(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のヘマグルチニンのエピトープに特異的に結合する抗体であって、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８７５７で寄託されたハイブリドーマ５Ｆ８により産生されるモノクローナル抗体５Ｆ８の免疫学的結合特性を有し、ここで前記免疫学的結合特性はモノクローナル抗体５Ｆ８が結合するエピトープＣＮＴＫＣＱＴＰに結合することを含む、抗体；および
（ｂ）Ｈ５ヘマグルチニンのエピトープＣＮＴＫＣＱＴＰに結合する抗体
から選択される抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８７５７で寄託されたハイブリドーマ５Ｆ８により産生されるモノクローナル抗体５Ｆ８。
【請求項４】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスのＨＡに対する抗体を検出する方法であって、
（ｉ）標本を
（ａ）トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質のエピトープＣＮＴＫＣＱＴＰを含む抗原、および
（ｂ）前記エピトープに特異的に結合する抗体であって、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８７５７で寄託されたハイブリドーマ５Ｆ８により産生されるモノクローナル抗体５Ｆ８の免疫学的結合特性を有し、ここで前記免疫学的結合特性はモノクローナル抗体５Ｆ８が結合する前記エピトープに結合することを含む、抗体
と接触させること；および
（ｉｉ）標本中の抗体が前記のエピトープに結合するかどうかを、どれだけ多くの前記モノクローナル抗体５Ｆ８の特性を有する抗体が前記抗原に結合するかを決定することにより決定すること
を含む方法。
【請求項５】
前記の標本を請求項３に記載のモノクローナル抗体と接触させる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、請求項１、２に、または３に記載の抗体、糖タンパク質またはその一部であってエピトープＣＮＴＫＣＱＴＰを含むもの、および前記の抗体の前記のエピトープへの結合を検出するための試薬を含むキット。
【請求項７】
請求項３に記載のモノクローナル抗体を含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
請求項６に記載のキットであって、前記の試薬が、前記の抗体が前記の生物学的標本中の前記の糖タンパク質またはその一部の前記のエピトープを認識する抗体の存在により前記の糖タンパク質またはその一部に結合するのを妨げられたかどうかを検出することができるキット。
【請求項９】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出する方法であって、
前記標本を請求項１、２、または３に記載の抗体と接触させること；および
前記抗体と前記Ｈ５亜型トリインフルエンザウイルスのＨ５ヘマグルチニンとの結合を決定すること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記標本を請求項３に記載のモノクローナル抗体と接触させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、請求項１、２、または３に記載の抗体、および前記抗体とエピトープＣＮＴＫＣＱＴＰとの結合を検出するための試薬を含む、キット。
【請求項１２】
請求項３に記載のモノクローナル抗体を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
標識され、または固体支持体に付着させた結合タンパク質をさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記結合タンパク質が、トリインフルエンザウイルスに結合する抗体またはモノクローナル抗体である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
以下：
（ａ）Ｈ５亜型トリインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのエピトープに特異的に結合する抗体であって、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８７５６で寄託されたハイブリドーマ１Ｇ５により産生されるモノクローナル抗体１Ｇ５の免疫学的結合特性を有し、ここで前記免疫学的結合特性はモノクローナル抗体１Ｇ５が結合するエピトープＩＨＰＬＴＩＧＥに結合することを含む、抗体；および
（ｂ）Ｈ５ヘマグルチニンのエピトープＩＨＰＬＴＩＧＥに結合する抗体
から選択される、抗体。
【請求項１６】
モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８７５６で寄託されたハイブリドーマ１Ｇ５により産生されるモノクローナル抗体１Ｇ５。
【請求項１８】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスのＨＡに対する抗体を検出する方法であって、
（ｉ）標本を
（ａ）トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質のエピトープＩＨＰＬＴＩＧＥを含む抗原、および
（ｂ）前記エピトープに特異的に結合する抗体であって、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８７５６で寄託されたハイブリドーマ１Ｇ５により産生されるモノクローナル抗体１Ｇ５の免疫学的結合特性を有し、ここで前記免疫学的結合特性はモノクローナル抗体１Ｇ５が結合する前記エピトープに結合することを含む、抗体
と接触させること；および
（ｉｉ）標本中の抗体が前記のエピトープに結合するかどうかを、どれだけ多くの前記モノクローナル抗体１Ｇ５の特性を有する抗体が前記抗原に結合するかを決定することにより決定すること
を含む方法。
【請求項１９】
前記の標本を請求項１７に記載のモノクローナル抗体と接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、請求項１５、１６、または１７に記載の抗体、糖タンパク質またはその一部であってエピトープＩＨＰＬＴＩＧＥを含むもの、および前記の抗体の前記のエピトープへの結合を検出するための試薬を含むキット。
【請求項２１】
請求項１７に記載のモノクローナル抗体を含む、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
請求項２０に記載のキットであって、前記の試薬が、前記の抗体が前記の生物学的標本中の前記の糖タンパク質またはその一部の前記のエピトープを認識する抗体の存在により前記の糖タンパク質またはその一部に結合するのを妨げられたかどうかを検出することができるキット。
【請求項２３】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出する方法であって、
前記標本を請求項１５、１６、または請求項１７に記載の抗体と接触させること；および
前記抗体とＨ５亜型トリインフルエンザウイルスのＨ５ヘマグルチニンとの結合を決定すること
を含む、方法。
【請求項２４】
前記標本を請求項１７に記載のモノクローナル抗体と接触させる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、請求項１５、１６、または１７に記載の抗体、および前記抗体とエピトープＩＨＰＬＴＩＧＥとの結合を検出するための試薬を含む、キット。
【請求項２６】
請求項１７に記載のモノクローナル抗体を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
標識され、または固体支持体に付着させた結合タンパク質をさらに含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記結合タンパク質が、トリインフルエンザウイルスに結合する抗体またはモノクローナル抗体である、請求項２７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、トリインフルエンザウイルスに対する抗体の検出のための特異的な血清学的アッセイの開発に関する。より具体的には、この発明は、Ｈ５インフルエンザウイルスの全ての既知の亜型と強力に反応するが非Ｈ５インフルエンザ亜型とは交叉反応せず、ヒトおよびヒトではない動物におけるＨ５インフルエンザ亜型に対する血清抗体および関連する結合タンパク質を検出するためのエピトープブロッキングＥＬＩＳＡを開発するために用いられるモノクローナル抗体の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）は鳥類における一般的な疾患である。家禽の間での亜型Ｈ５Ｎ１のＡＩＶの最初の感染は、１９９６年に中国広東省において飼育されたガチョウで、および１年後に香港においてヒトで見つかった（１）。それ以来、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶはトリインフルエンザのアウトブレイクを引き起こし、それは世界の多くの地域に広がっている。今までに影響を受けた地域には、ヨーロッパ、中東および特にアジアが含まれる（２）。世界保健機構（ＷＨＯ）からの最新の報告によると、合計で３２８件の確認されたヒトのＨ５Ｎ１トリインフルエンザの症例が存在し、その内の２００件は結果として患者の死亡をもたらした。３２８件の内、有意な大部分（１０６件の症例、８５件の死亡）はインドネシアから報告された（３、４）。ＷＨＯによると、現在の世界は、ヒトからヒトへの有効な伝染が可能である株へのウイルスの進化に基づくパンデミックアラートの（６の内の）フェーズ３にある（５）。
【０００３】
２００６年６月に、インドネシアの３３の州の内の２７が家禽におけるＨ５Ｎ１のアウトブレイクを報告し、疾患および選別除去（ｃｕｌｌｉｎｇ）の結果として１６００万羽を超える家禽が死んだ（６）。家禽産業はトリインフルエンザに数１００万ドルを失った。この損失は、家禽にその生計を依存している数百万人の人々の収入に影響を与えた。家禽におけるＨＰＡＩ（Ｈ５Ｎ１）のこれらのアウトブレイク、および現在のヒトにおける症例数の増加は、心配の種である。アウトブレイクの初期段階において病原体の存在を正確に、かつ適時に検出する能力は、疾患の抑制において役立つであろう。加えて、それは抗生物質の無差別な使用を低減し、適時の方式で抗ウイルス療法を用いる選択肢を与えることができる。
