(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
透孔を有し、かつ片面に粘着層を有する支持体の粘着層側を、ヒトの肌の皮膚上に貼着し、その後前記支持体を肌の皮膚から剥離して、粘着層の粘着作用によって支持体上にヒトの肌から剥離させた皮膚を接合採取して、接合した皮膚で透孔の粘着層側の中央付近の一定面積以上を覆った支持体を得、透孔の皮膚非接合側から走査型プローブ顕微鏡観察を行って、前記支持体に接合した角層細胞の表面の物性を測定する、角層細胞の物性測定方法。
【請求項２】
角層細胞の接合採取前に、粘着層による閉塞がない透孔の位置を確認する、請求項１に記載の角層細胞の物性測定方法。
【請求項３】
支持体における接合採取した角層細胞の存在箇所を確認し、多数の透孔から走査型プローブ顕微鏡観察を行う透孔を選択する、請求項１又は２に記載の角層細胞の物性測定方法。
【請求項４】
走査型プローブ顕微鏡観察を行って角層細胞の表面の弾性率又は摩擦力を測定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の角層細胞の物性測定方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の角層細胞の物性測定方法を用いた、皮膚性状の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、角層細胞の物性測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚の状態（特にヒトの肌のハリやなめらかさ）や、皮膚に対する剤処理による使用感や効果の評価、加齢に伴うヒトの皮膚の状態変化の評価は、これまで主に官能評価に頼ってきた。しかし、官能評価で出てくる曖昧な表現や個人差のあるような表現について、それらに関連するような物性を定量的に示すことは困難であった。
【０００３】
経表皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）測定は、非侵襲的に皮膚の状態、特に皮膚のバリア能を定量的に測定できる数少ない測定方法の１つであり、体表各部位の皮膚バリア能の相違を測定することができるため皮膚性状の評価方法として有用である（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ＴＥＷＬ測定は間接的な測定方法である。
直接的に皮膚の物性を定量的に示すためには、ヒトの皮膚、具体的には角層細胞を採取する必要がある。角層細胞を採取する方法としては、バイオプシー（生検）が採用されている。しかし、バイオプシーは皮膚を切り出すため、侵襲的で被験者の負担が大きいという問題がある。
さらに、テープストリッピングにより角層細胞を採取する方法も知られている（特許文献１〜２参照）。テープストリッピングは低侵襲的だが、採取時に角層細胞の表面に粘着性テープの粘着面を押し付けるので、角層細胞の表面の物性を測定する際、角層表面を露出させるため溶媒を用いて粘着性テープの粘着剤を除去しなければならない。溶媒を用いて粘着剤を除去すると、粘着剤だけではなく、粘着性テープに付着する角層細胞の物理的／化学的特性に影響を及ぼすため、角層細胞の物性を正確に測定することができない。さらに、溶媒中から角層細胞を回収しなければならず、採取した角層細胞は非常に薄いものであり採取した角層細胞の表面と裏面とを区別することは困難なため、回収した角層細胞を扱うのは非常に難しく、熟練度を要する。
【０００４】
上記問題点に対して、非特許文献２には、格子状のグリッドを用いて角層細胞を採取することが記載されている。しかし、非特許文献２には、採取した角層細胞について、透過型電子顕微鏡による細胞間脂質の構造解析を行っているだけであって、角層細胞の物性を測定することについて一切記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１０５７００号公報
