(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・オリゼを培養液中で培養し、培養物からデフェリフェリクリシンを回収してデフェリフェリクリシンを生産するにあたり、培養液の酸素容量移動速度を８mmol・l-1・h-1以上とし、かつ培養液の撹拌速度を５００ｒｐｍ以下とすることによりデフェリフェリクリシンの生産性を向上させる方法。
【請求項２】
培養液中の無機窒素源がアンモニウム塩である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アスペルギルス・オリゼを培養液中で培養し、培養物からデフェリフェリクリシンを回収してデフェリフェリクリシンを生産するにあたり、無機アンモニウム塩を０．５〜２．５ｗ／ｖ％含む培養液を用いることによりデフェリフェリクリシンの生産性を向上させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、鉄補給用の医薬品や健康食品などに有用なシデロフォアの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の中でも真菌(かび)の一種であるアスペルギルス属糸状菌は、伝統的に食品等の発酵に利用されてきた。アスペルギルス属糸状菌はヒトにとって有用な様々な物質を生産する。
【０００３】
アスペルギルス属糸状菌が生産する有用物質の一種にシデロフォアがある。シデロフォアは鉄キレート物質であり、その中にはフェリクロームが含まれる。フェリクロームは鉄をキレートする為、鉄補給用の医薬品や健康食品などに利用が可能である（特許文献１参照）。しかし、シデロフォアは二次代謝産物であることから大量生産はきわめて困難であり、シデロフォアの大量生産方法は技術的に確立されていない。
【特許文献１】特開２００５−２２５８７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、アスペルギルス属糸状菌を用いてシデロフォアを効率よく生産することができる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、アスペルギルス属糸状菌を培養する際に、培養液への通気量や攪拌速度などを調整して、酸素容量移動速度を８mmol・l-1・h-1以上にすることにより、培養物中にシデロフォアが効率よく生産されることを見出した。また、培養液中の無機窒素源をアンモニウム塩にすることによっても、培養物中にシデロフォアが効率よく生産されることを見出した。
【０００６】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下のシデロフォアの製造方法を提供する。
項１．  アスペルギルス属糸状菌を、酸素容量移動速度を８mmol・l-1・h-1以上とした培養液中で培養する培養工程と、培養物からシデロフォアを回収する回収工程とを含むシデロフォアの製造方法。
項２．  培養液中の無機窒素源がアンモニウム塩である項１に記載の方法。
項３．  アスペルギルス属糸状菌を、無機窒素源がアンモニウム塩である培養液中で培養する培養工程と、培養物からシデロフォアを回収する回収工程とを含むシデロフォアの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のシデロフォアの製造方法によれば、アスペルギルス属糸状菌を用いて効率よく、シデロフォアを生産することができる。
詳述すれば、本発明の第１の方法では、酸素容量移動速度を８mmol・l-1・h-1以上にすることにより、培養物中にシデロフォアが効率よく生産される。酸素容量移動速度は、培養液中への通気量、撹拌速度、攪拌翼の直径や形状、容器の形、または吹き込む気体の酸素濃度、容器内の圧力などの条件を適宜設定することにより調整することができる。また本発明の第２の方法では、培養液中の無機窒素源をアンモニウム塩にすることにより、培養物中にシデロフォアが効率よく生産される。
【０００８】
本発明方法により得られるシデロフォアは鉄をキレートするため、鉄補給用の医薬品や健康食品などに利用が可能である。本発明方法により得られるシデロフォアは古くから食品分野で利用されてきたアスペルギルス属糸状菌によって生産される為、その安全性は高く、さらに、長期間継続的に服用することによる副作用の心配もない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）第１の方法
本発明の第１のシデロフォアの製造方法は、アスペルギルス属糸状菌を、酸素容量移動速度を８mmol・l-1・h-1以上とした培養液中で培養する培養工程と、培養物からシデロフォアを回収する回収工程とを含む方法である。
