(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドを検出する融合タンパク質であって、
前記リガンドに対するリガンド結合タンパク質と、
当該リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質と、
その親水性領域において２つに分割された発光酵素の、Ｃ末側断片とＮ末側断片とを当該リガンド結合タンパク質及び当該認識タンパク質の間に有し、
前記Ｃ末側断片のＣ末端基が、前記Ｎ末側断片のＮ末端基の上流に位置しており、
前記リガンド結合タンパク質及び前記認識タンパク質は、下記(i)〜(iii)のいずれかであり：
(i)前記リガンド結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、且つ、前記認識タンパク質はＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインである；
(ii)前記リガンド結合タンパク質がアンドロゲン受容体であり、且つ、前記認識タンパク質は共転写因子である；
(iii)前記リガンド結合タンパク質がカルモジュリンであり、且つ、前記認識タンパク質はミオシン軽鎖キナーゼ由来のＭ１３ペプチドである、
前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された前記発光酵素の断片が相補して発光量を変化させることを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
前記発光酵素の活性部位の少なくとも一部が、前記Ｃ末側断片のＮ末端、及び前記Ｎ末側断片のＣ末端にそれぞれ位置するように、前記発光酵素が分割されていることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記発光酵素は、ホタルルシフェリン、レニラルシフェリン又は脂質を基質とするものであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記発光酵素は、ホタルルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、及び鉄道虫ルシフェラーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記リガンド結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、前記認識タンパク質がＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインであり、前記発光酵素がクリックビートルルシフェラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リガンド結合タンパク質がアンドロゲン受容体であり、前記認識タンパク質が共転写因子であり、前記発光酵素がホタルルシフェラーゼであることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列からなる、融合タンパク質；あるいは
配列番号１又は２に示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる、融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号４又は５に示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
配列番号４又は５に示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；
配列番号４又は５に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；あるいは
配列番号４又は５に示される塩基配列と少なくとも９０％同一であり、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする非ヒト形質転換体。
【請求項１２】
請求項１０に記載のベクターを含んでいることを特徴とする非ヒト形質転換体。
【請求項１３】
被験試料中のリガンドを検出する方法であって、
前記被験試料と、請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれかに記載の融合タンパク質を備えることを特徴とする被験試料中のリガンドを検出するためのキット。
【請求項１５】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴とするプローブの生産方法。
【請求項１６】
請求項８又は９に記載のポリヌクレオチドを備えていることを特徴とするプローブの生産キット。
【請求項１７】
請求項１０に記載のベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴とするプローブの生産方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載のベクターを備えていることを特徴とするプローブの生産キット。
【請求項１９】
リガンドを検出する融合タンパク質からなるプローブを生産する生産方法であって、
発光酵素の親水性領域における隣接する２アミノ酸残基の間を中心とするＣ末側断片およびＮ末側断片を、それぞれが独立して１つずつコードしている２つのポリヌクレオチドを作製する工程と、
前記リガンドに対するリガンド結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、当該リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質をコードするポリヌクレオチドとの間に、前記Ｃ末側断片をコードするポリヌクレオチドと前記Ｎ末側断片をコードするポリヌクレオチドとを連結して、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得る連結工程と、
前記連結工程で得られた、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、生細胞内外または非ヒト形質転換体において発現させる発現工程とを包含し、
前記融合タンパク質において前記Ｃ末側断片のＣ末端基と、前記Ｎ末側断片のＮ末端基とが連結されるように、前記連結工程において、前記Ｃ末側断片をコードするポリヌクレオチドと前記Ｎ末側断片をコードするポリヌクレオチドとを連結し、
前記リガンド結合タンパク質及び前記認識タンパク質は、下記(i)〜(iii)のいずれかであることを特徴とするプローブの生産方法：
(i)前記リガンド結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、且つ、前記認識タンパク質はＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインである；
(ii)前記リガンド結合タンパク質がアンドロゲン受容体であり、且つ、前記認識タンパク質は共転写因子である；又は
(iii)前記リガンド結合タンパク質がカルモジュリンであり、且つ、前記認識タンパク質はミオシン軽鎖キナーゼ由来のＭ１３ペプチドである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験試料中のリガンドを検出する融合タンパク質及びその利用に関し、より具体的には、被験試料中の標的タンパク質特異的リガンドを検出する一分子型プローブとして用いられる融合タンパク質及びその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
分子イメージング技術における革命的な進歩は、研究者が定量的に生細胞における分子の挙動及び細胞情報伝達を試験することが可能となったことである（非特許文献１）。非特許文献２に記載されているように、タンパク質を用いるイメージング技術の１つとして、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を円順列変異（ＣＰ：Circular Permutation）させたプローブを用いた技術が挙げられる。ＧＦＰのＣＰとは、ＧＦＰのアミノ酸鎖を途中で切断し、Ｎ末側とＣ末側とをひっくり返して連結させる変異をいう。
【０００３】
ＧＦＰの立体構造は一体構造の対称な円筒形状であり、その内部は疎水性のアミノ酸が格子状に連なって形成されている。ＧＦＰを用いた円順列変異プローブの原理は、ＧＦＰの一部に生じさせた亀裂部分から内部の発色団部位に水分子を導入することによってまず蛍光量を低減させ、あるリガンド認識タンパク質に特異的なリガンドが結合したときに亀裂が閉じることによって、水分子が排出され、蛍光量を増加させるものである。このように、細胞内に導入されたＧＦＰからの蛍光量を観察することによって、細胞内の分子の挙動を可視化している。
【０００４】
蛍光タンパク質において、本来のＮ末端とＣ末端との距離がかなり近い場合のみ、円順列変異させて種々のタンパク質の挿入に耐え得ることが、従前より広く研究されている（非特許文献１３）。ＧＦＰは、一体構造の対象な円筒形状を有すること、及び構成するタンパク質ストランドが複雑に絡み合っていることから、その変異に熟練した技術が必要となり、容易に変異することができない。
【０００５】
また、一般に、蛍光タンパク質は、自己蛍光によってバックグラウンド蛍光量が非常に高くなるという問題もある。さらに、蛍光タンパク質を用いた場合、外部光源が必要となることや、蛍光を測定するために比較的巨大な蛍光顕微鏡が必要となるという問題がある。例えば非特許文献２〜４に記載のＹｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｌｅｏｎｓを用いた場合、自己蛍光がバックグラウンド蛍光量を必然的に高め、シグナルとノイズとのコントラストを低下させる原因となっている。加えて、分析できる細胞数が制限されることにより、得られる結果は定量的というよりもむしろ、定性的となってしまう（非特許文献５）。
【０００６】
このような蛍光タンパク質に生じる問題を補うために、例えば、全細胞調査が可能であり、バックグラウンド発光量が低く、さらに外部光源が不要な、新規なプロービングシステムとして設計された発光体が使用されている（非特許文献５〜９）。
【０００７】
また、本発明者らは以前に、リガンドの男性ホルモン活性をイメージングするための一分子型発光プローブを提案している（非特許文献１０及び１１）。この一分子型発光プローブの基本的な概念は、信号を認識する要素及び光を発する要素の全てが一つの分子内に集積された発光型融合タンパク質を設計することであった。非特許文献１０及び１１に記載の一分子型発光プローブにおいては、２分割した発光酵素のＮ末端側断片とＣ末端側断片との間に、標的リガンド認識タンパク質と、当該標的リガンド認識タンパク質とその相互作用タンパク質とが一分子内に連結されている。そして、標的リガンド認識タンパク質にリガンドが結合することによって、発光プローブに構造変化が引き起こされ、発光酵素の活性（発光能を有する）が回復又は解消する。この発光量を観察することによって、細胞内におけるリガンド認識分子の挙動を可視化している。
【非特許文献１】Weissleder, R.; Ntziachristos, V. Nat. Med. 2003, 9, 123-128.
【非特許文献２】Souslova, E. A.; Chudakov, D. M. Biochemistry-Moscow 2007, 72, 683-697.
【非特許文献３】Truong, K.; Sawano, A.; Mizuno, H.; Hama, H.; Tong, K. I.; Mal, T. K.; Miyawaki, A.; Ikura, M. Nat. Struc. Biol. 2001, 8, 1069-1073.
【非特許文献４】Miyawaki, A.; Llopis, J.; Heim, R.; McCaffery, J. M.; Adams, J. A.; Ikura, M.; Tsien, R. Y. Nature 1997, 388, 882-887.
【非特許文献５】Kim, S. B.; Ozawa, T.; Watanabe, S.; Umezawa, Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 11542-11547.
【非特許文献６】Paulmurugan, R.; Gambhir, S. S. Anal. Chem. 2005, 77, 1295-1302.
【非特許文献７】Paulmurugan, R.; Gambhir, S. S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2006, 103, 15883-15888.
【非特許文献８】Remy, I.; Michnick, S. W. Nat. Meth. 2006, 3, 977-979.
【非特許文献９】Kim, S. B.; Kanno, A.; Ozawa, T.; Tao, H.; Umezawa, Y. ACS Chem. Biol. 2007, 2, 484-492.
【非特許文献１０】Kim, S. B.; Awais, M.; Sato, M.; Umezawa, Y.; Tao, H. Anal. Chem. 2007, 79, 1874-1880.
【非特許文献１１】Kim, S. B.; Otani, Y.; Umezawa, Y.; Tao, H. Anal. Chem. 2007, 79, 4820-4826.
【非特許文献１２】Kotlikoff, M. I. J. Physiol. 2007, 578, 55-67.
【非特許文献１３】Baird, G. S.; Zacharias, D. A.; Tsien, R. Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96, 11241-11246.
【非特許文献１４】Conti, E.; Franks, N. P.; Brick, P. Structure 1996, 4, 287-298.
【非特許文献１５】Viviani, V. R.; Uchida, A.; Viviani, W.; Ohmiya, Y. Photochem. Photobiol. 2002, 76, 538-544.
【非特許文献１６】Kawai, Y.; Sato, M.; Umezawa, Y. Anal. Chem. 2004, 76, 6144-6149.
【非特許文献１７】Kaihara, A.; Kawai, Y.; Sato, M.; Ozawa, T.; Umezawa, Y. Anal. Chem. 2003, 75, 4176-4181.
【非特許文献１８】Varricchio, L.; Migliaccio, A.; Castoria, G.; Yamaguchi, H.; de Falco, A.; Di Domenico, M.; Giovannelli, P.; Farrar, W.; Appella, E.; Auricchio, F. Mol. Cancer Res. 2007, 5, 1213-1221.
【非特許文献１９】Rich, R. L.; Hoth, L. R.; Geoghegan, K. F.; Brown, T. A.; LeMotte, P. K.; Simons, S. P.; Hensley, P.; Myszka, D. G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002, 99, 8562-8567.
【非特許文献２０】Zhong, L.; Skafar, D. F. Biochemistry 2002, 41, 4209-4217.
【非特許文献２１】Tyagi, R. K.; Lavrovsky, Y.; Ahn, S. C.; Song, C. S.; Chatterjee, B.; Roy, A. K. Mol. Endocrinol. 2000, 14, 1162-1174.
【非特許文献２２】Maruvada, P.; Baumann, C. T.; Hager, G. L.; Yen, P. M. J. Biol. Chem. 2003, 278, 12425-12432.
