(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液に両側又は片側が浸される圧電素子を用いたセンサーにより、前記溶液中で前記圧電素子表面、或いは、前記圧電素子上に固定化された膜に測定対象物が吸着されて膜が形成される系において、
共振周波数Fs、共振周波数のコンダクタンス値の半分のコンダクタンス値を持つ半値周波数F1,F2（F2>F1）のうちの何れか２つの変化量（ΔFs,ΔF1,ΔF2）を測定し、
基準となる物質の前記センサーへの最大吸着時の前記センサーの周波数変化量（Δ（F1−F2）/2）／ΔFsを基準として、前記測定対象物の前記センサーへの吸着時の前記センサーの周波数変化量（Δ（F1−F2）/2）／ΔFsと比較して、前記測定対象物が形成した膜が含有する水の質量を求めることを特徴とする含水量の測定方法。
【請求項２】
前記基準となる物質の前記センサーへの最大吸着時の前記センサーの周波数変化量を（G'/|G|2）として算出することを特徴とする請求項１に記載の含水量の測定方法。
【請求項３】
前記測定時に使用する周波数は、基本波及びオーバートーン（３倍波、５倍波、７倍波・・・）のいずれかであることを特徴とする請求項１又は２に記載の含水量の測定方法。
【請求項４】
前記圧電素子は、水晶振動子、APM（ACOUSTIC PLATE MODE SENSOR）、FPW(FLEXURAL PLATE-WAVE SENSOR)又はSAW(SOURFACE ACOUSTIC-WAVE SENSOR)であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載の含水量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学・物理・生化学・材料などの分野における粘弾性を備えた薄膜の評価する方法に関し、詳細には、圧電素子をセンサとして使用した場合の吸着物質に対する水分の質量を含水比として捉え、吸着物質が含有する含水量を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＱＣＭの周波数変化と質量負荷の関係は以下のSauerbreyの式が用いられる。
【数１】
0005591167.tif 000002
【０００３】
溶液中での吸着による周波数変化は、大気中で測定した時と違い溶液を吸着物資内に含むため、その分大きめの周波数変化を示すことが報告されている。実際溶液中での吸着による周波数変化量は、タンパク質の場合、タンパク質のみの質量による周波数変化の約２倍、DNAの場合は、DNAのみの質量による周波数変化の約６倍と大きく見積もられていた。
【０００４】
水を含まない吸着物質のみの吸着量を正確に知る為には、溶液中で吸着後に溶液を除去し大気に戻し周波数を測定し、予め吸着前に測定していた大気での周波数を差し引くことで、吸着した物質の質量を求める方法がある（乾燥重量測定法）。しかし、操作が煩雑であること、乾燥時に吸着したものが剥がれ正確な測定ができない物質もあること、乾燥後に活性を無くす物質もあること等が問題となっていた。また物質の吸着を繰り返すことで膜が何層にもなる場合もあり、全ての測定にこの方法が有効なわけではなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
吸着物の乾燥重量を測定しなくとも溶液中でリアルタイムで、吸着した膜の膜中に含まれる水の質量とその吸着物質のみの質量、またその吸着膜の含水比を求めることが可能な含水量の測定方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の含水量の測定方法は、請求項１に記載の通り、溶液に両側又は片側が浸される圧電素子を用いたセンサーにより、前記溶液中で前記圧電素子表面、或いは、前記圧電素子上に固定化された膜に測定対象物が吸着されて膜が形成される系において、共振周波数Fs、共振周波数のコンダクタンス値の半分のコンダクタンス値を持つ半値周波数F1,F2（F2>F1）のうちの何れか２つの変化量（ΔFs,ΔF1,ΔF2）を測定し、基準となる物質の前記センサーへの最大吸着時の前記センサーの周波数変化量（Δ（F1−F2）/2）／ΔFsを基準として、前記測定対象物の前記センサーへの吸着時の前記センサーの周波数変化量（Δ（F1−F2）/2）／ΔFsと比較して、前記測定対象物が形成した膜が含有する水の質量を求めることを特徴とする。
