(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における血清コレステロールレベルを低下させるのに用いるためのあるいは血清コレステロールレベルの上昇を阻害するのに用いるための、医薬の調製のための配列番号：３または配列番号：４で示される成熟ｍｉＲ−１２２ａに対し少なくとも９０％の配列相補性からなるところの、アンチセンス化合物の使用であって、該アンチセンス化合物が、１５〜３０ヌクレオシド長である、使用。
【請求項２】
血清コレステロールがＬＤＬ−コレステロールであるところの、請求項１記載の使用。
【請求項３】
血清コレステロールが血清総コレステロールであるところの、請求項１記載の使用。
【請求項４】
高コレステロール血症を治療するための医薬の調製における配列番号：３または配列番号：４で示される成熟ｍｉＲ−１２２ａに対し少なくとも９０％の配列相補性からなるところの、アンチセンス化合物の使用であって、該アンチセンス化合物が、１５〜３０ヌクレオシド長である、使用。
【請求項５】
アンチセンス化合物が、１７〜２５ヌクレオシド長であるか、またはアンチセンス化合物が、２１〜２３ヌクレオチド長であるところの、請求項１〜４のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
アンチセンス化合物が、成熟ｍｉＲ−１２２ａと完全に相補的であるところの、請求項５記載の使用。
【請求項７】
アンチセンス化合物が、複数の２’−糖修飾ヌクレオシドを含むところの、請求項５または６記載の使用。
【請求項８】
アンチセンス化合物が、少なくとも１個の二環式糖修飾ヌクレオシドをさらに含むところの、請求項５〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
アンチセンス化合物が、配列番号：１記載の核酸塩基配列を含むところの、請求項５〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
アンチセンス化合物が、配列番号：１記載の核酸塩基配列からなるか、または配列番号：２記載の核酸塩基配列からなるところの、請求項５〜９のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
アンチセンス化合物が、２’−ＭＯＥ糖修飾ヌクレオシドを均一に含むところの、請求項５〜１０のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
アンチセンス化合物が、少なくとも１つのホスホロチオエート・ヌクレオシド内結合を含むところの、請求項５〜１１のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
アンチセンス化合物が、少なくとも１個の５−メチルシトシンを含むところの、請求項５〜１２のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】
各ヌクレオシドが、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドであり、各結合が、ホスホロチオエート結合であり、各シトシンが５−メチルシトシンであるところの、請求項９または１０記載の使用。
【請求項１５】
各ヌクレオシド内結合が、ホスホロチオエート・ヌクレオシド内結合である、請求項５〜１４のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２００５年８月２９日に出願された米国仮出願番号第６０／７１２，２１１号、２００５年１０月２８日に出願された米国仮出願番号第６０／７３１，３７７号および２００６年２月７日に出願された米国仮出願番号第６０／７７１，５９２号に対する優先権を主張し、その各々はその全部が出典明示により本明細書中の一部とされる。
【０００２】
本出願は、２００３年７月３１日に出願された米国仮出願番号第６０／４９２，０５６、２００３年１０月３１日に出願された第６０／５１６，３０３号、２００３年１２月１９日に出願された第６０／５３１，５９６号、および２００４年４月１４日に出願された第６０／５６２，４１７号に対する優先権を主張する２００４年７月３０日に出願された米国特許出願番号第１０／９０９，１２５号と関連し、その各々はその全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、小さい非コードＲＮＡ、特にｍｉＲ−１２２ａをモジュレートする方法を提供する。ｍｉＲ−１２２ａのレベルまたは活性を阻害するアンチセンス化合物の投与を通じて、高血清総コレステロール、高血清ＬＤＬコレステロールまたは高血清トリグリセリドによって特徴づけられる心血管疾患または代謝性疾患の処置方法が、提供される。さらに、ｍｉＲ−１２２ａのレベルまたは活性を阻害するアンチセンス化合物の投与を通じて、肝臓脂肪症または肝組織トリグリセリド蓄積を低下させる方法が、提供される。該方法は、ｍｉＲ−１２２ａを含むもしくはコードする核酸分子とハイブリダイズするか、または立体的に干渉するアンチセンス化合物を用いる。そのようなアンチセンス化合物は該アンチセンス化合物の活性、安定性またはヌクレアーゼ抵抗性を改善し得る１つまたはそれ以上の修飾をそれ上に含んでもよい。これらの修飾されたアンチセンス化合物は、単一の化合物として、または、医薬組成物を含む組成物で、ｍｉＲ−１２２ａを阻害するために用いられる。
【背景技術】
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、植物および動物のゲノムでコードされる、小さい（約２１−２４ヌクレオチド長、これらは、「成熟」ｍｉＲＮＡとしても知られている）非コードＲＮＡ分子である。これらの非常に保存された、内因性発現されるＲＮＡは、特定のｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に結合することによって遺伝子の発現を調節すると考えられている。ｍｉＲＮＡは、細胞過程、例えば細胞増殖、細胞死（アポトーシス）、代謝および細胞分化の重要な調節装置として作用し得る。より大きな規模では、ｍｉＲＮＡ発現は、初期発生、脳発生、疾病進行（例えば癌およびウイルス感染）と関係する。より高度な真核細胞では、遺伝子発現を調節するｍｉＲＮＡの役割は、転写制御因子の役割と同程度重要であり得ることが推測される。２００以上の異なるｍｉＲＮＡが、植物および動物で確認された（Ambrosら、Curr. Biol., 2003, 13, 807-818）。成熟ｍｉＲＮＡは、しばしば何百ものヌクレオチド長の長い内因性の初期ｍｉＲＮＡ転写産物（別名ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉｒ、ｐｒｉ−ｍｉＲまたはｐｒｉ−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとしても知られる）から生じるようである（Leeら、EMBO J., 2002, 21(17), 4663-4670）。
【０００５】
哺乳動物では、ほんのわずかなｍｉＲＮＡだけが何らかの機能を割り当てられているが、生物情報科学標的予測に基づく見積もりでは、３０％程度の範囲に及ぶ高い百分率の遺伝子を調節することが予想されている(Lewisら、2005)。無脊椎動物での初期試験に基づけば、ｍｉＲＮＡは、哺乳動物の発達制御および細胞分化で類似の役割を有すること、および、心臓発生（Zhaoら、2005）とリンパ球発生（Chenら、2004）におけるｍｉＲＮＡの役割が実際に示された。いくつかの研究で、ｍｉＲＮＡ遺伝子が癌と関連するゲノム領域でしばしば見出されるという報告（Calinら、2004；McManus, 2003）およびｍｉＲＮＡ発現プロフィールが発生系譜および腫瘍の分化状態と相関するという研究（Luら、2005）を含み、ｍｉＲＮＡとヒト癌との間にも強い関係が見られた。ｍｉＲＮＡの代謝経路における潜在的な役割は、ｍｉＲＮＡが、脂肪細胞分化（Esauら、2004）および膵臓膵島細胞からのグルコース刺激性のインスリン分泌の調節(Poy ら、2004)と関係するという研究により示唆された。ｍｉＲ−１２２ａは、発生中の肝臓（Changら、2004）で、また成体肝臓では高度レベルで発現され、それは全ｍｉＲＮＡ（Changら、2004；LagosQuintanaら、2002）の最大７０％を占める。これは、組織の分化状態を維持する役割を果たし得る遺伝子発現パターンを確立するために重要であると考えられる多くの組織特異マイクロＲＮＡのうちの１つである（Lagos-Quintanaら、2002；Limら、2005）。ｍｉＲ−１２２ａは、まだ理解されていない新しい機序を通じてＨＣＶの複製を増強させることも報告されており、それにより、ＨＣＶ感染症に対する潜在的な治療標的となった（Joplingら、2005）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ｍｉＲ−１２２ａのモジュレーションが、高血清コレステロール、高血清トリグリセリドまたは肝臓脂肪症によって特徴づけられる疾病および状態における魅力的なアプローチであると、本明細書中で記載される。従って、本発明は、ｍｉＲ−１２２ａをモジュレートし、動物におけるコレステロール状態および脂質状態の臨床上の望ましい変化を達成するために有用なアンチセンス化合物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、高血清総コレステロール、高血清ＬＤＬコレステロールおよび高トリグリセリドレベルを含む心血管疾患リスクの血清指標を低下させる方法であって、高い心血管疾患の血清指標を有する動物を選択すること、および該動物にｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を投与することを含む方法が提供される。
【０００８】
本発明は、高血清コレステロールレベルを有する動物を選択すること、それから、該動物にｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物の血清コレステロールを低下させる方法を提供する。血清コレステロールレベルは、血清総コレステロールレベルまたは血清ＬＤＬコレステロールレベルであってよい。
本発明は、高トリグリセリドレベルを有する動物を選択すること、それから、該動物にｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物のトリグリセリドレベルを低下させる方法をさらに提供する。トリグリセリドレベルは、血清トリグリセリドレベルまたは肝組織トリグリセリドレベルであってよい。
【０００９】
さらに、高血清リポ蛋白質を有する動物を選択すること、および該動物にｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物の血清リポ蛋白質を低下させる方法が提供される。血清リポ蛋白質は、アポリポ蛋白質Ｂ−１００であってよい。
本発明は、肝臓脂肪症を有する動物を選択すること、および該動物にｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物の肝臓脂肪症を軽減させる方法を提供する。肝臓脂肪症は、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎であってよい。
【００１０】
動物にｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物の肝臓におけるトリグリセリド蓄積を低下させる方法がさらに提供される。
本発明は、動物にｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量を投与することを含む、動物の代謝経路をモジュレートする方法を提供する。代謝経路は、脂質生成、脂肪酸酸化、脂肪酸合成速度またはステロール合成から選択される。本方法は、脂質生成を低下させるか、脂肪酸合成速度を低下させるか、ステロール合成を低下させるか、または脂肪酸酸化を増加させることを提供する。
【００１１】
動物をｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量と接触させることを含む、動物の肝機能を改善する方法がさらに提供される。肝機能の改善は、血漿アミノ基転移酵素の減少が肝機能の改善を示すので、血漿アミノ基転移酵素のレベルを測定することで測定される。
また、糖尿病、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、非アルコール性脂肪肝疾病、非アルコール性脂肪性肝炎または代謝症候群から選択される心血管疾患または代謝性疾患または障害を処置する方法が提供される。動物は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸に本質的に相補的なアンチセンス化合物の治療上の有効量の投与を通じて処置される。
【００１２】
上述の方法のいずれかにおいて、アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸に本質的に完全に相補的である。別には、アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸と完全に相補的である。アンチセンス化合物は、複数の糖修飾されたヌクレオシドを含む。複数の糖修飾されたヌクレオシドは、いくつかの実施形態で、２つの異なる糖修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態において、糖修飾ヌクレオシドは、少なくとも１個の二環式糖修飾をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、複数の糖修飾ヌクレオシドのヌクレオシドはそれぞれ、２’−ＭＯＥ糖修飾を含んでもよい。アンチセンス化合物は、少なくとも１個のホスホロチオエート・ヌクレオシド内結合を含んでもよい。アンチセンス化合物は、少なくとも１個の５‐メチルシトシンをさらに含んでもよい。
【００１３】
配列番号：１記載の核酸塩基配列を含むアンチセンス化合物は、上述の方法のいずれかに用いることができる。さらに、配列番号：２記載の核酸塩基配列を含むアンチセンス化合物は、上述の方法のいずれかに用いることができる。アンチセンス化合物は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５またはＩＳＩＳ  ３８７５７４を含んでもよい。
【００１４】
本発明は、心血管疾患リスクの血清指標が高血清コレステロールレベル、高血清トリグリセリドレベルまたは高リポ蛋白質レベルから選択される、心血管疾患リスクの血清指標を低下させる医薬の調製のための、ｍｉＲ−１２２核酸に本質的に完全に相補的なアンチセンス化合物の使用を提供する。高血清コレステロールは、高ＬＤＬコレステロールまたは高血清総コレステロールであってよい。高血清リポ蛋白質は、高血清ＡｐｏＢ−１００であってよい。
【００１５】
本発明は、肝臓脂肪症を低下させる医薬の調製のための、ｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に完全に相補的なアンチセンス化合物の使用をさらに提供する。肝臓脂肪症は、脂肪性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎である。
本発明は、さらに、糖尿病、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、非アルコール性脂肪肝疾病、非アルコール性脂肪性肝炎または代謝症候群から選択される疾病または障害を処置するための医薬の調製における、ｍｉＲ−１２２ａ核酸と本質的に完全に相補的なアンチセンス化合物の使用を提供する。
【００１６】
上述の使用のいずれかで、医薬の調製に用いられるアンチセンス化合物は、２１〜２３ヌクレオシド長である。さらに、アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸と完全に相補的であってよい。加えて、アンチセンス化合物は、複数の２’−糖修飾ヌクレオシドを含んでもよい。アンチセンス化合物は、少なくとも１個の二環式糖修飾ヌクレオシドをさらに含んでいてもよい。加えて、アンチセンス化合物は、配列番号：１記載の核酸塩基配列を含む。別には、アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列を含む。医薬の調製で用いられるアンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ糖修飾ヌクレオシドを均一に含み得る。アンチセンス化合物は、少なくとも１個のホスホロチオエート・ヌクレオシド内結合をさらに含んでいてもよい。アンチセンス化合物は、さらに少なくとも１個の５‐メチルシトシンを含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害が、高脂血症と肥満の動物モデルでコレステロールと脂質状態の臨床的に望ましい改善をもたらすことが見い出された。したがって、本発明は、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸とハイブリダイズし、そしてそのレベル、活性または発現を阻害するアンチセンス化合物（すなわち、該アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とする）を提供する。アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸の安定性と結合性を増強させるため、化学的に修飾される。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、複数の糖修飾ヌクレオシドを含む。別の実施形態において、複数の糖修飾ヌクレオシドは、少なくとも２つの異なる糖修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態において、複数の糖修飾ヌクレオシドは、少なくとも１個の二環式糖修飾ヌクレオシドを含む。さらなる実施形態において、ヌクレオシドがそれぞれ２’−ＭＯＥ修飾を有するように、アンチセンス化合物は均一に修飾される。いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物は、核酸塩基配列ＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号：１）を含む。好ましい実施形態において、アンチセンス化合物は、核酸塩基配列ＡＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＣＡＣＴＣＣＡ（配列番号：２）を有する。さらなる実施形態において、アンチセンス化合物はＩＳＩＳ  ３２７８９５またはＩＳＩＳ  ３８７５７４である。
【００１８】
本発明は、血清コレステロール、血清ＬＤＬコレステロールまたは血清トリグリセリドを低下させるため、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物を動物に投与する方法を提供する。本発明はまた、肝臓脂肪症、肝臓トリグリセリドレベルおよび肝臓重量を低下させる方法を提供する。加えて、例えば、血清アミノ基転移酵素の減少によって評価される肝機能を改善する方法が提供される。また、ｍｉＲ−１２２ａ  ｍＲＮＡ標的、例えばＡＬＤＯ  Ａの発現をモジュレートする方法が提供される。本発明のアンチセンス化合物はまた、代謝経路のモジュレーションのため、例えば、ステロール合成を低下させるために、脂質生成を低下させるために、脂肪酸合成速度も低下させるために、ステロール合成も低下させるために、または脂肪酸酸化を増加させるために用いられる。
本発明は、高血清コレステロールレベル、高血清トリグリセリドレベルまたは高肝臓トリグリセリドレベルによって特徴づけられる疾病または健康状態の処置のための方法を提供する。これらの疾病または健康状態は、血漿アミノ基転移酵素の増加により測定されるような、損なわれた肝機能によってさらに特徴づけられ得る。
【００１９】
１つの実施形態において、本明細書中で提供される方法は、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症または高脂肪酸血症を含む疾病または健康状態の処置に有用である。さらなる実施形態において、本方法は、肝臓脂肪症または非アルコール性脂肪肝疾病の処置に有用である。いくつかの実施形態において、脂肪症は脂肪性肝炎である。さらなる実施形態において、脂肪症はＮＡＳＨである。さらなる実施形態は、代謝症候群の処置のために提供される本方法の使用を含む。１つの実施形態において、本方法は、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症、脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪肝疾病または代謝症候群を含むがこれに限定されない疾病または健康状態を有するまたは罹患しやすい動物、特にヒトへの、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物の投与を含む。１つの態様において、その疾病または健康状態は、治療上の有効量の本発明のアンチセンス化合物のヒトへの投与を通じて処置されるか、または改善される。別には、その疾病または健康状態の発症は、予防上の有効量の本発明のアンチセンス化合物のヒトへの投与を通じて遅延されるか、または予防される。
【００２０】
本明細書中に記載の実施形態は、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症または高脂肪酸血症を含む疾病または健康状態の処置のための医薬の調製における、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の使用にさらに関する。さらなる実施形態において、医薬は、脂肪性肝炎またはＮＡＳＨまたは非アルコール性脂肪肝疾病でもよい肝臓脂肪症の処置に用いられる。さらなる実施形態において、医薬は代謝症候群の処置に用いられる。さらなる実施形態において、医薬は肝機能の改善に用いられる。いくつかの実施形態で、医薬は、静脈内投与および皮下投与を含み、非経口的に投与されてもよい。
【００２１】
本発明のアンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸にハイブリダイズし（すなわち、アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とする）、それによってその内因性の機能と干渉し、ｍｉＲ−１２２ａ核酸のレベル、活性または発現をモジュレートする。ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とし、その各々がｍｉＲ−１２２ａ核酸の活性を干渉するアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションは、ｍｉＲ−１２２ａ核酸の分解、開裂および／または分離を生じさせ得る。ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物のハイブリダイゼーションは、立体化学的閉塞によってｍｉＲ−１２２ａの活性を干渉し得る。ｍｉＲ−１２２ａ核酸にハイブリダイズするアンチセンス化合物から生じるｍｉＲ−１２２ａレベル、活性または発現の阻害は、「アンチセンス阻害」と称される。
【００２２】
本発明の関係において、「ｍｉＲ−１２２ａ核酸のモジュレーション」は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸のレベル、活性または発現における増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。マイクロＲＮＡは蛋白質をコードする核酸を負に調節するため、マイクロＲＮＡの阻害は、一般に、そのマイクロＲＮＡによって調節される１つまたはそれ以上の蛋白質をコードする核酸の発現の刺激を生じる。ｍｉＲ−１２２ａの阻害は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸のモジュレーションの好ましい形態である。刺激は、ｍｉＲ−１２２ａ（例えばＡＬＤＯ  Ａ）により調節されるｍＲＮＡのモジュレーションの好ましい形態である。
【００２３】
１つの実施形態において、ｍｉＲ−１２２ａ核酸のレベル、活性または発現は、表現型変化、例えば減少の血清コレステロールまたは低下の肝臓脂肪症に結びつく程度まで阻害される。「ｍｉＲ−１２２ａ核酸レベル」または「ｍｉＲ−１２２ａレベル」は、試料、例えば動物細胞または組織中のｍｉＲ−１２２ａ核酸の存在量を示す。「ｍｉＲ−１２２ａレベル」はまた、対照試料（例えば、未処置の動物からの組織）と比較して、実験試料（例えば、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を用いて処置された動物からの組織）中のｍｉＲ−１２２ａ核酸の相対的な存在量を示し得る。「ｍｉＲ−１２２ａ活性」は、ｍｉＲ−１２２ａによる蛋白質コード核酸の調節を意味する。「ｍｉＲ−１２２ａ発現」は、成熟ｍｉＲ−１２２ａが、ｍｉＲ−１２２ａをコードするＤＮＡ配列から誘導される過程を意味し、いくつかの段階、例えば転写、ＤｒｏｓｈａプロセッシングおよびＤｉｃｅｒプロセッシングを含む。ｍｉＲ−１２２ａ発現は、単一段階の過程でまたは複数の工程で調節されてもよい。
