(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、サンプル中の修飾ペプチドの定量化方法：
（ａ）サンプルからペプチド類を得る；
（ｂ）工程（ａ）で得られたペプチド類に参照修飾ペプチドを追加して、ペプチド類と参照修飾ペプチドとの混合物を形成する；
（ｃ）ペプチド類と参照修飾ペプチドとの混合物について質量分析（ＭＳ）を行い、サンプル中のペプチド類に関するデータを得る；および
（ｄ）サンプル中のペプチド類に関するデータを、修飾ペプチドに関するデータベース内のデータと、コンピュータプログラムを使用して比較する；
ここで、修飾ペプチドに関するデータベースは、以下を含む方法によってコンパイルされる：
（ｉ）サンプルからペプチド類を得る；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた富化された修飾ペプチドについて液体クロマトグラフ−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う；
（ｉｖ）修飾ペプチドを同定するために工程（ｉｉｉ）で検出された修飾ペプチドを既知のリファレンスデータベースと比較する；
（ｖ）  工程（ｉｖ）で同定された修飾ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。
【請求項２】
前記修飾ペプチド類がリン酸化ペプチド類である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが細胞ラインまたは一次組織である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ａ）が以下を含む、請求項１から３のいずれか１項記載の方法：
（１）サンプルに細胞を溶解する；
（２）工程（１）で得られた溶解細胞からタンパク質を抽出する；および
（３）前記タンパク質をペプチド類に分解する。
【請求項５】
前記工程（３）が、プロテアーゼを使用して行われる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記プロテアーゼがトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｃ、およびＡｓｐＮから成る群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記工程（３）は、５から３０のアミノ酸類のペプチド類まで前記タンパク質を分解することを含む、請求項４から６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｂ）が、前記ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物から修飾ペプチドを富化し、富化された修飾ペプチドの混合物を製造し、工程（ｃ）は、該富化された修飾ペプチドの混合物に質量分析法（ＭＳ）を行い、サンプル中の修飾ペプチド類に関連したデータを得ることを含む、請求項１から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｂ）における修飾ペプチドの富化工程が、クロマトグラフィーを使用して行われる、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記クロマトグラフィーは固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィー、および二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）クロマトグラフィーから成る群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記工程（ｂ）における修飾ペプチドの富化工程が、抗体に基づく方法で行われる、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
前記サンプル内のペプチド類に関連するデータが、（質量／電荷）比（ｍ／ｚ）、電荷（ｚ）、ペプチド類の相対保持時間である、請求項１から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｃ）における前記質量分析法（ＭＳ）は液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）である、請求項１から１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記工程（ｉ）が以下を含む、請求項４から７のいずれか１項記載の方法：
（１）サンプルに細胞を溶解する；
（２）工程（１）で得られた溶解細胞からタンパク質を抽出する；および
（３）前記タンパク質を請求項４の工程（３）に記載されたものと同じ方法でペプチド類に分解する。
【請求項１５】
前記工程（ｉｉ）が、多次元クロマトグラフィーを使用して行われる、請求項１から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記多次元クロマトグラフィーが、強カチオン交換高速液クロマトグラフィー（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、または二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して行われる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記多次元クロマトグラフィーが、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、または二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して行われる、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ｉｉ）が、抗体に基づく方法を使用して行われる、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
前記修飾ペプチドに関連するデータが、修飾ペプチドの同定、（質量／電荷）比（ｍ／ｚ）、電荷（ｚ）、および相対保持時間から成る群から選択される、請求項１から１８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は修飾ペプチドの定量化方法に関し、特にはりん酸化ペプチドの定量化方法に関する。例えば、そのような方法は、タンパク質のリン酸化部位を特定し定量化して、プロテインキナーゼの活性を定量化するのに使用される。
【背景技術】
【０００２】
官能基の添加でほとんどのタンパク質は何らかの修飾を受け、これらの修飾は質量分析法で検出できる。
【０００３】
質量分析法で検出できる蛋白質修飾としては、リン酸化、ニトロ化、グルコシル化、アセチル化、メチル化、および脂質化があげられる。これらの蛋白質修飾は細胞で様々な生物学的役割を持っている。質量分析法（ＭＳ）は、分子または原子をイオン化して、蒸発させ、それらの質量／電荷数比によりこれらのイオン類を分離できる装置に導入し、イオン類の（質量／電荷）比を測定する解析技術である。また、質量分析法は、分子類を断片に破壊し、その結果、分子類の構造決定を可能にすることを伴う。液体クロマトグラフ法の物理的分離のテクニックとのＭＳの組み合わせは、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）として知られている。
【０００４】
典型的なＭＳ手順で、サンプルはＭＳ装置にロードされ、そしてこのサンプル中に存在している化合物はイオン化される。これは例えば、電子衝撃イオン化（ＥＳＩ）またはマトリツクスアシステッドレーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）による。そして、イオン類の質量／電荷比は異なった形式の質量分析、たとえば飛行時間、イオントラップまたは四重極、またはこれらの組み合わせで計算される。
【０００５】
正常細胞のホメオスタシスは細胞信号系路(cell signalling pathways)の動作で制御される。これが緩和されると、癌、神経変性、アレルギーおよび糖尿病を含む多くの疾病の原因となる。タンパク質と脂質キナーゼはこれらの系路の重要な要素である。したがって、これらの酵素は多くの疾病の治療のために最も重要な薬物標的のクラスの１つを表す。
【０００６】
酵素活性の不偏性検出のためのアプローチが報告された。酵素活性部位の反応性アミノ酸へ共有結合する化学プローブを使用することは可能である(Blethrow, J.D. 他. Proc NatlAcadSci USA 105, 1442-1447 (2008))または基体上のアミノ酸へ共有結合する化学プローブを使用することも可能である(Barglow, K.T. & Cravatt, B.F. Nat Methods 4, 822-827 (2007))。プローブに結合されたタンパク質は、親和性により精製され、質量分析法によって同定される。このアプローチは活性と基体を検出できるが、多くの細胞を必要とする。そして、提供された情報は、定性的である。
