(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物をイソプレンの二量体化に適した熱もしくは触媒条件に供してイソプレン二量体を産出してから、イソプレン二量体を触媒的に水素化して飽和Ｃ１０燃料構成要素を形成すること；または
（ｂ）（ｉ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を一部水素化してイソアミレンを産出すること、（ｉｉ）イソアミレン、プロピレンおよびイソブテンからなる群から選択されるモノ−オレフィンとイソアミレンを二量体化して二量体化の産物であるダイメートを形成すること、ならびに（ｉｉｉ）当該ダイメートを完全に水素化して燃料構成要素を産出すること、
によりＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンを非イソプレン化合物へ化学的変換することを含む、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物から燃料構成要素を産出する方法であって、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は遺伝子加工された細胞培養物、天然微生物、植物または動物により得られたものである、方法
【請求項２】
前記Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンの少なくとも９５％を非イソプレン化合物に変換する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を１５０℃〜２５０℃に加熱して不飽和環状イソプレン二量体を産出し、当該不飽和環状イソプレン二量体を触媒的に水素化して、飽和環状イソプレン二量体の燃料構成要素を産出する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法であり、前記方法が以下（ｉ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物をイソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒と接触させて、不飽和環状イソプレン二量体を産出し、当該不飽和環状イソプレン二量体を触媒的に水素化して、飽和環状イソプレン二量体の燃料構成要素を産出することとを含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
イソプレンのシクロ二量体化を触媒するための前記触媒が、ニッケル触媒、鉄触媒およびクロム触媒からなる群から選択される触媒を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物の一部水素化工程が、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を水素ガスおよびイソプレンの一部水素化を触媒するための触媒と接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
イソプレンの一部水素化を触媒するための前記触媒がパラジウム触媒を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記モノ−オレフィンとイソアミレンの二量体化工程が、モノ−オレフィンの二量体化を触媒するための触媒の存在下でイソアミレンをモノ−オレフィンと接触させることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
モノ−オレフィンの二量体化を触媒するための前記触媒が酸触媒を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を燃料構成要素へ化学的変換する前にＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物からイソプレンを精製することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物から燃料構成要素を産出する系であって、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンが、非イソプレン化合物に化学的変換される、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を含む系であり、ならびに：  （ａ）（ｉ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンを二量体化できる１以上の化学物質またはＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンを二量体化できる熱源；ならびに（ｉｉ）イソプレン二量体を水素化して飽和Ｃ１０燃料構成要素を形成することができる触媒；または
（ｂ）（ｉ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンを一部水素化してイソアミレンを産出することができる化学物質、（ｉｉ）イソアミレン、プロピレンおよびイソブテンからなる群から選択されるモノ−オレフィンとイソアミレンを二量体化して二量体化の産物であるダイメートを形成することができる化学物質ならびに（ｉｉｉ）当該ダイメートを完全に水素化して燃料構成要素を産出することができる化学物質を含む系であり、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は遺伝子加工された細胞培養物、天然微生物、植物または動物により得られるものである系。
【請求項１２】
前記Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物が２ｍｇ超のイソプレンを含み、かつ当該組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９４重量％または９９．９４重量％超のイソプレンを含む、請求項１１記載の系。
【請求項１３】
イソプレンを二量体化できる前記１以上の化学物質が、ルテニウム触媒、ニッケル触媒、鉄触媒およびクロム触媒からなる群から選択される触媒を含む、イソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒を含む、請求項１１記載の系。
【請求項１４】
不飽和イソプレン二量体の水素化のための前記触媒が、パラジウム触媒、ニッケル触媒、ルテニウム触媒およびロジウム触媒からなる群から選択される触媒を含む、請求項１１記載の系。
【請求項１５】
イソプレンを一部水素化できる前記化学物質がパラジウム触媒を含む、請求項１１記載の系。
【請求項１６】
イソアミレンをモノ−オレフィンと二量体化できる前記化学物質が酸触媒を含む、請求項１１記載の系。
【請求項１７】
請求項１の方法により産出された燃料構成要素を含む、燃料組成物。
【請求項１８】
前記燃料組成物が１５％未満のイソプレンを含む、請求項１７記載の燃料組成物。
【請求項１９】
前記燃料組成物が−２２‰を上回るまたは−３２〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する、請求項１７記載の燃料組成物。
【請求項２０】
請求項１の方法であって、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中の８０％以上のイソプレンが非イソプレン化合物へ変換される方法。
【請求項２１】
請求項１の方法であって、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、及び１０以上の炭素原子をもつイソプレノイド化合物からなる群から選択された１以上の化合物を含むものである、方法。
【請求項２２】
請求項１の方法であって、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物はエタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−及びｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、及びＣ５プレニルアルコールからなる群から選択された１以上の化合物を含むものである、方法。
【請求項２３】
請求項１の方法であって、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、２、４、５−トリメチルピリジン、２、３、５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１−ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、イソ酪酸エチル、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、3-メチル-3-ブテン-1-イルアセタート、３-メチル-２-ブテン-１-イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ-３、７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３、７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）-３、７−ジメチル−１、３、６−オクタトリエン、（Ｚ）−３、７−ジメチル−１、３、６−オクタトリエン及び２、３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択された１以上の化合物を含むものである、方法。
【請求項２４】
請求項１の方法であって、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中の当該イソプレンは連続的に、化学的に非イソプレン化合物ヘ変換される方法。
【請求項２５】
請求項１１の系であって、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中のイソプレンの８０％以上が化学的に非イソプレン化合物へ変換される系。
【請求項２６】
請求項１１の系であって、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、及び１０以上の炭素原子をもつイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を含むものである系。
【請求項２７】
請求項１１の系であって、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２ビニルオキシラン、cis-及びtrans-３−メチル１，３−ペンタジエン、及びＣ５プレニルアルコールからなる群から選択される１以上の化合物を含むものである系。
【請求項２８】
請求項１１の系であり、当該Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１−ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、イソ酪酸エチル、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ-３、７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３、７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１、３、６−オクタトリエン、及び（Ｚ）−３、７−ジメチル−１、３、６−オクタトリエン、及び２、３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の化合物を含むものである、系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年６月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／１８７，９５９号に対する優先権を主張するものであり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
再生可能な輸送燃料の開発は、２１世紀の重要課題の１つである。現在の市場は、ショ糖およびデンプンの酵母発酵から得られるエタノールが大部分を占めており、少ない範囲をトリグリセリド由来のバイオディーゼル（脂肪酸エステル）が占めている。エタノールは、炭化水素と比べてエネルギー密度が低く、液体燃料として限界がある。加えて、エタノールは水親和性および腐食性質のために従来の基盤において輸送することができない。再生可能な炭素源（バイオマス、糖、油）の炭化水素燃料への変換プロセスはバイオエタノールの魅力的な代替物を提供する。
【０００３】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、主に合成ゴムの産出のために使用される重要な産業化学物質である。現在、イソプレンは、ナフサおよび他の軽油画分の粉砕により直接、または化学合成を介して間接的に石油化学源から得られる（例えば、Ｈ．  Ｐｏｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ａ．  Ｎｕｒｒｅｎｂａｃｈ，  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｅｒｐｅｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９７５，  ４３，  ５２７−５５１；  Ｈ．  Ｍ．  Ｗｅｉｔｚ  ａｎｄ  Ｅ．  Ｌｏｓｅｒ，  Ｉｓｏｐｒｅｎｅ，  ｉｎ  Ｕｌｌｍａｎｎ´ｓ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｒｅｌｅａｓｅ，  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧＭＢＨ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，  ２００５；  ａｎｄ  Ｈ．Ｍ．  Ｌｙｂａｒｇｅｒ，  Ｉｓｏｐｒｅｎｅ  ｉｎ  Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９５），  １４，  ９３４−９５２を参照されたい）。
生成した粗イソプレンストリームは、典型的には、化学的に類似している無数の不純物（これらの多くが続くイソプレンのポリマーおよび他の化学物質への変換に干渉し得る）を取り除くために大規模の精製プロセスに供する。
【０００４】
対して、生物学的源から得られるイソプレンは、炭化水素不純物をほとんど含まず、代わりに、いくつかの酸化化合物、例えば、エタノール、アセトアルデヒドおよびアセトンを含む。これらの化合物の多くは、水と接触させることにより、またはアルミナもしくは他の吸着材を通過させることにより容易に除去できる。
【０００５】
産業はイソプレン産出のための石油化学供給原料に依存しており、イソプレンがポリマーおよび他の化学物質に変換し得る前に一連の大規模の精製が必要とされる。生物学的に産出されたイソプレンを、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅの高純度および／または独特な不純物プロファイルの点で有利な貴重な化学産物へ変換する費用効果的な方法が所望される。
【０００６】
本明細書に引用されている特許、特許出願、文書、および刊行物は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００７】
高純度イソプレンから燃料構成要素を産出するための方法および系ならびに高純度イソプレンから産出される燃料組成物を開示する。
【０００８】
一態様では、本発明は、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンの実質的な一部を非イソプレン化合物へ化学的変換することを含む、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物からの燃料構成要素の産出方法を提供する。一実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物をイソプレンの二量体化に適した熱もしくは触媒条件に供することにより化学的変換してイソプレン二量体を産出してから、イソプレン二量体を触媒的に水素化して飽和Ｃ１０燃料構成要素を形成する。別の実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、（ｉ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を一部水素化してイソアミレンを産出すること、（ｉｉ）イソアミレン、プロピレンおよびイソブテンからなる群から選択されるモノ−オレフィンとイソアミレンを二量体化してダイメートを形成すること、ならびに（ｉｉｉ）ダイメートを完全に水素化して燃料構成要素を産出すること、により化学的変換する。いくつかの実施形態では、化学的変換中、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンの少なくとも約９５％を非イソプレン化合物に変換する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、約１５０℃〜約２５０℃に加熱して不飽和環状イソプレン二量体を産出し、不飽和環状イソプレン二量体を触媒的に水素化して、飽和環状イソプレン二量体の燃料構成要素を産出する。いくつかの実施形態では、本方法は以下を含む（ｉ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物をイソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒と接触させて、不飽和環状イソプレン二量体を産出し、不飽和環状イソプレン二量体を触媒的に水素化して、飽和環状イソプレン二量体の燃料構成要素を産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒は、ニッケル触媒、鉄触媒およびクロム触媒からなる群から選択される触媒を含む。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物の一部水素化工程は、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を水素ガスおよびイソプレンの一部水素化を触媒するための触媒と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、イソプレンの一部水素化を触媒するための触媒はパラジウム触媒を含む。いくつかの実施形態では、モノ−オレフィンでのイソアミレンの二量体化工程は、モノ−オレフィンの二量体化を触媒するための触媒の存在下でイソアミレンをモノ−オレフィンと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、モノ−オレフィンの二量体化を触媒するための触媒は酸触媒を含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物の燃料構成要素への化学的変換前のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物からのイソプレン精製を含む。
【０００９】
一態様では、本発明は、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物から燃料構成要素を産出する系を提供し、ここでＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンの実質的な一部は、非イソプレン化合物に化学的変換し、この系は、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物ならびに（ａ）（ｉ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンを二量体化できる１以上の化学物質またはＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンを二量体化できる熱源；ならびに（ｉｉ）イソプレンの二量体を水素化して飽和Ｃ１０燃料構成要素を形成することができる触媒；または（ｂ）（ｉ）Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンを一部水素化してイソアミレンを産出することができる化学物質、（ｉｉ）イソアミレン、プロピレンおよびイソブテンからなる群から選択されるモノ−オレフィンでイソアミレンを二量体化してダイメートを形成することができる化学物質、ならびに（ｉｉｉ）ダイメートを完全に水素化して燃料構成要素を産出することができる化学物質、を含む。
【００１０】
この系のいくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを含み、かつ組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて約９９．９４重量％または９９．９４重量％超のイソプレンを含む。この系のいくつかの実施形態では、イソプレンを二量体化できる１以上の化学物質は、ルテニウム触媒、ニッケル触媒、鉄触媒およびクロム触媒からなる群から選択される触媒を含むイソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒を含む。この系のいくつかの実施形態では、不飽和イソプレン二量体の水素化のための触媒は、パラジウム触媒、ニッケル触媒、ルテニウム触媒およびロジウム触媒からなる群から選択される触媒を含む。この系のいくつかの実施形態では、イソプレンを一部水素化できる化学物質はパラジウム触媒を含む。この系のいくつかの実施形態では、イソアミレンをモノ−オレフィンと二量体化できる化学物質は酸触媒を含む。
【００１１】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の方法により産出される燃料構成要素を含む燃料組成物を提供する。いくつかの実施形態では、燃料組成物は、イソプレンを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、燃料組成物は、−２２‰を上回るまたは−３２‰〜−２４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。
【００１２】
いくつかの態様では、本発明は、以下を含む、イソプレンから燃料構成要素を産出する系であって、（ａ）商業的に有益な量の高純度イソプレン；ならびに（ｂ）高純度イソプレンの少なくとも一部から産出される燃料構成要素；ここで商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部は、化学的変換を経ることを含む系を提供する。
【００１３】
系のいくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、約２ｍｇ超のイソプレンを含み、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて約９９．９４重量％または９９．９４重量％超のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、約２ｍｇ超のイソプレンを含み、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、約２ｍｇ超のイソプレンを含み、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の第２の化合物を含む；ここで第２の化合物の量はイソプレンの量と比べて、約０．０１％（ｗ／ｗ）またはそれより多い。いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、約２ｍｇ超のイソプレンを含み、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する化合物当たり０．５μｇ／Ｌ未満または化合物当たり約０．５μｇ／Ｌを含む。いくつかの好ましい実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、生物学的プロセスにより産出される。
【００１４】
系のいくつかの実施形態では、燃料構成要素は、環状イソプレン二量体および三量体、線状イソプレンオリゴマー、芳香族および脂環式イソプレン誘導体、ならびに酸化イソプレン誘導体からなる群から選択される１以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、酸化イソプレン誘導体は、イソプレンから得られるアルコール、ケトン、エステルおよびエーテルからなる群から選択される化合物である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、環状イソプレン二量体を含み、化学的変換は、イソプレンの二量体化反応を含む。いくつかの実施形態では、二量体化反応は、商業的に有益な量の高純度イソプレンを加熱することにより実行する。いくつかの実施形態では、イソプレンの二量体化反応は、不飽和イソプレン二量体を含む産物を産出し、化学的変換はさらに、不飽和イソプレン二量体の水素化反応を含む。いくつかの実施形態では、系はさらに、不飽和イソプレン二量体の水素化反応を触媒するための触媒を含む。いくつかの実施形態では、不飽和イソプレン二量体の水素化反応を触媒するための触媒は、パラジウム触媒、ニッケル触媒、ルテニウム触媒およびロジウム触媒からなる群から選択される触媒を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、二量体化反応は、商業的に有益な量の高純度イソプレンを、イソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒と接触させることにより実行する。いくつかの実施形態では、イソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒は、ルテニウム触媒、ニッケル触媒、鉄触媒およびクロム触媒からなる群から選択される触媒を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒はニッケル触媒であり、燃料構成要素は１以上の８員環イソプレン二量体を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、線状および／または環状イソプレン三量体を含み、化学的変換は、イソプレンの触媒的三量体化を含む。
【００１８】
一態様では、本発明は、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）商業的に有益な量の高純度イソプレンを得ること；ならびに（ｂ）商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部を燃料構成要素へ化学的変換することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、以下：（ｉ）イソプレン産出のための適切な培養条件下で、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞を培養することを含む工程から得られ、この細胞は（１）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、（２）細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、または（３）イソプレン約０．１ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性を有し、ならびに（ｉｉ）イソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、イソプレンシンターゼポリペプチドまたはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。
【００２０】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部の燃料構成要素への化学的変換は、以下（ｉ）商業的に有益な量の高純度イソプレンを約１５０℃〜約２５０℃に加熱すること；（ｉｉ）商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部を不飽和環状イソプレン二量体へ変換すること；（ｉｉｉ）不飽和環状イソプレン二量体を水素化して飽和環状イソプレン二量体を産出すること；ならびに（ｉｖ）燃料構成要素を産出することとを含む。いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン中の少なくとも約２０％〜約１００％のイソプレンを不飽和環状イソプレン二量体に変換する。
【００２１】
この方法のいくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部の燃料構成要素への化学的変換は、以下（ｉ）商業的に有益な量の高純度イソプレンをイソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒と接触させること、（ｉｉ）商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部を環状イソプレン二量体へ変換すること；ならびに（ｉｉｉ）燃料構成要素を産出することとを含む。
【００２２】
この方法のいくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部の燃料構成要素への化学的変換は、以下（ｉ）商業的に有益な量の高純度イソプレンをイソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒と接触させること、（ｉｉ）商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部を不飽和環状イソプレン二量体へ変換すること；（ｉｉｉ）不飽和環状イソプレン二量体を水素化して飽和環状イソプレン二量体を産出すること；ならびに（ｉｖ）燃料構成要素を産出することとを含む。この方法のいくつかの実施形態では、イソプレンのシクロ二量体化を触媒するための触媒は、ニッケル触媒、鉄触媒およびクロム触媒からなる群から選択される触媒を含む。
【００２３】
この方法のいくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部の燃料構成要素への化学的変換は、以下（ｉ）高純度イソプレン組成物を触媒系と接触させること；（ｉｉ）出発イソプレン組成物の少なくとも一部を不飽和イソプレン二量体および／もしくは三量体へ変換すること；ならびに（ｉｉｉ）不飽和二量体および／もしくは三量体を水素化して飽和Ｃ１０および／もしくはＣ１５炭化水素を産出することとを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）本明細書に記載の商業的に有益な量の任意の高純度イソプレン出発組成物を得ること；（ｂ）出発イソプレン組成物の少なくとも一部の酸化イソプレン誘導体へ変換すること；ならびに任意選択的に（ｃ）任意の不飽和酸化イソプレン誘導体を水素化して飽和酸素化物を産出することとを含む。いくつかの実施形態では、酸化イソプレン誘導体は、イソプレンから得られるアルコール、ケトン、エステルおよびエーテルからなる群から選択される化合物である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部の燃料構成要素への化学的変換前の商業的に有益な量の高純度イソプレンの精製をさらに含む。
【００２６】
一態様では、（ａ）商業的に有益な量の高純度イソプレンを連続的に産出すること；ならびに（ｂ）商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部を燃料構成要素へ連続的に化学的変換することとを含むイソプレンから燃料構成要素を産出するための連続プロセスを提供する。いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、イソプレンを含む気相を含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、イソプレンを含む気相を、商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部を燃料構成要素へ化学的変換させるリアクターに通過させることを含む。１つの好ましい実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅを含む。
【００２７】
本明細書に記載のいずれかの方法により産出された燃料構成要素を含む燃料組成物も提供する。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、本明細書に記載の方法による工程を経た後、０．５μｇ／Ｌ未満または約０．５μｇ／Ｌのイソプレン以外のＣ５炭化水素由来の産物を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、本明細書に記載の方法による工程を経た後、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエンおよび２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の化合物からの１以上の産物を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、燃料組成物は、−２２‰を上回るδ１３Ｃ値を有する燃料組成物を含む。いくつかの実施形態では、燃料組成物は、−２２‰〜１０‰または−３４‰〜２４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する。いくつかの実施形態では、燃料組成物は、０．９を上回るｆＭ値を有する。本明細書に記載の任意の燃料組成物と、総燃料組成物の総重量または体積に基づく約１％〜約９５重量％または体積％の量の石油ベースの燃料との混合物も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現用にコドンが最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）である。ａｔｇ開始コドンはイタリック体になっており、終止コドンは太字になっており、付加されたＰｓｔＩ部位には下線が付されている。
【図２】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕのマップである。
【図３Ａ−Ｃ】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号２）である。ＲＢＳには下線が付されており、クズイソプレンシンターゼ開始コドンは太字の大文字になっており、終止コドンは太字の大文字になっている。ベクター骨格は、ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂである。
【図４】ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕのマップである。
【図５Ａ−Ｃ】ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号３）である。
【図６】ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕのマップである。
【図７Ａ−Ｃ】ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号４）である。
【図８Ａ】ベクターを含まない大腸菌ＢＬ２１細胞におけるイソプレンの産出を示すグラフである。
【図８Ｂ】ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕを有する大腸菌ＢＬ２１細胞におけるイソプレンの産出を示すグラフである。
【図８Ｃ】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕを有する大腸菌ＢＬ２１細胞におけるイソプレンの産出を示すグラフである。
【図８Ｄ】ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕを有する大腸菌ＢＬ２１細胞におけるイソプレンの産出を示すグラフである。
【図９Ａ】１４リットルフェドバッチ発酵における大腸菌ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕの発酵時間に伴うＯＤを示すグラフである。
【図９Ｂ】１４リットルフェドバッチ発酵における大腸菌ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕの発酵時間に伴うイソプレン産出を示すグラフである。
【図１０Ａ】パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）におけるイソプレンの産出を示すグラフである。対照細胞は組換えクズイソプレンシンターゼを有さない。灰色の菱形はイソプレン合成を表し、黒い四角はＯＤ６００を表す。
【図１０Ｂ】ｐＣＬ−ｌａｃ  Ｋｕｄｚｕを発現するパントエア・シトレアにおけるイソプレンの産出を示すグラフである。灰色の菱形はイソプレン合成を表し、黒い四角はＯＤ６００を表す。
【図１０Ｃ】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕを発現するパントエア・シトレアにおけるイソプレンの産出を示すグラフである。灰色の菱形はイソプレン合成を表し、黒い四角はＯＤ６００を表す。
【図１１】組換えイソプレンシンターゼを発現する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるイソプレンの産出を示すグラフである。ＢＧ３５９４ｃｏｍＫは、プラスミドを含まない枯草菌株である（ネイティブなイソプレン産出）。ＣＦ４４３は、ｐＢＳＫｕｄｚｕを有する枯草菌株ＢＧ３５９４ｃｏｍＫである（組換えイソプレン産出）。ｙ軸上のＩＳはイソプレンを示す。
【図１２Ａ−Ｃ】ｐＢＳ  Ｋｕｄｚｕ  ＃２のヌクレオチド配列（配列番号５）である。
【図１３】ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）での発現用にコドン最適化されたクズイソプレンシンターゼのヌクレオチド配列（配列番号６）である。
【図１４】ヤロウイアでの発現用にコドン最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子を含むｐＴｒｅｘ３ｇのマップである。
【図１５Ａ−Ｃ】ベクターｐＳＰＺ１（ＭＡＰ２９Ｓｐｂ）のヌクレオチド配列（配列番号７）である。
【図１６】ヤロウイアでの発現用にコドン最適化された合成クズ（タイワンクズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｍｏｎｔａｎａ））イソプレン遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）である。
【図１７】合成ハイブリッドポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌａ））イソプレンシンターゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）である。ＡＴＧ開始コドンは太字になっており、終止コドンには下線が付されている。
【図１８Ａ（１８Ａ１−１８Ａ２】ベクターｐＹＬＡ１、ｐＹＬ１およびｐＹＬ２（配列番号７５、７３、７２、７１、７０、６９）の模式的で概説的な構築を示す。
【図１８Ｂ】ベクターｐＹＬＡ（ＰＯＰ１）（配列番号６８、６９）の模式的で概説的な構築を示す。
【図１８Ｃ】ベクターｐＹＬＡ（ＫＺ１）の模式的で概説的な構築を示す。
【図１８Ｄ】ベクターｐＹＬＩ（ＫＺ１）（配列番号６６、６７）の模式的で概説的な構築を示す。
【図１８Ｅ】ベクターｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）の模式的で概説的な構築を示す。
【図１８Ｆ】ベクターｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）の模式的で概説的な構築を示す。
【図１９Ａ】イソプレンのＭＶＡ代謝経路とＤＸＰ代謝経路を示す（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．４４：３５７−４２９，２００５に基づく）。以下の記載には、これらの経路内の各々のポリペプチドの別名と、示されたポリペプチドの活性を測定するためのアッセイを開示している参考文献とが含まれる（これらの参考文献の各々は、特に、ＭＶＡ経路とＤＸＰ経路内のポリペプチドのポリペプチド活性についてのアッセイに関して、各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ；アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＭｖａＥ、ＥＣ  ２．３．１．９。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：２１１６−２１２２，２００２；ＨＭＧＳ；ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ、ＭｖａＳ、ＥＣ  ２．３．３．１０。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４０６５−４０７０，２００２；ＨＭＧＲ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ、ＭｖａＥ、ＥＣ  １．１．１．３４。アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：２１１６−２１２２，２００２；ＭＶＫ；メバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ１２、ＥＣ  ２．７．１．３６。アッセイ：Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  １９：９−１４，１９９１。ＰＭＫ；ホスホメバロン酸キナーゼ、ＥＲＧ８、ＥＣ  ２．７．４．２、アッセイ：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１：６２０−６３１，１９９１；ＤＰＭＤＣ；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、ＭＶＤ１、ＥＣ  ４．１．１．３３。アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１３３５５−１３３６２，１９９４；ＩＤＩ；イソペンテニル−二リン酸デルタ−イソメラーゼ、ＩＤＩ１、ＥＣ  ５．３．３．２。アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９１６９−１９１７５，１９８９。ＤＸＰ経路：ＤＸＳ；１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ、ｄｘｓ、ＥＣ  ２．２．１．７。アッセイ：ＰＮＡＳ，９４：１２８５７−６２，１９９７；ＤＸＲ；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、ｄｘｒ、ＥＣ  ２．２．１．７。アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４４６−４４５７，２００２；ＭＣＴ；４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、ＩｓｐＤ、ＥＣ  ２．７．７．６０。アッセイ：ＰＮＡＳ，９７：６４５１−６４５６，２０００；ＣＭＫ；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、ＩｓｐＥ、ＥＣ  ２．７．１．１４８。アッセイ：ＰＮＡＳ，９７：１０６２−１０６７，２０００；ＭＣＳ；２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＩｓｐＦ、ＥＣ  ４．６．１．１２。アッセイ：ＰＮＡＳ，９６：１１７５８−１１７６３，１９９９；ＨＤＳ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ、ｉｓｐＧ、ＥＣ  １．１７．４．３。アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，７０：９１６８−９１７４，２００５；ＨＤＲ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸レダクターゼ、ＩｓｐＨ、ＥＣ  １．１７．１．２。アッセイ：ＪＡＣＳ，１２��：１２８４７−１２８５５，２００４。
【図１９Ｂ】古典的ＭＶＡ経路と改変されたＭＶＡ経路を示す。１、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡＣＴ）；２、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧＳ）；３、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧＲ）；４、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；５、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；６、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤまたはＤＰＭＤＣ）；７、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）；８、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）；９、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）。古典的ＭＶＡ経路は、反応５と６を経由して、反応１から反応７へと進行するが、改変されたＭＶＡ経路は、反応８と９を通過する。構造式中のＰおよびＰＰは、それぞれ、リン酸およびピロリン酸である。この図は、Ｋｏｇａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｉｉ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，７１：９７−１２０，２００７から抜粋されたものであり、これは、特に、改変されたＭＶＡ経路の核酸とポリペプチドに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。改変されたＭＶＡ経路は、例えば、いくつかの古細菌生物（例えば、メタノサルキナ・マゼイ）に存在する。
【図２０（２０Ａ−２０Ｂ）】クズイソプレンシンターゼ遺伝子を有さない（左）またはクズイソプレンシンターゼ遺伝子を有する（右）組換えＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株によるイソプレン産出のＧＣ−ＭＳ分析の結果を示すグラフである。矢印は、本物のイソプレン標準の溶出時間を示す。
【図２１】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳ  Ｋａｎのマップである。
【図２２Ａ−Ｄ】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳ  Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１０）である。
【図２３Ａ】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）による誘導の時間である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。
【図２３Ｂ】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。
【図２３Ｃ】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ＤＸＳ  ｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。
【図２３Ｄ】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩＤＸＳ  ｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。
【図２３Ｅ】ＢＬ２１／ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。
【図２３Ｆ】ＢＬ２１／ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。
【図２３Ｇ】ＢＬ２１／ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ＤＸＳにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。時間０は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時である。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。菱形はＯＤ６００を表し、丸は総イソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、四角はイソプレンの比生産性（μｇ／Ｌ／ＯＤ）を表す。
【図２３Ｈ】ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＩＤＩＤＸＳｋａｎにおけるグルコースからのイソプレンの産出を示すグラフである。矢印は、ＩＰＴＧ（４００μｍｏｌ）で誘導する時を示す。ｘ軸は誘導後の時間である。ｙ軸はＯＤ６００であり、ｙ２軸はイソプレンの総生産性（μｇ／Ｌヘッドスペースまたは比生産性（μｇ／Ｌヘッドスペース／ＯＤ）である。黒い菱形はＯＤ６００を表し、黒い三角はイソプレン生産性（μｇ／Ｌ）を表し、白い四角はイソプレン（μｇ／Ｌ／ＯＤ）の比生産性を表す。
【図２４】ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ  ｋａｎのマップである。
【図２５Ａ−Ｄ】ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ  ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１１）である。
【図２６】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのマップである。
【図２７Ａ−２７Ｄ】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙのヌクレオチド配列（配列番号１２）である。
【図２８】ｎｐｒＥ遺伝子座における枯草菌染色体への組込み用の、下流ＭＶＡ経路と酵母ｉｄｉを含有するカセットのマップを示す。ｎｐｒＥ上流／下流は、組み込まれるｎｐｒＥ遺伝子座から各々１ｋｂの配列を示す。ａｐｒＥプロモーター（アルカリ性セリンプロテアーゼプロモーター）は、ａｐｒＥ遺伝子のプロモーター（−３５、−１０、＋１転写開始部位、ＲＢＳ）を示す。ＭＶＫ１は、酵母メバロン酸キナーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＰＭＫは、開始部位の上流のバシルスＲＢＳを含む酵母ホスホメバロン酸キナーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＭＰＤは、開始部位の上流のバシルスＲＢＳを含む酵母ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を示す。ＲＢＳ−ＩＤＩは、開始部位の上流のバシルスＲＢＳを含む酵母ｉｄｉ遺伝子を示す。ターミネーターは、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のターミネーターのアルカリ性セリンプロテアーゼ転写ターミネーターを示す。ＳｐｅｃＲは、スペクチノマイシン耐性マーカーを示す。「増幅用のｎｐｒＥ上流反復」は、増幅に用いられる上流領域の直接的反復を示す。
【図２９Ａ−Ｄ】ｎｐｒＥ遺伝子座における枯草菌染色体への組込み用の、下流ＭＶＡ経路と酵母ｉｄｉを含有するカセットのヌクレオチド配列（配列番号１３）である。
【図３０】ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒのマップである。
【図３１Ａ−Ｂ】ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒのヌクレオチド配列（配列番号１４）である。
【図３２】ｐＴｒｃＰｏｐｌａｒのマップである。
【図３３Ａ−Ｃ】ｐＴｒｃＰｏｐｌａｒのヌクレオチド配列（配列番号１５）である。
【図３４】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  Ｋａｎのマップである。
【図３５Ａ−Ｃ】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１６）である。
【図３６】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＤＸＳ  Ｋａｎのマップである。
【図３７Ａ−Ｃ】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＤＸＳ  Ｋａｎのヌクレオチド配列（配列番号１７）である。
【図３８】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕのマップである。
【図３９Ａ−Ｃ】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号１８）である。
【図４０】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  Ａ３のマップである。
【図４１Ａ−Ｃ】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  Ａ３のヌクレオチド配列（配列番号１９）である。
【図４２】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩのマップである。
【図４３Ａ−Ｃ】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩのヌクレオチド配列（配列番号２０）である。
【図４４】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ＤＸＳのマップである。
【図４５Ａ−Ｄ】ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ＤＸＳのヌクレオチド配列（配列番号２１）である。
【図４６Ａ−Ｅ】バイオマス原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。パネルＡは、コーンストーバーからのイソプレン産出を示し、パネルＢは、バガスからのイソプレン産出を示し、パネルＣは、針葉樹パルプからのイソプレン産出を示し、パネルＤは、グルコースからのイソプレン産出を示し、パネルＥは、原料を加えない細胞からのイソプレン産出を示す。灰色の四角は、示された播種後の時点での培養液のＯＤ６００測定値を表し、黒い三角は、示された播種後の時点でのイソプレン産出を表す。
【図４７Ａ】グルコースを添加していない培養液におけるＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳ（ｋａｎ）によるイソプレン産出を表すグラフを示す。四角はＯＤ６００を表し、三角は産出されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表す。
【図４７Ｂ】ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％グルコース原料転化糖からのイソプレン産出を表すグラフを示す。四角はＯＤ６００を表し、三角は産出されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表す。
【図４７Ｃ】ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％転化糖原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。四角はＯＤ６００を表し、三角は産出されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表す。
【図４７Ｄ】ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳ（ｋａｎ）による１％ＡＦＥＸコーンストーバー原料からのイソプレン産出を表すグラフを示す。四角はＯＤ６００を表し、三角は産出されたイソプレン（μｇ／ｍｌ）を表す。
【図４８Ａ−Ｃ】イソプレン産出に対する酵母抽出物の影響を示すグラフを示す。パネルＡは、様々な量の酵母抽出物を供給した発酵槽内の光学密度の時間経過を示す。パネルＢは、様々な量の酵母抽出物を供給した発酵槽内のイソプレン力価の時間経過を示す。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。パネルＣは、フェドバッチ培養で増殖した大腸菌でのイソプレン産出に対する酵母抽出物の影響を示す。
【図４９Ａ−Ｃ】ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ＋ｙＩＤＩ＋ＤＸＳプラスミドを含有する大腸菌細胞を含む５００Ｌバイオリアクターからのイソプレン産出を示すグラフを示す。パネルＡは、グルコースと酵母抽出物を供給した５００Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過を示す。パネルＢは、グルコースと酵母抽出物を供給した５００Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。パネルＣは、グルコースと酵母抽出物を供給した５００Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過を示す。
【図５０】ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２のマップである。
【図５１Ａ−Ｃ】ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２のヌクレオチド配列（配列番号２２）である。
【図５２】ｐＢＳ  Ｋｕｄｚｕ  ＃２のマップである。
【図５３Ａ】１４リットルフェドバッチ発酵で組換えクズイソプレンシンターゼを発現するバシルスの発酵時の増殖を示すグラフである。黒い菱形は、組換えイソプレンシンターゼを有さない対照株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）（ネイティブなイソプレン産出）を表し、灰色の三角は、ｐＢＳＫｕｄｚｕを有するバシルス株ＢＧ３５９４ｃｏｍＫであるＣＦ４４３（組換えイソプレン産出）を表す。
【図５３Ｂ】１４リットルフェドバッチ発酵で組換えクズイソプレンシンターゼを発現するバシルスの発酵時のイソプレン産出を示すグラフである。黒い菱形は、組換えイソプレンシンターゼを有さない対照株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）（ネイティブなイソプレン産出）を表し、灰色の三角は、ｐＢＳＫｕｄｚｕを有するバシルス株ＢＧ３５９４ｃｏｍＫであるＣＦ４４３（組換えイソプレン産出）を表す。
【図５４】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図５５】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図５６】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。
【図５７】グリセロールを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図５８】グリセロールを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図５９】グリセロールを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出された総イソプレンの時間経過である。
【図６０Ａ−６０Ｃ】グルコースを供給した１５０Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。
【図６１Ａ−６１Ｃ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。
【図６２Ａ−６２Ｃ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、メバロン酸力価、および比生産性の時間経過である。
【図６３Ａ−６３Ｃ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。
【図６４Ａ−６４Ｃ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。
【図６５Ａ−６５Ｃ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。
【図６６Ａ−６６Ｃ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。
【図６７Ａ−６７Ｃ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度、イソプレン力価、および比生産性の時間経過である。
【図６８】様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＡの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。例えば、図のキャプションの最初の項目（４０℃の大気中のイソプレン）は、グラフ中の最も上にある曲線に対応する。
【図６９】４％水と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＢの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。
【図７０】５％ＣＯ２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＣの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。
【図７１】１０％ＣＯ２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＤの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。
【図７２】１５％ＣＯ２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＥの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。
【図７３】２０％ＣＯ２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＦの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。
【図７４】３０％ＣＯ２と様々な酸素レベルの燃料濃度の関数としてのシリーズＧの計算断熱火炎温度のグラフである。図のキャプションには、曲線がグラフに現われる順に記載されている。
【図７５Ａ】シリーズＡについてＣＡＦＴモデル結果を重量パーセントから容積パーセントに変換したものの表である。
【図７５Ｂ】容積パーセントとしてプロットされた図６８のシリーズＡについてのＣＡＦＴモデルからの引火性結果のグラフである。
【図７６Ａ】シリーズＢについてＣＡＦＴモデル結果を重量パーセントから容積パーセントに変換したものの表である。
【図７６Ｂ】容積パーセントとしてプロットされた図６９のシリーズＢについてのＣＡＦＴモデルからの引火性結果のグラフである。
【図７７】引火性試験容器を示す図である。
【図７８Ａ】試験シリーズ１：０％ストリーム、０ｐｓｉｇ、および４０℃の引火性曲線のグラフである。
【図７８Ｂ】試験シリーズ１の爆発および非爆発データ点をまとめた表である。
【図７８Ｃ】ＣＡＦＴモデルと比較した試験シリーズ１の引火性曲線のグラフである。
【図７９Ａ】試験シリーズ２：４％ストリーム、０ｐｓｉｇ、および４０℃の引火性曲線のグラフである。
【図７９Ｂ】試験シリーズ２の爆発および非爆発データ点をまとめた表である。
【図７９Ｃ】ＣＡＦＴモデルと比較した試験シリーズ２の引火性曲線のグラフである。
【図８０Ａ−Ｂ】試験シリーズ１の詳細な実験条件および実験結果の表である。
【図８１】試験シリーズ２の詳細な実験条件および実験結果の表である。
【図８２】３気圧の圧力での様々な窒素／酸素比の燃料濃度の関数としてプロットされた計算断熱火炎温度のグラフである。
【図８３】１気圧の圧力での様々な窒素／酸素比の燃料濃度の関数としてプロットされた計算断熱火炎温度のグラフである。
【図８４】図８２からのデータを用いて、実施例１３に記載の方法論に従って構築された引火限度のグラフである。実験データ点（丸）は、１気圧の初期系圧で実施された本明細書に記載の試験からのものである。
【図８５】図８３からのデータを用いて、実施例１３に記載の方法論に従って構築された引火限度のグラフである。実験データ点（丸）は、１気圧の初期系圧で実施された本明細書に記載の試験からのものである。
【図８６Ａ】発酵オフガスのＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。
【図８６Ｂ】発酵オフガス中に存在するわずかな揮発性物質を示すための図８６Ａの拡大図である。
【図８７Ａ】−７８℃でクライオトラッピングした後のオフガス中に存在する微量の揮発性物質のＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。
【図８７Ｂ】−１９６℃でクライオトラッピングした後のオフガス中に存在する微量の揮発性物質のＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。
【図８７Ｃ】図８７Ｂの拡大図である。
【図８７Ｄ】図８７Ｃの拡大図である。
【図８８Ａ−Ｂ】石油から得られたイソプレン由来のＣ５炭化水素（図８８Ａ）と生物学的に産出されたイソプレン由来のＣ５炭化水素（図８８Ｂ）を比較したＧＣ／ＭＳクロマトグラムである。標準は、主要イソプレンピークの近くで溶出する３つのＣ５炭化水素不純物を含有する（図８８Ａ）。対照的に、生物学的に産出されたイソプレンは、大量のエタノールとアセトン（実行時間３．４１分）を含有する（図８８Ａ）。
【図８９】３ｇ／Ｌの酵母抽出物とともにグルコースを供給した、クズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＴｒｃＩＳ株の発酵オフガスの解析のグラフである。
【図９０】イソプレンと構造が類似していて、重合触媒毒としても作用し得るいくつかの不純物の構造を示す。
【図９１】ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡとも呼ばれる）のマップである。
【図９２Ａ−９２Ｃ】ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡとも呼ばれる）のヌクレオチド配列（配列番号２３）である
【図９３】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図９４】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図９５】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。
【図９６】転化糖を供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図９７】転化糖を供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図９８】転化糖を供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。
【図９９】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図１００】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図１０１】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターからのイソプレン比活性の時間経過である。
【図１０２】ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２のマップである。
【図１０３Ａ−１０３Ｃ】ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２のヌクレオチド配列（配列番号２４）である。
【図１０４】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図１０５】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図１０６】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。
【図１０７】プラスミドＭＣＭ３３０（ＦＲＴ−ｃｍ−ＦＲＴ−ｇｉ１．２−ＫＫＤｙ  ａｔ  ａｔｔＴｎ７）のマップである。
【図１０８Ａ−１０８Ｃ】プラスミドＭＣＭ３３０のヌクレオチド配列（配列番号２５）である。
【図１０９】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕのマップである。
【図１１０Ａ−Ｂ】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕのヌクレオチド配列（配列番号２６）である。
【図１１１Ａ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図１１１Ｂ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図１１１Ｃ】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターにおけるイソプレンの比生産性の時間経過である。
【図１１２Ａ】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのマップである。
【図１１２Ｂ−Ｃ】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのヌクレオチド配列（配列番号２７）である。
【図１１３Ａ】ＭＣＭ３８２−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（マゼイ）のマップである。
【図１１３Ｂ−Ｃ】ＭＣＭ３８２−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（マゼイ）のヌクレオチド配列（配列番号２８）である。
【図１１４Ａ】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのマップである。
【図１１４Ｂ−Ｃ】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのヌクレオチド配列（配列番号２９）である。
【図１１５Ａ−１１５Ｄ】ＭＶＫとイソプレンシンターゼの過剰発現によってイソプレン産出が増加することを示す。１００μＭおよび２００μＭのＩＰＴＧでイソプレン産出を誘導し、１００ｍＬバイオリアクター中、グルコースで増殖したときのＭＣＭ４０１およびＭＣＭ３４３からの蓄積したイソプレンおよびＣＯ２を、２２時間の時間経過にわたって測定した。図１１５Ａは、ＭＣＭ３４３からの蓄積したイソプレン（％）のグラフである。図１１５Ｂは、ＭＣＭ４０１からの蓄積したイソプレン（％）のグラフである。図１１５Ｃは、ＭＣＭ３４３からの蓄積したＣＯ２（％）のグラフである。図１１５Ｄは、ＭＣＭ４０１からの蓄積したＣＯ２（％）のグラフである。
【図１１６】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図１１７】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図１１８】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。
【図１１９】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、すなわち、代謝活性プロファイルである。
【図１２０】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン産出時の細胞生存性のグラフである。ＴＶＣ／ＯＤは、光学密度単位（ＯＤ５５０）当たりのブロス１ｍＬ中の総生菌数（コロニー形成単位）である。
【図１２１】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図１２２】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図１２３】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。
【図１２４】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の容積生産性の時間経過である。容積生産性は１時間当たりにブロス１リットルから産出されるイソプレンの量と定義される。
【図１２５】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の瞬間的収率の時間経過である。瞬間的収率は、データ点とデータ点の間の期間にバイオリアクターに供給されたグルコースの量（グラム）当たりに産出されるイソプレン（グラム）の量（ｗ／ｗ）と定義される。
【図１２６】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、すなわち、代謝活性プロファイルである。
【図１２７】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン産出時の細胞生存性のグラフである。ＴＶＣ／ＯＤは、光学密度単位（ＯＤ５５０）当たりのブロス１ｍＬ中の総生菌数（コロニー形成単位）である。
【図１２８】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。
【図１２９】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過である。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【図１３０】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過である。
【図１３１】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、すなわち、代謝活性プロファイルである。
【図１３２】バイオリアクターへの空気流量の一時的な減少によって、オフガス中のイソプレンの濃度の急増（これは、代謝活性（ＴＣＥＲ）の劇的な減少をもたらさなかった）が生じたことを示すグラフである。ＴＣＥＲ、すなわち代謝活性とは、総二酸化炭素発生速度のことである。
【図１３３】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン産出時の細胞生存性のグラフである。ＴＶＣ／ＯＤは、光学密度単位（ＯＤ５５０）当たりのブロス１ｍＬ中の総生菌数（コロニー形成単位）である。
【図１３４】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過である。縦点線は、イソプレンを１ｇ／Ｌ／時間の速度でバイオリアクターに導入したときの時間間隔を表す。
【図１３５】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）、すなわち、代謝活性プロファイルである。縦点線は、イソプレンを１ｇ／Ｌ／時間の速度でバイオリアクターに導入したときの時間間隔を表す。
【図１３６】グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン産出時の細胞生存性のグラフである。ＴＶＣ／ＯＤは、光学密度単位（ＯＤ５５０）当たりのブロス１ｍＬ中の総生菌数（コロニー形成単位）である。縦点線は、イソプレンを１ｇ／Ｌ／時間の速度でバイオリアクターに導入したときの時間間隔を表す。
【図１３７Ａ−Ｂ】ウラジロハコヤナギｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３０）である。
【図１３７Ｃ−Ｄ】クロヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｎｉｇｒａ）ｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３１）である。
【図１３７Ｅ−Ｆ】アメリカヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）ｐＥＴ２４ａの配列（配列番号３２）である。
【図１３７Ｇ】アメリカヤマナラシイソプレンシンターゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号３３）である。
【図１３７Ｈ−Ｉ】ブラックコットンウッド（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）ｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３４）である。
【図１３７Ｊ−Ｋ】ヨーロッパヤマナラシ×ウラジロハコヤナギｐＥＴ２４ａ（イソプレンシンターゼ遺伝子は太字で強調されている）の配列（配列番号３５）である。
【図１３７Ｌ】ｐＣＲ２．１骨格中にクズＩｓｐＳコード配列を含有するＭＣＭ９３のマップである。
【図１３７Ｍ−Ｎ】ＭＣＭ９３の配列（配列番号３６）である。
【図１３７Ｏ】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕのマップである。
【図１３７Ｐ−Ｑ】ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕ（配列番号３７）の配列である。
【図１３８】全細胞ヘッドスペースアッセイで測定したときの様々なポプラ種のイソプレンシンターゼ発現データである。Ｙ軸は、ＩＰＴＧで誘導した０．２ｍＬの培養物によって産出されたイソプレンのμｇ／Ｌ／ＯＤである。
【図１３９】ＤＭＡＰＰアッセイで測定したときのポプライソプレンシンターゼ酵素の相対活性である。ポプラ酵素は、クズ由来のイソプレンシンターゼよりも有意に高い活性を有する。ポプラ［ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ］だけは、微量（＜１％）の活性を有していた。これはプロットに示されていない。
【図１４０】ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０−ｈｙｂｒｉｄ＿ＨＧＳのマップである。
【図１４１】ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０−ｈｙｂｒｉｄ＿ＨＧＳのヌクレオチド配列、酵母にコドン最適化されたクズイソプレンシンターゼ（配列番号３８）の配列である。
【図１４２Ａ】ｐＤＷ１４のマップである。
【図１４２Ｂ−Ｃ】ｐＤＷ１４の完全ヌクレオチド配列（配列番号３９）である。
【図１４３】ｐＤＷ１４またはｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を保有する誘導されたＩＮＶＳｃ−１株である。図１４３Ａ．ガラクトースで誘導されたＩＮＶＳｃ−１株から作製され、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色されたライセートの４〜１２％ビストリスゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。図１４３Ｂ．ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた同じ株のウェスタンブロット解析。レーンは以下の通りである。１、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２；２、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＤＷ１４（分離株１）；３、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＤＷ１４（分離株２）。（ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ２分子量標準を用いて）ＭＷ（ｋＤａ）を示す。
【図１４４Ａ−１４４Ｂ】ｐＤＷ１４またはｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を保有する誘導されたＩＮＶＳｃ−１株である。図１４４Ａ．溶解前のガラクトース誘導株のＯＤ６００。ｙ軸はＯＤ６００である。図１４４Ｂ．対照およびイソプレンシンターゼ保有株におけるイソプレンシンターゼヘッドスペースのＤＭＡＰＰアッセイ。比活性をμｇＨＧ／Ｌ／ＯＤとして算出した。試料は以下の通りである。対照、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２；ＨＧＳ−１、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＤＷ１４（分離株１）；ＨＧＳ−２、ＩＮＶＳｃ−１＋ｐＤＷ１４（分離株２）。
【図１４５Ａ】コドン最適化されたイソプレンシンターゼｆｌｕｏ−ｏｐｔ２ｖ２のマップである。
【図１４５Ｂ】コドン最適化されたイソプレンシンターゼ  ｆｌｕｏ−ｏｐｔ２ｖ２のヌクレオチド配列（配列番号４０）である。
【図１４６Ａ】ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５のマップである。
【図１４６Ｂ−Ｃ】ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５のヌクレオチド配列（配列番号４１）である。
【図１４７Ａ】ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２のマップである。
【図１４７Ｂ−Ｃ】ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２のヌクレオチド配列（配列番号４２）である。
【図１４８】誘導されていないか、ＩＰＴＧ（４×５０μｍｏｌ）で誘導されたか、またはＩＰＴＧ（２×１００μｍｏｌ）で誘導されたＭＣＭ４０１株についてのＣＥＲ対発酵時間のグラフである。
【図１４９】ｐＨ調整されたかまたはｐＨ調整されていない、サトウキビ溶液中のグルコースの濃度を、オートクレーブサイクル（１サイクル＝３０分）の回数の関数として示す。
【図１５０】グルコース、サトウキビ、および転化サトウキビでのシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）Ｆ１およびシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＴＣＣ１３５２５の増殖曲線（時間の関数としてのＯＤ６００）を示す。
【図１５１】グルコース、サトウキビ、および転化サトウキビでの大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＭＧ１６５５、ＡＴＣＣ１１３０３およびＢ  ＲＥＬ  ６０６の増殖曲線（時間の関数としてのＯＤ６００）を示す。
【図１５２】プラスミドｐＥＴ２４  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳのマップである。
【図１５３Ａ−Ｂ】プラスミドｐＥＴ２４  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳのヌクレオチド配列（配列番号４３）である。
【図１５４】コンストラクトプラスミドＥＷＬ２３０に対するエンドヌクレアーゼ消化に用いられる制限部位およびＢｓｐＨＩ部位とＮｃｏＩ部位の間の互換性のある付着末端を示す模式図である。
【図１５５】プラスミドＥＷＬ２３０のマップである。
【図１５６Ａ−Ｂ】プラスミドＥＷＬ２３０のヌクレオチド配列（配列番号４４）である。
【図１５７】コンストラクトプラスミドＥＷＬ２４４に対するエンドヌクレアーゼ消化に用いられる制限部位およびＮｓｉＩ部位とＰｓｔＩ部位の間の互換性のある付着末端を示す模式図である
【図１５８】プラスミドＥＷＬ２４４のマップである。
【図１５９Ａ−Ｂ】プラスミドＥＷＬ２４４のヌクレオチド配列（配列番号４５）である。
【図１６０Ａ】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのマップである。
【図１６０Ｂ−Ｃ】Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンのヌクレオチド配列（配列番号４６）である。
【図１６１Ａ】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのマップである。
【図１６１Ｂ−Ｃ】ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄのヌクレオチド配列（配列番号４７）である。
【図１６２】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのマップである。
【図１６３Ａ−Ｂ】プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌのヌクレオチド配列（配列番号４８）である。
【図１６４Ａ−Ｆ】１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖させた、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｐｇｌを発現する大腸菌株（ＲＨＭ１１１６０８−２）によるイソプレン産出のグラフである。図１６４Ａは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の光学密度の時間経過を示す。図１６４Ｂは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。力価は発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。イソプレンの算出方法：５９時間で産出される累積イソプレン、５９時間でのｇ／発酵槽容積、Ｌ［＝］ｇ／Ｌブロス。図１６４Ｃもまた、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内のイソプレン力価の時間経過を示す。イソプレンの算出方法：∫（瞬間的イソプレン産出速度、ｇ／Ｌ／時間）ｄｔ  ｔ＝０〜５９時間［＝］ｇ／Ｌブロス。図１６４Ｄは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクターから産出される総イソプレンの時間経過を示す。図１６４Ｅは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の容積生産性を示す。図１６４Ｆは、グルコースを供給した１５Ｌバイオリアクター内の二酸化炭素発生速度（ＣＥＲ）、すなわち代謝活性プロファイルを示す。
【図１６５Ａ−Ｂ】１５Ｌバイオリアクターにおける発酵からのオフガスの分析を示すグラフである。試料Ａは、６４．８時間でサンプリングされたＲＭ１１１６０８−２株である。試料ＢはＥＷＬ２５６株であり、これは、３４．５時間でサンプリングされた、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫであった。水素は、両方の試料について、ベースライン（０．９５×１０−８ｔｏｒｒ）よりも上で検出される。
【図１６６Ａ】例示的なＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）回収装置を示す。
【図１６６Ｂ】例示的なＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）脱離／凝結の設定を示す。
【図１６７】Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。材料は純度９９．７％と測定された。
【図１６８Ａ−Ｃ】処理前（ａ）ならびにアルミナ処理後（Ｂ）もしくはシリカ処理後（Ｃ）のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）試料のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。イソプレンピークは、これらのクロマトグラムに示されない。
【図１６９】発酵オフガスからのイソプレン精製のプロセスおよび関連した装置の図解を示す。
【図１７０】一部水素化したＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）単量体のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。化合物１（ＲＴ＝１２．３０分）＝３−メチル−１−ブテン、化合物２（ＲＴ＝１２．７０分）＝２−メチルブタン、化合物３（ＲＴ＝１３．２３分）＝２−メチル−１−ブテン、化合物４（ＲＴ＝１３．５３分）＝イソプレン、化合物５（ＲＴ＝１４．０１分）＝２−メチル−２−ブテン）。
【図１７１】２−メチル−２−ブテンのＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５酸樹脂触媒化二量体化から引き出す産物のためのＧＣ／ＭＳ総イオンクロマトグラムを示す。
【図１７２】Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）単量体のＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５酸樹脂触媒化オリゴマー化から得られる産物のためのＧＣ／ＭＳ総イオンクロマトグラムを示す。
【図１７３】二量体化リアクターを用いたＣ５ストリームのＣ１０／Ｃ１５産物ストリームへの変換のためのプロセスフロー図を示す。Ｃ５ストリームは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）単量体のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）単量体および／またはＣ５誘導体を含む。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、とりわけ、イソプレン由来の燃料構成要素の組成物および産出方法を提供する。本明細書では、燃料構成要素もしくは添加物、例えば、環状イソプレン二量体および三量体、線状イソプレンオリゴマー、芳香族および脂環式イソプレン誘導体、ならびに酸化イソプレン誘導体を提供する。燃料構成要素は、商業的に有益な量の高純度イソプレンを含む出発材料の化学的変換により産出できる。一態様では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅを含む。別の態様では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅであることができる。別の態様では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、異種イソプレンシンターゼ酵素を発現する培養細胞により産出された高純度イソプレン組成物であることができる。他の態様では、高純度イソプレンは、オリゴマー化を経て、不飽和イソプレンオリゴマー、例えば、環状二量体もしくは三量体ならびに線状オリゴマーを形成する。不飽和オリゴマーを水素化して、飽和炭化水素燃料構成要素を産出し得る。いくつかの実施形態では、酸触媒の存在下における高純度イソプレンのアルコールとの反応は、燃料酸素化物を産出する。別の態様では、高純度イソプレンは、部分的に水素化してイソアミレンを産出する。いくつかの実施形態では、高純度イソプレンから得られるイソアミレン産物は、二量体化を経てイソデセンを形成する。いくつかの実施形態では、高純度イソプレンから得られるイソアミレン産物は、酸触媒の存在下でアルコールと反応し、燃料酸素化物を産出する。
【００３１】
再生可能な炭素から得られるＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは、化学触媒作用により種々の炭化水素燃料に変換できる。本明細書では、発酵からのイソプレンの回収方法、および続く化学触媒作用による炭化水素燃料のより高い分子量の化合物への変換方法を提供する。これらの方法は、限定するものではないが、発酵オフガスからのイソプレンの回収および精製、ならびに続く気相もしくは液相触媒作用により燃料価の化合物を提供することを含む。連続およびバッチモードの両プロセスを、本発明の範囲内に意図する。
【００３２】
本明細書にさらに記載しているように、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物が、限定するものではないが、１，３−シクロペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、およびｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インなどの通常石油−イソプレン組成物中に存在する任意の汚染不飽和Ｃ５炭化水素を実質的に含まないという点でＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は石油−イソプレン組成物と区別される。本明細書に記載のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ出発材料に任意の汚染不飽和Ｃ５炭化水素が存在する場合、それらは、石油−イソプレン組成物中のものより低レベルで存在する。したがって、本明細書に記載のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物から得られる任意の燃料産物は、任意の汚染不飽和Ｃ５炭化水素またはこのような汚染不飽和Ｃ５炭化水素から得られる産物を本質的に含まないか、または石油−イソプレンから得られる燃料産物より低レベルで含む。加えて、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中の硫黄レベルは、石油−イソプレン組成物中の硫黄レベルより低い。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物から得られる燃料産物は、石油−イソプレンから得られる燃料産物中のものより低レベルの硫黄を含む。
【００３３】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは、石油−イソプレン組成物中に存在しないかさらにより低レベルで存在するもの、例えば、アルコール、アルデヒド、ケトンなどの他の生体副産物（Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅと共に得られる、生物学的源由来のおよび／または生物学的プロセスと関連する化合物）と産出されるという点でＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは石油−イソプレンと区別される。生体副産物は、限定するものではないが、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、または線状イソプレンポリマー（例えば、複数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）を含み得る。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから得られる燃料産物は、任意の生体副産物から得られる１以上の生体副産物または化合物を含む。加えて、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから得られる燃料産物は、続く化学変換中にこれらの生体副産物から形成された化合物を含み得る。このような化合物の例としては、求ジエン体からイソプレンまたはその燃料誘導体へのディールス・アルダー環付加、イソプレンまたは燃料誘導体の酸化から得られるものが挙げられる。
【００３４】
さらに、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは、炭素フィンガープリント法により石油−イソプレンから区別される。一態様では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは、石油−イソプレンより高い放射活性炭素１４（１４Ｃ）含量またはより高い１４Ｃ／１２Ｃ比を有する。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは再生可能な炭素源から産出するため、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ中の１４Ｃ含量または１４Ｃ／１２Ｃ比は、大気中に存在するものと同じである。一方、石油−イソプレンは、数千〜数百万年前に沈殿した化石燃料に由来するため、１４Ｃ含量または１４Ｃ／１２Ｃ比は放射活性崩壊のために減少している。本明細書においてさらに論じるように、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから得られる燃料産物は、石油−イソプレンから得られる燃料産物より高い１４Ｃ含量または１４Ｃ／１２Ｃ比を有する。一実施形態では、本明細書に記載のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから得られる燃料産物は、大気中のものに類似している１４Ｃ含量または１４Ｃ／１２Ｃ比を有する。別の態様では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは、記号d１３Ｃにより表す「デルタ値」として報告できる安定した炭素同位体比（１３Ｃ／１２Ｃ）により石油−イソプレンと分析的に区別できる。例えば、石油精製のＣ５ストリームの抽出蒸留から得られるイソプレンにおいて、δ１３Ｃは約−２２‰〜約−２４‰である。この範囲は石油から得られた軽不飽和炭化水素において典型的であり、石油ベースのイソプレンから得られる産物は、典型的には同じδ１３Ｃのイソプレン単位を含む。トウモロコシ由来グルコースの発酵（δ１３Ｃ−１０．７３‰）により最少量の他の炭素含有栄養剤（例えば、酵母抽出物）と産出されたＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは、δ１３Ｃ−１４．６６‰〜１４．８５‰でポリイソプレンにポリマー化できるイソプレンを産出する。このようなＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから産出される産物は、石油ベースのイソプレンから得られるものより負の値が小さいδ１３Ｃ値を有することが予期される。
【００３５】
これらの方法により作製された化合物としては、環状イソプレン二量体および三量体、線状オリゴマー、芳香族および脂環式誘導体が挙げられる。ジイソアミレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物の一部水素化を含む方法により作製する。これらイソプレンの化学誘導体は、液体輸送燃料（Ｉｓｏｆｕｅｌｓ（商標））として、および燃料添加物として有用である。
【００３６】
本明細書において、アルコール、ケトン、エステルおよびエーテルを含むイソプレンの酸化誘導体の産出方法も提供する。イソプレンの酸化誘導体の合成方法は、同種および異種触媒を用いて液相または気相で実施することもできる。この化学クラスの化合物は、液体輸送燃料としても有用であり、放射還元のための燃料酸素化物として、および燃料改良剤として、例えばディーゼルのセタン価向上剤として燃料混合物中で使用できる。
【００３７】
イソプレンは石油を分別することによって得ることができるが、この物質の精製は高価で、時間がかかる。炭化水素のＣ５ストリームの石油分解からは、わずか約１５％のイソプレンしか産出されない。イソプレンは、種々の微生物、植物、および動物種によって天然にも産出される。イソプレンの生合成については、特に、２つの経路、すなわち、メバロン酸（ＭＶＡ）経路と非メバロン酸（ＤＸＰ）経路が同定されている。バイオリアクター中で遺伝子加工された細胞培養物は、例えば米国仮特許出願第６１／０１３，３８６号および第６１／０１３，５７４号（２００７年１２月１３日出願）、ＷＯ２００９／０７６６７６号、米国仮特許出願第６１／１３４，０９４号、第６１／１３４，９４７号、第６１／１３４，０１１号および第６１／１３４，１０３号（２００８年７月２日出願）、ＷＯ２０１０／００３００７号、米国仮特許出願第６１／０９７，１６３号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７９号、米国仮特許出願第６１／０９７，１８６号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０６２号、米国仮特許出願第６１／０９７，１８９号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７７号、米国仮特許出願第６１／０９７，２００号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０６８号、米国仮特許出願第６１／０９７，２０４号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７６号、米国仮特許出願第６１／１４１，６５２号（２００８年１２月３０日出願）、ＰＣＴ刊行物／米国特許第０９／０６９８６２号、米国特許第１２／３３５，０７１号（２００８年１２月１５日出願）（米国特許第２００９／０２０３１０２Ａ１号）および米国特許第１２／４２９，１４３号（２００９年４月２３日出願）（米国特許第２０１０／０００３７１６Ａ１号）に記載されているように（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、より効果的に、より大量に、より高純度および／もしくは独特な不純物プロファイルでイソプレンを産出している。
【００３８】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるものである。本発明を実施するために本明細書に記載された方法および材料と同様または同等の任意の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は、本明細書に記載されている。したがって、直下に定義する用語は、本明細書を全体として参照することによってさらに完全に記載される。引用した文書は全て、関連部分において、参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、いずれの文書の引用も、本発明に関する先行技術であると承認することを意図するものではない。
【００３９】
本明細書で使用する場合、特に明確に断りがない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という単数形の用語は、複数形の対象物を含む。
【００４０】
本明細書を通して与えられた数値上限は全て、より低い数値限界を、あたかもこのようなより低い数値限界が本明細書において明示的に記載されているかのように全て含むことを意図する。本明細書を通して与えられた数値下限は全て、より高い数値限界を、あたかもこのようなより高い数値限界が本明細書において明示的に記載されているかのように全て含む。本明細書を通して与えられた数値範囲は全て、このような広い数値範囲内に収まる狭い数値範囲を、あたかもこのような狭い数値範囲が全て本明細書において明示的に記載されているかのように全て含む。
【００４１】
「イソプレン」という用語は、３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からのピロリン酸塩の排除からの直接および最終揮発性Ｃ５炭化水素産物であり、ＩＰＰ分子（１以上）のＤＭＡＰＰ分子（１以上）への連結またはポリマー化には関与しない、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ番号７８−７９−５）を指す。「イソプレン」という用語は、本明細書において特に断りのない限り、一般にその産出方法を制限することを意図しない。
【００４２】
本明細書で使用する「生物学的に産出されたイソプレン」または「Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ」とは、任意の生物学的手段により産出された、例えば、遺伝子加工された細胞培養物、天然微生物、植物または動物により産出されたイソプレンである。
【００４３】
「Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物」とは、任意の生物学的手段、例えば、イソプレンを産出するように加工された系（例えば、細胞）を産出できる組成物を指す。イソプレンならびにイソプレンと共に共産出された（不純物を含む）および／もしくは単離された他の化合物を含む。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、通常は、石油化学源から産出されるイソプレンよりも少ない炭化水素不純物を含み、しばしばポリマー化グレードのための最小限の処理を必要とする。本明細書に記載のように、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物はまた、石油化学的に産出されたイソプレン組成物と異なる不純物プロファイルを有する。
【００４４】
本明細書で使用する「イソプレン出発組成物の少なくとも一部」とは、化学的変換を経たイソプレン出発組成物の少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％、または１００％を指すことができる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、Ｉｓｏｆｕｅｌｓ（商標）とは、イソプレンから得られる液体輸送燃料を含む燃料を指す。ＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）とは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから得られる液体輸送燃料を含む燃料を指す。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「オリゴマー化」という用語は、２以上の単量体単位を結合させるための化学プロセスを指す。イソプレンの「オリゴマー化」は、２以上のイソプレン分子、例えば、線状イソプレン二量体、環状イソプレン二量体、線状イソプレン三量体、環状イソプレン三量体などから得られるイソプレンの誘導体を産出する。
【００４７】
「完全な水素化（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｉｏｎ）」、「完全に水素化する（Ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅ）」または「完全に水素化する（Ｆｕｌｌｙ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅ）」とは、完全飽和生成化合物を得るための、典型的には水素化触媒の存在下で、前駆体化合物内の全ての不飽和官能基、例えば、炭素−炭素二重結合への水素（Ｈ２）の付加と定義される。例えば、イソプレンの完全な水素化は、イソプレン１モル当たり２モルのＨ２が消費されたイソペンタンを形成する。
【００４８】
「一部水素化」または「部分的に水素化する」とは、典型的には水素化触媒の存在下で、前駆体化合物内の少なくとも１つだが全てではない不飽和官能基、例えば、炭素−炭素二重結合への水素（Ｈ２）の付加と定義される。一部水素化の産物（１以上）は、さらに完全に水素化して、完全飽和生成化合物を得ることができる。ジエンの一部水素化は１以上のモノ−オレフィンを形成する。例えば、イソプレンの一部水素化により、イソプレン１モル当たり１モルのＨ２が消費された３つの異性体のイソペンタン（２−メチルブタ−１−エン、２−メチルブタ−２−エンおよび３−メチルブタ−１−エン）を得ることができる。
【００４９】
「選択的水素化」または「選択的に水素化する」とは、典型的には水素化触媒の存在下で、前駆体化合物内の少なくとも１つだが全てではない不飽和官能基、例えば、炭素−炭素二重結合への水素（Ｈ２）の付加と定義され、ある不飽和官能基は、選択条件下で他の不飽和基より選択的に水素化される。例えば、イソプレンの選択的水素化は、選択的に２−メチル−２−ブテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブテンまたはその混合物を形成し得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチドの断片、および融合ポリペプチドを含む。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、ポリペプチドのライブラリー、例えば、２、５、１０、２０、５０個またはそれより多くの異なるポリペプチドのライブラリーの一部ではなく、それが天然に生じる少なくとも１つの構成要素から分離されている。単離されたポリペプチドは、例えば、そのポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって得ることができる。
【００５２】
「異種ポリペプチド」とは、そのアミノ酸配列が同じ宿主細胞で天然に発現される別のポリペプチドのアミノ酸配列とは同一でないポリペプチドを意味する。特に、異種ポリペプチドは、天然で同じ宿主細胞中に見出される野生型ポリペプチドとは同一でない。
【００５３】
「コドン縮重」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変異を許容する遺伝暗号の相違を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用において特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」について十分に知っている。そのため、宿主細胞での発現を改善する核酸を合成する場合、いくつかの実施形態では、そのコドン使用の頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用の頻度に近づくように核酸を設計することが望ましい。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「核酸」とは、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態で共有結合した２以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを指す。  
【００５５】
「組換え核酸」とは、目的の核酸が得られる生物のゲノムに存在し、目的とする核酸をはさむ１以上の核酸（例えば、遺伝子）を含まない目的の核酸を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクターに、自律複製するプラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ、あるいは他の配列から独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、またはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡを含む。
【００５６】
「異種核酸」とは、その核酸配列が同じ宿主細胞で天然に見出される別の核酸の核酸配列とは同一でない核酸を意味する。特に、異種核酸は、天然で同じ宿主細胞中に見出される野生型核酸とは同一でない。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、１以上の目的の核酸を送達し、望ましくは宿主細胞内でこれを発現することができるコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、限定するものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、コスミド、およびファージベクターが挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「発現制御配列」は、目的の核酸の転写を導く核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター（例えば、構成的もしくは誘導性プロモーター）、またはエンハンサーであることができる。「誘導性プロモーター」は、環境的または発生的調節の下で活性のあるプロモーターである。発現制御配列は、転写される核酸断片に機能的に連結されている。
【００５９】
「選択マーカー」または「選択可能マーカー」という用語は、導入された核酸またはベクターを含有する宿主細胞の選択を容易にする宿主細胞で発現可能な核酸を指す。選択可能マーカーの例としては、限定するものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール）および／または代謝的利益（例えば、宿主細胞に対する栄養的利益）を付与する核酸が挙げられる。例示的な栄養選択マーカーとしては、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、およびｐｙｒ４のような当該技術分野で公知のマーカーが挙げられる。
【００６０】
組成物および系
石油化学源から得られたイソプレンは、通常は、物質がポリマー化または他の化学的変換に適する前に大規模の精製を必要とする不純Ｃ５炭化水素画分である。いくつかの不純物は、イソプレンとの構造的類似性、およびポリマー化触媒毒として作用し得るという事実を考慮すると、特に問題である。このような化合物としては、限定するものではないが、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、およびｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インが挙げられる。下記のとおり、生物学的に産出されたイソプレンは、大規模の精製を行なわずに任意の汚染不飽和Ｃ５炭化水素を実質的に含まないことができる。一部の生物学的に産出されたイソプレン組成物は、エタノール、アセトン、およびＣ５プレニルアルコールを含む。これらの成分は、石油化学源由来のイソプレン組成物中に存在する異性体Ｃ５炭化水素画分より容易にイソプレンストリームから取り出される。さらに、これらの不純物は、バイオプロセスにおいて、例えば産出菌株の遺伝子的修飾、炭素供給溶液、代替的発酵条件、回収プロセス修飾ならびに追加的もしくは代替的精製方法により処理できる。
【００６１】
一態様では、本発明は、（ａ）商業的に有益な量の高純度イソプレン出発組成物；ならびに（ｂ）高純度イソプレン出発材料の少なくとも一部から産出される燃料構成要素を含むイソプレンから燃料構成要素を産出するための組成物および系を特徴とし、ここで商業的に有益な量の高純度イソプレン出発組成物の少なくとも一部は、化学的変換を経る。高純度イソプレン出発材料は、燃料作製のために有用な商業的に有益な量の産物を産出する化学反応に供する。一態様では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅを含む。一態様では、商業的に有益な量の高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅであることができる。
【００６２】
例示的な出発イソプレン組成物
