(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法であって、
前記微生物を前培養する前培養工程と、
前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する採取工程と、
前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる微生物凝集膜形成工程であって、
前記培養基材の材質が、ガラス、ナイロン、ポリスチレン、ポリカーボネート、セルロース、ポリプロピレン、ポリイミド、フッ素樹脂、及びアクリル樹脂のいずれかであり、
（１）前記一定量の微生物を含む培地を充填した培養容器内に前記培養基材を浸漬して培養する工程、又は
（２）前記一定量の微生物を含む培地を前記培養基材上に補充し空気中湿潤状態で培養する工程と、
前記微生物凝集膜を振動させて分散させる分散工程と、
前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する計測工程と、
を含むことを特徴とする、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項２】
分散工程における振動の回数が、次式で表される合計振動数で１，１６０回〜１０，０００回である請求項１に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
合計振動数（回）＝１分間当たりの振動数（回）×振動時間（分間）
【請求項３】
分散工程における振動の振動形態が、上下方向、左右方向、及び前後方向の少なくとも１形態である請求項１から２のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項４】
分散工程が、容器に充填した微生物凝集膜を振動させる工程であり、該容器の内容積に対する前記微生物凝集膜の容積比率が１５容量％〜７５容積％である請求項１から３のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項５】
分散工程が、微生物凝集膜に消泡剤を添加して行われる請求項１から４のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項６】
分散工程が、複数回行われる請求項１から５のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項７】
微生物が微細藻類である請求項１から６のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項８】
微生物がバイオマスを産生する微生物である請求項１から７のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【請求項９】
バイオマスを産生する微生物が、珪藻類、黄緑藻類、及び緑藻類の少なくともいずれかである請求項８に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物から産生されるバイオマスには有用なものが多く、盛んに研究が行われている。そのため微生物の成長過程をモニターする必要性があるが、微生物の多くは、細胞外マトリックスのような細胞外物質を放出して増殖するに伴い微生物同士が凝集してしまい、該微生物が培養基材上に存在する場合は、微生物及びその細胞外マトリクスにより微生物凝集膜が形成されるため、該微生物凝集膜中の個々の微生物をモニターすることは困難である。
【０００３】
このような微生物凝集膜中の個々の微生物をモニターする方法としては、例えば、湿潤状態の微生物凝集膜を乾燥固化させることで微生物凝集膜中の微生物量を測定する方法、クロロフィルを有する微生物においては、そのクロロフィル量を測定することによりモニターする方法などが挙げられる（例えば、非特許文献１参照）。
しかし、これらの方法は、微生物凝集膜自体の質量などを測定することはできるものの、微生物凝集膜中に存在する微生物の細胞数を計測することはできず、また、微生物が産生する細胞外物質の放出量が、培養条件や微生物の生育段階によって異なることから、細胞外物質の質量と微生物凝集膜中の微生物の細胞数とは必ずしも一致しないため、個々の微生物についてモニターすることができない点で問題である。
【０００４】
また、事前に微生物の凝集を防止するために、培養槽に超音波を印加しながら微生物を培養する方法が提案されている（特許文献１参照）。
しかし、この方法は、培養中の微生物の凝集を防ぐ方法であるため、既に微生物凝集膜を形成している該凝集膜中の微生物をモニターする方法には適用できない。また、ある程度の液体培地量が必要であること、細胞へのダメージが大きく細胞が破砕してしまうことがあること、完全に分散できない場合があること、などの点からもこの方法を応用することは困難である。
【０００５】
更に、これらの微生物凝集膜自体又は微生物が放出する細胞外物質の質量を測定する方法は、実験系においては、微生物凝集膜中に存在する種々の培地等に含まれる各種塩なども含めた質量として算出されるため、純粋な微生物の質量ではない点においても問題である。特に、海水中に存在する微生物を用いる場合は、塩濃度の高い培地を用いるため、塩による影響が大きく現れてしまい、正確にモニターすることができないといった問題がある。
塩による影響を解消するために微生物凝集膜を低イオン強度の溶液で洗浄する等の方法を行うことも考え得るが、微生物凝集膜は、ある程度の厚みを有する微生物の集合体であるがゆえに、その内部に存在する塩などの濃度を低下させることは非常に困難である。また、低イオン強度の溶液で洗浄することは、微生物に対する浸透圧の影響から、微生物が破裂や収縮が生じ、微生物形状の消失により正確な微生物凝集膜量を測定することができないなどの種々の弊害がある。
【０００６】
したがって、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法の提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−２９８８６９号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋａｔｓｕｔａ  Ａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２００３，  １９，  ３２５−３２８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、微生物を前培養し、前記前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取し、これを一定面積の培養基材上で培養して、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させ、前記微生物凝集膜を振動させて分散させることにより、前記微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができること、また、前記分散された微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測することにより、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができることを知見し、本発明の完成に至った。
【００１１】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法であって、
前記微生物を前培養する前培養工程と、
前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する採取工程と、
前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる微生物凝集膜形成工程と、
前記微生物凝集膜を振動させて分散させる分散工程と、
前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する計測工程と、
を含むことを特徴とする、微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
＜２＞  分散工程における振動の回数が、次式で表される合計振動数で１，１６０回〜１０，０００回である前記＜１＞に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
合計振動数（回）＝１分間当たりの振動数（回）×振動時間（分間）
＜３＞  分散工程における振動の形態が、上下方向、左右方向、及び前後方向の少なくとも１形態である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
＜４＞  分散工程が、容器に充填した微生物凝集膜を振動させる工程であり、該容器の内容積に対する前記微生物凝集膜の容積比率が１５容量％〜７５容積％である前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
＜５＞  分散工程が、微生物凝集膜に消泡剤を添加して行われる前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
＜６＞  分散工程が、複数回行われる前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の微生物細胞数の計測方法である。
＜７＞  微生物が微細藻類である前記＜１＞から＜６＞のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
＜８＞  微生物がバイオマスを産生する微生物である前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
＜９＞  バイオマスを産生する微生物が、珪藻類、黄緑藻類、及び緑藻類の少なくともいずれかである前記＜８＞に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
