(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌（ＰＣａ）、およびそれに関連する疾病または疾患を治療するためのワクチンを調製するための、４つの異なる抗原をコードする、少なくとも４つのＲＮＡの使用であって、
上記少なくとも４つの異なる抗原は、
・ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）、
・ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、
・ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、および
・ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）
であり、
上記ワクチンの上記少なくとも４つのＲＮＡは、上記少なくとも４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つのＲＮＡが、上記少なくとも４つのＲＮＡのうちの別の少なくとも１つのＲＮＡと同時に、または続けて投与されるように投与される、使用。
【請求項２】
上記少なくとも４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つはｍＲＮＡである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、請求項１に記載の抗原の断片、変異体またはエピトープをコードするＲＮＡ配列を含む、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
上記４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号２、５、８または１１に示されるＲＮＡ配列と同一、または少なくとも８０％同一であるＲＮＡから選択されるＲＮＡを含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５】
上記４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、修飾されたＲＮＡである、請求項１から４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
上記４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、安定化されたｍＲＮＡである、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
上記４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して増加している、請求項５または６に記載の使用。
【請求項８】
上記４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つによってコードされたアミノ酸配列は、上記野生型ＲＮＡによってコードされたアミノ酸配列と比較して修飾されていない、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
上記４つのＲＮＡのうちの上記少なくとも１つのリボソーム結合部位の周囲におけるＡ／Ｕ含有量は、野生型ＲＮＡのリボソーム結合部位の周囲におけるＡ／Ｕ含有量と比較して増加している、請求項５から８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
修飾されたｍＲＮＡのコード領域、ならびに／または、５’非翻訳領域および／もしくは３’非翻訳領域は、野生型ＲＮＡと比較して不安定化配列要素を含まないように修飾されている、請求項５から９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
上記修飾されたｍＲＮＡによってコードされたアミノ酸配列は、野生型ＲＮＡによってコードされたアミノ酸配列と比較して修飾されていない、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
修飾されたｍＲＮＡは、５’キャップ構造および／もしくはポリ（Ａ）尾部、ポリＣ尾部、少なくとも１つのＩＲＥＳ、および／または少なくとも１つの５’安定化配列および／もしくは３’安定化配列を含む、請求項５から１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
上記修飾されたｍＲＮＡは、５’キャップ構造および／または１０〜２００アデノシンヌクレオチドのポリ（Ａ）尾部、および／または１０〜２００シトシンヌクレオチドのポリＣ尾部を含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
上記４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、配列番号１、３、４、６、７、９、１０または１２に示されるＲＮＡ配列と同一、または少なくとも８０％同一であるＲＮＡから選択されるＲＮＡを含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
ＰＳＡをコードしている上記ＲＮＡは、配列番号１または３と同一または少なくとも８０％同一であり、ＰＳＭＡをコードしている上記ＲＮＡは、配列番号４または６と同一または少なくとも８０％同一であり、ＰＳＣＡをコードしている上記ＲＮＡは、配列番号７または９と同一または少なくとも８０％同一であり、ＳＴＥＡＰをコードしている上記ＲＮＡは、配列番号１０または１２と同一または少なくとも８０％同一である、請求項１から１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
上記４つのＲＮＡのうちの少なくとも１つは、１つまたはそれ以上のポリカチオンと複合している、請求項１から１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
上記１つまたはそれ以上のポリカチオンは、プロタミンまたはオリゴフェクタミンである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
上記ワクチンは、少なくとも１つのアジュバントをさらに含んでいる、請求項１から１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
上記ワクチンは、上記少なくとも４つのＲＮＡを含んでいる活性（免疫賦活）組成物または上記少なくとも４つのＲＮＡを含んでいるキットを含んでいる、請求項１から１８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
上記ワクチンはさらに、薬学的に使用可能なキャリアを含んでいる、請求項１から１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
新規の補助療法、および／またはホルモン抵抗性前立腺癌を治療するためのワクチンを調製するための、請求項１から２０のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔技術分野〕
本発明は、哺乳動物の（適応）免疫応答を誘発することが可能な少なくとも２つの抗原（好ましくは異なる抗原）をコードする、少なくとも１つのＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を有する活性（免疫賦活）組成物に関し、上記抗原は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺肝細胞抗原）およびＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）からなる群から選択される。また、本発明は、上記活性（免疫賦活）組成物を含むワクチン、（ワクチン調製を目的とする）上記活性（免疫賦活）組成物の使用、ならびに、前立腺癌（ＰＣａ）の治療、好ましくは新規の補助療法（neoadjuvant）、および／またはホルモン抵抗性前立腺癌、それに関連する疾病または疾患の治療のための、（適応）免疫応答を引き起こすワクチンの使用に関する。さらに、本発明はキットに関し、特に上記活性（免疫賦活）組成物および／または上記ワクチンを含む、複数のパーツからなるキットに関する。
【０００２】
〔背景技術〕
前立腺癌は、現在、世界の先進国における男性において、癌に関する診断数において２番目に多く、癌の死因としては４番目に多い。有効な治療措置の方法は弱体化させることであり、局部的な疾患にのみ利用されている。ホルモン抵抗性前立腺癌に関しては、実質的に１年以上の延命が認められる薬はない（例えばPavlenko,M.,A.K.Roosら, (2004).“Aphase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen in patients with hormone-refractory prostate cancer.”Br J Cancer 91(4):688-94.参照）。現在、米国などのいくつかの欧米主要先進国においては、男性において、
前立腺癌は最も多く診断される悪性腫瘍であり、男性における癌死因としては、米国（例えばJemal,A.,R.Siegelら, (2006). “Cancer statistics,2006.”CA Cancer J Clin 56(2):106-30.参照）および欧州（例えばThomas-Kaskel,A.K.,C.F.Wallerら,(2007). “Immunotherapy with dendritic cells for prostate cancer.”Int J Cancer 121(3):467-73参照）それぞれにおいて、３番目に多い。診断される腫瘍の多くは腺癌であり、ホルモン依存性の態様で初期に増殖する。
【０００３】
前立腺癌は、男性生殖器系における分泌腺である前立腺において癌が発現する疾病である。前立腺の細胞が突然変異して制御を失い、増殖を始めることから発症する。正常な細胞と比較して、前立腺癌細胞によって過剰に発現することが分かっている抗原として、特に代表的なものとしては、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＨＥＲ−２およびＥｐ−ＣＡＭなどがある。これらの前立腺癌細胞は前立腺から体の別の部分へ、特に骨およびリンパ節に広がる（転移する）おそれがある。前立腺癌の症状としては、痛み、排尿困難および勃起不全などが挙げられる。一般的に、前立腺癌は、５０歳以上の男性が最も多く発症する癌であり、患者数全体において最も大きな割合を占めている。しかしながら、前立腺癌は、特定が可能な場合であっても、発見されないことがほとんどである。前立腺癌は、健康診断、またはＰＳＡ（前立腺特異抗原）テストといったスクリーニング血液検査によって発見されることが多い。前立腺癌の疑いがある場合は、主に前立腺を一部採取し（生体組織検査）、顕微鏡において検査することによって、癌を確認する。さらに、前立腺癌が転移しているかどうか確かめるために、Ｘ線、および骨スキャンといったテストを行なうこともある。
【０００４】
前立腺癌の治療は、いまだに解決されていない課題である。従来の治療法、例えば、手術、放射線治療、ホルモン療法、不定期の化学療法、陽子線治療またはそれらを組み合わせた治療法が前立腺癌治療に適用されている。しかし、癌の転移状態、顕微鏡によって確認される状態、および初期治療に対する癌反応などと同様に、患者の年齢および根本的な健康状態が疾病の転帰を決定する上で重要である。前立腺癌は高齢男性に多く見られる疾病であるため、患者は進行が遅い前立腺癌が転移または症状を引き起こす前に、他の死因によって亡くなってしまうことが多い。このことが治療法の選択を難しくしている。治癒目的で局在化した前立腺癌（前立腺内に発生した腫瘍）を治療するか否かの判断は、患者の生存および生活の質という点において、期待できる有益な効果の代償として弊害を受け入れるかどうかである。
【０００５】
しかしながら、上述した手術、放射線治療、ホルモン療法および化学療法といった治療法にはすべて厳しい制約がある。例えば、前立腺の外科的な除去、すなわち前立腺摘除術は、早期前立腺癌または放射線治療による効果が得られなかった癌の一般的な治療である。この治療法は神経損傷を引き起こし、生活の質を一変させてしまうことがある。深刻な合併症として最も多いのは、排尿制御損失およびインポテンスである。しかし、たとえ前立腺癌を無事に摘出できるとしても、生体全体に癌が転移している場合には用いることができない。
【０００６】
放射線治療は、前立腺癌治療に一般的に使用される治療法である。この治療法は、早期癌摘出手術の代わりに用いられ得、また、末期前立腺癌において、痛みが生じる骨への転移を治療するために用いられ得る。放射線治療の単独使用では癌治療に効果がないような場合、放射線治療と、リスクが中程度である疾病を治療するために用いられるホルモン療法とを組み合わせることができる。しかし、放射線治療もまた高い危険性を伴うものであり、患者の免疫システムを破壊し、免疫防御を完全に損失させてしまうことも多い。さらに、放射線治療は、主として癌が成長する部位に局所的に用いられる。そのため、上述したように前立腺癌が生体全体に転移している場合には適用できない。放射線治療を全身に施した場合、細胞および免疫システムに深刻な損傷を引き起こしかねない。
【０００７】
化学療法は、ごく限られた患者にしか反応が現れなかったため、長い間、前立腺癌には効果的ではないと考えられてきた。しかし、転移性前立腺癌を患った患者（応答者）には、化学療法が効果を示すこともある。応答率は約２０％であるため、化学療法は腫瘍再発時における治療、およびホルモン療法によって効果が得られなかった場合に用いられる。しかし、化学療法による効果はたいてい一時的なものであり、患者の前立腺癌を完全になくすことはできない。化学療法の薬として代表的なものは、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびスラミンなど含むが、いずれの薬も患者を長期延命させることに成功していない。２００４年発行ニューイングランドジャーナルオブメディシン（the New England Journal of Medicine）に記載された近年の研究によると、３週間ごとに治療薬ドセタキセルを投与した患者は、平均２．５ヶ月の延命することが実証されている。
【０００８】
ホルモン療法では、前立腺癌細胞がジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を得られないように、薬剤を使用したり、手術と組み合わせて用いたりする。ジヒドロテストステロンは前立腺内において生産されるホルモンであり、ほとんどの前立腺癌が成長および転移する際に必要になる。ＤＨＴの獲得を妨げることによって、前立腺癌の成長を止められることが多く、縮小することさえある。しかし、初期段階においてホルモン療法に反応があった癌は１〜２年後には抵抗力をつけてしまうため、ホルモン療法によって癌が治ることはほとんどない。例えば、緩和的アンドロゲン欠乏療法（palliative androgen deprovation therapy）によって、癌を沈静化させることができる患者は８０％に上るが、１５〜２０ヵ月後には、腫瘍細胞にホルモンが効かなくなり、アンドロゲン非依存性の前立腺癌が発現する。この状況では、化学療法による有効性も制限されていることから（上記参照）、治療法の選択肢は非常に少なくなる。それゆえ、ホルモン療法は通常、癌が前立腺から転移した場合に用いられる。また、放射線治療、または手術による治療を受けている患者に対して、癌が再発することを防止するために用いられることもある。
【０００９】
このため、前立腺癌患者、前立腺癌再発患者および末期前立腺癌患者のための、さらなる治療方法に対する必要性は高い。１つの方法として、前立腺全摘出手術、または外部照射法（遠隔照射法）および近接照射療法などの放射線療法を含む、上述した臓器局所的前立腺癌に使用される標準的な方法を、ある状況下において、新規の補助療法またはホルモン補助療法と組み合わせて用いてもよい（例えばTotterman,T.H.,A.Loskogら, (2005). “The immunotherapy of prostate and bladder cancer.”BJU Int 96(5):728-35.参照）。これらの治療法は短期間においては比較的有効であるが、一方、早期限局性疾患（initially localized disease）を患った患者では最終的に再発してしまう確率が非常に高い（３０％〜４０％）。転移性前立腺癌を治療するための主な治療法はアンドロゲンの除去である。アンドロゲンの除去は、通常、腫瘍を縮小し、苦痛を緩和させるが、１４〜２０ヶ月以内にホルモン抵抗性疾病へと進行する。アンドロゲン非依存性の末期前立腺癌のための化学療法分野においては、多くの臨床研究が報告されている。ごく最近では、２つの試験により、化学療法によってホルモン抵抗性疾病患者を延命するにあたり、わずかではあるが全面的な改善が見られたことが明らかになった。
【００１０】
上述した内容を要約すると、上述した手術、放射線治療、ホルモン療法、不定期の化学療法および陽子線療法などの標準的な治療法を単独で用いた場合、前立腺癌（ＰＣａ）を効果的に治療する方法としては好適でないと思われる。そのため、治療法を改善する１つの方法としては、これら標準的な治療法を補完することができる治療または補助治療を含み得る。このように、本明細書では、適応免疫システムを用いて、前立腺癌（ＰＣａ）の治療または補助治療を実現することを提案する。
【００１１】
本発明の技術分野において知られているように、免疫システムは様々な疾病の治療および予防において重要な役割を果たしている。現在までの研究によれば、哺乳動物によって多様な機構が提供されており、例えば腫瘍細胞を特定して死滅させることにより生体を保護している。本発明の目的のため、これらの腫瘍細胞を検出し、生体の正常な（健康な）細胞および正常な組織と区別する必要がある。
【００１２】
ヒトを含む脊髄動物が持つ免疫システムは、多くの種類のタンパク質、細胞、器官および組織から構成されており、これらは複雑および動的なネットワークにおいて相互に作用しあっている。この複雑な免疫応答の一環として、脊髄動物システムは、徐々に特定の病原体、または特定の腫瘍細胞をより効率的に認識するようになる。この適応過程では免疫記憶が形成され、その後それらに接触した場合に、より効果的に防御することができる。この適応免疫、すなわち後天免疫がワクチン接種法の基礎をなしている。
【００１３】
適応免疫システムは抗原特異的であり、抗原提示と呼ばれるプロセスの間に、自己抗原または非自己抗原を認識する必要がある。抗原特異性によって、特定の病原体、特定の病原体に感染した細胞または特定の腫瘍細胞に応じた反応が可能になる。これらの調整された反応を組み込む能力は、いわゆる「記憶細胞（メモリー細胞）」によって体内に維持されている。身体が１つの病原体に１回以上感染すると、これら特定の記憶細胞が使用され、すばやく病原体を除去する。このように適応免疫システムは、それぞれの病原体または腫瘍細胞が、１つ以上の抗原提示によって「記憶」される免疫記憶だけでなく、より強い免疫応答を可能にする。
【００１４】
脊髄動物における適応免疫システムを構成する主な成分は、細胞レベルにおいてはリンパ球、分子レベルにおいては抗原を多く含む。適応免疫システムにおける細胞成分であるリンパ球には、骨髄にある造血管細胞に由来するＢ細胞およびＴ細胞がある。Ｂ細胞は体液性応答に関与し、Ｔ細胞は細胞性免疫応答に関与している。Ｂ細胞およびＴ細胞はどちらも特定の標的を認識する受容体分子を持っている。Ｔ細胞は、抗原（例えば病原体の小断片）が処理され、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と呼ばれる「自己」受容体との組み合わせにおいて発現した後に限り、「非自己」標的（病原体標的構造など）を認識する。これに対し、Ｂ細胞抗原特異的受容体は、Ｂ細胞表面における抗体分子であり、該表面における抗体が特定の外来抗原と結合したときに、病原体を認識する。この抗原／抗体複合体はＢ細胞によって取り込まれ、タンパク質分解処理されてペプチドとなる。その後、Ｂ細胞は、Ｂ細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子上にこれらの抗原ペプチドを提示する。このＭＨＣと抗原との組み合わせが適合ヘルパーＴ細胞を引き付ける。適合ヘルパーＴ細胞はリンフォカインを放出し、Ｂ細胞を活性化させる。その後、活性化されたＢ細胞が分裂し始めると、分裂した細胞が該抗原を認識する抗体の複写を何百万も分泌する。これらの抗体は血漿およびリンパ液を循環しており、抗原を発現する病原体または腫瘍細胞に結合し、補体活性により破壊したり、食細胞による取り込みおよび破壊したりするために、病原体または腫瘍細胞をマーキングする。適応免疫システムの細胞成分である細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性）も、ＣＴＬ応答を形成し得る。細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性）は、内因性病原体、およびＭＨＣタイプＩ分子と結合した自己抗原から、ペプチドを認識することができる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、細胞内において細胞障害性タンパク質を放出することによって、その殺傷機能を働かせる。
【００１５】
このように免疫システムの機構は、様々な疾病の治療のための標的を形成し得る。主として、免疫促進剤（adjuvant）を投与して先天性免疫応答を引き起こす方法、または抗原もしくは免疫原を投与して適応免疫応答を引き起こす方法のいずれかに基づく方法が好ましい。通常、抗原は病原体（例えば表面タンパク質）またはその断片の特定の成分を基にしているため、患者への核酸投与した後、所望のポリペプチド、タンパク質または抗原を発現させることも考えられる。
【００１６】
一例として、周知の前立腺関連抗原に基づくワクチン接種の研究が、Ｎｏｇｕｃｈｉら（２００３）および（２００４）に記載されている（例えば、Noguchi,M.,K.Itohら, (2004). “Phase I trial of patient-oriented vaccination in HLA-A2-positive patientswith metastatic hormone-refractory prostate cancer.”Cancer Sci 95(1):77-84;andNoguchi,M.,K.Kobayashiら, (2003). “Induction of cellular and humoral immune responses to tumor cells and peptides in HLA-A24 positive hormone-refractory prostate cancer patients by peptide vaccination.”Prostate 57(1):80-92.Noguchiら2003 and Noguchiら 2004参照）。Ｎｏｇｕｃｈｉら（２００３）および（２００４）では、フェーズＩの２つの研究が記載されている。それらの研究では、転移性ホルモン抵抗性前立腺癌患者にワクチンを投与するマルチペプチド臨床試験が行なわれており、選択された標的に対する細胞免疫応答およびホルモン免疫応答が増加したことが示されている。ワクチン接種法は安全であり、毒性が低く良好な耐性を示した。しかし、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）レベルが固定されたり、減少したりすることも確認され、骨への転移が消失した患者は１人だけであった。臨床応用を困難にしているこの方法の主な制約は、前立腺癌細胞によるペプチド発現のみならず、患者のＨＬＡハプロタイプについても事前に知っていなければならないことである。
【００１７】
最近では別のいくつかの方法が用いられており、細胞をベースとしたワクチン接種法がある。例えば、ワクチン接種法における異なる抗原の使用、または異なる抗原もしくはその断片を取り入れた樹状細胞の使用がある。一例によれば、組換えヒトＰＳＡによりパルスした自己樹状細胞を用いた前立腺癌患者のワクチン接種が試験されている（例えばBarrou,B.,G.Benoitら, (2004). “Vaccination of prostatectomized prostate cancer patients in biochemical relapse,with autologous dendritic cells pulsed with recombinant human PSA.”Cancer Immunol Immunother 53(5):453-60参照）。末期の前立腺癌患者に対して、ＰＳＣＡペプチド荷重樹枝細胞およびＰＳＡペプチド荷重樹状細胞を用いたワクチン接種をしている間、患者の５〜１０人が、少なくとも１つの抗原に対して免疫応答を示した（例えばThomas-Kaskel,A.K.,R.Zeiserら, (2006). “Vaccination of advancedprostate cancer patients with PSCA and PSA peptide-loaded dendritic cells induces DTH responses that correlate with superior overall survival.”Int J Cancer 119(10):2428-34.参照）。
【００１８】
また、別の例として、Ｍｕｒｐｈｙら（１９９６）では、ワクチン接種をペプチド単独もしくはパルスした樹状細胞と共に用いる場合と比較するために、２つのＨＬＡ−Ａ＊０２０１ＰＳＭＡエピトープを使用して、対応するフェーズＩ試験において前立腺癌患者のワクチン接種を実施した。その結果、パルスした樹状細胞と共にワクチン接種した患者の場合、より多くの患者が接種したワクチンに対して反応を示した。この研究により、ペプチドまたはタンパク質をのせた樹状細胞と共にワクチン接種することにより、一時的なＰＳＣ減少またはＰＳＣ安定だけでなく、少なくとも部分的には検出可能な免疫応答が得られることが示された（例えばMurphy,G.,B.Tjoaら, (1996). “Phase I clinical trial: T-cell therapy for prostate cancer using autologous dendritic cells pulsed with HLA-A0201-specific peptides from prostate-specific membrane antigen.”Prostate 29(6):371-80参照）。
【００１９】
また、前立腺癌患者へのワクチン接種は、樹状細胞にのせるペプチドの組み合わせ（例えば、ペプチドカクテル荷重樹状細胞）により実施され得る（例えばFuessel,S.,A.Meyeら, (2006). “Vaccination of hormone-refractory prostate cancer patients with peptide cocktail-loaded dendritic cells: results of a phase I clinical trial.”Prostate 66(8):811-21参照）。カクテルは、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、スルビビン、プロステイン、およびＴｒｐ−ｐ８（一過性受容器電位ｐ８）由来のペプチドを含む。また、ホルモン抵抗性前立腺癌の樹状細胞に基づくマルチエピトープ免疫療法により、臨床試験が実施された（例えばWaeckerle-Men,Y.,E.Uetz-von Allmenら, (2006). “Dendritic cell-basedmulti-epitope immunotherapy of hormone-refractory prostate carcinoma.”Cancer Immunol Immunother 55(12):1524-33参照）。Waeckerle-Men,Y.,E.Uetz-von Allmenら(2006)においては、ＰＳＣＡ、ＰＡＰ（前立腺酸性フォスファターゼ）、ＰＳＭＡおよびＰＳＡ由来のペプチドを使用して、ホルモン抵抗性前立腺癌に対するワクチン接種が試験された。
