(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体アッセイを実施するための組立体であって、
マイクロ流体チップであって、上面及び下面を有し、且つ
前記上面に形成される１つ又は複数のアクセスポート、
対応するアクセスポートから該マイクロ流体チップの少なくとも一部に延びる少なくとも１つのマイクロチャネルであって、各アクセスポートが対応するマイクロチャネルと連通することで前記アクセスポートに送り出される流体が前記対応するマイクロチャネルに流れ込むようになっている、少なくとも１つのマイクロチャネル、
該マイクロチャネル内に設けられたＤＮＡ増幅領域、及び
該マイクロチャネル内に設けられた解析領域、
を含む、マイクロ流体チップと、
流体を収容する２つ又は複数の内部チャンバ、及び前記対応するチャンバから流体を送り出すか又は該対応する内部チャンバに流体を送るように各内部チャンバに対応付けられる流体ノズルを有する、流体カートリッジであって、各流体ノズルは、前記マイクロ流体チップのアクセスポートに着脱可能に結合されることにより前記対応する内部チャンバから前記ノズルと着脱可能に結合される前記アクセスポートに流体を送り出すか、又は前記ノズルと着脱可能に結合される前記アクセスポートから前記対応する内部チャンバに流体を送るように構成される、流体カートリッジと、
を備える、マイクロ流体アッセイを実施するための組立体。
【請求項２】
前記カートリッジは、３つの内部チャンバ及び３つのノズルを含む、請求項１に記載の組立体。
【請求項３】
前記ノズル及び前記アクセスポートの少なくとも一方は、前記ノズルが前記マイクロ流体チップの前記アクセスポートと結合された後で前記ノズルを前記アクセスポートから分離することができないように、一方向ロッキング接続部を有する構成にされる、請求項１に記載の組立体。
【請求項４】
前記カートリッジは射出成形される、請求項１に記載の組立体。
【請求項５】
前記カートリッジは、ポリプロピレン、ポリカーボネート、及びポリスチレンから成る群より選択される材料から射出成形される、請求項４に記載の組立体。
【請求項６】
前記カートリッジ内の少なくとも１つの内部チャンバは、反応流体を収容する、請求項１に記載の組立体。
【請求項７】
前記反応流体は、ＤＮＡ試料材料、緩衝溶液、試薬、又は２つ以上の前記流体の混合物から成る流体の群より選択される流体である、請求項６に記載の組立体。
【請求項８】
前記試薬はＰＣＲプライマーを含む、請求項７に記載の組立体。
【請求項９】
前記マイクロ流体チップは、３行で配置される複数のアクセスポートを含む、請求項１に記載の組立体。
【請求項１０】
前記カートリッジは、前記３行のアクセスポートのうち３つの整列したアクセスポートの列と協働するように構成される３つのノズルを含む、請求項９に記載の組立体。
【請求項１１】
前記マイクロ流体チップは、該マイクロ流体チップの前記下面から延びる１つ又は複数のシッパチューブを含み、該シッパチューブのそれぞれは、少なくとも１つのマイクロチャネルと連通する、請求項１に記載の組立体。
【請求項１２】
前記マイクロ流体チップは、２つ以上のシッパチューブを含む、請求項１１に記載の組立体。
【請求項１３】
前記マイクロ流体チップは、少なくとも１つの真空ポートを含み、それぞれの真空ポートが少なくとも１つのマイクロチャネルと連通する、請求項１に記載の組立体。
【請求項１４】
各マイクロチャネルは、１つのアクセスポートから延び、異なるアクセスポートで終端するように構成される、請求項１に記載の組立体。
【請求項１５】
前記カートリッジは、ノズルと連通する真空ポートを含む、請求項１に記載の組立体。
【請求項１６】
前記カートリッジ内の少なくとも１つの内部チャンバは、前記少なくとも１つのマイクロチャネルからの反応流体を収容するように構成される廃棄物容器である、請求項１に記載の組立体。
【請求項１７】
前記マイクロ流体チップの前記マイクロチャネルは、Ｕ字形の構成を有する、請求項１に記載の組立体。
【請求項１８】
請求項１に記載の組立体に含まれるマイクロ流体チップと着脱可能に連結するように構成されるカートリッジデバイスであって、
送出ポートと流体連通する送出チャンバであって、該送出チャンバは反応流体を収容するように構成され、前記送出ポートはＤＮＡ増幅領域及び解析領域を含むマイクロ流体チップと着脱可能に連結するように構成される、送出チャンバと、
回収ポートと流体連通する回収チャンバであって、該回収チャンバは前記マイクロ流体チップから廃棄物を受け取るように構成され、前記回収ポートは前記マイクロ流体チップと着脱可能に連結するように構成される、回収チャンバと、
を備える、マイクロ流体チップと連結するように構成されるカートリッジデバイス。
【請求項１９】
前記カートリッジは使い捨てである、請求項１８に記載のカートリッジデバイス。
【請求項２０】
前記マイクロ流体チップは、該チップに試薬を吸引するシッパチューブを組み込む、請求項１８に記載のカートリッジデバイス。
【請求項２１】
請求項１に記載の組立体に含まれるマイクロ流体チップに着脱可能に連結するように構成されるカートリッジデバイスであって、
試薬送出ポートに接続される試薬送出チャンバと、
緩衝液送出ポートに接続される緩衝液送出チャンバと、
