(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均粒径が５０ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子が分散した血管内投与に適した水溶液であり、
前記炭酸アパタイト粒子に、抗腫瘍活性を有する薬剤が内包されてなり、且つ
血管内投与される腫瘍治療剤として使用される、水溶液。
【請求項２】
抗腫瘍活性を有する薬剤が内包されている前記炭酸アパタイト粒子が超音波振動処理によって得られたものである、請求項１に記載の水溶液。
【請求項３】
水溶液が生理食塩水である、請求項１又は２に記載の水溶液。
【請求項４】
更に、アルブミンを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の水溶液。
【請求項５】
抗腫瘍活性を有する薬剤を内包した炭酸アパタイト粒子を含む水溶液を収容した容器に対して、溶媒を介して超音波振動与える超音波振動処理を行う工程を含む、請求項１に記載の水溶液を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、平均粒子径が５０ｎｍ以下の炭酸アパタイト粒子（本書では、これを「スーパーアパタイト超微細ナノ粒子」と呼ぶ場合もある）が分散した水溶液及びその利用、並びに、これらに関連する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）の水酸基（ＯＨ- ) の一部を炭酸基（ＣＯ３２- ) にて置換した化学構造を有する。特許文献１には、物質を細胞内に導入するための担体として炭酸アパタイトを用いることが提案されている。具体的に特許文献１には、目的の物質及びリン酸カルシウム系材料から構成される複合体粒子をｐＨ８．０からｐＨ６．０に変化させた場合において、ｐＨ６．０に変化させてから所定時間内に、ｐＨ８．０において存在していた前記複合体粒子の少なくとも５０％が溶解する細胞導入剤が開示されている。
【０００３】
また、特許文献２には、炭酸アパタイトは、一次粒子径は小さいが、凝集性が強く、二次的粒子径が大きいという問題があり、それを解消するための手段として、リン酸とカルシウムを含む水溶液の炭酸量や反応雰囲気を制御する方法を開示している。しかしながら、これらの従来技術を踏まえても、炭酸アパタイトを物質の細胞内や生体内へと運ぶ担体として実用化するには、更なる改善が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０４３４９５
【特許文献２】特開２００５−７５７１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
即ち、従来の炭酸アパタイトを用いた物質の細胞内への取り込み効率は、必ずしも満足できるものではなく、更なる改善の余地があった。また、炭酸アパタイトを動物に動静脈注射等によって投与するには、投与に適した生理食塩水等の溶液に溶解する必要があるところ、炭酸アパタイトの作製に用いた溶媒から、生理食塩水等の溶媒に置換する際に遠沈を行うと、炭酸アパタイトが凝集し、巨大な塊を形成し投与（特に、血中への投与）に用いることができないという事情がある。そこで、本発明は、このような従来の炭酸アパタイトに関する問題を解消することを代表的な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記のような問題を解決すべく、本発明者等は、鋭意研究を重ねた結果、次の知見を得た。（１）従来の炭酸アパタイトに対して、超音波振動処理を行うことで、平均粒径を５０ｎｍ以下に制御することができ、従来の炭酸アパタイト粒子を用いた場合よりも格段に細胞への物質の取り込み効率が向上し、より短時間で、大量の物質の導入が可能である。（２）当該スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いて物質を生体へ動静脈内投与することにより物質の肝臓及び腎臓への蓄積を大幅に低減することが可能になり、一方で腫瘍組織においては、血管から遠く離れた領域にまで物質を効率よく浸出させることが可能である。（３）スーパーアパタイト超微細ナノ粒子で抗腫瘍活性を有する物質を腫瘍モデルマウスに静脈内投与することにより、従来技術と比較して、より少量の抗腫瘍活性を有する物質で飛躍的に向上した抗腫瘍活性が奏される。（４）炭酸アパタイト粒子にアルブミンを添加して超音波振動処理にかけることにより、粒径をより小さくすることが可能であり、粒子の凝集を効果的に抑制できることが可能である。（５）平均粒径が５０ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子は、ポリトロンホモジナイザー（ＰＯＬＹＴＲＯＮ ＰＴ３０００）、ボルテックスミキサー、超音波破砕装置（ＵＬＴＲＡＳＯＮＩＣ ＤＩＳＲＵＰＴＯＲ  ＴＯＭＹＵＤ−２０１）等の一般的な微細化手段を用いても得ることはできないが、炭酸アパタイト粒子を適当な容器に収容して試験管等の洗浄に通常用いられる超音波洗浄器の水浴に浮かべながら、超音波をかけることによって簡便且つ確実に得られる。本発明者等は、斯かる知見に基づき、更なる検討と改良を加えた末、本発明を完成するに至った。
【０００７】
代表的な本発明を以下に示す。
項１．
平均粒径が５０ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子が分散した水溶液。
項２．
水溶液が生理食塩水等の生体投与可能な水溶液である、項１に記載の水溶液。
項３．
物質を細胞内に導入させるための運搬体である、項１又は２に記載の水溶液。
項４．
物質が薬剤である、項３に記載の水溶液。
項５．
薬剤が炭酸アパタイト粒子に内包されている、項１又は２に記載の水溶液。
項６．
更に、アルブミンを含む、項１〜５のいずれかに記載の水溶液。
項７．
従来の炭酸アパタイト粒子を含む水溶液を超音波振動処理することを含む、項１に記載の水溶液を製造する方法。
項８．アルブミンを含む、炭酸アパタイト粒子の凝集阻害剤。
項９．アルブミンを含む、炭酸アパタイト粒子の微細化促進剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の代表的な効果としては、次が挙げられる：（１）従来の炭酸アパタイト粒子を利用した場合と比較して、遥かに効率的に物質を細胞内に導入することが可能である。（２）炭酸アパタイトを用いた生体への物質の導入を血管内投与を介して行うことが可能である。（３）スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いたドラッグデリバリーシステムの実用化を可能にする。（４）薬物の投与による肝臓及び腎臓の毒性を格段に低減することが可能であるため、より安全性に優れた各種疾患の治療を提供することが可能である。（５）スーパーアパタイト超微細ナノ粒子は、血管内投与した場合に効率的に腫瘍組織に浸出する。（６）スーパーアパタイト超微細ナノ粒子をアルブミンと組み合わせることによって粒子の粒径をより小さくすること、及び再凝集を抑制することが可能である。（７）非常に簡便且つ効率的に炭酸アパタイト粒子を平均粒径数十ナノメールの大きさに微細化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１−１】実施例１のスーパーアパタイト超微細ナノ粒子（１）の粒径及び形態を走査型プローブ顕微鏡で測定した結果である。
【図１−２】実施例１のスーパーアパタイト超微細ナノ粒子（２）の粒径及び形態を走査型プローブ顕微鏡で測定した結果である。
【図１−３】実施例１のスーパーアパタイト超微細ナノ粒子（３）の粒径及び形態を走査型プローブ顕微鏡で測定した結果である。
【図２】従来型の炭酸アパタイト粒子の粒径及び形態を測定した結果である。
【図３−１】ＫＭ１２ｓｍ細胞に対するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の取り込みを測定した写真を示す。
【図３−２】ＫＭ１２ｓｍ細胞に対するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の取り込みを蛍光度で測定した結果を示す。
【図４−１】２２ＲＶ１細胞に対するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の取り込みを測定した写真を示す。
【図４−２】２２ＲＶ１細胞に対するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の取り込みを蛍光度で測定した結果を示す。
