(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病害真菌抑制作用を有し、配列番号１〜４においてチミンをウラシルとした四種類の二本鎖ＲＮＡを有するマイコウイルス。
【請求項２】
前記植物病害真菌の分生子形成を抑制する請求項１記載のマイコウイルス。
【請求項３】
イネ科植物に対する植物病害真菌を抑制する請求項１記載のマイコウイルス。
【請求項４】
イネいもち病菌を抑制する請求項１記載のマイコウイルス。
【請求項５】
配列番号１〜４においてチミンをウラシルとした四種類の二本鎖ＲＮＡを有するマイコウイルスゲノム。
【請求項６】
配列番号１〜４のいずれかに示す塩基配列からなる核酸。
【請求項７】
請求項１〜４いずれか一項記載のマイコウイルスを含有する植物病害真菌の弱毒菌株。
【請求項８】
受託番号ＤＳＭ２１３３４の菌株である請求項７記載の弱毒菌株。
【請求項９】
請求項１〜４いずれか一項記載のマイコウイルス、及び／又は、請求項７又は８記載の植物病害真菌の弱毒菌株を含有する植物病害防除剤。
【請求項１０】
請求項１〜４いずれか一項記載のマイコウイルスを含有する植物病害真菌を液体培地で培養し、その培養上清から前記マイコウイルスを回収する手順を少なくとも含む植物病害真菌抑制性マイコウイルス生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病害真菌を抑制する新規なマイコウイルス、それに関わる遺伝子・核酸・タンパク質、そのマイコウイルスを内在する植物病害真菌弱毒菌株、それらを含有する植物病害防除剤、マイコウイルス生産方法、植物病害真菌弱毒化方法、植物病害防除方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物病害には、気象・土壌など環境的要因で発生するもの、ウイルス・細菌・真菌（糸状菌）などの感染性要因で発生するもの、生理的障害により発生するもの、それらの複合的な要因で発生するものなどが存在する。現在においても、植物病害の中には食糧、花き、花木、樹木などの生産に阻害要因となるものが数多く含まれ、経済的影響が大きいものも多い。【０００３】
植物病害のうち、真菌は、最も重要な病害因子の一つである。植物病害の約８割は真菌によって引き起こされるといわれている。【０００４】
例えば、いもち病は、世界各地で発生している最も重要な植物病害の一つである。病原菌は、カビ（糸状菌）の一種であるイネいもち病菌（学名「Magnaporthe oryzae」）である。イネいもち病菌は、２５℃前後が発育・胞子形成・感染の適温であり、また、湿潤な環境を好む。そのため、夏季の低温、多雨、日照不足などの気象要因により大発生し、イネの不作・品質低下をもたらし、経済的に大きな打撃を与える。【０００５】
その他、紋枯病、さび病、うどんこ病、炭疸病、菌核病、べと病、灰色かび病など、真菌が原因で経済的影響も大きい植物病害は数多く存在する。そのため、現在においても、新しい農薬の開発や、品種改良などが試みられている（いもち病の防除に関して、例えば、特許文献１、２参照）。【０００６】
ここで、本発明に関連する事項であるマイコウイルスについて、以下説明する。【０００７】
真菌類（Ｆｕｎｇｉ、以下同じ）に感染するウイルスをマイコウイルスという。その中で、二本鎖ＲＮＡをゲノムとするマイコウイルスが報告されている。それらのマイコウイルスは、宿主菌に潜在的に感染し、宿主の形質にほとんど影響を与えないものが多い。【０００８】
二本鎖ＲＮＡをゲノムとするマイコウイルスは、現在、パルチチウイルス科（学名「Partitiviridae」、以下同じ）、トチウイルス科（学名「Totiviridae」、以下同じ）、クリソウイルス科（学名「Chrysoviridae」、以下同じ）など、５科に分類されている。パルチチウイルス科ウイルスは、ウイルス粒子中に、二つのほぼ同じ大きさの直鎖状二本鎖ＲＮＡを有し、全遺伝子量は４〜６ｋｂｐである。トチウイルス科ウイルスは、ウイルス粒子中に４〜７ｋｂｐの一本の直鎖状二本鎖ＲＮＡを有する。その他、クリ胴枯れ病菌（学名「Cryphonectria parasitica」）では、菌内在性に存在し、９〜１３ｋｂｐの二本鎖ＲＮＡを有するウイルスが発見されている（ハイポウイルスなど）。【０００９】
クリソウイルス科ウイルスは、球形のウイルス様粒子を有し、四成分の二本鎖ＲＮＡを有する。また、パルチチウイルス科及びトチウイルス科のウイルスと同様、ＲｄＲＰ（ＲＮＡ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、以下同じ）をコードする領域を有することが知られている。クリソウイルス科に属するウイルスとして、例えば、Ｈｖ１４５ＳＶ（「Helminthosprium victoriae 145S virus」、以下同じ）、ＰｃＶ（「Pencillium chrysogenum virus」、以下同じ）、ＡｂＶ１（「Agaricus bisporus virus 1」、以下同じ）などが知られている（非特許文献１など参照）。【００１０】
近年、特定の植物病害に対し、その病原菌をマイコウイルスなどで弱毒化し、その弱毒菌を用いてその病害を防除する方法が検討され、一部実用化されている。例えば、クリ胴枯れ病菌の毒性を抑制するウイルス性二本鎖ＲＮＡの完全長ｃＤＮＡを用いてその菌を弱毒化し、クリ胴枯れ病の防除に応用する方法（非特許文献２など参照）や、紫紋羽病菌（学名「Helicobasidium mompa」）を抑制する二本鎖ＲＮＡウイルスを発見し、その二本鎖ＲＮＡを内在する紫紋羽病菌弱毒菌株を用いて紫紋羽病を防除する方法（非特許文献３、特許文献３など参照）などが開示されている。
【特許文献１】特開２００４−１４３０４５号公報
【特許文献２】特開２００３−２５０３７０号公報
【特許文献３】特開２００１−７８７５２号公報
【非特許文献１】C. M. Fauquet, Mary Ann Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, L. A.Ball, “Virus Taxonomy: Classification and Nomenclature of Viruses; EighthReport Of The International Committee On Taxonomy Of Viruses”, ElsevierAcademic Press: p591-595
【非特許文献２】Gil H.Choi and Donald L.Nuss, “Hypovirulence of chestnut blightfungus conferred by an infectious viral cDNA.” Science. 1992 Aug7;257(5071):800-3
【非特許文献３】H.Osaki et al, “Detection of Double-Stranded RNA Virus from a Strainof the Violet Root Rot Fungus Helicobasidium mompa Tanaka” Virus Genes25:2,139-145, 2002
