(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型より高いリンゴ酸：キノン酸化還元酵素活性を有し、野生型より向上した５’−キサントシン一リン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)。
【請求項２】
リンゴ酸：キノン酸化還元酵素の活性がｍｑｏ発現増加によって増進された請求項１に記載のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)。
【請求項３】
下記式化１で示された構造を有する、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)由来のｍｑｏ遺伝子を含む、組換えベクター。
【化１】
0005553842.tif 000005
【請求項４】
請求項３の組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)。
【請求項５】
向上したリンゴ酸：キノン酸化還元酵素の活性を示す請求項４に記載のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)。
【請求項６】
菌株が向上した５’−キサントシン一リン酸生産能を有するコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)である請求項４に記載のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)。
【請求項７】
菌株がコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)ＫＣＣＭ１０９７２Ｐである請求項６に記載のコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)。
【請求項８】
請求項４によるコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)を培養する段階；および培養液から５’−キサントシン一リン酸を回収する段階を含む、５’−キサントシン一リン酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号７の遺伝子を含む図１の切断地図に示された構造を有する組換えベクター、前記組換えベクターで形質転換された、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を有するコリネバクテリア菌株(Corynebacteria strain)に関する。また、本発明は、前記コリネバクテリア菌株を用いた５’−キサントシン一リン酸の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５’−グアノシン一リン酸(5'-guanosine monophosphate：以下、“ＧＭＰ”という)は、イノシン一リン酸(inosine monophosphate：以下、“ＩＭＰ”という)のような香味増進剤として広く使用される食品添加剤である。ＧＭＰは、うま味を引き出し、その使用は、また使用されるグルタミン酸一ナトリウム(ＭＳＧ)に左右される。これは、普通にＩＭＰと共に使用され、ＭＳＧのうま味の強さを増加させる。
【０００３】
今まで知られているＧＭＰの製造方法の例には、（１）酵母ＲＮＡの酵素的分解法、（２）ＧＭＰへの直接微生物発酵法、（３）グアノシンへの微生物発酵に続いて化学的リン酸化する方法、（４）グアノシンへの微生物発酵に続いて酵素的リン酸化する方法、（５）キサントシン５’−一リン酸(xanthosine 5’-monophosphate：以下、“ＸＭＰ”という)への微生物発酵に続いてコリネバクテリア菌株によってＧＭＰに転換する方法、（６）ＸＭＰへの微生物発酵に続いてアミナーゼ活性を有するエシェリキア・コリ(Escherichia coli)によってＸＭＰをＧＭＰに転換する方法が含まれる。このうち、方法（１）は、物質供給の困難さがあり、経済的に無益であり、方法（２）は、ＧＭＰの膜透過性によって低い収率の短所がある。したがって、他の方法が産業的適用で広く用いられる。
【０００４】
ＸＭＰを生産してＧＭＰに転換させる方法において、ＸＭＰの生産性を増加させるのは重要である。例えば、韓国特許出願第１０−１９９１−０１８０１６号は、ＸＭＰを高収率で生産できるＸＭＰアミナーゼ不活性菌株を開示しており、これは、アデニンおよびグアニンに対して半栄養要求性であり、グアノシン類似体に耐性があり、細胞壁を破壊する酵素のリゾチームに対して非常に敏感である。韓国特許出願第１０−２００１−０００５１３号には、培養培地にＸＭＰを高濃度で直接蓄積させ得るコリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、およびそれを用いたＸＭＰの生産方法を開示している。前記菌株は、親株をＵＶ光で照射し、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(ＮＴＧ)などの突然変異誘発源で処理し、親株の形質を変形させてＸＭＰの生合成に影響を及ぼすバリンの類似体であるノルバリンに耐性の変異株を選別することによって製造される。韓国特許出願第１０−２００８−００６５３７号においては、ＸＭＰの生合成に関連した遺伝子のｐｕｒＮおよびｐｕｒＨを変形させてＸＭＰ収率を増加させる方法を開示している。