【０００７】
より定量的なアプローチとして、特異的キナーゼの基体であることが知られているタンパク質におけるリン酸化部位の定量化は、キナーゼ活性の尺度として機能する。
読み取りとして質量分析法を使用して実行すると、このアプローチはただ一つの実験で数百ないし数千のリン酸化部位の定量化を許容する。例えば、安定同位体での代謝性の標識付けを使用して（ＳＩＬＡＣアプローチ）、ＥＦＧでヒーラ細胞を処理したときに異なるレベルの発現を示す２０００よりも多いリン酸化部位の定量化が可能であった(Olsen, J.V. 他、 Cell 127, 635-648 (2006))。しかしながら、細胞が標識されたアミノ酸類を取り入れるために代謝的に活性である必要があるので、１次組織による細胞シグナリングを定量化する一般的ツールとしてこのアプローチを使用できない。また、少ないスループットは有用性を制限する。
【０００８】
りん酸化ペプチドを測定するために同位体でラベルされた内部標準ペプチド類の使用は代替手段である場合がある(Gerber, S. A.他、 Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6940-6945 (2003)) 。理論的には可能であるが、内部標準として使用する安定同位体でラベルされた何千ものりん酸化ペプチドの合成は実際には可能でない。
【０００９】
安定同位体で化学的にペプチド類をラベルするのに、ｉＴＲＡＱ試薬を使用できる(Ross, P. L.; 他、MoI Cell Proteomics 2004, 3, (12), 1154-69.)。修飾ペプチドを含むペプチド類の相対定量化にこのテクニックを使用できる。制限は、比較できるサンプル数が同位体標識の数によって制限されるということである。データの統計的検証を得るために有用性に限界がある。化学標識付けは、また、薬が使用される状況で実用的でなく、化学反応段階で可変性が導入される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、当該技術分野において、第１次組織における、シグナルリング系路の、不偏性で、包括的で正確な測定に使用できる方法に対する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の発明者は修飾ペプチド(modified peptides)の定量化方法、特にはりん酸化ペプチドの定量化方法の改良方法を見いだした。本発明の方法は修飾ペプチドに関するデータベースの作成と、生物試料から得たデータのデータベースとの比較、典型的にはコンピュータプログラムを使用した比較を含む。
【００１２】
第１の態様では、本発明はサンプル中の修飾ペプチドの定量化方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：
（ａ）  サンプルからペプチド類を得る；
（ｂ）  工程（ａ）で得られたペプチド類に参照修飾ペプチド（reference modified peptides）を追加し、ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物を製造する；
（ｃ）  ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物について質量分析法（ＭＳ）を行い、サンプル中のペプチド類に関連したデータを得る；および
（ｄ）  修飾ペプチドに関するデータベース内のデータと、サンプル中のペプチド類に関連するデータを、コンピュータプログラムを使用して比較する；
ここで、修飾ペプチドに関するデータベースが、以下を含む方法によってコンパイルされる：
ｉ）    サンプルからペプチド類を得る；
ｉｉ）  工程（ｉ）で得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する（enriching）；
ｉｉｉ）  工程（ｉｉ）で得られた富化された修飾ペプチドについて液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う。
ｉｖ）  修飾ペプチドを同定するために、工程（ｉｉｉ）で検出された修飾ペプチドを、既知のリファレンスデータベースと比較する；および
（ｖ）  工程（ｉｖ）で同定された修飾ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明はサンプルの修飾ペプチドの定量化方法を提供する。本発明の方法は、質量分析法で検出できるすべての修飾を含むペプチド類の定量化に適している。
【００１４】
本発明の方法は、より長いタンパク質から得られる修飾ペプチドを定量化するのに使用される。同時に何千もの修飾ペプチドを定量化するのに本発明の方法を使用できる。
【００１５】
また、本発明の方法は、例えば、アセチル化、ニトロ化、グリコシル化、メチル化および／または脂質化によって修飾されたペプチド類の定量化に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の実施態様について図説するフローチャートである。
【図２】図２Ａから2Ｄは、ＴＩＱＵＡＳを使用する細胞信号の定量分析のための戦略を示す。
【図３】図３−１から図３−３は、実施例１の分析で同定されたリン酸化部位の例を示す。
【図４】図４Ａは、ＰＩ−１０３に対する異なる感受性で、細胞ライン内のＰＩ−１０３による、増殖の５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を示す。図４Ｂは、同じ細胞ラインに本発明の方法を使用したりんペプチドの定量化の結果を示している。
【図５】図５Ａから５Ｄは、無標識のＬＣ−ＭＳによる、正確なりんペプチド定量化のための戦略を示す。
【図６】図６Ａから６Ｆは、シグナル伝達阻害剤への異なった鋭敏度を有するＡＭＬ細胞ラインが、蛋白質リン酸化の顕著に異なるパターンを示すことを示す。
【００１７】
本発明の方法は特にサンプル中のりん酸化ペプチドの定量化に有用である。その結果、１つの実施態様では、修飾ペプチドはりん酸化ペプチドである。本本明細書において、本発明の実施態様での「リンタンパク質」、または「ホスホタンパク質」という用語は、りん酸化蛋白質について言及するのに使用される。そして、「りんペプチド」、および「ホスホペプチド」という用語は、りん酸化ペプチドについて言及するのに使用される。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ペプチド類を含むすべてのサンプルの修飾ペプチドを定量化するのに本発明の方法を使用できる。サンプルは、典型的には生物試料であり、生物源から入手されたすべてのタイプのサンプル、例えば人間、動物、植物またはバクテリアから入手されたサンプルであることができる。その結果、本発明は人間および非人間のソースから入手されたサンプルの使用を包含する。
【００１９】
本発明の方法は対象となる任意の種からのサンプルの修飾ペプチドの検出と定量化に使用できる。典型的に、本発明の方法は、人間または動物からのサンプルを分析するのに使用される。動物は、典型的にマウス、ラット、モルモット、牛、羊またはヤギである哺乳動物である。あるいはまた、動物はたとえば鶏のような鳥、ゼブラ・フィッシュのような魚、虫の線虫のようなネマトーダ、またはミバエキイロショウジョウバエなどの昆虫などである。また、バクテリアや酵母などの他の生命体からのサンプルを分析するのに本発明の方法を使用できる。エシュリキア属大腸菌、サルモネラ・エンテリカ、肺炎球菌または黄色ブドウ球菌などのバクテリア、またはパン酵母サッカロマイセスセレビシアエまたは分裂酵母シゾサッカロマイセスポンベなどの酵母などの、実験的に重要な種からのサンプルを分析するのに本発明の方法を使用できる。また、植物、かび類またはウイルスからのサンプルを分析するのに本発明の方法を使用できる。
【００２０】
典型的には、人間から生物試料を得る。例えば、尿、血液、または別の組織などの体液のサンプルであることができる。典型的に、生物試料は、細胞ライン(cell line)または組織、典型的には１次組織である。例えば、サンプルは人間または動物からの組織であることができる。人間または動物は、健康であるか、または病的であることができる。
【００２１】