【００２０】
例えば、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドを樹状細胞にのせている場合、抗原性タンパク質または抗原性ペプチドをワクチン接種に使用することは、免疫応答を引き起こすためになされる一般的な方法である。一方、免疫付与またはワクチン接種は、所望する遺伝情報を細胞に組み込むための核酸の使用に基づき得る。一般に、核酸を細胞に導入するために様々な方法が開発されている。例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリプレントランスフェクション、原形質融合、電気せん孔法（エレクトロポレーション）、マイクロインジェクションおよびリポフェクションなどである。特に、リポフェクションが好適であることが証明されている。
【００２１】
一例によると、前立腺癌のワクチン接種治療は、自己腫瘍由来のｍＲＮＡすべてを樹状細胞に導入することに基づき得る（例えばHeiserら(2002)(Heiser,A.,D.Coleman,et al.(2002). “Autologous dendritic cells transfected with prostate-specific antigen RNA stimulate CTL responses against metastatic prostate tumors.”J Clin Invest 109(3):409-17.参照）。この方法は、ＨＬＡ分類（タイピング）を事前に行わずに、マルチＨＬＡクラスＩおよびマルチＨＬＡクラスＩＩ患者に特異的な腫瘍関連抗原（ＴＡＡｓ）を標的にできるという利点を有している。さらに、この方法によれば、ｍＲＮＡは腫瘍細胞株からではなく、外科的試料から採取されるため、ストローマ抗原さえ標的にできる。一例として、Ｈｅｉｓｅｒらが、ＰＳＡをコードするｍＲＮＡを樹状細胞（ＤＣ）に導入した、ＤＣベース免疫療法プロトコルを開発している。このワクチン接種は良好な耐性を示し、ＰＳＡに対するＴ細胞応答を増加させた。しかしながら、この樹状細胞をベースにした抗前立腺癌ワクチンは、臨床反応を伴う強いＴ細胞応答を発生させると思われるが、その臨床反応の頻度はいまだに不十分のままである。
【００２２】
所望の遺伝情報を細胞に組み込むため、ＤＮＡもワクチン治療法における核酸として使用し得る。ある一例によれば、ＤＮＡウイルスをＤＮＡ媒体（DNA vehicle）として使用してもよい。このようなウイルスは、その感染能によって、非常に高いトランスフェクション率を実現できる。使用されるウイルスは、導入された細胞において機能性感染粒子が一切形成されないように遺伝子操作されたウイルスである。例えば、Ｅｄｅｒら（２０００）の研究において、ＰＳＡを発現する組換えワクシニアウイルスを使用してフェーズＩの臨床試験が行われている。その著者らはＰＳＡに対するＴ細胞免疫応答、および選択された患者における血清ＰＳＡの安定化を実証した（例えば、Eder,J.P.,P.W.Kantoffら, (2000). “A phase I trial of a recombinant vaccinia virus expressing prostate-specific antigen in advanced prostate cancer.”Clin Cancer Res 6(5):1632-8.参照）。組換えウイルスからの高免疫原性ペプチドによって誘発される炎症反応によって、外来タンパク質の免疫原性を高めることができるが、免疫システムが組換えウイルスの複製を減少させ、それによって臨床転帰（clinical outcome）を制限してしまうことも分かっている。しかしながら、たとえ組換えワクチンが免疫原性を示し、腫瘍反応が複数の試験において確認されたとしても、これらの結果は実証される必要がある。
【００２３】
さらなる方法によれば、ホルモン抵抗性前立腺癌患者へのワクチン摂取が、ＰＳＡを発現するＤＮＡプラスミドを使用して行なわれている（例えばPavlenko,M.,A.K.Roosら, (2004). “A phase I trial of DNA vaccination with a plasmid expressing prostate-specific antigen in patients with hormone-refractory prostate cancer.”Br J Cancer91(4):688-94参照）。Ｇａｒｃｉａ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら（２００７）には、ＳＴＥ
ＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードする、プラスミドまたはウイルス様レプリコンを使用した治療的および予防的ワクチン摂取によって、腫瘍試験マウスを延命することに成功したことが示されている（例えばGarcia-Hernandez Mde,L.,A.Gray,et al.(2007). “In vivo effects of vaccination with six-transmembrane epithelial antigen of the prostate: a candidate antigen for treating prostate cancer.”Cancer Res 67(3):1344-51参照）。最近では、ＳＴＥＡＰは、ヒト前立腺癌において顕著に過剰に発現する末期ヒト前立腺癌用指標タンパク質として識別されている。その機能はいまだに解明されていない。
【００２４】
ＤＮＡを、遺伝情報キャリアとして使用することができるが、その一方で、例えば潜在的組換え現象によって、導入された遺伝子またはウイルス遺伝子が制御不能な増殖を起こすというリスクを無視できない。また、このことは、この遺伝子が突然変異し得、完全にもしくは部分的に不活性化されるという結果になるか、または遺伝子が語情報を引き起こし得るという結果になるため、例えば、組換えによるホスト細胞ゲノムの無傷の遺伝子にＤＮＡを組み込むリスクを伴う。ＤＮＡが、細胞増殖の調節に関与する遺伝子に組み込まれた場合、ある特別なリスクを伴う。この場合、ホスト細胞が変質して、癌または腫瘍を形成してしまう可能性がある。さらに、細胞に導入されたＤＮＡを発現する場合、対応するＤＮＡ媒体は、キャリアサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど、強力なプロモーターを含んでいることが必要である。このようなプロモーターを処理した細胞のゲノムに組み込むことは、細胞内における遺伝子発現調節において、望ましくない変質をもたらすことがある。免疫応答を引き起こす物質（例えばワクチン）としてＤＮＡを使用することは、さらに、外来ＤＮＡが導入されている患者において、病原性抗ＤＮＡ抗体を誘導し、それによって（致死的な場合もある）免疫応答を引き起こすという、別の危険性も伴う。
【００２５】
上述した方法の結果を要約すると、いまだに死亡率が高く、さらなる新しい治療法、または治療法を改善することが非常に必要とされてはいるが、前立腺癌（ＰＣａ）治療にいくらかの改善がなされていることに疑いはない。
【００２６】
このように、全体としてみれば、ＤＮＡに基づく組成物によって導入される遺伝子が制御不能に増殖してしまう問題を避けながら、免疫システムを効果的に刺激して前立腺癌（ＰＣａ）治療を可能にする、効果的なシステムに対しては考慮する余地があり、また、そのようなシステムが必要とされている。
【００２７】
それゆえ、本発明の目的は組成物を提供することであって、（ａ）免疫システムを促進することにより前立腺癌（ＰＣａ）治療を可能にすると共に、（ｂ）上述した問題を回避する組成物を提供することにある。
【００２８】
本発明の目的は本発明の特徴によって達成される。本発明の目的は特に、活性（免疫賦活）組成物であり、少なくとも１つのＲＮＡを含み、上記少なくとも１つのＲＮＡは、以下の抗原：
・ＰＳＡ（前立腺特異抗原）＝ＫＬＫ３（カリクレイン−３）
・ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）
・ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）
・ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）
からなる群から選択される少なくとも２つ、３つまたは４つの抗原（好ましくは異なる抗原）をコードしている、という本発明の特徴によって達成される。
【００２９】
驚くべきことに、本発明の活性（免疫賦活）組成物に含まれる、上記群に含まれる少なくとも２つ、好ましくは２つ、３つもしくは４つの抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの特定の組み合わせが（適応）免疫システムを効率的に促進し、前立腺癌（ＰＣａ）治療、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれらに関連する疾病または疾患の治療を可能にすることがわかった。本明細書において、抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドという用語は、同意語として使用され得る。さらに、本明細書において、本発明の活性（免疫賦活）組成物は免疫応答を促進できる組成物として解釈され、好ましくは活性（免疫賦活）組成物の構成物質に含まれる、またはコードされる構成物質の１つによって（好ましくは少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）に含まれる、またはコードされる構成物質の１つによって）、免疫応答（好ましくは本明細書において定義される適応免疫応答）を促進することができる組成物として解釈される。
【００３０】
ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、およびＰＳＣＡなどの抗原は、正常な細胞と比べると、前立腺癌細胞によって過剰発現することが分かっている。それゆえ、これらの抗原は、免疫療法における標的となり得る（例えばMarrari,A.,M.Iero,et al.(2007). “Vaccination therapy in prostate cancer.”Cancer Immunol Immunother 56(4):429-45.参照）。
【００３１】
上記活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡはＰＳＡであってもよい。本発明において、「ＰＳＡ」とは「前立腺特異抗原」を指し、本明細書において名づけられたＫＬＫ３（カリクレイン３）と同意語とみなしてよい。前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は３３ｋＤａタンパク質であり、良性および悪性、前立腺組織すべてのタイプの上皮細胞によって排他的に生産される、アンドロゲン調節カリクレイン様（androgen-regulated kallikrein-like）セリンプロテアーゼである。特に、ＰＳＡは、正常な前立腺上皮細胞によって多く発現され、前立腺癌において、最も特徴的な腫瘍関連抗原のうちの１つである。生理学的に、ＰＳＡは精液に高濃度な状態にて存在し、精液を凝固させる高分子重タンパク質を、より小さなポリペプチドに分割する役割を果たしている。この作用によって、精液の凝固が液化される。ＰＳＡはまた、血清にも存在し、単クローン免疫放射定量測定法、またはポリクローナル放射免疫測定法によって、確実に測定することができる。現在、ＰＳＡは、前立腺癌に対するスクリーニング、診断および観察に最も広く使用されている腫瘍マーカーである。特に、血清ＰＳＡを検出するためのいくつかの免疫学的測定は、臨床用途において幅広く使用されている。最近では、血清におけるＰＳＡｍＲＮＡのための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）検査が開発されている。しかしながら、ＰＳＡの上昇レベルは、ＢＰＨ患者および前立腺炎患者において、多くの割合（２５％−８６％）にて検出され（Gaoら、1997,Prostate 31:264-281）、また、他の非悪性疾患、および正常な男性においても検出されることがあるという、このマーカーの特異的診断を非常に制限する要素があることから、ＰＳＡは疾病特異的マーカーとは見なされていない。本発明において、本発明の活性（免疫賦活）組成物に使用する場合、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）をコードする、上記少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡの配列は、アクセッション番号ＮＭ＿００１６４８にて寄託されている配列を含んでいることが好ましく、図１（配列番号１）に示される配列を含んでいることがさらに好ましく、上記少なくとも１つのＲＮＡがＰＳＡ（前立腺特異抗原）をコードしている場合、図２または図３（配列番号２または３）のいずれかに示されるコード配列を含んでいることがさらに好ましい。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、代替的または付加的に、アクセッション番号ＮＭ＿００１６４８にて寄託されているＰＳＡ配列、あるいは図１〜図３（配列番号１、２、または３）のいずれかに示されるＰＳＡ配列の、断片、変異体またはエピトープから選択される、ＰＳＡ抗原配列をコードしていてもよい。
【００３２】
上記活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つのＲＮＡは、ＰＳＭＡであってもよい。本発明において、「ＰＳＭＡ」とは「前立腺特異膜抗原」であり、ＦＯＬＨ１（葉酸ヒドロラーゼ１）または「ＰＳＭ」と同意語とみなすことができる。ＰＳＭＡは１００ｋＤａＩのＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＳＭＡ発現は、主として前立腺組織に制限されているが、ＰＳＭＡｍＲＮＡの検出可能レベルは、脳腫瘍、唾液腺癌、小腸癌および腎臓細胞癌において観察されている（例えばIsraeliら,1993,Cancer Res 53:227-230参照）。ＰＳＭＡは、ほとんどの原発性および転移性前立腺癌において多く発現するが、ほとんどの正常な上皮内新生物検体においても多く発現する（Gaoら、(1997),supra）。特に、ＰＳＭＡは前立腺癌細胞および非前立腺固形腫瘍新生血管系（nonprostatic solid tumorneovasculature）において非常に多く発現し、抗癌造影剤および抗癌治療剤のための標
的となる。ＰＳＭＡは、小分子基質上において、グルタミン酸カルボキシペプチターゼ（ＧＣＰＩＩ）として作用し、葉酸、制癌剤メトトレキサートおよび神経ペプチド−Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパチル−Ｌ−グルタミン酸塩を含んでいる。前立腺癌において、ＰＳＭＡ発現は、疾病の進行と関連があり、ホルモン抵抗性および転移性疾病において最も高い発現レベルを示すことが分かっている。ＰＳＭＡ細胞は、細胞質および／または膜質に局在している。ＰＳＭＡは、前立腺癌（ＰＣａ）用のバイオマーカーとして考えられており、造影標的および治療標的として使用するために、盛んに研究がなされている。本発明において、本発明の活性（免疫賦活）組成物に使用される場合、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）をコードする、上記少なくとも１つのＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、アクセッション番号ＮＭ＿００４４７６にて寄託されている配列を含んでいることが好ましく、図４（配列番号４）に示される配列を含んでいることがさらに好ましく、上記少なくとも１つのＲＮＡは、ＰＳＭＡ（前立腺特異抗原）をコードする場合、図５または図６（配列番号５または６）いずれかに示されるコード配列を含んでいることがさらに好ましい。さらに好ましい実施形態によると、上記活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つのＲＮＡは、上述に代えて、または上述に加えて、アクセッション番号ＮＭ＿００４４７６にて寄託されているＰＳＭＡ配列、あるいは図５または図６（配列番号５または６）のいずれかに示されるＰＳＭＡ配列の、断片、変異体またはエピトープから選択されるＰＳＭＡ抗原配列をコードしていてもよい。
【００３３】
活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、ＰＳＣＡであってもよい。本発明において、「ＰＳＣＡ」とは、「前立腺肝細胞抗原」である。ＰＳＣＡは、高度前立腺上皮内新生組織形成（ＰＩＮ）、およびアンドロゲン依存性前立腺腫瘍およびアンドロゲン非依存性前立腺腫瘍などを含む、前立腺癌におけるすべての段階（ステージ）に渡って、広く過剰発現する。ＰＳＣＡ遺伝子は、グリコシルフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー細胞表面抗原のＴｈｙ−Ｉ／Ｌｙ−６族のメンバーである肝細胞抗原−２に対して３０％の相同性を示し、アミノ末端シグナル配列、カルボキシ末端ＧＰＩアンカー配列および多重Ｎグリコシレーション部位とともに、１２３個のアミノ酸タンパク質をコードする。ＰＳＣＡｍＲＮＡ発現は、アンドロゲン依存性前立腺癌異種移植片およびアンドロゲン非依存性前立腺癌異種移植片のどちらにおいても、非常に促進される。ｉｎ−ｓｉｔｕのｍＲＮＡ分析により、ＰＳＣＡ発現が、前立腺の推定幹細胞区画である、基底細胞上皮に特定されている。フローサイトメトリー分析によって、ＰＳＣＡは主に細胞表面において発現し、ＧＰＩ結合によってアンカーされていることが分かっている。蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析によって、ＰＳＣＡ遺伝子は、８０％を超える前立腺癌において、対立遺伝子（allelic gain）の領域である、染色体８ｑ２４．２に特定されている。ＰＳＣＡは、悪性前立腺癌、正常な前立腺および非悪性新生組織形成とを識別する、前立腺癌マーカーとして使用され得る。例えば、ＰＳＣＡは、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）に関連する前立腺癌において、非常に高いレベルにて発現する。本発明において、本発明の活性（免疫賦活）組成物に使用される場合、ＰＳＣＡ（前立腺肝細胞抗原）をコードする少なくとも１つのＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、アクセッション番号ＮＭ＿００５６７２にて寄託されている配列を含んでいることが好ましく、図７（配列番号７）に示される配列を含んでいることがさらに好ましい。少なくとも１つのＲＮＡがＰＳＣＡ（前立腺肝細胞抗原）をコードする場合、図８または図９（配列番号８または９）のいずれかに示されるコード配列を含んでいることがさらに好ましい。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、代替的にまたは付加的にアクセッション番号ＮＭ＿００５６７２にて寄託されているＰＳＣＡ配列、あるいは図８または図９（配列番号８または９）のいずれかに示されるＰＳＣＡ配列の、断片、変異体またはエピトープのいずれかから選択されるＰＳＣＡ抗原配列をコードしていてもよい。
【００３４】
活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、ＳＴＥＡＰであってもよい。本発明において、「ＳＴＥＡＰ」とは、前立腺６膜貫通上皮抗原であり、ＳＴＥＡＰ１と同意語として用いられ得る。ＳＴＥＡＰ、すなわちＳＴＥＡＰ１は、新規の細胞表面タンパク質であり、主にヒト前立腺組織において発現し、また、前立腺癌、膀胱癌、大腸癌、卵巣癌およびユーイング肉腫においても多く発現し、ほぼ万能な腫瘍抗原として機能し得ると考えられている。特に、ＳＴＥＡＰは原発性前立腺癌において多く発現し、正常な組織においては発現が制限される。骨髄標本におけるＳＴＥＡＰ陽性は、カプランメイヤー解析（ｐ＝０．００１）における新転移における生存率と非常に関連がある。本発明において、本発明の活性（免疫賦活）組成物に使用される場合、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードする少なくとも１つのＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、アクセッション番号ＮＭ＿０１２４４９にて寄託されている配列を含んでいることが好ましく、図１０（配列番号１０）に示される配列を含んでいることがさらに好ましく、少なくとも１つのＲＮＡがＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードする場合、図１１または図１２（配列番号１１または１２）に示されるコード配列を含んでいることがさらに好ましい。さらに好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、代替的にまたは付加的に、アクセッション番号ＮＭ＿０１２４４９にて寄託されているＳＴＥＡＰ配列、または図１１または図１２（配列番号１１または１２）のいずれかに示されるＳＴＥＡＰ配列の、断片、変異体またはエピトープのいずれかから選択されるＳＴＥＡＰ抗原配列をコードしていてもよい。
【００３５】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされ得る、上述した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドは、これらの配列の断片、または変異体を含んでいてもよい。このような断片または変異体は、主として、上述した抗原、抗原タンパク質、抗原ペプチド、配列またはそれらがコードする核酸配列のうちいずれか１つに対して、核酸レベルまたはアミノ酸レベルにおいて、野生型配列全体において少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％の配列相同性を持つ配列を含んでいてもよく、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％または９７％の配列相同性を持つ配列を含んでいてもよい。
【００３６】
本発明において、抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの「断片」は、上述した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの配列を含んでいてもよく、該配列は、そのアミノ酸配列（すなわちこれをコードしている核酸配列）に関して、元の（天然）タンパク質のアミノ酸配列（すなわちこれをコードしている核酸配列）と比べて、Ｎ末端側、Ｃ末端側および／または配列内部が短縮されていてもよい。このような短縮は、アミノ酸レベル、または同様に核酸レベルにおいても、どちらでも起こり得る。それゆえ、上述したこのような断片に対する配列相同性とは、上述した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチド全体、あるいはこのような抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの（コーディング）核酸配列全体を指すことが好ましい。
【００３７】
本発明において、抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの断片は、約６〜２０個、またはそれ以上の長さのアミノ酸を有する、上述した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの配列をさらに含んでいてもよい。例えば、ＭＨＣクラスＩ分子によって処理され、提示される、例えば８、９もしくは１０個のアミノ酸（６、７、１１または１２個のアミノ酸であってもよい）を有し、好ましくは約８〜１０個のアミノ酸を有する断片、または、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって処理、および提示される例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれ以上の長さのアミノ酸を有し、好ましくは１３個またはそれ以上の長さのアミノ酸を有する断片である。これらの断片は、アミノ酸配列のいかなる部分から選択されてもよい。これらの断片は、通常、ペプチド断片およびＭＨＣ分子により構成される複合体の形においてＴ細胞によって認識される。つまり、これらの断片は、概してその野生型においては認識されない。
【００３８】
本明細書において定義される抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの断片は、これらの抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドのエピトープを含み得る。本発明において、エピトープ（「抗原決定基」ともよばれる）は、概して、ここで定義される、（野生型の）抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの外表面に位置する断片であり、好ましくは５〜１５個のアミノ酸、より好ましくは５〜１２個のアミノ酸、さらに好ましくは６〜９個のアミノ酸を有しており、それらの天然型において抗体またはＢ細胞受容体に認識される。上記抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドのエピトープは、さらに、本明細書に記載の該抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの変異体のいずれかから選択され得る。本明細書において、抗原決定基は、本明細書において定義される抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの断片からなる立体構造エピトープまたは不連続エピトープであり得る。それら断片は、本明細書において定義される抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドのアミノ酸配列では非連続性であるが、三次元構造、または単一ポリペプチド鎖からなる連続的なエピトープもしくは直線的なエピトープでは結びつけられる。
【００３９】
定義した上記抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの「変異体」は、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされていてもよい。ここで、定義した上記抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドをコードする少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの核酸は置換されていてもよい。これにより、１つ以上の変異体（例えば、１つ以上の置換、挿入および／または欠失されたアミノ酸）中に元の配列とは異なるアミノ酸配列を有する抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドを生成し得る。これらの断片および／または変異体は、全長野生型の抗原または抗原タンパクと比較して、同じ生物学的機能または比活性度（例えば、抗原または抗原タンパクの抗原特異性）を有することが好ましい。
