(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうかの検出を補助する方法であって、前記対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物サインの発現レベルを測定する工程を含み、ここで、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物サインの発現レベルに対する前記試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルサインの変化は、前記対象が膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）を有するか、又はそれを発症する危険性があることの指標であり、
ここで当該ｍｉＲ遺伝子産物サインは、
コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ−１０３遺伝子産物の発現レベルに対する前記試験サンプル中のｍｉＲ−１０３遺伝子産物の発現レベルの増加、
コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ−１０７遺伝子産物の発現レベルに対する前記試験サンプル中のｍｉＲ−１０７遺伝子産物の発現レベルの増加、及び
コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ−１５５遺伝子産物の発現レベルに対する前記試験サンプル中のｍｉＲ−１５５遺伝子産物の発現レベルの減少、
を含む、
前記方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲ遺伝子産物サインが、さらに、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１８１ｂ−２、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−９２−１、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−７−１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−１３５ａ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−３ｐ２１−ｖ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−７−３、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３６７、ｍｉＲ−３０ｃ−２、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１３３ａ−１、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９４−１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される少なくとも１種類の追加のｍｉＲ遺伝子産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲ遺伝子産物サインが、さらに、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−３４２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される少なくとも１種類の追加のｍｉＲ遺伝子産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｉＲ遺伝子産物サインが、さらに、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される少なくとも１種類の追加のｍｉＲ遺伝子産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
膵臓癌を有する対象の予後の検出を補助する方法であって、前記対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを測定する工程を含み、ここで：
前記ｍｉＲ遺伝子産物が膵臓癌の予後不良と関連しており、ここで膵臓癌は少なくとも内分泌癌（ＰＥＴ）を含み、そして当該ｍｉＲ遺伝子産物は少なくともｍｉＲ−２１である；及び、
コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルに対する前記試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルの増加は、予後不良の指標である、前記方法。
【請求項６】
膵臓癌が、肝臓転移及び／又は高い増殖指数を伴う、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象が有する膵臓癌が対象の肝臓に対して転移性かどうかの検出を補助する方法であって、前記対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ−２１遺伝子産物の発現レベルを測定する工程を含み、ここで：
前記ｍｉＲ−２１遺伝子産物が肝臓転移性と関連しており；そして、
コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ−２１遺伝子産物の発現レベルに対する前記試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ−２１遺伝子産物の発現レベルの増加は、肝臓転移性の指標である、
前記方法。
【請求項８】
対象が有する膵臓癌の増殖指数が高いかどうかの検出を補助する方法であって、前記対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ−２１遺伝子産物の発現レベルを測定する工程を含み、ここで：
前記ｍｉＲ−２１遺伝子産物が高い増殖指数と関連しており；そして、
コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ−２１遺伝子産物の発現レベルに対する前記試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ−２１遺伝子産物の発現レベルの増加は、増殖指数が高いことの指標である、
前記方法。
【請求項９】
さらに、膵臓癌を有する対象の予後の検出を補助することを含み、当該検出は、前記対象からの試験サンプル中のＰＤＣＤ４の発現レベルを測定する工程を含む、そしてここで、コントロールサンプル中の対応するＰＤＣＤ４の発現レベルに対する前記試験サンプル中のＰＤＣＤ４の発現レベルの減少は、予後不良の指標である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
膵臓癌が転移及び／又は高い増殖指数を伴う、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここにおいて、対象が膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうかの検出を補助する方法は：
（１）前記対象から採取した試験サンプルからのＲＮＡを逆転写して１式の標的オリゴデオキシヌクレオチドを得る工程と；
（２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイにハイブリダイズし、前記試験サンプルのｍｉＲ遺伝子産物サインのハイブリダイゼーションプロファイルを得る工程と；
（３）前記試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルから作製されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する工程と、
を含み、
ここで、少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのハイブリダイゼーションプロファイルから得られたシグナルの変化は、対象が膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうかの指標である、前記方法。
【請求項１２】
前記マイクロアレイが、ｍｉＲ−１０３−２、ｍｉＲ−１０３−１、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−１００、 ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３６８、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−２６ａ−２、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１７、ｍｉＲ−９９ｂ、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１８１ｂ−２、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−９２−１、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−７−１、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−１３５ａ−２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−３ｐ２１−ｖ、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ−１、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−７−３、ｍｉＲ−２９ｃ、ｍｉＲ−３６７、ｍｉＲ−３０ｃ−２、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２０、ｍｉＲ−１２９−１、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−３０ｃ−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ｅ、ｍｉＲ−１２９−２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１３３ａ−１、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１９４−１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される１又は２種類以上の追加のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５に記載の方法であって、ここにおいて、対象が予後不良の膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうかの検出を補助する方法は：
（１）前記対象から採取した試験サンプルからのＲＮＡを逆転写して１式の標的オリゴデオキシヌクレオチドを得る工程と；
（２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイにハイブリダイズし、前記試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを得る工程と；
（３）前記試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルから作製されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する工程と、
を含み、
ここで、ハイブリダイゼーションプロファイルから得られたシグナルの変化は、対象が予後不良の膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があることの指標であり、
ここでｍｉＲ−２１のシグナルにおける変化は、対象が予後不良の膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があることの指標であり、
そして、ここで当該膵臓癌は少なくとも内分泌癌（ＰＥＴ）を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、その全体又は一部に関して、国立癌研究所からのプログラムプロジェクト助成金（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｒａｎｔｓ）、Ｐ０１ＣＡ７６２５９及びＰ０１ＣＡ８１５３４により支援を受けた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
膵臓癌は、癌が発見された膵臓内の場所、又は、癌が発生した細胞の種類に従って分類することができる。膵臓癌は、膵頭部、膵体部、又は膵尾部で発生することができ、その症状は、膵臓内のどこに腫瘍が位置するかによって異なる場合がある。７０乃至８０％の膵臓癌が膵頭部で発生する。大部分の膵臓癌が外分泌系であり、この膵外分泌癌の９０％超は腺癌である。そしてこのほとんどすべてが、膵管の内面を形成する細胞で癌が発生する管腺癌である。さらに、嚢胞性腫瘍、腺房細胞癌、及び肉腫などのより稀な種類の膵外分泌癌もある。嚢胞性腫瘍は、膵臓内に嚢腫又は内部に液体を貯留した嚢を生ずる腫瘍である。膵臓の細胞を互いに繋いでいる連結組織の癌である肉腫は稀な癌であり、子供に発生することが最も多い。
【０００３】
外分泌癌に加えて、内分泌系の膵臓癌も発生することがある。内分泌系癌は、例えば、ガストリノーマ（ガストリンを産生）、インスリノーマ（インスリンを産生）、ソマトスタチノーマ（ソマトスタチンを産生）、ビポーマ（ＶＩＰを産生）、及びグルカゴノーマ（グルカゴンを産生）など、癌が産生するホルモンに基づいて名付けることができる。さらに、稀ではあるが、膵臓のリンパ腫が発生することもある。
【０００４】
膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）は、散発的に、又は、多発性内分泌腫瘍症１型（ＭＥＮ１）症候群（Ｋｌｏｐｐｅｌ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１４：１３‐２７（２００４））の一部として発生する場合がある。このような腫瘍は、ホルモンの過剰分泌による症状の存在に従って、臨床的に、機能性（Ｆ‐ＰＥＴ）又は非機能性（ＮＦ‐ＰＥＴ）に分類される。Ｆ‐ＰＥＴは主にインスリノーマに代表される。診断において、転移性疾患が見られるのはインスリノーマのわずかに１０％であるが、ＮＦ‐ＰＥＴでは最大でその６０％であり、ＰＥＴ関連の死亡のほとんどは肝臓転移によるものである（Ｋｌｏｐｐｅｌ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１４：１３‐２７（２００４））。ＰＥＴの悪性度は非常に様々なものがあり、組織学的な外見から推定することはできない。実際、大多数のＰＥＴは高分化型内分泌腫瘍（ＷＤＥＴ）であり、浸潤又は転移が確認された場合にのみ、高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）と定義される（Ｋｌｏｐｐｅｌ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１４：１３‐２７（２００４））。
【０００５】
膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）は、３分の１のケースでの神経内分泌マーカーの発現及び混合型腺房‐内分泌癌（ｍｉｘｅｄ  ａｃｉｎａｒ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）の存在の両方の点においてＰＥＴと重なる部分は見られるものの、管腺癌やＰＥＴとは異なる極めて稀な腫瘍種である（Ｏｈｉｋｅ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．４４５：２３１‐３５（２００４））。ＰＡＣＣはすべて悪性で、生存期間中央値は１８ヶ月であり、これは、膵管腺癌と内分泌腫瘍（各々６ヶ月と４０ヶ月）の間に位置する値である（Ｈｏｌｅｎ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０：４６７３‐７８（２００２））。
【０００６】
ＰＥＴの分子的な病変形成についてはほとんど分かっていない（Ｋｌｏｐｐｅｌ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１４：１３‐２７（２００４））。ＭＥＮ１遺伝子の不活性化が、散発性のＰＥＴでもっとも頻繁に確認される遺伝子上の現象であり、一方、膵腺癌に通常見られる遺伝子の突然変異は稀である（Ｐｅｒｒｅｎ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１４：１９９‐２０８（２００４））。ＰＡＣＣの分子的な異常に関してはさらに分かっていない（Ａｂｒａｈａｍ，  Ｓ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：９５３‐６２  （２００２））。入手可能なＰＡＣＣの遺伝子発現プロファイルに関するデータはなく、ＰＥＴで発生する遺伝子発現の変化に関する我々の理解は、まだ初期の段階である（Ｈａｎｓｅｌ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：６１５２‐５８（２００４））。
【０００７】
マイクロＲＮＡは低分子（２０乃至２４ヌクレオチド）のコードしないＲＮＡ遺伝子産物であり、細胞の増殖、アポトーシス、及び発生タイミングなどの多くの生物的プロセスにおいて重要な役割を担っている。これらの作用を行なうために、マイクロＲＮＡは、標的であるｍＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率の負の制御を行なう（Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３１：３５０‐５５（２００４））。現在、３１３種類の異なる成熟ヒトマイクロＲＮＡが知られており、そのうちの２２３種類は実験によってヒトの内部で確認された（ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）。最近の研究により、神経障害（Ｉｓｈｉｚｕｋａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２４９７‐２５０８（２００２））や癌などのヒト疾患には特定のｍｉＲＮＡの異常発現が関与している可能性のあることが示唆されている。詳細には、ｍｉＲ‐１６‐１及び／又はｍｉＲ‐１５ａの異所性発現がヒト慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）で見られた（Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１５５２４‐１５５２９（２００２））。マイクロＲＮＡの異常発現は癌と関連付けられており、特定の種類の癌の診断／予後特性をそのマイクロＲＮＡプロファイルに基づいて区別することができる（Ｃａｌｄａｓ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｂｒｅｎｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１：７１２‐１４（２００５）；Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ，Ｃｅｌｌ  １２２：６‐７（２００５））。機能的な面からの研究においても、マイクロＲＮＡの異常発現と発癌性が関連付けられた（Ｃｈａｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：６０２９‐３３（２００５）；Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：１２９０‐９７（２００５）；Ｈｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８２８‐３３（２００５）；ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２０：６３５‐４７（２００５））。
【０００８】
既知のすべてのヒトマイクロＲＮＡを含むマイクロアレイの開発及び使用により、サンプル中の全てのｍｉＲＮＡの発現の同時分析が可能となった（Ｌｉｕ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：９７４０‐９７４４（２００４））。このようなマイクロＲＮＡマイクロアレイは、ｍｉＲ‐１６‐１がヒトＣＬＬ細胞中で調節解除されることの確認のためだけでなく、詳細に解明されているヒトＣＬＬの臨床病理学的特徴と関連するｍｉＲＮＡ発現サインの作製にも使用されてきた（Ｃａｌｉｎ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１１７５‐１１７６０（２００４））。
【０００９】
膵臓癌細胞中で異って発現されるマイクロＲＮＡを識別することにより、膵臓癌（例：膵内分泌腫瘍、腺房癌）に関与するｍｉＲＮＡを具体的に特定するための手助けとすることができる。さらに、これらのｍｉＲＮＡの推定標的を識別することにより、その病原体としての役割を解明する手助けとすることができる。本発明は、膵臓癌の診断、予後、及び治療のための新規な方法並びに組成物を提供する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、部分的には、膵臓癌細胞中で発現レベルの変化を伴う特定のｍｉＲＮＡの識別に基づく。
【００１１】
従って、本発明は、対象が膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法を包含する。本発明の方法によると、対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、対象が膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があるかが示される。
【００１２】
一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０７、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐３４２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００１３】
一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１５５である。
【００１４】
一つの態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１５５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３であり、これは試験サンプル中において、コントロールサンプルと比較して、上方制御される。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０７であり、これは試験サンプル中において、コントロールサンプルと比較して、上方制御される。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１５５であり、これは試験サンプル中において、コントロールサンプルと比較して、下方制御される。特別の態様において、これら３種類すべてのｍｉＲ（ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０７、及びｍｉＲ‐１５５）が、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲと比較される。
【００１５】
一つの態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）である。別の態様では、診断される膵臓癌は、膵外分泌腫瘍（例：腺癌）である。さらに別の態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）及び膵外分泌腫瘍（例：腺癌）から成る群より選択される。特別の態様では、診断される膵臓癌は、腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）及びインスリノーマから成る群より選択される。さらに別の態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）、膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）、及びインスリノーマから成る群より選択される。さらに別の態様では、診断方法を用いて、いかなる種類の膵臓癌も診断することができる。
【００１６】
一つの態様では、本発明は、対象が膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）を有しているか、又はそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、対象がＰＡＣＣを有するか、又はそれを発症する危険性があることが示される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐２１、 ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐２１５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１９‐１、ｍｉＲ‐２４２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。さらに別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１８‐２、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐１３８‐２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００１７】
一つの態様では、本発明は、対象が有する膵臓癌の種類を診断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、膵臓癌の種類が示される。
【００１８】
