(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センダングサ属植物酵素処理物からなる第一の抗単純ヘルペスウイルス剤を含み、アシクロビルからなる第二の抗単純ヘルペスウイルス剤を、投与量が０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／日となるように併用することを特徴とする、抗単純ヘルペスウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はセンダングサ属植物酵素処理物を有効成分として含む薬剤耐性単純ヘルペスウイルスに対する抗単純ヘルペスウイルス剤（抗ＨＳＶ剤ともいう）に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在単純ヘルペスウイルス（ヒトヘルペスウイルス）は８種類が知られており、ヒトに対して様々な病気を引き起こす。単純ヘルペスウイルス感染の特徴としては、感染成立後ウイルスは宿主内に潜伏し、宿主の免疫力低下時に再活性化して回帰発症を起こすことがあげられる。また、抗ヘルペスウイルス薬の多くはその作用点がウイルスＤＮＡポリメラーゼにある。これらの薬を長期間使用すると薬剤耐性ウイルスを生じることが問題とされており、作用点が異なる新たな抗ヘルペスウイルス薬の開発が求められている。
一方、ビデンス・ピローサ等のセンダングサ属植物は昔から身近にあるハーブであり、干した地上部分を煎じたものが飲用に供されている。ビデンス・ピローサの抗炎症作用については特許文献１に報告がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００３−８３４６３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、薬剤耐性単純ヘルペスウイルスに有効であり、また薬剤耐性ウイルスを新たに生じさせることのない新規な作用点を有する抗ＨＳＶ剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者等は、上記課題に対し、センダングサ属植物酵素処理物について単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に対する作用について検討したところ、前記処理物が、宿主細胞とＨＳＶの吸着を阻害し、更に感染後宿主細胞内でのＨＳＶ増殖を抑制するなど複数の作用点があること、更にＨＳＶの薬剤耐性株に対して高い効果を奏すること、また既存の抗ＨＳＶ剤であるアシクロビルと併用すると、両者の抗ＨＳＶ作用が相乗的に増強されることを見いだした。
【０００６】
すなわち、本発明は下記の抗単純ヘルペスウイルス剤に関する。
１．センダングサ属植物酵素処理物を有効成分として含む、薬剤耐性単純ヘルペスウイルスに対する抗単純ヘルペスウイルス剤。
２．薬剤耐性単純ヘルペスウイルスが、アシクロビル耐性株、アシクロビル・ホスホノ酢酸多剤耐性株、ガンシクロビル耐性株、ペンシクロビル耐性株、ピリブジン耐性株、シドフォビル耐性株、からなる群より選択される、上記１記載の抗単純ヘルペスウイルス剤。
３．センダングサ属植物がビデンス・ピローサ類である、上記１または２に記載の抗単純ヘルペスウイルス剤。
４．センダングサ属植物を処理する酵素が、多糖類加水分解酵素からなる群より選択される少なくとも一種である、上記１〜３のいずれか一に記載の抗単純ヘルペスウイルス剤。
５．センダングサ属植物酵素処理物の含有量（乾燥固形分換算）が０．００１〜５ｇ／ｋｇ体重／日となるように投与されることを特徴とする、上記１〜４のいずれか一に記載の抗単純ヘルペスウイルス剤。
６．更にアシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル、ピリブジン、からなる群より選択される抗単純ヘルペスウイルス剤を有効成分として含む、上記１〜５のいずれか一に記載の抗単純ヘルペスウイルス剤。
７．センダングサ属植物酵素処理物からなる第一の抗単純ヘルペスウイルス剤と、アシクロビル、ガンシクロビル、ペンシクロビル、ピリブジン、シドフォビルからなる群より選択される少なくとも一種である第二の抗単純ヘルペスウイルス剤とを有効成分として含み、第二の抗単純ヘルペスウイルス剤の投与量が、第二の抗単純ヘルペスウイルス剤を単独で使用する際の投与量範囲の１／２〜１／１００の投与量であることを特徴とする、抗単純ヘルペスウイルス剤。
８．第二の抗単純ヘルペスウイルス剤がアシクロビルであり、アシクロビルの投与量が０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／日である、上記７記載の抗単純ヘルペスウイルス剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のセンダングサ属植物酵素処理物を有効成分として含む抗ＨＳＶ剤は、その新規な作用機序により、ＨＳＶの薬剤耐性株に対して高い効果を奏するため、従来の抗ＨＳＶ剤で治療しえなかったＨＳＶ感染症を治療することができる。更に、既存の抗ＨＳＶ剤と併用すると、抗ＨＳＶ作用が相乗的に増強されるため、抗ＨＳＶ作用を低下させることなく既存の抗ＨＳＶ剤の量を低減させて、ＨＳＶ感染を治療することができる。既存の抗ＨＳＶ剤単独で抗ＨＳＶ作用を奏する量において副作用が知られている場合には、本発明の抗ＨＳＶ剤を併用することにより、かかる副作用を低減させることができ、有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末の細胞（ｖｅｒｏ，Ｒａｗ２６４．７）に対する細胞毒性確認試験の結果を示している。
