(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  試料を、
i)可溶性抗原上の2つの異なるエピトープに結合する１つ以上の抗体、および
ii)  Fcレセプターを含むエミッター細胞、ここで、前記１つ以上の抗体へのFcレセプターの結合により、細胞内カルシウムの増加が生じ、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、
と合わせる工程、ならびに
b)  エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の可溶性抗原を検出する工程
を含む、試料中の可溶性抗原を検出する方法。
【請求項２】
可溶性抗原がタンパク質または化学物質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記エミッター分子が、カルシウム感受性発光分子またはカルシウム感受性蛍光分子である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記エミッター分子が、エクオリン、オベリン（obelin）、サラシコリン（thalassicolin）、ミトロコミン（mitrocomin）、クリチン（clytin）、ネモプシン（mnemopsin）、ベロビン（berovin）、Indo-1、Fura-2、Quin-2、Fluo-3、Rhod-2、カルシウムグリーン、BAPTAおよびカメレオン（cameleon）からなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記エミッター細胞が、原核生物細胞、真核生物細胞、人工細胞、および非生存細胞からなる群より選択される細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記エミッター細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ細胞、マスト細胞および線維芽細胞からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、2001年2月7日に出願された米国仮出願第60/266,977号の利益を主張する2002年2月6日に出願され英語で公開された国際出願番号PCT/US02/03606の米国国内段階である、2004年1月16日に出願された米国出願第10/467,242号の一部継続出願である、2004年12月1日に出願された米国出願第11/001,583号の優先権を主張する。
【０００２】
上記出願の全体の教示は、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
（政府支援）
本発明は米国空軍契約番号F19628-00-C-0002からの政府資金により作り出された。政府は本発明における一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
環境を長期間監視できる小型で高速で感度のよい、生物因子の検出器の必要性は、貧者の核兵器である生物兵器および化学兵器の拡散によって強調されている。戦場条件下では、有用な検出器は、特定の生物因子または化学因子が検出される場合に迅速に兵士に警告し、対抗手段が素早く実行され得る。
【０００５】
かかる検出器は非軍事的な用途においても同様に有用である。患者における抗生物質耐性菌の迅速な検出は、臨床医学者がより効果的な治療法を選択するのに役立つ。都市の飲料水の供給の継続的な監視は潜在的な病原体の早期警戒を提供し、公衆に対する潜在的な健康危機を管理するために公共事業当局により多くの時間を与える。また、肉および家禽の検査におけるこれらの検出器の使用は、現在の「探って感づく」やり方からは著しい改善である。一般に、かかる検出器は、医学（例えば、獣医学）、農学、環境保護（例えば、シックハウス症候群を診断するため）および食品加工または規制の分野で、切実に必要とされる分析および診断用途である。
【０００６】
全ての脊椎動物は、部分的には抗体分子の大きな多様性を生ずることにより、異物因子（抗原）への特異的免疫応答を得る。抗体分子は高い特異性で抗原に結合する、例えば抗体分子は２つの密接に関連する株の細菌、ウイルス、タンパク質、核酸、真菌、原虫、多細胞寄生虫、またはプリオン、ならびにそれらの微粒子(particle)により生成されるかまたは誘発される生成物に、区別をつけて結合し得る。
【０００７】
抗体は免疫系に不可欠な成分であるＢ細胞によって生成される。抗原は、Ｂ細胞の表面上の抗体に結合しＢ細胞の細胞質ゾルへのカルシウムイオン流入をもたらす細胞内生化学反応のカスケードを導くことにより、Ｂ細胞を活性化し得る。
【０００８】
抗体の構造および機能ならびにＢ細胞活性化の概説についてはPaul, 編集者, Fundamental Immunology, 第３版 , Raven Press, New York (1993)を参照。
【０００９】
多数および希少な標的微粒子または抗原を検出するために抗体の多様性を有効に使う装置は米国特許第6,087,114号および米国特許第6,248,542号に記載されている。
【００１０】
これらの装置は一般に、本明細書でまた「CANARY」細胞またはエミッター(emittor)細胞と称されるセンサー細胞（例えばＢ細胞、マクロファージまたは線維芽細胞）を含む液体培地、光学検出器、および検出される標的微粒子を受け入れる液体培地を含む。各細胞は、その表面上で発現され、検出される抗原に特異的であるレセプター（例えば、キメラまたは単鎖の抗体）を有する。レセプターへの抗原の結合は、化学的また生化学的変化（例えばカルシウム濃度の増加）を伴うシグナル経路をもたらす。細胞はまた、シグナル経路（例えば細胞質ゾルにおけるカルシウム濃度増加）に応答して光子を放出し得るその細胞の細胞質ゾルにエミッター分子（例えばエクオリンまたはindo-1）を含む。検出器は、光子が透過する覆い（例えばガラス）によって、細胞を含む培地から分離され得る。かかる覆いは、培地を支持し、検出器の壊れやすい表面を保護する役割をし、またはレンズとして用いられ得る。光学検出器、例えば電荷結合素子（CCD）はレセプター媒介シグナル経路に応答して細胞から放出された光子を検出し、検出される抗原が存在することを使用者に知らせることができる。装置で使用され得る他の光学検出器としては、光電子増倍管、フォトダイオード、相補型(complimentary)金属酸化膜半導体（CMOS）画像装置、アバランシェ・フォトダイオード、および画像増倍(image-intensified)電荷結合素子（ICCD）（例えばPhotek Ltd, East Sussex, UKから入手可能な物を参照）が挙げられる。一部の態様において、光学検出器は個別細胞を識別できる。
【００１１】
（発明の概要）
本明細書に記載される本発明は、米国特許第6,087,114号および米国特許第6,248,542号に記載される装置を一部変更し発展させて、可溶性抗原の検出方法を提供する。特に、該方法は可溶性のタンパク質および化学物質の検出を提供する。また本明細書に記載される本発明は、試料中の核酸配列の検出方法を提供する。さらに、本明細書はまた、試料中の標的微粒子を検出するためのFcレセプターおよびエミッター分子を含むエミッター細胞を提供するが、ここで検出される標的微粒子とは一つ以上の抗体に結合される。光子検出器を用いる複数の試料において標的微粒子を検出するための光電子工学センサー装置もまた提供する。
【００１２】
標的微粒子（可溶性抗原または核酸など）の検出は、直接的または間接的のいずれかでエミッター細胞の細胞表面上に発現される、レセプターへの標的微粒子の結合により部分的に媒介される。直接結合は、直接的で特異的に標的微粒子に結合する抗体などのレセプターを介して起こり得る。標的微粒子の間接結合は、標的微粒子に付加（結合）している抗体に結合するFcレセプターを通じて起こり得る。
【００１３】
本発明の一つの態様において、本明細書は、a) 核酸配列への抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適切な条件下で、試料を少なくとも一つの抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドと合わせる工程、b) エミッター細胞を添加する工程であって、ここで前記エミッター細胞は、抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの抗原に結合する一つ以上のレセプターを含み、抗原への一つ以上のレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をもたらす、およびc)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の核酸配列を検出する工程を含む、試料中の核酸配列の検出方法を提供する。
【００１４】
本発明の別の態様において、本明細書は、a) 核酸配列への抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適切な条件下で、試料を複数の抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドと合わせる工程、b) エミッター細胞を添加する工程であって、ここで前記エミッター細胞は、抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの抗原に結合する一つ以上のレセプターを含み、抗原への一つ以上のレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をもたらす、およびc)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の核酸配列を検出する工程を含む、試料中の核酸配列の検出方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらなる態様において、本明細書は、a) 抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドと核酸配列にハイブリダイズする固相基材に結合したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適切な条件下で、i) 試験される試料、ii) 核酸配列に相補的な少なくとも一つの抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチド、およびiii) 固相基材に結合する核酸配列に相補的な少なくとも一つのオリゴヌクレオチドを含む固相基材を合わせることにより、ハイブリダイスした抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ有する核酸配列を含む固相基材を生成する工程、b) 抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの抗原に結合する一つ以上のレセプターを含むエミッター細胞をハイブリダイスした抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ有する核酸配列を含む固相基材に加える工程であって、ここで抗原への一つ以上のレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の核酸配列を検出する工程を含む、試料中の核酸配列の検出方法を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様において、本明細書は、a) 核酸配列への抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適切な条件下で、試料を少なくとも一つの抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドと合わせることにより、抗原コンジュゲートハイブリダイゼーション複合体を生成する工程、b) 抗原コンジュゲートハイブリダイゼーション複合体の抗原に対して特異的な一つ以上の抗体を添加する工程、c)Fcレセプターを含むエミッター細胞を添加する工程であって、ここで一つ以上の抗体へのFcレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびd)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の標的微粒子を検出する工程を含む、試料中の核酸配列の検出方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様において、本明細書は、a) 試料をi) 標的微粒子に対して特異的な抗体、およびii) Fcレセプターを含むエミッター細胞と合わせる工程であって、ここで抗体へのFcレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびb) エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の標的微粒子を検出する工程を含む、試料中の標的微粒子の検出方法を提供する。
【００１８】
さらなる態様において、本明細書は、a) 試料をi) 可溶性抗原上の２つの異なるエピトープに結合する一つ以上の抗体、およびii) Fcレセプターを含むエミッター細胞と合わせる工程であって、ここで一つ以上の抗体へのFcレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびb) エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の標的微粒子を検出する工程を含む、試料中の可溶性抗原の検出方法を提供する。
【００１９】
本明細書はまた、a) 複数の試料を保持する複数位置を含むローター、b) i) 標的微粒子について試験される試料、およびii) 標的微粒子に対するレセプターを含む細胞の混合物を含む一つ以上の試料であって、ここで標的微粒子へのレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)ローターの回転の際、一つ以上の試料から放出された光子を検出する位置に配置された光子検出器を含む、光子検出器を用いた複数の試料中の標的微粒子を検出する光電子センサー装置を提供する。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、本明細書は、a) 複数の試料を保持する複数位置を含むローター、b) i) 標的微粒子について試験される試料、ii) 標的微粒子に対して特異的な抗体、およびii) エミッター細胞の混合物を含む一つ以上の試料であって、ここで前記エミッター細胞はFcレセプターを含み、抗体へのFcレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)ローターの回転の際、一つ以上の試料から放出された光子を検出する位置に配置された光子検出器を含む、光子検出器を用いた一つ以上の試料中の標的微粒子を検出する光電子センサー装置を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様において、本明細書は、a) 複数の試料を保持する複数位置を含むローター、b) i) 核酸配列について試験される試料、ii) 核酸配列にハイブリダイズした少なくとも一つの抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチド、およびiii) 核酸配列にハイブリダイズした抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの抗原に結合する一つ以上のレセプターを含むエミッター細胞の混合物を含む一つ以上の試料であって、ここで抗原への一つ以上のレセプターの結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)ローターの回転の際、一つ以上の試料から放出された光子を検出する位置に配置された光子検出器を含む、光子検出器を用いた一つ以上の試料中の核酸配列を検出する光電子センサー装置を提供する。
【００２２】
一つの態様において、ローターは１６の試料を保持するための１６位置を含む。
【００２３】
さらに、本発明の別の態様において、本明細書は、a) 試料を可溶性抗原上の２つの異なるエピトープに結合する一つ以上の抗体を含むエミッター細胞と合わせる工程であって、ここで可溶性抗原への一つ以上の抗体の結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびb) エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の可溶性抗原を検出する工程を含む、試料中の可溶性抗原の検出方法を提供する。
【００２４】
本発明の別の態様において、本明細書は、a) 可溶性抗原を架橋することにより架橋抗原を生成する工程、b) 架橋抗原を、架橋抗原と結合する抗体を含むエミッター細胞と合わせる工程であって、ここで架橋抗原への抗体の結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の可溶性抗原を検出する工程を含む、試料中の可溶性抗原の検出方法を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる態様において、本明細書は、a) 可溶性抗原を固相基材に架橋することにより固相基材に結合した架橋可溶性抗原を生成する工程、b) 固相基材に結合した架橋可溶性抗原にエミッター細胞を添加する工程であって、ここで前記エミッター細胞は可溶性抗原上のエピトープに結合する抗体を含み、固相基材に結合した架橋可溶性抗原への抗体の結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の可溶性抗原を検出する工程を含む、試料中の可溶性抗原の検出方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらに別の態様において、本明細書は、a) 試料を可溶性抗原上の第一のエピトープに結合する第一の抗体を含む固相基材と合わせることにより固相基材に結合した架橋可溶性抗原を生成する工程、b) 固相基材に結合した架橋可溶性抗原にエミッター細胞を添加する工程であって、ここで前記エミッター細胞は可溶性抗原上の第二のエピトープに結合する第二の抗体を含み、固体支持体に結合した架橋可溶性抗原への第二の抗体の結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の可溶性抗原を検出する工程を含む、試料中の可溶性抗原の検出方法を提供する。
【００２７】
本発明の別の態様において、本明細書は、a) 化学物質をペプチドと合わせることにより化学物質-ペプチド複合体を生成する工程、b) 化学物質-ペプチド複合体上の２つの異なるエピトープに結合する一つ以上の抗体を含むエミッター細胞を添加する工程であって、ここで化学物質-ペプチド複合体への一つ以上の抗体の結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の化学物質を検出する工程を含む、試料中の化学物質の検出方法を提供する。
【００２８】
本発明のさらなる態様において、本明細書は、a) 化学物質をペプチドと合わせることにより化学物質-ペプチド複合体を生成する工程、b) 化学物質-ペプチド複合体を架橋することにより架橋化学物質-ペプチド複合体を生成する工程、c)架橋化学物質-ペプチド複合体を架橋化学物質-ペプチド複合体に結合する抗体を含むエミッター細胞と合わせる工程であって、ここで架橋化学物質-ペプチド複合体への抗体の結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびd)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の可溶性抗原を検出する工程を含む、試料中の化学物質の検出方法を提供する。
【００２９】
