(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来のＯｒｉＰ複製起点と；
（ｂ）ＳＶ４０複製起点と；
（ｃ）関心のある遺伝子を挿入するための挿入部位と；
（ｄ）挿入部位に操作可能に連結されるＥＦ−１αプロモーターとを含み、
任意選択的に
（ｅ）挿入部位に操作可能に連結される、抗体の重鎖又は軽鎖定常領域をコードする核酸配列を含む発現ベクターであって、
前記ＯｒｉＰ複製起点に、前記発現ベクターによってコードされていないトランス作用ＥＢＭＡ１複製開始因子が結合する、発現ベクター。
【請求項２】
関心のある遺伝子が抗体の重鎖又は軽鎖可変領域である請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
抗体の重鎖又は軽鎖可変領域が、マウス、ヒト化、キメラ及びヒトからなる群から選択される請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項４】
抗体重鎖可変領域が、アダリムマブ、ＡＢＴ−３２５及びＡＢＴ−８７４からなる群から選択される抗体の重鎖可変領域である請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項５】
抗体軽鎖可変領域が、アダリムマブ、ＡＢＴ−３２５及びＡＢＴ−８７４からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域である請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項６】
抗体重鎖定常領域がマウス又はヒトである請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項７】
抗体重鎖定常領域が、γ１，ｚ，ａ；γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ；γ２，ｎ＋；γ２，ｎ−；及びγ４からなる群から選択される請求項１から５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項８】
γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ抗体重鎖定常領域が、重鎖定常領域の位置２３４（ＥＵ付番システム）にアラニン置換をさらに含む請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
抗体重鎖定常領域の位置２３５又は２３７（ＥＵ付番システム）のいずれかにアラニン置換をさらに含む請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
抗体軽鎖定常領域がヒトκアイソタイプ又はヒトλアイソタイプのいずれかである請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
抗体重鎖定常領域が、マウスγ１アイソタイプ又はマウスγ２ａアイソタイプのいずれかである請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
抗体軽鎖定常領域がマウスκアイソタイプである請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
抗体重鎖定常領域がＦｃドメインである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
重鎖又は軽鎖抗体可変領域が挿入部位に対して５’である請求項２から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
選択可能マーカーをさらに含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
選択可能マーカーがアンピシリン耐性遺伝子である請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
ＥＦ−１αプロモーターがヒトである請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
ＥＦ−１αプロモーターが、配列番号２のヌクレオチド７６から１２６７と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
ＥＦ−１αプロモーターが、配列番号２のヌクレオチド７６から１２６７と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
ＥＦ−１αプロモーターが、配列番号２のヌクレオチド７６から１２６７を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
ＯｒｉＰ複製起点が、配列番号１のヌクレオチドの１７９５から３５４５を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
ＯｒｉＰ複製起点が、配列番号１のヌクレオチドの１７９５から３５４５と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
ＯｒｉＰ複製起点が、配列番号１のヌクレオチドの１７９５から３５４５と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ＳＶ４０複製起点が、配列番号１のヌクレオチド５８３４から６１４０と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
ＳＶ４０複製起点が、配列番号１のヌクレオチド５８３４から６１４０と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２６】
ＳＶ４０複製起点が配列番号１のヌクレオチド５８３４から６１４０を含む請求項１から請求項５及び請求項１３のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２７】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、３１及び３２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２８】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、３１及び３２からなる群から選択される配列と少なくとも９５％同一である核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２９】
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、３１及び３２からなる群から選択される核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項３０】
図２、９及び１２から２５のいずれか１つに記載の発現ベクター。
【請求項３１】
シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む請求項１から請求項５、請求項１３及び請求項２７から請求項３０のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項３２】
請求項１から請求項５、請求項１３及び請求項２７から請求項３０のいずれか一項に記載のベクターを含むキット。
【請求項３３】
請求項１から請求項５、請求項１３及び請求項２７から請求項３０のいずれか一項に記載のベクターを含む哺乳動物宿主細胞。
【請求項３４】
ＣＯＳ細胞又はヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞である請求項３３に記載の哺乳動物宿主細胞。
【請求項３５】
ＣＯＳ７細胞である請求項３４に記載の哺乳動物宿主細胞。
【請求項３６】
ＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞である請求項３４に記載の哺乳動物宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１から請求項５、請求項１３及び請求項２７から請求項３０のいずれか一項に記載の発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入することと、タンパク質を発現させるために適切な条件下で哺乳動物宿主細胞を培養することと、タンパク質を回収することとを含む、組み換えタンパク質を産生させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２００８年１月１５日提出の米国特許仮出願第６１／０２１２８２号及び２００８年１０月１０日提出の米国特許仮出願第６１／１０４５４６号（これらのそれぞれの内容は、それらの全体において本明細書により組み込まれる。）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
生物製剤を含むタンパク質の安定した産生は、タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを宿主細胞に遺伝子移入することによって遂行し得る。エピソーム性複製起点を通じた染色体外複製を含む様々な手段を通じて、細胞株中のベクターの維持を行うことができる。エピソームベクターは、配列が複製開始因子により結合されている場合、ベクターの複製を促進する複製起点を含有する。エピソームベクターは、宿主ゲノムへの挿入を必要とするベクターを上回るいくつかの長所がある。例えば、エピソームベクターは細胞における表現型の変化を減少させるが、これは、宿主ゲノムへのベクターの統合に起因し得る。エピソームベクターはまた、標準的ＤＮＡ抽出プロトコールを用いて遺伝子移入細胞からも単離され得る。
【０００３】
治療用タンパク質、即ち生物製剤の重要性の高まりに伴い、全体的な産生プロセスの効率を向上させると同時に、タンパク質産生の最適化に取り組まなければならない。従って、効率の向上は、ベクターのタンパク質産生能を踏まえて検討しなければならない。効率的なクローニングの選択肢ならびに高レベルの所望タンパク質産物をもたらす、より優れた発現系が必要とされている。時間的制約を改善し、費用を最小限に抑えるために、生物製剤、特に抗体の産生に関与するクローニング段階の数を減少させることは好都合である。小規模及び大規模細胞培養の両方に対して適正なタンパク質産生をもたらすベクターを提供することも好都合である。本発明は、下記の詳細な説明から明らかになるであろうさらなる長所をもたらすことによって、従来のベクターの限界を克服する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
組み換えタンパク質は、特に医薬探索プロセス中、哺乳動物細胞の一時的遺伝子移入により産生され得る。ＣＯＳ及びヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞などの哺乳動物細胞を含め、タンパク質を発現させるために、様々な宿主細胞を使用し得る。エピソームベクターは、複製起点及び、起点に結合するトランス作用複製開始因子の両方に依存する。エプスタイン−バーウイルスのＯｒｉＰに結合するエプスタイン−バーウイルス核抗原（ＥＢＮＡ）などの複製開始因子は、エピソームベクターにクローニングされ得るか、又は、あるいは、ベクターが遺伝子移入される宿主細胞により発現され得る。従って、エピソームベクターは、複製起点を通じて複製を活性化するために必要とされるトランス作用因子を発現するある種の細胞株に特異的であり得る。
【０００５】
本発明により、組み換えタンパク質発現のための様々なエピソームベクター骨格が不要となる。本発明は、少なくとも２つの異なるエピソーム複製起点を含むエピソームベクターを提供し、これにより、タンパク質発現のために様々な細胞型において同じベクターを使用することができるようになる。様々な複製起点により、必要なトランス作用複製因子を提供し、ベクターを複製可能とする様々な哺乳動物細胞タイプで、ベクターを使用できるようになる。タンパク質産生のための関心のある遺伝子の再クローニングを不要にすることにより、本発明は、効率を向上させ、複数ベクターに伴う費用を削減し、同時にタンパク質産生レベルを維持する。本発明の驚くべき態様は、ベクターに対するヌクレオチド、即ち、第二の複製起点の付加が、ベクターの所望レベルでのタンパク質産生能に悪影響を与えないことである。
【０００６】
好ましい実施形態において、本発明のベクターは、抗体重又は軽鎖定常領域を含む。従って、抗体軽又は重鎖可変領域は、それぞれ軽又は重鎖定常領域のベクター上流にクローニングされ得、発現系の効率をさらに改善する。エピソームベクターは、ＳＶ４０  Ｔ  Ａｇ又はエプスタイン−バーウイルス核抗原を発現する哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ７又はＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞）における高タンパク質産生を促進する。
【０００７】
本発明は、タンパク質収率、産生効率及び費用削減のための要素の最適な組み合わせを提供するが、これらは、全て、特に製薬産業におけるタンパク質産生及び抗体などの生体タンパク質の産生に対する重要な要素である。本発明のその他の特性及び長所は、下記の詳細な説明及び特許請求の範囲で述べる。
【０００８】
ある態様において、本発明は、（ａ）エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来のＯｒｉＰ複製起点と；（ｂ）ＳＶ４０複製起点と；（ｃ）関心のある遺伝子を挿入するための挿入部位と；（ｄ）挿入部位に操作可能に連結される、抗体重又は軽鎖定常領域をコードする核酸配列と、を含む、発現ベクターを提供する。ある実施形態において、関心のある遺伝子は、抗体重又は軽鎖可変領域、例えば、マウス、ヒト化、キメラ又はヒト抗体重もしくは軽鎖可変領域である。特定の実施形態において、抗体重鎖可変領域は、アダリムマブ、ＡＢＴ−３２５及びＡＢＴ−８７４からなる群から選択される抗体の重鎖可変領域である。別の特定の実施形態において、抗体軽鎖可変領域は、アダリムマブ、ＡＢＴ−３２５及びＡＢＴ−８７４からなる群から選択される抗体の軽鎖可変領域である。抗体重鎖定常領域は、例えば、マウス、ヒト化、キメラ又はヒトであり、γ１，ｚ，ａ；γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ；γ２，ｎ＋；γ２，ｎ−；及びγ４からなる群から選択される抗体重鎖定常領域であり得る。γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ抗体重鎖定常領域は、重鎖定常領域の位置２３４にアラニン突然変異をさらに含み得る。別の実施形態において、γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ抗体重鎖定常領域は、抗体重鎖定常領域の位置２３５又は２３７のいずれかにアラニン突然変異をさらに含み得る。
【０００９】
ある実施形態において、抗体軽鎖定常領域は、ヒトκアイソタイプ又はヒトλアイソタイプである。ある実施形態において、抗体重鎖定常領域は、マウスγ１アイソタイプ又はマウスγ２ａアイソタイプである。別の実施形態において、抗体軽鎖定常領域はマウスκアイソタイプである。ある実施形態において、抗体重鎖定常領域はＦｃドメインである。ある実施形態において、重又は軽鎖抗体可変領域は、挿入部位に対して５’である。
【００１０】
ある実施形態において、発現ベクターは、挿入部位に操作可能に連結されるプロモーターをさらに含み、プロモーターは、ＥＦ−１αプロモーター又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかである。
【００１１】
ある実施形態において、発現ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子などの選択可能マーカーをさらに含む。
【００１２】
ある実施形態において、ＣＭＶプロモーターは、配列番号１のヌクレオチド１から６０８と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＣＭＶプロモーターは、配列番号１のヌクレオチド１から６０８を含む。
【００１３】
ある実施形態において、ＥＦ−１αプロモーターはヒトである。ある実施形態において、ＥＦ−１αプロモーターは、配列番号２のヌクレオチド７６から１２６７と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＥＦ−１αプロモーターは、配列番号２のヌクレオチド７６から１２６７を含む。
【００１４】
ある実施形態において、ＯｒｉＰ複製起点は、配列番号１のヌクレオチド１７９５から３５４５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。
【００１５】
ある実施形態において、ＳＶ４０複製起点は、配列番号１のヌクレオチド５８３４から６１４０と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。特定の実施形態において、ＳＶ４０複製起点は、配列番号１のヌクレオチド５８３４から６１４０を含む。
【００１６】
本発明の典型的発現ベクターは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１及び３２からなる群から選択される配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を含む。特定の実施形態において、本発現ベクターは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１及び３２からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００１７】
本発明の発現ベクターはまた、図１、２及び１４から２５でも提供する。本発明のさらなるベクターは図８から１３で記載する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本発明のベクターを含む哺乳動物宿主細胞を提供する。哺乳動物宿主は、ＣＯＳ細胞、例えばＣＯＳ７細胞など、又はヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞、例えばＨＥＫ−２９３細胞などであり得る。
【００１９】
