(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料中の少なくとも１種の該当検体を判定するためのイムノアッセイであって、
前記イムノアッセイは、
ａ）（１）少なくとも１種の該当検体を判定する試験試料、（２）固相に固定化され、かつ少なくとも１種の該当検体と結合する第１の特異的結合パートナー、および（３）第１の検出可能なラベルで標識した第２の特異的結合パートナーを含む第１の混合物を第１の温置時間温置する段階であって、前記検体、第１の特異的結合パートナーおよび第２の特異的結合パートナーが第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体を形成する段階；
ｂ）未結合検体を第１の混合物から除去する段階；
ｃ）前記第１混合物に第３の特異的結合パートナーを添加して第２の混合物を形成する段階であって、前記第３の特異的結合パートナーは前記第２の特異的結合パートナーと同一であり、かつ前記第１の検出可能なラベルと同一の第２の検出可能なラベルで標識されており、ならびに前記第１の混合物に対して、第１の混合物中に存在する第２の特異的結合パートナーの量の１０％から５０％の量で添加される、段階；
ｄ）前記第２の混合物を第２の温置時間温置する段階；および
ｅ）前記第１の検出可能なラベルおよび前記第２の検出可能なラベルの検出によって、試験試料中の少なくとも１種の該当検体を検出する段階
を含み、
前記検体が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原である、イムノアッセイ。
【請求項２】
更に第３の特異的結合パートナーの添加後に第２の混合物を洗浄する段階を含む請求項１のイムノアッセイ。
【請求項３】
更に第２の温置時間後に第２の混合物を洗浄する段階を含む請求項１のイムノアッセイ。
【請求項４】
前記第１の特異的結合パートナーが抗体又は抗原である請求項１のイムノアッセイ。
【請求項５】
前記抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体および親和性成熟抗体から構成される群から選択される請求項４のイムノアッセイ。
【請求項６】
固相が磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子、フィルム、ろ紙、ディスクおよびチップから構成される群から選択される請求項１のイムノアッセイ。
【請求項７】
第１の検出可能なラベルが放射性ラベル、酵素ラベル、化学発光ラベル、蛍光ラベル、温度ラベルおよび免疫ポリメラーゼ連鎖反応ラベルから構成される群から選択される請求項１のイムノアッセイ。
【請求項８】
第１の温置時間が５分間から６０分間である請求項１のイムノアッセイ。
【請求項９】
第１の温置時間が１５分間から３０分間である請求項８のイムノアッセイ。
【請求項１０】
第２の温置時間が３０秒間から３０分間である請求項１のイムノアッセイ。
【請求項１１】
第２の温置時間が１分間から１０分間である請求項１０のイムノアッセイ。
【請求項１２】
未結合検体を洗浄により第１の混合物から除去する請求項１のイムノアッセイ。
【請求項１３】
イムノアッセイが検体の標準曲線の使用又は参照標準との比較により、形成された前記第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体および前記第１の特異的結合パートナー−検体−第３の特異的結合パートナー複合体の量を、試験試料中の検体の量と相関させる請求項１のイムノアッセイ。
【請求項１４】
検出可能なラベルの量を測定することにより試験試料中の検体の量を定量する請求項１のイムノアッセイ。
【請求項１５】
前記イムノアッセイが自動システム又は半自動システムで使用するように適応されている請求項１のイムノアッセイ。
【請求項１６】
試験試料中に存在する該当検体を捕捉抗体により捕捉し、捕捉抗体と検体と第１の抗体コンジュゲートの複合体を形成することにより検体を第１の抗体コンジュゲートにより検出する試験試料の検体のイムノアッセイの改良において、前記該当検体と結合する第２の抗体コンジュゲートを添加する付加的段階を含み、前記第２の抗体コンジュゲートの添加は、未結合検体を当該試験試料から除去した後に行われ、
前記検体が、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原である、改良。
【請求項１７】
前記イムノアッセイが自動システム又は半自動システムで使用するように適応されている請求項１６の改良。
【請求項１８】
前記第３の特異的結合パートナーが、第１の混合物中に存在する第２の特異的結合パートナーの量の１０％から４５％の量で、第１の混合物に添加される、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項１９】
前記第３の特異的結合パートナーが、第１の混合物中に存在する第２の特異的結合パートナーの量の１０％の量で、第１の混合物に添加される、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【請求項２０】
前記第３の特異的結合パートナーが、第１の混合物中に存在する第２の特異的結合パートナーの量の４５％の量で、第１の混合物に添加される、請求項１に記載のイムノアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、試験試料中の少なくとも１種の該当検体を検出又は定量するためのイムノアッセイに関する。特に、本発明のイムノアッセイは「プロゾーン現象」又は「フック効果」と呼ばれるイムノアッセイ定量妨害の低減を示す。
【背景技術】
【０００２】
イムノアッセイは試験試料に含まれる該当検体を試験するのに特に有用であることが分かっている。イムノアッセイでは、抗原等の検体と抗体等の特異的結合パートナーの相互作用の結果、検体−結合パートナー複合体が形成される。非限定的な例として放射能、蛍光、光吸収および光散乱等の各種測定によりこの複合体を検出することができる。その後、結果を試験試料中の検体の有無、理想的には濃度と相関させる。
【０００３】
しかし、イムノアッセイには「プロゾーン現象」又は「フック効果」と呼ばれる１つの問題が頻発する。「プロゾーン現象」とは検体希釈曲線の特徴的形状のことであり、非常に高濃度の該当検体（例えば抗原、抗体等）を含有する試験試料から疑似的な低い結果が生じることを特徴とする（Ｃｏｌｉｎ  Ｓｅｌｂｙ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６：７０４−７２１（１９９９）参照）。プロゾーン効果がイムノアッセイに与える影響は試験試料中の真の検体濃度のほんの一部分に相当する結果しか得られないという現象として現れる。
【０００４】
プロゾーン現象には多数の原因が考えられる。例えば、１段階「サンドイッチ型」イムノアッセイでは、該当検体を含有している疑いのある試験試料と（通常は固相に固定化した抗体である）捕捉抗体を混合する。検出可能なラベルを付加した抗体（以下、「コンジュゲート」と言う）をこの混合物に加える。このアッセイでは、捕捉抗体は試験試料中の検体と結合し、捕捉抗体−検体複合体を形成する。その後、コンジュゲートは捕捉抗体−検体複合体と結合し（「サンドイッチ」）、当分野で公知の常法を使用して該当検体の指標としてコンジュゲートラベルを検出する。非常に過剰の遊離検体の存在下では、全コンジュゲートが遊離検体と直接結合するため、捕捉抗体−検体複合体との結合に利用可能なコンジュゲートが少なくなる。従って、捕捉抗体−検体複合体との結合に利用可能な遊離コンジュゲートが少ないため、捕捉抗体−検体複合体と結合するラベルの量が減り、従って、検体検出量が減る。図１はプロゾーン現象の結果として形成される曲線の１例を示す。図１から明らかなように、高値側の検体濃度では、実際の検体濃度が高くなるほどその濃度測定値は逆説的に低下する。
【０００５】