【図５−１】ＦａＤｕ細胞に対するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の取り込みを測定した写真を示す。
【図５−２】ＦａＤｕ細胞に対するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の取り込みを蛍光度で測定した結果を示す。
【図６】ＨＣＴ１１６細胞に対するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の取り込みを解析した結果を示す。
【図７−１】ＨＣＴ１１６細胞に対するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の取り込みを高解像度で解析した写真を示す。
【図７−２】ＨＣＴ１１６細胞に対するリポフェクタミンの取り込みを高解像度で解析した写真を示す。
【図８】腫瘍形成モデルマウスにスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を静注した際の肝臓、腎臓及び脾臓における蓄積を解析した結果を示す。
【図９−１】肝臓におけるスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の蓄積の有無を示す。
【図９−２】腎臓におけるスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の蓄積の有無を示す。
【図１０−１】腫瘍組織（ＨＣＴ１１６）血管及びその周辺組織におけるスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の分布を示す。
【図１０−２】腫瘍組織（ＨＴ２９）におけるスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の分布を示す。
【図１０−３】腫瘍組織（ＨＣＴ１１６）におけるスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の分布を蛍光強度に基づいて解析した結果を示す。
【図１１】抗サバイビンｓｉＲＮＡを包含するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子のＨＣＴ１１６細胞中での標的遺伝子タンパクの発現抑制を機能解析した結果を示す。
【図１２】抗サバイビンｓｉＲＮＡを包含するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子をＨＣＴ１１６細胞へ導入した場合の細胞生存率に対する影響を調べた結果を示す。
【図１３】抗サバイビンｓｉＲＮＡ内包スーパーアパタイト超微細ナノ粒子の腫瘍形成モデルマウスにおける腫瘍増殖に対する影響を示す。
【図１４】ドキソルビシン包含スーパーアパタイト粒子による腫瘍形成モデルマウスにおける腫瘍増殖に対する影響を示す。
【図１５】アルブミンの添加によってスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の凝集が抑制されることを示す。（−）は、アルブミンの添加及び超音波処理が施されていない場合の結果ことを示す。（＋）は、アルブミンを添加せずに超音波振動処理が施した場合の結果を示す。（Ａｌｂ）は、アルブミンを添加し、且つ、超音波振動処理を施した結果を示す。
【図１６】従来型のアパタイト粒子と比較したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子のｐＨ感受性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において使用できる炭酸アパタイト及び炭酸アパタイト粒子は公知である。炭酸アパタイトは、水酸アパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）の水酸基（ＯＨ- ) の一部を炭酸基（ＣＯ３２- ) にて置換した化学構造を有し、一般式Ｃａ１０−ｍＸｍ（ＰＯ４）６（ＣＯ３）１−ｎＹｎで表すことができる。ここで、Ｘは、炭酸アパタイトにおけるＣａを部分的に置換しうる元素であればよく、例えば、Ｓｒ、Ｍｎ、希土類元素等を挙げることができる。ｍは、通常０以上１以下の正数であり、好ましくは０以上０．１以下であり、より好ましくは０以上０．０１以下であり、更に好ましくは０以上０．００１以下である。Ｙは、炭酸アパタイトにおけるＣＯ３を部分的に置換しうる単位であり、ＯＨ、Ｆ、Ｃｌ等を例示することができる。ｎは、通常０以上０．１以下の正数であり、好ましくは０以上０．０１以下であり、より好ましくは０以上０．００１以下であり、更に好ましくは０以上０．０００１以下である。
【００１１】
炭酸アパタイト粒子は、公知の手法に従って得ることが出来る。例えば、カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する水溶液を調製することにより得ることが出来る。水溶液中の各イオン濃度は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されず、下記を参考に適宜設定することができる。
【００１２】
水溶液中のカルシウムイオン濃度は、通常０．１ｍＭ以上であり、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、より好ましくは１ｍＭ以上である。カルシウムイオン濃度の上限は、通常１Ｍ以下であり、好ましくは１００ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下である。
【００１３】
水溶液中のリン酸イオン濃度は、通常０．１ｍＭ以上であり、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、より好ましくは１ｍＭ以上である。リン酸イオン濃度の上限は、通常１Ｍ以下であり、好ましくは１００ｍＭ以下であり、より好ましくは１０ｍＭ以下である。
【００１４】
水溶液中の炭酸水素イオン濃度は、通常１．０ｍＭ以上であり、好ましくは５ｍＭ以上であり、より好ましくは１０ｍＭ以上である。炭酸水素イオン濃度の上限は通常１０Ｍ以下であり、好ましくは１Ｍ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下である。
【００１５】
カルシウムイオン、リン酸イオン及び炭酸水素イオンの供給源は、水溶液中にこれらのイオンを供給可能である限り特に制限されないが、例えば、これらのイオンの塩を水溶液に添加することができる。具体的には、カルシウムイオン源としてＣａＣｌ２を用いることができ、リン酸イオン源としてＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏを用いることができ、炭酸イオン源としてＮａＨＣＯ３を用いることができる。
【００１６】
炭酸アパタイト粒子に他の物質を包含させる場合は、炭酸アパタイト粒子を形成する際に、他の物質を水溶液に添加することができる。他の物質の種類は特に制限されないが、炭酸アパタイト粒子を細胞又は生体への物質の運搬体として用いる場合は、種々の薬剤（生理活性物質）を用いることができる。本書において、「内包」とは、他の物質を運搬可能な状態で炭酸アパタイト粒子と他の物質とが任意の態様で接着している状態を含む。例えば、炭酸アパタイト粒子の内側又は外側に他の物質が接着した状態が含まれる。
【００１７】
上記薬剤としては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、sｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸、酵素、ペプチド又はタンパク質、各種ペプチド性ホルモン等のポリペプチド、各種抗がん剤、中枢神経系疾患治療薬、各種抗生物質、末梢神経疾患治療薬、感覚器官疾患治療薬、循環器官疾患治療薬、呼吸器官系疾患治療薬、消化器官系疾患治療薬、ホルモン剤、泌尿生殖器官疾患治療薬、外皮疾患治療薬、歯科口腔疾患治療薬、ビタミン剤、滋養強壮薬、細胞賦活用剤、抗アレルギー剤等を挙げることができるが、これらに限定されるものではあに。これらの薬物は、１種単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００１８】