【００１０】
アスペルギルス属糸状菌
アスペルギルス属糸状菌とは真菌(かび)の一種で、昔から日本酒、味噌、醤油などの発酵食品等に使用されている。本発明方法で使用するアスペルギルス属糸状菌はシデロフォアを生産する菌種であれば特に限定されないが、例えばアスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ウサミ、アスペルギルス・グラウカスなどが挙げられる。中でも、医薬品や健康食品の有効成分として有用なデフェリフェリクリシン（以下「Ｄｆｃｙ」という）を生産する点で、アスペルギルス・オリゼが好ましく、アスペルギルス・オリゼのＤｆｃｙ高生産変異株３１２９−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９６１）がより好ましい。
【００１１】
前培養工程
本発明の第１の製造方法においては、アスペルギルス属糸状菌を本培養する前に、前培養を行ってもよく、行わなくてもよい。前培養を行うことにより、菌の増殖に要する培養時間を短縮することができ、本培養工程において効率良くシデロフォアを生成することができる。また、本培養工程の初発菌数を増やし、雑菌によるコンタミネーションを防止することができる。
前培養工程で使用する培地は真菌類の培養に通常用いられる培地を制限なく使用できる。このような培地としてはツァペックドックス培地や麦芽エキス（ＭＡ）培地などが挙げられる。本培養に使用する培養液で前培養液を例えば５〜２０倍程度に希釈することにより、本培養を開始すればよい。なお、前培養は、固体培地を用いて行ってもよい。
【００１２】
本培養工程
本培養工程に使用する液体培地の種類は特に限定されず、アスペルギルス属糸状菌の培養に使用される公知の培地を制限なく使用できる。炭素源としては、デンプン、デキストリンのような高分子化合物；グルコース、スクロース、フラクトース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、エリスリトール、ラクトース、キシロース、イノシット、トレハロースのような単糖又はオリゴ糖；グリセロールのような低分子化合物などを用いることができる。また、窒素源としては、硝酸塩、亜硝酸塩、アンモニウム塩などの無機化合物の他、アミノ酸、酒粕のプロテアーゼ分解物のような有機化合物を用いることができる。酒粕は米の糖質が発酵中に分解されて大部分が除かれており、タンパク質を高濃度で含むため、酒粕プロテアーゼ分解物は効率良い窒素源となる。また、培地には、Ｐ、Ｋ、Ｓ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｃｕのようなミネラルや、ビオチン、チアミンなどのビタミン類などが含まれていてよい。培地中の鉄濃度は、約２ｐｐｍ以下とすることが好ましい。液体培地としては、代表的には、鉄濃度を約２ｐｐｍ以下にした、鉄制限ツァペックドックス液体培地や鉄制限麦芽エキス（ＭＡ）培地などの培地を用いることができる。培養液のｐＨは約３〜８とすればよい。
【００１３】
本培養時には、酸素容量移動速度(NA/V)を８mmol・l-1・h-1以上とした培養液中で培養する。酸素容量移動速度は、１０mmol・l-1・h-1以上とすることが好ましく、２０mmol・l-1・h-1以上とすることがより好ましい。これによりシデロフォアの生産量が格段に高くなる。酸素容量移動速度の上限値は特に限定されないが、通常８０mmol・l-1・h-1程度である。
酸素容量移動速度（NA/V）は液体体積(V)あたりの酸素の移動速度(NA)であり、酸素移動容量係数(KLa)と濃度勾配（Δc）との積で表され次式の関係で示される値である。
酸素容量移動速度(NA/V)＝(KLa)×(Δc)
酸素容量移動速度が大きいほど微生物の酸素要求量を連続的に充足しうる供給速度を有していることを示す。
酸素容量移動速度(NA/V)は、培養液への通気量(F)、液体体積(V)、培養槽からの排気中の酸素濃度(Cout＊)、培養液に通気する気体中の酸素濃度(Cin＊)を測定し、次式に従って算出することができる
NA/V＝(F/V)( Cin＊−Cout＊)
排気及び通気中の酸素濃度は排ガス分析装置（堀場製作所製、ＶＡ−３０００）を用いて測定した値である。
酸素容量移動速度を高めるためには、酸素の移動容量係数(KLa)、酸素の濃度勾配(Δc)のいずれか、あるいは両方を高めることが必要となる。KLは酸素の液境膜移動係数であり、またaは単位容積当たりの気体−液体間の接触面積である。従って、通常の液体培養においてKLは大きく変化せず、aの大小によってKLaは変化する。つまり酸素移動容量係数(KLa)は、培養液中への通気量、撹拌速度、攪拌翼の直径、または容器の形などにより変化する値である。また、酸素の濃度勾配(Δc)は通気する気体中の酸素濃度、容器内の圧力などにより変化する値である。
