(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactococcus lactis ssp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス・バイオバー・ジアセチラクチス（Lactococcus lactis ssp. lactis bv. diacetylactis）、及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）のいずれか一種以上の乳酸菌の菌体から、ｐＨ１０〜ｐＨ１２の緩衝液により抽出されたプラスミノーゲン活性化剤。
【請求項２】
前記菌体が８０℃〜１５０℃の温度で５分〜４０分加熱処理して用いられる請求項１に記載のプラスミノーゲン活性化剤。
【請求項３】
前記請求項１又は請求項２に記載のプラスミノーゲン活性化剤を用いた食品。 
【請求項４】
前記請求項１又は請求項２に記載の記載のプラスミノーゲン活性化剤を用いた飼料又はペットフード。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌の生産する線溶酵素活性化因子を有効成分とし、フィブリノーゲンを限定分解して、血栓形成もしくは血栓再閉塞を阻害するプラスミノーゲン活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血栓症により引き起こされる疾病は、心筋梗塞、脳梗塞、肺閉塞症などの重篤なものが多く、常に死因の上位を占めている。
【０００３】
血栓の形成にはフィブリンが重要な役割を演じるが、繊維素溶解系（繊溶系）の正常な活性化は、これらの循環器系疾患の予防となる。即ち、繊維素溶解酵素の不活性前駆体プラスミノーゲンは、活性化因子の作用によって活性型のプラスミンに変換され、血栓を形成するフィブリン及びフィブリノーゲンを小断片化し溶解する。プラスミノーゲン活性化因子としては、プラスミノーゲンアクチベーター（以下ｔＰＡと略記することがある。）、ウロキナーゼ（以下ＵＫと略記することがある。）、ストレプトキナーゼなどが知られており、これらはいずれも、血栓溶解剤として医療において用いられている。
【０００４】
しかし前記ｔＰＡ、ＵＫ等のプラスミノーゲン活性化因子は、高いプラスミノーゲン活性化能力をもつが、その一方で副作用も強い。そこで医薬品のような急性、且つ高い効果を求めるのではなく、食品から低レベルの有効成分を長期間にわたって摂取することによる保健効果が期待されている。中でも納豆はフィブリン分解活性を有し、食事による摂取によって血流改善効果を示すことが知られており、その有効成分も特定されている（例えば特許文献１を参照。）。
【０００５】
一方、乳酸菌は、炭水化物を分解して乳酸を生成することによってエネルギーを獲得する微生物のうち細菌に属するものの総称であり、代表的な属としてグラム陽性球菌であるLactococcus属、Streptococcus属、Pediococcus属、Leuconostoc属、及びグラム陽性桿菌であるLactobacillus属がある。この乳酸菌については、近年生体調節機能が大きく注目され、整腸作用、免疫調節作用、抗ストレス作用、抗酸化作用など、様々な機能性が明らかにされてきており、食品の差別化、需要の創出に貢献している（例えば特許文献２を参照。）。しかし従来乳酸菌において、プラスミノーゲンの活性化能や血流改善効果に関する知見は報告されていない。
【０００６】
【特許文献１】特開平３−１６８０８２号公報
【特許文献２】特開平８−２６８８９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
フィブリノーゲンを限定分解して、血栓形成もしくは血栓再閉塞を阻害する、新たなプラスミノーゲン活性化剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、乳酸菌がプラスミノーゲンを活性化させる作用を見出して、本発明をするに至った。即ち本発明は以下の通りである。
＜１＞ 本発明は、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactococcus lactis ssp. lactis）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス・バイオバー・ジアセチラクチス（Lactococcus lactis ssp. lactis bv. diacetylactis）、及びラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）のいずれか一種以上の乳酸菌の菌体から、ｐＨ１０〜ｐＨ１２の緩衝液により抽出されたプラスミノーゲン活性化剤である。
＜２＞ 更に本発明は、前記菌体が８０℃〜１５０℃の温度で５分〜４０分加熱処理して用いられるプラスミノーゲン活性化剤である。