【０００５】
一方、ＡＴＰ生産は、ＸＭＰ収得を誘導するが、これはＡＴＰがＸＭＰの生合成に関与するためである。また、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性は、ＡＴＰの生産に大きな影響を及ぼす。しかし、ＸＭＰ生産収率を増加させるためにリンゴ酸デヒドロゲナーゼの活性を増進させるように考案された微生物および方法は、以前文献のどこにも言及されたことがない。
【０００６】
ＸＭＰ生産菌株のＡＴＰ生産を増加させることが重要であるということに留意し、本発明者らは、集中研究を行い、そういう増加の原因になる遺伝子を明らかにした。また、前記遺伝子の２つのコピーを連続的に含む組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株がＸＭＰを高収率で生産できることを明らかにした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも高い活性を有するコリネバクテリア菌株を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、配列番号７の遺伝子を含む図１の切断地図に示された構造を有する組換えベクターを提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、前記組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株を提供することである。
【００１０】
本発明の他のさらなる目的は、前記形質転換された微生物を培養し、培養液からＸＭＰを収得することによってＸＭＰを生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様により、本発明は、内在的リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性よりも増進された活性を有するコリネバクテリア菌株に関する。好ましくは、本発明のコリネバクテリア菌株は、内在的活性よりも高いリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するように変更されてＸＭＰ生産能が向上する。
【００１２】
本願で使用される用語“リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(malate dehydrogenase)”は、脱水素化によるリンゴ酸のオキザロ酢酸への転換を触媒する酵素を意味する。この酵素は、乳酸デヒドロゲナーゼと共に生物の非常に広い領域で発見され、その活性のために補助因子としてＤＰＮおよびＮＡＤを必要とし、これらは普通乳酸デヒドロゲナーゼを伴う。本発明によるコリネバクテリア菌株において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性は増加されてＸＭＰを高収率で生産する。
【００１３】
本願で使用されたような用語“内在的活性”は、野生型微生物中の関心のある酵素活性を表そうとするものである。用語“内在的活性よりも高い活性”は、酵素それ自体による活性増加からもたらされたものでもまたは、内在的遺伝子または外来遺伝子による活性増加からもたらされたものでも、内在的変種の活性と比較して増加された酵素活性を意味する。例えば、酵素活性の増加は、これに制限されないが、遺伝子コピー数の増加または減少、関心のあるプロモーターの代替、変形または突然変異などをはじめとする、技術分野において十分公知の任意の方法によって達成され得る。
【００１４】
本発明により増加される活性を有する標的酵素であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、コリネバクテリアのｍｑｏ遺伝子によってエンコードされる。ｍｑｏ遺伝子と生物学的に同一であるとか、符合する限り、任意の変異体または類似体が本発明で使用され得る。すなわち、遺伝子の活性がｍｑｏ遺伝子の活性と実質的に同一であるとか、類似する場合、ｍｑｏ遺伝子の範囲内に属する任意の遺伝子が本発明で有用である。好ましくは、本発明に有用な遺伝子は、ｍｑｏ配列と７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、より一層好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有する。より好ましくは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、配列番号７のヌクレオチド配列によってエンコードされる。遺伝子コピーの増加は、外来遺伝子の導入および／または内在的遺伝子の増幅によって達成され得る。遺伝子のコピー数は、必要および目的に応じて当業者によって容易に決定され得る。内在的遺伝子の増幅は、また、当技術分野に公知の方法、例えば、圧力下で適当な選択培地で培養する方法を用いて行うことができる。好ましい例において、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を運ぶベクターをコリネバクテリア菌株へ導入して、内在的活性よりも増進された活性を有する形質転換された微生物を生成した。