【０００４】
インフルエンザの診断に利用可能な様々な方法には、ウイルスの単離、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるウイルス抗原の検出、ＲＴ−ＰＣＲによる分子検出および血清学的検査が含まれる。標準的なウイルス単離手順は、結果を得るのに数日を必要とする不都合を有し、それによって、それらは臨床家にとって用途が限られたものになっている。ＲＴ−ＰＣＲの不都合には、関係する高いコスト、技術的に熟練したスタッフの必要性、混入が起こりそうなことおよび結果として起こる偽陽性の結果の危険性が含まれる。加えて、ＰＣＲプライマーは抗原連続変異のために定期的に更新する必要がある可能性がある（７）。ウイルスの中和、血球凝集阻害（ＨＩ）、ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロット検査は、血清学的診断に好まれる方法である。しかし、中和アッセイおよびＨＩアッセイは非常に高感度であるとは考えられず、さらなるサブタイピングを必要とし、極めて労働集約型で時間もかかり（８、９）、従って血清の大規模な決まった手順での検査には理想的でない。ＥＬＩＳＡは多数の試料を調べるための前スクリーニング手段として広く用いられてきたが、間接ＥＬＩＳＡシステムは、他の種の種特異的二次抗体が入手できないために、ニワトリおよびシチメンチョウの血清に関してのみ商業的に入手することができる。間接ＥＬＩＳＡのさらなる制限は、高い抗原の純度を必要とすることである。しかし、間接ＥＬＩＳＡの最も重大な不都合は、ＨＡ抗原がウイルスの他の亜型と交叉反応することが知られていることである。結果として、間接ＥＬＩＳＡは検出に関して信頼できる方法ではない。
【０００５】
これらの方法のほとんどは、面倒であり労働集約型であるだけでなく時間がかかり、偽陽性の結果を得る危険性を含む。これらの技法のさらなる制限は、インフルエンザウイルスが分節ゲノム型ＲＮＡウイルスであり、それは連続的な変異および遺伝的再集合（抗原連続変異）を経てウイルスの検出を難しくすることが知られていることである（１０）。
【０００６】
これらの一般に行われるアッセイの短所を考慮して、およびＡＩＶ感染が野生動物、家畜化された動物およびヒトにもたらす危険性のため、使用が迅速、容易でありＡＩＶのＨ５亜型の検出に特異的である新しいアッセイの高い必要性が存在する。本発明は、ＡＩＶのＨ５亜型の診断および監視における画期的躍進である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明に従って、インフルエンザＨ５亜型ＨＡタンパク質に特異的なモノクローナル抗体および関連する結合タンパク質を提供する。抗体はヒトの血清試料も含めて哺乳類および鳥類の血清試料におけるインフルエンザＨ５感染の血清学的診断において用いることができる。より具体的には、それぞれの抗体はヒトおよび他の動物においてインフルエンザＨ５亜型を検出するための非常に高感度かつ特異的なエピトープブロッキングＥＬＩＳＡにおいて用いることができる。それぞれの抗体はＨ５亜型の多種多様な株と強く反応し、非Ｈ５インフルエンザ亜型との交叉反応性を示さない。
【０００８】
従って、本発明は、トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエピトープに結合し、実質的にモノクローナル抗体５Ｆ８またはモノクローナル抗体１Ｇ５の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含む。結合タンパク質はモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体またはヒト化抗体であることができ、好ましくはモノクローナル抗体である。
【０００９】
本発明はさらに、アミノ酸配列ＣＮＴＫＣＱＴＰのＡＩＶ  Ｈ５ヘマグルチニンのエピトープに結合する結合タンパク質を含む。本発明は、アミノ酸配列ＩＨＰＬＴＩＧＥのＡＩＶ  Ｈ５ヘマグルチニンのエピトープに結合する結合タンパク質も含む。
【００１０】
さらなる観点において、本発明は、標本をＨ５亜型ヘマグルチニン糖タンパク質のエピトープを含む抗原と接触させることおよび標本中の抗体がエピトープに結合するかどうかを決定することを含む、生物学的標本中のＨ５亜型ＡＩＶを検出するための方法を含む。好ましくは、結合の決定はエピトープブロッキングＥＬＩＳＡにおいてなされる。好ましくは、Ｈ５亜型ヘマグルチニン糖タンパク質のエピトープは配列ＣＮＴＫＣＱＴＰまたは配列ＩＨＰＬＴＩＧＥを含む。ＩＨＰＬＴＩＧＥおよびＣＮＴＫＣＱＴＰエピトープは両方とも全ての既知のヒトＨ５Ｎ１  ＡＩＶ株中に、本質的に全ての既知のニワトリＨ５Ｎ１  ＡＩＶ株中に、および他の動物および鳥類の本質的に全ての既知のＨ５Ｎ１株中に存在し、非常に安定であり抗原性が高く、これはそれらをＨ５Ｎ１感染を診断するのに非常に有用にする。
【００１１】
本発明はさらに、生物学的標本中でＨ５亜型ＡＩＶ感染を検出するためのキットに向けられており、ここでそのキットはＨ５亜型ＡＩＶのエンベロープ糖タンパク質のエピトープに結合する結合タンパク質を、結合タンパク質のエピトープへの結合を検出するための試薬と一緒に含む。好ましい態様において、エピトープは配列ＣＮＴＫＣＱＴＰを含む。別の好ましい態様において、エピトープは配列ＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫを含む。好ましい態様において、結合タンパク質は実質的にｍＡｂ  ５Ｆ８の免疫学的結合特性を有する。別の好ましい態様において、結合タンパク質は実質的にｍＡｂ  １Ｇ５の免疫学的結合特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】［図１Ａ〜図１Ｂ］  免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）およびウェスタンブロッティングによるｍＡｂ  ５Ｆ８の特性付け。図１Ａ１〜４は、免疫蛍光アッセイにおける、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶに感染したＭＤＣＫ細胞中の未変性のＨＡ１およびバキュロウイルスで発現させたｒＨＡ１の、ｍＡｂ  ５Ｆ８による認識を示す。ＭＤＣＫおよびＳｆ−９細胞を、それぞれＨ５亜型および組み替えバキュロウイルスを用いて感染させた。対照はＨ９Ｎ２を感染させたＭＤＣＫ細胞およびＳｆ−９細胞であった。図１Ｂは、ウェスタンブロットにおけるＨ５Ｎ１  ＡＩＶのＭＡｂ  ５Ｆ８による認識を示す。尿膜腔液からの精製したＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１（レーン１〜９）、Ｈ５Ｎ２（レーン１０）およびＨ５Ｎ３（レーン１１）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ニトロセルロース膜上に固定した。陰性対照（ウイルス無し）、Ｈ３Ｎ２（レーン１２）、Ｈ７Ｎ１（レーン１３）のＨＡはＭＡｂ  ５Ｆ８により認識されず、それはその抗体のＨ５亜型への特異性を示している。
【図２Ａ】ＭＡｂ  ５Ｆ８のエピトープマッピング。図２Ａは、エピトープマッピングのために用いた計画を示す。ＡからＥまで、およびＳＦ１からＳＦ８までの示した断片の全てを、Ｈｉｓ融合タンパク質として発現させた。
【図２Ｂ】ＭＡｂ  ５Ｆ８のエピトープマッピング。図２Ｂに示した断片Ａ〜Ｅのウェスタンブロット分析は、ＭＡｂ  ５Ｆ８を一次抗体として用いた。Ｃ：ｒＨＡ１タンパク質を対照として用いた。
【図２Ｃ】ＭＡｂ  ５Ｆ８のエピトープマッピング。図２Ｃは８種類のさらなる切り詰めたペプチド（ＳＦ１〜ＳＦ８）のウェスタンブロット分析の結果を示し、それは図２Ａの断片４の延長であるが断片５の領域中で切り詰められており、ヒスチジン融合ペプチドとして発現させた。
【図２Ｄ】ＭＡｂ  ５Ｆ８のエピトープマッピング。図２Ｄは点変異体のウェスタンブロット分析の結果を示しており、これもヒスチジン融合ペプチドとして発現させた。その分析は、ｍＡｂ  ５Ｆ８に関するエピトープのアミノ酸配列を決定するために行った。
【図３】［図３Ａおよび３Ｂ］  図３Ａおよび３Ｂは、免疫したニワトリ血清により引き起こされる、ＣＤＣ／５２３／Ｈ５ＨＡ１エピトープまたはｒＨ５ＨＡ１に関するｍＡｂ結合の５０％ブロッキングを示す。結果はパーセントブロッキング値の算術平均として表した（ｎ＝５／グループ＋標準誤差（ＳＥ））。
【図４Ａ】免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）およびウェスタンブロッティングによるｍＡｂ  １Ｇ５の特性付け。図４Ａ１〜４は、ｍＡｂ  １Ｇ５が免疫蛍光アッセイにおいてＨ５Ｎ１  ＡＩＶに感染したＭＤＣＫ細胞およびバキュロウイルスに感染したＳｆ−９中の未変性のＨＡを認識することを示す。ＭＤＣＫおよびＳｆ−９細胞を、それぞれＨ５ウイルスまたは組み替えＨ５ＨＡバキュロウイルスを用いて感染させた。対照はＨ４Ｎ１を感染させたＭＤＣＫ細胞およびＳｆ−９細胞であった。
【図４Ｂ】免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）およびウェスタンブロッティングによるｍＡｂ  １Ｇ５の特性付け。図４Ｂは、ウェスタンブロットにおけるＨ５ＨＡのｍＡｂ  １Ｇ５による認識を示す。モノクローナル抗体は、レーン１〜１４のそれぞれにおいてＨ５ＨＡを認識した。レーン１５の非Ｈ５ウイルスは１Ｇ５により認識されなかったが、これは抗体のＨ５亜型に対する特異性を示している。
【図５Ａ】ｍＡｂ  １Ｇ５のエピトープマッピング。図５Ａはエピトープマッピングのために用いた計画を示す。ＡからＥまで、およびＳＦ１からＳＦ８までの示した断片の全てを、実施例１におけるようなＨｉｓ融合断片として発現させた。
【図５Ｂ】ｍＡｂ  １Ｇ５のエピトープマッピング。図５Ｂに示した断片Ａ〜Ｅのウェスタンブロット分析は、ｍＡｂ  １Ｇ５を一次抗体として用いた。Ｃ：ｒＨＡ１タンパク質を対照として用いた。