本発明のさらなる態様において、本明細書は、a) 化学物質を抗原コンジュゲートペプチドと合わせることにより化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体を生成する工程、b) 化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体上の２つの異なるエピトープに結合する一つ以上の抗体を含むエミッター細胞を添加する工程であって、ここで化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体への一つ以上の抗体の結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびc)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の化学物質を検出する工程を含む、試料中の化学物質の検出方法を提供する。
【００３０】
本発明のさらなる態様において、本明細書は、a) 化学物質を抗原コンジュゲートペプチドと合わせることにより化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体を生成する工程、b) 化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体を架橋することにより架橋化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体を生成する工程、c)架橋化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体に結合する抗体を含むエミッター細胞を添加する工程であって、ここで化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体への抗体の結合は細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞は細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出するエミッター分子をさらに含む、およびd)エミッター細胞からの光子放出を測定することにより試料中の可溶性抗原を検出する工程を含む、試料中の化学物質の検出方法を提供する。
【００３１】
本発明のシステムは、医学（例えば、獣医学）、農学、環境保護（例えば、シックハウス症候群を診断するため）および食品加工または規制の分野で、分析および診断用途に有用である。
【００３２】
本発明の前述および他の目的、特徴および利点は、添付の図面で図解するように、以下の本発明の好ましい態様のより詳しい説明から明白である。
【００３３】
本特許または出願書類はカラーで作成された少なくとも一つの図面を含む。カラーの図面を有するこの特許または特許出願公報の写しは、要請および必要料金の支払いにより庁から提供される。
【００３４】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載される本発明は可溶性抗原を検出する方法を提供する。例えば、可溶性抗原は可溶性タンパク質または化学物質であり得る。一つの態様において、可溶性抗原は一つまたは二つのみの抗原エピトープを含む。細胞の表面で発現される抗体を用いた可溶性抗原の検出により、抗原への抗体の結合はカルシウム濃度の増大を引き起こし、そのことがエミッター分子を活性化して、抗原が細胞表面上の抗体に架橋する（または凝集することにより、細胞表面上の抗体を固定する）ことで細胞内カルシウムの増加を促進する能力に依存して、細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出する。可溶性抗原は細胞の表面上で発現される抗体を架橋するのに非効率であり得、そのために細胞内カルシウムの増加を促進するのに非効率である。本明細書は、細胞内カルシウムの増加を促進してカルシウム濃度の増加に応答するエミッター分子から光子の放出を引き起こす、記載される方法により、抗体の架橋が達成される可溶性抗原の検出方法を記載する。
【００３５】
検出される目的の可溶性抗原および化学物質は広範囲の物質を含む。例えば、制限なく、本明細書に記載される本発明の方法は、ボツリヌス毒素、血清型A、B、C、D、E、F、G、ブドウ球菌(Staphylococcal)エンテロトキシン-B(SEB)および他のスーパー抗原、リシン、百日咳毒素、志賀毒素、コノトキシン類、ウェルチ菌(Clostridium perfringens)イプシロン毒素、志賀リボソーム不活性化タンパク質などのタンパク質毒素類、ペスト菌(Y pestis)由来のF1抗原、防御抗原、致死因子、炭疽菌(B anthracis)由来の浮腫因子などの他の可溶性細菌産物を検出するのに用いられ得る。他の検出目的の分子としては、細菌の集団感知分子、例えばホモセリンラクトンが挙げられる。本明細書に記載される方法を用いて検出され得る化学兵器またはその加水分解後の崩壊産物の例としては、制限なく、シアン化物（シアン化水素酸）、ホスゲン（二塩化カルボニル）、CK（塩化シアン）、CL（塩素）、CX（カルボンイミド酸ジクロリド、ヒドロキシ）、DP（カルボノクロリド酸、トリクロロメチルエステル）、GA、タブン（ジメチルホスホルアミドシアニダート(Dimethylphosphoramidocyanidic acid)、エチルエステル）、GB、サリン 9メチルホスホノフルオリダート(Methylphosphonofluoridic acid)、(1-メチルエチル)エステル）、GD、ソマン（メチルホスホノフルオリダート、1,2,2-トリメチルプロピルエステル）、GF（メチルホスホノフルオリダート、シクロヘキシルエステル）、マスタード（1,1’-チオビス[2-クロロエタン]）、HN-1、ナイトロジェンマスタード（2-クロロ-N-(2-クロロエチル)-N-エチルエタンアミン）、HN-2、ナイトロジェンマスタード（2-クロロ-N-(2-クロロエチル)-N-メチルエタンアミン）、ルイサイト(Lewsite)（(2-クロロエテニル)ジクロロアルシン(arsonous dichloride)）、PFIB（1,1,3,3,3-ペンタフルオロ-2-トリフルオロメチル-1-プロペン）、トリホスゲン（炭酸、トリクロロメチルエステル）、V-ガス（メチルホスホノチオ酸、S-[2-(ジエチルアミノ)エチル]O-2-メチルプロピルエステル）、VX（メチルホスホノチオ酸、S-[2-[ビス(1-メチルエチル)アミノ]エチル]O-エチルエステル）、二成分VX（O-エチルO-2ジイソプロピルアミノエチルメチルホスホナイトおよび硫黄）、二成分GD（メチルホスホニルジフルオライド(DF)ならびにピナコリルアルコールおよびアミンの混合物、二成分GB（メチルホスホニルジフルオライド(DF)ならびにイソプロピルアルコールおよびイソプロピルアミンの混合物(OPA)が挙げられる。さらに、マイコトキシン類、特にトリコテシン(T2)マイコトキシン類、ジアセトキシシルペノール(Diacetoxyscirpenol)の様々なグループ、サキシトキシン、または他の渦鞭毛藻類(dinoflagellage)産物、ミクロシスチン類（各種）、パリトキシン、サトラトキシンH、アフラトキシン類、およびテトロドトキシンを含む他の生物学的由来の化学物質はまた本発明の方法によって検出され得る。
【００３６】
検出する目的のさらなるタンパク質としては、APP（アミロイド前駆体タンパク）、CJD、BSE、スクラピー、クールーに関連するプリオンタンパク質、およびPSA（前立腺特異抗原）が挙げられる。さらに、適当な可溶性抗原または化学物質の検出は、例えば甲状腺機能、副腎機能、骨代謝、妊孕性、不妊症、IVF、妊娠、成長および成長ホルモン欠損症、糖尿病、血液学、心臓機能、癌、アレルギー、自己免疫疾患、薬物治療管理、薬物乱用、研究免疫学的検定適用、遺伝子操作されたタンパク質、乳残留薬(milk drug residue)、肝機能、抗生物質、ならびに抗生物質合成経路がある臨床的適用等の様々な適用に有用である。これらの適用の分析に適切な可溶性抗原は当業者に公知である（例えば、The Immumoassay Handbook" (第二版), David Wild, 編. Nature Publishing Group 2001 NY NY参照）。
【００３７】
本発明はまた特定の核酸（NA）配列の検出および同定を提供する。一つの態様において、オリゴヌクレオチドプローブを用いて、抗原を標的NAに結合する。これらのプローブは特定のNA配列を一つまたは複数の抗原で装飾する。この抗原装飾（本明細書でまた抗原コンジュゲートといわれる）オリゴヌクレオチドは、その抗原に対する抗体を発現するエミッター細胞を活性化することができる。もし遊離のプローブが存在するならば、単量体であるため、エミッター細胞を活性化しない。同様に、NA上の非特異的な部位への標識されたオリゴヌクレオチドのバックグラウンド結合はエミッター細胞を有意に活性化しない、なぜならこれらの珍しいバックグラウンド結合事象は、分散しすぎて効果的に抗体を架橋できないからである。
【００３８】
抗原の選択は、当業者には理解されるように、入手可能性および対応する抗体の特性、試験される試料における交差反応性抗原がないこと、ならびに抗原-オリゴヌクレオチドコンジュゲートの溶解度、安定性およびコストを含む多くの因子による。本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、ペプチド核酸（PNA）、ロックド核酸、または当該技術分野で公知である特化した独自の特性を有する任意の様々な修飾核酸代用物であり得る。さらに、かかるプローブへの（ペプチドまたはタンパク質形状の）陽イオン性アミノ酸の添加は、ハイブリダイゼーション率を増大し得る。必要であれば、これらの陽イオン性ペプチド／タンパク質は、エミッター細胞に検出される抗原として二つの役目を果たし得る。従って、本発明の一つの態様において、表面上に一つ以上の抗体を有し、標的NAの存在のために多量体である抗原による刺激の際、光子を放出する化合物（エミッター分子）を含むエミッター細胞に基づいた検出システム、特に、光子放出は細胞内カルシウム濃度の増加により活性化される。
【００３９】
本明細書に記載される本発明はまた、一つ以上の抗体に結合される標的微粒子を検出するセンサー細胞を提供する。特に、センサー細胞はエミッター分子および標的物質または微粒子に結合される抗体に結合するFcレセプターを含む。一つの態様において、Fcレセプターを含むセンサー細胞は、ヒトマクロファージ細胞株U937などのマクロファージ細胞である。他の適切な細胞または細胞株は当業者に公知である。Fcレセプターは、抗体または免疫複合体に結合する膜発現性タンパク質の一群である。Fcレセプターは、単球およびマクロファージを含むいくつかの造血性細胞で発現される。FcガンマレセプターI（FcγRI）、可溶性抗体の高親和性バインダーを含む、いくつかのFcレセプターのサブクラスが存在する。FcγRIは、免疫グロブリンG（IgG）の定常領域（Fc部分）に結合して、抗体の抗原結合領域を空いたままにする。特異的抗原による抗体結合Fcレセプターの架橋は、カルシウム放出を促進するシグナル経路を開始する。従って、センサー細胞上のFcレセプターの架橋は、細胞内カルシウム濃度およびエミッター分子の増加をもたらすことにより、カルシウム濃度の増加に応じて光子を放出する。
【００４０】
本明細書に記載される本発明はまた、16チャンネルセンサーを提供する。その最も単純な形状において、エミッター細胞アッセイは、透明チューブに試料を調製すること、特別に調製されたエミッター細胞のアリコートをチューブに導入すること、速い遠心回転を用いてエミッター細胞をチューブの底へ追いやること、および光子計数センサーでチューブからの光出力を測定することから成る。実験室では、大部分のエミッター細胞アッセイは１回に一つの試料で順次行われ、自動化BAWS/CANARY装置においては、各試料が自身の集光チャンネルを有する、四つの試料が同時に測定される。前者のシステムはより多くの時間を要し、一方で後者はより複雑な（かつ高価な）ハードウェアを要する。
【００４１】
（ハードウェア要件は最小限のままで）複数の試料を測定する時間を減じる別のやり方を本明細書に記載する。センサーは単独の集光チャンネルを用いた16試料の同時測定を可能にするように設計されている。センサーは、ローターの外周に平等分配され、垂直軸周囲の可変速度モーターによって動かされる１６の1 5mlチューブを水平に保持するローターから成る（図３９）。単独の固定光子検出器（例えばPMT）を、回転中のチューブの軌道を少し越えたローターの平面に置く。この設計において、各チューブを光子検出器のすぐ近傍に順次繰り返し持ち込み、各通過でその光出力をサンプリングするのを可能にする。最終的に、光源（赤外線LED）および検出器（フォトトランジスター）からなる光スイッチを、検出された光子の計数およびそれぞれが特定の試料と関連のある16領域へのデータの再編成を制御するのに用いる。
【００４２】
この16チャンネル設計のさらなる実施はTCANセンサーとして称される。TCAN（トリガ(triggered)-CANARY）バイオセンサーはエアロゾル回収およびエミッター細胞液体送達の両者を合体して統合放射状ディスク形式とする自動化バイオセンサーである。TCAN CANARYディスク（CD）（図４２）は、気流を別々のチャンネルに分割するマニホールドアセンブリと連動する。エアロゾル回収アセンブリ（図４３）は乾燥圧入技術を用い、その後、気流から透明なプラスチックチューブの底に微粒子を局在化する。
【００４３】
エアロゾル微粒子の圧入後、CDはマニホールドアセンブリと連動して、ディスクに位置するバルブを作動させる。ディスクを素早く回転し、順に遠心力を用いて個々のチューブにエミッター細胞液体の送達をもたらす（図４４）。光学検出器はその後、エアロゾル微粒子と相互作用するエミッター細胞の光子出力に基づいて潜在的な病原体を同定するのに用いられる。このエアロゾル回収およびエミッター細胞送達の過程は、一つのディスクで数回繰り返され得る。この特徴は、CDを変えずにいくつかのトリガ事象の後に複数のエミッター細胞アッセイを実施することを可能にする。
【００４４】
本発明における使用に適切な材料および手順は、以下にさらに詳しく記載される。
【００４５】
エミッター細胞
エミッター細胞（本明細書中でセンサー細胞またはCANARY細胞とも言われる）は、天然に、遺伝子的に作り変えられて、または化学的付加によってのいずれかで、適切なレセプター、シグナル伝達経路、シグナル出力法を有する任意の原核または真核細胞であり得る。該細胞は、機能的レセプター、シグナル伝達経路およびシグナル出力法を有するものとして規定される人工または非生体的ユニットであり得る。抗体等の抗原レセプターの結合の際に、該細胞はカルシウムイオンを細胞質ゾルに動員させる。本発明の装置（device）および方法に有用な細胞の例は、遺伝的に作り変えられて一つ以上の表面結合モノクローナル抗体を発現し得るB細胞（すなわち、骨性の顎を有する冷血または温血脊椎動物由来のB細胞）である。該装置に有用な細胞の別の例は、細胞表面にFcレセプターを発現する、ヒト細胞株U937等のマクロファージ細胞である。抗体の標的への付加により抗原は抗体に結合し得、この抗原抗体複合体は細胞上のFcレセプターに結合し、細胞内カルシウムの増加を生じさせるシグナル伝達を刺激する。
【００４６】
モノクローナル抗体は、例えば検出される抗原で動物を免疫し、免疫した動物からB細胞を回収することにより生成され得る。次いでモノクローナル抗体をコードするDNAを単離し、検出される抗原に特異的な表面モノクローナル抗体の産生についてスクリーニングされる不死化された細胞株および細胞に移入され得る。さらなる標的生検がシグナルに曝露される際に、B細胞からの放出シグナルが有意に減少しないため、またかかる放出シグナルが直線的であるため、B細胞は定質的および定量的分析の両方に有用である。
【００４７】
あるいは、細胞は線維芽細胞であり得る。しかしながら、線維芽細胞は、表面抗体の細胞質部分からのシグナルを細胞のカルシウム貯蔵に変換するために必要なシグナル変換機構を有さない。この課題を克服するために、キメラ表面抗体を線維芽細胞に発現させ得る。このキメラ表面抗体は、線維芽細胞の細胞膜の内部表面からのシグナルを細胞内カルシウム貯蔵に変換し得るポリペプチド（例えば線維芽細胞成長因子レセプター）由来の細胞質アミノ酸配列を含む。従って、抗原がキメラ抗体の細胞外部分に結合して表面で抗体凝集を生じる場合、カルシウム動員が誘導される。B細胞ではない他の任意の細胞型についてキメラ抗体を使用した同様の戦略が用いられ得るので、細胞は本発明の装置および方法の使用に対して安定である。
【００４８】
本明細書の装置および方法に有用な細胞は、表面上にレセプターを有するものを含む特異的な物質を認識するように設計され、該物質に特異的に結合するものである。好ましいレセプターは抗体または一本鎖抗体であるが、他の適切なレセプターとしては、認識される物質に特異的に結合する、マイトジェンレセプター（リポ多糖（LPS）レセプター等）、マクロファージスカベンジャーレセプター、T細胞レセプター、細胞接着分子、配列特異的制限酵素の一部または転写因子等のDNA結合タンパク質、一本鎖RNAまたは二本鎖RNA結合タンパク質、認識されるDNAもしくはRNA配列に相補的なオリゴヌクレオチド、または他のリガンド結合レセプター（例えば、Fasサイトカイン、インターロイキンまたはホルモンレセプター、神経伝達物質レセプター、においレセプター、化学誘引物質レセプター等）が挙げられる。該レセプターは、膜貫通ドメイン、レセプターに特異的に結合する膜結合分子（抗体に結合するFcレセプター等）、または膜結合分子への共有結合もしくは非共有結合（例えばビオチンストレプトアビジン、ジスルフィド結合等）を介して細胞表面に結合し得る。レセプターはキメラ分子でもあり得、例えば抗体、一本鎖抗体、レクチンまたは他の物質特異的結合ドメインもしくはペプチド等の細胞外ドメイン、およびインシュリンレセプター、線維芽細胞成長因子、二次的メッセンジャーカスケードなどを誘導する他のタンパク質等由来の細胞内ドメインを有し得る。認識される物質への直接的な結合の代わりに、レセプターは別の分子、または二次抗体、標識化ビーズ、抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチド等の認識される物質に特異的に順次結合する目的物に特異的に結合する。
【００４９】
あるいは、これらの結合工程の一つのみが特異的であることを必要とし得る。例えば、一つの抗原（またはビーズに直接、またはマトリックス上に）にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、特定の配列を含むDNAまたはRNAが溶液から取り出され得、標的DNA/RNAにアニールされる非特異的抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドプローブを用いてかかる二次抗原に特異的な細胞を刺激する。また、細胞表面上にキメラとして発現されるタンパク質（ヒストン、プロタミン、RNA結合タンパク質）に結合する非特異的核酸、またはこれらの結合タンパク質に対する抗体も使用されて、配列特異的選択工程後に核酸の存在を検出し得る。
【００５０】
抗体
もともとの細胞の型が何であったとしても、モノクローナル抗体の抗原結合可変領域は一般的な供給源由来のDNA配列として入手され得るか、またはハイブリドーマ細胞株からのRT-PCRによりクローニングされ得る。RT-PCRは、5末端で、可変領域のリーダー領域または枠組み領域のいずれかに、および3末端で定常領域にアニールするように設計されたプライマーの組を用いて達成される。
【００５１】
次いで、抗体可変領域は、既に軽鎖および重鎖についての定常領域を含有する発現ベクターにクローニングされる。Persic et al , Gene 187:9-18, 1997に記載される軽鎖発現ベクターは本目的に特に適している。Persic et al、に記載されるVKExpressは、EF-1αプロモーター、リーダー配列、マルチプルクローニングサイト、およびヒトIgκ定常領域およびポリアデニル化シグナルを含む。重鎖発現ベクターはInvitrogen社のpDisplayに由来する。このベクターは、CMVプロモーター、リーダー配列、HAタグ、マルチプルクローニングサイト、およびmycタグを含み、それにPDGFR膜貫通ドメインおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが続く。
【００５２】
pDisplayは重鎖発現のため、以下のように改変され得る。pDisplayのPDGFR膜貫通ドメインは、分泌を可能にするエクソンを有さないマウスIgG定常領域に置き換えられる。これにより、タンパク質が膜境界にとどまることを確実にする。ネオマイシン耐性遺伝子を、限定されないが、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、ピューロマイシン、カナマイシン、およびブラストサイジン遺伝子を含む任意の多数の抗生物質耐性遺伝子に置き換え得る。重鎖（あるいは軽鎖）可変領域は、オーバーラップ伸長PCR（overlap-extension PCR）を用いてpDisplayのマルチプルクローニングサイトの両側に存在するHAタグおよびmycタグを除去する、ツーステップ法で挿入され得る。また、およそ300塩基対のIgM定常領域が融合された可変領域を含むオーバーラップ伸長産物の挿入を可能にするようなベクターも開発され得、一工程でクローニングがなされ得る。