請求項２記載の本発明は、請求項１に記載の含水量の測定方法において、前記基準となる物質の前記センサーへの最大吸着時の前記センサーの周波数変化量を（G'/|G|2）として算出することを特徴とする。
請求項３記載の本発明は、請求項１又は２に記載の含水量の測定方法において、前記測定時に使用する周波数は、基本波及びオーバートーン（３倍波、５倍波、７倍波・・・）のいずれかであることを特徴とする。
請求項４記載の本発明は、請求項１乃至３の何れか１項に記載の含水量の測定方法において、前記圧電素子は、水晶振動子、APM（ACOUSTIC PLATE MODE SENSOR）、FPW(FLEXURAL PLATE-WAVE SENSOR)又はSAW(SOURFACE ACOUSTIC-WAVE SENSOR)であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
QCMを使用した従来の方式では溶液中での吸着量（質量負荷）は、水を含むため、正しい値を求めるには乾燥重量を測る必要があった。しかし乾燥重量の測定は煩雑で、また物質によっては剥がれて測定できないものもあった。また溶液中でリアルタイムでの反応を追いながら吸着膜の含水比を求めることはできなかった。本発明によれば、乾燥重量測定法を用いずとも溶液中でリアルタイムに物質の吸着量（質量）を求めることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の測定方法を実施するための装置構成の説明図
【図２】本発明の一実施の形態における説明の本発明と従来の乾燥重量法の測定結果を示すグラフ
【図３】本発明の一実施例のQCMの測定結果を示すグラフ
【図４】同実施例における周波数変化から算出した含水比を示すグラフ
【図５】同実施例の測定対象物の質量と水の質量の関係を示すグラフ
【図６】本発明の一実施の形態のN倍波等の測定周波数の説明図
【発明を実施するための形態】
【０００９】
溶液中でのＱＣＭセンサーはでは薄膜がセンサー上に吸着したときの周波数の変化は薄膜でフォークトモデルを適用した場合に、以下の数２及び数３で表されることが一般的に知られている。
【数２】
0005591167.tif 000003
【数３】
0005591167.tif 000004
ここで、G：複素弾性率（MPa）、G’：貯蔵弾性率（動的弾性率）（MPa）、G”：損失弾性率（動的損失）（MPa）、ω：角周波数、ρ２：溶液の密度（g/cm3）、η２：溶液の粘度（Pa・S）、hf：形成された前期膜の厚み（nm）、ρ１：形成された前期膜の密度（g/cm3）、η１：形成された前期膜の粘度（Pa・S）、ｆ０：基本周波数（Hz）であり、zq：水晶のせん断モード音響インピーダンス(gm/sec/cm2)である。
【００１０】
この時ΔFsは共振周波数Fsの周波数変化値、ΔFwはΔ(F1-F2)/2式の周波数変化値である。また、ΔFsはΔ(F1+F2)/2からも求められる。
【００１１】
更に溶液の粘性変化がない場合は、粘性負荷項が消去され、数２においては質量負荷項より粘弾性項１が十分小さいとし、また一般的に生体分子膜は溶液中では水を多く含む場合が多いことから膜の密度は溶液の密度とほぼ同じとして近似できる。この近似を元に数３を数２で除することにより、ΔFw/ΔFsは、次の数４にまとめられる。
【数４】
0005591167.tif 000005
【００１２】
我々は、数４が吸着物質の含水比と関連があることを実験結果から見出した。
