(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、及びp7タンパク質、前記JFH-1株若しくは前記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株由来のNS2タンパク質又は前記JFH-1株由来のNS2タンパク質と前記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株由来のNS2タンパク質とのキメラNS2タンパク質、並びに、前記JFH-1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質、をコードするそれぞれの領域を、5’側から3’側に向かってこの順序で配置してなるC型肝炎ウイルス由来のキメラ遺伝子を含む核酸であって、
前記Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のプロリン残基は、アラニン又はトレオニンに置換されている、核酸。
【請求項２】
前記Coreタンパク質をコードする領域の5’側に前記JFH-1株の5’非翻訳領域を含み、前記NS5Bタンパク質をコードする領域の3’側に前記JFH-1株の3’非翻訳領域を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
前記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株は、遺伝子型1a、1b又は2aに属する株である、請求項１又は２記載の核酸。
【請求項４】
前記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株は、TH株、Con1株、J1株、及びそれらの派生株からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸であって、前記核酸は、配列表の配列番号１で示される塩基配列若しくは該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むDNA、又は配列表の配列番号３で示される塩基配列若しくは該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むRNAであり、かつ該DNA又はRNAにおいて配列番号１又は３で示される塩基配列の第1322番目〜第1324番目の塩基がアラニンをコードしている、核酸。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸であって、前記核酸は、配列表の配列番号２で示される塩基配列若しくは該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むDNA、又は配列表の配列番号４で示される塩基配列若しくは該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むRNAであり、かつ該DNA又はRNAにおいて配列番号２又は４で示される塩基配列の第1322番目〜第1324番目の塩基がトレオニンをコードしている、核酸。
【請求項７】
配列表の配列番号１で示される塩基配列を含むDNA、配列表の配列番号３で示される塩基配列を含むRNA、又は、配列表の配列番号６で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNA若しくはRNAである、請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸。
【請求項８】
配列表の配列番号２で示される塩基配列を含むDNA、配列表の配列番号４で示される塩基配列を含むRNA、又は、配列表の配列番号７で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むDNA若しくはRNAである、請求項１〜４のいずれか一項記載の核酸。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項記載の核酸をウイルスゲノムとして含有するキメラC型肝炎ウイルス粒子。
【請求項１１】
請求項１０に記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子を生産する細胞。
【請求項１２】
前記細胞は、Huh-7又はその派生株である、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
被検物質の存在下で、
(a) 請求項１１又は１２記載の細胞、又は
(b) 請求項１０記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子及びC型肝炎ウイルス感受性細胞、
を培養し、得られる培養物中の前記核酸由来のレプリコンRNA又はウイルス粒子を検出することを含む、抗C型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
請求項１０記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子を含む、C型肝炎ウイルスワクチン。
【請求項１５】
請求項１０記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子を抗原として非ヒト動物に投与することを特徴とする、抗C型肝炎ウイルス抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、C型肝炎ウイルス由来のキメラ遺伝子を含む核酸、JFH-1株とJFH-1株以外の株（好ましくは遺伝子型1a、1b又は2aに属する株）とのキメラC型肝炎ウイルス粒子、該ウイルス粒子を生産するためのベクター、及び該ウイルス粒子を生産する細胞に関する。【０００２】
本発明はまた、該ウイルス粒子を用いて抗HCV薬をスクリーニングするための方法、該ウイルス粒子を不活化又は弱毒化して得られるワクチン、及び該ウイルス粒子を抗原として認識する抗C型肝炎ウイルス抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
C型肝炎ウイルス（以下、単に「HCV」と称する）は、1989年、Chooらによって非A非B肝炎の原因ウイルスとして発見同定された（非特許文献１）。HCV感染は慢性肝炎ののち、持続感染したまま肝硬変、肝癌へと移行する主要な原因であり、全世界で約1億7千万人、日本においても約200万人の感染患者が存在すると言われている。主な感染経路は血液感染であり、輸血用血液のスクリーニングが可能となってからは我が国の新たな感染者は激減したとはいうものの、なお多くのウイルスキャリアーが存在すると考えられている。【０００４】
現在の治療法は主としてPEG化インターフェロンやPEG化インターフェロンと抗ウイルス薬リバビリン(ribavirin)の併用である。HCVは現在までに6つの遺伝子型に分類されているが、日本においては遺伝子型1b及び2aが主である。特に遺伝子型1bに関してはインターフェロン及びリバビリンの投与によっても完全に体内からウイルス除去ができず、治療効果も十分ではないのが現状である。そのような経緯から、発症予防やウイルスの排除を目的とした新たな抗ウイルス薬やワクチンの開発が望まれている。【０００５】
HCV治療薬の開発を進めるにあたり、チンパンジー以外にウイルス感染を反映する有効な動物がないこと、効率的なin vitroウイルス培養系が存在しなかったことが障害となっていた。近年、HCV-RNAの複製を評価できるHCVレプリコンが開発され（非特許文献２）、ウイルス複製阻害に関するHCV阻害薬のスクリーニング系として重要な進歩を遂げた。【０００６】
HCVは、ゲノム長約9.6kbからなる＋鎖の一本鎖RNAウイルスであり、翻訳後にプロテアーゼによる開裂を受けて10種類のウイルスタンパク質（Core、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及びNS5B）となる前駆体タンパク質をコードする遺伝子を有している。レプリコンシステムは、HCVの構造タンパク質の翻訳領域を薬剤耐性遺伝子に組換え、さらにその下流にEMCV(脳心筋炎ウイルス)のIRESを挿入したもので、その組換えRNAが導入された細胞内ではRNA複製が認められる。しかしながら、HCVの構造タンパク質を含めた全長ゲノムRNAを細胞に導入しても、培養液中へのウイルス粒子の放出は認められていなかった（非特許文献３）。【０００７】
近年、Wakitaらによって劇症肝炎患者より単離された遺伝子型2aに属するHCV株JFH-1が見出され、Huh-7細胞（肝癌細胞株）培養液中に感染性のウイルス粒子として放出されることが明らかとなった（特許文献１、非特許文献４）。この感染性HCV粒子のin vitro培養系は抗HCV薬開発において有用なスクリーニングツールとなり得るとともに、HCVワクチンの作製にも有効な手段となると期待され、in vitro培養系でのHCV粒子産生の研究が進み、ウイルス粒子を産生できるHCVゲノムは、JFH-1株とJFH-1株以外のHCVとのキメラHCVであることが判明した。このキメラHCVは、JFH-1ゲノムの構造遺伝子であるCore、E1、E2及びp7タンパク質コード部分を他のHCV株の構造遺伝子と組換えることにより作製することができる。【０００８】
JFH-1株以外のHCV株とJFH-1株のキメラHCVとして、J6CF株（遺伝子型2a）とJFH-1株のキメラHCV（非特許文献５）、及びH77株（遺伝子型1a）とJFH-1株のキメラHCV（特許文献２、非特許文献６）、及び、S52株（遺伝子型3a）とJFH-1株のキメラHCV(非特許文献７)が知られている。【０００９】
非特許文献８には、J6CFの構造遺伝子とJFH-1の非構造遺伝子からなるキメラHCVのウイルス産生量が最も高いこと、遺伝子型1bであるCon1株とJFH-1株のキメラHCVの感染性HCV粒子の生産量はその1/10以下であることが示されている。その他の遺伝子型1b株とJFH-1株のキメラとして、特許文献３にTH株の構造タンパク質をコードする領域をJFH-1ゲノムと組み換え、そのコード遺伝子上流に薬剤耐性遺伝子を挿入したゲノム（全長ゲノムレプリコンRNA）を作製し、Huh-7細胞に導入後、薬剤耐性株を取得することでその培養上清に感染性HCV粒子が産生されたことが記載されているが、その生産性については明記されていない。【００１０】
このような状況にあって、現在の治療法に対する著効率が低い上、患者数の多い遺伝子型1bの構造を有する感染性HCV粒子を高産生でき、かつ持続感染系で培養可能なHCV粒子生産法に対するニーズがある。
【特許文献１】国際公開WO05080575A1
【特許文献２】国際公開WO06096459A2
【特許文献３】国際公開WO06022422A1