試料送出ポートに接続される試料送出チャンバと、
廃棄物回収ポートに接続される廃棄物回収チャンバと、
を備え、前記試薬送出ポート、前記緩衝液送出ポート、前記試料送出ポート、及び前記廃棄物回収ポートは、前記マイクロ流体チップと着脱可能に連結するように構成される、マイクロ流体チップに連結するように構成されるカートリッジデバイス。
【請求項２２】
前記カートリッジは使い捨てである、請求項２１に記載のカートリッジデバイス。
【請求項２３】
前記マイクロ流体チップは、該チップに試薬を吸引するシッパチューブを組み込む、請求項２１に記載のカートリッジデバイス。
【請求項２４】
前記マイクロ流体チップは、試薬、緩衝液、及び／又は試料の１つ又は複数が前記試薬送出チャンバ、前記緩衝液送出チャンバ、及び／又は前記試料送出チャンバから前記廃棄物回収チャンバに流れ込む際に通る１つ又は複数のマイクロチャネルを備える、請求項２１に記載のカートリッジデバイス。
【請求項２５】
負圧制御によって、ＤＮＡ試料がカートリッジを経て導入され、ＰＣＲ試薬が、マイクロウェルプレートに接続されるシッパチューブを通して導入されるようにする、請求項１に記載の組立体において用いられるＤＮＡ解析用途用のマイクロ流体チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体アッセイを実施するための容器に関する。より詳細には、本発明は、試料材料、及び任意にアッセイ試薬、緩衝液、及び廃棄物を収容するカートリッジであって、カートリッジ内に担持されている試料材料に対してリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応等のアッセイを内部で実施するマイクロチャネルを有するマイクロ流体チップに結合され得るカートリッジに関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、参照により本明細書に援用される２００６年９月６日に出願された米国仮出願第６０／８２４，６５４号の優先権を主張する。
【０００３】
核酸の検出は、医学、法科学、産業加工、動植物育種、及び多くの他の分野において中心的な役割を果たす。病状（例えば癌）、感染性微生物（例えばＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝子マーカー等を検出する能力は、疾患の診断及び予後診断、マーカー利用選抜、犯罪現場特徴の正確な特定、産業微生物を繁殖させる能力、及び多くの他の技法に関して広く普及している技術である。目的の核酸の全体的な判定は、感染症又は癌の病理学と関係があり得る。少量の核酸を検出するのに最も有力でありかつ基本的である技術の１つとして、核酸配列の一部又は全部を何度も複製してから増幅産物を解析する方法が挙げられる。ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）が、数ある種々の増幅技法のうちでおそらく最もよく知られている。
【０００４】
ＰＣＲは、短いＤＮＡ断片を増幅させるのに有力な技法である。ＰＣＲでは、１つの鋳型ＤＮＡ分子から開始して何百万ものＤＮＡコピーを迅速に生産することができる。ＰＣＲは、ＤＮＡを変性して一本鎖にし、変性した一本鎖にプライマーをアニーリングし、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によってプライマーを伸長させるという３段階温度サイクルを含む。このサイクルは、検出及び解析に十分なコピーが得られるまで繰り返される。原理上、各ＰＣＲサイクルごとにコピー数が２倍になり得る。しかし実際には、各サイクルにより達成される増幅が２倍となることはない。さらに、ＰＣＲサイクルが続くと、必要な反応物の濃度が減るにつれて増幅ＤＮＡ産物の増加は最終的に止まる。ＰＣＲに関する一般的な詳細に関しては、非特許文献１、非特許文献２、及び非特許文献３を参照されたい。
【０００５】
リアルタイムＰＣＲは、反応の進行と同時に共に増幅ＤＮＡ産物の増加を、通常はＰＣＲサイクルごとに１回、測定する、成長を続ける一連の技法を指す。経時的に産物の蓄積を監視することで、反応の効率を判定すると共にＤＮＡ鋳型分子の初期濃度を推定することができる。リアルタイムＰＣＲに関する一般的な詳細に関しては、非特許文献４を参照されたい。
【０００６】
増幅ＤＮＡの存在を示すいくつかの異なるリアルタイム検出ケミストリが現存している。これらの大半は、ＰＣＲプロセスの結果として特性が変化する蛍光指示薬に依存する。これらの検出ケミストリの中には、二本鎖ＤＮＡに結合すると蛍光収率を増加させるＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ等）がある。他のリアルタイム検出ケミストリは、色素の蛍光収率が別の光吸収部分又はクエンチャーに対する近さに大きく影響される結果として生じる現象である、フェルスター共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を利用する。これらの色素及びクエンチャーは通常、ＤＮＡ配列特異的プローブ又はプライマーに結合する。ＦＲＥＴベースの検出ケミストリとしては、加水分解プローブ及び立体配座プローブなどがある。加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ等）は、オリゴヌクレオチドプローブに結合したクエンチャー色素分子からレポーター色素分子を切断するためにポリメラーゼ酵素を用いる。立体配座プローブ（分子指標等）は、オリゴヌクレオチドに結合した色素を利用し、この色素は、標的ＤＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの立体配座変化に応じて蛍光発光が変わる。