【非特許文献２３】Awais, M.; Sato, M.; Lee, X. F.; Umezawa, Y. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2707-2712.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上述した蛍光タンパク質に代わる発光プローブにおいても、検出するリガンドの種類によっては、十分な検出精度が得られず、新たなプローブの開発が求められていた。
【０００９】
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、より高精度にリガンドを検出し得る新規のプローブを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、酵素を２分割して円順列変異することによって、高精度にリガンドを検出し得るプローブが得られることを見出した。特に、酵素を２分割して円順列変異し、変異した酵素を含む一分子型プローブでは、バックグラウンド酵素活性を非常に低く抑えることができることを見出した。
【００１１】
この一分子型プローブを構築する上での第１の技術的難点は、（ｉ）２分割後酵素活性が失活し、信号ありの条件のみに都合よくその酵素活性を回復させることを補償し、（ｉｉ）変異後に哺乳動物細胞に発現された後分解されず、機能し得、かつ（ｉｉｉ）シグナル検出用タンパク質の挿入に耐え得るような、酵素の適切な切断部位を検出することであった。第２の技術的難点は、（ｉ）ホストプローブの全体的な構造のバランスを破壊せず、（ｉｉ）リガンド感受性が高く、又はリガンドに対する反応に応じて他のタンパク質を引き寄せることが可能な、最適な挿入タンパク質を決定することであった。第３の技術的難点は、（ｉ）構成タンパク質間の立体障害を最小限に抑え、（ｉｉ）ノイズに対するシグナルの比率を最大限に向上させるように、プローブの各構成要素のサイズ及び位置を最適化することであった。
【００１２】
そこで本発明者らは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ：firefly luciferase）、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ：Gaussia luciferase）、クリックビートルルシフェラーゼ（ＣＢＬｕｃ：click beetle luciferase）由来の発光酵素において、円順列変異した発光酵素を有する発光プローブの可能性を調査した。
【００１３】
まず、本発明者らは、ＣＢＬｕｃを円順列変異して発光プローブを構築した。ＣＢＬｕｃの本来のＮ末端及びＣ末端をＧＳリンカーで繋ぎ、ＣＢＬｕｃのＩ４３９とＫ４４０との間に新しいＮ末端及びＣ末端を作ることによって行った。そして円順列変異したＣＢＬｕｃの新しい端部に、ＥＲリガンド結合ドメイン（ＥＲ  ＬＢＤ）及びＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメイン（Ｓｒｃ  ＳＨ２）を繋げ、新規の発光プローブを構築した。この発光プローブは、乳癌抗がん剤の４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）を高感度に認識し、かつ特徴的な生物発光を発した。
【００１４】
また、本発明者らは、もっとも小さい発光タンパク質として知られているＧＬｕｃにおいて、円順列変異に最適な断片化切断部位を同定した。本来のＮ末端及びＣ末端をＧＳリンカーで繋ぎ、ＧＬｕｃのＧｌｎ１０５とＧｌｙ１０６との間に新たにＮ末端及びＣ末端を作る。新しいＮ末端及びＣ末端はそれぞれ、ミオシン軽鎖キナーゼ（Ｍ１３）のカルモジュリン結合ペプチド及びカルモジュリンに繋いだ。この融合タンパク質は、驚くべきことに、哺乳動物細胞において安定的に発現し、Ｍ１３及びＣａＭの挿入に耐え得た。ＣａＭは、内因性のカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を感知し、他端にＭ１３を呼び込む。この結合は、ＧＬｕｃのＮ末側断片とＣ末側断片との間の接近を促し、結果的に酵素活性の回復をもたらす。
【００１５】
さらに発光酵素の最適な切断部位を検討するために、すでに結晶構造が解明されているアシルＡ補酵素ファミリーに属するＦＬｕｃの分子構造をもとにクリックビートルルシフェラーゼの最適な切断部位を検討した。なお、ｃＢＬｕｃ及びＧＬｕｃの結晶構造は未だ知られていない。ＦＬｕｃの構造上の特徴は、（ｉ）２つのメインドメインからなり、（ｉｉ）ドメイン間の連結部位近傍に活性部位があると推定されることである（非特許文献１４及び１５）。この２つのドメインは、親水性のアミノ酸により架橋されている。多くの発光酵素の２次元疎水性検索から、２つの特徴的なドメインを含む場合には、その架橋部分に最適切断位置があると推定され、実際にこの推定に基づけば、適切な切断部位の決定が容易であることが見出された。
【００１６】
上述した本発明者らによる検討により、円順列変異したＧＬｕｃ（ｃｐＧＬｕｃ）を含む発光プローブは、代表的なセカンドメッセンジャーであるＣａ２＋のリアルタイムダイナミックスにより、円順列変異したＦＬｕｃ（ｃｐＦＬｕｃ）を含む発光プローブは、ステロイドホルモン受容体とその特異的なタンパク質間相互作用により、及び円順列変異したＣＢＬｕｃ（ｃｐＣＢＬｕｃ）を含む発光プローブは、エストロゲンレセプター（ＥＲ）のリン酸化により発光し可視化することができた。特に、ｃｐＣＢＬｕｃを含む発光プローブ及びｃｐＧＬｕｃを含む発光プローブにおいては、バックグラウンドがそれぞれおよそ１／１０００、１／１００まで減少し、その結果、バックグラウンド光に対するシグナル光の比率が非常に高くなることを見出した。Ｃａ２＋は典型的なセカンドメッセンジャーであり、エストロゲンは主要なステロイドホルモンであることに注目すべきである。それゆえに、ＧＬｕｃ及びＣＢＬｕｃを用いた例は、哺乳動物生細胞におけるタンパク質−タンパク質間相互作用の可視化に関する一般的な適用範囲を実証したと言える。
【００１７】
本発明者らが見出した発光酵素の円順列変異を利用した発光プローブの発光メカニズムは、円順列変異したＧＦＰ（ｃｐＧＦＰ）の発光メカニズムとは概念的に異なっている。すなわち、ｃｐＧＦＰを有する蛍光プローブのオン／オフシステムは、蛍光発色団を取り囲むβシートの亀裂に依存していると考えられる。一方、発光酵素を有する発光プローブにおける発光の回復は、ｃｐＧＦＰのような疎水性の変化ではなく、完全に分離した発光酵素断片間の物理的な接近及び解離により提供される。円順列変異したＧＦＰを利用した発光プローブは、これまでに報告されているが、本発明者らのように発光酵素を円順列変異して発光プローブとして利用する例は報告されていない。
【００１８】
また、発光酵素とＧＦＰとは分子構造及び発光成分が全く異なっているので、本発明者らにより構築された発光プローブと、従来のＧＦＰを用いたプローブとは、リガンドと代表される検出物質とに対する反応メカニズムが全く異なるものとして説明されるべきである。従来の円順列変異したＧＦＰを用いたプローブにおいては、βシート架橋部を切断しタンパク質を挿入して一時的にＧＦＰの構造に亀裂を生じさせ、この亀裂からＧＦＰタンパク質の中心部内に溶剤を注入することによって、蛍光活性部位とβシートとの相互作用を阻害する（非特許文献１２）。この阻害作用は、挿入されたタンパク質間の結合によって水分子が排出されて緩和される（非特許文献１３及び１６）。しかしながら、本発明者らが構築した発光プローブの発光酵素においては、その活性部位がＧＦＰ変異体とは異なる酵素であるため、親水性アミノ酸からなる酵素活性部位を持つ。本発明者らにより構築された発光プローブは、この分子メカニズムにおける本質的な相違により、シグナル光とバックグラウンド光との比率を向上させたと考えられる。本発明者らにより見出された新規プローブは、従来の発光プローブとは概念的に明確に区別され得る新規のプローブである。
【００１９】
以上のように、本発明は、上記課題を解決するために、リガンドを検出する融合タンパク質であって、前記リガンドに対するリガンド結合タンパク質と、当該リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質と、当該リガンド結合タンパク質及び当該認識タンパク質の間に、２つに分割された酵素の、Ｃ末側断片とＮ末側断片とを有し、前記Ｃ末側断片のＣ末端基が、前記Ｎ末側断片のＮ末端基の上流に位置しており、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された前記酵素断片が相補して酵素活性を変化させることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係る融合タンパク質において、前記酵素の活性部位の少なくとも一部が、前記Ｃ末側断片のＮ末端、及び前記Ｎ末側断片のＣ末端にそれぞれ位置するように、前記酵素が分割されていることが好ましい。
【００２１】
本発明に係る融合タンパク質の各要素の順番は、認識タンパク質の下流に酵素のＣ末側断片が位置し、Ｃ末側断片の下流にＮ末側断片が位置し、Ｎ末側断片の下流にリガンド結合タンパク質が位置していることが好ましい。また、認識タンパク質とリガンド結合タンパク質との位置が入れ替わってもよい。
【００２２】
本発明に係る融合タンパク質において、リガンド結合タンパク質は、核内受容体、サイトカイン受容体、タンパク質キナーゼ、セカンドメッセンジャー認識タンパク質、転写因子からなる群より選択されることが好ましい。
【００２３】
本発明に係る融合タンパク質において、前記酵素は発光酵素であることが好ましく、当該発光酵素は、ホタルルシフェリン、レニラルシフェリン又は脂質を基質とするものであることがより好ましく、ホタルルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、クリックビートルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、鉄道虫ルシフェラーゼからなる群より選択されることがさらに好ましい。
【００２４】
本発明に係る融合タンパク質は、リガンド結合タンパク質がエストロゲン受容体のリガンド結合ドメインであり、認識タンパク質がＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインであり、発光酵素がクリックビートルルシフェラーゼであることが好ましい。
【００２５】
本発明に係る融合タンパク質は、リガンド結合タンパク質がアンドロゲン受容体であり、認識タンパク質が共転写因子又はその部分断片であり、発光酵素がホタルルシフェラーゼであることが好ましい。
【００２６】
本発明に係る融合タンパク質は、リガンド結合タンパク質がカルモジュリンであり、認識タンパク質がミオシン軽鎖キナーゼ由来のＭ１３ペプチドであり、発光酵素がガウシアルシフェラーゼであることが好ましい。
【００２７】
本発明に係る融合タンパク質は、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質；あるいは配列番号１〜３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された前記発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質であることが好ましい。
【００２８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記本発明に係る融合タンパク質をコードすることを特徴としている。
【００２９】
本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなる、ポリヌクレオチド；あるいは配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一であり、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴としている。
【００３０】
本発明に係るベクターは、上記本発明に係るポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。また、本発明に係る形質転換体は、上記本発明に係るポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。さらに、本発明に係る形質転換体は、上記本発明に係るベクターを含んでいることを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る方法は、被験試料中のリガンドを検出する方法であって、前記被験試料と、上記本発明に係る融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴としている。また、本発明に係るキットは、上記本発明に係る融合タンパク質を備えることを特徴としている。
【００３２】
本発明に係るプローブの生産方法は、上記本発明に係るポリヌクレオチドを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴としている。また、本発明に係るプローブの生産キットは、上記本発明に係るポリヌクレオチドを備えていることを特徴としている。
【００３３】
本発明に係るプローブの生産方法は、上記本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴としている。本発明に係るプローブの生産キットは、上記本発明に係るベクターを備えていることを特徴としている。
【００３４】
