(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素基板上に細胞を吸着し、炭素基板上で細胞を増殖させ、顕微鏡観察を行うことを含み、前記炭素基板は、樹脂の焼成により得られたガラス状炭素とガラス状炭素中に均一に分散した結晶性炭素を含み、研削された表面を有し、結晶性炭素のエッジがその表面に露出している、細胞培養観察方法。
【請求項２】
前記細胞は神経細胞であり、前記方法は前記炭素基板上に神経細胞を吸着させる物質をコートすることをさらに含み、前記細胞を増殖させることは該コートされた神経細胞吸着物質に沿って神経細胞を伸長させることを含む請求項１記載の細胞培養観察方法。
【請求項３】
前記神経細胞吸着物質は、細胞外マトリックス由来の蛋白質、ポリアミノ酸またはコンカナパリンＡである請求項２記載の細胞培養観察方法。
【請求項４】
前記細胞外マトリックス由来の蛋白質は、フィブロネクチン、ラミニン、またはコラーゲンである請求項３記載の細胞培養観察方法。
【請求項５】
前記ポリアミノ酸は、ポリＬリジン、ポリＤリジンまたはポリＤオルニチンである請求項３記載の細胞培養観察方法。
【請求項６】
樹脂の焼成により得られたガラス状炭素およびガラス状炭素中に均一に分散した結晶性炭素を含み、研削された表面を有し、前記結晶性炭素のエッジがその表面に露出しており、その表面で細胞を増殖させて顕微鏡観察するための細胞培養観察用炭素基板。
【請求項７】
前記ガラス状炭素内に均一に分散した前記結晶性炭素を１質量％以上４０質量％以下の割合で含む請求項６記載の細胞培養観察用炭素基板。
【請求項８】
前記結晶性炭素は、カーボンナノチューブ、黒鉛ウイスカー、高配向性熱分解黒鉛、キッシュ黒鉛、天然黒鉛、人造黒鉛、フラーレン、黒鉛繊維チョップより成る群より選ばれた少なくとも一種である請求項７記載の細胞培養観察用炭素基板。
【請求項９】
熱硬化性樹脂の液状組成物中に結晶性炭素を混合し、混合物を、結晶性炭素が均一に分散するよう制御しつつ所望の基板形状に成形し、成形物を、不活性雰囲気、非酸化性雰囲気中、又は真空中で焼成し、その表面を研削して、結晶性炭素のエッジがその表面に露出しており、樹脂の焼成により得られたガラス状炭素とガラス状炭素中に均一に分散した結晶性炭素を含む、炭素基板を得る、細胞培養観察用炭素基板の製造方法。
【請求項１０】
焼成することが、７００℃〜２８００℃の温度に加熱処理することを含む請求項９記載の細胞培養観察用炭素基板の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を増殖させて顕微鏡観察する方法、そのために用いる基板およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
殆どの動物細胞は、細菌類とは違って、浮遊状態では分裂増殖できないので、物体の表面に付着させ培養される。この場合に、細胞が付着しやすいように表面加工した薄いガラス（カバーガラスやスライドガラス）やプラスチックに付着させて培養される事が多い。この培養細胞内部の、特定の蛋白分子の分布を知るために、研究の対象となる蛋白質を蛍光標識し、特定の分子の分布を「落斜型の蛍光顕微鏡」や「共焦点顕微鏡」を用いて、観察することが広く行われている。
【０００３】
この蛍光顕微鏡観察では、細胞以外のバックグランド（背景）の物質自体の蛍光や反射を低く抑える事が望ましい。現在は、蛍光を低く抑えたガラスが用いられているが、ガラス自体の蛍光や反射は、有意に検出できる程度に存在している。
【０００４】
上述のように、細胞の増殖のためには、細胞が基材の表面に付着する必要がある。基材（例えばガラスやプラスチック製の培養用シャーレの内底面）を、適当な物質（ポリ−Ｌリジンやコラーゲンなど）でコートしたり、ある種の残基（例えばアミノ基）で化学修飾したりして、細胞が付着しやすい状態にする事が行われている。生体試料観察用の基板は、細胞が表面に付着しやすいか、あるいは付着しやすい様に、表面加工が可能である必要があるとされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって本発明の目的は、細胞培養観察に適した基板およびそれを使った観察方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、炭素基板上に細胞を吸着し、炭素基板上で細胞を増殖させ、顕微鏡観察を行う、細胞培養観察方法が提供される。
【０００７】
本発明によれば、樹脂の焼成により得られたガラス状炭素を含み、その表面で細胞を増殖させて顕微鏡観察するための細胞培養観察用炭素基板もまた提供される。
【０００８】
前記炭素基板は、前記ガラス状炭素内に均一に分散した結晶性炭素を１質量％以上４０質量％以下の割合で含むことが好ましい。
【０００９】
前記結晶性炭素は例えば、カーボンナノチューブ、黒鉛ウイスカー、高配向性熱分解黒鉛、キッシュ黒鉛、天然黒鉛、人造黒鉛、フラーレン、黒鉛繊維チョップより成る群より選ばれた少なくとも一種である。
【００１０】
前記炭素基板は、熱硬化性樹脂の液状組成物中に結晶性炭素を混合し、混合物を、黒鉛が均一に分散するよう制御しつつ所望の基板形状に成形し、成形物を、不活性雰囲気、非酸化性雰囲気中、又は真空中で焼成することによって製造される。
【００１１】
本発明の細胞培養観察用炭素基板は、無蛍光・低反射であり、表面加工なしでもその表面に細胞を付着して培養することが可能であるという、細胞培養観察用基板としての優れた特性を有している。
【００１２】