スーパーアパタイト超微細ナノ粒子は、血管内投与した際に腫瘍組織に効率的に浸出し、集積する性質を有する。よって、スーパーアパタイト粒子に包含させる好ましい物質は抗癌剤である。使用可能な抗癌剤は特に制限されないが、例えば、次の化合物を挙げることができる：シクロホスファミド水和物、イホスファミド、チオテパ、ブスルファラン、メルファラン、ニムスチン塩酸塩、ラニムスチン、ダカルパジン、テモゾロミド等のアルキル化剤；メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム水和物、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、タガフール、シタラビン、ゲムシタビン塩酸塩、フルダラビン燐酸エステル、ネララビン、クラドリビン、レボホリナートカルシウム等の代謝拮抗剤；ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、プラルビシン、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、アムルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、マイトマイシンC、アクチノマイシンD、ブレオマシイン塩酸塩、プペロマシン塩酸塩、ジノスタチンスチマラマー、カリケアマイシン等の抗生物質、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、パクリタキセル等の微小管阻害剤；アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、ファドロゾール塩酸塩水和物等のアロマターゼ阻害剤；シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等の白金製剤；イリノテカン塩酸塩水和物、ノギテカン塩酸塩、エトポシド、ソブゾキサン等のトポイソメラーゼ阻害剤、プレドニゾロン、デキサメサゾンなどの副腎皮質ステロイド、サリドマイドおよびその誘導体であるレナリドマイド、プロテアーゼ阻害剤であるボルテゾミブ等。これらの抗癌剤は、いずれも商業的に入手可能であり、１種又は２種以上の物質を選択して使用することができる。
【００１９】
炭酸アパタイト作製に用いる水溶液中の他の物質の濃度は、その使用目的に応じて適宜設定することができる。抗がん剤を用いる場合は、例えば、１０〜１０００μＭ、２０〜５００μＭ、又は４０〜２００μＭの濃度で用いることができる。ｓｉＲＮＡ等の核酸を用いる場合は、例えば、０．１〜１０００ｎＭ、０．５〜５００ｎＭ、又は１〜２００ｎＭで用いることができる。
【００２０】
各イオン供給源及び他の物質の混合順序は特に限定されず、目的とする炭酸アパタイト粒子が得られる限り、いかなる混合順序で水溶液を調製してもよい。例えば、カルシウムイオン及び他の物質を含有する第１の溶液を調製するとともに、別途、リン酸イオン及び炭酸水素イオンを含有する第２の溶液を調製し、第１の溶液と第２の溶液とを混合して水溶液を調製することができる。
【００２１】
炭酸アパタイト粒子を作製するための水溶液は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り、上述する各イオン供給源及び他の物質以外の成分を含んでも良い。例えば、水溶液中に上記組成物中に、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎ等を添加することにより、炭酸アパタイトにおけるＣａまたはＣＯ３を部分的に置換してもよい。但し、フッ素イオン、塩素イオン、Ｓｒ、Ｍｎの添加量は、形成される複合体粒子のｐＨ溶解性、粒径範囲に著しい影響を与えない範囲内とすることが好ましい。また、炭酸アパタイト粒子を作製するための水溶液は、細胞培養用の各種培地やバッファーを利用して調製することもできる。
【００２２】
炭酸アパタイト粒子は、上記の各イオンを含有する水溶液のｐＨを６．０〜９．０の範囲に調整し、一定時間放置（インキュベート）することによって得ることができる。炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のｐＨは、好ましくは７．０以上であり、より好ましくは７．１以上、更に好ましくは７．２以上あり、より更に好ましくは７．３以上、特に好ましくは７．４以上、最も好ましくは７．５以上である。一方、炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液のｐＨは、好ましくは８．５以下であり、より好ましくは８．０以下である。
【００２３】
炭酸アパタイト粒子を形成する際の当該水溶液の温度条件は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが、通常１０℃以上であり、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３７℃以上である。一方、温度条件の上限は通常８０℃以下であり、好ましくは７０℃以下である。
【００２４】
炭酸アパタイト粒子を形成するための当該水溶液の放置時間は、炭酸アパタイト粒子が形成される限り特に制限されないが通常１分〜２４時間であり、好ましくは１０分〜１時間である。粒子形成の有無は、例えば、顕微鏡下で観察することによって確認することができる。
【００２５】
炭酸アパタイト粒子の平均粒径は、５０ｎｍ以下であることが好ましい。平均粒径を５０ｎｍ以下にすることに制御することにより、上述する所望の効果が奏される。炭酸アパタイト粒子の平均粒径の下限値は、上述する所期の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、１ｎｍ以上、好ましくは３ｎｍ以上、より好ましくは５ｎｍ以上である。一方、炭酸アパタイト粒子の平均粒径の上限は、より好ましくは４０ｎｍ以下であり、更に好ましくは３０ｎｍ以下、より更に好ましくは２０ｎｍ以下、一層好ましくは１０ｎｍ以下である。
【００２６】
炭酸アパタイト粒子の平均粒径を５０ｎｍ以下に制御する手段は、特に制限されないが、好ましくは超音波振動処理である。ここで、超音波振動処理とは、いわゆる菌体破砕等に用いられる超音波破砕機やホモジナイザー等の超音波振動子を直接試料に接触させて超音波をかける処理ではなく、一般に精密機器や試験管等の洗浄に用いられる超音波振動子と洗浄槽とが一体となった超音波洗浄器を用いた処理である。超音波洗浄器の洗浄槽（水槽）に液体（例えば、水）を入れ、そこに炭酸アパタイト粒子を収容した容器（例えば、プラスチック製のチューブ）を浮かべ、精密機器を洗浄する要領で液体を介して炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に超音波をかける処理を意味する。これによって、簡便且つ効率的に炭酸アパタイト粒子の粒径を５０ｎｍ以下に微細化することができる。
【００２７】
超音波振動処理に使用可能な装置は、上記超音波洗浄器のように、水などの溶媒を介して間接的に炭酸アパタイト粒子を収容した容器に超音波振動を与えることが可能であるものであれば特に制限されない。汎用性及び取り扱い性の良さという観点から、超音波振動子及び恒温槽を備えた超音波洗浄器を用いることが好ましい。
【００２８】
上記の超音波振動処理の条件は、粒径を５０ｎｍ以下に制御可能である限り特に制限されない。例えば、水槽の温度は、５〜４５℃の温度から適宜選択することができ、好ましくは１０〜３５℃であり、より好ましくは２０〜３０℃である。超音波振動処理の高周波出力は、例えば、１０〜５００Ｗの範囲で適宜設定することができ、好ましくは２０〜４００Ｗ、より好ましくは３０〜３００Ｗであり、更に好ましくは４０〜１００Ｗである。発振周波数は、通常１０〜６０Ｈｚであり、好ましくは２０〜５０Ｈｚであり、より好ましくは３０〜４０Ｈｚである。超音波振動処理期間は、例えば、３０秒〜３０分であり、好ましくは１〜２０分、より好ましくは３〜１０分の範囲で適宜設定することが出来る。
【００２９】
超音波振動処理を行う際に用いる、炭酸アパタイト粒子を包含する容器の種類は、粒子の粒径を５０ｎｍ以下に微細化することが可能である限り制限されず、水溶液の容量や使用目的に応じて適宜選択することができる。例えば、１〜１０００ｍｌ容量のプラスチック製チューブを用いることができる。
【００３０】