【特許文献２】特開２００７−３４１３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H.Tagami，International  Journal  of  Cosmetic  Science，30，p.413-434，2008
【非特許文献２】G.S.K.Pilgram  et  al.，Journal  of  Microscopy，189(1)，p.71-78，1997
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の点に鑑み、本発明は、低侵襲であると共に、角層細胞の物理的／化学的特性に影響を与えずに、角層細胞の物性を簡便、正確かつ客観的に測定する、角層細胞の物性測定方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記問題点を解決すべく、本発明者等は鋭意検討を行った。その結果、片面に粘着層を有する、透孔を設けた支持体を用いて角層細胞を採取し、粘着剤により接合採取した角層細胞を支持体上でしっかり固定して生体における皮膚の状態を再現／維持し、探針を用いた計測を行うことで、弾性力、摩擦力等の角層細胞の物性を簡便、正確かつ客観的に評価することができることを見い出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、片面に粘着層を有する、透孔を設けた支持体をヒトの皮膚に貼着し、前記支持体を皮膚から剥離して支持体に角層細胞を接合採取し、透孔内の角層細胞に対して支持体の非接合側から走査型プローブ顕微鏡観察を行い、角層細胞の物性を測定する、角層細胞の物性測定方法に関する。
さらに、本発明は、前記角層細胞の物性測定方法を用いた、皮膚性状の評価方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の角層細胞の物性測定方法は、低侵襲であると共に、角層細胞の物理的／化学的特性に影響を与えずに、角層細胞の物性を簡便、正確かつ客観的に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】本発明に用いられる支持体の一例を模式的に示す説明図であり、（ａ）は正面図、（ｂ）はＡ−Ａ断面図を示す。
【図１−２】図１−１に示す支持体をヒトの皮膚に貼着する工程を模式的に示す説明図である。
【図１−３】採取した角層細胞を支持体上に固定した様子を模式的に示す説明図である。
【図１−４】採取した角層細胞に対して走査型プローブ顕微鏡観察を行う工程を模式的に示す説明図である。
【図２】透孔の形状が他の部分とは異なる透孔を設けた支持体の光学顕微鏡写真（表示倍率：２５０倍）を示す図である。
【図３】実施例１における、支持体の透孔の形状、及び粘着面を有する前記支持体を用いて採取した角層細胞の光学顕微鏡写真を示す図である。
【図４】図４（ａ）は、実施例１におけるヒト前腕部の角層細胞の形状像を示す図である。図４（ｂ）は、実施例１におけるヒト前腕部の角層細胞の弾性率像を示す図である。
【図５】実施例１における、ヒト前腕部の角層細胞の弾性率分布を示す図である。
【図６】実施例１における、ヒト前腕部及び頬部の角層細胞の弾性率を示す図である。
【図７】図７（ａ）は、実施例２におけるヒト前腕部の角層細胞の形状像を示す図である。図７（ｂ）は、実施例２におけるヒト前腕部の角層細胞の摩擦力像を示す図である。
【図８】実施例２における、探針の先端部の走査型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図９】比較例における、探針の先端部の走査型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図１０】図１０（ａ）は、比較例におけるヒト前腕部の角層細胞の形状像を示す図である。図１０（ｂ）は、比較例におけるヒト前腕部の角層細胞の摩擦力像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の角層細胞の物性測定方法は、片面に粘着層を有する、透孔を設けた支持体をヒトの皮膚に貼着し、前記支持体を皮膚から剥離して支持体に角層細胞を接合採取し、透孔内の角層細胞に対して支持体の非接合側から走査型プローブ顕微鏡（Scanning  Probe  Microscope、本明細書において「ＳＰＭ」ともいう）観察を行い、角層細胞の物性を測定することを特徴とする。
