(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の対象における、抗原に対する抗原特異的免疫応答を誘導するための免疫原性組成物であって、
（ａ）ＤＮＡプラスミドによるその発現に対する調節配列による調節の下で、抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む一番目の組成物；および
（ｂ）少なくとも一つの、組換え水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）によるその発現に対する調節配列による調節の下で、該抗原をコード化する核酸配列を含む、組換えＶＳＶを含む二番目の組成物
を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
該ＶＳＶが複製可能である、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
該ＶＳＶが複製できない、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
該一番目の組成物がサイトカイン組成物をさらに含む、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
該サイトカイン組成物が、ＤＮＡプラスミドによるその発現に対する調節配列による調節の下で、サイトカインをコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む核酸組成物を含む、請求項４記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
該サイトカインが、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
該抗原が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、それらの断片または融合体であり、該タンパク質が、細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、癌細胞、腫瘍細胞、アレルゲンおよび自己分子からなる群から選択されるメンターに由来する、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
該ＤＮＡプラスミド組成物が、医薬上許容される希釈剤、賦形剤またはキャリアに投与される、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
該賦形剤がブピバカインを含む、請求項８記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
該ｒＶＳＶ組成物が、医薬上許容される希釈剤、賦形剤またはキャリアに投与される、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
哺乳類の対象における抗原特異的免疫応答を誘導するための方法に利用するためのキットであって、
ＤＮＡプラスミドによるその発現に対する調節配列による調節の下で、抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む、少なくとも一つの一番目の組成物；
組換え水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）によるその発現に対する調節配列による調節の下で、該抗原をコード化する核酸配列を含む組換えＶＳＶを含む、少なくとも一つの二番目の組成物；および
該一番目および二番目の組成物の使用のための使用説明書
を含むキット。
【請求項１２】
該ＶＳＶが複製可能である、請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
該ＶＳＶが複製できない、請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
該一番目の組成物がサイトカイン組成物をさらに含む、請求項１１記載のキット。
【請求項１５】
該サイトカイン組成物が、ＤＮＡプラスミドによるその発現に対する調節配列による調節の下で、サイトカインをコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む核酸組成物を含む、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
哺乳類の対象における、抗原に対する免疫応答を誘導するための医薬の調製における、
（ａ）ＤＮＡプラスミドによるその発現に対する調節配列による調節の下で、該抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む、一番目の組成物；および
（ｂ）少なくとも一つの、組換え水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）によるその発現に対する調節配列による調節の下で、該抗原をコード化する核酸配列を含む、組換えＶＳＶを含む、二番目の組成物；
の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一部、米国政府（国立衛生研究所、認可番号ＮＩＨ  ＮＯ１−ＡＩ０５３９７およびＮＩＨ  ＮＯ１−ＡＩ２５４５８）からの基金によって援助されてきた。それゆえに、米国政府は本発明において特定の権益を有しうる。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
免疫原性組成物の効能を高めるために、タンパク質組成物、プラスミドを基にした組成物および組換えウィルス構築物を免疫原性組成物として用いた、様々な免疫原性組成物および方法が報告されてきた。先行する研究において、プラスミドを基にした免疫原性組成物は、全身投与をすると、タンパク質または組換えウィルスのような伝統的な抗原と共に、全身の免疫系に二次全身免疫を準備させることが立証されてきた（例えば、Ｘｉａｎｇら，１９９７年  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９：２５７−２６８；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊら、１９９８年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，４：３９７；およびＳｅｄｅｇｕｈ，Ｍら、１９９８年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９５：７６４８；Ｒｏｇｅｒ，Ｗ．Ｏ．ら、２００１年  Ｉｎｆｅｃ．＆Ｉｍｍｕｎ．，６９（９）：５５６５−７２；Ｅｏ，Ｓ．Ｋら、２００１年  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６（９）：５４７３−９；Ｒａｍｓｈａｗ  Ｉ．Ａ．およびＲａｍｓａｙ，Ａ．Ｊ．，２０００年  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１（４）：１６３−５参照）。
【０００３】
しばしば用いられるＤＮＡプライム／生ベクターブースト投与法は、ブーストのためのワクシニアウィルスを含む。最近の論文における例としては、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に対するような免疫化を含む（Ｈａｎｋｅ  Ｔ．ら、２００２年  Ｖａｃｃｉｎｅ．２０（１５）：１９９５−８；Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｒ．ら、２００２年  Ｖａｃｃｉｎｅ．２０（１５）：１９４９−５５；Ｗｅｅ  Ｅ．Ｇ．ら、２００２年  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８３（Ｐｔ１）：７５−８０；Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｒ．ら、２００１年  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９２（５５１４）：６９−７４）。ＤＮＡ、および単純ヘルペスウィルス２糖タンパク質Ｄ、リシュマニア・インファクタムＰ３６／ＬＡＣＫ抗原、プラスモディウム・ファルシパルムＴＲＡＰ抗原、ＨＩＶ／ＳＩＶ抗原、ネズミ結核抗原およびインフルエンザ抗原のような抗原を発現した、修飾したワクシニアウィルスベクターによるプライムブースト免疫化は、特定の抗体およびサイトカイン反応を誘導すると報告された（例えば、Ｍｅｓａｄａ  Ｃ．Ａ．ら、２００２年  Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１８６（８）：１０６５−７３；Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｒ．ら，２００２年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（１５）：７６２５−３１；Ｇｏｎｚａｌｏ  Ｒ．Ｍ．ら  ２００２年  Ｖａｃｃｉｎｅ，２０（７−８）：１２２６−３１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｊ．ら  ２００１年  Ｖａｃｃｉｎｅ，１９（３２）：４５９５−６０２；Ｈｅｌ  Ｚ．ら  ２００１年  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７（１２）：７１８０−９１；ＭｃＳｈａｎｅ  Ｈ．ら  ２００１年  Ｉｎｆｅｃ．＆Ｉｍｍｕｎ．６９（２）：６８１−６およびＤｅｇａｎｏ  Ｐ．ら  １９９９年  Ｖａｃｃｉｎｅ，１８（７−８）：６２３−３２インフルエンザ抗原およびマラリアモデル参照）。
【０００４】
プラスミドプライムアデノウィルスブースト遺伝子免疫化投与法は、αフェトプロテイン特異的腫瘍免疫を誘導し、豚コレラから豚を守ることが、最近報告されてきた（例えば、Ｍｅｎｇ  Ｗ．Ｓ．２００１年  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１（２４）：８７８２−６；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｍ．ら  ２００１年  Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．，８０（２）：１０１−１９；および米国特許第６２１０６６３号参照）。
【０００５】
他のＤＮＡプラスミドプライムウィルスブースト投与法が報告された。例えば、Ｍａｔａｎｏ  Ｔ．ら、２００１年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２３）：１１８９１−６（ＤＮＡプライム／センダイウィルスベクターブースト）を参照のこと。組換えポックスウィルスブーストを用いたＤＮＡプライミングは、ＨＩＶ−１治療について報告された（例えば、Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｊ．ら、１９９８年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１０１８０−８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．ら、１９９９年  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５：５２６−３４；およびＴａｒｔａｇｌｉａ，Ｊ．ら、１９９８年  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．，１４：Ｓ２９１−８参照）。
【０００６】
多くのＤＮＡプライム／ウィルスブースト投与法が評価されているけれども、現行の免疫化投与法はいくつかの不都合な点がある。例えば、これら上記のウィルスには、対象にて疾患の徴候を惹起するものがあり；生体内で組換えを起こす可能性のあるものもある。さらに他のウィルスは、製造するのが困難であり、および／または外来の遺伝子を取り込む能力に乏しい。さらに他のウィルスは、重要な前もって存在するヒトのベクター免疫によって引き起こされる不都合、および他の安全上の問題がある。
【０００７】
当該分野において、問題の抗原に対する細胞性および体液性免疫応答のレベルを上昇させ、安全性、製造の容易さ、およびブースター免疫化の際にベクターに対する哺乳類の宿主の自然免疫応答に打ち勝つことができることという要求を満たすことのできる、新しく且つ有用な免疫化投与法の必要性が残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第６２１０６６３号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｘｉａｎｇら，１９９７年  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１９：２５７−２６８
【非特許文献２】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊら、１９９８年  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，４：３９７
【非特許文献３】Ｓｅｄｅｇｕｈ，Ｍら、１９９８年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９５：７６４８
【非特許文献４】Ｒｏｇｅｒ，Ｗ．Ｏ．ら、２００１年  Ｉｎｆｅｃ．＆Ｉｍｍｕｎ．，６９（９）：５５６５−７２
【非特許文献５】Ｅｏ，Ｓ．Ｋら、２００１年  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６（９）：５４７３−９
【非特許文献６】Ｒａｍｓｈａｗ  Ｉ．Ａ．およびＲａｍｓａｙ，Ａ．Ｊ．，２０００年  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，２１（４）：１６３−５
【非特許文献７】Ｈａｎｋｅ  Ｔ．ら、２００２年  Ｖａｃｃｉｎｅ．２０（１５）：１９９５−８
【非特許文献８】Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｒ．ら、２００２年  Ｖａｃｃｉｎｅ．２０（１５）：１９４９−５５
【非特許文献９】Ｗｅｅ  Ｅ．Ｇ．ら、２００２年  Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８３（Ｐｔ１）：７５−８０
【非特許文献１０】Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｒ．ら、２００１年  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９２（５５１４）：６９−７４
【非特許文献１１】Ｍｅｓａｄａ  Ｃ．Ａ．ら、２００２年  Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１８６（８）：１０６５−７３
【非特許文献１２】Ａｍａｒａ  Ｒ．Ｒ．ら，２００２年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６（１５）：７６２５−３１
【非特許文献１３】Ｇｏｎｚａｌｏ  Ｒ．Ｍ．ら  ２００２年  Ｖａｃｃｉｎｅ，２０（７−８）：１２２６−３１
【非特許文献１４】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｊ．ら  ２００１年  Ｖａｃｃｉｎｅ，１９（３２）：４５９５−６０２
【非特許文献１５】Ｈｅｌ  Ｚ．ら  ２００１年  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７（１２）：７１８０−９１
【非特許文献１６】ＭｃＳｈａｎｅ  Ｈ．ら  ２００１年  Ｉｎｆｅｃ．＆Ｉｍｍｕｎ．６９（２）：６８１−６
【非特許文献１７】Ｄｅｇａｎｏ  Ｐ．ら  １９９９年  Ｖａｃｃｉｎｅ，１８（７−８）：６２３−３２インフルエンザ抗原およびマラリアモデル
【非特許文献１８】Ｍｅｎｇ  Ｗ．Ｓ．２００１年  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１（２４）：８７８２−６
【非特許文献１９】Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｊ．Ｍ．ら  ２００１年  Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．，８０（２）：１０１−１９
【非特許文献２０】Ｍａｔａｎｏ  Ｔ．ら、２００１年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２３）：１１８９１−６（ＤＮＡプライム／センダイウィルスベクターブースト）
【非特許文献２１】Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｊ．ら、１９９８年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１０１８０−８
【非特許文献２２】Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．ら、１９９９年  Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５：５２６−３４
【非特許文献２３】Ｔａｒｔａｇｌｉａ，Ｊ．ら、１９９８年  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ．，１４：Ｓ２９１−８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の開示）
