(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓癌の予防用または治療用医薬の製造のためのトコトリエノールおよび化学療法剤を含む組成物の使用であって、治療有効量のトコトリエノールおよび治療有効量の化学療法剤を含む組成物を対象に投与することを含み、前記トコトリエノールがγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなる群から選択され、前記化学療法剤がゲムシタビンおよび５−ＦＵからなる群から選択される、使用。
【請求項２】
手術後の対象における転移を予防するための医薬の製造のための治療有効量のトコトリエノールおよび化学療法剤の使用であって、前記医薬を前記対象に投与する段階を含み、前記対象が膵臓癌の切除を受けた対象であり、前記トコトリエノールがγ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなる群から選択され、そして前記化学療法剤がゲムシタビンおよび５−ＦＵからなる群から選択される、使用。
【請求項３】
組成物が、α−トコトリエノールとβ−トコトリエノールを含まない請求項１または２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項４】
組成物が、α−トコトリエノール、β−トコトリエノールおよびγ−トコトリエノールからなる群から選択される少なくとも１種のトコトリエノールを含まない請求項１または２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項５】
組成物が、トコフェロール類を含まない請求項１または２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項６】
組成物が、１００ｍｇ〜３００ｍｇのトコトリエノールを含む請求項１または２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項７】
膵臓癌が、膵管癌、または膵臓癌のステージである請求項１または２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項８】
対象が、膵臓癌に対して遺伝的疾病素質を有する対象および新生物発生前の病変を有する対象からなる群から選択される請求項１または２のいずれか１つに記載の使用。
【請求項９】
新生物発生前の病変が、ＰａｎＩＮ、ＩＰＭＮおよびＭＣＮからなる群から選択される請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００６年６月２７日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６０／８０５，９１６号（引用により完全に本明細書中に取り込まれる）；および２００７年６月２６日に出願された同時係属中の米国非仮特許出願第１１／７６８，３７３号の非仮特許出願である。
【０００２】
（連邦政府の利害関係の宣言）
本発明は、国防総省により与えられた認可番号ＤＡＭＤ１７−０１−１−０４およびＮＣＩ認可番号３Ｒ０１ＣＡ０９８４７３−０３Ｓ１の下、連邦政府支援によりなされた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
膵臓は、早期新生物−非浸潤性クローン上皮細胞増殖の発生の非常に一般的な部位である。少数の人々においては、細胞のこれらのクローンは、浸潤性腺癌を生じさせる遺伝子の変化を順次に獲得する。膵臓癌は、一旦浸潤性となると、ほとんど一様に致命的である。このプロセスの進行した段階の上皮細胞は、非常に攻撃的であり、それらが膵管構造を越えて周囲組織に侵入したすぐ後に見られる転移のための固有の能力を一見有しているようである。この疾病に関連した暗い予後を緩和するために、膵臓の発癌のプロセスを認識し、浸潤前に治療することが必須である。化学的防御は、発癌の進行を遅らせる、後退させる、または抑制する薬剤（薬物、生物学的製剤、および栄養剤）の投与であり、それによって、浸潤性の、または臨床的に重大な病気を発症させる危険性を低下させる。浸潤性膵臓癌の前駆病変の形態と生態学を理解することは、したがって、最も重要な問題となってきている。ここ１０年の間に、著しい進歩が、これらの前駆病変の認知と適切な分類においてなされてきた。膵粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮｓ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮｓ）、および膵上皮内腫瘍性病変（ＰａｎＩＮ）は、浸潤性膵臓癌に対する３つの既知の形態学的に異なる前兆を包含する。
【０００４】
多数のケース−コントロール研究とコホート研究は、一部の家族で膵臓癌の著しい集積性があることを明らかにした。これらの高いリスクの遺伝性膵臓癌は、膵臓癌の約１０％に相当すると推測される。既知の遺伝子欠損を伴う５つの有名な遺伝的な症候群は、膵臓癌の集合がある家族の約２０％を占める。これらの症候群は、（１）ＢＲＣＡ２、（２）家族性異型多発母斑黒色腫症候群（ｐ１６／ＣＤＫＮ２Ａ）、（３）ポイツ・イエーガー症候群（Ｐｅｕｔｚ−Ｊｅｇｈｅｒｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；（４）ＨＮＰＣＣ；および（５）家族性膵炎を含む。膵臓癌の大多数は、単発性であり、転座および欠失の高い割合を含む広範囲にわたる染色体不安定性の証拠を有する。ほとんど全て（＞９０％）の浸潤前病変は、成長因子シグナル伝達に関係するＫ−Ｒａｓタンパク質での初期の突然変異を有する。浸潤前進行の中間のステージでは、病変の＞９０％が、ＣＤＫＮ２Ａ（ｐ１６）サイクリン依存性キナーゼ阻害剤の不活化を進展させる。後期のステージでは、大部分の浸潤前病変は、また、ＴＰ５３（ｐ５３）の突然変異およびＭＡＤＨ４におけるＴＧＦβの形質導入とアクチビンシグナルに関係する共通のＳｍａｄタンパク質の突然変異を保持する。膵臓新生物での化学予防剤に関する非常に明らかな恩恵にもかかわらず、化学的予防の適応症のための直接的な薬物探索が出現するのが遅かった。重要な要因は、臨床的な利益を明確にし、証明する研究を実施するという挑戦である。
【０００５】
膵臓癌の増殖は、異常な発癌性Ｒａｓシグナル伝達とｐ２７ｋｉｐ１などのサイクリンキナーゼ阻害剤に対するその効果によって制御される。先の研究は、Ｒａｓシグナル伝達経路の１つ（Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路）の薬理的な阻害が、ｐ２７の誘導された発現を通して膵臓癌細胞周期停止を引き出すことを証明した（非特許文献１）。トコトリエノール類（不飽和イソプレノイド側鎖を有するビタミンＥの化学的形態）は、癌の予防および治療のための有望な栄養補助食品として注目を受けている。  
【０００６】
トコトリエノール類は、ヤシや穀類（例えば米と小麦）などの大部分の単子葉植物の種の中にあるビタミンＥの主要な形態である。トコトリエノール類やトコフェロール類の生合成は、光合成の有機体だけに見られ、ホモゲンチジン酸に起因する。トコトリエノール類は、ホモゲンチジン酸とゲラニルゲラニル二リン酸の縮合により生じ、その一方でトコフェロール合成における始動ステップは、ホモゲンチジン酸とフィチル二リン酸の縮合である。構造的に、トコフェロール類とトコトリエノール類は、共通のクロマノール頭部とＣ−２位置での側鎖から成るいくつかの類似性を共有するが、しかしながら、それらの側鎖がトコフェロール類とトコトリエノール類を区別している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；６５（１１）：４８７０−８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
トコフェロールは、飽和フィチル尾部を有するのに対して、トコトリエノールは不飽和イソプレノイド側鎖を有する。トコフェロール類とトコトリエノール類は、クロマノール環上のメチル置換の数と位置に従って、ギリシャ文字接頭語（α、β、γ、δ）によって割り当てられた個々の化合物にさらに分けられる。それらの構造的な類似性に反映されるように、トコフェロール類とトコトリエノール類は、それらの抗酸化作用に関してよく認識されている。しかし、トコトリエノール類は、明らかな一貫した抗腫瘍活性を有する天然ビタミンＥ化合物の一群である。コハク酸トコフェロールなどの半合成トコフェロール類は、抗腫瘍活性を有するが、経口消費後の元の化合物の生物学的利用能は劣り、化学予防介入には不適切である。ビタミンＥ化合物のプロアポトーシス効果の構造活性研究は、それらの抗腫瘍生物活性において、ビタミンＥ化合物の不飽和イソプレノイド尾部の重要性を明確に立証した。さらにまた、これらの研究は、クロマノール環上のメチル置換の数を減少させることは、抗腫瘍効力を増大させることと関係していることを示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの実施形態において、本発明は、単離されたサンプルで、ｐ２７などの代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルの測定により化学療法剤の有効性を測定する方法を含む。次に、サンプルは、試験される化学療法剤の実験的有効量と接触させる。化学療法剤の投与後、代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルが測定され、第１（処置前）レベルと比較される。候補化学療法剤は、ｐ２７の第２（処置後）レベルが、処置前および／または対照レベルに対して統計学的に有意な程度に増加する有効性を証明する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、単離されたサンプルで、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫなどの第２代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルをさらに測定することにより化学療法剤の有効性を測定する方法を提供する。化学療法剤の投与後、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫの第２レベルが測定され、第１（処置前）レベルおよび／または対照と比較される。候補化学療法剤は、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫの第２（処置後）レベルが、処置前および／または対照レベルよりも統計学的に有意な程度に減少する有効性を証明する。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、例えば、単離されたサンプルで、バイオマーカー；すなわちｐ２７のレベルを測定することによって、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージをスクリーニングする方法を含む。次いで、バイオマーカーのレベルは、１つまたはそれ以上の対照サンプル中での対応する対照レベルと比較される。好ましい実施形態では、対照サンプルは、膵管癌、または膵臓癌のステージを有していないと決定された個体から得られる。
【００１２】
対象でのバイオマーカーのレベルと対照サンプル（複数を含む）のバイオマーカーのレベルとの間の統計学的に有意な類似度の測定は、対象において膵管癌、または膵臓癌のステージがないことを示す。対照サンプル（複数を含む）におけるバイオマーカーのレベルと比較して、対象でのｐ２７のレベルにおける統計学的に有意な減少は、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す。
【００１３】
別途の実施形態では、第２のバイオマーカー、すなわち、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベルが測定されて、１つまたはそれ以上の対照サンプル中のＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫの対照レベルと比較される。対象および対照サンプル（複数を含む）におけるＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベル間の統計学的に有意な増加は、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージを示す。対照サンプル（複数を含む）と比較した、対象でのＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベルにおける統計学的に有意な類似度は、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージがないことを示す。
【００１４】
対象および対照サンプル（複数を含む）でのバイオマーカーのレベルを測定する方法は、通常の開業医に公知である。１つの実施形態において、１例として、バイオマーカーのレベルは、バイオマーカーと結合する抗体を利用して測定される。バイオマーカーを含むサンプルは、バイオマーカーが抗体に結合するのを可能とする条件下で、抗体と接触させる；次いで、バイオマーカーの存在を定量化することができる。
【００１５】
本発明は、また、関連する方法を実行するために有用な組成物を含む。例えば、本発明は、関連バイオマーカー；すなわち、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫ、ならびにｐ２７のタンパク質産物と選択的に結合する複数の単離されたタンパク質から成る組成物を含む。好ましい実施形態において、単離されたタンパク質は、選択的に相補的な二本鎖ＤＮＡを増幅する。組成物は、また、複数のバイオマーカー特異的プライマーを含み、そこでは各バイオマーカー特異的プライマーは、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫ、およびｐ−２７などのユニークバイオマーカーに対して相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅する。あるいはまた、本発明は、少なくとも２つのユニークなバイオマーカーのタンパク質産物と選択的に結合する複数の単離されたタンパク質から成る組成物を含み、そこでは、各ユニークバイオマーカーがＫｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびｐ２７からなる群から選択される。