例として、50nmのラテックスビーズの溶液中での金電極への吸着を実験すると、27MHzの水晶振動子を用いたセンサーでは最大吸着時の代表値は表１のようになる。
【表１】
0005591167.tif 000006
【００１３】
このときの乾燥重量測定法によるはFsの周波数変化は-2514Ｈｚであり、これを溶液中でのFsの周波数変化−5020Hzから差し引くことで、膜中に含まれていた水の質量分-2506Hzが求められ、ラテックスビーズは溶液中でラテックスビーズ自体と同量の水を含む吸着膜を形成していたことがわかる。
【００１４】
つまりラテックスビーズが溶液中で吸着膜を形成した際の含水比は１（又は100%）となる。含水比とは物質中に含まれる水の質量をその物質（固体）の質量で割った値を示し、その物質に含まれる水の割合を示すものである。
【００１５】
27MHzの水晶振動子の感度は-1Hzあたり0.62ng/cm2であるので-2514Hz×0.62ng/cm2が単位面積当たりの質量となる。これに吸着面積をかけるとセンサー表面についたビーズの質量が算出できる。
【００１６】
このラテックスビーズの溶液中でのΔｆｗ／Δｆｓ＝0.069の値は、吸着膜の含水比が1であるときの値であることから、この0.069を基準とし、吸着膜の含水比を周波数変化から求める方法を、（ΔFw／ΔFs）／0.069で定義する。
【００１７】
溶液中で吸着した各物質の含水比を乾燥重量測定法から元に求めたものと、上記定義で求めた含水比（（ΔFw／ΔFs）／0.069）を下記表２及び図２に示す。含水比が良く一致することが実験データから得られた。
【表２】
0005591167.tif 000007
【００１８】
尚、基準となる物質は、ラテックスビーズに限定されるものではない。構造が簡単で27MHzの溶液中での浸入深度約１００nmより小さくかつ再現良く乾燥重量が求められるものであればよい。
また、「浸入深度」とは、水晶振動子の厚みすべり振動が、接している溶液へ伝わり減衰する距離をいい、下記の数５から導き出すことができる。
【数５】
0005591167.tif 000008
【００１９】
次に粘弾性係数G’、G” 値から吸着した膜中に含まれる水の質量とその吸着物質のみの質量、またその吸着膜の含水比を算出する方法を述べる。
【００２０】
膜の粘弾性項係数G’、G”については、下記方法１及び方法２で詳細に説明した方法により求めるものとする。
得られたG’、G”値からG’/｜G｜２値を算出する。G’/｜G｜２値は数４の右項に含まれる定数だが、数４の右項と違い、角周波数ω、溶液の粘性η1を含まない為、吸着膜の情報のみで表される値になる。そのため、この値を使ってより正確な吸着した膜中に含まれる水の質量とその吸着膜のみの質量、またその吸着膜の含水比を算出することが可能になる。
【００２１】
（膜の粘弾性項係数G’、G”の算出方法１）
Martin らの伝送理論（V.E.Granstaff,S.J..Martin,J.Appl.Phys. 1994,75,1319）により粘弾性膜が溶液中で水晶振動子に吸着した場合のインピーダンスZの変化は、以下の数６で表される。
【数６】
0005591167.tif 000009
数６から、共振周波数Fsの変化は数７で表され、半値周波数の半分の（F1 - F2）/2（=Fw）の変化量は数８で表される。
【数７】
0005591167.tif 000010
【数８】
0005591167.tif 000011
また、数７及び数８から、数９で示されるように周波数F2の変化量を求めることができる。
【数９】
0005591167.tif 000012
ここで、G：複素弾性率（MPa）、G’：貯蔵弾性率（動的弾性率）（MPa）、G”：損失弾性率（動的損失）（MPa）、ω：角周波数、ρ２：溶液の密度（g/cm3）、η２：溶液の粘度（Pa・S）、hf：形成された前期膜の厚み（nm）、ρ１：形成された前期膜の密度（g/cm3）、η１：形成された前期膜の粘度（Pa・S）、ｆ０：基本周波数（Hz）であり、zq：水晶のせん断モード音響インピーダンス(gm/sec/cm2)である。