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の通り、植物病害真菌は植物・作物の品質や収穫量などに重大な影響を与える。一方、植物病原真菌を抑制するマイコウイルスの発見は少なく、そのようなマイコウイルスを用いた植物病害防除の試みもほとんど行われていない。そこで、本発明は、植物病害真菌を抑制する新規なマイコウイルス、及び、植物病害の新規な防除手段を提供することなどを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、天然に存在する植物病害真菌を独自に採取し、それらの真菌に対して抑制性に作用するマイコウイルスの探索を行った。その結果、植物病害真菌抑制作用を有し、２．８〜３．６ｋｂの四種類の二本鎖ＲＮＡを有する新規マイコウイルスを単離・同定し、かつその全長配列を得た。【００１３】
そこで、本発明では、植物病害真菌抑制作用を有し、２．８〜３．６ｋｂの四種類の二本鎖ＲＮＡを有し、天然に存在し、発明者らによって単離された新規マイコウイルス、それらの遺伝子、その塩基配列、その配列中、所定機能を有する特定部分の配列を少なくとも有する核酸、その配列がコードする一又は複数のタンパク質などを提供する。【００１４】
このマイコウイルスは、二本鎖ＲＮＡの配列中に、ＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）の保存モチーフを含み、かつその領域をコードするＲＮＡの塩基配列が既知のクリソウイルス科ウイルスと相同性を有する。従って、このマイコウイルスは、クリソウイルス科に分類される新種のウイルスであると推測する。【００１５】
上記の通り、このマイコウイルスは、植物病害真菌の生育などを抑制する作用を有する。従って、例えば、このマイコウイルスを宿主菌に感染などさせ、宿主菌に内在させることにより、植物病害真菌の弱毒菌株を作製することができる。【００１６】
また、例えば、本発明に係るマイコウイルス、及び／又は、作製した植物病害真菌の弱毒菌株を少なくとも含有する植物病害防除剤を、植物（イネなど）に付加（散布、塗布など）することにより、その植物病害を防除できる可能性がある。【００１７】
その他、本発明に係るマイコウイルスには、次のような特徴がある。【００１８】
従来、マイコウイルスは、菌糸融合により、宿主菌の細胞から細胞へ垂直伝播されるとされており、マイコウイルスの生活環の中に、宿主菌の細胞外に存在する段階は存在しないと考えられている。それに対し、本発明者らの研究により、本発明に係るマイコウイルスは細胞外にも存在しうることが分かった。【００１９】
従って、菌糸融合に依存せずに細胞外から宿主菌に感染させることができるため、本発明に係るマイコウイルスを、接合型の異なる菌主・菌株間でも幅広く感染させることができ、かつ、宿主菌に対し高効率で感染させることができる。即ち、これにより、植物病害真菌の弱毒化や植物病害の防除を、簡易かつ高効率に行うことができる可能性が高い。【００２０】
また、本発明に係るマイコウイルスは細胞外にも存在するため、例えば、宿主菌を液体培地で培養し、その培養上清からマイコウイルスを回収することにより、簡易かつ比較的大量にマイコウイルスを生産することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、簡易かつ高効率に植物病害を防除できる可能性がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
＜本発明に係るウイルスについて＞
本発明は、植物病害真菌抑制作用を有し、２．８〜３．６ｋｂの四種類の二本鎖ＲＮＡを有するマイコウイルス全てを包含する。【００２３】
このマイコウイルスは、各ウイルス粒子が２．８〜３．６ｋｂの四種類の二本鎖ＲＮＡのいずれかを有し、かつ、その四種類のウイルス粒子が同時に存在する状態で生存・継代する。なお、上述のクリ胴枯れ病菌マイコウイルス及び紫紋羽病菌マイコウイルスは、いずれも１２ｋｂ以上の単一成分の二本鎖ＲＮＡで構成されており、本発明に係るマイコウイルスとは構造が大きく異なる。従って、全く異なるウイルス種である可能性が高く、また、宿主菌に対する弱毒化作用のメカニズムも大きく異なる可能性が高い。【００２４】
上述の通り、このマイコウイルスは、二本鎖ＲＮＡの配列中に、ＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）の保存モチーフを含み、かつその領域をコードするＲＮＡの塩基配列がクリソウイルス科ウイルスと相同性を有する。従って、このマイコウイルスは、クリソウイルス科に分類される新種のウイルスであると推測する。【００２５】
このマイコウイルスの四種類の二本鎖ＲＮＡの塩基配列を配列番号１〜４に、その塩基配列がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５〜８に、それぞれ示す。【００２６】
なお、配列表記載の塩基配列は全てＤＮＡ配列として記載されているが、本発明に係る配列は、これらの配列を含め、全て、ＲＮＡの場合の配列（チミンがウラシルに置換したもの）も包含する（以下同じ）。【００２７】
シークエンス解析の結果、ＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）をコードする領域の塩基配列について、このマイコウイルスとＨｖ１４５ＳＶとの相同性は２２％、類似性は３９％、このマイコウイルスとＰｃＶとの相同性は２３％、類似性は３８％、このマイコウイルスとＡｂＶ１との相同性は２８％、類似性は４５％であった。【００２８】
従って、本発明に係るマイコウイルスは、クリソウイルス科ウイルス（例えば、Ｈｖ１４５ＳＶ、ＰｃＶ、ＡｂＶ１のいずれか）のゲノム中におけるＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）をコードする領域との相同性が２０〜１００％のもの、又は、類似性が４０〜１００％のものを全て包含する。ここで、「相同性」とは塩基配列が完全に一致していることを、「類似性」とは、アデニンとグアニンとを、又は、チミン（ウラシル）とシトシンとを置換することにより塩基配列が完全に一致することをいう。【００２９】
本発明に係るマイコウイルスは、所定のイネいもち病菌に内在性に存在する。従って、例えば、このマイコウイルスが潜在的に感染しているイネいもち病菌株からウイルスを分離・回収などすることにより、このマイコウイルスを取得できる。なお、本発明に係るマイコウイルスを内在するイネいもち病菌については、通常のイネいもち病菌と同様の培地・培養条件で培養できる。【００３０】
