(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸のいずれかの糖鎖の構成糖からなる６糖のオリゴ糖の還元末端をピリジルアミノ化したピリジルアミノ化オリゴ糖を、これらの糖鎖のうちの他の糖鎖とともに溶媒に溶解してヒアルロニダーゼ固定化カラムに通液し、カラム内でヒアルロニダーゼの作用による糖鎖の糖転移反応によってピリジルアミノ化オリゴ糖の非還元末端に他方の糖鎖の構成糖を２糖単位で転移させることによるハイブリッド糖鎖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッド糖鎖の製造方法に関する。より詳細には、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸から選択される複数種類の糖鎖の構成糖からなるハイブリッド糖鎖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖は、核酸、タンパク質に次ぐ第三の“鎖”であり、近年、生体内におけるその役割や機能が注目されていることは当業者に周知の通りである。中でも、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸は、動物組織中に存在する糖鎖であり、生命現象に深く関与していることがこれまでの研究成果によって明らかにされていることから、医薬品や飲食品などへの応用に期待が寄せられている。しかしながら、その実態については未だ不明な点も多く、よりいっそうの研究の進展が待たれているところである。また、生体内では、例えばヒアルロン酸とコンドロイチン硫酸といった異なる糖鎖の相互作用によってある種の生理作用が導き出されている可能性が示唆されている。このような状況において、ヒアルロン酸の構成糖とコンドロイチン硫酸の構成糖からなる糖鎖のような、起源を異にする構成糖からなり、自然界には見出されていないハイブリッド糖鎖に関心が集まっている。
【０００３】
ハイブリッド糖鎖の研究を進めるためには、糖鎖を計画的に構築してデザインする方法の確立が望まれる。本発明者らは、糖鎖をデザインする方法に関し、特許文献１において、ヒアルロニダーゼ固体化カラムを利用した酵素学的手法による糖鎖改変方法を提案している。しかしながら、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸から選択される複数種類の糖鎖の構成糖からなるハイブリッド糖鎖については、特許文献１で言及していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−２７８９０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで本発明は、計画的なデザインのもとで行う、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸から選択される複数種類の糖鎖の構成糖からなるハイブリッド糖鎖の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の点に鑑みてなされた本発明のハイブリッド糖鎖の製造方法は、請求項１記載の通り、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸のいずれかの糖鎖の構成糖からなる６糖のオリゴ糖の還元末端をピリジルアミノ化したピリジルアミノ化オリゴ糖を、これらの糖鎖のうちの他の糖鎖とともに溶媒に溶解してヒアルロニダーゼ固定化カラムに通液し、カラム内でヒアルロニダーゼの作用による糖鎖の糖転移反応によってピリジルアミノ化オリゴ糖の非還元末端に他方の糖鎖の構成糖を２糖単位で転移させることによる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、計画的なデザインのもとで行う、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸から選択される複数種類の糖鎖の構成糖からなるハイブリッド糖鎖の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のハイブリッド糖鎖の製造方法は、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸のいずれかの糖鎖の構成糖からなる６糖のオリゴ糖の還元末端をピリジルアミノ化したピリジルアミノ化オリゴ糖を、これらの糖鎖のうちの他の糖鎖とともに溶媒に溶解してヒアルロニダーゼ固定化カラムに通液し、カラム内でヒアルロニダーゼの作用による糖鎖の糖転移反応によってピリジルアミノ化オリゴ糖の非還元末端に他方の糖鎖の構成糖を２糖単位で転移させることによるものである。
【０００９】
即ち、本発明のハイブリッド糖鎖の製造方法は、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸から選択される糖鎖を起源とするピリジルアミノ化オリゴ糖をヒアルロニダーゼの作用による糖鎖の糖転移反応における受容体（アクセプター）、これらの糖鎖のうちの他の糖鎖を供与体（ドナー）とし、カラム内でピリジルアミノ化オリゴ糖の非還元末端に他方の糖鎖の構成糖を２糖単位で転移させることで、起源を異にする構成糖からなるハイブリッド糖鎖を製造するものである。受容体とするピリジルアミノ化オリゴ糖は、構成糖の数が６糖であるので、供与体として機能せず、他方の糖鎖のみが供与体として機能するので、還元末端側の６糖が受容体由来の構成糖であってその非還元末端に供与体由来の構成糖が結合したハイブリッド糖鎖の製造を計画的に行うことができる。また、生成物であるハイブリッド糖鎖は、その還元末端に結合している２−ピリジルアミノ基を蛍光標識として液体クロマトグラフィーなどにより容易に分取や精製することができる。糖鎖の糖転移反応に用いるヒアルロニダーゼはカラム内に固定化されているので、ハイブリッド糖鎖にヒアルロニダーゼが混入することはない。よって両者を分離する工程は必要がない。