【００４０】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、定義した上記抗原または抗原タンパク質をコードしていてもよい。ここで、コードされたアミノ酸配列は、該ＲＮＡの生理学的配列と比べて、アミノ酸同類置換を含む。特に、これらのコードされたアミノ酸配列および該アミノ酸配列をコードする核酸配列は、上述で定義した用語「変異体」に該当する。同じクラスから派生したアミノ酸同士がそれぞれ交換される置換は、同類置換と呼ばれる。特に、同類置換されたアミノ酸は、脂肪族側鎖、正もしくは負に帯電した側鎖、側鎖もしくはアミノ酸内の芳香族基、または水素結合が可能な側鎖（例えば水酸基を有する側鎖）を有する。これは、例えば次のことを意味する。すなわち、極性側鎖を有するアミノ酸が、同様な極性側鎖を持つ別のアミノ酸と入れ替わること、または、疎水性側鎖によって特徴づけられるアミノ酸が、同様な疎水性側鎖によって特徴づけられる別のアミノ酸によって置換されること（例えば、セリンがトレオニン（トレオニンがセリン）に置換されるか、またはロイシンがイソロイシン（イソロイシンがロイシン）に置換される）を意味する。挿入および置換は、とりわけ、三次元構造に変更をもたらさない、または結合領域に影響しない配列位置において可能である。挿入または欠失による三次元構造の修飾は、例えばＣＤスペクトル（円二色性スペクトル）を用いることによって、容易に決定できる（Urry,1985,Absorption,Circular Dichroism and ORD of Polypeptides,in:Modern Physical Methods in Biochemistry,Neubergerら(ed.),Elsevier,Amsterdam）。
【００４１】
さらに、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされ得る、上述に定義した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドの変異体は以下の配列を含んでいてもよい。すなわち、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの核酸が、抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドそれぞれのアミノ酸配列に転換をもたらさずに、遺伝子コードの縮重に応じて交換されている配列、言い換えれば、アミノ酸配列または少なくともその一部が、上述した解釈の範囲内で、１つまたはそれ以上の変異において元の配列から変化していない配列を含んでいてもよい。
【００４２】
２つの配列（例えば、本明細書に定義するＲＮＡ配列もしくはｍＲＮＡ配列、またはアミノ酸配列などの核酸配列であり、好ましくはそれらをコードした、例えば上記定義した抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドのアミノ酸配列などのアミノ酸配列）における一致の割合を決定するべく、これらの配列が続けて互いに比較されるように、順番に配列することができる。それゆえ、例えば、第１の配列にギャップを挿入し、第２の配列の、対応する位置における構成要素を比べることができる。例えば、第１配列内のある位置において、第２配列内のある位置における構成要素と同一の構成要素によって占められている場合、２つの配列はこの位置において同一である。２つの配列が同一である割合は、同一である位置の数を、位置の総数によって割る関数によって求められる。２つの配列が同一である割合は数学アルゴリズムを利用して求めることができる。利用できる数学アルゴリズムの好ましい例として、Ｋａｒｌｉｎら、（１９９３）（PNAS USA,90:5873-5877)、またはAltschulら(1997)(Nucleic Acids Res.,25:3389-3402）に記載されているアルゴリズムが挙げられるが、特に限定はされない。このようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明の配列とある程度同一である配列は、このプログラムによって識別することができる。
【００４３】
本発明によれば、上記群のうち少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原の特定の組み合わせによって（適応）免疫システムを効率よく促進し、前立腺癌（ＰＣａ）を治療できる。それゆえ、本発明に係る活性（免疫賦活）組成物は、上記定義したように、上記群の抗原のいずれかから選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含んでいる。しかしながら、本発明は、上記群の抗原のいずれかから選択される３つまたは４つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡをさらに含んでいてもよく、これらの抗原のいかなる組み合わせも可能であり、本発明の範疇に含まれる。
【００４４】
より好ましくは、本発明は、上記群の抗原のいずれかから選択される、少なくとも３つまたは４つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含んでおり、これら抗原のいかなる組み合わせも可能である活性（免疫賦活）組成物を提供し得る。
【００４５】
したがって、特に好ましい別の実施形態によると、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、以下に示す抗原の組み合わせ：
・ＰＳＡおよびＰＳＭＡ
・ＰＳＡおよびＰＳＣＡ
・ＰＳＡおよびＳＴＥＡＰ
・ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡ
・ＰＳＭＡおよびＳＴＥＡＰ
・ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰ
または、
・ＰＳＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡ
・ＰＳＡ、ＰＳＭＡおよびＳＴＥＡＰ
・ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰ
・ＰＳＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰ
または、
・ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰ
のうち（少なくとも）いずれか１つを含んでいる上記群の抗原のいずれかから選択される、少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードしていてもよい。
【００４６】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、少なくとも２つ、３つまたは４つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む活性（免疫賦活）組成物を提供する。
（ａ）ここで、少なくとも１つの抗原は、
・ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）から選択され；
（ｂ）残りの抗原は、以下の抗原もしくはこれらの特定の組み合わせ：
・ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、
・ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、もしくは、
・ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）；
または、
・ＰＳＡおよびＰＳＭＡ、
・ＰＳＡおよびＰＳＣＡ、もしくは、
・ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡ；
または、
・ＰＳＡ、ＰＳＭＡおよびＰＳＣＡ；
のうちの少なくとも１つから選択される。
【００４７】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰから選択される４つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、少なくとも１つのＲＮＡを含む、活性（免疫賦活）組成物を提供する。
【００４８】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、概して、任意のＲＮＡであり、特に限定されないが、好ましくはコードＲＮＡ、環状ＲＮＡもしくは直線状ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡもしくは２本鎖ＲＮＡ（２本の１本鎖ＲＮＡが非共有結合しているため、１つのＲＮＡとみなされることもある）、または少なくとも部分的に自己相補的な、部分的２本鎖ＲＮＡまたは部分的１本鎖ＲＮＡである。なお、部分的１本鎖ＲＮＡ分子または部分的２本鎖ＲＮＡ分子はいずれも、主として、一方が長く、他方が短い１本鎖ＲＮＡ分子によって形成されるか、または長さがほぼ等しい２つの１本鎖ＲＮＡ分子によって形成される。ここで、１つの１本鎖ＲＮＡ分子が、もう１つの１本鎖ＲＮＡ分子と部分的に相互補完的であるため、その領域において２本鎖ＲＮＡ（すなわち、ＲＮＡ配列全体に対して部分的に２本鎖、または部分的に１本鎖であるＲＮＡ）を形成している。より好ましくは、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは１本鎖ＲＮＡであり、さらに好ましくは直線状ＲＮＡであり、最も好ましくはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。ここで、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とは、主として、（少なくとも）いくつかの構造要素からなるＲＮＡである。構造要素としては、例えば、任意的な５’−ＵＴＲ領域、コード領域の上流に位置するリボソーム結合部位、ポリ−Ａ尾部（および／またはポリ−Ｃ尾部）の上流にある任意的な３’−ＵＴＲ領域などである。
【００４９】
特に好ましい実施形態によると、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原はそれぞれ、１つの（モノシストロン性）ＲＮＡ、好ましくは１つの（モノシストロン性）ｍＲＮＡにコードされていてもよい。言い換えれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、少なくとも２つの（モノシストロン性）ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを含み、これら２つの（モノシストロン性）ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡは、それぞれ上記群またはサブ群のいずれか１つより選択される、好ましくは上記組み合わせのいずれか１つから選択される、単一の（好ましくは異なる）抗原をコードしていてもよい。
【００５０】
別の特に好ましい実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、（少なくとも）１つのビシストロン性ＲＮＡまたはマルチシストロン性ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ（すなわち、少なくとも２つの（好ましくは異なる）の抗原のコード配列を２つまたはそれ以上有している（少なくとも）１つのＲＮＡ）を含み得、上記群またはサブ群のいずれか１つ、好ましくは上記組み合わせのいずれか１つから選択される。（少なくとも）１つのビシストロン性ＲＮＡまたはマルチシストロン性ＲＮＡのうち少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原のコード配列は、後述するように、少なくとも１つのＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列によって分離されていてもよい。ここで、用語「少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする」とは、特に限定されないが、（少なくとも）１つの（ビシストロン性またはマルチシストロン性）ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが、例えば、抗原（または上記定義の範囲内におけるそれらの断片もしくは変異体）の群の少なくとも２つ、３つまたは４つの（好ましくは異なる）抗原をコードしていることを意味してもよい。より好ましくは、特に限定はされないが、（少なくとも）１つの（ビシストロン性またはマルチシストロン性）ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）は、例えば、上記抗原（または上記定義の範囲内におけるこれらの断片もしくは変異体）のサブ群の少なくとも２つ、３つまたは４つの（好ましくは異なる）抗原をコードしていてもよい。ここで、上記定義したいわゆるＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列は単一リボソーム結合部位として機能するが、リボソームによって独立して互いに翻訳されるいくつかのタンパク質をコードする、上記定義した１つのバイシストロン性ＲＮＡまたはマルチシストロン性ＲＮＡを提供する機能を果たすことができる。本発明において使用可能なＩＲＥＳ配列は、例えば、ピコナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ペスチウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典型豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）またはコオロギ麻痺病様ウイルス（ＣｒＰＶ）由来の配列である。
【００５１】
さらに、特に好ましい実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、上記定義した少なくとも１つのモノシストロン性ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）と、上記定義した少なくとも１つのビシストロン性またはマルチシストロン性ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡとの混合物を含んでいてもよい。少なくとも１つのモノシストロン性ＲＮＡおよび／または少なくとも１つのビシストロン性ＲＮＡまたはマルチシストロン性ＲＮＡは、異なる抗原（または上記定義におけるそれらの断片もしくは変異体）をコードしていることが好ましく、抗原は上記抗原の群またはサブ群のいずれか１つから選択されることが好ましく、上記組み合わせのいずれか１つから選択されることがさらに好ましい。しかしながら、本発明の活性（免疫賦活）組成物が、全体として、上記定義した少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原を提供する場合、少なくとも１つのモノシストロン性ＲＮＡおよび少なくとも１つのビシストロン性ＲＮＡまたはマルチシストロン性ＲＮＡは、上記抗原の群またはサブ群のいずれか１つから選択される、好ましくは上記組み合わせのいずれか１つから選択される、（部分的に）同一な抗原をコードすることが好ましい。このような実施形態は、本発明の活性（免疫賦活）組成物を必要とする患者に投与するにあたり、例えば時間差（例えば時間依存性）投与において利点を有する。このような本発明の活性（免疫賦活）組成物の構成成分、特に少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、異なるＲＮＡは、例えば複数のパーツに構成されるキット（その異なるパーツ）に含まれているか、または別の本発明の活性（免疫賦活）組成物の構成成分として別々に投与されてもよい。
【００５２】
上記定義された抗原の群から選択される、より好ましくは上記組み合わせから選択される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、主として、長さが約５０〜約２００００ヌクレオチド、または約１００〜約２００００ヌクレオチド、好ましくは約２５０〜約２００００ヌクレオチド、より好ましくは約５００〜約１００００ヌクレオチド、さらに好ましくは約５００〜約５０００ヌクレオチドである。
【００５３】
一実施形態によれば、上記定義された抗原の群またはサブ群、より好ましくは上記組み合わせから選択される、少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、修飾ＲＮＡであってもよ。ここで定義されるいかなる修飾も、活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つのＲＮＡに導入し得る。ここで定義される修飾は、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡを安定化させるものであることが好ましい。
【００５４】
第１の実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つのＲＮＡは、それゆえ、「安定ＲＮＡ」、好ましくは安定ｍＲＮＡとして、言い換えれば、インビボ分解（例えばエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる）に対して本質的に耐性を持つｍＲＮＡとして提供され得る。このような安定化は、例えば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのリン酸骨格を修飾することによって達成し得る。本発明において骨格修飾とは、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩の化学的な修飾である。この関係において好ましく使用され得るヌクレオチドは、例えば、リンチオン酸塩修飾されたリン酸塩骨格、好ましくはリン酸塩骨格に含まれるリン酸酸素の少なくとも１つが硫黄原子と交換されたリン酸骨格を含んでいてもよい。安定（ｍ）ＲＮＡはさらに、例えば、非イオン性リン酸類似体（例えば荷電リン酸酸素がアルキル基またはアリール基に交換されたアルキルおよびアリールリン酸化合物、または、荷電酸素残留物がアルキル化された形にて存在するリン酸ジエステルおよびアルキルリン酸トリエステル）を含んでいてもよい。このような骨格修飾は、特に限定されないが、概して、メチルホスソン酸、ホスホロアミデート、およびリンチオン酸塩（例えばシチジン５’−Ｏ−（１−チオリン酸エステル））からなる群から選択される修飾を含んでいる。
【００５５】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、付加的または代替的に、糖修飾を含んでいてもよい。本発明において糖修飾は、少なくとも１つのＲＮＡのヌクレオチドの糖の化学的な修飾であり、特に限定はされないが、概して、下記群から選択される糖修飾を含んでいる。すなわち、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−ジアミンオリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン−５’−三リン酸、２’−メチルウリジン−５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴヌクレオチド、およびそれらの異性体（２’−アラシチジン−５’−三リン酸、２’−アラウリジン−５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸  （２’−アジド−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン−５’−三リン酸）からなる群より選択される糖修飾を含んでいる。
【００５６】
また、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、付加的または代替的に、少なくとも１つの塩基修飾を含んでいてもよく、塩基修飾は、変更されていない（すなわち天然の（＝野生型））ＲＮＡ配列と比較して、少なくとも１つのＲＮＡ配列によってコードされているタンパク質の発現を著しく増加させるために好適なものであることが好ましい。この場合「著しく」とは、天然のＲＮＡ配列の発現と比べて、タンパク質発現における増加率が、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％または６０％、より好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％または１００％、最も好ましくは少なくとも１５０％、２００％、３００％またはそれ以上であること意味する。本発明に関して、このような塩基修飾を持つヌクレオチドは、下記からなる、塩基修飾ヌクレオチドの群から選択されることが好ましい。すなわち、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、２−アミノアデノシン−５’−三リン酸、２−チオシチジン−５’−三リン酸、２−チオウリジン−５’−三リン酸、４−チオウリジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン−５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リン酸、５−ブロモウリジン−５’−三リン酸、５−ヨードシチジン−５’−三リン酸、５−ヨードウリジン−５’−三リン酸、５−メチルシチジン−５’−三リン酸、５−メチルウリジン−５’−三リン酸、６−アザシチジン−５’−三リン酸、６−アザウリジン−５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド−５’−三リン酸、７−デアザアデノシン−５’−三リン酸、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、８−アザアデノシン−５’−三リン酸、８−アジドアデノシン−５’−三リン酸、ベンズイミダゾール−リボシド−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン−５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン−５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン−５’−三リン酸、シュードウリジン−５’−三リン酸、ピューロマイシン−５’−三リン酸またはキサントシン−５’−三リン酸からなる群から選択されることが好ましい。特に、５−メチルシチジン−５’−三リン、７−デアザグアノシン−５’−三リン酸、５−ブロモシチジン−５’−三リンおよびシュードウリジン−５’−三リン酸からなる塩基修飾ヌクレオチドの群から選択される塩基修飾のためのヌクレオチドが好ましい。
【００５７】
別の実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、同様に、自身のリボースまたは塩基構成成分の修飾を含んでいるさらに修飾されたヌクレオチドを導入することによって、修飾（および好ましくは安定化）することができる。一般に、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、任意の野生型（自然発生）ヌクレオチド、例えばグアノシン、ウラシル、アデノシンおよび／またはシトシンを含んでいてもよく、それらの類似体を含んでいてもよい。この関係において、ヌクレオチド類似体とは、自然発生のヌクレオチドのうち、非自然発生の変異体として定義される。したがって、類似体とは、非天然に発生した官能基を有する化学的に誘導体化されたヌクレオチドであり、該ヌクレオチドは自然発生のヌクレオチドに対して付加されているか、欠失しているか、またはヌクレオチドの自然発生の官能基と置換していることが好ましい。したがって、自然に発生したヌクレオチドを構成する成分はそれぞれ修飾されていてもよい。言い換えれば、塩基成分、糖（リボース）成分および／またはＲＮＡ配列の骨格（上記参照）を形成するリン酸成分がそれぞれ修飾されていてもよい。グアノシン、ウラシル、アデノシンおよびシトシンの類似体は特に限定されず、例えばアセチル化、メチル化、ヒドロキシル化などによって化学的に変更された、任意の自然発生または非自然発生である、グアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジンまたはシトシンを含んでいる。例えば、１−メチル−アデノシ、１−メチル−グアノシン、１−メチル−イノシン、２，２−ジメチル−グアノシン、２，６−ジアミノプリン、２’−アミノ−２’−デオキシアデノシン、２’−アミノ−２’−デオキシシチジン、２’−アミノ−２’−デオキシグアノシン、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド、２−アミノプリン−リボシド、２’−アラアデノシン、２’−アラシチジン、２’−アラウリジン、２’−アジド−２’−デオキシアデノシン、２’−アジド−２’−デオキシシチジン、２’−アジド−２’−デオキシグアノシン、２’−アジド−２’−デオキシウリジン、２−クロロアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシアデノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン、２’−フルオロ−２’−デオキシグアノシン、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン、２’−フルオロチミジン、２−メチル−アデノシン、２−メチル−グアノシン、２−メチル−チオ−Ｎ６−イソペネニル−アデノシン、２’−Ｏ−メチル−２−アミノアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシシチジン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｏ−メチル−２’−デオキシウリジン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルイノシン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、２−チオシチジン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、４−チオウリジン、５−（カルボキシルヒドロキシメチル）−ウラシル、５，６−ジヒドロウリジン、５−アミノアリルシチジン、５−アミノアリル−デオキシ−ウリジン、５−ブロモウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアモノメチル−ウラシル、５−クロロ−アラ−シトシン、５−フルオロ−ウリジン、５−ヨードウリジン、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシ−ウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン、６−アザシチジン、６−アザウリジン、６−クロロ−７−デアザ−グアノシン、６−クロロプリンリボシド、６−メルカプト−グアノシン、６−メチル−メルカプトプリン−リボシド、７−デアザ−２’−デオキシ−グアノシン、７−デアザアデノシン、７−メチル−グアノシン、８−アザアデノシン、８−ブロモ−アデノシン、８−ブロモ−グアノシン、８−メルカプト−グアノシン、８−オキソグアノシン、ベンズイミダゾール−リボシド、ベータ−Ｄ−マンノシル−キューオシン、ジヒドロ−ウラシル、イノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ６−（［６−アミノヘキシル］カルバモイルメチル）−アデノシン、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン、Ｎ６−メチル−アデノシン、Ｎ７−メチル−キサントシン、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ピューロマイシン、キューオシン、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ワイブトキソシン、キサントシンおよびキシロ−アデノシンである。このような類似体を調製することは、例えば米国特許第４，３７３，０７１号，第４，４０１，７９６号，第４，４１５，７３２号，第４，４５８，０６６号，第４，５００，７０７号，第４，６６８，７７７号，第４，９７３，６７９号，第５，０４７，５２４号，第５，１３２，４１８号，第５，１５３，３１９号，第５，２６２，５３０号および第５，７００，６４２号に記載されているように、当業者に周知である。上述した類似体の中で、本発明において特に好ましいのは、活性（免疫賦活）組成物のＲＮＡの免疫原性を増加させる類似体、および／または導入されたＲＮＡがさらに修飾されることを妨害しない類自体である。
