(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
注射可能なハイドロゲル形状の生体材料であり、ヒト以外の動物由来であり、臍帯内に存在し、臍帯膜と、血管と、細胞あるいは細胞残留物とを有していないグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の混合物を含むことを特徴とする生体材料。
【請求項２】
ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、デルタマン硫酸、およびヘパリンから成るグループから選択されるグリコサミノグリカンの混合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の生体材料。
【請求項３】
グリコサミノグリカンの上記混合物の総量の４０〜８０％にヒアルロン酸を含むことを特徴とする請求項２に記載の生体材料。
【請求項４】
グリコサミノグリカンの上記混合物の総量の２〜２５％にケラタン硫酸を含むことを特徴とする請求項２に記載の生体材料。
【請求項５】
グリコサミノグリカンの上記混合物の総量の３〜１０％にコンドロイチン−６−硫酸を含むことを特徴とする請求項２に記載の生体材料。
【請求項６】
グリコサミノグリカンの上記混合物の総量の１〜９％にヘパラン硫酸を含むことを特徴とする請求項２に記載の生体材料。
【請求項７】
グリコサミノグリカンの上記混合物の総量の０．５〜７％にコンドロイチン−４−硫酸を含むことを特徴とする請求項２に記載の生体材料。
【請求項８】
グリコサミノグリカンの上記混合物の総量の０．１〜７％にデルマタン硫酸を含むことを特徴とする請求項２に記載の生体材料。
【請求項９】
グリコサミノグリカンの上記混合物の総量の０．０５〜３％にヘパリンを含むことを特徴とする請求項２に記載の生体材料。
【請求項１０】
ヒト以外の動物の臍帯由来の生体材料であって、ヒアルロン酸（７０％）、ケラタン硫酸（１０％）、コンドロイチン−６−硫酸（７％）、ヘパラン硫酸（５％）、コンドロイチン−４−硫酸（４％）、デルマタン硫酸（３％）、およびヘパリン（１％）を含むことを特徴とする請求項２に記載の生体材料。
【請求項１１】
上記注射可能なハイドロゲルは、１０ｃＳ〜１５０，０００ｃＳの粘度を有することを特徴とする請求項１から１０に記載の生体材料。
【請求項１２】
１０〜１５，０００ｃＳの粘度を有することを特徴とする請求項１１に記載の生体材料。
【請求項１３】
１０〜２，０００ｃＳの粘度を有することを特徴とする請求項１２に記載の生体材料。
【請求項１４】
三次元構造を有することを特徴とする請求項１２に記載の生体材料。
【請求項１５】
直径が０．５〜１０００μｍの孔を有する実質的な多孔性構造を備えたことを特徴とする請求項１３に記載の生体材料。
【請求項１６】
上記孔の直径は０．５〜５００μｍであることを特徴とする請求項１５に記載の生体材料。
【請求項１７】
さらに細胞を含むことを特徴とする請求項１から１６に記載の生体材料。
【請求項１８】
上記細胞は、未分化間葉幹細胞または他の細胞株に分化した間葉幹細胞、および／または未分化造血幹細胞または他の細胞株に分化した造血幹細胞、および／または軟骨細胞、および／または軟骨芽細胞、および／または骨芽細胞、および／または骨細胞、および／またはケラチノサイト、および／または繊維芽細胞、および／または筋細胞、および／または脂肪細胞、および／または神経細胞、および／または神経系由来の他の細胞、および／または白血球系由来の細胞、および／または角膜細胞、および／または内皮細胞、および／または上皮細胞から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１７に記載の生体材料。
【請求項１９】
上記生体材料は、複合材料を形成する補強材と組み合わせられていることを特徴とする、請求項１から１８のいずれか１項に記載の生体材料。
【請求項２０】
請求項１から１８に記載の生体材料を取得する生体材料の取得方法であって、
（ａ）ヒト以外の動物の臍帯を取得する工程、
（ｂ）食塩水および抗生物質にて上記臍帯を処理する工程
（ｃ）上記臍帯の表面から全ての血液を除去する工程、
（ｄ）上記臍帯を１〜２ｃｍの切片に切断する工程、
（ｅ）内部に残留する全ての血液を洗浄する工程、
（ｆ）臍帯膜および血管を除去する工程、
（ｇ）ウォートンジェリーを含むゼラチン状物質を分離する工程、
（ｈ）得られた上記ゼラチン状物質を酵素消化する工程、
（ｉ）ＧＡＧを沈殿させて単離する工程、を含むことを特徴とする生体材料の取得方法。
【請求項２１】
上記方法は、さらに、請求項２０の工程（ｉ）にて得られたＧＡＧを溶解する工程を含むことを特徴とする請求項２０に記載の生体材料の取得方法。
【請求項２２】
上記方法は、さらに、請求項２０の工程（ｉ）にて得られたＧＡＧを架橋する工程を含むことを特徴とする請求項２０に記載の生体材料の取得方法。
【請求項２３】
共有結合の上記架橋が、温度変化、化学反応、または光重合により実行されることを特徴とする請求項２２に記載の生体材料の取得方法。
【請求項２４】
イオン結合の架橋が、ウォートンジェリーの中の単離されたＧＡＧ成分に対する側鎖の変異により実行されることを特徴とする請求項２２に記載の生体材料の取得方法。
【請求項２５】
軟部組織の改良、充填、または再構築のために用いられる請求項１から１９に記載の生体材料であって、
小皺、皺、および傷跡（やけど、潰瘍、軟部組織増大、顔面の脂肪萎縮、椎間板疾病、軟骨修復、筋骨格損傷、変形性関節症および関節周囲炎）の治療；
鎮痛剤および炎症抑制剤としての、腫瘍、膣疾患、脳損傷、骨髄修復、神経変性疾患、循環器疾患、および潤滑プロセスの治療；
やけど、潰瘍、および真皮性−表皮性の異常の治療、膜外傷、網膜損傷あるいは白内障といった眼科疾病の治療；
軟骨の修復、骨軟骨異常、骨関節炎または骨異常といったものにおける骨関節系の治療、および膣疾患の解消におけるアジュバント、歯肉炎および歯周炎の治療；および、
細胞培養系の開発での使用；に用いられることを特徴とする生体材料。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の技術分野〕
本発明は、臍帯の細胞外マトリックスから形成され、再生医療に利用する生体材料、特にハイドロゲルに関する。本発明は、特に、臍帯のウォートンジェリー（ＷＪ）内にのみ存在するグリコサミノグリカンから主に構成される生体材料、および、その製造方法並びにその利用方法に関する。実施態様によっては、この生成物を、単独で用いてもよいし、または細胞ベースの療法と組み合わせて用いてもよい。
【０００２】
〔発明の背景〕
高分子から形成される生体材料が、再生医療において中心的な役割を果たしている。これは、このような生体材料が、移植細胞の接着、増殖、および分化のために一時的な三次元アンカーを提供するからである。この三次元構造は、細胞間の情報伝達についての好適な基盤と、細胞と生体材料の構成要素との関係性とを提供する。マトリクスと細胞との間に生じる生体相互作用は、時間が経つと、細胞の増殖能力、新たな組織を形成するためのその組織化、その分化、および再生プロセスを導くシグナル分子の分泌を決定する（Dawson et al., 2008）。
【０００３】
これらの現象を生じさせるためには、生体材料は、再生結果を伴う好適な細胞内作用がもたらされるように、その構造を十分に長く維持しながら、再吸収されるまでの限られた時間、その適用部位に留まる必要がある。
【０００４】
ハイドロゲルは、特殊なタイプの生体材料であり、組織工学での利用に適した多数の特性を有している。
【０００５】
ハイドロゲルは、天然または合成の性質の親水性高分子を相互連結させることによって形成された構造であり、その構造内に、それ自体の重量の１０−２０％から数百倍までの大量の水を含有する性能を有する。これらのゲルは、三次元格子を有する半流動形態をしている。三次元格子は、支持体として機能することが可能な構造的マトリクスを形成するための理想的な候補である。この三次元構造は、物理的架橋および化学的架橋の両方によって形成することが可能である。物理的架橋は、最終用途に応じて構造を反転することが可能な可逆性ハイドロゲルを導く。その一方で、共有結合した化学的架橋は、適用中はその構造が維持される永久的なハイドロゲルを導く（Coburn et al., 2007）。従って、ハイドロゲルは、水と接触して膨張し、柔軟な弾性材料を形成する三次元網目構造の形で架橋された（天然または合成の性質の）高分子材料であり、その構造中に、溶解しなければその大きな断片を保持している。
【０００６】
ハイドロゲルは、一連の特別な特徴を有している。それは、例えば、次の通りである。
１．親水性：その構造内に水溶性の基（−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ、ＳＯ３Ｈ）が存在していることによる。これらの基は、天然の組織に似た含水量を有している（Elisseeff et al., 2005）。
２．不溶性：その構造内に、粘着性のある三次元高分子網目構造が存在していることによる。
３．これらのハイドロゲルは、親水性の初期モノマー、および高分子の低い架橋密度によって決定されるゼラチン状の粘性を有している。
【０００７】
これらのハイドロゲルは、水または水溶液の存在下において膨張し、その体積を、化学−物理平衡に達するまで著しく増大させるが、その形状は失わないという能力を有している。この膨張する能力は、柔軟な組織において細胞に与えられている微環境と匹敵する水溶性の微環境を提供する。水および多孔性構造の存在により、低分子量の溶質や、細胞存続性にとって重大かつ重要な栄養素を流動させることが可能になると共に、細胞老廃物をハイドロゲルの外部に運搬することが可能になる（Torres et al., 2000）。
【０００８】
ムコ多糖類とも呼ばれるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）は、有機体においてタンパク質核に結合されプロテオグリカンと呼ばれる巨大分子を形成した状態で見つかるヘテロ多糖である。グリコサミノグリカンは、細胞の表面上または細胞外マトリックス内に存在することが可能であり、細胞−細胞の相互作用、および細胞−細胞外マトリックスの相互作用にとって重要な機能を果たすものである。グリコサミノグリカンは、硫酸化および非硫酸化の形態を有し、これらの分子の共通の特徴は、異なる２つの糖によって形成される二糖類の反復配列を含む。異なる２つの糖のうちの一方は、通常、ヘキサウロン酸であり、他方は、ヘキソサミンである。二糖類の結合および硫酸化の位置を構成的に変形させることによって、これらの鎖の物理的特性および化学的特性における多様性が増大する。硫酸含有率が高いこと、およびウロン酸が存在することによって、ＧＡＧに大きな負電荷を与え、このため、ＷＪ中に大量のＧＡＧが存在することでこの組織が過度に親水性になる。
【０００９】
数種類のＧＡＧが存在しており、ＧＡＧは、その構造のためだけではなく、これらが幾つかの細胞シグナル分子のためのアンカー部位であるという理由により、基本的な細胞機能に直接的に関連している。
【００１０】
ヒアルロン酸は、ＷＪ中に最も豊富に存在するＧＡＧである。これは、ＧＡＧのファミリーの唯一の非硫酸化メンバーであり、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遊離炭水化物のように機能する。その構造は、Ｄ−グルクロン酸および（１−β−３）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなる二糖類の反復から構成されている（Goa et al., 1994; Laurent et al., 1992）ヒアルロン酸は、幾つかの種類の細胞によって合成され、細胞外の空間に分泌され、そこで、細胞外マトリックスの他の成分と相互作用し、細胞を包囲する支持および保護構造を生成する（Collins et al., 2008）。ヒアルロン酸は、大きな、ポリ陰イオン性の線状高分子であり、１００，０００〜５ｘ１０６Ｄａの分子量を有することが可能な単一の分子である（Toole et al., 2004; Bertolami et al., 1992）。ヒアルロン酸は、大きな体積を有するコイル状構造を有しており、高粘度溶液をもたらす。ヒアルロン酸の個々の分子は互いに関連しており、網状構造または格子を形成している。発達中の組織では、ヒアルロン酸は、細胞増殖および細胞移動に関連する主要な構造的巨大分子と考えられる。
【００１１】
ヒアルロン酸は、血管新生、形態形成、および、細胞外マトリックスの一般的な統合や修復、といった幾つかのプロセスに関連してきた。羊水に含まれる大量のヒアルロン酸が、胎児の傷の修復に有効であることが知られている（Longaker et al., 1989）。健康な肌と傷跡とでは、この分子の性質が変化していることがさらに観察されている。典型的な傷におけるヒアルロン酸は、肥厚性瘢痕におけるヒアルロン酸とは異なっている（Ueno et al., 1992）。