本発明の角層細胞の表面の物性測定方法によれば、角層細胞表面の物理的／化学的特性に影響を与えずに、皮膚の物性を簡便、正確かつ客観的に評価することができる。従って、剤の使用前後の物性変化に基づく剤開発における処方設計指針の提案や、皮膚の物性の部位差や加齢の影響等の測定／評価が容易となる。
【００１３】
本発明を図面に基づき詳細に説明する。しかし、本発明はこれに制限するものではない。
【００１４】
図１−１は、本発明に用いられる支持体の一例を模式的に示す説明図であり、（ａ）は正面図、（ｂ）はＡ−Ａ断面図である。
本発明に用いる支持体の材質に特に制限はないが、物性測定の際に採取した角層細胞を生体と同じ状態で再現／維持するために伸縮性が小さく、ヒトの皮膚表面の凹凸に適合を有するためのある程度の柔軟性を有し、使用する粘着剤と親和性が高い材質が好ましい。例えば、金、白金、ニッケル、アルミニウム、チタン、モリブデン、ステンレス、銅などが挙げられる。本発明では、銅、金、又はニッケルが好ましい。
本発明において、支持体１の厚さは特に制限はないが、採取した角層細胞を支持体上で固定し、ＳＰＭ観察を行う観点から、１〜２０μｍが好ましく、３〜１０μｍがより好ましい。
支持体１の大きさは特に制限はないが、２〜２５ｍｍ2が好ましく、５〜１０ｍｍ2がより好ましい。
【００１５】
本発明において用いる支持体１には透孔２が設けられている。透孔２の平面形状に特に制限はなく、円形、楕円形、三角形、四角形、六角形等が挙げられる。また、透孔２の大きさも特に制限はないが、３０〜２５００μｍ2が好ましく、１００〜９００μｍ2がより好ましい。
支持体１には透孔２が複数設けられていることが好ましい。
【００１６】
支持体１は、その片面に粘着層３を有する。図１−３に示すように、粘着層３は透孔２周辺の接合採取した角層細胞５と接触する部位になる。粘着層３が透孔２を閉塞すると、ＳＰＭ観察において接合採取した角層細胞と探針（カンチレバー）との間に粘着層が位置することになる。ＳＰＭ観察の際に粘着層により閉塞された透孔を観察すると、探針の先端に粘着剤が付着し、角層細胞の物性の定量的な測定ができなくなる場合がある。したがって、角層細胞の接合採取前に、粘着層による閉塞がなくＳＰＭ観察可能な透孔の位置を確認することが好ましい。確認方法としては特に制限はなく、目視で確認してもよいし、光学顕微鏡等を用いて確認してもよい。なお、図２に示すような、透孔の形状が他の部分とは異なる透孔を設けた支持体を用いると、当該部分が目印となりＳＰＭ観察可能な透孔の特定が容易となる。
【００１７】
皮膚から角層細胞を採取でき、支持体上で採取した角層細胞を生体と同じ状態で（そのままの状態で）再現／維持できる限り、粘着層３の材料に特に制限はなく通常の粘着剤を用いて形成することができる。具体例としては、アニオン性樹脂（例えば、酢酸ビニル−クロトン酸共重合体、クロトン酸−酢酸ビニル−ネオデカン酸ビニル共重合体、クロトン酸−酢酸ビニル−プロピオン酸ビニル共重合体、酢酸ビニル−マレイン酸モノブチル−アクリル酸イソボロニル共重合体、アクリル酸オクチルアミド−アクリル酸エステル共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸エステル−（メタ）アクリル酸共重合体、（メタ）アクリル酸−（メタ）アクリル酸エステル共重合体であるアクリル樹脂アルカノールアミン液、アクリル酸エステル−メタクリル酸エステル−ジアセトンアクリルアミド−メタクリル酸共重合体、メチルビニルエーテル−マレイン酸モノアルキル共重合体）、カチオン性樹脂（例えば、ヒドロキシエチルセルロースジメチルジアリルアンモニウムクロリド、塩化Ｏ−［２−ヒドロキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロピル］ヒドロキシエチルセルロース、Ｎ−ビニルピロリドン−メタクリル酸ジメチルアミノエチル共重合体、ビニルイミダゾリウムトリクロリド−Ｎ−ビニルピロリドン共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−メタクリル酸ジメチルアミノエチル共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−アクリル酸アミノアルキル−Ｎ−ビニルカプロラクタム共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド共重合体、Ｎ−アルキルアクリルアミド−アクリル酸−Ｎ−（アルキルアミノ）アルキルアクリルアミド−ポリエチレングリコールメタクリレート共重合体、ポリ塩化ジメチルメチレンピペリジニウム液、ジメチルジアリルアンモニウムクロリド−アクリルアミド共重合体、カチオン化グアーガム等）、ノニオン性樹脂（例えば、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル−プロピオン酸ビニル共重合体、Ｎ−ビニルピロリドン−酢酸ビニル−アミノアルキルアクリレート共重合体、酢酸ビニル−Ｎ−ビニル−５−メチル−２−オキサゾリン共重合体、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルホルムアミド、ポリビニルアセトアミド等）、両性樹脂（例えば、アクリル酸オクチルアミド−アクリル酸ヒドロキシプロピル−メタクリル酸ブチルアミノエチル共重合体、Ｎ−メタクリロイルオキシエチル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウム−α−Ｎ−メチルカルボキシベタイン−メタクリル酸エステル共重合体、アクリル酸−メタクリル酸−アクリル酸２−ヒドロキシプロピル−メタクリル酸ジメチルアミノエチル−メタクリル酸エチル−ジアセトンアクリルアミド−Ｎ−ビニルピロリドン共重合体及びそのアルカノールアミン液等）等が挙げられる。これらは、単独又は二種以上を併用して用いることができる。
【００１８】
図１−２に示すように、支持体１に設けた粘着層３がヒトの皮膚４に接触するように、前記支持体１をヒトの皮膚４に貼着する。なお、実際の皮膚表面は微小な凸凹や曲面が存在するが、図１−２においては説明の便宜上粘着層３と接触する部分を平面的に示している。
支持体１上に皮膚から角層細胞を採取するため、支持体１を皮膚４に貼着させた後、一定時間放置してもよいし、支持体１を皮膚４に押し付けてもよい。
【００１９】
次に、皮膚４に貼着させた支持体１を皮膚４から剥離し、図１−３に示すように、角層細胞５を支持体１に接合採取する。ここで、接合採取された角層細胞５は、支持体１の粘着層３によりしっかりと固定され、生体と同じ状態が（そのままの状態で）再現／維持される。従って、ＳＰＭ観察により、角層細胞の物性を正確に測定することができる。さらに、ＳＰＭ観察は探針を用いた計測方法であるが、採取した角層細胞５は支持体１にしっかりと固定されているので、ＳＰＭ観察中において角層細胞がずれることがなく角層細胞の物性を正確に測定することができる。
【００２０】
本発明において、採取する角層細胞の厚さに特に制限はないが、２００〜７００ｎｍが好ましい。
【００２１】
図１−４に示すように、支持体１をＳＰＭの試料台８に載せＳＰＭ観察を行う。ＳＰＭ観察を行う際に試料台８上の支持体１がずれないように固定することが好ましい。例えば、図１−４に示すように、両面に粘着性を有するテープ（両面粘着物７）等により支持体１をＳＰＭの試料台８に固定することがより好ましい。
【００２２】
