(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含むことを特徴とする試験物質の遺伝毒性を判定するための方法：
（ａ）配列番号３及び配列番号４からなる群より選ばれる、変異がある非蛍光性ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするヌクレオチド配列でゼブラフィッシュを形質転換させる工程と、
（ｂ）前記形質転換されたゼブラフィッシュを試験物質で処理する工程と、
（ｃ）前記試験物質で処理されたゼブラフィッシュ内の蛍光を測定する工程であって、前記蛍光が、前記試験物質で処理されたゼブラフィッシュにおいて、前記導入されたヌクレオチド配列の復帰変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）により前記非蛍光性ＥＧＦＰが蛍光性ＥＧＦＰに変異されることにより発生する工程。
【請求項２】
変異がある非蛍光性ＥＧＦＰは、野生型蛍光性ＥＧＦＰのヌクレオチド配列において（ｉ）フレームシフト変異、又は（ｉｉ）ミスセンス変異を誘発する置換変異により変異された請求項１に記載の方法。
【請求項３】
復帰変異は、フレームシフト変異がある非蛍光性ＥＧＦＰを蛍光性ＥＧＦＰに変異させる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
復帰変異は、置換変異がある非蛍光性ＥＧＦＰを蛍光性ＥＧＦＰに変異させる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
試験物質で処理される形質転換されたゼブラフィッシュは、胚（ｅｍｂｒｙｏ）である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
方法は、工程（ｂ）以後、試験物質で処理された形質転換ゼブラフィッシュの胚を培養して孵化させて仔稚魚（ｆｒｙｌａｒｖａｅ）を得る工程をさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）は、試験物質で処理されたゼブラフィッシュに対してフローサイトメトリーにより実施される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）は、試験物質で処理された胚を培養して孵化して得た仔稚魚に対してフローサイトメトリーにより実施される請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非蛍光性蛍光蛋白質を用いた遺伝毒性を判定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
周辺環境への化学物質の流入は環境及び人間健康に甚大な危険をもたらす。したがって、ヨーロッパ及び他の産業国家の最近の法律は、化学物質、殺虫剤、殺生物剤、及び医薬品の登録のために危険性評価データを要求している（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ、１９６７、１９９１、１９９２、１９９３ａ、ｂ、１９９４；ＣＶＭＰ／ＶＩＣＨ、２０００；ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ、２００６；ＶＩＣＨ、２００４）。化学物質の毒性を評価するために開発された多様な遺伝毒性アッセイのうちからエームスアッセイ（Ａｍｅｓ  ａｓｓａｙ）が最も頻繁に用いられている（非特許文献１及び２）。この方法は、ヒスチジンが欠乏された培養で成長を定量することで、サルモネラティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の欠損突然変異体（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔ）のｈｉｓ遺伝子で点突然変異の回復（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を検出することに基づく。しかしながら、エームスアッセイは次のような重大な欠点を持っている：サルモネラは発癌前駆物質（ｐｒｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ）を活性代謝物質（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）に転換させることに必要な脊椎動物の細胞内の機能を有しない。したがって、ＭｕｔａＭｏｕｓｅ（非特許文献３）、ＢｉｇＢｌｕｅ  ｍｏｕｓｅ（非特許文献４）、ｇｐｔ−Δトランスジェニックマウスシステム（非特許文献５）、及びｒｐｓＬトランスジェニックゼブラフィッシュ（非特許文献６）のような多様なトランスジェニック動物システムが開発された。しかしながら、前述した全てのシステムにおいて、トランスジェニックレポーター遺伝子は全て原核細胞起源で動物器官からＤＮＡを抽出した後、適切なテストバクテリア（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入されて評価されなければならなかった。
【０００３】
本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照にして挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｍｅｓ、Ｄｕｒｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３
【非特許文献２】Ｍａｒｏｎ  ａｎｄ  Ａｍｅｓ、１９８３
【非特許文献３】Ｇｏｓｓｅｎ、ｄｅ  Ｌｅｅｕｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９
【非特許文献４】Ｋｏｈｌｅｒ、Ｐｒｏｖｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１
【非特許文献５】Ｎｏｈｍｉ、Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６
【非特許文献６】Ａｍａｎｕｍａ、Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、試験物質の遺伝毒性を判定するための新規な方法を開発しようと努力した。その結果、本発明者らは蛍光蛋白質変異体、好ましくはＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）に形質転換された細胞、又はゼブラフィッシュを用いた遺伝毒性を判定するための方法（例えば、ＭｕｔａＦｉｓｈモデル）を開発し、これを用いて試験物質の遺伝毒性をＥＧＦＰ復帰突然変異体の蛍光により視覚化することができ、以前のモデルと比較して、より敏感で、かつ容易に遺伝毒性をテストすることができるということを見出し、本発明の完成に至った。
【０００６】
本発明の目的は、遺伝毒性を判定するための方法を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、遺伝毒性を判定するための組成物を提供することにある。
【０００８】
本発明の更に他の目的は、野生型ＥＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的及び利点は、以下の発明の詳細な説明、請求範囲、及び図面により、一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｐＥＧＦＰｍｕｔ：：ＣＡＴのベクターマップを示す。ｃａｔ遺伝子はｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）のｓｔｕＩ位置にクローニングされた。
【図２】図２は、変異体ＥＧＦＰｍｕｔのＤＮＡ配列が表示された野生型ＥＧＦＰのＤＮＡ（Ａ）及びアミノ酸配列（Ｂ）を示すものである。ＥＧＦＰｍｕｔ１の場合、１３７番目のロイシンがプロリンに置換された突然変異［Ｌ１３７Ｐ（ＣＴＧ  ｔｏ  ＣＣＣ）］を含み、ＥＧＦＰｍｕｔ２の場合、５１番目Ｇｌｙの次に、もう１つのＧｌｙが追加された突然変異（ＴＧ５１ＧＫＬＰＶＰＷＰＴ）であり、ＥＧＦＰｍｕｔ３の場合、５１番目Ｇｌｙの次に２つのＧｌｙが追加された−１フレームシフト突然変異である。ＥＧＦＰｍｕｔ２の蛋白質翻訳は、５１番目Ｇｌｙの以後、１０番目アミノ酸である６２番目のアミノ酸で中断される。ＥＧＦＰｍｕｔ３の配列は、次の通りである：ＮＨ２−ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＧＳＣＰＣＰＧＰＰＳ−ＯＨ。
【図３】図３は、ｐＣＭＶ−Ｍｕｔ−ＥＧＦＰ：：ｐＣＭＬＣ２−ｍＣｈｅｒｒｙのベクターマップを示す。ＥＧＦＰｍｕｔはｔｏ１２キット内の２つのａｔｔ位置の間にクローニングされた。