＜１０＞  黄緑藻類が、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ属である前記＜９＞に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
＜１１＞  緑藻類が、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属である前記＜９＞に記載の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を、乾燥固化させる工程を経ることなく、また培地中の塩の影響や細胞へのダメージがなく、簡便で正確に計測することができ、更に個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができる微生物細胞数の計測方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程で使用する振動装置の外観図の一例を示す概略図である。
【図２】図２は、図１の振動装置の容器ホルダーと駆動部とを示した斜視図の一例である。
【図３】図３は、振動装置に使用する密閉容器に微生物を充填する様子を示した斜視図の一例である。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法の分散工程における振動形態の一例を示す図である。
【図５】図５は、実施例１の微生物凝集膜形成工程においてナイロンフィルム上にフネケイソウが凝集膜を形成した様子を光学顕微鏡（１０倍率）で観察した図である。
【図６】図６は、実施例１の分散工程後のナイロンフィルム上の様子を光学顕微鏡（１０倍率）で観察した図である。
【図７】図７は、実施例１の分散工程においてナイロンフィルム上の凝集膜から培地中に分散したフネケイソウの数を計測する様子を光学顕微鏡（１０倍率）で観察した図である。
【図８】図８は、実施例２の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の数を計測する様子を光学顕微鏡（１０倍率）で観察した図である。
【図９Ａ】図９Ａは、実施例３の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の様子を光学顕微鏡（１０倍率）で観察した図である。破線部及び実践部は、破砕した細胞を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実施例３の分散工程においてスライドグラス上の凝集膜から培地中に分散した珪藻の様子を光学顕微鏡（４０倍率）で観察し、図９Ａの実線部を拡大した図である。
【図１０】図１０は、実施例３の微生物凝集膜形成工程においてポリスチレンフィルム上にボトリオコッカスが凝集膜を形成した様子を光学顕微鏡（４０倍率）で観察した図である。
【図１１】図１１は、実施例３の分散工程においてポリスチレンフィルム上の凝集膜から培地中に分散したボトリオコッカスの数を計測する様子を光学顕微鏡（１０倍率）で観察した図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、比較例１の珪藻の凝集膜の超音波処理後細胞の様子を光学顕微鏡（１０倍率）で観察した図である。破線部及び実践部は、破砕した細胞を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、比較例１の珪藻の凝集膜の超音波処理後細胞の様子を光学顕微鏡（４０倍率）で観察し、図１２Ａの実線部を拡大した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法）
本発明の微生物凝集膜中の微生物細胞数の計測方法は、前培養工程と、採取工程と、微生物凝集膜形成工程と、分散工程と、計測工程と、を少なくとも含み、必要に応じて、更にその他の工程を含む。
【００１５】
＜前培養工程＞
前記前培養工程は、微生物を前培養する工程である。
【００１６】
−微生物−
本発明において微生物としては、人の肉眼では、その個々の存在が識別できないような微小な生物を指し、微生物凝集膜を形成する微生物であれば、特に制限はなく、原核生物及び真核生物のいずれであってもよい。
なお、微生物凝集膜を形成することによって、人の肉眼で微生物の集合体が識別可能になる場合でも、集合体構造を崩して個々の微生物にすることによって、人の肉眼では識別することができない場合は、本発明における微生物とする。
また、個々の微生物の状態によるが、細胞数（例えば、微細藻類の藻体数）が増加することによって、色の変化でその存在を知ることが可能となるものもあるが、そのような場合でも、個々の微生物を人の肉眼によって観察することはできないことから、本発明でいうところの微生物に含むものとする。
【００１７】
前記原核生物としては、細胞核を有さない生物であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真性細菌、古細菌などが挙げられる。
前記真核生物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藻類、原生生物、菌類、粘菌、ワムシなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記微生物としてはバイオマスを産生する微生物が好ましく、微細藻類が特に好ましい。
【００１８】
前記「微細藻類」とは、酸素発生型光合成を行う生物のうち、主に地上で生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除いたものの総称であり、例えば、シアノバクテリア等の原核生物、単細胞生物又は多細胞生物の海藻類等の真核生物などが挙げられる。
【００１９】
前記微細藻類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、藍色植物門、灰色植物門、紅色植物門、緑色植物門、クリプト植物門、ハプト植物門、不等毛植物門、渦鞭毛植物門、ユーグレナ植物門、クロララクニオン植物門などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、前記微細藻類としては、緑色植物門が好ましく、バイオマスを産生する点で、珪藻類、黄緑藻類、緑藻類がより好ましく、ボトリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）属、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）属が更に好ましい。
【００２０】
本発明において、「バイオマス」とは、化石資源を除いた再生可能な生物由来の有機性資源をいい、例えば、生物由来の物質、食料、資材、燃料、資源などが挙げられる。また、前記バイオマスには、生物が産生する、多糖、炭化水素化合物、トリグリセリド等のオイルを含むものとする。
【００２１】
前記微生物を入手する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、自然界より採取する方法、市販品を用いる方法、保存機関や寄託機関から入手する方法などが挙げられる。
【００２２】
−前培養−
前記微生物を前培養する方法としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養法、振盪培養法、静置若しくは振盪しながら二酸化炭素や空気をバブリングさせて培養液を流動させながら培養する方法などが挙げられる。
前記微生物は、基本的には凝集する性質を有するものであるため、前培養することにより微生物凝集体を形成することがある。本発明において、「微生物凝集体」とは、複数個の微生物が集合した構造体のことをいい、その微生物の構造体は、複数種の微生物から構成されていてもよく、単一種の微生物から構成されていてもよい。更に、微生物同士が直接隣接していてもよく、ある種の物質、例えば、細胞間マトリックスのような物質を介して凝集していてもよい。また、群体といわれているものも、本発明では、凝集のことを意味するものとする。
【００２３】
前記微生物の前培養に用いる培地としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができる。例えば、前記微生物が前記微細藻類である場合、その前培養に用いる培地としては、例えば、無機物及び水から構成される培地などが挙げられる。具体的な例としては、後述する実施例に記載の培地などを用いることができる。また、前記培地は、有機物を含んでいてもよい。
前記前培養に用いる培地のｐＨとしては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、５〜９が好ましく、６〜８がより好ましい。前記ｐＨが、５未満又は９を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【００２４】
前記前培養における培養温度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、０℃〜１００℃が好ましく、１５℃〜４０℃がより好ましい。前記培養温度が、０℃未満又は１００℃を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【００２５】
前記前培養を行う期間としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、１日間〜３００日間が好ましく、２日間〜３０日間がより好ましい。前記培養期間が、１日間未満であると、前記微生物の細胞数を十分に得ることができないことがあり、３００日間を超えると、栄養分の不足により、微生物が死滅することがある。
【００２６】