【００１５】
当技術分野に公知され、コリネバクテリア属微生物に属する限り、任意の菌株が制限なく本発明で使用され得る。好ましくは、本発明に有用なコリネバクテリア菌株の例としては、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、およびブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(Brevibacterium lactofermentum)が含まれるが、これらに制限されない。詳細には、コリネバクテリア菌株中で、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)ＦＥＲＭ  ＢＰ−１５３９、コリネバクテリウム・グルタミクム  ＡＴＣＣ  １３０３２、コリネバクテリウム・グルタミクム  Ｒ、ブレビバクテリウム・フラバム  ＡＴＣＣ  １４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム  ＡＴＣＣ  １３８６９およびこれらの誘導体がある。好ましいのは、コリネバクテリア・アンモニアゲネス  ＫＣＣＭ−１０５３０から形質転換されたコリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＫＣＪ−１３０４である。
【００１６】
本発明の他の態様により、本発明は、配列番号７の遺伝子を運ぶ図１の切断地図に示された構造を有する組換えベクターに関する。
【００１７】
配列番号７の遺伝子は、コリネバクテリアからのｍｑｏ遺伝子の野生型ヌクレオチド配列を有する。しかし、前記したように、誘導体または類似体がｍｑｏ遺伝子と生物学的に同一であるか、相応する限り、ｍｑｏ遺伝子の誘導体または類似体を運ぶ組換えベクターも本発明に有用であることが明らかである。本願で使用される用語“ｍｑｏ遺伝子”は、“リンゴ酸：キノン酸化還元酵素(malate:quinone oxidoreductase)”遺伝子の略語であって、リンゴ酸をオキサロ酢酸に酸化させる役割を果たすリンゴ酸オキサロ酢酸をコードする遺伝子を意味する。
【００１８】
好ましい実施態様において、配列番号７のｍｑｏ遺伝子を運ぶ組換えベクターを提供する。ｍｑｏ遺伝子を運ぶ限り、任意の通常的組換えベクターが制限なく本発明で使用され得る。好ましいのは、ｐＤＺ−ｍｑｏである。本発明の好ましい例において、配列番号７を含有するｍｑｏ遺伝子を用いて組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターを構築した（図１参照）。
【００１９】
本発明のさらなる態様により、本発明は、ｍｑｏ遺伝子を運ぶ組換えベクターで形質転換されたコリネバクテリア菌株に関する。
【００２０】
コリネバクテリア由来ｍｑｏ遺伝子は、制限なく当技術分野に公知の形質転換を用いて使用され得る。好ましくは、ｍｑｏ遺伝子は細胞への形質転換に使用するためのベクターにクローン化される。
【００２１】
当該技術分野に公知された場合、任意の形質転換方法が形質転換のために使用され得る。本願に使用されたような用語“形質転換”とは、外部ＤＮＡの導入、ゲノム統合および発現による細胞の遺伝的変更を意味する。典型的な形質転換方法には、ＣａＣｌ２沈殿法、ＤＭＳＯ(ジメチルスルホキシド)と組合せてＣａＣｌ２沈殿の効果が改善されたハナハン(Hanahan)方法、電気穿孔法、リン酸カルシウム形質移入法、原形質体融合法、シリコンカーバイド繊維媒介形質転換法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、ＰＥＧ媒介形質転換法、デキストラン硫酸、リポフェクタミン、および乾燥／抑制媒介形質転換法などが含まれる。本発明によるｐＤＺ−ｍｑｏでの形質転換は、形質転換の例に限定されず、当技術分野に公知の任意の方法を制限なく使用して達成され得る。
【００２２】
本願で使用されたような用語“ベクター”は、外部遺伝物質を適合な宿主細胞に運ぶビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子を意味し、転移遺伝子が宿主ゲノムと組換わるように許容する調節要素を含有するＤＮＡ構築物である。好ましくは、本発明によるｍｑｏベクターを運ぶ組換えベクターは、図１の切断地図に示された構造を有することができる。図１の切断地図によって示されたベクターは、コリネバクテリアに順次にまたは、同時に導入され得る。本発明の好ましい実施態様により、組換えベクターは、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＫＣＣＭ−１０５３０中に形質転換された後、選択培地で培養して２つのコピーのｍｑｏ遺伝子を相同組換えを介して宿主のゲノムに統合させ、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス  ＫＣＪ−１３０４と命名したコリネバクテリウム・アンモニアゲネスを生成する。これを受託番号  ＫＣＣＭ１０９７２Ｐとして寄託した。