【０００７】
本発明の譲受人に譲渡され、その開示が参照により本明細書に援用される「Real-Time PCR in Micro-Channels」と題する同時係属中の特許文献１には、マイクロチャネルを流れてフローマーカーとして知られている緩衝溶液等の非反応性流体の液滴によって互いに分離される別個の液滴内でＰＣＲを実施するプロセスが記載されている。
【０００８】
１つ又は複数のマイクロチャネルが内部に形成されているマイクロ流体チップを含むマイクロチャネル内でＰＣＲ等のインラインアッセイを実施するデバイスが、当該技術分野において既知である。これらのチップは、チップ上面の試料シッパチューブ（sipper tubes：吸引管）及び開放ポートを利用して、試薬及び試料材料（例えばＤＮＡ）を受け取ってチップ内のマイクロチャネルに送る。チッププラットフォームは、チップ上面の開放ポートにおいて通常はピペッタによって送り出される試薬を受け取るように設計され、試薬は、通常は各マイクロチャネルの反対端に加えられる真空の影響により開放ポートからマイクロチャネルに流れ込む。ＤＮＡ試料は、チップの下に延びているシッパチューブを経てマイクロウェルプレートのウェルからマイクロチャネルに供給され、マイクロチャネルに加えられる真空によって試料材料がシッパチューブを通してウェルから引き出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国出願第１１／５０５，３５８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Sambrook and Russell, Molecular Cloning−A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)
【非特許文献２】Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2005)
【非特許文献３】PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, M.A. Innis et al., eds., Academic Press Inc. San Diego, Calif. (1990)
【非特許文献４】Real-Time PCR: An Essential Guide, K. Edwards et al., eds., Horizon Bioscience, Norwich, U.K. (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この公知の設計は、汚染、つまり試料及びアッセイ間のクロスオーバーと、潜在的感染因子への研究室職員の暴露との両方を被りやすい。したがって、マイクロ流体アッセイを実施するための改良型容器が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、反応流体又は副産物を収容するか又は収容するようになっており、マイクロ流体チップに連結して、そのマイクロ流体チップ内で実施されるＤＮＡ解析試験及び他のアッセイに融通性及び使いやすさを与える、カートリッジの使用に関する。カートリッジは、ＤＮＡ試料を収容し、且つアッセイで用いるべき緩衝液及び／又は１つ又は複数の試薬をも含み得るが、更に「閉鎖系」マイクロ流体システムを可能にする廃棄物格納チャンバも含むことができるため、ＤＮＡ試料及び他の反応生成物が同じ試料収容カートリッジに戻ることにより、バイオハザード廃棄物管理を別個に行う必要がなくなる。患者試料がカートリッジを経てマイクロ流体チャネル（又はマイクロチャネル）に導入され、アッセイに特定のプローブ／プライマーが各試料液滴に導入されることで、インラインの連続ＰＣＲアッセイ処理の利点を維持しつつ、患者間の試料間キャリーオーバーがないことが確実になる。
【００１３】
本発明の態様は、マイクロ流体アッセイを実施するための組立体において具現され、この組立体は、マイクロ流体チップと、流体カートリッジとを備える。マイクロ流体チップは、上面及び下面を有し、且つ上面に形成される１つ又は複数のアクセスポート、及び対応するアクセスポートから延びてマイクロ流体チップの少なくとも一部を通る少なくとも１つのマイクロチャネルを含む。各アクセスポートが対応するマイクロチャネルと連通することでアクセスポートに送り出される流体が対応するマイクロチャネルに流れ込むようになっている。流体カートリッジは、流体を収容する１つ又は複数の内部チャンバ、及び対応するチャンバからの流体を送り出すか又は対応する内部チャンバに流体を送るように各内部チャンバに対応付けられる流体ノズルを有する。各流体ノズルは、マイクロ流体チップのアクセスポートに結合されることにより、対応する内部チャンバからノズルが結合しているアクセスポートに流体を送り出すか、又はノズルが結合しているアクセスポートから対応する内部チャンバに流体を送るように構成される。