【００１０】
本発明において製造対象とするハイブリッド糖鎖の起源とするヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸は、それぞれ自然界に存在する自体公知の糖鎖である。従って、これらの糖鎖は自然界から取得することができるものであるが、コンドロイチンは自然界から大量に取得することが困難なものであるので、コンドロイチン硫酸を化学的に脱硫酸化することによって取得するのが一般的である。コンドロイチン硫酸としてはコンドロイチン４−硫酸（コンドロイチンＡ）やコンドロイチン６−硫酸（コンドロイチンＣ）を具体例として挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１１】
本発明のハイブリッド糖鎖の製造方法において用いることができるヒアルロニダーゼとしては、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸を供与体として、これらの糖鎖の構成糖を２糖単位で受容体の非還元末端に転移させる活性を有するものであればどのようなものであってもよく、ウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ，ＥＣ３．２．１．３５：必要であればＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３（２１），６５０３−６５０７，１９９４などを参照のこと）をその具体例として挙げることができる。
【００１２】
ヒアルロニダーゼ固定化カラムは、酵素固定化カラムの一般的な作製方法に従って作製することができる。その一例としては、ＣＮＢｒ（臭化シアン）活性化セファロースなどのＣＮＢｒによって活性化させたビーズ状のアガロースゲルにヒアルロニダーゼをカップリングさせてガラス製のカラムに充填する方法が挙げられる（ヒアルロニダーゼを固定する担体はビニルポリマーなどの合成樹脂からなるビーズなどであってもよい）。ヒアルロニダーゼをカラム内に固定化することで、その酵素活性の安定化が図られるため、カラムを繰り返し利用できる。また、作製したカラムは３〜５℃で保存することにより、少なくとも１２ヶ月はヒアルロニダーゼの酵素活性を維持しておくことができる（１６ヶ月経過後においても約７０％の酵素活性の維持が可能）。
【００１３】
ヒアルロニダーゼ固定化カラム内での糖鎖の糖転移反応は、受容体とするピリジルアミノ化オリゴ糖と供与体とする糖鎖を緩衝液などの溶媒に溶解し、予め緩衝液で緩衝化したカラムに通液して行うことが望ましい。カラム内を所定の反応条件、例えば、ウシ精巣性ヒアルロニダーゼを用いる場合、２〜４０℃、ｐＨ６．５〜８．５の条件とすることで、反応系内に存在する供与体とした糖鎖が加水分解され、その非還元末端から構成糖が２糖単位で遊離されるとともに、遊離した構成糖が２糖単位で受容体としたピリジルアミノ化オリゴ糖の非還元末端に次々に転移されて糖鎖が伸長する。糖鎖をより長く伸長させるためには反応温度は低い方が望ましく、例えば２〜２６℃の反応温度では１０個以上の２糖単位を、１６℃以下の反応温度では２０個以上の２糖単位を効率的に転移させることができる（全長として構成糖の数が１４０糖の糖鎖の製造も可能である）。所定の反応時間（例えば１０分間〜３日間）が経過した後、カラムに洗浄液として例えば水や塩化ナトリウム水溶液や酢酸アンモニウム水溶液などを通液して反応液を流出させ、糖鎖の還元末端に結合している２−ピリジルアミノ基を蛍光標識として液体クロマトグラフィーなどを用いて分取と精製を行うことで、ヒアルロニダーゼの混入がないハイブリッド糖鎖を得ることができる。
【００１４】
なお、糖鎖の糖転移反応における受容体とするヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸を起源とするピリジルアミノ化オリゴ糖は、自体公知の方法、例えば、これらの糖鎖を上記のウシ精巣性ヒアルロニダーゼを用いて加水分解することで構成糖の数が６糖のオリゴ糖（構成２糖が３つ結合したもの）を得た後、その還元末端を２−アミノピリジンを用いた還元アミノ化法によってピリジルアミノ化する方法で調製することができる（必要であればＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１３２−１３５，１９９１などを参照のこと）。
【００１５】
本発明のハイブリッド糖鎖の製造方法によれば、通常、構成糖の数が２糖単位で異なる一連のハイブリッド糖鎖を高い純度でかつ高収量で得ることができるので、ハイブリッド糖鎖のライブラリー化が可能となる。ハイブリッド糖鎖の還元末端に結合している２−ピリジルアミノ基は除去せずにそのまま蛍光標識として利用してもよいし、自体公知の方法で除去してもよい（必要であればＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３４，５１−５５，２００３などを参照のこと）。また、本発明の方法によって製造したハイブリッド糖鎖を受容体、本発明の方法において供与体とした糖鎖と異なる糖鎖を供与体とし、ヒアルロニダーゼ固定化カラムを利用して新たな供与体とした糖鎖を起源とする構成糖をハイブリッド糖鎖の非還元末端に２糖単位で転移させることで、多種多様のハイブリッド糖鎖を製造することができる。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。なお、以下の実施例では、ヒアルロン酸は市販のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ由来の平均分子量８００００のものを用いた（フードケミファ社製）。コンドロイチン硫酸は市販のコンドロイチン４−硫酸（クジラ軟骨由来、平均分子量３４０００）と市販のコンドロイチン６−硫酸（サメ軟骨由来、平均分子量６４０００）を用いた（いずれも生化学バイオビジネス社製）。コンドロイチンは上記のコンドロイチン４−硫酸またはコンドロイチン６−硫酸をＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，８６，１３２３−１３２９，１９７９に記載の方法に従って化学的に脱硫酸化したものを用いた。