本発明に係るマイコウイルスとして、例えば、本発明者らが同定・命名したＭｏＣＶ１（Magnaporthe oryzae chrysovirus 1）が挙げられる。このウイルスは、少なくとも、イネいもち病菌（学名「Magnaporthe oryzae」）の「Ｓ−０４１２−II  １ａ」株に内在する。このイネいもち病菌の菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター及び独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託を依頼したが、ウイルスを内在することを理由に受託を拒否された。本菌株は、国立大学法人東京農工大学農学部植物病理学研究室において保存されており、各法令の遵守を条件に、第三者に分譲可能である。【００３１】
また、イネいもち病菌（学名「Magnaporthe oryzae」）の「Ｓ−０４１２−II  １ａ」株は、ドイツの国際寄託機関・ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung con Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH、所在地：
Inhoffenstr. 7B D-38124 Braunschweig GERMANY）に国際寄託された（寄託日：２００８年３月２５日、受託番号：ＤＳＭ２１３３４）。同株は、アメリカ合衆国の国際寄託機関・ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection、所在地： 10801
University Boulevard Manassas, VA 20110-2209 USA）にも国際寄託された（寄託日：２００８年５月１５日、受託番号：ＰＴＡ−９１３７）。なお、本菌株の原産地はベトナムである。【００３２】
ウイルスの分離・回収手段として、公知の方法を採用できる。例えば、菌体を液体窒素などで冷凍・破砕し、所定の緩衝液で懸濁した後、超遠心分離などでウイルスを分離することにより、ウイルスを回収できる。【００３３】
また、上述の通り、このウイルスは細胞外にも存在しうる。従って、例えば、マイコウイルスを含有する植物病害真菌（所定のイネいもち病菌など）を液体培地で培養し、その培養上清からウイルスを分離・回収してもよい。このウイルス自体も国立大学法人東京農工大学農学部植物病理学研究室において常時調製可能であり、常時第三者に分譲可能である。【００３４】
＜本発明に係る遺伝子、核酸、タンパク質などについて＞
本発明者らは、本発明に係るマイコウイルスの一つについてシークエンス解析を行い、全長の塩基配列を得た（配列番号１〜４）。従って、本発明は、そのマイコウイルス遺伝子、その塩基配列又はその一部を有する核酸、それらの塩基配列がコードするタンパク質などを全て包含する。【００３５】
本発明は、配列番号１〜４の四種類の配列を有するマイコウイルス遺伝子を包含する。【００３６】
本発明は、また、それらの塩基配列の全部又は一部を有する核酸も全て包含する。核酸は、二本鎖・一本鎖のどちらでもよく、また、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡなどを全て包含する。【００３７】
例えば、配列番号１〜４の全て又はいずれかの配列、該配列中、所定機能を有する特定部分の配列、それらと同等の塩基配列を有するｃＤＮＡ、それらと同等の塩基配列を組み込んだ組換えベクター（プラスミド、ウイルスなど）なども、本発明に包含される。【００３８】
シークエンス解析の結果、配列番号１の配列部分にはＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）の保存モチーフが存在すること、及び、配列番号３の配列部分にはラ・フランス病ウイルスの二本鎖ＲＮＡ断片と相同性を有することが分かった。従って、目的・用途に応じ、例えば、所定機能を有する特定部分としてこれらの配列部分を少なくとも有する核酸、組換えベクターなどを作製し、用いてもよい。【００３９】
なお、本発明に係る核酸（又は遺伝子）には、上記塩基配列と相同性を有する核酸、例えば、その塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、イネいもち病菌抑制作用を有するものも広く包含される。ここで、ストリンジェントな条件は、二本鎖核酸のＴｍ値など、公知技術により取得できる。【００４０】
本発明は、また、上述のマイコウイルス遺伝子及び核酸がコードする全てのタンパク質も包含する。本発明に係るタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５〜８に示す。【００４１】
それぞれ、配列番号５は配列番号１記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列、配列番号６は配列番号２記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列、配列番号７は配列番号３記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列、配列番号８は配列番号４記載の塩基配列中のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列である。【００４２】
なお、本発明に係るタンパク質は、配列番号５〜８のいずれかのアミノ酸配列を有するもののほか、それらと相同性を有しかつその機能を保持しているものを全て包含する。【００４３】
例えば、組換えベクターに上述の核酸を組み込み、その宿主に強制発現させることにより、それらのタンパク質を大量調製できる可能性がある。宿主には大腸菌類、酵母類、培養細胞など公知のものを利用可能であると考えられる。マイコウイルスが真菌に対して感染すること、酵母類が高増殖性を有しかつ利用も比較的簡便なことなどを考慮すると、宿主としては酵母類が最適である可能性がある。組換えベクターについても、公知のものを利用可能であると考える。【００４４】
また、例えば、配列番号１〜４のいずれかを組み込んだベクターを複数用いて、その四種類の遺伝子の複数を共発現させることにより、マイコウイルスを再構成できる可能性がある。その場合も、公知の宿主及び公知の組換えベクターを利用可能であると考えるが、複数のベクターを同時に導入できる点で、酵母類が最適な可能性がある。【００４５】
＜植物病害真菌弱毒菌株について＞
本発明に係る植物病害真菌弱毒菌株は、本発明に係るマイコウイルスを内在するものを全て包含する。即ち、例えば、そのマイコウイルスを既に内在するイネいもち病菌などの菌株、及び、そのマイコウイルスを感染させた植物病害真菌の菌株の両方を包含する。【００４６】
植物病害真菌にマイコウイルスを感染などさせる手段として、例えば、従来通り、菌糸融合の際に宿主菌に感染させる方法がある。また、上述の通り、本発明に係るマイコウイルスは細胞外でも存在しうるため、例えば、細胞外から直接的に宿主菌に感染させることもできる。【００４７】