【図２】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末の抗単純ヘルペスウイルス感染不活化試験の結果を示している。
【図３】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末の抗ＨＳＶ作用の作用点を解析するために行ったｔｉｍｅ−ｏｆ−ａｄｄｉｔｉｏｎ実験の結果を示している。
【図４】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末のＨＳＶ増殖抑制実験の結果を示している。
【図５】Ｒａｗ２６４．７細胞におけるビデンス・ピローサ酵素処理物粉末のウイルス感染価を示している。
【図６】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末の抗ＨＳＶ作用にＮＯは関与していないことを示す実験の結果を示している。
【図７】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末の薬剤耐性株に対する作用を示す実験の結果を示している。
【図８】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末とアシクロビルを併用した時の抗ＨＳＶ作用を示している。
【図９Ａ】アイソボログラム解析におけるモデルグラフを示す。
【図９Ｂ】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末とアシクロビルを併用した時の抗ＨＳＶ作用をアイソボログラム解析図を示す。
【図１０】ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末中の構成成分であるカフェ酸とルチンの抗ＨＳＶ作用を示している。
【図１１】マウスにおける、ビデンス・ピローサ酵素処理物粉末の抗ＨＳＶ作用を示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明に使用されるセンダングサ属植物は、特開２００１−１７８３９０号公報および特開２００１−２３３７２７号公報に記載されるように、学名ではビデンス（Ｂｉｄｅｎｓ）属と言われる一群の植物である。種類も多岐に亘り互いに交配するので変種も多く、植物学上も混乱が見られ、学名、和名、漢名、の対応も交錯していて同定することは極めて困難であるが、本発明で用いられるセンダングサ属植物は以下に掲げるものを包含する。
【００１０】
Ｂｉｄｅｎｓ  ｐｉｌｏｓａ  Ｌ．（コセンダングサ、コシロノセンダングサ、咸豊草）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｐｉｌｏｓａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｍｉｎｏｒ  （Ｂｌｕｍｅ）Ｓｈｅｒｆｆ  （シロバナセンダングサ、シロノセンダングサ、コシロノセンダングサ、コセンダングサ、咸豊草）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｐｉｌｏｓａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｂｉｓｅｔｏｓａ  Ｏｈｔａｎｉ  ｅｔ  Ｓ．Ｓｕｚｕｋｉ（アワユキセンダングサ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｐｉｌｏｓａ  Ｌ．  ｆ．  ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ  Ｓｃｈｅｒｆｆ  （ハイアワユキセンダングサ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｐｉｌｏｓａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｒａｄｉａｔａ  Ｓｃｈｅｒｆｆ  （タチアワユキセンダングサ、ハイアワユキセンダングサを含むこともある）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｐｉｌｏｓａ  Ｌ．  ｖａｒ．  ｒａｄｉａｔａ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ｂｉｐｏｎｔｉｎｕｓ  （シロノセンダングサ、オオバナノセンダングサ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｂｉｔｅｒｎａｔａ  Ｌｏｕｒ．  Ｍｅｒｒｉｌｌ  ｅｔ  Ｓｈｅｒｆｆ（センダングサ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｂｉｐｉｎｎａｔａ  Ｌ．