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発組成物は、約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｍｇまたはそれらより多いイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇまたはそれらより多いイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００ｋｇまたはそれより多いイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、出発組成物中のイソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ、例えば、約２〜約１００ｍｇ、約１００〜約５００ｍｇ、約５００〜約１，０００ｍｇ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ、または約２，０００〜約５，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、出発組成物中のイソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ、約１００〜約５，０００ｍｇ、約２００〜約２，０００ｍｇ、約２００〜約１，０００ｍｇ、約３００〜約１，０００ｍｇ、または約４００〜約１，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、出発組成物中のイソプレンの量は、約２〜約５，０００ｇ、例えば、約２〜約１００ｇ、約１００〜約５００ｇ、約５００〜約１，０００ｇ、約１，０００〜約２，０００ｇ、または約２，０００〜約５，０００ｇである。いくつかの実施形態では、出発組成物中のイソプレンの量は、約２〜約５，０００ｋｇ、約１０〜約２，０００ｋｇ、約２０〜約１，０００ｋｇ、約２０〜約５００ｋｇ、約３０〜約２００ｋｇ、または約４０〜約１００ｋｇである。いくつかの実施形態では、出発組成物の揮発性有機画分の約２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは９５％（ｗ／ｗ）またはそれらより多くがイソプレンである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９８．０、９８．５、９９．０、９９．５、もしくは１００重量％またはそれより多いイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれらより多くのイソプレンとを含む。いくつかの実施形態では、出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、約９８．０、９８．５、９９．０、９９．５、もしくは１００％またはそれより多いイソプレンの相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、約９９．９０、９９．９１、９９．９２、９９．９３、９９．９４、９９．９５、９９．９６、９９．９７、９９．９８、９９．９９、もしくは１００％またはそれより多いイソプレンの相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９８．０〜約９８．５、約９８．５〜約９９．０、約９９．０〜約９９．５、約９９．５〜約９９．８、約９９．８〜１００重量％のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９９．９０〜約９９．９２、約９９．９２〜約９９．９４、約９９．９４〜約９９．９６、約９９．９６〜約９９．９８、約９９．９８〜１００重量％のイソプレンを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約２．０、１．５、１．０、０．５、０．２、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％またはそれらより少ない量のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、約２．０、１．５、１．０、０．５、０．２、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１％またはそれらより少ない量のイソプレン以外のＣ５炭化水素の相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、約２．０、１．５、１．０、０．５、０．２、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１％またはそれらより少ない量の１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インの相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約０．０２〜約０．０４％、約０．０４〜約０．０６％、約０．０６〜０．０８％、約０．０８〜０．１０％、または約０．１０〜約０．１２重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、イソプレンの重合を阻害する出発組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌまたはそれらより少ない量を含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、イソプレンの重合を阻害する出発組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約０．００５〜約５０、例えば、約０．０１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．０１〜約１、約０．０１〜約０．５、または約０．０１〜約０．００５μｇ／Ｌの化合物を含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌまたはそれらより少ない量のイソプレン以外の炭化水素（１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インなど）を含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約０．００５〜約５０、例えば、約０．０１〜約１０、約０．０１〜約５、約０．０１〜約１、約０．０１〜約０．５、または約０．０１〜約０．００５μｇ／Ｌのイソプレン以外の炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌまたはそれらより少ない量のタンパク質または脂肪酸（例えば、天然ゴムと天然に組み合わされているタンパク質または脂肪酸）を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、約１０、５、１、０．８、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５ｐｐｍまたはそれら未満のアルファアセチレン、ピペリレン、アセトニトリル、または１，３−シクロペンタジエンを含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５ｐｐｍまたはそれら未満の硫黄またはアレンを含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約３０、２０、１５、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５ｐｐｍまたはそれら未満の全てのアセチレン（例えば、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、およびｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約２０００、１０００、５００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５ｐｐｍまたはそれら未満のイソプレン二量体、例えば、環状イソプレン二量体（例えば、２つのイソプレン単位の二量体化から得られる環状Ｃ１０化合物）を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。特定の実施形態では、出発イソプレン組成物は、約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌまたはそれより多いエタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約０．００５〜約１２０、例えば、約０．０１〜約８０、約０．０１〜約６０、約０．０１〜約４０、約０．０１〜約３０、約０．０１〜約２０、約０．０１〜約１０、約０．１〜約８０、約０．１〜約６０、約０．１〜約４０、約５〜約８０、約５〜約６０、または約５〜約４０μｇ／Ｌのエタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、以下の成分：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、または線状イソプレンポリマー（例えば、複数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）のうちの１以上を含む。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの成分の１つの量は、約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）またはそれらより多い量である。いくつかの実施形態では、第２の化合物の相対検出器応答はイソプレンの検出器応答と比べて、約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％またはそれより多い。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの成分の１つの量は、約０．０１〜約１０５％（ｗ／ｗ）、例えば、約０．０１〜約９０、約０．０１〜約８０、約０．０１〜約５０、約０．０１〜約２０、約０．０１〜約１０、約０．０２〜約５０、約０．０５〜約５０、約０．１〜約５０、もしくは０．１〜約２０％（ｗ／ｗ）である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物の少なくとも一部は気相中にある。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物の少なくとも一部は、液相（例えば、凝結物）中にある。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物の少なくとも一部は固相中にある。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物の少なくとも一部は、シリカおよび／または活性炭を含む支持体などの固体支持体に吸着する。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、１以上の溶媒と混合する。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、１以上のガスと混合する。
【００７０】
他の実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発組成物は、生物学的プロセスにより産出される。いくつかの好ましい実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、約４００ｎｍｏｌｅのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間）を上回るイソプレンを産出する細胞の培養により産出されたＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。一実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、細胞培養培地中の約０．００２％超の炭素をイソプレンに変換する細胞培養により産出される。他の実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチド、例えば天然に生じる植物由来ポリペプチド、例えば、Ｐｕｅｒａｒｉａをコードする、ならびに（ｉｉ）プロモーター、例えばＴ７プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。他のイソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、ポプラ由来）、および天然に生じる変異体ならびに親イソプレンシンターゼは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅを産出するために使用できる。使用できるイソプレンシンターゼおよびその変異体の例は、米国特許第１２／４２９，１４３号に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上の組み合わせを含む培養培地中で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＤＶ経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、米国仮特許出願第６１／１３４，０９４号（２００８年７月２日出願）、ＷＯ２０１０／００３００７号、および米国特許第１２／３３５，０７１号（２００８年１２月１５日出願）（米国特許第２００９／０２０３１０２Ａ１号）(その全体が参照により本明細書に組み込まれる)に記載のイソプレン組成物または記載の任意の細胞培養により産出される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、イソプレンを産出する細胞培養により産出される気相（オフガス）を含む。いくつかの実施形態では、気相は、非引火イソプレン濃度を有する。いくつかの実施形態では、気相は、約９．５％（体積）未満の酸素を含む。いくつかの実施形態では、気相は、９．５％超または約９．５％（体積）の酸素を含み、気相中のイソプレンの濃度は、引火下限未満であるかまたは引火上限を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約０％〜約１００％（体積）の酸素、例えば、約１０％〜約１００％（体積）の酸素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約０％〜約９９％（体積）の窒素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約１％〜約５０％（体積）のＣＯ２を含む。
【００７３】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、以下のうちの１以上を含む：アルコール、アルデヒド、ケトン、またはエステル（例えば、本明細書に記載の任意のアルコール、アルデヒド、ケトンまたはエステル）。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。いくつかの実施形態では、任意のイソプレン組成物はさらに、エステルを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、以下のうちの１以上を含む生物学的源（例えば、細胞培養）から得られる：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、以下のうちの１以上を１ｐｐｍ以上含有する：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。いくつかの実施形態では、以下のもの：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドールのうちの１以上の濃度は、出発イソプレン組成物中（例えば、精製される前のオフガス）約１〜約１０，０００ｐｐｍである。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物（例えば、１以上の精製工程を経た後のオフガス）は、以下のもの：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドールのうちの１以上を、約１〜約１００ｐｐｍ、例えば、約１〜約１０ｐｐｍ、約１０〜約２０ｐｐｍ、約２０〜約３０ｐｐｍ、約３０〜約４０ｐｐｍ、約４０〜約５０ｐｐｍ、約５０〜約６０ｐｐｍ、約６０〜約７０ｐｐｍ、約７０〜約８０ｐｐｍ、約８０〜約９０ｐｐｍ、または約９０〜約１００ｐｐｍの濃度で含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、１ｐｐｍ未満のメタンチオール（最終燃料産物中の強力な触媒毒および硫黄源）を含む。細胞培養物由来の揮発性有機化合物（例えば、細胞培養物のヘッドスペース中の揮発性有機化合物）を、本明細書に記載した方法などの標準的な方法またはプロトン転移反応−マススペクトロメトリーなどの他の標準的な方法を用いて分析することができる（例えば、Ｂｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７４（７）：２１７９−２１８６，２００８を参照されたく、これは、特に、揮発性有機化合物の分析に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００７５】
本発明は、イソプレンと水素を共産出する生物学的源（例えば、細胞培養）から得られる高純度イソプレン出発組成物の使用も意図する。いくつかの実施形態では、出発Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、水素３モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンから水素４モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンの比率でイソプレンと水素を含む。いくつかの実施形態では、出発Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、約１対９、２対８、３対７、４対６、５対５、６対４、７対３、８対２、もしくは９対１のモル比でイソプレンと水素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１〜１１モルパーセントのイソプレンおよび４〜４４モルパーセントの水素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、酸素、二酸化炭素、または窒素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、０〜２１モルパーセントの酸素、１８〜４４モルパーセントの二酸化炭素、および０〜７８モルパーセントの窒素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１．０×１０−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性不純物を含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１以上を含む：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、または線状イソプレンポリマー（例えば、複数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１以上を含む：イソプレン組成物は、以下のうちの１以上を含む：アルコール、アルデヒド、またはケトン（例えば、本明細書に記載の任意のアルコール、アルデヒド、またはケトン）。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１以上を含む：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノ���ル、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。
【００７６】
培養細胞中のイソプレン産出技術は、米国仮特許出願第６１／０１３，３８６号および第６１／０１３，５７４号（２００７年１２月１３日出願）、ＷＯ２００９／０７６６７６号、米国仮特許出願第６１／１３４，０９４号、第６１／１３４，９４７号、第６１／１３４，０１１号および第６１／１３４，１０３号（２００８年７月２日出願）、ＷＯ２０１０／００３００７号、米国仮特許出願第６１／０９７，１６３号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７９号、米国仮特許出願第６１／０９７，１８６号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０６２号、米国仮特許出願第６１／０９７，１８９号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７７号、米国仮特許出願第６１／０９７，２００号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０６８号、米国仮特許出願第６１／０９７，２０４号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７６号、米国仮特許出願第６１／１４１，６５２号（２００８年１２月３０日出願）、ＰＣＴ刊行物／米国特許第０９／０６９８６２号、米国特許第１２／３３５，０７１号（２００８年１２月１５日出願）（米国特許第２００９／０２０３１０２Ａ１号）および米国特許第１２／４２９，１４３号（２００９年４月２３日出願）（米国特許第２０１０／０００３７１６Ａ１号）に記載されており、これらの教示は、このようなプロセスによるイソプレンの産出および回収技術を教示する目的のため、参照により本明細書に組み込まれる。いずれの場合も、米国仮特許出願第６１／０１３，３８６号および第６１／０１３，５７４号（２００７年１２月１３日出願）、ＷＯ２００９／０７６６７６号、米国仮特許出願第６１／１３４，０９４号、第６１／１３４，９４７号、第６１／１３４，０１１号および第６１／１３４，１０３号（２００８年７月２日出願）、ＷＯ２０１０／００３００７号、米国仮特許出願第６１／０９７，１６３号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７９号、米国仮特許出願第６１／０９７，１８６号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０６２号、米国仮特許出願第６１／０９７，１８９号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７７号、米国仮特許出願第６１／０９７，２００号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０６８号、米国仮特許出願第６１／０９７，２０４号（２００８年９月１５日出願）、ＷＯ２０１０／０３１０７６号、米国仮特許出願第６１／１４１，６５２号（２００８年１２月３０日出願）、ＰＣＴ刊行物／米国特許第０９／０６９８６２号、米国特許第１２／３３５，０７１号（２００８年１２月１５日出願）（米国特許第２００９／０２０３１０２Ａ１号）および米国特許第１２／４２９，１４３号（２００９年４月２３日出願）（米国特許第２０１０／０００３７１６Ａ１号）は細胞培養物中の増量イソプレン産出のための組成物および方法を教示する。米国特許第１２／３３５，０７１号（２００８年１２月１５日出願）および米国特許第２００９／０２０３１０２Ａ１号はさらに培養細胞からのイソプレンと水素の共産出のための組成物および方法を教示する。特に、これらの組成物および方法は、イソプレンの産出速度を増加させ、産出されるイソプレン総量を増加させる。例えば、４．８×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間のイソプレンを生成する細胞培養系が作製されている（表１）。これらの系の効率は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約２．２％がイソプレンに変換されることによって示される。実施例および表２に示すように、ブロス１リットル当たり約３ｇのイソプレンが生成された。所望により、他の条件（例えば、本明細書に記載の他の条件）を用いて、一層より多くの量のイソプレンを得ることができる。いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源をイソプレンの産出に使用する。いくつかの実施形態では、イソプレンの産出は、細胞の増殖とは切り離されている。いくつかの実施形態では、イソプレンと任意の酸化体の濃度は、イソプレンの産出または回収時に火災が発生し得る危険性を低下させるかまたは排除するために非引火範囲内とする。組成物および方法は、細胞当たりの高いイソプレン収率、高い炭素収率、高いイソプレン純度、高い生産性、低いエネルギー使用、低い生産コストと生産投資、および最小限の副反応を可能にするので望ましい。この効率的で、大規模なイソプレン産出のための生合成プロセスは、合成イソプレン系産物、例えば、ゴムのためのイソプレン源を提供し、天然ゴムの使用に代わる望ましい低コスト代替物を提供する。
【００７７】
以下でさらに論じるように、細胞によって産出されるイソプレンの量を、イソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、植物イソプレンシンターゼポリペプチド）をコードする異種核酸を細胞に導入することによって大いに増加させることができる。イソプレンシンターゼポリペプチドは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。実施例に示すように、異種タイワンクズ（クズ）イソプレンシンターゼポリペプチドを、大腸菌、パントエア・シトレア、枯草菌、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などの、種々の宿主細胞で発現させた。これらの細胞は全て、異種イソプレンシンターゼポリペプチドを有さない対応する細胞よりも多くのイソプレンを産出した。表１および２に示すように、本明細書に記載の方法を用いて、大量のイソプレンが産出される。例えば、異種イソプレンシンターゼ核酸を有する枯草菌細胞は、１４リットル発酵槽において、異種核酸を有さない対応する対照枯草菌細胞よりも約１０倍多いイソプレンを産出した（表２）。発酵槽における大腸菌による３００ｍｇのイソプレン／ブロス１リットル（ｍｇ／Ｌ、ここで、ブロスの容積は、細胞培地の容量と細胞の容積の両方を含む）および枯草菌による３０ｍｇ／Ｌは、相当な量のイソプレンを生成させることができることを示している（表２）。所望により、イソプレンを一層より大きい規模で産出させることができ、または本明細書に記載の他の条件を用いて、イソプレンの量をさらに増加させることができる。表１および２ならびに実験条件に記載のベクターは、以下および実施例の節でさらに詳細に記載されている。
本明細書に記載の細胞培養物と方法を用いた振盪フラスコからのイソプレンの例示的な収率。イソプレン産出を測定するためのアッセイは実施例Ｉ、第ＩＩ部に記載されている。このアッセイのために、試料を１以上の時点で振盪フラスコから取り出し、３０分間培養した。次に、この試料中で産出されたイソプレンの量を測定した。イソプレン産出のヘッドスペース濃度および比速度を表１に掲載し、さらに本明細書に記載する。
【表１】
0005448220.tif 000002
0005448220.tif 000003
＊液体とヘッドスペースの容積比が１：１９の密封ヘッドスペースバイアル中で１時間培養した、１ｍＬの１ＯＤ６００に対して標準化した
本明細書に記載の細胞培養物と方法を用いた発酵槽におけるイソプレンの例示的な収率。イソプレン産出を測定するためのアッセイは実施例Ｉ、第ＩＩ部に記載されている。このアッセイのために、発酵槽のオフガスの試料を採取し、イソプレンの量について解析した。ピークヘッドスペース濃度（これは、発酵時の最大ヘッドスペース濃度である）、力価（これは、ブロス１リットル当たりに産出される累積イソプレン総量である）、およびイソプレン産出のピーク比速度（これは、発酵時の最大比速度である）を表２に掲載し、さらに本明細書に記載する。
【表２】
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＊＊１ｖｖｍ（１容積オフガス／１Ｌブロス／分）のオフガス流速に対して標準化した
【００７８】
さらに、異種イソプレンシンターゼ核酸を含有する細胞によるイソプレン産出を、細胞によって発現される１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチドおよび／またはイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドの量を増加させることによって増強することができる。例えば、ＤＸＳ核酸および／またはＩＤＩ核酸を細胞に導入することができる。ＤＸＳ核酸は、異種核酸または重複コピーの内在性核酸であり得る。同様に、ＩＤＩ核酸は、異種核酸または重複コピーの内在性核酸であり得る。いくつかの実施形態では、ＤＸＳおよび／またはＩＤＩポリペプチドの量を、内在性ＤＸＳおよび／またはＩＤＩのプロモーターまたは調節領域をＤＸＳおよび／またはＩＤＩ核酸のより多くの転写をもたらす他のプロモーターおよび／または調節領域と置き換えることによって増加させる。いくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、植物イソプレンシンターゼ核酸）をコードする異種核酸とイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする重複コピーの内在性核酸の両方を含有する。
【００７９】
コードされたＤＸＳおよびＩＤＩポリペプチドは、イソプレンの生合成のためのＤＸＰ経路の一部である（図１９Ａ）。ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リンを１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、ＤＸＳポリペプチドの量を増加させると、ＤＸＰ経路を通る炭素の流れが増加して、より多くのイソプレン産出が生じると考えられている。ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、細胞内のＩＤＩポリペプチドの量を増加させると、ＤＭＡＰＰ（これはイソプレンに変換される）に変換されるＩＰＰの量（および変換速度）が増加すると考えられている。
【００８０】
例えば、クズイソプレンシンターゼ、出芽酵母ＩＤＩ、および大腸菌ＤＸＳ核酸を有する大腸菌細胞の発酵を用いて、イソプレンを産出させた。イソプレンのレベルは、１５時間の間に５０から３００μｇ／Ｌの間で変動した（実施例７、第ＶＩＩ部）。
【００８１】
いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＳ核酸の存在のために、これらの異種のまたは余分な内在性核酸のうちの１つだけまたは２つを有する対応する細胞と比べて、細胞がより繁殖して増殖するかまたはより長く生存し続ける。例えば、異種イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＳ核酸を含有する細胞は、異種イソプレンシンターゼとＤＸＳ核酸のみを有するかまたは異種イソプレンシンターゼ核酸のみを有する細胞よりも良好に増殖した。また、異種イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、およびＤＸＳ核酸を、大腸菌細胞により維持される高コピープラスミド上の強力なプロモーターに機能的に連結することができたが、これは、細胞に対して過剰量の毒性を引き起こすことなく、大量のこれらのポリペプチドを細胞内で発現し得ることを示唆する。特定の理論に束縛されるつもりはないが、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼおよびＩＤＩ核酸の存在によって、それがなければ、異種のまたは余分な内在性ＤＸＳ核酸のみが細胞内に存在する場合に蓄積するであろう１以上の潜在的な毒性中間体の量を減らし得ると考えられている。
【００８２】
いくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸を含有する細胞によるイソプレンの産出を、細胞によって発現されるＭＶＡポリペプチドの量を増加させることによって強化する（図１９Ａおよび１９Ｂ）。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、以下のポリペプチドのいずれかが挙げられる：アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）。例えば、１以上のＭＶＡ経路核酸を細胞に導入することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ核酸を含む上流ＭＶＡ経路を含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、およびＩＤＩ核酸を含む下流ＭＶＡ経路を含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、およびＩＤＩ核酸を含む全ＭＶＡ経路を含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＭＶＫ、ＰＭＤＣ、ＩＰＫ、およびＩＤＩ核酸を含む全ＭＶＡ経路を含有する。ＭＶＡ経路核酸は、異種核酸または重複コピーの内在性核酸であり得る。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの量を、ＭＶＡ経路核酸の内在性プロモーターまたは調節領域をＭＶＡ経路核酸のより多くの転写をもたらす他のプロモーターおよび／または調節領域と置き換えることによって増加させる。いくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチド（例えば、植物イソプレンシンターゼ核酸）をコードする異種核酸とイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする重複コピーの内在性核酸の両方を含有する。
【００８３】
例えば、クズイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸と、出芽酵母のＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、およびＩＤＩポリペプチドをコードする核酸とを含有する大腸菌細胞は、６．６７×１０−４ｍｏｌ／Ｌブロス／ＯＤ６００／時間の速度でイソプレンを生成させた（実施例８参照）。さらに、エンテロコックス・フェカーリスのＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードする核酸を有する大腸菌細胞の１４リットル発酵は、２２グラムのメバロン酸（ＭＶＡ経路の中間物）を産出した。これらの細胞の振盪フラスコは、１リットル当たり２〜４グラムのメバロン酸を産出した。これらの結果は、異種ＭＶＡ経路核酸が大腸菌において活性があることを示している。上流ＭＶＡ経路と下流ＭＶＡ経路の両方およびクズイソプレンシンターゼの核酸を含有する大腸菌細胞は、下流ＭＶＡ経路のみとクズイソプレンシンターゼの核酸を有する大腸菌細胞（ＭＣＭ１３１株）と比べて有意により多いイソプレン（８７４μｇ／Ｌ）を産出した（表３および実施例８、第ＶＩＩＩ部を参照されたい）。
【００８４】
いくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくとも約５、１０、２０、５０、７５、１００、２００、３００回、またはそれより多くの細胞分裂の間、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路核酸を維持する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種または重複コピーの内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路核酸を含む核酸はまた、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、またはクロラムフェニコール抗生物質耐性核酸などの選択マーカーを含む。
【００８５】
実施例７、第ＶＩ部に示すように、産出されるイソプレンの量を、酵母抽出物を細胞培養培地に添加することによってさらに増加させることができる。この実施例では、産出されたイソプレンの量は、試験された濃度について細胞培地中の酵母抽出物の量に直線的に比例した（図４８Ｃ）。さらに、ブロス１リットル当たり約０．１１グラムのイソプレンが、酵母抽出物とグルコースを含む細胞培地から産出された（実施例７、第ＶＩＩＩ部）。これらの実験は両方とも、イソプレンをさせるために、クズイソプレンシンターゼ、出芽酵母ＩＤＩ、および大腸菌ＤＸＳ核酸を有する大腸菌細胞を用いた。グルコースの存在下で酵母抽出物の量を増加させると、酵母抽出物の存在下でグルコースの量を増加させるよりもより多くのイソプレンが産出された。また、酵母抽出物の量を増加させることで、細胞により長い間にわたって高レベルのイソプレンを産出させることが可能になり、細胞の健康が改善された。
【００８６】
イソプレン産出はまた、３種類の加水分解されたバイオマス（バガス、コーンストーバー、および針葉樹パルプ）を炭素源として用いて示された（図４６Ａ〜Ｃ）。クズイソプレンシンターゼ、出芽酵母ＩＤＩ、および大腸菌ＤＸＳ核酸を有する大腸菌細胞は、等量のグルコース（例えば、１％グルコース、ｗ／ｖ）からと同じだけのこれらの加水分解されたバイオマス炭素源からのイソプレンを産出した。所望により、任意の他のバイオマス炭素源を本発明の組成物および方法で用いることができる。多くの従来の細胞培地よりも安価であり、それによりイソプレンの経済的な生産が促進されるので、バイオマス炭素源が望ましい。
【００８７】
さらに、転化糖は、イソプレンを生成させるための炭素源として機能することが示された（図４７Ｃおよび９６〜９８）。例えば、２．４ｇ／Ｌのイソプレンが、ＭＶＡ経路ポリペプチドとクズイソプレンシンターゼを発現する細胞から産出された（実施例８、第ＸＶ部）。グリセロールも、クズイソプレンシンターゼを発現する細胞から２．２ｍｇ／Ｌのイソプレンの生成させるための炭素源として用いられた（実施例８、第ＸＩＶ部）。イソプレンシンターゼ核酸に加えて、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、および／または１以上のＭＶＡ経路核酸（例えば、全ＭＶＡ経路をコードする核酸）を発現させると、グリセロールからのイソプレンの産出が増加し得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、油を細胞培地に含める。例えば、クズイソプレンシンターゼ核酸を含有する枯草菌細胞は、油とグルコース源とを含有する細胞培地で培養した場合、イソプレンを産出した（実施例４、第ＩＩＩ部）。いくつかの実施形態では、２種以上の油（例えば、２、３、４、５種またはそれより多くの油）を細胞培地に含める。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、（ｉ）油がイソプレンへの変換に利用可能な細胞内の炭素量を増加させ得る、（ｉｉ）油が細胞内のアセチル−ＣｏＡの量を増加させ、それによりＭＶＡ経路を通る炭素の流れを増加させ得る、および／または（ｉｉ）油が細胞に余分な栄養を提供し得る（これは、細胞内の炭素の多くが他の産物ではなくイソプレンに変換されるので望ましい）と考えられている。いくつかの実施形態では、油を含有する細胞培地中で培養される細胞は、自然にＭＶＡ経路を用いてイソプレンを産出するかまたは全ＭＶＡ経路の核酸を含有するように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、油は部分的または完全に加水分解された後、宿主細胞による油の使用を促進するために細胞培養培地に添加される。
【００８９】
細胞（例えば、細菌）内でイソプレンなどの小分子を商業的に産出させる上での大きな障害の１つは、分子の産出と細胞の増殖とを脱共役させることである。商業的に実現可能なイソプレン産出のためのいくつかの実施形態では、原料由来炭素の相当な量が、細胞の増殖や維持にではなく、イソプレンに変換される（「炭素効率」）。様々な実施形態では、細胞は、細胞培養培地中の炭素の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、６．０、７．０、もしくは８．０％またはそれらより多くをイソプレンに変換する。特定の実施形態では、下流産物に変換される原料由来炭素の相当な部分が、イソプレンに変換される。実施例１１でさらに記載するように、ＭＶＡ経路とクズイソプレンシンターゼ核酸を発現する大腸菌細胞は、イソプレンまたは中間体メバロン酸の産出と増殖とを脱共役させ、高い炭素効率を得ていることが示された。特に、メバロン酸は、エンテロコックス・フェカーリス由来の上流ＭＶＡ経路を発現する細胞から形成された。イソプレンは、エンテロコックス・フェカーリス由来の上流ＭＶＡ経路、出芽酵母由来の下流ＭＶＡ経路、およびタイワンクズ（クズ）由来のイソプレンシンターゼを発現する細胞から形成された。このイソプレンまたはメバロン酸産出と増殖の脱共役は、４つの異なる大腸菌株：ＢＬ２１（ＬＤＥ３）、ＢＬ２１（ＬＤＥ３）Ｔｕｎｅｒ、ＦＭ５、およびＭＧ１６５５で示された。最初の２つの大腸菌株はＢ株であり、後者２つは、Ｋ１２株である。産出と増殖の脱共役は、ａｃｋ遺伝子とｐｔａ遺伝子が欠失している変異体ＭＧ１６５５でも示された。この変異体は、より少ない酢酸の産出も示した。
【００９０】
例示的なポリペプチドおよび核酸
様々なイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドおよび核酸を本発明に記載の組成物および方法で用いることができる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、第１のポリペプチド（例えば、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子もしくはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドまたはそれらの触媒活性断片）の一部または全てを含み、第２のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドの精製または検出を容易にするペプチド、例えば、Ｈｉｓタグ）の一部または全てを任意で含み得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、２以上のＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼおよびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチド）の活性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有する天然のポリペプチド（例えば、エンテロコックス・フェカーリスｍｖａＥ核酸によってコードされるポリペプチド）である。
【００９２】
様々な実施形態では、ポリペプチドは、少なくともまたは約５０、１００、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００個、またはそれより多くのアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド断片は、全長ポリペプチド由来の少なくともまたは約２５、５０、７５、１００、１５０、２００、３００個、またはそれより多くの連続するアミノ酸を含有し、かつ対応する全長ポリペプチドの活性の少なくともまたは約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％を有する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、任意の天然のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドのアミノ酸配列の部分またはアミノ酸配列全体を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型（すなわち、天然に生じる配列）のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドの配列と比べて、１以上の突然変異を有する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは単離されたポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは異種ポリペプチドである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、核酸は組換え核酸である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、組換え核酸が、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドを含む融合ポリペプチドおよび別のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドの精製または検出を容易にするペプチド、例えば、Ｈｉｓタグ）の全てまたは一部をコードするように、別のポリペプチドの全てまたは一部をコードする別の核酸に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、組換え核酸の一部または全てを化学合成する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、核酸は異種核酸である。特定の実施形態では、核酸は、任意の天然のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の核酸配列の部分または核酸配列全体を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然のイソプレンシンターゼ核酸ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸由来の少なくともまたは約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００個、またはそれより多くの連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、野生型（すなわち、天然に生じる配列）イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の配列と比べて、１以上の突然変異を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、または転写因子核酸の転写または翻訳を増加させる１以上の突然変異（例えば、サイレント突然変異）を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドをコードする任意の核酸の縮重変異体である。
【００９６】
例示的なイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路のポリペプチドと核酸のアクセッション番号を別表１に掲載する（別表１のアクセッション番号およびその対応する配列は、特に、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドと核酸のアミノ酸配列と核酸配列に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。Ｋｅｇｇデータベースもまた、多数の例示的なイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路のポリペプチドと核酸のアミノ酸配列と核酸配列を含有する（例えば、“ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ／ｍａｐ／ｍａｐ００１００．ｈｔｍｌ”のワールド・ワイド・ウェブ、およびその中の配列を参照されたく、これらは各々、特に、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路のポリペプチドと核酸のアミノ酸配列と核酸配列に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドおよび／または核酸の１以上は、２００７年１２月１２日または２００８年９月１４日に公的に入手可能になった配列と同一の配列（例えば、別表１のアクセッション番号のいずれかに対応する配列のいずれかまたはＫｅｇｇデータベース中に存在する配列のいずれか）を有する。さらなる例示的なイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路のポリペプチドと核酸が以下でさらに記載されている。
【００９７】
例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドおよび核酸
上述のように、イソプレンシンターゼポリペプチド、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドには、イソプレンシンターゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが含まれる。標準的な方法を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボでＤＭＡＰＰをイソプレンに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがイソプレンシンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。例示的なアッセイでは、細胞抽出物を、実施例１に記載されるような振盪フラスコ法で株（例えば、本明細書に記載の大腸菌／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ株）を増殖させることにより調製する。誘導が終わった後、約１０ｍＬの細胞を７０００×ｇで１０分間の遠心分離でペレット化し、グリセロールを含まない５ｍｌのＰＥＢに再懸濁する。標準的な手順を用いて、フレンチプレス細胞破砕機（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）を用いて、細胞を溶解する。あるいは、−８０℃で凍結／融解した後、細胞をリゾチーム（Ｒｅａｄｙ−Ｌｙｓｅリゾチーム溶液；ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）で処理する。
【００９８】
細胞抽出物中のイソプレンシンターゼポリペプチド活性を、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０−１３０１６，１９９５およびその中の参考文献（これらは各々、特に、イソプレンシンターゼポリペプチド活性のアッセイに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように測定することができる。ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）を窒素流下で蒸発乾固させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ８．２中１００ｍＭの濃度になるように再水和させ、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍｌ）のＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出物緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、および２ｍＭ  ＤＴＴ）の溶液を、金属スクリューキャップとテフロンコーティングされたシリコンセプタムが付いた２０ｍｌヘッドスペースバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の２５μＬの細胞抽出物に添加し、振盪させながら３７℃で１５分間培養する。２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加して反応をクエンチし、実施例１、第ＩＩ部に記載されるようにＧＣ／ＭＳで定量する。
【００９９】
例示的なイソプレンシンターゼ核酸としては、イソプレンシンターゼポリペプチド核酸の少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なイソプレンシンターゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、マメ科（例えば、マメ亜科）に由来するものである。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、タイワンクズ（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００−７１２，２００５）、クズ（Ｐｕｅｒａｒｉａ  ｌｏｂａｔａ）、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシ、ブラックコットンウッド、もしくはウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ（ＣＡＣ３５６９６）  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ２１３：４８３−４８７，２００１）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ）  Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０−１３１６，１９９５）、またはヨーロッパナラ（ヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｒｏｂｕｒ））（Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９８／０２５５０号）（これらは各々、特に、イソプレンシンターゼ核酸と、イソプレンシンターゼポリペプチドの発現とに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に由来するポリペプチドまたは核酸である。好適なイソプレンシンターゼとしては、限定するものではないが、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、およびＡＹ１８２２４１（これらは各々、特に、イソプレンシンターゼ核酸およびポリペプチドの配列に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）により特定されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、ヨーロッパナラ由来の天然のポリペプチドまたは核酸ではない（すなわち、イソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸は、ヨーロッパナラ由来の天然のポリペプチドまたは核酸以外のイソプレンシンターゼポリペプチドまたは核酸である）。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、ポプラ由来の天然のポリペプチドまたは核酸である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ核酸またはポリペプチドは、ポプラ由来の天然のポリペプチドまたは核酸ではない。
【０１０１】
例示的なＤＸＳポリペプチドおよび核酸
上述のように、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチドは、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換する。例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、ピルビン酸とＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。例示的なＤＸＳ核酸としては、ＤＸＳポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＤＸＳポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０１０２】
例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸
イソペンテニル二リン酸イソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル二リン酸デルタイソメラーゼまたはＩＤＩ）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）とジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰに変換するおよび／またはＤＭＡＰＰをＩＰＰに変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、ＩＰＰとＤＭＡＰＰを相互変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。例示的なＩＤＩ核酸としては、ＩＤＩポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０１０３】
例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸
例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチドおよび２以上のＭＶＡ経路ポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＭＶＡ経路核酸としては、ＭＶＡ経路ポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なＭＶＡ経路ポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０１０４】
特に、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼポリペプチド（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼまたはＡＡＣＴ）は、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＡＡ−ＣｏＡチオラーゼポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１０５】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼまたはＨＭＧＳ）ポリペプチドは、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、アセトアセチル−ＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１０６】
３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼまたはＨＭＧＲ）ポリペプチドは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１０７】
メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチドはメバロン酸をリン酸化して、メバロン酸−５−リン酸を形成させる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、メバロン酸をメバロン酸−５−リン酸に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＭＶＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１０８】
ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチドはメバロン酸−５−リン酸をリン酸化して、メバロン酸−５−二リン酸を形成させる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、メバロン酸−５−リン酸をメバロン酸−５−二リン酸に変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＰＭＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１０９】
ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤまたはＤＰＭＤＣ）ポリペプチドは、メバロン酸−５−二リン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、メバロン酸−５−二リン酸をＩＰＰに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＭＶＤポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１１０】
ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチドは、メバロン酸−５−リン酸をイソペンテニルリン酸（ＩＰ）に変換する。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、メバロン酸−５−リン酸をＩＰに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＰＭＤＣポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１１１】
イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチドはイソペンテニルリン酸（ＩＰ）をリン酸化して、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を形成させる。標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、ＩＰをＩＰＰに変換するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがＩＰＫポリペプチド活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１１２】
例示的なＩＤＩポリペプチドおよび核酸は上に記載されている。
【０１１３】
例示的なヒドロゲナーゼポリペプチドおよび核酸
ヒドロゲナーゼポリペプチドは、次の反応を触媒する：２Ｈ＋＋２ｅ−⇔Ｈ２。インビトロでは、その反応は可逆的であるが、ある種のヒドロゲナーゼは、インビボでは、Ｈ２を酸化するかまたはＨ＋を還元するかのいずれかの、一方向でしか働かない場合がある。ヒドロゲナーゼポリペプチドは酸素感受性で、その触媒中心の一部として錯体金属補因子を含有することがあり、時には複数のサブユニットからなることもあり、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現には、「成熟」因子または転写調節因子（すなわち、活性化因子または抑制因子）などのさらなるアクセサリーポリペプチドが必要になることもある。ヒドロゲナーゼは、その触媒中心の金属補因子の種類に基づいて大きく少なくとも３つのグループに分類される。すなわち、（１）ニッケル−鉄（「ＮｉＦｅ」）ヒドロゲナーゼは、ニッケル／鉄補因子を有し、（２）鉄−鉄ヒドロゲナーゼ（「ＦｅＦｅ」）は、鉄／鉄補因子を有し、（３）鉄／非硫黄含有（「Ｆｅ」）ヒドロゲナーゼ（これは、グループ（１）と（２）に見られる４Ｆｅ４Ｓクラスターを欠く）は、鉄補因子とメテニル−テトラヒドロメタノプテリン電子担体とを有する。例えば、Ｃｈｕｎｇ−Ｊｕｎｇ  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｕｅｌｓ，”  Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．１０：３９４−４０４（２００８）、およびＧoeｎueｌ  Ｖａｒｄａｒ−Ｓｃｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｖｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，”  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１（２）：１０７−１２５（２００８）を参照されたく、これらは両方とも、特に、様々な種類およびクラスのヒドロゲナーゼに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。多くの生物は複数のヒドロゲナーゼを含有しているが、ＮｉＦｅヒドロゲナーゼとＦｅＦｅヒドロゲナーゼの両方の遺伝子を含有するものはわずかである。
【０１１４】
ＮｉＦｅヒドロゲナーゼの触媒中心はニッケル原子と鉄原子からなり、各々、２つの一酸化炭素（ＣＯ）配位子と２つのシアン化物（ＣＮ−）配位子を有する。ＮｉＦｅヒドロゲナーゼは全て、触媒中心の内外に電子を伝達するための複数の鉄−硫黄（Ｆｅ−Ｓ）中心を含有する少なくとも第２のサブユニットを含む。ＮｉＦｅヒドロゲナーゼは、４つの主なクラスにさらに分けることができる：（１）呼吸酵素。これは、Ｈ２の酸化を、嫌気性条件下での最終電子受容体（例えば、ＳＯ４２−もしくはＮＯ３−）の還元、または好気性微生物でのＯ２と共役させる多酵素系の一部である；（２）Ｈ２センサー。これは、代謝活性のあるＮｉＦｅヒドロゲナーゼの発現を活性化させる；（３）ＮＡＤＰ＋を利用することができる多サブユニットを含有する細胞質ヒドロゲナーゼ。これは、インビトロでは容易に可逆性となるが、インビボではＨ２の酸化しかしない場合がある；および（４）細菌や古細菌でも見出されている膜結合型のエネルギー変換多酵素複合体。Ｃｈｕｎｇ−Ｊｕｎｇ  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｕｅｌｓ，”  Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．１０：３９４−４０４（２００８）。
【０１１５】
ＦｅＦｅヒドロゲナーゼの触媒中心は、単一のタンパク質（システイン）配位子によって［４Ｆｅ−４Ｓ］中心に架橋した二核（ＦｅＦｅ）部位を配位する触媒「Ｈクラスター」を含有する。二核中心の２つの鉄原子は各々、２つの一酸化炭素（ＣＯ）配位子と２つのシアン化物（ＣＮ−）配位子を有し、小有機分子の一部となる２つの硫黄原子によっても架橋される。大部分のＦｅＦｅヒドロゲナーゼは、約５０キロダルトン（ｋＤａ）の単量体酵素であり、インビボでは主に、プロトンを水素ガスに還元することによって余剰の還元性等価物を廃棄するように働くように思われる。Ｃｈｕｎｇ−Ｊｕｎｇ  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｕｅｌｓ，”  Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．１０：３９４−４０４（２００８）。
【０１１６】
Ｆｅヒドロゲナーゼの触媒中心は、当初、有機補因子を基礎にした活性部位を有し、金属は含まないと考えられたが、後に単核Ｆｅ原子を含有することが示された。３種類のヒドロゲナーゼには系統発生上の違いがあるものの、少なくとも１つの鉄原子の他に、３種類のヒドロゲナーゼは全て、その活性部位に鉄原子に対する少なくとも１つの一酸化炭素（ＣＯ）配位子を含有し、この配位子によって、Ｈ２の触媒による酸化やプロトンの還元が促進される。Ｃｈｕｎｇ−Ｊｕｎｇ  Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｕｅｌｓ，”  Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｅｎｇ．１０：３９４−４０４（２００８）。
【０１１７】
例示的なヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、限定するものではないが、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（Ｈｙｄ−１）ポリペプチド、大腸菌ヒドロゲナーゼ−２（Ｈｙｄ−２）ポリペプチド、大腸菌ヒドロゲナーゼ−３（Ｈｙｄ−３）ポリペプチド、大腸菌ヒドロゲナーゼ−４（Ｈｙｄ−４）ポリペプチド、大腸菌ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体（これは、酸性ｐＨ、嫌気性条件下で、ギ酸とＣＯ２から水素ガスを産出させる（例えば、Ａｋｉｈｉｔｏ  Ｙｏｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｍａｔｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｌｙａｓｅ  ｏｆ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ  ｇｒｏｗｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｉｎ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｓｔｅｐ  ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ，”  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７４：７５４−７６０（２００７）を参照されたく、これは、特に、大腸菌におけるギ酸水素リアーゼの発現の誘導に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｈ１６ヒドロゲナーゼ（Ｒ．ユートロファＨｏｘＨ）、ロドコックス・オパクス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｐａｃｕｓ）ＭＲ１１ヒドロゲナーゼ（Ｒ．オパクスＨｏｘＨ）ポリペプチド、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ）種ＰＣＣ  ６８０３ヒドロゲナーゼ（Ｓｙｎ．ＰＣＣ  ６８０３  ＨｏｘＨ）ポリペプチド、デスルフォビブリオ・ギガス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｇａｓ）ヒドロゲナーゼ（Ｄ．ギガス）ポリペプチド、およびデスルホビブリオ・デスルフリカンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ  ７７５７ヒドロゲナーゼ（Ｄ．デスルフリカンス）ポリペプチド（例えば、Ｇoeｎueｌ  Ｖａｒｄａｒ−Ｓｃｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｖｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，”  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１（２）：１０７−１２５（２００８）を参照されたく、これは、特に、様々な種類およびクラスのヒドロゲナーゼに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ならびに２以上のヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、ヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なヒドロゲナーゼ核酸としては、ヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性、またはヒドロゲナーゼポリペプチドの発現、プロセッシング、もしくは成熟に必要な少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。例示的なヒドロゲナーゼポリペプチドおよび核酸としては、本明細書に記載の供給源細胞のいずれかに由来する天然のポリペプチドおよび核酸ならびに本明細書に記載の供給源細胞のいずれかから得られる突然変異体ポリペプチドおよび核酸が挙げられる。
【０１１８】
嫌気性ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体の一部である、大腸菌Ｈｙｄ−３は、（ｈｙｃＡ、ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦ、ｈｙｃＧ、ｈｙｃＨ、およびｈｙｃＩ遺伝子を含む）ｈｙｃオペロンによってコードされている。大腸菌Ｈｙｄ−４は、（ｈｙｆＡ、ｈｙｆＢ、ｈｙｆＣ、ｈｙｆＤ、ｈｙｆＥ、ｈｙｆＦ、ｈｙｆＧ、ｈｙｆＨ、ｈｙｆＩ、ｈｙｆＪ、およびｈｙｆＲ遺伝子を含む）ｈｙｆオペロンによってコードされている。大腸菌ＦＨＬは、ｈｙｃオペロン由来の６つの遺伝子（ｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦおよびｈｙｃＧ）と、（ギ酸デヒドロゲナーゼＨ（Ｆｄｈ−Ｈ）をコードする）ｆｄｈＦ遺伝子とによってコードされている。ＦＨＬ複合体の発現はさらに、ｆｄｈＦおよびｈｙｃオペロンの転写を活性化する転写因子であるピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）のＦｈｌＡの発現、またはＦＨＬの転写を負に調節するｈｙｃＡ遺伝子によってコードされる転写因子であるＨｙｃＡの欠失／不活化を必要とすることがある。イソプレンと水素の共産出は、ヒドロゲナーゼおよび例えば、鉄−硫黄錯体転写調節因子（ｉｓｃＲ）（Ｋａｌｉｍ−Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃＲ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｆｅ／Ｆｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｈ２−ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３），”  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８：８５３−８６２（２００８）、これは、特に、ｉｓｃＲ遺伝子を欠失させることによるクロストリジウムのＦｅ／Ｆｅヒドロゲナーゼ活性の刺激および大腸菌における水素蓄積に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの他の酵素の遺伝子発現の調節に関与するさらなるタンパク質の発現または不活化／欠失によって改善することができる。
【０１１９】
例示的なフェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、限定するものではないが、クロストリジウム・アセトブツリクムヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）（例えば、Ｐ．Ｗ．Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ［ＦｅＦｅ］  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ，”  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８（６）：１６３−１７２（２００６）を参照されたく、これは、特に、ＨｙｄＡと３つのＨｙｄＡ関連成熟酵素（ＨｙｄＥ、ＨｙｄＧおよびＨｙｄＦ）（これらは、単独でまたは以下のうちの１以上とともに発現させてもよい：（１）枯草菌ＮＡＤＰＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＮＦＯＲ）（例えば、Ｖｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００８））を参照されたく、これは、特に、ＮＦＯＲによる水素の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる；また、ＰＣＴ刊行物ＷＯ／２００７／０８９９０１号を参照されたく、これは、特に、水素を産出するための大腸菌株の最適化に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、クロストリジウム・クルイベリＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＲｎｆＣＤＧＥＡＢ）（Ｈｅｎｎｉｎｇ  Ｓｅｅｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ，  ａ  ｓｔｒｉｃｔ  ａｎａｅｒｏｂｅ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（６）：２１２８−２１３３（２００８）、これは、特に、ＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼに関して、および嫌気的エタノール−酢酸発酵経路の構成要素に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、もしくはクロストリジウム・パスツラニヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒａｎｉｕｍ）フェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｆｄｘ）；（２）グリセルアルデヒド−６−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（「ＧＡＰＯＲ」）；または（３）ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（「ＰＯＲ」））による水素の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、および２以上のヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を有するかまたは１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドの活性と１以上のフェレドキシン依存的オキシドレダクターゼの活性とを有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。
【０１２０】
例示的なＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、限定するものではないが、ピロコックス・フリオススヒドロゲナーゼ（例えば、Ｊ．Ｗｏｏｄｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５（６７９０）：１０１４−１０１５（２０００）を参照されたい）などの好熱性ヒドロゲナーゼポリペプチド、および２以上のＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドの活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）が挙げられる。特に、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドとしては、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチド、ポリペプチドの断片、ペプチド、および融合ポリペプチドが挙げられる。
【０１２１】
例示的な酸素耐性または酸素非感受性ヒドロゲナーゼとしては、限定するものではないが、ルブリビバクス・ゲラチノーススヒドロゲナーゼ（例えば、Ｐ．Ｃ．Ｍａｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ａ  ｃａｒｂｏｎ  ｍｏｎｏｘｉｄｅ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｒｕｂｒｉｖｉｖａｘ  ｇｅｌａｔｉｎｏｓｕｓ，”  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８（６）：２６３３−２６３６（２００２）を参照されたく、これは、特に、Ｒ．ゲラチノーススヒドロゲナーゼに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、およびラルストニア・ユートロファヒドロゲナーゼポリペプチド（例えば、Ｔ．Ｂｕｒｇｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，“［ＮｉＦｅ］−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｏｆ  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６：ｍｏｄｕｌａｒ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  ｏｘｙｇｅｎ−ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，”  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（２−４）：１８１−１９６（２００５）を参照されたく、これは、特に、Ｒ．ユートロファヒドロゲナーゼポリペプチドに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。あるいは、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を、標準的な方法およびアッセイを用いて突然変異させ、Ｏ２耐性またはＯ２非感受性についてスクリーニングすることができる（例えば、Ｌ．Ｅ．Ｎａｇｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ［ＦｅＦｅ］−ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，”  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｓ．２９（３）４２１−４３０（２００７）を参照されたく、これは、特に、酸素耐性ヒドロゲナーゼポリペプチドの突然変異導入およびスクリーニングに関して、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１２２】
標準的な方法（例えば、本明細書に記載の方法）を用いて、インビトロで、細胞抽出物中で、またはインビボで、水素ガスを産出するポリペプチドの能力を測定することにより、ポリペプチドがヒドロゲナーゼ活性を有するかどうかを決定することができる。
【０１２３】
発酵副産物の産出に関する遺伝子の例示的なポリペプチドおよび核酸
大腸菌における異種またはネイティブなヒドロゲナーゼの発現または過剰発現の他に、イソプレンと水素の共産出を、嫌気性生合成経路を不活化し、それにより、限定するものではないが、乳酸、酢酸、ピルビン酸、エタノール、コハク酸、およびグリセロールをはじめとする、酸素制限条件または嫌気性条件の下で産出される種々の代謝産物（すなわち、発酵副産物）への炭素の流れを遮断することによって改善することができる。発酵副産物の産出に関与する例示的なポリペプチドとしては、ギ酸デヒドロゲナーゼＮ、αサブユニット（ｆｄｎＧ）、ギ酸デヒドロゲナーゼＯ、大サブユニット（ｆｄｏＧ）、硝酸レダクターゼ（ｎａｒＧ）、ギ酸輸送体Ａ（ｆｏｃＡ）、ギ酸輸送体Ｂ（ｆｏｃＢ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分ａｃｋＡ／ｐｔａ（ａｃｅＥ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、フマル酸レダクターゼ膜タンパク質（ｆｒｄＣ）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）が挙げられる。例えば、Ｔｏｓｈｉｎｏｒｉ  Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（４）：８７９−８９０（２００７）を参照されたく、これは、特に、グルコース代謝が改変された大腸菌株の産出に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。イソプレンと水素の共産出を改善するために不活化することも可能な発酵副産物の産出に関与する遺伝子の調節または発現に関与する例示的なポリペプチドとしては、限定するものではないが、ギ酸水素リアーゼ（ｈｙｃＡ）の抑制因子、フマル酸レダクターゼ調節因子（ｆｎｒ）、アセチル−補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、およびギ酸デヒドロゲナーゼ調節タンパク質（ｈｙｃＡ）（これは、転写調節因子ｆｈｌＡ（ギ酸水素リアーゼ転写活性化因子）の発現を調節する）が挙げられる。
【０１２４】
水素再取込みに関連する遺伝子の例示的なポリペプチドおよび核酸
イソプレンと水素の共産出を改善するために不活化することが同じく可能な水素再取込みに関与する例示的なポリペプチドとしては、限定するものではないが、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（Ｈｙｄ−１）（ｈｙａオペロン）および大腸菌ヒドロゲナーゼ−２（Ｈｙｄ−２）（ｈｙｂオペロン）が挙げられる。大腸菌Ｈｙｄ−１は、（ｈｙａＡ、ｈｙａＢ、ｈｙａＣ、ｈｙａＤ、ｈｙａＥ、およびｈｙａＦ遺伝子を含む）ｈｙａオペロンによってコードされている。大腸菌Ｈｙｄ−２は、（ｈｙｂＡ、ｈｙｂＢ、ｈｙｂＣ、ｈｙｂＤ、ｈｙｂＥ、ｈｙｂＦ、ｈｙｂＧ、およびｈｙｂＯ遺伝子を含む）ｈｙｂオペロンによってコードされている。
【０１２５】
核酸を単離するための例示的な方法
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を標準的な方法を用いて単離することができる。目的の供給源生物由来の所望の核酸（例えば、細菌ゲノム）を得る方法は、分子生物学の技術分野において一般的かつ周知である（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、目的の核酸の単離に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例えば、核酸の配列が既知（例えば、本明細書に記載の既知の核酸のいずれか）である場合、好適なゲノムライブラリーを、制限エンドヌクレアーゼ消化によって作製し得、所望の核酸配列に相補的なプローブでスクリーニングし得る。配列が単離されれば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，２０２号、これは、特に、ＰＣＲ法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの標準的なプライマー特異的増幅法を用いてＤＮＡを増幅し、適当なベクターを用いた形質転換に好適な大量のＤＮＡを入手し得る。
【０１２６】
あるいは、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸（例えば、既知の核酸配列を有する任意のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸）を、標準的な方法を用いて化学合成することができる。
【０１２７】
本明細書に記載の組成物および方法で用いるのに好適であり得るさらなるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドおよび核酸を、標準的な方法を用いて同定することができる。例えば、天然にイソプレンを産出することが知られている生物の染色体ＤＮＡのコスミドライブラリーを、大腸菌などの生物において構築し、その後、イソプレン産出についてスクリーニングすることができる。特に、巨大なゲノムＤＮＡ断片（３５〜４５ｋｂ）がベクターにパッケージングされていて、適当な宿主を形質転換するのに用いられるコスミドライブラリーを作製し得る。コスミドベクターは、大量のＤＮＡを収容することができる点が独特である。通常、コスミドベクターは、異種ＤＮＡのパッケージングとその後の環状化に必要な少なくとも１コピーのｃｏｓ  ＤＮＡ配列を有する。ｃｏｓ配列の他に、これらのベクターは、複製起点（例えば、ＣｏｌＥＩ）や薬剤耐性マーカー（例えば、アンピシリンまたはネオマイシンに耐性のある核酸）も含有する。好適な細菌宿主の形質転換にコスミドベクターを用いる方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（これは、特に、形質転換法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に十分に記載されている。
【０１２８】
通常、コスミドをクローニングするためには、適当な制限エンドヌクレアーゼを用いて異種ＤＮＡを単離し、適当なリガーゼを用いてコスミドベクターのｃｏｓ領域の隣りに連結する。その後、線状化した異種ＤＮＡを含有するコスミドベクターを、バクテリオファージなどのＤＮＡパッケージングビヒクルと反応させる。パッケージングプロセスの間に、ｃｏｓ部位が切断され、異種ＤＮＡが細菌ウイルス粒子の頭部にパッケージングされる。その後、これらの粒子を用いて、大腸菌などの好適な宿主細胞をトランスフェクトする。細胞に注入されれば、異種ＤＮＡは、ｃｏｓ付着末端の影響を受けて環状化する。このようにして、巨大な異種ＤＮＡ断片を導入し、宿主細胞で発現させることができる。
【０１２９】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を入手するさらなる方法としては、アッセイ（例えば、本明細書に記載のヘッドスペースアッセイ）によるかまたはある長さの保存されたアミノ酸（例えば、少なくとも３つの保存されたアミノ酸）をコードするヌクレオチドに対するプライマーを用いるＰＣＲによるメタゲノムライブラリーのスクリーニングが挙げられる。保存されたアミノ酸は、既知のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすることによって同定することができる。イソプレンシンターゼポリペプチドの保存されたアミノ酸は、アラインした既知のイソプレンシンターゼポリペプチドの配列に基づいて同定することができる。天然にイソプレンを産出することが分かった生物を（当該技術分野で周知の）標準的なタンパク質精製法に供することができ、得られた精製ポリペプチドを、標準的な方法を用いてシークエンシングすることができる。他の方法が文献中に見出される（例えば、Ｊｕｌｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７５：１３７７−８４，２００７；Ｗｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３（１９）：６２７７−８３，２００７を参照されたく、これらは各々、特に、イソプレンの合成に関与する核酸の同定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３０】
さらに、標準的な配列アラインメントおよび／または構造予測プログラムを用いて、その一次構造および／または予測されるポリペプチド二次構造と、既知のＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドおよび核酸の一次構造および／または予測されるポリペプチド二次構造との類似性に基づいて、さらなるＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドおよび核酸を同定することができる。ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ−ｔｒｅｍｂｌデータベース（“ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ”のワールド・ワイド・ウェブ，Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｇｒｏｕｐ  ＣＭＵ  −  １  ｒｕｅ  Ｍｉｃｈｅｌ  Ｓｅｒｖｅｔ  ＣＨ−１２１１  Ｇｅｎｅｖａ  ４，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）などの標準的なデータベースを用いて、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟および／または転写調節のポリペプチドおよび核酸を同定することもできる。イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドの二次および／または三次構造を、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（６３０  Ｗｅｓｔ，１６８  Ｓｔｒｅｅｔ，ＢＢ２１７，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１００３２，ＵＳＡ）などの、標準的な構造予測プログラムのデフォルト設定を用いて予測することができる。あるいは、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドの実際の二次および／または三次構造を、標準的な方法を用いて決定することができる。さらなるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を、既知のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸から作製したプローブに対するハイブリダイゼーションによって同定することもできる。
【０１３１】
例示的なプロモーターおよびベクター
本明細書に記載のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸のいずれかを１以上のベクターに含めることができる。したがって、本明細書に記載のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドのいずれかをコードする１以上の核酸を含むベクターも本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現制御配列の制御下にある核酸を含有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ベクターは、選択マーカーまたは選択可能マーカーを含有する。トリコデルマの形質転換用のベクター系で有用なマーカーが当該技術分野で知られている（例えば、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ  第６章，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，編．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，第６章，１９９２；およびＫｉｎｇｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９２を参照されたく、これらは各々、特に、選択マーカーに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、ａｍｄＳ核酸であり、これは、酵素アセトアミダーゼをコードし、形質転換細胞が窒素源としてのアセトアミドで増殖するをの可能にする。選択マーカーとしてのＡ．ニヅランスａｍｄＳ核酸の使用がＫｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９，１９８５およびＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４，１９８７に記載されている（これらは各々、特に、選択マーカーに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟、または転写調節の核酸は、選択マーカーを伴わずに細胞の染色体に組み込まれる。
【０１３３】
好適なベクターは、使用される宿主細胞と適合するベクターである。好適なベクターを、例えば、細菌、ウイルス（例えば、バクテリオファージＴ７またはＭ−１３由来のファージ）、コスミド、酵母、または植物から得ることができる。このようなベクターを入手および使用するためのプロトコルは、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９を参照されたく、これは、特に、ベクターの使用に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３４】
プロモーターは当該技術分野で周知である。宿主細胞において機能するプロモーターはいずれも、宿主細胞におけるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の発現に用いることができる。様々な宿主細胞においてイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の発現を促進するために有用な開始制御領域またはプロモーターは数多くあり、当業者によく知られている（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、目的の核酸を発現させるためのベクターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。これらの核酸を促進することができるほとんど全てのプロモーターを使用することができ、これらには、限定するものではないが、（サッカロミセスでの発現に有用な）ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣＩ、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、およびＴＰＩ；（ピキアでの発現に有用な）ＡＯＸ１；ならびに（大腸菌での発現に有用な）ｌａｃ、ｔｒｐ、λＰＬ、λＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃが含まれる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモーターを使用する（例えば、米国特許第７，１３２，５２７号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、目的のポリペプチドを発現させるためのプロモーターおよびプラスミド系に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。報告されているグルコースイソメラーゼプロモーター突然変異体を用いて、グルコースイソメラーゼプロモーターに機能的に連結された核酸によってコードされるポリペプチドの発現のレベルを変化させることができる（米国特許第７，１３２，５２７号）。様々な実施形態では、グルコースイソメラーゼプロモーターは、低、中、または高コピーのプラスミドの含まれている（米国特許第７，１３２，５２７号）。
【０１３６】
様々な実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、低コピープラスミド（例えば、細胞当たり約１〜約４コピーで維持されるプラスミド）、中コピープラスミド（例えば、細胞当たり約１０〜約１５コピーで維持されるプラスミド）、または高コピープラスミド（例えば、細胞当たり約５０コピー以上で維持されるプラスミド）に含まれている。いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｔ７プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターに機能的に連結された異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、中または高コピープラスミドに含まれている、いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｔｒｃプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｔｒｃプロモーターに機能的に連結された異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、中または高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｌａｃプロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、Ｌａｃプロモーターに機能的に連結された異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、低コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、内在性エシェリキア、パントエア、バシルス、ヤロウイア、ストレプトミセス、またはトリコデルマプロモーターまたは内在性アルカリ性セリンプロテアーゼ、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のプロモーターなどの、内在性プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、内在性プロモーターに機能的に連結された異種のまたは余分な内在性イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、高コピープラスミドに含まれている。いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞内で染色体に組み込まれない複製プラスミドである。いくつかの実施形態では、ベクターの一部または全てが細胞内で染色体に組み込まれる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ベクターは、真菌宿主細胞に導入されたときに、宿主細胞ゲノムに組み込まれて、複製する任意のベクターである。ベクターのリストについては、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ（ＦＧＳＣ、“ｆｇｓｃ．ｎｅｔ”のワールド・ワイド・ウェブおよびその中に引用された参考文献、これらは各々、特に、ベクターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。好適な発現ベクターおよび／または組込みベクターのさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編）  １９８７，補遺３０巻，第７．７．１８節）；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ（編）  Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３９６−４２８，１９９１のｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；および米国特許第５，８７４，２７６号（これらは各々、特に、ベクターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。特に有用なベクターとしては、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００、およびｐＥＮＴＲ／Ｄが挙げられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、真菌宿主細胞で転写活性を示す好適なプロモーターに機能的に連結されている。プロモーターは、宿主細胞にとって内在性または異種のいずれかのポリペプチドをコードする１以上の核酸に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、トリコデルマ宿主において有用である。プロモーターの好適な非限定例としては、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｐｅｐＡ、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、およびａｍｙが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、宿主細胞にとってネイティブなプロモーターである。例えば、Ｔ．リーゼイが宿主であるいくつかの実施形態では、プロモーターは、ネイティブのＴ．リーゼイプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｔ．リーゼイのｃｂｈ１であるが、これは、誘導性プロモーターであり、アクセッション番号Ｄ８６２３５（これは、特に、プロモーターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の下でＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、真菌宿主細胞にとって異種のプロモーターである。有用なプロモーターの他の例としては、Ａ．アワモリおよびＡ．ニゲルのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）（Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５，１９８４およびＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１５８１−１５８５，１９８４（これらは各々、特に、プロモーターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）；アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のαアミラーゼ、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、Ｔ．リーゼイのｘｌｎ１、およびＴ．リーゼイのセロビオヒドラーゼ１（欧州特許第１３７２８０号（これは、特に、プロモーターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、発現ベクターには終結配列も含まれる。終結制御領域はまた、宿主細胞にネイティブな様々な遺伝子に由来するものであってもよい。いくつかの実施形態では、終結配列およびプロモーター配列は同じ源に由来するものである。別の実施形態では、終結配列は宿主細胞にとって内在性である。特に好適なターミネーター配列は、トリコデルマ株（例えば、Ｔ．リーゼイ）に由来するｃｂｈ１である。他の有用な真菌ターミネーターとしては、。Ａ．ニゲルまたはＡ．アワモリのグルコアミラーゼ核酸（Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５，１９８４およびＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１５８１−１５８５，１９８４；これらは各々、特に、真菌ターミネーターに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に由来するターミネーターが挙げられる。場合により、終結部位を含めてもよい。ポリペプチドの効率的な発現のために、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現によって適切なメッセンジャーＲＮＡが形成されるように、開始コドンを介して選択された発現制御領域に機能的に連結されている。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、プロモーター、コード領域およびターミネーターが全て、発現されるイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸に由来する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸のコード領域は、発現コンストラクトのプロモーター配列とターミネーター配列の転写制御下にあるように、汎用発現ベクターに挿入される。いくつかの実施形態では、遺伝子またはその部分は、強力なｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。
【０１４１】
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を、標準的な技術を用いて、発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２、これは、特に、適当なＤＮＡ配列のスクリーニングおよびベクターの構築に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。目的の核酸（例えば、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸）、プロモーター、ターミネーターならびに他の配列を含むＤＮＡコンストラクトを連結するために、およびそれらを好適なベクターに挿入するために用いられる方法は、当該技術分野で周知である。例えば、制限酵素を用いて、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸とベクターとを切断することができる。その後、切断されたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸と切断されたベクターの互換性のある末端を連結することができる。連結は、通常、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合は、従来の慣行に従って合成オリゴヌクレオチドリンカーを用いる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、およびＢｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ７０−７６，１９９１を参照されたく、これらは各々、特に、オリゴヌクレオチドリンカーに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ベクターを、既知の組換え技術を用いて構築することができる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を、天然の細胞で現在見られるよりもずっと高いレベルで過剰発現させることが望ましい場合がある。この結果は、それらのポリペプチドをコードする核酸を多コピープラスミドに選択的にクローニングするかまたはそれらの核酸を強力な誘導性もしくは構成的プロモーターの下に置くことによって達成され得る。所望のポリペプチドを過剰発現させる方法は、分子生物学の分野では一般的かつ周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（これは、特に、クローニング技術に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に例を見出し得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟、または転写因子ポリペプチドをコードする核酸を、天然の細胞で現在見られるよりもずっと低いレベルで過小発現する（例えば、突然変異させる、不活化する、または欠失させる）ことが望ましい場合がある。この結果は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の発現に必要な転写調節タンパク質の突然変異または不活化によるか、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の欠失によるか、あるいはそれらの核酸を強力な抑制性プロモーターの制御下に置くことによって達成され得る。所望のポリペプチドを突然変異させるか、不活化するか、または欠失させる方法は、分子生物学の分野では一般的かつ周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９（これは、特に、クローニング技術および突然変異導入技術に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に例を見出し得る。
【０１４４】
以下のリソースは、本明細書に記載の組成物および方法に従って有用なさらなる一般的方法論に関する記載を含む：Ｋｒｅｉｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９９０およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９４（これらは各々、特に、分子生物学およびクローニング技術に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１４５】
例示的な供給源生物
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸（ならびにそれらのコードされたポリペプチド）を、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を天然に含有する任意の生物から入手することができる。上述のように、イソプレンは、種々の生物（例えば、細菌、酵母、植物、および動物）によって天然に形成される。生物は、イソプレンを産出するためのＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、またはＭＶＡ経路とＤＸＰ経路の両方を含有している（図１９Ａおよび１９Ｂ）。したがって、ＤＸＳ核酸を、例えば、ＤＸＰ経路を含有するかまたはＭＶＡ経路とＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から入手することができる。ＩＤＩおよびイソプレンシンターゼの核酸を、例えば、ＭＶＡ経路、ＤＸＰ経路、またはＭＶＡ経路とＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から入手することができる。ＭＶＡ経路核酸を、例えば、ＭＶＡ経路を含有するかまたはＭＶＡ経路とＤＸＰ経路の両方を含有する任意の生物から入手することができる。ヒドロゲナーゼ核酸を、例えば、水素を酸化するかまたは水素イオンを還元する任意の生物から入手することができる。発酵副産物遺伝子を、例えば、酸素制限呼吸または嫌気性呼吸（例えば、解糖）をする任意の生物から入手または同定することができる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸の核酸配列は、以下の天然生物のいずれかによって産出される核酸の配列と同一である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の天然生物のいずれかによって産出されるポリペプチドの配列と同一である。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸またはポリペプチドは、本明細書に記載の生物のいずれかに由来する突然変異体核酸またはポリペプチドである。本明細書で使用される場合、「に由来する」とは、１以上の突然変異が導入される核酸またはポリペプチドの供給源を指す。例えば、「植物ポリペプチド」に由来するポリペプチドは、１以上の突然変異を野生型（すなわち、天然に生じる配列）の植物ポリペプチドの配列に導入することによって得られる目的のポリペプチドを指す。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、供給源生物は真菌であり、その例は、Ａ．オリザエやＡ．ニゲルなどのアスペルギルスの種、出芽酵母などのサッカロミセスの種、分裂酵母などのスキゾサッカロミセスの種、およびＴ．リーゼイなどのトリコデルマの種である。いくつかの実施形態では、供給源生物は糸状真菌細胞である。「糸状真菌」という用語は、ユーミコチナ亜分類の全ての糸状形態を指す（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．（１９６２），Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。これらの真菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖類から構成された細胞壁を有する栄養菌糸を特徴とする。糸状真菌は、形態学的に、生理学的に、および遺伝学的に酵母とは異なる。糸状真菌による栄養増殖は菌糸伸長によるものであり、炭素代謝は絶対好気性である。糸状真菌親細胞は、限定するものではないが、トリコデルマ（例えば、以前はＴ．ロンギブラキアツムと分類されていた、ヒポクレア・ジェコリナの無性モルフであるトリコデルマ・リーゼイ、トリコデルマ・ビリデ、トリコデルマ・コニンギイ、トリコデルマ・ハルジアヌム）（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：４６−５３，１９８４；ＡＴＣＣ番号５６７６５およびＡＴＣＣ番号２６９２１）；ペニシリウム種、フミコラ種（例えば、Ｈ．イソレンス、Ｈ．ラヌギノス、またはＨ．グリセア）；クリソスポリウム種（例えば、Ｃ．ルクノウェンス）、グリオクラジウム種、アスペルギルス種（例えば、Ａ．オリザエ、Ａ．ニゲル、Ａ．ソーエ、Ａ．ジャポニクス、Ａ．ニヅランス、またはＡ．アワモリ）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８０７４３，１９９３およびＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔ  ４１：８９−９８，２００２）、フサリウム種（例えば、Ｆ．ロセウム、Ｆ．グラミヌム、Ｆ．セレアリス、Ｆ．オキシスポリウム、またはＦ．ベネナツム）、ネウロスポラ種（例えば、Ｎ．クラッサ）、ヒポクレア種、ムコール種（例えば、Ｍ．ミエエイ）、リゾプス種、およびエメリセラ種（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．２２８：２１−２６，１９８５も参照されたい）の種の細胞であってもよい。「トリコデルマ」または「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）」または「トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）」という用語は、以前にトリコデルマと分類されていたかまたは現在トリコデルマと分類されている任意の真菌属を指す。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、真菌は、Ａ．ニヅランス、Ａ．アワモリ、Ａ．オリザエ、Ａ．アクレータス、Ａ．ニゲル、Ａ．ジャポニクス、Ｔ．リーゼイ、Ｔ．ビリデ、Ｆ．オキシスポルム、またはＦ．ソラニである。アスペルギルス株は、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８−７４３，１９９３およびＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅ  ４１：８９−９８，２００２（これらは各々、特に、真菌に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。特定の実施形態では、真菌は、トリコデルマの株、例えば、Ｔ．リーゼイの株である。Ｔ．リーゼイの株は既知であり、非限定例としては、ＡＴＣＣ番号１３６３１、ＡＴＣＣ番号２６９２１、ＡＴＣＣ番号５６７６４、ＡＴＣＣ番号５６７６５、ＡＴＣＣ番号５６７６７、およびＮＲＲＬ  １５７０９（これらは各々、特に、Ｔ．リーゼイの株に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。いくつかの実施形態では、宿主株は、ＲＬ−Ｐ３７の派生物である。ＲＬ−Ｐ３７は、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４６−５３，１９８４、これは、特に、Ｔ．リーゼイの株に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、供給源生物は、サッカロミセス種、スキゾサッカロミセス種、ピキア種、またはカンジダ種などの酵母である。いくつかの実施形態では、サッカロミセス種は出芽酵母である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、供給源生物は、バシルスの株（例えば、Ｂ．リケニフォルミスまたは枯草菌）、パントエアの株（例えば、Ｐ．シトレア）、シュードモナスの株（例えば、Ｐ．アルカリゲンス、Ｐ．プチダ、もしくはＰ．フルオレセンス）、ストレプトミセスの株（例えば、Ｓ．リビダンスもしくはＳ．ルビギノスス）、コリネバクテリウム種の株（例えば、コリネバクテリウム・グルタミクム）、ロドシュードモナス種の株（例えば、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ））、またはエシェリキアの株（例えば、大腸菌）などの細菌である。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「バシルス属」は、当業者に知られているような「バシルス」属内の全ての種を含み、これには、限定するものではないが、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンツス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステアロテルモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．ハロヅランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．ラウツス、およびＢ．ツリンギエンシスが含まれる。バシルス属は、分類上の再編成が引き続き行なわれていることが認められる。したがって、この属には、限定するものではないが、現在「ゲオバシルス・ステアロテルモフィルス」と名付けられているＢ．ステアロテルモフィルスなどの生物をはじめとする、再分類された種が含まれることが意図される。酸素の存在下での耐性内性胞子の産出は、バシルス属の特徴を規定するものと考えられているが、この特徴は、最近名付けられたアリシクロバシルス、アムフィバシルス、アネウリニバシルス、アノキシバシルス、ブレビバシルス、フィロバシルス、グラシリバシルス、ハロバシルス、パエニバシルス、サリバシルス、テルモバシルス、ウレイバシルス、およびビルギバシルスにも当てはまる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、供給源生物はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトミセスの株（例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリコロール、またはＳ．グリセウス）およびバシルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、供給源生物は、大腸菌、ロドシュードモナス種（例えば、ロドシュードモナス・パルストリス）、またはシュードモナス種（例えば、Ｐ．アルカリゲネス、Ｐ．プチダ、もしくはＰ．フルオレセンス）などの、グラム陰性細菌である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、供給源生物は、マメ科（例えば、マメ亜科）由来の植物などの植物である。いくつかの実施形態では、供給源生物は、クズ、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシＣＡＣ３５６９６）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ）、またはヨーロッパナラである。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、供給源生物は、緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ユーグレナ藻、クロミスタ、または渦鞭毛藻などの藻類である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、供給源生物は、形態に基づいて以下のグループ：クロオコックス目、プレウロカプサ目、ユレモ目、ネンジュモ目、またはスティゴネマ目のいずれかに分類されるシアノバクテリアなどのシアノバクテリアである。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、生物源は嫌気性生物である。嫌気性生物としては、偏性好気性菌、条件的好気性菌、および酸素耐性好気性菌が挙げられるが、これらに限定されない。このような生物は、バクテリア、酵母菌など、上に掲載の任意の生物であることができる。一実施形態では、偏性好気性菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｅｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、およびＢｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍからなる群から選択される任意の１つまたは組み合わせであることができる。本明細書に記載の任意の生物源の任意の組み合わせを本発明の他の実施形態のために使用できることが理解されるべきである。