【非特許文献１】Choo, QL.ら, Science, 244:359-362, 1989
【非特許文献２】Lohmann, V.ら, Science., 285:110-113, 1999
【非特許文献３】Pietschmann, T.ら, J. Virol., 76:4008-4021, 2002
【非特許文献４】Wakita, T.ら, Nat. Med., 11:791-796, 2005
【非特許文献５】Lindenbach, B. D.ら, Science, 309:623-626, 2005
【非特許文献６】MinKyung, Y.ら, J. Virol., 81:629-638, 2007
【非特許文献７】Gottwein, JMら, Gastroenterology 133:1614-1626, 2007
【非特許文献８】Pietschmann, T.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 103:7408-7413, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、遺伝子型1a、1b又は2aに属するJFH-1株以外のHCV株の構造タンパク質を有するHCV粒子を効率よく作製する方法、及び作製されたHCV粒子を用いたワクチン等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、HCV粒子の細胞培養での生産性を検討し、HCV増殖時に出現する適応変異（adaptive mutation）を見出した。この適応変異を導入することにより、変異導入前の野生型よりもHCV粒子の生産性を顕著に高めることができ遺伝子型1a、1b又は2aに属するHCV株の構造タンパク質を有するHCV粒子を持続感染系にて作製できることを明らかとして、本発明を完成させた。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（２２）に関する。【００１４】
（１）JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、及びp7タンパク質、上記JFH-1株若しくは上記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株由来のNS2タンパク質又は上記JFH-1株由来のNS2タンパク質と上記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株由来のNS2タンパク質とのキメラNS2タンパク質、並びに、上記JFH-1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質、をコードするそれぞれの領域を、5’側から3’側に向かってこの順序で配置してなるC型肝炎ウイルス由来のキメラ遺伝子を含む核酸であって、
上記Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のプロリン残基は、プロリン残基以外のアミノ酸残基に置換されている、核酸。【００１５】
（２）上記Coreタンパク質をコードする領域の5’側に上記JFH-1株の5’非翻訳領域を含み、上記NS5Bタンパク質をコードする領域の3’側に上記JFH-1株の3’非翻訳領域を含む、上記(1)に記載の核酸。【００１６】
（３）上記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株は、遺伝子型1a、1b又は2aに属する株である、上記(1)又は(2)に記載の核酸。【００１７】
（４）上記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株は、TH株、Con1株、J1株、及びそれらの派生株からなる群から選択される、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の核酸。【００１８】
（５)上記プロリン残基以外のアミノ酸残基は、Ala、Leu、Ile、Val、Thr、及びSerからなる群から選択される、上記(1)〜(4)のいずれかに記載の核酸。【００１９】
（６）上記核酸は、配列表の配列番号1で示される塩基配列若しくは該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むDNA、又は配列表の配列番号3で示される塩基配列若しくは該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むRNAである、上記(1)〜(5)のいずれかに記載の核酸。【００２０】
（７）上記核酸は、配列表の配列番号2で示される塩基配列若しくは該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むDNA、又は配列表の配列番号4で示される塩基配列若しくは該塩基配列と90％以上の同一性を有する塩基配列を含むRNAである、上記上記(1)〜(5)のいずれかに記載の核酸。【００２１】
（８）上記(1)〜(7)のいずれかに記載の核酸を含む、ベクター。【００２２】
（９）上記(1)〜(7)のいずれかに記載の核酸をウイルスゲノムとして含有するキメラC型肝炎ウイルス粒子。【００２３】
（１０）上記(9)に記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子を生産する細胞。【００２４】
（１１）上記細胞は、Huh-7又はその派生株である、上記(10)に記載の細胞。【００２５】
（１２）被検物質の存在下で、
(a) 上記(10)又は(11)に記載の細胞、又は
(b) 上記(9)に記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子及びC型肝炎ウイルス感受性細胞、
を培養し、得られる培養物中の前記核酸由来のレプリコンRNA又はウイルス粒子を検出することを含む、抗C型肝炎ウイルス物質をスクリーニングする方法。【００２６】
（１３）上記(9)に記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子を含む、C型肝炎ウイルスワクチン。【００２７】
（１４）上記キメラC型肝炎ウイルス粒子は、不活性化又は弱毒化されている、上記(13)に記載のＣ型肝炎ウイルスワクチン。【００２８】
（１５）上記(9)に記載のキメラＣ型肝炎ウイルス粒子を抗原として認識する、抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体。【００２９】
（１６）上記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株は、TH株又はその派生株である、上記(4)に記載の核酸。【００３０】
（１７）上記プロリン残基以外のアミノ酸残基他は、Ala又はThrである、上記(5)に記載の核酸。【００３１】
（１８）上記(10)又は(11)に記載の細胞を培養するステップと、
上記(9)に記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子を回収するステップと、
を含む、キメラC型肝炎ウイルス粒子の作製方法。【００３２】
（１９）上記(9)に記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子を不活性化又は弱毒化し、不活性化又は弱毒化キメラC型肝炎ウイルス粒子を調製するステップと、
上記不活性化又は弱毒化キメラC型肝炎ウイルス粒子をC型肝炎ウイルスワクチンの形態に製剤化するステップと、
を含む、C型肝炎ウイルスワクチンの製造方法。【００３３】
（２０）不活性化若しくは弱毒化された又はされない上記(9)に記載のキメラC型肝炎ウイルス粒子を動物（ヒトを除く）に免疫するステップを含む、抗C型肝炎ウイルス抗体の作製方法。【００３４】
（２１）上記抗C型肝炎ウイルス抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体である、上記(20)に記載の作製方法。【００３５】
（２２）上記抗C型肝炎ウイルス抗体は、ヒト化抗体である、上記(20)に記載の作製方法。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のC型肝炎ウイルス由来のキメラ遺伝子を含む核酸は、野生型HCV粒子よりも産生性が顕著に高いキメラHCV粒子の生産に使用できる。また、本発明のキメラHCV粒子は、野生型HCV粒子に比較して格別高い生産性と、細胞への高感染性を有するという利点があるため、HCVの予防又は治療用ワクチンとして、また、HCVに対する抗体を誘導するツールとしても利用価値が高い。【００３７】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-116193号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１はpTH/JFH1プラスミドの作製方法を示す。pJFH1の配列のうち、JFH-1のCoreタンパク質のアミノ酸配列のN末端のアミノ酸残基を第1番目とした場合における第1番目のアミノ酸残基から第846番目のアミノ酸残基までをコードする塩基配列を、TH株のCoreタンパク質のアミノ酸配列のN末端のアミノ酸残基を第1番目とした場合における第1番目のアミノ酸残基から第843番目のアミノ酸残基までをコードする塩基配列に組換えた。
【図２】図２はpTH/JFH1をもとに合成したRNAをHuh-7細胞に導入後、継代培養を繰り返し、その継代時ごとに測定した培養上清中のHCV Coreタンパク質の濃度変化を示す。培養上清中のCoreタンパク質は23日目まで減少したが、その後、増加し34日目以降に一定の高い値を示した。
【図３Ａ】図３ＡはpTH/JFH1(PA)プラスミドの作製方法を示す。
【図３Ｂ】図３ＢはpTH/JFH1(PT)プラスミドの作製方法を示す。
【図４】図４はpTH/JFH1、pTH/JFH1(PA)及びpTH/JFH1(PT)をもとに合成したRNAをHuh-7細胞に導入後、継代培養を繰り返し、その継代時ごとに測定した培養上清中のHCV Coreタンパク質の濃度変化を示す。TH/JFH-1は図２と同様に導入後29日目まで減少したが、その後、増加した。一方、TH/JFH-1(PA)及びTH/JFH-1(PT)では、導入後初期から培養上清中に高いCoreタンパク質が認められ、いずれの場合もTH/JFH-1と比較して高い値を維持していた。
【図５Ａ】図５ＡはpTH/JFH1及びpTH/JFH1(PA)をもとに合成したRNAをHuh-7細胞に導入後96時間後までの培養上清中のHCV Coreタンパク質の濃度変化を示す。TH/JFH-1(PA)の培養上清では、TH/JFH-1と比較してRNA導入48時間後からCoreタンパク質の産生量が高くなっていた。