＜３＞更に本発明は、前記プラスミノーゲン活性化剤を用いた食品、及び飼料又はペットフードである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、乳酸菌の菌体を有効成分とする新たなプラスミノーゲン活性化剤を提供する。本発明のプラスミノーゲン活性化剤である乳酸菌は、幅広い範囲の熱及びｐＨに安定であり、また乳酸菌は食品であることから、食事から日常的に摂取することにより、血流改善等の保健効果を期待することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のプラスミノーゲン活性化剤に用いられる乳酸菌としては、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス（Lactococcus lactis ssp. lactis、なお以下において菌種名の記載はラテン表記のみとし、他の菌種も同様とする。）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・ラクチス・バイオバー・ジアセチラクチス（Lactococcus lactis ssp. lactis bv. diacetylactis）、ラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシーズ・クレモリス（Lactococcus lactis ssp. cremoris）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）のいずれか一種以上を用いることができる。
【００１１】
前記の乳酸菌の中でも、Lactococcus lactis ssp. lactis、Lactococcus lactis ssp. lactis bv. diacetylactis、及びLactobacillus bulgaricusがより好ましく、特にLactococcuslactis ssp. lactisとLactococcuslactis ssp. lactis bv. diacetylactisが好ましい。
【００１２】
前記Lactococcus lactis ssp. lactisにおいては特にATTCC 19435株が、またLactococcuslactis ssp. lactis bv. diacetylactisにおいては特に C 59株が好ましい。なお前記C 59株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−５３６として寄託されている。
【００１３】
本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、培養後１２時間後から用いることが好ましく、培養後２０時間後から用いることが更に好ましい。  
【００１４】
本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、−３０℃の温度に反復凍結処理した後も、高温で一定時間加熱処理をした後も活性を失わず、広範囲の温度に対し安定である。したがって本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、加熱食品としても好適に用いることができる。
【００１５】
また本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、室温において用いるよりも、８０℃〜１５０℃の温度で、５分〜４０分、より好ましくは１００℃〜１３０℃の温度で、１０分〜２０分、加熱処理することが、活性が高まり好ましい。
【００１６】
また本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、ｐＨ３〜ｐＨ９という広い範囲で安定である。したがって本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、前記加温調理のみならず、酸を用いる調理等にも用いることができ、日常の広範囲の調理によって本発明のプラスミノーゲン活性化剤を摂取することができる。  
【００１７】
本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、前記菌体から、ｐＨ７〜ｐＨ１４、より好ましくはｐＨ１０〜ｐＨ１２の抽出液を用いることにより、プラスミノーゲン活性化成分を含む抽出液として使用することもできる。
【００１８】
さらに本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、ヒト型だけでなく他の動物種のプラスミノーゲンにも効果を発揮するため、飼料、ペットフードとしても有効に用いることができる。
【実施例】
【００１９】
＜実施例１  スクリーニング＞
（供試株及び培養）
実施例１に供試した菌株は、Lactococcus lactis ssp. lactisに属する菌株３種、Lactococcus lactis ssp. lactis bv. diacetylactisに属する菌株３種、Lactococcus lactisssp. cremorisに属する菌株１種、Lactobacillus bulgaricusに属する菌株２種、Lactobacillus coryniformisに属する菌株１種、Lactobacillus paraplantarumに属する菌株１種、Lactobacillus plantarumに属する菌株１種、Leuconostoc mesenteroidesに属する菌株１種、Pediococcus acidilacticiに属する菌株１種、及びStreptococcus thermophilusに属する菌株１種の合計１５株を用いた。試験に供試した乳酸菌株、及びその入手先を表１に示したが、表1の寄託機関欄の、1)はAmerican Type Culture Collection.（ＡＴＣＣ）を、2)は 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（ＦＥＲＭ）を、3)は農業生物資源ジーンバンク (ＭＡＦＦ)を、4)は独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＩＴＥ ）をそれぞれ示す。
