(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメトリーによる細胞分析において、インキュベーション緩衝液と、タンデム蛍光色素ＡＰＣ−Ｃｙ７（アロフィコシアニン−シアニン７）又はＡＰＣ−Ｈ７（アロフィコシアニン−Ｈｉｌｉｔｅ（登録商標）７−ＢＤ）である少なくとも１つの蛍光色素と結合した１つまたは複数のラベリング抗体とを含むラベリング溶液中の前記少なくとも１つの蛍光色素の分解を抑制する方法であって、
前記ラベリング溶液中に酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤を導入するステップと、
前記ラベリング溶液で細胞を標識するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞が血球であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がアスコルビン酸であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がビタミンＣであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞がリンパ球であり、前記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤が、０．１ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で前記ラベリング溶液中に存在しているビタミンＣであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ビタミンＣが１ｍＭと５ｍＭとの間（端値を含む）の濃度で前記ラベリング溶液中に存在することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ビタミンＣが前記ラベリング溶液中に１ｍＭの最終濃度で存在していることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が単球であり、前記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤が、１ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で前記ラベリング溶液中に存在しているビタミンＣであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ビタミンＣが前記ラベリング溶液中に１ｍＭの濃度で存在していることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が多核好中球であり、前記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤が、０．２５ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で前記ラベリング溶液中に存在しているビタミンＣであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ビタミンＣが、０．７５ｍＭと４ｍＭとの間（端値を含む）の濃度で前記ラベリング溶液中に存在する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビタミンＣが、０．７５ｍＭと２ｍＭとの間（端値を含む）の濃度で前記ラベリング溶液中に存在する請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ビタミンＣが、０．７５ｍＭの最終濃度の濃度で前記ラベリング溶液中に存在する請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞がリンパ球であり、前記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤が、１ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で前記ラベリング溶液中に存在しているビタミンＣであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フローサイトメトリーによって細胞を分析する方法、ならびにそのような方法における酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤の使用に関する。本発明は、酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤を含むインキュベーション緩衝液にも関する。
【背景技術】
【０００２】
フローサイトメトリーの方法論は、細胞レベルにおける、異なった形態学的パラメータおよび蛍光パラメータの同時測定を可能にする。多色系の開発は、細胞それ自体のレベルにおける多量の情報、希少な細胞集団でさえ正確な測定、および新規な細胞特性の同定を提供するなど、多くの利点を有する。
【０００３】
とりわけ、この技術は、全造血系内における細胞の亜集団を機能的に同定し、それによって、その細胞の生理学および悪性病態の生理病理学をよりよく理解するのを可能にするのに重要である。
【０００４】
したがってそれは、病的な血球の検出と、健康な血球と比較したそれらの差異の検出とを可能にする、様々な状態の診断または治療モニタリングを行うために、血液学で通例的に使用されている。
【０００５】
フローサイトメトリー実験はますます複雑になっているので、様々な特性を有する新規蛍光色素の需要が増大している。
【０００６】
蛍光色素は、所与の波長の光を吸収し、その結果として、それらの蛍光エネルギーをそれらより長い波長で発する。
【０００７】
新規蛍光色素のなかで、タンデムＡＰＣ−Ｃｙ７（アロフィコシアニン−シアニン７）およびその類似体であるＡＰＣ−Ｈ７（アロフィコシアニン−Ｈｉｌｉｔｅ（登録商標）７−ＢＤ）は、約６５０ｎｍに吸収極大がある類似したスペクトル特性を示すＡＰＣタンデムと呼ばれる蛍光色素である。赤色レーザー（ＨｅＮｅ、６３３ｎｍ）による励起下において、ＡＰＣタンデム内に存在するＡＰＣ蛍光色素が、そのエネルギーをシアニン色素に移し、それが今度は７６７ｎｍで発光する。ＡＰＣタンデム蛍光色素は、細胞性抗原に対して向けられた抗体と結合される。
【０００８】
しかし、これらの抗体−ＡＰＣタンデム結合体の励起は、ＡＰＣチャネル内の発光をもたらしうる。この発光は、フローサイトメトリー実験者によって一般的に観察されており、擬陽性の事象、およびラベリング感度の低下をもたらす。
【０００９】
現在まで、ＡＰＣチャネルでの発光は少なくとも２つの作用機序によって説明されていた。第一に、ＡＰＣ色素とＣｙ７またはＨ７色素との結合が最適でないと、Ｃｙ７またはＨ７色素による、ＡＰＣ分子が発した蛍光の不完全な再吸収を反映して、ＡＰＣの蛍光の発光をもたらしうる。第二に、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムおよびＡＰＣ−Ｈ７タンデムの安定性が不足していると、「好ましくない」ＡＰＣシグナルをもたらしうる。この作用機序は通常、「デカップリング現象」と呼ばれる。
【００１０】
ＡＰＣタンデム（すなわち、そのうちの１つがＡＰＣである、前後に並んだ色素）の安定性の不足は、光分解の結果であると一般的に考えられている。実際に、蛍光色素は光に対して感受性であることが知られている。それが、分析用の細胞の調製（溶解および免疫標識など）も含めて、分析を、光から保護した状態で行う理由であり、光からの保護は、ＡＰＣタンデムを含む結合体に関してとりわけ強調されている予防措置である。