【００２３】
コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４は、ＫＣＣＭ−１０５３０のゲノムに統合されたｍｑｏ遺伝子の２つのコピーを有するが、これは前記菌株への図１の切断地図に示された構造を有するｐＤＺ−ｍｑｏの導入および内在的遺伝子と２つのコピーのｍｑｏ遺伝子との相同組換えに起因する。
【００２４】
本発明のさらに別の態様により、本発明は、前記形質転換されたコリネバクテリア菌株を培養し、培養液からＸＭＰを回収する段階を含む、ＸＭＰの生産方法に関する。本発明において、ＸＭＰは形質転換された微生物の直接発酵によって高収率で生産される。好ましくは、形質転換された微生物は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が内在的活性よりも増進されたコリネバクテリア菌株である。組換えベクターのｍｑｏ遺伝子は、好ましくは形質転換された微生物のゲノムに統合されることによってＸＭＰを高収率で生産することができる。好ましい実施態様において、微生物は、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ１０９７２Ｐである。
【００２５】
当技術分野で公知の任意の培地が、ＸＭＰを生産できる菌株の培養に制限なく使用され得る。好ましくは、培地は、グルコースを炭素源として含有し、任意に様々な他の炭素源を含有する。関心のある微生物の培養に使用するために、培地は微生物の成長のための要求条件を満たさなければならない。コリネバクテリア菌株に対する培養培地は公知されている(例えば、文献[Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C.、USA,1981]参照)。コリネバクテリア菌株に有用な炭素源の例としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどのような糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などのようなオイルおよび脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸などのような脂肪酸、グリセロール、エタノールなどのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの炭素源は、個別的にまたは組合せて使用され得る。ペプトン、酵母抽出物、牛肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆粕のような有機物質、および尿素、および塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムのような無機化合物が培地で窒素源として個別的にまたは組合せて使用され得る。リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム塩がリン源として使用され得る。また、培養培地は、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などのような金属塩を含有することができる。さらに、アミノ酸および/またはビタミンが必須要素として要求され得る。培養培地は、また適合な前駆体を含有することができる。これらの物質は、回分式または連続式で培地に添加され得る。
【００２６】
培養培地は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどのような塩基性化合物または、リン酸または硫酸のような酸性化合物によってｐＨを調節することができる。脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して培養中に気泡の生成を防止することができる。培地は、酸素または、酸素含有気体(例えば、空気)で通気するようにして好気状態を維持するか、窒素、水素または二酸化炭素ガスで嫌気状態を維持する。培養温度は、一般的に２０℃〜４５℃、好ましくは、３０℃〜３５℃で維持する。培養は、最大量のＸＭＰが得られる時まで持続する。これに関連して、１０〜１６０時間の期間が要求される。
【００２７】
これで生産された５ＸＭＰは、培養培地に分泌されるか、細胞内に残っている。本発明によるＸＭＰ生産方法は、細胞または培養培地からＸＭＰを回収することを含む。細胞または培養培地からＸＭＰを回収するために、当技術分野でよく公知された任意の方法が用いられる。そのような方法の例としては、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