別の態様において、本発明は、本発明のベクターを含むキットを提供する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、哺乳動物宿主細胞に本発明の発現ベクターを導入することと、タンパク質を発現させるために適切な条件下で哺乳動物宿主細胞を培養することと、タンパク質を回収することと、を含む、組み換えタンパク質を産生する方法を提供する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。ある実施形態において、関心のある遺伝子は、シグナルペプチドをコードする核酸に操作可能に連結される。
【００２２】
添付の図面とともに読む場合、好ましい実施形態の次の記述から、本発明の前述及びその他の目的、特性及び長所ならびに本発明そのものがより詳細に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、空のｐＨｙｂ−Ｃベクターのマップを示す。搭載されるものには、ＳＶ４０真核複製起点、サイトメガロウイルス真核発現プロモーター（ｐＣＭＶ）、３成分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列（ＴＰＬ）、スプライスドナー部位（ＳＤ）、アデノウイルス主要後期エンハンサーエレメント（ｅｎｈＭＬＰ）、スプライス受容部位（ＳＡ）、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）、関心のある遺伝子に対する領域、続いてポリＡシグナル（ｐＡ）、二重対称（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）エレメント（ＤＳ）、エプスタインバーウイルス由来真核複製起点（ＯｒｉＰ）、反復領域（ＦＲ）、アンピシリン耐性マーカー（ＡｍｐＲ）及び細菌複製起点（ｐＭＢ１ｏｒｉ）が含まれる。
【図２】図２は、空のｐＨｙｂ−Ｅベクターのマップを示す。搭載されるものには、ＳＶ−４０真核複製起点、ＥＦ−１α真核プロモーター、関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）領域、続いて、ポリＡシグナル（ｐＡ）、二重対称（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）エレメント（ＤＳ）、エプスタインバーウイルス由来真核複製起点（ＯｒｉＰ）、反復領域（ＦＲ）、アンピシリン耐性マーカー（ＡｍｐＲ）及び細菌複製起点（ｐＭＢ１ｏｒｉ）が含まれる。
【図３】図３は、電気穿孔法を介してｐＢＯＳ、ｐＴＴ３、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥベクターにより遺伝子移入されたＣＯＳ細胞によって産生される組み換えＦｃ融合タンパク質タイターを示す。
【図４】図４は、ｐＢＯＳ、ｐＴＴ３、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥベクターによりＰＥＩを用いて遺伝子移入されたＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞によって産生された組み換えＦｃ融合タンパク質タイターを示す。
【図５】図５は、ＩｇＧ抗体を発現するように構築された、ｐＢＯＳ、ｐＴＴ３、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥベクターによりＰＥＩを用いて遺伝子移入されたＨＥＫ−２９３−６Ｅによって産生された抗体タイターを示す。
【図６】図６は、ＩｇＧ抗体を発現するように構築された、ｐＢＯＳ、ｐＴＴ３、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥベクターによる電気穿孔法を介したＣＯＳ遺伝子移入により産生された抗体タイターを示す。
【図７】図７は、ＩｇＧ抗体を発現するｐＨｙｂ−Ｅ−ＳｗａＩ（ｖ１）又はｐＨｙｂ−Ｅ（ｖ２）ベクターコンストラクトによる電気穿孔法を介してＣＯＳ遺伝子移入により産生された抗体タイターを示す。
【図８】図８は、ｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−ｍＣｇ２ａベクター（「ｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−Ｆｃ」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図９】図９は、ｐＨｙｂＥ−ｍＢＲ３−ｍＣｇ２ａベクター（「ｐＨｙｂＥ−ｍＢＲ３−Ｆｃ」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１０】図１０は、ｐＨｙｂＣ−Ｅ７−ｈＣｋベクター（「ｐＨｙｂＣ−Ｅ７」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１１】図１１は、ｐＨｙｂＣ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａベクター（「ｐＨｙｂＣ−Ｄ２」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１２】図１２は、ｐＨｙｂＥ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａベクター（「ｐＨｙｂＥ−Ｄ２」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１３】図１３は、ｐＨｙｂＥ−Ｅ７−ｈＣｋベクター（「ｐＨｙｂＥ−Ｅ７」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１４】図１４は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａ  Ｖ２（「ｐＪＰ１８２」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１５】図１５は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ  Ｖ２（「ｐＪＰ１８３」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１６】図１６は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）Ｖ２（「ｐＪＰ１８４」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１７】図１７は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）Ｖ２（「ｐＪＰ１８５」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１８】図１８は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ＋Ｖ２（「ｐＪＰ１８６」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図１９】図１９は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ−Ｖ２（「ｐＪＰ１８７」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図２０】図２０は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ４  Ｖ２（「ｐＪＰ１８８」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図２１】図２１は、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ１  Ｖ２（「ｐＪＰ１８９」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図２２】図２２は、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２ａ  Ｖ２（「ｐＪＰ１９０」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図２３】図２３は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ  Ｖ２（「ｐＪＰ１９１」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図２４】図２４は、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌ  Ｖ２（「ｐＪＰ１９２」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【図２５】図２５は、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｋ  Ｖ２（「ｐＪＰ１９３」とも呼ばれる。）のマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ｉ．定義
本発明がより容易に理解され得るように、本明細書中である一定の用語を最初に定義する。
【００２５】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びそれらの類似体を含むものとする。核酸分子は、１本鎖又は２本鎖であり得るが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。核酸は、単離し得るか又は別の核酸分子、例えば発現ベクター、又は真核宿主細胞の染色体に組み込み得る。
【００２６】
「単離」核酸分子は、その核酸の天然源に存在するその他の核酸分子から分離されるものである。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離される」という用語は、例えばゲノムＤＮＡが天然に会合される染色体から分離される核酸分子を含む。好ましくは、「単離」核酸は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、その核酸に天然に隣接する配列（即ち核酸の５’及び３’末端に位置する配列）不含である。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、実質的に、その他の細胞性物質不含もしくは、組み換え技術により産生される場合、培地不含であり得るか、又は実質的に、化学合成される場合、化学的前駆体もしくはその他の化学物質不含である。
【００２７】
本明細書中で交換可能に使用される「組み換えベクター」又は「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターのあるタイプは、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが結合され得る環状の２本鎖ＤＮＡループを指す。あるいは、ベクターは線状であり得る。ベクターの別のタイプはウイルスベクターであり、この場合、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに結合され得る。ある一定のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自律的に複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。好ましい実施形態において、本発明のベクターは、エピソーム哺乳動物ベクターである。「コンストラクト」という用語は、本明細書中で使用される場合、ベクターも指す。
【００２８】
ある一定のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を支配することができる。「発現ベクター」又は「組み換え発現ベクター」は、宿主細胞中で発現される遺伝子をコードする核酸分子であり、さらに、遺伝子の発現を調節するための必要なエレメントを含有する。通常、発現ベクターは、転写プロモーター、関心のある遺伝子及び転写終結因子を含む。遺伝子発現は、通常、プロモーターの調節下に置かれ、このような遺伝子は、プロモーターに「操作可能に連結される」と言われる。同様に、制御エレメント及びコアプロモーターは、制御エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、操作可能に連結される。ある実施形態において、本発明の発現ベクターは、１以上の複製起点を含み、従ってベクターは１つの細胞型に限定されない。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「エピソームとして複製するベクター」又は「エピソームベクター」は、通常、及び非常に好ましくは、宿主細胞のゲノムに組み込まれないが、平行して存在するベクターを指す。エピソームとして複製するベクターは、本明細書中で使用される場合、細胞周期中に複製され、一連のこの複製において、ベクターコピーは、細胞分裂前後に存在するコピー数に依存して、結果として得られる細胞中で統計的に分布する。好ましくは、エピソームとして複製するベクターは、宿主細胞の核中で生じ得、好ましくは、細胞周期のＳ期中に複製する。さらに、エピソームとして複製するベクターは、細胞周期のＳ期中に、宿主細胞の核において、少なくとも１回、即ち、１又は複数回複製される。非常に好ましい実施形態において、エピソームとして複製するベクターは、細胞周期のＳ期中に宿主細胞の核において１回複製される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、本明細書中で交換可能に使用される「複製起点配列」又は「複製起点」という用語は、ベクター中に存在する場合、複製を開始する配列を指す。複製起点は、複製開始因子により又は、あるいはＤＮＡヘリカーゼにより認識され得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「組み換え」とは、例えば微生物中で、核酸物質、例えばＤＮＡが、２つの核酸分子間で交換されるプロセスを指す。本明細書中で使用される場合、「相同組み換え」とは、配列相同性又は好ましくは配列同一性のセグメント又は領域を通じて２つの核酸分子間で核酸物質が交換されるプロセスを指す（例えば高度の配列同一性）。典型的な実施形態において、核酸物質は、微生物の染色体又はエピソーム上に位置する。別の典型的な実施形態において、核酸物質は、染色体外に、例えばプラスミド上に位置する。組み換えは、線状及び／又は環状ＤＮＡ分子の間で起こり得る。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、「関心のある遺伝子」という用語は、本発明のベクターに付加される外来ＤＮＡ配列を指す。関心のある遺伝子は、例えば、イントロンが置かれ得るか又はオープン・リーディング・フレームをコードするｃＤＮＡであるかいずれかの、コード配列を含み得る。「関心のある遺伝子」とは、本明細書中で使用される場合、最終的タンパク質発現のために本発明のベクターに付加されるＤＮＡ配列を指す。関心のある遺伝子がクローニングされるベクターの領域は、本明細書中で「挿入部位」と呼ばれる。好ましくは、関心のある遺伝子は、本発明のベクターを用いて発現される抗体又は融合タンパク質の一部を含む。例えば、重鎖定常領域を含む本発明のベクターに、抗体アダリムマブの重鎖可変領域、即ち、関心のある遺伝子をクローニングする。
【００３３】
本発明のある実施形態において、本ベクターは、関心のある遺伝子に対する挿入部位に対して３’であり、それに操作可能に連結される抗体軽又は重鎖定常領域を含む。従って、ある実施形態において、関心のある遺伝子は、本発明のベクターでコードされる抗体軽又は重鎖定常領域に操作可能に連結される抗体の軽又は重鎖の可変領域である。
【００３４】
ヌクレオチド配列は、別のヌクレオチド配列と機能的に関連するように置かれる場合、「操作可能に連結される」。例えば、シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、発現される際、その配列が、あるタンパク質又はポリペプチドとインフレームとなるようにシグナルペプチドをコードする場合、そのタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡに操作可能に連結される。同様に、プロモーター又はエンハンサーは、あるタンパク質又はポリペプチドの発現が促進又は増進される場合、そのタンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結される。ある実施形態において、操作可能に連結されるヌクレオチド配列は隣接する（例えばシグナル配列の場合）。あるいは、操作可能に連結されるヌクレオチド配列は非隣接であり得る（例えばエンハンサーの場合）。ある実施形態において、抗体軽又は重鎖定常領域コードする核酸配列は、関心のある遺伝子、例えば重又は軽鎖可変領域に操作可能に連結される。
【００３５】
「プロモーター」という用語は、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター及び構成的プロモーターを含む、真核細胞において転写を支配するのに十分な何らかの核酸配列を含む。一般に、プロモーターは、細胞型特異的、組織特異的もしくは時間特異的方式でプロモーター依存性の遺伝子発現を調節可能にするのに十分であるか又は外部シグナルもしくは物質により誘導可能なエレメントを含む。このようなエレメントは、特定の遺伝子の５’又は３’又はイントロン配列領域に位置し得る。普通、遺伝子発現は構成的であるが、必要に応じて、本発明で、制御可能なプロモーターを使用することができる。遺伝子発現は、例えばメタロチオニン遺伝子又は熱ショック遺伝子の使用によるなど、熱、光又は金属を用いて、転写制御により調節することもできる。
【００３６】