【００１６】
したがって、本発明はトコトリエノールの治療有効量を含む組成物を対象に投与することによって膵管癌、または膵臓癌のステージなどの癌を治療する方法を含む。好ましい実施形態において、トコトリエノールは、γ−トコトリエノールおよび／またはδ−トコトリエノールであり、それは医薬組成物として投与される。好ましい実施形態の組成物は、α−トコトリエノール、β−トコトリエノールおよび／またはトコフェロール類を実質的に含まない。当業者は、適切な用量を決定する方法を認識するであろうが、１つの実施形態の組成物は、１日２回投与される約１００ｍｇ〜３００ｍｇのトコトリエノールを含む。
【００１７】
好ましい実施形態のトコトリエノールは、式：
【００１８】
【化１】
0005490532.tif 000002
を有し、式中、ＲはＨおよびＣＨ３からなる群から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の性質と目的のより十分な理解のために、添付の図面と関連して、以下の詳しい説明を参照すべきである：
【図１Ａ】軟寒天中のＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞の画像である；ビヒクルと比較して、毎週δ−トコトリエノールで処置した場合、細胞の足場非依存性増殖の著しい抑制が起きた。
【図１Ｂ】ＭＩＡ  ＰａＣａ２膵臓癌細胞（３×１０３）が９６穴プレートに播種されて、翌日δ−トコトリエノールで処置されたグラフである。増殖は、ＭＴＴによって２４時間の間隔で評価された。結果は、増殖の用量依存性抑制を示す。全ての３つの膵臓癌細胞株に対するＩＣ５０は、２４時間で２０〜２５μＭであった。ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞もまた、２４時間δ−トコトリエノールの濃度を増加させて処置された。
【図１Ｃ】ＳＷ１９９０膵臓癌細胞（３×１０３）が、９６穴プレートでプレート化されて、翌日δ−トコトリエノールで処置されたグラフである。増殖は、ＭＴＴによって２４時間の間隔で評価された。結果は、増殖の用量依存性抑制を示す。全ての３つの膵臓癌細胞株に対するＩＣ５０は、２４時間で２０〜２５μＭであった。ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞もまた、２４時間δ−トコトリエノールの濃度を増加させて処置された。
【図１Ｄ】ＢＸＰＣ３膵臓癌細胞（３×１０３）が、９６穴プレートでプレート化されて、翌日δ−トコトリエノールで処置されたグラフである。増殖は、ＭＴＴによって２４時間の間隔で評価された。結果は、増殖の用量依存性抑制を示す。全ての３つの膵臓癌細胞株に対するＩＣ５０は、２４時間で２０〜２５μＭであった。ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞もまた、２４時間δ−トコトリエノールの濃度を増加させて処置された。
【図１Ｅ】２４時間でのδ−トコトリエノールによる膵臓癌細胞株増殖の選択的な抑制を表すグラフである。ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、最高濃度においてでさえ、トコトリエノールの抗増殖効果に対して比較的抵抗性であった。
【図２Ａ】δ−トコトリエノール（２５μＭ）で処置されたＨＰＤＥ  ６Ｃ７とＳＷ１９９０膵臓癌細胞株における有意なＧ１期細胞周期停止を表すグラフである。対照的に、δ−トコトリエノールは、不死化ヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ  ６Ｃ７）での細胞周期に何らの効果も有しなかった。
【図２Ｂ】δ−トコトリエノール（２０μＭ）で処置されたＭａＰａＣａ２とＢＸＰＣ３膵臓癌細胞株における有意なＧ１期細胞周期停止を表すグラフである。対照的に、δ−トコトリエノールは、不死化ヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ  ６Ｃ７）での細胞周期に何らの効果も有しなかった。
【図２Ｃ】全ての４つの膵臓癌細胞株でのｐ２７ｋｉｐ１発現における時間依存性上方制御を示す一連のブロットである。対照的に、ｐ２７ｋｉｐ１の下方制御は、δ−トコトリエノールで処置されたＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞で見られる。
【図２Ｄ】δ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞におけるルシフェラーゼ活性の増加を示すグラフである。
【図２Ｅ】ｓｉＲＮＡｐ２７が膵臓癌細胞増殖のトコトリエノール抑制をレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）することを示すグラフと関連ブロットである。
【図２Ｆ】ｓｉＲＮＡｐ２７が、膵臓癌細胞でのトコトリエノール誘導Ｇ１−Ｓ期細胞周期停止をレスキューすることを示す１対のグラフである。
【図３Ａ】発癌性Ｒａｓ  ｐ−ｃＲａｆ、ｐ−ＭＥＫ、およびｐ−ＥＲＫの下流のリン酸化された標的のδ−トコトリエノールによる選択的な抑制を示すブロット系列である。ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、δ−トコトリエノールの抑制効果に対して抵抗性であった。
【図３Ｂ】δ−トコトリエノール（２０μＭ）で２４時間および４８時間処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞およびＳＷ１９９０細胞を示すブロット系列である。細胞溶解液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ｐ−ＡＫＴとＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に関してイムノブロットされた。ブロットは、２４時間および４８時間でｐ−ＡＫＴタンパク質レベルの減少を示すが、ＡＫＴでは示さない。
【図４Ａ】時間依存性の様式でカスパーゼ８、カスパーゼ３、およびＰａｒｐの切断により証明されるようにカスパーゼカスケードの活性化を示すグラフである。
【図４Ｂ】時間依存性の様式でカスパーゼ８、カスパーゼ３、およびＰａｒｐの切断により証明されるようにカスパーゼカスケードの活性化を示す一連の画像である。
【図４Ｃ】時間依存性の様式でカスパーゼ８、カスパーゼ３、およびＰａｒｐの切断により証明されるようにカスパーゼカスケードの活性化を示す一連のブロットである。
【図４Ｄ】時間依存性の様式でカスパーゼ８、カスパーゼ３、およびＰａｒｐの切断により証明されるようにカスパーゼカスケードの活性化を示す一連のブロットである。
【図５Ａ】処置前および１０日目の対照群とδ−トコトリエノール群の代表的な発光計測を示す。処置後１０目までの増殖率は、トコトリエノール処置群ではより小さい。ルシフェラーゼによるＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞の安定な形質移入体が、ヌードマウスの皮下に注入された。腫瘍体積は、２日おきに口径測定器（Ｃａｌｉｂｅｒｓ）で測定され、増殖率は、毎週ＩＶＩＳ  １００  Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、腫瘍発光を測定することで決定された。類似の体積（１００〜１５０ｍｍ３）の腫瘍と発光に基づく増殖率は、ランダム化されてビヒクルまたはδ−トコトリエノール（１００ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかの２０日間にわたる強制給餌を受けた。
【図５Ｂ】ビヒクルと比較したδ−トコトリエノール処置の異種移植片における腫瘍増殖の５０％の著しい縮小を示すグラフである。
【図５Ｃ】発癌性Ｒａｓシグナル伝達標的に関するδ−トコトリエノールの効果の一連の免疫組織化学的染色である。増殖の抑制は、対照群からの腫瘍と比べた、δ−トコトリエノールで処置されたマウスからの腫瘍でのＫｉ６７の減少とＴＵＮＥＬによるアポトーシス誘導で証明される。
【図６】表Ｉ−ＩＩで示される２４時間および４８時間でのＳＷ１９９０膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ−１）のＭＴＳ分析のグラフである。
【図７】表ＩＶ−Ｖで示される２４時間および４８時間でのＭｉａＰａＣａ２膵臓癌細胞のＭＴＳ分析のグラフである。
【図８Ａ】ビヒクルまたは処置ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞と比較して、δ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡＰａＣａ２でのアポトーシス細胞の著しい増加を示す一連の画像である。
【図８Ｂ】ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞が、δ−トコトリエノールまたはビヒクルの濃度を変えて２４時間処置されたグラフである。細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣで染色し、アポトーシスに関してフローサイトメトリにより分析した。
【図８Ｃ】ＢＸＰＣ３膵臓癌細胞が、δ−トコトリエノールまたはビヒクルの濃度を変えて２４時間処置されたグラフである。細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣで染色し、アポトーシスに関してフローサイトメトリにより分析した。
【図８Ｄ】ＳＷ１９９０膵臓癌細胞が、δ−トコトリエノールまたはビヒクルの濃度を変えて２４時間処置されたグラフである。細胞を回収し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣで染色し、アポトーシスに関してフローサイトメトリにより分析した。
【図９Ａ】時間依存性の様式でのカスパーゼ８、カスパーゼ３、およびＰａｒｐの切断により証明されるようにカスパーゼカスケードの活性化を示す。
【図９Ｂ】δ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞は、シトクロムＣ放出またはカスパーゼ９の切断の欠如で示されるようにミトコンドリアの前アポトーシスタンパク質に有意な影響を及ぼさなかった。
【図９Ｃ】いくつかの膵臓癌細胞株での選択的なカスパーゼ８と３の切断を示すが、不死化膵管上皮細胞株であるＨＰＤＥ−６Ｃ７細胞では示されなかった。カスパーゼ９は、膵臓癌細胞で切断されなかった。
【図１０】膵臓癌細胞株でのリン酸化ＡＫＴ（しかし、全ＡＫＴではない）における時間依存性の減少を示すが、ＨＰＤＥ細胞ではそうではない。
【図１１Ａ】ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ｐＺＷＬベクターおよびｍｙｒＡＫＴ）が、１０時間のカスパーゼ８／３阻害剤での前処置ありでまたはなしで、血清ビヒクルまたはδ−トコトリエノール（５０μＭ）なしで２４時間処置されたグラフである。細胞は、また、陽性対照としてＴＲＡＩＬで処置された。次いで、細胞は、収集され、固定され、膜透過され、トリパンブルーで染色された。グラフは、ビヒクル、ｍｙｒ−ＡＫＴ、またはカスパーゼ８／３阻害剤処置細胞と比較した、ベクターにおけるアポトーシス細胞の有意な増加を示す。
【図１１Ｂ】ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ｐＺＷＬベクターおよびｍｙｒＡＫＴ）が、１０時間のカスパーゼ８／３阻害剤での前処置ありでまたはなしで、血清ビヒクルまたはδ−トコトリエノール（４０μＭ）なしで２４時間処置されたグラフである。次いで、細胞は、収集され、固定され、膜透過され、Ｔｕｎｅｌ染色された。グラフは、ビヒクル、ｍｙｒ−ＡＫＴ、またはカスパーゼ８／３阻害剤処置細胞と比較した、ベクターにおけるアポトーシス細胞の有意な増加を示す。
【図１２Ａ】ヌードマウスでのＭＩＡ  ＰａＣａ２異種移植片は、腫瘍増殖に関して１日おきに測定された。マウスは、米糠油（ビヒクル）またはδ−トコトリエノール（１００ｍｇ／ｋｇ／日）で１週につき５回、強制給餌された。結果は、δ−トコトリエノールで処置されたマウスにおいて膵臓腫瘍増殖の有意な抑制を示す。
【図１２Ｂ】免疫組織化学染色は、ＴＵＮＥＬ染色で測定されるδ−トコトリエノール誘導アポトーシスと減少したｐ−ＡＫＴ発現を示す。
【図１３Ａ】ミリストイル化されたＡＫＴをコードするｐＷＺＬレトロウイルスベクターでＭｉａ−ＰａＣａ２膵臓癌細胞の感染の後、δ−トコトリエノール抑制ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達のレスキューを示す一連のブロットである。
【図１３Ｂ】ミリストイル化されたＡＫＴをコードするｐＷＺＬレトロウイルスベクターでＭｉａ−ＰａＣａ２膵臓癌細胞の感染の後、δ−トコトリエノール抑制ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達のレスキューを示すｐＡＫＴデンシトメトリのグラフである。
【図１３Ｃ】δ−トコトリエノールがＡＫＴシグナル伝達を調整することを示す一連のブロットである。ミリストイル化されたＡＫＴをコードするｐＷＺＬレトロウイルスベクターを有するＭｉａ−ＰａＣａ２膵臓癌細胞。
【図１３Ｄ】（ｐ−ＡＫＴ／全ＡＫＴ）／β−アクチンのデンシトメトリを示すグラフである。
【図１３Ｅ】％ＦＬＩＰ（長鎖５５ｋｄａ）／β−アクチンのデンシトメトリを示すグラフである。
【図１３Ｆ】％ＦＬＩＰ（短鎖２８ｋｄａ）／β−アクチンのデンシトメトリを示すグラフである。