【００５８】
ある実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、脂質修飾を含むことができる。このような脂質修飾されたＲＮＡは、主として、本明細書において定義されるＲＮＡを含み、上記抗原の群、好ましくは上記組み合わせの中から選択される、少なくとも２つの抗原をコードする。このような脂質修飾されたＲＮＡは、概して、上記ＲＮＡと共有結合している少なくとも１つのリンカー、および上記リンカーにそれぞれ共有結合している少なくとも１つの脂質をさらに含んでいる。別の実施形態では、上記脂質修飾ＲＮＡは、本明細書において定義される（少なくとも１つの）ＲＮＡ、および該ＲＮＡと（リンカーを用いずに）共有結合している少なくとも１つの（二官能）脂質を含んでいる。さらに別の実施形態では、脂質修飾ＲＮＡは、本明細書において定義されるＲＮＡ、該ＲＮＡと共有結合している少なくとも１つのリンカー、該リンカーとそれぞれ共有結合している少なくとも１つの脂質、および該ＲＮＡと（リンカーを用いずに）共有結合している少なくとも１つの（二官能）脂質を含んでいる。
【００５９】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡに含まれる脂質（複合または共有結合している）は、概して、それ自身が生物活性を有している脂質または脂溶性残留物であることが好ましい。この脂質は、例えばビタミンなどの天然物質または天然化合物を含んでいることが好ましい。ビタミンとしては、例えば、ＲＲＲ−アルファ−トコフェロール（前身はＤ−アルファ−トコフェロール）、Ｌ−アルファ−トコフェロール、ラセミ化合物Ｄ、Ｌ−アルファ−トコフェロール、ビタミンＥ琥珀酸エステル（ＶＥＳ）などのアルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）、例えばレチノイン酸、レチノールなどのビタミンＡおよびその派生物、例えばビタミンＤおよびビタミンＤのエルゴステロール前駆体などのビタミンＤおよびその派生物、ビタミンＥおよびその派生物、例えばビタミンＫおよび関連するキノン化合物もしくはフィトール化合物などのビタミンＫおよびその派生物、または、例えば胆汁酸、例えばコール酸、デオキシコール酸、デヒドロコール酸、コルチゾン、ジゴキシゲニン、テストステロン、コレステロールもしくはチオコレステロールなどのステロイドを含む。さらに、本発明の範疇に含まれる脂質または脂溶性残留物は、特に限定はされないが、ポリアルキレングリコール（Oberhauserら,Nucl.Acids Res.,1992,20,533)、脂肪族基(例えばＣ１−Ｃ２０−アルカン、Ｃ１−Ｃ２０−アルカンまたはＣ１−Ｃ２０−アルカノール化合物など（例えばドデカンジオール、ヘキサデカノールもしくはウンデシル残留物（Saison-Behmoarasら,EMBO J,1991,10,111;Kabanovら,FEBS Lett.,1990,259,327;Svinarchukら,Biochimie,1993,75,49）、リン脂質（例えばホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジ−ヘキサデシル−ラセミ−グリセロール、スフィンゴリピド、セレブロシド、ガングリオシドまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ラセミ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩（Manoharanら,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651;Sheaら,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777）、ポリアミンもしくはポリアルキレングリコール（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Manoharanら,Nucleosides & Nucleotides,1995,14,969）、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）、パルミチンもしくはパルミチル残留物（Mishraら,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)、オクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール残留物（Crookeetら,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923）、ろう、テルペン、脂環式炭化水素、飽和脂肪酸残留物、およびモノ不飽和脂肪酸残留物もしくはポリ不飽和脂肪酸残留物などが含まれる。
【００６０】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、同様に、様々な方法によって、インビボにおけるＲＮＡ分解を防ぐために、安定化されてもよい。一般的に、当該分野において、インビボにおけるｍＲＮＡまたはＲＮＡの不安定度および（速い）分解は、ＲＮＡを基にした組成物を適用するにあたり、深刻な問題となることが知られている。このＲＮＡの不安性は、ＲＮＡ分解酵素である「ＲＮａｓｅｓ（リボヌクレアーゼ）」によるところが大きく、このようなリボヌクレアーゼによるコンタミネーションによって、溶液中においてＲＮＡが完全に分解してしまうことがある。したがって、細胞の細胞質内におけるｍＲＮＡの自然分解は細かく調節されており、ＲＮａｓｅのコンタミネーションは通常、上記組成物を使用する前に特別な処理、特にピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）を用いた処理により除去され得る。多くの自然分解機構がこれに関連する従来技術において周知であり、同様に利用することができる。例えば、末端構造は、概して、インビボにおけるｍＲＮＡにとって極めて重要である。一例として、自然発生のｍＲＮＡの５’末端には、通常いわゆる「キャップ構造（修飾グアノシンヌクレオチド）」があり、３’末端には、一般的に、最大２００個のアデノシンヌクレオチド（いわゆるポリＡ尾部）の配列がある。
【００６１】
それゆえ、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、特にｍＲＮＡとして提供される場合、いわゆる「５’キャップ」構造を付加することによって、ＲＮａｓｅｓによる分解に対して、安定化することができる。この関係において、「５’キャップ構造」として特に好ましいのは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡまたはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）構造である。しかしながら、このような修飾が導入されるのは、修飾、例えば脂質修飾が、本発明の免疫促進性組成物の（ｍ）ＲＮＡの５’末端に導入されていない場合、または修飾が（非修飾または化学的に修飾された）（ｍ）ＲＮＡの免疫特性を妨害しない場合に限られる。
【００６２】
さらに好ましい実施形態によると、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、特に該ＲＮＡがｍＲＮＡであるとき、３’末端上にポリＡ尾部を含み、その長さは約１０〜２００アデノシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００アデノシンヌクレオチド、より好ましくは約２０〜１００アデノシンヌクレオチド、さらに好ましくは約４０〜８０アデノシンヌクレオチドであってもよい。
【００６３】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、特に該ＲＮＡがｍＲＮＡであるとき、３’末端上にポリＣ尾部を含み、その長さは主に約１０〜２００シトシンヌクレオチド、好ましくは約１０〜１００シトシンヌクレオチド、より好ましくは約２０〜７０シトシンヌクレオチド、さらに好ましくは約２０〜６０または１０〜４０シトシンヌクレオチドであってもよい。
【００６４】
別の実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つのＲＮＡは修飾されてもよく、特に該ＲＮＡがｍＲＮＡであるとき、ＲＮＡのＧ／Ｃ含有量、好ましくは少なくとも１つのＲＮＡのコード領域におけるＧ／Ｃ含有量を修飾することによって安定化されてもよい。
【００６５】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、その特定の野生型（ｍ）ＲＮＡ（すなわち非修飾（ｍ）ＲＮＡ）のコード領域のＧ／Ｃ含有量と比較して、とりわけ増加して修飾されている。少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの、コードされたアミノ酸配列は、特定の野生型（ｍ）ＲＮＡのコードされたアミノ酸配列と比較して、修飾されていないことが好ましい。
【００６６】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの修飾は、翻訳される任意の（ｍ）ＲＮＡ領域の配列が、（ｍ）ＲＮＡを効率よく翻訳するために重要であるという調査に基づく。このように、様々なヌクレオチドの構成および配列が重要である。特に、Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）の含有量が増加した配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）の含有量が増加した配列よりも安定している。そのため、本発明によれば、（ｍ）ＲＮＡのコドンは、翻訳されたアミノ酸配列を保持しながら、その野生型（ｍ）ＲＮＡと比較して変化しており、コドンのＧ／Ｃヌクレオチドは増加している。いくつかのコドンが単一および同一のアミノ酸をコードする（いわゆる遺伝子コードの縮重）という調査に基づき、最も安定性に優れたコドンを決定することができる（いわゆる代替コドンの使用）。
【００６７】
少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡによってコードされるアミノ酸に応じて、その野生型配列と比較した、（ｍ）ＲＮＡの修飾は種々可能である。ＧヌクレオチドまたはＣヌクレオチドのみを含むコドンによってコードされるアミノ酸の場合、コドンの修飾は必要ない。それゆえ、Ｐｒｏ（ＣＣＣまたはＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣまたはＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣまたはＧＣＧ）およびＧｌｙ（ＧＧＣまたはＧＧＧ）といったコドンは、ＡまたはＵが存在しないため、修飾を必要としない。
【００６８】
逆に、Ａヌクレオチドおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンは、同じアミノ酸をコードするがＡヌクレオチドおよび／またはＵヌクレオチドを含まない、他のコドンとの置換によって修飾することができる。以下に例を示す：  Ｐｒｏをコードするコドンは、ＣＣＵまたはＣＣＡから、ＣＣＣまたはＣＣＧに修飾され得；
Ａｒｇをコードするコドンは、ＣＧＵ、ＣＧＡ、ＡＧＡまたはＡＧＧから、ＣＧＣまたはＣＧＧに修飾され得；
Ａｌａをコードするコドンは、ＧＣＵまたはＧＣＡから、ＧＣＣまたはＧＣＧに修飾され；
Ｇｌｙをコードするコドンは、ＧＧＵまたはＧＧＡから、ＧＧＣまたはＧＧＧに修飾され得る。
【００６９】
別の場合、ＡヌクレオチドまたはＵヌクレオチドをコドンから除去することはできないが、Ａヌクレオチドおよび／またはＵヌクレオチドの含有量が少ないコドンを使用して、ＡヌクレオチドおよびＵヌクレオチドの含有量を減少させることができる。以下に例を示す：
Ｐｈｅをコードするコドンは、ＵＵＵからＵＵＣに修飾され得；
Ｌｅｕをコードするコドンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵまたはＣＵＡから、ＣＵＣまたはＣＵＧに修飾され得；
Ｓｅｒをコードするコドンは、ＵＣＵ、ＵＣＡまたはＡＧＵから、ＵＣＣ、ＵＣＧまたはＡＧＣに修飾され得；
Ｔｙｒをコードするコドンは、ＵＡＵからＵＡＣに修飾され得；
Ｃｙｓをコードするコドンは、ＵＧＵからＵＧＣに修飾され得；
Ｈｉｓをコードするコドンは、ＣＡＵからＣＡＣに修飾され得；
Ｇｌｎをコードするコドンは、ＣＡＡからＣＡＧに修飾され得；
Ｉｌｅをコードするコドンは、ＡＵＵまたはＡＵＡから、ＡＵＣに修飾され得；
Ｔｈｒをコードするコドンは、ＡＣＵまたはＡＣＡから、ＡＣＣまたはＡＣＧに修飾され得；
Ａｓｎをコードするコドンは、ＡＡＵからＡＡＣに修飾され得；
Ｌｙｓをコードするコドンは、ＡＡＡからＡＡＧに修飾され得；
Ｖａｌをコードするコドンは、ＧＵＵまたはＧＵＡから、ＧＵＣまたはＧＵＧに修飾され得；
Ａｓｐをコードするコドンは、ＧＡＵからＧＡＣに修飾され得；
Ｇｌｕをコードするコドンは、ＧＡＡからＧＡＧに修飾され得；
終止コドンＵＡＡは、ＵＡＧまたはＵＧＡに修飾され得る。
【００７０】
一方、Ｍｅｔ（ＡＵＧ）およびＴｒｐ（ＵＧＧ）のコドンの場合、配列修飾はあり得ない。
【００７１】
列挙した置換は、単独で使用することが可能であり、本発明の活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのＧ／Ｃ含有量を、その特定の野生型（ｍ）ＲＮＡ（すなわち元の配列）と比べて、増加させる任意の組み合わせにおいて使用することも可能である。このように、例えば、野生型配列において発生するすべてのＴｈｒのコドンは、ＡＣＣ（またはＡＣＧ）に修飾することができる。しかしながら、例えば、上記置換の起こり得る組み合わせにて使用することが好ましい。以下に例を示す。
【００７２】
元の配列（野生型（ｍ）ＲＮＡ）においてＴｈｒをコードするすべてのコドンを、ＡＣＣ（またはＡＣＧ）へと置換し、
元はＳｅｒをコードするすべてのコドンを、ＵＣＣ（またはＵＣＧまたはＡＧＣ）へと置換する；
元の配列においてＩｌｅをコードするすべてのコドンを、ＡＵＣへと置換し、
元はＬｙｓをコードするすべてのコドンを、ＡＡＧへと置換し、
元はＴｙｒをコードするすべてのコドンを、ＵＡＣへと置換する；
元の配列においてＶａｌをコードするすべてのコドンを、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）へと置換し、
元はＧｌｕをコードするすべてのコドンをＧＡＧへと置換し、
元はＡｌａをコードするすべてのコドンをＧＣＣ（またはＧＣＧ）へと置換し、
元はＡｒｇをコードするすべてのコドンをＣＧＣ（またはＣＧＧ）へと置換する；
元の配列においてＶａｌをコードするすべてのコドンを、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）へと置換し、
元はＧｌｕをコードするすべてのコドンを、ＧＡＧへと置換し、
元はＡｌａをコードするすべてのコドンを、ＧＣＣ（またはＧＣＧ）へと置換し、
元はＧｌｙをコードするすべてのコドンを、ＧＧＣ（またはＧＧＧ）へと置換し、
元はＡｓｎをコードするすべてのコドンを、ＡＡＣへと置換する；
元の配列においてＶａｌをコードするすべてのコドンを、ＧＵＣ（またはＧＵＧ）へと置換し、
元はＰｈｅをコードするすべてのコドンを、ＵＵＣへと置換し、
元はＣｙｓをコードするすべてのコドンを、ＵＧＣへと置換し、
元はＬｅｕをコードするすべてのコドンを、ＣＵＧ（またはＣＵＣ）へと置換し、
元はＧｌｎをコードするすべてのコドンを、ＣＡＧへと置換し、
元はＰｒｏをコードするすべてのコドンを、ＣＣＣ（またはＣＣＧ）へと置換する；等が挙げられる。
【００７３】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含有量は、本明細書において定義される抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチド、あるいはそれらの断片または変異体をコードする、野生型（ｍ）ＲＮＡのコードされた領域のＧ／Ｃ含有量と比べて、少なくとも７％増加されることが好ましく、少なくとも１５％増加されることがより好ましく、少なくとも２０％増加されることがさらに好ましい。ある特定の実施形態によれば、本明細書において定義される抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチド、あるいはそれらの断片または変異体をコードする領域における置換可能なコドンを、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９５％または１００％置換し、または野生型（ｍ）ＲＮＡ配列全体を置換して、上記配列のＧ／Ｃ含有量を増加させる。
【００７４】
ここで、野生型配列と比べて、本発明の活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのＧ／Ｃ含有を、最大限（すなわち置換可能なコドンを１００％）増加させることが好ましく、特に、タンパク質をコードする領域において増加させることが好ましい。
【００７５】
本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の上なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのさらに好ましい修飾は、翻訳効率は、細胞におけるｔＲＮＡの出現頻度の違いによっても決定される、という知見に基づいている。そのため、いわゆる「レアコドン」が本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおいて存在する量が増加した場合、対応する修飾された少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡ配列は、比較的「頻繁に」ｔＲＮＡをコードするコドンが存在する場合よりも、顕著に低い割合で翻訳する。
【００７６】
本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の修飾された少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおいて、アジュバントタンパク質をコードする領域は、野生型（ｍ）ＲＮＡの対応領域と比べて修飾されている。その修飾では、細胞において比較的珍しいｔＲＮＡをコードする野生型配列の少なくとも１つのコドンが、細胞において比較的頻出するｔＲＮＡをコードするコドンと交換され、比較的珍しいｔＲＮＡと同一のアミノ酸を有するようになる。この修飾によって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの配列は、頻繁に発生するｔＲＮＡを利用できるコドンが挿入されるように修飾される。言い換えれば、本発明によれば、この修飾によって、細胞において比較的珍しいｔＲＮＡをコードする野生型配列のすべてのコドンを、いかなる場合でも、細胞において比較的頻出するｔＲＮＡをコードするコドンと交換可能であると共に、いかなる場合でも、比較的珍しいｔＲＮＡと同一のアミノ酸を有することが可能である。
【００７７】
この細胞において比較的頻出するｔＲＮＡおよび比較的珍しいｔＲＮＡは、当業者にとって周知である（例えばAkashi,Curr.Opin.Genet.Dev.2001,11(6):660-666参照）。最も頻出するｔＲＮＡを特定のアミノ酸のために使用するコドン、例えば（ヒト）細胞において最も頻出するｔＲＮＡを使用するＧｌｙコドンが特に好ましい。
【００７８】
本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の修飾された少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおいて増加、特に最大化された配列Ｇ／Ｃ含有量を、（ｍ）ＲＮＡのコード領域によってコードされているタンパク質のアミノ酸配列を修飾することなく、「頻出」するコドンと結合させることが特に好ましい。この好ましい実施形態によれば、特に効率よく翻訳および安定化（修飾）された、本発明の活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡを提供することができる。
【００７９】
上述したような（増加されたＧ／Ｃ含有量；ｔＲＮＡ交換）、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの修飾された（ｍ）ＲＮＡは、国際特許公開第ＷＯ０２／０９８４４３号に説明されるコンピュータープログラムを使用して決定できる。国際特許公開第ＷＯ０２／０９８４４３号が開示する内容はすべて、本発明の範囲に含まれる。このコンピュータープログラムを使用することによって、遺伝子コードまたはその縮重性質を活用して、いかなる所望する（ｍ）ＲＮＡのヌクレオチド配列も修飾することができ、その修飾は、細胞において最も高頻度で出現するｔＲＮＡに対応するコドンを使用して、Ｇ／Ｃ含有量を最大限増加させ、好ましくは修飾された少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにコードされるアミノ酸配列は、非修飾配列と比べて修飾されていない、というものである。または、元の配列と比べて、Ｇ／Ｃ含有量のみ、またはコドン処理のみを修飾することも可能である。ビジュアルベーシック６．０（使用開発環境：Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ６．０  ｗｉｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｐａｃｋ３）におけるソースコードもまた、国際特許公開第ＷＯ０２／０９８４４３号に記載されている。
【００８０】
本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含有量は、その特定の野生型（ｍ）ＲＮＡのリボソーム結合部位の環境におけるＡ／Ｕ含有量と比べて、増加している。この修飾（リボソーム結合部位周辺におけるＡ／Ｕ含有増加）は、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにリボソームをより効率良く結合させる。リボソームをリボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号２７）、ＡＵＧは開始コドンを形成する）に効率よく、順に結合させると、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡを効率よく翻訳することができる。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態によると、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、潜在的に不安定な配列要素に対して修飾されていてもよい。特に、上記少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのコード領域および／または５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域は、特定の野生型（ｍ）ＲＮＡと比べて、修飾させられていてもよく、その修飾は、不安定化配列要素をまったく有さないように、また、好ましくはその特定の野生型（ｍ）ＲＮＡと比べて、修飾された少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡのコードされたアミノ酸配列が修飾されていない。例えば、真核細胞ＲＮＡの配列において、不安定化配列要素（ＤＳＥ）が発生し、シグナルタンパク質が結合して、インビボにおけるＲＮＡの酵素分解を調整することは周知である。それゆえ、修飾された少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡをさらに安定化させるために、任意で、本明細書において定義する抗原、抗原タンパク質または抗原ペプチドをコードする領域において、野生型（ｍ）ＲＮＡの対応領域と比べて、このような１つまたはそれ以上の修飾を実行できるので、含有される不安定化配列要素を完全にまたは実質的になくすことができる。本発明によれば、非翻訳領域（３’−および／または５’−ＵＴＲ）において存在するＤＳＥを、このような修飾によって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡから除去することもできる。
【００８２】
このような不安定化配列とは、例えば多数の不安定なＲＮＡの３’−ＵＴＲ部に存在する、ＡＵ−リッチ配列（ＡＵＲＥＳ）である（Caput et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986,83:1670 to 1674）。それゆえ、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、野生型（ｍ）ＲＮＡと比べて、該少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡがこのような不安定化配列を含まないように修飾されていることが好ましい。また、これは、（ｍ）ＲＮＡの配列モチーフにも適用できる。配列モチーフは、潜在的エンドヌクレアーゼによって認識される。例えば、トランスフェリン受容体をコードする遺伝子の３’ＵＴＲ部分に含まれる、配列ＧＡＡＣＡＡＧである（Binderetら,EMBO J.1994,13:1969 to 1980）。これらの配列モチーフも、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡにおいて、除去されることが好ましい。
【００８３】
また、本発明によれば、例えばリボソーム結合を高めるために、または本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ビシストロン性またはマルチシストロン性）ＲＮＡ上に位置する、コードされた異なる抗原の発現を可能にするために、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、修飾形態において、少なくとも１つの上記定義したＩＲＥＳを含んでいることが好ましく、修飾形態において、少なくとも１つの５’および／または３’安定化配列を含んでいることが好ましい。
【００８４】
