(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包し、且つガン細胞を特異的に認識する抗体を有するリポソームの製造方法であって、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を包含するリポソームと、アルキレングリコールを含む緩衝液又は水に、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解した溶液に接触させる工程を含む、製造方法。
【請求項２】
グリコシドが、グルコシド、ガラクトシド、マンノシド、キシロシド、フルクトシド、ラムノシド、アラビノシド、アロシド、アルトロシド、イドシド、Ｎ−アセチルグルコサミニド、Ｎ−アセチルガラクトサミニド、タロシド、グルクロノシド、グルコサミニド、ガラクトサミニド、及びフコシドからなる群より選択される１種のグリコシドである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ポリオキシエチレンエステル誘導体が、ポリオキシエチレンヒマシ油エステルである請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
リポソームが、ＤＰＰＣ及びコレステロールをそれぞれ３：０．５〜３の物質量比で含有する、請求項１〜３の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
接触時間が、１０〜４０分である請求項１〜４の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
ガン細胞が、乳ガン細胞である請求項１〜５の何れか1項に記載の製造方法。
【請求項７】
抗体が、ＨＥＲ２タンパク質と特異的に結合する抗体である請求項１〜６の何れか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を含む混合溶媒にパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解する溶解液を内包し、且つガン細胞を特異的に認識する抗体を有するリポソーム製剤。
【請求項９】
グリコシドが、グルコシド、ガラクトシド、マンノシド、キシロシド、フルクトシド、ラムノシド、アラビノシド、アロシド、アルトロシド、イドシド、Ｎ−アセチルグルコサミニド、Ｎ−アセチルガラクトサミニド、タロシド、グルクロノシド、グルコサミニド、ガラクトサミニド、及びフコシドからなる群より選択される１種のグリコシドである請求項８に記載のリポソーム製剤。
【請求項１０】
ポリオキシエチレンエステル誘導体が、ポリオキシエチレンヒマシ油エステルである、請求項８又は９に記載のリポソーム製剤。
【請求項１１】
リポソームが、ＤＰＰＣ及びコレステロールをそれぞれ３：０．５〜３の重量比で含有する請求項８〜１０の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１２】
リポソームの全脂質の１モル量に対するパクリタキセルモノグリコシドのモル量が、１．０〜１５．０×１０−２である、請求項８〜１１の何れか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１３】
ガン細胞が、乳ガン細胞である請求項８〜１２の何れか1項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１４】
抗体が、ＨＥＲ２タンパク質と特異的に結合する抗体である請求項８〜１３のいずれか１項に記載のリポソーム製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包するリポソームの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗ガン剤は、細胞の増殖制御が破綻したガン細胞の分裂を抑制する機序を有するものが多く存在する。このような抗ガン剤は非常に効果的な抗ガン作用を示すので、有用に用いられているが、正常な細胞に対しても細胞増殖抑制作用を示すことから、副作用が多く使用の際に妨げとなることが多い。【０００３】
そこで抗ガン剤には、正常な細胞には作用させずガン細胞に特異的に薬剤を送達するＤＤＳ技術が必要とされていた。このように副作用を軽減するために、様々な抗ガン剤がＤＤＳ技術と組み合わせて進化している。このようなＤＤＳ技術は、脂質二重膜によって構成されるリポソームを用いた技術が好適に用いられている。【０００４】
例えば、このようなリポソームと、オキサリプラチン、シスプラチン又はカルボプラチン等のプラチナ錯体系抗ガン剤を用いた技術が開発されている（特許文献１）。また、このような抗がん剤を、リモートローディング法を用いて導入する際には、弱塩基性を有する抗がん剤に限られ、これを解消するための方法として、溶解度勾配を利用したリモートローディング法が開発されているものの、これに適用できるのは水溶性が高い薬剤に限られており、その導入効率も非常に低い（特許文献２）。【０００５】
一方、乳ガン、子宮頸ガン等に対して適用があるパクリタキセル、ドセタキセル等は、水にほとんど溶けず、アルコール等の溶媒に溶かして用時調製した後に投与するという点で手間がかかり、危険を伴うという点で問題点が生じていた。
【０００６】
このようなパクリタキセル、ドセタキセル等の水への溶解度を向上させる目的で、各種パクリタキセル誘導体が作製されており、例えば非特許文献１に示すようにパクリタキセルにグルコース、ガラクトース、マンノース、キシロースなどの単糖を付加する技術が開発されている。
【０００７】
しかしながら、このようなパクリタキセルモノグリコシド、ドセタキセルモノグリコシド等のパクリタキセル誘導体であっても十分な水溶性は得られず、これらとリポソームを組み合わせたＤＤＳ製剤について、何ら知見は得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許公報ＷＯ２００８／０７２５８４号
【特許文献２】特開２００９−１３２６２９号広報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｌ．Pｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００８  Ｊｕｎ；３１（６）：１１５５−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
優れた抗ガン作用を有するパクリタキセル誘導体の副作用を低減させるために、パクリタキセルモノグリコシド、ドセタキセルモノグリコシド等のパクリタキセル誘導体を内包するリポソームを製造することが試みられていたが、パクリタキセル誘導体等のリポソーム内へ導入効率は悪く、実用レベルに達していないという問題点があった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決すべく、本願発明者が鋭意研究を重ねた結果、パクリタキセルモノグリコシド、ドセタキセルモノグリコシド等のパクリタキセル誘導体をリポソームに効率よく導入させるためには、パクリタキセル誘導体とリポソームを構成する脂質を特定の割合の溶媒成分の存在下にて混合すればよいことを見出した。
【００１２】
また、予めリポソーム内にパクリタキセル誘導体を溶解する混合溶媒を含有させる事によってリポソーム内にパクリタキセルモノグリコシド、ドセタキセルモノグリコシド等を高効率に内包させることができることも見出した。
【００１３】
そして、このような方法によって得られるパクリタキセル、ドセタキセルモ
ノグリコシド等を内包するリポソームはＤＤＳとして優れた効果を発揮することを見出した。本発明は、係る知見に基づいて完成されたものであり、下記の態様を広く含むものである。
【００１４】
項１  パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包するリポソームの製造方法であって、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシド、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、リポソームを構成する脂質、及び緩衝液若しくは水を含む混合物に対してリポソーム形成処理を施す工程を含み、
該パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを混合物の総容量に対して１５００以上〜３０００重量％未満含み、
該緩衝液若しくは水１容量部当たり、
該ポリオキシエチレンエステル誘導体を０．１〜０．２容量部含み、
該低級アルコールを０．１〜０．２容量部含むことを特徴とし、
該リポソームを構成する総脂質１重量部当たり、０．１〜２．５重量部の前記パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包することを特徴とする製造方法。
【００１５】
項２  リポソーム形成処理が、薄膜静置水和法、凍結乾燥法、ドロップレット法、ＡＣ法、超音波法、逆相蒸発法、脂質溶解法、噴霧乾燥法、ＣＯ２／Ｈ２Ｏエマルションによる製法又はマイクロ流路を用いた製法の何れかである、上記項１に記載の製造方法。【００１６】
項３  グリコシドが、グルコシド、ガラクトシド、マンノシド、キシロシド、フルクトシド、ラムノシド、アラビノシド、アロシド、アルトロシド、イドシド、Ｎ−アセチルグルコサミニド、Ｎ−アセチルガラクトサミニド、タロシド、グルクロノシド、グルコサミニド、ガラクトサミニド、及びフコシドからなる群より選択される１種のグリコシドである、上記項１又は２に記載の製造方法。【００１７】
項４  パクリタキセルモノグリコシドが、７−α−グルコシルオキシアセチルパクリタキセルである上記項１〜３の何れか１項に記載の製造方法。【００１８】
項５  ポリオキシエチレンエステル誘導体が、ポリオキシエチレンヒマシ油エステルである上記項１〜４の何れか１項に記載の製造方法。【００１９】
項６  ポリオキシエチレンヒマシ油エステルが、クレモホール（登録商標）ＥＬである上記項１〜５の何れか１項に記載の製造方法。【００２０】
項８  パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの溶解液が、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を含む混合溶媒に該パクリタキセル及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解する溶解液である、上記項７に記載のリポソーム製剤。
【００２１】
項８  パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドタキセルモノグリコシドの溶解液が、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を含む混合溶媒に該パクリタキセル及び／又はドタキセルモノグリコシドが溶解する溶解液である、上記項７に記載のリポソーム製剤。【００２２】
項９  グリコシドが、グルコシド、ガラクトシド、マンノシド、キシロシド、フルクトシド、ラムノシド、アラビノシド、アロシド、アルトロシド、イドシド、Ｎ−アセチルグルコサミニド、Ｎ−アセチルガラクトサミニド、タロシド、グルクロノシド、グルコサミニド、ガラクトサミニド、及びフコシドからなる群より選択される１種のグリコシドである上記項７又は８に記載のリポソーム製剤。【００２３】
項１０  パクリタキセルモノグリコシドが、７−α−グルコシルオキシアセチルパクリタキセルである上記項７〜９の何れか１項に記載のリポソーム製剤。【００２４】
項１１  ポリオキシエチレンエステル誘導体が、ポリオキシエチレンヒマシ油エステルである、上記項７〜１０の何れか１項に記載のリポソーム製剤。【００２５】