前記前培養における二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、０．００１％〜５０％が好ましく、１％〜１０％がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、０．００１％未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、５０％を超えると、ｐＨの低下により、前記微生物が育成できないことがある。
前記二酸化炭素濃度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養環境中を密閉系にして公知のセンサーで測定する方法、ガスクロマトグラフや分光器等の分析機器で測定する方法、アルカリ吸収法により測定する方法などが挙げられる。
【００２７】
前記前培養における照度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、１ルクス〜１００万ルクスが好ましく、１，０００ルクス〜１０万ルクスがより好ましい。前記照度が、１ルクス未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、１００万ルクスを超えると、光障害により、前記微生物の増殖速度が低下したり、死滅したりすることがある。
前記照度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の照度計を用いて測定する方法などが挙げられる。
【００２８】
＜採取工程＞
前記採取工程は、前記前培養工程において前培養された前記微生物の凝集体から該微生物の一定量を採取する工程である。
【００２９】
前記一定量を採取する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を分散させた後、ピペットにより該微生物を採取する方法などが挙げられる。
【００３０】
前記微生物凝集体を分散させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を含む培地をピペッティングにより分散させる方法、振動により分散させる方法、超音波により分散させる方法などが挙げられる。これらの中でも、前記分散させる方法としては、振動により分散させる方法が、微生物が破砕されることがなく分散性がよいため、所望量を採取できる点で好ましい。
なお、前記分散の際に、前記微生物凝集体は、採取したそのまま用いられてもよく、前記微生物凝集体を濃縮したものを用いてもよく、前記微生物凝集体を濃縮したものを新しい培地や水等の溶液で適宜希釈して用いられてもよいが、前記微生物凝集体を濃縮したものを前記溶液で適希釈して用いられることが、前記微生物の破砕を防止することができ、効率よく分散させることができる点で好ましい。
前記濃縮の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記前培養後の培養液を静置することにより前記微生物凝集体を沈殿させ、該沈殿により濃縮された微生物凝集体を含む培地をピペットなどで採取する方法などが挙げられる。
【００３１】
前記採取工程において、前記微生物凝集体を分散させることにより、前記微生物の細胞数を計測することができ、一定量の微生物を採取することができる。
前記微生物の量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物凝集体を分散させた前記微生物を、光学顕微鏡、偏光顕微鏡、微分干渉顕微鏡等の各種顕微鏡で観察して直接計測する方法、血球計数盤上で計測する方法、光学顕微鏡で撮影した写真からソフトウエアを用いて算出する方法、フローサイトメーターで測定する方法、予め吸光度と微生物数との相関関係を求めておくことにより、吸光光度計で測定した測定値より算出する方法、予め濁度と細胞数との相関関係を求めておくことにより、濁度計で測定した濁度から算出する方法、予め乾燥重量と細胞数との相関関係を求めておくことにより、該乾燥重量から算出する方法、予め蛍光光度計によってクロロフィルの蛍光量と細胞数との相関を求めておくことにより、クロロフィルの蛍光量から算出する方法などが挙げられる。
【００３２】
＜微生物凝集膜形成工程＞
前記微生物凝集膜形成工程は、前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を、一定面積の培養基材上で培養し、該培養基材上に前記微生物の凝集膜を形成させる工程である。
【００３３】
−培養基材−
本発明において、前記「培養基材」とは、前記微生物が付着でき、一定面積を有する基材をいう。
前記培養基材の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ガラス（ソーダ石灰ガラス、鉛ガラス、ほうけい酸ガラスなど）、ナイロン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、セルロース、ポリプロピレン、ポリイミド、フッ素樹脂、アクリル樹脂などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３４】
前記培養基材の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、板状、球状、半球状、不定形、糸状、繊維状、不織布状、布状、織物状、編物状、寒天状などが挙げられる。
前記培養基材が板状の場合、その厚みとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．００１ｍｍ〜１，０００ｍｍが好ましく、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍがより好ましい。
前記培養基材が球状又は半球状の場合、その粒径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、０．００１ｍｍ〜１，０００ｍｍが好ましく、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍがより好ましい。
【００３５】
ここで、「培養基材上」とは、培養時に前記微生物を含む培地に接しており、前記微生物が前記培養基材に付着して増殖することができる前記培養基材表面をいう。
例えば、前記培養基材表面の全体が培地に接している場合は、前記培養基材表面の全体を培養基材上とする。
また、例えば、前記培養基材が板状であり、該板状の培養基材の一方の面が、例えば、培養容器の内部の底面に積置され、培地と接触していない場合は、前記一方の面を除くその他の面を培養基材上といい、前記板状の培養基材の全面が培地に接している場合は、前記板状の培養基材表面の全面を培養基材上という。
【００３６】
また、「一定面積」とは、前記培養基材上の面積をいい、前記培養基材の形状や培養形態などに応じて適宜選択することができるが、１ｍｍ２〜１ｍ２が好ましく、１ｃｍ２〜０．５ｍ２がより好ましく、１ｃｍ２〜０．１ｍ２が特に好ましい。前記面積は、１ｍｍ２未満であると、十分な量の前記微生物凝集膜を形成させることができないことがある。
なお、前記一定面積は、大規模培養を行う目的で１ｍ２を超える面積であってもよいが、その場合であっても１０，０００ｍ２以下であることが好ましく、１，０００ｍ２以下であることがより好ましい。前記一定面積が、１０，０００ｍ２を超えると、ハンドリングが困難となることがある。このような大規模培養を行う場合、後述する分散工程及び計測工程には、前記一定面積のうちの一部の面積を切り出して、若しくは、一部の面積の前記培養基材上に付着した前記微生物を剥離して用いることが好ましい。前記一部の面積としては、特に制限はなく、前記一定面積の範囲内で適宜選択することができる。
前記一定面積は、前記培養基材が複数個同時に用いる場合は、複数個の培養基材の合計表面積をいう。
【００３７】
前記培養基材の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、前記基材の表面が、平滑であってもよく、凹凸を有するものであってもよい。
【００３８】
−培養方法−
前記微生物を前記培養基材上で培養する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を含む培地を充填した培養容器内に前記培養基材を浸漬して培養する方法（以下、「第１の培養形態」と称することがある。）、前記培養基材上に前記採取工程において採取した前記一定量の微生物を含む培地を前記培養基材上に補充し空気中湿潤状態で培養する方法（以下、「第２の培養形態」と称することがある。）などが挙げられる。
【００３９】
ここで、前記「一定量」とは、特に制限はなく、前記培養形態や前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができる。
【００４０】
例えば、前記培養形態が、前記第１の培養形態である場合、前記一定量としては、前記微生物の種類、前記培養容器の大きさ、前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができるが、前記培養容器中の培地における前記採取工程において採取した微生物の濃度としては、１×１０３細胞／ｍＬ〜１×１０７細胞／ｍＬが好ましく、１×１０４細胞／ｍＬ〜１×１０６細胞／ｍＬがより好ましい。前記微生物の濃度が、１×１０３細胞／ｍＬ未満であると、前記培養基材上に前記微生物凝集膜を形成できないことや、前記微生物凝集膜の形成に長時間を要することなどがあり、１×１０７細胞／ｍＬを超えると、前記微生物凝集膜が厚くなりすぎて後述する計測工程における計測が非効率となることや、バイオマスの生産コストが増加することがある。
なお、前記培養基材が球状、半球状、不定形である場合は、その培養形態は、前記第１の培養形態で振盪培養することが、前記培養基材表面の全面に前記微生物を付着させて培養することができる点で好ましい。
【００４１】
