(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離細胞内の正常なゲノム成分及びクロマチン成分内にある内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法であって、
前記細胞を、第１のジンクフィンガータンパク質又は第１の核酸と接触させる工程であって、これにより前記内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程を含んでなり、
前記第１のジンクフィンガータンパク質は、調節ドメインを含む融合タンパク質であり、前記内因性細胞遺伝子内の第１の標的部位を認識するよう操作されてなるとともに、Ｋｄが２５ｎＭ未満であり、
前記第１の核酸は、前記第１のジンクフィンガータンパク質をコードするとともに、前記プロモーターに作動可能に連結されるように構成される、方法。
【請求項２】
前記接触工程が、前記内因性細胞遺伝子内における第２の標的部位を、第２のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の第１の標的部位及び第２の標的部位が隣接している、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の第１のジンクフィンガータンパク質及び第２のジンクフィンガータンパク質が共有結合している、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記の第１及び第２のジンクフィンガータンパク質が、それぞれ調節ドメインを含んでなる融合タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記第１及び第２のジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調節ドメインをそれぞれ含む融合タンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記内因性細胞遺伝子が、ＶＥＧＦ及びＥＰＯからなる群から選択される、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記調節ドメインが、転写リプレッサー、転写活性化因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ及びヒストンジアセチラーゼからなる群から選択される、請求項１、５及び６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のジンクフィンガータンパク質を含む送達ベヒクルを前記細胞に最初に投与する工程を更に含んでなり、
前記送達ベヒクルが、リポゾーム又は膜輸送ポリペプチドを含む、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の核酸を、脂質：核酸複合体として、又は裸の核酸として、前記細胞に最初に投与する工程を更に含む、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の核酸を含む発現ベクターを、前記細胞に最初に投与する工程を更に含む、請求項１〜１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現ベクターがウイルス発現ベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター又はＡＡＶ発現ベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１のジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、請求項１５〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のジンクフィンガータンパク質が、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、請求項１５〜１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の標的部位が、前記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流に存在する、請求項１〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の標的部位が、前記内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する、請求項１〜２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の標的部位が、前記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接する、請求項１〜２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のジンクフィンガータンパク質がＳＰ−１骨格を含む、請求項１〜２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のジンクフィンガータンパク質がヒト化されている、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記調節が遺伝子発現の活性化である、請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記調節が遺伝子発現の阻害である、請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記内因性細胞遺伝子の発現が少なくとも７５％〜１００％阻害される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記内因性細胞遺伝子の発現が少なくとも２００〜５００％に活性化される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記調節によって遺伝子活性化が予防される、請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記調節によって遺伝子発現の抑制が妨害される、請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記内因性細胞遺伝子が発生的にサイレント又は不活性である、請求項１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子の発現が少なくとも１５０％に活性化される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
正常なゲノム成分及びクロマチン成分内にある内因性細胞遺伝子を含んでなるとともに、第１のジンクフィンガータンパク質又は第１の核酸を投与された単離細胞であって、
前記第１のジンクフィンガータンパク質は、調節ドメインを含む融合タンパク質であり、前記内因性細胞遺伝子内の第１の標的部位を認識するよう操作されてなるとともに、Ｋｄが２５ｎＭ未満であり、
前記第１の核酸は、前記第１のジンクフィンガータンパク質をコードするとともに、前記プロモーターに作動可能に連結されるように構成され、
前記内因性細胞遺伝子が、ＶＥＧＦ及びＥＰＯからなる群から選択され、
但しヒト胚性幹細胞ではない、細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  （関連出願への相互参照）
本出願は、１９９９年１月１２日提出、ＵＳＳＮ  ０９／２２９，０３７の一部継続出願であり、そしてその権利を主張する。本出願はまた、１９９９年１月１２日提出、ＵＳＳＮ  ０９／２２９，００７に関し、両方は、本明細書においてその全体が参考として援用される。
【０００２】  （連邦政府支援の研究および開発に関する声明）
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより与えられた、助成金番号１Ｒ４３ＤＫ５２２５１−０１のもとで米政府の支援によりなされた。米政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】  本発明は、組換えジンクフィンガータンパク質を用いる内因性遺伝子の遺伝子発現を調節するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】  多数の病態生理学的なプロセスが、異常な遺伝子発現の結果である。例としては、慢性関節リウマチにおける炎症誘発性サイトカインの不適切な活性化、高コレステロール血症における肝性ＬＤＬレセプターの過少発現、脈管形成促進（ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）因子の過剰発現、および固体腫瘍増殖における抗脈管形成性因子の過少発現が挙げられる。遺伝子発現の制御のための治療的方法が存在する場合、これらの多数の病理は、より必要に応じて処置され得る。別の実施例では、発生的にサイレントな、またはそうでなければ不活性な遺伝子が、特定の疾患状態を処置するために活性化され得る。不活性な遺伝子は、いくつかの機構を介して抑制される。この機構には、クロマチン構造、特異的ｃｉｓ−作動性リプレッサー、およびＤＮＡメチル化が挙げられる（Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｃｅｌｌ  ９６：３１１（１９９６）；ＢｅａｔｏおよびＥｉｓｆｅｌｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３５５９（１９９７）；Ｗｏｌｆｆｅら、ＰＮＡＳ  ９６：５８９４（１９９９））。このような遺伝子の発現のための治療的利点の例としては、鎌状赤血球症を処置するための発生的にサイレントな胎児ヘモグロビン遺伝子の活性化および筋ジストロフィーを処置するためのユートロフィン（ｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）の活性化が挙げられる。さらに、病原性生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌および原生動物類）は、遺伝子発現を変化することにより制御され得る。従って、疾患関連遺伝子の配列特異的調節を通して作用する治療的アプローチの明白な未対処の必要性が存在する。【０００５】  遺伝子発現を操作する能力により提供された直接的な治療的有用性に加えて、この能力は、目的の遺伝子の機能を決定するために実験的に用いられ得る。新しく発見される遺伝子の機能を実験的に決定するための通常存在する１つの方法は、強力なプロモーターにより駆動される発現ベクターにそのｃＤＮＡをクローニングすること、および形質転換された細胞におけるその過剰発現の生理学的な結果の測定である。この方法は、労働集約的であり、そして標的遺伝子の下方制御の生理学的結果をアドレスしない。特徴づけされていない遺伝子の選択的な過剰発現および過少発現を可能にする簡易な方法は、科学の社会に対して大いに有用である。細胞モデル系、トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物における遺伝子の調節を可能にする方法は、学術的な研究室、製薬会社、ゲノム関連会社および生物工学産業において広範な用途を見出す。【０００６】  遺伝子発現の操作を可能にするツールのさらなる使用は、商業的に有用な生物学的産物の産生にある。細胞株、トランスジェニック動物およびトランスジェニック植物が、有用なタンパク質産物を過剰発現するために操作され得る。例として、このような操作された細胞株によるエリスロポイエチンの産生は、役立つ。同様に、代謝経路からの産生は、重要な酵素をコードする遺伝子の選択的な上方制御または下方制御により変化または改善され得る。この例は、脂肪酸飽和のレベルの変化を有する植物の作製である。【０００７】  現在、所定の遺伝子の発現を変化させ得る方法が、当該分野に存在し、これらの方法は、例えば、リボザ��ム、アンチセンス技術、低分子調節因子、ｃＤＮＡクローンの過剰発現および遺伝子ノックアウトを用いる。これらの方法は、現在まで、多数の適用には一般的に不十分であることが証明されており、そして代表的には、インビボにおける高い標的効率または高い特異性のいずれも実証しなかった。有用な実験的結果および治療的処置のために、これらの特徴は、望ましい。【０００８】  遺伝子発現は、通常、転写因子と呼ばれる、配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質の機能の変化を通じて制御される。これらは、遺伝子の転写開始点に一般的に近接して（時には大きい距離であるが）結合する。それらは、プロモーターで転写開始複合体の形成または機能の有効性に影響するように作用する。転写因子は、陽性の様式（トランスアクチベーション）または陰性の様式（トランスリプレッション）で作用し得る。【０００９】  転写因子の機能は、構成的（常に「オン」）または条件的であり得る。条件的な機能は、種々の手段により転写因子上に与えられ得るが、これらの調節機構の大部分は、細胞質における因子の隔離および誘導性放出ならびに引き続く核転移、ＤＮＡ結合およびトランスアクチベーション（またはリプレッション）に依存する。この手段に機能する転写因子の例としては、プロゲステロンレセプター、ステロール応答エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）およびＮＦ−κＢが挙げられる。リン酸化に応答する転写因子、またはそれらの同族ＤＮＡの認識配列に結合するそれらの能力を変化することによる、低分子リガンドの例が存在する（Ｈｏｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１７０１（１９９４）；ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ，ＰＮＡＳ  ８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９１〜４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２〜４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：１１４７〜１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７〜７６１（１９９８））。この機構は、原核生物では通常であるが、真核生物においては、それほど通常ではない。【００１０】  ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）は、配列特異的様式でＤＮＡに結合し得るタンパク質である。ジンクフィンガーは、最初、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞由来の転写因子ＴＦＩＩＩＡにおいて同定された。ＺＦＰは、真核生物において偏在している。これらのタンパク質の１つのクラス（Ｃ2Ｈ2クラス）を特徴付ける代表的モチーフは、−Ｃｙｓ−（Ｘ）2-4−Ｃｙｓ−（Ｘ）12−Ｈｉｓ−（Ｘ）3-5−Ｈｉｓ（ここでＸは、任意のアミノ酸である）である。単一のフィンガードメインは、約３０アミノ酸長であり、そしていくつかの構造的研究は、これが、単一のβターンの２つのシステインを有するジンクを通じて、整列された（ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ）２つの不変のヒスチジン残基を含むαヘリックスを含むことを実証している。現在まで、１０，０００個をこえるジンクフィンガー配列が、数千の公知の転写因子または推定の転写因子において同定されている。ＺＦＰは、ＤＮＡ認識だけでなく、ＲＮＡ結合およびタンパク質−タンパク質結合にも関���する。現在、このクラスの分子が全ヒト遺伝子の約２％を構成すると見積もられている。【００１１】  マウス転写因子由来の３フィンガードメインである、Ｚｉｆ２６８のＸ線結晶構造は、同属のＤＮＡ配列との複合体で解析されており、そして、それぞれのフィンガーが、同期的なローテーションおよびＤＮＡの主軸に沿ったフィンガーの翻訳により次のフィンガーに重ね合わせられ得ることを示す。この構造は、それぞれのフィンガーが、独立して３をこえる塩基対の間隔で、それぞれのＤＮＡトリプレットサブサイトと接触を生じるそれぞれの認識ヘリックス上の−１，２，３および６位で側鎖でＤＮＡと、相互作用することを示唆する。Ｚｉｆ２６８のアミノ末端は、そのＤＮＡ認識サブサイトの３’末端に位置する。いくつかのジンクフィンガーは、標的セグメントにおいて４番目の塩基と結合し得る。４番目の塩基は、ジンクフィンガーによって認識される他の３つの塩基の逆鎖上にあり、そして３塩基サブサイトのすぐ３’側の塩基に相補的である。【００１２】  Ｚｉｆ２６８−ＤＮＡ複合体の構造はまた、ＺＦＰのＤＮＡ配列特異性が、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（−１，２，３および６）でアミノ酸置換を作製することにより変化され得ることを示唆した。この観察を試験するための、ジンクフィンガーコンビナトリアルライブラリーを用いるファージ提示実験は、１９９４年の一連の文献に公開された（Ｒｅｂａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１〜６７３（１９９４）；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９〜５６９５（１９９４）；Ｃｈｏｏら、ＰＮＡＳ  ９１：１１１６３〜１１１６７（１９９４））。コンビナトリアルライブラリーは、Ｚｉｆ２６８の最初のフィンガーまたは中間のフィンガーのいずれかにおける無作為化側鎖で構築され、次いで、適切なＤＮＡサブサイトが変化したＤＮＡトリプレットにより置換された変化したＺｉｆ２６８結合部位を用いて単離された。導入された変異の性質と結合特異性において得られた変化との相関は、変化した結合特異性を有するＺＦＰの合理的な設計のための置換規則の部分的なセットを生じた。【００１３】  ＧｒｅｉｓｍａｎおよびＰａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：６５７〜６６１（１９９７）は、ジンクフィンガータンパク質のそれぞれのフィンガーが無作為化および選択に成功裏に供されるファージ提示方法の詳細について議論する。この文献は、核ホルモン応答エレメント、ｐ５３標的部位およびＴＡＴＡボックス配列についてのＺＦＰの選択を報告した。【００１４】  組み換えＺＦＰは、培養細胞における一過的に発現されたレポーター遺伝子の遺伝子発現を調節する能力を有することを報告されている（例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３〜９６（１９９５）；Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ９４：５５２５〜５５３０、１９９７）；およびＢｅｅｒｌｉら、ＰＮＡＳ  ９５：１４６２８〜１４６３３（１９９８）を参照のこと）。【００１５】  例えば、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３〜９６（１９９５）は、Ｏｃｔ−１由来のホメオドメインを有するＺｉｆ２６８由来の２つのフィンガーを融合することにより新規なＤ��Ａ結合タンパク質を設計する試みを報告する。次いで、このハイブリッドタンパク質は、キメラタンパク質として発現されるための転写アクチベーターまたはレプレッサードメインのどちらかと融合された。そのキメラタンパク質は、その２つの成分のサブサイトのハイブリッドを表示する標的部位を結合することが報告された。次いで、この著者らは、プロモーターに作動可能に連結されるルシフェラーゼ遺伝子、およびプロモーターに近接する、キメラＤＮＡ結合タンパク質についてのハイブリッド部位を含むレポーターベクターを構築した。この著者は、それらのキメラＤＮＡ結合タンパク質が、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を活性化し得るかまたは抑制し得ることを報告した。【００１６】  Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ９４：５５２５〜５５３０（１９９７）は、それぞれ３つのフィンガーを有する２つのコンポーネントＺＦＰに連結するためのペプチドスペーサーを用いることによる複合性のＺＦＰを形成する工程を報告する。次いで、この複合性タンパク質は、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメインにさらに連結される。得られたキメラタンパク質が、２つのコンポーネントＺＦＰにより結合される標的セグメントから形成される標的部位に結合することが報告された。さらに、キメラＺＦＰは、その標的部位がレポーターに作動可能に連結されたプロモーターに近接したレポータープラスミドに挿入された場合、レポーター遺伝子の転写を活性化または抑制し得ることが報告された。【００１７】  Ｂｅｅｒｌｉら、ＰＮＡＳ  ９５：１４６２８〜１４６３３（１９９８）は、ＫＲＡＢ、ＥＲＤもしくはＳＩＤ転写リプレッサードメイン、またはＶＰ１６もしくはＶＰ６４転写活性化ドメインのいずれかに融合したキメラ６フィンガーＺＦＰの構築を報告する。このキメラＺＦＰは、ヒトｅｒｂＢ−２遺伝子の５’未翻訳領域における１８ｂｐ標的部位を認識するように設計された。この構築物を用いて、この研究の著者らは、ｅｒｂＢ−２プロモーターに連結された、一過性に発現されたレポータールシフェラーゼ構築物の活性化および抑制の両方を報告する。【００１８】  さらに、組み換えＺＦＰは、ｂｃｒ−ａｂｌ癌遺伝子をコードする組み込まれ得たプラスミド構築物の発現を抑制することが報告された（Ｃｈｏｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：６４２〜６４５（１９９４））。ＺＦＰが結合する標的セグメントは、ｂｃｒおよびａｂｌをコードする遺伝子を融合する特異的な癌遺伝子転移により作製された接合部位を重複するように選択された９塩基配列ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＣであった。この概念は、この標的部位に特異的なＺＦＰが、ａｂｌまたはｂｃｒコンポーネント遺伝子への結合なく、癌遺伝子に結合することである。この著者らは、この標的セグメントに結合する改変ＺＦＰを選択するためにファージ提示を用いた。次いで、このように単離された改変体ＺＦＰは、細胞株における安定にトランスフェクトされたｂｃｒ−ａｂｌ構築物の発現を抑制することが報告された。【００１９】  現在まで、これらの方法は、一過性に発現された遺伝子または外因性の遺伝子（ゲノムに組み込まれた）のいずれかの調節に焦点をおいていた。Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、ＬｉｕらおよびＢｅｅｒｌｉにより記載��れた一過性に発現された遺伝子は、エピソームであり、そして染色体遺伝子と同様の様式ではクロマチンにパッケージされない。さらに、Ｃｈｏｏらによって記載された安定に発現された遺伝子でさえゲノムに無作為に組み込まれ、そして外因性遺伝子と比較した場合、天然のクロマチン環境には見出されない。対照的に、ＺＦＰを用いるその天然のクロマチン環境における内因性細胞遺伝子の特異的調節は、まだ当該分野では実証されていない。
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】  従って、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を調節する初めての方法を提供する。ここで、その内因性遺伝子は、細胞内で一過的に発現されている遺伝子とは対称的に、その天然のクロマチン環境下にあるか、ゲノム内に外因的に組込まれた遺伝子である。さらに、本発明は、発生的にサイレントな内因性遺伝子の初めての活性化を提供する。１つの好ましい実施態様において、調節方法は、約２５ｎＭ未満のＫｄを有するＺＦＰを使用して、遺伝子転写を活性化するかまたは抑制する。従って、本発明のＺＦＰを使用して、２０％以上まで内因性細胞遺伝子の転写を抑制し得、そして約１．５倍以上まで内因性細胞遺伝子の転写を活性化するために使用し得る。
【課題を解決するための手段】
【００２１】  １つの実施態様において、本発明は、細胞における内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法であって、この方法は、以下の工程：
この内因性細胞遺伝子における第１の標的部位を、第１のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここでこのジンクフィンガータンパク質のＫdは、約２５ｎＭ未満である工程であって；
これにより少なくとも約２０％この内因性細胞遺伝子の発現を阻害する工程、を含む、方法を提供する。
【００２２】  １つの局面において、本発明は、細胞中の内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する：その内因性細胞遺伝子における第一の標的部位を第一のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで、そのジンクフィンガータンパク質のＫdは、約２５ｎＭ未満である、工程であって；これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を少なくとも約２０％まで阻害する工程。
【００２３】  別の局面において、本発明は、細胞中の内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する：その内因性細胞遺伝子における標的部位を６つのフィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで、そのジンクフィンガータンパク質のＫdは、約２５ｎＭ未満である、工程であって；これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を少なくとも約２０％まで阻害する工程。
【００２４】  １つの実施態様において、内因性細胞遺伝子の発現は、少なくとも約７５〜１００％まで阻害される。別の実施態様において、遺伝子発現の阻害は、遺伝子の活性化を妨げる。
【００２５】  別の局面において、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する：その内因性細胞遺伝子における第一の標的部位を第一のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで、そのジンクフィンガータンパク質のＫdは、約２５ｎＭ未満である、工程であって；これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を少なくとも約１５０％まで活性化する工程。
【００２６】  別の局面において、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する：その内因性細胞遺伝子における標的部位を６つのフィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここで、そのジンクフィンガータンパク質のＫdは、約２５ｎＭ未満である、工程であって；これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を少なくとも約１５０％まで活性化する工程。
【００２７】  １つの実施態様において、内因性細胞遺伝子の発現は、少なくとも約２００〜５００％に活性化される。別の実施態様において、遺伝子発現の活性化は、遺伝子発現の抑制を妨げる。
【００２８】  別の局面において、本発明は、細胞中の内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する：その内因性細胞遺伝子における第一の標的部位を第一のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、；これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程。
【００２９】  １つの実施態様において、ジンクフィンガータンパク質は、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのフィンガーを有する。
【００３０】  別の局面において、本発明は、細胞中の内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法を提供し、本方法は、以下の工程を包含する：その内因性細胞遺伝子における標的部位を６つのフィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって；これにより、その内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程。
【００３１】  １つの実施態様において、その接触工程は、その内因性細胞遺伝子における第二の標的部位を第二のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程をさらに包含する。別の実施態様において、第一の標的部位および第二の標的部位は隣接する。別の実施態様において、第一のジンクフィンガータンパク質および第二のジンクフィンガータンパク質は、共有結合される。別の実施態様において、第一のジンクフィンガータンパク質は、調節ドメインを含む融合タンパク質である。別の実施態様において、第一のジンクフィンガータンパク質は、少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である。別の実施態様において、第一および第二のジンクフィンガータンパク質は、融合タンパク質であり、各々は調節ドメインを含む。別の実施態様において、第一および第二のジンクフィンガータンパク質は、融合タンパク質であり、各々は少なくとも２つの調節ドメインを含む。
【００３２】  １つの実施態様において、内因性細胞遺伝子は、以下からなる群より選択される；ＶＥＧＦ、ＥＧα、ＩＧＦ−Ｉ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＩＣＡＭ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＦＡＤ２−１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦおよびＬＤＬ−Ｒ。別の実施態様において、内因性遺伝子は、発生的にサイレントであるか、さもなければ不活性な遺伝子である（例えば、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ、インターロイキンファミリータンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ，ＭｙｏＤ、ユートロフィン（ｅｕｔｒｏｐｈｉｎ）、および胎児ヘモグロビンγおよび胎児ヘモグロビンδ）。別の実施態様において、調節ドメインは、以下からなる群より選択される；転写リプレッサー、転写活性化因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびヒストンデアセチラーゼ。
【００３３】  １つの実施態様において、細胞は、以下からなる群より選択される；動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生生物細胞、または真菌細胞。別の実施態様において、その細胞は、哺乳動物細胞である。別の実施態様において、その細胞は、ヒト細胞である。
【００３４】  １つの実施態様において、その方法は、そのジンクフィンガータンパク質を含む送達ビヒクルをその細胞に最初に投与する工程をさらに含み、ここで、その送達ビヒクルは，リポソームまたは膜輸送（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）ポリペプチドを含む。
【００３５】  １つの実施態様において、そのジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク質核酸によりコードされ、そしてこの方法は、その核酸を脂質：核酸複合体で、または裸の核酸として細胞に最初に投与する工程をさらに包含する。別の実施態様において、そのジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されたジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによりコードされ、そしてこの方法は、その発現ベクターを細胞に最初に投与する工程をさらに包含する。別の実施態様において、その発現ベクターは、ウイルス発現ベクターである。別の実施態様において、その発現ベクターは、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ＤＮＡプラスミド発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである。
【００３６】  １つの実施態様において、そのジンクフィンガータンパク質は、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる。別の実施態様において、そのジンクフィンガータンパク質は、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる。
【００３７】  １つの実施態様において、その細胞は、約１．５×１０6コピー未満のジンクフィンガータンパク質を含む。
【００３８】  １つの実施態様において、その標的部位は、その内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流である。別の実施態様において、その標的部位は、その内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する。別の実施態様において、その標的部位は、その内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ停止部位に隣接する。
【００３９】  別の実施態様において、ジンクフィンガータンパク質は、ＳＰ−１骨格を含む。１つの実施態様において、ジンクフィンガータンパク質は、調節ドメインを含み、かつヒト化されている。
【００４０】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで前記接触工程が、内因性細胞遺伝子における第２の標的部位を、第２のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程をさらに含む、方法を提供する。
【００４１】  別の実施態様において、本発明は、上記第１の標的部位および第２の標的部位が隣接している、上記の方法を提供する。
【００４２】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が共有結合する、上記の方法を提供する。
【００４３】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【００４４】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法をい提供する。
【００４５】  別の実施態様において、本発明は、第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が、それぞれ調節ドメインを含む、融合タンパク質である、請求項２に記載の方法。
【００４６】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調節ドメインをそれぞれ含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【００４７】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞または真菌細胞からなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【００４８】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞が哺乳動物細胞である、上記の方法を提供する。。
【００４９】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞がヒト細胞である、上記の方法を提供する。
【００５０】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子の発現が少なくとも約７５％〜１００％まで阻害される、上記の方法を提供する。