【００１２】
コンドロイチン硫酸は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルガラクトサミンとの二量体の反復から形成される線状高分子である。その有用性が、軟骨成分のマトリクスの変質の原因となる酵素の作用を阻害する関節疾患に対する療法において検証済みである。コンドロイチン硫酸は、補体を阻害することによる抗炎症剤として機能することが可能であり、血栓塞栓性疾患の治療、外科的処置および眼科学のクリニックにおいて有効である。
【００１３】
コンドロイチン硫酸Ｂとして知られるデルマタン硫酸は、その、トロンビンへのヘパリン副因子ＩＩに対する選択的な阻害作用により強力な抗凝血薬であり、出血のリスクが低いためｉｎ  ｖｉｖｏにおいて非常に有効である（Trowbridge et al., 2002）．
一般にはグリコサミノグリカン、そして、特にヘパリンは、血漿カスケード活性を調節する能力を有しており、内因性の凝血経路の阻害を促進し、従来の補体活性経路を異なる地点において阻害する性能を有している（Rabenstein, 2001）。ヘパリンの他の公知の機能は、血管形成の阻害、体液の成長、および、その抗ウイルス活性である。
【００１４】
ヘパラン硫酸は、ヘパリンに極めて関連した構造を有している。ヘパラン硫酸は、動物の組織に広く分布しており、その機能のうち細胞接着と細胞増殖の調整とが最も重要な機能である。ヘパラン硫酸は、タンパク質の劣化に対して保護作用を有しており、タンパク質の基底膜を介した輸送を調整し、その内在化を仲介する（Rabenstein, 2001）。
【００１５】
ヒトまたは動物由来のムコ多糖類に関する幾つかの特許文献が存在する。文献である米国特許第３，８８７，７０３号は、ウシの胎児またはヒツジの胎児の源からの皮膚被蓋および臍帯から得られたムコ多糖類の混合物に関するものである。上述の特許のムコ多糖類を得るためのプロセスは、臍帯から膜、細胞、および血管の要素を除去することを記載していない。この抽出生成物は粉の形で得られるが、この中に含まれている個々のムコ多糖類の構成または量は明確に分からない。このアクティブな生成物は、この混合物中に存在するヘキソサミンの量により識別される。この抽出物により、脂性頭皮や毛髪および炎症の治療のための、注射可能な形態および経口摂取の形態の組成物が調製される。
【００１６】
特許文献である米国特許第５，８１４，６２１号は、主に、水よりも有機溶媒／水の混合物においてより可溶性の高い薬物から構成される組成物、および薬物の一部を形成するムコ多糖類に関するものである。ここで、薬物の結晶または粒子は、ムコ多糖類の粒子の表面上に分布し、該薬物は、単独で溶解されるよりも迅速に水に溶解する。この組成物は顆粒剤の形をしていることがある。
【００１７】
国際公開ＷＯ第２００８／０２１３９１Ａ１号は、臍帯膜を含む生体材料を記載している。この生体材料はさらに、１つ以上の臍帯血管および／またはウォートンジェリーを含んでいることがある。生体材料は、好ましくは乾燥しており、平坦、管状、または、特定の構造に適合するように成形されていてよい。この発明はまた、臍帯膜の少なくとも１つの層を含む生体材料を生成する方法、および、上記生体材料を得るための方法、および、その、組織または臓器を修復するための使用を提供する。
【００１８】
この記載は、臍帯からの生体材料を特徴づけている。この記載によれば、上記材料の組成物は、コラーゲン（タイプＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ。これらのコラーゲンは、生体材料のマトリクスの７５−８０％の比率である）、フィブロネクチン、およびグリコサミノグリカンを含む。
【００１９】
また、この生体材料は、臍帯に由来するものでなく、市販の起源を有するコラーゲンを含んでいてよいことが記載されている。または、この生体材料は、従来技術において公知の方法で、他の組織から単離されることが可能である。この著者らはさらに、この生体材料が、発育因子、ホルモン、抗生物質、免疫調節因子などの非構造的化合物を含んでいてよいことも記載している。
【００２０】
スペイン国特許第８６００６１３号には、体組織を治療するプロセス、細胞膜、核酸、脂質、および細胞成分を分離し、主な成分がコラーゲンである細胞外マトリックスを形成するためのプロセス、および生体組織を生体移植片として使用するために適したものにするためのプロセスである。このプロセスは、生体移植するために適したサイズおよび形状を維持しながら、上記体組織を少なくとも１つの界面活性剤にて抽出する工程を含む。
【００２１】
スペイン国特許２１８０６５３Ｔ３号は、生体物質を細胞の少なくとも７０％を排除するための自己溶解が行われた物質に変換するための方法、および、ヒトまたは動物に移植した後に生体物質が無機物化することを阻害するための該生体物質の取り扱い方法を記載している。この文献は、具体的にはブタの大動脈弁に関するものであるが、初期生体物質は、特に臍帯であってよいことが記載されている。けれども、この文献は、当該方法を臍帯を用いて行うことに関して詳細に記載していない。結果として得られる生体材料は、心臓弁を生成するために用いられる。
【００２２】
特許文献である米国特許第４，２４０，７９４号は、ヒトまたは他の動物の臍帯を、血管の代替物として使用するために調製することに関するものでる。この文献は、具体的には、臍帯をアルコール中で脱水して、その後、これを所望の構成で定着させる技術を記載している。臍帯から存在し得る他の組織の残留物を除去するとすぐに、臍帯を、回転軸上に載せ、特定のエチルアルコール溶液に脱水に必要とされる時間浸すことが記載されている。脱水後、臍帯を１％のアルデヒド溶液中に浸し固定する。
【００２３】
特許文献であるフランス国第２，５６３，７２７号には、ウォートンジェリーが浸透され、凍結温度にて保存されていた、凍結が解除された結合組織から植皮片を生成するための方法が記載されている。著者らは、臍帯組織に固定され、圧縮空気を注入するカニューレを用いて拡張される装置を記載している。この記載によれば、その後、臍帯が切断および単離されるが、このプロセスに起因する生成物は、ＷＪだけから形成されているわけではない。
【００２４】
臍帯を用いて対象の細胞を得ることを記載した特許文献が存在する。この目的のために、ウォートンジェリーを単離し、これを除去して、上記細胞を得るためのプロセスが実施される。例えば、ＰＣＴ文献であるＰＣＴ出願第９８／１７７９１号には、臍帯からプレ軟骨細胞を単離することが記載されている。その後、プレ軟骨細胞は治療に用いられ、軟骨を生成する。同様に、文献である国際公開ＷＯ第２００４／０７２２７３Ａ１号には、臍帯の血管周囲の領域内にあるウォートンジェリーから前駆細胞を抽出し、ヒト組織を修復するために用いることが記載されている。
【００２５】
他の類似の生体材料とは異なり、本発明の生体材料は、臍帯のＷＪ中に存在する異なるＧＡＧの組み合わせから構成される。異なるＧＡＧの組み合わせは、主に、ヒアルロン酸から構成されるが、さらに、他のＧＡＧ化合物とは異なり、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、およびコンドロイチン−６−硫酸を含む。臍帯のＷＪ中に存在する異なるＧＡＧの特定の組み合わせは、生体材料の生理活性を向上させる。なぜなら、各ＧＡＧが、細胞挙動の制御的機能を実行するからである。例えば、ヘパラン硫酸およびヘパリンは、ＦＧＦおよびＥＧＦのための主な結合部位であることが知られている（Kanematsu et al., 2003; Ishihara et al., 2002）。ＦＧＦおよびＥＧＦは、ヘパラン硫酸およびヘパリンを蛋白質分解から保護し、細胞環境におけるこれらの因子の局所的な集中を可能にし、高い細胞活性化に適した分子的な微環境を生成する（Malkowski et al., 2007）。
【００２６】
しかし、我々が知る限り、臍帯のウォートンジェリーに由来するＧＡＧによって形成される生体材料、すなわち、（１）臍帯膜および血管が存在せず、（２）粘度が調節可能なハイドロゲルを形成可能であり、（３）広範囲のヒトの病理に適用可能な、生体材料について記載された文献は存在しない。さらに、上述した特許文献の例は、本明細書において記載する本実施形態とは明らかに異なる臍帯由来生成物を含むものである。本発明の生体材料は、ＷＪと呼ばれる臍帯の細胞外マトリックスだけを形成するグリコサミノグリカンに基づくものである。従って、上記文献において、細胞外マトリックスを合成するための多くの試みが発見されているが、特定の組織の自然状態を正確にシミュレートする組成物は、実現されていない。
【００２７】
本発明において開発した生体材料は、組織工学のベースマトリクスとしての用途を潜在的に有する三次元足場（骨格、基礎）を提供することが可能である。さらに、直接適用するか、病理における１つの構造として細胞と組み合わせて適用する場合、上記生体材料は、再生プロセスを仲介し、走化性を持って周辺組織の細胞に作用し、これによって、細胞プロセスの活性化のための好適な環境を提供する。
【００２８】
上記生体材料中に存在するＧＡＧの組み合わせは、特定のシグナル分子結合部位を多数提供する。このシグナル分子結合部位は、適用部位において、治療された欠陥を再生および修復する高いレベルの細胞外マトリックスの合成のために、組織自体の細胞活性を高くすることが可能である。
【００２９】
さらに、本発明の生体材料の由来は、非免疫原性領域からのヒトまたは動物由来の天然物を条件とする。この生体材料は、人体内の自然の生体内分解プロセスによって除去されるため、望ましくない反応または他の生体材料によって生じる副作用が回避される。例えば、幾つかの合成生体材料は、炎症、硬結（臓器組織の硬化）、肉芽腫の発症、粘膜の壊死、その製造において用いられる物質の毒性による組織合併を引き起こすことがある。
【００３０】
臍帯内のＧＡＧの最も重要な機能のうちの１つは、その中に位置する血管系を、外部の物理的障害（例えば、臍帯のよじれは胎児にとって致命的である）から保護するための強度、弾性、および、抵抗を提供することである。実際、これらの分子の合成における欠陥は、妊娠中の重要な病理に関連している（Gogiel et al., 2005）。従って、臍帯の一部を形成する７つの異なる種類のＧＡＧから成る生体材料は、有機体において生じる生理活性の反復性、臍帯に有効な同一の機械特性、および、さらなるプロセスおよび変形に適していること（例えば、架橋）などの性能を保有しているため、高い汎用性を有すると考えられる。
【００３１】
〔図面の説明〕
図１は、本発明の生体材料中に存在するＧＡＧの特徴付けおよび定量化を示す図である。棒グラフは、本発明の生体材料中に存在する異なる種類のＧＡＧを示すと共に、それぞれの構成比率を示している。ＨＡ：ヒアルロン酸、ＫＳ：ケラタン硫酸、Ｃ６Ｓ：コンドロイチン−６−硫酸、ＨＳ：ヘパラン硫酸、Ｃ４Ｓ：コンドロイチン−４−硫酸、ＤＳ：デルマタン硫酸、Ｈ：ヘパリン。
【００３２】
図２は、組織学的染色法を用いて、サンプル中のＧＡＧの存在、および、該サンプル中の細胞およびＤＮＡ／ＲＮＡの明らかな欠如を証明する図である。左の図は、細胞を有するサンプルを示しており、右の図は、生体材料だけを染色したものを示している。Ａ、Ｂ：ヘマトキシリン−エオシン染色液；Ｃ、Ｄ：メチルグリーン−ピロニン染色液；Ｅ、Ｆ：アルシアンブルー染色液。
【００３３】
図３は、本発明の生体材料の内部の三次元構造を示す、走査型電子顕微鏡による画像である。この画像は、本発明の生体材料の内部構造を異なる２つの倍率で示している（Ａ：１０μｍ、Ｂ：５μｍ）。この画像では、極めて均一な多孔質構造を提供する相互に連結されたＧＡＧユニットが確認できる。
【００３４】
図４は、本発明の生体材料中の細胞の毒性に関する研究結果を示す図である。このグラフは、ＡＭＳＣ細胞（脂肪−由来の間葉幹細胞）（Ａ）、マウスの繊維芽細胞（Ｂ）、Ｌ９２９（Ｃ）、骨芽細胞（Ｄ）、軟骨細胞（Ｅ）、およびケラチノサイト（Ｆ）における細胞毒性曲線を示している。これらの結果は、コントロール（生体材料を有さない細胞）、およびポジティブコントロール（ＩＳＯ−１０９９３規格に応じて決定された毒性の生体材料中の細胞、ＰＶＣ）に対するものである。グラフからわかるように、生体材料は、試験したどの種類の細胞においても毒性を生じさせない。これは、生体材料に配置された細胞のミトコンドリア活性が、コントロール細胞に対して差異を示さないからである（標準培地条件下）。
【００３５】
図５は、三次元の生体材料の拡大画像である。標準的な２４−ウェル培養プレートを鋳型として用いて本発明の固体の生体材料を凍結乾燥させた後の、肉眼で認識できる三次元構造が示されている。
【００３６】