【図４】図４は、ＵＶ光の下でＥＧＦＰ変異体プラスミドを保有するサルモネラＬＴ２株を観察した結果である。使用したプラスミドは以下の通りである：Ａ、ｐＥＧＦＰ：：ｃａｔ；Ｂ、ｐＥＧＦＰｍｕｔ１：：ｃａｔ；Ｃ、ｐＥＧＦＰｍｕｔ３：：ｃａｔ；Ｄ、ｐＥＧＦＰｍｕｔ２：：ｃａｔ。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一態様によれば、本発明は下記工程を含む試験物質の遺伝毒性を判定するための方法を提供する：（ａ）変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）がある非蛍光性蛍光蛋白質をコードするヌクレオチド配列で魚類を形質転換させる工程；（ｂ）上記形質転換された魚類を試験物質で処理する工程；及び（ｃ）で処理された魚類内の蛍光を測定する工程であって、前記蛍光が、前記試験物質で処理された魚類において、前記導入されたヌクレオチド配列の復帰変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）により前記非蛍光性蛍光蛋白質が蛍光性蛋白質に変異されることにより発生する工程。
【００１２】
本発明の他の態様によれば、本発明は変異がある非蛍光性蛍光蛋白質をコードするヌクレオチド配列で形質転換された魚類を含み、上記形質転換された魚類を試験物質で処理して復帰変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）の発生を観察することを特徴とする遺伝毒性を判定するための組成物を提供する。
【００１３】
本発明の更に他の態様によれば、本発明はＥＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）をコードする配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列又はそれらの相補的なヌクレオチド配列を提供する。
【００１４】
本発明者らは、試験物質に対する新規な遺伝毒性を判定するための方法を開発しようと努力した。その結果、本発明者らは、蛍光蛋白質変異体、好ましくはＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）に形質転換された細胞又はゼブラフィッシュを用いた遺伝毒性を判定するための方法（例えば、ＭｕｔａＦｉｓｈモデル）を開発し、これを用いて試験物質の遺伝毒性をＥＧＦＰ復帰突然変異体の蛍光で視覚化することができ、以前のモデルと比較して、より敏感で、かつ容易に遺伝毒性をテストすることができることを見出した。
【００１５】
化学物質がＤＮＡと反応する程度又はＤＮＡを修飾させる程度を測定するための短期試験（ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｔｅｓｔ）方法が開発されてきたものであり、このような方法を用いて得られた陽性結果は、化学物質の発癌性を十分に立証することはできないが、可能性を提示し、たびたび動物生体定量のための化学物質選択に利用されてきた。このような短期試験方法で、突然変異原性試験（例：エームステスト）、染色体効果試験（例：染色体の数又は構造変化を測定）、哺乳動物細胞形質転換試験（例：細胞の変化を測定）などがある。
【００１６】
これら短期試験方法のうち、エームステストは化学物質が発癌物質か否かを評価するために用いられる最も一般的な方法である。エームステストによれば、化学物質のサルモネラティフィムリウム株の特定遺伝因子に対する復帰突然変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ又はｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ）誘発程度を測定する。エームステストで陽性結果を表す化学物質は、約９０％以上の場合、動物実験で発癌性を示す。エームステストは、次のような長所を有する：（ａ）低廉な費用；（ｂ）容易性；及び（ｃ）迅速性。しかしながら、エームステストは次のような致命的な欠点を有する。エームステストで用いられるサルモネラは原核生物であるので、真核生物（例えば、人間）の細胞内の機能を正常に反映できない。例えば、サルモネラは発癌前駆物質（ｐｒｏｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｓ）を活性代謝物質（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）に転換させることに必要な脊椎動物の細胞内の機能を遂行することができない。したがって、本発明者らは前述した短所を克服するために変異がある非蛍光性蛍光蛋白質を用いて試験物質の遺伝毒性を判定するための新規な方法を開発した。
【００１７】
本発明は野生型ＥＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）に形質転換された細胞（例：サルモネラティフィムリウム；ＣＨ４００１及びＣＨ４００３株）又は魚類（例：ＭｕｔａＦｉｓｈ）を用いた試験物質の遺伝毒性を判定するための方法を提供する。
【００１８】
本発明によれば、本発明は下記工程を含む遺伝毒性を判定するための方法を提供する：
（ａ）変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）がある非蛍光性蛍光蛋白質をコードするヌクレオチド配列に細胞又は魚類を形質転換させる工程；
（ｂ）上記形質転換された細胞又は魚類を試験物質で処理する工程；及び
（ｃ）上記試験物質が処理された細胞又は魚類内の蛍光を測定する工程であって、前記蛍光が、前記試験物質で処理された魚類において、上記導入されたヌクレオチド配列の復帰変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）により上記非蛍光性蛍光蛋白質が蛍光性蛋白質に変異されることにより発生する工程。
【００１９】
前述したように、試験物質が突然変異誘発因子として機能しているか否かを調べる最も簡単な方法は、細菌の栄養性突然変異体を使用して復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）実験を実施する方法（例えば、エームステスト）である。最も簡単な復帰実験は一定数の突然変異体の細菌を突然変異誘発物質が入っている培地で培養しながら、そこで生じる復帰突然変異体（ｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ）の数をカウンティングするものである。試験物質が突然変異誘発因子の場合、復帰突然変異体の数は試験物質で処理されない培地より増加する。
【００２０】
本発明者らは、非蛍光性蛍光蛋白質を細胞又は魚類に形質転換させて得た形質転換体を用いて試験物質の遺伝毒性をより効率的に判定する方法を開発し、本発明の方法は、上記非蛍光性蛍光蛋白質が蛍光性蛋白質に変異されて発生する蛍光を通じた視覚化により、一層容易で、かつ速かに遺伝毒性を判定することができる。したがって、本発明の方法は従来技術（エームステスト）の限界点である原核細胞を利用し、したがって、真核生物に適用できないという限界点を克服できる非常に優れる方法である。
【００２１】
本明細書で、用語“変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）”又は“突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）”は、本発明で利用できる非蛍光性蛍光蛋白質をコードするヌクレオチド配列で発生する変異を意味し、好ましくは、形質転換された細胞又は魚類で上記非蛍光性蛍光蛋白質が蛍光性蛋白質に復帰される変異（ｂａｃｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ又はｒｅｖｅｒｔａｎｔ）を意味する。
【００２２】
一般に、ＤＮＡ変異は多様な因子（例えば、紫外線、ウイルス、トランスポゾン、突然変異誘発物質など）により誘発され、生物体自体（例えば、細胞内に発生する超突然変異（ｈｙｐｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎ））により誘発できる。また、突然変異は多様な形態にＤＮＡ配列の変化をもたらすことができる。例えば、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、ミスセンス突然変異などがある。ミスセンス突然変異は、ＤＮＡ配列で１つのヌクレオチドが他のヌクレオチドに交換又は置換される点突然変異により変異されたヌクレオチドにより形成されたコドンによって発現される蛋白質が決まる。フレームシフト突然変異は、多数のヌクレオチドの挿入又は欠失により誘発される突然変異であって、挿入又は欠失されたヌクレオチドの数によって発現される蛋白質が決まる。ナンセンス突然変異は、１つのヌクレオチドが変化されて他のアミノ酸をコードするコドンへの変異を誘発する点突然変異であって、発現された変異蛋白質が元の活性を無くす場合が発生する。