本発明に係るプローブの生産方法は、リガンドを検出する融合タンパク質を生産する生産方法であって、酵素を２つに分割し、Ｃ末側断片とＮ末側断片とを作製する工程と、前記リガンドに対するリガンド結合タンパク質と、当該リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質との間に、Ｃ末側断片とＮ末側断片とを連結する工程とを包含し、前記連結工程において、前記Ｃ末側断片のＣ末端基と、前記Ｎ末側断片のＮ末端基とを連結することを特徴としている。
【発明の効果】
【００３５】
本発明によれば、新規の一分子型プローブとして用いられる融合タンパク質を提供することができる。本発明に係る融合タンパク質によれば、バックグラウンド酵素活性を低く抑え、バックグラウンド光に対するシグナル光の比率を格段に向上させることが可能であるため、種々のタンパク質間相互作用の可視化検出をより高精度に行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
〔１．融合タンパク質及びポリヌクレオチド〕
本発明に係る融合タンパク質は、一分子型プローブとして用いられ、リガンドを検出する融合タンパク質であって、前記リガンドに対するリガンド結合タンパク質と、当該リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識する認識タンパク質との間に、２つに分割された酵素の、Ｃ末側断片とＮ末側断片とを有し、前記Ｃ末側断片のＣ末端基が、前記Ｎ末側断片のＮ末端基の上流に位置しており、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された前記酵素断片が相補して酵素活性を変化させる融合タンパク質である。
【００３７】
本明細書において、「プローブ」は、「生物発光プローブ」又は「発光プローブ」であってもよく、標的特異的リガンドによって引き起こされる様々な分子現象を、生きた細胞又は生体において、可視化イメージングすることが可能なプローブである。また、「一分子型プローブ」は、上述した可視化イメージングするために用いられる全構成要素を単一融合分子内に集積したことを特徴とするプローブである。例えば、上述した（ｉ）リガンド結合タンパク質、（ｉｉ）認識タンパク質、（ｉｉｉ）酵素のＣ末側断片、及び（ｉｖ）酵素のＮ末側断片を、基本構成要素として含む融合タンパク質が含まれ得る。以下、本発明に係る融合タンパク質を、その機能的側面から、プローブと称することもある。
【００３８】
ここで、「リガンド結合タンパク質」は、そのリガンド結合部位にリガンドが結合するタンパク質が意図される。リガンド結合タンパク質は、例えば、リガンドが結合することによって立体構造が変化し、後述する認識タンパク質の分子認識ドメインと結合することができるタンパク質であり得る。このようなリガンド結合タンパク質としては、例えば、ホルモン、化学物質又は信号伝達タンパク質をリガンドとする核内受容体（ＮＲ）、サイトカイン受容体、あるいは各種タンパク質キナーゼが用いられる。リガンド結合タンパク質は、対象とするリガンドによって適宜選択される。リガンド結合タンパク質に結合するリガンドとしては、リガンド結合タンパク質に結合するものであれば特に限定されず、細胞外から細胞内に取り込まれる細胞外リガンドであってもよく、細胞外からの刺激により細胞内で産生される細胞内リガンドであってもよい。例えば、受容体タンパク質（例えば核内受容体、Ｇタンパク質結合型受容体等）に対するアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。また、細胞内の情報伝達に関与するタンパク質に特異的に結合するサイトカイン、ケモカイン、インシュリン等の信号伝達タンパク質、細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー、リン酸化アミノ酸残基、Ｇタンパク質結合型受容体リガンド等であり得る。
【００３９】
例えば、リガンドとして細胞内セカンドメッセンジャー、脂質セカンドメッセンジャー等を対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、各セカンドメッセンジャーの結合ドメインを使用することができる。セカンドメッセンジャーとは、ホルモン、神経伝達物質等の細胞外情報伝達物質が細胞膜に存在する受容体と結合することによって、細胞内で新たに生成される別種の細胞内情報伝達物質を意図している。このセカンドメッセンジャーとして、例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＰＩＰ、ＰＩＰ２、ＰＩＰ３、イノシトール３リン酸（ＩＰ３：inositol triphosphate）、ＩＰ４、Ｃａ２＋、diacylglycerol、arachidonic achid等が挙げられる。例えば、セカンドメッセンジャーのＣａ２＋に対しては、リガンド結合タンパク質としてカルモジュリン（ＣａＭ）を用いることができる。
【００４０】
また、例えば、リガンドとして核内受容体に特異的なリガンドを対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、核内受容体の公知の結合ドメイン（ＬＢＤ：ligand binding domain）を使用することができる。さらに、リン酸化アミノ酸残基又はＧタンパク質結合型受容体リガンドを対象とする場合には、リガンド結合タンパク質として、それぞれリン酸化アミノ酸結合ドメイン又はＧタンパク質結合型受容体を使用することができる。核内受容体リガンド結合ドメインとしては、エストロゲンをリガンドとするエストロゲン受容体（ＥＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）のリガンド結合ドメインが好適に用いられる。
【００４１】
例えば、エストロゲン受容体のＬＢＤは、全長ヒトエストロゲン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/Ｐ０３３７２）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号３０５〜５５０）を、遺伝子工学的に又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、例えばアンドロゲン受容体のＬＢＤは、全長ヒトアンドロゲン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/ＡＦ１６２７０４）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号６７２〜９１０）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、例えばグルココルチコイド受容体のＬＢＤは、全長ヒトグルココルチコイド受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/１２０１２７７Ａ）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号５２７〜７７７）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。また、同様にプロゲステロン受容体のＬＢＤについても、全長ヒトプロゲステロン受容体の配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ/Ｐ０６４０１）に基づき、そのＬＢＤ領域（アミノ酸番号６７７−９３３）を、遺伝子工学的又はＰＣＲ合成によって調製したものを使用することができる。
【００４２】
本明細書において「認識タンパク質」は、上述したリガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識するタンパク質が意図され、例えば、リガンドの結合により立体構造が変化したリガンド結合タンパク質と、結合したりするタンパク質が包含される。
【００４３】
例えばリガンド結合タンパク質としてカルモジュリンを用いた場合、認識タンパク質として、ミオシン軽鎖キナーゼ（miosin light chain kinase）由来のペプチドであるＭ１３ペプチドが好適に用いられる。また、Ｍ１３以外にもカルモジュリンに対して結合できるタンパク質として、アデニリルシクラーゼ、カルモジュリンキナーゼＩＩのようなＣａＭ依存性タンパク質キナーゼ類を挙げることができる。このようなタンパク質の一部分をＭ１３の代わりに用いることができる。
【００４４】
また、例えばリガンド結合タンパク質として、アンドロゲン受容体、エストロゲン受容体等の核内受容体を用いた場合、認識タンパク質として共転写因子（coactivator）由来のＬＸＸＬＬモチーフ、ＦＱＮＬＦモチーフ、ＦＸＸＬＦモチーフ、ＷＸＸＬＦモチーフ等が用いられ得る。好ましくは、共転写因子の一種であるＲｉｐ１４０（ＧｅｎＢａｎｋ/ＮＰ００３４８０）、又はＳｒｃ−１ａ（steroid receptor coactivator 1 isoform 1 ;ＧｅｎＢａｎｋ/ＮＰ００３７３４）のＬＸＸＬＬモチーフ（約１５アミノ酸）が用いられる。
【００４５】
さらに、リン酸化アミノ酸残基を認識できるドメインである、各種キナーゼタンパク質のＳＨ２ドメインを、認識タンパク質として用いてもよい。例えば、発癌制御タンパク質であるＳｒｃ（proto-oncogene tyrosine-protein kinase Src ;ＧｅｎＢａｎｋ/ＮＰ９３８０３３）のリン酸化認識ドメイン（ＳＨ２ドメイン；アミノ酸番号１５０〜２４８）、細胞増殖、発癌等に関連する増殖因子レセプター結合タンパク質Ｇｒｂ２（growth factor receptor-binding protein2）のＳＨ２ドメイン等を用いることができる。また、リガンド結合タンパク質としてＧタンパク質結合型受容体を用いた場合、認識タンパク質としてＧタンパク質等を好適に用いることができる。
【００４６】
本明細書における「酵素」は、Ｎ末側とＣ末側とに２分割して完全な２つの断片とすることが可能であり、前記リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを前記認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された前記酵素断片が相補して酵素活性を変化させる酵素であり得る。このような酵素の代表的なものとして、発光酵素（ＬＥ：lighting enzyme）が挙げられる。分割した発光酵素のＮ末端側をＮ−ＬＥ、Ｃ末端側をＣ−ＬＥと称することもある。発光酵素としては、ホタルルシフェリン、レニラルシフェリン又は脂質を基質とするものであり、例えば、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ：firefly luciferase）、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ：Gaussia luciferase）、クリックビートルルシフェラーゼ（ＣＢＬｕｃ：click beetle luciferase）、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬｕｃ：Renilla luciferase）、鉄道虫ルシフェラーゼ等を好適に用いることができる。
【００４７】
本発明の円順列変異に適用可能な酵素類としては、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ類等がある。具体的には、以下の場合における応用が想定できる。２量体であるグルコースオキシダーゼの一単体を円順列変異することによって、一時非活性化させる。その後、外部信号が走った時のみに変異断片間の再合成により回復されたグルコース酸化活性を利用して、血糖値測定に応用できる。またラクターゼの最重要単体を円順列変異によって非活性化しておき、外部信号によるラクトースの加水分解を指標に、様々な生体試料分析系を組み立てることができる。他にトリプシンのようなエステラーゼの加水分解活性を利用した分析系を構成することができる。また、ＮＡＤのような酸化還元酵素の酵素活性を利用した、電気化学センサーを構築することができる。
【００４８】
これらの発光酵素は、アミノ酸配列や遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列が公知であり（例えば、ＦＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ/ＡＢ０６２７８６等、ＣＢＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ/ＡＹ２５８５９２．１等、ＧＬｕｃはＧｅｎＢａｎｋ/ＡＹ０１５９９３等）、これらの配列情報に基づいて公知の方法によりＤＮＡを取得することができる。
【００４９】
以下では、例として、本発明に係る融合タンパク質における酵素を発光酵素として説明し、本発明に係る融合タンパク質を発光プローブと称することもあるが、本発明はこれに限定されず、他の酵素であっても同様に説明され得る。
【００５０】
本発明は、一分子型発光プローブとして用いられるポリペプチドであって、ポリペプチドを構成する発光酵素は、円順列変異されていることを特徴としている。円順列変異とは、本来のポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）とカルボキシ末端（Ｃ末端）とを適当なリンカー配列で結び、配列上のどこかを切断することによって新たなＮ末端とＣ末端とを持たせた配列を作製する変異方法であり、２つに分割された発光酵素断片の本来のＣ末端側のアミノ酸配列の下流にＮ末端側アミノ酸配列が位置するように入れ替える変異方法である。本発明において円順列変異した発光酵素のＮ末側（Ｎ−ＬＥ）及びＣ末側（Ｃ−ＬＥ）は、それぞれ独立したポリペプチド断片として発光プローブの構成要素となる。ここで、図１に、発光酵素の立体構造の例として、ＦＬｕｃの結晶構造を示す。