【図１３Ｇ】δ−トコトリエノールが膵臓癌転移を抑制することを示すインビボでの結果の飽和発光画像である。画像は、ビヒクル対１００ＭＰＫの比較を示す。
【図１３Ｈ】マウス重量群別による腫瘍転移のグラフ定量化である。
【図１３Ｉ】ＰＢＳ、ビヒクル、５０ＭＰＫ（Ｔ３）、１００ＭＰＫ（Ｔ３）に対する相対的な強度（ｐ／ｓ）／時間を示すグラフである。
【図１３Ｊ】マウス膵臓でのトコトリエノールの蓄積の飽和発光画像である。
【図１３Ｋ】沈殿および抽出後の、ブランク血漿対δ−トコトリエノール含有血漿を比較したクロマトグラムである。
【図１３Ｌ】δ−トコトリエノールの組織レベルを示すグラフである。
【図１４Ａ】浸潤の程度と腫瘍のグレードが増加するにつれての増殖率の増加を示すグラフである。これは、Ｋｉ−６７に対する陽性の細胞染色の平均％での漸進的増加により示される。
【図１４Ｂ】ＴＵＮＥＬ染色されたアポトーシス細胞の数の漸進的減少を示すグラフであり、腫瘍浸潤の程度と負に相関する。
【図１５】非新生物の膵管組織、反応組織、前駆病変（ＰａｎＩＮ  １−３）、ならびに低いおよび高いグレードの浸潤性癌の一連の代表的なスライドである。各々の代表的な領域は、ヘマトキシリンとエオシンで、そして、Ｋｉ−６７、ｐ２７、ｐ−ＭＡＰＫとＴＵＮＥＬに対して染色された。結果は、非新生物の膵管からＰａｎＩＮ〜浸潤癌に進行するにつれて、Ｋｉ−６７とｐ−ＭＡＰＫ染色の増加を示す。最大程度の染色は、高いグレードの腫瘍においてである。対照的に、ｐ２７とＴＵＮＥＬ染色は、腫瘍浸潤と進行に伴い減少し、それは細胞周期抑制の欠損とアポトーシス誘導を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
好ましい実施形態の以下の詳細な説明では、添付図面（それはこの実施形態の一部を形成する）が参照され、それにより本発明が実施され得る特定の実施形態の説明によりその中に示される。他の実施形態を利用することが可能であり、構造的変化は、本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきである。
【００２１】
δ−トコトリエノールは、インビトロで膵臓癌細胞を抑制する。
【００２２】
一実施形態において、本発明はδ−トコトリエノールが、膵臓腫瘍増殖を抑制し、悪性形質転換を防止し、インビトロでのアポトーシスを誘導する方法を含む。ここで、本発明者らは、インビトロでのδ−トコトリエノールの抗腫瘍特性を示す。ヒト膵臓管癌細胞株（ＭＩＡ  ＰａＣａ２、ＳＷ１９９０、ＢＸＰＣ３）は、米国の菌寄託機関（ＡＴＴＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から取得され、プロトコルにつき７０％コンフルエントで増殖し、δ−トコトリエノールで処置された。不死化ヒト臓管上皮細胞ＨＰＤＥ  ６Ｃ７は、同一の状件下で処置され、膵臓癌細胞に対するδ−トコトリエノールの選択的な効果を調べた。結果によれば、δ−トコトリエノールは、選択的に形質転換と増殖を抑制することを示す。
【００２３】
ＭＩＡ  ＰａＣａ２、ＳＷ１９９０、ＢＸＰＣ３およびＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、δ−トコトリエノールの濃度を増やして処置した。図１Ａは、ビヒクルと比較したδ−トコトリエノールで毎週処置したときの、軟寒天中でのＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞の足場非依存性増殖の著しい抑制を示す。推奨培地単独中でのＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞増殖は、この前癌性細胞株で予想されたように軟寒天中で形質転換を受けず、我々の陰性対照として使用された。
【００２４】
膵臓癌細胞（３×１０３）は、９６穴プレート中で播種されて、翌日にδ−トコトリエノールで処置された。増殖は、２４時間の間隔でＭＴＴにより評価された。結果は、増殖（図１Ｂ〜１Ｄ）の用量依存性の抑制を示す。全ての３つの膵臓癌細胞株のＩＣ５０は、２４時間で２０〜２５μＭであった。ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、また、増加するδ−トコトリエノール濃度で２４時間処置された。図１Ｅは、２４時間でのδ−トコトリエノールによる膵臓癌細胞株の増殖の選択的な抑制を示す。ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、最大濃度においてでさえ、トコトリエノールの抗増殖効果に比較的抵抗性であった。
【００２５】
膵臓癌細胞におけるδ−トコトリエノールの観察された抗増殖効果は、細胞周期調節により恐らく生じる。結果は、また、δ−トコトリエノールが選択的なＧ１細胞周期停止を引き起こして、サイクリンキナーゼ阻害剤ｐ２７ｋｉｐ１の上方制御（アップレギュレート）と関係していることを示す。ＭＩＡ  ＰａＣａ２、ＳＷ１９９０、ＢＸＰＣ３およびＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、δ−トコトリエノール２０μＭまたはビヒクルのいずれかで２４時間処置された。細胞を収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、一晩エタノール中に固定した。ペレットは次の日にＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウムで染色し、細胞周期についてフローサイトメトリで分析した。
【００２６】
図２Ａおよび２Ｂは、δ−トコトリエノールで処置された３つの全ての膵臓癌細胞株で、有意なＧ１細胞周期停止を示す。対照的に、δ−トコトリエノールは、不死化ヒト膵管上皮細胞（ＨＰＤＥ  ６Ｃ７）で細胞周期相に何らの影響を及ぼさなかった。Ｇ１細胞周期相の重要な調節因子は、サイクリンキナーゼインヒビターファミリーのメンバーを含む。これらのメンバーのうちの１つであるｐ２７ｋｉｐ１は、膵臓癌の進行に重要であるように見える。図２Ｆは、ｓｉＲＮＡｐ２７が膵臓癌細胞でトコトリエノール誘導Ｇ１−Ｓ細胞周期停止をレスキューすることを示す。
【００２７】
δ−トコトリエノールによる細胞周期抑制は、ｐ２７ｋｉｐ１の改変タンパク質発現と関係していた。同じ４つの細胞株は、δ−トコトリエノール（２０μＭ）で処置され、漸進的な時間間隔で回収された。全細胞溶解液は、ＰＢＳで２回洗浄され、Ｍ−ＰＥＲ（哺乳類のタンパク質抽出試薬、Ｐｉｅｒｃｅ）に溶解される細胞ペレットから調製された。溶解液からのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されて、ｐ２７ｋｉｐ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に関してイムノブロットされた。図２Ｃは、３つの全ての膵臓癌細胞株でのｐ２７ｋｉｐ１発現において、時間依存性の上方制御を示す。対照的に、ｐ２７ｋｉｐ１の下方制御は、δ−トコトリエノールで処置されたＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞で見られる。
【００２８】
δ−トコトリエノールが、ｐ２７ｋｉｐ１タンパク質の発現の上方制御をするメカニズムが、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して調べられた。ｐ２７ｋｉｐ１ルシフェラーゼレポーター（Ｐｌｅｄｇｅｒ博士（Ｍｏｆｆｉｔｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｔａｍｐａ）からの寄贈品）で形質移入されたＭｉａ  ＰａＣａ２細胞は、δ−トコトリエノール（２０μＭ）またはビヒクルで２４時間処置された。次いで、ルシフェラーゼ活性は、発光測定装置を使って測定された。図２Ｄは、δ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞でのルシフェラ−ゼ活性の増加を示す。これは、δ−トコトリエノールが、転写の上方制御によりｐ２７ｋｉｐ１タンパク質の発現を増加させることを示唆している。この原動力は、ｓｉＲＮＡｐ２７によるＭｉａＰａＣａ−２細胞のトコトリエノール抑制のレスキューによってさらに示される（図２Ｅ）。
【００２９】
δ−トコトリエノールは、また、発癌性Ｒａｓシグナル伝達の下流のエフェクターを選択的に阻害することが示された。膵臓癌の８０％超は、異常な発癌性Ｒａｓシグナル伝達を示す。Ｒａｓエフェクター経路Ｒａｆ−ＭＥＫ−ＥＲＫとＰＩ３キナーゼ−ＡＫＴは、細胞増殖と生存にとってそれぞれ重要である。データは、δ−トコトリエノールが発癌性Ｒａｓシグナル伝達において抑制効果を有することを示す。
【００３０】
膵臓癌細胞株（ＭＩＡ  ＰａＣａ２、ＳＷ１９９０、ＢＸＰＣ３）およびＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、δ−トコトリエノール（２０μＭ）で処置され、細胞溶解液を回収し、上記した漸進的な時間間隔で調製された。溶解液からのタンパク質は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥに付され、以下の抗体でイムノブロットされた：Ｒａｓ、ｐ−ｃＲａｆ（ｓｅｒ  ３３８）、ｐ−ＭＥＫ１／２、ＭＥＫ１／２、ｐＥＲＫ  ４４／４２、ＥＲＫ  ４４／４２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびｃ−Ｒａｆ（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。図３Ａは、発癌性Ｒａｓ  ｐ−ｃＲａｆ、ｐ−ＭＥＫ、およびｐ−ＥＲＫの下流のリン酸化標的のδ−トコトリエノールによる選択的な抑制を示す。
【００３１】
ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、δ−トコトリエノールの抑制効果に抵抗性であった。それからＭＩＡ  ＰａＣａ２とＳＷ１９９０細胞は、δ−トコトリエノール（２０μＭ）で２４時間と４８時間、処置された。細胞溶解液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ｐ−ＡＫＴとＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対してイムノブロットされた。図３Ｂは、２４時間と４８時間でのｐ−ＡＫＴタンパク質レベルの減少を示すが、ＡＫＴでは減少しなかった。合わせて考えると、Ｒａｓタンパク質レベルへの影響なしでのδ−トコトリエノールによる発癌性Ｒａｓシグナル伝達の下流のエフェクターの抑制は、発癌性Ｒａｓの機能に対するδ−トコトリエノールの負の調整役割を示すのかもしれない。
【００３２】
その化学的予防効果に加えて、δ−トコトリエノールは、膵臓癌でアポトーシスを誘導する。ＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞は、δ−トコトリエノールまたはビヒクルのいずれかで２４時間処置された。細胞は収集され、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣで染色され、アポトーシスに関してフローサイトメトリによって分析された。図４Ａは、δ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞での初期アポトーシスの用量依存性誘導を示す。δ−トコトリエノールは膵臓癌細胞で選択的にアポトーシスを誘導した。
【００３３】
ＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞とＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞は、ビヒクルまたはδ−トコトリエノール（２０μＭ）で２４時間処置された。細胞を集め、ＴＵＮＥＬ染色した。図４Ｂは、ビヒクルまたは処置ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞と比較した、ＴＵＮＥＬに対するδ−トコトリエノールで処置されＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞の有意な染色を示す。この発見は、膵臓癌細胞でのアポトーシスの選択的な誘導を示唆する。次に、細胞溶解液は、先に記述したように漸進的な時間間隔でδ−トコトリエノール（２０μＭ）で処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞から調製された。溶解液からのタンパク質は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを行い、アポトーシスのバイオマーカーに対してイムノブロットされた。図４Ｃは、時間依存性の様式でカスパーゼ８、カスパーゼ３とＰａｒｐの切断により明示されるように、カスパーゼカスケードの活性化を示す。興味深いことに、δ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞は、シトクロムＣ放出またはカスパーゼ９の切断の欠如で示されるようにミトコンドリアのプロアポトーシスのタンパク質に大きな効果を有しなかった。合わせて考えると、これらのデータは、膵臓癌細胞でのδ−トコトリエノールによるアポトーシスの誘導は、外部アポトーシス経路の活性化を通して起こることを示す。
【００３４】
δ−トコトリエノールはまた、インビボで膵臓癌の増殖を抑制する。
【００３５】
膵臓癌細胞株の処置は、インビトロおよびインビボでアポトーシスの誘導をもたらす。δ−トコトリエノールのアポトーシスの効果は、不死化ヒト膵管上皮細胞がδ−トコトリエノールに対して感受性でないため、新生物細胞に対して選択的であった。膵臓癌細胞株の処置は、カスパーゼ８とカスパーゼ３の切断（カスパーゼ９は切断されない）によって明示されるように、アポトーシス誘導の外部経路のカスパーゼカスケードの活性化をもたらした。膵臓癌細胞のδ−トコトリエノール誘導アポトーシスのミトコンドリア介在性アポトーシスの欠如の更なる証拠は、シトクロムＣ放出の欠如とミトコンドリア関連タンパク質（例えばＢｃｌ−２およびＢａｄなど）のδ−トコトリエノール調節の欠如によって証明された。