【００２３】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の変異がある非蛍光性蛍光蛋白質は野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）蛍光蛋白質のヌクレオチド配列において（ｉ）フレームシフト変異，又は（ｉｉ）ミスセンス変異を誘発する置換変異により変異される。本発明によれば、本発明の非蛍光性蛍光蛋白質をコードするヌクレオチド配列で生じる変異は前述した突然変異を含む。即ち、本発明で誘発された変異は試験物質により非蛍光性蛍光蛋白質をコードするヌクレオチド配列の上に多様な形態の突然変異が発生して非蛍光性蛍光蛋白質（変異体）が蛍光蛋白質に復帰されて蛍光を引き起こす。試験物質の処理により非蛍光性蛍光蛋白質（変異体）が蛍光蛋白質に復帰されて蛍光を示す場合、試験物質が形質転換された細胞又は魚類で遺伝毒性を示すことと判定され、これは試験物質が発癌物質（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ）の候補物質として判断される。
【００２４】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の復帰変異はフレームシフト変異がある非蛍光性蛍光蛋白質を蛍光性蛋白質に変異させ、又は置換変異がある非蛍光性蛍光蛋白質を蛍光性蛋白質に変異させる。より好ましくは、本発明の復帰変異はＥＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）をコードする配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列又はそれらの相補的なヌクレオチド配列がコードする非蛍光性蛍光蛋白質を蛍光性蛋白質に変異させる。本明細書の用語“置換変異（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）”は本発明の非蛍光性蛍光蛋白質をコードするヌクレオチド配列を変異させて非蛍光性蛍光蛋白質を蛍光性蛋白質に変異させることを意味し、これは点突然変異、挿入、又は欠失などを含み、より好ましくはミスセンス突然変異により誘発される変異を意味する。
【００２５】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の判定方法で利用できる蛍光性蛋白質は、ＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＲＦＰ（ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ（ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ（ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＹＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＲＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＴｏｍａｔｏ、又はＥＢＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、本発明の蛍光性蛋白質はＥＧＦＰである。
【００２６】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のＥＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）は蛍光を示さない。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の方法が適用できる魚類はゼブラフィッシュを含むが、これに限定されるものではない。
【００２８】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の方法は前述した工程（ｂ）以後、試験物質で処理された形質転換魚類の胚を培養して孵化させて仔稚魚（ｆｌｙｌａｒｖａｅ）を得る工程をさらに含む。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の工程（ｃ）で、蛍光測定は当業界に公知された多様な方法を用いて実施することができ、最も好ましくはフローサイトメトリーを用いて実施される。
【００３０】
本発明のより好ましい具現例によれば、本発明は（ａ）前述した形質転換された細胞又は魚類に試験物質を処理する工程；及び（ｂ）上記ＥＧＦＰ変異体の蛍光を測定する工程を含む突然変異誘発物質（ｍｕｔａｇｅｎｓ）のスクリーニング方法であって、上記試験物質が配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列又はそれらの相補的なヌクレオチド配列からなる野生型ＥＧＦＰ変異体蛋白質の蛍光を誘導すれば、突然変異誘発物質であると判断される。
【００３１】
本発明の方法は、前述した本発明のＥＧＦＰ変異体を有効性分として含むため、両方に重複した内容は重複記載に従う本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法を言及しながら使われる用語“試験物質”は、多様な非蛍光性蛍光蛋白質をコードするヌクレオチド配列又はそれらの相補的なヌクレオチド配列、又は前述したヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなる非蛍光性蛍光蛋白質で変異を誘発して復帰突然変異体を発生させる未知の物質を意味し、より好ましくは、図２の配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列又はそれらの相補的なヌクレオチド配列、又は配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列からなる野生型ＥＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）蛋白質で変異を誘発して蛍光蛋白質を発生させる物質を意味する。
【００３３】
次に、試験物質で処理された細胞又は魚類において、非蛍光性蛍光蛋白質の蛍光蛋白質への変異を蛍光で検出する。より好ましくは、前述した野生型ＥＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）蛋白質において、非蛍光の蛍光への復帰変異を蛍光で検出する。
【００３４】
上記試験物質は合成又は天然化合物のライブラリー又は天然材料から得ることができる。合成又は天然化合物のライブラリーを得る方法は当業界に公知されている。合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（ＵＳＡ）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（ＵＳＡ）、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（ＵＳＡ）、及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）から商業的に購入可能であり、天然化合物のライブラリーはＰａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＵＳＡ）、及びＭｙｃｏＳｅａｒｃｈ（ＵＳＡ）から商業的に購入可能である。
【００３５】
試験物質は当業界に公知された多様な組合ライブラリー方法により得ることができ、例えば、生物学的ライブラリー、空間アドレッサブルパラレル固相又は液相ライブラリー（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、デコンボリューションが求められる合成ライブラリー方法、“１−ビード１−化合物”ライブラリー方法、そして親和性クロマトグラフィー選別を用いる合成ライブラリー方法により得ることができる。分子ライブラリーの合成方法は、ＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０，６９０９，１９９３；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１，１１４２２，１９９４；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，２６７８，１９９４；Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１，１３０３，１９９３；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０５９，１９９４；Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３，２０６１；Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７，１２３３，１９９４等に提示されている。