この植物病害真菌弱毒菌株の例として、上述のＳ−０４１２−II  １ａ株が挙げられる。この菌株は、本発明に係るマイコウイルスが感染したイネいもち病菌の菌株である。従って、形態的性質、培養的性質、胞子形成、生理学的・化学分類学的性質は、基本的に公知のイネいもち病菌と同様である。但し、通常のイネいもち病菌よりも成長が遅く、菌糸が非同心円状に成長し、色素沈着も不均一である。また、気中菌糸の異常な発達が見られ、セクター形成や溶菌が観察される。【００４８】
＜植物病害防除剤について＞
本発明に係る植物病害防除剤は、本発明に係るマイコウイルス又は本発明に係る植物病害真菌弱毒菌株のいずれか一方を少なくとも含有するものを全て包含する。また、そのマイコウイルスとその植物病害真菌弱毒菌株の両方を含有していてもよく、その他の成分を含有していてもよい。【００４９】
その他の成分として、例えば、所定の担体、粘結剤、増粘剤、固着剤、防腐防かび剤、溶剤、安定化剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、着色剤などを含有していてもよい。また、他の農薬成分、例えば、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺菌剤、抗ウイルス剤、誘引剤、除草剤、植物生長調整剤、共力剤などを含有していてもよい。【００５０】
担体としては、例えば、固体担体・液体担体のいずれかまたは両方を用いることができる。固体担体として、例えば、澱粉、活性炭、大豆粉、小麦粉、木粉、魚粉、粉乳などの動植物性粉末、タルク、カオリン、ベントナイト、ゼオライト、珪藻土、ホワイトカーボン、クレー、アルミナ、炭酸カルシウム、塩化カリウム、硫安などの鉱物性粉末が挙げられる。液体担体として、例えば、水、イソプロピルアルコール、エチレングリコールなどのアルコール類、シクロヘキサノン、メチルエチルケトンなどのケトン類、プロピレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノ−ｎ−ブチルエーテルなどのエーテル類、ケロシン、軽油などの脂肪族炭化水素類、キシレン、トリメチルベンゼン、テトラメチルベンゼン、メチルナフタリン、ソルベントナフサなどの芳香族炭化水素類、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどのアミド類、脂肪酸のグリセリンエステルなどのエステル類、大豆油、ナタネ油などの植物油が挙げられる。【００５１】
粘結剤、増粘剤、固着剤として、例えば、澱粉、デキストリン、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルデンプン、プルラン、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸アンモニウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、グアーガム、ローカストビーンガム、アラビアゴム、キサンタンガム、ゼラチン、カゼイン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキサイド、ポリエチレングリコール、エチレン・プロピレンブロックポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。【００５２】
本防除剤の剤型は、特に限定されない。例えば、乳剤、懸濁剤、粉剤、粒剤、錠剤、水和剤、水溶剤、液剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、エアゾール剤、ペースト剤、油剤、乳濁剤などの形態を適用できる。【００５３】
＜植物病害真菌抑制性マイコウイルス生産方法について＞
本発明に係る植物病害真菌抑制性マイコウイルス生産方法は、マイコウイルスを含有する植物病害真菌を液体培地などで培養し、その培養上清からマイコウイルスを回収する手順を少なくとも含むものを全て包含する。【００５４】
上述の通り、本発明に係るマイコウイルスは、宿主菌の細胞外にも存在しうる。従って、例えば、マイコウイルスが感染した植物病害真菌を液体培地などで培養し、遠心分離により菌体を分離した後、その培養上清からウイルスを分離・回収することにより、簡易かつ比較的大量にウイルスを回収できる。【００５５】
但し、本発明に係るマイコウイルスは、この生産方法により得られたものに狭く限定されない。即ち、例えば、マイコウイルスを内在するイネいもち病菌から分離・回収して取得したものも、本発明に広く包含される。【００５６】
＜植物病害真菌弱毒化方法について＞
上述の通り、例えば、本発明に係るマイコウイルスを特定の植物病害真菌に感染などさせることにより、その宿主菌の生育などを抑制し、その菌を弱毒化させることができる。マイコウイルスの感染手段については、上述と同様の方法を採用できる。【００５７】
＜植物病害防除方法について＞
本発明に係る植物病害防除方法は、上述のイネいもち病防除剤を特定の植物（イネなど）に付加する工程を少なくとも含むものを全て包含する。【００５８】
植物に防除剤を付加させる手段として、例えば、防除剤を葉の表面又は裏面に塗布する方法、所定の担体などを用いて防除剤を葉の表面又は裏面に付着させる方法、防除剤を葉に散布又は供給する方法などが挙げられる。【００５９】
防除剤の塗布量又は散布量は、有効成分の濃度、製剤の形態、対象病害や作物の種類、病害による被害の程度、施用場所、施用方法、施用時期、混用・併用する薬剤や肥料などの使用量、種類などの種々の条件に応じて、適宜選択すればよい。【００６０】
例えば、１×１０３〜１×１０１０個／ｍＬに調整したイネいもち病菌弱毒菌株の分生子含有液を一葉当たり１〜１，０００ｍＬ噴霧又は供給することにより、また、葉１ｍｍ２当たり１×１０３〜１×１０１０個、イネいもち病菌弱毒菌株の分生子を葉表面又は裏面に塗布する又は付着させることにより、植物病害を抑制できる可能性がある。【００６１】
本発明は、真菌を主な病因とする全ての植物病害に適用できる可能性がある。適用可能性のある植物病害として、例えば、以下のものが挙げられる（それらに限定されない）。【００６２】
イネ科植物に対する植物病害として、例えば、イネいもち病（原因菌「Magnaporthe  oryzae」）、イネごま葉枯病（原因菌「Cochliobolus  miyabeanus」）、紋枯病（原因菌「Thanatephorus  cucumeris」）、ばか苗（原因菌「Gibberella  fujikuroi」）、苗立枯病（原因菌「Fusarium菌」、「Rhizopus菌」、「Pythium菌」、「Trichoderma  viride」）、イネこうじ病（原因菌「Claviceps  virens」）、ムギ類の赤かび病（原因菌「Gibberella  zeae」、「Fusarium  avenaceum」、「Fusarium  culmorum」、「Monographella  nivale」）、雪腐病（原因菌「Pythium菌」、「Typhula菌」、「Monographella  nivalis」、「Myriosclerotinia  borealis」）、裸黒穂病（原因菌「Ustilago  nuda」）、なまぐさ黒穂病（原因菌「Tilletia  controversa」）、眼紋病（原因菌「Pseudocercosporella  herpotrichoides」）、葉枯病（原因菌「Septoria  tritici」）、ふ枯病（原因菌「Phaeosphaeria  nodorum」）、うどんこ病（原因菌「Blumeria  graminis」）。【００６３】
