(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に生物学的に活性なタンパク質を投与した際に惹起される免疫反応を減少または除去するための医薬であって、連鎖球菌のタンパク質Ｇのアルブミン結合ドメインが少なくとも１つカップリングされた生物学的に活性なタンパク質を含み、生物学的に活性なタンパク質が抗体およびそのフラグメントおよび誘導体、ブドウ球菌のタンパク質Ａおよびそのフラグメントおよび誘導体、フィブロネクチンおよびそのフラグメントおよび誘導体、リポカリンおよびそのフラグメントおよび誘導体、トランスフェリンおよびそのフラグメントおよび誘導体、レクチンおよびそのフラグメントおよび誘導体、成長ホルモン、毛様体神経栄養因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インスリン、インターフェロンβ、第VIII因子、エリスロポイエチン、ＧＬ１Ｐおよびトロンボポイエチンから選択される、医薬。
【請求項２】
上記アルブミン結合ドメインが、そのヒト血清アルブミンとの結合を強化するように調整される、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
医薬は、生物学的に有用な活性を有する第一の部位、および、医薬の哺乳動物の血清アルブミンへの結合に介在する第二の部位を有する、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
第一の部位は、生物学的に活性なタンパク質由来である、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
医薬は、相互作用のＫDが１０-6Ｍ未満またはそれに等しくなるような血清アルブミン
に関する結合親和性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
医薬は、１０-7Ｍ未満またはそれに等しい血清アルブミンに関する結合親和性を有する、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
医薬は、１０-8Ｍ未満またはそれに等しい血清アルブミンに関する結合親和性を有する、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
医薬は、１０-9Ｍ未満またはそれに等しい血清アルブミンに関する結合親和性を有する、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
医薬は、１０-10Ｍ未満またはそれに等しい血清アルブミンに関する結合親和性を有す
る、請求項８に記載の医薬。
【請求項１０】
医薬は、１０-11Ｍ未満またはそれに等しい血清アルブミンに関する結合親和性を有す
る、請求項９に記載の医薬。
【請求項１１】
医薬は、１０-12Ｍ未満またはそれに等しい血清アルブミンに関する結合親和性を有す
る、請求項１０記載の医薬。
【請求項１２】
医薬は、１０-13Ｍ未満またはそれに等しい血清アルブミンに関する結合親和性を有す
る、請求項１１に記載の医薬。
【請求項１３】
医薬は、１０-14Ｍ未満またはそれに等しい血清アルブミンに関する結合親和性を有す
る、請求項１２に記載の医薬。
【請求項１４】
哺乳動物はヒトである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１５】
哺乳動物は非ヒト哺乳動物である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１６】
免疫反応は、体液性免疫反応である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１７】
生物学的に活性なタンパク質の生物活性は、血清アルブミン以外の標的分子と相互作用する能力を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項１８】
生物学的に活性なタンパク質の生物活性は、標的分子の活性をブロックする能力を含む、請求項１７に記載の医薬。
【請求項１９】
標的分子は、細胞の表面に存在する、請求項１７または１８に記載の医薬。
【請求項２０】
細胞は、癌細胞または前癌細胞である、請求項１９に記載の医薬。
【請求項２１】
細胞の表面に存在する標的分子は、ＨＥＲ２、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７４、ＣＥＡ、および、ＥｐＣＡＭから選択される、請求項１９または２０に記載の医薬。
【請求項２２】
標的分子は酵素である、請求項１７または１８に記載の医薬。
【請求項２３】
標的分子は、ホルモン受容体、および、サイトカイン受容体から選択される、請求項１７または１８に記載の医薬。
【請求項２４】
標的分子は毒素である、請求項１７または１８に記載の医薬。
【請求項２５】
毒素はヘビ毒である、請求項２４に記載の医薬。
【請求項２６】
生物学的に活性なタンパク質は、ブドウ球菌のタンパク質Ａ、または、その生物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体である、請求項１に記載の医薬。
【請求項２７】
生物学的に活性なタンパク質は、ブドウ球菌のタンパク質ＡのＢドメイン、または、そ
のタンパク質Ｚ誘導体、または、その改変された結合親和性を有する変異体を含む、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
生物学的に活性なタンパク質の生物活性は、酵素活性を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項２９】
生物学的に活性なタンパク質の生物活性は、ホルモン活性を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項３０】
生物学的に活性なタンパク質の生物活性は、薬剤活性を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に活性なタンパク質の免疫原性を減少させる方法および使用に関する。特に、本発明は、医薬品を製造するための、生物学的に活性なタンパク質部分と、アルブミン結合性部位とを含む分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清アルブミン
血清アルブミンは、哺乳動物の血清中の最も豊富なタンパク質であり（ヒトにおいて、４０ｇ／１；約０.７ｍＭ）、その機能の１つは、脂質やビリルビンのような分子に結合することである（Ｐｅｔｅｒｓ  Ｔ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１６１，１９８５）。血清アルブミンの半減期は、動物の大きさに正比例し、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１９日間の半減期を有し、ウサギ血清アルブミンは、約５日間の半減期を有する（ＭｃＣｕｒｄｙ  ＴＲ等，Ｊ  Ｌａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ  １４３：１１５，２００４）。ヒト血清アルブミンは、体内に広く分布しており、特に、主として浸透圧モル濃度の維持に関与する腸および血液の区画に分布している。構造的に、アルブミンは、３つの相同ドメインを含み、総計５８４または５８５個のアミノ酸からなる単鎖タンパク質である（Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ  Ｌ等，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：７１（１９８２））。アルブミンは、１７個のジスルフィド架橋、および、１個の反応性チオール、Ｃｙｓ３４を含むが、Ｎと結合した、および、Ｏと結合した炭水化物成分を有しない（Ｐｅｔｅｒｓ，１９８５，上記；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ＪＰ等，Ｂｒ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ  ８５：５９９（２０００））。糖鎖付加の欠如が、アルブミンの組換え発現を簡単にしている。アルブミンは、この特性と、三次元構造が既知であることによって（Ｈｅ  ＸＭおよびＣａｒｔｅｒ  ＤＣ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２０９（１９９２））、組換え融合タンパク質に使用する魅力的な候補である。このような融合タンパク質は、一般的に、単一のポリペプチド鎖中で、治療用タンパク質（これは、タンパク質そのものを投与すると体から迅速に排除されると予想される）と、血漿タンパク質（これは、自然な遅いクリアランスを示す）とが組み合わされたものである（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ  ＷＰ，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｃｓ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  １：１（２００１））。このような融合タンパク質は、必要な注射の回数を減らし、かつ、インビボで治療用タンパク質がより高レベルであるという点で、臨床上の利点を提供する可能性がある。
【０００３】
ＨＳＡとの融合または結合により、インビボでのタンパク質の半減期が長くなる
血清アルブミンは、あらゆる酵素的または免疫学的な機能を欠いているため、生物活性ポリペプチドにカップリングされると望ましくない副作用を示さないと予想される。その上、ＨＳＡは、多数の天然の分子、同様に治療的な分子の内因性の輸送および送達に関与する天然のキャリアーである（Ｓｅｌｌｅｒｓ  ＥＭおよびＫｏｃｈ−Ｗｅｓｅｒ  ＭＤ，Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ，Ｒｏｓｅｎｏｅｒ  ＶＭ等編（Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ１５９（１９７７））。血清アルブミンに直接的に、または、インビボで血清アルブミンに結合が可能と予想されるペプチドもしくはタンパク質に、タンパク質を共有結合でカップリングさせる方策が数種報告されている。後者のアプローチの例は、例えば、ＥＰ４８６５２５およびＵＳ６２６７９６４、ＷＯ０１／４５７４６、ならびに、Ｄｅｎｎｉｓ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３５０３５〜４３（２００２）で説明されている。最初の２つの文献は、具体的には、その他のタンパク質の半減期を高めるための、連鎖球菌のタンパク質Ｇ（ＳｐＧ）から誘導されたアルブミン結合性ペプチドまたはタンパク質の使用を説明している。この考え方は、バクテリア由来のアルブミン結合性ペプチド／タンパク質を、血液中で迅速に排除されることが示されている治療上興味深いペプチド／タンパク質に融合させることである。このようにして生成した融合タンパク質は、インビボで血清アルブミンに結合し、そして、それらのより長い半減期による利点のために、この融合した治療上興味深いペプチド／タンパク質の正味の半減期が増加する。ＷＯ０１／４５７４６およびＤｅｎｎｉｓ等は同じ概念に関するが、そこで著者らは、血清アルブミンに結合させるために、比較的短いペプチドを利用している。このようなペプチドは、ファージ提示法によるペプチドライブラリーから選択されている。Ｄｅｎｎｉｓ等は、初期の研究で、連鎖球菌のタンパク質Ｇのアルブミン結合性ドメインのヒト１型補体受容体への組換え融合体に対する免疫反応の強化を見出したことを述べている。また、米国特許出願第２００４／０００１８２７号（Ｄｅｎｎｉｓ）は、腫瘍を標的にするための生物活性化合物と結合させた血清アルブミンに結合する、ファージ提示法によって再度同定されたペプチドリガンドを含むコンストラクトの使用も開示している。このようなコンストラクトは、改善された薬物動態学的および薬力学的な特性を有すると言われているが、その文書において、上記コンストラクトの免疫原性が、結合させていない生物活性化合物と比較して減少するという開示も示唆もない。さらなる血清アルブミン結合性の結合体分子が望ましいという示唆はない。
【０００４】
その代わりとして、問題の治療上興味深いペプチド／タンパク質はまた、血清アルブミンに直接融合させることもでき、これは、上述した通りであり、さらに、Ｙｅｈ等（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１９０４（１９９２））、および、Ｓｕｎｇ等（Ｊ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ  ２３：２５（２００３））によって説明されている。Ｙｅｈ等は、ＣＤ４の２つの細胞外Ｉｇ様ドメイン（Ｖ１およびＶ２）のＨＳＡへの結合を説明している。ＨＳＡ−ＣＤ４結合体はＣＤ４の保持された生物活性を有するが、実験ウサギモデルで、半減期がＣＤ４単独と比較して１４０倍増加したことが報告されている。溶解性ＣＤ４単独では、０.２５±０.１時間の排出半減期を有するが、それに対して、ＨＳＡ−ＣＤ４の排出半減期は、３４±４時間であると報告されている。また、Ｓｕｎｇ等（上記）によって概説されているように、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）がＨＳＡへ結合する際の排出半減期の延長も観察された。ここで、霊長類においてＩＦＮ−β−ＨＳＡ複合体を評価し、ＩＦＮ−βの半減期が、単独の場合は８時間であったが、ＨＳＡに結合された場合は３６〜４０時間に増加することが報告されている。
【０００５】
連鎖球菌のタンパク質Ｇのアルブミン結合性ドメイン
連鎖球菌のタンパク質Ｇ（ＳｐＧ）は、連鎖球菌属のある特定の株の表面に存在する二官能性の受容体であり、ＩｇＧと血清アルブミンの両方に結合することができる（Ｂｊｏｅｒｃｋ  Ｌ等，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：１１１３（１９８７））。その構造は、数種の構造的かつ機能的に異なるドメインの高度な繰り返しである（Ｇｕｓｓ  Ｂ等，ＥＭＢＯ  Ｊ  ５：１５６７（１９８６））。より正確には、ＳｐＧは、１つのＩｇ結合性モチーフと、３つの血清アルブミン結合性モチーフとを含む（Ｏｌｓｓｏｎ  Ａ等，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １６８：３１９（１９８７））。
【０００６】
アルブミン結合性タンパク質ＢＢは、連鎖球菌のタンパク質Ｇから誘導されたものであり、これは、２１４個のアミノ酸残基を有し、さらに、ＳｐＧのアルブミン結合性モチーフの約２.５を含む（Ｎｙｇｒｅｎ  Ｐ−Å等，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １：６９（１９８８））。これまでに、ＢＢは、強力なワクチンを作製するという目的で、ペプチド免疫原のための融合パートナーとしての高い適正を与える数種の特性を有することが示されている。例えば、ＢＢは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のマラリア抗原Ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ（Ｍ３）（Ｓｊｏｅｌａｎｄｅｒ  Ａ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２０１：１１５（１９９７））から、呼吸器系合胞体ウイルス（ＲＳＶ）（長い）Ｇタンパク質フラグメント（Ｇ２Ｎａ）に至る繰り返し構造と融合させている（Ｐｏｗｅｒ  ＵＦ等，Ｖｉｒｏｌ  ２３０：１５５（１９９７））。ＢＢ−Ｍ３とＢＢ−Ｇ２Ｎａはいずれも、数種の動物モデルにおいて、両方の免疫原融合成分に対して、強力かつ長期にわたる抗体反応を開始させることができる。ウサギにおいて、ＢＢ−Ｍ３は、免疫刺激複合体（ｉｓｃｏｍ）に共有結合した後に抗体の高いタイターを誘導し（Ｓｊｏｅｌａｎｄｅｒ  Ａ等，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈ  ２：７９（１９９３））、マウスにおいて（上記のＳｊｏｅｌａｎｄｅｒ等，１９９７）、および、ヨザル（Ａｏｔｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ）において（Ｂｅｒｚｉｎｓ  Ｋ等，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓ  ４：１２１（１９９５））免疫原性である。観察された作用は、有力なアジュバント、例えばフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）の存在下で観察された。その上、ＢＢ−Ｇ２Ｎａは、マウスとヒトの両方において、検出可能な防御性の抗体反応を誘導した（上記のＰｏｗｅｒ等，１９９７，Ｐｏｗｅｒ  ＵＦ等，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８４：１４５６（２００１））。ＢＢ−Ｍ３に一致して、この作用は、強力なアジュバント（この場合マンニトール、および、リン酸アルミニウム）の存在下で観察された。
【０００７】
Ａ３、ＡＢＤ３または単にＡＢＤ（「アルブミン結合性ドメイン」）と命名された、ＳｐＧの血清アルブミン結合性モチーフのうち１つの構造が決定されている（Ｋｒａｕｌｉｓ  ＰＪ等，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３７８：１９０（１９９６））。この研究により、驚くべきことに、構造がブドウ球菌のタンパク質ＡのＩｇ結合性ドメインに類似した３−へリックスバンドルドメインが解明された。ＳｐＧドメインＡＢＤは、４６個のアミノ酸に相当する。
【０００８】
ＳｐＧのアルブミン結合性部位は、Ｇｏｅｔｓｃｈ等によって説明されているようにして、厳密にエピトープマッピングされている（Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：１２５（２００３））。
【０００９】
その他のアルブミン−結合性ドメイン
アルブミン結合性タンパク質は、その他の細菌に見出される。例えば、天然に存在するアルブミン結合性タンパク質としては、グラム陽性細菌由来の所定の表面タンパク質、例えば連鎖球菌のＭタンパク質（例えば、Ｍ１／Ｅｍｍ１、Ｍ３／Ｅｍｍ３、Ｍ１２／Ｅｍｍ１２、ＥｍｍＬ５５／Ｅｍｍ５５、Ｅｍｍ４９／ＥｍｍＬ４９およびタンパク質Ｈ）、連鎖球菌のタンパク質Ｇ、ＭＡＧおよびＺＡＧ、ならびに、ファインゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）（以前は、ペプトストレプトコッカス・マグヌス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓ））の所定の株由来のＰＰＬおよびＰＡＢが挙げられる。Ｎａｖａｒｒｅ  ＷＷおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ  Ｏによるグラム陽性表面タンパク質の総論（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６３：１７４〜２２９（１９９９））、および、そこに記載された参考文献を参照。これらのタンパク質のうちのいくつかによるアルブミン結合性の特徴が、例えばＪｏｈａｎｓｓｏｎ  ＭＵ等（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：８１１４〜８１２０（２００２））；Ｌｉｎｈｕｌｔ等（Ｐｒｏｔ  Ｓｃｉ  １１：２０６〜２１３（２００２）、および、Ｌｅｊｏｎ  Ｓ．等  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４１，２００４，４２９２４〜４２９２８）によってさらに解明されている。