【００３６】
一方、本発明は前述したＥＧＦＰ変異体を含む組み換えベクター又はその転写物により形質転換された細胞及び遺伝子導入による形質転換された細胞又は形質転換体を提供する。
【００３７】
本発明の形質転換された細胞又は形質転換体は、前述した本発明のＥＧＦＰ変異体を有効成分として含むため、両方に重複した内容は重複記載に従う本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００３８】
本発明の組み換えベクターは、配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列又はそれらの相補的なヌクレオチド配列を含む。本発明の組み換えベクターは典型的にクローニングのためのベクター又は発現のためのベクターとして構築できる。また、本発明の組み換えベクターは原核細胞又は真核細胞を宿主にして構築できる。
【００３９】
好ましくは、本発明の組み換えベクターは、（ｉ）前述した本発明の発現対象物質をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）上記（ｉ）のヌクレオチド配列に動作可能なように連結され、動物細胞で作用してＲＮＡ分子を形成させるプロモーターを含み、より好ましくは、（ｉ）前述した本発明の配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列又はそれらの相補的なヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉ）上記（ｉ）のヌクレオチド配列に動作可能なように連結され、動物細胞で作用してＲＮＡ分子を形成させるプロモーター；及び（ｉｉｉ）動物細胞で作用して上記ＲＮＡ分子の３’−末端のポリアデニル化を引き起こす３’−非翻訳部位を含む組み換え発現ベクターを含む。
【００４０】
好ましくは、前述した発現対象物質は蛍光蛋白質が変異された非蛍光性蛍光蛋白質であり、上記蛍光蛋白質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＲＦＰ、及びＥＢＦＰを含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＥＧＦＰである。
【００４１】
本明細書において、用語“プロモーター”はコード配列（ＣＤＳ）又は機能的ＲＮＡの発現を調節するＤＮＡ配列を意味する。本発明の組み換え発現ベクターにおける発現対象物質コードヌクレオチド配列は、上記プロモーターに動作可能なように連結される。本明細書において、用語“動作可能なように結合された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）”は、核酸発現調節配列（例：プロモーター配列、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これによって上記調節配列は上記他の核酸配列の転写及び／又は翻訳を調節するようになる。
【００４２】
本発明のベクターが原核細胞を宿主にする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃ  ＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなど）、翻訳のためのリボゾーム結合部位及び転写／翻訳終結配列を含むことが一般的である。より好ましくは、本発明で用いられる宿主細胞はサルモネラであり、最も好ましくはサルモネラティフィムリウムＬＴ２株である。この際、本発明で用いられるプロモーターには、ｌａｃプロモーターが好ましい。また、宿主細胞としてＥ．ｃｏｌｉが用いられる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレーター部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４（１９８４））、そしてファージλの左向プロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｉ．ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ，Ｄ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９−４４５（１９８０））が調節部位として利用できる。一方、本発明に利用できるベクターは当業界でたびたび使われるプラスミド（例：ｐＳＣ１０１、ＣｏｌＥ１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＨＣ７９、ｐＵＣ１９、ｐＥＴなど）、ファージ（例：λｇｔ４λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１、及びＭ１３など）、又はウイルス（例：ＳＶ４０など）を操作して製作できる。
【００４３】
本発明のベクターを宿主細胞内に保有する方法は、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ２方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３））、ハナハン方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３）；及びＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７−５８０（１９８３））及び電気穿孔方法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：６１２７−６１４５（１９８８））などにより実施できる。
【００４４】
一方、本発明の組み換えベクターが魚類のような哺乳動物で適用される場合、利用できるプロモーターは、好ましくは動物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞で作動して本発明の発現対象物質の転写を調節できるものであって、哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター及び哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーターを含み、例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ヒト伸長因子アルファ（ｈＥＦ１α）プロモーター、メタロチオネインプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター、及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーターを含むが、これに限定されるものではない。最も好ましくは、ＣＭＶプロモーター又はｈＥＦ１αプロモーターである。好ましくは、本発明に用いられる発現コンストラクトはポリアデニル化配列を含む（例：ウシ成長ホルモンターミネーター及びＳＶ４０由来ポリアデニル化配列）。
【００４５】
より詳しくは、本発明の形質転換用組み換えベクターは“プロモーター−発現対象物質コードヌクレオチド配列−ポリアデニル化配列”の構造を有し、より好ましくは、“ＣＭＶプロモーター−非蛍光性蛍光蛋白質−ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列”から構成される。また、上記形質転換用組み換えベクターは、上記コンストラクトの両方にトランスポゾンエレメントを含むことができるように多位置ゲートウェイ−基盤コンストラクトキット（Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｋｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００７）を用いて製造する。構築された組み換えベクターをゼブラフィッシュ系列で得られた受精卵（ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｅｇｇｓ）、より好ましくは単一細胞段階の受精卵にマイクロインジェクションさせる（Ｘｕ，Ｑ．（１９９９）．Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｉｎ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｍ．Ｇｕｉｌｌｅ，Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１２７，ｐｐ．１２５−１３２．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．）。前述した受精卵は受精後２０分間が超えない受精卵を用いて、マイクロインジェクション後、生成された胚（Ｆ１  ｅｍｂｒｙｏｓ）で性成熟を誘導し、互いに交配させて形質転換された発現対象物質に対する同型接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）を含むＦ２胚を得る。以後、Ｆ２胚ゼブラフィッシュ間の交雑（ｉｎ−ｃｒｏｓｓ）を通じてＦ３胚を得る。