【００１１】
さらに、アスコルビン酸は、酸化物質およびフリーラジカルの有害効果を阻止できる酸化防止剤である。
【００１２】
Ｌ型のアスコルビン酸（ビタミンＣ）は、その上、ビタミン活性を有する。
【００１３】
しかし、ビタミンＣは、溶液中では非常にこわれやすく、空気との接触、光または熱によって破壊される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、ＡＰＣタンデムを蛍光色素として用いたフローサイトメトリーによる細胞分析を、デカップリング現象を起こさずに、またはデカップリング現象が少なくとも抑制されるように行うのを可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
この目的のために、本発明は、インキュベーション緩衝液と、ＡＰＣタンデムである少なくとも１つの蛍光色素と結合したラベリング抗体とを含むラベリング溶液中でのインキュベーションによって細胞を標識するステップを含む、フローサイトメトリーによって細胞を分析する方法であって、上記ラベリング溶液中に少なくとも１つの酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤を導入することを特徴とする方法を提案する。
【００１６】
ＡＰＣタンデムという表現は、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムまたはＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  ７５０タンデムを意味すると理解される。
【００１７】
上記細胞は血球であることが好ましい。
【００１８】
さらに、上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤はアスコルビン酸であることが好ましい。
【００１９】
上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤はビタミンＣであることがより好ましい。
【００２０】
上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がビタミンＣであり、上記細胞がリンパ球である場合、上記ビタミンＣは、０．１ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で、好ましくは、１ｍＭと５ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で、最も好ましくは１ｍＭの濃度で、フローサイトメトリーによって分析される溶液中に存在している。
【００２１】
上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がビタミンＣであり、上記細胞が単球である場合、上記ビタミンＣは、１ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で、最も好ましくは１ｍＭの濃度で、フローサイトメトリーによって分析される溶液中に存在している。
【００２２】
上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がビタミンＣであり、上記分析される細胞が多核好中球である場合、上記ビタミンＣは、０．２５ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）、好ましくは０．７５ｍＭと４ｍＭとの間（端値を含む）、より好ましくは０．７５ｍＭと４ｍＭとの間（端値を含む）、最も好ましくは０．７５ｍＭの最終濃度で、分析される溶液中に存在している。
【００２３】
本発明は、細胞のフローサイトメトリー分析中における、タンデム蛍光色素ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｈ７またはＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  ７５０の分解を抑制するための、酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤の使用も提案する。
【００２４】
本発明の使用では、上記細胞が血球であることが好ましい。
【００２５】
本発明の使用では、上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がアスコルビン酸であることも好ましく、Ｌ型のアスコルビン酸（ビタミンＣ）であることが最も好ましい。
【００２６】
上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がビタミンＣであり、上記細胞がリンパ球である場合、上記ビタミンＣは、０．１ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で、好ましくは、１ｍＭと５ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で、最も好ましくは１ｍＭの濃度で、フローサイトメトリーによって分析される溶液中に存在している。
【００２７】
上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がビタミンＣであり、上記細胞が単球である場合、上記ビタミンＣは、１ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）の最終濃度で、最も好ましくは１ｍＭの濃度で、フローサイトメトリーによって分析される溶液中に存在している。
【００２８】
上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がビタミンＣであり、上記分析される細胞が多核好中球である場合、上記ビタミンＣは、０．２５ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）、好ましくは０．２５ｍＭと４ｍＭとの間（端値を含む）、より好ましくは０．７５ｍＭと４ｍＭとの間（端値を含む）、最も好ましくは０．７５ｍＭの最終濃度で、分析される溶液中に存在している。
【００２９】
本発明は、酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤を含むインキュベーション緩衝液も提示する。
【００３０】
本発明のインキュベーション緩衝液では、上記酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤がアスコルビン酸であることが好ましく、Ｌ型のアスコルビン酸、すなわちビタミンＣであることがより好ましい。
【００３１】
添付図面について言及する下記の説明的記述を読んだ後、本発明がよりよく理解され、本発明の他の特徴および利点がよりはっきりと現れるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５（α−ＣＤ４５）抗体で標識された多核好中球、単球、およびリンパ球の、任意の単位（ｘ軸）における蛍光強度を、任意の単位における、それらの粒度の関数として示す、サイトメーターから得られた画像である。
【図２】インキュベーション直後（Ｔ０）における、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５（α−ＣＤ４５）抗体で標識されたリンパ球のＡＰＣチャネル内およびＡＰＣ−Ｃｙ７チャネル内の蛍光シグナル強度を示す図である。