【００２０】
供試菌株のうち、Ｃ25株、C59株、Ｃ75株、D55株、H80株は、いずれも独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに、Ｃ25株：受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−５３９、C59株：受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−５３６、Ｃ75株：受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−５３８、D55株：受領番号ＮＩＴＥ ＡＰ−５４０、H80株：受領番号ＮＩＴＥ  ＡＰ−５３７として、それぞれ寄託されている。
【００２１】
【表１】
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【００２２】
Lactoccocus属菌の培養には、M17培地 （トリプトン０．５％、ソイトン０．５％、肉消化物０．５％、酵母消化物０．２５％、アスコルビン酸０．０５％、硫酸マグネシウム０．０２５％、β−グリセロリン酸二ナトリウム１．９％、乳糖０．５％(Difco社製)）の乳糖を、ブドウ糖０．５％に置換した培地（以下GM17培地と表記する）を用い、それ以外の菌種の培養にはLactobacilliMRS培地（プロテオースペプトン１％、牛肉エキス１％、酵母エキス０．５％、ブドウ糖２％、Tween 80 ０．１％、クエン酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸二カリウム０．２％(Difco社製、以下MRS培地と表記する)）を用いた。
【００２３】
培養にあたっては、本培養の前に、各供試菌株について前培養を１回行い、菌を活性化した。該前培養は、オートクレーブ滅菌した新鮮な前記各培地５ｍｌに、保存菌を植金耳で接種し、３０℃で一晩培養して行った。
【００２４】
（プラスミノーゲン活性化能の測定）
前記により前培養を行った各供試菌株について、培養液５０ｕｌを滅菌した新鮮な前記各培地５ｍｌに接種し、３０℃で１４時間静置培養した。該培養液を日立ＣＲ２０型高速冷却遠心機（ローター形式  ＲＰＲＳ３−３）を用いて遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した。遠心上清（培養上清）を吸引して取り除き、沈殿している菌体を０．８５％塩化ナトリウム溶液１ｍｌに懸濁後、同様に遠心分離（３０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した。遠心上清（菌体洗浄液）を吸引して取り除き、沈殿している各供試菌株の菌体を回収した。
【００２５】
前記により得られた各菌体を、６００ｎｍの吸光度が０．２５（ＯＤ６００＝０．２５）になるように、緩衝液0.1M Tris-Cl pH7.4中に懸濁し、菌体懸濁液を得た。該菌体懸濁液５０ｕｌに、酵素基質液（0.1M Tris-ClpH7.4、75ug/ml ヒトプラスミノーゲン（Sigma社製 、plasminogen from human plasma）、0.15mMプラスミン基質(Sigma社製、
N-Tosylglycyl-L-prolyl-L-lysine 4-nitroanilide acetate salt)）１００ｕｌを加え、３０℃で１８時間静置した後、トミーＭＲＸ−１５２型微量冷却遠心機（ローター形式  ＴＭＳ−４）を用いて遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清の４０５ｎｍの吸光度を、ベックマンＤＵ６４０型分光光度計を用いて測定した。
【００２６】
前記各菌体懸濁液５０ｕｌに、盲検としてプラスミノーゲンを含まない酵素基質液（0.1M Tris-Cl pH7.4、0.15mM プラスミン基質(Sigma社製、
N-Tosylglycyl-L-prolyl-L-lysine 4-nitroanilide acetate salt)）１００ｕｌを加え、前記と同様に静置した後、トミーＭＲＸ−１５２型微量冷却遠心機（ローター形式  ＴＭＳ−４）を用いて遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清の４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００２７】
前記菌体懸濁液にプラスミノーゲンを含む酵素基質液を加えた上清の４０５ｎｍの吸光度の測定値（以下反応液測定値ということがある。）から、前記菌体懸濁液にプラスミノーゲンを含まない酵素基質液を加えた上清の４０５ｎｍの吸光度の測定値（以下盲検測定値ということがある。）を差し引くことにより、両値の差ｄＡ４０５を算出した。