本発明のいくつかの実施態様では、サンプル自体またはサンプルが入手される生体が、本発明の方法を行う前にテスト物質で処理される。したがって、この実施態様では、組織が得られる細胞ラインまたは生体が、細胞ラインまたは組織に本発明の方法を行う前に、テスト物質で処理される。テスト物質は、典型的には外来化学物質または薬物であり、たとえば低分子阻害剤、ＲＮＡｉ、治療用ペプチド、および抗体であることができる。本発明のこの実施態様は、テスト物質のペプチド修飾への効果の調査を許容する。たとえばりん酸化ペプチドを定量化するのに使用される１つの実施態様では、本発明の方法を行う前に、系路のアゴニスト（agonists of pathways）、および／またはキナーゼ阻害薬で細胞ラインを処理できる。典型的なキナーゼ阻害薬は、実施例で使用されるように、ワートマニンやＰＩ−１０３などのＰＩ３Ｋの阻害剤を含んでいる。少なくとも８０のキナーゼ阻害薬が異なったステージで臨床開発中である(Zhang, J.;et al Nat Rev Cancer 2009, 9,（１），２８−３９）。このテクニックも、キナーゼ経路に影響を与えると疑われた他のタイプの阻害剤、たとえばＨＳＰ９０阻害剤、ホスファターゼ阻害剤および抗体医薬を調査するために有用である。
【００２２】
本発明の方法の工程（ａ）は、サンプルからペプチド類を得ることを含む。当技術分野で知られていた任意の適切な方法を使用することでサンプルからペプチド類を得ることができる。
【００２３】
１つの実施態様では、本発明方法の工程（ａ）は以下を含む：
(1)サンプルに細胞を溶解する；
(2)工程（１）で得られた溶解細胞からタンパク質を抽出する；および
(3)前記タンパク質をペプチド類に分解する。
【００２４】
本発明のこの実施態様の工程（１）では、サンプル中の細胞は、溶解されるか、またはパックリと裂ける(split open)。当技術分野で知られている任意の適当な手段を使用して細胞を溶解することができる。例えば機械的な溶解（例えば、ワーリングブレンダを使用する）、液体均質化、超音波処理または手動による溶解（例えば、乳棒と乳鉢を使用する）などの物理的方法またはＣＨＡＰＳまたはトリトン−Ｘなどの界面活性剤に基づく方法を使用できる。典型的には、細胞は、尿素ベースのバッファなどの変性バッファを使用することで溶解される。
【００２５】
本発明のこの実施態様の工程（２）では、タンパク質が工程（１）で得られた溶解細胞から抽出される。言い換えれば、タンパク質は溶解細胞の他の成分から分離される。
【００２６】
本発明のこの実施態様の工程（３）では、溶解細胞からのタンパク質はペプチド類まで分解される。言い換えれば、タンパク質は、より短いペプチド類へ分解される。また、タンパク質の分解は一般的に消化と呼ばれる。本発明で当技術分野で知られている任意の適当な薬剤を使用することでタンパク質切断を行うことができる。
【００２７】
タンパク質切断または消化が、プロテアーゼを使用することで典型的に行われる。本発明では任意の適当なプロテアーゼが使用できる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にはトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｃ、および／またはＡｓｐＮである。あるいはまた、化学的にタンパク質を分解することができる。例えばヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、ＢＮＰＳ−スカトール、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）または他の適当な薬剤が使用できる。
【００２８】
本発明に使用されるペプチド類、および上で説明した工程（３）でタンパク質切断または消化で典型的に製造されるペプチド類は、質量分析に適している。典型的に、そのようなペプチド類は約５から３０のアミノ酸長さであり、例えば７から２５のアミノ酸類、１０から２０のアミノ酸類、１２から１８のアミノ酸または１４から１６のアミノ酸類である。しかしながら、より短いかまたはより長いペプチド類、たとえば約２から約５０、約３から約４０、または約４から約４５のアミノ酸類なども使用できる。分析できるペプチドの長さは、質量分析計のそのような長いペプチド類を配列する能力によって制限される。ある場合には、最大３００のアミノ酸類のポリペプチドを分析できる。
【００２９】
本発明の方法の工程（ｂ）では、参照修飾ペプチドはサンプルから得られたペプチド類に追加され、ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物を製造する。その結果、工程（ｂ）は１サンプルあたり１つのペプチド類混合物（修飾したものを含む）をもたらす。また、参照修飾ペプチドは本明細書では「内部標準」（ＩＳｓ）と呼ばれる。典型的には、５から１０、例えば、６から９または７から８の参照修飾ペプチドが加えられる。
【００３０】
本発明では、参照修飾ペプチドは典型的には、参照りん酸化ペプチドである。そのような参照りん酸化ペプチドは、しばしば内部標準（ＩＳ）タンパク質と呼ばれる、定義された特性と濃度の参照蛋白質から典型的に得る。ＩＳｓは市販のタンパク質、例えば、カゼインである場合がある。あるいはまた、ＩＳｓは特に本発明における使用のために合成される。本発明のこの実施態様では、参照りん酸化ペプチドはそれが定量化するのが望ましいりん酸化ペプチドのいくつかと同じ配列で典型的に合成されるが、炭素と窒素の安定した重同位元素が富化される。ペプチド類は、１回に１つのアミノ酸が加えられ、アミノ酸鎖またはポリペプチドを形成する固相化学を使用することで典型的に合成される。
【００３１】
典型的に、そのようなペプチド類は一般的な１２Ｃと１４Ｎを置換する、１３Ｃと１５Ｎで富化される。この富化作用は、同じ配列を有する内因のりん酸化ペプチドより約６から１０ダルトン重い参照りん酸化ペプチドをもたらし、質量分析計を使用することでそれらを区別できるようにする。
【００３２】
本発明の別の実施態様では、本発明方法がアセチル化ペプチドを定量化するのに使用されるとき、参照修飾ペプチドは、参照アセチル化ペプチド類である。そのような参照アセチル化ペプチドは、典型的にはアセチル化アミノ酸類を含む合成ペプチドである。
【００３３】
参照修飾ペプチドは、典型的には比較されるそれぞれのサンプルに既知量で加えられる。内因の修飾ペプチドに関する信号は、川下の分析での参照修飾ペプチドに関する信号に規格化される。
【００３４】
１つの実施態様では、本発明方法の工程（ｂ）が、工程（ｂ）で得たペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物から修飾ペプチドを富化し、富化された修飾ペプチドの混合物を製造する。その結果、この付加段階は１サンプルあたり１つの富化された修飾ペプチドの混合物をもたらす。本発明のこの実施態様では、工程（ｃ）は、富化された修飾ペプチドの混合物に質量分析法（ＭＳ）を行い、サンプル中のペプチド類に関連したデータを得る。本発明のこの実施態様では、工程（ｂ）は典型的には富化されたりん酸化ペプチドの混合物をもたらす。
【００３５】
修飾ペプチドの富化工程は、クロマトグラフィーを使用することで典型的に行われる。１つの実施態様では、クロマトグラフィーは固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィー、および／または二酸化ジルコニウム（ＺｒＯ２）クロマトグラフィーである。典型的には、クロマトグラフィーは、ＩＭＡＣおよびＴｉＯ２クロマトグラフィーである。
【００３６】
あるいはまた、修飾ペプチドを富化する工程は、抗体に基づく方法を使用することで行われる。
【００３７】
本発明の１つの実施態様では、定量化されるペプチド類がりん酸化ペプチドである場合、チロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジンなどのりん酸化アミノ酸への親和性を有する抗体が、固体マトリックスに結合される（固定される）。りん酸化ペプチドはこれらの抗体が特異的にりん酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。そして、りん酸化ペプチドが抗体被覆基質上に保持されるのに対して、非リン酸化ペプチド類は洗浄除去される。固定された抗体からのりん酸化ペプチドの溶離は、低ｐＨ溶媒の使用、または抗体とりん酸化ペプチドの間の相互作用をなくす他の適切な方法により行われる。
【００３８】
本発明の別の実施態様では、定量化されるペプチド類が、アセチル化ペプチドペプチド類である場合、アセチル化アミノ酸残基に対する特異的抗体の使用により富化される。そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが固定された抗体の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。
【００３９】
本発明の方法の工程（ｃ）では、質量分析法（ＭＳ）が工程（ｂ）で得たペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物について行われ、サンプル中のペプチド類に関連したデータを得る。典型的に、このデータはサンプルのためのＭＳデータファイルの形である。本発明のひとつの実施態様では、本発明方法の工程（ｂ）が、工程（ｂ）で得たペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物から修飾ペプチドを富化し、富化された修飾ペプチドの混合物を精製することをさらに含む場合に、工程（ｃ）は富化された修飾ペプチドの混合物に質量分析法（ＭＳ）を行い、典型的にはサンプルのＭＳデータファイルである、サンプル内のペプチド類に関するデータを得る。典型的に、質量分析法は液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）である。その結果、工程（ｃ）は典型的に、ＬＣ−ＭＳ  データファイル（それぞれのサンプルから１つ）をもたらす。