【００５１】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がＶＥＧＦ、ＥＲα、ＩＧＦ−Ｉ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＩＣＡＭおよびＨｅｒ２／Ｎｅｕからなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【００５２】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がＶＥＧＦである、上記の方法を提供する。
【００５３】  別の実施態様において、本発明は、遺伝子発現の上記阻害が遺伝子活性化を妨げる、上記の方法を提供する。
【００５４】  別の実施態様において、本発明は、上記調節ドメインが、転写リプレッサー、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼおよびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【００５５】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここでこの方法が上記ジンクフィンガータンパク質を含む送達ビヒクルを上記細胞に最初に投与する工程をさらに含み、ここでこの送達ビヒクルは、リポソームまたは膜輸送ポリペプチドを含む、方法を提供する。
【００５６】  別の実施態様において、本発明は、上記方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸によりコードされ、かつここで、この方法は、脂質：核酸複合体でまたは裸の核酸として上記細胞にこの核酸を最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。
【００５７】  別の実施態様において、本発明は、上記記載の方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによりコードされ、かつここで、この方法は、上記細胞にこの発現ベクターを最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。
【００５８】  別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、ウイルス性発現ベクターである、上記の方法を提供する。
【００５９】  別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、レトロウイルス性発現ベクター、アデノウイルス性発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである、上記の方法を提供する。
【００６０】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。
【００６１】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。
【００６２】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞が上記ジンクフィンガータンパク質の約１．５×１０6未満のコピーを含む、上記の方法を提供する。
【００６３】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流である、上記の方法を提供する。
【００６４】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する、上記の方法を提供する。
【００６５】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ停止部位に隣接する、上記の方法を提供する。
【００６６】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、ＳＰ−１骨格を含む、上記の方法を提供する。
【００６７】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含み、かつヒト化されている、上記の方法を提供する。
【００６８】  別の実施態様において、本発明は、細胞における内因性細胞遺伝子の発現を阻害する方法であって、この方法は、以下の工程：
この内因性細胞遺伝子における標的部位を、６フィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここでこのジンクフィンガータンパク質のＫdは、約２５ｎＭ未満である、工程であって；
これにより少なくとも約２０％この内因性細胞遺伝子の発現を阻害する工程、を含む、方法を提供する。
【００６９】  別の実施態様において、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法であって、この方法は、以下の工程：
この内因性細胞遺伝子における第１の標的部位を、第１のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここでこのジンクフィンガータンパク質のＫdは、約２５ｎＭ未満である工程であって；
これにより少なくとも約１５０％までこの内因性細胞遺伝子の発現を活性化する工程、
を含む、方法を提供する。
【００７０】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子が、発生的にサイレントまたは不活性である、上記の方法を提供する。
【００７１】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子が、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ、ヘモグロビンγ、ヘモグロビンδ、インターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、エウトロフィンまたはＭｙｏＤである、上記の方法を提供する。
【００７２】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記接触工程が、上記内因性細胞遺伝子における第２の標的部位と、第２のジンクフィンガータンパク質を接触させる工程をさらに含む、方法を提供する。
【００７３】  別の実施態様において、本発明は、上記第１の標的部位および第２の標的部位が隣接している、上記の方法を提供する。
【００７４】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が、共有結合する、上記の方法を提供する。
【００７５】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【００７６】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質が少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【００７７】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が、それぞれ調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【００７８】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調節ドメインをそれぞれ含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【００７９】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞または真菌細胞からなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【００８０】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞が哺乳動物細胞である、上記の方法を提供する。
【００８１】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞がヒト細胞である、上記の方法を提供する。
【００８２】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子の発現が少なくとも約２００〜５００％まで活性化される、上記の方法を提供する。
【００８３】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がＦＡＤ２−１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦおよびＬＤＬ−Ｒからなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【００８４】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がＶＥＧＦである、上記の方法を提供する。
【００８５】  別の実施態様において、本発明は、遺伝子発現の上記活性化が遺伝子発現の抑制を妨げる、上記の方法を提供する。
【００８６】  別の実施態様において、本発明は、上記調節ドメインが、転写活性化因子、またはヒストンアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【００８７】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここでこの方法が上記ジンクフィンガータンパク質を含む送達ビヒクルを上記細胞に最初に投与する工程をさらに含み、ここでこの送達ビヒクルは、リポソームまたは膜輸送ポリペプチドを含む、方法を提供する。
【００８８】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸によりコードされ、かつここで、この方法は、脂質：核酸複合体で、または裸の核酸として上記細胞にこの核酸を最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。
【００８９】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法をであって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによりコードされ、かつここで、この方法は、上記細胞にこの発現ベクターを最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。
【００９０】  別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、ウイルス性発現ベクターである、上記の方法を提供する。
【００９１】  別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである、上記の方法を提供する。
【００９２】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。
【００９３】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。
【００９４】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞がジンクフィンガータンパク質の約１．５×１０6コピー未満を含む、上記の方法を提供する。
【００９５】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流である、上記の方法を提供する。
【００９６】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する、上記の方法を提供する。
【００９７】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ停止部位に隣接する、上記の方法を提供する。
【００９８】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、ＳＰ−１骨格を含む、上記の方法を提供する。
【００９９】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含み、かつヒト化されている、上記の方法を提供する。
【０１００】  別の実施態様において、本発明は、内因性細胞遺伝子の発現を活性化する方法であって、この方法は、以下の工程：
この内因性細胞遺伝子における標的部位を、６フィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって、ここでこのジンクフィンガータンパク質のＫdは、約２５ｎＭ未満である工程であって；
これにより少なくとも約１５０％までこの内因性細胞遺伝子の発現を活性化する工程、
を含む、方法を提供する。
【０１０１】  別の実施態様において、本発明は、細胞における内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法であって、この方法は、以下の工程：
この内因性細胞遺伝子における第１の標的部位を、第１のジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって；
これによりこの内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程、
を含む、方法を提供する。
【０１０２】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記接触工程が、上記内因性細胞遺伝子における第２の標的部位と第２のジンクフィンガータンパク質を接触させる工程をさらに含む、方法を提供する。
【０１０３】  別の実施態様において、本発明は、上記第１標的部位および第２標的部位が隣接している、上記の方法を提供する。
【０１０４】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が、共有結合している、上記の方法を提供する。
【０１０５】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【０１０６】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調節ドメインを含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【０１０７】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が、それぞれ調節ドメインを含む、融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【０１０８】  別の実施態様において、本発明は、上記第１のジンクフィンガータンパク質および第２のジンクフィンガータンパク質が、少なくとも２つの調節ドメインをそれぞれ含む融合タンパク質である、上記の方法を提供する。
【０１０９】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞が、動物細胞、植物細胞、細菌細胞、原生動物細胞または真菌細胞からなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【０１１０】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞が哺乳動物細胞である、上記の方法を提供する。
【０１１１】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞がヒト細胞である、上記の方法を提供する。
【０１１２】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がＶＥＧＦ、ＥＲα、ＩＧＦ−Ｉ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＩＣＡＭ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＦＡＤ２−１、ＥＰＯ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＤＮＦおよびＬＤＬ−Ｒからなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【０１１３】  別の実施態様において、本発明は、上記内因性細胞遺伝子がＶＥＧＦである、上記の方法を提供する。
【０１１４】  別の実施態様において、本発明は、上記調節ドメインが、転写リプレッサー、転写活性化因子、エンドヌクレアーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼおよびヒストンデアセチラーゼからなる群から選択される、上記の方法を提供する。
【０１１５】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここでこの方法が上記ジンクフィンガータンパク質を含む送達ビヒクルを上記細胞に最初に投与する工程をさらに含み、ここでこの送達ビヒクルは、リポソームまたは膜輸送ポリペプチドを含む、方法を提供する。
【０１１６】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸によりコードされ、かつここで、この方法は、脂質：核酸複合体で、または裸の核酸として上記細胞にこの核酸を最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。
【０１１７】  別の実施態様において、本発明は、上記の方法であって、ここで上記ジンクフィンガータンパク質は、プロモーターに作動可能に連結されるジンクフィンガータンパク質核酸を含む発現ベクターによりコードされ、かつここで、この方法は、上記細胞にこの発現ベクターを最初に投与する工程をさらに含む、方法を提供する。
【０１１８】  別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、ウイルス発現ベクターである、上記の方法を提供する。
【０１１９】  別の実施態様において、本発明は、上記発現ベクターが、レトロウイルス発現ベクター、アデノウイルス性発現ベクター、またはＡＡＶ発現ベクターである、上記の方法を提供する。
【０１２０】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、誘導性プロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。
【０１２１】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、弱いプロモーターに作動可能に連結された核酸によりコードされる、上記の方法を提供する。
【０１２２】  別の実施態様において、本発明は、上記細胞が上記ジンクフィンガータンパク質の約１．５×１０6コピー未満を含む、上記の方法を提供する。
【０１２３】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の上流である、上記の方法を提供する。
【０１２４】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位に隣接する、上記の方法を提供する。
【０１２５】  別の実施態様において、本発明は、上記標的部位が、上記内因性細胞遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ停止部位に隣接する、上記の方法を提供する。
【０１２６】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、ＳＰ−１骨格を含む、上記の方法を提供する。
【０１２７】  別の実施態様において、本発明は、上記ジンクフィンガータンパク質が、調節ドメインを含み、かつヒト化されている、上記の方法を提供する。
【０１２８】  別の実施態様において、本発明は、細胞において内因性細胞遺伝子の発現を調節する方法であって、この方法は、以下の工程：
この内因性細胞遺伝子における標的部位を、６フィンガーおよび調節ドメインを含む融合ジンクフィンガータンパク質と接触させる工程であって；
これによりこの内因性細胞遺伝子の発現を調節する工程、
を含む、方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】  （発明の詳細な説明）
（導入）
本願は、ＺＥＰを使用して、その天然のクロマチン環境下に存在する内因性細胞遺伝子の発現を調節し得ることを初めて実証する。従って、本発明は、高い効率で内因性細胞遺伝子を特異的に認識するよう操作されたジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質を提供する。本明細書に記載される実験により、約１０ｎＭ未満の標的部位親和性を有する３つのフィンガーのＺＥＰ（ＶＥＧＦ１）を使用して、内因性遺伝子の活性化を効果的に活性化または抑制し得ることが実証される。さらに、６つのフィンガーのＺＥＰ（ＶＥＧＦ３ａ／１）もまた、内因性遺伝子の活性を効果的に抑制することが示された。最後に、３つのフィンガーのＺＥＰを使用して、内因性のＥＰＯ（発生的に不活性な遺伝子）を活性化し得る。好ましくは、本発明のＺＦＰは、約１００ｎＭ未満の、好ましくは、約５０ｎＭ未満の、最も好ましくは、約２５ｎＭ以下未満のＫdで、それらの標的部位に対する高い親和性を示す。
【０１３０】  結果として、本発明のＺＦＰを使用して、内因性遺伝子の転写の活性化および抑制の両方を通して、内因性遺伝子発現を調節し得る。ＺＦＰをまた調節ドメインに連結し、キメラ転写因子を作製して、転写を活性化または抑制し得る。１つの好ましい実施態様において、調節の方法は、約２５ｎＭ未満のＫｄを有するＺＦＰを使用して、遺伝子の転写を活性化または抑制する。従って、本発明のＺＦＰを使用して、２０％以上まで内因性細胞遺伝子の転写を抑制し得、そして約１．５倍以上まで内因性細胞遺伝子の転写を活性化し得る。
【０１３１】  このような遺伝子発現の調節の方法は、新規のヒトおよび哺乳動物の治療適用（例えば、遺伝病、癌、真菌感染、原生生物感染、細菌感染、およびウイルス感染、虚血、血管疾患、関節炎、免疫学的障害などの処置）を可能にし、そして機能的ゲノムアッセイについての方法および変化した表現型（病害耐性、果実成熟、糖および油組成、収量、および色を含む）を有する植物の開発のための方法。
【０１３２】  本明細書に記載のように、ＺＥＰは、選り抜きの任意の内因性遺伝子発現の調節のための、任意の適切な標的を認識するよう設計され得る。調節に適切な内因性遺伝子の例としては、以下が挙げられる；ＶＥＧＦ，ＣＣＲ５、ＥＲα、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＨＢＶ  Ｃ、Ｓ、Ｘ，およびＰ，ＬＤＬ−Ｒ、ＰＥＰＣＫ、ＣＹＰ７、フィブリノーゲン、ＡｐｏＢ、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ（ａ）、レニン、ＮＦ−κＢ、Ｉ−κＢ、ＴＮＦ−α、ＦＡＳリガンド、アミロイド前駆体タンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、ｏｂ−レプチン、ｕｃｐ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｅｐｏ、ＰＤＧＦ、ＰＡＦ、ｐ５３、Ｒｂ、胎児ヘモグロビン、ジストロフィン、ユートロフィン、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−１、ＶＥＧＦレセプターｆｌｔおよびｆｌｋ、トポイソメラーゼ、テロメラーゼ、ｂｃｌ−２、サイクリン、アンギオスタチン、ＩＧＦ、ＩＣＡＭ−１、ＳＴＡＴＳ、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ＴＨ、ＰＴＩ−１、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、ＦＡＤ２−１、Δ−１２デサチュラーゼ、Δ−９デサチュラーゼ、Δ−１５デサチュラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アシルＡＣＰチオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、デンプン合成酵素、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート剤、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ウイルス遺伝子、原生生物遺伝子、真菌遺伝子、および細菌遺伝子。一般に、調節されるに適切な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、分裂促進因子、走化因子、癌活性（ｏｎｃｏ−ａｃｔｉｖｅ）因子、レセプター、カリウムチャネル、Ｇ−タンパク質、シグナル伝達分子および他の疾患関連遺伝子を含む。好ましい発生的に不活性な遺伝子としては、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ、インターロイキンファミリータンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭｙｏＤ、ユートロフィン、および胎児ヘモグロビンγおよびδが挙げられる。
【０１３３】  転写因子機能における一般的なテーマは、プロモーターに対する単純な結合および十分な近接が、一般に必要とされる全てのものであることである。プロモーターに対する正確な位置取り、方向、および限界内での距離は、ＺＦＰによる発現調節にそれほど重要な事項でない。この特徴は、人工的な転写因子構築のための部位の選択において相当の柔軟性を可能にする。従って、ＺＥＰにより認識される標的部位は、その標的遺伝子における任意の適切な部位であり得、これはＺＦＰ（必要に応じて、調節ドメインに連結される）による遺伝子発現の活性化または抑制を可能にする。好ましい標的部位は、転写開始部位に隣接する領域、転写開始部位の下流の領域、または転写開始部位の上流の領域を含む。さらに、標的部位はまた、エンハンサー領域、リプレッサー部位、ＲＮＡポリメラーゼ停止部位、および特定の調節部位（例えば、ＳＰ−１部位、低酸素応答エレメント、核レセプター認識因子、ｐ５３結合部位）に位置され得るか、ｃＤＮＡコード領域中の部位であり得るか、または発現配列タグ（ＥＳＴ）コード領域中の部位であり得る。以下に記載のように、代表的に各々のフィンガーは、２〜４塩基対を認識し、２つのフィンガーのＺＦＰは、４〜７ｂｐの標的部位に結合し、３つのフィンガーのＺＦＰは６〜１０塩基対の部位に結合し、そして６つのフィンガーのＺＦＰは、２つの隣接する標的部位（各々の標的部位は、６〜１０塩基対を有する）を認識する。
【０１３４】  本明細書中に記載されるように、２つのＺＦＰは、細胞に投与され、同じ標的の内因性細胞遺伝子か、または異なる標的の内因性細胞遺伝子のいずれかを認識し得る。第１のＺＥＰは、必要に応じて、共有結合的に、または非共有結合的ににいずれかで第２のＺＦＰと結合する。結合したＺＥＰまたは個々のＺＥＰのいずれかによる隣接する標的部位の認識を使用して、ＺＦＰの共同的な結合をもたらし、これは、それらの標的部位に個々に結合される場合ＺＦＰの親和性よりも大きな親和性を生じる。
【０１３５】  一つの実施態様において、２つのＺＦＰを、アミノ酸リンカーによって連結される融合タンパク質として産生し、そして生じた６つのフィンガーのＺＦＰは、約１８塩基対の標的部位を認識する（例えば、Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ９４；５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと）。１８塩基対の標的部位は、ヒトゲノムにおける特異性を提供することが予測される。なぜなら、その大きさの標的部位は、３×１０10塩基対毎にたった１度生じ、そしてヒトゲノムの大きさは３．５×１０9塩基対であるはずだからである（例えば、Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ９４；５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと）。別の実施態様において、ＺＦＰは、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質を介して、非共有結合的に結合する（例えば、Ｏ‘Ｓｈｅａ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５３９（１９９１））、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：８２２−８２６（１９９６）を参照のこと）。
【０１３６】  別の実施態様において、ＺＦＰを、以下に記載の少なくとも１以上の調節ドメインに連結する。好ましい調節ドメインとしては、転写因子リプレッサーまたはアクチベータードメイン（例えば、ＫＲＡＢおよびＶＰ１６）、コリプレッサーおよびコアクチベータードメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）が挙げられる。遺伝子発現の抑制については、代表的に、その遺伝子の発現は、約２０％まで（すなわち、８０％の非ＺＦＰ調節発現）、より好ましくは約５０％まで（すなわち、５０％の非ＺＦＰ調節発現）、より好ましくは約７５〜１００％まで（すなわち、２５〜０％の非ＺＦＰ調節発現）減少される。遺伝子発現の活性化については、代表的に発現は、約１．５倍まで（すなわち、１５０％の非ＺＦＰ調節発現）、好ましくは、２倍（すなわち、２００％の非ＺＦＰ調節発現）、より好ましくは、約５〜１０倍（すなわち、５００〜１０００％の非ＺＦＰ調節発現）、少なくとも１００倍以上まで活性化される。
【０１３７】  操作されたＺＥＰアクチベーターおよびリプレッサーの発現はまた、ｔｅｔ調節系およびＲＵ−４８６系（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、ＰＮＡＳ  ８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：１１４７−１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１（１９９８）を参照のこと）により分類化された系により制御され得る。これらは、ＺＦＰアクチベーターおよびリプレッサーの発現に対する低分子の制御を与え、従って、目的の標的遺伝子に対する低分子の制御を与える。この有利な特徴は、細胞培養モデル、遺伝子治療、およびトランスジェニック動物および植物において使用され得る。
【０１３８】  （定義）
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限りそれらに示された意味を有する。
【０１３９】  用語「ジンクフィンガータンパク質」または「ＺＦＰ」とは、ジンクにより安定化されるＤＮＡ結合ドメインを有するタンパク質をいう。個々のＤＮＡ結合ドメインは、代表的に「フィンガー」といわれ、１つのジンクフィンガータンパク質は、少なくとも１つのフィンガーを有し、代表的には、２つのフィンガー、３つのフィンガー、４つのフィンガー、５つのフィンガーあるいは６つ以上のフィンガーを有する。各々のフィンガーは、２〜４塩基対のＤＮＡに結合し、代表的には３〜４塩基対のＤＮＡに結合する。ジンクフィンガータンパク質は、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各々のフィンガーは、代表的に、約３０アミノ酸の、ジンクを構成するＤＮＡ結合サブドメインを含む。これらのタンパク質の一つのクラス（Ｃｙｓ2Ｈｉｓ2クラス）を特徴づけする例示的なモチーフは、−Ｃｙｓ−（Ｘ）2-4Ｃｙｓ−（Ｘ）12−Ｈｉｓ−（Ｘ）3-5−Ｈｉｓ−（ここで、Ｘは任意のアミノ酸）である。研究により、このクラスの単一のジンクフィンガーが、単一のβターンの２つのシステイン残基を伴うジンクに結合する２つの無関係なヒスチジン残基を含むαヘリックスからなることが実証されている（例えば、ＢｅｒｇおよびＳｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１０８１−１０８５（１９９６）を参照のこと）。
【０１４０】  「標的部位」はジンクフィンガータンパク質により認識される核酸配列である。単一の標的部位は代表的に約４〜約１０以上の塩基対を有する。代表的に、２つのフィンガー化（Ｆｉｎｇｅｒｅｄ）ジンクフィンガータンパク質は、４〜７塩基対の標的部位を認識し、３つのフィンガー化ジンクフィンガータンパク質は、６〜１０塩基対の標的部位を認識し、６つのフィンガー化ジンクフィンガータンパク質は、２つの隣接した９〜１０塩基対の標的部位を認識し、そして６つを超えるフィンガーを有するタンパク質も同様である。標的部位は、遺伝子発現の調節を可能にする任意の位置に存在する；例えば、転写開始部位に隣接する位置、転写開始部位の上流の位置、または転写開始部位の下流の位置；エンハンサーまたはリプレッサーのような他の転写調節因子（例えば、ＳＰ−１結合部位、低酸素応答エレメント、核レセプター認識エレメント、ｐ５３結合部位など）に近接する位置、ＲＮＡポリメラーゼ停止部位；およびイントロン／エキソン境界。用語「隣接標的部位」とは、０〜約５塩基対はなれた非重複の標的部位をいう。
【０１４１】  「Ｋd」とは、化合物の解離定数をいい、すなわち、所定のアッセイ系（例えば、米国特許第５，７８９，５３８号を参照のこと）を用いて測定した場合に、所定の条件下（すなわち、標的濃度＜＜Ｋdの場合）でその標的に対する化合物の最大の結合の半分を与える（すなわち、その化合物の分子の半分が、標的に結合する）化合物（例えば、ジンクフィンガータンパク質）の濃度をいう。Ｋdを測定するために用いるアッセイ系は、それがＺＦＰの実際のＫdの最も正確な測定を与えるように選択されるべきである。Ｋdを測定するためのアッセイ系は、それがＺＦＰの実際のＫdの正確な測定を与える限り、任意のアッセイ系を使用し得る。一つの実施態様において、本発明のＺＦＰのＫdを、実施例Ｉおよび本明細書の１４ページに記載のように、電気泳動移動度シフトアッセイ（「ＥＭＳＡ」）を、使用して測定する。ＺＦＰの純度または活性について調整されないかぎり、実施例Ｉの方法を使用するＫdの計算は、所定のＺＦＰの実際のＫdの過少評価を生じ得る。好ましくは、内因性細胞遺伝子の転写調節に使用されるＺＦＰのＫｄは、約１００ｎＭ未満、より好ましくは、７５ｎＭ未満、より好ましくは、約５０ｎＭ未満、最も好ましくは、約２５ｎＭである。
【０１４２】  「内因性細胞遺伝子」とは、細胞に対してネイティブである遺伝子をいい、この遺伝子は、その正常なゲノム成分およびクロマチン成分中にあり、かつ細胞に対して異種でない。そのような細胞性遺伝子としては、例えば、動物遺伝子、植物遺伝子、細菌遺伝子、原生生物遺伝子、真菌遺伝子、ミトコンドリア遺伝子、および葉緑体遺伝子が挙げられる。
【０１４３】  「内因性遺伝子」とは、微生物感染細胞またはウイルス感染細胞中の天然に存在する微生物ゲノムまたはウイルスゲノムの一部である、微生物遺伝子またはウイルス遺伝子をいう。微生物ゲノムまたはウイルスゲノムは、染色体外であり得るか、宿主染色体に組み込まれ得る。この用語はまた、上記に記載の内因性細胞遺伝子を包含する。
【０１４４】  「天然のクロマチン環境」とは、ゲノムＤＮＡ（例えば、細菌性、動物性、真菌性、植物性、原生生物性、ミトコンドリア性、および葉緑体性）とＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ヒストンおよび細菌ＤＮＡ結合タンパク質ＩＩ）との、共に染色体を形成する、天然に存在する構造関係をいう。内因性細胞遺伝子は、天然クロマチン環境下で転写活性状態または転写不活性状態であり得る。
【０１４５】  「発生的にサイレントな遺伝子」または「不活性遺伝子」とは、細胞型の特定の発生段階の間、または細胞型の特定の期間の間で、その発現が特定の細胞型において抑制されるか、または活性化されていない（すなわち、ターンオフ（ｔｕｒｎ  ｏｆｆ）されている）遺伝子をいう。発生的に不活性な遺伝子の例としては、ＥＰＯ、ＧＡＴＡ、インターロイキンファミリータンパク質、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭｙｏＤ、ユートロフィン、ならびに胎児ヘモグロビンγおよびδが挙げられる。
【０１４６】  語句「転写開始部位に隣接する」とは、転写開始部位の上流または下流のいずれか約５０塩基内にある標的部位をいう。転写開始部位の「上流」とは、転写開始部位の５’側、約５０塩基を超える標的部位（すなわち、その遺伝子の非翻訳領域中）をいう。
【０１４７】  句「ＲＮＡポリメラーゼ休止部位（ｐａｕｓｅ  ｓｉｔｅ）」は、Ｕｐｔａｉｎら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：１１７−１７２（１９９７）に記載されている。