【００３６】
ルシフェラーゼによるＭＩＡ  ＰａＣａ２細胞の安定した形質移入株は、ヌードマウスの皮下に注入された。腫瘍体積は２日おきに口径測定器で計られ、増殖率はＩＶＩＳ  １００  Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、腫瘍発光を毎週測定することで決定された。類似した体積（１００〜１５０ｍｍ３）の腫瘍と発光に基づく増殖率は、２０日間の強制給餌によってビヒクルまたはδ−トコトリエノール（１００ｍｇ／ｋｇ／日）のどちらかを服用するためにランダム化された。図５Ａは、処置前と１０日目の対照群とδ−トコトリエノール群の代表的な発光測定値を表す。処置の１０日目までの増殖率は、トコトリエノール処置群では、より小さい。
【００３７】
図５Ｂは、ビヒクルと比較した、δ−トコトリエノールで処置された異種移植片での腫瘍増殖における５０％の著しい縮小を示す。腫瘍は処置の最終日に切除されて、パラフィン中に包埋した。免疫組織化学的な染色は、発癌性Ｒａｓシグナル伝達標的に対するδ−トコトリエノールの影響を決定するために実施された。図５Ｃは、対照群からの腫瘍と比較した、δ−トコトリエノールで処置されたマウスからの腫瘍におけるＴＵＮＥＬによるＫｉ６７での減少とアポトーシス誘導によって明示されるように、増殖の抑制を示す。さらにまた、バイオマーカータンパク質ｐ−ＭＡＰＫとｐ−ＡＫＴは、減少し、そしてｐ２７ｋｉｐ１発現は、δ−トコトリエノール処置された腫瘍で増加する。これらのインビボでの知見は、上記インビトロで示される細胞シグナル伝達タンパク質で、再現性のある改変を示す。
【実施例】
【００３８】
実施例Ｉ
ＳＷ１９９０膵臓癌細胞（Ｐａｎｃ−１）は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含む完全ＤＭＥＭ培地で培養された。ＢｘＰｃ−３膵臓癌細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のＨＥＰＥＳ緩衝剤、１％のピルビン酸ナトリウムおよび１％のＬ−グルタミンを含む完全ＲＰＭＩ培地中で培養された。ＨＰＤＥ６−Ｃ７細胞は、無血清ケラチノサイトＳＦＭ培地で培養された。すべての細胞は、５％のＣＯ２を有する加湿インキュベータで３７℃に維持された。
【００３９】
表Ｉ（２４時間）、ＩＩ（４８時間）およびＩＩＩ（７２時間）は、関連する結果を示す。各表の欄は異なる処置であり、以下の通りの単回用量（５０μＭ）を含む：対照（未処置）、ビヒクル（ビヒクルのみ、おそらく溶媒）、Ｔ３α（α−トコトリエノール）、Ｔ３β（β−トコトリエノール）、Ｔ３γ（γ−トコトリエノール）、Ｔ３δ（δ−トコトリエノール）、Ｔα（α−トコフェロール）、Ｔβ（β−トコフェロール）、ＴＳ（コハク酸トコフェロール）、ＧＧ（ゲラニルゲラニオール）、ＳＡ（コハク酸）。各欄の細胞の数は、ＭＴＳアッセイの結果である；但し、反復実験の平均を表す最後の欄は、対照値の平均（対照は、常に１００である）で割った値である。各欄は、９回の反復実験を表す。図６は、２４時間と４８時間の試験結果を例示する。
【００４０】
【表１】
0005490532.tif 000003
【００４１】
【表２】
0005490532.tif 000004
【００４２】
【表３】
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【００４３】
実施例ＩＩ
ＭｉａＰａＣａ−２細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含む完全ＤＭＥＭ培地で培養された。ＢｘＰｃ−３膵臓癌細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のＨＥＰＥＳ緩衝剤、１％のピルビン酸ナトリウムおよび１％のＬ−グルタミンを含む完全ＲＰＭＩ培地中で培養された。ＨＰＤＥ６−Ｃ７細胞は、無血清ケラチノサイトＳＦＭ培地で培養された。すべての細胞は、５％のＣＯ２を有する加湿インキュベータで３７℃に維持された。
【００４４】
表ＩＶ（２４時間）、Ｖ（４８時間）およびＶＩ（７２時間）は、関連する結果を示す。各表の欄は異なる処置であり、以下の通りの単回用量（５０μＭ）を含む：対照（未処置）、ビヒクル（ビヒクルのみ、おそらく溶媒）、Ｔ３α（α−トコトリエノール）、Ｔ３β（β−トコトリエノール）、Ｔ３γ（γ−トコトリエノール）、Ｔ３δ（δ−トコトリエノール）、Ｔα（α−トコフェロール）、Ｔβ（β−トコフェロール）、ＴＳ（コハク酸トコフェロール）、ＧＧ（ゲラニルゲラニオール）、ＳＡ（コハク酸）。各欄の細胞の数は、ＭＴＳアッセイの結果である；但し、反復実験の平均を表す最後の欄は、対照値の平均（対照は、常に１００である）で割った値である。各欄は、９回の反復実験を表す。図７は、２４時間と４８時間の試験結果を例示する。
【００４５】
【表４】
0005490532.tif 000006
【００４６】
【表５】
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【００４７】
【表６】
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【００４８】
実施例ＩＩＩ
ＭｉａＰａＣａ−２細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含む完全ＤＭＥＭ培地で培養された。ＢｘＰｃ−３膵臓癌細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のＨＥＰＥＳ緩衝剤、１％のピルビン酸ナトリウムおよび１％のＬ−グルタミンを含む完全ＲＰＭＩ培地中で培養された。ＨＰＤＥ６−Ｃ７細胞は、無血清ケラチノサイトＳＦＭ培地で培養された。すべての細胞は、５％のＣＯ２を有する加湿インキュベータで３７℃に維持された。
【００４９】
表ＶＩＩ（２４時間）およびＶＩＩＩ（５日間）は、関連する結果を示す。各表の欄は異なる処置であり、以下の通りの単回用量（５０μＭ）を含む：対照（未処置）、ビヒクル（ビヒクルのみ、おそらく溶媒）、Ｔ３α（α−トコトリエノール）、Ｔ３β（β−トコトリエノール）、Ｔ３γ（γ−トコトリエノール）、Ｔ３δ（δ−トコトリエノール）、Ｔα（α−トコフェロール）、Ｔβ（β−トコフェロール）、ＴＳ（コハク酸トコフェロール）、ＧＧ（ゲラニルゲラニオール）、ＳＡ（コハク酸）。各欄は、１つのブランクを有する7回の反復実験を表す。各欄の細胞の数は、ＭＴＳアッセイの結果である；但し、表右側３つの列は、それぞれ、反復実験の平均、ブランクを含む反復実験の平均、および対照値の平均（対照は、常に１００である）で割った反復実験の平均である。
【００５０】
【表７】
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【００５１】
【表８】
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【００５２】
実施例ＩＶ
ＢＸＰＣ３細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシン、および１％のＬ−グルタミンを含む完全ＤＭＥＭ培地で培養された。ＢｘＰｃ−３膵臓癌細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％のＨＥＰＥＳ緩衝剤、１％のピルビン酸ナトリウムおよび１％のＬ−グルタミンを含む完全ＲＰＭＩ培地中で培養された。ＨＰＤＥ６−Ｃ７細胞は、無血清ケラチノサイトＳＦＭ培地で培養された。すべての細胞は、５％のＣＯ２を有する加湿インキュベータで３７℃に維持された。
【００５３】
表ＩＸ（４８時間）および表Ｘ（５日間）は、関連する結果を示す。各表の欄は異なる処置であり、以下の通りの単回用量（５０μＭ）を含む：対照（未処置）、ビヒクル（ビヒクルのみ、おそらく溶媒）、Ｔ３α（α−トコトリエノール）、Ｔ３β（β−トコトリエノール）、Ｔ３γ（γ−トコトリエノール）、Ｔ３δ（δ−トコトリエノール）、Ｔα（α−トコフェロール）、Ｔβ（β−トコフェロール）、ＴＳ（コハク酸トコフェロール）、ＧＧ（ゲラニルゲラニオール）、ＳＡ（コハク酸）。各欄は、１つのブランクを有する7回の反復実験を表す。各欄の細胞の数は、ＭＴＴアッセイの結果である；但し、表右側３つの列は、それぞれ、反復実験の平均、ブランクを含む反復実験の平均、および対照値の平均（対照は、常に１００である）で割った反復実験の平均である。
【００５４】
【表９】
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【００５５】
【表１０】
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図８Ａは、ビヒクルまたは処置ＨＰＤＥ  ６Ｃ７細胞と比較した、δ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡＰａＣａ２におけるアポトーシス細胞の有意な増加を示す。図８Ｂ〜８Ｄは、ＭＩＡＰａＣａ−２、ＢｘＰｃ−３、およびＳＷ１９９０の膵臓癌細胞が、また、δ−トコトリエノールまたはビヒクルの濃度を変えて２４時間処置されたことを示す。細胞を収集し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣで染色し、アポトーシスをフローサイトメトリで分析した。図８Ｂ、８Ｃおよび８Ｄは、ビヒクルと比較したδ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞におけるアポトーシスの用量依存性誘導を示す。
【００５６】
図９Ａは、時間依存性の様式でのカスパーゼ８、カスパーゼ３、およびＰＡＲＰの切断により証明されるカスパーゼカスケードの活性化を示す。興味深いことに、δ−トコトリエノールで処置されたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞は、シトクロムＣ放出またはカスパーゼ９（９Ｂ）の切断の欠如で示されるようにミトコンドリアのプロアポトーシスのタンパク質に大きな効果を有しなかった。図９Ｃは、いくつかの膵臓癌細胞株におけるカスパーゼ８と３の選択的な切断［ＨＰＤＥ−６Ｃ７細胞（不死化膵管上皮細胞株）では切断されない］を示す。カスパーゼ９は、膵臓癌細胞で切断されなかった。図１０は、膵臓癌細胞株におけるリン酸化−ＡＫＴ（しかし全ＡＫＴではない）での時間依存性の減少を示すが、ＨＰＤＥ細胞では減少しない。
【００５７】
ＣＡ−ＡＫＴの機能的な過剰発現は、δ−トコトリエノール誘導細胞死におけるＡＫＴシグナル伝達とカスパーゼ８の役割を示す（図１１Ａ）。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（ｐＺＷＬベクターとｍｙｒＡＫＴ）は、１０時間のカスパーゼ８阻害剤前処理をしてまたはしないで、血清ビヒクルまたはδ−トコトリエノール（４０または５０μＭ）なしで２４時間処置された。細胞は、また、陽性対照としてＴＲＡＩＬで処置された。次いで、細胞を収集し、固定し、膜透過し、トリパンブルーで染色した。図１１Ａからの細胞溶解液のウエスタンブロット（図１１Ｂ）は、構成的に活性なＡＫＴを過剰発現する細胞と比較した、空のベクターでトランスフェクションされたＭｉａＰａｃａ２腸管外細胞でのトコトリエノール５０ｕＭ処理によるｐＡＫＴの減少を示している。
【００５８】
ヌードマウスでのＭＩＡ  ＰａＣａ２異種移植片は、腫瘍増殖に関して１日おきに測定された。マウスは、米糠油（ビヒクル）またはδ−トコトリエノール（１００ｍｇ／ｋｇ／日）で１週につき５回、強制給餌で処置された。結果（図１２Ａ）は、δ−トコトリエノールで処置されたマウスにおける膵臓腫瘍増殖の有意な抑制を示す。免疫組織化学的な染色（図１２Ｂ）は、ＴＵＮＥＬ染色で測定されるδ−トコトリエノール誘導アポトーシス、および減少したｐ−ＡＫＴ発現を証明している。
【００５９】
さらに、ミリストイル化されたＡＫＴをコードするｐＷＺＬレトロウイルスベクターによるＭｉａ−ＰａＣａ２膵臓癌細胞の感染は、δ−トコトリエノール抑制ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達のレスキューを示す。ＭｉａＰａＣａ−２親細胞株は、構成的に活性なミリストイル化されたＡＫＴを発現するレトロウイルスのｐＷＺＬベクター構築物を使って、安定的にトランスフェクション（形質移入）されてＭｉａＰａＣａ−２ＡＫＴ細胞が生成した。図１３Ａと１３Ｂは、ｐ−ＡＫＴを下方制御するためのδ−トコトリエノールの能力のレスキューを証明している。
【００６０】
図１３Ｃから１３Ｆは、ＡＫＴとカスパーゼ８／３経路が、トコトリエノールが細胞死を誘導するメカニズムに関係していることを示している。ビヒクルと比較したとき、トコトリエノールによる処置は、ｍｙｒ−ＡＫＴ細胞よりベクター細胞中で多くの細胞死を誘導した。ＴＲＡＩＬ誘導細胞死は、ビヒクルに匹敵した。最後に、カスパーゼ３、８および９阻害剤による前処理は、トコトリエノール誘導細胞死をレスキューした。
【００６１】
δ−トコトリエノールは、図１３Ｇから１３Ｊで示されるように、膵臓癌転移を防止する。トコトリエノールは、ビヒクル／ＰＢＳと比較すると、最大用量で腫瘍退縮をもたらした。したがって、トコトリエノールは、インビボでの膵臓腫瘍の増殖を抑制する。
【００６２】
ビタミンＥとδ−トコトリエノールを経るＨＰＬＣ−ＵＶによる血漿およびマウス組織での推定癌の化学的予防は、図１３Ｋと１３Ｌに示される。トコトリエノールは、血漿中で検出可能であり、膵臓にかなり集中していた。驚くべきことに、肝臓と腫瘍レベルと比較したとき、トコトリエノールは膵臓に１０倍局在する。これらの結果は、トコトリエノール作用に関するメカニズムを示している。
【００６３】
合わせて考えると、これらの知見は、δ−トコトリエノールが外部アポトーシス経路を通して膵臓癌細胞でのアポトーシスを選択的に誘導することを示す。δ−トコトリエノールは、選択的にＰＩ３−Ｋ／ＡＫＴ経路を阻害し、インビボでのアポトーシスを誘導し、そして、これはＡＫＴシグナル伝達標的の阻害と関係している。さらに、膵臓癌細胞でのｍｙｒＡＫＴの過剰発現は、δ−トコトリエノールがインビトロおよびインビボでアポトーシスを誘導するという効果をレスキューする。また、膵臓癌細胞増殖のトコトリエノール抑制は、構成的に活性なｍｙｒＡＫＴによってレスキューすることができる。このことは、トコトリエノールがｐＡＫＴのレベルで膵臓癌でのアポトーシスを誘導することを示唆している。