超音波振動処理によって得られるスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の粒径は、上述する実施例に示すように、走査型プローブ顕微鏡を用いて観察することにより測定することが可能である。尚、粒径を測定するに際して、測定部位をＣＣＤカメラで確認し、明らかに走査型プローブ顕微鏡を用いた測定に適さない巨大な粒子（例えば、粒径５μｍ以上）が存在する場合は、それらは測定対象範囲から除去される。本書において、粒径とは、走査型プローブ顕微鏡で測定した際に、別個の粒子として認識可能な独立した粒子の粒径を意味する。よって、複数の粒子が凝集している場合は、それらの集合体を一つの粒子と判断する。
【００３１】
超音波振動処理は、アルブミンの存在下（即ち、アルブミンを炭酸アパタイト粒子を含む水溶液に添加した状態）で行うことが好ましい。これは、アルブミンと炭酸アパタイト粒子とが共存する環境で超音波振動処理を行うことにより、より微細な粒径を有するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子が得られ、粒子の再凝集を抑制することも可能となるためである。
【００３２】
炭酸アパタイト粒子を含む水溶液中に添加するアルブミンの量は、微細化及び／又は再凝集抑制の効果が得られる限り特に制限されないが、例えば、０．１〜５００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌ程度添加することができる。
【００３３】
超音波振動処理による炭酸アパタイト粒子の微細化は、生体への投与に適した溶媒中に分散した炭酸アパタイト粒子を得ることを可能にする。上述の通り、炭酸アパタイト粒子は、各種のイオン供給源となる物質を水、培地、又はバッファー等の溶媒に溶解させることによって得られるが、そのようにして得られる炭酸アパタイト粒子分散溶液は、浸透圧、緩衝能、無菌性等の観点から必ずしも生体への投与（血管内投与）に適していない。よって、炭酸アパタイト粒子が分散した溶媒を生体への投与に適した溶媒（例えば、生理食塩水）に置換するためには、通常、遠沈によって炭酸アパタイト粒子を溶媒から分離し、回収して溶媒を置き換える操作が必要である。しかしながら、このような操作を行うと炭酸アパタイト粒子同士が凝集し、粒子が巨大化するため、却って生体への投与には適さない状態へと変化してしまう。そこで、凝集した炭酸アパタイト粒子を生体への投与に適した溶媒に添加した上で、上述する超音波振動処理を行うことにより、生体への投与に適した溶媒中に分散した平均粒径が５０ｎｍ以下の炭酸アパタイト粒子を得ることができる。
【００３４】
水溶液中の平均粒径５０ｎｍ以下の炭酸アパタイト粒子の量は、使用目的に応じて適宜設定することが出来る。Ｉｎ ｖｉｖｏ投与用途目的である場合は、例えば、１×１０８〜１×１０１２個／ｍｌ、好ましくは１×１０９〜１×１０１１個／ｍｌ、より１×１０１０〜５×１０１０個／ｍｌ、更に好ましくは３×１０9  〜３×１０１０個／ｍｌ、より更に好ましくは６×１０９〜１.５×１０10  個／ｍｌとすることができる。In vitroで使用する場合は、例えば、１×１０５〜１×１０１２個／ｍｌ、好ましくは１×１０６〜１×１０１１個／ｍｌ、より好ましくは１×１０７〜５×１０９個／ｍｌ、更に好ましくは３×１０7〜３×１０9個／ｍｌ、一層好ましくは６×１０7〜３×１０８個／ｍｌとすることができる。
【００３５】
スーパーアパタイト超微細ナノ粒子は、上述する薬物等の物質を包含（又は接着）させることにより、その物質を細胞又は生体内に導入するための運搬体として利用することが可能である。in vitroで物質を細胞内に導入する場合は、スーパーアパタイト粒子の存在下で細胞を培養することにより、物質を細胞内に導入することが出来る。スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いて物質を導入することが可能な細胞は特に制限されず、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞等の任意を細胞を適宜選択して使用することができる。
【００３６】
スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いて物質を生体内に導入する手法は、その目的に応じて適宜選択することができる。例えば、血管内（動脈内又は静脈内）注射、持続点滴、皮下投与、局所投与、筋肉内投与などによって投与することができる。好ましくは動静脈内投与である。
【００３７】
スーパーアパタイト超微細ナノ粒子に包含させる物質（例えば、薬物）の量は担持させる物質の種類や使用目的により異なるため、一概に定義することは困難である。炭酸アパタイト粒子作製の段階では、抗がん剤の炭酸アパタイトへの結合率は０．０２〜１％で、siRNAなどの核酸の結合率は、３０〜５０％であるが、遠沈などにより炭酸アパタイト粒子を多く集めることで、抗がん剤や核酸などの薬剤、物質の全体量を増やすことが可能である。
【００３８】
薬剤を包含したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の投与量は、担持される薬物の量や、患者の性別、年齢、症状などに応じて適宜決定されるため、一概に決定することはできないが、例えば、１日あたり１０〜３０ｍｇ／ｍ２（体表面積）程度を投与することができる。
【００３９】
スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を投与するタイミングは、特に制限されないが、投与前に粒子が凝集することを回避するという観点から、超音波振動処理後速やかに投与することが好まし。例えば、超音波振動処理後１分以内、好ましくは３０秒以内の投与が好ましい。但し、上述するように、アルブミンを添加することによってスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の凝集を抑制する場合は、超音波振動処理後、数分〜数十分経過後に投与することも可能である。
【実施例】
【００４０】
実施例１  スーパーアパタイト超微細ナノ粒子の製造
（１）ＤＭＥＭ溶液を用いたスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の製造
１００ｍｌの蒸留水に、１．３５ｇのＤＭＥＭ粉末及び０．３７ｇのＮａＨＣＯ３を順に添加して完全に溶解させ、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを７．５に調整した。このＤＭＥＭ溶液（１００ｍｌ）を直径０．２μｍのフィルターでろ過し、１ｍｌＤＭＥＭ溶液当たり、４μｌのＣａＣｌ２（１Ｍ）を混合し、３７℃の水浴中で３０分間インキュベートした。その後、１５０００ｒｐｍ×５分で遠沈し、得られたペレットを蒸留水、細胞培養液又は生理食塩水等の細胞や生体に投与可能な水溶液に溶解し、１０分間超音波振動処理をかけることにより、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子（以下、「粒子（１）」とする）を得た。超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、２０℃に設定した水に、プラスチック容器に収容したアパタイト粒子水溶液を浮かべ、高周波出力５５Ｗ、発振周波数３８ｋＨｚの条件で１０分間行った。尚、スーパーアパタイト粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に用いる場合は、上記の遠沈を行う必要はない。顕微鏡を用いた粒径の測定を行う場合には、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を蒸留水に溶解した。動物実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を生理食塩水に溶解調製した。細胞実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子をＤＭＥＭ溶液に溶解調製した。
【００４１】
（２）バッファーを用いたスーパーアパタイト粒子の製造