本発明は、ＤＮＡプラスミド成分または組換えウィルス成分のいずれかを個別に投与した際に得られた結果と比較して、抗原に対する細胞性免疫応答に対して驚くべき相乗的な刺激を示す、プライム／ブースト投与法を介して、哺乳類の対象に病原性の抗原または他の抗原に対する免疫応答を誘導するための、新しい方法、組成物およびキットを提供する。
【００１１】
一の実施形態において、本発明は、哺乳類の対象において、抗原特異的免疫応答を誘導する新しい方法を提供する。本方法は、哺乳類細胞において、ＤＮＡプラスミドによるその発現を指令する調節配列の調節の下で、抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む一番目の組成物の有効量を、対象に投与することを含む。本方法はさらに、哺乳類細胞において、ｒＶＳＶによるその発現を指令する調節配列の調節の下で、抗原をコード化する核酸配列を含む組換え水疱性口内炎ウィルス（ｒＶＳＶ）を含む二番目の組成物の有効量を、対象に投与することを含む。一の実施形態において、組換えＶＳＶは、弱毒化された複製に適したウィルスである。もう一つ別の実施形態において、組換えＶＳＶは非複製ウィルスである。一番目および二番目の組成物の投与は、どのような順序であってもよい。その上、本発明は、一方の組成物を多数投与し、続いて他方の組成物を多数投与することを考慮している。一の実施形態において、好ましくは、サイトカインが共に投与される。
【００１２】
もう一つ別の実施形態において、本発明は、哺乳類の対象において、抗原に対する抗原特異的免疫応答を誘導するための免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、ＤＮＡプラスミドによるその発現を指令する調節配列の調節の下で、抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む一番目の組成物を含む。この組成物はまた、組換えＶＳＶによる、それらの発現に対する調節配列による調節の下で、同じ抗原をコード化する核酸配列を含む、少なくとも一つの複製に適した組換え水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）を含む。
【００１３】
さらにもう一つ別の実施形態において、本発明は、哺乳類の対象における抗原特異的免疫応答のレベルの増強を誘導する、治療法または予防法において利用するためのキットを提供する。キットは、特に、哺乳類細胞において、それらの発現に対する調節配列による調節の下で、抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む一番目の組成物を少なくとも一つ含み；哺乳類細胞において、それらの発現に対する調節配列による調節の下で、抗原をコード化する核酸配列を含む、複製に適した組換え水疱性口内炎ウィルス（ｒＶＳＶ）を含む二番目の組成物を少なくとも一つ含み；上記の方法の実践のための使用説明書を含む。
【００１４】
もう一つ別の実施形態において、本発明は、組成物において利用される抗原に対する、動物における免疫応答を誘導するための薬剤の調製において、上で記述した免疫原性組成物またはそれらの成分を利用する方法を提供する。
本発明の他の態様および実施形態は、以下の発明の詳細な記載にて開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、サル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）ｇａｇｐ３７タンパク質をコード化する、プラスミドＤＮＡを図解した概略図である。図は、プラスミドが、ｇａｇタンパク質、牛成長ホルモンポリアデニル化部位（ＢＧＨｐｏｌｙＡ）、複製配列の開始部位（ｏｒｉ）およびカナマイシン耐性（ｋａｎＲ）マーカー遺伝子の発現を起こす、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）プロモーター／エンハンサーを含むことを示している。図１Ｂは、アカゲザル（Rhesus）のインターロイキン１２の二つのサブユニットｐ３５およびｐ４０をコード化する、二シストロンのプラスミドＤＮＡを図解した概略図である。ｐ３５サブユニットは、ＨＣＭＶプロモーターの調節下にあり、ＳＶ４０ポリＡ部位を有する。ｐ４０サブユニットは、サルサイトメガロウィルス（ＳＣＭＶ）プロモーターの調節下にあり、ＢＧＨポリＡ部位を有し、逆方向に転写される。プラスミドはまた、ｏｒｉ配列およびｋａｎＲ遺伝子を含む。
【図２】図２は、本発明のプライム／ブースト投与法によって免疫化された動物に由来する、未分画の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における、ＶＳＶＮ特異的γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳスポット反応を示す棒グラフである。最も左側の黒い棒線は、インフルエンザ赤血球凝集素（ｆｌｕＨＡ）タンパク質を発現しているＶＳＶベクターのブーストと共に、ＳＩＶｇａｇタンパク質をコード化するＤＮＡプラスミドを用いた免疫化のプロトコールを表す。薄い灰色の棒線は、プライミングＤＮＡｇａｇプラスミド免疫化、続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶブーストを行うことを含む発明のプロトコールを表す。淡い色の棒線は、何もなしかまたは対照群のＤＮＡプラスミド（ｃｏｎＤＮＡ）によってプライミング免疫化、続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶを用いた免疫化を行うことを含むプロトコールを表す。最も右側の黒い棒線は、ｃｏｎＤＮＡプラスミドを用いたプライミング免疫化、続いてｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶによる免疫化を行うことを含むプロトコールを表す。各々のグループは、５つの動物から得られた結果を表す。
【図３】図３は、本発明のプライム／ブースト投与法によって免疫化された動物に由来する未分画のＰＢＭＣにおける、ＨＩＶｅｎｖ６１０１特異的γインターフェロン（ＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳスポット反応を示す棒グラフである。最も左側の薄い灰色の棒線はｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶベクターのブーストと共に、ＳＩＶｇａｇタンパク質をコード化するＤＮＡプラスミドを用いた免疫化のプロトコールを表す。横縞をつけた棒線は、プライミングＤＮＡｇａｇプラスミド免疫化、続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶブーストを行うことを含む発明のプロトコールを表す。チェッカーボード状の棒線は、空の対照群のＤＮＡによるプライミング免疫化、続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶを用いた免疫化を行うことを含むプロトコールを表す。点を打った棒線は、対照群のＤＮＡプラスミドを用いたプライミング免疫化、続いてｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶブーストによる免疫化を行うことを含むプロトコールを表す。各々のグループは、５つの動物から得られた結果を表す。アステリスクは、統計学的有意差がｐ＝０．０００１で生じたことを示している。
【図４】図４は、本発明のプライム／ブースト投与法によって免疫化された動物について、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）による血清抗ＳＩＶｇａｇｐ２７抗体滴定価を示すグラフである。プラスミドＤＮＡを、０日目、第４週および第８週に投与し、ＶＳＶ（血清型インディアナ（Indiana）Ｇ）およびＶＳＶ（血清型チャンディプラ（Chandipura）Ｇ）ブーストを、第１５週および第２３週にそれぞれ投与した。ｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶベクターのブーストと共に、ＳＩＶｇａｇタンパク質をコード化するＤＮＡプラスミドを用いて免疫化するプロトコールを、（◆）によって表している。プライミングＤＮＡｇａｇプラスミド免疫化、それに続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶブーストを行うことを含む発明のプロトコールを、（■）によって表している。空の対照群のＤＮＡによるプライミング免疫化、それに続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶを用いた免疫化を行うことを含むプロトコールを、（▲）によって表している。対照群のＤＮＡプラスミドを用いたプライミング免疫化、それに続いてｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶによる免疫化を行うことを含むプロトコールを、（●）によって表している。各々のグループは、５つの動物から得られた結果を表す。グループ間の統計的有意差は、ｐ＝０．００７３ (*)；ｐ＝０．５９４１(#) またはｐ＝０．００２７(￥)として示されている。
【図５】図５は、本発明のプライム／ブースト投与法によって免疫化された動物について、ＥＬＩＳスポットアッセイによって評価した、細胞１００万あたりのＳＩＶｇａｇ特異的スポット形成細胞を示すグラフである。プラスミドＤＮＡを、０日目、第４週および第８週に投与し、ＶＳＶ（血清型インディアナＧ）およびＶＳＶ（血清型チャンディプラＧ）ブーストを、第１５週および第２３週にそれぞれ投与した。ｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶベクターのブーストと共に、ＳＩＶｇａｇタンパク質をコード化するＤＮＡプラスミドを用いて免疫化するプロトコールを、（◆）によって表している。プライミングＤＮＡｇａｇプラスミド免疫化、それに続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶブーストを行うことを含む発明のプロトコールを、（■）によって表している。空の対照群のＤＮＡによるプライミング免疫化、それに続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶを用いた免疫化を行うことを含むプロトコールを、（▲）によって表している。（●）は、対照群のＤＮＡプラスミドを用いたプライミング免疫化、それに続いてｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶによる免疫化を行うことを含むプロトコールを表す。各々のグループは、５つの動物から得られた結果を表す。グループ間の統計的有意差は、ｐ＝０．０００１およびｐ＝０．０００２の括弧として示されている。
【図６】図６は、図５の結果中と同じ記号によって表されたプライム／ブーストの組み合わせによって誘導された免疫応答の向上が、免疫化後数日のＣＤ４Ｔ細胞の細胞数の減少の低下によって測定される、エイズに対する防御の上昇につながることを示しているグラフである。
【図７】図７は、図５の結果中と同じ記号によって表されたプライム／ブーストの組み合わせによって誘導された免疫応答の向上が、免疫化後数日の血漿中の循環ウィルス量（ウィルスコピー／ｍｌ）の低下によって測定される、エイズに対する防御の上昇につながることを示しているグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（発明の詳細な記載）
本発明は、以前の論文において記述された免疫原性組成物の特定の成分の組み合わせを用いて、その成分を最適化して驚くべき相乗効果を生むことによって、哺乳類の対象または脊椎動物の対象における、抗原特異的免疫応答を誘導する新しい方法を提供する。一般に、本方法は、哺乳類または脊椎動物細胞における、ＤＮＡプラスミドによる、それらの発現に対する調節配列による調節の下で、抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む、有効量の組成物を対象に投与することを含む。本方法はまた、複製に適した組換え水疱性口内炎ウィルス（ｒＶＳＶ）を含む、有効量の組成物を対象に投与する工程を含む。このｒＶＳＶは、哺乳類または脊椎動物細胞における、ｒＶＳＶによる、それらの発現に対する調節配列による調節の下で、抗原をコード化する核酸配列を含む。
【００１７】
順番に投与されるこれら二つの免疫原性組成物のうち最初のものは、プライミング組成物と呼ばれている。順番に投与されるこれら二つの免疫原性組成物のうち二番目のものは、ブースティング組成物と呼ばれている。従って、ＤＮＡ組成物はプライミング組成物として投与し、ＶＳＶベクター組成物はブースティング組成物として投与してよく、またはその逆であってもよい。一つの具体例として、プライミング組成物は、ブースティング組成物の投与に先立って、少なくとも一回または複数回対象に投与される。その後、ブースティング組成物は、続いて少なくとも一回または複数回対象に投与される。その上、本発明は、組成物の一方を複数回投与し、続いて他方の組成物を複数回投与することを考慮している。本方法は、さらに、有効量のサイトカインを本方法の一工程として投与することを考慮している。
【００１８】
この方法を実施することで、意外にも、ＤＮＡプラスミドまたは組換えＶＳＶを単独で投与することによって達成されるよりも強い、抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応の増強を含む、哺乳類の対象における免疫応答が誘導されるということが見出された。実際、以下の実施例において示されるように、免疫応答は二つの免疫原性組成物を組み合わせて付加することで予期されるよりも強い。従って、新しい方法によって誘導される免疫応答は、抗原に対する細胞および／または抗体反応を、劇的に且つ相乗的に増加させる。例えば、ＨＩＶ−１ｇａｇに対する抗原特異的細胞反応のピークが、ＤＮＡプラスミド免疫原性組成物の単独投与に対する反応よりも３倍以上、またはｒＶＳＶ免疫原性組成物の単独投与に対する反応よりもほぼ９倍高いことを示す、以下の表１、図４および５を参照のこと。
【００１９】
哺乳類の対象は霊長類、好ましくはヒトであることを想定しているけれども、本発明は哺乳類の対象が何であるかによって制限されない。この方法の要素は、以下において、および出典明示により本明細書の一部とする、当業者に知られた引用文献にて詳細に述べている。
【００２０】
Ａ．ＤＮＡプラスミド免疫原性組成物
この発明の免疫原性組成物は、免疫応答が起こることが望ましい、選別した抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む。プラスミドにおいて、選別した抗原は、哺乳類または脊椎動物細胞における、それらの発現の調節配列の調節の下にある。プラスミドそれ自身の成分は、一般的なものである。
【００２１】
この発明において有用な非ウィルス、プラスミドベクターは、選別した免疫原性抗原をコード化するＤＮＡ配列を含む、単離して精製したＤＮＡ配列を含む。ＤＮＡ分子は、ウィルス、または非ウィルス、例えば外来のまたは異種の核酸配列をコード化するように構築された細菌種に由来してよい。そのようなプラスミドまたはベクターは、ウィルスまたはファージに由来する配列を含み得る。多様な非ウィルスベクターが当該分野において知られており、プラスミド、細菌ベクター、バクテリオファージベクター、「裸の」ＤＮＡおよびカチオン性脂質またはポリマーと融合したＤＮＡを含んでいてよいが、それに限定されない。
【００２２】
細菌ベクターの例としては、特にカルメット−ゲラン菌、サルモネラ、シゲラ、イー・コリおよびリステリアに由来する配列を含むが、それだけには限定されない。適当なプラスミドベクターには、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＬＧ３３９、ｐＲ２９０、ｐＫ３７、ｐＫＣ１０１、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５１、ｐＫＨ４７、ｐＵＢ１１０、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３１３、ｐＭＬ２１、ＲＳＦ２１２４、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ｐＢＡＤ１８およびｐＢＲ３２８を含む。
【００２３】
適当な誘導性エシェリキア・コリ発現ベクターの例としては、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら、１９８８年  Ｇｅｎｅ、６９：３０１−３１５）、アラビノース発現ベクター（例えば、ｐＢＡＤ１８、Ｇｕｚｍａｎら、１９９５年  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７：４１２１−４１３０）、およびｐＥＴＩＩｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら、１９９０年  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５：６０−８９）を含む。ｐＴｒｃベクターによる標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主のＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴＩＩｄベクターによる標的遺伝子発現は、共発現されたウィルスＲＮＡポリメラーゼＴ７ｇｎ１によって媒介される、Ｔ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存している。このウィルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写調節下で、Ｔ７ｇｎ１遺伝子を含んでいる内在するプロファージから、宿主種のＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって与えられる。ｐＢＡＤ系は、ａｒａＣ遺伝子によって調節されている、誘導性アラビノースプロモーターに依存している。プロモーターは、アラビノースの存在下で誘導される。