【００５１】
ここで、「２つに分割された発光酵素」とは、単一タンパク質である発光酵素を２分割することで、一時的に酵素活性が非活性化された発光酵素を意図している。本発明においては発光酵素を円順列変異するため、分割して円順列変異した発光酵素の各断片の物理的位置が近接し、相補して発光活性を再度回復することができるように、好適に再構築される位置で発光酵素を分割する必要がある。ここで、「相補する」は、分割された発光酵素の各断片が自己相補することと同義である。
【００５２】
これらの発光酵素を２分割する位置は、公知の情報等を参考に適宜設定することが可能である。発光酵素を適当な分割位置で分割しその発光量の変化を検討することによって、当業者であれば最適な分割位置を容易に決定することができる。また、本発明者らは、アミノ酸配列における親水性領域が発光酵素を構成する２つのメインドメイン間領域であると予想できることを見出した。したがって、発光酵素のアミノ酸配列の親水性分布解析により得られる情報により、分割位置を予想してもよい。
【００５３】
発光酵素の分割位置としては、例えばＦＬｕｃの場合には、非特許文献６に開示されているように、そのアミノ酸配列の４３７/４３８位で切断してもよく、後述する実施例に示すように、４１５/４１６位で切断してもよい。また、ＣＢＬｕｃの場合には、４１２/４１３又は４３９/４４０位で切断し得ることが知られている。また、ＧＬｕｃの場合にも、公知の切断部位で切断可能であり、後述する実施例に示すように、１０６/１０７位で切断してもよい。また、分割した各断片のアミノ酸配列が一部重複又は欠失してもよい。
【００５４】
また、本発明において、発光酵素は、その発光活性部位の少なくとも一部が、Ｃ−ＬＥのＮ末端、及びＮ−ＬＥのＣ末端のそれぞれに位置するように、分割されることが好ましい。本発明に係る発光プローブにおいては、リガンドの結合によりリガンド結合タンパク質の立体構造が変化してリガンド結合タンパク質と認識タンパク質とが結合し、Ｃ−ＬＥとＮ−ＬＥとの物理的な位置が近接することによって、発光酵素の酵素活性が回復する。したがって、Ｃ−ＬＥ及びＮ−ＬＥにおいて、それぞれポリペプチドの端部側（リガンド結合タンパク質又は認識タンパク質に連結されている側）に、発光酵素の活性部位が位置することによって、より確実に発光活性を回復させることができる。
【００５５】
本発明に係る発光プローブを構成するこれらの各構成要素は、直鎖状の融合分子と成るように、各構成要素をそれぞれ直接に、又は最適なリンカーペプチドを介して連結される。リンカーペプチドを介して連結する場合、連結するリンカー配列の種類及び長さを変えることで、各構成要素間の距離を適宜調整することが可能であり、その結果、２分割した発光酵素断片の位置を調整することができる。
【００５６】
このようなリンカーペプチドとしては、本発明に係る発光プローブを一本鎖の融合タンパク質として発現するための連結ペプチドであることが好ましい。さらに、リガンド結合タンパク質へのリガンドの結合により、２分割した発光酵素の物理的な位置が近接し、自己相補するのを妨げることがないように、立体妨害の少ない柔軟性の高いアミノ酸（glycine(G)、alanine(A)等）を主成分とし、更に親水性を付与するためにＳｅｒｉｎｅ（Ｓ）を一部添加したリンカーペプチドで連結することが好ましい。このようなリンカーペプチドとして、グリシン及びセリンの繰り返し配列からなる１〜１０アミノ酸程度の長さのＧＳリンカーを用いることが好ましく、５〜１０アミノ酸程度の長さのＧＳリンカーを用いることがより好ましい。
【００５７】
本発明に係る発光プローブは、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に、円順列変異した発光酵素が位置することを条件に、任意の順序で連結することができるが、認識タンパク質、Ｃ−ＬＥ、Ｎ−ＬＥ、リガンド結合タンパク質をこの順番で連結されていることが好ましい。言い換えると、認識タンパク質の下流にＣ−ＬＥが位置し、その下流にＮ−ＬＥが位置し、さらにその下流にリガンド結合タンパク質が位置していることが好ましい。本発明に係る発光プローブの例を示す概念図を図１に示す。
【００５８】
図１に示すように、Ｃａ２＋を検出するために、リガンド結合タンパク質としてＣａＭを用い、認識タンパク質としてＭ１３を用いる場合、Ｍ１３にＣ−ＬＥを連結し、ＣａＭにＮ−ＬＥを連結することが好ましい。このとき、発光酵素としてＧＬｕｃを円順列変異して、まずＧＬｕｃのＣ−ＬＥ（ＧＬｕｃ−Ｃ）、そしてＧＬｕｃのＮ−ＬＥ（ＧＬｕｃ−Ｎ）の順に配置することが好ましい。具体的には、Ｎ末端側から、Ｍ１３、ＧＬｕｃ−Ｃ、ＧＬｕｃ−Ｎ、ＣａＭの順に連結されて構成される。このように構成された発光プローブは、構造変化が可逆的であるため、Ｃａ２＋の結合又は解離をリアルタイムでイメージングすることが可能である。また、当該発光プローブによれば、細胞外刺激を直接的に検出するのではなく、細胞外刺激による細胞内２次現象であるセカンドメッセンジャーを認識し、構造変化するため、リガンドが細胞内に取り込まれる必要がなく、細胞膜上リセプターの信号増幅機構を使うため、より短時間でリガンドと発光プローブとを接触させることができる。
【００５９】
また、エストロゲン受容体のＬＢＤをリン酸化するリガンドを検出するために、リガンド結合タンパク質としてＥＲ  ＬＢＤを用い、認識タンパク質としてＳｒｃのリン酸化認識ドメイン（Ｓｒｃ  ＳＨ２）を用いた場合、Ｓｒｃ  ＳＨ２にＣ−ＬＥを連結し、ＥＲ  ＬＢＤにＮ−ＬＥを連結することが好ましい。このとき、発光酵素としてＣＢＬｕｃを円順列変異して、ＣＢＬｕｃのＣ−ＬＥ（ＣＢＬｕｃ−Ｃ）及びＣＢＬｕｃのＮ−ＬＥ（ＣＢＬｕｃ−Ｎ）を用いることが好ましい。具体的には、Ｎ末端側から、Ｓｒｃ  ＳＨ２、ＣＢＬｕｃ−Ｃ、ＣＢＬｕｃ−Ｎ、ＥＲ  ＬＢＤの順に連結されて構成される。
【００６０】
このように構成された発光プローブを用いたリガンド認識メカニズムを示す模式図を図２に示す。図２に示すように、本発光プローブにエストロゲンアンタゴニストを共存させると、ＥＲ  ＬＢＤのＴｙｒ５３７がリン酸化され、Ｓｒｃ  ＳＨ２が当該リン酸化部位を認識する。そして、分子内相互作用によりＥＲ  ＬＢＤのリン酸化部位にＳｒｃ  ＳＨ２が結合することによって、ＣＢＬｕｃ−ＣとＣＢＬｕｃ−Ｎとが互いに近接し相補して発光する。ここで、ＥＲ  ＬＢＤのＴｙｒ５３７をポイント変異させた場合には、図２に示すように、ＥＲ  ＬＢＤがリン酸化されないため、ＥＲ  ＬＢＤとＳｒｃ  ＳＨ２とが結合しない。よって、ＣＢＬｕｃ−ＣとＣＢＬｕｃ−Ｎとが相補せず、発光しない。
【００６１】
さらに、アンドロゲン受容体に対するリガンドを検出するために、リガンド結合タンパク質としてＡＲ  ＬＢＤを用い、認識タンパク質としてＬＸＸＬＬモチーフを用いる場合、ＬＸＸＬＬモチーフのＣ−末端にＣ−ＬＥを連結し、ＡＲ  ＬＢＤのＮ−末端にＮ−ＬＥを連結することが好ましい。このとき、発光酵素としてＦＬｕｃを円順列変異して、ＦＬｕｃのＣ−ＬＥ（ＦＬｕｃ−Ｃ）及びＦＬｕｃのＮ−ＬＥ（ＦＬｕｃ−Ｎ）を用いることが好ましい。ＣＢＬｕｃ及びＧＬｕｃの結晶構造は未だ知られていないが、ＦＬｕｃは結晶構造が解明している。ＦＬｕｃの結晶構造を図３に示す。本発光プローブは、具体的には、Ｎ末端側から、ＬＸＸＬＬモチーフ、ＦＬｕｃ−Ｃ、ＦＬｕｃ−Ｎ、ＡＲ  ＬＢＤの順に連結されて構成される。このように構成された発光プローブの立体構造の例を図４に示す。
【００６２】
本発明に係る発光プローブは、各構成要素のポリペプチドを遺伝子組換え法、化学合成法等で得た後に、それぞれを連結して得てもよいが、各構成要素のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを直鎖状に連結したキメラＤＮＡが挿入された発現ベクターを用いて細胞を形質転換し、形質転換した細胞内に発現させることによっても得られる。
【００６３】
ここで、キメラＤＮＡとは、由来の異なるいくつかのＤＮＡ断片が人工的に直鎖状に連結されたものであり、いくつかのポリペプチドを構成要素とする融合タンパク質を発現することのできるＤＮＡである。本発明に係るキメラＤＮＡは、生細胞内外において、一分子型発光プローブとして機能する融合タンパク質を発現可能なポリヌクレオチドである。本明細書中において、「生細胞」とは、その本来の機能を維持した状態の培養細胞又は生物個体内に存在する真核細胞（酵母細胞、昆虫細胞、動物細胞）であり、特にヒトを含めた哺乳動物由来の細胞である。生細胞には原核細胞も含まれる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、融合タンパク質は、由来の異なるいくつかのタンパク質又はポリペプチドが人工的に連結されたものであり得る。本明細書中において、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」又は「タンパク質」と交換可能に使用される。本発明に係る融合タンパク質はまた、化学合成されても、天然供給源より単離されてもよい。用語「単離された」ポリペプチド又はタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチド又はタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチド及びタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然又は組換えのポリペプチド及びタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００６５】
本発明に係る発光プローブにおいて、各構成要素のポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、及び原核生物宿主又は真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。
【００６６】
また、本発明に係る発光プローブ及び各構成要素のポリペプチドは、付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドとしては、例えば、ポリＨｉｓタグやＭｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。好ましい実施形態において、本発明に係る融合タンパク質は、改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係る融合タンパク質の付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間又は引き続く操作及び保存の間の安定性及び持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に付加され得る。
【００６７】
好ましくは、本発明に係る発光プローブは、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質あるいはその変異体であり得る。本明細書中においてポリペプチド又はタンパク質に関して用いられる場合、用語「変異体」は、本来のアミノ酸の少なくとも一つ以上がポイント変異、挿入、逆転、反復、欠損、タイプ置換されたポリペプチド又はタンパク質であって、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させるポリペプチド又はタンパク質が意図される。
【００６８】
一実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素が相補して発光量を変化させる融合タンパク質であって、配列番号１〜３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列の１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる融合タンパク質であることが好ましい。
【００６９】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、タイプ置換（例えば、親水性残基の別の残基への置換、しかし通常は強い親水性の残基を強い疎水性の残基には置換しない）、及びポイント変異を含む変異体が挙げられる。
【００７０】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造又は機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造又は機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００７１】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体又は付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００７２】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、又は添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、及び欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係る発光プローブの発光活性を変化させない。
【００７３】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅの中での１アミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基Ｓｅｒ及びＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐ及びＧｌｕの交換、アミド残基Ａｓｎ及びＧｌｎの間の置換、塩基性残基Ｌｙｓ及びＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００７４】