【００１０】
免疫原性の臨床上の意義
最も生物学的に活性なタンパク質（程度の差はあるが問題の種のタンパク質と同一なタンパク質など）は、かなりの割合の被験体において、投与すると抗体反応を誘導する。免疫原性に寄与する主要な因子は、外来のエピトープ、例えば新規のイディオトープ、異なるＩｇアロタイプまたは非自己配列、不純物の存在、および、タンパク質凝集体の存在である。ほとんどの場合において、このようにして誘導された抗体は、生物学的または臨床的な作用を有さない。臨床的な作用が観察される場合、最も一般的なことは、生物製剤の有効性の損失である。
【００１１】
しかしながら、より重篤な有害反応を示すケースが報告されている。このような場合において、タンパク質製剤に対して発生した抗体は、内因性タンパク質と交叉反応する。このような例として、エリスロポイエチンがある。エリスロポイエチンをヒトに投与すると、免疫反応が誘導され、それにより患者は赤芽球癆を発症する（Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ  Ｎ等，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４６：４６９（２００２））。生成した特異抗体は高い親和性を有しており、その他の形態のエリスロポイエチン、例えばＥｐｒｅｘ(R)、Ｅｐｏｇｅｎ(R)、および、ＮｅｏＲｅｃｏｒｍｏｎ(R)と交叉反応することも示され、すなわちこれは、その反応性は、エリスロポイエチン活性部位のコンフォメーションに対して向けられる可能性が最も高いことを示す。その他の例は、トロンボポイエチンであり、これをヒトに投与すると中和抗体が生産される。この抗体は内因性トロンボポイエチンの活性を阻害し、それにより自己免疫性血小板減少症が発症する（Ｋｏｒｅｎ  Ｅ等，Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３：３４９（２００２））。
【００１２】
生物製剤の臨床用途は免疫反応を惹起することが多いことを考えれば、免疫原性は、全ての生物製剤学的な製品の開発の際に扱うべき危険因子である。上述のエリスロポイエチンとトロンボポイエチンの他にも、数種のその他の生物製剤も、患者において免疫反応を誘導することが報告されている。例えば、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、成長ホルモン（ＧＨ）、インスリン、および、インターフェロンβ（ＩＦＮ−β）である。なぜ上記のタンパク質が、治療した患者において抗体を生産することが観察されるかの理由は、生成物に応じて様々である。より正確には、インスリンの免疫原性における主要な因子は、アジュバントとして作用するタンパク質不純物が存在することのようであり、それに対して、ＩＦＮ−βの場合、主要な因子は、細菌の宿主細胞中でタンパク質が生産される場合の糖鎖付加の欠如、および低い溶解性による集合体の存在と考えられていた（Ｋａｒｐｕｓａｓ  Ｍ等，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５４：１２０３（１９９８））。組換えヒトＧＨが出現する前は、ヒト死体からのＧＨを用いて、子供のＧＨ欠乏症を治療した。主としてタンパク質不純物が高含量であったことにより、この子供達の４５％が、この最初の産物の発生に対する抗体を生産した（Ｒａｂｅｎ  ＭＳ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇ  Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ  １５：７１（１９５９））。組換えＧＨの場合、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における生産を可能にする特別なメチオニン残基を含む組換えＧＨを患者に投与したところ、抗体が８.５％に減少する現象が起こった（Ｏｋａｄａ  Ｙ等，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｊｐｎ  ３４：６２１（１９８７））。ホモ結合型のＧＨ欠失突然変異体を有する双子を、上記治療用タンパク質で処理したところ、１組の双子しか組換えＧＨに対する抗体を生産しなかったことから判断すれば、ＧＨの免疫原性は、自己タンパク質に対する同一性のパーセントまたは免疫寛容の欠如より複雑である（Ｈａｕｆｆａ  ＢＰ等，Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １２１：６０９（１９８９））。ＣＮＴＦは運動ニューロンの生存を強化すると考えられていることから、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）に罹った患者を治療するための組換えヒトＣＮＴＦを生産した。遺憾ながら、これらの患者の９０％より多くが、処理の２週間後に、抗ＣＮＴＦ抗体陽性であることが試験された。治療用タンパク質の臨床的な作用は、１９９５年のＡＬＳ  ＣＮＴＦ研究グループの報告（Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  １８：５１５（１９９５））により示されたように、特異抗体によって著しく阻まれる。トランケーションされたＣ末端を含み、ペグ化された第二のＣＮＴＦ生産は、現在のところ、開発中である。
【００１３】
その上、治療用抗体分子の免疫原性は、多くの病気の治療におけるそれらの広範かつ繰り返しの適用を著しく限定する重要な問題である。
【００１４】
免疫原性を減少させる異なる方策
それゆえに、タンパク質の免疫原性を減少させる技術が必要である。実際には、タンパク質製剤は、天然に存在するタンパク質に比べてアミノ酸配列が改変されているか、または、被験体にとって異種のアミノ酸配列で全て構成されることがますます一般的になりつつあるため、このような技術の重要性は高まっている。免疫原性を防ぐ重要な方法の１つは、混入したアジュバントを含まない、可溶性の凝集していない天然型のタンパク質が生成されるように、生物製剤学的なタンパク質の生産、精製および配合を最適化することによる方法である。精製および配合を改善することによる、ヒト成長ホルモン（Ｍｏｏｒｅ  ＷＶ等，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎ  Ｍｅｔｈ  ５１：６９１（１９８０））、および、インターフェロン−α２ａ（Ｈｏｃｈｕｌｉ  Ｅ，Ｊ  Ｉｎｔｅｒ  Ｃｙｔｏ  Ｒｅｓ  １７：１５（１９９７））のようなタンパク質の免疫原性の減少に関する数々の報告がある。
【００１５】
免疫原性を改変するその他の方法は、問題のタンパク質の実際の配列または構造に対して向けられており、これはしばしば、「脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）法」と称される。このような方策の例は、エピトープの中和、遺伝子シャッフリング、化学修飾および免疫寛容である。エピトープの中和は、インシリコおよび／またはインビトロでの方法を用いた優勢のＴおよび／またはＢ細胞エピトープの合理的な同定、それに続いて、優勢なエピトープが除去され、願わくば減少した免疫原性が得られるような強調表示された配列のデザイン変更を含む（Ｓｔｉｃｋｌｅｒ  ＭＭ等，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ６：６５４（２０００）；米国特許出願公開番号２００３／０１６６８７７）。脱免疫化および遺伝子シャッフリングのその他の例は、抗体分子のヒト化である（Ｋｕｕｓ−Ｒｅｉｃｈｅｌ  Ｋ等，Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：３６５（１９９４））。その免疫原性は、マウス抗体から、キメラ抗体、完全ヒト抗体に至るまで落ちることが報告されている。ＤＮＡ遺伝子シャッフリングを用いたヒトタンパク質の進化は、遺伝子の秩序だったキメラを生成するための相同性依存性のＤＮＡフラグメント組換えを含む。遺伝子シャッフリングは、免疫原性が減少し、かつ生物活性が保持されたタンパク質を探すのに有用であり得る（Ｐａｖｌｉｎｋｏｖａ  Ｇ等，Ｉｎｔ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９４：７１７（２００１））。
【００１６】
タンパク質の抗原性（既存の抗体に結合すること）、および、免疫原性（新しい免疫反応を誘導する能力）を改変するその他の方法は、タンパク質を化学修飾することである。化学修飾は、共有結合したポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Ｍｏｌｉｎｅｕｘ  Ｇ，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ２３：３（２００３））、および、デキストラン（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｋ等，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ４９：８２３（２００１））を用いて、または、無水コハク酸を用いた正電荷の中和を行うことによって達成することができる。ＰＥＧは、非毒性で高い可溶性を有する分子であり、これは、それらに共有結合したタンパク質のインビボでの半減期を増加させること、および、このようなタンパク質の免疫原性を減少させることが示されている（Ｍｏｌｉｎｅｕｘ  Ｇ，上記）。ＰＥＧアプローチは、一般的にタンパク質の「ペグ化」と称される。
【００１７】
免疫寛容の誘導は、治療分子に化学的な付加がなされないため、免疫反応を防ぐためのペグ化よりも許容できる手段を提供する。同じ製薬でも、例えばより優れた患者のコンプライアンスを保証するものが投与される。このアプローチは、例えば、血友病Ａに罹った患者に第ＶＩＩＩ因子を投与することに関して試されてきた。血友病Ａを治療するために第ＶＩＩＩ因子を使用する際の合併症の１つは、治療用タンパク質に対する阻害抗体の生成であり、これは、全ての患者の約三分の一で観察される（Ｓｃｈａｒｒｅｒ  Ｉ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ５：２５３（１９９９））。免疫反応を限定しようとする努力において追求される１つの方策として、数ヶ月から数年の期間投与されると予想される免疫抑制剤を併用した多い用量の第ＶＩＩＩ因子の毎日の注射がある。
【００１８】
現在の免疫原性を減少させる方策の欠点
免疫原性を減少させる異なるアプローチの欠点がいくつかある。１つには、薬物の有効性に必須の活性部位を妨害することなく、共有結合によるＰＥＧ分子のタンパク質への付着を達成することが難しい。これを回避することが、ペグ化における主要な課題である。ペグ化した生成物の品質には大きなばらつきがあり、さらに、以下のような多数の因子が、このばらつきの一端を担っていることが示されている：ＰＥＧとタンパク質との間のリンカーの存在または非存在；ＰＥＧ、リンカーおよびタンパク質の間の結合の性質および安定性；得られたペグ化したタンパク質の表面電荷へＰＥＧが付着することの影響；カップリング条件；均一な生成物を提供するための必要条件；および、活性化されたポリマーの関連する毒性。その上、生物活性の保存に関して優れた結果を達成するために、プロトタイプの方法の著しい改変、さらには生物学的な最適化プロセスの著しい改変が、必要とされてきた。あらゆる活性の減少は、治療用量を増加させることによって対処してきたが、それにより再びこれら分子に対する免疫反応の危険が増加する。ペグ化アプローチのその他の欠点は、ペグ化した治療剤は、１ヶ月あたり患者１人あたり推定でＵＳＤ１０００まで治療費を増加させることである。治療用タンパク質分子の薬理学的および免疫学的な特性の改善に関して、ＰＥＧ以外にポリマーでは、ほとんど成功していない（Ｂｕｒｎｈａｍ  ＮＬ，Ａｍ  Ｊ  Ｈｏｓｐ  Ｐｈａｒｍ  ５１：２１０（１９９４））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上述したように、治療用抗体分子の免疫原性は、ヒト化アプローチを用いて対処されてきた。ヒト化は、いくつかのマウス抗体、例えばいくつかの乳ガンの治療に承認されているハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ(R)）ではよく作用している。その他の場合において、ヒト化抗体、例えばリウマチ様関節炎の治療に用いられるキャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ(R)）−１Ｈは、それでもなお、治療された患者の６０％において免疫反応を誘導する。加えて、動物実験からのデータによれば、齧歯類は、同じ種および系統由来の抗体に、明らかに寛容ではないことが示され（Ｃｏｂｂｏｌｄ  ＳＰ等，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍ  １２７：１９（１９９０））、さらに、完全ヒト抗体は、その他のあらゆる抗体と同様に抗イディオタイプ抗体を誘発する可能性を有すると考えられる。
【００２０】
その上、「脱免疫化」アプローチ、例えばＴおよびＢ細胞エピトープの標的化された除去は、一般に思われているほど些細ではない。インシリコでのエピトープ予想に利用可能なアルゴリズムは、信頼できない場合がある。Ｂ細胞エピトープを予想する場合、このようなエピトープは、かなりの程度、立体配座のエピトープであるため、アルゴリズムを用いて予想することは極めて難しい。一方で、Ｔ細胞エピトープは、直鎖状であるが、これは、現存するインシリコツールがより信頼できることを意味する。遺憾ながら、ほとんどのアルゴリズムは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連ペプチドを同定するのには適しているが、ＭＨＣクラスＩＩ関連ペプチドを同定するのには適していない。後者は、ヘルパーＴ細胞の活性化により関連しているため、これは、抗体反応の減少を探す場合、欠点である。その上、ＭＨＣ分子の多数の多型が、イムノインフォマティクスを用いて、あらゆる所定のタンパク質抗原のＴ細胞エピトープの大半を予測することを難しくしている。イムノインフォマティクスによって同定されたエピトープは、例えばインビトロでのヒトＴ細胞刺激分析での実証研究によって常に検証すべきであることを念頭に置くことが重要である。その理由の１つは、免疫原性ペプチド（すなわちＴ細胞エピトープ）のＭＨＣクラスＩＩ分子への結合は、そのペプチドに対する特異性を有する所定のＴ細胞抗原受容体による認識を確認するには十分ではないことである。Ｔ細胞エピトープとＢ細胞エピトープの両方を同定するのに必要な研究は、時間がかかり、同様に、実験的に難しい。
【００２１】
異なる治療剤（例えば上記で例示された第ＶＩＩＩ因子）に対する耐性の誘導に関与する主要な不利益は、免疫抑制剤を用いた長期治療の作用（例えば免疫系を抑制した後の感染への感受性や、上記抑制剤の潜在的毒作用）、および、付随する高いコストである。小児患者における第ＶＩＩＩ因子に対する免疫寛容の誘導の費用は、ほぼ１百万ＵＳドル
と推定されている。
【００２２】
生物製剤および生物活性を有するその他のタンパク質の免疫原性を減少させる方策があるにもかかわらず、これらの方策のなかで、免疫原性の減少または除去が要求される全ての状況においてそれ自身有用であることが証明されたものはない。従って、この問題への補足的なアプローチの必要性が存在し続けている。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明の目的は、この必要性を、哺乳動物の被験体にタンパク質を投与した際の、タンパク質の免疫原性に関連する問題を回避するための新しい方法を提供することによって満たすことである。
【００２４】
本発明の関連する目的は、投与された生物製剤またはタンパク質薬に対する抗体の生成を減少させるか、または、理想的には完全に回避することである。
【００２５】
本発明のその他の目的は、新規の目的のために、哺乳動物の血液において豊富な血清アルブミンを利用することである。
【００２６】
これらの目的、および本明細書での開示より当業者には当然であるその他の目的を考慮して、本発明は、その様々な観点で、免疫原性の問題を解決するための従来既知の方法に、驚くべき別法を提供する。
【００２７】
従って、一形態において、本発明は、生物学的に活性なタンパク質そのものを哺乳動物に投与した際に誘発される免疫反応と比較して、哺乳動物に投与する際に免疫反応を惹起しないか、または、免疫反応が減少される医薬品を製造するための、生物学的に活性なタンパク質である少なくとも１つの成分、および、哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる少なくとも１つの成分を含む分子（「本発明の分子」）の使用を提供する。
【００２８】
その他の形態において、本発明は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物に生物学的に活性なタンパク質を投与する際に誘発された免疫反応を減少させるか、または除去する方法を提供し、本方法は、該ポリペプチドを哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる少なくとも１つの成分にカップリングさせて分子を形成し、該哺乳動物に該分子（「本発明の分子」）を投与することを含む。
【００２９】
さらにその他の観点において、本発明は、非ヒトまたはヒト哺乳動物に生物学的に活性なタンパク質を投与する方法における良法を提供し、ここにおいて、本良法は、生物学的に活性なタンパク質から誘導される少なくとも１つの成分、および、哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる少なくとも１つの成分を含む分子（「本発明の分子」）を投与することを含み、それによって、該分子は、生物学的に活性なタンパク質それのみからなる化合物と比較して、免疫反応を惹起しないか、または、減少した免疫反応を惹起する。
【００３０】
本発明のその他の形態において、生物学的に活性なタンパク質である少なくとも１つの成分、および、哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる少なくとも１つの成分を含む分子（「本発明の分子」）が提供され、本分子は、哺乳動物に投与する際に、該生物学的に活性なタンパク質それのみを該哺乳動物に投与した際に誘発される免疫反応と比較して、免疫反応を惹起しないか、または、減少した免疫反応を惹起する。