図６は、ＭＴＴで染色された、本発明の生体材料と共培養した関節の軟骨細胞（軟骨細胞）およびＭＳＣの生存率を示す倒立光学顕微鏡画像である。染色は、３日間と７日間との両方行った。黒く染色された細胞は、生細胞であり代謝的に活性なものである。
【００３７】
図７は、ヒト軟骨細胞の増殖能力を、本発明の生体材料とヒアルロン酸とにおいて比較した図である。グラフ中のデータは、本発明の生体材料において維持された軟骨細胞の増殖能力が、ヒアルロン酸において培養された軟骨細胞よりも著しく増大していることを示している。
【００３８】
図８は、本発明の生体材料およびヒアルロン酸に接触させた繊維芽細胞Ｌ−９２９の増殖率を示す図である。グラフは、本発明の生体材料内に配置された細胞の増殖率が、ヒアルロン酸において培養された細胞と比べて、著しく増大していることを示している。
【００３９】
図９は、本発明の生体材料と供に細胞培養プラスチックに接種された細胞、およびヒアルロン酸ハイドロゲルと共に供に細胞培養プラスチックに接種された細胞の、倒立蛍光顕微鏡画像である。ここで、本発明の生体材料およびヒアルロン酸ハイドロゲルは該細胞培養表面と接触して配置された。これらの画像において、本発明の生体材料に接触させた細胞が、細胞培養表面から分離され、本発明の生体材料の内部で塊を形成していることが観察できる。
【００４０】
図１０は、コラーゲンＩＩおよびベルシカンの発現のＲＴ−ＰＣＲを示す図である。アガロースゲルを比重走査した結果が示されている。データは、コントロール値（Ｃ）に対する強度の任意単位として示されており、平均値±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。この画像は、本発明の生体材料に配置されたＡＭＳＣにおけるタイプＩＩコラーゲンの発現、および、ベルシカンの減少を示している。これらの発現特性は、軟骨細胞表現型への分化プロセスにおける、および成体の関節軟骨に相当する細胞外マトリックスの合成における細胞を示すものである。
【００４１】
図１１は、本発明のブタおよびヒト由来の生体材料についての異なる３つの濃度における貯蔵弾性率を示す図である。データは、サンプルの線形粘弾性を有する各領域に由来する単一の励起周波数／株から収集されたものである。生理学的な値を一括している温度間の温度スィープ（sweep）は、全てのサンプルについての粘弾性の温度の関係を示している。
【００４２】
図１２は、ブタおよびヒト由来のヒストゲルについての３つの異なる濃度における損失弾性率を示す図である。データは、サンプルの線形粘弾性を有する各領域に由来する単一の励起周波数／株から収集されたものである。生理学的な値を一括している温度間の温度スィープは、全てのサンプルについての粘弾性の温度の関係を示している。
【００４３】
図１３は、本発明のブタおよびヒト由来の生体材料についての３つの異なる濃度における損失弾性率を示す図である。データは、サンプルの線形粘弾性を有する各領域に由来する単一の励起周波数／株から収集されたものである。生理学的な値を一括している温度間の温度スィープは、全てのサンプルについての粘弾性の温度の関係を示している。
【００４４】
図１４は、周辺組織からの細胞加入（走化性）を示す、１日目（ａ）、３日目（ｂ）、および４日目（ｃ）の光学顕微鏡の画像である。ここで、（ｉ）は、ポジティブコントロールに相当し、（ｉｉ）は、ヒアルロン酸の実験セットに相当し、（ｉｉｉ）は、ネガティブコントロールに相当し、（ｉｖ）は、本発明の生体材料の実験セットに相当する。
【００４５】
図１５は、軟骨切片の表面に移動した細胞が生細胞であるかどうかを判別するための生死アッセイを行った後の光学顕微鏡の画像である。この画像は、軟骨切片から表面に出てきた大部分の細胞は、生細胞であることを示している。
【００４６】
図１６は、周辺組織からの細胞加入（走化性）を示す、５日目（ａ）および６日目（ｂ）の光学顕微鏡の画像である。ここでは、（ｉ）は、ポジティブコントロールに相当し、（ｉｉ）は、ヒアルロン酸の実験セットに相当し、（ｉｉｉ）は、ネガティブコントロールに相当し、そして（ｉｖ）は、本発明の生体材料の実験セットに相当する。
【００４７】
〔発明の詳細な説明〕
臍帯は、ＷＪと呼ばれる軟部結合組織の一部を構成する大量の（硫酸化および非硫酸化）ＧＡＧを含有している。これらのＧＡＧのうち、主な非硫酸化ＧＡＧは、ヒアルロン酸である（Hadidian et al., 1948; Jeanloz et al., 1950）けれども、硫酸化ＧＡＧもより少ない比率で検出されている（Danishefsky et al., 1966）。さらに、臍帯についての組織研究は、ヘパリンの存在を示唆している（Moore et al., 1957）。臍帯が、まだ識別されていない硫酸化ＧＡＧをわずかに有する可能性も極めて高い。
【００４８】
本発明は、臍帯のＷＪにのみ存在するＧＡＧから成る、注射可能なハイドロゲルに関する。このハイドロゲルは、細胞や、生体材料が得られる臍帯中に存在する他の血管成分を全く含んでいない。そのため、ほとんど免疫原性を有さない。本発明の生体材料は、細胞と組み合わされた形であっても単独であっても、治療上の処置および化粧にも有用である。
【００４９】
ここで、本発明の文脈において、次の用語を規定する。
【００５０】
“ハイドロゲル”とは、コロイドの構成を指し、分散相（コロイド）が連続相（水）と組み合わされて粘性のジェリー状物質を生成しているものである。このコロイドは、典型的には、合成または天然の親水性の繊維状の浸透性網状組織ある。
【００５１】
“注射”とは、ある物質を空洞に強制的に挿入することを指す。例えば、（通常は、治療上の値の）物質が、傷、または人体の空洞、循環部、あるいは他の位置に注射される。本発明の目的のために、注射は、所望の位置への浸透の種々の様態から構成される。例えば、注射は、０．５ｍｍ〜１５ｍｍの範囲のゲージサイズの皮下注射器を含んでいてよい。関節鏡視下手術または腹壁切開手術では、内部病理の治療をするために円柱ポート、針、または他の類似の物体が用いられる。この形態の注射では、足場としての治療剤が、皮下注射器よりも著しく大きなゲージサイズを有することが可能な（例えば、０．５ｃｍ〜４ｃｍの）アクセスポートを強制的に貫通する。
【００５２】
“注射可能なハイドロゲル”とは、注射技術を用いて、皮膚の保護体に侵入した病理にハイドロゲルを適用する行為に言及するものである。例えば、この病理は、皮膚の保護体の下の治療を必要とする、慢性の傷、損傷した臓器、損傷した組織、または他の任意の負傷であってもよい。適用方法は、皮下注射器から、関節鏡視下／腹腔鏡下の技術、具体的には物質を患部に適用するように設計された特別な装置まで、広範囲にわたり様々である。例えば、高粘度物質を供給するためにコーキングガン類似物を用いてよい。繊維状高分子化ハイドロゲル物質を供給するための針に通す糸を巻く装置を用いてもよい。ハイドロゲルプラグを軟骨性の関節丘の欠陥に供給するために関節鏡視下／腹腔鏡下のポートを用いてもよい。注射技術には多数の可能性があることは、当業者には明らかであろう。
【００５３】
“架橋されたハイドロゲル”とは、ハイドロゲル（可逆性または非可逆性であってよい）のイオン結合または共有結合の安定化に言及するものである。架橋されたハイドロゲルは、架橋されていないハイドロゲルよりも高い粘度を有しており、操作性に優れ、好適な三次元形態を有し、機械的な力を加えると破裂し得る。
【００５４】
“三次元ハイドロゲル”とは、例えば孔のような安定した微細な三次元構造を含む三次元の形状を維持する、架橋されたハイドロゲルを指す。逆に、架橋されていないハイドロゲルは、それが配置される任意の容器を充填するように流れる。架橋されたハイドロゲルの流れに対するこの抵抗は、安定した三次元構造を維持する架橋されたハイドロゲルの能力の特性である。
【００５５】
本発明の目的のためにＷＪを抽出する臍帯の起源は、動物およびヒトを含む哺乳類に由来していてよい。ＷＪが見込まれるさらなる起源は、ウシ、ヒツジ、ブタ、アンテロープ、ラクダ、シカ、ヤギ、馬、象、サイ、カバ、キリン、バイソン、バッファロー、トラ、ライオン、レオパード、クマ、等の動物の臍帯である。生体材料は、ヒアルロン酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、デルマタン硫酸、およびヘパリンを含むグループから選択されるグリコサミノグリカンの混合物によって形成される。
【００５６】
生体材料は、好ましくは、ＧＡＧの次の組み合わせおよび比率を形成する。ヒアルロン酸（４０−８０％）、ケラタン硫酸（２−２５％）、コンドロイチン−６−硫酸（３−１０％）、ヘパラン硫酸（１−９％）、コンドロイチン−４−硫酸（０．５−７％）、デルマタン硫酸（０．１−７％）およびヘパリン（０．０５−３％）。より好ましくは、ＧＡＧの次の組み合わせである。ヒアルロン酸（７０％）、ケラタン硫酸（１０％）、コンドロイチン−６−硫酸（７％）、ヘパラン硫酸（５％）、コンドロイチン−４−硫酸（４％）、デルマタン硫酸（３％）、および、ヘパリン（１％）。
【００５７】
本発明はまた、上述の、混合した治療の効果を得るために任意に細胞と組み合わせたハイドロゲルから成る生体材料にも関する。このハイドロゲルの作用は、生体材料が生成物の有効性に寄与することが可能な健康な細胞を含むため、重篤に損傷した組織、または患者のｉｎ  ｓｉｔｕ細胞加入の可能性がない組織内で、再生および組織修復プロセスにおいて強化される。この構造を形成するために生体材料足場に加えられる細胞は、特に、未分化の間葉幹細胞、または別の細胞株に分化した間葉幹細胞、未分化の造血幹細胞、または、別の細胞株に分化した造血幹細胞、軟骨細胞および軟骨芽細胞、骨芽細胞および骨細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、神経細胞または神経系由来の他の細胞、白血球系由来の細胞、角膜細胞、内皮細胞、または上皮細胞であってもよい。
【００５８】
本発明に関連する態様は、次の通りである。すなわち、（ｉ）臍帯のウォートンジェリーからＧＡＧの抽出物の取得、（ｉｉ）臍帯のウォートンジェリーから単離されたＧＡＧハイドロゲルの生成、（ｉｉｉ）得られたハイドロゲルの特徴付け、および（ｉｖ）ハイドロゲル生体材料の使用。さらに、後に説明する研究／実施例では、ヒアルロン酸（ＨＡ）と比較してポジティブに細胞動作および相互作用に影響する、注射可能なハイドロゲルの性能が示される。
【００５９】
（臍帯のＷＪからのＧＡＧの抽出物の取得）
生体材料を得るための方法は、次のステップを含む。
ａ：動物またはヒト由来の臍帯を得るステップ、
ｂ：上記臍帯を食塩水および抗生物質にて処理するステップ、
ｃ：上記臍帯の表面から全ての血液を除去するステップ、
ｄ：上記臍帯を１〜２ｃｍの切片に切断するステップ、
ｅ：内部に残留する全ての血液を洗浄するステップ、
ｆ：臍帯膜および血管を除去するステップ、
ｇ：ウォートンジェリーを含むゼラチン状物質を分離するステップ、
ｈ：得られた上記ゼラチン状物質を酵素消化するステップ、および、
ｉ：ＧＡＧを沈殿させて単離するステップ
具体的には、グリコサミノグリカンを臍帯のＷＪから単離するために、次のことを行う。
【００６０】
（ウォートンジェリーの取得）
送達後すぐに臍帯を回収し、そして、臍帯を処理するか、または処理まで４℃で維持する。この状態で２４時間以上経過してはならない。
【００６１】
処理のために、臍帯をバイオセイフティーレベルＩＩの層流フードにおいて無菌状態で保存されることが好ましい。臍帯を、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）溶液または抗生物質（penicillin, streptomycin, amphotericin-B）の混合物を有するリン酸緩衝１Ｘ（１Ｘ  ＰＢＳ）溶液、および／または赤血球溶解バッファー溶液を用いて、少なくとも３回連続的に洗浄して、血液の残留物を完全に除去する。
【００６２】
臍帯の表面から血液を除去するとすぐに、臍帯をペトリ皿に移し、１−２ｃｍの複数の切片に切断する。臍帯を複数の切片に切断する際に、臍帯の血管の内部に溜まっていた血液が放出されることがある。従って、この場合、臍帯の切片を十分に洗浄することが必要になる。
【００６３】
臍帯は、構造的レベルにおいて、２つの臍動脈と１つの臍静脈とを有している。これらは、ＷＪである一貫したマトリクスによって栄養が供給されていると共に、薄い膜で覆われている。ＷＪだけを得るためには、この膜と血管とを機械的に除去する。これを行うためには、臍帯の切片を、縦方向に切断し、外科用メスおよびピンセットにより、臍帯膜および血管を、慎重に除去する。この機械的な分離の結果として得られたゼラチン状の物質がＷＪである。一般に、２５〜２００ｇの臍帯から、２０〜１６０ｇのウォートンジェリーが得られる。
【００６４】
〔ウォートンジェリーからのＧＡＧの抽出〕