【図５Ｂ】図５Ｂは図５Ａで得られた各培養上清を未感染Huh-7細胞に接種したときの感染力価を示す。TH/JFH-1(PA)の培養上清では、TH/JFH-1と比較してRNA導入48時間後から感染力価が高かった。
【図６】図６に示す表は、図５に示す実験で得られた培養上清のHCV Coreタンパク質濃度及びHuh-7細胞に対する感染力価と、そのときの細胞内のHCV Coreタンパク質濃度を定量し、表としたものである。4時間後の細胞内のCoreタンパク質に対する96時間後のCoreタンパク質の比は、細胞内でのTH/JFH-1及びTH/JFH-1(PA) RNAの自律複製の度合を表す。HCV Core分泌効率は培養上清中へのHCV粒子の分泌効率の指標であり、その効率は（96時間後の培養上清中のCoreタンパク質量）を（96時間後の培養上清中のCoreタンパク質量＋96時間後の細胞内のCoreタンパク質量）で除したものとして計算した。TH/JFH-1(PA) RNAを導入した細胞では培養上清中へのHCV粒子の分泌効率がTH/JFH-1と比較して上昇していた。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明の核酸は、一般的に、JFH-1株の非構造タンパク質をコードする塩基配列と、JFH-1株以外のHCV株の構造タンパク質をコードする塩基配列とを含むHCVのキメラ遺伝子を特徴とし、これに加えて、特定のアミノ酸変異を有するE1タンパク質をコードする塩基配列を含むことを特徴としている。【００４０】
具体的には、本発明の核酸は、
（１）JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株由来のCoreタンパク質、E1タンパク質、E2タンパク質、及びp7タンパク質、上記JFH-1株若しくは上記JFH-1株以外のＣ型肝炎ウイルス株由来のNS2タンパク質又は上記JFH-1株由来のNS2タンパク質と上記JFH-1株以外のC型肝炎ウイルス株由来のNS2タンパク質とのキメラNS2タンパク質、並びに、上記JFH-1株由来のNS3タンパク質、NS4Aタンパク質、NS4Bタンパク質、NS5Aタンパク質、及びNS5Bタンパク質、をコードするそれぞれの領域を、5’側から3’側に向かってこの順序で配置してなるC型肝炎ウイルス由来のキメラ遺伝子を含む核酸であって、
（２）上記Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基であるメチオニン残基を1番目としたとき第328番目(或いは、E1タンパク質のN末端のアミノ酸残基を1番目としたとき137番目)のアミノ酸残基が、プロリン残基からプロリン残基以外のアミノ酸残基に置換された複合タンパク質（前駆体タンパク質）をコードする塩基配列を含む、核酸である。【００４１】
本発明の核酸において、NS2タンパク質は、JFH-1株由来であってもよいしJFH-1株以外のHCV株由来であってもよいし、或いは、JFH-1株以外のHCV株由来のNS2タンパク質の一部とJFH-1株由来のNS2タンパク質の残部からなるキメラタンパク質であってもよく、この場合該キメラタンパク質は野生型のNS2タンパク質と同様の機能を有するものであり、例えば、JFH-1株以外のHCV株由来のNS2タンパク質の一部がNS2タンパク質のN末端から33位までのアミノ酸配列からなる場合、JFH-1株由来のNS2タンパク質の残部が34位からC末端までのアミノ酸配列からなる。【００４２】
また、上記C型肝炎ウイルス由来のキメラ遺伝子としては、例えば、配列表の配列番号１若しくは２の第341番目から第9433番目の塩基からなるDNA、又は配列表の配列番号３若しくは４の第341番目から第9433番目の塩基からなるRNAを例示できる。【００４３】
本発明の実施形態において、本発明の核酸はさらに、上記Coreタンパク質をコードする領域の5’側に上記JFH-1株の5’非翻訳領域を含み、上記NS5Bタンパク質をコードする領域の3’側に上記JFH-1株の3’非翻訳領域を含むことができる。【００４４】
本発明の実施形態において、上記JFH-1株以外のHCV株は、遺伝子型1a、1b又は2aに属する株である。遺伝子型1bに属する株には、例えばTH株、Con1株、J1株及びそれらの派生株が含まれる。遺伝子型1aに属する株には、例えばH77株が含まれる。遺伝子型2aに属する株には、例えばJ6CF株などが含まれる。好適な株は、遺伝子型1bに属する上記例示のような株であり、さらに好ましくはTH株又はその派生株である。本発明では、例示した株由来の上記Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のアミノ酸残基はプロリン残基以外のアミノ酸残基に変異していることが必要である。【００４５】
本発明の別の実施形態において、プロリン残基以外の別のアミノ酸残基は、例えばAla、Leu、Ile、Val、Thr又はSer、好ましくはAla又はThrである。【００４６】
本発明の実施形態において、上記核酸は、配列番号１で示される塩基配列を含むDNA、又は、配列番号3で示される塩基配列を含むRNAである。或いは、別の実施形態において、上記核酸は、配列番号2で示される塩基配列を含むDNA、或いは、配列番号4で示される塩基配列を含むRNAである。これらの核酸は、JFH-1株とTH株とに由来するキメラ核酸であり、配列番号1又は3の核酸は、上記Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のアミノ酸残基がAlaとなるコドン（1322番目〜1324番目の塩基）を含んでおり、一方、配列番号2又は4の核酸は、上記Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のアミノ酸残基がThrとなるコドン（1322番目〜1324番目の塩基）を含んでいる以外は、それぞれ同一の塩基配列からなる。【００４７】
さらにまた、配列番号1で示されるDNAのORFに相当する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列(CoreのN末端からNS5BのC末端までの配列)は、配列番号6に示されているし、また、配列番号2で示されるDNAのORFに相当する塩基配列によってコードされるアミノ酸配列(CoreのN末端からNS5BのC末端までの配列)は、配列番号7に示されている。【００４８】
本発明の上記塩基配列は、配列番号1、2、3又は4の塩基配列と90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98〜99％以上同一性を有する塩基配列からなっていてもよいが、この場合、配列番号1、2、3又は4の塩基配列の5’末端の塩基から数えて第1322番目〜第1324番目の塩基がプロリン以外のアミノ酸残基（上記参照）をコードしているものとする。【００４９】
また本発明の上記アミノ酸配列は、配列番号5又は6のアミノ酸配列と90％以上、好ましくは95％以上、さらに好ましくは98〜99％以上同一性を有するアミノ酸配列からなっていてもよいが、この場合、Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のアミノ酸残基がプロリン残基以外のアミノ酸残基（上記参照）をコードしているものとする。【００５０】
これは、RNAウイルスであるHCVは、いくつかの遺伝子型が知られているとおり、構造領域、非構造領域及び/又は(5’若しくは3’)非翻訳領域は突然変異を起こしやすいためである。【００５１】
本発明において、上記の「Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のアミノ酸残基」とは、配列表の配列番号5、6又は7で示されるアミノ酸配列（CoreのN末端からNS5BのC末端までの配列）に対してアラインメントしたHCVのCoreのN末端からNS5BのC末端までを含むアミノ酸配列において、配列表の配列番号5、6又は7の第328番目のアミノ酸残基と同位置にアラインメントされるアミノ酸残基を、意味する。また本発明において「Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のプロリン残基は、プロリン残基以外のアミノ酸残基に置換されている」とは、上記のようにして配列表の配列番号5の第328番目のプロリン残基と同位置にアラインメントされる、所定のアミノ酸配列中のアミノ酸残基が、プロリン残基以外のアミノ酸残基であることを意味する。【００５２】
本明細書で使用する、2つの配列間の「％同一性」は、塩基配列又はアミノ酸配列が共有する位置の数の関数であり、ギャップを導入するか導入しないかで2つの配列を整列させたとき、位置の総数に対する同一位置の数のパーセントを意味する。％同一性は、BLASTN、BLASTX、Gapped BLASTなどの数学的アルゴリズム(KarlinとAltschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993; Altschulら, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997など)を利用することによって決定しうる。【００５３】
本発明は、上記核酸を含むベクター又はキメラHCV粒子を提供する。このキメラHCV粒子は、野生型と比べて、細胞培養系で高い効率で生産可能であるし、また高い感染性を有しているという特徴をもつ。この高効率生産や高感染性という効果は、上記Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から数えて第328番目のアミノ酸残基がPro以外のアミノ酸残基（好ましくはAla又はThr）への変異に起因することは、図4及び図5に示された結果から明らかである。【００５４】
本発明の核酸、ベクター及びキメラHCV粒子の作製に際しては、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学、ウイルス学などの従来技術を用いることができる。このような技術は、学術文献、特許文献、専門書などに記載されており、たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第3版, 2001, CSHL PRESS)、Mahyら、Virology: a practical approach（1985,IRL PRESS）、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (第3版, 1995, John Wiley & Sons)、米国特許第4,683,202号(Cetus Corporation; PCR法)などを含む。【００５５】
