(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドの共重合体を含み、安定化剤としてヒスチジン又はその塩を含み、かつｐＨが６．５〜７．５である、エリスロポエチン含有溶液製剤。
【請求項２】
前記共重合体が一般式；
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
［ここで、ａは２〜１２８であり、ｂは１６〜６７である］
で示される共重合体である、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記共重合体がポロクサマー１８８である請求項１または２に記載の製剤。
【請求項４】
ｐＨが、６．８〜７．２である、請求項１〜３のいずれかに記載の製剤。
【請求項５】
エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドの共重合体を含み、安定化剤としてＬ−ヒスチジンを含み、かつｐＨが６．８〜７．２である、エリスロポエチン含有溶液製剤。
【請求項６】
安定化剤としてのタンパク質を含まない、請求項１〜５のいずれかに記載の製剤。
【請求項７】
安定化剤として糖類を含まない、請求項１〜６のいずれかに記載の製剤。
【請求項８】
エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドの共重合体の添加量が、０．００１〜０．５％である、請求項１〜７のいずれかに記載の製剤。
【請求項９】
エリスロポエチンと、エチレンオキサイドとプロピレンキサイドの共重合体の重量比率が０．０１７〜１．２である、請求項１〜８のいずれかに記載の製剤。
【請求項１０】
注射時の疼痛が軽減された、請求項１〜９のいずれかに記載の製剤。
【請求項１１】
エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドの共重合体、およびヒスチジン又はその塩を添加することを含む、エリスロポエチン含有溶液製剤の長期保存後におけるエリスロポエチン二量体の生成を抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエリスロポエチン含有溶液製剤に関し、特に長期保存した後も活性成分の損失が少なく、二量体の生成、分解物の生成が顕著に抑制され、かつ使用時の疼痛を軽減することができる、エリスロポエチン含有溶液製剤に関する。【０００２】
本発明はさらに、上記エリスロポエチン含有溶液製剤の定量、純度試験にも有用な微量タンパク質の定量方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
赤血球系前駆細胞の分化、増殖を促進する酸性糖タンパク質ホルモンであるエリスロポエチン（以下においてＥＰＯと記載することもある）は、遺伝子工学的方法によって組換えヒトＥＰＯとして大量に生産され、本願出願人はこの精製したＥＰＯの製剤化に成功し、腎性貧血改善剤などとして、凍結乾燥製剤または溶液製剤の形で市場に製品を供給している。【０００４】
安定なＥＰＯ溶液製剤を市場に供給するための処方設計では、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンならびにその塩から選択されるアミノ酸を安定化剤として含むＥＰＯ溶液製剤が提案されている（特願平１１−５２３１４号）。【０００５】
生理活性タンパク質溶液の安定性はその溶液のｐＨに大きく依存し、酸性の方が比較的安定である。ＥＰＯではｐＨ６．０付近の酸性で安定であることが知られている。長期間保存しても安定なＥＰＯ溶液製剤として、現在市場に供給されているのは、生体内ｐＨからやや離れた弱酸性のｐＨ６．０の製品である。しかし、弱酸性の溶液製剤を皮下注射すると疼痛を伴うことが予測され、さらに使用性を改善し、かつ長期間保存にも安定なＥＰＯ溶液製剤の開発が求められている。【０００６】
注射用製剤の投与時の疼痛を軽減する方法としてマンニトールなどの糖類を添加することが提案されている（ＷＯ  ０２／１１７５３）。【０００７】
また、界面活性剤としてポロクサマーを含有する抗体製剤が報告されている（WO 2004/075913）が、ＥＰＯを含む溶液製剤の安定性や、注射時の疼痛については記載がない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、注射時の疼痛を軽減し、しかも長期の保存にも安定なＥＰＯ溶液製剤を提供することである。本発明はさらに、上記エリスロポエチン含有溶液製剤の定量、純度試験にも有用な微量タンパク質の定量方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは界面活性剤としてポロクサマーを使用することにより、ｐHが約７．０であっても長期間安定で、かつ注射投与時の疼痛が軽減されたエリスロポエチン含有溶液製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）ポロクサマー類を含み、ｐHが6.5〜7.5である、エリスロポエチン含有溶液製剤。
（２）ポロクサマーがポロクサマー１８８である（１）記載の製剤。
（３）さらに、安定化剤としてアミノ酸又はその塩を含む（1）記載の製剤。
（４）アミノ酸がヒスチジン、アルギニン又はそれらの塩である（３）記載の製剤。