また、例えば、前記培養形態が、前記第２の培養形態である場合、前記培養基材上に前記一定量の微生物を補充する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記一定量の微生物を含む培地をピペット等で前記培養基材に滴下する方法、前記一定量の微生物を含む培地に前記培養基材を含浸させてから引き上げる方法、前記一定量の微生物を含む培地を前記培養基材上にポンプを用いて供給する方法などが挙げられる。
【００４２】
ここで、「空気中湿潤状態」とは、前記培養基材上の微生物凝集膜が乾かない状態であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、空気中の湿度が、前記微生物凝集膜が乾かない程度であれば、前記培養基材上に補充した前記微生物をそのままの環境で培養することができる。また、例えば、前記微生物凝集膜が乾いてしまう環境である場合は、必要に応じて、前記微生物を含まない培地などを適宜補充する方法などが挙げられる。
前記微生物を含まない培地などの溶液を補充する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物を含まない溶液をピペット等で前記培養基材に滴下する方法、前記微生物を含まない溶液に前記培養基材を含浸させてから引き上げる方法、前記培養基材上にポンプを用いて前記微生物を含まない溶液を少しずつ供給する方法などが挙げられる。また、湿潤箱内で前記微生物を含む培地を補充した前記培養基材を培養する方法を用いてもよい。
【００４３】
このとき、前記一定量としては、前記微生物の種類、前記培養基材上の面積などに応じて適宜選択することができるが、前記培養基材上への補充に用いる培地における、前記採取工程において採取した微生物の濃度としては、１×１０３細胞／ｍＬ〜１×１０７細胞／ｍＬが好ましく、１×１０４細胞／ｍＬ〜１×１０６細胞／ｍＬがより好ましい。前記微生物の濃度が、１×１０３細胞／ｍＬ未満であると、前記培養基材上に前記微生物凝集膜を形成できないことや、前記微生物凝集膜の形成に長時間を要することなどがあり、１×１０７細胞／ｍＬ未満を超えると、前記微生物凝集膜が厚くなりすぎて後述する計測工程における計測が非効率となることや、バイオマスの生産コストが増加することがある。
【００４４】
前記採取工程において採取した前記微生物を前記培養基材上で培養する方法としては、前記微生物を前記培養基材上に付着させることができれば、特に制限はなく、微生物の種類、培養形態などに応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養法、振盪培養法、静置若しくは振盪しながら二酸化炭素や空気をバブリングさせて培養液を流動させながら培養する方法などが挙げられる。
例えば、前記培養基材が、ガラス等の割れ易い材質である場合は、培養液を流動させることなく静置培養することが好ましい。
また、例えば、前記培養基材が球状、半球状、又は不定形である場合は、静置培養すると、該培養基材のいずれの面が培養容器の内面や該培養基材同士で接触しているか判断することが難しく、後述する計測工程における計測が困難となるため、振盪培養が好ましい。
【００４５】
前記培養に用いる培地としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができる。例えば、前記微生物が前記微細藻類である場合、その培養に用いる培地としては、例えば、無機物及び水から構成される培地などが挙げられる。具体的な例としては、後述する実施例に記載の培地などを用いることができる。また、前記培地は、有機物を含んでいてもよい。
前記培養に用いる培地のｐＨとしては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、５〜９が好ましく、６〜８がより好ましい。前記ｐＨが、５未満又は９を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【００４６】
前記培養における培養温度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、０℃〜１００℃が好ましく、１５℃〜４０℃がより好ましい。前記培養温度が、０℃未満又は１００℃を超えると、前記微生物が育成できないことがある。
【００４７】
前記培養を行う期間としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、１日間〜３００日間が好ましく、２日間〜３０日間がより好ましい。前記培養期間が、１日間未満であると、前記微生物の細胞数を十分に得ることができないことがあり、３００日間を超えると、栄養分の不足により、微生物が死滅することがある。
【００４８】
前記培養における二酸化炭素濃度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、０．００１％〜５０％が好ましく、１％〜１０％がより好ましい。前記二酸化炭素濃度が、０．００１％未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、５０％を超えると、ｐＨの低下により、前記微生物が育成できないことがある。
前記二酸化炭素濃度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養環境中を密閉系にして公知のセンサーで測定する方法、ガスクロマトグラフや分光器等の分析機器で測定する方法、アルカリ吸収法により測定する方法などが挙げられる。
【００４９】
前記培養における照度としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができるが、１ルクス〜１００万ルクスが好ましく、１，０００ルクス〜１０万ルクスがより好ましい。前記照度が、１ルクス未満であると、前記微生物が光合成を十分に行うことができないことがあり、１００万ルクスを超えると、光障害により、前記微生物の増殖速度が低下したり、死滅したりすることがある。
前記照度を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、公知の照度計を用いて測定する方法などが挙げられる。
【００５０】
−微生物凝集膜−
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着して形成された複数個の微生物が集合した膜であり、その微生物の構造体は、複数種の微生物から構成されていてもよく、単一種の微生物から構成されていてもよい。更に、微生物同士が直接隣接していてもよく、ある種の物質、例えば、細胞間マトリックスのような物質を介して膜を形成していてもよい。更に、前記微生物凝集膜は、前記微生物が前記培養基材上に形成した一層の膜であってもよく、多層の膜であってもよい。また、本発明の微生物凝集膜とは、いわゆるバイオフィルムと呼ばれるものも含まれる。前記バイオフィルムとは、一般に、物質の状態が異なる界面上に形成される微生物から構成されたフィルム状の構造物のことをいい、本発明では、固体と液体、若しくは固体と気体の界面上に形成させるフィルム状の微生物集合体のことをいうものとする。また、本発明での前記微生物凝集膜には、“バイオフィルムの基礎と制御、株式会社エヌ・ティー・エス、２００８年２月出版”に記載されているバイオフィルムを含むものとする。
【００５１】
前記微生物凝集膜の平均膜厚としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１μｍ〜１０ｃｍが好ましく、１０μｍ〜１ｃｍがより好ましく、１０μｍ〜０．５ｃｍが特に好ましい。前記平均膜厚が、１μｍ未満であると、前記微生物凝集膜が十分に形成されていないことがあり、１０ｃｍを超えると、後述する計測工程における計測が非効率になることや、ハンドリング時や培養時に希望しない微生物凝集膜の剥離が起こることがある。
前記平均膜厚とは、前記微生物凝集膜における１０点以上の厚みの平均をいい、２０点以上の平均膜厚であることが好ましく、３０点以上の平均膜厚であることがより好ましい。前記平均値をとる点の数は、前記一定面積の大きさが大きくなるほど、多くの点でとることが、精度が高くなる点で好ましい。
前記微生物凝集膜の平均膜厚を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、偏光回析法（エリプソメトリー法）、走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）で測定する方法、公知の膜厚測定装置で測定する方法などが挙げられる。
【００５２】
＜分散工程＞
前記分散工程は、前記微生物凝集膜を振動させて分散させる工程である。
ここで、本発明において、前記微生物凝集膜を「分散させる」とは、前記微生物凝集膜中の凝集した細胞を、後述する計測工程で該細胞の数を数えられる程度に分散させることをいう。細胞の数が数えられる程度とは、後述する計測工程における計測方法により、適宜選択できるが、数個の塊程度にバラバラにされることが好ましく、１つ１つの細胞にバラバラにされることが特に好ましい。
【００５３】
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着したまま前記培養基材と共に前記分散工程に用いてもよく、前記培養基材上から回収してから前記分散工程に用いてもよい。このとき、前記培養基材の面積が大きい場合は、前記培養基材の一部を分離して分散工程に用いてもよい。
なお、前記培養基材と共に前記分散工程に用いる場合は、前記微生物凝集膜形成工程が、前記第１の培養形態で行われる場合、前記培養容器内で、前記培養基材上に付着していない微生物が混入しないように行う必要がある。
これらの方法は、前記培養基材の種類などに応じて適宜選択することができる。
前記回収する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記培養基材上から前記微生物凝集膜を剥離できるような薬剤（例えば、酵素など）を用いた化学的処理方法を施すことにより回収する方法、セルスクレーバー等を用いた物理的処理方法により回収する方法などが挙げられる。