【０１５７】
例示的な宿主細胞
種々の宿主細胞を用いて、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドを発現させ、本明細書に記載の方法においてイソプレンと水素を共産出させることができる。例示的な宿主細胞としては、先の「例示的な供給源生物」という見出しの節で記載された生物のいずれかに由来する生物が挙げられる。宿主細胞は、天然にイソプレンを産出する細胞であっても、天然にはイソプレンを産出しない細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路を用いて天然にイソプレンを産出しており、この経路を用いたイソプレンの産出を増強するためにイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、および／またはＩＤＩ核酸が付加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、イソプレンを用いて天然にイソプレンを産出しており、この経路を用いたイソプレンの産出を増強するためにイソプレンシンターゼおよび／または１以上のＭＶＡ経路核酸が付加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路を用いて天然にイソプレンを産出しており、ＭＶＡ経路およびＤＸＰ経路の一部または全てを用いてイソプレンを産出するために１以上のＭＶＡ経路核酸が付加される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方を用いて天然にイソプレンを産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方を用いて天然にイソプレンを産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ核酸が付加され、発酵副産物の産出を制限するために、発酵副産物を産出する１以上の遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方を用いて天然にイソプレンと水素を産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ核酸が付加され、発酵副産物の産出を制限するために、発酵副産物を産出する１以上の遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられ、水素産出を増加させるために１以上の水素再取込み遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方およびヒドロゲナーゼを用いて天然にイソプレンと水素を産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ成熟核酸が付加され、発酵副産物の産出を制限するために、発酵副産物を産出する１以上の遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられ、水素産出を増加させるために１以上の水素再取込み遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ経路とＭＶＡ経路の両方を用いて天然にイソプレンと水素を産出しており、これらの経路のうちの一方または両方によるイソプレンの産出を増強するために１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ核酸が付加され、水素産出を増強するために１以上のヒドロゲナーゼ成熟核酸が付加され、ヒドロゲナーゼ産出を増強するために１以上の転写因子核酸が付加されるかまたは不活化されるもしくは欠失させられ、発酵副産物の産出を制限するために、発酵副産物を産出する１以上の遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられ、水素産出を増加させるために１以上の水素再取込み遺伝子が不活化されるかまたは欠失させられる。
【０１５９】
例示的な形質転換方法
イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸あるいはそれらを含有するベクターを、コードされたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子および／またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドの発現させるための標準的な技術を用いて宿主細胞（例えば、本明細書に記載の植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞）に挿入することができる。形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション（例えば、リポフェクションを介するまたはＤＥＡＥ−デキストランを介するトランスフェクションまたは組換えファージウイルスを用いるトランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿を用いるインキュベーション、ＤＮＡをコーティングした微粒子銃を用いる高速衝突、およびプトロプラスト融合などの技術を用いて、ＤＮＡコンストラクトまたはベクターの宿主細胞への導入を行なうことができる。一般的な形質転換技術は当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編）  第９章，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；およびＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９を参照されたく、これらは各々、特に、形質転換方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。トリコデルマにおける異種ポリペプチドの発現は、米国特許第６，０２２，７２５号；米国特許第６，２６８，３２８号；米国特許第７，２６２，０４１号；ＷＯ２００５／００１０３６号；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７−２３３，１９９１；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：５９６−６０３，１９８９；欧州特許第２４４，２３４号；欧州特許第２１５，５９４号；およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮＹ  ｐｐ．１２９−１４８，１９９２中のＮｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ”（これらは各々、特に、形質転換方法および発現方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。アスペルギルス株の形質転換については、Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｃｉ．９：９９１−１００１，２０００；欧州特許第２３８０２３号；およびＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４，１９８４（これらは各々、特に、形質転換方法に関して、その全体が参照���より本明細書に組み込まれる）も参照されたい。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得るかまたは染色体外の複製配列として維持され得る。
【０１６０】
当該技術分野で公知の任意の方法を用いて形質転換体を選択し得る。１つの非限定的な例では、ａｍｄＳマーカーを含む安定な形質転換体を、そのより速い増殖速度や、アセトアミドを含有する固形培養培地上でのギザギザではなく、滑らかな輪郭を有する円形コロニーの形成によって、不安定な形質転換体から区別する。さらに、場合によっては、形質転換体を固形非選択培地（例えば、アセトアミドを欠く培地）上で増殖させ、この培養培地から胞子を採取し、アセトアミドを含有する選択培地上で後に発芽および増殖するこれらの胞子のパーセンテージを決定することによって、さらなる安定性の試験を実施する。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、真菌細胞を、プロトプラスト形成およびプロトプラストの形質転換、それに続く既知の方法での細胞壁の再生を伴うプロセスによって形質転換する。特定の一実施形態では、形質転換用のトリコデルマ種の調製は、真菌菌糸からのプロトプラストの調製を必要とする（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９を参照されたく、これは、特に、形質転換方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、菌糸を、発芽した栄養胞子から得る。菌糸を、細胞壁を消化する酵素で処理して、プロトプラストを生じさせる。次に、プロトプラストを、懸濁媒体中に浸透圧安定化剤を存在させることによって保護する。これらの安定化剤としては、ソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。通常、これらの安定化剤の濃度は、０．８Ｍから１．２Ｍの間で変動する。懸濁媒体中約１．２Ｍのソルビトール溶液を用いることが望ましい。
【０１６２】
宿主トリコデルマ種株へのＤＮＡの取込みは、カルシウムイオン濃度に依存する。通常、約１０ｍＭ  ＣａＣｌ２から５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を取込み溶液中で使用する。取込み溶液中のカルシウムイオンの他に、通常含まれる他の化合物は、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）または１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０緩衝液（モルホリンプロパンスルホン酸）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの緩衝系である。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、ポリエチレングリコールは細胞膜を融合させるように働き、それにより、媒体の内容物をトリコデルマ種株の細胞質に送達し、プラスミドＤＮＡを核に移すことを可能にすると考えられている。この融合によって、複数コピーのプラスミドＤＮＡが宿主染色体に組み込まれたままになることが多い。
【０１６３】
通常、１０５〜１０７／ｍＬ（例えば、２×１０６／ｍＬ）の密度で透過処理を受けさせたトリコデルマ種のプロトプラストまたは細胞を含有する懸濁液を形質転換で用いる。適当な溶液（例えば、１．２Ｍのソルビトールおよび５０ｍＭのＣａＣｌ２）中の１００μＬの容量のこれらのプロトプラストまたは細胞を、所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧを取込み溶液に添加する。０．１〜１容量の２５％ＰＥＧ  ４０００をプロトプラスト懸濁液に添加することができる。いくつかの実施形態では、約０．２５容量をプロトプラスト懸濁液に添加する。また、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどのような添加剤を取込み溶液に添加して、形質転換を助けてもよい。同様の手順が他の真菌宿主細胞に利用可能である（例えば、米国特許第６，０２２，７２５号および第６，２６８，３２８号を参照されたく、これらは各々、特に、形質転換に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１６４】
通常は、その後、混合物を約０℃で１０〜３０分間培養する。その後、この混合物にＰＥＧをさらに添加して、所望の核酸配列の取込みをさらに増強する。通常、２５％のＰＥＧ  ４０００を、形質転換混合物の容量の５〜１５倍の容量で添加するが、より多いまたはより少ない容量が好適である場合もある。２５％のＰＥＧ  ４０００は、望ましくは形質転換混合物の容量の約１０倍である。ＰＥＧを添加した後、形質転換混合物を室温または氷上のいずれかで培養し、その後、ソルビトール／ＣａＣｌ２溶液を添加する。その後、プロトプラスト懸濁液を、培養培地の溶解アリコートにさらに添加する。増殖培地に増殖を選択するもの（例えば、アセトアミドまたは抗生物質）が含まれる場合、それによって、形質転換体の増殖のみが許容される。
【０１６５】
細菌細胞の形質転換を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８２（これは、特に、形質転換方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような従来の方法に従って行なってもよい。
【０１６６】
例示的な細胞培養培地
イソプレンと水素を共産出する培養細胞かまたは培養細胞の集団も本明細書に記載する。「培養細胞」とは、細胞が１回以上の細胞分裂を経るのを可能にする溶液（例えば、細胞増殖培地）中の２以上の細胞を意味する。「培養細胞」には、植物組織に分化した細胞を含有する生きた多細胞植物の部分である植物細胞は含まれない。様々な実施形態では、細胞培養物には、少なくともまたは約１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、５，０００、１０，０００個またはそれより多くの細胞が含まれる。
【０１６７】
「酸素制限培養された細胞」とは、細胞が１回以上の細胞分裂を経るのを可能にする溶液（例えば、細胞増殖培地）中の２以上の細胞を意味し、その場合、この溶液は制限量の酸素を含有する。「酸素制限培養」という用語は、培養が無酸素性であるかまたは還元性等価物の酸素への生物学的移動を介した呼吸を支えるための所要量に満たない酸素を含有するかのいずれかであることを意味し、嫌気性培養も包含する。酸素制限培養条件下では、酸素濃度が低すぎるために、炭素代謝から得られるいくつかの電子を受容することができず、細胞が電子を受容するための適当な代謝経路を含まない場合、細胞を水素産出に切り替えさせる。酸素制限培養条件は、培養培地中のゼロに近い溶存酸素濃度で示される、酸素移動速度（「ＯＴＲ」）が酸素取込み速度（「ＯＵＲ」）よりも低い場合に発生する。
【０１６８】
任意の炭素源を用いて、宿主細胞を培養することができる。「炭素源」という用語は、宿主細胞または生物によって代謝されることができる１以上の炭素含有化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するために用いられる細胞培地は、宿主細胞の生存または増殖を維持するのに好適な任意の炭素源を含んでいてもよい。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、炭素源は、炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、もしくは多糖類）、転化糖（例えば、酵素処理したスクロースシロップ）、グリセロール、グリセリン（例えば、バイオディーゼルもしくは石鹸製造プロセスのグリセリン副生成物）、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油（例えば、植物油もしくは植物性油、例えば、トウモロコシ油、ヤシ油、もしくは大豆油）、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸（例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、もしくは多価不飽和脂肪酸）、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、再生可能な炭素源（例えば、バイオマス炭素源、例えば、加水分解されたバイオマス炭素源）、酵母抽出物、酵母抽出物由来の成分、ポリマー、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、コハク酸、乳酸、酢酸、エタノール、または上述のもののうちの２つ以上の任意の組合せである。いくつかの実施形態では、炭素源は、限定するものではないが、グルコースをはじめとする光合成産物である。
【０１７０】
例示的な単糖としては、グルコースおよびフルクトースが挙げられ、例示的なオリゴ糖としては、ラクトースおよびスクロースが挙げられ、例示的な多糖類としては、デンプンおよびセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、またはグルコース）およびＣ５糖（例えば、キシロースまたはアラビノース）が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞培地は、炭水化物および炭水化物（例えば、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、または酵母抽出物由来の成分）以外の１以上の炭素源を含む。いくつかの実施形態では、細胞培地は、炭水化物およびポリペプチド（例えば、微生物または植物のタンパク質またはペプチド）を含む。いくつかの実施形態では、微生物ポリペプチドは、酵母または細菌由来のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、植物ポリペプチドは、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、サフラワー、ゴマ、またはアマニ由来のポリペプチドである。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は、少なくともまたは約５グラム／ブロス１リットル（ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの容積は、細胞培地の容量と細胞の容積の両方を含む）、例えば、少なくともまたは約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００ｇ／Ｌ、またはそれよりも多い。いくつかの実施形態では、炭水化物の濃度は、約５０〜約４００ｇ／Ｌ、例えば、約１００〜約３６０ｇ／Ｌ、約１２０〜約３６０ｇ／Ｌ、または約２００〜約３００ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、炭水化物のこの濃度は、宿主細胞の培養前および／または培養中に添加される炭水化物の総量を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。「制限グルコース条件」とは、添加されるグルコースの量が、細胞によって消費されるグルコースの量の１０５％未満または約１０５％（例えば、約１００％）であることを意味する。特定の実施形態では、培養培地に添加されるグルコースの量は、一定期間内に細胞によって消費されるグルコースの量とほぼ同じである。いくつかの実施形態では、細胞培地中のグルコースの量で支えることができる速度で細胞が増殖するように、細胞増殖の速度を、添加されるグルコースの量を制限することで制御する。いくつかの実施形態では、グルコースは細胞培養中に蓄積しない。様々な実施形態では、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、もしくは７０時間またはそれらより長い時間、細胞を制限グルコース条件下で培養する。様々な実施形態では、細胞が培養される総時間の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、もしくは１００％またはそれらより長い時間、細胞を制限グルコース条件下で培養する。任意の特定の理論に束縛されるつもりはないが、制限グルコース条件が細胞のより有利な調節を可能にし得ると考えられている。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、細胞を過剰なグルコースの存在下で培養する。特定の実施形態では、添加されるグルコースの量は、一定期間内に細胞によって消費されるグルコースの量の約１０５％超（例えば、約１１０、１２０、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、もしくは５００％またはそれらを上回る）あるいはそれを上回る。いくつかの実施形態では、グルコースは細胞培養中に蓄積する。
【０１７４】
例示的な脂質は、飽和しているか、不飽和であるか、または分岐しているＣ４およびそれを上回る脂肪酸である１以上の脂肪酸を含有する任意の物質である。
【０１７５】
例示的な油は、室温で液体である脂質である。いくつかの実施形態では、脂質は、１以上のＣ４またはそれを上回る脂肪酸を含有する（例えば、４以上の炭素を有する１以上の飽和、不飽和、または分岐脂肪酸を含有する）。いくつかの実施形態では、油は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、サフラワー、ゴマ、アマニ、油脂性微生物細胞、ナンキンハゼ、または上述のもののうちの２つ以上の任意の組合せから得られる。
【０１７６】
例示的な脂肪酸としては、式ＲＣＯＯＨの化合物（式中、「Ｒ」は炭化水素である）が挙げられる。例示的な不飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む化合物が挙げられる。例示的な不飽和脂肪酸としては、限定するものではないが、オレイン酸、バクセン酸、リノレイン酸、パルミトレイン酸酸、およびアラキドン酸が挙げられる。例示的な多価不飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が複数の炭素−炭素二重結合を含む化合物が挙げられる。例示的な飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、炭素源は、１以上のＣ１２−Ｃ２２脂肪酸、例えば、Ｃ１２飽和脂肪酸、Ｃ１４飽和脂肪酸、Ｃ１６飽和脂肪酸、Ｃ１８飽和脂肪酸、Ｃ２０飽和脂肪酸、またはＣ２２飽和脂肪酸を含む。例示的な実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。いくつかの実施形態では、炭素源は、脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の塩、脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の誘導体、または脂肪酸（例えば、不飽和脂肪酸）の誘導体の塩である。好適な塩としては、限定するものではないが、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩などが挙げられる。ジグリセリドおよびトリグリセリドは、グリセロールの脂肪酸エステルである。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドの濃度は、少なくともまたは約１グラム／ブロス１リットル（ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの容積は、細胞培地の容量と細胞の容積の両方を含む）、例えば、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００ｇ／Ｌ、またはそれよりも多い。いくつかの実施形態では、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドの濃度は、約１０〜約４００ｇ／Ｌ、例えば、約２５〜約３００ｇ／Ｌ、約６０〜約１８０ｇ／Ｌ、または約７５〜約１５０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、この濃度は、宿主細胞の培養前および／または培養中に添加される脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドの総量を含む。いくつかの実施形態では、炭素源は、（ｉ）脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドおよび（ｉｉ）炭水化物（例えば、グルコース）を含む。いくつかの実施形態では、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドと炭水化物の比率は、炭素ベースで約１：１（すなわち、炭水化物の炭素１個当たりに脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリド中の炭素が１個）である。特定の実施形態では、脂質、油、脂肪、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリドの量は約６０〜１８０ｇ／Ｌであり、炭水化物の量は約１２０〜３６０ｇ／Ｌである。
【０１７８】
例示的な微生物ポリペプチド炭素源としては、酵母または細菌由来の１以上のポリペプチドが挙げられる。例示的な植物ポリペプチド炭素源としては、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、サフラワー、ゴマ、またはアマニ由来の１以上のポリペプチドが挙げられる。
【０１７９】
例示的な再生可能な炭素源としては、チーズホエー浸透液、コーンスティープリカー、甜菜糖液、大麦麦芽、および上述のもののいずれかに由来する成分が挙げられる。例示的な再生可能な炭素源としては、バイオマス（例えば、トウモロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、発酵プロセスの細胞廃棄物、および大豆、トウモロコシ、または小麦の製粉からのタンパク質副産物）中に存在するグルコース、ヘキソース、ペントース、およびキシロースも挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオマス炭素源は、限定するものではないが、草、小麦、麦わら、バガス、サトウキビバガス、針葉樹パルプ、トウモロコシ、トウモロコシの軸または皮、トウモロコシの実、トウモロコシの実からの繊維、コーンストーバー、スイッチグラス、籾殻産物、または穀物（例えば、トウモロコシ、ソルガム、ライ麦、トリティケート、大麦、小麦、および／またはディスティラーズグレイン）の湿式もしくは乾式製粉からの副産物などの、リグノセルロース系材料、ヘミセルロース系材料、またはセルロース系材料である。例示的なセルロース系材料としては、木材、紙およびパルプ廃棄物、草本植物、および果肉が挙げられる。いくつかの実施形態では、炭素源としては、茎、穀粒、根、または塊根などの任意の植物部分が挙げられる。いくつかの実施形態では、以下の植物のいずれかの全てまたは一部を炭素源として用いる：トウモロコシ、小麦、ライ麦、ソルガム、トリティケート、米、キビ、大麦、キャッサバ、マメ（例えば、豆およびエンドウ豆）、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、および／またはタピオカ。いくつかの実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物（例えば、キシロースとグルコースの両方を含むかまたはスクロースとグルコースの両方を含むバイオマス加水分解物）である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源（例えば、バイオマス）を、細胞培養培地に添加する前に前処理する。いくつかの実施形態では、前処理は、酵素的前処理、化学的前処理または酵素的前処理と化学的前処理の両方の組合せを含む（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９６（１８）：２０１４−２０１８，２００５；米国特許第６，１７６，１７６号；米国特許第６，１０６，８８８号を参照されたく、これらは各々、特に、再生可能な炭素源の前処理に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源を、細胞培養培地に添加する前に、部分的にまたは完全に加水分解する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、再生可能な炭素源（例えば、コーンストーバー）を細胞培養培地に添加する前にアンモニア繊維膨潤（ＡＦＥＸ）前処理する（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９６（１８）：２０１４−２０１８，２００５を参照されたい）。ＡＦＥＸ前処理の間、再生可能な炭素源を、液体無水アンモニアにより、穏やかな温度（例えば、約６０〜約１００℃）において高圧（例えば、約２５０〜約３００ｐｓｉ）で約５分間処理する。その後、圧力を速やかに解放する。このプロセスでは、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロース脱結晶化、および表面積の増加の化学的効果と物理的効果の組合せにより、セルロースとヘミセルロースを酵素的に変換して、ほぼ完全に発酵性糖にすることができる。ＡＦＥＸ前処理には、アンモニアのほぼ全量を回収して再使用することができるとともに、残量が下流プロセス中の微生物の窒素源として役立てられるという利点がある。また、ＡＦＥＸ前処理には洗浄ストリームが必要ない。したがって、ＡＦＥＸ処理後の乾燥物質の回収率は、本質的に１００％である。ＡＦＥＸは、基本的には、乾燥状態から乾燥状態へのプロセスである。処理された再生可能な炭素源は長期間安定であり、極めて高い固体含有量で酵素的加水分解または発酵プロセスに供給することができる。セルロースおよびヘミセルロースは、ほとんどまたは全く分解せず、ＡＦＥＸプロセスで十分に保存される。ＡＦＥＸ前処理した再生可能な炭素源の酵素的加水分解の前に中和する必要はない。ＡＦＥＸ処理した炭素源の酵素的加水分解により、次の発酵で使用するための清浄な糖ストリームが産出される。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）の濃度は、少なくともまたは約０.１、０.５、１、１.５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０％グルコース（ｗ／ｖ）に等しい。グルコースの当量は、グルコースを参照として標準的なＨＰＬＣ法を用いて、炭素源から生成されるグルコースの量を測定することにより決定することができる。いくつかの実施形態では、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）の濃度は、約０.１〜約２０％グルコース、例えば、約０.１〜約１０％グルコース、約０.５〜約１０％グルコース、約１〜約１０％グルコース、約１〜約５％グルコース、または約１〜約２％グルコースに等しい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、炭素源には、酵母抽出物または酵母抽出物の１以上の成分が含まれる。いくつかの実施形態では、酵母抽出物の濃度は、少なくとも１グラムの酵母抽出物／ブロス１リットル（ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの容積は、細胞培地の容量と細胞の容積の両方を含む）、例えば、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００ｇ／Ｌ、またはそれより多い。いくつかの実施形態では、酵母抽出物の濃度は、約１〜約３００ｇ／Ｌ、例えば、約１〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約１００ｇ／Ｌ、または約５〜約６０ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、濃度は、宿主細胞の培養前および／または培養中に添加される酵母抽出物の総量を含む。いくつかの実施形態では、炭素源は、酵母抽出物（または１以上のその成分）と別の炭素源（例えば、グルコース）の両方を含む。いくつかの実施形態では、酵母抽出物と他の炭素源の比率は、約１：５、約１：１０、または約１：２０（ｗ／ｗ）である。
【０１８４】
さらに、炭素源はまた、二酸化炭素またはメタノールなどの１炭素基質であってもよい。メチルトローフ酵母（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（２）  ５４１−５４３，１９８９、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）や細菌（Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，４１４８−４１５５，１９８５、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）において、１炭素源（例えば、メタノール、ホルムアルデヒド、またはギ酸）からグリセロールが産出されることが報告されている。これらの生物は、メタンからギ酸の範囲の酸化状態にある１炭素化合物を同化して、グリセロールを産出することができる。炭素同化の経路は、リブロース一リン酸経由、セリン経由、またはキシルロース−一リン酸経由であることができる（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８６、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。リブロース一リン酸経路では、ギ酸とリブロース−５−リン酸の縮合によって、フルクトースとなる６単糖が形成され、最終的に炭素数３の産物であるグリセルアルデヒド−３−リン酸になる。同様に、セリン経路では、１炭素化合物がメチレンテトラヒドロ葉酸を経由して解糖経路に取り込まれる。
【０１８５】
１炭素基質および２炭素基質の他に、メチルトローフ生物は、メチルアミン、グルコサミン、および代謝活性のための種々のアミノ酸などの、いくつかの他の炭素含有化合物を利用することも知られている。例えば、メチルトローフ酵母は、メチルアミンの炭素を利用して、トレハロースまたはグリセロールを形成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｌ  Ｃｏｍｐｄ．，［Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］，第７版．，４１５−３２．編者：Ｍｕｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ，１９９３、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。同様に、カンジダの様々な種は、アラニンまたはオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３（５），４８５−９，１９９０、これは、特に、炭素源に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、細胞を生理的塩と栄養素を含有する標準的な培地中で培養する（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，編．Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１−８６，１９８８およびＩｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６，１９９７を参照されたく、これらは各々、特に、細胞培地に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例示的な増殖培地は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブロー・デキストロース（ＳＤ）ブロス、または酵母培地（ＹＭ）ブロスなどの、一般的な市販調製培地である。また、他の規定増殖培地または合成増殖培地を用いてもよく、特定の宿主細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の分野の当業者に知られている。
【０１８７】
適当な炭素源の他に、細胞培地は、好適なミネラル、塩、補因子、緩衝剤、および培養物の増殖またはイソプレン産出の増強に好適であることが当業者に知られている他の成分を含有することが望ましい（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６号およびその中に引用された参考文献ならびにＷＯ９６／３５７９６号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、細胞培地および細胞培養条件に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路核酸が誘導性プロモーターの制御下にあるいくつかの実施形態では、誘導剤（例えば、糖、金属塩または抗微生物薬）を、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を誘導するために有効な濃度で培地に添加することが望ましい。いくつかの実施形態では、細胞培地は、１以上のＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸を有するベクター上の抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン耐性核酸）に対応する抗生物質（例えば、カナマイシン）を有する。
【０１８８】
例示的な細胞培養条件
細菌培養物の維持および増殖に好適な材料および方法は、当該技術分野で周知である。例示的な技術を、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）またはＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ中のＢｒｏｃｋ（これらは各々、特に、細胞培養技術に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出し得る。いくつかの実施形態では、細胞を、宿主細胞に挿入された核酸によってコードされる１以上のイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を許容する条件下、培養培地中で培養する。
【０１８９】
標準的な細胞培養条件を用いて細胞を培養することができる（例えば、ＷＯ２００４／０３３６４６号およびその中に引用された参考文献を参照されたく、これらは各々、特に、細胞培養条件および発酵条件に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。細胞を、適当な温度、ガス混合、およびｐＨで（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％ＣＯ２、およびｐＨ約５〜約９で）増殖させ、維持する。いくつかの実施形態では、細胞を適当な細胞培地中、３５℃で増殖させる。いくつかの実施形態では、例えば、培養物を、所望量のイソプレンと水素の共産出が達成されるまで、振盪培養液または発酵槽中の適当な培地中、約２８℃で培養する。いくつかの実施形態では、発酵のためのｐＨ範囲は、約ｐＨ５.０〜約ｐＨ９.０（例えば、約ｐＨ６.０〜約ｐＨ８.０または約６.５〜約７.０）である。反応は、宿主細胞の要件に基づいて、好気性、無酸素性、または嫌気性条件下で行なわれてもよい。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限条件下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を、産出されるイソプレン１モル当たり０．５モルの酸素が取り込まれる条件下、酸素の存在下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を嫌気性条件下で培養する。所与の糸状真菌のための例示的な培養条件は当該技術分野で公知であり、科学文献でおよび／またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒなどの真菌の供給源から見出し得る。
【０１９０】
様々な実施形態では、バッチプロセス、フェドバッチプロセス、または連続プロセスなどの任意の既知の発酵様式を用いて増殖させる。いくつかの実施形態では、バッチ発酵法を用いる。古典的なバッチ発酵は、培地の組成物を発酵の開始時に仕込み、発酵中に人為的な変更は行なわない閉鎖系である。したがって、発酵の開始時に、細胞培地に所望の宿主細胞を植菌し、この系に何も添加せずに発酵させる。しかしながら、通常、「バッチ」発酵は、炭素源の添加に関してバッチであり、ｐＨや酸素濃度などの因子を制御する試みはよく行なわれる。バッチ系では、系の代謝産物とバイオマスの組成が発酵が停止するまで絶えず変化する。バッチ培養では、細胞は、穏やかに静的遅滞期から高増殖対数増殖期を経て、最終的に増殖速度が減弱または停止する定常期に至る。いくつかの実施形態では、対数増殖期の細胞が、大部分のイソプレン産出に関与する。いくつかの実施形態では、定常期の細胞がイソプレンを産出する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、フェドバッチ系などの標準的なバッチ系に対する変更を用いる。フェドバッチ発酵プロセスは、発酵が進行するにしたがって炭素源を徐々に添加する点を除き、通常のバッチ系を含む。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制によって細胞の代謝が抑制される傾向があって、細胞培地中の炭素源の量を制限することが望ましいときに有用である。フェドバッチ発酵を、制限された量または過剰な量の炭素源（例えば、グルコース）を用いて行なってもよい。フェドバッチ系において実際の炭素源濃度を測定することは難しいので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ２等の排気ガスの分圧などの、測定可能な因子の変化に基づいて推定する。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は当該技術分野で一般的かつ公知であり、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（これは、特に、細胞培養条件および発酵条件に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に例を見出し得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、連続発酵法を用いる。連続発酵は、所定の発酵培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に処理のために等量の馴化培地が取り除かれる開放系である。連続発酵では、通常、培養物が一定の高密度に維持され、細胞は主に対数期増殖にある。
【０１９３】
連続発酵では、細胞増殖またはイソプレン産出に影響を及ぼす１つの因子または任意の数の因子を調節することができる。例えば、ある方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限栄養素を一定の割合に維持し、他の全てのパラメータを調節することができる。他の系では、細胞濃度（例えば、培地の濁度によって測定される濃度）を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼすいくつかの因子を連続的に変化させることができる。連続系は、安定な増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞の損失を、発酵における細胞増殖速度で釣り合わせる。連続発酵プロセスの栄養素および増殖因子を調節する方法ならびに産物形成の速度を最大化する技術は、工業微生物学の分野で周知であり、種々の方法がＢｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版（１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（これは、特に、細胞培養条件および発酵条件に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に詳述されている。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、細胞を全細胞触媒として基板上に固定し、イソプレンを産出するための発酵条件下に置く。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、酸素を液体に導入し、かつ培養物の均一性を維持するために培養液のボトルを振盪器の中に置く。いくつかの実施形態では、インキュベーターを用いて、温度、湿度、振盪速度、および／または培養物を増殖させる他の条件を制御する。最も簡単なインキュベーターは、通常約６５℃まで上昇する、調整可能なヒーターの付いた断熱箱である。より洗練されたインキュベーターは、（冷却により）温度を下げる能力、または湿度もしくはＣＯ２レベルを制御する能力も含むことができる。ほとんどのインキュベーターはタイマーを含み、異なる温度、湿度レベルなどを周期的に繰り返すようにプログラムできるものもある。インキュベーターのサイズは、卓上型から小さな部屋程度のものまで様々であり得る。
【０１９６】
所望により、細胞培地の一部または全てを取り換えて、栄養素を補給しかつ／または潜在的に有害な代謝副生成物と死んだ細胞の蓄積を防ぐことができる。懸濁培養物の場合、懸濁培養物を遠心分離または濾過し、次に、新鮮な培地に再懸濁することにより、細胞を培地から分離することができる。付着培養物の場合、培地をアスピレーションにより直接除去して、入れ換えることができる。いくつかの実施形態では、細胞培地は、細胞の少なくとも一部を、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５回、またはそれより多くの細胞分裂の間、分裂させることができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、構成的または漏出型プロモーター（例えば、Ｔｒｃプロモーター）を用い、プロモーターに機能的に連結されたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸の発現を誘導するために化合物（例えば、ＩＰＴＧ）を添加することはない。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結されたイソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、またはＭＶＡ経路核酸の発現を誘導するために化合物（例えば、ＩＰＴＧ）を添加する。
【０１９８】
イソプレン産出を細胞増殖から脱共役する例示的な方法
望ましくは、原料由来の炭素を、細胞の増殖や維持にではなく、イソプレンに変換する。いくつかの実施形態では、細胞を低から中程度のＯＤ６００まで増殖させ、その後、イソプレンの産出を開始または増加させる。この戦略により、炭素の大部分をイソプレンに変換することができる。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、細胞は、もはや分裂しないかまたは極端にゆっくりと分裂するが、数時間（例えば、約２、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０時間、またはそれより長い時間）の間、イソプレンを作り続けるような光学密度に達する。例えば、図６０Ａ〜６７Ｃは、細胞がもはや分裂しないかまたは極端にゆっくりと分裂する光学密度に達した後に、細胞が相当な量のメバロン酸またはイソプレンを産出し続け得ることを示している。場合によっては、５５０ｎｍにおける光学密度が時間の経過とともに減少し（例えば、細胞溶解によって細胞がもはや指数関数的増殖期にはいなくなった後の光学密度の減少）、細胞は相当な量のメバロン酸またはイソプレンを産出し続ける。いくつかの実施形態では、５５０ｎｍにおける細胞の光学密度は、一定の期間（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間またはそれらより長い時間）、５０％未満または約５０％（例えば、約４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％またはそれら未満）増加し、細胞は、この期間中に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ、もしくはそれより多くのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間である。
【０２００】
いくつかの実施形態では、５５０ｎｍにおける細胞の光学密度は、一定の期間（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間またはそれらより長い時間）、５０％未満または約５０％（例えば、約４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％またはそれら未満）増加し、細胞は、この期間中に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／ブロスのＬ（ｍｇ／Ｌブロス、ここで、ブロスの容積は、細胞と細胞培地の容積を含む）の累積力価（総量）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、または約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、または約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロスである。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、５５０ｎｍにおける細胞の光学密度は、一定の期間（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは６０時間またはそれらより長い時間）、５０％未満または約５０％（例えば、約４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％またはそれら未満）増加し、細胞は、この期間中に、細胞培養培地中の炭素の約０.００１５、０.００２、０.００５、０.０１、０.０２、０.０５、０.１、０.１２、０.１４、０.１６、０.２、０.３、０.４、０.５、０.６、０.７、０.８、０.９、１.０、１.２、１.４、１.６、１.８、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０、５.０、６.０、７.０、もしくは８.０％またはそれらより多くをイソプレンに変換する。いくつかの実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は、例えば、約０．００２〜約４．０％、約０．００２〜約３．０％、約０．００２〜約２．０％、約０．００２〜約１．６％、約０．００２〜約０．００５％、約０．００５〜約０．０１％、約０．０１〜約０．０５％、約０．０５〜約０．１５％、０．１５〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．５％、約０．５〜約０．８％、約０．８〜約１．０％、または約１．０〜約１．６％である。いくつかの実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は、約０．００２〜約０．４％、０．００２〜約０．１６％、０．０４〜約０．１６％、約０．００５〜約０．３％、約０．０１〜約０．３％、または約０．０５〜約０．３％である。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、イソプレンは定常期にのみ産出される。いくつかの実施形態では、イソプレンは増殖期と定常期の両方に産出される。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ６００で１時間当たりブロス１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍、もしくはそれより多い。様々な実施形態では、細胞が定常期にいる間に、産出されるイソプレンの総量（例えば、一定の時間、例えば、２０時間の発酵におけるイソプレンの産出）約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％もしくはそれより多くが産出される。様々な実施形態では、５５０ｎｍにおける細胞の光学密度が、５０％未満または約５０％（例えば、約４０、３０、２０、１０、５、もしくは０％またはそれら未満）増加するように細胞がゆっくりと分裂するかまたは全く分裂しない間に、産出されるイソプレンの総量（例えば、一定の時間、例えば、２０時間の発酵におけるイソプレンの産出）の約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％もしくはそれより多くが産出される。いくつかの実施形態では、イソプレンは増殖期にのみ産出される。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、増殖期よりも定常期に活性の高いプロモーターまたは因子の制御下に置かれている。例えば、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、定常期σ因子（例えば、ＲｐｏＳ）の制御下に置かれていてもよい。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、定常期に誘導可能なプロモーター（例えば、定常期に活性のある応答調節因子によって誘導可能なプロモーター）の制御下に置かれている。
【０２０４】
安全操作範囲内のイソプレンの産出
その引火特性に従う安全操作レベル内のイソプレンの産出によって、商業施設の設計と構築が単純化され、安全に操作する能力が大いに改善され、火災が発生する可能性が制限される。特に、イソプレン産出の最適な範囲は、安全圏、すなわち、イソプレン濃度の非引火範囲内である。そのような一態様では、イソプレン濃度の非引火範囲内（イソプレンの引火限度外）でのイソプレン産出方法を本明細書に記載する。
【０２０５】
したがって、プロセスの安全性を確保するために、コンピュータモデリング試験と実験的試験を用いて、イソプレン（例えば、Ｏ２、Ｎ２、ＣＯ２または前述のガスのうちの２つ以上の任意の組合せの存在下のイソプレン）の引火限界を決定した。引火限度は、引火下限（ＬＦＬ）、引火上限（ＵＦＬ）、制限酸素濃度（ＬＯＣ）、および制限温度によって特徴付けられる。系が引火性である場合、最少量の酸化体（通常、酸素）の存在下で、最少量の燃料（例えば、イソプレン）でなければならない。ＬＦＬは、燃焼を持続させるために存在しなければならないイソプレンの最少量であり、一方、ＵＦＬは、存在することができるイソプレンの最大量である。この限度を超えると、混合物は燃料過多となり、酸素の割合が低くなりすぎて、引火性混合物でなくなる。ＬＯＣは、引火性混合物を得るために存在しなければならない酸素の最低限の割合を示す。制限温度は、イソプレンの引火点に基づくものであり、イソプレンの燃焼を伝播させることができる最低の温度である。これらの限度は、イソプレンの濃度、酸化体の種類や濃度、系に存在する不活性ガス、温度、および系の圧力に特異的である。引火限度の限度内に収まる組成物は、燃焼を伝播させ、プロセス装置の設計と操作の両方におけるさらなる安全対策を必要とする。
【０２０６】
コンピュータシミュレーションと数理解析と実験的試験を用いて、以下の条件を試験した。所望により、本明細書に記載の方法を用いて、他の条件（例えば、他の温度、圧力、および永久ガス組成）を試験し、ＬＦＬ、ＵＦＬ、およびＬＯＣ濃度を決定してもよい。
（１）コンピュータシミュレーションおよび数理解析
試験項目１：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ２：６重量％〜２１重量％
Ｎ２：７９重量％〜９４重量％
試験項目２：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ２：６重量％〜２１重量％
Ｎ２：７９重量％〜９４重量％
Ｈ２Ｏで飽和する
試験項目３：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ２：６重量％〜２１重量％
Ｎ２：７９重量％〜９４重量％
ＣＯ２：５重量％〜３０重量％
（２）引火限界の最終決定のための実験的試験
試験項目１：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ２：６重量％〜２１重量％
Ｎ２：７９重量％〜９４重量％
試験項目２：
イソプレン：０重量％〜１４重量％
Ｏ２：６重量％〜２１重量％
Ｎ２：７９重量％〜９４重量％
Ｈ２Ｏで飽和する
【０２０７】
シミュレーションソフトウェアを用いて、いくつかの異なる検討条件について系の引火特性を推定した。ＣＯ２は、系の引火限界にそれほど影響を示さなかった。試験項目１と２は、実験的試験で確認した。モデリングの結果は、実験的試験結果と一致した。水を添加した場合に、ほんのわずかな変動が見られた。
【０２０８】
ＬＯＣは、イソプレンとＯ２とＮ２とＣＯ２の混合物について、４０℃、１気圧で９.５体積％であると決定された。最大３０％までのＣＯ２を添加しても、イソプレンとＯ２とＮ２の混合物の引火特性にそれほど影響がなかった。乾燥したイソプレンとＯ２とＮ２の系と、水飽和したイソプレンとＯ２とＮ２の系の間で、ほんのわずかな引火特性の変動が示された。制限温度は約−５４℃である。約−５４℃未満の温度では低すぎて、イソプレンの燃焼を伝播させることができない。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、系中の酸素の量に応じて、イソプレンのＬＦＬは約１.５体積％〜約２.０体積％であり、イソプレンのＵＦＬは約２.０体積％〜約１２.０体積％である。いくつかの実施形態では、ＬＯＣは約９.５体積％酸素である。いくつかの実施形態では、温度が約２５℃〜約５５℃（例えば、約４０℃）であり、圧力が約１気圧〜３気圧であるとき、イソプレンのＬＦＬは約１.５体積％〜約２.０体積％であり、イソプレンのＵＦＬは約２.０体積％〜約１２.０体積％であり、ＬＯＣは約９.５体積％酸素である。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、イソプレンは、約９.５体積％未満の酸素（すなわち、イソプレンの引火性混合物を得るために必要なＬＯＣ未満）の存在下で産出される。イソプレンが９.５体積％超または約９.５体積％の酸素の存在下で産出されるいくつかの実施形態では、イソプレン濃度は、ＬＦＬ未満（例えば、約１.５体積％未満）である。例えば、不活性ガスでイソプレン組成物を希釈することによって（例えば、イソプレン組成物をＬＦＬ未満に保つために窒素などの不活性ガスを連続的にまたは定期的に添加することによって）イソプレンの量をＬＦＬ未満に保つことができる。イソプレンが９.５体積％超または約９.５体積％の酸素の存在下で産出されるいくつかの実施形態では、イソプレン濃度はＵＦＬを上回る（例えば、約１２体積％を上回る）。例えば、イソプレンの量を、ＵＦＬを上回る濃度のイソプレンを産出する系（例えば、本明細書に記載の細胞培養系のいずれか）を用いることによって、ＵＦＬよりも大きく保つことができる。所望により、ＵＦＬも比較的低くなるように、比較的低レベルの酸素を用いることができる。この場合、ＵＦＬを上回り続けるためには、より低いイソプレン濃度が必要である。
【０２１１】
イソプレンが９.５体積％超または約９.５体積％の酸素の存在下で産出されるいくつかの実施形態では、イソプレン濃度は引火限度内（例えば、ＬＦＬとＵＦＬの間）である。イソプレン濃度が引火限度内に収まり得るいくつかの実施形態では、火災または爆発の可能性を低下させるために１以上の工程を行なう。例えば、１以上の発火源（例えば、火花を発生させるおそれのある任意の物質）を避けることができる。いくつかの実施形態では、イソプレンの濃度が引火限度内にあり続ける時間の量を減らすために１以上の工程を行なう。いくつかの実施形態では、センサーを用いて、イソプレンの濃度が引火限度に近いかまたは引火限度内にあるときに検出する。所望により、イソプレンの濃度を、細胞培養期間中の１以上の時点で測定することができ、イソプレンの濃度が引火限度に近いかまたは引火限度内にある場合、標準的な方法を用いて、細胞培養条件および／または不活性ガスの量を調整することができる。特定の実施形態では、細胞培養条件（例えば、発酵条件）を調整して、イソプレンの濃度をＬＦＬ未満に減らすかまたはイソプレンの濃度をＵＦＬよりも大きく増加させる。いくつかの実施形態では、不活性ガスでイソプレン組成物を希釈することによって（例えば、イソプレン組成物をＬＦＬ未満に保つために不活性ガスを連続的にまたは定期的に添加することによって）イソプレンの量をＬＦＬ未満に保つ。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、イソプレン以外の引火性揮発性物質（例えば、１以上の糖類）の量は、産出されるイソプレンの量よりも少なくとも約２、５、１０、５０、７５、または１００倍少ない。いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外の気相の部分は、約０％〜約１００％（体積）の酸素、例えば、約０％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約９０％〜約９０％、または約９０％〜約１００％（体積）の酸素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外の気相の部分は、約０％〜約９９％（体積）の窒素、例えば、約０％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約９０％〜約９０％、または約９０％〜約９９％（体積）の窒素を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、イソプレンガス以外の気相の部分は、約１％〜約５０％（体積）のＣＯ２、例えば、約１％〜約１０％、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、または約４０％〜約５０％（体積）のＣＯ２を含む。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物はまた、エタノールを含む。例えば、エタノールをイソプレンの抽出蒸留に用いて、エタノールとイソプレンの両方を含む組成物（例えば、中間産物ストリーム）を生じさせてもよい。望ましくは、エタノールの量は、エタノールの引火限度外にある。エタノールのＬＯＣは約８.７体積％であり、エタノールのＬＦＬは、標準的な条件（例えば、約１気圧、約６０°Ｆ）で約３.３体積％である（ＮＦＰＡ  ６９  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｎ  Ｅｘｐｌｏｓｉｏｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２００８年版、これは、特に、ＬＯＣ値、ＬＦＬ値、およびＵＦＬ値に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、イソプレンとエタノールを含む組成物は、エタノールの引火性混合物を得るために必要なＬＯＣ未満（例えば、約８.７％体積％未満）の存在下で産出される。イソプレンとエタノールを含む組成物が、エタノールの引火性混合物を得るために必要なＬＯＣよりも多くまたはエタノールの引火性混合物を得るために必要なおよそのＬＯＣの存在下で産出されるいくつかの実施形態では、エタノール濃度はＬＦＬ未満（例えば、約３.３体積％未満）である。
【０２１５】
様々な実施形態では、酸化体（例えば、酸素）の量は、系中の任意の燃料（例えば、イソプレンまたはエタノール）のＬＯＣ未満である。様々な実施形態では、酸化体（例えば、酸素）の量は、イソプレンまたはエタノールのＬＯＣの約６０、４０、３０、２０、１０、または５％未満である。様々な実施形態では、酸化体（例えば、酸素）の量は、少なくとも２、４、５、またはそれを上回る完全百分率点（体積％）だけ、イソプレンまたはエタノールのＬＯＣよりも少ない。特定の実施形態では、酸素の量は、イソプレンまたはエタノールのＬＯＣよりも少なくとも２完全百分率点（体積％）少ない（例えば、イソプレンのＬＯＣが９.５体積％であるとき、酸素濃度は７.５体積％未満である）。様々な実施形態では、燃料（例えば、イソプレンまたはエタノール）の量は、燃料のＬＦＬの２５、２０、１５、１０、もしくは５％未満または約２５、２０、１５、１０、もしくは５％である。
【０２１６】
揮発性炭化水素であるイソプレンの発酵による高効率産出および回収
イソプレンを産出する方法であって、ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、ｂ）イソプレンを産出することとを含む方法が提供されており、ここで、イソプレンの液相濃度は約２００ｍｇ／Ｌ未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、１７５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または２.５ｍｇ／Ｌの約いずれか未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、０.１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、または１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの約いずれかである。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンは、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、液相濃度は、イソプレンの溶解限界未満である。
【０２１７】
本方法のいくつかの実施形態では、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１ｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜４０ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜４ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜２５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、２５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜５００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または５００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１０００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１.５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、２ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間のいずれか程度である。
【０２１８】
ヘンリー係数の値（Ｍａｔｍ−１単位）が低いことは、イソプレンを低い放出速度（例えば、０.０１ｖｖｍ〜２ｖｖｍ）でのガスストリッピングにより発酵ブロスから回収することができることを意味する。いくつかの実施形態では、ガス放出速度は、０.１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、０.０１ｖｖｍ〜０.５ｖｖｍ、０.２ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、または０.５ｖｖｍ〜１ｖｖｍのいずれか程度である。いくつかの実施形態では、ガス放出速度は、０.１ｖｖｍ、０.２５ｖｖｍ、０.５ｖｖｍ、０.７５ｖｖｍ、１ｖｖｍ、１.２５ｖｖｍ、１.５ｖｖｍ、１.７５ｖｖｍ、または２ｖｖｍのいずれか程度である。いくつかの実施形態では、低い放出速度を、発酵操作の全期間、増殖期の間、または定常期の間、維持する。いくつかの実施形態では、低い放出速度を、１時間〜５時間、５時間〜１０時間、１０時間〜２０時間、２０時間〜３０時間、３０時間〜４０時間、４０時間〜５０時間、または５０時間〜６０時間の約いずれかの間、維持する。より低い望ましいガス放出限度は、水相がイソプレンで飽和するようになり、液体有機相が形成される時点によって規定される。これは、イソプレンの沸点（１気圧で３４.１℃）未満でしか起こり得ず、これより上で、液体イソプレン相が形成されることは決してない。イソプレンの沸点未満の温度では、液相の形成はイソプレンの水溶解度によって決定され、これは、２５℃で約６５０ｍｇ／Ｌである。液体イソプレン相の形成を避けることが極めて望ましいが、細胞が毒性効果を伴わずに液体イソプレンの存在に耐えることができるならば、これが絶対的に必要であるというわけではない。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、酸素、ＣＯ２、およびイソプレンは、「安全操作範囲のイソプレンの産出」という題の節に論じられている量または濃度のいずれかである。いくつかの実施形態では、完全に好気的な代謝を維持しながら、全ての酸素が細胞によって消費される。いくつかの実施形態では、細胞の酸素必要量を満たすために、過剰の酸素が用いられる。オフガス中の望ましい酸素範囲は、２０％未満または１５％未満または１０％未満（ｖ／ｖ）である。イソプレンの燃焼に必要な制限酸素濃度未満の酸素レベル（１気圧で９．５％ｖ／ｖ）が特に望ましい。いくつかの実施形態では、細胞の酸素必要量を満たしながら、最低限のガススイープ率を可能にする目的で、酸素濃縮空気を利用する。いくつかの実施形態では、ガススイープの気相の部分は、約０.１％〜約１０％、約１０％〜約２０％、または約２０％〜約３０％（体積）の酸素を含む。いくつかの実施形態では、液相中の所要の溶存酸素レベルを維持するために必要とされる余分な酸素量を最小限に抑えるために、イソプレン発酵を高圧下で行なう。
【０２２０】
いくつかの実施形態では、発酵槽全体のガススイープ率の低下は、そのような条件によって、細胞の生理機能に悪影響を及ぼすことなく、オフガスイソプレンレベルが最大約３０，０００μｇ／Ｌ（約１％ｖ／ｖ）まで濃縮されるという点でイソプレン産出プロセスの統合に有利である。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ガス放出速度の低下は、細胞の生理機能にそれほど悪影響を及ぼさない。いくつかの実施形態では、ガス放出速度を低下させた場合の培養細胞の二酸化炭素発生速度は、１×１０-１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、ガス放出速度を低下させた場合の細胞生存性は、１.７５倍、１.５倍、１.２５倍、１倍、０.７５倍、０.５倍、または０.２５倍の約いずれか未満だけ低下する。いくつかの実施形態では、ガス放出速度を低下させた場合の細胞生存性は、約２倍だけ低下する。いくつかの実施形態では、ガス放出速度を低下させた場合の異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸の１以上からＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路のＲＮＡおよび／またはタンパク質を発現する細胞の細胞生存性を、ガス放出速度を低下させた場合の異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路核酸の１以上を欠く対照細胞と比較する。いくつかの実施形態では、ガス放出速度を低下させた場合の、誘導性プロモーターの制御下にある異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸の１以上からＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路のＲＮＡおよび／またはタンパク質を発現する細胞（この場合、プロモーターは誘導されている）の細胞生存性を、ガス放出速度を低下させた場合の、誘導性プロモーターの制御下にある異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸の１以上を含有する対照細胞（この場合、プロモーターは誘導されていない（未誘導である））と比較する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、β−ガラクトシダーゼプロモーターである。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、生物によって消費される総炭素の少なくとも５％を揮発性の不飽和炭化水素に変換する遺伝子改変された宿主生物の発酵。いくつかの実施形態では、１００μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌ、１０００μｇ／Ｌ、２，５００μｇ／Ｌ、５，０００μｇ／Ｌ、７，５００μｇ／Ｌ、または１０，０００μｇ／Ｌの少なくともいずれか程度のレベルの発酵オフガス中に存在するような割合での不飽和炭化水素の産出。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、１００μｇ／Ｌ、５００μｇ／Ｌ、１０００μｇ／Ｌ、２，５００μｇ／Ｌ、５，０００μｇ／Ｌ、７，５００μｇ／Ｌ、または１０，０００μｇ／Ｌの少なくともいずれか程度のオフガス中の濃度に相当する、高率産出に相応しいやり方で、不飽和炭化水素をオフガス流から回収する。いくつかの実施形態では、得られるオフガスが目的の揮発性成分中に濃縮されるように、特に低いガススイープ率での発酵オフガスからの不飽和炭化水素の連続的な抽出および回収。いくつかの実施形態では、揮発性物質の濃度の上昇に依存する方法による揮発性炭化水素の回収。例えば、圧縮／凝結技術または抽出蒸留技術の使用による発酵オフガス中のイソプレン効率的な捕獲。シリカゲル吸着剤に加えた活性炭カートリッジの使用、炭素カートリッジからのイソプレンの解離および濃縮、および／またはグルコース基質の約５％またはそれより多くをイソプレンに変換し、約１５，０００μｇ／Ｌイソプレンを上回るオフガス濃度を生じさせることができる宿主生物（例えば、大腸菌株）の構築および発酵も企図される。回収方法は、本明細書に記載の方法のいずれかを含む。
【０２２４】
また、化合物の産出方法が本明細書で提供され、ここで、この化合物は、（ａ）約２５０Ｍ／ａｔｍ未満のヘンリー則係数と（ｂ）約１００ｇ／Ｌ未満の水溶解度からなる群から選択される１以上の特徴を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）化合物の産出に好適な条件下で細胞を培養すること、ここで、ガスは約０.０１ｖｖｍ〜約２ｖｖｍのガス放出速度で添加される（例えば、発酵系などの系へのガスの添加）と、ｂ）化合物を産出することとを含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、細胞質量に区分される化合物の量は、液相溶解度値には含まれない。いくつかの実施形態では、液相濃度は化合物の溶解限界未満である。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、化合物、特に、２５０Ｍ／ａｔｍ、２００Ｍ／ａｔｍ、１５０Ｍ／ａｔｍ、１００Ｍ／ａｔｍ、７５Ｍ／ａｔｍ、５０Ｍ／ａｔｍ、２５Ｍ／ａｔｍ、１０Ｍ／ａｔｍ、５Ｍ／ａｔｍ、または１Ｍ／ａｔｍ未満の約いずれかのヘンリー則係数を有する化合物を、中から低ガス放出速度でのガスストリッピングによって発酵ブロスから連続的に回収することができる。例としては、アセトアルデヒド（１５Ｍ／ａｔｍ）などのアルデヒド、アセトン（３０Ｍ／ａｔｍ）もしくは２−ブタノン（２０Ｍ／ａｔｍ）などのケトン、またはメタノール（２２０Ｍ／ａｔｍ）、エタノール（２００Ｍ／ａｔｍ）、１−ブタノール（１２０Ｍ／ａｔｍ）もしくはＣ５アルコール（３−メチル−３−ブテン−１−オール、および３−メチル−２−ブテン−１−オールを含む）（５０〜１００Ｍ／ａｔｍ）をはじめとするアルコールが挙げられる。アルコールのエステルは、通常、それぞれのアルコールよりも低いヘンリー定数を有する（例えば、酢酸エチル（６〜９Ｍ／ａｔｍ）またはＣ５アルコールのアセチルエステル（＜５Ｍ／ａｔｍ））。１Ｍ／ａｔｍ未満のヘンリー則係数を有する化合物が特に望ましい。例としては、Ｃ１〜Ｃ５炭化水素（例えば、メタン、エタン、エチレン、またはプロピレン）などの他の炭化水素の他に、ヘミテルペン、モノテルペン、またはセスキテルペンが挙げられる。いくつかの実施形態では、炭化水素（例えば、Ｃ１〜Ｃ５炭化水素）は、飽和したもの、不飽和のもの、または分岐したものである。
【０２２７】
一般に、係数の極めて低い化合物が水に溶けにくい（実質的に水に溶けない）という点でヘンリー則係数と水溶解度の間には相関関係がある。水に無限に溶ける揮発性物質（例えば、アセトンまたはエタノール）をガスストリッピングによって除去することができるが、望ましい溶解限界は、１００ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌの約いずれか未満である。
【０２２８】
上記の化合物のいずれかを産出する方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ガス放出速度は、およそ０.１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、０.２ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、または０.５ｖｖｍ〜１ｖｖｍのいずれかである。いくつかの実施形態では、ガス放出速度は、０.１ｖｖｍ、０.２５ｖｖｍ、０.５ｖｖｍ、０.７５ｖｖｍ、１ｖｖｍ、１.２５ｖｖｍ、１.５ｖｖｍ、１.７５ｖｖｍ、または２ｖｖｍの約いずれかである。いくつかの実施形態では、低放出速度を、発酵操作の全期間、増殖期の間、または定常期の間、維持する。いくつかの実施形態では、低放出速度を、１時間〜５時間、５時間〜１０時間、１０時間〜２０時間、２０時間〜３０時間、３０時間〜４０時間、４０時間〜５０時間、または５０時間〜６０時間の約いずれかの間、維持する。
【０２２９】
本明細書に記載の系はいずれも、上記の化合物を産出する方法において使用することができる。「例示的な精製方法」と題された節に記載されているような標準的な方法を用いて、精製することができる。例えば、蒸留または選択的吸着技術によって、回収後に分離を行なうことができる。
【０２３０】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅの例示的な産出
いくつかの実施形態では、細胞を、細胞によるイソプレンの産出を可能にする条件下で培養培地中で培養する。
【０２３１】
「ピーク絶対生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）オフガス中のイソプレンの最大絶対量を意味する。「ピーク絶対生産性時点」とは、オフガス中のイソプレンの絶対量が、特定の時間、細胞を培養したときに（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときに）最大となる発酵操作中の時点を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレン量をピーク絶対生産性時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク絶対生産性は、本明細書に開示されたイソプレン量の約いずれかである。
【０２３２】
「ピーク比生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）細胞当たりに産出されるイソプレンの最大量を意味する。「ピーク比生産性時点」とは、細胞当たりに産出されるイソプレンの量が最大になる特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）時点を意味する。ピーク比生産性は、総生産性を６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）により求められる細胞の量で割ることにより求められる。いくつかの実施形態では、イソプレン量をピーク比生産性時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク比生産性は、本明細書に開示された細胞当たりのイソプレン量の約いずれかである。
【０２３３】
「ピーク容積生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）ブロス（細胞と細胞培地の容積を含む）の容積当たりに産出されるイソプレンの最大量を意味する。「ピーク比容積生産性時点」とは、ブロスの容積当たりに産出されるイソプレンの量が最大になる特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）時点を意味する。ピーク比容積生産性は、総生産性をブロスの容積と時間とで割ることにより求められる。いくつかの実施形態では、イソプレン量をピーク比容積生産性時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク比容積生産性は、本明細書に開示された時間当たり容積当たりのイソプレン量の約いずれかである。
【０２３４】
「ピーク濃度」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）産出されるイソプレンの最大量を意味する。「ピーク濃度時点」とは、細胞当たりに産出されるイソプレンの量が最大になる特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）時点を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレン量をピーク濃度時点で測定する。いくつかの実施形態では、細胞のピーク濃度は、本明細書に開示されたイソプレン量の約いずれかである。
【０２３５】
「平均容積生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）ブロス（細胞と細胞培地の容積を含む）の容積当たりに産出されるイソプレンの平均量を意味する。平均容積生産性は、総生産性をブロスの容積と時間とで割ることにより求められる。いくつかの実施形態では、細胞の平均比容積生産性は、本明細書に開示された時間当たり容積当たりのイソプレン量の約いずれかである。
【０２３６】
「累計生産性」とは、特定の時間、細胞を培養したときの（例えば、特定の発酵操作時間、細胞を培養したときの）産出されるイソプレンの累積総量を意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンの累積総量を測定する。いくつかの実施形態では、細胞の累計生産性は、本明細書に開示されたイソプレン量の約いずれかである。
【０２３７】
本明細書に使用する「相対検出器応答」とは、ある化合物（例えば、イソプレン）の検出器応答（例えば、ＧＣ／ＭＳ面積）と１以上の化合物（例えば、全てのＣ５炭化水素）の検出器応答（例えば、ＧＣ／ＭＳ面積）の比を指す。検出器応答を、本明細書に記載の通りに、例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳ  ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×２５０μｍ；０．２５μｍ膜厚）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ／ＭＳシステムで実施されるＧＣ／ＭＳ分析により、測定してもよい。所望により、相対検出器応答を、各々の化合物の応答係数を用いて重量パーセントに換算することができる。この応答係数は、シグナルが所与の量の特定の化合物についてどの程度発生するか（すなわち、検出器が特定の化合物に対してどの程度の感度を有するか）という尺度である。検出器が比較されている化合物に対して様々な感度を有する場合は、この応答係数を、相対検出器応答を重量パーセントに換算するための相関係数として用いることができる。あるいは、比較されている化合物について応答係数が同じであると仮定して、重量パーセントを概算することができる。したがって、重量パーセントを相対検出器応答とほぼ同じものであると仮定することができる。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、培養細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１２，５００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１８８，０００ｎｍｏｌｅ、もしくはそれより多くのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間）またはそれを上回るイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約２００，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５，０００〜約１０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１０，０００〜約５０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５０，０００〜約１００，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１００，０００〜約１５０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または約１５０，０００〜約２００，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または約４００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２，０００〜約２０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５，０００〜約５０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１０，０００〜約１００，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２０，０００〜約１５０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または約２０，０００〜約２００，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間である。
【０２３９】
ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間という単位で表されるイソプレンの量を、米国特許第５，８４９，９７０号（これは、特に、イソプレン産出の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように測定することができる。例えば、２ｍＬのヘッドスペース（例えば、２００ｒｐｍで約３時間振盪しながら、密封バイアル中、３２℃で培養された２ｍＬの培養物などの培養物のヘッドスペース）を、標準的なガスクロマトグラフィーシステム、例えば、等温（８５℃）で操作され、ｎ−オクタン／ｐｏｒａｓｉｌ  Ｃカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．）を備え、ＲＧＤ２酸化水銀還元ガス検出器に接続されているシステムを用いて、イソプレンについて分析する（Ｔｒａｃｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｔｍｏｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．２７Ａ：２６８９−２６９２，１９９３；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１５８８−１５９１，１９９１を参照されたく、これらは各々、特に、イソプレン産出の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。ガスクロマトグラフィーの面積単位を、標準イソプレン濃度検量線を用いてｎｍｏｌイソプレンに換算する。いくつかの実施形態では、細胞の湿重量を表す細胞のグラム数は、細胞培養物の試料についてのＡ６００値を取得し、次に、このＡ６００値を、既知のＡ６００値を有する細胞培養物についての湿重量の検量線に基づいて細胞のグラムに換算することにより算出される。いくつかの実施形態では、細胞のグラムは、Ａ６００値が１の１リットルブロス（細胞培地と細胞を含む）に１グラムの湿細胞重量が含まれると仮定することにより推定される。また、この値を、培養物をインキュベートした時間（例えば、３時間）で割り算する。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、培養細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、または約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、または約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈで示されるイソプレンの量を、上で論じたｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間という単位で表されるイソプレン産出値に（下記の方程式５に記載したように）６８.１を掛けることで算出することができる。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、培養細胞は、１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／ブロスのＬ（ｍｇ／Ｌブロス、ここで、ブロスの容積は、細胞と細胞培地の容積を含む）累積力価（総量）のイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、または約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、または約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロスである。
【０２４２】
イソプレンのｍｇ／振盪フラスコ培養または同様の培養のヘッドスペースのＬで表されるイソプレンの比生産性は、（例えば、実施例Ｉ、第ＩＩ部に記載されているように）ＯＤ６００の値が約１．０の細胞培養物から１ｍｌ試料を採取し、それを２０ｍＬバイアルに入れ、３０分間インキュベートした後、ヘッドスペース中のイソプレンの量を測定することによって測定することができる。ＯＤ６００の値が１．０でない場合は、ＯＤ６００の値で割ることにより、測定値を１．０のＯＤ６００の値に標準化することができる。ｍｇイソプレン／Ｌヘッドスペースの値は、３８という係数を掛けることにより、ｍｇ／Ｌブロス／時間／培養ブロスのＯＤ６００に換算することができる。ｍｇ／Ｌブロス／時間／ＯＤ６００という単位で表される値に時間数とＯＤ６００の値を掛けることにより、イソプレンのｍｇ／ブロスのＬという単位で表される累積力価を得ることができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、培養細胞は、０.１、１.０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００ｍｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／ブロスのＬ／時間（ｍｇ／Ｌブロス／時間、ここで、ブロスの容積は、細胞と細胞培地の容積を含む）イソプレンの平均容積生産性を有する。いくつかの実施形態では、イソプレンの平均容積生産性は、約０．１〜約３，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、例えば、約０．１〜約１００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１，０００〜約１，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１，５００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２，０００〜約２，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、または約３，０００〜約３，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間である。いくつかの実施形態では、イソプレンの平均容積生産性は、約１０〜約３，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１００〜約３，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２００〜約１，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１，０００〜約３，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、または約１，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間である。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、培養細胞は、０.５、１.０、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１１００、１２００、１３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，７５０、４，０００、４，２５０、４，５００、４，７５０、５，０００、５，２５０、５，５００、５，７５０、６，０００、６，２５０、６，５００、６，７５０、７，０００、７，２５０、７，５００、７，７５０、８，０００、８，２５０、８，５００、８，７５０、９，０００、９，２５０、９，５００、９，７５０、１０，０００、１２，５００、１５，０００ｍｇ、もしくはそれより多くのイソプレン／ブロスのＬ／時間（ｍｇ／Ｌブロス／時間、ここで、ブロスの容積は、細胞と細胞培地の容積を含む）のイソプレンのピーク容積生産性を有する。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク容積生産性は、約０．５〜約１５，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、例えば、約０．５〜約１０ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１．０〜約１００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１，０００〜約１，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１，５００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２，０００〜約２，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２，５００〜約３，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約３，０００〜約３，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約３，５００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約５，０００〜約７，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約７，５００〜約１０，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１０，０００〜約１２，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、または約１２，５００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間である。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク容積生産性は、約１０〜約１５，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１００〜約２，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２，５００〜約７，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約５，０００〜約１０，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約７，５００〜約１２，５００ｍｇ／Ｌブロス／時間、または約１０，０００〜約１５，０００ｍｇ／Ｌブロス／時間である。
【０２４５】
ｍｇ／Ｌブロス／時間で表される発酵槽における瞬間イソプレン産出速度は、発酵槽オフガスの試料を採取し、それを、例えば、実施例１、第ＩＩ部に記載されているように、イソプレンの量（イソプレンのｍｇ／Ｌガスなどの単位で表される）について分析し、この値に、ブロス１リットルごとにオフガスが通過する速度（例えば、１ｖｖｍ（空気の容積／ブロスの容積／分）、これは、６０Ｌガス／時間である）を掛けることにより測定することができる。したがって、１ｍｇ／Ｌガスのオフガスレベルは、１ｖｖｍの空気流量における６０ｍｇ／Ｌブロス／時間の瞬間産出速度に相当する。所望により、ｍｇ／Ｌブロス／時間という単位で表される値をＯＤ６００の値で割って、ｍｇ／Ｌブロス／時間／ＯＤという単位で表される比速度を得ることができる。ｍｇイソプレン／Ｌガスの平均値は、この平均オフガスイソプレン濃度に発酵中に発酵ブロス１リットルから放出されたオフガスの総量を掛けることにより、総産物生産性（発酵ブロス１リットル当たりのイソプレンのグラム、ｍｇ／Ｌブロス）に換算することができる。したがって、１ｖｖｍで１０時間の０.５ｍｇ／Ｌブロス／時間の平均オフガスイソプレン濃度は、３００ｍｇイソプレン／Ｌブロスの総産物濃度に相当する。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、培養細胞は、細胞培養培地中の炭素の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２１．０、２２．０、２３．０、２３．２、２３．４、２３．６、２３．８、２４．０、２５．０、３０．０、３１．０、３２．０、３３．０、３５．０、３７．５、４０．０、４５．０、４７．５、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、８０．０、８５．０、もしくは９０．０モルパーセントまたはそれより多くをイソプレンに変換する。いくつかの実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は、約０．００２〜約９０．０モルパーセント、例えば、約０．００２〜約０．００５％、約０．００５〜約０．０１％、約０．０１〜約０．０５％、約０．０５〜約０．１５％、０．１５〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．５％、約０．５〜約０．８％、約０．８〜約１．０％、約１．０〜約１．６％、約１．６〜約３．０％、約３．０〜約５．０％、約５．０〜約８．０％、約８．０〜約１０．０％、約１０．０〜約１５．０％、約１５．０〜約２０．０％、約２０．０〜約２５．０％、約２５．０％〜３０．０％、約３０．０％〜３５．０％、約３５．０％〜４０．０％、約４５．０％〜５０．０％、約５０．０％〜５５．０％、約５５．０％〜６０．０％、約６０．０％〜６５．０％、約６５．０％〜７０．０％、約７５．０％〜８０．０％、約８０．０％〜８５．０％、もしくは約８５．０％〜９０．０％である。いくつかの実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は、約０．００２〜約０．４モルパーセント、０．００２〜約０．１６モルパーセント、０．０４〜約０．１６モルパーセント、約０．００５〜約０．３モルパーセント、約０．０１〜約０．３モルパーセント、約０．０５〜約０．３モルパーセント、約０．１〜０．３モルパーセント、約０．３〜約１．０モルパーセント、約１．０〜約５．０モルパーセント、約２〜約５．０モルパーセント、約５．０〜約１０．０モルパーセント、約７〜約１０．０モルパーセント、約１０．０〜約２０．０モルパーセント、約１２〜約２０．０モルパーセント、約１６〜約２０．０モルパーセント、約１８〜約２０．０モルパーセント、約１８〜２３．２モルパーセント、約１８〜２３．６モルパーセント、約１８〜約２３．８モルパーセント、約１８〜約２４．０モルパーセント、約１８〜約２５．０モルパーセント、約２０〜約３０．０モルパーセント、約３０〜約４０．０モルパーセント、約３０〜約５０．０モルパーセント、約３０〜約６０．０モルパーセント、約３０〜約７０．０モルパーセント、約３０〜約８０．０モルパーセント、もしくは約３０〜約９０．０モルパーセントである。
【０２４７】
炭素のイソプレンへの変換パーセント（「炭素収率％」とも呼ぶ）は、産出されたイソプレン中の炭素モル数を炭素源中の炭素モル数（例えば、バッチで供給されたグルコースおよび酵母抽出物中の炭素モル数）で割ることにより測定することができる。（方程式１に示すように）この数字に１００％を掛けると、パーセントの値が得られる。
方程式１
［数１］
炭素収率％＝（産出されたイソプレン中の炭素モル数）／（炭素源中の炭素モル数）＊１００
【０２４８】
この計算では、酵母抽出物は、５０％ｗ／ｗ炭素を含有すると仮定することができる。一例として、実施例７、第ＶＩＩＩ部に記載されている５００リットルの場合、炭素のイソプレンへの変換パーセントは、方程式２に示すように計算される。
方程式２
［数２］
％炭素収率＝（３９．１ｇイソプレン＊１／６８．１ｍｏｌ／ｇ＊５Ｃ／ｍｏｌ）／［（１８１２２１ｇグルコース＊１／１８０ｍｏｌ／ｇ＊６Ｃ／ｍｏｌ）＋（１７７８０ｇ酵母抽出物＊０．５＊１／１２ｍｏｌ／ｇ）］＊１００＝０．０４２％
【０２４９】
本明細書に記載の２例の５００リットル発酵（実施例７、第ＶＩＩ部および第ＶＩＩＩ部）では、炭素のイソプレンへの変換パーセントは、０．０４〜０．０６％であった。本明細書に記載の１４リットルの系を用いて０．１１〜０．１６％の炭素収率が達成されている。実施例１１、第Ｖ部には、本明細書に記載の方法を用いて、炭素の１．５３％がイソプレンに変換されたことが記載されている。
【０２５０】
当業者であれば、イソプレンの産出速度または産出されたイソプレンの量を任意の他の単位に容易に変換することができる。以下に、単位間で相互変換するための例示的な方程式を記載する。
イソプレン産出速度の単位（全体および比）
方程式３
［数３］
１ｇイソプレン／Ｌブロス／時間＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／時間（総容積速度）
方程式４
［数４］
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／時間＝１ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／時間／ＯＤ６００（この変換は、ＯＤ６００の値が１の１リットルのブロスに１グラムの湿細胞重量が含まれると仮定している。）
方程式５
［数５］
１ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／時間イソプレン＝６８．１ｎｇイソプレン／ｇｗｃｍ／時間（イソプレンの分子量を所与とする）
方程式６
［数６］
１ｎｍｏｌイソプレン／ＬガスＯ２／時間＝９０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／時間（培養ブロス１リットル当たりのＯ２流速が９０Ｌ／時間のとき）
方程式７
［数７］
１μｇイソプレン／オフガス中のＬガスイソプレン＝６０μｇイソプレン／Ｌブロス／時間  Ｌブロス当たりの流速が６０Ｌガスのとき（１ｖｖｍ）
力価の単位（全体および比）
方程式８
［数８］
１ｎｍｏｌイソプレン／ｍｇ細胞タンパク質＝１５０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ＯＤ６００（この変換は、ＯＤ６００の値が１の１リットルのブロスに約１５０ｍｇの総細胞タンパク質が含まれると仮定している）（比生産性）
方程式９
［数９］
１ｇイソプレン／Ｌブロス＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌブロス（総力価）
【０２５１】
所望により、方程式１０を用いて、細胞の湿重量を含む単位のいずれかを細胞の乾燥重量を含む対応する単位に変換することができる。
方程式１０
［数１０］
細胞の乾燥重量＝（細胞の湿重量）／３．３
【０２５２】
所望により、方程式１１を用いて、単位ｐｐｍとμｇ／Ｌを変換することができる。特に、「ｐｐｍ」は、μｇ／ｇ（ｗ／ｗ）で定義される百万分率を意味する。ガスの濃度は、μＬ／Ｌ（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で定義される「ｐｐｍｖ」（容積による百万分率）を用いて容積ベースで表すこともできる。オフガス１Ｌ当たりの質量（すなわち、ガスの密度）を測定することにより、μｇ／Ｌのｐｐｍへの変換（例えば、ガス１ｇ当たりの分析物のμｇ）を行なうことができる。例えば、標準的な温度および圧力（ＳＴＰ；１０１．３ｋＰａ（１ｂａｒ）および２７３．１５Ｋ）の空気の１リットルは、約１．２９ｇ／Ｌの密度を有する。したがって、１ｐｐｍ（μｇ／ｇ）の濃度は、ＳＴＰにおいて１．２９μｇ／Ｌに等しい（方程式１１）。ｐｐｍ（μｇ／ｇ）のμｇ／Ｌへの変換は、圧力と温度とオフガスの全組成の関数である。
方程式１１
［数１１］
１ｐｐｍ（μｇ／ｇ）＝１.２９μｇ／Ｌ（標準的な温度および圧力（ＳＴＰ；１０１．３ｋＰａ（１バール）および２７３．１５Ｋ）において）
【０２５３】
一般ガス法則（方程式１２）を用いて、μｇ／Ｌのｐｐｍｖ（例えば、ガス１ｇ当たりの分析物のμＬ）への変換を行なうことができる。例えば、１０００μｇ／Ｌガスのオフガス濃度は、１４．７μｍｏｌ／Ｌガスに相当する。一般ガス定数は、０．０８２０５７Ｌ．ａｔｍ  Ｋ−１ｍｏｌ−１であるので、方程式１２を用いると、ＳＴＰにおいて１４．７μｍｏｌのＨＧが占める容積は０．３２９ｍＬに等しい。したがって、１０００μｇ／ＬのＨＧの濃度は、ＳＴＰにおいて３２９ｐｐｍｖまたは０．０３２９％（ｖ／ｖ）に等しい。
【０２５４】
方程式１２
［数１２］
ＰＶ＝ｎＲＴ、式中、「Ｐ」は圧力、「Ｖ」は容積、「ｎ」はガスのモル数、「Ｒ」は一般ガス定数、「Ｔ」はケルビンで表される温度である。
【０２５５】
イソプレン組成物中の不純物の量は、本明細書では通常、μｇ／Ｌなどの単位で表される重量／容積（ｗ／ｖ）ベースで測定される。所望により、μｇ／Ｌという単位の測定値を方程式１３を用いてｍｇ／ｍ３という単位に変換することができる。
方程式１３
［数１３］
１μｇ／Ｌ＝１ｍｇ／ｍ３
【０２５６】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含まない本質的に同じ条件下で増殖した対応する細胞から産出されるイソプレンの量よりも少なくともまたは約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、またはそれを上回る量のイソプレンを産出する。
【０２５７】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸とＤＸＳ、ＩＤＩ、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸とを含む細胞は、異種核酸を含まない本質的に同じ条件下で増殖した対応する細胞から産出されるイソプレンの量よりも少なくともまたは約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、またはそれを上回る量のイソプレンを産出する。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれらより多くのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、９９.９０、９９.９１、９９.９２、９９.９３、９９.９４、９９.９５、９９.９６、９９.９７、９９.９８、９９.９９、もしくは１００％またはそれらより多くのイソプレンの相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９９.９０〜約９９.９２、約９９.９２〜約９９.９４、約９９.９４〜約９９.９６、約９９.９６〜約９９.９８、約９９.９８〜１００重量％のイソプレンを含む。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１重量％またはそれら未満のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１％またはそれら未満のイソプレン以外のＣ５炭化水素の相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の検出器応答と比べて、約０.１２、０.１０、０.０８、０.０６、０.０４、０.０２、０.０１、０.００５、０.００１、０.０００５、０.０００１、０.００００５、もしくは０.００００１％またはそれら未満の１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インの相対検出器応答を有する。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約０．０２〜約０．０４％、約０．０４〜約０．０６％、約０.０６〜０.０８％、約０.０８〜０.１０％、または約０．１０〜約０．１２重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌの化合物を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約０.００５〜約５０、例えば、約０.０１〜約１０、約０.０１〜約５、約０.０１〜約１、約０.０１〜約０.５、または約０.０１〜約０.００５μｇ／Ｌの化合物を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌまたはそれら未満のイソプレン以外の炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約０.００５〜約５０、例えば、約０.０１〜約１０、約０.０１〜約５、約０.０１〜約１、約０.０１〜約０.５、または約０.０１〜約０.００５μｇ／Ｌのイソプレン以外の炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５μｇ／Ｌのタンパク質または脂肪酸（例えば、天然ゴムと天然に合わされているタンパク質または脂肪酸）を含む。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、１０、５、１、０.８、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍ未満または約１０、５、１、０.８、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍのα−アセチレン、ピペリレン、アセトニトリル、または１，３−シクロペンタジエンを含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍのまたはそれら未満の硫黄またはアレンを含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約３０、２０、１５、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍまたはそれら未満の全アセチレン（例えば、１−ペンチン、２−ペンチン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、およびｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約２０００、１０００、５００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０.５、０.１、０.０５、０.０１、もしくは０.００５ｐｐｍまたはそれら未満のイソプレン二量体、例えば、環状イソプレン二量体（例えば、２つのイソプレン単位の二量体化から得られる環状Ｃ１０化合物）を含む。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、エタノール、アセトンＣ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。特定の実施形態では、イソプレン組成物は、約０.００５、０.０１、０.０５、０.１、０.５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌまたはそれらより多くのエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、約０.００５〜約１２０、例えば、約０.０１〜約８０、約０.０１〜約６０、約０.０１〜約４０、約０.０１〜約３０、約０.０１〜約２０、約０.０１〜約１０、約０.１〜約８０、約０.１〜約６０、約０.１〜約４０、約５〜約８０、約５〜約６０、または約５〜約４０μｇ／Ｌのエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、以下の成分：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプテン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、または線状イソプレンポリマー（例えば、複数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）のうちの１以上を含む。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、以下のもの：アルコール、アルデヒド、またはケトン（例えば、本明細書に記載のアルコール、アルデヒド、またはケトンのいずれか）のうちの１以上を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、以下のもの：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドールのうちの１以上を含有する。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、１ｐｐｍまたはそれより多くの以下のうちの１以上を含有する：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。いくつかの実施形態では、以下のもの：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドールのうちの１以上よりも多くの濃度は、イソプレン組成物中（例えば、精製される前のオフガス）約１〜約１０，０００ｐｐｍである。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物（例えば、１以上の精製工程を経た後のオフガス）は、以下のもの：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドールのうちの１以上を、約１〜約１００ｐｐｍ、例えば、約１〜約１０ｐｐｍ、約１０〜約２０ｐｐｍ、約２０〜約３０ｐｐｍ、約３０〜約４０ｐｐｍ、約４０〜約５０ｐｐｍ、約５０〜約６０ｐｐｍ、約６０〜約７０ｐｐｍ、約７０〜約８０ｐｐｍ、約８０〜約９０ｐｐｍ、または約９０〜約１００ｐｐｍの濃度で含む。細胞培養物由来の揮発性有機化合物（例えば、細胞培養物のヘッドスペース中の揮発性有機化合物）を、本明細書に記載した方法などの標準的な方法またはプロトン転移反応−マススペクトロメトリーなどの他の標準的な方法を用いて分析することができる（例えば、Ｂｕｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７４（７）：２１７９−２１８６，２００８を参照されたく、これは、特に、揮発性有機化合物の分析に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレン、例えば、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｍｇまたはそれらより多くのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇまたはそれらより多くのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物中のイソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ、例えば、約２〜約１００ｍｇ、約１００〜約５００ｍｇ、約５００〜約１，０００ｍｇ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ、または約２，０００〜約５，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、組成物中のイソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ、約１００〜約５，０００ｍｇ、約２００〜約２，０００ｍｇ、約２００〜約１，０００ｍｇ、約３００〜約１，０００ｍｇ、または約４００〜約１，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、組成物の揮発性有機画分の約２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは９５重量％またはそれらより多くがイソプレンである。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、組成物はエタノールを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約７５〜約９０重量％のエタノール、例えば、約７５〜約８０％、約８０〜約８５％、または約８５〜約９０重量％のエタノールを含む。組成物がエタノールを含むいくつかの実施形態では、組成物は、約４〜約１５重量％のイソプレン、例えば、約４〜約８％、約８〜約１２％、または約１２〜約１５重量％のイソプレンも含む。