項１２  ポリオキシエチレンヒマシ油エステルが、クレモホール（登録商標）ＥＬである、上記項７〜１１の何れか１項に記載のリポソーム製剤。【００２６】
項１３  リポソームが、ＤＰＰＣ及びコレステロールをそれぞれ３：０．５〜３の物質量比で含有する上記項７〜１２の何れか１項に記載のリポソーム製剤。【００２７】
項１４  リポソームの全脂質の１モル量に対するパクリタキセルモノグリコシドのモル量が、１．０〜１５．５×１０−２である、上記項７〜１５の何れか１項に記載のリポソーム製剤。【００２８】
項１７  ガン細胞が、乳ガン細胞である上記項７〜１６の何れか1項に記載のリポソーム製剤。【００２９】
項１８  抗体が、ＨＥＲ２タンパク質と特異的に結合する抗体である上記項７〜１７のいずれか１項に記載のリポソーム製剤。【００３０】
さらに、本発明は以下に示す態様の発明も包含する。【００３１】
項Ｉ  パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包し、且つガン細胞を特異的に認識する抗体を有するリポソームの製造方法であって、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を内包するリポソームと、アルキレングリコールを含む緩衝液又は水に、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解した溶液に接触させる工程を含む、製造方法。
【００３２】
項ＩＩ  パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解した溶液が、アルキレングリコールを含む緩衝液若しくは水に溶解した溶液である、上記項Ｉに記載の、製造方法。
【００３３】
項ＩＩＩ  グリコシドが、グルコシド、ガラクトシド、マンノシド、キシロシド、フルクトシド、ラムノシド、アラビノシド、アロシド、アルトロシド、イドシド、Ｎ−アセチルグルコサミニド、Ｎ−アセチルガラクトサミニド、タロシド、グルクロノシド、グルコサミニド、ガラクトサミニド、及びフコシドからなる群より選択される１種のグリコシドである、上記項Ｉ又はＩＩに記載の製造方法。【００３４】
項ＩＶ  パクリタキセルモノグリコシドが、７−α−グルコシルオキシアセチルパクリタキセルである上記項Ｉ〜ＩＩＩの何れか１項に記載の、製造方法。【００３５】
項Ｖ  ポリオキシエチレンエステル誘導体が、ポリオキシエチレンヒマシ油エステルである上記項Ｉ〜ＩＶの何れか１項に記載の、製造方法。【００３６】
項ＶＩ  ポリオキシエチレンヒマシ油エステルが、クレモホール（登録商標）ＥＬである上記項Ｉ〜Ｖの何れか１項に記載の、製造方法。【００３７】
項ＶＩＩ  リポソームが、ＤＰＰＣ及びコレステロールをそれぞれ３：０．５〜３の物質量比で含有する、上記項Ｉ〜ＶＩの何れか１項に記載の、製造方法。【００３８】
項ＶＩＩＩ  接触時間が、５〜６０分である上記項Ｉ〜ＶＩＩの何れか１項に記載の、製造方法。【００３９】
項ＩＸ  ガン細胞が、乳ガン細胞である上記項Ｉ〜ＶＩＩＩの何れか1項に記載の、製造方法。【００４０】
項Ｘ  抗体が、ＨＥＲ２タンパク質と特異的に結合する抗体である上記項Ｉ〜ＩＸのいずれか１項に記載の、製造方法。
【発明の効果】
【００４１】
本発明の製造方法によると、リポソームに効率よくパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包させることができる。また、本発明の方法によって得られるパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包するリポソームは、ガン細胞を特異的に認識する抗体を結合させることができ、このような抗体が結合した本発明の製造方法によって得られるリポソームは、ＤＤＳとして非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】試験例４による急性毒性試験結果。グラフの縦軸は生存割合を示し、横軸は投与回数を示す。
【図２】試験例５による本発明の製造方法によって得られたパクリタキセルモノグリコシドを内包し、乳ガン細胞を認識する抗体を担持したリポソームの乳ガン細胞への集積を示す蛍光写真像。図中のバーは、１０μｍを示す。
【図３】試験例８による急性毒性試験結果。グラフの縦軸は生存割合を示し、横軸は投与後の日数を示す。
【図４】試験例８による急性毒性試験結果。グラフの縦軸は体重を示し、横軸は投与後の日数を示す。
【図５】試験例１０によるインビボ送達実験結果。図左はＣｙ５．５で標識化されたＨＳＡを内包し、抗体を有するリポソームを、図右はＣｙ５．５で標識化されたＨＳＡを内包し、抗体を有さないリポソームをマウスに尾静脈投与した後の集積位置とその度合いを示している。図中の棒矢印は、腫瘍を示し、三角は肝臓を示す。
【図６】図５に示すイメージング結果をグラフ化したもの。（Ａ）腫瘍組織の結果、（Ｂ）は肝臓の結果、（Ｃ）は肝臓に対する腫瘍組織での集積度を比として数値化した結果である。なお、数値化は、腫瘍および肝臓部位を閾値により選択し、蛍光強度合計を測定し、具体的には、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｌｉｄｅ  Ｂｏｏｋ  ４．２（株式会社  日本ローパー）を使用した。
【図７】試験例１１によるインビボ抗ガン活性実験結果。グラフの縦軸は腫瘍体積を示し、横軸は投与後の日数を示す。
【図８】試験例１１によるインビボ抗ガン活性実験結果。グラフの縦軸は体重を示し、横軸は投与後の日数を示す。
【図９】試験例１１によるインビボ抗ガン活性実験結果。グラフの縦軸は生存率を示し、横軸は投与後の日数を示す。
【図１０】試験例１１によるマウスの写真像。図中の矢印は、腫瘍を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
＜リポソームの製造方法＞
本発明のリポソームの製造方法の１つの態様（以後、「第１の態様の製造方法」と呼ぶことがある）である、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包するリポソームの製造方法は、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシド、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、リポソームを構成する脂質、及び緩衝液若しくは水を含む混合物に対してリポソーム形成処理を施す工程を含むものである。
【００４４】
ここで、予めパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドと、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を含む溶液を調製し、これを、リポソームを構成する脂質と混合して、次いでリポソーム形成処理に供する方法であってもよい。
【００４５】
別の態様としては、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドと、ポリオキシエチレンエステル誘導体、及び低級アルコールを含む溶液を調整して、リポソームを構成する脂質と緩衝液若しくは水を含む混合物と混合して、次いでリポソーム形成処理に供してもよい。
【００４６】
すなわち、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドと、脂質を混合する順序は問わないが、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシド、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水の総容量に対するパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの使用量は、１５００以上〜３０００重量％未満程度である。好ましくは１７００以上２５００重量％未満以下程度、より好ましくは１８００以上２２００重量％以下程度である。
【００４７】
ポリオキシエチレンエステル誘導体の使用量は、緩衝液若しくは水１容量部に対して０．１〜０．２容量部程度、好ましくは０．１２〜０．１９容量部程度、より好ましくは０．１３〜０．１８容量部程度である。
【００４８】
低級エタノールの使用量は、緩衝液若しくは水１容量部に対して０．１〜０．２容量部程度、好ましくは０．１２〜０．１９容量部程度、より好ましくは０．１３〜０．１８容量部程度である。
【００４９】
なお、本明細書において用いる用語「容量部」とは、常圧及び室温環境下にて測定して得られる数値である。
【００５０】
ポリオキシエチレンエステル誘導体とは、特に限定されないが、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）メチルポリシロキサン共重合体、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリン酸アミド、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンヒマシ油エステル等があげられる。
【００５１】
これらの中でも、ポリオキシエチレンヒマシ油エステルが好ましく、より好ましくはポリオキシアルキレン(Ｃ２４)ヒマシ油脂肪酸エステル（クレモホール（登録商標）ＥＬ）である。
【００５２】
低級アルコールとは、特に限定はされないが、通常は炭素数１〜４のアルコールとすればよい。
【００５３】
緩衝液とは、特に限定はされないが、例えばＰＢＳ、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、クエン酸、ホウ酸、酒石酸が挙げられる。
【００５４】
リポソームの構成成分としては、リン脂質、コレステロール類、脂肪酸等が挙げられる。具体的にリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン、これらを常法によって水素添加したもの等の天然リン脂質；ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジチオピリジン−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、エレオステアロイルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスファチジルセリン等の合成リン脂質等が挙げられる。
【００５５】
上述したリン脂質、コレステロール類、及び脂肪酸は、それぞれ適宜修飾されていてもよい。具体的な特に修飾は限定されないが、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等といったポリアルキレングリコール等による修飾が挙げられる。これらのリン脂質は、適宜組み合わせて使用してもよい。
【００５６】
コレステロール類としては、例えばコレステロール、フィトステロール等が挙げられる。
【００５７】
また、脂肪酸としては、例えばオレイン酸、パルミトオレイン酸、リノール酸、或いはこれら不飽和脂肪酸を含む脂肪酸混合物等が挙げられる。中でも、側鎖の小さい不飽和脂肪酸を含むリポソームは曲率の関係から粒子径の小さいリポソームの作製に有効である。
【００５８】
本発明の第１の態様の製造方法によって得られるリポソームは、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドをリポソームに内包するものである。
【００５９】