【図３】インキュベーションの３０分後（Ｔ３０）における、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球のＡＰＣチャネル内およびＡＰＣ−Ｃｙ７チャネル内の蛍光シグナル強度を示す図である。
【図４】時間Ｔ０およびＴ３０に観察された、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球のデカップリングのパーセントの変動を示す図である。
【図５】ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５（α−ＣＤ４５）抗体で標識された多核好中球、単球、およびリンパ球の、任意の単位（ｘ軸）における蛍光強度を、任意の単位における、それらの粒度の関数として示す、サイトメーターから得られた画像である。
【図６】インキュベーション直後（Ｔ０）における、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球のＡＰＣチャネル内およびＡＰＣ−Ｈ７チャネル内の蛍光シグナル強度を示す図である。
【図７】３０分間のインキュベーションの後（Ｔ３０）における、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球のＡＰＣチャネル内およびＡＰＣ−Ｈ７チャネル内の蛍光シグナル強度を示す図である。
【図８】時間Ｔ０およびＴ３０に観察された、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球のデカップリングのパーセントの変動を示す図である。
【図９】Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標）および細胞への、ＡＰＣタンデムと結合した抗体の結合様式の模式図である。
【図１０】ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標）、およびＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図１１】ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標））、およびＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図１２】ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ２０（α−ＣＤ２０）抗体で標識されたリンパ球、およびＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ２０抗体で標識されたリンパ球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図１３】ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ３（α−ＣＤ３）抗体で標識されたリンパ球、およびＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ３抗体で標識されたリンパ球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図１４】ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムまたはＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、およびＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムまたはＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図１５】ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムまたはＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図１６】ａ）光から保護された、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、  ｂ）光に暴露された、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、  ｃ）光から保護された、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球、  ｄ）光に暴露された、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球、  ｅ）光から保護された、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球、  ｆ）光に暴露された、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図１７】ａ）光から保護された、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、  ｂ）光に暴露された、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、  ｃ）光から保護された、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球、  ｄ）光に暴露された、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球、  ｅ）光から保護された、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球、  ｆ）光に暴露された、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図１８】光の存在下および非存在下における、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標））の蛍光の平均強度の変動を時間の関数として示す図である。
【図１９】光の存在下および非存在下における、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標））の蛍光の平均強度の変動を時間の関数として示す図である。
【図２０】光の存在下および非存在下における、ＡＰＣ蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標））の蛍光の平均強度の変動を時間の関数として示す図である。