【００５３】
以下の実施例は、直前に記載された抗体ベクター構築手法を用いて実行された。
【００５４】
検出される抗原に特異的に結合する抗体は、抗原または抗原のエピトープに結合する抗体であるが、試料中の他の抗原またはエピトープには実質的に結合しない。かかる抗体は、キメラ（すなわち、非抗体アミノ酸配列を含む）または一本鎖（すなわち、抗体の相補性決定領域が一つの連続したポリヌクレオチド配列により形成される）であり得る。
【００５５】
あるいは、表面抗体産生細胞は、動物より入手され得、Kohler et al , Nature 256 495-497 (1975)、Kozbor et al , Immunol Today 4 72 (1983)、またはCole et al , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss lnc , pp 77-96 (1985)にもともと記載されるハイブリドーマ技術等の標準技術による表面抗体を産生する細胞のモノクローナル集団の調製に使用され得る。モノクローナル抗体を産生する技術は、（例えば、Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al (編) John Wiley & Sons, Inc , New York, N Y 参照）周知であり、分泌抗体よりも表面抗体を選択するための改変の必要性を有する。
【００５６】
表面モノクローナル抗体の生成のために、リンパ球と不死化細胞株の融合に使用される、任意の多くの周知のプロトコルを応用し得る（例えば、Current Protocols in Immunology上述、 Galfre et al , Nature 266:55052, 1977、Kenneth, In Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp , New York, N Y , 1980、およびLemer, Yale J Biol Med 54:387-402 (1981) 参照。さらに、当業者は、有用であり得るかかる方法の多くの変形があることを理解しよう。
【００５７】
抗体を発現するポリクローナル細胞は、適切な動物を、検出される抗体で免疫することにより調製し得る。抗原に対する抗体分子を産生する細胞は、動物（例えば血液から）から単離され得、さらに抗原コートされたペトリ皿に対してパンニング（panning）等の周知技術により生成され得る。モノクローナル抗体の調製に代わって、モノクローナル抗体をコードする核酸を同定し得、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば抗体ファージディスプレイライブラリー）を抗原でスクリーニングして抗原に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより単離し得る。ファージディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングのキットは市販されている（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, カタログ番号27-9400-01、およびStratagene SurfZAP（登録商標） Phage Display Kit, カタログ番号240612）。さらに、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングの使用に特に従順な方法および試薬の例は、例えば、U S特許番号5,223,409、PCT公報番号WO 92/18619、PCT公報番号WO 91/17271、PCT公報WO 92/20791、PCT公報番号WO 92/15679、PCT公報WO 93/01288、PCT公報番号WO 92/01047、PCT公報番号WO 92/09690、PCT公報番号WO 90/02809、Fuchs et al , Bio/Technology 9 1370-1372 (1991)、Hay et al , Human Antibod Hybridomas 3 81-85 (1992)、Huse et al , Science 246 1275-1281 (1989), Griffiths et al , EMBO J 12 725-734 (1993) に見ることができる。
【００５８】
ライブラリーの所望のメンバーを同定した後、特定の配列を適切な核酸発現体（例えばベクター）にクローニングし得、線維芽細胞等の細胞にトランスフェクトし得る。該発現体も、抗体を発現する細胞に適切なものとして、抗体配列に作動可能に連結されたアミノ酸配列をコードし得る。上述のように、線維芽細胞成長因子レセプターの細胞膜貫通配列は、検出される抗原に特異的な一本鎖抗体に連結され得るので、抗原に接触した場合に細胞はカルシウムを動員する。別々の組換え重鎖および軽鎖が線維芽細胞中で発現してキメラ抗体を形成し得るが、一本鎖抗体も適している（例えば、Bird et al , Trends Biotechnol 9.132-137, 1991; およびHuston et al , Int Rev Immunol 10 195-217, 1993参照）。
【００５９】
光子エミッター分子
所望の物質の細胞表面レセプターへの結合により、細胞内部のシグナル伝達経路が誘発されるはずである。好ましいシグナル伝達経路は、B細胞、T細胞、マスト細胞、マクロファージ、または他の免疫細胞中に見られる二次的メッセンジャーカスケードであり、細胞表面レセプターの架橋により、チロシンキナーゼが活性化され、次いでそれによりホスホリパーゼCがリン酸化され、次いでそれによりホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスファターゼ（PIP2）をイノシトール1,4,5-ホスファターゼ（IP3）とジアシルグリセロールに切断し、次いでIP3によりカルシウムチャネルが開いて、細胞質内小網等の細胞内貯蔵からカルシウムを放出させるか、または細胞外カルシウムを取り込み、それにより細胞の細胞質ゾル内のカルシウム濃度を上昇させる。レセプターの型、細胞の型、および所望のシグナル伝達方法に依存して、G-タンパク質-アデニリルサイクリック-cAMP-タンパク質キナーゼAカスケード等の選択的な二次的メッセンジャーカスケードが使用され得る。
【００６０】
同定される物質に応答した内部シグナル伝達をモニターする方法が提供されるべきである。内部シグナル伝達が細胞質内カルシウムの増加を含む場合、好ましい検出方法は、エクオリン、オベリン（obelin）、サラシコリン（thalassicolin）、ミトロコミン（mitrocomin）（ハリスタウリン（halistaurin））、クリチン（clytin）（フィアリジン（phiahdin））、ネモプシン（mnemopsin）、ベロビン（berovin）、Indo-1、Fura-2、Quin-2、Fluo-3、Rhod-2、カルシウムグリーン、BAPTA、カメレオンズ（cameleons）（A Miyawaki et al , (1999) Proc Natl Acad Sci 96, 213540）、または同様の分子等のカルシウム感受性発光または蛍光分子である。有意な利益を提供するいくつかの場合（例えば改善された感受性、定量的検出または定質的検出）において、カルシウム感受性分子の使用により可能となる光の相対的な強度およびセンサー細胞の貯蔵特性が、特異的エミッター分子および活性化エミッター分子の半減期についての光生成の効果に依存して変化し得ることが予想される。光タンパク質エミッター分子の天然のコファクター構造アナログの使用により、さらなる性能の増大が生じ得る。生細胞により取り込まれ得る種々のカルシウム感受性蛍光染料は、Molecular Probes, Inc、Eugene、Oregを含む市販の供給源から入手可能である。エクオリン、オベリン、サラシコリン、ミトロコミン（ハリスタウリン）、クリチン（フィアリジン）、ネモプシン、ベロビンまたはカメレオンズ等のタンパク質が、一般的に添加され、細胞に注入され、またはHIV TAT（およそアミノ酸47〜57、A Ho et al (2001) Cancer Research 61, 474-477）由来のタンパク質取り込みタグまたは他の手段により送達され得る。所望の場合、かかるレポーター分子は、該レポーター分子を細胞質内小網もしくは細胞膜の細胞質表層、ミトコンドリアの内部、または局所カルシウム濃度の変化が特に大きい他の場所へと向かわせるターゲッティングシグナルを含み得る。シグナル伝達経路の構成成分に結合した蛍光基の蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）（S. R Adams et al (1991) Nature 349, 694-697）等の、シグナル伝達経路の他の点由来の活性を検出する光学的方法も使用され得る。内部シグナル伝達が相対的な酸素種の増加を含む場合（例えば、スーパーオキシドアニオンラジカル、ヒドロキシルラジカル、セイヨウワサビペルオキシダーゼの化合物Iまたは化合物II等）、好ましい検出方法は、光タンパク質ホラシン（pholasin）（生物発光軟体動物フォーラスダクチルス（Pholas dactylus）由来の34-kDa糖タンパク質）または同様の分子等の相対的な酸素感受性発光または蛍光分子である。あるいは、任意のルシフェラーゼに関するレポーター遺伝子を、シグナル経路により誘導されるプロモーターに連結し得る。T細胞およびマスト細胞等のいくつかの細胞において、シグナル伝達経路は、グランザイム、トリプターゼ、またはチルナーゼ（chyrnases）等のプロテアーゼを含む顆粒のエキソサイトーシスを誘発する。これらのプロテアーゼのエキソサイトーシスが、熱量計測法または蛍光計測法（例えば、プロテアーゼにより切断されたペプチドに結合したp-ニトロアナリン（nitroanaline）または7-アミノ-4-トリフルオロメチルクマリン（AFC） [S E Lavens et al (1993) J Immunol Methods 166, 93, D Masson et al (1986) FEBS Letters 208, 84, R&D Systems]）により検出され得る。また、カルシ���ム流出または他のシグナル伝達イオン流出に関連する電気的活性を検出するための微小電極または他の方法が、細胞内のシグナル応答のモニターに適している。
【００６１】
適切なエミッター分子は、生物発光分子および蛍光分子を含む、細胞質ゾルのカルシウム濃度の上昇に応答して光子を放出する任意のエミッター分子である。あるエミッター分子、生物発光エクオリンタンパク質は、Button et al , Cell Calcium 14 663-671 (1993)、Shimomura et al , Cell Calcium 14 373-378 (1993)、およびShimomura, Nature 227 1356-1357 (1970)に記載される。エクオリンは、コエンテラジン、低化学分子の酸化により光子を生じる。コエンテラジンは細胞膜を介して拡散するので、コエンテラジンまたはそのアナログは細胞の周囲の培養メディウムに添加され得る。あるいは、コエンテラジンを生成する酵素をコードする遺伝子を細胞に導入し得る。別の態様において、生物発光緑色蛍光タンパク質（GFP）（Chalfie, Photochem Photobiol 62 651-656 [1995]）または黄色蛍光タンパク質（YFP）が用いられ得る。この態様において、該細胞の細胞質ゾルにはGFPおよびエクオリンの両方が含まれる。放出の無いエネルギー転移過程において、細胞質ゾル中で上昇したカルシウムに応答して、エクオリンはGFPにエネルギーを寄与する。次いでGFPは光子を放出する。あるいは、エミッター分子は、蛍光を誘導するのに適した光の波長で照射されるカルシウム感受性蛍光分子（例えば、indo-1）であり得る。
【００６２】
エクオリンまたは任意の他のエミッター分子は、当該分野に周知の方法で細胞に導入され得る。エミッター分子がタンパク質の場合（例えばエクオリンの場合）、細胞は該タンパク質をコードする発現ベクター（すなわち、細胞に導入された場合に核酸またはエミッター分子を産生するウイルス）を含み得る。発現ベクターは、染色体外に存在し得るかまたは細胞のゲノムに取り込まれ得る。
【００６３】
コンジュゲート抗原／タグ
1以上の抗原またはタグが分子に付加（本明細書中ではコンジュゲートとも言う）され、公知の抗原性エピトープを提供し得る。例えば、1以上の抗原がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ、公知の抗原性エピトープを有する抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドを提供し得る。抗原コンジュゲート分子は、同一であるか異なる一つまたは複数の抗原を含み得る。例えば、限定されること無く、検出のための分子にコンジュゲートされる抗原またはタグとしては、（Corey, J Am Chem Soc , (1995) 117 9373-4に記載されるような）ジゴキシゲニン、ホスホコリン、フルオロセインまたは他のフルオロフォア、およびビオチン等の小抗原ならびにHIS、VSV-G、FLAG、およびC（AAKK）マルチマーが挙げられる。
【００６４】
オリゴヌクレオチド
従来のDNAおよびRNAプローブに加えて、種々の改変された核酸が、配列特異的様式で標的核酸配列にハイブリダイズすることが示されている。これらには、ペプチド核酸（PNA）（Nielsen et al , (1991) Science 254 1497-1500）、ビス-PNA（Griffith et al , (1995) J Am. Chem Soc 117 831-832）、テイル-クランプ（Tail-clamp）PNA（Bentin (2003) Biochemistry 42 13987-13995）、PDループ（Bukanov et al , (1998) PNAS 95 5516-5520)、偽相補的塩基を組み込んだPNA（Lohse et al , (1999) PNAS 96 (21) 11804-11808）、またはロックト核酸（Braasch and Corey (2001) Chem Biol 8 1-7）が含まれる。種々のこれらの改変された核酸は、ハイブリダイゼーション特性、安定性、親和性、および特異性に違いを有することが示されており、従来のDNAオリゴヌクレオチドの代わりに使用され得る（BeckおよびNielsen, Artificial DNA Methods and Applicationsのpp 91-114, CRC Press, Y E Khudyakov and H. A Fields編に概説される）。陽イオン性タンパク質、ペプチド、またはDNA結合タンパク質の結合は、ハイブリダイゼーション動態を改善するように示されている（Corey (1995) J Am Chem Soc 117. 9373-9374、Zhang et al , (2000) Nuc Ac Res 27 (17) 3332-3338）。
【００６５】
オリゴヌクレオチドの結合は、ヘルパーオリゴヌクレオチドの追加により改善することが示されている（O'Meara et al , (1998) Anal Biochem 225 195-203, Barken et al, Biotechniques (2004) 36 124-132）。非標識ヘアピン競合プローブの追加により特異性が改善され得る（Huang et al , (2002) Nucleic Ac. Res 30 (12) e55）。
【００６６】
ハイブリダイゼーション後に結合していないオリゴヌクレオチドの除去は核酸配列検出には必要でないが、望ましい。結合していない標識されたオリゴヌクレオチドは、使用された特定のプローブの化学的性質に依存して、サイズ排出、疎水性相互作用、またはイオン交換等の種々の従来のクロマトグラフィー技術を用いて除去され得る。
【００６７】
他の核酸結合分子
オリゴヌクレオチドは、特定の核酸配列を検出し得る唯一の分子ではない。タンパク質もかかる識別を行い得、エミッター細胞の表面に発現し得、結合の際にカルシウム応答を開始する細胞質ドメインに組換えにより結合し得る。これには、例えば抗体のFc部分に結合する核酸結合タンパク質が含まれる。エミッター細胞表面上の核酸結合タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの前の二重鎖核酸の変性の必要性を無くし得、さらに該系は、全ての必要とされる構成成分を生成し、外来的に合成されたオリゴヌクレオチドは必要ではない。DNA結合タンパク質に特異的な可能性のある配列としては、（1）DNA制限酵素（好ましくはDNA-切断触媒部位が除去されたか不活性化された、例えばL F Dorner & I Schildkraut (1994) Nucl Acids Res 22, 1068-1074）；（2）転写因子または他のDNAもしくはRNA結合タンパク質、特に目的の病原体もしくは生物体に特有のDNAもしくはRNA配列を認識するもの（例えば、HIV TAT転写因子C Brigati et al (2003) FEMS Microbiology Letters 220, 57-65、ポックスウイルス転写因子S S Broyles (2003) Journal of General Virology 84, 2293-2303）が挙げられる。かかるレセプターを有するエミッター細胞が、特異的繰返し配列または択一的に二つ以上の特有の配列のいずれかを有する標的DNA/RNA上で架橋するように設計され得る。
【００６８】
捕捉オリゴヌクレオチド
検出に必要ではないが、沈降し得るか固形の支持体上の標的核酸配列の捕捉により、アッセイの感度が改善され得る。例えば、ストレプトアビジンコート化ポリスチレンまたは常磁性ビーズに結合したビオチン標識化捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、一本鎖DNA標的も捕捉され得る。捕捉された物質は、適切なように、遠心分離または磁場への曝露により結合していない物質から分離され得る。オリゴヌクレオチドのビーズへの結合中の、中間結合反応体（アビジン-ビオチン）の使用は、オリゴヌクレオチドを固形支持体へと結合させる、直接コンジュゲートを含む任意の相互作用が使用される場合に必要でなくても良い。さらに、捕捉オリゴヌクレオチドが結合し得る任意の固形支持体で十分である。これは、特異的な捕捉オリゴヌクレオチドがアレイの特定の位置にあるような、二次元アレイの形状であり得る。あるいは、標的核酸配列が非特異的様式（例えば、イオン交換樹脂、沈降、ヒストンまたはプロタミン結合）で捕捉され得る。標的の捕捉によっても、標的核酸配列が濃縮され、および／またはアッセイ障害物が除去される。
【００６９】
多価性
エミッター細胞の刺激は、エミッター細胞に対して多価（multivalent）であるような抗原に依存している。一般的に、これは少なくとも二つの方法で達成され得る。第一に、例えば複数の抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイズのように、抗原の複数のコピーが標的分子に結合し得る。第二に、各々が単一抗原に結合している標的核酸のいくつかのコピーは、互いに結合し得るか、または極めて近接に互いに結合し得る（例えば、ビーズに結合する）。この例において、個々の標的核酸配列は、多価性でなくても良いが、結合している複数のコピーの標的核酸配列が結合するビーズは、多価性の抗原を提示し得る。
【００７０】
反応チャンバー