本明細書にて用いる用語「内包」とは、リポソーム内部にパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが完全に包含されていてもよいが、リポソームを構成する脂質二重膜に、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシド分子が貫通した状態も「内包」であることを意味する。また本明細書では、「内包」と同義で「内封」との文言を用いる事がある。
【００６０】
本発明の第１の態様の製造方法によって得られるリポソームは、総脂質１重量部当たり０．１〜２．５重量部程度のパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包する。より好ましくは１．３〜２．４重量部であり、より好ましくは１．６〜２．３重量部程度である。
【００６１】
パクリタキセルモノグリコシド及びドセタキセルモノグリコシドは、それぞれパクリタキセル及びドセタキセルに単糖が付加したものである。例えばパクリタキセルに対して、単糖が付加される位置は、特に限定されるものではないが、例えばパクリタキセルが有するタキサン環の１０位又は７位に、単糖が付加される。天然界にパクリタキセル７位の糖誘導体が存在することが知られており、結合の安定性の観点によると、７位に付加されることが好ましい。
【００６２】
また、ドセタキセルに対しても、単糖が付加される位置は、特に限定されるものではないが、例えばドセタキセルが有するタキサン環の１０位又は７位に、単糖が付加される。
【００６３】
具体的な単糖は特に限定されるものではないが、例えばグルコース、ガラクトース、マンノース、キシロース、フルクトース、ラムノース、アラビノース、アロース、アルトロース、イドース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、タロース、グルクロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、フコース等が挙げられる。中でも、パクリタキセル及びドセタキセルが有する抗ガン効果を過度に損なわないようにする観点から、グルコース、ガラクトース、マンノース、キシロースなどが好適に用いられる。
【００６４】
すなわち、本発明に関するパクリタキセルモノグリコシド、及びドセタキセルモノグリコシドにおけるグリコシドとしては、グルコシド、ガラクトシド、マンノシド、キシロシド、フルクトシド、ラムノシド、アラビノシド、アロシド、アルトロシド、イドシド、Ｎ−アセチルグルコサミニド、Ｎ−アセチルガラクトサミニド、タロシド、グルクロノシド、グルコサミニド、ガラクトサミニド、フコシドなどが挙げられる。
【００６５】
上述のパクリタキセルモノグリコシド及びドセタキセルモノグリコシドは、パクリタキセル及びドセタキセルと単糖の間に更なる基を有していてもよく、例えば炭素数が１〜８のアルカノイル基等が挙げられる。
【００６６】
すなわち、上述のパクリタキセルモノグリコシド及びドセタキセルモノグリコシドは、それぞれパクリタキセル及びドセタキセルのタキサン環の７位又は１０位の水酸基の水素原子が、上述の単糖で置換された炭素数が１〜８のアルカノイルオキシ基で置換されててもよい。
【００６７】
なお、単糖が付加される前のパクリタキセルは、公知のパクリタキセル誘導体であってもよい。また、特開平８−７３４４９号公報、特開平７−２３３１５９号公報などに記載されたパクリタキセル誘導体も挙げられる。
【００６８】
上述のパクリタキセルモノグリコシドとして最も好ましいものは、下記式（１）にて表される７−α−グルコシルオキシアセチルパクリタキセルである。
【００６９】
【化１】
0005490326.tif 000002
【００７０】
上述のパクリタキセルモノグリコシドは公知の方法を用いて製造することができ、例えば非特許文献１に記載の方法を参照して製造することができる。具体的な製造方法は、パクリタキセルに付加する所望の単糖を予めアセチル化しておき、上述したようにパクリタキセルが有するタキサン環の７位又は１０位にエステル化することによって糖鎖が付与される。
【００７１】
上述のドセタキセルモノグリコシドとして最も好ましいものは、下記式（２）〜（４）にて表されるドセタキセルモノグリコシドである。
【００７２】
【化２】
0005490326.tif 000003
【００７３】
【化３】
0005490326.tif 000004
【００７４】
式中のαグルコシル基は、βグルコシル基、αガラクトシル基、βガラクトシル基、又はαマンノシル基であってもよい。
【００７５】
【化４】
0005490326.tif 000005
【００７６】
式中のｎは２、３、４、６、又は８の何れかである。
【００７７】
上述のドセタキセルモノグリコシドは公知の方法を用いて製造することができ、例えば、ＨＥＴＥＲＯＣＹＣＬＥＳ，２００１，Ｖｏｌ ５４，Ｎ０．２，５６１−５６６．、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２００８，３１（６）１１５５−１１５８（２００８）等に記載の方法を適宜参照して製造すればよい。
【００７８】
本発明の第１の態様の製造方法によって製造されるリポソームの種類は、上述のリポソームの構成脂質によって決定されるものであるが、アニオン性リポソーム、カチオン性リポソーム、両性リポソームのいずれであってもよい。例えばカチオン性リポソームは、細胞への効率的な物質導入という観点から他の種のリポソームよりも好ましいが、細胞への非特異的な吸着を起こす面から、本発明の方法によって得られたパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを含むリポソームを、特定の細胞へのＤＤＳ効果を発揮させる点で劣るので好ましくない。
【００７９】
本発明の第１の態様の製造方法におけるリポソーム形成処理方法は、公知の方法を用いて製造することができ、特に限定はされないが、例えば薄膜静置水和法、凍結乾燥法、ドロップレット法、ＡＣ法、超音波法、逆相蒸発法、脂質溶解法、噴霧乾燥法、ＣＯ２／Ｈ２Ｏエマルションによる製法、又はマイクロ流路を用いた等の方法により製造することができる。
【００８０】
本発明の第１の態様の製造方法におけるリポソーム形成処理の例を具体的に説明すると、例えば前記したリン脂質、コレステロール等を適当な有機溶媒に溶解し、これを適当な容器に入れて減圧下に溶媒を留去して容器内面にリン脂質膜を形成し、これに上述のパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを含む溶液、好ましくはその緩衝液を加えて攪拌して、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包するリポソームを得ることができる。このようなリポソームは凍結乾燥して保存してもよい。
【００８１】
また、本発明の第１の態様の製造方法によって得られるリポソームの粒子径は、特に限定されないが、本発明の製造方法によって得られるリポソームは、抗ガン作用を有するパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包するリポソーム製剤として好適に用いられる観点から、通常は５０〜３００ｎｍ程度とすればよい。このような数値範囲を満たすリポソーム製剤は、生体内に投与した際に毛細血管、特にガン細胞によって誘発される血管新生等に基づいた毛細血管等を通過できる大きさとなり好ましい。５０ｎｍ以上の粒子径のリポソームであれば、実質的に細胞への漏洩が起こりにくいので好しい。また、３００ｎｍ以下の粒子径のリポソームは、生体内に投与した後に、血中の白血球（マクロファージ）に貧食されにくいので、好ましい。
【００８２】
このような観点から、本発明の第１の態様の製造方法によって得られるリポソームは所定の粒子径に調節することが可能である。具体的には予めリポソーム形成処理時において、各種条件を変更することによって達成されるが、細孔径が調節されたフィルターを通過させることによっても達成できる。フィルターを通過させてリポソーム製剤の粒子径を調節する方法として、エクストルーダー等を用いる方法が挙げられる。
【００８３】
本発明の第１の態様の製造方法によって得られるリポソームは、ガン細胞を認識する抗体を有していてもよい。このような抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、抗体の由来となる動物種も特に限定されない。
【００８４】
また、一本鎖抗体、ドミノ抗体、短鎖抗体、多価化抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ化抗体、F(ａｂ′)２化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等のように抗原認識機能を有する分子であれば、どのような分子構造を有する抗体であってもよく、ＩｇＧに代表されるイムノグロブリンの構造を有する抗体に限定されるものではない。
【００８５】
このような抗体は、上述の本発明の製造方法によって得られるリポソームの脂質二重膜に対して結合しており、その結合様式については特に限定されず、使用する抗体の構造に応じて適宜選択することで、所望の抗体を有するリポソームが得られる。
【００８６】
例えば、抗体がイムノグロブリンであれば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート）等を用いて、抗体をリポソームに結合させればよい。
【００８７】
また、抗体を担持させるのは、上述した本発明の第１の態様の製造方法によって、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが内包されるリポソームに抗体を結合させてもよく、リポソームの構成脂質に予め抗体を結合させてもよい。結合させる抗体がより多くリポソーム表面に提示できるようにするためには、本発明の製造方法によって、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが内包されるリポソームに対して抗体を結合させることが好ましい。
【００８８】
本発明のリポソームが有する抗体はガン細胞を認識するものである。このようなガン細胞は、特に限定されるものではないが、肺ガン細胞、非小細胞肺ガン、乳ガン細胞、食道ガン、胃ガン細胞、肝臓ガン細胞、膵臓ガン細胞、大腸ガン細胞、卵巣ガン、子宮頸ガン細胞、子宮体ガン細胞、前立腺ガン細胞、頭頸部ガン細胞（口腔ガン細胞、咽頭ガン細胞、喉頭ガン細胞、鼻腔、若しくは副鼻腔ガン細胞、唾液腺ガン細胞、甲状腺ガン細胞等を含む）等が挙げられる。
【００８９】
なかでも、パクリタキセルの臨床的な適用知見に基づいて、非小細胞肺ガン細胞、乳ガン細胞、食道ガン細胞、胃ガン細胞、子宮体ガン細胞、卵巣ガン細胞、前立腺ガン細胞等が好ましい。
【００９０】
上述のガン細胞を認識する抗体は、ガン細胞の表層に存在するタンパク質（例えば、ＣＤ４４、ＣＤ１３３等のようなＣＤタンパク質群を形成するＣＤタンパク質；成長因子、若しくはホルモンに対するレセプター；膜貫通、若しくは膜結合ドメインを有するタンパク質等。）、ペプチド、糖鎖等の生体分子を特異的に認識する抗体である。このような抗体は、特に限定されるものではなく、それぞれのガン細胞の表層にて発現することが公知となっている抗体であればよい。
【００９１】