【図２１】ａ）ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された未結合のリンパ球、  ｂ）ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された結合済のリンパ球、  ｃ）ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された未結合の多核好中球、  ｄ）ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された結合済の多核好中球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図２２】ａ）室温でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、  ｂ）４℃でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、  ｃ）室温でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球、  ｄ）４℃でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図２３】ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された未結合の単球、およびＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された結合済の単球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図２４】室温でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球、および４℃でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図２５】ａ）ビタミンＣの非存在下でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、  ｂ）１ｍＭのビタミンＣの存在下でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、  ｃ）ビタミンＣの非存在下でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球、  ｄ）１ｍＭのビタミンＣの存在下でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【図２６】ビタミンＣの非存在下でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球、および１ｍＭのビタミンＣの存在下でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球のフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
「デカップリングのパーセント」、「％デカップリング」、「ＡＰＣ−Ｃｙ７に対するＡＰＣの％デカップリング」、および「ＡＰＣ−Ｈ７に対するＡＰＣの％デカップリング」という用語が、上記の本文および以下の本文、ならびに添付図面において、下記の比率を指示するのに使用されている。すなわち、
［ＡＰＣタンデムで標識されたが、ＡＰＣチャネルに蛍光を発する（かつ使用されたＡＰＣタンデムのチャネル内には蛍光を発しない）細胞の数］／［それらの細胞がどのチャネル内に蛍光を発するかに関係なく、ＡＰＣタンデムで標識された細胞の総数］
であり、この比率に１００が掛けられている。
【００３４】
「室温」という用語は、上記の本文および以下の本文、ならびに添付図面において、１８℃と２５℃との間（端値を含む）の温度を指示するのに使用されている。
【００３５】
本発明は、免疫標識された細胞上での、ＡＰＣタンデムと結合したマーカーの機能障害の作用機序に関する、発明者らによる解明に基づいている。ＡＰＣタンデムを蛍光色素として用いたフローサイトメトリーによる、これらの細胞の分析中に観察されたデカップリング現象は、この機能障害によってもたらされる。
【００３６】
デカップリング現象をもたらす作用機序を解明するために、本発明者らは、ＡＰＣ蛍光色素、またはＡＰＣ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｈ７もしくはＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  ７５０タンデム蛍光色素と結合した様々な抗体で標識された細胞の試料をフローサイトメトリーによって分析した。
【００３７】
使用された物質および方法は以下の通りである。
【００３８】
物質
ＡＰＣ−Ｃｙ７蛍光色素またはＡＰＣ−Ｈ７蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ１９抗体、ならびに溶解緩衝液ＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）溶解／固定緩衝液５×は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社から購入した。
【００３９】
溶解緩衝液は塩化アンモニウム溶解緩衝液であった。
【００４０】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）はＢｉｏｍｅｒｉｅｕｘ社から入手した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｍｂｈ社から購入し、使用する前に５６℃で３０分間、加熱した。Ｌ−アスコルビン酸（ビタミンＣ）はＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社から入手した。
【００４１】
方法
ヒト末梢血のアリコート（５００，０００個の白血球を含有している）を溶解緩衝液中でインキュベートし、その後、２．５％のＦＢＳを補充した１×ＰＢＳで３回洗浄した。その後、上記細胞（５００，０００個）を、１００μｌのインキュベーション緩衝液中において、室温で２０分間、所望のＡＰＣタンデムまたはＡＰＣ単独と結合した所望の抗体のそれぞれ５μｌで免疫標識し、ＰＢＳ／ＦＢＳ溶液で３回洗浄し、２００μｌのＰＢＳ／ＦＢＳ溶液中に再懸濁した。
【００４２】
フローサイトメトリーによって得られたデータの分析中に死細胞を除外するために、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製のインターカレート剤である７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）を用いて、死細胞を標識した。
【００４３】
各免疫標識実験について、上記細胞を混合し、それらのフローサイトメトリー分析をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ装置で行った。１試験あたり１０，０００から５０，０００のイベントを獲得した。一般的に使用されている細胞ソーティング手順、すなわち２パラメータヒストグラムにおける３つのウィンドウ（Ｐ１、Ｐ２、およびＰ３）の交差によって、シングレット(singlet)細胞を選択した。
【００４４】
各細胞型について、デカップリングのパーセントを、以前の記載の通り、ＢＤ  ＦＡＣＳＤＩＶＡ（商標）ソフトウェアを用いて計算した。
【００４５】
添付図面は、３から４回の反復実験の代表的実験を示す。
【００４６】
第一に、本発明者らは、細胞表面タンパク質に対して向けられた抗体と結合したＡＰＣ−Ｃｙ７およびＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素の分解が上述した細胞モデルで起こり、ＡＰＣチャネル内のシグナルの出現を引き起こすことを確認した。
【００４７】
そのために、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムまたはＡＰＣ−Ｈ７タンデムのいずれかと結合した抗ＣＤ４５抗体でヒト末梢血細胞を標識した。
【００４８】
フローサイトメトリーによる分析用の細胞を含有する溶液を調製した直後、すなわち時間Ｔ０の時、およびその３０分後、すなわち時間Ｔ３０の時に、フローサイトメトリーによって上記細胞を分析した。
【００４９】
図１および図５は、予測通り、ＡＰＣタンデム蛍光色素と結合した全白血球抗ＣＤ４５抗体が、リンパ球、単球、および多核好中性白血球を標識することを示す。
【００５０】