プロゾーン現象を低減するための各種技術が提案されている。例えば、米国特許第６，１８３，９７２号は抗体を固定化した別個の捕捉領域を形成した多孔質材料の使用について記載している。同様に、米国特許出願第２００６／０２４６６０１号は多孔質膜と複数ゾーンを使用するラテラルフローアッセイ装置を開示しており、試験試料中の検体がフック効果領域内にあるか否かの指標としてゾーンの１個を使用している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，１８３，９７２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６／０２４６６０１号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｏｌｉｎ  Ｓｅｌｂｙ，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３６：７０４−７２１（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、当分野では検体濃度の正確且つ簡単な改良型定量的測定を可能にするイムノアッセイが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は試験試料中の少なくとも１種の該当検体を判定するためのイムノアッセイに関する。前記イムノアッセイは、
ａ）（１）少なくとも１種の該当検体を判定する試験試料、（２）少なくとも１種の該当検体と結合する第１の特異的結合パートナー、および（３）第１の検出可能なラベルで標識した第２の特異的結合パートナーを含む第１の混合物を第１の温置時間温置する段階であって、前記検体、第１の特異的結合パートナーおよび第２の特異的結合パートナーが第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体を形成する段階；
ｂ）未結合検体を第１の混合物から除去する段階；
ｃ）前記第１混合物に第３の特定結合パートナーを添加して第２の混合物を形成する段階であって、前記第３の特定結合パートナーは第２の検出可能な標識で標識されておりならびに前記第１の混合物に対して、前記イムノアッセイにおいて前記第３の特定結合パートナーを添加しないイムノアッセイと比較していかなるプロゾーン現象も減少させるために十分な量で添加される、段階；
ｄ）前記第２の混合物を第２の温置時間温置する段階；および
ｅ）第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体を検出する段階を含む。
【００１０】
本発明のイムノアッセイにおいて、第３の特異的結合パートナーは第１の混合物中に存在する第２の特異的結合パートナーの量の約１％から約５０％の範囲の量で第２の混合物中に存在する。
【００１１】
未結合検体が存在する場合には、例えば第１の温置時間後に混合物を洗浄することにより第１の混合物から除去することができる。
【００１２】
上記イムノアッセイは更に、第３の特異的結合パートナーの添加後に第２の混合物を洗浄する付加的段階を含むことができる。
【００１３】
上記イムノアッセイは更に、第２の温置時間後に第２の混合物を洗浄する付加的段階を含むことができる。
【００１４】
上記イムノアッセイで使用することができる第１の特異的結合パートナーの１例は抗原又は抗体である。使用することができる抗体の１例はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体および親和性成熟抗体から構成される群から選択される。
【００１５】
上記イムノアッセイで使用される第１の特異的結合パートナー、第２の特異的結合パートナー、又は第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナーは固相に固定化することができる。固相は磁性粒子、ビーズ、試験管、マイクロタイタープレート、キュベット、膜、足場分子（例えばウシ血清アルブミン、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、フィルム、ろ紙、ディスクおよびチップから構成される群から選択することができる。
【００１６】
上記イムノアッセイで使用される第１の検出可能なラベルは放射性ラベル、酵素ラベル、化学発光ラベル、蛍光ラベル、温度ラベルおよび免疫ポリメラーゼ連鎖反応ラベルから構成される群から選択することができる。上記イムノアッセイで使用される第２の検出可能なラベルは放射性ラベル、酵素ラベル、化学発光ラベル、蛍光ラベル、温度ラベルおよび免疫ポリメラーゼ連鎖反応ラベルから構成される群から選択することができる。第１の検出可能なラベルと第２の検出可能なラベルは同一ラベルでもよいし、異なるラベルでもよい。
【００１７】
上記イムノアッセイにおける第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナーは同一（即ち共通）でも異なるものでもよい。更に、第２の特異的結合パートナー、第３の特異的結合パートナー、又は第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナーは複数の結合パートナーを含むことができる。
【００１８】
上記イムノアッセイにおける第１の温置時間は約５分間から約６０分間、好ましくは約１５分間から３０分間とすることができる。
【００１９】
上記イムノアッセイにおける第２の温置時間は約３０秒間から約３０分間、好ましくは約１分間から約１０分間とすることができる。
【００２０】
上記イムノアッセイにおいて、イムノアッセイは検体の標準曲線の使用又は参照標準との比較により、形成された前記第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体の量を試験試料中の検体の量と相関させる。
【発明の効果】
【００２１】
上記イムノアッセイは自動システム又は半自動システムで使用すること、使用するように適応させること又は実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】プロゾーン現象の結果として形成される代表的な曲線を示す。横軸：検体濃度（例えばｎｇ／ｍＬ等の単位）。縦軸：シグナル振幅（例えば相対発光量カウント等の単位）。
【図２】実施例１に詳述するような１段階イムノアッセイを使用してＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を定量した場合のプロゾーン現象緩和を示すグラフである。横軸：ＨＢｓＡｇの濃度（「ＨＢｓＡｇ  ａｄ」），ｎｇ／ｍＬ。縦軸：相対発光量（「カウント」）。記号：黒三角，組合せＡ；黒菱形，組合せＢ；黒正方形，組合せＣ。
【図３】実施例２に詳述するような１段階イムノアッセイを使用してＨＢｓＡｇを定量した場合のプロゾーン現象緩和を示すグラフである。横軸：ＨＢｓＡｇの濃度（「ＨＢｓＡｇ  ａｄ」），ｎｇ／ｍＬ。縦軸：相対発光量（「カウント」）。記号：黒正方形，組合せＡ；黒三角，組合せＢ；黒菱形，組合せＣ。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「方法」と言う場合には本明細書に記載する型および／又は本明細書の開示を読了後に当業者に自明となる型の１種類以上の方法および／又は段階を含み、他の用語についても同様である。本明細書に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味である。
【００２４】
定義
