基、ヒトＡＰＰ６９５−（５８８−５９６）（Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ：配列１）はヒトからマウスまで動物種間で保存されていることから、免疫原として選択した。【００５９】
抗原の免疫：
配列１に示すネオエピトープペプチドのＮ末にＣｙｓ残基を導入したペプチド（Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ：配列２）：を合成した（ＳＩＧＭＡ社製）。
合成ネオエピトープペプチド１．３ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解したものと、１０ｍｇのマレイミド化ｇｉａｎｔ  ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔｓヘモシアニン（マレイミド化ＫＬＨ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１ｍｌの蒸留水に溶解したものと混合し、４℃で一晩反応させた。
上記の混合液を０．９％  生理食塩水に対して透析後、使用時まで−８０℃保管した。
このペプチド−ＫＬＨ複合体０．１ｍｇをフロイント完全アジュバントと共にＡ／Ｊ  Ｊｍｓ  Ｓｌｃ雌性マウス７匹に腹腔内投与した。その後、３週間隔でペプチド−ＫＬＨ複合体０．１ｍｇをフロイント不完全アジュバントと共に４回追加免疫した。最終免疫の３週間後にペプチド−ＫＬＨ複合体０．１ｍｇを生理食塩水０．１ｍｌに懸濁した溶液を腹腔内にブースター投与した。【００６０】
ネオエピトープペプチドのビオチン標識：
合成ネオエピトープペプチド０．４ｍｇを０．４ｍｌの５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものと、０．１６ｍｇのＰＥＯ−マレイミド活性化ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を０．１ｍｌの蒸留水に溶解したものとを混合し、室温で２時間反応後に逆相ＨＰＬＣにてビオチン標識ネオエピトープペプチドを精製した。【００６１】
ハイブリドーマの作製：
最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、２匹のマウスから脾臓細胞を回収した。脾臓細胞とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３６３−Ａｇ８、東京腫瘤研究所）を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地で選択した。【００６２】
ネオエピトープ抗体の選択：
細胞融合１０日後に特異抗体産生細胞のスクリーニングを以下に記載したＥＬＩＳＡを用いて行なった。
３８４穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに０．３５μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）３５μｌを加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを９０μｌの洗浄液（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を９０μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行なった。（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）【００６３】
各ウェルを９０μｌの洗浄液で１回洗浄した後、１５μｌのハイブリドーマ培養上清を含む１０μｌの緩衝液Ａ（０．５％  ウシ血清アルブミン、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、０．０５％  Ｐｒｏｃｌｉｎ１５０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  トリス緩衝液、ｐＨ７．４）および０．０４ｎｇのビオチン標識ネオエピトープベプチドと２ｎｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む１０μｌの緩衝液Ａを混合し、４℃で１６時間反応させた。【００６４】
次に各ウェルを９０μｌの洗浄液で３回洗浄した後に、２５μｌのＴＭＢ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、２５μｌの０．０５Ｍ硫酸を添加して反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。【００６５】
スクリーニングの結果から、ネオエピトープペプチドと強い親和性を示したハイブリドーマクローンを１個選択し、４Ｇ４と命名した。４Ｇ４についてマウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて調べた結果、アイソタイプはＩｇＧ２ａ／κであった。【００６６】
ＥＬＩＳＡによる抗体親和性評価