本発明で使用されたような用語“５’−キサントシン一リン酸”は、核酸生合成の中間体であって、動植物において生理学上重要性を有する。したがって、食品産業、製薬産業および医療産業をはじめとする様々な分野で適用され得る。キサントシン一リン酸は、特にＭＳＧとともに相乗作用をするキノコ味を提供するための核酸系香味増進剤として使用される食品添加剤である。ＸＭＰは、ＩＭＰから形成されるプリン代謝系の中間物質で、ＧＭＰを形成する。本発明による形質転換された微生物を使用する場合、ＸＭＰは既存の微生物に比べて約６％増進された高収率で生成され得る。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の形質転換されたコリネバクテリア菌株は、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの増進された活性によって、既存の微生物に比べて高収率でＸＭＰを生産する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、２つのコピーのｍｑｏ遺伝子がｐＤＺベクターに挿入された組換えベクターｐＤＺ−ｍｑｏの構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
例示のために提示された下記実施例を介して本発明をさらによく理解できるが、これは本発明を制限しようとするものではない。
【００３２】
実施例１：ＸＭＰ生産菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ−１０５３０由来ｍｑｏのクローニングおよびゲノム統合のための組換えベクター（ｐＤＺ−ｍｑｏ）の構築
ｍｑｏ遺伝子のヌクレオチド配列(NCBI ID_3345228)をＮＩＨジェンバンク(GenBank)のデータから得た。前記配列に基づいて、２対のプライマー(配列番号１〜４)を合成した。
コリネバクテリウムＫＣＣＭ−１０５３０を鋳型としながら、高信頼ＤＮＡポリメラーゼ  ＰｆｕΜｌｔｒａＴＭ(ストラタジーン(Stratagene))の存在下で前記配列番号１〜４のプライマーを使用して９５℃で３０秒間変性させ、５５℃で３０秒間アニーリングさせ；６８℃で２分間伸長させることを２５回繰り返した。こうして得たＰＣＲ生成物は、それぞれ２．１ｋｂのｍｑｏ遺伝子２つのコピー(ｍｑｏ−Ａ、ｍｑｏ−Ｂ)であり、これを配列番号１と２、および配列番号３と４の２つのセットをそれぞれ使用して増幅させた。
配列番号１：ｇｃｔｃｔａｇａＡＴＣＧＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣ
配列番号２：ｃｇｃｇｇａｔｃｃＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡ
配列番号３：ｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＣＧＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣ
配列番号４：ｇｃｔｃｔａｇａＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡ
適合した制限酵素で処理した後に（ｍｑｏ−Ａ：ＸｂａＩ＋ＢａｍＨＩ、ｍｑｏ−Ｂ：ＢａｍＨＩ＋ＸｂａＩ）、ＰＣＲ生成物であるｍｑｏ−Ａおよびｍｑｏ−Ｂを３片接合を介してＸｂａＩとエビアルカリ性リン酸加水分解酵素で以前に処理したｐＤＺベクターへ挿入した(大韓民国特許出願第１０−２００７−９４４３３号参考)。最終的に、ｍｑｏ遺伝子２つのコピーが連続的にクローン化された組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターを得た。図１は、コリネバクテリウムゲノムに統合させるための組換えｐＤＺ−ｍｑｏベクターの構造を示す模式図である。
【００３３】
実施例２：ｍｑｏ挿入された菌株の生成
前記ｐＤＺ−ｍｑｏベクターをＫＣＣＭ−１０５３０菌株に形質転換し、ゲノム上のｍｑｏ遺伝子に隣接した位置で一つのｍｑｏ遺伝子を挿入するためにゲノムと相同組換えを行った。こうして、そのゲノム上に２つのコピーのｍｑｏ遺伝子を有する、コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４と命名した新規ＸＭＰ生産菌株を得た。２つコピーのｍｑｏ遺伝子の連続的挿入は、２つコピーのｍｑｏ遺伝子のヌクレオチド配列の上流と下流を標的とするプライマーセット(配列５および６)を用いたＰＣＲで確認した。
配列番号５  ＣＴＴＴＴＣＧＡＴＧＡＣＧＣＣＣＡＡ
配列番号６  ＣＣＡＣＴＴＴＡＴＣＧＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡ
【００３４】
実施例３：ｍｑｏ挿入された菌株のリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性