【００１４】
他の実施の形態では、マイクロ流体チップと連結するように構成されるカートリッジデバイスが提供され、このカートリッジデバイスは、送出チャンバ及び回収チャンバを含む。送出チャンバは、送出ポートと流体連通しており、反応流体を収容するように構成される。送出ポートは、マイクロ流体チップと連結するように構成される。回収チャンバは、回収ポートと流体連通しており、マイクロ流体チップから廃棄物を受け取るように構成される。回収ポートも、マイクロ流体チップと連結するように構成される。
【００１５】
さらに他の実施の形態では、マイクロ流体チップと連結するように構成されるカートリッジデバイスが提供され、このカートリッジデバイスは、試薬送出ポートに接続される試薬送出チャンバ、緩衝液送出ポートに接続される緩衝液送出チャンバ、試料送出ポートに接続される試料送出チャンバ、及び廃棄物回収ポートに接続される廃棄物回収チャンバを備え、試薬送出ポート、緩衝液送出ポート、試料送出ポート、及び廃棄物回収ポートは、マイクロ流体チップと連結するように構成される。この実施の形態では、マイクロ流体チップは、試薬、緩衝液、及び／又は試料のうち１つ又は複数が試薬送出チャンバ、緩衝液送出チャンバ、及び／又は試料送出チャンバから送出される際、及び上記廃棄物回収チャンバに流れ込む際に通る１つ又は複数のマイクロチャネルを含む。
【００１６】
動作の方法及び構造の要素の機能及び相互関係を含む本発明の他の態様は、添付図面を参照して以下の説明及び添付の特許請求の範囲を検討すればより明確になるであろう。以下の説明、添付の特許請求の範囲、及び添付図面は全て、本開示の一部を成し、種々の図で同じ参照符号は対応の部分を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１ａ】カートリッジをマイクロ流体チップから分離して示す、本発明の態様を具現するマイクロ流体チップ及びカートリッジの一実施形態の斜視図である。
【図１ｂ】カートリッジをマイクロ流体チップに結合して示す、図１ａに示すマイクロ流体チップ及びカートリッジの斜視図である。
【図２ａ】マイクロウェルプレートの上に動作可能に位置決めされている、図１ｂに示すマイクロ流体チップ及びカートリッジ組立体の斜視図である。
【図２ｂ】マイクロウェルプレートの上に動作可能に位置決めされている、図１ｂに示すマイクロ流体チップ及びカートリッジ組立体の側面図である。
【図３】シッパチューブがマイクロウェルプレートのウェルと係合している、マイクロ流体チップのマイクロチャネル及びシッパチューブの概略図である。
【図４】マイクロチャネル内でのマイクロ流体アッセイ実施中の、マイクロチャネル内に収容されている反応流体の概略図である。
【図５】図２ａ及び図２ｂに示すようにマイクロウェルプレートと動作可能に配置されたマイクロ流体チップ及びカートリッジ組立体で実施されるマイクロ流体アッセイ中に実施されるステップを示すフローチャートである。
【図６】カートリッジをマイクロ流体チップに結合して示す、本発明の態様を具現するマイクロ流体チップ及びカートリッジの代替的な一実施形態の斜視図である。
【図７】マイクロチャネル及びマルチシッパ（multisipper）チップ構成の概略図である。
【図８】本発明の態様を具現するマイクロ流体チップ及びカートリッジの代替的な一実施形態のシッパレス（sipper-less）マイクロ流体チップのマイクロチャネルの概略図である。
【図９】本発明の態様を具現するシッパレスマイクロ流体チップ及びカートリッジの代替的な一実施形態の概略図である。
【図１０】図８又は図９に示すようなマイクロ流体チップ及びカートリッジ組立体で実施されるマイクロ流体アッセイ中に実施されるステップを示すフローチャートである。
【図１１】カートリッジをマイクロ流体チップに結合して示す、本発明の態様を具現するマイクロ流体チップ及び複数のカートリッジの代替的な一実施形態の斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の態様を具現するマイクロ流体チップ及び試薬カートリッジ構成の第１の実施形態を図１ａ及び図１ｂに示す。この構成は、マイクロ流体チップ４０に結合されているカートリッジ１０を含む。カートリッジ１０及びマイクロ流体チップ４０は、参照により本明細書に援用される特許文献１に記載されているようなインラインリアルタイムＰＣＲ等のアッセイを実施するシステムで用いることができる。
【００１９】