【００３１】
本発明はまた、このような分子と、製薬上許容できるキャリアーとを含む組成物、および、医薬品の製造におけるこのような分子の使用を提供する。
【００３２】
本発明の様々な形態を基礎として、驚くべきことに、本発明者等により、生物学的に活性なタンパク質を血清アルブミンへの親和性を有する成分に共有結合でカップリングすることによって、生物学的に活性なタンパク質に対する免疫反応を実質的に減少させるか、または、さらに除去することが実行可能であることが示された。このようにして得られた分子を哺乳動物に投与することによって誘発された免疫反応は、共有結合でそれらにカップリングされたアルブミン結合性成分を有しない生物学的に活性なタンパク質を投与することによって誘発された免疫反応と比較して、顕著に減少する。実際に、これは、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドをアルブミン結合性成分にカップリングする従来技術で示される唯一の免疫学的な作用は、アジュバントの存在下で（発明の背景を参照）アルブミン結合性タンパク質ＢＢにカップリングされた免疫原に対する抗体の生成の増加であるということを特に考慮すると、驚くべき観察である。
【００３３】
本発明の一実施形態において、上記の減少した、または除去された免疫反応は、体液性免疫反応である。この実施形態において減少した、または、除去された体液性免疫反応は、例えば抗体（特にＩｇＧアイソタイプ）の生産であり得る。
【００３４】
いかなる特定の理論に縛られることは望まないが、分子を被験体哺乳動物に投与した後、体内で分子と血清アルブミンとが結合することによって、被験体の免疫系は、上記分子への免疫反応が生じないように分子を無視するようになると考えられている。アルブミンの結合の平衡は、分子とアルブミンとの複合体の方に極端にシフトする可能性が高い。
【００３５】
哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる成分は、タンパク質またはペプチドが可能であり、例えばポリペプチド、または、オリゴペプチドである。
【００３６】
哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる成分は、血清アルブミンと相互作用する望ましい能力を有する天然に存在するポリペプチドであり得る。また、このような天然に存在するポリペプチドのフラグメントまたは誘導体も、アルブミン結合性成分として用いることができ、ただし、当然ながら、このようなフラグメントまたは誘導体において、アルブミンと結合する能力は、少なくとも部分的に保持される。アルブミン結合活性を有する天然に存在するポリペプチドの非限定的な例としては、グラム陽性細菌由来の所定の表面タンパク質、例えば連鎖球菌のＭタンパク質（例えばＭ１／Ｅｍｍ１、Ｍ３／Ｅｍｍ３、Ｍ１２／Ｅｍｍ１２、ＥｍｍＬ５５／Ｅｍｍ５５、Ｅｍｍ４９／ＥｍｍＬ４９、および、タンパク質Ｈ）、連鎖球菌のタンパク質Ｇ、ＭＡＧおよびＺＡＧ、ならびに、ファインゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）（以前は、ペプトストレプトコッカス・マグヌス）の所定の株由来のＰＰＬ、および、ＰＡＢが挙げられる。Ｎａｖａｒｒｅ  ＷＷおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ  Ｏによるグラム陽性表面タンパク質の総論（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６３：１７４〜２２９（１９９９））、および、そこに記載された参考文献を参照。さらに、これらのタンパク質のうち数種によるアルブミン結合性の特徴が、例えばＪｏｈａｎｓｓｏｎ  ＭＵ等（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：８１１４〜８１２０（２００２））；Ｌｉｎｈｕｌｔ等（Ｐｒｏｔ  Ｓｃｉ  １１：２０６〜２１３（２００２）、および、Ｌｅｊｏｎ  Ｓ．等  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９，４１，２００４，４２９２４〜４２９２８）によって解明されている。これらのおよびその他のタンパク質のどのドメインがアルブミン結合に関与しているか、に関する上記出版物などからの知見を用いて、本発明に従って用いることができる分子においてアルブミン結合性成分として使用するための、列挙されたタンパク質のいずれかの適切なフラグメントまたは誘導体を見出すことは、当業者の通常の能力の範囲内である。例えば、タンパク質ＰＡＢは、ＧＡモジュールとして知られている５３個のアミノ酸残基のアルブミン結合性ドメインを含み、このドメインは、連鎖球菌のＡＢＤと高い配列相同性を有しており、上記のＬｅｊｏｎ等で詳細に考察されている。特に、この論文では、モジュールとヒト血清アルブミンとの結合に重要なアミノ酸残基の同定が開示されている。熟練者であれば、血清アルブミン結合性成分をアルブミンに結合させる適切な残基、または、上記成分のアルブミン結合特性を強化させる適切な残基を有する血清アルブミン結合性成分を生産することができる。
【００３７】
具体的には、上記のＬｅｊｏｎ等は、ヒト血清アルブミンとＧＡモジュールとの境界面の疎水性コアは、ヒト血清アルブミンからの残基Ｐｈｅ−２２８、Ａｌａ−２２９、Ａｌａ−３２２、Ｖａｌ−３２５、Ｐｈｅ−３２６およびＭｅｔ−３２９、ならびに、ＧＡからの残基Ｐｈｅ−２７、Ａｌａ−３１、Ｌｅｕ−４４およびＩｌｅ−４８という配列であることを見出した。熟練者であれば、分子のアルブミンへの結合が強化されるように、この相互作用の表面（例えば境界面の疎水性コア）に寄与する、または、周囲の水素結合の相互作用に寄与する代替アミノ酸残基を含む血清アルブミン結合性成分を提供することが可能である。このような血清アルブミンへの親和性が保持または強化された変異体は、上記のＬｅｊｏｎ等で見出される複合体に関する情報に基づき構築することもでき、さらに、ヘリックス２および３、および、へリックス２の前後のループの代替の表面残基を含む。結合に直接関与する残基を置換することによって結晶化した複合体の結合表面を改変することに加えて、間接的な構造的な作用または静電気による操舵力によって、血清アルブミンに関する強化された結合親和性を得る手段として（Ｌｏｗ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６０：３５９〜３６８，１９９６；ＳｃｈｒｅｉｂｅｒおよびＦｅｒｓｈｔ，Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：４２７〜４３１，１９９６）、または、血清アルブミンのその他の部分との同時の相互作用を導入する手段として、代替アミノ酸が置換されてもよい。当然のことながら、この相互作用は、状況によって水素結合、フンデルワールス相互作用または静電結合の性質によるものであり得る。これらの改変アプローチのいずれか、または、その両方によって生じた全ての配列変異体は、上記のＫｒａｕｌｉｓ等で説明されている血清アルブミン結合性ドメインの直接的に関連する変異体とみなされ、本願の実施例で用いられる。
【００３８】
ヒト血清とアルブミンとの結合境界面で脂肪酸との複合体が形成される可能性が、上記のＬｅｊｏｎ等によって考察されている。本発明の適用は、脂肪酸の存在下または非存在下での結合が強化されるように改変されていてもよい。
【００３９】
従って、上記および背景の章で述べられたように、アルブミン結合能を有する天然に存在するポリペプチドの１つは、連鎖球菌のタンパク質Ｇ、ＳｐＧである。それゆえに、無傷のＳｐＧ、もしくはあらゆるアルブミン結合性ドメイン、または、それらのフラグメントもしくは誘導体は、本発明に従って用いられる分子においてアルブミン結合性成分として用いることもできる。このようなアルブミン結合能を有するドメインの一例は、ＳｐＧドメインＡＢＤである（従来技術では、４６個のアミノ酸のドメインもＡＢＤ３またはＡ３として言及されている。例えば上記のＫｒａｕｌｉｓ  ＰＪ等を参照）。当然ながら、アルブミン結合能が保持されたそれらの変異体またはフラグメントもまた、有用であり得る。例えば、適切な変異体またはフラグメントのアルブミンへの好ましい結合親和性は、以下に示した通りであり得る。
【００４０】
その他の限定されない代替物として、哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる成分は、約５〜約４０個のアミノ酸残基（例えば、約１０〜約２０個のアミノ酸残基）を有するアルブミン結合性ペプチドであり得る。このようなペプチドは、例えば、ＷＯ０１／４５７４６、および、Ｄｅｎｎｉｓ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：３５０３５〜４３（２００２）で、生物学的に活性なタンパク質の半減期を長くする用途で説明されている。具体的には、アミノ酸配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷを含むペプチド、および／または、アミノ酸配列ＤＬＣＬＲＤＷＧＣＬＷを含むペプチド、および／または、アミノ酸配列ＤＩＣＬＡＲＷＧＣＬＷを含むペプチド、または、それらの配列のアルブミン結合性の誘導体が、本発明に係るアルブミン結合性成分として有用であり得る。有用なアルブミン結合性ペプチドの具体的な例は、上記のＤｅｎｎｉｓ等の表ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ、および、ＷＯ０１／４５７４６の１２〜１３頁に見出され、これらの章は、参照により本発明の開示に加入させる。
【００４１】
あるいは、哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる成分は、哺乳動物の血清アルブミンへの親和性を有する有機性の非タンパク質様の化合物でもよい。この成分は、好ましくは、生物学的に活性なタンパク質成分に共有結合した、このような有機化合物のラジカルである。血清アルブミンへの親和性を有する化合物は当業界既知であり、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばイブプロフェン、および、カルプロフェン；ジクロフェナク；サリチル酸；ワルファリン；プロポフォール；ならびに、ハロタンからなる群より選択してもよい。
【００４２】
分子と、それが投与される哺乳動物の血清アルブミンとの効率的な結合を得るために、上記分子は、相互作用のＫDが、≦１０-6Ｍ、例えば≦１０-7Ｍ、≦１０-8Ｍ、≦１０-9Ｍ、≦１０-10Ｍ、≦１０-11Ｍ、≦１０-12Ｍ、≦１０-13Ｍ、または、≦１０-14Ｍになるようなアルブミンに関する結合親和性を有すると予想される。しかしながら、所定の環境において、本発明に従って用いられる分子が、体内で解離し、その目的とする機能を実行できるように、アルブミンの結合が過度に堅くならないことが望ましい場合がある。本発明におけるアルブミンと分子との間の相互作用のような、生体特異的な相互作用のＫDは、例えば、当業者既知の表面プラズモン共鳴を用いて測定してもよく、例えばビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ(R)）の機器を用いて測定してもよい。
【００４３】
本発明の分子のアルブミン結合性成分、従って本発明の分子そのものは、所定の哺乳動物由来の血清アルブミンへの親和性を有する。適切には、被験体の血清中でアルブミン結合性成分とアルブミンとの結合が最適になるように、本分子が投与される被験体は同じ哺乳動物種に属する。好ましくは、アルブミン結合性成分は、所定の哺乳動物の血清アルブミンへの結合が強化されるように適合させる。例えば、哺乳動物がサルの場合、アルブミン結合性成分は、強化されたサル血清アルブミンへの親和性を有していてもよい。同様に、ヒト被験体の場合、アルブミン結合性成分は、本発明の分子のヒト血清アルブミンへの親和性が強化されるように改変されていてもよい。
【００４４】
哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる成分の親和性は、治療しようとする哺乳動物に適するように改変されていてもよい。どのような時でも、アルブミンに結合していない本発明の分子が少量存在する場合がある。薬物動態学的な用語では、結合していない分子の経時的総暴露量は、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）として表現することもできる。薬物動態学分野の当業者には当然であるが、所定の種におけるこのＡＵＣ値は、アルブミンへの親和性と、アルブミンの半減期の両方に依存すると予想される。特に、哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる成分の親和性、すなわち本発明の分子の親和性は、哺乳動物（例えばヒト）で使用する場合、血清アルブミンの半減期が大きくなるにつれて上記親和性も大きくなるように調整してもよい。従って、アルブミンの循環時間がより長い種（例えばヒト個体）において、より高い親和性が必要とされる場合がある。例えば、血清アルブミンに結合することができる成分のヒト血清アルブミンへの親和性は、その成分を変異させることによって増加させてもよい。現在のマウスにおける実験により、ＡＵＣは、免疫反応を回避するために最小化されるべきであるという仮説が確認されている；親和性が低すぎる突然変異体は、免疫反応に対する保護を得られなかった。従って、アルブミンの循環時間がより長い種（例えばヒト個体）では、より高い親和性が必要とされる場合がある。それゆえに、ヒト血清アルブミンへの親和性は、好ましくは、上述のようなアルブミン結合性成分を変異させることによって増加させることができる。
【００４５】
しかしながら、同一のアルブミン結合性成分が、異なる哺乳動物種由来の血清アルブミンに結合することが可能である。従って、例えば、ＳｐＧおよびそのフラグメントは、少なくともマウス、ラットおよびヒト由来の血清アルブミンに結合することができる。本発明の一実施形態において、本発明に係る免疫反応の減少または除去は、本分子をヒトに投与する際に達成される。その他の実施形態において、この作用は、その他の非ヒト哺乳動物への投与に関連して活用される。
【００４６】
また、減少した免疫反応を惹起する分子は、生物学的に活性なタンパク質成分も含む。生物学的に活性なタンパク質成分は、所定の目的で、例えば治療、予防または診断目的で哺乳動物に投与することが望まれるあらゆるタンパク質が可能である。従って、用語「生物学的に活性なタンパク質」は、それが投与される哺乳動物において有用な生物活性を示すあらゆるタンパク質もしくはポリペプチド、または、タンパク質もしくはポリペプチドのフラグメントを含み、一般的に、本明細書で用いられるタンパク質という用語は、ポリペプチド、ならびに、タンパク質およびポリペプチドのフラグメントを包含する。生物学的に活性なタンパク質成分は、本分子が投与される哺乳動物にとって内因性のタンパク質から誘導されてもよいが、異種タンパク質または改変されたタンパク質が都合がよい場合もある。生物学的に活性なタンパク質成分は、可溶性分子でもよいし、または、受容体に結合してもよい。このような活性の非限定的な例を以下で考察する。
【００４７】
生物学的に活性なタンパク質の活性は、問題の哺乳動物の体内で、所定の標的分子と相互作用する能力に属していてもよい。適切には、この標的分子は、哺乳動物の血清アルブミンではない。標的分子、例えば細胞の表面に存在する受容体および他のタンパク質を認識し結合するか、または、細胞の様々な区画のいずれかの内で標的分子を認識し結合するか、または、細胞外の体液に存在する標的分子を認識し結合する生物学的に活性なタンパク質の例がいくつかある。
【００４８】
このような生物学的に活性なタンパク質は、例えば、腫瘍細胞または癌細胞の表面に選択的に存在する標的分子への結合において有用なことが示されている。多数の癌標的または腫瘍標的は、これらの標的への親和性を有する多くの抗体、抗体フラグメントおよびその他の結合分子を有すると説明されている。このような標的の例としては、ＨＥＲ２（乳ガンの所定の形態に関与）、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＣＤ７４（いずれも、様々な異なるリンパ腫に関与）、ならびに、ＣＥＡおよびＥｐＣＡＭ（充実性腫瘍の所定の形態に存在）が挙げられる。本発明に係る生物学的に活性なタンパク質は、例えば、標的分子としてＨＥＲ２、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ７４、ＣＥＡまたはＥｐＣＡＭと相互作用する能力を有するタンパク質であり得る。
【００４９】
さらなる標的分子としては、毒素が挙げられる。例えば、ヘビ毒は適切な標的の可能性があり、本発明の方法は、さらなる免疫反応を刺激しないで毒素を中和する生物学的に活性な成分を送達するために用いられる。
【００５０】
また、本発明に従って用いられる分子の生物学的に活性なタンパク質成分は、細胞に結合していない分子、および／または、癌と関係がない分子とも相互作用する可能性がある。従って、生物学的に活性なタンパク質は、例えば、酵素をブロックする能力、例えば血液凝固カスケードに関与する酵素をブロックする能力、または、エラスターゼをブロックする能力を有するタンパク質であり得る。あるいは、生物学的に活性なタンパク質は、ホルモンまたはサイトカイン受容体をブロックする能力を有していてもよい。
【００５１】
上記で概説したように、生物学的に活性なタンパク質は、所定の標的分子と相互作用する能力を有するタンパク質からなる群より選択されてもよい。このようなタンパク質の非限定的な例としては、抗体、ならびにそのフラグメントおよび誘導体、ブドウ球菌のタンパク質Ａ、ならびにそのフラグメントおよび誘導体、フィブロネクチン、ならびにそのフラグメントおよび誘導体、リポカリン、ならびにそのフラグメントおよび誘導体、トランスフェリン、ならびにそのフラグメントおよび誘導体、および、レクチン、ならびにそのフラグメントおよび誘導体が挙げられる。これらの分子の多くの天然に存在する形態は、新規の特性、例えば天然に存在する形態が結合しない標的分子への結合親和性を新たに作るという観点で、タンパク質工学技術、例えば部位特異的な、またはランダム化したアプローチでの突然変異および変更で処理されてきた。上記で列挙したタンパク質のこのような変異体または誘導体はいずれも、本発明に係る方法または使用で、そのまま生物学的に活性なタンパク質成分として用いてもよい。また、このような分子のフラグメントはいずれも、天然に存在する形態か、または、加工されたそれらの変異体かに関わらず、全長タンパク質の活性がフラグメントに実質的に保持されている限り定義に包含される。
【００５２】
さらなる適切な生物学的に活性なタンパク質としては、成長ホルモン（ＧＨ）、特にヒト成長ホルモン、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インスリン、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）、第ＶＩＩＩ因子、エリスロポイエチン、ＧＬ１Ｐ、および、トロンボポイエチンが挙げられる。
【００５３】