【００５４】
例えば、前記培養基材がガラスなどの割れやすく比重の重い材質からなる場合は、前記培養基材をそのまま分散工程に用いると、割れた培養基材の破断面により振動に用いる容器は破壊されるなど安全上問題があり、後述する計測工程に影響を及ぼすことがあるため、前記培養基材上から回収する方法を用いることが好ましい。
また、前記培養基材が球状、半球状、不定形である場合は、用いる培養基材の粒径に応じて適宜選択できるが、前記培養基材の数が多い場合は、前記回収する方法は操作が煩雑であり、またその粒径が小さい場合は回収することが困難となる観点から、前記培養基材と共に前記分散工程に用いることが好ましい。更に、前記培養基材上に凹凸がある場合は、前記回収する方法では凹部の微生物を回収することが困難であるため、前記培養基材をそのまま分散工程に用いることが好ましい。
【００５５】
前記微生物凝集膜は、前記培養基材上に付着したまま又は前記回収したものを、そのまま前記分散工程に用いてもよく、培地や水等の溶液で適宜希釈して用いてもよいが、希釈して用いることが、前記微生物の破砕を防止することができ、効率よく分散させることができる点で好ましい。以下、希釈した微生物を含む溶液を「微生物凝集膜希釈液」と称することがある。
前記微生物凝集膜希釈液における前記微生物の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
また、前記微生物凝集膜希釈液は、振動を行う前に、ピペッティングなどを行ってもよい。
【００５６】
また、前記分散工程において、前記振動により前記微生物凝集膜希釈液を振動させる際に、前記微生物凝集膜希釈液中の前記微生物凝集膜が高濃度の場合や、種々の代謝物を細胞外に放出する微生物の場合には、振動により気泡が発生し、前記微生物凝集膜の分散性が著しく低下することがある。この様な場合には、前記微生物凝集膜希釈液に消泡剤を添加することが好ましい。
前記消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
前記消泡剤の、前記微生物凝集膜希釈液への添加量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５７】
前記振動させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズ式細胞破砕装置（例えば、株式会社トミー精工製のＭＳ−１００）、ビーズ式ホモジナイザー（例えば、ＢｉｏＳｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔ社のＢＳＰ−３１１０ＢＸ）等の市販の装置を用いる方法などが挙げられる。
これらの装置を用いて振動を行う場合は、ビーズを用いないことが好ましいが、前記微生物の種類などに応じて、該微生物の分散性が悪い場合は、適宜ビーズを用いることもできる。
【００５８】
前記振動させる条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微生物凝集膜中の微生物を破砕させることなく分散性を向上させる観点から、１分間当たりの振動数と振動時間（分間）とを組み合わせて決めることが好ましい（以下、「合計振動数」と称することがある。）。例えば、次式により合計振動数を算出することができる。
合計振動数（回）＝１分間当たりの振動数（回）×振動時間（分間）
本発明において、振動とは、一の位置から他の位置に移動し、前記一の位置に戻ることをいい、例えば、振動が左右方向である場合は、左から右へ移動し左に戻ること、振動が上下方向である場合は、上から下へ移動し上に戻ること、即ち、１往復を１振動とする。なお、振動が回転の場合は、１回転を１振動とし、１分間当たりの振動数はｒｐｍで表すことができる。即ち、振動数と、回転数とは同じことを意味するものとする。
【００５９】
前記合計振動数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１６０回〜５０，０００回が好ましく、１，１６０回〜１０，０００回がより好ましく、１，２００回〜５，５００回が更に好ましい。前記合計振動数が、１６０回未満であると、分散性が低下することがあり、５０，０００回を超えると、前記微生物が破砕することや、温度が上昇して前記微生物が失活又は死滅することがある。
【００６０】
即ち、振動数が高い（例えば、５，０００回）場合には、短時間（例えば、５秒間）で振動を行うことが好ましく、このときの合計振動数は４１７回となる。
反対に、振動数が低い（例えば、３，５００回）場合には、振動時間を長時間（例えば、２０秒間以上）で振動を行うことが好ましく、このときの合計振動数は１，１６７回となる。
【００６１】
したがって、前記所望の合計振動数を得るためには、前記振動の条件としては、１５０回〜５０，０００回で５秒間〜３００秒間行うことが好ましく、３，５００回〜１０，０００回で２０秒間〜１分間行うことがより好ましく、４，０００回〜６，０００回で２０秒間〜６０秒間行うことが更に好ましい。
【００６２】
前記分散工程を行う回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記微生物凝集膜の温度の上昇を防ぐことができ、前記微生物の失活又は死滅を防ぐことができる点で、複数回行うことが好ましい。
なお、複数回の振動を行う場合は、一回の振動が、前記好ましい合計振動数の範囲内となることが好ましい。
また、複数回振動させる場合の各回の間は、１秒間〜６０分間あけることが好ましく、３秒間〜１分間がより好ましい。各回の間が、１秒間未満であると、前記微生物が失活又は死滅することがあり、６０分間を超えると、非効率である。前記各回の間は、前記前培養の条件と同様の条件に置くことが好ましい。
【００６３】
前記振動の振動形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上下方向、左右方向、前後方向などが挙げられる。これらは、１形態単独で行ってもよく、２形態以上を組み合わせて行ってもよい。これらの中でも、３形態全てを組み合わせて８の字に振動させることが特に好ましい（図４Ｃ参照）。
【００６４】
なお、前記微生物凝集膜を振動させる場合は、該微生物凝集膜又は微生物凝集膜希釈液を密閉容器に入れて行うことが好ましい。前記密閉容器としては、特に制限はなく、振動に用いる装置の種類などに応じて適宜選択することができる。
【００６５】
前記密閉容器の内容積に対する前記微生物凝集膜希釈液の容積比率（微生物凝集膜希釈液の容積／密閉容器の内容積×１００％）としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５容量％〜７５容積％が好ましく、２０容量％〜６０容量％がより好ましい。前記容積比率が、１５容量％未満であると、分散性が大幅に低下することがあり、７５容量％を超えると、前記微生物凝集膜が十分に振動できず分散性が低下することがある。
【００６６】
以下に、図１〜３を用いて、前記分散工程の一形態について説明するが、本発明の微生物細胞数の計測方法における分散工程は、この形態に限られるものではない。
図１の振動装置１０は、前記分散工程に用いられる装置の一例の概略図であり、装置本体１２と蓋部材１４とで構成される。
図２は、装置本体１２の内部の一例を示す概略図であり、振動を行う円板状の密閉容器ホルダー１６が配置され、駆動軸１８を介して振動駆動部２０に支持される。密閉容器ホルダー１６の周縁部には、蓋２２Ａ付き密閉容器２２（図３参照）を着脱自在に保持する複数のチャック部２４が設けられる。
【００６７】
図３に示すように、蓋２２Ａ付き密閉容器２２は、試験管形状に形成され、微生物２７及び前記微生物凝集膜希釈液２６中の前記微生物２７を除くその他の成分２５が充填された後、蓋２２Ａにより密閉できるように構成されている。
【００６８】
図１に示すように、装置本体１２の正面には、ＯＮ−ＯＦＦスイッチ２８、密閉容器ホルダー１６を介して密閉容器２２を振動する際の振動数を設定する振動数ダイヤル３０及び振動時間を設定するタイマーダイヤル３２が設けられる。更には密閉容器２２を振動させる振動方向の形態設定を行う切り換えスイッチ３４等が設けられる。
【００６９】
図４Ａ〜Ｃに示すように、微生物凝集膜希釈液２６が充填された密閉容器２２を振動させる振動形態としては、上下方向、左右方向、前後方向の少なくとも１形態であるが、例えば、図４Ａに示すように、上下方向と左右方向との組み合わせ、図４Ｂに示すように、左右方向と前後方向との組み合わせを採用することが好ましい。また、図４Ｃに示すように、上下しながら８の字を描くように密閉容器２２が振動する特殊な振動形態が特に好ましい。
【００７０】
このように、本発明の微生物細胞数の計測方法は、従来のように超音波振動で微生物自体を振動させることがないため、前記微生物を破砕させることがなく、かつ、前記微生物凝集膜中の前記微生物を１つ１つの細胞に分散させることができる。
【００７１】
なお、本発明において、「破砕する」とは、前記微生物凝集膜中の全微生物細胞数に対する破砕した微生物細胞数の割合（破砕した微生物細胞数／全微生物細胞数×１００％）が、３０％未満であることをいい、好ましくは、２０％未満であり、より好ましくは１０％未満である。
前記微生物が破砕したか否かの確認は、例えば、顕微鏡で観察することにより確認することができる。
【００７２】
＜計測工程＞
前記計測工程は、前記分散工程において分散された前記微生物凝集膜中の前記微生物の細胞数を計測する工程である。
なお、前記計測工程は、例えば、装置などにより前記分散工程と同時に行われてもよい。
【００７３】