本発明における使用に適している反応チャンバーは、エミッター細胞および候補粒子が混合されて互いに結合し得る任意の基材または容器であり得る。一態様において、反応容器は遠心分離チューブである（例えば、極小遠心分離チューブまたはエッペンドルフチューブ）。本明細書に記載のように、遠心分離は特に、他のものが第一ペレットに入り込む前に、第一に候補粒子およびエミッター細胞をペレット化するのに十分に適した手段である。粒子または細胞の両方のペレット化をさらに増加させるために、チューブの側壁は、ウシ血清アルブミン等の粘着性の無いキャリアタンパク質でコートされてエミッター細胞が側壁に貼り付くのを防ぎ得、チューブの底をポリ-L-リジンでコートして、標的粒子がチューブの底に接着したままになることを確実にし得る。細胞接着を妨害または促進する他のタンパク質または分子が細胞生物学の分野で公知であり、本発明における使用に適している。
【００７１】
十分に幾何学的にカスタマイズされた試料を有する遠心分離チューブは、遠心分離によりエミッター細胞と沈降しにくい粒子との相互作用を増加させ、スピン配列のカスタマイズの必要性を減少させる、さらなる態様を提供する。この態様において、分析される粒子含有試料を、試料チャンバーの最大幅がエミッター細胞の直径とほぼ等しいチューブに入れる。濃縮されたエミッター細胞沈降物を次に遠心分離される試料の上に層状に重ねることで、大量の密に充填されたエミッター細胞を、より小さな粒子間に入り込ませるが、一方で窮屈な幾何学構造はエミッター細胞抗体と粒子との相互作用の可能性を高める。抗体と結合した細胞の粒子との結合はあまり沈降していない粒子を捕捉し、結果的に生じた光が光電子増倍管で観察される、エミッター細胞を有したチューブの底へと該粒子を迅速に引き落とす。
【００７２】
別の態様において、反応チャンバーは二次元アレイ状のウェルであり、例えば図に示されるような、マイクロタイタープレート、またはテープに沿ったスポットもしくはウェルである。これらの配置により、複数試料および／または複数の標的粒子の検出が可能になる。候補粒子および／またはエミッター細胞の自動的な送達のために、反応チャンバーもしくは検体回収器およびエミッター細胞レザバーの両方が、少なくとも二次元的にアドレス可能（addressable）である。また、アレイのウェルは、上述のように遠心分離チューブがエミッター細胞と候補粒子の間の接触を容易にするために、粘着性および非粘着性のコーティングで処理される。
【００７３】
検体回収器
異なる装置を使用して、例えば空気から試料を回収し得る。一般的に、空気サンプリング装置は、空気もしくは気体が通過する回収チャンバー中またはそれに並んで液体を含有するか、または空気もしくは気体が通過する場合に粒子（例えば標的粒子）を捕獲する多孔性フィルターを含有する回収チャンバーを有する。液体を含有する回収チャンバーについて、回収液は遠心分離または処理されて、粒子を液体から分離し得る。次いで、分離された粒子は反応チャンバー中に沈降する。フィルター（例えばニトロセルロース）を含有する回収チャンバーについて、フィルターまたはフィルターの孔が反応チャンバーとして作動し得る。あるいは、粒子をフィルターから洗い出すか、またはフィルターを粒子から溶解(dissolve)もしくは除去し得る。フィルター回収チャンバーも、フィルターを通して流れる液体（例えば、水供給試料または脳脊髄液）から粒子を回収するのに適している。さらに、上述のように、液体試料を遠心分離して液体試料中に存在する任意の粒子物を取り出し得る。種々の試料が公知であり、本発明による使用に利用可能である。SKC BioSampler（登録商標）を販売するSKC, Incおよび他のサンプリング装置を参照。
【００７４】
他の空気試料が使用され得る。例えば、選択的な装置はAir-O-Cellサンプリングカセット（SKC, Inc）である。この装置において、空気中の粒子を加速させて、種々の染色手順および顕微鏡的検査に直接的に適した粘着性のスライドに衝突させる。
【００７５】
インパクター(impactor)としても公知である装置中の慣性分離を用いてエーロゾル粒子を回収し得る。回収される粒子を含有する気流を、目的の大気から、衝突に対して表面に向かうインパクターへと引き込む。インパクター中の適切な幾何学的パラメーターおよび流速により、十分な慣性を有する粒子は流線的な流れを続けないが、表面に衝突する。表面接着に衝突する有意な割合の粒子は、静電的相互作用および／またはファンデルワールス相互作用により接着し、それにより回収されて濃縮される。この方法で、タンパク質（毒素を含む）、ウイルス、細菌（植物性および胞子型）、寄生生物、花粉および他の検出可能な物質を含むエーロゾル粒子は、本明細書中の装置および方法を含む、種々の利用可能なアッセイ技術を用いた検出のために回収され得る。
【００７６】
アッセイコストを減少させ、自動化を容易にする液体消耗品および移送機構を減らすか消すことによる、空気インパクターを使用したバイオアッセイのための乾燥試料の回収により、従来の空気から液体への試料回収に対して一般的な利点が提供される。本明細書中の装置および方法についての特別な利点のうち、乾式衝突を使用した回収により、個々の分析粒子の大きさに関係なく、本明細書の装置および方法のセンサー細胞の添加より前に、回収された全試料が表面に位置することが確実となる。このことは、液体中の沈降の程度に関係しない分析物の局在を達成し、それにより本明細書の装置および方法の感度を最大にし、時間消費工程を消すことによりアッセイの多くの方法を早める。
【００７７】
表面に衝突し、以降のバイオアッセイに適合性のある、一定の割合の粒子を保持する任意の表面は回収表面として適している。適切な物質としては、生体適合性金属、プラスティック、ガラス、クリスタル、エーロゲル、ハイドロゲル、紙等が挙げられる。これらの物質の特に有用な形態としては、遠心分離チューブ、高処理量スクリーニングに使用される複数ウェルプレート、連続テープ、フィルター、側方フローイムノアッセイのコンジュゲート放出パッド等が挙げられる。生物粒子の粘着を増強させるコーティングの添加（これらのコーティングは化学的または生化学的性質のもの、例えばポリリシンであり得る）、回収に利用し得る表面積を大きくするための増加した表面の粗さ、および表面上に規定された領域中の粒子の沈降を容易にするカスタマイズされた表面幾何学を含む回収表面の改変により回収効率は増加し得る。さらに、回収表面の静電的電荷および粒子の流入を操作してさらなる引力を生じさせることにより、回収効率の付加的な改良がなされ得る。
【００７８】
回収器の上流の空気から空気への濃縮装置を用いて、回収表面に衝突する空気試料の各単位中の粒子数を増加させることで、乾式衝突回収器にさらなる改良がなされ得る。このことは、十分量のエーロゾル粒子を回収して、検出器に関する信頼性のある結果を提供するために必要な時間を十分に減少させ得る。
【００７９】
この回収コンセプトの一例において、図23で記載されたインパクターは、エーロゾル粒子を市販のプラスティックチューブの底に回収するように形成されている。ノズルはチューブ中に下方へと突き出し、放出口はチューブ内表面の曲率半径に位置する。この位置により、装置センサー細胞同士が最も接触しやすい、チューブの底での粒子の衝突の見込みを増加させる。一旦回収が完了すると、装置センサー細胞を含む一滴の水滴が、回収されたエーロゾル粒子を含むチューブに直接加えられ、チューブ表面への細胞送達を加速するために5秒間回転し、放出された光が光検出器（例えばPMT、CCD、フォトダイオード）を用いて測定される。この器具を用いて、乾燥細菌胞子をエーロゾルから回収し得、光電子装置を用いて1分未満で直接的に同定し得る。この方法は、試料の回収に使用された複数のチューブおよび以降のアッセイを行なうための自動化システムにより行われ得る。システムが少なくとも10の独立したアッセイをどのように行い得るかの例が、図4、6、9、12および15に示される。1チューブ中でアッセイが複数の分析物を探し得るようになる（多重化された）アプローチを行なうことで、1アッセイサイクル間に検出可能な基質の数は、利用可能なチューブの数よりも多くなり得る。このことは、異なる分析物に親和性を有する複数のレセプターを発現する、個々の光電子装置細胞株を生成すること、または1チューブ中の異なる特異性を有する複数の細胞株を組み合わせることによってなされ得る。
【００８０】
図4は一体型生物学的エーロゾル警告センサー（BAWS）/光電子センサーシステムの模式図である。BAWSトリガーモジュールを用いて、粒子、例えば前もって決定された大きさの範囲のものを予備的に検出する。特異性を備えた（meet）粒子が検出される場合、BAWSは、特定の大きさ範囲の粒子が回収され、ウェルに沈降させることを可能にする空気から空気への濃縮器を誘導する。乾式インパクターモジュールは乾燥試料の回収を可能にし、反応チャンバー（例えばチューブ）への細胞（例えばエミッター細胞）送達のためのシリンジモジュールに連結される。輸送モジュールを用いて、（1以上のチャンバーまたはチューブを有する）反応チャンバーの集合体を粒子試料および細胞の沈降または混合のための遠心分離モジュールへと移動させる。遠心分離モジュールは、必ずしも必要ではないが、光放出の検出のための光学/PMTモジュールと連結され得る。制御モジュールは該システムの操作の制御に有用である。
【００８１】
図6は、乾式インパクターモジュールの例を示す。この例において、個々の試料チューブ（例えばPCRチューブ）およびチューブキャリアを含み、粒子試験試料が回収される空気から空気への濃縮器に連結される、単一（例えば基本型のシステム）および複数チャンネル装置が図示される。
【００８２】
図9は、自動化され得る細胞送達の例を示す。ピペッターまたは他の送達装備を含み得る、シリンジおよびシリンジポンプ構成によって、センサー細胞（例えばエミッター細胞）を該システムに導入する。集合体のこの型は、センサー細胞の粒子試料（例えば反応チャンバー（例えばチューブ）中の試料への複数および同時導入を可能にする。
【００８３】
図12は、粒子サンプルまたは細胞サンプルの回転に使用される遠心分離モジュールコンセプトの例を示す。試料チューブを有するキャリアは、キャリアを受けるのに適したローター集合体への装填メカニズムにより導入される。ローターは試料を回転させる。ローター集合体はシグナル回収（例えば光子放出）用の光学モジュールに連結され、インデックス化（indexed）ローターを使用して、検出器（例えば光学モジュール）との試料チャンバーの整列を可能にし得る。
【００８４】
図15は、光学モジュールの例を示す。正確な配置に依存して、該モジュールは複数の試料の同時試験（例えば反応チャンバー、チューブ中で）を可能にする。その場合キャリアおよびチューブユニットに導入され、レンズ集合体（例えば統合された反射板、レンズ）は、必要に応じて、最終的に光検出器（例えばPMT）に連結されるようになる。PMTは、その後プロセスおよび表示のためのプロセッサーに送られるシグナルを生じる。
【００８５】
図21は、一体型乾式インパクター／光電子センサーを図示する。このセンサー中で、上述のモジュールは、30のベルト駆動型（belt-driven）キャリア輸送モジュールに送達可能なキャリアを伴い、直線的な配列に組み立てされる。この輸送モジュールは、回収器から遠心分離モジュールに対する細胞送達モジュールへ、最終的に確認試料貯蔵モジュールへとアッセイチューブを順次移動させ、その後光子の検出が完了する。この組み合わされたセンサーの全体の大きさは、およそ幅54インチ×高さ33インチ×奥行き22インチである。
【００８６】
現実の世界の試料は、アッセイを阻害する（偽陰性）か、特異的な抗原の非存在に応答を生じる（偽陽性）かのいずれかの物質を含み得る。多くの場合、アッセイの前にこれらの試料を処理して、これらの物質を除去し得る。例えば、洗剤または血清因子等の可溶性物質を、事前の遠心分離工程により除去し得、この場合、該作用剤（agent）はチューブの底に濃縮され、液体はアッセイメディウム（Portal Shield samples）で置き換えられる。不溶性の大きな粒状物質は、作用剤が通過可能な孔サイズ（3〜5μm）の市販のフィルターを使用して、試料から除去され得るが、汚染（ディーゼル試料またはすす試料）は残る。試料はシリンジフィルターにより迅速に加工され得、全アッセイ時間にわずか数分が追加される。
【００８７】
検体の局在
検体回収器または反応チャンバーの一部として、異なる機構（遠心分離以外）が実行されてエミッター細胞と候補粒子の間の接触が容易になり得る。例えば、生体電気的装置において、電気泳動、等電点電気泳動、二電気泳動（dielectrophoresis）、磁性タグ化粒子等の使用が本発明のシステムに一体化され得る。例えば、U S.特許番号6,017,696およびNanogen, Incに与えられた他の特許；Goater et al , Parasitology 117 S177-189, 1998、およびU.S.特許番号5,512,439および4,910,148およびDynal ASに与えられた他の特許を参照。
【００８８】
エミッター細胞を含む培地のアリコートと標的粒子（粒子はここでは、エミッター細胞タンパク質／毒素、ウイルス、細菌、寄生生物核酸等により認識され得る何かであり得る）を含む水性試料との混合は、光子放出の速度の一過的な増加をもたらす粒子細胞接触を生じる。混合過程の開始と最大放出速度の間の時間は、特定の細胞の刺激に対する特徴的な応答、ならびに混合が行なわれる時間（混合時間）および粒子と細胞とが混合後に接触するようになる典型的な時間（拡散時間）に依存する。
【００８９】
検出された光子のバックグラウンド速度が標的の非存在下でも存在するため（例えば、光子検出器およびその電子機器中のバックグラウンド細胞放出および熱ノイズ）、単一標的細胞相互作用から放出される光子は該バックグラウンドと区別することが困難であり得る。シグナルとして有用であるために、バックグラウンドを超えて検出される光子の速度の有意な増加が無くてはならない。所定の試料について、混合時間および拡散時間が最小になる場合に、この速度は最大になる。試料中に標的粒子が存在する他の可能なシグナルとしては、時間内のバックグラウンドのみを超えて検出される光子の総数の増加、検出される光子の統計学的な変化、または検出される光子のスペクトルの質の変化が挙げられる。
【００９０】
混合後の粒子と細胞の間の平均距離を減少させることにより拡散時間は最小になり得る。これは粒子および／または細胞を、小容量、しばしば層中に、より大きな混合容量中に局在させることにより達成され得る。しかしながら、粒子および／または細胞を局在させる時間は細胞の特徴的な応答時間よりも長くなり得る。この延長された局在中の粒子と細胞の間の混合は、放出の間の平均時間を増加させることで、より低い速度の光子放出を生じ得、それにより、少量のシグナルを生じ得る。これを避けるために、一つまたは両方が別々に局在させられ、それらの間の接触が最小となる。この局在は短い混合時間ももたらし得る。
【００９１】
一般的に、粒子または細胞を移動させる手段としては、その後の沈降（重力また遠心分離による）、液体フロー（外力によるかまたは対流性）、電力（電気泳動および二電気泳動）、磁力（磁性をビーズ得を用いた）、および音波／超音波（定常波または進行波）が挙げられる。
【００９２】
局在には、粒子および／または細胞が回収され得るチャンネルもしくは容器の固形表面、フィルターの表面、または最小の磁場の周囲にある潜在的なエネルギー防壁等の防壁に組み合わされた、粒子および／または細胞を移動させる手段が必要である。例としては、沈降（チャンバーのより低い表面に細胞を局在させる）、空気衝突（回収表面に貼り付くかまたは落ち着く衝突した粒子）、濾過（フィルターの表面または内部の粒子または細胞回収物）、親和性捕捉粒子または細胞が特異的または非特異的結合相互作用により局在し得る）、磁性捕捉（局在した磁場により固形表面、フィルター表面またはフィルターの内部に固定された拘束された磁性ビーズ、ビーズは粒子または細胞の結合を容易にする表面化学的性質を有し得るかまたは有し得ない）、電気泳動（電荷を帯びた粒子のみが電極表面に回収される）、および二電気泳動（粒子または細胞の電極表面への積極的回収、最小磁場領域への消極的回収）が挙げられる。
【００９３】
粒子および細胞の局在および混合は、上述の方法および他のものを組み合わせることにより達成され得る。下の表に種々の局在／検出器の組合せの例が提供される。特定の典型的な例は、粒子または細胞を二次元的に局在させる方法を示し、光子検出器のアレイ（CCDを含む）が単一光子検出器（PMT等）として使用される場合、異なる粒子間の感度または識別の改善を可能にする。
0005523673.tif 000002
0005523673.tif 000003
【００９４】
局在の例
以下の各例において、特に記載の無い限り、以下のことが仮定される。試料は、短期間細胞生涯および機能に適合性のある水溶液であり、（以下の記載は粒子が存在すると仮定しているが）標的粒子を含む可能性がある。水性試料は、環境、臨床、空気から液体、洗ったモップまたは他の試料から入手し得る。空気試料は、流れる気流（driven air stream）（空気サンプラーまたは表面ピックアップ）、電気的捕捉、または定着した浮遊粒子から入手し得る。細胞についての参照は、生涯および機能に適合性がある水性培地中のエミッター細胞が意味されることが理解されよう。接触した粒子および細胞は、1以上の光子の放出を生じると仮定される。単一またはアレイの光子検出器は、試料および細胞を混合するチャンバーの外に存在し、放出された光子の捕捉および検出を容易にするさらなる光学要素（鏡、レンズ、光ガイド等）が、チャンバーの内側か外側のいずれかに存在し得る。チャンバーは部分的または全体的に透明であるか、または放出された光子が検出器に届き得るようにするための別の手段を有すると推定されるかのいずれかである。
【００９５】
遠心分離
試料は、粒子の沈降に十分な時間、チャンバー中で遠心分離され得る。細胞は、粒子を破壊することなくチャンバー内に導入され、簡易に遠心分離され粒子の上に沈降し得る。光子の検出は、回転の間に、より典型的には回転の後に行なわれ得る。
【００９６】
親和性捕捉（表面捕捉）
試料は、微小遠心チューブ、マルチウェルプレート、フィルターユニット、他の適切な装置に導入され得、ここで、試料との接触表面のいくらかの部分が改変されて、試料中に存在し得る粒子と特異的または非特異的相互作用により結合し、維持し得る。非特異的結合は、静電的／イオン交換相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用等を介して促進され得る。特異的結合は、成分を、基材または粒子と結合する表面（例えば、抗体、レセプター、糖タンパク質、タンパク質ペプチド、炭水化物、オリゴヌクレオチド等）に固定することにより、または粒子表面でレセプターに結合される成分を拘束することにより促進され得る。
【００９７】
親和性捕捉（可動性基材）
表面上での親和性補足と同様ではあるが、粒子は、本明細書に記載される種々の方法により、粒子および／または細胞を移動および／または局在させる可動性基材（ポリマービーズ、細胞、帯電分子、磁性ビーズ、細菌等）に結合する。
【００９８】
フローセル
エミッター細胞は、浅いフローセル(flow cell)へと導入され得、底表面への結合が可能となり、結合しなかった細胞はさらなる流れにより除去され得る。試料が導入され、大量の細胞培地が置き換えられ、粒子が結合した細胞上に沈降し得る。粒子が細胞に接触した際に光子が放出される。
【００９９】
フローセル（複数の細胞株）
フローセルと同様であり、エミッター細胞の明確な領域は異なる標的粒子に感受性である。画像検出器による光子検出によって、刺激される細胞の同定、およびそれにより標的粒子が試料中に存在することの同定が可能になる。
【０１００】
フローセル（磁性ビーズ）
これはフローセルと同様である。適切な磁性ビーズを試料と混合し、標的粒子のビーズへの結合を可能にする。これらの修飾された（decorated）ビーズをフローセルに導入し得、強力に局在された磁場（永久磁石または電磁石により）により、粒子は接した細胞の表面上に捕捉される。混合は、磁力を除去し、ビーズを細胞に沈降させ得ること、または磁力を移動させ、細胞が結合する表面にビーズを引き付けさせることのいずれかにより開始され得る。
【０１０１】
フローセル（電場）
フローセルと同様であり、細胞が結合する表面、および表面に対して平行である別々の電極を伴う（少なくとも一つの電極が透明であり得る）。試料が導入され得、大量の細胞培地が置き換えられる。電極間に適切なDC電圧がかけられ、粒子は電気泳動により結合した細胞へと移動する。
【０１０２】
テープ／芯（wick）
標的粒子を含む可能性がある空気試料は、硬いかまたは柔軟性であり得るか（例えばテープ）、多孔性かまたは無孔性であり得る透明な表面に衝突し得る。吸着物質または芯は、衝突領域の周辺で結合し得るか、または孔の表面の場合は表面の反対側で結合し得る。細胞は衝突領域に位置し、芯のために余分な培地が吸収されて、細胞有する培地の容量と深さが減少し、細胞が粒子により近づき得る。表面が多孔性で、芯物質を背面に有する場合、衝突した粒子への細胞の沈降は、流れによりさらに粒子に引き付けられる。
