(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の筋形成を促進させる方法であって、前記哺乳動物に対し、出生前の筋線維過形成期に十分な量の２５−水酸化ビタミンＤ３を投与することを含み、
出生前に投与する方法は、妊娠中の母親に投与することを含み、
前記哺乳動物は、出生前の筋線維過形成期と出生後の両方において２５−水酸化ビタミンＤ３補給を受け、
前記哺乳動物はヒトを含まない、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物は、豚（ｐｉｇ）である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記動物に、離乳後に連続して、出生後の２５−水酸化ビタミンＤ３補給を行う請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、２５−水酸化ビタミンＤ３の投与により、哺乳動物の筋肉量を増加させる方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
ビタミンＤを含む飼料を与えることは、特に骨の健康に関し、多くの利益をもたらすことは知られているが、他の身体系に対するビタミンＤおよびその誘導体の効果は殆ど知られていない。
【０００３】
多くの哺乳動物では、その一般的健康および幸福の観点からも、その経済および／または農業特性からも、筋肉量は重要な資質である。したがって、骨強度だけでなく筋肉量も増加させるメカニズムを提供することは有益なことであろう。
【０００４】
［発明の説明］
本発明によれば、哺乳動物にその出生前に十分な量の２５−水酸化ビタミンＤ３を与えることによって、筋の形成が増進されることがわかった。
【０００５】
「２５−ＯＨ  Ｄ３」は、本明細書および特許請求の範囲中で使用されるとき、２５−水酸化ビタミンＤ３を意味する。
【０００６】
哺乳動物においては、筋線維の数は出生前に決定され、出生後の生活を通して変わらない。筋線維には、一次および二次の２つのタイプがある。筋線維の過形成（細胞または線維の数の増加）においては、まず、一次筋芽細胞が増え、次いで、一次筋芽細胞が融合して一次線維を形成する。次に、これらの一次線維の表面で、二次筋芽細胞がより長い期間にわたって増加する（二次線維過形成）。予想されるように、すべての哺乳動物で概ねこの予定通りに発達が進むが、それぞれの種類がそれら自身のスケジュールを有している。
【０００７】
例えば、豚では、一次線維の過形成は妊娠の略３５日目で始まり６０日目まで続く。二次線維の過形成は、妊娠の約５０日目で始まり約９０日目まで続く。要するに、骨格筋線維の形成は、妊娠９０日後に完了する。同様に、一次筋線維は、羊で妊娠３２日目に、牛で６０日目に、そしてヒトで５６日目に現れる。二次筋線維の形成は、羊、牛およびヒトでそれぞれ妊娠３８日目、９０日目および９０日目で始まる。
【０００８】
豚の出生後の骨格筋の成長は、筋線維の肥大（細胞サイズの増大）によって起こり、ＤＮＡ含有量の増加を伴う。最終分化した筋線維は有糸分裂することができず、したがって、その筋核はＤＮＡ合成能を有さない。骨格筋細胞中に存在する筋原性前駆体細胞である遊星細胞は、出生後の筋線維の成長に寄与するＤＮＡ源である。ＤＮＡの増加は、遊星細胞が増殖し、次いで、それが分化し、かつ存在する筋線維と融合することによって起こり、その結果、筋細胞のサイズおよび核量が劇的に増加する。
【０００９】
遊星細胞由来の核の増加は、筋タンパクの増加、すなわち、筋の成長に比例し、また、それへの前提条件でもある。遊星細胞は、後期胚発生期のそれらの特定の発達プログラムに関係する。遊星細胞は、基底層の下にあり、互いに融合して新たな線維を形成するため、増殖し、分化し、そして存在する線維と結合することができる。出生時、骨格筋の約１０％は増殖遊星細胞で構成されている。しかしながら、それらは成長期の終わりまでには急速に減少する。
【００１０】
哺乳動物における骨格筋の発達は、初期胚期に始まり、生涯を通じて続く。骨格筋の形成は、胚において、筋原細胞の運命を特定する周辺組織からのシグナル伝達分子の結果として始まる。特に骨格筋細胞で発現するＭｙｆ５、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＭＲＦ４などの筋調節因子（ＭＲＦ）遺伝子ファミリーは、骨格筋の発生および成長に重要な役割を果たす。ＭｙｏＤおよびＭｙｆ５は、筋原細胞の運命および胚形成時の筋芽細胞の形成に対する前駆体細胞を決定する。ミオゲニンおよびＭＲＦ４は筋芽細胞の筋管への末端分化に関与する。