【００２４】
本明細書中で用いられる用語「小さい非コードＲＮＡ」は、限定するものではなく、内因的に転写されてもよいし、または外因的に産生されてもよいが（化学的に、または、合成的に）、蛋白質に翻訳されない約１７〜約４５０ヌクレオシド長の範囲にあるポリヌクレオチド分子を包含して用いられる。当分野で知られていているように、初期ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲおよびｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとしても知られている）は約７０ヌクレオシド長〜約４５０ヌクレオシド長の範囲にあり、しばしばヘアピン構造を形成する。次に、初期ｍｉＲＮＡは、Ｄｒｏｓｈａによって処理され、約５０ヌクレオシド長〜約１１０ヌクレオシド長の範囲にあるｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉｒおよびフォールドバックｍｉＲＮＡ前駆体としても知られる）が産生される。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、次に、Ｄｉｃｅｒによって処理され、１９〜２４ヌクレオシド長の範囲あるｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ、Ｍｉｒ、ｍｉＲ、ｍｉｒおよび成熟ｍｉＲＮＡとしても知られる）が産生される。小さい非コードRNAは、単離された一本鎖、二本鎖、またはマルチ鎖（multiple-stranded）分子を含んでもよく、そのいずれも鎖内に、完全もしくは不完全な相補性領域による完全もしくは部分的に二本鎖またはマルチ鎖の特徴を有する分子に折り畳むまたは形成することができる核酸塩基相補性領域を含み得る。
【００２５】
本明細書中で用いられる「ｍｉＲ−１２２ａ核酸」は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２２ａおよびｍｉＲ−１２２ａを含む。本発明の関係において、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａは、初期ｍｉＲＮＡであり、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２２ａはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡであり、そしてｍｉＲ−１２２ａは成熟ｍｉＲＮＡである。「成熟ｍｉＲ−１２２ａ」および「ｍｉＲ−１２２ａ」は、本明細書中で交換可能に用いられ得る。
本明細書中で用いられる「ｍｉＲ−１２２ａまたはその前駆体」は、ｍｉＲ−１２２ａ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２２ａ、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ、またはｍｉＲ−１２２ａあるいはその前駆体が誘導される一次ＲＮＡ転写産物を含む。
本明細書中で用いられる「ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸」は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ、ｐｒｅ−ｍｉＲ−１２２ａおよびｍｉＲ−１２２ａを含む。
【００２６】
本発明の関係において、ｍｉＲ−１２２ａ（すなわち、成熟ｍｉＲ−１２２ａ）は、核酸塩基配列５’−ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵ−３’（配列番号：３）を有する。他のｍｉＲ−１２２ａ、「ｍｉＲ−１２２ａ／ｂ（Ｔｕｓｃｈｌ）が、当分野で提唱された。ｍｉＲ−１２２ａ／ｂ（Ｔｕｓｃｈｌ）は、ｍｉＲ−１２２ａと比較して３’の大部分のヌクレオシドを欠き、したがって、核酸塩基配列５’−ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧ−３’（配列番号：４）を有する。当業者であれば、本発明のアンチセンス化合物がｍｉＲ−１２２ａまたはｍｉＲ−１２２ａ／ｂ  Ｔｕｓｃｈｌを標的とし得ることは理解されよう。
本明細書中で用いられる用語「ｍｉＲ−１２２ａシード配列」は、ｍｉＲ−１２２ａ配列の５’末端からの２個〜８個のヌクレオシドを意味する。本発明の関係において、ｍｉＲ−１２２ａシード配列は、５’−ＧＧＡＧＵＧＵ−３’である
本発明は、１つまたはそれ以上の改変または構造要素またはその化合物をmiR-122aまたはその前駆体を模倣もしくは置換させ得るモチーフを含む「ｍｉＲ−１２２ａ模倣体」として知られている、アンチセンス化合物もまた提供する。
【００２７】
治療法
ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物およびその組成物の特異性と感受性は、治療的使用に当業者により利用され得る。様々な治療領域で、他の標的物に対するアンチセンス化合物を試験するための多くの臨床試験が現在行われている。
【００２８】
「処置を必要とするヒト」または「処置を必要とする被検体」は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与によって処置、改善または予防され得る疾病または健康状態に罹患しているもしくは罹患し易いと診断されたヒトまたは被検体を含む。そのような疾病または健康状態には、限定するものではないが、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高脂肪酸血症または高脂血症、非アルコール性脂肪肝疾病、肝臓脂肪症（非アルコール性脂肪性肝炎および脂肪性肝炎を含む）および代謝症候群が含まれる。処置を必要とする被検体はまた、本明細書中に記載の１つまたはそれ以上の疾病または健康状態、例えば高コレステロール血症または肝臓脂肪症を有し、ＨＣＶと診断された被検体を含み得る。前記の疾病または健康状態のいずれかの診断は、日常的に臨床設定で、例えば医師が行う。処置を必要とするヒトまたは被検体には、心血管疾患の危険因子および／または代謝症候群の危険決定因子を有すると医学専門家、例えば医師により認められる者が含まれる。
【００２９】
本明細書中で用いられる「治療上の有効量」は、前記の疾病または健康状態の１つまたはそれ以上に罹患しているヒトに投与された場合に臨床上望ましい結果を生じる、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の量である。そのような臨床上望ましい結果は、限定するものではなく、減少の血清総コレステロール、減少の血清ＬＤＬコレステロール、減少の血清トリグリセリド、減少の肝臓トリグリセリド、低下の脂肪症、改善された肝機能または増加の脂肪酸酸化を含み得る。
本明細書中で用いられる「予防上の有効量」は、ヒトに投与した場合に前記の疾病または健康状態の１つまたはそれ以上に対するヒトの罹病性を予防もしくは低下させる、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の量である。前記の疾病または健康状態に対するヒトの罹病性の予防または低下は、高血清総コレステロール、高血清ＬＤＬコレステロール、高血清トリグリセリド、高肝臓トリグリセリド、肝臓脂肪症、異常な肝機能または脂肪酸酸化の低下を防ぐことによって達成され得る。
【００３０】
本明細書中で用いられる用語「予防」は、健康状態または疾病の発症もしくは発生をある期間、好ましくは数週間、数ヵ月または何年の間遅延させるか、あるいは未然に対処することを意味する。本明細書中で用いられる用語「改善」は、本明細書中で開示される１つまたはそれ以上の代替指標の改善によって示される、健康状態または疾病の重症度を減ずることを意味する。そのような指標の改善は、当業者には既知の主観的もしくは客観的な計測により決定され得る。本明細書中で用いられる「処置」は、疾病または健康状態の変化または改善をもたらす、本発明組成物の投与を意味する。予防、改善および／または処置は、健康状態または疾病の経過を変えるため、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の反復投与を要求してもよい。さらに、単一のアンチセンス化合物は、健康状態または疾病の予防、改善または処置のいずれかを組み合わせて達成する目的で、単一個体に用いることができ、そして、そのような組み合わせは同時的にまたは順次達成されてもよい。本発明のアンチセンス化合物は、いくつかの例で、他の処置で投与されてもよい。
【００３１】
投与の適切な方法は、例えば、静脈内投与、皮下投与および腹腔内投与を含む、非経口投与である。本発明は、非経口的に、例えば、静注でまたは皮下に投与される医薬の調製のための、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の使用を提供する。
【００３２】
本明細書中で用いられる用語「心血管疾患リスクの血清指標」は医療専門家によって認識される危険因子を含み、全米コレステロール教育プログラム（ＮＣＰ）に記載のもの、例えば、高血清コレステロール、高血清トリグリセリドまたは高血清リポ蛋白質を含む。血清コレステロールは、血清総コレステロールと血清ＬＤＬコレステロールをさらに含む。血清リポ蛋白質は、血清ＡｐｏＢ−１００蛋白質をさらに含む。臨床設定では、心血管疾患リスクの血清指標は、本明細書に記載の疾病または健康状態の処置または予防の必要性を決定するために測定される。脂質を低下させる治療のガイドラインは、ＮＣＥＰのアダルト・トリートメント・パネル（Adult Treatment Panel）ＩＩＩ（ＡＴＰ  ＩＩＩ）により２００１年に確立されて、２００４年に更新された（Grundyら、Circulation, 2004, 110, 227-239）。このガイドラインは、ＬＤＬコレステロール、総コレステロールおよびＨＤＬコレステロールレベルを決定すること（すなわち、リポ蛋白質レベルを決定すること）を含む。最近確立されたガイドラインによれば、ＬＤＬコレステロールレベルが１３０−１５９ｍｇ／ｄＬ、１６０−１８９ｍｇ／ｄＬ、そして１９０ｍｇ／ｄＬ以上は、それぞれ高い境界線、高い、そして非常に高いとされる。総コレステロールが２００−２３９そして２４０超もしくは２４０は、それぞれ高い境界線そして高いとされる。４０未満のＨＤＬコレステロールレベルは、低いとされる。血清トリグリセリドレベルが１５０−１９９、２００−４９９そして５００以上は、それぞれ高い境界線、高い、そして非常に高いとされる。処置が開始される時点の血清コレステロールレベル（例えばＬＤＬコレステロール、総コレステロール）および／または血清トリグリセリドレベルは、臨床虚血性心疾患、症候性頚動脈疾患、末梢動脈疾患のような虚血性心疾患に高い危険性を与える臨床アテローム性動脈硬化症または腹部大動脈瘤の存在、同様に、さらなる危険因子、例えばタバコ喫煙、高血圧、低ＨＤＬコレステロール、虚血性心疾患の家族歴および年齢に依存する。処置に対する被検体の応答は、治療量および期間を決定するため、医師により用いられる。
【００３３】
ＮＣＥＰ  ＡＴＰ  ＩＩＩは、５つのリスク決定因子のうちの３つまたはそれ以上が存在する代謝症候群の診断の基準も確立した。「代謝症候群」は、代謝起源の脂質および非脂質心血管危険因子のクラスター形成と定義される。それは、インスリン抵抗性として知られる全身性代謝異常と密接に関連している。５つのリスク決定因子は、男性は１０２ｃｍ超または女性は８８ｃｍ超の胴囲、１５０ｍｇ／ｄＬ以上のトリグリセリドレベル、男性は４０ｍｇ／ｄＬ未満および女性は５０ｍｇ／ｄＬ未満のＨＤＬコレステロールレベル、１３０／８５ｍｍ  Ｈｇ以上の血圧ならびに１１０ｍｇ／ｄＬ以上の空腹時血糖値レベルとして定義される、腹部肥満である。これらの決定因子は、臨床実地で容易に測定することができる（JAMA、2001、285、2486-2497）。
【００３４】
当業者であれば、多少強力な治療が必要な場合には、医師が容易に個人の患者に関する心血管リスクの決定を修飾し得ることとは認められよう。当業者であれば、本発明の範囲が、ＮＣＥＰによって提供されるいずれかの改訂ガイドラインに、または、本明細書中で列挙された疾病または健康状態のいずれかを処置する際に使用される医師のガイドラインを確立する他のものに応用されるように、心血管疾患リスクを決定し代謝症候群を診断することに関し、本明細書記載の方法の実地を含むことも理解されよう。
本明細書記載の実施形態は、心血管疾患リスクの血清指標を減少するための医薬の調製における、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の使用を提供し、該血清指標は、高血清総コレステロール、高血清ＬＤＬコレステロールまたは高血清トリグリセリドから選択される。
【００３５】
ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の投与に続く、ｍｉＲ−１２２ａレベル、活性または発現を直接測定することが困難なため、本発明のアンチセンス化合物の投与の効果を評価するために、代わりの指標の使用が必要とされる。代替指標は、ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害から生じる表現型変化を評価するために用いられる。代替指標は、動物の血清中で、別には血漿中でしばしば見出される。分析のために血清または血漿サンプルを得る方法および分析を可能にする血清サンプルの調製法は、当業者に周知である。リポ蛋白質、コレステロール、およびトリグリセリドの測定に関して、用語「血清」および「血漿」は本明細書中で交換可能に用いられる。
【００３６】
本発明の関係において、「代替指標」は、心血管疾患リスク（危険性）、例えば血清ＬＤＬコレステロールレベルおよび血清総コレステロールレベル、および血清トリグリセリドレベルの血清指標を含む。血清指標は、血清アミノ基転移酵素レベルをさらに含む。本発明の関係において、「血清ＬＤＬコレステロールレベル」は、血清ＬＤＬ粒子にて運搬されるコレステロール量を意味し、典型的にはｍｇ／ｄＬまたはｎｍｏｌ／Ｌで測定される。また、ｍｇ／ｄＬで発現される「血清総コレステロールレベル」は、その中にＬＤＬコレステロールとＨＤＬコレステロールを含む血清コレステロールの異なるすべての型の合計を意味する。
ｍｉＲ−１２２ａ阻害の代替指標の好ましい変化は、減少の血清ＬＤＬコレステロールレベル、減少の血清トリグリセリドレベル、減少のリポ蛋白質レベルを含む。これらの前記変化は臨床上望ましく、本明細書中で開示される疾病および障害の予防、改善および／または処置に有用である。
【００３７】
「血清リポ蛋白質」は、限定するものではないが、アポリポ蛋白Ｂ（ＡｐｏＢ−１００）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）および超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）を含む。
肝臓脂肪症の検出方法は、当分野で周知であり、磁気共鳴映像法、コンピューター断層撮影および超音波検査が挙げられる。肝臓脂肪症の検出に用いられる方法は、本明細書中で開示される疾病および障害の予防、改善および／または処置をモニターするために用いることができる。
【００３８】
本発明の関係において、用語「改善された肝臓の機能」または「改善された肝機能」は、動物の肝臓で実施される正常な機能の改善を意味する。肝機能検査の1つの非限定的な例としては、血清アミノ基転移酵素の測定が挙げられ、これは、アラニンアミノ基転移酵素またはアスパラギン酸アミノ基転移酵素などの血清アミノ基転移酵素の減少が肝機能の改善を示す、さらなる代替指標である。「血清アミノ基転移酵素レベル」は、血清中のアミノ基転移酵素の存在量（典型的に、ユニット／ｄＬとして表される）を意味し、「血清アラニンアミノ基転移酵素レベル」および「血清アスパラギン酸アミノ基転移酵素レベル」が挙げられる。これらの酵素の増加は、しばしば肝臓の炎症または肝臓細胞死と関連しており、場合によっては、健康状態、例えば高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症または高脂血症に起因し得る。血清アミノ基転移酵素の減少は、臨床上望ましく、本明細書中で開示される疾病および障害の予防、改善および／または処置に有用である。
【００３９】
用語「非アルコール性脂肪肝疾病」（ＮＡＦＬＤ）は、肝細胞（肝臓脂肪症）の単純なトリグリセリド蓄積から炎症（脂肪性肝炎）、線維形成および肝硬変を伴う肝臓脂肪症までの範囲にある疾病スペクトラムを包含する。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、トリグリセリドの沈着を越えてＮＡＦＬＤの進行により生じる。壊死、炎症および線維形成を誘導し得る第２の生理的発作は、ＮＡＳＨ発症に要求される。その第２の発作の候補物質は、大きなカテゴリー：酸化ストレスの増加を引き起こす因子および炎症誘発性サイトカインの発現を促進する因子に分類され得る。増加した肝臓トリグリセリドが、動物とヒトの肝細胞における増加した酸化ストレスを引き起こすことが示され、これは、肝臓のトリグリセリド蓄積、酸化ストレスと肝臓脂肪症のＮＡＳＨへの進行との間に潜在的な因果関係を示す（BrowningおよびHorton, J. Clin. Invest., 2004, 114, 147-152）。高トリグリセリド血症および高脂肪酸血症は、末梢組織においてトリグリセリド蓄積を引き起こし得る（Shimamuraら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 322, 1080-1085）。本発明の関係において、さらなる臨床上望ましい結果は、肝臓脂肪症、脂肪性肝炎、線維形成または肝硬変の軽減を含む。
【００４０】
本明細書中で記載される疾病または健康状態、例えば高い血清ＬＤＬコレステロールまたは肝臓脂肪症は、ＨＣＶ感染症と診断されたヒトで生じ得る。従って、本明細書で提供される方法は、ＨＣＶ感染症と診断された被検体に用いられ得る。加えて、本発明は、ＨＣＶに罹患している動物の血清コレステロール、血清トリグリセリドまたは血清リポ蛋白質を減少させるための医薬の製造における、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の使用を提供する。
【００４１】
創薬
本発明のアンチセンス化合物および組成物は、さらなる研究と創薬のために利用され得る。
研究での使用について、本発明のアンチセンス化合物は、miR-122a標的核酸の通常の機能と干渉させるために用いられる。本発明の１つまたはそれ以上アンチセンス化合物または組成物で処置された細胞または組織中の発現パターンは、アンチセンス化合物または組成物で処置されていない対照細胞または組織と比較され、そして、それらは、例えば試験される遺伝子の疾病関連性、シグナル伝達経路、細胞局在、発現レベル、大きさ、構造または機能に関係するので、得られる発現パターンが核酸発現の様々なレベルについて分析される。これらの分析は、刺激されたまたは刺激されていない細胞において、そして発現パターンに影響を及ぼす他の化合物の有無において実施され得る。例として、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ調節に影響される代謝経路を解明するために用いられた。
【００４２】
創薬での使用について、本発明のアンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａまたはその前駆体と疾病状態、表現型または健康状態との間に存在する関係を解明するために用いられる。これらの方法は、本発明のアンチセンス化合物および組成物を試料、組織、細胞または生物と接触させること、それによる標的ｍｉＲ−１２２ａ核酸レベルおよび／またはｍＲＮＡを含む下流の遺伝子産物レベルまたはコードされる蛋白質を測定すること、さらに、処置の後のある時点での表現型変化を評価することを含み、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を検出またはモジュレートすることを含む。これらの方法は、標的確認の過程に関する未知の遺伝子の機能を決定するために、または処置もしくは疾病予防のための標的として、特定のｍｉＲ−１２２ａ標的核酸の有効性を決定するために、他の実験と平行してまたは組み合わせて実施さ得る。例として、本明細書中で記載されるように、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物は、表現型変化、例えば低血清コレステロール、低肝臓トリグリセリドおよび低下された肝臓脂肪症をもたらすために用いられた。
【００４３】
アンチセンス化合物
本発明の関係において、用語「オリゴマー化合物（群）」は、少なくともＲＮＡ分子のある領域にハイブリダイズできる重合体構築物を意味する。一般に、５’から３’方向に記載され、それが標的核酸の対応する領域の逆相補性を含む場合、オリゴマー化合物は標的核酸に対して「アンチセンス」である。そのようなオリゴマー化合物は、「アンチセンス化合物」として知られており、それには、限定するものではないが、オリゴヌクレオチド（すなわちアンチセンスオリゴヌクレオチド）、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体およびこれらの組み合わせが含まれる。一般に、アンチセンス化合物は、連結された単量体サブユニットの骨格（糖部分）を含み、そこで、各々連結された単量体サブユニットは、複素環式の塩基部分と直接または間接的に連結される。アンチセンス化合物に対する修飾は、ヌクレオシド内結合、糖部分または複素環式の塩基部分（例えば後述のもの）への置換または変化を包含する。本明細書中で用いられる用語「修飾」は、最初もしくは天然ヌクレオシドまたはヌクレオチドからの置換および／またはいずれかの変化を含む。修飾されたアンチセンス化合物は、所望の特性、例えば増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された結合性、ヌクレアーゼ存在下での増大した安定性または増大した阻害活性のため、しばしば天然型より好まれる。アンチセンス化合物は、標的とハイブリダイズした際に、標的遺伝子発現または標的遺伝子活性の低下を誘導するかもしくは誘発することが可能であるとのさらなる限定を含むものとして、当分野でしばしば定義される。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸標的のレベル、活性または発現の低下を誘発する。
【００４４】
アンチセンス化合物は、直鎖型に日常的に調製されるが、環状に連結されてもよいし、あるいは調製されてもよく、分岐型を含んでいてもよい。分離のアンチセンス化合物は、平滑末端であってもよいし、一端もしくは両端に突出を含んでもよい二本鎖化合物を形成するためにハイブリダイズし得る。
本発明によるアンチセンス化合物は、１５〜３０のヌクレオシド長、すなわち、１５個から３０個の連結されたヌクレオシドを含む。当業者であれば、これが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオシド長のアンチセンス化合物を例示することは認められよう。
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、本明細書中で例示されるように１７〜２５ヌクレオシド長である。
好ましい実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、１９、２０、２１、２２または、２３ヌクレオシド長である。
本明細書中で用いられて、用語「約」は、以後可変部分の±５％を意味する。
【００４５】
本明細書中で用いられる「相補的」は、核酸塩基間のハイブリダイゼーション能力を意味する。アンチセンス化合物の各核酸塩基が標的核酸と等しい数の核酸塩基と相補的である場合、アンチセンス化合物と標的核酸は互いに「完全に相補的」である。例えば、アンチセンス化合物の２３個の核酸塩基の各々がｍｉＲ−１２２ａに相補的である場合、ｍｉＲ−１２２ａを標的とした２３ヌクレオシド長のアンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａと完全に相補的である。正味の塩基対形成の程度は、アンチセンス化合物と標的核酸との間に安定かつ特異的な結合を可能にし、そのため、アンチセンス化合物が標的核酸のレベル、活性または発現を阻害する場合、そのアンチセンス化合物とその標的核酸は互いに「本質的に完全に相補的」である。ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸に関して１個または２個の非相補的核酸塩基を有するアンチセンス化合物は、完全に本質的に相補的と考えられる。「十分に相補的」は、「本質的に完全に相補的」の代わりに用いられ得る。