上述した抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレートに、１０μｌの４Ｇ４抗体を含む緩衝液Ａを加え、免疫原ペプチド（配列：２）あるいは、長鎖ペプチド（Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ：配列３、ＳＩＧＡＭＡ社製）、短鎖ペプチド（Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ：配列４、ＳＩＧＭＡ社製）、ヒトｓＡＰＰβタンパク（ＭＥＳＯ  ＳＣＡＬＥ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ社製）、ヒトｓＡＰＰαタンパク（ＭＥＳＯ  ＳＣＡＬＥ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ社製）を加えた。そして、０．０４ｎｇのビオチン標識ネオエピトープベプチドと２ｎｇのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（ＰＩＥＲＣＥ社製）を含む１０μｌの緩衝液Ａを混合し、４℃で１６時間反応させた後に洗浄後、２５μｌのＴＭＢ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（ＤＡＫＯ社製）を添加して室温で３０分間発色させた後に、２５μｌの０．０５Ｍの硫酸を添加し反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（図３）。以上により算出されるヒトｓＡＰＰβタンパクに対するＩＣ５０は、８．４ｎＭと示され、ｓＡＰＰαとの交差性は０．０１％未満であった。【００６７】
抗体の親和性
センサーチップＧＬＭ（バイオラッド社製）にネオエピトープ抗体４Ｇ４を固相化し、ＰｒｏｔｅＯｎ（バイオラッド社製）を用いて、４０、２０、１０、５ｎＭのｓＡＰＰβを反応させ解離定数を解析した結果、４Ｇ４の解離定数ＫＤは、４．４×１０−１０（Ｍ）であった（図４）。
【実施例２】
【００６８】
ｓＡＰＰβ内部配列抗体の調製【００６９】
抗原の選定：
ｓＡＰＰβ及びその分解物を検出するために、その切断点であるＣ末端のネオエピトープ構造の近傍の配列を選択した。また、動物種共通の配列である部分を認識する抗体を作製することにした。【００７０】
ＡＰＰの内部構造部分配列を図１に示した。ｓＡＰＰβの３４アミノ酸残基、ヒトＡＰＰ６９５−（５５２−５８５：配列５）のＣ末端にＣｙｓ残基を導入したペプチド（Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ：配列６、３５アミノ酸残基）を免疫原として選択した。【００７１】
抗原の免疫：
配列２に示す内部構造ペプチドのＣ末にＣｙｓ残基導入したペプチドを合成した（ＳＩＧＭＡ社製）。
合成ネオエピトープペプチド４．０ｍｇを０．５ｍｌの蒸留水に溶解したものと、１０ｍｇのマレイミド化ＫＬＨ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を１ｍｌの蒸留水に溶解したものと混合し、４℃で一晩反応させた。
上記の混合液を０．９％  生理食塩水に対して透析後、使用時まで−８０℃保管した。
このペプチド−ＫＬＨ複合体０．１ｍｇをフロイント完全アジュバントと共にＡ／Ｊ  Ｊｍｓ  Ｓｌｃ雌マウス７匹に腹腔内投与し、初回免疫とした。
その後、３週間隔でペプチド−ＫＬＨ複合体０．１ｍｇをフロイント不完全アジュバントと共に４回追加免疫した。最終免疫の３週間後にペプチド−ＫＬＨ複合体０．１ｍｇを生理食塩水０．１ｍｌに懸濁した溶液を腹腔内にブースター投与した。【００７２】
内部構造ペプチドのビオチン標識：
合成内部構造ペプチド（配列５）０．２ｍｇを０．２ｍｌの５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解したものと、２９μｇのＰＥＯ−マレイミド活性化ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を混合し、４℃で一晩反応後に逆相ＨＰＬＣにてビオチン標識内部構造ペプチドを精製した。【００７３】
ハイブリドーマの作製：
実施例１と同様の方法で行った。【００７４】
内部構造抗体の選択：
ビオチン標識内部構造ペプチドを用いて、実施例１と同様の方法でハイブリドーマ上清をスクリーニングした。その結果から、内部構造ペプチド（配列５）およびヒトｓＡＰＰβタンパク（ＭＥＳＯ  ＳＣＡＬＥ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ社製）と強い親和性を示したハイブリドーマクローンを複数個選択した。【００７５】
獲得した内部構造抗体の中でもｓＡＰＰβタンパクに対して最も親和性の強かった５Ｈ１０についてマウスモノクローナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて調べた結果、アイソタイプはＩｇＧ１／κであった。【００７６】
ＥＬＩＳＡによる抗体のエピトープ決定
実施例１と同様にして、競合ＥＬＩＳＡ法により、免疫原ペプチドを下記に示す４つの断片１〜４（配列番号８、９、１０、１１）に分割したペプチドで競合阻害をかけ、そのペプチドとの反応性を調べた。各抗体のエピトープ断片を表１に示す。また、５Ｈ１０の競合阻害結果を図５に示した。【００７７】