【０１０３】
空気衝突
標的粒子を含む可能性のある空気試料は、遠心分離に適した（固定され、最初は空である）チャンバーに衝突し得る。細胞は、粒子を乱すことなくチャンバーに導入され得、簡易に遠心分離され、細胞を粒子上に沈降させる。回転中、またはより典型的には回転後にではなく、光子検出が行なわれ得る。
【０１０４】
フィルター装置／磁性ビーズ
フィルターに適したチャンバーおよびプランジャーからなる、改変された注射筒の無い（syringeless）フィルター装置（WhatmanTM、Mini-UniprepTMまたは同様物）に、チャンバーの底面に結合し得る細胞が充填され得、結合しない細胞は洗浄され得る。試料は、適切な親和性で磁性ビーズと共にチャンバーに導入され得る。適切な磁性挿入内部を有し、フィルターの背面付近で固定された、改変されたプランジャーは、捉えられた空気がフィルターを通して漏れる前にチャンバー内に導入され得る。この集合体は逆さにされ（ビーズをフィルターの表面に沈降させるための時間の後、可能なときに）、チャンバーはプランジャーまで押し下げられる。磁性ビーズおよび粒子は、濾過、沈降、および磁力によりフィルター表面に蓄積され得る。粒子は磁性ビーズに結合し得るか、または磁性ビーズ間に捕捉され得る。集合体を再び逆さにする際に、プランジャー内部の磁石で順次拘束される磁性ビーズにより、粒子は細胞から離される。磁石がビーズおよび粒子を放出することを解除（remove）することで、短い距離を通り細胞上に沈降する。
【０１０５】
細胞を通過する流れ
1以上の層の細胞が、チャンバーの底で、適切なフィルターまたは膜の表面に沈降し得る。試料は、チャンバーの細胞上に導入され得、（例えばプランジャーまたは外部ポンプにより）圧力がかけられ得る。試料が、密接に接触している細胞を通過して流れる場合、粒子は、細胞の狭い範囲に持ち込まれ、接触が可能となる。
【０１０６】
向流
1以上の層の細胞が、「セル」チャンバーの底で、適切なフィルターまたは膜の表面に沈降することが可能になり得る。試料は、いくつかのフローチャンネルでフィルターの下の一点でセルチャンバーに連結される分離試料チャンバー中に位置し得る。チャンバーはお互いに並んで配置されるので、遠心分離において試料チャンバーは回転軸の近くに存在し、試料チャンバー中の流体のレベルは、細胞チャンバー中の流体よりも回転軸の近くに存在する。この方法で、遠心分離の回転中に、流体は、回転軸の通常の距離を要するチャンバー間を流れる。このことによりいくらかの試料は、細胞を支持するフィルターの上を通過し、外側へ向かう遠心力による流れに対して維持される細胞を通過する。試料が細胞を通過して流れる場合、粒子は、細胞の狭い範囲に持ち込まれ、接触が可能となる。
【０１０７】
遠心分離チューブフィルター
試料は、サイズ排除に適した遠心分離チューブフィルターのフィルターバスケットに導入され得る。適切な遠心分離条件下で、試料はフィルターを通過させられ、フィルター表面で、フィルターの排除サイズよりも大きい粒子を蓄積させる。細胞をフィルターバスケットに加え、簡易な遠心分離をかけ、フィルター表面および粒子に細胞を導き得る。
【０１０８】
二電気泳動による捕捉
フローセルと同様ではあるが、任意の表面上またはフローセル中に突き出している適切な電極を有する。連結され、外部電源により電気的に稼動する電極を通過する連続的な流れによって、試料は導入され得る。流速、頻度、波形、および振幅の適切な組合せについて、粒子は、陰極の二電気泳動によって、細胞の上の電界強度の最小限の領域に誘導および捕捉され得る。フローおよび（いくつかの電極間にDC電圧を含み、電気泳動力を生じる可能性のある）電極への電気的な稼動の変更後に、粒子は（電気泳動または陽極二電気泳動により）、結合される細胞へと沈降、または移動し得る。
【０１０９】
進行波二電気泳動
浅い円筒状のチャンバー中で、適切な電極（おそらく透明）が、粒子を回収するための中心平面電極、周辺の電極、および一組の螺旋形電極を含む一つまたは両方の並行面上（中心電極の場合同一平面上、または反対表面上のいずれかで）に作られ得る。試料がチャンバーに導入され得、周辺および中心電極間にDC電位がかけられ、電気泳動により粒子を中心電極へとひきつけ得る。液体の交換により細胞をチャンバーに導入し得る。適切な位相シフトAC電圧を有する螺旋形電極に電圧をかけることで、進行波二電気泳動により細胞は中心へと押し流され、細胞が粒子上に沈降し得る。
【０１１０】
溶解性膜チューブ
電気作動型溶解性金の膜の使用がなされ、遠心分離沈降の際の標的粒子およびエミッター細胞間の分離が維持され得る。粒子が細胞の上方の膜に沈降され得る（図20に示される）か、または別のチャンバーの底に存在する（おそらくは挿入）膜によって細胞がチャンバーの底から離れて維持され得るかのいずれかである。いずれの場合においても、膜が電気的活性化により溶解された後、粒子および細胞が沈降、可能ならば遠心分離により混合され得る。
【０１１１】
音波／超音波
音波または超音波を使用して、粒子の濃縮がなされ得る。粒子は、サンディング波（sanding wave）パターンで節に蓄積するか、または進行波パターンで移動し得る。細胞も、この方法で移動し得るか、または上で議論される任意のいくつかの手段により送達され得る。
【０１１２】
毒素検出
一価の抗原を検出するために、二つの一般的な戦略のうちの一つを使用して表面抗体の架橋を誘導することが必要である。まず、一つは細胞表面上に二つの独立した結合部位を発現し得るので、二つのレセプター分子が単一のリガンドに結合し得る。あるいは、細胞に対するリガンドが多価であるような様式で存在する場合、一つの結合部位が細胞表面上に発現され得る。以下は抗体-抗原認識のモデルを用いた具体的な例である。
【０１１３】
まず、個々の分子の異なるエピトープ（エピトープ1および2）に特異的な、二つの抗体が一細胞株の表面上に発現され得る。単一分子の二つの抗体に対する結合（エピトープ1に対する一つの抗体およびエピトープ2に対する別の抗体）は、架橋および光放出を開始させる。より具体的に、単一B細胞株が遺伝子操作により作り変えられて、それぞれが単一分子上の異なるエピトープを認識する二つの独立した抗体を発現する。そこで、単量体抗体が存在することで、高い細胞内Ca2+およびエクオリンにより光の放出を生じる表面抗体を架橋し得る。ペスト菌および野兎病菌の両方に対する機能的な抗体（内在的に発現されるPC抗体に加えて）を発現する細胞株を試験した（実施例参照）。これらの因子のそれぞれは独立してこの細胞株に認識されるので、両抗体が機能的であることが示され、エミッター細胞が二つの機能的抗体を同時に発現することが明らかにされる。
【０１１４】
別の潜在的な課題は、光電子装置の感度および遠心力を用いてペレット化ができない抗原を用いた方法である。ペスト菌F1抗原は溶液中で低分子量ポリマーとして存在するため、発明者らのアッセイでは沈降しない。しかしながら、F1に対する抗体を発現するB細胞は、5ng/mlで可溶性F1抗原を検出し得る。このことは、現在の免疫アッセイ技術と好適に比較され、光電子装置が可溶性抗原に対して完全に感受性であり得ることを示す。オボアルブミンにコンジュゲートするホスホリルコリンを用いて、相補的な実験が行なわれた。細胞表面上で抗体の架橋を刺激するこの小抗原の能力により、PCエピトープの複数のコピーを含有するこの低分子量抗原は、表面抗体を効率的に架橋し得、カルシウム流出および光子放出を生じ得るということが示された。
【０１１５】
第二の戦略により、遠心分離形式を利用することによる、上で示された一価の抗原についての検出の制限が改善され得る。このアプローチは、毒素抗体の一つが良性の細菌の表面に発現され、第二の抗体がB細胞表面に発現される場合の計画を利用する。そこで、毒素は遠心分離により沈降し得、第二の抗体を発現するB細胞が加えられる。複数の抗原が細菌表面上に固定されるので、本質において、毒素はB細胞に対して多価性であり、架橋事象および光子の放出を開始する。さらに具体的に、単量体抗原（例えば毒素）のエピトープ1に対する抗体が、細菌表面に発現される。可溶性毒素は、これらの抗体に結合し、細菌を毒素抗原でコーティングする。これらの毒素でコートされた細菌は、エピトープ2に対する抗体を発現するB細胞の添加前に遠心分離により沈降する。B細胞抗体の架橋は、エクオリンにより光放出を生じる。この戦略における実験の結果により、細菌表面抗原の検出の可能性、およびB細胞の添加前のこれらの細菌の沈降により生じる高い感度が示される。任意の乏しい沈降作用剤にも同様のアプローチを使用して、それのB細胞への提示が改善され得る。
【０１１６】
架橋
標的粒子の架橋は任意の公知手段により達成され得る。例えば、架橋は1以上の中間体薬剤、またはペプチド、抗体、化合物、抗体、ビオチン、ストレプトアビジン等の分子を用いて達成され得、さらに、架橋は共有結合または非共有結合によってなされ得る。また、架橋の方法としては、沈降、または当該分野に公知のリガンド、抗体もしくは化学的官能基を介した固相への結合が挙げられる。
【０１１７】
多重化アッセイ
以下は、B細胞混合物をどのように使用して、チャンネル（チューブ等）の数を増やすことなく検出可能抗原数を増加させるかの記載である。複数の分析物を検出するための最も単純な方法は、検出チャンネル当りに一つのエミッター細胞を使用すること、および検出チャンネルの数を増加させることで細胞アッセイの数を増加させることである。このことは少数のアッセイには許容され得るが、大量の分析物が加えられる場合、該方法はより複雑になり、資源が集約的になる。しかしながら、異なるB細胞株が共に混合される場合、わずか5のチャンネルのシステムにおいて同時のネガティブコントロールを有する、31までの試験を行なうことが可能である。
【０１１８】
例として、1チャンネルを有する場合、多くて一つのB細胞アッセイを検出し得る。しかしながら二つのチャンネルを有する場合、三つの別々のアッセイを検出し得、各チャンネルは三つの別々のB細胞株のうち二つの同等混合物を含む。
例えば三つのB細胞株A、B、Cを有する場合
およびこれらを二つのチャンネルをこのように、二つの
チャンネル1 A、B  チャンネル2 B、Cに混合する
【０１１９】
すると、三つの陽性読出しの可能性がある。
0005523673.tif 000004
【０１２０】
同様に、三つのチャンネルを有する場合、4種の細胞株の群を混合することにより、アッセイは7個の独立したアッセイを検出し得る。
【０１２１】
（これ以降、便利な省略表記が使用され、個々の作用剤についての細胞株が、細胞株の数に対応する一文字で、Aから記され、チャンネル番号は、以下--123.F--がチャンネル1、2および3が全てID作用剤Fについて陽性であるはずであることを意味するように、個々の作用剤について、陽性に検出するためにどのチャンネルを必要とするかを示すように表記するために記載される。）
0005523673.tif 000005
【０１２２】
所定の数のチャンネルでアクセス（access）可能である独立したアッセイ数を単純に記載する関係を体現する式は、全アッセイが同等の割合で混合されると仮定すると、
細胞アッセイ数=2n-1（式中nはチャンネルの数である）
であり、各々のチャンネルを混合する必要のある細胞アッセイの数は、2(n-1)で定められる。
【０１２３】
従って、16種の異なる細胞株を共に混合するために、5個のチャンネルで31の異なるアッセイに信号を送る必要がある。実際、10個のチャンネルのシステムについての設計を使用して、同時にネガティブコントロールを有する31の別々の作用剤にIDを提供し得る（5チャンネル陽性ID、5チャンネル陰性ID）。
【０１２４】
4チャンネルシステム（15の異なるアッセイ）についてのチャンネル混合物およびポジティブ検出の相関は以下に示される。
【０１２５】
0005523673.tif 000006
【０１２６】
さらなる詳細は無いが、上述の開示および以下の実施例に基づき、当業者は本発明をその最大限に利用し得ることが考えられる。以下の実施例は、当業者が本発明をどのように実施するかということの単なる例示として解釈され、いかなる方法においても開示の残りを限定しない。
【実施例】
【０１２７】
図1は、エミッター分子 (ここではエクオリン)を含む本発明のA細胞(ここではB細胞)の一般的な細胞成分が、その表面上に存在する抗体を有することを示す概略図である。これらの抗体は、生物兵器(warfare)剤などの標的粒子上の抗原に特異的である。B細胞上の抗体への標的粒子の結合は、2つ以上の抗体を細胞表面上で互いに近づけ、細胞内貯蔵から細胞質内へのカルシウムの放出をもたらすシグナル伝達カスケードを引き起こす。この細胞質カルシウム濃度の増加は、エクオリンの光子放出を引き起こす。光子は、次いで、捕捉され、CCDなどの光電素子によって記録される。したがって、細胞バイオセンサーは、機能性表面抗体を有し、増加したカルシウム濃度に応答する細胞質エミッター分子を含む細胞を用いて実践され得る。
【０１２８】
かかる細胞系検出システムは、任意の抗原の任意の標的粒子上の迅速で感度がよく、特異的で、正確で順応性のある検出を提供する。順応性に関して、系は、任意の粒子または粒子の群を標的化するように修正され得る。一例では、単一のエミッター細胞が、各型が標的粒子の非重複群に特異的である複数の抗体型を含み得る。この単一のエミッター細胞は、次いで、標的粒子種の属を一度に同定するために使用され得る。
【０１２９】
第２の例では、反応チャンバは2つの型のエミッター細胞を含み得る。一方の型のエミッター細胞は、ある属の標的粒子(例えば、細菌) に特異的な抗体を含み、属の任意の構成員との接触に応答して第１の波長の光子を放出する。第２の型のエミッター細胞は、属内の特定の種 (例えば、ペスト菌) に特異的な抗体を含み、該種との接触に応答して第１の波長と異なる第２の波長の光子を放出する。この構成は、偽陽性シグナルを低減または排除することにより、極めて高い正確性を提供する。第１および第２の波長の光子が検出された場合のみ、陽性事象が記録され得る。エミッター細胞特異性のこのネスティング(nesting)は、偽陽性シグナルを低減または排除するために、必要に応じて、２つより多くのレベルに拡張され得る。
【０１３０】
図2は、本発明の一般的な構造および使用環境の概略図である。
【０１３１】
図3は、本発明の１つの態様で用いられる分子生物学の概略図である。この例では、エミッター分子 (例えば、エクオリン)を発現するが、抗体を発現しない一般的な(universal)B細胞株が、任意の抗原に特異的な任意の抗体を発現し得るB細胞を作製するための基礎になっている。抗体発現ベクターは、一般的なB細胞に導入され、発現ベクターの存在について選択され、本発明の検出システムでの使用に拡張される。pDisplayおよびVKExpress (上記の「抗体」セクションに記載)とともにこのストラテジーを用い、種々の標的に対する標的特異的エミッター細胞を作製した。口蹄疫ウイルス(FMDV)、ベネズエラウマ脳脊髄炎(VEE)ウイルス、ペスト菌、野兎病菌、ブルセラ種(Brucella spp)、コレラ菌のO1およびO139株、ならびにオルトポックスウイルスに特異的なエミッター細胞を作製した。FMDV抗体可変領域cDNAおよびの配列はUSDAから得た。ペスト菌、野兎病菌、ブルセラ種、コレラ菌のO1およびO139株抗体可変領域のcDNAおよび配列は、NMRCの研究者から得た。VEEおよびオルトポックス抗体の可変領域を、それぞれ、CDCおよびUSAMRIIDから得たハイブリドーマからクローン化した。口蹄疫ウイルス(FMDV)、ペスト菌、野兎病菌およびベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス(VEEV)は、それぞれ、口蹄疫、ペスト、野兎病および脳炎の原因である。いくつかの公表された論文に記載されたプライマーの組合せを用いてハイブリドーマからのクローニングを行った。Bacillus globigiiに特異的なエミッター細胞は、この非病原性細菌が、いくつかの軍事機関によって生物兵器剤検出システムの実地試験において試験生物として使用されているため、作製されている。図5は、FMDV-特異的なエミッター細胞のいくつかのクローンを生FMDV標的と接触させたときの光子放出応答を示す折れ線グラフを含む。各場合において、エミッター細胞は、標的および細胞間の接触後、約20〜30秒以内に光子を放出した。グラフには、エミッター細胞に結合することが期待され得ない変異FMDV (ウイルス外皮タンパク質に単一のアミノ酸変異を有する)をエミッター細胞クローンと接触させたときの放出の欠如を示すデータが含まれる。陰性対照は、検出システムに組み込まれる高い特異性を支持する。
【０１３２】
遠心機および光電子増倍管(PMT)配置の種々の構成が、本発明のシステムに組み込まれ得る。構成は、スイングハーネス(swinging harness)の試料ミクロ遠心(microfuge)チューブを回転させ、固定された位置にバランス(balance)チューブを含むローター (モーター) を含む。PMTが底部に示されており、静止した試料チューブの底部端の方に上に向いている。エミッター細胞よりも小さな標的粒子の典型的な実験では、粒子含有液体試料を試料チューブ内に配置し、大部分の粒子をチューブ底部に沈殿させるのに充分な条件下で遠心分離する (例えば、野兎病菌では5600×gで60秒間)。次いで、エミッター細胞の懸濁液をチューブ内の試料に重層し (沈殿した粒子をかく乱しないように)、軽く回転させ、細胞をペレット化して標的粒子と接触させた。標的粒子が候補粒子に存在する場合、特定波長の光子が、細胞から放出され、PMTによって捕捉され、記録されるはずである。
【０１３３】
特定の態様では、PMTは、Stanford ResearchシステムSR400 Two Channel Gated Photon Counterに接続されたHamamatsu HC 125-08 PMTであり得る。遠心機は、スイングバケット構造を有するSapphire 17 turn, 18 5 AWG, 5アンプモーターであり得る。
【０１３４】
遠心チューブ(反応チャンバ)は、候補粒子およびエミッター細胞間の接触を補助するために必要に応じて変更およびグレードアップされ得る。図20に示す１つの態様において、チューブは、チューブの底部に予め負荷されたエミッター細胞を保持する閉鎖区画を含む。この区画は、チューブの残部から溶解性金アノード膜によって分離されている。操作時、候補粒子を含む同じものがチューブ内に置かれ、回転させて候補粒子を膜に濃縮させる。次いで、膜を溶解させ、チューブを簡単に回転させ、粒子をエミッター細胞と接触させる。この溶解性膜系は、Langerおよび同僚らによって、Angewantde Chimie International Edition 39.2396-2407, 2000およびNature 397 335-338, 1999に記載されている。
【０１３５】
遠心機プロセスでの工程は、自動化され得、あるいは、ユーザーが全く遠心機を停止させる必要がないように設計され得る。例えば、液体および試料の導入および除去は、Beckman Instrumentsから入手可能な調製用遠心機(例えば、超遠心分離機)の機械的特性を適合させることにより、ローターを停止させる必要なく達成され得る。また、求心力がなお負荷されたまま、光子放出を検出することが望ましいことがあり得る(例えば、エミッター細胞および標的粒子間の接触が遠心分離なしでは不安定な場合)。回転中に試料チューブから放出された光子を検出するため、PMTは、ローター軸に対して放射状の位置に配置され得る。ほとんどの場合、この配置のPMTは、試料チューブとともに回転させる必要はなく、代わりに固定され得、単に、試料チューブがPMTの前面を通過したときに光子の放出を記録する。放出シグナルが非常に弱い場合、次いで、検出器(例えば、PMT、CCDチップ)をローターに連結し、試料チューブとともに回転させ得る。あるいは、放出を検出するために多数のPMrをローターの周囲に沿って整列させ得る。
【０１３６】
多数の試料を同じローターで回転させる場合、PMTの位置決めまたはシグナル処理は、必要により変更され得る。１つの態様において、ローターは、各々同じ波長で放出する細胞を含有する4つの試料チューブを収容できる。１つの試料から生じる放出を別のものからの放出と区別するため、単一の放射状に整列されたPMTが、放出を連続的に検出し得る。次いで、連続的な放出データを、各試料の位置を長期にわたってモニターするローターからのタイミングトレース(timing trace) を用いて分割(resolve)し、各試料に対して放出を割り当てた。他の変形は、本発明内であることが理解される。
