(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はこれらの塩を被検体に投与した後、該被検体から尿を採取し、採取した尿中の細胞における蛍光を検出することを特徴とする尿路上皮がんの検出方法。
【請求項２】
５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はこれらの塩を投与した被検体から採取した尿から細胞を分離し、分離した細胞における蛍光を検出することを特徴とする尿路上皮がんの検出方法。
【請求項３】
５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体、又はこれらの塩を、ＡＬＡ塩酸塩換算で被検体１ｋｇあたり、０．０５〜２０ｍｇ投与することを特徴とする請求項１又は２記載の尿路上皮がんの検出方法。
【請求項４】
５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体、又はこれらの塩を経口投与することを特徴とする請求項１又は２記載の尿路上皮がんの検出方法。
【請求項５】
被検体が、尿路上皮がんの疑いのあるヒトであることを特徴とする請求項１又は２記載の尿路上皮がんの検出方法。
【請求項６】
請求項１又は２記載の方法に用いる、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体、又はこれらの塩を含有することを特徴とする尿路上皮がん検出剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿路上皮がんの検出方法に関し、詳しくは、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はこれらの塩（以下、「ＡＬＡ類」ということがある。）を用いた尿路上皮がんの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
尿路上皮がんの検査は、通常、尿にこぼれ落ちる細胞をパパニコロウ染色し顕微鏡で観察して行っているが、診断には熟練を要し、また見落としも多いという問題がある。検出が困難であることは、がん発見の遅れにつながり、また再発の見逃しにもつながっている。
他方、膀胱がんの患者の内視鏡手術において、ＡＬＡ類を膀胱内に注入し、膀胱内のがん細胞由来の蛍光を観察して切除部位を決定することが知られており（例えば、非特許文献１参照）、ＡＬＡ類を経口投与又は静脈注射することによっても、膀胱内の蛍光の観察が可能であることが知られている（特許文献１参照）。【０００３】
その他、ＡＬＡ類を含有する腫瘍診断剤であって、該腫瘍診断剤を１回に体重１ｋｇあたり０．００１ｍｇ〜１０ｇ投与後、血液、体液、組織、尿、糞便、唾液、汗、髄液、精液又は涙等の体内又は体外から採取した試料中のプロトポルフィリンIX、ウロポルフィリンＩ、コプロポルフィリンＩ等を測定することにより診断する、脳、鼻道、鼻腔、気管、気管支、口腔、咽頭、食道、胃、乳房、結腸直腸、肺、卵巣、中枢神経系、肝臓、膀胱、尿道、尿管、膵臓、頚管、腹腔、肛門管又は子宮頚等の組織の腫瘍の有無を判定することを目的とした腫瘍診断剤（例えば特許文献２参照）が提案されている。【０００４】
また、膀胱癌患者から回収した尿沈査をＡＬＡ濃度２００μｇ／ｍＬに調整した無血清培養液に溶解し、３７℃にて２時間暗室において保温後検査に供するIn vitro incubation 法と、膀胱癌患者の膀胱内でＡＬＡ溶液 (1.5g ALA/50mL緩衝液)から２時間保持した後回収した尿沈渣を検査に供するin vivo incubation法とを行う、蛍光尿中剥離細胞を対象に、ＡＬＡ誘導蛍光陽性細胞を検出する蛍光細胞診およびフローサイトメトリーを行うＰＤＤcytology法が報告されている（例えば、非特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００９／１３０８９３号公報
【特許文献２】特開２００６−１２４３７２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）膀胱内注入による蛍光膀胱鏡を用いた膀胱癌の光力学的診断、井上 啓史、辛島 尚、鎌田 雅行、執印 太郎、倉林 睦、大朏 祐治、日本泌尿器科學會雜誌、Vol.97、pp.719-729
【非特許文献２】膀胱癌の光力学的診断−蛍光尿細胞診の有用性−、藤本清秀、三宅牧人、中井清、松村善昭、穴井智、平尾佳彦、日本泌尿器科学界雑誌Ｖｏｌ．１０１、Ｎｏ．2、総会特集号February、2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、従来の尿路上皮がんの検査は、熟練を要し、また見落としも多いという問題があることから、精度が高く簡易な新たな手法が待ち望まれていた。例えば、前記In vitro incubation 法では、暗黒化で培養する培養装置が必要であり、また、採尿後結果が出るまで何時間も患者が待つ必要があった。前記in vivo incubation法では、膀胱内へのＡＬＡ溶液の注入の際に患者に負担がかかる上に、膀胱がんしか見いだせないという問題があった。