【００４６】
本発明のベクターシステムは当業界に公知された多様な方法により構築されることができ、これに対する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は本明細書に参照として挿入される。
【００４７】
本発明の組み換え発現ベクターを用いて形質転換された動物細胞の製造は、当業界に通常的に公知された遺伝子転移方法により実施できる。例えば、電気穿孔法（工法）（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポゾーム−媒介転移方法（Ｗｏｎｇ等、１９８０）、レトロウイルス−媒介転移方法（Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０），Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．４１：１７３−１８２；Ｋｏｐｃｈｉｃｋ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｉｎ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌｓ，ｅｄ．Ｎ．Ｌ．Ｆｉｒｓｔ＆Ｆ．Ｐ．Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ，ｐｐ．２７５−２９３，Ｂｏｓｔｏｎ；Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ；Ｌｅｅ，Ｍ．−Ｒ．ａｎｄ  Ｓｈｕｍａｎ，Ｒ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．４ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｎｇｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ａｐｐｌ．Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ  Ｐｒｏｄ．１６，１０７−１１０）及びマイクロインジェクション（Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  Ｃｏｕｒｓｅ，Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ａｕｇｕｓｔ，２００５；Ｘｕ，Ｑ．（１９９９）．Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｅｍｂｒｙｏｓ．  Ｉｎ  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｍ．Ｇｕｉｌｌｅ，Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１２７，ｐｐ．１２５−１３２．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ．）があり、より好ましくはマイクロインジェクションにより実施される。
【００４８】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、蛍光蛋白質変異体、好ましくは野生型ＥＧＦＰ変異体（ＥＧＦＰｍｕｔ）を用いた遺伝毒性を判定するための方法に関する。
（ｂ）本発明によれば、本発明の蛍光蛋白質変異体、好ましくは野生型ＥＧＦＰ変異体が形質転換されたゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）系統であるＭｕｔａＦｉｓｈシステムは試験物質処理により蛍光蛋白質変異体の復帰（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）が誘発された蛍光仔稚魚を生産して試験物質の遺伝毒性を測定できる非常に優れる動物システムを提供する。
（ｃ）本発明のＭｕｔａＦｉｓｈシステムは、従来技術（例えば、エームステスト）の限界点であった真核生物で試験物質の遺伝毒性を非常に簡単で、かつ速かに判定することができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施形態を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施形態は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施形態により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【００５０】
（実施例）
実験材料及び実験方法
サルモネラ株
エームステスト用Ｓ．チフィムリウム株であるＴＡ９８及びＴＡを購入して製造者の指示によって培養した（Ｘｅｎｏｍｅｔｒｉｘ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。染色体の上にＥＧＦＰｍｕｔ  ＤＮＡを保有するＣＨ４００１及びＣＨ４００３株（表１）を実験結果に記載した通り製造した。
【００５１】
【表１】
0005634531.tif 000002
【００５２】
ＥＧＦＰｍｕｔの製造
突然変異を誘発するプライマーを用いた位置指定突然変異誘発法（ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により非蛍光突然変異されたＥＧＦＰを得た。次のような４セットのプライマーを用いた：ｌａｃプロモーターの上流にｐＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）（Ｙａｎｇ，Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）のＢａｍＨＩ位置を含む正方向プライマー（プライマー１）及び停止コドンの下流にＥｃｏＲＩ位置を含む逆方向プライマー（プライマー４）（表２）。好ましい突然変異を含む第２セットのプライマー（プライマー２−ｘ及びプライマー３−ｘ）は必要な変異（ｃｈａｎｇｅ）を生産するためにデザインされた（Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００１）。ＥＧＦＰｍｕｔ１を製作するために、プライマー１及び３ｄを用いて最初のＰＣＲ（９５℃、３０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、１分間）を実施し、プライマー２ｄ及び４を用いて第２セットのＰＣＲ（９５℃、３０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、１分間）を実施した。ＥＧＦＰｍｕｔ２を製作するために、プライマー１及び３ａを用いて最初のＰＣＲ（９５℃、３０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、１分間）を実施し、プライマー２ａ及び４を用いて第２セットのＰＣＲ（９５℃、３０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、１分間）を実施した。ＥＧＦＰｍｕｔ３を製作するために、プライマー１及び３ｂを用いて最初のＰＣＲ（９５℃、３０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、１分間）を実施し、プライマー２ｂ及び４を用いて第２セットのＰＣＲ（９５℃、３０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、１分間）を実施した。２つ反応のＰＣＲ産物を混合し、最適化してアニーリングさせ、以後、プライマー１及び４を用いた最終ＰＣＲのテンプルレートとして用いた。最終ＰＣＲ産物をＥｃｏＲ１及びＢａｍＨ１で切断してｐＥＧＦＰ空ベクターに再ライゲーションさせた。前述したプラスミドはｌａｃプロモーターの調節の下で非蛍光ＥＧＦＰ遺伝子を含んでいる。サルモネラ染色体にＥＧＦＰｍｕｔ遺伝子を位置させるために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をプラスミドのＳｔｕＩ位置に挿入させてｐＥＧＦＰｍｕｔ：：ＣＡＴプラスミドを作った（図１）。ＥＧＦＰｍｕｔの配列変更は図２に記載されている。
【００５３】
【表２】
0005634531.tif 000003
【００５４】
ＥＧＦＰｍｕｔ  ＤＮＡのサルモネラ染色体への挿入