一つの態様では、診断される膵臓癌の種類は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）及び膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）から成る群より選択される。別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、膵臓癌の種類は膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）であり、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。さらに別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。さらに別の態様では、膵臓癌の種類は膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）であり、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００１９】
一つの態様では、診断される膵臓癌の種類は、高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）及び膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）から成る群より選択される。別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。さらに別の態様では、膵臓癌の種類は高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）であり、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１３２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。さらに別の態様では、膵臓癌の種類は高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）であり、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１４８ａである。
【００２０】
一つの態様では、診断される膵臓癌の種類は、インスリノーマ及び非機能性膵内分泌腫瘍（ＮＦ‐ＰＥＴ）から成る群より選択される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、膵臓癌の種類はインスリノーマであり、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２０４、ｍｉＲ‐２０３、ｍｉＲ‐２１１、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００２１】
一つの態様では、本発明は、膵臓癌を有する対象の予後を判断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル（例：膵臓癌サンプル）中における、膵臓癌の予後不良と関連付けられる少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、予後不良が示される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、測定される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１である。さらに別の態様では、膵臓癌は、転移及び／又は高い増殖指数を伴う。
【００２２】
一つの態様では、本発明は、対象が有する膵臓癌が転移性かどうかを判断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル（例：膵臓癌サンプル）中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、転移性が示される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１である。
【００２３】
一つの態様では、本発明は、対象が有する膵臓癌の増殖指数が高いかどうかを判断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル（例：膵臓癌サンプル）中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、増殖指数が高いことが示される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１である。
【００２４】
一つの態様では、本発明は、膵臓癌を有する対象の予後を判断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル（例：膵臓癌サンプル）中のＰＤＣＤ４のレベルを測定する。コントロールサンプル中のＰＤＣＤ４のレベルに対する試験サンプル中のＰＤＣＤ４のレベルの変化（例：上昇、低下）により、予後不良が示される。一つの態様では、試験サンプル中のＰＤＣＤ４のレベルは、コントロールサンプル中のＰＤＣＤ４のレベルよりも低い。別の態様では、膵臓癌は、転移及び／又は高い増殖指数を伴う。
【００２５】
少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、当業者に公知の様々な技術を用いて測定することができる（例：定量的若しくは半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーションによる検出）。特別の態様において、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの測定は、対象から採取した試験サンプルのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチド１式を作製し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドを１又は２種類以上のｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例：ｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイ）とハイブリダイズして試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを作製し、そして、この試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルから作製されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することによって行なう。コントロールサンプルに対する試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルの変化により、対象が膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があることが示される。一つの態様では、少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルは、コントロールサンプルから得られるシグナルに比べて、上方制御される。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルは、コントロールサンプルから得られるシグナルに比べて、下方制御される。特別の態様では、マイクロアレイは、既知のすべてのヒトｍｉＲＮＡの大部分に対するｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む。さらなる態様では、マイクロアレイは、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１��４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される１又は２種類以上のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００２６】
本発明は、さらに、対象が予後不良である膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法も提供する。本方法では、膵臓癌の予後不良と関連する少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物レベルを、対象から採取した試験サンプルのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチド１式を作製することによって測定する。次に、その標的オリゴデオキシヌクレオチドを、１又は２種類以上のｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例：ｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイ）とハイブリダイズして試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを作製し、この試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルから作製されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。コントロールサンプルに対する試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルの変化により、対象が予後不良である膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があることが示される。一つの態様では、ｍｉＲ‐２１のシグナルの変化により、対象が予後不良である膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があることが示される。
【００２７】
本発明は対象中の膵臓癌を治療する方法も包含し、ここで少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物が対象の癌細胞中で調節解除（例：下方制御、上方制御）される。少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が膵臓癌細胞中で下方制御される場合、本方法は効果量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又は単離されたその変異体若しくは生物活性断片を投与することを含み、それによって対象中の癌細胞の増殖を阻害する。一つの態様では、対象に投与される少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせ（又は、これらのｍｉＲの１種類以上の単離された変異体若しくは生物活性断片）から成る群より選択される。少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞中で上方制御される場合、本方法は、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する少なくとも１種類の化合物を効果量対象に投与することを含み、それによって膵臓癌細胞の増殖を阻害する。一つの態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する化合物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択されるｍｉＲ遺伝子産物を阻害する。
【００２８】
関連する態様では、対象の膵臓癌を治療する方法は、さらに、まず対象からの膵臓癌細胞中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定し、そのｍｉＲ遺伝子産物のレベルをコントロール細胞中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する工程も含む。もしｍｉＲ遺伝子産物の発現が膵臓癌細胞中で調節解除（例：下方制御、上方制御）される場合は、本方法は、膵臓癌細胞中で発現される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の量を変化させることをさらに含む。一つの態様では、癌細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量がコントロール細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量よりも少なく、効果量のｍｉＲ遺伝子産物、又は単離されたその変異体若しくは生物活性断片を対象へ投与する。別の態様では、癌細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量がコントロール細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量よりも多く、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する少なくとも１種類の化合物を、効果量対象へ投与する。適切なｍｉＲ及びｍｉＲ遺伝子の発現を阻害する化合物としては、例えば、本明細書で述べるものが挙げられる。
【００２９】
本発明はさらに、膵臓癌を治療するための医薬組成物を提供する。一つの態様では、医薬組成物は、少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又は単離されたその変異体若しくは生物活性断片、及び薬理学的に許容される担体を含む。特別の態様では、この少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、適切なコントロール細胞と比べて膵臓癌細胞中での発現レベルが低下した（すなわち、下方制御された）ｍｉＲ遺伝子産物に対応する。特定の態様では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００３０】
別の態様では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種類のｍｉＲ発現阻害化合物及び薬理学的に許容される担体を含む。特別の態様では、この少なくとも１種類のｍｉＲ発現阻害化合物は、コントロール細胞中よりも膵臓癌細胞中における発現の方が高い（すなわち、上方制御される）ｍｉＲ遺伝子産物に特異的である。特定の態様では、ｍｉＲ発現阻害化合物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される１又は２種類以上のｍｉＲ遺伝子産物に特異的である。
【００３１】
本発明はさらに、膵臓癌の抗癌剤を識別する方法も包含し、その方法は、試験薬剤を細胞へ提供すること、及び、その細胞中における少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。一つの態様では、その方法は、試験薬剤を細胞へ提供すること、及び、膵臓癌細胞中での発現レベルの低下を伴う少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適切なコントロール細胞と比べたその細胞内でのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの上昇により、その試験薬剤が膵臓癌の抗癌剤であることが示される。特別の態様では、膵臓癌細胞中での発現レベルの低下を伴う少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００３２】
他の態様では、この方法は、試験薬剤を細胞へ提供すること、及び、膵臓癌細胞中での発現レベルの上昇を伴う少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適切なコントロール細胞と比べたその細胞内における膵臓癌中で発現レベルの上昇を伴うそのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの低下により、その試験薬剤が膵臓癌の抗癌剤であることが示される。特別の態様では、膵臓癌細胞中での発現レベルの上昇を伴う少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、部分的には、膵臓癌細胞中の発現が正常なコントロール細胞に比べて変化する特定のマイクロＲＮＡの識別、並びに、これらのマイクロＲＮＡと特定の診断、予後、及び治療上の特徴との関連性に基づいている。本明細書で述べるように：
【００３４】
ｉ）共通するマイクロＲＮＡの発現パターンによって、膵腫瘍種が正常な膵臓と区別され、それにより特定のマイクロＲＮＡの膵腫瘍形成への関与が示唆され；
ｉｉ）ｍｉＲ‐１５５の発現の欠如を伴うｍｉＲ‐１０３及びｍｉＲ‐１０７の発現によって、膵腫瘍が正常な膵臓と区別され；
ｉｉｉ）少なくとも１０種類のマイクロＲＮＡによって、内分泌腫瘍が腺房腫瘍と区別され、このことは、内分泌分化及び／又は内分泌腫瘍形成での特定のマイクロＲＮＡの関与を示唆し；
ｉｖ）ｍｉＲ‐２０４は主にインスリノーマで発現され、インスリンの免疫組織化学的発現と相関があり、そして；
ｖ）ｍｉＲ‐２１の過剰発現は、Ｋｉ６７の高い増殖指数及び肝臓転移の存在と強い関連性を示す。
【００３５】
これらの結果は、マイクロＲＮＡの発現の変化が、内分泌及び腺房腫瘍性形質転換、並びに悪性腫瘍の進行と関連していることを示している。従って、特定のマイクロＲＮＡの発現、並びにそのようなマイクロＲＮＡの発現の変化を、本明細書で述べる診断、予後、及び治療の方法に用いることができる。
【００３６】
本明細書で区別なく用いる「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、又は「ｍｉＲＮＡ」とは、プロセッシングを受けていないか若しくは受けた、ｍｉＲ遺伝子からのＲＮＡ転写物を意味する。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質へ翻訳されないため、「ｍｉＲ遺伝子産物」という用語にタンパク質は含まない。プロセッシングを受けていないｍｉＲ遺伝子転写物は、「ｍｉＲ前駆体」とも称され、通常、長さが約７０乃至１００ヌクレオチドのＲＮＡ転写物を含む。ｍｉＲ前駆体は、ＲＮＡｓｅ（例えば、ダイサー、アルゴノート、ＲＮＡｓｅＩＩＩ（例：大腸菌ＲＮＡｓｅＩＩＩ））による分解によってプロセッシングされ、１９乃至２５ヌクレオチドの活性なＲＮＡ分子となることができる。この１９乃至２５ヌクレオチドの活性なＲＮＡ分子は、「プロセッシングされた」ｍｉＲ遺伝子産物、又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも称される。
【００３７】
１９乃至２５ヌクレオチドの活性なＲＮＡ分子は、天然のプロセッシング経路（例：インタクトな細胞若しくは細胞ライセートを用いて）、又は合成的なプロセッシング経路（例：単離されたダイサー、アルゴノート、若しくはＲＮＡｓｅＩＩＩなどの単離されたプロセッシング酵素を用いて）によってｍｉＲ前駆体から得ることができる。この１９乃至２５ヌクレオチドの活性なＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体のプロセッシングを経なくとも、生物又は化学合成によって直接作製することもできる。本明細書においてマイクロＲＮＡを名称で表す場合、特にことわりのない限り、その名称は前駆体及び成熟体の両方に対応する。
【００３８】
本発明は、対象が膵臓癌を有しているか、又はそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法を包含し、その方法は、対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定し、試験サンプル中のそのｍｉＲ遺伝子産物のレベルをコントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することを含む。本明細書で用いる「対象」とは、膵臓癌を有するか、又は有すると疑われるいかなる哺乳類でもよい。好ましい態様では、対象は、膵臓癌を有するか、又は有すると疑われるヒトである。
【００３９】
膵臓癌は、例えば組織学的に異なる膵臓癌（例：外分泌腫瘍、内分泌腫瘍、癌、リンパ腫）など、いかなる形態の膵臓癌であってもよい。一つの態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）である。別の態様では、診断される膵臓癌は、膵外分泌腫瘍（例：腺癌）である。さらに別の態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）及び膵外分泌腫瘍（例：腺癌）から成る群より選択される。特別の態様では、診断される膵臓癌は、腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）及びインスリノーマから成る群より選択される。さらに別の態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）、膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）、及びインスリノーマから成る群より選択される。さらに、本明細書で述べるように、膵臓癌は特定の予後を伴う場合がある（例：低い生存率、早い進行）。
【００４０】
表１ａ及び１ｂは、特定のヒトマイクロＲＮＡの前駆体及び成熟体のヌクレオチド配列を示す。
【００４１】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【００４２】
【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【００４３】
少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、対象から採取した生物サンプルの細胞中で測定することができる。例えば、膵臓癌を有することが疑われる対象から従来の生検技術によって組織サンプルを採取することができる。別の態様では、対象から血液サンプルを採取し、標準的な技術により、ＤＮＡ抽出のための白血球を単離することができる。血液又は組織サンプルは、放射線療法、化学療法、又はその他の治療処置を開始する前に対象から採取することが好ましい。対応する組織若しくは血液のコントロールサンプル、又はコントロール対照サンプルは、対象の影響を受けていない組織から、正常なヒトの個体若しくは個体の集団から、又は対象のサンプル中の大部分の細胞に対応する培養細胞から採取することができる。組織又は血液のコントロールサンプルは、次に、対象からのサンプルと共に処理され、対象のサンプルからの細胞中の任意のｍｉＲ遺伝子により産生されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、コントロールサンプルの細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができる。別の選択肢として、対照サンプルを試験サンプルとは別に（例：異なる時間に）採取、処理し、試験サンプルからの細胞中の任意のｍｉＲ遺伝子により産生されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対照サンプルからの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができる。
【００４４】
一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「上方制御」される）。本明細書で用いるｍｉＲ遺伝子産物の発現が「上方制御」されるとは、対象からの細胞又は組織サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物の量が細胞又は組織のコントロールサンプル中の同じ遺伝子産物の量よりも多い場合に用いる。別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「下方制御」される）。本明細書で用いるｍｉＲ遺伝子の発現が「下方制御」されるとは、対象からの細胞又は組織サンプル中のその遺伝子から産生されるｍｉＲ遺伝子産物の量が細胞又は組織のコントロールサンプル中の同じ遺伝子から産生される量よりも少ない場合に用いる。コントロール及び正常サンプル中の相対的ｍｉＲ遺伝子発現は、１又は２種類以上のＲＮＡ発現標準に対して求めることができる。この標準は、例えば、ゼロであるｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準細胞系列内でのｍｉＲ遺伝子発現レベル、影響を受けていない対象の組織中でのｍｉＲ遺伝子発現レベル、又はコントロールとしての正常なヒトの集団に対して過去に得られたｍｉＲ遺伝子発現レベルの平均、を含むことができる。
【００４５】
対象から採取したサンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する変化（すなわち、上昇若しくは低下）により、対象中での膵臓癌の存在が示される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。膵臓癌中で正常膵臓組織中よりも発現レベルが高いｍｉＲ遺伝子産物は本明細書に記載している（例えば、実施例を参照）。一つの態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０７、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐３４２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００４６】
一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。膵臓癌中で正常膵臓組織中よりも発現レベルが低いｍｉＲ遺伝子産物は本明細書に記載している（例えば、実施例を参照）。一つの態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、 ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１５５である。
【００４７】
一つの態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１５５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐１０３であり、これは、コントロールサンプルに比べて試験サンプル中で上方制御される。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐１０７であり、これは、コントロールサンプルに比べて試験サンプル中で上方制御される。さらに別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ‐１５５であり、これは、コントロールサンプルに比べて試験サンプル中で下方制御される。特別の態様では、この３つのｍｉＲ（ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０７、及びｍｉＲ‐１５５）すべてをコントロールサンプル中の対応するｍｉＲと比較する。本明細書で述べ、例示するように、ｍｉＲ‐１５５の発現の欠如を伴うｍｉＲ‐１０３及びｍｉＲ‐１０７の発現により、膵腫瘍が正常膵臓から区別される。