本発明の核酸又は感染性HCV粒子を生産するためには、JFH-1株又はJFH-1株以外のHCV株由来のゲノムRNAのcDNAをクローン化したベクターを鋳型とし、該cDNAの配列から設計された正方向及び逆方向プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を実施することによって、目的の配列部分を増幅することができる。具体的には、図1又は図3に示されるように、互いに重複配列を有する異なるPCR産物を複数合成し、それらのPCR産物を混合し、これを鋳型として、目的核酸の5'端を含む正方向プライマーと、該核酸の相補鎖の5'端を含む逆方向プライマーを用いるPCRを実施することによって該目的核酸を増幅することができる。合成した核酸の各末端を制限酵素で切断し、同じ酵素で切断したプラスミドpJFH1（Wakita, T.ら, Nat. Med., 11:791-796, 2005；国際公開WO2004/104198）に連結する。このような操作の基本技術はまた、例えばWO04104198A1、WO06022422A1、Wakita, T.ら, Nat. Med., 11:791-796, 2005、及びLindenbach, B. D.ら, Science, 309:623-626, 2005にも記載されている。【００５６】
PCR反応は、非限定的に、鋳型、プライマー、dNTPs、耐熱性ポリメラーゼ、Mg2+含有バッファーの存在下で、94〜98℃ 約10〜60秒、55〜58℃ 約10〜60秒、72℃ 約30〜60秒からなる工程を1サイクルとして20〜40サイクルの操作条件を含む。【００５７】
HCVゲノムは、一般に、5'非翻訳領域、Coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域、NS2タンパク質コード領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3'非翻訳領域を含むRNAである。これに対して、感染性HCV粒子を生成できる本発明の核酸は、2種類又はそれ以上のHCV株のウイルスゲノムRNA、或いは該RNAをコードするDNA、から構成される。【００５８】
本発明の核酸は、例えば、5'非翻訳領域、NS2タンパク質の一部をコードする領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3’非翻訳領域がJFH-1株に由来し、Coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域、及びNS2タンパク質の残部をコードする領域がJFH-1株以外のHCV株に由来する。ここで、5'非翻訳領域は、JFH-1株以外のHCV株由来であってもよい。【００５９】
或いは、本発明のキメラ核酸の別の例は、5'非翻訳領域、Coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域、及びNS2タンパク質コード領域がJFH-1株以外のHCV株に由来し、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3'非翻訳領域がJFH-1株に由来する。【００６０】
或いは、本発明の核酸の別の例は、5'非翻訳領域がJFH-1株に由来し、Coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域、及びNS2タンパク質の一部をコードする領域がTH株に由来し、NS2タンパク質の残部をコードする領域、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域及び3'非翻訳領域がJFH-1株に由来するが、但し、Coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域がTH株由来であれば、このキメラ核酸に限定されるものではない。【００６１】
以下に、本発明のベクター、感染性HCV粒子、HCV粒子産生細胞、HCV粒子の利用について、さらに詳しく説明する。【００６２】
（１）ベクターの作製
C型肝炎ウイルス（HCV）のゲノムは、約9600ヌクレオチドからなる＋鎖の一本鎖RNAである。このゲノムRNAは、5'非翻訳領域（5'NTR又は5'UTRとも表記する）、構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、及び3'非翻訳領域（3'NTR又は3'UTRとも表記する）からなる。その構造領域にはHCVの構造タンパク質がコードされており、非構造領域には複数の非構造タンパク質がコードされている。【００６３】
このようなHCVの構造タンパク質（Core、E1、E2及びp7）と非構造タンパク質（NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及びNS5B）は、翻訳領域から一続きのポリプロテイン複合タンパク質（前駆体タンパク質）として翻訳された後、感染細胞内でプロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、生成される。これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質（すなわち、HCVのウイルスタンパク質）のうち、Coreはコアタンパク質であり、E1及びE2はエンベロープタンパク質である。非構造タンパク質はウイルス自身の複製に関与するタンパク質であり、NS2はメタロプロテアーゼ活性、NS3はセリンプロテアーゼ活性（N末端側の3分の1）とヘリカーゼ活性（C末端側の3分の2）を有することが知られている。さらに、NS4AはNS3のプロテアーゼ活性に対するコファクターであり、NS5BはRNA依存RNAポリメラーゼ活性を有することも報告されている。【００６４】
HCVはエンベロープと呼ばれる被膜で包まれている。エンベロープは宿主細胞の膜に由来する成分とウイルスに由来するタンパク質からなる。HCVのエンベロープを構成するタンパク質は、エンベロープタンパク質1（E1と称する）、エンベロープタンパク質2（E2と称する）及びp7からなる。特にE1及びE2はそのC末端に膜貫通領域を持っており、HCVの膜にこの膜貫通領域を介してアンカーされている。従って、HCVのE1及びE2タンパク質は外界に面しており、HCVはE1及び/又はE2を介在して細胞に接着し感染する。【００６５】
HCV株の塩基配列を用いた系統解析法では、HCVは遺伝子型1から遺伝子型6の6タイプに分類され、さらにそれら各タイプがいくつかのサブタイプに分類される。そして、HCVの複数の遺伝子型についてはそのゲノム全長の塩基配列も決定されている（Simmonds, P. ら, Hepatology, 10:1321-1324, 1994、及びChoo, Q. L. ら, Science, 244:359-362, 1989、Okamoto, H. ら, J. Gen. Virol., 73:73-679, 1992、Mori, S. ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 183:334-342, 1992）。具体的には、遺伝子型1aのHCV株としては、H77株（GenBank アクセッション番号AF011751）、遺伝型1b型のHCV株としては、J1株、(GenBank アクセッション番号D89815)、Con1株（GenBank アクセッション番号AJ238799、Con-1株、con1株と称することもある）及びTH株(Wakita, T. ら, J. Biol. Chem., 269, 14205-14210, 1994、特開2004-179)、遺伝子型2aのHCV株としては、JFH-1株（GenBank アクセッション番号AB047639、JFH1株と称することもある）、J6CF株(GenBank アクセッション番号AF177036)、JCH-1(GenBank アクセッション番号AB047640)、JCH-2(GenBank アクセッション番号AB047641)、JCH-3(GenBank アクセッション番号AB047642)、JCH-4(GenBank アクセッション番号AB047643)、JCH-5(GenBank アクセッション番号AB047644)及びJCH-6(GenBank アクセッション番号AB047645)が知られている。さらに遺伝子型2bのHCV株としては、HC-J8株(GenBank アクセッション番号D01221)などが、遺伝子型3aのHCV株としてはNZL1株(GenBank アクセッション番号D17763)、S52(GenBank アクセッション番号  )などが、遺伝子型3bのHCV株としてはTr-Kj（GenBank アクセッション番号D49374）などが、遺伝子型4aのHCV株としてはED43(GenBank アクセッション番号  )などが知られている。その他の株についても既にGenBankアクセッション番号のリストが報告されている(Tokita, T. ら, J. Gen. Virol., 79:1847-1857, 1998、Cristina, J. & Colina, R., Virol. J., 3: 1-8, 2006)。【００６６】
本発明に記載のJFH-1株及びJFH-1株以外のHCV株のゲノム塩基配列は、上記の文献又はGenBankから入手可能であり、また、JFH-1株以外のHCV株は、上記の遺伝子型から選択しうるが、好ましい遺伝子型は1a、1b又は2aに属する株である。【００６７】
キメラHCV遺伝子は、各HCVゲノムRNAのcDNAをクローン化したベクターを鋳型にして、合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、それぞれのHCV遺伝子の必要な領域を増幅し、連結することにより作製することができる。【００６８】
さらに、キメラHCV遺伝子cDNAを、プラスミドpJFH1（Wakita, T. et al., Nat. Med., 11:791-796, 2005、国際公開WO2004/104198）のT7プロモーターなどのプロモーターの下流の適切な制限サイトに連結し、HCVゲノムRNAを合成するためのベクターを作製することができる。このベクターから転写されたRNAをHuh-7などの細胞に導入すると、ウイルスの複製及びパッケージングが起こり、感染性HCV粒子を産生することができる。【００６９】
（２）HCV粒子の作製
プロモーターの制御下にクローン化したHCV cDNAからRNAを合成し、このRNAを細胞に導入することでキメラHCV粒子を作製することができる。【００７０】
すなわち、キメラHCV粒子は、該HCV粒子を生産する細胞を培養するステップと、該HCV粒子を回収するステップとを含む方法によって作製することができる。ここで、HCV粒子を生産する細胞は、本発明のキメラHCV粒子を、HCV感受性細胞（すなわち、HCV粒子形成を許容する細胞）に感染させることによって得ることができる。【００７１】