本発明の課題は、特別な培養装置を必要とせず、採尿後直ちに判定することができるなど、尿路上皮がんの検出を簡易かつ精度よく行うことができる尿路上皮がんの検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記のようなＡＬＡ類を用いた技術が尿路上皮がんの細胞診断にも応用可能ではないかとの着想の下、鋭意検討を重ねた結果、ＡＬＡ類を投与した被検体の体外に排出される尿中の遊離がん細胞における蛍光を検出することにより、尿路上皮がんの検出ができることを見いだすと共に、そのＡＬＡ類の投与量も、従来の切除部位の決定に用いられる量の半量以下といった極めて少ない量で十分であることを見いだし、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、（１）５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はこれらの塩を被検体に投与した後、該被検体から尿を採取し、採取した尿中の細胞の蛍光の存在又は量を検出することを特徴とする尿路上皮がんの検出方法や、（２）５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体又はこれらの塩を投与した被検体から採取した尿から細胞を分離し、該細胞の蛍光の存在又は量を検出することを特徴とする尿路上皮がんの検出方法や、（３）５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体、又はこれらの塩を、ＡＬＡ塩酸塩換算で被検体１ｋｇあたり、０．０５〜２０ｍｇ投与することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の尿路上皮がんの検出方法や、（４）５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体、又はこれらの塩を経口投与することを特徴とする上記（１）又は（２）記載の尿路上皮がんの検出方法や、（５）被検体が、尿路上皮がんの疑いのあるヒトであることを特徴とする上記（１）又は（２）記載の尿路上皮がんの検出方法や、（６）上記（１）又は（２）記載の方法に用いる、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）若しくはその誘導体、又はこれらの塩を含有することを特徴とする尿路上皮がん検出剤に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、特別な培養装置を必要とせず、採尿後直ちに判定することができる上に、尿中の細胞における蛍光が検出された時点で、異常があると判定され、すぐに内視鏡での診断や経尿道的摘出措置に移行することができる。例えば、再発の有無のための内視鏡検査の前に、この尿中の細胞における蛍光検出検査を行い、疑いが無ければ内視鏡検査を受ける必要がない。このことは、大きく患者の負担を軽減し、また、国民医療費の軽減にもつながる。このように本発明の方法は、膀胱がんだけでなくすべての尿路上皮がんの検出を迅速かつ簡易に精度よく行うことができ、当該分野の医療において画期的な手法である。また、ＡＬＡ類の投与量が少量でも検出可能なため、コスト的にも有利であり、また、光傷害が実質的に引き起こされないという安全面の効果も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＡＬＡ塩酸塩１ｇ投与時の尿から分離した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図２】ＡＬＡ塩酸塩５００ｍｇ投与時の尿から分離した細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の尿路上皮がんの検出方法としては、５−アミノレブリン酸若しくはその誘導体、又はこれらの塩（ＡＬＡ類）を被検体に投与した後、該被検体から尿を採取し、採取した尿中の細胞における蛍光を検出（例えば、蛍光の存在又は蛍光量の検出）する方法や、５−アミノレブリン酸若しくはその誘導体、又はこれらの塩（ＡＬＡ類）を投与した被検体から採取した尿から細胞を分離し、分離した細胞における蛍光を検出する方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の尿路上皮がんの検出方法には、検出のためのデータを収集する方法も含まれる。また、本発明の尿路上皮がん検出剤としては、上記本発明の方法に用いる、ＡＬＡ類を含有するものであれば特に制限されるものではない。また、本発明の検出の対象となる尿路上皮がんとは、尿路（腎臓，腎盂，尿管，膀胱，尿道）の内腔を覆っている移行上皮から発生する悪性腫瘍をいう。また、本発明の被検体とは、ヒトを含む哺乳動物をいい、具体的には、問診等の診察により尿路上皮がんを疑われたヒトを例示することができる。
【００１３】
ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡの誘導体としては、ＡＬＡのエステル基とアシル基を有するものを挙げることができ、好ましくはメチルエステル基とホルミル基、メチルエステル基とアセチル基、メチルエステル基とｎ−プロパノイル基、メチルエステル基とｎ−ブタノイル基、エチルエステル基とホルミル基、エチルエステル基とアセチル基、エチルエステル基とｎ−プロパノイル基、エチルエステル基とｎ−ブタノイル基の組み合わせを例示することができる。
【００１４】
ＡＬＡ類のうち、ＡＬＡ又はその誘導体の塩としては、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、トルエンスルホン酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、メタンスルホン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩、及びナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等を例示することができる。なお、これらの塩は使用時において溶液として用いられ、その作用はＡＬＡ及びその誘導体と同一である。
【００１５】
これらのＡＬＡ類の中でも、５−アミノレブリン酸や、５−アミノレブリン酸のメチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、ブチルエステル、ペンチルエステルや、これらの塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩が好ましい。以上のＡＬＡ類は、水和物又は溶媒和物を形成していてもよく、またいずれかを単独で又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。