【００４６】
本発明の関係において、「ハイブリダイゼーション」は、アンチセンス化合物の標的核酸中の対応する核酸塩基との核酸塩基対合を意味する。本発明の関係において、対合の機序は、対応する核酸塩基との間の水素結合（ワトソン−クリック、フーグスティーン（Hoogsteen）または逆フーグスティーン水素結合であってよい）を含む。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を通じて対合する相補的核酸塩基である。天然のおよび修飾された核酸塩基は、水素結合に関与することができる。ハイブリダイゼーションは、様々な状況下で生じ得る。
【００４７】
当分野では、アンチセンス化合物の配列は、その標的核酸の活性を阻害する際に活性であれば、標的核酸の配列と完全に相補的である必要がないことは理解される。さらに、アンチセンス化合物は、間のまたは隣のセグメントがハイブリダイゼーションに関与しないような１つまたはそれ以上のセグメント（例えば、突出部、ループ構造、またはヘアピン構造）を越えてハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物と標的核酸間の「非相補的」部位（「ミスマッチ」としても知られる）が存在し、アンチセンス化合物が標的核酸に対して特異的にハイブリダイズするのであれば、アンチセンス化合物と標的核酸との間のそのような非相補的部位は許容的され得る。「非相補的核酸塩基」は、標的核酸の対応する部位の核酸塩基と正確な塩基対形成ができないアンチセンス化合物の核酸塩基を意味する。本明細書中で用いられる用語「非相補的な」と「ミスマッチ」は、相互変換可能である。３個までの非相補的核酸塩基は、標的核酸の活性、レベルまたは機能をモジュレートするアンチセンス化合物の能力に有意な低下を引き起こすことがなければ、アンチセンス化合物ではしばしば許容される。好ましい実施形態において、アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸に関して、わずか２個または１個の非相補的核酸塩基しか含まない。例えば、そのうちの２２個は標的核酸の対応する部位の核酸塩基と正確な塩基対合を受けることができ、そのうちの１個はそのような塩基対合を受けることができない、２３ヌクレオシド長のアンチセンス化合物は、１個の非相補的核酸塩基を有すると考えられる。そのような非相補的核酸塩基の場所はアンチセンス化合物の５’末端または３’末端が好ましいが、しかしながら非相補的核酸塩基はアンチセンス化合物のいずれの部位にあってもよい。いくつかの実施形態において、非相補的核酸塩基は、ｍｉＲ−１２２ａのシード配列に相補的なアンチセンス化合物の領域の外が好ましい。２個またはそれ以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは隣接してもよいし（すなわち、連結されている）、あるいは隣接していないくてもよい。
【００４８】
本発明の他の実施形態において、アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸と少なくとも９０％配列相補性を含む。本発明のさらなる実施形態において、アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸と少なくとも９５％配列相補性を含む。例えば、アンチセンス化合物の２３個の核酸塩基のうち２２個がｍｉＲ−１２２ａ核酸と相補的なアンチセンス化合物（すなわち、１個の核酸塩基が非相補的である）は、９５．６％の相補性を表す。同様に、２３個の核酸塩基のうち２１個がｍｉＲ−１２２ａ核酸と相補的なアンチセンス化合物（すなわち、２個の核酸塩基が非相補的である）は、９１．３％の相補性を表す。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物の相補性パーセントは、日常的に当業者により決定されてよく、当分野で既知のＢＬＡＳＴプログラム（basic local alignment search tools）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて達成することができる（Altschulら、J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410；ZhangおよびMadden, Genome Res., 1997, 7, 649-656）。
【００４９】
本発明において、成句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、本発明のアンチセンス化合物がその標的配列にハイブリダイズし、最小数の他の配列とハイブリダイズする条件を意味する。ストリンジェントな条件は、配列に依存するものであり、異なる状況で、そして本発明の内容で変わり得る；アンチセンス化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、アンチセンス化合物の性質と組成およびそれらが調査されるアッセイによって決定される。当業者であれば、実験プロトコルの変動性を理解するであろうし、最小の非特異的なハイブリダイゼーション事象を伴うストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の最適なところを決定することが可能であろう。
【００５０】
アンチセンス化合物は、配列番号または特異的なＩＳＩＳ番号を有するアンチセンス化合物と同一の定義パーセントを有していてもよい。この同一性は、アンチセンス化合物の全長に及んでいてもよいし、またはアンチセンス化合物の全長未満であってもよい。アンチセンス化合物が本明細書中記載のアンチセンス化合物と同様に機能すれば、本明細書中記載の配列と同一の配列を有する必要がないことは、当業者により理解される。本明細書中で教示されたアンチセンス化合物の短いもしくは切断型は、１個、２個またはそれ以上の欠失ヌクレオシドを有し、本発明の範囲内にある。アンチセンス化合物が２個またはそれ以上の欠失ヌクレオシドを有する場合、欠失されるヌクレオシドは互いに隣接してもよく、例えば、アンチセンス化合物の５’末端から（５’切断）、あるいは３’末端から（３’切断）切断された２個のヌクレオシドを有するアンチセンス化合物であってよい。別には、欠失ヌクレオシドは、アンチセンス中で分離されていてもよく、例えば、５’末端から１個の欠失ヌクレオシドと３’末端から１個の欠失ヌクレオシドを有しているアンチセンス化合物であってよい。
【００５１】
また、本明細書中で教示されるアンチセンス化合物の長い形態、すなわち、本明細書中で開示されるアンチセンス化合物と比較して１個またはそれ以上の付加的なヌクレオシドを有するアンチセンス化合物もまた本発明の範囲内にある。２個またはそれ以上の付加的なヌクレオシドが存在する場合、その付加ヌクレオシドは、互いに隣接していてもよく、例えば、アンチセンス化合物の５’末端に（５’付加）、あるいは３’末端に（３’付加）付加された２個のヌクレオシドを有するアンチセンス化合物であってよい。別には、付加ヌクレオシドは、アンチセンス化合物中で分離されていてもよく、例えば、５’末端に付加された１個のヌクレオシドと３’末端に付加された１個のヌクレオシドを有するアンチセンス化合物であってよい。
【００５２】
アンチセンス化合物の同一性パーセントは、配列番号と同一である核酸塩基数または比較されるアンチセンス化合物により算出される。そのような算出は、当業者の能力の範囲内にある。例えば、２３個のヌクレオシドアンチセンス化合物の２−２１と同じ核酸塩基配列を有する２１個のヌクレオシドアンチセンス化合物は、２３個のヌクレオシドアンチセンス化合物と９１．３％同一である。別には、２３個のヌクレオシドアンチセンス化合物と比較して１個のヌクレオシドの付加のみ配列に違いのある２４個のヌクレオシドアンチセンス化合物は、２３個のヌクレオシドに対しては１００％同一性があるが、全体的には９５．８％の同一性を有し得る。
ｍｉＲ−１２２ａ核酸を含む特定の核酸分子に対してアンチセンス化合物を「標的化する」ことは、この発明の関係では多段階過程であってもよい。通常、この過程は、モジュレートされるべき標的核酸のレベル、発現または機能の同定から始まる。本発明の関係において、標的核酸は、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸である。
【００５３】
標的化過程はまた、通常、所望の効果、例えばレベル、活性または発現のモジュレーションが生じるように相互作用を生じさせるための、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸内の少なくとも１つの標的部分の決定を含む。本明細書中で用いられる「標的部分」は、１つまたはそれ以上のアンチセンス化合物が相補的なｍｉＲ−１２２ａ核酸の配列を意味する。所定の標的部分と相補的な複数のアンチセンス化合物は、重なり合う配列を有してもよいし、あるいは有しなくてもよい。本発明の関係で、用語「標的部位」は、１個の核酸塩基配列が相補的なｍｉＲ−１２２ａ核酸の配列と定義される。例えば、配列番号：８の核酸塩基配列は、配列番号：５の標的部位２７〜４９に相補的であり、そして、配列番号：２の核酸塩基配列は配列番号：５の標的部位２９〜５１に相補的である。したがって、配列番号：５のヌクレオシド２７〜５１は、配列番号：５の標的部分を表す。いくつかの実施形態において、標的部分と標的部位は、同じ核酸塩基配列を表す。
【００５４】
標的部位および標的部分は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａが誘導されるｍｉＲＮＡ遺伝子中で見つかる場合があり、それは、単独の転写産物として見つかる場合があるし、あるいはそれはイントロン内の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）中に、または遺伝子の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）中で見つかる場合もある。
本発明のアンチセンス化合物はまた、標的部位の部分に対して相補的と記載されてもよい。「部分」は、標的部位の少なくとも１８個の連続ヌクレオシドと定義される。他の実施形態において、部分は標的部位の１９個または２０個の連続ヌクレオシドである。好ましい実施形態において、部分は標的部位の２１個または２２個の連続ヌクレオシドである。
ひとたび１個またはそれ以上の標的部分または標的部位が認められると、アンチセンス化合物は、標的部分または標的部位に十分相補的となるように、すなわち、十分によく特異的にハイブリダイズし所望の効果を与えるように、設計される。所望の効果には、限定するものではないが、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸のレベル、発現または活性のモジュレーションが含まれ得る。所望の効果は、表現型変化をさらに含む。
【００５５】
本発明のアンチセンス化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンアンチセンス化合物の形であってよく、内部もしくは終端の突出部またはループなどの構造要素を含んでもよい。ひとたび系に導入されると、本発明のアンチセンス化合物は、その標的核酸のレベル、発現または機能のモジュレーションに影響を及ぼす１つまたはそれ以上の酵素または蛋白質の作用を引き出し、または阻害し得る。そのような蛋白質の１つの非限定的な例としては、Ｄｒｏｓｈａ  ＲＮアーゼＩＩＩ酵素がある。さらに非限定的な例としては、酵素のＲＩＳＣ複合体が挙げられる。
【００５６】
本発明のアンチセンス化合物または組成物は、ＲＩＳＣ複合体によって処理される低分子非コードＲＮＡに対する相互作用または模倣を通じて、遺伝子機能の強力な特異的モジュレーションを誘導するために用いられ得る。これらの化合物は、ＲＩＳＣ複合体で結合する一本鎖のアンチセンス化合物、アンチセンス化合物の二本鎖のアンチセンス／センス対、またはアンチセンス部分とセンス部分を含む一本鎖のアンチセンス化合物を含む。
【００５７】
オリゴヌクレオチド合成
アンチセンス化合物とホスホラミダイトは、当業者に周知の方法によって作製される。修飾および非修飾ヌクレオシドのオリゴマー形成は、必要に応じて、ＤＮＡ様化合物合成（Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press）および／またはＲＮＡ様化合物合成（Scaringe、Methods（2001）、23、206-217. Gaitら、Applications of Chemically synthesized RNA in RNA：Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Galloら、Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713）に関する文献手順によって実施される。ＲＮＡオリゴマーは、本明細書中で開示される方法により合成されてもよいし、様々なＲＮＡ合成会社、例えば、Dharmacon Research社（ラフィーエット、CO）から購入してもよい。
【００５８】
用いられる特定のプロトコルに関わらず、本発明に関して用いられるアンチセンス化合物は、固相合成の周知技術により便利にそして日常的に作製され得る。そのような合成用の機器は、例えば、アプライドバイオシステム（フォスターシティー、カリフォルニア州）を含む、いくつかの業者により販売されている。当分野で既知の該合成のためのいずれかの他の方法が、さらにもしくは代わりに用いられてよい。
オリゴヌクレオチドの単離および分析法は、当分野で周知である。９６ウエルプレート形式は、特にオリゴヌクレオチドの合成、単離および分析に有用である。
【００５９】
ＲＮＡ合成
ＲＮＡの合成法は、当分野で周知である（Scaringe, S. A. Ph.D. Thesis, University of Colorado, 1996；Scaringe, S. Aら、J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 11820-11821；Matteucci, M. D.およびCaruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc., 1981, 103, 3185-3191；Beaucage, S. L.およびCaruthers, M. H. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862；Dahl, B. Jら、Acta Chem. Scand,. 1990, 44, 639-641；Reddy, M. Pら、Tetrahedrom Lett., 1994, 25, 4311-4314；Wincott, F.ら、Nucleic Acids Res., 1995, 23, 2677-2684；Griffin, B. Eら、Tetrahedron, 1967, 23, 2301-2313；Griffin, B. Eら、Tetrahedron, 1967, 23, 2315-2331)。
【００６０】
アンチセンス化合物修飾
本明細書中で教示されるアンチセンス化合物のいずれも、限定するものではないが、改善された結合親和性、安定性、電荷、局在性または取込みを含む、アンチセンス化合物に所望の薬物動態学的および／または薬力学的特性を与える修飾を含んでいてよい。さらに、本発明の修飾合成アンチセンス化合物は、内因性低分子非コードＲＮＡを模倣して設計されてもよい。
【００６１】
当分野で知られていているように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基（別名、核酸塩基）部分は、通常、複素環式の塩基部分である。そのような複素環式塩基の最も一般的な２つのクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合で連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関して、リン酸基は、糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分に連結されてよい。オリゴヌクレオチドを形成するにあたって、リン酸基は共有結合で隣接するヌクレオシドと互いに連結され、直線状の高分子化合物を形成する。この直線状の重合体構造のそれぞれの端は、ハイブリダイゼーションによって、または、共有結合の形成によって、環状構造を形成するよう連結されてもよい。加えて、直線状の化合物は、内部の塩基（すなわち核酸塩基）相補性を有してもよく、かくして完全にもしくは部分的に二本鎖の構造を形成するような方式で折り畳まれ得る。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド内結合を形成するものと称される。ＲＮＡとＤＮＡの正常なヌクレオシド内結合は、３’から５’のホスホジエステル結合である。
【００６２】
本発明の関係において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーを一般に意味し、非修飾オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を意味して用いることができる。用語「非修飾オリゴヌクレオチド」は、天然の核酸塩基、糖および共有結合ヌクレオシド内結合から成るオリゴヌクレオチドを一般に意味する。用語「オリゴヌクレオチド類似体」は、１つまたはそれ以上の非天然核酸塩基、糖および／またはヌクレオシド内結合を有するオリゴヌクレオチドを意味する。そのような非天然のオリゴヌクレオチドは、所望の特性、例えば増加した細胞取込み、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的について増強された結合性、ヌクレアーゼ存在下での増大した安定性または増大した阻害活性により、天然型よりもしばしば選択される。
【００６３】
修飾されたヌクレオシド内結合
この発明で有用なアンチセンス化合物の特定の例としては、修飾された、すなわち非天然のヌクレオシド内結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。そのような非天然ヌクレオシド内結合は、所望の特性、例えば増加した細胞取込み、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸標的について増強された結合性およびヌクレアーゼ存在下での増大した安定性のため、天然型よりもしばしば選択される。
本発明のアンチセンス化合物は、１つまたはそれ以上の修飾されたヌクレオシド内結合を有してもよい。本明細書で定義されるように、修飾されたヌクレオシド内結合を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を有するヌクレオシド内結合と、リン原子を有しないヌクレオシド内結合がある。本明細書の目的に関し、また当分野で場合により言及されるように、ヌクレオシド内骨格にリン原子を有さない修飾されたオリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオシド」と見做すことができる。
【００６４】
適切なリン含有の修飾されたヌクレオシド内結合は、ホスホロチオエート・ヌクレオシド内結合である。リン原子をその中に含むさらなる修飾されたヌクレオシド内結合としては、例えば、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィナート、３’アミノホスホルアミデートやアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、そして通常の３’−５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類似体、そして逆の極性を有するものが挙げられ、ここで、１つまたはそれ以上のヌクレオシド内結合は、３’から３’、５’から５’または２’から２’の連結である。逆の極性を有するオリゴヌクレオチドは、ほとんど３’にヌクレオシド内結合、すなわち、無塩基でもよい単一の逆のヌクレオシド残基（核酸塩基が失われているか、その部分にヒドロキシル基を有する）で、単一の３’から３’連結を含む。様々な塩類、混合塩類および遊離酸型が含まれる。
【００６５】
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な英国特許としては、限定するものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号が挙げられ、その各々は出典明示により本明細書の一部とされる。
【００６６】
本発明の他の実施形態において、アンチセンス化合物は、１つまたはそれ以上のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド内結合、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで、天然のホスホジエステルヌクレオシド内結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−と表される）を有する。ＭＭＩ型ヌクレオシド内結合は、上述の米国特許第５，４８９，６７７号で開示される。アミドヌクレオシド内結合は、上述した米国特許第５，６０２，２４０号で開示される。
【００６７】
リン原子をその中に含まない修飾されたヌクレオシド内結合は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド内結合、混合ヘテロ原子とアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド内結合、または１つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド内結合により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分の一部で形成される）；シロキサン骨格；硫化物、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホンネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２を有する他の構成要素を有するものが含まれる。
【００６８】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許には、限定するものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号が挙げられ、その各々は出典明示により本明細書の一部とされる。
【００６９】
アンチセンス化合物は、「オリゴヌクレオチド模倣体」を含んでもよく、それはフラノース環のみ、またはフラノース環とヌクレオシド内結合の両方が新たな基で置換されているオリゴヌクレオチドを意味する。フラノース環だけの置換も、当分野では糖の代用物であることを意味する。複素環式の塩基部分または修飾された複素環式の塩基部分は、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションが維持される。オリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾を含有するアンチセンス化合物を含み得る。ＰＮＡアンチセンス化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を含有するアミドで置換される。核酸塩基は保持され、直接的もしくは間接的に骨格のアミド部分のアザ窒素原子に結合する。ＰＮＡアンチセンス化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、限定するものではないが、米国特許第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号および第５，７１９，２６２号が挙げられ、その各々は出典明示により本明細書の一部とされる。ＰＮＡアンチセンス化合物の教示は、Nielsenら、Science, 1991, 254, 1497-1500で見つけることができる。基本的なＰＮＡ構造が最初に調製されたため、ＰＮＡは修飾され、多数の修飾を有する。
【００７０】
研究されたオリゴヌクレオチド模倣体の別の種類は、モルホリノ環に結合された複素環式塩基を有する連結されたモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸中にモルホリノモノマー単位を連結する多くの連結基が報告された。モルホリノに基づくアンチセンス化合物は、１９９１年７月２３日に出願された米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。アンチセンス化合物のモルホリノのクラスは、単量体サブユニットを連結する多種多様な連結基を有して調製された。