本発明によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、少なくとも１つの５’安定化配列および／または３’安定化配列を有していることがさらに好ましい。５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域におけるこれらの安定化配列は、細胞質ゾルにおいて少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡの半減期を増加させる効果がある。これらの安定化配列は、ウイルス、バクテリア、および真核生物において発生する自然発生型配列と１００％の相同性を有することも可能であるが、部分的または完全に合成されていてもよい。ＲＮＡを安定化するために、本発明において使用される安定化配列の一例として、例えばヒトまたはアフリカツメガエルから得られるベータグロビン遺伝子の非翻訳配列（ＵＴＲ）を挙げることができる。安定化配列の別の例としては、一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮｘＣＣＣ（Ｕ／Ａ）ＰｙｘＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣ（配列番号２８）を有するものが挙げられる。これはアルファグロビン、アルファ（Ｉ）−コラーゲン、１５−リポキシゲナーゼまたはチロシンヒドロキシラーゼをコードする非常に安定したＲＮＡの３’ＵＴＲに含まれる（Holcik et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,94:2410 to 2414参照）。このような安定化配列はもちろん単独で使用することが可能であるし、それぞれ組み合わせて使用することも可能である。また、当業者に周知である他の安定化配列と組み合わせて使用することもできる。それゆえ、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡは、グロビンＵＴＲ（非翻訳領域）安定ＲＮＡ、特にベータグロビンＵＴＲ安定ＲＮＡとして存在することが好ましい。
【００８５】
それでもなお、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡにおいては、塩基の置換、付加または欠失されていることが好ましく、周知の部位特異的突然変異誘発法またはオリゴヌクレオチド結紮法によって、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡを調製するためのＤＮＡマトリクスを用いて行なうことが好ましい（例えば、Maniatis et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,3rd ed.,Cold Spring Harbor,NY,2001参照）。このようなプロセスにおいては、少なくとも１つの（ｍ）ＲＮＡを調製するために、対応するＤＮＡ分子がインビトロで転写されてもよい。このＤＮＡマトリクスは、インビトロ転写に好適なプロモーター、例えばＴ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを有していることが好ましく、プロモーターは少なくとも１つのＲＮＡが調製されるための所望のヌクレオチド配列、およびインビトロ転写のための終止シグナルの上流に位置する。対称となる少なくとも１つのＲＮＡのマトリクスを形成するＤＮＡ分子は、バクテリアにおいて複製することができるプラスミドの一部として、発酵延命およびそれに続く分離によって調製することができる。本発明において好適なプラスミドとしては、例えばプラスミドｐＴ７Ｔｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ２６４０４；Laiら,Development 1995,121:2349 to 2360）
、ｐＧＥＭ（登録商標）シリーズ、例えばｐＧＥＭ（登録商標）−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３００；ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｍｅｇａ）およびｐＳＰ６４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６５３２７）である（Mezei and Storts,Purification ofPCR Products,in:Griffin and Griffin(ed.),PCR Technology:Current Innovation,CRC Press,Boca Raton,FL,2001.参照）。
【００８６】
本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡをカチオン複合体、特にポリカチオン複合体（例えば（ポリ）カチオンペプチドまたはタンパク質）と結びつける、複合させる、または結合させることによって、少なくとも１つのＲＮＡを同様に安定化させることができる。ＲＮＡに結合するポリカチオン核酸結合タンパク質としてプロタミン、ヌクレオリン、スペルミンまたはスペルミジンを使用すると、特に効果的である。さらに、ポリ−Ｌ−リジンまたはヒストンなど、他のカチオンペプチドまたはタンパク質も同様に使用できる。このＲＮＡ安定化手順は欧州特許第１０８３２３２号明細書に開示されており、開示内容は参考として本発明に援用される。さらに好ましい、本発明の活性（免疫賦活）組成物のＲＮＡを安定化させるために使用可能なカチオン成分として、カチオン性多糖類（例えばキトサン、ポリブレン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）など）が挙げられる。本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡと、カチオン複合物（例えばカチオンタンパク質）またはカチオン脂質（例えば脂質ベース錯化剤としてオリゴフェクタミン）とを結合または合成した活性組成物薬品として、治療すべき細胞または生体に導入される少なくとも１つのＲＮＡを増加させることが好ましい。合成による、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡのための安定化効果についても、上記開示内容を参照されたい。また、上記開示内容は、ＲＮＡ安定化についても同様に記載している。
【００８７】
別の特に好ましい実施形態によれば、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡは、付加的にまたは代替的に、分泌シグナルペプチドをコードしていてもよい。このようなペプチドが示す長さは概して１５〜３０個のアミノ酸であり、特に限定はされないが、コードされたペプチドのＮ末端に位置する配列であることが好ましい。本明細書において定義されるシグナルペプチドは、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされる抗原、抗原タンパク質、または抗原ペプチドを、特定細胞内コンパートメントの中へ、好ましくは細胞表面、小胞体（ＥＲ）、またはエンドソーム−リソソームコンパートメント内へと運ぶことができる。特に限定されないが、本明細書において定義される分泌シグナルペプチド配列の例として、従来のＭＨＣ分子のシグナル配列もしくは従来にないＭＨＣ分子のシグナル配列（例えばＭＨＣＩおよびＩＩ分子のシグナル配列、例えばＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のシグナル配列）、上述のサイトカインもしくは免疫グロブリンのシグナル配列、上述の免疫グロブリンもしくは抗体の不変鎖シグナル配列、Ｌａｍｐ１、Ｅｒｐ５７、カルレチクリン、カルネキシンおよび膜結合タンパク質のシグナル配列、または小胞体（ＥＲ）もしくはエンドソーム−リソソームコンパートメントと結合したタンパク質のシグナル配列が挙げられる。本発明によれば、ＭＨＣクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のシグナル配列を使用することが特に好ましい。
【００８８】
上述した修飾はいずれも、本発明の活性（免疫賦活）組成物の上記少なくとも１つのＲＮＡに適用することができ、さらに本発明との関連において使用される場合、任意の（ｍ）ＲＮＡにも適用することができ、また、好適または必要であるならば、少なくとも１つのＲＮＡそれぞれにおいて組み合わせた修飾が干渉し合わないのであれば、上述した修飾をどのように組み合わせて使用してもよい。当業者は、適宜選択することができるであろう。
【００８９】
別の実施形態によれば、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、免疫賦活剤（アジュバント）を含んでいてもよい。ここで、アジュバントは、本発明の活性（免疫賦活）組成物の管理、および投与を補助することに好適である化合物と理解されたい。さらに、このようなアジュバントは、結合することなく、先天性免疫システムの免疫応答、すなわち非特異的免疫応答を引き起こすか、または増加させてもよい。言い換えれば、投与時において、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、主として、発明の活性（免疫賦活）組成物に含まれる少なくとも１つのＲＮＡによってコードされる少なくとも２つの抗原によって、適応免疫応答を引き起こす。さらに、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、上述のアジュバントを、本発明の活性（免疫賦活）組成物に対して付加することによって、（支持的）先天性免疫応答を引き起こしてもよい。このようなアジュバントは当業者にとって周知であり、本発明において好適である、すなわち哺乳動物において免疫システムを引き起こすことをサポートする、いかなるアジュバントから選択されてもよい。アジュバントは、特に限定はされないが、以下からなる群から選択されることが好ましい。すなわち、ＴＤＭ、ＭＤＰ、ムラミールジペプチド、プルロニック、カリ明礬溶液、水酸化アルミニウム、ＡＤＪＵＭＥＲ（登録商標）（ポリホスファゼン）；リン酸アルミニウムゲル；藻グルカン；アルガムリン；水酸化アルミニウムゲル；高タンパク質吸収水酸化アルミニウムゲル；低粘性水酸化アルミニウムゲル；ＡＦまたはＳＰＴ（スクアランのエマルジョン（５％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．２％）、プルロニックＬ１２１（１．２５％）、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）；ＡＶＲＩＤＩＮＥ（登録商標）（プロパンジアミン）；ＢＡＹ  Ｒ１００５（登録商標）（（Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−ｂ−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシル−ドデカノイル−アミドハイドロアセテート）；ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬ（登録商標）（１−アルファ，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３）；リン酸カルシウムゲル；ＣＡＰＴＭ（リン酸カルシウムナノ粒子）；コレラホロトキシン、コレラトキシン−Ａ１−タンパク質−Ａ−Ｄ−断片融合タンパク質、コレラトキシンのサブユニットＢ；ＣＲＬ  １００５（ブロック共重合体Ｐ１２０５）；サイトカイン含有リポソーム；ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）；ＤＨＥＡ（デヒドロエピアンドロステロン）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＯＣ／ミョウバン複合体（デオキシコール酸ナトリウム塩）；フロイント完全アジュバント；フロイント不完全アジュバント；ガンマイヌリン；ゲルブアジュバント（下記（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の混合物：（ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミニル−（Ｐ１−４）−Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン（ＧＭＤＰ）、（ｉｉ）ジメチルジオクタデシルアンモニウムクロライド（ＤＤＡ）、（ｉｉｉ）亜鉛−Ｌ−プロリン塩複合体（ＺｎＰｒｏ−８）；ＧＭ−ＣＳＦ）；ＧＭＤＰ（Ｎ−アセチルグルコサミニル−（ｂ１−４）−Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ��アラニル−Ｄ−イソグルタミン）；イミキモド（１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）；ＩｍｍＴｈｅｒ（登録商標）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミタート）；ＤＲＶｓ（脱水／再水和小胞から調製された免疫リポゾーム）；インターフェロン−ガンマ；インターロイキン−１ベータ；インターロイキン−２；インターロイキン−７；インターロイキン−１２；ＩＳＣＯＭＳ（登録商標）；ＩＳＣＯＰＲＥＰ７．０．３．（登録商標）；リポソーム；ＬＯＸＯＲＩＢＩＮＥ（登録商標）（７−アリル−８−オキソグアノシン）；ＬＴオーラルアジュバント（大腸菌不安定エンテロトキシン−プロトキシン）；組成物のミクロスフェアおよび微小粒子；ＭＦ５９（登録商標）；（スクアレン−水エマルジョン）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ５１（登録商標）（精製フロイント不完全アジュバント）；ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ７２０（登録商標）（代謝可能油脂アジュバント）；（登録商標）（３−Ｑ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ）；ＭＴＰ−ＰＥおよびＭＴＰ−ＰＥリポソーム（（Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ））−エチルアミド、モノナトリウム塩）；ＭＵＲＡＭＥＴＩＤＥ（登録商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＯＣＨ３）；ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（登録商標）およびＤ−ＭＵＲＡＰＡＬＭＩＴＩＮＥ（登録商標）（Ｎａｃ−Ｍｕｒ−Ｌ−Ｔｈｒ−Ｄ−ｉｓｏＧＩｎ−ｓｎ−グリセロールジパルミトイル）；ＮＡＧＯ（ノイラミニダーゼ−ガラクトース酸化酵素）；組成物のナノスフェアまたはナノ粒子；ＮＩＳＶｓ（非イオン界面活性剤小胞）；ＰＬＥＵＲＡＮ（登録商標）（β−グルカン）；ＰＬＧＡ，ＰＧＡおよびＰＬＡ（乳酸およびグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマー；ミクロスフェア／ナノスフェア）；ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ１２１（登録商標）；ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリル樹脂）；ＰＯＤＤＳ（登録商標）（プロテイノイドミクロスフェア）；ポリエチレンカルバメート派生物；ポリ−ｒＡ：ポリ−ｒＵ（ポリアデニル酸−ポリウリジル酸複合体）；ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）；タンパク質シチリエート（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ
Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）；ＳＴＩＭＵＬＯＮ（登録商標）（ＱＳ−２１）；Ｑｕｉｌ−Ａ（Ｑｕｉｌ−Ａサポニン）；Ｓ−２８４６３（４−アミノ−ｏｔｅｃ−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール）；ＳＡＦ−１（登録商標）（シンテックスアジュバント形成）；センダイプロテオリポソームおよびセンダイ含有脂質マトリックス；Ｓｐａｎ−８５（ソルビタントリオレエート）；Ｓｐｅｃｏｌ（Ｍａｒｃｏｌ５２、Ｓｐａｎ８５およびＴｗｅｅｎ８５のエマルジョン）；スクアレンまたはＲｏｂａｎｅ（商標登録）（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサンおよび２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサン）；ステアリルチロシン（オクタデシルチロシン塩酸塩）；Ｔｈｅｒａｍｉｄ（商標登録）（Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド）；トレオニル−ＭＤＰ（Ｔｅｒｍｕｒｔｉｄｅ（登録商標）または［ｔｈｒ１］−ＭＤＰ；Ｎ−アセチルムラニル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン）；Ｔｙ粒子（Ｔｙ−ＶＬＰｓまたはウイルス様粒子）；Ｗａｌｔｅｒ−Ｒｅｅｄリポソーム（水酸化アルミニウムに吸着したリポソーム含有脂質Ａ）、およびリポペプチド、（Ｐａｍ３Ｃｙｓを含む、特にアルミニウム塩、例えばＡｄｊｕ−ｐｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ；ＣＦＡ、ＳＡＦ、ＩＦＡ、ＭＦ５９、Ｐｒｏｖａｘ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎを含むエマルジョン；Ｏｐｔｉｖａｘ（ＣＲＬ１００５），Ｌ１２１，Ｐｏｌｏａｘｍｅｒ４０１０）などを含む共重合体；ステルス、ＢＩＯＲＡＬを含むコチリエート、を含むリポソーム；ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｉｓｃｏｍａｔｒｉｘ、ＩＳＣＯＭを含む植物由来アジュバント；複刺激に好適な、トマチン、（ＰＬＧ、ＰＭＭ、イヌリンを含む）バイオポリマーを含むアジュバント；アジュバント由来微生物（以下を含む：Ｒｏｍｕｒｔｉｄｅ、ＤＥＴＯＸ、ＭＰＬ、ＣＷＳ、マンノース、ＣｐＧ核酸配列、ＣｐＧ７９０９、ヒトＴＬＲ  １−１０リガンド、マウスＴＬＲ  １−１３リガンド、ＩＳＳ−１０１８、ＩＣ３１、イミダゾキノリン、Ａｍｐｌｉｇｅｎ、Ｒｉｂｉ５２９、ＩＭＯｘｉｎｅ、ＩＲＩＶｓ、ＶＬＰｓ、コレラトキシン、易熱性トキシン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、フラジェリン、ＧＰＩアンカー、ＬＮＦＰＩＩＩ／Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、抗微生物ペプチド、ＵＣ−１Ｖ１５０、ＲＳＶ融合タンパク質、ｃｄｉＧＭＰ；およびＣＧＲＰ神経ペプチドを含む抑制因子として好適なアジュバント、からなる群より選択される。
【００９０】
好適に使用できるアジュバントは、カチオンまたはポリカチオン化合物から選択してもよく、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡと、カチオンまたはポリカチオン化合物とを、複合することによって調製することが好ましい。活性（免疫賦活）組成物のＲＮＡを、本明細書において定義するカチオンまたはポリカチオン化合物と結合または複合させることによって、アジュバント性質を提供し、また活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡを安定化させる効果を与えることが好ましい。このようなカチオン性もしくはポリカチオン性化合物は、カチオン性もしくはポリカチオン性のペプチドもしくはタンパク質（プロタミン、ヌクレオリン、スペルミンまたはスペルミジンを含む）から選択されるか、または他のカチオン性ペプチドまたはタンパク質から選択されることが特に好ましい。他のカチオン性ペプチドまたはタンパク質は、例えばポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、ポリ−アルギニン、塩基性ポリペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰｓ）（ＨＩＶ結合ペプチド、Ｔａｔ、ＨＩＶ−１  Ｔａｔ（ＨＩＶ）、Ｔａｔ由来ぺプチド、ペネトラチン、ＶＰ２２由来または類似ペプチド、ＨＳＶ  ＶＰ２２（単純ヘルペス）、ＭＡＰ、ＫＡＬＡまたはタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤｓ、ＰｐＴ６２０、高プロリンペプチド、高アルギニンペプチド、高レジンペプチド、ＭＰＧ−ペプチド、Ｐｅｐ−１、Ｌ−オリゴマー、カルシトニンペプチド、アンテナペディア由来ペプチド（特にショウジョウバエアンテナペディア由来））、ｐＡｎｔ、ｐＩｓｌ、ＦＧＦ、ラクトフェリン、トランスポータン、ブホリン−２、Ｂａｃ７１５−２４、ＳｙｎＢ、ＳｙｎＢ（１）、ｐＶＥＣ、ｈＣＴ由来ペプチド、ＳＡＰ、プロタミン、スペルミン、スペルミジン、またはヒストンである。さらに好ましいカチオン性またはポリカチオン性化合物は、カチオン性多糖類（例えばキトサン、ポリブレン、カチオン性ポリマー（例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ））、カチオン性脂質（例えばＤＯＴＭＡ：［１−（２，３−シオレイルオキシ）プロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＭＲＩＥ、ｄｉ−Ｃ１４−アミジン、ＤＯＴＩＭ、ＳＡＩＮＴ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＢＧＴＣ、ＣＴＡＰ、ＤＯＰＣ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＰＥ：ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＤＡＢ、ＤＯＩＣ、ＤＭＥＰＣ、ＤＯＧＳ：ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン、ＤＩＭＲＩ：ジミリスト−オキシプロピルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、ＤＯＴＡＰ：ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、ＤＣ−６−１４：Ｏ，Ｏ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド、ＣＬＩＰ１：ｒａｃ−［（２，３−ジオクタデシルオキシプロピル）（２−ヒドロキシエチル）］−ジメチルアンモニウムクロリド、ＣＬＩＰ６：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシメチルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウム、ＣＬＩＰ９：ｒａｃ−［２（２，３−ジヘキサデシルオキシプロピル−オキシスクニシルオキシ）エチル］−トリメチルアンモニウム、オリゴフェクタミン）、カチオン性またはポリカチオン性ポリマー（例えば修飾ポリアミノ酸（例えばβ−アミノ酸−ポリマー、または逆ポリアミドなど）、修飾ポリエチレン（例えばＰＶＰ（ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジニウムブロミド））など）、修飾アクリレート（例えばｐＤＭＡＥＭＡ（ポリ（ジメチルアミノエチルメチルアクリレート））など）、修飾アミドアミン（例えばｐＡＭＡＭ（ポリ（アミドアミン））など）、修飾ポリベータアミノエステル（ＰＢＡＥ）（例えばジアミン末端修飾１，４ブタンジオルジアクリレート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノールポリマーなど）、デンドリマー（例えばポリプロピルアミンデンドリマーまたはｐＡＭＡＭベースデンドリマーなど）、ポリイミン（例えばＰＥＩ：ポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）など）、ポリアリルアミン、糖骨格ベースポリマー（例えばシクロデキストリンベースポリマー、デキストランベースポリマー、キトサンなど）、シラン骨格ベースポリマー（例えばＰＭＯＸＡ−ＰＤＭＳ共重合体など）、１つまたはそれ以上のカチオン性ブロック（例えば上記したカチオン性ポリマーから選択される）と、１つまたはそれ以上の親水性または疎水性ブロック（例えばポリエチレングリコール）との組み合わせからなるブロック重合体）、などである。
【００９１】
さらに、活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡと合成することによってアジュバントとして使用できるカチオン性またはポリカチオン性タンパク質またはペプチドは、以下の一般式（Ｉ）：
（Ａｒｇ）ｌ；（Ｌｙｓ）ｍ；（Ｈｉｓ）ｎ；（Ｏｒｎ）ｏ；（Ｘａａ）ｘ・・・（Ｉ）
（式中、ｌ＋ｍ＋ｎ＋ｏ＋ｘは８〜１５であり、ｌ、ｍ、ｎまたはｏは互いに独立して、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＯｒｎの総含有量がオリゴペプチドの全アミノ酸の少なくとも５０％を示すように、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５から選択される任意の数であり；Ｘａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＨｉｓまたはＯｒｎを除く、野生型（すなわち自然発生）または非天然アミノ酸から選択される任意のアミノ酸であればよく；ｘはＸａａの総含有量がオリゴペプチドのすべてのアミノ酸の５０％を超えない範囲で、０、１、２、３または４から選択される任意の数であればよい）を有するタンパク質またはペプチドから選択されることが好ましい。ここで、特に好ましいオリゴアルギニンとしては、例えばＡｒｇ７、Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ａｒｇ７、Ｈ３Ｒ９、Ｒ９Ｈ３、Ｈ３Ｒ９Ｈ３、ＹＳＳＲ９ＳＳＹ、（ＲＫＨ）４、Ｙ（ＲＫＨ）２Ｒなどが挙げられる。
【００９２】
さらに、好適なアジュバントは以下の一般式（ＩＩ）：
ＧｌＸｍＧｎ・・・（ＩＩ）
（式中、Ｇはグアノシン、ウラシルあるいはグアノシンまたはウラシルの類似体であり、Ｘはグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシンまたは上記ヌクレオチドの類似体であり；ｌは１から４０までの整数であり、ｌ＝１のとき、Ｇはグアノシンまたはその類似体であり；ｌ＞１のとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％はグアノシンまたはその類似体であり；ｍは整数であり、少なくとも３であり；ｍ＝３のとき、Ｘはウラシルまたはその類似体であり、ｍ＞３のとき、少なくとも３つの連続するウラシルまたはウラシルの類似体があり；ｎは１から４０までの整数であり、ｎ＝１のとき、Ｇはグアノシンまたはその類似体であり、ｎ＞１のとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％はグアノシンまたはその類似体である）を有する核酸から選択されてもよい。
【００９３】
さらに、他の好適なアジュバントとして、以下の一般式（ＩＩＩ）：
ＣｌＸｍＣｎ・・・（ＩＩＩ）