前記計測する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記分散された微生物を含む溶液を、光学顕微鏡、偏光顕微鏡、微分干渉顕微鏡等の各種顕微鏡で観察して直接計測する方法、血球計数盤上で計測する方法、フローサイトメーターで測定する方法、予め吸光度と微生物数との相関関係を求めておくことにより、吸光光度計で測定した測定値より算出する方法、予め濁度と細胞数との相関関係を求めておくことにより、濁度計で測定した濁度から算出する方法、予め乾燥重量と細胞数との相関関係を求めておくことにより、該乾燥重量から算出する方法、予め蛍光光度計によってクロロフィルの蛍光量と細胞数との相関を求めておくことにより、クロロフィルの蛍光量から算出する方法などが挙げられる。
また、前記計測する方法として、光学顕微鏡で撮影した写真からソフトウエアを用いて算出する方法を用いることもできる。従来、前記微生物凝集膜中の１つ１つの微生物を分散させることができなかったため、計測に前記ソフトウエアを用いた場合、個々の微生物の認識能力が人間の目と比較して極めて低く、その精度が悪いことから、使用に耐えるものではなかった。しかし、本発明の微生物細胞数の計測方法によれば、前記微生物凝集膜中微生物を好適に分散させることができるため、画像認識ソフトウエアの認識能力を最大限に生かすことができる。更に、自動で前記微生物の細胞数を計測することができることから、人間が手動で計測するのと比較して、早く簡便に計測でき、人間の手間の省力化ができると共に、用いるソフトウエアの種類によっては、前記微生物の細胞の大きさの分布等の微生物に関する情報も同時に得ることが可能となる点で有利である。
【００７４】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記微生物を自然界より採取する場合、前記微生物を自然界から採取後に純化する純化工程、前記計測工程において細胞を計測する前に染色する染色工程などが挙げられる。
【００７５】
−純化工程−
自然界から微生物を採取する場合、採取した微生物は多種類の微生物の混合物であることが多い。このような場合に、目的の微生物を単一種の微生物として得るためには、純化工程を行うことが好ましい。
前記純化する方法としては、特に制限はなく、微生物の種類などに応じて適宜選択することができ、例えば、自然界から採取してきた微生物を寒天ゲル上に展開し、常法で培養して増殖させた後、得られたコロニーを採取し、採取したコロニーが単一種の微生物から構成されているかどうかを確認し、得られたコロニーが複数種の微生物から構成されている場合には、もう一度寒天培地上で展開して、単一種の微生物が得られるまで繰り返す方法などが挙げられる。
また、前記寒天培地に塗布する前に、遠心分離処理や多孔質膜による濾過処理を行ってもよい。例えば、微細藻類とバクテリアとでは大きさが異なるため、前処理工程の後に多孔質膜の使用によって分離したり、遠心により比重差を利用して分離したりすることにより、純化がより簡便にできる点で好ましい。
前記純化工程により、所望の微生物が純化されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、微生物の形態や色を観察する方法などが挙げられる。
【００７６】
−染色工程−
前記染色工程としては、前記計測する方法などに応じて適宜選択することができるが、光学顕微鏡などにより目視で計測する際には、予め染色することが、細胞を認識しやすくなる点で好ましい。このような染色に用いる色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トリパンブルー等の公知の色素を用いることができる。
また、前記計測する方法が、フローサイトメーターで測定する方法である場合は、公知の蛍光色素で染色する必要がある。
【００７７】
＜用途＞
前記微生物細胞数の計測方法は、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を正確に計測することができ、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができるため、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発に好適に利用可能である。
【実施例】
【００７８】
以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００７９】
（実施例１）
＜前培養工程＞
フネケイソウ（ＮＩＥＳ−１７６、国立環境研究所より入手）を、滅菌したＣ培地  ２００ｍＬを入れた５００ｍＬ容のガラス製三角フラスコ（６−０１７−０５、アズワン株式会製）で、温度２０℃、照度２，０００ルクスの条件下で、振盪培養機（Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ｓｈａｋｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＲＧＳ−２０ＲＬ、株式会社サンキ精機製）を用いて、１００ｒｐｍにて２０日間前培養した。この前培養により増殖したフネケイソウを光学顕微鏡で観察したところ、フネケイソウが培地中で凝集体を形成していることが確認された。
なお、前記Ｃ培地は、硝酸カルシウム四水和物  １５０ｍｇ、硝酸カリウム  １００ｍｇ、β−グリセロリン酸二ナトリウム五水和物  ５０ｍｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ４０ｍｇ、ビタミンＢ１２  ０．１μｇ、ビオチン  ０．１μｇ、チアミン塩酸  １０μｇ、トリス  ５００ｍｇに、以下の組成で調製したＰＩＶ  ｍｅｔａｌｓ  ３ｍＬを添加し、蒸留水で１Ｌとして溶解後、ｐＨ７．５に調製した。
前記ＰＩＶ  ｍｅｔａｌｓは、塩化鉄六水和物  ９８ｍｇ、塩化マンガン四水和物  １８ｍｇ、硫酸亜鉛七水和物  １１ｍｇ、塩化コバルト六水和物  ２ｍｇ、モリブデン酸ナトリウムニ水和物  １．２５ｍｇ、ＥＤＴＡナトリウム二水和物  ５００ｍｇを水  ５００ｍＬに溶解した。
【００８０】
＜採取工程＞
前記前培養したフネケイソウの凝集体を含む培養液を０．５ｍＬ採取し、２ｍＬ容のホモジナイズ用マイクロチューブ（ＴＭ−６２６Ｓ滅菌付、株式会社トミー精工製）に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置（Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００、株式会社トミー精工製）にセットし、１分間当たりの振動数５，５００回にて２０秒間、図４Ｃの振動形態で振動させ、フネケイソウの凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の１０μＬを血球計数盤（カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製）上に滴下し、光学顕微鏡下でフネケイソウの数を計測した結果、前培養工程中のフネケイソウの微生物濃度は、５×１０４個／ｍＬであった。
【００８１】
＜微生物凝集膜形成工程＞
前記採取工程で得られたフネケイソウを、滅菌したＣ培地で１×１０３個／ｍＬに調製したものを５００ｍＬ容のガラス製三角フラスコ（６−０１７−０５、アズワン株式会製）に２００ｍＬ入れ、フネケイソウが培地中に均一になるように攪拌した。次いで、この三角フラスコの中に、０．７ｃｍ×１．４ｃｍのナイロンフィルムを入れ、前培養と同様の条件で１ヶ月間振盪培養した。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、ナイロンフィルムの両面であり、１．９６ｃｍ２である。
１ヵ月後、ナイロンフィルムを三角フラスコから取り出し、光学顕微鏡（１０倍率）で観察したところ、ナイロンフィルム上にフネケイソウが密集して付着しフネケイソウの凝集膜が形成されていることが観察された。結果を図５に示す。なお、このとき、フネケイソウが高度に凝集していたため、該凝集膜中の細胞数を計測することはできなかった。
【００８２】
＜分散工程＞
フネケイソウが凝集膜を形成したナイロンフィルムを、Ｃ培地が０．５ｍＬ入った２ｍＬ容のホモジナイズ用マイクロチューブ（ＴＭ−６２６Ｓ滅菌付、株式会社トミー精工製）に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置（Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００、株式会社トミー精工製）にセットし、１分間当たりの振動数５，５００回にて２０秒間、図４Ｃの振動形態で振動させ、フネケイソウの凝集膜を分散させた凝集膜分散液を得た。
分散工程終了後のナイロンフィルムを光学顕微鏡（１０倍率）で観察したところ、ナイロンフィルム上にはフネケイソウはほとんど認められず、この振動処理により効率よくナイロンフィルムからフネケイソウを分離することができた。結果を図６に示す。
【００８３】
＜計測工程＞
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤（カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製）上に１０μＬ滴下し、光学顕微鏡（１０倍率）下で観察したところ、フネケイソウの凝集膜から個々のフネケイソウの細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図７に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中のフネケイソウの細胞数は、７．７×１０５個／ｍＬであった。
これより、凝集膜分散液が０．５ｍＬであり、ナイロンフィルムの面積は、１．９６ｃｍ２であったことから、該ナイロンフィルムにおけるフネケイソウの付着量は、表裏を考慮すると１．９６×１０５個／ｃｍ２であった。
【００８４】
（実施例２）
＜前培養工程＞
自然海水から採取した珪藻を人工海水（マリンアート  スーパーフォーミュラ  ＳＦ−１、冨田製薬株式会社製）を３８ｇ／Ｌ含むＩＭＫ培地（ダイゴＩＭＫ培地、日本製薬株式会社）のアガロースゲル上で培養し、得られたコロニーをピックアップした。これを、光学顕微鏡で観察したところ、珪藻以外の微生物が混入してないことが確認でき、珪藻を純化することができた。なお、顕微鏡観察により、微生物の形態、及び着色が茶色であることを観察することにより、珪藻であると判断した。