【図５Ｃ】ｍＡｂ  １Ｇ５のエピトープマッピング。サブフラグメントＳＦ１〜ＳＦ８の、およびエピトープ決定の最終段階の点変異体のウェスタンブロット分析を、それぞれ図５Ｃおよび５Ｄに示す。
【図５Ｄ】ｍＡｂ  １Ｇ５のエピトープマッピング。サブフラグメントＳＦ１〜ＳＦ８の、およびエピトープ決定の最終段階の点変異体のウェスタンブロット分析を、それぞれ図５Ｃおよび５Ｄに示す。
【図６】［図６Ａおよび６Ｂ］  図６Ａおよび６Ｂは、ｍＡｂ類５Ｆ８および１Ｇ５がＨ５亜型と特異的に反応することを図説する。図６Ａは、抗体がインドネシアＨ５Ｎ１株の１５種類の異なる試料と特異的に反応したことを示している；図６Ｂは、抗体がインドネシアＨ５Ｎ１株（１〜９）、Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８（１０）；Ｈ５Ｎ２（１１）およびＨ５Ｎ３（１２）と特異的に反応したが、Ｈ４Ｎ１またはＨ７Ｎ１（それぞれ１３および１４）とは反応しなかったことを示している。アッセイはｍＡｂ  ５Ｆ８、１Ｇ５またはそれらの組み合わせを捕捉抗体として、およびポリクローナル抗Ｈ５ＨＡ１を検出抗体として用いて実施した。
【図７】図７は、ｍＡｂ  ５Ｆ８およびｍＡｂ  １Ｇ５に基づいた抗原捕捉ＥＬＩＳＡの両方がＨ５Ｎ１の１０２ＴＣＩＤ５０単位を検出したことを示す。Ｈ４Ｎ１を含むアッセイは、バックグラウンドレベルを有意に上回る吸光度を生じなかった。
【図８】図８は、感染した、およびワクチン接種した試料からのヒト血清により引き起こされる、ＣＤＣ／５２３  Ｈ５ＨＡ１エピトープに関するｍＡｂ  １Ｇ５の５０％ブロッキングを示す（試料１〜１０：感染および回復した血清試料；試料１１〜１５：ワクチン接種したヒト血清試料；試料１６：健康なヒトの対照血清）。
【図９】［図９Ａおよび９Ｂ］  図９Ａおよび９Ｂは、免疫したニワトリ血清により引き起こされる、ＣＤＣ／５２３  Ｈ５ＨＡ１エピトープに関するｍＡｂ  １Ｇ５の結合の５０％ブロッキングを示す。図９Ａにおいて、試料１〜１４は、１：３０希釈での、Ｈ５Ｎ１インドネシア株で免疫したニワトリの血清試料であった。図９Ｂにおいて、試料１〜１０は、１：３０希釈での、Ｈ５Ｎ１インドネシア株で免疫したニワトリの血清試料であり、試料１１および１２はＨ５亜型株であり、試料１３〜１７は非Ｈ５亜型株であった。結果はパーセントブロッキング値の算術平均として表した（ｎ＝５／グループ＋Ｓ．Ｅ．）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＡＩＶのＨ５亜型のＨＡ１タンパク質に特異的に結合するｍＡｂ類および関連する結合タンパク質に、ならびにエピトープブロッキングＥＬＩＳＡにおけるそれらのｍＡｂ類および関連する結合タンパク質の使用に向けられている。そのｍＡｂは、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶおよび他のＨ５亜型の全ての既知のインドネシア株に対して、ＩＦＡおよびウェスタンブロット分析による試験の結果が陽性である。
【００１４】
特に、一方のそのｍＡｂまたは関連する抗原結合タンパク質は、２００７年１１月６日にアメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８７５７を割り当てられた、ハイブリドーマ５Ｆ８により産生されるｍＡｂ  ５Ｆ８の免疫学的結合特性を有する。２番目のそのｍＡｂまたは関連する抗原結合タンパク質は、２００７年１１月６日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８７５６を割り当てられた、ハイブリドーマ１Ｇ５により産生されるｍＡｂ  １Ｇ５の免疫学的結合特性を有する。本発明はさらに、Ｈ５亜型ＡＩＶの感染の検出および診断のための方法ならびに本発明のｍＡｂ類または結合タンパク質を含むアッセイキットに関する。インフルエンザに関する一般に入手できる血清学的アッセイはＨＩ、ＡＧＩＤおよびマイクロ中和アッセイであるが、上記で言及したように、これらの試験はそれぞれに欠点を有しており、ＡＩＶに対するヒト抗体の検出のための高感度かつ特異的な血清学的アッセイが必要とされてきた。インフルエンザ感染に対する抗体の検出のための間接ＥＬＩＳＡは、多数の試料の迅速なスクリーニングのための高感度な方法として提案されたが、そのアッセイは高度に精製された抗原を必要とする可能性があり、異なる亜型のＨＡ類の間で交叉反応性を示す可能性がある（１８）。この発明はさらに、Ｈ５亜型を検出するための非常に高感度かつ特異的なエピトープブロッキングＥＬＩＳＡ（ＥＢ  ＥＬＩＳＡ）に関する。
【００１５】
様々な用語が本明細書で用いられ、それは下記の意味を有する：
ｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の免疫学的結合特性（Ａｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ＠）という用語は、その文法形式の全てにおいて、ｍＡｂまたは結合タンパク質のその抗原に関する特異性、親和性および交叉反応性を指す。
【００１６】
用語：結合タンパク質（Ａｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ＠）は、本発明のｍＡｂまたは本発明のｍＡｂの免疫学的結合特性を有するｍＡｂの抗原結合部位を含むタンパク質を指す。
【００１７】
ｍＡｂ  ５Ｆ８またはｍＡｂ  １Ｇ５の結合特性を有するモノクローナル抗体は、動物を組み替えＨ５Ｎ１  ＨＡ０タンパク質で免疫することにより調製される。その抗原は、望まれる免疫学的結合特性を有する抗体を生じさせるための免疫原として用いることができる。その抗体には、ｍＡｂ  ５Ｆ８またはｍＡｂ  １Ｇ５の抗原結合配列を含むモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびタンパク質が含まれるが、それらに限定されない。
【００１８】
ｍＡｂ  ５Ｆ８はアミノ酸配列ＣＮＴＫＣＱＴＰを含む特異的なエピトープを認識することが分かっており、それは、今までに確認された、ヒトにおいて見つかった全てのＨ５Ｎ１株およびニワトリを含む全ての既知の源からの全ての株の９９％を超える割合の株に存在することが示されている。そのエピトープは非常に安定である（変異が起こらない）ことも示されている。そのエピトープは、本質的に全ての感染した人の血清中にそのエピトープに対する抗体が見つかるように、高度に抗原性であり、それはそのエピトープを診断検査において非常に信頼できるものにする。
【００１９】
ｍＡｂ  １Ｇ５は配列ＩＨＰＬＴＩＧＥを含む特異的なエピトープを認識することが分かっており、それは、今までに確認された全ての源からの１２８８種類のＨ５Ｎ１株の全てに存在することが示されている。このエピトープも非常に安定であり、本質的に全ての人の血清中にそのエピトープに対する抗体が見つかるように高度に抗原性であり、従ってこのエピトープも診断検査において非常に信頼できるものにしている。
【００２０】
この発明のモノクローナル抗体は、培養中の連続継代性細胞株（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）による抗体分子の産生を提供するあらゆる技法により得ることができる。その方法には、元はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたハイブリドーマの技法(1975, Nature 256:495-497)、さらにトリオーマの技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマの技法(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマの技法(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96における)が含まれるが、それらに限定されない。ヒトの抗体を用いることができ、それはヒトのハイブリドーマを用いることにより(Cote et al., 1983, Proc. Nat=l. Acad. Sci. U.S.A., 80:2026-2030)、またはインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスを用いて形質転換することにより(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96における)得ることができる。さらに、本発明のマウス抗体分子からの配列を導入して適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にすることによる”キメラ抗体”または”ヒト化抗体”の産生のために開発された技法(Morrison et al., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)を用いることができる。キメラ抗体は、ヒトのＦｃ部分およびマウス（または他のヒト以外）のＦｖ部分を含む抗体である。ヒト化抗体は、マウス（または他のヒト以外）の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体の中に組み込まれた抗体である。キメラおよびヒト化抗体は共にモノクローナルである。そのヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾患または障害のインビボ診断または療法における使用に好ましい。
【００２１】
本発明の追加の態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して記述された技法(Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281)を利用して、本発明の抗体、またはその誘導体、もしくは類似体に望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とする。
【００２２】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は既知の技法により生成することができる。例えば、その断片は次のものを含むがそれらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ＝）２断片；Ｆ（ａｂ＝）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるＦａｂ＝断片、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成することができるＦａｂ断片。その抗体断片は、本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれから生成することもできる。