一実施形態において、本発明に係る発光プローブは、配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによりコードされる融合タンパク質又はその変異体であることが好ましい。ここで、当該変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００７５】
他の実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００７６】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００７７】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）が意図される。
【００７８】
他の実施形態において、本発明に係る発光プローブの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素が相補して発光量を変化させる融合タンパク質であって、配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一、より好ましくは少なくとも８０％、９５％又は９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることが好ましい。
【００７９】
ＤＮＡ塩基配列の６６％以上が同一であれば、全く同様の活性を持つ融合タンパク質を作製できる根拠としては、サイレント変異を考えられる。遺伝子暗記票によれば、例えば、アミノ酸のバリン（Ｖａｌｉｎｅ）をコードする遺伝子は、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧのいずれでもよい。従って、最大３３％の遺伝子塩基が違っても全く同一の融合タンパク質プローブを作製できることから、数字の６６％が同一塩基配列か否かを判定する上で妥当な意味を持つ。
【００８０】
また、機能が解明されている多くのタンパク質は、自然変異体またはアイソフォームを持つ。本実施例にあげたＥＲでさえ、自然界にはＥＲαとＥＲβとが存在しており、女性ホルモンに対して全く同じ強度で結合することが知られている（Hodges, Y. K.; Tung, L.; Yan, X. D.; Graham, J. D.; Horwitz, K. B.; Horwitz, L. D. Circulation 2000, 101, 1792-1798.）。ところが、そのアミノ酸間の相同性はわずか３０％（Ｎ-末側領域；ＮＴＤ）、５３％（リガンド結合領域；ＬＢＤ）に過ぎない点を考慮すべきである。
【００８１】
さらに、本実施例のＥＲやＡＲと同じ核受容体であるグルココルチコイド（ＧＲ）では、ＧＲαＡ、ＧＲβＡ、ＧＲα２、ＧＲβ２、ＧＲＡα、ＧＲＡβ、ＧＲ−Ｐ、ＧＲ−βＢなどのイソフォームが存在し、それぞれ同じＧＲ類として生体内で機能している（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ０４１５０）点を考慮しなければならない。
【００８２】
例えば、「本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも６６％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり３３つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを、参照塩基配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも６６％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の３３％までが、欠失され得るか又は別の塩基で置換され得るか、あるいは参照塩基配列における全塩基の３３％までの多くの塩基が、参照塩基配列に挿入され得る。参照塩基配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’又は３’末端位置又は参照塩基配列における塩基中で個々にか又は参照塩基配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。
【００８３】
本発明はまた、本発明に係る発光プローブをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明に係るポリヌクレオチドを細胞内に導入することによって、本発明に係る発光プローブを細胞内に発現させることができる。一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド又はその変異体であることが好ましい。
【００８４】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」又は「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）もしくはリボヌクレオチド（Ｃ、Ａ、Ｇ及びＵ）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及び／又はＴによって示される配列を含むポリヌクレオチド又はその断片部分が意図される。
【００８５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、又はＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、又は、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００８６】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの変異体は、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合したことを認識タンパク質が認識した場合に、２つに分割された発光酵素断片が相補して発光量を変化させる融合タンパク質をコードし、かつ以下のポリヌクレオチドのいずれかであることが好ましい：配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列の１個又は数個の塩基配列が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；配列番号４〜６のいずれかに示される塩基配列と少なくとも６６％同一、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００８７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列又はベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【００８８】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、生物材料（例えば、ヒト又はマウスなどの諸器官）であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプル又は細胞サンプル）が意図される。
【００８９】
本発明に係る融合タンパク質又はポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、細胞内外における分子の可視化イメージングのためのプローブとして使用され得る。より具体的には、本発明に係る融合タンパク質は一本鎖の融合ポリペプチドとして構成されるが、リガンド結合タンパク質にリガンドが結合すると、その立体構造が変化し、リガンド結合タンパク質は認識タンパク質に結合する。そして、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との間に位置する、円順列変異した発光酵素は、リガンド結合タンパク質と認識タンパク質との結合により近接し、相補して発光量を増加させる。このように、本発明に係る融合タンパク質によれば、発光量の変化に基づいて、細胞内外における分子の動き、信号伝達等を可視化検出することができる。したがって、本発明に係る融合タンパク質を用いれば、標的特異的なリガンドの生理活性、濃度等を高精度に検出することが可能であり、例えば発癌物質のような生体内危険因子のスクリーニング、抗癌剤の薬理作用の定量評価（新薬の開発）に役立つ。
【００９０】
つまり、本発明の目的は、プローブ及びこれをコードするポリヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した融合タンパク質作製方法及びポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。従って、上記各方法以外によって取得されるプローブ及びこれをコードするポリヌクレオチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００９１】
〔２．ベクター〕
本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質を生物又は細胞内で発現させるベクターを提供する。本発明に係るベクターを用いれば、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを生物又は細胞に導入し、当該生物又は細胞内において本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。
【００９２】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクター等が挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ又はコスミド等を用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【００９３】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、発現に用いる宿主中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。また、本発明に係るベクターは、本発明に係るポリヌクレオチドの発現を制御するために（例えば、生物個体における特定組織での発現）、公知の組織特異的プロモータ配列を組み込むようにしてもよい。すなわち、確実に本発明に係るポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現させるために、適宜プロモータ配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとすればよい。また、ある臓器に特異的に宿る既知のベクターを使うことによって、特定臓器に選択的に本プローブを導入することもできる。
【００９４】
本発明に係るベクターは、例えばマイクロインジェクション法やエレクトロポーレーション法等の公知のトランスフェクション法により宿主内に導入することができる。あるいは脂質による細胞内導入法（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社）等）を採用することもできる。上記の宿主は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞、生物個体等を好適に用いることができる。
【００９５】
なお、目的とする本発明に係る融合タンパク質が常に合成される場合に限定されず、ＩＰＴＧを添加することにより、合成が誘導されるものであってもよい。また、ベクターには、合成されるタンパク質のＮ末端又はＣ末端にポリヒスチジンタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇ等のタグ配列を付加する配列を含むものであってもよい。
【００９６】
本発明に係るベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、又はネオマイシン、ゼオシン、ジェネティシン、ブラストシジンＳ、ハイグロマイシンＢ等の薬剤耐性遺伝子、及び大腸菌及び他の細菌における培養については、カナマイシン、ゼオシン、アクチノマイシンＤ、セフォタキシム、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ピューロマイシン、テトラサイクリン又はアンピシリン等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主に導入されたか否か、さらには宿主中で確実に発現しているか否かを確認することができる。
【００９７】
本発明に係るベクターを用いれば、本発明に係る融合タンパク質を生物又は細胞に導入して、当該生物又は細胞中に本発明に係る融合タンパク質を発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、本発明に係る融合タンパク質を合成することができる。
【００９８】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含めればよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【００９９】
〔３．形質転換体〕
本発明はまた、本発明に係る融合タンパク質を発現させ得る形質転換体を提供する。本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいることを特徴としている。本明細書中において、「形質転換体」は、細胞、組織又は器官だけでなく、生物個体をも含むことが意図される。本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドを含むベクターを含んでいる限り、特に限定されるものではない。
