(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子を鋳型としてPCR法を行うために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーであって、配列番号１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２】
被検試料におけるバチルスコアグランスの存在の判定方法であって、
被検試料から核酸を抽出し、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR法を行うことを含む前記判定方法。
【請求項３】
被検試料からの核酸の抽出時のＲＮＡ分解酵素阻害剤としてジチオトレイトールを用いる請求項２記載の判定方法。
【請求項４】
被検試料から抽出した核酸を鋳型としてPCR法を行うことによって得られる特定の増幅産物を指標として、前記被検試料におけるバチルスコアグランスの存在を判定するために用いられる判定キットであって、
配列番号１に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中のバチルスコアグランス（Bacillus coagulans）を検出する方法に関するものであり、より詳細には被検試料中のバチルスコアグランスを特異的、短時間、かつ、高感度で検出し、その存在の有無を判定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バチルスコアグランスは、缶詰やレトルト製品においてフラットサワーを引き起こす細菌であり、非アルコール飲料（特に低酸性飲料など）において指標菌となっている。バチルスコアグランスによる汚染を確認するためには、一般に培養法などの各種確認試験が行われる。培養法に関して例えば、バチルスコアグランスの生菌数検出用の培地に関する出願がある（特許文献１）。しかしながら、培養法でのバチルスコアグランスの検出には、以下の問題点が挙げられる。
バチルスコアグランスの培養には、温度や培地等の適切な調整が必要であり、さらに本菌の増殖は遅発であるため本菌由来の汚染を確認する場合には、１週間程度は必要である。
したがって、バチルスコアグランスによる汚染の確認試験の操作は煩雑で熟練を求められる。
【０００３】
微生物の検出方法としては、培養法の他に遺伝子による検出方法がある。遺伝子検出法とは、PCR法で特異的なプライマーによりターゲットの増幅産物を増幅させて検出する方法である。微生物を特定する遺伝子の対象領域としては16SやITSなどさまざまな領域が存在し、種々のプライマーを用いることで対象遺伝子の増幅が試みられている。
しかしながら、製造現場での検出では、バチルスコアグランスの有無を判断することが求められているが、現在までに報告されているPCR法を用いたバチルスコアグランスの検出では、3.9×103cfu/mlでなければ検出できない。したがって、感度を高めることは実用化に向けて課題である（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平6-113823号公報
【特許文献２】特開2003-38182号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、被検試料中のバチルスコアグランスを特異的、短時間、かつ、高感度で検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、バチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子に特異的な塩基配列又は前記塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記特異的な塩基配列が配列番号１又は２に示される塩基配列である、前記オリゴヌクレオチドを提供する。
また、本発明は、バチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子を鋳型としてPCR法を行うために用いられるオリゴヌクレオチドプライマーであって、バチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子に特異的な塩基配列又は前記塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを１種以上含み、前記特異的な塩基配列が配列番号１又は２に示される塩基配列である、前記オリゴヌクレオチドプライマーを提供する。
また、本発明は、被検試料におけるバチルスコアグランスの存在の判定方法であって、被検試料から核酸を抽出し、前記オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR法を行うことを含む前記判定方法を提供する。
また、本発明は、被検試料から抽出した核酸を鋳型としてPCR法を行うことによって得られる特定の増幅産物を指標として、前記被検試料におけるバチルスコアグランスの存在を判定するために用いられる判定キットであって、バチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子に特異的な塩基配列又は前記塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記特異的な塩基配列が配列番号１又は２に示される塩基配列である前記オリゴヌクレオチドを１種以上含む前記キットを提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、被検試料中のバチルスコアグランスを特異的、短時間、かつ、高感度で検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】被検試料中の菌体濃度を変えた結果を示す電気泳動図である。