【００４８】
一つの態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）である。別の態様では、診断される膵臓癌は、膵外分泌腫瘍（例：腺癌）である。さらに別の態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）及び膵外分泌腫瘍（例：腺癌）から成る群より選択される。特別の態様では、診断される膵臓癌は、腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）及びインスリノーマから成る群より選択される。さらに別の態様では、診断される膵臓癌は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）、膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）、及びインスリノーマから成る群より選択される。さらに別の態様では、診断方法を用いて、いかなる種類の膵臓癌も診断することができる。
【００４９】
一つの態様では、本発明は、対象が膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）を有しているか、又はそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、対象がＰＡＣＣを有するか、又はそれを発症する危険性があることが示される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、上方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐２１、 ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐２１５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１９‐１、ｍｉＲ‐２４２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。さらに別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。さらに別の態様では、下方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１８‐２、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐１３８‐２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。
【００５０】
一つの態様では、本発明は、対象が有する膵臓癌の種類を診断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化  （例：上昇、低下）により、膵臓癌の種類が示される。
【００５１】
特別の態様では、診断される膵臓癌の種類は、膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）及び膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）から成る群より選択される。別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、膵臓癌の種類は膵内分泌腫瘍（ＰＥＴ）であり、上方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。さらに別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。さらに別の態様では、膵臓癌の種類は膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）であり、下方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。本明細書で述べるように、特定のｍｉＲ遺伝子産物の発現により、ＰＥＴとＰＡＣＣとを区別することができる（例えば、実施例参照）。
【００５２】
一つの態様では、診断される膵臓癌の種類は、高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）及び膵腺房細胞癌（ＰＡＣＣ）から成る群より選択される。別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。さらに別の態様では、膵臓癌の種類は高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）であり、上方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１３２、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。別の態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。さらに別の態様では、膵臓癌の種類は高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）であり、下方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１４８ａである。本明細書で述べるように、特定のｍｉＲ遺伝子産物の発現により、ＷＤＥＣとＰＡＣＣとを区別することができる（例えば、実施例参照）。
【００５３】
一つの態様では、診断される膵臓癌の種類は、インスリノーマ及び非機能性膵内分泌腫瘍（ＮＦ‐ＰＥＴ）から成る群より選択される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、膵臓癌の種類はインスリノーマであり、上方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２０４、ｍｉＲ‐２０３、ｍｉＲ‐２１１、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。本明細書で述べるように、特定のｍｉＲ遺伝子産物の発現により、ＷＤＥＣとＰＡＣＣとを区別することができる（例えば、実施例参照）。
【００５４】
本発明は、膵臓癌を有する対象の予後を判断する方法も提供する。本方法では、対象からの試験サンプル中における、膵臓癌の特定の予後（良好な、若しくは前向きな予後、悪い、若しくは不良の予後）と関連付けられる少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、対象が特定の予後の膵臓癌を有することが示される。一つの態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、不良な（すなわち、悪い）予後と関連している。不良な予後の例としては、低い生存率及び早い疾患の進行が挙げられるが、これらに限定されない。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、上方制御され、測定される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１である。さらに別の態様では、膵臓癌は、転移及び／又は高い増殖指数を伴う。本明細書で述べるように、膵臓癌における予後不良と関連付けられる特定のｍｉＲ遺伝子産物の発現により、対象の膵臓癌の予後を判定することができる（例えば、実施例参照）。特定の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの測定は、対象から採取した試験サンプルからのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチド１式を作製し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズして試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを作製し、この試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルから作製されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することによって行なう。
【００５５】
一つの態様では、本発明は対象の膵臓癌が転移性であるかどうかを判断する方法である。本明細書で述べるように、ほとんどのＰＥＴ関連の死亡は肝臓転移が原因である。従って、転移性膵臓癌の識別は、適切な治療方法を決定する際の手助けとすることができる。本方法では、対象からの試験サンプル中（例：膵臓癌サンプル）の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、転移性が示される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、上方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１である。
【００５６】
一つの態様では、本発明は対象の膵臓癌が高い増殖指数を有するかどうかを判断する方法である。公知のように、高い増殖指数を有する膵臓癌は予後不良をもたらすため、高い増殖指数を有する膵臓癌の識別も、適切な治療方法を決定する際の手助けとすることができる。本方法では、対象からの試験サンプル中（例：膵臓癌サンプル）の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定する。コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルに対する試験サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化（例：上昇、低下）により、増殖指数が高いことが示される。一つの態様では、試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、上方制御される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１である。
【００５７】
特定のｍｉＲ遺伝子産物の標的（例：コントロールサンプルに対して発現が上方制御又は下方制御されるｍｉＲ遺伝子産物）を識別することで、マイクロＲＮＡの作用のメカニズムを解明する手助けとすることができる。本明細書で例示するように、選択されたマイクロＲＮＡ、すなわち、ｍｉＲ‐１０３／ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐２０４／ｍｉＲ‐２１１、及びｍｉＲ‐２１の特定の推定標的を識別した。分析により、膵臓癌サンプル中で上方制御（２８種類の標的遺伝子）、及び下方制御（７種類の標的遺伝子）された特定のマイクロＲＮＡの多くの標的遺伝子が明らかとなった。表１０に示すように、ｍｉＲ‐１０３／ｍｉＲ‐１０７の上方制御された標的遺伝子２８種類及び下方制御された標的遺伝子７種類が膵臓癌サンプル中で識別された（実施例及び表１０）。さらに、ｍｉＲ‐１０３／ｍｉＲ‐１０７の上方制御された標的遺伝子２種類及び下方制御された標的遺伝子２種類、並びにｍｉＲ‐２１の上方制御された標的遺伝子１種類及び下方制御された標的遺伝子１種類が膵臓癌サンプル中で識別された（実施例及び表１０）。従って、一つの態様では、特定のマイクロＲＮＡの標的遺伝子（例：表１０に挙げたもの）の発現を用いて、癌（例：膵臓癌）の診断をすることができる。当業者であれば、これらのいずれの標的遺伝子の発現レベルも、本明細書に記載のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定するための公知の方法（例：定量的若しくは半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーションによる検出、マイクロアレイ分析）を用いて、必要以上の実験をすることなく、測定することができる。一つの態様では、測定される標的遺伝子は、プログラム細胞死４型（ＰＤＣＤ４）である。
【００５８】
一つの態様では、本発明は、膵臓癌を有する対象の予後を判断する方法である。本方法では、対象からの試験サンプル中（例：膵臓癌サンプル）における、ＰＤＣＤ４のレベルを測定する。コントロールサンプル中のＰＤＣＤ４のレベルに対する試験サンプル中のＰＤＣＤ４のレベルの変化（例：上昇、低下）により、予後不良が示される。一つの態様では、試験サンプル中のＰＤＣＤ４のレベルは、コントロールサンプル中のＰＤＣＤ４のレベルよりも低い。別の態様では、膵臓癌は、転移及び／又は高い増殖指数を伴う。
【００５９】
少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、当業者に公知の様々な技術を用いて測定することができる（例：定量的若しくは半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーションによる検出）。特別の態様において、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの測定は、対象から採取した試験サンプルのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチド１式を作製し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドを１又は２種類以上のｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例：ｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイ）とハイブリダイズして試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを作製し、この試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルから作製されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することによって行なう。コントロールサンプルに対する試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルの変化により、対象が膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があることが示される。一つの態様では、少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルは、コントロールサンプルから得られるシグナルに比べて、上方制御される。別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルは、コントロールサンプルから得られるシグナルに比べて、下方制御される。特別の態様では、マイクロアレイは、既知のすべてのヒトｍｉＲＮＡの大部分に対するｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む。さらなる態様では、マイクロアレイは、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１��ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される１又は２種類以上のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含む。
【００６０】
マイクロアレイは、既知のｍｉＲＮＡ配列から作られた遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから作製することができる。アレイは、各ｍｉＲＮＡに対して２種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブ、一つは活性な成熟配列を含むもの、もう一つはｍｉＲＮＡの前駆体に特異的なもの、を含むことができる。アレイは、ヒトオルソログとは数塩基のみの違いである１又は２種類以上のマウス配列などのコントロールをさらに含むことができ、これはハイブリダイゼーションのストリンジェントな条件に対するコントロールとすることができる。両方の種からのｔＲＮＡ及びその他のＲＮＡ（例：ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）をマイクロチップ上に固定し、特定のハイブリダイゼーションに対する比較的安定な内部ポジティブコントロールとすることもできる。非特異的ハイブリダイゼーションに対する１又は２種類以上の適切なコントロールをマイクロチップに含めることもできる。この目的のために、既知のどのｍｉＲＮＡともいかなる相同性も有さないということに基づいて配列が選択される。
【００６１】
マイクロアレイは、本技術分野で公知の技術を用いて作製することができる。例えば、適切な長さ、例えば４０ヌクレオチド、のオリゴヌクレオチドプローブをＣ６位で５’末端をアミン修飾し、例えばＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ、及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）活性化スライド、などの市販のマイクロアレイシステムを用いて固定する。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーを、標識プライマーで標的ＲＮＡを逆転写することによって作製する。最初の鎖合成に続いて、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性し、鋳型ＲＮＡを分解する。こうして作製された標識された標的ｃＤＮＡを、次に、６Ｘ  ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド中、２５℃、１８時間、などのハイブリダイセーションの条件下でマイクロアレイチップにハイブリダイズし、続いて０．７５Ｘ  ＴＮＴ中、３７℃で４０分間洗浄する。固定ＤＮＡプローブがサンプル中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の地点においてハイブリダイゼーションが発生する。標識された標的ｃＤＮＡによって、結合が発生したアレイ上の正確な地点がマークされ、それにより自動検出及び定量が可能となる。出力されるのはハイブリダイゼーション発生のリストであり、これは特定のｃＤＮＡ配列の相対的な存在量を、従って、患者のサンプル中の対応する相補的なｍｉＲの相対的な存在量を示す。一つの態様によると、標識されたｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチンで標識されたｃＤＮＡであり、ビオチンで標識されたプライマーから作製される。次に、マイクロアレイは、例えば、ストレプトアビジン‐Ａｌｅｘａ６４７抱合体などを用いたビオチン含有転写物の直接検出によって処理され、従来のスキャン法によってスキャンされる。アレイ上の各スポットの画像強度は、患者のサンプル中の対応するｍｉＲの存在量に比例する。
【００６２】
このアレイの使用は、ｍｉＲＮＡの発現の検出にとっていくつかの利点を有する。第一に、数百個の遺伝子の発現全体を、同一サンプル中で、一回で識別することができる。第二に、オリゴヌクレオチドプローブを注意深く設計することにより、成熟分子及び前駆体分子の両方の発現を識別することができる。第三に、ノーザンブロット分析と比較して、チップに要するＲＮＡの量は少量であり、全ＲＮＡ２．５μｇを用いることで再現性のある結果が得られる。ｍｉＲＮＡの数が比較的限定的（一つの種あたり数百）であることから、いくつかの種に共用され、各種に対する固有のオリゴヌクレオチドプローブを有するマイクロアレイを構築することができる。このようなツールにより、種々の条件下における公知の各ｍｉＲに対する種を超えた発現の分析が可能となるであろう。
【００６３】
特定のｍｉＲの定量的な発現レベルのアッセイに用いるのに加えて、大部分のｍｉＲＮｏｍｅ、好ましくはすべてのｍｉＲＮｏｍｅに対応するｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロチップを、ｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングの実施に用いて、ｍｉＲ発現のパターンを分析することができる。固有のｍｉＲサインを、確立された疾患マーカーに、又は直接疾患状態に関連付けることができる。
【００６４】
本明細書で述べる発現プロファイリングの方法によると、癌（例：膵臓癌）を有する疑いのある対象のサンプルからの全ＲＮＡを定量的に逆転写して、サンプル中のＲＮＡと相補的な標識された標的オリゴデオキシヌクレオチドが得られる。次に、標的オリゴデオキシヌクレオチドを、ｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせ、サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルが得られる。結果として得られるサンプルのハイブリダイゼーションプロファイルは、サンプル中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表す。ハイブリダイゼーションプロファイルは、サンプルからの標的オリゴデオキシヌクレオチドとマイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブとの結合からのシグナルを含む。プロファイルは、結合の有無（信号ありｖｓ信号ゼロ）によって記録することができる。記録されたプロファイルは、各ハイブリダイゼーションからのシグナル強度を含むことがより好ましい。このプロファイルを、例えば非癌性などの正常コントロールサンプルから作製されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。シグナルの変化により、対象中の癌の存在又は癌を発症しやすい性質が示される。
【００６５】
ｍｉＲ遺伝子発現を測定するその他の技術も本技術分野の範囲内であり、ＲＮＡの転写及び分解の速度を測定する種々の技術を含む。
【００６６】
本発明は、さらに、対象が予後不良である膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があるかどうかを診断する方法も提供する。本方法では、膵臓癌の予後不良と関連する少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを、対象から採取した試験サンプルのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチド１式を作製することによって測定する。次に、その標的オリゴデオキシヌクレオチドを、１又は２種類以上のｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブ（例：ｍｉＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプローブを含むマイクロアレイ）とハイブリダイズして試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルを作製し、この試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルから作製されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。コントロールサンプルに対する試験サンプル中の少なくとも１種類のｍｉＲＮＡのシグナルの変化により、対象が予後不良である膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があることが示される。一つの態様では、ｍｉＲ‐２１のシグナルの変化により、対象が予後不良である膵臓癌を有するか、又はそれを発症する危険性があることが示される。
【００６７】
本発明の診断、予後、及び治療の方法に関する特別の態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｌｅｔ７ａ‐２、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｇ、ｌｅｔ‐７ｉ、ｍｉＲ‐７‐２、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐９、ｍｉＲ‐９‐１、ｍｉＲ‐１０ａ、 ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐１５ｂ、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐１７‐５ｐ、ｍｉＲ‐２０ａ、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐３０、ｍｉＲ‐３０ａ‐５ｐ、ｍｉＲ‐３０ｃ、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐３１、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐３４、ｍｉＲ‐３４ａ、ｍｉＲ‐３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐３４ａ‐１、ｍｉＲ‐３４ａ‐２、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐９６、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１２３、ｍｉＲ‐１２４ａ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２６＊、ｍｉＲ‐１２７、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐１２９、ｍｉＲ‐１２９‐１／２  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３５‐１、ｍｉＲ‐１３６、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１４１、ｍｉＲ‐１４２‐ａｓ、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１４８、ｍｉＲ‐１４９、ｍｉＲ‐１５３、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐１５９‐１、ｍｉＲ‐１８１、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１８６、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐１９５、ｍｉＲ‐１９６‐１、ｍｉＲ‐１９６‐１  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１９６‐２、ｍｉＲ‐１９９ａ‐１、ｍｉＲ‐１９９ａ‐２、ｍｉＲ‐１９９ｂ、ｍｉＲ‐２００ｂ、ｍｉＲ‐２０２、ｍｉＲ‐２０３、ｍｉＲ‐２０４、ｍｉＲ‐２０５、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐２１１、ｍｉＲ‐２１２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐２１５、ｍｉＲ‐２１７、ｍｉＲ‐２２１、及び／又はｍｉＲ‐２２３の１又は２種類以上ではない。