その他の植物病害として、例えば、カンキツ類の黒点病（原因菌「Diaporthe  citri」）、小黒点病（原因菌「Diaporthe  medusa、Alternaria  citri」）、そうか病（原因菌「Elsinoe  fawcettii」）、褐色腐敗病（原因菌「Phytophthora  citrophthra」）、緑かび病（原因菌「Penicillium  digitatum」）、青かび病（原因菌「Penicillium  italicum」）、リンゴのモニリア病（原因菌「Monilinia  mali」）、黒星病（原因菌「Venturia  inaequalis」）、斑点落葉病（原因菌「Alternaria  mali」）、黒点病（原因菌「Mycosphaerella  pomi」）、すす斑病（原因菌「Gloeodes  pomigena」）、すす点病（原因菌「Zygophiala  jamaicensis」）、輪紋病（原因菌「Botryosphaeria  berengeriana」）、褐斑病（原因菌「Diplocarpon  mali」）、赤星病（原因菌「Gymnosporangium  yamadae」）、腐らん病（原因菌「Valsa  ceratosperma」）、ナシの黒星病（原因菌「Venturia  nashicola」）、赤星病（原因菌「Gymnosporangium  asiaticum」）、輪紋病（原因菌「Botryosphaeria  berengeriana」）、胴枯病（原因菌「Phomopsis  fukushii」）、モモの縮葉病（原因菌「Taphrina  deformans」）、灰星病（原因菌「Monilinia  fructicola、Monilinia  fructigena」）、黒星病（原因菌「Cladosporium  carpophilum」）、ホモプシス腐敗病（原因菌「Phomopsis  sp.」）、オウトウの灰星病（原因菌「Monilinia  fructicola」、「Monilinia  fructigena」）、幼果菌核病（原因菌「Monilinia  kusanoi」）、ウメの黒星病（原因菌「Cladosporium  carpophilum」）、ブドウの黒とう病（原因菌「Elsinoe  ampelina」）、晩腐病（原因菌「Colletotrichum  acutatum」、「Glomerella  cingulata」）、褐斑病（原因菌「Pseudocercospora  vitis」）、つる割病（原因菌「Phomopsis  viticola」）、カキの角斑落葉病（原因菌「Cercospora  kaki」）、円星落葉病（原因菌「Mycosphaerella  nawae」）、茶の輪斑病（原因菌「Pestalotiopsis  longiseta」、「Pestalotiopsis  theae」）、褐色円星病（原因菌「Pseudocercospora  ocellata」、「Cercospora  chaae」）、もち病（原因菌「Exobasidium  vexans」）、網もち病（原因菌「Exobasidium  reticulatum」）、ウリ類のつる枯病（原因菌「Mycosphaerella  melonis」）、つる割病（原因菌「Fusarium  oxysporum」）、黒星病（原因菌「Cladosporium  cucumerinum」）、褐斑病（原因菌「Corynespora  cassiicola」）、トマトの葉かび病（原因菌「Fulvia  fulva」）、輪紋病（原因菌「Alternaria  solani」）、ナスの褐紋病（原因菌「Phomopsis  vexans」）、すすかび病（原因菌「Mycovellosiella  nattrassii」）、アブラナ科野菜の白さび病（原因菌「Albugo  macrospora」）、白斑病（原因菌「Cercosporella  brassicae」、「Pseudocercosporella  capsellae」）、タマネギの灰色腐敗病（原因菌「Botrytis  allii」）、イチゴの蛇の目病（原因菌「Mycosphaerella  fragariae」）、ジャガイモの夏疫病（原因菌「Alternaria  solani」）、ダイズの茎疫病（原因菌「Phytophthora  sojae」）、紫斑病（原因菌「Cercospora  kikuchii」）、アズキの茎疫病（原因菌「Phytophthora  vignae」）、ラッカセイの褐斑病（原因菌「Mycosphaerella  arachidis」）、テンサイの褐斑病（原因菌「Cercospora  beticola」）、葉腐病（原因菌「Thanatephorus  cucumeris」）、シバのカーブラリア葉枯病（原因菌「Curvularia菌」）、ダラースポット病（原因菌「Sclerotinia  homoeocarpa」）、ヘルミントスポリウム葉枯病（原因菌「Cochliobolus菌」）、バラの黒星病（原因菌「Diplocarpon  rosae」）、キクの白さび病（原因菌「Puccinia  horiana」）、各種作物のべと病（原因菌「Peronospora菌」、「Pseudoperonospora菌」、「Plasmopara菌」、「Bremia菌」）、疫病（原因菌「Phytophthora菌」）、うどんこ病（原因菌「Erysiphe菌」、「Blumeria菌」、「Sphaerotheca菌」、「Podosphaerea菌」、「Phyllactinia菌」、「Uncinula菌」、Oidiopsis菌」）、さび病（原因菌「Puccinia菌」、「Uromyces菌」、「Physopella菌」)、黒斑病（原因菌「Alternaria菌」）、灰色かび病（原因菌「Botrytis  cinerea」）、菌核病（原因菌「Sclerotinia  sclerotiorum」）、白紋羽病（原因菌「Rosellinia  necatrix」）、紫紋羽病（原因菌「Helicobasidium  mompa」）、白絹病（原因菌「Sclerotium  rolfsii」）、その他各種土壌病害（原因菌「Fusarium菌」、「Rhizoctonia菌」、「Pythium菌」、「Aphanomyces菌」、「Phoma菌」、「Verticillium菌」、「Plasmodiophora  brassicaeなど」）。
【実施例１】
【００６４】
実施例１では、イネいもち病菌５７株から内在性二本鎖ＲＮＡの検出を試みた。【００６５】