【００２４】
望ましい哺乳類または脊椎動物の宿主における抗原の発現を引き起こす、プロモーターおよび他の調節配列は、その目的に有用であると知られている幅広いプロモーターのリストから同様に選別されてよい。多様なそのようなプロモーターは、以下に開示している。以下で記述している免疫原性ＤＮＡプラスミド組成物の具体例として、有用なプロモーターは、ヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（例えば、出典明示によって本明細書の一部とする、米国特許第５１６８０６２号および５３８５８３９号に記述されている）およびＳＣＭＶプロモーターエンハンサーである。
【００２５】
本発明の核酸配列、分子またはベクターに含まれている、追加の調節配列には、エンハンサー配列、ポリアデニル化配列、スプライシングドナー配列およびスプライシングアクセプター配列、翻訳されるポリペプチドの最初および末端にそれぞれ位置している転写開始および終結部位、転写された領域にある翻訳のためのリボソーム結合部位、エピトープタグ、核局在配列、ＩＲＥＳ分子、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓ「ＴＡＴＡ」分子、制限酵素解離部位、選別可能なマーカーおよびその類似物を含むが、それだけに限定されない。エンハンサー配列には、例えば、ＳＶ４０ＤＮＡの７２塩基対の直列反復配列、またはレトロウィルスの長い末端反復配列またはＬＴＲその他を含み、転写効率を増加させるために用いられる。
【００２６】
例えば、複製の起点、ポリアデニル化配列（例えば、ＢＧＨｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ）、薬剤耐性マーカー（例えば、カナマイシン耐性）およびその類似物を含めた、これら他のＤＮＡプラスミドにおける有用な成分はまた、実施例において記述されているものおよび以下で特に言及したものを含めた、広く知られた配列から選択してよい。
【００２７】
プロモーターおよび他の共通ベクター分子の選別は慣習的であり、非常に多くの配列が、この発明において有用なプラスミドを構築するために利用できる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク，（１９８９年）、および例えば３．１８−１．２６および１６．１７−１６．２７ページで引用されている参考文献、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８９年）を参照のこと。本発明において有用なプラスミドの全ての成分は、当業者によって、当該分野において知られた材料から容易に選別でき、医薬産業からも入手し得る。プラスミド成分および調節配列の選別は、本発明の範疇を制限するものであるとは考えていない。
【００２８】
免疫原性組成物において利用するための適当なＤＮＡプラスミド構造の例は、次の特許公報において詳細に記述されており、例えば特に国際特許公報番号ＷＯ９８／１７７９９、ＷＯ９９／４３８３９およびＷＯ９８／１７７９９；および米国特許第５５９３９７２号；５８１７６３７号；５８３０８７６号；および５８９１５０５号であり、ここに出典明示することにより本明細書の一部とする。
【００２９】
同様に、選別した抗原は、以下の考察において特定された抗原であってよい。本明細書の免疫原性組成物の具体例として、選別した抗原は、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆおよびｔａｔによって発現されるようなＨＩＶ−１抗原である。好ましくは、ＤＮＡプラスミドの抗原配列および他の成分は、目的の宿主に適したコドン選別、および全ての抑制配列の除去によって最適化され、そのことはまた抗原調製に関して以下で考察されている。
【００３０】
免疫原性組成物は、それゆえに、宿主において発現するための単一の選別した抗原をコード化する一つのプラスミドを含む。本方法に従って、プラスミド組成物はまた、一つより多くのコピーの同一の選別した抗原をコード化するＤＮＡ配列を含む一つのＤＮＡプラスミドを含む。あるいは、その組成物は、多数の選別した抗原を発現している一つのプラスミドを含んでいてよい。各々の抗原は、別々の調節分子または成分の調節下にあってよい。あるいは、各々の抗原は、同一の調節分子または成分の調節下にあってよい。さらに他の具体例として、ＤＮＡプラスミド組成物は、各々のＤＮＡプラスミドが同一または異なる抗原をコード化する、多数のプラスミドを含んでいてよい。
【００３１】
その上にさらなる実施形態において、ＤＮＡプラスミド免疫原性組成物は、一個体のＤＮＡプラスミド成分としてまたは抗原を含んでいるＤＮＡプラスミドの一部として、望ましいサイトカイン、リンホカインまたは他の遺伝的アジュバントをコード化するヌクレオチド配列をさらに含んでいてよい。核酸配列が利用可能である、適当なアジュバントの宿主は、以下において特定している。本発明において例示している具体例において、本発明のＤＮＡプラスミドと共に投与するために望ましいサイトカインは、インターロイキン１２である。
【００３２】
ＤＮＡプラスミド組成物は、望ましくは、以下で考察したように、医薬上許容された希釈剤、賦形剤またはキャリア中に投与される。本組成物は選別されたあらゆる投与経路で投与してもよいけれども、一つの具体例として、望ましい投与方法は、以下に記述するように、促進剤としてのブピバカインと共にプラスミドを含む組成物を、筋肉内に共に投与することである。
【００３３】
ＤＮＡ組成物がプライミング組成物である、本発明の方法の具体例として、本方法は、ｒＶＳＶに先立って、少なくとも一つのＤＮＡプラスミドを投与することを含み、そのプラスミドは、それに対する免疫応答が誘導されることが望ましい抗原をコード化する配列を含んでいる。他の具体例として、ＤＮＡプライミング組成物は、さらに、選別したサイトカインをコード化する二番目のプラスミドからなっている。さらに他の具体例として、以下に例示するように、ＤＮＡプライミング組成物は三つのプラスミドを含み、一つのプラスミドは一番目の抗原を発現しており、二番目のプラスミドは二番目の異なる抗原を発現しており、三番目のプラスミドは選別したサイトカインアジュバントを発現している。実施例において詳説しているように、ＤＮＡプライミング組成物の一つの具体例は、三つの最適化されたプラスミド、（１）ＲＮＡ最適化したＳＩＶｇａｇｐ３７遺伝子（図１Ａ参照）をコード化するプラスミド；（２）二つのプロモーターの個別の調節の下で、アカゲザルのインターロイキン１２のサブユニットｐ３５およびｐ４０をコード化するプラスミド；および（３）ＨＩＶ−１ｇｐ１６０ｅｎｖ遺伝子をコード化するプラスミドを含む。
【００３４】
プライミング組成物として用いる場合、このＤＮＡプラスミド組成物は、ブースティングｒＶＳＶ組成物に先立って、一回、好ましくは一回より多く投与される。ブースティング組成物として用いる場合、このＤＮＡプラスミド組成物は、プライミングｒＶＳＶ組成物の後に、一回、好ましくは一回より多く投与される。
【００３５】
Ｂ．ｒＶＳＶ免疫原性組成物
本発明の方法および組成物において有用な他の免疫原性組成物は、複製に適した、生きた、弱毒化した水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）輸送担体である。この組換えＶＳＶは、哺乳類または脊椎動物細胞において、それらの発現の調節配列による調節の下で、選別した抗原をコード化している核酸配列を含む。本発明の方法において、ＤＮＡプラスミド組成物中に用いられる抗原は、ｒＶＳＶ免疫原性組成物中に用いられるものと同一の抗原である。
【００３６】
ＶＳＶはウシのウィルスであり、分類学上、モノネガウィルスと称される目のメンバーであり、四つの内部構造タンパク質および一つの外部の膜貫通タンパク質をコード化する、１１ｋｂの非分節型のマイナス鎖ＲＮＡゲノムを含む。３’から５’の順序で、遺伝子は、ヌクレオカプシド（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、細胞間質タンパク質（Ｍ）、膜貫通糖タンパク質（Ｇ）およびポリメラーゼ（Ｌ）に指定するタンパク質をコード化する。生きたＶＳＶを単離し、当該分野において知られた技術を用いて「救助」してよい。例えば、米国特許第６０４４８８６号；６１６８９４３号；および５７８９２９９号；国際特許公報番号ＷＯ９９／０２６５７；Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ、１９９８年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、３２：１２３−１６２；ＲｏｂｅｒｔおよびＲｏｓｅ、１９９８年、Ｖｉｒｏｌ．、２４７：１−６；Ｌａｗｓｏｎら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ９２：４４７７−４４８１を参照のこと。加えて、例えば、ＶＳＶ（インディアナ）のゲノム配列は、ＮＣＢＩデーターベースにおける受入番号ＮＣ００１５６０の下で利用可能である。ＶＳＶ（チャンディプラ）配列を含めた、ＶＳＶについての他の配列がそのデーターベースで利用可能であり；例えば、特に受入番号Ａｙ３８２６０３、Ａｆ１２８８６８、Ｖ０１２０８、Ｖ０１２０７、Ｖ０１２０６、Ｍ１６６０８、Ｍ１４７１５、Ｍ１４７２０およびＪ０４３５０を参照のこと。特にニュージャージーおよびインディアナのような、ＶＳＶ種はまた、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（例えば、受入番号ＶＲ−１２３８およびＶＲ−１２３９を参照のこと）のような寄託機関から利用できる。他の配列は、本明細書の至る所で引用されている文献にて記載または引用されている。本明細書において引用された全ての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００３７】
ＶＳＶゲノムは、一つより多くの外来の遺伝子と、少なくとも３キロベースにまで伸長して適応することが明らかにされた。これらのウィルスのゲノムは非常に安定しており、組換えを起こさず、滅多に重大な変異を起こさない。それに加えて、複製は細胞質で起こり、ゲノムはＲＮＡからなるので、感染した宿主細胞のゲノム中に組み込むことができない。また、これらのマイナス鎖ＲＮＡウィルスは、比較的単純な転写調節配列を有し、効率的な外来遺伝子の挿入のために容易に扱うことができる。最後に、外来遺伝子の発現レベルは、ウィルス転写プロモーターに関して、外来遺伝子の位置を変化させることによって調節し得る。遺伝子発現の３’から５’への勾配は、転写しているウィルスポリメラーゼが、ゲノムの鋳型に沿って進んでいくときに遭遇する、各々の遺伝子間の遺伝子停止／遺伝子開始シグナルを、正しく通過していく可能性が低下することを反映している。従って、３’末端の転写開始プロモーターの近傍に位置した外来遺伝子は豊富に発現し、一方より遠いゲノムの位置に挿入されたものはあまり発現しない。
【００３８】
ＶＳＶは多数の異なる細胞型において高い力価で複製し、ウィルスタンパク質は非常に豊富に発現される。このことはＶＳＶが強力な機能性外来遺伝子輸送担体として作用することを意味するだけでなく、関連するｒＶＳＶベクターがヒトバイオロジカルの産生について承認された細胞系の製造レベルにまで拡大しうることをも意味している。
【００３９】
ｒＶＳＶは、臨界的な保護免疫原をコード化する外来遺伝子をウィルス病原体から多種の異なる細胞型にデリバリーし、その後忠実に形成された免疫原性タンパク質の豊富な発現を引き起こすという、驚くべき能力を有する（Ｈａｇｌｕｎｄ，Ｋ．ら、２０００年  Ｖｉｒｏｌ．，２６８：１１２−１２１；Ｋａｈｎ，Ｊ．Ｓ．ら、１９９９年  Ｖｉｒｏｌ．２５４：８１−９１；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．ら、１９９９年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：３７２３−３２；Ｒｏｓｅ，Ｎ．Ｆ．ら、２０００年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１０９０３−１０；およびＳｃｈｌｅｒｅｔｈ，Ｂ．ら、２０００年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：４６５２−７）。そのように発現された免疫原は、同時に、極めて持続性のあるウィルス抗体中和反応、ならびに保護細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の両方を誘導する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ａ．ら、１９９８年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：４７０４−１１）。
【００４０】
ｒＶＳＶの効能に加えて、野生型のＶＳＶは、健康な人間においては、実質的なウィルスの複製に直面しても、ほとんど、全くと言っていいほど疾患の徴候または病原性を示さないので、この生ウィルス遺伝子輸送担体は安全である（Ｔｅｓｈ，Ｒ．Ｂ．ら、１９６９年  Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．、９０：２５５−６１）。それに加えてＶＳＶのヒトへの感染は稀であり、従ってＶＳＶに対して前もって免疫が存在することも稀である。さらに弱毒化すると、これらのｒＶＳＶ組成物は、免疫抵抗性減弱またはそうでなくともあまり体が丈夫でない人間の対象においての利用にも適している。この方法においてＶＳＶベクターを利用することの重大な利点は、ＶＳＶのウィルス結合Ｇタンパク質の変化または修飾によって、いくつかの血清型のＶＳＶが存在するということである。従って、同一の異種抗原を輸送する異なる血清型のＶＳＶベクターは、ＶＳＶのＧタンパク質に対して起こされる、宿主の免疫系によるあらゆる抗体中和反応を避けるために、反復投与のために用いられ得る。
【００４１】
組換えＶＳＶは、ウィルス転写プロモーターの調節の下で、選別した抗原およびＶＳＶのあらゆる位置に挿入された調節配列を輸送する、以前当該分野において記述された技術を用いて構築し得る。一つの具体例として、選別した抗原をコード化する異種遺伝子は、ＶＳＶのＧおよびＬコード領域の間に挿入される。他の具体例として、異種遺伝子は。Ｇタンパク質の部位に融合してよい。さらに他の具体例として、異種遺伝子は、あらゆる他のＶＳＶ遺伝子の部位または近接した部位に融合する。
【００４２】
さらに他の具体例として、遺伝子をゲノム中の異なる位置に「シャッフルする」。特に、Ｎ遺伝子は、ゲノム中の異なる位置に「シャッフルする」。シャッフルした組換えｃＤＮＡ配列を生成するためのクローニングは、元のＶＳＶプラスミド主鎖（ｐＶＳＶ−ＸＮ１）の修飾を含む。元のベクターの三つの変異体は、次のような標準的な遺伝子の順序からはずれるプラスミド：ｉ）３’−Ｐ−Ｎ−Ｍ−Ｇ−Ｌ−５’； ｉｉ）３’−Ｐ−Ｍ−Ｎ−Ｇ−Ｌ−５’； およびｉｉｉ）３’−Ｐ−Ｍ−Ｇ−Ｎ−Ｌ−５’；を含む。これらのプラスミドを作成するために用いられるクローニング戦略は、Ｂａｌｌ，Ｌ．Ａ．ら  １９９９年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：４７０５−１２によって記述された方法を利用する。この技術は、各々のコード配列の間にみられる遺伝子停止／遺伝子開始シグナルがほとんど同一であり、何らかのヌクレオチドの置換を導入することなく遺伝子再構成を構築することを可能にするという事実を利用している。あるいは、戦略的に少数の点突然変異を、ゲノム再構成を容易にする便利な制限部位を作成するために、非コード領域に導入してよい。
【００４３】
その上にさらなるこれらのベクターの具体例として、Ｇ遺伝子の２９アミノ酸細胞質ドメインについてのカルボキシ末端コード配列は、Ｇ遺伝子の５’Ｃ末端に由来するアミノ酸を除去することによって、先端部を切り取られる。あるいは、Ｇ遺伝子を完全に欠失させる。一つの具体例として、Ｇ遺伝子の細胞質ドメイン全体が除去される。他の具体例として、細胞質ドメインの少なくとも２８アミノ酸が除去される。その上にさらなる具体例として、細胞質ドメインの約２０アミノ酸が除去される。その上にさらなる具体例として、細胞質ドメインの約１０またはそれより少ないアミノ酸が除去される。
【００４４】
ゲノムシャッフル法およびＧタンパク質修飾法は共に、一部に成長不全を生ずることが報告されている（Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｅ．Ｂ．ら、２００１年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：６１０７−１４；Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９８年  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：１２８９−９６）そのようなＶＳＶの修飾によって、より弱毒化された血清型、または本発明の様々な具体例において利用されている非複製ＶＳＶにまで至る可能性があると予想される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｅら、１９９８年  Ｖｉｒｏｌ．，２５１：２４４−５２．３７；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｅら、１９９７年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５０６０−８を参照のこと。