例えば乳ガン細胞を認識する抗体としては、乳ガンに罹患する患者から採取した乳ガン細胞、乳ガン組織由来細胞であるＨｓ２７４．Ｔ細胞、Ｈｓ２８０．Ｔ細胞、Ｈｓ２８１．Ｔ細胞、Ｈｓ３４３．Ｔ細胞、Ｈｓ３６２．Ｔ細胞、Ｈｓ７３９．Ｔ細胞、Ｈｓ７４１．Ｔ細胞、Ｈｓ７４２．Ｔ細胞、Ｈｓ１９０．Ｔ細胞、Ｈｓ３１９．Ｔ細胞、Ｈｓ３２９．Ｔ細胞、Ｈｓ３４４．Ｔ細胞、Ｈｓ３５０．Ｔ細胞、Ｈｓ３７１．Ｔ細胞、Ｈｓ７４８．Ｔ細胞、Ｈｓ８４１．Ｔ細胞、Ｈｓ８４９．Ｔ細胞、Ｈｓ８５１．Ｔ細胞、Ｈｓ８６１．Ｔ細胞、Ｈｓ９０５．Ｔ細胞、Ｈｓ４７９．Ｔ細胞、Ｈｓ５４０．Ｔ細胞、Ｈｓ５６６(Ｂ)．Ｔ細胞、Ｈｓ６０５．Ｔ細胞、Ｈｓ６０６細胞、ＢＴ−２０細胞、ＵＡＣＣ−８１２細胞、ＨＣＣ１９５４細胞、Ｈｓ５７４．Ｔ細胞、ＢＴ−４８３細胞、ＢＴ−５４９細胞、ＤＵ４４７５細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＢＴ−４７４細胞、ＵＡＣＣ−８９３細胞、ＨＣＣ３８細胞、ＨＣＣ７０細胞、ＨＣＣ２０２細胞、ＨＣＣ１１４３細胞、ＨＣＣ１１８７細胞、ＨＣＣ１３９５細胞、ＨＣＣ１４１９細胞、ＨＣＣ１５００細胞、ＨＣＣ１５９９細胞、ＨＣＣ１９３７細胞、ＨＣＣ２１５７細胞、ＨＣＣ２２１８細胞、ＨＣＣ１５６９細胞、ＭＢ１５７細胞、ＳＫ−ＢＲ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−３３０細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１３４細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、ＺＲ−７５細胞、ＭＣＦ−７細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ２抗体（抗ＥｒｂＢ２抗体）、抗ＣＥＡ抗体等が挙げられる。
【００９２】
例えば肺ガン細胞を認識する抗体としては、肺ガンに罹患する患者から採取した肺ガン細胞、肺ガン組織由来細胞であるＨｓ２２９．Ｔ細胞、ＮＣＩ−Ｈ２０６６細胞、ＮＣＩ−Ｈ２２８６細胞、ＮＣＩ−Ｈ１７０３細胞、Ｈｓ５７３．Ｔ細胞、Ａ５４９細胞、Ａ４２７細胞、Ｎ４１７細胞、ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞、ＳＷ１５７３細胞、ＮＣＩ−Ｈ８３５Ｕ細胞、ＭＣ１１細胞、ＮＣＩ−Ｈ７２７細胞、ＮＣＩ−Ｈ７２０細胞、ＮＣＩ−Ｈ８１０細胞、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞、ＮＣＩ−Ｈ２１２６細胞、Ｈ６９細胞、ＮＣＩ−Ｈ１６８８細胞、ＮＣＩ−Ｈ１４１７細胞、ＮＣＩ−Ｈ１６７２細胞、ＮＣＩ−Ｈ１８３６細胞、ＤＭＳ７９細胞、ＤＭＳ５３細胞、ＤＭＳ１１４細胞、ＳＷ１２７１細胞、ＮＣＩ−Ｈ２２２７細胞、ＮＣＩ−Ｈ１９６３細胞、ＳＨＰ−７７細胞、Ｈ６９細胞、Ｈ６９ＡＲ細胞、ＮＣＩ−Ｈ２１７０細胞、ＮＣＩ−Ｈ５２０細胞、ＳＷ９００細胞等の表層に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡ抗体等が挙げられる。
【００９３】
例えば非小細胞肺ガン細胞を認識する抗体としては、非小細胞肺ガンに罹患する患者から採取した非小細胞肺ガン細胞、非小細胞肺ガン組織由来細胞であるＮＣＩ−Ｈ２３細胞、ＮＣＩ−Ｈ５２２細胞、ＮＣＩ−Ｈ１４３５細胞、ＮＣＩ−Ｈ１５６３細胞、ＮＣＩ−Ｈ１６５１細胞、ＮＣＩ−Ｈ１７３４細胞、ＮＣＩ−Ｈ１７９３細胞、ＮＣＩ−Ｈ１８３８細胞、ＮＣＩ−Ｈ１９７５細胞、ＮＣＩ−Ｈ２０７３細胞、ＮＣＩ−Ｈ２０８５細胞、ＮＣＩ−Ｈ２２２８細胞、ＮＣＩ−Ｈ２３４２細胞、ＮＣＩ−Ｈ２３４７細胞、ＮＣＩ−Ｈ２１３５細胞、ＮＣＩ−Ｈ２１７２細胞、ＮＣＩ−Ｈ２４４４細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体等が挙げられる。
【００９４】
例えば食道ガン細胞を認識する抗体としては、食道ガンに罹患する患者から採取した食道ガン細胞、食道ガン組織由来細胞であるＳＧＦ−３細胞、ＥＣ−ＹＯ細胞、ＴＥ−１細胞、ＴＥ−２細胞、ＴＥ−３細胞、ＴＥ−４細胞、ＴＥ−５細胞、ＴＥ−６細胞、ＴＥ−７細胞、ＴＥ−８細胞、ＴＥ−９細胞、ＴＥ−１０細胞、ＴＥ−１１細胞、ＴＥ−１２細胞、ＴＥ−１３細胞、ＴＥ−１４細胞、ＴＥ−１５細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体等が挙げられる。
【００９５】
例えば胃ガン細胞を認識する抗体としては、胃ガンに罹患する患者から採取した胃ガン細胞、胃ガン組織由来細胞であるＡＺ５２１細胞、ＡＧＳ細胞、ＳＮＵ−１細胞、ＳＮＵ−５細胞、ＳＮＵ−１６細胞、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞、Ｈｓ７４６Ｔ細胞、ＫＡＴＯ  ＩＩＩ細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＳＬＸ抗体等が挙げられる。
【００９６】
肝臓ガン細胞を認識する抗体としては、肝臓ガンに罹患する患者から採取した肝臓ガン細胞、肝臓ガン組織由来細胞であるＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ−７細胞、Ｃ３Ａ細胞、ＳＮＵ−３９８細胞、ＳＮＵ−４４９細胞、ＳＮＵ−１８２細胞、ＳＮＵ−４７５細胞、Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７細胞、ＰＬＨＣ−１細胞、ＳＮＵ−３８７細胞、ＳＮＵ−４２３細胞、ＳＫ−ＨＥＰ−１等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ２抗体等が挙げられる。
【００９７】
膵臓ガン細胞を認識する抗体としては、膵臓ガンに罹患する患者から採取した膵臓ガン細胞、膵臓ガン組織由来細胞であるＭＩＡＰａＣａ−２細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、ＨＰＡＦ−ＩＩ細胞、ＨＰＡＣ細胞、Ｐａｎｃ０３．２７細胞、Ｐａｎｃ０８．１３細胞、Ｐａｎｃ０２．０３細胞、Ｐａｎｃ０２．１３細胞、Ｐａｎｃ０４．０３細胞、Ｐａｎｃ０５．０４細胞、Ｃａｐａｎ−２細胞、ＣＦＰＡＣ−１細胞、ＰＬ４５細胞、Ｐａｎｃ１０．０５細胞、ＰＡＮＣ−１細胞、ＡｓＰＣ−１細胞、Ｃａｐａｎ−１細胞、ＳＷ１９９０細胞、Ｈｓ７６６Ｔ細胞、ＳＵ．８６．８６細胞、等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＳＬＸ抗体等が挙げられる。
【００９８】
大腸ガン細胞を認識する抗体としては、大腸ガンに罹患する患者から採取した大腸ガン細胞、大腸ガン組織由来細胞であるＷｉＤｒ細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、ＮＣＩ−Ｈ５４８細胞、Ｈｓ２５５．Ｔ細胞、ＴＡＣ−１細胞、ＣＯＬＯ３２０ＤＭ細胞、ＣＯＬＯ３２０ＨＳＲ細胞、ＤＬＤ−１細胞、ＨＣＴ−１５細胞、ＳＷ４８０細胞、ＳＷ４０３細胞、ＳＷ４８細胞、ＳＷ１１１６細胞、ＳＷ９４８細胞、ＳＷ１４１７細胞、ＬＳ１２３細胞、ＬＳ180細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、Ｃ２ＢＢｅ１細胞、Ｈｓ２５７．Ｔ細胞、Ｈｓ５８７．Ｉｎｔ細胞、ＨＴ−２９細胞、ＨＣＴ−８細胞、Ｈｓ６７５．Ｔ細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＡＴＲＦＬＯＸ細胞、Ｈｓ６９８．Ｔ細胞、ＳＷ６２６細胞、ＳＮＵ−Ｃ１細胞、ＣＯＬＯ２０５細胞、ＣＯＬＯ２０１細胞、ＳＷ６２０細胞、ＬｏＶｏ細胞、ＳＫ−ＣＯ−１細胞、Ｔ８４細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＣＥＡ抗体等が挙げられる。
【００９９】
卵巣ガンを認識する抗体としては、卵巣ガンに罹患する患者から採取した卵巣ガン細胞、卵巣ガン組織由来細胞であるＰＡ−１細胞、Ｃａｏｖ−３細胞、ＴＯＶ−２１Ｇ細胞、ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞、Ｈｓ３８．Ｔ細胞、Ｈｓ５７１．Ｔ細胞、ＥＳ−２細胞、ＴＥ８４．Ｔ細胞、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３細胞、ＳＫ−ＯＶ−３細胞、Ｃａｏｖ−４細胞、ＯＶ−９０細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には抗ＨＥＲ２抗体等が挙げられる。
【０１００】
子宮頸ガン細胞を認識する抗体としては、子宮頸ガンに罹患する患者から採取した子宮頸ガン細胞、子宮頚ガン組織由来細胞であるＨｅＬａ細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈ１ＨｅＬａ細胞、Ｈｓ５８８．Ｔ細胞、ＧＨ３２９細胞、ＧＨ３５４細胞、ＨｅＬａＮＲ１細胞、Ｃ−４Ｉ細胞、Ｃ−４ＩＩ細胞、ＤｏＴｃ２  ４５１０細胞、Ｃ−３３Ａ細胞、ＳＷ７５６細胞、ＳｉＨａ細胞、ＨＴ−３細胞、ＭＳ７５１細胞、ＣａＳｋｉ細胞、ＭＥ−１８０細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ２抗体等が挙げられる。
【０１０１】
子宮体ガン細胞を認識する抗体としては、子宮体ガンに罹患する患者から採取した子宮体ガン細胞、子宮体ガン組織由来細胞であるＨＨＵＡ細胞、ＫＬＥ細胞、ＨＥＣ−１−Ａ細胞、ＨＥＣ−１−Ｂ細胞、ＨＥＣ−６細胞、ＨＥＣ−５０細胞、ＨＥＣ−５９細胞、ＨＥＣ−１０８細胞、ＨＥＣ−１１６細胞、ＲＬ９５−２細胞、ＳＫ−ＵＴ−１細胞、ＳＫ−ＵＴ−１Ｂ細胞、ＭＥＳ−ＳＡ細胞、ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞、ＭＥＳ−ＳＡ／ＭＸ２細胞、ＡＮ３ＣＡ細胞、ＳＮＧ−Ｐ細胞、ＳＮＧ−Ｍ細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ
２抗体、抗ＣＥＡ抗体等が挙げられる。
【０１０２】
前立腺ガン細胞を認識する抗体としては、前立腺ガンに罹患する患者から採取した前立腺ガン細胞、前立腺ガン組織由来細胞であるＬＮＣａＰ細胞、２２Ｒｖ１細胞、ＰＣ−３細胞、ＭＤＡ  ＰＣａ  ２ｂ細胞、ＴＲＡＭＰ−Ｃ３細胞、ＤＵ１４５細胞、ＮＣＩ−Ｈ６６０細胞、ＴＳＵ−ＰＲ１ＰＣ−８２細胞、ＰＰＣ−１細胞、ＶＣＲＵ−Ｐｒ−２細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。具体的には、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体等が挙げられる。
【０１０３】
頭頚部ガン細胞のうち、口腔ガン細胞を認識する抗体としては、口腔ガンに罹患する患者から採取した口腔ガン細胞、口腔ガン組織由来細胞であるＨｓ５３．Ｔ細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。
【０１０４】
頭頚部ガン細胞のうち、咽頭ガン細胞を認識する抗体としては、咽頭ガンに罹患する患者から採取した咽頭ガン細胞、咽頭ガン組織由来細胞であるＣ６６６−１細胞、ＮＰＣ−ＴＹ８６１細胞、ＭＰＣ−Ｙ８５１細胞、ＭＰＣ−Ｋ８５２細胞、ＫＫＫ−ＹＴ細胞、ＭＰＣ−ＳＴ細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。
【０１０５】
頭頚部ガン細胞のうち、喉頭ガン細胞を認識する抗体としては、喉頭ガンに罹患する患者から採取した喉頭ガン細胞、喉頭ガン組織由来細胞であるＦａＤｕ細胞、Ｈｓ８４０．Ｔ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。
【０１０６】
頭頚部ガン細胞のうち、鼻腔若しくは副鼻腔ガン細胞を認識する抗体としては、鼻腔、若しくは副鼻腔ガンに罹患する患者から採取した鼻腔、若しくは副鼻腔ガン細胞、鼻腔、若しくは副鼻腔ガン組織由来細胞であるＲＰＭＩ２６５０細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。
【０１０７】
頭頚部ガン細胞のうち、唾液腺ガン細胞を認識する抗体としては、唾液腺ガンに罹患する患者から採取した唾液腺ガン細胞、唾液腺ガン組織由来細胞であるＳＧＴ−１細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。