（５）ｐHが、6.8〜7.2である、（１）〜（４）のいずれかに記載の製剤。
（６）ポロクサマー類を含み、安定化剤としてＬ−ヒスチジンを含み、かつｐHが6.8〜7.2である、エリスロポエチン含有溶液製剤。
（７）安定化剤としてのタンパク質を含まない、請求項（１）〜（６）のいずれかに記載の製剤。
（８）安定化剤として糖類を含まない、（１）〜（７）のいずれかに記載の製剤。
（９）ポロクサマー類を添加することを含む、エリスロポエチン含有溶液製剤の長期保存後におけるエリスロポエチン二量体の生成を抑制する方法。
（１０）以下のステップを含む微量タンパク質の定量方法：
１）タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；
２）得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する；
３）所望の分析物を定量して、その量からタンパク質の量を換算する。
（１１）高輝度蛍光色素がCyanine Dye系色素である（１０）記載の方法。
（１２）高輝度蛍光色素がＣｙ３である（１１）記載の方法。
（１３）分離手段が電気泳動または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）である（１０）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）微量タンパク質がエリスロポエチンである（１０）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＥＰＯ濃度及びＥＰＯ二量体を種々の濃度で測定して、検量線を作成し、検出限界を確認した結果を示す図である。
【図２】図２は、hPM-1 及びhPM-1二量体を種々の濃度で測定して、検量線を作成し、検出限界を確認した結果を示す図である。
【図３】図３は、EPOを蛍光色素Cy5、Alexa 647およびHiLyte Fluor 647を用いて測定した純度試験法の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、BSAを蛍光色素Cy5、Alexa 647およびHiLyte Fluor 647を用いて測定した純度試験法の結果を示すグラフである。
【図５】図５は、BSAを蛍光色素Cy5を用いて、マイクロ電気泳動システムで測定した純度試験法の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、BSAを蛍光色素Alexa 647を用いて、マイクロ電気泳動システムで測定した純度試験法の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、BSAを蛍光色素HiLyte Fluor 647を用いて、マイクロ電気泳動システムで測定した純度試験法の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の製剤に使用するＥＰＯは、どのようなＥＰＯでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたＥＰＯであり、より具体的には、哺乳動物ＥＰＯ、特にヒトＥＰＯと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。【００１３】
本発明で用いるＥＰＯは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト由来の抽出物から精製して得られた天然のヒトＥＰＯ（特公平1-38800号公報、など）や、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したヒトＥＰＯなどを用いることができる。本発明において用いられるＥＰＯは、遺伝子工学的手法により製造されたＥＰＯが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたＥＰＯが好ましい（例えば、特公平1-44317号公報、Kenneth Jacobs et al., Nature, 313 806-810 (1985)、など）。【００１４】
遺伝子組換え法により得られるＥＰＯには、天然由来のＥＰＯとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のＥＰＯと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275；Zoller, M.J. and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500；Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456；Kramer, W. and Fritz, H.J. (1987) Methods Enzymol. 