【０２６８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む細胞は、１以上の異種核酸を含まない本質的に同じ条件下で増殖した対応する細胞から産出されるイソプレノイド化合物の量よりも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、もしくはそれより多くの量のイソプレノイド化合物（例えば、１以上のＩＰＰ分子と１以上のＤＭＡＰＰ分子との反応から形成される１０個またはそれより多くの炭素原子を含む化合物）を産出する。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む細胞は、１以上の異種核酸を含まない本質的に同じ条件下で増殖した対応する細胞から産出されるＣ５プレニルアルコールの量よりも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、４００倍、もしくはそれより多くの量のＣ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールまたは３−メチル−２−ブテン−１−オール）を産出する。
【０２６９】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅと水素の例示的な共産出
いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結された、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、および／またはＭＶＡ経路ポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む本明細書に記載のイソプレン産出細胞はいずれも、１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドまたはヒドロゲナーゼポリペプチドの調節または発現に関与する１以上のポリペプチド（例えば、ヒドロゲナーゼ成熟タンパク質または転写因子）をコードし、プロモーターに機能的に連結された異種核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結された、イソプレンシンターゼポリペプチド、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、１以上のヒドロゲナーゼポリペプチドまたはヒドロゲナーゼポリペプチドの調節または発現に関与する１以上のポリペプチドをコードする１以上の異種核酸を含む本明細書に記載のイソプレン産出細胞はいずれも、発酵副産物の産出に関与する１以上のポリペプチド、発酵副産物の産出に関する遺伝子の調節または発現に関与する１以上のポリペプチド、または水素再取込みに関与する１以上のポリペプチドを不活化する突然変異または欠失をさらに含む。このような細胞は、イソプレンと水素を共産出することができる。
【０２７０】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陽性細菌細胞（例えば、枯草菌細胞などのバシルス細胞またはストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、もしくはストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞などのストレプトミセス細胞）などの細菌細胞である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陰性細菌細胞（例えば、大腸菌細胞などのエシェリキア細胞、ロドシュードモナス・パルストリス細胞などのロドシュードモナス種、シュードモナス・フルオレセンス細胞またはシュードモナス・プチダ細胞などのシュードモナス種、またはパントエア・シトレア細胞などのパントエア細胞）である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、糸状真菌細胞（例えば、トリコデルマ・リーゼイ細胞などのトリコデルマ細胞もしくはアスペルギルス・オリザエおよびアスペルギルス・ニゲルなどのアスペルギルス細胞）または酵母細胞（例えば、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞または出芽酵母などのサッカロミセス細胞）などの真菌細胞である。
【０２７１】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（例えば、タイワンクズもしくはクズ）またはポプラ属（例えば、アメリカヤマナラシ、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシ、ブラックコットンウッド、もしくは交配種であるウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）植物由来のポリペプチドである。
【０２７２】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする１以上の核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つのベクターが、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、選択マーカーまたは選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性核酸）を含む。
【０２７３】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、出芽酵母またはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする異種核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、出芽酵母またはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、およびＭＶＡ経路核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、およびＭＶＡ経路核酸を含む。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、プロモーターに機能的に連結された、ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（Ｈｙｄ−１）、大腸菌ヒドロゲナーゼ−２（Ｈｙｄ−２）、大腸菌ヒドロゲナーゼ−３（Ｈｙｄ−３）、大腸菌ヒドロゲナーゼ−４（Ｈｙｄ−４）、大腸菌ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体（これは、酸性ｐＨ、嫌気性条件下で、ギ酸とＣＯ２から水素ガスを産出させる）、ロドコックス・オパクスＭＲ１１ヒドロゲナーゼ（Ｒ．オパクス  ＨｏｘＨ）、シネコシスティス属ＰＣＣ  ６８０３ヒドロゲナーゼ（Ｓｙｎ．ＰＣＣ  ６８０３  ＨｏｘＨ）、デスルフォビブリオ・ギガスヒドロゲナーゼ（Ｄ．ギガス）、およびデスルホビブリオ・デスルフリカンスＡＴＣＣ  ７７５７ヒドロゲナーゼ（Ｄ．デスルフリカンス）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターに機能的に連結されたヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする異種核酸をさらに含むイソプレン産出細胞はさらに、大腸菌ヒドロゲナーゼ−３（Ｈｙｄ−３）、大腸菌ピルビン酸ギ酸リアーゼ（ｐｆｌ）、および大腸菌ギ酸水素リアーゼ（ＦＨＬ）複合体を含む。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドは、クロストリジウム・アセトブツリクムヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）を含み、これは、以下のもの：（１）枯草菌ＮＡＤＰＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＮＦＯＲ）もしくはクロストリジウム・クルイベリＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＲｎｆＣＤＧＥＡＢ）、クロストリジウム・パスツラニヌムフェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｆｄｘ）；（２）グリセルアルデヒド−６−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）；または（３）ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）のうちの１以上とともに発現させることができる。いくつかの実施形態では、フェレドキシン依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドクロストリジウム・アセトブツリクムヒドロゲナーゼＡ（ＨｙｄＡ）を３つのＨｙｄＡ関連成熟酵素（ＨｙｄＥ、ＨｙｄＧおよびＨｙｄＦ）とともに、またさらに以下のもの：（１）枯草菌ＮＡＤＰＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＮＦＯＲ）もしくはクロストリジウム・クルイベリＮＡＤＨフェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＲｎｆＣＤＧＥＡＢ）、クロストリジウム・パスツラニヌムフェレドキシンオキシドレダクターゼ（Ｆｄｘ）；（２）グリセルアルデヒド−６−リン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＧＡＰＯＲ）；または（３）ピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＯＲ）のうちの１以上とともに発現させる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＰＨ依存的ヒドロゲナーゼポリペプチドは、ピロコックス・フリオススヒドロゲナーゼを含む。いくつかの実施形態では、ヒドロゲナーゼポリペプチドは、酸素耐性ヒドロゲナーゼをコードする。いくつかの実施形態では、酸素耐性ヒドロゲナーゼは、ルブリビバクス・ゲラチノーススヒドロゲナーゼ、およびラルストニア・ユートロファヒドロゲナーゼを含む。
【０２７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、鉄−硫黄錯体転写調節因子（ｉｓｃＲ）などの、ヒドロゲナーゼ活性の調節に関与する遺伝子を不活化する突然変異または欠失を含む（Ｋａｌｉｍ−Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃＲ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ  Ｆｅ／Ｆｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｈ２−ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３），”  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８：８５３−８６２（２００８）、これは、特に、ｉｓｃＲ遺伝子を欠失させることによるクロストリジウムＦｅ／Ｆｅヒドロゲナーゼ活性の刺激および大腸菌における水素蓄積に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、乳酸、酢酸、ピルビン酸、エタノール、コハク酸、およびグリセロールなどの発酵副産物の産出に関与する１以上の細胞ポリペプチドをコードする遺伝子を不活化する突然変異または欠失を含む。いくつかの実施形態では、発酵副産物の産出に関与する不活化ポリペプチドは、ギ酸デヒドロゲナーゼＮ、αサブユニット（ｆｄｎＧ）、ギ酸デヒドロゲナーゼＯ、大サブユニット（ｆｄｏＧ）、硝酸レダクターゼ（ｎａｒＧ）、ギ酸輸送体Ａ（ｆｏｃＡ）、ギ酸輸送体Ｂ（ｆｏｃＢ）、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分ａｃｋＡ／ｐｔａ（ａｃｅＥ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ）、フマル酸レダクターゼ膜タンパク質（ｆｒｄＣ）、または乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）をコードする１以上のポリペプチドを含む。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、発酵副産物の産出に関与する遺伝子の調節または発現に関与する１以上の細胞ポリペプチドをコードする遺伝子を不活化する突然変異または欠失を含む。いくつかの実施形態では、発酵副産物の産出に関与する遺伝子の調節または発現に関与する不活化ポリペプチドは、ギ酸水素リアーゼ（ｈｙｃＡ）、フマル酸レダクターゼ調節因子（ｆｎｒ）、アセチル−補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ）、およびギ酸デヒドロゲナーゼ調節タンパク質（ｈｙｃＡ）の抑制因子を含む。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のイソプレン産出細胞はさらに、水素再取込みに関与する１以上の細胞ポリペプチドをコードする遺伝子を不活化する突然変異または欠失を含む。いくつかの実施形態では、水素再取込みに関与する不活化ポリペプチドは、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（Ｈｙｄ−１）（ｈｙａオペロン）および大腸菌ヒドロゲナーゼ−２（Ｈｙｄ−２）（ｈｙｂオペロン）を含む。
【０２８１】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子のポリペプチドまたは核酸は、Ｔ７プロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴ７プロモーター）に機能的に連結されている。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｔｒｃプロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴｒｃプロモーター）に機能的に連結されている。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、Ｌａｃプロモーター（例えば、低コピープラスミドに含まれるＬａｃプロモーター）に機能的に連結されている。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、内在性プロモーター（例えば、内在性アルカリ性セリンプロテアーゼプロモーター）に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、選択マーカーを伴わずにまたは選択可能マーカーを伴わずに、細胞のゲノムに組み込まれる。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、増殖期よりも定常期に活性の高いプロモーターまたは因子の制御下に置かれている。例えば、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、定常期σ因子（例えば、ＲｐｏＳ）の制御下に置かれていてもよい。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＳ、イソプレンシンターゼ、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸は、定常期に誘導可能なプロモーター（例えば、定常期に活性のある応答調節因子によって誘導可能なプロモーター）の制御下に置かれている。
【０２８３】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５回、またはそれより多くの細胞分裂の間、異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸を維持する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ成熟因子またはヒドロゲナーゼ転写因子の核酸異種イソプレンシンターゼ、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＭＶＡ経路、エタノール発酵関連および／または転写因子核酸を含む核酸はまた、選択マーカーまたは選択可能マーカー（例えば、抗生物質耐性核酸）を含む。
【０２８４】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンと水素を共産出する細胞を、細胞によるイソプレンと水素の共産出を促進する酸素制限条件下で、本明細書に記載の培養培地のいずれかにおいて培養する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、イソプレン１モル当たり０．５モルの酸素の存在下で増殖させる。いくつかの実施形態では、細胞を、酸素の不在下で、嫌気的に増殖させる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも酸素制限培養で増殖し、イソプレンと水素を共産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回る速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回る速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約２．０×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約２．０×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．５×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、および約１×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、またはそれより多くを超えるイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１２５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、および約１．００×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１２５、２５０、５００、７５０、１０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、１０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、またはそれより多くを超える水素を産出する。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも酸素制限培養で増殖し、イソプレンと水素を共産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１０００ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約５ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回る水素のピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約３０００ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約５ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回る水素のピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンのピーク容積生産性と、約５ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回る水素のピーク容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間の水素の平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、約１ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約５ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１０ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２５ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約５０ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１００ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約２５０ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約５００ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１０００ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間、および約２５００ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５０００ｍｇ／Ｌブロス／時間のイソプレンの平均容積生産性と、約０．０１ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間、約０．０５ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間、約０．１ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間、約０．２５ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間、約０．５ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間、約１ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間、および約２．５ｍｇ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｇ／Ｌブロス／時間の水素の平均容積生産性とを有する。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞はいずれも酸素制限培養で増殖し、イソプレンと水素を共産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約４００モルパーセント超に等しい水素を産出する。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、イソプレンと水素を共産出する本明細書に記載の細胞をいずれかを酸素制限培養で増殖させる。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、水素３モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンから水素４モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンの比率でイソプレンと水素を共産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、１〜１１モルパーセントのイソプレンと、３〜３３モルパーセントの水素とを産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、１〜１１モルパーセントのイソプレンと、４〜４４モルパーセントの水素とを産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、酸素、二酸化炭素、または窒素も産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、０〜２１モルパーセントの酸素と、１８〜４４モルパーセントの二酸化炭素と、０〜７８モルパーセントの窒素とを産出する。
【０２８９】
別の態様では、イソプレンと水素を共産出する酸素制限培養された細胞であって、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞を本明細書で提供し、ここで、細胞は、（ｉ）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回る速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回る速度で水素を産出するか、（ｉｉ）約０．１ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有するか、または（ｉｉｉ）細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、酸素制限条件下でイソプレンと水素を共産出することができる。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンと、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回る水素とを産出する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有する。いくつかの実施形態では、酸素制限培養された細胞は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、この異種核酸はプロモーターに機能的に連結されており、この細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超を水素に変換する。いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、植物イソプレンシンターゼポリペプチドである。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約２．０×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．５×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、および  約１×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１２５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、および  約１．００×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、イソプレンと水素を共産出する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の共産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を共産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞は、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回る水素を産出する。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限培養で増殖させる。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む酸素制限培養された細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約２．０×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．５×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、および約１×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１×１０５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度でイソプレンを産出し、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約１２５０ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約２５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約５０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、約７５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、および約１．００×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜約１．２５×１０４ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の速度で水素を産出する。
【０２９４】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅと水素の例示的な共産出
いくつかの実施形態では、イソプレンと水素を共産出する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の共産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を共産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約０．１ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性と、約０．００５ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回る水素の平均容積生産性とを有する。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、イソプレンと水素を共産出する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の共産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を共産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、水素３モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンから水素４モルパーセントごとに少なくとも１モルパーセントのイソプレンの比率のイソプレンおよび水素と、０．１モルパーセントまたはそれ未満の揮発性不純物とを含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１〜１１モルパーセントのイソプレンと、４〜４４モルパーセントの水素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、酸素、二酸化炭素、または窒素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、０〜２１モルパーセントの酸素、１８〜４４モルパーセントの二酸化炭素、および０〜７８モルパーセントの窒素を含む。いくつかの実施形態では、組成物はさらに、１．０×１０−４モルパーセント以下のメタン以外の揮発性不純物を含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１以上を含む：２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）およびシトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、２，３−シクロヘプテノルピリジン、または線状イソプレンポリマー（例えば、複数のイソプレン単位の重合から得られる線状イソプレン二量体もしくは線状イソプレン三量体）。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１以上を含む：イソプレン組成物は、以下のうちの１以上を含む：アルコール、アルデヒド、またはケトン（例えば、本明細書に記載のアルコール、アルデヒドまたはケトンのいずれか）。いくつかの実施形態では、イソプレン組成物は、（ｉ）アルコールとアルデヒド、（ｉｉ）アルコールとケトン、（ｉｉｉ）アルデヒドとケトン、または（ｉｖ）アルコールとアルデヒドとケトンを含む。いくつかの実施形態では、メタン以外の揮発性不純物は、以下のうちの１以上を含む：メタノール、アセトアルデヒド、エタノール、メタンチオール、１−ブタノール、３−メチル−１−プロパノール、アセトン、酢酸、２−ブタノン、２−メチル−１−ブタノール、またはインドール。
【０２９７】
また、イソプレンと水素を共産出する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の共産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を共産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、酸素制限培養された細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロスを上回り、細胞の水素発生速度は、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間を上回る。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限条件下で増殖させる。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、水素発生速度は、０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約０．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約０．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜１０ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜１０ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜５０ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜１００ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、および約０．０１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜２００ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間の約いずれかである。
【０２９８】
また、イソプレンと水素を共産出する方法であって、（ａ）イソプレンと水素の共産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンと水素を共産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、イソプレンの液相濃度は、約２００ｍｇ／ｍＬ未満であり、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の水素発生速度は、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、細胞を酸素制限条件下で増殖させる。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、１７５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または２．５ｍｇ／Ｌの約いずれか未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、または１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌのいずれか程度である。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、水素発生速度は、０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約０．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．００２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約０．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．０２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜約１０ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜１ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜２．５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間、および約０．２５ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間〜１０ｍｍｏｌ／Ｌブロス／時間の約いずれかである。
【０２９９】
一態様では、イソプレンと水素を共産出する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、本発明は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンと、約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回る水素を産出する酸素制限培養された細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。
【０３００】
いくつかの実施形態では、細胞培養培地中の炭素の約０．００２％超をイソプレンに変換し、細胞培養培地中の炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出する酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む酸素制限培養された細胞が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。
【０３０２】
一態様では、イソプレンを別の化合物とともに共産出する方法、例えば、本明細書に記載の細胞のいずれかを用いてイソプレンと水素を共産出する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンと約１２５ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回る水素を産出するのに十分な酸素制限条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞によって産出されたイソプレンと水素を回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、細胞によって産出されたイソプレンと水素を精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ６００で１時間当たりブロス１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の２倍以上よりも多いかまたは約２倍以上である。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞培養培地の炭素（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の約０．００２％超をイソプレンに変換し、細胞培養培地中の炭素の約０．０２４モルパーセント超に等しい水素を産出するのに十分な酸素制限条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、酸素制限培養は嫌気的である。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞によって産出されたイソプレンと水素を回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はさらに、細胞によって産出されたイソプレンと水素を精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。
【０３０４】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、微生物ポリペプチド炭素源は、酵母または細菌由来の１以上のポリペプチドを含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、植物ポリペプチド炭素源は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、サフラワー、ゴマ、またはアマニ由来の１以上のポリペプチドを含む。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、イソプレンと水素は、定常期にのみ共産出される。いくつかの実施形態では、イソプレンと水素は、増殖期と定常期の両方に共産出される。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ６００で１時間当たりブロス１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多い。様々な実施形態では、定常期に産出される水素の量（例えば、産出される水素の総量またはＯＤ６００で１時間当たりブロス１リットルから産出される水素の量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出される水素の量の約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多い。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、水素と、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インについて、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％未満または約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％を有する。特定の実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、かつ組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％超または約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％のイソプレンを有する。いくつかの実施形態では、組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌまたはそれ未満の化合物を有する。特定の実施形態では、組成物はまた、約２ｍｇ超のイソプレンと、約０．４８ｍｇ超の水素とを含む。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンの重合を阻害する、気相の揮発性有機画分中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌ未満または約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌの化合物を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分はまた、約２ｍｇ超のイソプレンと、約０．４８ｍｇ超の水素とを含む。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、この系は、本明細書に記載の細胞および／または組成物のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、この系は、チャンバーが、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、またはそれより多いイソプレンと、約１２５、２５０、５００、７５０、１０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、７，５００、１０，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、またはそれより多い水素とを産出する酸素制限培養された細胞を含む反応器を含む。いくつかの実施形態では、この系は、閉鎖系ではない。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部をこの系から取り出す。いくつかの実施形態では、この系は、イソプレンと水素とを含む気相を含む。様々な実施形態では、この気相は、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む。
【０３０９】
一態様では、本明細書において、本明細書に記載の任意の組成物または方法により産出される産物を特徴とする。
【０３１０】
高イソプレン力価での細胞生存性
イソプレンは、多くの植物、動物、および微生物によって分泌される疎水性分子である。バシルスなどの細菌は、かなり低いレベルでイソプレンを産出する。植物がイソプレンを分泌して熱保護を助けるという証拠もあるが、イソプレンは、シアノバクテリアもしくは真菌に対してアンタゴニストとして作用し得る、または抗微生物剤として作用し得るという仮説が立てられている。例えば、Ｌａｄｙｇｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１００１−１０１４（２００６）を参照されたく、これは、特に、アンタゴニストとして作用するイソプレンに関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。抗微生物性であるには、自然で発生する極めて低い産出レベルで十分なので、イソプレンの商業化に必要なイソプレンの力価および産出レベルでは宿主微生物が死滅するということが大きな懸念であった。
【０３１１】
本発明者らは、二酸化炭素発生速度または総二酸化炭素発生速度によって示されるような細胞生存性および／または代謝活性を維持すると同時に、イソプレンの商業化のためのイソプレンの力価および産出レベルを産出する方法を見出した。
【０３１２】
イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンは、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１ｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜４０ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜４ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜２５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、２５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜５００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または５００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１０００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、２ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。
【０３１３】
また、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞生存性は、約２倍未満低下する。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンは、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１ｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜４０ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜４ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜２５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、２５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜５００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または５００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１０００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、２ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、１．７５倍、１．５倍、１．２５倍、１倍、０．７５倍、０．５倍、または０．２５倍のいずれか程度未満低下する。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、約２倍低下する。
【０３１４】
さらに、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間〜５ｇ／Ｌブロス／時間、０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間〜１ｇ／Ｌブロス／時間、１ｇ／Ｌブロス／時間〜２．５ｇ／Ｌブロス／時間、２．５ｇ／Ｌブロス／時間〜５ｇ／Ｌブロス／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。
【０３１５】
イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回り、細胞生存性は約２倍未満低下する。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間〜５ｇ／Ｌブロス／時間、０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間〜１ｇ／Ｌブロス／時間、１ｇ／Ｌブロス／時間〜２．５ｇ／Ｌブロス／時間、２．５ｇ／Ｌブロス／時間〜５ｇ／Ｌブロス／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、１．７５倍、１．５倍、１．２５倍、１倍、０．７５倍、０．５倍、または０．２５倍のいずれか程度未満低下する。
【０３１６】
また、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロスを上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、１０ｎｇ／Ｌブロス〜５００ｎｇ／Ｌブロス、５００ｎｇ／Ｌブロス〜１μｇ／Ｌブロス、１μｇ／Ｌブロス〜５μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜５０μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜１００μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜２５０μｇ／Ｌブロス、２５０μｇ／Ｌブロス〜５００μｇ／Ｌブロス、５００μｇ／Ｌブロス〜１ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜５０ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜１００ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロス、１０ｎｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜１００ｍｇ／Ｌブロス、または５μｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロスの約いずれかである。いくつかの実施形態では、ピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロス、１００ｎｇ／Ｌブロス、１μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス、３０ｍｇ／Ｌブロス、１００ｍｇ／Ｌブロス、または２００ｍｇ／Ｌブロスのいずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。
【０３１７】
さらに、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロスを上回り、細胞生存性は約２倍未満低下する。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、１０ｎｇ／Ｌブロス〜５００ｎｇ／Ｌブロス、５００ｎｇ／Ｌブロス〜１μｇ／Ｌブロス、１μｇ／Ｌブロス〜５μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜５０μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜１００μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜２５０μｇ／Ｌブロス、２５０μｇ／Ｌブロス〜５００μｇ／Ｌブロス、５００μｇ／Ｌブロス〜１ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜５０ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜１００ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロス、１０ｎｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜１００ｍｇ／Ｌブロス、または５μｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロスのいずれか程度である。いくつかの実施形態では、ピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロス、１００ｎｇ／Ｌブロス、１μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス、３０ｍｇ／Ｌブロス、１００ｍｇ／Ｌブロス、または２００ｍｇ／Ｌブロスのいずれかである。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、１．７５倍、１．５倍、１．２５倍、１倍、０．７５倍、０．５倍、または０．２５倍のいずれか程度未満低下する。いくつかの実施形態では、細胞生存性は、約２倍低下する。
【０３１８】
また、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、産出されるイソプレンは、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１ｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜４０ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜４ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜２５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、２５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜５００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または５００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間〜１０００ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、イソプレンの量は、１ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、１．５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、２ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、３ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、４ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、または５ｍｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。
【０３１９】
また、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、この培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンの累計生産性は、０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間〜５ｇ／Ｌブロス／時間、０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間〜１ｇ／Ｌブロス／時間、１ｇ／Ｌブロス／時間〜２．５ｇ／Ｌブロス／時間、２．５ｇ／Ｌブロス／時間〜５ｇ／Ｌブロス／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間のいずれか程度である。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。
【０３２０】
さらに、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、この培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロスを上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、「イソプレンの例示的な産出」と題された節に開示された任意の濃度または量である。いくつかの実施形態では、イソプレンのピーク濃度は、１０ｎｇ／Ｌブロス〜５００ｎｇ／Ｌブロス、５００ｎｇ／Ｌブロス〜１μｇ／Ｌブロス、１μｇ／Ｌブロス〜５μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜５０μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜１００μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜２５０μｇ／Ｌブロス、２５０μｇ／Ｌブロス〜５００μｇ／Ｌブロス、５００μｇ／Ｌブロス〜１ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜５０ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜１００ｍｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロス、１０ｎｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス〜１００ｍｇ／Ｌブロス、または５μｇ／Ｌブロス〜２００ｍｇ／Ｌブロス。いくつかの実施形態では、ピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロス、１００ｎｇ／Ｌブロス、１μｇ／Ｌブロス、５μｇ／Ｌブロス、１ｍｇ／Ｌブロス、３０ｍｇ／Ｌブロス、１００ｍｇ／Ｌブロス、または２００ｍｇ／Ｌブロスのいずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、３５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。
【０３２１】
本明細書に記載の方法および細胞のいずれかのいくつかの実施形態では、異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸の１以上からＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路のＲＮＡおよび／またはタンパク質を発現する細胞の二酸化炭素発生速度および／または細胞生存性を、異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路核酸の１以上を欠く対照細胞と比較する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターの制御下にある異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路の核酸の１以上からＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路のＲＮＡおよび／またはタンパク質を発現する細胞の二酸化炭素発生速度および／または細胞生存性（この場合、プロモーターは誘導されている）を、誘導性プロモーターの制御下にある異種および／または重複コピーのＭＶＡ経路および／またはＤＸＰ経路核酸の１以上を含有する対照細胞（この場合、プロモーターは誘導されていない（未誘導である））と比較する。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、β−ガラクトシダーゼプロモーターである。
【０３２２】
本発明は、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法を提供し、ここで、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。さらに、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。また、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、この培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロスを上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。これらの方法のいずれかのいくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間または約５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間である。
【０３２３】
さらに、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、この細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。また、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンの累計生産性は、約０．２ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。さらに、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする核酸を含む培養細胞が本明細書で提供され、ここで、培養細胞によって産出されるイソプレンのピーク濃度は、約１０ｎｇ／Ｌブロスを上回り、細胞の二酸化炭素発生速度は、約１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間を上回る。これらの培養細胞のいずれかのいくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、１×１０−１８ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜約１ｍｏｌ／Ｌ／時間、１ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜１ｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、２５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜７５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間、または４５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間〜５５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間の約いずれかである。いくつかの実施形態では、二酸化炭素発生速度は、約５０ｍｍｏｌ／Ｌ／時間または約５００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間である。
【０３２４】
また、イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンの産出に好適な条件下で細胞を培養することと、（ｂ）イソプレンを産出することとを含む、方法が本明細書で提供され、ここで、イソプレンの液相濃度は、約２００ｍｇ／Ｌ未満であり、細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、１７５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、または２．５ｍｇ／Ｌの約いずれか未満である。いくつかの実施形態では、培養物中のイソプレンの液相濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、または１０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの約いずれかである。
【０３２５】
また、化合物を産出する方法が本明細書で提供され、ここで、この化合物は、（ａ）約２５０Ｍ／ａｔｍ未満のヘンリー則係数および（ｂ）約１００ｇ／Ｌ未満の水溶解度からなる群から選択される１以上の特徴を有する。いくつかの実施形態では、本方法は、ａ）化合物の産出に好適な条件下で細胞を培養すること、その場合、約０．０１ｖｖｍ〜約２ｖｖｍのガス放出速度でガスを添加する（例えば、ガスを発酵系などの系に添加する）と、ｂ）化合物を産出することとを含む。いくつかの実施形態では、化合物のヘンリー則係数は、２００Ｍ／ａｔｍ、１５０Ｍ／ａｔｍ、１００Ｍ／ａｔｍ、７５Ｍ／ａｔｍ、５０Ｍ／ａｔｍ、２５Ｍ／ａｔｍ、１０Ｍ／ａｔｍ、５Ｍ／ａｔｍ、または１Ｍ／ａｔｍの約いずれか未満である。いくつかの実施形態では、化合物の水溶解度は、７５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、または１ｇ／Ｌの約いずれか未満である。いくつかの実施形態では、化合物は、イソプレン、アルデヒド（例えば、アセトアルデヒド）、ケトン（例えば、アセトンまたは２−ブタノン）、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、１−ブタノール、またはＣ５アルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールまたは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、アルコールのエステル（例えば、酢酸エチルまたはＣ５アルコールのアセチルエステル）、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、およびＣ１〜Ｃ５炭化水素（例えば、メタン、エタン、エチレン、またはプロピレン）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃ１〜Ｃ５炭化水素は、飽和したもの、不飽和のもの、または分岐したものである。特定の実施形態では、化合物はイソプレンである。上記の化合物のいずれかを産出する方法のいくつかの実施形態では、ガス放出速度は、０．１ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、０．２ｖｖｍ〜１ｖｖｍ、または０．５ｖｖｍ〜１ｖｖｍの約いずれかである。
【０３２６】
一態様では、培養細胞を用いて、イソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、培養細胞は、約４００ｎｍｏｌｅのイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間）を上回るイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、かつ（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上の組み合わせを含む培養培地中で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養培地中の炭素の約０．００２％超をイソプレンに変換する培養細胞を提供する。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、本発明は、イソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む培養細胞を提供する。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。
【０３２９】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の細胞のいずれかを用いてイソプレンを産出する方法などの、イソプレンを産出する方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、本方法は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出するのに十分な条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞により産出されたイソプレンを回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたイソプレンを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞は（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ６００で１時間当たりブロス１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の２倍以上よりも多いかまたは約２倍以上である。いくつかの実施形態では、気相は、９．５％超または約９．５％（体積）の酸素を含み、気相中のイソプレンの濃度は、引火下限未満であるかまたは引火上限を上回る。特定の実施形態では、（ｉ）気相中のイソプレンの濃度は、引火下限未満であるかまたは引火上限を上回り、（ｉｉ）細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出する。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、本方法は、細胞培養培地中の炭素（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の約０．００２％超をイソプレンに変換するのに十分な条件下で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、細胞により産出されたイソプレンを回収することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞により産出されたイソプレンを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを重合させることを含む。いくつかの実施形態では、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上を含む。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、イソプレンは定常期にのみ産出される。いくつかの実施形態では、イソプレンは増殖期と定常期の両方に産出される。様々な実施形態では、定常期に産出されるイソプレンの量（例えば、産出されるイソプレンの総量またはＯＤ６００で１時間当たりブロス１リットルから産出されるイソプレンの量）は、同じ時間の長さで増殖期に産出されるイソプレンの量の約２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０倍もしくはそれより多い
【０３３２】
一態様では、イソプレンを含む組成物および系を本明細書に記載する。いくつかの実施形態では、組成物は、約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｍｇまたはそれらより多くのイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇｍまたはそれらより多くのイソプレン（ｗ／ｗ）を含み、組成物の揮発性有機画分はイソプレンである。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれらをこえる量のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％またはそれら未満のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、組成物は１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インについて、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％またはそれら未満を有する。特定の実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれらより多いイソプレンを有する。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌまたはそれ未満の化合物を有する。特定の実施形態では、組成物はまた、約２ｍｇ超のイソプレンを有する。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、組成物は、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌまたはそれらより多くのエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を有する。特定の実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、組成物は、イソプレンと、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の第２の化合物とを含む。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの第２の成分の１つの量は、約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）またはそれらより多い。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、組成物は、（ｉ）イソプレンを含む気相と、（ｉｉ）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間またはそれらを上回るイソプレンを産出する培養細胞とを含む。いくつかの実施形態では、組成物は閉鎖系を含み、気相は、１時間培養した１ｍＬの１ＯＤ６００に対して標準化したとき、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／Ｌまたはそれらを超えるイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、開放系を含み、気相は、１ｖｖｍの速度で放出されるとき、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／Ｌまたはそれらを超えるイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれらを超えるイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、約０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％またはそれら未満の１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インを含む。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれより多いイソプレンを有する。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンの重合を阻害する、気相の揮発性有機画分中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌまたはそれ未満の化合物を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分はまた、約２ｍｇ超のイソプレンを有する。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌまたはそれらより多くのエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールまたは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンと、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の第２の化合物とを含む。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの第２の成分の１つの量は、気相の揮発性有機画分中、約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）またはそれらより多い量である。
【０３４１】
本発明の組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部は気相中にある。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部は、液相（例えば、凝結物）中にある。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部は固相中にある。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部は、シリカおよび／または活性炭を含む支持体などの固体支持体に吸着する。いくつかの実施形態では、組成物は、エタノールを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約７５〜約９０重量％のエタノール、例えば、約７５〜約８０重量％、約８０〜約８５重量％、または約８５〜約９０重量％のエタノールを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約４〜約１５重量％のイソプレン、例えば、約４〜約８重量％、約８〜約１２重量％、または約１２〜約１５重量％のイソプレンを含む。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、本方法はまた、本明細書に記載の細胞および／または組成物のいずれかを含む系を特徴とする。いくつかの実施形態では、この系は、チャンバーが、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、またはそれより多くをイソプレンを産出する培養細胞を含む反応器を含む。いくつかの実施形態では、この系は、閉鎖系ではない。いくつかの実施形態では、イソプレンの少なくとも一部をこの系から取り出す。いくつかの実施形態では、この系は、イソプレンを含む気相を含む。様々な実施形態では、この気相は、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む。
【０３４３】
本明細書に記載の組成物、系および方法のいずれかのいくつかの実施形態では、気相中の引火しない濃度のイソプレンが産出される。いくつかの実施形態では、気相は、約９．５％（体積）未満の酸素を含む。いくつかの実施形態では、気相は、９．５％（体積）超または約９．５％（体積）の酸素を含み、気相中のイソプレンの濃度は、引火下限未満であるかまたは引火上限を上回る。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約０％〜約１００％（体積）の酸素、例えば、約１０％〜約１００％（体積）の酸素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約０％〜約９９％（体積）の窒素を含む。いくつかの実施形態では、イソプレン以外の気相の部分は、約１％〜約５０％（体積）のＣＯ２を含む。
【０３４４】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養細胞は、約４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間、またはそれより多くのイソプレンを産出する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養細胞は、細胞培養培地中の炭素の約０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６％、もしくはそれより多くをイソプレンに変換する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００ｎｇ、もしくはそれより多いイソプレン／細胞の湿重量に対する細胞のグラム／時間（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）でイソプレンを産出する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、培養細胞は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ、もしくはそれより多いイソプレン／ブロスのＬ（ｍｇ／Ｌブロスブロスの容量は細胞の容量と培地の容量を含む）で累積力価（総量）のイソプレンを産出する。他の例示的なイソプレン産出の速度とイソプレン産出の総量が本明細書に開示されている。
【０３４５】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする異種核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＤＸＳポリペプチドをコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする１以上の核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つの核酸が、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つのベクターが、イソプレンシンターゼポリペプチドとＩＤＩポリペプチドとＤＸＳポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ベクターは、抗生物質耐性核酸などの選択マーカーを含む。
【０３４６】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、Ｔ７プロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴ７プロモーター）に機能的に連結されている。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、Ｔｒｃプロモーター（例えば、中または高コピープラスミドに含まれるＴｒｃプロモーター）に機能的に連結されている。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、Ｌａｃプロモーター（例えば、低コピープラスミドに含まれるＬａｃプロモーター）に機能的に連結されている。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、内在性プロモーター（例えば、内在性アルカリ性セリンプロテアーゼプロモーター）に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、異種イソプレンシンターゼ核酸は、選択マーカーを伴わずに細胞の染色体に組み込まれる。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、増殖期よりも定常期に活性の高いプロモーターまたは因子の制御下に置かれている。例えば、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、定常期σ因子（例えば、ＲｐｏＳ）の制御下に置かれていてもよい。いくつかの実施形態では、１以上のＭＶＡ経路、ＩＤＩ、ＤＸＰ、またはイソプレンシンターゼ核酸は、定常期に誘導可能なプロモーター（例えば、定常期に活性のある応答調節因子によって誘導可能なプロモーター）の制御下に置かれている。
【０３４８】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞の少なくとも一部は、連続培養（例えば、希釈しない連続培養）において少なくともまたは約５、１０、２０、４０、５０、６０、６５回、またはそれより多くの細胞分裂の間、異種イソプレンシンターゼ核酸を維持する。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＩＤＩ、またはＤＸＳ核酸を含む核酸はまた、抗生物質耐性核酸などの選択マーカーを含む。
【０３４９】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、出芽酵母またはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする異種核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、出芽酵母またはエンテロコックス・フェカーリス由来のＭＶＡ経路ポリペプチド）をコードする１コピーの内在性核酸の挿入を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、およびＭＶＡ経路核酸を含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、イソプレンシンターゼ核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、および（ＩＤＩ核酸に加えて）ＭＶＡ経路核酸を含む。
【０３５０】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、イソプレンシンターゼポリペプチドは、クズ属（例えば、タイワンクズもしくはクズ）またはポプラ属（例えば、アメリカヤマナラシ、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシ、ブラックコットンウッド、もしくは交配種であるウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）などの植物由来のポリペプチドである。
【０３５１】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陽性細菌細胞（例えば、枯草菌細胞などのバシルス細胞またはストレプトミセス・リビダンス、ストレプトミセス・コエリコロル、もしくはストレプトミセス・グリセウス細胞などのストレプトミセス細胞）などの細菌細胞である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、グラム陰性細菌細胞（例えば、大腸菌細胞などのエシェリキア細胞、ロドシュードモナス・パルストリス細胞などのロドシュードモナス種、シュードモナス・フルオレセンス細胞もしくはシュードモナス・プチダ細胞などのシュードモナス種、またはパントエア・シトレア細胞などのパントエア細胞）である。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、糸状真菌細胞（例えば、トリコデルマ・リーゼイ細胞などのトリコデルマ細胞もしくはアスペルギルス・オリザエおよびアスペルギルス・ニゲルなどのアスペルギルス細胞）または酵母細胞（例えば、ヤロウイア・リポリティカ細胞などのヤロウイア細胞または出芽酵母などのサッカロミセス細胞）などの真菌細胞である。
【０３５２】
本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、微生物ポリペプチド炭素源は、酵母または細菌由来の１以上のポリペプチドを含む。本明細書に記載の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、植物ポリペプチド炭素源は、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、ジャトロファ、ヤシ、落花生、ヒマワリ、ココナッツ、カラシ、菜種、綿の実、パーム核、オリーブ、サフラワー、ゴマ、またはアマニ由来の１以上のポリペプチドを含む。
【０３５３】
エネルギー源として合成ガスを用いる嫌気性細菌におけるイソプレンの産出
いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、米国仮特許出願第６１／２８９，３４７号および第６１／２８９，３５５号（２００９年１２月２２日出願）（この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、エネルギー源として合成ガスを用いる嫌気性細菌において産出される。
【０３５４】
嫌気性生物による合成ガスからのイソプレンの産出は、好気性生物による糖からのイソプレンの産出に対していくつかの利点を提供し得る。第１に、イソプレンの質量収率の最大理論値は、以下にさらに論じるように、好気性生物においてより高値であり得る。第２に、嫌気性生物は、細胞増殖、副産物（例えば、グリセロール、乳酸、またはエタノール）の形成または分子酸素を用いた酸化を介してターンオーバーしなければならないＮＡＤ（Ｐ）Ｈ状の過剰な還元粉を有さない。このＮＡＤ（Ｐ）Ｈターンオーバーを必要とせずに、嫌気性生物のエネルギー収率はより高く、酸素の需要量はより低く、発酵熱はより低いことができ、プロセス実行の使用コストを下げる。第３に、系における酸素欠如のため、嫌気性生物は、オフガス中でより高いイソプレン濃度、引火イソプレン−酸素混合物生成のより低い可能性、より容易な回収、およびより高いイソプレン質を有することができる。第４に、嫌気性生物は、既存の基盤、例えば、バイオエタノールの産出のために設計した既存の植物を用いることにより、より容易に増殖できる。
【０３５５】
イソプレン産出のために有用な嫌気性生物としては、偏性好気性菌、条件的好気性菌、および酸素耐性好気性菌を挙げることができる。偏性好気性菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｅｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ、およびＢｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍからなる群から選択される任意の１つまたは組み合わせであることができる。イソプレンの産出のためのエネルギー源として有用な合成ガスは、メタン改良、石炭液化、共燃焼、発酵反応、酵素反応、およびバイオマスガス化を含む種々のプロセスにより供給溶液から得ることができる。
【０３５６】
例示的な精製方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、共産出された化合物を回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、イソプレンを回収することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、極低温膜吸着マトリックスに基づく分離方法によって水素を回収することをさらに含む。
【０３５７】
本明細書に記載の組成物および方法を用いて産出されるイソプレンと水素を、固相からのイソプレンのガスストリッピング、膜増強分離、分別、吸着／脱離、パーベーパレーション、熱脱離もしくは真空脱離、または溶媒による固相に固定化もしくは吸収されたイソプレンの抽出などの標準的な技術を用いて回収することができる（例えば、米国特許第４，７０３，００７号、第４，５７０，０２９号、および第４，７４０，２２２号（「Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｆｒｏｍ  Ｒｅｆｉｎｅｒｙ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｏｆｆ−ｇａｓ  Ｓｔｒｅａｍｓ」）を参照されたく、特に、イソプレンの回収および精製方法（’００７号および’０２９号特許）に関して、および水素の回収および精製方法（’２２２号特許）に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）。特定の実施形態では、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、またはそれらの組合せ）による抽出蒸留を用いて、イソプレンを回収する。いくつかの実施形態では、イソプレンの回収は、液体形態のイソプレン（例えば、イソプレンのニート溶液または溶媒中のイソプレン溶液）の単離を含む。ガスストリッピングは、連続的に発酵オフガス流からイソプレン蒸気を除去することを含む。このような除去を、限定するものではないが、固相への吸着、液相への分離、または直接的な凝結（例えば、凝結コイルへの曝露もしくは圧力の増加による凝結）をはじめとするいくつかの異なる方法で達成することができる。いくつかの実施形態では、蒸気の露点を超えた希薄なイソプレン蒸気流の膜濃縮により、液体イソプレンの凝結が生じる。いくつかの実施形態では、イソプレンを圧縮および凝結させる。
【０３５８】
イソプレンの回収は、１工程または複数工程を含み得る。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレン蒸気の除去とイソプレンの液相への変換を同時に行なう。例えば、イソプレンをオフガス流から直接凝結させて、液体を形成させることができる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレン蒸気の除去とイソプレンの液相への変換を順次行なう。例えば、イソプレンを固相に吸着させ、その後、溶媒を用いて固相から抽出し得る。
【０３５９】
水素の回収は、１工程または複数工程を含み得る。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからの水素ガスの除去と水素の液相への変換を同時に行なう。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからの水素ガスの除去と水素の液相への変換を順次行なう。例えば、水素を固相に吸着させ、その後、圧力スイングによって固相から脱離させ得る。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、イソプレンを精製することをさらに含む。例えば、本明細書に記載の組成物および方法を用いて産出されたイソプレンを、標準的な技術を用いて精製することができる。精製とは、イソプレンが産出されるときに存在する１以上の成分からイソプレンを分離するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、イソプレンを実質的に純粋な液体として得る。精製方法の例としては、（ｉ）液体抽出剤中の溶液からの蒸留および（ｉｉ）クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用される場合、「精製イソプレン」は、イソプレンが産出されるときに存在する１以上の成分から分離されたイソプレンを意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンは、少なくとも約２０重量％であり、イソプレンが産出されるときに存在する他の成分を含まない。様々な実施形態では、イソプレンは、少なくともまたは約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または９９重量％で、純粋である。純度は、任意の適切な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、またはＧＣ−ＭＳ分析により、アッセイすることができる。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、水素を精製することをさらに含む。例えば、本明細書に記載の組成物および方法を用いて産出された水素を、標準的な技術を用いて精製することができる。精製とは、水素が産出されるときに存在する１以上の成分から水素を分離するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、水素を実質的に純粋なガスとして得る。いくつかの実施形態では、水素を実質的に純粋な液体として得る。精製方法の例としては、（ｉ）極低温凝結および（ｉｉ）固体マトリックス吸着が挙げられる。本明細書で使用される場合、「精製水素」は、水素が産出されるときに存在する１以上の成分から分離された水素を意味する。いくつかの実施形態では、水素は、少なくとも約２０重量％であり、水素が産出されるときに存在する他の成分を含まない。様々な実施形態では、水素は、少なくともまたは約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または９９重量％で、純粋である。純度は、任意の適切な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィーまたはＧＣ−ＭＳ分析により、アッセイすることができる。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、イソプレンを除去するための１以上の回収工程の後に残存する気相の少なくとも一部が、この気相をイソプレン産出用の細胞培養系（例えば、発酵槽）に導入することにより再利用される。
【０３６３】
発酵オフガスからのＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物の精製の方法および装置は、米国仮特許出願第６１／８８，１４２号（２００９年１２月１８日出願）に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６４】
発酵オフガスからのＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、揮発性不純物および生体副産物不純物とＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅを含み得る。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物は、以下を含む方法を用いて精製する：（ａ）発酵オフガスを第１のカラム内の溶媒と接触させて、溶媒、大部分のイソプレンおよび大部分の生体副産物不純物を含むイソプレンの豊富な溶液；ならびに大部分の揮発性不純物を含む蒸気を形成すること；（ｂ）イソプレンの豊富な溶液を第１のカラムから第２のカラムへ移すこと；ならびに（ｃ）第２のカラムのイソプレンの豊富な溶液からイソプレンをストリッピングして大部分の生体副産物不純物；ならびに精製されたイソプレン組成物を含むイソプレン希薄液を形成することである。
【０３６５】
図１６９にイソプレンの例示的な精製方法および例示的な装置を例証する。イソプレンを含む発酵オフガスは、例えば、米国仮特許出願第６１／１８７，９４４号に記載されている（この内容は、特に、イソプレンを含む発酵オフガスを産出する方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる）当該技術分野の任意の方法により、再生可能な資源（例えば、炭素源）から生成し得る。１以上の個々の発酵槽１２（連続しておよび／または並行して接続した、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多い発酵槽）から生成された発酵オフガスは第１のカラム１４を通過するように方向付け得る。下記のとおり、発酵オフガスは単離単位１６を通過するように方向付け得るおよび／または圧力手段、例えば、圧力系１８により圧縮し得る。追加的に、発酵オフガス温度は任意選択的に溶媒との接触前の任意の時点で低下させて、例えば、凝結物または部分的な凝結物を形成させ得る（これは１以上のオフガス成分、例えば、イソプレンの可溶化を促進し得る）。発酵オフガスは、カラム１４で溶媒（例えば、本明細書に記載の任意の溶媒、例えば、非極性の高沸点溶媒）と接触（例えば、吸着）し得る。溶媒中の吸着傾向の低い揮発性不純物（特に非極性の高沸点溶媒）は残りの溶媒／発酵オフガス混合物から分離し、（例えば、ポート２０に存在する）大部分の揮発性不純物を含む蒸気、ならびに大部分のイソプレンおよび大部分の生体副産物不純物（例えば、ポート２２）を有するイソプレンの豊富な溶液を生じる。溶媒は、発酵オフガスと接触の前、接触と同時、および／または接触後に任意の適切な手段により（例えば、蒸気により）任意選択的に加熱し得、これは残りの溶液からの揮発性不純物の分離を促進し得る。蒸気は、カラム（任意の適切な位置、例えば、図１６９に示すとおりオフガス入り口付近および／または揮発性不純物が出る反対端）を通過するように方向付け得、揮発性不純物の除去を促進し得る湿潤性蒸気相を提供する。
【０３６６】
大部分のイソプレンおよび大部分の生体副産物不純物を（例えば、ポート２２で）有するイソプレンの豊富な溶液は、第２のカラム２４を通過するように方向付け得る。第２のカラムは、（図１６９に示すように）第１のカラム１４から単離されてもよく、または第１のカラムと第２のカラムの両方を含む単一カラム（例えば、溶媒が第１のカラムの片端またはその付近に入り、反対端またはその付近の第２のカラムから出る直列カラム）の一部であってもよい。イソプレンは、第２のカラム内のイソプレンの豊富な溶液からストリップして、（例えば、ポート２６で）精製されたイソプレン組成物を、および（例えば、ポート２８で）大部分の生体副産物不純物を含むイソプレン希薄液を生成し得る。イソプレンの豊富な溶液は、任意の適切な手段により（例えば、蒸気により）加熱し得、これは残りの溶液からのイソプレンのストリッピングを促進し得る。蒸気は、カラム（任意の適切な位置、例えば、図１６９に示すようにイソプレンの豊富な溶液の入り口と反対端および／またはイソプレン希薄液の出口付近）を通過するように方向付け得る。
【０３６７】
本明細書に記載のように、カラムは、従来のおよび任意の適切なサイズであり得る。例示的なタイプのカラムは、Ｋｏｃｈ  Ｍｏｄｕｌａｒプロセスシステム（Ｐａｒａｍｕｓ，  ＮＪ）、Ｆｌｕｏｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｉｒｖｉｎｇ，  ＴＸ），  Ｋｕｈｎｉ  ＵＳＡ  （Ｍｏｕｎｔ  Ｈｏｌｌｙ，  ＮＣ）を含む製造元から市販されている。通常、カラムは、所望の有効性を得るために蒸気／液体との接触を最大化するように設計されている。これは、カラムに、カラムに沿って一定間隔でパッキング物質、またはトレーのいずれかを装填することによって達成される。適切なパッキング物質としては、金属、ガラス、ポリマーおよびセラミック物質に基づく無作為タイプと構造タイプの両方が挙げられる。例示的な無作為パッキングタイプとしては、Ｒａｓｃｈｉｇ  ｒｉｎｇｓ，  Ｐａｌｌ  ｒｉｎｇｓ，  Ａ−ＰＡＫ  ｒｉｎｇｓ，  Ｓａｄｄｌｅ  ｒｉｎｇｓ，  Ｐｒｏ−Ｐａｋ，  Ｈｅｌｉ−Ｐａｋ，  Ｃｅｒａｍｉｃ  ｓａｄｄｌｅｓ  ａｎｄ  ＦＬＥＸＩＲＩＮＧＳ（登録商標）が挙げられる。構築パッキングとしては、ワイヤーメッシュおよび穿孔性金属プレートタイプ物質が挙げられる。カラムパッキング専門製造元としては、ＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ＆  Ｍａｓｓ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  （Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸ），  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｂｒｏｓ．  Ｍｅｔａｌ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｃｏ．  （Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  ＩＬ）  ａｎｄ  Ｋｏｃｈ  Ｇｌｉｔｓｃｈ，  Ｉｎｃ．  Ｋｎｉｇｈｔ  Ｄｉｖ．  （Ｅａｓｔ  Ｃａｎｔｏｎ，  ＯＨ）が挙げられる。ガスストリッピングカラムの有効性は、カラム内のプレートの理論的なプレートの高さおよび総数に関して表される。通常、理論的なプレート数値が高いほど、カラムの有効性は高い。実験室規模のカラムは、Ａｃｅ  Ｇｌａｓｓ  （Ｖｉｎｅｌａｎｄ，  ＮＪ），  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）およびＣｈｅｍｇｌａｓｓ  （Ｖｉｎｅｌａｎｄ，  ＮＪ）から購入できる。適切なタイプのガラス製カラムとしては、Ｖｉｇｒｅｕｘ、Ｓｎｙｄｅｒ、ＨｅｍｐｌｅおよびＰｅｒｆｏｒａｔｅｄプレートタイプカラムが挙げられる。カラムは、パッキング材料を含むこともでき、蒸気／液体接触を最大化するように設計された特徴を含むこともできる。実験室規模のガス洗浄器単位（パーツ番号ＣＧ−１８３０−１０）は、Ｃｈｅｍｇｌａｓｓから入手可能であり、パックしたガラス製カラム、溶媒容器および溶媒再利用ポンプからなる。
【０３６８】
第２のカラム２４（例えば、ポート２６に存在する）から精製されたイソプレン組成物は、任意の適切な手段により（例えば、還流コンデンサー３４および／または吸着系３６、例えば、シリカ吸着系を用いて）、さらに精製し得る。還流は、イソプレン産物中の溶媒組成物を還元する。イソプレン希薄液は、（例えば、図１６９ポート３０に示すように）再利用のために第１のカラムに戻して再循環させ得る。イソプレン希薄液は、第１のカラム１４への再利用前に任意の適切な手段により（例えば、液体−液体抽出および／または吸着系３２、例えば、シリカ吸着系により）精製して、生体副産物の量を減らし得る。追加的に、イソプレン希薄液の温度は、第１のカラム１４への再利用前（例えば、任意選択的にイソプレン溶液の精製前、精製と同時、および／または精製後）に任意の適切な手段により低下させ得る。図１６９に、イソプレン希薄液の精製前のポート４０におけるイソプレン希薄液の温度低下の例（この場合、温度を低下させるための冷却液を使用）を示す。
【０３６９】
大部分の揮発性不純物を含む蒸気（例えば、図１６９のポート２０から出る蒸気）は、少量のイソプレン（例えば、イソプレンの豊富な溶液中に残らない残存イソプレン）を含み得る。残存イソプレンは、使用のため、大部分の揮発性不純物を含む蒸気から任意の適切な手段（例えば、吸着系３８、例えば、活性炭吸着系）により再回収し得、場合により、図１６９に示すように、精製されたイソプレン組成物と組み合わせ得る（例えば、追加の精製、例えば、系３６に類似している吸着系の前、間、または後）。図１６９には、蒸気から大気（例えば、ＣＯ２）中に放出された望ましくない成分量を減らすことができる任意選択的な捕獲機器４２（例えば、熱酸化剤および／またはＣＯ２捕獲系）も示す。
【０３７０】
イソプレンの例示的な化学的変換
現在のイソプレンの産業的使用の大部分は合成ゴムの産出であるが、イソプレンは反応性の抱合体化ジエンであり、種々の化学的変換を経て、酸素化物およびより高い分子量の炭化水素を形成する。例えば、パラジウム（０）錯体（Ｐｄ（ａｃａｃ）２−Ｐｈ３ＰおよびＰｄ（ＯＡｃ）２−Ｐｈ３Ｐ）はアルコール溶媒中のイソプレンの二量体化および短鎖重合化を触媒して、線状イソプレン二量体（例えば２，７−ジメチル−１，３，７−オクタトリエン）およびメトキシジメチルオクタジエンを得る（Ｚａｋｈａｒｋｉｎ，  Ｌ．  Ｉ．  ａｎｄ  Ｂａｂｉｃｈ，  Ｓ．  Ａ．  Ｒｕｓｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｕｌｌ．  （１９７６），  ｐｐ  １９６７−１９６８）。Ａｄａｍｓ，  Ｊ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｃｌａｐｐ，  Ｔ．  Ｖ．  （Ｃｌａｙ  ａｎｄ  Ｃｌａｙ  Ｍｉｎｅｒａｌｓ  （１９８６），  ３４（３），  ２８７−２９４）は、イソプレン二量体およびメタノールとの付加物を得るための、２価および３価転移金属交換モンモリロナイト（例えばＣｒ３＋−モンモリロナイト）上のイソプレン反応について報告している。Ｎｉ（０）−アミノ亜ホスフィン酸系により触媒化されたイソプレンの線状二量体化はｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ型の位置選択的線状二量体に至り、競合的シクロ二量体化反応によって達成される（Ｄｅｎｉｓ，  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ；  Ｃｒｏｉｚｙ，  Ｊｅａｎ  Ｆｒａｎｃｏｉｓ；  Ｍｏｒｔｒｅｕｘ，  Ａｎｄｒｅ；  Ｐｅｔｉｔ，  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  （１９９１），  ６８（２），  １５９−７５．    Ｄｅｎｉｓ，  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ；  Ｊｅａｎ，  Ａｎｄｒｅ；  Ｃｒｏｉｚｙ，  Ｊｅａｎ  Ｆｒａｎｃｏｉｓ；  Ｍｏｒｔｒｅｕｘ，  Ａｎｄｒｅ；  Ｐｅｔｉｔ，  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （１９９０），  １１２（３），  １２９２−４）。新規キラルアミノ亜ホスフィン酸リガンド、例えば、（＋）−ＭｅＣＨ２ＣＨＭｅＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２ＯＰＰｈ２がイソプレンの線状二量体化における同種の触媒として調査され、５０％以上の変換率に至った（Ｍａｓｏｔｔｉ，  Ｈｅｎｒｉｅｔｔｅ；  Ｐｅｉｆｆｅｒ，  Ｇｉｌｂｅｒｔ；  Ｓｉｖ，  Ｃｈｈａｎ；  Ｃｏｕｒｂｉｓ，  Ｐｉｅｒｒｅ；  Ｓｅｒｇｅｎｔ，  Ｍｉｃｈｅｌｌｅ；  Ｐｈａｎ  Ｔａｎ  Ｌｕｕ，  Ｒｏｇｅｒ，  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｄｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｅｓ  Ｃｈｉｍｉｑｕｅｓ  Ｂｅｌｇｅｓ  （１９９１），  １００（１），  ６３−７７）。
【０３７１】
ポリマー化阻害剤としてのジニトロクレゾールの存在下、１１０〜２５０℃でイソプレンの熱二量体化により高収率の二量体およびわずかなポリマーを得た（米国特許第４，９７３，７８７号）。イソプレンのＮｉ触媒化二量体化により、８０％の１，５−ジメチル−１，５−シクロオクタジエンおよび２０％の１，６−ジメチル−１，５−シクロオクタジエンからなるジメチル−１，５−シクロオクタジエン混合物を得る（Ｄｏｐｐｅｌｔ，  Ｐａｓｃａｌ；  Ｂａｕｍ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｈ．；  Ｒｉｃａｒｄ，  Ｌｏｕｉｓ，    Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９９６），  ３５（５），  １２８６−９１）。
イソプレンは、触媒量のＣｐ＊Ｒｕ（η４−イソプレン）ＣｌおよびＡｇＯＴｆでジメチルシクロオクタジエンに変換される（Ｉｔｏｈ，  Ｋｅｎｊｉ；  Ｍａｓｕｄａ，  Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；  Ｆｕｋａｈｏｒｉ，  Ｔａｋａｈｉｋｏ；  Ｎａｋａｎｏ，  Ｋａｔｓｕｍａｓａ；  Ａｏｋｉ，  Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；  Ｎａｇａｓｈｉｍａ，  Ｈｉｄｅｏ，  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  （１９９４），  １３（３），  １０２０−９）。
日本国特許第５９０６５０２６Ａ号（１９８４年）は、Ｆｅカルボキシレートもしくはβ−ジケトン化合物、有機−ＡｌもしくはＭｇ化合物、ならびに電子供与基を有する２，２’−ジピリジル誘導体を含む触媒存在下のイソプレンの環状二量体化による１，６−ジメチル−１，５−シクロオクタジエンの調製について報告している。Ｎｉカルボキシレートもしくはβ−ケトン、有機アルミニウムもしくは有機マグネシウム化合物ならびに置換したトリフェニル亜リン酸を含む３成分触媒上でのイソプレンのシクロ二量体化によりジメチルシクロオクタジエンを調製した（日本国特許第５８０５５４３４Ａ号、１９８３年）。Ｆｅ（３）塩、有機アルミニウム化合物および活性化因子を含む同種の触媒の存在下（ソ連特許第６１５０５６Ａ１号、１９７８年）、Ｎｉアセチルアセトネート、亜リン酸トリアリールおよびペルヒドロアルモフェノレンを含む同種の触媒の存在下（ソ連特許第４９３４５５Ａ１号、１９７５年）、ＮｉカルボキシレートまたはＮｉと１−ヒドロキシ−３−カルボニル化合物のカルボキシレートもしくはキレート化合物の混合物、トリアルキルアルミニウム、ジアルキルマグネシウムまたは抱合体化ジエンおよびＭｇ、亜リン酸トリアリールおよび三次アミンから得られる活性有機−Ｍｇ化合物を含む触媒の存在下（日本国特許第４８０６４０４９Ａ号、１９７３年）、またはＮｉナフテン酸、Ｅｔ３Ａｌ、およびトリ−ｏ−クレシルホスファートからなる触媒の存在下において１００〜３００℃で不活性有機溶媒中のイソプレンをシクロ二量体化させて、１，５−ジメチル−１，５−シクロオクタジエンを調製した（Ｓｕｇａ，  Ｋ．；  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｓ．；  Ｆｕｊｉｔａ，  Ｔ．；  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔ．，  Ｉｓｒａｅｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９７２），  １０（１），  １５−１８）。米国特許第３，９５４，６６５号には、Ｆｅ、Ｃｏ、またはＮｉカルボニルと［（η３−Ｃ６Ｈ５）ＮｉＢｒ］２または［Ｍ（ＮＯ）２Ｘ］２（Ｍ＝Ｆｅ、Ｃｏ；Ｘ＝Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ）反応産物の存在下でのイソプレンの二量体化について開示されている。欧州特許第２４１１（１９８１）には、１−メチル−４−イソプロペニル−１−シクロヘキセンおよび２−メチル−４−イソプロペニル−１−シクロヘキセンならびに１，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセンおよび２，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセンを得るための、Ｆｅ（ＮＯ）２Ｃｌ−ビス（１，５−シクロオクタジエン）ニッケル触媒上、−５℃〜＋２０℃でのイソプレンのシクロ二量体化について開示されている。米国特許第４，１８９，４０３号には、トリス（置換したヒドロカルビル）亜リン酸、亜ヒ酸、もしくはアンチモナイトならびにＶＩＩＩ群金属（０）化合物（例えばＮｉアセチルアセトネート）の混合した触媒とイソプレンを接触させることによる１，５−ジメチル−１，５−シクロオクタジエンおよび１，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセンの調製について開示されている。Ｊａｃｋｓｔｅｌｌ，  Ｒ．；  Ｇｒｏｔｅｖｅｎｄｔ，  Ａ．；  Ｍｉｃｈａｌｉｋ，  Ｄ．；  Ｅｌ  Ｆｉｒｄｏｕｓｓｉ，  Ｌ．；  Ｂｅｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ��ｌｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．  （２００７）  ６９２（２１），  ４７３７−４７４４には、イソプレン二量体化のためのパラジウム／カルベン触媒の使用について引用されている。Ｂｏｗｅｎ，  Ｌ．；  Ｃｈａｒｅｒｎｓｕｋ，  Ｍ．；  Ｗａｓｓ，  Ｄ．Ｆ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （２００７）  ２８３５−２８３７は線状および環状イソプレン三量体の産出のためのクロムＮ，Ｎ−ビス（ジアリールホスフィノ）アミン触媒の使用について記載している。