接合採取する角層細胞は非常に薄く、角層細胞を採取する部位の皮膚面状も部位によって異なるので、接合採取した角層細胞が支持体の透孔全体に存在しない場合がある。この場合、接合採取した角層細胞が存在しない支持体の透孔部分でＳＰＭ観察を行うと、ＳＰＭの探針がＳＰＭの試料台又は支持体１をＳＰＭの試料台上に固定するための両面粘着物７を構成する粘着剤に接触する。その結果、角層細胞の物性を正確に測定できないばかりか、ＳＰＭの探針が損傷する場合がある。さらに、先端に粘着剤が付着したままの探針を用いてＳＰＭ観察を行うと、得られるデータの正確性が損なわれる場合がある。測定対象物と測定装置とが直接接触しない透過型電子顕微鏡観察とは異なり、測定対象物と測定装置の一部とが直接接触する摩擦力等を測定するＳＰＭ観察では探針を測定対象物に確実に接触させなければならない。さらに、角層細胞が存在しない支持体の透孔部分で一旦ＳＰＭ観察を行うと、角層細胞が存在しないと判断してから別の透孔でＳＰＭ観察を行わなければならず、測定時間が長くなる。
そこで、本発明では、ＳＰＭ観察を行う前に、上述のような粘着層の閉塞がなくＳＰＭ観察可能な透孔において、角層細胞に対して確実に測定を行うために支持体における接合採取した角層細胞の存在箇所を確認し、多数の透孔からＳＰＭ観察を行う透孔を選択することが好ましい。これにより、探針が汚染されることなく、角層細胞の物性を正確かつ迅速に測定することができる。確認方法としては特に制限はなく、目視で確認してもよいし、光学顕微鏡等を用いて確認してもよい。なお、図２に示すような、透孔の形状が他の部分とは異なる透孔を設けた支持体を用いると、当該部分が目印となり測定箇所の特定が容易となる。
【００２３】
角層細胞の物性を測定するには、一定面積の接合採取した角層細胞に対してＳＰＭ観察を行う必要がある。さらに、支持体１に接触することによる探針６の損傷を防止するため、探針６の走査を透孔２の中央付近で行う必要がある。従って、角層細胞により透孔の中央付近が覆われ、かつ一定面積以上覆われている支持体の透孔を選択してＳＰＭ観察を行うことが好ましい。本発明において、ＳＰＭ観察を行う透孔を選択するための指標としては、支持体１の厚さ、透孔２の大きさ、探針６の太さ等を考慮して適宜決定することができるが、接合採取した角層細胞により５０％〜１００％（好ましくは８０％〜１００％）覆われている支持体の透孔を、ＳＰＭ観察を行う透孔として選択することが好ましい。
【００２４】
接合採取した角層細胞に対して、図１−４に示すように、支持体１の非接合側から探針６を透孔２に侵入させ、ＳＰＭ観察を行い、角層細胞の物性を測定する。
本発明では、透孔２を設けた支持体１の粘着層３を皮膚４に貼着し、皮膚４から支持体１を剥がす。従って、支持体１の接合側の粘着層３とは反対側の非接合側に、接合採取した皮膚（角層細胞）の表面が露出している。よって、本発明の角層細胞の物性測定方法において、図１−４に示すように、支持体１の非接合側から透孔２内の角層細胞５に対してＳＰＭ観察を行うことで、正確に角層細胞表面の物性を測定することができる。
【００２５】
本発明の方法により、皮膚のハリの指標となる弾性率や、皮膚のなめらかさの指標となる摩擦力等の物性を測定することができる。ＳＰＭのうち、弾性力を測定するには原子間力顕微鏡(Atomic  Force  Microscope、本明細書において「ＡＦＭ」ともいう)を、摩擦力を測定するには摩擦力顕微鏡（Friction  Force  Microscope、本明細書において「ＦＦＭ」ともいう）を用いる。
【００２６】
本発明の角層細胞の物性測定方法によれば、角層細胞の物性を正確かつ客観的に測定することができる。したがって、本発明の方法により、被験者の皮膚角質細胞の物性値を正常な皮膚又は異常な皮膚の角層細胞の物性値と比較することにより被験者の皮膚性状の評価が可能となる。さらに、本発明の方法により、化粧料、皮膚用剤、浴用剤及び内服剤等の各種剤及び組成物の使用前後における皮膚角質細胞の物性値を比較することにより、各種剤及び組成物の皮膚に与える影響を評価することもできる。さらに、本発明の方法により、被験者の皮膚の部位差を評価することもできる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１  角層細胞の弾性率の測定
ヒトの皮膚の角層細胞の物性（弾性率）測定方法を図１−１〜図１−４に則して説明する。