【００８５】
純化した珪藻を、前記滅菌した人工海水を３８ｇ／Ｌ含むＩＭＫ培地２００ｍＬを入れた５００ｍＬ容のガラス製三角フラスコ（６−０１７−０５、アズワン株式会製）で、２０℃、照度２，０００ルクスの条件下で、振盪培養機（Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ｓｈａｋｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＲＧＳ−２０ＲＬ、株式会社サンキ精機製）を用いて、１００ｒｐｍにて２０日間前培養した。この前培養により増殖した珪藻を光学顕微鏡で観察したところ、珪藻が培地中で凝集体を形成していることが確認された。
【００８６】
＜採取工程＞
前記前培養後、珪藻を含む三角フラスコを０．５時間静置しながら放置することにより、珪藻の比重が前記滅菌した人工海水を３８ｇ／Ｌ含むＩＭＫ培地よりも重いことを利用して珪藻を自然沈降させた。次いで、三角フラスコ底部に自然沈降した珪藻を、ピペットを用いて２ｍＬ吸い取り、この全量を５ｍＬ容のホモジナイズ用チューブ（ＴＭ−６５５Ｓ滅菌付、株式会社トミー精工製）に入れ、該チューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置（Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００、株式会社トミー精工製）にセットし、１分間当たりの振動数４，２００回にて２０秒間、図４Ｃの振動形態で振動させた。なお、振幅操作は３回行い、振幅操作間の間に１分間の非振動時間を入れた。この振動を、同様の操作で３回行うことにより、珪藻の凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の１０μＬを血球計数盤（カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製）上に滴下し、光学顕微鏡下で珪藻の数を計測した結果、２．３５×１０７個／ｍＬであった。
【００８７】
＜微生物凝集膜形成工程＞
前記採取工程で得られた珪藻を、前記滅菌した人工海水を３８ｇ／Ｌ含むＩＭＫ培地で２×１０４個／ｍＬに調製したものを１００ｍＬ容のガラス製三角フラスコ（６−０１７−０５、アズワン株式会製）に２０ｍＬに入れ、珪藻が培地中に均一になるように攪拌した。１０ｃｍのプラスチック製シャーレ（アズノール滅菌シャーレ、アズワン株式会社製）の内部に、７．６ｃｍ×２．６ｃｍのスライドグラス（白スライドグラス、アズワン株式会社製）を置き、前記調製した珪藻を２０ｍＬ添加し、温度２３℃、照度２，０００ルクスの条件下で、１０日間静置培養を行った。なお、珪藻の凝集膜を形成させたスライドグラスは４０枚作製した。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、スライドグラスの片面であり、１９．７６ｃｍ２であった。
【００８８】
＜分散工程＞
１０日間培養後、２枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水を３８ｇ／Ｌ含むＩＭＫ培地中に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻を、セルスクレーバーを用いて剥離し、７ｍＬの前記滅菌した人工海水を３８ｇ／Ｌ含むＩＭＫ培地に入れた。次いで、１ｍＬのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を１０回ピペッティングした。ピペッティング後、光学顕微鏡で観察したところ、珪藻の凝集膜のほとんどは分散されておらず、凝集の形態をとったままであった。
この珪藻の凝集膜を含む培地を０．５ｍＬ用いての２ｍＬ容のホモジナイズ用マイクロチューブ（ＴＭ−６２６Ｓ滅菌付、株式会社トミー精工製）に入れ、該マイクロチューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置（Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００、株式会社トミー精工製）にセットし、１分間当たりの振動数５，５００回にて２０秒間、図４Ｃの振動形態で振動させ、珪藻の凝集膜を分散させた実施例２の凝集膜分散液を得た。
【００８９】
＜計測工程＞
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤（カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製）上に１０μＬ滴下し、光学顕微鏡（１０倍率）下で観察したところ、珪藻の凝集膜から個々の珪藻の細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図８に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中の珪藻の細胞数は、２枚のスライドグラスの平均値で、１．２×１０６個／ｃｍ２であった。
【００９０】
（実施例３）
実施例２において、分散工程を以下の分散方法に変えたこと以外は、実施例２と同様の方法で微生物細胞数の計測を行った。
【００９１】
実施例２の微生物凝集膜形成工程において、１０日間培養後、２枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水３８ｇ／Ｌを含むＩＭＫ培地に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻を、セルスクレーバーを用いて剥離し、７ｍＬの前記滅菌した人工海水３８ｇ／Ｌを含むＩＭＫ培地に入れた。次いで、１ｍＬのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を１０回ピペッティングした後、０．５ｍＬの珪藻の凝集膜を含む培地を２ｍＬ容のホモジナイズ用マイクロチューブ（ＴＭ−６２６Ｓ滅菌付、株式会社トミー精工製）に入れ、更に直径  ０．５ｍｍのジルコニアビーズを約０．１ｍＬ入れ、ビーズ式細胞破砕装置（Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００、株式会社トミー精工製）にセットし、１分間当たりの振動数５，５００回にて２０秒間、図４Ｃの振動形態で振動させ、珪藻の凝集膜を分散させた実施例３の凝集膜分散液を得た。
【００９２】
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤を用いて、光学顕微鏡（１０倍率）下で観察し、細胞数の計測を行った。観察した結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。珪藻の細胞が破砕しているものがいくつか認められたが、破砕した細胞と、生細胞とを観察により区別することができるため、生細胞を計測することができた。
即ち、凝集膜分散液中の珪藻の細胞数は、２枚のスライドグラスの平均値で、１．０×１０６個／ｃｍ２であった。
【００９３】
（実施例４）
＜前培養工程＞
ボトリオコッカス（ＮＩＥＳ−２１９９、国立環境研究所より入手）を、滅菌した２×ＣＨＵ１３培地  ２００ｍＬを入れた５００ｍＬ容のガラス製三角フラスコ（６−０１７−０５、アズワン株式会製）で、温度２０℃、照度２，０００ルクスの条件下で、振盪培養機（Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ  Ｓｈａｋｅｒ  Ｍｏｄｅｌ  ＲＧＳ−２０ＲＬ、株式会社サンキ精機製）を用いて、１００ｒｐｍにて２０日間前培養した。この前培養により増殖したボトリオコッカスを光学顕微鏡で観察したところ、ボトリオコッカスが培地中で凝集体を形成していることが確認された。
なお、２×ＣＨＵ１３培地の組成は、Ｋ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ５１  （２），  ４９３−４９８，  １９８７を参照し、以下の組成とした。即ち、２×ＣＨＵ１３培地は、硝酸カリウム  ４００  ｍｇ、リン酸水素二カリウム  ８０ｍｇ、硫酸マグネシウム七水和物  ２００ｍｇ、塩化カルシウム二水和物  １０７ｍｇ、クエン酸鉄  ２０ｍｇ、クエン酸  １００ｍｇ、塩化コバルト  ０．０２ｍｇ、ホウ酸  ５．７２ｍｇ、塩化マンガン四水和物  ３．６２ｍｇ、硫酸亜鉛七水和物  ０．４４ｍｇ、硫酸銅五水和物  ０．１６ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム  ０．０８４ｍｇを蒸留水  １Ｌに溶解し、０．０７２Ｎ  硫酸によりｐＨ７．５に調製した。
【００９４】
＜採取工程＞
前記前培養後、ボトリオコッカスを含む三角フラスコを１時間静置しながら放置することにより、ボトリオコッカスを自然沈降させた。次いで、三角フラスコ底部に自然沈降したボトリオコッカスを、ピペットを用いて２ｍＬ吸い取り、５ｍＬ容のホモジナイズ用チューブ（ＴＭ−６５５Ｓ滅菌付、株式会社トミー精工製）に入れ、該チューブにはビーズを入れずに、ビーズ式細胞破砕装置（Ｍｉｃｒｏ  Ｓｍａｓｈ  ＭＳ−１００、株式会社トミー精工製）にセットし、１分間当たりの振動数５，５００回にて２０秒間、図４Ｃの振動形態で振動させて、ボトリオコッカスの凝集体を分散させた凝集体分散液を得た。この凝集体分散液の１０μＬを血球計数盤（カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製）上に滴下し、光学顕微鏡下で珪藻の数を計測した結果、２．０×１０６個／ｍＬであった。
【００９５】
＜微生物凝集膜形成工程＞