【００４０】
典型的には、サンプル内のペプチド類に関するデータは、ペプチド類の質量／電荷（ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、および／または相対保持時間を含む。
【００４１】
本発明方法の工程（ｄ）では、サンプル中のペプチド類に関連するデータ（典型的にはＭＳデータファイル形式であり、より典型的にはＬＣ−ＭＳデータファイルの形式である）は、修飾ペプチドに関するデータベースのデータと、コンピュータプログラムを使用して比較される。たとえば、サンプル中のペプチド類の（質量／電荷：ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、および相対保持時間が、データベースの（質量／電荷：ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）、および相対保持時間と比較される。これは、修飾ペプチドに関するデータベースを使用することで、サンプルのそれぞれの修飾ペプチドの同定と定量化を可能にする。
【００４２】
典型的には、コンピュータプログラムは、ＰＥＳＣＡＬ(Vanhaesebroeck、B.MoI Cell Proteomics 6(9)、1560-73、Cutillas、P.R.;2007)と呼ばれるプログラムである。ＰＥＳＣＡＬは、比較されるべきすべてのサンプルから、データベースに存在するそれぞれの修飾ペプチドのために抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ、すなわち溶出プロファイル）を構成する。りん酸化されるべき、先に同定されたペプチドの質量／電荷と保持時間（すなわち、手順の第１で構成されたデータベース中の存在）にＸＩＣをセンタリングすることによって行われる。また、ＰＥＳＣＡＬは、ペプチドの電荷が同一性の正しい指摘の助けになると考えている。また、プログラムはそれぞれのＸＩＣのピーク高さとカーブの下の面積について計算する。データは、参照修飾ペプチドにより分析されたそれぞれの修飾ペプチドの強度読み（ピーク面積または高さ）で割ることによって規格化される。
【００４３】
本発明の方法において、修飾ペプチドに関するデータベースは、以下の工程を含む方法によってコンパイルされる：
（ｉ）サンプルからペプチド類を得る；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた富化された修飾ペプチドに液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う；
（ｉｖ）修飾ペプチドを同定するために、工程（ｉｉｉ）で検知された修飾ペプチドと、既知のリファレンスデータベースを比較する；および
（ｖ）工程（ｉｖ）で同定された修飾ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。
【００４４】
本発明方法の工程（ｉ）は、サンプルからペプチド類を得ることを含む。当該技術分野で知られていた任意の適切な方法を使用してサンプルからペプチド類を得ることができる。
【００４５】
サンプルは典型的に生物試料であり、上記のように生物源から入手されたすべてのタイプのサンプルであることができる。典型的に、サンプルは、細胞ラインまたは１次組織である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施態様では、工程（ｉ）に使用されるサンプルは細胞ラインであり、サンプルは工程（ｉ）を行う前に阻害剤で処理される。阻害剤は任意の適当なタイプの阻害剤であることができる。典型的には、本発明の方法がりん酸化ペプチドを定量化するのに使用されるときには、阻害剤はホスファターゼ阻害剤である。ホスファターゼ阻害剤による処理はリン酸化の化学量論量を増加させ、データベースに含むことができるより大きい数のりん酸化ペプチドに帰結する。さらに、目的がアセチル化されたペプチド類およびメチル化されたペプチド類である場合には、それぞれメチル基転移酵素またはアセチル加水分解酵素阻害剤を使用できる。
【００４７】
１つの実施態様では、本発明方法の工程（ｉ）は以下を含む：
(1)サンプルの細胞を溶解する；
(2)工程（１）で得られた溶解細胞からタンパク質を抽出する；および
(3)上記の工程（ａ）の工程（３）と同じ方法を使用して、前記タンパク質をペプチド類に分解する。
【００４８】
本発明のこの実施態様の工程（１）では、サンプルの細胞は、溶解されるか、またはパックリと裂ける。当技術分野で知られている任意の適当な手段を使用して細胞を溶解することができる。例えば機械的な溶解（例えば、ワーリングブレンダを使用する）、液体均質化、超音波処理または手動による溶解（例えば、乳棒と乳鉢を使用する）などの物理的方法またはＣＨＡＰＳまたはトリトン−Ｘなどの界面活性剤に基づく方法を使用できる。典型的に、細胞は、尿素ベースのバッファなどの変性バッファを使用して溶解される。
本発明のこの実施態様の工程（２）では、タンパク質は工程（１）で得られた溶解細胞から抽出される。言い換えれば、タンパク質は溶解細胞の他の成分から分離される。
【００４９】
本発明のこの実施態様の工程（３）では、溶解細胞からのタンパク質は、上記の工程（ａ）の工程（３）と同じ方法を使用してペプチド類まで分解される。その結果、工程（ｉ）の工程（３）は、変性されたペプチド類を含むペプチド類の混合物をもたらす。
【００５０】
本発明では、当該技術分野で公知の任意の適当な薬剤を使用してタンパク質切断を行うことができる。しかしながら、上記のように、工程（ｉ）の工程（３）に使用される切断方法は、上記の工程（ａ）の工程（３）で使用される切断方法と同じでなければならない。タンパク質切断は、典型的にはプロテアーゼを使用して行われる。本発明では任意の適当なプロテアーゼが使用できる。本発明では、プロテアーゼは、典型的にトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−ＣまたはＡｓｐＮである。あるいはまた、化学的にタンパク質を分解することができる。例えばヒドロキシルアミン、ギ酸、臭化シアン、ＢＮＰＳ−スカトール、２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）または他の適当な薬剤が使用できる。
【００５１】
本発明に使用されるペプチド類、および上で説明した工程（３）でタンパク質切断で典型的に製造されるペプチド類は、質量分析に適している。典型的に、そのようなペプチド類は約５から３０のアミノ酸長さであり、例えば、７から２５のアミノ酸類、１０から２０のアミノ酸類、１２から１８のアミノ酸または１４から１６のアミノ酸類である。しかしながら、より短いかまたはより長いペプチド類、たとえば約２から約５０、約３から約４０、または約４から約４５のアミノ酸類なども使用できる。分析できるペプチドの長さは、質量分析計のそのような長いペプチド類を配列する能力によって制限される。ある場合には、最大３００のアミノ酸類のポリペプチドを分析できる。
【００５２】
本発明方法の工程（ｉｉ）では、修飾ペプチド類は工程（ｉ）で得られたペプチド類から富化される。工程（ｉｉ）は修飾ペプチド類内で富化されたいくつかの断片をもたらす。
【００５３】
工程（ｉｉ）における修飾ペプチドの富化工程は、多次元クロマトグラフィー(multidimensional chromatography)を使用することで典型的に行われる。１つの実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、強カチオン交換高速液クロマトグラフ（ＳＣＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーで行われる。他の実施態様では、多次元クロマトグラフィーは、陰イオン交換高速液クロマトグラフ（ＳＡＸ−ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して行われる。本発明のこれらの実施態様では、クロマトグラフィー技術は逐次的に行われる。
【００５４】
別法として、工程（ｉｉ）の修飾ペプチドの富化工程は、抗体に基づく方法で行われる。
【００５５】
本発明の１つの実施態様では、定量化されるペプチド類がりん酸化ペプチドである場合、チロシン、トレオニン、セリンまたはヒスチジンなどのりん酸化アミノ酸への親和性を有する抗体が、固体マトリックスに結合される。りん酸化ペプチドはこれらの抗体が特異的にりん酸化ペプチドに結合する能力によって富化される。そして、りん酸化ペプチドが抗体被覆基質上に保持されるのに対して、非リン酸化ペプチド類は洗浄除去される。固定された抗体からのりん酸化ペプチドの溶離は、低ｐＨ溶媒の使用、または抗体とりん酸化ペプチドの間の相互作用をなくす他の適切な方法により行われる。