「上流」及び「下流」は、ヌクレオチド配列又はベクターに存在する２つのエレメント間の相対的方向を示すために使用される用語である。一方の「上流」であるエレメントは、他方のエレメントよりもその配列の５’末端に近い位置にある（即ち、分子が線状である場合、リボース又はデオキシリボース骨格の５’炭素に連結されるリン酸基を有する分子の末端に近い。）。エレメントは、他のエレメントと比較した場合、それがその配列の３’末端（即ち、線状分子において、リボース又はデオキシリボース骨格の３’炭素に連結されるヒドロキシル基を有する分子の末端）により近い位置に位置する場合、「下流」と呼ばれる。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）配列」という用語は、好ましくはベクターにおける、５’及び３’両末端の制限酵素部位に隣接する核酸配列を指す。スタッファー配列は、ベクターにおいて、関心のある遺伝子をコードする核酸に対する挿入部位に位置する。クローニングプロセス中、スタッファー配列は、適切な制限酵素を用いて消化されてベクターから除去され、関心のある遺伝子をコードする核酸が結合されるか又はスタッファー配列の元の位置でベクターへと相同的に組み換えられる。好ましくは、スタッファー配列は、制限酵素が効率的にベクターを切断できるように５’及び３’制限酵素部位間で十分な距離を与えられるよう十分に大きい。さらに、スタッファー配列の長さは、関心のある遺伝子をコードする核酸の大きさとは異なることが好ましく、例えば、約３００塩基対以下又は約４００塩基対以上のスタッファー配列は、約３５０塩基対である関心のある遺伝子をコードする核酸に対して使用され得る。別の実施形態において、スタッファー配列は約１ｋｂの大きさである。
【００３８】
「組み換え宿主細胞」（又は単純に「宿主細胞」）という用語は、本明細書中で使用される場合、組み換え発現ベクターが導入されている細胞を指すのものとする。このような用語は、特定の目的細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すものであることを理解されたい。突然変異又は環境の影響のいずれかにより、ある種の修飾が続く世代で起こり得るので、このような子孫は、実際、親細胞と同一でない場合があるが、これらも本明細書中で使用される場合の「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【００３９】
「抗体」という用語は、本明細書中で示される場合、全抗体及び何らかの抗原結合断片（即ち「抗原−結合部分」）又はその１本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書注でＶＨと略）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存性の高い領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割され得る。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成され、次の順番、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に並んでいる。重及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。ＶＨ及びＶＬの組み合わせの６個のＣＤＲは、抗原結合部位を形成する。２本のＨ鎖及び２本のＬ鎖から構成される抗体の場合、抗体は、２個の同一の抗原結合部位、同じ抗原に結合する２個の異なる抗原結合部位又は異なる抗原に結合する２個の抗原結合部位を含有し得る。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的な補体系の補体第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００４０】
抗体の「抗原結合部分」（又は単純に「抗体部分」）という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原（例えばＩＬ−１α、ＩＬ−１β）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により果たされ得る。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結される２個のＦａｂ断片を含む２価断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＶＬドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ及びＶＬドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片、ＶＬ及びＶＨの２つのドメインは別個の遺伝子によりコードされるが、これらをＶＬ及びＶＨ領域が対となって一価分子を形成する単一タンパク質鎖にすることができる合成リンカーにより、組み換え法を用いて、これらが連結され得る（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。このような１本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。これらの抗体断片は、当業者にとって公知の従来技術を用いて得られ、インタクトな抗体であるものと同様にして有用性についてこの断片をスクリーニングする。本発明のある実施形態において、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｄ’、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖａ及びドメイン抗体（ｄＡｂ）からなる群から選択される。
【００４１】
またさらに、抗体又はその抗原結合部分は、１以上のその他のタンパク質又はペプチドとの抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成される、より大きい免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体ｓｃＦｖ分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）及び、２価及びビオチン化ｓｃＦｖ分子を作製するための、システイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。Ｆｃ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、全抗体のそれぞれパパイン又はペプシン消化など、従来技術を用いて全抗体から調製され得る。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００４２】
「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分と独立にその三次元構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の個々の機能特性に関与し、多くの場合、タンパク質及び／又はドメインの残りの部分の機能を喪失することなく、その他のタンパク質に対して付加、除去又は転移され得る。１つの抗体可変ドメインは、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含む折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。従って、これは、完全抗体可変ドメイン及び修飾された可変ドメイン、例えば、１以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列で置換されているもの、又は短縮されているか又はＮもしくはＣ末端伸長を含む抗体可変ドメイン、ならびに少なくとも部分的に全長ドメインの結合活性及び特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。
【００４３】
ドメインの群を形成するために、本発明の可変ドメインを組み合わせ得、例えば、相補性ドメインが組み合わせられ得る（ＶＬドメインがＶＨドメインと組み合わせられるなど）。非相補性ドメインもまた、例えばＶＨドメイン及び第二のＶＨドメインと組み合わせられ得る。共有又は非共有手段によるドメインの連結を含む多くの方法でドメインを組み合わせ得る。
【００４４】
「ｄＡｂ」又は「ドメイン抗体」は、抗原に特異的に結合する１つの抗体可変ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）ポリペプチドを指す。ある実施形態において、本発明のベクターは、ｄＡｂを発現させるために使用される。
【００４５】
「組み換え抗体」という句は、宿主細胞に遺伝子移入された組み換え発現ベクターを用いて発現される抗体、組み換え体から単離された抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリ、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５）など、組み換え手段により調製され、発現され、作製されるか又は単離された抗体又は、その他のＤＮＡ配列に対する、特定の免疫グロブリン遺伝子配列（ヒト免疫グロブリン遺伝子配列など）のスプライシングを含む何らかのその他の手段により、調製され、発現され、作製されるか又は単離される抗体など、を指す。組み換え抗体の例には、キメラ、ＣＤＲグラフト及びヒト化抗体が含まれる。
【００４６】
「ヒト抗体」という用語は、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）により記載されるように、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応するか又はそれに由来する、可変及び定常領域を有する抗体を指す。しかし、本発明のヒト抗体は、例えばＣＤＲにおいて及び特にＣＤＲ３において、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発により又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）。
【００４７】
本発明の組み換えヒト抗体は可変領域を有し、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の定常領域も含み得る（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２参照）。しかし、ある一定の実施形態において、このような組み換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発に供され（又はヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発）、従って、組み換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列由来であり、それに関連する一方で、ヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内にインビボで天然に存在し得ない配列である。しかし、ある一定の実施形態において、このような組み換え抗体は、選択的突然変異誘発又は復帰突然変異又はその両方の結果である。
【００４８】
「復帰突然変異」という用語は、ヒト抗体の体細胞突然変異したアミノ酸の一部又は全てが、相同な生殖細胞系列抗体配列からの対応する生殖細胞系列残基で置き換えられるプロセスを指す。本発明のヒト抗体の重及び軽鎖配列は、最大相同性のある配列を同定するために、ＶＢＡＳＥデータベース中の生殖細胞系列配列と個々に整列化（アライン）される。本発明のヒト抗体における相違は、このような異なるアミノ酸をコードする規定されるヌクレオチド位置を突然変異させることによって、生殖細胞系列配列に戻される。従って復帰突然変異に対する候補として同定される各アミノ酸の役割は、抗原結合における直接又は間接的役割について調べられるべきであり、突然変異後にヒト抗体の何らかの所望の特徴に影響を与えることが分かった何らかのアミノ酸は、最終的ヒト抗体に含めるべきではない。復帰突然変異を行うアミノ酸の数を最小限に抑えるために、第二の生殖細胞系列配列が、問題となっているアミノ酸の両側で少なくとも１０、好ましくは１２アミノ酸にわたり本発明のヒト抗体の配列と同一であり、同一直線上にある場合、最も近い生殖細胞系列配列と異なるが、第二の生殖細胞系列配列の対応するアミノ酸と同一であることが分かったそれらのアミノ酸の位置はそのままにし得る。復帰突然変異は抗体最適化のいずれかの段階で起こり得る。
【００４９】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されるマウス重及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種からの重及び軽鎖可変領域配列及び別の種からの定常領域配列を含む抗体を指す。
【００５０】
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、マウスＣＤＲの１以上（例えばＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置換されているマウス重及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種からの重及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１以上の配列が、別の種のＣＤＲ配列で置換されている抗体を指す。
【００５１】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えばマウス）からの重及び軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より「ヒトに似ている」、即ちヒト生殖細胞系列可変配列により類似するように改変されている、抗体を指す。ヒト化抗体のあるタイプは、ＣＤＲグラフト抗体であり、ここで、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置換するために、ヒトＣＤＲ配列が非ヒトＶＨ及びＶＬ配列に導入されている。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「連結される」、「融合される」又は「融合」という用語は交換可能に使用される。これらの用語は、化学的結合又は組み換え手段を含むどのような手段を用いるものであれ、２以上のエレメント又は成分を一緒に連結することを指す。「インフレーム融合」又は「操作可能に連結」という用語は、元のＯＲＦの正しい読み枠を維持する形で、連続したより長いＯＲＦを形成するための２以上のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の連結を指す。従って、得られる組み換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによりコードされるポリペプチドに対応する２以上のセグメントを含有する単一タンパク質である（セグメントは通常、天然ではそのように連結されない。）。従って、読み枠が融合セグメントを通して連続的にされるにもかかわらず、セグメントは、例えばインフレームリンカー配列により、物理学的又は空間的に分離され得る。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖の定常領域由来のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、Ｆｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。
【００５４】
Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の機能的に同等な類似体であり得る。Ｆｃ領域の機能的に同等な類似体は、野生型又は天然に存在するＦｃ領域に対する１以上のアミノ酸修飾を含む可変Ｆｃ領域であり得る。ある実施形態において、可変Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域と少なくとも５０％の相同性を保持し、約８０％から９９％が好ましい（少なくとも約８５％相同性、少なくとも約９０％相同性、少なくとも約９５％相同性、少なくとも約９６％相同性、少なくとも約９７％相同性、少なくとも９８％相同性又は少なくとも約９９％相同性を含む。）。Ｆｃ領域の機能的に同等な類似体は、タンパク質のＮ又はＣ末端への１以上のアミノ酸残基の付加又はタンパク質のＮ又はＣ末端からの１以上のアミノ酸残基の欠失を含み得る（好ましくは３０以下、最も好ましくは１０以下）。Ｆｃ領域の機能的に同等な類似体には、融合パートナーに操作可能に連結されるＦｃ領域が含まれる。
【００５５】
「Ｆｃ融合」又は「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、本明細書中で使用される場合、１以上のタンパク質、ポリペプチド又は小分子がＦｃ領域又はその誘導体に操作可能に連結されるタンパク質を含む。「Ｆｃ融合」という用語は、本明細書中で使用される場合、先行技術（Ｃｈａｍｏｗら、１９９６、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：５２−６０；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９７、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１９５−２００）で使用されるように、「Ｉｇ融合」、「Ｉｇキメラ」及び「受容体グロブリン」（ダッシュ付きの場合もある。）などの用語と同義であるものとする。Ｆｃ融合は、融合パートナー（一般に、何らかのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は小分子であり得る。）と、免疫グロブリンの１以上のＦｃ領域又はその変異体を組み合わせる。ある実施形態において、Ｆｃ融合物の非−Ｆｃ部分、即ち融合パートナーの役割は、標的結合を媒介することであり得、従ってそれは抗体の可変領域に対して機能的に類似し得る。
【００５６】
本発明において、融合もしくは結合パートナーにＦｃポリペプチドを共有結合させるために、又はＦＣ融合物を作製するために、様々なリンカーを使用し得る。本明細書中で使用される場合、「リンカー」、「リンカー配列」、「スペーサー」、「連結配列」という用語又はその同等物は、２つの分子を連結し、好ましい構造でこの２つの分子を配置するのに役立ち得る分子又は分子の群（単量体又はポリマーなど）を指す。分子を一緒に共有結合させるために多くのストラテジーを使用し得る。これらには、以下に限定されないが、タンパク質又はタンパク質ドメインのＮ及びＣ末端間のポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介した連結及び化学的架橋試薬を介した連結が含まれる。
【００５７】
ＩＩ．本発明のベクター