（コバノセンダングサ、センダングサ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｃｅｒｎｕａ  Ｌ．（ヤナギタウコギ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｆｒｏｎｄｏｓａ  Ｌ．（アメリカセンダングサ、セイタカタウコギ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｍａｘｉｍｏｗｉｃｚｉａｎａ  Ｏｅｔｔ（羽叶鬼針草）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｐａｒｖｉｆｌｏｒａ  Ｗｉｌｌｄ（ホソバノセンダングサ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｒａｄｉａｔａ  Ｔｈｕｉｌｌ．  ｖａｒ．  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ  （Ｔｕｒｃｚ．）Ｋｉｔａｍｕｒａ（エゾノタウコギ）
Ｂｉｄｅｎｓ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔａ  Ｌ．（タウコギ）
【００１１】
上記センダングサ属植物の中で、特にビデンス・ピローサ（Bidens pilosa）類が、効果の観点から好ましい。
【００１２】
上記センダングサ属植物の使用部位は、根、地上部（茎、葉、花等）又は全草何れの部位を用いてもよい。特に、葉及び茎の部分を使用することが効力の点において好ましい。
上記センダングサ属植物は、生で用いても良いが、乾燥物、あるいは加工乾燥物でもよい。通常、生の植物を天日乾燥または熱風（例えば７０〜８０℃）乾燥したもの、又は蒸気で、例えば１時間〜１時間半程度蒸した後、乾燥したものを使用する。また、特開２００１−１７８３９０の方法により加工乾燥した物を用いてもよい。
【００１３】
さらに、常温又は加温下に水又は含水溶媒を添加して抽出したものを用いてもよい。抽出方法としては例えば、浸漬して静置、またはソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出物を得ることもできる。
【００１４】
抽出若しくは固液分離後に酵素処理を行う場合において、濃縮物として使用する場合、濃度を調整した後そのまま用いてもよい。また、抽出物は、脱色、不要物除去のため活性炭処理、ＨＰ20等の樹脂処理、低温放置、瀘過等の処理を施してから用いてもよい。さらに当該抽出物を適当な分離手段、例えばゲル瀘過法やシリカゲルカラムクロマト法、又は逆相若しくは順相の高速液体クロマト法により活性の高い画分を分画して用いることもできる。本発明においてセンダングサ属植物にはこのような分画物も含むものとする。また使用目的に応じて他の成分を混合してもよい。
【００１５】
上記のように得られた加工乾燥物あるいは抽出物を酵素により処理を行う。酵素処理は酵素の種類によって異なるが、通常２０〜９０℃の温度範囲で、１〜５０時間程度行うことが好ましい。また、反応液のｐＨは酵素の種類にもよるが、通常３．５〜９．０程度の範囲に調整して処理することが好ましい。加工乾燥物をそのまま用いる場合には、加工乾燥物１ｋｇに対して、１〜３０Ｌの水または３０％以上含水の親水性有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール等）を添加して酵素処理を行う。
【００１６】
酵素の種類は、多糖類加水分解酵素が特に好ましく、セルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、マンナーゼ、マセレイティングエンザイム、アミラーゼ、グルコシダーゼ、プルラナーゼがより好ましい。セルラーゼとペクチナーゼを組み合わせて使用することが最も好ましい。
本発明において酵素はＡｓｐ．ｎｉｇｅｒなどの菌類由来のものを初めとして様々な由来のものを使用することができる。また、酵素を含有する微生物の培養液、麹などの培養物そのもの、あるいはそれらの抽出物を用いてもよい。
【００１７】
使用する酵素の量は、基質の全質量（乾燥質量）に対して、０．００１〜１０質量％程度添加することが好ましい。２種類以上使用する場合には合計がこの範囲となればよい。
【００１８】
酵素処理終了後、酵素を高温（９０〜１２０℃）で失活させることが好ましい。失活後、フィルタープレスまたは遠心分離等の工程を加えて固液分離し、清澄な液相を使用することが好ましい。
【００１９】
また酵素処理後、抽出溶媒により更に抽出処理を行っててもよい。
酵素を作用させた後、抽出に使用される溶媒の例としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン等のアルコール類、並びにこれらの含水物、アセトン、エチルメチルケトン、クロロホルム、塩化メチレン及び酢酸エチル、並びにそれらの含水物を用いてもよい。また、上記溶媒を二種以上含む混合物であってもよい。溶媒の添加量は、例えば用いる植物の合計乾燥重量１ｋｇに対して１Ｌ〜１００Ｌ程度使用することができる。本発明において特に水抽出が好ましい。