本明細書で交換可能に使用する「検体」又は「該当検体」なる用語は一般に被検出物質を意味する。検体としては、抗原性物質、ハプテン、抗体およびその組合せが挙げられる。検体としては限定されないが、毒素、有機化合物、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤（治療目的で投与されるものと違法目的で投与されるものを含む）、薬剤中間体又は副生物、細菌、ウイルス粒子および上記物質のいずれかの代謝産物又は抗体が挙げられる。所定検体の具体例としては限定されないが、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）１−３２；ＮＴ−プロＢＮＰ；プロＢＮＰ；プレプロＢＮＰ；トロポニンＩ；トロポニンＴ；トロポニンＣ；任意型のトロポニンに対する抗体を含む心臓血管抗原に対する抗体又は自己抗体；ヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリン（ｈＮＧＡＬ）；タクロリムス；シクロスポリン；フェリチン；クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）；ジゴキシン；フェニトイン；フェノバルビタール；カルバマゼピン；バンコマイシン；ゲンタマイシン；テオフィリン；バルプロ酸；キニジン；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；エストラジオール、プロゲステロン；Ｃ反応性蛋白；リポカリン；ＩｇＥ抗体；サイトカイン；ビタミンＢ２ミクログロブリン；糖化ヘモグロビン（Ｇｌｙ．Ｈｂ）；コルチゾール；ジギトキシン；Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）；プロカインアミド；風疹ＩｇＧや風疹ＩｇＭ等の風疹抗体；トキソプラズマＩｇＧ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＧ）やトキソプラズマＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ＩｇＭ）等のトキソプラズマ抗体；テストステロン；サリチル酸塩；アセトアミノフェン；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；抗Ｂ型肝炎コア抗原ＩｇＧおよびＩｇＭ等のＢ型肝炎コア抗原に対する抗体（抗ＨＢＣ）；ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨｂｅＡｇ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原に対する抗体（抗Ｈｂｅ）；インフルエンザウイルス；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；サイロキシン（Ｔ４）；総トリヨードサイロニン（Ｔｏｔａｌ  Ｔ３）；遊離トリヨードサイロニン（Ｆｒｅｅ  Ｔ３）；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；リポ蛋白質、コレステロールおよびトリグリセリド；並びにα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）が挙げられる。依存性薬物および規制物質としては限定されないが、アンフェタミン；メタンフェタミン；アモバルビタール、セコバルビタール、ペントバルビタール、フェノバルビタールおよびバルビタール等のバルビツール酸系；プロポキシやバリウム等のベンゾジアゼピン；ハシシやマリファナ等のカンナビノイド；コカイン；フェンタニル；ＬＳＤ；メタカロン；ヘロイン、モルヒネ、コデイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、メタドン、オキシコドン、オキシモルフォンおよびオピウム等のオピエート；フェンシクリジン；並びにプロポキシフェンが挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用する「抗体」なる用語は免疫グロブリン分子又はその免疫活性部分、即ち抗原結合部分を意味する。免疫グロブリンの免疫活性部分の例としては、抗体をペプシン等の酵素で処理することにより作製することができるＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。本発明で使用することができる抗体の例としては限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、組換え抗体、１本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）、親和性成熟抗体、１本鎖抗体、シングルドメイン抗体、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（「ｓｄＦｖ」）および抗イディオタイプ（「抗Ｉｄ」）抗体、並びに上記抗体のいずれかの機能的に活性なエピトープ結合フラグメントが挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用する「シグナル抗体」、「コンジュゲート抗体」および「コンジュゲート」なる用語は本明細書では交換可能に使用する。シグナル抗体、コンジュゲート抗体およびコンジュゲートとは検出可能なラベルを付加した抗体を意味する。
【００２７】
検出可能なラベルとしては、当分野で公知の任意の検出可能なラベルを使用することができる。例えば、検出可能なラベルは放射性ラベル（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐ）、酵素ラベル（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリペルオキシダーゼ、グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ等）、化学発光ラベル（例えばアクリジニウムエステル、ルミナール、イソルミナール、チオエステル、スルホンアミド、フェナントリジニウムエステル等）、蛍光ラベル（例えばフルオレセイン（例えば５−フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、３’６−カルボキシフルオレセイン、５（６）−カルボキシフルオレセイン、６−ヘキサクロロフルオレセイン、６−テトラクロロフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート等）、ローダミン、フィコビリプロテイン、Ｒ−フィコエリスリン、量子ドット（例えば硫化亜鉛で被覆したセレン化カドミウム））、温度ラベル又は免疫ポリメラーゼ連鎖反応ラベルとすることができる。ラベル、標識手順およびラベル検出の手引きについては、Ｐｏｌａｋ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９９７）と、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎにより発行された便覧兼カタログであるＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（１９９６）に記載されている。
【００２８】
本明細書で使用する「特異的結合パートナー」とは特異的結合対のメンバーである。即ち、化学的又は物理的手段により一方の分子が他方の分子と特異的に結合する２個の異なる分子である。従って、通常のイムノアッセイの抗原と抗体の特異的結合対に加え、他の特異的結合対としては、ビオチンとアビジン、糖鎖とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子と受容体分子、補因子と酵素、酵素阻害剤と酵素等が挙げられる。更に、特異的結合対としては、元の特異的結合メンバーの類似体であるメンバー（例えば検体類似体）が挙げられる。免疫反応性特異的結合メンバーとしては、抗原、抗原フラグメント、モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗体フラグメント、並びにその複合体（組換えＤＮＡ分子により形成されるものを含む）が挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用する「試験試料」なる用語は一般に該当検体を含有している疑いのある生物材料および／又は前記検体について試験する生物材料を意味する。試験試料は任意生物ソースに由来するものを使用することができ、限定されないが、全血、血清、血漿、間質液、唾液、眼房水、脳脊髄液、汗、尿、乳、腹水、粘液、鼻汁、痰、滑液、腹膜液、膣液、月経血、羊水、精液等の体液が挙げられる。体液以外に、環境又は食糧生産アッセイを実施するために、水、食品等の他の液体試料も使用することができる。更に、検体を含有している疑いのある固体材料も試験試料として使用することができる。試験試料は生物ソースから得られたまま直接使用してもよいし、試料の特性を改変するように前処理後に使用してもよい。例えば、このような前処理としては血液から血漿の調製、粘液の希釈等が挙げられる。前処理方法としては更に濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、干渉成分の不活化、試薬添加、溶解等も挙げられる。更に、液体媒体を形成又は検体を放出するように固体試験試料を改変すると有益な場合もある。