【０１０８】
頭頚部ガン細胞のうち、甲状腺ガン細胞を認識する抗体としては、甲状腺ガンに罹患する患者から採取した甲状腺ガン細胞、甲状腺ガン組織由来細胞であるＨＴＣ／Ｃ３細胞、ＳＷ５７９細胞、ＴＴ細胞等の表面に存在するタンパク質、ペプチド、糖鎖等の生体分子を認識する抗体を用いればよい。
【０１０９】
これらの頭頚部ガン細胞を認識する抗体として、具体的には抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体等が挙げられる。
【０１１０】
上述の抗体のうち最も好ましいものは、本発明のリポソーム製剤が有するパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが適用されるガン細胞の表層にて著量発現している観点から、抗ＨＥＲ２抗体である。
【０１１１】
このような抗体は、公知の方法を用いて製造することも可能であるが、一般的に分子標的薬剤とされる抗体医薬品を入手し、その有効成分を用いてもよい。例えば、上述の乳ガン細胞等を特異的に認識するＨＥＲ２に対する抗ＨＥＲ２抗体は、中外製薬よりハーセプチン（登録商標）として販売されている抗体医薬品の有効成分である。
【０１１２】
本発明のリポソームの製造方法のもう１つの態様（以後、「第２の態様の製造方法」と呼ぶことがある）は、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包し、且つガン細胞を特異的に認識する抗体を有するリポソームの製造方法であって、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を包含するリポソームと、アルキレングリコールを含む緩衝液又は水に、前記パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解した溶液に接触させる工程を含む、製造方法である。
【０１１３】
第２の態様の製造方法は、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を内包するリポソームと、アルキレングリコールを含む緩衝液又は水にパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解した溶液とを接触させる工程を含み、その後、得られたリポソームにガン細胞を特異的に認識する抗体を結合する工程が含まれる方法（方法１）であってもよく、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を包含するリポソームに対して予めガン細胞を特異的に認識する抗体を結合させて得られるものと、アルキレングリコールを含む緩衝液又は水にパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解した溶液を接触させる工程を含む方法（方法２）であってもよい。
【０１１４】
第２の態様の製造方法における、「パクリタキセルモノグリコシド」、「ドセタキセルモノグリコシド」「ガン細胞」、「癌細胞を特異的に認識する抗体」、「リポソーム」の脂質組成、「リポソーム」の製造方法（形成処理方法）、「リポソーム」の粒子径、「リポソーム」へのガン細胞を特異的に認識する抗体の「リポソーム」への結合方法、「ポリオキシエチレンエステル誘導体」、「低級アルコール」等については、本発明の第１の態様の製造方法にて詳述するものをそのままか、適宜改変して用いればよい。なお、リポソームとは、ガン細胞を特異的に認識する抗体の結合する前後のどちらでのものあってであってもよく、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包する前後のどちらのものであってもよい。
【０１１５】
なお、第２の態様の製造方法におけるリポソームの脂質組成に関して、ＤＰＰＣ及びコレステロールを含んでいることが好ましく、これらの具体的な物質量比は特に限定はされないが、通常は３：０．５〜３程度とすればよく、好ましくは３：１〜３、より好ましくは３：１〜２、最も好ましくは３：１である。
【０１１６】
第２の態様の製造方法における、リポソームに内包されるポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水に関して、これらの容量比は、上述の第１の態様の製造方法と同様で、特に限定はされないが、ポリオキシエチレンエステル誘導体を、通常は緩衝液若しくは水１容量部に対して通常は０．１〜０．２容量部程度とすればよく、好ましくは０．１２〜０．１９容量部程度、より好ましくは０．１３〜０．１８容量部程度すればよい。
【０１１７】
また、低級エタノールを、通常は緩衝液若しくは水１容量部に対して０．１〜０．２容量部程度とすればよく、好ましくは０．１２〜０．１９容量部程度、より好ましくは０．１３〜０．１８容量部程度とすればよい。
【０１１８】
このような、リポソームにポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を内包させる方法は、上述した第１の態様の製造方法を適宜参照すればよい。
【０１１９】
第２の態様の製造方法におけるアルキレングリコールは、特に限定されないが、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコールなどが挙げられる。なお、これらのアルキレングリコールは、適宜組み合わせて用いてもよい。
【０１２０】
このようなアルキレングリコールの使用量は、上述の緩衝液若しくは水の１容量部に対して、通常は０．１〜１．５容量部程度とすればよく、好ましくは０．２〜１．０容量部程度、より好ましくは０．３〜０．８容量部程度、最も好ましくは０．４〜０．７容量部である。
【０１２１】
アルキレングリコールを含む緩衝液若しくは水に対する、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの溶解度は、通常は０．１〜２ｍｇ／ｍＬ程度である。
【０１２２】
第２の態様の製造方法における、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を包含するリポソームと、アルキレングリコールを含む緩衝液又は水に、前記パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解した溶液に接触させる時間は、特に限定されるわけではないが、通常は５分〜６０分程度とすればよい。より好ましくは１０〜３０分程度、更に好ましくは１０〜２０分程度である。
【０１２３】
なお、接触させる際の温度等の他の条件に関しては、特に限定されず公知のリモートローディング法に準拠すればよい。
【０１２４】
本発明の第２の態様の製造方法では、リポソームへのパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの導入効率が、通常は５０〜９０％程度、より好ましくは７０〜９０％とすることができる。この様な導入効率が、後述の実施例において説明する包効率（ＥＥ：％）によって求めることができる。
【０１２５】
なお、本発明のリポソームの製造方法には、上述の第１の態様であっても、第２の態様であっても、得られたリポソームを精製する工程に供してもよい。具体的な精製方法は、公知の方法を採用すればよく特に限定されないが、例えば、ゲル濾過レジン等を用いるクロマトグフィー法、限外濾過法、透析法等の方法が挙げられる。
【０１２６】
上述の方法で得られるリポソームは、適宜公知の方法で保存することが可能であり、特に限定はされないが、例えば凍結乾燥してもよく、必要に応じて公知の防腐剤を含有させたパラオキシ安息香酸エステル、フェノキシエタノール等の液体中にて保存してもよい。
【０１２７】
上述した本発明の製造方法によって得られるリポソームは、上述のガン細胞に対してリポソームに含まれるパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドによる効率的な抗ガン活性効果を与えることが可能となる。具体的には、ガン細胞の増殖を抑制し、ひいてはガン組織を縮小させることが可能となる。また、本発明の製造方法によって得られるパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドを内包する、又はパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの溶解液を内包するリポソームは、それが含有する抗体の働きによってガン細胞特異的に送達されるために、副作用が少なくなるという利点もある。
【０１２８】
従って、上述のようなガン細胞を特異的に認識する抗体を有する本発明の製造方法によって得られるリポソームはリポソーム製剤としてガンの治療剤として有用である。
＜リポソーム製剤＞
本発明のリポソーム製剤は、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの溶解液を内包し、且つガン細胞を特異的に認識する抗体を有する。
【０１２９】
本発明のリポソーム製剤は、上述の本発明の製造方法によって得られるリポソームをそのままか、或いは公知の製剤化技術を採用することによって製造すればよい。
【０１３０】
すなわち、本発明のリポソーム製剤は、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの溶解液を内包し、且つガン細胞を特異的に認識する抗体を有する。
【０１３１】
本発明のリポソーム製剤におけるパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの溶解液は、ポリオキシエチレンエステル誘導体、低級アルコール、及び緩衝液若しくは水を含む混合溶媒に、パクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドが溶解するものであることが好ましい。
【０１３２】
本発明のリポソーム製剤における、「パクリタキセルモノグリコシド」、「ドセタキセルモノグリコシド」、「ガン細胞」、「癌細胞を特異的に認識する抗体」、「リポソーム」の脂質組成、「リポソーム」の製造方法（形成処理方法）、「リポソーム」の粒子径、「リポソーム」への抗体の結合方法、「ポリオキシエチレンエステル誘導体」、「低級アルコール」等については、上述の態様の本発明のリポソームの製造方法をそのままか、適宜改変して用いればよい。
【０１３３】
リポソームの脂質組成は、上述の本発明のリポソームの製造方法と同様であるが、特にＤＰＰＣ及びコレステロールを通常は３：０．５〜３程度の物質量比で含有していればよく、好ましくは３：１〜３、より好ましくは３：１〜２、最も好ましくは３：１である。
【０１３４】
本発明のリポソーム製剤におけるパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの含有モル量は、リポソームにおける全脂質のモル量に対して、通常は１．０〜１５．０×１０−２倍のモル量程度であり、好ましくは７．０〜１５．０×１０−２倍のモル量程度である。なお、この様なパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドのモル量は、後述する実施例において説明する担持率（ＬＥ：％）によって求めることができる。
【０１３５】
本発明のリポソーム製剤は、生体に投与することによってガン細胞へ効率よく且つ特異的に送達される。また、送達の後に、細胞内に侵入する効果も併せ持つ。このようなリポソーム製剤の投与方法は、特に限定はされないが、例えば血中へ直接投与することが好ましい。具体的な投与として、経静脈投与、経動脈投与、筋肉内投与、心臓内投与、皮下投与、骨内投与、皮内投与、くも膜下（腔）投与、腹腔内投与、膀胱内投与などが挙げられる。投与手段も特に限定はされず、注射、点滴、注入ポンプなどといった公知の方法を採用すればよい。