【００２０】
抽出時の温度は、通常、室温〜沸点程度で行うことができる。また、抽出時間は、温度や溶媒にもよるが、室温〜沸点程度で抽出を行う場合には、１〜３００時間程度の範囲にわたって行うことができる。
抽出液は必要により溶媒を留去濃縮して濃縮物または固形物（乾燥物）としてもよい。
濾液または抽出液を濃縮し、乾燥することにより、本発明のセンダングサ属植物の酵素処理物を得ることができる。
【００２１】
上記センダングサ属植物酵素処理物を有効成分として含む本発明の抗ＨＳＶ剤は、薬剤耐性単純ヘルペスウイルスによる感染を予防あるいは治療することができる。既存の抗ＨＳＶ剤の多くはその作用点がウイルスＤＮＡポリメラーゼにあることが知られている。一方、本発明の抗ＨＳＶ剤は、宿主細胞とＨＳＶの吸着を阻害し、更に感染後宿主細胞内でのＨＳＶ増殖を抑制するなど複数の作用点があることが実験により明らかにされた。本発明の抗ＨＳＶ剤の薬剤耐性単純ヘルペスウイルスに対する効果は、複数の作用点をもつためと考えられる。また、複数の作用点をもつことから、本発明の抗ＨＳＶ剤は、ウイルスに対して薬剤耐性を誘起しにくいという有利な効果をも奏するものである。
【００２２】
薬剤耐性単純ヘルペスウイルスの例として、アシクロビル耐性株、アシクロビル・ホスホノ酢酸多剤耐性株、ガンシクロビル耐性株、ペンシクロビル耐性株、ピリブジン耐性株、シドフォビル耐性株、その他、臨床的に単離される様々な耐性株を挙げることができる。本発明の抗ＨＳＶ剤は、特に、アシクロビル耐性株、アシクロビル・ホスホノ酢酸多剤耐性株に対して、有効な治療効果を奏する。
【００２３】
本発明の抗ＨＳＶ剤は、経口、経皮、静脈内、腹腔内等様々な投与方法により投与することができる。特に経口あるいは経皮による投与が簡便でかつ有効であり好ましい。
経口で投与する場合には、センダングサ属植物酵素処理物固形分に換算して、０．００１〜５ｇ／ｋｇ体重／日程度投与することが好ましく、０．０１〜２ｇ／ｋｇ体重／日程度投与することが更に好ましい。
本発明の抗ＨＳＶ剤は、ウイルス感染後のみではなく、ウイルス感染前に接種することによりウイルス感染を予防的に防ぐことができる。
【００２４】
経口で投与する場合には、センダングサ属植物酵素処理物の乾固物をそのまま、あるいはデキストリン等の賦形剤を添加して、粉末、錠剤顆粒剤、ハードカプセル等の剤形に形成して投与してもよい。また、上述のとおり、水または湯に植物乾燥物を添加してその場で抽出して飲用することも可能である。錠剤等に成型する場合には従来知られている担体、倍散剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いることができる。
経皮投与する場合には、例えば、クリーム、ローション、ゲル、軟膏、溶液、チック剤等の剤形に形成して皮膚に適用してもよい。
【００２５】
センダングサ属植物酵素処理物を含む抗ＨＳＶ剤は、更に、既存の抗ＨＳＶ剤と併用すると、既存の抗ＨＳＶ作用を相乗的に増強することが実験的に見いだされた。すなわち、アシクロビル感受性株であるＨＦ株を細胞に感染後、様々な濃度で本発明の抗ＨＳＶ剤とアシクロビルとを併用して作用させたところ、抗ＨＳＶ作用が相乗的に増強された。従って、本発明の他の態様は、センダングサ属植物酵素処理物からなるる第一の抗単純ヘルペスウイルス剤と、既存の抗ＨＳＶ剤から選択される第二の抗単純ヘルペスウイルス剤とを有効成分として含む抗ＨＳＶ剤である。
【００２６】
本発明の抗ＨＳＶ剤と併用しうる既存の抗ＨＳＶ剤としては、トリホスフェート形態への燐酸化後のヌクレオシド類似体のようなウイルスＤＮＡポリメラーゼに対して作用する化合物、ホスホノギ酸およびホスホノ酢酸およびそれらの類似体、および異なる作用機構を有する他の抗ＨＳＶ剤からなる群から選択することができる。
より具体的には、アシクロビル、アシクロビル−ホスホネート、ブリブジン、ブシクロビル、シドホビル、デスシクロビル、エドクスウジン、フアムシクロビル、ガンシクロビル、ガンシクロビル−ホスホネート、等が挙げられる。
【００２７】
他の抗ＨＳＶ剤と併用する場合には、他の抗ＨＳＶ剤が通常使用されうる投与量範囲あるいは前記投与量の１／２〜１／１００程度の低い投与量で投与することができる。例えば、アシクロビルの場合、通常５０ｍｇ／ｋｇ／日程度であるが、本発明の抗ＨＳＶ剤を０．００１〜５ｇ／ｋｇ体重／日程度、より好ましくは０．０１〜２ｇ／ｋｇ体重／日程度で併用する場合には、アシクロビルの投与量を０．５〜２５ｍｇ／ｋｇ／日程度まで量を減らすことができる。
【実施例】
【００２８】
以下に本発明の実施例について述べる。
薬剤製造例
ビデンス・ピローサ（Bidens pilosa L. var. radiate Sch）の加工乾燥物（特開２００１−１７８３９０の方法により加工した乾燥物）１００ｋｇを１８００Ｌの熱水に２時間浸漬後、ｐＨ４．５、５０℃に調整してセルラーゼ（阪急バイオインダストリー（株）のセルロシンＡＣ−４０）とペクチナーゼ（セルロシンＰＥ−６０）各２００gを添加して攪拌後、一夜置いた。その後、９０℃で１時間加熱して酵素を失活させ、濾過して固形物を除去し、濾液を減圧濃縮した。減圧濃縮物に、デキストリン８ｋｇを添加混合し、噴霧乾燥した。得られた乾燥粉末物は４０ｋｇであった。以下、これを“ＢＰ酵素処理物”と呼ぶ。なお、以下の実験において、ＢＰ酵素処理物の量を述べる場合には、乾燥粉末中のビデンス・ピローサの固形物量に換算した値を述べる。例えば、「ＢＰ酵素処理物粉末１ｇ」とは、「デキストリンを含まないビデンス・ピローサ酵素処理物の乾燥固形物に換算した１ｇ」に相当し、デキストリンを含む粉末の１．２５ｇに相当する。