【００３０】
プロゾーン現象改善型イムノアッセイ
一般に、本発明は試験試料中の少なくとも１種の該当検体を判定（例えば検出又は定量）するためのイムノアッセイとして、「プロゾーン現象」又は「フック効果」と呼ばれるイムノアッセイ定量妨害を改善（例えば抑制、量的低減又は完全排除）したイムノアッセイに関する。
【００３１】
当分野で公知の典型的な「１段階」イムノアッセイでは、該当検体と、第１の特異的結合パートナー（例えば捕捉抗体）と、検出可能なラベルで標識した第２の特異的結合パートナー（例えばコンジュゲート抗体）を同時に加えて反応混合物を形成する。得られた混合物を次に温置し、未結合検体を前記混合物から除去する。場合により、未結合検体の除去後に希釈剤を加えてもよい。その後、限定されないが、検体の標準曲線の使用および／又は参照標準との比較等の当業者に公知の常法を使用して検体の濃度を測定する。過剰の遊離（即ち未結合）検体が試験試料中に存在する場合にはプロゾーン現象が発生する可能性がある。具体的には、過剰の未結合検体が反応混合物中に存在する遊離コンジュゲート抗体を飽和し、捕捉抗体−検体複合体と結合してこれを標識するに十分な不飽和遊離コンジュゲート抗体が混合物中に残存しなくなってしまう可能性がある。
【００３２】
一般に、以下に更に詳述するように、本発明によると、第３の特異的結合パートナーを反応混合物に加えることによりプロゾーン現象を低減又は排除することができる。この第３の特異的結合パートナーは検出可能なラベルで標識し、未結合検体を反応混合物から除去した後に反応混合物に加える。具体的には、第３の特異的結合パートナーは該当検体と結合するが、第１の特異的結合パートナー又は第２の特異的結合パートナーのいずれにも結合しない。例えば、該当検体が蛋白質又は抗原である場合には、第３の特異的結合パートナーは前記蛋白質又は抗原と結合する抗体とすることができる。あるいは、該当検体が抗体である場合には、第３の特異的結合パートナーは前記抗体と結合する蛋白質又は抗原とすることができる。標識した第３の特異的結合パートナーを加えると、標識した第２の特異的結合パートナーが試験試料中の過剰の遊離検体により使い果たされている場合にはこれに置換するように機能するので、標識した第３の特異的結合パートナーの添加後、プロゾーン現象は改善（例えば抑制、量的低減又は完全排除）される。
【００３３】
本明細書に記載するプロゾーン現象のこのような改善としては、第３の特異的結合パートナーを添加しない同等アッセイに比較してプロゾーン現象の任意減弱、緩和又は低減が挙げられる。減弱又は緩和とは一般に、高検体濃度（即ち、例えば図１に示すように第３の特異的結合パートナーの非添加時）で生じるようなシグナル振幅の低下が全く発生しないか又は所定もしくは全高検体濃度で低減もしくは排除されるような検体濃度対シグナル振幅曲線の「平滑化」を意味する。このような量的低減は単一検体濃度又は一定範囲の検体濃度で観測される任意低減とすることができる。このような低減は約２％から約１００％（例えば１００％低減は該当検体濃度の前記現象の「排除」に相当する）とすることができ、特に約５％を上回る低減（例えば約５％から約９８％、又は約５％から約９５％、又は約５％から約９０％）、特に約１０％を上回る低減（例えば約１０％から約９０％、又は約１０％から約８５％、又は約１０％から約８０％）、および場合により約３０％を上回る低減（例えば約３０％から約８０％、又は約３０％から約７０％、又は約３０％から約６０％）とすることができる。
【００３４】
一態様において、本発明は１段階イムノアッセイに関する。前記イムノアッセイは少なくとも１種の該当検体と、少なくとも１種の検体と結合する第１の特異的結合パートナーと、第２の特異的結合パートナーを含む第１の反応混合物を含み、第２の特異的結合パートナーは第１の検出可能なラベルで標識する。少なくとも１種の該当検体と、第１の特異的結合パートナーと、第２の特異的結合パートナーは各々任意順序で加えることができ、順次でも同時でもよい。前記イムノアッセイは更に、第３の特異的結合パートナーを第１の反応混合物に加えて第２の反応混合物を形成する段階を含み、第３の特異的結合パートナーは第２の検出可能なラベルで標識する。第１の検出可能なラベルと第２の検出可能なラベル同一でも異なるものでもよい。第３の特異的結合パートナーは第１の特異的結合パートナーと少なくとも１種の検体と第２の特異的結合パートナーを含む第１の反応混合物の温置後にイムノアッセイに加えることができる。第３の特異的結合パートナーを加える前に、第１の反応混合物中に未結合検体が含まれている場合には、洗浄等の当分野で公知の常法を使用して除去する。好ましくは、第１の特異的結合パートナーは捕捉抗体であり、第２の特異的結合パートナーはコンジュゲート抗体である。
【００３５】
従って、別の態様において、本発明は、
ａ）（１）少なくとも１種の該当検体を判定する試験試料、（２）少なくとも１種の該当検体と結合する第１の特異的結合パートナー、および（３）第１の検出可能なラベルで標識した第２の特異的結合パートナーを含む第１の混合物を第１の温置時間温置する段階であって、前記検体、第１の特異的結合パートナーおよび第２の特異的結合パートナーが第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体を形成する段階；
ｂ）未結合検体を第１の混合物から除去する段階；
ｃ）前記第１混合物に第３の特定結合パートナーを添加して第２の混合物を形成する段階であって、前記第３の特定結合パートナーは第２の検出可能な標識で標識されておりならびに前記第１の混合物に対して、前記イムノアッセイにおいて前記第３の特定結合パートナーを添加しないイムノアッセイと比較していかなるプロゾーン現象も減少させるために十分な量で添加される、段階；
ｄ）前記第２の混合物を第２の温置時間温置する段階；および
ｅ）前記第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体の量を測定する段階
を含むイムノアッセイに関する。
【００３６】
少なくとも１種の該当検体を含有する試験試料と、第１の特異的結合パートナーと、第２の特異的結合パートナーは任意順序で加えることができ、順次でも同時でもよい。
【００３７】
本明細書に記載するイムノアッセイでプロゾーン現象を低減するために十分な第３の特異的結合パートナーの量は各種因子により異なり、このような因子としては限定されないが、アッセイが特定該当検体の定量を目的とするか又は定性を目的とするかが挙げられる。一般に、定性アッセイでは、第３の特異的結合パートナーの使用量は偽陰性結果が生じないようにするために十分な量とすべきである。実際には該当検体が試験試料中に現実に存在するときに検体が試験試料中に存在しないと判定される場合には偽陰性結果が生じる。一般に、定量アッセイでは、添加量はシグナルが検体量を測定するために試料の希釈を必要とする最高指標を下回らないようにすると共に、検体量の過少定量を避けるために十分な量とすべきである。本明細書に記載するイムノアッセイで使用する第３の特異的結合パートナーの量は第２の特異的結合パートナーの量の約１％から約５０％が好ましい。