【００１６】
これらＡＬＡ類は、化学合成、微生物による生産、酵素による生産のいずれの方法によっても製造することができ、微生物や酵素により生産した場合は、特に不都合な阻害物を含まない限り精製せずにそのまま用いることができる。
【００１７】
これらＡＬＡ類の被検体に対する投与量としては、ＡＬＡ塩酸塩換算で被検体１ｋｇあたり、例えば０．０２〜５０ｍｇであり、０．０５〜２０ｍｇであることが好ましく、０．２〜１０ｍｇであることがより好ましく、５〜１０ｍｇであることがさらに好ましい。
【００１８】
本発明の尿路上皮がんの検出方法におけるＡＬＡ類の投与方法としては、舌下投与を含む経口投与、点滴を含む静脈注射、発布剤等による経皮投与剤、座薬、点滴等を例示することができ、患者の負担軽減や蛍光の感度向上の観点から、経口投与が好ましい。
【００１９】
上記ＡＬＡ類を含む本発明の尿路上皮がん検出剤は、必要に応じて、他の薬効成分、栄養剤、担体等、他の成分を含有していてもよい。本発明の検出剤に配合できる担体としては、摂取するために適した有機又は無機の固体又は液体の、通常は不活性な製薬学的に許容できる担体材料が挙げられ、具体的には、例えば、結晶性セルロース、ゼラチン、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物性及び動物性脂肪、油脂、ガム、ポリアルキレングリコールを例示することができる。経口投与剤の剤型としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液等を挙げることができ、これらは溶剤、分散媒、増量剤、賦形剤等を適宜用いて常法に従って製造することができる。なお、本発明の検出剤を水溶液として調製する場合、ＡＬＡ類の分解を防ぐため、水溶液がアルカリ性とならないように調製することが好ましく、アルカリ性となる場合には、酸素を除去することによって分解を防ぐことができる。
【００２０】
本発明の尿路上皮がんの検出方法は、ＡＬＡ類（本発明の検出剤）を投与した後に尿を採取し、採取した尿中の細胞における蛍光の有無や蛍光量を蛍光顕微鏡等で検出することにより、尿路上皮がんを検出することができる。また、採取した尿にさらにＡＬＡ類を添加し、必要に応じて所定時間放置して、蛍光の有無や蛍光量を検出することにより、さらに感度を向上することができる。本発明の尿路上皮がんの検出方法では、蛍光の存在をもとに尿路上皮がんの検出（判定）を機械的に行うことができるので、医師等の特別な知識をもたない者でも容易に検出を行うことができ、また、装置を用いて検出を行うこともできる。
【００２１】
尿の採取は、ＡＬＡ類（本発明の検出剤）投与後に初めて排出される尿であることが好ましく、１時間以降１２時間以内に行うことがより好ましく、２時間以降１２時間以内に行うことがさらに好ましい。なお、尿の摂取方法は、自然排尿でもカテーテルによる摂取でもその手法を問わない。
【００２２】
細胞における蛍光の検出に際しては、通常の細胞診断同様、尿から遠心分離や濾過にて細胞を分離して行う。蛍光の検出時には、ソーレーバンドに匹敵する紫外線から紫−青の可視光線を含む励起光を照射し、発生する蛍光を蛍光顕微鏡等で検出する。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。【００２４】
［実施例１］
ＡＬＡ塩酸塩１ｇを５０ｍｌのオレンジジュースに溶解し、膀胱癌の疑いのある患者（体重約６０ｋｇ）に内服させた。約４時間後に採尿し、遮光状態ですぐに遠心（３０００回転／分×１５分）して、沈渣を用いて検鏡した。その結果を図１に示す。なお、顕微鏡は、OLYMPUS BX50CCDに、カメラOLYMPUS DP70がセットされたもので、ミラーセットはいずれもOMEGA OPTICAL社製で、Exciter: XF1076 400AF30 Dichroic：XF2007 475DCLP、Emitter: XF3090 585ALP、いずれも標準的な蛍光顕微鏡のシステムである。【００２５】
図１から明らかなように、明瞭ながん細胞由来のＰＰＩＸ蛍光が見られた。また、同細胞について通常の病理診断を行ったところがん細胞であることが示された。
以上より、本発明の方法によれば、従来のように膀胱内の観察を行うことなく、尿中の細胞の蛍光を検出することにより、尿路上皮がんの検出を行うことができることが明らかとなった。ＡＬＡ類を経口投与する場合、ＡＬＡ類は血液からがん患部に供給されることから、がん患部のみならずがん患部から剥離したがん細胞にまでＡＬＡ類に由来するＰＰＩＸが蓄積しているとは従来考えられなかったが、実際には、がん患部から剥離した尿中のがん細胞にもＡＬＡ類に由来するＰＰＩＸが蓄積しており、尿中の細胞の蛍光を検出することにより、尿路上皮がんを検出できるという予想外の結果を得た。【００２６】
［実施例２］
投与量を実施例１の半量である５００ｍｇとする以外は実施例１と同様に検出法を実施した。その結果、図２の写真を得た。また、同細胞について通常の病理診断を行ったところがん細胞であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明の尿路上皮がんの検出方法は、患者への負担も少なく、非常に迅速かつ簡易に正確な検出を行うことができ、また、ＡＬＡ類の投与量が従来の半量で十分であるので、経済的なメリットはもちろん、まれに見られる嘔吐や肝機能障害、光過敏などの危険性を実質的に排除することができることから、尿路上皮がんの早期発見に貢献する画期的な方法といえる。
【図１】
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【図２】
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