ＥＧＦＰｍｕｔ  ＤＮＡが染色体の終結（ｔｅｒ）部位から約５ｍｉｎ位離れたｐｕｔＡ位置を用いてサルモネラティフィムリウムＬＴ２株の染色体に挿入された（Ｅｌｌｉｏｔｔ、１９９２）。サルモネラエンテリカ血清型ティフィムリウムのｐｕｔＡ位置の配列を含む次のプライマーを用いてｌａｃＰ−ＥＧＦＰｍｕｔ：：ＣＡＴ  ＤＮＡを増幅した：５’プライマー、５’−ＧＡＡＡＴＣＧＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＴＡ  ＣＣＡＡＴＡＧＣＣＴＴＧＡＣＧＣＡＡＴＡＧＡＧＴＡＡＴＧＡＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴ−３’及び３’プライマー、５’−ＣＧＴＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＣＴＣＴＴＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＣＡＣＧＡＴＴＡＴＴＴＣＡ  ＴＣＧＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＣＧＴＡＧＣＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＡＡＧ−３’。前述したプライマーは、ｐＥＧＦＰｍｕｔ：：ＣＡＴプラスミドをテンプレートでｌａｃＰ−ｎｏｎＥＧＦＰ：：ｃａｔに隣接した５０−ｎｔ又は５５−ｎｔのｐｕｔＡ（アンダーラインした配列）、及び２５−ｎｔ配列又は２２−ｎｔ配列で各々構成された。１．４−ｋｂｐのＰＣＲ産物を精製してレッドヘルパープラスミド（ｐＫＤ４６）を有するバクテリアに電気穿孔法により形質転換した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ、２０００）。線形ＤＮＡはエームステストのサルモネラティフィムリウム株であるＴＡ１００及びＴＡ９８でｐ２２形質導入するためのマーカーとしてクロラムフェニコール遺伝子を含み、結果的にＣＨ４００１及びＣＨ４００３を各々製造した（Ｄａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）。
【００５５】
エームステスト（Ａｍｅｓ  ｔｅｓｔ）
プレート−挿入アッセイ（ｐｌａｔｅ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）を以前の記述したように実施した（ＯＥＣＤ、１９９７）。簡略には、ストック溶液からバクテリア細胞を液体培地で１２時間の間３７℃で培養した。０．１ｍＬのバクテリア懸濁液を０．６％アガー、０．６％ＮａＣｌ、２０．９６μｇのｌ−ヒスチジン及びｄ−バイオチン（Ｓｉｇｍａ）を含む２ｍＬのトップアガー（Ｄｉｆｃｏ）培地に添加した。また、テスト溶液（又は、溶媒照合群、又は製剤陽性照合群）、及びＳ９−混合物（Ｓ９−ｍｉｘ；０．５ｍＬ／プレート；１０ｖ／ｖ％Ｓ９；Ｓｉｇｍａ）、又はカリウムリン酸緩衝液（０．５ｍＬ／プレート；０．２Ｍ、ｐＨ７．４）（Ｓｉｇｍａ）をトップアガーに添加して混合した後、Ｖｏｇｅｌ−Ｂｏｎｎｅｒ最小培地アガープレートの塗抹した（処理実験群の場合、投与当たり独立的な３個の複製群及び溶媒照合群の場合、投与当たり独立的な６個の複製群）。コロニーを３７℃で４８時間の間培養した後、カウントした。プレートに添加されたテスト溶液の最も大きい容量は最初実験の場合１００μＬに制限し、再確認実験では２００μＬまで増加させた。
【００５６】
Ｓ９−混合物
組成：１ｍＬのＳ９−混合物は０．１ｍＬのＳ９、０．０１ｍＬの０．４Ｍ  ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ）、０．０１ｍＬの１．６５Ｍ  ＫＣｌ（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＬの０．２Ｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４；Ｓｉｇｍａ）、０．０４ｍＬの０．１Ｍ  ＮＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ）、０．００５ｍＬの１Ｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）及び０．３３５ｍＬの蒸溜水を含んでいる。全ての補助因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）は使用前に０．４５−μｍの滅菌膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。
【００５７】
突然変異誘発因子の製造
５ｍＭ  ２−（Ｎ−モルフォリノ）エテインスルホン酸（ｐＨ６．０）（Ｓｉｇｍａ）で緩衝化した０．００８％  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔｓ（Ｓｅｎｊｕ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｈｙｏｇｏ，Ｊａｐａｎ）１０５．５ｍＬにＥＮＵ（ｉｓｏｐａｃｋ  Ｎ−３３８５；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）１ｇを溶解させて８１ｍＭ  ＥＮＵのストック溶液を製造し、−８０℃に格納した。２ｍｇ／ｍＬ  ＩＣＲ−１９１（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡ）のストック溶液は１０ｍＬの滅菌蒸溜水に２０ｍｇのＩＣＲ−１９１を溶解させて製作した。
【００５８】
ＥＧＦＰｍｕｔを保有するゼブラフィッシュ発現ベクターの構築
ｐＥＧＦＰｍｕｔ：：ＣＡＴプラスミド内のＥＧＦＰｍｕｔ遺伝子を正方向プライマー（ａｔｔＢ１）及び逆方向プライマー（ａｔｔＢ２）を用いてＰＣＲ増幅した。プライマー配列は、次の通りである：５’−ＧＧＧＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ−３’（正方向）；５’−ＧＧＧＧＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＡＴＣＴＡＧＡＧ−３’（逆方向）。増幅されたＰＣＲ産物をＴｏ１２プラスミドでゲートウェイクローニングしたが、ＥＧＦＰｍｕｔ遺伝子はＣＭＶプロモーターにより発現された（Ｔｏ１２キット：Ｔｏ１２トランスポゾン形質転換コンストラクトのための多位置ゲートウェイ−基盤構築キット（Ｆｉｓｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｋｗａｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００７））。Ｔｏ１２プラスミドは心臓−特異的ＣＭＬＣ２プロモーターにより調節されるｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子を保有するが、これは生殖系列伝逹の指示子として用いられる。最終的なコンストラクトであるｐＣＭＶ−Ｍｕｔ−ＥＧＦＰ：：ｐＣＭＬＣ２−ｍＣｈｅｒｒｙ（図３）は、制限酵素切断及びＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００５９】
トランスジェニックゼブラフィッシュの製作
前述した通り製作されたＥＧＦＰｍｕｔプラスミドはトランスポサーゼｍＲＮＡを有するＡＢ＊ゼブラフィッシュ系列（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯＲ、ＵＳＡ）で作られた単一細胞段階受精卵にマイクロインジェクションされた。マイクロインジェクションされた受精卵は、性成熟（ｓｅｘｕａｌ  ｍａｔｕｒｉｔｙ）が誘発され、野生型ＡＢ＊ゼブラフィッシュと交配（ｍａｔｅ）した。以後、生成された胚（ｅｍｂｒｙｏｓ）の心臓でｍＣｈｅｒｒｙ蛍光の存否に対してスクリーニングした。突然変異されたＥＧＦＰのゲノム組込み（挿入）を確認するために、スクリーンされた胚（Ｆ１）でＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング及びサザンブロッティングを実施した。Ｆ１胚にまた性成熟が誘発され、互いに交配（ｍａｔｅ）してＥＧＦＰｍｕｔに対して同型接合であるＦ２胚を発生させた。Ｆ２ゼブラフィッシュ間の交配を通じて発生したＦ３胚で再び性成熟を誘発した。
【００６０】
突然変異誘発因子の処理
受精卵を、トランスジェニックＦ３雌及び非トランスジェニック雄フィッシュを交配して得た。本発明者らは相変らずコリオンで囲まれた２４時間胚を３グループ（２６６胚／グループ）に分類した後、０．１％  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｏｃｅａｎ  ｓａｌｔｓ（Ｓｅｎｊａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，Ｈｙｏｇｏ，Ｊａｐａｎ）に含まれた０、２ｍＭ、又は５ｍＭ  ＥＮＵ  １０ｍＬで処理して３０分間２６℃で反応した。以後、突然変異誘発された胚をリンスし、２８．５℃培養器で３日間維持した。ほとんど全ての胚が培養期間の間に孵化した。合わせられた生存稚魚を形態的な非正常稚魚とＥＧＦＰ＋稚魚をカウントした。