【００６８】
本明細書で述べるように、サンプル中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物サンプル中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適したいかなる技術を用いても測定することができる。生物サンプル（例：細胞、組織）中のＲＮＡ発現レベルを測定するのに適した技術（例：ノーザンブロット分析、ＲＴ‐ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）は、当業者に公知である。特別の態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、ノーザンブロット分析を用いて検出される。例えば、全細胞内ＲＮＡを、核酸抽出バッファーの存在下での均質化、及びそれに続く遠心分離によって細胞から精製することができる。核酸は析出され、ＤＮＡはＤＮａｓｅによる処理と析出によって除去される。次に、標準的な技術に従ったアガロースゲル上でのゲル電気泳動によってＲＮＡ分子を分離し、ニトロセルロースフィルターへ移す。そして、加熱によってＲＮＡをフィルター上へ固定する。特定のＲＮＡの検出及び定量は、対象であるＲＮＡと相補的であり、適切に標識されたＤＮＡ又はＲＮＡプローブを用いて達成される。例えば、その開示事項のすべてが参照することで本明細書に組み入れられる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７、を参照のこと。
【００６９】
任意のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションに適したプローブ（例：ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ）は、表１ａ及び表１ｂに示す核酸配列から作製することができ、対象であるｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相補性を有するプローブ、並びに対象であるｍｉＲ遺伝子産物に対して完全な相補性を有するプローブを含むが、これらに限定されない。標識されたＤＮＡ及びＲＮＡプローブを作製する方法、並びにそれらを標的ヌクレオチド配列へハイブリダイズする条件は、その開示事項が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ｃｈａｐｔｅｒ  １０  ａｎｄ  １１、を参照のこと
【００７０】
例えば、核酸プローブは、例えば３Ｈ，３２Ｐ．３３Ｐ、１４Ｃ、若しくは３５Ｓなどの放射性核種、重金属、標識されたリガンドに対する特異的な結合対の要素として機能することができるリガンド（例：ビオチン、アビジン、若しくは抗体）、蛍光体分子、化学発光分子、酵素、などによって標識することができる。
【００７１】
プローブは、Ｒｉｇｂｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１３：２３７‐２５１、に記載のニックトランスレーション法、又は、Ｆｉｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６‐１３、に記載のランダムプライミング法によって、高い比放射能での標識が可能であり、これらの文献の全開示内容は参照することで本明細書に組み入れられる。後者は、一本鎖ＤＮＡ又は鋳型ＲＮＡから高い比放射能を有する３２Ｐで標識したプローブを合成するのに最適な方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って元々存在するヌクレオチドを高放射性ヌクレオチドで置換することにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを優に超える比放射能の３２Ｐ標識核酸プローブを作製することが可能である。そうすれば、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフによる検出は、ハイブリダイズされたフィルターを写真フィルムに曝露することによって行うことができる。ハイブリダイズされたフィルターに曝露された写真フィルムの濃度測定スキャンにより、ｍｉＲ遺伝子転写レベルの正確な測定が行なわれる。別の手法としては、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、ピスカタウエイ、より入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００‐Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒなどのコンピュータによる画像化システムを用いることにより、ｍｉＲ遺伝子転写レベルの定量が可能である。
【００７２】
ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブの放射性核種による標識が実行可能でない場合、ランダムプライマー法を用いて、例えば、ｄＴＴＰ類似体である５‐（Ｎ‐（Ｎ‐ビオチニル‐イプシロン‐アミノカプロイル）‐３‐アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸などの類似体をプローブ分子中へ組み込むことができる。ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブは、発色反応を生ずる蛍光色素又は酵素と結合したアビジン、ストレプトアビジン、及び抗体（例：抗ビオチン抗体）などのビオチン結合性タンパク質との反応によって検出することができる。
【００７３】
ノーザン、及びその他のＲＮＡハイブリダイゼーション技術に加えて、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの技術を用いてＲＮＡ転写物のレベルを測定することができる。この技術によると、ノーザンブロット技術よりも必要な細胞の数が少なくてすみ、顕微鏡のカバーガラス上に全細胞を載せること、及び、放射性標識された、又はその他の方法で標識された核酸プローブ（例：ｃＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を含む溶液によって細胞の核酸含有量を調べることを含む。この技術は、対象からの組織生検サンプルの分析に特に適している。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術の実践に関しては、米国特許第５，４２７，９１６号により詳細に記載されており、この文献の全開示内容は参照することで本明細書に組み入れられる。上述のように、任意のｍｉＲ遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに適したプローブは、表１ａ及び表１ｂに示す核酸配列から作製することができ、対象であるｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の相補性を有するプローブ、並びに対象であるｍｉＲ遺伝子産物に対して完全な相補性を有するプローブを含むが、これらに限定されない
【００７４】
細胞中のｍｉＲ遺伝子転写物の相対数は、ｍｉＲ遺伝子転写物の逆転写、及びそれに続く逆転写された転写物のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ‐ＰＣＲ）による増幅によっても測定することができる。ｍｉＲ遺伝子転写物のレベルは、例えば、同一サンプル中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子からのｍＲＮＡレベルなどの内部標準との比較により定量することができる。内部標準として用いるのに適した「ハウスキーピング」遺伝子としては、例えば、ミオシン、又はグリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）が挙げられる。定量的若しくは半定量的ＲＴ‐ＰＣＲ、及びこれらの変形を実施する方法は、当業者に公知である。
【００７５】
ある場合では、サンプル中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に測定することが好ましいことがある。別の場合では、癌（例：膵臓癌）と相関を有する既知のすべてのｍｉＲ遺伝子の転写物の発現レベルを測定することが好ましいこともある。何百というｍｉＲ遺伝子又はｍｉＲ遺伝子産物に対する癌に特有の発現レベルを評価することは時間のかかる作業であり、大量の全ＲＮＡ（例：少なくとも各ノーザンブロットに対して２０μｇ）及び放射性同位元素を要するオートラジオグラフ技術が必要である。
【００７６】
この欠点を克服するために、一式のｍｉＲ遺伝子に特異的な一式のオリゴヌクレオチド（例：オリゴデオキシヌクレオチド）プローブを含む、マイクロチップの形態（すなわち、マイクロアレイ）のオリゴライブラリーを構築することができる。このようなマイクロアレイを用いると、ＲＮＡを逆転写して一式の標的オリゴデオキシヌクレオチドを作製し、これをマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしてハイブリダイゼーションプロファイル又は発現プロファイルを作製することによって、生物サンプル中の複数のマイクロＲＮＡの発現レベルを測定することができる。そして、試験サンプルのハイブリダイゼーションプロファイルをコントロールサンプルのそれと比較し、どのマイクロＲＮＡの発現レベルが膵臓癌細胞中で変化したかを判断することができる。本明細書で用いる「オリゴヌクレオチドプローブ」又は「オリゴデオキシヌクレオチドプローブ」とは、標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味する。「標的オリゴヌクレオチド」又は「標的オリゴデオキシヌクレオチド」とは、検出（例：ハイブリダイゼーションによって）されるべき分子を意味する。「ｍｉＲ特異的オリゴヌクレオチドプローブ」又は「ｍｉＲに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ」とは、特定のｍｉＲ遺伝子産物又は特定のｍｉＲ遺伝子産物の逆転写物とハイブリダイズするよう選択された配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを意味する。
【００７７】
特定のサンプルの「発現プロファイル」又は「ハイブリダイゼーションプロファイル」は、実質的にサンプルの状態のフィンガープリントであり、２種類の状態は同じ様に発現されたいかなる特定の遺伝子も有することができるが、多くの遺伝子を同時に評価することによって、細胞の状態に特有の遺伝子発現プロファイルを作製することができる。すなわち、正常な組織を膵臓癌組織と区別することができ、そして膵臓癌組織の中で、異なる予後の状態（例えば、長期的な生存の可能性の高低）を判断することができる。状態の異なる膵臓癌組織の発現プロファイルを比較することによって、これらの各状態においてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子の上方制御及び下方制御の両方を含む）が得られる。膵臓癌組織又は正常膵臓組織中で異なって発現された配列、並びに異なる予後の結果につながる異なった発現を識別することによって、この情報を様々な方法で利用することができる。例えば、特定の治療方法を評価することができる（例：特定の患者に対して、化学療法薬が長期的な予後の改善に役立つかどうか）。同様に、患者のサンプルを既知の発現プロファイルと比較することによって、診断を行い、又は確認することができる。さらに、このような遺伝子発現プロファイル（若しくは個々の遺伝子）により、膵臓癌の発現プロファイルを抑制する、又は不良な予後のプロファイルを良好な予後のプロファイルへと変換する薬物候補のスクリーニングが可能となる。
【００７８】
理論に束縛されるものではないが、細胞中の１又は２種類以上のｍｉＲ遺伝子産物のレベルの変化が、これらのｍｉＲの１又は２種類以上の意図する標的の調節解除をもたらす結果となり、このことが膵臓癌の形成につながる場合があると考えられる。従って、ｍｉＲ遺伝子産物レベルを変化させる（例：膵臓癌細胞内で上方制御されるｍｉＲのレベルの低下、膵臓癌細胞内で下方制御されるｍｉＲのレベルの上昇）ことによって、膵臓癌の治療に成功することができる。
【００７９】
従って、本発明は対象中の膵臓癌を治療する方法を包含し、ここで少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物が対象の細胞中（例：膵臓癌細胞）で調節解除（例：下方制御、上方制御）される。一つの態様では、試験サンプル（例：膵臓癌サンプル）中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも高い。別の態様では、試験サンプル（例：膵臓癌サンプル）中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、コントロールサンプル中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも低い。少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が膵臓癌細胞中で下方制御される場合、本方法は効果量の少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又は単離されたその変異体若しくは生物活性断片を投与することを含み、それによって対象中の癌細胞の増殖を阻害する。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物が対象の癌細胞中で下方制御される場合、効果量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物を対象に投与することにより、癌細胞の増殖を阻害することができる。対象に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞中で下方制御される内在性の野生型ｍｉＲ遺伝子産物（例：表１ａ又は表１ｂに示すｍｉＲ遺伝子産物）と同一であってよく、又は、その変異体若しくは生物活性断片であってもよい。本明細書で定義するｍｉＲ遺伝子産物の「変異体」とは、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して１００％未満の同一性を有するｍｉＲＮＡを意味し、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１又は２個以上の生物活性を持つ。そのような生物活性の例としては、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害（例：標的ＲＮＡ分子の翻訳の阻害、標的ＲＮＡ分子の安定性の調節、標的ＲＮＡ分子のプロセッシングの阻害）、及び膵臓癌に付随する細胞プロセス（例：細胞分化、細胞増殖、細胞死）の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。これらの変異体には、種変異体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔ）、及びｍｉＲ遺伝子中の１又は２個以上の変異（例：置換、欠失、挿入）の結果としての変異体が含まれる。特定の態様では、変異体は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性を有する。
【００８０】
本明細書で定義するｍｉＲ遺伝子産物の「生物活性断片」とは、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１又は２個以上の生物活性を持つｍｉＲ遺伝子産物のＲＮＡ断片を意味する。上述のように、そのような生物活性の例としては、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害、及び膵臓癌に付随する細胞プロセスの阻害が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、生物活性断片は、少なくとも約５、７、１０、１２、１５、又は１７ヌクレオチドの長さである。特別の態様では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物を、１又は２種類以上のさらなる抗癌治療と組み合わせて対象に投与することができる。適切な抗癌治療としては、化学療法、放射線療法、及びこれらの組み合わせ（例：化学放射線療法）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞内で上方制御される場合、本方法はその少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する化合物を効果量、対象へ投与することを含み、それによって膵臓癌細胞の増殖が抑えられる。本明細書において、そのような化合物は、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物、と称する。適切なｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の例としては、本明細書に記載のもの（例：二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸、酵素ＲＮＡ分子）が挙げられるが、これらに限定されない。特別の態様では、ｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を、１又は２種類以上のさらなる抗癌治療と組み合わせて対象に投与することができる。適切な抗癌治療としては、化学療法、放射線療法、及びこれらの組み合わせ（例：化学放射線療法）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
特定の態様では、膵臓癌内で調節解除される単離された（そして、対象に投与される）ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせ（又は、１種類以上のこれらのｍｉＲの単離された変異体若しくは生物活性断片）から成る群より選択される。特別の態様では、投与されるｍｉＲ遺伝子産物は、ｌｅｔ７ａ‐２、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｇ、ｌｅｔ‐７ｉ、ｍｉＲ‐７‐２、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐９、ｍｉＲ‐９‐１、ｍｉＲ‐１０ａ、 ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐１５ｂ、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐１７‐５ｐ、ｍｉＲ‐２０ａ、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐３０、ｍｉＲ‐３０ａ‐５ｐ、ｍｉＲ‐３０ｃ、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐３１、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐３４、ｍｉＲ‐３４ａ、ｍｉＲ‐３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐３４ａ‐１、ｍｉＲ‐３４ａ‐２、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐９６、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１２３、ｍｉＲ‐１２４ａ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２６＊、ｍｉＲ‐１２７、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐１２９、ｍｉＲ‐１２９‐１／２  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３５‐１、ｍｉＲ‐１３６、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１４１、ｍｉＲ‐１４２‐ａｓ、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１４８、ｍｉＲ‐１４９、ｍｉＲ‐１５３、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐１５９‐１、ｍｉＲ‐１８１、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１８６、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐１９５、ｍｉＲ‐１９６‐１、ｍｉＲ‐１９６‐１  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１９６‐２、ｍｉＲ‐１９９ａ‐１、ｍｉＲ‐１９９ａ‐２、ｍｉＲ‐１９９ｂ、ｍｉＲ‐２００ｂ、ｍｉＲ‐２０２、ｍｉＲ‐２０３、ｍｉＲ‐２０４、ｍｉＲ‐２０５、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐２１１、ｍｉＲ‐２１２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐２１５、ｍｉＲ‐２１７、ｍｉＲ‐２２１、及び／又はｍｉＲ‐２２３の１又は２種類以上ではない。
【００８３】
既述のように、少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が癌細胞中で上方制御される場合、本方法はその少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する少なくとも１種類の化合物を効果量、対象へ投与することを含み、それによって膵臓癌細胞の増殖が抑えられる。一つの態様では、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現を阻害する化合物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択されるｍｉＲ遺伝子産物を阻害する。
【００８４】
関連する態様では、対象中の膵臓癌を治療する方法は、対象からの膵臓癌細胞中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の量をまず測定し、そのｍｉＲ遺伝子産物のレベルをコントロール細胞中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較する工程をさらに含む。ｍｉＲ遺伝子産物の発現が膵臓癌細胞中で調節解除（例：下方制御、上方制御）される場合、本方法は、膵臓癌細胞中で発現される少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の量を変化させる工程をさらに含む。一つの態様では、癌細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量は、コントロール細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量よりも少なく、効果量のｍｉＲ遺伝子産物、又はその単離された変異体若しくは生物活性断片を対象へ投与する。別の態様では、癌細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量は、コントロール細胞中で発現されるｍｉＲ遺伝子産物の量よりも多く、効果量の、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子の発現を阻害する少なくとも１種類の化合物を対象へ投与する。適切なｍｉＲ、及びｍｉＲ遺伝子の発現を阻害する化合物は、例えば、本明細書に記載のものが挙げられる。
【００８５】
本明細書で用いる「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療の（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という言葉は、例えば膵臓癌などの疾患又は状態に付随する症状を寛解させることを意味し、疾患症状の発症の防止若しくは遅延、及び／又は、疾患若しくは状態の症状の重症度又は頻度の軽減を含む。本明細書で定義する「対象」、「患者」、及び「個体」という用語は、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、又はその他のウシ類、ヒツジ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類、げっ歯類、若しくはマウス類の種を含むがこれらに限定されない哺乳類などの動物を含む。好ましい態様では、動物はヒトである。
【００８６】
本明細書で用いる単離されたｍｉＲ遺伝子産物の「効果量」とは、膵臓癌にかかっている対象中の癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量のことである。当業者であれば、対象の大きさ及び体重、疾患の浸透度合い、対象の年齢、健康状態、及び性別、投与経路、並びに局所投与か全身投与か、などの要因を考慮することで、任意の患者に投与するｍｉＲ遺伝子産物の効果量を容易に決定することができる。
【００８７】
例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の効果量は、治療すべき腫瘍塊の概略重量に基づいたものとすることができる。腫瘍塊の概略重量は、腫瘍塊の概略体積を算出することによって求めることができ、ここで１立方センチメートルの体積が、おおよそ１グラムに相当する。腫瘍塊の重量に基づいた単離されたｍｉＲ遺伝子産物の効果量は、約１０乃至５００マイクログラム／腫瘍塊１グラムの範囲とすることができる。特定の態様では、効果量は、少なくとも約１０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、少なくとも約６０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、又は少なくとも約１００マイクログラム／腫瘍塊１グラムとすることができる。