【０１４８】  「ヒト化」とは、代表的には、アミノ酸配列を、そのポリペプチド配列の機能を実質的に変更することなく、変更して既存のヒト配列を模倣することによって、ヒトにおける免疫反応性を最小化するように改変された非ヒトポリペプチド配列をいう（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）、および公開英国特許出願第８７０７２５２号を参照のこと。）。ＺＦＰについてのバックボーンの配列は、好ましくは、既存のヒトＣ2Ｈ2ＺＦＰ（例えば、ＳＰ−１）から選択される。機能的ドメインは、好ましくは、既存のヒト遺伝子（例えば、ＮＦ−κＢのｐ６５サブユニットからの活性化ドメイン）から選択される。可能である場合、認識ヘリックス配列は、ヒトゲノムの配列決定によって提供された数千もの既存のＺＦＰ  ＤＮＡ認識ドメインから選択される。可能な限り多数のドメインが、同じ既存のタンパク質から単位として組み合せられる。これらの工程の全てをキメラＺＦＰにおける新たな接合エピトープの導入を最小化し、そして操作されたＺＦＰをさらに免疫原性を少なくさせる。
【０１４９】  発現ベクター、核酸、ＺＦＰまたは送達ビヒクルを、細胞に「投与する（こと）」とは、形質導入方法、トランスフェクト方法、エレクトロポレーション方法、転座方法、融合方法、食作用方法、シュート方法または弾丸方法など、すなわち、タンパク質または核酸が、細胞膜を横切って、そして好ましくは細胞核へと輸送され得る任意の手段を含む。
【０１５０】  「送達ビヒクル」とは、ＺＦＰを投与するために使用される化合物（例えば、リポソーム、毒素または膜移行ポリペプチド）をいう。送達ビヒクルはまた、ＺＦＰをコードする核酸を投与するために使用され得る（例えば、脂質：核酸複合体、発現ベクター、ウイルスなど）。
【０１５１】  用語、遺伝子の「発現を調節する」、遺伝子の「発現を阻害する」、および遺伝子の「発現を活性化する」とは、ＺＦＰが遺伝子の転写を活性化または阻害する能力をいう。活性化には、転写阻害の妨害（すなわち、遺伝子発現の抑制の妨害）を含み、そして阻害は、転写活性化の予防（すなわち、遺伝子活性化の予防）を含む。
【０１５２】  「遺伝子発現の抑制を妨害する遺伝子発現の活性化」とは、ジンクフィンガータンパク質がリプレッサー分子の結合をブロックまたは妨害する能力をいう。
【０１５３】  「遺伝子活性化を妨害する遺伝子発現の阻害」とは、ジンクフィンガータンパク質が、アクチベーター分子の結合をブロックまたは妨害する能力をいう。
【０１５４】  調節は、その標的遺伝子の発現によって間接的にまたは直接影響を受ける任意のパラメータを決定することによってアッセイされ得る。そのようなパラメータとしては、例えば、ＲＮＡまたはタンパク質レベルにおける変化、タンパク質活性における変化、産物レベルにおける変化、下流の遺伝子発現における変化、レポーター遺伝子転写における変化（ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、βガラクトシダーゼ、βグルクロニダーゼ、ＧＦＰ（例えば、ＭｉｓｔｉｌｉおよびＳｐｅｃｔｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：９６１−９６４（１９９７））；シグナル伝達における変化、リン酸化および脱リン酸化、レセプター−リガンド相互作用、セカンドメッセンジャー濃度（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３およびＣａ2+）、細胞増殖、および新脈管形成が挙げられる。これらのアッセイは、インビトロ、インビボおよびエキソビボであり得る。そのような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段（例えば、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルの測定、ＲＮＡ安定性の測定、下流またはレポーター遺伝子発現の同定（例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導性マーカー、リガンド結合アッセイを介する）；細胞内セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＧＭＰおよびイノシトール三リン酸（ＩＰ３））における変化；細胞内カルシウムレベルにおける変化；サイトカイン放出など）により測定され得る。
【０１５５】  ＺＦＰによって遺伝子発現調節のレベルを決定するために、ＺＦＰと接触させた細胞を、コントロール細胞（例えば、ジンクフィンガータンパク質なし、または非特異的なＺＦＰを用いる）と比較して、阻害または活性化の程度を試験する。コントロールサンプルには、１００％の相対遺伝子発現活性値を与える。遺伝子発現の調節/阻害は、そのコントロールに対するその遺伝子発現活性値が、約８０％、好ましくは５０％（すなわち、そのコントロールの０．５倍の活性）、より好ましくは２５％、より好ましくは５〜０％である場合に達成される。遺伝子発現の調節／活性化は、そのコントロールに対するその遺伝子発現活性値が、１１０％、より好ましくは１５０％（すなわち、そのコントロールの１．５倍の活性）、より好ましくは２００％〜５００％、より好ましくは１０００％〜２０００％またはそれを超える場合に達成される。
【０１５６】  「転写アクチベーター」および「転写リプレッサー」とは、上記のように、転写を調節する能力を有するタンパク質またはタンパク質のエフェクタードメインをいう。そのようなタンパク質としては、例えば、転写因子および補因子（例えば、ＫＲＡＢ、ＭＡＤ、ＥＲＤ、ＳＩＤ、核因子κＢサブユニットｐ６５、初期増殖応答因子１、および核ホルモンレセプター、ＶＰ１６、ＶＰ６４），エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどが挙げられる。アクチベーターおよびリプレッサーとしては、コアクチベーターおよびコリプレッサー（例えば、Ｕｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：４９８−５０２（１９９８）を参照のこと）が挙げられる。
【０１５７】  「調節ドメイン」とは、ＤＮＡ結合ドメイン（すなわち、ＺＦＰ）に係留される場合に、転写調節活性を有するタンパク質またはタンパク質ドメインをいう。代表的には、調節ドメインは、ＺＦＰに共有結合的または非共有結合的に連結されて、転写調節をもたらす。あるいは、ＺＦＰは、単独で、調節ドメインを伴わずに、転写調節をもたらすように作用し得る。
【０１５８】  用語「異種」とは、相対的な用語であり、核酸の部分に関して使用される場合は、その核酸が、天然に互いに同じ関係にあるとは見出されない２つ以上のサブ配列を含むことをいう。例えば、組換え産生される核酸は、代表的に、無関連の遺伝子からの２以上の配列を合成的に整列させて有して、新たな機能的核酸を作製する（例えば、１つの供給源からの１つのプロモーターおよび別の供給源からのコード領域）。従って、２つの核酸は、この状況において互いに異種である。細胞に添加される場合、その組換え核酸はまた、その細胞の内在性遺伝子に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸は、染色体に組み込まれた非ネイティブ（天然に存在しない）核酸、または非ネイティブ（天然に存在しない）染色体外核酸を含む。対照的に、染色体の天然に転座する部分は、本特許出願の状況においては異種とは考えない。なぜなら、それは、変異された細胞にとってネイティブである内在性核酸配列を含むからである。
【０１５９】  同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然で互いに同じ関係にあるとは見出されない２以上のサブ配列を含むことをいう（例えば、２つのサブ配列が単一の核酸配列によってコードされる「融合タンパク質」）。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、を、組換え技術への手引きとして参照のこと。
【０１６０】  用語「組換え」とは、例えば、細胞または核酸、タンパク質もしくはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸タンパク質またはベクターが異種核酸もしくはタンパク質の導入、またはネイティブの核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されているか、あるいは、その細胞が、そのように改変された細胞に由来することをいう。従って、例えば、組換え細胞は、その細胞のネイティブ（天然に存在する）形態には見出されない遺伝子を発現するか、または通常では他の様式でもしくは異常に発現されるか、過小発現もしくは全く発現されないネイティブ遺伝子の第二のコピーを発現する。
【０１６１】  「プロモーター」とは、転写を指向する一連の核酸制御配列として定義される。本明細書において使用される、プロモーターとしては、代表的には、転写開始部位付近の必要な核酸配列（例えば、特定のＲＮＡポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合は、ＴＡＴＡエレメント、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＳＰ−１部位など）が挙げられる。本明細書において使用される場合、プロモーターはまた、必要に応じて、遠位エンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含み、これらエレメントは、転写開始部位から、数千塩基対ほどに位置し得る。このプロモーターはしばしば、ポリペプチド（例えば、核レセプター、Ｇａｌ４、ｌａｃリプレッサーなど）のようなＤＮＡ結合部分によるトランス活性化に応答性であるエレメントを有する。
【０１６２】  「構成性（的）」プロモーターは、殆どの環境条件および発生条件の下で活性であるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、特定の環境条件または発生条件の下で活性であるプロモーターである。
【０１６３】  「弱いプロモーター」とは、ＥｉｓｅｎｂｅｒｇおよびＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１９４０−１９４７（１９８５）に記載されるように、野生型単純ヘルペスウイルス（「ＨＳＶ」）チミジンキナーゼ（「ｔｋ」）プロモーターまたは変異されたＨＳＶ  ｔｋプロモーターとほぼ同様の活性を有するプロモーターをいう。
【０１６４】  用語「作動可能に連結」とは、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターまたは一連の転写因子結合部位）と第二の核酸との間の機能的連結をいい、ここで、発現制御配列は、その第二の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【０１６５】  「発現ベクター」とは、組換え産生または合成で生成された、核酸構築物である。この構築物は、一連の特定の核酸エレメントを伴う。このエレメントによって、宿主細胞における特定の核酸の転写が可能となり、そして必要に応じて、宿主細胞における発現ベクターの組込みまたは複製を可能にする。発現ベクターは、ウイルス起源または非ウイルス起源のプラスミド、ウイルスまたは核酸フラグメントの一部であり得る。代表的に、発現ベクターは、「発現カセット」を備え、これは、プロモーターに作動可能に連結された、転写されるべき核酸を含む。用語、発現ベクターはまた、プロモーターに作動可能に連結された裸のＤＮＡを含む。
【０１６６】  「宿主細胞」とは、ＺＦＰまたはＺＦＰをコードする発現ベクターもしくは核酸を含む細胞を意味する。この宿主細胞は、代表的に、その発現ベクターの複製または発現を支持する。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物細胞（例えば、酵母、真菌、原生動物、高等植物、昆虫または両生類の細胞、あるいはＣＨＯ、ＨｅＬａ、２９３、ＣＯＳ−１などのような哺乳動物細胞）であり得、例えば培養細胞（インビトロ）、外植体および初代培養物（インビトロおよびエキソビボ）ならびにインビボの細胞であり得る。
【０１６７】  「核酸」とは、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは連結を含む核酸を含み、これは、合成のもの、天然に存在するもの、および天然に存在しないものであり、参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。そのようなアナログの例としては、限定することなく、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルのメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。
【０１６８】  他に言及しない限り、特定の核酸配列はまた、保存的改変されたその改変体（例えば、縮重コドン置換体）およびその相補的配列、ならびに明示的に示された配列を黙示的に包含する。特に、縮重コドン置換体は、１以上の選択された（またはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ，オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。
【０１６９】  用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体をいうために本明細書において交換可能に使用される。この用語はまた、１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的な人工模倣物であるアミノ酸重合体、ならびに天然に存在するアミノ酸重合体および天然に存在しないアミノ酸重合体にも適用される。
【０１７０】  用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、および後に改変されたアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学的構造（すなわち、水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）をいう。このようなアナログは、改変されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の基本的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する化学的化合物をいう。
【０１７１】  アミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨するその一般に公知の３文字記号によるか、または１文字記号によるかのいずれかによって言及され得る。ヌクレオチドも同様に、その一般的に受容された一文字コードによって言及され得る。
【０１７２】  「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸および核酸の配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいうか、または、その核酸は本質的に同一の配列に対して、アミノ酸配列をコードしないことをいう。遺伝子コードの縮重性のために、大多数の機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは、すべて、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンによって特定されるすべての位置にて、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変更することなく、対応する記載されたコドンのいずれかに変更され得る。そのような核酸改変体は「サイレント改変体」であり、この改変体は、保存的に改変された改変の１種である。ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸配列はまた、その核酸のすべての可能なサイレンと改変体を記載する。当業者は、核酸における各コドン（通常、メチオニンについての唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常、トリプトファンについての唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができる。従って、あるポリペプチドをコードする核酸の各サイレント改変は、各々記載された配列において黙示的である。
【０１７３】  アミノ酸配列に関して、当業者は、その変更が、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸置換で生じる場合、コードされた配列におけるアミノ酸の単一のアミノ酸または少数の割合のアミノ酸を変更、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的に改変された改変体」であることを、認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型性改変体、種間ホモログおよび対立遺伝子に加えて存在し、そしてこれらを除外しない。
【０１７４】  以下の８グループは、それぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照のこと）。
【０１７５】（ＺＦＰの設計）
本発明のＺＦＰを、選択した内因性遺伝子において選択した標的部位を認識するように操作する。代表的には、任意の適切なＣ2Ｈ2ＺＦＰ（例えば、ＳＰ−１、ＳＰ−１ＣまたはＺＩＦ２６８）からの骨格を、操作されるＺＦＰについての足場として使用する（例えば、Ｊａｃｏｂｓ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４５０７（１９９２）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）を参照のこと）。次いで、多数の方法を使用して、その標的について高親和性を有するＺＦＰ（例えば、好ましくは、約２５ｎＭ未満のＫdを有する）を設計し、そして選択し得る。上記のように、ＺＦＰは、高親和性を伴って、標的の内因性遺伝子における任意の適切な標的部位に結合するように設計または選択され得る。同時係属中の特許出願ＵＳＳＮ０９／２２９，００７（１９９９年１月１２日出願）は、選択された標的部位についてのＺＦＰの設計、構築および発現のための方法を包括的に記載する。
【０１７６】  当該分野で公知の任意の適切な方法を使用して、ＺＦＰをコードする核酸を設計および構築し得る（例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピュータ／合理的設計、親和性選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムのライブラリーからのクローニング、合成構築など）（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号；Ｗｕら、ＰＮＡＳ  ９２：３４４−３４８（１９９５）；Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９−５６９５（１９９４）；ＲｅｂａｒおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−６７３（１９９４）；ＣｈｏｏおよびＫｌｕｇ、ＰＮＡＳ  ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）；ＣｈｏｏおよびＫｌｕｇ、ＰＮＡＳ  ９１：１１１６８−１１１７２（１９９４）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ８９：７３４５−７３４９（１９９２）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：９３−９６（１９９５）；Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、ＰＮＡＳ  ９２：９７５２−９７５６（１９９５）；ならびにＬｉｕら、ＰＮＡＳ  ９４：５５２５−５５３０（１９９７）；ＧｒｉｅｓｍａｎおよびＰａｂｏ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：２７５：６５７−６６１（１９９７）；ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）を参照のこと）。
【０１７７】  好ましい実施態様において、同時係属中の出願ＵＳＳＮ０９／２２９，００７（１９９９年１月１２日出願）は、標的遺伝子を選択し、そして１〜６（またはそれを超える）Ｄ可能な部位（定義については以下を参照のこと）を含む遺伝子内の標的部位を同定する方法を提供する。次いで、これらの方法を使用して、ＺＦＰを、所定の部位に結合するように合成し得る。標的部位選択のこれらの方法は、標的セグメントにおける１以上のＤ可能な部位の存在が、Ｄ可能な部位を欠く標的セグメント（以下を参照のこと）に結合するＺＦＰと比較して、その部位に結合するように選択または設計したＺＦＰにおいて、より高い結合親和性についての潜在性を付与するという認識を一部仮定する。この洞察を支持する実験的な証拠は、同時係属中の出願ＵＳＳＮ０９／２２９，００７（１９９９年１月１２日出願）における実施例２〜９に提供される。
【０１７８】  Ｄ可能な部位またはサブ部位は、単一のジンクフィンガーが、標的部位のうち３塩基ではなく、４塩基に結合するように適切に設計されることを可能にする標的部位の領域である。そのようなジンクフィンガーは、二本鎖標的セグメントのうちの一方の鎖（標的鎖）における塩基のトリプレットおよび他方の鎖上の第四の塩基に結合する（同時係属中の出願ＵＳＳＮ０９／２２９，００７（１９９９年１月１２日出願）の図２を参照のこと）。単一のジンクフィンガーの４塩基標的セグメントへの結合は、標的鎖の配列上およびジンクフィンガーのアミノ酸配列上の両方の束縛を課す。標的鎖内の標的部位は、「Ｄ可能な」部位のモチーフ５’ＮＮＧＫ３’を含むべきである。ここで、ＮおよびＫは、慣用されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢのあいまいコードである。そのような部位への結合のためのジンクフィンガーは、−１位にアルギニン残基、および＋２位にアスパラギン酸（または、あまり好ましくはないがグルタミン酸）を含むべきである。−１位のアルギニン残基は、Ｄ可能な部位におけるＧ残基と相互作用する。ジンクフィンガーの＋２位でのアスパラギン酸（またはグルタミン酸）残基は、Ｄ可能な部位のＫ塩基と相補的な反対の鎖の塩基と相互作用する。Ｄ可能な部位との名称を付与するのは、アスパラギン酸（シンボルＤ）と反対の鎖の塩基（第四の塩基）との間の相互作用である。Ｄ可能な部位の式から明らかなように、２つのサブタイプのＤ可能な部位が存在する：５’ＮＮＧＧ３’および５’ＮＮＧＴ３’。前者の部位について、ジンクフィンガーの＋２位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、Ｄ可能な部位の反対の鎖におけるＣと相互作用する。後者の部位において、ジンクフィンガーの＋２位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、Ｄ可能な部位の反対の鎖におけるＡと相互作用する。一般的に、ＮＮＧＧが、ＮＮＧＴよりも好ましい。
【０１７９】  ３つのフィンガーを有するＺＦＰの設計において、標的部位は、タンパク質の少なくとも１つのフィンガーおよび必要に応じて２または３つすべてのフィンガーがＤ可能な部位に結合する可能性を有するように選択されるべきである。そのようなものは、式５’−ＮＮｘ  ａＮｙ  ｂＮｚｃ−３’を有するより大きな標的遺伝子内から標的部位を選択することによって達成され得る。ここで、
（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）のセットの各々は、（Ｎ，Ｎ）または（Ｇ，Ｋ）のいずれかであり；
（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）の少なくとも１つは、（Ｇ，Ｋ）であり、そして
ＮおよびＫは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢのあいまいコードである。
【０１８０】  換言すれば、（ｘ、ａ）、（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）の３つのセットの少なくとも１つが、セット（Ｇ，Ｋ）であるとは、そのセットの一位がＧであり、そして二位がＧまたはＴであるという意味である。（Ｇ，Ｋ）ではない３つのセットのもの（ある場合）は、（Ｎ，Ｎ）であるとは、そのセットの一位が任意のヌクレオチドによって占有され得、そしてそのセットの二位が任意のヌクレオチドによって占有され得ることを意味する。例として、セット（ｘ、ａ）は、（Ｇ，Ｋ）であり得、そしてセット（ｙ、ｂ）および（ｚ、ｃ）は、両方とも（Ｎ，Ｎ）であり得る。
【０１８１】  式５’−ＮＮｘ  ａＮｙ  ｂＮｚｃ−３’において、ＮＮｘ  ａＮｙおよびｂＮｚｃのトリプレットは、ＺＦＰにおける３つのフィンガーによって結合される標的鎖上の塩基のトリプレットを表す。ｘ、ｙおよびｚの１つのみがＧであり，そしてこのＧにＫが続く場合、その標的部位は単一のＤ可能なサブ部位を含む。例えば、ｘのみがＧであり、そしてａがＫである場合、その部位は、５’−ＮＮＧ  ＫＮｙ  ｂＮｚｃ−３’（ここで、ＮＮＧ  Ｋは、太字（ボールド）表記）であり、ここで、Ｄ可能なサブ部位を強調する。ｘおよびｙの両方がＧであるがｚはＧでなく、そしてａおよびｂがＫである場合、その標的部位は、以下のように２つの重複するＤ可能なサブ部位を有する：５’−ＮＮＧ  ＫＮＧ  ＫＮｚ  ｃ−３’ （ここで、ＮＮＧ  Ｋは、太字（ボールド）表記、ＫＮＧ  Ｋは斜体字表記）であり、一方のそのような部位を、ボールドで表し、そして他方を斜体字で表す。ｘ、ｙおよびｚの３つすべてがＧであり、そしてａ、ｂおよびｃがＫである場合、その標的セグメントは、以下のような３つのＤ可能なサブ部位を含む：５’ＮＮＧ  ＫＮＧ  ＫＮＧ  Ｋ−３’ （ここで、ＮＮＧ  Ｋは、太字（ボールド）表記、ＫＮＧ  Ｋは斜体字表記）、ここで、Ｄ可能なサブ部位は、ボールド、斜体字、および下線によって表される。
【０１８２】  従って、これらの方法は、上記のように、標的遺伝子を選択し、そして式５’−ＮＮｘ  ａＮｙ  ｂＮｚｃ−３’に適合する標的部位についてその遺伝子の可能なサブ配列内を系統的に検索することによって作用する。いくつかのそのような方法において、潜在的な標的遺伝子のいずれかの鎖上の１０の連続する塩基の全ての可能なサブ配列を評価して、その配列が上記の式に適合するか否か、およびそうであれば、どれだけのＤ可能な部位が存在するかを決定する。代表的にはそのような比較は、コンピュータによって実行され、そしてその式に適合する標的部位のリストが出力される。必要に応じて、そのような標的部位は、どれだけ多くのＤ可能な部位が存在するかに従って、異なるサブセットにおいて出力され得る。
【０１８３】  変形において、本発明の方法は、第一および第二の標的セグメントを同定する。これら各々は、上記の式に独立して適合する。そのような方法における２つの標的セグメントは、その標的遺伝において互いの近接または近位（すなわち、約０〜５塩基以内）に存在するように束縛される。近位の標的セグメントの選択の基礎をなす戦略は、それぞれ第一および第二の標的セグメントについて特異的な２成分ＺＦＰの結合によって形成されるＺＦＰの設計を可能にすることである。これらの原理は、任意の数の成分フィンガーを有するＺＦＰによって結合されるべき標的部位を選択するように拡張され得る。例えば、９フィンガータンパク質についての適切な標的部位は、３成分セグメントを有し、ここで、各セグメントは、上記の式に適合する。
【０１８４】  上記の方法によって同定された標的部位は、他の基準による評価にさらに供され得るか、またはこれを、設計または選択（必要な場合）およびそのような部位について特異的なＺＦＰの産生について直接使用し得る。潜在的な標的部位を評価するためのさらなる基準は、遺伝子内の特定の領域に近位であることである。ＺＦＰがそれ自体における細胞遺伝子を抑制するように使用されるべき場合（すなわち、抑制性部分へのそのＺＦＰの結合を伴わない）、その最適な位置は、転写開始部位、またはその５０ｂｐ上流もしくは下流に存在するようであるか、転写複合体の形成を阻害するようであるか（ＫｉｍおよびＰａｂｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２９７９５−２９６８０（１９９７））、または必須のエンハンサー結合タンパク質と競合するようである。しかし、ＺＦＰが、ＫＲＡＢリプレッサードメインまたはＶＰ１６アクチベータードメインのような機能的ドメインと融合される場合、その結合部位の位置は、相当に、より可撓性であり、そして公知の調節領域の外側に存在し得る。例えば、ＫＲＡＢドメインは、ＫＲＡＢが結合する場所から少なくとも３ｋｂｐまでにあるプロモーターでの転写を抑制し得る（Ｍａｒｇｏｌｉｎら、ＰＮＡＳ  ９１：４５０９−４５１３（１９９４））。従って、調節配列のような標的遺伝子を有する実証可能な生物学的意義のセグメントを、必ずしも含まないかまたは重複しない標的部位が選択され得る。標的セグメントをさらに評価するための他の基準は、そのようなセグメントまたは関連するセグメントへのＺＦＰの結合の先行する利用可能性、および／または所定の標的セグメントを結合するような新たなＺＦＰを設計する容易さを含む。
【０１８５】  標的セグメントが選択された後、そのセグメントに結合するＺＦＰは、種々のアプローチによって提供され得る。アプローチの最も単純なものは、その標的部位へ結合することがすでに公知である既存の収集物からの予備的に特徴付けられたＺＦＰを提供することである。しかし、多くの場合、そのようなＺＦＰは存在しない。既存のＺＦＰのデータベースにおける情報およびそれらのそれぞれの結合親和性を使用する別のアプローチもまた、新たなＺＦＰを設計するために使用され得る。さらなるアプローチは、上記のような置換規則に基づいてＺＦＰを設計することである。なおさらなる別のものは、ファージディスプレーのような経験的なプロセスによって所定の標的に対する特異性を有するＺＦＰを選択することである。いくつかのそのような方法において、ＺＦＰの各々の成分フィンガーは、他の成分フィンガーとは独立して設計または選択される。例えば、各フィンガーは、異なる既存のＺＦＰから得られ得るか、または各フィンガーは、別個のランダム化および選択に供され得る。
【０１８６】  一旦ＺＦＰが所定の標的セグメントに対して選択され、設計され、または他の方法で提供されると、そのＺＦＰまたはそれをコードするＤＮＡが合成される。ジンクフィンガータンパク質をコードするＤＮＡを合成および発現するための例示的な方法は、以下に記載される。次いで、ＺＦＰまたはＺＦＰをコードするポリヌクレオチドは、発現の調整、またはＺＦＰが結合する標的部位を含む標的遺伝子の分析のために使用され得る。
【０１８７】  （ＺＦＰの発現および精製）
ＺＦＰポリペプチドおよび核酸は、組換え遺伝学の分野において慣用的な技術を用いて作製され得る。本発明における一般的使用法を開示する基本書は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９），Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４）を含む。さらに、本質的に任意の核酸を、任意の種々の商業的供給元に特注することが可能である。同様に、ペプチドおよび抗体を、任意の種々の商業的供給元に特注することが可能である。
【０１８８】  代表的に、２つの代替的方法を用いて、新規に設計したＤＮＡ結合ペプチドを発現するために必要とされるコード配列を作製する。１つ目のプロトコルは、６つが重複するオリゴヌクレオチドを利用するＰＣＲに基づく構築手順である（図１）。３つのオリゴヌクレオチド（図１におけるオリゴ１、３、および５）は、認識ヘリックス間のＤＮＡ結合ドメインの部分をコードする「汎用（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、全てのジンクフィンガー構築物について一定に保たれる。その他の３つの「特異的」オリゴヌクレオチド（図１における、オリゴ２、４および６）は、認識ヘリックスをコードするように設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックス上の主に−１位、２位、３位および６位での置換を含み、このことはオリゴヌクレオチドを異なるＤＮＡ結合ドメインの各々に対して特異的にさせる。
【０１８９】  ＰＣＲ合成は、２つの工程で実行される。第一に、二重鎖ＤＮＡの鋳型が、低温度アニーリング工程での４サイクルＰＣＲ反応において、６つのオリゴヌクレオチド（３つは汎用、３つは特異的）を組み合わせることによって作製され、それによってオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ＤＮＡ「骨格」を形成する。この骨格におけるギャップは、高忠実度熱安定ポリメラーゼ（ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼの組み合わせもまた十分である）によって埋められる。構築の第二段階において、ジンクフィンガーの鋳型は、クローニングするためにいずれか一方の末端の制限部位をシャトルベクターか、または直接発現ベクターに組み込むために設計された外部プライマーによって増幅される。
【０１９０】  新規に設計したＤＮＡ結合タンパク質をクローニングする代替的方法は、所望のＺＦＰの特定の領域をコードする相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることに依存する。この特定用途は、オリゴヌクレオチドが最終連結工程の前にリン酸化されることを必要とする。これは、通常、アニーリング反応を準備する前に行われるが、キナーゼ処理はまた、アニーリング後に起こり得る。簡単に言えば、タンパク質の定常領域をコードする「汎用」オリゴヌクレオチド（上記のオリゴ１、２および３）は、それらの相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングされる。さらに、フィンガー認識ヘリックスをコードする「特異的」オリゴヌクレオチドは、それらのそれぞれに相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングされる。これらの相補的オリゴは、上記のプロトコルにおいてポリメラーゼによって以前に埋められた領域を埋めるために設計される。通常のオリゴ１およびフィンガー３に相補的なオリゴは、選択したベクターへのクローニングに用いられる制限部位に特異的な配列をオーバーハングしたままにするように操作される。第２の構築プロトコルは、以下の局面で最初のプロトコルとは異なる：新規に設計したＺＦＰをコードする「骨格」は、全体的に合成ＤＮＡから成り立っており、それによってポリメラーゼの埋める（ｆｉｌｌ−ｉｎ）工程を排除する。さらに、ベクターへクローニングされるフラグメントは、増幅を必要としない。最後に、配列特異的にオーバーハングしたままにする設計は、挿入フラグメントの制限酵素消化の必要を排除する。
【０１９１】  得られた、新規に設計したＺＦＰをコードするフラグメントは、発現ベクターに連結される。一般的に利用される発現ベクターは、改変化ｐＭＡＬ−ｃ２細菌発現ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，「ＮＥＢ」）または真核生物発現ベクター、ｐｃＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含むがこれらに限定されない。
【０１９２】  当業者に公知の任意の適切なタンパク質精製の方法は、本発明のＺＦＰを精製するのに用いられ得る（Ａｕｓｕｂｅｌ、前出、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出を参照のこと）。さらに、任意の適切な宿主が、用いられ得る（例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞など）。