【００３８】
本発明のイムノアッセイでは、検体の標準曲線の使用又は参照標準との比較により、形成された前記第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体の量を試験試料中の検体の量と相関させる。標準曲線は質量分析法、重量測定および当分野で公知の他の技術により既知濃度の該当検体の系列希釈を使用して作成することができる。場合により、第２の検出可能なラベルの量を測定することにより試験試料中の検体の量を定量する。
【００３９】
第１の温置時間後、洗浄等の当分野で公知の常法を使用して未結合検体を除去することができる。
【００４０】
更に、本発明のイムノアッセイでは、第１の検出可能なラベルと第２の検出可能なラベルは同一（共通）でも異なるものでもよい。
【００４１】
更に、別の態様において、イムノアッセイは更に、第３の特異的結合パートナーの添加後に第２の混合物を洗浄する付加的段階を含むことができる。
【００４２】
あるいは、更に別の態様において、イムノアッセイは更に、第２の温置時間後に第２の混合物を洗浄する付加的段階を含むことができる。
【００４３】
本明細書に記載するイムノアッセイでは、場合により第１の特異的結合パートナー、  第２の特異的結合パートナー、第３の特異的結合パートナー、第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナー、第１の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー、第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー又は第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナーを固相に固定化する。固相は非限定的な例として抗体や抗原等の特異的結合パートナーを結合することができる当業者に公知の任意材料とすることができる。使用可能な固相の例としては限定されないが、マイクロタイタープレートの試験ウェル、ニトロセルロース、ナイロン、（ガラス、ガラス繊維、ラテックス、プラスチック又は紙材料製の）ビーズもしくはディスク、ゲル（例えばポリペプチドを流した後に乾燥するゲル）、足場分子（限定されないが、例えばウシ血清アルブミン、ＤＮＡ又はＲＮＡ）又は（ニトロセルロース、ナイロン、プラスチック又は紙製の）ストリップ、ディスクもしくはシートが挙げられる。場合により、特異的結合パートナー（即ち、第１の特異的結合パートナー、第２の特異的結合パートナー、第３の特異的結合パートナー、第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナー、第１の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー、第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー又は第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー）が該当検体と結合する能力を妨げない限り、吸着、化学的カップリング剤による共有結合又は当分野で公知の他の手段により第１の特異的結合パートナー、第２の特異的結合パートナー、第３の特異的結合パートナー、第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナー、第１の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー、第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー又は第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナーを固相に結合することができる。更に、必要に応じて、特異的結合パートナー（即ち、第１の特異的結合パートナー、第２の特異的結合パートナー、第３の特異的結合パートナー、第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナー、第１の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー、第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー又は第１の特異的結合パートナーと第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナー）上の各種官能基に対して反応性となるように固相を誘導体化することができる。このような誘導体化には所定のカップリング剤を使用する必要があり、限定されないが、無水マレイン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。
【００４４】
本明細書に記載するイムノアッセイにおいて、第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナーは同一でも異なるものでもよい。例えば、第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナーは各々同一抗体又は抗原でもよいし、各々異なる抗体と抗原でもよい。第３の特異的結合パートナーの重要な特徴は、イムノアッセイに添加する結果としてプロゾーン現象が低減する点である。
【００４５】
更に、第２の特異的結合パートナー、第３の特異的結合パートナー又は第２の特異的結合パートナーと第３の特異的結合パートナーは複数の結合パートナーを含むことができる。例えば、前記結合パートナーは同一又は異なる濃度の抗体の混合物でもよい。
【００４６】
本発明のイムノアッセイに記載する第１および第２の温置時間は各種因子により異なり、このような因子としては限定されないが、特異的結合パートナーの種類が挙げられる。一般に、温置は公知イムノアッセイにおける場合と同様であるので、必要な時間は当業者が容易に決定できよう。好ましい一態様において、第１の温置時間は約５分間から約６０分間である。より好ましい態様において、第１の温置時間は約１５分間から約３０分間である。好ましい一態様において、第２の温置時間は約３０秒間から約３０分間である。より好ましい態様において、第２の温置時間は約１分間から約１０分間である。一般に、固相抗体は検体で飽和されるため、第２の温置コンジュゲート抗体が検体／固相抗体複合体と複合体を形成するために必要な時間は短くなるので、第２の温置時間は第１の温置時間よりも短くすることができる。
【００４７】
好ましい一態様において、第３の特異的結合パートナーの濃度は第２の特異的結合パートナーの濃度よりも低い。第１の特異的結合パートナーは検体で飽和されるので、第３の特異的結合パートナーは第１の特異的結合パートナー−検体−第２の特異的結合パートナー複合体の高度の結合と標識を実現することができる。更に、低濃度の第３の特異的結合パートナーを使用すると、バックグラウンドシグナルが低下し（従ってシグナル対ノイズ比が低下し）、より高感度の検体検出が可能になる。
【００４８】
従って、本発明では特に、試験試料中に存在する該当検体を捕捉抗体により捕捉し、捕捉抗体と検体と第１の抗体コンジュゲートの複合体を形成することにより検体を第１の抗体コンジュゲートにより検出する試験試料の検体のイムノアッセイの改良が提供され、前記改良は前記該当検体と結合する第２の抗体コンジュゲートを加える付加的段階を含む。前記付加的な標識コンジュゲートは従来の１段階イムノアッセイ後に付加的温置として加えることができる。あるいは、第２の温置は改変型２段階イムノアッセイの既存の第２の温置とすることができる。この添加は混合物から未結合検体の除去後に実施すると最適である。当然のことながら、この改良型アッセイは当業者に周知の変法を使用して検体を複合体化するために抗体の代わりに抗原を使用して実施することができる。