【００４５】
同様に、選別した抗原は、以下の考察において特定された抗原であってよい。本明細書の免疫原性組成物の一つの具体例として、選別した抗原は、クレードＢウィルス単離集団のＨＩＶ−１ｇａｇおよび／またはｅｎｖ（ｇｐ１６０）遺伝子である。さらに他の具体例として、抗原は、ＨＩＶ−１のｐｏｌ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｉｆまたはｔａｔ遺伝子である。好ましくは、抗原配列は、目的の宿主に適したコドン選別、および／またはあらゆる抑制配列を除去することによって最適化され、また抗原調製に関しては以下で考察している。
【００４６】
連続投与によってベクター複製効率が低下するという潜在的な問題を克服するために、異なるＶＳＶ血清型に由来するＧ遺伝子を輸送する、類似したデザインのベクターセットは、ブースター免疫化を可能にしている。ＶＳＶインディアナ、ニュージャージーおよびチャンディプラに由来するＧタンパク質の最初のアミノ酸配列は、十分互いに異なっているので、そのうちの一つに対する前もって存在する免疫性が、他のものの感染および複製を排除しない。従って、ｒＶＳＶ（インディアナ）によって生じる抗体中和反応は、ｒＶＳＶ（ニュージャージー）またはｒＶＳＶ（チャンディプラ）のいずれかの複製を妨げない。連続免疫化を成功させることのできるベクターセットは、ＶＳＶインディアナに由来するＧ遺伝子を、ＶＳＶチャンディプラまたはＶＳＶニュージャージーに由来する互いに異なる相同物のいずれかに置き換えることによって調製でき、三つの免疫学的に性質の異なるベクターを形成する。
【００４７】
このｒＶＳＶ免疫原性組成物は、それゆえに、宿主において発現する単一の選別した抗原をコード化する、一つのｒＶＳＶを含んでいてよい。本方法に従うと、ｒＶＳＶ免疫原性組成物は、同一の選別した抗原の一つより多くのコピーをコード化する核酸配列を含む、一つのｒＶＳＶを含む。あるいは、本組成物は、多数の選別した抗原を発現している一つのｒＶＳＶを含んでいてよい。各々の抗原は、別々の調節分子または成分による調節下にあってよい。さらに他の具体例として、ｒＶＳＶ組成物は、各々のｒＶＳＶは同一または異なる抗原をコード化する、多数のｒＶＳＶを含んでいてよい。
【００４８】
その上にさらなる具体例として、ｒＶＳＶ免疫原性組成物は、サイトカイン、リンホカインまたは遺伝的アジュバントをさらに含み、または投与してよい。サイトカインは、タンパク質として、上で述べたようなプラスミドで投与してよく、または組換えＶＳＶ中の配列をコード化するサイトカインの挿入によってコード化してよい。例えば、配列をコード化しているサイトカインは、ＶＳＶゲノム中のあらゆる位置に挿入してよく、ウィルス転写プロモーターで発現してよい。核酸配列が利用可能である適当なアジュバントの宿主は、以下で特定している。本発明において例示している具体例において、本発明のｒＶＳＶ組成物を投与するための望ましいサイトカインは、インターロイキン１２である。
【００４９】
ｒＶＳＶ組成物は、望ましくは、以下で考察しているような、医薬上許容される希釈剤、賦形剤またはキャリア中で投与される。組成物はあらゆる選別された投与経路で投与してよく、一つの具体例として、望ましい投与経路は経鼻投与である。
【００５０】
ｒＶＳＶ組成物がブースティング組成物であるところの、本発明の方法の一つの具体例として、本方法は、ＤＮＡ免疫原性プライミング組成物の投与後に、少なくとも一つのｒＶＳＶ免疫原性組成物を投与することを含む。ｒＶＳＶ組成物は、プライミング組成物によって発現するものと同一の抗原を発現している。一つの具体例として、ｒＶＳＶ組成物は、選別したサイトカインをコード化する追加の組換えウィルスを含む。さらに他の具体例として、ｒＶＳＶは、サイトカイン、例えば抗原を発現しているのと同一のｒＶＳＶに存在しているインターロイキン１２、を発現している配列を含む。さらに他の具体例として、多数のｒＶＳＶ組成物は、後期のブースターとして投与される。一つの具体例として、少なくとも二つのｒＶＳＶ組成物が、プライミング組成物の後で投与される。他の具体例として、少なくとも三つのｒＶＳＶ組成物が、プライミング組成物の後で投与される。
【００５１】
望ましくは、上で記述したように、各々の後のｒＶＳＶ組成物は異なる血清型を有するが、同一の抗原のコード化配列である。異なる血清型は、既知の自然に生じた血清型の中から、およびＶＳＶのＧタンパク質を操作することで得られるあらゆる人工的な血清型の中から選別される。ｒＶＳＶのＧタンパク質を変化させる既知の方法の一つは、国際公報番号ＷＯ９９／３２６４８およびＲｏｓｅ，Ｎ．Ｆ．ら、２０００年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１０９０３−１０に記述されている技術である。
【００５２】
他の具体例として、各々のｒＶＳＶは、異なる抗原コード化配列を有するが、同一のＶＳＶＧタンパク質を有している。さらに他の具体例として、各々のｒＶＳＶは、異なる抗原コード化配列を有し、異なるＶＳＶＧタンパク質を有している。実施例において詳説されているように、一連のｒＶＳＶブースティング組成物の一つの具体例としては、ＨＩＶ−１ｇｐ１６０ｅｎｖ遺伝子を含む二つの最適化したｒＶＳＶを含み、一方のｒＶＳＶはインディアナ血清型であり、他方はチャンディプラ血清型である。
【００５３】
本発明に従うと、このｒＶＳＶ免疫原性組成物は、宿主に対して同一の抗原を呈示するプライミングＤＮＡ免疫原性組成物の投与の後に、ブースティング組成物として投与してよい。本発明の方法のあらゆる具体例において、二番目およびあらゆる追加のｒＶＳＶは、最初のｒＶＳＶ投与の後のブースターとして投与される。ある具体例における追加のｒＶＳＶブースターは、同一の抗原を生じる同一の血清型である。あるいは、異なる血清型を有する追加のｒＶＳＶブースターは、ブースティングＤＮＡ免疫原性組成物を投与する前に、連続的に投与する。それは少なくとも三つのブースターを投与するのに有用であることが示されている。ブースティング組成物として用いた場合、プライミングＤＮＡ免疫原性組成物の後に、ｒＶＳＶ組成物は連続的に投与する。プライミング組成物として用いた場合、ｒＶＳＶ免疫原性組成物は、一回または好ましくは複数回投与する。ある具体例における追加のｒＶＳＶブースターは、同一の抗原を生じる同一の血清型である。あるいは、異なる血清型を有する追加のｒＶＳＶブースターは、ブースティングＤＮＡ免疫原性組成物を投与する前に、連続的に投与する。
【００５４】
生体内でＨＩＶ−１タンパク質を発現することができる適当なｒＶＳＶ構造の例は、次の実施例において、および例えば出典明示により本明細書の一部とする次の出版物、Ｒｏｓｅら、２０００年  Ｖｉｒｏｌ．，２６８：１１２−１２１；Ｒｏｓｅら、２０００年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１０９０３−１０９１０；Ｒｏｓｅら、２００１年  Ｃｅｌｌ，１０６：５３９−５４９；Ｒｏｓｅら、２００２年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：２７３０−２７３８；Ｒｏｓｅら、２００２年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：７５０６−７５１７において、詳細に記述されている。追加のｒＶＳＶベクターは、ＶＳＶのＧタンパク質を順次末端切断するか、または上述したようにＶＳＶの構造遺伝子をシャッフルするかのいずれかによって、さらに弱毒化してもよい。非複製ＶＳＶもまた、本発明に従って用いてよい。弱毒化および免疫原性の望ましいバランスを示すｒＶＳＶは、本発明において有用であると予想される。
【００５５】
以下の実施例において例示した、いくつかの図示したｒＶＳＶの構造は、組換えゲノム：（１）３’Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−ＨＩＶｅｎｖ−Ｌ−５’ （２）３’Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−ＨＩＶｇａｇ−Ｌ−５’ （３）３’Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｇ−ＳＩＶｇａｇ−Ｌ−５’を有する。一つの具体例として、本発明の方法および免疫原性組成物は、これらのｒＶＳＶ構造の一つを利用する。他の具体例として、本発明の方法および免疫原性組成物は、これらのｒＶＳＶ−ＨＩＶｅｎｖおよびｒＶＳＶ−ＨＩＶｇａｇを共に利用する。この後者の免疫原性組成物は、ＨＩＶ−１ウィルス感染細胞を殺すことのできる（ＥｎｖおよびＧａｇに対する）ＣＴＬに加えて、忠実に形成されたｇｐ１６０に対する強力な体液性免疫応答を同時に誘導する。この方法で発現しているＨＩＶ−１ｇｐ１６０は、ＣＤ４／共受容体に結合し、受容体結合に関する構造変化を受ける。適当なｇｐ１６０／受容体相互作用によって、感染からの抗体媒介性防御を誘導するために必要となる、ｇｐ１６０上に存在する抗原決定基を中和する潜在的なウィルスが露出する（例えば、ＬａＣａｓｓｅ，Ｒ．Ａ．ら、１９９９年  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８３：３５７−６２を参照のこと）。
【００５６】
Ｃ．本発明の免疫原性組成物において利用するための抗原
本発明の方法および組成物において有用な抗原性または免疫原性組成物は、選別した抗原に対する脊椎動物の宿主における免疫応答を高める。選別した抗原は、プラスミドＤＮＡまたはＶＳＶによって発現される場合は、病原性ウィルス、細菌、真菌または寄生虫に由来する、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、断片およびそれらの融合体であってよい。あるいは、選別した抗原は、癌細胞または腫瘍細胞に由来するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、断片およびそれらの融合体であってよい。もう一つ別の実施形態において、選別した抗原は、アレルゲンに対するアレルギー反応を和らげるためにＩｇＥの生成を妨げるために、アレルゲンに由来するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、断片およびそれらの融合体であってよい。さらにもう一つ別の実施形態において、脊椎動物宿主におけるアミロイド沈着によって特徴づけられる疾患を予防または治療するために、選別した抗原は、アミロイド前駆タンパク質に由来するもののような、宿主（自己分子）によって望ましくない方法、量または位置にて産生されるものである、分子またはその一部分に由来するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、断片およびそれらの融合体であってよい。本発明の一つの具体例として、選別した抗原は、ＨＩＶ−１に由来するタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、断片およびそれらの融合体であってよい。
【００５７】
本発明はまた、（１）脊椎動物宿主の免疫応答を誘導するための病原性のウィルス、細菌、真菌または寄生虫、または（２）脊椎動物宿主の抗癌治療または予防効果を誘導するための、癌細胞または腫瘍細胞に由来する、癌抗原または腫瘍関連抗原、または（３）アレルゲンに対するアレルギー反応を和らげるために、ＩｇＥの生成を妨げるためのアレルゲン、または（４）非常に望ましくない作用を低下させるための、宿主（自己分子）によって望ましくない方法、量または位置にて産生されるものである、分子またはその一部分から選別された抗原を含む免疫原性組成物の能力を向上させる方法についてのものである。
【００５８】
他の具体例として、本発明のプライム／ブースト投与法を利用する望ましい免疫原性組成物は、それだけに限定されないが、ヒト免疫不全ウィルス、サル免疫不全ウィルス、呼吸器シンチウムウィルス、パラインフルエンザウィルス１−３型、インフルエンザウィルス、単純ヘルペスウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ヒトパピローマウィルス、ポリオウィルス、ロタウィルス、カリシウィルス、麻疹ウィルス、ムンプスウィルス、風疹ウィルス、アデノウィルス、狂犬病ウィルス、犬ジステンパーウィルス、牛疫ウィルス、ヒトメタニューモウィルス、トリニューモウィルス（以前は七面鳥鼻気管支炎ウィルスと呼ばれた）、ヘンドラウィルス、ニパウィルス、コロナウィルス、パルボウィルス、感染性鼻気管支炎ウィルス、ネコ白血病ウィルス、ネコ感染性腹膜炎ウィルス、トリ伝染性ファブリキウス嚢病ウィルス、ニューカッスル病ウィルス、マレック病ウィルス、ブタ呼吸器および生殖器症候群ウィルス、ウマ動脈炎ウィルスおよび様々な脳炎ウィルスによって引き起こされる疾患の予防および／または治療のためのものを含む。
【００５９】
他の具体例として、本発明のプライム／ブースト投与法を利用する望ましい細菌免疫原性組成物は、それだけに限定されないが、ヘモフィルス・インフルエンザ（定型および非定型とも）、ヘモフィルス・ソムナス、モラクセラ・カタラーリス、ストレプトコッカス・ニューモニア、ストレプトコッカス・ピオジェンス、ストレプトコッカス・アガラクチア、ストレプトコッカス・フェカリス、ヘリコバクター・ピロリ、ナイセリア・メニンジティディス、ナイセリア・ゴノレア、クラミジア・トラコーマ、クラミジア・ニューモニア、クラミジア・シッタキ、ボルデテラ・ペルツーシス、アロイオコッカス・オティジチス、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・ティフィムリナム、サルモネラ・コレラスイス、エシェリキア・コリ、シゲラ、ビブリオ・コレレ、コリネバクテリウム・ジフテリア、マイコバクテリウム・ツベクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ複合体、プロテウス・ミラビリス、プロテウス・ブルガリス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、クロストリジウム・テタニー、レプトスピラ・インタロガンス、ボレリア・ブルグドルフェリ、パスツレラ・ヘモリチカ、パスツレラ・ムルトシダ、アクチノバシラス・プルロニューモニエおよびマイコプラズマ・ガリセプチカムによって引き起こされる疾患の予防および／または治療のためのものを含む。
【００６０】
他の具体例として、本発明のプライム／ブースト投与法を利用する、真菌の病原体に対する望ましい免疫原性組成物は、それだけに限定されないが、アスペルギウス、ブラストミセス、カンジダ、コクシジオイデス、クリプトコッカスおよびヒストプラズマによって引き起こされる疾患の予防および／または治療のためのものを含む。
【００６１】
他の具体例として、本発明のプライム／ブースト投与法を利用する、寄生虫に対する望ましい免疫原性組成物は、それだけに限定されないが、大型リーシュマニア、回虫、鞭虫、ジアルジア、住血吸虫、クリプトスポロジウム、トリコモナス、トキソプラズマ・ゴンディおよびニューモシスチス・カリニによって引き起こされる疾患の予防および／または治療のためのものを含む。
【００６２】
他の具体例として、本発明のプライム／ブースト投与法を利用する、脊椎動物宿主の抗癌治療または予防効果を誘導するための、望ましい免疫原性組成物は、それだけに限定されないが、前立腺特異的抗原、癌胚抗原、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５およびＭＡＧＥ−３を含めた、癌抗原または腫瘍関連抗原を利用するものを含む。
【００６３】
上で列挙した既知の抗原についてのヌクレオチドおよびタンパク質配列は、ＮＣＢＩのようなデーターベースによって容易に公的に入手可能であり、またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎおよび大学のような他の情報源から入手可能である。
【００６４】
本発明のプライム／ブースト投与法を利用する、脊椎動物の宿主におけるアレルゲンに対する反応を和らげるための望ましい免疫原性組成物は、アレルゲンまたはそれらの断片を含むものを含む。そのようなアレルゲンの例としては、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５８３０８７７号および国際特許公報ＷＯ９９／５１２５９において記述されている。そのようなアレルゲンには、花粉、昆虫の毒液、動物の鱗屑、真菌の胞子および（ペニシリンのような）薬剤を含むが、それだけに限定されない。これらの免疫原性組成物は、アレルギー反応の原因として知られている、ＩＧＥ抗体の生成を妨げる。
【００６５】
本発明のプライム／ブースト投与法を利用する、脊椎動物における自己分子に対する反応を和らげるための望ましい免疫原性組成物は、自己分子またはそれらの断片を含むものを含む。そのような自己分子の例としては、糖尿病に伴うβ鎖インスリン、胃食道逆流症に伴うＧ１７分子、および多発性硬化症、ループスおよび関節リウマチのような疾患における自己免疫応答をダウンレギュレーションする抗原を含む。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の内部３９−４３アミノ酸断片であり、βおよびγセクレターゼ酵素によるＡＰＰの切断によって生じる、βアミロイドペプチド（またＡβペプチドとも呼ばれる）もまた含まれる。Ａβ１−４２ペプチドは、次の配列：配列番号１：Ａｓｐ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｈｉｓ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｈｉｓ  Ｈｉｓ  Ｇｌｎ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｌａ  ＩＩｅ  ＩＩｅ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  ＩＩｅ  Ａｌａを有する。