オリゴヌクレオチド模倣体の別の種類は、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環が、シクロヘキセニル環で置換される。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホラミダイト・モノマーが調製され、典型的なホスホラミダイト化学にならいアンチセンス化合物の合成に用いた。ＣｅＮＡで修飾された特定の部位を有し、完全に修飾されたＣｅＮＡアンチセンス化合物およびオリゴヌクレオチドが調製されて、研究された（Wangら、J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602を参照のこと）。
【００７１】
修飾された糖部分
本発明のアンチセンス化合物は、１つまたはそれ以上の修飾または置換された糖部分を含んでいてもよい。塩基部分（天然、修飾型またはその組み合わせ）は、適当な核酸標的とのハイブリダイゼーションを維持する。糖修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはいくつかの他の有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に与え得る。代表的な修飾された糖は、炭素環式もしくは非環式の糖、その２’、３’もしくは４’部位の１個またはそれ以上に置換基を有する糖、糖の１個またはそれ以上の水素原子の代わりに置換基を有する糖および糖中のいずれか２個の他の原子の間に連結を有する糖を含む。本発明で特定の使用におけるアンチセンス化合物は、ＯＨ；ハロ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；または、Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換もしくは未置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルである）から選択される糖置換基を含んでもよい。特に適切なものは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ここで、ｎおよびｍは、０から約１０までである。いくつかのオリゴヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低アルキル、置換低アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター遺伝子、インターカレータ、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および類似の特性を有する他の置換基、から選択される糖置換基を含む。
【００７２】
増加したヌクレアーゼ抵抗と非常に高度な結合親和性をヌクレオシドに与える１つの修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥまたは２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）側鎖（Bakerら、J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000）。２’−ＭＯＥ置換の直接の長所の１つは、結合親和性の改善であり、それは多くの類似の２’修飾、例えばＯ−メチル、Ｏ−プロピルとＯ−アミノプロピルより大きい。２’−Ｏ−メトキシエチル置換基を有するオリゴヌクレオチドは、また、インビボ使用において有望な特徴を有する遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることが示された（Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504；Altmannら、Chimia, 1996, 50, 168-176；Altmannら、Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637；およびAltmannら、Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926）。ＤＮＡと比較して、２’−ＭＯＥ修飾を有するオリゴヌクレオチドは、改善されたＲＮＡ結合性とより高いヌクレアーゼ抵抗性を示した。１つまたはそれ以上２’−ＭＯＥ修飾を有するアンチセンス化合物は、インビトロおよびインビボでｍｉＲＮＡ活性を阻害することができる（Esauら、J. Biol. Chem., 2004, 279, 52361-52365；米国特許公報第2005/0261218号）。
さらなる修飾は、２’−ジメチルアミノフェノール、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、別名２’−ＤＭＡＯＥ、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（また、当分野で２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして知られる）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【００７３】
他の糖置換基には、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）が含まれる。２’−糖置換基は、アラビノ（上）部またはリボ（下）部であってもよい。類似の修飾は、アンチセンス化合物の他の部位、特に３’端末ヌクレオシドの糖の３’位、または、２’−５’結合オリゴヌクレオチド、そして５’端末ヌクレオシドの５’位でなされてもよい。アンチセンス化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分のような糖模倣体を有してもよい。そのような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許には、限定するものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号および第５，７００，９２０号が挙げられ、その各々は、出典明示により本明細書の一部とされる。
【００７４】
代表的な置換基は、標題「Capped ２’- Oxyethoxy Oligonucleotides」の米国特許６，１７２，２０９号で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
代表的な環式置換基は、標題「RNA Targeted ２’Oligomeric compounds that are Conformationally Preorganized」の米国特許第６，２７１，３５８号で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
代表的なグアニジノ置換基は、標題「Functionalized Oligomers」の米国特許第６，５９３，４６６号で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
代表的なアセトアミド置換基は、米国特許第６，１４７，２００号で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、１９９９年８月６日に出願された標題「２’-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-Oligomeric compounds」の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８９５で開示されており、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
【００７５】
さらなる糖修飾は、糖環をロックされた３’−エンド立体結合構造にあてはめる２’、４’架橋を有する二環式糖部分を含む。二環式修飾は、アンチセンス化合物に核酸標的に対する非常に増加した結合性を与える。さらにまた、二環式糖修飾を有するヌクレオシドは、キメラアンチセンス化合物の核酸標的に対する結合性を増強するため、キメラアンチセンス化合物のＤＮＡやＲＮＡと協調して作用しもよい。二環式糖部分は、式４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−２’（ここで、Ｘは、例えばＯまたはＳであってよい）により表される。ＬＮＡ（登録商標）は、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋（すなわち、ＸはＯであり、ｎは１である）を有する二環式糖部分である。α−Ｌヌクレオシドもまた報告されており、その連結は上記のように、環と複素環式塩基がβ立体配座ではなくα立体配座である（米国特許出願公報第２００３／００８７２３０号を参照のこと）。キシロ類似体もまた調製された（米国特許出願公報第２００３／００８２８０７号を参照のこと）。別の二環式糖部分はＥＮＡＴＭであり、前記の式中、ＸはＯであり、ｎは２である。用語「ロックされた核酸」は、「ロックされた」立体配座を有するいずれかの二環式糖部分を記載するために用いられ得る。
【００７６】
ＬＮＡ（登録商標）およびＥＮＡ（登録商標）類似体を一部とするアンチセンス化合物は、相補ＤＮＡおよびＲＮＡとで非常に高い二本鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３℃〜＋１０℃）、３’ヌクレオチド鎖分解性分解に対する安定性および良好な溶解度特性を示す。
【００７７】
ＬＮＡ（登録商標）モノマーのアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシルの合成および調製、それらのオリゴマー形成とともに、さらに核酸認識特性は記載されている(Koshkinら、Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630)。ＬＮＡおよびその調製法もまた、国際公開公報第９８／３９３５２号および第９９／１４２２６号に記載されている。
【００７８】
ＬＮＡ（登録商標）の類似体、例えば、ホスホロチオエート−ＬＮＡおよび２’−チオ−ＬＮＡ（すなわち２’−Ｓ−ＣＨ２−４’）もまた調製された（Kumarら、Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222)。核酸ポリメラーゼの基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を含むロックされたヌクレオシド類似体の調製もまた記載されている（Wengelら、PCT国際特許出願第98-DK393  19980914号）。さらにまた、２’-アミノ−ＬＮＡ、ハンドルを有する新規の高次構造制限的な高結合性オリゴヌクレオチド類似体の合成が、当分野で記載された（Singhら、J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039）。加えて、２’−アミノ−および２’−メチルアミノ−ＬＮＡが調製され、また相補的ＲＮＡおよびＤＮＡストランドとの二本鎖の熱安定性が以前に報告された。
【００７９】
二環式および三環ヌクレオシドの類似体を含み、いくつかのオリゴヌクレオチド模倣体が調製されている（Steffensら、Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 2426-2439；Steffensら、J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 3249-3255；およびRennebergら、J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5993-6002を参照のこと）。これらの修飾されたヌクレオシド類似体は、ホスホラミダイト法を用いてオリゴマー形成され、そして、その結果得られる三環ヌクレオシド類似体を含有するアンチセンス化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれ自体がハイブリダイズした場合に増加した熱安定性（Ｔｍ）を示す。二環式ヌクレオシド類似体を含有するアンチセンス化合物は、ＤＮＡ二本鎖の熱安定性に近い熱安定性を示す。
オリゴヌクレオチド模倣体の別の種類は、ホスホノモノエステル核酸と称され、骨格にリン基を含む。この種類のオリゴヌクレオチド模倣体は、遺伝子発現を阻害する領域で有用な物理的および生物学的そして薬理学特性を有することが報告されている。
【００８０】
核酸塩基修飾
本発明のアンチセンス化合物は、天然もしくは合成の非修飾核酸塩基と、構造的に識別可能であるが、機能的に交換可能な１つまたはそれ以上核酸塩基（当分野では、しばしば単に「塩基」と称される）修飾または置換を含んでもよい。そのような核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはいくつかの他の有益な生物学的特性をアンチセンス化合物に与え得る。本明細書中で用いられる「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）とグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。また、本明細書中で複素環式塩基部分と称される修飾された核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えば、５‐メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルとアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルとアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２‐チオウラシル、２−チオチミンと２−チオシトシン、５−ハロウラシルとシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基、６−アゾウラシル、シトシンとチミンの他のアルキニル誘導体、５−ウラシル（シュードウラシル）、４‐チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンとグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルとシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８‐アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。
【００８１】
複素環式の塩基部分には、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンと２−ピリドキサルで置換されたものが挙げられる。いくつかの核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に記載のもの、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, 858-859頁、Kroschwitz, J.I., 編. John Wiley ＆ Sons, 1990に開示のもの、Englischら、Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613により開示されたもの、そして、Sanghvi, Y.S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S.T. およびLebleu, B. , 編., CRC Press, 1993により開示されたものが含まれる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明のアンチセンス化合物の結合親和性を増加させるために特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６とＯ−６置換プリンが含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが挙げられる。
【００８２】
本発明の１つの態様において、１つまたはそれ以上の複素環式の塩基部分の代わりに多環式ヘテロ環式化合物を有するアンチセンス化合物が、調製される。多くの三環ヘテロ環式化合物が、これまでに報告された。これらの化合物は、修飾されたストランドの結合特性を標的ストランドに対して増大させるためのアンチセンスの応用に通常用いられる。最も研究された修飾は、グアノシンに標的化され、Ｇ−クランプまたはシチジン類似体と称される。
【００８３】
第二のストランドのグアノシンと３個の水素結合を作る代表的なシトシン類似体には、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｈ）（Kurchavovら、Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846）、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｓ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｈ）、（Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874)および６，７，８，９−テトラフオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｆ）（Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388)が含まれる。オリゴヌクレオチドに組み込まれた場合、これらの塩基修飾は、相補的なグアニンとハイブリダイズすることが示され、また、後者はアデニンとハイブリダイズし、増大したスタッキング相互作用によってヘリックスの熱安定性が増強されることも示された（また、米国特許出願第２００３０２０７８０４号および米国特許出願第２００３０１７５９０６号を参照のこと、この両方は、その全部が出典明示により一部とされる）。
【００８４】
本発明に基づく三環複素環式の化合物およびそれらの使用方法は、米国特許第６，０２８，１８３号および米国特許第６，００７，９９２号（両方の開示内容はその全部が本明細書の一部とされる）に開示されている。
フェノキサジン誘導体の増強の結合親和性に加え、その配列特異性は、それらを、より強力なアンチセンスに基づく薬物開発の有益な核酸塩基類似体とする。実際に、フェノキサジン置換を含有するヘプタヌクレオチドが、ＲＮａｓｅＨを活性化し、細胞取込みを増強し、そして増強されたアンチセンス活性を示し得ることを実際に示す有望なデータが、インビトロ実験から得られた（Lin, K-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532）。この活性の増強は、単一の置換が２０個のヌクレオシド、２’デオキシホスホロチオ酸オリゴヌクレオチドのインビトロ効力の有意な改善を示すため、さらにＧクランプとも称さる（Flanagan, W. M.；Wolf, J.J.；Olson, P.；Grant, D.；Lin, K.-Y.；Wagner, R. W.；Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513-3518）。
【００８５】
複素環式塩基として有用な修飾された多環式ヘテロ環式化合物は、限定するものではないが、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４３４，２５７号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，６４６，２６９号；第５，７５０，６９２号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８号；第６，００５，０９６号および第５，６８１，９４１号および米国特許出願公報第２００３０１５８４０３号に開示されており、その各々は、その全部が出典明示により本明細書の一部とされる。
【００８６】
５−メチルシトシン置換を含む、いくつか核酸塩基置換は、特に本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させるのに有用である。例えば、５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６℃〜１．２℃増加させることが示され（Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T.およびLebleu, B., 編., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、特に、好ましい塩基置換であり、また２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にはさらに好ましい。
【００８７】
コンジュゲート型アンチセンス化合物
本発明のアンチセンス化合物に付け加え得る１つの置換には、結果として生じるアンチセンス化合物の活性、細胞分布または細胞取込みを増強する１つまたはそれ以上の部分またはコンジュゲート結合が含まれる。１つの実施形態において、そのような修飾されたアンチセンス化合物は、コンジュゲート基を官能基（例えばヒドロキシルまたはアミノ基）に共有結合で結合させることにより調製される。本発明のコンジュゲート基は、インターカレータ、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール類、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびアンチセンス化合物の薬物動態学的特性を増強する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基は、コレステロール部分と脂質部分を含む。さらなるコンジュゲート基は、炭水化物、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンと色素を含む。本発明の関係で薬力学的特性を増強する基は、アンチセンス化合物に、改善された取込み、分解に対する増強の抵抗性および／またはＲＮＡとの増強のハイブリダイゼーションなどの特性を与える基を含む。この発明の関係で、薬物動態学的特性を増強する基には、アンチセンス化合物に、例えば改善された取込み、分布、代謝または排出などの特性を与える基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６に開示されており、その全開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【００８８】
さらにまた、本発明のアンチセンス化合物は、アンチセンス化合物の能動もしくは受動輸送、局在化またはコンパートメント化を容易にするために、１つまたはそれ以上のコンジュゲート部分を有してもよい。細胞局在化は、限定されるものではないが、核、核小体または細胞形質への局在を含む。コンパートメント化は、限定するものではないが、核、核小体、ミトコンドリアを含む細胞区画への方向づけられた移動、または細胞膜への埋め込みを含む。さらにまた、本発明のアンチセンス化合物は、転写後修飾を容易にする１つまたはそれ以上のコンジュゲート部分を含む。
【００８９】
本発明の組成物で用いられるアンチセンス化合物は、例えばヌクレアーゼ安定性などの特性を増強するため、一般的にアンチセンス化合物の一端または両端に付す１つまたはそれ以上の安定化基を含めて修飾してもよい。キャップ構造は安定化基に含まれる。アンチセンス化合物のいずれの末端にも組み込まれる「キャップ構造」または「末端のキャップ部分」は、化学修飾を意味する（例えば、Wincottら、国際特許公報第９７／２６２７０号、出典明示により本明細書の一部とされる）。これらの末端修飾は、末端の核酸分子を有するアンチセンス化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内での送達および／または局在化をよくし得る。キャップは、５’−末端（５’−キャップ）に、または３’−末端（３’−キャップ）に存在してもよし、あるいは両端に存在してもよい。二本鎖アンチセンス化合物について、キャップは、いずれかのストランドの一端もしくは両端に存在し得る。キャップ構造は当分野で周知であり、例えば、逆デオキシ無塩基キャップを含む。さらに、ヌクレアーゼ安定性を与えるため、アンチセンス化合物の一端または両端をキャップするために用いることができる３’と５’安定化基としては、２００３年１月１６日に公開された国際特許公報第０３／００４６０２号に開示されたものが挙げられる。
【００９０】
アンチセンス化合物モチーフ