【００１１】
遊星細胞は胚形成の終わり頃にまず現れ、出生後の骨格筋の成長、修復および維持に必要な筋原細胞の主要源となる。それらは、通常、最終分化した成熟骨格筋線維の筋鞘と基底膜の間に休眠状態で存在する。出生後の筋成長（筋肥大）やミオトラウマ（ｍｙｏｔｒａｕｍａ）などの刺激によって、遊星細胞は活性化され、増殖し、分化する。筋調節因子および成長因子（ＧＦ）はいずれも、遊星細胞の活性化、増殖および分化に関与している。成長因子としては、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）スーパーファミリーのメンバー（ミオスタチンおよびＴＧＦ−□１）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などが挙げられる。
【００１２】
いかなる理論にも束縛されることを望むものではないが、２５−水酸化ビタミンＤ３の食餌補給により、「ビタミンＤカスケード強化」が開始され、ビタミンＤがゲノム機構（ビタミンＤ受容体、核内転写因子を介して）および／または非ゲノムシグナル変換経路で働いて、出生前の筋過形成および出生後の筋肥大の促進において筋原性調節タンパク（ＭＲＦ）および成長因子（ＧＦ）の遺伝子発現を直接および間接的に制御するようである。２５−水酸化ビタミンＤ３がＭＲＦおよびＧＦを介して作用し、出生前、筋原性前駆体細胞（胚筋芽細胞、胎児筋芽細胞、および特に遊星細胞）の特定の筋原性系統へ成長し、「ビタミンＤメモリー」筋芽細胞になる増殖体細胞関与の決定段階に影響する。ビタミンＤメモリー筋芽細胞は、２５−水酸化ビタミンＤ３により「スイッチオン」となり、
出生後の筋成長期に、その増殖、分化、存在する筋線維との融合を増幅させる。
【００１３】
したがって、本発明の一態様は、哺乳動物の筋形成を促進させる方法であって、哺乳動物に対し、出生前の筋線維過形成期に十分な量の２５−水酸化ビタミンＤ３を投与することを含む方法である。本発明の好ましい実施形態においては、出生前の２５−ＯＨ  Ｄ３の投与方法は、哺乳動物の妊娠中の母親への経口投与（例えば、母親の餌に２５−ＯＨを加えるなど）である。この形の投与方法は、胚期の哺乳動物における筋肉量に影響を及ぼし得ることがわかった。本発明の他の態様は、胚期の哺乳動物における筋線維過形成を増大させるための２５−ＯＨ  Ｄ３の使用である。
【００１４】
本発明の哺乳動物はいかなる種類であってもよい。本発明の好ましい哺乳動物は、ヒト、豚（ｓｗｉｎｅ）、牛、馬、イヌ、ネコ、ウサギ、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）（ヤギ（ｇｏａｔ））、および羊である。好ましくは、哺乳動物は豚（ｐｉｇ）である。
【００１５】
妊娠中の豚に対する２５−ＯＨ  Ｄ３の投与量は、豚の餌１ｋｇ当たり約１０μｇ〜約１００μｇであり、好ましくは豚の餌１ｋｇ当たり約５０μｇ〜約８０μｇである。他の哺乳動物でも、量は同様であり、１日に与える餌の量に基づいて決められる。最良の結果を得るためには、２５−ＯＨ  Ｄ３は、その生物に有効であると一般に知られている栄養素を十分に含む食餌の一部として補給すべきである。例えば、豚では、ビタミンＢ群が必須であり、したがって、それらは、水、炭水化物、タンパク質、脂質、他のビタミン類、およびミネラルのような他のあらゆる栄養素が生産機能や維持に効果的に使用されるように、定期的に補給される。
【００１６】
哺乳動物は、筋形成期には、出生前投与量の２５−水酸化ビタミンＤ３を摂取することが好ましい。本発明においては、また、出生前に２５−ＯＨ  Ｄ３が投与されていたこの動物が、その後にも、２５−水酸化ビタミンＤ３補給剤を含む食餌が与えられると、２５−ＯＨ  Ｄ３の食餌が与えられたものの、出生前投与量を摂取していない同様の動物より、筋肉量が増加することがわかった。したがって、本発明の特に好ましい実施形態では、哺乳動物、好ましくは豚は、出生前の２５−ＯＨ  Ｄ３補給を受け（母親へ与えることにより）、かつ死ぬまで（離乳後）２５−ＯＨ  Ｄ３が補給された食餌が与えられる。
【００１７】
以下の実施例により本発明をより明確に示すが、それらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
［実施例］
［実施例１］
［豚の発育］
［試験Ａ．］