【００６４】
膵臓癌細胞のδ−トコトリエノール誘導アポトーシスは、Ａｋｔシグナル伝達経路の調節におそらく関わっていることが分かる。その理由は、Ａｋｔ生存シグナル伝達経路は、しばしば膵臓癌で過剰発現して、非ミトコンドリア関連アポトーシスに関与するからである。δ−トコトリエノールは、インビトロおよびインビボで、セリン／トレオニンキナーゼＡｋｔのリン酸化レベルを抑制した。さらにまた、構成的に活性なＡｋｔの過剰発現は、膵臓癌細胞を、δ−トコトリエノールとのインキュベーション後にアポトーシスを受けることから保護した。合わせてこれらのデータは、δ−トコトリエノールがカスパーゼ８カスケードの活性化とＡｋｔ生存経路の阻害により膵臓癌細胞でのアポトーシスを誘導することを指摘しており、そしてこの微量栄養素がインビボでの膵臓癌の化学的抑制と治療に役立つことを示している。
【００６５】
膵臓癌のための代用エンドポイントバイオマーカー
歴史的に、薬剤の化学的予防の利点は、減少した癌発生率または死亡率によって示すことができるだけであった。エンドポイントとしての減少した発生率または死亡率の使用は、化学的予防試験を長期間に、大規模に、経費がかかるものとするので、高い事象率を有する癌を除いて非実用的である。実際、膵臓癌に対する化学的予防試験の唯一の報告は、他の適応症のために実施された化学的予防試験のサブセット分析から生じたものであった。このアプローチは、α−トコフェロール、β−カロテン、アスピリン、および非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）などの薬剤の重要性について確定的でない観察に終わっていた。
【００６６】
伝統的な癌療法のための第１相と第２相試験と類似の化学的予防薬剤のために「初期相」臨床試験の方法論を開発することは、膵臓癌での化学的予防薬剤の開発を進めるために重要な研究優先順位である。理想的には、これらの研究は、化学的予防への可能性を確認するだけでなく、最適用量と投与計画についての質問にも答えなければならない。これらの挑戦に応じて、幾人かの研究者達は、長期の癌抑制に関するよりも、むしろ標的病変の病態生理学の代用エンドポイントバイオマーカー（ＳＥＢ）候補に焦点を当てる研究を提案してそれを開始した。
【００６７】
ＳＥＢ試験では、腫瘍発生率の減少は、新生物形成表現型（例えば、異常増殖、細胞生存、または異常な遺伝子発現など）の１つまたはそれ以上の要素の破棄のための証拠で置き換えられる。具体的には、これらの戦略は、重大な前癌病変である上皮内腫瘍（ＩＥＮ）に関する薬剤の効果に焦点を当てている。ＩＥＮが大部分の上皮組織で確認された前癌であるのに対して、粘液性嚢胞腫瘍（ＭＣＮ）、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、および膵上皮内腫瘍性病変（ＰａｎＩＮ）は、膵臓組織において最も特性が解析されているＩＥＮである。浸潤癌へのこれらの病変の進行は十分に特性が解析されており、これらの病変の外科的除去は膵臓癌の予防のためのすでに推奨された医療実務である。
【００６８】
ＳＥＢ研究は、外科的介入を必要としないＩＥＮのセッティングで確立されているが（例えば、口腔粘膜またはバレット食道の白斑症）、指標病変は取り除かれて、それ以降のフォローアップには責任がないので、そのような研究は、即時の外科的介入を必要とする前癌病変で実施するのはより困難である。しかしながら、浸潤性および前浸潤性の膵臓病変を診断して、除去するための連続した手順に対する必要性は、短期間のＳＥＢ研究の機会を提供する。２から４週の間隔は、大部分の実施において標準であり、したがって、化学的予防薬をＳＥＢ調節におけるその薬剤の効果を評価するために投与できる機会を提供する。本発明者の実験は、標準的なＳＥＢ（例えば、増殖率、アポトーシス指標、およびこれらの病変の初期の遺伝的変化によって調節されるタンパク質の発現（以下に検討する））の重要性を示している。
【００６９】
一実施形態において、本発明は膵臓の浸潤性膵管腺癌（ＩＰＭＮ）の切除を受けた患者の外科的標本で優勢であった代用エンドポイントバイオマーカーを含む。トコトリエノール（例えば、ベニノキ豆からのδ−トコトリエノールなど）は、ヒト膵臓癌細胞で選択的に抑制を示した。データは、δ−トコトリエノールがアポトーシスの誘導と腫瘍増殖の抑制を含む多くの分子プロセスに影響を及ぼすこと、そしてδ−トコトリエノールが膵臓腫瘍細胞で発癌性シグナルの伝達経路を阻害することを示す。具体的には、δ−トコトリエノールは、ヒト膵臓癌細胞でのリン酸化−Ｒａｆ、リン酸化−ＭＥＫ、リン酸化−ＥＲＫ、およびリン酸化−ＡＫＴレベルを低下させる。さらにまた、δ−トコトリエノールは、ｐ２７Ｋｉｐ１などの増殖抑制メディエータの発現を誘導して、アポトーシスメディエータであるカスパーゼ８とカスパーゼ３を活性化する。
【００７０】
１９８６年から２００６年までの切除された膵管癌の症例は、Ｍｏｆｆｉｔｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ情報システムから集められた。各症例からのスライドは、独りの病理学者によって組織学的腫瘍タイプ、グレード、および膵管前駆病変の存在について検討された。組織学的タイプとグレードは、現在のＷ．Ｈ．Ｏ命名法に基づいて割り当てられた。膵上皮内腫瘍性病変（ＰａｎＩＮ）と呼ばれる膵臓癌前駆病変は、発表された基準（Ｈｒｕｂａｎ、２００１）に従ってＩａ、Ｉｂ、２、および３に等級づけされた。スライドの検討に基づいて、１０の代表的な組織ブロックが、１０の連続的な切除標本から選択された。癌（望ましくは１より大きいグレードの癌）、非腫瘍性管、および前駆病変を示している切片が優先されて選択された。すべての症例は、膵管腺癌、ＮＯＳ、または十分に分化したもの〜僅かに分化したものであった。
【００７１】
図１４Ａから１５に示されるデータは、これらの中間のバイオマーカーを測定できる正確度を示す。Ｋｉ６７は、正常から中間、浸潤癌への核における陽性反応の漸進的増加を有する増殖に対する信頼できるマーカーである点で注目された。逆の進行が、腫瘍膵管細胞でのアポトーシスの発癌性抑制を示すＴＵＮＥＬ染色に関して注目された。類似した逆の進行は、ｐ２７サイクリン依存性キナーゼ阻害タンパク質の発現において観察された。対照的に、リン酸化−ＭＡＰＫおよびリン酸化−ＡＫＴなどの活性化された発癌性Ｒａｓシグナル伝達の下流メディエータが、増加する。意外なことに、膵臓浸潤性膵管癌およびＩＰＭＮの全患者は、彼らの外科的標本において非浸潤性前駆病変を有していた。
【００７２】
未分化癌または膵管癌異形の症例は、このパイロット研究のためには選択されなかった。１つの切片は、ルーチンのヘマトキシリンおよびエオシン染色のために各々のブロックから切り取られた。免疫組織化学のために切り取られた切片は、ポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたスライド上に置いた。使用された抗体は、Ｋｉ−６７、ｐ２７、およびｐ−ＭＡＰＫを含んでいた。ＴＵＮＥＬアッセイは、アポトーシスの評価のために使用された。免疫組織化学的な研究は、標準的な免疫組織化学的な技術を使用して実施された。次いで、スライドは、正確で、再現性のある、客観的なハイスループット解析のために、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＩｍａｇｉｎｇからのＡｒｉｏｌ  ＳＬ−５０（バージョン３．０．７０）でスキャンされた。画像は、１人の病理学者によって癌、ＰａｎＩＮ、反応性管、および非腫瘍性管の代表的な領域について検討された。十分に分化した、および適度に分化した癌は、この研究の目的のために低いグレードの１つのカテゴリに分類された。低分化癌は、ハイグレード癌と分類された。スライド上で存在するならば、神経周囲浸潤のさらなる領域もまた分析のために選択された。
【００７３】
図１４Ａは、浸潤の程度および腫瘍のグレードとしての増殖率の増加を表す。これは、Ｋｉ−６７に対する陽性細胞染色の平均％の漸進的増加によって示される。対照的に、図１４Ｂは、ＴＵＮＥＬで染色されたアポトーシス細胞の数の漸進的減少を示し、そしてそれは腫瘍浸潤の程度と負に相関する。
【００７４】
図１５は、非新生物性膵管組織、反応性組織、前駆病変（ＰａｎＩＮ  １−３）ならびに低グレードおよび高グレード浸潤癌の代表的なスライドを表す。各々の代表的な領域は、ヘマトキシリンとエオシンで、そしてＫｉ−６７、ｐ２７、ｐ−ＭＡＰＫとＴＵＮＥＬのために染色された。
【００７５】
結果は、膵管が非新生物からＰａｎＩＮ、浸潤癌への進行につれて、Ｋｉ−６７とｐ−ＭＡＰＫ染色での増加を示す。染色の最大程度は、腫瘍の高グレードにおいてである。対照的に、ｐ２７とＴＵＮＥＬ染色は、腫瘍浸潤と進行とともに減少し、これは細胞周期抑制とアポトーシス誘導の欠損を示す。
【００７６】
本発明の別の実施形態は、例えば単離されたサンプルで、バイオマーカー、すなわち、ｐ２７のレベルを測定することによって、対象での膵管癌または膵臓癌のステージをスクリーニングする方法を含む。次いで、バイオマーカーのレベルは、１つまたはそれ以上の対照サンプルにおける対応する対照レベルと比較される。好ましい実施形態において、対照サンプルは、膵管癌または膵臓癌のステージを有しないと決定された個体から得られる。
【００７７】
対象でのバイオマーカーのレベルと対照サンプル（複数を含む）でのバイオマーカーのレベルとの間の統計学的に有意な増加の測定は、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージの欠如を示す。対照サンプル（複数を含む）でのバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのｐ２７のレベルの統計学的に有意な減少は、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す。
【００７８】
別途の実施形態において、第２のバイオマーカー、すなわち、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベルが測定されて、１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫの対照レベルと比較される。対象でのＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベルと対照サンプル（複数を含む）のレベルとの間の統計学的に有意な増加の測定は、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージを示す。対照サンプル（複数を含む）と比較した、対象でのＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベルの統計学的に有意な減少は、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージの非存在を示す。
【００７９】
対象および対照サンプル（複数を含む）でのバイオマーカーのレベルを測定する方法は、通常の開業医に公知である。一実施形態において、例えば、バイオマーカーのレベルは、バイオマーカーと結合する抗体を利用して測定される。バイオマーカーを含むサンプルは、バイオマーカーが抗体に結合することができる条件下で、抗体と接触させる；そしてバイオマーカーの存在は、定量化することができる。
【００８０】
本発明はまた、関連した方法を実施するのに有用な組成物を含む。例えば、本発明は、関連バイオマーカー、すなわち、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫ、ならびにｐ２７のタンパク質産物と選択的に結合する複数の単離されたタンパク質を含む組成物を含む。好ましい実施形態において、単離されたタンパク質は、相補的二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅する。複数のバイオマーカー特異的プライマーを含む組成物も含まれ、そこでは各バイオマーカー特異的プライマーは、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびｐ２７などの特有なバイオマーカーと相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅する。あるいはまた、本発明は、少なくとも２つの特有なバイオマーカーのタンパク質産物と選択的に結合する複数の単離されたタンパク質を含む組成物を含み、そこでは各々の特有なバイオマーカーが、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびｐ２７から成る群から選択される。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、膵臓癌または膵臓癌のステージを含む癌を有しない個体と比較して、膵臓癌または膵臓癌のステージを含む癌を有する個体で示差的に発現される遺伝子を指す。用語「バイオマーカー」は、膵臓癌を有しない個体と比較して、表在性膵臓癌を有する個体で示差的に発現される遺伝子を含むことができる。
【００８２】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー特異的プライマー」は、本発明のバイオマーカーの１つまたはそれ以上のＲＮＡ産物の一部と相補的な二本鎖ＤＮＡを生産することができる１組のプライマーを指す。例えば、プライマーは、本発明のバイオマーカーと相補的なＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＥＳＴと選択的にハイブリダイズして伸張産物を生成することができる第１プライマーと、その伸張産物と選択的にハイブリダイズすることができる第２プライマーを含むことができ、それらは本発明のバイオマーカーと相補的な二本鎖ＤＮＡを生産するのに用いられる。