断片１：Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（配列番号：８）
断片２：Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号：９）
断片３：Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（配列番号：１０）
断片４：Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（配列番号：１１）【００７８】
ＥＬＩＳＡによる抗体親和性評価
実施例１と同様にして、競合ＥＬＩＳＡ法により、ヒトｓＡＰＰβタンパク（ＭＥＳＯ  ＳＣＡＬＥ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ社製）に対するＩＣ５０を算出した結果、１．５ｎＭと示された（図６）。【００７９】
抗体の親和性
センサーチップＧＬＭ（バイオラッド社製）にネオエピトープ抗体５Ｈ１０を固相化し、ＰｒｏｔｅＯｎ（バイオラッド社製）を用いて、１０００、２５０、６２．５、１５．６、３．９１ｎＭのｓＡＰＰβを反応させ解離定数を解析した結果、５Ｈ１０の解離定数ＫＤは、６．２×１０−１０（Ｍ）であった（図７）。
【実施例３】
【００８０】
抗体配列の決定【００８１】
樹立した４Ｇ４及び５Ｈ１０のハイブリドーマ細胞より、常法に従ってＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列を決定した。（配列番号１２、１３、１４、１５）
【実施例４】
【００８２】
４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築【００８３】
９６穴マキシソーププレート（Ｎｕｎｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３７７５９１）の各ウェルに、１μｇのストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を含むトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）１００μｌを加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルを３００μｌの洗浄液（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水）で１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を３００μｌ加えて室温で２時間放置して、ブロッキングを行なった。ウェルを３００μｌの洗浄液で１回洗浄した後、ＥＺ−ＬｉｎｋR  Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて作製したビオチン標識４Ｇ４ネオエピトープ抗体を２００ｎｇずつ添加した。２−４時間室温で静置後、洗浄液にて３回洗浄した。０．５５−４００ｐＭの標準品（ヒトｓＡＰＰβタンパク、ＭＥＳＯ  ＳＣＡＬＥ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ社製）あるいは被検試料を含む１００μｌの緩衝液Ｂ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１  ｍＭ  ＺｎＣｌ２、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０、１％  ウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ社製）、２％  ブロックエース、１０μｇ／ｍｌ  マウスγ−グロブリン、０．０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ  トリス緩衝液、ｐＨ７．５）を添加し、４℃で一晩静置した。洗浄液にて４回洗浄後、１０ｎｇのアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識した５Ｈ１０  Ｆａｂ’を含む１００μｌの緩衝液Ｂを混合し、室温で２−３時間反応させた。４回洗浄液にて洗浄後、１００μｌのＣＤＰ−Ｓｔａｒ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、１５−２０分間静置し、ＡＲＶＯ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い発光強度を測定した。【００８４】
ＡＬＰ標識５Ｈ１０  Ｆａｂ’の作製は、ペプシン（Ｒｏｃｈｅ社製）により、内部構造抗体５Ｈ１０  ＩｇＧを消化後、２−メルカプトエチルアミンにて還元してＦａｂ’としとした。これに、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてアルカリフォスファターゼ  （ＡＬＰ、  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ、  Ｒｏｃｈｅ）にマレイミド基を導入したものを添加し、ゲルろ過により５Ｈ１０  Ｆａｂ’−ＡＬＰ  を調製した。