【００４９】
本明細書に記載する本発明は更に、例えば米国特許第５，０８９，４２４号および５，００６，３０９号に記載され、例えばＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）から市販されているような各種自動および半自動システム（固相が微粒子から構成されるものを含む）で使用するように適応させることができ、このようなシステムとしては限定されないが、Ａｂｂｏｔｔ社のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）、ＡｘＳＹＭ、ＩＭＸ、ＰＲＩＳＭおよびＱｕａｎｔｕｍ  ＩＩ機器と他のプラットフォームが挙げられる。更に、本発明は場合によりサンドイッチイムノアッセイを実施するためのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの市販ポイントオブケア（ｉ−ＳＴＡＴ（登録商標））電気化学イムノアッセイシステムにも適応可能である。イムノセンサーと、その製造方法および使い捨て試験装置における操作方法は例えば米国特許第５，０６３，０８１号、米国特許出願第２００３０１７０８８１号、米国特許出願第２００４００１８５７７号、米国特許出願第２００５００５４０７８号および米国特許出願第２００６０１６０１６４号に記載されている。
【００５０】
以下、特定実施例により本発明を更に例証する。これらの実施例は本発明の好ましい態様に過ぎす、限定的なものではない。
【実施例１】
【００５１】
１段階イムノアッセイを使用してＨＢｓＡｇを定量する場合のプロゾーン現象緩和
自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用し、試験試料中の高濃度のＨＢｓＡｇとみなされる１．２７ｍｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを含有するヒト血漿単位中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を定量するイムノアッセイを実施した。
【００５２】
１０倍希釈系列を使用してＨＢｓＡｇ（１．２７ｍｇ／ｍＬから１２７ｐｇ／ｍＬ）を含有するヒト血漿単位の希釈液を調製した。自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムで個々の試験に使用されている反応容器で試験を実施した。記載する全段階はＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器で実施した。各ＨＢｓＡｇ希釈液を各反応容器に７５μＬずつ分配した。同時に、０．０７５％  １−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（「ＥＤＡＣ」）を被覆した磁性微粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，ＩＮ）（５０μＬ）に抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を被覆したものと、アクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体１００ｎｇ／ｍＬ又は０．０ｎｇ／ｍＬ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を同一反応容器に５０μＬずつ分配した。次に反応容器をボルテックスし、試料と反応剤を混合した。反応混合物を加えた各反応容器を３７℃で１８分間温置した。
【００５３】
この温置中に、試料中のＨＢｓＡｇは磁性微粒子に被覆した抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体により捕捉された。
【００５４】
抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム標識抗体も磁性微粒子により捕捉されたＨＢｓＡｇと結合した。こうして微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体が形成された。
【００５５】
１８分間温置の完了後、微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体は反応容器の側面に磁気的に捕捉され、固定化された。次に、容器からの液体吸引と反応容器への洗浄バッファー（洗浄バッファーはＰＢＳ，Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル）を含有しており、ｐＨ約６．８である）の添加を交互に行うことにより固定化微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体を洗浄した（洗浄バッファー１ｍＬ，４回反復）。
【００５６】
このプロセスにより、未結合試料と未結合アッセイ反応剤を反応混合物から除去した。１８分間温置中に形成された磁気的に捕捉された微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体は反応容器に残存していた。
【００５７】
第２の温置（４分間）中に、捕捉された磁性微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体は磁気から解放された。次に微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体を加えた反応容器にアクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体（上記に使用したものと同じ）（４５又は０．０ｎｇ／ｍＬ（０．０ｎｇ／ｍＬとは希釈剤のみを使用し、第３の特異的結合パートナーを使用しないことを意味する））５０μＬを分配した。次にこの反応混合物をボルテックスし、微粒子を分散させ、反応剤を混合した。反応混合物を３７℃で４分間温置した。
【００５８】
４分間温置の完了後、微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体は再び磁気的に捕捉される。次にバッファーで反復洗浄する（洗浄バッファー１ｍＬ，４回反復）（上記と同一の洗浄バッファー）。こうして未結合標識抗ＨＢｓＡｇ抗体を除去する。
【００５９】
その後、磁気的に捕捉された微粒子−ＨＢｓＡｇ複合体は解放される。
【００６０】
次にアクリジニウムラベル（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）から発光するように誘発する。これはＨ２Ｏ２（１．３２％）を加えた低ｐＨ（ｐＨ１）バッファー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ）約１００μＬを微粒子複合体に加えてボルテックスすることにより実施する。このバッファーを加えると、微粒子により捕捉されたＨＢｓＡｇと結合しているアクリジニウム標識抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ）は解放される。
【００６１】
次に、解放されたＨＢｓＡｇ−標識アクリジニウムを反応混合物溶液中に残して磁性微粒子を磁気的に捕捉する。その後、ｐＨ１３バッファー約３００μＬを加え、溶液中に放出されたアクリジニウムからの発光を「誘発」する。
【００６２】
試料中に存在するＨＢｓＡｇの量を測定するために発光量（「相対発光量」（ＲＬＵ）として測定）を使用する。
【００６３】