（式中、Ｃはシトシン、ウラシル、またはそれらの類似体であり；Ｘはグアノシン、ウラシル、アデノシン、チミジン、シトシンまたは上記ヌクレオチドの類似体であり；ｌは１から４０までの整数であり、ｌ＝１のとき、Ｃはシトシンまたはその類似体であり、ｌ＞１のとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％はシトシンまたはその類似体であり；ｍは整数であり、少なくとも３であり；ｍ＝３のとき、Ｘはウラシルまたはその類似体であり、ｍ＞３のとき、少なくとも３つの連続するウラシルまたはその類似体があり；ｎは１から４０までの整数であり、ｎ＝１のとき、Ｃはシトシンまたはその類似体であり、ｎ＞１のとき、ヌクレオチドの少なくとも５０％はシトシンまたはその類似体である）を有する核酸から選択されるアジュバントが挙げられる。
【００９４】
好ましい一実施形態によると、本発明は、さらに、本発明の活性（免疫賦活）組成物を含むワクチンを提供してもよい。また、発明のワクチンは、薬学的に使用可能なキャリア、および／またはさらなる補助剤および添加剤を含んでいてもよく、アジュバントを含んでいてもよい。特に好ましい実施形態によれば、発明のワクチンに含まれる活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡにコードされる抗原は、上記群から選択される。
【００９５】
発明のワクチンは、主として、上述した少なくとも２つの抗原をコードし、さらに好ましくは、上記群のいずれかから選択される少なくとも２つの抗原をコードし、最も好ましくは上記示した組み合わせの中から選択される少なくとも２つの抗原をコードする、上述した活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡを、安全かつ効果的な量だけ含んでいる。本明細書において用いられる「安全かつ効果的な量」とは、上記定義したワクチンにおける活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡの量であり、前立腺癌（ＰＣａ）、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患において、活性修飾を著しく誘導するために十分な量を意味している。しかし同時に、「安全かつ効果的な量」は副作用を引き起こさない程度に十分に少ない量、すなわち利点とリスクとの適切な関係を可能にする量を意味する。これらの制限の決定は、適切な医学的判断という範疇に属する。本発明のワクチンに関して、「安全かつ効果的な量」という表現は、好ましくは過剰な、または損傷を与えるような免疫応答を起こさず、同時に、好ましくはこのような免疫応答が測定可能なレベルであるように、適応免疫システムを促進するにあたって好適なＲＮＡ（つまりコードされた２つの抗原）の量を意味している。上記定義したワクチンにおける活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡの、このような「安全かつ効果的な量」は、さらにＲＮＡタイプ（例えばモノシストロン性、ビシストロン性またはマルチシストロン性）によって選択してもよい。なぜならば、ビシストロン性ＲＮＡまたはマルチシストロン性ＲＮＡは、同量のモノシストロン性ＲＮＡを使用した場合と比べて、コードされた抗原を極めて多く発現させ得るからである。発明のワクチンに含まれる、上記定義した活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡの「安全かつ効果的な量」は、さらに、主治医の知識および経験において、治療すべき特定の疾病および治療する患者の年齢および健康状態、疾病状態の程度、治療期間、付随する治療法の性質、使用される特定の薬学的に使用可能なキャリアの性質、および同様な因子に関連して変化する。本発明のワクチンは、薬学的組成物またはワクチンとして、ヒトを対象とする発明、または獣医による医療目的のための発明にしたがって使用することができる。
【００９６】
本発明のワクチンは、主として、薬学的に使用可能なキャリアを含んでいる。ここで使用される「薬学的に使用可能なキャリア」という表現には、発明のワクチンの液体状成分または非液体状成分が含まれることが好ましい。本発明のワクチンが液体状である場合、キャリアは概してピロゲンを含まない水、等張食塩水または（水性）緩衝液（例えばリン酸塩、クエン酸塩などの緩衝液）である。特に本発明のワクチン注入にあたっては、水、好ましくはバッファ、より好ましくは水性バッファを使用してもよく、ナトリウム塩（好ましくは少なくとも５０ｍＭのナトリウム塩）、カルシウム塩（好ましくは少なくとも０．０１ｍＭのカルシウム塩）、および任意でカリウム塩（好ましくは少なくとも３ｍＭのカリウム塩）を含んでいてもよい。好ましい実施形態によれば、ナトリウム塩、カルシウム塩および必要に応じてカリウム塩は、そのハロゲン化物（例えば塩化物、ヨウ化物または臭化物）、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩または硫酸塩などの形態で作製されてもよい。以下に限定はされないが、ナトリウム塩の例としてＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、Ｎａ２ＳＯ４などが挙げられ、任意のカリウム塩の例としてＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ＣＯ３、ＫＨＣＯ３、Ｋ２ＳＯ４などが挙げられ、カルシウム塩の例としてＣａＣｌ２、ＣａＩ２、ＣａＢｒ２、ＣａＣＯ３、ＣａＳＯ４、Ｃａ（ＯＨ）２などが挙げられる。また、上記バッファは、上記カチオンの有機アニオンを含んでいてもよい。さらに好ましい実施形態によると、上記定義した注入目的に適しているバッファは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、および必要に応じて塩化カリウム（ＫＣｌ）のいずれかから選択される塩を含んでいてもよく、塩化物に加えてさらにアニオンが存在していてもよい。ＣａＣｌ２はＫＣｌのような、別の塩と置換が可能である。概して、注入バッファにおける塩は塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が少なくとも５０ｍＭ、塩化カリウム（ＫＣｌ）が少なくとも３ｍＭ、塩化カルシウムが少なくとも０．０１ｍＭの濃度である。注入バッファは特定の参照媒体と比べて、高張、等張または低張であってよい。すなわち、バッファは特定の参照媒体と比べて、より高い、等しい、またはより低い塩含有を有していてもよく、上記塩の上記濃度を使用することが好ましく、この場合、浸透作用またはその他の集中効果によって起こる細胞損傷を避けることができる。参照媒体は、例えば「インビボ」法において発生する液体、例えば血液、リンパ液、細胞質液またはその他の体液、あるいは「インビトロ」法において参照媒体として使用され得る液体、例えば一般的なバッファまたは液体である。このような一般的なバッファまたは液体は、当業者にとって周知である。液体成分としては、乳酸リンゲル液が特に好ましい。
【００９７】
しかしながら、１つまたはそれ以上の適合固形賦形剤または適合液状賦形剤、または希釈剤、または封入材料も同様に使用可能であり、患者へ投与する場合に適している。ここで使用される「適合」とは、発明のワクチンの構成物質が、上記定義した少なくとも２つの抗原をコードする活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡと混合可能であり、その混合によって、通常使用状況において、本発明のワクチンの薬剤的効果を実質的に減少させる相互作用を引き起こさない、ということを意味している。薬学的に使用可能なキャリア、賦形剤および希釈剤は、治療する患者へ投与するにあたって好適となるように、当然、十分な高純度および十分な低毒性を有していなければならない。薬学的に使用可能なキャリア、賦形剤、またはその構成物質として、使用が可能な化合物の例として、例えば、糖（例えばラクトース、グルコースおよびスクロース）、でんぷん（例えばトウモロコシでんぷんおよびジャガイモでんぷん）、セルロースおよびその派生物（例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、セルロースアセテート）、粉末状トラガント、麦芽、ゼラチン、獣脂、固形流動促進剤（例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム）、硫酸カルシウム、植物性油脂（例えばラッカセイ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびカカオ脂）、ポリオール（例えばポリプロピレングリコール、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール）、アルギン酸が挙げられる。
【００９８】
薬学的に使用可能なキャリアは、原則的に本発明のワクチンを投与する方法に応じて選択される。本発明のワクチンは、例えば全身または局所的に投与できる。一般的な全身投与のための経路は、例えば、経皮経路、経口経路、非経口経路（皮下注入、静脈内注入、筋肉内注入、動脈内注入、皮内注入、腹腔内注入および／または鼻内注入経路を含む）である。一般的な局所投与のための経路は、例えば、局所性投与経路であるが、皮内注入、経皮注入、皮下注入または筋肉内注入、または病巣内注入、頭蓋内注入、胚内注入、心臓内注入および舌下注入であってもよい。皮内経路、皮下経路または筋肉内経路によってワクチンを投与することがさらに好ましい。それゆえ、組成物／ワクチンを液体状、または固体状に調剤することが好ましい。投与される発明のワクチンの好適な量は、動物モデルを使用したルーチン実験によって決定することができる。このようなモデルとしては、限定はされないが、ウサギ、ヒツジ、マウス、ネズミ、イヌおよびヒト以外の霊長類モデルが挙げられる。好ましい投薬の形態は、水の滅菌溶液、生理的食塩水またはそれらの混合物である。このような溶液のｐＨの値は、約７．４に調節すべきである。好適な注入キャリアは、ヒドロゲル、放出制御装置または放出遅延装置、ポリ乳酸およびコラーゲンマトリクスである。局所的に投与するために好適に薬学的に使用可能なキャリアとしては、ローション、クリーム、ジェルなどの形態において好適に使用できるものが挙げられる。本発明のワクチンが経口的に投与される場合、錠剤、カプセルなどが好適な投薬の形態である。経口投与に使用することができる投薬型を調製するための薬学的に使用可能なキャリアは、先行技術において周知である。その選択は、２次的考察、すなわち、味、コスト、保存性などによって決められ、それらは本発明の目的にとって不可欠な要素ではなく、当業者が容易に成すことができるものである。
【００９９】
免疫原性をより高めるために、発明のワクチンにさらに１つまたはそれ以上の補助剤を含めることができる。これにより、上記定義した活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡ、および上記定義した発明のワクチンに任意で含まれ得る補助剤の相乗作用が達成されることが好ましい。この点において、様々なタイプの補助剤によって、様々な作用を考慮することができる。例えば、樹状細胞を成熟させることができる化合物（例えばリポ多糖体、ＴＮＦ−アルファまたはＣＤ４０リガンド）は、好適な補助剤の第１クラスを形成する。一般に、補助剤として、「危険信号（ＬＰＳ、ＧＰ９６など）」またはＧＭ−ＣＦＳなどのサイトカインのように免疫システムに影響を及ぼす補助物質を使用することが可能である。ここで、補助物質は、対象となる方法において、本発明の免疫促進性アジュバントによってもたらされる免疫応答を強化および／または影響を与えることができる。補助剤として特に好ましいのは、サイトカイン（例えばモノカイン、リンフォカイン、インターロイキンまたはケモカイン）であり、コードされた少なくとも２つの抗原によって適応免疫応答を引き起こすことに加えて、先天性免疫応答を促進する。例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＮＦ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＮＦ−ガンマ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＴ−ベータまたはＴＮＦ−アルファ、増殖因子（例えばｈＧＨ）である。
【０１００】
本発明のワクチンに含まれ得る、さらなる添加物としては、乳化剤（例えばＴｗｅｅｎ（商標登録））、潤滑剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）、着色剤、味付与剤、製薬キャリア、錠剤形成剤、安定剤、酸化防止剤、防腐剤などが挙げられる。
【０１０１】
本発明のワクチンは、ヒトトール様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０に対して、（リガンドとして）その結合親和性によって免疫促進性を持つことが知られる任意の化合物、またはマウストール様受容体ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＬＲ１１、ＴＬＲ１２またはＴＬＲ１３に対して、（リガンドとして）その結合親和性によって免疫促進性を持つことが知られている任意の化合物をさらに含むことができる。
【０１０２】
ここで、本発明のワクチンに付加できる化合物の別のクラスは、ＣｐＧ核酸、特にＣｐＧ−ＲＮＡまたはＣｐＧ−ＤＮＡであってよい。ＣｐＧ−ＲＮＡまたはＣｐＧ−ＤＮＡは、１本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＤＮＡ）、２本鎖ＣｐＧ−ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）または２本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｄｓ
ＣｐＧ−ＲＮＡ）であってもよい。ＣｐＧ核酸はＣｐＧ−ＲＮＡという形態であることが好ましく、１本鎖ＣｐＧ−ＲＮＡ（ｓｓ  ＣｐＧ−ＲＮＡ）とう形態であることがさらに好ましい。ＣｐＧ核酸は、少なくとも１つまたはそれ以上の（マイトジェン）シトシン／グアニンジヌクレオチド配列（ＣｐＧモチーフ）を含んでいることが好ましい。別の好ましい第１の形態によれば、これらの配列に含まれる少なくとも１つのＣｐＧモチーフ、すなわちＣｐＧモチーフのＣ（サイトカイン）およびＧ（グアニン）は非メチル化されている。これらの配列に任意で含まれる、さらなるシトシンまたはグアニンはすべてメチル化されていてもよく、非メチル化されていてもよい。しかしながら、さらに好ましい別の形態によれば、ＣｐＧモチーフのＣ（サイトカイン）およびＧ（グアニン）はメチル化された形態とすることができる。
【０１０３】
本発明のさらに好ましい目的によると、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、（本発明のワクチンを調製する目的において）前立腺癌（ＰＣａ）治療のために、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療のために使用できる。
【０１０４】
本発明のさらに好ましい目的によると、本発明のワクチン、またはここで定義する少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡは、前立腺癌（ＰＣａ）治療、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療のために使用できる。
【０１０５】
ここで、本発明は、必要性のある患者に対して薬剤として効果的な分量の本発明のワクチン、または薬剤として効果的な分量の本発明の活性（免疫賦活）組成物を投与することによる、前立腺癌（ＰＣａ）治療方法、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療方法もまた含んでいる。このような方法は、主として、第１工程（任意）として本発明の活性（免疫賦活）組成物または本発明のワクチンを調製する工程、および第２工程として（薬剤として効果的な分量の）本発明の活性（免疫賦活）組成物または本発明のワクチンを、必要性のある患者に投与する工程とを含んでいる。主として、必要性のある患者としては、哺乳動物のいずれかが選択される。本発明との関連において、哺乳動物とは、限定はされないが、以下からなる群から選択される哺乳動物であることが好ましい。すなわち、例えばヤギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ロバ、サル、類人猿、齧歯動物（例えばマウス、ハムスター、ウサギ）および特にヒトからなる群であり、主として前立腺癌（ＰＣａ）を、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連した疾病または疾患を患っている哺乳動物である。
【０１０６】
また、本発明は、本発明の活性（免疫賦活）組成物または本明細書において定義する少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡの（発明のワクチンを調製する目的における）使用、好ましくは哺乳動物における免疫応答を促進するための使用、好ましくは前立腺癌（ＰＣａ）治療を目的とする使用、さらに好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療を目的とする使用に関する。
【０１０７】
同様に、本発明は、哺乳動物における適応免疫応答を促進することを目的とする、好ましくは前立腺癌（ＰＣａ）治療を目的とする、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療を目的とする、発明のワクチンそれ自体の使用またはここで定義する少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする上記少なくとも１つのＲＮＡの使用に関する。
【０１０８】
前立腺癌（ＰＣａ）の予防または治療、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の予防または治療は、本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチンを１度に、または時間をずらして投与することによって（例えば複数のパーツから構成され、それぞれの構成物は少なくとも１つの（好ましくは異なる）抗原を備えているキットとして）実行されてもよい。投与にあたって、上述したように、いかなる投与経路も使用できることが好ましい。例えば、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡによってコードされる少なくとも２つの（特異的に選択される）抗原に基づいて、適応免疫応答を引き起こすまたは高めることによって、前立腺癌（ＰＣａ）、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患を治療することができる。本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチンの投与は、異なる抗原をコードするＲＮＡの別の組み合わせを有する、上述の本発明の別の活性（免疫賦活）組成物または本発明の別のワクチンを投与する前、同時または後であってもよく、本発明の活性（免疫賦活）組成物の少なくとも１つのＲＮＡにコードされる抗原それぞれが、前立腺癌（ＰＣａ）の治療に好適であることが好ましく、新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療に好適であることがさらに好ましい。ここで、本明細書において定義される治療とは、前立腺癌（ＰＣａ）に関連する疾病を、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患を修飾することも含んでいてもよい。
【０１０９】
さらなる実施形態によると、本発明はさらに、上記定義した哺乳動物における免疫応答を修飾、好ましくは誘導または向上させることを目的とした、より好ましくは前立腺癌（ＰＣａ）、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患を治療および／または治療を補助することを目的とした、（（本発明の）ワクチンを調製する目的における）本発明の活性（免疫賦活）組成物またはここで定義される少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡの使用をさらに含んでいる。ここで、前立腺癌（ＰＣａ）の治療の補助は、手術、放射線治療、ホルモン治療、不定期化学治療、陽子腺治療またはそれらの組み合わせなど、任意の従来の前立腺癌治療法と、上述した本発明の活性（免疫賦活）組成物を使用する治療法との組み合わせであってもよい。また、前立腺癌（ＰＣａ）治療の補助は、上述したいかなる他の実施形態において想定されてもよい。
【０１１０】
本発明の活性（免疫賦活）組成物またはここで定義する少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡ、または本発明のワクチンは、時間差を有する治療法において実行されてもよい。時間差を有する治療は、例えば、従来の前立腺癌（ＰＣａ）治療法、好ましくは新規の補助療法および／もしくはホルモン抵抗性前立腺癌、およびそれに関連する疾病または疾患の治療法よりも前、同時、または後に、本発明の活性（免疫賦活）組成物、または上述した少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡ、または本発明のワクチンを投与してもよい。例えば、本発明の薬剤、活性（免疫賦活）組成物、またはワクチンを前立腺癌（ＰＣａ）、好ましくは新規の補助療法、および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療、または治療に好適な治療薬の投与の前、同時、または後に投与してもよい。このような時間差を持つ治療は、例えばキット、特に下記に定義する複数のパーツからなるキットを使用して実行してもよい。
【０１１１】
時間差を持つ治療は、付加的または代替的に、本発明の活性（免疫賦活）組成物、またはワクチン、好ましくは上記定義した少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡを、以下のように投与することを含んでいてもよい。すなわち、上述した少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡ、好ましくは本発明の活性（免疫賦活）組成物またはワクチンを構成するＲＮＡを、好ましくは同一の活性（免疫賦活）組成物またはワクチンを部分的に構成する、該少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする別の少なくとも１つのＲＮＡよりも前、同時、または後に投与することを含んでいてもよい。投与（すべての少なくとも１つのＲＮＡ）は、１時間以内に行なうことが好ましく、３０分以内に行なうことがより好ましく、１５分、１０分、５分、４分、３分、２分または１分以内に行なうことがさらに好ましい。このような時間差を持つ治療は、例えばキット、好ましくは以下に定義する、複数のパーツからなるキットを使用して実行してもよい。
【０１１２】
最後の実施形態によると、本発明はさらにキット、特に本発明の活性（免疫賦活）組成物、および／または本発明のワクチン、および本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチンの投与および投与量に関する情報を記載した任意の技術指示書を含む、複数のパーツからなるキットを提供する。技術指示書は、本発明の活性（免疫賦活）組成物および／または本発明のワクチンに関する投与および投与量についての情報を含んでいてもよい。このようなキット、好ましくは複数のパーツからなるキットは例えば、上述した適用または使用のいずれにも適用でき、前立腺癌（ＰＣａ）治療、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療を目的とする（発明の薬剤、好ましくはワクチン調製を目的とする）、少なくとも１つの本発明の活性（免疫賦活）組成物の使用に適用することが好ましい。キットは、前立腺癌（ＰＣａ）治療、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌およびそれに関連する疾病または疾患の治療を目的とする（本発明のワクチン調製を目的とする）、少なくとも１つの本発明の活性（免疫賦活）組成物の使用に適用してもよく、コードされた２つの抗原によって、本発明の活性（免疫賦活）組成物および／またはワクチンが、上記定義した哺乳動物における免疫応答を促進または向上させることを可能にしてもよい。このようなキットはさらに、（発明の薬剤、好ましくはワクチン調合を目的として）少なくとも１つの本発明の活性（免疫賦活）組成物の使用に適用することができ、上記定義した哺乳動物における免疫応答を修飾して、好ましくは引き起こして（例えば誘導または向上させ）、好ましくは前立腺癌（ＰＣａ）治療、好ましくは新規の補助療法および／またはホルモン抵抗性前立腺癌、およびそれに関連する疾病または疾患の治療を補助することを目的とする使用に適用することができる。キットの特別な形態として、複数のパーツからなるキットは同一のまたは異なる、本発明の活性（免疫賦活）組成物、および／または１つまたはそれ以上の異なる、本発明のワクチンを、キットの異なるパーツに含んでいてもよい。複数のパーツからなるキットは、また、（例えば１つの）本発明の活性（免疫賦活）組成物、（例えば１つの）本発明のワクチン、および／または上記定義した少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡを、キットの異なるパーツに含んでいてもよい。例えば、キットのパーツそれぞれが（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡを備えていてもよい。さらに、複数のパーツからなるキットにおける上記両方のタイプを組み合わせてもよい。複数のパーツからなるキットは例えば、時間差を有する治療を想定した場合、例えば生体内（インビボ）において同一の治療をしている間に、異なる処方設計を使用している場合、および／または本発明の活性（免疫賦活）組成物、本発明のワクチンおよび／または上記定義した少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡの濃度を上げる場合に使用してもよい。複数のパーツからなるキットは、また、本発明の活性（免疫賦活）組成物の異なる抗原を分離した処方設計にて、または分離した投与にて（すなわち、分割して）使用することが（例えば技術的理由によって）想定または必要とされるときに使用されてもよいが、例えば、インビボにおいて異なる抗原を組み合わせて使用することも可能である。特別な形態を持つキットとして、複数のパーツからなるキットは、特に、キットのそれぞれのパーツが、上記定義した少なくとも１つの（好ましくは異なる）抗原を含んでおり、キットのすべてのパーツが、本明細書において定義する本発明の活性（免疫賦活）組成物または発明のワクチンを形成していることが好ましい。複数のパーツからなる、このような特定のキットは、特に、例えば異なる抗原が別々に、キットの異なるパーツとして処方設計されているが、その後同時に、または時間差を持って、必要とする哺乳動物に投与される場合に好適である。後者の場合、主として、このようなキットの異なるパーツのすべてを、短い制限時間内において投与し、キットの最後のパーツが投与された後、ほぼ同時に哺乳動物内においてすべての抗原が存在するように投与される。上述したいずれのキットも、上記定義した治療法において使用してよい。
【０１１３】
〔発明の効果〕