パパイヤラテックス（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｐ４７６２）からの酵素パパインで酵素消化することによって軟骨からＧＡＧを得る文献（Rogers et al., 2006）に記載の手順をいくらか変形させて用いて、臍帯のＷＪからＧＡＧを得た。上述のステップで得たＷＪを、２０ｍｌの抽出バッファー溶液（５ｍＭ  Ｌ−システイン、１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４バッファー溶液、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍｇ（１４Ｕ／ｍｇ）  パパイン、ｐＨ７．５）に６０℃にて２４〜４８時間浸して、完全に消化させる。
【００６５】
ＷＪが完全に消化されるとすぐに、これを遠心分離して、無用な消化残留物を除去する。この時点で、消化体積は初期体積よりも大きくなっていることが観察される。この体積の増大は、ＷＪ中に存在するＧＡＧの溶解し、そしてその結果、これらが蓄積していた水の放出に起因する。
【００６６】
サンプルを遠心分離させるとすぐに、上清を別の容器に移し、そしてサンプル中に存在するＧＡＧを沈殿させる。
【００６７】
〔臍帯のＷＪからのＧＡＧの沈殿および単離〕
ＷＪのＧＡＧを、５倍の容量の１００％エタノールで沈殿させる。このステップによって、サンプルのＧＡＧ、およびサンプルに存在する塩を沈殿させる。沈殿は、サンプルに存在する水分子がエタノール分子と相互作用し、このため、水分子がサンプルのＧＡＧとは相互作用できず、ＧＡＧが不溶性になり沈殿することによって生じる。従って、エタノールを添加してチューブを振ったすぐ後に、白っぽい沈殿物が観察される。ＧＡＧを−２０℃で１２時間静置して沈殿させる。沈殿後、これらを遠心分離して、１００％エタノールを取り除き、沈殿物を５倍の容量の７５％エタノールで洗浄して、サンプル内に沈殿し残留し得る塩を取り除く。再度、サンプルを遠心分離して、上清を完全に除去する。
【００６８】
ＧＡＧのサンプルが沈殿した後、残留物を、全てのエタノールが蒸発するまで少なくとも３０分間室温で静置して乾燥させる。エタノールが蒸発すると、ＧＡＧのサンプルを、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏ中に再懸濁させ、使用するまで４℃で保存する。こうして得られたハイドロゲルを、治療のために、注射可能な血清と混合してもよいし、および／または、当該領域に直接塗布してもよい。上記に関わらず、この種の材料の機械的な抵抗は低い。すなわち、補強材と組み合わせて複合材料を形成しない限り、この種の材料が負荷に耐えることは考えられない。例えば、リン酸カルシウムサポートが、複合材料内の補強用のマトリクスとして機能し得る。さらに、この注射可能なハイドロゲルを形成する多糖分子間には、極めて高い親和性が存在する。この親和性は、ハイドロゲル生体材料の粘着性が高い点に表れている。しかし、ハイドロゲルに対して高い接着性が存在する。この接着性は、注射されたハイドロゲルの局所的単離に有効である。最後に、ハイドロゲルの汎用性は、単独で投与されてもよいし、細胞と組み合わせて投与されてもよいことを決定付けている。
【００６９】
他にも、適用部位の隣接する組織の細胞による、または、その移植の前に生体材料中に配置された特定の細胞による移植をより良好に行う内部構造を有し、より抵抗が高く、安定性がある、持続して注射可能なハイドロゲル生体材料を必要とする、治療上の用途がある。この場合、本発明の生体材料は、組織傷の治癒および修復を誘発する生理活性の三次元マトリクスのように作用する。
【００７０】
ヒアルロン酸、コンドロイチン−６−硫酸およびコンドロイチン−４−硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンは、細胞活性を調節し、新たな細胞外マトリックスの合成を活性化させる。生体材料中に存在するＧＡＧの多様性および組成物は、細胞増殖および分化プロセスを調節する発育因子に特異的な多数の結合部位の存在を、および、新たな細胞外マトリックスと発育因子との合成のための、細胞の性能を可能にする。この作用により、患部組織における細胞応答の性能を増大させ、再生を加速させ、慢性潰瘍の場合のような著しく劣化した領域においても治癒を可能にする。
【００７１】
生体材料が安定した三次元足場として機能する適用を促進するためには、安定化（架橋）の方法が必要とされる。この目的を達成するためには、ＧＡＧを、化学修飾または架橋して、本発明の注射可能なハイドロゲルを形成することが可能である。これらの化学修飾（架橋、重合）は、典型的には、アルコールまたはカルボキシル基を含み、注射の後または注射の前に、ｉｎ  ｓｉｔｕで起こり得る。さらに、このプロセスは、水溶性高分子の鎖が不溶性になることを含む（Elisseeff et al., 2005）。
【００７２】
架橋によって得られた注射可能なハイドロゲルは、組織工学にとって潜在的に有用な独特の特性を有している。すなわち、栄養素または老廃物物質を運搬するための高い含水量、弾性、および、細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで３次元微環境内に被包または固定化する能力を有している。架橋密度は、注射可能なハイドロゲルの孔の寸法、従って、その、含水量または機械的抵抗といった物理的特性に直接影響する。このため、架橋密度が高く、極めて小さい寸法の孔を有する注射可能なハイドロゲルは、架橋密度が低く、大きな孔の寸法を有する注射可能なハイドロゲルよりも、少ない水を吸収し、高い機械的抵抗を有している。
【００７３】
注射可能な架橋されたハイドロゲルの形成は、幾つかの方法によって行うことが可能である。この方法には、温度変化、化学反応、および光重合が含まれるが、これらに限定されない。架橋は、標準的な皮下注射方法による注射の後にｉｎ  ｓｉｔｕで、または、注射の前にｅｘ  ｖｉｖｏで、行うことが可能であり、従って、本明細書の最初の部分で規定した腹腔鏡下検査／関節鏡検査により類似した技術を利用するものである。
【００７４】
本発明の一実施形態では、次のように架橋反応を起こす。架橋される高分子の水溶液（この場合、ＧＡＧの水溶液）を得て、架橋を生じさせる化学試剤を添加する。この場合、安定したハイドロゲルを得るために、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩））を用いる。なぜなら、ＥＤＣは、水溶液中のカルボキシル基を活性化させるからである。これらの、活性化されたカルボキシル基は、第一級アミンまたはヒドロキシル基と反応することが可能であり、結果として、アミドまたはエステル結合となる。ハイドロゲルが形成されるとすぐに、ハイドロゲルをＰＢＳで数回洗浄して、残留しているかもしれないＥＤＣの残留物を除去する（Pieper et al., 1999; Wissink et al., 2001）。
【００７５】
任意により、架橋反応の間、注射可能なハイドロゲルをこのようなプロセスに使用することを意図した鋳型に入れて、用いられる鋳型に応じた所望の形状および寸法になるように凝固してもよい。これらのハイドロゲルを、凍結乾燥と呼ばれるプロセスによって乾燥させて、ハイドロゲル中に存在するＧＡＧ分子間に挟まれた水分子を除去することによる多孔性構造を得ることができる（図５）。さらに、生体材料を凍結乾燥させるとすぐに、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて、ハイドロゲルの三次元構造を特徴づけることが可能である（図３）。その最終形状のハイドロゲルを得るとすぐに、紫外線に４０分間さらすことによって、該ハイドロゲルを滅菌する。ハイドロゲルに対して行った無菌テストは、生体材料が最適に滅菌されていることを示している。滅菌のためのさらなる技術は、エチレンオキシドガス処理またはガンマ線照射であってよい。これについては、当業者であれば認識できるであろう。
【００７６】
注射可能なハイドロゲルは、滅菌した後、直接用いてもよいし、または、細胞と一緒に用いてもよい。本発明のハイドロゲルの細胞結合アッセイは、増殖性の実験結果に基づき、生体材料が細胞傷害性を有していないことを示した（図４）。
【００７７】
〔バイオゲルの使用〕
本発明の生体材料は、細胞と組み合わせた形で、または単独で、その注射可能な形において、関節系疾患や美観治療に適用可能である。使用可能な細胞は、特に、未分化の間葉幹細胞、または別の細胞株に分化した間葉幹細胞、未分化の造血幹細胞、または別の細胞株に分化した造血幹細胞、軟骨細胞および軟骨芽細胞、骨芽細胞および骨細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、脂肪細胞、神経細胞、または神経系由来の他の細胞、白血球系由来の細胞、角膜細胞、内皮細胞、または上皮細胞である。
【００７８】
ハイドロゲルを使用する治療用途または化粧用途に応じて、注射技術は、様々であり、ハイドロゲルの粘度は、注射システムの口径に適合されてもよい。
【００７９】
本発明のハイドロゲルの粘度は、１０〜１５０，０００ｃＳの範囲であってよく、架橋されてないハイドロゲルの場合、１０〜１５，０００ｃＳ、好ましくは１０〜２，０００ｃＳであってよい。架橋されたハイドロゲルは、１５，０００〜１５０，０００ｃＳの範囲の粘度を有していてよい。ハイドロゲルの粘度は、必要に応じて、架橋によって変更してよい。
【００８０】
【表１】
0005591995.tif 000002
【００８１】
本発明において開発した生体材料は、次の治療法および化粧法、すなわち、軟部組織の改良再、充填、または再構築に利用でき、小皺、皺、および傷跡（やけど、潰瘍、軟部組織増大、顔面の脂肪萎縮、椎間板疾病、軟骨修復、筋骨格損傷、変形性関節症、および関節周囲炎）の治療；鎮痛剤および炎症抑制剤としての、腫瘍、膣疾患、脳損傷、骨髄修復、神経変性疾患、循環器疾患、および潤滑プロセスの治療において有効である。
【００８２】
本発明の注射可能な架橋ハイドロゲルは、実質的には多孔性構造を有していてよい。一実施形態では、孔の直径は０．５〜１，０００μｍ、好ましくは０．５〜５００μｍであり、１５，０００ｃＳよりも高い粘度を有している。この生体材料は、好ましくは、次の病理、すなわち、やけど、潰瘍、および真皮性−表皮性の異常の治療、眼科疾患（例えば、角膜外傷、網膜外傷、または、白内障）の治療；軟骨の修復、骨軟骨異常の場合のような変形性関節系の治療、変形性関節症、または、骨の欠陥における足場として、膣疾患の解消おけるアジュバント、歯肉炎および歯周炎の治療、細胞培養系の開発における使用；に適用可能である。
【００８３】
軟骨疾患は、世界的な重大な社会経済的問題である。この意味で、この発生率を記録することは困難ではあるが、５億人が関節損傷を患っていると推定される。
【００８４】
軟骨疾病は、治療しなければ変形性関節炎（ＯＡ）などの変性疾患の原因となり得る、疾患または損傷の結果、生じる。
【００８５】
ＯＡは、欧米では３，５００万〜４，０００万人が患う最も一般的な種類の関節炎の１つである。ＯＡは、骨の反応によって引き起こされる軟骨の崩壊を生じさせる変性疾患である。通常は、成人の、手、膝、腰、足、および、首に発現し、身体的無能力の最も一般的な原因の一つと考えられている。
【００８６】
関節軟骨は、接合面の間に摩擦を導く重量および衝撃に関連する力から、可動関節の骨を保護する、極めて特殊な血管組織である。この組織は、単一の種類の細胞、軟骨細胞によって、および、重要かつ肥沃な細胞外マトリックスによって、形成されている。このマトリクスは、タイプＩＩコラーゲン線維（主な分子）の密度の高い網目構造と、当該網目構造において、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、ヒアルロン酸、およびアグリカンなどのＧＡＧを含むプロテオグリカンのマクロ凝集体とからなる。
【００８７】
軟骨のこの特殊な構造、およびその修復能力が限られていることは、この種の損傷の治療を、極めて複雑にしている。血管新生がないことは、その再生能力を非常に制限する。再生プロセスを施すために幹細胞を損傷した部分に接近させることが不可能であるからである。
【００８８】
近年、軟骨損傷の治療には、生物分解性の生体材料が用いられている。これが意味するところでは、巨視的合成高分子（乳酸、グリコール酸、カプロラクトン等）が、生体材料の最も重要かつ最大の基になっている。しかし、この固体の肉眼で視認できる材料は、従来の手術のような、大規模な外科手術の使用を必要とする。この限定を克服するために、最低限の浸潤性の技術、例えば、注射または関節鏡検査によって移植することが可能な新規の生体マトリクスが、現在、開発されている。
【００８９】
従って、本発明の注射可能な生体材料の用途の１つは、変形性関節症の変性プロセスにおいて損傷した関節軟骨を再生することである。本発明の生体材料は、関節鏡検査などの皮内注射技術、または任意の注射装置によって、再生される部分に簡単に投与することが可能である。投与が容易であることに加えて、注射可能なハイドロゲルは、悪化した組織の寸法および形状に合った、安定した移植片を形成する性能を有している。