例えば、５Ｌの通気攪拌型培養槽に３Ｌの液体培地を入れて培養を行う場合に酸素容量移動速度(NA/V)を８mmol・l-1・h-1以上にするには、その通気量を約０．６７〜１vvm(volume/volume/minute)とすればよい。攪拌翼の直径は４〜７cm程度とすればよい。攪拌速度は、約３００〜５００rpmとすればよい。上記の攪拌速度の範囲であれば、酸素移動容量係数を大きくすることができ、かつせん断応力により菌体に損傷を与えることがない。また、培養液中へ酸素を空気より高い濃度で吹き込めばよく、純酸素の方がよりよい。容器内の圧力を常圧より高圧にすればよく、常圧〜0.2MPa程度とすればよい。上記の酸素濃度、加圧条件であれば酸素の濃度勾配を大きくすることができる。
培養液中への通気量、撹拌速度、攪拌翼の直径や形状、容器の形、または吹き込む気体の酸素濃度、容器内の圧力などの条件を上記範囲で適宜設定することにより、培養液の酸素容量移動速度(NA/V)を８mmol・l-1・h-1以上にすることができる。また、培養槽の容量及び培養液量を変える場合は、上記条件に準じて培養槽の条件を適宜設定することにより、培養液の酸素容量移動速度(NA/V)を８mmol・l-1・h-1以上にすることができる。
本培養工程の培養方法は、回分培養や流加（半回分）培養などのバッチ方式や灌流培養などの連続培養方式などいずれであってもよい。
また、培養温度は、使用する菌種や菌株によって異なるが、概ね２５〜３５℃程度とすればよい。また、培養時間は、回分培養や流加（半回分）培養では２〜７日間程度とすればよい。また、連続培養では滞留時間を２〜６日間程度とすればよい。
【００１４】
回収工程
本発明において回収工程とは、培養物からシデロフォアを回収する工程をいう。
アスペルギルス属糸状菌は、通常、菌体外にシデロフォアを分泌生産する。よって、菌体を含んだまま培地ごと回収してもよいし、遠心分離等で菌体を除去した後の培地から、公知の方法で精製してもよい。
シデロフォア
シデロフォアとは細菌や放線菌又は真核微生物が生産する分子量１５００以下の鉄イオンキレート物質である。アスペルギルス属糸状菌体が生産するシデロフォアとしては、以下の一般式（鉄をキレートした状態を示す）で表わされる化合物が挙げられる。
【化１】
0005553969.tif 000002
（式中、R1は水素原子、又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ2は水素原子、メチル基又はヒドロキシメチル基を示し；Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5は、同一又は異なって、メチル基、Ｎ5−（トランス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、Ｎ5−（シス−５−ヒドロキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基、又はＮ5−（トランス−４−カルボキシ−３−メチルペント−２−エノイル）基を示す。）
これらの化合物の一般式(1)における官能基であるＲ1〜Ｒ5を以下の表１にまとめて示す。
【００１５】
【表１】
0005553969.tif 000003
本発明方法により製造されるシデロフォアの種類は、使用菌種によって定まる。アスペルギルス・オリゼを用いる場合は、主にフェリクリシンのデフェリ体であるＤｆｃｙが得られる。
【００１６】
（ＩＩ）第２の方法
本発明の第２のシデロフォアの製造方法は、アスペルギルス属糸状菌を、無機窒素源がアンモニウム塩である培養液中で培養する培養工程と、培養物からシデロフォアを回収する回収工程とを含む方法である。
第２の方法では、前培養を行ってもよく、行わなくてもよい。前培養を行う場合の条件は、第１の方法について説明した通りである。
培養液中の無機窒素源のアンモニウム塩としては、アスペルギルス属糸状菌の培養に用いられる公知のアンモニウム塩を制限なく使用できる。このようなアンモニウム塩としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、クエン酸二アンモニウム、クエン酸三アンモニウム、酢酸アンモニウム、燐酸水素二アンモニウム、燐酸二水素アンモニウム、蟻酸アンモニウムなどが挙げられる。中でも、硫酸アンモニウムが好ましい。アンモニウム塩は１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