【０１３７】
例えば、図17は、チューブの下方に整列された２つのPMTを有するローターに連結させた２つの反応チューブの概略図である。静止位置には、ローターが、ローター位置エンコーダを用いて、対応するPMTの下方に各チューブを配置する。別の例において、図18に示すシステムを得るため、図17に示す遠心機システムが空気試料収集装置と一体化され得る。放射状のエーロゾルインパクター(impactor)チューブは、米国特許第5,932,795号およびそこに挙げられた文献に記載のものなどの任意の型の粒子モニターを含み得る。さらに別の例において、図18に記載のシステムは、図19に示すように、ローター軸に対して放射状に整列された１つだけのPMTが必要とされるように改変され得る。上記のように、PMTによって記録された放出が、シャフトエンコーダを用いて各試料チューブに対して分割され得る。
【０１３８】
また図17に関して、限定されないが、特異的な病原体を認識するように操作されたB細胞の懸濁液、バッファー溶液、保存剤、細胞培養培地を含む液体成分が、いくつかの遠心チューブの各々に配置され、別のプロセスであらかじめエーロゾル試料から収集した試料粒子の液体懸濁液と混合され得る。粒子としては、限定されないが、タンパク質、ペプチド、化学物質、ウイルス、植物性および胞子形態の細菌、真菌胞子、花粉粒、原虫、血液または組織由来細胞、ならびに単独または塵などの担体粒子と組み合わされているかのいずれかのその断片)が挙げられ得る。スピンモーターを開始させると、遠心チューブは放射状の位置に振られ、B細胞および／または試料粒子が、粒子の大きさおよび密度に応じた速度で遠心チューブの底部に誘導される。細胞および試料含有液を添加し遠心する正確な順序は、シグナルを最大にする相対沈殿速度に基づいてカスタマイズされ得る。一般に、最大光子出力がB細胞の添加前に適当な時間、これらの試料を回転 (予備回転)させ、回転によりこれらを接触させることにより、B細胞よりゆっくり沈殿する粒子から得られ得ることが期待される。B細胞と同等またはより速い速度の粒子沈殿では、試料およびB細胞成分の混合物の１回の回転で、システムからの最大光子出力が開始される。遠心装置の上流に組み込まれた粒径解析装置(限定されないが、BAWSユニット、および液体粒子解析装置を含む)のデータは、最適操作順を自動的に測定し、適切なコンピュータ制御自動化試料取り扱いを開始するために使用され得る。
【０１３９】
「回転サイクル」が終了し、ローターが、スピンモーターおよびシャフトエンコーダに制御される所定の位置の制御停止にきたら、スウィングアームは、遠心チューブの底部が光電子増倍管の感度のよい表面に提示されるように重力下で回転し、次いで、任意の光シグナルが記録される。この実施の変形型では、単一の光電子増倍管が、ローター/チューブ構成の最大半径に配置され、連続して光電子増倍管の感度のよい表面を通過したとき、各チューブから光子を集めるために使用され得る。個々のチューブから測定される光子出力は、シャフトエンコードシステムのモニタリングに基づいて割り当てられ、合わされ得る。
【０１４０】
また図18に関して、エーロゾル粒子の収集のプロセスは、エーロゾル粒子をB細胞と接触させるプロセスと統合される。ここで、遠心チューブは、回転しながら放射状のインパクターチューブの末端を覆うのを可能にするスウィングアームに取り付けられ、エーロゾル試料は、回転している放射状のインパクターチューブ内の空気に対して作用する遠心力によって試料供給口内に流入させる(必要により、さらなる送風ユニットによって補助され得る)。高速度の流動は、エーロゾル粒子を遠心チューブの内面またはチューブに含まれた液体の表面に衝突させ、それぞれ、チューブの表面ならびに液体中での粒子の捕捉をもたらす。液体が存在する場合、液体に作用する遠心圧力は、液体中での粒子捕捉に必要とされる高速空気流れによって与えられる力を均衡させ、衝突空気によって吹き飛ばされるのを回避する。エーロゾル粒子は、チューブ表面または液体との衝突後、保持され、液体収集の場合は、放射状に外側に流動され、それにより最大半径(遠心チューブの底部)での局所粒子濃度の増加が提供される。B細胞の添加および収集段階後にこれを局所的に濃縮された粒子ゾーン内に回転させることは、光子出力を開始させる。あるいは、B細胞は、単一の光電子増倍管で回転させながら、リアルタイムでモニターされる収集および光出力中に液体中に存在し得る(図19)。この実施の変形型では、液体成分 (限定されないが、別のバイオエーロゾル収集装置によって収集された粒子試料、および操作されたB細胞の懸濁液を含む)は、供給口(１または複数)に添加され得、これをチューブに配するために遠心力が使用され得る。
【０１４１】
「回転サイクル」が終了し、ローターが、スピンモーターおよびシャフトエンコーダに制御される所定の位置の制御停止にきたら、スウィングアームは、遠心チューブの底部が光電子増倍管の感度のよい表面に提示されるように重力下で回転し、次いで、任意の光シグナルが記録される。この実施の変形型では、単一の光電子増倍管が、ローター/チューブ構成の最大半径に配置され、連続して光電子増倍管の感度のよい表面を通過したとき、各チューブから光子を集めるために使用され得る。個々のチューブから測定される光子出力は、シャフトエンコードシステムのモニタリングに基づいて割り当てられ、合わされ得る。
【０１４２】
図7は、逐次遠心分離の結果の概略図である。エミッター細胞より小さいが、エミッター細胞と同じ密度を有する標的粒子では、まず、候補粒子(例えば、高速で)を回転させてペレット化することが有益である。その後、エミッター細胞を、必要に応じてその応答性の低下を抑制するために軽度にし得る条件下で添加し、回転させ得る(上段)。また、この遠心分離シーケンスは、ほとんどすべての候補粒子およびエミッター細胞を、遠心チューブの底部に相対的に小容量に押しつける。対照的に、候補粒子およびエミッター細胞を一緒に混合し、一度に回転させることは、粒子およびエミッター細胞間の接触よりむしろ分離をもたらす(中段)。もちろん、全く回転させないことは、反応中の粒子およびエミッター細胞の有効濃度を劇的に低下させる (下段)。
【０１４３】
図8は、実際の実験での図7で提案された結果の確認を示す折れ線グラフを含む。図7に示す３つの方法で、野兎病菌に特異的なエミッター細胞を野兎病死菌細胞と混合した。折れ線グラフに見られるように、逐次回転方法は、接触後、高速で効率的な放出をもたらした。対照的に、１回の回転方法の放出プロフィールは、時期および大きさの両方においてはるかに明白さが低かった。非回転方法はわずかに反応を示した。
【０１４４】
図8に示す折れ線グラフにまとめるように、同様の放出プロフィールが別の実験でもたらされた。放出跡の検査は、１回の回転方法が2回回転方法より少し速い標的特異的な放出をもたらすこと示した。しかしながら、この結果は、主に、2回回転方法に必要とされるより長い回転の結果であり、B細胞の応答時間における実際の改善を反映しないことがわかった。実際、2回回転方法の最初の傾きは、１回の回転方法よりも有意に大きく、2回回転方法が強いエミッター応答をもたらすことを示した。
【０１４５】
図8に示す検出システムの感度を、遠心チューブ内に堆積された野兎病細胞の数を滴定することによって評価した。結果を図10に示す折れ線グラフにまとめる。25,000のエミッター細胞が、約5,300の野兎病標的粒子に応答してバックグラウンドより上の検出可能な光子を放出することができたようである。反応条件のさらなる最適化は感度を増大させることが期待される。
【０１４６】
細胞応答は、１回の凍結解凍サイクル後に改善される(図22参照)。この実験では、ペスト菌(YP) に特異的な細胞を遠心分離し、凍結培地(10%DMSOおよびさらに10%FBSを有するRPMI)に再懸濁し、-80℃で凍結させ、液体窒素に移した。細胞を37℃で解凍し、1 ml(2 x 106)の細胞を4 mlのRPMI中で希釈し、一晩37℃でインキュベートした。翌日、細胞を2時間セレンテラジン(coelenterazine)に入れ、CO2非依存培地 (CO2-I) 中で洗浄し、24時間回収した。10,000細胞を5 x 105 YP (107/mlで50 ulのYP) で刺激した。未処理細胞は、１秒あたり9500光子の応答を示したが、凍結解凍細胞は、YPに応答しておよそ6倍多くの光子を放出した。この刺激効果は、実際に凍結させることなく細胞を凍結培地に曝露することにより大きく複製され得る (5倍刺激)。凍結培地中の刺激因子は、DMSOであるようである。細胞を2%DMSO (10%DMSOを含有する凍結培地中の細胞1 mlを4 mlの通常培地で希釈した場合のDMSOの最終濃度)で処理した場合、同様のレベルの刺激が検出された。DMSO効果は、いくつかの因子のためであり得る。DMSOは、造血細胞分化を行なうことが知られており、この経路を介して細胞を刺激しているものであり得る。また、グリセロールを含有する培地中で凍結させた細胞もまた、同様のレベルの刺激を示す。したがって、この効果はまた、一部、DMSOによって誘導されるストレス応答のためであり得、「熱ショック」応答を刺激するいくつかの条件のいずれかを用いてこの刺激を複製することが可能であり得るようである。
【０１４７】
細胞は、セレンテラジンを含む状態で凍結させて貯蔵され得る。細胞にセレンテラジンを入れ、24時間回収し、次いで凍結させた。解凍時、細胞を10 mlのCO2-I培地により洗浄し、細胞を5 x 105細胞/mlの濃度までCO2I培地に再懸濁した。これらの細胞は、YPを検出することができた (この場合では、解凍約1時間後、しかし、より短時間もあり得る)。これらの細胞は、RTで貯蔵した場合、まだ数日間薬剤を検出することができた。セレンテラジンを入れ、凍結する前のDMSOでのこれらの細胞の前処理は、解凍後の薬剤に対する細胞の感受性を増加させ得る。
【０１４８】
図22では、種々の細胞処理後、CO2-I中で希釈した50 ulの10,000,000 YP/mlで細胞を刺激した。未処理細胞をRPMI中で成長させ、セレンテラジンを入れ、洗浄し、24時間回収し、YPで刺激した。凍結/解凍細胞をRPMI中で成長させ、凍結培地に移し、凍結させた。解凍細胞 (1 ml)を4 mlのRPMI中に配置し、37℃で24時間インキュベートし、セレンテラジンを入れ、洗浄し、24時間回収し、刺激した。凍結培地細胞をRPMI中で成長させ、凍結培地に移し、RTで10分間インキュベートした。細胞 (1 ml)を4 mlのRPMI中に配置し、37℃で24時間インキュベートし、セレンテラジンを入れ、洗浄し、24時間回収し、刺激した。2%DMSO細胞をRPMI中で成長させ、2%DMSOを含有するRPMIに移し、37℃で24時間インキュベートし、セレンテラジンを入れ、洗浄し、24時間回収し、刺激した。
【０１４９】
成功した生物兵器検出システムは、戦場に存在する一般的な環境物質による汚染に抵抗性であるべきである。環境ストレスまたは汚染下でエミッター細胞が機能し得るかを評価するため、１時間の充分な強度のディーゼル排気へのエミッター細胞の曝露後(図11の左折れ線グラフ)、またはエミッター細胞を107の大腸菌で汚染したとき(図11の右折れ線グラフ)、エミッター細胞を標的粒子と混合し、これを、任意の実地の細菌の代理汚染物として使用した。図11に示されるように、試験した特定の化学的および生物学的汚染物質は、標的粒子に応答して光子を発するエミッター細胞の能力に影響を与えなかった。
【０１５０】
図13〜14は、遠心分離を必要としない本発明の異なる態様を示す。図13の概略図は、この態様の種々の成分を示す。生物学的エーロゾル警告センサー(BAWS)は、例えば、所定の粒径範囲内の粒子の存在を検出する。BAWSの一例がPrimmerman, Lincoln Laboratory Journal 12 3-32, 2000に記載されている。規格を満たす粒子が検出されると、BAWSが、特定の粒径範囲の粒子が回収され、図14に異なる図で示す第１ステーションの検体テープの一部上のウェル (反応チャンバ)に堆積されるのを可能にする空気対空気濃縮器 (米国特許第5,932,795号に記載の検体収集装置)を始動させる。候補粒子がウェルに堆積された後、テープが、エミッター細胞の貯蔵部の下部でPMTの上部の第２ステーションに進行する。標的粒子の特定の抗原に特異的なエミッター細胞がウェルに堆積され、ウェルからの光子放出がモニターされる。
【０１５１】
候補粒子がBAWSによって検出される時間中、候補粒子は、テープが第１ステーションを進行するにつれて、連続的なウェルに堆積され得る(図14)。第２ステーションでは、各々が異なる標的特異性を有するエミッター細胞を含有する複数のエミッター細胞貯蔵部が特定の貯蔵部を位置に回転させて異なるエミッター細胞をウェルに堆積させるターレット上に配置されている。このようにして、図14のウェルの概略的な上面図に示すように、候補粒子内の異なる標的が検出され得る。もちろん、異なるエミッター細胞が異なる波長で放出する場合、第２ステーションの下方のPMTが異なる波長の光子を区別できるのであれば、異なるエミッター細胞を、候補粒子を含有する単一のウェルに堆積することが可能である。
【０１５２】
図16は、本発明のシステムのまた別の態様を概略的に示す。この態様では、空気粒子が、第１ステーションの一列の二次元アレイ (例えば、6列および数百段を有するテープ)内の６つのウェルの各々に堆積される。アレイが１列進行すると、第２ステーション内の列の位置が決められ、異なるエミッター細胞がその列内の各ウェルに堆積され、第２ステーションの下のPMTの列によって６つのすべての反応からの放出が同時に検出される。テープ上のウェルへの粒子の接着を補助するため、ウェルを接着剤または液体でコーティングし得る。
【０１５３】
細胞操作およびアッセイ方法の例
A 細胞操作方法
M12g3R細胞を、10%ウシ胎児血清、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、100μM非必須アミノ酸、50μM 2-メルカプトエタノール、50μg/mlストレプトマイシン、および5OU/ml ペニシリン、250 ng/ml アンフォテリシンB (Life Technologies)を補ったRPMI 1640中で、5%CO2の加湿雰囲気内で37℃で維持した。エレクトロポレーション(270V, 950μF)によりpCMV AEQ IRES NEOで細胞をトランスフェクトし、1 mg/ml G418中で２週間選択した。G418耐性クローンを抗IgMへの応答についてスクリーニングした。表面IgMの架橋時、光子放出の最大増加を有するクローンを特定の病原体に特異的なB細胞株を作製するための次のトランスフェクションに使用した。操作された特異性を有する抗体の表面発現は、軽鎖および重鎖のための発現ベクター、ならびにプロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子をコードするものとのコトランスフェクション(エレクトロポレーションにより)によって達成される。プロマイシン耐性プールおよびクローンを、抗原に対するその応答に基づいて選択した。軽鎖発現ベクターVKExpressは、ヒト伸長因子-lα(EF-lα)プロモーターの制御下のマルチクローニング部位 (MCS)の下流にヒトκ遺伝子の定常領域を含む。重鎖ベクターはpDisplay (Invitrogen)を修飾し、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびリーダー配列を保持するが、血小板由来増殖因子 (PDGF)レセプター膜貫通ドメインをマウスIgMの膜結合定常領域の遺伝子で置き換え、MCSの両側の両方のタグを除去することにより作製した。PCRを用いて適切な制限部位を抗体可変領域に付加し、発現構築物へのクローニング前に、すべてのPCR産物の配列を確認する。組換え抗体を作製するために使用する可変領域を、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写(RT)およびPCRを用いて、cDNAまたはハイブリドーマのいずれかからクローン化した。製造業者の推奨に従ってTrizol試薬(Life Technologies)を用いてRNAを抽出し、Retroscriptキット(Ambion)を用いて第１鎖合成を行なった。5'末端で軽鎖または重鎖 [S T Jones および M. M Bendig, Bio/Technology 9, 88 (1991)] のいずれかのリーダー配列および3'末端でマウスκまたはIgG2の定常領域にアニーリングするために設計されたプライマーの組を用いてPCRを行なった。
【０１５４】
B  FMDVに対する生物発光B細胞応答:
pCMV AEQ IRES NEOプラスミドおよびFMDVのA12株を認識する組換え抗体用の発現ベクターで安定してトランスフェクトしたM12g3R B細胞株を、以下のようにして発光(luminescence)アッセイのために調製した。細胞を第１日目に解凍した。解凍24時間後細胞の調製は、最大活性および信頼性に必須である。凍結/解凍工程は、100倍もB細胞の応答を増加させる。第2日目、50μM セレンテラジン (Molecular Probes, Eugene, Oreg.)を有するアッセイ培地 [CO2非依存培地、10%FBS、50μg/ml ストレプトマイシン、および50U/mil ペニシリン、250 ng/ml アンフォテリシンB (Life Technologies)]中で、106細胞を室温で2時間インキュベートし、ホイルで覆い、2回洗浄し、5 x105細胞/mlの最終濃度でアッセイ培地に再懸濁した。1 5 ml ミクロ遠心チューブ内で細胞を一晩室温で回転させ、15〜20時間後にアッセイした。アッセイでは、25μlの細胞を抗原(1 4 x 108 pfu/mlのwt A12pRMC35株5μl、7 5 x 107 pfu/mlのA12 バリアントB2PD 3  10μl)と混合し、照度計 (Lumat LB 9507, Perkin Elmer)で応答を測定した。
【０１５５】
C  細菌および大きなウイルスを用いた生物発光アッセイ
センサー素子および方法は、細菌ならびにウイルス病原体の迅速な検出に使用され得る。細菌、野兎病菌、野兎病の病因因子に応答するように細胞株を操作した。しかしながら、FMDおよびVEEウイルスと同じプロトコルを用いてアッセイした場合、シグナルは低速で、バックグラウンドとほとんど区別不可能であり、B細胞および抗原間の低い相互作用割合を示す (0秒予備回転/0秒回転)。抗原系擬似物を用いて行なった先の実験は、感度および速度が、抗原およびB細胞の濃度によって増大され得ることを示し(データ示さず)、そのため、照度計を光電子増倍管チューブ(PMT)の上部に配置される遠心機を含むように再構成した。薬剤および細胞が一緒に混合されると、次いで、5秒間の遠心分離によって濃縮され、シグナルが改善され、応答が速くなる(0秒予備回転/5秒回転)。細胞の添加前に、ゆっくり沈殿する野兎病菌を遠心分離した場合に、最適な結果が観察される (60秒予備回転/5秒回転)。この構成は、多数の細胞が短時間枠内で抗原と物理的に接触することを確実にし、それにより、感度および速度の大きな改善が提供される。アッセイプロトコルのさらなる最適化後、本発明者らは、現在、わずか60のコロニー形成単位(cfu)の野兎病菌を、薬剤の予備回転にかかる時間を含み3分未満で検出できるが、ペストを引き起こす細菌である不活性化されたペスト菌に対する応答は見られない。この検出限界は、不活性化された野兎病菌の２つの他の供給源および異なる１つの株を用いて確認した(データ示さず)。さらにまた、センサー素子は、広範囲の感度を示し、７桁以上わたる範囲の濃度を検出する。
【０１５６】
B細胞は、上記のようにして作製した。表示された量のペスト菌または野兎病菌を含有する50μlを、6500 x gで60秒間遠心し、次いで、20μlの細胞を添加し、遠心機照度計内でさらに５秒間回転させた。光子をHamamatsu HC-125光電子増倍管で検出し、シグナルをStanford Research Systems SR400 Gated Photon Counterでモニターした。
【０１５７】
核酸検出の例
ジゴキシゲニン抗体を発現するエミッター細胞の特性付け