それゆえに、生物学的に活性なタンパク質は、ブドウ球菌のタンパク質Ａ、または、そのフラグメントもしくは誘導体であり得る。例えば、ＩｇＧ結合性Ｂドメインまたはそれから誘導されたＺタンパク質（Ｎｉｌｓｓｏｎ等（１９８７），Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  １，１０７〜１３３、および、米国特許第５１４３８４４号を参照）が、生物学的に活性なタンパク質成分として有用であり得る。基本構造または骨格としてＺタンパク質に基づき、改変された結合親和性を有する変異体は、コンビナトリアルアプローチでのランダム変異誘発によって製作されたライブラリーから選択されている。このようなタンパク質は、幾つかの報告で特性決定されており、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ(R)）分子という名称で商品化されている。代表的な出版物としては、米国特許第６５３４６２８号、Ｎｏｒｄ  Ｋ等，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ８：６０１〜６０８（１９９５）、および、Ｎｏｒｄ  Ｋ等，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：７７２〜７７７（１９９７）が挙げられる。このようなブドウ球菌のタンパク質Ａから誘導されたタンパク質Ｚの変異体が、本発明に係る生物学的に活性なタンパク質成分として有用である。
【００５４】
あるいは、または、加えて、生物学的に活性なタンパク質は、所定の標的分子に結合すること以外の有用な生物学的な活性を示す可能性もある。例えば、これらは、酵素活性またはホルモン活性を示す可能性もある。
【００５５】
当然ながら、上記で例示された活性はいずれも、治療、予防または診断的な作用を有していてもよい。従って、当然ながら、生物学的に活性なタンパク質の活性は、場合によっては、薬剤活性として説明されることもある。
【００５６】
上記の、本発明の実施に際し投与される分子の少なくとも２つの成分は、投与の際に免疫反応が減少するか、または、免疫反応を示さない分子を提供するために、共有結合でカップリングされた２種の異なる分子種から誘導されると説明されている。しかしながら、ｉ）生物学的に有用な活性、および、ii）アルブミン結合能力の２種の機能が、同一の分子種に共存していてもよい、ということも考慮される。本発明で特許請求されたこのような分子の使用もまた本発明の範囲内である。この状態を説明する分子の例は、第一の部位（生物学的に有用な活性が存在する部位）と、第二の部位（アルブミン結合性部位）とを含むタンパク質である。言い換えれば、本分子は、生物学的に有用な活性を有し、生物学的に活性なタンパク質に相当する第一の部位と、哺乳動物の血清アルブミンに結合する能力を仲介する第二の部位とを含むタンパク質からなる。従って、生物学的に有用な活性は、生物学的に活性なタンパク質成分に関して上記で考察された活性のいずれかであり得る。２つの部位は、空間的に分離しており、例えば、タンパク質の異なる面に存在している可能性もある。このようなタンパク質の具体例は、連鎖球菌のタンパク質Ｇ由来のアルブミン−結合性ドメインで構成されたものであり、これは分子の表面上のその他の位置に追加の結合部位を備えている。アルブミン−結合性ドメインは、この追加の部位に、例えば上記で考察された標的のいずれか一つと相互作用する能力を有していてもよい。この追加の結合部位は、タンパク質にアミノ酸突然変異の部位特異的な導入またはランダム導入（例えばアミノ酸残基の付加、欠失または置換）によって提供することができる。得られたタンパク質は、全ての観点において類似しているが、ただしアルブミン結合機能が存在しないタンパク質の免疫原性と比較して、減少した免疫原性、または、除去された免疫原性を示すと予想される。
【００５７】
本発明のさらなる形態によれば、コンストラクトＺTaq4:1−ＡＢＤ、ＡＢＤ−Ｚher2:4、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）3、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）4、（ＺAβ3）2、ＡＢＤ−、および、（ＺAβ3）2が提供される。
【００５８】
本発明のさらなる形態によれば、上述したように生物学的に活性なタンパク質そのものを哺乳動物に投与した際に誘発される免疫反応と比較して、哺乳動物に投与する際に免疫反応を惹起しないか、または、免疫反応が減少される医薬品を製造するための、生物学的に活性なタンパク質である少なくとも１つの成分と、哺乳動物の血清アルブミンに結合することができる少なくとも１つの成分とを含む分子、および、生物学的に活性なタンパク質が結合する、または、それ以外の方法で相互作用する標的分子またはその一部または類似体を含む組成物が提供される。好ましくは、標的分子は、生物学的に活性なタンパク質成分に結合している。
【００５９】
以下、本発明に従って行われた実験を開示することによって、かつ添付の図１〜２５を参照して、本発明を説明する。本実施例は、本発明の範囲を限定するものとは解釈されない。
【００６０】
図１は、実施例１で説明されているように、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００６１】
図２は、実施例１で説明されているように、ＺTaq4:1−ＡＢＤでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。実験３４日目の血漿のタイターを示すパネルには標準曲線が含まれる。
【００６２】
図３は、実施例１で説明されているように、ＡＢＤまたはＨｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿から精製されたＩｇＧに関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００６３】
図４は、実施例１で説明されているように、ストレプトキナーゼでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ストレプトキナーゼが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００６４】
図５は、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、実施例２で説明されているスキーム１に従ってＨｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００６５】
図６は、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、実施例２で説明されているスキーム２に従ってＨｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００６６】
図７は、ＺTaq4:1−ＡＢＤでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、実施例２で説明されているスキーム１に従ってＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００６７】
図８は、ＺTaq4:1−ＡＢＤでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、実施例２で説明されているスキーム２に従ってＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００６８】
図９は、ＡＢＤでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、実施例２で説明されているスキーム１（パネルＡ）、または、スキーム２（パネルＢ）に従ってＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００６９】
図１０は、実施例３で説明されているように、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5−でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００７０】
図１１は、実施例３で説明されているように、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ＡＢＤ−Ｚher2:4が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。７日目および１４日目からの血漿の図表でみられるピークは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機の問題に起因するものである。
【００７１】
図１２は、実施例３で説明されているように、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。７日目からの血漿の図表でみられるピークは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機の問題に起因するものである。
【００７２】
図１３は、実施例３で説明されているように、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）3が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。７日目からの血漿の図表でみられるピークは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機の問題に起因するものである。
【００７３】
図１４は、実施例３で説明されているように、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）4が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。７日目からの血漿の図表でみられるピークは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機の問題に起因するものである。
【００７４】
図１５は、実施例４で説明されているように、（Ｚαβ:3）2でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、（Ｚαβ:3）2が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００７５】
図１６は、実施例４で説明されているように、ＡＢＤ−（Ｚαβ:3）2でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ＡＢＤ−（Ｚαβ:3）2が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００７６】
図１７は、実施例４で説明されている阻害ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【００７７】
図１８は、実施例５で説明されているように、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００７８】
図１９は、実施例５で説明されているように、ＺTaq4:1−ＡＢＤでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００７９】
図２０は、実施例５で説明されているように、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した場合の、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００８０】
図２１は、実施例５で説明されたように、ＺTaq4:1−ＡＢＤ、次にＨｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００８１】
図２２は、実施例５で説明されているように、ＺTaq4:1−ＡＢＤ、次にＺTaq4:1−ＡＢＤとＨｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００８２】
図２３は、実施例５で説明されているように、ＺTaq4:1、次にＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００８３】
図２４は、実施例６で説明されているように、（ＺAβ3）2が注射されたラットからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００８４】
図２５は、実施例６で説明されているように、ＡＢＤ（ＺAβ3）2が注射されたラットからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【００８５】
図２６は、本発明に係る様々なコンストラクトの配列を示す表である。
【００８６】
図２７Ａは、実施例５の設定の要約である；図２７Ｂは、実施例５で得られた結果を説明している。
【００８７】
実施例１
様々な分子を投与した後のマウスにおける体液性免疫反応
研究される分子
この実施例において、本発明の概念を、様々な分子を投与した際のマウスにおける抗体反応の比較によって研究した。投与された分子は以下の通りである:
Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1−ブドウ球菌のタンパク質ＡのＢドメインから誘導されたタンパク質Ｚの変異体である。このＺ変異体は、それをコードするＤＮＡ配列の発現による組換えＤＮＡ技術を用いて生産され、同時に、既知の分子生物学的手法に従ってヘキサヒスチジルタグを有する。Ｚ変異体のＺTaq4:1は、そのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼへの親和性に基づき予め選択された。ＺTaq4:1分子の説明（そのアミノ酸配列やそれらの選択手法など）は、Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  Ｅ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２：１０，８７３〜８７８（１９９９）（例えばこの記事の図１を参照）に示されている。比較のために使用された。
【００８８】
ＺTaq4:1−ＡＢＤ−Ｚ変異体のＺTaq4:1と、連鎖球菌のタンパク質ＧのＧ１４８株の４６個のアミノ酸のアルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）（Ｋｒａｕｌｉｓ  ＰＪ等，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３７８：１９０（１９９６）））との融合タンパク質である。この融合タンパク質は、既知の分子生物学的手法に従ってそれに対応するＤＮＡ配列の発現によって製造された。本発明を説明するために使用された。
【００８９】
ストレプトキナーゼ−強い抗体反応を誘導することがわかっている市販の細菌の酵素である。シグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入し（カタログ番号Ｓ−８０２６，ロット０９２Ｋ１５１５）、ポジティブコントロールとして使用した。
【００９０】
材料および方法
マウスおよび投与計画：雌ＮＭＲＩマウス（マウス２０匹、予備としてプラス２匹）をこの実験で用いた。到着時の体重は２０ｇであった。免疫化実験の開始時点で、これらのマウスは、８〜１２週齢であった。スウェーデン農漁食糧省（Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ）からのガイドラインに従って、これらのマウスを維持し、エサを与えた。エサと水は、適宜与えた。免疫化実験のために、マウスを５つのグループに分けた（各グループは４匹の動物を含む）。表１に示される本分子２０μｇを、０.９％ＮａＣｌ（０.１ｍｌ）で各マウスに皮下投与した。
【表１】
0005634008.tif 000002
【００９１】
試験分子の溶液を−２０℃で凍結保存し、注射の前に融解させた。実験の０、３、６、９、１２および２１日目に繰り返し注射した。１５０μｌの血液サンプルを、実験の０（処理前血漿）、７、１４および２１日目に、マウスの眼窩静脈叢から採取した。実験の３４日目にマウスを殺し、最大限の量の血液を得た。血液をＫ+ＥＤＴＡ試験管に回収し、サンプリング後１時間放置した。その後、サンプルを、血漿を分離するために６０００ｒｐｍで６分間遠心分離した。解析まで、貯蔵のために血漿を−２０℃で凍結した。
【００９２】
特異的ＥＬＩＳＡによる血漿サンプルの解析：上記の分子のいずれか１種を投与されたマウスからの血漿の解析のために、ＥＬＩＳＡプレート（コースター（Ｃｏｓｔａｒ），番号９０１８）を、コーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ2ＨＣＯ3、３５ｍＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ９.６）で最終濃度１μｇ／ｍｌに希釈したそれに対応する分子でコーティングした。ウェルあたり１００μｌのコーティング溶液を添加し、プレートを４℃で１〜３晩インキュベートした。次に、プレートを手動で３回、脱イオン水で洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ製，カタログ番号Ａ−２１５３）、または、２％ドライミルク（センパーＡＢ（Ｓｅｍｐｅｒ  ＡＢ），ストックホルム，スウェーデン）のいずれかを含むＰＢＳ（２.６８ｍＭのＫＣｌ、１.４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭのＮａＣｌ、８.１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ７.４）を２００μｌ／ウェルで用いて、１〜２時間ブロックした。次に、ブロッキング溶液を除去し、血漿１００μｌを各ウェルに添加し、ブロッキング溶液で１：１００に希釈し、続いて連続倍数希釈した。２時間インキュベートした後に、プレートを手動で３回、ＰＢＳ−Ｔ（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ；アクロス・オーガニクス（Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ）製のＴｗｅｅｎ２０，カタログ番号２３３３６２５００）で洗浄した。その後、１００μｌの二次抗体、ブロッキング溶液で１：２０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（サザン・バイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ），番号１０３１−０５）を、各ウェルに添加した。プレートを１時間インキュベートした。３つの工程（ブロッキング、血漿サンプルの添加、二次抗体の添加）を振盪機で行い、最後の工程は暗所で行った。プレートを手動で５回ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。その後、基質溶液１００μｌ（イムノピュア（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ(R)）ＴＭＢ；ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ），カタログ番号３４０２１）を、各ウェルに添加し、その後プレートを暗所でインキュベートした。１５分後に、ストップ溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4；ＶＷＲ，カタログ番号１４３７４−１）１００μｌの添加によって発色を止めた。プレートを、ＥＬＩＳＡ分光光度計（ベーシック・サンライズ（Ｂａｓｉｃ  Ｓｕｎｒｉｓｅ），テカン（Ｔｅｃａｎ））で、４５０ｎｍで読んだ。