アクリジニウム（Ａｃｒｄ）で標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体の３種類の組合せでＨＢｓＡｇ試料の希釈液を試験した。組合せ（Ａ）は第１の温置中のみにアクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用した。組合せ（Ｂ）は第１および第２の温置中にアクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用した。組合せ（Ｃ）は第２の温置中のみにアクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用した。具体的に、これらの３種類の組合せの各々を下表１により詳細に記載する。
【００６４】
試験した抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム組合せ：
組合せ（Ａ）−［「１００／０」］抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄ：
−１００ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置１に添加。
−０ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置２に添加。
組合せ（Ｂ）−［「１００／４５」］抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄ：
−１００ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置１に添加。
−４５ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置２に添加。
組合せ（Ｃ）−［「０／４５」］抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄ：
−０ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置１に添加。
−４５ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置２に添加。
【００６５】
【表１】
0005553615.tif 000002
【００６６】
図２は各試験条件および試験した試料により発生したカウントをＨＢｓＡｇ濃度に対比して示すグラフである。
【００６７】
これらの結果から、第１の温置のみでアクリジニウム標識抗体を使用すると、明白なプロゾーン効果が生じ、１．２７ｍｇ／ｍＬ  ＨＢｓＡｇ試料のＲＬＵは１２８，５０６カウントまで低下することが確認される。これは１２，７００ｎｇ／ｍＬ  ＨＢｓＡｇでは２，５５９，８１８カウントに相当する。これらのカウントをこのグラフの下降部分と比較することによりＨＢｓＡｇ  １．２７ｍｇ／ｍＬの１２５，８０６カウントを解釈するならば、１．２７ｍｇ／ｍＬ  ＨＢｓＡｇ希釈液は約から２９．７ｎｇ／ｍＬとして定量されることになる。これは、プロゾーン現象による顕著なイムノアッセイシグナル抑制を実証するものである。
【００６８】
抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム標識抗体を第２の温置と第１の温置に加えると、プロゾーン現象を制限することによりフック効果は有意に低減し、１．２７ｍｇ／ｍＬで２，４６５，４１３カウントとなる。この結果、１．２７ｍｇ／ｍＬ  ＨＢｓＡｇ試料の定量は１０６７ｎｇ／ｍＬまで増加し、３５倍の定量増加となる。
【００６９】
抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム標識抗体を第２の温置のみに加えると、プロゾーン現象抑制のメカニズムが明らかになる。抗ＨＢｓＡｇアクリジニウムを第２の温置に加えると、プロゾーン現象を受けないシグナルが得られる。第１の温置からのシグナル全体がプロゾーン現象により排除されたとしても、シグナルが抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム標識抗体により提供されるレベルを下回ることはない。
【実施例２】
【００７０】
１段階イムノアッセイを使用してＨＢｓＡｇを定量する場合のプロゾーン現象緩和
自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システム（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を使用し、試験試料中の高濃度のＨＢｓＡｇとみなされる１．２７ｍｇ／ｍＬのＨＢｓＡｇを含有するヒト血漿単位中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を定量するイムノアッセイを実施した。本実施例では、アクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体の量を実施例１で使用した量よりも実質的に減らした。即ち、第１の温置で０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬを使用し、第２の温置で０ｎｇ／ｍＬ又は４５ｎｇ／ｍＬを使用する代わりに、第１および第２の温置の各々で量を１．５ｎｇ／ｍＬまで減らして試験した。
【００７１】
１０倍希釈系列を使用してＨＢｓＡｇ（１．２７ｍｇ／ｍＬから１．２７ｎｇ／ｍＬ）を含有するヒト血漿単位の希釈液を調製した。自動ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）システムで個々の試験に使用されている反応容器で試験を実施した。記載する全段階はＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）機器で実施した。各ＨＢｓＡｇ希釈液を各反応容器に７５μＬずつ分配した。同時に、０．０７５％  ＥＤＡＣを被覆した磁性微粒子（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｏ，ＩＮ）（５０μＬ）に抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を被覆したものと、アクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体１．５ｎｇ／ｍＬ又は０．０ｎｇ／ｍＬ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）を同一反応容器に５０μＬずつ分配した。次に反応容器をボルテックスし、試料と反応剤を混合した。反応混合物を加えた各反応容器を３７℃で１８分間温置した。
【００７２】
この温置中に、試料中のＨＢｓＡｇは磁性微粒子に被覆した抗ＨＢｓＡｇモノクローナル抗体により捕捉された。
【００７３】
抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム標識抗体も磁性微粒子により捕捉されたＨＢｓＡｇと結合した。こうして微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体が形成された。
【００７４】
１８分間温置の完了後、微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体は反応容器の側面に磁気的に捕捉され、固定化された。次に、容器からの液体吸引と反応容器への洗浄バッファー（洗浄バッファーはＰＢＳ，Ｂｒｉｊ−３５（ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテル）を含有しており、ｐＨ約６．８である）の添加を交互に行うことにより固定化微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体を洗浄した（洗浄バッファー１ｍＬ，４回反復）。
【００７５】
このプロセスにより、未結合試料と未結合アッセイ反応剤を反応混合物から除去した。１８分間温置中に形成された磁気的に捕捉された微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体は反応容器に残存していた。
【００７６】