プロモーターとしては、限定するものではないが、T7プロモーター、SP6プロモーター、T3プロモーターなどが挙げられるが、T7プロモーターが好ましい。【００７２】
T7プロモーターの制御下にHCV cDNAをクローン化した核酸を鋳型として、in vitroでRNAを作製する方法は、例えば、MEGAscript T7 kit(Ambion社)を用いて実施することができる。【００７３】
RNAを導入する細胞はHCV粒子形成を許容する細胞であればよく、Huh-7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293、293T細胞、又はそれらの派生株が挙げられ、さらに好適にはHuh-7細胞又はその派生株であるHuh7.5細胞、Huh7.5.1細胞などが挙げられる。また、Huh-7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293又は293T細胞にCD81遺伝子及び/又はClaudin-1遺伝子を発現させた細胞も挙げることができる(Lindenbach, B. D.ら, Science, 309:623-626, 2005, Evans, M. J.ら, Nature, 446:801-805, 2007, Akazawa, D.ら, J. Virol., 81:5036-5045, 2007)。【００７４】
RNAを導入する方法として、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられるが、好適にはリポフェクション法及びエレクトロポレーション法、さらに好適にはエレクトロポレーション法である。【００７５】
また、cDNAを導入する場合は、HCV cDNAをRNAポリメラーゼIプロモーターとターミネーターとを用いた系（WO27037428A1）で発現させてもよい。【００７６】
細胞のウイルス粒子産生能は、培養液中に放出されたHCVウイルス粒子を構成する、例えば、Coreタンパク質、E1タンパク質、又はE2タンパク質に対する抗体を用いて検出することができる。また、培養液中のHCVウイルス粒子が含有するHCVゲノムRNAを、特異的プライマーを用いたRT-PCR法により増幅して検出することによって、HCVウイルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。【００７７】
作製されたウイルスが感染能を有しているか否かは、HCV RNAを導入した細胞を培養して得られた上清をHCV許容性細胞（たとえばHuh-7又はその派生株）と接触させて、たとえば48時間後に細胞を抗コア抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、細胞の抽出物をSDS-ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウエスタンブロットにて、コアタンパク質を検出することで判断できる。【００７８】
（３）粒子産生細胞株の取得
HCVゲノムの効率的な複製には、ゲノムの塩基配列に変異が起こることが必要であることが示されており（Lohmann, V. ら, J. Virol., 75:1437-1449, 2001）、複製を向上させる変異は適応変異（adaptive mutation）と呼ばれている。上記(2)により作製したHCVゲノムRNAが導入された細胞を継代培養することで、HCV粒子を持続的に生産する細胞株を得ることができる。このように培養を続けることで、HCVゲノムに適応変異が起こり、HCV粒子生産が著しく向上することがある。【００７９】
この現象を利用した典型例が、キメラHCVのゲノムRNAを細胞に導入し、ウイルス生産性が向上した変異体を選択する手法である。そのような変異の例として、H77株とJFH-1株のキメラHCV粒子における許容変異を挙げることができる（MinKyung Yら, J Virol., 81: 629-638, 2007）。許容変異は、ウイルスの株、キメラHCVのゲノムの設計(コンストラクト)、実験条件によりランダムに起こる。従って、この変異が遺伝子型1bにも当てはまる必然性はないので、所望するコンストラクト毎に実験を行い、許容変異体を取得しなければならない。【００８０】
１つのアミノ酸残基の変異で複製能やHCV粒子生産性は大きく変化し、変異はHCVの遺伝子型、培養に使用する細胞の種類、実験毎に異なる。また、ハイブリダイゼーション技術では、１つのアミノ酸残基が変異するのに必要な核酸の変異を検出できないので、これらの変異を検出するためには、HCVの遺伝子配列をシークエンスする必要がある。【００８１】
従って、このような細胞からHCVゲノムRNAを単離し、塩基配列を決定することで、HCV粒子を高生産することのできるHCVゲノム配列を明らかにすることができる。【００８２】
さらに、これらの変異が、HCV複製能やHCV粒子生産性に関与しているかを確認するために、オリジナルのHCVゲノムに変異を導入して、HCV複製能やHCV粒子生産性が再現されるかを確認する必要がある。オリジナルのHCVゲノムに変異を導入するにはPCR法や市販の変異導入キット（例えば、東洋紡社製のKOD -Plus- Mutagenesis Kitなど）を用いることができる。【００８３】
さらにまた、その変異が、使用したHCVゲノムに特異的であるか、他のHCVゲノムにも効果的であるかについても、変異のないHCVゲノムに再度変異を導入して確認することができる。【００８４】
本発明では、TH/JFH-1（後述の実施例1）のCoreタンパク質のN末端のアミノ酸残基を１番目とした場合の第328番目のアミノ酸残基（或いは、E1タンパク質のN末端のアミノ酸残基を１番目とした場合の第137番目のアミノ酸残基）であるプロリン残基がアラニン残基又はトレオニン残基に変異が認められた。また、上記Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から第328番目のアミノ酸残基は、TH株のみならず、遺伝子型1bのCon1株（GenBank アクセッション番号AJ238799）、J1株(GenBank アクセッション番号D89815)、遺伝子型1aのH77株（GenBank アクセッション番号AF011751）、遺伝子型2aのJFH-1株（GenBank アクセッション番号AB047639）、J6CF株(GenBank アクセッション番号AF177036)に共通しており、プロリン残基から別のアミノ酸残基、好ましくはアラニン残基又はトレオニン残基、への変異はTH株のみならず、Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基から第328番目のアミノ酸残基としてプロリン残基を有する任意のHCV株に有効であることが示唆される。【００８５】
（４）HCV粒子の利用
HCV粒子はワクチンとしての用途、抗HCV抗体作製のための抗原としての用途に好適である。【００８６】
具体的には、HCV粒子をそのままワクチンとして使用することもできるが、当該分野で既知の方法により弱毒化又は不活化して用いることができる。ウイルスの不活化は、ホルマリン、β−プロピオラクトン、グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させることにより達成することができる（Appaiahgari, M. B. & Vrati, S., Vaccine, 22:3669-3675, 2004）。また、弱毒化ワクチンは、キメラHCV粒子を培養動物細胞又は動物（ヒトを除く）に感染させ継代培養を繰り返して病原性を極めて弱めることによって得ることができるし、或いは、遺伝子操作によってHCVの増殖性や感染性に関与する領域、例えばCore-NS5B領域、を負(negative)に改変することによって病原性を弱めることも可能であると考えられる。【００８７】
このように、本発明のHCVワクチンは、本発明の上記キメラHCV粒子を不活性化又は弱毒化し、不活性化又は弱毒化キメラHCV粒子を調製するステップと、該不活性化又は弱毒化キメラHCV粒子をHCVワクチンの形態に製剤化するステップとを含む方法によって製造することができる。【００８８】
本発明のワクチンは、例えば溶液又は懸濁液のいずれかの投与形態に製剤化されうる。或いは、使用直前に再構成可能なように液体中の溶解又は懸濁に適した固形物（例えば凍結乾燥調製物）の形態で調製することができる。或いは、そのような固形物又は調製物は医薬用界面活性剤の存在下で乳濁されてもよいし、又はリポソームにカプセル化され得る。【００８９】
HCV粒子などの活性免疫原性成分は、通常、薬学的に受容可能でありかつ活性成分に適合した賦形剤としばしば混合されうる。適切な賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの混合物がある。【００９０】
さらに、所望であれば、ワクチンは、少量の補助剤（例えば加湿剤又は乳化剤）、pH緩衝剤、及び/又はワクチンの効能を高めるアジュバントを含有し得る。【００９１】
有効であり得るアジュバントの例は、限定されないが、水酸化アルミニウム、N−アセチル−ムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン（thr-MDP）、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン（CGP11637、nor-MDPと称せられる）、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−（1’−2’−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（CGP19835A、MTP-PEと称せられる）、及びRIBIを包含する。ここで、RIBIは、バクテリアから抽出した3成分、すなわちモノホスホリルリピドA、トレハロースジミコレート、及び細胞壁骨格（HPL+TDM+CWS)を2%スクアレン/Tween(登録商標)80エマルジョン中に含有している。【００９２】
アジュバントの効能は、HCV粒子から構成されるワクチンを哺乳動物に投与することにより生じる、抗体の量を測定することにより決定され得る。【００９３】
本発明のワクチンは、通常、非経口的に、例えば皮下注射又は筋内注射のような注射により投与される。他の投与態様に適切な別の処方としては、坐薬、及びある場合には経口処方薬が挙げられる。【００９４】