本発明のアンチセンス化合物は、化学的に修飾されたサブユニットが、そのアンチセンス化合物の阻害活性を増強するパターンにて配置されていてもよい。これらのパターンは、本明細書中「モチーフ」と記載され、それは均一に修飾されたモチーフ、位置的に修飾されたモチーフ、ギャップマー（gapmer）あるいはギャップした（gapped）モチーフ、交互（alternating）モチーフ、ヘミマー（hemimer）およびブロックマー（blockmer）モチーフを含む。
【００９１】
本発明で用いられる用語「均一な・モチーフ」は、各ヌクレオシドが天然の糖または修飾された糖でもよい同型の糖部分を有するアンチセンス化合物を含むことを意味する。さらに、「均一に修飾されたモチーフ」、「均一な修飾」、および「均一に修飾された」は、各ヌクレオシドが同型の糖修飾を有するアンチセンス化合物を含むことを意味する。適切な糖部分は、限定されるものではないが、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３［２’−ＭＯＥ］、２’−ＯＣＨ３［２’−Ｏ−メチル］、ＬＮＡおよびＥＮＡ（登録商標）を含む。例えば、アンチセンス化合物は、その各糖修飾が２’−ＭＯＥ糖修飾となるよう、均一に修飾されてもよい。別には、アンチセンス化合物は各糖修飾が２’−Ｏ−メチル糖修飾であるように、均一に修飾されてもよい。
【００９２】
本発明で用いられる用語「ギャップしたモチーフ」または「ギャップマー」は、２つの外部領域（また、「ウィング」もしくは「ウィング部分」と称される）の間に位置する内部領域（また、「ギャップ」または「ギャップ部分」と称される）を有するアンチセンス化合物を含むことを意味する。この領域は、各異なる領域を含む糖部分の型によって区別される。ギャップマーの領域を区別するために用いられる糖部分の型は、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’修飾されたヌクレオシド（そのような２’−修飾されたヌクレオシドは、特に２’−ＭＯＥと２’−Ｏ−ＣＨ３を含み得る）および二環式糖修飾ヌクレオシド（そのような二環式糖修飾ヌクレオシドは、特にＬＮＡ（登録商標）またはＥＮＡ（登録商標）を含み得る）を含む。一般に、各異なる領域は、領域内の均一な・モチーフ糖部分が均一であることを要する。
【００９３】
ギャップしたモチーフまたはギャップマーは、「対称」または「非対称」のいずれかによって、さらに定義される。第一のウィングのヌクレオシドが、第二のウィングのヌクレオシドと同じ糖修飾を有するギャップマーは、対称のギャップしたアンチセンス化合物と称される。対称のギャップマーは、例えば、少なくとも１つの糖部分が修飾された糖部分である、第一の糖部分を含む内部領域およびそれぞれ第二の糖部分を含む外部領域を有してもよい。
【００９４】
本発明で用いられるギャップマーは、独立して１個から７個のヌクレオシドを有するウィングを含む。従って、本発明は、各ウィングが独立して１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個のヌクレオシドを含むギャップマーを含む。各ウィングのヌクレオシド数は、同じであっても異なっていてもよい。１つの実施形態において、内部領域またはギャップ領域は、１７個から２１個のヌクレオシドを含み、それは１７個、１８個、１９個、２０個または２１個のヌクレオシドを含むと理解される。
【００９５】
本発明で用いられる用語「位置的に修飾されたモチーフ」は、その配列が１個〜約８個の糖修飾ヌクレオシドを含む２個またはそれ以上の領域により分断されており、内部領域は一般に１個〜約４個のヌクレオシドである、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドを含むことを意味する。言い換えれば、特定の糖部分を有する領域が、異なる糖部分を有する領域で分離されている。糖修飾ヌクレオシドを含む領域は、同じ糖修飾を有するか、あるいは、ある領域が別の領域とは異なる糖修飾を有するよう変化する。位置的に修飾されたモチーフは、核酸塩基配列またはヌクレオシド内結合の場所もしくは型によっては決まらない。用語「位置的に修飾されたモチーフ」は、多くの異なる特異的な置換パターンを含む。これらの置換パターンの多くが、組成物に調製され、試験された。
【００９６】
本発明は、第二の異なる２’−糖修飾ヌクレオシドまたは二環式修飾された糖ヌクレオシド領域によって分離された、２’−糖修飾ヌクレオシド領域によって特徴づけられる位置的に修飾されたモチーフを有するアンチセンス化合物を含む。好ましい２’−糖部分は、２’−Ｏ−メチルと２’−ＭＯＥを含む。好ましい二環式糖部分は、ＬＮＡおよびＥＮＡを含む。２’−糖修飾部分の領域は、２〜８ヌクレオシド長でもよく、また二環式修飾された糖部分の領域は、１または２ヌクレオシド長でもよい。
【００９７】
１つの実施形態において、本発明のアンチセンス化合物は、５’−末端から始まって、アンチセンス化合物は第１位と第２位のいずれにも２’−糖修飾ヌクレオシドを有し、第３位のすべてに二環式の修飾されたヌクレオシドを有するように、１つの二環式の修飾されたヌクレオシドの領域によって分離された、２つの２’−糖修飾ヌクレオシドの領域により特徴づけられる。そのようなモチーフは、式５’−（Ａ−Ａ−Ｂ）ｎ（−Ａ）ｎｎ−３’（ここで、Ａは第一の糖部分であり、Ｂは第二の糖部分であり、ｎは６〜７であり、そしてｎｎは０〜２である）により示される。好ましい実施形態において、Ａは２’−ＭＯＥであり、ＢはＬＮＡである。さらなる実施形態において、Ａは２’−Ｏ−メチルであり、そしてＢはＬＮＡである。いくつかの実施形態において、そのようなモチーフが、アンチセンス化合物（例えば、２１ヌクレオシド長のアンチセンス化合物）の３’−末端に二環式ヌクレオシドを生じる場合、２’−糖修飾ヌクレオシドが、二環式修飾されたヌクレオシドに代えて一部とされる。例えば、ｎが７であり、ｎｎが０である場合、２’−糖修飾ヌクレオシドは、二環式修飾されたヌクレオシドに代えて３’末端部位に利用される。
【００９８】
標準的でないパターンを有する位置的に修飾されたモチーフもまた、本発明に含まれる。例えば、大部分の２’−糖修飾領域は２ヌクレオシド長であってよく、少数の２’−糖修飾領域は１ヌクレオシド長でもあってもよい。同様に、大部分の二環式修飾された領域は１ヌクレオシド長であってよく、少数の二環式修飾された領域は２ヌクレオシド長であってよい。前の段落で記載されるように、そのようなアンチセンス化合物の１つの非限定的な例は、位置的に修飾されたモチーフを含み、１ヌクレオチド長の１個の２’−糖修飾された領域、そして２ヌクレオシド長の１個の二環式修飾された領域を有する。
【００９９】
本発明で用いられる用語「交互モチーフ」は、本質的に全長の化合物が２つの異なる交互のヌクレオシドからなる連続配列を含むことを意味する。この交互のパターンは、式：５’−Ａ（Ｂ−Ａ）ｎ（−Ｂ）ｎｎ−３’（式中、ＡおよびＢは、少なくとも異なる糖部分を有することにより区別されるヌクレオシドであり、ｎｎは０または１であり、そしてｎは約７〜約１１である）により記載され得る。これは、１７〜２４ヌクレオシド長のアンチセンス化合物であってよい。この長さの範囲は制限を意味するものではなく、より長いおよびより短いアンチセンス化合物もまた本発明にある。また、この式は５’−および３’−末端ヌクレオシドが同じ（余分の）または異なる（同等の）糖部分を含む、同等および余分な長さの交互アンチセンス化合物を可能にする。
【０１００】
本発明の交互のアンチセンス化合物を含む「Ａ」および「Ｂ」ヌクレオシドは、少なくとも異なる糖部分を有することによって互いに区別される。ＡおよびＢヌクレオシドはそれぞれ、β−Ｄ−リボヌクレオシド、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド、２’修飾されたヌクレオシド（そのような２’修飾されたヌクレオシドは、特に２’−ＭＯＥおよび２’−Ｏ−ＣＨ３を含んでいてもよい）、および二環式糖修飾ヌクレオシド（そのような二環式糖修飾ヌクレオシドは、特にＬＮＡまたはＥＮＡを含んでいてもよい）から選択される、修飾された糖部分を有する。交互のモチーフは、核酸塩基配列とヌクレオシド内結合から独立している。ヌクレオシド内結合は、各部位でまたは特定の選択された部位で変わってもよいし、あるいはアンチセンス化合物の全体を通じて一様であってもよいし、または交互になっていてもよい。
【０１０１】
本発明で用いられる用語「ヘミマー・モチーフ」は、一様な糖部分（同一の糖、修飾されるかもしくは非修飾）を有するヌクレオチドの配列を含むことを意味し、ここで、５’末端または３’末端のうちの一方は、２個〜１２個のヌクレオチドの配列を有し、それは糖修飾されたヌクレオシドであり、ヘミマー修飾されたアンチセンス化合物において他のヌクレオシドから区別される。典型的なヘミマーの例は、一方の末端ではβ−Ｄ−リボヌクレオシドまたはβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの配列、そして他の末端では糖修飾されたヌクレオシドの配列を含むアンチセンス化合物である。あるヘミマー・モチーフは、一方の末端にβ−Ｄ−リボヌクレオシドまたはβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの配列、次にもしくは前に、他の末端には２個〜１２個の糖修飾ヌクレオシドの配列を含む。別のヘミマー・モチーフは、一方の末端にβ−Ｄ−リボヌクレオシドまたはβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの配列、次にもしくは前に、同様に適切な２個〜４個の糖修飾ヌクレオシドを有する、他の末端に位置する２個〜６個の糖修飾ヌクレオシドを含む。本発明の好ましい実施形態において、ヘミマー・アンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ修飾されたヌクレオシド領域とβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシド領域を含む。１つの実施形態において、β−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドは、アンチセンス化合物内に１３個未満の連続ヌクレオシドを含む。
【０１０２】
本発明で用いられる用語「ブロックマー・モチーフ」は、均一に修飾された糖修飾ヌクレオシドのブロックによって内部で分断された均一な糖（同一の糖、修飾もしくは非修飾）を有するヌクレオシドの配列を含むことを意味し、ここで、該修飾は他のヌクレオシドと異なる。より一般には、ブロックマー・モチーフを有するアンチセンス化合物は、２個〜６個、または２個〜４個の糖修飾ヌクレオシドからなる内部ブロックを有するβ−Ｄ−リボヌクレオシドまたはβ−Ｄ−デオキシリボヌクレオシドの配列を含む。内部のブロック領域は、それが一方の末端にあってヘミマーとならない限り、アンチセンス化合物内のいずれいの部位にあってもよい。塩基配列およびヌクレオシド内結合は、ブロックマー・モチーフ内のいずれの部位に変わってもよい。
【０１０３】
均一に、位置的に修飾された、交互の、ギャップした、ヘミマーまたはブロックマーから選択されるモチーフを有するアンチセンス化合物は、ヌクレオシド内結合修飾または核酸塩基修飾、例えば本明細書に記載のものをさらに含んでいてもよい。
【０１０４】
この発明の関係において、「キメラ・アンチセンス化合物」または「キメラ」は、それぞれ少なくとも１個のモノマー単位（すなわち、核酸に基づくアンチセンス化合物の場合ヌクレオチドまたはヌクレオシド）からなる少なくとも２つの化学的に異なる領域のある、アンチセンス化合物である。したがって、位置的に修飾された、ギャップマー、交互の、ヘミマーまたはブロックマーから選択されるモチーフを有するアンチセンス化合物は、キメラ・アンチセンス化合物であると考えられる。
【０１０５】
キメラ・アンチセンス化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増大した抵抗性、増大した細胞摂取、標的核酸に対する増加した結合親和性および／または増加した阻害活性を与えるように修飾された少なくとも１つの領域を含む。例として、アンチセンス化合物は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡストランドを切断する細胞エンドヌクレアーゼＲＮａｓｅＨの基質として働く領域を含むよう設計され得る。従って、開裂領域を有するアンチセンス化合物によるＲＮａｓｅＨの活性化は，ＲＮＡ標的を開裂することとなり、それによりアンチセンス化合物の効率が増強する。別には、アンチセンス化合物は、アンチセンス阻害が酵素の開裂よりむしろ立体化学的閉鎖のような機序を通じて達成されるように、増加した結合性または活性をアンチセンス化合物に与える領域を含むよう、設計し得る。
【０１０６】
化学修飾ヌクレオシドは、短いもしくは切断されたアンチセンス化合物のその標的核酸に対する結合親和性を増加させるために用いることができる。従って、相当する結果は、そのような化学修飾ヌクレオシドを有する、より短いアンチセンス化合物を用いてしばしば得ることができる。
均一に、位置的に修飾された、交互の、ギャップマー、ヘミマーまたはブロックマーから選択されるモチーフを有する、本明細書記載のアンチセンス化合物のいずれも、本明細書に記載のようなヌクレオシド内結合修飾および／または核酸塩基修飾をさらに含んでいてもよい。
【０１０７】
天然、修飾の両方のヌクレオシドは、そのハイブリダイゼーションおよび結合性特性に影響を及ぼす特定の立体配座ジオメトリーを有する。ホモ二本鎖核酸の立体配座のジオメトリーを記載するために用いられる用語は、ＲＮＡについては「Ａ型」およびＤＮＡについては「Ｂ型」である。一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖は、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖より安定で、より高い融解温度（Ｔｍ）を有する（Sangerら、Principles of Nucleic Acid Structure, 1984, Springer-Verlag; New York, NY.；Lesnikら、Biochemistry, 1995, 34, 10807-10815；Conteら、Nucleic Acids Res., 1997, 25, 2627-2634）。ＲＮＡの増大の安定性は、いくつかの構造上の特徴、特にＡ型ジオメトリーの結果としての、改善された塩基スタッキング相互作用に起因する（Searleら、Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056）。ＲＮＡ中の２’ヒドロキシルの存在が、糖にＣ３’エンド・パッカー（endo pucker）に対する偏りを与え（すなわち、ノーザン・パッカー（Northern pucker）とも称される）、それが、この二本鎖がＡ型ジオメトリーをとりやすくなる要因である。加えて、ＲＮＡ中の２’ヒドロキシル基は、ＲＮＡ二本鎖を安定させるのを助ける水媒介性の水素結合ネットワークを形成し得る（Egliら、Biochemistry, 1996, 35, 8489-8494）。一方、デオキシ核酸は、Ｃ２’エンド糖パッカーを好み（すなわち、サザン・パッカー（Southern pucker）としても知られる）、それはより安定でないＢ型ジオメトリーを与えると考えられている（Sanger, W. (1984) Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, New York, NY）。本明細書中で用いられるＢ型ジオメトリーは、Ｃ２’−エンド・パッカーおよびＯ４’−エンド・パッカーの両方を含む。Ｂ型二本鎖を引き起こすフラノース立体配座を考慮した場合に、Ｏ４’−エンド・パッカー立体配座を与えられなければないことを考慮して指摘したBergerら、Nucleic Acids Research, 1998, 26, 2473-2480と一致する。
【０１０８】
しかしながら、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二本鎖は、通常、純粋なＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖より安定でなくて、その配列によってはＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖より多少安定であり得る（Searleら、Nucleic Acids Res., 1993, 21, 2051-2056）。ハイブリッド二本鎖の構造は、Ａ型とＢ型ジオメトリーとの中間にあり、それは弱いスタッキング相互作用であり得る（Laneら、Eur. J. Biochem., 1993, 215, 297-306；Fedoroffら、J. Mol. Biol., 1993, 233, 509-523；Gonzalezら、Biochemistry, 1995, 34, 4969-4982；Hortonら、J. Mol. Biol., 1996, 264, 521-533）。これらの機序はＲＮＡ標的ストランドに対する合成配列ストランドのハイブリダイゼーションまたは立体障害が関与するので、標的ＲＮＡと合成配列とで形成された二本鎖の安定性は、限定するものではないが、ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介型を含むアンチセンス機序およびＲＮＡ干渉機序などの治療に重要である。
【０１０９】
糖パッカリングを修飾する１つの通常用いられる方法は、糖ジオメトリーに影響する置換基を用いた２’位の糖置換である。環立体配座における影響は、２’位での置換基の性質に依存する。多くの異なる置換基は、その糖パッカリング効果を決定するために研究された。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態において、二本鎖安定性は、Ａ−型ジオメトリーを示す修飾された糖部分を組み込むことにより増強され得る。当業者であれば、所定の置換糖がＡ−型ジオメトリーを有するかどうか決定することができる。
【０１１１】
本発明の1つの態様において、アンチセンス化合物は、３’エンド糖立体配座を誘導するために合成により修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、所望の３’エンド糖立体配座を誘導するため、複素環式の塩基、糖部分またはその両方に合成修飾を組み込むことができる。これらの修飾されたヌクレオシドは、所望の３’エンド立体配座ジオメトリーを維持しながら、アンチセンス化合物の特定の特性が増強され得るよう、ＲＮＡ様ヌクレオシドを模倣するために用いられる。ＲＮＡ型二本鎖（Ａ型ヘリックス、主に３’エンド）は、ＲＮＡ干渉の要求（例えばトリガー）としての明白な優先性がある。より安定な３’エンドヌクレオシドを使用することで増強される特性は、以下：蛋白結合；蛋白質の解離速度；吸着および除去；ヌクレアーゼ安定性ならびに化学安定性のモジュレーション；結合親和性およびアンチセンス化合物の特異性（酵素ならびに相補的配列に対する結合性および特異性）のモジュレーション；ＲＮＡ開裂の増加した効能；および増加の立体化学的閉塞の１つまたはそれ以上のモジュレーションを含む。本発明は、Ｃ３’エンド型立体配座を与える様式で修飾された１つまたはそれ以上のヌクレオシドを有する、ＲＮＡｉのトリガーとして作用するよう設計されたアンチセンス化合物を提供する。
【０１１２】
修飾されたヌクレオシドの立体配座およびそれらを含むアンチセンス化合物は、様々な方法、例えば分子動力学算出、核磁気共鳴スペクトル測定法およびＣＤ測定により評価することができる。したがって、ＲＮＡ様立体配座を誘導すると予測される修飾（アンチセンス化合物の内容ではＡ型二本鎖ジオメトリー）は、本発明のアンチセンス化合物に有用である。本発明に従う修飾されたヌクレオシド合成は、当分野で既知である（例えば、Chemistry of Nucleosides and Nucleotides Vol 1-3, ed. Leroy B. Townsend, 1988, Plenum Pressを参照のこと）。
【０１１３】
1つの態様において、本発明は天然のＲＮＡと比較して増強された特性を有するよう設計されたアンチセンス化合物に関する。最適化または増強のアンチセンス化合物を設計する１つの方法は、選択された配列の各ヌクレオシドが可能な増強化修飾について精査することを含む。１つの修飾は、同じ３’エンド立体配座ジオメトリーを有するヌクレオシドによる１つまたはそれ以上のＲＮＡヌクレオシドの置換である。合成および／またはオリゴヌクレオチドへの組み込みが非常により安価でより容易となると共に、該修飾は、天然のＲＮＡと比較して化学的安定性およびヌクレアーゼ安定性を増強し得る。配列は、キメラ立体配置の結果として増強性の修飾に関して評価された領域と各領域のヌクレオシドに、さらに分けることができる。１つまたはそれ以上の末端のヌクレオシドに行うことができるしばしば有利な修飾があるので、５’と３’末端に与えることも考えられる。本発明のアンチセンス化合物は、一本鎖上に少なくとも1個の５’修飾されたリン酸基または二本鎖の配列または配列群の少なくとも１個の５’位を含んでもよい。考えられる他の修飾には、ヌクレオシド内結合、コンジュゲート基、置換糖または塩基、１つまたはそれ以上ヌクレオシドのヌクレオシド模倣体による置換、およびアンチセンス化合物の所望の特性を増強し得る他のいずれかの修飾がある。
【０１１４】
本明細書中で特に定義されない限り、アルキルは、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ８またはＣ１−Ｃ６の直鎖または（可能な場合には）分岐脂肪族ヒドロカルビルを意味する。
本明細書中で特に定義されない限り、ヘテロアルキルは、鎖の末端を含む鎖内に少なくとも１個、または約１個〜約３個のヘテロ原子を含む、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ８またはＣ１−Ｃ６の直鎖または（可能な場合には）分岐鎖脂肪族ヒドロカルビルを意味する。適切なヘテロ原子は、N、OおよびSを含む。
【０１１５】
本明細書中で特に定義されない限り、シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ１２、Ｃ３−Ｃ８またはＣ３−Ｃ６脂肪族ヒドロカルビル環を意味する。
本明細書中で特に定義されない限り、アルケニルは、少なくとも1個の炭素−炭素二重結合を含む直鎖または（可能な場合には）分岐ヒドロカルビル部分であってよいＣ２−Ｃ１２、Ｃ２−Ｃ８またはＣ２−Ｃ６アルケニルを意味する。
本明細書中で特に定義されない限り、アルキニルは、少なくとも1個の炭素−炭素三重結合を含む直鎖または（可能な場合には）分岐ヒドロカルビル部分であってよいＣ２−Ｃ１２、Ｃ２−Ｃ８またはＣ２−Ｃ６アルキニルを意味する。
【０１１６】
本明細書中で特に定義されない限り、ヘテロシクロアルキルは、少なくとも３個の環メンバーを含み、そのうちの少なくとも１個は炭素であり、そして１個、２個または３個の環メンバーは、炭素以外の環部分を意味する。炭素原子の数は、１個〜約６個、１個〜約１２個まで変化してよく、そして環メンバーの総数は３個〜約１５個、または約３個〜約８個まで変化する。適切な環ヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳである。適切なヘテロシクロアルキル基は、限定するものではないが、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、ホモモルホリノ、ホモチオモルホリノ、ピロロジニル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイミダゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソオキサゾリル、テトラヒドロピラゾリル、フラニル、ピラニルとテトラヒドロイソチアゾリルを含む。
【０１１７】
本明細書中で特に定義されない限り、アリールは、少なくとも１個のアリール環を含むいずれかの炭化水素環構造を意味する。適切なアリール環は、約６個〜約２０子の環炭素を有する。特に適切なアリール環は、フェニル、ナフチル、アントラセニルおよびフェナントレニルを含む。
本明細書中で特に定義されない限り、ヘタリールは、炭素および非炭素原子からなる少なくとも１個の完全不飽和環を含む環部分を意味する。環系は、約１個〜約４個の環を含んでもよい。炭素原子数は、１個〜約１２、１個〜約６まで変化してもよく、そして環メンバーの総数は３個〜約１５個、または約３個〜約８個まで変化する。適切な環ヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳである。適切な環ヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳである。適切なヘタリール部分は、限定するものではないが、ピラゾリル、チオフェニル、ピリジル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、プリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチオフェニルなどを含む。