本サンドイッチＥＬＩＳＡによるｓＡＰＰβの最低検出限界は０．８ｐＭであった（図８）。またｓＡＰＰαに対する交差性は０．２％であった（図９）。
【実施例５】
【００８５】
細胞におけるｓＡＰＰβ（全長ｓＡＰＰβおよびｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体も含む、以下同じ）及びアミロイドβ（Ａβ）産生抑制作用の測定【００８６】
ヒト野生型ＡＰＰを過剰発現させた神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞（ＳＨ／ＡＰＰｗｔ）を８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調整し、１ウェルあたり１５０μｌずつ９６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）に蒔き、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータ内で２時間培養した。その後、化合物Ａ（ＷＯ２００８／１３３２７３に記載された化合物６２２。ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド溶液）を２  μｌ／５０  μｌ培地となるようにあらかじめ添加・懸濁した溶液を細胞液に添加した。すなわち、最終ＤＭＳＯ濃度が１％、細胞培養液は２００μｌとなった。化合物Ａ添加から２４時間インキュベートした後、培養上清を１００μｌずつ回収し、その中に含まれるｓＡＰＰβ量及びＡβ量を測定した。【００８７】
ｓＡＰＰβ量は、上述の４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ系により測定した。また、Ａβ量の測定方法は、３８４ウェルハーフエリアプレート（黒色プレート；コースター社製）に、均一系時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）測定試薬（Ａｍｙｌｏｉｄ  β１−４０ペプチド；ＩＢＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｈｏｌｄｉｎｇ、  Ｓ．Ａ．）１０  μｌと、培養上清１０  μｌを入れて混ぜ合わせ、遮光して４℃一晩静置した。その後、蛍光強度（励起波長  ３３７ｎＭ、測定波長  ６２０ｎＭおよび６６５ｎＭ）をＷａｌｌａｃ１４２０マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて測定した。Ａβ量は各測定波長のカウント率（１００００  ｘ  Ｃｏｕｎｔ  ６６５／Ｃｏｕｎｔ  ６２０）から求め、化合物Ａの各濃度でのＡβ産生阻害を算出した。また、その結果、ＢＡＣＥ１阻害剤濃度依存的に、ｓＡＰＰβ及びＡβ産生の有意な阻害が観察された（図１０ａ、ｂ）。
【実施例６】
【００８８】
ＢＡＣＥ１阻害剤投与ラット血漿、脳脊髄液中ｓＡＰＰβ測定【００８９】
化合物Ａを０．５％メチルセルロースに懸濁させ、雄性Ｃｒｊ：ＳＤラット（７〜９週齢）に対し、３０ｍｇ／１５ｍＬ／ｋｇとなるように経口投与した。基剤対照群は０．５％メチルセルロースのみを投与し、各群５匹で投与試験を実施した。投与６時間後、脳脊髄液は麻酔下において直接採取法  （大槽内）  により採取し、速やかに液体窒素で凍結した。さらに血液は腹部大動脈より採取し、速やかに氷冷した。その後１００００ｒｐｍ  １０ｍｉｎ  ４℃遠心し、血漿を採取後、液体窒素で凍結した。本試料中のｓＡＰＰβを上述の４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ系により測定した結果、ＢＡＣＥ１阻害剤投与群でｓＡＰＰβ産生の有意な阻害が観察された（図１１）。
【実施例７】
【００９０】
ＢＡＣＥ１阻害剤を投与したイヌ血漿および脳脊髄液中ｓＡＰＰβの測定  【００９１】
化合物Ａを０．５％メチルセルロースに懸濁させ、雄性ＴＯＹＯビーグル犬（２４ヶ月齢または６ヶ月齢）に対し、３０ｍｇ／１５ｍＬ／ｋｇとなるように経口投与した。基剤対照群は０．５％メチルセルロースのみを投与し、各群２匹で投与試験を実施した。投与  １２、２４時間後に脳脊髄液と血液を採取した。脳脊髄液は麻酔下において直接採取法  （大槽内）  により採取し、速やかに液体窒素で凍結した。血液は非麻酔下で橈側皮静脈もしくは伏在静脈より採血し、速やかに氷冷した。その後１３０００ｒｐｍ  ２ｍｉｎ  ４℃遠心し、血漿を採取後、液体窒素で凍結した。本試料中のｓＡＰＰβを上述の４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ系により測定した結果、ＢＡＣＥ１阻害剤投与群でｓＡＰＰβ産生の有意な阻害が観察された（図１２）。
【実施例８】
【００９２】
ＩＢＬ社キットとの標準曲線比較【００９３】
４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡとＩＢＬ社のｓＡＰＰβ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ．Ｎｏ．２７７３２）の標準曲線を比較した。その結果、４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡの方がＩＢＬのものと比べ、感度が１０倍ほど高いことが示された。（図１３）