粘着剤（コスメディ製薬社製、商品名：MASCOS08K）を酢酸エチルで３０ｗｔ％に希釈した。図１−１に示す支持体１として、図２に示すような透孔の形状を有する透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察用の銅グリッド（商品名：Ｇ６００ＨＨ、日新ＥＭ製、直径３ｍｍΦ、六角形の透孔２の大きさ３０μｍ）を濾紙に置き、希釈した粘着剤を１滴滴下し、表面をシリコーン加工処理したシール台紙（ＫＯＫＵＹＯ社製タックタイトル（商品名））で上から強く押すことにより余剰な粘着剤を除去した。銅グリッドからシール台紙を剥がし、グリッドの透孔が粘着剤で閉塞していないことを光学顕微鏡（商品名：ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００  ＰＯＬ、Ｎｉｋｏｎ社製）で確認し、支持体１の透孔２周辺に粘着剤を用いて図１−１（ｂ）に示すような粘着層３を形成した（粘着層３の厚さ：数μｍ）。なお、支持体１には多数の透孔があるため、支持体１の透孔２の形状が他とは異なる中央部分（以下、「中央の目印」ともいう）付近の透孔が粘着層で閉塞されないように粘着層を形成させた支持体１を作製した。粘着層の溶剤を揮発させるために、減圧下で支持体１を一晩放置した。
【００２９】
図１−２に示すように支持体１の粘着層３を被験者（２９才男性）の皮膚４（前腕又は頬）に貼着し、金属ヘラで押さえつけた後、支持体１を剥がし、図１−３に示すように支持体１に角層細胞５（厚さ：約５００ｎｍ）を接合採取した。光学顕微鏡で観察したところ、接合採取した角層細胞５はフィルム状であり、支持体１上でしっかり固定されていて、たるみがなく、生体における皮膚の状態を再現／維持されていた。
【００３０】
支持体１における採取した角層細胞５の存在箇所を光学顕微鏡（商品名：ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００  ＰＯＬ、Ｎｉｋｏｎ社製）で確認し（図３参照）、多数の透孔から、接合採取した角層細胞５により中央付近が覆われ、かつ角層細胞５により５０％以上覆われている透孔を選択し、選択した透孔が前記中央の目印に対してどの位置にあるかを確認し、測定箇所を決定した。
【００３１】
角層細胞５の表面が上側、支持体の粘着面３が下側になるように、原子間力顕微鏡（商品名：NanoScope  Dimension  Ｖ、Veeco  Instruments社製）の試料台に支持体１を置き、両面粘着物７で固定した。
図１−４に示すように、支持体１の非接合側から選択した透孔２内に探針６を侵入させ、角層細胞５の表面をトレースし、ＡＦＭ測定を行い、角層細胞の表面の形状像及び弾性率を測定した（Ｓｃａｎ  ｒａｔｅ：形状測定時：０．５Hz、弾性率像測定時：３．２６Hz）。なお、ＡＦＭ測定における解像度は、５１２×５１２ピクセルとした。さらに、Force  Volumeモードでナノインデンテーション・マッピング（弾性率イメージング）を行った。解像度は、６４×６４ピクセルとした。
【００３２】
前腕部の角層細胞の形状像及び弾性率像を図４に示し、前記弾性率像から算出したヒストグラム（６４×６４ピクセル分の弾性率）を図５に示す。
弾性率測定の結果、前腕部の弾性率は０．５９±０．１６ＧＰａであった。
【００３３】
前腕部及び頬部それぞれ３箇所の角層細胞について前記と同様に弾性率を測定した。その結果を図６に示す。
図６の結果から、前腕の方が頬に比べて弾性率の平均値が高い傾向が得られた。さらに、角層細胞の弾性率に部位差があることもわかった。
【００３４】
実施例２  角層細胞の摩擦力の測定
実施例１と同様にして、片面に粘着層３を有する、透孔２を設けた支持体１を作製し、被験者（２９才男性）の皮膚４（前腕）から角層細胞５（厚さ：約５００ｎｍ）を接合採取した。光学顕微鏡で観察したところ、接合採取した角層細胞５はフィルム状であり、支持体１上でしっかり固定されていて、たるみがなく、生体における皮膚の状態を再現／維持されていた。
【００３５】
支持体１における採取した角層細胞５の存在箇所を光学顕微鏡（商品名：ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００  ＰＯＬ、Ｎｉｋｏｎ社製）で確認し、多数の透孔から、接合採取した角層細胞５により中央付近が覆われ、かつ角層細胞５により５０％以上覆われている透孔を選択し、選択した透孔が前記中央の目印に対してどの位置にあるかを確認し、測定箇所を決定した。