【０１１８】
本明細書中で特に定義されない限り、部分が化合物部分として定義されるように、例えばヘタリールアルキル（ヘタリールとアルキル）、アラルキル（アリールとアルキル）など、それぞれのサブ部分が本明細書中で定義される。
本明細書中で特に定義されない限り、電子吸引基は、電子電荷をそれが付随する炭素から引き離すシアノまたはイソシアナート基などの基である。重要な他の電子吸引基は、電気陰性が炭素のそれを上回るもの、例えば、ハロゲン、ニトロまたは１個またはそれ以上のシアノ、イソチオシアネート、ニトロもしくはハロ基でオルト位もしくはパラ位で置換されたフェニルを含む。
本明細書中で特に定義されない限り、用語ハロゲンおよびハロは、それらの通常の意味を有する。適切なハロ（ハロゲン）置換基は、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒおよびＩである。
【０１１９】
前記の任意の置換基は、本明細書中で特に定義されない限り、所望の特性に応じて適切な置換基である。ハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アルキル、アルケニルとアルキニル部分、ＮＯ２、ＮＨ３（置換および非置換）、酸部分（例えば−ＣＯ２Ｈ、−ＯＳＯ３Ｈ２など）、ヘテロシクロアルキル部分、ヘタリール部分、アリール部分などを含む。
リン酸保護基は、米国特許第５，７６０，２０９号、米国特許第５，６１４，６２１号、米国特許第６，０５１，６９９号、米国特許第６，０２０，４７５号、米国特許第６，３２６，４７８号、米国特許第６，１６９，１７７号、米国特許第６，１２１，４３７号、米国特許第第６，４６５，６２８号（その各々は明らかにその全部が出典明示により本明細書の一部とされる）に記載のものが挙げられる。
【０１２０】
アンチセンス化合物スクリーニング
ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸の有効なモジュレーターを同定するためのスクリーニング法は、本発明によっても理解され、そして、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸またはその部分を１つまたはそれ以上の候補モジュレーターと接触させる工程、およびｍｉＲ−１２２ａ標的核酸のレベル、発現または機能を阻害する１つまたはそれ以上の候補モジュレーターを選択する工程も含む。本明細書中で記載されるように、候補モジュレーターは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、またはそのいずれかの部分、成熟ｍｉＲＮＡ、Ｄｒｏｓｈａ認識領域、Ｄｒｏｓｈａ開裂領域、ヘアピンのステムまたはヘアピンのループを含む部分を標的とするアンチセンス化合物であってよい。候補モジュレーターは、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸、例えばｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ内の構造領域の構造領域と結合する小分子化合物をさらに含む。候補モジュレーターまたはモジュレーターは、ｍｉＲ−１２２ａ標的核酸のレベル、発現または機能をモジュレートすることができる、好ましくは減少することができることが示されれば、そのモジュレーターはさらに調査研究に用いることができ、または、標的確認、研究、診断または本発明に従う治療薬としての使用のために用いることができる。
【０１２１】
組成物および医薬組成物を処方する方法
本発明はまた、本発明のアンチセンス化合物と組成物を含む医薬組成物と製剤を含む。組成物および医薬組成物の製剤法は、限定するものではないが、投与経路、疾病の範囲または投与される用量を含む多くの基準に依存する。このような考慮すべき問題は、当業者に十分理解される。
【０１２２】
本発明のアンチセンス化合物および組成物は、化合物または組成物の有効な量を適切な医薬上許容される希釈剤または担体に加えることによって、医薬組成物において利用され得る。本発明のアンチセンス化合物の使用および方法は予防に有用であり得る。
【０１２３】
本発明のアンチセンス化合物および組成物は、それがヒトを含む動物に投与されると、生物学的に活性のある代謝産物またはその部分を（直接、または、間接的に）提供することができる、医薬上許容される塩類、エステルまたは該エステルの塩類または他のいずれかの化合物を包含する。したがって、例えば、開示内容は、本発明のアンチセンス化合物のプロドラッグおよび医薬上許容される塩類、そのようなプロドラッグの医薬上許容される塩類および他の生物学的等価物を記載する。
【０１２４】
用語「プロドラッグ」は、内因性酵素または他の化学物質の作用および／または条件によって、体内またはその細胞内で活性型（すなわち薬物）に変わる、不活性型で調製される治療薬を示す。これは、活性アンチセンス化合物を形成するために、体内で内因性ヌクレアーゼによって切断されるさらなるヌクレオシドをアンチセンス化合物の一端または両端に組み込むことを含んでもよい。
【０１２５】
用語「医薬上許容される塩」は、本発明のアンチセンス化合物および組成物の生理的および医薬的に許容できる塩：すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、それに対して望ましくない毒性効果を与えない塩を意味する。適切な例は、限定するものではないが、ナトリウム塩とカリウム塩を含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、アンチセンス化合物は、投与の経口経路で、被検体に投与されてもよい。被検体は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、イヌ、モルモット、ヒト以外の霊長類またはヒトであってよい。いくつか実施形態において、被検体は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸レベルまたは発現のモジュレーションを必要としてもよいし、あるいは本明細書記載の代替指標のモジュレーションを必要としてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書中で記載されるように、被検体に投与するための組成物は、１つまたはそれ以上の修飾を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを含む。
【０１２７】
細胞培養およびアンチセンス化合物処置
ｍｉＲ−１２２ａにより調節されるｍｉＲ−１２２ａ標的核酸、蛋白質をコードするＲＮＡのレベル、活性または発現におけるアンチセンス化合物の効果は、インビトロまたは様々な細胞型で試験することができる。そのような分析に用いられる細胞型は、商業ベンダーから入手可能であり（例えば、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）、マナッサス、バージニア州；ゼン−バイオ社（Zen-Bio, Inc.）、リサーチトライアングルパーク、ニューカレドニア；クローンテック社（Clonetics Corporation）、ウォーカーズビル（Walkersville）、メリーランド州）、細胞は、市販の試薬（例えば、インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、ベンダーの指示に従って培養される。例示的な細胞型には、限定するものではないが、Ｔ−２４細胞、Ａ５４９細胞、正常ヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）、ＭＣＦ７細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＢＪ細胞、Ｂ１６−Ｆ１０細胞、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）細胞、ヒト胚性ケラチノサイト（ＨＥＫ）、２９３Ｔ細胞、ＨｅｐＧ２、ヒト前脂肪細胞、ヒト分化脂肪細胞（前脂肪細胞は、当分野で既知の方法に従って分化させた）、ＮＴ２細胞（別名ＮＴＥＲＡ−２  ｃｌ．Ｄ１）およびＨｅＬａ細胞を含む。
【０１２８】
アンチセンス化合物による細胞の処置
一般に、細胞が約６０〜約８０％の集密度に達した場合に、それらを本発明のアンチセンス化合物で処置する。
アンチセンス化合物を培養細胞に導入するために通常用いられる１つの試薬として、陽イオン脂質トランスフェクション試薬ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）が含まれる。アンチセンス化合物の所望の終濃度およびを典型的に１００ｎＭのアンチセンス化合物につき２〜１２μｇ／ｍＬの範囲のＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）濃度にするため、アンチセンス化合物をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）中のＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）と混合した。
【０１２９】
アンチセンス化合物を培養細胞に導入するために用いられる別の試薬には、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）が含まれる。アンチセンス化合物の所望の濃度および典型的に１００ｎＭのアンチセンス化合物につき２〜１２のμｇ／ｍＬの範囲のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＲ濃度にするため、アンチセンス化合物をＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）１低血清培地（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）中のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）と混合した。
【０１３０】
細胞は、当業者に周知の通常の方法によってアンチセンス化合物を用いて処置される。細胞は、通常アンチセンス化合物処置の１６〜２４時間後に収集され、その時点で、標的核酸のＲＮＡまたは蛋白質レベルを当分野で既知の、本明細書中に記載の方法で測定する。標的核酸がｍｉＲＮＡである場合、ｍｉＲＮＡによって調節される蛋白質をコードするＲＮＡのＲＮＡレベルまたは蛋白質レベルを測定し、ｍｉＲＮＡに標的とされるアンチセンス化合物の効果を評価することができる。一般に、処置が複数反復して行われる場合、データは反復処置の平均で示される。
使用したアンチセンスの濃度は、細胞系から細胞系で異なる。特定の細胞系の最適のアンチセンス濃度を決定する方法は、当分野で周知である。アンチセンス化合物は、通常１ｎＭから３００ｎＭの濃度範囲で用いられる。
【０１３１】
ＲＮＡ単離
ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行い得る。ＲＮＡ単離法は、当分野で周知である。ＲＮＡは、製造業者の推奨されたプロトコルに従って、例えばＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）を用い、当分野で周知の方法を用いて調製される。
【０１３２】
標的レベルまたは発現の阻害の分析
ｍｉＲ−１２２ａ核酸のレベルまたは発現の阻害またはｍｉＲ−１２２ａ蛋白質をコードするＲＮＡ標的（例えばＡＬＤＯ  Ａ）のモジュレーションは、当分野で既知の様々な方法でアッセイすることができる。例えば、標的核酸レベルは、例えばノーザンブロット解析、競争的ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）または定量リアルタイムＰＣＲによって定量化できる。ＲＮＡ分析は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで行い得る。ＲＮＡ単離法は当分野で周知である。ノーザンブロット解析も当分野では通常のものである。定量リアルタイムＰＣＲは、ＰＥアプライド・バイオシステム、フォスターシティー、カリフォルニア州、から入手可能な、市販のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００または７９００のシークエンス・ディテクションシステムを用いて便利に達成でき、製造業者の指示に従って用いられる。
【０１３３】
当分野で知られている遺伝子発現分析の方法のさらなる例は、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（Brazma および Vilo, FEBS Lett., 2000, 480, 17-24; Celisら、 FEBS Lett., 2000, 480, 2-16）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（Maddenら、 Drug Discov. Today, 2000, 5, 415-425)、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡの制限酵素増幅（restriction enzyme amplification of digested cDNAs））(Prashar および Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72）、ＴＯＧＡ（全遺伝子発現分析（total gene expression analysis））（Sutcliffeら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 1976-81）、蛋白質アレイおよびプロテオミクス（Celisら、 FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Jungblutら、 Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10）、発現配列タグ（expressed sequence tag）（ＥＳＴ）配列決定（Celisら、 FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larssonら、 J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57）、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリンティング（ＳｕＲＦ）（Fuchsら、 Anal. Biochem., 2000, 286, 91-98; Larsonら、 Cytometry, 2000, 41, 203-208）、サブトラクティブ・クローニング、ディファレンシャルディスプレイ（DD）（Jurecic および Belmont, Curr. Opin. Microbiol., 2000, 3, 316-21）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Carulliら、 J. Cell Biochem. Suppl., 1998, 31, 286-96）、ＦＩＳＨ（蛍光インシトゥハイブリダイゼーション）技術（Going および Gusterson, Eur. J. Cancer, 1999, 35, 1895-904）、および質量分析方法（To, Comb. Chem. High Throughput Screen, 2000, 3, 235-41）を含む。
【０１３４】
標的ＲＮＡレベルの定量リアルタイムＰＣＲ分析
標的ＲＮＡレベルの定量化は、製造業者の指示に従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７６００、７７００または７９００のシークエンス・ディテクションシステム（ＰＥアプライド・バイオシステム、フォスターシティー、カリフォルニア州）を用い定量リアルタイムＰＣＲによって達成される。定量リアルタイムＰＣＲの方法は当分野で周知である。
リアルタイムＰＣＲの前に、単離されたＲＮＡは逆転写酵素（ＲＴ）反応にかけ、それによりリアルタイムＰＣＲ増幅の基質として用いられる相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が産生される。ＲＴとリアルタイムＰＣＲ反応は、同じ試料ウェルで順番に行われる。ＲＴとリアルタイムＰＣＲ試薬は、インビトロジェン（カールズバッド、カリフォルニア州）から入手できる。ＲＴ、リアルタイムＰＣＲ反応は、当業者に周知の方法によって実施される。
【０１３５】
リアルタイムＰＣＲによって得られる遺伝子（またはＲＮＡ）標的量は、発現が一定の遺伝子、例えばＧＡＰＤＨの発現レベルを用いて、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）（モレキュラープローブ社  ユージーン、オレゴン州）を用いて全ＲＮＡを定量化することにより規準化される。ＧＡＰＤＨ発現は、標的と同時に
または別々に実行し複合化させる、リアルタイムＰＣＲによって定量される。全ＲＮＡは、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（モレキュラープローブ社、ユージーン、オレゴン州）を用いて定量される。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）によるＲＮＡ定量化法は、Jones, L.J、ら（Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374）にて示される。ＣＹＴＯＦＬＵＯＲ（登録商標）４０００機器（ＰＥアプライドバイオシステム社）を用いて、ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標）蛍光を測定する。
プローブとプライマーは、ｍｉＲ−１２２ａにより調節される蛋白質コードＲＮＡ（例えばＡＬＤＯ  Ａ）を含む標的配列にハイブリダイズするように設計される。リアルタイムＰＣＲプローブとプライマーを設計する方法は、当分野で周知であり、ソフトウェア、例えばＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）ソフトウェア（アプライドバイオシステム、フォスターシティー、カリフォルニア州）の使用を含んでもよい。
【０１３６】
標的ＲＮＡレベルのノーザンブロット解析
ノーザンブロット解析は、当分野で既知の通常の手順によって行われる。より高い百分率のアクリルアミドゲル、例えば１０〜１５％アクリルアミドウレアゲルは、通常ｍｉＲＮＡを分離するために用いられる。１５〜２０マイクログラムの全ＲＮＡを、ＴＢＥ緩衝系を用いる１０％アクリルアミドウレアゲル（インビトロジェン）を通じ、電気泳動により分離される。ＲＮＡは、Ｘｃｅｌｌ  ＳＵＲＥＬＯＣＫ（登録商標）ミニセル（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）で電気ブロットすることによって、ゲルからＨＹＢＯＮＤ（登録商標）−Ｎ＋ナイロン膜（アマシャム・ファルマシア・バイオテック、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に転写される。膜を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（登録商標）ＵＶクロスリンカー２４００（ストラタジーン社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）を用いるＵＶ架橋によって固定し、次いで、オリゴヌクレオチド・プローブに製造業者の推奨しているＲＡＰＩＤ  ＨＹＢ（商標）緩衝液（アマシャム）を用いてプローブする。
【０１３７】
その配列を有する標的特異的なＤＮＡオリゴヌクレオチド・プローブを用いて、関心あるＲＮＡを検出する。ｍｉＲＮＡｓを検出するために用いられるプローブは、ＩＤＴ（コラルビレ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌ）、アイオワ州）のような商業的なベンダーによって合成される。プローブは、（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ（プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）とともに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端のラベルが付いている。ローディングと転写効率の変動を規格化するため、膜をストリップし、濃度が一定のＲＮＡ（例えばＧＡＰＤＨ）に再びプローブする。ｍｉＲＮＡを分離するために用いられるより高い百分率のアクリルアミドゲルについては、Ｕ６  ＲＮＡをローディングと転写効率の変動を規格化するために用いる。Ｕ６  ＲＮＡ。ハイブリダイズした膜を、ＳＴＯＲＭ（登録商標）８６０  ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥ（登録商標）システムおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（登録商標）ソフトウェアＶ３．３（モレキュラーダイナミックス、サニーヴェール、カリフォルニア州）を用いて視覚化して数量化する。
【０１３８】
蛋白質レベルの分析
ｍｉＲ−１２２ａによってモジュレートされるか、または調節される下流の標的の蛋白質レベル（例えばＡＬＤＯ  Ａ）は、免疫沈降、ウェスタンブロット解析（免疫ブロット）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、定量的蛋白質アッセイ、蛋白質活性アッセイ（例えばカスパーゼ活性アッセイ）、免疫組織化学、免疫組織化学または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）などの当分野で周知の様々な手段で、評価しまたは数量することができる。標的に対する抗体は、ＭＳＲＳカタログの抗体（アエリー、バーミンガム、ミシガン州）など、様々な供給源から確認し入手することができるし、または当分野で周知の一般的なモノクローナルもしくはポリクローナル抗体産生法により調製することもできる。
【０１３９】
インビボ研究
本発明によれば、本発明のアンチセンス化合物は、正常マウス、痩せマウス、ｏｂ／ｏｂマウス、ｄｂ／ｄｂマウス、食餌性肥満マウス、ならびに極度の食餌性肥満マウスおよびラットモデルを含む、疾病の様々な動物モデルで試験される。
レプチンは、食欲を調節する脂肪細胞によって産生されるホルモンである。ヒトとヒト以外の動物の両方でこのホルモンの欠乏は、肥満を引き起こす。ｏｂ／ｏｂマウスは、レプチン遺伝子に変異を有し、その結果として肥満と高血糖となる。このように、これらのマウスは、肥満と糖尿病の研究に、およびこれらの病気を処置するために設計される処置の有用なモデルである。ｏｂ／ｏｂマウスは、高循環レベルのインスリンを示し、レプチン受容体に変異を有するｄｂ／ｄｂマウスよりも高血糖でない。ｄｂ／ｄｂマウスは、レプチン受容体遺伝子に変異を有し、その結果として肥満と高血糖となる。このように、これらのマウスは、肥満と糖尿病の研究に、およびこれらの病気の処置するために設計される処置の有用なモデルである。ｄｂ／ｄｂマウスは、低循環レベルのインスリンを示し、レプチン遺伝子に変異を有するｏｂ／ｏｂマウスよりさらに高血糖でり、ＩＩ型糖尿病の齧歯類モデルとしてよく用いられる。
【０１４０】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスは、対照（痩せた）動物に用いられる標準的な齧歯類の食事で育てられる。さらに、Ｃ５７ＢＬ／６マウス株は、アテローム硬化型プラーク形成誘導高脂血症に罹患しやすいことが報告されている。その結果、これらのマウスは高脂肪食を与えられると、食餌性肥満を発病する。したがって、これらのマウスは、肥満の研究およびこれらの病気の処置するために設計される処置に有用なモデルである。
レヴィン・モデル（Levin Model）は、高脂肪食を与えた場合に耐糖能異常、異脂肪血症とインスリン抵抗性と関連した食餌性肥満（ＤＩＯ）を発病するよう選択的に繁殖させたラットの多遺伝子性モデルである（Levinら、 Am. J. Physiol、1997、273、R725-30）。このモデルは、肥満および関連する合併症（例えば耐糖能異常、異脂肪血症およびインスリン抵抗性）に影響を及ぼすそれらの能力について、本発明のアンチセンス化合物を研究する際に有用である。
【０１４１】