【００９３】
さらに、２１０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1ＩｇＧを含むこれまでに得られたマウス血漿のプールを含む標準も含めた。連続倍数希釈液にこのプールを用いた。Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートにおける検出限界は、約５ｎｇ／ｍｌであった。
【００９４】
血漿サンプル中のＩｇＧの総含量の解析：サンプル中のＩｇＧの総量を決定するために、定量ＥＬＩＳＡ解析を、マウスＩｇＧのＥＬＩＳＡ定量キット（ベチル（Ｂｅｔｈｙｌ），カタログ番号Ｅ９０−１３１）を製造元の説明書に従って用いて行った。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレートを、製造元によって提供された抗マウスＩｇＧでコーティングした。調査しようとする血漿と標準血漿を、連続倍数希釈液（２０００ｎｇ／ｍｌより開始）に添加した。検出抗体をブロッキング緩衝液で１：１０００００に希釈した（抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合体；製造元によって提供）。ＥＬＩＳＡ解析を、上述のイムノピュア(R)ＴＭＢを用いて展開した。
【００９５】
ＩｇＧの精製：ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスから得られた３４日目の血漿のプールから、ＩｇＧを精製した。ブドウ球菌のタンパク質Ａから誘導されたＩｇＧ特異的な親和性リガンドを有するＨｉＴｒａｐカラムにローディングする前に、このプールをＰＢＳ−Ｔで１２.５倍に希釈した。カラムをＰＢＳ−Ｔで予め平衡化させた。吸光度がゼロに達するまでカラムを洗浄し、結合したＩｇＧを、溶出緩衝液（０.２Ｍグリシン、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ２.８）を用いて溶出させた。中和するために、濃度５０ｍＭのトリス塩基、および、体積１／１０の１０×ＰＢＳを添加した。
【００９６】
データ解析：ＥＬＩＳＡ値を、テカン製のマジェラン（Ｍａｇｅｌｌａｎ）・ソフトウェアを用いて得た。この値を解析のためにマイクロソフトエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）にエクスポートした。ＩｇＧ濃度を、Ｘｌｆｉｔ．３プログラム（www.idbs.com）を用いて標準曲線と比較することによって計算した。値／曲線は、抗Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1ＩｇＧの標準プールを用いて得て、特異的ＩｇＧと総ＩｇＧそれぞれの決定にはベチルの標準血漿を用いた。
【００９７】
結果
Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1：マウス番号１〜４に、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1を注射した。免疫化の前（処理前血漿）、および、７、１４、２１および３４日後に得られた血漿サンプルを、方法の章で説明されている通りに、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1特異抗体の存在に関して解析した。ＥＬＩＳＡプレートを１％ＢＳＡでブロックした。処理前血漿中に、注射された分子に対する抗体は存在していなかった。４匹のマウスは全て、注射されたタンパク質に対する中程度の抗体反応が生じることによって反応した。特異抗体のタイターが処理中徐々に上昇し、３４日目で最高のタイターを示した。図１は、個々の血漿サンプルの、４５０ｎｍでのＯＤ値に対してプロットされた滴定曲線を示す。
【００９８】
ＩｇＧの総濃度を、ベチルのＥＬＩＳＡを用いて決定し、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1に特異的なＩｇＧの濃度を、上述の標準プールを用いて決定した。表２に結果を示す。３４日間の処理中に、特異抗体の濃度は、５０〜５００倍に増加した。ＩｇＧの総濃度を考慮すると、特異抗体は、ＩｇＧの総量の約１〜４％を構成していた。
【表２】
0005634008.tif 000003
【００９９】
ＺTaq4:1−ＡＢＤ：マウス番号５〜８に、ＺTaq4:1−ＡＢＤを注射した。免疫化の前（処理前血漿、データ示さず）、および、７、１４、２１および３４日後に得られた血漿サンプルを、方法の章で説明されている通りに、ＺTaq4:1−ＡＢＤに特異抗体の存在に関して解析した。ＥＬＩＳＡプレートを１％ＢＳＡでブロックした。図２は、４５０ｎｍでのＯＤ値に対してプロットされた個々の血漿サンプルから得られた結果を示す。要約すると、注射されたＺTaq4:1−ＡＢＤに対して特異抗体は検出されなかった。
【０１００】
マウス血清アルブミンがＥＬＩＳＡウェルにコーティングされたタンパク質のＡＢＤ成分と相互作用することによって、マウス抗体のＺTaq4:1−ＡＢＤ分子への特異的結合を立体的に妨害する危険を試験した。第一のアプローチにおいて、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングすることによってＡＢＤを遮蔽した。３４日目の血漿を試験し、その結果は、マウス抗体とＨｉｓ6−ＺTaq4:1との特異的な相互作用は示さなかった（データ示さず）。その他のアプローチは、血漿からアルブミンを除去するためである。そのために、総ＩｇＧを、「材料および方法」の章で説明されている通りに、ＨｉＴｒａｐカラムを用いてマウス番号５〜８からの３４日目の血漿のプールから精製した。ＩｇＧ分画をＡＢＤまたはＨｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたプレートで試験し、その結果を、図３に示す。要約すると、マウス抗体と、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1またはＡＢＤでコーティングされた表面との結合を検出することができなかった。
【０１０１】
ＩｇＧの総濃度を、上述のようにしてベチルのＥＬＩＳＡを用いて決定し、表３に結果を示す。
【表３】
0005634008.tif 000004
【０１０２】
ストレプトキナーゼ：マウス番号１７〜２０に、ストレプトキナーゼ（血液凝固を予防する細菌の酵素であり、強い抗体反応を誘導することがわかっている）を注射した。注射の前（処理前血漿、示さず）に、および、７、１４、２１および３４日後に得られた血漿サンプルを、方法の章で説明されている通りに、ストレプトキナーゼに特異抗体の存在に関して解析した。ＥＬＩＳＡプレートを２％ドライミルクでブロックした。図４は、４５０ｎｍでのＯＤ値に対してプロットされた個々の血漿サンプルから得られた結果を示す。図４で示されるように、ストレプトキナーゼは、治療期間中に増加する抗体反応を誘導した。３４日目に、４匹のマウス全てにおいてストレプトキナーゼに特異抗体の高いタイターを検出した。
【０１０３】
ＩｇＧの総濃度を、上述のようにしてベチルのＥＬＩＳＡを用いて決定し、表４に結果を示す。全てのケースにおいて（ただし１つのケースを除く）、ＩｇＧ総濃度は、死亡時の採血において、処理前血漿よりも顕著に高く、これは、免疫系の正常な成熟、および／または、進行中の免疫反応を示す。
【表４】
0005634008.tif 000005
【０１０４】
終点のタイター：その他のタンパク質に関する適切な標準は欠如していたため、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿においてのみ、投与された分子に特異抗体の濃度を決定した。この理由のために、終点のタイターを、注射された異なるタンパク質での比較に用いた。終点のタイターは、ＯＤ値がバックグラウンドの２倍に等しい希釈度と定義された（このバックグラウンドは、同じマウスからの処理前血漿で得られたＯＤ値である）。表５は、各マウスの終点のタイターを示す。結果を要約すると、ストレプトキナーゼで免疫化後の終点のタイターは、異なるＺ変異体を用いて得られたタイターよりも顕著に高かった。特に本発明に関連性を有するのは、ＺTaq4:1−ＡＢＤで免疫化した後の抗体のタイターが、検出不可能であったことである。
【表５】
0005634008.tif 000006
【０１０５】
考察
動物モデルにおける特異的なＢ細胞活性化の開始と抗体生成の際の様々な分子の投与の作用を研究するために、ＮＭＲＩマウスに、様々な分子を皮下注射した。正常な治療サイクルを模擬実験するために、マウスに十分な用量（アジュバントなし）を６回の注射で投与した（３日間のインターバル、２１日目にブースター注射）。治療された動物からの血漿を、注射された分子に特異性を有するＩｇＧアイソタイプの抗体の存在について解析した。加えて、処理前血漿、および、死亡時の採血の日（３４日目）における、全ての動物のＩｇＧの総含量のレベルを決定した。
【０１０６】
上記の「結果」の章で示されるように、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1は、研究された動物において特異的なＩｇＧ応答を誘導した。抗体反応は、少量から中程度であり（３４日目で５〜３７μｇ／ｍｌ）、２１日目のブースター注射の後に最も顕著に増加した（２〜２０倍の増加）。この応答は、３４日目でピークを示した。
【０１０７】
重要なことには、ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射された動物からの血漿は、ＥＬＩＳＡによって決定したところ、注射された分子への特異的結合をまったく示さなかった。この結果は、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1、すなわちＡＢＤの代わりにＨｉｓ6に融合した同じＺ配列を解析した際に観察された特異的なＩｇＧのタイターとは極めて対照的であった。解析された５つのタイムポイントは全て、標的に特異的なマウスＩｇＧ抗体に関して陰性であった。ＥＬＩＳＡにおける検出限界（ＬＯＤ）は約５ｎｇ／ｍｌであった。
【０１０８】
この研究において、ストレプトキナーゼ（強い免疫原とみなされている細菌のタンパク質）がポジティブコントロールとして用いられた。予想通りに、ストレプトキナーゼが注射された動物で高い特異的なＩｇＧ応答が観察された。
【０１０９】
すなわち、注射されたタンパク質は、それらの特異的なＩｇＧ応答を誘発する能力により以下のようにランク付けできる：ストレプトキナーゼ＞＞Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1＞＞ＺTaq4:1−ＡＢＤ。最も興味深く、関連する結果は、ＡＢＤのＺTaq4:1への融合により、特異的なＩｇＧ応答が検出できなかった。
【０１１０】
実施例２
様々な分子を様々な頻度で投与した後のマウスにおける体液性免疫反応
研究された分子
この実施例において、本発明の概念を、様々な分子を投与した際のマウスにおける抗体反応の比較によって再度研究した。投与された分子は以下の通りである：
Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5−ブドウ球菌のタンパク質ＡのＢドメインから誘導されたタンパク質Ｚの変異体である。ＺTaq4:5変異体は、それをコードするＤＮＡ配列の発現による組換えＤＮＡ技術を用いて生産され、同時に、既知の分子生物学的手法に従ってヘキサヒスチジルタグを有する。ＺTaq4:5は、その選択およびアミノ酸配列を含めて上記のＧｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  Ｅ等で説明されており、そこでこれは、ＺTaqS1-1と示されている。比較のために使用された。
ＺTaq4:1−ＡＢＤ−実施例１で説明されている通り。本発明を説明するために使用された。
ＡＢＤ−連鎖球菌のタンパク質ＧのＧ１４８株のアルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）である（参考文献として上記を参照）。既知の分子生物学的手法に従って、それに対応するＤＮＡ配列の発現によって製造された。比較のために使用された。
【０１１１】
材料および方法
マウスおよび投与計画：雌ＮＭＲＩマウス（マウス４０匹，予備としてさらに２匹）をこの実験で用いた。到着時の体重は２０ｇであった。免疫化実験の開始時点で、これらのマウスは、８〜１２週齢であった。スウェーデン農漁食糧省からのガイドラインに従って、これらのマウスを維持し、エサを与えた。エサと水は、適宜与えた。免疫化実験のために、表６に従ってマウスを７つのグループに分けた。表６に示される分子２０μｇを、０.９％ＮａＣｌ（０.１ｍｌ）で各マウスに皮下投与した。
【表６】
0005634008.tif 000007
【０１１２】
試験分子の溶液を−２０℃で凍結保存し、注射の前に融解させた。実験の０、７および２１日目に、グループ１〜３のマウスに皮下注射した（スキーム１，低い頻度）。実験の０、１および２１日目に、グループ４〜６のマウスに皮下注射した（スキーム２、高い頻度）。血液サンプル（１５０μｌ）を、実験の０（処理前血漿）、７、１４および２１日目に、マウスの眼窩静脈叢から採取した。実験の３４日目にマウスを殺し、最大限の量の血液を得た。血液をＫ+ＥＤＴＡ試験管に回収し、サンプリング後１時間放置した。その後、サンプルを、血漿を分離するために６０００ｒｐｍで６分間遠心分離した。解析まで、貯蔵のために血漿を−２０℃で凍結した。
【０１１３】
特異的ＥＬＩＳＡによる血漿サンプルの解析：上記の分子のいずれか１種を投与されたマウスからの血漿の解析のために、ＥＬＩＳＡプレート（コースター，番号９０１８）を、コーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ2ＨＣＯ3，３５ｍＭのＮａＨＣＯ3，ｐＨ９.６）で最終濃度１μｇ／ｍｌに希釈したそれに対応する分子でコーティングした。ウェルあたり１００μｌのコーティング溶液を添加し、プレートを４℃で１〜３晩インキュベートした。次に、プレートを手動で３回、脱イオン水で洗浄し、０.５％カゼイン（シグマ，カタログ番号Ｃ−８６５４）を含むブロッキング緩衝液（２００μｌ／ウェル；ＰＢＳ（２.６８ｍＭのＫＣｌ、１.４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭのＮａＣｌ、８.１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4，ｐＨ７.４）で１〜２時間ブロックした。次に、ブロッキング緩衝液を除去し、血漿１００μｌを各ウェルに添加し、ブロッキング溶液で１：１００に希釈し、続いて連続倍数希釈した。さらに、２１０μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1ＩｇＧを含むこれまでに得られたマウス血漿のプールを含む標準も含めた。連続倍数希釈液にこのプールを用いた。Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートにおける検出限界は、約５ｎｇ／ｍｌであった。
【０１１４】
２時間インキュベートした後に、プレートを手動で３回ＰＢＳ−Ｔ（０.０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で洗浄した。その後、ブロッキング緩衝液で１：２０００に希釈した二次抗体、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（サザン・バイオテック，番号１０３１−０５）１００μｌを、各ウェルに添加した。プレートを１時間インキュベートした。全ての工程を振盪機で行い、最後の工程を暗所で行った。プレートを手動で５回ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。その後、基質溶液（イムノピュア(R)ＴＭＢ；ピアース，カタログ番号３４０２１）１００μｌを各ウェルに添加し、その後プレートを暗所でインキュベートした。１５分後に、ストップ溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4；ＶＷＲ，カタログ番号１４３７４−１）１００μｌの添加によって発色を止めた。プレートを、ＥＬＩＳＡ分光光度計（ベーシック・サンライズ、テカン）で、４５０ｎｍでマジェラン・ソフトウェアを用いて読んだ。
【０１１５】
血漿サンプル中のＩｇＧの総含量の解析：サンプル中のＩｇＧの総量を決定するために、定量ＥＬＩＳＡ解析を、マウスＩｇＧのＥＬＩＳＡ定量キット（ベチル，カタログ番号Ｅ９０−１３１）を製造元の説明書に従って用いて行った。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレートを、製造元によって提供された抗マウスＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）でコーティングした。調査しようとする血漿と標準血漿を連続倍数希釈して添加した。標準血漿を、２０００ｎｇ／ｍｌから希釈した。検出抗体（抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合体；製造元によって供給）をブロッキング緩衝液で１：１０００００に希釈して用いた。ＥＬＩＳＡ解析を、上述のイムノピュア(R)ＴＭＢを用いて展開した。
【０１１６】
データ解析：ＥＬＩＳＡ値を、テカン製のマジェラン・ソフトウェアを用いて得た。この値を解析のためにマイクロソフトエクセルにエクスポートした。ＩｇＧ濃度を、Ｘｌｆｉｔ．３プログラム（ｗｗｗ．ｉｄｂｓ．ｃｏｍ）を用いて標準曲線と比較することによって計算した。値／曲線は、抗Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1ＩｇＧの標準プールを用いて得て、特異的ＩｇＧと総ＩｇＧそれぞれの決定にはベチルの標準血漿を用いた。
【０１１７】
結果
Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5：８匹のマウス（番号５３〜６０）に、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5を２０μｇ／マウスで注射し、ここで注射はスキーム１に従った（上記参照）。注射の前（処理前血漿）、注射の期間（７、１４、２１日目）、および、注射の後に（３４日目）得られた血漿サンプルを、上述の通りにＨｉｓ6−ＺTaq4:5特異抗体の存在に関して解析した。その結果を、図５に示す。処理前血漿（データ示さず）、または、７日目にＨｉｓ6−ＺTaq4:5特異抗体は存在しなかった（図５）。１４および２１日目までに陽性の血漿の数が増加した。３４日目に、全ての血漿サンプルに、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5特異抗体が含まれていたが、そのレベルは個々のマウス間で顕著に差が生じた。