【００８８】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物の効果量は、治療すべき対象の体重の概略値又は算出値に基づいたものとすることもできる。本明細書で述べるように、そのような効果量を、非経口的に、又は経腸的に投与することが好ましい。例えば、対象に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の効果量は、約５乃至３０００マイクログラム／体重１ｋｇの範囲、約７００乃至１０００マイクログラム／体重１ｋｇの範囲、又は約１０００マイクログラム／体重１ｋｇを超える量とすることができる。
【００８９】
当業者であれば、任意の対象への単離されたｍｉＲ遺伝子産物の投与に関する適切な投与計画を容易に決定することもできる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物を対象へ１回投与することができる（例：一回の注射、又は沈着による）。別の選択肢として、ｍｉＲ遺伝子産物を、約３日間乃至約２８日間、より詳細には約７日間乃至約１０日間にわたって、１日に1回又は２回、対象へ投与することができる。特定の投与計画において、ｍｉＲ遺伝子産物は、１日に１回、７日間投与される。投与計画が複数の投与を含む場合、対象に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の効果量として、全投与計画を通して投与される遺伝子産物の総量を含むことができることは理解される。
【００９０】
本明細書で用いる「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物とは、合成された、又は人の手によって自然状態から変化した若しくは分離されたもののことである。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、又は自然状態において共存する物質から部分的に若しくは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物が、「単離された」とみなされる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、実質的に精製された状態で存在してもよく、又は、ｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞中に存在していてもよい。従って、意図的に細胞へ送達された、又は細胞中で発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物とみなされる。細胞内部でｍｉＲ前駆体分子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物も、「単離された」分子とみなされる。本発明によると、本明細書で述べる単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、対象（例：ヒト）の膵臓癌を治療するための薬物の製造に使用することができる。
【００９１】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、様々な標準的な技術を用いて得ることができる。例えば、本技術分野で公知の方法を用いて、ｍｉＲ遺伝子産物を化学的に合成、又は組換えによって作製することができる。一つの態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイト、及び従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学的に合成される。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の市販業者としては、例えば、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、ハンブルグ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国、コロラド州、ラフィエット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、米国、イリノイ州、ロックフォード）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国、バージニア州、スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国、マサチューセッツ州、アシュランド）、及びＣｒｕａｃｈｅｍ（イギリス、グラスゴー）が挙げられる。
【００９２】
別の選択肢として、ｍｉＲ遺伝子産物は、適切なプロモーターを用いて、組換え環状又は直鎖ＤＮＡプラスミドから発現することができる。プラスミドからのＲＮＡの発現に適したプロモーターとしては、例えば、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、又はサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられる。その他の適切なプロモーターの選択も、本技術分野の範囲内である。本発明の組換えプラスミドも、癌細胞内でのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導性プロモーター又は調節性プロモーター（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含むことができる。
【００９３】
組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、標準的な技術によって培養細胞発現系から単離される。組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、癌細胞へ送達することも、癌細胞中で直接発現することもできる。ｍｉＲ遺伝子産物の癌細胞への組換えプラスミドを用いた送達については、以下でさらに詳しく述べる。
【００９４】
ｍｉＲ遺伝子産物は、別々の組換えプラスミドから発現することも、同じ組換えプラスミドから発現することもできる。一つの態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、その前駆体分子は、癌細胞内に存続しているプロセッシングシステムを含むがこれらに限定されない適切なプロセッシングシステムによってプロセッシングを受け、機能性ｍｉＲ遺伝子産物となる。その他の適切なプロセッシングシステムとしては、例えば、インビトロのショウジョウバエ細胞ライセートシステム（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ）（例：その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号、に記載）、及び大腸菌ＲＮＡｓｅＩＩＩシステム（例：その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００４／００１４１１３号、に記載）が挙げられる。
【００９５】
ｍｉＲ遺伝子産物の発現に適したプラスミドの選択、プラスミドに核酸配列を挿入して遺伝子産物を発現させる方法、及び対象である細胞へ組換えプラスミドを送達する方法は、本技術分野の範囲内である。例えば、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７‐１３３３；Ｔｕｓｃｈｌ（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：４４６‐４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０‐５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４９７‐５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：９４８‐９５８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５００‐５０５；及びＰａｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：５０５‐５０８、を参照のこと。
【００９６】
一つの態様では、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ中間‐初期プロモーター（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御の下、ｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を有する。本明細書で用いるプロモーターの「制御の下」とは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列が、プロモーターの３’末端に位置し、それによってプロモーターがｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列の転写を開始することができることを意味する。
【００９７】
ｍｉＲ遺伝子産物は、組換えウイルスベクターからも発現することができる。ｍｉＲ遺伝子産物が２種類の別々の組換えウイルスベクターから発現可能なことも、又は同一のウイルスベクターから発現可能なことも考慮の範囲内である。組換えウイルスベクターから発現されるＲＮＡは、培養細胞発現系から標準的な技術によって単離するか、又は、癌細胞中で直接発現することができる。ｍｉＲ遺伝子産物の癌細胞への組換えウイルスベクターを用いた送達については、以下でさらに詳しく述べる。
【００９８】
本発明の組換えウイルスベクターは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列、及びＲＮＡ配列を発現する適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターとしては、Ｕ６若しくはＨ１ ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター配列、又はサイトメガロウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。その他の適切なプロモーターの選択も、本技術分野の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターも、癌細胞中でのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導性プロモーター又は調節性プロモーターを含むことができる。
【００９９】
ｍｉＲ遺伝子産物のコード配列を受け入れることができるものであればいかなるウイルスベクターも使用することができ、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例：レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）、ヘルペスウイルス、など由来のベクターが挙げられる。ウイルスベクターの指向性は、必要に応じて、他のウイルスからの外被タンパク質又はその他の表面抗原によるベクターのシュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）、又は異なるウイルスのカプシドタンパク質の置換により、変化させることができる。
【０１００】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス、などからの表面タンパク質によるシュードタイピングが可能である。本発明のＡＡＶベクターは、このベクターが異なるカプシドタンパク質の血清型を発現するように設計することによって、異なる細胞を標的とさせることができる。例えば、血清型２型のカプシドを血清型２型ゲノム（ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ２  ｇｅｎｏｍｅ）上に発現するＡＡＶベクターはＡＡＶ２／２と呼ぶ。ＡＡＶ２／２ベクターのこの血清型２型カプシド遺伝子を血清型５型カプシド遺伝子で置換することによって、ＡＡＶ２／５ベクターを作製することができる。異なる血清型のカプシドタンパク質を発現するＡＡＶベクターを構築する技術は本技術分野の範囲内であり、例えば、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１‐８０１、を参照のこと。
【０１０１】
本発明における使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ベクターにＲＮＡを発現する核酸配列を挿入する方法、対象である細胞へウイルスベクターを送達する方法、及び発現されたＲＮＡ産物の回収は本技術分野の範囲内である。例えば、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ（１９９５），Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：３０１‐３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８‐６１４；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０），Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５‐１４；及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５‐３０、を参照のこと。
【０１０２】
特に適切なウイルスベクターは、ＡＶ及びＡＡＶ由来のものである。ｍｉＲ遺伝子産物の発現に適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、及び標的細胞へベクターを送達する方法は、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６‐１０１０、に記載されている。ｍｉＲ遺伝子産物の発現に適したＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターを構築する方法、及び標的細胞へベクターを送達する方法は、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６‐３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ.，７０：５２０‐５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ.  ６３：３８２２‐３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号;米国特許第５，１３９，９４１号;国際出願ＷＯ９４／１３７８８; 及び国際出願ＷＯ９３／２４６４１、に記載されている。一つの態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ＣＭＶ中間初期プロモーターを含む単一の組換えＡＡＶベクターから発現される。
【０１０３】
特定の態様では、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６ＲＮＡプロモーターの制御の下、ＰｏｌｙＴ終結配列と操作可能な形で連結するｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本明細書で用いる「ＰｏｌｙＴ終結配列と操作可能な形で連結する」とは、センス鎖又はアンチセンス鎖をコードする核酸配列がＰｏｌｙＴ終結シグナルの５’方向に直接隣接していることを意味する。ベクターからのｍｉＲ配列の転写の際、ＰｏｌｙＴ終結シグナルが作用して転写を終結させる。
【０１０４】
本発明の治療方法に関する他の態様では、ｍｉＲ発現を阻害する少なくとも１種類の化合物を効果量、対象へ投与することができる。本明細書で用いる「ｍｉＲ発現を阻害する」とは、ｍｉＲ遺伝子産物の前駆体及び／又は活性で成熟した形態のｍｉＲ遺伝子産物の治療後の産生が、治療前の産生量よりも少ないことを意味する。当業者であれば、例えば、本明細書で述べるｍｉＲ転写レベルを測定する技術を用いて、ｍｉＲ発現が癌細胞中で阻害されたかどうかを容易に判断することができる。阻害は、遺伝子発現のレベルで発生してもよく（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することによって）、又は、プロセッシングのレベルで発生してもよい（例：ｍｉＲ前駆体が成熟した活性ｍｉＲへプロセッシングされることを阻害することによって）。
【０１０５】
本明細書で用いる、ｍｉＲ発現を阻害する化合物の「効果量」とは、癌（例：膵臓癌）にかかっている対象中での癌細胞の増殖を阻害するのに十分な量のことである。当業者であれば、対象の大きさ及び体重、疾患の浸透度合い、対象の年齢、健康状態、及び性別、投与経路、並びに局所投与か全身投与か、などの要因を考慮することで、任意の患者に投与するｍｉＲ発現阻害化合物の効果量を容易に決定することができる。
【０１０６】
例えば、発現阻害化合物の効果量は、本明細書で述べるように、治療すべき腫瘍塊の概略重量に基づいたものとすることができる。ｍｉＲ発現を阻害する化合物の効果量は、本明細書で述べるように、治療すべき対象の体重の概略値又は算出値に基づいたものとすることもできる。
【０１０７】
当業者であれば、本明細書で述べるように、任意の対象へのｍｉＲ発現を阻害する化合物の投与に関する適切な投与計画を容易に決定することもできる。ｍｉＲ遺伝子発現を阻害する適切な化合物としては、二本鎖ＲＮＡ（短鎖若しくは低分子干渉ＲＮＡ、又は「ｓｉＲＮＡ」）、アンチセンス核酸、リボザイムなどの酵素ＲＮＡ分子が挙げられる。これらの化合物は各々、任意のｍｉＲ遺伝子産物を標的とすることができ、標的ｍｉＲ遺伝子産物の発現を干渉する（例：翻訳を阻害することにより、切断及び／又は分解を引き起こすことにより）。
【０１０８】
例えば、ｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部と、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％など、少なくとも９０％の配列相同性を有する単離された二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子を用いてｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を引き起こすことによって、任意のｍｉＲ遺伝子の発現を阻害することができる。特別の態様では、ｄｓＲＮＡ分子は、「短鎖若しくは低分子干渉ＲＮＡ」、又は「ｓｉＲＮＡ」である。
【０１０９】
本方法に有用なｓｉＲＮＡは、約１７ヌクレオチド乃至約２９ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１９乃至約２５ヌクレオチドの長さである短鎖二本鎖ＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは、センス鎖ＲＮＡ及び相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡを有し、これが標準的なワトソン‐クリック塩基対相互作用によって互いにアニールされている（以降、「塩基対形成」と称する）。センス鎖は、標的ｍｉＲ遺伝子産物内に含まれる核酸配列に対して実質的に同一である核酸配列を有する。
【０１１０】
本明細書で用いる、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列に対して「実質的に同一である」ｓｉＲＮＡ中の核酸配列、とは、標的配列と同一であるか、又は、標的配列と１若しくは２個のヌクレオチドで異なる核酸配列のことである。ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖は、２個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含んでもよく、又は、２個の相補部位が塩基対形成し、一本鎖「ヘアピン」領域による共有結合で連結している単一分子を含んでもよい。
【０１１１】
ｓｉＲＮＡは、１若しくは２個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変性によって天然のＲＮＡと異なっている、変性されたＲＮＡであってもよい。そのような変性としては、ｓｉＲＮＡの末端若しくはｓｉＲＮＡの１箇所以上の内部ヌクレオチドなどへの非ヌクレオチド物質の付加、又は、ｓｉＲＮＡにヌクレアーゼ分解に対する耐性を付与する修飾、又は、ｓｉＲＮＡの１箇所以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドによる置換、を挙げることができる。
【０１１２】
ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖は、３’末端オーバーハングを有してもよい。本明細書で用いる「３’末端オーバーハング」とは、ＲＮＡ二重鎖の３’末端から伸びる少なくとも１個の対合しないヌクレオチドを意味する。従って、特定の態様では、ｓｉＲＮＡは、１乃至約６ヌクレオチドの長さ、１乃至約５ヌクレオチドの長さ、１乃至約４ヌクレオチドの長さ、又は約２乃至約４ヌクレオチドの長さである、少なくとも１個の３’末端オーバーハング（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む）を含む。特別の態様では、３’末端オーバーハングはｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、長さは２ヌクレオチドである。例えば、ｓｉＲＮＡの各鎖は、ジチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’末端オーバーハングを含むことができる。
【０１１３】
ｓｉＲＮＡは、単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して上述したように、化学的に若しくは生物学的に作製することができ、又は、組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現することもできる。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を作製し、分析する典型的な方法は、Ｇｅｗｉｒｔｚ、米国特許出願第２００２／０１７３４７８号、及びＲｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許出願第２００４／００１８１７６号、に記載されており、両文献ともにその全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
任意のｍｉＲ遺伝子の発現は、アンチセンス核酸によって阻害することもできる。本明細書で用いる「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ‐ＲＮＡ、ＲＮＡ‐ＤＮＡ、又はＲＮＡ‐ペプチド核酸の相互作用によって標的ＲＮＡと結合する核酸分子を意味し、これによって標的ＲＮＡの活性を変化させる。本方法での使用に適したアンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物の連続する核酸配列と相補的な核酸配列を一般的に有する一本鎖核酸（例：ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ‐ＤＮＡキメラ、ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物の連続する核酸配列に対して、５０乃至１００％の相補性、７５乃至１００％の相補性、又は９５乃至１００％の相補性を有する核酸配列を含むことができる。特定のヒトｍｉＲ遺伝子産物の核酸配列を表１ａ及び表１ｂに示す。理論に束縛されるものではないが、アンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸二重鎖を分解するＲＮａｓｅＨ又は他の細胞内のヌクレアーゼを活性化すると考えられる。
【０１１５】
アンチセンス核酸は、核酸バックボーン又は糖及び塩基部分（若しくはこれらと同等のもの）に修飾部位を有することもでき、それによって標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達性、若しくはその他のこの分子の効力と関連する性質を高めることができる。そのような修飾部位としては、コレステロール部分、アクリジンなどの二重鎖インターカレーター、又は１若しくは２個以上のヌクレアーゼ耐性基が挙げられる。
【０１１６】
アンチセンス核酸は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して上述したように、化学的に若しくは生物学的に作製することができ、又は、組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現することもできる。作製及び分析の典型的な方法は本技術分野の範囲内であり、例えば、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｈｅｎｇ（１９９３）, Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００４、及びＷｏｏｌｆ ｅｔ ａｌ.、米国特許第５，８４９，９０２号を参照のこと。
【０１１７】
ｍｉＲ遺伝子産物の発現は、酵素核酸によって阻害することもできる。本明細書で用いる「酵素核酸」とは、ｍｉＲ遺伝子産物の連続する核酸配列に対して相補性を有する基質結合領域を含む核酸を意味し、ｍｉＲ遺伝子産物を特異的に切断することができる。酵素核酸の基質結合領域は、例えば、ｍｉＲ遺伝子産物の連続する核酸配列に対して、５０乃至１００％の相補性、７５乃至１００％の相補性、又は９５乃至１００％の相補性を有することができる。酵素核酸は、塩基、糖、及び／又はリン酸基に修飾部位を有することもできる。本方法に使用される典型的な酵素核酸は、リボザイムである。
【０１１８】