まず、独自に採取したイネいもち病菌５７株の各菌体を摩砕し、フェノールＳＤＳ法で核酸を抽出した後、ＤＮａｓｅ  １及びＳ１  ＮｕｃｌｅａｓｅによりＤＮＡと一本鎖核酸を選択的に分解し、菌体内在性の二本鎖ＲＮＡ液を得た。そして、１％アガロースゲルで、２０Ｖ、１８時間、電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。【００６６】
その結果、５７株のうち、１１株で二本鎖ＲＮＡのバンドを検出した。そのうち、７株では２．８〜３．６ｋｂに４成分のバンドを、３株では１．０〜２．６ｋｂに３成分のバンドを、１株では１．０〜３．６ｋｂに８成分のバンドを、それぞれ検出した。【００６７】
なお、図１はイネいもち病菌５７株のうち９株についての二本鎖ＲＮＡ検出結果を表す電気泳動写真である。図１中、レーン１はＤＮＡマーカーをアプライしたもの、レーン２からレーン１０は菌体から調製したサンプルをアプライしたものである。図１において、レーン６及びレーン８では二本鎖ＲＮＡのバンドを検出しなかったのに対し、レーン２、レーン３、レーン４、レーン５、及びレーン１０では２．８〜３．６ｋｂに４成分のバンドを、レーン７では１．０〜２．６ｋｂに３成分のバンドを、レーン９では１．０〜３．６ｋｂに８成分のバンドを、それぞれ検出した。【００６８】
上述の実験結果において、一つの株から複数のバンドが検出された点、及び、二本鎖ＲＮＡの長さを考慮すると、イネいもち病菌１１株から検出された二本鎖ＲＮＡは、マイコウイルスを構成する二本鎖ＲＮＡである可能性が高い。即ち、本実施例の結果は、これらのイネいもち病菌株に、新規なマイコウイルスが内在することを示唆する。
【実施例２】
【００６９】
実施例２では、実施例１の結果に基づき、二本鎖ＲＮＡを内在する菌株と内在しない菌株の成長速度を比較した。【００７０】
実施例１において、内在性二本鎖ＲＮＡを検出しなかった菌株と検出した菌株について、それぞれ、ＰＤＡ培地で培養し、培養開始から６日後及び１０日後にコロニーを観察した。【００７１】
その結果、内在性二本鎖ＲＮＡを検出しなかった菌株では、菌糸が同心円状に成長し、色素沈着も均一であった。一方、内在性二本鎖ＲＮＡを検出した菌株では、検出しなかった菌株よりも成長が遅く、菌糸が非同心円状に成長し、色素沈着も不均一であった。また、気中菌糸の異常な発達が見られ、セクター形成や溶菌も観察された。【００７２】
即ち、二本鎖ＲＮＡを内在する菌株では、内在しない菌株と比較して生育抑制が見られた。これらの実験結果は、実施例１で得られた二本鎖ＲＮＡ（マイコウイルス）が、イネいもち病菌の生育抑制因子（弱毒化因子）であることを示唆する。
【実施例３】
【００７３】
実施例３では、二本鎖ＲＮＡを内在する菌株を低濃度のサイクロヘキシミド（タンパク質合成阻害剤）で処理し、マイコウイルス治癒株の作製を試みた。【００７４】
サイクロヘキシミドを０．２５〜０．５０μｇ／ｍｌ加えたＹＧプレートを作製し、そこに実施例２で培養した菌株（内在性二本鎖ＲＮＡを検出した菌株）を移植した。そして、形成されたコロニーのうち、正常な生育に回復した部位を、さらに、別のＹＧプレートに移植し、サイクロヘキシミド処理菌株を得た。その結果、サイクロヘキシミド処理菌株は、通常のイネいもち病菌株よりも良好な生育を示した。【００７５】
次に、得られたサイクロヘキシミド処理菌株から、実施例１と同様の方法で二本鎖ＲＮＡを抽出し、電気泳動により、二本鎖ＲＮＡのバンドの検出を試みた。その結果、サイクロヘキシミド処理菌株から二本鎖ＲＮＡのバンドが検出されなかった。【００７６】
また、別手法でも、マイコウイルス治癒菌株を作製し、同様の実験を行った。【００７７】
実施例２で培養した菌株をＰＤＡ培地又はオートミール培地上で約１〜３週間生育させた後、分生子を単離し、その分生子を一つずつ新しいＰＤＡ培地に移植し、マイコウイルスが脱落した菌コロニーを選抜し、マイコウイルス治癒菌株とした。【００７８】
その結果、その治癒菌株でも、ウイルス保持菌株よりも明らかに生育が良好となった。また、上記と同様、電気泳動により、二本鎖ＲＮＡのバンドの検出を試みた結果、治癒菌株からは二本鎖ＲＮＡのバンドが検出されなかった。【００７９】
これらの結果は、イネいもち病菌に内在した二本鎖ＲＮＡがマイコウイルスであること、及び、このマイコウイルスがイネいもち病菌の生育抑制因子であることを示す。
【実施例４】
【００８０】
実施例４では、本発明に係るマイコウイルスがイネいもち病菌の菌体外にも存在するかどうかを調べた。【００８１】
実施例１において２．８〜３．６ｋｂに４成分の内在性二本鎖ＲＮＡのバンドを検出した菌株のうち、３株を液体培地に移植・培養した後、培養液を遠心し、その培養上清を回収した。次に、得られた培養上清を１％アガロースゲルで、２０Ｖ、１８時間、電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。【００８２】
その結果、これらの菌株の培養上清中にも、菌内在性二本鎖ＲＮＡと同じ位置に、二本鎖ＲＮＡのバンドを検出した。【００８３】
この結果は、本発明に係るマイコウイルスが、イネいもち病菌の菌体内だけでなく、菌体外にも存在しうることを示す。
【実施例５】
【００８４】
実施例５では、菌体外に存在するマイコウイルスに、正常の菌株（マイコウイルスを保持しない菌株）に対する感染能力があるかどうかについて調べた。【００８５】
まず、実施例１において２．８〜３．６ｋｂに４成分以上の内在性二本鎖ＲＮＡのバンドを検出した菌株を液体培地に移植し、４週間培養した後、培養液を遠心し、その培養上清を回収した。この培養上清について、実施例４と同様の手順で、１％アガロースゲルで電気泳動した結果、二本鎖ＲＮＡのバンドを確認できた。得られた培養上清については、０．２２μＬのフィルターを用いてろ過滅菌を行った。【００８６】
次に、１００ｍｌコルベンにＹＧ培地５０ｍｌを入れ、そこにイネいもち病菌の正常菌株（マイコウイルスを保持しない菌株）を接種し、３日間培養した後、得られた培養上清を５００μＬ添加し、菌体の生育を観察した。【００８７】
その結果、観察３日目において、培養上清を添加していない菌株では、菌糸の先端がまっすぐに伸び、正常の生育を示したのに対し、培養上清を添加した菌株では、菌糸の先端があまり伸びずに絡まった状態になった。【００８８】
この結果は、培養上清中に存在するマイコウイルスがイネいもち病菌正常菌株に感染し、その生育を抑制したためであると考える。即ち、本実験結果は、菌体外に存在するマイコウイルスに、正常の菌株に対する感染能力があることを示唆する。
【実施例６】
【００８９】
実施例６では、マイコウイルスが感染したイネいもち病菌株について、その分生子数を測定した。【００９０】
実施例１において２．８〜３．６ｋｂに４成分以上の内在性二本鎖ＲＮＡのバンドを検出した菌株をＹＧプレートに移植し、２週間培養した後、直径４ｍｍのコルクボーラーで菌体を抜き取り、採取した。【００９１】
次に、１．５ｍｌチューブに、５％グリセロールを入れ、採取した菌体を入れ、５分間混和・懸濁した。そして、血球計算盤を用いて、懸濁液中に存在する分生子数を計測した。【００９２】