【００６１】
統計分析
全ての分析をウィンドウ統計パッケージ用  ＳＰＳＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．０を用いて実施した。エームステストで得られた実験的な値に対する統計的分析は、母数的方法、即ちＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔ−検定（Ｄｕｎｎｅｔｔ、１９５５；Ｄｕｎｎｅｔｔ、１９６４）、及び投与量に従う反応を観察した線形回帰分析（Ｋｉｒｋｌａｎｄ、１９９４）により実施した。ＳＣＥテストの場合、一元変量分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した後、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−検定及びｐｏｓｔ−ｈｏｃ  Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ  ｔ−検定を遂行した。ＴＦ分析はχ２−テストを用いて実施した。実施された全てのテストで≦０．０５のｐ−値が統計的に留意性を有することと見なした。
【００６２】
実験結果
非蛍光ＥＧＦＰの製造
エームステストと遺伝的に類似のＥＧＦＰを用いた視覚的遺伝毒性テストシステムを作るための試みとして、本発明者らはエームステストで採択された２つの突然変異、ｈｉｓＧ４６（ＴＡ１００）及びｈｉｓＤ６６１０（ＴＡ９７）に注目した。ｈｉｓＧ４６突然変異はＬｅｕ（ＣＴＣ）がＰｒｏ（ＣＣＣ）に置換された塩基対を有し、ｈｉｓＤ６６１０突然変異はＣ１フレームシフト突然変異により６個のシトシン（−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−）をもたらす。これら突然変異は、反復的なＣ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−配列のリーディングフレームに影響を及ぼすｈｉｓＤ３０５２（ＴＡ９８）の−１フレームシフト突然変異を復帰させる幾つかの突然変異誘発因子に感受性がある（Ｉｓｏｎｏ  ａｎｄ  Ｙｏｕｒｎｏ，１９７４；Ｌｅｖｉｎ，Ｙａｍａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。本発明者らはＥＧＦＰで類似の突然変異を誘発させて非蛍光蛋白質を作るために位置指定突然変異誘発法を用いた。まず、本発明者らはｈｉｓＧ４６突然変異と類似するようにＬｅｕ１３７をＰｒｏに置換した。このような置換は、突然変異ＥＧＦＰを非蛍光蛋白質に変化させた（図４）。これをＥＧＦＰｍｕｔ１と命名し、ｈｉｓＧ４６突然変異のように突然変異誘発因子により塩基対置換を検出できることと期待した。以後、本発明者らはＧＦＰのコア構造で空のシリンダーを形成するβ−バレルに連結されたα−ヘリックスの部位（ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｔｓｉｅｎ、１９９８）に位置したＧｌｙ５１（ＧＧＧ）の次にＧｌｙ（ＧＧＧ）が追加された更に他の突然変異ＥＧＦＰを作った。これは、Ｇｌｙ５１（ＧＧＧ）の次に追加的なグリシンがＥＧＦＰ分子にほとんど影響を及ぼさないので、蛍光蛋白質を生産する。図４は、追加的なＧｌｙを持つＥＧＦＰ蛋白質（ＥＧＦＰｍｕｔ２）が蛍光を発することを示す結果である。一方、フレームシフト突然変異のための６個のグアノシンを有する頻発部位（ｈｏｔ  ｓｐｏｔ）ＤＮＡ配列を製作した。したがって、５個のグアノシンを有するＥＧＦＰｍｕｔ２から−１Ｇフレームシフト突然変異が誘発されてＥＧＦＰｍｕｔ３が製作された。この場合、ＥＧＦＰ蛋白質翻訳がＧｌｙ５１以後の１０番目のアミノ酸である６２番目のアミノ酸で中断される。この蛋白質は非蛍光性を有するものと分かった（図４）。５個のグアノシンを保有するＥＧＦＰｍｕｔ３はフレームシフト突然変異の検出に用いられる株であるｈｉｓＤ６６１０と類似するものと予想された。
【００６３】
ＥＧＦＰｍｕｔを保有するサルモネラティフィムリウムテスト株を用いた遺伝毒性テスト
次に、エームステストと類似の突然変異テスト株を確立するためにＥＧＦＰｍｕｔ遺伝子を関連サルモネラティフィムリウムの染色体に移した。ＥＧＦＰｍｕｔ遺伝子が野生型サルモネラ（ＬＴ２）染色体の上のｐｕｔＡＰ位置（Ｅｌｌｉｏｔｔ、１９９２）に入るようにλレッドシステムを用いた線形ＤＮＡ形質転換方法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ、２０００）を実施した。一般的な形質導入ファージであるＰ２２を用いてＥＧＦＰｍｕｔ１及びＥＧＦＰｍｕｔ３遺伝子を各々ＴＡ１００及びＴＡ９８に挿入させてＣＨ４００１及びＣＨ４００３を製作した。
【００６４】
本発明者らは突然変異誘発因子（ＥＮＵ及びＩＣＲ１９１）の存在下で従来のエームステスト株であるＴＡ１００及びＴＡ９８と一緒にＣＨ４００１及びＣＨ４００３の突然変異頻度をテストした。ＥＮＵは塩基−対の置換を誘発するものと知られている一方、ＩＣＲ１９１はフレームシフト突然変異を誘発するものと知られている（ＯＥＣＤ、１９９７）。最小培地プレートの下でＨｉｓ＋復帰突然変異体（ｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ）を選択し、約１０６コロニーを個別的に視覚化できるＮＡプレートでＥＧＦＰ＋復帰突然変異体をスクリーニングした。突然変異誘発因子の不在下で、Ｈｉｓ＋及びＥＧＦＰ＋復帰突然変異体は全てＴＡ及びＣＨ株で１．１〜１．８×１０−６の頻度で発生した（表３）。ＥＮＵ（０．１ｍｇ／プレート）の存在下で、塩基置換用テスト株であるＴＡ１００及びＣＨ４００１でＨｉｓ＋復帰突然変異体の頻度は各々５．６×１０−６及び５．２×１０−６に増加した。このような復帰頻度は、以前の報告（Ｌａｎｇ、１９８４）で報告された範囲内にあるものである。非常に興味深くても、本発明者らはＥＮＵの存在下でＥＧＦＰ＋復帰突然変異体も７．１×１０−６の頻度で類似するように増加した。ＴＡ９８及びフレームシフト突然変異用テスト株であるＣＨ１００３をＩＣＲ１９１（１ｍｇ／プレート）と反応させた。Ｈｉｓ＋復帰突然変異体は以前の報告（Ｈｅｒａ  ａｎｄ  Ｐｕｅｙｏ、１９８８）と類似するように４２０．８×１０−６の突然変異頻度で増加した。また、ＴＡ９８でＨｉｓ＋復帰突然変異体が３２７．６×１０−６の突然変異頻度で増加した。ＩＣＲ１９１の存在下で、ＥＧＦＰ＋復帰突然変異体は４５６．３×１０−６の突然変異頻度で類似するように増加した。総合して見ると、前述した結果はＨｉｓ＋復帰突然変異においてＣＨ４００１及びＣＨ４００３がＴＡ１００及びＴＡ９８と機能的類似体ということを表した。したがって、ＣＨ株等のＥＧＦＰ＋復帰突然変異システムはエームステストのＨｉｓ＋復帰突然変異システムを置換することができる。
【００６５】
【表３】
0005634531.tif 000004
【００６６】
遺伝子を保有するトランスジェニックゼブラフィッシュを用いた細胞毒性テスト
本発明者らはＥＧＦＰｍｕｔをコードするＴｏ１２プラスミド及びトランスポサーゼｍＲＮＡを単一細胞段階ゼブラフィッシュ受精卵に注入した。実験プロトコルに記載されたように、生殖系列伝達によるＦ１子孫をＰＣＲ及びサダンブロット分析により選択した。１つの高い導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）−陽性系列を同定した。この系列のＦ３子孫をＦ２ゼブラフィッシュと非トランスジェニックゼブラフィッシュとを交配させて得た場合、Ｆ２ゼブラフィッシュはＦ３子孫ゼブラフィッシュの約５０％に導入遺伝子を伝達したが、これは導入遺伝子が安定的にゼブラフィッシュ染色体のうちの１つに統合されることを表す。結果的に、本発明者らはＥＧＦＰｍｕｔ１を保有するＭｕｔａＦｉｓｈ１及びＥＧＦＰｍｕｔ３を保有するＭｕｔａＦｉｓｈ３を確立した。
【００６７】
これらトランスジェニックゼブラフィッシュを用いてインビボで突然変異を検出できるか否かを調べるために、トランスジェニックゼブラフィッシュと非トランスジェニックゼブラフィッシュとを交尾させて得た２４時間胚に突然変異誘発因子を３０分間処理した：５ｍＭ  ＥＮＵで処理されたＭｕｔａＦｉｓｈ１及び１０ｍＭ  ＩＣＲ１９１で処理されたＭｕｔａＦｉｓｈ３。３日後、ＥＧＦＰ＋稚魚の数を測定した（表４）。突然変異誘発因子の不在下で発生する突然変異体の頻度のバックグラウンドは約２〜３×１０−５であった。この値はマウスシステム（Ｇｏｎｄｏ，Ｓｈｉｏｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）及びｒｐｌＳを保有するトランスジェニックゼブラフィッシュ（Ａｍａｎｕｍａ，Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）で観察される値と類似しており、処理された胚のゲノムＤＮＡで突然変異を検出するには非常に低い値である。ＥＮＵで処理されたＭｕｔａＦｉｓｈ１は６．３×１０−４の頻度でＥＧＦＰ＋ラルヴァの数を増加させたが、これは形態学的異常の増加（２０．９％）と関連していた。これはｒｐｌＳを保有するトランスジェニックゼブラフィッシュでの結果と類似している（Ａｍａｎｕｍａ，Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＩＣＲ１９１で処理されたＭｕｔａＦｉｓｈ３は２．３２×１０−３の頻度でＥＧＦＰ＋稚魚の数を増加させたが、これは形態学的異常の増加（２４．２％）と関連していた。総合して見ると、前述したデータはＭｕｔａＦｉｓｈシステムがアルキル化剤及び塩基性付加物を含む突然変異−誘発性化合物（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）の遺伝毒性を調べることに利用できることを表した。