【００２３】
抗体の産生において、望ましい抗体のスクリーニングは当分野で既知の技法、例えば放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着アッセイ）、”サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、免疫蛍光アッセイおよび免疫電気泳動アッセイ等により成し遂げることができる。１つの態様において、抗体の結合は一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の態様において、一次抗体は二次抗体または他の試薬の一次抗体への結合を検出することにより検出される。さらに別の態様において、二次抗体は標識されている。免疫アッセイにおいて結合を検出するための手段は当分野で既知であり、本発明の範囲内である。
【００２４】
本発明の５Ｆ８結合タンパク質は、下記で論じるように、アミノ酸配列ＣＮＴＫＣＱＴＰを有するＨ５Ｎ１  ＨＡのエピトープを認識することが分かっている。このエピトープは全てのヒトの、および本質的に全てのニワトリのインフルエンザＨ５亜型において、さらに動物および鳥類の他の種のインフルエンザＨ５亜型の大部分において高度に保存されていることが分かっている。具体的には、ＮＣＢＩのデータベースで入手できる１２８８株のインフルエンザＡ  Ｈ５Ｎ１  ＨＡ株の内で、９９．６１％（１２８３）がＣＮＴＫＣＱＴＰ配列を含んでいる。これらの１２８８株の内で２８０株がヒトＨ５Ｎ１株であり、それらの全てがこの配列を含んでいる。加えて、４２７株のニワトリＨ５Ｎ１株の内で、１株を除く全てがＣＮＴＫＣＱＴＰ配列を含んでいる。合計で、ヒト以外のＨ５株の内の５株のみがＣＮＴＫＣＱＴＰ配列の変形を含んでいた：カモから得られた１株のＨ５株
は配列ＣＮＴＲＣＱＴＰを有しており、ガチョウから得られた１株は配列ＣＮＴＲＣＱＴＰを有しており、ニワトリから得られた２株は配列ＣＮＴＫＣＱＴＬまたはＣＮＡＫＣＱＴＰを有していた。合計で、ニワトリからの４２７株、サギ類からの５株、カモ類からの１８９株およびガチョウ類からの６２株を検査した。そのエピトープは、シチメンチョウ類、マガモ類、ハト類、オオゴシキドリ類（ｇｒｅａｔ  ｂａｒｂｅｔｓ）、マクジャク（ｇｒｅｅｎ  ｐｅａ  ｆｏｗｌ）、クジャク類（ｐｅａｃｏｃｋｓ）、スズメ類（ｔｒｅｅ  ｓｐａｒｒｏｗｓ）、ハヤブサ類（ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  ｆａｌｃｏｎｓ）、ユリカモメ類（ｂｌａｃｋ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｕｌｌｓ）、キンケイ類（ｇｏｌｄｅｎ  ｐｈｅａｓａｎｔｓ）、ワシミミズク類（ｅａｇｌｅ  ｏｗｌｓ）、ヤマウズラ類（ｐａｒｔｒｉｄｇｅｓ）、オオハクチョウ類（ｗｈｏｏｐｅｒ  ｓｗａｎｓ）、ダチョウ類（ｏｓｔｒｉｃｈｅｓ）、イエガラス類（ｈｏｕｓｅ  ｃｒｏｗｓ）、カササギ類（ｍａｇｐｉｅｓ）、スズメ類（ｓｐａｒｒｏｗｓ）およびキュウカンチョウ類（ｍｙｎａｓ）のような種においても高度に保存されていることが分かった。
【００２５】
本発明の１Ｇ５結合タンパク質は、下記で論じるように、アミノ酸配列ＩＨＰＬＴＩＧＥを有するＨ５Ｎ１  ＨＡのエピトープを認識することが分かっている。このエピトープは今までに知られている全てのヒトのインフルエンザＨ５亜型において、および他の種の全てのインフルエンザＨ５亜型において高度に保存されていることが分かっている。前述の抗体を、ＡＩＶのＨ５亜型の検出または位置測定に関して当技術で既知の方法、例えばウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、および同様のものにおいて用いることができる。加えて、好ましい態様において、下記でより詳細に論じるようにその抗体をエピトープブロッキングＥＬＩＳＡにおいて用いることができる。これらのアッセイは、ＡＩＶのＨ５亜型の質的および定量的測定ならびにそのウイルスに感染した動物またはヒトの診断および監視を提供する。
【００２６】
本発明には、ＡＩＶのＨ５亜型の質的および／または定量的検出のためのアッセイおよび検査キットも含まれる。そのアッセイ系および検査キットは、例えば本発明のｍＡｂもしくは関連する結合タンパク質またはその結合パートナーを標識することにより調製される標識された構成要素を含んでいることができる。そのアッセイまたは検査キットは、さらに使用のための、免疫アッセイの技法の技術者に周知の試薬、希釈剤および説明書を含んでいることができる。
【００２７】
本発明の特定の態様において、そのキットは、少なくとも本発明のｍＡｂまたは関連する結合タンパク質、生物学的試料中のＡＩＶへのそのｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の免疫特異的結合を検出するための構成要素、および使用のための説明書を、選択された方法、例えばエピトープブロッキング、競合、サンドウィッチ、および同様のものに依存して含むであろう。キットは陽性および陰性対照を含んでいることもできる。それらは自動化された分析器または自動化された免疫組織化学的スライド染色機器と共に使用されるように設計することができる。
【００２８】
アッセイキットはさらに二次抗体または結合タンパク質を含んでいることができ、それは標識することができ、または固体支持体への付着のために提供する（または固体支持体に付着させる）ことができる。その抗体または結合タンパク質は、例えば、ＡＩＶに結合するものであることができる。その二次抗体または結合タンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができる。
【００２９】
好ましいキットは、エピトープブロッキングＥＬＩＳＡにおいて用いられるためのものである。そのキットは、ＡＩＶのＨ５亜型のＨＡ１エンベロープ糖タンパク質のエピトープＣＮＴＫＣＱＴＰに、またはエピトープＩＨＰＬＴＩＧＥに結合するｍＡｂまたは関連する結合タンパク質、そのエピトープのアミノ酸を含むＨＡ１糖タンパク質またはその一部、および前記の結合タンパク質の前記のエピトープへの結合を検出するための試薬を含む。
【００３０】
Ｈ５亜型ヘマグルチニンタンパク質に対するモノクローナル抗体は、動物をＡＩＶまたはＨ５タンパク質またはそれらの断片で免疫することにより調製することができる。好ましい方法には、Ｈ５亜型ＨＡ０遺伝子の増幅とそれに続く遺伝子の発現、Ｈ５組み換えタンパク質の回収および精製ならびにそのタンパク質の免疫原としての使用が含まれる。例えば、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶを、ニワトリ胚にそのウイルスの利用可能な株を接種することにより増殖させ、続いてウイルスＲＮＡを分離する。ＨＡ０遺伝子をｃＤＮＡから増幅し、細菌の中にクローン化し、次いで発現させる。そのように生成されたタンパク質を、マウスまたは他のハイブリドーマの生成に適した種を免疫するのに用いることができる。
【００３１】
ハイブリドーマを、Ｈ５タンパク質に特異的に結合することができ、それらを他のＡＩＶ亜型から識別する高親和性ｍＡｂ類を安定して産生するそれらの能力に関してスクリーニングする。この発明に従って、一方の免疫グロブリンｍＡｂ、ＩｇＭアイソタイプであると決定され５Ｆ８と名付けられたｍＡｂは、既知のインドネシアＨ５亜型株に関して、さらに他のＨ５株に関して強く陽性であり、Ｈ７Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ２およびＨ９Ｎ２を含む検査したあらゆる他の亜型と交叉反応を示さないことが分かった。
【００３２】
この発明の第２の態様において、アイソタイプがＩＧＭであると決定され１Ｇ５と名付けられた別のｍＡｂも、既知のインドネシアＨ５亜型株に関して、さらに他のＨ５亜型に関して強く陽性であり、Ｈ７Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ２およびＨ９Ｎ２を含む検査したあらゆる他の亜型と交叉反応を示さないことが分かった。
【００３３】
ｍＡｂ  ５Ｆ８および１Ｇ５は両方ともＨ５Ｎ１ヘマグルチニンの線状エピトープを認識する。２種類の抗体を同じ濃度で用いた場合、ｍＡｂ  ５Ｆ８の強さがより大きい。２種類の抗体により認識される別個の線状エピトープは、Ｈ５抗原を検出する感度を増大させる。ｍＡｂ  ５Ｆ８により認識されるエピトープは普遍的エピトープであり、上記で論じたように、そのエピトープの８アミノ酸は現在遺伝子バンクにおいて入手できる全ての既知のヒトの、および全部で１２８８種類の内のほとんど全ての既知のＨ５Ｎ１インフルエンザＡの配列中に存在する。１Ｇ５  ｍＡｂは、現在既知であり遺伝子バンクにおいて入手できる全てのヒトのインフルエンザＨ５亜型中に、および他の種からの全てのＨ５亜型株中に存在する８アミノ酸のエピトープを認識する。２種類のエピトープ（アミノ酸２９０〜２９７およびアミノ酸３１０〜３１７）の間が離れていることは、抗原の結合および検出に関して高い親和性を可能にする。
【００３４】