【０１００】
本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、本発明に係る融合タンパク質が発現され得るように生物又は細胞中に導入することによって得られる。
【０１０１】
本発明に係るポリヌクレオチド、又は当該ポリヌクレオチドを含むベクターを宿主に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、本発明に係る形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主のゲノムに組み込まれていない状態で一過性に発現する、一過性形質転換体であってもよく、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主のゲノムに組み込まれ安定的に発現し続ける、安定形質転換体であってもよい。
【０１０２】
本発明に係る形質転換体を用いれば、本発明に係る融合タンパク質を発現させることができるため、本発明に係る形質転換体をリガンドで刺激し、当該形質転換体からの発光量の変化を測定することによって、リガンドの性質、活性の程度等を評価することができる。
【０１０３】
〔４．リガンド検出方法及びキット〕
本発明は、さらに、被験試料中のリガンドを検出するリガンド検出方法及びキットを提供する。本発明に係るリガンド検出方法は、被験試料と、本発明に係る融合タンパク質とを接触させる工程を包含することを特徴としている。本方法においては、被験試料と接触させる融合タンパク質に含まれる酵素の基質を、適宜接触させてもよい。これにより、本発明に係る融合タンパク質からの発光量に基づいて、被験試料中のリガンドを検出する。本明細書中において、「被験試料」は、リガンドそのものであってもよく、リガンドを含む試料であってもよい。また、被験試料は、本発明に係る融合タンパク質が発現した細胞の細胞内物質であることもできる。
【０１０４】
上記工程において、被験試料の存在下及び非存在下において、本発明に係る融合タンパク質からの発光量が変化した場合、当該被験試料中において、本発明に係る融合タンパク質のリガンド結合タンパク質に結合するリガンドを検出することができる。本発明に係るリガンド検出方法によれば、後述する実施例に示すように、リガンドの性質、リガンドの活性の程度、リガンドの濃度等を分析することが可能である。
【０１０５】
本発明に係るリガンド検出方法によれば、既知のアゴニストに対する未知のアンタゴニストを検出することもできる。例えば、本発明に係る融合タンパク質に候補物質を含む被験試料を接触させ、ついで既知のアゴニストを接触させて、本発明に係る融合タンパク質からの発光量を測定する。被験試料中の候補物質がアンタゴニスト作用を有するものであれば、リガンド結合タンパク質のアゴニスト結合部位は候補物質によって占有されているので、その後に導入されたアゴニストはリガンド結合タンパク質に結合することはできない。
【０１０６】
このとき、アンタゴニストの結合によっては立体構造が変化しないリガンド結合タンパク質を用いていれば、アンタゴニストの結合により発光プローブからの発光量は変化しないため、アゴニスト単独で導入した場合に比して発光量は減少する。一方、アゴニストの結合によっては立体構造が変化しないリガンド結合タンパク質を用いていれば、同様に既知のアンタゴニストを用いて、未知のアゴニストを検出することもできる。
【０１０７】
本発明に係るリガンド検出方法においては、典型的には、本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて形質転換した生細胞と、被験試料とを接触させて刺激し、刺激前後における本発明に係る融合タンパク質からの発光量の変化を測定する。本発明に係る融合タンパク質と被験試料とを接触させる方法は、特に限定されないが、例えば本発明に係る融合タンパク質が発現した生細胞の培養培地に被験試料を添加し、エンドサイトーシス作用によって被験試料を細胞内に取り込ませて接触させてもよい。また、被験試料が細胞内物質の場合には、本発明に係る融合タンパク質を当該細胞内において発現させることによって、接触させてもよい。また、生細胞がない状態であっても、例えば培地中に分泌した本発明に係る融合タンパク質を含む培養液、又は精製した本発明に係る融合タンパク質を用いれば、各発光酵素の基質を同時に存在させて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの測定も可能である。
【０１０８】
本発明に係るリガンド検出方法において、生細胞中に発現させた発光プローブを用いる場合、以下の方法を適用できるが、この方法に限定されない。
（ｉ）本発明に係る融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するプラスミドを、２４穴プレート上の生細胞に導入し、さらに１６時間培養する。
（ｉｉ）上記細胞を、基質を含む溶液に浸す。
（ｉｉｉ）上記細胞を被験試料で刺激し、刺激前後の発光量の変化を発光度計で測定する。
【０１０９】
本発明に係るリガンド検出方法において、本発明に係る融合タンパク質を用いた非細胞系実験（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）を行った場合、以下の方法を適用できるが、この方法に限定されない。
（ｉ）公知の方法により精製した発光プローブを直径１．２センチの十字架型紙片の末端に垂らして乾燥させる。
（ｉｉ）上記十字架型紙片の中央に刺激物質を含む基質溶液１５ｍＬを点滴し、即時に発光Ｓｃａｎｎｅｒ（例えば、ＲＡＳ−３０００；ＦｕｊｉＦｉｌｍ）で発光量を測定する。
【０１１０】
本発明に係るリガンドを検出するためのリガンド検出キットは、本発明に係る融合タンパク質を備えていることを特徴としている。また、本キットは、本発明に係る融合タンパク質に含まれる発光酵素の基質を、さらに備えていてもよい。
【０１１１】
ここで、本キットが備える本発明に係る融合タンパク質は、真核細胞内及び原核細胞内において大量発現させることが可能である。例えば哺乳動物細胞を用いた場合、従来公知の適切なシグナル配列を繋いで培地中に大量に分泌させることによって、精製工程なしでも分析に用いることが可能な、大量の発光プローブ含有培養上清が得られる。また、さらに精製用のタグ（例えば、Ｈｉｓ  Ｔａｇ）をつけることで、容易に融合タンパク質を大量精製することができる。
【０１１２】
このようにして得られた融合タンパク質を備えたキットと同様に、本発明に係る融合タンパク質を発現している形質転換体を備えたキットも、被験試料中のリガンドの検出に用いられ得る。また、本発明に係るポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドにより形質転換される細胞とを備えたキット、及び本発明に係るベクターと当該ベクターにより形質転換される細胞とを備えたキットも、同様に被験試料中のリガンドの検出に用いられ得る。
【０１１３】
〔５．プローブ生産方法及びキット〕
本発明は、さらに、本発明に係るプローブの生産方法及びキットを提供する。本発明に係るプローブの生産方法は、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換する工程を包含することを特徴としている。本方法においては、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを用いて細胞を形質転換し、本発明に係るプローブを細胞中に発現させることによって、本発明に係るプローブを生産する。細胞中に発現させたプローブは、公知の方法により細胞中から回収し、精製することができる。
【０１１４】
具体的には、本発明に係るポリヌクレオチド又は発現ベクターを用いて細胞を形質転換し、培養した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、本発明に係るプローブを回収、精製することができる。また、細胞中で発現させたポリヌクレオチドに精製用のタグが付加されている場合には、より容易に回収することができる。
【０１１５】
本発明に係るプローブの生産キットは、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターを備えていることを特徴としている。また、本キットは、本発明に係るポリヌクレオチド又は本発明に係るベクターにより形質転換される細胞を、さらに供えていてもよい。さらに、本発明に係るポリペプチドに含まれる発光酵素の基質を備えていてもよい。また、本発明に係るプローブの生産キットは、本発明に係る融合タンパク質をコードするリボ核酸を備えていてもよい。
【０１１６】
本発明に係るプローブは、例えば、以下のように生産されるものであり得る。まず、酵素を２つに分割し、Ｃ末側断片とＮ末側断片とを作製する。そして、リガンド結合タンパク質と、認識タンパク質との間に、円順列変異させたＣ末側断片とＮ末側断片とを連結する。このように本発明に係るプローブを生産してもよい。
【０１１７】
本発明に係る融合タンパク質によれば、バックグラウンド発光量を、例えばおよそ１／１０００まで低く抑えることが可能であり、バックグラウンド光に対するシグナル光の比率を格段に向上させることができる。したがって、種々のタンパク質間相互作用の可視化検出をより高精度に行うことができる。
【０１１８】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１１９】
〔実施例１：プラスミドの構築〕
適当なプライマー及びテンプレートを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）しながら断片のそれぞれの端部に特異的な制限酵素認識部位を導入し、円順列変異したプローブを構成する各ｃＤＮＡ断片を生成した。例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓ由来のカルモジュリン（ＣａＭ）を増幅するために、Ｄｒ  Ｍｉｙａｗａｋｉから提供されたＹｅｌｌｏｗ  Ｃａｍｅｌｅｏｎ−３．１（ＹＣ３．１）を、ＰＣＲのテンプレートとして用いた（非特許文献４参照）。特異的な制限酵素認識部位を図５に示す。
【０１２０】
各ｃＤＮＡ制限酵素断片を図５に示すように繋ぎ、それぞれｐｃＤＮＡ  ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローンした。構築したプラスミドを、円順列変異した発光酵素の種類によってそれぞれ、ｐＣＰＧ（ｃｐＧＬｕｃプローブ）、ｐＣＰＦ（ｃｐＦＬｕｃプローブ）及びｐＣＰＣ（ｃｐＣＢＬｕｃプローブ）と称する。これらのプラスミド中で発現した発光プローブをそれぞれ、ＣＰＧ、ＣＰＦ及びＣＰＣと称することもある。
【０１２１】
加えて、ｃｐＣＢＬｕｃプローブのコントロールとして、ｐＣＰＣにおけるエストロゲンレセプターのリガンド結合タンパク質（ＥＲ  ＬＢＤ）のＹ５３７をコードする核酸を、ＴＡＴからＴＴＴに部分変異した（例えばＹ５３７Ｆ）。このプラスミドをｐＣＰＣ変異体と称する。また、ｃｐＣＰＣプローブのさらなるコントロールとして、図９示す従来の一分子型プローブを平行して構築した。このプラスミドをｐＳＭＣと称する。ｃｐＧＬｕｃプローブ（ＣＰＧ）のコントロールとして、図１４に示す一分子型プローブＳＭＧを作製した。このプラスミドをｐＳＭＧと称する。
【０１２２】
構築したプラスミドの全てにおいて、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット及び遺伝子分析ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）により配列を確認した。
【０１２３】
ここで、円順列変異に用いる合理的な発光酵素断片を生成するために、各プラスミドに導入した発光酵素の、分子内相補性により生物発光が回復するような分割位置を、以下のように検討した。本発明者らは、活性を一時的に喪失し、直ちに回復するような可能性のある発光酵素のいくつかの分割位置を、これまでに検討してきた（非特許文献６、１０、１１及び１７）。本発明者らは、ＧＬｕｃ、ＦＬｕｃ及びＣＢＬｕｃそれぞれの全アミノ酸配列における親水性分布解析に基づいて分割位置を検討した。
【０１２４】
図６に、各発光酵素の親水性分布解析の結果を示す。本発明者らのこれまでの研究から、アミノ酸配列における親水性領域が発光酵素を構成する２つの主要ドメイン間領域であると予想した。そこで、この親水性領域を中心に分割位置を検討した。その結果、図５に示すように、ＧＬｕｃにおいては１０６位と１０７位との間で分割し、ＦＬｕｃにおいては４１５位と４１６位との間で分割し、ＣＢＬｕｃにおいては４１２位と４１３位との間で分割し、それぞれ円順列変異して作製したプローブが最適であることが見出された。発光酵素の本来のＮ末端及びＣ末端を１０ＧＳリンカーを用いて遺伝子融合し、分割位置に新しい端部を設けることによって円順列変異した。
【０１２５】
〔実施例２：細胞培養及び形質転換〕
アフリカ緑ザル腎臓由来のＣＯＳ−７細胞を、１０％ステロイドフリーウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ製）を含む２４ウエルプレートにおいて、ｃｅｌｌインキュベータ（Ｓａｎｙｏ製）中で、３７℃、５％ＣＯ２存在下で培養した。導入試薬としてＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（Ｍｉｒｕｓ製）を用いて、ＣＯＳ−７細胞に、ｐＣＦＧ、ｐＣＰＦ又はｐＣＰＣ（各ウエル当り０．２μｇ）を一過性形質転換した。形質転換した細胞を、５％ＣＯ２存在下で１６時間インキュベートした。