これらの２つの図において、「ＰＮＮ」という用語は、「多核好中性白血球、すなわち好中性白血球 (neutrophilic polynuclear leukocyte or leukocyte)」を意味する。
【００５１】
ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムまたはＡＰＣ−Ｈ７タンデムのいずれかと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球集団を選択し、時間Ｔ０および時間Ｔ３０におけるＡＰＣチャネル内およびＡＰＣ−Ｃｙ７チャネル内で観察された、それらの蛍光強度を表す二次元プロットを作成した。
【００５２】
これらのプロットを図２、３、５および７に示す。
【００５３】
時間Ｔ０に、ＡＰＣ−Ｃｙ７またはＡＰＣ−Ｈ７チャネル内で強い陽性であり、かつＡＰＣチャネル内で弱い陽性である均一な細胞集団の形態で上記リンパ球が現れることが、図２および５から見て取れる。
【００５４】
対照的に、室温かつ暗条件下における３０分間のインキュベーションの後に、上記リンパ球細胞集団がＡＰＣチャネル内に広がっていることが、図３および７から見て取れる。
【００５５】
蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を考慮すると、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムまたはＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合したＣＤ４５陽性細胞の間で、初期時間Ｔ０と比較して、時間Ｔ３０におけるＡＰＣシグナルの増大が観察される。
【００５６】
併せて、これらの観察は、ＡＰＣチャネル内のシグナルの増大が、ＡＰＣタンデム蛍光色素の減失と連結していることを示している。
【００５７】
この現象を評価するために、本発明者らは、ＡＰＣ−Ｃｙ７またはＡＰＣ−Ｈ７タンデムに関して陽性であるリンパ球集団、すなわちＡＰＣ−Ｃｙ７またはＡＰＣ−Ｈ７チャネル内に発光しているリンパ球集団における、ＡＰＣチャネル内に発光している亜集団、すなわちＡＰＣに関して陽性である亜集団、すなわち図３および７で「デカップリングした」と標識されている集団を対象とした。
【００５８】
陽性閾値は、時間Ｔ０におけるＡＰＣチャネルで決定し、時間Ｔ３０と関係している。「デカップリングした」細胞のパーセントは、ＡＰＣタンデム陽性のリンパ球の総数に対する、ＡＰＣ陽性かつＡＰＣタンデム陽性である細胞の総数の比率として表した。
【００５９】
結果を図４および８に示す。
【００６０】
これらの図で見て取れるように、時間Ｔ３０における蛍光色素ＡＰＣ−Ｃｙ７およびＡＰＣ−Ｈ７のデカップリングのパーセントは、時間Ｔ０におけるものより高い。
【００６１】
ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  ７５０タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体でも同様な結果が得られた。
【００６２】
デカップリングのベースのパーセント（時間Ｔ０におけるデカップリング）は、ＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素より、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素の方が高いが、２種のＡＰＣタンデム蛍光色素のデカップリング比は、インキュベーション時間中、同様な変動、すなわち、図４および８で見て取れるように、４倍から５倍の増大を有する。
【００６３】
併せて、これらのデータは、抗ＣＤ４５抗体と結合したＡＰＣタンデム蛍光色素がリンパ球内で、経時的に分解を受けていることを示唆している。
【００６４】
この研究におけるこの第１部は、ＡＰＣタンデム、すなわちＡＰＣ−Ｃｙ７、ＡＰＣ−Ｈ７またはＡＰＣ−Ａｌｅｘａ  ７５０タンデムを用いたフローサイトメトリー分析中に観察されたデカップリング現象が、用いられた実験条件下で実際に生じることの確認を可能にした。これは、用いられたモデルの正当性を立証するものである。
【００６５】
次に、本発明者らは、このデカップリング現象への細胞性の背景の影響を調査した。
【００６６】
そのために、本発明者らは、リンパ球に結合したＡＰＣタンデム蛍光色素の安定性を分析し、それを、ビーズに結合したこれらの同じＡＰＣタンデムの安定性と比較した。そのＡＰＣタンデムが使用されている背景にかかわらず、分解されたのが上記ＡＰＣタンデムであるか否か、または上記ＡＰＣタンデムが細胞の存在下でのみ分解されているのかどうか、この比較によって判定することが可能となる。
【００６７】
これらの実験で用いたビーズは、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標）であった。
【００６８】
リンパ球を、ビーズと同様に、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素またはＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識した。
【００６９】
図９から１５は、これらの実験中に取得されたデータを表す。
【００７０】
より詳細には、図９は、模式図の形態で、ビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標））またはリンパ球への抗体の結合を示す。
【００７１】
図９で見て取れるように、抗体は、それらの抗原結合部位によって細胞マーカーに結合し、一方、ビーズは、軽鎖の認識を介してそれらのマーカーに結合する。
【００７２】
ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムがビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標））またはリンパ球と結合している時間の関数として観察されたデカップリングのパーセントの変動を図１０に示し、ビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のビーズであるＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標））またはリンパ球がＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合している時間の関数として観察されたデカップリングのパーセントの変動を図１１に示す。
【００７３】
これらの図から、極めて興味深いことに、細胞に結合した抗体でのみ、ＡＰＣ−Ｃｙ７およびＡＰＣ−Ｈ７蛍光色素のデカップリングのパーセントが経時的に増大していることが見て取れる。実際、ビーズに結合した抗体では、デカップリングが観察されない。
【００７４】
同様な結果は、抗ＣＤ２０抗体などの他の抗体を用いても得られた。
【００７５】
これらのデータは、ＡＰＣタンデム蛍光色素の減失が、これらの蛍光色素の従来の使用条件下では、蛍光色素の内在的な不安定性ではなく、上記細胞のラベリングと結びついていることを示唆する。
【００７６】
ＡＰＣタンデム蛍光色素の分解が、使用された抗体に関係なく起こったことを確認するために、リンパ球細胞膜マーカーに対して向けられ、かつＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素またはＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素と結合したいくつかの抗体を試験した。
【００７７】