【００９０】
本発明の生体材料の他の用途は、傷の治療である。慢性糖尿病、褥瘡、および静脈潰瘍は、米国において３〜６百万人が患っている重要な問題である。この病気は、先進国の人口の１〜３％が患っており、および、この病気で入院している患者の１５％が、この状態で苦しんでいる。この損傷を負った多数の患者は、社会経済的および医療保証的に多大な影響を与えており、治療費は高額となり、患者の生活の質は、著しく変化する。
【００９１】
潰瘍は、極めて複雑な生理病理を伴って、有機体に重大な影響を与える外傷である。傷のベッドにおいて、繊維芽細胞（真皮細胞）、ケラチノサイト（表皮細胞）、細胞外マトリックス、および血漿に由来するタンパク質の間に、複雑な協働作用が生じる。異なる創傷治癒段階（止血、炎症、修復、および、再構築）を経た進行が、典型的であるが、これらの傷の慢性化および再発は、臨床的に重要なものである。現在種々の治療および足場が利用可能であるにもかかわらず、治癒効果および治癒速度は、依然として極めて低い。従って、迅速な創傷治癒を実現可能な、より効果的な治療法が求められている。近年得られる、慢性潰瘍の生理病理についての先進的知識は、この疾患の治療において極めて発達した新たな足場の生成および開発を促進してきた。これまで、皮膚を覆うための理想的な足場は存在しなかったが、上記足場は、一連の基本特徴、例えば、（１）傷に迅速に粘着すること、（２）液体の損失に対して有効なバリア機能を提供すること、（３）機械的弾性および長期安定性を有していること、（４）殺菌が容易であること、（５）扱いおよび持ち運びが簡単であること、および、（６）無害でなければならないこと、を満たしている必要がある。
【００９２】
概して、本発明の生体材料は、上述の疾患の治療に有効な足場または希釈剤に必要とされるほとんどの特徴を有している。この意味において、本発明の生体材料の治療効果を評価するために、実施例９および１０に記載するｉｎ  ｖｉｖｏでの実証研究を行った。
【００９３】
〔実施例〕
（実施例１．ウォートンジェリーの取得）
以下の実施例は、ヒトおよびブタ由来の臍帯を用いて行った。各臍帯のＷＪからＧＡＧを単離するために、以下の手順に従った。
【００９４】
各ケースにおいて、５０ｇの臍帯は、納入後すぐに、滅菌ビンの中に回収した。滅菌ビンには、３００ｍｌの１Ｘ濃度のＰＢＳ（水１リットル中：８ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇ  ＫＣｌ、１．４４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）、および３ｍｌの１Ｘ濃度の抗生物質の混合物（ペニシリン（３０，０００ユニット）、ストレプトマイシイン（３０，０００μｇ）、およびアンフォテリシン−Ｂ（７５μｇ）（ＬＯＮＺＡ、Ｒｅｆ：１７−７４５Ｅ））を事前に入れておいた。臍帯は、処理まで２４時間以内であれば４℃で保存することができるが、本実施例では臍帯は受領後すぐに処理した。
【００９５】
処理では、臍帯をバイオセイフティーレベルＩＩ層流フード内に滅菌条件で維持し、臍帯に含まれる血液の残留物を完全に除去するために連続的に洗浄した。このために、これら臍帯を２つの容器の中に置き、ここに３ｍｌの抗生物質の混合物（ペニシリン（３０，０００ユニット）、ストレプトマイシイン（３０，０００μｇ）およびアンフォテリシン−Ｂ（７５μｇ）（ＬＯＮＺＡ、Ｒｅｆ：１７−７４５Ｅ））を含む、３００ｍｌの１ＸＰＢＳ（水１リットル中：８ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇ  ＫＣｌ、１．４４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）を添加し、傾けた容器を手動で垂直に１０秒間５回振り、そして液体を捨て、この操作を血液の大部分が除去されるまで少なくとも３回繰り返した。その後、血液の残留物が完全に除去されるまで５００ｍｌの１Ｘ濃度の赤血球溶解溶液（水１リットル中：８．９９ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ  ＫＨＣＯ３、３７ｍｇ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．３）で臍帯を洗浄した。
【００９６】
臍帯を、表面の血液を洗浄した後、１０ｃｍペトリ皿に移し、滅菌したはさみを用いて１〜２ｃｍの切片に切断した。臍帯を切片に切断している間に血管中に残っていた血液が放出したため、ストレプトマイシイン（１０，０００μｇ）およびアンフォテリシン−Ｂ（２５μｇ）から成る１ｍｌの抗生物質の混合物（１０，０００ユニット）を含む１０ｍｌの１ＸＰＢＳを、十分に洗浄した上述した切片に添加し、 そして、切片の表面をその表面の支持に抗うように圧迫し、滅菌した外科用メスを用いて切片に沿って水平方向に移動させた。このプロセスを、全ての血液の残留物が内部から除去されるまで繰り返した。完全に洗浄された臍帯の切片は、滅菌チューブに移し、すぐに処理した。しかし、必要であれば、これらは−８０℃で永久に凍結保存できる。
【００９７】
それから、臍帯を取り巻く膜およびその中に位置する血管を機械的に除去した。このために、臍帯切片を縦方向に開き、外科用メスおよびピンセットを用いて臍帯膜および血管の両方を慎重に除去した。この機械的分離の結果として得られたゼラチン状の物質が、ＷＪである。２５ｇのＷＪが得られた。
【００９８】
（実施例２．ウォートンジェリーからのＧＡＧの抽出）
以下の実施例は、ヒトおよびブタ由来の臍帯を用いて行った。臍帯のＷＪからＧＡＧを取得するために、記述されたヒト軟骨からＧＡＧを取得するためのプロトコルを、いくらか修正を加えて使用した（Rogers et al., 2006）。
【００９９】
実施例１で取得した両方のＷＪは、２０ｍｌの抽出バッファー溶液（２４２μｌ  ２００ｍＭ  Ｌ−システイン、１．４２ｍｌ  ７０４ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４バッファー、１００μｌ  ０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１０ｍｇ（１４Ｕ／ｍｇ）パパイン、ｐＨ７．５）（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｐ−４７６２）に浸し、そして、ＷＪを完全に消化するため、これを６０℃で１２時間維持し、そして消化した後、消化残留物を除去するため、サンプルを８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。消化量は約３０ｍｌであることが観測され、初期量２０ｍｌより約１０ｍｌ多く、これは、ＷＪの中に存在するＧＡＧが溶解し、そしてそれゆえ、これらが蓄積していた水が放出されたことによるものである。
【０１００】
サンプルを遠心分離するとすぐに、上清を他のチューブに移し、そしてその後サンプル中に存在するＧＡＧを沈殿させた。
【０１０１】
（実施例３．臍帯のＷＪからのＧＡＧの沈殿および単離）
実施例２の上清に含まれるＷＪのＧＡＧを５倍の容量の１００％エタノールで沈殿させた。このステップによって、サンプルのＧＡＧと共にサンプルに存在する塩を沈殿させた。沈殿は、サンプルに存在する水分子がエタノール分子と相互作用し、このため、水分子がサンプルのＧＡＧとは相互作用できなくなるという事実によるものである。ＧＡＧを−２０℃で１２時間静置して沈殿させる。沈殿後、これらを１，５００ｇで５分間遠心分離して、１００％エタノールを取り除いた。沈殿物を５倍の容量の７５％エタノールで洗浄して、サンプル内に沈殿していた残留し得る塩を取り除いた。その後、サンプルを１，５００ｇで５分間遠心分離して、上清を完全に除去した。
【０１０２】
サンプルが沈殿した後、残留物を、全てのエタノールが蒸発するまで少なくとも３０分間室温で静置して乾燥させた。約２５ｇのＷＪサンプルから始まり、沈殿したＧＡＧの量は、始まりの材料に応じて、５０〜３００ｍｇの範囲となり得る。この特定の場合では、２５０ｍｇのＧＡＧの沈殿物が得られた。本発明のハイドロゲルを得るために、ＧＡＧの沈殿物を１ｍｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏに再懸濁させ、４℃で保存した。
【０１０３】
（実施例４．臍帯のＷＪのＧＡＧを含む注射可能なハイドロゲルの製造）
ハイドロゲルの含水量は、その適用に要求される粘度に基づいて、それ自身の重量の１０％〜１００倍となることができる。
【０１０４】
１ｍｌのＨ２Ｏ中で沈殿したＧＡＧの再懸濁後に得られたハイドロゲルを、生理的な血清溶液中に再懸濁し、そして、完全に溶解して均一化するまでボルテックス中で穏やかに撹拌した。ハイドロゲルが溶解した後、４℃で保存した。
【０１０５】
（実施例５．臍帯のＷＪ由来のＧＡＧを含む架橋されたハイドロゲルの製造）
より信頼でき安定したハイドロゲルを製造するために、文献に記載されているプロセスに従った（Cui et al., 2006）。実施例３によるＷＪから得られたＧＡＧの抽出物から、水溶液を調製した。特に、ＧＡＧの１％水溶液を調製した。このために、沈殿および単離後に得られたＧＡＧ（実施例３）２００ｍｇに１０ｍｌの水を添加した。この溶液に１．２ｇのアジピンジヒドラジド（adipic dihydrazide）（ＡＤＨ）を添加し、溶液のｐＨを０．１Ｎ  ＨＣｌでｐＨ＝３．５に調整した。ｐＨを調整した後、この溶液に０．６ｇの固定剤、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩））（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｅ６３８３）、を添加した。安定したハイドロゲルが得られるまで、この混合液を３０分〜１時間、室温で一定に撹拌し続けた。
【０１０６】
安定したハイドロゲルが形成した後、過剰のＥＤＣを除去するために、１ＸＰＢＳ（水１リットル中：８ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｇ  ＫＣｌ、１．４４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝７．４）で、５分３回洗浄した。ハイドロゲルの物理的形状については、これを固める鋳型の形状を有し得る。鋳型は、標準的な９６、４８、２４、１２および６−ウェルの培養プレート、ペトリ皿または使用できる所望の形状を有するあらゆる他の容器などである。
【０１０７】
さらに、ハイドロゲルは、ビーカーなどの大きい容器内で固めることができ、固まった後に、ハイドロゲルを固有の形状および厚さに切断することができる。特に、本実施例ではハイドロゲルを２４−ウェルのプレートのウェル内で固め、固めた後に５００μｌの１ＸＰＢＳで５分間３回洗浄した。
【０１０８】
ここでは、２４−ウェルプレート内で架橋したハイドロゲルを、典型的技術に従って、凍結乾燥させた。
【０１０９】
本実施例では、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により三次元のハイドロゲルの三次元構造を解析した。ハイドロゲルを凍結乾燥させた後、以下を実行した。凍結乾燥したハイドロゲルの切片を切断し、この切片をＡＵＴＯＳＡＭＤＲＩ−８１４乾燥機内でＣＯ２により臨界点まで乾燥し、その後ＳＰＵＴＴＥＲ内で金を用いて金属化した。この標本を、ＪＥＵＬ走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ３５）において２０ＫＶの電圧にて観察した。
【０１１０】
脱水されたハイドロゲルのＳＥＭ解析（図３）により、脱水されたハイドロゲルが均一の多孔質構造を有することが示された。顕微鏡写真は、直径が０．５〜５００μｍの範囲の孔を有する高多孔質の三次元構造の存在を示す。この孔の範囲は、ミクロの孔構造およびマクロの孔構造の存在を意味する。マクロ細孔（３００〜５００μｍ）が必要とされ、それは、マクロ細孔によって、適した細胞のコロニー形成が行なわれたり、多数の細胞が濃縮されたり、異なる種類の細胞が共存したりするためであり、この共存は構造化組織の形成に有利である。例えば、血管のネットワークを形成することができる。中間の孔は、細胞を統合させる。ミクロ細孔（０．５〜５０μｍ）は細胞の生存に必要であり、それは、ミクロ細孔は、ガス、栄養物の正しい拡散、細胞の代謝によって生じた老廃物の除去を行なうことを担っているためである。孔のサイズは、走査型電子顕微鏡によって得られた計量スケールに基づいて測定される。
【０１１１】