154, 350-367；Kunkel, T.A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492；Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766）などを用いて、ＥＰＯのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、ＥＰＯと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666；Zoller, M.J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500；Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433；Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。また、ＥＰＯのＮ末端にシアル酸が付着した糖鎖改変体ＥＰＯであるNESP（Novel Erythropoietin Stimulating Protein: ＷＯ85/02610、ＷＯ９１/05867、ＷＯ95/05465等に記載）などの糖鎖の改変されたＥＰＯ類似体であってもよい。【００１５】
又、ＥＰＯと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、ＥＰＯをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のＥＰＯとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。【００１６】
又、化学修飾したＥＰＯを用いることも可能である。化学修飾したＥＰＯの例としては、例えば、ポリエチレングリコール・ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたＥＰＯなどを挙げることができる。具体的には、特開2001-64300などに記載のポリエチレングリコール化ＥＰＯなどを挙げることができる。【００１７】
本発明のＥＰＯ含有溶液製剤では、ポロクサマー類を添加することにより、ｐＨが約７．０であっても長期間安定で、かつ注射投与時の疼痛が軽減されたエリスロポエチン含有溶液製剤とすることができる。ポロクサマー類を添加したｐＨが約７．０の本発明のＥＰＯ含有溶液製剤では、後述する実施例に示すように、マンニトールなどの糖類を添加しなくても疼痛が抑制されることが明らかとなった。【００１８】
ポロクサマーは非イオン性の界面活性剤であって、タンパク質溶液製剤においては容器への吸着防止剤としても使用され、一般的にはエチレンオキサイドとプロピレンオキサイドの共重合体を意味する。具体的には、以下の一般式を有するエチレンオキサイドとプロピレンオキサイドのブロック共重合体のシリーズなどが挙げられる：
ＨＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）a（Ｃ3Ｈ6Ｏ）b（Ｃ2Ｈ4Ｏ）aＨ
ポロクサマーにはポロクサマー１２４、１８８、２３７、３３８、４０７がＵＳＰ（米国薬局方）に収載されている。ＵＳＰ記載のポロクサマー１８８は上記式におけるａが８０、ｂが２７、平均分子量が７６８０−９５１０であり、ＢＰ（英国薬局方）記載のポロクサマー１８８は上記式におけるａが約７５、ｂが約３０、平均分子量が８３５０である。さらに、EP（欧州薬局方）にはこれ以外に、ポロクサマー１８２、１８４、３３１が記載されている。これら以外に、ポロクサマー１０８、３３５、４０３なども使用できる。また、Pluronic (ポロクサマーのBASF社の商標) としては、Pluronic Ｌ３５、Ｌ４３、Ｌ４４、Ｌ６１、Ｌ６２、Ｌ６４、Ｆ６８、Ｌ８１、Ｐ８４、Ｐ８５、Ｆ８７、Ｆ８８、Ｌ９２、Ｆ９８、Ｌ１０１、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５、Ｆ１０８、Ｌ１２１、Ｐ１２３、Ｆ１２７があり、これらのものも本発明におけるポロクサマーに含まれる。上記構造式における a、bの数は一般的に2〜128、16〜67の組み合わせであり、好ましくは、11〜100、16〜67の組み合わせであり、さらに好ましくは、50〜100、20〜40の組み合わせである。また、平均分子量は一般的に1000〜15000であり、好ましくは、2000〜10000であり、さらに好ましくは、7000〜10000である。【００１９】
後述する実施例に示すように、ポロクサマー系の界面活性剤を用いた処方ではいずれも、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油やポリソルベートを界面活性剤として用いた処方よりも長期保存後のＥＰＯ二量体の生成が抑制され、安定であることが判明した。好ましいポロクサマーはポロクサマー１０８、１２４、１８８、３３５、４０３であり、最も好ましいのはポロクサマー１８８である。【００２０】
ポロクサマーの添加量は使用するポロクサマーの種類により異なるが、一般には0.0001〜10%であり、好ましくは0.001〜0.5%であり、さらに好ましくは0.005〜0.1%であり、また、ＥＰＯ/ポロクサマー188の重量比率としては、0.001〜5であり、好ましくは0.017〜1.2である。【００２１】
本発明のＥＰＯ含有溶液製剤では、界面活性剤としてポロクサマーを使用することにより、ｐＨ７．０付近でも安定、すなわち長期間保存した後にもＥＰＯの残存率が高く、二量体や分解物の生成が抑制され、かつ疼痛の軽減されたＥＰＯ含有溶液製剤とすることができた。【００２２】