所望により、アジュバント活性を有する1以上の化合物をHCVワクチンに加えることができる。アジュバントは、該免疫系の非特異的刺激因子である。それらは、HCVワクチンに対する宿主の免疫応答を増強する。当技術分野で公知のアジュバントの具体例としては、フロイント完全及び不完全アジュバント、ビタミンE、非イオンブロック重合体、ムラミルジペプチド、サポニン、鉱油、植物油及びCarbopolが挙げられる。粘膜適用に特に適したアジュバントとしては、例えば、大腸菌（E. coli）易熱性毒素（LT）又はコレラ（Cholera）毒素（CT）が挙げられる。他の適当なアジュバントとしては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム又は酸化アルミニウム、油性乳剤（例えば、Bayol（登録商標）又はMarcol 52（登録商標）のもの）、サポニン又はビタミンEソリュビリゼートが挙げられる。したがって、好ましい形態においては、本発明のワクチンはアジュバントを含む。【００９５】
例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内に投与する注射剤において、本発明のHCVワクチンと医薬上許容される担体又は希釈剤の他の具体例には、安定化剤、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、ショ糖、グルコース、デキストラン）、アルブミン又はカゼインなどのタンパク質、ウシ血清又は脱脂乳などのタンパク質含有物質、及びバッファー（例えば、リン酸バッファー）などともに投与することができる。【００９６】
坐薬に使用される従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが含まれ得る。このような坐薬は、活性成分を重量％で0.5％から50％までの範囲で、好ましくは1％から20％までの範囲で含有する混合物から形成され得る。経口処方薬は、通常用いられる賦形剤を含有する。この賦形剤としては、例えば、薬学的なグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。【００９７】
本発明のワクチンは、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方剤、又は粉末剤の形態をとり、重量％で10％〜95％、好ましくは25％〜70％の活性成分（ウイルス粒子又はその一部分）を含有する。【００９８】
本発明ワクチンは、投与剤形に適した方法で、そして予防及び/又は治療効果があるような量で投与される。投与されるべき量は、通常投与当たり抗原を0.01μgから100,000μgまでの範囲であり、これは、処置される患者、その患者の免疫系での抗体合成能、及び所望の防御の程度に依存し、経口、皮下、皮内、筋肉内、静脈内投与経路などの投与経路にも依存する。【００９９】
本発明ワクチンは、単独投与スケジュールで、又は好ましくは複合投与スケジュールで与えられ得る。複合投与スケジュールでは、接種の開始時期に1〜10の個別の投与を行い、続いて免疫応答を維持する及び又は強化するのに必要とされる時間間隔で、例えば2回目の投与として1〜4ヵ月後に、別の投与を行い得る。必要であれば、数ヶ月後に引続き投与を行い得る。投与のレジメもまた、少なくとも部分的には、個体の必要性により決定され、医師の判断に依存する。【０１００】
さらに、本発明のHCV粒子を含有するワクチンは、他の免疫制御剤（例えば、免疫グロブリン）と共に投与され得る。【０１０１】
さらに本発明のHCV粒子ワクチンを、健常人に投与し、健常人にHCVに対する免疫応答を誘導することにより、新たなHCV感染に対し、予防的に使用する方法も本発明により提供される。本発明は、本発明のHCV粒子ワクチンをHCVに感染した患者に投与し、生体内にHCVに対する強い免疫反応を誘導することにより、HCVを排除する治療的ワクチンとして使用する方法も提供する。【０１０２】
本発明のHCV粒子はまた、抗体作製のための抗原として有用である。抗原として用いた本発明のHCV粒子を認識する抗体は、受動免疫薬としてHCV感染の予防又は治療のために使用できる。抗体の種類は問わないが、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、それらのフラグメント（Fc、Fab、(Fab')2など）、単鎖抗体（scFvなど）、ラクダ抗体、多価抗体（二価、三価抗体など）などを例示することができる。抗体は、任意の種類、例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgYでありうるし、また、そのクラスは、例えばIgG1〜IgG4、IgA1〜IgA2などを含む。さらにまた、抗体は、グリコシル化、ペグ化、アセチル化、リン酸化、アミド化などの化学修飾を含んでもよい。【０１０３】
本発明の不活性化若しくは弱毒化された又はされない上記キメラHCV粒子を動物（ヒトを除く）、好ましくは哺乳類又は鳥類、に投与するステップを含む方法で抗HCV抗体を作製することができる。【０１０４】
哺乳類動物として、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、モルモット、ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマなどを挙げることができる。ヒトコブラクダ、フタコブラクダ及びラマはH鎖のみからなる抗体を作製するには好適である。鳥類動物としては、ニワトリ、ガチョウ、ダチョウなどを挙げることができる。【０１０５】
本発明HCV粒子が投与された動物の血清を採取して、既知の方法（例えば硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、Protein A又はProtein G結合親和性クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーなどを含む）に従って抗体を取得することができる。【０１０６】
さらにまた、本発明のHCV粒子を免疫した動物の細胞又は組織（B細胞、脾臓細胞、リンパ節）とミエローマ細胞（マウス、ラット由来など）を用いてモノクローナル抗体産生細胞を産生するハイブリドーマを作製することができる。ハイブリドーマを製造する方法は周知であり、Antibodies: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory, 1988；富山及び安東編、単クローン抗体実験マニュアル、講談社、1987など）に記載された方法を用いることができる。【０１０７】
モノクローナル抗体産生細胞は、細胞融合により生成してもよく、また癌遺伝子DNAの導入やEpstein-Barrウイルスの感染によりBリンパ球を不死化させるような他の方法で生成してもよい。【０１０８】
ヒト化抗体やヒト抗体は、ファージディスプレイ法(Brinkmanら, J. Immunol. Methods, 182:41-50, 1995; Amesら, J. Immunol. Methods, 184:177-186, 1995；国際公開WO98/46645; 国際公開WO98/50433;国際公開WO98/24893など)、或いはヒト抗体産生マウス（KMマウス(キリンファーマ社)、Xenoマウス（Abgenix/Amgen社）など）を利用することによって作製しうる。【０１０９】
これらの方法によって得られたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体及びヒト抗体又はヒト化抗体はHCVの診断、治療、予防に有用である。【０１１０】
本発明のHCV粒子を用いて作製された抗体は、医薬上許容される、溶解剤、添加剤、安定剤、バッファーなどとともに投与される。投与経路はいずれの投与経路でもよいが、好ましくは、皮下、皮内、筋肉内投与であり、より好ましくは、静脈内投与が好ましい。【０１１１】
本発明のHCV粒子を用いて作製された抗体の好ましい例は、本発明に係るキメラHCV（C型肝炎ウイルス）粒子（すなわち、本発明に係る上記核酸をウイルスゲノムとして含有するキメラHCV粒子）を抗原として認識する、抗C型肝炎ウイルス抗体である。この抗C型肝炎ウイルス抗体は、本発明に係るキメラHCV粒子に対して生成されたものであり得るが、その生成過程にかかわらず、本発明に係るキメラHCV粒子と結合（反応）するだけでなく、他の広範なC型肝炎ウイルス粒子に対しても結合（反応）し、その機能を阻害することができる。【０１１２】
本発明のHCV粒子（キメラHCV粒子）又は該粒子を生成する細胞はさらに、抗HCV物質をスクリーニングするために利用することができる。【０１１３】
この方法は、具体的に、被検物質の存在下で、下記の(a)又は(b)
(a)キメラHCV粒子を生成する細胞、或いは、
(b)キメラHCV粒子及びC型肝炎ウイルス感受性細胞
を培養し、得られる培養物中の、本発明のキメラHCV粒子が含有する前記核酸に由来するレプリコンRNA又はウイルス粒子を検出することを含む、抗HCV物質をスクリーニングするための方法である。【０１１４】
上記方法では、抗HCV物質は、ウイルス感染又は増殖を抑制可能なものとして選択される。本発明において「レプリコンRNA」とは、主としてHCVウイルスゲノムを改変して作製される、自律複製能を有するRNAを指す。本発明において「自律複製能」とは、プラスミドDNAのように、細胞内で自律的に核酸自身のコピーを再生（すなわち複製）することができる能力をいう。サブゲノムレプリコンRNAの従来公知の例としては、HCVの構造タンパク質の翻訳領域を薬剤耐性遺伝子に組換え、さらにその下流にEMCV(脳心筋炎ウイルス)のIRESを挿入して作製された組換えRNAが挙げられ、その組換えRNAが導入された細胞内ではRNA複製が認められる。一方、全長ゲノムレプリコンRNAは、細胞に導入したHCVの全長ゲノム由来のRNAを自己複製できるRNAを言い、典型的には、HCV全長ゲノム由来のRNAにおいてその5'非翻訳領域とHCVコアタンパク質をコードする遺伝子の間に薬剤耐性遺伝子（又はレポーター遺伝子）とIRESが挿入された組換えRNAが挙げられる。上記方法において「前記核酸に由来するレプリコンRNA」とは、当該核酸から転写されたレプリコンRNAを意味する。C型肝炎ウイルス感受性細胞としては、以下に限定するものではないが、上記「（２）HCV粒子の作製」においてHCV由来のRNAを導入する細胞として列挙された細胞、例えばHuh-7、HepG2、IMY-N9、HeLa、293、若しくは293T細胞又はそれらの派生株が挙げられる。
【実施例】
【０１１５】
以下に、本発明を実施例を挙げてさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。また、実施例では、JHF-1株以外のHCV株としてTH株を例示するが、この特定株以外の株も同様に作製可能である。【０１１６】
実施例１：TH/JFH-1プラスミドの構築