また、樹脂の焼成前に黒鉛、カーボンナノチューブなどの結晶性炭素を混合することによって、ガラス状炭素中に結晶性炭素が均一に分散した複合炭素が得られる。
【００１３】
このように、ガラス状炭素中に、結晶性炭素が均一に分散した複合炭素材料とすることで、表面に露出した結晶のエッジにより細胞の吸着性が向上し、また、加工性が向上するので顕微鏡観察に支障がないように表面を平坦に加工することが容易になる。
【実施例】
【００１４】
フラン樹脂（日立化成工業（株）製  ヒタフランＶＦ−３０２）９２部に天然鱗状黒鉛粉末（日本黒鉛工業（株）製  平均粒度１μｍ）８部を添加して、充分に分散、混合することで、基板用液状材料を得た。次に、この液状材料をドクターブレードタイプ塗工機に投入し、塗工後固化させることでグリーンシートを作製した。グリーンシートを円盤状に加工後乾燥炉内で加熱硬化処理を施すことで硬化板を得た。得られた硬化板を、窒素ガス雰囲気下１０００℃まで５０時間で昇温させ炭素化処理した後、真空高温炉により１４００℃処理を施すことで、ガラス状炭素／黒鉛の割合が質量比で約８０／２０で３５mm径の寸法を有し、ショアー硬度９０の全炭素質からなる円盤状の基板を得た。得られた基板を平面研削盤（真空チャック使用）で厚み１．０mmまで研削し細胞培養観察用基板を得た。
【００１５】
培養細胞株はアメリカ細胞バンク（ＡＴＣＣ）より購入したニューロブラストーマ（ＮＧ１０８株）、上皮細胞（ＮＩＨ３Ｔ３株）を用いた。培養液はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍを用いた。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子を含むプラスミド（クローンテック社）を、キアゲン社の遺伝子導入用キットを用いてリポフェクション法により上記の細胞株に導入した。
【００１６】
γ線滅菌済の２つのプラスチックシャーレ（内径３５mm）の一方の底面に、上記の３５mm径の円盤状の炭素板を他方には細胞増殖用コート（ポリＬ−リジンコート）を施したカバーガラス（２４mm角、マツナミガラス製）を入れ、紫外線滅菌３０分を行った。ここに培養液を入れ、遺伝子導入した細胞を含む溶液を、細胞密度が１×１０4コ／mlの濃度になるように添加した。炭酸ガス培養器（３７度、ＣＯ2濃度５％）に静置した。
【００１７】
細胞は速やかに炭素板に接着し分裂増殖し、数日後には、約７−８０％の細胞が、緑色蛍光蛋白質の遺伝子を発現し、緑色に光る細胞となった。無処理の炭素板でも、細胞増殖用コートを施したカバーガラスと同様に細胞が増殖した。
【００１８】
細胞の増殖した炭素基板またはスライドガラスが底面に沈んでいる培養用プラスチックシャーレを正立型光学顕微鏡（オリンパス社ＡＸ−７０）のステージ上に固定し、水浸用対物レンズ（６０倍）の先端部を培養液の中に浸けて、生きた細胞の蛍光（緑色）を上記顕微鏡の落斜型蛍光装置で観察した。蛍光で緑色に染まった細胞の画像は冷却型ＣＣＤカメラを用いて記録した。
【００１９】
図１は炭素板上で培養した細胞の画像、図２は図１の画像にプロットプロファイルの位置を示す白いラインを入れた画像、図３は図２の白いライン上の輝度値をグラフで表わしたもの、図４は図１の画像全体の輝度値の分布を等高線で示したものである。また、図５はガラス板上で培養した細胞の画像、図６は図５の画像にプロットプロファイルの位置を示す白いラインを入れた画像、図７は図６の白いライン上の輝度値をグラフで表わしたもの、図８は図５の画像全体の輝度値の分布を等高線で示したものである。
【００２０】
図１〜４を図５〜図８と比較してわかるように、炭素板上の細胞の方が背景の反射や蛍光が低減されているため、コントラストの高い明瞭な画像が得られた。
【００２１】
神経細胞は、神経に親和性を持つ物質例えばフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンなどの細胞外マトリックス由来の蛋白質）に沿って神経突起を伸ばすことが知られている。これを炭素基板の表面に所定のパターンでコートしておけば、それに沿って神経を伸長させ神経回路を作らせることが可能である。神経細胞の内部に、蛍光蛋白質が発現するようにしておくと、物質に沿って神経が伸びて行く様子を、落斜型の蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡で観察できる。前述の細胞外マトリックス由来の蛋白質の代わりに、ポリＬリジン、ポリＤリジン、ポリＤオルチニンなどのポリアミノ酸、またはコンカナパリンＡなどを用いても同様の効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】炭素板上で培養した細胞の画像である。
【図２】図１の画像にプロットプロファイルの位置を示す白いラインを入れた画像である。
【図３】図２の白いライン上の輝度値を表わすグラフである。
【図４】図１の画像全体の輝度値の分布を等高線で示した図である。
【図５】ガラス板上で培養した細胞の画像である。
【図６】図５の画像にプロットプロファイルの位置を示す白いラインを入れた画像である。
【図７】図６の白いライン上の輝度値を表わすグラフである。
【図８】図５の画像全体の輝度値の分布を等高線で示した図である。
【図３】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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