カートリッジ１０は、複数のノズル又は流出ポート１４、１６、１８が突出している本体部１２を含む。図示の実施形態は限定を意図するものではなく、カートリッジのノズルは、図示のような３つよりも多くても少なくてもよい。本体部１２内に、カートリッジ１０は対応するノズルと連通する内部チャンバ（図示せず）を含み、このようなチャンバは、マイクロ流体チップ４０内の対応するマイクロチャネルへ送出する又は対応するマイクロチャネルから除去する種々の流体を収容し得る。このような流体として、例えば、試料ＤＮＡ材料、アッセイに特定の試薬を含む緩衝液又は試薬、及び反応廃棄物、又は他の反応流体及び／又は副産物を挙げることができる。カートリッジ１０は、流体を内部チャンバに注入するために対応する内部チャンバと連通するポート２０、２２等の投入ポートをさらに含み得る。このようなポートは、流体がカートリッジに注入された後でポートを閉鎖するキャップを含むことが好ましい。キャップは、流体がキャップで塞がれたポートを通してチャンバから出るのを防止する一方で、チャンバからの流体の引き出し中に周囲大気圧と内部チャンバ圧との間の圧力を均等にするための通気を可能にする、何らかのタイプの疎水性ベントを含むことが好ましい。カートリッジ１０は、負圧（すなわち真空）源との接続用の真空ポート２４も含み得るが、負圧源は、流体、例えば反応廃棄物を真空ポート２４と連通する廃棄物チャンバにノズル１４、１６、又は１８の１つ又は複数を通して引き込むためのものである。
【００２０】
一実施形態では、カートリッジ１０は、ポリプロピレン、ポリカーボネート、又はポリスチレン等の適当な、好ましくは不活性の材料から射出成形される。カートリッジ１０は、流体格納用（すなわちチャンバ）、流体送出用、圧力制御用、及び試料調製用（図示せず）の内部設計特徴も含み得る。カートリッジは、他の適当な材料からも構成することができる。
【００２１】
内部チャンバのそれぞれの流体容量は、２０μＬ〜５ｍＬであり得るが、好ましくは５０μＬ〜１０００μＬ、最も好ましくは１００μＬ〜５００μＬである。当然ながら、他のチャンバ容積を用いることもできる。廃棄物区画室がカートリッジ設計に組み込まれる場合、これは、最大約５ｍＬ以上の容量を有し得る。
【００２２】
マイクロ流体チップ４０は、例えばアクセスポート４４、４６、及び４８等のアクセスポート行を有する本体４２を含む。アクセスポート４４、４６、４８と連通するマイクロチャネルが、マイクロ流体チップ４０を通って延びる。マイクロ流体チップ４０は、マイクロチャネルが形成されるマイクロチャネル部５０を含み、これは、より詳細に後述するように、マイクロチャネル内を流れる材料に対して種々のアッセイに関連した動作が実施される場所である。マイクロチャネル部５０は、ガラス又はプラスチック等の任意の適当な材料で作ることができる。マイクロチャネル部の一例は、本発明の譲受人に譲渡されており、参照により本明細書に援用される同時係属中の特許文献１に開示されている。
【００２３】
カートリッジ１０は、ノズル１４、１６、１８を行４４、４６、及び４８のうちの１つのアクセスポートの列と接続することによって、マイクロ流体チップ４０に結合される。ノズルとアクセスポートとの接続は、各ノズル１４、１６、１８と対応するアクセスポート４４、４６、４８との間の摩擦嵌めによって行うことができる。代替的に、接続は、カートリッジをマイクロ流体チップに取り付けることはできるが一度取り付けるとカートリッジをマイクロ流体チップから取り外すことができない、ルアーロック接続又は他の何らかのタイプの一方向ロッキング接続であり得る。
【００２４】
マイクロ流体チップ４０は、外部容器から流体（例えば試薬）を引き出すシッパチューブ５２を含み得る。図２ａ及び図２ｂに示すように、マイクロ流体チップ４０及びカートリッジ１０の構成は、複数の個別のウェル８２を有するマイクロウェルプレート８０の上に位置決めされ得る。マイクロ流体チップ４０及びマイクロウェルプレート８０が互いに対して（例えば、コンピュータ制御下でマイクロ流体チップ４０及び／又はマイクロウェルプレート８０を動かすロボットデバイスによって）動かされることにより、マイクロ流体チップの下に延びているシッパチューブ５２がウェル８２の選択された１つに入り、ウェルの内容物がシッパチューブ５２に引き込まれることでマイクロ流体チップ４０に引き込まれる。
【００２５】
図３は、マイクロ流体チップ４０に形成されているマイクロチャネル６２を概略的に示す。マイクロチャネル６２は、マイクロ流体チップ４０の行４８又は行４６（又は両方）のアクセスポートに対応し得る投入ポート７０を含み、これを通してカートリッジ１０からの流体がマイクロチャネルに注入される。この実施形態では、マイクロチャネル６２は、マイクロ流体チップ４０の行４４のアクセスポートに対応する出口（又は廃棄物）ポート７２も含み、これを通してマイクロチャネル６２からの材料がカートリッジ１０に注入される。シッパチューブ５２は、接合部６０によってマイクロチャネル６２に結合される。一実施形態では、マイクロ流体チップ４０のアクセスポートの行４４、４６、４８内のアクセスポート列毎に１つのマイクロチャネル６２が対応付けられる。したがって、図１ａに示す実施形態では、マイクロ流体チップ４０は、６つのアクセスポート列のそれぞれに１つずつ対応付けられる６つのマイクロチャネルを含む。
【００２６】
単一のシッパチューブ５２を有する一実施形態では、シッパチューブ５２は、接合部６０によってマイクロチャネル６２のそれぞれに結合されるため、シッパチューブ５２を通してマイクロ流体チップ４０に引き込まれた材料は、マイクロ流体チップ４０内に収容されているマイクロチャネルのそれぞれに分配される。図３に破線８０で表すように、マイクロ流体チップ４０及びマイクロウェルプレート８０は、シッパチューブ５２をマイクロウェルプレート８０の複数のウェル８２１、８２２、８２ｉ、のいずれか１つに入れることができるように、互いに対して動かされる。