HCVゲノムRNAのcDNAとして、5’UTRが遺伝子型2aのJFH-1株（GenBankアクセッション番号AB047639、Kato, T.ら, Gastroenterology, 125:1808-1817, 2003）、Coreタンパク質からNS2タンパク質のN末端33アミノ酸残基までが遺伝子型1bのTH株（Wakita, T.ら, J. Biol. Chem., 269:14205-14210, 1994、Moradpour, D.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 246:920-924, 1998、及び国際公開WO2006/022422）、NS2のN末端34アミノ酸残基から3’UTRまでが遺伝子型2a株のJFH-1株であるTH/JFH-1キメラのcDNAを作製した。【０１１７】
TH/JFH-1のコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号5に記載した。また、これらのプラスミドの作製方法を図1に示す。【０１１８】
具体的には、JFH-1株由来ゲノムRNA全領域に対応するcDNAをpUC19プラスミド中にクローニングすることにより構築されたプラスミドDNAであるpJFH1（Wakita, T.ら, Nat. Med., 11:791-796, 2005、国際公開WO2004/104198）及び肝炎患者から分離したウイルスゲノムTH株の一部を含むpTH（国際公開WO2006/022422）を使用した。【０１１９】
pJFH1を鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマー-21M13（配列番号8）及びMS98（配列番号9）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 45秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.1とした。【０１２０】
次に、pTHを鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマーMS97（配列番号10）及びMS96（配列番号11）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 45秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.2とした。【０１２１】
次にpJFH1を鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマーMS99（配列番号12）及びMS89（配列番号13）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 45秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.3とした。【０１２２】
それぞれのPCR産物をアガロースゲルより精製し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN社）を用いて、添付のEB buffer 50μlで溶出した。PCR産物no.1、PCR産物no.2及びPCR産物no.3のDNAを各1μlずつ混合し、これを鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマー-21M13（配列番号8）及びMS89（配列番号13）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 2分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.4とした。【０１２３】
pJFH1及び精製したPCR産物no.4を制限酵素EcoRI及びSpeIで消化し、各DNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分離し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation high（New England Biolabs社）を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpTH/JFH1と名付けた。このpTH/JFH1は、JFH-1株由来の5’非翻訳領域、TH株由来のCore、E1、E2、p7、NS2タンパク質領域のN末端33アミノ酸残基まで、JFH-1株のNS2タンパク質領域のN末端34アミノ酸残基から、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5Bタンパク質領域及び3’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列である。【０１２４】
実施例2：In vitro RNA合成と細胞内への導入
pTH/JFH1をXbaIで切断し、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。次いで、このXbaI切断断片をMung Bean Nuclease処理し、XbaI認識配列由来の3’末端の余分な塩基配列を除去した。さらにproteinase K処理、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ってDNA断片を精製した。この切断したプラスミドを鋳型として、MEGAscript T7 kit(Ambion社)を用いて37℃、3時間反応させ、HCV RNAの合成を行った。反応後の合成RNAはDNaseI処理後、酸性フェノールによって抽出し、エタノール沈殿を行って精製した。【０１２５】
3×106個のHuh7細胞と10 μgのHCV RNAをCytomix溶液(120mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 25 mM Hepes, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 20 mM ATP, 50 mM Glutathione) 400μlで懸濁し、4 mmキュベットに移した後、Gene Pulser(BioRad社)を用いて260 V、950μFでエレクトロポレーションを行った。その後、HCV RNA導入細胞を10 cm2ディッシュに播種し、継代培養を行った。【０１２６】
実施例3：TH/JFH-1 RNA導入細胞によるHCV粒子の産生
TH/JFH-1 RNAを導入した細胞の継代時に、HCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)を用いて培養上清中に含まれるHCV Coreタンパク質を定量し、HCV粒子産生の確認を行った。その結果、培養上清中のHCV Core量は導入23日目までは経時的に減少していったが、導入から26日を経過した時点でHCV Core量が上昇し始め、34日経過時点で一定の高い産生量を示した(図2)。このことから、TH/JFH-1 RNAは、Huh7細胞に導入当初は高いウイルス産生能を有していないが、後にウイルスゲノム内にウイルス産生に必要な適応変異が導入され、高いウイルス産生能を有するようになると考えられた。【０１２７】
実施例4：継代を重ねたTH/JFH-1ウイルス感染細胞内のHCVゲノム配列解析
TH/JFH-1ウイルスが高い産生量を有するために必要な適応変異を調べるために、RNA導入から34日目の感染細胞内のtotal RNAを抽出し、この中に含まれるHCVゲノムの配列解析を行った。【０１２８】
Total RNAはTrizol(Invitrogen社)を用いて抽出し、転写反応を行ってcDNAとした。このcDNAをPCRによって5つのDNA断片に分け、pGEM-T Easy vector(Promega社)に連結し、大腸菌DH5aに形質転換させてコロニーを得た。各10個のコロニーよりQIAprep Mini kit(QIAGEN社)を用いてプラスミドを抽出し、各DNA断片の塩基配列を確認した。【０１２９】
その結果、TH株のE1領域のプロリンCCU（P）がアラニンACU（A）又はトレオニンGCU(T)に置換されていた。なお、プロリンはTH株（Wakita, T.ら, J. Biol. Chem., 269(1994) p14205-14210、Moradpourら, Biochem. Biophys. Res. Commun., 246(1998) p920-924、及び国際公開WO2006/022422）のCoreタンパク質のN末端アミノ酸残基であるメチオニン残基を第1番目として数えて第328番目のアミノ酸残基、或いは、E1タンパク質のN末端のアミノ酸残基を１番目として数えて、第137番目のアミノ酸残基に対応する。【０１３０】
TH/JFH-1(PA)のアミノ酸配列を配列番号6に、TH/JFH-1(PT)のアミノ酸配列を配列番号7に示す。【０１３１】
実施例5：TH/JFH-1変異プラスミドの構築
実施例4で示した、TH/JFH-1ウイルスが高い産生量を有するために必要な適応変異を持つプラスミドの構築を行った。プラスミドの作製方法を図3に示す。【０１３２】
具体的には、pTH/JFH1を鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマーMS151（配列番号14）及びMS165（配列番号15）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 1分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.5とした。【０１３３】
次に、pTH/JFH1を鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマーMS164（配列番号16）及びMS156（配列番号17）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 1分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.6とした。【０１３４】
それぞれのPCR産物をアガロースゲルより精製し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN社）を用いて、添付のEB buffer 50μlで溶出した。PCR産物no.5、及びPCR産物no.6のDNAを各1μlずつ混合し、これを鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマーMS151（配列番号14）及びMS156（配列番号17）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.7とした（図3A）。【０１３５】
次に、pTH/JFH1を鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマーMS151（配列番号14）及びMS163（配列番号18）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 1分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.8とした。【０１３６】