１００ｍｌの蒸留水に、０．３７ｇのＮａＨＣＯ３、９０μｌのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１Ｍ）、及び１８０μｌのＣａＣｌ２（１Ｍ）をこの順で添加して溶解させ、１ＮのＨＣｌでｐＨを７．５に調整した。これを直径０．２μｍのフィルターでろ過した。得られたバッファー１ｍｌ当たりに４μｌのＣａＣｌ２（１Ｍ）を混合し、３７℃の水浴中で３０分間インキュベートした後、１５０００ｒｐｍ×５分で遠沈し、得られたペレットを、蒸留水、細胞培養液又は生理食塩水等の細胞や生体に投与可能な水溶液に溶解し、１０分間超音波振動処理をかけることにより、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子（以下、「粒子（２）」とする）を得た。超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、２０℃に設定した水に、プラスチック容器に収容したアパタイト粒子水溶液を浮かべ、高周波出力５５Ｗ、発振周波数３８ｋＨｚの条件で１０分間行った。尚、スーパーアパタイト粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に用いる場合は、上記の遠沈を行う必要はない。顕微鏡を用いた粒径の測定を行う場合には、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を蒸留水に溶解した。動物実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を生理食塩水に溶解調製した。細胞実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子をＤＭＥＭ溶液に溶解調製した。
【００４２】
（３）ｓｉＲＮＡを包含したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の製造
上記（１）と同様に、１００ｍｌの蒸留水に、１．３５ｇのＤＭＥＭ粉末及び０．３７ｇのＮａＨＣＯ３を順に添加して完全に溶解させ、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを７．５に調整した。このＤＭＥＭ溶液（１００ｍｌ）を直径０．２μｍのフィルターでろ過し、１ｍｌのＤＭＥＭ溶液あたり、２μgのｓｉＲＮＡ、４μｌのＣａＣｌ２（１Ｍ）を混合し、３７℃の水浴中で３０分間インキュベートした。バッファーを用いて作製する場合は、上記（２）と同様に、１００ｍｌの蒸留水に、０．３７ｇのＮａＨＣＯ３、９０μｌのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１Ｍ）、及び１８０μｌのＣａＣｌ２（１Ｍ）をこの順に添加して溶解させ、１ＮのＨＣｌでｐＨを７．５に調整した。これを直径０．２μｍのフィルターでろ過した。得られたバッファー１ｍｌ当たりに２μgのｓｉＲＮＡ、４μｌのＣａＣｌ２（１Ｍ）を混合し、３７℃の水浴中で３０分間インキュベートした。その後、１５０００ｒｐｍ×５分で遠沈し、得られたペレットを蒸留水、細胞培養液又は生理食塩水等の細胞や生体に投与可能な水溶液に溶解し、１０分間超音波振動処理をかけることにより、ｓｉＲＮＡを包含したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子（以下、「粒子（３）」とする）を得た。ここでは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４４８で蛍光標識したｓｉＲＮＡ（ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇ．ｓｉＲＮＡ ＡＦ４８８(QIAGEN社製)）を用いた。超音波振動処理は、超音波振動機能を有するウォーターバスを用いて、２０℃に設定した水に、プラスチック容器に収容したアパタイト粒子水溶液を浮かべ、高周波出力５５Ｗ、発振周波数３８ｋＨｚの条件で１０分間行った。尚、スーパーアパタイト粒子をｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に用いる場合は、上記の遠沈を行う必要はない。顕微鏡を用いた粒径の測定を行う場合には、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を蒸留水に溶解した。動物実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を生理食塩水に溶解調製した。細胞実験に用いる場合は、遠沈後にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子をＤＭＥＭ溶液に溶解調製した。
【００４３】
実施例２  粒径及び形態の測定
実施例１で作製したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子（１）〜（３）の粒径及び形態等をマイクロカンチレバー（ＯＭＣＬ−ＡＣ２４０ＴＳ−ＲＳ，オリンパス社製）を備えた走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ−９５００，島津製作所製）をダイナミックモードで使用して測定した。測定は、超音波振動処理後３０秒以内に２回ずつ実施した。カバーガラスの表面に約１０μlのサンプル水溶液を滴下し、５分の真空乾燥後、ＣＣＤカメラにて、平滑面を選択し、１〜５平方μｍの範囲について測定した。その結果を以下の表１に示す。また、測定範囲について得られた２次元解析画像及び粒子の大きさのその数の分布を示すグラフを図１に示す。図１−１は粒子（１）であり、図１−２は粒子（２）であり、図１−３は粒子（３）である。これらの結果から、超音波振動処理によって、アパタイト粒子の粒径が１０ｎｍ以下にすることが可能であることが確認された。また、ｓｉＲＮＡを包含している場合にも同様であることも確認された。
【００４４】
【表１】
0005436650.tif 000002
【００４５】
比較例１  従来型の炭酸アパタイト粒子の粒径及び形態の測定
上記実施例１の（１）と超音波処理を行わない以外は同様にして炭酸アパタイト粒子を作製し、粒径及び形態の測定を実施例２と同様に実施した。その２次元解析画像を図２に示す。図２から、超音波振動処理をせずに作製した従来型の炭酸アパタイト粒子は、互いに凝集し、大部分がもはやミクロレベルでも粒径を保持していないことが確認された。このように従来型の炭酸アパタイト粒子は凝集しているため、個々の粒子の粒径を測定することはできないが、図２に示す解析画像から、個々の粒子が横方向に凝集し、幅が数μｍオーダーであることは明らかである。
【００４６】
実施例３  スーパーアパタイト超微細ナノ粒子の細胞への取り込み
３種類のヒト癌細胞株（ＫＭ１２ｓｍ、２２Ｒｖ１、及びＦａＤｕ）を２４ウェルプレートに均等に播種し（約３×１０５細胞／ディッシュ）、一晩培養した。ＫＭ１２ｓｍは、ヒト大腸癌細胞株、２２Ｒｖ１株はヒト前立腺癌細胞株であり、ＦａＤｕ株はヒト頭頚部癌細胞株である。ＫＭ１２ｓｍ株及びＦａＤｕ株の培養には、１０％のウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ培地を用いた。２２Ｒｖ１株の培養には、１０％のウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ培地を用いた。培養は、５％ＣＯ２、３７℃の条件で行った。
【００４７】
培養した各細胞株に、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子、従来型の炭酸アパタイト粒子、又はリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で蛍光標識したコントロールｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を細胞に導入した。このｓｉＲＮＡを包含したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子は、実施例１の（３）の手順で作製した。従来型のアパタイト粒子は、超音波振動処理を行わない以外は実施例１の（３）の手順で作製した。リポフェクタミン２０００は、製品のプロトコールに従って作製した。これらを癌細胞株を培養したウェルに添加し、その後４時間、１２時間、及び２４時間の時点で培地を除去し、ＰＢＳで洗浄した後、細胞内へのｓｉＲＮＡの取り込みを各ウェルを蛍光顕微鏡（ＢＺ−９０００，ＫＥＹＥＮＣＥ社製）で観察することにより評価した。結果を図３（ＫＭ１２ｓｍ株）、図４（２２Ｒｖ１株）及び図５（ＦａＤｕ株）に示す。
【００４８】