【００２９】
細胞毒性確認実験
ＢＰ酵素処理物粉末単体に毒性がないことを確認するため、以下の実験を行った。
Ｖｅｒｏ細胞とＲａｗ２６４．７細胞をそれぞれ１×１０5／ｍｌの濃度に調整し、９６穴プレートに５０μｌ入れ、炭酸ガスインクベーター内で２４時間培養した。培養後ＢＰ酵素処理物粉末を培養液（Ｖｅｒｏ細胞は１０％ＦＢＳ添加イーグルＭＥＭ培養液、Ｒａｗ２６４．７細胞は１０％ＦＢＳ添加ダルベッコＭＥＭ培養液）で各濃度に調整し、５０μｌずつ入れた。炭酸ガスインキュベーターで７２時間培養後、ＷＳＴ−８法により細胞毒性を測定した。
ＷＳＴ−８法は、高感度水溶性ホルマザンを生成する新規テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，一ナトリウム塩）を発色基質として用いる方法である（M. Ishiyama, Y. Miyazono, K. Sasamoto, Y. Ohkura, K. Ueno, Talanta  Volume 44, Issue 7, July 1997, Pages 1299-1305）。ＷＳＴ−８は細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成する。このホルマザンの４５０ ｎｍの吸光度を測定することにより、細胞毒性を計測することができる。結果を図１に示す。
ＢＰ酵素処理物粉末は２ｍｇ／ｍｌ程度の濃度まで殆ど細胞毒性は見られなかった。
【００３０】
抗単純ヘルペスウイルス感染不活化試験
Ｖｅｒｏ細胞６×１０5／Ｗｅｌｌを６穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳ（リン酸緩衝液）で洗浄後ＥＭＥＭ培地を１ｍｌ入れた。また、ＰＢＳで各濃度に調整したＢＰ酵素処理物粉末と培地で希釈したヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１:ＨＦ株、ＨＳＶ−２：ｓａｖａｇｅ株）（各々１×１０6ＰＦＵ／ｍｌ）を３７℃で１時間反応させた。これを上記Ｖｅｒｏ細胞に０．１ｍｌ感染させた。４℃で１時間感染後ＰＢＳで洗浄し、０．５％メチルセルロース添加ＥＭＥＭ培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌ入れ、７２時間炭酸ガスインキュベーターで培養した。これをメタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水洗後プラーク数を測定した。ＢＰ酵素処理物を添加していないものを１００％とし、各濃度の感染率を比較した。結果を図２に示す。
図２の結果から明らかなとおり、本発明の抗ＨＳＶ剤は、単純ヘルペスウイルスに直接作用して感染力を不活化し、Ｖｅｒｏ細胞との吸着を阻害する。
【００３１】
抗ＨＳＶ作用点の解析
本発明の抗ＨＳＶ剤がウイルス粒子に直接作用する以外に抗ＨＳＶ作用を持つかどうか調べるためにｔｉｍｅ−ｏｆ−ａｄｄｉｔｉｏｎ実験を行った。この実験はウイルスのライフサイクルにあわせて本発明の抗ＨＳＶ剤を作用させ、それぞれの感染価を比較することで作用点を解明する方法である。
ＢＰ酵素処理物の作用点を（１）細胞前処理、（２）吸着時、（３）侵入時、（４）増殖時、（５）全過程とした。Ｖｅｒｏ細胞６×１０5／Ｗｅｌｌを６穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳで洗浄後ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌ入れた。（１）細胞前処理と（５）全過程にＥＭＥＭ培地で各濃度に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で１時間炭酸ガスインキュベーターに静置した。（２）と（３）と（４）にはＥＭＥＭ培地を０．１ｍｌ加えた。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄後、ＥＭＥＭ培地を０．８ｍｌ入れた。すべてのプレートに１×１０4ＰＦＵ／ｍｌに調整したウイルス溶液（ＨＳＶ−１:ＨＦ株、ＨＳＶ−２:ｓａｖａｇｅ株）を０．１ｍｌ加え、（２）吸着時と（５）全過程にＥＭＥＭ培地で各濃度に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ、（１）と（３）と（４）ＥＭＥＭ培地を０．１ｍｌ加え、４℃で１時間冷蔵庫内で静置した。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄後、ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌ入れた。