【０１９３】  １つの実施態樣において、細菌株ＪＭ１０９におけるマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−ＺＦＰ）と融合されたＺＦＰの発現は、アミロースカラム（ＮＥＢ）を通じた簡単な精製を可能にする。ジンクフィンガーキメラタンパク質の高い発現レベルは、ＩＰＴＧを用いる誘発によって得られ得る。なぜならば、ｐＭａｌ−ｃ２発現プラスミドにおけるＭＢＰ−ＺＦＰ融合物は、ＩＰＴＧ誘発性ｔａｃプロモーター（ＮＥＢ）の制御下にあるからである。ＭＢＰ−ＺＦＰ融合プラスミドを含む細菌は、１０μＭ  ＺｎＣｌ2、０．０２％グルコース、および５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ｘＹＴ培地に接種され、そして３７℃で振蘯される。指数増殖の中期にＩＰＴＧが０．３ｍＭ添加され、そして培養物を振蘯する。３時間後、細菌は、遠心分離によって収集され、超音波処理によって破壊され、次いで不溶物質が遠心分離によって取り除かれる。ＭＢＰ−ＺＦＰタンパク質は、アミロース結合樹脂に捕捉され、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび５０μＭ  ＺｎＣｌ2を含む緩衝液で徹底的に洗浄され、次いで本質的に同じ緩衝液中のマルトースで溶出される（精製は、ＮＥＢからの標準的プロトコルに基づく）。精製したタンパク質は、定量され、そして生化学的分析のために保存される。
【０１９４】  精製したタンパク質の生化学的特性（例えば、Ｋd）は、任意の適切なアッセイによって特徴づけされ得る。１つの実施態様において、Ｋdは、電気泳動移動度シフトアッセイ（「ＥＭＳＡ」）を介して特徴づけされる（ＢｕｒａｔｏｗｓｋｉおよびＣｈｏｄｏｓｈ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １２．２．１−１２．２．７頁（Ａｕｓｕｂｅｌ編、１９９６）；本明細書中で参考として援用される米国特許第５，７８９，５３８号、１９９９年１月１２日に出願された米国特許出願第０９／２２９，００７、および実施例Ｉもまた参照のこと）。アフィニティーは、低固定量の標識化二重鎖オリゴヌクレオチド標的に対して、精製したタンパク質を滴定することによって測定される。この標的は、天然の配列に見出される３ｂｐに隣接する天然の結合部位配列（９または１８ｂｐ）を含む。結合部位および隣接配列に対する外側は、定常配列である。アニーリングしたオリゴヌクレオチド標的は、Ｔ４ファージポリヌクレオチドキナーゼを用いて標的の効率的な標識化を可能にする１ｂｐの５’オーバーハングを保有する。アッセイのために、標的は、４０ｎＭまたは４０ｎＭ未満の濃度（実際の濃度は、最も低いタンパク質希釈度より、少なくとも１０倍より低く保たれる）で添加され、そして反応は少なくとも４５分間平衡化させておく。さらに、反応混合物はまた、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．０２％ＢＳＡ（ポリ（ｄＩｄＣ）または（ｄＡｄＴ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）はまた、１０〜１００μｇ／μｌで添加され得る）を含む。
【０１９５】  平衡化した反応物は、１０％ポリアクリルアミドゲル上にロードされる。１０％ポリアクリルアミドゲルは、Ｔｒｉｓ／グリシン緩衝液において４５分間、前泳動（ｐｒｅ−ｒｕｎ）されており、次いで結合および非結合標識標的は、１５０Ｖでの電気泳動によって分離される（あるいは、４％ポリアクリルアミドスタッカを含む１０〜２０％勾配Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲルが用いられ得る）。乾燥したゲルは、オートラジオグラフィーかまたはホスホロイメージング（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｉｍａｇｉｎｇ）によって可視化され、見かけ上のＫdが、最大の半分の結合を与えるタンパク質濃度を算出することによって決定される。
【０１９６】  同様のアッセイはまた、タンパク質調製物における活性な画分を決定することを含む。活性な画分は、タンパク質が高濃度の標的ＤＮＡに対して滴定される化学量論的ゲルシフトによって決定される。滴定は、１００、５０、および２５％の標的（通常、μＭレベル）で行われる。
【０１９７】  別の実施態様において、ファージ提示ライブラリーを用いて、選択された標的部位に対して高いアフィニティーを有するＺＦＰを選択し得る。この方法は、それが、変異誘発されたＺＦＰの多様なライブラリーの作製、続いて、アフィニティー選択法を用いて所望のＤＮＡ結合特性を有するタンパク質の単離を含むという点において直接の設計とは本質的に異なる。この方法を用いるために、この実験は、代表的には以下のように進行する。
【０１９８】  始めに、ＺＦＰについての遺伝子が変異誘発され、結合特異性および／またはアフィニティーについて重要な領域へ多様性を導入する。代表的な適用において、これは、−１位、＋２位、＋３位、および＋６位で、ならびに＋１位、＋５位、＋８位、または＋１０位のようなおそらくアクセサリー位置での単一のフィンガーの無作為化を介して達成される。
【０１９９】  次いで、変異誘発された遺伝子は、例えば、コートタンパク質ｐＩＩＩをコードする糸状ファージの遺伝子ＩＩＩを有する融合物としてファージベクターまたはファージミドベクターへクローニングされる。ジンクフィンガー遺伝子は、膜輸出シグナルペプチドをコードする遺伝子ＩＩＩのセグメントとｐＩＩＩの残余物との間に挿入され、その結果ＺＦＰは、成熟プロセス化タンパク質におけるｐＩＩＩとのアミノ末端融合物として発現される。ファージミドベクターが用いられる場合、変異誘発されたジンクフィンガー遺伝子はまた、ファージ粒子へのｐＩＩＩの構築に必要とされるＣ末端領域を最小にコードする、短縮型バージョンの遺伝子ＩＩＩへ融合され得る。
【０２００】  生じたベクターライブラリーは、Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換され、そして糸状ファージを産生するために用いられる。糸状ファージは、コートタンパク質ｐＩＩＩを有する融合物としてそれらの表面上に改変体ＺＦＰを発現する（ファージミドベクターが用いられる場合、この工程はヘルパーファージとの重感染を必要とする）。次いで、ファージライブラリーは、標的ＤＮＡ部位とインキュベートされ、そしてアフィニティー選択法を用いて、高いアフィニティーで標的に結合するファージを、大量のファージから単離する。代表的には、ＤＮＡ標的は、固体支持体に固定化される。次いで、これは最も固く結合するファージ以外全てを取り除くのに十分な条件下で洗浄される。洗浄後、支持体上に残存する任意のファージが、ジンクフィンガー−ＤＮＡ結合を完全に破壊する条件下での溶出を介して回収される。
【０２０１】  回収したファージを用いて、新鮮なＥ．ｃｏｌｉを感染させる。次いでこれを、増幅し、そして新しいファージ粒子のバッチを生成するために用いる。次いで、結合工程および回収工程は、固い結合剤のためのファージプールを十分に富化するのに必要な回数だけ繰り返され、その結果、固い結合剤が、配列決定法および／またはスクリーニング法を用いて同定され得る。
【０２０２】  （調節ドメイン）
本発明のＺＦＰは、必要に応じて、遺伝子発現の調節のための調節ドメインと結合し得る。ＺＦＰは、１つ以上の調節ドメイン、あるいは、同じドメインかまたは２つの異なるドメインの２つのコピーである２つ以上のドメインを有する、２つ以上の調節ドメインと共有的にかまたは非共有的に結合され得る。この調節ドメインは、ＺＦＰへ共有的に連結され得る（例えば、アミノ酸リンカーを介して、融合タンパク質の一部として）。ＺＦＰはまた、非共有的二量体化ドメインを介して調節ドメインと結合され得る（例えば、ロイシンジッパー、ＳＴＡＴタンパク質Ｎ末端ドメイン、またはＦＫ５０６結合タンパク質（例えば、Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：５３９（１９９１），Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−１２８（１９９６）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｋｌｅｍｍら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２（１９９８）；Ｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：８２２−８２６（１９９６）；およびＰｏｍｅｒａｎｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７：９６５（１９９８）を参照のこと））。調節ドメインは、ＺＦＰのＣ末端またはＮ末端を含む、任意の適切な位置でＺＦＰと結合され得る。
【０２０３】  ＺＦＰへ付加するための一般的な調節ドメインは、例えば、以下を含む：転写因子由来のエフェクタードメイン（活性化因子、リプレッサー、活性化補助因子、コリプレッサー）、サイレンサー、核ホルモンレセプター、癌遺伝子転写因子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）；ＤＮＡ修復酵素、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子；ＤＮＡ再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）酵素、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子；クロマチン関連タンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）；およびＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらに関連する因子および修飾因子。
【０２０４】  調節ドメインを獲得し得る転写因子ポリペプチドは、調節された転写および基礎的な転写に関与するポリペプチドを含む。このようなポリペプチドは、転写因子、それらのエフェクタードメイン、活性化補助因子、サイレンサー、核ホルモンレセプターを含む（例えば、転写に関与するタンパク質および核酸エレメントの総説については、Ｇｏｏｄｒｉｃｈら、Ｃｅｌｌ  ８４：８２５−３０（１９９６）を参照のこと；一般の転写因子は、ＢａｒｎｅｓおよびＡｄｃｏｃｋ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２５  増補．２：４６−９（１９９５）ならびにＲｏｅｄｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７３：１６５−７１（１９９６）に総説される）。転写因子専用のデータベースは公知である（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：６３０（１９９５）を参照のこと）。核ホルモンレセプター転写因子は、例えば、Ｒｏｓｅｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：４８５５−７４（１９９５）に記載される。Ｃ／ＥＢＰファミリーの転写因子は、Ｗｅｄｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９３：１７１−８５（１９９５）に総説される。核ホルモンレセプターによって転写調節を媒介する活性化補助因子およびコリプレッサーは、例えば、Ｍｅｉｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３４（２）：１５８−９（１９９６）；Ｋａｉｓｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：３４２−５（１９９６）；およびＵｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９４：４９８−５０２（１９９８））に総説される。ＧＡＴＡ転写因子（これは、造血の調節に関与する）は、例えば、Ｓｉｍｏｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１１：９−１１（１９９５）；Ｗｅｉｓｓら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：９９−１０７に記載される。ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）およびその関連したＴＡＦポリペプチド（これはＴＡＦ３０、ＴＡＦ５５、ＴＡＦ８０、ＴＡＦ１１０、ＴＡＦ１５０、およびＴＡＦ２５０を含む）はＧｏｏｄｒｉｃｈおよびＴｊｉａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６：４０３−９（１９９４）ならびにＨｕｒｌｅｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．６：６９−７５（１９９６）に記載される。ＳＴＡＴファミリーの転写因子は、例えば、Ｂａｒａｈｍａｎｄ−Ｐｏｕｒら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：１２１−８（１９９６）に総説される。疾患に関与する転写因子は、Ａｓｏら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１５６１−９（１９９６）に総説される。
【０２０５】  １つの実施態様において、ヒトＫＯＸ−１タンパク質由来のＫＲＡＢリプレッションドメインは、転写リプレッサーとして用いられる（Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、ＰＮＡＳ  ９１：４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２９０８−２９１４（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら、ＰＮＡＳ  ９１：４５１４−４５１８（１９９４）；実施例３もまた参照のこと）。別の実施態様において、ＫＡＰ−１（ＫＲＡＢコリプレッサー）は、ＫＲＡＢと共に用いられる（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１０：２０６７−２０７８（１９９６））。あるいは、ＫＡＰ−１は、ＺＦＰと共に単独で用いられ得る。転写リプレッサーとして作用する他の好ましい転写因子および転写因子ドメインは、ＭＡＤを含む（例えば、Ｓｏｍｍｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：６６３２−６６４２（１９９８）；Ｇｕｐｔａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：１１４９−１１５９（１９９８）；Ｑｕｅｖａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １６：９６７−９７７（１９９８）；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：７３７−７４８（１９９７）；Ｌａｈｅｒｔｙら、Ｃｅｌｌ  ８９：３４９−３５６（１９９７）；およびＣｕｌｔｒａｒｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７：２３５３−２３５９（１９９７）；ＦＫＨＲ（横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド（ｆｏｒｋｈｅａｄ  ｉｎ  ｒｈａｐｄｏｓａｒｃｏｍａ  ｇｅｎｅ）；Ｇｉｎｓｂｅｒｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：３５４２−３５４６（１９９８）；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４１１８−４１３０（１９９８））；ＥＧＲ−１（即時型遺伝子産物−１；Ｙａｎら、ＰＮＡＳ  ９５：８２９８−８３０３（１９９８）；およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））；ｅｔｓ２リプレッサー因子リプレッサードメイン（ＥＲＤ；Ｓｇｏｕｒａｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４７８１−４７９３（１９９５））；およびＭＡＤ  ｓｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ；Ａｙｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：５７７２−５７８１（１９９６）を参照のこと）。
【０２０６】  １つの実施態様において、ＨＳＶ  ＶＰ１６活性化ドメインは、転写活性化因子として用いられる（例えば、Ｈａｇｍａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５９５２−５９６２（１９９７）を参照のこと）。活性化ドメインを供給し得る他の好ましい転写因子は、ＶＰ６４活性化ドメイン（Ｓｅｉｐｅｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：４９６１−４９６８（１９９６））；核ホルモンレセプター（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３−３８３（１９９８）を参照のこと）；核因子κＢのｐ６５サブユニット（ＢｉｔｋｏおよびＢａｒｉｋ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０−５６１８（１９９８）ならびにＤｏｙｌｅおよびＨｕｎｔ、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ８：２９３７−２９４２（１９９７））；ならびにＥＧＲ−１（即時型遺伝子産物−１；Ｙａｎら、ＰＮＡＳ９５：８２９８−８３０３（１９９８）；およびＬｉｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３−２８（１９９８））を含む。
【０２０７】  キナーゼ、ホスファターゼ、および遺伝子調節に関与するポリペプチドを修飾する他のタンパク質はまた、ＺＦＰについての調節ドメインとして有用である。このような修飾因子は、しばしば、例えば、ホルモンにより媒介される転写のスイッチを入れることか、または切ることに関与する。転写調節に関与するキナーゼは、Ｄａｖｉｓ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４２：４５９−６７（１９９５）、Ｊａｃｋｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２８：２７９−８６（１９９３）、およびＢｏｕｌｉｋａｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．５：１−７７（１９９５）において総説される。一方ホスファターゼは、例えば、ＳｃｈｏｎｔｈａｌおよびＳｅｍｉｎ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：２３９−４８（１９９５）において総説される。核チロシンキナーゼは、Ｗａｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３７３−６（１９９４）において記載される。
【０２０８】  記載されるように、有用なドメインはまた、癌遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｏｓファミリーメンバー）の遺伝子産物、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子から得られ得る。癌遺伝子は、例えば、Ｃｏｏｐｅｒ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，第２版、ＪｏｎｅｓおよびＢａｒｔｌｅｔｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５において記載される。ｅｔｓ転写因子は、Ｗａｓｌｙｌｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１１：７−１８（１９９３）およびＣｒｅｐｉｅｕｘら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇ．５：６１５−３８（１９９４）において総説される。ｍｙｃ癌遺伝子は、例えば、Ｒｙａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：７１３−２１（１９９６）において総説される。ｊｕｎおよびｆｏｓ転写因子は、例えば、Ｔｈｅ  Ｆｏｓ  ａｎｄ  Ｊｕｎ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ，ＡｎｇｌｅおよびＨｅｒｒｌｉｃｈ，編（１９９４）において記載される。ｍａｘ癌遺伝子は、Ｈｕｒｌｉｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５９：１０９−１６において総説される。ｍｙｂ遺伝子ファミリーは、Ｋａｎｅｉ−Ｉｓｈｉｉら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１１：８９−９８（１９９６）において総説される。ｍｏｓファミリーは、Ｙｅｗら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．３：１９−２５（１９９３）において総説される。
【０２０９】  ＺＥＰは、ＤＮＡ修復酵素から得られた調節ドメイン、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子を含み得る。ＤＮＡ修復系は、例えば、Ｖｏｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：３８５−９５（１９９２）；Ｓａｎｃａｒ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２９：６９−１０５（１９９５）；Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｇｅｎｅｔ；Ｅｎｇ．１７：１−１９（１９９５）；およびＷｏｏｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６５：１３５−６７（１９９６）において総説される。ＤＮＡ再配列酵素、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子はまた、調節ドメインとして用いられ得る（例えば、Ｇａｎｇｌｏｆｆら、Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ  ５０：２６１−９（１９９４）；Ｓａｄｏｗｓｋｉ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：７６０−７（１９９３）を参照のこと）。
【０２１０】  同様に、調節ドメインは、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ）、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子由来であり得る。ヘリカーゼは、Ｍａｔｓｏｎら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ，１６：１３−２２（１９９４）において総説され、そしてメチルトランスフェラーゼは、Ｃｈｅｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：４−１０（１９９５）において記載される。ヒストンデアセチラーゼ（Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：３７１−２（１９９６））のような、クロマチンに関連したタンパク質およびそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ）はまた、選択したＺＦＰへ付加するためのドメインとして有用である。１つの好ましい実施態様において、調節ドメインは、転写リプレッサーとして作用するＤＮＡメチルトランスフェラーゼである（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｙｎｇａｅｒｔら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２６：２８３−２８９（１９９８）；Ｆｌｙｎｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７９：１０１−１１６（１９９８）；Ｏｋａｎｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：２５３６−２５４０（１９９８）；およびＺａｒｄｏおよびＣａｉａｆａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６５１７−１６５２０（１９９８）を参照のこと）。別の好ましい実施態様において、Ｆｏｋ１のようなエンドヌクレアーゼは、転写リプレッサーとして用いられる。これは、遺伝子切断を介して作用する（例えば、ＷＯ９５／０９２３３；およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２０１を参照のこと）。
【０２１１】  クロマチンおよびＤＮＡの構造、移動および局在を制御する因子、ならびにそれらに関連する因子および修飾因子；微生物（例えば、原核生物、真核生物およびウイルス）由来の因子およびそれらに関連するかまたはそれらを修飾する因子はまた、キメラタンパク質を得るために用いられ得る。１つの実施態様において、組換え酵素およびインテグラーゼは、調節ドメインとして用いられる。１つの実施態様において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写活性化因子として用いられる（例えば、ＪｉｎおよびＳｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；Ｗｏｌｆｆｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：３７１−３７２（１９９６）；Ｔａｕｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：４０８−４１１（１９９６）；およびＨａｓｓｉｇら、ＰＮＡＳ  ９５：３５１９−３５２４（１９９８）を参照のこと）。別の実施態様において、ヒストンデアセチラーゼは、調節リプレッサーとして用いられ得る（例えば、ＪｉｎおよびＳｃｏｔｔｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：４３７７−４３８４（１９９８）；ＳｙｎｔｉｃｈａｋｉおよびＴｈｉｒｅｏｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４４１４−２４４１９（１９９８）；Ｓａｋａｇｕｃｈｉら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２：２８３１−２８４１（１９９８）；およびＭａｒｔｉｎｅｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２３７８１−２３７８５（１９９８）を参照のこと）。
【０２１２】  ポリペプチドドメインの間（例えば、２つのＺＦＰ間またはＺＦＰと調節ドメインとの間）のリンカードメインが、含まれ得る。このようなリンカーは、代表的には、約５アミノ酸と２００アミノ酸との間のポリグリシン配列のようなポリペプチド配列である。好ましいリンカーは、代表的には、可撓性アミノ酸部分配列である。これは、組換え融合タンパク質の一部として合成される。例えば、１つの実施態様において、リンカーＤＧＧＧＳを用いて２つのＺＦＰを連結する。別の実施態様において、２つのＺＦＰを連結する可撓性リンカーは、配列ＴＧＥＫＰを含むアミノ酸部分配列である（例えば、Ｌｕｉら、ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照のこと）。別の実施態様において、リンカーＬＲＱＫＤＧＥＲＰを用いて２つのＺＦＰを連結する。別の実施態様において、以下のリンカーを用いて２つのＺＦＰを連結する：ＧＧＲＲ（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚら、１９９５、前出）、（Ｇ４Ｓ）n（Ｋｉｍら、ＰＮＡＳ９３，１１５６−１１６０（１９９６）；およびＧＧＲＲＧＧＧＳ；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ；ＬＲＱＫＤ（Ｇ３Ｓ）2ＥＲＰ。あるいは、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自身の両方をモデリングすることが可能なコンピュータープログラムを用いて（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３），ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４））か、またはファージ提示方法によって合理的に設計され得る。
【０２１３】  他の実施態様において、化学的リンカーを用いて合成的にか組換え的に生成されるドメイン配列を接続する。このような可撓性リンカーは、当業者に公知である。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａから入手可能である。これらのリンカーは、必要に応じて、アミド結合、スルフヒドリル結合、またはヘテロ官能基結合を有する。調節ドメインへのＺＦＰの共有結合に加えて、非共有法を用いて、調節ドメインと結合するＺＦＰを有する分子を生成する。
【０２１４】  調節ドメインに加えて、しばしば、ＺＦＰは、精製を容易にするため、発現をモニタリングするため、または細胞および亜細胞の局在をモニタリングするための、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン、ｃ−ｍｙｃ、およびＦＬＡＧエピトープのような融合タンパク質として発現される。
【０２１５】  （ＺＦＰをコードする核酸のための発現ベクター）
選択のＺＦＰをコードする核酸は、代表的に、複製および／または発現のための（例えば、Ｋdを決定するための）原核生物細胞または真核生物細胞中に形質転換するための中間ベクター中にクローニングされる。中間ベクターは、代表的に、ＺＦＰをコードする核酸またはタンパク質の産生の保存または操作のための原核生物ベクター（例えば、プラスミド）またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。ＺＦＰをコードする核酸はまた、代表的には、植物細胞、動物細胞（好ましくは哺乳動物細胞またはヒト細胞）、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞へ投与するための発現ベクター中にクローニングされる。
【０２１６】  クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るために、ＺＦＰは、代表的には、直接転写するためのプロモーターを含む発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは、当該分野で周知であり、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、編、１９９４）に記載される。ＺＦＰ発現のための細菌発現系は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３））において利用可能である。このような発現系のためのキットは、市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、そしてまた市販されている。
【０２１７】  ＺＦＰ核酸の発現を指向するために用いられるプロモーターは、特定の適用に依存している。例えば、強力な構成性プロモーターは、代表的には、ＺＦＰの発現および精製のために使用される。対照的に、ＺＦＰが、遺伝子調節のためにインビボで投与される場合、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターのいずれかがＺＦＰの特定の使用に依存して、使用される。さらに、ＺＦＰの投与のために好ましいプロモーターは、ＨＳＶ  ＴＫのような弱いプロモーターまたは類似の活性を有するプロモーターであり得る。プローモーターはまた、代表的には、トランス活性化に応答性の（例えば、低酸素症応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびにｔｅｔ−調節系およびＲＵ−４８６系のような低分子制御系）エレメントを含み得る（例えば、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、ＰＮＡＳ  ８９：５５４７（１９９２）；Ｏｌｉｇｉｎｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：４９１−４９６（１９９８）；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４３２−４４１（１９９７）；Ｎｅｅｒｉｎｇら、Ｂｌｏｏｄ  ８８：１１４７−１１５５（１９９６）；およびＲｅｎｄａｈｌら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７５７−７６１（１９９８）を参照のこと）。
【０２１８】  プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的に、原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞において核酸の発現に要求される全てのさらなるエレメントを含む、転写単位または発現カセットを含む。従って、代表的な発現カセットは例えば、ＺＦＰをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、転写、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結を効率的にポリアデニル化するために要求されるシグナルを含む。このカセットのさらなるエレメントは、例えば、エンハンサーおよび異種のスプライシングしたイントロンのシグナルを含み得る。
【０２１９】  遺伝的情報を細胞に輸送するために使用される特定の発現ベクターは、ＺＦＰの意図された使用（例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現）に関して選択される（以下および実施例の節に記載の発現ベクターを参照のこと）。標準的な細菌発現ベクターは、ｐＢＲ３２２に基づいたプラスミドである、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄのようなプラスミド、ならびに市販されているＧＳＴおよびＬａｃＺのような融合発現系を含む。好ましい融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質である「ＭＢＰ」である。このような融合タンパク質は、ＺＦＰの精製に使用される。エピトープタグもまた、組換えタンパク質に添加され、発現をモニタリングするため、ならびに細胞および細胞下の局在化をモニタリングするための単離の簡便な方法を提供し得る（例えば、ｃ−ｍｙｃまたはＦＬＡＧ）。
【０２２０】  真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、しばしば真核生物発現ベクター（例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン−バーウイルス由来のベクター）において使用される。他の例示的な真核生物ベクターは、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）プロモーター、または真核生物細胞において効率的な発現を示す他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターを含む。
【０２２１】  いくつかの発現系は、安定なトランスフェクト細胞株の選択のためのマーカーを有する（例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ）。高収率発現系はまた、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下でＺＦＰコード配列を用いて、例えば、昆虫細胞へのバキュロウイルスベクターの使用に適切である。
【０２２２】  代表的に発現ベクターに含まれるエレメントはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするためのプラスミドの非必須領域での独特の制限部位を含む。