【００５６】
本発明の別の実施態様では、定量化されるペプチド類が、アセチル化ペプチドペプチド類である場合、アセチル化アミノ酸残基に対する特異的抗体の使用により富化される。
そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが固定された抗体の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。
【００５７】
本発明の工程（ｉｉｉ）では、工程（ｉｉ）で得られた富化された修飾ペプチドについて液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う。
【００５８】
本発明の工程ｉｖ）では、修飾ペプチドを同定するために、工程（ｉｉｉ）で検出された修飾ペプチドを、既知のリファレンスデータベースと比較する。この工程は、典型的には市販のサーチエンジン、たとえばＭＡＳＣＯＴ、ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｓｐｅｃｔｏｒ  Ｐｈｅｎｙｘ、またはＳｅｑｕｅｓｔサーチエンジン（ただしこれらに限定されるものではない）を使用することで行われる。
【００５９】
本発明の方法の工程（ｖ）では、工程（ｉｖ）で同定された修飾ペプチドに関連するデータが、データベースにコンパイルされる。このデータベースは次の生物学的実験における、りん酸化ペプチドの定量化に必要であるすべてのパラメータ類を記載する。典型的に、修飾ペプチドに関連するデータは、修飾ペプチドのアイデンティティ、質量／電荷（ｍ／ｚ）比、電荷（ｚ）および／または相対保持時間を含む。これは、サンプル中のペプチドに関連するデータ、典型的にはサンプル中のペプチド類の（質量／電荷数）比、電荷（ｚ）、および相対保持時間がデータベース内の修飾ペプチドの値と比較されることを許容して、その結果、サンプルの修飾ペプチドの識別と定量化を許す。
【００６０】
本発明の方法を使用して比較できるサンプル数の限界は全くない。
【００６１】
本発明の方法は、りん酸化ペプチドを定量化するのに典型的に使用される。この実施態様では、本発明の方法はシグナルリングの、標的の徹底的な定量化のためのテクニック（ＴＩＱＵＡＳと命名される）であり、シグナルリング系路活性の感受性のある、迅速かつ包括的な定量化を許容する。本発明方法は、１つの分析で、同時に、タンパク質上の何千ものリン酸化部位の量を測定できる。
【００６２】
本発明の方法は、シグナルリング系路の分析に用途がある。なぜなら、シグナルリング系路の束(flux)が、脂質、プロテインキナーゼ、タンパク質をリン酸化する酵素によって大きい程度で制御されるからである。
【００６３】
本発明のこの実施態様による方法は、りん酸化ペプチドを定量化するのに質量分析法を使用する他の方法に比較して利点がある（表１を参照）。これらの利点としては、包括性（何千ものりん酸化ペプチドを定量化できる）、スループット（分析時間は約２時間／サンプル、または約２０サンプル／日／ＬＣ−ＭＳである）、無制限な数のサンプルを比較する技術能力、およびその優れた感受性（定量化はタンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）によるペプチド類の同定を必要としない）があげられる。比較のために、ＳＩＬＡＣ実験は最大３個のサンプルを比較するために３週間を要する。なぜなら、細胞が約２週間、ＳＩＬＡＣ培地で成長する必要があるからであり、大規模な分離がそれぞれの実験に必要である。
【００６４】
表１の参照文献
1. Olsen, J.V. 他、 Cell 127, 635-648 (2006)
2. Cutillas, P.R 他、 Mol Cell Proteomics 4, 1038-1051 (2005)
3. Gygi, S.P. 他、 Nat Biotechnol 17, 994-999 (1999)
4. Ross, P.L. 他、 Mol Cell Proteomics 3, 1154-1169 (2004)
5. Gerber, S.A. 他、Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6940-6945 (2003)
6. Barglow, K.T. & Cravatt, B.F. Nat Methods 4, 822-827 (2007)
7. Cutillas, P.R. 他、 Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8959-8964 (2006)
【００６５】
【表１】
0005588584.tif 000002
【００６６】
１つの実施態様では、本発明は以下を含む、サンプル中のりん酸化ペプチドの定量化方法を提供する：
（ａ）サンプルからペプチド類を得る；
（ｂ）任意に、工程（ａ）で得られたペプチド類に参照りん酸化ペプチドを追加して、ペプチド類と参照りん酸化ペプチドとの混合物を形成し、工程（ｂ）で得られたペプチド類と参照りん酸化ペプチドとの混合物からりん酸化ペプチドを富化し、りん酸化ペプチドが富化された混合物を形成する；
（ｃ）ペプチド類と参照りん酸化ペプチドとの混合物、またはりん酸化ペプチドが富化された混合物について質量分析（ＭＳ）を行い、サンプル中のペプチド類に関するデータを得る；および
（ｄ）サンプル中のペプチド類に関するデータを、りん酸化ペプチドに関するデータベース内のデータと、コンピュータプログラムを使用して比較する；
ここで、りん酸化ペプチドに関するデータベースは、以下を含む方法によってコンパイルされる：
（ｉ）サンプルからペプチド類を得る；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたペプチド類からりん酸化ペプチドを富化する；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得られた富化されたりん酸化ペプチドについて液体クロマトグラフ−タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を行う；
（ｉｖ）りん酸化ペプチドを同定するために工程（ｉｉｉ）で検出されたりん酸化ペプチドを既知のリファレンスデータベースと比較する；
（ｖ）  工程（ｉｖ）で同定されたりん酸化ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。
【００６７】
１つの実施態様では、本発明は図１で示されるようなサンプル中のりん酸化ペプチドの定量化方法を提供する。
【００６８】
１つの実施態様では、本発明は以下のような、サンプル中のりん酸化ペプチドを定量化する方法を提供する。本発明方法は本明細書においてＴＩＱＵＡＳと呼ばれる。ＴＩＱＵＡＳ技術の基礎はＬＣ−ＭＳで検出して定量化できる、りん酸化ペプチドに関するデータベースの構築である。このデータベースは、次の生物学的実験におけるりん酸化ペプチドの定量化に必要であるすべてのパラメータ類を記載し、これはりん酸化ペプチドの同一性、質量／電荷比（ｍ／ｚ）、電荷および相対保持時間を含む。データベースは、多次元クロマトグラフィー（たとえば強カチオン交換、ＩＭＡＣまたはＴｉＯ２）を使用してりん酸化ペプチドを富化することによって、構成される。そして、富化されたりん酸化ペプチドの断片はりん酸化ペプチドの同定のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析される。データベースを構成するのは質量分析時間の約２から３週間かかるが、それがいったん組み立てられると、良いスループットおよび感受性を伴う生物学的実験を実行するのに使用できる。
【００６９】
本発明の発明者は生物学的実験から取られたりん酸化ペプチドについてのＬＣ−ＭＳにおいて、データベースに記載されたそれぞれのりん酸化ペプチドの定量化を自動化するＰＥＳＣＡＬ(Cutillas and Vanhaesebroeck, Molecular & Cellular Proteomics 6, 1560-1573 (2007))というコンピュータプログラムを作成した。これらの生物学的実験において、細胞溶解物のタンパク質は、トリプシンまたは他の適当なプロテアーゼを使用することで消化される。りんペプチド内部標準（参照りん酸化ペプチドである）は、比較されるすべてのサンプルに既知量でスパイクされる(spiked)。得られたペプチド混合物の中のりん酸化ペプチドは、実行が簡単な（simple-to-perform）ＩＭＡＣまたはＴｉＯ２抽出段階を使用して富化される。富化されたりん酸化ペプチドは約１２０分（総サイクル）の１回のＬＣ−ＭＳ測定で分析される。ＰＥＳＣＡＬは次いで、比較されるすべてのサンプルにわたり、データベースに存在するそれぞれのりん酸化ペプチドのために、抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ、溶出プロファイル）を作図する。プログラムはそれぞれのＸＩＣのピーク高さと曲線下の面積を計算する。データは、それぞれのりんペプチド分析物質の強度読み値（ピーク面積または高さ）をりんペプチド内部標準のもので割ることによって、規格化される。