【０３７２】
イソプレンはＮｉ触媒の存在下で二量体化して、ｃｉｓ−２−イソプロペニル−１−メチルビニルシクロブタンを生じることが報告されている（Ｂｉｌｌｕｐｓ，  Ｗ．  Ｅ．；  Ｃｒｏｓｓ，  Ｊ．  Ｈ．；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｃ．  Ｖ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （１９７３），  ９５（１０），  ３４３８−９）。電子供与体として様々な亜リン酸の存在下、ニッケルナフテン酸およびイソプレンマグネシウムにより触媒されたイソプレン［７８−７９−５］のオリゴマー化により、ジメチルシクロオクタジエン［３９８８１−７９−３］を含む環状二量体を得た；特に１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパン亜リン酸［３９８６５−１９−５］によりトリメチルシクロドデカトリエン［３９８８１−８０−６］を選択的に得た（Ｓｕｇａ，  Ｋｙｏｉｃｈｉ；  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｓｈｏｊｉ；  Ｆｕｊｉｔａ，  Ｔｓｕｔｏｍｕ；  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｔａｋａｓｈｉ，    Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （１９７３），  ２３（２），  １３１−８）。ＷＯ２００６／０５１０１１号は、Ｎｉおよび／もしくはＴｉ、１以上の有機金属化合物、ならびにＶＡ群化合物を含む触媒系の存在下のイソプレンの三量体化による（この反応は、水酸基含有溶媒で行なわれる）、香料および芳香剤に有用なトリメチルシクロドデカトリエンの調製について開示している。Ｌｉｇａｂｕｅ，  Ｒ．  Ａ．；  Ｄｕｐｏｎｔ，  Ｊ．；  ｄｅ  Ｓｏｕｚａ，  Ｒ．  Ｆ．，  Ａｌｅｇｒｅ，  Ｒ．Ｓ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔ．  Ａ：  Ｃｈｅｍ．  （２００１），  １６９（１−２），  １１−１７は、イオン性液体中で鉄ニトロシル触媒を用いたイソプレンの６員環二量体への選択的二量体化について記載している。Ｈｕｃｈｅｔｔｅ，  Ｄ．；  Ｎｉｃｏｌｅ，  Ｊ．；  Ｐｅｔｉｔ，  Ｆ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  （１９７９），  （１２），  １０３５−８は、鉄ニトロシル触媒の電気化学生成および続くイソプレンのシクロヘキセン二量体への二量体化のための使用について記載している。Ｚａｋｈａｒｋｉｎ，  Ｌ．  Ｉ．；  Ｚｈｉｇａｒｅｖａ，  Ｇ．  Ｇ．；  Ｐｒｙａｎｉｓｈｎｉｋｏｖ，  Ａ．  Ｐ．  Ｚｈｕｒｎａｌ  Ｏｂｓｈｃｈｅｉ  Ｋｈｉｍｉｉ  （１９８７），  ５７（１１），  ２５５１−６は、錯体ニッケルおよび鉄触媒上のイソプレンのシクロオリゴマー化について記載している。
【０３７３】
本明細書に記載の高純度イソプレン出発組成物は、引用された参考文献に開示の各触媒系および反応条件を用いて化学的変換される。当該技術分野で公知である他の触媒および反応条件、例えば、１，３−ブタジエンの化学的変換に適用される触媒および反応条件は、当業者によってイソプレン出発組成物に適用できる。
【０３７４】
二量体化および三量体化
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、触媒的化学的変換を経て、二量体および三量体を生じる。触媒系は、当該技術分野で公知である方法を用いて同定される。好ましい触媒としては、イソプレンを高い効率で二量体および三量体に変換する上で公知のものが挙げられる。例としては、パラジウム、ニッケル、コバルト、鉄およびクロムベースのものが挙げられる。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、熱もしくは触媒的二量体化を経る。出発組成物を圧力下で加熱することにより、イソプレン出発組成物を不飽和６および８員環を含む二量体の混合物に変換する。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物を圧力下で約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５もしくは２５０℃またはそれより高温に加熱する。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、抗酸化剤（例えば２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）の存在下で加熱してラジカル媒介性ポリマー化を予防する。いくつかの実施形態では、反応は、イソプレンの環状二量体化を触媒するための当該技術分野で公知である触媒（例えば、米国特許第４，１４４，２７８号、第４，１８１，７０７号、第５，５４５，７８９号および欧州特許第０３９７２６６Ａ２号に記載の鉄ニトロシルハロゲン化触媒）から選択される１以上の触媒により加速する。イオン性液体中の鉄ニトロシル触媒の使用については、Ｌｉｇａｂｕｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  １６９  （２），  １１−１７により記載されている。触媒の例としては、限定するものではないが、Ｆｅ（ＮＯ）２Ｃｌ２およびＣｒ３＋−モンモリロナイトが挙げられる。別の例では、イソプレン出発組成物は、ルテニウム触媒を用いてＣ１０環状二量体（例えばジメチル−シクロオクタジエンの混合物）に変換する（Ｉｔｏｈ，  Ｋｅｎｊｉ；  Ｍａｓｕｄａ，  Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；  Ｆｕｋａｈｏｒｉ，  Ｔａｋａｈｉｋｏ；  Ｎａｋａｎｏ，  Ｋａｔｓｕｍａｓａ；  Ａｏｋｉ，  Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；  Ｎａｇａｓｈｉｍａ，  Ｈｉｄｅｏ，  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  （１９９４），  １３（３），  １０２０−９）。
【０３７６】
特定の実施形態では、液体状態のイソプレン出発組成物は、圧力下、抗酸化剤の存在下で１００℃超に加熱して、６および８員環、例えば、リモネン（１−メチル−４−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−−１−エン）、１−メチル−５−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−−１−エン、１，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、２，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、１，５−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、１，６−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、２，６−ジメチル−１，３−シクロオクタジエン、２，６−ジメチル−１，４−シクロオクタジエン、３，７−ジメチル−１，５−シクロオクタジエン、３，７−ジメチル−１，３−シクロオクタジエン、３，６−ジメチル−１，３−シクロオクタジエン、ならびにＯｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  （１９９４），  １３（３），  １０２０−９に記載されている他の８員環イソプレン二量体を含む二量体の混合物を産出する。これらの化合物の立体異性体を全て意図する。イソプレンの二量体への変換を、望ましくない反応産物の産出を避けるように酸素の不在下で最良に実施する。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、光二量体化を経て、４員環二量体を生じる。イソプレン出発組成物は、１以上の１，２−ジ（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１，３−ジ（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−ビニル−３−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−ビニル−２−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１，３−ジメチル−１，３−ジビニルシクロブタン、１，２−ジメチル−１，２−ジビニルシクロブタンおよびその立体異性体を含む混合物への光照射により変換される。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発材料は、触媒（例えばニッケル触媒）または光増感剤（例えばベンゾフェノン）の存在下で二量体化され、６および８員環に加えて４員環二量体、例えばｃｉｓ−２−イソプロペニル−１−メチルビニルシクロブタン、を生じる［Ｈａｍｍｏｎｄ，  Ｊ．Ｓ．  ；Ｔｕｒｒｏ，  Ｎ．Ｊ．  ；  Ｌｉｕ，  Ｒ．Ｓ．Ｈ．  （１９６３）  “Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ．  ＸＶＩ．  Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｄｉｅｎｅｓ．”  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ２８，  ３２９７−３３０３を参照されたい］。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、触媒系の存在下、環状三量体に変換する。いくつかの実施形態では、環状三量体は、トリメチルシクロドデカトリエンである。いくつかの実施形態では、触媒系は、ニッケル触媒を含む。いくつかの実施形態では、触媒系は、チタン化合物を含む。いくつかの実施形態では、触媒系は、ニッケル触媒およびチタン化合物を含む。いくつかの実施形態では、触媒系は、１以上の有機金属化合物、ならびにＶＡ群化合物を含む。いくつかの実施形態では、触媒的変換は、水酸基含有溶媒で行なわれる。特定の実施形態では、出発イソプレン組成物を、Ｎｉおよび／もしくはＴｉ、１以上の有機金属化合物、ならびにＶＡ群化合物を含む触媒系の存在下（この反応は、水酸基含有溶媒で行なわれる）、トリメチルシクロドデカトリエンに変換する。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、Ｃ２〜Ｃ５不飽和炭化水素処理によるＣ７〜Ｃ１４範囲内の炭化水素への熱もしくは触媒的変換を経る。Ｃ２〜Ｃ５炭化水素は、アルケン、ジエンまたはアルキンであることができる。例えば、いくつかの実施形態では、イソプレンは、エチレンおよび適切な触媒と接触させてＣ７化合物を産出する。別の実施形態では、イソプレンを１，３−ブタジエンと接触させて環状Ｃ９炭化水素を形成する。これらのＣ７〜Ｃ１４炭化水素の水素化は、ジェット燃料および他の航空燃料としての使用に適した組成物に至る。さらに別の実施形態では、イソプレンに由来する不飽和Ｃ７〜Ｃ１４炭化水素ならびに１以上の不飽和炭化水素は水素化を経て、ジェット燃料および他の航空燃料として、またはこのような燃料のための混合ストックとしての使用に適した芳香族誘導体を形成する。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料を、アルコール溶媒中で触媒系を用いて線状二量体と三量体の混合物に変換する。この反応もまた、メタノールまたはエタノール中で実施時にアルコキシ誘導体を産出する。いくつかの実施形態では、触媒系は、パラジウムベースの触媒系、例えば、パラジウムアセチルアセトネート−トリフェニルホスフィン系またはパラジウムアセタート−トリフェニルホスフィン系である。いくつかの実施形態では、アルコール溶媒は、メタノール、エタノールまたはイソプロピルアルコールである。産物の性質は、使用した触媒および溶媒による。例えば、パラジウムベースの触媒系、例えば、Ｐｄ（ａｃａｃ）２−Ｐｈ３ＰまたはＰｄ（ＯＡｃ）２−Ｐｈ３Ｐをイソプロピルアルコール溶媒に使用時、線状イソプレン二量体、例えば２，７−ジメチル−１，３，７−オクタトリエンおよび２，７−ジメチル−２，４，６−オクタトリエンが形成される。この反応をメタノール中で実施時、線状イソプレン二量体、例えば、ジメチルオクタトリエンに加えて、メトキシジメチルオクタジエン（例えば、１−メトキシ−２，７−ジメチル−２，７−オクタジエンおよび３−メトキシ−２，７−ジメチル−１，７−オクタジエン）が形成される。一部の反応は、線状イソプレン三量体、例えば、α−ファルネセン（３，７，１１−トリメチル−１，３，６，１０−ドデカテトラエン）、β−ファルネセン（７，１１−ジメチル−３−メチレン−１，６，１０−ドデカトリエン）および他の位置異性体（例えばｔａｉｌ−ｔｏ−ｔａｉｌ型およびｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ型のイソプレン単位の添加）を産出する。別の例では、イソプレンは、クロムＮ，Ｎ−ビス（ジアリールホスフィノ）アミン触媒を用いて線状および環状Ｃ１５三量体に変換する（Ｂｏｗｅｎ，  Ｌ．；  Ｃｈａｒｅｒｎｓｕｋ，  Ｍ．；  Ｗａｓｓ，  Ｄ．Ｆ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （２００７）  ２８３５−２８３７）。
【０３８１】
酸素化物への変換
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、酸触媒の存在下、エタノールおよび他のアルコールとの反応により燃料酸素化物に変換する。一実施形態では、酸触媒は硫酸である。別の実施形態では、酸触媒は固相硫酸（例えば、Ｄｏｗｅｘ  Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標））である。他の触媒としては、液相と固相の両方のフルオロスルホン酸、例えば、トリフルオロメタンスルホン酸およびナフィオン−Ｈ（ＤｕＰｏｎｔ）が挙げられる。リモネンおよび関連モノテルペンのメトキシル化のため、ゼオライト触媒、例えばベータ−ゼオライトも、Ｈｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ［Ｈｅｎｓｅｎ，  Ｋ．；  Ｍａｈａｉｍ，  Ｃ．；  Ｈｏｌｄｅｒｉｃｈ，  Ｗ．Ｆ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：  Ｇｅｎｅｒａｌ  （１９９７）  １４０（２），  ３１１−３２９．］により記載されているものに類似している条件下で使用できる。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発材料は、水酸化／エステル化プロセスもしくは当該技術分野で公知である他のアルケン反応、例えば過酸、例えば、過酢酸および３−クロロ過安息香酸とのエポキシ化への過酸化；ならびに水和によりアルコールおよびエステルに変換して、ｉ）水および酸触媒ならびにｉｉ）ヒドロホウ素化反応方法でアルコールおよびジオールを得る。このような反応については、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ２００７に記載されている。図３および４に出発イソプレン組成物から産出できるアルコールおよび酸素化物の例を示す。
【０３８２】
一部水素化
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、モノ−オレフィン（例えば２−メチルブタ−１−エン、３−メチル−ブタ−１−エンおよび２−メチルブタ−２−エン）に部分的に水素化する。いくつかの実施形態では、モノ−オレフィンは、例えば、イソブチレンをイソオクタンに変換する上で使用される従来の炭化水素カチオン触媒作用を用いて二量体化または他のオレフィンとの反応を経る。例えば、Ｈ．Ｍ．  Ｌｙｂａｒｇｅｒ．  Ｉｓｏｐｒｅｎｅ  ｉｎ  Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９５），  １４，  ９３４−９５２を参照されたい。いくつかの好ましい実施形態では、高純度イソプレン出発材料はＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、一部水素化を経て、モノ−オレフィン（例えば２−メチルブタ−１−エン、３−メチル−ブタ−１−エンおよび２−メチルブタ−２−エン）を形成する。いくつかの好ましい実施形態では、高純度イソプレン出発材料はＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。いくつかの実施形態では、イソプレン出発材料の一部水素化は、イソペンタンへの変換を最小限に抑えて低い残存イソプレンレベルで高収率のモノ−オレフィンを産出する。いくつかの実施形態では、低い残存イソプレンレベルでモノ−オレフィンとイソペンタンの混合物を産出する。いくつかの実施形態では、一部水素化は、特定のモノ−オレフィン、例えば、２−メチルブタ−２−エン、２−メチルブタ−１−エン、または３−メチルブタ−１−エンが選択的に産出される選択的水素化である。好ましい水素化触媒は高い触媒活性をもたらし、経時的な触媒活性を維持し、イソプレンのモノ−オレフィンへの変換に対する選択性が高い。
【０３８４】
イソプレン出発組成物の一部水素化に適した触媒は、白金群金属、例えば、白金、パラジウム、ロジウム、もしくはルテニウム、または遷移金属、例えば、ニッケル、コバルト、銅、鉄、モリブデン、または貴金属、例えば、元素形態の銀もしくは金、または有機リガンドと無機リガンドの塩もしくは錯体を含み得る。これらの金属の合金も、一部の状況において使用することができる。これらの金属およびそれらの誘導体は、純粋であることもでき、他の活性および不活性物質と混合していることもできる。触媒は、効果的な表面領域を最大化するために支持体物質（例えば、活性炭、アルミナ、またはシリカ）に吸着させ得る。水素化触媒の物理的形態学は、それらの実施に対してかなりの影響を有することが知られている。好ましい水素化触媒としては、支持体物質に対して０．１％Ｐｄ〜２０％Ｐｄ（ｗ／ｗ）の範囲のグレードの異種パラジウム触媒、例えば、炭素上のパラジウム（Ｐｄ／Ｃ）、アルミナ上のパラジウム（Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３）、またはシリカ上のパラジウム（Ｐｄ／ＳｉＯ２）が挙げられる。適切な選択的水素化触媒の例は、アルミナ上の硫黄耐性促進ＰｄであるＬＤ  ２７７３である（Ａｘｅｎｓ，  Ｒｕｅｉｌ−Ｍａｌｍａｉｓｏｎ  Ｃｅｄｅｘ，  Ｆｒａｎｃｅ）。イソプレンのイソアミレンへの変換を、イソペンタンへの変換を最小限に抑えて行なうことができる一部水素化触媒としては、リンドラー触媒（キノリンで処理したＰｄ／ＢａＳＯ４）、第１５族元素（Ｎ、Ｐ、Ａｓ）のトリフェニル誘導体で処理したＰｄ／Ｃ、硫黄含有化合物で処理したＰｄ／Ｃ、モリブデン硫化物、およびＰｄ／Ｆｅ合金が挙げられる。１つの好ましい触媒は、卵殻アルミナ（δ−Ａｌ２Ｏ３）に吸着したパラジウムを含む。熱分解ガソリンからのジオレフィンおよびアルキンの除去のために製油業界において使用される触媒、例えばＮｉ／Ａｌ２Ｏ３およびＰｄ／Ａｌ２Ｏ３ベースの触媒が特に好ましい。イソプレンのイソアミレンへの変換に適した別の触媒クラスは、産業において熱分解ガソリンの水素処理に使用されるものである。例えば米国特許第７，０１４，７５０号および第６，９９４９，６８６号、ならびに引用された参考文献を参照されたい。通常、熱分解ガス水素処理に使用される触媒は、アセチレンおよびジオレフィン（例えばイソプレンおよびピペリレン）のモノオレフィンへの選択的変換を可能とする。
【０３８５】
水素源は、水素ガス（Ｈ２）、ギ酸、ヒドラジン、またはイソプロパノールが挙げられるが、これらに限定されない水素ガスまたは水素源であることができる。水素源は、化学的に引き出すこともでき、生物学的に引き出すこともできる。いくつかの実施形態では、水素化のために使用される水素は、発酵中にイソプレンと共産出される。水素化は、０．５ａｔｍ〜２００ａｔｍの範囲、またはより高い水素圧で実施できる。温度は０℃〜２００℃の範囲であることができる。
【０３８６】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物の一部水素化からの産物は、出発イソプレン組成物に元々存在するある不純物（例えば、アセトン、エタノール、アミルアルコール、エチルアセタート、イソアミルアセタート、メチルエチルケトンおよび他の飽和極性不純物および／または不純物の水素化した誘導体、）を含むことが予期される。
【０３８７】
いくつかの実施形態では、イソプレン出発組成物は、パラジウム触媒の存在下、一部水素化または選択的水素化を経る。例えば、パラジウム触媒、例えば、Ｐｄ／ＣａＣＯ３、Ｐｄ／ＢａＳＯ４、Ｐｄ／Ｃ、Ｐｄブラック、Ｐｄ／ＳｉＯ３、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３、またはＰｄ／ＳｉＯ２は完全に還元されたＣ５アルカンに対し９５％超の選択性でイソプレンをモノ−オレフィンに変換したことが示された。これらのパラジウム触媒の使用は、３−メチルブタ−１−エンに対する最大選択性を有する５％Ｐｄ／ＣａＣＯ３および２−メチルブタ−２−エンに対する最大選択性を有する５％のＰｄ／ＳｉＯ２とモノ−オレフィン産物の混合物を生じる。（Ｇ．Ｃ．  Ｂｏｎｄ  ａｎｄ  Ａ．Ｆ．  Ｒａｗｌｅ．    Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  １０９  （１９９６）  ２６１−２７１を参照されたい）。ＢｏｎｄおよびＲａｗｌｅは、パラジウム−金およびパラジウム−銀触媒（例えば、Ｐｄ−Ａｕ／ＳｉＯ２およびＰｄ−Ａｇ／ＳｉＯ２）が完全に還元されたＣ５アルカンによりも高い選択性でイソプレンをモノ−オレフィンへ還元することも示している。いくつかの実施形態では、シリカ支持ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー−パラジウム錯体が環状および非環状ジエンのモノ−オレフィン異性体の混合物への還元を選択的に触媒するために使用されている。様々なモノ−オレフィン異性体に対する選択性は、触媒に使用される正確なＰＡＭＡＭリガンドに応じた（Ｐ．Ｐ．  Ｚｗｅｎｉ  ａｎｄ  Ｈ．  Ａｌｐｅｒ．    Ａｄｖ．  Ｓｙｎｔｈ．  Ｃａｔａｌ．  ３４８  （２００６）  ７２５−７３１を参照されたい）。いくつかの実施形態では、イソプレンのモノ−オレフィンへの還元は、触媒として無機支持体（例えば、金属ゼオライト）上でＶＩＢ群金属を用いて実行できる。例えば、Ｍｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒を用いて１，３−ブタジエンをそれぞれのモノ−オレフィンに選択的に還元する（米国特許第６，２３５，９５４Ｂ１号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、イソプレンは、ＩＢ、ＶＩＢ、ＶＩＩＢ、または亜鉛群からの金属により促進されたＶＩＩＩ群金属触媒を用いてモノ−オレフィンに還元し、触媒毒を減らすことができる（米国特許第６，９４９，６８６Ｂ２号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、イソプレンは、ハニカム配置であり得る一体化した触媒床を用いてモノ−オレフィンに還元できる。一体化した触媒床のための触媒支持体物質としては、金属、例えば、ニッケル、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、銀、鉄、銅、コバルト、クロム、イリジウム、スズ、ならびにその合金もしくは混合物を挙げ得る。（米国特許第７，０１４，７５０Ｂ２号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、イソプレンは、特に反応に水を含まない場合、卵殻Ｐｄ／δ−Ａｌ２Ｏ３触媒を用いてモノ−オレフィンに還元できる。卵殻Ｐｄ／δ−Ａｌ２Ｏ３触媒は、完全に還元されたアルカンよりも、モノ−オレフィンに対して選択的であり、２−メチルブタ−２−エンは、熱力学的に良好な異性体である。（Ｊ．−Ｒ．  Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．−Ｈ．  Ｃｈｅｎｇ．    Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ３６  （１９９７）  ４０９４−４０９９を��照されたい）。
【０３８８】
軽オレフィン（Ｃ３〜Ｃ６）は、酸触媒を用いて容易に二量体化して、ダイメートとしても知られているより高級なオレフィン（Ｃ６〜Ｃ１２）を得ることができる。例えば、イソブチレン（２−メチルプロペン）のイソオクテンへの変換は、硫酸、リン酸および他の鉱酸、スルホン酸、フルオロスルホン酸、ゼオライトおよび酸性粘土を含む種々の酸触媒を用いて、当該技術分野で十分に記載されている。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、イソプレン出発組成物は、一部水素化または選択的水素化を経て、モノ−オレフィンを形成し、このモノ−オレフィンは、例えば、イソブチレンをイソオクタンに変換するために使用される従来の炭化水素カチオン触媒、例えば硫酸、リン酸および他の鉱酸、スルホン酸、フルオロスルホン酸、ゼオライトおよび酸性粘土を用いて、他のオレフィンとの二量体化または反応を経る。例えば、Ｈ．Ｍ．  Ｌｙｂａｒｇｅｒ．  Ｉｓｏｐｒｅｎｅ  ｉｎ  Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  ｅｄ．，  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９５），  １４，  ９３４−９５２を参照されたい。いくつかの好ましい実施形態では、高純度イソプレン出発材料はＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。液体と固体の両形態の酸触媒を使用できる。酸樹脂が好ましく、これには、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ１５、３５、ＸＥ５８６、ＸＮ１０１０（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）および類似の酸性イオン交換樹脂が挙げられる。培地間隙酸分子シーブ、例えば、ＺＳＭ−５、フェリエライト、ＺＳＭ−２２およびＺＳＭ−２３を含む中径細孔モレキュラーシーブも好ましい触媒である。
【０３９０】
いくつかの実施形態では、イソプレン出発組成物は、一部水素化または選択的水素化を経て、イソアミレンを形成する。いくつかの実施形態では、イソアミレンを二量体化して、Ｃ１０ダイメート、例えば、イソデセンを得る。いくつかの実施形態では、イソアミレンをオレフィン、例えば、プロピレン、ブタンまたはイソブテンと二量体化して、Ｃ８〜Ｃ１０ダイメートを得る。いくつかの実施形態では、モノ−オレフィンは、樹脂触媒（例えば、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ３５、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ１５、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  ＸＮ１０１０、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  ＸＥ５８６）を用いて二量体化を経て、ジイソアミレンを産出する。このような樹脂触媒の使用は、クラッキングおよびさらなるオリゴマー化反応を最小限に抑え、最適条件下で樹脂触媒は、８％未満の三量体形成を伴う９２％超の二量体に対する選択性を提供することが示されている。例えば、Ｍ．  Ｍａｒｃｈｉｏｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｄａｙ  ６５  （２００１）  ３９７−４０３を参照されたい。いくつかの実施形態では、モノ−オレフィンは、酸性メソポーラスモレキュラーシーブ、例えば、ゼオライト構造に組み込まれているメソポーラスシーブ、ＺＳＭ−５、フェリエライト、ＺＳＭ−２２、またはＺＳＭ−２３を含む触媒物質を用いて二量体化を経る。特定の実施形態では、触媒物質は、高温（例えば、少なくとも９００℃）で熱的に安定している。別の特定の実施形態では、モノ−オレフィンは、多不飽和炭化水素、例えば、イソプレンを実質的に含まない。二量体化のための酸性メソポーラス分子シーブを含む触媒物質の使用は、８０％超の二量体に対する選択性をもたらすことができる。例えば、米国特許第２００７／０１９１６６２Ａ１号を参照されたい。いくつかの実施形態では、モノ−オレフィンは、固体酸性触媒（例えば、固体リン酸触媒、酸性イオン交換樹脂）を用いて二量体化を経る。固体リン酸触媒を用いた二量体に対する選択性は、少なくとも７５％、少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％であることができる。例えば、米国特許第２００９／００９９４００Ａ１号および米国特許第６，６６０，８９８Ｂ１号を参照されたい。
【０３９１】
効率的な二量体化は、しばしば極性成分（１以上）、例えば、供給ストリーム内の水および酸化化合物の存在を必要とし得る。例としては、アルコール、例えば、メタノール、エタノールおよびｔ−ブタノール、エーテル、例えば、メチルｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）およびメチルｔ−アミルエーテル（ＴＡＭＥ）またはエステル、例えば、Ｃ１〜Ｃ５アセタートが挙げられる。いくつかの実施形態では、イソアミレンは、酸触媒の存在下でアルコール処理によりエーテル、例えば、ＴＡＭＥに変換できる。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかの方法により産出されたモノ−オレフィンのＣ１０二量体は、（例えば、水素化により）完全飽和Ｃ１０アルキル化に還元できる。特定の実施形態では、イソプレンまたはモノ−オレフィンは、酸成分を含む触媒、例えば、硫酸、フルオロスルホン酸、過ハロアルキルスルホン酸、イオン性液体、またはポリマー成分、例えば、ポリアクリル酸と混合したブレーンステッド酸とルイス酸の混合物を用いてアルキレートに還元できる。（米国特許第２０１０／００９４０７２Ａ１号を参照されたい）。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発材料は、酸触媒の存在下でオリゴマー化を経て、二量体、三量体、より高いオリゴマー、芳香族産物、および／またはポリマー性産物を産出する。ゴム形成およびコーキングは触媒の脱活性化に至ることが既知の課題であるが、反応物の動力学的制御は、ある産物、例えばより低いオリゴマーに有利であることができる。
【０３９４】
例示的な不飽和イソプレン誘導体
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出するための組成物および系はさらに、イソプレン出発組成物の燃料構成要素への化学的変換のための不飽和炭化水素または酸素化中間体を含む。いくつかの実施形態では、不飽和炭化水素中間体は、１，２−ジ（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１，３−ジ（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−ビニル−３−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−ビニル−２−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１，３−ジメチル−１，３−ジビニルシクロブタン、１，２−ジメチル−１，２−ジビニルシクロブタン、１−メチル−４−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−１−エン）、１−メチル−５−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−１−エン、１，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、２，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、１，５−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、１，６−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、１，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセン、２，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセン、２，７−ジメチル−１，３，７−オクタトリエン、２，７−ジメチル−２，４，６−オクタトリエン、２，６−ジメチル−１，３−シクロオクタジエン、２，６−ジメチル−１，４−シクロオクタジエン、３，７−ジメチル−１，５−シクロオクタジエン、３，７−ジメチル−１，３−シクロオクタジエンおよび３，６−ジメチル−１，３−シクロオクタジエンからなる群から選択される１以上の不飽和イソプレン二量体を含む。いくつかの実施形態では、不飽和炭化水素中間体は、１以上の不飽和三量体、例えば、α−ファルネセン、β−ファルネセン、トリメチルシクロドデカトリエン（例えば１，５，９−トリメチル−（１Ｅ，５Ｅ，９Ｅ）−シクロドデカトリエンならびにその位置および幾何学的異性体）およびトリメチルドデカテトラエンなどを含む。いくつかの実施形態では、不飽和酸素化中間体は、１以上の不飽和メチルエーテル、例えば、１−メトキシ−２，７−ジメチル−２，７−オクタジエンおよび３−メトキシ−２，７−ジメチル−１，７−オクタジエンなどを含む。いくつかの実施形態では、不飽和酸素化中間体は、１以上の不飽和エチルエーテル、例えば、エチル３−メチル−３−ブテニルエーテル、エチル１，１−ジメチル−２−プロペニルエーテル、エチル１，２−ジメチル−２−プロペニルエーテル、エチル２−メチル−３−ブテニルエーテルなどを含む。いくつかの実施形態では、不飽和酸素化中間体は、１以上の不飽和アルコール、例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オール、２−メチル−３−ブテン−２−オール、３−メチル−３−ブテン−２−オール、２−メチル−３−ブテン−１−オールなどを含む。いくつかの実施形態では、不飽和酸素化中間体は、１以上の不飽和エステル、例えば、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、２−メチル−３−ブテン−２−イルアセタート、３−メチル−３−ブテン−２−イルアセタート、２−メチル−３−ブテン−１−イルアセタートおよび他のＣ３〜Ｃ１８脂肪族カルボン酸のエステルを含む。いくつかの実施形態では��不飽和炭化水素中間体は、１以上のイソアミレン、例えば２−メチルブタ−１−エン、３−メチル−ブタ−１−エンおよび２−メチルブタ−２−エンを含む。いくつかの実施形態では、不飽和炭化水素中間体は、イソアミレンの二量体化から得られる１以上のジイソアミレンを含む。
スキームＩ．不飽和６および８員環中間体の例
【化１】
0005448220.tif 000006
スキームＩＩ．不飽和４員環中間体の例
【化２】
0005448220.tif 000007
スキームＩＩＩ．不飽和イソプレン短鎖重合体および酸素化中間体の例
【化３】
0005448220.tif 000008
スキームＩＶ．不飽和エチルエーテル中間体の例
【化４】
0005448220.tif 000009
スキームＶ．不飽和アルコール中間体の例
【化５】
0005448220.tif 000010
スキームＶＩ．不飽和エステル中間体の例
【化６】
0005448220.tif 000011
【０３９５】
例示的な不飽和中間体の水素化
不飽和イソプレン誘導体は、水素化触媒の存在下で水素化に供して飽和化合物を産出する。飽和化合物は特性化して、それらの燃料としての値を評価する。いくつかの実施形態では、水素化のための水素源は水素ガスである。いくつかの実施形態では、水素ガスは、米国仮特許出願第６１／１４１，６５２号（２００８年１２月３０日出願）および米国特許第２００９／０２０３１０２Ａ１号に記載されているＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅと共産出する。いくつかの実施形態では、水素化触媒は、パラジウムベースの触媒、例えば、Ｐｄ／Ｃ（例えば５％（重量）Ｐｄ／Ｃ）である。いくつかの実施形態では、水素化触媒は、ラネーニッケル触媒である。いくつかの実施形態では、水素化触媒は、同種触媒、例えば、ルテニウムまたはロジウムベースの同種水素化触媒である。いくつかの実施形態では、不飽和イソプレン二量体および三量体を水素化して、燃料作製に適した飽和Ｃ１０およびＣ１５炭化水素を産出する。いくつかの実施形態では、不飽和環状二量体を水素化して、飽和環状Ｃ１０炭化水素、例えば、１，２−ビス（イソプロピル）シクロブタン、１，２−ビス（イソプロピル）シクロブタン、１−メチル−４−イソプロピルシクロヘキサン、１−メチル−３−イソプロピルシクロヘキサン、１−エチル−１，４−ジメチルシクロヘキサン、１−エチル−１，３−ジメチルシクロヘキサン、１，５−ジメチルシクロオクタンおよび１，４−ジメチルシクロオクタンを産出する。いくつかの実施形態では、不飽和環状三量体を水素化して、飽和環状Ｃ１５炭化水素、例えば、１，５，９−トリメチルシクロドデカンおよび１，５，１０−トリメチルシクロドデカンを産出する（スキームＶＩＩを参照）。いくつかの実施形態では、不飽和線状二量体を水素化して、飽和脂肪族Ｃ１０炭化水素、例えば、２，６−ジメチルオクタン、２，７−ジメチルオクタンおよび３，６−ジメチルオクタンを産出する。いくつかの実施形態では、不飽和線状三量体を水素化して、飽和脂肪族Ｃ１５炭化水素、例えば、２，６，１０−トリメチルドデカン、２，７，１０−トリメチルドデカンおよび３，７，１０−トリメチルドデカンを産出する（スキームＶＩＩＩを参照）。いくつかの実施形態では、イソアミレン二量体化産物（ジアミレンまたはＣ１０ダイメート）は、イソパラフィン（例えば２，３，４，４−テトラメチルヘキサン、２，２，３，４−テトラメチルヘキサン、２，３，３，４−テトラメチルヘキサンおよび３，３，５−トリメチルヘプタン）に完全に水素化する（スキームＶＩＩＩａを参照）。いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発組成物を水素化して、２−メチルブタンを含む産物を産出する。いくつかの実施形態では、不飽和イソプレンヒドロキシレートを水素化して、飽和ヒドロキシレート、例えば、Ｃ５アルコールおよびジオール（例えば３−メチル−ブタン−１−オール、２−メチル−ブタン−１−オールおよび２−メチル−ブタン−２−オール、３−メチル−ブタン−１，３−ジオールおよび２−メチル−ブタン−２，３−ジオール）、Ｃ１０アルコールおよびジオール（例えば３，７−ジメチルオクタン−１−オール、２，７−ジメチルオクタン−１−オール、２，７−ジメチルオクタン−２−オールおよび２，７−ジメチルオクタン−２，７−ジオール）および環状Ｃ１０アルコール（例えば２−（４−メチルシクロヘキシル）プロパン−２−オール、２−（４−メチルシクロヘキシル）プロパン−１−オール、２−（１，４−ジメチルシクロヘキシル）エタノールおよび４−エチル−１，４−ジメチルシクロヘキサノール）を産出する（スキームＩＸを参照）。いくつかの実施形態では、不飽和イソプレン酸素化物を水素化して、飽和エーテル、例えば、１，３−ジエトキシ−３−メチルブタン、１−エトキシ−３−メチルブタン、１−メトキシ−２，７−ジメチルオクタンおよび３−メトキシ−２，７−ジメチルオクタンを産出する（スキームＸを参照）。アルケン部分が水素化する場合、１以上の立体異性体が産出されることが理解される。立体異性体間の相対比率は、使用する反応条件および触媒による。適切な場合、立体異性体は各々および全て、本明細書に記載の飽和炭化水素および酸素化物を意図する。
スキームＶＩＩ．イソプレンから得られる環状炭化水素の例
【化７】
0005448220.tif 000012
スキームＶＩＩＩ．イソプレンから得られる脂肪族炭化水素の例
【化８】
0005448220.tif 000013
スキームＶＩＩＩａ．イソアミレンから得られるイソデカンの例
【化９】
0005448220.tif 000014
スキームＩＸ．イソプレンから得られるＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）アルコールの例
【化１０】
0005448220.tif 000015
スキームＸ．イソプレンから得られるＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）酸素化物の例
【化１１】
0005448220.tif 000016
【０３９６】
いくつかの実施形態では、商業的に有益な量の高純度イソプレン出発組成物の化学的変換により産出された燃料構成要素は、飽和イソプレン誘導体を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、イソプレンから得られる飽和Ｃ１０およびＣ１５炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１，２−ビス（イソプロピル）シクロブタン、１，２−ビス（イソプロピル）シクロブタン、１−メチル−４−イソプロピルシクロヘキサン、１−メチル−３−イソプロピルシクロヘキサン、１−エチル−１，４−ジメチルシクロヘキサン、１−エチル−１，３−ジメチルシクロヘキサン、１，５−ジメチルシクロオクタンおよび１，４−ジメチルシクロオクタンからなる群から選択される１以上の飽和環状Ｃ１０炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１，５，９−トリメチルシクロドデカンおよび１，５，１０−トリメチルシクロドデカンからなる群から選択される１以上の飽和環状Ｃ１５炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、２，６−ジメチルオクタン、２，７−ジメチルオクタンおよび３，６−ジメチルオクタンからなる群から選択される１以上の飽和脂肪族Ｃ１０炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、２，６，１０−トリメチルドデカン、２，７，１０−トリメチルドデカンおよび３，７，１０−トリメチルドデカンからなる群から選択される１以上の飽和脂肪族Ｃ１５炭化水素を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、２−メチルブタンを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、２，３，４，４−テトラメチルヘキサン、２，２，３，４−テトラメチルヘキサン、２，３，３，４−テトラメチルヘキサンおよび３，３，５−トリメチルヘプタンからなる群から選択される１以上のイソパラフィンを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、３−メチル−ブタン−１−オール、２−メチル−ブタン−１−オールおよび２−メチル−ブタン−２−オール、３−メチル−ブタン−１，３−ジオール、２−メチル−ブタン−２，３−ジオール、３，７−ジメチルオクタン−１−オール、２，７−ジメチルオクタン−１−オール、２，７−ジメチルオクタン−２−オール、２，７−ジメチルオクタン−２，７−ジオール、２−（４−メチルシクロヘキシル）プロパン−２−オール、２−（４−メチルシクロヘキシル）プロパン−１−オール、２−（１，４−ジメチルシクロヘキシル）エタノールおよび４−エチル−１，４−ジメチルシクロヘキサノールからなる群から選択される１以上の飽和ヒドロキシレートを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１，３−ジエトキシ−３−メチルブタン、１−エトキシ−３−メチルブタン、１−メトキシ−２，７−ジメチルオクタンおよび３−メトキシ−２，７−ジメチルオクタンからなる群から選択される１以上の飽和エーテルを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、３−メチルテトラヒドロフラン、３−メチル−２−ブタノンおよびイソペンチルアセタートからなる群から選択される１以上のイソプレンの酸素化物を含む。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出するための組成物および系はさらに、イソプレン出発組成物の、燃料構成要素または燃料構成要素作製のための中間体への化学的変換を触媒するための触媒を含む。いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出するための組成物および系はさらに、飽和燃料構成要素を産出するために不飽和中間体の水素化を触媒するための触媒を含む。いくつかの実施形態では、触媒は、記載した任意の触媒、または１以上の本明細書に記載の触媒の組み合わせである。
【０３９８】
燃料を産出する方法および／またはプロセス
本発明は、（ａ）商業的に有益な量の高純度イソプレンを得ること；ならびに（ｂ）商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部を燃料構成要素へ化学的変換することを含むイソプレンから燃料構成要素を産出する方法および／またはプロセスを提供する。一実施形態では、高純度イソプレン組成物は、連続化学プロセスにおいて燃料成分へ変換する。別の実施形態では、高純度イソプレンを燃料組成物へ化学的変換前にさらに精製する。さらに別の実施形態では、高純度イソプレンは、中間体組成物への化学的変換；中間体組成物は、さらに化学的変換を経て、燃料または燃料成分を産出する。さらなる１つの実施形態では、産出された燃料成分は、石油留出物および他の任意の添加物と混合して燃料を産出する。いくつかの好ましい実施形態では、高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、商業的に有益な量の高純度イソプレン組成物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用な高純度イソプレン組成物は、約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００ｍｇまたはそれより多い量のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン組成物は、約２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｇまたはそれより多い量のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００ｋｇまたはそれより多いイソプレンを含む。
【０４００】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、商業的に有益な量の高純度イソプレン組成物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン出発組成物は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９８．０、９８．５、９９．０、９９．５、もしくは１００重量％またはそれより多いイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用な高純度イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれより多い量のイソプレンとを含む。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン組成物は、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約２．０、１．５、１．０、０．５、０．２、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％またはそれ未満のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン組成物は、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インについて、組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約２．０、１．５、１．０、０．５、０．２、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量パーセントを有する。特定の実施形態では、高純度イソプレン組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、組成物中のＣ５炭化水素の総重量に対し約９８．０、９８．５、９９．０、９９．５、９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれより多いイソプレンを有する。
【０４０１】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、商業的に有益な量の高純度イソプレン組成物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用な高純度イソプレン組成物は、イソプレンの重合を阻害する、組成物中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害する約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌ又はそれら未満の化合物を有する。特定の実施形態では、組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンも有する。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、商業的に有益な量の高純度イソプレン組成物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用な高純度イソプレン組成物は、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。いくつかの実施形態では、高純度イソプレン組成物は、約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌまたはそれより多いエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を有する。特定の実施形態では、高純度イソプレン組成物は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、商業的に有益な量の高純度イソプレン組成物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本発明において有用な高純度イソプレン組成物は、イソプレンと、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の第２の化合物とを含む。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの第２の成分の１つの量は、約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）またはそれより多い量である。いくつかの実施形態では、イソプレン量と比べてメタンチオール量は重量パーセント単位で０．０１％（ｗ／ｗ）未満である。
【０４０４】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、商業的に有益な量の高純度イソプレン組成物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、生物学的プロセスから商業的に有益な量の高純度イソプレン組成物を得ることを含み、（ａ）イソプレンの産出に好適な培養条件下でイソプレンシンターゼポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞を培養すること、ここで細胞は（ｉ）約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出し、（ｉｉ）細胞が細胞培養培地から消費する炭素の約０．００２モルパーセント超をイソプレンに変換し、または（ｉｉｉ）約０．１ｍｇ／Ｌブロス／時間を上回るイソプレンの平均容積生産性を有し、ならびに（ｂ）イソプレンを産出することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、（ｉ）イソプレンシンターゼポリペプチド、例えば植物、例えば、Ｐｕｅｒａｒｉａ由来の天然に生じるポリペプチドをコードし、（ｉｉ）プロモーター、例えばＴ７プロモーターに機能的に連結されている異種核酸を有する。いくつかの実施形態では、細胞を、限定するものではないが、炭水化物、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、１炭素源、油、動物性脂肪、動物性油、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、ポリペプチド（例えば、微生物もしくは植物のタンパク質もしくはペプチド）、酵母抽出物、または酵母抽出物由来の成分などの１炭素源、または前述のもののいずれか２つ以上の組み合わせを含む培養培地中で培養する。いくつかの実施形態では、細胞を制限グルコース条件下で培養する。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、細胞はさらに、ＭＤＶ経路ポリペプチドをコードする異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、米国仮特許出願第６１／１３４，０９４号（２００８年７月２日出願）、ＷＯ２０１０／００３００７号、および米国特許第１２／３３５，０７１号（２００８年１２月１５日出願）（米国特許第２００９／０２０３１０２Ａ１号）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を用いてイソプレンを産出することを含む。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを産出する細胞の培養により産出された気相（オフガス）を得ることを含む。いくつかの実施形態では、培養細胞は、約４００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／時間を上回るイソプレンを産出する。いくつかの実施形態では、気相は、１ｖｖｍの速度で発生時、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００μｇ／Ｌまたはそれより多い量のイソプレンを含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれより多い量のイソプレンとを含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、約２．０、１．５、１．０、０．５、０．２、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％またはそれらより少ない量のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インについて、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、約２．０、１．５、１．０、０．５、０．２、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量パーセントまたはそれより少ない量を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、揮発性有機画分中の全てのＣ５炭化水素の総量と比べて、約９９．９０、９９．９２、９９．９４、９９．９６、９９．９８、もしくは１００重量％またはそれより多いイソプレンを有する。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、本方法は、イソプレンを産出する細胞の培養により産出された気相（オフガス）を得ることを含む。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンの重合を阻害する気相の揮発性有機画分中の任意の化合物について、イソプレンの重合を阻害するは約５０、４０、３０、２０、１０、５、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、もしくは０．００５μｇ／Ｌまたはそれらより少ない量の化合物を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約２ｍｇ超のイソプレンも有する。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００、もしくは１２０μｇ／Ｌまたはそれより多いエタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、または前述のもののいずれか２つ以上を有する。特定の実施形態では、気相の揮発性有機画分は、約２ｍｇ超のイソプレンを有し、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される１以上の化合物を有する。いくつかの実施形態では、気相の揮発性有機画分は、イソプレンと、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、アセトアルデヒド、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の第２の化合物とを含む。様々な実施形態では、重量パーセント（すなわち、成分の重量をイソプレンの重量で割って１００を掛けたもの）の単位で表されるイソプレンの量と比べたこれらの第２の成分の１つの量は、気相の揮発性有機画分中、約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１１０％（ｗ／ｗ）またはそれらより多い。いくつかの実施形態では、��方法はさらに、気相からイソプレンを回収することを含む。例えば、イソプレンを含む気相中のイソプレンは、ガスストリッピング、膜増強分離、分別、吸着／脱離、パーベーパレーション、熱脱離もしくは真空脱離、または溶媒による固相に固定化もしくは吸収されたイソプレンの抽出などの標準的な技術を用いて回収することができる（例えば、米国特許第４，７０３，００７号および第４，５７０，０２９号を参照されたく、これらは各々、特に、イソプレンの回収および精製方法に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの特定の実施形態では、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、またはそれらの組合せ）による抽出蒸留を用いて、イソプレンを回収する。いくつかの実施形態では、イソプレンの回収は、液体形態のイソプレン（例えば、イソプレンのニート溶液または溶媒中のイソプレン溶液）の単離を含む。ガスストリッピングは、連続的に発酵オフガス流からイソプレン蒸気を除去することを含む。このような除去を、限定するものではないが、固相への吸着、液相への分離、または直接的な凝結（例えば、凝結コイルへの曝露もしくは圧力の増加による凝結）をはじめとするいくつかの異なる方法で達成することができる。いくつかの実施形態では、蒸気の露点を超えた希薄なイソプレン蒸気流の膜濃縮により、液体イソプレンの凝結が生じる。いくつかの実施形態では、回収したイソプレンを圧縮および凝結させる。
【０４０７】
イソプレンの回収は１つの工程または複数の工程を含み得る。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレン蒸気の除去とイソプレンの液相への変換を同時に実施する。例えば、イソプレンは、オフガスストリームから直接濃縮して液体を形成することができる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレン蒸気の除去とイソプレンの液相への変換は、連続して実施する。例えば、イソプレンは、固相に吸着させてから溶媒で固相から抽出する。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、ニートＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅの加熱を含む環状イソプレン二量体の産出方法を提供する。産出された環状イソプレン二量体は、６員環二量体（例えば［２＋４］電子的環化産物、例えば、リモネン）もしくは８員環二量体またはその混合物であり得る。６員環二量体の例としては、限定するものではないが、１−メチル−４−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−−１−エン、１−メチル−５−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−−１−エン、１，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、２，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセンなどが挙げられる。８員環二量体の例としては、限定するものではないが、１，５−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、１，６−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエンなどが挙げられる。一実施形態では、ニートの生物学的に産出されたイソプレンは、約１００℃〜約３００℃の温度、好ましくは約１５０℃〜約２５０℃に加熱することにより二量体化する。圧力は約２〜３ａｔｍで維持する。別の実施形態では、抱合体化ジエンの触媒的二量体化に適した触媒を使用し得る。産物混合物中の様々な二量体の割合は、触媒および他の反応条件により制御し得る。例えば、ニッケル触媒は、８員環二量体の形成を促進できる。
【０４０９】
いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅの光二量体化を含む環状イソプレン二量体を産出する方法を提供する。産出された環状イソプレン二量体は、１以上の４員環二量体またはその混合物であり得る。４員環二量体の例としては、限定するものではないが、１，２−ジ（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１，３−ジ（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−ビニル−３−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−ビニル−２−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１，３−ジメチル−１，３−ジビニルシクロブタン、１，２−ジメチル−１，２−ジビニルシクロブタンなどが挙げられる。一実施形態では、ニートの生物学的に産出されたイソプレンは、好ましくは光増感剤、例えば、ベンゾフェノンの存在下で、ＵＶ光照射により二量体化する。
【０４１０】
イソプレン二量体は、水素化して、燃料として役立ち得る飽和Ｃ１０炭化水素を形成することもでき、燃料に混合することもできる。一実施形態では、不飽和イソプレン二量体を触媒的水素化に供して、一部水素化したおよび／または完全に水素化した産物を産出する。完全に水素化した産物の例としては、限定するものではないが、１−メチル−４−イソプロピルシクロヘキサンおよび１−メチル−５−イソプロピルシクロヘキサン、１，４−ジメチル−４−エチルシクロヘキサン、２，４−ジメチル−４−エチルシクロヘキサン、１，２−ジイソプロピルシクロブタンおよび１，３−ジイソプロピルシクロブタン、１−メチル−１−ビニル−３−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−エチル−２−（プロプ−２−イル）シクロブタン、１，３−ジメチル−１，３−エチルシクロブタン、１，２−ジメチル−１，２−ジエチルシクロブタン、１，５−ジメチルシクロオクタン、１，６−ジメチルシクロオクタンなどが挙げられる。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）商業的に有益な量の本明細書に記載の任意の高純度イソプレン出発組成物を得ること；（ｂ）（ｉ）高純度イソプレン組成物を圧力下で１００℃超または約１００℃に加熱すること；（ｉｉ）出発イソプレン組成物の少なくとも一部を不飽和環状イソプレン二量体へ変換すること；ならびに（ｉｉｉ）不飽和環状イソプレン二量体を水素化して飽和環状イソプレン二量体を産出することとを含む高純度イソプレン出発組成物の少なくとも一部を燃料構成要素へ化学的変換することとを含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物を圧力下で約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５もしくは２５０℃またはそれより高温に加熱する。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、抗酸化剤（例えば２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）の存在下で加熱してラジカル媒介性ポリマー化を予防する。一実施形態では、イソプレンの熱二量体化は、ポリマー化阻害剤としてのジニトロクレゾールの存在下で実施する。適切な抗酸化剤をポリマー化阻害剤として使用してよい。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物の少なくとも一部を６および８員環、例えば、リモネン（１−メチル−４−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−−１−エン）、１−メチル−５−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−１−エン、１，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、２，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、１，５−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、１，６−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、２，６−ジメチル−１，３−シクロオクタジエン、２，６−ジメチル−１，４−シクロオクタジエン、３，７−ジメチル−１，５−シクロオクタジエン、３，７−ジメチル−１，３−シクロオクタジエンおよび３，６−ジメチル−１，３−シクロオクタジエンを含む不飽和二量体の混合物とする。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物中の約２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９もしくは１００％またはそれより多いイソプレンが不飽和環状イソプレン二量体に変換する。いくつかの実施形態では、不飽和環状イソプレン二量体の水素化は、水素化触媒、例えば、パラジウムベースの触媒（例えばＰｄ／Ｃ、例えば５％（重量）Ｐｄ／Ｃ）により触媒される。いくつかの実施形態では、飽和環状イソプレン二量体は、１−メチル−４−イソプロピルシクロヘキサン、１−メチル−３−イソプロピルシクロヘキサン、１，５−ジメチルシクロオクタンおよび１，４−ジメチルシクロオクタンからなる群から選択される１以上のＣ１０炭化水素を含む。いくつかの好ましい実施形態では、出発イソプレン組成物はＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）商業的に有益な量の本明細書に記載の任意の高純度イソプレン出発組成物を得ること；（ｂ）（ｉ）高純度イソプレン組成物を触媒系と接触させること；（ｉｉ）出発イソプレン組成物の少なくとも一部を不飽和イソプレン二量体および／もしくは三量体へ変換すること；ならびに（ｉｉｉ）不飽和二量体および／または三量体を水素化して飽和Ｃ１０および／もしくはＣ１５炭化水素を産出することとを含む高純度イソプレン出発組成物の少なくとも一部を燃料構成要素へ化学的変換することとを含む。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物中の約２０、３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９もしくは１００％またはそれより多いイソプレンが不飽和二量体および／または三量体イソプレンに変換する。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、当該技術分野で公知である適切な触媒系と接触させて、１，２−ジ（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１，３−ジ（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−ビニル−３−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１−メチル−１−ビニル−２−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロブタン、１，３−ジメチル−１，３−ジビニルシクロブタン、１，２−ジメチル−１，２−ジビニルシクロブタン、１−メチル−４−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−−１−エン）、１−メチル−５−（プロプ−１−エン−２−イル）シクロヘキサ−−１−エン、１，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、２，４−ジメチル−４−ビニルシクロヘキセン、１，５−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、１，６−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエン、１，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセン、２，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセン、２，７−ジメチル−１，３，７−オクタトリエン、２，７−ジメチル−２，４，６−オクタトリエン、２，６−ジメチル−１，３−シクロオクタジエン、２，６−ジメチル−１，４−シクロオクタジエン、３，７−ジメチル−１，５−シクロオクタジエン、３，７−ジメチル−１，３−シクロオクタジエンおよび３，６−ジメチル−１，３−シクロオクタジエンからなる群から選択される１以上の不飽和環状イソプレン二量体を得る。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、当該技術分野で公知である適切な触媒系と接触させて、１以上の不飽和環状イソプレン三量体、例えば、トリメチルシクロドデカトリエンおよびトリメチルドデカテトラエンなどを得る。いくつかの実施形態では、出発イソプレン組成物は、当該技術分野で公知である適切な触媒系と接触させて１以上の不飽和線状二量体および／または三量体イソプレン、例えば、ジメチルオクタトリエン（例えば２，７−ジメチル−１，３，７−オクタトリエンおよび２，７−ジメチル−２，４，６−オクタトリエン）およびトリメチルドデカテトラエン（例えば２，６，１０−トリメチル−１，５，９，１１−ドデカテトラエン、α−ファルネセンおよびβ−ファルネセン）などを得る。いくつかの好ましい実施形態では、出発イソプレン組成物はＢｉ��ｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。
【０４１３】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、高純度イソプレン組成物を触媒系と接触させて、出発イソプレン組成物の少なくとも一部を不飽和イソプレン二量体および／または三量体に変換することを含む。いくつかの実施形態では、触媒系は、Ｎｉ、ＦｅまたはＣｏ触媒を含み、出発組成物中イソプレンは、ジメチルシクロオクタジエン、例えば、１，５−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエンおよび１，６−ジメチルシクロオクタ−１，５−ジエンを含む８員環イソプレン二量体に変換する。いくつかの実施形態では、触媒系はニッケル化合物を含む。イソプレンのＮｉ触媒化二量体化により、約９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０および１０：９０比率の１，５−ジメチル−１，５−シクロオクタジエン対１，６−ジメチル−１，５−シクロオクタジエンからなるジメチル−１，５−シクロオクタジエン混合物を得る。一実施形態では、触媒系は、Ｎｉカルボキシレートもしくはβ−ケトン、有機アルミニウムもしくは有機マグネシウム化合物ならびに置換したトリフェニル亜リン酸を含む３成分触媒を含む。例えば、無水トルエン中の高純度イソプレン出発組成物の脱気溶液は、Ｎｉ（ａｃａｃ）２、Ｅｔ３Ａｌ、およびトリス（３，４−ビス（ジメチルアミノ）フェニル）亜リン酸と窒素大気下で混合し、混合物を９５℃で加熱してジメチルシクロオクタジエンを得る。別の実施形態では、触媒系は、Ｆｅカルボキシレートもしくはβ−ジケトン化合物、有機−ＡｌもしくはＭｇ化合物、ならびに電子供与基を有する２，２’−ジピリジル誘導体を含む。例えば、出発イソプレン組成物は、Ｆｅアセチルアセトネート、４，４’−ジメチル−２，２’−ジピリジル、およびＥｔ３Ａｌのトルエン溶液の混合物で加熱して、１，６−ジメチル−１，５−シクロオクタジエンを良好な収率で得る。いくつかの好ましい実施形態では、出発イソプレン組成物はＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。
【０４１４】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、高純度イソプレン組成物を触媒系と接触させて、出発イソプレン組成物の少なくとも一部を不飽和イソプレン二量体および／または三量体に変換することを含む。いくつかの実施形態では、触媒系は、Ｒｕ、Ｆｅ、ＮｉもしくはＰｄ触媒またはその組み合わせを含み、出発組成物中イソプレンを６員環イソプレン二量体を含む混合物に変換する。一実施形態では、触媒系は、Ｆｅ（ＮＯ）２Ｃｌ−ビス（１，５−シクロオクタジエン）ニッケル触媒系であり、出発組成物中イソプレンは、低温（例えば−５〜＋２０℃）でシクロ二量体化して、１−メチル−４−イソプロペニル−１−シクロヘキセンおよび２−メチル−４−イソプロペニル−１−シクロヘキセンならびに１，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセンおよび２，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセンを得る。別の実施形態では、トリス（置換したヒドロカルビル）亜リン酸、亜ヒ酸、もしくはアンチモナイトならびにＶＩＩＩ群金属（０）化合物（例えばＮｉアセチルアセトネート）の混合触媒と接触させることにより、出発組成物中イソプレンを１，４−ジメチル−４−ビニル−１−シクロヘキセンおよび１，５−ジメチル−１，５−シクロオクタジエンに変換する。別の実施形態では、イソプレン出発組成物をルテニウム触媒と接触させること（例えばＩｔｏｈ，  Ｋｅｎｊｉ；  Ｍａｓｕｄａ，  Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；  Ｆｕｋａｈｏｒｉ，  Ｔａｋａｈｉｋｏ；  Ｎａｋａｎｏ，  Ｋａｔｓｕｍａｓａ；  Ａｏｋｉ，  Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；  Ｎａｇａｓｈｉｍａ，  Ｈｉｄｅｏ，  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  （１９９４），  １３（３），  １０２０−９を参照されたい）により、イソプレンをＣ１０環状二量体（例えばジメチル−シクロオクタジエンの混合物）に変換する。ルテニウム触媒は、ＲｕＣｌ３およびペンタメチルシクロペンタジエン（Ｃ５Ｍｅ５Ｈ）から２つの工程において合成できる。本プロセスは、バッチモードで実施し得、触媒は回収して再利用する。いくつかの好ましい実施形態では、出発イソプレン組成物はＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。この方法の一実施形態をスキームＸＩに例証する。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、高純度イソプレン組成物を触媒系と接触させて、出発イソプレン組成物の少なくとも一部を不飽和イソプレン二量体および／または三量体に変換することを含む。いくつかの実施形態では、触媒系は、Ｎｉ、Ｔｉ、Ａｌ、もしくはＭｇ触媒またはその混合物を含み、出発組成物中イソプレンを環状イソプレン三量体、例えば、トリメチルシクロドデカトリエンを含む混合物に変換する。一実施形態では、イソプレンの三量体化のための触媒系は、Ｎｉおよび／もしくはＴｉ、１以上の有機金属化合物、ならびにＶＡ群化合物を含む。反応は、水酸基含有溶媒で行ない得る。別の実施形態では、電子供与体としての様々な亜リン酸の存在下、ニッケルナフテン酸およびイソプレンマグネシウムにより触媒されたイソプレンのオリゴマー化により、ジメチルシクロオクタジエンを含む環状二量体が得られ、特に１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）プロパン亜リン酸によりトリメチルシクロドデカトリエンが選択的に得られる。
スキームＸＩ
【化１２】
0005448220.tif 000017
【０４１６】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、高純度イソプレン組成物を触媒系と接触させて、出発イソプレン組成物の少なくとも一部を不飽和イソプレン二量体および／または三量体に変換することを含む。いくつかの実施形態では、触媒系は、Ｎｉ、ＰｄもしくはＣｒ触媒またはその混合物を含み、出発組成物中イソプレンは、短鎖重合体または線状二量体および／もしくは三量体に変換される。一実施形態では、Ｐｄ（０）錯体を含む触媒系（例えばＰｄ（ａｃａｃ）２−Ｐｈ３ＰおよびＰｄ（ＯＡｃ）２−Ｐｈ３Ｐ）は、イソプレンの二量体化および短鎖重合化を触媒して、線状イソプレン二量体（例えば２，７−ジメチル−１，３，７−オクタトリエン）を得る。１つの代表例を挙げると、反応は、メタノールを溶媒として実施され、メチルエーテル、例えば、メトキシジメチルオクタジエン（例えば１−メトキシ−２，７−ジメチル−２，７−オクタジエンおよび３−メトキシ−２，７−ジメチル−１，７−オクタジエン）が産出される。別の実施形態では、触媒系は、２価および３価遷移金属交換モンモリロナイト（例えばＣｒ３＋−モンモリロナイト）を含む。別の実施形態では、触媒系は、Ｎｉ（０）−アミノ亜ホスフィン酸触媒を含み、出発組成物中イソプレンは線状二量体にｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ型で位置選択的に変換する。いくつかの代表例を挙げると、線状二量体形態は、競合的シクロ二量体化反応により達成される。別の実施形態では、触媒系は、クロムＮ，Ｎ−ビス（ジアリールホスフィノ）アミン触媒（例えばＢｏｗｅｎ，  Ｌ．；  Ｃｈａｒｅｒｎｓｕｋ，  Ｍ．；  Ｗａｓｓ，  Ｄ．Ｆ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （２００７）  ２８３５−２８３７を参照されたい）を含み、イソプレンは、線状および環状Ｃ１５三量体に変換する。１つの代表例を挙げると、クロム触媒は、ＣｒＣｌ３（ＴＨＦ）３およびＰＮＰホスフィンリガンドからｉｎ  ｓｉｔｕ作製される。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物から燃料構成要素を産出する方法は、（ｉ）イソプレンの三量体化を触媒するための触媒とＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を接触させて不飽和イソプレン三量体を産出すること、および（ｉｉ）イソプレン三量体を水素化して燃料構成要素を産出することにより、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中イソプレンの実質的な一部を化学的変換させることを含む。いくつかの実施形態では、化学的変換中、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中少なくとも約９５％のイソプレンが非イソプレン化合物に変換される。
【０４１８】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）商業的に有益な量の本明細書に記載の任意の高純度イソプレン出発組成物を得ること；（ｂ）出発イソプレン組成物の少なくとも一部を不飽和イソプレン誘導体へ変換すること；ならびに（ｃ）不飽和イソプレン誘導体を水素化して飽和化合物を産出することとを含む。いくつかの実施形態では、不飽和イソプレン誘導体の飽和化合物への水素化は、バッチモードで実施する。いくつかの実施形態では、不飽和イソプレン誘導体の飽和化合物への水素化は、連続モードで実施する。この方法の一実施形態をスキームＸＩＩに例証する。
スキームＸＩＩ
【化１３】
0005448220.tif 000018
【０４１９】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）商業的に有益な量の本明細書に記載の任意の高純度イソプレン出発組成物を得ること；（ｂ）出発イソプレン組成物の少なくとも一部を酸化イソプレン誘導体へ変換すること；ならびに任意選択的に（ｃ）任意の不飽和酸化イソプレン誘導体を水素化して飽和酸素化物を産出することを含む。いくつかの実施形態では、イソプレン出発組成物は、アルコール（例えばメタノールもしくはエタノールまたはその混合物）の存在下で触媒と接触させて、１以上の不飽和または飽和エーテル（例えばメチルエーテルもしくはエチルエーテルまたはその混合物）を含む酸化イソプレン誘導体を形成する。いくつかの実施形態では、触媒は、酸触媒、例えば、硫酸、固相硫酸（例えば、Ｄｏｗｅｘ  Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標））、液相および固相フルオロスルホン酸（例えばトリフルオロメタンスルホン酸およびナフィオン−Ｈ（ＤｕＰｏｎｔ））である。ゼオライト触媒、例えばベータ−ゼオライトも、リモネンおよび関連モノテルペンのメトキシル化のために、Ｈｅｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ［Ｈｅｎｓｅｎ，  Ｋ．；  Ｍａｈａｉｍ，  Ｃ．；  Ｈｏｌｄｅｒｉｃｈ，  Ｗ．Ｆ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ａ：  Ｇｅｎｅｒａｌ  （１９９７）  １４０（２），  ３１１−３２９．］により記載されているものに類似した条件下で使用できる。いくつかの実施形態では、イソプレン出発組成物または不飽和イソプレン二量体もしくは三量体は、酸化／水素化を経て、１以上のアルコール、例えば、Ｃ５、Ｃ１０およびＣ１５アルコールならびにジオールを含むヒドロキシル化イソプレン誘導体を形成する。いくつかの実施形態では、イソプレン出発組成物は、水酸化／エステル化を経て、アルコールおよびエステルを形成する。例えば、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅまたは不飽和中間体は、過酸、例えば、過酢酸および３−クロロ過安息香酸でのエポキシドへの過酸化；ならびに水和を経て、ｉ）水と酸触媒およびｉｉ）ヒドロホウ素化反応方法でアルコールとジオールを得る。このような反応については、例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂ．  Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｅｒｒｙ  Ｍａｒｃｈ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ２００７に記載されている。いくつかの好ましい実施形態では、出発イソプレン組成物はＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）商業的に有益な量の本明細書に記載の任意の高純度イソプレン出発組成物を得ること；（ｂ）出発イソプレン組成物をモノ−オレフィン（例えば２−メチルブタ−１−エン、３−メチル−ブタ−１−エンおよび２−メチルブタ−２−エン）に一部水素化すること；ならびに（ｃ）燃料構成要素をモノ−オレフィンから産出することを含む。一実施形態では、モノ−オレフィンは、二量体化を経る。別の実施形態では、例えば、イソブチレンをイソオクタンへ変換するために使用されるように従来の炭化水素カチオン触媒作用を用いてモノ−オレフィンを他のオレフィンと反応させる。次いで、二量体化または他のオレフィンとの反応産物は水素化を経て、飽和燃料構成要素を生じる。いくつかの好ましい実施形態では、高純度イソプレンはＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。いくつかの実施形態では、パラジウム触媒、例えば、Ｐｄ／ＣａＣＯ３、Ｐｄ／ＢａＳＯ４、Ｐｄ／Ｃ、Ｐｄブラック、Ｐｄ／ＳｉＯ３、Ｐｄ／Ａｌ２Ｏ３、またはＰｄ／ＳｉＯ２を用いて出発イソプレン組成物を一部水素化する。いくつかの実施形態では、シリカ支持ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー−パラジウム錯体を用いて出発イソプレン組成物を一部水素化する。いくつかの実施形態では、パラジウム−金およびパラジウム−銀触媒（例えば、Ｐｄ−Ａｕ／ＳｉＯ２およびＰｄ−Ａｇ／ＳｉＯ２）を用いて一部水素化した出発イソプレン組成物は、完全に還元されたＣ５アルカンよりも、イソプレンをモノ−オレフィンへ還元する高い選択性を有する。いくつかの実施形態では、無機支持体（例えば、金属ゼオライト）上のＶＩＢ群金属を触媒、例えばＭｏ／Ａｌ２Ｏ３触媒として用いて出発イソプレン組成物を一部水素化する。いくつかの実施形態では、ハニカム配置であり得る一体化した触媒床を用いて出発イソプレン組成物を一部水素化する。一体化した触媒床のための触媒支持体物質としては、金属、例えば、ニッケル、白金、パラジウム、ロジウム、ルテニウム、銀、鉄、銅、コバルト、クロム、イリジウム、スズ、および合金またはその混合物を挙げ得る。いくつかの実施形態では、特に反応に水を含まない場合、卵殻Ｐｄ／δ−Ａｌ２Ｏ３触媒を用いて出発イソプレン組成物を一部水素化する。いくつかの実施形態では、ＩＢ、ＶＩＢ、ＶＩＩＢ群からの金属、または亜鉛により促進されたＶＩＩＩ群金属触媒を用いて出発イソプレン組成物を一部水素化し、触媒毒を減らす。イソプレンからイソアミレン（モノ−オレフィン）への変換方法は、同種触媒または異種触媒の両方を用いて、連続モードで実施することもでき、バッチモードで実施することもできる。この方法の一実施形態をスキームＸＩＩＩに例証する。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、イソプレンの部分的な水素化から産出するイソアミレンは、イオン交換樹脂およびゼオライト上で液相中の三量体化を経る。ＧｒａｎＧｒａｎｏｌｌｅｒｓ，  Ｉｎｄ．  Ｅｎｇ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  ４９  （８），  ｐｐ  ３５６１−３５７０  （２００１）を参照されたい。
スキームＸＩＩＩ
【化１４】
0005448220.tif 000019
【０４２２】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）商業的に有益な量の本明細書に記載の任意の高純度イソプレン出発組成物を得ること；（ｂ）出発イソプレン組成物をモノ−オレフィン（例えば２−メチルブタ−１−エン、３−メチル−ブタ−１−エンおよび２−メチルブタ−２−エン）に一部水素化すること；（ｃ）モノ−オレフィンの二量体化のための触媒とモノ−オレフィンを接触させて、モノ−オレフィンと別のダイメートを形成すること；ならびに（ｄ）二量体化の産物（ダイメート）を水素化して飽和炭化水素燃料構成要素を産出することとを含む。いくつかの好ましい実施形態では、高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。いくつかの実施形態では、他のモノ−オレフィンは、高純度イソプレン出発組成物から得られるイソアミレンである。いくつかの実施形態では、他のモノ−オレフィンは、別の源、例えば、プロピレン、ブタンまたはイソブテン由来のオレフィンである。いくつかの実施形態では、二量体化のための触媒は、樹脂触媒（例えば、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ３５、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ１５、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  ＸＮ１０１０、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ  ＸＥ５８６）である。いくつかの実施形態では、二量体化のための触媒は、酸性メソポーラスモレキュラーシーブ、例えば、ゼオライト構造、ＺＳＭ−５、フェリエライト、ＺＳＭ−２２、またはＺＳＭ−２３に組み込まれているメソポーラスシーブを含む触媒物質である。いくつかの実施形態では、二量体化のための触媒は、高温（例えば、少なくとも９００℃）で熱的に安定している触媒物質である。いくつかの実施形態では、二量体化のための触媒は、酸性メソポーラスモレキュラーシーブを含む触媒物質である。いくつかの実施形態では、二量体化のための触媒は、固体酸性触媒（例えば、固体リン酸触媒、酸性イオン交換樹脂）である。この方法の一実施形態をスキームＸＩＶに例証する。
スキームＸＩＶ
【化１５】
0005448220.tif 000020
【０４２３】
いくつかの実施形態では、イソプレンから燃料構成要素を産出する方法は、（ａ）商業的に有益な量の本明細書に記載の任意の高純度イソプレン出発組成物を得ること；（ｂ）出発イソプレン組成物をイソアミレン（例えば２−メチルブタ−１−エン、３−メチル−ブタ−１−エンおよび２−メチルブタ−２−エン）に一部水素化すること；（ｃ）イソアミレンをアルコールおよび触媒と接触させて酸素化物を形成すること；ならびに（ｃ）イソアミレン酸素化から燃料構成要素を産出することとを含む。いくつかの好ましい実施形態では、高純度イソプレンは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物である。いくつかの実施形態では、イソアミレンはエタノールと接触させて、形成される燃料酸素化物は、エーテル、例えば、ＴＡＭＥである。
【０４２４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、化学的変換前に出発イソプレン組成物を精製することをさらに含む。例えば、本発明の組成物および方法を用いて産出されたイソプレンを、標準的な技術を用いて精製することができる。精製とは、イソプレンが産出されるときに存在する１以上の成分からイソプレンを分離するプロセスを指す。いくつかの実施形態では、イソプレンを実質的に純粋な液体として得る。精製方法の例としては、（ｉ）液体抽出剤中の溶液からの蒸留および（ｉｉ）クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用される場合、「精製イソプレン」は、イソプレンが産出されるときに存在する１以上の成分から分離されたイソプレンを意味する。いくつかの実施形態では、イソプレンは、少なくとも約２０重量％であり、イソプレンが産出されるときに存在する他の成分を含まない。様々な実施形態では、イソプレンは、少なくともまたは約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、または９９重量％で、純粋である。純度は、任意の適切な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、またはＧＣ−ＭＳ分析により、アッセイすることができる。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは、活性炭への初回吸着、その後の脱離および凝結により発酵オフガスから回収して、燃料構成要素への化学的変換のための液体イソプレン組成物を得る。
【０４２５】
燃料を産出するための連続プロセス
本発明は、イソプレンから燃料構成要素を産出するための連続プロセスも提供し、この連続プロセスは、（ａ）商業的に有益な量の高純度イソプレンを連続的に産出すること；ならびに（ｂ）商業的に有益な量の高純度イソプレンの少なくとも一部を燃料構成要素へ連続的に化学的変換することとを含む。本発明による連続プロセスにおいて、高純度イソプレンストリームを、例えば、（例えばイソプレンを産出する細胞を培養する）生物学的プロセスにより連続的に産出して、化学的変換リアクターに通過させる。いくつかの実施形態では、発酵オフガスからのイソプレンは、抽出蒸留、凝結、吸着または連続精製単位の膜を用いて水および他の恒久的ガス（例えば、Ｏ２、Ｎ２およびＣＯ２）から分離し、ここで酸素レベルはｐｐｍ範囲に低下し、他の関心の不純物は除去される；イソプレン蒸気は、異種触媒を用いて二量体（Ｃ１０）および三量体（Ｃ１５）に触媒的に変換する；所望の産物を分離し、未反応イソプレンはさらに変換するためリアクターに戻す。いくつかの実施形態では、気相中の所望されるＣ１０炭化水素レベルを測定することにより触媒の二量体化をモニタリングする。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、生物学的に産出されたイソプレンストリームは、温度を約１００℃〜約３００℃で維持した化学リアクター（例えば、反応管）を通過させ、ここで生物学的に産出されたイソプレンは二量体化反応を経る。１つの代表例を挙げると、イソプレン二量体は産物ストリームから分離され、未反応イソプレンの少なくとも一部は化学リアクターに戻されて再利用される。一実施形態では、産出された不飽和イソプレン二量体は、第２の化学リアクター内で水素化触媒および水素源と接触させて、一部水素化したおよび／または完全に水素化した産物を産出する。本プロセスは、イソプレンを産出するバイオリアクターのオフガスからのイソプレン回収工程をさらに含むことができる。
【０４２７】
いくつかの実施形態では、共産出された水素を含むＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅストリームは、最初に水素ガスから分離され、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅストリームは化学リアクター（例えば、反応管）に通過させて約１００℃〜約３００℃の温度で維持し、ここで生物学的に産出されたイソプレンは二量体化反応を経る。１つの代表例を挙げると、イソプレン二量体は産物ストリームから分離され、未反応イソプレンの少なくとも一部は化学リアクターに戻されて再利用される。一実施形態では、産出された不飽和イソプレン二量体は、第２の化学リアクター内で水素化触媒および水素源と接触させて、一部水素化したおよび／または完全に水素化した産物を産出する。１つの代表例を挙げると、イソプレン−水素の共産出から単離された水素ストリームは、水素化工程に使用される。本プロセスは、イソプレンを産出するバイオリアクターのオフガスからのイソプレン回収工程をさらに含むことができる。本プロセスは、当該技術分野で公知である精製方法、例えば、極低温凝結および固体マトリックス吸着を用いた、イソプレン−水素の共産出から単離された水素ストリームの精製工程をさらに含むことができる。
【０４２８】
燃料産物からのジエンおよびポリマーの除去
燃料組成物は、ゴム、樹脂、ポリマーおよび他の望ましくない副産物を経時的に形成し得る不飽和化合物（オレフィン、ジオレフィンおよびポリオールフィン）をしばしば含む（例えば、Ｐｅｒｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｐａｓａ  （２００６）  Ｆｕｅｌ，  ８５，  １８６０−１８６５およびその参考文献を参照されたい）。通常、所定の化合物の不飽和増加度につれて、化合物がこのような副産物を形成する可能性が高くなる。イソプレンは、燃料組成物中に存在するとき望ましくないポリマー性副産物を形成しやすい１，３−ジエンである。副産物の形成程度を減らすことができる燃料添加物（抗酸化剤、ラジカル消光剤など）が存在する一方、このような副産物は依然として経時的に形成され得る。オレフィンも、燃料から蒸発して大気中に放出されるとき、またはオレフィン含有燃料の不完全燃焼の結果として、地表濃度オゾンの形成に寄与し得る。
【０４２９】
したがって、イソプレンに完全にまたは部分的に由来する燃料組成物は、イソプレンをほとんど含まないか全く含まないべきである。この一連の方法は、燃料組成物からイソプレンを例えば、蒸留精製、アルコールとの反応により取り出してエーテルを形成するか、または水素化してイソプレンを飽和誘導体に変換するかのいずれかのために使用できる。あるいは、イソプレンは、求ジエン体、例えば、無水リンゴ酸で処理して望ましくない副産物の形成に寄与しない不活性付加物を産出できる。
【０４３０】
イソプレンを実質的に含まないイソプレン誘導体を含む燃料組成物を提供する。いくつかの実施形態では、燃料組成物は、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％または１５％未満のイソプレンを含む。イソプレンを実質的に含まないイソプレン誘導体を含む燃料組成物へＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物を化学的変換するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物由来のイソプレンの実質的な一部を燃料構成要素に変換する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物由来のイソプレンの実質的な一部を、燃料構成要素を産出するためにさらに変換できる中間体に変換する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物由来のイソプレンの実質的な一部をイソプレン以外の化合物に変換する。「実質的な一部」とは、９９．９９％、９９．９％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％である。
【０４３１】
いくつかの例では、イソプレンおよび他の共役ジエンは、所望の産物の収率の低下および／または触媒を失活させることができるゴム様の粘りのあるポリマー性産物を形成できる。（例えば、Ｒ．Ｃ．Ｃ．  Ｐｅｒｅｉｒａ  ａｎｄ  Ｖ．Ｍ．Ｄ．  Ｐａｓａ．  Ｆｕｅｌ  ８５  （２００６）  １８６０−１８６５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、生成物混合物中に存在する共役ジエン量の決定方法を提供する。Ｄ．Ｆ．  Ａｎｄｒａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．は、共役ジエン存在量の以下を含む様々な決定方法について記載している（Ｆｕｅｌ  （２０１０），  ｄｏｉ：１０．１０６／ｊ．ｆｕｅｌ／２０１０．０１．００３）：１）ＵＯＰ−３２６方法（マレイン酸無水物方法）、ジエンでディールス・アルダー反応を介して消費したマレイン酸無水物量を測定する半定量方法；２）ポーラログラフィー；３）ガスクロマトグラフィー、ジエンは誘導体化剤、例えば、４−メチル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＭＴＡＤ）または４−フェニル−１，２，４−トリアゾリン−３，５−ジオン（ＰＴＡＤ）と反応し得る；４）ＨＰＬＣ；５）超臨界流体クロマトグラフィー；６）ＮＭＲ；７）ＵＶおよび近赤外分析；ならびに８）ｐ−ニトロベンゼンジアゾニウムテトラフルオロボラートによるジエンの最初の誘導化を含み得る他の分光方法。
【０４３２】
本明細書では、ゴム形成の最小化および／またはゴム産出量の低減方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗酸化剤を使用してゴム形成を最小限に抑える。他の実施形態では、ポリマー性副産物は、プロセスストリームに戻して再利用する。いくつかの実施形態では、ポリマー性副産物の脱ポリマー化は、オレフィンメタセシスを介して実行する。オレフィンメタセシスは、モリブデンまたはタングステン触媒、例えば、２，６−ジイソプロピルフェニルイミドネオフィリデンモリブデンビス（２−ｔｅｒｔブチルフェノキシド）を用いて実行できる。（米国特許第５，４４６，１０２号を参照されたい）。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法はいずれも、これらの反応の産物を特性の分析をし、潜在的な燃料価値を評価することをさらに含む。例えば、産物は、当該技術分野で公知である標準的な方法、例えばＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲ、ＵＶ−ＶｉｓおよびＩＲ分光学、沸騰温度、密度ならびに他の物理的特性により特徴付けられる。産物は、二重炭素−同位体のフィンガープリント法によりさらに特性化することができる（米国特許第７，１６９，５８８号を参照されたい）。産物の潜在的燃料価値は、燃料特性、例えば、エネルギー密度、加熱値、水可溶性、オクタン／セタン価、密度、粘度、表面張力、蒸気化のエンタルピー、蒸気拡散度、引火点、自己発火点、可燃限界、曇点および化学安定性ののような燃料の性質の尺度となるパラメーターにより評価する。
【０４３４】
市販の石油燃料と同様に、ＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）産物は、酸性度、密度、微量無機物含量、ベンゼン、総芳香族含量、含水量、および腐食性について試験できる。ＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）産物中の少量不純物がそれらの物質特性に有害な影響を与えないことを確実にするため、試料の腐食性および燃料系との適合性について、水のためのＫａｒｌ  Ｆｉｓｃｈｅｒ、腐食性についての銅のストリップのような標準的ＡＳＴＭ試験により試験することもできる。
【０４３５】
燃料組成物
本発明は、本明細書に記載の任意の方法およびプロセスにより産出された燃料構成要素を含む燃料組成物を提供する。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、イソプレンおよびイソプレンの酸化誘導体から得られる飽和Ｃ１０およびＣ１５炭化水素からなる群から選択される１以上の炭化水素を含む。炭化水素ＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）産物は、石油ガソリンおよびディーゼルと完全に適合性のあることが期待される。ＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）と市販の石油燃料の混合物は酸、硫黄、芳香族、または他の望ましくない不純物を含まないため、より所望される特性を有することが期待される。
【０４３６】
いくつかの好ましい実施形態では、燃料構成要素は、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅの誘導体を含む。再生可能な非石油化学ベースの資源から作製されるＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから得られる燃料に対して強い需要があるであろうことが予期される。産業的顧客および消費者は、石油化学プロセスから得られたイソプレンで作製されるこのような環境に優しい源から得られる燃料成分を購入する方を好むと考えられる。さらに、顧客は、再生可能な資源で作製されるこのような環境に優しい産物を割増価格で喜んで支払うものと考えられる。本明細書に記載のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物から得られる燃料成分は、非石油化学ベースの資源から得られることが証明できる便益を提供する。
【０４３７】
いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１以上の飽和環状Ｃ１０炭化水素、例えば、１，２−ビス（イソプロピル）シクロブタン、１，２−ビス（イソプロピル）シクロブタン、１−メチル−４−イソプロピルシクロヘキサン、１−メチル−３−イソプロピルシクロヘキサン、１−エチル−１，４−ジメチルシクロヘキサン、１−エチル−１，３−ジメチルシクロヘキサン、１，５−ジメチルシクロオクタンおよび１，４−ジメチルシクロオクタンを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１以上の飽和環状Ｃ１５炭化水素、例えば、１，５，９−トリメチルシクロドデカンおよび１，５，１０−トリメチルシクロドデカンを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１以上の飽和脂肪族Ｃ１０炭化水素、例えば、２，６−ジメチルオクタン、２，７−ジメチルオクタンおよび３，６−ジメチルオクタンを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１以上の飽和脂肪族Ｃ１５炭化水素、例えば、２，６，１０−トリメチルドデカン、２，７，１０−トリメチルドデカンおよび３，７，１０−トリメチルドデカンを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、２−メチルブタンを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１，２−ビス（イソプロピル）シクロブタン、１，２−ビス（イソプロピル）シクロブタン、１−メチル−４−イソプロピルシクロヘキサン、１−メチル−３−イソプロピルシクロヘキサン、１−エチル−１，４−ジメチルシクロヘキサン、１−エチル−１，３−ジメチルシクロヘキサン、１，５−ジメチルシクロオクタン、１，４−ジメチルシクロオクタン、１，５，９−トリメチルシクロドデカン、１，５，１０−トリメチルシクロドデカン、２，６−ジメチルオクタン、２，７−ジメチルオクタン、３，６−ジメチルオクタン、２，６，１０−トリメチルドデカン、２，７，１０−トリメチルドデカン、３，７，１０−トリメチルドデカンおよび２−メチルブタンからなる群から選択される１以上の炭化水素を含む。
【０４３８】
いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１以上の飽和ヒドロキシレート、例えば、Ｃ５アルコールおよびジオール（例えば３−メチル−ブタン−１−オール、２−メチル−ブタン−１−オールおよび２−メチル−ブタン−２−オール、３−メチル−ブタン−１，３−ジオールおよび２−メチル−ブタン−２，３−ジオール）、Ｃ１０アルコールおよびジオール（例えば３，７−ジメチルオクタン−１−オール、２，７−ジメチルオクタン−１−オール、２，７−ジメチルオクタン−２−オールおよび２，７−ジメチルオクタン−２，７−ジオール）および環状Ｃ１０アルコール（例えば２−（４−メチルシクロヘキシル）プロパン−２−オール、２−（４−メチルシクロヘキシル）プロパン−１−オール、２−（１，４−ジメチルシクロヘキシル）エタノールおよび４−エチル−１，４−ジメチルシクロヘキサノール）を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１以上の飽和エーテル、例えば、１，３−ジエトキシ−３−メチルブタン、１−エトキシ−３−メチルブタン、１−メトキシ−２，７−ジメチルオクタンおよび３−メトキシ−２，７−ジメチルオクタンを含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、３−メチル−ブタン−１−オール、２−メチル−ブタン−１−オール、２−メチル−ブタン−２−オール、３−メチル−ブタン−１，３−ジオール、２−メチル−ブタン−２，３−ジオール、３，７−ジメチルオクタン−１−オール、２，７−ジメチルオクタン−１−オール、２，７−ジメチルオクタン−２−オール、２，７−ジメチルオクタン−２，７−ジオール、２−（４−メチルシクロヘキシル）プロパン−２−オール、２−（４−メチルシクロヘキシル）プロパン−１−オール、２−（１，４−ジメチルシクロヘキシル）エタノール、４−エチル−１，４−ジメチルシクロヘキサノール、１，３−ジエトキシ−３−メチルブタン、１−エトキシ−３−メチルブタン、１−メトキシ−２，７−ジメチルオクタンおよび３−メトキシ−２，７−ジメチルオクタンからなる群から選択される１以上のイソプレン誘導酸素化物を含む。
【０４３９】
いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、本明細書に記載の任意の方法およびプロセスによる工程を経た後、０．５μｇ／Ｌ未満または約０．５μｇ／Ｌのイソプレン以外のＣ５炭化水素由来の産物を含む。一実施形態では、燃料構成要素は、本明細書に記載の任意の方法およびプロセスによる工程を経た後、イソプレン以外のＣ５炭化水素由来の産物を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、出発組成物中の全てのＣ５炭化水素の総重量と比べて、約０．２、０．１２、０．１０、０．０８、０．０６、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１重量％またはそれ未満のイソプレン以外のＣ５炭化水素（例えば、１，３−シクロペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−イン）を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、イソプレン以外のＣ５炭化水素（１，３−シクロペンタジエン、ｔｒａｎｓ−１，３−ペンタジエン、ｃｉｓ−１，３−ペンタジエン、１，４−ペンタジエン、１−ペンチン、２−ペンチン、１−ペンテン、２−メチル−１−ブテン、３−メチル−１−ブチン、ペント−４−エン−１−イン、ｔｒａｎｓ−ペント−３−エン−１−イン、またはｃｉｓ−ペント−３−エン−１−インなど）を、１００、１０、１、０．１もしくは０．０１ｐｐｍ未満の濃度で含む。
【０４４０】
本明細書に記載のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ組成物中のイソプレン以外の成分は、本明細書に記載の様々なプロセスを経た後、異なる産物に変換されるであろうことが理解される。イソプレン以外の成分への方法／プロセスに用いる金属ベースの触媒の感受性は、これらの成分の性質およびレベルに応じて異なる。熱二量体化プロセスにおいて、非常に広範囲の化合物が許容されるであろう。場合により、イソプレン以外の成分はイソプレンと反応して付加物を産出する。例えば、メタクロレインとメチルビニルケトンのイソプレンとのディールス・アルダー反応により、６員環産物が生じる。不飽和付加物は、燃料構成要素および組成物に含まれる飽和誘導体、例えば１，４−ジメチル−１−（ヒドロキシメチル）シクロヘキサンおよび１−（１−ヒドロキシエチル）−４−メチルシクロヘキサンにさらに水素化できる（スキームＸＶを参照）。
スキームＸＶ．Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）から得られる微量不純物の例
【化１６】
0005448220.tif 000021
【０４４１】
いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、本明細書に記載の任意の方法およびプロセスによる工程を経た後、エタノール、アセトン、Ｃ５プレニルアルコール、および１０以上の炭素原子を有するイソプレノイド化合物からなる群から選択される化合物由来の産物を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、本明細書に記載の任意の方法およびプロセスによる工程を経た後、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の化合物からの１以上の産物を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１，４−ジメチル−１−（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン、１−（１−ヒドロキシエチル）−４−メチルシクロヘキサン、２−メチルブタン、３−メチルペンタン、２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、２−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、エチルアセタートおよび３−メチル−１−ブチルアセタートからなる群から選択される１以上の化合物を含む。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、１，４−ジメチル−１−（ヒドロキシメチル）シクロヘキサン、１−（１−ヒドロキシエチル）−４−メチルシクロヘキサン、２−メチルブタン、３−メチルペンタン、２−プロパノール、２−メチル−１−プロパノール、２−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、エチルアセタートおよび３−メチル−１−ブチルアセタートからなる群から選択される１以上の化合物を約１０ｐｐｍ、１ｐｐｍ、１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂもしくは１ｐｐｂまたはそれより多いレベルで含む。
【０４４２】
いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、エタノール、アセトン、メタノール、アセトアルデヒド、メタクロレイン、メチルビニルケトン、２−メチル−２−ビニルオキシラン、ｃｉｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエンおよびｔｒａｎｓ−３−メチル−１，３−ペンタジエン、Ｃ５プレニルアルコール（例えば、３−メチル−３−ブテン−１−オールもしくは３−メチル−２−ブテン−１−オール）、２−ヘプタノン、６−メチル−５−ヘプタン−２−オン、２，４，５−トリメチルピリジン、２，３，５−トリメチルピラジン、シトロネラル、メタンチオール、メチルアセタート、１−プロパノール、ジアセチル、２−ブタノン、２−メチル−３−ブテン−２−オール、エチルアセタート、２−メチル−１−プロパノール、３−メチル−１ブタナール、３−メチル−２−ブタノン、１−ブタノール、２−ペンタノン、３−メチル−１−ブタノール、エチルイソブチレート、３−メチル−２−ブテナール、ブチルアセタート、３−メチルブチルアセタート、３−メチル−３−ブテン−１−イルアセタート、３−メチル−２−ブテン−１−イルアセタート、３−ヘキセン−１−オール、３−ヘキセン−１−イルアセタート、リモネン、ゲラニオール（ｔｒａｎｓ−３，７−ジメチル−２，６−オクタジエン−１−オール）、シトロネロール（３，７−ジメチル−６−オクテン−１−オール）、（Ｅ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、（Ｚ）−３，７−ジメチル−１，３，６−オクタトリエン、および２，３−シクロヘプテノルピリジンからなる群から選択される１以上の化合物を約１０ｐｐｍ、１ｐｐｍ、１００ｐｐｂ、１０ｐｐｂもしくは１ｐｐｂまたはそれより多いレベルで含む。
【０４４３】
炭素フィンガープリント法
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから得られるＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌは、二重炭素−同位体のフィンガープリント法に基づき、石油化学炭素由来の燃料と区別できる。加えて、生物源炭素の具体的な源（例えばグルコース対グリセロール）は二重炭素−同位体のフィンガープリント法により決定できる（米国特許第７，１６９，５８８号を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４４４】
本方法は、化学的に等価な材料を区別したり、生物圏（植物）構成要素の成長源（および、おそらくは成長年代）により炭素材料を分類するのに有用である。同位体１４Ｃと１３Ｃがこの問題に相補的な情報をもたらす。放射性炭素年代測定で使用する同位体（１４Ｃ）は、５７３０年の核半減期を有しており、試料炭素を化石（「死んでいる」）原料と生物圏（「生きている」）原料に明確に分けることができる［Ｃｕｒｒｉｅ，  Ｌ．  Ａ．  “Ｓｏｕｒｃｅ  Ａｐｐｏｒｔｉｏｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，  Ｊ．  Ｂｕｆｆｌｅ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｐ．  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，  Ｅｄｓ．，  １  ｏｆ  Ｖｏｌ．  Ｉ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＵＰＡＣ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  （Ｌｅｗｉｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ）  （１９９２）  ３  ７４］。放射性炭素年代測定の基本的な前提は、大気圏に存在する１４Ｃ濃度が一定であることから、生きている有機体内の１４Ｃも一定であるとすることである。単離した試料を扱うとき、試料の年代は、ｔ＝（−５７３０／０．６９３）ｌｎ（Ａ／ＡＯ）（式１４）（式中、ｔ＝年代、５７３０年は放射性炭素の半減期であり、ＡおよびＡＯはそれぞれ試料およびモデム炭素標準物質の１４Ｃ比放射能である）の関係により近似的に推定することができる［Ｈｓｉｅｈ，  Ｙ．，  Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉ．  Ｓｏｃ．  Ａｍ  Ｊ．，  ５６，  ４６０，  （１９９２）］。しかしながら、１９５０年以降の大気圏核実験および１８５０年以降の化石燃料の燃焼により、１４Ｃは第２の地球化学的時間特性を有するようになった。大気圏における、したがって生物圏におけるＣＯ２中の１４Ｃの濃度は、１９６０年代半ばの核実験ピーク時には約２倍に達した。以降、緩和「半減期」が約７〜１０年で、定常状態のコスモジェニックな（大気圏の）同位体比（１４Ｃ／１２Ｃ）のベースラインが約１．２×１０−１２に徐々に戻りつつある。この後者の半減期は文字通りに取ってはならず、むしろ、詳細な大気圏の核生成／崩壊関数を使って核時代の幕開け以来の大気圏および生物圏の１４Ｃの変動を追跡しなければならない。近年の生物圏炭素の年代測定を保証するのは、この後者の生物圏１４Ｃの時間特性である。１４Ｃは加速器質量分析法（ＡＭＳ）によって測定することができ、結果は「モデム炭素分率」（ｆＭ）の単位で与えられる。ｆＭは、米国標準技術局（ＮＩＳＴ）の標準基準物質（ＳＲＭ）４９９０Ｂおよび４９９０Ｃ、(それぞれシュウ酸標準物質ＨＯｘＩおよびＨＯｘＩＩとして知られる)より定義されている。基本の定義はＨＯｘＩの１４Ｃ／１２Ｃ同位体比を０．９５倍することに関係している（ＡＤ１９５０を基準として）。これは大体、崩壊を補正した産業革命以前の樹木と等価である。現在の生物圏（植物材料）はｆＭ約１．１である。