【００２８】
プラスミノーゲン活性の測定は、菌体懸濁液の代わりに組織プラスミノーゲンアクチベーター（生化学工業）の含量を、１００００ＩＵ／ｍｌ、２００００ ＩＵ／ｍｌ、５００００ ＩＵ／ｍｌ、１０００００ ＩＵ／ｍｌと替えた0.1M Tris-ClpH7.4の各50ulに、前記プラスミノーゲンを含む酵素基質液、及び前記プラスミノーゲンを含まない酵素基質液をそれぞれ１００ｕｌ加え、前記と同様に反応液測定値から盲検測定値を差し引くことによりｄＡ４０５を算出した。前記組織プラスミノーゲンアクチベーターの含量（以下プラスミノーゲン活性化能ということがある。）とｄＡ４０５の測定結果を表２に、また該測定結果より得られたプラスミノーゲン活性化能とｄＡ４０５値の検量線の一例を図１に示す。
【００２９】
【表２】
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【００３０】
前記図１により作成した活性量の検量線は、Ｙ軸を（ｄＡ４０５）、Ｘ軸を（プラスミノーゲン活性化能）とすると、下記数１に示された回帰式となる（Ｒ２＝ ０．９１２２）。したがって下記数２により、各菌体懸濁液（ＯＤ６００＝０．２５）のプラスミノーゲン活性化能（ＩＵ／ｍｌ）を求めた。
【００３１】
【数１】
0005488949.tif 000004
【００３２】
【数２】
0005488949.tif 000005
【００３３】
（結果）
前記により求めた各供試菌株の菌体懸濁液（OD600=0.25）１ｍｌ当たりのプラスミノーゲン活性化能を表３に示す。
【００３４】
【表３】
0005488949.tif 000006
【００３５】
表３から、供試した１５株すべてで、プラスミノーゲン活性化能を検出した。中でもLactococcus lactis subsp. lactis に属するATCC19435株、Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactisに属するC59株及びCVT8W株、Lactococcus lactis ssp. cremorisに属するATCC 19257株、Lactobacilluscoryniformisに属するH80株及びC75株が高い活性を示し、特にATCC 19435株及びC59株が極めて高い活性を示した。
【００３６】
＜実施例２  ウシ型プラスミノーゲンに対する作用＞
（方法）
実施例１においてプラスミノーゲン活性化能が強かったATCC 19435株及びC 59株について、ウシ型プラスミノーゲンに対する活性化能を観察した。菌体懸濁液の調製と活性化能測定は、実施例１に記載の方法と同様とし、ウシプラスミノーゲンに対する活性化能測定は、実施例１の酵素基質液のヒトプラスミノーゲンを、ウシプラスミノーゲン(Sigma社製、plasminogen from bovine plasma)に代えることによって行った。
【００３７】
（結果）
前記各菌体のｄＡ４０５値と数２に示す算式から、ウシ型プラスミノーゲン活性化能を算出した。該各菌株の菌体懸濁液（OD600=0.25）１ｍｌ当たりのヒト型及びウシ型プラスミノーゲンに対するプラスミノーゲン活性化能を表４に示す。
【００３８】
【表４】
0005488949.tif 000007
【００３９】
表４から、供試株はヒトプラスミノーゲンだけでなく、ウシプラスミノーゲンにも活性を有することが明らかになった。
【００４０】
＜実施例３  熱安定性＞
（方法）
Ｃ５９株について、実施例１の方法と同様にして得た菌体懸濁液（pH7.4、ＯＤ６００＝０．２５）を、次の５条件で処理した。（１）４℃で４時間静置、（２）室温で４時間静置、（３）−３０℃凍結後、室温融解を３回繰り返し、（４）沸騰水浴上で１０分間加熱、（５）オートクレーブ（１２１℃、１気圧加圧）で１５分間加熱。
【００４１】
（結果）
前記各処理した菌体懸濁液について、前記実施例１の方法と同様にして、プラスミノーゲン活性化能を測定、算出した。各処理について、菌体懸濁液（OD600=0.25）１ｍｌ当たりの残存するプラスミノーゲン活性化能、及び（１）の活性量を１００とした相対値を残存活性として表５に示す。
【００４２】
【表５】
0005488949.tif 000008
【００４３】
表５の結果から、（４）の100℃・10分の加熱処理、及び（５）の121℃・15分の加熱処理では、（１）の４℃・４時間静置に対して、それぞれ１７３％、１８１％と活性量は増加した。（２）の室温・４時間静置では活性低下はほとんど見られなかった。（３）の−３０℃凍結・融解処理によって、活性は約７０％に低下したが、活性は維持された。本活性は加温することにより、むしろ向上することが明らかになった。
【００４４】
＜実施例４  ｐＨ安定性＞
（方法）
Ｃ５９菌体について、前記実施例１と同様の方法により得た菌体について、緩衝液0.1M Tris-Cl pH7.4に替えて、pH3.0, pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH8.0, pH 9.0の各緩衝液を用いて、６００ｎｍの吸光度が５．０（ＯＤ６００＝５．０）になるように、各緩衝液中に懸濁した。前記緩衝液は、pH3.0ないしpH7.0については、McIlvaine緩衝液（リン酸−クエン酸緩衝液）を、pH7.0ないしpH 9.0については、0.1M Tris-Cl緩衝液を、それぞれ用いた。前記菌体懸濁液を、30℃で３時間加温処理後、0.1MTris-Cl pH7.4で２０倍に希釈し、その５０ulを用いて残存するプラスミノーゲン活性化能を測定した。