【実施例９】
【００９４】
ヒト血漿および脳脊髄液の測定【００９５】
８例の健常人ヒトＥＤＴＡ血漿（社内ボランティア採血により入手）及びヒト脳脊髄液（Ａｓｔｅｒａｎｄ社）中のｓＡＰＰβ量を上述のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定した。血漿は緩衝液Ｂで５倍希釈、脳脊髄液は５０−４００倍希釈したものを被検試料として使用した。健常人の血漿中には、平均５２．０  ±  １１．５ｐＭのｓＡＰＰβが含まれることが観察された（表１）。また脳脊髄液では、１０００−１００００ｐＭのｓＡＰＰβが観察され（表２）、血漿、脳脊髄液共に試料の前処理を必要とせず、定量範囲内で精度よく測定可能であった。血漿については、ＩＢＬのキットでも測定を実施した。血漿の影響が少ない１５倍希釈で測定を行った結果、８検体中７検体が測定定量限界以下で測定できなかった。ＭＳＤのキットでも２倍希釈で測定を行ったが、全ての検体が測定限界以下で、２つの市販キットでは血漿中のｓＡＰＰβを精度高く測定できないことを確認した。【００９６】
【表１】
0005605879.tif 000002
【００９７】
【表２】
0005605879.tif 000003
【実施例１０】
【００９８】
血漿及び脳脊髄液中のｓＡＰＰβのゲルろ過による分子量分画【００９９】
ヒト血漿もしくはヒト脳脊髄液  ２５０μLをゲルろ過カラムＴＳＫ−３０００ＳＷＸＬ（東ソー社製）を接続したＬＣ−６Ａシステム（島津製作所社製）に供し、溶出液を０．５ｍLずつ分画した。血漿を分画したものについては、凍結乾燥機ＤＲＺ３５０ＷＢ（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を用いて１０倍濃縮した。上述の４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ及びＩＢＬ社のｓＡＰＰβ測定キットの両法により、各画分に含まれるｓＡＰＰβ濃度を測定した。血漿及び脳脊髄液いずれにおいても、ＩＢＬ社のＥＬＩＳＡキットでは全長体（約１００ｋＤａ）と推定される溶出位置にのみピークが検出されたが、４Ｇ４／５Ｈ１０  サンドイッチＥＬＩＳＡでは、１５ｋＤａ以下の領域にもピークが観察された。この断片化画分をＭＳ解析に供した結果、ｓＡＰＰβのネオエピトープ近傍の配列が確認できた。従って、ヒト血漿（図１４ａ）及び脳脊髄液（図１４ｂ）中には、１０ｋＤａ程度の分子量を持つｓＡＰＰβが断片化したものが多く含まれ、４Ｇ４／５Ｈ１０サンドイッチＥＬＩＳＡ系では、ｓＡＰＰβ断片体も測定できることが示された。
【実施例１１】
【０１００】
シオノギＥＬＩＳＡとＭＳＤ社ＥＬＩＳＡを用いたＣＳＦ中ｓＡＰＰβ反応成分の比較【０１０１】
購入ヒトＣＳＦ検体（ＡＤ×４例、ＭＣＩ×４例、Ｎｏｒｍａｌ×５例）各５０μＬをプールした試料計６５０μＬを、４Ｇ４抗体固相化カラムを用いてアフィニティー精製を行った。これらプール溶液をカラムに通液し、洗浄後、カラム結合成分を１００  ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  （ｐＨ２．３）にて溶出した。続いて、この溶出画分を逆相カラム（ＹＭＣ−ｐａｋ  ＯＤＳ−ＡＭ、φ６．０×１５０  ｍｍ）を接続したＬＣ−４Ａシステム（島津製作所社製）に供し、移動相として０．１％  ＴＦＡ／ＡＣＮ系を用いて、流速１．０  ｍＬ／ｍｉｎにて、溶出液を０．５  ｍＬ／ｔｕｂｅにて分画した。（以下、４Ｇ４抗体精製／逆相カラムクロマトグラフィーを用いた精製・分画法を４Ｇ４／ＲＰＣ法と呼称する。）上述のシオノギ及びＭＳＤ社のｓＡＰＰβ  ＥＬＩＳＡ測定キットの両法により、各画分に含まれるｓＡＰＰβ濃度を測定した（図１５）。このとき、シオノギＥＬＩＳＡキットにて測定されるｓＡＰＰβ  ＥＬＩＳＡ反応画分を溶出順に、ピーク１〜６と命名した。ＭＳＤ社のＥＬＩＳＡキットではｓＡＰＰβ全長体（約１００ｋＤａ）と推定されるピーク６のみ反応性を示した。よって、シオノギＥＬＩＳＡキットで検出されるピーク１〜５は、ｓＡＰＰβ全長体ではなく、ｓＡＰＰβのＣ末端側エピトープ配列を有する断片体ペプチド成分を含むことが考えられた。【０１０２】
続いて、ピーク１−６に関して、Ｌｙｓ−Ｃ＋Ａｓｐ−ＮもしくはＬｙｓ−Ｃ＋Ｔｒｙｐｓｉｎ消化酵素を用いて、含有ｓＡＰＰβ成分のＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ解析を試みた。各ピーク画分の一部を分注し、減圧乾燥させた後、８Ｍ  Ｕｒｅａ／０．１％  Ｒａｐｉｇｅｓｔ  ＳＦ／１００  ｍＭ  Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  （ｐＨ８．６）溶液を添加し、再溶解させた。次に、２５  ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ  （ＤＴＴ）を添加し、３７℃で１時間保温後、５０  ｍＭ  Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ  （ＩＡＡ）を添加し、暗所にて３７℃、１時間反応させ、還元アルキル化を行った。