【００２７】
一実施形態では、マイクロチャネル６２は、ポート７０及びシッパチューブ５２を経てマイクロチャネル６２に導入される材料を混合するための混合セクション６４を含む。混合セクション６４は、マイクロチャネルの蛇行セクション又はマイクロチャネルの内容物を混合する別の既知の手段を含み得る。他の実施形態では、マイクロチャネル６２は混合セクションを含まない。
【００２８】
さらに、マイクロチャネル６２は、マイクロ流体チップ４０のマイクロチャネル部５０内に位置付けられるインラインＰＣＲセクション６６及び解析セクション６８も含む。解析セクション６８は、反応材料に添加される色素の蛍光の検出等のマイクロチャネルの内容物の光学的解析、又は高分解能熱融解解析（high resolution thermal melting analysis）（ＨＲＴｍ）等の他の解析を実施するために設けられ得る。このようなインラインＰＣＲ及びマイクロ流体解析は、参照により本明細書に援用される特許文献１に記載されている。一実施形態では、マイクロチャネル６２は、マイクロ流体チップ４０内でＵターンしてカートリッジ１０に戻るため、インラインＰＣＲ及び解析の最後に出口ポート７２を通してカートリッジ１０内の廃棄物チャンバに反応生成物を注入することができる。他の実施形態では、マイクロチャネルに関して他の構成も用いることができる。
【００２９】
本発明の構成は、複数の連続アッセイを実施するために用いることができ、それによって、マイクロチャネル内に収容されているＤＮＡ又は他の試料材料の液滴内で別個のアッセイが実施される。連続的に配置される液滴は、異なるＰＣＲプライマー又はアッセイに特定の他の試薬を収容することができ、フローマーカーとして知られている非反応性材料の液滴によって互いに分離させることができる。単一のマイクロチャネル内で複数の別個のアッセイを実施するこのような技法は、本発明の譲受人に譲渡された同時係属中の特許文献１にも記載されている。
【００３０】
図４は、一実施形態によるＤＮＡ又は他の試料材料の別個の液滴内で複数の別個のアッセイが実施されるマイクロチャネルの内容物を概略的に示す。図４を参照して、マイクロチャネルの左から右へ移動している流体について図内で右から左に見ていくと、参照符号１０８は、マイクロチャネルのプライミングを行うようにマイクロチャネルに最初に注入されるプライミング流体を表す。プライミング流体が加えられた後で、ＰＣＲプライマーと混合された対照試料を含有する（例えば、既知のＤＮＡ及び／又は既知のＤＮＡ濃度を含む試料を含有する）液滴又はボーラス１０４が、マイクロチャネルに注入される。対照液滴１０４は、フローマーカー流体１０６の液滴によってプライミング流体１０８から分離される。フローマーカー１０６は、例えば緩衝溶液等の非反応性流体を含み得る。参照符号１００及び９８は、第１の試料液滴及び第ｎの試料液滴をそれぞれ表す。各試料液滴は、通常は約８ナノリットルの容積を有し、２ナノリットル〜５０ナノリットルの容積を有することができ、各液滴内でアッセイを実施してその結果を解析するために特定のＰＣＲプライマー又はアッセイに特定の他の試薬と組み合わせられる一定量のＤＮＡ又は他の試料材料を含む。液滴９８〜１００のそれぞれが、フローマーカーによって互いに分離される。図４に示すように、対照液滴１０４は、フローマーカー１０２によって試料液滴１００から分離される。参照符号９４は、ＰＣＲプライマー又はアッセイに特定の他の試薬と組み合わせられる第２の対照試料を含む第２の対照液滴を含む。対照液滴９４は、フローマーカー９６によって第ｎの試験液滴９８から分離される。
【００３１】
図４は、試験液滴９８〜１００の前後にそれぞれ位置決めされる対照液滴１０４、９４のみを示している。しかしながら、１つ又は３つ以上の対象液滴を用いることができ、対照液滴が試験液滴間に点在してフローマーカーによって試験液滴から分離され得ることを理解されたい。また、図４は、直線状に配置された液滴を示しているが、マイクロチャネルは非直線状であってもよく、例えば図３に示すようにＵターンしてもよい。
【００３２】
参照符号９２は、マイクロチャネルから内容物を流し出すためにマイクロチャネルに通されるフラッシュ溶液を表す。参照符号９０は、マイクロチャネルの内容物を廃棄物容器に押し込むためにマイクロチャネルに最後に圧送される流体を表す。なお、図４では、明確にするためにブロックのそれぞれが隣接するブロックから分離して示されている。しかしながら、実際には、フローマーカーの種々の液滴と試料液滴とを分離する隙間はなく、マイクロチャネル内の流れは通常は実質的に連続している。
【００３３】