【図２】核酸（RNA）分解酵素阻害剤の種類及び濃度を変えた結果を示す電気泳動図である。
【図３】各種菌体に対する検出結果を示す電気泳動図である。
【図４】バチルスコアグランスの各種株に対する検出結果を示す電気泳動図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の被検試料におけるバチルスコアグランスの存在の判定方法は、被検試料から核酸を抽出し、特定のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR法を行うことを含む。
被検試料としては、緑茶、烏龍茶、麦茶などの低酸性飲料をはじめとする飲料のほか、レトルト食品及びこれらの原料などが挙げられる。
被検試料から核酸（RNA）を抽出する方法としては、従来技術において公知の方法を使用することができる。例えば、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）などを用いて行うことができる。また、抽出の際には、RNA分解酵素阻害剤としてジチオトレイトールを用いることが好ましい。従来技術においてよく使用されているβ-メルカプトエタノールを用いる場合と比較して、検出感度が高くなる。また、ジチオトレイトールはβ-メルカプトエタノールのように猛烈な悪臭や異臭を発することも無く、毒物及び劇物に指定されたβ-メルカプトエタノールよりも扱いが容易である。好ましくは、ジチオトレイトールは、20〜80mMの範囲で用いられ、より好ましくは35〜60mMの範囲で用いられる。
また、被検試料から核酸を抽出する前に、例えばメンブレンフィルターを用いて菌体を補足し、これを培養してもよい。これにより検出感度を高めることができる。
【００１０】
本発明の判定方法においては、次いで抽出した核酸を鋳型としてPCR法を行う。PCR法においては、バチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子に特異的な塩基配列又は前記塩基配列の相補的配列を含むオリゴヌクレオチドを１種以上含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。ここで、前記特異的な塩基配列は、下記配列番号１又は２に示される塩基配列である。
(5')GCATGGAGAAAAAGGAAAG(3')（配列番号１）
(5')CCCGAAGGCCTTCTTCAC(3')（配列番号２）
配列番号１又は２で表される塩基配列又はこれに相補的な塩基配列に50以下、好適には20以下の塩基が付加されたオリゴヌクレオチドを含むものであっても、このようなオリゴヌクレオチドがバチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子に特異的である限り、本発明においてオリゴヌクレオチドプライマーとして使用しても良い。さらに、配列番号１又は２で表される塩基配列又はこれに相補的な塩基配列において、10以下の塩基が、置換、欠失、挿入及び/又は付加されたオリゴヌクレオチドを含むものであっても、このようなオリゴヌクレオチドがバチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子に特異的である限り、本発明においてオリゴヌクレオチドプライマーとして使用しても良い。本発明の判定方法において、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマーとして、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。
【００１１】
本発明の判定方法において、PCR法は公知の方法を用いて行われる。例えば、抽出された核酸（RNAまたはDNA）を鋳型としてcDNAを合成し、熱変性によりcDNAを一本鎖にした後（例えば94℃）、これにプライマーをアニーリングさせ（例えば、60℃）、耐熱性DNAポリメラーゼを用いて相補鎖を合成する（例えば、72℃）、というサイクルを、例えば20〜40回繰返すことにより、目的とする遺伝子領域だけを増幅させる。このようにして得られた増幅産物を、例えば電気泳動やクロマトグラフィー、DNAチップ（マイクロアレイ）、抗原抗体反応などによって検出することができる。
【実施例】
【００１２】
１．前培養
あらかじめ適宜希釈した菌体１mLを500mLの緑茶に摂取して菌懸濁液を得た。この菌懸濁液500mLをメンブレンフィルターにより吸引ろ過して菌体を捕捉し、このメンブレンフィルターを平板寒天培地上に載せた。次いで、バチルスコアグランスの最適な増殖温度である45℃で６時間の培養を行った。使用した寒天培地は以下のとおりである。
製品名：パールコア標準寒天培地（栄研化学株式会社製）
組成（培地：1,000mLあたり）：
酵母エキス：2.5ｇ
リプトン：5.0ｇ
ブドウ糖：1.0ｇ
カンテン：15.0ｇ
【００１３】