本発明は前立腺癌（ＰＣａ）治療のための活性（免疫賦活）組成物を提供するものであって、哺乳動物における（適応）免疫応答を誘導することができる少なくとも２つの（好ましくは異なる）抗原をコードする少なくとも１つのＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）を含んでおり、上記抗原はＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）およびＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）からなる群から選択されることを特徴とする、活性（免疫賦活）組成物を提供する。このような活性（免疫賦活）組成物は、前立腺癌（ＰＣａ）に対する効率的な治療を可能にする、または従来の治療法を使用において補助的治療を可能にする。さらに、本発明は治療法のための方法としてＲＮＡを使用することによって、導入されたＤＮＡ配列が制御不能に増殖してしまうという問題を回避する。本発明の活性（免疫賦活）組成物において使用されるＲＮＡは、ＤＮＡ発現システム（例えば免疫応答、免疫付与またはワクチン接種において）において、さらなる顕著な利点を有している。利点として、特に、細胞に導入されたＲＮＡがゲノムに組み込まれない点が挙げられる。これにより、遺伝子が突然変異してしまう危険性を回避する。この突然変異は完全、または部分的な不活性化、または誤った遺伝子情報を引き起こす可能性がある。さらに、本発明の活性（免疫賦活）組成物は、ＤＮＡを抗原として使用して免疫応答を誘導する際に付随する他のリスク（例えばワクチンとして使用した場合）、例えば外来ＤＮＡが導入された患者において病原性抗ＤＮＡ抗体を誘導して、（至死的な場合もある）免疫応答を引き起こすというリスクを回避する。その一方で、抗ＲＮＡ抗体は検出されていない。
【０１１４】
〔図面の簡単な説明〕
以下の図面は本発明をさらに詳しく説明するためのものである。これらは本発明の対象を制限することを意図したものではない。
【０１１５】
図１は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードする、プラスミドコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号１）を示す図である（このコンストラクトは以下の配列要素を含む：
安定化およびより良いコドン処理のためのＧＣ最適配列；
３’−末端に〜７０×アデノシン（ポリ−Ａ−尾部）；
３’−末端に〜３０×シトシンを（ポリ−Ｃ−尾部）；
このＤＮＡコンストラクトはコードｍＲＮＡに対応しており、インビトロ転写実験によって、対応するＲＮＡコンストラクトを調製するためのベースとして供給される）。
【０１１６】
図２は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０に対応する野生型コード配列（配列番号２）、すなわち、ＧＣ最適配列を持たずに、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【０１１７】
図３は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードする、ＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０のＧＣ最適コード配列（配列番号３）、すなわち、ＧＣ最適配列を持ち、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【０１１８】
図４は、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードする、プラスミドコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号４）を示す図である（このコンストラクトは以下の配列要素を含む：安定化およびより良いコドン処理のためのＧＣ最適配列；
３’−末端に〜７０×アデノシン（ポリ−Ａ−尾部）；
３’−末端に３０×シトシン（ポリ−Ｃ−尾部）；
このＤＮＡコンストラクトはコードｍＲＮＡに対応しており、インビトロ転写によって、対応するＲＮＡコンストラクトを生成するためのベースとして供給される）。
【０１１９】
図５は、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードするＲＮＡコンストラクトとなるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０に対応する野生型コード配列（配列番号５）、すなわち、ＧＣ最適配列を持たずに、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【０１２０】
図６は、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０のＧＣ最適コード配列（配列番号６）、すなわち、ＧＣ最適配列を持ち、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【０１２１】
図７は、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするプラスミドコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号７）を示す図である（上記構成は以下の配列要素を含む：
安定化およびより良いコドン処理のためのＧＣ最適配列；
３’−末端に〜７０×アデノシン（ポリ−Ａ−尾部）；
３’−末端に３０×シトシン（ポリ−Ｃ−尾部）；
このＤＮＡコンストラクトはコードｍＲＮＡに対応しており、インビトロ転写によって、対応するＲＮＡ構成を生成するためのベースとして供給される）。
【０１２２】
図８は、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０に対応する野生型コード配列（配列番号８）、すなわち、ＧＣ最適配列を持たずに、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【０１２３】
図９は、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０のＧＣ最適コード配列（配列番号９）、すなわち、ＧＣ最適配列を持ち、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【０１２４】
図１０は、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするプラスミドコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号１０）を示す図である（上記構成は以下の配列要素を含む：
安定化およびより良いコドン処理のためのＧＣ最適配列；
３’−末端に〜７０×アデノシン（ポリ−Ａ−尾部）；
３’−末端に３０×シトシン（ポリ−Ｃ−尾部）；
このＤＮＡ構成はコードｍＲＮＡに対応しており、インビトロ転写によって、対応するＲＮＡ構成を生成するベースとして供給される）。
【０１２５】
図１１は、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０に対応する野生型コード配列（配列番号１１）、すなわち、ＧＣ最適配列を持たずに、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【０１２６】
図１２は、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０のＧＣ最適コード配列（配列番号１２）、すなわち、ＧＣ最適配列を持ち、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【０１２７】
図１３は、抗原特異的抗体を検出することによって検出された抗原特異的免疫応答（Ｂ細胞免疫応答）を示す図である（図１３に示すように、ＲＮＡ−Ｍｉｘ、すなわちＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを含むＰＣａ−ＲＮＡカクテルを投与することにより、バッファまたはコントロール（対称）を含むサンプルと比べて、ＰＳＡに対してＩｇＧ２抗体が著しく形成され、抗原特異的免疫応答（Ｂ細胞免疫応答）が著しく誘導された）。
【０１２８】
図１４は、エリスポットによって検出された抗原特異的細胞免疫応答を示す図である（図１５に示すように、ＲＮＡ−Ｍｉｘ、すなわちＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを含むＰＣａ−ＲＮＡカクテル、またはＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを使用した、マウスに対するワクチン接種によって、天然マウスおよびバッファを使用してワクチン接種されたマウスと比べて、ＩＮＦガンマが著しく形成されて、抗原特異的免疫応答が著しく誘導された）。
【０１２９】
図１５は、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを５μｇ含む、発明のＰＣａ−ＲＮＡカクテルを使用した、免疫付与および腫瘍治療を示す図である（図１５に示すように、（ａ）ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを含むＰＣａ−ＲＮＡカクテルを２回ｉ．ｍ（筋肉内経路）にて使用した免疫付与において、腫瘍容積が著しく減少した。腫瘍容積は、上記（ａ）によるＰＣａ−ＲＮＡカクテルを４回ｉ．ｍ（筋肉内経路）にて投与されたとき、さらに減少している）。
【０１３０】
図１６は、ＰＳＡ特異的ＩｇＧ１抗体の誘導を示す図である。特に、図１６では、ヒト前立腺分化抗原であるＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡを含んでいる、４つの成分からなるｍＲＮＡワクチンを接種したマウスの腫瘍抗原ＰＳＡに特異的なＩｇＧ１抗体の存在を示す。抗体は、それぞれカチオン性ペプチドプロタミンによって調製した。
コントロールのマウスは、バッファ（リンガー乳酸塩）、またはｍＲＮＡワクチンのプロタミン類似体によって調製した無関係のＲＮＡ（Ｐｐ  Ｌｕｃ）のいずれかにより処理した。血清分析のため、グループ毎に５匹のマウスから血清を採取し、滴定した。エラーバーは、平均値から２回の繰り返しの平均偏差を示す。
【０１３１】
図１７は、ＰＳＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体の誘導を示す図である。特に、図１７では、ヒト前立腺分化抗原であるＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含んでいる、４つの成分からなるｍＲＮＡワクチンを接種したマウスの腫瘍抗原ＰＳＡに特異的なＩｇＧ２ａの存在を示す。抗体は、それぞれカチオン性ペプチドプロタミンによって調製した。コントロールのマウスには、バッファ（リンガー乳酸塩）、またはｍＲＮＡワクチンのプロタミン類似体によって調製されたＲＮＡ（Ｐｐ
Ｌｕｃ）どちらかを投与した。それぞれのグループにおける５匹のマウスから採取した血清をため、滴定して、分析を行った。エラーバーは平均からの、２つの複製の平均偏差を示している）。
【０１３２】
図１８は、ＰＳＣＡ特異的ＩｇＧ１抗体の誘導の結果を示す図である。図１８では特に、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む、４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用してワクチン接種されたマウスにおける、腫瘍抗原ＰＳＣＡに対して特異的なＩｇＧ１抗体の存在を示している。それぞれの抗原はカチオン性ぺプチドプロタミンから調製した。コントロールマウスにはバッファ（リンガー乳酸塩）を投与した。それぞれのグループにおける５匹のマウスから採取した血清をため、滴定して、分析を行った。エラーバーは平均からの、２つの複製の平均偏差を示している。
【０１３３】
図１９は、ＰＳＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を示す図である。ここでは、それぞれのグループにおける５匹のマウスに対して、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチン、またはｍＲＮＡワクチンに対するプロタミン類似体から調製された無関連なｍＲＮＡ（Ｐｐ  Ｌｕｃ）を使用して、ワクチン接種を行った。ワクチン接種されたマウスおよびコントロールマウスの脾細胞を、最終ワクチン投与から６日後に分離し、ＰＳＭＡ由来ライブラリーまたはコントロールペプチドライブラリー、どちらかを使用して促進した。ＩＦＮ−γ分泌は、エリスポット技術を使用して、生体外において測定した。ラインは、別々に分析された、それぞれのグループにおける５匹のマウスの平均値および範囲を示している。統計分析はグラフパッドプリズム（GraphPad Prism）を用いて実行し、ｐ値は片側マンホイットニー検定（one-sided Mann-Whitney test）を用いて算出した。
【０１３４】
図２０は、インビボにおけるＰＳＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を示す図である。ここでは、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、皮内経路にてワクチン接種サイクルを３度繰り返し、ワクチン接種を行った。コントロールマウスにはコントロールｍＲＮＡ  Ｐｐ  Ｌｕｃ、またはバッファ（リンガー乳酸塩）を使用してワクチン接種を行った。最終注入から６日後、３０ｘ１０６特異的標識脾細胞（ＰＳＭＡ由来ライブラリーまたはコントロールペプチドライブラリーが負荷され、１：１の割合にて混合された低個体群および高個体群）を静脈内注入した。１６時間後、受容マウスの脾細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは個々のマウスごとに、単一のデータポイントを示している。ラインは平均値および値の範囲を示している。それぞれのグループにおいて５匹のマウスを分析した。統計分析はグラフパッドプリズムを用いて実行し、ｐ値はマンホイットニー検定を用いて算出した）。
【０１３５】
図２１は、最後にワクチンを接種してから１０週間後における、ＰＳＡ特異的記憶細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を示す図である。ここでは、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用して、２ワクチン接種サイクルを２回繰り返し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対してワクチン接種を行った。コントロールマウスにはバッファ（リンガー乳酸塩）を使用した。最終注入から１０週間後、３０×１０６特異的標識脾細胞（ＰＳＡ由来ライブラリーまたはコントロールペプチドライブラリーを負荷され、１：１の割合にて混合された、低個体群および高個体群）を静脈内に移植した。１６時間後、受容マウスの脾細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは単一のデータポイントを示し、ラインは別々に分析したそれぞれのグループにおける６匹のマウスの平均値を示している。統計分析をグラフパッドプリズムを用いて実行し、ｐ値をマンホイットニー検定を用いて算出した）。
【０１３６】
図２２は、最後にワクチンを接種してから１０週間後における、ＰＳＣＡ特異的記憶細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を示す図である。ここでは、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用して、ワクチン接種サイクルを２回繰り返して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにワクチン接種を行った。コントロールマウスにはバッファ（リンガー乳酸塩）を使用した。最終注入から１０週間後、３０×１０６特異的標識脾細胞（ＰＳＣＡ由来ライブラリーまたはコントロールペプチドライブラリーが負荷された、１：１の割合にて混合された、低個体群および高個体群）を静脈内に移植した。１６時間後、受容マウスの脾細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは単一のデータポイントを示し、ラインは別々に分析されたそれぞれのグループにおける６匹のマウスの平均値を示している。統計分析をグラフパッドプリズム用いて実行し、ｐ値をマンホイットニー検定テストを用いて算出した。
【０１３７】
図２３は、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用してワクチン接種されたマウスにおける腫瘍成長の抑制を示す図である。ここでは、ｍＲＮＡワクチンを使用して、ワクチン接種サイクルを２回繰り返し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して静脈内ワクチン接種を行った。コントロールマウスにはバッファを使用した。最終ワクチン接種から１５日後、１×１０６同種ＴＲＡＭＰ−Ｃ１腫瘍細胞を皮下経路にて用いて、マウスに対して試験を行った。腫瘍成長を監視した。グラフは腫瘍導入から５２日後に測定した腫瘍容積の対数を示している。統計分析はグラフパッドプリズムを用いて実行し、ｐ値をマンホイットニー検定を用いて算出した。
【０１３８】
〔実施例〕
以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものである。これらは、本発明の対象を制限することを意図してはいない。
【０１３９】
〔１．コードプラスミドの調製〕
以下の実験では、下記の抗原をそれぞれ末端にコードするｍＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ配列を調整し、インビトロ転写およびトランスフェクション実験に使用した。
・ＰＳＡ（前立腺特異抗原）
・ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）
・ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）および、
・ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）
これにより、野生型抗原をコードするｍＲＮＡ（図２、５、８および１１（すなわち、配列番号２、５、８および１１）に示されるコード配列を含んでなる配列）に対応するＤＮＡ配列を、より良いコドン使用のためにＧＣ最適化し、図３、６、９および１２（配列番号３、６、９および１２）に示されるコード配列からなる配列を得た。その後、ポリ−Ａ−タグおよびポリ−Ｃ−タグ（Ａ７０−Ｃ３０）を用いて修飾したＧＣ最適化コンストラクト（ＣｕｒｅＶａｃ  ＧｍｂＨ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ）に、コード配列を転写した。最終的なコンストラクトは、それぞれ以下のようになった：
ＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号１）、
ＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号４）、
ＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号７）および、
ＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号１０）と称する。
最終的なコンストラクトはそれぞれ、図１、４、７および１０（配列番号１、４、７および１０）に示される配列による配列を含んでおり、以下の配列要素を含む：
安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ最適配列、
３’−末端に〜７０個のアデノシン（ポリ−Ａ−尾部）
３’−末端に３０個のシトシン（ポリ−Ｃ−尾部）
〔２．インビトロ転写〕
実施例１において得られた組換えプラスミドＤＮＡを基に、インビトロ転写によってＲＮＡ配列を調製した。その結果線形化した組換えプラスミドＤＮＡを、続いてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、インビトロ転写した。その後、ＤＮＡテンプレートをＤＮａｓｅ
Ｉ消化によって分解し、ＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿によって再生し、さらにＨＰＬＣ抽出によって洗浄した（ＰＵＲＥＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（商標登録），ＣｕｒｅＶａｃ  ＧｍｂＨ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，ドイツ）。
【０１４０】
〔３．プロタミンとの複合〕
ＲＮＡを細胞および生体に導入するために、インビトロ転写によって得られたＲＮＡを好ましくは複合させ、より好ましくはＲＮＡをプロタミンに混合することで、プロタミンと複合させた。
【０１４１】
〔４．免疫付与実験〕
免疫付与のため、上述したインビトロ転写実験（実施例２参照）によって得られたＲＮＡ、好ましくはプロタミンと複合しているＲＮＡを、マウス（Ｍｉｃｅ：Ｃ５７  ＢＬ／６）に導入した。異なるグループにワクチンを接種し、１つのグループ（コントロールグループ）に属するマウスにはコントロール（対称）として、バッファを注入した。グループごとに４匹のマウスに、プロタミンと複合した２０μｇのｍＲＮＡ（遺伝子ごとに５μｇ）を４回経皮投与して免疫を与えた。ここで、ＲＮＡはＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰをコードしていた。
【０１４２】
〔５．抗原特異的免疫応答の検出（Ｂ細胞免疫応答）〕
抗原特異的抗体を検出することによって、抗原特異的免疫応答（Ｂ細胞免疫応答）を検出した。その結果、ワクチン接種したマウスから、最後にワクチンを投与してから１週間経過した後、血液サンプルを採取し、血清を調製した。ＭａｘｉＳｏｒｂプレート（Nalgene Nunc International）をヒトＰＳＡタンパク質（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を用いてコートした。１×ＰＢＳ含有０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１％ＢＳＡを用いてブロックした後、プレートを希釈したマウス血清（１：３０、１：９０、１：２７０、１：８１０）とともに培養した。その後、ビオチン結合した第２抗体（抗マウスＩｇＧ２ａ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加えた。洗浄後、プレートをセイヨウワサビペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン（Horseradish peroxidase-streptavidi）とともに培養し、その後、ＡＢＴＳ基質（（２，２’−アジノ−ｂｉｓ（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホン酸）の転換を測定した。
【０１４３】
図１３に示すように、ＲＮＡ−Ｍｉｘ、すなわちＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡ（図１、４、７および１０（配列番号１、４、７および１０）それぞれに示される配列）を含むＰＣａ−ＲＮＡカクテルの投与は、コントロールのマウスから得たサンプルと比較してＰＳＡに対するＩｇＧ２ａ抗体の形成が顕著であったため、抗原特異的免疫応答（Ｂ細胞免疫応答）の著しい誘導を示した。
【０１４４】
〔６．エリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）による抗原特異的細胞免疫応答の検出〕
最後にワクチンを接種してから２ヵ月経過したマウスを殺傷し、脾臓を摘出し、脾細胞を分離した。脾細胞を、ＩＬ−４の存在下において７日間培養し、樹状細胞を選択した。抗原特異的細胞免疫応答を検出するために再び刺激した後、ＩＮＦガンマ分泌を測定した。標的細胞として、野生型マウスから採取した脾細胞を使用した。脾細胞はＰＣａ−ｍＲＮＡ−カクテル（Ｍｉｘ）、またはＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡもしくはＳＴＥＡＰをコードするｍＲＮＡ（図１、４、７および１０（配列番号１、４、７および１０）それぞれに示される配列）を用いて電気穿孔した。
【０１４５】
ＩＮＦガンマ検出のために、コートマルチスクリーンプレート（Millipore）を、ＩＮＦγ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ドイツ）に対する抗体を含む０．１Ｍのコートバッファ（Ｃａｒｂｏｎａｔ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔ  Ｂｕｆｆｅｒ
ｐＨ９．６、１０．５９ｇ／ｌＮａ２ＣＯ３、８．４ｇ／ｌＮａＨＣＯ３）と共に、一晩培養した。標的細胞およびエフェクター細胞を１：２０の割合にて、１つのプレートにおいて２４時間一緒に培養した。プレートを１×ＰＢＳを用いて洗浄し、ビオチン結合第２抗体を用いて培養した。１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０によって洗浄した後、基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩／Ｎｉｔｒｏ  Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｒｏｍ  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，ドイツ）をプレートに加えることにより、基質の転換を視覚的に検出できた。
【０１４６】
図１４に示すように、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＳＴＥＡＰをコードするＰＣａ−ｍＲＮＡカクテル（図１、４、７および１０（配列番号１、４、７および１０）にそれぞれ示される配列）をマウスにワクチン接種したところ、野生型マウスおよびバッファを使用してワクチン接種したマウスと比較して、ＩＮＦガンマが著しく形成され、４つの抗原すべてに対して抗原特異免疫応答（ＣＴＬ）が著しく引き起こされた。
【０１４７】
〔７．腫瘍試験〕
（ａ）免疫付与
ｍＲＮＡ（ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを５μｇずつ含むＰＣａ−ＲＮＡカクテル、例えばＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０、ＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０、ＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０およびＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（図１、４、７および１０（すなわち配列番号１、４、７および１０）に示される配列）をそれぞれ構成するｍＲＮＡ）を２０μｇ、筋肉内経路にてマウスに注入した。７週間にわたって、免疫付与を１回または３回繰り返した。最後に免疫付与してから４０日後、ＭｉｏＴｒａｍｐ−Ｃ１腫瘍細胞を皮下経路にてマウスに注入した。５０日間、腫瘍体積を測定した。
【０１４８】
（ｂ）結果
図１５に示すように、腫瘍体積は、（ａ）ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを含むＰｃａ−ＲＮＡカクテルによって、をｉ．ｍ（筋肉内経路）にて２回使用した免疫付与において、著しく減少した。腫瘍体積は、上記（ａ）によるＰＣａ−ＲＮＡ  カクテルを筋肉内経路にて４回投与したとき、さらに著しく減少した。