この生体材料は、例えば特に潰瘍および他の真皮性−上皮性疾患の治療、軟骨修復および眼科学的な治療に適用されるために、求められている生理活性および栄養性作用だけでなく、組織修復が行なわれるまで一時的に細胞を収容することができる構造もまた示唆される、より高い構造的な感受性を示す。生体材料内に含まれる細胞は、移植部位に隣接する組織の細胞であって、何とかコロニー形成した細胞であってもよいし、または臨床の適用の前に生体材料内に生体外にて配置された細胞であって、その再生作用が向上されている細胞であってもよい。
【０１１２】
この生体材料は、走査型電子顕微鏡の手法によって測定されるサイズが０．０１〜５００μｍの範囲の、均一に配置された孔を有する。この多孔度の範囲は、その全体構造を通したガスおよび栄養分の拡散のため、および細胞がコロニーを形成するための両方に好適である。
【０１１３】
（実施例６．本発明の生体材料中に存在するＧＡＧの特徴付けおよび定量化）
本発明に係る生体材料中に存在する異なるＧＡＧを、質量分析（ＥＳＩ／ＭＳ）法によって解析かつ定量化した。この手法を用いると、２００〜２，０００ダルトンの分子量を有する分子のみを測定することが可能であり、そして、ＧＡＧ分子は、おおむねこの範囲を超える。はじめに、２００〜２，０００Ｄａの分子量を有するＧＡＧ鎖を得るために、サンプルを酵素消化した。
【０１１４】
ＧＡＧの同定および定量化をするための基準として、既知の濃度を有するＧＡＧそれぞれの標準的な市販の化合物を用いた。特に、ＧＡＧの定量化を行なうために用いた標準物質は、次の通りである。ヒアルロン酸用：ヒアルロン酸カリウム塩（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：５３７５０）；コンドロイチン硫酸用：コンドロイチン硫酸ナトリウム塩（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｃ４３８４）；デルマタン硫酸用：デルマタン硫酸ナトリウム塩（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｃ３７８８）；ケラタン硫酸用：ケラタン硫酸（ＣＨＥＭＯＳ、Ｒｅｆ：７２９５）；ヘパリン用：ヘパリンナトリウム塩（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｈ８５３７）；およびヘパラン硫酸用：ヘパラン硫酸ナトリウム塩（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ  ５１５４１）。
【０１１５】
サンプル中に存在するＧＡＧの定量化の値は、使用したそれぞれのＧＡＧ標準物質について得られた結果に基づいて取得した。
【０１１６】
ＧＡＧを酵素消化するために、文献に記載されているプロセスに従った（Mahoney et al., 2001）。そのために、それぞれのＧＡＧの消化に特異的な酵素を用いた。
【０１１７】
ヒアルロン酸のために、ヒアルロニダーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｈ３５０６）を用い；コンドロイチン硫酸のために、コンドロイチナーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｃ２７８０）を用い；デルマタン硫酸のために、コンドロイチナーゼＢ（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｃ８０５８）を用い；ヘパリンのために、ヘパリナーゼＩ（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｈ２５１９）を用い；ヘパラン硫酸のために、ヘパリナーゼＩ（ＳＩＧＭＡ、Ｒｅｆ：Ｈ２５１９）を用い；ケラタン硫酸のために、ケラタナーゼ（Ｋ２８７６）を用いた。
【０１１８】
これらの酵素は、以下のバッファー１０ｍｌに４４０Ｕに相当する酵素を再懸濁することによって調製した。２ｍｌ  １００ｍＭリン酸バッファー  ｐＨ＝７．７７、７７０μｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍｇ  ＢＳＡ、および７．２３ｍｌ  Ｈ２Ｏ。
【０１１９】
酵素濃度１６０Ｕ／ｍｌを有する酵素消化バッファーを、以下のように調製した。４．５ｍｌの酵素（２０００Ｕ）を、７．５ｍｌ  消化バッファー、１．５ｍｌ  １Ｍ  ＮａＣｌ、０．３３３ｍｌ  ３Ｍ  酢酸ナトリウム  ｐＨ＝５．２、および５．６７ｍｌ  Ｈ２Ｏに添加した。酵素消化させるためのサンプルおよび標準物質を、以下のように調製した。５００μｌの消化バッファー（酵素８０Ｕ）を、各ＧＡＧに対する濃度２ｍｇ／ｍｌの標準物質５００μｌに添加し、これにより、標準物質の最終溶液の濃度は１ｍｇ／ｍｌとなった。ＧＡＧのサンプルについても同様に行なった。５００μｌ消化バッファー（酵素８０Ｕ）を、ＧＡＧのサンプル５００μｌに添加した。
【０１２０】
サンプルを、３７℃１時間消化し、その後６０℃５分間の熱変性によって酵素を不活性化した。
【０１２１】
消化を行なった後、サンプルおよび標準物質を質量分析によって解析した。質量分析法は、解析すべきサンプル中に存在する特定のイオンの質量／電荷数の測定を用いた実験的方法である。質量分析計は、３つの基本的な構成要素からなる。イオン源、質量分析器および検出器である。解析すべきサンプルは、イオン源によってイオン化され、質量分析器内で分離され、そしてマススペクトルを作るために検出される。マススペクトルでは、質量対電荷の値は、特定のイオン種の相対的な存在量と比較されて示される。
【０１２２】
特に、本実施例では質量分析計へのサンプルの注入は、以下のように行なった。２０μｌのサンプルを、マス／マス検出器（Ｔｈｅｒｍｏ  ＬＣＱ  ｍｏｄｅｌ）の中に直接、０．２ｍｌ／分の流速で注入した。陰性エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ／ＭＳ）法を用い、クロマトグラム時刻を１０分に設定した。文献（Mahoney et al., 2001）に従って、認識されたそれぞれのタイプのＧＡＧについての鎖の分子量に相当する、±６Ｄａの範囲の分子イオンを選択した。標準ＧＡＧのサンプル中、および解析すべきサンプル中の両方に存在するイオンが残っており、これによりサンプル中の各ＧＡＧの存在が定性的に示された。この結果の再現性を保証するために、サンプルおよび標準物質を二通りに注入した。
【０１２３】
種々のＧＡＧの定量化のために、各ＧＡＧの標準物質について１ｍｇ／ｍｌにて標準ラインを作成した。各標準ＧＡＧ（ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびケラタン硫酸）を、次の濃度にて使用して標準ラインを作成した。７５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、および０μｇ／ｍｌである。標準ラインの希釈はＨ２Ｏを用いて行い、等しい割合の酵素消化バッファーとＨ２Ｏとを含む混合液をラインのブランクとして使用した。
【０１２４】
本発明の生体材料中の各ＧＡＧの項目および割合の結果は、次の通りである。生体材料の起源が天然であることに注意すべきであり、これらの組成（図１）に若干のばらつきが存在することが示される。
７０％  ヒアルロン酸
１０％  ケラタン硫酸
７％  コンドロイチン−６−硫酸
５％  ヘパラン硫酸
４％  コンドロイチン−４−硫酸
３％  デルマタン硫酸
１％  ヘパリン
である。
【０１２５】
（実施例７．生体材料内の細胞の残留を測定するための組織学的研究）
本発明の生体材料は、天然起源のＧＡＧの組合せを含む。この天然起源は、その再生効果および細胞活性に対する効果を高める。ＧＡＧの構造およびこれらの間の相互作用が、生理的条件下で細胞外マトリクスにおいて見られるものと類似しているためである。
【０１２６】
臍帯は、ほとんど免疫原性を示さないタイプの組織であり、実際に複数の研究において、ＷＪに含まれる幹細胞を治療のために異種使用することが検討されている。また、異種使用のために、臍帯の脈管構造から動脈または静脈系を発展させる研究もある。しかしながら、本発明の生体材料が、炎症性反応または移植の拒絶反応を引き起こし得る細胞および細胞の残りを有さないことを保証するために、ヘマトキシリン−エオシン、アルシアンブルーおよびメチルグリーン−ピロニンによる組織学的な染色を行なった（図２）。
【０１２７】
［ヘマトキシリン−エオシン］これは、組織病理学的レベルで最も広く使用される組織化学的染色である。これは、細胞および細胞成分の観察を可能にする。ヘマトキシリンは、細胞における酸性の成分に対する親和性を示し、またエオシンは基礎的領域に対する親和性を示し、細胞の細胞質の良好な観察を可能にする。ＧＡＧサンプルの調製物を染色し（図２Ｂ）、そしてポジティブコントロールとして細胞を伸ばしたものを使用した（図２Ａ）。
【０１２８】
ヘマトキシリン−エオシン染色を実施するために行なったプロセスは、次の通りである。滅菌したスワブを用いてスライド上にＧＡＧサンプルを伸ばし、この伸ばしたものを少なくとも２４時間静置して乾燥させた。スライドが乾燥した後、この伸ばしたものを７０％メタノールにより５分間固定した。その後、Ｈ２Ｏで洗浄することにより固定液を除去した。このスライドを、ヘマトキシリンを用いて３分間染色した（ＰＡＮＲＥＡＣ、ＤＣ  Ｈａｒｒｉｓのヘマトキシリン溶液）。その後、Ｈ２Ｏで洗浄することにより余分な染料を除去した。全てのスライドを０．５％ＨＣｌの水溶液に通し、色素の非特異的結合を取り除いた。スライドをＨ２Ｏで洗浄した。このスライドを、エオシン（０．５％水溶液）で３０秒間染色した。過剰のエオシンを除去するため、スライドをＨ２Ｏで洗浄した。この調製物にＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ封入剤（ＳＯＵＴＨＥＲＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ、Ｒｅｆ：０１００−０１）を数滴添加し、スライドカバーでカバーし、そして顕微鏡下で観察した。
【０１２９】
ヘマトキシリン−エオシン染色の結果（図２の画像ＡおよびＢ）は、解析したＧＡＧのサンプルにおいて細胞が存在しないことを示す。
【０１３０】
［アルシアンブルー］アルシアンブルーは、主要なカチオン染料（分子中に正電荷を含む）の１つであり、プロテオグリカンの一部を形成する、硫酸、リン酸または炭酸塩のラジカルを有する多糖類の、負電荷を有する部位に結合する。これらの静電気的結合は、媒体のｐＨに依存する。中性のｐＨでは、染料は、中性のラジカルを有するプロテオグリカンに結合し、酸性のｐＨでは、硫酸化プロテオグリカンに結合し、そして塩基性のｐＨでは、リン酸化プロテオグリカンに結合する。ｐＨ＝１では、アルシアンブルーは弱い、かつ強固に硫酸化プロテオグリカンに結合する。硫酸化プロテオグリカンは、ウォートンジェリーのＧＡＧの一部を構成するコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸およびケラタン硫酸を含む。ＧＡＧのサンプルの調製物（図２のＦ）を染色し、コントロールとして細胞を伸ばしたものを使用した（図２のＥ）。
【０１３１】
本実施例においてアルシアンブルー染色を実施するために行なったプロセスは次の通りである。
【０１３２】
滅菌したスワブを用いてスライド上にＧＡＧのサンプルを伸ばし、伸ばしたものを少なくとも２４時間静置して乾燥させた。スライドが乾燥した後、この伸ばしたものを７０％メタノールにより５分間固定した。その後、１ＸＰＢＳで洗浄することにより固定液を除去した。このスライドを、０．１Ｎ  ＨＣｌ  ｐＨ＝１に５分間浸した。その後、これらを０．１Ｎ  ＨＣｌ  ｐＨ＝１中で１％アルシアンブルーにより２時間染色した。このスライドを０．１Ｎ  ＨＣｌに５分間浸し、すぐにＨ２Ｏで洗浄して余分な染料を除去した。この調製物にＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ封入剤（ＳＯＵＴＨＥＲＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ、Ｒｅｆ：０１００−０１）を数滴添加し、スライドカバーでカバーし、そして顕微鏡下で観察した。アルシアンブルー染色の結果（図２の画像ＥおよびＦ）は、解析した生体材料サンプル内にＧＡＧが存在することを示す。
【０１３３】
［メチルグリーン−ピロニン］この染色法は、組織に含まれる核酸の組織学的な調査のためだけでなく、リンパ性の細胞およびプラズマ細胞の存在を示すためにも使用される。また、この染色法は、組織切片および細胞学的調製物におけるプラズマ細胞およびＲＮＡの同定にも有用である。ピロニンは、プラズマ細胞の細胞質、および核小体の大部分を赤色に染色する。メチルグリーンは、ＤＮＡを青みを帯びた緑（薄紫）色に染色する。ＧＡＧのサンプルの調製物を染色し（図２のＤ）、コントロールとして細胞を伸ばしたものを使用した（図２のＣ）。