【００８３】
用語「プライマー」とは、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチド（精製された制限消化物として天然に生じるか、または合成により生成される）を指し、このオリゴヌクレオチドは、プライマー伸長産物（これは核酸の鎖に相補的である）の合成が誘導される条件下に置かれた場合、すなわち、ヌクレオチドおよび誘導物質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下で、そして適切な温度およびｐＨで、合成の開始点として作用し得る。プライマーは、一本鎖かまたは二本鎖のいずれかであってもよく、そして誘導物質の存在下で所望の伸長産物の合成をプライムするのに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、多くの因子（温度、プライマーの起源、および使用される方法を含む）に依存する。例えば、診断的適用のためには、標的配列の複雑性に依存し、そのオリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５から２５またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、それは、より少ないヌクレオチドを含んでもよい。プライマーの適切な長さを決定するのに関与している因子は、当業者に容易に知られている。一般に、本発明で具現化されるプライマーの設計と選択は、当該分野で標準的な周知の方法に従っている。参照：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．，Ｌｏｗｅ，Ｔ．Ｍ．Ｊ．，Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．（１９９５）Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ．Ｉｎ：ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄｓ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ，ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１３３−１５５；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．（１９９０）Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ．Ｉｎ：ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ；，  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，３−１２；Ｓｈａｒｒｏｃｋｓ，Ａ．Ｄ．（１９９４）Ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ．Ｉｎ：ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（Ｅｄｓ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ，Ｅｄ．）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，５−１１。
【００８４】
本明細書中で使用される用語「バイオマーカー特異的プローブ」は、特有のバイオマーカーのＲＮＡ産物に選択的および特異的にハイブリダイズするプローブを指す。１つの実施形態において、バイオマーカー特異的プローブは、フルオロフォアとクエンチャーを有するプローブ、例えばＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．プローブまたはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓプローブである。別の実施形態では、バイオマーカー特異的プローブは、アレイに結合し、特有のバイオマーカーの１つまたはそれ以上のＲＮＡ産物（または、前記ＲＮＡ産物に対応するｃＤＮＡ、ＥＳＴもしくはＰＣＲ産物）に選択的に、そして特異的にハイブリダイズするプローブである。バイオマーカー特異的プローブは、オリゴヌクレオチドプローブを含むことができ、またより長いプローブ（例えば、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ヌクレオチド、その他）を含むこともできる。
【００８５】
本明細書中で使用される用語「プローブ」は、オリゴヌクレオチドとその類似体を意味し、標的配列のヌクレオチド塩基との水素結合相互作用によりポリヌクレオチド標的配列を認識する一連の化学種を指す。プローブまたは標的配列は、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡまたは１本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡ塩基の組み合わせであってもよい。プローブは、長さが少なくとも８個のヌクレオチドであり、そして全長遺伝子の長さより小さい。プローブは、長さが１０、２０、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００個の、および最高２０００個までのヌクレオチドであってもよい。プローブは、蛍光、化学発光などによって検出可能なタグを有するように改変されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。プローブは、また、検出可能なタグとクエンチャー分子を有するように改変される（例えば、Ｔａｑｍａｎ．ＲＴＭ．プローブやＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ．ＲＴＭ．プローブ）こともできる。
【００８６】
本明細書中で使用される場合、用語「バイオマーカーの産物」または「バイオマーカー産物」は、バイオマーカーに相当するか、またはそれによりコードされる（すなわち、その遺伝子または遺伝要素から転写されるか、または遺伝子または遺伝要素から転写されるＲＮＡから翻訳される）ＲＮＡまたはタンパク質を指す。例えば、いくつかの実施形態において、バイオマーカーから生じるＲＮＡは、以下の種の１つまたはそれ以上を含むことができる；ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡおよび／または１つまたはそれ以上のｍＲＮＡのスプライスバリアント。いくつかの実施形態において、分子マーカーから生じるタンパク質は、バイオマーカーから生じるＲＮＡに対応する血液中で見られる任意のタンパク質を含むことができる。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、本発明の文脈中での用語「対照」または「対照サンプル」は、１つまたはそれ以上の組織核酸サンプルおよび／または血液核酸サンプルおよび／または当業者に公知のそれらの技術を使用することによって測定した場合に、膵臓癌を有し、膵臓癌および／または表在性膀胱癌の１つまたはそれ以上のステージを有する；膵臓癌を有しないで、膵臓癌および／または表在性膀胱癌の１つまたはそれ以上のステージを有する、として分類される１つまたはそれ以上の個体を指す。用語「対照」または「対照サンプル」は、また、正常（膵臓癌を有しない）、膵臓癌を有する、または膵臓癌のステージを有すると診断された１つまたはそれ以上の個体からのサンプルに由来するデータを編集したものを指すこともできる。当業者によって理解されるように−対照という用語は、実験の文脈中で使われて、所望の比較に依存する。本明細書中で使用される場合、予防薬または治療薬のためのスクリーニングの文脈における用語「対照」は、他の状況が比較され得るアッセイまたは方法論に対する標準または参照を指す。
【００８８】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、膵臓癌またはその１つまたはそれ以上の症状の進行およびまたは重篤度を減らすか、または緩和する；膵臓癌またはその１つまたはそれ以上の症状の進展、再発または発症を防止する；膵臓癌またはその１つまたはそれ以上の症状の進行を防止する；または別の治療の予防もしくは治療効果（複数可）を強化するか、または改善する；のに十分である化合物の量を指す。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、用語「化学療法剤」は、膵臓癌またはその１つまたはそれ以上の症状の治療、管理または緩和において使用することができる任意の化合物（複数可）を指す。
【００９０】
本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量」は、膵臓癌またはその１つまたはそれ以上の症状の緩和をもたらす；膀胱癌の進行を防止するか、または膀胱癌の退縮をもたらす；または他の療法（例えば化学療法剤）の治療効果（複数可）を増強するか、または改善する；のに十分な治療の量を指す。
【００９１】
本明細書中で使用される場合、用語「効力」は、薬物および／または薬剤の有効性を指す。「化学療法的効力」は、通常、薬物および／または薬剤で治療されたか、または治療されている患者の臨床応答により測定される。それが望ましい臨床結果（例えば、膵臓癌、膵臓癌のステージに伴う症状の軽減、または本明細書で記述される膵臓癌の進行の防止）を達成するならば、薬物は高度な効力を有すると考えられる。吸収される薬物の量は、患者の応答性を予測するのに用いることが可能である。一般的な法則は、薬物の用量が増加するにつれて、より大きな効果が最大の望ましい結果に達するまで患者で認められることである。
【００９２】
本明細書中で使用される場合、用語「発現のレベル」とは、当業者に公知の方法で測定されるような、遺伝子に対応する所定の核酸またはタンパク質の量の測定を指す。本発明のバイオマーカーに対応するＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのスプライスバリアントに関して、発現のレベルは、定量的リアルタイムＲＴ  ＰＣＲなどの他の測定方法と同様に、ハイブリダイゼーションで測定することができ、それはＳＹＢＲ．ＲＴＭ．ｇｒｅｅｎ、ＴａｑＭａｎ．ＲＴＭ．およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ技術の使用を含む。本明細書中で使用されるように、発現の示差的なレベルの測定は、所定の核酸またはタンパク質の量の違いの視覚的観察、例えばノーザンブロットまたはウエスタンブロットの分析を含むことができる点に注目すべきである。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、用語「選択的に増幅された」または「選択的増幅」は、特定の標的核酸配列の１つまたはそれ以上のコピーが、テンプレート核酸から選択的に生成されるプロセスを指す。「選択的増幅」または「選択的に増幅されること」は、例えば、核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）のポピュレーションを増幅するランダムプライマーおよびオリゴｄＴプライマーと組み合わせた方法として使用することができる一般的な増幅と比較されるべきものである。選択的な増幅は、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応の方法により行われる（Ｍｕｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：３３５）。
【００９４】
本明細書中で使用されるように、本発明により包含されるタンパク質の文脈中での用語「選択的に結合する」は、ペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよび抗体の任意の２つの特異的相互作用を指し、該相互作用は、任意の他のペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよび抗体と比較した場合に、好ましくはペプチド、タンパク質、ポリペプチドおよび抗体の任意の２つの間で優先して起こる。例えば、２つの分子がタンパク質分子であるとき、第１分子上の構造は、他のタンパク質よりはむしろ第２分子の構造を認識し、それに結合する。用語として本明細書中で使用される「選択的結合」、「選択的結合」は、それが非特異的分子に結合するよりも、分子が少なくとも２倍の大きさの親和性で、好ましくは、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれより高い親和性でその特異的結合パートナーと結合することを意味する。
【００９５】
したがって、１つの実施形態において、本発明は、単離されたサンプルで、ｐ２７などの代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルを測定することで化学療法剤の効果を測定する方法を含む。次いで、サンプルは、試験される化学療法剤の実験的有効量と接触させる。化学療法剤が投与されたあと、代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルの記録を取り、第１レベル（前処置）と比較される。候補化学療法剤は、第２（処置後）レベルｐ２７が前処置および／または対照レベルより統計学的に有意な程度まで増加する有効性を示す。
【００９６】
別の実施形態において、本発明は、単離されたサンプルで、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫなどの第２代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルをさらに測定することにより化学療法剤の有効性を決定する方法を提供する。化学療法剤が投与されたあと、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫの第２レベルを測定し、第１レベル（前処置）および／または対照と比較する。候補化学療法剤は、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫの第２（処置後）のレベルが前処置および／または対照レベルより下に統計学的に有意に減少する有効性を示す。