【０１４９】
〔８．ｍＲＮＡワクチン調製、および抗原特異的細胞傷害性抗体および抗原特異的傷害性Ｔ細胞の誘導〕
（８．１．ｍＲＮＡワクチン調製）
ｍＲＮＡワクチンは、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡ（配列番号３、６、９および１２に示される）からなり、それぞれの抗原は８０％（ｖ／ｖ）リンガー乳酸塩溶液に、カチオン性ペプチドプロタミンを４：１の質量比（ＲＮＡ：プロタミン）にて溶解して調製される。
【０１５０】
（８．２．ワクチン接種）
上記８．１に記載したｍＲＮＡワクチンを６４μｇ（各抗原を１６μｇ）、Ｃ５７ＢＬ／６のマウスに皮内経路にてワクチン接種した。コントロールのマウスにはバッファ（リンガー乳酸塩）、ｍＲＮＡワクチンに対するプロタミン類似体を使用して調整した無関係のＲＮＡ（フォチナスフィラリスルシフェラーゼ（Photinus pyralis luciferase）をコードする、高ＧＣｍＲＮＡ）どちらかを使用した。ワクチン接種は第１週、第３週（および第７週）において、２回または３回の免疫付与サイクルにて行った。それぞれのサイクルにおいて、４回（週の１日目、２日目、３日目および４日目）注入した。
【０１５１】
（８．３．腫瘍試験）
ワクチン接種完了から１５日後、各マウスに、１×１０６ＴＲＡＭＰ−Ｃ１細胞（ヒトＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰに対するマウスホモログを発現している、マウス前立腺細胞株１における遺伝子組換え腺癌）を皮下経路にて移植した。腫瘍は、腫瘍細胞移植から４週間後には明確となった。キャリパーを使用して腫瘍サイズを測定し、腫瘍成長を観察した。
【０１５２】
（８．４．抗原特異的抗体の検出）
ワクチン接種から１４日後、血液サンプル（２００μｌ）を眼窩後方から採取し、血清を下記のＥＬＩＳＡプロトコルを使用して、抗原特異的抗体サブタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの存在から分析した。９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートを組み替えタンパク質ＰＳＣＡまたはヒト精製ＰＳＡ（どちらもコートバッファにおいて１０μｇ／ｍｌ）によってコートし、（ブロックし、洗浄した後に）血清とともに３７℃にて４時間培養した。マウスＩｇＧ１またはマウスＩｇＧ２ａに対するビオチン標識抗体とともに培養し、ＨＲＰ−ストレプトアビジンとともに培養した後、ＴＭＢ基質を加えた。比色反応を、Ｔｅｃａｎ  ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４５０ｎｍにて測定した。
【０１５３】
（８．５．ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）反応のエリスポット検出）
ＣＴＬ（細胞傷害性Ｔ細胞）反応を検出するにあたって、エリスポット法によって、特定の刺激に対するＩＦＮ−γ分泌の分析を、単一細胞レベルにて視覚化することができる。上記８．１において記載したｍＲＮＡワクチンを接種したマウス、およびコントロールマウスの脾細胞を、３番目のワクチン接種サイクルにおいて最後にワクチンを接種してから６日後に分離し、その後、α−ＩＦＮ−γ捕獲抗体によってコートされた９６ウェルのエリスポットプレートへと移した。その後、ＰＳＭＡ由来ペプチドライブラリー、またはコントロール（対象）としてＨＩＶ由来ライブラリーどちらかを使用し、細胞を３７℃にて２４時間刺激した。どちらのライブラリーも、１μｇ／ペプチド／ｍｌ濃度にて使用した。培養期間経過後、細胞をプレートから洗浄し、細胞から分泌されたＩＦＮ−γを、マウスのＩＦＮ−γに対するビオニチル化二次抗体、その後ストレプトアビジン−ＡＫＰを使用して検出した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を使用してスポットを視覚化し、自動エリスポットリーダー（Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ    Ａｎａｌｙｚｅｒ，ＣＴＬ  Ａｎａｌｙｚｅｒｓ  ＬＬＣ）を使用してカウントした。
【０１５４】
（８．６．インビボ細胞傷害性）
インビボにおける細胞傷害性Ｔ細胞の活性を検出するために、ワクチンを接種したマウスおよびコントロールのマウスにおける、特定の標的細胞の溶解を分析した。記憶細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導を検出するために、分析は最後に免疫付与してから１週間後および１０週間後に行った。
【０１５５】
実験未使用マウスから採取した脾細胞を分離し、濃度の違う２つの蛍光染料ＣＦＳＥを使用して標識した。これにより、高蛍光度および低蛍光度の２つの個体群を生成した。低蛍光細胞に、３７℃にて３時間に渡って、ＰＳＭＡ、ＰＳＡまたはＰＳＣＡ由来制限ペプチドライブラリー（１μｇ／ｍｌ／ペプチド）を負荷した。それに応じて、高蛍光コントロール細胞に、ＨＩＶＰｏｌ由来ペプチドライブラリー（１μｇ／ｍｌ／ペプチド）を負荷した。両方の個体群を細胞内において１：１の細胞割合にて混合し、実験未使用マウスまたはワクチンを接種した受容マウスに静脈内経路にて移植した。１６時間後、受容マウスの脾細胞を分離し、フローサイトメトリーによって蛍光細胞の存在を分析した。ワクチンを接種したマウスにおける低蛍光細胞と高蛍光細胞との割合の変化は、インビボにおける標的細胞の特異的な死滅を示した。観察された特定の標的細胞およびコントロール細胞の数の正確な割合は、すべてのコントロールマウスにおける平均値とみなした。この割合によって、ワクチンを接種したマウスにおいて想定される特定の標的を、観察されたコントロール細胞に基づいて予想することができる。特定の標的の、観察された数と、予想された数との比は、残存（死滅していない）特定標的の割合を示す。
【０１５６】
以下の公式を適用した：
残存特定標的の割合＝コントロールマウスにおける（観察された）特定標的／コントロールマウスにおける（観察された）コントロール標的
残存特定標的の割合×ワクチン接種マウスにおいて観察されたコントロール標的の数＝ワクチン接種マウスにおける予想された特定標的の数
死滅％＝（１−（観察された特定標的／予想された特定標的）
（８．７．統計分析）
グラフパッド（GraphPad Prism）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．０１を使用して、統計分析を行なった。サンプル個体群の正規分布が欠如しており、サンプルサイズが小さいため、非パラメトリックマンホイットニー検定（non-parametric Mann Whitney tests）を５％の危険率有意水準にて使用して、テストグループ間の差分を分析した。
【０１５７】
（８．９．結果および考察）
ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡからなるｍＲＮＡワクチンをマウスに接種した。それぞれの抗原は、別々に、質量比４：１（ＲＮＡ：プロタミン）にて、カチオン性ペプチドプロタミンを使用して調製した。コントロールマウスにはバッファ（リンガー乳酸塩）またはｍＲＮＡワクチンに対するプロタミン類似体によって調製した無関係のＲＮＡ（ＰｐＬｕｃ）を使用した。
【０１５８】
（ａ）ｍＲＮＡワクチンを使用したワクチン接種に対する、抗原特異的抗体の誘導
抗体を検出するために必要な組換えタンパク質の可用性に制限があり、４つのうち２つの抗原に対する特定の抗体の誘導を試験した。分析したどちらのタンパク質においても、ＰＳＡ抗原特異的抗体およびＰＳＣＡ抗原特異的抗体が、ｍＲＮＡワクチンを接種したマウスの血清において検出され、どちらのｍＲＮＡもインビボにおいて機能性および免疫原性を有することが証明された（図１６〜図１８参照）。
【０１５９】
（ｂ）ｍＲＮＡワクチンを使用したワクチン接種に対する、抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導
さらに、ｍＲＮＡワクチン投与に対する細胞傷害性Ｔ細胞の活性化を、２つの独立した機能性分析を適用して分析した。すなわち、ＩＦＮ−γの分泌、およびインビボ細胞傷害性分析である。ＩＦＮ−γはＴｈｌ反応の主要なメディエーターであり、活性化されたＣＴＬによって分泌される。それゆえ、ワクチン接種マウスの脾細胞における抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の存在を、エリスポット技術を使用して調査した。脾細胞用抗原促進剤として、制限ＰＳＭＡ由来ペプチドラブラリーを使用した。このライブラリーによる刺激は、高いＩＦＮ−γ分泌を引き起こしたが、上記ｍＲＮＡワクチンを用いてワクチンを接種したマウスの脾細胞においてのみであり、関連のないタンパク質ルシフェラーゼ（Ｐｐ  Ｌｕｃ）をコードするｍＲＮＡを用いてワクチンを接種したコントロールマウスには現れなかった。ＨＩＶ由来コントロールペプチドライブラリーに反応した脾細胞は１つもなかった（図１９参照）。
【０１６０】
ＰＳＭＡに対する抗原特異的細胞性免疫は、インビボ細胞傷害性分析によって確認できた。制限ＰＳＭＡ由来ペプチドライブラリーを負荷された標的細胞を特異的に死滅することが、ｍＲＮＡワクチンを接種した５匹のマウスすべてにおいて観察されたが、細胞傷害効果は１２％〜９０％の間であった。コントロールＲＮＡ（Ｐｐ  Ｌｕｃ）または注射液（リンガー乳酸塩）を使用してワクチンを接種されたマウスは、注入された標的細胞を除去できなかった（図２０参照）。
【０１６１】
別の実験において、ｍＲＮＡワクチンを使用したワクチン接種がインビボにおいて持続記憶効果を誘導するかどうかを調査した。この論点に取り組むために、ワクチン接種が完了してから１０週間後に、抗原特異的記憶細胞傷害性Ｔ細胞の存在をインビボ細胞傷害性テストによって確認した。ＰＳＡ用およびＰＳＣＡ用のワクチン接種の後では、標的細胞が特異的に殺傷されることが観察された（図２１および図２２参照）。総合すれば、ｍＲＮＡワクチンは、マウスにおいて、長期間に渡って効果が持続する（少なくとも１０週間）細胞免疫を誘導する。
【０１６２】
最後に、マウスにおいて、ｍＲＮＡワクチンが抗腫瘍反応を誘導する能力を試験した。この論点に取り組むに当たって、ＴＲＡＭＰ−Ｃ１腫瘍細胞株を使用した。ＴＲＡＭＰ−Ｃ１は、ｍＲＮＡをコードする抗原としてｍＲＮＡワクチンに含まれる、ヒト抗原ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰに対するマウスホモログを発現させる。マウスとヒトとの相同性は、抗原によって５０％〜８０％の範囲において異なる。実際には、マウスにヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡを使用してワクチン接種したため、ＴＲＡＭＰ−Ｃ１腫瘍細胞に対する防御は、交差反応によって媒介されることしかできない。図２３に示されるように、マウスに対するｍＲＮＡワクチンを使用したワクチン接種は、移植されたＴＲＡＭＰ−Ｃ１腫瘍の成長に対する防御を媒介した。この観察によって、マウスにおいて、ｍＲＮＡワクチンが交差反応を誘導する能力が示された。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードする、プラスミドコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号１）を示す図である（このコンストラクトは以下の配列要素を含む：安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ最適配列；３’−末端に〜７０×アデノシン（ポリ−Ａ−尾部）；３’−末端に〜３０×シトシンを（ポリ−Ｃ−尾部）；このＤＮＡコンストラクトはコードｍＲＮＡに対応しており、インビトロ転写実験によって、対応するＲＮＡコンストラクトを調製するためのベースとして供給される）。
【図２】図２は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０に対応する野生型コード配列（配列番号２）、すなわち、ＧＣ最適配列を持たずに、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【図３】図３は、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（＝ＫＬＫ３）をコードする、ＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＫＬＫ３（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０のＧＣ最適コード配列（配列番号３）、すなわち、ＧＣ最適配列を持ち、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【図４】図４は、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードする、プラスミドコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号４）を示す図である（このコンストラクトは以下の配列要素を含む：安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ最適配列；３’−末端に〜７０×アデノシン（ポリ−Ａ−尾部）；３’−末端に３０×シトシン（ポリ−Ｃ−尾部）；このＤＮＡコンストラクトはコードｍＲＮＡに対応しており、インビトロ転写によって、対応するＲＮＡコンストラクトを生成するためのベースとして供給される）。
【図５】図５は、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードするＲＮＡコンストラクトとなるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０に対応する野生型コード配列（配列番号５）、すなわち、ＧＣ最適配列を持たずに、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【図６】図６は、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＦＯＬＨ１（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０のＧＣ最適コード配列（配列番号６）、すなわち、ＧＣ最適配列を持ち、ＰＳＭＡ（前立腺特異膜抗原）（＝ＦＯＬＨ１）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【図７】図７は、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするプラスミドコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号７）を示す図である（上記構成は以下の配列要素を含む：安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ最適配列；３’−末端に〜７０×アデノシン（ポリ−Ａ−尾部）；３’−末端に３０×シトシン（ポリ−Ｃ−尾部）；このＤＮＡコンストラクトはコードｍＲＮＡに対応しており、インビトロ転写によって、対応するＲＮＡ構成を生成するためのベースとして供給される）。
【図８】図８は、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０に対応する野生型コード配列（配列番号８）、すなわち、ＧＣ最適配列を持たずに、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【図９】図９は、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＰＳＣＡ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０のＧＣ最適コード配列（配列番号９）、すなわち、ＧＣ最適配列を持ち、ＰＳＣＡ（前立腺幹細胞抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【図１０】図１０は、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするプラスミドコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０（配列番号１０）を示す図である（上記構成は以下の配列要素を含む：安定化およびより良いコドン使用のためのＧＣ最適配列；３’−末端に〜７０×アデノシン（ポリ−Ａ−尾部）；３’−末端に３０×シトシン（ポリ−Ｃ−尾部）；このＤＮＡ構成はコードｍＲＮＡに対応しており、インビトロ転写によって、対応するＲＮＡ構成を生成するベースとして供給される）。
【図１１】図１１は、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０に対応する野生型コード配列（配列番号１１）、すなわち、ＧＣ最適配列を持たずに、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【図１２】図１２は、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするＲＮＡコンストラクトであるＲＮＡｃｔｉｖｅ  ＣＡＰ−ＳＴＥＡＰ（ＧＣ）−ｍｕａｇ−Ａ７０−Ｃ３０のＧＣ最適コード配列（配列番号１２）、すなわち、ＧＣ最適配列を持ち、ＳＴＥＡＰ（前立腺６膜貫通上皮抗原）をコードするコード配列（ＣＤＳ）を示す図である。
【図１３】図１３は、抗原特異的抗体を検出することによって検出された抗原特異的免疫応答（Ｂ細胞免疫応答）を示す図である（図１３に示すように、ＲＮＡ−Ｍｉｘ、すなわちＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを含むＰＣａ−ＲＮＡカクテルを投与することにより、バッファまたはコントロール（対称）を含むサンプルと比べて、ＰＳＡに対してＩｇＧ２抗体が著しく形成され、抗原特異的免疫応答（Ｂ細胞免疫応答）が著しく誘導された）。
【図１４】図１４は、エリスポットによって検出された抗原特異的細胞免疫応答を示す図である（図１５に示すように、ＲＮＡ−Ｍｉｘ、すなわちＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを含むＰＣａ−ＲＮＡカクテル、またはＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡまたはＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを使用した、マウスに対するワクチン接種によって、天然マウスおよびバッファを使用してワクチン接種されたマウスと比べて、ＩＮＦガンマが著しく形成されて、抗原特異的免疫応答が著しく誘導された）。
【図１５】図１５は、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを５μｇ含む、発明のＰＣａ−ＲＮＡカクテルを使用した、免疫付与および腫瘍治療を示す図である（図１５に示すように、（ａ）ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡおよびＳＴＥＡＰをそれぞれコードするｍＲＮＡを含むＰＣａ−ＲＮＡカクテルを２回ｉ．ｍ（筋肉内経路）にて使用した免疫付与において、腫瘍容積が著しく減少した。腫瘍容積は、上記（ａ）によるＰＣａ−ＲＮＡカクテルを４回ｉ．ｍ（筋肉内経路）にて投与されたとき、さらに減少している）。
【図１６】図１６は、ＰＳＡ特異的ＩｇＧ１抗体の誘導を示す図である。特に、図１６では、ヒト前立腺分化抗原であるＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡを含んでいる、４つの成分からなるｍＲＮＡワクチンを接種したマウスの腫瘍抗原ＰＳＡに特異的なＩｇＧ１抗体の存在を示す。抗体は、それぞれカチオン性ペプチドプロタミンによって調製した。コントロールのマウスは、バッファ（リンガー乳酸塩）、またはｍＲＮＡワクチンのプロタミン類似体によって調製した無関係のＲＮＡ（Ｐｐ  Ｌｕｃ）のいずれかにより処理した。血清分析のため、グループ毎に５匹のマウスから血清を採取し、滴定した。エラーバーは、平均値から２回の繰り返しの平均偏差を示す。
【図１７】図１７は、ＰＳＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体の誘導を示す図である。特に、図１７では、ヒト前立腺分化抗原であるＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含んでいる、４つの成分からなるｍＲＮＡワクチンを接種したマウスの腫瘍抗原ＰＳＡに特異的なＩｇＧ２ａの存在を示す。抗体は、それぞれカチオン性ペプチドプロタミンによって調製した。コントロールのマウスには、バッファ（リンガー乳酸塩）、またはｍＲＮＡワクチンのプロタミン類似体によって調製されたＲＮＡ（Ｐｐ  Ｌｕｃ）どちらかを投与した。それぞれのグループにおける５匹のマウスから採取した血清をため、滴定して、分析を行った。エラーバーは平均からの、２つの複製の平均偏差を示している）。
【図１８】図１８は、ＰＳＣＡ特異的ＩｇＧ１抗体の誘導の結果を示す図である。図１８では特に、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む、４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用してワクチン接種されたマウスにおける、腫瘍抗原ＰＳＣＡに対して特異的なＩｇＧ１抗体の存在を示している。それぞれの抗原はカチオン性ぺプチドプロタミンから調製した。コントロールマウスにはバッファ（リンガー乳酸塩）を投与した。それぞれのグループにおける５匹のマウスから採取した血清をため、滴定して、分析を行った。エラーバーは平均からの、２つの複製の平均偏差を示している。
【図１９】図１９は、ＰＳＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を示す図である。ここでは、それぞれのグループにおける５匹のマウスに対して、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチン、またはｍＲＮＡワクチンに対するプロタミン類似体から調製された無関連なｍＲＮＡ（Ｐｐ  Ｌｕｃ）を使用して、ワクチン接種を行った。ワクチン接種されたマウスおよびコントロールマウスの脾細胞を、最終ワクチン投与から６日後に分離し、ＰＳＭＡ由来ライブラリーまたはコントロールペプチドライブラリー、どちらかを使用して促進した。ＩＦＮ−γ分泌は、エリスポット技術を使用して、生体外において測定した。ラインは、別々に分析された、それぞれのグループにおける５匹のマウスの平均値および範囲を示している。統計分析はグラフパッドプリズム（GraphPad Prism）を用いて実行し、ｐ値は片側マンホイットニー検定（one-sided Mann-Whitney test）を用いて算出した。
【図２０】図２０は、インビボにおけるＰＳＭＡ特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を示す図である。ここでは、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して、皮内経路にてワクチン接種サイクルを３度繰り返し、ワクチン接種を行った。コントロールマウスにはコントロールｍＲＮＡ  Ｐｐ  Ｌｕｃ、またはバッファ（リンガー乳酸塩）を使用してワクチン接種を行った。最終注入から６日後、３０ｘ１０６特異的標識脾細胞（ＰＳＭＡ由来ライブラリーまたはコントロールペプチドライブラリーが負荷され、１：１の割合にて混合された低個体群および高個体群）を静脈内注入した。１６時間後、受容マウスの脾細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは個々のマウスごとに、単一のデータポイントを示している。ラインは平均値および値の範囲を示している。それぞれのグループにおいて５匹のマウスを分析した。統計分析はグラフパッドプリズムを用いて実行し、ｐ値はマンホイットニー検定を用いて算出した）。
【図２１】図２１は、最後にワクチンを接種してから１０週間後における、ＰＳＡ特異的記憶細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を示す図である。ここでは、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用して、２ワクチン接種サイクルを２回繰り返し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対してワクチン接種を行った。コントロールマウスにはバッファ（リンガー乳酸塩）を使用した。最終注入から１０週間後、３０×１０６特異的標識脾細胞（ＰＳＡ由来ライブラリーまたはコントロールペプチドライブラリーを負荷され、１：１の割合にて混合された、低個体群および高個体群）を静脈内に移植した。１６時間後、受容マウスの脾細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは単一のデータポイントを示し、ラインは別々に分析したそれぞれのグループにおける６匹のマウスの平均値を示している。統計分析をグラフパッドプリズムを用いて実行し、ｐ値をマンホイットニー検定を用いて算出した）。
【図２２】図２２は、最後にワクチンを接種してから１０週間後における、ＰＳＣＡ特異的記憶細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を示す図である。ここでは、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用して、ワクチン接種サイクルを２回繰り返して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにワクチン接種を行った。コントロールマウスにはバッファ（リンガー乳酸塩）を使用した。最終注入から１０週間後、３０×１０６特異的標識脾細胞（ＰＳＣＡ由来ライブラリーまたはコントロールペプチドライブラリーが負荷された、１：１の割合にて混合された、低個体群および高個体群）を静脈内に移植した。１６時間後、受容マウスの脾細胞を分離し、フローサイトメトリーによって分析した。グラフは単一のデータポイントを示し、ラインは別々に分析されたそれぞれのグループにおける６匹のマウスの平均値を示している。統計分析をグラフパッドプリズム用いて実行し、ｐ値をマンホイットニー検定テストを用いて算出した。
【図２３】図２３は、ヒト前立腺分化抗原ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、ＰＳＡおよびＰＳＣＡをコードするＧＣ最適ｍＲＮＡをそれぞれ含む４つの構成物質を含むｍＲＮＡワクチンを使用してワクチン接種されたマウスにおける腫瘍成長の抑制を示す図である。ここでは、ｍＲＮＡワクチンを使用して、ワクチン接種サイクルを２回繰り返し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対して静脈内ワクチン接種を行った。コントロールマウスにはバッファを使用した。最終ワクチン接種から１５日後、１×１０６同種ＴＲＡＭＰ−Ｃ１腫瘍細胞を皮下経路にて用いて、マウスに対して試験を行った。腫瘍成長を監視した。グラフは腫瘍導入から５２日後に測定した腫瘍容積の対数を示している。統計分析はグラフパッドプリズムを用いて実行し、ｐ値をマンホイットニー検定を用いて算出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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