【００４５】
（結果）
各ｐＨで処理後菌体懸濁液（OD600=0.25）１ｍｌ当たりの残存するプラスミノーゲン活性化能、及びプラスミノーゲン活性化能が最も高い値を示したｐＨ４．０の値を１００とした相対値を括弧書きとして表６に示す。
【００４６】
【表６】
0005488949.tif 000009
【００４７】
表６の結果から、ｐＨ３．０−ｐＨ９．０の間でプラスミノーゲン活性化能の低下は認められず、広範囲のｐＨで安定であることが明らかになった。
【００４８】
＜実施例５  培養時間＞
（方法）
Ｃ５９菌株について、前記実施例１と同様の方法により前培養をした前培養液５０ｕｌを、滅菌した新鮮なGM17培地５ｍｌに接種し、３０℃で培養した。接種後３時間から２７時間後まで３時間ごとに培養液を採取し、該採取した培養液について、実施例１の方法で菌体懸濁液（ＯＤ６００＝０．２５）を作製し、菌体のプラスミノーゲン活性化能を測定した。また、培養上清、及び菌体洗浄液のプラスミノーゲン活性化能についても測定した。培養上清、及び菌体洗浄液は0.1M Tris-Cl pH7.4にて３０倍に希釈し、その希釈液５０ｕｌに前記酵素基質液１００ｕｌを加え、菌体懸濁液と同様の方法でプラスミノーゲン活性化能を測定した。
【００４９】
前記処理後菌体懸濁液（OD600=0.25）１ｍｌ当たりの残存するプラスミノーゲン活性化能、及び培養上清と菌体洗浄液の１ｍｌあたりのプラスミノーゲン活性化能（ＩＵ／ｍｌ）を、表７及び図２に示した。
【００５０】
【表７】
0005488949.tif 000010
【００５１】
（結果）
表７及び図２から、菌の生育は、接種後６時間でプラトーに達した。菌体量あたりのプラスミノーゲン活性化能は、15時間後から増加し、21時間後にプラトーに達した。培養上清及び菌体洗浄液には活性はほとんど認められず、本活性は菌体に結合している成分によると示唆された。
【００５２】
＜実施例６  無細胞抽出液の調製  抽出液のｐＨ＞
（方法）
前記実施例５のＣ５９菌体について、２１時間培養液から実施例１に記載の方法で菌体を調製した。前記菌体について、抽出液としてMcIlvaine緩衝液（リン酸−クエン酸緩衝液）pH3.0, pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0、及び0.1MTris-Cl緩衝液pH7.0, pH 8.0、並びに0.1M 重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.0, pH 10.0, pH 11.0を、ＯＤ６００＝５．０となるようにそれぞれ加え、菌体懸濁液を調製した。
【００５３】
該菌体懸濁液は、４℃で１時間静置した後、トミーＭＲＸ−１５２型微量冷却遠心機（ローター形式  ＴＭＳ−４）を用いて遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して沈殿を除き、遠心上清（抽出液）を得た。
【００５４】
前記各ｐHの菌体懸濁液、及び抽出液各１０ｕｌを、0.1M Tris-Cl pH7.4 190ulにそれぞれ加えよく混和した後、菌体懸濁液（OD600=0.25）及び抽出液の各１ｍｌ当たりのプラスミノーゲン活性化能を測定した。該各プラスミノーゲン活性化能の測定値より、各ｐＨの菌体懸濁液から抽出液への抽出率を、下記数３により求めた。結果を表８に示す。
【００５５】
【数３】
0005488949.tif 000011
【００５６】
【表８】
0005488949.tif 000012
【００５７】
（結果）
表８の結果から、ｐＨ３−ｐＨ８の緩衝液で抽出した際にはプラスミノーゲン活性化能の緩衝液への移行は見られなかったのに対して、ｐＨ１０以上の緩衝液を用いた際には緩衝液へ活性が移行した。ｐＨ１０以上の緩衝液を用いることにより、無細胞抽出液のプラスミノーゲン活性化剤を作成することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明により、乳酸菌の菌体を有効成分とする新たなプラスミノーゲン活性化剤が提供される。本発明のプラスミノーゲン活性化剤である乳酸菌は、幅広い範囲の熱及びｐＨに安定であり、また乳酸菌は食品であることから、新たな機能を有する食品を提供することができ、血流改善等の保健効果が期待される。さらに本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、ヒトプラスミノーゲンのみならず、動物のプラスミノーゲンも活性化するために、飼料、ペットフード等としても利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】プラスミノーゲン活性化能とｄＡ４０５値の検量線
【図２】C59株培養時のプラスミノーゲン活性化能の継時変化
【図１】
0005488949.tif 000013
【図２】
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