【０４４５】
安定な炭素同位体比（１３Ｃ／１２Ｃ）は成長源の分別と分類を行なうための相補的な手段となる。与えられた生物由来材料の１３Ｃ／１２Ｃ比は、二酸化炭素が固定された時点における大気圏の二酸化炭素中の１３Ｃ／１２Ｃ比の結果であり、また正確な代謝経路を反映する。地域的な変動もある。石油、Ｃ３植物（広葉樹）、Ｃ４植物（草類）および海洋の炭酸塩は全て、１３Ｃ／１２Ｃおよび対応するδ１３Ｃ値に有意差を示す。さらに、Ｃ３植物とＣ４植物の脂質を分析すると、同じ植物の炭水化物成分から誘導された物質とは代謝経路を反映して異なる結果が得られる。１３Ｃは、同位体分別効果によって測定精度の範囲内で大きく変動するが、その中で本発明にとって最も重大なものは光合成のメカニズムである。植物中の炭素同位体比が異なる主な原因は、植物の光合成による炭素の代謝経路の違い、特に、最初のカルボキシル化、すなわち大気圏ＣＯ２の初期の固定化段階で起こる反応の違いに密接に関係している。植物の生育を２つに大別すると、「Ｃ３」（またはＣａｌｖｉｎ−Ｂｅｎｓｏｎ）光合成回路を組み込んだものと、「Ｃ４」（またはＨａｔｃｈ−Ｓｌａｃｋ）光合成回路を組み込んだものに分類される。Ｃ３植物、例えば、広葉樹および針葉樹は温帯気候の地域で優勢な植物である。Ｃ３植物では、最初のＣＯ２固定化またはカルボキシル化反応に、酵素リブロース−１，５−ジホスフェートカルボキシラーゼ酵素を使用し、最初の安定な生成物は炭素数が３の化合物である。他方、Ｃ４植物としては、熱帯の草類、トウモロコシおよびサトウキビなどの植物が挙げられる。Ｃ４植物では、別の酵素のホスフェノール−ピルビン酸カルボキシラーゼが関与するさらなるカルボキシル化反応が、最初のカルボキシル化反応である。最初の安定な炭素化合物は炭素数４の酸であって、これはその後脱カルボキシル化される。こうして放出されたＣＯ２はＣ３回路で再固定化される。
【０４４６】
Ｃ４植物とＣ３植物は共に、ある範囲の１３Ｃ／１２Ｃ同位体比を示すが、典型的な値は約−１０〜−１４パーミル（Ｃ４）および−２１〜−２６パーミル（Ｃ３）である［Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ４５，  ２９４２  （１９９７）］。石炭と石油は、一般に、この後者の範囲内に収まる。１３Ｃ測定の尺度は、当初ピー・ディー・ベレムナイト（ＰＤＢ）石灰石によりゼロ点が定義され、数値はこの物質からの千分率の偏差で与えられる。「δ１３Ｃ」値は、‰と略される千分率（パーミル）で表され、次のように計算される（式１５）：
【数１４】
0005448220.tif 000022
（式１５）
ＰＤＢ基準物質（ＲＭ）が使い尽されてしまったので、一連の代替ＲＭがＩＡＥＡ、ＵＳＧＳ、ＮＩＳＴ、および他の選ばれた国際同位体研究所の協力の下に開発されている。ＰＤＢからの千分率偏差の表記はδ１３Ｃである。測定はＣＯ２を試料として高精度安定比質量分析法（ＩＲＭＳ）により質量数４４、４５および４６の分子イオンについて行なう。
【０４４７】
石油精製からのＣ５ストリーム抽出蒸留から得られるイソプレンにおいて、δ１３Ｃは約−２２‰〜約−２４‰である。この範囲は石油から得られる軽不飽和炭化水素において典型的であり、石油ベースのイソプレンから得られる産物は典型的には同じδ１３Ｃでイソプレン単位を含む。最少量の他の炭素含有栄養剤（例えば、酵母抽出物）とトウモロコシ派生グルコース（δ１３Ｃ−１０．７３‰）発酵により産出されたＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは、ポリイソプレンにポリマー化できるイソプレンをδ１３Ｃ−１４．６６〜−１４．８５‰産出する。このようなＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅから産出される産物は、石油ベースのイソプレンから得られるものより負の値が小さいδ１３Ｃ値を有することが予期される。イソブチレンとホルムアルデヒドの反応から得られるイソプレンにおいて、δ１３Ｃ値は約−３４．４‰であることができる。なぜならホルムアルデヒドは、しばしば、さらにより負のδ１３Ｃ値をもつ供給原料由来であるためである。
【０４４８】
生物再生可能な炭素源を用いて細胞培養からイソプレンで生成される本発明の燃料および燃料構成要素は、それらのδ１３Ｃ値および他の燃料特徴に基づいてそのようなものとして同定できる。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、−２２‰より高い（負の値が小さい）δ１３Ｃ値を有する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、−２０、−１８、−１６、−１４、−１２、または−１０‰を上回るδ１３Ｃ値を有する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、−２２〜−１０、−２１〜−１２、または−２０〜−１４‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、−３４〜−２４、−３４〜−２５、−３３〜−２５、−３２〜−２４、−３２〜−２５、−３１〜−２５、−３０〜−２９、−３０．０〜−２９．５、−２９．５〜−２８．５、または−２９．０〜−２８．５‰の範囲内であるδ１３Ｃ値を有する。
【０４４９】
いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、放射性炭素１４を含む。いくつかの実施形態では、１４Ｃ／１２Ｃ比は、約１．０×１０−１２、１．０５×１０−１２、１．１×１０−１２、１．１５×１０−１２、もしくは１．２×１０−１２またはそれより多い。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、約０．９、０．９５、１．０、１．０５もしくは１．１またはそれより多いｆＭ値を有する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、約０．９、０．９５、１．０、１．０５もしくは１．１またはそれより多いｆＭ値と−２２‰より高い（負の値が小さい）δ１３Ｃ値を有する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、約０．９、０．９５、１．０、１．０５もしくは１．１またはそれより多いｆＭ値と−２２〜−１０、−２１〜−１２、または−２０〜−１４‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。いくつかの実施形態では、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ由来の燃料構成要素は、約０．９、０．９５、１．０、１．０５もしくは１．１またはそれより多いｆＭ値と−３４〜−２４、−３４〜−２５、−３３〜−２５、−３２〜−２４、−３２〜−２５、−３１〜−２５、−３０〜−２９、−３０．０〜−２９．５、−２９．５〜−２８．５、または−２９．０〜−２８．５‰の範囲内のδ１３Ｃ値を有する。
【０４５０】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ誘導体および関連したＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ、中間体、および混合物は、１４Ｃ（ｆＭ）および二重炭素−同位体のフィンガープリント法に基づき石油化学派生対応物と完全に区別し得、新規の組成合成物であることを示す。
【０４５１】
いくつかの実施形態では、本発明の燃料構成要素は、エタノールの燃料構成要素より高いエネルギー密度を有する。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、燃料のセタン数、例えば、石油ベースの燃料をブーストする。いくつかの実施形態では、燃料構成要素は、石油ベースの燃料放出を減らす。いくつかの実施形態では、燃料組成物は、約８０〜約１２０の範囲のオクタン数を有する。いくつかの実施形態では、燃料組成物は、約３０〜約１３０の範囲のセタン数を有する。
【０４５２】
いくつかの実施形態では、本発明の燃料組成物は、１以上のジメチルシクロオクタン化合物を含む。いくつかの実施形態では、本発明の燃料組成物は、１以上のＣ１０炭化水素、例えば、置換シクロヘキサンを含む。いくつかの実施形態では、本発明の燃料組成物は、本明細書に記載の１以上のイソプレン派生酸素化物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の燃料組成物はさらに、総燃料組成物の総重量または総体積に基づき約１％〜約９５重量％または体積％の量で石油ベースの燃料を含む。
【０４５３】
本発明はさらには、石油留出物を得ることおよび本発明の燃料構成要素を添加することを含む燃料組成物の作製方法を提供する。
【０４５４】
本発明は、さらに以下の実施例を参照することにより理解でき、この実施例は例証として提供し、制限することを意味しない。
実施例
【０４５５】
実施例１：組換えクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌におけるイソプレンの産出
Ｉ．大腸菌でクズイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築
クズ（タイワンクズ）イソプレンシンターゼ遺伝子（ＩｓｐＳ）のタンパク質配列をＧｅｎＢａｎｋ（ＡＡＱ８４１７０）から得た。大腸菌コドン使用に最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子を、ＤＮＡ２．０から購入した（配列番号１）。イソプレンシンターゼ遺伝子を、供給されたプラスミドからＢｓｐＬＵ１１Ｉ／ＰｓｔＩによる制限エンドヌクレアーゼ消化で取り出し、ゲル精製し、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化しておいたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結した。コンストラクトを、イソプレンシンターゼ遺伝子の終止コドンがＰｓｔＩ部位の５’になるように設計した。結果として、このコンストラクトが発現されたときに、Ｈｉｓタグはイソプレンシンターゼタンパク質に付加されない。得られたプラスミド、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕをシークエンシングで確認した（図２および３；配列番号２）。
【０４５６】
イソプレンシンターゼ遺伝子をｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にもクローニングした。この場合は、組換えイソプレンシンターゼタンパク質がＮ末端Ｈｉｓタグを含有するように、イソプレンシンターゼ遺伝子をｐＥＴ１６ｂに挿入した。イソプレンシンターゼ遺伝子を、プライマーセットのｐＥＴ−Ｈｉｓ−Ｋｕｄｚｕ−２Ｆ：５’−ＣＧＴＧＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＣ（配列番号４９）およびｐＥＴ−Ｈｉｓ−Ｋｕｄｚｕ−Ｒ：５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）を用いたＰＣＲにより、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕから増幅した。これらのプライマーにより、遺伝子の５’末端と３’末端に、それぞれ、ＮｄｅＩ部位とＢａｍＨ１部位が付加された。上記のプラスミド、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕを鋳型ＤＮＡとして用い、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元の取扱説明書に従って用い、プライマーを１０ｐＭｏｌの濃度で添加した。ＰＣＲを総量２５μｌで行なった。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ／ＢａｍＨ１で消化し、同じ酵素で消化したｐＥＴ１６ｂにクローニングした。ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、正しいクローンをシークエンシングで選択した。得られたプラスミドは、クズイソプレンシンターゼ遺伝子がＴ７プロモーターから発現されるが、これを、ｐＥＴＮＨｉｓＫｕｄｚｕと命名した（図４および５；配列番号５１）。
【０４５７】
クズイソプレンシンターゼ遺伝子を低コピー数プラスミドｐＣＬ１９２０にもクローニングした。プライマーを用いて、上記のｐＴｒｃＫｕｄｚｕからクズイソプレンシンターゼ遺伝子を増幅した。フォワードプライマーには、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位と大腸菌コンセンサスＲＢＳを付加した。ＰｓｔＩクローニング部位は、終止コドンのすぐ３’でｐＴｒｃＫｕｄｚｕに既に存在していたので、リバースプライマーは、最終的なＰＣＲ産物がＰｓｔＩ部位を含むように構築された。プライマーの配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ−ｒｂｓ−Ｋｕｄｚｕ  Ｆ：５’−ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＣＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＡＣＣ（配列番号５１）およびＢａｍＨ１−Ｋｕｄｚｕ  Ｒ：
【０４５８】
５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）であった。１０ｐｍｏｌの濃度のプライマーと１ｎｇの鋳型ＤＮＡ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ）とともにＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼを用いてＰＣＲ産物を増幅した。増幅プロトコルは３０サイクルの（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分）が含まれた。この産物をＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化し、同じくＨｉｎｄＩＩＩとＰｓｔＩで消化しておいたｐＣＬ１９２０に連結した。ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０に形質転換した。いくつかの形質転換体をシークエンシングで調べた。得られたプラスミドをｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕと命名した（図６および７；配列番号４）。
【０４５９】
ＩＩ．イソプレン産出の測定
振盪フラスコ培養のために、１ｍｌの培養物を振盪フラスコから２０ｍｌＣＴＣヘッドスペースバイアル（Ａｇｉｌｅｎｔバイアルカタログ番号５１８８  ２７５３；キャップカタログ番号５１８８  ２７５９）に移した。キャップを回して堅く締め、２５０ｒｐｍで振盪させながらバイアルを等価温度でインキュベートした。３０分後、バイアルをインキュベーターから取り出し、以下に記載するように分析した（このアッセイから得られるいくつかの実験的値については、表１を参照されたい）。
【０４６０】
発酵槽中のイソプレン産出を測定する場合、試料を発酵槽のオフガスから採取し、以下に記載するように直接分析した（このアッセイから得られるいくつかの実験的値については、表２を参照されたい）。
【０４６１】
ヘッドスペースモードで操作するＣＴＣ  Ａｎａｌｙｓｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）  ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーを接続したＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ／ＭＳシステムを用いて分析を行なった。分析物の分離にはＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳ  ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×０.２５ｍｍ；０．２５μｍ膜厚）を用いた。５００μＬのヘッドスペースガスを注入するようにサンプラーを設定した。ＧＣ／ＭＳ法では、キャリアガスとして１ｍｌ／分の流量でヘリウムを用いた。注入口を２５０℃に保ち、分割比を５０：１とした。２分間の分析の間、オーブン温度を３７℃に保った。ｍ／ｚ  ６７での単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードでＡｇｉｌｅｎｔ  ５７９３Ｎ質量選択検出器を操作した。１．４分から１．７分まで検出器を切り、永久ガスを溶出させた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、１．７８分で溶出することが観察された。較正表を用いて、イソプレンの絶対量を定量し、１μｇ／Ｌ〜７０，０００μｇ／Ｌまで線形であることが分かった。この方法を用いて、検出限界は５０〜１００ｎｇ／Ｌと推定された。
【０４６２】
ＩＩＩ．組換えイソプレンシンターゼを発現する大腸菌細胞を含有する振盪フラスコにおけるイソプレンの産出
上記のベクターを大腸菌株ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入して、ＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕ株、ＢＬ２１／ｐＣＬ−ｌａｃ−Ｋｕｄｚｕ株およびＢＬ２１／ｐＥＴＨｉｓＫｕｄｚｕ株を作製した。単離するために、これらの株をＬＡ（ルリア寒天）＋カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）上に播き、３７℃で一晩インキュベートした。単一のコロニーを、２０ｍｌルリア・ベルターニブロス（ＬＢ）とカルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに植菌した。培養物を、２００ｒｐｍで振盪させながら２０℃で一晩増殖させた。終夜培養物のＯＤ６００を測定し、培養物を、３０ｍｌ  ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有する２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに入れてＯＤ６００が約０．０５になるまで希釈した。培養物を２００ｒｐｍで振盪させながら３０℃でインキュベートした。ＯＤ６００が約０．５〜０．８になったとき、４００μＭのＩＰＴＧを添加し、２００ｒｐｍで振盪させながら、細胞をさらに３０℃で６時間インキュベートした。ＩＰＴＧによる誘導の０、２、４および６時間後、培養物の１ｍｌアリコートを回収し、ＯＤ６００を測定し、産出されたイソプレンの量を上記のように測定した。結果を図８に示す。
【０４６３】
ＩＶ．１４リットル発酵におけるＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕからのイソプレンの産出
組換えクズイソプレンシンターゼ遺伝子を含有する大腸菌からのイソプレンの大規模産出をフェドバッチ培養物から測定した。発酵培地１リットル当たりの発酵培地（ＴＭ２）のレシピは次の通りであった：Ｋ２ＨＰＯ４  １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３．２ｇ、酵母抽出物５ｇ、１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。水酸化カリウム（ＫＯＨ）でｐＨを６．８に調整し、適量を加えて全量とした。最終産物を０．２２μフィルターで濾過滅菌した（濾過滅菌のみで、オートクレーブなしない）。１０００×改変微量金属溶液のレシピは次の通りであった：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、適量を加えて全量とし、０．２２μフィルターで濾過滅菌した。
【０４６４】
所望の発酵（ｐＨ６．７および温度３４℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために、この実験を１４Ｌバイオリアクターで行なった。凍結バイアルから採取した大腸菌株ＢＬ２１／ｐｔｒｃＫｕｄｚｕの種菌をソイトン−酵母抽出物−グルコース培地中に調製した。種菌が増殖してＯＤ５５０＝０．６になったときに、２つの６００ｍｌフラスコを遠心分離し、その中身を７０ｍｌ上清に再懸濁して、細胞ペレット（ＯＤ３．１の材料７０ｍｌ）をバイオリアクターに移した。植菌後の様々な時点で、サンプルを取り出し、産出されたイソプレンの量を上記のように測定した。結果を図９に示す。
【０４６５】
実施例２：組換えポプライソプレンシンターゼを発現する大腸菌におけるイソプレンの産出
ポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）イソプレンシンターゼのタンパク質配列（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ，Ｊ−Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｐｌａｎｔａ  ２２２：７７７−７８６）をＧｅｎＢａｎｋ（ＣＡＣ３５６９６）から得た。大腸菌用にコドンが最適化された遺伝子をＤＮＡ２．０から購入した（ｐ９７９６−ｐｏｐｌａｒ、図３０および３１；配列番号１４）。このイソプレンシンターゼ遺伝子を、供給されたプラスミドからＢｓｐＬＵ１１Ｉ／ＰｓｔＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化によって取り出し、ゲル精製し、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで消化しておいたｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂに連結した。このコンストラクトは、挿入物中の終止コドンがＰｓｔＩ部位の前にあるようにクローニングされ、Ｈｉｓタグがイソプレンシンターゼタンパク質に付加されないコンストラクトを生じさせる。得られたプラスミドｐＴｒｃＰｏｐｌａｒ（図３２および３３；配列番号１５）をシークエンシングで確認した。
【０４６６】
実施例２Ｂ：いくつかのポプラ属イソプレンシンターゼのイソプレンシンターゼ活性の証明
以下のイソプレンシンターゼ；ウラジロハコヤナギ（アクセッション番号ＢＡＤ９８２４３；図１３７ＡおよびＢ；配列番号３０）、クロヤマナラシ（アクセッション番号ＣＡＬ６９９１８；図１３７ＣおよびＤ；配列番号３１）、アメリカヤマナラシ（アクセッション番号ＡＡＱ１６５８８；図１３７Ｅ、Ｆ、およびＧ；配列番号３２〜３３）、ブラックコットンウッド（アクセッション番号ＡＣＤ７０４０４；図１３７ＨおよびＩ；配列番号３４）、ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ（アクセッション番号ＣＡＪ２９３０３；図１３７ＪおよびＫ；配列番号３５）、ならびにＭＣＭ１１２−Ｋｕｄｚｕを調べた。
【０４６７】
ｐＥＴ２４Ｋｕｄｚｕ（ＭＣＭ１１２とも呼ぶ）を以下のように構築した。クズイソプレンシンターゼ遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からｐＥＴ２４ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。クズＩｓｐＳ遺伝子を、プライマーのＭＣＭ５０  ５’−ｇａｔｃａｔｇｃａｔ  ｔｃｇｃｃｃｔｔａｇ  ｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｔｇｔｇｃｇａｃｃｔｃｔｔｃ  ｔｃａａｔｔｔａｃｔ（配列番号５２）；およびＭＣＭ５３  ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧ  ＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣ  ＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）を用いて、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ鋳型ＤＮＡから増幅した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ反応を行ない、得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ−寒天にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有する５ｍｌのルリアブロス培養液に単一の形質転換体を植菌し、３７℃で一晩増殖させた。１ｍｌの培養液（ルリアブロス）から単離されたプラスミドＤＮＡのシークエンシングにより、５つのコロニーを正しい挿入についてスクリーニングし、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＭＣＭ９３と命名された、得られたプラスミドは、ｐＣＲ２．１骨格中にクズＩｓｐＳコード配列を含有する（図１３７Ｌ）。ＭＣＭ９３の配列（配列番号３６）を図１３７ＭおよびＮに示す。
【０４６８】
クズコード配列をＰｃｉＩとＢａｍＨ１（Ｒｏｃｈｅ）を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により取り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ｐＥＴ２４ｄベクターＤＮＡをＮｃｏＩとＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。クズＩｓｐＳ断片を、２０μｌの全容量中、５：１の断片対ベクター比で迅速ＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨ１消化したｐＥＴ２４ｄに連結した。このライゲーション混合物（５μｌ）の一部を大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセルに形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にプレーティングした。正しい形質転換体をシークエンシングで確認し、化学的コンピテントＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で、３７℃で一晩増殖させた後、単一コロニーを選択した。ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕと命名された得られたプラスミドのマップを図１３７Ｏに示す。ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕの配列（配列番号３７）を図１３７ＰおよびＱに示す。
【０４６９】
アメリカヤマナラシ、ウラジロハコヤナギ、クロヤマナラシおよびブラックコットンウッドについては、ｐＥＴ２４ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングされた大腸菌に最適化されたイソプレンシンターゼ遺伝子をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）から購入した。葉緑体輸送ペプチド配列を除去して遺伝子を合成し、成熟タンパク質を発現させた。
【０４７０】
クズイソプレンシンターゼのコンストラクトをこの実施例の対照として用いた。このプラスミドを大腸菌発現宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳに形質転換し、形質転換体を０.６ｍｌのＴＭ３培地中で増殖させた。ＴＭ３培地のレシピは次の通りである：Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ／ｌ）  ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ／Ｌ）  クエン酸一水和物（２ｇ／Ｌ）  クエン酸第二鉄アンモニウム（０．３ｇ／Ｌ）（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ／Ｌ）  酵母抽出物（０．２ｇ／Ｌ）  １０００×微量元素溶液１ｍｌ（これらを水酸化アンモニウムでｐＨを６．８に調整し、滅菌ＤＩＨ２Ｏを適量を加えて全量とし、０.２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した）。１０００×微量元素溶液のレシピは次の通りである：クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ／Ｌ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（１０ｇ／Ｌ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ／Ｌ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ／Ｌ）、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ／Ｌ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ／Ｌ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ／Ｌ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ／Ｌ）。各成分を一度にＤＩＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０に調整し、適量を加えて全量とし、０.２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０４７１】
培養物を４００μＭのＩＰＴＧで誘導し、ＯＤ６００が約５になるまで増殖させ続けた。培養物のアリコートを深ウェルガラスプレートに移し、ウェルをアルミニウムプレートシーラーで密封した。プレートを、４５０ｒｐｍで振盪させながら、２５℃で３０分間インキュベートした。この反応液を、５分間、温度を７０℃に上昇させることにより、熱不活化した。全細胞ヘッドスペースを、実施例１、第ＩＩ部に記載したようなＧＣＭＳ法により測定した。
【０４７２】
同様の方法で増殖させたが、細胞を回収して、凍結／融解リゾチームプロトコルで溶解させた培養物からＫｍ値を得た。容量４００μＬの培養物を新しい９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号６００８２９０）に移し、細胞を、２５００×ｇで、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離器で遠心分離することにより回収した。ペレットを２００ｍＬの低張緩衝液（５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ８．０）に再懸濁し、プレートを−８０℃で最低６０分間、凍結させた。プレートを融解し、３２ｍＬのイソプレンシンターゼＤＭＡＰＰアッセイ緩衝液（５７ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７４ｍｇ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＤＮ−２５）、２．６３×１０５Ｕ／ｍＬのＲｅａｄｙＬｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号Ｒ１８０２Ｍ）、および５ｍｇ／ｍＬの分子生物学等級ＢＳＡを添加することにより、細胞ライセートを調製した。プレートを振盪させながら２５℃で３０分間インキュベートした後、氷上に置いた。上記の全細胞ヘッドスペースアッセイのために、ＤＭＡＰＰおよびライセートを、密封した深ウェルガラスブロック中に所望の濃度で添加した。この反応を１時間進行させておいた後、上記の加熱工程で終了させ、同じく上記のようにヘッドスペース活性を測定した。
【０４７３】
代わりのアプローチでは、２５ｍＬ容量で培養し、上記のように誘導した細胞から酵素の活性を測定した。細胞を遠心分離により回収し、５０％グリセロールと２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴを１：１で混合したものからなる緩衝液中でフレンチプレスで破壊することによりペレットを溶解させた。容量２５μＬのライセートを、７５μＬのアッセイ緩衝液（６６．６  ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ８、６．６６ｍＭ  ＤＭＡＰＰ、４３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を含有する２ｍＬスクリューキャップバイアル中でイソプレンシンターゼ活性についてアッセイした。反応液を３０℃で１５分間インキュベートし、バイアルのセプタムを通して１００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによりクエンチした。イソプレンを実施例１、第ＩＩ部で記載したようなＧＣ／ＭＳで測定した。
【０４７４】
全ての活性測定方法により、純系のポプラに由来するポプラ酵素は、ポプラ［ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ］よりも数倍高いことが示された。図１３８および１３９は、それぞれ、これらの全細胞ヘッドスペースアッセイおよびＤＭＡＰＰアッセイの結果を示し、驚くべきことに、クロヤマナラシ、アメリカヤマナラシ、ブラックコットンウッド、およびウラジロハコヤナギ由来の酵素が全て、交配種の［ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ］よりも有意に高い活性を有していたことを示している。
【０４７５】
ＤＭＡＰＰアッセイを次のように行なった。容量４００μＬの培養物を新しい９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，カタログ番号６００８２９０）に移し、細胞を、２５００×ｇで、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  ６Ｒ遠心分離器で遠心分離することにより回収した。ペレットを２００ｍＬの低張緩衝液（５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ８．０）に再懸濁し、プレートを−８０℃で最低６０分間、凍結させた。プレートを融解し、３２ｍＬのイソプレンシンターゼＤＭＡＰＰアッセイ緩衝液（５７ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、１９ｍＭ  ＭｇＣｌ２、７４ｍｇ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩ（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＤＮ−２５）、２．６３×１０５Ｕ／ｍＬのＲｅａｄｙＬｙｓｅリゾチーム溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅカタログ番号Ｒ１８０２Ｍ）、および５ｍｇ／ｍＬの分子生物学等級ＢＳＡを添加することにより、細胞ライセートを調製した。プレートを振盪させながら２５℃で３０分間インキュベートした後、氷上に置いた。イソプレン産出のために、ライセートのアリコート８０ｍＬを９６深ウェルガラスプレート（Ｚｉｎｓｓｅｒカタログ番号３６００６００）に移し、１００ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号６３１８０）中の２０ｍＬの１０ｍＭ  ＤＭＡＰＰ溶液を添加した。このプレートをアルミニウムプレートシール（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｏｒカタログ番号５３８６１９）で密封し、浸透させながら３０℃で６０分間インキュベートした。ガラスブロックを加熱することにより（７０℃、５分間）、酵素反応を終了させた。実施例１、第ＩＩ部に記載したように、各ウェルの細胞ヘッドスペースを定量的に分析した。
【０４７６】
注目すべきことに、ウラジロハコヤナギ、Ｐ．トレムロイデス、Ｐ．トリコカルパは、クズ由来のイソプレンシンターゼよりも高い活性を有していた。ウラジロハコヤナギ由来の酵素は、試験した全ての酵素のうち最も大きい活性を有して発現した。全細胞ヘッドスペースアッセイと比べてより高い活性が細胞ライセートで観察されたのは、細胞の内在性デオキシキシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路によって送達される、これらの酵素基質のＤＭＡＰＰが制限されていたためである可能性が高い。
【０４７７】
速度論的パラメータＫｍは、値が測定された全ての酵素について約２〜３ｍＭと測定された。
【０４７８】
実施例３：組換えクズイソプレンシンターゼを発現するパントエア・シトレアにおけるイソプレンの産出
実施例１に記載のｐＴｒｃＫｕｄｚｕプラスミドおよびｐＣＬ−ｌａｃ  ＫｕｄｚｕプラスミドをＰ．シトレア（米国特許第７，２４１，５８７号）にエレクトロポレートした。形質転換体をそれぞれ、カルベニシリン（２００μｇ／ｍｌ）またはスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択した。振盪フラスコからのイソプレンの産出と産出されたイソプレンの量の測定を、組換えクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌株について実施例１に記載したように行なった。結果を図１０に示す。
【０４７９】
実施例４：組換えクズイソプレンシンターゼを発現する枯草菌におけるイソプレンの産出
Ｉ．クズイソプレンシンターゼを発現させるための枯草菌複製プラスミドの構築
クズイソプレンシンターゼ遺伝子を、ａｐｒＥプロモーターの制御下にある複製プラスミド（クロラムフェニコール耐性カセットを有するｐＢＳ１９）を用いて枯草菌ａｐｒＥｎｐｒＥ  Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫ株（ＢＧ３５９４ｃｏｍＫ）で発現させた。イソプレンシンターゼ遺伝子、ａｐｒＥプロモーターおよび転写ターミネーターを別々に増幅し、ＰＣＲを用いて融合させた。その後、コンストラクトをｐＢＳ１９にクローニングし、枯草菌に形質転換した。
【０４８０】
ａ）ａｐｒＥプロモーターの増幅
ａｐｒＥプロモーターを、以下のプライマーを用いて枯草菌由来の染色体ＤＮＡから増幅した。
ＣＦ  ７９７（＋）  開始点  ａｐｒＥプロモーター  ＭｆｅＩ
［化１７］
５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣ（配列番号５３）
ＣＦ  ０７−４３（−）  ａｐｒＥプロモーターをクズｉｓｐＳに融合する
［化１８］
５’−ＡＴＴＧＡＧＡＡＧＡＧＧＴＣＧＣＡＣＡＣＡＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡ（配列番号５４）
［０４８１］
ｂ）イソプレンシンターゼ遺伝子の増幅
クズイソプレンシンターゼ遺伝子をプラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（配列番号２）から増幅した。この遺伝子は大腸菌用にコドンが最適化されており、ＤＮＡ２.０により合成されていた。以下のプライマーを用いた。
ＣＦ  ０７−４２（＋）  ａｐｒＥプロモーターをクズイソプレンシンターゼ遺伝子（ＧＴＧ開始コドン）に融合する
［化１９］
５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴ（配列番号５５）
ＣＦ  ０７−４５（−）  クズイソプレンシンターゼ遺伝子３’末端をターミネーターに融合する
［化２０］
５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＣ（配列番号５６）
【０４８１】
ｃ）転写ターミネーターの増幅
バシルス・アミリケファシエンスのアルカリ性セリンプロテアーゼ由来のターミネーターを、以前に配列が決定されたプラスミドｐＪＨＰｍｓ３８２から、以下のプライマーを用いて増幅した。
ＣＦ  ０７−４４（＋）  クズイソプレンシンターゼの３’末端をターミネーターに融合する
［化２１］
５’−ＧＡＴＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＧＴＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧ（配列番号５７）
ＣＦ  ０７−４６（−）  Ｂ．アミロリケファシエンスターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端
［化２２］
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）
【０４８２】
このクズ断片を、以下のプライマーを用いたＰＣＲを用いてターミネーター断片に融合した。
ＣＦ  ０７−４２（＋）  ａｐｒＥプロモーターをクズイソプレンシンターゼ遺伝子（ＧＴＧ開始コドン）に融合する
［化２３］
５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴ（配列番号５５）
ＣＦ  ０７−４６（−）  Ｂ．アミロリケファシエンスターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端
［化２４］
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）
【０４８３】
このクズターミネーター断片を、以下のプライマーを用いたＰＣＲを用いてプロモーター断片に融合した。
ＣＦ  ７９７（＋）  開始点  ａｐｒＥプロモーター  ＭｆｅＩ
［化２５］
５’−ＧＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＡＴＣ（配列番号５３）
ＣＦ  ０７−４６（−）  Ｂ．アミロリケファシエンスターミネーター（ＢａｍＨＩ）の末端
［化２６］
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）
【０４８４】
この融合ＰＣＲ断片をＱｉａｇｅｎキットを用いて精製し、制限酵素のＭｆｅＩとＢａｍＨＩで消化した。この消化したＤＮＡ断片をＱｉａｇｅｎキットを用いてゲル精製した。これを、ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製しておいたｐＢＳ１９として知られるベクターに連結した。
【０４８５】
このライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、コロニーをＬＡ＋５０カルベニシリンプレート上で選択した。合計６つのコロニーを選び、ＬＢ＋５０カルベニシリン中で一晩増殖させた後、Ｑｉａｇｅｎキットを用いてプラスミドを単離した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化して、挿入物を調べ、正しいプラスミドのうちの３つを、以下のプライマーを用いるシークエンシングに回した。
ＣＦ  １４９（＋）  ＥｃｏＲＩ  ａｐｒＥプロモーターの開始点
［化２７］
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号５９）
ＣＦ  ８４７（＋）  ｐＸＸ  ０４９中の配列（ａｐｒＥプロモーターの終点）
［化２８］
５’−ＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＧ（配列番号６０）
ＣＦ  ０７−４５（−）  クズイソプレンシンターゼの３’末端をターミネーターに融合する
［化２９］
５’−ＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＴＣ（配列番号５６）
ＣＦ  ０７−４８（＋）  クズイソプレンシンターゼのシークエンシングプライマー
［化３０］
５’−ＣＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＡＡＧ（配列番号６１）
ＣＦ  ０７−４９（＋）  クズイソプレンシンターゼ中の配列
［化３１］
５’−ＧＧＣＧＡＡＡＴＧＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＣ（配列番号６２）
【０４８６】
ｐＢＳ  Ｋｕｄｚｕ  ＃２（図５２および１２；配列番号５）と命名されたプラスミドは、シークエンシングにより正しいものであった。これを、枯草菌宿主株のＢＧ  ３５９４  ｃｏｍＫに形質転換した。ＬＡ＋５クロラムフェニコールプレート上で選択を行なった。形質転換体を選び、ＬＡ＋５クロラムフェニコール上で単一コロニーを突いた後、ＯＤ６００が１．５に達するまで、ＬＢ＋５クロラムフェニコール中で増殖させた。これを、グリセロールの存在下、−８０℃でバイアル中に凍結保存した。得られた株をＣＦ  ４４３と命名した。
【０４８７】
ＩＩ．組換えイソプレンシンターゼを発現する枯草菌細胞を含有する振盪フラスコにおけるイソプレンの産出
終夜培養液に、ＬＡ＋クロラムフェニコール（Ｃｍ、２５μｇ／ｍｌ）からのＣＦ  ４４３の単一コロニーを植菌した。培養物を２００ｒｐｍで振盪させながらＬＢ＋Ｃｍ中、３７℃で増殖させた。これらの終夜培養物（１ｍｌ）を用いて、２５ｍｌのＧｒａｎｔｓ  ＩＩ培地と最終濃度２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールとを含有する２５０ｍｌバッフル付き振盪フラスコに植菌した。Ｇｒａｎｔｓ  ＩＩ培地のレシピは、１０ｇソイトン、３ｍｌ  １Ｍ  Ｋ２ＨＰＯ４、７５ｇグルコース、３．６ｇ尿素、１００ｍｌ  １０×ＭＯＰＳを、Ｈ２Ｏ（ｐＨ７．２）を適量加えて１Ｌにしたものであり；１０×ＭＯＰＳのレシピは、８３．７２ｇ  ＭＯＰＳ、７．１７ｇトリシン、１２ｇ  ＫＯＨペレット、１０ｍｌ  ０．２７６Ｍ  Ｋ２ＳＯ４溶液、１０ｍｌ  ０．５２８Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液、２９．２２ｇ  ＮａＣｌ、１００ｍｌ  １００×微量栄養素を、Ｈ２Ｏを適量加えて１Ｌにしたものであり；１００×微量栄養素のレシピは、１．４７ｇ  ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、０．４ｇ  ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２０、０．１ｇ  ＭｎＳＯ４＊Ｈ２０、０．１ｇ  ＺｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ、０．０５ｇ  ＣｕＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ、０．１ｇ  ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏを、Ｈ２Ｏを適量加えて１Ｌにしたものであった。振盪フラスコを３７℃でインキュベートし、サンプルを１８、２４、および４４時間で採取した。１８時間で、ＣＦ４４３および対照株のヘッドスペースをサンプリングした。これは、イソプレンが１８時間蓄積したものに相当した。イソプレンの量を、実施例１に記載したようにガスクロマトグラフィーで測定した。イソプレンの産出は、組換えイソプレンシンターゼを発現させることにより有意に増強された（図１１）。
【０４８８】
ＩＩＩ．１４Ｌ発酵におけるＣＦ４４３によるイソプレンの産出
複製プラスミド上に組換えクズイソプレンシンターゼ遺伝子を含有する枯草菌からのイソプレンの大規模産出を、フェドバッチ培養から測定した。クズイソプレンシンターゼ遺伝子を発現するバシルス株ＣＦ  ４４３、またはクズイソプレンシンターゼ遺伝子を発現しない対照株を、大豆ミール（Ｃａｒｇｉｌｌ）、リン酸ナトリウムおよびリン酸カリウム、硫酸マグネシウムならびにクエン酸、塩化第二鉄および塩化マンガンの溶液を含有する栄養培地中で従来のフェドバッチ発酵により培養した。発酵前に、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼを含む酵素の混合物を用いて、培地を９０分間軟化させる（ｍａｃｅｒａｔｅ）（ＷＯ９５／０４１３４号を参照されたい）。１４Ｌバッチ発酵に、６０％ｗｔ／ｗｔグルコース（Ｃａｒｇｉｌｌ  ＤＥ９９デキストロース、ＡＤＭ  Ｖｅｒｓａｄｅｘ  ｇｒｅｅｎｓまたはＤａｎｉｓｃｏ転化糖）と９９％ｗｔ／ｗｔ油（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｆａｍｉｌｙ大豆油、ここで、９９％ｗｔ／ｗｔとは、細胞培養培地に添加されてしまう前の油の濃度である）とを供給する。バッチ中のグルコースが検出されなくなったときに供給を開始した。供給速度を数時間かけて上昇させ、炭素量が等しくなるように油が添加されるように調整した。２８％ｗ／ｖ水酸化アンモニウムを用いてｐＨを６．８〜７．４に調節した。泡が立つ場合、消泡剤を培地に添加した。発酵温度を３７℃に調節し、発酵培養物を７５０ｒｐｍで撹拌した。ｐＨ、ＤＯ％、空気流量、および圧力などの様々な他のパラメータを、プロセス全体を通じてモニタリングした。ＤＯ％は２０より高く維持される。サンプルを３６時間にわたってずっと採取し、細胞増殖（ＯＤ５５０）およびイソプレン産出について分析した。これらの実験の結果を図５３Ａおよび５３Ｂに示す。
【０４８９】
ＩＶ．クズイソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）の枯草菌への組込み
クズイソプレンシンターゼ遺伝子を、ａｐｒＥプロモーターの制御下にある組込みプラスミド（ｐＪＨ１０１−ｃｍｐＲ）にクローニングした。試験した条件下では、イソプレンが検出されなかった。
【０４９０】
実施例５：トリコデルマにおけるイソプレンの産出
Ｉ．トリコデルマ・リーゼイにおいてクズイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築
ヤロウイア・リポリティカのコドンに最適化されたクズＩＳ遺伝子はＤＮＡ２.０によって合成された（配列番号６）（図１３）。このプラスミドは、以下のＰＣＲ増幅反応（全反応容量５０μｌ中、１μｌのプラスミド鋳型（２０ｎｇ／ｕｌ）、１μｌのプライマーＥＬ−９４５（１０μＭ）５’−ＧＣＴＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＡＣＡＣＧＴＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＧ（配列番号６３）、１μｌのプライマーＥＬ−９６５（１０μＭ）５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＡＣ（配列番号６４）、１μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、５μｌの１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、１μｌのＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ、４０μｌの水）の鋳型としての役割を果たした。フォワードプライマーは、Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子に対応するものではないが、ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターへのクローニングに必要な５’末端の追加の４ヌクレオチドを含んでいた。リバースプライマーは、Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子に対応するものではないが、他のベクター骨格にクローニングするために挿入される５’末端の追加の２１ヌクレオチドを含んでいた。ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを用いて、以下のようにＰＣＲ反応を行なった。９５℃で２分間（最初のサイクルのみ）、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間（２７サイクル繰り返す）、最後のサイクルの後に７２℃で１分間。ＰＣＲ産物を１．２％Ｅ−ゲル上で解析して、Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子が増幅できたことを確認した。
【０４９１】
次に、このＰＣＲ産物を、製造元のプロトコル（全反応容量６μｌ中、１μｌのＰＣＲ反応液、１μｌの塩溶液、１μｌのＴＯＰＯ  ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクターおよび３μｌの水）に従って、ＴＯＰＯ  ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯクローニングキットを用いてクローニングした。反応液を室温で５分間インキュベートした。１μｌのＴＯＰＯ反応液をＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシンプレート上で選択した。いくつかのコロニーを取り、各々をＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５ｍｌチューブに植菌し、培養物を、２００ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で一晩増殖させた。製造元のプロトコルに従って、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキットを用いて終夜培養チューブからプラスミドを単離した。いくつかのプラスミドをシークエンシングし、ＤＮＡ配列が正しいことを確認した。
【０４９２】
Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子をコードする単一のｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯプラスミドを、オーダーメイドのｐＴｒｅｘ３ｇベクターへのＧａｔｅｗａｙクローニングに用いた。ｐＴｒｅｘ３ｇの構築については、ＷＯ２００５／００１０３６  Ａ２号に記載されている。Ｇａｔｅｗａｙ  ＬＲクロナーゼＩＩ酵素ミックスキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）用の製造元のプロトコル（全反応容量８μｌ中、１μｌのＹ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子ｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯドナーベクター、１μｌのｐＴｒｅｘ３ｇデスティネーションベクター、６μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０））に従って、反応を行なった。反応液を室温で１時間インキュベートした後、１μｌのプロテイナーゼＫ溶液を添加し、３７℃で１０分間インキュベーションを続けた。その後、反応液１μｌをＴＯＰ１０化学的コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリンプレート上で選択した。いくつかのコロニーを取り、各々をＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する５ｍｌチューブに植菌し、培養物を、２００ｒｐｍで振盪させながら、３７℃で一晩増殖させた。製造元のプロトコルに従って、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキットを用いて終夜培養チューブからプラスミドを単離した。いくつかのプラスミドをシークエンシングし、ＤＮＡ配列が正しいことを確認した。
【０４９３】
Ｙ．リポリティカのコドンに最適化されたクズイソプレンシンターゼｐＴｒｅｘ３ｇプラスミド（図１４）の四重欠失トリコデルマ・リーゼイ株への微粒子銃による形質転換を、微粒子銃ＰＤＳ−１０００／ＨＥ粒子送達系を用いて行なった（ＷＯ２００５／００１０３６  Ａ２号参照）。安定な形質転換体の単離と振盪フラスコの評価は、特許刊行物ＷＯ２００５／００１０３６  Ａ２号の実施例１１に記載のプロトコルを用いて行なった。
【０４９４】
ＩＩ．組換えＴ．リーゼイの株におけるイソプレンの産出
上記のイソプレンシンターゼ形質転換体の１５時間および３６時間培養物１ｍｌをヘッドスペースバイアルに移した。このバイアルを密封し、３０℃で５時間インキュベートした。ヘッドスペースガスを測定し、実施例１に記載の方法によりイソプレンを同定した。これらの形質転換体のうちの２つは、微量のイソプレンを示した。１４時間インキュベートすることにより、イソプレンの量を増加させることができた。この２つの陽性サンプルは、１４時間のインキュベーンで約０.５μｇ／Ｌのレベルのイソプレンを示した。形質転換していない対照は、検出可能なレベルのイソプレンを示さなかった。この実験により、Ｔ．リーゼイが、外因性イソプレンシンターゼを供給したときに内在性前駆体からイソプレンを産出することができることが示される。
【０４９５】
実施例６：ヤロウイアにおけるイソプレンの産出
Ｉ．ヤロウイア・リポリティカにおいてクズイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築
ヤロウイア・リポリティカにおいてクズイソプレンシンターゼを発現させるためのベクターの構築するための出発点は、ベクターｐＳＰＺ１（ＭＡＰ２９Ｓｐｂ）であった。このベクターの全配列（配列番号７）を図１５に示す。
【０４９６】
Ｙ．リポリティカ株ＧＩＣＣ  １２０２８５の染色体ＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲにより、以下の断片を増幅した：プロモーターレス形態のＵＲＡ３遺伝子、１８ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の断片、Ｙ．リポリティカＸＰＲ２遺伝子の転写ターミネーターならびにＸＰＲ２遺伝子およびＩＣＬ１遺伝子のプロモーターを含有する２つのＤＮＡ断片。以下のＰＣＲプライマーを用いた。
ＩＣＬ１  ３
［化３２］
５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＴＡＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＣＣＡＡＡＴＣＴＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣ（配列番号６５）
ＩＣＬ１  ５
［化３３］
５’−ＧＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＴＡＴＧＣＡＣＴＣＣ（配列番号６６）
ＸＰＲ  ３
［化３４］
５’−ＣＣＴＧＡＡＴＴＣＴＧＴＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＧＴＧＧＧ（配列番号６７）
ＸＰＲ  ５
［化３５］
５’−ＧＧＴＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＧＣＴＴＡＴＴＧＡＣＣ（配列番号６８）
ＸＰＲＴ３
［化３６］
５’−ＧＧＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＴＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＧ（配列番号６９）
ＸＰＲＴ  ５
［化３７］
５’−ＧＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＧＣＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＡＡＣＧＧ（配列番号７０）
Ｙ１８Ｓ３
［化３８］
５’−ＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＧ（配列番号７１）
Ｙ１８Ｓ  ５
［化３９］
５’−ＧＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＡＡＡＴＣＡＧＴＴＡＴＣＧＴＴＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧ（配列番号７２）
ＹＵＲＡ３
［化４０］
５’−ＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＧＴＧＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧ（配列番号７３）
ＹＵＲＡ  ５０
［化４１］
５’−ＧＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＴＣＣＡＡＣＴＡＴＧ（配列番号７４）
ＹＵＲＡ  ５１
［化４２］
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＣＴＣＣ（配列番号７５）
【０４９７】
ＰＣＲ増幅のために、ＰｆｕＵｌｔｒａＩＩポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、供給元により提供された緩衝液およびｄＮＴＰ、２．５μＭプライマーならびに示された鋳型ＤＮＡを製造元の取扱説明書の通りに用いた。以下のサイクル：９５℃で１分間；３４回（９５℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３分）および７２℃、１０分を用いて増殖を行ない、次いで、４℃でインキュベーションした。
【０４９８】
ヤロウイアにおける発現のためにコドンが最適化されたクズイソプレンシンターゼ遺伝子をコードする合成ＤＮＡ分子を、ＤＮＡ２．０から得た（図１６；配列番号８）。それぞれ、ＸＰＲ２プロモーターおよびＩＣＬ１プロモーターの制御下にある合成クズイソプレンシンターゼ遺伝子を担持するプラスミドであるｐＹＬＡ（ＫＺ１）およびｐＹＬＩ（ＫＺ１）の構築スキームの完全な詳細を図１８に示す。接合因子遺伝子（ＭＡＰ２９）がイソプレンシンターゼ遺伝子の代わりに挿入されている対照プラスミドも構築した（図１８Ｅおよび１８Ｆ）。
【０４９９】
同様のクローニング手順を用いて、ポプラ（ウラジロハコヤナギ×ヨーロッパヤマナラシ）イソプレンシンターゼ遺伝子を発現させることができる。ポプライソプレンの配列は、Ｍｉｌｌｅｒ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｐｌａｎｔａ  ２１３，４８３−４８７に記載されており、これを図１７に示す（配列番号９）。それぞれ、ＸＰＲ２プロモーターおよびＩＣＬ１プロモーターの制御下にある合成ポプライソプレンシンターゼ遺伝子を担持するプラスミドであるｐＹＬＡ（ＰＯＰ１）およびｐＹＬＩ（ＰＯＰ１）を作製するための構築スキームを図１８ＡおよびＢに示す。
【０５００】
ＩＩ．Ｙ．リポリティカの組換え株によるイソプレンの産出
ベクターｐＹＬＡ（ＫＺ１）、ｐＹＬＩ（ＫＺ１）、ｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）およびｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）をＳａｃＩＩで消化し、これらを用いて、標準的な酢酸リチウム／ポリエチレングリコール手順によってＹ．リポリティカ株ＣＬＩＢ  １２２をウリジン原栄養性に形質転換した。簡潔に述べると、ＹＥＰＤ（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％グルコース）中で一晩増殖させた酵母細胞を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分）で回収し、滅菌水で１回洗浄し、０．１Ｍ酢酸リチウム、ｐＨ６．０に懸濁した。細胞懸濁液のアリコート２００μｌを線状化プラスミドＤＮＡ溶液（１０〜２０μｇ）と混合し、室温で１０分間インキュベートし、同じ緩衝剤中で１ｍｌの５０％ＰＥＧ  ４０００と混合した。この懸濁液を室温でさらに１時間インキュベートした後、４２℃で２分間熱ショックを与えた。次に、細胞をＳＣ  ｈｉｓ  ｌｅｕプレート（０．６７％酵母窒素塩基、２％グルコース、各々１００ｍｇ／Ｌのロイシンおよびヒスチジン）上にプレーティングした。３０℃で３〜４日間インキュベートした後に形質転換体が現われた。
【０５０１】
ｐＹＬＡ（ＫＺ１）形質転換からの３つの単離株、ｐＹＬＩ（ＫＺ１）形質転換からの３つの単離株、ｐＹＬＡ（ＭＡＰ２９）形質転換からの２つの単離株およびｐＹＬＩ（ＭＡＰ２９）形質転換からの２つの単離株を、振盪させながらＹＥＰ７培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン、ｐＨ７．０）中、３０℃で２４時間増殖させた。培養物１０ｍｌから遠心分離により細胞を回収し、３ｍｌの新鮮なＹＥＰ７に再懸濁し、１５ｍｌスクリューキャップバイアルに入れた。このバイアルを穏やかに（６０ｒｐｍ）振盪させながら室温で一晩インキュベートした。これらのバイアルのヘッドスペース中のイソプレン含有量を、実施例１に記載したようにマススペクトロメトリー検出器を用いてガスクロマトグラフィーで分析した。ｐＹＬＡ（ＫＺ１）およびｐＹＬＩ（ＫＺ１）で得られた形質転換体は全て、すぐに検出可能な量のイソプレン（０．５μｇ／Ｌ〜１μｇ／Ｌ、図２０）を産出した。イソプレンシンターゼ遺伝子の代わりにフィターゼ遺伝子を担持する対照株のヘッドスペースにはイソプレンが検出されなかった。
【０５０２】
実施例７：クズイソプレンシンターゼとｉｄｉ、またはｄｘｓ、またはｉｄｉとｄｘｓを発現する大腸菌におけるイソプレンの産出
Ｉ．大腸菌においてイソプレンを産出させるためのクズイソプレンシンターゼとｉｄｉ、またはｄｘｓ、またはｉｄｉとｄｘｓをコードするベクターの構築
ｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎの構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（実施例１に記載）のｂｌａ遺伝子を、カナマイシン耐性を付与する遺伝子と置き換えた。ｂｌａ遺伝子を取り除くために、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕをＢｓｐＨＩで消化し、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理し、６５℃で熱不活化した後、クレノー断片とｄＮＴＰで末端を充填した。５ｋｂｐの大きな断片をアガロースゲルから精製し、ｋａｎｒ遺伝子に連結した。このｋａｎｒ遺伝子は、プライマーのＭＣＭ２２  ５’−ＧＡＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＣＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＧＣＴＧ（配列番号７６）およびＭＣＭ２３  ５’−ＧＡＴＣＣＧＡＴＣＧＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＣＧＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣ（配列番号７７）を用いてｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ−ＩＩ−ＴＯＰＯからＰＣＲ増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｖｕＩで消化し、末端を充填しておいたものである。カナマイシン耐性を付与するプラスミドを担持する形質転換体（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  Ｋａｎ）をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ上で選択した。
【０５０３】
ｉｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  Ｋａｎの構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＫａｎをＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化し、ゲル精製した。これを、合成ＲＢＳとともに出芽酵母由来のｉｄｉをコードするＰＣＲ産物に連結した。ＰＣＲ用のプライマーは、ＮｓｉＩ−ＹＩＤＩ  １Ｆ  ５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣ（配列番号７８）およびＰｓｔＩ−ＹＩＤＩ  １Ｒ  ５’−ＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＣ（配列番号７９）であり、鋳型は出芽酵母ゲノムＤＮＡであった。ＰＣＲ産物をＮｓｉＩとＰｓｔＩで消化し、ライゲーションの前にゲル精製した。このライゲーション混合物を化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有するＬＡ上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、配列を決定し、得られたプラスミドをｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（ｋａｎ）と名付けた（図３４および３５；配列番号１６）。
【０５０４】
ｉｉｉ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ＤＸＳ  Ｋａｎの構築
プラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ＫａｎをＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化し、ゲル精製した。これを、合成ＲＢＳとともに大腸菌由来のｄｘｓをコードするＰＣＲ産物に連結した。ＰＣＲ用のプライマーは、ＭＣＭ１３  ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧ（配列番号８０）およびＭＣＭ１４  ５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴ（配列番号８１）であり、鋳型は大腸菌ゲノムＤＮＡであった。ＰＣＲ産物をＮｓｉＩとＰｓｔＩで消化し、ライゲーションの前にゲル精製した。得られた形質転換反応液をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ上で選択した。いくつかの形質転換体を単離し、配列を決定し、得られたプラスミドをｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ（ｋａｎ）と名付けた（図３６および３７；配列番号１７）。
【０５０５】
ｉｖ）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）の構築
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（ｋａｎ）をＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化し、ゲル精製した。これを、合成ＲＢＳとともに大腸菌ｄｘｓをコードするＰＣＲ産物に連結した（プライマーはＭＣＭ１３  ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＧＴＴＴＴＧＡＴＡＴＴＧＣＣＡＡＡＴＡＣＣＣＧ（配列番号８０）およびＭＣＭ１４  ５’−ＣＡＴＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＴ（配列番号８１）；鋳型はＴＯＰ１０細胞）。このＰＣＲ産物は、ＮｓｉＩおよびＰｓｔＩで消化し、ゲル精製しておいたものである。最終的なプラスミドをｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）と名付けた（図２１および２２；配列番号１０）。
【０５０６】
ｖ）ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕの構築
上記の実施例１由来のプロモーター、構造遺伝子およびターミネーターを含有するＤＮＡの断片をＳｓｐＩを用いてｐＴｒｃＫｕｄｚｕから消化し、ゲル精製した。これを、ＰｖｕＩＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化しておいたｐＣＬ１９２０に連結した。得られたライゲーション混合物をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ中で選択した。いくつかのクローンを単離し、配列を決定し、２つを選択した。ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕおよびｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ａ３）は、反対の向きで挿入物を有している（図３８〜４１；配列番号１８〜１９）。
【０５０７】
ｖｉ）ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩの構築
ＮｓｉＩ−ＰｓｔＩ消化し、ゲル精製した上記（ｉｉ）由来のＩＤＩのＰＣＲアンプリコンを、ＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化しておいたｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕに連結した。このライゲーション混合物をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ中で選択した。いくつかのクローンを単離し、配列を決定し、得られたプラスミドをｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩと名付けた（図４２および４３；配列番号２０）。
【０５０８】
ｖｉｉ）ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ＤＸＳの構築
ＮｓｉＩ−ＰｓｔＩ消化し、ゲル精製した上記（ｉｉｉ）由来のＤＸＳ  ＰＣＲアンプリコンを、ＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰで処理し、熱不活化しておいたｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ａ３）に連結した。このライゲーション混合物をＴＯＰ１０細胞に形質転換し、スペクチノマイシン５０μｇ／ｍｌを含有するＬＡ中で選択した。いくつかのクローンを単離し、配列を決定し、得られたプラスミドをｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ  ＤＸＳと名付けた（図４４および４５；配列番号２１）。
【０５０９】
ＩＩ．様々なコピー数でクズイソプレンシンターゼ、ｉｄｉ、および／またはｄｘｓを発現する培養物からのヘッドスペース中のイソプレンの測定
プラスミドのｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（ｋａｎ）（Ａ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ  ｋａｎ（Ｂ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ  ｋａｎ（Ｃ）、ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ＤＸＳ  ｋａｎ（Ｄ）で以前に形質転換した大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）の培養物をＬＢカナマイシン５０μｇ／ｍＬ中で増殖させた。ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ（Ｅ）、ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ、ｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ（Ｆ）およびｐＣＬ  ＰｔｒｃＫｕｄｚｕ−ＤＸＳ（Ｇ）の培養物をＬＢスペクチノマイシン５０μｇ／ｍＬ中で増殖させた。培養物を、時間０（ＯＤ６００  約０．５）において４００μＭのＩＰＴＧで誘導し、イソプレンヘッドスペース測定用にサンプルを採取した（実施例１参照）。結果を図２３Ａ〜２３Ｇに示す。
【０５１０】
プラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ−ｙＩＤＩ−ｄｘｓ（ｋａｎ）を形質転換により大腸菌株ＢＬ２１に導入した。得られた株ＢＬ２１／ｐＴｒｃ  Ｋｕｄｚｕ  ＩＤＩ  ＤＸＳをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ中、２０℃で一晩増殖させ、これを用いて、１％グルコースを含有するＴＭ３（１３．６ｇ  Ｋ２ＰＯ４、１３．６ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、２．０ｇ  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、２．０ｇクエン酸一水和物、０．３ｇクエン酸第二鉄アンモニウム、３．２ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ酵母抽出物、１．０ｍｌ  １０００×改変微量金属溶液をｐＨ６．８に調整し、適量のＨ２Ｏを加えて全量とし、濾過滅菌したもの）の振盪フラスコに植菌した。ＯＤ６００が０．８に達するまでフラスコを３０℃でインキュベートした後、４００μＭのＩＰＴＧで誘導した。サンプルを誘導後の様々な時点で採取し、ヘッドスペース中のイソプレンの量を実施例１に記載したように測定した。結果を図２３Ｈに示す。
【０５１１】
ＩＩＩ．Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩＤＸＳにおけるバイオマスからのイソプレンの産出
ＢＬ２１  ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ＩＤＩ  ＤＸＳ株を、グルコースを対照として、３種類のバイオマス；バガス、コーンストーバーおよび針葉樹パルプからイソプレンを生成する能力について試験した。バイオマスの加水分解物を酵素的加水分解（Ｂｒｏｗｎ，Ｌ  ａｎｄ  Ｔｏｒｇｅｔ，Ｒ．，１９９６，ＮＲＥＬ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ａｓｓａｙ  ｍｅｔｈｏｄ  Ｌａｐ−００９  “Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ  Ｂｉｏｍａｓｓ”）により調製し、グルコース当量に基づく希釈で用いた。この実施例では、グルコース当量は１％グルコースに等しかった。新たに形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳ（ｋａｎ）細胞のプレート由来の単一コロニーを用いて、５ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に植菌した。この培養物を振盪させながら２５℃で一晩インキュベートした。翌日、終夜培養物を、ＯＤ６００が０．０５になるまで２５ｍｌのＴＭ３＋０．２％ＹＥ＋１％原料中で希釈した。原料は、コーンストーバー、バガス、または針葉樹パルプであった。グルコースを陽性対照として用い、グルコースなしを陰性対照として用いた。培養物を１８０ｒｐｍで振盪させながら３０℃でインキュベートした。培養物をＯＤ６００についてモニタリングし、ＯＤ６００が約０.８に達したとき、培養物を、実施例１に記載したようにイソプレン産出について、１時間および３時間で分析した。培養物は誘導されていない。追加した原料を含有する培養物は全て、グルコース陽性対照のイソプレンと同等のイソプレンを産出する。実験は２つ１組で行なわれた。これを図４６に示す。
【０５１２】
ＩＶ．Ｅ．ｃｏｌｉ／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＩＤＩＤＸＳにおける転化糖からのイソプレンの産出
新たに形質転換したＢＬ２１（λＤＥ３）／ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳ（ｋａｎ）細胞のプレート由来の単一コロニーを用いて、５ｍｌのＬＢ＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）に植菌した。この培養物を振盪させながら２５℃で一晩インキュベートした。翌日、終夜培養物を、ＯＤ６００が０．０５になるまで２５ｍｌのＴＭ３＋０．２％ＹＥ＋１％原料中で希釈した。原料はグルコース、転化グルコースまたはコーンストーバーであった。転化糖原料（Ｄａｎｉｓｃｏ転化糖）は、スクロースシロップを酵素処理することにより調製した。ＡＦＥＸコーンストーバーは、以下（第Ｖ部）に記載するように調製した。細胞を３０℃で増殖させ、培養物のＯＤ６００が約０.８〜１.０に達したとき（０時間）、最初のサンプルを測定した。この培養物を、ＯＤ６００によって測定される増殖と、実施例１に記載の０、１および３時間でのイソプレン産出について分析した。結果を図４７に示す。
【０５１３】
Ｖ．ＡＦＥＸ前処理コーンストーバーからの加水分解物の調製
ＡＦＥＸ前処理コーンストーバーをＭｉｃｈｉｇａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから得た。前処理条件は、湿度６０％、アンモニア負荷１：１、および９０℃、３０分間とし、その後、風乾した。ＡＦＥＸ前処理コーンストーバーの含水率は２１．２７％であった。ＡＦＥＸ前処理コーンストーバーにおけるグルカンとキシランの含有率は、それぞれ３１．７％と１９．１％（乾燥ベース）であった。糖化プロセスは次の通りであった。２０ｇのＡＦＥＸ前処理コーンストーバーを、５ｍｌの１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．８、２．２５ｍｌのアセレラーゼ１０００、０．１ｍｌのグリンダミルＨ１２１（製パン業界用のアスペルギルス・ニゲル由来のＤａｎｉｓｃｏキシラナーゼ製品）、および７２．６５ｍｌのＤＩ水とともに５００ｍｌフラスコに添加した。フラスコをオービタルシェーカー内に置き、５０℃で９６時間インキュベートした。シェーカーからサンプルを１つ採取し、ＨＰＬＣを用いて分析した。この加水分解物は、３８．５ｇ／ｌのグルコース、２１．８ｇ／ｌのキシロース、および１０．３ｇ／ｌのグルコースおよび／またはキシロースのオリゴマーを含有していた。
【０５１４】
ＶＩ．フェドバッチ培養で増殖した大腸菌におけるイソプレン産出に対する酵母抽出物の影響
上記のｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳプラスミドを含有する大腸菌細胞に関して記載したように、１４Ｌスケールで発酵を行なった。酵母抽出物（Ｂｉｏ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，ＣａＮＡＤａ）を指数関数的割合で供給した。発酵槽に送達した酵母抽出物の総量は、４０時間の発酵の間に７０から８３０ｇの間で変動した。発酵ブロスの光学密度を５５０ｎｍの波長で測定した。発酵槽内の最終的な光学密度は、添加された酵母抽出物の量に比例した（図４８Ａ）。発酵槽からのオフガス中のイソプレンレベルを先に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に増加した（図４８Ｂ）。産出されたイソプレンの量は、供給された酵母抽出物の量に直線的に比例した（図４８Ｃ）。
【０５１５】
ＶＩＩ．ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ＤＸＳ  ｙＩＤＩの５００Ｌ発酵におけるイソプレンの産出
クズイソプレンシンターゼ、出芽酵母ＩＤＩ、および大腸菌ＤＸＳ核酸（大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）  ｐＴｒｃ  Ｋｕｄｚｕ  ｄｘｓ  ｙｉｄｉ）を有する大腸菌細胞の５００リットル発酵を用いて、イソプレンを産出した。イソプレンのレベルは、１５時間の間に５０から３００μｇ／Ｌの間で変動した。平均イソプレン濃度、装置を通る平均流量およびイソプレン分解の程度に基づくと、回収されたイソプレンの量は約１７ｇと計算された。
【０５１６】
ＶＩＩＩ．フェドバッチ培養で増殖した大腸菌の５００Ｌ発酵におけるイソプレンの産出
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０.３ｇ、酵母抽出物０.５ｇ、１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした。アンモニアガス（ＮＨ３）でｐＨを７.０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０g、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０５１７】
１０００×改変微量金属溶液：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にＤＩＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５１８】
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩ  ＤＸＳプラスミドを含有する大腸菌細胞を含む５００Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）でグルコースと酵母抽出物からのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をソイトン−酵母抽出物−グルコース培地中に調製した。種菌をＯＤが０．１５になるまで増殖させ、５５０ｎｍで測定し、２０ｍｌを用いて、２．５Ｌのソイトン−酵母抽出物−グルコース培地を含有するバイオリアクターに植菌した。２．５ＬのバイオリアクターをＯＤが１．０になるまで３０℃で増殖させ、２．０Ｌを５００Ｌバイオリアクターに移した。
【０５１９】
酵母抽出物（Ｂｉｏ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，ＣａＮＡＤａ）とグルコースを指数関数的割合で供給した。５０時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースと酵母抽出物の総量は、ぞれぞれ、１８１．２ｋｇと１７．６ｋｇであった。バイオリアクター内の経時的な光学密度を図４９Ａに示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを先に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に増加した（図４９Ｂ）。５０時間の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は５５．１ｇであった。産出の時間経過を図４９Ｃに示す。
【０５２０】
実施例８：クズイソプレンシンターゼと組換えメバロン酸経路遺伝子を発現する大腸菌におけるイソプレンの産出
Ｉ．下流ＭＶＡ経路のクローニング
下流メバロン酸経路のクローニング戦略は以下の通りであった。メバロン酸生合成経路の４つの遺伝子；メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）およびイソペンテニルジホスホイソメラーゼ遺伝子を出芽酵母染色体ＤＮＡからＰＣＲで増幅し、個々にｐＣＲ  ＢｌｕｎｔＩＩ  ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。場合によっては、ｉｄｉ遺伝子を大腸菌染色体ＤＮＡから増幅した。大腸菌コンセンサスＲＢＳ（ＡＧＧＡＧＧＴ（配列番号８２）またはＡＡＧＧＡＧＧ（配列番号８３））が、５’末端で、開始コドンの８ｂｐ上流に挿入され、ＰｓｔＩ部位が３’末端で付加されるように、プライマーを設計した。次に、これらの遺伝子を経路全体がアセンブルされるまで１つずつｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターにクローニングした。
【０５２１】
出芽酵母Ｓ２８８Ｃ由来の染色体ＤＮＡを、ＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ  ２０４５０８Ｄ）から得た。製造元の取扱説明書の通りにＰｆｕＴｕｒｂｏを用いて、プライマー、ＭＶＫＦ（５’−ＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＴＴＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＡＣＴＴＣＴＧＣ、配列番号８４）およびＭＶＫ−Ｐｓｔ１−Ｒ（５’−ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＴＣＧＣＡＡＡＴＴＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＴＡＡＡＴＴＣＧＴＧ、配列番号８５）を用いて、ＭＶＫ遺伝子を出芽酵母の染色体から増幅した。サイズの正しいＰＣＲ産物（１３７０ｂｐ）を、１．２％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を通した電気泳動で同定し、ｐＺｅｒｏＢＬＵＮＴ  ＴＯＰＯにクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＶＫ１と命名した。このプラスミドｐＭＶＫ１を制限エンドヌクレアーゼのＳａｃＩとＴａｑ１で消化し、その断片をゲル精製して、ＳａｃＩとＢｓｔＢＩで消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂに連結した。得られたプラスミドをｐＴｒｃＭＶＫ１と名付けた。
【０５２２】
メバロン酸生合成経路中の２番目の遺伝子であるＰＭＫを、プライマー：ＰｓｔＩ−ＰＭＫ１  Ｒ（５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＡＣＣ、配列番号８６）およびＢｓｉＨＫＡ  Ｉ−ＰＭＫ１  Ｆ（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＴＧＣＡＣＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧ、配列番号８７）を用いたＰＣＲで増幅させた。製造元の取扱説明書の通りにＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲ反応を行なった。サイズの正しい産物（１３８７ｂｐ）をＰｓｔＩとＢｓｉＨＫＩで消化し、ＰｓｔＩで消化したｐＴｒｃＭＶＫ１に連結した。得られたプラスミドをｐＴｒｃＫＫと名付けた。ＭＶＤ遺伝子とｉｄｉ遺伝子を同じようにクローニングした。ＭＶＤ遺伝子を増幅するために、プライマー対のＰｓｔＩ−ＭＶＤ  １  Ｒ（５’−ＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣ、配列番号８８）およびＮｓｉＩ−ＭＶＤ  １  Ｆ（５’−ＧＴＡＧＡＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＧ、配列番号８９）を用いて、ｙＩＤＩ遺伝子を増幅するために、プライマー対のＰｓｔＩ−ＹＩＤＩ  １  Ｒ（５’−ＣＣＴＴＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＧＴＴＧＴＴＡＴＡＧＣ、配列番号７９）およびＮｓｉＩ−ＹＩＤＩ  １  Ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣ、配列番号７８）を用いて、ＰＣＲを行なった。場合によって、大腸菌由来のＩＰＰイソメラーゼ遺伝子であるｉｄｉを用いた。大腸菌染色体ＤＮＡからｉｄｉを増幅するために、以下のプライマーセットを用いた：ＰｓｔＩ−ＣＩＤＩ  １  Ｒ（５’−ＧＴＧＴＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧ、配列番号９０）およびＮｓｉＩ−ＣＩＤＩ  １  Ｆ（５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧ、配列番号９１）。鋳型ＤＮＡは、標準的な方法で大腸菌ＦＭ５から単離された染色体ＤＮＡであった（ＷＯ９６／３５７９６号およびＷＯ２００４／０３３６４６号、これらは各々、特に、核酸の単離に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。最終的なプラスミドを、酵母ｉｄｉ遺伝子コードするコンストラクトを表すｐＫＫＤＩｙまたは大腸菌ｉｄｉ遺伝子をコードするコンストラクトを表すｐＫＫＤＩｃと名付けた。後に解析するために、これらのプラスミドを大腸菌宿主ＢＬ２１に形質転換した。場合によって、クズ由来のイソプレンシンターゼをｐＫＫＤＩｙにクローニングして、プラスミドｐＫＫＤＩｙＩＳを得た。
【０５２３】
下流ＭＶＡ経路を、カナマイシン抗生物質耐性マーカーを含有するｐＴｒｃにもクローニングした。プラスミドｐＴｒｃＫＫＤＩｙを制限エンドヌクレアーゼのＡｐａＩとＰｓｔＩで消化し、５９３０ｂｐ断片を１．２％アガロースＥ−ゲル上で分離し、製造元の取扱説明書に従ってＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製した。実施例７に記載のプラスミドｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  Ｋａｎを制限エンドヌクレアーゼのＡｐａＩとＰｓｔＩで消化し、このベクターを含有する３３３８ｂｐ断片を、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルから精製した。この３３３８ｂｐのベクター断片と５９３０ｂｐの下流ＭＶＡ経路断片を、Ｒｏｃｈｅクイックライゲーションキットを用いて連結した。このライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、形質転換体を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択しながら、３７℃で一晩増殖させた。形質転換体を制限酵素消化で確認し、１つをストックとして凍結させた。このプラスミドをｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙと命名した。
【０５２４】
ＩＩ．ｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙへのクズイソプレンシンターゼ遺伝子のクローニング
クズイソプレンシンターゼ遺伝子を、プライマーのＭＣＭ５０  ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＴＴＴＡＣＴ（配列番号５２）およびＭＣＭ５３  ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）を用いて、実施例１に記載のｐＴｒｃＫｕｄｚｕからＰＣＲで増幅させた。得られたＰＣＲ断片をｐＣＲ２．１にクローニングし、大腸菌ＴＯＰ１０に形質転換した。この断片は、クズイソプレンシンターゼのコード配列と、大腸菌由来のＲＢＳを含有する上流領域とを含有する。形質転換体を、カルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択しながら、３７℃で一晩インキュベートした。断片の正しい挿入をシークエンシングで確認し、この株をＭＣＭ９３と命名した。
【０５２５】
ＭＣＭ９３株由来のプラスミドを制限エンドヌクレアーゼのＮｓｉＩとＰｓｔＩで消化して、ＲＢＳとクズイソプレンシンターゼとを含有する１７２４ｂｐ挿入物を遊離させた。この１７２４ｂｐ断片を１．２％アガロースＥ−ゲル上で分離し、製造元の取扱説明書に従ってＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて精製した。プラスミドｐＴｒｃＫａｎＫＫＤＩｙを制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩで消化し、ＳＡＰを用いて３７℃で３０分間処理し、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製した。このプラスミドとクズイソプレンシンターゼをコードするＤＮＡ断片を、Ｒｏｃｈｅクイックライゲーションキットを用いて連結した。このライゲーション混合物を大腸菌ＴＯＰ１０細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌでカナマイシンを含有するＬＡ上で選択しながら、形質転換体を３７℃で一晩増殖させた。正しい形質転換体を制限消化で確認し、このプラスミドをｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳＫａｎと命名した（図２４および２５；配列番号１１）。このプラスミドをＢＬ２１（λＤＥ３）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。
【０５２６】
ＩＩＩ．クズ由来の組換え下流メバロン酸経路とイソプレンシンターゼを発現する大腸菌におけるメバロン酸からのイソプレン産出
ＢＬ２１／ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳＫａｎ株を、ｐＨを７．１に調整し、０．５％グルコースおよび０．５％メバロン酸を補充したＭＯＰＳ培地（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７４）  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １１９：７３６−７４７）中で培養した。同一条件を用いるが、０．５％メバロン酸を添加しないで、対照培養物も用意した。培養を１％の種菌を含む終夜種培養物から始め、培養物が０．３〜０．５のＯＤ６００に達したときに５００μＭのＩＰＴＧで誘導した。この培養物を２５０ｒｐｍで振盪させながら３０℃で増殖させた。誘導して３時間後、実施例１に記載のヘッドスペースアッセイを用いてイソプレンの産出を分析した。イソプレンの最大産出は、６．６７×１０−４ｍｏｌ／Ｌブロス／ＯＤ６００／時間（ここで、Ｌブロスはブロスの容積であり、細胞培地の容積と細胞の容積の両方を含む）であった。メバロン酸を添加していない対照培養物は、測定可能なイソプレンを産出しなかった。
【０５２７】
ＩＶ．上流ＭＶＡ経路のクローニング
３つの酵素活性をコードする２つの遺伝子を含む、上流メバロン酸生合成経路を、エンテロコックス・フェカーリスからクローニングした。ｍｖａＥ遺伝子は、この経路の最初のタンパク質と３番目のタンパク質である、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼと３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼの両方の酵素活性を持つタンパク質をコードしており、ｍｖａＳ遺伝子は、この経路中の２番目の酵素である、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードしている。ｍｖａＥ遺伝子を、以下のプライマーを用いて、大腸菌リボソーム結合部位とスペーサーとを前に付けて、Ｅ．フェカーリスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ７００８０２Ｄ−５）から増幅させた。
ＣＦ  ０７−６０（＋）  ｍｖａＥの開始点（ＲＢＳを含む）＋ＡＴＧ開始コドン  ＳａｃＩ
［化４３］
５’−ＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号９３）
ＣＦ  ０７−６２（−）  ｍｖａＥをその間にあるＲＢＳとともにｍｖａＳと融合する
［化４４］
５’−ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣ（配列番号９４）
【０５２８】
ｍｖａＳ遺伝子を、以下のプライマーを用いて、大腸菌由来のＲＢＳとスペーサーを前に付けて、Ｅ．フェカーリスのゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ  ７００８０２Ｄ−５）から増幅させた。
ＣＦ  ０７−６１（＋）  ｍｖａＥをその間にあるＲＢＳとともにｍｖａＳと融合する
［化４５］
５’−ＧＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡ（配列番号９５）
ＣＦ  ０７−１０２（−）  ｍｖａＳ遺伝子の終点  ＢｇｌＩＩ
［化４６］
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号９６）
【０５２９】
ＰＣＲ断片を、以下のプライマーを用いるＰＣＲで１つに融合した。
ＣＦ  ０７−６０（＋）  ｍｖａＥの開始点（ＲＢＳを含む）＋ＡＴＧ開始コドン  ＳａｃＩ
［化４７］
５’−ＧＡＧＡＣＡＴＧＡＧＣＴＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号９３）
ＣＦ  ０７−１０２（−）  ｍｖａＳ遺伝子の終点  ＢｇｌＩＩ
［化４８］
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号９６）
【０５３０】
融合ＰＣＲ断片を、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて精製し、制限酵素のＳａｃＩとＢｇｌＩＩで消化した。この消化したＤＮＡ断片を、Ｑｉａｇｅｎキットを用いてゲル精製し、ＳａｃＩとＢｇｌＩＩで消化し、ゲル精製しておいた市販のベクターｐＴｒｃＨｉｓ２Ａに連結した。
【０５３１】
ライゲーション混合物を大腸菌Ｔｏｐ１０細胞に形質転換し、コロニーをＬＡ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリンプレート上で選択した。合計６つのコロニーを選び、ＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中で一晩増殖させ、Ｑｉａｇｅｎキットを用いてプラスミドを単離した。このプラスミドをＳａｃＩとＢｇｌＩＩで消化して、挿入物について調べ、１つの正しいプラスミドを、以下のプライマーを用いてシークエンシングした。
ＣＦ  ０７−５８（＋）  ｍｖａＥ遺伝子の開始点
［化４９］
５’−ＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号９７）
ＣＦ  ０７−５９（−）  ｍｖａＥ遺伝子の終点
［化５０］
５’−ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号９８）
ＣＦ  ０７−８２（＋）  ｍｖａＳ遺伝子の開始点
［化５１］
５’−ＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号９９）
ＣＦ  ０７−８３（−）  ｍｖａＳ遺伝子の終点
［化５２］
５’−ＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１００）
ＣＦ  ０７−８６（＋）  ｍｖａＥ中の配列
［化５３］
５’−ＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＣ（配列番号１０１）
ＣＦ  ０７−８７（＋）  ｍｖａＥ中の配列
［化５４］
５’−ＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣ（配列番号１０２）
ＣＦ  ０７−８８（＋）  ｍｖａＥ中の配列
［化５５］
５’−ＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号１０３）
ＣＦ  ０７−８９（＋）  配列ｍｖａＳ
［化５６］
５’−ＧＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号１０４）
【０５３２】
ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１と呼ばれるプラスミドは、シークエンシングにより正しかった。これを市販の大腸菌株ＢＬ２１に形質転換した。ＬＡ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン上で選択を行なった。２つの形質転換体を選び、ＯＤ６００が１．５に達するまでＬＢ＋５０μｇ／ｍｌカルベニシリン中で増殖させた。両方の株を、グリセロールの存在下、バイアル中、−８０℃で凍結させた。株を、ＢＬ２１中のｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１（単離株＃１）についてはＣＦ  ４４９、およびＢＬ２１中のｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ＃１（単離株＃２）についてはＣＦ  ４５０と命名した。解析したとき、両方のクローンは同一の挙動を示すことが分かった。
【０５３３】
Ｖ．上流ＭＶＡ経路のｐＣＬ１９２０へのクローニング
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙを制限エンドヌクレアーゼＳｓｐＩで消化して、ｐＴｒｃ−ｍｖａＥ−ｍｖａＳ−（Ｈｉｓタグ）−ターミネーターを含有する断片を放出させた。この断片では、ｈｉｓタグは翻訳されなかった。この平滑末端の４．５ｋｂｐ断片をＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルから精製した。ベクターを制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩＩで消化し、ＳＡＰで処理し、Ｑｉａｇｅｎゲル精製キットを用いて１．２％Ｅ−ゲルから精製することにより、ｐＣＬ１９２０由来のリン酸化された平滑末端の４．２ｋｂｐ断片を調製した。２つの断片をＲｏｃｈｅ迅速ライゲーションキットを用いて連結し、ＴＯＰ１０化学的コンピテントセルに形質転換した。形質転換体をスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択した。ＰＣＲで挿入物の存在をスクリーニングすることにより、正しいコロニーを同定した。このプラスミドをｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙと命名した（図２６および２７Ａ〜２７Ｄ；配列番号１２）。
【０５３４】
ＶＩ．組み合わせた上流メバロン酸経路と下流メバロン酸経路を発現する株
完全なメバロン酸経路とクズイソプレンシンターゼとを有する株を得るために、プラスミドｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳｋａｎおよびｐＣＬｐＴｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙを両方ともＢＬ２１（λＤＥ３）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択した。形質転換体をプラスミドプレップで調べて、両方のプラスミドが宿主内に保持されていることを保証した。この株をＭＣＭ１２７と命名した。
【０５３５】
ＶＩＩ．大腸菌／ｐＵｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙにおけるグルコースからのメバロン酸の産出
ＢＬ２１／ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ−ｍｖａＥ／ｍｖａＳまたはＦＭ５／ｐ  ｐＴｒｃＨｉｓ２Ａ−ｍｖａＥ／ｍｖａＳの単一コロニーをＬＢ＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）に植菌し、２００ｒｐｍで振盪させながら３７℃で一晩増殖させる。これらの培養物を、ＯＤ６００が０．１になるまで２５０ｍｌバッフル付きフラスコ中の５０ｍｌ培地中に希釈する。この培地は、ＴＭ３＋１または２％グルコース＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）またはＴＭ３＋１％グルコース＋加水分解した大豆油＋カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）またはＴＭ３＋バイオマス（調製済みのバガス、コーンストーバーまたはスイッチグラス）であった。培養物を、２００ｒｐｍで振盪させながら、ＯＤ６００が０．４に達するまで３０℃で約２〜３時間増殖させた。この時点で、ＩＰＴＧ（４００μＭ）を添加することにより、ｍｖａＥ  ｍｖａＳコンストラクトからの発現を誘導した。培養物をさらに２０または４０時間インキュベートし、２時間間隔で誘導６時間後まで、また、その後、必要に応じて２４、３６および４８時間でサンプルを採取した。サンプリングは、１ｍｌの培養物を取り出し、そのＯＤ６００を測定し、微量遠心管中で細胞をペレット化し、上清を除去し、それをメバロン酸について分析することにより行なった。
【０５３６】
エンテロコックス・フェカーリスＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼポリペプチドをコードする核酸を有する大腸菌細胞の１４リットル発酵は、ＴＭ３培地と２％グルコースを細胞培地として用いた場合、２２グラムのメバロン酸を産出した。これらの細胞の振盪フラスコは、ＬＢ培地と１％グルコースを細胞培養培地として用いた場合、１リットル当たり２〜４グラムのメバロン酸を産出した。これらの株におけるメバロン酸の産出は、ＭＶＡ経路が大腸菌内で機能的であることを示した。
【０５３７】
ＶＩＩＩ．上流ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路＋クズイソプレンシンターゼを含有する大腸菌ＢＬ２１からのイソプレンの産出
上記の上流ＭＶＡ経路遺伝子および下流ＭＶＡ経路遺伝子およびクズイソプレンシンターゼ遺伝子を含有するプラスミドと、実施例７に記載のｉｄｉ遺伝子、ｄｘｓ遺伝子、およびｄｘｒ遺伝子ならびにイソプレンシンターゼ遺伝子を含有するプラスミドの様々な組合せで形質転換することにより以下の株を作製した。使用した宿主細胞は化学的コンピテントＢＬ２１（λＤＥ３）であり、形質転換は標準的な方法により行なった。形質転換体をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）またはカナマイシン＋スペクチノマイシン（両方とも５０μｇ／ｍｌの濃度）を含有するＬ寒天上で選択した。プレートを３７℃で増殖させた。得られた株を次のように命名した。
カナマイシン＋スペクチノマイシン（各５０μｇ／ｍｌ）上で増殖したもの
ＭＣＭ１２７−ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ＋ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
ＭＣＭ１３１−ｐＣＬ１９２０＋ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
ＭＣＭ１２５−ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ＋ｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）上で増殖したもの
ＭＣＭ６４−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩＤＸＳ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
ＭＣＭ５０−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
ＭＣＭ１２３−ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  ｙＩＤＩＤＸＳ  ＤＸＲ（ｋａｎ）を含むＢＬ２１（λＤＥ３）
【０５３８】
上記の株を凍結ストックからＬＡ＋適当な抗生物質にストリークし、３７℃で一晩増殖させた。各プレート由来の単一コロニーを用いて振盪フラスコ（２５ｍｌのＬＢ＋適当な抗生物質）に植菌した。このフラスコを２００ｒｐｍで振盪させながら２２℃で一晩インキュベートした。翌朝、フラスコを３７℃インキュベーターに移し、２００ｒｐｍで振盪させながらさらに４．５時間増殖させた。２５ｍｌ培養物を遠心分離して細胞をペレット化し、この細胞を５ｍｌのＬＢ＋適当な抗生物質に再懸濁した。次に、この培養物を、ＯＤ６００が０．１になるまで２５ｍｌのＬＢ＋１％グルコース＋適当な抗生物質中に希釈した。各株に２つのフラスコを用意し、１つの組はＩＰＴＧ（８００μＭ）で誘導し、２つ目の組は誘導しなかった。培養物を２５０ｒｐｍで振盪させながら３７℃でインキュベートした。これらの培養物のうちの１つの組を１．５０時間後（サンプリング時点１の直後）に誘導した。各サンプリング時点で、ＯＤ６００を測定し、実施例１に記載したようにイソプレンの量を決定した。結果を表３に示す。生成されたイソプレンの量は、特定の株についてのピーク産出時の量として示されている。
【表３】
0005448220.tif 000023
【０５３９】
ＩＸ．メバロン酸の分析
メバロノラクトン（１．０ｇ、７．７ｍｍｏｌ）（ＣＡＳ＃５０３−４８−０）は、メバロン酸のカリウム塩を生成するために水（７．７ｍＬ）に溶解され、水酸化カリウム（７．７ｍｍｏｌ）で処理されたシロップとしてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＷＩ，ＵＳＡ）から供給された。メバロン酸への変換は１Ｈ  ＮＭＲ分析により確認した。ＨＰＬＣ分析用のサンプルは、１４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞を除去し、次いで上清のアリコート３００μｌを９００μｌのＨ２Ｏに添加して調製した。次に、過塩素酸（３６μｌの７０％溶液）を添加し、その後、混合して、氷上で５分間冷却させた。次に、サンプルを再度遠心分離し（１４，０００ｒｐｍ、５分間）、上清をＨＰＬＣにかけた。メバロン酸標準（２０、１０、５、１および０．５ｇ／Ｌ）を同じように調製した。メバロン酸（２０μＬ注入容量）の分析は、屈折率（ＲＩ）を検出しながら、５ｍＭ硫酸を０．６ｍＬ／分で用いて溶出させるＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ８７−Ｈ＋カラム（３００ｍｍ×７．０ｍｍ）を用いるＨＰＬＣで行なった。これらの条件下では、メバロン酸は、１８．５分でラクトン形態として溶出した。
【０５４０】
Ｘ．上流ＭＶＡ経路＋クズイソプレンシンターゼを含有する大腸菌ＢＬ２１からのイソプレンの産出
メバロン酸経路ポリペプチドとクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、フェドバッチ培養された細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、グルコース制限条件下で細胞を増殖させることにより、２．２ｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。
【０５４１】
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０５４２】
１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５４３】
ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙプラスミド（図２６）およびｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをソイトン−酵母抽出物−グルコース培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定したときに種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。
【０５４４】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５４時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３．７ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ５５０が１９０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。発酵して３８時間でＩＰＴＧ濃度を１００μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図５４に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２．２ｇ／Ｌまで増加した（図５５）。５４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１５．９ｇであった。産出の時間経過を図５６に示す。
【０５４５】
ＸＩ．メバロン酸経路の遺伝子を発現し、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
メバロン酸経路ポリペプチドとクズイソプレンシンターゼとを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、フェドバッチ培養された細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、グルコース制限条件下で細胞を増殖させることにより、３．０ｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。
【０５４６】
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０５４７】
１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ，  Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５４８】
ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドとｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。