この発明は、Ｈ５亜型ＡＩＶを検出するための便利で非常に特異的かつ高感度な手段を提供する。その手段の１つはエピトープブロッキングＥＬＩＳＡ（ＥＢ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＢ  ＥＬＩＳＡにおいて、陽性の血清からの特異的な抗体は、選択されたｍＡｂがその特異的なエピトープを認識するのを阻害し、その結果、選択されたｍＡｂに結合する色を生成する試薬が試料に添加された際に発色が阻害される。しかし、陰性の血清は強い発色反応を許す。そのアッセイは、生物学的試料中に存在するＨ５インフルエンザ抗体が、選択されたＨ５  ＨＡ１  ｍＡｂの微量定量プレート上に吸着させたＨ５Ｎ１インフルエンザ抗原または組み替え抗原への結合を妨げる能力に依存している。より具体的には、この発明のＥＢ  ＥＬＩＳＡにおいて、ＥＬＩＳＡプレートはコーティング緩衝液中の最適な濃度の組み換えＨＡ１または不活化Ｈ５Ｎ１株でコートされている。最適な濃度は、コーティング抗原および既知の陽性抗体の２次元系列希釈による交差力価測定を用いて、ＥＬＩＳＡの読みにおいて最大の光学密度（Ｏ．Ｄ．）の値を与える最も都合の良い濃度を選択することにより決定することができる。検査血清試料をコートされたプレートのそれぞれのウェルに入れて保温し、洗浄し、次いでｍＡｂ  ５Ｆ８または１Ｇ５の上清と共に保温する。プレートを再度洗浄し、結合したｍＡｂを、ｍＡｂ  ５Ｆ８または１Ｇ５に結合する希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体、例えばＨＲＰ標識ウサギ抗マウス抗体の添加により検出する。プレートを洗浄し、次いで３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたは他の色を生成する試薬、例えば２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸またはｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩と共に保温する。反応を止め、発色を読む。５Ｆ８または１Ｇ５  ｍＡｂの抗原への結合を阻害する試料中の抗体により引き起こされる比色反応のパーセント阻害を、それぞれの血清試料に関して算出する。
【００３５】
エピトープブロッキングＥＬＩＳＡは、Ｈ５亜型ＡＩＶを検出するための便利で非常に特異的かつ感度の高い手段を提供する。この好ましい検出法は、他のＡＩＶ亜型からの交叉反応無しにＡＩＶの様々なＨ５亜型株からのＨＡ抗原の検出を可能にする。ＥＢ  ＥＬＩＳＡは、他の検査において安定して検出することができるものよりも低いレベルの抗体を検出することができる。
【００３６】
ｍＡｂ  ５Ｆ８およびｍＡｂ  １Ｇ５の強い反応性は、その抗体を抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣ  ＥＬＩＳＡ）において用いることができることも意味し、それにおいて臨床試料中の生きたウイルスまたは不活化されたもしくは溶解されたウイルスから抗原を検出することができる。ＡＣ−ＥＬＩＳＡは、Ｈ５抗原の検出のための迅速で信頼できる経済的な方法であることができ、家禽およびヒト両方のＨ５Ｎ１の分離株からのＨ５ＨＡ抗原を検出するのに用いることができる。
【００３７】
このように、この発明のＨ５亜型ｍＡｂ類は非常に好都合な診断の道具である。上記で言及したように、それらは感染性Ｈ５Ｎ１亜型ＡＩＶに高度に特異的である。この特異性は、さまざまな源から得られたＨ５Ｎ１に感染した組織標本の分類において実証された。その高度に特異的なモノクローナル抗体は、Ｈ５Ｎ１の診断に関して明らかな利点である。そのｍＡｂ類は、Ｈ５  ＡＩＶの検出のための安全かつ便利な診断検査において用いることができる。
【００３８】
下記の実施例は、本発明を説明するために提供されるのであって、制限するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００３９】
実施例１
Ｉ．実験的なこと
ウイルス
この試験において使用し、下記の表１にリストしたインドネシアＨ５Ｎ１インフルエンザ株の２４種類の分離株（記載１〜２４）は、インドネシア国立保健研究開発研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ）から得た。他のＨ５および非Ｈ５亜型は、シンガポールの農産食品＆家畜管理局（Ａｇｒｉ−Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）（ＡＶＡ）により提供された（表１の記載２５〜３１）。
【００４０】
表１．この実験において用いたトリインフルエンザウイルス
【００４１】
【表１−１】
0005490725.tif 000002
【００４２】
【表１−２】
0005490725.tif 000003
【００４３】
【表１−３】
0005490725.tif 000004
【００４４】
＊高病原性ＡＩＶ
高病原性および低病原性ウイルスを、両方とも１１日齢の発育鶏卵の尿膜腔中に接種した。４８時間の培養の後、卵から尿膜腔液を集めた。ウイルスの力価を、血球凝集アッセイを用いて測定した。次いでウイルスを精製し、−８０ＥＣで保管した。生ウイルスを用いた全ての実験はバイオセーフティーレベル３の封じ込め実験室中で実施され、全ての動物実験はＣＤＣ／ＮＩＨおよびＷＨＯの推奨（１２、１３）に従って動物バイオセーフティーレベル３（ＡＢＳＬ３）の封じ込め実験室中で行われ、それらはシンガポールの農産食品＆家畜管理局（ＡＶＡ）および保健省（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＭＯＨ）によっても承認された。
【００４５】
分子クローニング
Ｈ５Ｎ１（ＣＤＣ／６６９／インドネシア／０６）をベータ−プロピオラクトンを用いて不活化し（１４）、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて抽出した。ＨＡ０遺伝子をｃＤＮＡから増幅し、細菌における発現のために標準的なクローニングの技法を用いてｐＱＥ−３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）の中にクローニングした。タンパク質を発現させるために、クローンを大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４コンピテントセルの中に形質転換した。同じ株からのＨＡ１遺伝子を、Ｈ５Ｎ１  ＨＡ１遺伝子を有する組み換えバキュロウイルスを構築するために用いられるベクターであるｐＦＡＳＴＢＡＣ−ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）の中にクローニングし、次いでそれを用いて、Ｈ５  ＨＡ１特異的ｍＡｂ類に関するスクリーニングのための免疫蛍光アッセイの開発のために、Ｓｆ−９００ＩＩ培地中で増殖させたＳｆ−９細胞を感染させた。
【００４６】
組み替えＨＡ０タンパク質（ｒＨＡ０）の生成
形質転換した大腸菌Ｍ１５細胞を、３７ＥＣにおいて、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で、０．５〜０．６のＯＤ６００まで増殖させ、タンパク質発現を１ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧの添加により振盪しながら３時間誘導した。細胞をペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁した。ヒスチジン融合タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）上で精製し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによる分析のために用いた。
【００４７】
モノクローナル抗体の生成
４匹の成体の雌の４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを、等体積のアジュバント（ＳＥＰＰＩＣ，フランス）を用いて乳化させた０．１ｍｌのＰＢＳ中の２５μｇの組み替えＨ５Ｎ１  ＨＡ０タンパク質を用いて筋肉内に３回免疫した。マウスの体液性免疫反応をＩＦＡおよび間接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で監視した。
【００４８】
融合の３日前に、マウスを０．１ｍｌのＰＢＳ中の２５μｇの組み替えＨ５Ｎ１  ＨＡ０タンパク質を用いて静脈内に追加免疫し、脾臓細胞を集めて、以前に記述したようにしてＳＰ２／０細胞と融合させた（１５）。融合した細胞を９６ウェルプレート中にまき、それらの上清を、下記で記述するような、膜擬感染させた、または組み換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ９細胞、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ３を感染させたＭＤＣＫ細胞を抗原として用いる免疫蛍光アッセイによりスクリーニングした。陽性のウェル中のハイブリドーマを、限界希釈により２回クローニングした。陽性のクローンを、アイソタイプに関して、ｏｎｅ−ｍｉｎｕｔｅアイソタイピングキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，イギリス）を用いることにより、製造者の（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ＝ｓ）プロトコルに記述されているようにしてチェックした。ハイブリドーマの培養物を集めて細胞破壊片を４００×ｇにおける１０分間の遠心分離により除去した。上清を集め、−２０ＥＣで保管した。
【００４９】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
９６ウェルプレート中のＳｆ−９およびＭＤＣＫ細胞を、切り詰めたＨ５Ｎ１  ＨＡ１遺伝子を有する組み換えバキュロウイルスまたはＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１インドネシア株、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ３株でそれぞれ感染させた。感染の３６時間（Ｓｆ−９細胞に関して）および２４〜４８時間（ＭＤＣＫ細胞に関して）後に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間、室温で固定し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄した。固定した細胞を、ハイブリドーマ培養液と共に３７ＥＣで１時間保温した。細胞をＰＢＳで３回すすぎ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇ（Ｄａｋｏ，デンマーク）の１：４０希釈液と共に保温した。細胞をＰＢＳ中で再度すすいだ後、最適化されたＦＩＴＣの可視化のための適切なバリアおよび励起フィルターのある落射蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，日本）中で結果を記録した。