そのために、Ｂリンパ球の抗ＣＤ２０もしくは抗ＣＤ１９、またはＴリンパ球の抗ＣＤ３に対して向けられた抗体と結合したＡＰＣ−Ｃｙ７およびＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素を用いた。
【００７８】
図１２は、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素またはＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素のいずれかと結合した抗ＣＤ２０抗体の使用中に観察されたデカップリングのパーセントの変動をインキュベーション時間の関数として示す。図１３は、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムまたはＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ３抗体の使用中におけるデカップリングのパーセントの変動をインキュベーション時間の関数として示す。
【００７９】
図１２および１３で見て取れるように、インキュベーション時間の関数として増大するデカップリング現象が観察される。
【００８０】
この場合も、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素の分解のレベルは、ＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素のものより高い。
【００８１】
これらの結果は、ＡＰＣタンデム蛍光色素の減失がＴリンパ球およびＢリンパ球の両方の表面マーカーのターゲッティング中に起こることも確認する。
【００８２】
細胞型の影響も調査した。
【００８３】
そのために、様々な型の白血球細胞の集団を、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素またはＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素のいずれかと結合した全白血球抗ＣＤ４５抗体で標識し、各亜集団におけるデカップリングを経時的に測定した。
【００８４】
得られた結果を、図１４および図１５に示す。図１４は、
−ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、
−ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球、
−ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、
−ＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、および
−ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球
のデカップリングのパーセントを時間の関数として示し、図１５は、ＡＰＣ−Ｃｙ７蛍光色素またはＡＰＣ−Ｈ７蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球で観察されたデカップリングのパーセントを示す。
【００８５】
これらの図で見て取れるように、抗ＣＤ４５抗体がリンパ球、単球および顆粒球に結合しているときに、ＡＰＣ−Ｃｙ７およびＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素のデカップリングのパーセントが増大している。
【００８６】
しかし、すべての結合ＡＰＣタンデムに関して、分解速度はリンパ球、単球および顆粒球の間で漸増している。
【００８７】
これらの結果は、ＡＰＣタンデム蛍光色素の分解が細胞型に依存しているが、すべての場合で起こっていることを示す。
【００８８】
第１の結論として、本発明者らの上記実験は、デカップリング現象が、細胞の存在下でのみ、この細胞の型に関係なく現れること、およびデカップリング現象が、その細胞型に従って、より大きな程度、またはより小さな程度で存在することを示している。
【００８９】
これらの結果に基づいて、本発明者らは、次に、ＡＰＣタンデム蛍光色素の細胞依存性分解を遮断する可能性のある経路を探求した。
【００９０】
そのため、第一に、ＢＤ  Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（商標）溶解／固定緩衝液を用いて、ＡＰＣタンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された細胞を固定して、その後、蛍光色素の経時的な分解を測定した。
【００９１】
図２１は、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された、結合済または未結合のリンパ球または多核好中球で生じたデカップリングのパーセントの経時的な変動を表し、図２１で見て取れるように、この生じたデカップリングのパーセントは、リンパ球および多核好中性白血球で、経時的に安定しており、かつベースライン、すなわち時間Ｔ０で得られた値近くに維持されている。図２３で見て取れるように、同じことが単球でも当てはまる。図２３は、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体が結合した単球で生じたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として表している。
【００９２】
これらの同じ型の細胞で、今回はＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体を用いて、同じ結果が得られた。
【００９３】
細胞の代謝活性を停止させる固定緩衝液を用いた、デカップリング現象の強い抑制は、ＡＰＣタンデム蛍光色素の減失における細胞代謝の役割を実証している。
【００９４】
しかし、細胞の固定は、細胞死を引き起こし、とりわけ機能的エピトープの減失をもたらし得る。
【００９５】
さらに、細胞の固定は、細胞の日常的分析のプロトコールを用いる際の状態の１つではない。
【００９６】
したがって、細胞の固定はデカップリング現象の抑制を可能にするが、それは本発明の好ましい方法ではない。
【００９７】
本発明者らは、次に、類似した白血球標識条件下で、４℃でインキュベーションを行うことによって、温度の影響を調査した。上述の通り、通常のアッセイでは、このインキュベーションが室温、すなわち１８℃と２５℃（端値を含む）との間の温度で行われる。
【００９８】
結果を図２２および２４に示す。
【００９９】
図２２は、室温でインキュベートされたリンパ球および４℃でインキュベートされたリンパ球、ならびに室温でインキュベートされた多核好中球および４℃でインキュベートされた多核好中球のフローサイトメトリー分析中に経時的に生じたデカップリングのパーセントの変動を示す。
【０１００】
図２４は、室温でインキュベートされた、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された単球、および４℃でインキュベートされた単球のフローサイトメトリー分析中に現れたデカップリングのパーセントの変動を示す。
【０１０１】
図２２および２４から見て取れるように、４℃では、リンパ球、多核好中性白血球および単球におけるＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素の分解のパーセント全てが、これらの同じ細胞で、同一条件下、但し室温でのインキュベーションを用いて観察されたパーセントと比較して経時的に増大せず、非常に低いままである。
【０１０２】
同じ結果が、ＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素を用いて得られた。