酵素核酸は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して上述したように、化学的に若しくは生物学的に作製することができ、又は、組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現することもできる。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を作製し、分析する典型的な方法は、Ｗｅｒｎｅｒ ａｎｄ Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ （１９９５），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. ２３：２０９２‐９６；Ｈａｍｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．(１９９９)，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ９：２５‐３１；及び、Ｃｅｃｈ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９８７，０７１号に記載されており、これらの全開示内容は参照することで本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ発現を阻害する少なくとも１種類の化合物を投与することにより、癌（例：膵臓癌）を有する対象の癌細胞の増殖を阻害する。本明細書で用いる「癌細胞の増殖を阻害する」とは、細胞を殺すこと、又は、永久に若しくは一時的に細胞の成長を停止若しくは遅延させることを意味する。ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物の投与後に、対象中のそのような細胞の数が一定であるか又は減少すれば、癌細胞の増殖が阻害されたと推察することができる。また、そのような細胞の絶対数が増加しても、腫瘍の成長速度が減少すれば、やはり癌細胞の増殖が阻害されたと推察することができる。
【０１２０】
対象の体内の癌細胞の数は、直接測定することができ、又は、一次腫瘍塊若しくは転移性腫瘍塊の大きさから算出することもできる。例えば、対象中の癌細胞の数は、免疫組織学的方法、フローサイトメトリー、又は癌細胞の 特徴的な表面マーカーを検出するように設計されたその他の技術によって測定することができる。
【０１２１】
腫瘍塊の大きさは、視覚による直接観察、又は、Ｘ線、磁気共鳴画像法、超音波、及びシンチグラフィーなどの画像診断法によって確認することができる。腫瘍塊の大きさを確認するための画像診断法の使用にあたっては、本技術分野で公知のように、造影剤を用いても用いなくてもよい。腫瘍塊の大きさは、組織塊の触診、又はノギスなどの測定器具による組織塊の測定などの物理的手段によって確認することもできる。
【０１２２】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、これらの化合物を対象の癌細胞へ送達するのに適したいかなる手段によっても対象へ投与することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、これらの化合物で、若しくはこれらの化合物をコードする配列を有する核酸で対象の細胞をトランスフェクトするのに適した方法によって投与することができる。一つの態様では、細胞は、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を有するプラスミド又はウイルスベクターでトランスフェクトされる。
【０１２３】
真核細胞に対するトランスフェクションの方法は本技術分野で公知であり、例えば、細胞の核若しくは前核への核酸の直接注入、エレクトロポレーション、リポソームによる輸送若しくは親油性物質の媒介による輸送、受容体の媒介による核酸の送達、微粒子銃（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）又は粒子加速、リン酸カルシウム沈殿、及びウイルスベクターの媒介によるトランスフェクションなどが挙げられる。
【０１２４】
例えば、細胞は、例えば、ＤＯＴＡＰ（Ｎ‐［１‐（２，３‐ジオレオイロキシ）プロピル‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモニウムメチルサルフェート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ‐Ｍａｎｎｈｅｉｍ)、又はリポフェクチンなどのその同等物、などのリポソーム系輸送化合物によってトランスフェクトすることができる。使用する核酸の量は本発明の実践には重要ではなく、１０５個の細胞に対して０．１乃至１００マイクログラムの核酸によって、許容される結果を得ることができる。例えば、１０５個の細胞に対して、３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中約０．５マイクログラムのプラスミドベクター、という比率を用いることができる。
【０１２５】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、さらに、適切ないかなる経腸的、又は非経口的投与経路によっても、対象へ投与することができる。本方法における適切な経腸的投与経路としては、例えば、経口、直腸内、又は鼻腔内送達が挙げられる。適切な非経口的投与経路としては、例えば、血管内投与（例：静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、及び脈管構造中へのカテーテルによる点滴注入）；組織周囲、及び組織内注射（例：腫瘍周囲及び腫瘍内注射、網膜内注射、又は網膜下注射）；皮下注入（浸透圧ポンプによる、など）を含む皮下注射若しくは皮下沈着；例えば、カテーテル若しくはその他の設置デバイス（例：網膜植込錠（ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｅｌｌｅｔ）、又は坐薬、又は多孔性、無孔性、若しくはゼラチン状物質を含むインプラント）による対象である組織への直接投与；並びに吸入、が挙げられる。特に適する投与経路は、注射、注入、及び腫瘍への直接注射である。
【０１２６】
本方法では、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、ＲＮＡ単体として、送達試薬と組み合わせて、又はｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例：組換えプラスミド、又はウイルスベクター）として対象へ投与することができる。適切な送達試薬としては、例えば、Ｍｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬、リポフェクチン、リポフェクタミン、セルフェクチン、ポリカチオン（例：ポリリシン）、及リポソームが挙げられる。
【０１２７】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物を発現する配列を有する組換えプラスミド及びウイルスベクター、及びそのようなプラスミド及びベクターを癌細胞へ送達するための技術は、本明細書に記載されており、及び／又は、本技術分野で公知である。
【０１２８】
特別の態様では、リポソームを用いて、ｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、これらをコードする配列を有する核酸）を対象へ送達する。リポソームは、遺伝子産物又は核酸の血中半減期を伸ばすことができる。本発明における使用に適したリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成することができ、これには通常、中性若しくは負に帯電したリン脂質及びコレステロールなどのステロールが含まれる。脂質の選択は、一般に、所望のリポソームの大きさ、及び血流中でのリポソームの半減期などの要因を考慮して行なう。リポソームを調製する方法としては、例えば、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；並びに、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、及び第５，０１９，３６９号、に記載のように、種々の方法が公知である。
【０１２９】
本方法に用いられるリポソームは、リポソームを癌細胞に対して標的化させるリガンド分子を含むことができる。腫瘍細胞抗原と結合するモノクローナル抗体など、癌細胞中に蔓延する受容体と結合するリガンドが好ましい。
【０１３０】
本方法に用いられるリポソームは、修飾することによって、単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び細網内皮系（「ＲＥＳ」）によるクリアランスを避けることもできる。そのような修飾されたリポソームは、表面又はリポソーム内部に取り込まれる形で、オプソニン化阻害部分を有する。特に好ましい態様では、本発明のリポソームは、オプソニン化阻害部分及びリガンドの両方を有することができる。
【０１３１】
本発明のリポソームの調製に用いるオプソニン化阻害部分は、通常、リポソーム膜と結合する高分子親水性ポリマーである。本明細書で用いる、オプソニン化阻害部分がリポソーム膜と「結合」しているとは、例えば、脂溶性アンカーの膜自体の内部へのインターカレーション、又は膜脂質の活性基との直接結合により、化学的又は物理的に膜と接触している状態のことである。例えば、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、米国特許第４，９２０，０１６号、に記載のように、このようなオプソニン化阻害親水性ポリマーは、表面保護層を形成し、リポソームのＭＭＳ及びＲＥＳによる取り込みを著しく低下させる。
【０１３２】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化阻害部分は、数平均分子量が約５００乃至約４００００ダルトンの水溶性ポリマーであることが好ましく、より好ましくは約２０００乃至約２００００ダルトンである。そのようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、若しくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、又は、例えば、メトキシＰＥＧ若しくはＰＰＧ、及び、ＰＥＧ若しくはＰＰＧのステアリン酸エステルなどの、これらの誘導体；ポリアクリルアミド、若しくはポリＮ‐ビニルピロリドンなどの合成ポリマー；直鎖、分岐鎖、若しくはデンドリマー状のポリアミドアミン；ポリアクリル酸；例えば、カルボキシル基若しくはアミノ基が化学的に結合したポリビニルアルコール、及びポリキシリトール、並びにガングリオシドＧＭ１などのガングリオシドなどのポリアルコール、が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、若しくはメトキシＰＰＧ、又はこれらの誘導体の共重合体も適している。さらに、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧと、ポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレオチドとのブロック共重合体であってもよい。オプソニン化阻害ポリマーは、例えば、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナンなどの、アミノ酸若しくはカルボン酸を含む天然の多糖類；アミノ化多糖類若しくはオリゴ糖類（直鎖、若しくは分岐鎖）；又は、例えば、カルボン酸誘導体と反応させた結果カルボキシル基が結合したもの、などのカルボキシル化多糖類若しくはオリゴ糖類であってもよい。好ましくは、オプソニン化阻害ポリマーは、ＰＥＧ、ＰＰＧ、又はこれらの誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは、「ペグ化リポソーム」と称することがある。
【０１３３】
オプソニン化阻害部分は、数多くの公知の技術の中のいずれか一つによって、リポソーム膜と結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ‐ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ホスファチジルエタノールアミン脂溶性アンカーと結合させ、続いて膜と結合させることができる。同様に、デキストランポリマーは、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３、及び、３０：１２の比率のテトラヒドロフランと水との混合物、などの混合溶媒を用いた６０℃での還元アミノ化反応によって、ステアリルアミン脂溶性アンカーで誘導体化することができる。
【０１３４】
オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、未修飾のリポソームに比べて非常に長く循環中に維持される。このため、そのようなリポソームは「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」リポソームと呼ばれることがある。ステルスリポソームは、多孔性又は「漏出性（ｌｅａｋｙ）」である微小脈管構造によって供給されて、組織中に蓄積することが知られている。従って、例えば、固形腫瘍など、そのような微小脈管構造の欠陥を特徴とする組織は、このようなリポソームを効率的に蓄積することになる。Ｇａｂｉｚｏｎ，ｅｔ ａｌ．(１９８８)，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，１８：６９４９‐５３を参照のこと。さらに、ＲＥＳによる取り込みが減少することによって、肝臓及び脾臓内でリポソームが大量に蓄積されることが防がれ、ステルスリポソームの毒性が低下する。従って、オプソニン化阻害部分で修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、これらをコードする配列を有する核酸）の腫瘍細胞への送達に特に適している。
【０１３５】
ｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、対象へ投与する前に、本技術分野で公知の技術に従い、「薬物」と称することもある医薬組成物として製剤することができる。従って、本発明は、膵臓癌を治療するための医薬組成物を包含する。一つの態様では、医薬組成物は、少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又は単離されたその変異体若しくは生物活性断片、及び薬理学的に許容される担体を含む。特別の態様では、この少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、適切なコントロール細胞と比べて膵臓癌細胞中での発現レベルが低下した（すなわち、下方制御された）ｍｉＲ遺伝子産物に対応する。特定の態様では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。一つの態様では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１５ａでもｍｉＲ‐１６‐１でもない。追加的な態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１０でもｍｉＲ‐２１２でもない。別の態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１でもｍｉＲ‐１４３でもｍｉＲ‐２０５でもｍｉＲ‐９でもない。さらに別の態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐１９１、Ｒ‐１２６＊、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐２０５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐３０ａ‐５ｐ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐２１８‐２、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２０３、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１２、又はｍｉＲ‐９ではない。
【０１３６】
他の態様では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種類のｍｉＲ発現阻害化合物及び薬理学的に許容される担体を含む。特別の態様では、この少なくとも１種類のｍｉＲ発現阻害化合物は、コントロール細胞内よりも膵臓癌細胞内における発現の方が高い（すなわち、上方制御される）ｍｉＲ遺伝子産物に特異的である。特定の態様では、ｍｉＲ発現阻害化合物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される１又は２種類以上のｍｉＲ遺伝子産物に特異的である。一つの態様では、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１５ａにもｍｉＲ‐１６‐１にも特異的ではない。別の態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１０にもｍｉＲ‐２１２にも特異的ではない。さらに別の態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１にもｍｉＲ‐１４３にもｍｉＲ‐２０５にもｍｉＲ‐９にも特異的ではない。さらに別の態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐１９１、Ｒ‐１２６＊、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐２０５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐３０ａ‐５ｐ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐２１８‐２、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２０３、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１２、又はｍｉＲ‐９に特異的ではない。
【０１３７】
本発明の医薬組成物は、少なくとも無菌であり、パイロジェンを含有しないことを特徴とする。本明細書で用いる「医薬組成物」は、ヒト及び獣医学での使用のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は、本技術分野の範囲内であり、例えば、その全開示内容が参照することで本明細書に組み入れられる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．(１９８５)、に記載されている。
【０１３８】
本医薬組成物は、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、そのｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を有する少なくとも１種類の核酸）（例：０．１乃至９０重量％）、又はその生理学的に許容される塩を、薬理学的に許容される担体と混合された形で含む。特定の態様では、本発明の医薬組成物は、さらに、１若しくは２種類以上の抗癌剤（例：化学療法薬）を含む。本発明の医薬製剤も、リポソームによって封入された少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、そのｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を有する少なくとも１種類の核酸）、及び薬理学的に許容される担体を含むことができる。一つの態様では、医薬組成物は、ｍｉＲ‐１５、ｍｉＲ‐１６、ｍｉＲ‐１４３、及び／若しくはｍｉＲ‐１４５ではないｍｉＲ遺伝子又は遺伝子産物を含む。
【０１３９】
特に適切な薬理学的に許容される担体は、水、緩衝水、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、などである。
【０１４０】
特別の態様では、本発明の医薬組成物は、ヌクレアーゼによる分解に対して耐性を有する少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、そのｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を有する少なくとも１種類の核酸）を含む。当業者であれば、例えば、２’位で修飾された１若しくは２個以上のリボヌクレオチドをｍｉＲ遺伝子産物中へ取り込むことによって、ヌクレアーゼ耐性を有する核酸を容易に合成することができる。適切な２’位修飾リボヌクレオチドとしては、２’位においてフルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ、及びＯ‐アリルで修飾されたものが含まれる。
【０１４１】
本発明の医薬組成物は、さらに、従来の医薬賦形剤及び／又は添加剤を含むことができる。適切な医薬賦形剤としては、安定化剤、抗酸化剤、重量モル浸透圧濃度調節剤、バッファー、及びｐＨ調節剤が挙げられる。適切な添加剤としては、例えば、生理学的に生体適合性であるバッファー（例：トロメタミン塩酸塩）、キレート化剤（例えば、ＤＴＰＡ若しくはＤＴＰＡビスアミドなど）若しくはカルシウムキレート錯体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡビスアミドなど）である添加剤、又は、任意に、カルシウム塩若しくはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、若しくは乳酸カルシウム）である添加剤が含まれる。本発明の医薬組成物は、液体の形で使用するように包装してもよく、又は、凍結乾燥してもよい。
【０１４２】
本発明の固体医薬組成物に対しては、従来の無毒性である固体の薬理学的に許容される担体を使用することができ、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム、などである。
【０１４３】
例えば、経口投与のための固体医薬組成物は、上記で挙げた担体及び賦形剤のいずれか、及び、１０乃至９５％、好ましくは２５乃至７５％の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、それらをコードする配列を有する少なくとも１種類の核酸）を含むことができる。エアロゾル（吸入）投与のための医薬組成物は、０．０１乃至２０重量％、好ましくは１乃至１０重量％の、上述のようにリポソームで封入された少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、そのｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を有する少なくとも１種類の核酸）、及び噴霧剤を含むことができる。必要に応じて、例えば鼻腔内送達のためのレシチンなどの担体を含めることもできる。
【０１４４】
本発明の医薬組成物は、さらに、１又は２種類以上の抗癌剤を含むことができる。特別の態様では、組成物は、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（又は、そのｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を有する少なくとも１種類の核酸）、及び少なくとも１種類の化学療法薬を含む。本発明の方法に適した化学療法薬としては、ＤＮＡアルキル化剤、抗腫瘍性抗生物質、抗代謝剤、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、ホルモン拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＨＭＧ‐ＣｏＡ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイクリン阻害剤、カスパーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンチセンス核酸、三重らせんＤＮＡ、核酸アプタマー、並びに、分子修飾したウイルス剤、バクテリア剤、及び外毒素剤（ｅｘｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物に適した薬剤の例としては、シチジンアラビノシド（ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）、メトトレキサート、ビンクリスチン、エトポシド（ＶＰ‐１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、デキサメサゾン、アルグラビン（ａｒｇｌａｂｉｎ）、シクロホスファミド、サルコリシン、メチルニトロソウレア、フルオロウラシル、５‐フルオロウラシル（５ＦＵ）、ビンブラスチン、カンプトテシン、アクチノマイシン‐Ｄ、マイトマイシンＣ、過酸化水素、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ＣＰＴ‐１１、タクソール、タモキシフェン、ダカルバジン、リツキシマブ、ダウノルビシン、１‐β‐Ｄ‐アラビノフラノシルシトシン、イマチニブ、フルダラビン、ドセタキセル、及びＦＯＬＦＯＸ４、が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本発明はさらに、膵臓癌の抗癌剤を識別する方法も包含し、その方法は、試験薬剤を細胞へ提供すること、及び、その細胞中における少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。一つの態様では、その方法は、試験薬剤を細胞へ提供すること、及び、膵臓癌細胞中での発現レベルの低下を伴う少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適切なコントロール（例：コントロール細胞内のｍｉＲ遺伝子産物のレベル）と比べたその細胞内でのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの上昇により、その試験薬剤が膵臓癌の抗癌剤であることが示される。特別の態様では、膵臓癌細胞中での発現レベルの低下を伴う少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐３２６、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐３３９、ｍｉＲ‐３４ｃ、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１５２、ｍｉＲ‐３７２、ｍｉＲ‐１２８ａ、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。一つの態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｌｅｔ７ａ‐２、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｇ、ｌｅｔ‐７ｉ、ｍｉＲ‐７‐２、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐９、ｍｉＲ‐９‐１、ｍｉＲ‐１０ａ、 ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐１５ｂ、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐１７‐５ｐ、ｍｉＲ‐２０ａ、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐３０、ｍｉＲ‐３０ａ‐５ｐ、ｍｉＲ‐３０ｃ、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐３１、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐３４、ｍｉＲ‐３４ａ、ｍｉＲ‐３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐３４ａ‐１、ｍｉＲ‐３４ａ‐２、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐９６、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１２３、ｍｉＲ‐１２４ａ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２６＊、ｍｉＲ‐１２７、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐１２９、ｍｉＲ‐１２９‐１／２  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３５‐１、ｍｉＲ‐１３６、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１４１、ｍｉＲ‐１４２‐ａｓ、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１４８、ｍｉＲ‐１４９、ｍｉＲ‐１５３、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐１５９‐１、ｍｉＲ‐１８１、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１８６、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐１９５、ｍｉＲ‐１９６‐１、ｍｉＲ‐１９６‐１  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１９６‐２、ｍｉＲ‐１９９ａ‐１、ｍｉＲ‐１９９ａ‐２、ｍｉＲ‐１９９ｂ、ｍｉＲ‐２００ｂ、ｍｉＲ‐２０２、ｍｉＲ‐２０３、ｍｉＲ‐２０４、ｍｉＲ‐２０５、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐２１１、ｍｉＲ‐２１２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐２１５、ｍｉＲ‐２１７、ｍｉＲ‐２２１、及び／又はｍｉＲ‐２２３の１又は２種類以上ではない