（３）侵入時と（５）全過程にＥＭＥＭ培地で各濃度に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で１時間炭酸ガスインキュベーターに静置した。（１）と（２）と（４）にはＥＭＥＭ培地を０．１ｍｌ加えた。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄後、ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌ入れた。（４）増殖時と（５）全過程にＥＭＥＭ培地で各濃度に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ、（１）と（２）と（３）ＥＭＥＭ培地を０．１ｍｌ入れた。すべてのプレートに１％メチルセルロース添加ＥＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、３７℃で７２時間炭酸ガスインキュベーターに静置した。培養後すべてのプレートをＰＢＳで洗浄しメタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水洗後プラーク数を測定した。
ＨＳＶ−１，２が細胞に吸着時、侵入時、増殖時でＢＰ酵素処理物粉末はＨＳＶの感染を抑制した。また細胞に１時間ＢＰ酵素処理物粉末を前処理した場合は抗ＨＳＶ作用は見られなかった（図３）。
この結果は本発明の抗ＨＳＶ剤の抗ＨＳＶ作用が、ウイルスに直接作用しているだけでなく、感染後の増殖についても関与していることを示唆している。
【００３２】
ＨＳＶ増殖抑制実験
ＢＰ酵素処理物粉末のウイルス増殖時の抗ＨＳＶ作用について詳細に検討するため、ＨＳＶを細胞に感染させた直後からＢＰ酵素処理物粉末を作用させ、一定時間ごとに培養上清と培養細胞内でのウイルスの感染価を比較した。この実験ではウイルスが細胞に感染し、１回の増殖サイクルを経て細胞外に放出されるまでを調べることができる。
Ｖｅｒｏ細胞４×１０5／Ｗｅｌｌを２４穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳで洗浄後ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌ入れた。すべてのプレートに４×１０5ＰＦＵ／ｍｌに調整したウイルス溶液（ＨＳＶ−１:ＨＦ株）を０．１ｍｌ加え、４℃で１時間冷蔵庫内で感染させた。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄し、ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌとＥＭＥＭ培地で各濃度に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で炭酸ガスインキュベーター内で培養した。０、３、６、９、１２、１８、２４時間後に培養上清を回収し、ウェルには新たにＥＭＥＭ培地を１ｍｌ入れた。培養上清は３０００ｒｐｍ１５分遠心しウイルス溶液とした。細胞はプレートごと３回凍結・融解を繰り返し回収後３０００ｒｐｍ１５分遠心しウイルス溶液とした。
Ｖｅｒｏ細胞６×１０5／Ｗｅｌｌを６穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳで洗浄後ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌ入れた。培養上清と細胞のウイルス溶液を０．１ｍｌ入れ、４℃で１時間冷蔵庫内で感染させた。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄後０．５％メチルセルロース添加ＥＭＥＭ培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌ入れ、７２時間炭酸ガスインキュベーターで培養した。これをメタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水洗後プラーク数を測定した。結果を図４に示す。
図４からわかるように、細胞外へのウイルス放出以前の段階でＢＰ酵素処理物粉末はＨＳＶの増殖を抑制した。
これらのことから、本発明の抗ＨＳＶ剤の抗ＨＳＶ作用は、ウイルスが細胞に吸着するときと、感染後細胞内で増殖するときの両方に働いていることが示唆された。
【００３３】
抗ＨＳＶ作用におけるＮＯの関与
これまでの研究でマクロファージ様細胞（Ｒａｗ２６４．７）においてＢＰ酵素処理物粉末はＮＯ産生を誘導することで免疫賦活作用を発揮することが明らかにされている。