第２の温置（４分間）中に、捕捉された磁性微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体は磁気から解放された。次に微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体を加えた反応容器にアクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体（上記に使用したものと同じ）（０．１５又は０．０ｎｇ／ｍＬ）５０μＬを分配した。次にこの反応混合物をボルテックスし、微粒子を分散させ、反応剤を混合した。反応混合物を３７℃で４分間温置した。
【００７７】
４分間温置の完了後、微粒子−ＨＢｓＡｇ−標識抗体複合体は再び磁気的に捕捉される。次にバッファーで反復洗浄する（洗浄バッファー１ｍＬ，４回反復）（上記と同一の洗浄バッファー）。こうして未結合標識抗ＨＢｓＡｇ抗体を除去する。
【００７８】
その後、磁気的に捕捉された微粒子−ＨＢｓＡｇ複合体は解放される。
【００７９】
次にアクリジニウムラベル（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）から発光するように誘発する。これは実施例１に記載したように実施し、即ち、Ｈ２Ｏ２（１．３２％）を加えた低ｐＨ（ｐＨ１）バッファー（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ）約１００μＬを微粒子複合体に加えてボルテックスすることにより実施する。
【００８０】
次に、解放されたＨＢｓＡｇ−標識アクリジニウムを反応混合物溶液中に残して磁性微粒子を磁気的に捕捉する。その後、ｐＨ１３バッファー約３００μＬを加え、溶液中に放出されたアクリジニウムからの発光を「誘発」する。
【００８１】
実施例１と同様に、発光量をＲＬＵとして測定し、試料中に存在するＨＢｓＡｇの量を測定するために使用する。
【００８２】
アクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体の３種類の組合せでＨＢｓＡｇ試料の希釈液を試験した。組合せ（Ａ）は第１の温置中のみにアクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用した。組合せ（Ｂ）は第１および第２の温置中にアクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用した。組合せ（Ｃ）は第２の温置中のみにアクリジニウムで標識した抗ＨＢｓＡｇ抗体を使用した。これらの３種類の各組合せの各々を表２により詳細に記載する。
【００８３】
試験した抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム組合せ：
組合せ（Ａ）−［「１．５／０」］抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄ：
−１．５ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置１に添加。
−０ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置２に添加。
組合せ（Ｂ）−［「１．５／０．１５」］抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄ：
−１．５ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置１に添加。
−０．１５ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置２に添加。
組合せ（Ｃ）−［「０／０．１５」］抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄ：
−０ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置１に添加。
−０．１５ｎｇ／ｍＬ  抗ＨＢｓＡｇ  Ａｃｒｄを温置２に添加。
【００８４】
【表２】
0005553615.tif 000003
【００８５】
図３は各試験条件および試験した試料により発生したカウントをＨＢｓＡｇ濃度に対比して示すグラフである。
【００８６】
これらの結果から、第１の温置のみでアクリジニウム標識抗体を使用すると、明白なプロゾーン効果が生じ、１．２７ｍｇ／ｍＬ  ＨＢｓＡｇ試料のＲＬＵは４３８７カウントまで低下することが確認される。これは１２，７００ｎｇ／ｍＬ  ＨＢｓＡｇでは９１９６７カウントに相当する。これらのカウントをこのグラフの下降部分と比較することによりＨＢｓＡｇ  １．２７ｍｇ／ｍＬの４３８７カウントを解釈するならば、１．２７ｍｇ／ｍＬ  ＨＢｓＡｇ希釈液は約から４１．９ｎｇ／ｍＬとして定量されることになる。これは、プロゾーン現象による顕著なイムノアッセイシグナル抑制を実証するものである。
【００８７】
抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム標識抗体を第２の温置と第１の温置に加えると、プロゾーン現象を制限することによりフック効果は有意に低減し、１．２７ｍｇ／ｍＬで２１０７２カウントとなる。この結果、１．２７ｍｇ／ｍＬ  ＨＢｓＡｇ試料の定量は２７６．９ｎｇ／ｍＬまで増加し、６．６倍の定量増加となる。
【００８８】
抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム標識抗体を第２の温置のみに加えると、プロゾーン現象抑制のメカニズムが明らかになる。抗ＨＢｓＡｇアクリジニウムを第２の温置に加えると、プロゾーン現象を受けないシグナルが得られる。第１の温置からのシグナル全体がプロゾーン現象により排除されたとしても、シグナルが第２の温置に加えた抗ＨＢｓＡｇアクリジニウム標識抗体により提供されるレベルを下回ることはない。
【００８９】
更に、本明細書に記載するようなプロゾーン現象の改善は短時間の第２の温置段階中に少量の抗体コンジュゲートを使用して得ることができ、検体検出感度を実質的に低下させず、バックグラウンド非特異的シグナルの増加を最小限に止めることがこれらの結果から確認される。
【００９０】
上記目的を実施し、上記効果および利点とそれらに内在する効果および利点を得るために本発明が好適であることは当業者に容易に理解されよう。本明細書に記載する分子複合体と方法、手順、処理、分子、特定化合物は好ましい態様の現在の代表例であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。発明の範囲と精神から逸脱せずに本明細書に開示する発明に種々の置換および変更を実施できることは当業者に容易に理解されよう。
【００９１】
本明細書に引用する全特許および刊行物は本発明が属する分野の当業者の技術水準を表すものである。
【００９２】
本明細書に具体的に記載する発明は本明細書に具体的に開示しない１種以上の要素、１種以上の限定の不在下で適切に実施することができる。従って、例えば本明細書に記載する各場合に「含む」、「から基本的に構成される」および「から構成される」なる用語は相互に置き換えることができる。使用した用語および表現は限定的ではなく、記載上の用語として使用するものであり、このような用語および表現の使用では、表示および記載する特徴又はその部分の等価物を排除する意図はなく、請求する発明の範囲内で種々の変更が可能であるとみなされる。従って、当然のことながら、好ましい態様と付加的特徴により本発明を具体的に開示したが、当業者は本明細書に開示する概念の変更および変形も採用することができ、このような変更および変形も特許請求の範囲に定義する本発明の範囲内に含まれるとみなされる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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