２．核酸（RNA）抽出
上記で示す培養したメンブレンフィルターを回収し、RNeasy Mini Kit（QIAGEN社）を使用して、次のようにして核酸の抽出を行った。
・溶菌工程
（１）ハイブリダイゼーション用バックにメンブレンフィルターを挿入した。
（２）リゾチーム（15mg/mL）を添加したTEバッファーを400μL添加後、ヒートシールした。
（３）室温で10分間静置した（ただし、２分間隔で10秒間揉む）。
（４）バッファーRLTにRNA分解酵素阻害剤としてDTTの終濃度が40mMとなるように加えたものを1.4mL添加した。
（５）混合液を２mLチューブに回収した。
（６）18900×ｇで２分間遠心し、上清1.6mLを除き、エタノールを１mL添加し、ピペッテイングにて激しく撹拌した。
・精製工程
（１）得られた溶菌液をカラムにアプライし、8000×ｇで15秒間遠心した後、流下液を廃棄した。
（２）700μLのバッファーRW1を加え、≧8000×ｇで15秒間遠心し、流下液とチューブを廃棄した。
（３）新しいチューブにカラムを移し、500μLのバッファーRPEを加え、≧8000×ｇで15秒間遠心し、流下液を廃棄した。
（４）500μlのバッファーRPEを加え、≧8000×ｇで２分間遠心した。
（５）新しい1.5mLチューブにカラムを移し、30〜50μLのRNase Free Waterを添加し、8000×ｇで１分間遠心してRNAを抽出した。
【００１４】
３．バチルスコアグランスの特異的なヌクレオチド配列の特定
バチルスコアグランスを特異的に検出するために、他の微生物と異なる特異的なバチルスコアグランスの16S rRNA遺伝子をコードするヌクレオチド配列を特定し、そのヌクレオチド配列と相補的になるように化学合成された以下のオリゴヌクレオチドをRT-PCR法のプライマーセットとして用いた。
(5')GCATGGAGAAAAAGGAAAG(3')（配列番号１）
(5')CCCGAAGGCCTTCTTCAC(3')（配列番号２）
【００１５】
４．RT-PCR増幅
上記プライマーセットを用いてRT−PCRによる増幅を行った。反応は、サンプル５μLに対して、逆転写酵素：Prime Script Rtase 、DNA 合成酵素：Takara Ex TaqTM及びRNase Inhibitorを含むPrime Script One Step RT-PCR Kit Ver.2（タカラバイオ株式会社）を２μL、反応バッファーにdNTP Mixture及びOne Step Enhancer Solutionを含む「2×1 step buffer」（タカラバイオ株式会社）を25μL、プライマーとして配列番号１及び配列番号２に示すプライマーセットを20pmol加え、最終的に滅菌水で50μLに調整して行った。 RT-PCR条件を以下に示す。
（ｉ）逆転写：50℃/30分〔１サイクル〕
（ii）熱変性：94℃/２分〔１サイクル〕
（iii）熱変性：94℃/１分、アニーリング：60℃/１分、伸長反応：72℃/１分〔30サイクル〕
（iv）伸長反応：72℃/２分〔１サイクル〕
【００１６】
５．検出
３％アガロースゲルを用いてTAE Buffer中で120Ｖ及び40分間の条件で電気泳動し、臭化エチジウム溶液で15分染色した。流水で15分間洗浄した後、トランスイルミネーターにより発色させ、カメラで撮影した。
【００１７】
６．検出可能な菌体濃度
被検試料中の菌体濃度を変えた結果を図１に示す。Sample 1は、1.1×104cfu/mLの菌体濃度のサンプルから核酸（RNA）を抽出したものである。Sample 2〜5は、段階希釈（数字が増えるに従い菌体数は1/10ずつ減少する）したサンプルである。なお、Sample 5は、約1cfuに相当する。
この結果より、本発明の方法は、バチルスコアグランスを14時間で、かつ、ほぼ１菌体からの検出が可能であることを示した。
【００１８】
７．β-MEとDTTの比較
55cfuを含む菌体液10μLをチューブに取り、リゾチーム（15mg/mL）を添加したTEバッファーを100μL添加し、上記核酸抽出操作・溶菌工程（３）以降と同様の操作を続けてサンプルを調整した。この際、核酸抽出操作・溶菌工程（４）において、RNA分解酵素阻害剤をβ-メルカプトエタノール（β-ME）109mM、及びジチオトレイトール（DTT）を20〜76mMとして同様の検出を行った。その結果を図２に示す。
図２から明らかなように、39mM〜60mMのジチオトレイトールを用いることにより、β-メルカプトエタノール109mMよりも抽出効率が格段に高くなる。
【００１９】
８．バチルスコアグランスの特異的な検出
下記に示す菌体の核酸（DNA）抽出サンプル（No.１〜18）について増幅産物の検出を行った。核酸濃度は200ng/mL〜1400ng/mLである。
核酸（DNA）のPCR増幅反応において、手順４を以下のように変更した。サンプル５μLに対して、DNA合成酵素：Takara Ex TaqTMを0.25μL、10xbufferを５μL、dNTP Mixture及びMgCl2を4μL（タカラバイオ株式会社）、プライマーとして手順３で特定したものと同じ配列番号１及び配列番号２に示すプライマーセットを20pmol加え、最終的に滅菌水で50μLに調整して行った。PCR条件は、逆転写反応を含まないことを除いて手順４のRT-PCR条件と同様である。
結果を図３に示す。この結果より、バチルスコアグランスを特異的に検出できることがわかる。