本発明は、哺乳動物宿主細胞でタンパク質を発現させるためのエピソームベクターを提供する。本発明のベクターは、複製起点のいずれかに対するトランス作用複製開始因子を含有する何らかの細胞株においてベクターを使用できるようにする、２つのエピソーム複製起点の含有に基づく。本ベクターが、複製起点に結合する複製開始因子も含有し得る一方、好ましい実施形態において、トランス作用複製因子は宿主細胞により提供される。さらに、ある実施形態において、本発明のベクターは、本ベクターが関心のある遺伝子に操作可能に連結される重又は軽鎖定常領域を含有するので、抗体及びＦｃ融合タンパク質の産生のための効率的で有効な手段を提供する。本発明のベクターの例は図１、２及び８から２５に記載する。さらに、典型的ベクターの配列は配列番号１から３２で提供する。図１及び２（及び対応する配列番号１及び２）は、「オープン」ベクター、即ち、抗体重又は軽鎖定常領域及び関心のある遺伝子を含有しない本発明のベクターを記載する。図８−２５は、関心のある遺伝子をクローニングするための部位とともに様々なマウス又はヒト定常領域も含む本発明のベクターのマップを提供する。
【００５８】
本発明のベクターは、少なくとも２つの別個の複製起点、例えばエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）由来のＯｒｉＰ複製起点及びＳＶ４０複製起点を含む。複製起点は、ＤＮＡウイルス由来、より好ましくは、例えば、エプスタイン−バーウイルス、単純ヘルペスウイルス、リスザルヘルペスウイルス、マウスガンマヘルペスウイルス６８、ヒトサイトメガロウイルス、マウスサイトメガロウイルス、仮性狂犬病ウイルス、サルウイルス４０、ポリオーマウイルス、ヒトＢＫウイルス、ウシパピローマウイルス及びアデノ関連ウイルス由来の複製起点を含む、エピソーム性複製を可能にするＤＮＡウイルス由来であり得る。
【００５９】
ある実施形態において、複製起点は、エプスタイン−バーウイルス、例えば、ＯｒｉＰ又はその機能的部分由来である（Ａｉｙａｒら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１７：６３９４にエプスタイン−バー機能的起点の例が記載されている。）。エプスタイン−バーウイルス複製起点（ＯｒｉＰ）は、細胞によるＤＮＡ合成を促進する２つの主要なエレメント及び複数のシス作用エレメント及びウイルス維持エレメントからなる。２つの主要エレメントのうち第一のものは、反復ファミリー（ＦＲ）を含有し、これは、ＥＢＮＡ結合部位を含む（図１及び２で示される。）。ＥＢＮＡは、ＯｒｉＰを介してベクターの複製を開始させる複製開始因子である（ＥＢＮＡ配列に対するＧｅｎｅｂａｎｋ受入番号Ｖ０１５５５（ｇｉ：９４７３４０７４）参照）。ＯｒｉＰに含有される第二のエレメントは、いわゆる二重対称（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）（ＤＳ）を含有し、その機能は、起点認識エレメントとして作用することである。一般に、ＤＳ及びＦＲエレメントは、いくつかの塩基対、通常は１０００ｂｐによって間隔があけられる。ＯｒｉＰの相対配向及び特にＤＳ及びＦＲの相対配向は、ＯｒｉＰ機能に影響を与えることなく変化させることができる。本発明の発現ベクター上に位置するその他のエレメントに対するＯｒｉＰの配向及び特にＤＳ及びＦＲの配向は、ＯｒｉＰ機能に影響を与えることなく変化させることができる。複製起点がエプスタイン−バーウイルス複製起点（ＯｒｉＰ）であり、ＯｒｉＰが反復ファミリー（ＦＲ）及び二重対称（ＤＳ）を含む、本発明の好ましい実施形態においては、順序は、ＤＳエレメントが関心のある遺伝子とＦＲエレメントとの間にあるようになる。ある実施形態において、本発明のベクターは、配列番号１のヌクレオチドの１７９５から３５４５又はそれと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含むＯｒｉＰ（エプスタイン−バーウイルス）複製起点を含む。
【００６０】
別の実施形態において、本ベクターはＳＶ４０複製起点を含む。ＳＶ４０（サルウイルス４０）複製起点（例えば図１及び２で「ＳＶ４０  Ｏｒｉ」と記載される。）は、この起点を介したベクターの複製の開始のために、１つのウイルスタンパク質、ラージＴ抗原を必要とする。ＳＶ４０複製起点は、エピソームベクターを複製及び維持するために、エピソームベクターにおいて使用され得る（Ｃａｌｏｓ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：４６２；Ｈａｒｒｉｓｏｎら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６８：１９１３；Ｃｏｏｐｅｒら（１９９７）ＰＮＡＳ  ９４：６４５０；及びＡｓｃｅｎｚｉｏｎｏら（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  １１８：１３５）。ある実施形態において、本発明のベクターは、配列番号１のヌクレオチド５８３４から６１４０又はこれと８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である配列を含むＳＶ４０複製起点を含む。
【００６１】
本明細書中に記載の複製起点の機能的変異もまた、本発明による複製起点の意味に包含される。
【００６２】
複製のエピソーム複製起点に加えて、本発明のベクターはまた、細菌中でベクターを複製するための複製起点も有し得る。図１及び２で示されるような、これに限定されるわけではない例は、Ｅ．コリで機能するｐＭＢ１  ｏｒｉである。
【００６３】
本発明のベクターはまた選択可能マーカーも含み得る。選択マーカーは、原核及び真核生物でのベクター配列のクローニング及び増幅を促進し得る。ある一定の実施形態において、選択マーカーは、抗生物質などの化合物又は化合物のクラスに対する耐性を与える。本発明の核酸分子及び発現系とともに使用することができる典型的選択マーカーは、ピューロマイシンに対する耐性を与えるものである。あるいは、ハイグロマイシン、ｇｐｔ、ネオマイシン、ゼオシン、ウアバイン、ブラストシジン、カナマイシン、ジェネティシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシン、ナリジクス酸、リファンピシン、クロラムフェニコール、ゼオシン又はブレオマイシンに対する耐性を与える選択マーカー又はＤＨＲＦ、ｈｉｓＤ、ｔｒｐＢもしくはグルタミンシンテターゼなどのマーカーを使用し得る。
【００６４】
本発明のベクターには、タンパク質への関心のある遺伝子（ならびに選択可能マーカー）の転写及び翻訳に必要な制御エレメントも含まれる。転写制御エレメントは、通常、発現されるべき遺伝子配列のプロモーター５’、転写開始及び終結部位及びポリアデニル化シグナル配列を含む。「転写開始部位」という用語は、一次転写物、即ちｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる最初の核酸に対応するコンストラクト中の核酸を指し；この転写開始部位はプロモーター配列と重複し得る。「転写終結部位」という用語は、通常、ＲＮＡポリメラーゼを転写終結させる、関心のある遺伝子又は一続きの転写されるべき配列の３’末端に相当するヌクレオチド配列を指す。ポリアデニル化シグナル配列又はポリＡ付加シグナルは、真核ｍＲＮＡの３’末端での特異的部位での切断及び切断される３’末端への約１００−２００アデニンヌクレオチド（ポリＡテール）の配列の核における転写後付加のためのシグナルを提供する。ポリアデニル化シグナル配列には、切断部位から約１０−３０ヌクレオチド上流に位置する配列ＡＡＴＡＡ、さらに、下流配列が含まれる。
【００６５】
本発明のベクターに含まれ得る制御エレメントはプロモーターである。このプロモーターは、構成的又は誘導可能であり得る。エンハンサー（即ち、転写を増加させるためにプロモーターにおいて作用するシス作用ＤＮＡエレメント）は、プロモーターのみで得られる発現レベルを向上させるためにプロモーターと連結して機能するために必要であり得、転写制御エレメントとして含まれ得る。しばしば、プロモーターを含有するポリヌクレオチドセグメントはエンハンサー配列も含む（例えばＣＭＶ  ＩＥ  Ｐ／Ｅ；ＳＶ４０  Ｐ／Ｅ；ＭＰＳＶ  Ｐ／Ｅ）。スプライシングされた転写物を得るために必要な場合、スプライスシグナルが含まれ得る。分泌ポリペプチドを産生させるために、選択された配列は通常、分泌のためにポリペプチドが送られ得るＥＲ膜に及びＥＲ膜を通じ、新たに合成されたポリペプチドを移動させる、リーダーペプチドをコードするシグナル配列を含む。リーダーペプチドは、分泌タンパク質のアミノ末端にあり、タンパク質がＥＲ膜を横断した後、シグナルペプチダーゼにより切断除去されることが多い（しかし全てがそうではない。）。分泌される配列には、一般に、それ自身のシグナル配列が含まれる（しかし必ずしもそうではない。）。ネイティブシグナル配列がない場合、異種シグナル配列を選択された配列に融合させることができる。多くのシグナル配列は当技術分野で公知であり、ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬなどの配列データベースから入手可能である。翻訳制御エレメントには、発現されるべき各個別のポリペプチドに対する、翻訳開始部位（ＡＵＧ）、停止コドン及びポリＡシグナルが含まれる。配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）はいくつかのコンストラクト中に含まれる。
【００６６】
本発明での使用のためのプロモーターには、ウイルス、哺乳動物及び酵母プロモーター、例えば、マウスβグロブリンプロモーター、ユビキチンプロモーター、ポリオーマプロモーター、哺乳動物サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、酵母アルコールオキシダーゼ、ホスホグリセロキナーゼプロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、ガラクトシダーゼプロモーター、アデノ関連ウイルスプロモーター、ポックスウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡプロモーター、チミジンキナーゼプロモーター、Ｈ５Ｒポックスウイルスプロモーター、アデノウイルス２型ＭＰＣ後期プロモーター、α−アントリプシンプロモーター、フォックスＩＸプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ＣＦＴＲサーファクタントプロモーター、アルブミンプロモーター及びトランスフェリンプロモーターが含まれる。本発明の核酸及び発現ベクターとの使用のために選択されたプロモーターは、（１）例えば関心のある遺伝子の発現を推進することにおける高レベル発現又は（２）例えば選択可能マーカー遺伝子の発現を推進することにおける、発現レベル低下（修飾による減弱後）をもたらし得る。好ましくは、関心のある遺伝子を推進するプロモーターは、発現を向上させ、関心のある産物の適正なスプライシングを促進するための、強力なプロモーター、例えば、ユビキチン、ＣＭＶ、ＥＦ−１α及びＳＲαプロモーターである。
【００６７】
ある実施形態において、本発明のベクターには、関心のある遺伝子の発現を推進するためのＣＭＶプロモーターが含まれる。ＣＭＶプロモーターの使用は、本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第５，３８５，８３９号及び同第５，８４９，５２２号に記載されている。ある実施形態において、本発明のベクターにおいて使用されるＣＭＶプロモーターは、関心のある遺伝子及び配列番号１の１から６０８のヌクレオチドに操作可能に連結される。配列番号１のヌクレオチド１から６０８と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＣＭＶプロモーター配列も本発明の範囲に含まれる。
【００６８】
本発明のベクターで使用され得る別のプロモーターは、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）、例えばヒトＥＦ−１αからのプロモーターである。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１４０２（ｇｉ：８３３６７０７８）でヒトＥＦ−１αプロモーターに対する配列を見出すことができる。ある実施形態において、本発明のベクターは、配列番号２のヌクレオチド７６から１２６７を含む。配列番号１のヌクレオチド１から６０８と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＥＦ−１αプロモーター配列も本発明の範囲に含まれる。
【００６９】
ある実施形態において、本ベクターは、クローニングのためのＳｗａＩ制限部位を含む。
【００７０】
通常、遺伝子（例えば選択可能マーカー及びＧＯＩ）は、プロモーターとポリアデニル化部位との間に挟まれる。使用されるポリＡ配列は、関心のある遺伝子由来であり得るか（即ちネイティブポリＡ配列が使用され得る。）又は異種ポリＡ配列（即ちＧＯＩとは異なる遺伝子由来）、例えば、ＢＧＨポリＡ及びＳＶ４０ポリＡが使用され得る。ｍＲＮＡは、プロモーターから転写され、コード領域に対して３’に位置するポリアデニル化シグナルにより安定化される。ポリＡシグナルは当技術分野で周知であり、本発明で使用されるベクター及び宿主細胞との使用のために安定性に基づき選択され得る。使用することができるポリＡシグナルの例には、ヒトＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０ポリＡ、ヒトβアクチンポリＡ、ウサギβグロブリンポリＡ及び免疫グロブリンκポリＡが含まれる。
【００７１】
本発明のベクターには、関心のある遺伝子が含まれ、このベクターは細胞培養で発現させるための手段である。関心のある遺伝子は、機能的な核酸分子（例えば、アンチセンスＲＮＡ分子などのＲＮＡ）をコードし得るか又は、より一般的には、産生増加が所望される、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする。本発明のベクターは、関心のある遺伝子を有し得、これは、関心のある遺伝子の発現を可能にする制御核酸配列に関心のある遺伝子が操作可能に連結されるように、挿入部位に挿入される。ある実施形態において、基本的に何らかの関心のある遺伝子、特に治療的に有用な活性又はその他の商業的に適切な適用を有する組み換えタンパク質をコードする遺伝子を発現させるために、本発明のベクターを使用することができる。
【００７２】
関心のある遺伝子の非限定例には、ホルモン、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、抗体、受容体、接着分子及び酵素が含まれる。所望の産物の限定的な一覧には、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン成長、黄体形成ホルモン；ホルモン放出因子；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；カルシトニン；グルカゴン；レニンなどの分子；第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子及びフォン・ウィルブラント因子などの凝固因子；タンパク質Ｃ、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタントなどの抗凝固因子；ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−α及び−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−Ｉ−α）；ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン；ミュラー管退縮因子；リラキシンＡ−又はＢ−鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；ホルモン又は成長因子に対する受容体；インテグリン；タンパク質Ａ又はＤ；リウマチ因子；骨由来栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５又はＮＴ−６）などの栄養因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ＮＧＦ−βなどの神経成長因子を含む成長（増殖）因子；血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６などの線維芽細胞増殖因子；上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４又はＴＧＦ−β５を含む。）などの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び-ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−α、−β及び−γなどのインターフェロン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−３３；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ−細胞受容体；表面膜タンパク質、例えば、ＨＥＲ２；分解促進因子；例えばＡＩＤＳエンベロープの一部などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；成長（増殖）因子、サイトカイン、ケモカイン及びリンホカインに対する受容体；調節タンパク質；抗体；イムノアドへシンなどのキメラタンパク質及び上記で列挙したポリペプチドのいずれかの断片が含まれる。細菌ポリペプチド又はタンパク質の例には、例えばアルカリホスファターゼ及びβ−ラクタマーゼが含まれる。
【００７３】
本発明のある態様において、本ベクターは、挿入部位に操作可能に連結される抗体重又は軽鎖領域を含む。２個のエピソーム複製起点及び抗体の軽又は重鎖定常領域を含むベクターの例は、配列番号３−３２で見出され得る。
【００７４】
本発明のある実施形態は、完全な抗体、即ち重又は軽鎖のいずれかに対する定常領域に連結される可変領域を発現させるために使用することができるベクターを含む。従って、関心のある遺伝子は、いずれかの抗体タイプ、例えば、マウス、キメラ、ヒト化及びヒトであり得る、抗体重鎖又は軽鎖可変領域をコードし得る。重鎖又は軽鎖可変領域をコードする関心のある遺伝子は、全長可変領域を含み得るか又はあるいは、重鎖又は軽鎖の断片のみ、例えば抗原結合部分領域をコードし得る。ある実施形態において、関心のある遺伝子は、マウス又はヒト抗体可変領域をコードする。このような例において、定常領域は、可変領域の種と一致し得る（配列番号３−８、２７及び２８はマウス定常領域をコードし、一方、配列番号９−２６及び２９−３２はヒト定常領域をコードする。）。