アンモニウム塩の含有量は、通常０．１〜２．５%(w/v)程度、好ましくは０．５〜１．０%(w/v)程度とすればよい。
その他の無機窒素化合物は、前培養培地から混入したものを除き、実質的に含まれない。このような、アンモニウム塩以外の無機窒素化合物としては、硝酸塩、亜硝酸塩などが挙げられる。
培地中のその他の成分や培地ｐＨなどの培地条件は、第１の方法について説明した通りである。培養方法、培養温度、培養時間、回収工程も、第１の方法と同様である。
【００１７】
実施例
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
シデロフォアの製造方法
後掲の実施例１〜４は、基本的に以下の条件で行った。各実施例で変更した条件は後述する。
＜前培養工程＞
以下の表２に示す条件で、Dfcy高生産変異株アスペルギルス・オリゼ３１２９−７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−２０９６１）の前培養を行なった。
【表２】
0005553969.tif 000004
※酒粕プロテアーゼ分解物粉末は、酒粕をプロテアーゼで分解したものであり、以下の方法で調製したものを用いた。即ち、酒粕の凍結乾燥品３００ｇに蒸留水６００ｍｌを加え均一にし、市販のプロテアーゼであるスミチームＬＰ（新日本化学工業社製）を０．６ｇ加えて５０℃で１６時間攪拌しながら反応させた。反応終了後、８０℃で１０分間加熱し、酵素を失活させた後、遠心分離（１１０００rpm、１５分）により不溶性の残渣を除去し、上清液を凍結乾燥機で粉末になるまで除湿乾燥したものを使用した。
【００１９】
＜本培養工程＞
以下の表３に示す条件で本培養を行なった。
【表３】
0005553969.tif 000005
※酒粕プロテアーゼ分解物粉末に関しては前培養と同様である。
【００２０】
酸素容量移動速度の測定方法
下記式に各数値を代入することにより算出した。
酸素容量移動速度(NA/V) ＝(F/V)( Cin＊−Cout＊)
F：培養液への通気量
V：培養液体積
Cin＊：培養液に通気する気体中の酸素濃度
Cout＊：培養槽からの排気中の酸素濃度
Cin＊、Cout＊は排ガス分析装置（堀場製作所製、VA-3000）を用いて測定した。
【００２１】
Ｄｆｃｙ生産量の測定方法
培養上清に１００μｌに１０μｌの０．２Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０μｌの３０００ｐｐｍ  ＦｅＣｌ３溶液を添加し、Ｄｆｃｙに鉄をキレートしフェリクリシン（Ｆｃｙ）とした。
このＦｃｙ溶液を、ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製；Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）を用いた逆相クロマト分析に供し、Ｆｃｙに特異的な吸収波長である波長４３０ｎｍを指標にＦｃｙピークを同定した。そのピーク面積からＦｃｙの定量を行った。定量したＦｃｙ量に、Ｆｃｙに対するＤｆｃｙの分子量比０．９３（７４４／８００）を乗じてＤｆｃｙ量を算出した。
【００２２】
実施例１
酸素容量移動速度がＤｆｃｙ生産性に与える影響の検討（１）（通気条件）
培養時の通気条件を変化させることにより酸素容量移動速度を変化させ、酸素容量移動速度がＤｆｃｙの生産性に与える影響について検証した。即ち、空気を０．６７（ｖｖｍ）で通気する場合と、酸素（濃度約１００％、以下同じ。）を０．３３（ｖｖｍ）で通気する場合との間で、酸素容量移動速度、及びＤｆｃｙの生産量を比較した。前培養条件は前掲の表２の条件の通りである。本培養条件は前掲の表３の通りであり、但し窒素源としてはＮａＮＯ３を１．０％（ｗ／ｖ）添加し、（ＮＨ４）２ＳＯ４は非添加とした。ｐＨ制御は行わなかった。また、本培養時の攪拌速度は３００ｒｐｍとし、４８時間培養した。
結果を以下の表４に示す。
【表４】
0005553969.tif 000006
【００２３】
表４より、Ｄｆｃｙ生産量は、酸素通気時は空気通気時と比較して約２倍近くになることが分かる。
【００２４】
実施例２
酸素容量移動速度がＤｆｃｙ生産性に与える影響の検討（２）（攪拌翼速度）
培養時の攪拌翼速度を変化させることにより酸素容量移動速度を変化させ、酸素容量移動速度がＤｆｃｙの生産性に与える影響について検証した。即ち、攪拌速度を１００ｒｐｍ、３００ｒｐｍ、５００ｒｐｍ、及び７００ｒｐｍに変化させて、酸素容量移動速度、及びＤｆｃｙの生産量を比較した。前培養条件は前掲の表２の条件の通りである。本培養条件は前掲の表３の通りであり、但し窒素源としてはＮａＮＯ３を１．０％（ｗ／ｖ）添加し、（ＮＨ４）２ＳＯ４は非添加とした。ｐＨ制御は行わなかった。通気は空気を０．６７ｖｖｍとし、６４時間培養した。