【００２２】
また、ここで膜の粘弾性のモデルとしてよく使用されるVoigt モデルをG’、G”に適用する。
弾性要素のばねGとダッシュポットηを並列に接続したモデルは、以下の式で表される。
【数１０】
0005591167.tif 000013
ここで、ωη=Cμとおくと（C：定数、μ：剛性率（MPa））、数７は、以下のように変形することができる。
【数１１】
0005591167.tif 000014
そして、N倍波の場合は以下の式になる。
【数１２】
0005591167.tif 000015
２つの周波数のそれぞれのΔFwの値を除算することで、定数Cを含む近似式になる。
【数１３】
0005591167.tif 000016
【００２３】
上記の式は、基本波（N=1）と3倍波（N＝３）の周波数変化量Fwを使用した場合の式である。
測定によって得られた周波数変化量Fw3をFw1により除算することにより得られる値をAとし、その値Aを上記式の左辺に代入することで、以下の定数Cを算出することができる。
【数１４】
0005591167.tif 000017
【００２４】
算出した値Cと、測定した基本波の周波数変化量ΔF2、ΔFw、ΔFs値から、以下の数１５〜数１７で示される各項の周波数変化を求める。この時、溶液の粘性負荷は生じない測定を条件とする。
【数１５】
0005591167.tif 000018
【数１６】
0005591167.tif 000019
【数１７】
0005591167.tif 000020
【００２５】
まず、ΔFwが粘弾性項（２）のみで成立しているため、
粘弾性項（２）＝ΔFw
となる。
【００２６】
次に、粘弾性項（１）は次式で求められる。定数CはG"/G’で表すことができるので、C=G"/G’を代入し、粘弾性項（２）と乗算すると粘弾性項（１）が算出できる。
粘弾性項（１）＝−（１＋C）＊粘弾性項（２）
質量負荷項は、ΔF2の式に上記で得られた粘弾性項（１）の値を代入することで得られる。
質量負荷項＝ΔF2−粘弾性項（１）
最後に粘弾性項（３）は、ΔFsの式に上記で得られた質量負荷項の値を代入することで得られる。
粘弾性項（３）＝ΔFs−質量負荷項
【００２７】
さらに上記で得られた質量負荷項と粘弾性項（２）の周波数変化量を使用し、粘弾性係数G’、G”を下記式より算出する。式中において、ω：角周波数、ρ２：溶液の密度（g/cm3）、η２：溶液の粘度（Pa・S）、ρ１：膜の密度（g/cm3）とする。
【数１８】
0005591167.tif 000021
G’’＝Ｃ＊Ｇ’
【００２８】
（膜の粘弾性項係数G’、G”の算出方法２）
溶液中で、タンパク質、DNAや糖鎖等の物質が水と合成され、圧電素子の電極上に前記物質が薄膜状に吸着された際に、基本波とオーバートーン（3倍波、5倍波、７倍波・・・）のいずれか２つを使って、特許文献１に記載されるように、数２、数３のそれぞれの項（質量負荷項、粘性負荷項、粘弾性項１、粘弾性項２）をVoigtモデルによって求め、その値と吸着物の密度から粘弾性係数 Ｇ’、Ｇ’’の値を算出した結果を下記表１に示す。
【００２９】
【数１９】
0005591167.tif 000022
【数２０】
0005591167.tif 000023
【００３０】
【表３】
0005591167.tif 000024
【００３１】
この結果から、Ｇ’’＝Ｇ’／２の直線上に収束していることがわかるので、溶液の粘性負荷がない場合に、Ｇ’’＝Ｇ’／２の関係を用いて、基本波、オーバートーン（3倍波、5倍波、７倍波・・・）のいずれか１つの周波数変化量を測定して、質量負荷と粘性負荷と粘弾性のいずれかを残りの負荷から分離して測定する。
溶液の粘性変化がない場合、数１９は下式になる。
【数２１】
0005591167.tif 000025
Δ（F1−F2）/2の変化量から粘弾性項（２）の値が求まる。
また溶液の粘性変化がない場合、下式が成立する。
【数２２】
0005591167.tif 000026