次に、pTH/JFH1を鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマーMS162（配列番号19）及びMS156（配列番号17）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 1分からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.9とした。【０１３７】
それぞれのPCR産物をアガロースゲルより精製し、QIAquick Gel Extraction kit（QIAGEN社）を用いて、添付のEB buffer 50μlで溶出した。PCR産物no.8、及びPCR産物no.9のDNAを各1μlずつ混合し、これを鋳型として、Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた、5×緩衝液を10μl、10mM dNTP混合液を1μl、10μMのプライマーMS151（配列番号14）及びMS156（配列番号17）をそれぞれ2.5μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。その後Phusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてから、PCR反応を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、58℃ 30秒、72℃ 1分30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.10とした(図3B)。【０１３８】
pTH/JFH1及び精製したPCR産物no.7を制限酵素Acc65Iで消化し、各DNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分離し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation high（New England Biolabs社）を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpTH/JFH-1(PA)と名付けた。このpTH/JFH1(PA)は、JFH-1株由来の5’非翻訳領域、TH株由来のCore、E1、E2、p7、NS2タンパク質領域のN末端33アミノ酸残基まで、JFH-1株のNS2タンパク質領域のN末端34アミノ酸残基から、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5Bタンパク質領域及び3’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列で、Coreタンパク質のN末端アミノ酸残基であるメチオニン残基を1番目として数えて第328番目のアミノ酸残基がアラニン残基となるような塩基配列を含む。【０１３９】
次いで、pTH/JFH1及び精製したPCR産物no.10を制限酵素Acc65Iで消化し、各DNA断片をアガロースゲル電気泳動にて分離し、精製した。これら2つのDNA断片とLigation high（New England Biolabs社）を混合し、2つのDNA断片を連結した。このベクターをpTH/JFH1(PT)と名付けた。このpTH/JFH1(PT)は、JFH-1株由来の5’非翻訳領域、TH株由来のCore、E1、E2、p7、NS2タンパク質領域のN末端33アミノ酸残基まで、JFH-1株のNS2タンパク質領域のN末端34アミノ酸残基から、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5Bタンパク質領域及び3’非翻訳領域からなるキメラ遺伝子をコードする塩基配列で、Coreタンパク質のN末端のアミノ酸残基であるメチオニン残基を1番目として数えて第328番目のアミノ酸残基がトレオニン残基となるような塩基配列を含む。【０１４０】
pTH/JFH1(PA)を配列番号1、pTH/JFH1(PT)を配列番号2としてこれらの塩基配列を配列表に示した。【０１４１】
実施例6：TH/JFH-1(PA)及びTH/JFH-1(PT)ウイルスの作製
実施例5で作製したプラスミドをそれぞれXbaIで切断し、フェノール/クロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。次いで、このXbaI切断断片をMung Bean Nuclease処理し、XbaI認識配列由来の3’末端の余分な塩基配列を除去した。さらにproteinase K処理、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を行ってDNA断片を精製した。この切断したプラスミドを鋳型にMEGAscript T7 kit(Ambion社)を用いて各HCV RNAの合成を行った。【０１４２】
3×106個のHuh-7細胞と10μgのHCV RNAをCytomix溶液(120mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 25 mM Hepes, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 20 mM ATP, 50 mM Glutathione) 400μlで懸濁し、4 mmキュベットに移した後、Gene Pulser(BioRad社)を用いて260 V、950μFでエレクトロポレーションを行った。その後、HCV RNA導入細胞を10 cm2ディッシュに播種し、継代培養を行った。【０１４３】
実施例2で作製したTH/JFH-1 RNA、TH/JFH-1(PA) RNA(配列番号3)及びTH/JFH-1(PT) RNA(配列番号4)を導入した各細胞の継代時に、HCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)を用いて培養上清中に含まれるHCV Coreタンパク質を定量し、HCV粒子産生の確認を行った。培養初期から後期にわたって、変異を導入しないRNAを導入した細胞の培養上清中に含まれるHCV Core量と変異を導入したRNAを導入した細胞の培養上清に含まれるHCV Core量とを比較すると後者の方が高いことが示された（図4）。【０１４４】
実施例7：変異導入ウイルスの感染性の評価
TH/JFH-1(PA) RNAを導入した細胞から産生されるウイルスの感染性を野生型TH/JFH-1と比較した。各RNAを導入後4、24、48、72及び96時間までの細胞内及び培養上清のHCV Coreタンパク質の変動を調べ、その培養上清の感染性を調べた。【０１４５】
具体的には、実施例6と同様にTH/JFH-1及びTH/JFH-1(PA) RNAを合成し、3×106個のHuh-7細胞と10μgのHCV RNAをCytomix溶液(120mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 25 mM Hepes, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 20 mM ATP, 50 mM Glutathione) 400μlで懸濁し、4 mmキュベットに移した後、Gene Pulser(BioRad社)を用いて260 V、950μFでエレクトロポレーションを行った。その後、HCV RNA導入細胞を10 cm2ディッシュに播種し、4、24、48、72及び96時間後に培養上清を回収、0.45μmフィルター（Millipore社）で濾過した後HCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)を用いてHCV Coreタンパク質を定量した。また、培養上清を除いた10 cm2ディッシュはPBSで洗浄した後、500μlのPBSとともにスクレーパー（住友ベークライト社）で細胞を掻き取り、遠心分離して細胞を回収した。回収した細胞は100μlのPassive Lysis Buffer（Promega社）を添加してライセートを調製し、培養上清と同様にHCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)を用いてHCV Coreタンパク質を定量した。【０１４６】
培養上清の感染力価は培養液で段階希釈して次のように定量した。ポリリジンコートされた96 well plate（Corning社）にHuh-7細胞を1×104個/wellで播種し、一昼夜培養後、培養液で段階希釈した培養上清に交換し、さらに3日間培養した。その後、培養液を捨て、PBSで3回洗浄した後、メタノールで15分間固定した。次に、0.3% Triton X-100含有ブロックエース（大日本住友製薬）で各ウェルをブロッキングし、抗HCV Core特異的抗体（クローン2H9）と反応させた。次に、PBSでウェルを洗浄し、Alexa488標識抗マウスIgG抗体（Invitrogen社）と反応させた。その後、PBSでウェルを洗浄し、各ウェルの感染フォーカス数を蛍光顕微鏡（オリンパス社）で観察し、各培養上清の感染力価をフォーカス形成ユニット（FFU）として算出した。【０１４７】
その結果、TH/JFH-1(PA) RNA導入細胞では、野生型TH/JFH-1と比較して培養上清中へのHCV Coreタンパク質の分泌率が高く、培養上清の感染力価も高かった（図5及び6）。TH/JFH-1(配列番号5)における328番目のプロリン残基の変異はHCV粒子の産生を増加させる変異であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明の方法によって提供されるHCV粒子は高発現性、高産生、高感染性であるため、HCVの予防又は治療用ワクチンとして好適に利用できる。さらに、本発明にかかるHCV粒子はHCVに対する抗体を誘導するツールとしても利用できる。【０１４９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はその全体を参照により本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
0005593220.tif 000002
【図２】
0005593220.tif 000003
【図３Ａ】
0005593220.tif 000004
【図３Ｂ】
0005593220.tif 000005
【図４】
0005593220.tif 000006
【図５Ａ】
0005593220.tif 000007
【図５Ｂ】
0005593220.tif 000008
【図６】
0005593220.tif 000009
【配列表】
0005593220000001.app