その結果、イネいもち病菌の正常菌株（コントロール、マイコウイルスを保持しない菌株）では分生子数が３３×１０４個／ｍＬであったのに対し、マイコウイルスを内在するイネいもち病菌株では分生子数が１×１０４個／ｍＬ以下であった。【００９３】
この結果は、本発明に係るマイコウイルスが、宿主菌の分生子形成を抑制することを示す。即ち、本発明が、植物病害菌の増殖を抑制するとともに、その伝播・感染拡大なども抑制できる可能性を示唆する。
【実施例７】
【００９４】
実施例７では、イネいもち病菌から抽出された二本鎖ＲＮＡの塩基配列を解析した。【００９５】
（１）二本鎖ＲＮＡの抽出・精製
はじめに、二本鎖ＲＮＡの抽出・精製を以下の手順で行った。【００９６】
実施例１において二本鎖ＲＮＡが検出された一つの菌株について、液体窒素で凍結後摩砕し、抽出バッファー（２×ＳＴＥ、１％ＳＤＳ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール）を菌体０．１ｇに対し１ｍｌ添加した。該溶液に、ＰＣＩ（５０％フェノール、４８％クロロホルム、２％イソアミルアルコール）を抽出バッファーと等量加え、室温で３０分間よく攪拌し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、２０分間、室温）し、その上清（水相）を採取した。次に、採取した上清に等量の１００％エタノールを加え（最終濃度で、５０％エタノール／１×ＳＴＥ溶液）、エタノール沈殿を行った。【００９７】
得られた沈殿物（核酸）を１７．５％エタノール／１×ＳＴＥ溶液に溶解し、６５℃、１０分間、加熱処理後氷中で急冷し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）し、その上清を採取した。その上清に繊維性セルロース充填剤（商品名「ＣＦ１１」、ワットマン社製）を加え、３０〜６０分間、４℃条件下で攪拌した後、カラム（直径１．５ｃｍ、高さ１２ｃｍ）に充填した。【００９８】
次に、カラムに１７．５％エタノール／１×ＳＴＥ溶液を供給し、非吸着画分を除去した後、１×ＳＴＥ溶液を供給し、吸着画分を溶出・回収した。溶出画分中の混入ＤＮＡを除去するため、ＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ株式会社製）を２５Ｕ加え、３７℃、３０分間反応させた後、エタノール沈殿を行い、目的の二本鎖ＲＮＡを得た。【００９９】
（２）ｃＤＮＡクローニング
続いて、得られた二本鎖ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡクローニングを行った。【０１００】
得られた二本鎖ＲＮＡについて、ランダムプライマー、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII逆転写酵素（インビトロジェン社製、以下同じ）を用いて、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。次に、ＲＮａｓｅ  Ｈで処理した後、ＤＮＡポリメラーゼＩを用いてＳｅｃｏｎｄ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。合成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社製、以下同じ）で精製した。【０１０１】
次に、その末端をリン酸化修飾した後、ｐＵＣ１９プラスミドベクター（タカラバイオ株式会社製、以下同じ）にそのｃＤＮＡを組み込み、その組換えベクターを大腸菌に形質転換させ、各ｃＤＮＡのクローンを得た。そして、各ｃＤＮＡクローンについてシークエンス測定を行った。【０１０２】
得られた各塩基配列情報に基づきコンティグシークエンスを作成した結果、菌体中に存在した四種類の二本鎖ＲＮＡについて、いずれについても、ほぼ全長の塩基配列を取得できた。【０１０３】
（３）５’ＲＡＣＥ法による両末端配列の解析
続いて、それらの配列情報に基づき、遺伝子特異的なアンチセンスプライマーを合成し、上記と同様の手順で菌体から二本鎖ＲＮＡを抽出・精製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIII逆転写酵素及びそのプライマーを用いてｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅ  Ｈで処理し、一本鎖のＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを得た。【０１０４】
次に、Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いてその一本鎖ｃＤＮＡにデオキシシトシンホモポリマーをアンカー配列として付加した。次に、デオキシグアニンホモポリマーの付いたアダプタープライマーを合成し、遺伝子特異的なアンチセンスプライマーを合成し、両プライマーに挟まれた部分をＰＣＲ法により増幅してｃＤＮＡを合成した。【０１０５】
次に、そのｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼで末端平滑化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製し、その末端をリン酸化修飾した後、ｐＵＣ１９プラスミドベクターにそのｃＤＮＡを組み込み、その組換えベクターを大腸菌に形質転換させ、各ｃＤＮＡのクローンを得た。そして、各ｃＤＮＡクローンについてシークエンス測定を行った。【０１０６】
以上の手順により、新規マイコウイルスの遺伝子情報の全長配列を得た。このマイコウイルスは、四種類の二本鎖ＲＮＡから構成されている。各二本鎖ＲＮＡの配列を配列番号１〜４に示す。なお、二本鎖ＲＮＡをｃＤＮＡに置換してシークエンス測定を行っているため、配列表では「ウラシル」が「チミン」に置換されている。【０１０７】
なお、得られた塩基配列について解析を行った結果、配列番号１に示すＲＮＡ配列には、トチウイルス及びその近縁ウイルスなどに存在するＲｄＲｐ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡ合成酵素）の保存モチーフが含まれていた。また、配列番号３に示すＲＮＡ配列には、ラ・フランス病ウイルスのＬ３二本鎖ＲＮＡ断片と相同性を有する領域が含まれていた。【０１０８】
この結果は、本発明に係る四種類の二本鎖ＲＮＡが、新規マイコウイルスの遺伝子情報であることを示す。
【実施例８】
【０１０９】
実施例８では、本発明に係るマイコウイルスのウイルス粒子について、生化学的特性の解析を行った。【０１１０】
イネいもち病菌Ｓ−０４１２−ＩＩ  １ａ株を液体窒素で凍結させ、乳鉢で摩砕した。そのサンプルに４〜６倍容量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、ミキサーで攪拌した。次に、リン酸緩衝液に対して４０％容積のブタノール・クロロホルム（容積比１：１）を加え、３０分間攪拌し、遠心（８，０００×ｇ、１０分間）してその上清を回収し、この操作を数回繰り返した。【０１１１】