本明細書中で開示される発明がより効率的に理解されるよう、以下に実施例を提供する。これらの実施例は例証のみを目的とし、いかようにも本発明を制限するものと解釈されるべきではない。これらの実施例の全体を通じて、分子クローニング反応および他の標準的な組み換えＤＮＡ技術は、特記する場合を除き、商業的に入手可能な試薬を用い、Maniatisら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Press （1989）に記載の方法によって実施された。
本明細書中で記載される例に加えて、本発明のさまざまな変更は、前述の説明から当業者には明らかである。そのような変更もまた、添付の請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。本明細書にて引用される各報文（限定するものではないが、学術誌記事、米国と米国以外の特許、特許出願公報、国際特許出願公報、ＧＥＮＢＡＮＫＲ（登録商標）受入番号などを含む）は、その全部が引用により本明細書の一部とする。
【０１４２】
実施例
実施例１：ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ配列
ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ配列は、本発明の特定の実施形態で、例えばｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の設計に用いられた。ヒトｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａの配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＴ＿０３３９０７．３を有する配列から抽出され、配列番号：５（ＵＧＧＣＵＡＣＡＧＡＧＵＵＵＣＣＵＵＡＧＣＡＧＡＧＣＵＧＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵＧＵＣＵＡＡＡＣＵＡＵＣＡＡＡＣＧＣＣＡＵＵＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡＡＵＡＧＣＵＡＣＵＧＣＵＡＧＧＣＡＡＵＣＣＵＵＣＣＣＵ）として本明細書中の一部とされる。マウスｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ配列は、配列番号：６（ＵＵＣＣＵＵＡＧＣＡＧＡＧＣＵＧＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵＧＵＣＣＡＡＡＣＣＡＵＣＡＡＡＣＧＣＣＡＵＵＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡＡＵＡＧＣＵＡＣＵＧ）として本明細書中の一部とされる。ラットｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ配列は、配列番号：７（ＵＣＣＵＵＡＧＣＡＧＡＧＣＵＣＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵＧＵＣＣＡＡＡＡＣＡＵＣＡＡＡＣＧＣＣＡＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＡＡＡＣＡＧＣＵＡＣＵＧ）として本明細書中の一部とされる。配列は、５’から３’方向に記載され、ＤＮＡ型で表される。当業者には、標的配列中のチミジン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）と置換することによって、標的配列をそのＲＮＡ型に転換するできることは理解される。
【０１４３】
実施例２：成熟ｍｉＲＮＡ配列
ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ配列内に見出される成熟ｍｉＲＮＡは、本発明の特定の実施形態で、例えば、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物の設計で用いられた。アンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａを模倣するが、模倣体の１つまたはそれ以上の特性を改変する特定の化学修飾を含み、それによって内因性のｍｉＲＮＡより優れた特性を有する構築物を作り出せるよう設計され得る。
【０１４４】
成熟ｍｉＲ−１２２ａ配列を表１に示す。ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ前駆体からの成熟ｍｉＲ−１２２ａ配列は、いくつかの群が提案されている；従って、２つの成熟ｍｉＲ−１２２ａ配列を表１で開示する。配列は５’方向から３’方向に記載され、ＲＮＡ型で表される。当業者であれば、単純に配列中のウラシル（Ｕ）をチミジン（Ｔ）で置換することにより、標的配列をＤＮＡ型に変換し得ることは理解される。
表１
【表１】
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【０１４５】
実施例３：ｍｒＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物
本発明に関して、一連のアンチセンス化合物は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸内の様々な部位を標的とするよう設計されて合成された。アンチセンス化合物は、上記のノーザンブロット法または定量リアルタイムＰＣＲにより、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡレベルに関する効果について分析されるか、あるいはｍｉＲ−１２２ａまたはｍｉＲ−１２２ａ下流標的の役割を調査するため、他のアッセイで用いることもできる。
【０１４６】
以下のアンチセンス化合物の相補的な標的部位は、成熟ｍｉＲ−１２２ａ、ならびにｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａの標的部位を含む。例えば、配列番号：１２の配列を有するアンチセンス化合物は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａ構造のステムループを標的とするように設計された。
【０１４７】
核酸塩基配列と本発明のアンチセンス化合物の標的部位を表２に示す。表２において、標的部位は、配列番号：５の配列であり、それとアンチセンス化合物は相補的である。表２の核酸塩基配列は、ＤＮＡ核酸塩基の「Ｔ」でもって示されるが、当業者であればＲＮＡ配列では「Ｔ」が「Ｕ」に置換されることは理解される。例えば、特有のＲＮＡアンチセンス化合物ＩＳＩＳ  ３４２９７０の核酸塩基配列において、「Ｔ」が「Ｕ」に置換される。
表２：ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２ａまたはｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物の配列
【表２】
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【０１４８】
表４は、表２で示される配列のいずれか、および本明細書中記載のモチーフのうちいずれかを有するアンチセンス化合物を列記する。表４において、「糖」はアンチセンス化合物で見出される糖型（類）を示す；「骨格」は、ヌクレオシド内結合型を示す；「モチーフ」は、アンチセンス化合物の特定のモチーフを示す。モチーフは、それぞれ別の領域でのヌクレオシド数によって記載される。例えば、２’−ＭＯＥとＬＮＡ糖を有する位置的に修飾されたモチーフ「５−１−５−１−４−１−６」は、５個の２’−ＭＯＥ修飾されたヌクレオシド、続いて１つのＬＮＡ修飾されたヌクレオシド領域、およびその他の領域を有する。糖、ヌクレオシド内結合または塩基修飾の型は、ｔＲＮＡ修飾のような省略形を用いて示される。配列、ヌクレオシド内結合、核酸塩基および糖型は、すべて以下のように示される：
・配列の塩基は、大文字で示される
・塩基修飾は、上付き小文字コード（数は部位を示し得る）で塩基残基の前に示され、任意である
・糖型は、下付き小文字コードで塩基残基の後に示される
・ヌクレオシド内結合型は、下付き小文字コードで糖（３’側）の後に示される。
【０１４９】
糖、核酸塩基およびヌクレオシド内結合の省略形を表3で示す。
表３
【表３】
0005523705.tif 000004
【０１５０】
表４：ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【０１５１】
表５：ｍｉＲ−１２２ａを標的とする：２’−ＭＯＥおよびホスホロチオエート連結で均一に修飾される切断されたアンチセンス化合物
【表５】
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【０１５２】
表６：ｍｉＲ−１２２ａを標的とする：２’−ＭＯＥおよびホスホロチオエート連結で均一に修飾されるミスマッチのアンチセンス化合物
【表６】
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【０１５３】
ＩＳＩＳ  ３４３１６０は、化学修飾を施したｍｉＲ−１２２ａ模倣体を表すオリゴマー化合物である。ヒトｍｉＲ−１２２ａ模倣化合物は、例えば、哺乳動物由来の他のｍｉＲＮＡ、例えば齧歯目の種由来のものを模倣してもよいことは理解される。これらの模倣体が、化学修飾を有する化合物、例えば同型もしくはキメラ型の２’−ＭＯＥオリゴマー化合物、ならびにＬＮＡおよびＰＮＡを含む、核酸オリゴマー化合物の様々な変異体の基礎として用い得ることは理解される；そのようなオリゴマー化合物は本発明の範囲内にある。
【０１５４】
実施例４：表現型アッセイにおいてｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物の効果
アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  ３２８３７２、ＩＳＩＳ  ３２８３７３およびＩＳＩＳ  ３２７８９５のｍｉＲ−１２２ａにおける効果は、アポトーシスアッセイ、脂肪細胞分化アッセイとインスリンシグナル伝達アッセイを含む、いくつかの表現型アッセイで試験された。これらのアッセイの実験の詳細および得られる結果は、米国特許公報第２００５／０２６１２１８号で詳述され、その全部が出典明示により一部とされる。本明細書で記載されるように、ＩＳＩＳ  ３２８３７２およびＩＳＩＳ  ３２８３７３は、アポトーシスアッセイにおいてアポトーシスを誘導しなかった。ＩＳＩＳ  ３２７８９５は、脂肪細胞の分化指標レベルを低下させ、インスリンシグナル伝達アッセイにおいてホリスタチンおよびＰＥＰＣＫｃのメッセンジャーＲＮＡ発現を減少させた。
【０１５５】
実施例５：アンチセンス化合物を用いたインビトロでのｍｉＲ−１２２ａ活性のモジュレーション
アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたｍｉＲ−１２２ａの阻害をモニターするため、いくつかの演算的に予測されるｍｉＲ−１２２ａ標的の調節をインビトロで試験した。
【０１５６】
マウス初代肝細胞は、当分野で記載された方法（Neufeld, 1997, Methods Mol. Biol., 75:145-151.）を用いて、Ｂａｌｂ／ｃマウスから単離された。細胞を、９６ウェルプレート中の培地（１０％ウシ胎児血清、１０ｎＭ  ＨＥＰＥＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたウィリアムス培地Ｅ）に播種し、トランスフェクションの前に一晩培養した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（インビトロジェン、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いたオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、製造業者の指示に従い、三重に実施した。細胞を、１５ｎＭ、４４ｎＭまたは１３３ｎＭ濃度のＩＳＩＳ  ３２７８９５または対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  ３４２６８３のいずれかで処置した。細胞をトランスフェクションの２４時間後に溶解し、そして全ＲＮＡを、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）３０００のＱＩＡＧＥＮ（登録商標）ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）の９６カラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア、カリフォルニア州）を用いて集めた。
【０１５７】
ターゲットスキャン(ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ)アルゴリズム（Lewisら、2005, Cell, 120: 15-20；Lewisら、2003, Cell, 115:787-798）により予測されるｍｉＲ−１２２ａ標的遺伝子のｍＲＮＡレベルは、それぞれの特定の予測される標的遺伝子にハイブリダイズするように設計されたプライマーのプローブセットおよび通常のＴＡＱＭＡＮ（登録商標）リアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した。調べた予測された標的ｍＲＮＡを表７で示す。また、表７では、マウスとヒト標的ｍＲＮＡと関連したＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）の受入番号を示す。
表７：ターゲットスキャン・アルゴリズムによって予測されるｍｉＲ−１２２ａ標的遺伝子
【表７】
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【０１５８】
標的のうちの５つ（ＧＹＳ１、ＳＬＣ７Ａ１、ＡＬＤＯＡ、ＣＣＮＧ１、Ｐ４ＨＡ１）は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５を用いた処置後に１．５倍〜３倍上方に調節されたが、一方で、対照オリゴヌクレオチドを用いた処置によってはいずれも影響を及ぼさなかった。予測されたＭＩＮＫ１（図中ではｍＭＩＮＫと称される）標的だけは、ＩＳＩＳ  ３２７８９５を用いた処置後、影響を受けなかった。
【０１５９】
交換可能な実験でリアルタイムＰＣＲによって評価されるように、マウス肝癌ＡＭＬ１２細胞系のｍｉＲ−１２２ａ模倣体を用いた処置は、ＧＹＳ１、ＳＬＣ７Ａ１／ＣＡＴ−１およびＡＬＤＯＡの阻害を引き起こした。ｍｉＲ−１２２ａ模倣体として用いたｍｉＲ−１２２ａ二本鎖ＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ラフィーエット、CO）から購入した。ｍｉＲ−１２２ａ二本鎖は、ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵ（配列番号：３）とその相補鎖ＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡＵＡ（配列番号：２５）から成る。５’ミスマッチｍｉＲ−１２２ａ二本鎖は、ＵＧＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＵＧＧＵＧＵＵＵＧＵ（配列番号：２６）とその相補鎖ＡＡＡＣＡＣＣＡＵＵＧＵＣＵＣＵＧＵＧＣＡＵＡ（配列番号：２７）から成る。３’ミスマッチｍｉＲ−１２２ａ二本鎖は、ＵＧＧＡＧＵＧＵＧＡＣＡＵＵＧＣＡＧＵＡＧＵＧ（配列番号：２８）とその相補鎖ＡＵＡＣＵＧＣＡＡＵＧＵＣＡＣＡＣＵＣＣＡＵＡ（配列番号：２９）から成る。ＡＭＬ１２細胞は、初代肝細胞で見られるような（図６を参照）、ｍｉＲ−１２２ａの高い発現レベルを有さない。ｍｉＲ−１２２ａ模倣体のトランスフェクションは、ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害に従い上方に調節された５個の同じ標的（ＧＹＳ１、ＳＬＣ７Ａ１、ＡＬＤＯＡ、ＣＣＮＧ１、Ｐ４ＨＡ１）のｍＲＮＡレベルの減少をもたらした。面白いことに、ｍｉＲ−１２２ａ模倣体は、ＭＩＮＫまたはＮＰＥＰＰＳの発現をモジュレートせず、インビトロで、ｍｉＲ−１２２ａ標的遺伝子に対するアンチセンスおよびｍｉＲ模倣体の効果と相関することを示した。
【０１６０】
実施例６：インビトロでアンチセンスｍｉＲＮＡを使ったｍｉＲ−１２２ａ活性のモジュレーション
ｍｉＲ−１２２ａの多様な修飾を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた阻害をモニターするため、予測されたｍｉＲ−１２２ａ標的ＧＹＳ１の調節を、本明細書中記載のリアルタイムＰＣＲ法を用いてマウス初代肝細胞で評価した。細胞を、１５ｎＭ、４４ｎＭ、１３３ｎＭまたは４００ｎＭ用量の、ＩＳＩＳ  ３２７８９５、ＩＳＩＳ  ３６５２１９、ＩＳＩＳ  ３８６６５３、ＩＳＩＳ  ３８６６５４、ＩＳＩＳ  ３４５３６３または対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  ３４２６８３で処置した。ＩＳＩＳ  ３４２６８３の配列は、ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号：３０）である；このオリゴマー化合物は、２’−ＭＯＥヌクレオシドから均一に成り、ホスホロチオエート骨格を有し、そして、全てのシトシンは５‐メチルシトシンである。ＧＹＳ１の増加した発現によって明示されるように、ＩＳＩＳ  ３２７８９５およびＩＳＩＳ  ３６５２１９はｍｉＲ−１２２ａを阻害するにあたって効果的であった。ＩＳＩＳ  ３８６６５３およびＩＳＩＳ  ３８６６５４は、より小さい範囲であるがＧＹＳ１  ｍＲＮＡレベルを増加させた。ギャップマーＩＳＩＳ  ３４５３６３は、ＧＹＳ１  ｍＲＮＡレベルを顕著に増加させなかった。
【０１６１】
同様の実験で、試験した６個の予測されたｍｉＲ−１２２ａ標的遺伝子（ＧＹＳ１、ＳＬＣ７Ａ１、ＡＬＤＯ  Ａ、ＣＣＮＧ１、ＭＩＮＫ、Ｐ４ＨＡ１）のうちｍＭＩＮＫが、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによってモジュレートされないことが示された。
【０１６２】
ｍｉＲ−１２２ａ阻害に関し可変長のオリゴヌクレオチド効果を調べるため、予測されたｍｉＲ−１２２ａ標的ＧＹＳ１の調節を、本明細書記載の方法を用いてマウス初代肝細胞で評価した。細胞は、１５ｎＭ、４４ｎＭ、１３３ｎＭまたは４００ｎＭ用量の、ＩＳＩＳ  ３８６６５５、ＩＳＩＳ  ３８６６５６、ＩＳＩＳ  ３８６６５７、ＩＳＩＳ  ３８６６５８、ＩＳＩＳ  ３８６６５９またはＩＳＩＳ  ３８６６６０で処置した。切断が、ＧＹＳ１  ｍＲＮＡレベルのわずかに少ない刺激をもたらす一方で、いくつかの切断されたアンチセンス化合物はＧＹＳ１  ｍＲＮＡ発現を刺激し得た。対照試料と比較して、２個、４個または６個のヌクレオシドが５’末端から切断されたアンチセンス化合物は、このアッセイでＧＹＳ１  ｍＲＮＡ発現を刺激し得た。対照試料と比較して、２個のヌクレオシドが３’末端から切断されたアンチセンス化合物は、ＧＹＳ１  ｍＲＮＡ発現を刺激し得た。しかしながら、３’末端から４個または６個のヌクレオシドの切断は、ＧＹＳ１  ｍＲＮＡ発現を刺激するアンチセンス化合物の能力を有意に低下させた。
【０１６３】
予測された標的ＧＹＳ１における効果を阻害するｍｉＲ−１２２ａを標的とするオリゴヌクレオチドの能力におけるミスマッチの効果を調べるため、マウス初代肝細胞を、ｍｉＲ−１２２ａに対するミスマッチを有するオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ  ３８６６６１、ＩＳＩＳ  ３８６６６２、ＩＳＩＳ  ３８６６６３、ＩＳＩＳ  ３８６６６４、ＩＳＩＳ  ３８６６６５とＩＳＩＳ  ３８６６６６）で処置した。ミスマッチの数を増加させることは、ＧＹＳ１  ｍＲＮＡレベルをモジュレートするアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力を低下させるようである。１個のミスマッチは許容的であった；しかしながら、２個のミスマッチはＧＹＳ１  ｍＲＮＡレベルのわずかな増加をもたらしたが、３個〜６個のミスマッチはｍｉＲ−１２２ａアンチセンスオリゴヌクレオチド活性を完全に取り去った。
【０１６４】
本発明の実施形態は、予測されたｍｉＲ−１２２ａ標的を確認する方法を含む。また、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を用いてｍｉＲ−１２２ａ標的をモジュレートする方法が提供される。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列を有する。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ糖修飾を均一に含む。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５である。さらに、ｍｉＲ−１２２ａ標的遺伝子のモニタリング発現を含む、ｍｉＲ−１２２ａ阻害のアッセイ方法が提供される。
【０１６５】
実施例７：アンチセンスｍｉＲＮＡによるインビボのｍｉＲ−１２２ａ活性のモジュレーション−正常マウス
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）研究所から得た。マウスを治療群に分け、４週間、週二回、１２．５ｍｇ／ｋｇ〜７５ｍｇ／ｋｇ範囲のＩＳＩＳ  ３２７８９５用量で、または７５ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  ３４２６８３で腹膜内処置した。さらに、食塩水だけで処置したマウスを対照として取り扱った。マウスは、正常範囲の血漿ＡＳＴとＡＬＴレベルを有し、体重または食物摂取低下もなく、処置終了後も健常で正常に見えた。肝臓部の組織学的分析は、形態学的な外見上の変化を示さなかった。（肝臓の組織学的分析は、当分野で既知の通常の手順で行われた。簡潔には、肝臓を１０％緩衝ホルマリンに固定し、パラフィンろうに封埋した。4mmの切片に切り、スライドガラス上に乗せた。脱水後、切片をヘマトキシリン−エオシン染色した）。
【０１６６】
インビトロで特定された５個のｍｉＲ−１２２ａ標的ｍＲＮＡレベルは、タックマン（Ｔａｑｍａｎ）リアルタイムＰＣＲを用い、肝組織で評価された。５個のｍＲＮＡのうちの４個（ＧＹＳ１、ＡＬＤＯＡ、Ｐ４ＨＡ１とＣＣＮＧ１）は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５処置されたマウスで増加したが、対照オリゴヌクレオチドで処置されたマウスでは、標的ｍＲＮＡに変化は観察されなかった、これは、肝臓でのｍｉＲ−１２２ａの特異的な阻害を実際に示す。Ｐ４ＨＡ１は、試験したＩＳＩＳ  ３２７８９５で最も低用量で、最大の上方調節を示した。本発明の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与することを含む、動物でｍｉＲ−１２２ａ標的をモジュレートする方法である。１つの実施形態において、標的は肝臓においてモジュレートされる。１つの実施形態において、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ  ３２７８９５である。
【０１６７】
処置されたマウスの肝臓ＲＮＡ中のｍｉＲ−１２２ａに対するノーザンブロットは、ＩＳＩＳ  ３２７８９５の最も低用量（１２．５ｍｇ／ｋｇ）を用いた処置後のｍｉＲ−１２２ａレベルの３倍の低下、そして最も高用量（７５ｍｇ／ｋｇ）では１０倍を超える低下を示したが、対照オリゴヌクレオチドでは、肝臓中のｍｉＲ−１２２ａレベルに影響を及ぼさなかった。本発明の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与することを含む、動物における肝臓中のｍｉＲ−１２２ａレベルを低下させる方法である。１つの実施形態において、該アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ  ３２７８９５である。
【０１６８】
総コレステロール、トリグリセリドおよびグルコースの血漿レベルもまた、当分野で既知の方法（例えば、オリンパスＡＵ４００ｅ自動臨床解剖学分析器（Olympus AU400e automated clinical chemistry analyzer）、メルヴィル、ニューヨーク州）を用いて観察した。処置の４週後、食塩水または対照−オリゴヌクレオチド処置したマウスと比較して、ＩＳＩＳ  ３２７８９５を用いたｍｉＲ−１２２ａの阻害は血漿グルコース・レベルに有意に影響を及ぼさなかったが、総コレステロールおよびトリグリセリドの有意の低下は、試験した全ての用量で観察された。
【０１６９】