【００７５】
ある実施形態において、本発明のベクターには、ある一定のアイソタイプ及び／又はアロタイプ特性を有する抗体重鎖定常領域をコードする核酸配列が含まれる。重鎖定常領域は、例えば、γ１、γ２、γ３又はγ４などのγアイソタイプ（ＩｇＧ）であり得る。ある実施形態において、重鎖γ１定常領域は、以下に限定されないが、アロタイプ  ｚ，ａ及びｚ，ｎｏｎ−ａを含む、ある一定のアロタイプである。ｚ，ａ、アロタイプはまた、Ｇ１ｍ１７及びＧ１ｍ１アロタイプとしても知られており、位置２１４（ＣＨ１内）にＬｙｓ、３５６（ＣＨ３）にＡｓｐ及び３５８（ＣＨ３）にＬｅｕ（ＥＵ付番システムに従い付番）があるＩＧＨＧ１に対応する。ｚ，ｎｏｎ−ａアロタイプはまた、Ｇ１ｍ１７及びｎＧ１ｍ１アロタイプとしても知られており、位置２１４（ＣＨ１内）にＬｙｓ、３５６（ＣＨ３）にＧｌｕ及び３５８（ＣＨ３）にＭｅｔがあるＩＧＨＧ１に対応する（ＥＵ付番システムに従い付番）。
【００７６】
別の実施形態において、重鎖γ２定常領域（ｈｃＧ２）は、以下に限定されないが、ｎ−又はｎ＋を含む、ある一定のアロタイプである。Ｇ２ｍ（ｎ）又はＧ２ｍ（２３）としても知られるｈｃＧ２のｎ＋アロタイプは、ＣＨ１の位置１８９にＴｈｒ及び位置２８２にＭｅｔがあるＩＧＨＧ２に対応する（ＥＵ付番システムに従い付番）。Ｇ２ｍ（ｎ−）としても知られるｈｃＧ２のｎ−アロタイプは、ＣＨ１の位置１８９にＰｒｏ及び位置２８２にＶａｌがあるＩＧＨＧ２に対応する（ＥＵ付番システムに従い付番）。ｎ＋及びｎ−アロタイプのさらなる詳細は、Ｈｏｕｇｓら（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５２：２４２及びＢｒｕｓｃｏら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２：４１４に記載されている。
【００７７】
その他の実施形態において、重鎖定常領域は、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ又はＩｇＥアイソタイプであり得る。
【００７８】
ある実施形態において、重鎖定常領域は、次のヒトアイソタイプ及びアロタイプ特性：γ１，ｚ，ａ；γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ；γ２，ｎ＋；γ２，ｎ−；又はγ４を有し得る。ある実施形態において、アイソタイプ／アロタイプγ１，ｚ，ｎｏｎ−ａは、重鎖定常領域の位置２３４に突然変異を含み得る。さらなる実施形態にいおて、アイソタイプ／アロタイプγ１，ｚ，ｎｏｎ−ａは、重鎖定常領域の位置２３４及び２３５又は２３４及び２３７に突然変異を含み得る。このようなベクターの例は、図８から２５で提供される。
【００７９】
別の例において、本発明のベクター中でコードされる軽鎖定常領域は、κアイソタイプ又はλアイソタイプを含み得る。
【００８０】
本発明のベクターによりコードされる定常領域は、ヒトに限定されないが、しかし、かわりに定常領域のマウス又はその他の種を含み得る。ある実施形態において、本発明の発現ベクターは、マウスγ１アイソタイプ又はマウスγ２ａアイソタイプのいずれかである重鎖定常領域又はマウスκアイソタイプである軽鎖定常領域をコードする核酸を含む。
【００８１】
２つの本発明のベクター、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥは、これらのベクターが定常領域を含有しない空のベクターであり、関心のある遺伝子をクローニングするために使用され得る。ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥの説明を下記で与え、これらのベクターのマップは図１及び２で見出すことができる。
【００８２】
ｐＨｙｂＣ
ｐＨｙｂＣベクター（空）は、様々な細胞株中でこのベクターが複製され得るように、２個のウイルス複製起点を含有する。ｐＨｙｂＣは、次のエレメントを含有する：ＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質を発現する細胞（例えばＣＯＳ７細胞）でベクタープラスミド複製を可能にする、ＳＶ４０複製起点（「ＳＶ４０  Ｏｒｉ」）；関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結される、ＣＭＶプロモーター（「ｐＣＭＶ」）；３成分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列（ＴＰＬ）；スプライスドナー部位（ＳＤ）；アデノウイルス主要後期エンハンサーエレメント（ｅｎｈＭＬＰ）；スプライス受容部位（ＳＡ）；関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）領域とそれに続くポリＡシグナル（ｐＡ）；二重対称エレメント（ＤＳ）；ウイルスＥＢＮＡ−１タンパク質を発現する細胞（例えばＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞）でのベクタープラスミドの複製を可能にする、エプスタインバーウイルス由来真核性複製起点（ＯｒｉＰ）；反復領域（ＦＲ）；アンピシリン耐性マーカー（ＡｍｐＲ）；及び細菌複製起点（ｐＭＢ１ｏｒｉ）。ｐＨｙｂＣベクターは、入手可能な最強プロモーターエレメントの１つであるｐＣＭＶプロモーターを使用する。ｐＨｙｂＣ（空）のベクターマップは図１に記載する。ｐＨｙｂＣベクターの核酸配列は配列番号１で示す。
【００８３】
ｐＨｙｂＥ
ｐＨｙｂＥベクター（空）は、異なる細胞株中でこのベクターが複製され得るように、２つの複製起点を含有する。ｐＨｙｂＥは、次のエレメントを含有する：ＳＶ４０のラージＴ抗原タンパク質を発現する細胞（例えばＣＯＳ７細胞）でのベクタープラスミド複製を可能にする、ＳＶ４０複製起点（「ＳＶ４０  Ｏｒｉ」）；関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結される、ＥＦ−１α真核性プロモーター；関心のある遺伝子に対するオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）領域と、それに続くポリＡシグナル（ｐＡ）；二重対称（ｄｙａｄ  ｓｙｍｍｅｔｒｙ）エレメント（ＤＳ）；エプスタインバーウイルス由来真核複製起点（ＯｒｉＰ）；反復領域（ＦＲ）；アンピシリン耐性マーカー（ＡｍｐＲ）；及び細菌複製起点（ｐＭＢ１ｏｒｉ）。ｐＨｙｂＥ（空）のベクターマップは図２に記載する。ｐＨｙｂＥは、ｐＨｙｂＥが関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるＥＦ−１αプロモーターを含有し、一方ｐＨｙｂＣがＣＭＶプロモーターを含有するという点で、ｐＨｙｂＣとは区別される。ｐＨｙｂＥベクターの核酸配列は配列番号２で示す。
【００８４】
下記ベクターは、ｐＨｙｂＥ又はｐＨｙｂＣのいずれかに基づき、免疫グロブリン重又は軽鎖定常領域をさらに含有する。ｐＨｙｂＥ及びｐＨｙｂＣのように、次のベクターは、関心のある遺伝子、例えば免疫グロブリン可変領域又はその抗原結合部分のコード配列の挿入のために使用され得るクローニング部位を有する。各例において、関心のある遺伝子に対するクローニング部位は、ベクター内に含有される定常領域のコード配列に隣接する。従って、下記のベクターは、特定の定常領域及び特定の可変領域を含有する抗体軽又は重鎖を発現させるために使用され得る。ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥのように、下記の本発明のベクターのそれぞれは、同じベクターを用いて抗体軽又は重鎖が様々な細胞株で発現され得るように、複数の複製起点を含有する。本発明のさらなるベクターの説明は以下に記載する（図８から２５で与えられるベクターマップも参照）。注目すべきことに、バージョン１（Ｖ１）として記載されるｐＨｙｂベクターは、ＳｒｆＩ制限部位の上流にさらなるＳｗａＩ部位を有し、一方、バージョン２（Ｖ２）として記載されるｐＨｙｂベクターにはさらなるＳｗａＩ部位がない。
【００８５】
マウス定常領域を含む本発明のベクター
ｐＨｙｂＣ−ｍＣｇ２ａ
ベクターｐＨｙｂＣ−ｍＣｇ２ａは、ｐＨｙｂＣベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＣに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ２ａ重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＣ−ｍＣｇ２ａベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域（又はその一部）及びマウスγ２重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＣ−ｍＣｇ２は、γ２重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。図８は、関心のある遺伝子としてマウスＢＲ３タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するコード配列を含むｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−ｍＣｇ２のマップを示す。ｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−ｍＣｇ２ａの核酸配列は配列番号２７で示す。
【００８６】
ｐＨｙｂＥ−ｍＣｋ
ベクターｐＨｙｂＥ−ｍＣｋは、ｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。ｐＨｙｂＥ−ｍＣｋは、κ軽鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｋベクターは、免疫グロブリン軽鎖可変領域及びマウスκ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｋは、マウスκ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。ｐＨｙｂＥ−ｍＣｋ  Ｖ２のベクターマップは図２５で与える。ｐＨｙｂＥ−ｍＣｋ  Ｖ１の核酸配列ば配列番号３で示し、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｋ  Ｖ２の核酸配列は配列番号４で示す。
【００８７】
ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ１
ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ１は、ｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ１重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ１ベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及びマウスγ１重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ１は、マウスγ１重鎖定常領域に融合される関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ１  Ｖ２のベクターマップは図２１で与える。ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ１  Ｖ１の核酸配列は配列番号５で示し、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ１  Ｖ２の核酸配列は配列番号６で示す。
【００８８】
ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２ａ
ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２ａはｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ２ａ重鎖定常領域に対するマウス免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２ａベクターは、免疫グロブリン重鎖可変領域及びマウスγ２重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２ａは、γ２重鎖定常領域に融合される関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２ａ  Ｖ２のベクターマップは図２２で与える。ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２ａ  Ｖ１の核酸配列は配列番号７として示し、ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２ａ  Ｖ２の核酸配列は配列番号８で示す。ｐＨｙｂＥ−ｍＣｇ２がどのように使用され得るかというある実施形態の例として、図９は、ｐＨｙｂＥ−ｍＢＲ３−ｍＣｇ２ａのマップを示す。図９に記載のベクターは、マウスＢＲ３タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するコード配列を含有する。ｐＨｙｂＥ−ｍＢＲ３−ｍＣｇ２ａの核酸配列は配列番号２８で示す。
【００８９】
ヒト定常領域を含む本発明のベクター
ｐＨｙｂＣ−Ｅ７−ｈＣｋ
ｐＨｙｂＣ−Ｅ７−ｈＣｋは、ｐＨｙｂＣベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＣに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、κ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。さらに、ｐＨｙｂＣ−Ｅ７−ｈＣｋは、アダリムマブの軽鎖可変領域のコード配列を含有する（「Ｅ７」とも呼ばれる。）。ｐＨｙｂＣ−Ｅ７−ｈＣｋのベクターマップは図１０で与え、ｐＨｙｂＣ−Ｅ７−ｈＣｋの核酸配列は配列番号２９で示す。
【００９０】
ｐＨｙｂＣ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａ
ｐＨｙｂＣ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａは、ｐＨｙｂＣベクターに基づく（従って、ｐＨｙｂＣに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ１，ｚ，ａ重鎖定常領域に対するコード配列も含む。さらに、ｐＨｙｂＣ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａは、アダリムマブの重鎖可変領域のコード配列を含有する（「Ｄ２」とも呼ばれる。）。ｐＨｙｂＣ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａのベクターマップは図１１で与える。ｐＨｙｂＣ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａの核酸配列は配列番号３０で示す。
【００９１】
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋはｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、κ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、例えば、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋベクターは、免疫グロブリン可変軽鎖領域及びヒトκ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋは、κ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ  Ｖ２のベクターマップは図２３で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ  Ｖ１の核酸配列は配列番号９で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｋ  Ｖ２の核酸配列は配列番号１０で示す。ｐＨｙｂＥ−Ｅ７−ｈＣｋのベクターマップもまた図１３で与える。上述のｐＨｙｂＥ−ｈＣｋベクターのエレメント全てに加えて、ｐＨｙｂＥ−Ｅ７−ｈＣｋは、アダリムマブの軽鎖可変領域のコード配列を含有する（「Ｅ７」とも呼ばれる。）。ｐＨｙｂＥ−Ｅ７−ｈＣｋの核酸配列は配列番号３２で示す。
【００９２】
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌ
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌはｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、λ軽鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌベクターは、免疫グロブリン可変軽鎖領域及びヒトλ軽鎖定常領域を含む抗体軽鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌは、λ軽鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌ  Ｖ２のベクターマップは図２４で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌ  Ｖ１の核酸配列は配列番号１１で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌ  Ｖ２の核酸配列は配列番号１２で示す。
【００９３】
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａ
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａは、ｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ１，ｚ，ａ重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ１，ｚ，ａ重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａは、γ１，ｚ，ａ重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａのベクターマップは図１４で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａ  Ｖ１の核酸配列は配列番号１３で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａ  Ｖ２の核酸配列は配列番号１４で示す。ｐＨｙｂＥ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａに対するベクターマップは図１２で与える。上述のｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ａのエレメントに加えて、ｐＨｙｂＥ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａは、アダリムマブの重鎖可変領域（「Ｄ２」とも呼ばれる。）のコード配列を含有する。ｐＨｙｂＥ−Ｄ２−ｈＣｇ１，ｚ，ａの核酸配列は配列番号３１で示す。
【００９４】
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａはｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａは、γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ  Ｖ２のベクターマップは図１５で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ  Ｖ１の核酸配列は配列番号１５で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ  Ｖ２の核酸配列は配列番号１６で示す。
【００９５】
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）はｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）は、γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）Ｖ２のベクターマップは図１６で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈｃＧ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）Ｖ１の核酸配列は配列番号１７で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３５）Ｖ２の核酸配列は配列番号１８で示す。
【００９６】
ｐＨｖｂＥ−ｈＣｇ１、ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）はｐＨｙｂＥベクターに基づく。（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）は、γ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）Ｖ２のベクターマップは図１７で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）Ｖ１の核酸配列は配列番号１９で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ１，ｚ，ｎｏｎ−ａ，ｍｕｔ（２３４，２３７）Ｖ２の核酸配列は配列番号２０で示す。
【００９７】
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ−
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ−はｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまたγ２，ｎ−重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ−ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ２，ｎ−重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ−は、γ２，ｎ−重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ−Ｖ２のベクターマップは図１９で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ−Ｖ１の核酸配列は配列番号２１で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ−Ｖ２の核酸配列は配列番号２２で示す。
【００９８】
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ＋
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ＋はｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ２，ｎ＋重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ＋ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ２，ｎ＋重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ＋は、γ２，ｎ＋重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ＋のベクターマップは図１８で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ＋Ｖ１の核酸配列は配列番号２３で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ２，ｎ＋Ｖ２の核酸配列は配列番号２４で示す。
【００９９】
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ４
ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ４はｐＨｙｂＥベクターに基づく（従ってｐＨｙｂＥに対する上述のエレメント全てを含有する。）。このベクターはまた、γ４重鎖定常領域に対するヒト免疫グロブリンコード配列も含む。従って、ある実施形態において、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ４ベクターは、免疫グロブリン可変重鎖領域及びヒトγ４重鎖定常領域を含む抗体重鎖を発現させるために使用され得る。あるいは、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ４は、γ４重鎖定常領域に融合された関心のある遺伝子を発現させるために使用され得る（例えばＦｃ融合タンパク質）。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ４のベクターマップは図２０で与える。ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ４  Ｖ１の核酸配列は配列番号２５で示し、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｇ４  Ｖ２の核酸配列は列番号２６で示す。
【０１００】
本発明のベクターの配列は配列番号１−３２で与える。ある実施形態において、本発明のベクターは、配列番号１−３２のいずれか１つで示される配列又はそれらと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含む。
【０１０１】
本発明は、特異的細胞標的、例えば上述のタンパク質のいずれか、ヒトＥＧＦ受容体、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ抗原、ＣＥＡ抗原、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ５、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＮＧＦ、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ５２、Ｅｐ−ｃａｍ、その他の癌細胞表面分子、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ｂ１、ＶＥＧＦ、その他のサイトカイン、α４β７インテグリン、ＩｇＥ、ウイルス性タンパク質（例えばサイトメガロウイルス）を免疫特異的に認識するヒト及び／又はヒト化抗体の産生において使用され得る。本発明の組成物及び方法を用いて作製され得る抗体の例には、以下に限定されないが、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１８抗体及び抗ＥＰＯ受容体（ＥＰＯ−Ｒ）抗体が含まれる。ある実施形態において、抗ＴＮＦα抗体は、完全ヒト抗ＴＮＦα抗体、例えば、アダリムマブ／Ｄ２Ｅ７である（本明細書中に参照により組み込まれる、米国特許第６，０９０，３８２号参照；Ｈｕｍｉｒａ（Ｒ）；Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。ある実施形態において、抗ＩＬ−１２抗体は、完全ヒト抗ＩＬ−１２抗体、例えば、ＡＢＴ−８７４である（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；本明細書中に参照により組み込まれる、米国特許第６，９１４，１２８号参照）。ある実施形態において、抗ＩＬ−１８抗体は、完全ヒトＩＬ−１８抗体（例えばＡＢＴ−３２５）であり、例えば本明細書中に参照により組み込まれる、ＵＳ２００５０１４７６１０Ａ１に記載の抗体も参照のこと。ある実施形態において、抗ＥＰＯ／Ｒ（ＡＢＴ−００７とも呼ばれる。）抗体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願ＵＳ２００６００１８９０２Ａ１に記載のような、完全ヒト抗体である。
【０１０２】
さらに、本ベクターにおいてコードされる定常領域はまた、融合タンパク質（例えばＦｃ−融合タンパク質）を形成させるためにタンパク質に定常領域、例えばＦｃドメインを操作可能に連結するためにも使用され得る。従って、本発明の方法及び組成物を用いて作製され得るタンパク質のこのタイプの別の例には、融合タンパク質が含まれる。このような融合タンパク質の例には、免疫グロブリン分子の一部との融合物として発現されるタンパク質、ジッパー部分との融合タンパク質として発現されるタンパク質及び新規多機能性タンパク質、例えばサイトカイン及び成長（増殖）因子（即ち、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−３、ＭＧＦ及びＩＬ−３）の融合タンパク質など、が含まれる。ＷＯ９３／０８２０７及びＷＯ９６／４０９１８は、それぞれ、免疫グロブリン融合タンパク質及びジッパー融合タンパク質を含む、ＣＤ４０Ｌと呼ばれる分子の様々な可溶性オリゴマー形態の調製を記載し；そこで考察される技術は、その他のタンパク質に適用可能である。別の融合タンパク質は、エンタネルセプト（ｅｎｔａｎｅｒｃｅｐｔ）としても知られる、組み換えＴＮＦＲ：Ｆｃである。エンタネルセプト（ｅｎｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（又はＥｎｂｒｅｌ（Ｒ）；Ａｍｇｅｎ／Ｗｙｅｔｈ）は、ｐ７５ＴＮＦα受容体の細胞外部分の２つの分子（各分子は、ヒトＩｇＧ１の２３２個のアミノ酸Ｆｃ部分に融合される２３５個のアミノ酸ＴＮＦＲ−由来ポリペプチドからなる。）の二量体である。実際、以下に限定されないが、細胞性受容体分子の細胞外ドメイン、酵素、ホルモン、サイトカイン、免疫グロブリン分子の一部、ジッパードメイン及びエピトープを含め、融合タンパク質として、あらゆる分子を発現させることができる。
【０１０３】
核酸及びアミノ酸「配列同一性」を決定するための技術もまた当技術分野で公知である。通常、このような技術には、遺伝子に対するｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること及び／又はそれによりコードされるアミノ酸配列を決定すること及び第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列とこれらの配列を比較することが含まれる。一般に、「同一性」とは、それぞれ２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の、正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の一致を指す。２以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）の「％同一性」を決定することによって、それらを比較することができる。核酸であれ又はアミノ酸配列であれ、２つの配列の％同一性は、２つの整列化された配列間の完全な一致の数をより短い配列の長さで除して、１００を掛けたものである。核酸配列に対するおおよそのアラインメントはＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的な相同性アルゴリズムにより与えられる。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５  ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．ＵＳＡにより開発されたスコアリングマトリクスを使用することによって、アミノ酸配列に対して適用することができ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）により正規化される。配列の％同一性を決定するためのこのアルゴリズムの典型的な実施は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）により与えられる。この方法に対する初期設定パラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．から入手可能）に記載されている。本発明と関連して％同一性を定める好ましい方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋにより開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）により配布されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有する。）を使用することである。このパッケージ一式から、スコアリング表に対して初期設定パラメータ（例えば、ギャップオープンペナルティーが１２、ギャップ伸長ペナルティーが１及びギャップが６）が使用される場合、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｎａｎアルゴリズムを利用することができる。生成されるデータから、「マッチ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の％同一性又は類似性を計算するためのその他の適切なプログラムは、一般に当技術分野で公知である。
【０１０４】
２つの核酸断片は、本明細書中で記載されるように、「選択的にハイブリッド形成する」と考えられる。２つの核酸分子間の配列同一性の程度は、このような分子間のハイブリッド形成事象の効率及び強度に影響する。部分的に同一である核酸配列は、完全に同一である配列が標的分子とハイブリッド形成することを少なくとも部分的に阻害する。当技術分野で周知のハイブリッド形成アッセイを用いて、完全に同一である配列のハイブリッド形成の阻害を評価することができる（例えば、サザンブロット、ノザンブロット、溶液ハイブリッド形成など、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；又はＡｕｓｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）参照）。様々な選択性の程度を使用して、例えば、低から高ストリンジェンシーまで変化する条件を使用して、このようなアッセイを行うことができる。低ストリンジェンシー条件が使用される場合、非特異的結合事象がないときに二次プローブが標的とハイブリッド形成しないように、部分的にすら配列同一性がない二次プローブ（例えば、標的分子との配列同一性が約３０％未満であるプローブ）を用いて、非特異的結合がないことを評価することができる。
【０１０５】
ハイブリッド形成に基づく検出系を利用する場合、標的核酸配列と相補的であり、適切な条件の選択により、プローブ及び標的配列が、ハイブリッド分子を形成するために「選択的にハイブリッド形成する」か又は互いに結合する、核酸プローブが選択される。「中程度にストリンジェント」な条件下で標的配列に選択的にハイブリッド形成することができる核酸分子は、通常、選択された核酸プローブの配列と少なくともおよそ７０％配列同一性を有する少なくとも約１０−１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリッド形成する。ストリンジェントなハイブリッド形成条件は、通常、選択された核酸プローブの配列と約９０−９５％を超える配列同一性を有する少なくとも約１０−１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ及び標的が具体的な程度の配列同一性を有する場合のプローブ／標的ハイブリッド形成に有用なハイブリッド形成条件は、当技術分野で知られるように決定することができる（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（１９８５）Ｏｘｆｏｒｄ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．；ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ参照）。