【００９７】
本発明の別の実施形態は、例えば単離されたサンプルで、バイオマーカー、すなわちｐ２７のレベルを測定することによって、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージをスクリーニングする方法を含む。次いで、バイオマーカーのレベルは、１つまたはそれ以上の対照サンプルにおける対応する対照レベルと比較される。好ましい実施形態において、対照サンプルは、膵臓癌、または膵管癌のステージを有していないと決定された個体から得られる。
【００９８】
対象でのバイオマーカーのレベルと対照サンプル（複数を含む）でのバイオマーカーのレベルとの間の統計学的に有意な増加の測定は、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージの非存在を示す。対照サンプル（複数を含む）でのバイオマーカーのレベルと比較された、対象でのｐ２７のレベルの統計学的に有意な減少は、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す。
【００９９】
別途の実施形態においては、第２バイオマーカー、すなわち、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベルが測定されて、１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫの対照レベルと比較される。対象および対照サンプル（複数を含む）でのＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベル間の統計学的に有意な増加は、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージを示す。対照サンプル（複数を含む）と比較した、対象におけるＫｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫのレベルの統計学的に有意な減少は、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージの非存在を示す。
【０１００】
対象と対照サンプル（複数を含む）におけるバイオマーカーのレベルを測定する方法は、通常の開業医に公知である。１つの実施形態において、例えば、バイオマーカーのレベルは、バイオマーカーと結合する抗体を利用して測定される。バイオマーカーを含むサンプルは、バイオマーカーが抗体に結合するのを可能とする条件下で、抗体と接触させる；次いで、バイオマーカーの存在を定量化することができる。
【０１０１】
本発明は、また、関連する方法を実行するために有用な組成物を含む。例えば、本発明は、関連バイオマーカー；すなわち、Ｋｉ−６７および／またはｐ−ＭＡＰＫ、ならびにｐ２７のタンパク質産物と選択的に結合する複数の単離されたタンパク質を含む組成物を含む。好ましい実施形態において、単離されたタンパク質は、相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅する。組成物は、また、複数のバイオマーカー特異的プライマーを含み、そこでは各バイオマーカー特異的プライマーは、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびｐ−２７などの特有のバイオマーカーに対して相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅する。あるいはまた、本発明は、少なくとも２つの特有なバイオマーカーのタンパク質産物と選択的に結合する複数の単離されたタンパク質を含む組成物を含み、そこでは、各特有なバイオマーカーがＫｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびｐ２７からなる群から選択される。
【０１０２】
バイオマーカーのレベルを測定する方法（例えば、定量化）は、通常の当業者に、容易に知られており、限定されるものではないが、発現レベル、ＲＮＡのレベル、ＲＮＡ産物のレベル、タンパク質レベル、および／またはタンパク質活性レベルを測定することを含む。
【０１０３】
上記の利点、および前述の説明から明らかにされる利点は、効率的に達成されるであろうし、本発明の範囲から逸脱することなく上記の構成で特定の変更がなされ得るので、前記の記述に含まれる、または添付図面で示される全ての事項は、例示的であり、限定的に解釈されるべきではないことが意図される。
【０１０４】
また、以下の特許請求の範囲は、本明細書に記述された一般的および特定的な特徴の全てを、および言語上の問題として、本発明の範囲の間に入ると言われるかもしれない本発明の範囲の全ての説明をカバーするものであると理解すべきである。
なお、本願は、特許請求の範囲に記載の発明に関するものであるが、他の態様として以下も包含し得る。
１．トコトリエノールの治療有効量を含む組成物を対象に投与することを含む、癌を治療または予防する方法。
２．トコトリエノールが、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなる群から選択される上記１に記載の方法。 
３．トコトリエノールの治療有効量を含む組成物が、医薬組成物として投与される上記１に記載の方法。 
４．組成物が、α−トコトリエノールとβ−トコトリエノールを実質的に含まない上記１に記載の方法。 
５．組成物が、α−トコトリエノール、β−トコトリエノールおよびγ−トコトリエノールからなる群から選択される少なくとも１種のトコトリエノールを実質的に含まない上記１に記載の方法。 
６．組成物が、トコフェロール類を実質的に含まない上記１に記載の方法。 
７．組成物が、約１００ｍｇ〜３００ｍｇのトコトリエノールを含む上記１に記載の方法。 
８．組成物が、ゲムシタビンおよび５−ＦＵからなる群から選択される化学療法剤の治療有効量をさらに含む上記１に記載の方法。 
９．癌が、膵管癌、または膵臓癌のステージである上記１に記載の方法。 
１０．細胞をトコトリエノールの有効量をさらに含む組成物と接触させる段階を含む、細胞でのｐ２７の発現を上方制御する方法。 
１１．トコトリエノールが、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなる群から選択される上記１０に記載の方法。 
１２．トコトリエノールの治療有効量を含む組成物が、医薬組成物として投与される上記１０に記載の方法。 
１３．組成物が、α−トコトリエノールとβ−トコトリエノールを実質的に含まない上記１０に記載の方法。 
１４．組成物が、α−トコトリエノールおよびβ−トコトリエノールからなる群から選択される少なくとも１種のトコトリエノールを実質的に含まない上記１０に記載の方法。
１５．腫瘍を、細胞内でｐ２７の発現を増やすのに適している化学療法剤と接触させる段階を含む腫瘍を治療する方法。 
１６．腫瘍が、膵管癌、または膵臓癌のステージである上記１５に記載の方法。 
１７．化学療法剤が、低分子干渉ＲＮＡである上記１５に記載の方法。 
１８．腫瘍を、Ｋｉ−６７およびｐ−ＭＡＰＫからなる群から選択されるバイオマーカーの細胞内での発現を減少させるのに適している化学療法剤と接触させる段階を含む腫瘍を治療する方法。 
１９．腫瘍が、膵管癌、または膵臓癌のステージである上記１８に記載の方法。 
２０．化学療法剤が、低分子干渉ＲＮＡである上記１８に記載の方法。 
２１．単離されたサンプルで、ｐ２７の第１レベルを測定すること；サンプルを化学療法剤の実験的有効量と接触させること；単離されたサンプルを化学療法剤の実験的有効量と接触させた後、ｐ２７の第２レベルを測定すること；およびｐ２７の第１レベルと代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルを比較すること；
を含む化学療法剤の有効性を測定する方法であって、そこではｐ２７の第１および第２レベルの統計学的有意差の測定が化学療法剤の有効性を示す、前記方法。 
２２．ｐ２７の第１レベルと比較したｐ２７の第２レベルの統計学的に有意な増加が、化学療法剤の有効性を示す上記２１に記載の方法。 
２３．ｐ２７の第１レベルと比較したｐ２７の第２レベルの統計学的に有意な減少が、化学療法剤の有効性の欠如を示す上記２１に記載の方法。 
２４．単離されたサンプルで、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫ、ｐ−ＡＫＴおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルを測定すること；単離されたサンプルを化学療法剤の実験的有効量と接触させた後、第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルを測定すること；および第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルと第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルを比較すること；をさらに含み、そこでは第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第１および第２レベル間の統計学的有意差の測定が化学療法剤の有効性を示す、上記２１に記載の方法。 
２５．第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルと比較した第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルにおける統計学的に有意な増加が、化学療法剤の有効性を示す上記２４に記載の方法。 
２６．第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルと比較した第２の代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルにおける統計学的に有意な減少が、化学療法剤の有効性の欠如を示す上記２４に記載の方法。 
２７．第１および第２レベルが、ｐ２７のＲＮＡ産物のレベルを測定することにより測定される上記２１に記載の方法。 
２８．第１および第２レベルが、ｐ２７によりコードされるＲＮＡのレベルを測定することにより測定される上記２１に記載の方法。 
２９．ｐ２７のレベルがｐ２７と結合する抗体を使用して測定され、抗体へのｐ２７の結合を可能とする条件下で、ｐ２７を含むサンプルを抗体と接触させること；およびサンプル中のｐ２７の存在を定量すること、をさらに含む、上記２１に記載の方法。 
３０．ｐ２７のレベルが、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、ＲＮＡ産物のレベル、タンパク質レベル、およびタンパク質活性レベルからなる群から選択される上記２１に記載の方法。 
３１．単離されたサンプルで、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫ、ｐ−ＡＫＴおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルを測定すること；サンプルを化学療法剤の実験的有効量と接触させること；単離されたサンプルを化学療法剤の実験的有効量と接触させた後、代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルを測定すること；および代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルと代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルを比較すること；を含む化学療法剤の有効性を測定する方法であって、そこでは代用エンドポイントバイオマーカーの第１および第２レベル間の統計学的有意差の測定が化学療法剤の有効性を示す、前記方法。 
３２．代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルと比較した代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルにおける統計学的に有意な減少が、化学療法剤の有効性を示す上記３１に記載の方法。 
３３．代用エンドポイントバイオマーカーの第１レベルと比較した代用エンドポイントバイオマーカーの第２レベルにおける統計学的に有意な増加が、化学療法剤の有効性の欠如を示す上記３１に記載の方法。 
３４．代用エンドポイントバイオマーカーの第１および第２レベルが、代用エンドポイントバイオマーカーのＲＮＡ産物のレベルを測定することにより測定される上記３１に記載の方法。 
３５．代用エンドポイントバイオマーカーの第１および第２レベルが、代用エンドポイントバイオマーカーによりコードされるＲＮＡのレベルを測定することにより測定される上記３１に記載の方法。 
３６．代用エンドポイントバイオマーカーのレベルが、代用エンドポイントバイオマーカーと結合する抗体を使用して測定され、代用エンドポイントバイオマーカーを含むサンプルを、抗体への代用エンドポイントバイオマーカーの結合を可能とする条件下で、抗体と接触させること；およびサンプル中の代用エンドポイントバイオマーカーの存在を定量すること、をさらに含む、上記３１に記載の方法。 
３７．代用エンドポイントバイオマーカーのレベルが、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、ＲＮＡ産物のレベル、タンパク質レベル、およびタンパク質活性レベルからなる群から選択される上記３１に記載の方法。 