【０２２３】  標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌細胞株、哺乳動物細胞株、酵母細胞株または昆虫細胞株を産生し、次いでこのタンパク質は、標準的な技術を使用して精製される（例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒら、１９９０））。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換を、標準的な技術に従って行なう（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２：３４９−３５１（１９７７）；Ｃｌａｒｋ−ＣｕｒｔｉｓｓおよびＣｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：３４７−３６２（Ｗｕら編、１９８３））。
【０２２４】  外来のヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の方法のいずれかを使用し得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび組みこみの両方、および宿主細胞への、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または外来の他の遺伝物質の導入のための他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出を参照のこと）。特定の遺伝子操作手順が、選択したタンパク質を発現し得る宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を首尾よく導入し得るように使用されることのみが必要である。
【０２２５】  （ＺＦＰによる遺伝子発現の調節を決定するためのアッセイ）
種々のアッセイを使用して、ＺＦＰによる遺伝子発現調節のレベルを決定し得る。特定のＺＦＰの活性は、種々のインビトロアッセイおよびインビボアッセイを使用して、例えば、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベル、産物レベル、酵素活性、腫瘍増殖；レポーター遺伝子の転写活性化または転写抑制；セカンドメッセンジャーレベル（例えば、ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ、ＩＰ３、ＤＡＧ、Ｃａ2+）；サイトカインおよびホルモンの産生レベル；ならびに新生血管形成を測定することによって、例えば、イムノアッセイ（例えば、抗体を用いるＥＬＩＳＡおよび免疫組織化学アッセイ）、ハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ＲＮａｓｅ保護、ノーザン、インサイチュハイブリダイゼーション、オリゴヌクレオチドアレイ研究）、比色定量アッセイ、増幅アッセイ、酵素活性アッセイ、腫瘍増殖アッセイ、表現型アッセイなどを使用して、評価され得る。
【０２２６】  ＺＦＰは、初めに、例えば、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞などの培養細胞を使用して、活性についてインビトロで試験され得る。好ましくは、ヒト細胞が使用される。ＺＦＰは、しばしば、初めに、レポーター遺伝子を用いる一過性の発現系を使用して試験され、次いで標的内因性遺伝子の調節は、インビボおよびエキソビボの両方で、細胞および動物において試験される。ＺＦＰは、細胞中で組換え発現され得るか、動物中に移植された細胞中で組換え発現され得るか、またはトランスジェニック動物中で組換え発現され得、そして以下に記載される送達ビヒクルを使用して動物または細胞にタンパク質として投与され得る。この細胞は、固定化され得るか、溶液中であり得るか、動物に注射され得るか、またはトランスジェニック動物または非トランスジェニック動物において天然に存在し得る。
【０２２７】  遺伝子発現の調節は、本明細書中に記載されるインビトロアッセイまたはインビボアッセイの１つを使用して試験される。サンプルまたはアッセイは、ＺＦＰで処理され、そして試験化合物なしのコントロールサンプルと比較され、調節の範囲を調べる。上記のように、内因性遺伝子発現の調節について、ＺＦＰは、代表的には２００ｎＭ以下、より好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ、最も好ましくは２５ｎＭ以下のＫｄを有する。
【０２２８】  ＺＦＰの効果は、上記の任意のパラメータのいずれかを試験することによって測定され得る。任意の適切な遺伝子発現変化、表現型変化、または生理学的変化を使用して、ＺＦＰの影響を評価し得る。インタクトな細胞または動物を使用して機能的な結果を決定する場合、種々の効果（例えば、腫瘍増殖、新生血管形成、ホルモン放出、公知および特徴付けされていない遺伝マーカーの両方の転写変化（例えば、ノーザンブロットまたはオリゴヌクレオチドアレイ研究）、細胞の代謝における変化（例えば、細胞増殖またはｐＨ変化）、ならびに細胞内セカンドメッセンジャーの変化（例えば、ｃＧＭＰ）もまた測定し得る。
【０２２９】  内因性遺伝子発現のＺＦＰ調節についての好ましいアッセイは、インビトロで実行され得る。１つの好ましいインビトロアッセイの形式において、培養された細胞における内因性遺伝子発現のＺＦＰ調節は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、タンパク質産生を調べることによって測定される（実施例ＶＩおよびＶＩＩを参照のこと）。この試験サンプルは、空のベクターまたは別の遺伝子に標的化される無関連なＺＦＰで処理したコントロール細胞と比較される。
【０２３０】  別の実施態様において、内因性遺伝子発現のＺＦＰ調節は、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルを測定することによってインビトロで決定される。遺伝子発現のレベルは、例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、またはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、ドットブロッティング）を使用する増幅を使用して測定される。ＲＮａｓｅ保護は、１つの実施態様において使用される（実施例ＶＩＩＩおよび図１０を参照のこと）。タンパク質またはｍＲＮＡのレベルは、本明細書中に記載されるような、標識された検出試薬（例えば、蛍光標識核酸または放射性標識核酸、放射性標識抗体または酵素標識抗体など）を直接的または間接的に使用して検出される。
【０２３１】  あるいは、レポーター遺伝子系は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、ＣＡＴ、またはβ−ｇａｌ）に作動可能に連結された標的遺伝子プロモーターを使用して考案され得る。レポーター構築物は、代表的には、培養された細胞中に同時にトランスフェクトされる。選り抜きのＺＦＰでの処置の後、レポーター遺伝子の転写、翻訳、または活性の量は、当業者に公知の標準的技術に従って測定される。
【０２３２】  内因性遺伝子発現のＺＦＰ調節をモニターするために有用な好ましいアッセイ形式の別の例は、インビボで実行される。このアッセイは、腫瘍促進遺伝子、新生血管形成のような腫瘍支持に関与する遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）、または腫瘍サプレッサー遺伝子を活性化する遺伝子（例えば、ｐ５３）の発現を阻害するＺＦＰを調べるために特に有用である。このアッセイにおいて、選り抜きのＺＦＰを発現する培養された腫瘍細胞は、免疫が損なわれたマウス（例えば、無胸腺マウス、放射線照射されたマウス、またはＳＣＩＤマウス）に皮下注射される。適切な長さの時間、好ましくは４〜８週間後に、腫瘍増殖は、例えば、容積によってかまたはその２つの最も大きい寸法によって、そしてコントロールと比較されて測定される。実質的に有意な減少（例えば、スチューデントｔ検定を使用）を有する腫瘍は、阻害された増殖を有するといわれる。あるいは、腫瘍の新生血管形成の程度もまた測定し得る。内皮細胞特異的抗体を使用するイムノアッセイは、腫瘍において、腫瘍の血管新生および管の数について染色するするために使用される。管の数において、実質的に有意な減少を有する腫瘍（例えば、スチューデントｔ検定を使用）は、新生血管形成の阻害を有するといわれる。
【０２３３】  トランスジェニック動物および非トランスジェニック動物はまた、インビボで内因性遺伝子発現の調節を調べるための好ましい実施態様として使用される。トランスジェニック動物は、代表的に選り抜きのＺＦＰを発現する。あるいは、選り抜きのＺＦＰを一過性で発現する動物、またはＺＦＰが送達ビヒクルにおいて投与されている動物が使用され得る。内因性遺伝子発現の調節は、本明細書中に記載されるアッセイのいずれか１つを使用して試験される。
【０２３４】  （ＺＦＰをコードする核酸および遺伝子治療）
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法は、哺乳動物細胞または標的組織に、操作されたＺＦＰをコードする核酸を導入するために使用され得る。このような方法は、ＺＦＰをコードする核酸をインビトロで細胞に投与するために使用され得る。好ましくは、ＺＦＰをコードする核酸は、インビボまたはエキソビボでの遺伝子治療の使用のために投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、および送達ビヒクル（例えば、リポソーム）と複合化した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソームであるかまたはゲノムに組み込まれるかのいずれかである、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子治療の手順の概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８〜８１３（１９９２）；ＮａｂｅｌおよびＦｅｌｇｎｅｒ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１〜２１７（１９９３）；ＭｉｔａｎｉおよびＣａｓｋｅｙ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２〜１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７〜１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５〜４６０（１９９２）；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）；１１４９〜１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ、Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５〜３６（１９９５）；ＫｒｅｍｅｒおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１〜４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ＤｏｅｒｆｌｅｒおよびＢｏｈｍ（編）（１９９５）；ならびにＹｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３〜２６（１９９４）を参照のこと。
【０２３５】  操作されたＺＦＰをコードする核酸の非ウイルス送達方法は、リポフェクション、マイクロインジェクション、バリスティックス（Ｂａｌｌｉｓｔｉｃｓ）、ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸結合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、および薬剤で増強されたＤＮＡの取り込みを含む。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号；および米国特許第４，８９７，３５５号）に記載され、そしてリポフェクション試薬は、市販されている（例えば、ＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍTMおよびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎTM）。ポリヌクレオチドの効率的なレセプター認識リポフェクションについて適切であるカチオン性脂質および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のカチオン性脂質および中性脂質を含む。送達は、細胞に対してか（エキソビボ投与）または標的組織（インビボ投与）に対してであり得る。
【０２３６】  免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４〜４１０（１９９０）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２９１〜２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：３８２〜３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：６４７〜６５４（１９９４）；Ｇａｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０〜７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：４８１７〜４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号を参照のこと）。
【０２３７】  操作されたＺＦＰをコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、身体中の特定の細胞に対してウイルスを標的化して、そして核に搭載されるウイルスの輸送のための高度に発達したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に（インビボで）直接投与され得るか、またはウイルスベクターは、インビトロで細胞を処置するために使用され得、そしてこの改変された細胞を患者に（エキソビボで）投与し得る。ＺＦＰの送達のための従来のウイルスに基づく系は、遺伝子移入のための、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、現在、標的細胞および標的組織において、遺伝子移入の最も効果的かつ用途の広い方法である。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子移入方法を用いて可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期間の発現を生じる。さらに、高い遺伝子導入効率が、多数の異なる細胞型および標的組織で観察されている。
【０２３８】  レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を組み込むことによって変化され得、標的細胞の潜在的な標的集団を広げる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し得、そして代表的には高いウイルス力価を生じ得るレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列についてパッケージング能力を有するシス作用性の長末端反復から構成される。最少のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、次いでこれは、標的細胞中に治療用遺伝子を組み込み、永続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広範に使用されるレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくレトロウイルスベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１〜２７３９（１９９２）Ｊｏｈａｎｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５〜１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔら、Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８〜５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４〜２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０〜２２２４（１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照のこと）。
【０２３９】  ＺＦＰの一過性の発現が好ましい場合の適用において、アデノウイルスに基づく系が、代表的に使用される。アデノウイルスに基づくベクターは、多数の細胞型において非常に高い形質導入効率であり得、そして細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて、高力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生され得る。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターはまた、細胞に標的核酸を形質導入するために（例えば、核酸およびペプチドのインビトロでの産生のために、およびインビボおよびエキソビボでの遺伝子治療手順のために）使用される（例えば、Ｗｅｓｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８〜４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ  ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３〜８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照のこと）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１（１９８４）；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、ＰＮＡＳ  ８１：６４６６〜６４７０（１９８４）；ならびにＳａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２〜３８２８（１９８９）を含む、多数の刊行物に記載される。
【０２４０】  特に、少なくとも６つのウイルスベクターのアプローチが、はるかに最も頻繁に使用される系のレトロウイルスベクターと共に、臨床試験において遺伝子移入に現在利用可能である。全てのこれらのウイルスベクターは、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞株中に挿入された遺伝子により欠損ベクターの補完を含むアプローチを利用する。
【０２４１】  ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒら、Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８〜３０５（１９９５）；ｋｏｈｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１０１７〜１０２（１９９５）；Ｍａｌｅｃｈら、ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３〜１２１３８（１９９７））。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療試験において使用された初めての治療用ベクターであった。（Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５〜４８０（１９９５））。５０％以上の形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターで観察されている。（Ｅｌｌｅｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．４４（１）：１０〜２０（１９９７）；Ｄｒａｎｏｆｆら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１１〜２（１９９７））。
【０２４２】  組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損しかつ非病原性のパルボウイルスＩＩ型アデノ随伴ウイルスに基づく有望な代替的な遺伝子送達系である。全てのベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するＡＡＶ  １４５ｂｐの反転した末端反復のみを保持するプラスミド由来である。形質導入された細胞のゲノム中への組込みに起因して、効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特性である。（Ｗａｇｎｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２〜３（１９９８）、Ｋｅａｒｎｓら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７４８〜５５（１９９６））。
【０２４３】  複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、主に結腸癌の遺伝子治療に使用される。なぜなら、それらは、高力価で産生され得、そしてそれらは、多数の異なる細胞型に容易に感染するからである。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、およびＥ３遺伝子を置換するように操作される；続いて、複製欠損ベクターは、トランスで欠失した遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞中で増殖される。Ａｄベクターを、インビボで複数の型の組織に形質導入し得、これらの組織は、肝臓、腎臓および筋肉系の組織に見出される細胞のような、分裂しない分化した細胞を含む。従来のＡｄベクターは、大きい運搬能力を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射を用いる抗腫瘍免疫化についてのポリヌクレオチド治療を含む（Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３〜９（１９９８））。臨床試験における遺伝子移入についてのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例は、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５〜１０（１９９６）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７  １０８３〜１０８９（１９９８）；Ｗｅｌｓｈら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：２０５〜１８（１９９５）；Ａｌｖａｒｅｚら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５９７〜６１３（１９９７）；Ｔｏｐｆら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：５０７〜５１３（１９９８）；Ｓｔｅｒｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３〜１０８９（１９９８）を含む。
【０２４４】  パッケージング細胞は、宿主細胞に感染し得るウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞およびレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に使用されるウイルスベクターは、通常、ウイルス粒子中に核酸ベクターをパッケージングする産生細胞株により生成される。このベクターは、代表的に、パッケージングおよび宿主中への引き続く組込みに必要とされる最少ウイルス配列、発現されるべきタンパク質についての発現カセットにより置換されている他のウイルス配列を含む。この欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に使用されるＡＡＶベクターは、代表的に、ＡＡＶゲノム由来のＩＴＲ配列を有するのみであり、このＩＴＲ配列は、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組込みに必要とされる。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠いている、ヘルパープラスミドを含む、細胞株中でパッケージングされる。この細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスを用いて感染される。このヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミド由来のＡＡＶ遺伝子の複製を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠損に起因して、有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスの汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により減少され得る。
【０２４５】  多数の遺伝子治療適用において、遺伝子治療ベクターが特定の組織型に高い程度の特異性で送達されることが所望される。ウイルスベクターは、代表的には、ウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドをウイルス外表面上に発現することによって所定の細胞型に対して特異性を有するように改変される。このリガンドは、目的の細胞型上に提示されることが公知であるレセプターに対して親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎら、ＰＮＡＳ  ９２：９７４７〜９７５１（１９９５）は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）を発現するように改変され得、そしてこの組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子レセプターを発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原則は、リガンド融合タンパク質を発現するウイルスおよびレセプターを発現する標的細胞の他の対にまで及び得る。例えば、糸状ファージは、実質的に任意の選択された細胞レセプターに対して特異的な結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）を提示するように操作され得る。上記の記載は、主にウイルスベクターに適用するが、同じ原則が非ウイルスベクターに適用され得る。このようなベクターは、特定の標的細胞により好ましく取り込まれると考えられる特定の取り込み配列を含むように操作され得る。
【０２４６】  遺伝子治療ベクターは、インビボで、個々の患者に投与することによって、代表的には、以下に記載されるような、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内の注射）または局所適用によって送達され得る。あるいは、ベクターは、エキソビボで、個々の患者から外稙された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）または一般のドナー造血幹細胞のような細胞に送達され得、次いで、通常はベクターを組み込んだ細胞について選択した後に、患者に細胞を再移植する。
【０２４７】  診断、研究、または遺伝子治療のためのエキソビボでの細胞のトランスフェクション（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介する）は、当業者に周知である。好ましい実施態様において、細胞は、被検生物から単離され、ＺＦＰの核酸（遺伝子またはｃＤＮＡ）でトランスフェクトされ、そして被検生物（例えば、患者）に再注入される。エキソビボでのトランスフェクションに適切な種々の細胞型は、当業者に周知である（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙら、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（第３版、１９９４）および患者由来の細胞を単離しそして培養する方法の議論についてその中で引用される参考文献を参照のこと）。
【０２４８】  １つの実施態様において、幹細胞は、細胞のトランスフェクションおよび遺伝子治療についてのエキソビボでの手順に使用される。幹細胞を使用する利点は、幹細胞がインビトロで他の細胞型に分化され得ること、または哺乳動物に導入され得る（例えば、細胞のドナー）（ここでこれらは骨髄中に移植させる）ということである。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのようなサイトカインを使用して、ＣＤ３４＋細胞をインビトロで臨床的に重要な免疫細胞型に分化させる方法は、公知である（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２（１９９２）を参照のこと）。
【０２４９】  幹細胞は、公知の方法を使用して、形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、所望されない細胞（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（全ての（ｐａｎ）Ｂ細胞）、ＧＲ−１（顆粒球）、およびＩａｄ（分化した抗原提示細胞）を結合する抗体と骨髄細胞をパニングすることによって、骨髄細胞から単離される（Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１６９３〜１７０２（１９９２）を参照のこと）。
【０２５０】  治療用ＺＦＰ核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接的に投与され得る。あるいは、裸のＤＮＡが投与され得る。投与は、血液または組織の細胞との最終的な接触中に分子を導入するために通常使用される経路のいずれかによる。このような核酸を投与する適切な方法は、利用可能でありかつ当業者に周知であり、そして特定の組成物を投与するために、１以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、しばしば、別の経路よりも迅速かつ効果的な反応を提供する。
【０２５１】  薬学的に受容可能なキャリアは、投与されている特定の組成物によって、ならびにこの組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、以下に記載されるように、本発明の薬学的組成物の広範な種々の適切な処方物が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８９を参照のこと）。
【０２５２】  （ＺＦＰについての送達ビヒクル）
ポリペプチド化合物（例えば、ＺＦＰ）の投与における重要な因子は、このポリペプチドが細胞の形質膜、または核のような細胞内区画の膜を横切る能力を有することを確実にすることである。細胞膜は、非イオン性の脂溶性低分子に対して自由に透過性であり、かつ極性化合物、巨大分子、および治療剤または診断剤に対して固有に不透過性である、脂質タンパク質の二重層から構成される。しかし、細胞膜を横切るＺＦＰのようなポリペプチドを輸送する能力を有する、タンパク質およびリポソームのような他の化合物が記載されている。
【０２５３】  例えば、「膜輸送ポリペプチド」は、膜輸送キャリアとして作用する能力を有する両親媒性または疎水性のアミノ酸部分配列を有する。１つの実施態様において、ホメオドメインタンパク質は、細胞膜を横切って輸送する能力を有する。ホメオドメインタンパク質の最も短い内部移行可能なペプチドであるアンテナペディア（Ａｎｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）は、タンパク質の第３のヘリックスであることが見出された（アミノ酸４３位〜５８位）（例えば、Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：６２９〜６３４（１９９６）を参照のこと）。別の部分配列である、シグナルペプチドのｈ（疎水性）ドメインは、類似の細胞膜輸送の特徴を有することが見出されている（例えば、Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１  ４２５５〜１４２５８（１９９５）を参照のこと）。
【０２５４】  細胞中へのＺＦＰの取り込みを促進するための、本発明のＺＦＰに連結され得るペプチド配列の例は、以下を含むがこれらに限定されない：ＨＩＶのｔａｔタンパク質の１１アミノ酸のペプチド；ｐ１６タンパク質のアミノ酸８４〜１０３に対応する２０残基のペプチド配列（Ｆａｈｒａｅｕｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：８４（１９９６）を参照のこと）；アンテナペディアの６０アミノ酸長のホメオドメインの第３のヘリックス（Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４（１９９４））；カポジ線維芽細胞増殖因子（Ｋ−ＦＧＦ）ｈ領域のようなシグナルペプチドのｈ領域（Ｌｉｎら、前出）；またはＨＳＶ由来のＶＰ２２輸送ドメイン（ＥｌｌｉｏｔおよびＯ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ  ８８：２２３〜２３３（１９９７））。細胞取り込みの増強を提供する他の適切な化学部分もまた、ＺＦＰに化学的に連結され得る。
【０２５５】  毒素分子もまた、細胞膜を横切ってポリペプチドを輸送する能力を有する。しばしば、このような分子は、少なくとも２つの部分（「２要素毒素」と呼ばれる）：輸送または結合のドメインまたはポリペプチドおよび別々の毒素ドメインまたはポリペプチドから構成される。代表的には、輸送ドメインまたは輸送ポリペプチドは、細胞レセプターに結合して、次いで毒素が細胞中に輸送される。いくつかの細菌毒素（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  Ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓイオータ毒素、ジフテリア毒素（ＤＴ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＰＥ）、百日咳毒素（ＰＴ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ａｎｔｈｒａｃｉｓ毒素、および百日咳アデニレートシクラーゼ（ＣＹＡ）を含む）は、内部融合物またはアミノ末端融合物として細胞のサイトゾルにペプチドを送達する試みにおいて使用されている（Ａｒｏｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３３３４〜３３４１（１９９３）；Ｐｅｒｅｌｌｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６１：５１４７〜５１５６（１９９３）；Ｓｔｅｎｍａｒｋら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１３：１０２５〜１０３２（１９９１）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、ＰＮＡＳ  ９０：３５３０〜３５３４（１９９３）；Ｃａｒｂｏｎｅｔｔｉら、Ａｂｓｔｒ．Ａｎｎｕ．Ｍｅｅｔ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９５：２９５（１９９５）；Ｓｅｂｏら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３８５１〜３８５７（１９９５）；Ｋｌｉｍｐｅｌら、ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０２７７〜１０２８１（１９９２）；およびＮｏｖａｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１７１８６〜１７１９３  １９９２））。