次に、その上清にポリエチレングリコール（平均分子量６，０００）を終濃度８％、塩化ナトリウムを終濃度１％になるように加えて溶解させ、４℃で３時間放置してウイルス同士を凝集させ、遠心（１２，０００×ｇ、２０分間）し、ポリエチレングリコールにより凝集されたウイルス沈殿物を得た。【０１１２】
このウイルス沈殿物を適量の０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、溶け残った不純物を遠心（６，０００×ｇ、５分間）して除去し、その上清を回収した。【０１１３】
次に、クッションとして遠心チューブの底から約１ｃｍ程度の高さになるように２０％ショ糖を分注し、回収した上清を重層させ、超遠心（１００，０００×ｇ、２時間）し、その沈殿物を少量の0.05Mリン酸緩衝液（ｐH7.0）に溶かし、これを部分純化ウイルス標品とした。【０１１４】
このウイルス標品の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％ゲル、トリスーグリシンバッファー（ｐＨ８．８）、２０ｍＡ、９０分間）し、ＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）で染色し、ウイルスタンパク質の主な成分（外皮タンパク質）の分子量解析を行った。【０１１５】
その結果、約７０ｋＤａのサイズにウイルス粒子由来のタンパク質のバンドを検出した。【０１１６】
そこで、ＳＤＳ−フェノール法で、この７０ｋＤａのタンパク質が検出される成分から核酸抽出を行った。その結果、２．８〜３．６ｋｂｐの４成分の２本鎖ＲＮＡが検出された。【０１１７】
以上、本実施例により、本発明に係るマイコウイルスのウイルス粒子の存在を確認できた。
【実施例９】
【０１１８】
実施例９では、本発明が植物病害真菌の防除に有効であるかどうかを、噴霧接種法で検討した。【０１１９】
イネいもち病菌Ｓ−０４１２−ＩＩ  １ａ株をオートミール培地プレートに接種し、２５℃の室内で培養した。接種後１５日目に分生子が充分できていない場合は、プレートに滅菌蒸留水を２ｍＬ程度注ぎ、筆で培地表面をこすって気菌糸を取り除き、このプレートを３日間ブラックライト下に置いて分生子形成を誘導し、滅菌蒸留水を１ｍＬ程度注ぎ、再び筆で培地表面をこすって気菌糸ごと分生子を回収し、分生子含有液を得た。接種後１５日目に分生子が充分できている場合は、プレートに滅菌蒸留水を２ｍＬ程度注ぎ、筆で培地表面をこすって気菌糸ごと分生子を回収し、分生子含有液を得た。また、対照として、イネいもち病菌のマイコウイルス完全治癒株を実施例３と同様の手順で作製し、その菌から同様の手順で分生子含有液を得た。【０１２０】
次に、それらの分生子含有液をキムワイプ又はガーゼでろ過し、分生子濃度を２×１０６個／ｍＬに調整し、０．０２％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０を加え、分生子懸濁液とした。【０１２１】
次に、イネ苗（いもち病真性抵抗性遺伝子型と菌のレースを考慮して適宜選択した品種、播種後２〜３週間目のもの）に、ノズルを用いて分生子懸濁液をまんべんなく噴霧し、植物体を２６℃、相対湿度１００％の接種箱で２４時間静置した後、ポットを温室に移して室温を２３〜３０℃に維持し、噴霧接種後７日間培養した。そして、噴霧接種後７日目に一定葉面積あたりの３〜４ｍｍとなった罹病性病斑の数を計測した。【０１２２】
結果を図２に示す。図２は、イネいもち病菌を接種した葉における病斑数を示すグラフである。図中、縦軸はイネいもち病菌を接種した葉における病斑数を表す。図中、「混合感染株」は本発明に係るマイコウイルスに感染したイネいもち病菌から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合の病斑数を、「完全治癒株」はイネいもち病菌のマイコウイルス完全治癒株から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合の病斑数（対照）を、それぞれ表す。【０１２３】
図２に示す通り、本発明に係るマイコウイルスに感染したイネいもち病菌から調製した分生子懸濁液を噴霧した場合、対照と比較し、病斑数が顕著に減少した。この結果は、本発明が植物病害真菌の防除に有効であることを示す。
【実施例１０】
【０１２４】
実施例１０では、本発明が植物病害真菌の防除に有効であるかどうかを、パンチ付傷接種法で検討した。【０１２５】
実施例９と同様の手順で分生子懸濁液を調製し、３％素寒天膜に同液を付着させ，寒天膜を約２ｍｍ角に切り取り、寒天片を作製した。２３〜３０℃の温室で栽培したイネの第４葉を接種用パンチではさみ、浸潤状の傷をつけ、その付傷部分に寒天片を乗せ、植物体を２６℃、相対湿度１００％の接種箱で２４時間静置した後、ポットを温室に移して室温を２３〜３０℃に維持し、接種後１４日間培養した。そして、接種後１４日目に病斑の大きさを計測した。【０１２６】
その結果、本発明に係るマイコウイルスに感染したイネいもち病菌から調製した分生子懸濁液を接種した場合、対照と比較し、病斑の大きさが顕著に小さかった。この結果は、実施例９と同様、本発明が植物病害真菌の防除に有効であることを示す。
【実施例１１】
【０１２７】
実施例１１では、菌体外に存在したウイルス粒子を電子顕微鏡により同定した。【０１２８】
イネいもち病菌Ｓ−０４１２−ＩＩ  １ａ株を、ＹＧ培地（Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ０．５％、グルコース２％）中で培養し、その培養上清からウイルス粒子を単離した。その培養上清を遠心（１０，０００×ｇ、５分間）し、その上清を超遠心（１００，０００×ｇ、３０分間）し、ウイルス粒子を含む沈殿物を得た。その沈殿物を０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解し、リンタングステン酸又は酢酸ウランを用いてネガティブ染色し、電子顕微鏡（倍率：×２０，０００〜４０，０００）で観察した。【０１２９】
結果を図３に示す。図３は、イネいもち病菌Ｓ−０４１２−ＩＩ  １ａ株の培養上清から得られたウイルス粒子の電子顕微鏡写真である。図３に示す通り、電子顕微鏡により、本発明に係るマイコウイルスのウイルス粒子を同定できた。このウイルス粒子は、約３０〜４０ｎｍの正６角形様であり、エンベロープ様の構造に包まれていた。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】実施例１において、イネいもち病菌５７株のうち９株についての二本鎖ＲＮＡ検出結果を表す電気泳動写真。
【図２】実施例９において、イネいもち病菌を接種した葉における病斑数を示すグラフ。
【図３】実施例１１において、本発明に係るウイルス粒子の電子顕微鏡写真。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【配列表】
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