【００１７】
（１）ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸を起源とするピリジルアミノ化オリゴ糖の調製
Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１３２−１３５，１９９１に記載の方法に従って、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸を起源とする６糖のピリジルアミノ化オリゴ糖をそれぞれ調製した。
【００１８】
（２）ヒアルロニダーゼ固定化カラムの作製
１．２ｇのウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（Ｔｙｐｅ１−Ｓ、シグマ社製）と、膨潤させる前の乾燥重量で３０ｇ（膨潤させた後におけるタンパク質濃度が１０ｍｇ／ｍＬ）のＧＥヘルスケア社製のＣＮＢｒ活性化セファロース４ＦＦを、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、室温で２時間または４℃で１８時間かけてカップリングさせ、直径が１５ｍｍで長さが１０ｃｍのガラス製のカラムに充填することで作製した（充填した担体のベッドボリュームは３．６ｍＬで高さは２ｃｍ）。カップリング効率は１１．８６％で、担体１ｍＬ（ベッドボリューム）あたりのヒアルロニダーゼのタンパク質量と力価はそれぞれ１．２ｍｇと５３４Ｕ程度であった。このようにして作製したカラムは使用時まで４℃で保存した。
【００１９】
（３）ハイブリッド糖鎖の製造
（２）で作製したウシ精巣性ヒアルロニダーゼ固定化カラムを平衡化緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液，ｐＨ７．０）で平衡化した後、受容体として（１）で調製したピリジルアミノ化オリゴ糖から選択される１種類、供与体としてヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸から選択される１種類をカラムに同時にアプライした。それぞれのアプライ量は、酵素固定化担体１ｍＬ（ベッドボリューム）あたり約０．０４ｍｇと約１．２５ｍｇとした（平衡化緩衝液を溶媒として使用）。供与体がヒアルロン酸およびコンドロイチンの場合には３７℃で１時間、コンドロイチン４−硫酸の場合には４℃で１晩、コンドロイチン６−硫酸の場合には４℃で３晩、カラム内に受容体と供与体を保持し、糖鎖の糖転移反応を行って受容体としたピリジルアミノ化オリゴ糖の非還元末端に供与体とした糖鎖の構成糖を２糖単位で転移させた。反応後、カラムに洗浄液として水を通液して反応液を流出させ、脱塩してから濃縮することでハイブリッド糖鎖の混合物を得た。このハイブリッド糖鎖の混合物を高速液体クロマトグラフィーにかけ、糖鎖の還元末端に結合している２−ピリジルアミノ基の蛍光を指標として（励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４００ｎｍ）、それぞれのハイブリッド糖鎖を分取した。なお、高速液体クロマトグラフィーは以下の２種類の条件を適宜採用して行った。
（条件１）
・カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ＩＩ（ＹＭＣ社製）
※  分析用：４．６×２５０ｍｍ、分取用：１０×２５０ｍｍ
・溶出液：Ａ液（１６ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４）、Ｂ液（５００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４）
・直線的濃度勾配：Ｂ液０−１００％（０−６０分）
・流速：１ｍＬ／分（分析時）または３ｍＬ／分（分取時）
・カラム温度：４０℃
（条件２）
・カラム：ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ａｍｉｄｅ−８０（４．６×２５０ｍｍ、東ソー社製）
・溶出液：Ａ液（３％酢酸：アセトニトリル＝１０：９０、ｐＨ７．３）
Ｂ液（３％酢酸：アセトニトリル＝５０：５０、ｐＨ７．３）
・直線的濃度勾配：Ｂ液０−１００％（０−６０分）
・流速：１ｍＬ／分
・カラム温度：４０℃
【００２０】
（４）結果
構成糖の数が６糖のピリジルアミノ化オリゴ糖を受容体として得られたハイブリッド糖鎖の種類を表１に示す。なお、表１において、Ｈはヒアルロン酸の構成２糖（−ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃ−）、０はコンドロイチンの構成２糖（−ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ−）、４はコンドロイチン４−硫酸の構成２糖（−ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）−）、６はコンドロイチン６−硫酸の構成２糖（−ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）−）、ＰＡは２−ピリジルアミノ基を意味する。
【００２１】
【表１】
0005610428.tif 000002
【００２２】
表１から明らかなように、本発明の方法によれば、構成糖の数が２糖単位で異なる一連のハイブリッド糖鎖を計画的に製造することができた。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
本発明は、計画的なデザインのもとで行う、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸から選択される複数種類の糖鎖の構成糖からなるハイブリッド糖鎖の製造方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。