【０１０３】
これらの実験から、ＡＰＣタンデム蛍光色素の分解への細胞代謝の重要性が再度確認される。
【０１０４】
しかし、この場合も、４℃でのインキュベーションは、細胞の日常的な分析プロトコールの状態ではない。さらに、４℃でインキュベーションするためには、インキュベーションの持続時間がより長くなり、より限定的な条件を必要とする。したがって、この方法は効率的ではあるが、本発明の好ましい方法ではない。
【０１０５】
細胞が室温で維持されているときに、細胞の代謝活性を遮断するために、本発明者らは、次に、多くの結合体にしばしば添加されるアジ化ナトリウム（ＮａＮ３）の影響を試験した。
【０１０６】
次いで、リンパ球でのデカップリング現象には、０．０５％ＮａＮ３は弱い影響を与えるに過ぎなかったが、ＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素の減失を０．０５％ＮａＮ３が強く抑制したことが観察された。
【０１０７】
単球および多核好中性白血球で、同様な効果が細胞生存率に影響を与えずに観察された。
【０１０８】
これは、代謝活性の抑制がＡＰＣタンデム蛍光色素の保護をもたらすことを実証するものである。
【０１０９】
しかし、アジ化ナトリウムはシトクロムオキシダーゼを非可逆的に抑制し、技師および環境にとって毒性であると考えられている。
【０１１０】
次に、本発明者らは、当技術分野に存在する先入観に反して、ＡＰＣタンデム蛍光色素の分解に対する、光への暴露の影響を調査した。
【０１１１】
実際、従来技術によれば、概して、そしてこれはすべての蛍光色素に関して、細胞のラベリングは光の非存在下で行うことが強く推奨されており、そしてＡＰＣタンデム蛍光色素に関しては、この点が製造会社の指示書において、とりわけ強調されている。
【０１１２】
それゆえ、本発明者らは、この先入観に挑戦して、免疫標識された血球を人工光源（ネオン管）に暴露し、これらの条件下で得られたデカップリングのパーセントを、免疫標識を光の非存在下で行った場合に得られたデカップリングのパーセントと比較した。
【０１１３】
得られた結果を図１６から２０に示す。
【０１１４】
図１６は、光への暴露中または光への暴露なしで、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、単球および多核好中球で生じたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す。
【０１１５】
図１７は、同じく光の存在下または光の非存在下で、これらの同じ細胞ではあるが、ＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された細胞で得られたデカップリングのパーセントの変動を示す。
【０１１６】
図１６および１７から見て取れるように、驚いたことに、これらの３つの細胞型における、ＡＰＣ−Ｃｙ７およびＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素の分解のパーセントは、１時間という短い時間ではその全体を通して、光の存在下でも、光の非存在下でも同様であった。これらの実験条件下における、これらタンデムの分解への光の影響のこの欠如は、ＡＰＣ蛍光色素、およびＡＰＣ−Ｃｙ７またはＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素の同等な消光を伴う。
【０１１７】
この仮説を、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で免疫標識されたビーズ、ＡＰＣ−Ｈ７タンデム蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で免疫標識されたビーズ、およびＡＰＣ蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で免疫標識されたビーズによって、すなわち細胞の非存在下で確認した。
【０１１８】
時間の関数としての平均蛍光強度（ＭＦＩ）の変動を、図１８、１９および２０に示す。
【０１１９】
より詳細には、図１８は、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で免疫標識されたビーズの、光の存在下および非存在下における、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の変動を時間の関数として示す。
【０１２０】
図１９は、光の存在下および非存在下における、ＡＰＣ−Ｈ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたビーズの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の変動を時間の関数として示す。
【０１２１】
図２０は、光の存在下および非存在下における、ＡＰＣ蛍光色素と結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたビーズの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の変動を時間の関数として示す。
【０１２２】
これらの図から見て取れるように、３種の蛍光色素の平均蛍光強度は、光の非存在下でも、存在下でも、同様な速度論で経時的に漸減し、これは、光の影響の欠如がＡＰＣ蛍光色素の消光の過小評価と結びついていないことを示唆している。
【０１２３】
併せて、これらの実験は、光への暴露がこれらの実験条件下でＡＰＣタンデムの分解の触媒として働いているかもしれないとする仮説を強く排除する。
【０１２４】
したがって、本発明者らは、当技術分野の先入観を克服した。
【０１２５】
本発明者らは、次に、酸化現象の潜在的役割を探索した。
【０１２６】
本発明者らは、次に、ＡＰＣタンデム蛍光色素の分解における、フリーラジカルの存在および／またはその基底にある酸化現象の潜在的影響を調査することを決定した。
【０１２７】
実際、以前に得られた結果は、ＡＰＣタンデム蛍光色素の分解が単球内で、リンパ球内および多核好中球内より高い割合で生じたことを示しており、これは、調査された細胞の型の特性に、デカップリング現象が依存していたかもしれないことを示唆する。
【０１２８】
単球およびマクロファージの主要機能の１つは、微生物の食作用および殺作用であり、これらはスーパーオキシドおよび過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の産生に依存している。
【０１２９】
ＡＰＣタンデム蛍光色素の分解へのＨ２Ｏ２の影響を試験するために、本発明者らは、ＡＰＣ−Ｃｙ７と結合した抗ＣＤ４５抗体で細胞を免疫標識し、Ｈ２Ｏ２の存在下または非存在下でそれらをインキュベートした。
【０１３０】
これらの細胞を２０から６０分間分析した。
【０１３１】
得られた結果は、０．０１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２はリンパ球のデカップリングのパーセントを変化させないが、０．１ｍＭ  Ｈ２Ｏ２はそれを増大させたことを示している。
【０１３２】
これに匹敵する過酸化水素の働きが、細胞の生存率にいかなる影響も与えずに、単球および多核好中球で観察された。これは、フリーラジカルの存在および／または酸化現象がデカップリング現象で役割を果たしているかもしれないことを示唆している。
【０１３３】
過酸化水素は、時間をかければ、ビーズに結合したＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム結合抗体のデカップリングを誘導できることに留意するべきである。