【０１１８】
４匹のマウス（番号８２〜８５）に、スキーム２に従ってＨｉｓ6−ＺTaq4:5を注射した（上記参照）。注射の前（処理前血漿）、注射の期間（７、１４、２１日目）、および、注射の後に（３４日目）得られた血漿サンプルを、上述の通りにＨｉｓ6−ＺTaq4:5特異抗体の存在に関して解析した。その結果を、図６に示す。処理前血漿にＨｉｓ6−ＺTaq4:5特異抗体は、存在しなかった（データ示さず）。７日目からすでにいくつかの（だだし全てではない）血漿サンプルで、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5に対する抗体が低いレベルで見出された。スキーム１と同様に１４および２１日目には陽性の血漿サンプルの数およびタイターは増加しなかった。３４日目に、１つを除く全ての血漿サンプルが、２１日目のレベルと比較して高いレベルのＨｉｓ6−ＺTaq4:5特異抗体を示した。
【０１１９】
特異的なＩｇＧの濃度を、抗Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1ＩｇＧの標準プールを用いて決定した（方法の章を参照）。このプールは、２１０μｇ／ｍｌのＨｉｓ6−ＺTaq4:1特異抗体を含むことが予め示されていた。ＸＬｆｉｔプログラムと片側の用量反応の式を用いて濃度を計算した。両方のサンプルと標準をそれぞれ個々に試験した（それゆえに方法標準偏差は未知である）。加えて、計算のために選択された数式もまた値に影響を与え、偏差は、式に応じて計算されなかった。従って、以下の表に示された濃度は、絶対値ではなく相対値とみなされると予想される。表７は、個々のマウスからの血漿中のＨｉｓ6−ＺTaq4:5特異抗体の濃度を示す。上記の滴定解析で示されるように、３４日目の特異的なＩｇＧの濃度は、両方のグループにおいて、個々のマウス間で顕著な差が生じた。スキーム１のグループにおける濃度は見たところ高いようであるが、スチューデントのＴ検定（ＴＴＥＳＴ関数，マイクロソフトエクセル）で試験したところ、統計学的に有意ではなかった。
【０１２０】
また、ＩｇＧの総濃度も、上述の通りに定量ＥＬＩＳＡを用いて、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスからの３４日目の血漿サンプルで決定された。表７に結果を示す（カラム７）。
【表７】
0005634008.tif 000008
【０１２１】
ＺTaq4:1−ＡＢＤ：８匹のマウス（番号６１〜６８）に、スキーム１を用いてＺTaq4:1−ＡＢＤを注射した。注射の前に（処理前血漿、データ示さず）、および、７、１４、２１および３４日後に得られた血漿サンプルを、上述の通りにＺTaq4:1−ＡＢＤ特異抗体の存在に関して解析した。図７に、その結果を示す。図７から明らかなように、ＺTaq4:1−ＡＢＤに対して特異的ＩｇＧは、誘導されなかった。
【０１２２】
解析されたサンプルに、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）が高レベルで存在する。ＺTaq4:1−ＡＢＤでコーティングされたＥＬＩＳＡ表面に結合する可能性があるＭＳＡの問題を回避するために、血漿サンプルも、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたプレートで滴定した（データ示さず）。解析は再び陰性であり、これは、ＺTaq4:1−ＡＢＤ分子は、非免疫原性であるという観察を追認するものである。
【０１２３】
４匹のマウス（番号８６〜８９）に、スキーム２に従ってＺTaq4:1−ＡＢＤを注射した。注射の前に（処理前血漿、データ示さず）、および、７、１４、２１日、および３４日間後に得られた血漿サンプルを、上述の通りにＺTaq4:1−ＡＢＤ特異抗体の存在に関して解析した。その結果を、図８に示す。再度、ＩｇＧ応答は測定できなかった。
【０１２４】
ＩｇＧの総濃度を、上述のようにしてベチルのＥＬＩＳＡを用いて決定し、表８に結果を示す。
【表８】
0005634008.tif 000009
【０１２５】
ＡＢＤ：８匹のマウス（番号６９〜７６）に、スキーム１に従ってＡＢＤを注射した。注射の前に（処理前血漿）、および、７、１４、２１および３４日後に得られた血漿を、上述の通りにＡＢＤに特異抗体の存在に関して解析した。３４日目の血漿においてのみ、極めて少量のＡＢＤ分子に対する抗体が検出された（図９Ａ）。処理前血漿と７、１４および２１日目からの血漿は陰性であった（データ示さず）。
【０１２６】
４匹のマウス（番号９０〜９３）に、スキーム２に従ってＡＢＤを注射した。注射の前に（処理前血漿）、および、７、１４、２１および３４日後に得られた血漿を、上述の通りにＡＢＤに特異抗体の存在に関して解析した。抗体反応は測定できなかった（図９Ｂは、３４日目のサンプルに関する結果を示す）。
【０１２７】
ＩｇＧの総濃度を、上述のようにしてベチルのＥＬＩＳＡを用いて決定し、表９に結果を示す。
【表９】
0005634008.tif 000010
【０１２８】
考察
実施例１の結果によれば、ＺTaq4:1−ＡＢＤは、マウスにおいて特異的ＩｇＧ応答を誘導することができなかった。同様に、融合パートナーなしのＡＢＤそのものの投与は、あらゆる測定可能な特異的ＩｇＧ応答を惹起しなかった。これらのグループにおける動物に、実施例１の場合と同量のタンパク質を投与した。低い頻度の注射でも高い頻度の注射でも、検出可能なＩｇＧ応答は生じなかった。Ｚタンパク質およびその誘導体はＴ依存性抗原であると考えられるため、それらは、ＩｇＧアイソタイプの特異抗体を優勢に生成すると予想される。それゆえに、これらの結果からＩｇＧ抗体が形成されないことが示されたため、ＺTaq4:1−ＡＢＤ融合タンパク質に応答して、その他のいずれのアイソタイプの抗体も形成されないことを示す。
【０１２９】
実施例３
アルブミン結合性成分と共に提供されたＺ変異体の多量体を投与した後のマウスにおける体液性免疫反応
研究される分子
実施例１および２と同様に、本発明の概念を、様々な分子を投与した際のマウスにおける抗体反応の比較によって再度研究した。投与された分子は以下の通りである：
Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5−実施例２で説明されている通り。比較のために使用された。
【０１３０】
ＡＢＤ−Ｚher2:4−連鎖球菌のタンパク質ＧのＧ１４８株のアルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）（上記参照）と、Ｚ変異体のＺher2:4との融合タンパク質である。Ｚher2:4をＺの変異体のコンビナトリアルライブラリーから選択し、特徴付けた。選択手法において、癌抗原ＨＥＲ２（また、文献では、ｎｅｕ、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２とも説明されている）に対応する精製タンパク質を、標的分子として用いた。Ｚher2:4は、約５０ｎＭのＫD値でＨＥＲ２と相互作用することがわかった。標準的な一文字表記によるＺher2:4のアミノ酸配列は、以下の通りである：
VDNKFNKELR QAYWEIQALP NLNWTQSRAF IRSLYDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
【０１３１】
この融合タンパク質は、既知の分子生物学的手法に従って、ＡＢＤ成分をコードするＤＮＡ配列と共に、それに対応するＤＮＡ配列の発現によって製造された。ＡＢＤ−Ｚher2:4融合タンパク質を用いて本発明を説明する。
【０１３２】
ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2−Ｚher2:4配列情報の追加の知見と共に、既知の分子生物学的手法に従って製造された、アルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）と、Ｚ変異体のＺher2:4の二量体との融合タンパク質である。本発明を説明するために使用された。
【０１３３】
ＡＢＤ−（Ｚher2:4）3−Ｚher2:4配列情報の追加の知見と共に、既知の分子生物学的手法に従って製造された、アルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）と、Ｚ変異体のＺher2:4の三量体との融合タンパク質である。本発明を説明するために使用された。
【０１３４】
ＡＢＤ−（Ｚher2:4）4−Ｚher2:4配列情報の追加の知見と共に、既知の分子生物学的手法に従って製造された、アルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）と、Ｚ変異体のＺher2:4の四量体との融合タンパク質である。本発明を説明するために使用された。
【０１３５】
材料および方法
マウスおよび投与計画：雌ＮＭＲＩマウス（マウス３０匹，予備としてさらに２匹）をこの実験で用いた。到着時の体重は２０ｇであった。免疫化実験の開始時点で、これらのマウスは、８〜１２週齢であった。スウェーデン農漁食糧省からのガイドラインに従って、これらのマウスを維持し、エサを与えた。エサと水は、適宜与えた。免疫化実験のために、マウスを表１０に従って５つのグループに分けた。表１０に示された分子２０μｇを、０.１ｍｌの０.９％ＮａＣｌで各マウスに皮下投与した。
【表１０】
0005634008.tif 000011
【０１３６】
試験分子の溶液を−２０℃で凍結保存し、注射の前に融解させた。グループ１のマウスに、実験の０、３、６、９、１２および６３日目に皮下注射を行なった（スキーム１）。実験の０（処理前血漿）、７、１４、２１、３４、４９および６３日目に、血液サンプル１５０μｌを、グループ１のマウスの眼窩静脈叢から採取した。実験の７３日目に、これらのマウスを殺し、最大限の量の血液を得た。
【０１３７】
グループ２〜５のマウスに、実験の０、３、６、９、１２および２１日目に皮下注射を行った（スキーム２）。実験の０（処理前血漿）、７、１４および２１日目に、血液サンプル１５０μｌを、グループ２〜５のマウスの眼窩静脈叢から採取した。実験の３４日目に、これらのマウスを殺し、最大限の量の血液を得た。血液をＫ+ＥＤＴＡ試験管に回収し、サンプリング後１時間放置した。その後、サンプルを、血漿を分離するために６０００ｒｐｍで６分間遠心分離した。解析まで、貯蔵のために血漿を−２０℃で凍結した。
【０１３８】
特異的ＥＬＩＳＡによる血漿サンプルの解析：一般的に、全てのインキュベート工程に、ウェルあたり体積１００μｌを用いた（ただしブロッキングには２００μｌを用いた）。ＥＬＩＳＡプレート（コースター，番号９０１８）を、コーティングのために１〜３日間、ブロッキングと血漿のために１〜２時間、二次抗体のために１時間、および、基質溶液のために１５分間インキュベートした。インキュベーションは、振盪機で、室温で行われた（ただし、コーティングは、４℃でインキュベートされた）。特に他の指定がない限り、全ての工程の間に、ウェルあたり４×３５０μｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ、実施例１を参照）で、ＥＬＩＳＡ  Ｓｋａｎ洗浄機３００（スカトロン（Ｓｋａｔｒｏｎ））を用いて洗浄を行った。プレートを、テカン製のＥＬＩＳＡリーダーで、マジェランｖ３．１１ソフトウェアを用いて４５０ｎｍで読んだ。コーティング以外の全ての希釈にブロッキング緩衝液を用い、コーティングには、その代わりにコーティング緩衝液（１５ｍＭのＮａ2ＨＣＯ3、３５ｍＭのＮａＨＣＯ3，ｐＨ９.６）を用いた。
【０１３９】
ＥＬＩＳＡプレートを、５μｇ／ｍｌの濃度に希釈したＨｉｓ6−ＺTaq4:5、または、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2でコーティングした。コーティング後に、プレートを、ＰＢＳ＋０.５％カゼイン（０.５％カゼイン（シグマ，カタログ番号Ｃ−８６５４）を含むＰＢＳ（２.６８ｍＭのＫＣｌ、１.４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、１３７ｍＭのＮａＣｌ、８.１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4，ｐＨ７.４））でブロックした。ブロッキングを除去し、血漿を添加し、１：１００から連続３倍希釈した。Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスからの血漿は、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析し、それに対して、４種の異なるＺher2:4コンストラクトが注射されたマウスからの血漿は、ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートで解析した。また、これまで得られたマウス抗体のプールを含む標準も含めた。１：２０００に希釈したＺTaq4:5とＺher2:4−ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（サザン・バイオテック，カタログ番号１０３１−０５）に対して向けられたＩｇＧを含むプールを、第二の試薬として用い、イムノピュア(R)ＴＭＢ基質溶液（ピアース，カタログ番号３４０２１）を用いて反応を展開した。このインキュベートを暗所で行った。ストップ溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4；ＶＷＲ，カタログ番号１４３７４−１）の添加によって１５分後に発色を止めた。
【０１４０】
結果
免疫化の前（処理前血漿）に、および、７、１４、２１および３４日後に得られた血漿サンプルを、「材料および方法」の章で説明されている通りに特異抗体の存在に関して解析した。あらゆる処理前血漿において、注射された分子に特異抗体は、存在しなかった（データ示さず）。図１０〜１４に示される図表は、４５０ｎｍでのＯＤ値に対してプロットされた個々の血漿サンプルの滴定曲線を示す。
【０１４１】
Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5：その結果を、図１０に示す。Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスは、高い抗体反応を示した。この応答は時間依存性であり、２１日目にピークを示しているようであった。Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5を用いた前の実験（実施例２）は、一般的に、３４日目でピークを示した。この実験において３４日目のＯＤ値がそれより低い理由は、これらの動物は２１日目にブースター注射を受けていないことによる可能性が高かった。
【０１４２】
ＡＢＤ−Ｚher2:4：図１１に結果を示す。ＡＢＤ−Ｚher2:4が注射されたマウスは、特異的ＩｇＧ応答を示さなかった。７日目および１４日目からの血漿の図表でみられるピークは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機の問題に起因するものであるため、血漿中の抗体含量を正確に示していない。
【０１４３】
ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2：その結果を、図１２に示す。ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2が注射されたマウスは、特異的ＩｇＧ応答を示さなかった。７日目からの血漿の図表でみられるピークは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機の問題に起因するものであるため、血漿中の抗体含量を正確に示していない。
【０１４４】
ＡＢＤ−（Ｚher2:4）3：その結果を、図１３に示す。ＡＢＤ−（Ｚher2:4）3が注射されたマウスは、特異的ＩｇＧ応答を示さなかった。７日目からの血漿の図表でみられるピークは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機の問題に起因するものであるため、血漿中の抗体含量を正確に示していない。
【０１４５】
ＡＢＤ−（Ｚher2:4）4：その結果を、図１４に示す。ＡＢＤ−（Ｚher2:4）4が注射されたマウスは、特異的ＩｇＧ応答を示さなかった。７日目からの血漿の図表でみられるピークは、ＥＬＩＳＡプレート洗浄機の問題に起因するものであるため、血漿中の抗体含量を正確に示していない。
【０１４６】
また、４種の異なるＡＢＤ−（Ｚher2:4）nコンストラクトの特異的ＩｇＭ応答を惹起する能力も試験した。このような応答は検出されなかった（データ示さず）。
【０１４７】
考察
この実験の結果より、アルブミン結合性成分を提供することにより、生物学的に活性なタンパク質に対する免疫反応を減少させるか、または除去するという実施例１および２からの発見が確認された。重要なことには、この作用は、よりいっそう大きいサイズのタンパク質でも有効であることが示された。Ｚher2:4の四量体は、２３０個より多いアミノ酸残基を含むが、それにもかかわらず、そのサイズでも、マウスに投与した際に実質的な抗体反応を惹起しない。
【０１４８】
実施例４
さらなる生物学的に活性な分子の二量体で試験される免疫反応の減少
研究される分子
この研究の目的もまた、免疫化の後に生産された抗体が、特異的なアフィボディ(R)分子と、それらの標的タンパク質との結合を阻害することができるかどうかを評価することである。これまでの免疫反応における減少の観察は、生物学的に活性なタンパク質がアルブミン結合性ドメインにカップリングされている場合、２種のその他のアフィボディ(R)分子：（ＺAβ3）2、および、ＡＢＤ−（ＺAβ3）2を用いて確認された。
【０１４９】
（ＺAβ3）2−ブドウ球菌のタンパク質ＡのＢドメインから誘導されたタンパク質Ｚの変異体の二量体である。ＺAβ3変異体は、既知の分子生物学的手法に従って、それをコードするＤＮＡ配列の発現による組換えＤＮＡ技術を用いて生産された。比較のために使用された。
【０１５０】
ＡＢＤ−（ＺAβ3）2−既知の分子生物学的手法に従って製造された、アルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）と、Ｚ変異体ＺAβ3の二量体との融合タンパク質である。本発明を説明するために使用された。
【０１５１】
Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1−実施例１で説明されているｈｉｓ−タグを有するタンパク質Ｚの変異体である。比較のために使用された。
【０１５２】
Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5−実施例２で説明されているｈｉｓ−タグを有するタンパク質Ｚの変異体である。比較のために使用された。
【０１５３】
材料および方法