本発明のタンパク質含有製剤には安定化剤としてアミノ酸を添加してもよい。安定化剤として添加されるアミノ酸には、遊離のアミノ酸、そのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩などが含まれる。アミノ酸は1種又は２種以上を組み合わせて添加することができる。安定化剤として添加されるアミノ酸は特に限定されないが、好ましいアミノ酸としては、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジンを挙げることができる好ましいアミノ酸はヒスチジン、アルギニン又はそれらの塩である。また、アミノ酸はＬ−アミノ酸が好ましい。最も好ましいアミノ酸はＬ−ヒスチジンである。【００２３】
アミノ酸の添加量は、使用するアミノ酸の種類により、好ましい範囲を定めることができる。一般には0.0001〜5%、アルギニンでは好ましくは0.01〜4%、さらに好ましくは0.1〜1%であり、ヒスチジンでは好ましくは0.05〜1％、さらに好ましくは0.05〜0.5%、最も好ましくは0.05〜0.2%である。【００２４】
本発明のタンパク質製剤のｐＨは、ｐH６．５〜７．５であり、好ましくはｐH６．８〜７．２であり、最も好ましくはｐＨが約７．０である。【００２５】
本発明のＥＰＯ含有溶液製剤には好ましくは安定化剤としてヒト血清アルブミンや精製ゼラチンなどのタンパク質を実質的に含まない。現在市場に供給されているタンパク質製剤には、タンパク質の化学的、物理的変化を抑制するために安定化剤としてヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が添加されているものがある。しかしながら、タンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウイルスのコンタミを除去するために非常に煩雑な工程を必要とすることになるなどの問題がある。【００２６】
本発明の溶液製剤に中に含まれるＥＰＯの量は、一般には１００〜５０００００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは２００〜２０００００ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは７５０〜１０８０００ＩＵ／ｍｌ、最も好ましくは１５００〜１０８０００ＩＵ／ｍｌである。【００２７】
本発明のＥＰＯ溶液製剤は、ＥＰＯ含量が４８０００ＩＵ／ｍＬである場合、３５℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＥＰＯ残存率が９５％以上、好ましくは９７％以上であり、二量体生成率が１．０％以下、好ましくは０．７％以下であるか、３５℃−３ヶ月の加速試験後におけるＥＰＯ残存率が９３％以上、好ましくは９５％以上であり、二量体生成率が１．２％以下、好ましくは１．０％以下である。【００２８】
本発明の治療剤には、必要に応じて、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を適宜添加することができる。【００２９】
懸濁剤の例としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等を挙げることができる。【００３０】
溶液補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、マグロゴール、ヒマシ油脂肪酸エチルエステル等を挙げることができる。【００３１】
安定化剤としては、デキストラン４０、メチルセルロース、ゼラチン、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム等を挙げることができる。【００３２】
等張化剤としては例えば、Ｄ−マンニトール、ソルビート、塩化ナトリウム等を挙げることができる。【００３３】
保存剤としては例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等を挙げることができる。【００３４】
吸着防止剤としてはポロクサマー類以外に、例えば、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール等を加えてもよい。【００３５】
含硫還元剤としては例えば、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。【００３６】
酸化防止剤としては例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。【００３７】
さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてもよい。【００３８】
本発明のＥＰＯ溶液製剤は、これらの成分をリン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）及び／又はクエン酸緩衝液（好ましくはクエン酸ナトリウムの緩衝液）などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製する。【００３９】