【００５０】
５Ｆ８と名付けられた１種類の免疫グロブリン、ＩｇＭ  ＭＡｂは、全てのインドネシア株に関して強く陽性であった。それをエピトープマッピングおよびさらにブロッキングＥＬＩＳＡの開発のために選択した。
【００５１】
免疫ブロッティング
選択したｍＡｂ  ５Ｆ８を、免疫ブロッティングアッセイにより評価した。組み換えＨ５Ｎ１  ＨＡ０タンパク質ならびに完全な精製したＨ５Ｎ１インドネシア株ならびにＨ５Ｎ２およびＨ５Ｎ３株を、非還元条件下で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画した。分かれたタンパク質をニトロセルロース膜上に電気転写し、固定した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中５％脱脂乳で３７ＥＣにおいて１時間ブロッキングした。続いて膜をハイブリドーマ上清と共に保温し、ＰＢＳＴ中ですすぎ、ＨＲＰコンジュゲートウサギ抗マウスＩｇと共に保温した。膜に結合した抗体を、ＨＲＰにコンジュゲートしたウサギ抗マウスで検出した。ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に保温することにより膜を現像した（１６）。
【００５２】
５Ｆ８のエピトープマッピング
５Ｆ８のエピトープの位置を決定するために、ｒＨＡ１タンパク質を５種類の重なり合う断片に切り分けた（図２Ａ参照）。対応するＤＮＡの断片を、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＱＥ−３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）の中にクローニングした。ヒスチジン融合タンパク質を発現させるため、クローンを大腸菌Ｍ１５ｐＲＥＰ４コンピテントセル（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ）の中に形質転換した。形質転換した大腸菌Ｍ１５細胞を、３７ＥＣにおいて、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で、０．５〜０．６のＯＤ６００まで増殖させ、タンパク質発現を１ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧの添加により振盪しながら３時間誘導した。細胞をペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁した。発現した融合ペプチドを、ウェスタンブロットによるエピトープマッピングのために用いた。
【００５３】
エピトープマッピングの第２工程のために、断片４の延長であるが断片５の領域中で切り詰められている８種類のさらなる切り詰めたペプチドを発現させた（図２Ｂ）。これらの８種類のサブフラグメントも上記のようにヒスチジン融合（Ｈｉｓ融合）ペプチドとして発現させ、ウェスタンブロット分析に用いた。最終工程のために、アミノ酸２８７〜３００を変異させた点変異を有する１４種類の変異体を生成した。一連の変異体において、そのアミノ酸の全てを、グリシンに変異させたＡｌａ−２９７を除いてアラニンに変異させた。点変異は、ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発のプロトコルを用いて生じさせた。
【００５４】
これらの変異体も、上記のようにＨｉｓ融合ペプチドとして発現させ、ウェスタンブロットを実施して、ｍＡｂ  ５Ｆ８に関するエピトープを形成しているアミノ酸を正確に決定した。
【００５５】
血清の検査
選択したｍＡｂ  ５Ｆ８を用いるエピトープブロッキングＥＬＩＳＡの特異性を決定するため、ヒトおよびニワトリの血清試料を検査し、その結果をＨＩアッセイの結果と比較した。本試験のために用いられる試料を、ヒトおよびニワトリのグループに分けた。ヒトのグループは、３個のグループに分けられた２５種類のヒト血清試料からなっていた。グループ１は、Ｈ５Ｎ１インフルエンザに感染して回復した患者に由来する１０種類の血清試料を含んでおり、インドネシアの保健省（ＭＯＨ）から得た。感染はＰＣＲにより確認され、インドネシアのＭＯＨにより保証されていた。グループ２は、前の６ヶ月以内に市販のインフルエンザウイルスワクチン（ＦＬＵＡＲＩＸ７）をワクチン接種した５人の健康なボランティアからなっていた。ＦＬＵＡＲＩＸ７は次の３種類のウイルス株のそれぞれのヘマグルチニン（ＨＡ）を含む：Ａ／ソロモン諸島／３／２００６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／マレーシア／２５０６／２００４。グループ３は、インフルエンザ感染の履歴およびインフルエンザワクチンの使用が無いことが分かっている１０人の健康なボランティアからなっていた。全ての試料は、それらの状態に関してインドネシアのＭＯＨにより保証されていた。
【００５６】
陽性の血清は、ワクチン接種していない健康な群れからのニワトリのグループ（ｎ＝５）を用いて生成した。ニワトリに、ＩＳＡ−７０（ＳＥＰＰＩＣ，フランス）アジュバント中で乳化させた、全２４種類の不活化したインドネシアＨ５Ｎ１株（表１）および非Ｈ５亜型、例えばＨ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ１、Ｈ７Ｎ１およびＨ９Ｎ２を、２週間の間隔で２回、筋肉内に接種した。血清試料を、第１および第２免疫のそれぞれの後の１０日目に集め、上記で記述したようにＩＦＡおよび間接ＥＬＩＳＡにより適切な株に対する抗体に関して評価した。他の陽性の血清は、実験的に低病原性Ｈ５Ｎ２またはＨ５Ｎ３を感染させた雛から、ウイルス負荷の２週間後に得た。
【００５７】
エピトープブロッキングＥＬＩＳＡ
５Ｆ８  ｍＡｂの最大に近い結合を与えるために、Ｈ５Ｎ１ウイルス抗原／組み換えＨＡ１および５Ｆ８  ｍＡｂの最適濃度を交差力価測定により決定した。Ｕ底９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、高度に精製された最適濃度の組み換えＨＡ１またはＣＤＣ／５２３  Ｈ５Ｎ１不活化ウイルス株で、１００μＬ／ウェルで、適切な生物学的封じ込めの下でコートし、コーティング緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ  カーボネート／ビカーボネート、ｐＨ９．６）中で４ＥＣにおいて一夜保温した。抗原でコートしたプレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈ７．５））で３回洗浄し、非特異的部位を１００μＬのブロッキング緩衝液（５％スキムミルクを含むＰＢＳ）で３７ＥＣにおいて１時間ブロッキングした。検査血清試料をＰＢＳ−Ｔ中で２倍で系列希釈し、１００μＬをそれぞれのウェルに添加し、３７ＥＣで４５分間保温した。プレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μＬのＭＡｂ上清と共に３７ＥＣで１時間保温した。プレートを再度４回洗浄し、結合したＭＡｂを、１００μＬの１：１０００希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスＩｇの添加により、３７ＥＣで１時間保温して検出した。ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、プレートを１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ，米国）と共に保温した。０．１Ｎ硫酸の添加により反応を止め、４５０ｎｍにおいて発色を読んだ。ＭＡｂの抗原への結合を阻害する、試料の抗体により引き起こされる比色反応のパーセント阻害を、異なる希釈率のそれぞれの血清に関して、次のパーセント阻害に関する式を用いることにより算出した：
パーセント阻害＝１００−［ＯＤ（検査血清）／ＯＤ（陰性対照）×１００］。検査血清による５０％阻害の閾値を、Ｈ５ＨＡ抗体に関して＞陽性＝であると考えた。検査試料により引き起こされる阻害に関して、結果をＭＡｂ結合のパーセント阻害として表した。
【００５８】
ＩＩ．結果
モノクローナル抗体の特性づけ
Ｈ５ＮＡ１抗原に対するｍＡｂ類を分泌する一群のハイブリドーマクローンを、全２４種類のインドネシアＨ５Ｎ１インフルエンザ株および他のＨ５および非Ｈ５亜型に対する免疫蛍光（ＩＦＡ）によりスクリーニングした。結果は、５Ｆ８  ＭＡｂが全てのＨ５亜型を用いて感染させた全てのＭＤＣＫ細胞および組み換えＨＡ１を発現するバキュロウイルスを用いて感染させたＳｆ−９細胞と強く反応し、陽性の細胞質の免疫蛍光パターンを生じたことを示し（図１Ａ−１〜１Ａ−３）、それはウサギ抗Ｈ５Ｎ１血清を用いて得られたパターンと同じであった。全ての他の亜型、例えばＨ７Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ２およびＨ９Ｎ２を感染させたＭＤＣＫ細胞は、蛍光シグナルを与えなかった（図１Ａ−２および１Ａ−４）。ｍＡｂ  ５Ｆ８を、Ｈ５Ｎ１株またはＨ５亜型の未変性のＨＡ１およびｒＨＡ１を検出する能力に関してウェスタンブロッティングによりスクリーニングした（図１Ｂ）。ウェスタンブロッティングにより、ｍＡｂ  ５Ｆ８は全てのインドネシアＨ５Ｎ１株およびＨ５亜型と強く反応し、Ｈ７Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ２およびＨ９Ｎ２のような他のいずれの亜型とも交叉反応は観察されなかった。ＩＦＡおよびウェスタンブロットによるモノクローナル抗体の感度および特異性に基づき、５Ｆ８  ｍＡｂをエピトープマッピングのために、次いでＥＢ−ＥＬＩＳＡにおける使用のために選択した。５Ｆ８  ｍＡｂのアイソタイプはＩｇＭのクラスであると決定された。
【００５９】
ｍＡｂのエピトープマッピング
エピトープマッピングの第１段階において、ウェスタンブロットの結果は、ｍＡｂ  ５Ｆ８が断片５（アミノ酸２５６〜３３７）と反応したことを示した（図２Ａおよび２Ｂ；図２Ｂにおいて、最初の”Ｃ”は対照を表し、”Ａ  Ｂ  Ｃ  Ｄ  Ｅ”は図２Ａにおいて言及されている断片の名前を表す）。
【００６０】