実施例２で製造されたＸＭＰ生産コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４に対して下記のようにリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を分析した。前記菌株をバクトペプトン１０ｇ／ｌ、バクト牛肉抽出物５ｇ／ｌ、バクト酵母抽出物５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ、アデニン５０ｍｇ／ｌ、およびグアニン５０ｍｇ／ｌを含有した培地に接種し、３０℃で１２時間ＯＤ１０が得られるまでインキュベーションさせた。細胞培養液１０ｍｌを回収して５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ 酢酸カリウム、１０ｍＭ ＣａＣｌ２および１０ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む緩衝液で２回洗浄し、同じ緩衝液１ｍｌに懸濁させた。超音波粉砕機(sonicator)を用いて中断させた後、細胞溶解物を遠心分離させた。上澄液を再び遠心分離してペレットを得た後、これを緩衝液１００μｌに懸濁させた。この懸濁液のうち、１０μｌを酵素液として使用した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ酢酸カリウムおよび５０μＭ２，６−ジクロロインドフェノール(Cl2Ind)を混合して反応緩衝液を製造した。Ｃｌ２Ｉｎｄは、解凍させて反応直前に混合した。前記反応混合物９８０μｌに基質として１００ｍＭリンゴ酸１０μｌおよび酵素液１０μｌを添加した後、３０℃で１５分間振盪しながらインキュベーションさせた。酵素活性は、還元されたＣｌ２Ｉｎｄの濃度を測定することによって決定した。Ｃｌ２Ｉｎｄは、６００ｎｍで２２ｃｍ−１ｍＭ−１の吸収係数を有した。
【００３５】
【表１】
0005553842.tif 000002
【００３６】
表１に示されたように、ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０に比べてリンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性が３０．６％増加したことが観察された。
【００３７】
実施例４：ｍｑｏ挿入された菌株のＸＭＰ生産
ＸＭＰを生産するために、実施例２で製造されたＸＭＰ生産菌株であるコリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＪ−１３０４を下記のように培養した。母菌株コリネバクテリウム・アンモニアゲネスＫＣＣＭ−１０５３０および変異株ＫＣＪ−１３０４をそれぞれ下記の種培地３ｍｌを含有する１４ｍｌチューブにそれぞれ接種し、３０℃で２０時間２００ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションさせた。その後、種培養液を０．４ｍｌの量でそれぞれ２５０ｍｌコーナーバッフル(corner-baffle)フラスコに含まれた３２ｍｌの下記の生産培地(２４ｍｌ本培地＋８ｍｌ培地Ａ)に添加した後、続いて３０℃で２３０ｒｐｍで９６時間振盪培養した。以後、ＨＰＬＣを用いて５’−ＸＭＰの生産を定量的に測定した。コリネバクテリウム・アンモニアゲネズＫＣＪ−１３０４から生産されたＸＭＰの量を下記の表２に示した。
【００３８】
【表２】
0005553842.tif 000003
【００３９】
種培地：グルコース３０ｇ／ｌ、ペプトン１５ｇ／ｌ、酵母抽出物１５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ２．５ｇ／ｌ、尿素３ｇ／ｌ、アデニン１５０ｍｇ／ｌ、グアニン１５０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
生産培地（本培地）：グルコース８０ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム１０ｇ／ｌ、硫酸鉄２０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／ｌ、硫酸マンガン１０ｍｇ／ｌ、アデニン３０ｍｇ／ｌ、グアニン３０ｍｇ／ｌ、ビオチン１００μｇ／ｌ、硫酸銅１ｍｇ／ｌ、塩化チアミン５ｍｇ／ｌ、塩化カルシウム１０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．２
生産培地（培地Ａ）：リン酸一水素カリウム１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１０ｇ／ｌ、尿素７ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／ｌ
【００４０】
表２のデータから明らかなように、ＫＣＪ−１３０４は、母菌株ＫＣＣＭ−１０５３０と比較して、ＸＭＰ生産が５．９％増加に相応する１．７ｇ／ｌ増加したことが確認された。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様が例示的な目的のために開示されたが、当業者は添付された請求項に開示されたような本発明のカテゴリーおよび趣旨を逸脱することなく、様々な変更、付加および代替が可能であることが理解されよう。
【００４２】
【表３】
0005553842.tif 000004
【図１】
0005553842.tif 000006
【配列表】
0005553842000001.app