マウスに、２種の異なる二量体アフィボディ(R)分子、（ＺAβ3）2、および、ＡＢＤ−（ＺAβ3）2を注射した。マウスからの血漿を、処理スキームの際に、および、ブースターの後に４回、以前と同様にして得て、アフィボディ(R)に特異的ＩｇＧの存在に関して解析した。その結果によれば、（ＺAβ3）2が注射されたマウスは強いＩｇＧ応答を起こしたことが示された。抗体産生は約１４日目に始まり、３４日目でピークを示した。死亡時の採血における特異的ＩｇＧの平均濃度は、２７８μｇ／ｍｌ（ＺAβ3）2であった。ＡＢＤ−（ＺAβ3）2で処理したマウスからの血漿中に特異抗体は検出されなかった。
【０１５４】
両方のマウスのグループからの、０日目および３４日目の血漿中のＩｇＧの総濃度を決定した。両方のグループにおいて、総ＩｇＧの濃度は、３４日までに約２倍に増加した。
【０１５５】
抗（ＺAβ3）2−抗体が、アフィボディ(R)分子と標的タンパク質との相互作用を中和することができるかどうかを試験するために、阻害−ＥＬＩＳＡを設定した。その結果によれば、（ＺAβ3）2に特異的なＩｇＧは、（ＺAβ3）2とβ−アミロイド４０との相互作用を中和しなかったことが示された。
【０１５６】
マウスおよび投与計画
マウスを、スキームに従って（表１１）、（ＺAβ3）2、および、（ＺAβ3）2−ＡＢＤで処理した。表１２に、注射および採血スキームを示す。採血の２２日後にグループ１中のマウス５が病気になり、実験からはずした。
【０１５７】
【表１１】
0005634008.tif 000012
【０１５８】
【表１２】
0005634008.tif 000013
【０１５９】
マウス血漿からのＩｇＧの精製
（ＺAβ3）2で免疫化されたマウスからプールした３４日目（マウス番号５については２１日目）の血漿から、総ＩｇＧを精製した。血漿プール２４００μｌをＰＢＳ−Ｔで５倍に希釈し（総量１２ｍｌ）、その後、ＰＢＳ−Ｔで予め平衡化させたＺｗｔ結合Ｈｉｇｈ−Ｔｒａｐカラム（Ｌ００９１−９８）にローディングした。カラムを吸光度がゼロに達するまで洗浄し、結合したＩｇＧを、酸性溶出緩衝液（０.２Ｍグリシン，１ｍＭのＥＧＴＡ，ｐＨ２.８）を用いて溶出させた。中和するために、１Ｍトリス塩基を、最終濃度５０ｍＭまで添加した。溶出体積の１／１０量の１０×ＰＢＳ（２.６８ｍＭのＫＣｌ，１.４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4，１３７ｍＭ，ＮａＣｌ，８.１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4，ｐＨ７.４，ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ），０.０５％Ｔｗｅｅｎを含む１×ＰＢＳ）を加えることによって、緩衝能力を回復させた。
【０１６０】
ＥＬＩＳＡ−プレート（９６ウェル，平底の高い結合性のコースター番号９０１８）を、コーティング緩衝液で最終濃度２μｇ／ｍｌに希釈した適切なアフィボディ(R)分子でコーティングした。ウェルあたり１００μｌのコーティング溶液を添加し、プレートを４℃で１〜３晩インキュベートした。次に、プレートを手動で脱イオン水で４回洗浄し、ブロッキング緩衝液で１〜２時間ブロックした（０.５％カゼイン（シグマ），１×ＰＢＳ中；２００μｌ／ウェル）。ブロッキング緩衝液を除去し、血清１００μｌを、連続希釈して各ウェルに添加した。１時間インキュベートした後に、プレートを、自動ＥＬＩＳＡ−洗浄機または手動で、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、ブロッキング緩衝液で１：２０００に希釈した第二工程の抗体であるＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ１００μｌを各ウェルに添加した。その後プレートを１時間インキュベートした。プレートを４回ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、基質溶液１００μｌ（イムノピュア(R)ＴＭＢ）を各ウェルに添加し、続いて暗所でインキュベートした。ストップ溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4）１００μｌの添加によって１５分後に発色を止めた。プレートを、ＥＬＩＳＡリーダーで、マジェラン・ソフトウェアを用いて４５０ｎｍで読んだ。
【０１６１】
マウス抗ＺAβ3に特異的なＩｇＧのＥＬＩＳＡ
プレートを、コーティング緩衝液中２μｇ／ｍｌの（ＺAβ3）2でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、上述の通りにプレートをブロックした。（ＺAβ3）2、または、ＡＤＢ−（ＺAβ3）2で免疫化したマウスからの血漿を連続３倍希釈（１／１００から開始）で添加した。インキュベート後に、上述の通りにプレートを処理した。アフィボディ(R)に特異的なＩｇＧの濃度を測定するために、標準血漿プールのシェーレ８プール（Ｓｃｈｅｅｌｅ  ８ｐｏｏｌ）を用いた。この血清プール中の抗ＺＩｇＧの濃度が、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングしたプレートで９７μｇ／ｍｌと決定された。シェーレ８プールにおける抗Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5、および、抗（ＺAβ3）2ＩｇＧの濃度が、それぞれ２９１および９７μｇ／ｍｌと決定された（Ｌ０２４２−１４／１６）。ポジティブコントロールとして、本発明者らは、標準曲線の屈曲点に近いＯＤ値を与えると予想されるマウス番号１１７からの血漿（シェーレ７；７３日目，１：１０,０００の希釈で）を用いた。ネガティブコントロールは、ブロッキング緩衝液であった。検出限界は、３ｎｇ／ｍｌであった。
【０１６２】
総ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
両方のマウスグループからの０日目および３４日目（マウス番号５については２１日目）からの血漿をＩｇＧ総量に関して解析した。この分析において、ＥＬＩＳＡプレートを、ヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆｃ抗体の（Ｆａｂ）2フラグメント（サザン・バイオテック，番号１０３１−０５  ０.５μｇ／ｍｌ）でコーティングした。連続３倍希釈（それぞれ１：１００００および１００ｎｇ／ｍｌから開始）の血漿または標準（マウスＩｇＧ）を、コーティングされたウェルに添加した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−ｆａｂ抗体のＨＲＰ結合（Ｆａｂ）2フラグメント（０.２μｇ／ｍｌ）を用いて反応を展開した。基質溶液（イムノピュア(R)ＴＭＢピアース番号３４０２１）を添加し、暗所で１０分インキュベートした後に発色をストップ溶液の添加によって止めた。
【０１６３】
阻害ＥＬＩＳＡ解析
プレートを、コーティング緩衝液中２μｇ／ｍｌの（ＺAβ3）2でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、上述の通りにプレートをブロックした。精製した抗（ＺAβ3）2のＩｇＧを連続３倍希釈（１μｇ／ｍｌから開始）で添加した。１時間インキュベートした後に、ビオチン化したタンパク質β−アミロイド４０を洗浄しないでウェルに添加した。β−アミロイド４０バイオサイト（ＢｉｏＳｉｔｅ）Ａ２２７５−７４Ｄの最終濃度は、１０μｇ／ｍｌであった。さらに１時間インキュベートした後にプレートを洗浄し、解析する反応に応じて、ヤギ−抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｄａｋｏ  Ｐ０３９７，１／２０００希釈）、または、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／５０００希釈）のいずれかを添加した。最終的なインキュベートの後に、プレートを洗浄し、上述の通りに展開した。
【０１６４】
データ解析
ＥＬＩＳＡリーダーソフトウェアとして、マジェラン（テカン）を用いた。その結果をデータ解析と発表のためにエクセルにエクスポートした。濃度決定のために、ＸＬｆｉｔプログラム、式「用量反応−片側」、方程式２０５を用いた。毎日の加工したデータと測定タイプ（すなわちＩｇＧ、濃度など）を、エクセルファイルで示した。
【０１６５】
結果
アフィボディ(R)に特異的なＩｇＧ  ＥＬＩＳＡグループ１
６匹の（ＺAβ3）2が注射されたマウスからの血漿を（ＺAβ3）2でコーティングしたプレートで滴定した。全てのマウスが１４日目までに応答したが、マウス５は極めて低い応答を示した。３４日目に、最高の抗アフィボディ(R)−ＩｇＧレベルが観察された（図１５）。３４日目の特異的ＩｇＧの平均濃度は、２７８μｇ／ｍｌであった（表１３）。マウス番号５はあまりよく応答せず、死亡時の採血サンプルは２１日目のものであった。０日目（すなわち投与前）からの血清サンプルでは、特異的ＩｇＧ応答は、検出できなかった（データ示さず）。
【０１６６】
【表１３】
0005634008.tif 000014
【０１６７】
アフィボディ(R)に特異的なＩｇＧ  ＥＬＩＳＡグループ２
６匹のＡＤＢ−（ＺAβ3）2が注射されたマウスからの血漿を、（ＺAβ3）2でコーティングしたプレートで滴定した。どの採血サンプルでも特異的ＩｇＧ濃度は検出できなかった。（図１６）。
【０１６８】
総ＩｇＧのＥＬＩＳＡ
マウス０日目および３４日目（マウス番号５については２１日目）両方のグループからの血漿を、（ＺAβ:3）2でコーティングされたプレートで滴定した。表１５で示されるように、総ＩｇＧの量は、両方のグループにおいて３４日の期間までに増加した。しかしながら、０日目のレベルが驚くほど低いことを考慮すると、この増加は、マウスの生存中の特定の期間にわたる正常な増加を反映している可能性がある。ビヒクルマウスからの血漿は、適切なコントロールであったと思われる。
【０１６９】
【表１４】
0005634008.tif 000015
【０１７０】
阻害ＥＬＩＳＡ：標的タンパク質
アフィボディ(R)に特異的なＩｇＧ抗体が、標的タンパク質とアフィボディ(R)分子との相互作用を中和／阻害する可能性を、阻害ＥＬＩＳＡで調査した。ＥＬＩＳＡプレートを、上述の通りに（ＺAβ3）2でコーティングした。グループ１の３４日目からの血漿のプールから精製された総ＩｇＧを添加した。ＩｇＧ抗体を３倍希釈（１μｇ／ｍｌから）で添加した。この抗体を、コーティングされたアフィボディ(R)分子に１時間結合させ、その後、標的タンパク質β−アミロイド４０を最終濃度１０μｇ／ｍｌまで添加した。この反応を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて展開し、（ＺAβ3）2と標的タンパク質との相互作用を可視化した（青いライン）。ＩｇＧ抗体とコーティングされたアフィボディ(R)分子との相互作用を、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰで可視化した（図１７）。具体的には、図１７は、阻害ＥＬＩＳＡの結果を示す。β−アミロイド４０の存在または非存在下での、精製した（ＺAβ3）2に特異的なマウス抗体のコーティングされた（ＺAβ3）2への結合である。精製したＩｇＧおよび標的タンパク質を、ストレプトアビジンＨＲＰで展開した（◆）。精製したＩｇＧおよび標的タンパク質を、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰで展開した（■）。精製したＩｇＧを、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰで展開した（▲）。この実験を２回繰り返したところ、同じ結果が得られた。
【０１７１】
コントロールとして、滴定したＩｇＧ抗体を、標的タンパク質をまったく加えないでコーティングされたアフィボディ(R)分子と反応させた。図１７はまた、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰを用いたＩｇＧ−検出に関して、標的タンパク質が存在する場合と存在しない場合とで、ＯＤ値がほとんど同一であることを示す。これらの結果から、（ＺAβ3）2に特異的なＩｇＧ抗体は、（ＺAβ3）2とβ−アミロイド４０との相互作用を阻害しないことが示される。
【０１７２】
実施例５
追加のマウス系統において試験された免疫反応の減少
実施例４で示されるように、本発明者らはこれまで、ＺTaq4:1−ＡＢＤではなくＨｉｓ6−ＺTaq4:1が、非近交系のＮＭＲＩマウスで抗体反応を誘導することを観察してきた。この研究において、追加の非近交系のマウス系統（ＣＤ１）を試験し、その結果によれば、ＣＤ１マウスは、ＺTaq4:1−ＡＢＤではなくＨｉｓ6−ＺTaq4:1を投与した場合、ＮＭ
ＲＩマウスと同様に、特異的ＩｇＧを生産することによって応答することが示された。従って、ＡＢＤと融合したアフィボディ(R)分子（ＺTaq4:1）の注射の際に観察された免疫不応答は、マウスにおける一般的な現象のようである。
【０１７３】
ＡＢＤで誘導された不応答の性質を、ＮＭＲＩマウスでさらに解析した。マウスの４つのグループに、１０回のアフィボディ(R)注射を行い、ここで５回目の注射の後に注射される分子を変えた（処理スキーム２に従って）。その結果によれば、ＺTaq4:1−ＡＢＤに感作されたマウスは、抗原をＨｉｓ6−ＺTaq4:1にスイッチ切り替えた後に、アフィボディ特異的ＩｇＧを生産したことが示された（グループ４）。抗体産生は、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1に切り替えた後、約１４日目（これは、通常、実験未使用のマウスが抗体を生産するのに必要な日数である）に始まった。また、ＺTaq4:1−ＡＢＤ、および、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1の混合物が投与される前にＺTaq4:1−ＡＢＤに感作されたマウス（グループ５）も、アフィボディ(R)分子に対する特異的ＩｇＧの生産を開始した。グループ５において観察された特異的な応答は、グループ４で観察された応答よりも小さかったが、これは、グループ５は、注射されたＨｉｓ6−ＺTaq4:1の用量がグループ４と比較して半分しか投与されていないことによる可能性が高い。グループ６におけるマウスは、ＺTaq4:1−ＡＢＤを投与する前にＨｉｓ6−ＺTaq4:1に感作され、この処理により、抗原の切り替え後に、タイターは時間と共に減少したものの継続的なアフィボディ(R)特異的ＩｇＧの生産が起こった。
【０１７４】
このシェーレ９実験は、主として：１）第二の非近交系のマウス系統（ＣＤ１）は、ＮＭＲＩマウス（ＢＴ１−ＰＡＲ０７、ＢＴ１１−ＰＡＲ０３）と同じようにＡＢＤと融合した、および、融合していないアフィボディ(R)分子を投与すると応答するかどうか、および、２）ＺTaq4:1−ＡＢＤ、それに続いてＨｉｓ6−ＺTaq4:1が注射された場合、マウスは、アフィボディ(R)特異的ＩｇＧ応答を生成するかどうか、という２つの理由で行なわれた。後者の質問の答えによって、我々は、観察されたＡＢＤと融合したアフィボディ(R)分子に対する不応答は、能動的な抑制プロセスなのか、または受動的な抑制プロセスなのかを明確にすることができた。表１６に、各動物グループにおいて用いられた分子を列挙し、表１７および１８に、２つの処理スキームを示した。図２７Ａに、この実験の設定を説明した。
【０１７５】
【表１５】
0005634008.tif 000016
【０１７６】
【表１６】
0005634008.tif 000017
【０１７７】
【表１７】
0005634008.tif 000018
【０１７８】
材料および方法
アフィボディ(R)ＥＬＩＳＡ
９６ウェル、平底の、高い結合性のコースターＥＬＩＳＡプレートを、コーティング緩衝液（１０×コーティング緩衝液，１５０ｍＭのＮａ2ＣＯ3，３５０ｍＭのＮａＨＣＯ3，ｐＨ９.６）で最終濃度５μｇ／ｍｌに希釈したＨｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングした。ウェルあたりコーティング溶液１００μｌを添加し、プレートを４℃で１〜４晩インキュベートした。次に、プレートを手動で脱イオン水で４回洗浄し、ブロッキング緩衝液で１〜２時間ブロックした（２００μｌ／ウェル）。ブロッキング緩衝液を除去し、血漿１００μｌを各ウェルに添加し、ブロッキング緩衝液で１：１００から連続３倍希釈した。アフィボディ(R)に特異的なＩｇＧの濃度を測定するために、標準血漿プールのシェーレ６Ｂプールを用いた。この血漿プール中の抗Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1ＩｇＧの濃度は、１２０μｇ／ｍｌと決定された。ポジティブコントロールとして、本発明者らは、標準曲線の屈曲点に近いＯＤ値を与えると予想される、シェーレ７実験７３日目のマウス番号１１８からの血漿を１：９２００の希釈度で用いた。ネガティブコントロールはブロッキング緩衝液であった。
【０１７９】
２時間インキュベートした後に、プレートをＰＢＳ−Ｔ（リン酸緩衝生理食塩水（１０×ＰＢＳ），２.６８ｍＭのＫＣｌ，１.４７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4，１３７ｍＭＮａＣｌ，８.１ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4，ｐＨ７.４；ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ），０.０５％Ｔｗｅｅｎを含む１×ＰＢＳ）で４回洗浄し、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ），０.０５％Ｔｗｅｅｎを含む１×ＰＢＳ）で１：２０００に希釈した第二工程の抗体であるＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（１００μｌ）を各ウェルに添加した。その後プレートを１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、基質溶液（イムノピュア(R)１ＭＢ）１００μｌを、各ウェルに添加した。プレートを暗所でインキュベートし、１５分後に、ストップ溶液（２ＭのＨ2ＳＯ4）１００μｌの添加によって発色を止めた。プレートを、ＥＬＩＳＡリーダーで、マジェラン・ソフトウェアを用いて４５０ｎｍで読んだ。
【０１８０】
総ＩｇＧのＥＬＩＳＡ
血漿中の総ＩｇＧを決定するために、定量ＥＬＩＳＡを行った。
アフィボディ(R)ＥＬＩＳＡの手順と同じ手法を用いたが、以下の点で異なる：
ＥＬＩＳＡプレートを、濃度０.５μｇ／ｍｌのアフィニピュア（ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ）（Ｆａｂ’）2フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）１１５−００６−００８（Ｆｃγ−フラグメント特異的）でコーティングした。第一および第二工程の希釈をＰＢＳ−Ｔ（カゼイン非含有）で行い、血漿の連続希釈は、１：１０.０００で開始した。標準ＩｇＧは、クロムピュア（ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ）マウスＩｇＧジャクソン０１５−０００−００３（分子全体）であり、連続希釈は、１００ｎｇ／ｍｌから開始した。第二工程の抗体として、１：２０００に希釈したペルオキシダーゼ標識アフィニピュアＦ（ａｂ’）2フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）2−フラグメント特異的）ジャクソン１１５−０３６−００６を用いた。