エピトープマッピングの第２段階のため、断片４の延長であるが断片５の領域中で切り詰められている切り詰めたペプチドを発現させた（図２Ａにおいてダイアグラムにより表す）。これらの８種類のサブフラグメントも上記で記述したようなヒスチジン融合ペプチドとして発現させ、ウェスタンブロット分析のために用いた（図２Ｃ）。ウェスタンブロットの結果は、ｍＡｂ  ５Ｆ８が断片８、７、６、５および４と反応したことを示しており、これはエピトープが２８７〜３００の範囲内にあることを示している。第３および最終段階において、第４断片中のアミノ酸２８７〜３００のそれぞれをアラニンに変異させ、タンパク質を大腸菌中でヒスチジン融合タンパク質として発現させた。ウェスタンブロットの結果は、変異体Ｙ２８７Ａ、Ｇ２８８Ａ、Ｎ２８９Ａ、Ｍ２９８Ａ、Ｇａ９９ＡおよびＡ３００Ｇに関して陽性の結果を示した。変異体Ｃ２９０Ａ、Ｎ２９１Ａ、Ｔ２９２Ａ、Ｋ２９３Ａ、Ｃ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｔ２９６ＡおよびＰ２９７Ａはウェスタンブロットで陰性の結果を示した。これらのデータは、陰性の結果を示したアミノ酸の変異体はエピトープに含まれているアミノ酸であり、従って変異させた際にｍＡｂ  ５Ｆ８により認識されなかったことを示している。他の変異体は変異にも関わらずｍＡｂにより認識され、これはそれらがエピトープの形成に関わっていないことを示している。これらのデータは、エピトープに含まれる具体的なアミノ酸がＣＮＴＫＣＱＴＰであったことを示している。
【００６１】
表２
【００６２】
【表２】
0005490725.tif 000005
【００６３】
エピトープブロッキングＥＬＩＳＡ
エピトープブロッキングＥＬＩＳＡアッセイの診断上の有効性を、ヒトおよびニワトリの血清試料中でＨ５ＨＡ抗体を検出するその能力により特性付けした。全てのＨ５Ｎ１インフルエンザ感染から回復したヒトの血清試料は、ｍＡｂ  ５Ｆ８を用いて実施したエピトープブロッキングＥＬＩＳＡにおいて、感染から回復した時間に依存して９６を超える希釈率において５０％を超える平均ブロッキング値（ｍｅａｎ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｖａｌｕｅｓ）で検査の結果が陽性であった（表３Ｂ）。ＨＩ検査も２４（ｌｏｇ２４〜２５）のＨＩ力価を示した。非Ｈ５ワクチン接種したヒトの血清を用いた試料は、１：５希釈で１０〜１５％の阻害を示した。しかし、ヘマグルチニン阻害アッセイは１４．４（ｌｏｇ２３〜２８）のＨＩ力価を示し、これは交叉反応性を示している。普通のヒトの血清は、ＭＡｂのその抗原部位に対する結合の７％未満のブロッキングを示した。
【００６４】
全てのＨ５Ｎ１で免疫したニワトリの血清試料は、ｍＡｂ  ５Ｆ８を用いて実施したエピトープブロッキングＥＬＩＳＡにおいて、最初の免疫の後の１０日目に、４７を超える平均血清希釈率（４０〜５７．６）で５０％を超える平均ブロッキング値で検査の結果が陽性であった。第２免疫の後の１０日目に、ｍＡｂのその対応するエピトープに対する結合をブロッキングする２９６．４６を超える平均血清希釈率（２５６〜３２８）を示した。しかし、ヘマグルチニン阻害アッセイはそれらの日（７日目および１４日目）においてｌｏｇ２３〜２４およびｌｏｇ２８〜２９のＨＩ力価を示した。非Ｈ５亜型を感染させた血清試料は、１：２〜１：４希釈において１５％〜２０％の最大ブロッキングを示した。しかし、検査した非Ｈ５亜型の中で、Ｈ３Ｎ２で免疫した血清は、第２免疫の後の１０日目のピークにおいてＨＩ検査で陽性（ｌｏｇ２４）を示した（表３ａ）。
【００６５】
さらに、図３Ａおよび３Ｂで示したように、抗体反応はｒＨ５ＨＡおよびＨ５Ｎ１ウイルス抗原をブロッキングに用いた場合の両方において類似の動態を示した。この試験は、抗体の検出のためのブロッキングＥＬＩＳＡのための代替Ｈ５Ｎ１ウイルス抗原としての組み換えＨ５ＨＡ抗原の実証を提供する。
【００６６】
表３ａ
【００６７】
【表３−１】
0005490725.tif 000006
【００６８】
【表３−２】
0005490725.tif 000007
【００６９】
【表３−３】
0005490725.tif 000008
【００７０】
ａ）  ｍＡｂ結合を５０％ブロッキングする血清の力価を表し、それぞれのニワトリ血清をブロットし、平均値を見つけて表した（ｎ＝５／グループ  ∀  Ｓ．Ｅ．）。
表３ｂ
【００７１】
【表４】
0005490725.tif 000009
【００７２】
ａ）  ｍＡｂ結合を５０％ブロッキングする血清の力価を表し、それぞれのヒト血清をブロットし、平均値を見つけて表した（ｎ＝５／グループ  ∀  Ｓ．Ｅ．）。
ＥＢ−ＥＬＩＳＡおよびインフルエンザ感染に対する抗体に関する血清学的検査に一般的に用いられるＨＩ検査の結果は、既存の血清学的検査と比較したＥＢ−ＥＬＩＳＡの能力を説明している。１０種類の十分に定義された陽性のヒトＨ５Ｎ１血清試料および非Ｈ５ワクチン接種した提供者からの５種類の血清を含む１５種類の十分に定義された陰性の血清試料を用いた検査の結果は、全ての抗Ｈ５Ｎ１陽性の血清を同定することができ非Ｈ５ワクチン接種した血清とは交叉反応しないＥＢ−ＥＬＩＳＡの信頼性を実証している。系列希釈した血清試料をＥＢ  ＥＬＩＳＡおよびＨＩ検査の両方で検査した際に、ＥＬＩＳＡはＨＩよりも低い抗体レベルを検出することができ、非Ｈ５ワクチン接種した血清試料と交叉反応しなかった。それに対し、ＨＩ検査は非Ｈ５ワクチン接種した血清試料の異種の抗ＨＡ抗体と反応した。
【００７３】
２４種類のＨ５Ｎ１インドネシア株、さらにＨ５Ｎ２およびＨ５Ｎ３株からの十分に定義された陽性の試料からのニワトリ血清試料を検査することにより、ＥＢ  ＥＬＩＳＡの感度も決定した。また、結果はブロッキング検査がＨＩ検査よりも低い抗体レベルを検出することを示し、特異性に関しても検査した。ＥＢ  ＥＬＩＳＡは非Ｈ５亜型の異種の抗ＨＡ抗体の系列希釈物と交叉反応しなかった。しかし、ＨＩ検査では、Ｈ３ＨＡ抗体との交叉反応性が観察され、平均ＨＩ力価は第１および第２免疫の後の１０日目にそれぞれｌｏｇ２２．４およびｌｏｇ２４．２であることが分かった。ＥＢ  ＥＬＩＳＡおよびＨＩにより測定される抗体の力価の比較は、ヒトおよびニワトリの血清の両方を試験した際に感度および特異性において前者がより優れていることを明らかにした。ＨＩ検査は有効かつ高感度であるが、それは危険なウイルスの産生および取り扱いを必要とし、それはその望ましさにとってかなりの制限である。それに対し組み換えＨ５ＨＡ抗原は、その抗原が感染性ではなく、影響を受けやすい動物にとって危険でないため、細胞培養施設を有するあらゆる実験室で調製することができる。
【００７４】
ヒトを含む哺乳類種におけるトリインフルエンザウイルスに対する抗体の、ＨＩアッセイを用いた検出は一般に、実験的な感染がウイルスの分離により確認された場合においてさえも失敗してきた（２５）。さらに、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、およびＨ６亜型のＨＡ類は、抗ＨＡ抗体により認識される交叉反応性エピトープを含むことが示されている（２６、２７）。この研究において開発されたＥＢ−ＥＬＩＳＡはインフルエンザＨ５亜型に高度に特異的であった。それはヒト、動物および鳥類におけるインフルエンザＨ５感染と関係するウイルスの感染の方式および危険因子を決定するための大規模血清疫学研究に用いることができる。
【００７５】
ｍＡｂ  ５Ｆ８により認識されるエピトープのＣＮＴＫＣＱＴＰ配列（ａａ２９０〜２９７）は、全てのヒトおよび本質的に全てのニワトリのインフルエンザＨ５亜型において高度に保存されていることが分かっている。それは動物および鳥類の他の種からのほとんど全てのＨ５亜型株においても保存されている。その領域は、Ｈ１亜型を除く非Ｈ５ヘマグルチニンのいずれにおいても存在せず、後者においては変異した形でのみ見つかっている。従って、５Ｆ８  ｍＡｂは、そのエピトープの安定性および高い免疫原性がその抗体をＨ５亜型の診断に非常に特異的にするために、特に有用である。
【００７６】
実施例２
Ｉ．実験的なこと
１Ｇ５と名付けられた第２のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ上清を得るための、実施例１の一般的な手順に従って生成した。そのｍＡｂは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルス株Ａ／ガチョウ／広東省／９７からクローニングされた組み替えＨＡ０タンパク質に対して産生された。
【００７７】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）
Ｓｆ−９およびＭＤＣＫ細胞を９６０ウェルプレート中にまき、それぞれ切り詰めたＨ５Ｎ１  ＨＡ１遺伝子を有する組み換えバキュロウイルスおよびＨ５Ｎ１ウイルスと共に保温し、感染の３６時間後において、細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間、室温で固定した。全ての洗浄はＰＢＳ、ｐＨ７．４で実施した。固定した細胞を、ハイブリドーマ培養液と共に３７℃で１時間保温し、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇの１：５０希釈液と共に保温した。細胞を洗浄し、蛍光を適切なバリアおよび励起フィルターのあるＯｌｙｍｐｕｓ  １Ｘ７１を用いて可視化した。
【００７８】
１Ｇ８と名付けられた１種類のｍＡｂは、ＩｇＭ  ｍＡｂであると決定され、全ての２４種類の既知のインドネシア株に対して、さらに他のＨ５亜型に対して、ＩＦＡおよびウェスタンブロット分析による検査の結果が陽性であった。それをエピトープマッピングおよびさらにブロッキングＥＬＩＳＡの開発のために選択した。
【００７９】
免疫ブロッティング
免疫ブロッティングは、実施例１の一般的な手順に従って行った。
１Ｇ５のエピトープマッピング
ｍＡｂ  １Ｇ５に関するエピトープを、断片化したタンパク質の過剰発現のプロトコルを用いてマッピングした。１Ｇ５のエピトープの位置を決定するために、ｒＨＡ１タンパク質を図５Ａに示した５種類の重なり合う断片に、実施例１で述べたプロトコルを用いて切り分けた。
【００８０】