本発明のＥＰＯ溶液製剤は、例えば通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されている。容器はアンプル、バイアルまたはディスポーザブル注射器のような規定用量の形状で供給することができ、あるいは注射用バックまたは瓶のような大用量の形状で供給することもできる。プレフィルドシリンジの形で提供することが便利である。【００４０】
本発明の安定化されたタンパク質製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。【００４１】
本発明はさらに、本発明のＥＰＯ含有溶液製剤の定量、純度試験にも有用な微量タンパク質の定量方法を提供する。【００４２】
従来、タンパク質溶液中の不純物量を求める時には分離能に優れるゲル電気泳動法がよく用いられるが、検出感度は、汎用される高感度染色法である銀染色法において0.6〜1.2ng /band程度と良好な感度を有するものの定量性が乏しいため定量法に用いることは不可能である。一方、さらなる感度向上に対しては、RI標識、及び膜転写後に免疫染色を行う方法があるが、前者については放射能汚染が危惧され、汎用性に乏しいこと、後者については、最高pgオーダーまで感度は上昇するが、操作の煩雑性によりバラツキを生じ、定量には向かない。【００４３】
そこで、本発明は免疫染色と同程度の感度を持ち、且つ汎用性のある微量タンパク質の定性、定量、純度試験法を提供する。【００４４】
本発明の微量タンパク質の定量方法は以下のステップを含む：
１）タンパク質試料と高輝度蛍光色素を結合させる；
２）得られる試料から所望の分析物を適切な分離手段により分離する；
３）所望の分析物を定量して、その量からタンパク質の量を換算する。【００４５】
本発明では感度を上昇させるために、蛍光試薬を用いた。電気泳動を行ったゲルを蛍光染色する蛍光ゲル染色試薬には、Ruby stain や、SYPRO orange などがあるが、これらは、銀染色法に比べ定量性は優れているものの検出感度は劣り、また銀染色と同様に泳動後染色であるため、煩雑な染色操作が必要である。一方、今回用いた蛍光試薬Cyanine Dyeは泳動後染色には向かないが、NHS（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、またはMaleimideを介してタンパク質と強固な共有結合をすることから、電気泳動の前にタンパク質を染色することができる。また、Cyanine Dyeにより標識される部位は特定位置（NHSの場合はNH2基、また、Maleimideの場合はSH基）であることから、Cyanine Dyeと各タンパク質の結合性にバラツキが少なく、定量性を確保することが可能となった。したがって、上記ステップ２）における所望の分析物とは、タンパク質と蛍光色素との結合体であり、NHS、Maleimideなどを介して結合したものを含む。【００４６】
本発明の方法で、試料中のタンパク質と高輝度蛍光色素を結合させる方法としては、通常一般的なタンパク質のNH2基やSH基に蛍光色素を化学結合させる方法であればいかなる方法でもよく、また市販の各高輝度蛍光色素のInstructionに沿った方法で行ってもよい。その反応温度に関しては通常０℃〜５０℃の範囲内であればよく、具体的には市販の高輝度蛍光色素の各Instructionに記載してある反応温度を用いいてもよいが、本発明のごとく試料を定量的に測定する場合は、試料のタンパク質を均一に染色するために試料が凍らない範囲で低温条件、好ましくは０℃〜１０℃、さらに好ましくは０℃〜５℃、最も好ましくは約1℃で行うとよい。【００４７】
さらに、Cyanine Dyeを用いることで、数10pg／bandと免疫染色と同程度以上の検出が可能となり、定性的な試験に用いることができる。さらに、標準品の検量線や、内標準物質を用いることで、微量タンパク質溶液の定量も可能である。また、104オーダー以上の定量範囲（数10pg〜100ng前後／band）を有し、標準品等を用いない純度試験として0.1％以下の会合体等の不純物含有量を正確に評価することが可能である。【００４８】
加えて、泳動前に染色することで、使用する試薬量を少なくでき、コストの面からも泳動後染色を行う蛍光試薬よりも優位となった。【００４９】
本発明の高輝度蛍光色素としては、直接或いはNHS、Maleimideなどを介してタンパク質と強固に共有結合し、104以上の広い定量範囲（ダイナミックレンジ）を有する蛍光色素であればいかなるものでもよく、例えば、Cy3、Cy3.5、Cy5、そしてCy5.5 Mono-reactive Dye (NHSタイプとMaleimideタイプ)（GE Healthcare社製）などのCyanine Dye系の色素を用いることができ、Cy3 Mono-reactive DyeのNHSタイプが好ましい。【００５０】
またその他本発明の高感度蛍光色素としては、Sulfonated CoumarinやSulfonated rhodamine Dyeである、Alexa Fluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、680、700、そして750のタンパク質ラベリングキット（Molecular Probes社製）、さらにHiLyte Fluor 555、647などのタンパク質ラベリングキット（同人化学社製）などを用いることもできる。【００５１】