【００７０】
このホスホプロテオミック(phosphoproteomic)アプローチは無制限なサンプルと複製の比較を許容する。
【００７１】
別の実施態様では、本発明の方法はサンプル中のアセチル化ペプチドのための定量化方法である。アセチル化の定量分析は、何千ものペプチド類を発生させるための、たとえばトリプシンのような適当なプロテアーゼで細胞溶解物中のタンパク質を消化することを含む。そして、アセチル化ペプチドはアセチル化アミノ酸残基に対して特異的な抗体の使用により富化される。アセチル化アミノ酸類を含む合成ペプチドは、富化工程の前にサンプルにスパイクされる内部標準として使用される。そして、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳがこれらのアセチル化ペプチド類を同定するために使用され、データベースに組み入れられる。アセチル化ペプチドは個々のサンプル内でＬＣ−ＭＳによって同定され、参照としてデータベースにエントリーされる。
【００７２】
本発明は以下の実施例を参照してさらに詳細に説明される。この実施例は例示の目的にのみ示される。実施例では、多くの図を参照する。
【００７３】
図１は、本発明の実施態様について図説するフローチャートである。フローチャートの備考は以下の通りである。
１；    ホスファターゼ阻害剤による処理は、リン酸化の化学量論量を増加させ、データベースに含むことができる多量のりん酸化ペプチドに帰結する。
２；    プロテアーゼは、典型的にはトリプシン、キモトリプシン、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、Ｖ８、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−ＣまたはＡｓｐＮである。
３；    多次元的クロマトグラフが、典型的には強カチオン交換を利用する、高速液クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）、および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用するか、または陰イオン交換を利用する高速液クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）および二酸化チタン（ＴｉＯ２）クロマトグラフィーを使用して行われる。代替手段としては、抗体ベースの方法を使用できる。
４；    生物試料は適当な生物試料で、典型的には細胞ライン（任意に研究薬剤で処理される）であるか、または動物または患者からの１次組織である。
比較できるサンプル数の限界はない。
５；    内部標準は、参照りん酸化ペプチドであり、比較されるサンプルのそれぞれに既知量で追加される。内因のりん酸化ペプチドの信号は、川下の分析で内部標準ペプチドに関する信号に対して規格化される。
【００７４】
図２は、ＴＩＱＵＡＳを使用する細胞信号の定量分析のための戦略を示している：
（Ａ）実験設計を示す；
（Ｂ）得られたデータ（４つの非依存性の生物学的複製）のまとめを与え、確率によって分類されたデータのスナップを撮る（snapshot）。
（Ｃ）プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）制御サブユニット１１からのりん酸化ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の例である。
（Ｄ）ＰＩ３Ｋの川下に先に示されたタンパク質のリン酸化部位の例を示す。
【００７５】
図３は、実施例１の分析で同定されたリン酸化部位の例を示す。
【００７６】
図４  （Ａ）は、ＰＩ−１０３に対する異なる感受性で、細胞ライン内のＰＩ−１０３による、増殖の５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を示す。
（Ｂ）は、同じ細胞ラインに本発明の方法を使用したりんペプチドの定量化の結果を示している。表はりんペプチドと正の相関（より抵抗力がある細胞ラインの高いリン酸化）を示している。
【００７７】
図５は無標識のＬＣ−ＭＳによる、正確なりんペプチド定量化のための戦略を示している。
（Ａ）ＭＳスペクトルは、m/z = 751.33939, tR＝54.54 分、z = 3に、ミトジェン活性化プロテインキナーゼ3 (mitogen-activated protain kinase:pERKl) ペプチド(IADPEHDHTGFLTEpYVATR)を示している。
（Ｂ）この質量／電荷数±２５ｐｐｍの抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）は４
つの可能な候補をもたらす。
（Ｃ）；  追加の荷電および同位体分布制限を適用した後に、このペプチドのクロマトグラフ溶出ピークを明確に同定できる（図では、矢印で示される）。なぜなら、最初の３つの同位体のためのＸＩＣｓにはスペクトルに示されたものに対応する相対強度がある（また、配列データから同位体の相対強度について計算できる）からである。
（Ｄ）；  更なる特異性は、ＸＩＣが組み立てられる質量窓（mass window）を狭くする（±７ｐｐｍ）ことによって、達成される。
【００７８】
図６は、シグナル伝達阻害剤への異なった鋭敏度を有するＡＭＬ細胞ラインが、蛋白質リン酸化の顕著に異なるパターンを示すことを示している。（Ａ）,（Ｂ）および（Ｃ）ＡＭＬ細胞ラインは、示した阻害剤の存在下で７２時間培養され、ＭＴＳアッセイによって生存が測定された。データ点は平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）として示される。りんペプチドの例は、ＴＩＱＵＡＳにより同定され、確固として（倍率変化によって評価される）、顕著に（ｔ−検定統計によって評価される）、（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）のシグナル伝達阻害剤への異なった鋭敏度で、異なって細胞ラインが制御されることが示された。
【００７９】
実施例１−ＰＩ３Ｋシグナリングの研究
本発明の新規な定量化技術は、ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞中のリン酸化部位を定量化するのに使用された。３Ｔ３線維芽細胞は、飢餓状態にされ（starved）、ついでｐａｎ−ＰＩ３Ｋ阻害剤ウォルトマンニン（wortmannin：ＷＭ）の存在下でのプレインキュベーションをしたものとしないものについて、血清によって刺激された。
これらの実験が４回行われた。
【００８０】
図２（Ａ）は実験設計を示している。細胞は、示したように処理され、尿素ベースのバッファで溶解され、核と細胞内可溶質タンパク質を得て、タンパク質は消化された。得られたりん酸化ペプチドは、ＩＭＡＣとＴｉＯ２クロマトグラフによって富化され、発明者によって開発されたコンピュータプログラム（ＰＥＳＣＡＬ）(Cutillas and Vanhaesebroeck, Molecular & Cellular Proteomics 6, 1560-1573 (2007))を使用して定量化された。
【００８１】
図２（Ｂ）は得られたデータのまとめと、確率によって分類されたデータのスナップショット（snapshot）を示す。３，１００のりんペプチドがデータベースに検出されて、２，３５０のりん酸化ペプチドがこれらの分析で定量化された。その２６５が血清刺激の前の細胞のＷＭ処理で顕著な影響を受けた（ｐ＜０．０５）。図２（Ｂ）に示されたりんペプチドに関する詳細を表２に示す。
【００８２】
【表２−１】
0005588584.tif 000003
【００８３】
【表２−２】
0005588584.tif 000004
【００８４】
【表２−３】
0005588584.tif 000005
【００８５】
【表２−４】
0005588584.tif 000006
【００８６】
図２（Ｃ）はＰＰｌ制御サブユニット１１（ＣＣＣＩｐＹＥＫＰＲ；ＸＩＣ＝質量／電荷（ｍ／ｚ）６８３．２６）からのりん酸化ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）の例である。この部位がＷＭに感受性であることを示している。
【００８７】
図２（Ｄ）は、ＰＩ３Ｋの川下であることが先に示されたタンパク質上のリン酸化部位の例を示す。４つの非依存性の実験に関するデータは、実験の再現性を示すために別々に示されている。これらの部位はＰＩ３Ｋの川下にあることが知られており、その結果、これらのデータは本発明が有効であると確認するものである。このホスホプロテオミックなアプローチは無制限なサンプルと複製の比較を許容する。