結果を以下の表５に示す。
【表５】
0005553969.tif 000007
表５より、酸素容量移動速度が高いほどＤｆｃｙ生産量が多くなることが分かる。また、攪拌速度３００ｒｐｍ、５００ｒｐｍ、及び７００ｒｐｍのときの６４時間培養後の菌体の光学顕微鏡写真を図１に示す。攪拌速度が７００ｒｐｍのときに菌体がせん断されている。攪拌速度を余りに大きくすると菌体がせん断されて、酸素容量移動速度の増大に見合うようにはＤｆｃｙ生産量が増大しないことも分かる。
表４及び表５から、酸素容量移動速度を８mmol・l-1・h-1以上にすることによりＤｆｃｙを高生産できることが示された。また、酸素容量移動速度を高くする方法としては、酸素通気や攪拌速度上昇などの方法があるが、攪拌速度は菌体がせん断されない範囲に設定することが必要であることも示された。
【００２５】
実施例３
無機窒素源の種類がＤｆｃｙ生産に与える影響の検討
培養液中の窒素源の種類がＤｆｃｙの生産性に与える影響について検証した。即ち、窒素源として硝酸ナトリウムを用いた場合と、硫酸アンモニウムを用いた場合とで、Ｄｆｃｙの生産量を比較した。前培養条件は前掲の表２の条件の通りである。本培養条件は前掲の表３の通りであり、培地のｐＨは、硫酸アンモニウムを使用した場合のみ４．０以下にならないように１２．５％アンモニア水を添加して制御した。通気及び攪拌速度は、培養開始後１６時間までは空気を０．６７ｖｖｍ及び３００ｒｐｍとし、その後は酸素を０．５ｖｖｍ及び４５０ｒｐｍとした。合計６４時間培養した。
結果を以下の表６に示す。
【表６】
0005553969.tif 000008
【００２６】
表６に示すように、Ｎ源として硝酸ナトリウムを添加した場合よりも、硫酸アンモニウムをＮ源として添加した方が、Ｄｆｃｙの生産性が高いことが示された。
【００２７】
実施例４
生産されるシデロフォアの種類
鉄制限培地及び鉄添加培地を用いて、以下に示す条件で、アスペルギルス・オリゼ１０１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１６５２８）を培養し、培養上清に最終濃度（５００ｐｐｍ）のＦｅＣｌ３溶液を添加した場合と、添加しない場合とについてＨＰＬＣ分析を行い、シデロフォアを検出した。
＜培養条件＞
前培養条件は前掲の表２の条件の通りである。本培養条件は前掲の表３の通りであり、培地のｐＨは、硫酸アンモニウムを使用した場合のみ４．０以下にならないように１２．５％アンモニア水を添加して制御した。通気及び攪拌速度は、培養開始後１６時間までは空気を０．６７ｖｖｍ及び３００ｒｐｍとし、その後は硫酸アンモニウムを使用した場合のみ酸素を０．５ｖｖｍ及び４５０ｒｐｍとした。合計６４時間培養した。
＜ＨＰＬＣ分析条件＞
培養上清１００μｌに１０μｌの０．２Ｍ クエン酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０μｌの３０００ｐｐｍ  ＦｅＣｌ３溶液を添加し、シデロフォアに鉄をキレートさせた。
これをＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製；Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）を用いた逆相クロマト分析に供し、シデロフォアに特異的な吸収波長である波長４３０ｎｍを指標にＦｃｙやその他のシデロフォアを同定した。各シデロフォアはピーク面積比にて生産量を比較した。
結果を以下の表７に示す。
【表７】
0005553969.tif 000009
なお、培養上清に鉄を添加しなかった場合にはＤｆｃｙやその他のシデロフォアＡ、Ｂのいずれのピークも検出されなかった。
結果を図２に示す。鉄制限培養して得た培養液の上清にＦｅＣｌ３溶液を添加して初めて検出されるピークがシデロフォアのピークであると考えられることから、１０１３株はＤｆｃｙの他に２種のシデロフォアを生産していることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明の製造方法は、鉄補給用の医薬品や健康食品などとして有用なシデロフォアを効率的に生産するために好適に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例２で培養した菌体の光学顕微鏡写真である。
【図２】実施例４のＨＰＬＣチャートである。
【図２】
0005553969.tif 000010
【図１】
0005553969.tif 000011