３８．単離されたサンプルで、ｐ２７のレベルを測定すること；およびｐ２７のレベルを、１つまたはそれ以上の対照サンプルでのｐ２７の対照レベルと比較すること；を含む、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージをスクリーニングする方法であって、そこでは対象におけるｐ２７のレベルと１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるｐ２７のレベルとの間の統計学的有意差の測定が、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージを示す、前記方法。 
３９．ｐ２７のレベルが、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベル、およびタンパク質活性レベルからなる群から選択される上記３８に記載の方法。 
４０．１つまたはそれ以上の対照サンプルが、膵管癌、または膵臓癌のステージを有していないことが知られている対象から得られる上記３８に記載の方法。 
４１．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるｐ２７のレベルと比較した、対象でのｐ２７のレベルにおける統計学的に有意な類似度または増加が、対象において膵管癌、または膵臓癌のステージがないことを示す上記４０に記載の方法。 
４２．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるｐ２７のレベルと比較した、対象でのｐ２７のレベルにおける統計学的に有意な減少が、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す上記４０に記載の方法。 
４３．１つまたはそれ以上の対照サンプルが、膵管癌、または膵臓癌のステージを有していることが知られている対象から得られる上記３８に記載の方法。 
４４．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるｐ２７のレベルと比較した、対象でのｐ２７のレベルにおける統計学的に有意な増加が、対象において膵管癌、または膵臓癌のステージがないことを示す上記４３に記載の方法。 
４５．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるｐ２７のレベルと比較した、対象でのｐ２７のレベルにおける統計学的に有意な類似度または減少が、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す上記４３に記載の方法。 
４６．単離されたサンプルで、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオマーカーのレベルを測定すること；およびバイオマーカーのレベルを、１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーの対照レベルと比較すること；をさらに含み、そこでは対象におけるバイオマーカーのレベルと１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルとの間の統計学的有意差の測定が、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージを示す、上記３８に記載の方法。 
４７．バイオマーカーのレベルが、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベル、およびタンパク質活性レベルからなる群から選択される上記３８に記載の方法。 
４８．１つまたはそれ以上の対照サンプルが、膵管癌、または膵臓癌のステージを有していないことが知られている対象から得られる上記４６に記載の方法。 
４９．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのバイオマーカーのレベルにおける統計学的に有意な増加が、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す上記４８に記載の方法。
５０．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのバイオマーカーのレベルにおける統計学的に有意な類似度または減少が、対象において膵管癌、または膵臓癌のステージがないことを示す上記４８に記載の方法。 
５１．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのバイオマーカーのレベルにおける統計学的に有意な類似度または増加が、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す上記４６に記載の方法。 
５２．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのバイオマーカーのレベルにおける統計学的に有意な減少が、対象において膵管癌、または膵臓癌のステージがないことを示す上記４６に記載の方法。 
５３．単離されたサンプルで、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびそれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオマーカーのレベルを測定すること；およびバイオマーカーのレベルを１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較すること；を含む、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージをスクリーニングする方法であって、そこでは対象におけるバイオマーカーのレベルと１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルとの間の統計学的有意差の測定が、対象における膵管癌、または膵臓癌のステージを示す、前記方法。 
５４．バイオマーカーのレベルが、遺伝子発現レベル、ＲＮＡのレベル、タンパク質レベル、およびタンパク質活性レベルからなる群から選択される上記５３に記載の方法。 
５５．１つまたはそれ以上の対照サンプルが、膵管癌、または膵臓癌のステージを有していないことが知られている対象から得られる上記５３に記載の方法。 
５６．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのバイオマーカーのレベルにおける統計学的に有意な増加が、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す上記５５に記載の方法。 
５７．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのバイオマーカーのレベルにおける統計学的に有意な類似度または減少が、対象において膵管癌、または膵臓癌のステージがないことを示す上記５５に記載の方法。 
５８．１つまたはそれ以上の対照サンプルが、膵管癌、または膵臓癌のステージを有していることが知られている対象から得られる上記５３に記載の方法。 
５９．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのバイオマーカーのレベルにおける統計学的に有意な類似度または増加が、対象での膵管癌、または膵臓癌のステージの存在を示す上記５８に記載の方法。 
６０．１つまたはそれ以上の対照サンプルにおけるバイオマーカーのレベルと比較した、対象でのバイオマーカーのレベルにおける統計学的に有意な減少が、対象において膵管癌、または膵臓癌のステージがないことを示す上記５８に記載の方法。 
６１．Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫ、ｐ−２７およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する複数の単離されたタンパク質を含む、対象における膵管癌のスクリーニングに使用するための組成物。 
６２．複数のバイオマーカー特異的プライマーを含み、各バイオマーカー特異的プライマーが、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびｐ−２７からなる群から選択されるユニークバイオマーカーに対して相補的な二本鎖ＤＮＡを選択的に増幅する、対象における膵管癌のスクリーニングに使用するための組成物。 
６３．少なくとも２つのユニークバイオマーカーのタンパク質産物に選択的に結合する複数の単離されたタンパク質を含み、各ユニークバイオマーカーが、Ｋｉ−６７、ｐ−ＭＡＰＫおよびｐ−２７からなる群から選択される、対象における膵管癌のスクリーニングに使用するための組成物。 
６４．トコトリエノールの治療有効量を含む化合物を対象に投与する段階を含む、それを必要とする対象の膵臓癌の進行を予防する方法。 
６５．トコトリエノールが、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなる群から選択される上記６４に記載の方法。 
６６．対象が、膵臓癌に対して遺伝的疾病素質を有する対象および新生成物発生前の病変を有する対象からなる群から選択される上記６４に記載の方法。 
６７．新生成物発生前の病変が、ＰａｎＩＮ、ＩＰＭＮおよびＭＣＮからなる群から選択される上記６６に記載の方法。 
６８．トコトリエノールの治療有効量を含む化合物を対象に投与する段階を含む、膵臓癌の切除を受けた手術後の対象における転移を予防する方法。 
６９．トコトリエノールが、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなる群から選択される上記６８に記載の方法。 
７０．細胞をトコトリエノールの治療有効量を含む組成物と接触させることを含む、癌細胞においてアポトーシスを誘導する方法。 
７１．トコトリエノールが、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなる群から選択される上記７０に記載の方法。 
７２．組成物が、α−トコトリエノールおよびβ−トコトリエノールを実質的に含まない上記７０に記載の方法。 
７３．組成物が、α−トコトリエノール、β−トコトリエノールおよびγ−トコトリエノールからなる群から選択される少なくとも１種のトコトリエノールを実質的に含まない上記７０に記載の方法。 
７４．組成物が、トコフェロール類を実質的に含まない上記７０に記載の方法。 
７５．癌が、膵管癌、または膵臓癌のステージである上記７０に記載の方法。 
７６．細胞を、トコトリエノールの治療有効量を含む組成物と接触させることを含む、癌細胞での発癌性ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路を阻害する方法。 
７７．トコトリエノールが、γ−トコトリエノールおよびδ−トコトリエノールからなる群から選択される上記７６に記載の方法。 
７８．組成物が、α−トコトリエノールおよびβ−トコトリエノールを実質的に含まない上記７６に記載の方法。 
７９．組成物が、α−トコトリエノール、β−トコトリエノールおよびγ−トコトリエノールからなる群から選択される少なくとも１つのトコトリエノールを実質的に含まない上記７６に記載の方法。 
８０．組成物が、トコフェロール類を実質的に含まない上記７６に記載の方法。 
８１．癌が、膵管癌、または膵臓癌のステージである上記７６に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
0005490532.tif 000018
【図２Ｂ】
0005490532.tif 000019
【図２Ｃ】
0005490532.tif 000020
【図２Ｄ】
0005490532.tif 000021
【図２Ｅ】
0005490532.tif 000022
【図２Ｆ】
0005490532.tif 000023
【図３Ａ】
0005490532.tif 000024
【図３Ｂ】
0005490532.tif 000025
【図４Ａ】
0005490532.tif 000026
【図４Ｂ】
0005490532.tif 000027
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
0005490532.tif 000029
【図５Ａ】
0005490532.tif 000030
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
0005490532.tif 000034
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
0005490532.tif 000036
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
0005490532.tif 000041
【図１０】
0005490532.tif 000042
【図１１Ａ】
0005490532.tif 000043
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
0005490532.tif 000045
【図１２Ｂ】
0005490532.tif 000046
【図１３Ａ】
0005490532.tif 000047
【図１３Ｂ】
0005490532.tif 000048
【図１３Ｃ】
0005490532.tif 000049
【図１３Ｄ】
0005490532.tif 000050
【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
0005490532.tif 000052
【図１３Ｇ】
0005490532.tif 000053
【図１３Ｈ】
0005490532.tif 000054
【図１３Ｉ】
0005490532.tif 000055
【図１３Ｊ】
0005490532.tif 000056
【図１３Ｋ】
0005490532.tif 000057
【図１３Ｌ】
0005490532.tif 000058
【図１４Ａ】
0005490532.tif 000059
【図１４Ｂ】
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【図１５】
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