【０２５６】  このような部分配列は、細胞膜を横切ってＺＦＰを輸送するために使用され得る。ＺＦＰは、このような配列と都合よく融合され得るか、またはこれを用いて誘導体化され得る。代表的には、この輸送配列は、融合タンパク質の一部として提供される。必要に応じて、リンカーは、ＺＦＰおよび輸送配列に連結するために使用され得る。任意の適切なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）が使用され得る。
【０２５７】  ＺＦＰはまた、リポソームおよびイムノリポソームのようなリポソーム誘導体を介して、動物細胞に、好ましくは哺乳動物細胞中に導入され得る。用語「リポソーム」とは、水相を包み込む、１以上の同心性の状態の脂質二重層から構成される小胞をいう。水相は、代表的に、細胞に送達されるべき化合物（すなわち、ＺＦＰ）を含む。
【０２５８】  リポソームは、形質膜と融合して、それによってサイトゾル中に薬物を放出する。あるいは、リポソームは、食細胞化されるかまたは輸送小胞の状態で細胞によって取り込まれる。リポソームは、一旦エンドソームまたは食胞において、輸送小胞の膜を分解するか、またはこれと融合するかのいずれかであり、そしてその内容物を放出する。
【０２５９】  リポソームを介する薬物送達の現在の方法において、リポソームは、最終的には透過性になり、そして包み込まれた化合物（この場合は、ＺＦＰ）を、標的組織または標的細胞で放出する。全身送達または組織特異的送達のために、これは、例えば、受動的な様式（ここでこのリポソーム二重層は、身体中の種々の因子の作用を介して経時的に分解する）において達成され得る。あるいは、能動的な薬物放出は、リポソーム小胞において透過性の変化を誘導する因子を使用する工程を含み得る。リポソーム膜は、リポソーム膜の近くの環境が酸性になる場合、不安定になるように、構築され得る（例えば、ＰＮＡＳ  ８４：７８５１（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：９０８（１９８９）を参照のこと）。リポソームが、標的細胞によってエンドサイトーシスされる場合、例えば、リポソームは、不安定になり、そしてそれらの内容物を放出する。この不安定化は、フゾジェネシス（ｆｕｓｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれる。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）は、多数のフゾジェネシス系の基礎である。
【０２６０】  このようなリポソームは、代表的には、ＺＦＰおよび脂質成分（例えば、中性脂質および／またはカチオン性脂質、必要に応じて、所定の細胞表面レセプターまたはリガンドに結合する抗体のような、レセプター認識分子（例えば、抗原）を含む）を包含する。以下に記載されるようなリポソームを調製するための種々の方法が利用可能である：例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９４６，７８７号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１７４２４、ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３：６２９〜６３４（１９７６）；Ｆｒａｌｅｙら、ＰＮＡＳ  ７６：３３４８〜３３５２（１９７９）；Ｈｏｐｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８１２：５５〜６５（１９８５）；Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８５８：１６１〜１６８（１９８６）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ  ８５：２４２〜２４６（１９８８）；Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（Ｏｓｔｒｏ（編）、１９８３、第１章）；Ｈｏｐｅら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐ．４０：８９（１９８６）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４）およびＬａｓｉｃ、Ｌｉｐｏｓｅｍｅｓ：ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３））。適切な方法は、例えば、超音波破砕、排出、高圧／ホモジネーション、微量流動化、洗剤透析、小さなリポソーム小胞のカルシウム誘導性融合およびエーテル融合方法（これらの全ては、当該分野において周知である）を含む。
【０２６１】  本発明の特定の実施態様において、特定の細胞型、組織などに特異的な標的部分を使用して、本発明のリポソームを標的化することが所望される。種々の標的部分（例えば、リガンド、レセプター、およびモノクローナル抗体）を使用するリポソームの標的化は、以前に記載されている（例えば、米国特許第４，９５７，７７３号および同第４，６０３，０４４号を参照のこと）。
【０２６２】  標的部分の例は、新生物に関連した抗原（例えば、前立腺癌特異的抗原およびＭＡＧＥ）に特異的なモノクローナル抗体を含む。腫瘍はまた、癌遺伝子（例えば、ｒａｓまたはｃ−ｅｒｂＢ２）の活性化または過剰発現から生じる遺伝子産物を検出することによって診断され得る。さらに、多数の腫瘍は、胎児組織により通常発現される抗原（例えば、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ））を発現する。ウイルス感染の部位は、種々のウイルス抗原（例えば、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１）およびパピローマウイルス抗原を使用して診断され得る。炎症は、インテグリン（例えば、ＶＣＡＭ−１）、セレクチンレセプター（例えば、ＥＬＡＭ−１）などのような、炎症の部位で発現される表面分子により特異的に認識される分子を使用して検出され得る。
【０２６３】  リポソームを標的剤と共役させるための標準的な方法が使用され得る。これらの方法は、一般に、標的因子、または誘導体化された脂溶性化合物（例えば、脂質誘導体化ブレオマイシン）の付着に対して活性化され得る、リポソーム脂質成分（例えば、ホスファチジルエタノールアミン）中への組込みを含む。抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインＡを組み込むリポソームを使用して構築され得る（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１６３３７〜１６３４２（１９９０）およびＬｅｏｎｅｔｔｉら、ＰＮＡＳ  ８７：２４４８〜２４５１（１９９０）を参照のこと）。
【０２６４】  （ＺＦＰの用量）
ＺＦＰの治療的適用のために、本発明の状況において患者に投与される用量は、経時的に患者において有益な治療的応答をもたらすのに充分であるべきである。さらに、特定の投与レジメが、実験設定（例えば、機能的ゲノム研究における設定、および細胞または動物モデルにおける設定）における表現型の変化を決定するために有用であり得る。用量は、用いられる特定のＺＦＰの効力およびＫd、標的細胞の核の容量、および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または表面積によって決定される。用量のサイズはまた、特定の患者における特定の化合物もしくはベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定される。
【０２６５】  標的部位に対する約９９％の結合のための、治療的に有効なＺＦＰの最大の投与量は、細胞１個あたり特異的なＺＦＰ分子の約１．５×１０5〜１．５×１０6コピーより少ない範囲にあると計算される。この結合のレベルのための細胞１個あたりのＺＦＰの数は、以下のように、ＨｅＬａ細胞核の容量（約１０００μｍ3または１０-12Ｌ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（ＡｌｔｍａｎおよびＫａｔｚ、編（１９７６）））を用いて計算される。ＨｅＬａ核は比較的大きいので、この投与量の数は、必要な場合、標的細胞の核の容量を使用して再計算される。この計算はまた、他の部位によるＺＦＰ結合との競合を考慮しない。この計算はまた、基本的にすべてのＺＦＰが核に局在化されると仮定している。１００×Ｋdの値が、標的部位に対する約９９％の結合を計算するために使用され、そして１０×Ｋdの値が、標的部位に対する約９０％の結合を計算するために使用される。例えば、Ｋd＝２５ｎＭでは、
【０２６６】
【数１】
0005490971.tif 000002
【０２６７】  ＺＦＰをコードする発現ベクターの適切な用量はまた、プロモーターからのＺＦＰ発現の平均速度および細胞内のＺＦＰ分解の平均速度をを考慮することによって計算され得る。好ましくは、野生型または変異体ＨＳＶ  ＴＫのような弱いプロモーターが、上記のように使用される。マイクログラムのＺＦＰの用量は、利用される特定のＺＦＰの分子量を考慮に入れることによって計算される。
【０２６８】  疾患の処置または予防において投与されるＺＦＰの有効量を決定するうえで、医師は、ＺＦＰまたはＺＦＰをコードする核酸の循環の血漿レベル、潜在的なＺＦＰ毒性、疾患の進行、および抗ＺＦＰ抗体の産生を評価する。投与は、単回用量、または分割した用量で達成され得る。
【０２６９】  （薬学的組成物および投与）
ＺＦＰおよびＺＦＰをコードする発現ベクターは、遺伝子発現の調節のために、そして治療的または予防的適用（例えば、癌、虚血、糖尿病性網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチ、乾癬、ＨＩＶ感染、鎌状赤血球貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、発作など）のために、患者に直接的に投与され得る。ＺＦＰ遺伝子治療によって阻害され得る微生物の例は以下を含む：病原性細菌（例えば、クラミジア、リケッチア属細菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌およびｃｏｎｏｃｏｃｃｉ、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア菌、サルモネラ菌、バシラス属、コレラ菌、破傷風菌、ボツヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌、およびライム病細菌；感染性真菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種；胞子虫のような原生動物（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫（例えば、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）および鞭毛動物（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａなど））；ウイルス性疾患（例えば、肝炎（Ａ型、Ｂ型、またはＣ型）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、およびＥＢＶ）、ＨＩＶ、エボラ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、ＥＣＨＯウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（ｃｏｒｎｏｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ならびにアルボウイルス性脳炎ウイルスなど））。
【０２７０】  治療的に有効な量の投与は、ＺＦＰを導入して、処置される組織に最終的に接触させるために、通常使用される経路のいずれかによる。ＺＦＰは、任意の適切な様式で、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアとともに投与され得る。このような調節物の適切な投与方法は、当業者に利用可能でありかつ周知であり、そして１を超える経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路は、別の経路よりもより直接的な、そしてより効果的な反応をしばしば提供し得る。
【０２７１】  薬学的に受容可能なキャリアは、部分的には、投与される特定の組成物、および、その組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、本発明の薬学的組成物の種々の広範な適切な処方が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５を参照のこと）。
【０２７２】  ＺＦＰは、単独でまたは他の適切な組成物と組み合わせて、吸入を介して投与されるためのエアロゾル処方物（すなわち、それらは「霧状に」され得る）に作られ得る。エアロゾル処方物は、加圧した受容可能な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など）中に配置され得る。
【０２７３】  非経口的投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮内および皮下経路によるような）のための適切な処方物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および意図されたレシピエントの血液と等張性である処方物を与える溶質を含み得る、水溶性および非水溶性の等張性滅菌注入溶液、ならびに懸濁剤、溶解剤、濃化剤、安定剤、および保存剤を含み得る水溶性および非水溶性滅菌懸濁液を含む。本発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入、経口的、局所的、腹腔内、膀胱内、または鞘内によって投与され得る。化合物の処方は、単位用量または多用量を封入した容器（例えば、アンプルまたはバイアル）中に提供され得る。注入溶液および懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。
【０２７４】  （植物における遺伝子発現の調節）
ＺＦＰは、例えば、病気に対する抵抗力の増加、構造的ポリサッカライドおよび貯蔵ポリサッカライドの改変、香り、タンパク質、および脂肪酸、果実成熟、収量、色、栄養的特性、貯蔵能の改善などのような形質について植物を操作するために使用され得る。特に、油脂産生の増強のための作物種の操作（例えば、脂肪種子において産生される脂肪酸の改変）が、目的のものである。
【０２７５】  脂肪種子は、主に脂肪酸のグリセロールエステルであるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）からなる。これらの植物性油脂の商業的生産は、主に６つの主要な油脂作物（ダイズ、油ヤシ、アブラナ、ヒマワリ、綿実、およびピーナッツ）によって占められる。植物性油脂は、マーガリン、ショートニング、サラダオイル、およびフライ用オイルとして、人間が消費するために優勢的に（９０％）使用される。残りの１０％が、非食料的な適用（例えば、潤滑剤、油化学物質（ｏｌｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ）、化石燃料、洗剤、および他の工業的適用）のために使用される。
【０２７６】  これらの適用のそれぞれにおいて使用されるオイルの所望の特性は、特にＴＡＧを形作る脂肪酸において存在する鎖の長さおよび二重結合の数によって広範に変動する。これらの特性は、膜の流動性および温度感受性を制御するために植物によって操作される。これらの同じ特性は、ＺＦＰを使用して、食料用途および工業的用途のために改善された特性を有するオイルを産生するように制御され得る。
【０２７７】  脂肪種子作物のＴＡＧにおける主要な脂肪酸は、１６〜１８炭素長であり、そして０〜３つの二重結合を含む。パルミチン酸（１６：０［１６個の炭素：０個の二重結合］）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、およびリノレン酸（１８：３）が優勢である。二重結合の数、または飽和の程度は、得られるオイルの融点、反応性、料理の効率、および健康特性を決定する。
【０２７８】  オレイン酸（１８：１）のリノール酸（１８：２）（次いでこれは、１８：３形成のための前駆体である）への転換の原因である酵素は、ω−６デサチュラーゼとも呼ばれるΔ１２−オレイン酸デサチュラーゼである。脂肪酸不飽和化経路のこの段階のブロックは、ポリ不飽和油脂の支出におけるオレイン酸の蓄積を生じるはずである。
【０２７９】  １つの実施態様において、ＺＦＰは、ダイズにおけるＦＡＤ２−１遺伝子の発現を調節するために使用される。ミクロソームのΔ６デサチュラーゼをコードする２つの遺伝子が、最近ダイズからクローニングされ、そしてＦＡＤ２−１およびＦＡＤ２−２と呼ばれる（Ｈｅｐｐａｒｄら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１０：３１１〜３１９（１９９６））。ＦＡＤ２−１（Δ１２デサチュラーゼ）は、ダイズ種子中のオレイン酸不飽和化の大部分を制御するようである。従って、ＺＦＰは植物においてＦＡＤ２−１の遺伝子発現を調節するために使用され得る。具体的には、脂肪種子中のオレイン酸（１８：１）の蓄積を増加させるために、ＺＦＰが使用され、ダイズにおけるＦＡＤ２−１遺伝子の発現を阻害し得る。さらに、ＺＦＰは、例えば以下のような任意の他の植物遺伝子の発現を調節するために使用され得る：Δ９−デサチュラーゼ、他の植物由来のΔ−１２デサチュラーゼ、Δ−１５デサチュラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル−ＡＣＰ−チオエステラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、デンプンシンターゼ、セルロースシンターゼ、スクロースシンターゼ、老化関連遺伝子、重金属キレート因子、脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、植物ウイルス遺伝子、植物真菌病原体遺伝子、および植物細菌病原体遺伝子。
【０２８０】  植物細胞の形質転換に適切な組換えＤＮＡベクターはまた、植物細胞に本発明のＺＦＰを送達するために使用される。広範な種々の高等植物種を形質転換するための技術は周知であり、そして技術的および科学的文献に記載されている（例えば、Ｗｅｉｓｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１〜４７７（１９８８）を参照のこと）。所望のＺＦＰをコードするＤＮＡ配列は、形質転換植物の意図された組織中でのＺＦＰの転写を方向付ける、転写および翻訳開始調節配列と組み合わせられる。
【０２８１】  例えば、再生された植物のすべての組織におけるＺＦＰの発現を方向付ける植物プロモーターフラグメントが使用され得る。このようなプロモーターは、本明細書中では「構成的」プロモーターといい、そして大部分の環境条件下および発生または細胞分化の状態で活性である。構成的プロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ転写開始領域、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ由来の１’−または２’−プロモーター、および当業者に公知の種々の植物遺伝子由来の他の転写開始領域を含む。
【０２８２】  あるいは、植物プロモーターは、特定の組織中でＺＦＰの発現を方向付け得るか、またはさもなくばより正確な環境的または発生的制御のもとにあり得る。このようなプロモーターは、本明細書では「誘導性」プロモーターという。誘導性プロモーターによって転写をもたらし得る環境条件の例としては、嫌気的条件または光の存在が挙げられる。
【０２８３】  発生的制御のもとでのプロモーターの例としては、特定の組織（例えば、果実、種子、または花）においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。例えば、ポリガラクツロナーゼプロモーターの使用は、果実においてＺＦＰの発現を方向付け得、ＣＨＳ−Ａ（ペチュニア由来のカルコンシンターゼＡ）プロモーターは、植物の花におけるＺＦＰの発現を方向付け得る。
【０２８４】  ＺＦＰ配列を含むベクターは、代表的には、植物細胞上で選択可能な表現型を与えるマーカー遺伝子を含む。例えば、このマーカーは、殺生物剤耐性、特に抗生物質耐性（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンに対する耐性）または除草剤耐性（例えば、クロロスルホロンまたはＢａｓｔａに対する耐性）をコードし得る。
【０２８５】  このようなＤＮＡ構築物は、種々の従来の技術によって所望の宿主植物のゲノムに導入され得る。例えば、このＤＮＡ構築物は、植物細胞プロトプラストのエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションのような技術を使用して、植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入され得るか、またはこのＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ粒子ボンバードメントのような弾道的方法を使用して、植物組織に直接導入され得る。あるいは、このＤＮＡ構築物は、適切なＴ−ＤＮＡ隣接領域と組み合わせられ得、そして従来のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主ベクターに導入され得る。細胞が細菌によって感染される場合、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ宿主の病原性機能が、この構築物および隣接するマーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を方向付ける。
【０２８６】  マイクロインジェクション技術は当該分野で公知であり、そして科学的文献および特許文献において充分に記載されている。ポリエチレングリコール沈澱を使用するＤＮＡ構築物の導入は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７１７〜２７２２（１９８４）において記載されている。エレクトロポレーション技術は、Ｆｒｏｍｍら、ＰＮＡＳ  ８２：５８２４（１９８５）において記載されている。弾道的形質転換技術は、Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０〜７３（１９８７）において記載されている。
【０２８７】  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換技術は、科学文献に充分に記載されている（例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６〜４９８（１９８４）；およびＦｒａｌｅｙら、ＰＮＡＳ  ８０：４８０３（１９８３）を参照のこと）。
【０２８８】  上記の形質転換技術のいずれかによって得られる形質転換された植物細胞は、培養されて、形質転換された遺伝子型、従って所望のＺＦＰ制御表現型を有する植物全体が再生され得る。このような再生技術は、組織培養増殖培地への特定の植物ホルモンの操作に頼っており、代表的には、ＺＦＰヌクレオチド配列とともに導入された殺生物剤および／または除草剤マーカーに頼っている。培養されたプロトプラストからの植物の再生は、Ｅｖａｎｓら、Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ、１２４〜１７６頁（１９８３）；およびＢｉｎｄｉｎｇ、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｌａｓｔｓ、２１〜７３頁（１９８５）に記載される。再生はまた、植物カルス、外植体、器官、またはそれらの一部から得られ得る。このような再生技術は、一般的には、Ｋｌｅｅら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．３８：４６７〜４８６（１９８７）において記載される。
【０２８９】  （機能的ゲノムアッセイ）
ＺＦＰはまた、表現型の結果および遺伝子発現の機能を決定するためのアッセイについての使用を有する。分析技術における近年の進歩は、集中された大量の配列決定（ｆｏｃｕｓｓｅｄ  ｍａｓｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の努力と合わせて、以前に利用可能であったものよりもずっと多い分子標的を同定および特徴付ける機会を作り出した。遺伝子およびそれらの機能に関するこの新しい情報は、基礎的な生物学的な理解とともに加速し、そして治療的介入のための多くの新しい標的を提供する。いくつかの場合において、分析の手段は、新しいデータの生成と歩調を合わせない。１つの例は、全体の示差的な遺伝子発現の測定における近年の進歩によって提供される。これらの方法は、遺伝子発現マイクロアレイ、示差的ｃＤＮＡクローニング頻度、差引きハイブリダイゼーションおよびディファレンシャルディスプレイ法によって代表され、異なる組織でアップレギュレートされるか、またはダウンレギュレートされる遺伝子、あるいは特定の刺激に応答する遺伝子を非常に迅速に同定し得る。このような方法は、形質転換、腫瘍の進行、炎症応答、神経障害などのような生物学的プロセスを探索するためにますます使用されつつある。所定の生理学的な現象と相関する、示差的に発現された遺伝子の長いリストを今や非常に容易に生成し得るが、これは、個々の示差的に発現された遺伝子とその現象との間の原因となる関係が難しいということを実証する。今日まで、示差的に発現された遺伝子に機能を割り当てる簡単な方法は、示差的な遺伝子発現をモニタリングする能力と歩調を合わせてこなかった。
【０２９０】  従来の分子的アプローチを使用して、候補遺伝子の過剰発現は、全長ｃＤＮＡをクローニングすること、それを哺乳動物発現ベクターへサブクローニングすること、およびその組換えベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクトすることによって達成され得る。このアプローチは、直線的であるが労働集約的である（特に最初の候補遺伝子が単純な発現配列タグ（ＥＳＴ）によって表された場合）。「従来的な」方法による候補遺伝子の発現のもとでは、なおより問題である。アンチセンス手法および標的化されたリボザイムに頼る方法は信頼できず、選択された標的の小さな画分のみについて成功する。相同組換えによる遺伝子ノックアウトは、組換えを生じる幹細胞においてかなり良好に機能するが、体細胞由来の細胞株においては非常に非効率的である。いずれの場合においても、同系のゲノムＤＮＡの大きなクローン（１０ｋｂのオーダー）が、効率よく機能する組換えのために単離されるべきである。
【０２９１】  ＺＦＰ技術は、示差的遺伝子発現研究を迅速に分析するために使用され得る。操作されたＺＦＰは、任意の内因性標的遺伝子をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするために容易に使用され得る。非常に少ない配列情報が、遺伝子特異的なＤＮＡ結合ドメインを作製するために要求される。このことは、ＺＦＰ技術を、特徴付けが乏しい示差的に発現された遺伝子の長いリストの分析のために理想的にする。各々の候補遺伝子についてジンクフィンガーに基づくＤＮＡ結合ドメインを単に築き得、キメラをアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションする人工の転写因子を作製し得、そしてモデル系において一度に候補遺伝子をオンまたはオフにスイッチングすることによる研究（形質転換、サイトカインに対する応答など）のもとでの表現型のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの結果を試験し得る。
【０２９２】  操作されたＺＦＰを使用してゲノムデータに機能的な情報を追加するこの特異的な例は、単なる例示に過ぎない。遺伝子（単数または複数）の特異的なアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションから利益を得る任意の実験的状況は、操作されたＺＦＰの信頼度および使用の容易さから利益を受け得る。
【０２９３】  さらに、より従来的な方法によって達成され得るものよりもより大きい実験的制御が、ＺＦＰによって与えられ得る。これは、操作されたＺＦＰの産生および／または機能が、低分子制御の下に置かれ得るからである。このアプローチの例は、Ｔｅｔ−Ｏｎシステム（エクジソンによって調節されるシステムおよび変異プロゲステロンレセプターを含むキメラ因子を組み込んだシステム）によって提供される。これらのシステムはすべて、低分子制御下にあるＺＦＰレギュレーターの機能および／または発現を配置することによって、任意の内在性の目的の遺伝子および任意の導入遺伝子上の低分子制御を間接的に与え得る。
【０２９４】  （トランスジェニックマウス）
ＺＦＰ技術のさらなる適用は、トランスジェニック動物における遺伝子発現を操作することである。細胞株を用いる場合、内在性遺伝子の過剰発現または異種遺伝子のトランスジェニック動物（例えば、トランスジェニックマウス）への導入は、かなり直線的なプロセスである。ＺＦＰ技術は、これらの型の方法の改善である。なぜなら、研究対象の遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを産生する必要性を回避し得るからである。
【０２９５】  同様に、細胞に基づく系を用いる場合、トランスジェニック動物における遺伝子発現の従来的なダウンレギュレーションは、技術的な困難さによって悩まされる。相同組換えによる遺伝子ノックアウトは、現在最も一般的に適用される方法である。この方法は、ノックアウトされる遺伝子の比較的長いゲノムクローン（約１０ｋｂ）を必要とする。代表的には、選択マーカーは、遺伝子の破壊をもたらすために目的の遺伝子のエキソンに挿入され、そして第２のカウンター選択マーカーが、非相同組換え体に対して相同組換え体を選択するための相同性領域の外側に提供される。この構築物は、胚性幹細胞にトランスフェクトされ、そして培養中に組換え体が選択される。組換え幹細胞は、非常に初期の胚と組合わせて、キメラ動物を生成する。キメラ現象が生殖系列にまで及ぶ場合、ホモ接合性のノックアウト動物は、戻し交配によって単離され得る。この技術が首尾よく適用される場合、ノックアウト動物は約１年間で生成され得る。不運にも２つの共通した問題がしばしばノックアウト技術の首尾よい適用を妨害する；胚の致死性および発生的補償である。胚の致死性は、ノックアウトされる遺伝子が発生において本質的な役割を果たす場合に生じる。これは、それ自体がキメラ現象の欠如、生殖系列の伝達の欠如、またはホモ接合性の戻し交配を生成することの不可能性を明らかにし得る。遺伝子は、成体の動物に対して、発生の期間中に有意に異なる生理学的役割を果たし得る。従って、胚の致死性は、成体における治療的介入のために有用な標的としての遺伝子標的を退けるための理論的根拠とは考えられない。胚の致死性は、最も頻繁には、従来的な方法を用いて、マウスモデル中で目的の遺伝子が容易に研究され得ない、単なる手段である。
【０２９６】  発生的補償は、ノックアウトされる遺伝子産物の代わりの関連する遺伝子産物の置換である。遺伝子はしばしば、広範なファミリーで存在する。発生の過程の間の選択または誘導は、いくつかの場合において、別の変異体メンバーの代わりに１つのファミリーメンバーの置換を引き起こし得る。この型の機能的置換は、成体動物においては可能でないかもしれない。発生的補償の代表的な結果は、成体におけるこの遺伝子の機能の除去が、さもなければ生理的変化を引き起こす場合の、ノックアウトマウスにおける表現型の欠如である。これは、従来的なノックアウトマウスモデルの解釈をしばしば混乱させる、ある種の間違ったネガティブな結果である。
【０２９７】  いくつかの新しい方法が、胚の致死性を回避するために開発されてきた。これらの方法は、ｃｒｅリコンビナーゼおよびｌｏｘＤＮＡ認識エレメントを使用するアプローチによって代表される。その認識エレメントは、発生後の成体マウスにおいて、相同組換え（上記のような）および誘導されたリコンビナーゼの発現を用いて、目的の遺伝子に挿入される。これは、標的遺伝子の一部の欠失を引き起こし、そして発生的な複雑さを回避する。この方法は、労働集約的であり、そしてリコンビナーゼの非均一的な誘導によるキメラ現象に悩まされる。
【０２９８】  遺伝子発現を操作するために操作されたＺＦＰの使用は、以前の節に記載された低分子により調節される系を用いて、成体動物に限定され得る。ジンクフィンガーに基づくリプレッサーの発現／機能は、発生の間にスイッチを切り得、そして成体動物において随意にスイッチを入れ得る。このアプローチは、ＺＦＰ発現モジュールの付加のみに頼っている；相同組換えは必要とされない。ＺＦＰリプレッサーはトランスでドミナントであるので、生殖系列伝達またはホモ接合性について関係がない。これらの問題は、マウスモデルに対する特徴付けが乏しい遺伝子の候補（ｃＤＮＡまたはＥＳＴクローン）から出発するために必要とされる時間および労力に劇的に影響する。この能力は、治療的介入のための遺伝子標的を迅速に同定および／または確認し、新規なモデル系を生成し、そして複雑な生理的現象（発生、造血、形質転換、神経機能など）を分析するために使用され得る。キメラ標的化マウスは、Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（１９８８）；Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、編、（１９８７）；およびＣａｐｅｃｃｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８（１９８９）に従って得られ得る。
【０２９９】  本明細書中に引用される全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個別に参考として援用されることが示されるように、本明細書中に参考として援用される。
【０３００】  前述の発明は、理解の明確さの目的のために例証および実例によっていくぶん詳細に記載してきたけれども、本発明の教示を考慮して、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく、特定の変更および改変が本発明に対してなされ得ることは、当業者にとって容易に明らかである。
【実施例】
【０３０１】  以下の実施例は、例証の目的のみのために提供され、限定する目的ではない。当業者は、変更または改変されて基本的に類似した結果を生じ得る種々の決定的ではないパラメーターを容易に認識する。【０３０２】  （実施例Ｉ：ヒトＶＥＧＦ遺伝子に対して標的化されるＺＦＰの設計および試験）
この第１の実施例は、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遺伝子のプロモーターに含まれるＤＮＡ配列を認識するように設計されるＺＦＰの構築を実証する。ＶＥＧＦは、約４６ｋＤａの糖タンパク質であり、これは低酸素によって誘導される内皮細胞特異的マイトジェンである。ＶＥＧＦは、癌、種々の網膜症、および他の重篤な疾患に関連する新脈管形成に関連している。選択されたＤＮＡ標的部位は、遺伝子の転写開始部位を取り囲む領域であった。選択された２つの９塩基対（ｂｐ）部位は、配列ａｇｃＧＧＧＧＡＧＧＡＴｃＧＣＧＧＡＧＧＣＴｔｇｇ（ここで、大文字は、実際の９ｂｐの標的物を表す）内に見出される。９ｂｐ上流の標的物を標的化するタンパク質をＶＥＧＦ１と示し、そして９ｂｐ下流の標的物を標的化するタンパク質をＶＥＧＦ３ａと示した。ＶＥＧＦについての主な転写開始部位は、第１の９ｂｐ標的物の３’末端のＴであり、これは上記配列の下線部である。【０３０３】  ヒトＳＰ−１転写因子を前駆体分子として、設計されたＺＦＰの構築のために使用した。ＳＰ−１は、よく研究されたマウスＺｉｆ２６８に関連する、３フィンガーＤＮＡ結合ドメインを有する（Ｃｈｒｉｓｔｙら、ＰＮＡＳ  ８５：７８５７−７８６１（１９８８））。このドメインを使用した部位特異的変異誘発実験は、Ｚｉｆ２６８において作動する提案された「認識規則」が用いられてＳＰ−１を他の標的ＤＮＡ配列に適応させ得ることを示した（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、ＰＮＡＳ  ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４））。ジンクフィンガークローンの構築のために使用されるＳＰ−１配列は、ＳＰ−１転写因子におけるアミノ酸５３３〜６２４に対応した。【０３０４】  ２つの設計されたＺＦＰである、ＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａの認識らせん体におけるアミノ酸の選択を、表１に要約する。【０３０５】