これを２倍希釈し、１  μｇ  Ｌｙｓ−Ｃを添加し、３７℃で一晩消化した。翌日、反応液を４倍希釈し、１  μｇ  Ａｓｐ−Ｎもしくは１  μｇ  Ｔｒｙｐｓｉｎを添加して、３７℃、６時間消化した。その後、Ｍｏｎｏｓｐｉｎ  Ｃ１８  （ＧＬ  ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて脱塩処理を行い、減圧乾燥させた。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ解析には、ｎａｎｏＬＣ／Ｑ−ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）  を用いた。サンプルを０．１％  ＴＦＡ／５％  ＡＣＮ  ５  μLに再溶解させ、流速３００  ｎＬ／ｍｉｎ、バッファーＡ：  ０．１％  Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ、  バッファーＢ：  ０．１％  Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ／９９．９％  ＡＣＮ、グラジエント濃度：  ５−３５％Ｂ  （１０  ｍｉｎ）、測定時間：  ２０ｍｉｎ、イオンモード：  ｐｏｓｉｔｉｖｅ、測定モード：  ＴＯＰ１０−ｄｄＭＳ／ＭＳ、質量範囲  （ｍａｓｓ  ｒａｎｇｅ）：  ｍ／ｚ  ３００−１、６５０、イオン価数（ｃｈａｒｇｅｄ  ｉｏｎ）：  ＋２、  ＋３、  ＋４、解像度  （Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：  Ｒ＝１７、５００、プレカーサーイオン質量誤差（ＭＳ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：  ３  ｐｐｍ、フラグメントイオン質量誤差（ＭＳ／ＭＳ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：  ０．０２  Ｄａの測定条件にて、ｓＡＰＰβ消化ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを観測した。得られたデータはＰＥＡＫＳ  ６  ｓｏｆｔｗａｒｅ  （Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）を用いて、Ｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｓ  （＋５７．０２）、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔ  （＋１５．９９）、Ｍｉｓｓ  ｃｌｅａｖａｇｅ：  ２  （Ａｓｐ−Ｎ）／１（Ｔｒｙｐｓｉｎ）、Ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ：  ｏｎｅ  ｓｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅを考慮してＤｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行い、ｓＡＰＰβ配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：  Ｐ０５０６７［１８−６７１］、  Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  Ａ４  ｐｒｏｔｅｉｎ、  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に対して検索・同定を行った。【０１０３】
その結果、ピーク２−６において、ｓＡＰＰβのＣ末端側配列である５Ｈ１０エピトープおよび４Ｇ４ネオエピトープ配列を観測した。特に、ピーク２−４は全長ｓＡＰＰβ−Ｃ末端側から最大で５７残基の配列しか検出できなかったため、１０ｋＤａ以下の断片体を多く含む画分と考えられた。また、ピーク５においては、全長ｓＡＰＰβ−Ｎ末端側の配列を観測したが、ＭＳＤ社ＥＬＩＳＡのような全長ｓＡＰＰβを測定するキットでは反応性を示さなかったことから、この画分には、全長ｓＡＰＰβのＮ末端側が１００残基程度欠損したＴｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍを含むことが推測された。
【実施例１２】
【０１０４】
ヒトＣＳＦ中ｓＡＰＰβ−Ｃ末端断片体の構造決定【０１０５】
４Ｇ４／ＲＰＣ法にて分画され、シオノギＥＬＩＳＡにて反応性を示す画分ピーク２および３（図１５）に関して、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを用いたｓＡＰＰβ断片体の構造決定を行った。ピーク２に関しては、含まれるペプチドの分子量測定を行うＩｎｔａｃｔ解析を実施し、ピーク３に関しては、酵素消化してＮ末端側配列を特定するＤｉｇｅｓｔｉｏｎ解析を実施した。【０１０６】