【００６８】
【表４】
0005634531.tif 000005
【００６９】
ディスカッション
ＥＧＦＰ復帰突然変異システムを用いるＭｕｔａＦｉｓｈシステムは遺伝毒性テストのための選択的動物テストを提供する。ＭｕｔａＦｉｓｈシステムの最も大きい長所は遺伝毒性の視覚化ということができる：ＵＶ光の下でＥＧＦＰ＋稚魚の定量化は化学物質の遺伝毒性の反映であり、稚魚に対するいかなる追加的な操作も必要としない。医薬品を登録するための調節システムは遺伝毒性テストを実施する必要があるが（Ｂｉｌｌｉｎｔｏｎ，Ｈａｓｔｗｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，２００８；ＣＰＭ／ＩＣＨ  １９９５）、このようなテストはゲノムを損傷させたり、又は他の方法を通じてゲノムを修飾させて癌発病率（ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）及び／又は遺伝性突然変異の危険を増加させる化合物を同定するために考案された。例え化学物質の環境的な危険を予測する多様な選択的接近方法が用いられるが、本発明者らは本研究でＭｕｔａＦｉｓｈが最も便利な動物アッセイシステムということを証明した。ゼブラフィッシュは利用可能な研究内容、技法、及び接近方法的な面で独特である。しかしながら、本発明でゼブラフィッシュに適用されたＥＧＦＰｍｕｔシステムを用いた本発明の視覚的技法はメダカ（ｍｅｄａｋａ；Ｏｒｙｚｉａｓ  ｌａｔｉｐｅｓ）及びファットヘッドミノー（ｆａｔｈｅａｄ  Ｍｉｎｎｏｗ；Ｐｉｍｅｐｈａｌｅｓ  ｐｒｏｍｅｌａｓ）のような他の実験モデルフィッシュ種にも適用できる。また、これら種の稚魚が稚魚／成魚に対する急性毒性テストを置換することができる方法として提案できる（Ｂｒａｕｎｂｅｃｋ，Ｂｏｅｔｔｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｃｈｏｌｚ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００７０】
ＭｕｔａＦｉｓｈシステムの感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を向上させるために、今後ＤＮＡ復旧酵素に欠陥を有するフィッシュが考慮されなければならない。多くのインビボマウスモデルで、次の株が開発されてより効果的に多くの毒性化学物質を検出することに利用されてきた：ＸＰＡ−／−、ＸＰＣ−／−、Ｍｓｈ２＋／−、Ｍｓｈ２−／−、及びｐ５３＋／−突然変異マウス、Ａｐｃ（ＡｐｃΔ７１６、Ａｐｃ１６３８Ｎ、Ａｐｃｍｉｎ）突然変異マウス、Ａ３３Δ＿β−ｃａｔノックイン（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）マウス（Ｄａｓｈｗｏｏｄ、２００３）。これらのうち、いろいろなモデルが腫瘍形成（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）のターゲット及び非ターゲット器官で化学物質によりインビボで誘発された突然変異スペクトラムに対する考察を提供した。また、ＤＮＡ復旧システムに含まれるが、まだ同定されない他の遺伝子等も検出感度のさらなる向上のためにＭｕｔａＦｉｓｈでテストできる。
【００７１】
本研究で、本発明者らが蛍光ＧＦＰの利点を利用したとしても、本発明の技法は一連のＧＦＰ変異体（Ｓｈａｎｅｒ，Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，２００５）及びホタルルシフェラーゼ及びレニラルシフェラーゼを含む光発生蛋白質のような他の蛍光蛋白質に拡張できる。また、本研究で記載されない蛍光を無くすことができるＧＦＰの更に他の突然変異が本発明より化学物質への曝露に対し、より高い復帰率（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅ）を有することも可能である。
【００７２】
去る数年間、ゼブラフィッシュは発生を研究するモデルとして生物学者にその重要性が非常に大きい手段となったが、その理由はゼブラフィッシュの胚が透明で、かつ早く発生し、ゼブラフィッシュの遺伝子がヒトと非常に類似（約７５％）し、脊椎動物であるためである（Ｂｒａｄｂｕｒｙ，２００４；Ｓｃｈｏｌｚ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００８）。発生する胚が毒性損傷に非常に敏感であるという事実を考慮する時、化学物質の遺伝毒性を視覚化するに当たってゼブラフィッシュシステムは魅力的なインビボモデルである。最近に実験及び他の科学的目的として用いられる動物の保護のためのヨーロッパ連合法律によれば、脊椎動物の胚段階での利用は規制されなかった（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ、１９８６）。したがって、胚を用いた実験は動物実験に対する代替手段として考慮されている（Ｆｌｅｍｉｎｇ、２００７）。したがって、修飾されたフローサイトメトリー法を用いて小規模（ｓｍａｌｌ−ｓｃａｌｅ）、高速（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）分析を実施できるという点でＭｕｔａＦｉｓｈシステムは化学物質の環境的危険評価のための卓越なモデルである。
【００７３】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たってこのような具体的な技術は単に好ましい具現例であるだけであり、これに本発明の範囲が制限されるものでないことは明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されるべきである。
【００７４】
参考文献
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Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（１９９２）．“Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ９２／３２／ＥＥＣ  ｏｆ  ３０  Ａｐｒｉｌ  １９９２  ａｍｅｎｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｖｅｎｔｈ  ｔｈｉｍｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ６７／５４８／ＥＥＣ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｌａｗｓ，  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｖｉｓｉｏｎｓ  ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｄａｎｇｅｒｏｕｓ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．”
Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ（１９９３ａ）．“Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ７９３／９３／ＥＥＣ  ｏｆ  ２３  Ｍａｒｃｈ  １９９３  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｉｓｋｓ  ｏｆ  ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．”Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ，Ｌ８４／１．
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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