Ｇ’’＝Ｇ’／２から、数２２の粘弾性項（３）が求まり、更に、ΔFsに現実の変化量を代入することで質量負荷項を求めることができる。
【００３２】
以上のことから、系の粘弾性項（２）を、Δ（F1−F2）/2とし、前記系の粘弾性項（３）を、Δ（F1−F2）/4とし、前記系の質量負荷を、Δ（F1−F2）/4−ΔFsとして、それぞれ独立して求めることができる。
以上は２７ＭＨｚの水晶振動子の基本波を用いた場合で、Ｇ’’＝ＣＧ’なる関係のＣはほぼ１／２となるが、オーバートーン（Ｎ＝３，５、７・・・）を用いた場合は、Ｇ’は周波数依存性がなく、Ｇ’’＝ωη（ω：角周波数、η：溶液の粘度）の関係があることにより、ＣはほぼＮ／２となる。このことから、G'及びG''を求めることができる。
【００３３】
上記の方法を用い、27MHzの水晶振動子の基本波と３倍波で各膜のG’、G”を求めたものである。50nmラテックスビーズが溶液中で吸着膜を形成した際の含水比は１となることが実験で解かっているので、含水比が１の時のG’/｜G｜２=0.350を基準とし、吸着膜の含水比を粘弾性係数から求める方法を、（G’/｜G｜２）/0.350で定義する。
【表４】
0005591167.tif 000027
【００３４】
尚、上記の測定方法で使用されるFs,F1,F2の周波数の測定は、発振回路による方法やインピーダンスアナライザーやネットワークアナライザーなど外部機器からの周波数掃引によって得られる方法など、共振周波数Fs、共振周波数のコンダクタンス値の半分のコンダクタンス値を持つ半値周波数F1,F2（F2>F1）であれば、その測定方法を制限するものではない。
測定方法に使用する装置についての例を挙げると、図１に示されるように、圧電素子を備えたセル１をネットワークアナライザー２を介して、ネットワークアナライザー２の制御、測定及び演算を行うパソコン等の制御手段３に接続して構成する。尚、図示した例では、セル１の温度調整を行うために、ペルチェ素子等の温度制御手段４をセル１の下面に備え、温度制御手段４を調整するための温度調整手段５を、同様に制御手段３により制御する構成としている。
また、上記説明したものでは、基本波と３倍波とを使用したが、図６に示すような、基本波を含むオーバートーンの周波数のうちの少なくとも２つの周波数であれば、本発明を使用することができる。
【００３５】
また、本発明において使用される圧電素子は、上記対象となる周波数を測定できるものであれば制限はなく、水晶振動子、APM（ACOUSTIC PLATE MODE SENSOR）、FPW(FLEXURAL PLATE-WAVE SENSOR)又はSAW(SOURFACE ACOUSTIC-WAVE SENSOR)も使用することができる。
【実施例】
【００３６】
上記実施の形態で説明した装置を使用し、圧電素子として水晶振動子を使用し、金電極表面にNeutravidin（たんぱく質）を吸着させる実験を行った。
図３は通常のQCM測定で得られる共振周波数変化（ΔFs）の経時変化である。
【００３７】
図３の測定データを本発明の方法で解析することで、リアルタイムでNeutravidin 膜の含水比を算出した結果（図４）、Neutravidin膜に含まれる水の質量とNeutravidin自体の質量を算出した結果（図５）することが可能である。
溶液中でのNeutravidin膜は吸着量が小さい時は含水比が小さく、最大吸着量（飽和吸着量）に近づくにつれ含水比が大きくなることがわかった。
【符号の説明】
【００３８】
１  セル
２  ネットワークアナライザー
３  制御手段
４  温度制御手段
５  温調調整手段
【図１】
0005591167.tif 000028
【図６】
0005591167.tif 000029
【図２】
0005591167.tif 000030
【図３】
0005591167.tif 000031
【図４】
0005591167.tif 000032
【図５】
0005591167.tif 000033