【００６６】
本発明のＤＮＡプラスミドおよびｒＶＳＶ構造の構築のための抗原配列の選別および利用において、挿入されるＤＮＡプラスミドと共に、選別した抗原コード化遺伝子配列のコドンの使用法を変えること、および／またはその中の抑制配列を除去することもまた望ましい。抑制配列の除去は、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５９６５７２６号；５９７２５９６号；６１７４６６６号；６２９１６６４号；および６４１４１３２号；および国際特許公報第ＷＯ０１／４６４０８号において詳細に考察された技術によって達成され得る。簡潔に述べると、本技術は、好ましくは多数の点突然変異によって、選別した遺伝子において同定された抑制／不安定配列を変異させることを含む。
【００６７】
以下で例示されている一つの特定の具体例のように、本発明の免疫原性プラスミドおよびｒＶＳＶ組成物は、望ましくは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ抗原、または免疫原性断片またはそれらの融合体のようなＨＩＶ−１抗原をコード化するために最適化した、一つまたはそれより多くの配列を利用する。サル−ヒトキメラ免疫不全ウィルス（ＳＨＩＶ）（８９．６Ｐ）のｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子は、ｒＶＳＶを作るのに有用であり、ウィルス保持および疾患の感染防御および緩和が、マカークザルの疾患モデルにおいて立証され得る。以下の実施例は、ＳＨＩＶ類似物、すなわちＳＩＶｇａｇおよびＨＩＶ８９．６Ｐｅｎｖの利用を立証している。
【００６８】
Ｄ．免疫原性ＤＮＡプラスミドまたはｒＶＳＶ構造において有用なプロモーター
本発明のあらゆる成分において利用するために適当なプロモーターは、構成性プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターおよびその他から容易に選別してよい。活性が非特異的であり、本発明の抗原をコード化する核酸分子において用いられている、構成性プロモーターの例には、レトロウィルスのラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）プロモーター、レトロウィルスのＬＴＲプロモーター（所望によりＲＳＶエンハンサーを有していてもよい）、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター（所望によりＣＭＶエンハンサーを有していてもよい）（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５年  Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０を参照）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、βアクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むが、それだけに限定されない。外界から供給された化合物によって調節される、誘導性プロモーターには、アラビノースプロモーター、亜鉛誘導性金属結合性タンパク質（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ９８／１００８８）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら、１９９６年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１）、テトラサイクリン抑制系（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９２年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１）、テトラサイクリン誘導系（Ｇｏｓｓｅｎら、１９９５年  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，Ｈａｒｖｅｙら、１９９８年  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８も参照のこと）、ＲＵ４８６誘導系（Ｗａｎｇら、１９９７年  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３およびＷａｎｇら、１９９７年  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１）およびラパマイシン誘導系（Ｍａｇａｒｉら、１９９７年  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２）を含むが、それだけに限定されない。
【００６９】
この関連において有用である可能性のある、他のタイプの誘導性プロモーターは、例えば温度または急性期または複製中の細胞のみのような、特定の生理的状態で調節されるものである。有用な組織特異的プロモーターには、自然に生じるプロモーターよりも高い活性を有する人工筋プロモーター（Ｌｉら、１９９９年  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：２４１−２４５参照）と共に、骨格筋のβアクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコード化する遺伝子に由来するプロモーターを含む。組織特異的なプロモーターの例は、特に肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅら、１９９７年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４−３２；Ｂ型肝炎ウィルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、１９９６年  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３：１００２−９；αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔら、１９９６年  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：１５０３−１４）、骨（オステオカルシン、Ｓｔｅｉｎら、１９９７年  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５−９６；骨シアロタンパク質、Ｃｈｅｎら、１９９６年  Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４−６４）、リンパ球（ＣＤ２、Ｈａｎｓａｌら、１９８８年  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３−８；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体α鎖）、ニューロン（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎら、１９９３年  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５；神経線維軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、１９９１年  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１−５；ニューロン特異的ｎｇｆ遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉら、１９９５年  Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４）について知られている。例えば、この関連において有用である既知のプロモーターの追加のリストについては、国際特許公報第ＷＯ００／５５３３５号を参照のこと。
【００７０】
Ｅ．本発明の免疫原性組成物について有用なキャリア、賦形剤、アジュバントおよび処方
本発明において有用な免疫原性組成物は、ＤＮＡプラスミドまたはｒＶＳＶ組成物のいずれでも、無菌の水または無菌の生理食塩水のような、免疫学的に許容される希釈剤または医薬上許容されるキャリアをさらに含む。抗原性組成物もまた、従来の方法でそのような希釈剤またはキャリアと混合してよい。本明細書で用いられている「医薬上許容されているキャリア」という言葉は、ヒトまたは他の脊椎動物の宿主に適合した、あらゆる全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張の吸収遅延薬等を含めることを意味している。適切なキャリアは、当業者には明白であるが、投与経路に大部分が依存しているであろう。
【００７１】
本発明の免疫原性組成物中に存在していてよいさらなる追加の成分は、アジュバント、保存剤、界面活性剤、および化学安定剤、懸濁剤または分散剤である。典型的には、安定剤、アジュバントおよび保存剤は、標的のヒトまたは動物における効能を最高にする処方を決定するために最適化される。
【００７２】
１．アジュバント
アジュバントは、免疫原または抗原と共に投与された際に免疫応答を高める物質である。いくつかのサイトカインまたはリンホカインが、免疫調節活性を有することが示されており、従って、それだけに限定されないが、インターロイキン１−α、１−β、２、４、５、６、７、８、１０、１２（例えば、米国特許第５７２３１２７号参照）、１３、１４、１５、１６、１７および１８（およびその変異体）、インターフェロンα、βおよびγ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（例えば、米国特許第５０７８９９６号およびＡＴＣＣ受け入れ番号３９９００を参照）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、ＧＳＦ、および腫瘍壊死因子αおよびβを含めたものを、アジュバントとして用いてよい。本発明において有用なさらに他のアジュバントには、ＭＣＰ−１ＭＣＰ−１α、ＭＣＰ−１βおよびＲＡＮＴＥＳを含むがそれだけに限定されない、ケモカインを含む。例えば、Ｌセレクチン、ＰセレクチンおよびＥセレクチンといったセレクチンのような接着分子もまた、アジュバントとして有用である可能性がある。さらに他の有用なアジュバントには、例えばＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１およびＭａｄＣＡＭ−１のようなムチン様分子、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１およびｐ１５０．９５のようなインテグリンファミリーのメンバー、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３、ＣＤ２およびＬＦＡ−３といった、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭのような免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌのような共刺激分子、血管成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、Ｂ７．２、ＰＤＧＦ、ＢＬ−１および血管内皮成長因子を含めた成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２およびＤＲ６を含めた受容体分子を含むが、それだけに限定されない。さらに他のアジュバント分子には、カスパーゼ（ＩＣＥ）を含む。出典明示により本明細書の一部とする、国際特許公報第ＷＯ９８／１７７９９号およびＷＯ９９／４３８３９もまた参照のこと。
【００７３】
免疫応答を高めるために用いられる適当なアジュバントには、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第４９１２０９４号に記述されている、ＭＰＬ（商標登録）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）を含むが、それだけに限定されない。Ｃｏｒｉｘａ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）から入手でき、出典明示により本明細書の一部とする米国特許第６１１３９１８号に記述されている、人工の脂質Ａ類似物またはアミノアルキルグルコサミンリン酸化合物（ＡＧＰ）、または誘導体またはそれらの類似物もまた、アジュバントとしての利用に適している。そのようなＡＧＰの一つは、２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシドであり、５２９としてもまた知られている（以前はＲＣ５２９として知られていた）。この５２９アジュバントは、水性の形態でまたは安定した懸濁液として、処方される。
【００７４】
さらに他のアジュバントには、鉱油および水乳濁液、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムその他のようなアルミニウム塩（ミョウバン）、アンフィゲン、アブリジン、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニックポリオール、ムラミル酸ジペプチド、殺したボルデテラ、スティミュロン（商標登録）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）のような、出典明示により本明細書の一部とする米国特許第５０５７５４０号に記述されているサポニン、およびＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）などのそれらから産生される粒子、マイコバクテリウム・ツベクローシス、細菌リポポリサッカライド、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのような人工ポリヌクレオチド（出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第６２０７６４６号）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９のような百日咳毒素（ＰＴ）またはイー・コリ易熱性毒素（ＬＴ）を含む；例えば出典明示により本明細書の一部とする、国際特許公報第ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと。
【００７５】
公開された国際特許出願書番号ＷＯ００／１８４３４（２９位のアミノ酸のグルタミン酸が、（アスパラギン酸以外の）他のアミノ酸、好ましくはヒスチジンで置換されている）に記述されているものを含めた、コレラ毒素およびその変異体もまた、アジュバントとして有用である。同様のＣＴ毒素または変異体は、公開した国際特許出願書番号ＷＯ０２／０９８３６８（１６位のアミノ酸のロイシンを、単独でまたは６８位のアミノ酸を他のアミノ酸と置換することと組み合わせて、他のアミノ酸によって置換している；および／または７２位のアミノ酸のバリンを、他のアミノ酸によって置換している）に記述されている。他のＣＴ毒素は、公開した国際特許出願書番号ＷＯ０２／０９８３６９（２５位のアミノ酸のアルギニンを、他のアミノ酸によって置換している；および／または一つのアミノ酸が４９位のアミノ酸に挿入されている；および／または二つのアミノ酸が３５位および３６位のアミノ酸に挿入されている）に記述されている。
【００７６】
以下で例示した一つの具体例として、プラスミドから発現される、望ましいアジュバントはインターロイキン１２である。例えば、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５４５７０３８号；５６４８４６７号；５７２３１２７号および６１６８９２３号を参照のこと。このＩＬ−１２を発現しているプラスミドは、実施例の免疫原性のあるＤＮＡプラスミドを含むプライミング組成物に組み込まれる。しかしながら、このプラスミドは、ｒＶＳＶ（またはｒＶＳＶによって発現した）組成物と共にまたは単独で、プライミング組成物およびブースティング組成物の間に、哺乳類または脊椎動物の宿主に投与され得ることは注目すべきである。一つの具体例として、サイトカインは、タンパク質として投与してよい。好ましい具体例としては、サイトカインは、哺乳類細胞におけるそれらの発現の調節配列による調節の下でサイトカインをコード化するＤＮＡ配列を含む核酸組成物として投与される。さらに他の有用な具体例として、サイトカインを発現しているプラスミドは、ＤＮＡ組成物と共に投与される。さらに他の具体例として、サイトカインは、プライミング組成物およびブースティング組成物の投与の間に投与される。さらに他の工程として、サイトカインは、ブースティング工程と共に投与される。さらに他の具体例として、サイトカインは、プライミングおよびブースティング組成物と共に投与される。
【００７７】
プライミング組成物がＤＮＡプラスミド組成物である場合は、以下の実施例に示すように、プラスミド組成物は、哺乳類細胞におけるそれらの発現の調節配列による調節の下でサイトカインをコード化するＤＮＡ配列を含み得る。ある具体例として、サイトカインコード化配列は、抗原コード化配列と同一のＤＮＡプラスミド上に存在している。さらに他の具体例として、サイトカインコード化配列は、抗原をコード化するＤＮＡプラスミドとは異なるＤＮＡプラスミド上に存在している。
【００７８】
２.促進剤または共試薬