【０１４６】
他の態様では、この方法は、試験薬剤を細胞へ提供すること、及び、膵臓癌細胞中での発現レベルの上昇を伴う少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含む。適切なコントロール（例：コントロール細胞内のｍｉＲ遺伝子産物のレベル）と比べたその細胞内における膵臓癌中で発現レベルの上昇を伴うそのｍｉＲ遺伝子産物のレベルの低下により、その試験薬剤が膵臓癌の抗癌剤であることが示される。特別の態様では、膵臓癌細胞中での発現レベルの上昇を伴う少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、ｍｉＲ‐１０３‐２、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１０３‐１、ｍｉＲ‐３４２、ｍｉＲ‐１００、 ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐１２５ａ、ｍｉＲ‐２６ａ‐１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐３６８、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐２６ａ‐２、ｍｉＲ‐３３５、ｍｉＲ‐１２６、ｍｉＲ‐１‐２、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐９３、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１４５、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐２、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐１９７、ｍｉＲ‐１０ａ、ｍｉＲ‐２２４、ｍｉＲ‐９２‐１、ｍｉＲ‐２７ａ、ｍｉＲ‐２２１、ｍｉＲ‐３２０、ｍｉＲ‐７‐１、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐１５０、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐２９ａ、ｍｉＲ‐２３ｂ、ｍｉＲ‐１３５ａ‐２、ｍｉＲ‐２２３、ｍｉＲ‐３ｐ２１‐ｖ、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐３０ｂ、ｍｉＲ‐２９ｂ‐１、ｍｉＲ‐１０６ｂ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐２９ｃ、ｍｉＲ‐３６７、ｍｉＲ‐３０ｃ‐２、ｍｉＲ‐２７ｂ、ｍｉＲ‐１４０、ｍｉＲ‐１０ｂ、ｍｉＲ‐２０、ｍｉＲ‐１２９‐１、ｍｉＲ‐３４０、ｍｉＲ‐３０ａ、ｍｉＲ‐３０ｃ‐１、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐９５、ｍｉＲ‐２２２、ｍｉＲ‐３０ｅ、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐３４５、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１‐１、ｍｉＲ‐１３３ａ‐１、ｍｉＲ‐２００ｃ、ｍｉＲ‐１９４‐１、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐１８１ｃ、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐２２０、ｍｉＲ‐２１３、ｍｉＲ‐３２３、ｍｉＲ‐３７５、及びこれらの組み合わせから成る群より選択される。一つの態様では、ｍｉＲ遺伝子産物は、ｌｅｔ７ａ‐２、ｌｅｔ‐７ｃ、ｌｅｔ‐７ｇ、ｌｅｔ‐７ｉ、ｍｉＲ‐７‐２、ｍｉＲ‐７‐３、ｍｉＲ‐９、ｍｉＲ‐９‐１、ｍｉＲ‐１０ａ、 ｍｉＲ‐１５ａ、ｍｉＲ‐１５ｂ、ｍｉＲ‐１６‐１、ｍｉＲ‐１６‐２、ｍｉＲ‐１７‐５ｐ、ｍｉＲ‐２０ａ、ｍｉＲ‐２１、ｍｉＲ‐２４‐１、ｍｉＲ‐２４‐２、ｍｉＲ‐２５、ｍｉＲ‐２９ｂ‐２、ｍｉＲ‐３０、ｍｉＲ‐３０ａ‐５ｐ、ｍｉＲ‐３０ｃ、ｍｉＲ‐３０ｄ、ｍｉＲ‐３１、ｍｉＲ‐３２、ｍｉＲ‐３４、ｍｉＲ‐３４ａ、ｍｉＲ‐３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐３４ａ‐１、ｍｉＲ‐３４ａ‐２、ｍｉＲ‐９２‐２、ｍｉＲ‐９６、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１０３、ｍｉＲ‐１０６ａ、ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１２３、ｍｉＲ‐１２４ａ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２６＊、ｍｉＲ‐１２７、ｍｉＲ‐１２８ｂ、ｍｉＲ‐１２９、ｍｉＲ‐１２９‐１／２  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１３２、ｍｉＲ‐１３５‐１、ｍｉＲ‐１３６、ｍｉＲ‐１３７、ｍｉＲ‐１４１、ｍｉＲ‐１４２‐ａｓ、ｍｉＲ‐１４３、ｍｉＲ‐１４６、ｍｉＲ‐１４８、ｍｉＲ‐１４９、ｍｉＲ‐１５３、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐１５９‐１、ｍｉＲ‐１８１、ｍｉＲ‐１８１ｂ‐１、ｍｉＲ‐１８２、ｍｉＲ‐１８６、ｍｉＲ‐１９１、ｍｉＲ‐１９２、ｍｉＲ‐１９５、ｍｉＲ‐１９６‐１、ｍｉＲ‐１９６‐１  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ‐１９６‐２、ｍｉＲ‐１９９ａ‐１、ｍｉＲ‐１９９ａ‐２、ｍｉＲ‐１９９ｂ、ｍｉＲ‐２００ｂ、ｍｉＲ‐２０２、ｍｉＲ‐２０３、ｍｉＲ‐２０４、ｍｉＲ‐２０５、ｍｉＲ‐２１０、ｍｉＲ‐２１１、ｍｉＲ‐２１２、ｍｉＲ‐２１４、ｍｉＲ‐２１５、ｍｉＲ‐２１７、ｍｉＲ‐２２１、及び／又はｍｉＲ‐２２３の１又は２種類以上ではない
【０１４７】
適切な薬剤としては、薬物（例：低分子、ペプチド）及び生物的高分子（例：タンパク質、核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。薬剤は、組換えや合成によって作製することができ、又は、天然源より単離（すなわち、精製）することもできる。このような薬剤を細胞へ提供する種々の方法（例：トランスフェクション）が本技術分野で公知であり、そのような方法のいくつかは本明細書において上既されている。少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物の発現を検出する方法（例：ノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＴ‐ＰＣＲ、発現プロファイリング）も本技術分野で公知である。このような方法のいくつかについても本明細書に記載されている。
【０１４８】
以下に示す限定されない例により、本発明を例示する。
【実施例】
【０１４９】
材料と方法
患者データ、腫瘍性細胞濃縮、及びＲＮＡ抽出
イタリア、ベローナ大学、病理学部（Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｒｏｎａ）の凍結保存組織バンクより入手した４０個のＰＥＴ及び４個のＰＡＣＣの臨床病理学的特性を表２に示す。患者との直接の面談から得た個人及び家族の病歴から判断して、すべての腫瘍は散発性であった。ＰＥＴは、病理組織学的な細胞マーカー分析によって診断し、ＷＨＯの基準に従って分類した（Ｋｌｏｐｐｅｌ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｔｕｍｏｒｓ： Ｔｈｅ ＷＨＯ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．”Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１４：１３‐２７（２００４））。２８個の非機能性腫瘍と１２個の機能性腫瘍が含まれていた。２８個のＮＦ‐ＰＥＴには、１１個の高分化型内分泌腫瘍（ＷＤＥＴ）及び１８個の高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）が含まれていた。１２個のＦ‐ＰＥＴはインスリノーマであり、１１個のＷＤＥＴ及び１個のＷＤＥＣが含まれていた。ＷＤＥＴは、腫瘍の大きさ、Ｋｉ‐６７増殖指数、及び血管侵入を考慮するＷＨＯの基準に従って、その生物的挙動が良性又は不明と見なした（表２）。ＰＡＣＣの診断は、腫瘍性細胞中のリパーゼ、アミラーゼ、及びトリプシンのの免疫組織化学的発現によって確認した。コントロールとして、１２個の対応する患者の検体から正常膵臓を採取した。
【０１５０】
マイクロダイセクション又はクリオスタットによる濃縮により、すべてのケースにおいて、９０％超の腫瘍性細胞率が得られた。全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールズバッド）を用い、製造元の説明書に従って、少なくとも１０個の２０‐３０μｍの厚さのクリオスタット片から、５片ごとに細胞組成を確認しながら抽出した。全ＲＮＡの完全性は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州、パロアルト）を用いて、各ケースについて確認した。
【０１５１】
【表３４】
0005490413.tif 000035
【表３５】
0005490413.tif 000036
【０１５２】
マイクロＲＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション及び定量
マイクロＲＮＡマイクロアレイチップ上でのマイクロＲＮＡの標識とハイブリダイゼーションは、過去に報告された内容に従って行なった（Ｌｉｕ， Ｃ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，”Ａｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ‐Ｗｉｄｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ．” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０１：９７４０‐４４（２００４））。簡単に述べると、各サンプルからの全ＲＮＡ５μｇを、ビオチンで末端標識したランダム八量体を用いて逆転写した。ハイブリダイゼーションは、発明者らの独自仕様であるマイクロＲＮＡマイクロアレイチップ（ＯＳＣ‐ＣＣＣバージョン２．０）を用いて行い、これには、四つ組サンプルとして配置され、アノテートされた活性部位を有する４６０の成熟マイクロＲＮＡ用のプローブ（ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）２３５、ムスムスクルス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）２２２、アラビドプシスタリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）３）が含まれている。多くの場合、任意の成熟マイクロＲＮＡに対して、２個以上のプローブセットが存在する。さらに、マイクロＲＮＡ前駆体を検出するために、ほとんどのプレマイクロＲＮＡに対応する四つ組のプローブも有する。マイクロアレイはさらに、Ｕ６を含む、いくつかのスプライシングｓｎＲＮＡに対するプローブも有する。ハイブリダイゼーションシグナルは、ストレプトアビジン‐Ａｌｅｘａ６４７抱合体によって検出し、Ａｘｏｎ４０００Ｂを用いてスキャンした。スキャン画像は、Ｇｅｎｅｐｉｘ６．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（現在は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、カリフォルニア州、サニーベール）を用いて定量した。
【０１５３】
マイクロＲＮＡマイクロアレイデータのコンピュータ解析
ほとんどの解析及び画像は、Ｒソフトウェア ｖ．２．０．１、及びＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｖ．１．６パッケージ（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ，Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，”Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５：Ｒ８０（２００４））を用いて行なった。続いて、５６個のマイクロＲＮＡアレイのデータセットからブランク及びコントロールのスポットを除き、メジアンシグナルからローカルバックグラウンド（ｌｏｃａｌ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を差し引いた。次に、ｖｓｎパッケージにより、各アレイ内においてグリッドによって層別化される分散安定化変換を用いることで、データを標準化した。続いて、ｇｅｎｅｆｉｌｔｅｒパッケージを用いて、すべてのアレイについて、ブランクスポットの９９パーセンタイル値よりも低い強度であるスポットをすべて除いた。ブランク／ネガティブコントロールプローブに対する相対的ハイブリダイゼーション、及び続いて行なったノーザン分析により、ログ変換シグナルが４．５未満である絶対値には信頼性がないことが示された。
【０１５４】
得られたデータは、さらにｓａｍｒパッケージを用いて、直接二群不対比較（ｄｉｒｅｃｔ  ｔｗｏ  ｃｌａｓｓ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）によって分析した。タイトルに具体的に示される入力基準（倍率変化値（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ）及びデルタ値に基づく）を適用することで、異なった発現をしたマイクロＲＮＡの表が得られた。厳密性を高めるために、マイクロＲＮＡプローブをさらにフィルターにかけ、反復実験のうちの少なくとも３個が有意であるものを残した。
【０１５５】
階層的クラスタ解析は、Ｔｕｋｅｙのメジアンポリッシュアルゴリズムを適用することで得られた反復実験のスポットの集約値を用いて行なった。解析は、成熟マイクロＲＮＡ配列を含む、四分位範囲の最も広い最初の２００個のプローブを用いて行った。サンプル及び遺伝子のクラスタリングに使用した距離関数は、各々、ピアソン相関及びユークリッド距離であった。凝集法は、完全連結法であった。結果はＭａｐｌｅ  Ｔｒｅｅ（バージョン０．２．３．２）（ｗｗｗ．ｍａｐｌｅｔｒｅｅ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ）を用いて視覚化した。データはすべて、ＭＩＡＭＥｘｐｒｅｓｓを用いてＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓデータベースへ送付した。
【０１５６】
マイクロＲＮＡ間の協調発現のレベルをピアソン相関によって測定し、マイクロＲＮＡ遺伝子は、その距離が５０ｋｂ未満の場合に同じクラスタとした（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，”Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｆｒｅｑｕｅｎｔ  Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ  ｍｉＲＮＡｓ  ａｎｄ  Ｈｏｓｔ  Ｇｅｎｅｓ．”ＲＮＡ  １１：２４１‐４７（２００５））。次に、測定した同じクラスタに所属するマイクロＲＮＡ間の相関値一式を、そのクラスタ内の各マイクロＲＮＡとそのクラスタ外の他の全マイクロＲＮＡとの間の相関値一式と、マンホイットニーの非パラメトリック検定を用いて比較した。
【０１５７】
ノーザンブロッティング
５μｇの全ＲＮＡを、１５％ＣｒｉｔｅｒｉｏｎをプレキャストしたＰＡＧＥ／尿素ゲル（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）上で電気泳動にかけ、Ｈｙｂｏｎｄ‐Ｎ＋メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）に移し、３２Ｐ末端標識ＤＮＡプローブにより、ＵＬＴＲＡｈｙｂ（商標）‐Ｏｌｉｇｏハイブリダイゼーションバッファー（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州、オースチン）中、３７℃で一晩ハイブリダイズした。メンブレンを、２Ｘ ＳＳＣ／０．５％ＳＤＳを各々用いて３７℃で２回、３０分間洗浄した。ＤＮＡプローブは、成熟マイクロＲＮＡ、及びコントロールとしての５Ｓ ＲＮＡに対するアンチセンスヌクレオチドであった。フィルターは、Ｔｙｐｈｏｏｎ９４１０ホスフォイメージャー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）を用いて分析し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＴＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）を用いて定量した。ブロットは、０．１％ＳＤＳ水溶液中で５分間煮沸することでストリッピングを行い、数回リプロービングした。
【０１５８】
結果
マイクロＲＮＡ発現プロファイルを、１２個の正常膵臓サンプル、及び４０個のＰＥＴと４個のＰＡＣＣを含む４４個の膵腫瘍について、独自仕様のマイクロアレイを用いて求めた。このプラットフォームは、過去のいくつかの研究（Ｌｉｕ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０１：９７４０‐４４ （２００４)；Ｃａｌｉｎ，Ｇ．， ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３（１７）：１７９３‐１８０１(２００５)；Ｉｏｒｉｏ，Ｍ．Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６５：７０６５‐７０（２００５））で確認されているように、ロバストな結果をもたらすことが示された。ゲノムによるクラスタ内で物理的に繋がっているマイクロＲＮＡが共発現したということの発見もさらなる証拠をもたらし、グループ化したマイクロＲＮＡ遺伝子が協調発現を示すこと（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ  １１：２４１‐４７（２００５）；Ａｌｔｕｖｉａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：２６９７‐２７０６（２００５））が確認された。
【０１５９】
２００個の最も多様であるマイクロＲＮＡを用いた階層的クラスタによる教師なし解析により、膵内分泌腫瘍と膵腺房腫瘍を正常膵臓から区別する共通のマイクロＲＮＡ発現パターンが示された（図１Ａ‐１Ｅ）。特に、ＰＡＣＣは、すべてのＰＥＴを含む大きなクラスタの一部である固有のクラスタに分類され、一方、インスリノーマとＮＦ‐ＰＥＴとの間には明確なパターンはなかった。
【０１６０】
群比較解析（ｃｌａｓｓ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）により、ＰＡＣＣ又はＰＥＴと正常組織との間で、いくつかのマイクロＲＮＡが異なった発現をし、一方、少数のマイクロＲＮＡがＰＥＴとＰＡＣＣとの間、並びにＰＥＴのサブグループであるＷＤＥＣとＰＡＣＣとの間で異なった発現をしたことが確認された。特に、ＰＥＴは、正常膵臓と比べて上方制御されたマイクロＲＮＡが８７種類、下方制御されたマイクロＲＮＡが８種類であり（表３）、一方、ＰＡＣＣは、上方制御されたマイクロＲＮＡが３０種類、下方制御されたものが８種類であった（表４）。ＰＥＴとＰＡＣＣの間で異なって発現されたマイクロＲＮＡはわずかに１０種類であり（表５）、ＰＡＣＣと比べてＷＤＥＣに特有のものは４種類であった（表６）。
【０１６１】
【表３６】
0005490413.tif 000037
【０１６２】
【表３７】
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【０１６３】
【表３８】
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【０１６４】
【表３９】
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【０１６５】
【表４０】
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【０１６６】
【表４１】
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【０１６７】
【表４２】
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【０１６８】
【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【０１６９】
膵内分泌腫瘍及び膵線房腫瘍と正常膵臓を区別する共通のマイクロＲＮＡ発現パターン
ＰＡＣＣ対正常組織において見られた大多数の異なって発現するマイクロＲＮＡは、ＰＥＴ対正常組織でも見られた。特に、ＰＡＣＣ中で過剰発現された３０種類のマイクロＲＮＡのうち２８種類（９３％）が、ＰＥＴ中でも上方制御されることが分かった。同様に、７種類の過少発現されたマイクロＲＮＡのうちの５種類（７１％）が、両方の腫瘍サブタイプ中で下方制御された。このような共通点は、ＰＥＴとＰＡＣＣ間、又はＰＥＴのサブタイプ間において異なった発現をするマイクロＲＮＡは限られた種類でしかなかったという事実と合わせると、腺房腫瘍及び膵島由来の腫瘍に共通のマイクロＲＮＡ発現パターンの存在が示唆される。
【０１７０】
ＰＡＣＣにも共通するＰＥＴ中で上方制御されたマイクロＲＮＡの中で、７種類はノーザンブロット分析によって確認された。特に、ｍｉＲ‐１０３が、正常膵臓、腺房細胞癌、及び膵内分泌腫瘍のすべての対比較において最も良い識別因子であった（図２Ａ及び２Ｂ）。ｍｉＲ‐１０７の発現が、高い相同性を有するｍｉＲ‐１０３のそれと類似していること、及び正常組織に対して腫瘍中で、ｍｉＲ‐２３ａ、ｍｉＲ‐２６ｂ、ｍｉＲ‐１９２、及びｍｉＲ‐３４２が著しく過剰発現されることも確認された（図６Ａ‐６Ｃ）。
【０１７１】
ＰＥＴ中で下方制御されたマイクロＲＮＡの中で、ｍｉＲ‐１５５は、ＰＥＴ及びＰＡＣＣの両方においてノーザンブロット分析によって検出可能な発現が見られなかった（図２Ａ及び２Ｂ）。ｍｉＲ‐１５５はＰＡＣＣ中で下方制御される遺伝子の上位に挙げられるものではなかったが（表４）、この腫瘍種の中での低発現は、図２Ａの箱ひげ図に示すように、マイクロアレイによっても検出された。
【０１７２】
膵内分泌腫瘍と膵腺房腫瘍を区別する限られた種類のマイクロＲＮＡ
ＰＥＴとＰＡＣＣの直接比較によって示された、上方制御されたマイクロＲＮＡはわずかに１０種類（表５）であり、それらはすべて、正常組織と比べてＰＥＴ中でも過剰発現された。対照的に、ＰＡＣＣ中で特異的に下方制御又は上方制御されたマイクロＲＮＡはなかった。