【０１８１】
データ解析
ＥＬＩＳＡリーダーソフトウェアとして、マジェラン（テカン）を用いた。その結果を、データ解析と発表のためにエクセルにエクスポートした。濃度決定のために、ＸＬｆｉｔプログラム、式「用量反応−片側」、方程式２０５を用いた。
【０１８２】
結果
処理スキーム１
グループ１および２は、ＣＤ１マウスで構成された。これら動物に、処理スキーム１に従って、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1（グループ１）、または、ＺTaq4:1−ＡＢＤ（グループ２）のいずれかを注射した（表１７）。Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1を特異的に認識するＩｇＧ抗体の検出のために、免疫化の前、その最中およびその後に得られた血液サンプルを、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたプレートで解析した。
【０１８３】
グループ１
予想通りに、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1を注射した５匹のマウスは、ＩｇＧ抗体を生産した。５匹のマウスは全て１４日目までに応答し、３４日目に最大限の抗アフィボディ(R)−ＩｇＧ応答を示した（図１８）。０日目（投与前）からの血漿中のサンプルにおいて、免疫反応は観察できなかった（データ示さず）。表１９は、ＸＬｆｉｔプログラムで計算された特異的ＩｇＧ、および、総ＩｇＧの濃度を示す。３４日目の特異的ＩｇＧの平均濃度は、８５μｇ／ｍｌであった。
【表１８】
0005634008.tif 000019
【０１８４】
グループ２
グループ２は、ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射された５匹のＣＤ１マウスで構成された。図１９に示す通りである。０日目（データ示さず）またはその他のあらゆるサンプリング日からの血漿中のサンプル中にも、特異抗体は検出できなかった。表２０に、ＩｇＧの総濃度を示す。
【表１９】
0005634008.tif 000020
【０１８５】
処理スキーム２
グループ３〜６は、１０回の注射を受けたＮＭＲＩマウスで構成された。グループ３は、全ての注射時にＨｉｓ6−ＺTaq4:1が投与されたが、その他のグループは、最初の５回の注射の後に抗原を切り替える注射スキームで処理された（処理スキーム２，表３．３）。免疫化の前、その最中およびその後に得られた血液サンプルを、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1でコーティングされたプレートで、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1ＩｇＧ−に対して向けられた抗体に関して解析した。グループ３〜６のいずれの処理前血漿サンプルにも抗体反応性は見出されなかった（データ示さず）。
【０１８６】
グループ３
グループ３に、処理スキーム２に従ってＨｉｓ6−ＺTaq4:1を注射した（表１８）。１４日目から特異抗体産生を観察することができた。特異的ＩｇＧの濃度は長期にわたり増加し、死亡時の採血で最大値に到達した（図２０）。表２１に、これらのデータと総ＩｇＧの濃度を要約する。４５日目での特異的ＩｇＧの平均濃度は、７１μｇ／ｍｌであった。
【表２０】
0005634008.tif 000021
【０１８７】
グループ４
グループ４には、最初の３週間は、ＺTaq4:1−ＡＢＤの５回の注射が行われ、次に、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1の５回のさらなる注射が行われた。これら動物は、最初の抗原のＺTaq4:1−ＡＢＤには反応しなかったが、３５日目からずっとＨｉｓ6−ＺTaq4:1に特異抗体を生じた。３５日目は、注射されるアフィボディ(R)分子を切り替えてから１４日目に相当する（図２１）。表２２に、これらのデータおよび総ＩｇＧの濃度を要約する。総ＩｇＧ濃度は正常であった（ただし異常に高いタイターを有していたマウス１５９を除く）。４５日目（死亡時の採血、および、切り替え後２４日目）の特異的ＩｇＧの平均濃度は、４μｇ／ｍｌであった。
【表２１】
0005634008.tif 000022
【０１８８】
グループ５
グループ５には、最初の３週間は、ＺTaq4:1−ＡＢＤの５回の注射が投与され、続いて、ＺTaq4:1−ＡＢＤとＨｉｓ6−ＺTaq4:1との混合物（１０μｇ／タンパク質）の５回の追加の注射が投与された。最初の抗原（すなわちＺTaq4:1−ＡＢＤ）を注射した際の動物では、検出可能な免疫反応は存在しなかった。Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1の注射に切り替えた後に、３５日目から低いレベルの特異的抗体を検出することができた（図２２）。表２３に、これらのデータと総ＩｇＧの濃度を要約する。４５日目の特異的ＩｇＧの平均濃度は、０.８μｇ／ｍｌであった。この反応は、グループ４よりも弱く、これは、より低い用量のＨｉｓ6−ＺTaq4:1による可能性が最も高い。
【表２２】
0005634008.tif 000023
【０１８９】
グループ６
グループ６には、最初の３週間は、５回のＨｉｓ6−ＺTaq4:1の注射が投与され、続いて、ＺTaq4:1−ＡＢＤの５回の注射が投与された。その結果を図２３で説明した。動物の免疫系は、正常な抗体反応速度論に従って、すなわち以前にＨｉｓ6−ＺTaq4:1の注射で観察されたのと同様に応答した。特異的ＩｇＧ応答は、２８日目で最大限に達し、抗原の切り替え後しばらくして減少した。表２４に、これらのデータと総ＩｇＧの濃度を要約する。２８日目の特異的ＩｇＧの平均濃度は６２μｇ／ｍｌであり、４５日目における死亡時の採血では４２μｇ／ｍｌであった。
【表２３】
0005634008.tif 000024
【０１９０】
結果を図２７Ｂで説明した。
【０１９１】
考察
この研究には２つ主な目的があり、より正確に言えば、ａ）追加の非近交系のマウスの系統におけるＨｉｓ6−ＺTaq4:1、および、ＺTaq4:1−ＡＢＤの免疫原性を調査すること、および、ｂ）ＡＢＤに融合したアフィボディ(R)分子の観察された不応答は、動物の免疫系の能動的な抑制に起因するものなのか、または、動物の免疫系の単に受動的な無視に起因するものなのかを決定すること、である。
【０１９２】
その結果によれば、非近交系のＣＤ１マウスは、以前に研究したＮＭＲＩマウスと同様に、ＺTaq4:1−ＡＢＤではなくＨｉｓ6−ＺTaq4:1を認識し、そして、それに結合する特
異抗体を生産することによって応答したことが示された。従って、ＡＢＤで誘導された不応答は、ＮＭＲＩ系にのみ関連する応答パターンではなく、一般的な現象のようである。
【０１９３】
上述したように、ＡＢＤが介在する不応答が能動的なプロセスなのか、または受動的なプロセスなのかを決定するために、グループ３〜６のマウスに、ＡＢＤに融合した、および、融合していないＺTaq4:1の異なる組み合わせを注射した。グループ４および５のマウスに、５回のＺTaq4:1−ＡＢＤを主に不応答を誘導する目的で注射し、それに続いて、５回のＨｉｓ6−ＺTaq4:1（グループ４）、または、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1とＺTaq4:1−ＡＢＤとの混合物（グループ５）を注射した。両方のグループは、Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1特異的ＩｇＧ応答を生産することによって応答し、これは、ＡＢＤに融合したアフィボディ(R)分子を用いた注射は、免疫系によるタンパク質の能動的な抑制（すなわちアネルギー）を起こさないことを示唆している。この研究結果により、ＡＢＤに融合したアフィボディ(R)分子は、血清アルブミンに結合することによって能動的に抑制されるのではなくて、血清アルブミンに結合することによってマウスの免疫系に無視されることが強く示される。最初にＨｉｓ6−ＺTaq4:1が投与されたマウスは、ＺTaq4:1−ＡＢＤに切り替えた後、レベルはわずかに減少したもののアフィボディ(R)特異的ＩｇＧを生産し続けた。
【０１９４】
実施例６
ラットにおける慢性的に投与された生物学的に活性な分子の免疫原性
この研究において、長期間にわたり異なるアフィボディ(R)分子が注射されたラットで生じた免疫反応を解析した。この報告は、免疫化してから９６日間までのデータを網羅する。用いられた分子は、実施例４で述べた通りの（ＺAβ3）2、および、ＡＢＤ−（ＺAβ3）2であった。この研究の目的は、１）ラットにおいて特異的な免疫反応を誘導する（ＺAβ3）2の能力を解析すること、および、２）ＡＢＤ−（ＺAβ3）2が、ＡＢＤを有しないアフィボディ(R)分子より低い免疫反応を示すかどうかを調査すること、である。免疫化スキームの前に、免疫化スキームの最中に９回、および、最後の注射の後に得られた血液サンプルを、反応性に関して解析した。（ＺAβ3）2でコーティングされたプレートで、結果によれば、（ＺAβ3）2の投与により、ＩｇＧ応答が起こり、個体間で大きなばらつきがあったが長期にわたり増加したことが示された。それに対して、ＡＢＤに融合した（ＺAβ3）2分子が注射された全てのラットからの血清中に特異的ＩｇＧは検出不可能であったか、または、極めてわずかであった。加えて、ラットにおいて副作用はみられなかった。
【０１９５】
方法
一般的なＥＬＩＳＡ方法
一般的に、全てのインキュベート工程に、体積１００μｌ／ウェルを用いた（ただし、ブロッキングには体積２００μｌを用いた）。プレートを、コーティングのために１日、ブロッキングおよび血漿のために１〜２時間、第二工程の抗体のために１時間、および、基質溶液のために１０分間インキュベートした。インキュベーションを室温で行った（ただし、コーティングには、４℃でインキュベートした）。全ての工程の間に、特に他の指定がない限り、ＥＬＩＳＡ  Ｓｋａｎ洗浄機３００を用いて、洗浄緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）４×３５０μｌ／ウェルを用いて洗浄を行った。プレートを、テカン製のＥＬＩＳＡリーダーで、マジェラン・ソフトウェアを用いて４５０ｎｍで読んだ。全ての希釈にＰＢＳ−Ｔ緩衝液を用いた（ただし、コーティングには、その代わりにコーティング緩衝液を用いた）。
【０１９６】
ラット抗（ＺAβ3）2に特異的なＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
プレートを、コーティング緩衝液中２μｇ／ｍｌの（ＺAβ3）2でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。洗浄後、上述の通りにプレートをブロックした。（ＺAβ3）2、または、ＡＢＤ−（ＺAβ3）2が注射されたウサギからの血清を連続３倍希釈（１／
１０から開始）で添加した。インキュベート後に、プレートを洗浄し、１：６０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ、サザン・バイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）３０５０−０５を添加した。最終的なインキュベートの後に、プレートを洗浄し、上述の通りに展開した。
【０１９７】
データ解析
ＥＬＩＳＡリーダーソフトウェアとして、マジェラン２（テカン）を用いた。データ解析と発表のために、その結果をエクセルにエクスポートした。濃度決定のために、Ｘｌｆｉｔ３．０プログラム、式「用量反応−片側」、方程式２０５を用いた。毎日の加工したデータ、および、測定のタイプ（すなわちＩｇＧ、濃度など）を、エクセルファイルで示した。
【０１９８】
結果
処理および注射スキーム
２つのラットのグループ（１グループあたり１０匹）に、同じ用量のアフィボディ(R)分子（２００μｇ／ｍｌ）をほぼ２８日間毎日注射した。注射スキームの前（０日目）、スケジュールに従って注射スキームの最中、および、最後の注射から２週間後（死亡時の採血）に、血清を採取した。
【０１９９】
【表２４】
0005634008.tif 000025
【０２００】
【表２５】
0005634008.tif 000026
【０２０１】
（ＺAβ3）2およびＡＢＤ−（ＺAβ3）2の注射
個々のラットからの血清サンプルを、連続３倍希釈で、（ＺAβ3）2でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート上で滴定し、方法の章で説明されている通りに、特異抗体の存在に関して解析した。
【０２０２】
滴定曲線，（ＺAβ3）2
図２４で示されるように、（ＺAβ3）2が注射されたグループ１のラットからの血清は、免疫化から最初の２週間は、応答を示さないか、または、低い応答しか示さなかった。１４日後に、抗体のタイターが徐々に増加し、広い範囲で応答を示した。９６日後に、全てのラットが応答した（ただし、それでも応答の規模は個々の動物間で差があった）。
【０２０３】
滴定曲線，ＡＢＤ−（ＺAβ3）2
図２５で示されるように、ＡＢＤ−（ＺAβ3）2が注射されたグループ２のラットの血清は、（ＺAβ3）2でコーティングしたプレートで試験した場合、注射スキームの最初の９６日間は、一貫して抗体反応を示さないか、または、低い抗体反応しか示さなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図２】ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図３】ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿から精製されたＩｇＧに関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図４】ストレプトキナーゼが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図５】Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図６】Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図７】ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図８】ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図９】スキーム１（パネルＡ）、または、スキーム２（パネルＢ）に従って、ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１０】Ｈｉｓ6−ＺTaq4:5が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１１】ＡＢＤ−Ｚher2:4が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１２】ＡＢＤ−（Ｚher2:4）2が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１３】ＡＢＤ−（Ｚher2:4）3が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１４】ＡＢＤ−（Ｚher2:4）4が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１５】（Ｚαβ:3）2が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１６】ＡＢＤ−（Ｚαβ:3）2が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１７】実施例４で説明されている阻害ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。
【図１８】Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図１９】ＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図２０】Ｈｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図２１】ＺTaq4:1−ＡＢＤ、次にＨｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図２２】ＺTaq4:1−ＡＢＤ、次にＺTaq4:1−ＡＢＤとＨｉｓ6−ＺTaq4:1が注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図２３】ＺTaq4:1、次にＺTaq4:1−ＡＢＤが注射されたマウスからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図２４】（ＺAβ3）2が注射されたラットからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図２５】ＡＢＤ（ＺAβ3）2が注射されたラットからの血漿に関するＥＬＩＳＡ滴定曲線を示す。
【図２６】本発明に係る様々なコンストラクトの配列を示す表である。
【図２７】Ａは、実施例５の設定の要約であり、Ｂは、実施例５で得られた結果を説明している。
【図１】
0005634008.tif 000027
【図２】
0005634008.tif 000028
【図３】
0005634008.tif 000029
【図４】
0005634008.tif 000030
【図５】
0005634008.tif 000031
【図６】
0005634008.tif 000032
【図７】
0005634008.tif 000033
【図８】
0005634008.tif 000034
【図９】
0005634008.tif 000035
【図１０】
0005634008.tif 000036
【図１１】
0005634008.tif 000037
【図１２】
0005634008.tif 000038
【図１３】
0005634008.tif 000039
【図１４】
0005634008.tif 000040
【図１５】
0005634008.tif 000041
【図１６】
0005634008.tif 000042
【図１７】
0005634008.tif 000043
【図１８】
0005634008.tif 000044
【図１９】
0005634008.tif 000045
【図２０】
0005634008.tif 000046
【図２１】
0005634008.tif 000047
【図２２】
0005634008.tif 000048
【図２３】
0005634008.tif 000049
【図２４】
0005634008.tif 000050
【図２５】
0005634008.tif 000051
【図２６】
0005634008.tif 000052
【図２７】
0005634008.tif 000053
【配列表】
0005634008000001.app