【００３６】
角層細胞５の表面が上側、すなわち支持体の粘着面３が下側になるように、摩擦力顕微鏡（商品名：Veeco  Dimension  ３０００、Veeco  Instruments社製）の試料台に支持体１を置き、両面粘着物７で固定した。
図１−４に示すように、支持体１の非接合側から選択した透孔２内に探針６（商品名D-NP-S（Si3N4lever）、NANOSENSOR社製、バネ定数０．１２Ｎ／ｍ）を侵入させ、探針６の先端部を角層細胞５に当接させ、ＦＦＭ測定を行い、角層細胞の表面の形状像及び摩擦力を測定した（Ｓｃａｎ  ｒａｔｅ：１．０Ｈｚ（２μｍ四方）、Ｓｃａｎ  ａｎｇｌｅ：９０°）。なお、ＦＦＭ測定における解像度は、５１２×５１２ピクセルとした。
【００３７】
前腕部の角層細胞の形状像及び摩擦力像を図７に示す。摩擦力測定の結果、前腕部の摩擦力は０．６１ｍＶであった。
なお、ＦＦＭ測定後の探針６の先端部の走査型電子顕微鏡写真を図８に示す。図８の結果から、上述の通り角層採取前に粘着層による閉塞がない透孔の位置を確認し、粘着剤で覆われなかった透孔に採取された角層を測定したので、ＦＦＭ測定後の探針６の先端部には粘着剤は全く付着していなかった。
【００３８】
比較例
実施例２で用いたものと同じ探針を用いて、ＦＦＭ測定の前に、両面粘着物７を走査した。その後、探針６の先端部の走査型電子顕微鏡で観察した。結果を図９に示す。図９からわかるように、探針６の先端部には粘着剤が付着していた。
その後、実施例２においてＦＦＭ測定を行った部位と同じ部位について、前記の先端部に粘着剤が付着した探針６を用いて、実施例２と同様にＦＦＭ測定を行った。その結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、先端部に粘着剤が付着した探針を用いたため、摩擦力像が全体的にぼやけて観察された。
さらに、図７（ｂ）及び図１０（ｂ）の画像において、同位置の５０ピクセル×５０ピクセルの画像５枚について摩擦力の平均値を算出し、有意差検定を行った。その結果、図７（ｂ）及び図１０（ｂ）の画像から算出した摩擦力の平均値には有意差があり（Ｐ＜０．０５）、探針６の先端部の汚染が皮膚表面の物性の測定結果に影響を及ぼすことは明らかであった。
【００３９】
実施例２では、ＳＰＭ測定前に支持体における接合採取した角層細胞の存在箇所を確認したので、角層細胞の物性を正確に測定することができた。これに対し、角層細胞の存在箇所をあらかじめ確認せずにＳＰＭ測定を行った場合、粘着剤を走査する危険性がある。粘着剤を走査した場合、探針の先端部に粘着剤が付着する可能性が高く、粘着剤が付着すると試料表面と探針の接触面積の変化や走査時に探針に作用する力が変化するため、角層細胞の物性を正確に測定することができない。
従って、ＳＰＭ測定前に支持体における接合採取した角層細胞の存在箇所を確認したうえで、支持体の透孔内の角層細胞に対してＳＰＭ測定を行うことで、探針先端部への粘着剤の付着を防止できるため角層細胞の物性を正確に測定することができ、さらに、角層細胞の物性測定に要する時間も短縮することができる。
【００４０】
以上の結果から、本発明によれば、採取した角層細胞を粘着剤で格子状の支持体に固定し、そのままＳＰＭ測定に用いるので、物理的／化学的特性に影響を及ぼすことなく、皮膚の物性を簡便、正確かつ客観的に評価することができる。さらに、本発明の角層細胞の物性測定方法は前腕部と頬部等角層細胞の物性の相違（部位差）を評価することもでき、皮膚性状の評価方法として有用である。
【符号の説明】
【００４１】
１  支持体
２  透孔
３  粘着層
４  皮膚
５  角層細胞
６  探針
７  両面粘着物
８  試料台
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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