Ｒａｗ２６４．７細胞４×１０5／Ｗｅｌｌを２４穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳで洗浄後ＤＭＥＭ培地を０．９ｍｌ入れた。すべてのプレートに４×１０5ＰＦＵ／ｍｌに調整したウイルス溶液を０．１ｍｌ加え、４℃で１時間冷蔵庫内で感染させた。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ培地を０．９ｍｌとＤＭＥＭ培地で各濃度に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で炭酸ガスインキュベーター内で培養した。２４時間後、４８時間後、７２時間後に培養上清を回収し、ウェルには新たにＤＭＥＭ培地を１ｍｌ入れた。培養上清は３０００ｒｐｍ１５分遠心しウイルス溶液（ＨＳＶ−１:ＨＦ株）とした。細胞はプレートごと３回凍結・融解を繰り返し回収後３０００ｒｐｍ１５分遠心し、ウイルス溶液とした。Ｖｅｒｏ細胞６×１０5／Ｗｅｌｌを６穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳで洗浄後ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌ入れた。培養上清と細胞のウイルス溶液を０．１ｍｌ入れ、４℃で１時間冷蔵庫内で感染させた。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄後０．５％メチルセルロース添加ＥＭＥＭ培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌ入れ、７２時間炭酸ガスインキュベーターで培養した。これをメタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水洗後プラーク数を測定した。結果を図５に示す。
また同様の実験をＢＰ酵素処理物溶液に代わりにＮＯ合成阻害剤であるＬ−ＮＡＭＥを用いて行った。培養上清中のＮＯ量は阻害剤によって低下しているにも関わらず、抗ＨＳＶ作用は変化が見られなかったことからＢＰ酵素処理物粉末の抗ＨＳＶ作用にＮＯは関与していないことを示唆している。結果を図６に示す。
【００３４】
薬剤耐性株に対する作用
Ｖｅｒｏ細胞６×１０5／Ｗｅｌｌを６穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳで洗浄後ＥＭＥＭ培地を０．８ｍｌ入れた。ＥＭＥＭ培地で１×１０4ＰＦＵ／ｍｌに調整したウイルス溶液（野生型ＨＳＶ−１株:
７４０１Ｈ株、アシクロビル耐性ＨＳＶ−１株:ＴＫ-ＨＳＶ-１、アシクロビル・酢酸多剤耐性ＨＳＶ−１株:ＡｐｒＨＳＶ-１）、を０．１ｍｌとＥＭＥＭ培地で各濃度に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ加え、４℃で１時間冷蔵庫内で感染させた。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄後、ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌとＥＭＥＭ培地で各濃度に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ入れた。すべてのプレートに１％メチルセルロース添加ＥＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、３７℃で７２時間炭酸ガスインキュベーターに静置した。培養後すべてのプレートをＰＢＳで洗浄しメタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水洗後プラーク数を測定した。結果を図７に示す。
ＢＰ酵素処理物は明らかに、薬剤耐性株(アシクロビル耐性ＨＳＶ−１株:ＴＫ-ＨＳＶ-１、アシクロビル・酢酸多剤耐性ＨＳＶ−１株:ＡｐｒＨＳＶ-１）に対して、アシクロビル、ホスホノ酢酸よりも強い効果を示した。
【００３５】
アシクロビル併用の効果の検討
Ｖｅｒｏ細胞６×１０5／Ｗｅｌｌを６穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳで洗浄後ＥＭＥＭ培地を０．８ｍｌ入れた。ＥＭＥＭ培地で１×１０4ＰＦＵ／ｍｌに調整したウイルス溶液（ＨＳＶ−１:ＨＦ株）を０．１ｍｌとＥＭＥＭ培地で各濃度（０．１２５，０．２５，０．５，１．０ｍｇ／ｍＬ）に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ、ＥＭＥＭ培地で各濃度（１．２５，２．５，５，１０μｇ／ｍＬ）に調整したアシクロビル溶液を０．１ｍｌ加え、４℃で１時間冷蔵庫内で感染させた。すべてのプレートをＰＢＳで洗浄後ＥＭＥＭ培地を０．８ｍｌとＥＭＥＭ培地で各濃度（０．１２５，０．２５，０．５，１．０ｍｇ／ｍＬ）に調整したＢＰ酵素処理物溶液を０．１ｍｌ、ＥＭＥＭ培地で各濃度（１．２５，２．５，５，１０μｇ／ｍＬ）に調整したアシクロビル溶液を０．１ｍｌ加えた。すべてのプレートに１％メチルセルロース添加ＥＭＥＭ培地を１ｍｌ加え、３７℃で７２時間炭酸ガスインキュベーターに静置した。培養後すべてのプレートをＰＢＳで洗浄しメタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水洗後プラーク数を測定した。結果を図８に示す。
図８の結果から明らかなとおり、アシクロビルと本発明の抗ＨＳＶ剤を併用した場合、ウイルス感染を抑制することができた。
【００３６】