【００２０】
・サンプル
1: Alicyclobacillus  acidocaldarius
2: Bacillus licheniformis
3: バチルスコアグランス（B.coagulans）
4: Bacillus subtilis
5: Bacillus cereus
6: Bacillus megaterium
7: Paenibacillus polymyxa
8: Bacillus smithii
9: Brevibacillus agri
10: Paenibacillus chibensis
11: Staphylococcus aureus
12: Bacillus thruringiensis
13: Sporolactobacillus inulinus
14: Aeromonas hydrophila
15: Escherichia coli
16: Paenibacillus macerans
17: Brevibacillus brevis
18: バチルスコアグランス（B.coagulans）
【００２１】
９．バチルスコアグランスの確実な検出
バチルスコアグランスを確実に検出できることを確認するために、下記の計32株の核酸（DNA）抽出サンプルを入手して上記８と同様の方法で増幅産物の検出を行い、擬陰性を確認した。その結果を図４に示す。この結果より、擬陰性は認められず、すべてのバチルスコアグランスを検出することができた。
【００２２】
・サンプル
上の段、左から                             下の段、左から
Bacillus coagulans  TIFT  115001           Bacillus coagulans  TIFT  115017
Bacillus coagulans  TIFT  115004           Bacillus coagulans  TIFT  115018
Bacillus coagulans  TIFT  115005           Bacillus coagulans  TIFT  115019
Bacillus coagulans  TIFT  115006           Bacillus coagulans  TIFT  115020
Bacillus coagulans  TIFT  115007           Bacillus coagulans  TIFT  115021
Bacillus coagulans  TIFT  115008           Bacillus coagulans  TIFT  115022
Bacillus coagulans  TIFT  115012           Bacillus coagulans  TIFT  115025
Bacillus coagulans  TIFT  115013           Bacillus coagulans  TIFT  115026
Bacillus coagulans  TIFT  115014           Bacillus coagulans  TIFT  115027
Bacillus coagulans  TIFT  115015           Bacillus coagulans  TIFT  115028
Bacillus coagulans  TIFT  115016           Bacillus coagulans  TIFT  115029
No Sample                                  Bacillus coagulans  TIFT  115030
Maker                                      Bacillus coagulans  TIFT  115031
Bacillus coagulans  ATCC  8038             Bacillus coagulans  NBRC  3557
Bacillus coagulans  ATCC  11014            Bacillus coagulans  NBRC  3886
Bacillus coagulans  ATCC  11369            Bacillus coagulans  NBRC  3887
Bacillus coagulans  ATCC  12245            Bacillus coagulans  NBRC  12583
Bacillus coagulans  ATCC  15949            Bacillus coagulans  NBRC  12714
Bacillus coagulans  ATCC  23498
Bacillus coagulans  ATCC  31284
Bacillus coagulans  ATCC  BAA-748
TIFT：東洋食品研究所
NBRC：独立行政法人 製品評価技術基盤機構 生物遺伝資源部門
ATCC：American Type Culture Collection
【図１】
0005605739.tif 000002
【図２】
0005605739.tif 000003
【図３】
0005605739.tif 000004
【図４】
0005605739.tif 000005
【配列表】
0005605739000001.app