【０１０６】
ハイブリッド形成に対するストリンジェンシー条件に関して、例えば次の因子：プローブ及び標的配列の長さ及び性質、様々な配列の基本組成、塩及びその他のハイブリッド形成溶液成分の濃度、ハイブリッド形成溶液中のブロッキング剤又は界面活性剤（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン及びポリエチレングリコール及びドデシル硫酸ナトリウム）の有無、ハイブリッド形成反応温度及び時間パラメータを変化させ、ならびに洗浄条件を変化させることによって、特定のストリンジェンシーを確立するために、多くの同等の条件を使用することができることは当技術分野で周知である。特定の一連のハイブリッド形成条件の選択は、当技術分野における標準的方法に従い選択される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出又はＡｕｓｂｅｌら、前出参照）。第一のポリヌクレオチドは、それが第二のポリヌクレオチドの領域、そのｃＤＮＡ、その相補体と、同じ又は実質的に同じ塩基対配列を有する場合、又はそれが、上述のような配列同一性を示す場合、第二のポリヌクレオチド「由来」である。第一のポリペプチドは、それが（ｉ）第二のポリヌクレオチド由来の第一のポリヌクレオチドによりコードされるか又は（ｉｉ）上述のように第二のポリペプチドと配列同一性を示す場合、第二のポリペプチド「由来」である。
【０１０７】
本発明はまた、バイアルなどの適切な容器中に１以上の本発明のベクターを含有するキットも提供する。発現ベクターは、選択された関心のある配列の挿入のための少なくとも１つのクローニング部位を含有し得るか又は特異的な関心のある遺伝子が既にそのベクターに存在し得る。このベクターは、乾燥又は凍結乾燥形態で又は水溶液中で提供され得る。本キットは、乾燥ポリヌクレオチドを再構成するための緩衝液を含み得る。本キットには、その他の試薬、例えば、反応緩衝液、比較用の陽性及び陰性対照ベクターが含まれ得る。通常、本キットはまた、その中の試薬の使用に関する説明書も含み得る。
【０１０８】
ＩＩＩ．本発明のベクターの使用
本発明は、本明細書中に記載のベクターを用いてタンパク質を発現させる方法を含む。従って、本発明は、本発明の発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入し、タンパク質を発現させるために適切な条件下でその哺乳動物宿主細胞を培養し、タンパク質を回収することを含む、組み換えタンパク質を産生させる方法を含む。本発明のベクターの長所は、それが、哺乳動物細胞培養系を用いて高いタンパク質産生をもたらすことである。
【０１０９】
本発明において、本発明の核酸又は発現ベクターを介して遺伝子発現可能なあらゆる細胞型を宿主細胞として使用することができる。「宿主細胞」という用語は、組み換えＤＮＡ技術を用いて構築されたベクターにより形質転換されている細胞を指す。
【０１１０】
当業者は、本発明のベクターを介してＧＯＩ及び選択可能マーカー遺伝子を発現させるために最適である特定の宿主細胞株を選択することができる。本発明で使用することができる細胞には、哺乳動物細胞及び細胞株及びそれら由来の細胞培養物が含まれる。哺乳動物細胞、例えば生殖細胞又は体細胞、は、マウス、ラットもしくはその他のげっ歯類などの哺乳動物又はヒトもしくはサルなどの霊長類由来であり得る。本発明の技術を遂行する際に初代細胞培養又は不死化細胞を使用することができることを理解されたい。
【０１１１】
特定の実施形態において、細胞型は、以下に限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えばＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１；Ｕｒｌａｕｂら、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５、１９８６；Ｈａｙｎｅｓら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１１：６８７−７０６、１９８３；Ｌａｕら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１４６９−１４７５、１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９９１、ｖｏｌ．１８５、ｐｐ５３７−５６６。Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、チャイニーズハムスター繊維芽細胞（例えばＲ１６１０）、ヒト子宮頸癌（例えばＨＥＬＡ）、サル腎臓株（例えばＣＶＩ及びＣＯＳ）、マウス繊維芽細胞（例えばＢＡＬＢｃ／３Ｔ３）、マウス骨髄腫（Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３；ＮＳ０；ＳＰ２／Ｏ）、ハムスター腎臓株（例えばＨＡＫ）、マウスＬ細胞（例えばＬ−９２９）、ヒトリンパ球（例えばＲＡＪＩ）、ヒト腎臓（例えば２９３及び２９３Ｔ）を含む、哺乳動物由来である。宿主細胞株は、通常、市販されているか（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｋｙ．；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ）から入手可能である。
【０１１２】
好ましい実施形態において、本発明で使用される宿主細胞は、本発明のベクターに含まれる少なくとも１つの複製起点に対応する複製開始因子をトランスで提供する。例えば、ベクターが、ＳＶ４０起点及びＯｒｉＰ起点に対応する２つの複製起点を含む場合、ラージＴ抗原又はＥＢＮＡタンパク質のいずれかを発現する何らかの細胞株、好ましくは哺乳動物細胞株、を使用することができる。ある実施形態において、ＣＯＳ細胞又はヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞を本ベクターで形質転換する。例えば、ＣＯＳ７細胞は、ＳＶ４０の起点欠失突然変異体により形質転換されたＣＶ−１サル細胞由来である（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。ＥＢＮＡは、例えばＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞を使用することにより提供され得る。
【０１１３】
ゲノム内に複製開始因子を安定的に組み込んだ細胞株は、複製開始因子の安定な長期発現及び複製の長期的支持及び複製起点含有プラスミドの維持の長所を有する。ＥＢＮＡ−１を発現する市販の細胞株の例は、ＡＴＣＣ：２９３ＨＥＫ−ＥＢＮＡ１及びＣＶ１−ＥＢＮＡ１である。少なくとも１つの複製開始因子、好ましくは、ＥＢＮＡ１タンパク質又はＳＶ４０ラージＴ抗原を過剰発現する特異的な細胞株は、安定した細胞クローンの遺伝子移入及び選択により作製することができる。
【０１１４】
当技術分野で周知の様々な技術によって、適切な宿主細胞に核酸及び発現ベクターを導入するか又は形質転換することができる（例えば、Ｒｉｄｇｗａｙ、１９７３、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２、ｐｐ．４７０−４７２、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ及びＤｅｎｈａｒｄｔ編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．；Ｇｒａｈａｍら、１９７３、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｄａｖｉｓら、１９８６、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及びＣｈｕら、１９８１、Ｇｅｎｅ  １３：１９７参照）。「形質転換」及び「遺伝子移入」という用語及びそれらの文法的変異は、本明細書中で交換可能に使用され、実用的な何らかの手段による、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指す。外来核酸が細胞膜の内側に導入されている場合、細胞は「形質転換」されている。取り込みが完遂される手段（遺伝子移入（電気穿孔法を含む。）、原形質融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープ付きＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション及びインタクトなウイルスでの感染を含み得る。）にかかわらず、核酸の取り込みの結果、安定した形質転換体が得られる。正常レベルより高い一時的発現さえも、機能試験又は関心のあるタンパク質の産生及び回収に有用である。関心のあるタンパク質の産生に適切な条件下で、形質転換された細胞を増殖させ（例えば、ある実施形態において、抗体重及び／又は軽鎖）、コードされる関心のあるポリペプチドを同定するためにアッセイを行う。遺伝子産物を同定し、定量するための典型的アッセイ技術には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は蛍光活性化細胞分類分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが含まれる。
【０１１５】
標準的細胞培養技術に従い、本発明で使用される細胞を培養することができ、例えば、固体表面にそれらを固定し、適切な栄養培地中の縣濁液中で増殖させることができる。
【０１１６】
本明細書中に記載のベクターを含む哺乳動物宿主細胞も本発明により包含される。
【０１１７】
本発明の実施は、別段の断りがない限り、当技術分野の技術の範囲内である、分子生物学などの従来技術を使用する。このような技術は、文献で詳細に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ａｕｓｂｅｌら編、１９８７  改訂）；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔ．Ｂｒｏｗｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ（Ａ．Ｂｏｔｈｗｅｌｌら編、Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌ．１９９０）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｍ．Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｗｕら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）；ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ（Ｒ．Ａｄａｍｓ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  １９９０）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、１９９１）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄら編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、２．ｓｕｐ．ｎｄ．Ｅｄ．（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙら編、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  １９８７）；Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（Ｍ．Ｍｅｌａｍｅｄら編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  １９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；及びＡｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）；及びＷｉｒｔｈ  Ｍ．及びＨａｕｓｅｒ  Ｈ．（１９９３）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２  Ｐｕｈｌｅｒ  Ａ（編）ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｃｉｍ  ６６３−７４４参照。）。
【０１１８】
（実施例）
次の実施例は、様々な哺乳動物宿主細胞、例えば、ＣＯＳ７及びＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞に対して個別のベクター構築を不要にするための革新的な解決法を説明する。次の実施例はまた、抗体の完全な軽又は重鎖の発現における又はＦｃ融合タンパク質の発現における使用のための、抗体の定常領域をコードする核酸を含有するベクターも提供する。
【０１１９】
様々なその他のベクター、即ちｐＢＯＳ及びｐＴＴ３ベクターから選択される特性を組み合わせることによって、ｐＨｙｂ−Ｃ及びｐＨｙｂ−Ｅと呼ばれる２つの新しいベクター骨格を構築した（２００７年１２月２８日提出の「ＤＵＡＬ−ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＩＬ−１Ａ／ＩＬ−１ｂ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ」という題名の、米国仮出願第６０／８７８，１６５、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／２６４８２、及びＵＳＳＮ１２／００６，０６８（これら全ては本明細書中に参照により組み込まれる。）参照）。対照ベクターｐＢＯＳは、関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるＥＦ−１αプロモーターを含有し、ＳＶ４０複製起点を持つ。対照ベクターｐＴＴ３は、関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるＣＭＶプロモーター及びＥＢＮＡ複製起点（ＯｒｉＰ）を含有する。
【０１２０】
ＣＯＳ７及びＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞の両方における、マウスＢＲ３−Ｆｃ融合物及びヒト抗体（アダリムマブ）の両方のタンパク質発現を評価するために、本発明のベクターを試験した。ＣＯＳ７及びＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞における良好なタンパク質発現から、両細胞型における組み換え発現に対する一体化ベクター系が示される。
【実施例１】
【０１２１】
ベクターｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥの構築
図１及び２は、それぞれが２つの複製起点を含有する新しいベクターのマップを与える。図１及び２は、ベクターの「空」のものに相当し、即ち、関心のある遺伝子又は抗体定常領域の核酸を含有しない（下記実施例４で詳述）。ｐＨｙｂＣは、関心のある遺伝子に対する挿入部位に操作可能に連結されるＣＭＶプロモーターを含有し、一方、ｐＨｙｂＥはＥＦ−１αプロモーターを含有する。
【０１２２】
ｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−Ｆｃ構築のために（「ｍＢＲ３」は、第三のＢＬｙｓ受容体のマウス型を指し、本明細書中で使用される場合、具体的に、ｍＢＲ３タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）部分に対するコード配列を指す。）、増幅ＤＮＡ断片の５’及び３’両末端にＰｓｐＸＩ制限部位を導入するプライマーを用いて、ｐＥＦ−ＢＯＳベクターからのＳＶ４０複製起点領域をＰＣＲ増幅した。次に、ＰｓｐＸＩによりこの挿入断片を消化した。ＣＭＶプロモーターの上流にＳａｌＩ制限部位を有するｐＴＴ３−ｍＢＲ３−ＦｃコンストラクトをＳａｌＩで消化した。次に、ｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−Ｆｃベクターを作製するために、ｐＴＴ３−ｍＢＲ３−ＦｃのＳａｌＩ部位に、ＰｓｐＸＩ消化した挿入断片を結合させた。
【０１２３】
ｍＢＲ３細胞外ドメインを通じ、ＳＶ４０複製起点領域を含有する、５’末端ＰｓｐＸＩ修飾された断片化ＤＮＡをＰＣＲにより最初に増幅することによって、ｐＨｙｂＥ−ｍＢＲ３−Ｆｃコンストラクトを作製した。次に、５’でＰｓｐＸＩにより、３’でＢｓｐ６８Ｉにより（これは、ｍＢＲ３細胞外ドメイン配列の上流のリーダー配列において部位を有する。）この産物を消化し、続いて、ｐＨｙｂＥ−ｍＢＲ３−Ｆｃコンストラクトを作製するために、ＳａｌＩ及びＢｓｐ６８Ｉ消化したｐＴＴ３−ｍＢＲ３−Ｆｃコンストラクトに、この消化断片をサブクローニングした。
【０１２４】
それぞれ受容体−Ｆｃ融合タンパク質ｍＢＲ３−Ｆｃを発現する、ｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−Ｆｃ及びｐＨｙｂＥ−ｍＢＲ３−Ｆｃのマップは図８及び９で見出され得る。
【０１２５】
ｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−Ｆｃとして、即ち、既に構築された、ＳａｌＩにより予め消化されたｐＴＴ３−Ｅ７ベクターに、ｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−Ｆｃ（上述）の作製中に単離され消化された同じＰｓｐＸＩ消化ＳＶ４０  Ｏｒｉ領域を結合することにより、Ｄ２Ｅ７抗体（アダリムマブ）の軽鎖タンパク質を発現するｐＨｙｂＣ−Ｅ７ベクターを同様に構築した。
【０１２６】
ｐＨｙｂＥ−Ｅ７ベクター構築のために、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素での既存のｐＢＯＳ−Ｅ７ベクターの消化によって、挿入断片を作製した。次に、Ｄ２Ｅ７軽鎖タンパク質の発現のため、ｐＨｙｂＥ−Ｅ７を作製するために、同じ酵素で予め消化されたｐＨｙｂＣ−Ｅ７ベクターにこの挿入断片を結合させた。
【０１２７】