Ｉｎｔａｃｔ解析に関して、ピーク２画分の一部を分注し、減圧乾燥させたものを試料とした。ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ解析には、ｎａｎｏＬＣ／Ｑ−ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ    を用いた。サンプルを０．１％  ＴＦＡ／５％  ＡＣＮ  ５  μLに再溶解させ、流速３００  ｎＬ／ｍｉｎ、バッファーＡ：  ０．１％  Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ、  バッファーＢ：  ０．１％  Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ／９９．９％  ＡＣＮ、グラジエント濃度：  ５−３５％Ｂ  （１０  ｍｉｎ）、測定時間：  ２０ｍｉｎ、イオンモード：  ｐｏｓｉｔｉｖｅ、測定モード：  ＴＯＰ１０−ｄｄＭＳ／ＭＳ、質量範囲  （ｍａｓｓ  ｒａｎｇｅ）：  ｍ／ｚ  ３００−１、６５０、イオン価数（ｃｈａｒｇｅｄ  ｉｏｎ）：  ＋２、  ＋３、  ＋４、  ＋５、  ＋６、  ＋７、  ＋８、  ＞＋８、解像度  （Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）：  Ｒ＝１７、５００、プレカーサーイオン質量誤差（ＭＳ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：  ３  ｐｐｍ、フラグメントイオン質量誤差（ＭＳ／ＭＳ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）：  ０．０２  Ｄａの測定条件にて、ｓＡＰＰβ−Ｃ末断片体のＭＳ／ＭＳスペクトルを観測した。得られたデータはＰＥＡＫＳ  ６  ｓｏｆｔｗａｒｅ  を用いて、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔ  （＋１５．９９）を考慮してＤｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行い、ｓＡＰＰβ配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：  Ｐ０５０６７［１８−６７１］、  Ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ  Ａ４  ｐｒｏｔｅｉｎ、  Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）に対して検索・同定を行った。
Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ解析に関しては、ピーク３画分の一部を用いて、実施例１１で述べた方法と同様の条件でＮ末端配列の同定を試みた。【０１０７】
その結果、ピーク２のＩｎｔａｃｔ解析から、８分子（２５、２６、３６、３９、４５、４７、４８、４９  ｍｅｒ）、ピーク３のＤｉｇｅｓｔｉｏｎ解析から１分子（５７  ｍｅｒ）、計９分子のｓＡＰＰβ断片体の構造を決定した（図１７）。
【実施例１３】
【０１０８】
シオノギＥＬＩＳＡとＭＳＤ社ＥＬＩＳＡを用いたＣＳＦ中ｓＡＰＰβ測定値の比較【０１０９】
ＭＭＳＥ  ｔｅｓｔにより、ＡＤ患者と判定された５例の脳脊髄液（ＣＳＦ）を用いて、ｓＡＰＰβ全長体のみ測定可能なＭＳＤ社ｓＡＰＰβ  ＥＬＩＳＡキットとｓＡＰＰβ全長体および断片体を測定可能なシオノギ（４Ｇ４／５Ｈ１０）ｓＡＰＰβ  ＥＬＩＳＡキットの測定値の比較を行った。シオノギＥＬＩＳＡの測定方法は実施例４に従った。また、ＭＳＤ社製ＥＬＩＳＡは添付プロトコルに従った。いずれのＥＬＩＳＡにおいても、ｓＡＰＰβ濃度を算出するための検量線に用いたｓＡＰＰβ標準品は、ＭＳＤ社ＥＬＩＳＡに添付されているｓＡＰＰβ全長体を共通して用いた。結果、ＭＳＤ社ＥＬＩＳＡよりもシオノギＥＬＩＳＡの方が、７倍程度測定値が高く検出できた（図１８）。また、ＭＳＤ社ＥＬＩＳＡとの比較から、ＣＳＦ中のｓＡＰＰβ全長体は１４．５％程度と見積もられ、実際はｓＡＰＰβ断片体のほうがＣＳＦ中に多量に存在していることが判明した。このことは、ＣＳＦをゲル濾過分画し、ｓＡＰＰβ成分をＥＬＩＳＡ測定した実施例１０（図１４ｂ）からも示唆できる。
【図１】
0005605879.tif 000004
【図２】
0005605879.tif 000005
【図３】
0005605879.tif 000006
【図４】
0005605879.tif 000007
【図５】
0005605879.tif 000008
【図６】
0005605879.tif 000009
【図７】
0005605879.tif 000010
【図８】
0005605879.tif 000011
【図９】
0005605879.tif 000012
【図１０】
0005605879.tif 000013
【図１１】
0005605879.tif 000014
【図１２】
0005605879.tif 000015
【図１３】
0005605879.tif 000016
【図１４】
0005605879.tif 000017
【図１５】
0005605879.tif 000018
【図１６】
0005605879.tif 000019
【図１７】
0005605879.tif 000020
【図１８】
0005605879.tif 000021
【配列表】
0005605879000001.app