一実施形態によるインラインアッセイのタイミングステップを図５に示す。このようなタイミングステップの実施は、通常はシステムコンピュータの制御下で行われる。ステップ１２２において、緩衝溶液でマイクロチャネルのプライミングを行う。緩衝溶液は、カートリッジ１０内の区画室内に収容されてもよく、又はマイクロウェルプレート８０のウェル８２の１つからシッパチューブ５２を通して吸い取られてもよい。その一方で、他の全ステップに矢印でつながるステップ１２０で表されるように、ＤＮＡ材料等の試料材料を、カートリッジ１０内の試料区画室からマイクロチャネルに連続的に注入する。プライミングステップ１２２の後、ステップ１２４において、一定量のフローマーカー緩衝液材料をマイクロチャネルに吸い込む。次に、ステップ１２６において、陰性対照試料及びＰＣＲプライマーをマイクロチャネルに吸い込み、対照試験液滴を形成する。ステップ１２８において、別の量のフローマーカー緩衝溶液をマイクロチャネルに吸い込む。上述のように、ＤＮＡ試料を、ステップ１２０に示すようにプロセス全体を通してマイクロチャネルに連続的に注入する。ステップ１３０において、ＰＣＲアッセイプライマー又はアッセイに特定の他の試薬を、シッパチューブ５２によってマイクロウェルプレート８０のウェル８２ｉからマイクロチャネルに吸い込み、連続的に流れているＤＮＡ試料の一部と混合することにより、試験液滴を形成する。ステップ１３２において、フローマーカー緩衝液をマイクロチャネルに吸い込み、連続的に流れているＤＮＡ試料の一部と混合されることにより、フローマーカー液滴を形成して、前のステップで形成された試験液滴を次の試験液滴から分離する。ステップ１３４において、試料材料に対して実施すべきアッセイが全て完了したか否かを判定する論理ステップを実施する。完了していない場合、プロセスはステップ１３０を戻し、別の量のＰＣＲアッセイプライマー又はアッセイに特定の他の試薬をマイクロチャネルに吸い込み、連続的に流れているＤＮＡ試料の一部と混合することにより、次の試験液滴を形成する。次に、ステップ１３２を、別のフローマーカー液滴を形成するために繰り返す。全アッセイが完了すると、ステップ１３６において、陽性対照試料及びＰＣＲプライマーをマイクロチャネルに吸い込み、第２の対照試験液滴を形成する。しかしながら、上述のように、対照液滴が試験液滴の前後にあることは必ずしも必要ではない。そして、ステップ１３８において、マイクロチャネルの内容物を廃棄物容器に流す。
【００３４】
図６は、カートリッジ１０が３つのシッパチューブ１４２、１４４、１４６を有するマイクロ流体チップ１４０に接続される配置を示す。この配置では、行４４、４６、４８の各投入ポート列が３つの異なるマイクロチャネルに結合され、マイクロチャネルのそれぞれが３つのシッパチューブ１４２、１４４、及び１４６の１つに接続される。したがって、図６に示す配置では、マイクロ流体チップ１４０は、６つのアクセスポート列のそれぞれに３つずつ、１８個のマイクロチャネルを含むことになる。この配置は、並行処理スループットの向上を可能にする。例えば、薬理ゲノミクスの用途では、単一のＤＮＡサンプルを複数のＰＣＲプライマーセットで並行して処理することができる。この並行構成は、４つ以上のシッパチューブを有する設計にすることもできる。
【００３５】
図７は、図６のマルチシッパ構成のマイクロ流体チップ４０に形成されるマイクロチャネル６２を概略的に示す。マイクロチャネル６２のそれぞれは、実質的に図３に関連して上述したように構成されることが好ましい。しかしながら、この実施形態では、行４４、４６、４８の各投入ポート列が３つの異なるマイクロチャネルに結合され、マイクロチャネルのそれぞれが３つのシッパチューブ１４２、１４４、及び１４６の１つに接続される。
【００３６】
図８及び図９は、シッパチューブを含まない本発明の代替的な一実施形態を示す。このようなシッパレス配置では、緩衝液、ＤＮＡ試料材料、及びアッセイに特定の試薬を含む材料の全てがカートリッジ内に内蔵され得る。この設計では、試薬カートリッジが、ＤＮＡ試料調製、試薬供給、緩衝液／試薬供給、及び廃棄物格納といった機能の全てを提供する。
【００３７】
図８及び図９は、シッパチューブを含まないマイクロ流体チップ１８２のマイクロチャネル１７０の概略図である。図８に示すように、マイクロチャネル１７０は、緩衝液溶液の連続流がマイクロチャネル１７０に注入される際に通る緩衝液投入ポート１６０を含む。ＤＮＡ試料材料又は他の試料材料は、ＤＮＡ投入ポート１６２を通してマイクロチャネル１７０に注入され、ＰＣＲプライマー又はアッセイに特定の他の試薬は、試薬投入ポート１６４を通してマイクロチャネル１７０に注入される。反応廃棄物は、マイクロチャネル１７０から出て出口ポート１６６を通してカートリッジ１０の廃棄物区画室に入る。マイクロチャネル１７０は、混合セクション１７２、インラインＰＣＲセクション１７４、及び解析領域１７６を含み得る。投入ポート１６２及び１６４を通した物質の注入は、例えば圧電型又はバブルジェット（登録商標）型の弁であり得る注入ポート弁１７８及び１８０によって制御される。弁１７８及び１８０の目的は、試料材料及びアッセイに特定の試薬を緩衝溶液の連続流中に選択された間隔で注入して、例えば図４に示すような別個の試験液滴を発生させることである。
【００３８】
図９に示すように、カートリッジ１０のノズル１８は、マイクロチャネル１７０のポートＡと連通する。図９は、カートリッジ１０内に収容されているＤＮＡ試料材料及び緩衝溶液の混合物がポートＡを通してマイクロチャネル１７０に注入されるように、図８に示す投入ポート１６０及び１６２が事実上結合される構成を示す。代替的に、緩衝溶液は、第４のノズル及びカートリッジの対応する区画室（図示せず）から、又は外部の緩衝溶液源から、図８に示すように別個のポートで注入されてもよい。カートリッジ１０のノズル１６は、図８の投入ポート１６４に対応する投入ポートＢと連通する。カートリッジ１０のノズル１４は、図９に示す出口ポート１６６に対応するマイクロ流体チップ１８２のポートＣと連通する。マイクロチャネル１７０を通してＤＮＡ試料材料及び試薬並びに緩衝溶液をカートリッジ１０の廃棄物区画室に引き込むために、カートリッジ１０の真空ポート２４に真空源が接続される。