エピトープマッピングの第２工程のために、断片４の延長であるが断片５の領域中で切り詰められている８種類のさらなる切り詰めたペプチドを発現させた。これらの８種類のサブフラグメントも、実施例１で記述したようにヒスチジン融合ペプチドとして発現させた。最終工程のために、アミノ酸３０８〜３２０を変異させた点変異を有する１３種類の変異体を生成した。一連の変異体において、そのアミノ酸の全てをアラニンに変異させた。点変異は、ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発のプロトコルを用いて生じさせた。実施例１において記述したように、変異体はＨｉｓ融合ペプチドとしても発現させ、ウェスタンブロット分析を実施して、ｍＡｂ  １Ｇ５に関するエピトープを形成しているアミノ酸を正確に決定した。
【００８１】
血清の検査
ｍＡｂ  １Ｇ５を用いるエピトープブロッキングＥＬＩＳＡの特異性を、実施例１で述べた手順に従って決定した。
【００８２】
エピトープブロッキングＥＬＩＳＡ
実施例１の教えに従って、エピトープブロッキングＥＬＩＳＡにおいてｍＡｂ  １Ｇ５を用いた。
【００８３】
ＩＩ．結果
モノクローナル抗体の特性付け
Ｈ５Ａ１抗原に対するｍＡｂ類を分泌する一群のハイブリドーマクローンを、全２４種類の既知のインドネシアＨ５Ｎ１インフルエンザ株および他のＨ５および非Ｈ５亜型に対する免疫蛍光（ＩＦＡ）によりスクリーニングした。結果は、ｍＡｂ  １Ｇ５が全てのＨ５亜型を用いて感染させた全てのＭＤＣＫ細胞および組み換えＨＡ１を発現するバキュロウイルスを用いて感染させたＳｆ−９細胞と強く反応し、陽性の細胞質の免疫蛍光パターンを生じたことを示し（図４Ａ−１および４Ａ−３）、それはウサギ抗Ｈ５Ｎ１血清を用いて得られたパターンと同じであった。全ての他の亜型、例えばＨ７Ｎ１（図４Ａ−２および図４Ａ−４）、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ１、Ｈ９Ｎ２およびＨ１０Ｎ５は蛍光シグナルを与えなかった。ｍＡｂ  １Ｇ５を、Ｈ５Ｎ１株またはＨ５亜型の未変性のＨＡ１およびｒＨＡ１を検出する能力に関してウェスタンブロッティングによりスクリーニングした（図４Ｂ）。ｍＡｂ  １Ｇ５は全ての既知のインドネシアＨ５Ｎ１株およびＨ５亜型と強く反応した；ウェスタンブロッティングにより、他の亜型との交叉反応は観察されなかった。ＩＦＡおよびウェスタンブロットによるモノクローナル抗体の感度および特異性に基づき、１Ｇ５  ｍＡｂをエピトープマッピングのために、次いでＥＢ−ＥＬＩＳＡにおける使用のために選択した。ｍＡｂ  １Ｇ５のアイソタイプはクラスＩｇＭであると決定された。
【００８４】
ｍＡｂ  １Ｇ５のエピトープマッピング
エピトープマッピングの第１段階において、断片のウェスタンブロット分析は、ｍＡｂ  １Ｇ５がアミノ酸２５６〜３３７である第５断片と反応したことを示した（図５Ｂ）。
【００８５】
表４
ウェスタンブロッティングの結果
【００８６】
【表５】
0005490725.tif 000010
【００８７】
さらにエピトープの位置を決めるため、第２段階において、第５断片の８種類のサブフラグメントを第４断片の延長として発現させ、Ｈｉｓ融合タンパク質として発現させた。ウェスタンブロットの結果（図５Ｃ）は、１Ｇ５が断片６、７および８と反応したことを示しており、これはエピトープがアミノ酸３０８〜３２０の範囲内にあることを示している。
【００８８】
表５
ウェスタンブロッティングの結果
【００８９】
【表６】
0005490725.tif 000011
【００９０】
これらの結果は、エピトープがアミノ酸３０８〜３２０の範囲に存在することを示した。１Ｇ５に関する仮のエピトープはＨＮＩＨＰＬＴＩＧＥＣＰＫであると決定された。
第３段階において、クローンＳＦ６の中に、３０８から３２０までの全てのアミノ酸がアラニンに変異するように、一度に１つのアミノ酸に点変異を導入し、タンパク質断片を再度Ｈｉｓ融合タンパク質として発現させた。ウェスタンブロットにおいて、そのｍＡｂはアミノ酸３１０〜３１７に変異のあるタンパク質断片とは反応しないが、それ以外とは陽性の反応を示すことが観察された（図５Ｃ）。これらの結果から、ｍＡｂ  １Ｇ５により認識されるエピトープはＩＨＰＬＴＩＧＥであると結論づけた。
【００９１】
表６
点変異した断片のウェスタンブロット分析
【００９２】
【表７】
0005490725.tif 000012
【００９３】
ｍＡｂ  １Ｇ５により認識されるエピトープのＩＨＰＬＴＩＧＥ配列は、今までに確認された全てのヒトおよびニワトリのインフルエンザ亜型において高度に保存されていることが分かっている。その領域は、そのエピトープの領域が変異を含みその抗体と反応しない特定のＨ１亜型を除く非Ｈ５ヘマグルチニンのいずれにも存在しない。従って、１Ｇ５  ｍＡｂは、そのエピトープの安定性および高い免疫原性がその抗体をＨ５亜型の診断に非常に特異的にするために、非常に有用である。
【００９４】
エピトープブロッキングＥＬＩＳＡ
エピトープブロッキングＥＬＩＳＡアッセイの診断上の有効性を、ヒトおよびニワトリの血清試料中でＨ５ＨＡ抗体を検出するその能力により特性付けした。全てのＨ５Ｎ１で免疫したヒトおよびニワトリの血清試料は、ｍＡｂ  １Ｇ５を用いて実施したＥＢ−ＥＬＩＳＡにおいて、ニワトリにおいて１：３０の平均血清希釈率で（図８ならびに図９Ａおよび９Ｂ参照）、および回復したヒトの血清試料において１：１０希釈で（図８）、５０％の平均ブロッキング値で検査の結果が陽性であった。さらに、非Ｈ５ワクチン接種したヒトの血清は、１：５希釈で７〜１３％の阻害を示した。それに対し、ＨＩアッセイはＨＩ力価ｌｏｇ２２を示した。
【００９５】
実施例３
抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣ−ＥＬＩＳＡ）の開発
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，デンマーク）を、５０μｌの炭酸緩衝液（７３ｍＭ重炭酸ナトリウムおよび３０ｍＭ炭酸ナトリウム）中の精製したｍＡｂ類５Ｆ８および／または１Ｇ５でコートし、３７℃で１時間または４℃で一夜保温した。それぞれの保温工程の後、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、全ての希釈液は１％脱脂乳を含むＰＢＳＴ中で作った。プレートを１００μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ−Ｔ中５％脱脂乳と共に３７℃で１時間保温することによりブロッキングし、すすぎ、５０μｌの精製した高病原性Ｈ５Ｎ１インドネシア株／低病原性ＡＩＶ  Ｈ５亜型（Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ３）／他の非Ｈ５亜型と共に３７℃で１時間保温した。すすいだ後、１００μｌのモルモット単一特異性抗体ＩｇＧ（１：５００希釈）を添加し、３７℃で１時間保温し、洗浄し、さらに１００μｌのＨＲＰコンジュゲートウサギ抗モルモット免疫グロブリン（１：１０００で希釈した）と共に保温した。発色は１００μｌのＴＭＢ基質溶液の添加により行った；反応を４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により止め、ｓｕｎｒｉｓｅ  Ｔｅｃａｎ  Ｒｅｍｏｔｅ  ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いてＡ４５０の値を測定した。ｍＡｂ類および単一特異性抗体の使用濃度（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を、交差力価測定により決定した。
【００９６】
ＡＣ−ＥＬＩＳＡを最適化するため、モノクローナルおよびポリクローナル抗体を捕捉および検出抗体として交換できるように用いた。微量定量プレートをモルモット抗ｒＨＡ１ポリクローナル抗体でコートした場合、プレートを捕捉抗体としてのｍＡｂ類でコートした場合に記録されたものと比較してはるかに低い吸光度が記録された。従って、ｍＡｂ類は捕捉抗体として用いられ、一方でポリクローナル抗体は検出抗体として役立った。捕捉抗体として用いられるｍＡｂ  ５Ｆ８およびｍＡｂ  １Ｇ５の組み合わせは、どちらかのｍＡｂ類単独よりも強い検出シグナルを与えた（図６Ａおよび６Ｂ）。その２種類のモノクローナル抗体の組み合わせは、ＡＣ−ＥＬＩＳＡにおけるＨ５抗原の検出に関して高い親和性および特異性を示す。いずれの他の亜型との交叉反応も観察されなかった。ｍＡｂ  ５Ｆ８およびｍＡｂ  １Ｇ５の両方に基づくアッセイは、Ｈ５Ｎ１の１０２ＴＣＩＤ５０単位を検出した（図７）。Ｈ４Ｎ１を含むアッセイは、バックグラウンドレベルを有意に上回る吸光度をもたらさなかった。
【００９７】
２種類のｍＡｂ類のマッピングは、それらが同じＨＡ１抗原の２種類の異なるエピトープに向けられていることを示した。それらの別個の線状エピトープは、Ｈ５抗原の検出に関する感度を高める。ｍＡｂ  ５Ｆ８により認識されるエピトープは普遍的エピトープであり、そのエピトープの８アミノ酸は、遺伝子バンクで入手できる１２８８種類のインフルエンザａ  Ｈ５Ｎ１配列のほとんど全てに存在する。ｍＡｂ  １Ｇ５により認識されるエピトープは、現在知られており遺伝子バンクで入手できる全ての１２８８種類のインフルエンザＨ５亜型株に存在する。その２種類のエピトープの間が離れていることは、抗原の結合および検出に関して高い親和性を生み出す。
【００９８】
参考文献
【００９９】
【化１】
0005490725.tif 000013
【０１００】
【化２】
0005490725.tif 000014
【０１０１】
【化３】
0005490725.tif 000015
【０１０２】
【化４】
0005490725.tif 000016
【０１０３】
【化５】
0005490725.tif 000017
【図１（Ａ）】
0005490725.tif 000018
【図１（Ｂ）】
0005490725.tif 000019
【図２Ａ】
0005490725.tif 000020
【図２Ｂ】
0005490725.tif 000021
【図２Ｃ】
0005490725.tif 000022
【図２Ｄ】
0005490725.tif 000023
【図３】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0005490725.tif 000031
【図４Ａ】
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【図５Ｂ】
0005490725.tif 000033
【図５Ｄ】
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