ｐＨｙｂＣ−Ｄ２及びｐＨｙｂＥ−Ｄ２ベクター構築のために、既存のｐＴＴ３−Ｄ２ベクターをＢｓｐ６８Ｉ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化することにより、Ｄ２Ｅ７抗体（アダリムマブ）の重鎖可変及び定常コード領域からなる挿入断片（即ち、Ｄ２重鎖コード配列）を作製した。Ｄ２Ｅ７抗体（アダリムマブ）の重鎖タンパク質の発現のための、それぞれｐＨｙｂＣ−Ｄ２及びｐＨｙｂＥ−Ｄ２作製するために、同じ酵素で予め消化したｐＨｙｂＣ−ｍＢＲ３−Ｆｃ及びｐＨｙｂＥ−ｍＢＲ３−Ｆｃベクターに、この挿入断片を結合させた。
【実施例２】
【０１２８】
タンパク質収率の比較
２つの複製起点の付加によるベクターサイズの上昇がそのベクターによるタンパク質産生に影響を与えたか否か判定するために、それぞれが１つの複製起点のみを含有した対照ベクターｐＢＯＳ及びｐＴＴ３と、上記のｐＨｙｂ−Ｅ及びｐＨｙｂ−Ｃベクターを比較した。ｐＢＯＳ、ｐＴＴ３、ｐＨｙｂ−Ｃ及びｐＨｙｂ−Ｅからの発現を比較するために、マウスＢＡＦＦ受容体−ヒトＦｃ融合タンパク質コンストラクト（ｍＢＲ３−Ｆｃ）を４つのベクター骨格にサブクローニングし、エンドフリーＤＮＡ  ｐｒｅｐキットにより平行して調製した。
【０１２９】
ｍＢＲ３−Ｆｃ配列を含有するこの４つのベクターをＣＯＳ細胞へと電気穿孔法で移入するか又はＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞へと遺伝子移入した（プロトコールは下記）。この細胞を５又は７日間温置した。培地試料を採取し、培地中のｍＢＲ３−Ｆｃ分泌タンパク質の濃度を測定した。ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡによりタイターを調べ、ＣＯＳ７細胞の場合は５日後及びＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞の場合は７日後の調整済み培地からのｍＢＲ３−Ｆｃタンパク質とＩｇＧタンパク質標準との間の分子量の差を調整した。ＥＬＩＳＡにおいて標準物質としてより大きなヒトＩｇＧタンパク質を使用することによる、ｍＢＲ３−Ｆｃタンパク質タイターの過大評価を回避するために、タイター調整が必要である。
【０１３０】
２９３遺伝子移入
本実験で使用される２９３の一時的遺伝子移入手順は、Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（２００２）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０（２）：Ｅ９及びＰｈａｍら（２００５）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９０（３）：３３２−４４で公開されている方法の変法であった。遺伝子移入において使用された試薬には次のものが含まれる。
【０１３１】
・１３０ｒｐｍ、３７℃及び５％ＣＯ２に設定された加湿恒温槽中で使い捨てエルレンマイヤーフラスコ中で培養したＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞（ＥＢＮＡ１を安定して発現するヒト胚腎臓細胞株；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｃａｎａｄａから得られる。）。
【０１３２】
・培養液：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現用培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２３３８−０１８）＋２５μｇ／ｍＬジェネティシン（Ｇ４１８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０１３１−０２７）及び０．１％プルロニックＦ−６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ２４０４０−０３２）。
【０１３３】
・遺伝子移入用培地：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現用培地＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５６３０−０８０）。
【０１３４】
・ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）保存液：１ｍｇ／ｍＬ滅菌保存溶液、ｐＨ７．０、直線状２５ｋＤａ  ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）で調製し、−１５℃未満で保存。
【０１３５】
・トリプトン供給培地：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現用培地中のトリプトンＮ１の５％ｗ／ｖ滅菌保存液（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、１９５５４）。
【０１３６】
遺伝子移入のための細胞調製：遺伝子移入のおよそ２−４時間前に、ＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞を遠心により回収し、およそ１００万個の細胞／ｍＬの細胞密度で培養液中で再懸濁した。各遺伝子移入に対して、細胞縣濁液４０ｍＬを使い捨て２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移し、２から４時間温置した。
【０１３７】
遺伝子移入：遺伝子移入液及びＰＥＩ保存液を予め室温（ＲＴ）に温めた。各遺伝子移入に対して、遺伝子移入液５ｍＬ中でプラスミドＤＮＡ２５μｇ及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）５０μｇを組み合わせ、ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体を形成させるためにＲＴで１５−２０分間温置した。ＢＲ３−Ｉｇ遺伝子移入に対して、１回の遺伝子移入あたり、ＢＲ３−Ｉｇプラスミド２５μｇを使用した。予め調製した４０ｍＬ培養物に各５ｍＬ  ＤＮＡ：ＰＥＩ複合体混合物を添加し、１３０ｒｐｍ、３７℃及び５％ＣＯ２に設定した加湿恒温槽に戻した。２０から２８時間後、トリプトン供給培地５ｍＬを各遺伝子移入に対して添加し、６日間培養を継続した。
【０１３８】
ＣＯＳ７細胞遺伝子移入
次のような標準的電気穿孔条件を用いて、１コンストラクトあたり２枚のＣＯＳ７  １５０ｍｍプレートを遺伝子移入した。ＣＯＳ７遺伝子移入実験に対して、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１ｘグルタミン中でＣＯＳ細胞を培養した。電気穿孔法に対して、１本のコンフルエントのＴ−１５０フラスコからの細胞を使用した。この細胞をトリプシン処理し、血清を不活性化するために、培地＋血清中で沈降させた。次に細胞を１ｘＰＢＳ中で洗浄した。
【０１３９】
各Ｔ−１５０に対して、０．８ｍｌｓ電気穿孔緩衝液中でペレットを再懸濁した。ＣＯＳ電気穿孔緩衝液には、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（又はＰ３緩衝液）、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び６ｍＭデキストロースが含まれていた。電気穿孔緩衝液を７．０のｐＨに調整し、ろ過滅菌した。ＤＮＡ６０μｇ（それぞれ重及び軽鎖プラスミドＤＮＡ３０μｇ又はＦｃ融合タンパク質の場合、６０μｇ  ＤＮＡ）を各電気穿孔に対して使用した。細胞／緩衝液／ＤＮＡの０．８ｍｌｓを各キュベットに対して混合した（０．４ｃｍキュベット−Ｂｉｏｒａｄ）。さらに、ブランクとして使用するために、１個のキュベットには緩衝液のみを添加した。キュベットを氷上に置いた。１５から２５ミリ秒間、２５０Ｖ及び９５０μＦで細胞を電気穿孔処理した。次に、キュベットを氷上に戻した。２０ｍｌｓハイブリドーマＳＦＭを含有する１本の５０ｍＬコニカルチューブに２個のキュベットの内容物を移した。塊を破壊し、別の２０ｍＬ培地をそれぞれ含有する２枚の１５０ｍｍ組織培養皿に移すために、１０ｍＬピペットを使用した。各培養皿の総培地体積は３０ｍＬであった。次に、この培養皿を３７℃、５％ＣＯ２で３日間温置した。
【０１４０】
ＣＯＳ細胞調整済み培地（上清）を５０ｍＬコニカルチューブに回収し、沈降させた。沈降後、２ミクロン（μｍ）フィルターを用いて上清をろ過した。ＥＬＩＳＡ分析用に試料を採取した。５日後、上清を回収し、それらの個々のタンパク質収率を調べるために標準的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで分析した。
【０１４１】
ｍＢＲ３及びアダリムマブ（Ｄ２Ｅ７）実験において、ベクターのｐＢＯＳ、ｐＴＴ３、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥを個別に試験した。
【０１４２】
タンパク質試験
ＥＬＩＳＡ及び／又はＰｏｒｏｓＡを用いて、遺伝子移入から５日後（ＣＯＳ７細胞の場合）又は７日後（２９３−６Ｅ細胞の場合）に、培地上清中のｍＢＲ３−Ｆｃ融合タンパク質濃度を試験した。
【０１４３】
結果
対照及び実験的遺伝子移入からのタンパク質発現レベルを示すデータを図３（ＣＯＳ細胞）及び図４（ＨＥＫ−２９３細胞）で示す。図３のデータは、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥが両者とも、ＣＯＳ細胞中で融合タンパク質を産生することにおいて有効であり、両ベクターとも対照ベクターｐＴＴ３よりも高いレベルで発現したことを示す。図４で与えられるデータは、ｐＨｙｂ−Ｅにより遺伝子移入されたＨＥＫ細胞からの発現レベルがその他の３種類のベクターで見られる発現を超え、一方でｐＨｙｂ−Ｃタンパク質産生レベルは対照と同等であったことを示す。従って、ｐＨｙｂ−Ｃ及びｐＨｙｂ−Ｅは両者とも、それ以上とは言わないまでも、対照ベクター、ｐＴＴ３及びｐＢＯＳと同程度に、ｍＢｒ３−Ｆｃ融合タンパク質を発現することができる。
【実施例３】
【０１４４】
２つのＤＮＡコンストラクトの同時遺伝子移入を必要とするタンパク質収率の比較
４つのベクター骨格に、ＴＮＦα（アダリムマブ）／Ｄ２Ｅ７に対するヒトＩｇＧ１／κモノクローナル抗体をサブクローニングし、エンドフリーＤＮＡ  ｐｒｅｐキットにより平行して調製した。
【０１４５】
アダリムマブの発現のための配列を含有する４つのベクターをＣＯＳ細胞に電気穿孔法により移入し、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞に遺伝子移入した。
【０１４６】
使用した２９３一時的遺伝子移入手順は、アダリムマブ遺伝子移入を除き、実施例３に記載のものと同じであり、１回の遺伝子移入あたり、Ｄ２Ｅ７重鎖（「Ｄ２」と呼ばれる。）プラスミド１０μｇ及びＤ２Ｅ７軽鎖（「Ｅ７」と呼ばれる。）プラスミド１５μｇを使用した。
【０１４７】
１プレート遺伝子移入あたり各重及び軽鎖ベクター３０μｇを使用したことを除き、上述のように、ＣＯＳ７遺伝子移入実験を行った。
【０１４８】
ＥＬＩＳＡ及び／又はＰｏｒｏｓＡを用いて、遺伝子移入から７日後に、培地上清中のアダリムマブ抗体濃度を試験した。ＣＯＳ７細胞の場合５日後及びＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞の場合７日後に、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡにより調整済み培地からタイターを調べた。
【０１４９】
対照及び実験遺伝子移入からのタンパク質発現レベルを示すデータを図５（ＨＥＫ−２９３細胞）及び図６（ＣＯＳ細胞）で示す。図５のデータは、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥ骨格ベクターの両方が対照ベクターｐＢＯＳよりも多くのアダリムマブを産生することができ、対照ベクターｐＴＴ３と同等（ｐＨｙｂＣ）又はより多い（ｐＨｙｂＥ）量を産生することができることを示す（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、Ｙ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：Ｅ９（２００２））。同様に、図６のデータは、ｐＨｙｂＣ及びｐＨｙｂＥ骨格ベクターの両方が対照ベクターｐＴＴ３よりも多くのタンパク質を産生することができ、対照ベクターｐＢＯＳと同等レベルのタンパク質を産生できることを示す。
【実施例４】
【０１５０】
ｐＨｙｂ−Ｅ抗体定常領域ベクターの構築
新しいｐＨｙｂ−Ｅベクター骨格を用いた抗体産生のために使用し得るベクターの作製を促進するために、１２種類の様々な重及び軽鎖ベクターのパネルを作製した（表２及び３で概要を与える。）。ヒト及びマウスＩｇＧ発現の両方を可能にする１２種類のマスター鋳型ｐＨｙｂＥベクターを構築した。
【０１５１】
図１４−２５に記載のベクターを作製するために、６１２３ｂｐ  ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ断片をｐＨｙｂＥ−スタッファー−ｈＣｇ１，ｚ，ａ（ｐＪＰ１６７）から単離し、シグナルペプチドコード領域、λスタッファー及び定常領域コード領域からなるｐＢＯＳベクターからのＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ制限断片と結合した。シグナルペプチドコード領域、λスタッファー及び定常領域コード領域からなる挿入断片を作製するため、ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ制限断片を作製するために、ＳｒｆＩ／ＮｏｔＩ制限消化を行った（定常領域配列については表１参照）。これらの断片は、ｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドＤＮＡに構築されたｐＢＯＳマスター鋳型由来であった（本明細書中に参照により組み込まれる、Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ、Ｓ．及びＮａｇａｔａ、Ｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５３２２（１９９０）参照；２００７年１２月２８日提出の「ＤＵＡＬ−ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＩＬ−１Ａ／ＩＬ−１ｂ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ」という題名の、米国仮出願第６０／８７８１６５号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０２６４８２号にも記載）及びＵＳＳＮ１２／００６，０６８参照）。このベクターへのクローニングを促進するため、Ｊ領域の３’末端にＡｆｅＩ制限部位を生じさせるために、オーバーラップＰＣＲにより、ｐＨｙｂＥ−ｈＣｌコンストラクトに対する挿入断片を最初に修飾した。次のベクターを作製するために、ＳｒｆＩ及びＮｏｔＩで予め消化した、既に配列確認済みのｐＨｙＢＥコンストラクトに全ての挿入物を結合させた。
【０１５２】
次に、マウス及びヒト抗体定常領域に対して、新規定常領域含有ベクターの配列確認を行った（配列番号３−３２参照）。
【０１５３】
表２及び３に記載のベクターは全て、可変領域配列と交換され得る（λファージＤＮＡの）〜１−ｋｂ「スタッファー」配列を有する。これらの新しいマスターベクターはまた、ＳｒｆＩ部位のすぐ上流に新しいＳｗａＩ制限部位も含有する。この新規ＳｗａＩ部位は、ＣＨＯ発現ベクターなど、クローニングのためにＳｗａＩ部位も利用するその他の発現ベクターにｐＨｙｂ−Ｅから抗体オープン・リーディング・フレームを移すために有用である。代替的クローニング部位の柔軟性に加えて、これらのベクターはまた、既存のｐＢＯＳ、ｐＴＴ３及びＣＨＯベクターと下位互換性（ｂａｃｋｗａｒｄ  ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）でもある。
【０１５４】
図７で見られるように、ＣＯＳ７細胞における予備的遺伝子移入データから、さらなるＳｗａＩ部位がないコンストラクト（ｖ２ベクター）と比較した場合、このさらなるＳｗａＩ部位（ｖ１ベクター）がアダリムマブ発現レベルにおいて顕著な影響がなかったことが示された。
【０１５５】
【表１】
0005635912.tif 000002
【０１５６】
【表２】
0005635912.tif 000003
【０１５７】
要約：
実施例１−４で述べられる先行する実験は、複数の細胞株でｐＨｙｂ−Ｃ及びｐＨｙｂ−Ｅベクターが機能的であり、同時に、元のｐＢＯＳ及びｐＴＴ３ベクターで見られる発現レベルを超えることが多い、十分なタンパク質発現を提供することを示す。ＨＥＫ−２９３−６Ｅ細胞中で収率の低いｍＢＲ３−Ｆｃ融合タンパク質を発現させるためにｐＨｙｂ−Ｅベクターを使用した場合、この発現増大は特に顕著である。このデータにより示されるように、ｐＨｙｂ−Ｃ及びｐＨｙｂ−Ｅベクターは、ベクター技術において、以前に使用されたベクターを上回る顕著な長所を示す。
【０１５８】
【表３】
0005635912.tif 000004
【０１５９】
同等性
当業者は、通常の実験のみを用いて、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識し、解明することができる。かかる同等物は、次の特許請求の範囲により包含されるものとする。
【０１６０】
参照による組み込み
本願を通して引用され得る、引用される参照物全ての内容（参考文献、特許、特許出願及びウェブサイトを含む。）は、参照物がそこで引用されるように、あらゆる目的に対してそれらの全体において、本明細書により、参照により明確に組み込まれる。本発明の実施は、別段の断りがない限り、当技術分野で周知である、免疫学、分子生物学、細胞生物学及び薬物製造及び送達の従来技術を使用する。これらの技術には、以下に限定されないが、次の刊行物で記載される技術が含まれる。
【図１】
0005635912.tif 000005
【図２】
0005635912.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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