本発明の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を投与することを含む、動物における血清コレステロール、グルコースまたはトリグリセリドを低下させる方法を含む。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列を有する。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ糖修飾を均一に含む。
【０１７０】
実施例８：肥満の食餌誘発性モデルにおけるｍｉＲ−１２２ａアンチセンス・オリゴヌクレオチド処置の効果：２５ｍｇ／週の研究
雄のＣ５７ｂｌ／６マウス（６〜７週齢）は、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる処置を開始する前に、１９週間、高脂肪食（脂肪の６０％ｋｃａｌ）を与えられた。マウスは自由に食事をした。開始のインスリン・レベルは約１５ｎｇ／ｄＬであり、身体組成は約２０％が脂肪であった。合計１１回の全量について、マウスは、１２．５ｍｇ／ｋｇで週２回皮下に投薬された（すなわち２５ｍｇ／週）。各治療群は、５匹のマウスから成った。
【０１７１】
治療群は以下の通りである：食塩水、ＩＳＩＳ  ３２７８９５、ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス；ＩＳＩＳ  ３４２６８３、スクランブルの対照オリゴヌクレオチド。ＩＳＩＳ  ３４２６８３の配列は、ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号：３０）であり；このオリゴマー化合物は、２’−ＭＯＥヌクレオシドから均一に成り、ホスホロチオエート骨格を有し、そして、すべてのシトシンは５‐メチルシトシンである。
【０１７２】
身体組成は、研究の開始時にＭＲＩで決定され、処置の３．５週および５週後に行った。血清生化学的検査は、処置の２週、３週、４週、５週および６週後に分析された。インスリンは、処置の３週後の食事をする状態で、そして、処置の５週後の絶食状態で通常のＥＬＩＳＡにより測定された。経口ブドウ糖負荷試験は、処置の５週後に実施された（ルーチン手順：グルコースを投与し、血液サンプルを臨床分析器で採取し、分析した）。
【０１７３】
血清リポ蛋白質およびコレステロール・プロファイリングは、ベックマン・システム・ゴールド（Beckman System Gold）１２６ＨＰＬＣシステム、５０７ｅレフリジレイティッド・オートサンプラー（refrigerated autosampler）、１２６フォトダイオード・アレイ探知器（photodiode array detector）（ベックマン）、およびスパーロース（Superose）６ＨＲ１０／３０カラム（ファイザー）を用い、記載のように（Kieftら、1991）実施した。ＨＤＬ、ＬＤＬとＶＬＤＬ画分を５０５ｎｍの波長で測定し、コレステロール・キャリブレーション・キット（シグマ、セントルイス、ＭＯ）で確認した。各実験に関し、各リポ蛋白分画の絶対濃度を決定するために、三点標準曲線を三重に実施した。このように実施されたリポ蛋白質分析は、総コレステロールの減少が、低密度リポタンパク質と高比重リポタンパクの両方の割合の低下を反映することを示した。
【０１７４】
グリコーゲン合成酵素１は、ｍｉＲ−１２２ａの標的であり、その発現はｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害によってモジュレートされる。グリコーゲン合成酵素１の発現がＩＳＩＳ  ３２７８９５で処置したマウスの肝臓で上昇したので、肝臓のグリコーゲン含有量を評価した。ＩＳＩＳ  ３２７８９５で処置されたマウスの肝臓のグリコーゲン・レベルの有意な増加が観察され、これは、ｍｉＲ−１２２ａが筋肉グリコーゲン合成酵素（ＧＹＳ１）ｍＲＮＡの抑制を通じてグリコーゲン貯蔵を調節し得ることを示す。
【０１７５】
平均インスリン・レベルを表８に示す。血清化学的検査分析を表９に示す。
表８：２５ｍｇ／週ＤＩＯ研究の平均インスリン・レベル
【表８】
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【０１７６】
表９：２５ｍｇ／週ＤＩＯ研究の平均血清生化学的検査レベル。
ＧＬＵＣ＝グルコース；ＡＬＴ＝アラニンアミノ基転移酵素；ＡＳＴ＝アスパラギン酸アミノ基転移酵素；ｃｈｏｌ＝コレステロール；ｔｒｉｇｓ＝トリグリセリド；ＨＤＬ＝ＨＤＬコレステロール；ＬＤＬ＝ＬＤＬコレステロール；ＮＥＦＡ＝離脂肪酸
【表９】
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【０１７７】
その発現がインビボでのｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害に続いて上方調節されるｍｉＲ−１２２ａ標的遺伝子には、ＧＹＳ１、ＡＬＤＯ  Ａ、ＣＣＮＧ１およびＰ４ＨＡ１が含まれる。ｍＲＮＡレベルは、本明細書中で記載されて、当分野で一般に知られている手順を用い、リアルタイムＰＣＲで測定された。ＩＳＩＳ  ３２７８９５で処置されたマウスにおけるこれらの遺伝子の上方調節により、ｍｉＲ−１２２ａ活性の阻害が確認される。
【０１７８】
肝臓の組織学的分析は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５処置により肝臓脂肪症の実質的な軽減を示した。肝臓トリグリセリドレベルもまた、ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害で低下した。肝臓重量もまた減少した。ＩＳＩＳ  ３２７８９５処置されたマウスにおける血漿アミノ基転移酵素レベルの低下傾向は、肝機能の改善を示す。これらの変化はまた、重要な酵素、ＦＡＳＮ、ＡＣＣ２およびＳＣＤ１のｍＲＮＡレベルの低下と相関した。
【０１７９】
摂食量のわずかな低下が、ＩＳＩＳ  ３２７８９５処置されたマウスで観察された。コレステロールは、２週間の処置で約３５％、そして本研究終了時に約４０％減少した。ＨＤＬは、４週間の処置で５０％減少し、そしてＬＤＬは２８％減少した。観察されたコレステロールの低下と一致して、ウエスタンブロット法で測定された、ＩＳＩＳ  ３２７８９５処置されたマウス血漿中のＡｐｏＢ−１００蛋白質レベルは、食塩水処置されたマウスと比較して減少していた。グルコース、血清アミノ基転移酵素、身体組成または摂食量に有意な変化は、観察されなかった。ＦＦＡおよび血清トリグリセリドにわずかな変化が観察された。変化は、表８で示されるようにインスリン・レベルで観察された。ＩＳＩＳ  ３２７８９５による処置は、わずかに肝臓グリコーゲン・レベルを増加させた。
【０１８０】
本発明の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を投与することにより、動物の血清中の、インスリン感受性を改善する方法、コレステロールを低下させる方法、ＬＤＬコレステロールを低下させる方法、ＦＦＡを低下する方法、ＡｐｏＢ−１００レベルを低下させる方法およびトリグリセリドを低下させる方法を含む。さらなる実施形態において、インスリン感受性の改善は、循環インスリン・レベルの低下として測定される。つの実施形態において、アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列を有する。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ糖修飾を均一に含む。さらなる実施形態において、アンチセンス化合物はＩＳＩＳ  ３２７８９５である。
【０１８１】
実施例９：ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害に続く遺伝子発現変化
１つの実施形態において、ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害に続く肝臓遺伝子発現の変化は、マイクロアレイ分析によって評価した。肝臓ＲＮＡは、週二回５０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  ３２７８９５で処置された正常なマウスから、および食塩水単独で処置された動物から単離し、そしてマイクロアレイ分析を実施した。GE CODELINK（登録商標）Mouse Whole Genome Bioarraysは、製造業者のプロトコルに従って用いられた。ジーン・オントロジー（Gene Ontology）カテゴリーによるモジュレートされた遺伝子の分析は、脂質代謝と炭水化物代謝の調節に関与する多くの遺伝子が、ＩＳＩＳ  ３２７８９５処置されたマウスで影響を受けたことを示した。脂肪酸合成経路、コレステロール生合成経路、アセチルＣｏＡ輸送経路および解糖経路の重要な酵素が阻害された。ホスホメバロネートキナーゼ（ＰＭＶＫ）ｍＲＮＡの下方調節は、統計学的に有意だった。ＨＭＧＣＲおよびＰＭＶＫを含む、コレステロール代謝に関連するいくつかの他の遺伝子も低下した。ＡＣＣ１、ＡＣＣ２、ＡＣＬＹ、ＳＣＤ１およびＦＡＳＮを含む、脂肪酸合成と脂肪酸酸化を調節することが知られているいくつかの重要な遺伝子は、マイクロアレイ実験で有意に下方調節され、そして、この５個の遺伝子の下方調節はリアルタイムＰＣＲによって確認された。
【０１８２】
上方調節された遺伝子の多くは、脳、受精卵および胎盤で強い発現を示す。肝細胞脱分化の指標となる遺伝子、例えばＨＮＦ−１α、ＨＮＦ−１β、ＨＮＦ−４、アルブミン、サイトケラチン１９およびα‐フェトプロテイン）は、ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害に続いて、変化した発現を示さなかった。マイクロアレイデータは、一連の受入番号ＧＳＥ３６０３で公的にアクセス可能なデータベースGene Expression Omnibus（GEO、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）に供託されており、出典明示により本明細書の一部とされる。
【０１８３】
マイクロアレイ実験は、直接的にｍｉＲ−１２２ａ標的遺伝子を特定するよりはむしろ主に慢性処置後のｍｉＲ−１２２ａ阻害の下流の影響を明らかにするために設計されたが、その３’ＵＴＲにあるマッチングのシード（種）となる限られた７個または８個のヌクレオシドを有する、有意に上方調節された１０８個の遺伝子が確認された。これらは、直接的なｍｉＲ−１２２ａ標的遺伝子であり得る。これら大部分のｍＲＮＡは、わずか１．５−３倍だけ増加した。これらの遺伝子は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号および関連遺伝子記号により、以下の表（表１０）中で特定される。標的が７個または８個のヌクレオシドのシードを含むかどうかも示す。
【０１８４】
表１０：インビボでのｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害に続く標的遺伝子発現プロフィール
【表１０−１】
0005523705.tif 000013
【表１０−２】
0005523705.tif 000014
【表１０−３】
0005523705.tif 000015
【０１８５】
従って、本発明の別の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａ標的を特定する方法である。本発明の別の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａをモジュレートすることを含む、上記表中で特定される１０８個の標的のいずれかの発現をモジュレートする方法である。特定の実施形態において、ｍｉＲ−１２２ａは、アンチセンス化合物によってモジュレートされる。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列を有する。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ糖修飾を均一に含む。さらなる実施形態において、アンチセンス化合物は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５である。
【０１８６】
実施例１０：ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害に続く脂質代謝のモジュレーション
脂肪酸酸化は、ＡＴＰ産生異化経路である。中心的な代謝センサーＡＭＰＫは、脂肪酸酸化のようなＡＴＰ生成経路を促進させるために作用し、そして脂肪酸合成のようなエネルギー貯蔵経路を阻害する重要な調節酵素である。
【０１８７】
脂肪酸酸化は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５処置されたマウスの肝臓から単離された肝細胞で測定された。初代肝細胞は、合計５回の用量で週２回、２５ｍｇ／ｋｇで食塩水、ＩＳＩＳ  ３２７８９５またはＩＳＩＳ  ３４２６８３処置された痩せＣ５７Ｂｌ／６マウスから単離された。肝細胞を、フラスコに１×１０６細胞密度で２５ｃｍ２の培養フラスコに蒔いた。細胞を蒔く前に、フラスコを、室温で１０分間リン酸緩衝食塩水中２ｍｌの０．１ｍｇ／ｍｌのコラーゲンで処置した。各肝臓で４つのフラスコを作り、そのうちの３つを脂肪酸酸化実験に用い、そのうちの１つは蛋白質測定のために取っておいた。肝細胞の各フラスコに、１．０ｎＭインスリンおよび１０％ウシ胎児血清を添加した３ｍｌのウィリアムＥ培地を加えた（培地と添加剤は、例えばインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ、カールズバッド、カリフォルニア州から入手可能である）。一晩の培養に続き、細胞を、リン酸緩衝食塩水で二回洗浄し、次に０．２５％ウシ血清アルブミンと０．２５ｕＣｉ  １４Ｃ−オレイン酸を含む２．０ｍｌの低グルコースＤＭＥＭ中で培養した。フラスコを、５％ＣＯ２／９５％Ｏ２で満たし、濾紙を有する０．５ｍｌ管付きの中隔ゴムストップで栓をした。３時間後、０．４ｍｌの７０％ＨＣｌＯ４を培地中に注入し、そして０．０５ｍｌの２５％  ＮａＯＨを、ＣＯ２を回収するために濾紙上に素早く注入した。ＣＯ２収集の３〜４時間後、濾紙を取り出し、シンチレーション・バイアルに置いた。濾紙を含む０．５ｍｌ管を水で２回洗浄し、そしてその水をシンチレーション・バイアルから移した。培地１．２ｍｌを、各フラスコから回収し、遠心分離して、その上清をさらなるシンチレーション管に移した。ＣＯ２回収中および培地上清中の放射能を決定し、脂肪酸酸化速度を算出するために用いた。脂肪酸酸化速度は、各フラスコの蛋白質レベルで規準化した。
【０１８８】
結果を図５に示す。ＩＳＩＳ  ３２７８９５による処置は、食塩水および対照オリゴヌクレオチドにより処置された試料と比較して、有意に脂肪酸酸化を増加させた。ＡＭＰＫレベルは、ＩＳＩＳ  ３２７８９５で処置されたマウスの肝臓抽出物全体のウェスタンブロット法により調べられ、食塩水または対照オリゴマー化合物で処置されたマウスと比較された。全ＡＭＰＫα１蛋白質レベルは、ＩＳＩＳ  ３２７８９５で処置されたマウスで不変であったが、リン酸化ＡＭＰＫα１レベルは、食塩水で処置されたマウスと比較して２．５倍以上増加した。
【０１８９】
ｍｉＲ−１２２ａ阻害後のＦＡＳＮ、ＡＣＣ１およびＡＣＣ２  ｍＲＮＡの観察された低下によれば、脂肪酸合成速度は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５で処置されたマウスからの肝細胞において、食塩水で処置されたマウスからの肝細胞と比較してほぼ２倍低下された。ステロール合成速度もまた、有意に低下された。ステロール合成速度および脂肪酸合成速度は、それぞれ、当分野で記載の方法を用いて、［１４Ｃ］アセテートのステロールと脂肪酸への取り込みを測定することによって決定された(Jiangら、2005 J. Clin. Invest. 115:1030-1038)。
【０１９０】
本発明の実施形態は、動物にｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を投与することを含む、肝臓の脂肪酸合成とステロール合成を減少させる方法および動物で肝臓の脂肪酸酸化を増加させる方法を含む。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列を有する。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ糖修飾を均一に含む。
【０１９１】
実施例１１：ｏｂ／ｏｂマウスにおけるｍｉＲ−１２２ａアンチセンス・オリゴヌクレオチド処置の効果
８週齢のｏｂ／ｏｂマウスに、４．５週間、週２回、食塩水に２５ｍｇ／ｋｇ用量で溶解させたＩＳＩＳ  ３２７８９５または対照オリゴヌクレオチドを腹腔内注射で与えた。血液を、通常の臨床分析器（例えば、オリンパスＡＵ４００ｅ自動臨床解剖学分析器、メルヴィル、ニューヨーク州）を用いて採取し、分析した。ＩＳＩＳ  ３２７８９５による処置は、対照オリゴヌクレオチドによる処置（約２３７ｍｇ／ｄＬ）または塩類単独での処置（約２４１ｍｇ／ｄＬ）と比較して、血漿コレステロールレベルの有意な低下（約１６８ｍｇ／ｄＬ）を引き起こした。
【０１９２】
ｍｉＲ−１２２ａのアンチセンス阻害はまた、対照オリゴヌクレオチドによる処置（約１６１ｍｇ／ｇ）または塩類単独での処置（約１５１ｍｇ／ｇ）と比較して、肝臓トリグリセリドレベルを低下させた（約８９ｍｇ／ｇ）。肝臓トリグリセリドレベルは、当分野で記載される通常の方法を用いて測定される(Desai, et al. 2001, Diabetes, 50: 2287-2295）。脂肪症の軽減は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５を用いた処置群における血漿ＡＬＴおよびＡＳＴレベルの減少に反映される。従って、本発明の他の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａ機能を阻害するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを投与することを含む、動物において肝臓トリグリセリドを低下させる方法、動物で血清コレステロールを低下させる方法および動物で肝臓機能を改善する方法を含む。本発明はまた、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を投与することを含む、動物で高脂血症または肝臓脂肪症を改善する方法または予防する方法が考えられる。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列を有する。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ糖修飾を均一に含む。さらなる実施形態において、アンチセンス化合物は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５である。
【０１９３】
血漿グルコースまたは耐糖能の変化は観察されず、また明白な毒性もなく、食物摂取または体重の変化は治療群全体で観察されなかった。これらの結果は、ｍｉＲ−１２２ａがコレステロールおよび脂質代謝を調節する役割を果たすことを実際に示す。この効果はレプチン作用からは独立しており、そしてｍｉＲ−１２２ａの低下に起因する明白な副作用はない。
本発明の別の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａを阻害することによってコレステロールおよび脂質代謝を調節する方法である。
【０１９４】
実施例１２：強化アンチセンス化合物を用いたインビボでのｍｉＲ−１２２ａ活性アンチセンス阻害
本発明のアンチセンス化合物は、それらが標的とされる低分子非コードＲＮＡの活性または機能をモジュレートする。この実施例では、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を例示する；しかしながら、本発明のアンチセンス化合物の修飾は、ｍｉＲ−１２２ａをモジュレートするアンチセンス化合物に限定されない。
【０１９５】
雄のＣ５７ＢＬ／６マウスはジャクソン研究所から得た。マウスは、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物で処置するか、または対照処置として食塩水を与えた。試験したアンチセンス化合物のうちの１つには、完全にｍｉＲ−１２２ａと相補的な２’−ＭＯＥの均一に修飾された化合物、ＩＳＩＳ  ３２７８９５が含まれた。また、モチーフ（Ａ−Ａ−Ｂ）７（−Ａ−Ａ）１を有する位置的に修飾されたアンチセンス化合物（Ａは２’−ＭＯＥであり、ＢはＬＮＡである）、ＩＳＩＳ  ３８７５７４をインビボ試験した。ＩＳＩＳ  ３８７５７４は、完全にｍｉＲ−１２２ａと相補的である。
【０１９６】
マウスは、合計６回の用量で腹膜内にアンチセンス化合物を２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与された。治療期間の終わった後、ＲＮＡを肝臓から単離し、そしてｍｉＲ−１２２ａ標的ｍＲＮＡ、ＡＬＤＯＡのレベルをタックマン（Ｔａｑｍａｎ）リアルタイムＰＣＲを用いて測定された。食塩水処置された動物と比較して、２’−ＭＯＥで均一に修飾された化合物を用いた処置は、ＡＬＤＯ  Ａ  ｍＲＮＡレベルが、食塩水処置された動物のレベルの約４倍となった。位置的にに修飾された化合物を用いた処置は、ＡＬＤＯ  Ａ  ｍＲＮＡレベルが、食塩水処置された動物で観察されるレベルの約５倍となった。したがって、二環式糖部分の、特に均一に修飾された骨格への組み込みは、ｍｉＲ−１２２ａ活性を阻害するアンチセンス化合物のインビボにおける能力を増強した。
【０１９７】
血清総コレステロールレベルはまた、当分野で既知の方法（例えば、オリンパスＡＵ４００ｅ自動臨床解剖学分析器を介して、メルヴィル、ニューヨーク州）を用いて観察された。総コレステロールの低下は、２’−ＭＯＥで均一に修飾された化合物または位置的に修飾された２’−ＭＯＥ／ＬＮＡ化合物で処置されたマウスで観察された。
【０１９８】
血清サンプルに対して行われるさらなる測定には、ＬＤＬコレステロール、トリグリセリドおよび血清アミノ基転移酵素測定が挙げられる。そのようなインビボ研究で実施されるさらなる分析には、形態学的変化を評価する肝臓切片の組織学的分析が含まれる。肝臓の組織学的分析は、当分野で既知の通常の手順で行われる。簡単には、肝臓を１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンろうに封埋する。４ｍｍの切片に切り、スライドガラス上に乗せる。脱水後、切片をヘマトキシリン−エオシンで染色する。形態学的分析は、当分野で既知のオイル・レッド・オー（Oil Red O）染色手順を用いる、肝臓脂肪症の評価を含んでもよい。
【０１９９】
本発明の実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａ核酸を標的とするアンチセンス化合物を投与することを含む、動物における血清総コレステロールを低下させる方法を含む。１つの実施形態において、アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列を有する。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、２’−ＭＯＥ糖修飾を均一に含む。さらなる実施形態において、アンチセンス化合物が位置的に修飾されたモチーフ、５’−（Ａ−Ａ−Ｂ）ｎ（−Ａ）ｎｎ−３’（Ａは２’−ＭＯＥであり、ＢはＬＮＡであり、ｎは７であり、そしてｎｎは２である）を有する。さらなる実施形態において、アンチセンス化合物は、ＩＳＩＳ  ３２７８９５である。別の実施形態において、アンチセンス化合物は、ＩＳＩＳ  ３８７５７４である。加えて、これらのアンチセンス化合物はいずれも、１つまたはそれ以上のさらなる表現型変化、例えば低血清ＬＤＬコレステロール、低血清トリグリセリドまたは軽減された肝臓脂肪症を達成するために用いられる。
【０２００】
類似の研究で、ｍｉＲ−１２２ａを標的とし、そして切断を有するアンチセンス化合物をインビボ試験した。アンチセンス化合物の５’末端の単一ヌクレオシドの切断は、全長のアンチセンス化合物、ＩＳＩＳ  ３２７８９５と同等のＡＬＤＯ  Ａ  ｍＲＮＡレベルの増加となった。５’末端から２個のヌクレオシド切断、３’末端から５個のヌクレオシド切断または３’末端から１個のヌクレオシド切断は、わずかに高いＡＬＤＯ  Ａ  ｍＲＮＡレベルとなった。３’末端から３個のヌクレオシド切断は、ＡＬＤＯ  Ａ  ｍＲＮＡレベルの増加とならなかった。従って、本発明のさらなる実施形態は、ｍｉＲ−１２２ａを標的とするアンチセンス化合物を用い、本明細書中記載の方法のいずれかを行うことを含み、ここで、該アンチセンス化合物は、配列番号：２記載の核酸塩基配列と比較して、５’末端から２個までの切断または３’末端から１個までの切断を有する。
【配列表】
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