【表１】
0005490971.tif 000003
【０３０６】  コード配列を、６つの重複オリゴヌクレオチドを利用したＰＣＲに基づくのアセンブリ手順を用いてこれらのペプチドを発現するために、構築した（図１）。「ユニバーサル」配列に対応する３つのオリゴヌクレオチド（図１中のオリゴ１、３および５）は、認識らせん体の間のＤＮＡ結合ドメインの一部をコードする。これらのオリゴヌクレオチドは、任意のジンクフィンガー構築物について一定のままである。他の３つの「特異的」オリゴヌクレオチド（図１中のオリゴ２、４、および６）は、認識らせん体をコードするように設計された。これらのオリゴヌクレオチドは、認識らせんをそれぞれ異なるＤＮＡ結合ドメインに対して特異的にさせるために、その認識らせん上の−１、２、３および６位で置換を含んだ。コドンの偏りを選択して、哺乳動物細胞およびＥ．ｃｏｌｉの両方において発現可能にした。【０３０７】  ＰＣＲ合成を、２つの工程において実行した。第１に、二本鎖ＤＮＡの鋳型を、６つのオリゴヌクレオチド（３つはユニバーサルオリゴヌクレオチド、３つは特異的オリゴヌクレオチド）を組み合わせ、そして低温（２５℃）のアニーリング工程を有する４サイクルのＰＣＲ反応を用いて作製した。この温度で、この６つのオリゴヌクレオチドは結合してＤＮＡ「骨格」を形成する。この骨格におけるギャップをＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼの組み合わせにより充填した。構築の第２段階において、ジンクフィンガーの鋳型を、ｐＵＣ１９へクローニングするための制限部位を組み入れるために設計された外部プライマーによって、３０サイクルで増幅した。ＶＥＧＦ  ＺＦＰについてのクローニング精度は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。２つの構築物のそれぞれのＤＮＡ配列は以下である。【０３０８】
【化１】
0005490971.tif 000004
【０３０９】  設計されたＺＦＰのそれらの標的部位と結合する能力を、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の組換えタンパク質を発現および精製、ならびに電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行うことによって確認した。ＺＦＰ発現を２つの異なる系で行った。第１の系において、ＤＮＡ結合ペプチドを、市販のｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入することによりＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。このベクターは、組換えタンパク質の発現を駆動するためのＴ７プロモーター配列を含む。この構築物をＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ＤＥ３（ｌａｃＩq）細胞に導入した。この細胞は、ＩＰＴＧ誘導性Ｔ７ポリメラーゼを含む。培養物を、５０μＭ  ＺｎＣｌ2で補充し、ＯＤが６００ｎｍで０．５〜０．６になるまで、３７℃で増殖させ、そしてタンパク質の産生をＩＰＴＧを用いて２時間誘導した。ＺＦＰ発現は、非常に高いレベルで（全細胞性タンパク質の約３０％）見られた（図２）。これらのタンパク質を「非融合」ＺＦＰという。【０３１０】  部分的に純粋な非融合ＺＦＰを以下のように作製した（ＤｅｓｊａｒｌａｉｓおよびＢｅｒｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：１０１−１０４（１９９２）から改変される）。凍結した細胞ペレットを１Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００μＭ  ＺｎＣｌ2、５ｍＭ  ＤＴＴの１／５０の容量中に再懸濁した。このサンプルを１０分間煮沸し、そして約３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。この時点で上清中のＺＦＰタンパク質は、クマシーブルーを用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲルの染色によって推定すると、５０％より高い純度であった。そしてこの産物は、約１１ｋＤａの推定分子量に移動した（図２）。【０３１１】  ＺＦＰを作製する第２の方法は、それらをＥ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合物として発現させることであった。ＺＦＰとのＮ末端ＭＢＰ融合物をｐＥＴ１５ｂクローンのＰＣＲ増幅により構築し、そしてＴａｃプロモーター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の制御下でベクターｐＭａｌ−ｃ２に挿入した。この融合は、組換えタンパク質の簡単な精製および検出を可能にする。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高いレベルでこのベクターから可溶形態で発現され得、そして再折り畳みすることなく適切なＤＮＡ標的物と効率良く結合し得ることが、以前に報告された（Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ９４：５５２５−５５３０（１９９７））。ＭＢＰ融合タンパク質の生成は、製造者によって記載された（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。形質転換体を、グルコースおよびアンピシリンを補充したＬＢ培地において増殖させ、そしてＩＰＴＧを用いて３時間３７℃で誘導した。この細胞をフレンチプレスによって溶解し、次いでアガロースベースのアミロース樹脂（これは、ＭＢＰ部分に特異的に結合し、従ってこのタンパク質に対する親和性樹脂として作用する）に曝露した。ＭＢＰ融合タンパク質を、１０ｍＭマルトース（図２Ｃ）を用いて溶出させ、５０％より高い純度のＺＦＰを放出した。いくつかの場合において、このタンパク質を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ３０フィ���ターユニット（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてさらに濃縮した。【０３１２】  部分精製された非融合およびＭＢＰ融合ＺＦＰをＥＭＳＡによって試験し、それらの標的ＤＮＡ配列への結合を評価した。調製物中のタンパク質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によって測定した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲルは、いずれかの精製方法によって５０％より高い均質性を示したので、ＺＦＰの精製度の計算において調整しなかった。さらに、調製物中に有意な量の不活性なタンパク質が存在し得た。従って、ＥＭＳＡによって生じた以下のデータは、タンパク質の標的物についてのタンパク質の真の親和性の過小評価を示す（すなわち、Ｋdｓの過大評価）。２つの分離した調製物を、ＺＦＰ活性における差異の制御を補助するために各タンパク質について作製した。【０３１３】  ＥＭＳＡ実験についてのＶＥＧＦ  ＤＮＡ標的部位を、２９ｂｐ二本鎖オリゴヌクレオチドにおける９ｂｐの結合部位を埋め込むことによって生成した。このアッセイにおいて用いられる、認識「ｔｏｐ」鎖の配列およびそれらの相補体（「ｂｏｔｔｏｍ」）は、以下である：
ＶＥＧＦ部位１、ｔｏｐ：５’−ＣＡＴＧＣＡＴＡＧＣＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＡＴ
ＶＥＧＦ部位１、ｂｏｔｔｏｍ：５’−ＡＴＣＧＡＴＧＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＧＣＴＡＴＧＣＡＴＧ
ＶＥＧＦ部位３、ｔｏｐ：５’−ＣＡＴＧＣＡＴＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＣＡＴＣＧＡＴ
ＶＥＧＦ部位３、ｂｏｔｔｏｍ：５’−ＡＴＣＧＡＴＧＣＣＡＡＧＣＣＴＣＣＧＣＧＡＴＡＴＧＣＡＴＧ
ＶＥＧＦ  ＤＮＡ標的部位は下線部である。９ｂｐの結合部位のいずれかの側上の３ｂｐもまた、実際のＶＥＧＦ  ＤＮＡ配列由来であった。ｔｏｐ鎖の各標的部位をポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−32Ｐ  ｄＡＴＰを用いて標識化した。０．５μＭの各オリゴヌクレオチド、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む反応においてｔｏｐ鎖およびｂｏｔｔｏｍ鎖をアニールした。この混合物を９５℃まで５分間加熱し、そして６０分間にわたって３０℃までゆっくりと冷却した。二重鎖の形成を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって確認した。標的調製物中に残ったままである遊離標識およびｓｓＤＮＡは、結合反応を干渉しそうではなかった。【０３１４】  標的オリゴヌクレオチドへのＺＦＰの結合を、二重鎖基質の固定量に対するタンパク質を滴定することによって行った。２０マイクロリットルの結合反応物は、１０ｆモル（０．５ｎＭ）５’−32Ｐ標識化二本鎖標的ＤＮＡ、３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ジチオトスレイトール、１０％グリセロール、２０μｇ／ｍｌ  ポリｄＩ−ｄＣ（必要に応じて）、２００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および２５μＭ  ＺｎＣｌ2を含んだ。タンパク質を、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ中で作製された連続希釈の１／５の容量として添加した。結合によって室温での３０分間の進行が可能になった。前もって作製された１０％または１０〜２０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａｄ）および標準Ｔｒｉｓ−グリシン泳動緩衝液（０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ2を含む）を用いて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を４℃で実行した。【０３１５】  ＭＢＰ融合ＺＦＰを用いる代表的なＥＭＳＡの結果を図３に示す。この場合、ＭＢＰ−ＶＥＧＦ１タンパク質の３倍の連続希釈を用いた。移動した産物をｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上で定量し、そしてタンパク質濃度ｎＭのｌｏｇ10に対する相対シグナル（プラトー値の百分率）をプロットした。見かけのＫdを、標的部位へのＭＢＰ−ＶＥＧＦの結合の最大の半分を与えるタンパク質濃度を決定することによって見出し、それはこの実験において約２ｎＭであった。【０３１６】  ＶＥＧＦタンパク質について決定された結合親和性は、以下のように要約され得る。ＶＥＧＦ１は、より強力なＤＮＡ結合親和性を示した；複数のＥＭＳＡ分析において、見かけのＫdの平均が、ＶＥＧＦ部位１に結合した場合、約１０ｎＭであると決定された。そのＶＥＧＦ３ａは、標的部位に良好に結合したが、ＶＥＧＦ１よりも高い見かけのＫdを有した；ＶＥＧＦ３ａについての平均Ｋdは、約２００ｎＭであった。タンパク質のＭＢＰ融合バージョンおよび非融合バージョンは両方の場合において類似の親和性で結合した。Ｋdをまた、野生型Ｚｉｆ２６８およびＳＰ−１  ＺＦＰのＭＢＰ融合についてのこれらの条件下で決定した。これらは、それぞれ６０および６５ｎＭのＫdを生じた。これらの結果は、約２〜３０ｎＭのＺｉｆ２６８について文献中で報告された結合定数と類似している（例えば、Ｊａｍｉｅｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：５６８９−５６９５（１９９４）を参照のこと）。従って、合成ＶＥＧＦ  ＺＦＰについてのＫdは、これらの天然に生じるＤＮＡ結合タンパク質について決定したＫdと非常に都合よく比較される。【０３１７】  要するに、この実施例は、ＶＥＧＦ遺伝子の転写開始に近い特異的標的物に関する２つの新規なＤＮＡ結合タンパク質の生成を示す。これらのタンパク質は、それらの標的物に結合する天然に生じる転写因子の親和性と同様の親和性で結合する。【０３１８】  （実施例ＩＩ：ヒトＶＥＧＦ遺伝子において１８ｂｐ標的物を結合するＺＦＰの連結）
ＺＦＰ設計における重要な考慮は、ＤＮＡ標的物の長さである。無作為のＤＮＡについて、ｎヌクレオチドの配列は、０．５×４n塩基対毎に１回生じると期待される。従って、９ｂｐのＤＮＡのみを認識するように設計されたＤＮＡ結合ドメインは、１３０，０００ｂｐ毎に部位が見出され、従って複雑なゲノムにおける複数の位置に結合し得る（ヒトゲノム中２０，０００部位のオーダーにおいて）。９ｂｐの推定リプレレッサー結合配列は、５’ＵＴＲ中のＶＥＧＦについて選択され、そしてこれらは直接転写を干渉し得る。しかし、細胞の内部で発現される場合、必要な親和性または特異性を欠失した９ｂｐ部位を認識するジンクフィンガードメインの場合において、より大きなドメインが、６フィンガータンパク質を形成するためのリンカー配列を有する別々の３つのフィンガードメインを結合させることによって、１８塩基対を認識するために構築された。このことは、リプレッサーが、特に微量のリプレッサーのみが生成されている条件下で、特異的に適切な配列を標的化することを保証すべきである。ＶＥＧＦにおける９ｂｐ標的部位を、ジンクフィンガーが１８ｂｐ配列を認識するように連結され得るように、互いに隣接して選択した。ＶＥＧＦ１部位およびＶＥＧＦ３ａ部位についての場合のように、１つのヌクレオチドギャップによって分離された２つの９ｂｐ部位へのＺＦＰの結合を可能にするので、リンカーＤＧＧＧＳを選択した（Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）もまた参照のこと）。【０３１９】  ６−フィンガーＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質コード配列を以下の様に生成した。ＶＥＧＦ３ａを、プライマーＳＰＥ７（５’−ＧＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣ）およびＳＰＥａｍｐ１２（５’−ＧＴＧＧＴＣＴＡＧＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＡＣＴＴＣＧＣ）を用いてＰＣＲ増幅し、末端にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限部位を生成した（制限部位は下線部）。ＶＥＧＦ１を、プライマーＳＰＥａｍｐ１３（５’−ＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＡＡＡＧＴＴＴＡＣＧＧ）およびＳＰＥａｍｐ１１（５’−ＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＡＴＣＣＣ）を用いてＰＣＲ増幅し、末端にＳｔｙＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を生成した（制限部位は下線部）。合成オリゴヌクレオチドを用いて、以下の配列をＸｂａＩおよびＳｔｙＩ部位間で連結した。ここで、ＸｂａＩおよびＳｔｙＩは、下線部である：ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＡＡＡ  ＣＡＧ  ＣＡＣ  ＡＴＡ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＣＡＡ  ＧＧ。
これは、２つのＳＰ−１ドメイン間でリンカー配列ＤＧＧＧＳを導入した。この連結産物を、プライマーＳＰＥ７およびＳＰＥａｍｐ１１を用いて再増幅し、そしてＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてｐＵＣ１９にクローニングした。次いで、連結されたＺＦＰ配列を以下のプライマー；
（１）ＧＢ１９
ＧＣＣＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣＣＣＡＴＡＣＣＴＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣ）
（２）ＧＢ１０
ＣＡＧＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＴＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＴを用いて増幅し、上記のように改変されたｐＭＡＬ−ｃ２発現ベクターにクローニングするためのＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ部位を導入した。【０３２０】  設計された６−フィンガーＺＦＰ  ＶＥＧＦ３ａ／１のＫｐｎＩからＢａｍＨＩのヌクレオチド配列は以下である：【０３２１】
【化２】
0005490971.tif 000005
【０３２２】  ＶＥＧＦ３ａ／１のアミノ酸翻訳（一文字コードを用いて〉は、以下である：【０３２３】
【化３】
0005490971.tif 000006
【０３２４】  １８ｂｐ結合タンパク質ＶＥＧＦ３ａ／１をＥ．ｃｏｌｉ中でＭＢＰ融合物として発現し、アフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして実施例１に記載のようにＥＭＳＡ実験で試験した。標的オリゴヌクレオチドを記載のように調製し、そして以下の相補的配列を含んだ：
（１）ＪＶＦ９
ＡＧＣＧＡＧＣＧＧＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＧＧＣＡＧＣＣＧＧＧＴＡＧおよび、
（２）ＪＶＦ１０
ＣＧＣＴＣＴＡＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣＣＴＣＣＧＣＧＡＴＣＣＴＣＣＣＣＧＣＴ。【０３２５】  ＥＭＳＡ研究について、２０μｌの結合反応液は、１０ｆモル（０．５ｎＭ）５’−32Ｐ−標識化二本鎖標的ＤＮＡ、３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５ｍＭ  ジチオスレイトール、１０％グリセロール、２０μｇ／ｍｌポリｄＩ−ｄＣ、２００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および２５μＭ  ＺｎＣｌ2を含んだ。３倍の連続希釈の５分の１の容量でタンパク質を添加した。結合は、室温かまたは３７℃のいずれかで６０分間進行させた。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を室温かまたは３７℃のいずれかで、予め作製した１０％または１０〜２０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌゲル（ＢｉｏＲａｄ）および標準Ｔｒｉｓ−グリシン泳動緩衝液を用いて実行した。室温でのアッセイは、このＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質について、約１．５ｎＭの見かけのＫdを生じた。従って、１８ｂｐ結合ＺＦＰは、高い親和性でその標的部位に結合した。並行実験において、実施例Ｉに記載のオリゴヌクレオチドを用いて、ＶＥＧＦ１タンパク質をその標的に対して試験し、約２．５ｎＭの見かけのＫdを生じた。標的に対して試験したＶＥＧＦ１についての４０ｎＭのＫｄと比較して、１８ｂｐ標的物に対して試験した場合、結合および電気泳動を３７℃で実行した場合、ＶＥＧＦ３ａ／１の見かけのＫdは、約９ｎＭであった。このことは、結合親和性における差異がより高温で強調されることを示す。【０３２６】  見かけのＫdは、そのＤＮＡ標的に対するタンパク質の親和性を測定するのに有用である。しかし、インビトロまたはインビボのいずれかでのＤＮＡ結合部位について、その占有率は、ＤＮＡ結合タンパク質のオフ割合によって大きな程度まで決定される。このパラメーターは、図４に示されるような競合的実験によって測定され得る。ＥＭＳＡについての条件を上記に記載した；結合および電気泳動を３７℃で実行した。これらのデータは、タンパク質−ＤＮＡ複合体の半減期が、ＶＥＧＦ１についてより、ＶＥＧＦ３ａ／１についての方が１０倍より長いことを示す。従って、これらのインビトロ条件下で、標的部位の占有率は、９ｂｐ結合タンパク質についてよりも１８ｂｐ結合タンパク質についての方がずっと高い。【０３２７】  （実施例ＩＩＩ：設計されたＺＦＰ配列の哺乳動物発現ベクター中の機能的ドメインへの融合）
この実施例は、哺乳動物細胞内のＺＦＰの作製、それらの核への移行、およびＺＦＰによって標的ＤＮＡ配列に局在化される機能的ドメインを提供するための発現ベクターの開発を記載する。使用した機能的ドメインは、Ｋｒｕｐｐｅｌ−関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑止ドメインおよび単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）ＶＰ１６活性化ドメインである。【０３２８】  特定のＤＮＡ結合タンパク質は、転写リプレッサーとして機能する分離可能なドメインを含む。約２０％のＺＦＰは、転写リプレッサーとして機能する約９０アミノ酸の非ＤＮＡ結合ドメインを含む（Ｔｈｉｅｓｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：３６３−３７４（１９９０）；Ｍａｒｇｏｌｉｎら、ＰＮＡＳ  ９１：４５０９−４５１３（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、（１９９４）、前出；Ｗｉｔｚｇａｌｌら（１９９４）、前出）。ＫＲＡＢドメインと呼ばれるこのドメインは、モジュラーであり、そして他のＤＮＡ結合タンパク質を結合して、標的ＤＮＡ配列を含む遺伝子の発現をブロックし得る（Ｍａｒｇｏｌｉｎら、（１９９４）；Ｐｅｎｇｕｅら、（１９９４）；Ｗｉｔｚｇａｌｌら（１９９４）前出）。ＫＲＡＢドメインは、単独では効果を示さない；ＫＲＡＢドメインは、リプレッサーとして機能するためにＤＮＡ結合タンパク質を介してＤＮＡ配列に連結される必要がある。ＫＲＡＢドメインは、転写開始をブロックすることが示され、そして転写開始部位から少なくとも３ｋｂまでの距離で機能し得る。ヒトＫＯＸ−１タンパク質（Ｔｈｉｅｓｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ２：３６３−３７（１９９０））由来のＫＲＡＢドメインを、本明細書に記載されるような研究のために使用した。この６４アミノ酸ドメインは、ＺＦＰに融合され得、そして細胞培養物中で抑制を与えることを示した（Ｌｉｕら、前出）。【０３２９】  ＨＳＶ−１のＶＰ１６タンパク質は、広く研究されており、そしてＣ末端の７８アミノ酸がＤＮＡ結合ドメインに融合される場合、トランス活性化ドメインとして作用し得ることが示された（Ｈａｇｍａｎｎら、Ｋ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：５９５２−５９６２（１９９７））。ＶＰ１６はまた、少し離れておよび配向非依存様式において機能することが示されている。これらの研究について、ＶＰ１６タンパク質配列におけるアミノ酸４１３〜４９０を使用した。このドメインをコードするＤＮＡを、以下の配列を有するプライマーを用いて，プラスミドｐＭＳＶＰ１６ΔＣ＋１１９からＰＣＲ増幅した：
（１）ＪＶＦ２４
ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＧＡＣＣＧＡＴＧ、および
（２）ＪＶＦ２５
ＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＣＣＧＴＡＣＴＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣ。【０３３０】  下流プライマーＪＶＦ２５を下流ＦＬＡＧエピトープコード配列を含むように設計した。【０３３１】  ３つの発現ベクターをこれらの研究のために構築した。一般的な設計を図５に要約する。このベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来であり、そしてサイトメガウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にあるＺＦＰ構築物を配置する。このベクターは、それぞれ細菌および哺乳動物細胞培養物における選択のためのアンピシリンおよびネオマイシンマーカーを保有する。適切な翻訳開始のためのコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｊ.Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０（１９９１））を組み入れた。産物の核局在化を達成するために、ＳＶ４０の大きなＴ抗原由来の核局在化配列（ＮＬＳ）（Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ）（Ｋａｌｄｅｒｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３９：４９９−５０９（１９８４））を付加した。ＺＦＰコード配列についての挿入部位に、機能的ドメイン配列が続く。このベクターの３つのバージョンは、機能的ドメインにおいて異なる；「ｐｃＤＮＡ−ＮＫＦ」は、ＫＲＡＢ抑制ドメイン配列を保有し、「ｐｃＤＮＡ−ＮＶＦ」は、ＶＰ１６活性化ドメインを保有し、そして「ＮＦ−コントロール」は、機能的ドメインを保有しない。以下の機能的ドメインは、ＺＦＰの特異的検出を可能にするＦＬＡＧエピトープ配列（Ｋｏｄａｋ）である。【０３３２】  ベクターを以下のように構築した、プラスミドｐｃＤＮＡ−ΔＨＢを、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて付着末端を塞ぎ、そして再連結することによって構築した。これは、ポリリンカー中のＨｉｎｄＩＩＩ部位、ＫｐｎＩ部位、ＢａｍＨＩ部位を除去した。ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのカタログに記載される。プラスミドｐｃＤＮＡ−ＮＫＦを、１）開始コドンを含むＫｏｚａｋ配列およびＳＶ４０  ＮＬＳ配列を含む、ＥｃｏＲＩからＫｐｎＩのセグメントであり、全体として以下のＤＮＡ配列：
ＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＴＡＣ、
（ここで、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ部位は下線部である）
を含むセグメント；および２）ＢａｍＨＩ部位、ＫＯＸ１（アミノ酸は、Ｔｈｉｅｓｅｎ、１９９０、前出の１１〜５３と同等である）由来のＫＲＡＢ−Ａボックス、ＦＬＡＧエピトープ（Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩカタログから）、およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むＫｐｎＩからＸｈｏＩまでのセグメントであり、全体として以下の配列を含むセグメント：【０３３３】
【化４】
0005490971.tif 000007
【０３３４】（ここで、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位は下線部である）
を含むｐｃＤＮＡ−ΔＨＢのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位へのフラグメントの挿入によって、生成した。【０３３５】  ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドを、ＺＦＰ配列を含むＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩカセットをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐｃＤＮＡ−ＮＫＦに挿入することによって生成した。ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＭおよびＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドを、プラスミドｐＬｉｔｍｕｓ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）の状況において、ＺＦＰ配列を、第１にＮＬＳ−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧ配列にクローニングし、そして続いてＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩカセットとして、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位まで移動した（ここで、ＢｇｌＩＩ部位がＥｃｏＲＩ部位の直ぐ上流で置換される）（これらのベクターの発現について実施例ＩＶを参照のこと）以外は、同様の方法で構築した。【０３３６】  実施例Ｖにおいて使用されるエフェクタープラスミドを以下のように構築した。プラスミドｐｃＤＮＡ−ＮＶＦを、ＶＰ１６トランス活性化ドメインを上記のようにＰＣＲ増幅し、そしてその産物をｐｃＤＮＡ−ＮＫＦのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入し、ＫＲＡＢを置換することによって、構築した。挿入されたフラグメントのＢａｍＨＩからＨｉｎｄＩＩＩまでの配列は以下であった：【０３３７】
【化５】
0005490971.tif 000008
【０３３８】  ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６ベクターおよびＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６ベクターを、ＺＦＰ配列を含むＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩカセットをＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化されたｐｃＤＮＡ−ＮＶＦに挿入することによって構築した。【０３３９】  実施例ＶＩにおいて使用されたエフェクタープラスミドを以下のように構築した。プラスミドＮＦ−コントロールを、以下の配列：【０３４０】
【化６】
0005490971.tif 000009
【０３４１】をｐｃＤＮＡ−ＮＫＦのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、それによってＮＬＳ−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧ配列をＮＬＳ−ＦＬＡＧのみと置換することによって生成した。【０３４２】  ＶＥＧＦ１−ＮＦおよびＶＥＧＦ３ａ／１−ＮＦを、ＺＦＰ配列を含むＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩカセットをＫＰｎＩおよびＢａｍＨＩで消化したＮＦ−コントロールに挿入することによって構築した。ＣＣＲ５−ＫＲＡＢを、ＺＦＰ配列をＶＥＧＦ標的物に関連しないＤＮＡ標的部位について特異的であるように設計することを除いて、ＶＥＧＦ  ＫＲＡＢベクターと同じ方法で構築した。【０３４３】  最終的には、ＫＲＡＢおよびＶＰ１６発現プラスミドの両方のコントロールバージョンを構築した。プラスミドＮＫＦコントロールを、ジンクフィンガータンパク質配列を有さないＮＬＳ−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧを発現するように設計した；プラスミドＮＶＦ−コントロールを、ＺＦＰ配列を有さないＮＬＳ−ＶＰ１６−ＦＬＡＧを発現するように設計した。これらのプラスミドを、ＢａｍＨＩを用いてそれぞれｐｃＤＮＡ−ＮＫＦおよびｐｃＤＮＡ−ＮＶＦを消化し、Ｋｌｅｎｏｗで末端を充填し、そして下流ドメインを適切なリーディングフレームへ配置するために再連結することによって作製した。これらのプラスミドは、細胞培養研究についての厳密なコントロールとして用いる。【０３４４】  ＶＥＧＦ操作されたＺＦＰの哺乳動物細胞発現および核局在化を、免疫蛍光研究を通して実証した。２９３（ヒト胚腎臓）細胞をＮＬＳ−ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ−ＦＬＡＧキメラをコードする発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。リポフェクタミンを以下に記載のように使用した。２４〜４８時間後、細胞を固定し、そしてＦＬＡＧエピトープに対する一次抗体に曝露した。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識した二次抗体を適用し、そして細胞をＤＡＰＩで対比染色した。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ染色によって、ＤＡＰＩ染色の一貫した同時局在化が観察された。このことは、このプラスミドから発現されるＺＦＰが、核局在化したことを示す。【０３４５】  （実施例ＩＶ：同時トランスフェクション実験におけるＶＥＧＦレポーターの抑制）
この実施例は、細胞におけるＺＦＰリプレッサータンパク質の活性を測定するための、一過性の同時トランスフェクトション研究の使用を実証する。このような実験は、ＺＦＰ−ＫＲＡＢ発現（「エフェクター」）プラスミドと、ＶＥＧＦ標的部位を保有するレポータープラスミドとの同時トランスフェクションを含む。空ベクターコントロールに対するエフェクタープラスミドの存在下のレポーター遺伝子の発現の抑制によって、有効性を評価する。【０３４６】  このレポータープラスミド系は、ｐＧＬ３ホタルルシフェラーゼベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に基づいた。ｐＶＦＲ１−４ｘを作製するために、ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーをプラスミドｐＧＬ３−コントロールのＳＶ４０プロモーター（これは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動する）の上流に挿入した。このプラスミドはＳＶ４０エンハンサーを含み、そして多くの細胞型において高レベルでホタルルシフェラーゼを発現する。２つの相補的な４２ｂｐのオリゴヌクレオチドの直列コピー（実施例ＩＩに記載される、ＪＶＦ９およびＪＶＦ１０）を共に連結することにより挿入体を作製した。アダプター配列を連結し、そしてこのアセンブリをｐＧＬ３−コントロールのＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩ部位に挿入した。これは、それらの部位間の以下の配列の挿入を生じた。【０３４７】
【化７】
0005490971.tif 000010