図３〜５に示される結果から、いずれの細胞株に対してもスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いた場合にのみ、トランスフェクション後４時間の時点で明確なｓｉＲＮＡの取り込みが確認された。時間の経過に伴って、取り込み量が増加する傾向が見られたが、ＫＭ１２ｓｍ株に対しては、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いた場合にのみ実質的にｓｉＲＮＡの取り込みの増加が確認された。ＦａＤｕ細胞株に対しては、培養開始後１２時間の時点で従来型のアパタイト粒子及びリポフェクタミンを用いたトランスフェクションによってもｓｉＲＮＡの取り込みが見られ始めたが、その量はスーパーアパタイト粒子を用いた場合と比較すると圧倒的に低い。これらの結果から、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子は、従来型のアパタイト粒子やリポフェクタミン等の手法と比較して格段に効率的（短時間で）且つ効果的に細胞内に物質を導入することが可能であることが実証された。また、全ての癌細胞株に対して同様の効果が確認されたことから、癌細胞の種類による影響を受け難いことが示された。
【００４９】
実施例４  共焦点レーザー顕微鏡を用いた細胞への取り込みの解析
ヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６株をμ−ディッシュ（３５ｍｍ，ｈｉｇｈ：ｉｂｉｄｉ社製）に均等に播種し（１×１０５細胞／ディッシュ）、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で２４時間培養した。その後、実施例３で用いたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で蛍光標識したコントロールｓｉＲＮＡを包含するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子又はリポフェクタミン２０００を含有する新たなＤＭＥＭ培地（２ｍｌ）に培地を交換して培養を継続した。尚、ネガティブコントロールとして、ｓｉＲＮＡの包含しないスーパーアパタイト超微細ナノ粒子及びリポフェクタミン２０００を用いた。培地交換後、０時間、４時間、及び１２時間の時点で培地を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄して、４％のＰＦＡを用いて３０分間固定化した。そして、ＤＡＰＩが添加されたプロロングゴールド褐色防止剤（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を培養ディッシュに一滴添加し、４℃で２４時間インキュベートした。その後、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１０００−Ｄ，オリンパス社製）を用いて解析した。
【００５０】
４時間後及び１２時間後に測定した蛍光強度を図６に示す。図６から、スーパーアパタイト粒子の使用によって、リポフェクタミン２０００を使用する場合と比較して約２倍以上の蛍光強度（即ち、ｓｉＲＮＡの取り込み）が確認された。また、リポフェクタミン２０００を用いた場合は、４時間後よりも１２時間後で蛍光強度が低下し、持続的なｓｉＲＮＡの取り込みは見られなかったが、スーパーアパタイト粒子を用いた場合は、１２時間後の蛍光強度は４時間後よりも有意に上昇しており、持続的な取り込みが確認された。
【００５１】
高解像度で解析した写真を図７に示す。図７−１はスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いた結果であり、図７−２はリポフェクタミン２０００を用いた結果である。これらの図において、左側はＤＡＰＩによって染色された細胞の核の位置を示し、中央はｓｉＲＮＡを包含するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子又はリポフェクタミン２０００の位置を示し、右側はこれらを融合させた写真である。０時間の画像を比較すると、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いた場合は、この時点で既に細胞表面にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子が結合しているが、リポフェクタミン２０００についてはその存在は確認できない。これは、リポフェクタミンよりもスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の方が、細胞への親和性が高く、急速に細胞表面に接着することを示し、結果としてより短時間での物質の細胞内への導入を可能にすると考えられる。次に、４時間後及び１２時間後の結果を比較すると、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子の場合は、４時間後に細胞質中に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８蛍光が観察され、１２時間後には蛍光が細胞質全体に広がり、核にまで到達している。一方、リポフェクタミン２０００の場合は、１２時間後においても蛍光シグナルは細胞質の一部に凝集した状態であった。これら違いは、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子が、ナノスケールの粒子であること及びｐＨに依存して内容物質を放出する性質を有することに起因していると考えられる。即ち、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子は電荷的に細胞表面に接着する。そして、細胞表面に接着したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子は、そのナノスケールのサイズによって、加速的にエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれる。その後、エンドソーム内でのｐＨ低下によってスーパーアパタイト超微細ナノ粒子内の物質が迅速に放出され、エンドソームからも抜け出すことが可能となる。一方、リポフェクタミンには、これらの機構は存在しない。エンドソームからの遊離は、リソソームによるｓｉＲＮＡの分解を回避するという意味で有益である。
【００５２】
実施例５  スーパーアパタイト超微細ナノ粒子の生体内分布
７週齢のＢＡＬＢ／ｃＡヌードマウス（日本クレア社製）の背部左右に、ヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６株又はＨＴ２９株を皮下注射し、固形腫瘍を有するモデルマウスを作製した。腫瘍が１０ｍｍの大きさに達した時点でマウスをランダムに３グループに分けた：コントロール群、ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡ投与群、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子投与群。ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡ投与群には、６−ＦＡＭで蛍光標識したコントロールｓｉＲＮＡ（ＫＯＫＥＮ社製）を４０μｇ含有する生理食塩水を尾静脈注射によって投与した。実施例１の（３）と同様の手順で６−ＦＡＭで標識したコントロールｓｉＲＮＡを包含するスーパーアパタイト粒子を作製し、ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡ投与群への投与量と同量を、スーパーアパタイト粒子投与群に尾静脈投与した。投与量の調整は、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１４７，１０１−１０８（２０１０）に記載される手法に従って行った。尚、従来型のアパタイト粒子は、比較例１に示す通り凝集して非常に大きな塊を形成しているため、静脈内へ投与すれば血管内で詰まるため、そのような投与はできない。
【００５３】
血管を染色するために開腹３０分前にＴｅｘａｓ  ｒｅｄで標識したデキストランを静脈内投与した。ｓｉＲＮＡの投与後、４時間又は１２時間が経過した時点で、麻酔下で肝臓、腎臓、脾臓及び腫瘍を摘出し、Ｏ.Ｃ.Ｔ.コンパウンドに包埋して−８０℃で保存した。凍結したサンプルから厚み２０μｍの切片を作製し、４％のＰＦＡを用いて３０分間固定し、ＰＢＳ−Ｔを用いた５分間の洗浄を３回繰り返した。その後、ＤＡＰＩを含有するプロロングゴールド褐色防止剤をマウントし、４℃で２４時間インキュベートした。そして、サンプル中の蛍光標識されたｓｉＲＮＡを蛍光顕微鏡（ＢＸ−９０００、ＫＥＹＥＮＣＥ社製）を用いて評価した。血管からのスーパーアパタイト粒子又はｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡの浸出を可視化するために、二光子イメージングを実施した。このイメージングには、９００ｎｍに調整されたレーザー（Ｍａｉ−Ｔａｉ  ＨＰ  Ｔｉ：Ｓａｐｐｈｉｒｅ；スペクトラ・フィジックス社製）で駆動される多光子顕微鏡（ＳＰ５，Ｌｅｉｃａ社製）と２０倍水浸対物レンズを備えた直立型顕微鏡（ＤＭ６０００Ｂ；Ｌｅｉｃａ社製）とからなるシステムを利用した。解析した結果を図８〜１０に示す。図９−１は４時間後の肝臓の画像であり、図９−２は４時間後の腎臓の画像である。図１０−１は、ＨＣＴ１１６株由来の腫瘍組織の画像であり、図１０−２はＨＴ２９株由来の腫瘍組織の画像であり、図１０−３はＨＣＴ１１６株由来の腫瘍組織において検出された６−ＦＡＭに由来する蛍光強度を示す。