【０１３４】
ＡＰＣタンデム蛍光色素の分解を抑制するのに細胞固定、低温またはアジ化ナトリウムを用いることには多くの不都合があるので、本発明者らは、デカップリング現象への酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤の使用を試験した。
【０１３５】
そのために、ビタミンＣそれ自体は、溶液中で非常にこわれやすく、室温でのインキュベーションの前に、空気、光、および熱によって分解されるが、ＡＰＣタンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で免疫標識された細胞を、酸化防止剤および／またはフリーラジカル除去剤として使用されるビタミンＣの存在下または非存在下でインキュベートした。結果を図２５および２６に示す。
【０１３６】
図２５は、ビタミンＣの非存在下、および最終濃度１ミリモル（１ｍＭ）のビタミンＣの存在下における、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識されたリンパ球、ならびにビタミンＣの非存在下、および最終濃度１ｍＭのビタミンＣの存在下における、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデムと結合した抗ＣＤ４５抗体で標識された多核好中球で生じたデカップリングのパーセントの変動を時間の関数として示す。
【０１３７】
図２６は、ビタミンＣの非存在下、および最終濃度１ｍＭのビタミンＣの存在下における、ＡＰＣ−Ｃｙ７タンデム結合抗ＣＤ４５抗体に結合した単球で得られたデカップリングのパーセントの変動を示す。
【０１３８】
分解のパーセントを１時間モニターした。
【０１３９】
図２５および２６から見て取れるように、驚いたことに、ビタミンＣの存在は、リンパ球および多核好中性白血球におけるデカップリングのパーセントを経時的に強く抑制し、単球では、より少ない程度で抑制する。
【０１４０】
この結果は、免疫標識された細胞表面のＡＰＣタンデム結合体の減失における、酸化および／またはフリーラジカルの存在の重要な役割を示しており、驚いたことに、上記酸化および／またはフリーラジカルの存在は、溶液中のビタミンＣによって抑制される。
【０１４１】
この役割は、１ｍＭのビタミンＣを添加した、漸増する濃度のＨ２Ｏ２（０から１ｍＭ）にＣｏｍｐｂｅａｄｓ（登録商標）ビーズを暴露することによって確認した。ビタミンＣのこの添加は、試験されたすべての濃度のＨ２Ｏ２で、ＡＰＣタンデムのシグナルの減失を阻止する。
【０１４２】
それゆえ、ビタミンＣの使用は、ＡＰＣチャネル内の異常なシグナルを阻止するのに非常に有利である。
【０１４３】
したがって、本発明は、免疫標識された血球におけるＡＰＣタンデムの減失の作用機序、すなわち従来技術でそうであると考えられていたように光分解現象によるのではなく、フリーラジカルによるＡＰＣタンデム蛍光色素の酸化および／または分解の作用機序の発見に基づいている。
【０１４４】
本発明は、ビタミンＣが、上記分析を可能にするのに十分な時間にわたって溶液中に存在する場合でさえ、その酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉作用を効果的に行うという発見にも基づいている。
【０１４５】
上記の本文では、血球との関連において本発明を説明したが、当業者には、骨髄細胞または植物細胞、および同様の細胞など、フローサイトメトリーで分析できるすべての型の細胞に本発明が適用可能であることは明らかであろう。
【０１４６】
同様に、ビタミンＣの使用は、デカップリング現象を引き起こす作用機序を発見するのを可能にしたが、細胞に毒性でないいかなる酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤も本発明で使用できることは当業者には明らかであろう。
【０１４７】
詳細には、あらゆる形態のアスコルビン酸が特に適している。
【０１４８】
しかし、Ｌ型のアスコルビン酸、すなわちビタミンＣは、水性溶媒に可溶性であり、かつこれらの濃度で細胞に毒性でなく、その使用は、他の酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤と比較して、多数の利点を有する。
【０１４９】
同様に、記載および例示したアッセイは、１ｍＭの最終ビタミンＣ濃度で行ったが、０．１ミリモル濃度（０．１ｍＭ）および１０ミリモル濃度（１０ｍＭ）の濃度のビタミンＣが存在する濃度でもアッセイを行った。
【０１５０】
上記細胞がリンパ球である場合には、ビタミンＣは、０．１ｍＭの濃度で、既に効果をもたらすが、それは低減した効果しかもたらさない。それゆえ、それより低濃度のビタミンＣはデカップリングのパーセントの十分な低減を得るのに適していない。さらに、１０ｍＭ超では、リンパ球の形態および生存率が変化する。
【０１５１】
最も良い結果は、リンパ球では、１ｍＭと５ｍＭとの間（端値を含む）のビタミンＣ濃度で得られる。
【０１５２】
したがって、リンパ球では、本発明における、ビタミンＣの好ましい濃度は、それが最適なビタミンＣ濃度を用いたデカップリング現象の最適な抑制を得ることを可能にするので、１ｍＭである。
【０１５３】
上記細胞が単球である場合には、デカップリングのパーセントの十分な低減は、１ｍＭのビタミンＣ濃度で現れる。この低減は、最大１０ｍＭのビタミンＣ濃度まで存在する。１０ｍＭというこの濃度を超えると、単球の生存率および形態が変化する。
【０１５４】
上記細胞が多核好中球である場合には、デカップリングのパーセントの十分な低減は、０．２５ｍＭのビタミンＣ濃度で得られる。
【０１５５】
この低減は、最大１０ｍＭのビタミンＣ濃度まで存在する。１０ｍＭを超えると、上記細胞は、それらの生存率を低下し始める。
【０１５６】
多核好中球では、０．７５ｍＭと４ｍＭ（端値を含む）との間のビタミンＣ濃度で、最も良い結果が得られる。４ｍＭを超えると、上記細胞は形態学的障害を起こし始める。
【０１５７】
この理由から、多核好中球では、０．７５ｍＭと２ｍＭ（端値を含む）との間が、より好ましいビタミンＣ濃度であり、０．７５ｍＭが最も好ましい。
【０１５８】
さらに、上記の本文では、ラベリング溶液中でのインキュベーションの時点で酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤を添加したが、あらかじめそれを、例えばあらかじめ調製しておいたインキュベーション緩衝液に添加しておいて、蛍光色素と結合した抗体で標識するのに使用してもよいことは当業者には明らかであろう。
【０１５９】
したがって、本発明は、フローサイトメトリーによる分析法における、酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤、好ましくはアスコルビン酸、そして最も好ましくはＬ型のアスコルビン酸、すなわちビタミンＣの使用に関する。
【０１６０】
ビタミンＣは、上記ラベリング溶液中の最終濃度が０．１ｍＭと１０ｍＭとの間（端値を含む）、好ましくは１ｍＭで用いるのが好ましい。
【０１６１】
同様に、本発明は、酸化防止剤および／またはフリーラジカル捕捉剤、好ましくはアスコルビン酸、そして最も好ましくはビタミンＣを含む、上記細胞のラベリング中に使用されるインキュベーション緩衝液にも関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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