上で述べたキャリアに加えて、ポリヌクレオチド分子からなる免疫原性組成物は、望ましくは、局所麻酔薬、ペプチド、カチオン脂質を含めた脂質、リポソームまたは脂質粒子、ポリリシンのようなポリカチオン、デンドリマーのような分枝した三次カチオン、炭水化物、カチオン両親媒性化合物、洗浄剤、ベンジルアンモニウム界面活性剤、または細胞へのポリヌクレオチド輸送を促進する他の化合物のような、ポリヌクレオチドの促進剤または共試薬を、所望により含んでいてもよい。そのような促進剤には、局所麻酔薬のブピバカインまたはテトラカインを含む（出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５５９３９７２号；５８１７６３７号；５３８０８７６号；５９８１５０５号および６３８３５１２号、および国際特許公報ＷＯ９８／１７７９９を参照）。本発明において有用なそのような促進剤または共試薬の他の例は、それだけに限定されないが、出典明示により各々本明細書の一部とする、米国特許第５７０３０５５号；５７３９１１８号；５８３７５３３号；１９９６年４月４日に公開された、国際特許公報ＷＯ９６／１００３８；および１９９４年８月８日に公開された、国際特許公報ＷＯ９４／１６７３７において記述されている。
【００７９】
最も好ましくは、局所麻酔薬は、核酸分子と一つまたはそれより多くの複合体を形成する量で存在している。局所麻酔薬を本発明の核酸分子またはプラスミドと混合すると、ＤＮＡを束ねる同質の、様々な小分子または粒子を形成する。従って、本発明の免疫原性組成物の一つの具体例として、複合体は、局所麻酔薬および少なくとも一つの本発明のプラスミドを混合することによって形成される。この混合物から生じるあらゆる単一の複合体は、様々な異なるプラスミドの組み合わせを含んでいてよい。あるいは、本発明の組成物の他の具体例として、局所麻酔薬は、各々のプラスミドと別々に前もって混合しておいてよい。別々の混合物は、全てのプラスミドを単一のボーラス投与で投与したいのであれば、望ましいプラスミドの比率で単一の免疫原性組成物に存在していることを保証するように、その後単一の組成物に混合する。あるいは、局所麻酔薬および各々のプラスミドは、望ましい比率を得るために、別々に混合し、別々に投与してよい。
【００８０】
「複合体」または「一つまたはそれより多くの複合体」または「複合体群」という用語はが、本明細書の以下で免疫原性組成物の具体例と定義するために用いられる場合は、その用語は一つまたはそれより多くの複合体を包含していると考えている。各々の複合体は、プラスミドの混合物、または別々に形成された複合体の混合物を含む。各々の複合体は、一つのタイプのプラスミドまたは複合体のみ、または、複数のプラスミドまたは複合体の混合物を含み、その中の各々の複合体はポリシストロンＤＮＡを含む。好ましくは、複合体は、直径が約５０ｎｍから約１５０ｎｍの間である。用いられる促進剤が局所麻酔薬、好ましくはブピバカインである場合は、ポリヌクレオチド組成物の全重量に対して、約０．１重量パーセントから約１．０重量パーセントまでの量であることが好ましい。出典明示により本明細書の一部とする、好ましくは約０．００１−０．０３重量パーセントの間の量で投与されるベンジルアンモニウム界面活性剤を共試薬として組み込むことを説いている、国際特許公報ＷＯ９９／２１５９１もまた参照のこと。本発明に従うと、局所麻酔薬の量が、１−１０μｇ／ｍｌの核酸に対して重量／体積比が０．０１−２．５％の局所麻酔薬という、核酸分子に対する比率で存在する。他のそのような範囲は、１００μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの核酸に対して重量／体積比が０．０５−１．２５％の局所麻酔薬である。
【００８１】
３．免疫原性組成物に対する他の添加剤
保存剤、安定化成分、表面活性試薬などを含めた他の添加剤が、本発明の免疫原性組成物に含まれ得る。
【００８２】
適当な例の保存剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールを含む。
【００８３】
用いてよい適当な安定化成分には、例えば、カザミノ酸、スクロース、ゼラチン、フェノールレッド、Ｎ−Ｚアミン、二リン酸カリウム、ラクトース、ラクトアルブミン、加水分解産物およびドライミルクを含む。
【００８４】
適当な表面活性物質には、フロイント不完全アジュバント、キノン類似物、ヘキサデキシラミン、オクタデシラミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニックポリオール；例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、カルボポールのようなポリアミン；例えばムラミルペプチドおよびジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシンのようなペプチド；および、例えばリン酸アルミニウムその他のようなミネラルゲル、および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）を含むが、それだけには限定されない。プラスミドおよびｒＶＳＶはまた、免疫原性組成物として利用するために、リポソームに組み込んでよい。免疫原性組成物はまた、組成物の投与の選別した方法に適している他の添加剤を含む。本発明の組成物は、粉末、液体または懸濁液の投薬形態を作り出すための、他の医薬上許容される賦形剤と共に用いられ得る、凍結乾燥したポリヌクレオチドもまた含んでいてよい。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２巻  第１９版（１９９５年），例えばＣｈａｐｔｅｒ９５  Ａｅｒｏｓｏｌｓ；および国際特許公報ＷＯ９９／４５９６６といった、出典明示により本明細書の一部とする文献を参照のこと。
【００８５】
これらの免疫原性組成物は、あらゆる従来の投与経路を介して、投与に適した添加剤を含み得る。ある好ましい具体例として、本発明の免疫原性組成物は、例えば液体、粉末、エアロゾル、錠剤、カプセル、腸溶性の被覆した錠剤またはカプセル、または坐薬の形態で、人間の対象に投与するために調製する。従って、免疫原性組成物はまた、懸濁液、溶液、油性または水性の媒質中の乳濁液、ペースト、および移植可能な徐放性または生物分解性の処方を含むが、それに限定されない。非経口投与のための処方の一つの具体例として、活性成分は、復元した組成物の非経口投与に先立って、適当な媒質（例えば、無菌の発熱物質不含の水）で復元する乾燥した形態（すなわち、粉末または顆粒）にて提供される。他の有用な非経口投与可能な処方には、微晶質の形態、リポソーム調製、または生物分解性ポリマー系の成分として、活性成分を含むものを含む。徐放性または移植のための組成物は、乳濁液、イオン交換樹脂、やや溶解しやすいポリマー、またはやや溶解しやすい塩のような、医薬上許容されるポリマーまたは疎水性の物質を含んでいてよい。
【００８６】
本発明の免疫原性組成物は、上で述べたタイプの医薬調製に有用な、従来の、生理学的に許容されるキャリア、アジュバント、または他の成分の選別によって制限されない。適切なｐＨ等張性、安定性および他の従来の特徴を有する、これらの医薬上許容される組成物の、上で記述した成分からの調製は、当業者の知るところである。
【００８７】
Ｆ．本発明の免疫原性組成物のための投与用量および経路
一般に、本発明の免疫原性組成物の成分の適切な「有効量」または用量はまた、免疫化した対象の全身の健康状態、年齢および体重を特に最も含めた、対象の身体の状態と共に、用いた免疫原性組成物における抗原の同定に基づいているであろう。免疫原性組成物における投与の方法および経路、および追加の成分の存在はまた、プラスミドおよびｒＶＳＶ組成物の用量および量に影響を与える可能性がある。そのような選別および有効用量の上方または下方調節は、当業者の知るところである。免疫応答、好ましくは防御反応を誘導するために、または対象における外来の効果を重大な有害な副作用なく生じるために必要となるプラスミドおよびｒＶＳＶの量は、それらの因子に依存して変化する。適当な用量は、当業者によって容易に決定される。
【００８８】
本発明の抗原性または免疫原性組成物は、ヒトまたは非ヒト脊椎動物に、経鼻、経口、経膣、直腸内、腸管外、皮内、経皮（例えば、出典明示により本明細書の一部とする、国際特許公報番号ＷＯ９８／２０７３４号参照）、筋肉内、腹膜内、皮下、静脈内および動脈内を含むが、それだけに限定されない様々な経路で投与される。適切な経路は、用いた免疫原性組成物の性質、および対象の年齢、体重、性別および全身の健康状態の評価、および免疫原性組成物中に存在している抗原、および顧問医による類似した因子に応じて選別される。
【００８９】
以下に与えられた実施例において、免疫原性ＤＮＡ組成物は、筋肉内に投与される（筋注）。一つの具体例として、ｒＶＳＶ組成物は筋注よりもむしろ経鼻的に投与することが望ましい。しかしながら、投与用量および経路の選別は、本発明の範疇を制限するものではない。
【００９０】
同様に、免疫原性組成物投与の順序および個別の投与の間の時間周期は、身体的特徴および宿主の本方法の適用に対する反応に基づいて、顧問医または当業者によって選別してよい。そのような最適化は当該分野にてよく知られていると考えられる。
【００９１】
Ｇ．キット成分
さらに他の具体例として、本発明は、抗原に対する免疫応答が望ましい、あらゆる上記の疾患または症状を治療するための、免疫原性、予防または治療投与法を容易に投与するための医薬用キットを提供する。このキットは、哺乳類または脊椎動物の対象における、高いレベルの抗原特異的免疫応答を誘導する方法において利用するために構築される。本キットは、哺乳類または脊椎動物の細胞において、それらの発現に対する調節配列の調節の下で、抗原をコード化するＤＮＡ配列を含むＤＮＡプラスミドを含む、少なくとも一つの免疫原性組成物を含む。好ましくは、ＤＮＡ免疫原性組成物を予めパックした複数回用量が、複数回の投与のためのキットにおいて与えられる。本キットはまた、哺乳類または脊椎動物の細胞において、それらの発現に対する調節配列の調節の下で、同一の抗原をコード化する核酸配列を含む、複製に適した、組換え水疱性口内炎ウィルス（ｒＶＳＶ）を含む、少なくとも一つの免疫原性組成物を含む。好ましくは、ｒＶＳＶ免疫原性組成物の予めパックした複数回用量が、多数の投与のためのキットにおいて与えられる。
【００９２】
上で記述した免疫原性組成物がまた、ＩＬ−１２のようなサイトカインを発現するＤＮＡプラスミドおよび／またはｒＶＳＶを含んでいない場合は、キットはまた、所望により、別々のサイトカイン組成物または多数の投与のためのサイトカイン組成物の予めパックした複数回用量を含んでいてよい。これらのサイトカイン組成物は、一般に、哺乳類または脊椎動物の細胞において、それらの発現に対する調節配列の調節の下で、選別したサイトカインをコード化するＤＮＡ配列を含む核酸組成物である。
【００９３】
本キットはまた、本発明において記述されている、プライム／ブースト法において免疫原性組成物を利用するための使用説明書を含む。本キットはまた、注射器、スプレー器具その他のような組成物の投与のための器具と共に、あるアッセイを実行するための使用説明書、様々なキャリア、賦形剤、希釈剤、アジュバントおよび上で記述した類似物を含む。他の成分として、とりわけ、使い捨て手袋、汚染除去法説明書、アプリケーター棒または容器が挙げられる。
【００９４】
本発明をより良く理解してもらうために、次の実施例を示している。実施例は、説明の目的のみのためのものであり、本発明の範疇を制限するものとしては構成されていない。次の実施例において引用された、全ての文献、出版物および特許は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００９５】
以下の実施例において実証されているように、本発明のプライム／ブーストプロトコールは、免疫化した対象における、抗原特異的な細胞性および体液性免疫応答に対して、驚くべき相乗効果を誘導する。実際、本発明のプライム／ブーストプロトコールによって誘導されたこれらの反応を、複数のプライミング組成物のみの投与または複数のブースティング組成物のみの投与の結果と比較した場合、本発明の組成物に対する反応の驚くべき性質は、劇的に明らかとなる。ＤＮＡプラスミドを投与し、続いてｒＶＳＶブーストを投与することによる、望ましい抗原の呈示の組み合わせは、免疫化した対象における抗原特異的Ｔ細胞の増加、すなわち、追加の反応がかなり過剰な状態をもたらす。同様に、望ましい抗原に対する体液性免疫において実証された増加は、免疫化プロトコールにおいてＤＮＡプラスミドおよびｒＶＳＶ免疫原性組成物の両方を利用することによって、予想外に大きい。例えば、以下の表１および図４および５を参照のこと。
【実施例】
【００９６】
実施例１：ＤＮＡプラスミドの調製
本実施例は、実施例２および３において述べているような、本発明の具体例において有用なプラスミドの実例を記述している。これらのプラスミドは、本発明の範疇を制限するものではないが、その後の実験において利用するために最適化された。次のＤＮＡ免疫原性組成物は、標準的な組換えＤＮＡ技術を利用して構築された。ＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇ遺伝子を発現しているＤＮＡ骨格ベクターは、ＨＣＭＶプロモーター、ＢＧＨポリＡ末端配列、Ｃｏ１Ｅ１細菌の複製の開始遺伝子（ｏｒｉ）；および選別のためのカナマイシン耐性遺伝子を利用する。
【００９７】
Ａ．ＳＩＶｇａｇｐ３７ＤＮＡプラスミド
ＷＬＶ１０２プラスミドは、それに対する免疫応答が望ましかった選別した抗原として、ＳＩＶｇａｇｐ３７を発現している細菌のプラスミドである。ＷＬＶ１０２プラスミド（４３８３ｂｐ）は、ＤＮＡプラスミド発現ベクターＷＬＶ００１に挿入された、ＲＮＡ最適化した先端部を切り取られたＳＩＶに由来するｇａｇ遺伝子（ｐ３７）（Ｑｉｕら、１９９９年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：９１４５−９１５２）からなる。ｇａｇ遺伝子は、抑制配列を不活化することによってＲＮＡ最適化し、それによって、出典明示により本明細書の一部とする、米国特許第５９６５７２６号；５９７２５９６号；６１７４６６６号；６２９１６６４号および６４１４１３２号；および国際特許公報ＷＯ０１／４６４０８において詳細に考察された技術を用いて、高いレベルのＲｅｖから独立したｇａｇ遺伝子の発現を可能にした。
【００９８】
ＷＬＶ１０２プラスミド骨格は、三つの遺伝子単位からなる。一番目は、ＨＣＭＶ即時型プロモーター／エンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５年、上で引用）およびＢＧＨポリアデニル化シグナル（ＧｏｏｄｗｉｎＥＣおよびＲｏｔｔｍａｎＦＭ、１９８２年  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６３３０−１６３３４）に由来する遺伝子要素を含む、真核生物遺伝子発現単位である。ｇａｇ遺伝子は、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間でクローニングされる。二番目の成分は、キメラカナマイシン耐性遺伝子の（ｋｍ’）遺伝子、アデニル４’−ヌクレオチジルトランスフェラーゼタイプ１ａである（米国特許第５８５１８０４号参照）。この遺伝子は、限られた数のアミノグリコシドに対する耐性を与え、プラスミドを含む細菌の選別を可能にするように考案された。三番目の成分は、細菌の発酵の間にプラスミドが増殖するために必要となる、ＣｏｌＥ１細菌複製開始配列である。このプラスミドは、図１Ａに示している。
【００９９】
Ｂ．サイトカインをコード化するプラスミド−ｒＩＬ−１２ＤＮＡ
サルＩＬ−１２ＷＬＶ１０４プラスミドは、サルＩＬ−１２のヘテロ二量体を発現している二重プロモーター構造である。ＷＬＶ１０３プラスミドは、ヒトＩＬ１２タンパク質ｐ３５およびｐ４０をコード化する二つの遺伝子からなる二重プロモーター発現プラスミドである。プラスミドは、全体で６２５９ヌクレオチドを有する。二つのインターロイキン１２サブユニット、ｐ３５またはｐ４０のうちの一つを含むＷＬＶ１０３における各々のシストロンは、別々の調節分子の調節の下にある。ｐ３５サブユニットは、ＨＣＭＶプロモーター／エンハンサー、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳａｌＩおよびＭｌｕＩ部位の間でクローニングされる）の調節下にある。ｐ４０サブユニットは、ＳＣＭＶプロモーターの調節下にあり、ＢＧＨポリアデニル化シグナル（ＸｈｏＩ部位にクローニングされる）を有する。
【０１００】
プラスミド骨格は、いくつかの成分からなる。一番目の成分は、ＨＣＭＶ即時型プロモーター／エンハンサーおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ＭおよびＳｈｅｎｋ  Ｔ．，１９８１年  Ｃｅｌｌ，２４：２５１−２６０）に由来する遺伝子要素を含む、真核生物遺伝子発現単位である。二番目の成分は、ＳＣＭＶプロモーター（Ｊｅａｎｇら、１９８７年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：１５５９−１５７０）およびＢＧＨポリアデニル化シグナルからなる、真核生物遺伝子発現単位である。三番目の成分は、キメラカナマイシン耐性遺伝子の（ｋｍ’）遺伝子、アデニル４’−ヌクレオチジルトランスフェラーゼタイプ１ａである。四番目の成分は、細菌中のプラスミドの増殖に必要となる、ＣｏｌＥ１細菌複製開始配列である。
【０１０１】
生じたプラスミドベクターのＳＩＶｇａｇ／ＨＩＶｇａｇおよびＩＬ−１２ＤＮＡを、制限酵素消化によって分析した。プラスミドを、１０％の胎児子牛血清（ＦＣＳ）および抗菌物質を加えたＤＭＥＭ中で増殖させたラブド肉腫細胞に、一過性にトランスフェクションさせた。これらの細胞を、その後ＨＩＶｇａｇに対する特定のモノクローナル抗体（ＡＢＩ）およびサル由来（ＳＩＶ感染動物由来）のＳＩＶｇａｇに対するポリクローナル血清をウエスタンブロットアッセイにおいて用いて、ウィルスタンパク質の適切な発現について分析した。ＩＬ−１２は、ｐ７０タンパク質を検出するＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、上澄みから検出された。