【００５４】
図８及び９に示される結果から、投与後４時間及び１２時間の両方において、ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡは肝臓及び腎臓に蓄積するが、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子は肝臓及び腎臓のいずれに実質的に蓄積しないことが確認された。スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を利用した場合の４時間後及び１２時間後のｓｉＲＮＡの肝臓での蓄積量は、ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡの場合の１０分の１及び２６分の１である。また、スーパーアパタイト粒子利用した場合の４時間後及び１２時間後のｓｉＲＮＡの腎臓での蓄積量は、ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡの場合の４分の１及び５分の１である。更に、図８に示される蛍光強度はコントロールとの比であり、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を利用した場合の正常臓器における蛍光比が約１である。これは、何もしていないコントロールとほぼ同じ蛍光を示すことを意味し、正常組織にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子がほとんど蓄積されないことを示唆した。これらの結果は、スーパーアパタイト粒子が肝臓や脾臓における細胞内皮系に捕らえられ難く、肝毒性が低く、腎臓によっても除去され難いことを示す。
【００５５】
図１０−１は、ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡを投与した場合に、血管中にｓｉＲＮＡの存在を示すシグナル（緑）が幾分検出されたことを示すが、腫瘍細胞のエリアにはそのようなシグナルは明確には検出されなかったことを示す。これは、ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡを静脈投与した場合は、腫瘍組織において、血管から腫瘍細胞への十分なｓｉＲＮＡの浸出が得られないことを示唆する。一方、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を投与した場合は、血管組織だけでなく、腫瘍組織でも広範囲に亘ってｓｉＲＮＡの存在を示す明確なシグナルが検出された。同様の結果が、ＨＴ２９株由来の腫瘍組織においてもより明確に示された（図１０−２）。これらは、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子に包含されたｓｉＲＮＡがｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡよりも生体内の環境においてより安定であり、血管壁からの浸出及び血管から遠く離れた腫瘍組織にまで到達可能であることを示す。これは、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いた場合に腫瘍組織において検出された蛍光強度が、ｎａｋｅｄ‐ｓｉＲＮＡを用いた場合と比較して格段に高いことからも支持される（図１０−３）。尚、図１０−３において、スーパーアパタイト粒子を用いた場合に１２時間後に検出された蛍光強度が４時間後に検出された蛍光強度よりも低いのは、アパタイト粒子が腫瘍組織等の低ｐＨの環境において内容物を速やかに放出する性質を有していることを反映していると考えられる。
【００５６】
実施例６  スーパーアパタイト超微細ナノ粒子によって導入された物質の機能評価１
上記の実施例からスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を利用することによって、より効率的に物質を細胞に導入することが可能であることが示された。そこで、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を利用して導入されたｓｉＲＮＡが実際に細胞中で機能しているのか否かを抗サバイビンｓｉＲＮＡ（ＫＯＫＥＮ社製）を用いて検証した。実施例１の（３）の手順に従い、抗サバイビンｓｉＲＮＡを包含するスーパーアパタイト粒子を作製した。また、製品のプロトコールに従って、抗サバイビンｓｉＲＮＡを含むリポフェクタミン２０００を作製した。これらを実施例４と同様にして、ＨＣＴ１１６株に導入した。導入後２４時間及び４８時間の時点でウェスタンブロットによってサバイビンタンパク質の存在を確認した。その結果を図１１に示す。図１１の左は、リポフェクタミン２０００の結果であり、右はスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いた結果である。図１１から、リポフェクタミン２０００を用いた場合は、４８時間後にサバイビンタンパク質が完全に消失しているのが確認されたのに対し、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を使用した場合は、２４時間の時点でサバイビンタンパク質の完全な消失が確認された。これより、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子で導入されたｓｉＲＮＡが細胞中で機能することが確認されただけでなく、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子の利用によってリポフェクタミンよりも迅速にｓｉＲＮＡを細胞内に導入し、機能させることが可能であることが確認された。
【００５７】
実施例７  スーパーアパタイト超微細ナノ粒子によって導入された物質の機能評価２
上記実施例６に引き続き、ＨＣＴ１１６株の細胞増殖に対する影響をＷＳＴ−８アッセイ（同仁化学研究所製）で評価した。ＨＣＴ１１６株を９６ウェルプレートに均等に播種し（１×１０４細胞／ウェル）、２４時間培養後に培地を抗サバイビンｓｉＲＮＡを包含するスーパーアパタイト粒子又はリポフェクタミン２０００を含む新たな培地（１００μｌ）と交換した。その後４８時間及び７２時間の時点で細胞の生存率をマイクロプレートリーダー（６８０ＸＲ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いた分光光度分析によって評価した。その結果を図１２に示す。図１２から、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子で抗サバイビンｓｉＲＮＡを導入した場合にのみ顕著な細胞生存率の低下が確認された。
【００５８】
実施例８  腫瘍モデルマウスを用いた抗腫瘍活性の評価
実施例５と同様にしてＨＣＴ１１６株由来の腫瘍を形成したマウスを作成し、腫瘍の大きさが５〜６ｍｍになった時点で抗サバイビンｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡを包含するスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の尾静脈投与を開始した。０日、２日、４日、７日、９日、１１日、１４日、１６日及び１８日に各１５μｇの抗サバイビンｓｉＲＮＡ内包スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を投与した。抗腫瘍活性を腫瘍のサイズに基づいて測定した。腫瘍の大きさは次の式に基づいて算出した：Ｖ＝ａ×ｂ２／２（ここで、Ｖは大きさ、ａは長径、ｂは短径を意味する）。尚、ｎ数は１０である。結果を図１３に示す。図１３に示される結果から、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いて抗サバイビンｓｉＲＮＡを投与することによって、初期の段階から継続して腫瘍の増大を抑制する効果が得られることが確認された。本試験においてマウスに投与されたｓｉＲＮＡの全量は１３５μｇであり、この値は既に報告されている他の手段を用いた投与に必要な量の約６分の１〜１１分の１である。よって、この結果は、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子が従来の手法よりも効果的であることを示す。