【０３４８】  示される最初の６ヌクレオチドおよび最後の６ヌクレオチドは、ＭｌｕＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位であり；小文字はＨｉｎｄＩＩＩ部位を示す。ＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａの結合部位は下線である。【０３４９】  エフェクタープラスミドの構築を上記に記載する。全てがＣＭＶプロモーターの制御下の、ＳＶ４０核局在配列、ＶＥＧＦ  ＺＦＰ、ＫＲＡＢ抑制ドメイン、およびＦＬＡＧエピトープマーカー融合体を生成するために、ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ、ＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢ、およびＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ発現ベクターを設計した。コントロール（ｐｃＤＮＡ）として、空のｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを使用した。【０３５０】  全てのベクターをＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製キットを使用して調製した。図６は、ＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎臓）細胞を使用する代表的なトランスフェクションのセットを示す。２４ウェルプレートの各ウェルに約４０，０００個の細胞を播種し、そして１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）培地中で５％ＣＯ2と共に３７℃にて一晩増殖させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、そして２００μｌの血清を含まないＤ−ＭＥＭで重層した。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して、プラスミドを導入した。６μｌのリポフェクタミンおよび２５μｌのＤ−ＭＥＭと複合体化されている約０．３μｇのエフェクタープラスミド、約０．３μｇのレポータープラスミド、および約０．０１μｇのプラスミドｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、各ウェルを３７℃にて３０分間トランスフェクトした。トランスフェクションを三連で行った。３時間後、１０％血清を含む１ｍｌの培地を各ウェルに加えた。トランスフェクション後４０〜４８時間で細胞を回収した。Ｄｕａｌ  ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅTM  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクトされる第３のプラスミド（ｐＲＬ−ＳＶ４０）は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子を有し、そしてトランスフェクション効率についての標準として同時トランスフェクトした。図６に示されるデータは、Ｒｅｎｉｌｌａ活性に対して基準化した三連アッセイの平均である。【０３５１】  コントロールレポータープラスミドｐＧＬ３−コントロール（ｐＧＬ３−Ｃ）については、ＺＦＰ−ＫＲＡＢ発現プラスミドの存在もしくは非存在は、ルシフェラーゼ発現レベルに影響を及ぼさない。しかし、ｐＶＦＲ１−４ｘ（ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーを含むレポーター）については、ＶＥＧＦ１（９ｂｐ結合ＺＦＰ）発現プラスミドもしくはＶＥＧＦ３ａ／１（１８ｂｐ結合ＺＦＰ）発現プラスミドの存在は、ルシフェラーゼ発現を、空のｐｃＤＮＡベクターコントロールに対して２〜３倍減少する。ＶＥＧＦ３ａ（９ｂｐ結合ＺＦＰ）発現プラスミドは、ほとんどもしくは全く効果を示さないようである。これらの実験は、ＺＦＰの標的部位が存在する場合、設計されたＺＦＰが細胞内で機能して遺伝子の転写を抑制し得ることを明確に実証する。さらに、特定レベルの親和性が機能に必要とされるようである；すなわち、１０ｎＭ以下のＫdを有するＶＥＧＦ１およびＶＥＧＦ３ａ／１は機能的であるが、２００ｎＭの���dを有するＶＥＧＦ３ａは機能的ではない。【０３５２】  第２のレポータープラスミドであるｐＶＦＲ２−４ｘを、ＨｉｎｄＩＩＩを使用してＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーを取り出すことにより構築し、そしてこれらをｐＧＬ３コントロールのＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した（順方向で）。これは、ＳＶ４０プロモーターのための転写開始部位と、ルシフェラーゼ遺伝子の転写開始コドンとの間に標的部位を配置する。記載されるのと同様の同時トランスフェクション実験において、ｐｃＤＮＡコントロールに対して、約３〜４倍のルシフェラーゼシグナルの抑制がＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢリプレッサーもしくはＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢリプレッサーで観察された（データ未掲載）。このことは、リプレッサーが、転写の開始部位の上流または下流のいずれかに結合した場合、活性であることを示す。【０３５３】  （実施例Ｖ：同時トランスフェクション実験でのＶＥＧＦレポーターの活性化）
この実施例は、細胞においてＺＦＰ転写アクチベーターの活性を測定するための一過性の同時トランスフェクション研究の使用を実証する。この実験の準備は、異なるトランスフェクション法、異なる細胞株、および異なるセットのレポータープラスミドおよびエフェクタープラスミドが使用されたことを除いて、実施例ＩＶの準備と同様である。【０３５４】  活性化実験について、レポーターを標識したｐＶＦＲ３−４ｘに構築した。このレポーターは、プラスミドｐＧＬ３−プロモーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩ部位に、ＶＥＧＦ標的の４つのコピー（上記に示される配列を有する）を含む。このベクターは、ＳＶ４０エンハンサー配列を欠失するので、より低い基底レベルのホタルルシフェラーゼ発現を有する。ｐＶＦＲ１−４ｘのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩフラグメントをｐＧＬ３−プロモーターのＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ部位と交換することによって、ｐＶＦＲ３−４ｘを構築した。【０３５５】  エフェクタープラスミドの構築は上記される。全てがＣＭＶプロモーターの制御下の、ＳＶ４０核局在配列、ＶＥＧＦ  ＺＦＰ、ＶＰ１６トランス活性化ドメイン、およびＦＬＡＧエピトープタグを融合体を生成するために、ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６、ＶＥＧＦ３ａ−ＶＰ１６、およびＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６発現ベクターを設計した。コントロールとして、空のｐｃＤＮＡ３発現ベクターを使用した。【０３５６】  全てのベクターをＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製キットを使用して調製した。図７は、２９３（ヒト胚腎臓）細胞を使用する代表的なトランスフェクションのセットを示す。２４ウェルプレートの各ウェルに約４０，０００個の細胞を播種し、そして１０％ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地中で５％ＣＯ2と共に３７℃にて一晩増殖させた。細胞を血清を含まないＤ−ＭＥＭで洗浄し、そして２００μｌの同じＤ−ＭＥＭで重層した。リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を製造者の取扱説明書に従って使用して、プラスミドを導入した。各ウェル中の細胞を、１．５μｇのレポータープラスミド、１．５μｇのエフェクタープラスミド、および０．５μｇのアクチン／β−ｇａｌプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドを１５μｌのＣａＣｌ2と組み合わせ、そしてｄＨ2Ｏで１００μｌにした。ボルテックスしている間、１００μｌのＨＥＰＥＳ溶液を滴下して添加した。この混合物を室温にて３０分間インキュベートした。次いで、２００μｌのリン酸カルシウム処理ＤＮＡを各ウェル中の培地に添加した。トランスフェクションは三連で行った。５時間後、この培地を除去し、そして１ｍｌの１０％血清を含む培地を添加した。トランスフェクションの４０〜４８時間後で細胞を回収した。Ｄｕａｌ−ＬｉｇｈｔTMシステム（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用して、ルシフェラーゼアッセイを行った。トランスフェクトされる第３のプラスミドであるアクチン／β−ｇａｌは、アクチンプロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保有し、そしてこのプラスミドをトランスフェクション効率についての標準として同時トランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼアッセイもまた、製造業者の取扱説明書（Ｔｒｏｐｉｘ）に従って行った。図７に示すデータは、β���ガラクトシダーゼ活性に対して基準化した三連アッセイの平均である。【０３５７】  コントロールレポータープラスミドであるｐＧＬ３−プロモーター（ｐＧＬ３−Ｐ）については、ＺＦＰ−ＶＰ１６発現プラスミドの存在もしくは非存在は、ルシフェラーゼ発現レベルに有意に影響しない。ｐＶＦＲ３−４ｘ（ＶＥＧＦ標的部位の４つのコピーを含むレポーター）については、ＶＥＧＦ１（９ｂｐ結合ＺＦＰ）の存在は、空のｐｃＤＮＡベクターコントロールに対してごくわずかな活性化を示す。ＶＥＧＦ３ａ／１（１８ｂｐ結合ＺＦＰ）発現プラスミドは、非常に実質的にルシフェラーゼ発現を活性化し、これはｐｃＤＮＡに対して約１４倍の増加を示す。これらの実験は、設計したＺＦＰは、ＶＰ１６活性化ドメインに融合された場合、その標的が存在する場合、細胞内で機能して、伝子の転写を活性化し得ることを明らかに示す。さらに、これらの結果は、１８ｂｐ結合タンパク質であるＶＥＧＦ３ａ／１が、このアッセイにおいて、９ｂｐ結合ＶＥＧＦ１タンパク質よりもずっと良いアクチベーターであることを明らかに示す。これは、ＶＥＧＦ３ａ／１タンパク質の改善された親和性または減少したオフ速度を生じ得る。【０３５８】  第４のＶＥＧＦレポータープラスミドを、ｐＶＦＲ２−４ｘのＫｐｎＩ／ＮｃｏｌＩフラグメントをｐＧＬ３−プロモーターにクローニングすることにより構築して、プラスミドｐＶＦＲ４−４ｘを作製した。このレポーターをＶＥＧＦ１−ＶＰ１６およびＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６融合体を発現するエフェクタープラスミドと組み合わせて使用する同時トランスフェクションにおいて、活性化が観察された（データ未掲載）。このことは、これらの人工的なトランスアクチベーターは、転写開始の上流または下流のいずれかに結合した場合に機能性であることを示す。【０３５９】  これらの同時トランスフェクションデータは、ＺＦＰを使用してレポーター遺伝子の発現を調節し得ることを示す。このような実験は、内因性細胞遺伝子の発現のモジュレーターとしてのさらなる使用のために、ＺＦＰの同定のための有用な手段として働く。以下に示されるように、調節の結果は、同じＺＡＰ構築物を使用する場合でも、同時トランスフェクション実験と内因性遺伝子実験との間で変化し得る。【０３６０】  （実施例ＶＩ：ヒト細胞における内因性ＶＥＧＦ遺伝子の抑制）
この実施例は、設計したＺＦＰが、天然の状況およびクロマチン構造にある内因性細胞遺伝子の発現を抑制し得ることを例証する。詳細には、ＫＲＡＢ抑制ドメインに融合されたＶＥＧＦ  ＺＦＰを発現するエフェクタープラスミドを細胞に導入し、そしてＶＥＧＦ遺伝子を下方制御することを示した。【０３６１】  真核生物発現ベクターを、実施例ＩＩＩにおいて上述されるように、ＶＥＧＦ３ａ／１およびＶＥＧＦ１  ＺＦＰをＳＶ４０  ＮＬＳおよびＫＲＡＢに融合して構築した。トランスフェクションをリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬからの市販のリポソーム調製物）を使用して行った。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  ＤＮＡ精製システムを使用して調製した。総容量１６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で、１０μｇのエフェクタープラスミドを１００μｇのリポフェクタミン（５０μｌ）と混合した。トランスフェクトション効率についての内部コントロールとして、ｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）もまたＤＮＡ混合物中に含めた。３０分のインキュベーションの後、６．４ｍｌのＤＭＥＭを添加し、そしてこの混合物を３×１０6の２９３細胞上に重層した。５時間後、このＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を除去し、そして細胞上に１０％ウシ胎児血清を含む新鮮な培養培地を重層した。【０３６２】  トランスフェクションの１８時間後、２９３細胞を１００μＭ  ＤＦＸ（デスフェリオキサミン）での処置により誘導した。その結果、ＶＥＧＦ遺伝子の迅速でかつ持続的な転写活性を生じ、そしてまたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ安定性の漸進的な増加を生じた（Ｉｋｅｄａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９７６１−１９７６６（１９９５））。慣用的な培養条件下で、２９３細胞は培養培地において低レベルのＶＥＧＦを分泌する。この上清をＥＬＩＳＡアッセイによるＶＥＧＦレベルの決定のために回収する前に、これらの細胞をさらに２４時間インキュベートし得る。【０３６３】  類似したレベルの抑制を実証した平行の実験において、細胞の生存率をＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してモニターした。１８時間のＤｆｘ処置の後、２ｍｌの最初の培地から５００μＬを取り出し、そして上記に記載されるようにしてＶＥＧＦ発現について分析した。細胞の生存率を評価するために、残りの１．５ｍｌに３００μＬのＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを添加した。次いで、細胞を３７℃にて約２時間インキュベートした。各ウェルからの１００μＬを９６ウェルプレートに移し、そしてＥＬＩＳＡプレートリーダー上でＯＤ４９０ｎｍにて読み取った。空のベクターコントロールでトランスフェクトした細胞に対して、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ構築物を発現する細胞の生存率において有意な減少は見られなかった。このことは、観察されたＶＥＧＦ抑制は、一般化された細胞死のためではなかったことを示す。【０３６４】  ＶＥＧＦ発現の４０〜５０倍の減少は、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ（１８ｂｐ結合ＶＥＧＦ高親和性ＺＦＰをコードする発現ベクター）でトランスフェクトされたＤＦＸ処置細胞において顕著であった。発現の２倍の減少が、細胞をＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ（９ｂｐ結合ＶＥＧＦ高親和性ＺＦＰをコードする発現ベクター）でトランスフェクトした場合に観察された。非ＶＥＧＦ  ＺＦＰ（ＣＣＲ５−ＫＲＡＢ）またはＮＫＦ−コントロールでトランスフェクトされた細胞においては、ＶＥＧＦ発現の有意な減少は観察されなかった（図８）。３つの独立したトランスフェクション実験において同様の結果が得られた。【０３６５】  別に実験において、以下の結果が得られた（データ未掲載）。ＶＥＧＦ１−ＮＦ（機能的ドメインをなしで９ｂｐ結合ＶＥＧＦ１  ＺＦＰを発現する）は、ＶＥＧＦ遺伝子発現に対して効果を及ぼさないことが示された。ＶＥＧＦ発現における有意な減少は、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＮＦ（機能的ドメインをなしで１８ｂｐ結合タンパク質を発現する）で観察された。この結果は、転写の開始部位への結合が、抑制ドメインなしでさえも、転写を妨害することを示唆する。ＫＲＡＢドメインに融合した場合でさえも、ＶＥＧＦ３ａ  ＺＦＰは、発現レベルに影響し得ない（プラスミドＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢ）。しかし、ＫＲＡＢに融合されたＶＥＧＦ１（ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ）は、劇的な発現の減少を生じる。ＫＲＡＢに融合されたＶＥＧＦ３ａ／１（ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ）は、完全にＶＥＧＦ発現を妨げる。【０３６６】  これらのデータは、設計したＺＦＰが、染色体上のその標的部位を見つけ出し得そして結合し得、そして内因性細胞標的遺伝子の発現を妨げ得ることを示す。特に、これらの結果は、約２５ｎＭより低いＫｄを有するＺＦＰ（例えば、ＶＥＧＦ１は、約１０ｎＭの平均推定Ｋｄを有する）が、発現において劇的な減少を提供することを示す。さらに、このデータは、ＫＲＡＢ機能ドメインが遺伝子サイレンシングを増大することを示す。この実験において、ＶＥＧＦの誘導因子（ＤＦＸ）を添加する前にリプレッサーの誘導が生じるので、このデータは、設計したリプレッサーの、既に静止状態の遺伝子の活性化を妨げる能力を示す。さらに、これらの結果は、その標的に対してｎＭの親和性を有する６フィンガーの操作されたＺＦＰ（ｓｉｘ−ｆｉｎｇｅｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）（ＶＥＧＦ３ａ／１）が、転写開始部位に重複する標的に結合する場合、ＶＥＧＦ遺伝子の低酸素応答を阻害し得ることを示す。【０３６７】  （実施例ＶＩＩ：ヒト細胞における内因性ＶＥＧＦ遺伝子の活性化）
この実施例は、設計したＺＦＰは、天然の状況およびクロマチン構造にある遺伝子の発現を活性化し得ることを例証する。詳細には、ＶＰ１６活性化ドメインに融合されたＶＥＧＦ  ＺＦＰを発現するエフェクタープラスミドを細胞に導入し、そしてＶＥＧＦ遺伝子を上方制御することを示した。【０３６８】  真核生物発現ベクターを、実施例ＩＩＩに記載されるように、ＶＥＧＦ３ａ／１およびＶＥＧＦ１  ＺＦＰをＳＶ４０  ＮＬＳおよびＶＰ１６に融合して構築した。トランスフェクションをリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬからの市販のリポソーム調製物）を使用して行った。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  ＤＮＡ精製システムを使用して調製した。総容量１６００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で、１０μｇのエフェクタープラスミド（操作されたエフェクタープラスミドを含む）を１００μｇのリポフェクタミン（５０μｌ）と混合した。トランスフェクトション効率についての内部コントロールとして、ｐＣＭＶβ−ｇａｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）もまたＤＮＡ混合物中に含めた。３０分のインキュベーションの後、６．４ｍｌのＤＭＥＭを添加し、そしてこの混合物を３×１０6の２９３細胞上に重層した。５時間後、このＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を除去し、そして細胞上に１０％ウシ胎児血清を含む新鮮な培養培地を重層した。１日後、新鮮な培地を添加し、そして市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＶＥＧＦレベルの決定のために、この上清を２４時間後に回収した。【０３６９】  ３フィンガーのＶＥＧＦ１に特異的なＺＦＰ（ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６）については、コントロールプラスミド（ＮＶＦ−コントロール）および擬態トランスフェクト細胞と比較した場合、ＶＥＧＦ発現において７〜１０倍の増加が観察された（図９）。５つの独立した実験において同様の結果が得られた。ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６トランスフェクト細胞におけるＶＥＧＦ分泌のレベルが、ＤＦＸで処理した細胞におけるレベル以上であったことに注目することが重要である（図９）。ＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６の導入は、ＶＥＧＦのより適度の誘導を刺激した。この結果は、実施例ＶＩにおける発見（機能ドメインなしの１８ｂｐ結合タンパク質の発現は、ある程度まで活性化を妨げた）と一致する。この結果は、このタンパク質の転写の開始部位への密接な結合が、活性化を妨げることを示唆した。【０３７０】  これらのデータは、設計したＺＦＰが、染色体上のその標的部位を見つけ出しそして結合して転写活性化ドメインを提示し得、そしてその遺伝子の発現レベルを劇的に増強し得ることを示す。特に、これらの結果は、約２５ｎＭより低いＫdを有するＺＦＰ（例えば、ＶＥＧＦ１が、約１０ｎＭの平均推定Ｋdを有する）が、発現において劇的な増加を提供することを示す。【０３７１】  （実施例ＶＩＩＩ：ＲＮａｓｅ保護アッセイ）
実施例ＶＩおよびＶＩＩの結果をさらに実証するために、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）を行い、ＶＥＧＦタンパク質の増加レベルをＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルの増加（実施例ＶＩＩ）と相関させ、そしてＶＥＧＦタンパク質の減少レベルをＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルの減少（実施例ＶＩ）と相関させた。【０３７２】  ＲＮＡを、トランスフェクト細胞からＲＮＡ単離キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して単離した。ＶＥＧＦ特異的プローブを含む放射性標識した多重テンプレートプローブをインビトロ転写によって調製し、そして実験トランスフェクト細胞由来およびコントロールトランスフェクト細胞由来の５μｇの各ＲＮＡに５６℃にて一晩ハイブリダイズした。このハイブリダイゼーション混合物を、ＲＮａｓｅで処理し、そして保護されたプローブを精製して５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、そして放射活性をオートラジオグラフィーによって評価した。ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６でトランスフェクトされた２９３細胞は、ＮＶＦ−コントロールでトランスフェクトされた細胞と比較した場合、２〜４倍の増加したレベルのＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを有した（図１０、パネルＡ；実験の詳細については実施例ＶＩＩを参照のこと）。保護されたプローブのサイズは、ＲＮＡ整合性のためのコントロールとして提供されたコントロールヒトＲＮＡから生成されたプローブのサイズと同一であった（図１０、パネルＡ）。【０３７３】  別の実験において、ＶＥＧＦ特異的ｍＲＮＡのレベルもまた、ＶＥＧＦ−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドでトランスフェクトした細胞において定量した（図１０、パネルＢ；実験の詳細については実施例ＶＩを参照のこと）。このトランスフェクションの詳細は、実施例ＶＩに記載される。細胞をＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドでトランスフェクトした場合、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡのレベルの劇的な減少が観察された。細胞をＮＫＦ−コントロールおよび非ＶＥＧＦ特異的ＺＦＰ（ＣＣＲ５−５−ＫＲＡＢおよびＣＣＲ５−３−ＫＲＡＢ、これらは異なるＣＣＲ５標的部位を認識する）でトランスフェクトした場合、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの有意な減少は観察されなかった。【０３７４】  この実験は、ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６キメラ転写因子でのトランスフェクションの際に観察されたＶＥＧＦタンパク質の増加が、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルの増加によって媒介されることを示す。同様に、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢキメラ転写因子でのトランスフェクションの際に観察されたＶＥＧＦタンパク質の減少は、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルの減少によって媒介される。【０３７５】  （実施例ＩＸ：ＥＰＯ（発生的にサイレントな遺伝子）の活性化）
ＥＰＯは３０．４ｋＤの糖タンパク質ホルモンであり、赤血球産生の制御に重要な役割を果たす。ＥＰＯ遺伝子は、通常、低酸素に応じて胎児肝臓および成体腎臓のみで発現される。ＥＰＯは、骨髄内の赤血球前駆体細胞上のＥＰＯレセプターと相互作用することによって作用して、それらの細胞の増殖および成熟赤血球への分化を刺激する（Ｊｅｌｋｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ７２：４４９（１９９２）；Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８：８６３（１９９４）；Ｒａｔｃｌｉｆｆｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．（１９９１））。組換えヒトＥＰＯ遺伝子産物は、貧血および慢性腎不全を処置するために首尾良く使用されてきた（Ｅｇｒｉｅ，Ｐｈａｒａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  １０：３Ｓ（１９９０））。【０３７６】  ＥＰＯ転写開始部位の８５３ｂｐ上流に位置する９ｂｐ  ＤＮＡ結合部位を認識するように、ＥＰＯ２Ｃ  ＺＦＰを設計した。ＥＰＯ２Ｃの設計および構築のための方法は、本明細書およびＵＳＳＮ  ０９／２２９，００７（１９９９年１月１２日出願）に記載される。ＥＰＯ２Ｃ結合部位配列は、ＧＣＧＧＴＧＧＣＴである。【０３７７】  真核生物発現ベクターを、本明細書およびＵＳＳＮ  ０９／２２９，００７（１９９９年１月１２日出願）に記載されるようにして、ＥＰＯ２Ｃ  ＺＦＰをコードする配列をＳＶ４０核局在シグナル（ＮＬＳ）およびＨＳＶ  ＶＰ１６トランス活性化ドメインに融合することにより構築した。全てのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ精製システムを使用して調製した。【０３７８】  ２×１０6Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ヒト肝細胞癌由来細胞株）または５×１０6ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胚腎臓上皮由来細胞株）をトランスフェクションの１日前に６ウェルプレートに播種した。５００ｎｇのエフェクタープラスミド（操作されたＺＦＰをコードする）をこれらの細胞にリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を使用して一過的にトランスフェクトした。擬態トランスフェクションおよび空の発現ベクターでのトランスフェクションを、コントロールとして使用した。１日後、増殖培地を除去し、そして新鮮なＤＭＥＭ培地を添加した。ＥＰＯタンパク質発現レベルの決定のために、培養上清を２４時間後に回収した。この決定には、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用した。【０３７９】  図１１ａの結果は、ＥＰＯ２Ｃ  ＺＦＰトランス活性化タンパク質をコードするベクターのトランスフェクションが、コントロールベクター（ｐｃＤＮＡＮＶＦ）トランスフェクト細胞または擬態トランスクェクト細胞と比較した場合、ＥＰＯ発現レベルを有意に増大させたことを示す。この活性化は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞およびＨＥＫ２９３細胞の両方で観察された（図１１ａ）。【０３８０】  Ｈｅｐ３Ｂ細胞は、特定の条件下でＥＰＯ遺伝子を発現し得ることが公知である（Ｇｏｌｄｂｅｒｇら，ＰＮＡＳ  ８４：７９７２（１９８７））。これらの細胞は、ＥＰＯの胎児供給源である肝細胞に由来する。Ｈｅｐ３Ｂ細胞において、低酸素（または低酸素の模倣であるＣｏＣｌ2での処置）は、ＥＰＯ遺伝子の発現を活性化する（この遺伝子は他の状���ではサイレントである）（図１１ａを参照のこと）。ＶＥＧＦ発現はまた、Ｈｅｐ３Ｂ細胞において低酸素によって制御される。【０３８１】  低酸素またはＣｏＣｌ2処置は、ＨＥＫ２９３細胞においてＶＥＧＦ発現を活性化する。このことは、低酸素応答がこれらの細胞株において正常に機能することを示す（図８を参照のこと）。しかし、低酸素またはＣｏＣｌ2での処置は、ＨＥＫ２９３細胞においてＥＰＯ発現を誘導し得ない（図１１ａ）。この結果は、ＨＥＫ２９３細胞が胚腎臓上皮細胞（ＥＰＯの供給源として作用しない組織）に由来するので生じる。これらの細胞でのＥＰＯの不活性化にもかかわらず、キメラＥＰＯ２Ｃ−ＶＰ１６  ＺＦＰは、ＥＰＯ遺伝子を活性化し得る（図１１ａ）。【０３８２】  ＥＰＯ遺伝子発現に対するＣｏＣｌ2効果およびＺＦＰ効果は、ＥＰＯ転写に影響を及ぼすことが示された。ＴａｑＭａｎアッセイ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）として公知の方法を使用して、定量的なＲＴ−ＰＣＲを行った。データを図１１ｂに示す。【０３８３】  以上のように、本発明は、組換えジンクフィンガータンパク質を用いる内因性細胞遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。
【発明の効果】
【０３８４】  本発明により、内因性細胞遺伝子の発現を調節する初めての方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＺＥＰコード合成遺伝子の生成のためのＰＣＲ増幅スキーム。
【図２】  代表的なＺＦＰの発現および精製。図２Ａ：誘導前の非融合ＺＦＰ（レーン１）、誘導後の非融合ＺＦＰ（レーン２）、および精製後の非融合ＺＦＰ（レーン３）。図２Ｂ：誘導前のＭＢＰ−ＶＥＧＦ発現（レーン１）、誘導後のＭＢＰ−ＶＥＧＦ発現（レーン２）、およびフレンチプレス溶解後のＭＢＰ−ＶＥＧＦ発現（レーン３）。図２Ｃ：フロースルー（ＦＴ）画分、および最初の画分（１−４）を示すアミロースアフィニティーカラムによるＭＢＰ−ＶＥＧＦの精製。画分２を、電気泳動移動度シフトアッセイ（「ＥＭＳＡ」）に使用した。Ｍは分子量マーカーである。
【図３】  ＺＦＰに融合されたＭＢＰでの代表的なＥＭＳＡ実験。ＭＢＰ−ＶＥＧＦ１タンパク質を、テキストに記載されるように標識二重鎖ＤＮＡに結合させた。３倍のタンパク質希釈系列を行った；各点は、片対数グラフ上にプロットされた特定のタンパク質濃度でのシフトしたパーセントを表す。定量は、ホスホルイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）によった。この場合、５０％の最大シフトを生じた（見かけのＫd）タンパク質濃度は２ｎＭであった。
【図４】  ＶＥＧＦ３ａ／１に対するＶＥＧＦ１を比較するオフレイト（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）実験。タンパク質−ＤＮＡ複合体を予め形成し、そして１０００倍過剰の非標識オリゴヌクレオチドとインキュベートした。サンプルを種々の時間で電気泳動し、そしてシフトした産物の量を、ホスホリメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）により測定した。カーブフィッティングを用いて、示された複合体の半減期を計算した。
【図５】  哺乳動物細胞における一過性のＺＦＰ発現に使用した代表的発現ベクター
【図６】  ＶＥＧＦ−ＫＲＡＢタンパク質発現を介するルシフェラーゼレポーター活性の抑制を示す同時トランスフェクションデータ。誤差棒は、３連のトランスフェクションの標準偏差を示す。ｐＧＬ３−Ｃ（レポーターベクターコントロール）；ｐＶＦＲ１−４ｘ（ＶＥＧＦレポータープラスミド）；ＶＥＧＦ１（ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ）；ＶＥＧＦ３ａ（ＶＥＧＦ３ａ−ＫＲＡＢ）；ＶＥＧＦ３ａ／１（ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ）。
【図７】  ＶＥＧＦ−ＶＰ１６タンパク質発現を介するルシフェラーゼレポーター活性の活性化を示す同時トランスフェクションデータ。誤差棒は、３運のトランスフェクションの標準偏差を示す。ｐＧＬ３−Ｐ（ＶＥＧＦ標的を有さないレポーターベクターコントロール）；ｐｃＤＮＡ（空のエフェクターベクターコントロール）；ｐＶＦＲ３−４ｘ（ＶＥＧＦレポータープラスミド）；ＶＥＧＦ１（ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６）；ＶＥＧＦ３ａ（ＶＥＧＦ３ａ−ＶＰ１６）；ＶＥＧＦ３ａ／１（ＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６）。
【図８】  ＶＥＧＦ  ＺＦＰ−ＫＲＡＢエフェクタープラスミドのトランスフェクションに起因する内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現の抑制を示すＶＥＧＦのＥＬＩＳＡデータ。ＤＦＸ処理（コントロールのトランスフェクトしていないＤｆｘ処理細胞）；ＺＦＰなし（ｐｃＤＮＡ−コントロール）、ＶＥＧＦ１（ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ）、ＶＥＧＦ３ａ／１（ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ）、ＣＣＲ５（ＣＣＲ５−ＫＲＡＢ）；非誘導のモック（偽）（ＤＦＸで非処理の偽トランスフェクト細胞）。誤差棒は、２連のトランスフェクションの標準偏差を示す。
【図９】  ＶＥＧＦ  ＺＦＰ−ＶＰ１６エフェクタープラスミドのトランスフェクションに起因する内因性ＶＥＧＦ遺伝子発現の活性化を示すＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡデータ。モック（偽トランスフェクト細胞）；ＺＦＰなし（ＮＶＦ−コントロール）、ＶＥＧＦ１（ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６）、ＶＥＧＦ３ａ／１（ＶＥＧＦ３ａ／１−ＶＰ１６）；誤差棒は、２連のトランスフェクションの標準偏差を示す。
【図１０】  ＶＥＧＦ特異的ＺＦＰによるＶＥＧＦ特異的ｍＲＮＡにおける変化を示すＲＮアーゼ保護アッセイ。パネルＡ：ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ、ＮＶＦ−コントロール（ＺＦＰなし）、ＶＥＧＦ１−ＮＶＦ（ＶＥＧＦ１−ＶＰ１６）、ＣＣＲ５−５−ＮＶＦ（ＣＣＲ５−ＶＰ１６）、ＣＣＲ５−３−ＮＶＦ（ＣＣＲ５−ＶＰ１６）の活性化；パネルＢ：ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡ、ＮＶＦ−コントロール（ＺＦＰなし）、ＶＥＧＦ１−ＮＶＦ（ＶＥＧＦ１−ＫＲＡＢ）、ＶＥＧＦ３ａ／１−ＮＶＦ（ＶＥＧＦ３ａ／１−ＫＲＡＢ）、ＣＣＲ５−３−ＮＶＦ（ＣＣＲ５−ＫＲＡＢ）の抑制。１４８ヌクレオチドＶＥＧＦ特異的バンドの大きさを、矢印で示す。ＶＥＧＦ特異的プローブを、ヒト脈管形成マルチプローブテンプレートセット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）から合成した。コントロールとして、ハウスキーピング遺伝子Ｌ３２およびＧＡＰＤＨからのシグナルを示す（矢印）。
【図１１ａ】  図１１ａはＥＬＩＳＡを使用して測定した場合の、Ｈｅｐ３Ｂおよび２９３細胞におけるＥＰＯ産生の測定による内因性ＥＰＯ遺伝子の発現の活性化を示す。
【図１１ｂ】  図１１ｂは、ｍＲＮＡ発現を測定することによるＨｅｐ３Ｂ細胞および２９３細胞における内因性ＥＰＯ遺伝子の活性化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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