【０１０２】
プラスミドベクターは、カナマイシンを補ったＬＢ培地で増殖させた、形質転換したＤＨ１０Ｂ細胞中に広がり、業者の説明に従ってＱｉａｇｅｎキットを用いて精製した。その後、ＤＮＡを、既知の標準的手法と異なり、アガロースゲル上で電気泳動することによって分析した。
【０１０３】
次の実施例において利用するために、各々のプラスミドは、０．２５％のブピバカイン中に２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で、総体積を４．０ｃｃとして処方した。
【０１０４】
実施例２：組換えＶＳＶベクターの調製
Ａ．ＶＳＶゲノムｃＤＮＡクローニング
ＶＳＶゲノムｃＤＮＡ操作についての遺伝的背景は、ｐＶＳＶ−ＸＮ１（Ｓｃｈｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９６年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２３１８−２３）である。このクローンは、修飾を受けた形態のＶＳＶインディアナ種（ＶＳＶｉ）ｃＤＮＡ配列を含む。修飾には、二つの特有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩ）を付加し、ＶＳＶ遺伝子開始シグナルおよびＶＳＶ遺伝子停止シグナルのコピーを付加することを含む。ＨＩＶ−１８９．６ｐｅｎｖｇｐ１６０またはＳＩＶｇａｇｐ５５またはＨＩＶ−１ｇａｇのような外来の遺伝子が、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩ部位の間に都合よく挿入される場合は、ＶＳＶ転写調節シグナルによる発現調節に適した位置に定着する。ＶＳＶｃＤＮＡ配列にはまた、生きたウィルス複製産物を回復させることを促進するために必要となるシス作用性ＤＮＡ配列が側面に位置している。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、ウィルスｃＤＮＡ全体にわたる一次転写産物の転写にあたるものである。リボザイムは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが転写を終結させた後に、ＲＮＡゲノムの末端を形成するために一次転写産物を解離する。
【０１０５】
最初に、ｒＶＳＶｉゲノムクローン（ｐＶＳＶ−ＸＮ１）を、ｇａｇ遺伝子（ＨＩＶクレードＢ）をＧおよびＬ遺伝子の間に挿入することによって修飾し、ｐｒＶＳＶｉ−ｇａｇプラスミドを生成した。同様に、ＨＩＶｅｎｖ遺伝子を含む、異なるｒＶＳＶｉｃＤＮＡクローンを作った（ｐｒＶＳＶｉ−ｅｎｖ）。ＨＩＶＨＸＢｃ２ｇａｇ遺伝子またはＨＩＶ６１０１種ｅｎｖ遺伝子を含むプラスミドの鋳型に由来する、コード領域配列を増幅することによって、ｇａｇおよびｅｎｖｃＤＮＡ配列を、ｐＶＳＶ−ＸＮ１に挿入するために調製した。ＰＣＲ増幅のために用いられるプライマーは、その後のクローニングに適した、末端制限酵素解離部位を含んでいた：５’プライマーはＸｈｏＩ部位を含んでおり、３’プライマーはＮｈｅＩ部位を含んでいた。増幅したコード領域配列を、別々にｐＶＳＶ−ＸＮ１に挿入し、ｇａｇを含んでいるクローンおよびｅｎｖを含んでいるクローンを生成した。
【０１０６】
ｐＶＳＶ−ＸＮ１に挿入されたｅｎｖ遺伝子は、ＨＩＶＥｎｖ／ＶＳＶＧ融合タンパク質をコード化する、修飾を受けた形態であった。Ｅｎｖの細胞質尾部が、ＶＳＶＧタンパク質のより短い細胞質尾部によってオーバーラップＰＣＲの手順を用いて置換された場合は、ｒＶＳＶ−ＨＩＶＥｎｖベクターに感染した後に細胞表面のＥｎｖ発現が高まることが示された（例えば、上で引用した、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９８年；上で引用した、Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年参照）。これら二つのプラスミドのベクター骨格は、公開された技術に従って、インディアナＧ遺伝子をチャンディプラまたはニュージャージー血清型のＧ遺伝子に変換することによって、変化させた。Ｇ遺伝子の変換は、Ｍ遺伝子中の特有のＭｌｕＩ部位、およびＶＳＶｃＤＮＡクローンにおいて作られたＸｈｏＩ部位を利用することによってなされた。
【０１０７】
チャンディプラ株またはニュージャージー株に由来する、ＶＳＶＧ遺伝子コード配列を、Ｍ遺伝子中のＭｌｕＩ部位を横切って伸びる５’プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅した。遺伝子停止／遺伝子開始シグナルおよびＸｈｏＩ部位に対応する追加の末端配列と共に、Ｇ遺伝子の３’末端に一致した配列を含む、３’ＰＣＲプライマーを用いた。これらのプライマーを用いて増幅した、Ｇ遺伝子のコード配列は、ＭｌｕＩおよびＸｈｏＩを有するプラスミド骨格から削除された後、元のインディアナＧ遺伝子を置換するために用いられた。
【０１０８】
Ｂ．ｃＤＮＡクローンからのｒＶＳＶの回復
ゲノムｃＤＮＡプラスミドまたはゲノムｃＤＮＡプラスミドから転写したＲＮＡは、細胞に導入した後、ウィルス複製周期を開始させるには不十分であった。ウィルスゲノムＲＮＡは、単独では、翻訳または複製のための活性のある鋳型ではなかった。従って、組換えウィルスは、様々なＶＳＶゲノムｃＤＮＡ構造から復元されなければならない。当該分野において知られた回復手順は、クローニングしたＤＮＡからウィルスを復元することを可能にする。ウィルスの回復の成功には、ウィルスｍＲＮＡ合成およびゲノム複製のために必要としたウィルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを形成する、ＰおよびＬタンパク質と共に、ウィルスゲノムＲＮＡをカプシドに包むために、ＶＳＶゲノムＲＮＡがＶＳＶＮタンパク質と共に細胞中に存在することを必要とした。培養した細胞中でこれら全てのウィルス成分を生成することは、ＶＳＶ、Ｎ、ＰおよびＬタンパク質をコード化する発現プラスミドに加えて、ＶＳＶゲノムｃＤＮＡについてのプラスミドを共感染させることによって達成された。
【０１０９】
これらのプラスミドは全て、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって転写させるために構築され；それによってトランスフェクションした細胞をまた、ファージポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルス（ＭＶＡ／Ｔ７またはＶＴＦ７−３）に感染させた。ＶＳＶの回復のために用いられた標準的手順は、上で引用した、Ｌａｗｓｏｎら、１９９５年；およびＳｃｈｎｅｌｌら、１９９６年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２３１８−２３に記述されている。この手順を、高度に弱毒化したウィルスの回復をより効率的にするために修正し、その手順がまた調節機関ガイドラインに一致するようにした。本方法は、簡潔に以下に記述している。
【０１１０】
変性ベロ細胞を、１２．５ｃｍ２のフラスコ中、ｒＶＳＶゲノムクローンを用いてトランスフェクトし、リン酸カルシウムトランスフェクション手順を用いて、ＶＳＶ、Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子をコード化するプラスミドを支持した。トランスフェクションが開始された時に、十分に証明されたＭＶＡ／Ｔ７を付加し、細胞あたりの２プラーク形成単位の多様性のある感染を与えた。トランスフェクション開始３時間後、細胞をヒートショック工程に３時間付し、いくつかのマイナス鎖ＲＮＡウィルスの回復効率を改善させた（Ｐａｒｋｓ，Ｃ．Ｌら、１９９９年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：３５６０−６）。トランスフェクションの４８−７２時間後、細胞および培養培地を、確立した単層のベロ細胞を含むより大きいフラスコへ移し、その後回復したウィルスの増幅を可能にするために、一日またはそれより多くインキュベーションした。この増幅工程後に採取したウィルスを濾過して、最も混合しているＭＶＡ／Ｔ７を除去し、ｒＶＳＶ種のクローン単離のために用いた。
【０１１１】
ウィルスゲノムＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＲＮＡウィルスゲノムを分析するために、共通配列決定法によって決定された。簡潔に言うと、精製したウィルスＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成し、その後ゲノムの一部重複している領域を、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物はゲル精製され、その後蛍光色素付きの終了暗号を用いた周期配列決定に付した。配列決定反応生成物を精製し、オートメーション化した配列決定機上で分析した。
【０１１２】
Ｃ．実施例において用いられた特異的構造
次の実施例において用いた特異的な組換えＶＳＶベクターを生成するために、ＨＩＶ−１８９．６Ｐｇｐ１６０を発現している組換えＶＳＶをＶＳＶＧタンパク質（ｒＶＳＶＨＩＶ−１ｅｎｖＧ）膜貫通領域に融合させ、ＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇｐ５５（ｒＶＳＶＳＩＶｇａｇ）を混合し、実施例の免疫原性組成物として用いた。インフルエンザ血球凝集素タンパク質を発現しているｒＶＳＶ（ｒＶＳＶｆｌｕＨＡ）を、調節組成物として用いた。組換えＶＳＶベクターを、ＶＳＶのＧおよびＬ転写単位の間に挿入した望ましい抗原をコード化する遺伝子を用いて、以前に記述されたように（Ｒｏｓｅら、２０００年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１０９０３−１０）調製した。次の構造は、上記の、Ｒｏｓｅらの論文において記述された。
【０１１３】
１．プラスミド構造
チャンディプラ糖タンパク質［Ｇ（Ｃｈ）］遺伝子を含むプラスミド（Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｐ．Ｓ．，１９８９年  Ｖｉｒｏｌ．，１７１：２８５−２９０）は、Ｄｒ．Ａｍｉｙａ、Ｂａｎｅｒｊｅｅ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃによって与えられた。インディアナ糖タンパク質［Ｇ（Ｉ）］遺伝子の代わりに、Ｇ（Ｃｈ）遺伝子を含むＶＳＶベクターを構成するために、相補的プライマー
【化１】
0005635950.tif 000002
および
【化２】
0005635950.tif 000003
およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発キットによるオリゴヌクレオチドに対する突然変異誘発を用いて、ＸｈｏＩ部位を、最初にＧ（Ｃｈ）遺伝子中から除去した。
【化３】
0005635950.tif 000004
を
【化４】
0005635950.tif 000005
に突然変異させることで、Ｇ（Ｃｈ）タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えることなく、ＸｈｏＩ部位を排除した。その遺伝子を、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたＰＣＲによって、その後増幅した。フォワードプライマーは、Ｇ（Ｃｈ）タンパク質についてのＡＴＧ開始コドンの上流にあるＭｌｕＩ部位（下線を引いた部分）を含む、
【化５】
0005635950.tif 000006
であった。リバースプライマーは、
【化６】
0005635950.tif 000007
であり、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ部位（太線部）、続いてＶＳＶ転写開始および停止シグナル（下線部）、続いてＧ（Ｃｈ）の３’コード配列に相補的な配列を含んでいた。
【０１１４】
ＰＣＲ産物を、ＭｌｕＩおよびＳａｌＩによって消化し、ＶＳＶＧ（Ｉ）コード配列（ＳａｌＩおよびＸｈｏｌは、ライゲーションのために適合した末端を残す）を除去するためにＭｌｕＩおよびＸｈｏｌを用いて消化した、ｐＶＳＶＸＮ−１ベクター（Ｓｃｈｎｅｌｌら、１９９６年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２３１８−２３２３）にクローニングした。本方法に由来するプラスミドは、ｐＶＳＶ（ＧＣｈ）ＸＮ−１と呼ばれ、Ｇ（Ｃｈ）遺伝子およびＬ遺伝子の間の特有のＸｈｏＩおよびＮｈｅＩ部位が側面に位置する、外来遺伝子のための発現部位を含む。
【０１１５】
上で記述されたものと同一の手順を、ｐＮＪＧプラスミドに由来するＧ（ＮＪ）タンパク質遺伝子を含むベクターを生成するために用いた（Ｇａｌｌｉｏｎｅ，Ｃ．Ｊ．，およびＪ．Ｋ．Ｒｏｓｅ、１９８３年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：１６２−１６９）。フォワードプライマーは、
【化７】
0005635950.tif 000008
であり、リバースプライマーは、
【化８】
0005635950.tif 000009
であった。太線の文字および下線部を引いた配列で示された部位は、上でチャンディプラ構造について記述した通りであり、その後のクローニング工程もまた上で記述した通りであった。生じた最終的なベクタープラスミドは、ｐＶＳＶ（ＧＮＪ）ＸＮ−１と呼ばれ、Ｇ（ＮＪ）遺伝子およびＶＳＶのＬ遺伝子の間の特有のＸｈｏＩおよびＮｈｅＩ部位が側面に位置する、外来遺伝子のための発現部位を含む。
【０１１６】
ＨＩＶＥｎｖ８９．６Ｇ遺伝子を含むベクターを生成するために、８９．６エンベロープタンパク質をＶＳＶＧ細胞質尾部と共にコード化する遺伝子を、ｐＶＳＶ−８９．６ｇｐ１６０Ｇに由来するＸｈｏＩおよびＮｈｅＩによって削除し（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９７年、上で引用した）、ベクターｐＶＳＶ（ＧＮＪ）ＸＮ−１またはｐＶＳＶ（ＧＣｈ）ＸＮ−１中の、ＸｈｏＩおよびＮｈｅＩ部位の間でクローニングした。このｇｐ１６０Ｇ遺伝子は、全てのｇｐ１２０およびｇｐ４１の細胞膜外および細胞膜貫通ドメインをコード化し、配列Ｉ−Ｈ−Ｌ−Ｃ（配列番号１１）で始まる、ＶＳＶＧ細胞質ドメインの２６Ｃ末端アミノ酸に融合した、８９．６Ｅｎｖ細胞質ドメイン（Ｎ−Ｒ−Ｖ−Ｒ）（配列番号１０）の四つのアミノ酸を有する。
【０１１７】
２．組換えウィルスの回復
組換えＶＳＶは、確立された方法（Ｌａｗｓｏｎら  １９９５年  上で引用した）を用いて復元された。簡潔に言うと、赤ん坊のハムスター腎（ＢＨＫ）細胞は、１０ｃｍのディッシュ上で増殖し、約６０％融合した。細胞を、その後１０の重複感染度（ＭＯＩ）で、ｖＴＦ７−３、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルスに感染させた（Ｆｕｅｒｓｔら、１９８７年  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２５３８−２５４４）。１時間後、各々のディッシュの細胞を、３μｇのｐＢＳ−Ｎ、５μｇのｐＢＳ−Ｐ、１μｇのｐＢＳ−Ｌ、および上で記述した三つの全長の組換え体のうちの一つをコード化する１０μｇのプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションを、ジメチルジオクトアデシル臭化アンモニウムおよびジオレイルホスファチジルエタノラミンを含む、カチオンリポソーム試薬を用いて実行された（Ｒｏｓｅら、１９９１年  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １０：５２０−５２５）。細胞を、その後３７℃で４８時間インキュベーションした。細胞の上澄みを、０．２μｍのフィルターを通過させてワクシニアウィルスの大部分を除去し、その後新しいＢＨＫ細胞に加えて追加で４８時間３７℃インキュベーションした。復元のために、ＶＳＶＧ（ｐＢＳ−Ｇ）をコード化する追加のプラスミド、４μｇ／プレートが、Ｎ、ＰおよびＬ支持プラスミドと共に含まれた。感染性ウィルスの復元は、ＢＨＫ細胞の単層を、ＶＳＶ細胞変性効果について調べることによって確認された。ウィルスプラークを、その後ＢＨＫ細胞上で単離し、個別のプラークに由来するウィルス群を、ＢＨＫ細胞の直径１０ｃｍのプレートに単一のプラークに由来するウィルスを付加することによって、増殖させた。これらの群を、その後８０℃で貯蔵した。ＶＳＶ（ＧＩ）−８９．６Ｇ、ＶＳＶ（ＧＣｈ）−８９．６ＧおよびＶＳＶ（ＧＮＪ）−８９．６Ｇについて得られた滴定価は、ＶＳＶ滴定価を約３倍減少させる手順である冷凍および解凍後、全て１０７から１０８ＰＦＵ／ｍｌの範囲にあった。
【０１１８】
次の実施例において利用するために、各々のｒＶＳＶ構造を、無菌のＤＭＥによって０．８ｃｃの最終体積に希釈した。
【０１１９】
実施例３：プライム／ブースト免疫化投与法
Ａ．免疫化プロトコール
マカークザル（グループにつき５体）を、ＳＩＶｇａｇｐ３７ポリタンパク質を発現しているＤＮＡプラスミド５ｍｇ（グループ１および２）、または空のＤＮＡプラスミド５ｍｇ（グループ３および４）を組み合わせて、サルのＩＬ−１２ｐ３５およびＩＬ−１２ｐ４０をコード化する５ｍｇの二シストロンのＤＮＡプラスミドを筋内注射することによって免疫化した。これら全てのＤＮＡプラスミドおよびその処方は、実施例１に詳細に記述されている。ＤＮＡ免疫化スケジュールは、０日目に最初の免疫化、続いて４週目および８週目に最初および二番目の免疫化することを規定していた。注射は、三角筋および大腿四頭筋における四つの部位に、針および注射器を用いて部位あたり１ｃｃで行った。
【０１２０】