【０１２６】
〔実施例３：ＣＰＣ、ＣＰＦ又はＣＰＧにおける相対的な発光強度の比較〕
ＣＰＣ、ＣＰＦ又はＣＰＧからの相対的な発光強度を、各リガンドの存在下又は非存在下において比較した。結果を図７に示す。
【０１２７】
まず、実施例２で作製したｐＣＰＣ又はｐＣＰＦが導入されたＣＯＳ−７細胞を、４−ヒドロキシタモキシフェン（ＯＨＴ）又は５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）  １０−６Ｍ（終濃度）で刺激した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を用いて生じさせた発光強度を、発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製）を用いて１５秒測定した。Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ基質溶液を用いた処理の概要を以下に示す。
【０１２８】
プラスミドを導入したＣＯＳ−７細胞をリガンドによって２０分間刺激した後、ＰＢＳを用いた洗浄を１回行った。基質溶液（D-luciferin）４０μＬをプレートの各ウエルに添加した。基質溶液を添加してから３分後、プレートを穏やかに叩き、得られた細胞溶解物をテストチューブに移して発光強度を測定した。
【０１２９】
一方、ｐＣＰＧが導入されたＣＯＳ−７細胞を、トリプシン処理及び遠心分離によって回収した。回収後の細胞を１ｍＭ  ヒスタミン又はＰＢＳを含む４０μＬ基質溶液（セレンテラジン）に穏やかに混合した。その後、発光強度を発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６）を用いて決定した。結果を以下に示す。
【０１３０】
リガンド刺激後のＣＰＣ及びＣＰＧからの光の発光量はそれぞれ、バックグラウンドよりも６倍及び３倍強かった。ＣＰＦにおいてもリガンド刺激によって発光量が増加したが、バックグラウンドに対するシグナル比率は、ＣＰＣ及びＣＰＧよりも低かった。これらのデータは、（ｉ）発光酵素を円順列変異して、生物発光プローブを構築し得ること、（ｉｉ）リガンドの存在下において、発光酵素の円順列変異断片間の分子内タンパク質相補性が確実に引き起こされること、（ｉｉｉ）回復した発光強度が、分子イメージングの利用に十分なほど強いこと、（ｉｖ）ＣＰプローブの構成要素間の立体障害及び空間的ミスマッチが原因で、ノイズに対するシグナルの比率が変化し得ること、を示している。
【０１３１】
〔実施例４：ＣＰＣ又はＣＰＣ変異体における発光強度の比較〕
ＣＢＬｕｃ又はその変異体は、ｐＨ、温度及び重金属イオンには感受性を示さず、組織透過性の高い６１５ｎｍの赤色発光を生成する。我々は、ＣＢＬｕｃ  Ｒｅｄのこれらの利点を、新規のプローブの合成に利用した。ＥＲリガンドの刺激により、ＥＲ  ＬＢＤのＹ５３７がリン酸化される。これはＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインによって感度よく認識される（非特許文献１８）。本発明者らは、本発明のプローブを構築するために、この典型的なＥＲの非ゲノム相互作用を利用した。
【０１３２】
ＥＲ  ＬＢＤのＹ５３７におけるリン酸化が、結果的にＳｒｃタンパク質のＳＨ２ドメインとの分子内相互作用を引き起こすか否かを、ＣＰＣ及びＣＰＣ変異体（ＣＰＣ−ｍｕｔ）を用いて実験した。実施例２と同様に、２４ウエルプレート中で培養したＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＰＣ又はｐＣＰＣ変異体で一過性形質転換した。形質転換してから１６時間経過した後、形質転換細胞を様々なリガンド（１０−６Ｍ）で２０分間刺激した。細胞の刺激には、溶媒（終濃度０．１％ＤＭＳＯ）、ＯＨＴ（4-hydroxytamoxifen）、エストロン、Ｅ２（１７β−エストラディオール）、ＤＨＴ（5α-dihydrotestosterone）及びコルチゾールを用いた。
【０１３３】
発光強度の測定を以下のとおり行った。形質転換したＣＯＳ−７細胞を、ｃｅｌｌインキュベータ中で１６時間インキュベートした。インキュベート後の細胞を、Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを含む２００μＬのセル溶解バッファに溶解し、全溶解物を石英セル（４５×１２．５×７．５ｍｍ）に移した。分光光度計（ＦＰ−７５０；Ｊａｓｃｏ社）を用いて、４００ｎｍから７００ｎｍの範囲の発光を測定した（ｎ＝３）。リガンドの存在下又は非存在下におけるＣＰＣのスペクトルを、ＣＰＣ変異体のスペクトルと比較した結果を図８に示す。
【０１３４】
図８に示すように、ＣＰＣは様々なステロイドを認識したが、特に、エストロゲンアンタゴニストであるＯＨＴに感受性を示した。一方、ＣＰＣ変異体は、全てのリガンドに対して感受性を示さなかった（無反応であった）。この結果は、（ｉ）ＥＲ  ＬＢＤのＹ５３７におけるリン酸化を介して、ＥＲ  ＬＢＤ−Ｓｒｃ  ＳＨ２の分子内相互作用が起こること、（ｉｉ）ＥＲ  ＬＢＤのＹ５３７はリガンド依存的にリン酸化されること、（ｉｉｉ）ＣＰＣの発光強度が、リガンドのアンタゴニスト活性の指標となること、（ｉｖ）分析的観点から、ノイズに対するシグナルの比率がリガンドの非ゲノム活性を識別するに十分大きいこと、を示している。Ｅ２がＥＲのＹ５３７のリン酸化に影響するか否かは、これまでに議論されている。本実施例によれば、Ｅ２だけでなく、ＯＨＴもＥＲのＹ５３７をリン酸化を引き起こし得ることを示している。また、Ｅ２及びＯＨＴの両方がＥＲ  ＬＢＤをリン酸化するが、Ｅ２よりもＯＨＴの方が、ＣＢＬｕｃの発光活性回復により好ましいＥＲ  ＬＢＤの立体配置変化を引き起こすことも示された。この結果は、ＥＲアンタゴニストにおける発光に関する以前の研究と一致する。
【０１３５】
〔実施例５：ＣＰＣのリガンド濃度−反応曲線及びＳＭＣとの比較〕
種々の濃度のリガンドに対するＣＰＣのリガンド感受性を測定した。実施例２と同様に、２４ウエルプレートで培養したＣＯＳ−７細胞をｐＣＰＣで一過性形質転換した。形質転換してから１６時間経過後、種々の濃度のリガンドを用いて形質転換細胞を刺激した。発光強度を発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６）を用いて測定した。細胞の刺激には、溶媒（終濃度０．１％ＤＭＳＯ）、ＯＨＴ、エストロン、１７β−エストラディオール（Ｅ２）、ＤＨＴ及びコルチゾールを用いた。
【０１３６】
ＣＰＣのコントロールとして、図９に示すＳＭＣの感受性を、ＣＰＣと同一の実験条件において平行して実験した。図９に示すように、ＳＭＣは、ＣＢＬｕｃのＮ末端断片とＣ末端断片との間にＳｒｃ  ＳＨ２と  ＥＲ  ＬＢＤとがつなげられている点においてＣＰＣと異なっている。すなわち、ＳＭＣにおいては発光酵素を円順列変異していない。このＳＭＣを含むプラスミドｐＳＭＣでＣＯＳ−７細胞を形質転換した。形質転換細胞を種々の濃度のＯＨＴを用いて刺激し、得られた発光強度を発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６）を用いて測定した。
【０１３７】
ＣＰＣ及びＳＭＣのリガンド濃度−反応曲線を図１０に示す。図１０に示すように、ＣＰＣは選択的にＯＨＴを認識し、１０−９Ｍのような低濃度のＯＨＴでさえ認識した。半数影響濃度（ＥＣ５０）は、およそ５×１０−８Ｍであった。検出下限は、円順列変異していないコントロールプローブ（ＳＭＣ）と比して１０倍増であった。ＳＭＣは、ＣＰＣよりも７倍強いバックグラウンド発光を発した（例えば３８４５９対５４８４  ＲＬＵ（ｎ＝３））。このように検出下限が改善した理由は、円順列変異により、リガンドの非存在下において、ＥＲ  ＬＢＤ及びＳＨ２間の基底相互作用が減少したことで説明することができる。
【０１３８】
〔実施例６：アンタゴニスト結合ＣＰＣに対するＥ２の抑制効果の比較〕
ＣＰＣがＥＲアゴニストではなく、ＥＲアンタゴニストに対して感受性を示すという結果に基づいて、アンタゴニスト結合ＣＰＣに対するＥ２の抑制効果を調べた。実施例２と同様に、２４ウエルプレートで培養したＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＰＣで一過性形質転換した。形質転換してから１６時間経過した後、細胞を１０−５Ｍ  Ｅ２で５分間、前刺激した。Ｅ２刺激後の細胞を、種々の核レセプターアンタゴニストを更に導入し、インキュベートした。核レセプターアンタゴニストとして、シグリタゾン、ＩＣＩＩ８２７８０、ゲジステイン及びＯＨＴ（それぞれ終濃度１０−６Ｍ）を用いた。結果として得られた発光強度を、核レセプターアンタゴニスト単独で刺激した細胞の発光強度と比較した。結果を図１１に示す。
【０１３９】
図１１に示すように、種々のアンタゴニストにより増大した発光強度に、Ｅ２は阻害効果を示した。この結果は、（ｉ）ＥＲ  ＬＢＤの結合において、アンタゴニストとＥ２とは競合すること、（ｉｉ）ＯＨＴが、１０倍以上の量のＥ２によりわずかに影響される、最も効果的なアンタゴニストであることを示している。
【０１４０】
〔実施例７：リガンド−プローブ結合の経時変化〕
リガンド−プローブ結合の経時変化を、ｐＣＰＣで形質転換したＣＯＳ−７細胞で評価した。実施例２と同様に、１２ウエルプレートで培養したＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＰＣで一過性形質転換し、さらに６時間インキュベートした。インキュベート後の形質転換細胞に１０−６Ｍ  ＯＨＴ又は溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）を添加後、２、５、１０、２０及び３０分後の発光強度を測定した。結果を図１２に示す。
【０１４１】
図１２に示すように、ＣＰＣの発光強度は、ＯＨＴ添加５分後から大きく増大し、２０分後に停滞した。２０分の総反応時間は、（ｉ）ＯＨＴが細胞膜を透過して細胞質中に導入され、（ｉｉ）ＯＨＴ−ＥＲ  ＬＢＤ結合によりＥＲ  ＬＢＤの立体配置変化し、（ｉｉｉ）更にＥＲ  ＬＢＤとＳｒｃ  ＳＨ２とが結合し、かつ（ｉｖ）ＣＢＬｕｃ断片間の分子内相補性により発光するまでに係る全ての時間が含まれる。リガンド−ＥＲの結合及びＥＲの立体配置変化は１分以内に完了することが、以前に無細胞分析によって証明されている（非特許文献１９）。それゆえに、総反応時間２０分の大部分はＯＨＴが細胞質に導入される時間に費やされると考えられる。この反応時間は、本発明者らが構築した従来のプローブにおける反応時間よりも非常に遅い。これは、他のステロイドと異なりＯＨＴは親水性であるため、細胞膜透過に時間がかかることが原因であると考えられる。
【０１４２】
また、時間の経過よるＯＨＴ−ＣＰＣ結合の解離を、ＯＨＴ刺激後の培養培地を交換する方法で測定した。ｐＣＰＣで形質転換された細胞を、１０−６Ｍ  ＯＨＴ又は溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）により２０分間刺激し、その後培養培地をリガンドを添加していない新しい培地に交換した。培地交換後１０、２０及び６０分後の発光強度をＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ基質溶液で処理した。各時間毎の強度を、基剤（０．１％ＤＭＳＯ）で偽刺激した細胞の強度と比較した。結果を図１３に示す。図中黒棒グラフはＯＨＴ刺激した細胞からの発光量を示し、白棒グラフは溶媒で偽刺激した細胞からの発光量を示している。
【０１４３】
図１３に示すように、培地交換から１時間以内は、発光強度は顕著には低減しなかった。培地交換後６０分を経過した後でさえ、細胞からの発光強度は弱まらなかった。この結果は、（ｉ）ＯＨＴの親水性がＯＨＴの流出を遅らせること、又は（ｉｉ）ＯＨＴによって引き起こされたＳｒｃ  ＳＨ２−ＥＲ結合が長時間持ちこたえることが理由であると考えられる。この結合において、ＥＲのヘリックス１２の役割は、（ａ）Ｙ５３７がＥＲのヘリックス１２のヒンジ領域に位置し、Ｓｒｃ  ＳＨ２に認識されること（非特許文献２０）、及び（ｂ）Ｙ５３７がＳＨ２−ＥＲ  ＬＢＤ結合の解離を潜在的に妨げる適切な位置であることと考えることがもっともらしい。この分子現象に関するリガンド認識メカニズムをＥＲとＡＲとの間で比較することが興味深い。生理条件下において、ＥＲはリガンド−ＥＲ結合後に核内に保持される一方で、ＡＲは転写後に再利用される（非特許文献２１及び２２）。すなわち、ＥＲは核内で分解されるため、転写後にリガンドを解放する必要がない。ＥＲ及びＡＲのリガンド認識メカニズムにおけるこのような生理学上の相違点は、上記ＳＨ２−ＥＲ結合の維持に現れているかもしれない。
【０１４４】
〔実施例８：ｐＣＰＧで形質転換されたＣＯＳ−７細胞におけるＣａ２＋動向の追跡〕
ＣＯＳ−７細胞における細胞質Ｃａ２＋の動向を、ｐＣＰＧで形質転換した細胞、及びコントロールとして図１４に示すＳＭＧで形質転換した細胞においてそれぞれ観察した。哺乳動物細胞における遊離Ｃａ２＋は、代表的なセカンドメッセンジャーである。図１４に示すように、ＣＰＧは、ＧＬｕｃをＱ１０５地点で切断し、断片を１０ＧＳリンカーを用いて円順列変異し、その外側の端部に、Ｍ１３ペプチド及びカルモジュリンをそれぞれ融合して合成した。ＳＭＧは、ＧＬｕｃのＮ末端断片とＣ末端断片との間にカルモジュリンとＭ１３ペプチドとがつなげられている点においてＣＰＧと異なっている。すなわち、ＳＭＧにおいては発光酵素を円順列変異していない。
【０１４５】