【００８８】
リン酸化のいくつかの部位がプロテインキナーゼとホスファターゼで同定された。細胞のＷＭ処理により、転写および翻訳因子が影響を受けた（図３）。値は４つの非依存性の実験の、規格化されたホスホリル化ペプチドレベルの平均である。ｐ値は、血清とＷＭサンプルグループに対する平均に、スチューデントのｔ検定を使用することで計算された。図３に示されたりんペプチドに関するさらなる情報を表３に示す。
【００８９】
【表３−１】
0005588584.tif 000007
【００９０】
【表３−２】
0005588584.tif 000008
【００９１】
実施例２−ＰＩ３ＫとｍＴＯＲの二重阻害剤へのさまざまな鋭敏度を有する細胞における、シグナルリング系路の調査
本発明のテクニックは、ＰＩ−１０３、脂質キナーゼＰＢＫ、およびプロテインキナーゼｍＴＯＲ阻害剤へある範囲の鋭敏度を有する細胞ラインのパネル内のキナーゼ経路をプロファイルするのに使用された。図４Ａに示されたパネルの細胞ラインは、ＰＩ−１０３を滴定してインキュベートされた。その増殖速度が阻害剤濃度の関数として測定された。阻害剤濃度は５０％抑制濃度（ＩＣ５０）として、マイクロモル単位の濃度で示された（図４Ａ）。
【００９２】
別の実験（図４Ｂ）では、これらの細胞ラインのりんペプチドは、開示されたテクニックを使用することで定量化された。実験は３回行われた。図４Ｂに示すように、いくつかのりんペプチドが５０％抑制濃度値と相関を有した。これは、キナーゼ経路活性化と阻害剤効力の因果関係を示唆する。これらの値は統計的有意性と相関を有する（０．７５を超えたＲ２値は統計的に有意である）。さらに、抵抗と感受性細胞ラインのりんペプチドの平均の信号の統計的検査法（スチューデントのｔ検定）の結果も、有意であった。これらのりんペプチドは、阻害剤効力の新規なバイオマーカーとして機能し、また、これらの阻害剤の作用機序を明らかにする。
【００９３】
実施例３−キナーゼ阻害薬へのがん細胞の鋭敏度に関連するキナーゼ経路活性化の調査
分析法
この実施例に使用されるＴＩＱＵＡＳアプローチは、先にＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定されたりんペプチドの定量化を目的としたＬＣ−ＭＳの使用から成る。この分析は、本明細書に記載されたコンピュータプログラムＰＥＳＣＡＬ(Cutillas, P. R.; Vanhaesebroeck, B. MoI Cell Proteomics 6(9), 1560-73, 2007)を使用することで自動化されている。ＰＥＳＣＡＬは所定の分子状イオンの最初の３つの同位体の抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を実行する。これはペプチドイオンの電荷の識別と、次に理論上の同位体分布と相関されることができる同位体の相対強度の計算の両方を許容する。
【００９４】
図５は分析の原理について図説する。分析は無標識の定量化のためのクロマトグラフピークの具体的かつ信頼できる識別のためにＰｅｓｃａｌの新バージョンを備えた高分解性および高質量精度質量分析法を組み合わせる。サンプルがただ一つのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定で分析される標的へのアプローチであるので、データ依存実験でのアンダーサンプリング(undersampling in data-dependent experiments)に関する問題は避けられる。アプローチの特徴は、サンプルと複製の無制限な数の詳細な定量的情報を提供する能力と、定常的なホスホプロテオミックツールとしての使用のための十分なスループットを提供する能力である。
【００９５】
白血病細胞における薬物反応のＴＩＱＵＡＳ分析
ＡＭＬ発達、すなわちＪＡＫ、ＭＥＫおよびＰＩ３Ｋ系路について重要なキナーゼのための阻害剤のパネルへの８個のＡＭＬ細胞ラインの反応が調査された。細胞はＬＹ２９４００２、ＰＩｌ０３、およびＩＣ８７１１４（主要標的としてＰＩ３Ｋを有する阻害剤）、ＭＥＫ阻害剤（ＭＥＫ  Ｉ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＪＡＫ阻害剤（ＪＡＫ  Ｉ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、およびＦＬＴ３阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の濃度を増大させて細胞を処理した。これらのキナーゼはすべてさまざまの型の癌腫の処理のための潜在的薬物標的である。しかしながら、細胞をそれらの阻害に影響されやすくする原因となる機構は不十分にしか理解されていない。患者が制癌剤に異なった程度で応じるかもしれない臨床的症状を反映し、これらのキナーゼ阻害薬の関数としての我々のパネルの細胞ラインの増殖は、さまざまな鋭敏度を示す。
【００９６】
次に、ＴＩＱＵＡＳアプローチは、ＨＥＬ対ＡＭＬ−１９３（ＪＡＫ  Ｉへの抵抗力および感受性）、Ｐ３１／ＦＵＪ対ＭＶ４−１１（ＰＩ−１０３への抵抗力および感受性）、およびＨＥＬ対ＭＶ４−１１（ＭＥＫ  Ｉへの抵抗力および感受性）における基本りん酸化レベルを比較するのに使用された。これらの実験は３回行われた（図６Ａ、Ｂ、およびＣ）。３０００より多くのりんペプチドがこれらの分析で同定された。合計１０９５のりんペプチドが、これらの細胞ラインで定量化された。細胞ラインの感受性と抵抗力について、数百が顕著（ｐ＜０．０５）で確固とした（＞２倍）差異を示した（これらの例は図６Ｄ、ＧおよびＦに示される）。
【００９７】
材料と方法
細胞培養
急性骨髄白血病細胞ライン（ＡＭＬ−１９３、ＣＭＫ、ＣＴＳ、ＨＥＬ、Kasumi-１、ＫＧ−１、ＭＶ４−１１、およびＰ３１／ＦＵＪ）とネズミのＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞は１０％のウシ血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００マイクロｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補われた培地で、５％のＣＯ２の湿気のある環境の中、３７℃で培養された。ＡＭＬ細胞ラインは、ＲＰＭＩ中、約５から１０×１０５細胞／ミリリットルで、５０マイクロモルのβ−メルカプトエタノールを追加補充して維持された。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞はＤＭＥＭ培地で育てられた。
【００９８】
ホスホプロテオミック研究において、ＡＭＬ細胞は実験の前の日に５×１０５細胞／ミリリットルで新鮮培地にシードされた。それぞれの培養物は１０ｍｌ中に５×１０６細胞を含み、独立して３つの細胞培養が実行された。薬物阻害剤の効果をテストするとき、収穫の１時間前に、細胞は１マイクロＭのＰＩ−１０３、５００ｎＭのＭＥＫ  Ｉ阻害剤、および５００ｎＭのＪＡＫ  Ｉ阻害剤（それぞれＣａｌｂｉｏｃｈｅｍからの５２８１００、４４４９３７および４２００９９）で処理された。
【００９９】
細胞は１０分間３００ｘｇで遠心沈殿し、１ｍＭのバナジウム酸ナトリウムと１ｍＭのフッ化ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳで二度洗浄した。溶解物は、１０×１０６細胞／ミリリットルの濃度で、変性バッファ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、８Ｍ尿素、１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭフッ化ナトリウム、２．５ｍＭピロリン酸ソーダ、１ｍＭβグリセロールリン酸）を使用して行なわれた。更なる蛋白質可溶化は超音波処理で達成された。溶解残渣は１０分間、２００００ｘｇで遠心沈殿してきれいにされた。上澄の蛋白質濃度はブラッドフォードアッセイで決定した。サンプルは−８０℃で更なる分析まで冷凍された。
【０１００】
薬物治療へのＡＭＬ細胞ラインの感受性
９６ウエルプレートで１×１０５細胞／ミリリットルで、８個の細胞ライン（ＡＭＬ１９３、ＣＭＫ、ＣＴＳ、ＨＥＬ、Kasumi−１、ＫＧ−１、ＭＶ４−１１、およびＰ３１／ＦＵＪ）をシードした。それぞれの条件について３回実験した。２時間の回収時間の後、細胞は増大する濃度（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１マイクロＭおよび１０マイクロＭ）のＦＬＴ３阻害剤、ＭＥＫ  Ｉ阻害剤、ＪＡＫ  Ｉ阻害剤、ＬＹ２９４００２、ＰＩ−１０３、およびＩＣ８７１１４で処理された。コントロールとして、細胞は、ビヒクル（ＤＭＳＯ）で処理されたものと、未処理のものが利用される。７２時間の処理の後に、ＭＴＳアッセイ (CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation assay, Promega Corporation, Madison, WI, USA)によって細胞生存率が評価された。