【０５４９】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５９時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、２．２ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ５５０が１９０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図９３に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値３．０ｇ／Ｌまで増加した（図９４）。５９時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は２２．８ｇであった。産出の時間経過を図９５に示す。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は２．２％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は１．０％であった。
【０５５０】
ＸＩＩ．メバロン酸経路の遺伝子を発現し、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
メバロン酸経路ポリペプチド、クズイソプレンシンターゼ、およびクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、フェドバッチ培養された細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、グルコース制限条件下で細胞を増殖させることにより、３．３ｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。
【０５５１】
ｉ）ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２の構築
クズ由来のイソプレンシンターゼをコードする遺伝子を、プライマーのＮｓｉＩ−ＲＢＳ−ＨＧＳ  Ｆ（ｃｔｔｇＡＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＧＡＧＧ、配列番号１０５）およびｐＴｒｃ  Ｒ（ＣＣＡＧＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＡＧ、配列番号１０６）と、鋳型としてのｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳとを用いてＰＣＲ増幅した。このようにして得られたＰＣＲ産物をＮｓｉＩとＰｓｔＩで制限消化し、ゲル精製した。プラスミドｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙをＰｓｔＩで制限消化し、製造元の取扱説明書に従ってｒＡＰｉｄアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて脱リン酸化した。
【０５５２】
これらのＤＮＡ断片を１つに連結し、ライゲーション反応液を大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋスピンミニプレップキットを用いて６つのコロニーから調製した。このプラスミドＤＮＡを制限酵素のＥｃｏＲＶとＭｌｕＩで消化し、挿入物が正しい向きを有するクローン（すなわち、ｐＴｒｃプロモーターと同じ方向に向いた遺伝子）を同定した。
【０５５３】
得られた正しいプラスミドをｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２と命名した。このプラスミドを本明細書に記載のヘッドスペースアッセイを用いてアッセイし、大腸菌Ｔｏｐ１０においてイソプレンを産出することが分かった。したがって、この遺伝子の機能性を確認した。プラスミドをｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳを含有するＢＬ２１（ＬＤＥ３）に形質転換して、ＢＬ２１／ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２−ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ株を得た。この株は、ＢＬ２１／ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡ＋ｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳ株（実施例８、第ＸＩ部）と比べて、余分なコピーのイソプレンシンターゼを有する。この株はまた、実施例８、第ＸＩ部で使用されたＢＬ２１／ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡ＋ｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳ株と比べて、ＨＭＧＳの発現と活性が増加していた。
【０５５４】
ｉｉ）ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２−ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳを発現し、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０５５５】
１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ，  Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで滅菌濾過した。
【０５５６】
ｐＣＬＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙＨＧＳ２プラスミドとｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。
【０５５７】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５８時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、２．１ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ５５０が１７０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図１０４に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値３．３ｇ／Ｌまで増加した（図１０５）。５８時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は２４．５ｇであった。産出の時間経過を図１０６に示す。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は２．５％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は１．２％であった。分析により、イソプレンシンターゼの活性が、ＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドとｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＢＬ２１と比較して約３〜４倍増加したことが示された（データは示さない）。
【０５５８】
ＸＩＩＩ．大腸菌における下流メバロン酸経路の染色体組込み
メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼを含有する合成オペロンを大腸菌の染色体に組み込んだ。所望により、様々なプロモーターをオペロンの５’に組み込むことにより、発現を変化させてもよい。
【０５５９】
表４に、この実験に用いられるプライマーを掲載する。
【表４】
0005448220.tif 000024
【０５６０】
ｉ）標的ベクター構築
ａｔｔＴｎ７部位を組込み用に選択した。上流（ａｔｔＴｎ７  ｕｐ）（プライマー、ＭＣＭ７８およびＭＣＭ７９）と下流（ａｔｔＴｎ７  ｄｏｗｎ）（プライマー、ＭＣＭ８８およびＭＣＭ８９）の相同領域をＭＧ１６５５細胞からＰＣＲで増幅した。１μＬの１０μＭプライマー、３μＬのｄｄＨ２Ｏ、４５μＬのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙを含む５０μＬの反応液と、擦り取ったＭＧ１６５５のコロニーとを９４℃で２分間変性させ、２５サイクル繰り返し（９４℃で２分、５０℃で３０秒、および６８℃で１分）、７２℃で７分伸長させ、４℃に冷却した。この得られたＤＮＡを製造元の取扱説明書に従ってｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、プラスミドのＭＣＭ２７８（ａｔｔＴｎ７  ｕｐ）とＭＣＭ２５２（ａｔｔＴｎ７  ｄｏｗｎ）を得た。ＭＣＭ２５２から消化してゲル精製した８３２ｂｐのＡｐａＩ−ＰｖｕＩ断片を、ＡｐａＩ−ＰｖｕＩ消化し、ゲル精製したプラスミドｐＲ６Ｋにクローニングし、プラスミドＭＣＭ２７６を作製した。ＭＣＭ２７８から消化し、ゲル精製した８２５ｂｐのＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ断片を、ＰｓｔＩ−ＮｏｔＩ消化し、ゲル精製したＭＣＭ２７６にクローニングし、プラスミドＭＣＭ２８１を作製した。
【０５６１】
ｉｉ）下流経路およびプロモーターのクローニング
ＭＶＫ−ＰＭＫ−ＭＶＤ−ＩＤＩ遺伝子を製造元の取扱説明書に従ってＲｏｃｈｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  ＰＣＲシステムを用い、プライマーのＭＣＭ１０４とＭＣＭ１０５を用いてｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳから増幅した。この産物をＮｏｔＩとＡｐａＩで消化し、ＮｏｔＩとＡｐａＩで消化し、ゲル精製しておいたＭＣＭ２８１にクローニングした。プライマーのＭＣＭ１２０とＭＣＭ１２７を用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩを用いてＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ  ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴ鋳型ＤＮＡからＣＭＲカセットを増幅した。１μＬの約１０ｎｇ／μＬの鋳型、１μＬの各プライマー、１．２５μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５μＬの１０×緩衝液、１μＬの酵素、および３９．７５μＬのｄｄＨ２０を含有する４つの５０μＬのＰＣＲ反応液で、９５℃で４分間の変性、５サイクルの９５℃で２０秒、５５℃で２０秒、７２℃で２分、２５サイクルの９５℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で２分、７２℃で１０分、その後４℃に冷却というＰＣＲプログラムを用いた。反応液をプールし、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップカラム上で精製し、これを用いて、プラスミドＭＣＭ２９６を含有する水で洗浄したＰｉｒ１細胞にエレクトロポレートした。エレクトロポレーションは、２ｍＭキュベット中、２．５Ｖおよび２００ｏｈｍで行なった。エレクトロポレーション反応液をＬＢ中、３０℃で３時間、回復させた。形質転換体ＭＣＭ３３０をＣＭＰ５、Ｋａｎ５０を含むＬＡ上で選択した（図１０７および１０８Ａ〜１０８Ｃ；配列番号２５）。
【０５６２】
ｉｉｉ）大腸菌染色体への組込み
ＭＣＭ３３０由来のミニプレップＤＮＡ（Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンキット）をＳｎａＢＩで消化し、これを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）またはＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓプラスミドｐＲｅｄＥＴ  Ｃａｒｂを含有するＭＧ１６５５にエレクトロポレートした。細胞を３０℃で約ＯＤ１まで増殖させた後、０．４％のＬ−アラビノースを用いて、３７℃で１．５時間誘導した。これらの細胞を４℃のｄｄＨ２Ｏ中で３回洗浄した後、細胞に２μＬのＤＮＡをエレクトロポレートした。組込み体をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で選択し、その後、Ｌ寒天＋カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）上で増殖しないことを確認した。ＢＬ２１組込み体ＭＣＭ３３１およびＭＧ１６５５組込み体ＭＣＭ３３３を凍結させた。
【０５６３】
ｉｖ）クズイソプレンシンターゼをコードするｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕの構築
クズイソプレンシンターゼ遺伝子をｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のｐＥＴ２４ｄベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。特に、クズイソプレンシンターゼ遺伝子を、プライマーのＭＣＭ５０  ５’−ＧＡＴＣＡＴＧＣＡＴ  ＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧ  ＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡ  ＡＡＣＡＴＧＴＧＴＧ  ＣＧＡＣＣＴＣＴＴＣ  ＴＣＡＡＴＴＴＡＣＴ（配列番号５２）およびＭＣＭ５３  ５’−ＣＧＧＴＣＧＡＣＧＧ  ＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧ  ＴＴＡＧＡＣＡＴＡＣ  ＡＴＣＡＧＣＴＧ（配列番号５０）を用いてｐＴｒｃＫｕｄｚｕ鋳型ＤＮＡから増幅した。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲ反応を行ない、得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にプレーティングし、３７℃で一晩インキュベートした。カルベニシリン５０μｇ／ｍｌを含有する５ｍｌのルリアブロス培養液に単一の形質転換体を植菌し、３７℃で一晩増殖させた。１ｍｌの培養液（ルリアブロス）から単離したプラスミドＤＮＡをシークエンシングすることにより、５つのコロニーを正しい挿入についてスクリーニングし、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。ＭＣＭ９３と命名された得られたプラスミドは、ｐＣＲ２．１骨格中にクズイソプレンシンターゼコード配列を含有している。
【０５６４】
クズコード配列をＰｃｉＩとＢａｍＨ１（Ｒｏｃｈｅ）を用いた制限エンドヌクレアーゼ消化により取り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製した。ｐＥＴ２４ｄベクターＤＮＡをＮｃｏＩとＢａｍＨＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で処理し、ＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。クズイソプレンシンターゼ断片を、迅速ＤＮＡライゲーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いてＮｃｏＩ／ＢａｍＨ１消化したｐＥＴ２４ｄに総容量２０μｌ中５：１の断片対ベクター比で連結した。ライゲーション混合物（５μｌ）の一部を大腸菌Ｔｏｐ１０化学的コンピテントセルに形質転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上にプレーティングした。正しい形質転換体をシークエンシングで確認し、化学的コンピテントＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で、３７℃で一晩増殖させた後、単一コロニーを選択した。ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕと命名された得られたプラスミドのマップを図１０９に示す。ｐＥＴ２４Ｄ−Ｋｕｄｚｕの配列（配列番号２６）を図１１０Ａおよび１１０Ｂに示す。イソプレンシンターゼ活性は、ヘッドスペースアッセイを用いて確認した。
【０５６５】
ｖ）産出株
ＭＣＭ３３１株とＭＣＭ３３３株にプラスミドｐＣＬＰｔｒｃｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙとｐＴｒｃＫｕｄｚｕまたはｐＥＴＫｕｄｚｕのいずれかを共形質転換し、表５に示す株を得た。
【表５】
0005448220.tif 000025
【０５６６】
ｖｉ）メバロン酸経路の遺伝子を発現し、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０５６７】
１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５６８】
上記のｇｉ１．２組込み下流ＭＶＡ経路とｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃＫｕｄｚｕプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。
【０５６９】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５７時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３．９ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。二酸化炭素発生速度が１００ｍｍｏｌ／Ｌ／時間に達したときＩＰＴＧ濃度を１００μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図１１１Ａに示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値１．６ｇ／Ｌまで増加した（図１１１Ｂ）。イソプレン発酵の間の比生産性が図１１１Ｃに示されており、１．２ｍｇ／ＯＤ／時間でピークであった。５７時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１６．２ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は０．９％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は０．４％であった。
【０５７０】
ＸＩＶ．グリセロールを炭素源として用いたクズイソプレンシンターゼを含有する大腸菌ＢＬ２１からのイソプレンの産出
クズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、フェドバッチ培養でグリセロールを供給した細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、グリセロール（グルコースなし）の存在下で細胞を増殖させることにより、２．２ｍｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。
【０５７１】
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グリセロール５．１ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０５７２】
１０００×改変微量金属溶液：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０５７３】
ｐＴｒｃＫｕｄｚｕプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３５℃）におけるグリセロールからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＡブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをソイトン−酵母抽出物−グルコース培地中に植菌し、３５℃で増殖させた。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、６００ｍＬを用いて、７．５Ｌバイオリアクターに植菌した。
【０５７４】
細胞が１５３という５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）に達するまでグリセロールを指数関数的割合で供給した。３６時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されるグリセロールの総量は１．７ｋｇであった。種菌中のグルコース以外に、グルコースはバイオリアクターに添加されなかった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。ＯＤ５５０が５０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２０μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図５７に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２．２ｍｇ／Ｌまで増加した（図５８）。５４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は２０．９ｍｇであった。産出の時間経過を図５９に示す。
【０５７５】
ＸＶ．メバロン酸経路の遺伝子を発現し、転化糖を炭素源として用いた１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖した大腸菌からのイソプレン発酵
メバロン酸経路ポリペプチドとクズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌の１５Ｌスケール発酵を用いて、フェドバッチ培養で転化糖を供給した細胞からイソプレンを産出させた。この実験は、転化糖の存在下で細胞を培養することにより、２．４ｇ／Ｌのイソプレンが産出されたことを示している。
【０５７６】
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。転化糖１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０５７７】
１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで滅菌濾過した。
【０５７８】
ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドとｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）における転化糖からのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。
【０５７９】
細胞が定常期に達するまで転化糖を指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるように転化糖供給を減らした。４４時間の発酵の間にバイオリアクターに送達される転化糖の総量は２．４ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ５５０が２００に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図９６に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２．４ｇ／Ｌまで増加した（図９７）。４４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１８．４ｇであった。産出の時間経過を図９８に示す。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１．７％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は０．８％であった。
【０５８０】
実施例９．枯草菌に組み込むための上流ＭＶＡ経路および下流ＭＶＡ経路の構築
Ｉ．枯草菌における上流ＭＶＡ経路の構築
エンテロコックス・フェカーリス由来の上流経路をａｐｒＥプロモーターの制御下に枯草菌に組み込む。この上流経路は、２つの遺伝子；ｍｖａＥ（これはＡＡＣＴおよびＨＭＧＲをコードする）とｍｖａＳ（これはＨＭＧＳをコードする）からなる。この２つの遺伝子は、間に終止コドンを挟み、ＲＢＳ部位をｍｖａＳの前にして１つに融合され、ａｐｒＥプロモーターの制御下に置かれる。ターミネーターはｍｖａＥ遺伝子の後に置かれる。クロラムフェニコール耐性マーカーをｍｖａＥ遺伝子の後ろにクローニングし、このコンストラクトを相同な隣接領域を用いた二重乗換えによってａｐｒＥ遺伝子座に組み込む。
【０５８１】
４つのＤＮＡ断片を、ＰＣＲ反応で１つに融合されることができる突出を含有するように、ＰＣＲで増幅する。製造元の説明書に従ってＨｅｒｃｕｌａｓｅポリメラーゼを用いてＰＣＲ増幅を行なう。
１．ＰａｐｒＥ
ＣＦ  ０７−１３４（＋）  ａｐｒＥプロモーターの開始点  ＰｓｔＩ
［化５７］
５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１１５）
ＣＦ  ０７−９４（−）  ＰａｐｒＥをｍｖａＥに融合する
［化５８］
５’−ＣＡＡＴＡＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＴＴＴＡＡ（配列番号１１６）
鋳型：枯草菌染色体ＤＮＡ
２．ｍｖａＥ
ＣＦ  ０７−９３（＋）  ｍｖａＥをａｐｒＥプロモーター（ＧＴＧ開始コドン）に融合する
［化５９］
５’−ＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号１１７）
ＣＦ  ０７−６２（−）  ｍｖａＥを間にあるＲＢＳとともにｍｖａＳに融合する
［化６０］
５’−ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＴＣＡＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣ（配列番号９４）
鋳型：エンテロコックス・フェカーリス染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣから得た）
３．ｍｖａＳ
ＣＦ  ０７−６１（＋）  ｍｖａＥを間にあるＲＢＳとともにｍｖａＳに融合する
［化６１］
５’−ＧＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＣＡＡＴＡＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡ（配列番号９５）
ＣＦ  ０７−１２４（−）  ｍｖａＳの末端をターミネーターに融合する
［化６２］
５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１１８）
鋳型：エンテロコックス・フェカーリス染色体ＤＮＡ
４．Ｂ．アミロリケファシエンスアルカリ性セリンプロテアーゼターミネーター
ＣＦ  ０７−１２３（＋）  ｍｖａＳの終点をターミネーターに融合する
［化６３］
５’−ＡＣＣＧＴＴＣＧＴＴＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＧ（配列番号１１９）
ＣＦ  ０７−４６（−）  Ｂ．アミロリケファシエンスの終点  ターミネーター  ＢａｍＨＩ
［化６４］
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）
鋳型：バシルス・アミリケファシエンス染色体ＤＮＡ
ＰＣＲ融合反応
５．ｍｖａＥをｍｖａＳに融合する
ＣＦ  ０７−９３（＋）  ｍｖａＥをａｐｒＥプロモーター（ＧＴＧ開始コドン）に融合する
［化６５］
５’−ＴＴＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧ（配列番号１１７）
ＣＦ  ０７−１２４（−）  ｍｖａＳの末端をターミネーターに融合する
［化６６］
５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１１８）
鋳型：上記の＃２および＃３
６．ｍｖａＥ−ｍｖａＳをａｐｒＥプロモーターに融合する
ＣＦ  ０７−１３４（＋）  ａｐｒＥプロモーターの開始点  ＰｓｔＩ
［化６７］
５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１１５）
ＣＦ  ０７−１２４（−）  ｍｖａＳの末端をターミネーターに融合する
［化６８］
５’−ＣＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１１８）
上記の鋳型＃１および＃４
７．ＰａｐｒＥ−ｍｖａＥ−ｍｖａＳをターミネーターに融合する
ＣＦ  ０７−１３４（＋）  ａｐｒＥプロモーターの開始点  ＰｓｔＩ
［化６９］
５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１１５）
ＣＦ  ０７−４６（−）  Ｂ．アミロリケファシエンスの終点  ターミネーター  ＢａｍＨＩ
［化７０］
５’−ＧＡＣＡＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＧＴＣＴＣ（配列番号５８）
鋳型：＃４および＃６
【０５８２】
産物を制限エンドヌクレアーゼのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩで消化されているｐＪＭ１０２に連結する（Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ，ａｎｄ  Ｒ．Ｌｏｓｉｃｋ（編），Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．中のＰｅｒｅｇｏ，Ｍ．１９９３．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｐ．６１５−６２４）。このライゲーション液を大腸菌ＴＯＰ  １０化学的コンピテントセルに形質転換し、形質転換体をカルベニシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＡ上で選択する。正しいプラスミドをシークエンシングで同定し、ｐＪＭＵｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ２と命名する（図５０および５１）。精製したプラスミドＤＮＡを枯草菌ａｐｒＥｎｐｒＥ  Ｐｘｙｌ−ｃｏｍＫに形質転換し、形質転換体をクロラムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）を含有するＬ寒天上で選択する。正しいクローンを選択し、１０、１５および２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するＬ寒天上に順次プレーティングして、上流経路を含有するカセットのコピー数を増幅する。
【０５８３】
１％グルコースと１％を含有するＬＢ中で増殖させることにより、得られた株をメバロン酸産出について試験する。培養物をメバロン酸の産出についてＧＣで分析する。
【０５８４】
この株は、後に、下流メバロン酸経路を組み込むための宿主として用いる。
【０５８５】
以下のプライマーを用いて、上記の様々なコンストラクトをシークエンシングする。
シークエンシングプライマー：
ＣＦ  ０７−１３４（＋）  ａｐｒＥプロモーターの開始点  ＰｓｔＩ
［化７１］
５’−ＧＡＣＡＴＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＧＣ（配列番号１１５）
ＣＦ  ０７−５８（＋）  ｍｖａＥ遺伝子の開始点
［化７２］
５’−ＡＴＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＧＣ（配列番号９７）
ＣＦ  ０７−５９（−）  ｍｖａＥ遺伝子の開始点
［化７３］
５’−ＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＣ（配列番号９８）
ＣＦ  ０７−８２（＋）  ｍｖａＳ遺伝子の開始点
［化７４］
５’−ＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号９９）
ＣＦ  ０７−８３（−）  ｍｖａＳ遺伝子の終点
［化７５］
５’−ＴＴＡＧＴＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＡＡＣＧＧＴ（配列番号１００）
ＣＦ  ０７−８６（＋）  ｍｖａＥ中の終点
［化７６］
５’−ＧＡＡＡＴＡＧＣＣＣＣＡＴＴＡＧＡＡＧＴＡＴＣ（配列番号１０１）
ＣＦ  ０７−８７（＋）  ｍｖａＥ中の配列
［化７７］
５’−ＴＴＧＣＣＡＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＡＡＴＣ（配列番号１０２）
ＣＦ  ０７−８８（＋）  ｍｖａＥ中の配列
［化７８
５’−ＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧ（配列番号１０３）
ＣＦ  ０７−８９（＋）  配列ｍｖａＳ
［化７９］
５’−ＧＡＡＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣ（配列番号１０４）
【０５８６】
形質転換体を５μｇ／ｍｌの濃度のクロラムフェニコールを含有するＬＡ上で選択する。あるコロニーが正しい組込みを有することをシークエンシングで確認し、最終レベル２５μｇ／ｍｌまで数日かけて増加する濃度のクロラムフェニコールを含有するＬＡ上にプレーティングする。これにより、目的の遺伝子を含有するカセットが増幅される。得られた株をＣＦ  ４５５：ｐＪＭｕｐｐｅｒｐａｔｈｗａｙ＃１×Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ  ａｐｒＥｎｐｒＥ  Ｐｘｙｌ  ｃｏｍＫと命名する（増幅して、クロラムフェニコール２５μｇ／ｍｌを含有するＬＡ上で増殖させる）。
【０５８７】
ＩＩ．枯草菌における下流ＭＶＡ経路の構築
遺伝子ｍｖｋ１、ｐｍｋ、ｍｐｄおよびｉｄｉからなる下流ＭＶＡ経路を、枯草菌染色体（組込み部位）のｎｐｒＥ領域由来の隣接ＤＮＡ領域、ａｐｒＥプロモーター、およびスペクチノマイシン耐性マーカーからなるカセット中で組み合わせる（図２８および２９；配列番号１３参照）。このカセットをＤＮＡ２．０により合成し、ａｐｒＥ遺伝子座に組み込まれた上流ＭＶＡ経路を含有する枯草菌の染色体に組み込む。このクズイソプレンシンターゼ遺伝子を実施例４に記載の複製プラスミドから発現させ、上流経路と下流経路の両方が組み込まれた株に形質転換する。
【０５８８】
実施例１０：例示的なイソプレン組成物とその作製方法
Ｉ．イソプレンを含有する発酵オフガスの組成分析
イソプレノイド前駆体生合成のための完全なメバロン酸経路をコードする２つのプラスミド（ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒＭｅｖ；ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ）、酵母由来のイソプレニルピロリン酸イソメラーゼ、およびクズ由来のイソプレンシンターゼを含有する組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いて、１４Ｌスケール発酵を行なった。１４Ｌタンクからの発酵オフガスをピークイソプレン生産性（２７．９時間の経過発酵時間、「ＥＦＴ」）の時点の前後で２０ｍＬヘッドスペースバイアルに回収し、揮発性物質成分についてヘッドスペースＧＣ／ＭＳで分析した。
【０５８９】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳ  ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×２５０μｍ；０．２５μｍ膜厚）に取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ／ＭＳシステムを用いて、ヘッドスペース分析を行なった。２０ｍＬヘッドスペースバイアルからの５００μＬアリコートのサンプリングにはｃｏｍｂｉＰＡＬオートインジェクターを用いた。ＧＣ／ＭＳ法では、ヘリウムがキャリアガスとして１ｍＬ／分の流量で利用された。注入口を２５０℃に保ち、分割比を５０：１とした。オーブン温度は、最初の２分間は３７℃に保ち、次いで１０分間の全方法時間の間、２５℃／分の速度で２３７℃にまで上昇させた。Ａｇｉｌｅｎｔ  ５７９３Ｎ質量選択検出器をｍ／ｚ  ２９からｍ／ｚ  ３００までスキャンした。このシステムの検出限界は、約０．１μｇ／Ｌガスまたは約０．１ｐｐｍである。所望により、検出限界がより低い、より感度の高い装置を用いてもよい。
【０５９０】
オフガスは、９９．９２５％（ｖ／ｖ）の永久ガス（Ｎ２、ＣＯ２およびＯ２）、約０．０７５％のイソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）（約７５０ｐｐｍｖ、２１００μｇ／Ｌ）および微量（＜５０ｐｐｍｖ）のエタノール、アセトン、および２種のＣ５プレニルアルコールからなっていた。水蒸気の量は測定されなかったが、０℃における平衡蒸気圧に等しいと推定された。揮発性有機画分の組成は、ＧＣ／ＭＳクロマトグラムのピーク下面積を積分して決定された（図８６Ａおよび８６Ｂ）。これを表６に記載する。エタノール標準およびアセトン標準の検量線から、標準的な方法を用いてＧＣ面積をμｇ／Ｌという単位で表される気相濃度に変換することができた。
発酵オフガス中の揮発性有機成分の組成。異種メバロン酸経路、酵母由来のイソプレニルピロリン酸イソメラーゼ、およびクズ由来のイソプレンシンターゼを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いた発酵の２７．９時間の時点でオフガスを分析した。
【表６】
0005448220.tif 000026
【０５９１】
ＩＩ．組換え大腸菌株の発酵の間にイソプレンとともに共産出される微量の揮発性有機化合物（ＶＯＣ）の測定
イソプレノイド前駆体生合成のための完全なメバロン酸経路をコードする２つのプラスミド（ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒＭｅｖ；ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ）、酵母由来のイソプレニルピロリン酸イソメラーゼ、およびクズ由来のイソプレンシンターゼを含有する組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用いて、１４Ｌスケール発酵を行なった。
【０５９２】
微量の揮発性有機成分を濃縮し同定するために、発酵オフガスを、冷却したヘッドスペースバイアルに通した。この発酵からのオフガスを、石英ウール（２ｇ）を詰めた２０ｍＬヘッドスペースバイアルを通して、１Ｌ／分の速度で１０分間サンプリングし、ドライアイスで−７８℃に冷却した。このバイアルに新しいバイアルキャップで再度蓋をし、実施例１０、第Ｉ部に記載の条件を用いて、トラップしたＶＯＣについてヘッドスペースＧＣ／ＭＳで分析した。図８７Ａ〜８７Ｄに見られる化合物の比率は、発酵オフガス中の全体的なレベルと−７８℃での相対蒸発圧と質量分析計の検出器応答を組み合わせたものである。例えば、酸素化した揮発性物質（例えば、アセトンおよびエタノール）と比べた低レベルのイソプレンは、−７８℃でヘッドスペースバイアルに蓄積しない程度のこの物質の高揮発性の関数である。
【０５９３】
これらの化合物の多くの存在は、生物学的源に由来するイソプレン組成物に特有である。これらの結果を図８７Ａ〜８７Ｄに示し、表７および８にまとめる。
−７８℃でクライオトラッピングした、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒＭｅｖ；ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ）によって産出されたオフガス中に存在する微量揮発性物質
【表７】
0005448220.tif 000027
0005448220.tif 000028
１、ＧＣ面積は、記載された化合物に対応する未補正のピーク下面積である。
２、面積％は、％として表された、全化合物の総ピーク面積に対するピーク面積である。
３、比率％は、％として表された、２−メチル−１，３−ブタジエンのピーク面積に対するピーク面積である。
−１９６℃でクライオトラッピングした、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒＭｅｖ；ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ）によって産出されたオフガス中に存在する微量揮発性物質
【表８】
0005448220.tif 000029
0005448220.tif 000030
１  ＧＣ面積は、記載された化合物に対応する未補正のピーク下面積である。
２  面積％は、％として表された、全化合物の総ピーク面積に対するピーク面積である。
３  比率％は、％として表された、２−メチル−１，３−ブタジエンのピーク面積に対するピーク面積である。
【０５９４】
ＩＩＩ．発酵から得られるイソプレンにおけるＣ５炭化水素異性体の不在
液体窒素中で冷却した２ｍＬヘッドスペースバイアルを用いて、発酵オフガス中に存在するイソプレンのクライオトラッピングを行なった。２ｍＬバイアル（−１９６℃）中での氷と固体ＣＯ２の蓄積を最小限に抑えるために、オフガス（１Ｌ／分）を水酸化ナトリウムペレットを含有する２０ｍＬバイアルにまず通した。約１０Ｌのオフガスをバイアルに通した後、通気して−７８℃まで温めておき、次に、新しいバイアルキャップで再度密封して、ＧＣ／ＭＳで分析した。
【０５９５】
ヘッドスペースモードで１００μＬガスタイトシリンジを用いるＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ／ＭＳシステムでＧＣ／ＭＳヘッドスペース分析を行なった。分析物の分離には、Ｚｅｂｒｏｎ  ＺＢ−６２４  ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×２５０μｍ；１．４０μｍ膜厚）を用いた。ＧＣオートインジェクターをガスタイト１００μＬシリンジに取り付け、２ｍＬのＧＣバイアルから５０μＬのヘッドスペースサンプルを注入することができるように針の高さを調整した。ＧＣ／ＭＳ法では、ヘリウムがキャリアガスとして１ｍＬ／分の流量で利用された。注入口は、分割比を２０：１にして２００℃に保った。オーブン温度は、５分間の分析の間、３７℃に保った。Ａｇｉｌｅｎｔ  ５７９３Ｎ質量選択検出器を、ｍ／ｚ  ５５、６６、６７および７０で単一イオンモニタリング（ＳＩＭ）モードで操作した。これらの条件下では、イソプレンが２．９６６分で溶出することが観察された（図８８Ｂ）。この方法を用いて、石油から得られたイソプレン標準（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）も分析し、さらなるＣ５炭化水素異性体を含有することが分かった。この異性体は、主ピークのすぐ前またはすぐ後に溶出し、補正したＧＣ面積に基づいて定量された（図８８Ａ）。
【表９】
0005448220.tif 000031
【表１０】
0005448220.tif 000032
【０５９６】
別々の実験で、検出器応答が各々の化合物について同じであるかどうかを決定するために、Ｃ５炭化水素の標準混合物を分析した。化合物は、２−メチル−１−ブテン、２−メチル−１，３−ブタジエン、（Ｅ）−２−ペンテン、（Ｚ）−２−ペンテンおよび（Ｅ）−１，３−ペンタジエンであった。この例では、５０℃で１５分間保持されたＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＢ−Ｐｅｔｒｏカラム（１００ｍ×０．２５ｍｍ、０．５０μｍ膜厚）で分析を行なった。ＧＣ／ＭＳ法では、ヘリウムがキャリアガスとして１ｍＬ／分の流量で利用された。注入口は、分割比を５０：１にして２００℃に保った。Ａｇｉｌｅｎｔ  ５７９３Ｎ質量選択検出器をフルスキャンモードでｍ／ｚ  １９からｍ／ｚ  ２５０まで操作した。これらの条件下では、１００μｇ／Ｌの濃度の各標準は、実験誤差の範囲内の同じ検出器応答を生じさせた。
【０５９７】
ＩＶ．固相に吸着したイソプレンを含む組成物
生物学的に産出されるイソプレンを活性炭に吸着させて、５０〜９９．９％炭素、０．１％〜５０％イソプレン、０．０１％〜５％水、および微量（＜０．１％）の他の揮発性有機成分を含有する固相を生じさせた。
【０５９８】
水蒸気を除去するために、発酵オフガスを０℃に保持された銅凝結コイル、次いで粒状シリカ乾燥フィルターに通して流した。その後、除湿したオフガスを、炭素含有フィルター（Ｋｏｂｙ  Ｊｒ，Ｋｏｂｙ  Ｆｉｌｔｅｒｓ，ＭＡ）から、ＧＣ／ＭＳでイソプレンの分解がフィルター排ガス中に検出される位置まで流した。カートリッジに吸着したイソプレンの量は、オフガス中の濃度、全体的な流速および回収期間中の分解パーセントを計算することにより間接的に決定することができる。あるいは、吸着したイソプレンを熱、真空、または溶媒による脱離によってフィルターから回収することができる。
【０５９９】
Ｖ．濃縮イソプレンの回収および分析
発酵オフガスを除湿し、好適な吸着剤（例えば、アスカライト）に通して濾過することにより、ＣＯ２を除去する。次に、ストリーム中のＶＯＣを凝結するために、得られるオフガス流を、液体窒素で冷却した凝結器に通して流す。回収容器には、得られるイソプレン凝結物を阻害するためのｔ−ブチルカテコールが含まれる。本明細書に記載した方法などの標準的な方法を用いて純度を測定するために、この凝結物をＧＣ／ＭＳおよびＮＭＲで分析する。
【０６００】
ＶＩ．発酵によるプレニルアルコールの産出
クズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株からのオフガスの分析から、イソプレンと３−メチル−３−ブテン−１−オール（イソプレノール）の両方が存在することが明らかになった。ヘッドスペースＧＣ／ＭＳで測定した場合の発酵全体での発酵オフガス中の２つの化合物のレベルを図８９に示す。得られたイソプレノール（３−メチル−３−ブテン−１−オール、３−ＭＢＡ）のレベルは、この実験ではほぼ１０μｇ／Ｌオフガスであった。さらなる実験により、発酵オフガス中に約２０μｇ／Ｌオフガスのレベルが産出された。
【０６０１】
実施例１１：メバロン酸経路由来の遺伝子を発現し、フェドバッチ培養で発酵させた大腸菌における増殖とイソプレン産出の脱共役
実施例１１は、メバロン酸およびイソプレン産出からの細胞増殖の脱共役を示す。
【０６０２】
Ｉ．発酵条件
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０６０３】
１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０６０４】
ｐＴｒｃＨｉｓ２ＡＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（ｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡとも呼ぶ、図９１および９２Ａ〜９２Ｃ；配列番号２３）（５０μｇ／ｍｌカルベニシリン）またはｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡ（ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙとも呼ぶ（図２６））（５０μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）プラスミドを含有する大腸菌細胞を用いて発酵を行なった。イソプレンを産出する実験の場合、大腸菌細胞は、ｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳ（５０μｇ／ｍｌカナマイシン）プラスミドも含有していた。これらの実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのメバロン酸またはイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＡブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定したときに種菌が光学密度１．０まで増殖した後、それをバイオリアクターに植菌するために用いた。
【０６０５】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。過塩素酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃２４４２５２）処理したサンプル（０．３Ｍ、４℃で５分間インキュベートしたもの）を有機酸ＨＰＬＣカラム（ＢｉｏＲａｄ  ＃１２５−０１４０）に適用して、発酵ブロス中のメバロン酸濃度を測定した。ブロスメバロン酸ピークサイズを、メバロノールアセトン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃  Ｍ４６６７）を過塩素酸で処理して、Ｄ，Ｌ−メバロン酸を形成したものから作成した検量線と比較することにより、濃度を決定した。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は、発酵ブロス１リットル当たりに産出されるイソプレンの量と定義される。
【０６０６】
ＩＩ．１５０ＬスケールでのｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からのメバロン酸産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、４５ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、１７０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で５時間インキュベートした。この溶液をトリプトン−酵母抽出物培地の５Ｌバイオリアクターに移し、培養物のＯＤ５５０が１．０に達するまで、細胞を３０℃、２７．５ｒｐｍで増殖させた。５Ｌの種菌を４５ｋｇの培地を含有する１５０Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１．１ｍＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図６０Ａに示す。メバロン酸力価は、発酵の間に最終値６１．３ｇ／Ｌまで増加した（図６０Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６０Ｃに示す。図６０Ａとの比較から、増殖とメバロン酸産出の脱共役が示されている。５２．５時間の発酵の間に産出されるメバロン酸の総量は、利用されたグルコース１４．１ｋｇから４．０ｋｇであった。発酵の時にメバロン酸産出に回った利用炭素のモル収率は３４．２％であった。
【０６０７】
ＩＩＩ．１５ＬスケールでのｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からのメバロン酸産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１．０ｍＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図６１Ａに示す。メバロン酸力価は、発酵の間に最終値５３．９ｇ／Ｌまで増加した（図６１Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６１Ｃに示す。図６１Ａとの比較から、増殖とメバロン酸産出の脱共役が示されている。４６．６時間の発酵の間に産出されるメバロン酸の総量は、利用されたグルコース２．１ｋｇから４９１ｇであった。発酵の時にメバロン酸産出に回った利用炭素のモル収率は２８．８％であった。
【０６０８】
ＩＶ．１５ＬスケールでのｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドを発現する大腸菌ＦＭ５細胞からのメバロン酸産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたＦＭ５細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ５５０が３０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１．０ｍＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図６２Ａに示す。メバロン酸力価は、発酵の間に最終値２３．７ｇ／Ｌまで増加した（図６２Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６２Ｃに示す。図６２Ａとの比較から、増殖とメバロン酸産出の脱共役が示されている。５１．２時間の発酵の間に産出されるメバロン酸の総量は、利用されたグルコース１．１ｋｇから１４０ｇであった。発酵の時にメバロン酸産出に回った利用炭素のモル収率は１５．２％であった。
【０６０９】
Ｖ．１５ＬスケールでのｐＴｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ５５０が１９０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。発酵して３８時間でＩＰＴＧ濃度を１００μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図６３Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値２．２ｇ／Ｌブロスまで増加した（図６３Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６３Ｃに示す。図６３Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。５４．４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース２．３ｋｇから１５．９ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１．５３％であった。
【０６１０】
ＶＩ．１５ＬスケールでのｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）チューナー細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２６μＭにした。ＯＤ５５０が１７５に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図６４Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値１．３ｇ／Ｌブロスまで増加した（図６４Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６４Ｃに示す。図６４Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。４８．６時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース１．６ｋｇから９．９ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１．３４％であった。
【０６１１】
ＶＩＩ．１５ＬスケールでのｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現する大腸菌ＭＧ１６５５細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＭＧ１６５５細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ５５０が４５という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２４μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図６５Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値３９３ｍｇ／Ｌブロスまで増加した（図６５Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６５Ｃに示す。図６５Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。６７．４時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース５２０ｇから２．２ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は０．９２％であった。
【０６１２】
ＶＩＩＩ．１５ＬスケールでのｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＭＧ１６５５ａｃｋ−ｐｔａ細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＭＧ１６５５ａｃｋ−ｐｔａ細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ５５０が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を３０μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図６６Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値３６８ｍｇ／Ｌブロスまで増加した（図６６Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６６Ｃに示す。図６６Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。５６．７時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース５３１ｇから１．８ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は０．７３％であった。
【０６１３】
ＩＸ．１５ＬスケールでのｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現する大腸菌ＦＭ５細胞からのイソプレン産出
上記の実施例１１、第Ｉ部で説明したようにプレート上で増殖させたｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを発現するＦＭ５細胞を、５００ｍＬのトリプトン−酵母抽出物培地を含有するフラスコに植菌し、培養物のＯＤ５５０が１．０になるまで、３０℃、１６０ｒｐｍで増殖させた。この材料を４．５ｋｇの培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに播種した。ＯＤ５５０が１５という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２７μＭにした。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図６７Ａに示す。イソプレン力価は発酵の間に最終値２３５ｍｇ／Ｌブロスまで増加した（図６７Ｂ）。発酵の全期間を通じた比生産性プロファイルを図６７Ｃに示す。図６７Ａとの比較から、増殖とイソプレン産出の脱共役が示されている。５２．３時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は、利用されたグルコース９４８ｇから１．４ｇであった。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は０．３２％であった。
【０６１４】
実施例１２：メバロン酸経路由来の遺伝子を発現し、フェドバッチ培養で発酵させた大腸菌の指数関数的増殖期におけるイソプレンの産出
実施例１２は、細胞の指数関数的増殖期におけるイソプレンの産出を示す。
【０６１５】
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
発酵培地１リットル当たり以下の成分を用いて培地を作製した：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０６１６】
１０００×改変微量金属溶液：
以下の成分を用いて１０００×改変微量金属溶液を作製した：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで滅菌濾過した。
【０６１７】
ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＭＶＡプラスミドおよびｐＴｒｃ  ＫＫＤｙＩｋＩＳプラスミドを含有するＡＴＣＣ１１３０３大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて５Ｌバイオリアクターに植菌した。
【０６１８】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５０時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、２．０ｋｇであった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を２５μＭにした。ＯＤ５５０が１９０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５０μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図９９に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルを本明細書に記載したように測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値１．４ｇ／Ｌまで増加した（図１００）。５０時間の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は１０．０ｇであった。バイオリアクター内の経時的なイソプレン比生産性のプロファイルを図１０１に示す。発酵の時にイソプレン産出に寄与した利用炭素のモル収率は１．１％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は０．５％であった。
【０６１９】
実施例１３：イソプレンの引火性のモデリングと試験
Ｉ．イソプレンの引火性のモデリングと試験の概要
引火性のモデリングと実験を様々な炭化水素／酸素／窒素／水／二酸化炭素混合物について行なった。試験されたこのモデリングと実験は、一定の圧力および温度における特定の蒸気および一酸化炭素濃度下のイソプレンおよび酸素／窒素引火性曲線を規定することが目的であった。モデル条件のマトリックスを表１１に示し、実施された実験のマトリックスを表５に示す。
【表１１】
0005448220.tif 000033
モデリングされたイソプレン引火性のまとめ
【表１２】
0005448220.tif 000034
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【０６２０】
ＩＩ．計算断熱火炎温度（ＣＡＦＴ）モデルの説明
計算断熱火炎温度（ＣＡＦＴ）を燃焼伝播のための選択限界火炎温度とともに用いて、イソプレンの引火限度を決定した。この研究で火炎温度を計算するために用いられたコンピュータプログラムは、ＮＡＳＡ  Ｇｌｅｎｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＣＥＡ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｗｉｔｈ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）ソフトウェアである。
【０６２１】
均質な燃焼機構（この場合、燃料と酸化体の両方がガス状態にある）に関する断熱火炎温度モデルを用いた引火限度の決定には、５つの工程、すなわち、所望の反応剤の選択、試験条件の選択、限界火炎温度の選択、反応剤の修飾、および計算値からの引火限度の構築が関与している。
【０６２２】
この最初の工程である、所望の反応剤の選択では、この系に存在する反応剤種と各々の量に関して決定がなされなければならない。多くの場合、計算に用いられるコンピュータプログラムは、反応剤および産物種のリストを有している。調査すべき種に関するデータがプログラム中に見つからない場合は、ＪＡＮＡＦ表などの他の情報源またはインターネットから取得してもよい。この現在のモデルでは、水、窒素、酸素および二酸化炭素に関するデータが、プログラムデータベース中に存在していた。このプログラムデータベースは、イソプレンを種として含んでいなかった。そのため、熱力学特性を手動で組み入れた。
【０６２３】
次の工程は、燃焼プロセスが生じる初期の圧力および温度条件を決定することである。このモデルでは、圧力は１気圧（絶対気圧）、温度は、イソプレンの沸点である４０℃である。
【０６２４】
燃焼の限界火炎温度は、理論的原理に基づいて選択されるかまたは実験的に決定されるかのいずれかであることができる。各々の方法にそれ独自の限界がある。
【０６２５】
先行研究に基づくと、炭化水素の限界火炎温度は、１０００Ｋ〜１５００Ｋの範囲に収まる。このモデルでは、１５００Ｋという値を選択した。これは、一酸化炭素から二酸化炭素への反応（高発熱反応であり、火炎エネルギーのかなりの割合を占める）が自律的になる温度である。
【０６２６】
ひとたび限界火炎温度が決定されれば、所与の反応剤混合物に対してモデル計算を行ない（種濃度）、断熱火炎温度を決定する。温度が限界火炎温度を超えた場合にのみ、火炎伝播が起こったと考えられる。次に、反応剤混合物の組成を変更して、伝播混合物と非伝播混合物のデータセットを作成する。
【０６２７】
この種のモデルは、実験的に決定される引火限界と十分一致する。得られた限度外の領域が非引火性であり、得られた限度の範囲内の領域が引火性である。限度の形状は先端を形成する。限度の先端は、ガス燃料の制限酸素濃度（ＬＯＣ）に関連する。
【０６２８】
ＩＩＩ．計算断熱火炎温度（ＣＡＦＴ）モデルからの結果
シリーズＡからＧまでのＣＡＦＴモデル結果が、それぞれ、図６８から図７４にかけてプロットされている。これらの図では、計算断熱火炎温度が、（ＮＡＳＡ  ＣＥＡプログラムを用いて）いくつかの酸素／窒素比（重量による）に対する燃料濃度（重量による）の関数としてプロットされている。１５００Ｋを超える曲線の部分である、選択限界火炎温度は、火炎伝播に十分な燃料レベルを含有している。これらの結果は、図６８から図７４にかけて提示された形で解釈するのは困難な場合がある。さらに、現在の形は、通常は容積パーセントの単位で提示される実験データと比較することができない。
【０６２９】
シリーズＡを例として用いて、図６８のデータを従来的な引火限度の形でプロットすることができる。図６８および縦座標上の１５００Ｋの温度線と交差する読取り値を用いて、それが交わる各曲線（酸素対窒素比）の横座標に向かって接線を引くことにより、この限界火炎温度の燃料濃度を決定することができる。次に、これらの値を、所与の酸化体の重量パーセントに対する燃料の重量パーセントとして一覧にすることができる（図７５Ａ）。次に、燃料の組成（１００重量％イソプレン）と酸化体の組成（水、酸素および窒素の相対含有量）が分かれば、モル量を確定することができる。
【０６３０】
これらのモル量から、容積濃度パーセントを計算することができる。次に、容積パーセント単位の濃度をプロットして、引火限度を生成することができる（図７５Ｂ）。この限度によって囲まれる部分が爆発範囲であり、除外される部分が非爆発範囲である。この限度の「先端」が制限酸素濃度である。図７６Ａおよび７６Ｂは、図６９に提示されたデータから生成されたシリーズＢの引火限度の計算容積濃度を含有している。図７０〜７４に提示されたデータに対して同様の手法を用いることができる。
【０６３１】
ＩＶ．引火性試験実験装置および手順
引火性試験は、４リットル高圧容器内で行なわれた。容器は円筒状で、内径が６インチ、内のり高さが８．６２５インチであった。容器（および内部のガス）の温度は、ＰＩＤコントローラーで制御される外部加熱器を用いて維持された。熱損失を防ぐために、セラミックウールと反射断熱材とを圧力容器の周囲に巻き付けた。Ｋタイプの熱電温度計を用いて、ガススペースの温度および容器それ自体の温度を測定した。図７７に試験容器を示す。
【０６３２】
試験を実施する前に、容器を空にし、窒素でパージして、それまでの試験で発生したガスを全て確実に除去した。次に、容器に真空を引いた。これが行なわれた後の圧力は、通常、約０．０６ｂａｒであった（ａ）。窒素パージングしたため、この初期の圧力の原因となるガスは、窒素であると仮定された。分圧を用いて、次に、水、イソプレン、窒素、および酸素を適当な量で添加して、問題とする試験条件を達成した。容器内の磁気駆動型ミキシングファンで、ガス内容物を確実に混合した。点火の約１分前に切れるファンを用いて、ガスを約２分間混合させておいた。
【０６３３】
点火装置は、タイマー回路上の１．５ｏｈｍのニクロムコイルとＡＣ電源から構成されていた。オシロスコープを用いて、３４．４のＶＡＣがこの点火装置に３．２秒間送達されると決定された。点火サイクルのほぼ中間で３．８ａｍｐの最大電流が発生した。したがって、最大出力は１３１Ｗであり、点火サイクルの間に提供される総エネルギーは、約２１０Ｊであった。
【０６３４】
データ獲得システムに接続された可変リラクタンスＶａｌｉｄｙｎｅ  ＤＰ２１５圧力変換器を用いて爆燃データを獲得した。ガス混合物は、圧力が５％以上上昇した場合に爆燃すると考えられた。
【０６３５】
Ｖ．引火性試験の結果
最初の実験シリーズ（シリーズ１）は、４０℃、０ｐｓｉｇ、蒸気なしで実施された。様々な濃度のイソプレンと酸素で試験を実施すると、図７８Ａに示す引火性曲線が生成された。この曲線で示すデータ点は、曲線に接するもののみである。このシリーズで取得された全データ点の詳細なリストを図８０Ａおよび８０Ｂに示す。
【０６３６】
図７８Ａで示した爆発データ点を図７８Ｂにまとめる。図７８Ｃは、実験データをＣＡＦＴモデルで予測された引火限度と比較したものである。このモデルは、実験データと非常によく一致している。不一致は、試験チャンバーの非断熱性とモデルの限界とによるものであり得る。このモデルは、酸化反応に対して無限時間軸を考えており、反応の動力学的な限界を全く考慮していない。
【０６３７】
さらに、このモデルは、そのデータベースに含まれる平衡化学種の数によって制限され、したがって、熱分解種を適切に予測し得ない。また、このモデルで生じる引火限度では、限界火炎温度（１５００Ｋ）に対して１つの値が用いられる。限界火炎温度は、反応する化学種によって、１，０００Ｋ〜１，５００Ｋの範囲の値であることができる。化学量論的燃料／酸化体レベルを上回る燃料濃度で形成される熱分解化学種の複雑な性質は、このモデルでこの系の引火上限を正確に予測し得ない１つの理由である。
【０６３８】
第２の実験シリーズ（シリーズ２）は、４０℃、０ｐｓｉｇ、４％という一定の蒸気濃度で実施された。様々な濃度のイソプレンと酸素で試験を実施すると、図７９Ａに示す引火性曲線が生成された。この曲線で示すデータ点は、曲線に接するもののみである。このシリーズで取得された全データ点の詳細なリストを図８１に示す。シリーズ１のデータと類似しているので、引火下限、制限酸素濃度、および引火上限といった重要な点だけを試験した。試験混合物に４％の蒸気を添加しても、引火限度の主要な限界はそれほど変化しなかった。より高濃度の蒸気／水および／または他の不活性ガスが引火限度に影響を与えた可能性があることに留意すべきである。
【０６３９】
図７９Ａで示した爆発データ点を図７９Ｂにまとめる。図７９Ｃは、実験データをＣＡＦＴモデルで予測された引火限度と比較したものである。このモデルは、実験データと非常によく一致している。不一致は、シリーズ１に記載したものと同じ要因によるものであり得る。
【０６４０】
Ｖ．３気圧の空気中のイソプレンの引火限界の計算
３気圧の絶対系圧および４０℃におけるイソプレンの引火限界を計算するために、実施例１３の第Ｉ部から第ＩＶ部に記載された方法も用いた。これらの結果を、１気圧の絶対系圧および４０℃における実施例１３の第Ｉ部から第ＩＶ部の結果と比較した。初期の系圧が増加するにつれて引火限度が拡大するかまたは大きくなるので、このより高い圧力を試験した。引火上限が最も影響を受け、制限酸素組成物がそれに続く。引火下限は最も影響を受けなかった（例えば、“Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ６２７−Ｆｌａｍｍａｂｉｌｉｔｙ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｕｓｔｉｂｌｅ  Ｇａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｐｏｒｓ”  ｗｒｉｔｔｅｎ  ｂｙ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｇ．Ｚａｂｅｔａｋｉｓ  ａｎｄ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍｅｒ  ＵＳ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｍｉｎｅｓ（１９６５）を参照されたく、これは、特に、引火限界の計算に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【０６４１】
図８２では、計算断熱火炎温度が、総燃料／窒素／酸素の重量パーセントで表されるイソプレン（燃料）濃度の関数としてプロットされており、ここで、系圧は最初は３気圧であった。計算火炎温度は、１気圧の系で最初に決定されたものと非常によく似ている（図８３）。結果として、計算断熱引火性データを用いて引火限度が生成される場合は、曲線が非常によく似ている（図８４および８５を参照）。それゆえ、これらの理論的計算に基づくと、１気圧から３気圧への系圧増加は、引火限度の著しい増加／拡大をもたらさない。所望により、これらのモデル結果の妥当性を、実験的試験（例えば、１気圧の圧力における本明細書に記載の実験的試験）を用いて確認してもよい。
【０６４２】
ＶＩＩ．引火性研究のまとめ
計算断熱温度モデルを、４０℃および０ｐｓｉｇにおけるイソプレン／酸素／窒素／水／二酸化炭素の系の引火限度のために開発した。開発されたＣＡＦＴモデルは、この研究で実施された試験によって生成された実験データとよく一致した。シリーズ１および２の実験結果により、シリーズＡおよびＢのモデル結果の妥当性が確認された。
【０６４３】
実施例１４：発現コンストラクトおよび株
Ｉ．メバロン酸キナーゼをコードするプラスミドの構築
メタノサルキナ・マゼイの下流ＭＶＡ経路（アクセッション番号ＮＣ＿００３９０１．１、ＮＣ＿００３９０１．１、ＮＣ＿００３９０１．１、およびＮＣ＿００３９０１．１、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）をコードするコンストラクトを、大腸菌での発現のためにコドンを最適化して合成した。このコンストラクトは、Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロンと名付けられ（図１１２Ａ〜１１２Ｃ；配列番号２７）、Ｍ．マゼイのＭＶＫ酵素（デカルボキシラーゼと推定される）、ＩＰＫ酵素、およびＩＤＩ酵素をコードしている。ＭＶＫ（アクセッション番号ＮＣ＿００３９０１．１）をコードする遺伝子を、アニーリング温度５５℃および伸長時間６０秒の３０サイクルを用いて、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎキットを用いて、プライマーのＭＣＭ１６５およびＭＣＭ１７７（表１３）を用いてＰＣＲ増幅した。このアンプリコンをＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲカラムを用いて精製した後、ＰｍｅＩを含む１０μＬの反応液（ＮＥＢ緩衝液４とＢＳＡの存在下）中３７℃で消化した。１時間後、ＮｓｉＩとＲｏｃｈｅの緩衝液Ｈとを３７℃でさらに１時間添加した。消化されたＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲカラムで精製し、同じように消化され、精製されたプラスミドＭＣＭ２９（ＭＣＭ２９は、クズイソプレンシンターゼをコードするｐＴｒｃＫｕｄｚｕで形質転換した大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である）に、１１μＬの反応液（５μＬのＲｏｃｈｅ  Ｑｕｉｃｋリガーゼ緩衝液１、１μＬの緩衝液２、１μＬのプラスミド、３μＬのアンプリコン、および１μＬのリガーゼ）中で連結した（室温で１時間）。ＭＣＭ２９はｐＴｒｃＫｕｄｚｕ  Ｋａｎである。ライゲーション反応液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体を３７℃で一晩インキュベートしたＬＡ／ｋａｎ５０プレート上で選択した。得られたプラスミドＭＣＭ３８２中のＭＶＫ挿入物をシークエンシングした（図１１３Ａ〜１１３Ｃ；配列番号２８）。
オリゴヌクレオチド
【表１３】
0005448220.tif 000036
【０６４４】
ＩＩ．メバロン酸キナーゼとイソプレンシンターゼを過剰発現する株の作製
プラスミドＭＣＭ３８２を、ＬＢ培地中で対数増殖期中期（ｍｉｄｌｏｇ）まで増殖させ、氷冷滅菌水で３回洗浄しておいたＭＣＭ３３１細胞（出芽酵母メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードする染色体コンストラクトｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを含有する）に形質転換した。１μＬのＤＮＡを５０μＬの細胞懸濁液に添加し、この混合物を２ｍｍキュベット中、２．５ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートし、その後すぐに、５００μＬのＬＢ培地中、３７℃で１時間回復させた。形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択し、ＭＣＭ３９１と名付けた。プラスミドＭＣＭ８２を同じエレクトロポレーションプロトコルでこの株に導入し、その後、ＬＡ／ｋａｎ５０／ｓｐｅｃ５０上で選択した。得られた株ＭＣＭ４０１は、ｃｍｐをマーカーとする染色体コンストラクトｇｉ１．２ＫＫＤｙＩと、ｋａｎをマーカーとするプラスミドＭＣＭ３８２と、ｓｐｅｃをマーカーとするプラスミドＭＣＭ８２（これは、Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙである）とを含有している。表１４を参照されたい。
メバロン酸キナーゼとイソプレンシンターゼを過剰発現する株
【表１４】
0005448220.tif 000037
【０６４５】
ＩＩＩ．プラスミドＭＣＭ３７６の構築−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄ
Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロン由来のＭＶＫ  ＯＲＦ（図１１２Ａ〜１１２Ｃ；配列番号２７）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲミックスを用いて、プライマーのＭＣＭ１６１およびＭＣＭ１６２（表１３）を用いてＰＣＲ増幅した。４５μＬのＰＣＲミックスを、１μＬの鋳型、１μＬの１０μＭの各プライマー、および２μＬの水と合わせた。反応を以下のようなサイクルで繰り返した：９４℃、２分；９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、および６８℃、１分１５秒を３０サイクル；その後、７２℃、７分、冷えるまで４℃。３μＬのこのＰＣＲ反応液を、製造元のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＥＴ２００Ｄプラスミドに連結した。３μＬのこのライゲーション液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択した。形質転換体からのプラスミドを単離し、挿入物をシークエンシングし、ＭＣＭ３７６が得られた（図１１４Ａ〜１１４Ｃ；配列番号２９）。
【０６４６】
Ｖ．発現株ＭＣＭ３７８の作製
プラスミドＭＣＭ３７６を、製造元のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞に形質転換した。形質転換体ＭＣＭ３７８をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択した。
【０６４７】
実施例１５：上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを発現し、２０ｍＬバッチスケールでフェドバッチ培養された大腸菌によるイソプレンの産出
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、Ｋ２ＨＰＯ４  １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３．２ｇ、酵母抽出物１ｇ、および１０００×微量金属溶液１ｍｌが含まれていた。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）を用いてｐＨを６．８に調整し、全量とした。培地を０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。グルコース（２．５ｇ）と抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０６４８】
１０００×微量金属溶液：
１０００×微量金属溶液には、クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にｄｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０６４９】
株：
ＭＣＭ３４３細胞は、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、クズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕ）とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞である。
【０６５０】
ＭＣＭ４０１細胞は、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞である。
【０６５１】
２０ｍＬワーキング容量を含む１００ｍＬバイオリアクター中、３０℃で、これらの株を増殖させることにより、イソプレン産出を分析した。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３０℃でインキュベートした。単一コロニーを培地に植菌し、一晩増殖させた。細菌を２０ｍＬの培地中に希釈し、５５０ｎｍで測定して０．０５の光学密度に達した。１００ｍＬバイオリアクターを密封し、８ｍＬ／分の速度で空気をポンプで送り出した。磁気撹拌子を用いて６００ｒｐｍで撹拌することにより、培地を十分に撹拌した。オンライン式のＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ−２０質量分析計を用いて、バイオリアクターからのオフガスを分析した。イソプレン、ＣＯ２、および空気中に天然に存在する他のガスに対応する質量をモニタリングした。それぞれのガスの経時的な濃度（パーセント単位）を合計することにより、蓄積したイソプレンおよびＣＯ２産出を計算した。代謝活性により放出されたＣＯ２を推定するために、大気のＣＯ２を全体から差し引いた。
【０６５２】
完全なメバロン酸経路とクズイソプレンシンターゼとを発現する株（ＭＣＭ３４３）からのイソプレン産出を、Ｍ．マゼイ由来のＭＶＫとクズイソプレンシンターゼとをさらに過剰発現する株（ＭＣＭ４０１）と、１００ｍＬバイオリアクターにおいて比較した。グルコースを炭素源として用いる規定培地中、同一条件下で、細菌を増殖させた。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１００μＭまたは２００μＭのいずれかの最終濃度で添加することにより、イソプレン産出の誘導を達成した。図１１５Ａ〜１１５Ｄに示すように、オフガス測定から、ＭＶＫとイソプレンシンターゼの両方をを過剰発現する株（ＭＣＭ４０１）は、メバロン酸経路とクズイソプレンシンターゼのみを発現する株（ＭＣＭ３４３）と比べて有意に多いイソプレンを産出することが明らかになった。１００μＭによる誘導では、ＭＣＭ４０１株は、ＭＣＭ３４３株と比べて２倍多いイソプレンを産出した。２００μＭのＩＰＴＧによる誘導では、ＭＣＭ４０１株は、ＭＣＭ３４３株と比べて３．４倍多いイソプレンを産出した。代謝活性の尺度となる、バイオリアクターからのオフガス中のＣＯ２の分析により、代謝活性がＩＰＴＧ誘導やイソプレン産出とは無関係であったことが示される。
【０６５３】
実施例１６：上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを発現し、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖させた大腸菌によるイソプレンの産出
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌが含まれていた。全ての成分を一緒に添加し、ＤＩＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０６５４】
１０００×改変微量金属溶液：
１０００×改変微量金属溶液には、クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にＤＩＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０６５５】
上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（出芽酵母メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードするｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて、１５Ｌバイオリアクター中の５Ｌの培地に植菌した。
【０６５６】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。６８時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３．８ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度が（ＯＤ５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５１μＭにした。ＯＤ５５０が１４９に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を８８μＭに上昇させた。ＯＤ５５０＝１９５で１１９μＭまで、ＯＤ５５０＝２１０で１５２μＭまで、ＩＰＴＧをさらに添加して濃度を上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図１１６に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２３．８ｇ／Ｌまで増加した（図１１７）。６８時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は２２７．２ｇであった。産出の時間経過を図１１８に示す。ＴＣＥＲで測定したときの代謝活性プロファイルを図１１９に示す。総生菌数（総コロニー形成単位）は、発酵１０時間から３９時間で２桁減少した（図１２０）。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１３．０％であった。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は６．３％であった。
【０６５７】
実施例１７：上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを発現し、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖させた大腸菌によるイソプレンの産出（２×１００μＭのＩＰＴＧによる誘導）
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌが含まれていた。全ての成分を一緒に添加し、ＤＩＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０６５８】
１０００×改変微量金属溶液：
１０００×改変微量金属溶液には、クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ，  Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にＤＩＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０６５９】
上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（出芽酵母メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードするｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて、１５Ｌバイオリアクター中の５Ｌの培地に植菌した。
【０６６０】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５５時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、１．９ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度が（ＯＤ５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１１１μＭにした。ＯＤ５５０が１５５に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１９３μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図１２１に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値１９．５ｇ／Ｌまで増加した（図１２２）。５５時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１３３．８ｇであった。産出の時間経過を図１２３に示す。瞬間的容積生産性レベルは、１．５ｇイソプレン／Ｌブロス／時間と同じくらい高い値に達した（図１２４）。瞬間的収率レベルは、１７．７％ｗ／ｗにも達した（図１２５）。ＴＣＥＲで測定したときの代謝活性プロファイルを図１２６に示す。総生菌数（総コロニー形成単位）は、発酵８時間から３６時間で２桁減少した（図１２７）。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１５．８％であった。発酵全体を通じたグルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は７．４％であった。
【０６６１】
さらに、対照として、上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（出芽酵母メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードするｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのＣＥＲフォーマットで測定した場合の誘導されていない細胞代謝活性をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株（上記のＭＣＭ４０１）の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて、１５Ｌバイオリアクター中の５Ｌの培地に植菌した。細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。
【０６６２】
図１４８は、上記の誘導されていない細胞と実施例１６および１７に見られるイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して誘導された細胞のＣＥＲプロファイルを比較したものである。
【０６６３】
実施例１８：上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを発現し、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖させた大腸菌によるイソプレンの産出（１×５０μＭのＩＰＴＧ＋１５０μＭの供給ＩＰＴＧによる誘導）
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、以下が含まれていた。Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０６６４】
１０００×改変微量金属溶液：
１０００×改変微量金属溶液には、クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にＤＩＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０６６５】
上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードするｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（出芽酵母メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードするｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびクズ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＫｕｄｚｕＭＶＫ（Ｍ．ｍａｚｅｉ））とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３７℃でインキュベートした。単一コロニーをトリプトン−酵母抽出物培地中に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて、１５Ｌバイオリアクター中の５Ｌの培地に植菌した。
【０６６６】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。５５時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、２．２ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度が（ＯＤ５５０）が１０という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を５１μＭにした。ＯＤ５５０＝１０でＩＰＴＧを添加したのに加えて、定期的な供給を開始し、１８時間かけて１６４ｍｇのＩＰＴＧを供給した。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図１２８に示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は発酵の間に最終値２２．０ｇ／Ｌまで増加した（図１２９）。５５時間の発酵の間に産出されるイソプレンの総量は１７０．５ｇであった。産出の時間経過を図１３０に示す。ＴＣＥＲで測定したときの代謝活性プロファイルを図１３１に示す。バイオリアクターへの空気流量が約１．７時間の間に８ｓｌｐｍから４ｓｌｐｍへと減少したとき、オフガス中のイソプレンの濃度は、０．５１ｗ／ｗ％から０．９２ｗ／ｗ％へと増加した（図１３２）。これらのイソプレンレベルの上昇は、総二酸化炭素発生速度（ＴＣＥＲ）で測定したとき、３７．２時間から３９．３時間の間にわずか７％しか低下しなかったので、細胞代謝活性に負の影響を及ぼすようには見えなかった（図１３２）。総生菌数（総コロニー形成単位）は、発酵７時間から３６時間で２桁減少した（図１３３）。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は１６．６％であった。発酵全体を通じたグルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は７．７％であった。
【０６６７】
実施例１９：１Ｌスケールの野生型フェドバッチ培養で増殖した大腸菌に対する外部適用したイソプレンの影響
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：
各々１リットルの発酵培地には、以下のものが含まれていた。Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、および１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした水酸化アンモニウム（３０％）でｐＨを７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０６６８】
１０００×改変微量金属溶液：
１０００×改変微量金属溶液には、クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、およびＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇが含まれていた。各成分を一度にＤＩＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０６６９】
ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３０℃）におけるグルコースフェドバッチバイオリアクター内の細胞生存性および代謝活性に対するイソプレンの影響をモニタリングするために行なわれた。凍結バイアルからの大腸菌株の種菌をトリプトン−酵母抽出物培地に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５０ｍを用いて、１Ｌバイオリアクター中の０．５Ｌの培地に植菌した。
【０６７０】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を供給した。窒素をキャリアとして用いて、イソプレンをバイオリアクターに供給した。イソプレン供給速度は、中間の増殖期（ＯＤ５５０＝３１〜４４）は１ｇ／Ｌ／時間であり、計７５分（１３．２〜１４．４時間）持続した。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図１３４に示す。ＴＣＥＲで測定したときの代謝活性プロファイルを図１３５に示す。総生菌数（総コロニー形成単位）は、イソプレンがバイオリアクターに導入されている間に１４倍増加した（図１３６）。
【０６７１】
実施例２０：出芽酵母によるイソプレンの産出とイソプレンシンターゼの発現
クズイソプレンシンターゼ酵素を、交配種の出芽酵母／ピキア・パストリスのコドン使用表に従って発現のため最適し、合成し、ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０（ＤＮＡ２．０製、マップについては図１４０、配列については図１４１（配列番号３８））にクローニングした。製造元のプロトコルに従って、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）反応を行なった。ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０は「エントリー」ベクターであるので、ＬＲクロナーゼＩＩ酵素（ＬＲ反応）を用いて、コドン最適化イソプレンシンターゼを「デスティネーション」ベクターｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。
【０６７２】
次に、ＬＲ反応液を製造元のプロトコルに従ってＴｏｐ１０化学的コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、イソプレンシンターゼＯＲＦを含むｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２プラスミドを有する細菌を５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＡプレート上で選択した。個々の陽性形質転換体を、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（商標）ＰＣＲビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＴ７フォワードプライマーおよび酵母イソプレンシンターゼ−Ｒｅｖ２プライマー（表１５参照）とともに用いるコロニーＰＣＲで試験した（プライマー濃度およびサーモサイクリングパラメータについては下記参照）。
イソプレンシンターゼを増幅するためのプライマー配列
【表１５】
0005448220.tif 000038
【０６７３】
正しいサイズ（１３５４ｂｐ）のＰＣＲ断片を生じさせたプラスミドをミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、Ｔ７フォワードプライマーおよび酵母イソプレンシンターゼ−Ｆｏｒ２プライマー（表１５参照）を用いるシークエンシング（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）に回した。シークエンシング実施から得た結果を、（Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェア、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎを使用して）既知のｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０配列と比較し、単一のプラスミド、ｐＤＷ１４をさらなる研究用に選択した（マップについては図１４２Ａ、完全な配列については図１４２ＢおよびＣ（配列番号３９））。ｐＤＷ１４の配列は、１ヌクレオチド（図１４２Ｂ中、太字で目印が付けられている）だけ、ｐＤＯＮＲ２２１：１９４３０の配列と違っていた。リジンをコードするコドンの３番目の位置にあったので、１ヌクレオチドの変化（ＧからＡ）によりＯＲＦに変化は生じなかった。この塩基変化がＬＲクローニング反応で導入されたのか、またはＤＮＡ２．０により合成されたもとの配列中のエラーであったのかは不明である。シークエンシングされたプラスミドは全て、この塩基変化を含有していた。
【０６７４】
精製したｐＤＷ１４をＳ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ形質転換キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載されたプロトコルに従って、出芽酵母株ＩＮＶＳｃ−１に形質転換した。ｐＤＷ１４または（インタクトのＵＲＡ３遺伝子を含有する）ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を有するＩＮＶＳｃ−１株を、ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２  Ｇａｔｅｗａｙベクターマニュアル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に記載されているように選択し、ＳＣ最小培地（２％グルコース含有、ウラシル非含有）上で維持した。ｐＤＷ１４を含有するＩＮＶＳｃ−１２つの独立した単離株とｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２を含む１つの対照株をさらなる解析用に選んだ。
【０６７５】
イソプレンシンターゼ発現を誘導するために、培養物を液体ＳＣ最小培地中で一晩増殖させた。次に、この培養物をＯＤ６００が約０．２になるまで希釈し、２〜３時間増殖させた。培養物を遠心分離でスピンし、１回洗浄し、等量（１０ｍｌ）のＳＣ最小培地（１％ラフィノース含有、２％ガラクトース含有、ウラシル非含有）に再懸濁し、一晩増殖させて、イソプレンシンターゼの発現を誘導した。この株のＯＤ６００を測定し（図１４４Ａ）、株を遠心分離で回収し、２ｍｌの溶解緩衝液（５０％グリセロールとＰＥＢ  ｐＨ７．４：Ｔｒｉｓベース２．４２３ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２（無水物）  １．９０４ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  １４．９１０ｇ／Ｌ、ＤＴＴ  ０．１５４ｇ／Ｌ、グリセロール５０ｍＬ／Ｌの１：１混合液）に再懸濁した。
【０６７６】
溶解混合物をフレンチプレスに３回通し、ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。クマシーゲル解析（図１４３Ａ）のために、サンプルを、還元剤を含む２×ＳＤＳローディング緩衝液で１：１に希釈し、４−１２％ビス−ｔｒｉｓゲルに充填し（２０μｌ総容量）、ＭＥＳ緩衝液中で泳動し、製造元のプロトコルに従って、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｏｖｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いて染色した。
【０６７７】
ニトロセルロース膜へのイソプレンシンターゼの転写およびニトロセルロース膜上での発色による検出には、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。１次抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ抗体希釈液中で１：１０００倍に薄く希釈した１７９９Ａ  １０であった。１次抗体の結合後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ａ−１１００８）を用いて発色させて、定量的なシグナル測定を可能にした。ウェスタンブロット手順は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに記載の通りに行なった。蛍光シグナルを青のフィルターセッティングを用いてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｔｏｒｍ装置で記録し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ画像解析ソフトウェアパッケージで定量的に解析した。誘導培養物のＡ６００か、またはウェスタンブロットで測定されたイソプレンシンターゼタンパク質濃度のいずれかで割った産出されたイソプレンの量の比からライブラリーメンバーの比活性を算出した。図１４３Ｂは、イソプレンシンターゼが、ｐＹＥＳ−ＤＥＳＴ５２（レーン１）を有する対照と比較してｐＤＷ１４を有する誘導されたＩＮＶＳｃ−１株（レーン２および３）中に存在したことを示す。
【０６７８】
各々の株から得た２５μＬのライセート（５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、５μＬの１００ｍＭ  ＤＭＡＰＰ、および６５μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）を添加した）に対して、イソプレンシンターゼヘッドスペースのＤＭＡＰＰアッセイを行なった。ガスタイト１．８ｍＬ  ＧＣチューブ中、３０℃で１５分間、反応を行なった。１００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）を添加して、反応を停止させた。図１４４Ｂには、対照と比較してｐＤＷ１４を有する誘導された株の比活性値（μｇ  ＨＧ／Ｌ／ＯＤ単位）を示した。ｐＤＷ１４を有する誘導された株は、イソプレンシンターゼを欠く対照よりも約２０倍高い活性を示した。
【０６７９】
ＰＣＲサイクリングパラメータ
Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＰｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（商標）ＰＣＲビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、各々２５μｌの総容量／反応で、濃度０．４μＭのオリゴヌクレオチドプライマー対とともに用いた。ＬＲクロナーゼ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得られるプラスミドを解析するために、選択プレート上の個々のコロニー由来の少量の細菌を、上記のＰＣＲミックスを含有する各チューブに添加した。反応サイクルは、次の通りであった。１）９５℃、４分；２）９５℃、２０秒；３）５２℃、２０秒；４）７２℃、３０秒；ステップ２から４までを５サイクル；５）９５℃、２０秒；６）５５℃、２０秒；７）７２℃、３０秒；ステップ５から７までを２５サイクル、７２℃、１０分、および冷えるまで４℃。
【０６８０】
実施例２１：シュードモナスおよび他のグラム陰性細菌におけるイソプレンの産出
ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２の構築、シュードモナスにおける接合およびイソプレンシンターゼ活性の測定
クズ（クズ植物）由来のイソプレンシンターゼをコードする遺伝子を目的の様々な微生物種用にコドン最適化され（表１６；ｆｌｕｏ−ｏｐｔ２ｖ２は選ばれた配列であった）、ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡにより合成されたものであった。ｆｌｕｏ−ｏｐｔ２ｖ２のマップと配列を、図１４５Ａと１４５Ｂ（配列番号４０）に見出すことができる。クローニングしやすくするために、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位を合成された配列に付加し、転写を増強するためにＲＢＳをＡＴＧの前に付加した。
【０６８１】
様々なバージョンのコドン最適化されたクズ由来イソプレンシンターゼにおける、微生物種の関数としての、レアコドンの数。数回の最適化によって、目的の全ての種においてレアコドンのない遺伝子が生じた。
レアコドンの数  
【表１６】
0005448220.tif 000039
【０６８２】
遺伝子は、ＤＮＡ２．０によりクローニングベクター中に提供された。ベクターをＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、目的の挿入物に対応するバンドをゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（Ｋｏｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  １６６：１７５−１７６，１９９５、これは、特に、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。マップについては図１４６Ａ、配列については図１４６ＢおよびＣ（配列番号４１））に再び連結した。これにより、プラスミドｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２が得られ（マップについては図１４７Ａ、配列については図１４７ＢおよびＣ（配列番号４２））、このプラスミドにおいて、イソプレンシンターゼは、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ５に提供されているｌａｃプロモーターから発現された。
【０６８３】
ベクターを大腸菌Ｓ１７−１に形質転換し、シュードモナス・プチダＦ１  ＡＴＣＣ７００００７およびシュードモナス・フルオレセンスＡＴＣＣ  １３５２５と接合させた。ＬＢ上で接合させた後、プラスミドを保有するシュードモナス株の選択をＭ９＋１６ｍＭクエン酸ナトリウム＋ゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌ上で行なった。Ｑｉａｇｅｎキット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてプラスミドを調製することにより、このように生成された株にプラスミドが存在することを調べた。
【０６８４】
組換え株であるＰ．プチダ、ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２およびＰ．フルオレセンス、ｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２のイソプレンシンターゼ活性をこれらの株を、ＴＭ３培地（実施例１、第ＩＩ部に記載されたもの）＋１０ｇ／Ｌグルコース中で増殖させ、対数増殖期中期のバイオマスを回収し、細胞をフレンチプレスで破壊し、ＤＭＡＰＰアッセイに進めることにより、アッセイした。アッセイの結果を表１７に示した。ＤＭＡＰＰアッセイで測定された活性の存在から、イソプレンシンターゼがシュードモナスで発現されることを確認された。
【０６８５】
イソプレンシンターゼ活性を、プラスミドｐＢＢＲ５ＨＧＳＯｐｔ２＿２を用いて、ｌａｃプロモーターからイソプレンシンターゼを発現するシュードモナス・プチダおよびシュードモナス・フルオレセンスで調べた。
シュードモナス・プチダおよびシュードモナス・フルオレセンスにおけるイソプレンシンターゼ活性
【表１７】
0005448220.tif 000040
【０６８６】
実施例２２：グルコースと比べたサトウキビでの大腸菌株およびシュードモナス株の増殖、ならびに両方の基質を用いたイソプレンシンターゼの発現
Ｉ．液体サトウキビの調製
結晶化した原料サトウキビ糖を次のように水に溶解させた。７５０ｇのＨ２Ｏを２５０ｇの糖に添加した。この溶液を撹拌し、溶解するまで穏やかに加熱した。溶けない物質もあった。溶解した後に溶液の重量を１ｋｇに調整して、蒸発した水を補った。溶液の容量を測定すると、９４０ｍＬであった。したがって、溶液の濃度は２６５ｇ／Ｌであった。製品ラベルには、原料サトウキビ１５ｇで炭水化物１４ｇと書かれていた。したがって、溶液の炭水化物濃度は２４８ｇ／Ｌであった。乾燥固体を測定すると、２４．０３％であり、予想された２５０ｇ／ｋｇと大差なかった。溶液のｐＨは５．４９であった。グルコース濃度は、グルコースオキシダーゼを用いる酵素／分光学アッセイを用いて測定した。グルコース濃度は１７．４ｇ／Ｌであった。
【０６８７】
大部分の微生物はスクロースを利用しないが、グルコースとフルクトースを利用することができるので、この溶液を２つに分けた。一方の半分は、（未処理のサトウキビを）１回、３０分間オートクレーブした。グルコース含有量が２９．７５ｇ／Ｌにまで増加したとき、ある程度の転化が生じた（図１４９参照）。溶液のもう一方の半分は、リン酸を用いてｐＨ４．０に調整し、次に、この溶液をオートクレーブして転化させた（転化サトウキビ）。図１４９に示すように、完全な転化を達成するのに３０分間３サイクルで十分であった。両方の溶液を下記の増殖曲線に用いた。
【０６８８】
ＩＩ．グルコースと比べたサトウキビでの様々な大腸菌株およびシュードモナス株の増殖曲線
表１８に示す各々の株の１つのコロニーを２５ｍｌ  ＴＭ３＋１０ｇ／Ｌグルコースに植菌し、２００ｒｐｍ、３０℃で一晩増殖させた。ＴＭ３は実施例７、第ＩＩ節に記載されている。翌朝、各々の培養物１ｍｌを用いて、２５ｍＬのＴＭ３と１０ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの未処理のサトウキビ、または１０ｇ／Ｌ転化サトウキビ（上記のサトウキビ溶液）とを含有するフラスコに植菌した。このフラスコを３０℃、２００ｒｐｍでインキュベートし、サンプルを定期的に採取して、ＯＤ６００を測定した。図１５０および１５１は、増殖速度とバイオマス収率が、シュードモナス株と大腸菌株の両方について、グルコースと転化サトウキビで同程度であったことを示している。Ｐ．フルオレセンスは、あまり転化されていないサトウキビを利用することができるいくつかの兆候を示した。
本研究で用いた株  
【表１８】
0005448220.tif 000041
【０６８９】
ＩＩＩ．グルコースまたはサトウキビで増殖させた場合のイソプレンシンターゼを発現する大腸菌からのイソプレン産出の比較
実施例１４、第ＩＩ節に記載したような、完全なＭＶＡ経路と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、クズ由来のイソプレンシンターゼとを含有する大腸菌ＭＣＭ４０１（ＢＬ２１（ＤＥ３））をＴＭ３＋１０ｇ／Ｌグルコースまたは１０ｇ／Ｌ転化サトウキビ（シロップの炭水化物濃度に基づく）中で増殖させた。ＯＤ６００＝０．２でＴＭ３＋１０ｇ／Ｌグルコースに終夜培養物からフラスコに植菌した。必要な場合、抗生物質を添加した。２時間後、大腸菌培養物を４００μＭのＩＰＴＧで誘導した。増殖して６時間後、実施例２Ｂに記載のＤＭＡＰＰアッセイを用いて、イソプレン産出およびイソプレンシンターゼ活性を測定した。結果を表１９に示す。これにより、転化サトウキビが１細胞ベースのイソプレンおよびイソプレンシンターゼ産出に関してグルコースと等価であることが明白に示されている。
【表１９】
0005448220.tif 000042
0005448220.tif 000043
【０６９０】
実施例２３：出芽酵母ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩオペロンと、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼと、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼと、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳ）と、ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）とを発現する大腸菌株の構築
（ｉ）ＥＷＬ２０１（ＢＬ２１、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）株の構築
大腸菌ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎブランド，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）は、ＭＣＭ３３１  Ｐ１ライセート（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載の方法によって調製されたライセート）を形質導入された、レシピエント株であった。ＭＣＭ３３１細胞は、出芽酵母メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼ（すなわち、出芽酵母由来のｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロン）をコードする染色体コンストラクトｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを含有している。細胞をＬ寒天＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコール上に広げることにより、形質導入体を選択した。このプレートを３０℃で一晩インキュベートした。形質導入体の解析から対照プレート上にはコロニーがないことが示された（復帰については、水＋細胞対照プレート、ライセート汚染については水＋Ｐ１ライセート対照プレート）。