【００５９】
実施例９  抗癌剤包含スーパーナノアパタイト粒子の抗腫瘍効果
１００ｍｌの蒸留水に０．３７ｇのＮａＨＣＯ３、９０μｌのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（１Ｍ）、及び１８０μｌのＣａＣｌ２（１Ｍ）をこの順に添加して溶解させ１ＮのＨＣｌでｐＨを７．５に調整した。これを直径０．２μｍのフィルターでろ過した。２０gのマウス一匹に一回静脈投与に必要な抗癌剤包含スーパーナノアパタイト粒子は、以下のように作製した。即ち、上記のように得られたバッファー４０ｍｌ当たりに、１.２８ｍｌのドキソルビシン（５ｍＭ）及び２００μｌのＣａＣｌ２（１Ｍ）を混合し、３７℃の水浴中で３０分間インキュベートした後、１５０００ｒｐｍ×５分で遠沈し、得られたペレットを２５０μｌの生理食塩水に溶解し、１０分間超音波振動処理をかけることにより、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を得た。
【００６０】
７週齢のＢＡＬＢ／ｃＡヌードマウス（日本クレア社製）の背部左右側に、ヒト大腸癌細胞であるＨＣＴ１１６株（５．０×１０６cell）を皮下注射し、固形腫瘍を有するモデルマウスを作製した。腫瘍が５〜６ｍｍの大きさに達した時点でマウスをランダムに３グループに分けた：コントロール群、ドキソルビシン単独投与群、ドキソルビシン包含スーパーアパタイト超微細ナノ粒子投与群。０日、１日、２日、７日、８日、９日、１４日、１５日及び１６日に、ドキソルビシン単独群は 0.33mg/kg/day の投与量を、ドキソルビシン包含スーパーアパタイト超微細ナノ粒子投与群では、同量のDXRをスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いて、マウス尾静脈よりi.v.投与した。スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いた投与は、超音波振動処理後、迅速に（３０秒以内に）行った。抗腫瘍活性を腫瘍のサイズに基づいて測定した。腫瘍の大きさは次の式に基づいて算出した：Ｖ＝ａ×ｂ２／２（ここで、Ｖは大きさ、ａは長径、ｂは短径を意味する）。尚、ｎ数は６である。結果を図１４に示す。図１４に示される結果から、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いたドキソルビシンを投与することによって、１２日目および１９日目においてコントロール群、free-DXR投与群よりスーパーアパタイト超微細ナノ粒子投与群では、有意に腫瘍の大きさが小さかった。
【００６１】
実施例１０  スーパーアパタイト超微細ナノ粒子の凝集抑制
実施例１の（２）と同様にしてスーパーアパタイト超微細ナノ粒子を作製した。但し、ここでは、水溶液にスーパーアパタイト超微細ナノ粒子ペレットを溶解した後、５ｍｇ／ｍｌのアルブミンを添加して、１０分間超音波振動処理を行った。超音波振動処理は、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を含む蒸留水又は生理食塩水を５０ｍｌ容量のチューブ(BD Falcon社製)に入れ、洗浄槽を３０℃以下の水で満たした超音波洗浄器にそれを浮かべて、５５Ｗの高周波出力、３８ｋＨｚの発振周波数１０分間の条件で超音波振動処理を行った。コントロールとして、アルブミンを添加せずに同様の処理を行って作製したスーパーアパタイト超微細ナノ粒子、並びにアルブミンの添加及び超音波振動処理を行わずに作製した炭酸アパタイト粒子を使用した。このようにして調製したスーパーアパタイト粒子の粒径を実施例２と同様にして測定した。その結果を下記の表２及び図１５に示す。
【００６２】
【表２】
0005436650.tif 000003
【００６３】
表２及び図１５に示されるように、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子水溶液にアルブミンを添加することによって、超音波処理後に粒子が再凝集することを抑制可能であることが判明した。アルブミンの添加によってスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の再凝集が抑制される機構は未だ十分には解明されていないが、１０ｎｍオーダーの個々の粒子表面にアルブミンがコーティングし、再凝集を防ぐと考えられる。これは、アルブミンは陰性に荷電しており、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子のカルシウム陽性荷電部位に対して、電荷的に付着するため、結果としてスーパーアパタイト超微細ナノ粒子の陽性荷電部位であるカルシウムイオンが、別の粒子の陰性荷電部位である炭酸イオンやリン酸イオンと電荷的に結合することが妨げられるためと考えられる。
【００６４】
実施例１１  スーパーアパタイト超微細ナノ粒子のｐＨ感受性
実施例１及び比較例１に従って、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子（２）及び（３）並びに従来型の炭酸アパタイト粒子を作製した。遠沈後、各粒子のペレットを１ｍｌの生理食塩水で溶解した。各サンプルに対して１ＮのＨＣｌを滴下して、低下する各ｐＨに対する各サンプルの混濁度をマイクロプレートリーダー（６８０ＸＲ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いた分光光度分析によってOptical Densityとして評価した。なお、pH測定は、微小ｐＨ電極（Microelectrodes, Inc.）を備えたDocu pH meter(sartorius社製)を用いた。
【００６５】
結果を図１６に示す。この結果から、スーパーアパタイト超微細ナノ粒子は、従来型の炭酸アパタイト粒子よりも高いｐＨ感受性を有する（即ち、ｐＨの低下に伴って粒子が崩壊し易い）ことが示された。スーパーアパタイト超微細ナノ粒子を用いるにとによって、従来型の炭酸アパタイト粒子と比較して、物質の細胞内への取り込み効率が向上することは、このより高いｐＨ感受性にも起因していると考えられる。
【要約】
【課題】従来の炭酸アパタイトに関する問題を解消した炭酸アパタイト粒子の提供を目的とする。
【解決手段】平均粒径が５０ｎｍ以下である炭酸アパタイト粒子が分散した水溶液。
【選択図】なし【図１−１】
0005436650.tif 000004
【図１−２】
0005436650.tif 000005
【図１−３】
0005436650.tif 000006
【図２】
0005436650.tif 000007
【図３−１】
0005436650.tif 000008
【図３−２】
0005436650.tif 000009
【図４−１】
0005436650.tif 000010
【図４−２】
0005436650.tif 000011
【図５−１】
0005436650.tif 000012
【図５−２】
0005436650.tif 000013
【図６】
0005436650.tif 000014
【図７−１】
0005436650.tif 000015
【図７−２】
0005436650.tif 000016
【図８】
0005436650.tif 000017
【図９−１】
0005436650.tif 000018
【図９−２】
0005436650.tif 000019
【図１０−１】
0005436650.tif 000020
【図１０−２】
0005436650.tif 000021
【図１０−３】
0005436650.tif 000022
【図１１】
0005436650.tif 000023
【図１２】
0005436650.tif 000024
【図１３】
0005436650.tif 000025
【図１４】
0005436650.tif 000026
【図１５】
0005436650.tif 000027
【図１６】
0005436650.tif 000028