【０１３６】
本発明のリポソーム製剤の投与量は、ガンの治療を所望する患者の年齢、性別、ガンの程度等によって決定されるものであり、具体的に決定されるものではないが、通常は、リポソーム製剤に含まれるパクリタキセルモノグリコシド及び／又はドセタキセルモノグリコシドの量に換算して、１回当たり、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ程度とすればよい。投与間隔、投与回数等も、上述のようにガンの治療を所望する患者の年齢、性別、ガンの程度によって適宜決定すればよい。なお、投与対象となるガンとは、上述の本発明のリポソームの製造方法にて詳述したガンであれば特に限定されることはなく、適宜選択すればよい。
【０１３７】
また、本発明のリポソーム製剤に抗体を担持させ、ＤＤＳとして生体投与すれば、目的の部位のみならず、ある程度は肝臓に集積するという問題点が発生するようであれば、例えばポリエチレングリコールによって修飾を施すことも有効である。このような方法は、公知の方法を適宜採用すれば良い。
【実施例】
【０１３８】
本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明が以下に示す実施例に限定されないのは言うまでも無い。【０１３９】
試験例１：７−α−グルコシルオキシアセチルパクリタキセルの溶解度
下記化学式（１）【０１４０】
【化５】
0005490326.tif 000006
【０１４１】
にて示される、７−α−グルコシルオキシアセチルパクリタキセル（以下、本実施例においてｇＰＴＸとする。）の溶解度を検討した。【０１４２】
上述の非特許文献１にて示す方法にて作製した粉末状のｇＰＴＸ及びパクリタキセル（以下、本実施例においてＰＴＸとする。）をそれぞれ所定量秤量し、１２０μＬのエタノールを加え、ボルテックスにより混合させた。さらに、溶解液に１２０μＬのクレモホール（登録商標）ＥＬ（和光純薬より入手）を混合後、さらに７６０μＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を混合してｇＰＴＸ並びにＰＴＸの溶解性を確認した。結果を表１に示す。【０１４３】
【表１】
0005490326.tif 000007
【０１４４】
無配糖体であるＰＴＸは２ｍｇ／ｍｌ程度の濃度でしか溶解しなかったが、ｇＰＴＸでは２０ｍｇ／ｍｌもの高濃度で溶解することが明らかとなった。すなわち、ＰＴＸもｇＰＴＸも通常であればほとんど水に溶解することはなく、クレモホール：エタノール：ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）が容量比で１２：１２：７６の割合となる非水系混合溶媒であっても、ＰＴＸは十分な溶解度は示さないが、ｇＰＴＸは非常に高い濃度で、上述の非水系混合溶媒に溶解させることができることが明らかとなった。【０１４５】
また、比較実験例として１０〜４０％（容量）のエチレングリコール（ＥＧ）を含有する１０ｍＭリン酸緩衝液に対する、ｇＰＴＸの溶解度を同様に実験した結果を表２に示す。全て１ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、ｇＰＴＸを混合した結果である。【０１４６】
【表２】
0005490326.tif 000008
【０１４７】
ｇＰＴＸは、１０〜２０％（容量）のエチレングリコール含有ＰＢＳには溶解せず、３０％（容量）のエチレングルコースを含有するＰＢＳにて溶解し始め、４０％（容量）のエチレングルコースを含有するＰＢＳにて溶解することが明らかとなった。この時の溶解度は、おおよそ１ｍｇ（ｇＰＴＸ）／ｍＬ程度であった。従って、ｇＰＴＸそのものは水系溶媒単独では殆ど溶解させることはできず、３０〜４０％（容量）程度のエチレングリコールを含む混合溶媒として、溶解させることができることが明らかとなった。【０１４８】
試験例２：７−α−グルコシルオキシアセチルパクリタキセル内包リポソーム
１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ-ｒａｃ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＰＰＣ）、１，２−Ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏｌ−３−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒａｃ−（１−ｇｌｙｃｅｒｏｌ）ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＤＰＰＧ）、及びコレステロールを、それぞれ１３．５、１．５、及び１．５ｍｇ秤量し、５０ｍｌのナスフラスコ内で混合した。混合した脂質を３ｍｌの有機溶媒（クロロホルム：メタノール＝９：１）で溶解した後、ロータリーエバポレーターで乾燥後、２時間の真空乾燥をすることにより溶媒を完全に除去し脂質フィルムを調製した。【０１４９】
次に、ナスフラスコを６０℃の温浴中に５分間浸漬させた後、１ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したｇＰＴＸ溶液（クレモホール：エタノール：超純水＝１２：１２：７６；容量比）又は２ｍｇ／ｍｌのＰＴＸ溶液（クレモホール：エタノール：超純水＝１２：１２：７６；容量比）を加え脂質フィルムを溶かし、Ｍｕｌｔｉ  Ｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＭＬＶ）を調製した。【０１５０】
これを５分間のソニケーションを１分間のインターバルをおき３回行うことによりＳｍａｌｌ  Ｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＳＬＶ）を調製した。未包入の薬剤溶液および遊離の脂質を取り除くために限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を行った。また、  ｇＰＴＸを内包したリポソームを、以後ｇＰＴＸ−Ｌとし、そしてＰＴＸを内包したリポソームを、以後ＰＴＸ−Ｌとする。【０１５１】
さらに、比較例として、ｇＰＴＸに代えて、上記の１ｍｇ／ｍｌのｇＰＴＸ溶液（含４０％（容量）エチレングリコール１０ｍＭリン酸緩衝液）を用いてリポソームにｇＰＴＸを内包させた。【０１５２】
引き続いて、抗体が結合したリポソームへの上記ｇＰＴＸを内包させる実験を行った。まず、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＧ、及びコレステロールをそれぞれ１３．５、１．５、及び１．５ｍｇ秤量し、５０ｍｌナスフラスコ内で混合した。混合した脂質を３ｍｌの有機溶媒（クロロホルム：メタノール＝９：１）で溶解し、そこへ８ｍＭのＮ−３−（２−ｄｉｔｈｉｏｐｙｒｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎｙｌｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ＤＴＰ−ＤＰＰＥ）溶液を２７μｌ（０．２ｍｇ）加えた。その後、ロータリーエバポレーターで乾燥後、２時間の真空乾燥をすることにより溶媒を完全に除去し脂質フィルムを調製した。【０１５３】
次に、ナスフラスコを６０℃の温浴中に５分間浸漬させた後、１ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌの濃度に調製したｇＰＴＸ溶液（クレモホール：エタノール：超純水＝１２：１２：７６；容量比）を加え脂質フィルムを溶かし、Ｍｕｌｔｉ  Ｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＭＬＶ）を調製した。【０１５４】
これを５分間のソニケーションを１分間のインターバルをおき３回行うことによりＳｍａｌｌ  Ｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＳＬＶ）を調製した。未包入の薬剤溶液および遊離の脂質を取り除くために限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を行った。【０１５５】
同時に、リポソームに結合させる抗体を調製した。１ｍｇのＮ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＳＰＤＰ）を脱水メタノール５００μｌに溶解し、２ｍｇ／ｍｌのＳＰＤＰ溶液を得た。５μＬのＳＰＤＰ溶液を１ｍｌのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ヒト型化抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に入れ３０分間、室温で撹拌した。未結合のＳＰＤＰを除去するために透析チューブ（分画分子量：１４，０００）にＳＰＤＰ修飾Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ溶液を入れ、１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ  ４．５）によって透析した。透析は４℃の冷暗所にて行い、外液交換を３時間４回、１２時間２回行った。【０１５６】
ＳＰＤＰ修飾Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ溶液に５０ｍＭのｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）溶液５００μｌを混合し、３０分間室温で撹拌した。未反応のＤＴＴと副生成物であるピリジン−２−チオンを除去するため限外濾過（（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を行った。【０１５７】
ろ過後、上述のＰＴＸ又はｇＰＴＸを内包させたリポソームと混合し、リポソームにＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを結合させた。【０１５８】
抗体が結合したリポソームに上記ｇＰＴＸが内包されたリポソームを、以後ｇＰＴＸ−ＩＬとし、そしてＰＴＸが内包されたリポソームをＰＴＸ−ＩＬとする。また、抗体が結合していないリポソームに上記ｇＰＴＸが内包されたリポソームを、以後ｇＰＴＸ−Ｌとし、そしてＰＴＸが内包されたリポソームをＰＴＸ−Ｌとする。【０１５９】
また、比較例として、ｇＰＴＸに代えて、上記の１ｍｇ／ｍｌのｇＰＴＸ溶液（含４０％エチレングリコール１０ｍＭリン酸緩衝液）を用いて抗体が結合したリポソームに内包する実験を行った。【０１６０】
得られたリポソーム又はイムノリポソームに内包されたパクリタキセルモノグリコシドの効率は、以下の手順にて算出した。まずｇＰＴＸおよびＰＴＸの検量線を得た。検量線は０．０１から０．５ｍｇ／ｍｌの薬剤溶液（クレモホール：エタノール：ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）が１２：１２：７６；容量比）をＨＰＬＣで検出し、各薬剤濃度におけるピーク面積から作成した。【０１６１】
次に、調製したリポソームに１／１０体積量の０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、超音波処理によりリポソームを破壊した後に、この溶液１０μｌをＨＰＬＣで測定し検量線を用いて内包された薬剤含有量を求めた。ＨＰＬＣのカラムはＷＰ３００  Ｃ１８、５μｍ  ４．６×１５０ｍｍを使用し、測定条件は検出波長２２７ｎｍ、移動相にはメタノール：超純水＝６：４の溶媒を使用し、１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速で送液した。【０１６２】