【０１０１】
消化および固相抽出
サンプルの還元とアルキル化は、暗闇の中の４．１ｍＭ  ＤＴＴおよび８．３ｍＭヨードアセトアミドで室温でそれぞれ１５分間、実行された。ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０と２Ｍ尿素でサンプルを希釈した後に、トリプシン処理が、５×１０６細胞あたり１０ＴＡＭＥ単位の固定されたＴＬＣＫ−トリプシンを使用して、３７℃で１６時間行われた。消化は、１％の終末濃度でＴＦＡを加えて停止された。得られたペプチド溶液は、メーカーガイドラインにより、Sep-Pak C18カラムを使用して脱塩した(Waters UK Ltd, Manchester, UK) 。ペプチド溶出は５ｍｌの５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡで行われた。
【０１０２】
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）
りんペプチド分離は、改良されたＩＭＡＣ富化実験計画書（Ａｌｃｏｌｅａ、Ｍ．Ｐ．他、ＪＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ８（８）、３８０８（２００９））を使用することで達成された。要約すれば、それぞれのサンプルは３０分間、室温で、３００マイクロリットルのＦｅ（ＩＩＩ）−コーティングされたセファロース高性能ビーズを、５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ中５０％のスラリーとして使用して、インキュベートされた。非結合のペプチド類は捨てられ、ビーズは二度５０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡの３００マイクロリットルで洗浄された。富化されたりんペプチド画分は３００マイクロリットルの１．５％アンモニア水、ｐＨ１１で溶離された。５０％のＡＣＮを含む５０マイクロリットルの１．５％アンモニア水、ｐＨ１１で第２の溶出が行われ、さらに富化された。溶出されたペプチド類は、SpeedVacで最終的に乾燥され、−８０℃で貯蔵された。
【０１０３】
ナノ流れ液体クロマトグラフタンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）
ホスホプロテオミック実験において、乾燥されたりんペプチド富化サンプルは、０．１％のＴＦＡの１０マイクロリットルに溶解され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置で分析した。後者は約３０００ｐｓｉの操作背圧で５マイクロリットル／分（ロード）が供給され、４００ｎＬ／分（溶離）を有する、ナノフロー高速液体クロマトグラフィー(nanoAcquity、Waters/Micromass)にオンラインで接続されたＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ質量分析計(Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead, UK) から成る。分離は１００μｍ×１００ｍｍののＢＥＨカラム(Waters/Micromass)で実行された。移動相は溶液Ａ、ＬＣ−ＭＳグレード水中の０．１％ＦＡ、および溶液Ｂ、ＬＣ−ＭＳグレードＡＣＮ中の０．１％ＦＡであった。操作勾配は、１００分で１％のＢから３５％のＢにし、８５％のＢで５分間洗浄し、１％のＢで７分間平衡させた。完全なスキャン調査スペクトル（ｍ／ｚ３５０−１６００）は、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬでｍ／ｚ  ４００で、６００００の解像度で取得された。データ依存分析（ＤＤＡ）が利用され、調査スペクトルに存在している５つの最も豊富な多価イオンが、衝突誘起解離（衝突エネルギーを３５％に規格化した）によって自動的に質量選択され断片化された。５つのＭＳ／ＭＳスキャン（ｍ／ｚ  ５０−２０００）がＭＳスキャンのあとに続いた。ダイナミックな除外は５００のエントリーに制限された除外リスト、１０ｐｐｍの質量窓と４０秒の除外時間（exclusion duration）により可能にされた。
【０１０４】
データ分析
ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ／ＭＳ  データは平滑化されて、Ｍａｓｃｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒを使用することでセントロイドされた(centroided)。処理されたファイルは、国際タンパク質インデックス(IPI マウス v3.49, 165169 配列および IPI ヒト v3.56, 76539 配列) をＭａｓｃｏｔサーチエンジンを使用することで人間またはマウス配列ライブラリに対して検索された。検索はＭａｓｃｏｔ  Ｄａｅｍｏｎ(v2.2.2; Matrix Science、London,UK)で自動化された。パラメータは、消化酵素としてトリプシンを選び、１回の失敗は許容され、固定された修飾としてカルバミドメチル（Ｃ）が設定され、ピロ−グル（Ｐｙｒｏ−ｇｌｕ）（Ｎ−ｔｅｒｍ）、オキシデェィションまたは酸化（Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）（Ｍ）、ホスホ（Ｐｈｏｓｐｈｏ）（ＳＴＹ）は可変修飾である。データセットは±７ｐｐｍの質量許容度と±８００ｍｍｕの断片質量許容度で検索された。統計的に有意な閾値（期待値＜０．０５）（Ｍａｓｃｏｔによって返される）を超えていたとき、ヒットは有意であると考えられた。おとりのデータベースに対する検索で見積もられている偽陽性率は、約２％であった。これらもＭａｓｃｏｔによって返されて、また、ｐｈｏｓｐｈｏＥＬＭデータベースにも存在していたとき、修飾部位が報告される。そうでない場合には、修飾の場所があいまいであると考えられた。そのような場合には、りんペプチドはタンパク質配列中の、スタート端残基(start-end residue)として報告される。
【０１０５】
統計的に有意な閾値でＭａｓｃｏｔによって同定されたりんペプチドは、ＬＣ−ＭＳで定量化可能なペプチド類に関するデータベース中に置かれた。コンピュータプログラムＰＥＳＣＡＬ (Cutillas, P.R. & Vanhaesebroeck, B. 無標識の機能プロテオミクスを使用する５つのネズミのコアプロテオムの定量的なプロファイル（Quantitative profile of five murine core proteomes using label-free functional proteomics） MoI Cell Proteomics 6, 1560-1573 (2007))が使用された。ＰＥＳＣＡＬは比較したがっているすべてのサンプルにわたり、データベースに存在しているペプチド類の強度を定量化する。ＰＥＳＣＡＬは選択されたペプチド類の質量／電荷数と保持時間を使用し、それぞれのイオンの最初の３つの同位体について、抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣｓ）を構成する。これは分子質量、保持時間、および電荷の制限を適用する。これは研究されたりんペプチドに対応するＬＣ−ＭＳ溶出プロフィルの明確な識別を可能にする。ＸＩＣ構造のための窓(windows)は、質量／電荷が７ｐｐｍで、保持時間は５分であった。それぞれのＸＩＣのピーク高さを決定することによって、強度値について計算できるだろう。
【図１】
0005588584.tif 000009
【図２Ａ】
0005588584.tif 000010
【図２Ｂ】
0005588584.tif 000011
【図２Ｃ】
0005588584.tif 000012
【図２Ｄ】
0005588584.tif 000013
【図３−１】
0005588584.tif 000014
【図３−２】
0005588584.tif 000015
【図３−３】
0005588584.tif 000016
【図４Ａ】
0005588584.tif 000017
【図４Ｂ】
0005588584.tif 000018
【図５Ａ】
0005588584.tif 000019
【図５Ｂ】
0005588584.tif 000020
【図５Ｃ】
0005588584.tif 000021
【図５Ｄ】
0005588584.tif 000022
【図６Ａ】
0005588584.tif 000023
【図６Ｂ】
0005588584.tif 000024
【図６Ｃ】
0005588584.tif 000025
【図６Ｄ】
0005588584.tif 000026
【図６Ｅ】
0005588584.tif 000027
【図６Ｆ】
0005588584.tif 000028
【配列表】
0005588584000001.app