【０６９１】
４つの形質導入体を選び、これらを用いて５ｍＬ  Ｌブロス＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコールに植菌した。これらの培養物を２００ｒｐｍで振盪させながら３０℃で一晩増殖させた。ＰＣＲ解析用の各形質導入体のゲノムＤＮＡプレップを作製するために、１．５ｍＬの終夜細胞培養物を遠心分離した。細胞ペレットを４００μｌの再懸濁緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で再懸濁し、ＤＮアーゼを含まないＲＮアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を４μｌ添加した。チューブを３７℃で３０分間インキュベートした後、４μｌの１０％ＳＤＳおよび４μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫストック溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。チューブを３７℃で１時間インキュベートした。細胞ライセートを２ｍｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｌｉｇｈｔ  Ｇｅｌチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移し、各々２００μｌの飽和フェノールｐＨ７．９（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）とクロロフォルムを添加した。チューブをよく混合し、５分間微量遠心分離した。４００μｌクロロフォルムで２回目の抽出を行ない、水相を新しいエッペンドルフチューブに移した。１ｍｌの１００％エタノールを添加し、５分間遠心分離して、ゲノムＤＮＡを沈殿させた。ゲノムＤＮＡペレットを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄した。エタノールを除去し、ゲノムＤＮＡペレットを短時間風乾させておいた。ゲノムＤＮＡペレットを２００μｌのＴＥに再懸濁した。
【０６９２】
Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と、鋳型としての２００ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡとを用いて、製造元のプロトコルに従って、２つの異なるＰＣＲ反応チューブのセットを準備した。セット１の場合、プライマーのＭＣＭ１３０およびＧＢ  Ｃｍ−Ｒｅｖ（表２０）を用いて、形質導入体がａｔｔＴｎ７遺伝子座にうまく組み込まれることを保証した。セット１のＰＣＲパラメータは、９５℃で２分（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で２５秒（ステップ２〜４を２８サイクル繰り返す）、７２℃で１分であった。セット２の場合、プライマーのＭＶＤ  ＦｏｒおよびＭＶＤ  Ｒｅｖ（表２０）を用いて、ｇｉ１．２−ＫＫＤｙＩオペロンが適切に組み込まれることを保証した。セット２のＰＣＲパラメータは、９５℃で２分（最初のサイクルのみ）、９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で１０秒（ステップ２〜４を２８サイクル繰り返す）、７２℃で１分であった。１．２％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）でのＰＣＲアンプリコンの解析から、４つの形質導入体クローンの全てが正しいことが示された。１つを選んで、ＥＷＬ２０１株と命名した。
【０６９３】
（ｉｉ）ＥＷＬ２０４（ＢＬ２１、ｌｏｏｐｏｕｔ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ）株の構築
Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ａｎｄ  Ｗａｎｎｅｒ（２０００）（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６６４０−６６４５，２０００）に記載されているように、プラスミドｐＣＰ２０を用いて、クロラムフェニコールマーカーをＥＷＬ２０１株からループアウトさせた。Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  ｕｓｉｎｇ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７：６６４０−６６４５，２０００）。ＥＷＬ２０１細胞を対数増殖期中期までＬブロス中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液のアリコート５０μｌを、１μｌのｐＣＰ２０と混合し、細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）を用いて、２ｍｍキュベット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加し、その後、金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。３０℃で１時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬ寒天＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコール＋５０μｇ／μｌカルベニシリン上で選択し、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、対数増殖期初期まで単一クローンを１０ｍｌＬブロス＋５０μｇ／μｌカルベニシリン中、３０℃で増殖させた。その後、増殖中の培養物の温度を２時間４２℃に変えた。連続希釈物を作製した後、細胞をＬＡプレート（抗生物質選択なし）上に広げ、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、２０個のコロニーを選び、Ｌ寒天（抗生物質なし）プレートおよびＬＡ＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコールプレート上に当てた。その後、プレートを３０℃で一晩インキュベートした。細胞はＬＡプレート上では増殖することができたが、ＬＡ＋２０μｇ／μｌクロラムフェニコール上では増殖することができず、クロラムフェニコールマーカーがループアウトしたとみなされた（１つ選んで、ＥＷＬ２０４株と命名した）。
【０６９４】
（ｉｉｉ）プラスミドｐＥＷＬ２３０（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ）の構築
大腸菌発現用のコドン最適化方法に基づくウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ（ウラジロハコヤナギＨＧＳ）をコードする合成遺伝子の作製を、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）に外注した。合成遺伝子は、プラスミドｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎブランド，ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）にカスタムクローニングされ、凍結乾燥品として配送された（図１５２、１５３Ａ〜Ｂ；配列番号４３）。
【０６９５】
鋳型としてのｐＥＴ２４  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳと、プライマーのＭＣＭ１８２およびＭＣＭ１９２と、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元のプロトコルに従って用いて、ＰＣＲ反応を行なって、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ（ウラジロハコヤナギＨＧＳ）遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りであった。９５℃で２分（最初のサイクルのみ）、２５サイクルの９５℃で２５秒、５５℃で２０秒、７２℃で１分の繰返し、７２℃で３分の最後の伸長。ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
【０６９６】
次に、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼのＰＣＲ産物を、１μｌのＢｓｐＨＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と２μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液４を含有する２０μｌ反応液中で消化した。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。１μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と２μｌの１０×緩衝液Ｈを含有する２０μｌ反応液中で２回目の制限消化を行なった。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。プラスミドｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を、１μｌのＮｃｏＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）と、１μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼと、２μｌの１０×緩衝液Ｈを含有する２０μｌ反応液中で消化した。反応液を３７℃で２時間インキュベートした。消化したｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂベクターを１．２％Ｅ−ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した（図１５４）。ＢｓｐＨＩ部位とＮｃｏＩ部位という互換的な付着末端を用いて、５μｌのウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ挿入物、２μｌのｐＴｒｃベクター、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μｌの１０×リガーゼ緩衝液、および１０μｌのｄｄＨ２Ｏを含有する２０μｌライゲーション反応液を調製した。このライゲーション混合物を室温で４０分間インキュベートした。ペトリ皿のｄｄＨ２Ｏに０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を浮かべ、このニトロセルロース膜フィルターの上にライゲーション混合物を室温で３０分間軽く適用することにより、ライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞（第ＩＩ節参照）を対数増殖期中期までＬＢ中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液のアリコート５０μｌを、５μｌの脱塩ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ  ＨＧＳライゲーションミックスと混合した。この細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２ｍｍキュベット中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加し、その後、金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）に移した。３０℃で２時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬ寒天＋５０μｇ／μｌカルベニシリン＋１０ｍＭ  メバロン酸上で選択し、３０℃でインキュベートした。翌日、６個の形質転換体を選び、５ｍｌのＬブロス＋５０μｇ／μｌカルベニシリンチューブ中、３０℃で一晩増殖させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、終夜培養物に対してプラスミドプレップを行なった。プラスミド増殖にＢＬ２１細胞を用いたため、高品質のプラスミドＤＮＡを得るための標準的な製造元のプロトコルに、スピンカラムをＰＢ緩衝液で５回、ＰＥ緩衝液で３回洗浄するという変更を組み入れた。プラスミドを、２０μｌ反応液中のＰｓｔＩで消化して、正しいサイズの線状断���を保証した。６つのプラスミドは全てサイズが正しく、プライマーのＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００（表２０）を用いるシークエンシングのためにＱｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）に送った。ＤＮＡシークエンシングの結果から、６つのプラスミド全てが正しいことが示された。１つのプラスミドを選び、プラスミドＥＷＬ２３０と命名した（図１５５、１５６Ａ〜Ｂ；配列番号４４）。
【０６９７】
（ｉｖ）プラスミドｐＥＷＬ２４４（ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）の構築
鋳型としてのＭＣＭ３７６（下記第（ｖ）節参照）と、プライマーのＭＣＭ１６５およびＭＣＭ１７７（表２０参照）と、Ｐｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩフュージョンＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とを製造元のプロトコルに従って用いて、ＰＣＲ反応を行ない、メタノサルキナ・マゼイ（Ｍ．マゼイ）ＭＶＫ遺伝子を増幅した。ＰＣＲ条件は次の通りであった。９５℃で２分（最初のサイクルのみ）、２８サイクルの９５℃で２５秒、５５℃で２５秒、７２℃で１８秒の繰返し、７２℃で１分の最後の伸長。Ｍ．マゼイＭＶＫのＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
【０６９８】
次に、Ｍ．マゼイＭＶＫのＰＣＲ産物を、８μｌのＰＣＲ産物、２μｌのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、４μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液４、４μｌの１０×ＮＥＢ  ＢＳＡ、および２２μｌのｄｄＨ２Ｏを含有する４０μｌ反応液中で消化した。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。２μｌのＮｓｉＩエンドヌクレアーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、４．７μｌの１０×緩衝液Ｈ、および４０μｌのＰｍｅＩ  消化したＭ．マゼイＭＶＫ断片を含有する４７μｌ反応液中で２回目の消化を行なった。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片を１．２％Ｅ−ゲルを用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて抽出した。プラスミドＥＷＬ２３０を、１０μｌのプラスミド、２μｌのＰｍｅＩエンドヌクレアーゼ、４μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液４、４μｌの１０×ＮＥＢ  ＢＳＡ、および２０μｌのｄｄＨ２Ｏを含有する４０μｌ反応液中で消化した。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。２μｌのＰｓｔＩエンドヌクレアーゼ、４．７μｌの１０×緩衝液Ｈ、および４０μｌのＰｍｅＩ消化したＥＷＬ２３０線状断片を含有する４７μｌ反応液中で２回目の消化を行なった。反応液を３７℃で３時間インキュベートした。次に、消化したＰＣＲ断片を１．２％Ｅ−ゲルを用いてゲル精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した（図１５７）。ＮｓｉＩ部位とＰｓｔＩ部位の互換性のある付着末端を用いて、８μｌのＭ．マゼイＭＶＫ挿入物、３μｌのＥＷＬ２３０プラスミド、１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、２μｌの１０×リガーゼ緩衝液、および６μｌのｄｄＨ２Ｏを含有する２０μｌのライゲーション反応液を調製した。このライゲーション混合物を１６℃で一晩インキュベートした。翌日、ペトリ皿のｄｄＨ２Ｏに０．０２５μｍニトロセルロース膜フィルターを浮かべ、このニトロセルロース膜フィルターの上にライゲーション混合物を室温で３０分間軽く適用することにより、ライゲーション混合物を脱塩した。ＭＣＭ４４６細胞を対数増殖期中期までＬＢ中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。細胞懸濁液のアリコート５０μｌを、５μｌの脱塩ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ  ｍＭＶＫライゲーションミックスと混合した。細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２ｍｍキュベット中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加し、その後、金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブに移した。３０℃で２時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／μｌカルベニシリン＋５ｍＭ  メバロン酸プレート上で選択し、３０℃でインキュベートした。翌日、６個の形質転換体を選び、５ｍｌのＬＢ＋５０μｇ／μｌカルベニシリンチューブ中、３０℃で一晩増殖させた。ＱＩＡｑｕｉｃｋスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、終夜培養物に対してプラスミドプレップを行なった。プラスミド増殖にＢＬ２１細胞を用いたため、高品質のプラスミドＤＮＡを得るための標準的な製造元のプロトコルに、スピンカラムをＰＢ緩衝液で５回、ＰＥ緩衝液で３回洗浄するという変更を組み入れた。プラスミドを、２０μｌ反応液中のＰｓｔＩで消化して、正しいサイズの線状断片を保証した。６つのプラスミドのうち３つはサイズが正しく、プライマーのＭＣＭ６５、ＭＣＭ６６、ＥＬ１０００、ＥＬ１００３、およびＥＬ１００６（表２０）を用いるシークエンシングのためにＱｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに送った。ＤＮＡシークエンシングの結果から、３つのプラスミド全てが正しいことが示された。１つのプラスミドを選び、プラスミドＥＷＬ２４４と命名した（図１５８、１５９Ａ〜Ｂ；配列番号４５）。
【０６９９】
（ｖ）ＭＣＭ３７６−Ｍ．マゼイ古細菌下流由来のＭＶＫを含むｐＥＴ２００Ｄの構築プラスミド
Ｍ．マゼイ古細菌下流経路オペロン由来のＭＶＫ  ＯＲＦ（図１６０Ａ〜Ｃ；配列番号４６）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＨｉＦｉ  ＰＣＲミックスを用い、プライマーのＭＣＭ１６１およびＭＣＭ１６２（表）を用いてＰＣＲ増幅した。４５μＬのＰＣＲミックスを１μＬの鋳型、１μＬの各プライマー（１０μＭ）、および２μＬの水と合わせた。反応を次のようなサイクルで行なった。９４℃で２分；３０サイクルの９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および６８℃で１分１５秒；次に、７２℃で７分、そして、冷えるまで４℃。３μＬのこのＰＣＲ反応液を製造元のプロトコルに従ってＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐＥＴ２００Ｄプラスミドに連結した。３μＬのこのライゲーション液をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰ１０細胞に導入し、形質転換体をＬＡ／ｋａｎ５０上で選択した。形質転換体から得たプラスミドを単離し、挿入物をシークエンシングし、ＭＣＭ３７６を得た（図１６１Ａ〜Ｃ；配列番号４７）。
【０７００】
（ｖｉ）ＥＷＬ２５１株（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）の構築
ＭＣＭ３３１細胞（これは、出芽酵母メバロン酸キナーゼ、メバロン酸リン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、およびＩＰＰイソメラーゼをコードする染色体コンストラクトｇｉ１．２ＫＫＤｙＩを含有する）を対数増殖期中期までＬＢ中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。５０μｌの細胞懸濁液を１μｌのプラスミドＥＷＬ２４４混合した。細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２ｍｍキュベット中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加し、その後、金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブに移した。３０℃で２時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／μｌカルベニシリン＋５ｍＭ  メバロン酸プレート上で選択し、３７℃でインキュベートした。１つのコロニーを選択し、ＥＷＬ２５１株と命名した。
【０７０１】
（ｖｉｉ）ＥＷＬ２５６株（ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ，  ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ）の構築
ＥＷＬ２５１細胞を対数増殖期中期までＬＢ中で増殖させた後、氷冷滅菌水で３回洗浄した。５０μｌの細胞懸濁液を１μｌのプラスミドＭＣＭ８２（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳをコードする、ｐＣＬ  ＰｔｒｃＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ（別名「ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ」）を含む）と混合した。プラスミドｐＣＬ  Ｐｔｒｃ  Ｕｐｐｅｒ  Ｐａｔｈｗａｙは上記の実施例８に記載したように構築した。この細胞懸濁混合物を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒを用いて、２ｍｍキュベット中、２．５Ｖｏｌｔ、２５μＦｄでエレクトロポレートした。１ｍｌのＬＢをすぐに細胞に添加した。その後、細胞を金属のキャップの付いた１４ｍｌポリプロピレンチューブに移した。３０℃で２時間増殖させて、細胞を回復させておいた。形質転換体をＬＡ＋５０μｇ／μｌカルベニシリン＋５０μｇ／μｌスペクチノマイシンプレート上で選択し、３７℃でインキュベートした。１つのコロニーを選び、ＥＷＬ２５６株と命名した。
プライマー配列
【表２０】
0005448220.tif 000044
0005448220.tif 000045
（ｖｉｉｉ）ＲＭ１１１６０８−２株（Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃ  Ｐ．ａｌｂａ−ｍＭＶＫ、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ、ｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ）の構築
【０７０２】
複製プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）（Ｋ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ博士，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手）上のｙｂｈＥ遺伝子（大腸菌６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする）を構成的に発現する、イソプレンを産出するＢＬ２１株の大腸菌（ＥＷＬ２５６）を構築した。
【０７０３】
ＦＲＴに基づく組換えカセットと、Ｒｅｄ／ＥＴによる組込みおよび抗生物質のマーカーループアウト用のプラスミドをＧｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓ  ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。これらの材料を用いた処理を、Ｇｅｎｅ  Ｂｒｉｄｇｅｓのプロトコルに従って行なった。プライマーのＰｇｌ−Ｆ（配列番号１３９）およびＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ（配列番号１４０）を用い、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎキットを用いて、ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴ鋳型の耐性カセットを増幅した。ＰＣＲ反応液（最終容量５０μＬ）は、５μＬの緩衝液、１μＬの鋳型ＤＮＡ（Ｇｅｎｅ  ＢｒｉｄｇｅｓからのＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−Ｆ）、１０ｐｍｏｌの各プライマー、および１．５μＬの２５ｍＭ  ｄＮＴＰミックスを含んでおり、これをｄＨ２Ｏで５０μＬにした。反応を次のようなサイクルで行なった。１×２分、９５℃、次に、３０サイクルの（９５℃、３０秒；６３℃、３０秒；７２℃、３分）。
【０７０４】
得られたＰＣＲ産物をＱｉａＱｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、以下のように、ｐＲｅｄ−ＥＴリコンビナーゼ含有プラスミドを有するエレクトロコンピテントＭＧ１６５５細胞にエレクトロポレートした。ＯＤ６００が約０．６になるまで５ｍＬのＬブロス中、３０℃で増殖させることにより、細胞を調製した。リコンビナーゼを発現させるために４％アラビノースを添加して細胞を誘導し、３０℃で３０分間増殖させておき、その後、３７℃で３０分間増殖させた。細胞のアリコート１．５ｍＬを、氷冷ｄＨ２Ｏで３〜４回洗浄した。最終的な細胞ペレットを４０μＬの氷冷ｄＨ２Ｏに再懸濁し、２〜５μＬのＰＣＲ産物を添加した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｎｃ．）で、１ｍｍのギャップのキュベット中、１．３ｋＶでエレクトロポレーションを行なった。細胞を３０℃で１〜２時間回復させ、クロラムフェニコール（５μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上にプレーティングした。５つの形質転換体をＰＣＲで解析し、組込み部位に隣接するプライマー（２つのプライマーセット：ｐｇｌ＋４９  ｒｅｖおよび３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ；Ｂｏｔｔｏｍ  Ｐｇｂ２およびＴｏｐ  ＧＢ’ｓ  ＣＭＰ（９４６））を用いてシークエンシングした。正しい形質転換体を選択し、この株をＭＧ１６５５  ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰと命名した。
【０７０５】
ＭＧ１６５５  ＧＩ１．５−ｐｇｌ：：ＣＭＰの染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、ＦＲＴ−ＣＭＰ−ＦＲＴ−ＧＩ１．５−ｙｂｈＥコンストラクトを含有するＰＣＲ断片を生成させた。このコンストラクトを以下のようにｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）にクローニングした。この断片（ここでは、ＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌと呼ぶ）を、５’プライマーのＰｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ（配列番号１４１）および３’プライマーの３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ（配列番号１４２）を用いて増幅した。得られた断片を、製造元が提案するようにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＯＰＯ−Ｂｌｕｎｔクローニングキットを用いてプラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯにクローニングした。ＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌ断片を有するＮｓｉＩ断片をｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）のＰｓｔＩ部位にクローニングした。５μｌのＣＭＰ−ＧＩ１．５−ｐｇｌ挿入物、２μｌのｐＢＢＲ１ＭＣＳ５（ゲンタマイシン）ベクター、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、２μｌの１０×リガーゼ緩衝液、および１０μｌのｄｄＨ２Ｏを含有する２０μｌのライゲーション液を調製した。このライゲーション混合物を室温で４０分間インキュベートした後、２〜４μＬを、上で開示したパラメータを用いてエレクトロコンピテントＴｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にエレクトロポレートした。形質転換体を１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび５μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＬ寒天上で選択した。上記のいくつかのプライマーならびにＳｅｑｕｅｔｅｃｈ，ＣＡによって提供された自社製のＴ３プライマーおよびリバースプライマーを用いて、選択されたクローンの配列を決定した。このプラスミドをｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌ（図１６２、１６３Ａ〜Ｂおよび配列番号４８）と命名した。
【０７０６】
プラスミドｐＢＢＲＣＭＰＧＩ１．５−ｐｇｌを上記のようにＥＷＬ２５６にエレクトロポレートし、形質転換体をクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）、ゲンタマイシン（５μｇ／ｍＬ）、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、およびカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬ寒天上にプレーティングした。１つの形質転換体を選択し、ＲＭ１１１６０８−２株と命名した。
プライマー：
Ｐｇｌ−Ｆ
［化８０］
５’−ａｃｃｇｃｃａａａａｇｃｇａｃｔａａｔｔｔｔａｇｃｔｇｔｔａｃａｇｔｃａｇｔｔｇａａｔｔａａｃｃｃｔｃａｃｔａａａｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃ−３’（配列番号１３９）
［化８１］
ＰｇｌＧＩ１．５−Ｒ
５’−ｇｃｔｇｇｃｇａｔａｔａａａｃｔｇｔｔｔｇｃｔｔｃａｔｇａａｔｇｃｔｃｃｔｔｔｇｇｇｔｔａｃｃｔｃｃｇｇｇａａａｃｇｃｇｇｔｔｇａｔｔｔｇｔｔｔａｇｔｇｇｔｔｇａａｔｔａｔｔｔｇｃｔｃａｇｇａｔｇｔｇｇｃａｔａｇｔｃａａｇｇｇｃｇｔｇａｃｇｇｃｔｃｇｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｃｇａｇ−３’（配列番号１４０）
３’ＥｃｏＲＶ−ｐｇｌｓｔｏｐ：
［化８２］
５’−ＣＴＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＴＡ  ＧＴＧ  ＴＧＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ（配列番号１４２）
［化８３］
ｐｇｌ＋４９  ｒｅｖ：ＣＧＴＧＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＡＧ（配列番号１３６）
［化８４］
Ｂｏｔｔｏｍ  Ｐｇｂ２：ＧＧＴＴＴＡＧＴＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号１３５）
［化８５］
Ｔｏｐ  ＧＢ’ｓ  ＣＭＰ（９４６）：ＡＣＴＧＡＡＡＣＧＴＴＴＴＣＡＴＣＧＣＴＣ（配列番号９２）
Ｐｇｌｃｏｎｆｉｒｍ−Ｆ
［化８６］
５’−ａｃｃｇｃｃａａａａｇｃｇａｃｔａａｔｔｔｔａｇｃｔ−３’（配列番号１４１）
【０７０７】
実施例２４：大腸菌におけるｙｂｈＥ（ｐｇｌ）の構成的発現によるイソプレン産出の改善
この実施例は、野生型レベルでｙｂｈＥを発現する対照株（すなわち、ＥＷＬ２５６）と比べた、大腸菌ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を構成的に発現する株におけるイソプレンの産出を示す。遺伝子ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）は、異種発現されたタンパク質の翻訳後グルコニル化を抑制し、産物の溶解度と収率を改善すると同時に、バイオマスの収率とペントースリン酸経路への流量を改善する大腸菌６−ホスホグルコノラクトナーゼをコードする。（Ａｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７４（４）：９５０−９５８，２００８）。
【０７０８】
ｉ）小規模解析
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４  １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３．２ｇ、酵母抽出物１ｇ、１０００×微量金属溶液１ｍｌ。全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。水酸化アンモニウム（３０％）を用いてｐＨを６．８に調整し、全量に合わせた。培地を０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。グルコース５．０ｇおよび抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０７０９】
１０００×微量金属溶液（発酵培地１リットル当たり）：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にｄｉＨ２Ｏに溶解させる。ｐＨをＨＣｌ／ＮａＯＨで３．０に調整した後、溶液を全量に合わせ、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌する。
【０７１０】
（ａ）実験手順
ＭｉｃｒｏＲｅａｃｔｏｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ製のＣｅｌｌｅｒａｔｏｒ（商標）で株を増殖させることにより、イソプレン産出を分析した。各々２４ウェル中のワーキング容量は４．５ｍＬであった。温度は３０℃で維持され、ｐＨ定値は７．０であり、酸素流量定値は２０ｓｃｃｍであり、撹拌速度は８００ｒｐｍであった。凍結バイアルから採取した大腸菌株の種菌をＬＢブロス寒天プレート（抗生物質を含む）上にストリークし、３０℃でインキュベートした。単一コロニーを抗生物質を含む培地に植菌し、一晩増殖させた。５５０ｎｍで測定して光学密度が０．０５に達するように、細菌を抗生物質を含む４．５ｍＬの培地に希釈した。
【０７１１】
ガスクロマトグラフ−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるヘッドスペースアッセイを用いて、イソプレンのオフガス分析を行なった。サンプル調製は次のようにした。１００μＬの全ブロスを密封ＧＣバイアルに入れ、３０℃で３０分という一定時間インキュベートした。７０℃で５分間のインキュベーションからなる熱不活化工程の後、サンプルをＧＣに投入した。
【０７１２】
実行中にマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を用いて波長５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を得た。イソプレン濃度（μｇ／Ｌ）をこのＯＤ測定値と時間（時間）で割って比生産性を得た。
【０７１３】
２００および４００μＭのＩＰＴＧ誘導レベルで、２つの株、ＥＷＬ２５６およびＲＭ１１６０８−２を評価した。誘導後１、２．５、４．７５、および８時間でのイソプレン産出および細胞増殖（ＯＤ５５０）について、サンプルを分析した。サンプルは２つ１組で作製した。
【０７１４】
（ｂ）結果
２つの異なるＩＰＴＧ濃度で、ｙｂｈＥ（ｐｇｌ）を発現する株は、対照株と比べて劇的に２〜３倍イソプレン比生産性を増加させることが実験により示された。
【０７１５】
Ｃｍ−ＧＩ１．２−ＫＫＤｙＩ、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼ、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼ、およびｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＲＭ１１１６０８−２）を発現し、１５Ｌスケールのフェドバッチ培養で増殖させた大腸菌からのイソプレン発酵
培地レシピ（発酵培地１リットル当たり）：Ｋ２ＨＰＯ４  ７．５ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、酵母抽出物０．５ｇ、１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。これらの成分を全て一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させた。この溶液をオートクレーブした。ｐＨを水酸化アンモニウム（３０％）で７．０に調整し、適量を加えて全量とした。グルコース１０ｇ、チアミン＊ＨＣｌ  ０．１ｇ、および抗生物質を、滅菌およびｐＨ調整の後に添加した。
【０７１６】
１０００×改変微量金属溶液：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。各成分を一度にＤｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にし、次に、適量を加えて全量とし、０．２２ミクロンフィルターで濾過滅菌した。
【０７１７】
上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｇｉ１．２ＫＫＤｙＩ）と、高発現のＭ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼおよびウラジロハコヤナギ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）と、高発現の大腸菌ｐｇｌ（ｐＢＢＲ−ｐｇｌ）とを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵（ｐＨ７．０および温度３４℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。大腸菌株の凍結バイアルを解凍し、トリプトン−酵母抽出物培地に植菌した。５５０ｎｍで測定して、種菌がＯＤ１．０にまで増殖した後、５００ｍＬを用いて１５Ｌバイオリアクターに植菌し、初期容量を５Ｌにした。
【０７１８】
細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。４０時間（５９時間）の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は３．１ｋｇ（５９時間で４．２ｋｇ）であった。ＩＰＴＧを添加して誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）が４という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１１０μＭにした。ＯＤ５５０が１５０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１９２μＭに上昇させた。バイオリアクター内の経時的なＯＤ５５０プロファイルを図１６４Ａに示す。バイオリアクターからのオフガス中のイソプレンレベルをＨｉｄｅｎ質量分析計を用いて測定した。イソプレン力価は、発酵の間に、４０時間で最大値３３．２ｇ／Ｌ（５９時間で最大値４８．６ｇ／Ｌ）まで増加した（図１６４Ｂ）。イソプレン力価は、発酵の間に、４０時間で最大値４０．０ｇ／Ｌ（５９時間で最大値６０．５ｇ／Ｌ）まで増加した（図１６４Ｃ）。４０時間（５９時間）の発酵の間に産出されたイソプレンの総量は、２８１．３ｇ（５９時間で４５１．０ｇ）であった。産出の時間経過を図１６４Ｄに示す。容積生産性の時間経過を図１６４Ｅに示す。これは、１．０ｇ／Ｌ／時間という平均速度が０〜４０時間の間（１９〜５９時間では１．４ｇ／Ｌ／時間）に維持されたことを示す。ＣＥＲで測定された場合の代謝活性プロファイルを図１６４Ｆに示す。発酵の時にイソプレン産出に回った利用炭素のモル収率は、４０時間で１９．６％であった（５９時間で（２３．６％）。グルコースからのイソプレンの重量パーセント収率は、４０時間で８．９％（５９時間で１０．７％）であった。
【０７１９】
実施例２５：Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼと、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼと、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳ）とｙｂｈＥ（ｐｇｌ）とを発現する大腸菌株におけるイソプレンと水素の共産出
発酵オフガスの回収ならびに発酵オフガスの水素レベルおよびイソプレンレベルの分析
ＲＭ１１１６０８−２株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ、ｐＢＢＲ  ｃｍＲ−ｇｉ１．５−ｐｇｌ）およびＥＷＬ  ２５６株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）を用いて発酵を行なった。細菌株の構築は上の実施例２３に記載されている。
【０７２０】
大腸菌からのイソプレンの大量産出を、Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼと、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼと、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳ）と、構成的に発現するｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＲＭ１１１６０８−２）または正常に発現するｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＥＷＬ２５６）のいずれかとを発現する大腸菌株のＥＷＬ２５６およびＲＭ１１１６０８−２のフェドバッチ培養から決定した。この実験により、グルコースの存在下で細胞を増殖させると、イソプレンと水素の共産出が生じたことが示されている。
【０７２１】
ＴＭ２発酵培地１リットル当たりの発酵培地（ＴＭ２）のレシピは次の通りであった。Ｋ２ＨＰＯ４  １３．６ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、クエン酸一水和物２ｇ、クエン酸第二鉄アンモニウム０．３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３．２ｇ、酵母抽出物５ｇ、１０００×改変微量金属溶液１ｍｌ。１０００×改変微量金属溶液：クエン酸＊Ｈ２Ｏ  ４０ｇ、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ  ３０ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ  １ｇ、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３  １００ｍｇ、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ  １００ｍｇ。１０００×改変微量金属溶液の場合、各成分を一度にＤｉＨ２Ｏに溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨでｐＨを３．０にした後、蒸留水中で最終容量に合わせ、０．２２ミクロン（μｍ）フィルターで滅菌濾過する（この溶液はオートクレーブしない）。ＴＭ２発酵培地の場合、全ての成分を一緒に添加し、ｄｉＨ２Ｏに溶解させ、水酸化カリウム（ＫＯＨ）でｐＨを６．８に調整し、適量を加えて全量とし、培地を０．２２ミクロン（μｍ）フィルターで濾過滅菌した。グルコースは、９９ＤＥ（デキストロース当量）の７１％ＤＳ（乾燥固体）シロップとしてＣａｒｇｉｌｌから供給された。
【０７２２】
上流メバロン酸（ＭＶＡ）経路（ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ）と、組み込まれた下流ＭＶＡ経路（ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ）と、Ｍ．マゼイ由来のメバロン酸キナーゼと、ウラジロハコヤナギ由来のイソプレンシンターゼ（ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）と、構成的に発現するｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＲＭ１１１６０８−２）または正常に発現するｙｂｈＥ（ｐｇｌ）（ＥＷＬ２５６）とを含有する大腸菌株のＥＷＬ２５６またはＲＭ１１１６０８−２を含む１５Ｌバイオリアクター中で発酵を行なった。この実験は、所望の発酵条件（ｐＨ７．０および温度３４℃）におけるグルコースからのイソプレン形成をモニタリングするために行なわれた。
【０７２３】
凍結バイアルから採取された適当な大腸菌株の種菌をペプトン−酵母抽出物培地中に調製した。種菌がＯＤ５５０＝０．６まで増殖した後、６００ｍＬを用いて、ＴＭ２培地を含有する１５Ｌバイオリアクターに植菌した。細胞が定常期に達するまで、グルコースを指数関数的割合で供給した。定常期以降、代謝要求量を満足させるようにグルコース供給を減らした。６７時間の発酵の間にバイオリアクターに送達されたグルコースの総量は、３．９ｋｇであった。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して、誘導を達成した。５５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５５０）が９という値に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１０２μＭにした。ＯＤ５５０が１４０に達したとき、ＩＰＴＧ濃度を１９２μＭに上昇させた。植菌後の様々な時点で、サンプルを取り出し、産出されたイソプレンの量を以下のように測定した。バイオリアクターからのオフガス中の水素、窒素、酸素、二酸化炭素、およびイソプレンのレベルを、以下に論じるように、Ｈｉｄｅｎ  ＨＰＲ−２０質量分析計を用いて測定した。
【０７２４】
１５Ｌバイオリアクターからの発酵オフガスのサンプルを、１Ｌオフガス／分で１０秒間、バイアルに放出することにより、２０ｍＬガラスヘッドスペースバイアル中に回収し、テフロンコートしたセプタム（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＣＡ）が付いた金属スクリューキャップで密封した。このバイアルを回収から３０分以内に分析した。
【０７２５】
質量分析計の注入チューブをキャップしていないヘッドスペースバイアルに１〜２分間入れることによって４ｓｃｃ／分（４ｍＬ／分）の速度でＨｉｄｅｎ  ＨＰＲ−２０質量分析計（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｓｔｉｃ，Ｕ．Ｋ．）に注入することにより、２つのサンプルの分析を行なった。ＨＰＲ−２０装置は、水素（ｍ／ｚ  ２）、窒素（ｍ／ｚ  ２８）、酸素（ｍ／ｚ  ３２）、二酸化炭素（ｍ／ｚ  ４４）およびイソプレン（ｍ／ｚ  ６７）に対応する質量をスキャンするように構成された。質量２８、３２、４４および６７にはＦａｒａｄａｙ検出器を用いた。水素（ｍ／ｚ  ２）にはＳＥＭ検出器を用いた。検出器応答を任意単位の圧力（Ｔｏｒｒ）として測定した。絶対水素レベルを信頼のおける水素ガス標準との比較により推定した。ＭＡＳｓｏｆｔ  Ｖ  ６．２１．０．５１ソフトウェア（Ｈｉｄｅｎ  Ａｎａｌｙｓｔｉｃ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を用いて結果を記録した。
【０７２６】
結果
オフガスサンプルを２つの発酵操作から採取し、上記のように分析した。
【０７２７】
Ａ）ＲＭ１１１６０８−２株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ、ｐＢＢＲ  ｃｍＲ−ｇｉ１．５−ｐｇｌ）。サンプルは６４．８時間でｒｕｎに取り込まれたが、その間、発酵は、窒素放出１ｖｖｍで嫌気的に行なわれていた。
【０７２８】
Ｂ）ＥＷＬ２５６株（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ）。サンプルは、３４．５時間でに取り込まれたが、その間、発酵は、空気放出１ｖｖｍで好気的行なわれていた。
【０７２９】
結果を図１６５Ａ〜Ｂに示す。両方の場合において、イソプレン、酸素および二酸化炭素の他に、低レベルの水素を検出した。水素のベースライン測定値は０．９５×１０−８トールであった。サンプルＡとＢは両方とも、約１．３×１０−８トールという測定値を与えた。水素標準との比較を基にすると、サンプルＡとＢのオフガス中に存在する水素の量は、１０ｐｐｍｖ（容積百万分率）未満であると推定されたが、ベースラインを上回っていた。図１６５Ａ〜Ｂに示すように、サンプルＡとＢは両方とも、かなりの量のイソプレンと二酸化炭素も含んでいた。
【０７３０】
実施例２６：Ｍ．マゼイメバロン酸キナーゼと、ウラジロハコヤナギイソプレンシンターゼと、ｐＣＬ  Ｕｐｐｅｒ  ＭＶＡ（Ｅ．フェカーリスのｍｖａＥおよびｍｖａＳ）とｙｂｈＥ（ｐｇｌ）とを発現する大腸菌株におけるイソプレンと水素の共産出
発酵オフガスの回収ならびに発酵オフガスの水素レベルおよびイソプレンレベルの分析
この実験の目的は、人為操作した大腸菌株において水素とイソプレンを共産出させることである。この目的のために、上記のように調製される大腸菌ヒドロゲナーゼ−３を発現するｈｙｃオペロンの一部をＥＷＬ２５６株［ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫ］で発現させるが、ＲＭ１１１６０８−２などの、上記の細菌株のどれかを同じように改変することができる。ｈｙｃオペロン遺伝子のｈｙｃＢ（ｇｉ｜１６１３０６３１）、ｈｙｃＣ（ｇｉ｜１６１３０６３０）、ｈｙｃＤ（ｇｉ｜１６１３０６２９）、ｈｙｃＥ（ｇｉ｜１６１３０６２８）、ｈｙｃＦ（ｇｉ｜１６１３０６２７）、およびｈｙｃＧ（ｇｉ｜１６１３０６２６）を含む発現コンストラクトを、公けに利用可能な遺伝子配列に基づいて当該技術分野で公知の標準的なクローニング方法で調製し、ＥＷＬ２５６株に導入して、新しいＥＷＬ２５６＋Ｈｙｄ−３株を作製する。
【０７３１】
さらなる突然変異が水素とイソプレンの共産出に与える影響を単独でまたはヒドロゲナーゼ−３の成熟もしくは調節に関与する遺伝子（例えば、ｈｙｃＨ（ｇｉ｜１６１３０６２５）およびｈｙｃＩ（ｇｉ｜１６１３０６２４））を導入することによって、水素取込みもしくは輸送に関与する遺伝子（例えば、大腸菌ヒドロゲナーゼ−１（ｈｙａオペロン）およびヒドロゲナーゼ−２（ｈｙｂオペロン））もしくは関連タンパク質（例えば、ギ酸デヒドロゲナーゼ（ｆｄｈＦ（ｇｉ｜１６１３０６２４））、ギ酸リアーゼのリプレッサー（ｈｙｃＡ（ｇｉ｜１６１３０６３２））、ギ酸デヒドロゲナーゼＮ、αサブユニット（ｆｄｎＧ（ｇｉ｜１６１２９４３３））、ギ酸デヒドロゲナーゼＯ、大サブユニット（ｆｄｏＧ（ｇｉ｜１６１３１７３４））、硝酸レダクターゼ（ｎａｒＧ（ｇｉ｜１６１２９１８７））、フマル酸レダクターゼ調節因子（ｆｎｒ（ｇｉ｜１６１２９２９５））、およびアセチル−補酵素Ａシンセターゼ（ａｃｓ（ｇｉ｜１６１３１８９５）））を不活化もしくは欠失させることによって、ヒドロゲナーゼの上方調節に関与する遺伝子（例えば、ギ酸水素リアーゼの活性化因子（ｆｈｌＡ（ｇｉ｜１６１３０６３８））を活性化することによって、発酵副産物の産出に関与する遺伝子（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ（ｇｉ｜１６１２９３４１））、フマル酸レダクターゼ膜タンパク質（ｆｒｄＣ（ｇｉ｜１６１３１９７７））、アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｄｈＥ（ｇｉ｜１６１２９２０２））、ピルビン酸オキシダーゼ（ｐｏｘＢ（ｇｉ｜１６１２８８３９））、ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１成分ａｃｋＡ／ｐｔａ（ａｃｅＥ（ｇｉ｜１６１２８１０７））、ギ酸デヒドロゲナーゼ調節タンパク質（ｈｙｃＡ（ｇｉ｜１６１３０６３２  ））、およびギ酸輸送体ＡおよびＢ（ＦｏｃＡ（ｇｉ｜１６１２８８７１）ならびにＦｏｃＢ（ｇｉ｜１６１３０４１７））を不活化もしくは欠失させることによって、または水素代謝に関与する異種遺伝子（例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼｆｒｏｍ  クロストリジウム・アセトブツリクム（ｇａｐＣ（ｇｉ｜１５８９３９９７））を発現させることによって、ＥＷＬ２５６＋Ｈｙｄ−３と組み合わせて評価した。
【０７３２】
本質的に上記の実施例２５に記載したように、単独でまたは組み合わせて、上記のような１以上の追加の突然変異を含むように改変された、ＥＷＬ２５６＋Ｈｙｄ−３株（ＢＬ２１（ＤＥ３）、ｐＣＬ  ｕｐｐｅｒ、ｃｍＲ−ｇｉ１．２−ｙＫＫＤｙＩ、ｐＴｒｃＡｌｂａ−ｍＭＶＫおよびｈｙｃＢ−Ｆ）という人為操作した変異体を用いて発酵を行なう。水素とイソプレンの共産出を、本質的に上に記載したように、オフガスサンプルの分析によって評価する。株をイソプレンと水素の共産出の速度に基づくさらなる分析用に選択する。
【０７３３】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通に理解されるものである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本発明で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。記載された特定の方法、プロトコル、および試薬は様々に異なり得るので、本発明は、これらに限定されるものではないことが理解されるべきである。また、当業者であれば、本発明を実施または試験するために、本明細書に記載された方法および材料と同様または同等の任意の方法および材料を用いることができることも理解するであろう。
【０７３４】
実施例２７：上流または上流および下流メバロン酸経路＋クズイソプレンシンターゼを含む大腸菌ｆａｄＲ  ａｔｏＣＬＳ５２１８内の脂肪酸またはパーム油由来のイソプレンまたはメバロナートの産出。
大腸菌ｆａｄＲ  ａｔｏＣ菌株ＬＳ５２１８（番号６９６６）をＣｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋセンターから得た。ＦａｄＲは脂肪酸分解酵素をコードする遺伝子発現を負制御する転写リプレッサーをコードする（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８３：  ５９８２−５９９０，  ２００１）。ＡｔｏＣは、ＡｔｏＳがアセト乳酸代謝を調節する２成分調節系における反応調節因子である。ｆａｄＲ  ａｔｏＣ菌株は脂肪酸分解遺伝子を構造的に発現させ、長鎖脂肪酸を長鎖ポリヒドロキシアルカノエートに組み込む。パーム油をメバロナートまたはイソプレン産出のいずれかのための炭素源として使用する場合、パーム油をグリセロール＋脂肪酸に変換する。この方法は当該技術分野で周知であり、それは、リパーゼ（例えばブタ膵リパーゼ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａリパーゼ、または他の類似しているリパーゼ）とのインキュベーションにより酵素的に、または塩基、例えば、水酸化ナトリウムとの鹸化により化学的に行なうことができる。
【０７３５】
ｉ）上流メバロン酸経路を発現する大腸菌ｆａｄＲ  ａｔｏＣ菌株
標準的な方法を用いてｐＣＬＰｔｒｃ  ＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙをＬＳ５２１８中に電気穿孔して菌株ＷＷ４を作製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版編集，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８９）。炭素源としてＣ１２脂肪酸（ＦＡ）またはパーム油のいずれかで補充したＴＭ３培地内で細胞培養時、メバロン酸（ＭＶＡ）の産出によりプラスミド挿入が示された。脂肪酸からのＷＷ４によるＭＶＡ産出を示すため、０．２５％のＣ１２  ＦＡ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ９７５５）で補充した５ｍＬの修飾ＴＭ３培地（酵母抽出物を含まないＴＭ３）内で一晩培養した細胞を１〜１００希釈した。ＭＶＡ産出の最初の兆候（２４ｍｇ／Ｌ）は、ＩＰＴＧ誘発培養で３０℃で一晩インキュベーション後に明らかであった。産出は３日間にわたり増加し、最終レベル１９４ｍｇ／ＬのＭＶＡを産出した。油からのＷＷ４によるＭＶＡ産出を示すため、一晩培養した細胞を、２００ｍｇの消化したパーム油／５ｍＬのＴＭ３培地で補充した修飾ＴＭ３培地内で１〜１００希釈した。ＭＶＡ産出の最初の兆候（５０ｍｇ／Ｌ）は、ＩＰＴＧ誘発培養で３０℃で一晩インキュベーション後に明らかであった。産出は３日間にわたり増加し、最終レベル５００ｍｇ／ＬのＭＶＡを産出した。
【０７３６】
ｉｉ）上流および下流ＭＶＡ経路＋クズイソプレンシンターゼを発現する大腸菌ｆａｄＲ  ａｔｏＣ菌株
大腸菌菌株ＷＷ４（ＬＳ５２１８  ｆａｄＲ  ａｔｏＣ  ｐＣＬＰｔｒｃ  ＵｐｐｅｒＰａｔｈｗａｙ）をｐＭＣＭ１１８［ｐＴｒｃＫＫＤｙＩｋＩＳ］と変換してＷＷ１０を得た。ＴＭ３およびグルコース内で菌株を培養してＩＰＴＧ（１００、３００、または９００μＭ）で誘発時のイソプレン産出の証拠によりプラスミド挿入が示された。菌株はＩＰＴＧに比較的感受性であり、１００μＭのＩＰＴＧでさえ有意な増殖欠損を示した。これらの結果を図７０Ａに示す。
【０７３７】
ドデカン酸からのイソプレン産出を試験するため、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬブロス内でＷＷ１０を２００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で一晩培養した。この培地とそれらの元々の培養容積内で遠心分離および再懸濁することにより、細胞を修飾ＴＭ３培地で洗浄した。この出発培養から洗浄および再懸濁した細胞を、０．１２５％のＣ１２脂肪酸（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ９７５５）を含む５ｍＬの修飾ＴＭ３培地内で１〜１００および１〜１０希釈した。
【０７３８】
パーム油からのメバロナートの産出を示すため、油をリパーゼで３７℃、２５０ｒｐｍで数日間前消化して脂肪酸を放出させた（加水分解の証拠は管を撹拌時に形成される発泡体により判断した）。
【０７３９】
加えて、培養を、パーム油と試験管内に含まれる修飾ＴＭ３培地内で洗浄した細胞により１〜１０希釈して調整した。残り（２．５ｍＬ）の洗浄した細胞に０．１２５％のＣ１２ＦＡをそれ以上希釈（生物変換）せずに添加してさらなる管を調整した。２５０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で３．７５時間増殖後、５０μＭのＩＰＴＧを添加して全ての培養物を誘発した。インキュベーションを４時間継続後、各培養物２００μＬのイソプレン蓄積について、修飾ヘッドスペースアッセイでアッセイした（５００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で１時間蓄積）。追加のイソプレンアッセイを、ＧＣＭＳ分析の前にアッセイガラスブロックの１２時間のインキュベーションにより実施した。誘発した培養物のインキュベーションを一晩継続して、翌朝、アリコート２００μＬのイソプレン産出について再びアッセイした（１時間、３０ｄｅｇ、５００ｒｐｍ  Ｓｈｅｌ−Ｌａｂ振盪機）。これらの培養の分析は、有意なレベルのイソプレン産出を示した。最高レベルのイソプレンは、一晩インキュベートおよび誘発後に一晩の出発培養物から１／１０希釈で播種した培養に観察された。この結果は、この培養が増殖し続けて細胞密度が増加したことを示唆する。これらの結果を図７０Ｂに示す。脂肪酸懸濁液は混濁していたため、細胞密度を直接測定することはできなかった。そのためこの培養の細胞密度は培養のアリコートをプレートすることにより測定し、８×１０７コロニー形成単位が示された。これは約ＯＤ６００  ０．１に相当する。それにも関わらず、この培養物は有意なイソプレン産出を提供した；この実施例に記載の経路のない類似している菌株において、イソプレンは観察されない。
【０７４０】
実施例２８：Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ植物からのイソプレンシンターゼ発現。
イソプレンシンターゼクズ遺伝子をプラスミドｐＪ２０１：１９８１３から得た。プラスミドｐＪ２０１：１９８１３はＰｕｅｒａｉａ  ｌｏｂａｔａ（クズ植物）からイソプレンシンターゼをコードし、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍのためにコドン最適化した（図７９Ａ〜７９Ｃ（配列番号１２３））。
制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩのプラスミドｐＪ２０１：１９８１３を消化し、遺伝子ｉｓｏ１９８１３を分離し、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−Ｅ．ｃｏｌｉシャトルベクターｐＵＷＬ２０１ＰＷ内にライゲーションした。（Ｄｏｕｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２６４：  ４７７−４８５，  ２０００；図７１）、ｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏを産出した。ｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏの制限分析により成功的なクローニングを確認した。イソプレンシンターゼｉｓｏ１９８１３発現は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ種において構成的に発現させるが大腸菌において発現させないｅｒｍプロモーターの制限下にあった。
【０７４１】
Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  ｉｎｎｅｓ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  Ｎｏｒｗｉｃｈ，  １９８５に記載の原形質体の形質転換によりＰＵＷＬ２０１ＰＷ（挿入なし）およびｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏをＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ  Ｊ１０７４（Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ９：５１９−５３１，  ２００２）に導入した。
【０７４２】
原形質体懸濁液のアリコート２００μｌを１．９μｇのｐＵＷＬ２０１ＰＷまたは２．９μｇのｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏで形質転換させた。非選択的Ｒ５−寒天プレート上で２８℃で一晩インキュベーション後、陽性形質転換体をチオストレプトン（２５０μｇ／ｍｌ）を含むＲ３−オーバーレイ寒天内でさらに４日間インキュベーションして選択した。プラスミドＭｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたプラスミド調製により、チオストレプトン耐性形質転換体のｐＵＷＬ−プラスミドの存在を評価した。調製したプラスミドＤＮＡを大腸菌ＤＨ５α内で再導入して制限分析により分析するための十分な量のプラスミドＤＮＡを生成した。陽性形質転換体をアンピシリン含有Ｌ寒天プレート上で選択して、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼでのプラスミドＤＮＡの消化により挿入分析を行なった。イソプレンシンターゼを陽性ｐＵＷＬ２０１イソクローン中で１．７ｋｂ断片として同定した一方、対照菌株（ｐＵＷＬ２０１ＰＷ）内ではこのような断片は観察されなかった。
【０７４３】
対照プラスミドｐＵＷＬ２０１ＰＷまたはｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏをコードするイソプレンシンターゼを含むＳ．ａｌｂｕｓの野生型菌株および形質転換体のイソプレン形成について分析した。菌株を固体培地（トリプシン大豆ブロス寒天、ＴＳＢ；２．５ｍｌ）上、チオストレプトン（２００μｇ／ｍｌ）の存在または不在下で反復培養し、密閉ヘッドスペースバイアル（総容積２０ｍｌ）内で２８℃で４日間インキュベートした。５００μｌのヘッドスペース試料（評価項目測定）をＳＩＭモード内でＧＣ−ＭＳにより分析し、基準保持時間および分子質量（６７ｍ／ｚ）に応じてイソプレンを同定した。先に作成した較正曲線によってヘッドスペース試料中に存在するイソプレンを定量化した。野生型Ｓ．ａｌｂｕｓおよびｐＵＷＬ２０１ＰＷを内部に持つ対照菌株はイソプレンを検出限界よりわずかに高い濃度（０．０４〜０．０７ｐｐｍ）で産出した一方、ｐＵＷＬ２０１＿ｉｓｏを内部に持つＳ．ａｌｂｕｓはイソプレンを対照と比べて少なくとも１０倍多く（０．７５ｐｐｍ；図７２）産出した。この結果は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ群の原核生物内の植物由来イソプレンシンターゼの成功的な発現を示す。
【０７４４】
実施例２９：Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）の回収
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）を、活性炭へ吸着させてからオフライン蒸気の脱離および凝結により液体Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）を得る、発酵オフガス流からイソプレンをストリッピングすることに関与する２つの工程操作における一連の４つの１４−Ｌスケールの発酵から回収した（図１６６Ａおよび１６６Ｂ）。４つの発酵槽に産出されたＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）の総量は１１５０ｇ（１６．９ｍｏｌ）であり、このうち９５３ｇ（１４ｍｏｌ、８３％）を炭素フィルターにより吸着した。蒸気の脱離／凝結工程後、回収した液体Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）量は８１０ｇであり、これは全回収率の７０％相当である。回収したＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）中の不純物の存在について分析した。
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）液体の分析および不純物プロファイル
【０７４５】
回収したＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）液体をＧＣ／ＭＳおよびガスクロマトグラフィー／水素炎イオン化検出（ＧＣ／ＦＩＤ）により分析して、不純物の性質およびレベルを決定した。産物は純度９９．５％超であり、多くの少量成分に加えていくつかの優勢な不純物を含んでいることが測定された。ＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを図１６７に示し、典型的レベルの不純物を表２１に示す。不純物プロファイルは、このスケールで産出した他のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）バッチに類似していた。
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）のいくつかのバッチに見られる不純物の性質およびレベルの概要。
【表２１】
0005448220.tif 000046
0005448220.tif 000047
【０７４６】
吸着材処理によるＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）の精製
吸着材は、炭化水素供給原料からの微量不純物の除去のための産業により広範囲に使用されている。適切な吸着材としては、ゼオライト、アルミナおよびシリカベース材料が挙げられる。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）は、シリカゲルに通過させることにより、少ない範囲のアルミナで実質的に精製できる。図１６８に、処理前（Ａ）ならびにアルミナ処理後（Ｂ）もしくはシリカ処理後（Ｃ）のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）試料のＧＣ／ＦＩＤクロマトグラムを示す。ＢＡＳＦからのＳｅｌｅｘｓｏｒｂ（商標）吸着産物は、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）からの極性不純物の除去のための選択の吸着材の１つである。具体的には、イソプレンおよびブタジエン供給原料からの極性不純物の除去において実績のある用途を考慮すると、Ｓｅｌｅｘｓｏｒｂ  ＣＤおよびＣＤＸ産物が好ましい。
【０７４７】
実施例３０：Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）の化学的変換
Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ  （ＷＩ，  ＵＳＡ）から受けとった化学物質および溶媒を使用した。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）は、イソプレンシンターゼおよび異種メバロン酸（ＭＶＡ）イソプレン前駆体生合成経路を発現する大腸菌ＢＬ２１菌株の発酵により産出された。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅを活性炭へ吸着させて発酵オフガスから回収してから、蒸気を脱離および凝結させて粗液体Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅを得た。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅは使用直前に分別蒸留により精製した。
【０７４８】
１Ｈ  ＮＭＲ分析
プロトン（１Ｈ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルをＶａｒｉａｎ  ＶＮＭＲＳ  ５００ＭＨｚ  ＮＭＲシステム上で記録した。特に断りのない限り、テトラメチルシラン（ＴＭＳ、０ｐｐｍ）またはクロロホルム（ＣＨＣｌ３、７，２６ｐｐｍ）を全てのＮＭＲスペクトルの基準とし、ピーク周波数はｐｐｍで記録する。試料は重水素化クロロホルム（ＣＤＣｌ３）またはメタノール（ＣＤ３ＯＤ）のいずれかで測定した。
【０７４９】
ＧＣ／ＭＳ分析
ヘッドスペースモードで操作するＣＴＣ  ａｌｙｓｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）  ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーを接続したＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ／ＭＳシステムを用いて分析を行なった。分析物の分離にはＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ−５ＭＳ  ＧＣ／ＭＳカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ；０．２５μｍ膜厚）を用いた。１０μＬ液体シリンジから１μＬの液体試料を注入するようにオートサンプラーを設定する。ＧＣ／ＭＳ法では、キャリアガスとして１ｍｌ／分の流量でヘリウムを用いた。注入口を２５０℃に保ち、分割比を１００：１とする。オーブンプログラムを５０℃２分間から開始し、２５℃／分の速度で２２５℃に上昇させてから１分間保ち、総実行時間１０分とした。ｍ／ｚ  ２９〜５００でのスキャンモードでＡｇｉｌｅｎｔ  ５７９３Ｎ質量選択検出器を操作した。１．５分の溶媒遅延化を用いた。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、０．６７５分で溶出することが観察された。
【０７５０】
ＧＣ／ＦＩＤ分析
液体モードで操作するＣＴＣ  ａｌｙｓｔｉｃｓ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）  ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーを接続したＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ＧＣ／ＦＩＤシステムを用いて分析を行なった。分析物の分離にはアジレントＤＢ−石油ＧＣカラム（１００ｍ×０．２５ｍｍ；０．５０μｍ膜厚）を用いた。１０μＬ液体シリンジから１μＬの液体試料を注入するようにオートサンプラーを設定する。ＧＣ／ＦＩＤ方法には、ヘリウムを担体ガスとして流速１ｍＬ／分で用いた。注射ポートを分割比５０：１で２００℃に保った。オーブンプログラムを５０℃１５分間から開始し、２５℃／分の速度で２５０℃に上昇させてから１０分間保ち、総実行時間３３分とした。ＦＩＤ検出器を定常補給モードで、水素流３５ｍＬ／分および空気流２５０ｍＬ／分で２８０℃で保った。これらの条件下で、イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、１３．５４分で溶出することが観察された。
【０７５１】
Ｉ．熱ディールス・アルダー環付加を介した環状イソプレン二量体の調製
イソプレン（１．０２ｇ、０．０１５モル）を熱ポリマー化の阻害剤として、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール（０．１６５ｇ、０．０５モル）作用の存在下、１５０℃で２４時間加熱した。反応前に真空オーブン内で２４時間乾燥させた密閉ガラス製厚壁反応容器内で反応を実施した。磁気撹拌子を用いて反応混合物を撹拌した。マススペクトルメータ検出器（ＧＣ−ＭＳ）でガスクロマトグラフィーにより反応進行をモニタリングした。反応完了後、ヘキサンを溶出剤としたシリカゲルクロマトグラフィーを用いて、生成した異性体混合物を精製した。回転真空蒸発器上で濃縮した後、生成物をＧＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲにより分析した。ＧＣ−ＭＳ：生成物Ａ：５．１７、５．１９分；生成物Ｂ：５．７２、５．７４分；生成物Ｃ：６．１１分。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：５．８（ｍ）；５．４（ｍ）；４．９５（ｍ）；２．４−１．２（ｍ）。
【０７５２】
ＩＩ．Ｐｄ触媒オリゴマー化を介したイソプレンオリゴマーの調製
密閉ガラス製厚壁反応容器内でイソプレン（２．０３ｇ、０．０３モル）をイソプロパノール（１．７９ｇ、０．０３モル）と混合した。反応前にガラス製チャンバーを真空オーブン内で２４時間乾燥させた。試薬は全て不活性窒素大気下で移した。パラジウムアセチルアセトネート（０．５５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（１．４９ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。次いで磁気撹拌子を介して混合しながら反応チャンバーを１００℃に２４時間加熱した。反応過程をＧＣ−ＭＳにより分析した。反応完了後、ヘキサンを溶出剤として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより生成物を単離した。最終生成物をＧＣ−ＭＳおよび１Ｈ−ＮＭＲ分光学により分析した。ＧＣ−ＭＳ：生成物Ａ：５．５４分；生成物Ｂ：６．６分；生成物Ｃ：６．８５分。
【０７５３】
ＩＩＩ．不飽和化合物の水素化
磁気撹拌子を備えて、水素化触媒（Ｐｄ／Ｃ、５重量％）（０．２１ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を含むガラス製チャンバーに実施例２において得られた異性体の混合物（１．３６ｇ、０．０１ｍｏｌｅ）を入れる。ガラス器具は全て、実験操作前に真空乾燥する。水素ガスを系に導入して、圧力を３ａｔｍで保つ。数時間後、反応混合物Ｐｄ／Ｃを反応混合物から濾過し、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて生成物を分離する。最終分析は、ＧＣ−ＭＳおよびＮＭＲを用いて行なう。
【０７５４】
ＩＶ．イソプレンのエトキシル化誘導体の調製
磁気撹拌子を備えたガラス製厚壁チャンバー内でイソプレン（０．９８２ｇ、０．０１４モル）を無水エタノール（０．６６５ｇ、０．０１４ｍｏｌ）と混合した。触媒量の濃硫酸を反応混合物に添加してから、８５℃で一晩撹拌した。反応進行をＧＣ−ＭＳによりモニタリングした。１６時間加熱後、ＧＣ−ＭＳトレースにより以下の保持時間の異性体の混合物の存在を明らかにした：生成物Ａ：２．６６分ｍ／ｚ＋＝９９；生成物Ｂ：３．８８ｍ／ｚ＋＝９９，１１４；生成物Ｃ：５．４１分、ｍ／ｚ＋＝８７，９９，１１４。
Ｖ．ルテニウム触媒を用いたイソプレンのＣ１０環状二量体への変換
【化８７】
0005448220.tif 000048
【０７５５】
イソプレンのＣ１０環状二量体への変換はジメチル−シクロオクタジエン混合物へのルテニウム触媒を用いて優れた収率で達成されている（Ｉｔｏｈ，  Ｋｅｎｊｉ；  Ｍａｓｕｄａ，  Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；  Ｆｕｋａｈｏｒｉ，  Ｔａｋａｈｉｋｏ；  Ｎａｋａｎｏ，  Ｋａｔｓｕｍａｓａ；  Ａｏｋｉ，  Ｋａｔｓｕｙｕｋｉ；  Ｎａｇａｓｈｉｍａ，  Ｈｉｄｅｏ，  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  （１９９４），  １３（３），  １０２０−９）。非常に温和な温度（６０℃ほどの低さ）で９５％超の変換が報告されている。この触媒、ペンタメチルシクロペンタジエニルに基づくルテニウム有機金属化合物は、ルテニウムクロライド（ＲｕＣｌ３）およびペンタメチルシクロペンタジエン（Ｃ５Ｍｅ５Ｈ）を出発材料として用いて２つの容易な工程において調製できる。二量体化反応において、触媒は銀トリフレート（ＡｇＯＴｆ）で活性化されて活性種を産出するが、他の活性化因子も同様に使用できる。
ＶＩ．クロム触媒を用いたイソプレンのＣ１５三量体への変換
【化８８】
0005448220.tif 000049
【０７５６】
イソプレンのＣ１５三量体への変換は、Ｐ−Ｎ−Ｐリガンド、Ｎ，Ｎ−ビス（ジアリールホスフィノ）アミンとクロム触媒を用いて実行できる。触媒は、ｉｎ  ｓｉｔｕ調製し、Ｂｏｗｅｎ，  Ｌ．；  Ｃｈａｒｅｒｎｓｕｋ，  Ｍ．；  Ｗａｓｓ，  Ｄ．Ｆ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （２００７）  ２８３５−２８３７に記載されているようにＭＡＯを用いて活性化する。線状産物と環状産物の混合物（３：１）からなるイソプレンのＣ１５三量体への変換が中温（７０℃）で高い（９５％ほど）ことが報告されている。どの場合においても、４量体は大部分の他の産物として同定される。
【０７５７】
ＶＩＩ．イソプレンの水素化
Ｈ−ｃｕｂｅ水素化機器（ＴｈａｌｅｓＮａｎｏ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  ＮＪ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、イソプレン（１０％無水エタノール（ｖ／ｖ）溶液１０ｍＬ）を連続式に２−メチルブタン（イソペンタン）に水素化した。イソプレン溶液は７０℃で保った１０％Ｐｄ／Ｃ触媒カートリッジを介して０．５ｍＬ／分でポンプした。１ａｔｍ気圧で「完全モード」を用いて水素ガスを誘発した。産物を回収して、１Ｈ  ＮＭＲおよびＧＣ／ＦＩＤにより分析し、これによりイソプレンが２−メチルブタンへ変換し（収率９０％超）、少量がモノ−オレフィンに一部水素化したことを確認した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：δ０．８（ｍ、９Ｈ、ＣＨ３）；１．１２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）；１．３７（ｍ、１Ｈ、ＣＨ）。ＧＣ／ＦＩＤ：２−メチルブタン；保持時間＝１２．６９分。
【０７５８】
ＶＩＩＩ．イソプレンの一部水素化
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物（５０ｍＬ、０．５ｍｏｌ）をトルエン（２００ｍＬ）と混合し、Ｍｉｄｉ−Ｃｕｂｅ水素化機器（ＴｈａｌｅｓＮａｎｏ，  Ｂｕｄａｐｅｓｔ，  Ｈｕｎｇａｒｙ）上、４０℃および５ｂａｒ水素圧で５％のＰｄ／Ｃ触媒上で一部水素化した。基質流速は１０ｍＬ／分であり、水素は１２５ｍＬ／分（５ｍｍｏｌ／分）で送達された。機器を介して産物ストリームを２時間再利用後、産物のアリコートをＧＣ／ＭＳおよびＧＣ／ＦＩＤにより分析したところ、イソペンタンおよび一部の未反応イソプレンに加えて、出発材料の大部分はイソアミレン（２−メチル−１−ブテン、２−メチル−２−ブテンおよび３−メチル−１−ブテン）の混合物に変換されたことが示された（図１７０）。
【０７５９】
ＩＸ．Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物の選択的水素化
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物は、卵殻Ｐｄ／δ−Ａｌ２Ｏ３触媒を用いて上の例に引用された条件下で選択的に水素化し、２−メチル−２−ブテンが総イソアミレンの５０％超の割合を占める優勢な産物であり、３−メチル−１−ブテンが総イソアミレン産物の２５％未満の割合を占める少量の産物であることがＧＣ／ＭＳ分析により測定されたイソアミレンの混合物を得る。イソペンタンと残存イソプレンの量は総産物ストリームの１０％未満の割合を占める。炭素触媒上で硫化パラジウムを用いて反応を実施した場合、類似した結果が得られる。
【０７６０】
Ｘ．気相中のＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物の部分的な水素化
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物を含む乾燥ガスストリームをわずかに過剰の水素ガス（ｍｏｌ／ｍｏｌ）と混合し、ガス状混合物を不均一な水素化触媒、例えば、米国特許第２００９０２０３５２０号に記載されている高間隙容積でＩＢ族促進パラジウム触媒に通し、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物を得た発酵プロセスから得られた１以上の不純物とイソアミレンの混合物を産出する。変換は、０．５〜２００ｂａｒ範囲の圧力、および０℃〜２００℃の温度で実行する。
【０７６１】
ＸＩ．固体酸触媒でのイソアミレンの二量体化
２−メチル−２−ブテン（１．５ｍＬ）およびトルエン（４ｍＬ）をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５酸樹脂（１８６ｍｇ）と室温で１２時間撹拌した。アリコート（５００μｌ）を反応混合物から取り出し、ＧＣバイアルに移した。混合物の分析をＧＣ／ＭＳにより実施し（図１７１）、ＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）成分として適切なＣ１０二量体（ジイソアミレン）への部分的な変換を明らかにした。
【０７６２】
二量体化反応の産物（ジイソアミレン、Ｃ１０ダイメート）は実施例３０、第ＶＩＩ部に記載の条件下で、または当該技術分野で公知であるオレフィンのイソパラフィンへの水素化条件［例えば、Ｍａｒｉｃｈｏｎｎａ  （２００１）を参照されたい］を介して任意選択的に完全に水素化する。
ＸＩＩ．固体酸触媒でのＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物のオリゴマー化
【化８９】
0005448220.tif 000050
【０７６３】
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）単量体、２−メチル−２−ブテン（１．５ｍＬ）とトルエン（４ｍＬ）の混合物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５酸樹脂（１８６ｍｇ）と室温で１２時間撹拌した。アリコート（５００μｌ）を反応混合物から取り出し、ＧＣバイアルに移した。混合物の分析をＧＣ／ＭＳにより実施し（図１７２）、イソプレン、線状、環状および芳香族Ｃ１０、Ｃ１５およびより高いオリゴマーからなる産物の複合混合物を明らかにした。
【０７６４】
ＸＩＩＩ．固体酸触媒でのＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）産物の連続オリゴマー化
Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）単量体は、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂または等価触媒を含む二量体化リアクター内でＣ１０二量体とＣ１５三量体に連続的に変換する。Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）供給ストリームは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）単量体ならびに任意選択的にＢｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ（商標）および共溶媒のＣ５誘導体を含む。本プロセスは、２０〜２００℃の温度範囲および０．５〜２００ｂａｒ圧で行なう。二量体化工程の産物は、第１の分別カラム中で画分化して、未反応イソプレンをより高い（Ｃ５超）オリゴマーから分離する。Ｃ５画分は、二量体化リアクターに戻し、Ｃ５より重い画分を第２の分別カラムに導入し、ここで所望のＣ１０／Ｃ１５画分を頭上ストリームから回収する。Ｃ１５超のオリゴマーからなる底画分を、転換触媒、例えば、第２世代グラブスメタセシス触媒を含む重再利用リアクター内に供給する。図１７３に示すとおり、メタセシス触媒は、より高いオリゴマー画分部分をオレフィン交差メタセシスによってより軽い成分に変換してから反応物を分別カラム番号１に供給した。
【０７６５】
全体として、本プロセスは、Ｂｉｏｉｓｏｐｒｅｎｅ単量体のＣ１０二量体およびＣ１５三量体ＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）前駆体への変換に至り、これは次いで実施例３０、第ＶＩＩ部に記載の部分的または完全な水素化条件下に供する。生成した部分的または完全飽和化合物は、ＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）組成物としておよびＢｉｏＩｓｏＦｕｅｌ（商標）混合ストックとして適切である。
【０７６６】
実施例３１  １３Ｃ／１２Ｃ同位体分析
１３Ｃ分析は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｌｕｓ  ＸＰ同位体比マススペクトロメータのための入り口としてＣｏｓｔｅｃｈ  ＥＣＳ４０１０  Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ分析器を用いて、０．５〜１．０ｍｇ試料を炭素同位体の分析用の錫のカップに入れることにより行なうことができる。試料は１０２０℃で酸化第一コバルト/酸化第二コバルト燃焼反応器へ落ち、燃焼ガスは８５ｍL/分のヘリウム流の中で銅反応器（６５０℃）を通り、ＮＯｘはＮ２となる。ＣＯ２とＮ２は、３−ｍ  ５Åモレキュラーシーブカラムを用いて分離する。次いで、Ｔ．  Ｂ．  Ｃｏｐｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｅｗ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  δ１３Ｃ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ，  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ７８，  ２４３９−２４４１  （２００６）の２つの標準的なアプローチを用いてオフライン燃焼および二重吸気分析によりＶＰＤＢ尺度に慎重に較正されている２つの実験室標準（Ａｃｅｔａｎｉｌｉｄｅ  Ｂ、−２９．５２±０．０２‰ｍおよびトウモロコシデンプンＡ、−１１．０１±０．０２‰）を用いて１３Ｃ／１２Ｃ比をＶＰＤＢ尺度に較正する。Ｃｏｐｌｅｎの教示は、δ１３Ｃ値測定技術を教示する目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【０７６７】
米国仮特許出願第６１／１３３，５２１号（２００８年６月３０日出願）およびＷＯ２０１０／０５５２５Ａ１号は、供給溶液のδ１３Ｃ値および様々な源（表２２に掲載したものを含む）から得られるイソプレンのポリマーについて掲載している。
【表２２】
0005448220.tif 000051
【０７６８】
実施例３２−例示的な燃料特性
表２３は、本明細書に記載の方法を用いてイソプレンから作製できるある化合物の燃料特性を掲載する。
【表２３】
0005448220.tif 000052
0005448220.tif 000053
【０７６９】
本明細書で提供する見出しは、本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。本発明の様々な態様または実施形態は、本明細書を全体として参照することによって捉えることができる。
【０７７０】
本明細書に引用されている刊行物、特許出願、および特許は全て、あたかも各々の個々の刊行物、特許出願、または特許が具体的かつ個別的に参照により組み込まれることが示されるように、参照により本明細書に組み込まれる。特に、本明細書に引用されている刊行物は全て、本発明に関連して使用し得る組成物および方法を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。上述の発明は、理解を明確にするために説明や例によってある程度詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく、本発明を種々変更および修正し得ることが当業者には明白となるであろう。
別表１
例示的な１−デオキシ−Ｄ−キシロース−５−リン酸シンターゼ核酸およびポリペプチド
0005448220.tif 000054
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005448220.tif 000079
【図３Ｃ】
0005448220.tif 000080
【図４】
0005448220.tif 000081
【図５Ａ】
0005448220.tif 000082
【図５Ｂ】
0005448220.tif 000083
【図５Ｃ】
0005448220.tif 000084
【図６】
0005448220.tif 000085
【図７Ａ】
0005448220.tif 000086
【図７Ｂ】
0005448220.tif 000087
【図７Ｃ】
0005448220.tif 000088
【図８Ａ】
0005448220.tif 000089
【図８Ｂ】
0005448220.tif 000090
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
0005448220.tif 000092
【図９Ａ】
0005448220.tif 000093
【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
0005448220.tif 000096
【図１０Ｃ】
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【図１１】
0005448220.tif 000098
【図１２Ａ】
0005448220.tif 000099
【図１２Ｂ】
0005448220.tif 000100
【図１２Ｃ】
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【図１３】
0005448220.tif 000102
【図１４】
0005448220.tif 000103
【図１５Ａ】
0005448220.tif 000104
【図１５Ｂ】
0005448220.tif 000105
【図１５Ｃ】
0005448220.tif 000106
【図１６】
0005448220.tif 000107
【図１７】
0005448220.tif 000108
【図１８Ａ１】
0005448220.tif 000109
【図１８Ａ２】
0005448220.tif 000110
【図１８Ｂ】
0005448220.tif 000111
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
0005448220.tif 000113
【図１８Ｅ】
0005448220.tif 000114
【図１８Ｆ】
0005448220.tif 000115
【図１９Ａ】
0005448220.tif 000116
【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
0005448220.tif 000118
【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
0005448220.tif 000122
【図２２Ｃ】
0005448220.tif 000123
【図２２Ｄ】
0005448220.tif 000124
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
0005448220.tif 000126
【図２３Ｃ】
0005448220.tif 000127
【図２３Ｄ】
0005448220.tif 000128
【図２３Ｅ】
0005448220.tif 000129
【図２３Ｆ】
0005448220.tif 000130
【図２３Ｇ】
0005448220.tif 000131
【図２３Ｈ】
0005448220.tif 000132
【図２４】
0005448220.tif 000133
【図２５Ａ】
0005448220.tif 000134
【図２５Ｂ】
0005448220.tif 000135
【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
0005448220.tif 000138
【図２７Ａ】
0005448220.tif 000139
【図２７Ｂ】
0005448220.tif 000140
【図２７Ｃ】
0005448220.tif 000141
【図２７Ｄ】
0005448220.tif 000142
【図２８】
0005448220.tif 000143
【図２９Ａ】
0005448220.tif 000144
【図２９Ｂ】
0005448220.tif 000145
【図２９Ｃ】
0005448220.tif 000146
【図２９Ｄ】
0005448220.tif 000147
【図３０】
0005448220.tif 000148
【図３１Ａ】
0005448220.tif 000149
【図３１Ｂ】
0005448220.tif 000150
【図３２】
0005448220.tif 000151
【図３３Ａ】
0005448220.tif 000152
【図３３Ｂ】
0005448220.tif 000153
【図３３Ｃ】
0005448220.tif 000154
【図３４】
0005448220.tif 000155
【図３５Ａ】
0005448220.tif 000156
【図３５Ｂ】
0005448220.tif 000157
【図３５Ｃ】
0005448220.tif 000158
【図３６】
0005448220.tif 000159
【図３７Ａ】
0005448220.tif 000160
【図３７Ｂ】
0005448220.tif 000161
【図３７Ｃ】
0005448220.tif 000162
【図３８】
0005448220.tif 000163
【図３９Ａ】
0005448220.tif 000164
【図３９Ｂ】
0005448220.tif 000165
【図３９Ｃ】
0005448220.tif 000166
【図４０】
0005448220.tif 000167
【図４１Ａ】
0005448220.tif 000168
【図４１Ｂ】
0005448220.tif 000169
【図４１Ｃ】
0005448220.tif 000170
【図４２】
0005448220.tif 000171
【図４３Ａ】
0005448220.tif 000172
【図４３Ｂ】
0005448220.tif 000173
【図４３Ｃ】
0005448220.tif 000174
【図４４】
0005448220.tif 000175
【図４５Ａ】
0005448220.tif 000176
【図４５Ｂ】
0005448220.tif 000177
【図４５Ｃ】
0005448220.tif 000178
【図４５Ｄ】
0005448220.tif 000179
【図４６Ａ】
0005448220.tif 000180
【図４６Ｂ】
0005448220.tif 000181
【図４６Ｃ】
0005448220.tif 000182
【図４６Ｄ】
0005448220.tif 000183
【図４６Ｅ】
0005448220.tif 000184
【図４７Ａ】
0005448220.tif 000185
【図４７Ｂ】
0005448220.tif 000186
【図４７Ｃ】
0005448220.tif 000187
【図４７Ｄ】
0005448220.tif 000188
【図４８Ａ】
0005448220.tif 000189
【図４８Ｂ】
0005448220.tif 000190
【図４８Ｃ】
0005448220.tif 000191
【図４９Ａ】
0005448220.tif 000192
【図４９Ｂ】
0005448220.tif 000193
【図４９Ｃ】
0005448220.tif 000194
【図５０】
0005448220.tif 000195
【図５１Ａ】
0005448220.tif 000196
【図５１Ｂ】
0005448220.tif 000197
【図５１Ｃ】
0005448220.tif 000198
【図５２】
0005448220.tif 000199
【図５３Ａ】
0005448220.tif 000200
【図５３Ｂ】
0005448220.tif 000201
【図５４】
0005448220.tif 000202
【図５５】
0005448220.tif 000203
【図５６】
0005448220.tif 000204
【図５７】
0005448220.tif 000205
【図５８】
0005448220.tif 000206
【図５９】
0005448220.tif 000207
【図６０Ａ】
0005448220.tif 000208
【図６０Ｂ】
0005448220.tif 000209
【図６０Ｃ】
0005448220.tif 000210
【図６１Ａ】
0005448220.tif 000211
【図６１Ｂ】
0005448220.tif 000212
【図６１Ｃ】
0005448220.tif 000213
【図６２Ａ】
0005448220.tif 000214
【図６２Ｂ】
0005448220.tif 000215
【図６２Ｃ】
0005448220.tif 000216
【図６３Ａ】
0005448220.tif 000217
【図６３Ｂ】
0005448220.tif 000218
【図６３Ｃ】
0005448220.tif 000219
【図６４Ａ】
0005448220.tif 000220
【図６４Ｂ】
0005448220.tif 000221
【図６４Ｃ】
0005448220.tif 000222
【図６５Ａ】
0005448220.tif 000223
【図６５Ｂ】
0005448220.tif 000224
【図６５Ｃ】
0005448220.tif 000225
【図６６Ａ】
0005448220.tif 000226
【図６６Ｂ】
0005448220.tif 000227
【図６６Ｃ】
0005448220.tif 000228
【図６７Ａ】
0005448220.tif 000229
【図６７Ｂ】
0005448220.tif 000230
【図６７Ｃ】
0005448220.tif 000231
【図６８】
0005448220.tif 000232
【図６９】
0005448220.tif 000233
【図７０】
0005448220.tif 000234
【図７１】
0005448220.tif 000235
【図７２】
0005448220.tif 000236
【図７３】
0005448220.tif 000237
【図７４】
0005448220.tif 000238
【図７５Ａ】
0005448220.tif 000239
【図７５Ｂ】
0005448220.tif 000240
【図７６Ａ】
0005448220.tif 000241
【図７６Ｂ】
0005448220.tif 000242
【図７７】
0005448220.tif 000243
【図７８Ａ】
0005448220.tif 000244
【図７８Ｂ】
0005448220.tif 000245
【図７８Ｃ】
0005448220.tif 000246
【図７９Ａ】
0005448220.tif 000247
【図７９Ｂ】
0005448220.tif 000248
【図７９Ｃ】
0005448220.tif 000249
【図８０Ａ】
0005448220.tif 000250
【図８０Ｂ】
0005448220.tif 000251
【図８１】
0005448220.tif 000252
【図８２】
0005448220.tif 000253
【図８３】
0005448220.tif 000254
【図８４】
0005448220.tif 000255
【図８５】
0005448220.tif 000256
【図８６Ａ】
0005448220.tif 000257
【図８６Ｂ】
0005448220.tif 000258
【図８７Ａ】
0005448220.tif 000259
【図８７Ｂ】
0005448220.tif 000260
【図８７Ｃ】
0005448220.tif 000261
【図８７Ｄ】
0005448220.tif 000262
【図８８Ａ】
0005448220.tif 000263
【図８８Ｂ】
0005448220.tif 000264
【図８９】
0005448220.tif 000265
【図９０】
0005448220.tif 000266
【図９１】
0005448220.tif 000267
【図９２Ａ】
0005448220.tif 000268
【図９２Ｂ】
0005448220.tif 000269
【図９２Ｃ】
0005448220.tif 000270
【図９３】
0005448220.tif 000271
【図９４】
0005448220.tif 000272
【図９５】
0005448220.tif 000273
【図９６】
0005448220.tif 000274
【図９７】
0005448220.tif 000275
【図９８】
0005448220.tif 000276
【図９９】
0005448220.tif 000277
【図１００】
0005448220.tif 000278
【図１０１】
0005448220.tif 000279
【図１０２】
0005448220.tif 000280
【図１０３Ａ】
0005448220.tif 000281
【図１０３Ｂ】
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【図１０３Ｃ】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８Ａ】
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【図１０８Ｂ】
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【図１０８Ｃ】
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【図１０９】
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【図１１０Ａ】
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【図１１０Ｂ】
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【図１１１Ａ】
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【図１１１Ｂ】
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【図１１１Ｃ】
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【図１１２Ａ】
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【図１１２Ｂ】
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【図１１２Ｃ】
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【図１１３Ａ】
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【図１１３Ｂ】
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【図１１３Ｃ】
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【図１１４Ａ】
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【図１１４Ｂ】
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【図１１４Ｃ】
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【図１１５Ａ】
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【図１１５Ｂ】
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【図１１５Ｃ】
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【図１１５Ｄ】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６】
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【図１３７Ａ】
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【図１３７Ｂ】
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【図１３７Ｃ】
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【図１３７Ｄ】
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【図１３７Ｅ】
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【図１３７Ｆ】
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【図１３７Ｇ】
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【図１３７Ｈ】
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【図１３７Ｉ】
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【図１３７Ｊ】
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【図１３７Ｋ】
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【図１３７Ｌ】
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【図１３７Ｍ】
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【図１３７Ｎ】
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【図１３７Ｏ】
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【図１３７Ｐ】
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【図１３７Ｑ】
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【図１３８】
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【図１３９】
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【図１４０】
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【図１４１】
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【図１４２Ａ】
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【図１４２Ｂ】
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【図１４２Ｃ】
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【図１４３】
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【図１４４Ａ】
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【図１４４Ｂ】
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【図１４５Ａ】
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【図１４５Ｂ】
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【図１４６Ａ】
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【図１４６Ｂ】
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【図１４６Ｃ】
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【図１４７Ａ】
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【図１４７Ｂ】
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【図１４７Ｃ】
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【図１４８】
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【図１４９】
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【図１５０】
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【図１５１】
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【図１５２】
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【図１５３Ａ】
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【図１５３Ｂ】
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【図１５４】
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【図１５５】
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【図１５６Ａ】
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【図１５６Ｂ】
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【図１５７】
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【図１５８】
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【図１５９Ａ】
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【図１５９Ｂ】
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【図１６０Ａ】
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【図１６０Ｂ】
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【図１６０Ｃ】
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【図１６１Ａ】
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【図１６１Ｂ】
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【図１６１Ｃ】
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【図１６２】
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【図１６３Ａ】
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【図１６３Ｂ】
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【図１６４Ａ】
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【図１６４Ｂ】
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【図１６４Ｃ】
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【図１６４Ｄ】
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【図１６４Ｅ】
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【図１６４Ｆ】
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【図１６５】
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【図１６６Ａ】
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【図１６６Ｂ】
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【図１６７】
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【図１６８】
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【図１６９】
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【図１７０】
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【図１７１】
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【図１７２】
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【図１７３】
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