前記採取工程で得られたボトリオコッカスを、滅菌した２×ＣＨＵ１３培地で２×１０６個／ｍＬに調製したものを１００ｍＬ容のガラス製三角フラスコ（６−０１７−０５、アズワン株式会製）に２０ｍＬに入れ、ボトリオコッカスが培地中に均一になるように攪拌した。消毒用エタノールに３０分間浸漬後、クリーンベンチ内で乾燥させた、直径１ｃｍのポリスチレンフィルムを、２４穴プレート（微生物培養プレート、アズワン株式会社製）の内部に置き、前記調製したボトリオコッカスを２ｍＬ／ウエル添加し、温度２３℃、照度２，０００ルクスの条件下で、７日間静置培養を行った。なお、このとき培養基板上として定義される面積は、ポリスチレンフィルムの片面であり、０．７９ｃｍ２である。
培養後のボトリオコッカスが付着したポリスチレンフィルムの様子を光学顕微鏡（４０倍）で観察した結果を図１０に示す。なお、このとき、ボトリオコッカスが高度の凝集しているため、該凝集膜中の細胞数を計測することはできなかった。
【００９６】
＜分散工程＞
７日間培養後、２４穴プレートからポリスチレンフィルムを取り出し、滅菌済みの２×ＣＨＵ１３培地に浸漬して洗浄することで、ポリスチレンフィルムに非付着のボトリオコッカスを洗浄除去した。次いで、ポリスチレンフィルムを２×ＣＨＵ１３培地が２ｍＬ入ったホモジナイズ用マイクロチューブ（ＴＭ−６５５Ｓ滅菌付、株式会社トミー精工製）にセットし、１分間当たりの振動数５，５００回にて２０秒間、図４Ｃの振動形態で振動させ、ボトリオコッカスの凝集膜を分散させた実施例４の凝集膜分散液を得た。
【００９７】
＜計測工程＞
分散工程で得られた凝集膜分散液を血球計数盤（カウンティングチェンバー、アズワン株式会社製）上に１０μＬ滴下し、光学顕微鏡（１０倍率）下で観察したところ、ボトリオコッカスの凝集膜から個々のボトリオコッカスの細胞が分散されており、数を計測することができた。結果を図１１に示す。細胞の状態を観察すると、破砕した細胞も少なく、良好に分散されていることがわかった。
即ち、凝集膜分散液中のボトリオコッカスの細胞数は、１０．６×１０６個／ｃｍ２であった。
【００９８】
（比較例１）
実施例２において、分散工程を以下の分散方法に変えたこと以外は、実施例２と同様の方法で微生物細胞数の計測を行った。
【００９９】
実施例２の微生物凝集膜形成工程において、１０日間培養後、２枚のスライドグラスを、前記滅菌した人工海水３８ｇ／Ｌを含むＩＭＫ培地に前記培養後のスライドグラスを浸けることでそれぞれ洗浄し、スライドグラス上に非付着の珪藻を洗浄除去した。次いで、スライドグラス上に付着して凝集膜を形成した珪藻をセルスクレーバーを用いて剥離し、７ｍＬの前記滅菌した人工海水３８ｇ／Ｌを含むＩＭＫ培地に入れた。次いで、１ｍＬのピペットを用いて、この珪藻の凝集膜を含む培地を１０回ピペッティングした後、０．５ｍＬの珪藻の凝集膜を含む培地を２ｍＬ容のホモジナイズ用マイクロチューブ（ＴＭ−６２６Ｓ滅菌付、株式会社トミー精工製）に入れ、超音波洗浄機（ＵＳＤ−４Ｒ、アズワン株式会社）にセットした。次いで、珪藻の凝集膜を含む培地に対して２８ｋＨｚで５分間超音波を印加し、珪藻の凝集膜を分散させた比較例１の凝集膜分散液を得た。
【０１００】
得られた凝集膜分散液を光学顕微鏡（１０倍率）で観察した結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。その結果、珪藻の細胞が破砕しているものが多く認められ、細胞数を計測することができなかった。
【０１０１】
実施例１〜４及び比較例１の計測工程で凝集膜分散液を光学顕微鏡にて観察し、分散性を下記評価基準に基づいて評価した。また、破砕した微生物細胞の割合を下記式により算出し、細胞破砕を下記評価基準に基づいて評価した。実施例１〜４及び比較例１、並びに試験例１の結果をまとめて表１に示す。
破砕した微生物細胞の割合（％）＝破砕した微生物細胞数／全微生物細胞数×１００％
［分散性の評価基準］
○  ：  個々の分散されており顕微鏡にて容易に計測できる
△  ：  数個細胞からなる塊が存在するものの計測できる
×  ：  微生物細胞が大きく凝集しており計測できない
［細胞破砕の評価］
◎  ：  破砕した細胞が１０％未満
○  ：  破砕した細胞が２０％未満
△  ：  破砕した細胞が３０％未満
×  ：  破砕した細胞が３０％以上
【０１０２】
【表１】
0005636207.tif 000002
【０１０３】
（試験例１）
実施例２及び３で計測工程に使用しなかった３８枚のスライドグラスから、実施例２及び３の分散工程と同様の方法で珪藻を分散させた凝集膜分散液を得た。次いで、実施例２及び３と同様の方法で、スライドグラス３８枚の珪藻の細胞数をそれぞれ数えた。その結果、スライドグラス３８枚の合計の珪藻の細胞数は、９×１０８個であった。
また、実施例４と同様にプラスチック製シャーレ（アズノール滅菌シャーレ、アズワン株式会社製）にポリスチレンフィルム（直径８ｃｍ）を入れた容器を１２枚作成し、実施例４と同様の方法でボトリオコッカスからなる微生物凝集膜を作製した。実施例４と同様の方法で、ポリスチレンフィルムを２枚のボトリオコッカスの細胞数をそれぞれ数えた。その結果、ポリスチレンフィルムを１０枚の合計のボトリオコッカスの細胞数は、６．２３×１０９個であった。
【０１０４】
上記得られた珪藻（実施例１及び２）を、卓上遠心機（チビタンＲ、アズワン株式会社製）を用いて６，２００ｒｐｍ（２，０００Ｇ）で１分間遠心分離した。次いで、上清を除去し、珪藻からなる沈殿に、１／１０濃度の人工海水（マリンアート  スーパーフォーミュラ  ＳＦ−１、冨田製薬株式会社製）を３８ｇ／Ｌ含むＩＭＫ培地（ダイゴＩＭＫ培地、日本製薬株式会社）を１ｍＬ添加し、卓上攪拌機（ボルテックスミキサー、アズワン株式会社製）を用いて１分間の攪拌処理を行った。これを、卓上遠心機を用いて６，２００ｒｐｍ（２，０００Ｇ）で１分間遠心分離しすることにより、珪藻の細胞表面を洗浄した。この洗浄は２回行った。次いで、マイクロチューブを１００℃のオーブン中で加熱することで溶媒を除去し、乾燥珪藻の藻体を得た。乾燥珪藻の藻体の質量は、空のマイクロチューブの重さとの差を測定することで得た。
【０１０５】
上記得られたボトリオコッカス（実施例４）は、前記珪藻の処理において、珪藻をボトリオコッカスに代え、人工海水を３８ｇ／Ｌ含むＩＭＫ培地を２×ＣＨＵ１３培地に代えたこと以外は、前記珪藻の処理と同様の方法により乾燥ボトリオコッカスの藻体の質量を測定した。
【０１０６】
次に、乾燥珪藻又は乾燥ボトリオコッカスの藻体を１５ｍＬの遠沈管に移し、そこへ２ｍＬの５質量％塩酸−メタノール溶液を添加し、１００℃で１時間反応を行った。この反応液にヘキサン１．５ｍＬ及び水０．５ｍＬを添加した後、卓上遠心機を用いて６，２００ｒｐｍ（２，０００Ｇ）で１分間遠心分離した。上清を分取し、純水１ｍＬを加え、よく攪拌した後、卓上遠心機を用いて６，２００ｒｐｍ（２，０００Ｇ）で１分間遠心分離した。上層のヘキサン層を分取し、溶媒をエバポレーションにより除去した後、予め質量を測定しておいた空の遠沈管の質量との差から、珪藻又はボトリオコッカスが細胞内に産生したオイル含有量を測定した。結果を表２に示す。
【０１０７】
【表２】
0005636207.tif 000003
【０１０８】
表１の結果より、前記微生物細胞数の計測方法は、微生物凝集膜中の微生物を破砕させることなく簡便な操作で分散させることができ、正確に細胞数を計測することができることがわかった。また、これにより微生物が産生するバイオマスを、細胞１個あたりの量として測定することができることもわかった。これより、前記微生物細胞数の計測方法によれば、例えば、微生物から産生されたバイオマス量が増加した場合、その増加が、微生物の細胞数が増えたことによるものなのか、あるいは、微生物の１細胞から産生されるバイオマス量が増加したのかをモニターすることができる。したがって、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発などに好適に利用可能である。
【０１０９】
本実施例の微生物細胞数の計測方法により、微細藻類が産生するバイオマスについて、細胞１個あたりの産生量を正確に、かつ簡便に測定できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
本発明の微生物細胞数の計測方法は、培養基材上に付着し増殖することにより形成された微生物凝集膜中の、個々の微生物の細胞数を正確に計測することができ、個々の微生物が産生するバイオマスの産生能などについて正確にモニターすることができるため、バイオマスの生産量のモニターや、バイオマス量を向上させる方法の開発に好適に利用可能である。
【符号の説明】
【０１１１】
１０    振動装置
１２    装置本体
１４    蓋部材
１６    密閉容器ホルダー
１８    駆動軸
２０    振動駆動部
２２    密閉容器
２２Ａ  蓋
２４    チャック部
２５    その他の成分
２６    微生物凝集膜希釈液
２７    微生物
２８    ＯＮ−ＯＦＦスイッチ
３０    振動数ダイヤル
３２    タイマーダイヤル
３４    切り換えスイッチ
【図１】
0005636207.tif 000004
【図２】
0005636207.tif 000005
【図３】
0005636207.tif 000006
【図４Ａ】
0005636207.tif 000007
【図４Ｂ】
0005636207.tif 000008
【図４Ｃ】
0005636207.tif 000009
【図５】
0005636207.tif 000010
【図６】
0005636207.tif 000011
【図７】
0005636207.tif 000012
【図８】
0005636207.tif 000013
【図９Ａ】
0005636207.tif 000014
【図９Ｂ】
0005636207.tif 000015
【図１０】
0005636207.tif 000016
【図１１】
0005636207.tif 000017
【図１２Ａ】
0005636207.tif 000018
【図１２Ｂ】
0005636207.tif 000019