【０１７３】
インスリノーマに特異的であり、インスリンの免疫組織化学的発現と相関するｍｉＲ‐２０４の過剰発現
インスリノーマをＮＦ‐ＰＥＴと比較することによって識別した、インスリノーマ中で著しく過剰発現するマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ‐２０４、その相同体ｍｉＲ‐２１１、及びｍｉＲ‐２０３を含む３種類のみであった（表７）。とりわけ、免疫組織化学染色法によって検出したインスリンタンパク質の発現は、インスリンｍＲＮＡの発現よりも、ｍｉＲ‐２０４の発現と強い相関を示した（図３Ａ‐３Ｃ）。実際、ＩＣＨ染色の陰性又は陽性に基づいたロジスティック回帰分析では、インスリンタンパク質の発現はインスリンｍＲＮＡ及びｍｉＲ‐２０４の発現の両方によって予想されたが（Ｐ＜０．００１）、多変量モデルでは、ｍｉＲ‐２０４の発現のみが統計的な有意性（Ｐ＜０．００１）を保持することが示された。
【０１７４】
ｍｉＲ‐３７５はマウス膵島中で特異的に発現し、インスリン開口分泌の負の制御因子として機能すると提唱されたことから（Ｐｏｙ，Ｍ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：２２６‐３０（２００４））、発明者らは、正常ヒト組織中及び発明者らのサンプル中でのその発現をノーザンブロットによって調べた。いくつかのヒト成人組織に一群を用いたところ、ｍｉＲ‐３７５は正常膵臓でのみ検出された（図７Ａ）。ｍｉＲ‐３７５の発現レベルは、正常膵臓に比べて腫瘍中の方が一般に高かったが、インスリノーマと非機能性腫瘍との間では違いは見られなかった（図７Ｂ及び７Ｃ）。
【０１７５】
増殖指数及び肝臓転移の存在と強い関連性を示すｍｉＲ‐２１の発現
発現プロファイルを評価して、転移の状態又は増殖指数に基づいてＰＥＴを区別するマイクロＲＮＡを識別したところ、有意であったのはｍｉＲ‐２１のみであった（図４Ａ‐４Ｃ及び表８）。この２つの腫瘍特性が互いに関連していることを考えると、これは驚くにあたらない。実際、転移性ＰＥＴはすべて＞２％の増殖指数を有しており、一方、増殖スコアの低い腫瘍で転移性であるものはなかった。さらに、ｍｉＲ‐２１によって、ＮＦ‐ＰＥＴ又はＷＤＥＣの増殖指数が高いもの（Ｋｉ‐６７＞２％）と低いもの（Ｋｉ‐６７≦２％）も区別された。別の興味深い結果としては、ｍｉＲ‐２１が、正常膵臓と比べてＰＡＣＣ中でも過剰発現したことである（表４）。
【０１７６】
異なって発現されたマイクロＲＮＡに対する推定ｍＲＮＡ標的の識別
３つの異なるプログラム（ｍｉＲａｎｄａ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＰｉｃＴａｒ、各々、ｗｗｗ．ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｏｒｇ／ｍａｍｍａｌｉａｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ／；及びｗｗｗ．ｐｉｃｔａｒ．ｂｉｏ．ｎｙｕ．ｅｄｕ、より入手可能）を用いて、選択されたマイクロＲＮＡ、すなわち、ｍｉＲ‐１０３／ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐２０４／ｍｉＲ‐２１１、及びｍｉＲ‐２１、の推定標的を識別した。分析の厳密性を高めるため、３つのアルゴリズムすべてで発見された標的遺伝子のみを考慮した（表９）。マイクロＲＮＡ発現の分析を行った同じ腫瘍サンプル及び５個の正常膵臓は、独自仕様のＥＳＴマイクロアレイ（データは示さず）による遺伝子発現プロファイルの評価も行なったため、ＰＥＴ及び正常組織中、並びに臨床病理学的特性の異なるＰＥＴ中での推定ｍＲＮＡ標的の状態の評価も試みた。２サンプルｔ検定により、下方制御又は上方制御されたいくつかの推定標的遺伝子、すなわち、ｍｉＲ‐１０３／１０７に対しては２８種類の上方制御遺伝子及び７種類の下方制御遺伝子、ｍｉＲ‐１５５又はｍｉＲ‐２０４／２１１に対しては２種類の上方制御遺伝子及び２種類の下方制御遺伝子、ｍｉＲ‐２１に対しては１種類の上方制御遺伝子及び１種類の下方制御遺伝子を識別した（表１０）。とりわけ、ｍｉＲ‐２１の推定標的であるＰＤＣＤ４遺伝子のｍＲＮＡ発現は、肝臓転移性ＰＥＴ中、並びに増殖指数の高い腫瘍中での下方制御が見られ、ｍｉＲ‐２１の発現との逆相関を示した（図５）。
【０１７７】
考察
正常膵臓、膵内分泌腫瘍、及び腺房癌中でのマイクロＲＮＡ発現プロファイルを調べた結果は、以下のようにまとめることができる：
ｉ）共通のマイクロＲＮＡ発現プロファイルにより、内分泌腫瘍及び腺房腫瘍の両方が正常膵臓から区別される；
ｉｉ）ｍｉＲ‐１５５の発現の欠如を伴うｍｉＲ‐１０３及びｍｉＲ‐１０７の発現により、腫瘍が正常な膵臓と区別される；
ｉｉｉ）限られた数のマイクロＲＮＡが内分泌腫瘍に特異的であり、内分泌分化又は内分泌腫瘍形成と関連する可能性がある；
ｉｖ）ｍｉＲ‐２０４の発現は主にインスリノーマで発生し、インスリンの免疫組織化学的発現と相関がある；そして、
ｖ）ｍｉＲ‐２１の発現は、増殖指数及び肝臓転移と強い関連性を示す。
発現プロファイルの教師なし階層的クラスタリングにより、両腫瘍種が正常膵臓から区別されることが示された。ＰＡＣＣは固有のクラスタに分類されたが、これはすべてのＰＥＴを含むより大きなクラスタの一部であった。正常組織に対してＰＥＴ中で発現が異なるマイクロＲＮＡは、正常組織に対する腺房癌よりも多く識別されたが、ＰＡＣＣ中で異なった発現をするマイクロＲＮＡの大部分はＰＥＴ中でも同様の変化を示した。膵臓塊は主に腺房から形成されるため、腺房細胞癌の分析において正常状態の対応物として理想的であり、一方、膵内分泌腫瘍に対しては、膵島細胞が正常状態の対応物となるであろうということには着目すべきである。残念なことに、発明者らはこれらの細胞の製剤を入手できなかった。しかしながら、上方制御された２８種類、及び下方制御された５種類の遺伝子を含む、腺房腫瘍と膵島腫瘍との間で異なって発現するマイクロＲＮＡのパターンが概ね一致することが見られたことは、この両方の腫瘍種に共通の組み合わせが、膵臓の腫瘍化と関連性を持つ可能性があることを示唆している。この考えをさらに支持するものとして、両方の腫瘍種で異なった発現をするいくつかのマイクロＲＮＡは、乳癌、大腸癌、及びＢ細胞白血病において異なった発現をすることが示された（Ｃａｌｄａｓ，Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７１２‐１４（２００５）；Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ，Ｃｅｌｌ  １２２：６‐７（２００５）；Ｉｏｒｉｏ，Ｍ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：７０６５‐７０（２００５））。さらに、発明者らの腫瘍サンプル中で異なった発現をしたマイクロＲＮＡのうち少なくとも２０種類が、Ａ５４９肺癌又はＨｅＬａ子宮頚癌細胞系内において、増殖に関連する効果、又はアポトーシス効果を有することが確認されている（Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：１２９０‐９７（２００５））。
【０１７８】
さらに、ＰＡＣＣ及びＰＥＴの両方において、ｍｉＲ‐１７、ｍｉＲ‐２０、及びｍｉＲ‐９２‐１の協調した過剰発現が見られ、これらはポリシストロニック性のクラスタに含まれる。このｍｉＲ‐１７‐９２クラスタは、ｃ‐ＭＹＣ遺伝子と共に発癌遺伝子として作用することが報告されている（Ｈｅ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３５：８２８‐３３（２００５））。特に、膵内分泌腫瘍中、及び過形成膵島中でもｃ‐ＭＹＣの過剰発現が報告されており、このことはこの遺伝子が膵島腫瘍形成の初期フェーズに関与していることを示唆している（Ｐａｖｅｌｉｃ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１６：１７０７‐１７（１９９６））。さらに、インビトロ若しくはインビボでマウスの膵島細胞、又は腺房細胞へＭＹＣを導入したモデルでは、それぞれ、分泌腫瘍（Ｋａｔｉｃ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０：１５２１‐２７（１９９９）；Ｌｅｗｉｓ，Ｂ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：３１２７‐３８（２００３））、又は混合型の腺房癌／管腺癌（ｍｉｘｅｄ  ａｃｉｎａｒ／ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）（Ｓａｎｄｇｒｅｎ，Ｅ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：９３‐９７（１９９１））が発生し、一方、ＭＹＣに誘起されたアポトーシスを抑えることにより、膵島細胞癌が引き起こされる（Ｐｅｌｅｎｇａｒｉｓ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０９：３２１‐３４（２００２））。
【０１７９】
ｍｉＲ‐１５５の発現の欠如を伴う、高い相同性を有するｍｉＲ‐１０３及びｍｉＲ‐１０７マイクロＲＮＡの発現は、正常膵臓サンプルと比較した場合の腫瘍サンプルに特徴的であった。興味深いことに、ｍｉＲ‐１０３／ｍｉＲ‐１０７はいくつかの腫瘍種中で過剰発現されることが報告されている（Ｓｔｅｆａｎｏ  Ｖｏｌｉｎｉａ，Ｇｅｏｒｇｅ  Ａ．Ｃａｌｉｎ， ａｎｄ  Ｃａｒｌｏ  Ｍ．Ｃｒｏｃｅ、発明の名称”Ｍｉｃｒｏ‐ＲＮＡ‐Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｃａｎｃｅｒｓ”、米国特許出願第    号；本願と同日に出願されたＡｔｔｏｒｎｅｙ  Ｄｏｃｋｅｔ、米国特許出願第    号；これらの全教示内容は参照することで本明細書に組み入れられる）。ｍｉＲ‐１５５が正常膵臓中では発現されたがＰＥＴ及びＰＡＣＣの両方では過少発現されたか又は発現されなかったということは、ｍｉＲ‐１５５の過剰発現がリンパ腫中（Ｃａｌｄａｓ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７１２‐１４（２００５）；Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ，Ｃｅｌｌ  １２２：６‐７（２００５））及び乳癌中（Ｉｏｒｉｏ，Ｍ．Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：７０６５‐７０（２００５））で観察されており、この発見がｍｉＲ‐１５５が発癌性マイクロＲＮＡではないかとする見方の基になっていることを考えると、かなり興味深い。このことは、成人中で発現するマイクロＲＮＡが組織に特異的であり（Ｂａｂａｋ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  １０：１８１３‐１９（２００４））、マイクロＲＮＡの異所性発現の結果が、マイクロＲＮＡに制御されるｍＲＮＡの細胞に特異的な発現パターンに大きく依存する（Ｃｈｅｎｇ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：１２９０‐９７（２００５））ことから、予想外のことではないであろう。
【０１８０】
１０種類のマイクロＲＮＡがＰＥＴ中で独特の過剰発現をし、これによってこの腫瘍がＰＡＣＣ及び正常膵臓の両方から区別された。これに含まれるのは、ｍｉＲ‐９９ａ、ｍｉＲ‐９９ｂ、ｍｉＲ‐１００、ｍｉＲ‐１２５ａ，ｍｉＲ‐１２５ｂ‐１、ｍｉＲ‐１２５ｂ‐２、ｍｉＲ‐１２９‐２、ｍｉＲ‐１３０ａ、ｍｉＲ‐１３２、及びｍｉＲ‐３４２であった。これらのマイクロＲＮＡは、内分泌分化又は内分泌腫瘍形成の特徴であろう。他方、ＰＡＣＣサンプルの数が限られていたことが分析能力に影響を与えた可能性はあるが、ＰＡＣＣ中で特異的に上方制御又は下方制御されたマイクロＲＮＡは見られなかった。
【０１８１】
インスリノーマと非機能性内分泌腫瘍との間でマイクロＲＮＡのプロファイルはほとんど区別できなかったが、２種類の密接に関連しているマイクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲ‐２０４とｍｉＲ‐２１１、の過剰発現は、主にインスリノーマに限られていた。非常に興味深いことは、ｍｉＲ‐２０４の発現が、インスリンの免疫組織化学的発現と相関を示したことである。この点で、ｍｉＲ‐３７５がマウスの膵島中で特異的に発現し、インスリンの開口分泌の負の制御因子として機能することが最近報告された（Ｐｏｙ，Ｍ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３２：２２６‐３０（２００４））。発明者らのデータによると、このマイクロＲＮＡはヒトの正常膵臓中、並びに腺房細胞腫瘍及び内分泌腫瘍中で発現することが示された。しかし、インスリノーマと非機能性内分泌腫瘍との間で、発現レベルの違いは見られなかった。
【０１８２】
マイクロＲＮＡの発現がＰＥＴの臨床特性と相関を示すかどうかの確認も行なった。その結果によると、ｍｉＲ‐２１の過剰発現は高いＫｉ‐６７増殖指数及び肝臓転移と関連性があることが示された。ｍｉＲ‐２１の過剰発現は、神経膠芽腫、乳癌、肺癌、及び大腸癌を含むいくつかの癌で観察されている（Ｃａｌｄａｓ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７１２‐１４（２００５）；Ｃｒｏｃｅ，Ｃ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇ．Ａ．Ｃａｌｉｎ，Ｃｅｌｌ  １２２：６‐７（２００５））。ｍｉＲ‐２１の癌関連の機能は、神経膠芽腫細胞系内でのノックダウン実験によっても裏付けられており、このマイクロＲＮＡが抗アポトーシス機能を有することを示している（Ｃｈａｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：６０２９‐３３（２００５））。この点で、ｍｉＲ‐２１の推定標的であるプログラム細胞死４型（ＰＤＣＤ４）遺伝子は、転移性及び高増殖指数のＰＥＴサンプル中で大きく下方制御され、ｍｉＲ‐２１の発現と逆相関の関係にあることが分かった。この遺伝子は、ｐ２１ｗａｆｌの活性化、及び転移因子複合体ＡＰ‐１の阻害を通して腫瘍の抑制因子として作用し、後者は細胞侵入と転移の進行への関与が示唆される遺伝子を制御することが報告されている（Ｊａｎｓｅｎ，Ａ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．３：１０３‐１０（２００４））。さらに、ＰＤＣＤ４の発現は、肺癌、乳癌、大腸癌、及び前立腺癌の進行した癌腫中では失われ（Ｇｏｋｅ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８７：Ｃ１５４１‐４６（２００４））、特に、ＰＤＣＤ４の腫瘍の抑制因子としての役割は、神経内分泌腫瘍細胞のモデルでも報告されている（Ｇｏｋｅ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０１４：２２０‐２１（２００４））。
【０１８３】
ＰＥＴ中で異なった発現をしたマイクロＲＮＡは、染色体腕部の間での選択的な分布を示し、５ｑ、７ｑ、１３ｑ、及び１９ｑの染色体腕部に位置するほどんどのマイクロＲＮＡは過剰発現した。この結果は、ポリシストロニック性のクラスタ内のマイクロＲＮＡとの高頻度の会合によるものか（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ  １１：２４１‐４７（２００５）；Ａｌｔｕｖｉａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：２６９７‐２７０６（２００５））、又は、これらのマイクロＲＮＡを含む染色体腕部の増幅によるものであろう。発明者らの分析では、この両方の現象がともにＰＥＴと関与している可能性を示している。実際、クラスタ内のマイクロＲＮＡの対の間で測定した相関係数は、クラスタ外のマイクロＲＮＡの対の間で測定したものと大きく異なっていた。これらのデータは、ＰＥＴ中で一群のマイクロＲＮＡ遺伝子が協調発現を示すという一般的な観察結果を裏付けるものである（Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ，Ｓ．ａｎｄ  Ｄ．Ｐ．Ｂａｒｔｅｌ，ＲＮＡ  １１：２４１‐４７（２００５）；Ａｌｔｕｖｉａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：２６９７‐２７０６（２００５））。
【０１８４】
マイクロＲＮＡは、特定のｍＲＮＡを標的として分解や翻訳阻害を行なうことによってその生物学的効果を発揮する。例えば、ｍｉＲ‐１０３／ｍｉＲ‐１０７、ｍｉＲ‐１５５、ｍｉＲ‐２０４／ｍｉＲ‐２１１、及びｍｉＲ‐２１などの、膵腫瘍中で発現に変化を示す最も興味深いマイクロＲＮＡの生物学的な意味合いに関する見識を得るため、３種類の異なるアルゴリズム（結果、を参照）で識別されたものの間で共通の推定標的を調べた。そして、同一の腫瘍及び正常サンプルのＥＳＴ発現プロファイルを利用して、マイクロＲＮＡとその推定標的の発現の間に相関があるかどうかを評価した。発明者らのＥＳＴマイクロアレイに含まれていた選択された標的の中で、いくつかの上方制御された遺伝子と下方制御された遺伝子を発見した。興味深いことに、ｍｉＲ‐１０３／ｍｉＲ‐１０７の推定標的遺伝子は、予想よりも過剰発現されることが多かった。この結果は、１７種類の異なるマウス組織一式において、マイクロＲＮＡの発現とその推定ｍＲＮＡ標的との間の相関が低いことを報告したＢａｂａｋ  ｅｔ  ａｌ．による結果（Ｂａｂａｋ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  １０：１８１３‐１９（２００４））と一致するものである。このことは、ほとんどのマイクロＲＮＡがｍＲＮＡの分解を伴わない翻訳阻害を通して作用する可能性が高いとする、現在支持されているモデル（Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．Ｐ．，Ｃｅｌｌ  １１６：２８１‐９７（２００４））を裏付けるものである。
【０１８５】
結論としては、本明細書に示す結果は、マイクロＲＮＡの発現の変化は、内分泌及び腺房腫瘍化、並びに悪性腫瘍の進行と関連していることを示唆している。
【０１８６】
本明細書で引用し、参照することで本明細書に組み入れられることが明示されていないすべての刊行物の該当する全教示内容は、参照することで本明細書に組み入れられる。さらに、具体的な受託番号によって本明細書で識別されるヌクレオチド配列（例：マイクロＲＮＡヌクレオチド配列）も、そのすべてが参照することで本明細書に組み入れられる。本発明を、その好ましい態様を用いて詳細に示し、説明したが、当業者であれば、添付の請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱しない限りにおいて、本発明の形態及び細部について種々の変更が可能であることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
本特許又は出願ファイルには少なくとも１個のカラー図面が含まれる。カラー図面付きの本特許又は特許出願公開公報のコピーは、必要な料金と共に米国特許商標局へ申請することで提供されるであろう。
【図１】図１Ａは、１２個の正常な膵臓（Ｎｏｒｍａｌ）、並びに、２２個の高分化型膵内分泌腫瘍（ＷＤＥＴ）、１８個の高分化型膵内分泌癌（ＷＤＥＣ）、及び４個の膵腺房細胞癌（ＡＣＣ）を含む４４個の膵腫瘍（図の最上部に記載）に対するｍｉＲＮＡ発現の教師なしの階層的クラスタを示す図である。ＷＤＥＴサンプルには、１１個のインスリノーマ（ＩＮＳ）及び１個の非機能性ＰＥＴ（ＮＦ）が、ＷＤＥＣサンプルには１個のＩＮＳ及び１７個のＮＦ‐ＰＥＴが含まれていた。分析は、メディアンポリッシュアルゴリズム（ｍｅｄｉａｎ  ｐｏｌｉｓｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用して得られた反復実験スポット（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ  ｓｐｏｔ）の集約値を用い、成熟マイクロＲＮＡ配列を含む、四分位範囲の広い最初の２００個のプローブを選択することで行なった。特に、ＰＡＣＣサンプルは、すべてのＰＥＴを含む大きなクラスタの一部である固有のクラスタに分類され、一方、インスリノーマとＮＦ‐ＰＥＴとの間には明確なパターンはなかった。図に示すように、共通するマイクロＲＮＡの発現パターンにより、膵内分泌腫瘍及び膵腺房腫瘍が、正常な膵臓と区別される。図１Ｂは、正常組織に比べてＰＥＴ中で上方制御されることが分かった特定のマイクロＲＮＡを示す図である（上方制御されたマイクロＲＮＡは赤色で示す）。図１Ｃは、正常組織に比べてＰＥＴ中で上方制御されることが分かった特定のマイクロＲＮＡを示す図である（上方制御されたマイクロＲＮＡは赤色で示す）。  図１Ｄは、非機能性ＰＥＴに比べてインスリノーマ中で上方制御される２種類のマイクロＲＮＡを示す図である（上方制御されたマイクロＲＮＡは青色で示す）。図１Ｅは、正常組織に比べてＰＥＴ中で下方制御されることが分かった特定のマイクロＲＮＡを示す図である（下方制御されたマイクロＲＮＡは緑色で示す）。
【図２】図２Ａは、１２個の正常な膵臓（Ｎｏｒｍａｌ）、並びに、２２個の高分化型膵内分泌腫瘍（ＷＤＥＴ）、１８個の高分化型膵内分泌癌（ＷＤＥＣ）、及び４個の膵腺房細胞癌（ＡＣＣ）を含む４４個の膵腫瘍のマイクロアレイ分析によって測定した、ｍｉＲ‐１０３及びｍｉＲ‐１５５の発現レベルを示す箱ひげ図である。強度の中央値を太線で示す。図から分かるように、ｍｉＲ‐１０３の過剰発現及びｍｉＲ‐１５５の発現の欠如が、膵島腫瘍及び膵腺房腫瘍で顕著である。図２Ｂは、図２Ａに示すマイクロアレイ発現データに対応する、ノーザンブロット分析を示す図である。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。
【図３】図３Ａは、１２個の正常な膵臓（Ｎｏｒｍａｌ）、１２個のインスリノーマ、２８個の非機能性膵内分泌腫瘍（ＮＦ‐ＰＥＴ）、及び４個の膵腺房細胞癌（ＡＣＣ）のマイクロアレイ分析によって測定した、ｍｉＲ‐２０４の発現レベルを示す箱ひげ図である。強度の中央値を太線で示す。図３Ｂは、ｍｉＲ‐２０４の発現と免疫組織化学（ＩＨＣ）によって評価したインスリン染色との間の強い相関を示すグラフである。図３Ｃは、マイクロアレイによる発現データを確認するノーザンブロット分析を示す図であり、ｍｉＲ‐２０４の過剰発現はインスリノーマに特異的であることが分かる。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。
【図４】図４Ａは、マイクロアレイ分析で測定したｍｉＲ‐２１の発現レベルの、肝臓転移のある膵内分泌腫瘍（Ｍｅｔａ＋）とないもの（Ｍｅｔａ−）との間での違いを示す箱ひげ図である。図から分かるように、ｍｉＲ‐２１の発現は肝臓転移の存在と強い関連性がある。図４Ｂは、マイクロアレイ分析で測定したｍｉＲ‐２１の発現レベルの、Ｋｉ６７を用いた免疫組織化学的手法で測定した増殖指数が＞２％の腫瘍（高）と≦２％（低）の腫瘍との間での違いを示す箱ひげ図である。図から分かるように、ｍｉＲ‐２１の発現は腫瘍の増殖指数と強い関連性がある。図４Ｃは、マイクロアレイによる発現データを確認するノーザンブロット分析を示す図である。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。
【図５】ｍｉＲ‐２１及びＰＤＣＤ４ｍＲＮＡの、正常膵臓中（＊）、転移性ＰＥＴ中（▲）、及び非転移性ＰＥＴ中（△）における発現を示すグラフである。ロバスト局所加重回帰関数（ｒｏｂｕｓｔ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いてデータポイントを直線回帰させた。図から分かるように、ｍｉＲ‐２１とその推定ｍＲＮＡ標的であるＰＤＣＤ４との発現の間には、逆相関の関係がある。
【図６】図６Ａは、実験を行なったすべての膵臓インスリノーマ及び非機能性内分泌腫瘍（ＮＦ‐ＰＥＴ）におけるｍｉＲ‐２６ｂ及びｍｉＲ‐１０７の過剰発現を示すノーザンブロット分析の図である。この結果により、マイクロＲＮＡの過剰発現を示すマイクロアレイのデータが確認される。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。図６Ｂは、実験を行なったすべての膵臓インスリノーマ及び非機能性内分泌腫瘍（ＮＦ‐ＰＥＴ）におけるｍｉＲ‐２３ａ及びｍｉＲ‐３４２の過剰発現を示すノーザンブロット分析の図である。この結果により、マイクロＲＮＡの過剰発現を示すマイクロアレイのデータが確認される。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。図６Ｃは、８個の高分化型内分泌腫瘍（ＷＤＥＴ）のうち４個、４個の高分化型内分泌癌（ＷＤＥＣ）のすべて、及び１個の腺房細胞癌（ＡＣＣ）でのｍｉＲ‐１９２の過剰発現を示すノーザンブロット分析の図である。この結果により、マイクロＲＮＡの過剰発現を示すマイクロアレイのデータが確認される。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。
【図７】図７Ａは、ｍｉＲ‐３７５が膵臓に特異的なｍｉＲであることを示すノーザンブロット分析の図である。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。  図７Ｂは、ｍｉＲ‐３７５の発現が、臨床的に明らかなインスリンの過剰分泌の存在（インスリノーマ）又は非存在（ＮＦ‐ＰＥＴ）に関係なく、膵内分泌腫瘍及び膵腺房腫瘍の特徴であることを示すノーザンブロット分析の図である。ＮＦ‐ＰＥＴは非機能性膵内分泌腫瘍である。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。図から分かるように、ｍｉＲ‐３７５の発現は、膵島腫瘍及び膵腺房腫瘍に共通である。  図７Ｃは、ｍｉＲ‐３７５の発現が、臨床的に明らかなインスリンの過剰分泌の存在（インスリノーマ）又は非存在（ＮＦ‐ＰＥＴ及びＡＣＣ）に関係なく、膵内分泌腫瘍及び膵腺房腫瘍の特徴であることを示すノーザンブロット分析の図である。ＮＦ‐ＰＥＴは非機能性膵内分泌腫瘍、ＡＣＣは膵腺房細胞癌である。ローディングコントロールは５ＳｒＲＮＡ（５Ｓ‐ＲＮＡ）とした。図から分かるように、ｍｉＲ‐３７５の発現は、膵島腫瘍及び膵腺房腫瘍に共通である。
【図１Ａ−１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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