実施例２と同様に、黒のガラス底プレート（２４ウエル）で培養したＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＰＧ又はＳＭＧを含むプラスミドｐＳＭＧで形質転換し、ｃｅｌｌインキュベータ中に１６時間ストックした。形質転換細胞を、セレンテラジンを含むＨａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）バッファ  ３００μＬに浸した。発光強度の変化を、ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製）により、０．１から１ｍＭの範囲のヒスタミンの添加前後３０秒毎に観察した。結果を図１５に示す。
【０１４６】
図１５に示すように、１ｍＭヒスタミン刺激に対して、ＣＰＧの発光強度は直ちに上昇し、１０分後におおよそ停滞した。また、ＣＰＧのバックグラウンド強度は非常に低かった。一方、ＳＭＧは、ヒスタミンの非存在下でさえ、非常に高いバックグラウンド強度を示した。１ｍＭヒスタミンによる刺激でも発光強度はあまり上がらなかった。これらの結果から、ＧＬｕｃを円順列変異することによって、ＣＢＬｕｃを円順列変異した場合と同様に、バックグラウンド強度が低くなる傾向にあることが結論付けられた。基底発光の低下により、ヒスタミンによる遊離Ｃａ２＋イオンレベルの動向をより容易かつ正確に決定することができた。
【０１４７】
従来、セカンドメッセンジャーの動向のリアルタイムイメージングは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に多く依存していた（非特許文献３、４及び２３）。ＧＦＰ変異体間のＦＲＥＴは、蛍光顕微鏡により観測され得る。しかしながら、自己蛍光による測定妨害、限られた細胞数しか観測できないという問題点がある。本発明のＣＰＧによれば、単純な全細胞分析及びリアルタイムイメージングを提供することが可能であるため、哺乳動物由来の生細胞において分子動向を追跡するのに非常に有利である。本実施例は、生細胞内において、ヒスタミンが誘因するセカンドメッセンジャーの動向を生物発光プローブにより決定した最初の例である。
【０１４８】
〔実施例９：様々なリガンドによって上昇したＣａ２＋イオンレベルの洗浄後の保持〕
細胞質Ｃａ２＋イオンレベルの保持を、ｐＣＰＧで形質転換したＣＯＳ−７細胞からの発光強度に基づいて観察した。実施例２と同様に、２４ウエルプレートで培養したＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＰＧで一過性形質転換し１６時間インキュベートした。インキュベート後の形質転換細胞を、溶媒（ＰＢＳ）、０．５ｍＭヒスタミン、０．５ｍＭヒスタミン及び１０μＭシクロヘプタジエン、０．５ｍＭヒスタミン、０．５ｍＭ  ＡＴＰ、０．５ｍＭ  ＡＴＰ及び１０μＭシクロヘプタジエン、０．５ｍＭ  ＡＴＰ及び１μＭ  タプシガーギン（thapsigargen）、２μＭイオノマイシン、により２０分間刺激した。
【０１４９】
リガンド刺激後の細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理及び遠心分離により回収した。このＰＢＳによる洗浄により、細胞質内Ｃａ２＋イオンレベルを上昇させるリガンドの外部刺激を終了させる。回収した細胞をセレンテラジンを含む基質バッファに再懸濁した後、テストチューブに移し、発光度計（Ｍｉｎｉｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０６）を用いて発光量を測定した。結果を図１６に示す。
【０１５０】
図１６に示す結果から、以下のように結論付けられる。ヒスタミン及びＡＴＰは、細胞膜を通過できないため、膜上のこれらの特異的レセプターに結合する。ヒスタミン又はＡＴＰ単独により上昇した細胞質Ｃａ２＋イオンレベルは、細胞のカルシウムポンプによって直ちに減少する。小胞体Ｃａ２＋イオンポンプ阻害剤として知られるタプシガーギンをさらに添加すると、ヒスタミン又はＡＴＰにより上昇した発光強度が維持される。
【０１５１】
一方、ヒスタミンに加えて、シプロヘプタジエンで刺激すると、細胞質内Ｃａ２＋イオンレベルの上昇が選択的に阻害された。シプロヘプタジエンが、抗ヒスタミン剤としてヒスタミン効果を阻害していると考えられる。イオノマイシンは、細胞質中への、外因性Ｃａ２＋イオンの流入を引き起こすものであることから、Ｃａ２＋イオンポンプの存在に関わらず、細胞質内において一定のＣａ２＋イオンレベルが維持されることが結論付けられた。
【０１５２】
これらの結果は、（ｉ）本発明のＣＰＧが、哺乳動物生細胞における分子現象を解明するための適切な測定を提供し得ること、（ｉｉ）本発明のＣＰＧを用いれば、生細胞中において、Ｃａ２＋イオンを含むセカンドメッセンジャーの動きを可視化し得ることを示している。今まで蛍光発光プローブを用いた蛍光測定法は頻繁に用いられているが、このような生物発光に基づくプローブは新規である。
【０１５３】
〔実施例１０：ＣＰＣとＣＰＣコントロール（ＣＰＣ−ｃｔｒｌ）とのリガンド感受性の比較〕
ＣＰＣのさらなるコントロールであるＣＰＣ−ｃｔｒｌのリガンド感受性を、ＣＰＣのリガンド感受性とを比較した。図１７に示すように、ＣＰＣ−ｃｔｒｌは、Ｓｒｃ  ＳＨ２と  ＥＲ  ＬＢＤとの間に、ＣＢＬｕｃのＮ末端断片とＣ末端断片とが、この順に連結されている。すなわち、ＣＰＣ−ｃｔｒｌにおいては、Ｓｒｃ  ＳＨ２と  ＥＲ  ＬＢＤとの間に位置する酵素を円順列変異していない点においてのみＣＰＣと異なっている。
【０１５４】
実施例２と同様に、２４ウエルプレートで培養したＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＰＣ又はｐＣＰＣ−ｃｔｒｌで一過性形質転換した。形質転換してから１６時間経過後、種々の濃度のＥ２又はＯＨＴによって、形質転換細胞を２０分間刺激した。発光強度を発光度計を用いて測定した。結果を図１８に示す。
【０１５５】
図１８に示すように、ＣＰＣはＯＨＴに感受性を示し、１０−９Ｍのような低濃度のＯＨＴでさえ反応した。半数影響濃度（ＥＣ５０）は、およそ５×１０−８Ｍであった。一方、ＣＰＣ−ｃｔｒｌは、ＯＨＴ又はＥ２に対して、全く発光量の変化を示さなかった（図１８）。その理由は、刺激物質の非存在下でさえ、バックグラウンド光発光量が非常に高いことであると考えられる。ＣＰＣ−ｃｔｒｌのバックグラウンド発光量は、ＣＰＣのバックグラウンド発光量よりも、おおよそ１０００倍多かった。結果として、図１８に示すように、バックグラウンド光に対するシグナル光の比率が乏しかった。
【０１５６】
〔実施例１１：ｐＣＰＣを導入したＣＯＳ−７細胞から発する光の波長〕
帯域通過フィルターにより遮光したそれぞれの発光量を比較した。ＣＯＳ−７細胞から発する光の波長を、一連の帯域通過フィルターを用いて試験した。実施例２と同様に、２４ウエルガラスプレートで培養したＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＰＣで一過性形質転換し、１６時間インキュベートした。セレンテラジンと、溶媒（０．１％  ＤＭＳＯ）、１０−６Ｍ  Ｅ２及び１０−６Ｍ  ＯＨＴのいずれか１つとを含むＨＢＳＳバッファ  ５００μＬに、細胞を浸した。リガンド刺激後２０分間のそれぞれの細胞からの発光量を、一連の帯域通過フィルターを用いて一定時間毎に、５１０±１０ｎｍ、５３５±１０ｎｍ、５４０±１０ｎｍ、５６０±１０ｎｍ、６１０±１０ｎｍの波長において観察した。結果を図１９に示す。
【０１５７】
図１９に示すように、当該ＣＯＳ―７細胞からの光は、６１０±１０ｎｍフィルターを能率的に通過した、すなわち、当該ＣＯＳ−７細胞は、赤−オレンジ光を発していることが示された。ＯＨＴによる発光量は、溶媒（０．１％  ＤＭＳＯ）による発光量よりも約５倍強かった。一方、Ｅ２による発光量は、溶媒による発光量よりも強かったが、その差は１．８倍程度であった。これらの結果から、ＯＨＴが赤−オレンジ光を選択的に上昇させることが示されたので、この発光は、エストロゲンレセプターに対するリガンドのアンタゴニスト活性の特異的な指標になることができる。
【０１５８】
〔実施例１２：ＣＰＧのリガンド感受性〕
ＣＯＳ−７細胞において、細胞質Ｃａ２＋の挙動を、ＣＰＧ及びＣＰＧ−ｃｔｒｌを用いて観察した。ＧＬｕｃをＱ１０５地点で切断し、断片を１０ＧＳリンカーを用いて円順列変異した。その外側の端部に、Ｍ１３及びＣａＭをそれぞれ融合して、ＣＰＧを作製した。ＣＰＧのコントロールプローブとして、ＣＰＧと同一の構成要素を用いて、ＧＬｕｃを円順列変異しない点のみにおいてＣＰＧと異なるＣＰＧ−ｃｔｒｌを並行して作製した（図２０）。
【０１５９】
実施例２と同様に、２４ウエル黒色ガラスプレートで培養したＣＯＳ−７細胞を、ｐＣＰＧ又はｐＣＰＧ−ｃｔｒｌで一過性形質転換し、セルインキュベータに１６時間ストックした。この細胞を、セレンテラジンを含むＨＢＳＳバッファ  ３００μＬに浸した。生物発光プレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を用いて、３０秒毎の発光量の変化を、０．１ｍＭから１ｍＭの濃度範囲のヒスタミンの添加後及び添加前にそれぞれ観察した。結果を図２１に示す。
【０１６０】
図２１に示すように、１ｍＭ  ヒスタミンに対して、ＣＰＧの発光量は直ちに上昇し、１０分後に概ね平衡に達した。ＣＰＧは、ヒスタミン濃度０．２５ｍＭで感受性を示し、ヒスタミン濃度０．２５ｍＭ〜０．７５ｍＭの範囲で、発光量が線形に上昇した。一方、ＣＰＧ−ｃｔｒｌは発光が不安定であり、ヒスタミンの非存在下でさえ、ＣＰＧよりも約１００倍多いバックグラウンド発光量を示した。ＣＰＧ−ｃｔｒｌは、１ｍＭのヒスタミン刺激では、ほとんど発光量を増加させなかった。
【０１６１】
これらの結果から、ＣＰＣとＣＰＣ−ｃｔｒｌとの場合にも示されたように、ＧＬｕｃの円順列変異はバックグラウンド発光を減少させるのに有利であることが理解される。バックグラウンド発光の減少により、ヒスタミンによって引き起こされる遊離Ｃａ２＋のレベルの挙動を安定して決定することができるようになった。
【０１６２】
〔実施例１３：ｐＣＰＧ−ｃｔｒｌを導入したＣＯＳ−７細胞における基質飽和の反応速度〕
ＣＯＳ−７細胞におけるセレンテラジン飽和の反応速度を、ｐＣＰＧ−ｃｔｒｌを導入したＣＯＳ−７細胞で観察した。実施例２と同様に、２４ウエルプレートで培養したＣＯＳ−７細胞をｐＣＰＧ−ｃｔｒｌで一過性形質転換し、１６時間インキュベートした。プレート上の細胞をＨＢＳＳバッファにより１回洗浄し、ＨＢＳＳバッファ  ５００μＬに浸した。セレンテラジン添加後の発光量の変化を、生物発光プレートリーダー（Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０；Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）により追跡した。結果を図２２に示す。図２２に示すように、ＣＯＳ−７細胞において、セレンテラジンの吸収は８．５分後に飽和した。
【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明に係る融合タンパク質は一分子型プローブであって、より高精度に標的タンパク質特異的リガンドを検出することが可能であるため、種々のタンパク質間相互作用を試験し得る。したがって、本発明に係る融合タンパク質は、バイオ産業、医薬品産業、食品産業等の広範な分野に応用することができる。特に、診断医療分野、ナノバイオ分野、薬理作用評価分野、環境分析分野等において、好適に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】本発明に係る円順列変異した発光酵素を有する生物発光プローブを示す概念図である。
【図２】本発明に係るＣＰＣのリガンド認識メカニズムを示す模式図である。
【図３】ホタルルシフェラーゼの結晶構造を示す図である。
【図４】ｐＣＰＦを発現させて得られた本発明に係る生物発光プローブ（ＣＰＦ）の分子構造を示す図である。
【図５】本発明に係る円順列変異した発光酵素を有する生物発光プローブを示す概念図である。
【図６】ＧＬｕｃ、ＦＬｕｃ及びＣＢＬｕｃの親水性分布解析の結果を示す図である。
【図７】本発明に係る生物発光プローブのリガンド感受性を比較したグラフを示す図である。
【図８】ＥＲ  ＬＢＤとＳｒｃ  ＳＨ２ドメインとの結合における、ＣＰＣとＣＰＣ-ｍｕｔのリガンド感受性を調査した結果を示す図である。
【図９】ＣＰＣ及びＳＭＣの分子構造を比較する模式図である。
【図１０】ＣＰＣのリガンド濃度−反応曲線を示す図である。
【図１１】様々なアンタゴニストに対するＣＰＣの相対感受性を比較したグラフを示す図である。
【図１２】ＯＨＴ−ＣＰＣ結合の経時変化のグラフを示す図である。
【図１３】ＯＨＴ−ＣＰＣ結合による発光量の経時変化のグラフを示す図である。
【図１４】ＣＰＧ及びＳＭＧの分子構造を比較する模式図である。
【図１５】ＣＰＧ及びＳＭＧのリガンド応答性を、それぞれの発光強度で比較したグラフを示す図である。
【図１６】ｐＣＰＧで形質転換されたＣＯＳ−７細胞における、リガンドにより上昇したＣａ２＋レベルに対する洗浄（リガンド除去）の効果のグラフを示す図である。
【図１７】ＣＰＣ及びＣＰＣ−ｃｔｒｌの分子構造を比較する模式図である。
【図１８】ＣＰＣ及びＣＰＣ−ｃｔｒｌのリガンド感受性を比較したグラフを示す図である。
【図１９】帯域通過フィルターで遮光した相対発光強度のグラフを示す図である。
【図２０】ＣＰＧ及びＣＰＧ−ｃｔｒｌの分子構造を比較する模式図である。
【図２１】ＣＰＧ及びＣＰＧ−ｃｔｒｌのリガンド結合反応速度を比較したグラフを示す図である。
【図２２】ＣＯＳ−７細胞におけるセレンテラジンの飽和速度のグラフを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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