【０１３４】
本実施例においてメチルグリーン−ピロニン染色を実施するために行なったプロセスは次の通りである。
【０１３５】
滅菌したスワブを用いてスライド上に各ＧＡＧサンプルを伸ばし、伸ばしたものを少なくとも２４時間静置して乾燥させた。スライドが乾燥した後、この伸ばしたものを７０％メタノールにより５分間固定した。その後、Ｈ２Ｏで洗浄することにより固定液を除去した。このスライドを、０．１Ｎ  ＨＣｌ  ｐＨ＝１に５分間浸した。その後、これらを０．１Ｎ  ＨＣｌ  ｐＨ＝１中でメチルグリーン−ピロニン（０．０１２％メチルグリーン水溶液、０．０１％ピロニン水溶液、０．７５％メタノール）により５分染色し、すぐにＨ２Ｏで洗浄して余分な染料を除去した。この調製物にＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ封入剤（ＳＯＵＴＨＥＲＮ  ＢＩＯＴＥＣＨ、Ｒｅｆ：０１００−０１）を数滴添加し、スライドカバーでカバーし、そして顕微鏡下で観察した。メチルグリーン−ピロニン染色の結果（図２の画像ＣおよびＤ）は、解析したＧＡＧのサンプル中に核酸が存在しないことを示す。
【０１３６】
（実施例８．本発明の生体材料上のいくつかの細胞タイプについての細胞毒性テスト）
移植に使用することができる、または組織工学のためのマトリクスとして使用することができる生体材料に対する主な要求は、完全に細胞毒性がないことである。
【０１３７】
本発明の生体材料が毒性効果を引き起こさないことを検証するために、細胞毒性を、ＭＴＴ法（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）によって測定し、本発明の生体材料上に配置された細胞に対してＥＣＶＡＭ（European Centre for the Validation of Alternative Methods）により確証した。使用する細胞タイプは、生体材料の標的である病理と関連しており、例えば、皮膚のケラチノサイトおよび線維芽細胞、骨の骨芽細胞、軟骨の軟骨細胞、および脂肪由来の間葉幹細胞、ならびにＬ９２９毒性アッセイのためのＩＳＯ１０９９３において示される細胞株である。
【０１３８】
ＭＴＴアッセイは、生細胞のミトコンドリア酵素における特定の基質を他の二次代謝産物に変換する能力に基づく。形成される化合物量は、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性に依存し、培養中に存在する生細胞の数の明瞭な指標である。
【０１３９】
特に、このミトコンドリア試験（Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（ＭＴＴ）Ｃａｔ．Ｎｏ．１  ４６５  ００７  Ｒｏｃｈｅ）は、細胞のミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによって行なわれる（黄色い）テトラゾリウム塩のコハク酸塩から不溶性の（青い）ホルマザン結晶への変換を測定する。その後細胞を透過させ、そして形成された結晶を溶解させて着色した溶液にし、５５０ｎｍの波長にてＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーにおいてこの溶液の吸光度を測定することにより、定量化することができる。得られた結果を図４に示す。
【０１４０】
従ったプロセスは次の通りである。
【０１４１】
１．各ウェルに５０μｌの生体材料を有する非接着性の９６−ウェルプレートに、細胞タイプに依存して１ウェルあたり２，０００〜５，０００細胞の濃度で細胞を接種した。各細胞タイプにとっての適切な細胞濃度は、あらかじめ決定されている。線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪由来の間葉幹細胞（全てヒト起源の初代培養から）は、１ウェルあたり４０００細胞の濃度で接種し、Ｌ９２９マウス線維芽細胞株は、１ウェルあたり２００細胞の濃度で接種し、そして初代培養におけるヒトの皮膚から得られたケラチノサイトは、１ウェルあたり５，０００細胞の濃度で接種した。
【０１４２】
２．培養液を、安定化させるために、細胞毒性アッセイを始める前に３７℃、５％ＣＯ２で２４時間放置した。このアッセイは、ポジティブコントロール（細胞＋培地＋細胞毒性を誘導する既知の材料、ここではポリビニルポリクロライドまたはＰＶＣを使用した）、コントロール（細胞＋標準的な培地）、および本発明の生体材料と接触させた細胞を含んでいた。
【０１４３】
３．これら細胞を、プロトコルに示される定量が行なわれるまでの時間（ここでは、接触後２４、４８および７２時間）、インキュベーターで３７℃でインキュベートした。
【０１４４】
４．インキュベーション時間が終了した後、ＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）１０μｌを、各１００μｌの培地が入った各ウェル内の培養液に添加し、インキュベーターで３７℃、４時間インキュベートした。
【０１４５】
５．インキュベート終了後、細胞の内部のホルマザン結晶が観察された。１００μｌの可溶性を与える溶液を、各培養液または各ウェルに添加し、これをインキュベーターで３７℃にて一晩インキュベートした。その後細胞を透過させ、１００μｌの可溶化剤を用いて結晶を可溶化させ、容易に定量化できる着色した溶液を得た。
【０１４６】
６．結晶を可溶化させた後、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて５５０ｎｍにて培養プレートを直接読み取った。読み取る前に、エタノールにてプレートの下面を清浄するのが得策である。図４に見られるように、本発明の生体材料は、テストしたどの細胞株に対しても毒性効果を引き起こさず、コントロールとの著しい違いはなかった。
【０１４７】
（実施例９．変形性関節炎の治療のための注射可能な形態における本発明の生体材料の使用）
変形性関節症（ＯＡ）における本発明の生体材料の治療効果をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、実施例３で得られたハイドロゲルを用い、これを、アロジェニックの軟骨由来の軟骨細胞を含む注射用生理的血清溶液に再懸濁させた。ひざの１つにおける前十字靱帯が切除されたウサギを実験モデルとして使用した。この靱帯の切除は、側方の関節切開によって行なわれた。次に、ひざを不安定化させるために、変形性関節炎と同様に軟骨において侵食が起こるまで、数ヶ月から数週間にわたる期間待機した。また、ひざの関節切開を行なわない動物をコントロール群として用いた。
【０１４８】
洗浄、および関節鏡視下手術による創面切除によって損傷した接合面を準備し、本発明の注射可能な生体材料により損傷を覆った。生体材料を沈着させて４週間後、動物を屠殺して軟骨を抽出した。得られた軟骨を、その後の組織学的工程のために４％パラホルムアルデヒドで固定した。組織学的切片を得るために、サンプルをパラフィンに含ませた。このために、サンプルを５０、７０、９０および１００％のアルコールに５分間保持した。その後サンプルをシトロソール（citrosol）中に５分間おき、固体のブロックを得るまでパラフィン中に含ませた。ミクロトームを用いて５μｍの組織学的切片を取得し、これらの切片を用いて組織学的な染色および免疫標識を行なった。
【０１４９】
免疫組織化学的手法を用いて、組織学的切片における軟骨の細胞外マトリクスの多様なマーカーを解析した。解析した軟骨の細胞外マトリクスの特異的分子および分子マーカーは、タイプＩおよびタイプＩＩコラーゲン、アグリカンおよびベルシカンであった。免疫標識は、モノクローナル抗体を用いて行なった。組織切片を標識するために用いた手法は、蛍光色素で標識されたモノクローナル抗体を用いて直接的に免疫標識する手法である。この標識を、共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【０１５０】
以下の理由により、得られた結果は、損傷した軟骨の再生を生体材料が誘発することを示した。
【０１５１】
−注射可能な生体材料は、移植後に毒性を引き起こさなかった。すなわち、組織学的切片において、肉眼で、あるいは顕微鏡レベルで、炎症の事実が観察されなかった。
【０１５２】
−生体材料は、修復されるべき傷の形状およびサイズに適合し、移植領域に留まった。
【０１５３】
−移植領域に隣接する健康な組織の細胞の形態に変化が観察されなかった。
【０１５４】
−移植領域において、軟骨に特異的な細胞外マトリクス分子、例えばタイプＩＩコラーゲン、が存在した。このことは、天然の組織の細胞外マトリクスと同じクオリティの新しい細胞外マトリクスの形成を伴う再生プロセスの始まりを示す。
【０１５５】
これらの事実から、本発明の生体材料は、軟骨修復のどのような徴候も存在しなかったコントロール動物と異なって、軟骨の異常における再生を促進することが分かった。
【０１５６】
（実施例１０．三次元生体材料の使用）
実施例５で得られた本発明の固体の生体材料は、慢性潰瘍の治療に効果的な包袋に必要な特性の大部分を有している。この意味で、慢性潰瘍における治療効果を評価するために、背部領域に約３ｃｍ２の熱的擦過傷を受けたスイスのアルビノマウスを用いて、in vivoで実証研究を行なった。同じタイプの傷を受けたが市販のヒアルロン酸ゲルにより治療した動物を、コントロール群として使用した。
【０１５７】
本発明の生体材料を適用するために、洗浄、消毒および外科的な創面切除によって、誘導された傷の表面を準備し、本発明における成形用の固体の生体材料を用いて、損傷を深層的かつ表面的に覆うとともに充填した。生体材料を置いて１５日後に、動物を屠殺し、傷の領域を摘出し、その後の組織学的調査のために４％パラホルムアルデヒド中で固定した。このプロセスのために、サンプルをパラフィンに含ませた。このために、サンプルを５０、７０、９０および１００％のアルコールに５分間放置した。その後サンプルをシトロソール中に５分間置き、固体のブロックを得るまでパラフィン中に含ませた。ミクロトームを用いて５μｍの組織学的切片を取得し、これらの切片を用いて組織学的な染色および免疫標識を行なった。
【０１５８】
免疫組織化学的手法を用いて、組織学的切片における、多様な上皮性の形態マーカー、例えば５および１０ケラチン、例えばインボルクリンおよびロリクリンと言った分化マーカー、皮膚のマーカー、ビメンチン、ならびにラミニンなどのマトリクス成分を解析した。組織切片を標識するために用いた手法は、蛍光色素で標識されたモノクローナル抗体を用いて直接的に免疫標識する手法である。この標識は、共焦点顕微鏡を用いて観察された。
【０１５９】
以下の理由により、得られた結果は、生体材料が潰瘍の再生に効果的であることを示した。
【０１６０】
−傷に適用された生体材料は免疫学的に不活性であり、毒性の徴候が全く存在しなかった。
【０１６１】
−生体材料は、修復されるべき傷の形状およびサイズに適合し、深層的かつ表面的に、作用する領域を完全に覆った。
【０１６２】
−治癒プロセスが進行するにつれて、生体材料は分解し、真皮性−上皮性成分に取って代わられた。
【０１６３】
−組織学的切片は、生体材料が、その中に生存可能に残存する線維芽細胞およびケラチノサイトの移動および増殖を誘導したことを示した。
【０１６４】
−本発明の生体材料は、傷に対する治療効果を、コントロール動物に関する有効性の２倍において誘導し、そしてまた、新たな瘢痕組織の質は、本発明の生体材料の適用を受けていない動物よりも著しく高かった。
【０１６５】
（実施例１１．注射可能な形態の本発明の生体材料と共培養した関節の軟骨細胞および間葉幹細胞（ＭＳＣ）の生存率および代謝活性）
生存率および代謝活性を決定するために、２×１０６の細胞を、２４ウェルのプレートで１０ｍg／ｍlの本発明の生体材料８００μlで培養した。軟骨細胞 およびＭＳＣは、７日間培地で培養した。３日目および７日目に、代謝活性のある細胞を染色するＭＴＴ生体染料にて染色を実行し、それにより、細胞の生存率を測定した。
【０１６６】
図６は、ＭＴＴで染色された、本発明の生体材料と共培養した関節の軟骨細胞（軟骨細胞）およびＭＳＣの生存率を示す倒立光学顕微鏡画像である。染色は、３日間と７日間との両方行った。黒く染色された細胞は、生細胞であり代謝的に活性なものである。要約すると、図６に示された結果に基づくと、本発明の生体材料は、テストした細胞塊において、コントロールに対する細胞の生存率を維持する。
【０１６７】
（実施例１２．本発明とヒアルロン酸（ＨＡ）とにおいて成長した細胞の増殖性の比較）
本発明の生体材料およびＨＡにおける細胞の増殖性は、実施例８に記載の技術に従って、ＭＴＴを用いて調べられた。テストされた細胞は、次のものを含む。ヒト軟骨細胞、繊維芽細胞Ｌ−９２９、ヒト繊維芽細胞、およびヒト脂肪組織（ＡＭＳＣ）間葉幹細胞である。培養時間２４、４８、７２時間にて、増殖したものを得た。図７および８の両方に示すように、培養細胞の増殖および生存は、同じ濃度のＨＡと比較した場合、本発明の生体材料における方がわずかに高かった。