ジゴキシゲニンに対する抗体(Daugherty et al (1998) Protein Engineering 11 (9) 825-832)をコードするプラスミドをエミッター細胞内に導入し、ジゴキシゲニンに化学的にコンジュゲートしたタンパク質(BSA)(Dig-BSA) を用いてこれらの細胞をスクリーニングした。12の独立したプールを選択し、12〜24の独立した細胞株を得た。第１実験では、これらの細胞が、DNAによって架橋されたジゴキシゲニン抗原(Dig-DNA)を検出し得るがどうかを試験した。３つの型の市販のDig-DNAをDig抗体発現CANARY細胞との反応性について(図26A〜C)、プラスミドDNAを、20塩基対毎に結合させたジゴキシゲニンとの反応性について (図26A)、DNA分子量マーカーを、200塩基毎に結合させたジゴキシゲニンとの反応性について (図26B)、およびDNA分子量マーカーを、各末端に結合させた１つのジゴキシゲニンとの反応性について(図26C) 試験した。これらの標準品の各々は、種々の程度にエミッター細胞を刺激し、最も感度のよい応答は、Dig標識プラスミドDNAに対するものであった。平均20塩基間隔を空けた抗原が、200塩基間隔を空けた抗原より100倍多く(ジゴキシゲニンあたりベースであって、DNA１マイクログラムあたりベースではない)細胞を刺激するという事実は、200塩基は理想的な応答を刺激するのに間隔が大きすぎることの現れである。カルシウム放出およびエクオリン発光をもたらす細胞内カスケードを刺激するため、隣接抗体は、細胞内の反応を開始させるために互いに充分近くに固定されていなければならない。
【０１５８】
また、従来のCANARYを用いる可溶性抗原および不溶性抗原の両方の検出における通常作業である光出力の測定直前の遠心分離は、実際は、可溶性Dig-DNA抗原に対するCANARYの感度を減少させ得ることに注意されたい。示した実験では(図27Aおよび27B)、DNA溶液を介する細胞の遠心分離は、検出限界をほぼ10倍減少させるようである。この結果は、DNAの検出および他の沈殿しない抗原の検出の差を反映し得る。
【０１５９】
エミッター細胞を用いるハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドプローブの検出
このアッセイは、標的DNAへのジゴキシゲニン標識(Dig標識)プローブのハイブリダイゼーションを検出するために設計された。これらの実験のための標的DNA は、ファージミドpBluescript II由来であった。この3100塩基対の長さの環状ファージミドは、二本鎖DNA(dsDNA)またはDNAの２つの単鎖のいずれか (ssDNA)を作製するように誘導され得る。これらの２つのssDNA鎖を(+)鎖または(-)鎖とよぶ。(+)鎖に特異的に結合する10のDig標識オリゴヌクレオチドプローブを設計した。
0005523673.tif 000007
pBluescriptファージミドDNAに沿った位置の順に、オリゴヌクレオチドに番号をつける。各々について、オリゴヌクレオチドのDNA配列、配列のファージミド上の位置、およびオリゴヌクレオチドの融解温度 (Tm)(結合親和性の近似)を示す。これらのオリゴヌクレオチドのTmの小さい範囲はそれらの各々が同様の結合特性を有することを示す。
【０１６０】
これらのオリゴヌクレオチドの各々は、第１残基に結合されたジゴキシゲニン(Dig)分子を有し、各々は、同様の計算融解温度(Tm)によって反映される類似の標的DNA結合特性を有する。標的DNAの(+)鎖へのこの10のジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドの一組のハイブリダイゼーションにより、20塩基毎に１個のDig分子を有する200塩基の長さの二本鎖DNAが生じる。プラスミドの残りの2900塩基は単鎖のままである。この固定化されたジゴキシゲニン抗原の集団(collection)は、ジゴキシゲニン抗体をエミッター細胞の表面に架橋させ、発光を刺激する。
【０１６１】
11番目のオリゴヌクレオチド (NEG 3)は対照である。NEG 3は、オリゴヌクレオチド番号3に直接結合させるために設計され、各末端に単一のDigを有する20ヌクレオチド長の小片dsDNAを作製した。ジゴキシゲニン抗体を発現するエミッター細胞は、80 フェムトモルの投入オリゴヌクレオチドを検出することができた(図28)。この対照は、選択したハイブリダイゼーション条件が、このTm範囲内で２つのオリゴヌクレオチドの結合を支持するのに少なくとも充分であることを示した。より重要なことに、この対照は、相補DNAの20塩基間の結合は、抗体を架橋し、エミッター細胞からシグナルを誘発するために充分強いことを示した。
【０１６２】
オリゴヌクレオチド-オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションは、きわめて急速に起こる (図29)。オリゴヌクレオチドNEG3をハイブリダイゼーション溶液に添加した後、Oligo3を添加した。溶液を培地で直ちに希釈し、エミッター細胞を添加し、反応物を照度計に配置した (オリゴ3の添加からの経過時間は15秒間であった)。この短縮されたハイブリダイゼーションプロトコルは、アッセイの感度に劇的に影響しなかった(図29を図28と比較)。
【０１６３】
次に、多数のDig標識オリゴヌクレオチドを単鎖DNA標的にハイブリダイズした。 この複合体をエミッター細胞を刺激する能力について試験した。図30は、所定量のssDNAへのDig-オリゴヌクレオチドプローブ組の異なる濃度の一連のハイブリダイゼーションを示す。この実験で最良シグナルを与えるssDNAオリゴヌクレオチドプローブの比は1.2〜1 4であった。高濃度のプローブでは、非結合Dig標識オリゴヌクレオチドは、シグナル伝達を阻害するようであった。これらの実験では、0 63 pmolのオリゴヌクレオチドが、試験した条件下の多くで充分作用した。用量反応曲線は、およそ50 ngまたは約50 fmolの単鎖DNAの検出限界を与える(図31)。(-)鎖DNAは、これらの実験のいずれでも検出されなかったことに注意することは重要であり、Dig標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび続くエミッター細胞からのシグナル伝達が標的DNAの配列に依存することを示す。
【０１６４】
温度およびバッファー成分は、標的NAへのDig-オリゴのハイブリダイゼーションに影響する。PBS (図32A)またはTBS (図32B)のいずれかにおける47℃〜51℃でのハイブリダイゼーションは、最も高い応答を与えた。より高温またはより低温で行なわれるハイブリダイゼーションは、シグナルの振幅を減少させる。バッファー成分の変化は、理想的なハイブリダイゼーション温度に明白に影響する。
【０１６５】
標的DNA捕捉
ビオチン標識オリゴヌクレオチドを、ストレプトアビジンコーティング磁気および非磁気ビーズの表面に結合させた。 これらの「捕捉」オリゴは、Dig標識オリゴヌクレオチドの位置から充分離れた位置の標的DNAに結合するように設計される。沈降し得る支持体への標的NAの結合は、エミッター細胞の添加前のDNAのより徹底的な洗浄を可能にし、アッセイの感度を改善する。標的NAの沈降のための１つのストラテジーを図33に示す。このスキームでは、ビオチン標識捕捉オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンコーティングポリスチレンまたは磁気ビーズのいずれかに結合される。ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズさせ、遠心分離または磁場の適用によって複合体を沈降させる。次いで、エミッター細胞を再懸濁し、ビーズで沈降させ、反応チューブを照度計内に配置する。標的DNAの検出に対する沈降の効果を図34に示す。この場合、LODは、DNAを沈降させない典型的な結果と比べて、高いアトモル範囲まで改善される。市販のブロッキング試薬(Roche Applied Science Cat # 1 096 176)の添加は、さらにシグナルを改善する。図35は、ハイブリダイゼーション/捕捉工程中での異なる濃度のブロッキング剤の添加の結果を示す。この実験では、1%〜10%のブロッキング試薬の添加により、試験した標的のすべての濃度で、バックグラウンドに対するシグナルの比が改善された。
【０１６６】
Fcレセプターエミッター細胞
Fcレセプターは、抗体または免疫複合体に結合する一群の膜発現タンパク質である。これらは、単球およびマクロファージを含むいくつかの造血細胞上に発現される。FcγI型レセプター (FcγRI) を含む、Fcレセプターのいくつかのサブクラスが存在し、可溶性抗体 FcγRIの高親和性結合体は、免疫グロブリンG (IgG)の定常領域 (Fc部分)に結合し、抗体の抗原結合領域を空いたままにする。特異的抗原による抗体結合レセプターの架橋は、カルシウム放出を刺激するシグナル伝達経路を開始させる。
【０１６７】
ヒトマクロファージ細胞株U937は、内因性FCγRlを含む。図36Aに見られるように、IFNγでのこれらの細胞の処理は、FcγRIの発現を増加させる。エクオリン発現プラスミドでトランスフェクトしたU937細胞は、機能性エクオリンを産生し、これは、これらの細胞カルシウムイオノフォアイオノマイシンで処理することにより示される。図36Bに見られるように、これにより、エクオリンの発光を刺激する急速で一過性のカルシウムの上昇が引き起こされる。次いで、エクオリンがFcレセプターの架橋によって開始されるカルシウム上昇によって刺激されるかどうかを調べるために、U937細胞を試験した。U937細胞をヒトIgGとともに15分間室温でインキュベートした。細胞を洗浄して非結合IgGを除去し、ヤギ抗ヒトIgGで処理した。図36Cに示されるように、カルシウムの急速な上昇が観察された。
【０１６８】
実験は、U937細胞は、いくつかの異なる病原体または擬似物に対して応答するように急速に「操作され」得ることを示した。U937細胞をIFN (200 ng/ml)で24時間処理し、内因性FcγRIの発現を増加させ、エミッター細胞アッセイのために調製した。細胞を以下の抗体: マウス抗炭疽菌胞子 (図37A)、ウサギポリクローナル抗炭疽菌胞子 (図37B)、マウス抗野兎病菌(図37C)、またはマウス抗枯草菌(図37D)とともにインキュベートした。次いで、細胞を、モノクローナル抗体を有するわずか1000 cfuの炭疽菌胞子、ウサギポリクローナルを有する10,000 cfuの胞子、ならびに10,000 cfuの野兎病菌および1,000 cfuの枯草菌胞子が検出される標準アッセイに使用した。
【０１６９】
次の組の実験は、アッセイの特異性が、使用する抗体によって決定されることを示した。U937細胞をマウス抗野兎病菌抗体とともにインキュベートし、105 cfuの炭疽菌胞子に対する応答について試験した。図38Aに示されるように、細胞は、炭疽菌に応答しなかったが、106 cfuの野兎病菌には応答した。あるいは、図38Bに示されるように、マウス抗炭疽菌胞子抗体を有する細胞は、野兎病菌に応答しなかったが、106 cfuの炭疽菌胞子には応答した。さらにまた、図38Cに見られるように、細胞は、抗野兎病菌 抗体の非存在下で、106 cfuの野兎病菌に対する応答を示さなかった。
【０１７０】
16チャネルセンサーの例
多数の試料を測定する時間を縮小する(が、ハードウェア要件は最小限に維持される)新しいアプローチは、うまく試験された。単一の集光チャネルを用いて16個の試料の同時測定を可能にする実験的センサーを設計した。センサーは、その周囲に均等に分布され、垂直軸周囲の可変速度モーターによって駆動される16個の1 5-mlチューブを水平を保持するローターからなる(図39)。単一の固定光子検出器(この場合、PMT)を回転中のチューブの経路を少し越えた(just beyond)ローターの平面に配置する。このようにして、チューブの各々を順次および反復的にPMTに接近させ、各通過時のその光出力のサンプリングを可能にする。最後に、光源(赤外LED)および検出器(光トランジスタ)からなる光学的スイッチを用いて検出された光子のカウントおよび各々特定の試料と関連する16個の領域内へのデータの再編成を制御する。
【０１７１】
単一の測定は、
1  個々の1 5-mlチューブ内での16個の試料 (および／または対照)の調製、
2  各チューブ内へのエミッター細胞のアリコートの導入;
3  暗色ボックス内に配置したローター内へのチューブの設置、
4  高RCF(約2000 g)で短時間(5秒間)遠心回転を用いたチューブ底部へのエミッター細胞の局在化、
5  各チューブが１秒ごとに１回サンプリングされる測定期間中 (1〜2分間)での60 rpmへのローター速度の減速、、および
6  評価のためのコンピュータアルゴリズムへの表示および／または入力のための各試料についての時系列の光子数の作成
からなる。
【０１７２】
図40に見られる16-チャネル測定のデータの一例は、単一チューブの方法のLODに匹敵するLODを示す。この16 チャネルセンサーは、設計された通りの16個の試料を測定し、物理的な大きさおよびサンプリングの統計学が、実際の限界を決定するが、チャネルの数を増加させることによって、より多くの試料数が可能である。同様に、センサーに載せる試料を減少させるか、またはセンサー上のチャネルの数を減少させるかのいずれかによって、より少ない試料数が可能である。16-チャネル携帯用センサー設計のCAD図を図41に示す。
【０１７３】
この16-チャネル設計のさらなる実施をTCANセンサーという。TCAN (Triggered-CANARY)バイオセンサーは、エーロゾル収集およびB細胞液送達の両方を合わせて一体化された放射状のディスク型式とする自動化バイオセンサーである。TCAN CANARYディスク(CD) (図42)は、空気流を別々のチャネルに分割するマニホールドアセンブリと連動する。エーロゾル収集アセンブリ(図43)は、乾式圧入(impaction)技術を使用し、次いで、空気流からの粒子を透明なプラスチックチューブの底部に局在させる。
【０１７４】
エーロゾル粒子の圧入後、CDはマニホールドアセンブリと連動し、ディスクに配置されたバルブを作動させる。ディスクを急速に回転させ、これが、遠心力を用いた個々のチューブへのエミッター細胞液の送達を引き起こす (図44)。次いで、光学的検出器を用い、エーロゾル粒子と相互作用する光子出力エミッター細胞に基づいて、潜在的病原体を同定する。エーロゾル収集およびエミッター細胞送達のこのプロセスは、１つのディスクで数回繰返すことができる。この特徴により、CDを変えることなく、いくつかの誘発事象後に、多数のCANARYアッセイを行なうことが可能になる。
【０１７５】
毒素検出の例
可溶性タンパク質の検出は、種々の方法を用いて達成され得る。例えば、１つの方法では、同じエミッター細胞で２種類の抗体を発現させ得、ここで、２種類の抗体は、各々、同じ分子の異なるエピトープに対するものである。次いで、単量体抗原によって抗体を架橋する (図48)。分泌経路における抗体の分類が図48の概略図において理想化されていることが指摘されるべきである。一例では、抗体はヘテロ機能性であり得る、すなわち、１つの抗体が２つの異なる機能性抗原結合部位を有し得る。別の例において、各抗体は１つだけの機能性抗原結合部位を有する。この方法は、２つの因子(1) 多数の機能性抗体が同じエミッター細胞によって発現されること、および (2) ２種類の関連するエピトープがエミッター細胞を刺激するのに充分である(ある細胞を刺激するために、これらの対の１つより多くが必要とされ得るが)ことに依存する。
【０１７６】
１つの実験において、多数の機能性抗体が同じエミッター細胞株で発現された(図49)。炭疽菌およびペスト菌に対する抗体を発現する単一の細胞株を作製した。このクローン細胞株は、良好な感度で両方の抗原に対して反応する。同じ可溶性単量体上の２種類のエピトープに対する２種類の抗体はまた、機能的に発現され得ることが理解される。さらにまた、２種類の関連するエピトープは、エミッター細胞を刺激するために充分である。
【０１７７】
可溶性の単量体抗原を検出するための第２方法は、可溶性抗原を架橋してエミッター細胞に対して多価で出現させることである(図50)。この架橋は、ボツリヌス毒素Hc断片で示されているように、組換えタンパク質の場合はタグ、または抗体のいずれかによってタンパク質をビーズに結合させることによって行なわれ得る。当業者によって理解されるように、トリクロロ酢酸(TCA)、熱またはエタノールでの抗原の沈殿、およびリガンド、抗体または化学的官能基による固相への抗原の結合を含む、抗原を効果的に架橋させる種々の他の可能な方法がある。次いで、この架橋された単量体は、架橋された抗原上でなお利用可能なエピトープを認識する抗体を発現するエミッター細胞を用いて検出され得る。
【０１７８】
この第２方法は、実際に、ボツリヌス毒素A型の重鎖 (BoNT/A Hc)を可溶性単量体標的タンパク質(図51)およびPless et al, Infection and Immunity (2001) 570-574に記載の抗体を用いて実証された。１つのエピトープに対するモノクローナル抗体(6E10-10)は、タンパク質Gコーティングビーズに架橋された。これらのビーズをBoNT/A Hcとともに3時間 4℃でインキュベートし、洗浄し、異なるBoNT/A Hc エピトープを認識する第２抗体 (6B2-2)を発現するエミッター細胞を刺激するために使用した。BoNT/A Hcが施されたビーズは、約6 ngのLODでエミッター細胞を効果的に刺激した。BoNT/Aをビーズに結合させるために使用したものと同じ抗体を発現するエミッター細胞は刺激されず、エミッター反応が標的タンパク質の凝集によって引き起こされなかったことを示す。
【０１７９】
化学物質検出の例
化学物質検出は、軍事状況および臨床状況の両方において重要である。いくつかの化学物質は、抗体が独立して結合し得る２つのエピトープを有し得ることがあり得る。かかる場合において、化学物質検出の方法は、上記に概略を述べた毒素検出のものと同一であり得る。しかしながら、多くの場合、目的の化学物質に２つの独立したエピトープはない。かかる場合では、エミッター細胞を刺激できるように化学物質を修飾することが必要である。これらの修飾の４つを以下に概説する。
【０１８０】
1.  固相支持体に目的の化学物質を固定化する。利用可能で残存する化学物質部分を認識する抗体を発現するエミッター細胞を作製する。固相支持体に固定化された化学物質の密度が充分高い場合、エミッター細胞表面上の抗体は、細胞を刺激するのに互いに充分接近して固定化される。これは、図50に示す毒素検出のスキームと同様である。
【０１８１】
2  まず、化学物質に特異的に結合するペプチドを作製する。次に、化学物質-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体を作製する。化学物質-ペプチド複合体が2つ以上のエピトープで構成される場合、複合体は、毒素検出のセクションで概略を述べた２抗体技術のいずれかによって検出され得る。複合体が１つの特異的エピトープのみで構成される場合、ジゴキシゲニンなどのさらなるエピトープをペプチドに合成的に付加し得る (図52)。これで、複合体は、２つの抗体結合部位 (l) ペプチド-化学物質複合体によって形成されたエピトープおよび(2)ジゴキシゲニンエピトープを含み得る。化学物質の存在下でのみ、両方のエピトープが存在し得る。次いで、これらの２つのエピトープは、毒素検出のセクションで概略を述べた２抗体技術いずれかによって検出され得る。
【０１８２】
3  化学物質に特異的に (または化学物質の存在下で互いに)結合する２つのペプチドを作製する。これらのペプチドの各々は、化学物質の存在下でのみ、２つのエピトープが互いに結合し、したがって、エミッター細胞によって検出可能であり得るように合成的にタグ化し得る (図53)。あるいは、ペプチド-化学物質複合体に対する１種類以上の抗体を作製し得、化学物質の存在を、複合体に対する抗体の組合せ、または複合体に対する１種類の抗体およびペプチドタグに対する１種類の抗体を用いて上記のようにして検出し得る。
【０１８３】
4.  上記のようにして、化学物質に特異的に結合するペプチドを作製し、ペプチド-化学物質複合体に特異的に結合する抗体を作製する。二量体が２つの化学物質に結合した場合、２つの抗体結合部位を含むように、化学物質結合ペプチドを二量体化する。この複合体は、化学物質-ペプチド複合体に対する抗体を発現するエミッター細胞によって検出され得る。
【０１８４】