【００３９】
緩衝液及び試薬等の反応流体は、好ましくは工場でカートリッジ自体に設けられるロット番号及び有効期限等の情報をつけてカートリッジに充填され得る。そして、カートリッジの使用前にユーザがＤＮＡ試料材料を適当なチャンバに追加することができる。代替的に、空のカートリッジを提供して、このようなカートリッジをマイクロ流体チップに取り付ける前に研究室の職員がカートリッジに所望のアッセイ流体（例えば、試料材料、緩衝液、試薬）を充填してもよい。
【００４０】
図１０は、図９に示すシッパレスカートリッジ及びマイクロ流体チップ構成を用いて実施されるタイミングシーケンスを示す。ステップ１９０において、マイクロチャネル１７０内で負圧を形成するために負圧をカートリッジ廃棄物ポート（すなわち、真空ポート２４）に加える。ステップ１９２において、ＤＮＡ及び緩衝溶液を点Ａでマイクロチャネルに連続的に流し込む。ステップ１９４において、ＰＣＲプライマー／試薬又はアッセイに特定の他の試薬を点Ｂ（すなわち、ポート１６４）でマイクロ流体流に注入する。ステップ１９６において、マイクロチャネルへの反応流体の投入を遅延させる。ステップ１９８において、マイクロチャネル１７０のセクション１７４でＰＣＲ熱サイクル（又は他のアッセイプロセス）をマイクロチャネル内の材料に対して実施する。ステップ２００において、マイクロチャネル１７０のセクション１７６でＨＲＴｍ測定又は他の解析をマイクロチャネルの内容物に対して実施する。ステップ２０２において、追加のアッセイを実施する必要があるか否かに関する判定を行う。さらなる反復アッセイを実施する必要がある場合、プロセスをステップ１９４に戻し、追加のＰＣＲプライマー／試薬を点Ｂで流れに注入した後で、遅延（ステップ１９６）、ＰＣＲ熱サイクル（ステップ１９８）、及び測定又は解析（ステップ２００）を行う。所望のアッセイが全て完了すると、ステップ２０４において、マイクロチャネル１７０を点Ｃ（出口ポート１６４）で廃棄物区画室まで洗い流す。図１０に示すタイミングシーケンスは、図８に示すようなシッパレスカートリッジ及びマイクロ流体チップ構成を用いて実施されるタイミングシーケンスと同様であるが、ＤＮＡ試料材料がＤＮＡ投入ポート１６２を通してマイクロチャネル１７０に注入され、ＰＣＲプライマーが試薬投入ポート１６４を通してマイクロチャネル１７０に注入される点が異なる。
【００４１】
図１１は、参照符号２４０で示すマイクロ流体チップの代替的な一実施形態を示す。マイクロ流体チップ２４０は、本体２４２と、３行のアクセスポート２４４、２４６、２４８を有するマイクロチャネル窓２５０とを含む。複数のカートリッジ２１０がアクセスポート２４４、２４６、２４８に結合される。（なお、複数のカートリッジは、前述の実施形態のマイクロ流体チップに同様の方法で結合され得る。）マイクロ流体チップ２４０は、マイクロ流体チップ２４０内のマイクロチャネルが使用済みの反応流体をマイクロチャネルからカートリッジ２１０の廃棄物区画室に移送するためにＵターンして廃棄物ポートに戻らないという点で、前述のマイクロ流体チップと異なる。その代わりに、マイクロ流体チップ２４０は、窓２５０を挟んでアクセスポート２４４、２４６、２４８の反対側で本体２４２に配置される真空ポート２２４を含む。マイクロチャネル毎に専用の真空ポート２２４があってもよく、又は１つ又は複数のポートが２つ以上（又は全て）のマイクロチャネルに結合されてもよい。
【００４２】
図１１に示す実施形態を使用する際、材料をカートリッジ内に収容されている廃棄物区画室に引き込むために真空ポートをカートリッジ２１０に取り付ける代わりに、マイクロ流体チップ２４０のマイクロチャネルを通して流体を引き出すために外部真空源（図示せず）がポート２２４に接続される。同じくこの実施形態に関連して、マイクロチャネルからの使用済みの反応流体は、マイクロチャネル（図示せず）と流体連通するがカートリッジ２１０内に収容されていない廃棄物区画室に移送される。
【００４３】
本発明は、特定の好ましい実施形態の開示によってかなり詳細に説明及び図示されているが、本発明の他の実施形態も当業者には容易に理解されるであろう。したがって、本発明は、以下の特許請求項の精神及び範囲内に包含される全ての変更形態及び変形形態を含むとみなされる。
【図１ａ】
0005553602.tif 000002
【図１ｂ】
0005553602.tif 000003
【図２ａ】
0005553602.tif 000004
【図２ｂ】
0005553602.tif 000005
【図３】
0005553602.tif 000006
【図４】
0005553602.tif 000007
【図５】
0005553602.tif 000008
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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