なお、アシクロビルとビデンスピローサの併用が相乗的効果であるか相加的効果であるか調べるために、Ｃｈｏｕらの方法（J Biol Chem. 1977 Sep 25;252(18):6438-42. A simple generalized equation for the analysis of multiple inhibitions of Michaelis-Menten kinetic systems. Chou TC, Talaly P.）をもとに作製された統計ソフト「ＣａｌｃｕＳｙｎ」（ＢＩＯＳＯＦＴ社）を用いて判定した。上記実験（「アシクロビル併用の効果の検討」）で得られた結果をＣａｉｃｕＳｙｎでアイソボログラム解析を行った。アイソボログラム解析とは薬剤単独のＩＣ50値から、併用時のＩＣ50値を計算的に求め、薬剤Ａ、薬剤Ｂをそれぞれ縦軸、横軸としたグラフに示し、実際に得られた併用時のＩＣ50値をプロットしたものである。単剤でのＩＣ50値を１として相対値（ＣＩ値：combination index）でプロットした。プロットがＡ単剤とＢ単剤のＣＩ値を結ぶ直線状にあれば、ＡとＢの作用は相加的、直線より下部にプロットされれば相乗的、直線より上部にプロットされれば拮抗的と判定される（図９Ａ参照）。アシクロビルとビデンスピローサを併用した場合、相乗的作用エリアにプロットされ、これらの薬剤は相乗的に作用していると判定した（図９Ｂ参照）。
【００３７】
構成成分の抗ＨＳＶ作用
ＢＰ酵素処理物の構成成分の一つである、カフェ酸（Ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ）とルチン（Ｒｕｔｉｎ）について感染不活化による抗ＨＳＶ作用を検討した。Ｖｅｒｏ細胞６×１０5／Ｗｅｌｌを６穴プレートに入れ、炭酸ガスインキュベーターで２４時間培養した後、培地を除去しＰＢＳ（リン酸緩衝液）で洗浄後ＥＭＥＭ培地を０．９ｍｌ入れた。また、ＰＢＳで各濃度に調整したカフェ酸もしくはルチンとＥＭＥＭ培地で希釈したヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１:ＨＦ株１×１０6ＰＦＵ／ｍｌ）を３７℃で１時間反応させた。これを先ほどのＶｅｒｏ細胞に０．１ｍｌ感染させた。４℃で１時間感染後ＰＢＳで洗浄し、０．５％メチルセルロース添加ＥＭＥＭ培地を２ｍｌ／ｗｅｌｌ入れ、７２時間炭酸ガスインキュベーターで培養した。これをメタノールで固定し、０．５％クリスタルバイオレットで染色し、水洗後プラーク数を測定した。ＢＰ酵素処理物を添加していないものを１００％とし、各濃度の感染率を比較した。結果を図１０に示す。
この結果から、ＢＰ酵素処理物粉末の抗ＨＳＶ作用はカフェ酸によることが示唆されたが、含有濃度からカフェ酸だけによるものではないことも示唆される。
【００３８】
インビボ試験
マウスを対照群、ＢＰ酵素処理物粉末前投与群、ＢＰ酵素処理物粉末投与群、アシクロビル投与群の４群（各群６匹づつ）に分けて感染実験を行った。
使用したマウス：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ４週齢
使用したウイルス：７４０１Ｈ株（単純ヘルペスウイルス１型）
ＢＰ酵素処理物粉末投与量：１ｇ／ｋｇ（マウス体重）  ２回／日
アシクロビル投与量：５ｍｇ／ｋｇ（マウス体重）  ２回／日
ＢＰ酵素処理物粉末前投与群は、ウイルス感染１週間前から投与を開始した。
【００３９】
感染方法：
Ｃ５７ＢＬ／６ｊマウスにセボフレン麻酔後固定し、左側の後肢、腰部をハサミと除毛クリームで除毛処置を行った。除毛後２７Ｇ注射針で乱切し、１×１０7  ｐｆｕのＨＳＶ−１（７４０１Ｈ株）を滴下、塗布することによりＨＳＶ−１経皮接種を行った。ウイルス接種後、帯状疱疹の発生をスコア化し、各群で比較した。病変のスコア化は報告されている方法（Takasaki et al.,Pain 86:95-101,2000）で行った。
【００４０】
結果
対照群に比較してＢＰ酵素処理物粉末前投与群、ＢＰ酵素処理物粉末投与群、アシクロビル投与群で帯状疱疹スコアの低下が確認された（図１１）。
ＢＰ酵素処理物粉末を投与することで、マウスにおける帯状疱疹の軽減が確認され、その効果は感染後からＢＰ酵素処理物粉末を投与した群よりも１週間前から前投与した方がより強かった。またその効果はアシクロビルとほぼ同程度であった。
【００４１】
以上のとおり、本発明の抗ＨＳＶ剤は、単純ヘルペスウイルスに直接作用して感染力を不活化し、宿主細胞との吸着を阻害する点と、感染後宿主細胞の中でウイルスが増殖するのを阻害する点の複数の作用点があることが明らかになった。アシクロビルを含め、現在の抗単純ヘルペスウイルス薬はウイルスの増殖抑制薬であり、宿主からウイルスを排除することができない。さらにこれらの薬は長期使用で耐性株を出現させることが問題となっている。これに対し、本発明の抗ＨＳＶ剤は吸着時に作用するという、現行の抗単純ヘルペスウイルス剤とは異なる作用点を持ち、さらに薬剤耐性株に対しても抗ＨＳＶ作用を発揮することが明らかになった。従って、本発明の抗ＨＳＶ剤は、薬剤耐性単純ヘルペスウイルスに対する抗ＨＳＶ剤として、非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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