得られた薬剤含有量から以下の式（１）及び（２）を用いて内包効率（Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＥＥ）および担持率（ｌｏａｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ：ＬＥ）を算出した。【０１６３】
内包効率（ＥＥ：％）＝薬剤含有量／初期使用薬剤量×１００       （１）
担持率（ＬＥ：％）＝｛（薬剤含有量／薬剤モル重量）／初期脂質モル数｝×１００  （２）【０１６４】
また、得られたリポソームの粒子径も動的光散乱法に基づいたＺ平均粒子径として測定した。これらの結果を下記の表３に示す。【０１６５】
【表３】
0005490326.tif 000009
【０１６６】
表３に示す結果から、４０％のエチレングリコールに溶解したＰＴＸはリポソームへ内包されないことが明らかとなった。また、内包効率を見ると、クレモホール等を含む溶媒に溶解したｇＰＴＸのほうが、ＰＴＸよりも優れていることも明らかとなった。【０１６７】
更に、リポソームを構成する脂質に対するＰＴＸの担持率に関して、クレモホール含有溶媒に溶解したＰＴＸは、１．２％程度の数値しか示していないのに対して、同じくクレモホール含有溶媒に溶解したｇＰＴＸは、１３．７％もの数値を示し、抗体が結合したリポソームへの内包実験からは、１１．４％もの数値を示した。このことは、リポソームを構成する脂質あたりのｇＰＴＸの担持量が、ＰＴＸと比べて、おおよそ９．５〜１１．４倍も上昇したことを示している。すなわち、ｇＰＴＸのほうがリポソームへの内包に有利であることを示している。【０１６８】
また、内包効率に関して、４０％（容量）のエチレングリコール溶液に溶解したｇＰＴＸはリポソームへ０．４１％、抗体が結合したリポソームへは０．５１％程度しか内包されないのに対して、クレモホール含有溶媒に溶解したｇＰＴＸではリポソームへ１７．６％、抗体が結合したリポソームへは１４．８％と、３０〜４０倍程度で内包効率が上昇していることも明らかとなった。【０１６９】
従って、リポソームへｇＰＴＸを内包する場合、クレモホール含有溶媒に溶解させたｇＰＴＸを用いることが非常に有利であることを示している。【０１７０】
試験例３：抗ガン活性評価
ジメチルスルホキシドに溶解したＰＴＸ、並びにｇＰＴＸ、及び４０％（容量）のエチレングリコール溶液に溶解したｇＰＴＸを用いて作製したｇＰＴＸ−Ｌ並びにｇＰＴＸ−ＩＬのＩＣ５０をＭＴＴアッセイによって評価した。試験対象細胞としては、ヒト由来の乳ガン細胞であるＳＫ−ＢＲ−３を用いた。また、ＩＴ５０を算出した。ＩＴ５０とは、細胞が１００％死滅する薬剤濃度の半分の濃度に到達するまでの時間を表すものであり、時間軸に対して細胞生存率をプロットすることにより得られる生存曲線を基に容易に算出できる。これらの結果を、表４に示す。【０１７１】
【表４】
0005490326.tif 000010
【０１７２】
表４に示す結果から、ＩＣ５０についてはｇＰＴＸであっても、ｇＰＴＸ−Ｌであってもそれらの乳ガン細胞に対する死滅効果に関して、特に差は見られなかった。一方で、ｇＰＴＸ−ＩＬでは、これらよりも乳ガン細胞への死滅効果が高いことが示されている。なお、ＰＴＸが最も高い乳ガン細胞への死滅効果を示しているが、薬剤を個体に投与するという観点からすると、死滅させたいガン細胞への薬剤を積極的な送達することができず、たとえ優れた抗ガン作用を示したとしても、目的としない部位へ薬剤が送達されてしまう可能性を大きくはらんでいるために副作用を示すことは必至であり、従来の問題点を解決するものではない。【０１７３】
また、ＩＴ５０では、ＰＴＸ、ｇＰＴＸ、並びにｇＰＴＸ−Ｌでは細胞を細胞が１００％死滅するまでにかかる時間に差は見られなかった。ｇＰＴＸ−ＩＬでは、これらの３者と比較して３分の１程度の数値を示していることが明らかである。すなわち、ｇＰＴＸ−ＩＬが他の３者と比較して、細胞を死滅に至らしめるまでにかかる時間が大いに短いことを示している。これは、乳ガン細胞へｇＰＴＸ−ＩＬが積極的に送達され、且つ乳ガン細胞内に取り込まれ、ＰＴＸそのものによる高い抗ガン作用を発揮したものと考えられる。従って、ｇＰＴＸ−ＩＬは、乳ガン細胞に対して優れたＤＤＳ効果を発揮していることが明らかである。【０１７４】
試験例４：急性毒性試験
ＢＡＬＢ／ｃ マウス（♀, ５週齢）にｇＰＴＸ、ｇＰＴＸ−Ｌ、溶媒コントロール（クレモホール：エタノール：超純水＝１２：１２：７６；容量比）を尾静脈注射により１時間のインターバルをおき、５回の投与を行った（Ｎ＝３）。1回の投与は２００μｌ／２０ｇで行った。ｇＰＴＸの合計投与量は２００ｍｇ／ｋｇである。投与途中および投与後経過観察を行った。結果を図１に示す。【０１７５】
ｇＰＴＸを投与した群では、三回目の投与でほぼ全て死滅してしまう結果となったが、リポソームにｇＰＴＸが内包されたｇＰＴＸ−Ｌでは、コントロールと同程度に生存することが確認された。以上のことから、抗ガン作用を増強させるために、リポソームにｇＰＴＸが包入されたｇＰＴＸ−Ｌは、従来のｇＰＴＸの投与量より多く投与できる可能性がある。【０１７６】
試験例５：細胞観察
ヒト由来乳ガン細胞であるＳＫ−ＢＲ−３細胞に、ＦＩＴＣを内包したリポソーム（脂質組成は上述のものと同じ：以後、ＦＩＴＣ−Ｌとする。）、及び上記方法と同様にして作成したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂが結合したリポソーム（脂質組成は上述のものと同じ：以後、ＦＩＴＣ−ＩＬとする。）を作用させ、２時間のインキュベートの後、蛍光顕微鏡を用いた常法に従って細胞を観察した。結果を、図２に示す。【０１７７】
図２から、ＦＩＴＣ−Ｌでは、細胞への集積は見られなかったのに対して、ＦＩＴＣ−ＩＬでは、細胞への集積のみならず、細胞内部に取り込まれている様子までも観察された。以上のことから、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂが結合したリポソームはＳＫ−ＢＲ−３細胞表面上にて発現するＨＥＲ２に結合し、更に細胞内にまで取り込まれることが明らかとなった。【０１７８】
試験例６：ｇＰＴＸ内包リポソームの調製改変法（リポソーム脂質組成の検討）
ＤＰＰＣを１３．２、１０．６もしくは８．８ｍｇ、コレステロールを２．１、３．７もしくは４．６ｍｇおよびｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを２．１ｍｇ秤量し、５０ｍｌのナスフラスコ内で混合した。混合した脂質を３ｍｌの有機溶媒（容量比：クロロホルム：メタノール＝９：１；容量比）で溶解し、湯浴型ソニケータにより５分間ソニケーションを行った後、ロータリーエバポレーターで乾燥後、一晩、真空乾燥することにより溶媒を完全に除去し脂質フィルムを調製した。【０１７９】
次にナスフラスコを６０℃の温浴中に５分間浸漬させた後、１ｍｌのＣＥＰ緩衝液（クレモホール  ＥＬ：エタノール：ＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）＝１２：１２：７６；容量比）を加え脂質フィルムを溶かし、Ｍｕｌｔｉ  Ｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＭＬＶ）を調製した。これを５分間のソニケーションを行うことにより、Ｓｍａｌｌ  Ｌａｍｅｌｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅ（ＳＬＶ）を調製した。未包入の緩衝液及び遊離の脂質を取り除くために限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を行った。【０１８０】
調製したリポソームへ、上述の１ｍｇ／ｍｌのｇＰＴＸ溶液（溶媒：４０％ＥＧを含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．４））を１ｍｌ加え、６０℃の湯欲中に１５分間浸漬させた。未包入の薬剤溶液を取り除くため限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を行った。以上の操作をさらに２回行い、薬剤の封入を行った。封入後、ＰＢＳ洗浄を行い、未包入の薬剤溶液を完全に除去した。【０１８１】
得られたリポソームに内包されたパクリタキセルモノグリコシドの効率は、内包された薬剤含有量、及び粒子径を、上述の試験例２と同様の方法で測定並びに算出した。これらの結果を下記の表５に示す。【０１８２】
【表５】
0005490326.tif 000011
【０１８３】
表５に示すように、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ（コレステロール）の重量比が３：１、３：２、及び３：３の全てにおいて、内包率が６０％以上と非常に高い効率を発揮した。更に、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌの重量比が３：１及び３：２の場合、ｇＰＴＸを内包しても平均粒子径にほとんど変化が無かった。【０１８４】
また、得られたｇＰＴＸを内包するリポソームからのｇＰＴＸのリーク試験を行ったところ、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌの重量比が３：１の場合に最も優れたｇＰＴＸの担持・保持効果を発揮することも明らかとなった（データ示さず）。【０１８５】
試験例７：ｇＰＴＸ内包リポソームの調製改変法（加温時間の検討）
試験例６に示す実験において、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌの物質量比が３：１とした場合の加温時間を、５分、１０分、３０分、及び６０分とした場合の封入効率を測定した。測定方法は、上述の試験例２と同様の方法で測定し、算出した。これらの結果を下記の表６に示す。【０１８６】
【表６】
0005490326.tif 000012
【０１８７】
表６に示す結果から、加温時間を１５分とした場合に最も効率的にｇＰＴＸをリポソーム内に内包させることができる結果が明らかとなった。【０１８８】
試験例８：改変法で得られたｇＰＴＸ内包リポソームを用いた急性毒性試験
上述の試験例７にて得られたｇＰＴＸ内包リポソーム（ｇＰＴＸ−Ｌ）を用いて、急性毒性試験を行った。【０１８９】
具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、６週齢）にｇＰＴＸ、ｇＰＴＸ−Ｌ、ＣＥＰ  ｂｕｆｆｅｒ（クレモホール：エタノール：超純水＝１２：１２：７６；容量比）、及びＰＢＳを、それぞれ尾静脈注射により３時間のインターバルをおき、２回の投与を行った（Ｎ＝４）。1回の投与は２００μｌ／２０ｇで行った。ｇＰＴＸの合計投与量はｇＰＴＸに換算してそれぞれ総量で１５０及び１００ｍｇ／ｋｇである。投与途中及び投与後経過観察を行った。結果を図３に示す。【０１９０】
図３に示すように、総量で１５０ｍｇ／ｋｇとなるようにｇＰＴＸ投与した群では、投与後１日で３匹の死亡が確認され、ＣＥＰ  ｂｕｆｆｅｒを投与した群では、投与後１日で２匹の死亡が確認された。一方で、総量でｇＰＴＸが１５０ｍｇ／ｋｇとなるようにｇＰＴＸ−Ｌを投与した群では、ＰＢＳと同様に１４日間もの間、生存率が１００％であった。【０１９１】
次いで、図４に上述の各投与群における体重の変化を測定した。ｇＰＴＸを投与した群では、著しい体重の減少が確認されたが、ｇＰＴＸの総量として同量となるｇＰＴＸ−Ｌを投与した群では、ＰＢＳを投与した群と同様の体重推移が確認された。これらの結果から、ｇＰＴＸを内包するリポソームは、ｇＰＴＸに比べて優れた安全性を示すことが明らかとなった。【０１９２】