【０１６８】
（実施例１３．本発明とヒアルロン酸（ＨＡ）とにおける細胞の親和性および立体的増殖性の比較）
本発明の生体材料を使用する目的は、負傷への治療上の細胞群の適用に対する運搬手段としての作用と同様に、組織周囲から負傷した領域に細胞を充填させることである。その結果、細胞を維持する恒常性において本発明の生体材料の重要性が、明確になる。
【０１６９】
本発明の生体材料内で凝集を形成する軟骨細胞の能力を測定するために、１．０ｍｇ／ｍＬおよび２．０ｍｇ／ｍＬの本発明の生体材料で満たした６ウェルプレートのウェル毎に７５０ｋの軟骨細胞を培養した。培養開始から７２時間後、２．０ｍｇ／ｍＬの濃度本発明の生体材料において、塊を形成する軟骨細胞が観測された。一方で、１．０ｍｇ／ｍＬのハイドロゲルにおいては、凝集は無かった。培養開始から９６時間後、２．０ｍｇ／ｍＬの本発明の生体材料における軟骨細胞は、塊として完全に凝集した。一方、１．０ｍｇ／ｍＬのハイドロゲルにおいては、塊を形成し始めた。言い換えれば、凝集および塊の構成は、コントロールと比べると高い本発明の材料の濃度において、直ちに発生する。
【０１７０】
本発明の生体材料に接触配置された細胞は、本発明の生体材料に対して、細胞培養のプラスチック表面に対する親和性を上回る、高い親和性を示す。これらを、細胞培養プレートから切り離し、本発明の生体材料に移植する。本発明の生体材料では、生存能力がある塊が形成される。しかしながら、コントロールとして同じ濃度のＨＡを用いた場合、細胞は、細胞培養プラスチックに対して高い親和性を示す。同じ濃度においても、本発明の生体材料とＨＡとの間には実質的な粘度の差がある。ＨＡは、本発明の生体材料よりも粘性が低い。図９は、ＨＡと比較した場合に、本発明の生体材料に見られる遊走効果を示している。生細胞（緑色）と死細胞（赤色）とを線引きをするのに、生死アッセイを使用した。結論として、本実施例で用いた細胞は、細胞培養プラスチックよりも本発明の生体材料に高い親和性を有し、ＨＡおよびプラスチックに対する反復性は発見されなかった。
【０１７１】
（実施例１４．本発明において培養された細胞とＨＡにて培養された細胞との機能性の観察比較）
本実施例では、組織再生に関連するマーカーの発現が測定された。
【０１７２】
本発明の生体材料およびコントロールであるＨＡを用いて、ＭＳＣにおける異なる軟骨マーカーの発現を測定するために、異なる２つの濃度のハイドロゲル（０．１および０．５ｍｇ／ｍＬ）およびＨＡのフラスコ毎に、７．５×１０５の細胞となるように、細胞をＴ７５フラスコにて培養した。４日後、細胞を遠心分離し、その後、ＲＮＡの精製をＡｇｉｌｅｎｔの総ＲＮＡ単離ミニキット（Agilent technologies, USA）を用いて行うことで、ＲＮＡをサンプルから抽出した。ＲＮＡ抽出に引き続いて、コラーゲンタイプＩＩおよびベルシカンの発現に対する典型的な手順に従って、ｃＤＮＡを合成し、ＲＴ−ＰＣＲを実行した。
【０１７３】
図１０は、発明の生体材料にて培養したＭＳＣ由来の軟骨要素であるコラーゲンＩＩおよびベルシカンの遺伝子発現解析の結果を示し、ＨＡコントロールと比較したものである。 タイプＩＩのコラーゲンは、関節の軟骨マトリクス（９０％）の大分を形成するものであり、かつ、軟骨細胞の表現型への細胞の分化のマーカーである。本発明の生体材料にて培養されたＭＣＳは、４日間の培養に続けてタイプＩＩのコラーゲンの発現を開始し、ＨＡにて培養されたものには、事象は現れない。ベルシカンは、軟骨の細胞外マトリックスにおけるマイナー要素である。以前の軟骨細胞のような細胞にて、軟骨細胞の表現型が異なるあるいは失ったマーカーとしてみなされる。成熟細胞から直接得られる軟骨細胞について、これらはベルシカンの欠乏を示し、および、これに付随して、アグリカン、コンドロイチン硫酸、およびコラーゲンＩＩの発現を増大させる。本発明の生体材料におけるＭＳＣは、コントロールである濃度を合わせたＨＡの細胞群に対して、増大したコラーゲンＩＩの発現を伴う遺伝子ベルシカンの発現において、減少を示す。それゆえ、本発明の生体材料は、軟骨細胞の表現型の相違、あるいは関節の軟骨再生に関する分子の合成能力の相違の示唆を指摘する。
【０１７４】
（実施例１５．ヒトおよびブタ起源を由来とする本発明の生体材料の流体測定的な特徴付け）
生体材料の機械的な特徴付けが通常実行されることで、組織工学の足場についての関連情報および比較情報の両方が与えられる。ハイドロゲルについての機械的な研究は、様々な技術を使用する注入に対して好適なハイドロゲルに関する、あるいは架橋のような化学プロセスの完了の程度に関する、重要な情報を提供することが可能である。
【０１７５】
本実施例では、前述のようにＷＪから単離されたＧＡＧの足場を、それぞれが２ｍｌの体積である３つの％の溶液（１％、５％、１０％）に等分し、流体測定のパラメータにおける濃度の影響を評価した。実験では、ＴＡ器具モデルＡＲ２０００ｅｘレオメータを用いた。粘度と同様に貯蔵弾性率および損失弾性率を含む後述の研究において、各サンプルが線形粘弾性レンジ（データは示さない）にてテストされたのを保障するために、初めに、各サンプルに対して、系統の排除が実行された。
【０１７６】
以下の線形粘弾性のレンジの測定では、損失弾性率、貯蔵弾性率、および粘度が、生理学的に関連する２０℃から５０℃まで変化する温度曲線上の一定の周波数を用いて、各サンプルについて決定された。データは、図１１から１３にプロットされて示される。
【０１７７】
図１１では、１０％濃度のヒトの値が、１０％濃度のブタの値よりも高いことが示される。５％でのヒトの値は、５％でのブタの値を上回っていた。より低い濃度（両方の１％、ブタでの５％）での結果は、粘度計のコーンの内部のクオリティにより、低いシグナル／ノイズ比を有していた。定量的および定性的に、ヒトのサンプルは、ブタのサンプルとグラム基準にて比較すると、より大きな値を示した。さらに、一定の振動周波数の下での温度変化における粘弾性の温度効果を有する定数の検出を変更するテストした温度において、わずかな減少率が見られた。図１２では、ヒトの値による結果は、どの濃度においても、ブタのサンプルによる値よりも上回っていることがわかる。より低い濃度（両方の１％、ブタでの５％）での結果は、粘度計のコーンの内部のクオリティにより、低いシグナル／ノイズ比を有していた。貯蔵弾性率の結果として、温度に連れた予想されたわずかな減少率が見られる。損失弾性率の値は、どのケースにおいても貯蔵弾性率の値よりも高く、従って、弾性の効果を上回る粘性の効果の優勢を示唆している。これは、単離したＧＡＧは固有の流量の作用を伴う架橋されていないハイドロゲルであるということを示す、予期された結果である。損失弾性率の結果が、３つの異なる濃度のブタおよびヒトの起源由来の本発明の生体材料に対して、得られる。図１３では、ヒトの値による結果は、どの濃度においても、ブタのサンプルによる値よりも上回っていることがわかる。より低い濃度（両方の１％、ブタでの５％）での結果は、粘度計のコーンの内部のクオリティにより、低いシグナル／ノイズ比を有していた。粘度は、グラム基準あたりのサンプルの様々な濃度によって、幅広いレンジを取ることが可能であり、ヒトハイドロゲルは、一定のより大きな粘性を有する。この実施例における本発明のヒト生体材料の１０％溶液は、ヒマシ油のそれに類似した平均粘度を有している。
【０１７８】
結果として、抽出されたＧＡＧの濃度を主に調整することによって、幅広い種類の粘性とモジュールとが利用可能であることがわかった。
【０１７９】
（実施例１６:組織の取り囲み（走化性）からの細胞補強）
この試験の目的は、組織由来の細胞に対する本発明の生体材料の走化性の能力を決定付けることである。このため、異なる２人のヒト患者由来のヒト軟骨のサンプルを使用した。ＭＳＣおよび軟骨細胞についての生存率および増殖の試験において２ｍｇ／ｍＬの濃度が適切であることが立証されており、本実施例においてもこの濃度を用いた。前段階で付着する基質）が存在するのを避けるために粘着性のないプレートを使用した。実験に用いたものは、以下の通りである。
・ネガティブコントロール：ＤＭＥＭ内の切片
・ヒアルロン酸：２ｍｇ／ｍＬのＨＡ内の切片
・対象物質：２ｍｇ／ｍＬの本発明の生体材料内の切片
さらに、ポジティブコントロールとして粘着性の血小板を用いた。組織は、１０％のウシの胎児の血清を１０％添加したＤＭＥＭ内で培養された。画像を日ごとに収集し、これらは図１４に示される。いずれのコントロールにもＨＡ露出切片にも細胞は存在しない、という結果が得られた。しかしながら、本発明の生体材料中の切片の中には、早期から、軟骨の表面の外側に移動した多数の細胞が観察された。生死アッセイは、軟骨切片の表面に移動する細胞に生存能力があるか否かを決定するのに利用された。その結果は、図１５に示され、軟骨切片から表面に出てくる大部分の細胞は生細胞であることを示唆する。しかしながら、軟骨切片の表面から本発明の生体材料の周囲への移動が観測された細胞はなかった。
【０１８０】
この結果に基づき、以下のように結論付ける。
１．本発明の生体材料は、天然組織由来の軟骨細胞を補強（補充）する能力を備えている。
２．本発明の生体材料により補強された軟骨細胞は、生存能力がある。
【０１８１】
上記発明から成る様々な実行可能な実施形態として、および上記以降の実施例において成される様々な変更として、明細書に記載された全ての物質は、実例として解釈されるものであり、意味を限定するものでもないことが理解できる。
【０１８２】
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【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】本発明の生体材料中に存在するＧＡＧの特徴付けおよび定量化を示す図である。
【図２】織学的染色法を用いて、サンプル中のＧＡＧの存在、および、該サンプル中の細胞およびＤＮＡ／ＲＮＡの明らかな欠如を証明する図である。左の図は、細胞を有するサンプルを示しており、右の図は、生体材料だけを染色したものを示している。Ａ、Ｂ：ヘマトキシリン−エオシン染色液；Ｃ、Ｄ：メチルグリーン−ピロニン染色液；Ｅ、Ｆ：アルシアンブルー染色液。
【図３】本発明の生体材料の内部の三次元構造を示す、走査型電子顕微鏡による画像である。この画像は、本発明の生体材料の内部構造を異なる２つの倍率で示している（Ａ：１０μｍ、Ｂ：５μｍ）。
【図４】本発明の生体材料中の細胞の毒性に関する研究結果を示す図である。このグラフは、ＡＭＳＣ細胞（脂肪−由来の間葉幹細胞）（Ａ）、マウスの繊維芽細胞（Ｂ）、Ｌ９２９（Ｃ）、骨芽細胞（Ｄ）、軟骨細胞（Ｅ）、およびケラチノサイト（Ｆ）における細胞毒性曲線を示している。
【図５】三次元の生体材料の拡大画像である。
【図６】ＭＴＴで染色された、本発明の生体材料と共培養した関節の軟骨細胞（軟骨細胞）およびＭＳＣの生存率を示す倒立光学顕微鏡画像である。
【図７】ヒト軟骨細胞の増殖能力を、本発明の生体材料とヒアルロン酸とにおいて比較した図である。
【図８】本発明の生体材料およびヒアルロン酸に接触させた繊維芽細胞Ｌ−９２９の増殖率を示す図である。
【図９】本発明の生体材料と供に細胞培養プラスチックに接種された細胞、およびヒアルロン酸ハイドロゲルと共に供に細胞培養プラスチックに接種された細胞の、倒立蛍光顕微鏡画像である。
【図１０】コラーゲンＩＩおよびベルシカンの発現のＲＴ−ＰＣＲを示す図である。アガロースゲルを比重走査した結果が示されている。データは、コントロール値（Ｃ）に対する強度の任意単位として示されており、平均値±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝３である（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１１】本発明のブタおよびヒト由来の生体材料についての異なる３つの濃度における貯蔵弾性率を示す図である。
【図１２】ブタおよびヒト由来のヒストゲルについての３つの異なる濃度における損失弾性率を示す図である。
【図１３】本発明のブタおよびヒト由来の生体材料についての３つの異なる濃度における損失弾性率を示す図である。
【図１４】周辺組織からの細胞加入（走化性）を示す、１日目（ａ）、３日目（ｂ）、および４日目（ｃ）の光学顕微鏡の画像である。
【図１５】軟骨切片の表面に移動した細胞が生細胞であるかどうかを判別するための生死アッセイを行った後の光学顕微鏡の画像である。
【図１６】周辺組織からの細胞加入（走化性）を示す、５日目（ａ）および６日目（ｂ）の光学顕微鏡の画像である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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