ＨＩＶ−１ｇｐ１６０ｅｎｖ（５×１０６ｐｆｕ）遺伝子を含む血清型インディアナ（Ｉ）の組換え水疱性口内炎ウィルス（ｒＶＳＶ）、およびＳＩＶｇａｇｐ５５遺伝子を含む二番目のｒＶＳＶ（Ｉ）（５×１０６ｐｆｕ）（グループ２および３）、またはインフルエンザ赤血球凝集素遺伝子を含むｒＶＳＶ（Ｉ）（１×１０７ｐｆｕ）（グループ１および４）のいずれかに基づいた実施例２のベクターを、経鼻接種（手持ちのピペットを用いて、０．４ｃｃ／鼻孔）することによって、マカークザルを、その後１５週目にブーストした。ＨＩＶ−１ｇｐ１６０ｅｎｖ（５×１０６ｐｆｕ）遺伝子を含むｒＶＳＶ（血清型チャンディプラ、Ｃｈ）、およびＳＩＶｇａｇｐ５５遺伝子を含む二番目のｒＶＳＶ（Ｃｈ）（５×１０６ｐｆｕ）（グループ２および３）、またはインフルエンザ赤血球凝集素遺伝子を含むｒＶＳＶ（Ｃｈ）（１×１０７ｐｆｕ）（グループ１および４）のいずれかに基づいた実施例２のベクターを、経鼻接種（手持ちのピペットを用いて、０．４ｃｃ／鼻孔）することによって、マカークザルを、再び２３週目にブーストした。
【０１２１】
マカークザルを、細胞性および体液性免疫応答の誘導については末梢血で、抗体反応について様々な粘膜表面で厳密にモニターした。このモニターリングは、γインターフェロンに対するＳＩＶｇｓｇｐ５５ペプチドプールについての酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）、γインターフェロンに対するＨＩＶ−１ｅｎｖ６１０１ペプチドについてのＥＬＩＳｐｏｔ、およびγインターフェロンに対するＶＳＶＮペプチドについてのＥＬＩＳｐｏｔを実行することを含む。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ＰＢＬにおける細胞性免疫応答を検出した。
【０１２２】
血清（図４）、鼻腔内洗浄、直腸分泌液および唾液（データは示していない）を、ＥＬＩＳＡによる抗ＳＩＶｇｓｇｐ２７ＩｇＧ滴定価およびＥＬＩＳＡによる抗ＨＩＶ−１ｇｐ１６０ｅｎｖ滴定価について評価することによって、体液性免疫応答を検査した。血清について、ＥＬＩＳＡにおいて用いられた抗体は、キメラウィルスＳＨＩＶ８９．６およびＳＨＩＶ８９に対する標準的な抗体であった。
【０１２３】
Ｂ．サイトカインを分泌するネズミおよびヒト細胞を検出するためのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
他には酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）とも呼ばれる、濾過免疫プラークアッセイは、個別の抗体分泌Ｂ細胞を検出し、定量するために、最初に開発された。本技術は、迅速で用途の広い、従来のプラーク形成細胞アッセイに代わる選択肢を提供した。最近の改良ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの感受性が向上したため、１秒あたりの特定のタンパク質を１００分子生成する細胞が検出され得る。これらのアッセイは、タンパク質分泌細胞のすぐ近くを取り巻く環境において、（サイトカインのような）タンパク質の濃度が相対的に高いことを利用している。これらの細胞生成物を、高親和性抗体を用いて捕捉し、検出した。
【０１２４】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、同一のサイトカイン分子上の異なるエピトープに対する二つの高親和性サイトカイン特異的抗体：二つのモノクローナル抗体、または一つのモノクローナル抗体および一つの多価抗血清の組み合わせのいずれかを利用している。ＥＬＩＳｐｏｔは、単一の細胞によって分泌されるサイトカインを検出する比色反応を基にしたスポットを生成する。スポットは、最初のサイトカイン生成細胞の「足跡」を表す。スポット（すなわち、スポット形成細胞またはＳＦＣ）は恒久的であり、視覚的、顕微鏡的、電子工学的に定量され得る。
【０１２５】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、次のように実行された：９６ウェルの平底のＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を、一晩中１μｇ／ｍＬの濃度のマウスの抗ヒトγインターフェロン（ｈＩＦＮ−γ）モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ２７、ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア）で被覆し、０．２５％ツゥイーン２０を補足した１×ＰＢＳで１０回洗浄し、５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳで２時間ブロックした。マカークザル末梢血リンパ球（ＰＢＬｓ）を、フィコール・ハイパック密度勾配遠心法によって、新鮮に抜き取られたヘパリン投与した全血から単離し、５０μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｍ（Ｓｉｇｍａ）、ＳＩＶｇａｇのオープンリーディングフレーム全体に及ぶ１１アミノ酸と重複する１５アミノ酸ペプチドのプール（１μＭの最終ペプチド濃度）のいずれかを含む完全培養培地（５％ＦＣＳを補足したＲＰＭＩ１６４０培地、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００μＭの非必須アミノ酸）、または培地単独中に再び懸濁した。
【０１２６】
投入した細胞数は、１００μＬ／ウェル中２×１０５ＰＢＬｓであり、複製ウェル中でアッセイした。細胞を３７℃で１６時間インキュベーションし、その後最初にイオン除去した水で洗浄し、次に０．２５％ツゥイーン２０を含む１×ＰＢＳで１０回洗浄することによって、プレートから除去した。その後、プレートを、１％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳで希釈したウサギのポリクローナル抗ｈＩＦＮ−γビオチン化検出抗体（０．２μｇ／ウェル、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カマリロ、カリフォルニア）で処理し、室温で２時間インキュベーションした。プレートを、その後０．２５％ツゥイーン２０を含む１×ＰＢＳで１０回洗浄し、５％ＦＢＳおよび０．００５％ツゥイーン２０を含むウェルあたり１００μＬのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、バーミングハム  アラバマ）で処理し、室温で追加で２．５時間インキュベーションした。結合していないコンジュゲートを、プレートを０．２５％ツゥイーン２０を含む１×ＰＢＳで１０回すすぐことにより除去した。色素産生基質（１００μＬ／ウェル、１−ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰ、Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ）をその後付加して３−５分おき、水ですすぎ、プレートを空気乾燥させ、生じたスポットを倒立解剖顕微鏡を用いて目視で数えた。
【０１２７】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを本発明について実行することで、γインターフェロンの生成によって測定される、本発明のプライム／ブースト免疫化法における反応において誘導された、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）およびＣＤ４＋Ｔ細胞の数を測定した。この評価を、上で処理したマカークザル（３ＤＮＡプライムおよび２ＶＳＶブースト後）について２５週間追跡した。
【０１２８】
Ｃ．結果
最初のＤＮＡ免疫化後、ＳＩＶｇａｇ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ反応は、ＳＩＶｇａｇ／ＩＬ−１２ＤＮＡで免疫化したマカークザル（平均２５４ＳＦＣ／１０６細胞）１０頭のうち８頭で容易に検出された。二番目のＳＩＶｇａｇ／ＩＬ−１２ＤＮＡ免疫化後、免疫化したマカークザル１０頭のうち１０頭が、高いレベルのＥＬＩＳｐｏｔ反応を起こし、三番目のｇａｇ／ＩＬ−１２ＤＮＡ投与は、動物の大多数（平均１１３３ＳＦＣ／１０６細胞）においてｇａｇ特異的ＥＬＩＳｐｏｔ反応をブーストした。最初のｒＶＳＶＨＩＶｅｎｖ／ｒＶＳＶＳＩＶｇａｇブーストの後、平均ＳＩＶｇａｇＥＬＩＳｐｏｔ反応は、一回のｒＶＳＶＨＩＶｅｎｖ／ｒＶＳＶＳＩＶｇａｇ免疫化のみを受けた反応（平均３８６ＳＦＣ／１０６細胞）よりも、実質的に高かった。これらの結果は、ｒＶＳＶ免疫化の免疫原性を増大させるために、サイトカインで向上させたＤＮＡプライムを利用することを支持している。
【０１２９】
これらの結果は、以下の表１および図２、３、４および５において報告されている。図２は、２５週後に免疫化したこれらの動物に由来する、細分されていない末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）におけるｒＶＳＶＮ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ反応を示す。図３は、同一の試料についてのＨＩＶｅｎｖ６１０１特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ反応を示す。アステリスクは、統計学的有意差がｐ＝０．０００１で生じたことを示している。図４は、ＥＬＩＳＡによる抗ＳＩＶｇｓｇｐ２７ＩｇＧ滴定価およびＥＬＩＳＡによる抗ＨＩＶ−１ｇｐ１６０ｅｎｖ滴定価を測定する、血清抗体反応の結果を示す。ｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶベクターのブーストと共に、ＳＩＶｇａｇタンパク質をコード化するＤＮＡプラスミドを用いて免疫化するプロトコールを、（◆）によって表している。プライミングＤＮＡｇａｇプラスミド免疫化、それに続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶブーストを行うことを含む発明のプロトコールを、（■）によって表している。空の対照群のＤＮＡによるプライミング免疫化、それに続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶを用いた免疫化を行うことを含むプロトコールを、（▲）によって表している。対照群のＤＮＡプラスミドを用いたプライミング免疫化、それに続いてｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶによる免疫化を行うことを含むプロトコールを、（●）によって表している。各々のグループは、５つの動物から得られた結果を表す。グループ間の統計的有意差は、ｐ＝０．００７３(*)；ｐ＝０．５９４１(#)またはｐ＝０．００２７(￥)として示されている。
【０１３０】
図５は、同一の試料についての、平均ＳＩＶｇａｇ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ反応を示している。ｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶベクターのブーストと共に、ＳＩＶｇａｇタンパク質をコード化するＤＮＡプラスミドを用いて免疫化するプロトコールを、（◆）によって表している。プライミングＤＮＡｇａｇプラスミド免疫化、それに続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶブーストを行うことを含む発明のプロトコールを、（■）によって表している。空の対照群のＤＮＡによるプライミング免疫化、それに続いてＨＩＶｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を発現しているＶＳＶを用いた免疫化を行うことを含むプロトコールを、（▲）によって表している。（●）は、対照群のＤＮＡプラスミドを用いたプライミング免疫化、それに続いてｆｌｕＨＡタンパク質を発現しているＶＳＶによる免疫化を行うことを含むプロトコールを表す。各々のグループは、５つの動物から得られた結果を表す。グループ間の統計的有意差は、ｐ＝０．０００１およびｐ＝０．０００２の括弧として示されている。
表１は、同一の結果を、表の形で報告している。
【０１３１】
【表１】
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ａ平均ＳＩＶｇａｇ特異的ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔ反応は、最初のＤＮＡ免疫化の２５週間後で報告されている。
【０１３２】
これらのアッセイの結果は、複数のプライミング組成物のみの投与または複数のブースティング組成物のみの投与の結果と比較した場合、本発明に従ったプライム／ブースト投与法が驚くべき相乗効果を示すことを実証している。ＤＮＡプラスミドを投与し、続いてｒＶＳＶブーストを投与することによる、望ましい抗原の呈示の組み合わせは、免疫化した対象における抗原特異的Ｔ細胞を増加させ、それは追加の反応を相当超過している。同様に、望ましい抗原に対する体液性免疫において実証された増加は、免疫化プロトコールにおいてＤＮＡプラスミドおよびｒＶＳＶ免疫原性組成物の両方を利用することによって、予想外に大きい。
【０１３３】
実施例４：ＨＩＶに対する免疫化についてのマカークモデル
マカークザル（Ｒｈ）を、実施例３のプライム／ブースト戦略、および同一のプロトコールに従ったその中に記述されているプラスミドおよびＶＳＶベクターを用いて免疫化する。最初のプライミング組成物投与の約３２週後、マカークを、病原性ＳＩＶ／ＨＩＶ組換えウィルスＳＨＩＶ８９．６Ｐの５０％サル感染用量（ＭＩＤ５０）の３３０倍の用量で刺激する（Ｒｅｉｍａｎｎら、１９９６年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：３１９８−３２０６；Ｒｅｉｍａｎｎら、１９９６年  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：６９２２−６９２８）。
【０１３４】
刺激の後約５０−７０日間、動物を疾患についてモニターする。動物を、各々の免疫化の直前、１および２週間後に、細胞媒介性および抗体反応の誘導についてモニターする。刺激に先立って、およびその刺激の２、４、６、８および１２週後に収集した血清を、ＨＩＶ−１８９．６、８９．６Ｐ、６１０１および他のクレードＢ初期単離集団に対する中和抗体反応について検査する。本実験の免疫化段階の間、刺激の直前に、およびその刺激の２週間後ごとに、ＣＤ４／ＣＤ８数をモニターする。刺激の直前に、およびその刺激の１週間後ごとに、血清中のウィルス存在量を、分枝ＤＮＡ分析によって決定する。動物の他の体液（唾液と共に、膣液、直腸液および鼻腔分泌物）を、細胞性および体液性免疫について検査する。
【０１３５】
望ましい抗原に対する細胞媒介性免疫応答を、５１Ｃｒ遊離ＣＴＬアッセイ、可溶性ＭＨＣクラスＩ四量体染色、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイおよび細胞内サイトカイン分析を含む、いくつかの最も適切な細胞に基づくアッセイを用いて分析する。粘膜抗体反応は、粘膜試料と共に利用するために最適化したＥＬＩＳＡ技術によって評価する。血清抗体反応は、標準的なＥＬＩＳＡ技術によって評価する。それに加えて、全ての免疫化した動物由来の血清を、ＨＩＶＥｎｖ６１０１および他のクレードＢ初期単離集団に対する中和抗体反応について検査する。図６は、刺激後少なくとも２５０日間ＣＤ４Ｔ細胞の減少量が低下することによって評価できるように、本発明のプライム／ブーストの組み合わせによって誘導された免疫応答の向上によって、ＡＩＤＳからの防御力が向上する。
【０１３６】
免疫原性組成物によって誘導される免疫応答のモニターリングに加えて、生きたウィルスベクターの感染性を、ウィルスが散布されるレベルおよび継続期間を決定することによって評価する。各々の免疫化の後最初の３週間の間、頻繁な間隔で得られた鼻洗浄は、生きたＶＳＶが存在するかについて検査した。細胞質のウィルス存在量もまた、生きたウィルスコピーが存在するかについて検査した。図７は、プライム／ブーストの組み合わせによって誘導された免疫応答の向上によって、刺激後少なくとも２５０日間細胞質中に循環しているウィルスが減少することを実証している。
【０１３７】
そのような検査の結果はまた、対照群の動物と対比して、本発明に従って免疫化した動物において、非常に高い抗原特異性を有するＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞が存在する可能性がある。本発明のプライム／ブースト方法論に従って免疫化した動物は、ＨＩＶ曝露後も健康なままであり、一方免疫化していない動物はＡＩＤＳを発症するであろうと予想される。
【０１３８】
本プロトコールを他の既知のプライム／ブースト方法論と比較することで、本発明の方法が、免疫化した動物に対する安全性の点で、一回または複数回のＤＮＡプライミング組成物免疫化単独で、または一回または複数回のｒＶＳＶベクター免疫化単独で免疫化することによって提供されるよりも高いレベルの抗ＨＩＶＣＴＬｓおよび抗体を誘導する点で利点があることを実証していると予想される。本発明に従ったプライム／ブーストの反復は、相乗的である可能性があり、従ってＨＩＶに曝露される前の対象に対する事前の感染防御に有益であり、および既にＨＩＶに感染した対象に対する治療に有益である可能性がある。
【０１３９】
上の明細書において引用した全ての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。本方法および成分における、様々な修正および小さな変更は、当業者には明白であると信ずる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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