すべての試験で２つの処置グループを使用した。対照グループは、２５−ＯＨ  Ｄ３未添加の餌が与えられた１〜５産目の豚（雌豚および子孫）で構成した。実験グループは、２５−ＯＨ  Ｄ３を飼料１ｋｇ当たり５０ｍｃｇ添加した餌が与えられ、生後６ヶ月から２５−ＯＨ  Ｄ３を含む餌が与えられた雌豚から産まれた１〜５産目の豚で構成した。試験Ａでは、１〜３産目の豚に対してはプレスターター期からフィニッシャー期（生後４１〜１５０日）のみをカバーし、４および５産目の豚に対してはブースター期からフィニッシャー期（生後７〜１５０日）のみをカバーした。
【００１９】
［試験Ｂ．］
この試験でも２つの処置グループを使用した。豚は、同じ農場で２５−ＯＨを含まない餌を与えた種々の経産回数の雌豚からランダムに選んだ。対照グループには、２５−ＯＨ  Ｄ３を含まない餌を与え、一方、実験グループには、２５−ＯＨ  Ｄ３（飼料１ｋｇ当たり５０ｍｃｇ）を添加した餌を与えた。試験Ｂでは、プレスターター期からフィニッシャー期（生後４１〜１５０日）をカバーした。
【００２０】
［豚およびレプリケートの数：］
１つの処置当たりのレプリケート数は８〜１１とし、１レプリケートに４匹の豚を使用した。
【００２１】
［豚のランダム化および配分：］
豚を大きさおよび性でグループ分けし、各処置にランダムに分配した。２つの処置群における雄のレプリケートの数は同数とした。
【００２２】
［餌：］
すべての試験で与えた餌は、雌豚については妊娠期用および授乳期用の餌とした。子孫には、ブースター、プレスターター、スターター、グローワーおよびフィニッシャーの餌を与えた。
【００２３】
［給餌：］
実験用の豚に、乾燥飼料を不断に与えた。ブースター期の豚（哺乳期の豚）には、生後７日目に給餌を開始した。餌は、子豚用に設計された直線状トラフに入れた。数日間はごく少量の餌を豚に与えたが、食べているときには、常に必要量をフィーダーに入れておいた。餌の量を適宜秤量し記録した。プレスターター期の豚は、スラットのある高所の育児用の囲いに入れ、直線状フィーダーを使用して３０日間餌を与えた。グローワー〜フィニッシャー期の豚は、セメント床の小屋にいれ、コンクリート製の直線状フィーダーを使用して８０日間餌を与えた。豚にはその日齢に応じて以下に示す餌を与えた。
【００２４】
【表１】
0005509502.tif 000002
【００２５】
［他の管理方法：］
すべての実験動物に対する取り扱いは、これらの試験が行われる農場で一般に用いられている標準にしたがった。
【００２６】
［データの収集：］
以下に示すデータを収集した。
１．生後７日目の子豚の体重
２．生後２８日目の子豚の体重
３．生後４１、７０、１００、１３０および１５０日目の豚の体重
４．以下の時期における餌の消費量
ａ）ブースター期（生後７〜２８日；生後２９〜４０日）
ｂ）プレスターター期（生後４１〜７０日）
ｃ）スターター期（生後７１〜１００日）
ｄ）グローワー期（生後１０１〜１３０日）
ｅ）フィニッシャー期（生後１３１〜１５０日）
【００２７】
［結果：］
全ての経産回数で、２５−ＯＨ  Ｄ３が給与された雌豚から離乳した豚には、２５−ＯＨ  Ｄ３が飼料１ｋｇ当たり５０μｇ与えられ、対照の雌豚から離乳した豚には、対照の餌（２５−ＯＨ  Ｄ３を含まない）が与えられた。下記の表１〜５は、１〜５産目のプレスターター〜フィニッシャー期の豚の発育を示している。３つの経産回数で、２５−ＯＨ  Ｄ３が与えられた豚は、常に、対照の餌が与えられた豚より速く体重が増加し（デルタ平均３．９ｋｇ）、かつより効率良く餌を体重増加に変換させた（デルタ平均７点）。
【００２８】
【表２】
0005509502.tif 000003
【００２９】
【表３】
0005509502.tif 000004
【００３０】
【表４】
0005509502.tif 000005
【００３１】
【表５】
0005509502.tif 000006
【００３２】
【表６】
0005509502.tif 000007
【００３３】
［実施例２］
この試験では、２５−ＯＨ  Ｄ３が給与されなかった雌豚から離乳した豚を使用した。これらの豚は、２５−ＯＨ  Ｄ３を含まない餌を与えられた豚に似た速さで体重が増加したが、下記の表６に示すように、前者は後者より、より効率良く餌を体重増加に変換させた。
【００３４】
【表７】
0005509502.tif 000008
【００３５】
２５−ＯＨ  Ｄ３が与えられた雌豚から離乳したものの、２５−ＯＨ  Ｄ３が給与されなかった豚は、２５−ＯＨ  Ｄ３が与えられた豚に比べ体重増加が遅かったことが観察された（農場の記録データ、ｎ＝２３匹の豚、平均体重＝８０．９０ｋｇ）。表１を参照されたい。それらは、また、対照の豚（表１の）、および、２５−ＯＨ  Ｄ３が与えられなかった雌豚から離乳した豚（表６）と同程度、体重が増加した。