試験例９：改変法で得られたｇＰＴＸ内包リポソームを用いた細胞送達実験
上述のｇＰＴＸを内包するリポソーム（ｇＰＴＸ−Ｌ）に対して、ＰＢＳに溶解させた３ｍｇ／ｍｌのＭａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを４７０μｌ加え、５０℃の湯浴中に１０分間浸漬させた。【０１９３】
同時に、リポソームに結合させる抗体を調製した。ＨＥＰＥＳ緩衝液（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に溶解した１．５ｍｇのＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ溶液に５００ｎｍｏｌの２−ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ溶液を加え、１時間、室温、遮光下で反応させＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂにＳＨ基を導入した。反応させた溶液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて未反応物質を除去し、ＰＢＳへと緩衝液の交換を行った。【０１９４】
次いで、ＳＨ基を導入したＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂ溶液とリポソーム溶液とを混合し、４℃、一晩、振盪することによりリポソームにＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを結合させた。未反応のＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂを取り除くため限外濾過（ＶＩＶＡＳＰＩＮ  ２  ３００Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社製））を行った。これによって、抗体が結合したｇＰＴＸを内包するリポソーム（ｇＰＴＸ−ＩＬ）を得た。【０１９５】
また、対照としてリポソームの調製においてはリポソーム溶液に３ｍｇ／ｍｌのｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを４７０μｌ加え、５０℃の湯浴中に１０分間浸透させた。その後、限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を行った。【０１９６】
上述の試験例３と同様に、抗ガン活性を測定した。使用した細胞は、ヒト由来の乳ガン細胞であるＳＫ−ＢＲ−３及び結腸腺ガンであるＨＴ−２９を用いた。具体的には、９６ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに細胞を５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、２４時間インキュベートした。その後、ＰＴＸ、ｇＰＴＸ、ｇＰＴＸ−Ｌ及びｇＰＴＸ−ＩＬを種々の濃度で加えインキュベートした。【０１９７】
７２時間後、ＭＴＴアッセイにより細胞の生存率を算出した。まず、生存率曲線から５０％の細胞が死滅する濃度（ＩＣ５０）を求めた。次いで、生存率曲線から５０％の細胞が死滅する時間（ＩＴ５０）の算出を行った。上述の細胞を播種した後、上記の生存率曲線からにより求めたＩＣ１００となる濃度で上述の各種を加え、１、２、６、１２、２４、４８、及び７２時間インキュベートした後、培地交換を行った。薬剤を加えてから７２時間後に上記の実験と同様にしてＭＴＴアッセイを行い、生存率を求め、それからＩＴ５０を算出した。結果を表７及び表８に示す。【０１９８】
【表７】
0005490326.tif 000013
【０１９９】
表７に示すＩＣ５０及びＩＣ１００の結果から、ＰＴＸ、ｇＰＴＸ、ｇＰＴＸ−Ｌ、及びｇＰＴＸ−ＩＬは全て、乳ガン細胞及び結腸腺ガン細胞に対して極めて優れた抗ガン活性を発揮することが明らかとなった。また、ｇＰＴＸとＰＴＸの比較から、ＰＴＸに糖鎖が結合したことによって抗ガン活性が減衰していたものの、これをリポソームに内包することによって（ｇＰＴＸ−Ｌ及びｇＰＴＸ−ＩＬ参照。）抗ガン活性がＰＴＸと同等に発揮されることも明らかとなった。但し、ｇＰＴＸ−ＬとｇＰＴＸ−ＩＬとの間においては特に抗ガン活性の差は認められなかった。すなわち、抗体の有無によって抗ガン活性は特に変わらないことが示唆された。【０２００】
【表８】
0005490326.tif 000014
【０２０１】
表８に示す及びＩＴ50の結果からは、ｇＰＴＸ−ＩＬのほうが、ｇＰＴＸ−ＬよりもＩＴ50の数値が低いことが明らかとなった。このことは、各種ガン細胞の死滅させるための時間が短いことを示しており、ＰＴＸがより短時間に効率よくガン細胞に送達され、それによってガン細胞をより速く死滅させることができることを示唆している。【０２０２】
試験例１０：抗体を有するリポソームのインビボ送達実験
次いで、抗体が結合したリポソームの腫瘍組織への送達をインビボでの実験で検証するために、蛍光色素を内包する抗体が結合したリポソームを作製した。具体的には、１０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．３）１ｍｌに溶解させ、１０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ溶液を得た。１０ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ溶液１ｍｌを１バイアルのＣｙ５．５Ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｙｅへ溶解させた。これを室温で３０分間振盪した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて、未反応物を取り除き、Ｃｙ５．５結合ＨＳＡ（ＨＳＡ−Ｃｙ５．５）を回収した。【０２０３】
上記試験例に従って脂質フィルムを調製しこれを６０℃温浴中に５分間浸漬させた後、ＨＳＡ−Ｃｙ５．５溶液を加え、脂質フィルムを溶かした。この溶液を６０℃温浴中に浸漬させながら、３分間ソニケーションを行った。未包入のＨＳＡ−Ｃｙ５．５を取り除くため限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １００Ｋ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製））を行った。その後、得られたリポソームに抗体（Ｔｒａｓｔｕｍａｂ）を、試験例８に示す方法を用いて結合させた。【０２０４】
ＩＣＲーｎｕ／ｎｕマウス（♀、５週齢）へＨＴー２９細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで皮下注射により抗体を結合させたＨＳＡ−Ｃｙ５．５を内包するリポソームを投与した。比較実験として、抗体を結合させないＨＳＡ−Ｃｙ５．５を内包するリポソームも投与した。腫瘍体積がおよそ１００ｍｍ３に達した時点で、ＨＳＡ−Ｃｙ５．５内包リポソーム（Ｌ）または抗体を有するリポソーム（ＩＬ）を尾静脈注射により投与した。投与から１、２、３、４、５、６、２４、及び４８時間後にＣＣＤカメラ（インビボマクロイメージングシステムＩ．Ｃ．Ｅ．）によりＣｙ５．５の蛍光を撮影した（励起光６５０ｎｍ／蛍光波長７１０ｎｍ）。結果を図５及び図６に示す。【０２０５】
図５に示す結果から、抗体の有無にかかわらず、リポソームはＥＰＲ効果によって腫瘍に集積していることが明らかとなった。しかしながら、抗体が結合したリポソームのほうがより効率的に腫瘍組織に集積し、肝臓への集積が少ないことが明らかとなった。【０２０６】
図６に示す結果から、抗体を有するリポソームのほうが抗体を有さないリポソームよりも常に多く腫瘍組織に集積していることが明らかであり、一方で抗体を有さないリポソームは、常に肝臓組織のほうに多く集積していることが明らかとなった。また、抗体を有さないリポソームは投与後４８時間では抗体を有するリポソームとは異なり、腫瘍組織への集積がみられなくなった。【０２０７】
試験例１１：ｇＰＴＸを内包し、抗体を有するリポソームのインビボ抗ガン活性実験
ＩＣＲーｎｕ／ｎｕマウス（♀、５週齢）へＨＴー２９細胞を３．０×１０６ｃｅｌｌｓ  ／ｍｏｕｓｅで皮下注射により投与した。腫瘍体積が５０〜２００ｍｍ３程度になった時点で、上述のｇＰＴＸ、試験例７にて作製したｇＰＴＸーＬ、試験例９にて作成したｇＰＴＸーＩＬ、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、試験例９にてｇＰＴＸを内包させず、且つ抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を結合させずに作製したリポソーム（ｅｍｐｔｙ  Ｌ）、試験例９にてｇＰＴＸを内包させず、且つ抗体（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）を結合させて作製したリポソーム（ｅｍｐｔｙ  ＩＬ）、ＣＥＰ緩衝液、及びＰＢＳを尾静脈注射により３時間のインターバルをおき、２回投与を行った（Ｎ＝４）。１回の投与は２００μｌ／２０ｇで行った。ｇＰＴＸの合計投与量は１５０ｍｇ／ｋｇであり、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂは２００ｍｇ／ｋｇである。投与後の腫瘍体積推移の観察を行った。結果を図に示す。腫瘍体積は下記式（３）により算出した。
腫瘍体積＝（腫瘍短辺２×腫瘍長辺）／２          （３）
また、各投与群の体重推移、及び生存率も測定した。結果を図６〜９に示す。【０２０８】
図６に示す結果から、ｇＰＴＸ−ＩＬは、ｇＰＴＸと同様に顕著に優れた腫瘍増殖を抑制する効果を発揮することが明らかとなった。一方で、他の投与群については、腫瘍増殖抑制効果がほとんど見られなかった。【０２０９】
また、図７に示す結果から、ｇＰＴＸ−ＩＬは投与後に体重の減少がみられたものの、その後回復し、結果として他の投与群等と同様の体重推移となった。【０２１０】
そして、ＣＥＰ投与群は投与後３時間ですべて死亡し、ｇＰＴＸ投与群では投与後３時間で２匹が死亡し、さらに１週間後に１匹死亡した。図７に示す体重推移においてｇＰＴＸ投与群の体重が著しく減少しているのは、死亡したマウスによるものである。【０２１１】
これらの腫瘍増殖効果は、図１０に示す写真像からも明らかに見て取ることができる。【０２１２】
以上のことから、ｇＰＴＸを内包し、且つＨｅｒ２を特異的に認識するモノクローナル抗体であるＴｒａｓｔｕｚｕｍａｂが結合したリポソームは、結腸腺ガンであるＨＴ−２９担癌マウスの腫瘍組織における増殖を顕著に抑制する効果を発揮することが明らかとなった。また、このようなリポソームは、投与によって体重減少も示さず、致死率が低いことから、きわめて副作用が少ないといった効果を発揮することも明らかとなった。以上のことから、斯かるリポソームは、ガン細胞に対して極めて優れた効果を発揮するリポソーム製剤として有用であることが明らかとなった。
【図１】
0005490326.tif 000015
【図２】
0005490326.tif 000016
【図３】
0005490326.tif 000017
【図４】
0005490326.tif 000018
【図５】
0005490326.tif 000019
【図６】
0005490326.tif 000020
【図７】
0005490326.tif 000021
【図８】
0005490326.tif 000022
【図９】
0005490326.tif 000023
【図１０】
0005490326.tif 000024