小分子に結合するペプチドをコンビナトリアルライブラリーから単離した。これらの分子としては、ポルフィリン (Nakamura et al, Biosensors and Bioelectronics 2001, 16 1095-1100)、トリプトファン (Sugimoto et al, 1999, 677-678)およびカドミウム(Mejare et al, 1998, Protein Engineering 11(6). 489-494)が挙げられる。しかしながら、ペプチドの代わりのタンパク質の使用は、より高い親和性結合体を生じ得る。結合部位が組み合わせで規定されるライブラリーを構築し、これらを、小分子に結合するものを単離するために使用され得る。出発タンパク質としてリポカリンを用いるかかるライブラリーを、ジゴキシゲニンバリアント (SchlehuberおよびSkerra, 2002, Biophysical Chemistry 96 213-228) への結合剤を単離するために使用した。このアプローチは、任意の数の他のタンパク質から使用され得るが、特に、化学物質標的(例えば、VXおよびサリンの場合は、アセチルコリンエステラーゼ)と、既にある程度の結合活性を有することが期待され得るものである。
【０１８５】
本発明を、その好ましい態様を参照して具体的に示し、記載したが、形態および詳細における種々の変形が、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱せずになされ得ることは、当業者によって理解される。
【０１８６】
本明細書に挙げたすべての参考文献、特許、および特許出願の関連する教示は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】図１は光電子センサー細胞のコンセプトの概略図である。
【図２】図２は疑わしい物質の予備的検知のためのサンプラー（トリガ）を有する光電子センサーの一般的な構造を示す概略図である。
【図３】図３は光電子センサーで用いる細胞株の作製を図解する概略図である。
【図４】図４は統合生物学的エアロゾル警告センサー(BAWS)／光電子センサーシステムの概略図である。
【図５】図５は光電子センサーにおける口蹄疫ウイルスに対するＢ細胞応答を図解する。
【図６】図６は光電子センサーのための乾燥-インパクターモジュールを図解する。
【図７】図７は局在性および混合の効果を図解する概略図である。
【図８】図８はツラレミア細胞を用いた局在性の効果を図解する。
【図９】図９は光電子センサーのための自動化細胞送達モジュールを図解する。
【図１０】図１０は光電子センサーを用いたツラレミア細胞の試料についての用量反応関係を図解する。
【図１１】図１１はＢ細胞の化学的汚染および生物学的汚染に対する耐性を図解する。
【図１２】図１２は光電子センサーのための自動化遠心分離モジュールを図解する。
【図１３】図１３は空気インパクター／光電子センサーを図解する概略図である。
【図１４】図１４は光電子センサーを図解する概略図である。
【図１５】図１５は光電子センサーのための光学-光電子増倍管(PMT)モジュールを図解する。
【図１６】図１６は空気インパクター／光電子センサーを図解する概略図である。
【図１７】図１７は光電子センサーにおけるマルチチャンネル遠心分離を図解する概略図である。
【図１８】図１８は光電子センサーにおける湿式遠心分離／インパクターコンセプトを図解する概略図である。
【図１９】図１９は光電子センサーにおける湿式遠心分離／インパクターコンセプトを図解する概略図である。
【図２０】図２０は光電子センサーのためのカスタムチューブの概略図である。
【図２１】図２１は統合乾燥-インパクター／光電子センサーを図解する。
【図２２】図２２はペスト菌(Yersenia pestis)特異的Ｂ細胞の応答に対する細胞処置の影響を図解する。
【図２３】図２３はエアロゾル試料を回収するために構成されたインパクターを図解する。
【図２４】図２４は「CANARY」センサーの基礎をなすコンセプトの図式的概観である。Ｂ細胞は細胞内部中のエクオリンおよび細胞表面上の病原体に対する抗体を発現するように改変されている。病原体の存在下、抗体は細胞表面上に「架橋され」（固定され、凝集されて）、細胞内カルシウムの増加をもたらすシグナル伝達カスケードを活性化する。エクオリンは、エクオリン酸化および光放射によってこの細胞内カルシウムの増加に応答する。光子出力はPMTを用いて監視され得る。
【図２５】図２５はDNA検出の概略図である。標的DNA配列に相補的で末端ジゴキシゲニン標識を含むオリゴヌクレオチドを、標的DNAにハイブリダイズする。標的DNAに沿って結合する複数のジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドは、CANARY細胞（エミッター細胞）の表面上のジゴキシゲニン抗体に結合し、光放射を活性化する。
【図２６Ａ】図２６Ａはグラフである。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するCANARY細胞（エミッター細胞）はジゴキシゲニン標識DNAによって活性化され得る。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するエミッター細胞を、50μlの表示濃度のジゴキシゲニン標識DNA標準を含む遠心チューブに添加した。チューブを軽く遠心分離してPMTに一番近いチューブの底に細胞をペレット化し、光子放出を時間の関数として記録した。３つの異なる型のジゴキシゲニン標識DNAを用いて細胞を活性化し、各型は異なる程度の感度で成功した。図２６Ａ：高密度にジゴキシゲニンで標識されたプラスミドDNA（およそ4000塩基対に200ジゴキシゲニン分子が添付される）がおよそ1ng/ml（50pg絶対量）の検出限界で検出された。
【図２６Ｂ】図２６Ｂはグラフである。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するCANARY細胞（エミッター細胞）はジゴキシゲニン標識DNAによって活性化され得る。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するエミッター細胞を、50μlの表示濃度のジゴキシゲニン標識DNA標準を含む遠心チューブに添加した。チューブを軽く遠心分離してPMTに一番近いチューブの底に細胞をペレット化し、光子放出を時間の関数として記録した。３つの異なる型のジゴキシゲニン標識DNAを用いて細胞を活性化し、各型は異なる程度の感度で成功した。図２６Ｂ：わずかにジゴキシゲニンで標識された（200塩基対あたり１回）様々な大きさ（81〜8576塩基対）のDNA分子量標準は、1μg/ml（50ng絶対量）で検出された。
【図２６Ｃ】図２６Ｃはグラフである。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するCANARY細胞（エミッター細胞）はジゴキシゲニン標識DNAによって活性化され得る。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するエミッター細胞を、50μlの表示濃度のジゴキシゲニン標識DNA標準を含む遠心チューブに添加した。チューブを軽く遠心分離してPMTに一番近いチューブの底に細胞をペレット化し、光子放出を時間の関数として記録した。３つの異なる型のジゴキシゲニン標識DNAを用いて細胞を活性化し、各型は異なる程度の感度で成功した。図２６Ｃ：２つのジゴキシゲニンでそれぞれ標識された（DNA分子の各末端に１つのジゴキシゲニン）様々な大きさ（8〜587塩基対）のDNA分子量標準は、100ng/ml（5ng絶対量）で検出された。
【図２７Ａ】図２７Ａはグラフである。細胞の遠心分離は可溶性抗原への検出感度を減少し得る。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するエミッター細胞を、50μlの表示濃度のジゴキシゲニン標識プラスミドDNAを含んだ遠心チューブに添加した。図２７Ａ：チューブを軽く遠心分離してPMTに一番近いチューブの底に細胞をペレット化し、光子放出を時間の関数として記録した。
【図２７Ｂ】図２７Ｂはグラフである。細胞の遠心分離は可溶性抗原への検出感度を減少し得る。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するエミッター細胞を、50μlの表示濃度のジゴキシゲニン標識プラスミドDNAを含んだ遠心チューブに添加した。図２７Ｂ：細胞およびDNAを手動で混合し、遠心分離なしでPMTの上に置いた。
【図２８】図２８はグラフである。２つの相補的なDig標識オリゴヌクレオチド（オリゴ「3」およびオリゴ「NEG 3」）を実験条件下でハイブリダイズさせた。試料を1：10でCO2I培地にて希釈して全容積を100μlとし、20μlの細胞を添加して、光放射を測定した。Dig細胞はDig抗体を発現する一方、対照細胞は発現しない。
【図２９】図２９はグラフである。ジゴキシゲニン標識されたssDNAオリゴヌクレオチドの迅速なハイブリダイゼーション。表示量のオリゴヌクレオチド「NEG3」を8μlのハイブリダイゼーション溶液（50mM NaCl、40mM Tris pH 7.5）に添加した。1μlの「オリゴ3」を添加し、直後に90μlのCO2I培地および20μlのDig CANARY細胞を添加した。チューブを軽くたたいて混合し、素早く照度計に設置し、光出力を監視した。２回目のオリゴヌクレオチドの添加と照度計への設置（x軸で「0」）の間の総計時間はおよそ15秒であった。
【図３０】図３０はグラフである。一本鎖DNAをpBluescriptファージミドから生成し、全10個のDig標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、反応物をCO2Iで100μlに希釈し、20μlのDig細胞を添加し、光放射を測定した。説明文に表示されたモル比は標的ssDNAに対するオリゴヌクレオチドのモル比である。この実験の理想的な比は1 2〜1 4であると思われる。
【図３１】図３１はグラフである。一本鎖DNAの配列特異的な検出。ファージミドpBluescriptの(+)ストランドに相補的な１０個のジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドプローブを、表示量の一本鎖ファージミドDNAにハイブリダイズした。ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するエミッター細胞を添加し、細胞からの光出力を光電子増倍管で監視した。ファージミドの(+)ストランドのみが検出され、鑑定は配列特異的であることを示した。オリゴヌクレオチドプローブがない場合、一本鎖DNAは細胞を活性化しなかった。この実験の検出限界は50ngであった。
【図３２Ａ】図３２Ａは、棒グラフである。ハイブリダイゼーション温度の核酸検出への影響。一本鎖ファージミドDNAを様々の温度で表示濃度のプローブにハイブリダイズし、最大のRLUをプロットした。図３２Ａ：PBS中のハイブリダイゼーションは51℃でのハイブリダイゼーションで最大のシグナルを示すが、47℃および42℃でハイブリダイズされた試料から類似のシグナルを示す。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、棒グラフである。ハイブリダイゼーション温度の核酸検出への影響。一本鎖ファージミドDNAを様々の温度で表示濃度のプローブにハイブリダイズし、最大のRLUをプロットした。図３２Ｂ：42℃でのハイブリダイゼーションは、0 16pモルのオリゴヌクレオチドが0 63pモルのオリゴヌクレオチドとほぼ同じだけ機能するほど、より低濃度のオリゴヌクレオチドプローブを用いた実験からシグナルの増大を見せ、0 04pモルからのシグナルが２倍になった。
【図３３】図３３はDNA沈降の計画の概略図である。捕捉オリゴヌクレオチドを沈降可能な微粒子の表面に添付する。これらのオリゴヌクレオチドはDigオリゴヌクレオチドが結合する領域から離れた領域に結合する。標的NAは捕捉オリゴヌクレオチドに結合し、ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドは標的に結合する。全体の複合体を遠心分離（または磁場）により沈降し、ジゴキシゲニンに対する抗体を発現するエミッター細胞により検出する。
【図３４】図３４はグラフである。標的DNAの沈降は検出感度を改善する。ストレプトアビジンコンジュゲートビーズをビオチン標識捕捉オリゴヌクレオチドと飽和して、過剰のオリゴヌクレオチドを洗浄により除去した。pBluescript ssDNA（+ストランド）を47℃で5分間ビーズと共にインキュベートし、洗浄した。Dig標識検出オリゴヌクレオチドを添加し、47℃で20分間ハイブリダイズして、過剰分を洗浄により除去した。ビーズを200μl CO2Iに再懸濁し、各アッセイに40μlを用いた。
【図３５】図３５は棒グラフである。pBSファージミドssDNAを、ストレプトアビジン被膜ポリスチレンビーズに結合したビオチン標識オリゴヌクレオチドおよびジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドと共に、表示濃度のブロッキング試薬中で47℃にて２０分間インキュベートした。ビーズが結合したジゴキシゲニン標識標的をTBS中（50mM Tris、130mM NaCl）室温で３回洗浄した。ビーズをCO2I培地に再懸濁し、エミッター細胞を添加し、反応物を回転し、光出力を照度計で監視した。
【図３６】図３６Ａ〜Ｃはグラフである。図３６Ａ  U937細胞をIFNγで処理するとFcγ RI発現の増大を示す。IFNγで処理された（200ng/ml、緑の塗りつぶしていない(open)ピーク）または処理されない（紫のベタ塗りの(solid)ピーク）U937細胞上のFcγ RIの相対発現を、免疫蛍光検査で測定した。図３６Ｂ  U937細胞はエクオリン機能タンパク質を発現する。カルシウム感受性発光タンパクエクオリンでトランスフェクトしたU937細胞は、イオノマイシン（50M）で処理すると光を放射する。図３６Ｃ  光は、安定したエクオリン発現を有するU937細胞上のFcレセプターの架橋に続いて検出される。U937細胞を10μg/mlヒトIgGでプレインキュベートし、その後、洗浄し、ヤギ抗ヒトIgG（Fab2’）で処理した。
【図３７】図３７Ａ〜Ｄはグラフである。U937細胞は、様々な異なる病原体または擬似物(simulant)に応答するように遺伝子工学で迅速に作り変えられ得る。U937細胞を24時間IFNγ(200ng/ml)で処理し、内在性FcγRIの発現を増加し、CANARYアッセイのために調製した。その後、細胞を以下の抗体とインキュベートした。図３７Ａ  マウス抗炭疽菌胞子、図３７Ｂ  ウサギポリクローナル抗炭疽菌胞子、図３７Ｃ  マウス抗野兎病菌(F tularensis)、または図３７Ｄ  マウス抗枯草菌(B subtilis)ハイブリドーマ上清。その後、細胞を、モノクローナル抗体でわずか1000cfuの炭疽菌胞子およびウサギポリクローナルで10,000cfuの胞子、ならびに10,000cfuの野兎病菌および1,000cfuの枯草菌胞子を検出した標準CANARYアッセイにおいて用いた。
【図３８】図３８Ａ〜Ｃはグラフである。迅速に遺伝子工学で作り変えられたU937細胞は特異的で、特異性は抗体によって測定される。図３８Ａ  マウス抗野兎病菌抗体と共にインキュベートされたU937細胞は、105cfuの炭疽菌胞子に応答しなかったが、106cfuの野兎病菌に応答した。図３８Ｂ  マウス抗炭疽菌胞子抗体を負荷した細胞は野兎病菌に応答しなかったが、106cfuの炭疽菌胞子に応答した。図３８Ｃ  細胞は、抗野兎病菌抗体がない106cfuの野兎病菌[106 cfu F t (No ab)]に何の応答も示さなかった。
【図３９】図３９は16チャンネルセンサーの図解である。センサーは単独の集光チャンネルを用いた16試料の同時測定を可能にするように設計された。センサーは、ローターの外周に平等分配され、垂直軸周囲の可変速度モーターによって動かされる１６の1 5mlチューブを水平に保持するローターから成る。単独の固定光子検出器（例えばPMT）を、回転中のチューブの軌道を少し越えたローターの平面に置く。このような方法で、各チューブをPMTのすぐ近傍に順次繰り返し持ち込み、各通過でその光出力をサンプリングするのを可能にする。最終的に、光源（赤外線LED）および検出器（フォトトランジスター）からなる光スイッチを、検出された光子の計数およびそれぞれが特定の試料と関連のある16領域へのデータの再編成を制御するのに用いる。
【図４０】図４０はグラフである。16チャンネルセンサーからのデータは、16の試料が同時に測定されること以外は、単独チャンネル装置で得られたLODと同一のLODを示す。単独測定は以下の工程：個々の1 5mlのチューブに16の試料（および／または対照物）を調製する工程、各チューブにエミッター細胞のアリコートを導入する工程、暗い箱の中に置いたローターにチューブを取り付ける工程、高いRCF（〜2000g）にて短時間（5秒）の遠心回転を用いてエミッター細胞をチューブの底に局在化する工程、測定（各チューブは毎秒１回サンプリングされる）の間、回転速度を60rpmに減少する工程、および各試料について評価のためにコンピューターアルゴリズムへの表示および／または入力のため、時系列の光子数をもたらす工程から成る。
【図４１】図４１は携帯用の16チャンネルセンサー設計の図解である。
【図４２】図４２はCANARYディスク（CD）統合エアロゾル回収およびエミッター細胞送達の図解である。
【図４３】図４３は、圧入ノズルおよび透明チューブを有するエアロゾル回収モジュールの断面図の図解である。
【図４４】図４４はバルブ送達システムを有するエミッター細胞送達モジュールの図解である。
【図４５】図４５は16チャンネルセンサーおよび16チャンネルセンサーを用いた結果の概略である。
【図４６】図４６は毒素の検出の概略である。
【図４７】図４７はエクオリンおよび汎用の抗体レセプターを発現するセンサー細胞の概略である。
【図４８】図４８は可溶性、モノマー抗原計画１の検出の概略図である。単独のエミッター細胞を、同じモノマー抗原上の２つの異なるエピトープに対する２つの異なる抗体を発現するために遺伝子工学で作り変える。抗原の存在が抗体を架橋し、エミッター細胞を活性化して光を放射する。
【図４９】図４９は各炭疽菌およびペスト菌に攻撃された炭疽菌およびペスト菌両者に対する抗体を発現する細胞株の結果を表すグラフである。このクローン細胞株はわずか50cfuの炭疽菌およびペスト菌のいずれかを検出し得、両者の抗体からの両者の抗原結合部位を発現し、有効であることを示す。
【図５０】図５０は可溶性タンパク質の検出計画の概略図である。一つはビーズ（または複数の抗体に結合する任意の支持体）に結合し、もう一つの抗体はエミッター細胞により発現される二つの抗体を用いて二つ以上のエピトープから成る抗原を検出する。抗原を抗体被膜ビーズでインキュベートし、その表面を複数の抗原で装飾する。その後(them)ビーズをエミッター細胞に提示する。抗原はビーズにより架橋されるので、エミッター細胞抗体は架橋され、光放射が活性化される。
【図５１】図５１は、4℃にて3時間、様々な量のBoNT/A Hcでインキュベートしたタンパク質G磁気ビーズに架橋した抗体6E10-10の結果を表すグラフである。ビーズをCO2I培地で３回洗浄した。6B2-2抗体を発現するエミッター細胞を添加し、反応物を5秒間回転し、光出力を照度計で監視した。
【図５２】図５２は化学物質の検出の概略図である。目的の化学物質に特異的に結合するペプチドを単離し、ペプチド-化学物質複合体に特異的に結合する抗体を生成する。ペプチド-化学物質が単一機能のエピトープのみを形成する場合、さらなるエピトープがペプチドに組み込まれ得る。示されるように、このエピトープはジゴキシゲニン分子であるが、任意の特異的なエピトープで十分である。化学物質の存在下、化学物質-ペプチド複合体は二つの抗体結合部位を含み、タンパク質毒素と同様のやり方で検出され得る。
【図５３】図５３は化学物質を検出する別の方法を表す概略図である。目的の化学物質と縦一列に結合する二つのペプチドを単離する。これらのペプチドの結合は各ペプチド-化学物質複合体に対する抗体を生成することにより、または示されるようにペプチドに抗体結合部位の標識をつけることにより検出され得る。
【図５４】図５４は化学物質を検出するもう一つの別の方法の概略図である。目的の二つの化学物質に結合するペプチドを調製し、化学物質-ペプチド二量体複合体を形成する。化学物質-ペプチド二量体複合体に特異的に結合する抗体を調製する。化学物質-ペプチド二量体複合体は、エミッター細胞を活性化して細胞内カルシウムを増加するのに十分な二つの抗体結合部位を含み得、それによりエミッター分子による光子放出をもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【配列表】
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