本発明の方法で、試料から所望の分析物を適切に分離する手段としては、SDS-PAGE、キャピラリー電気泳動、マイクロチップ電気泳動など電気泳動法全般、そしてHPLCによるゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどで分離することが可能で、電気泳動またはHPLCでの分離手段が好ましい。【００５２】
電気泳動で分離する場合、泳動イメージの取り込みについては、泳動前染色であることから、電気泳動後のゲルの染色操作を必要とせず、ガラスで固定化されたゲルを用いれば、泳動終了後ガラスプレートの表面を水洗後直ぐに蛍光ゲルイメージャーによる泳動イメージの取り込みが可能となった。【００５３】
また、測定前に染色できることから、電気泳動に限らず、蛍光検出器を接続したHPLCなど他の分離手段にも応用可能である。【００５４】
本発明の定量方法を用いて、ＥＰＯ含有溶液製剤中のＥＰＯを感度よく定量することができた。さらに、本発明の定量方法は、ＥＰＯ以外のタンパク質の定量にも使用できる。後述する実施例に示すように、ヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体である抗体タンパク質hPM-1や、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の定量において、種々の濃度のタンパク質で良好な検量線が得られ、何れの条件においても、非常に高感度で検出することが可能であった。したがって、本発明の方法は、微量タンパク質溶液の定量方法として極めて優れており、その応用範囲は広い。【００５５】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。【００５６】
なお、以下の実施例において、ＥＰＯ試料は、ＣＨＯ細胞を用いる遺伝子組換えＥＰＯ（中外製薬製）を用いた。
【実施例】
【００５７】
実施例１：処方の疼痛比較試験
二重盲検下で、同一被験者に対し以下の表１に示す処方1、処方2の製剤を片腕ずつに皮下注射した。注射時の痛みの評価を被験者自身が行った。得られた結果を表２に示す。【００５８】
【表１】
0005553506.tif 000002
【００５９】
【表２】
0005553506.tif 000003
被験者内比較による痛みの評価では、処方1が処方2よりも痛みが強いとする被験者が100%であり、処方2が有意に痛くないことが示された。
実施例２：処方の安定性試験
以下に示す二種の処方について、安定性を比較するため、35°C苛酷試験を実施した。【００６０】
これらの処方は調製後、無菌濾過を行い、滅菌済みのシリンジに充填、打栓した。試験に用いた処方及び試験結果を表３に示す。【００６１】
【表３】
0005553506.tif 000004
処方 4は処方3よりもＥＰＯの残存率が高く、かつ二量体の生成、分解物の生成が顕著に抑制されており、処方4が安定であることを確認した。【００６２】
なお、上記の試験では以下の試験方法を用いた。
（１）残存率の測定
液体クロマトグラフ法により測定し、初期品に対して残存率を求めた。
使用カラム： 214TP54(Size250mm×4.6mmI.D. 粒径5μm) ：Vydac製
移動相
A：水：アセトニトリル：TFA＝400：100：1
B：水：アセトニトリル：TFA＝100：400：1
A：B＝65：35  →  A：B＝0：100を線形グラジエントで実施した。
（２）二量体の測定
ＥＰＯ濃度1250IUに希釈した試料に蛍光試薬（Cy3 Mono-reactive DyeのNHSタイプ）を溶解したDMSOを加え、ＥＰＯを標識した後、SDSを含むサンプルバッファーを加え50°C-15分加温したもの15μLについて、電気泳動法により試験を行った。電気泳動したゲルをイメージアナライザーで読み込み、二量体のピーク面積%を算出した。
使用ゲル：トリスグリシンゲル12.5%
（３）低分子量分解物の測定
ＥＰＯ濃度3000IUに希釈した試料にSDS、メルカプトエタノールを含むサンプルバッファーを加え50°C-15分加温したもの7.5μLについて、電気泳動法により試験を行った。抗ＥＰＯ抗体を用いたウェスタンブロット法により検出し、分解物精製品25〜500ng/mLの検量線から試料の低分子量分解物量を算出した。
使用ゲル：トリスグリシンゲル8-16%
実施例３：界面活性剤種の影響
界面活性剤がＥＰＯの安定性へ与える影響を確認するため、以下の処方にて安定性を確認した。【００６３】
これら処方は調製後、無菌濾過を行い、洗浄滅菌したバイアルに充填、打栓した。試験方法は実施例2の二量体の測定の方法に従った。試験に用いた処方及び試験結果を表４に示す。【００６４】
【表４】
0005553506.tif 000005
ポロクサマーを界面活性剤として用いた処方10〜14は、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油またはポリソルベートを界面活性剤として用いた処方と比べ、３５℃−３ヶ月の加速試験において、二量体生成量が顕著に少なく、安定であった。また、ポロクサマー系の界面活性剤は全てＥＰＯの二量体生成を抑制した。
実施例４：ＥＰＯ含量の安定性に及ぼす影響
pH7.0、界面活性剤としてポロクサマー188を添加した処方について、ＥＰＯ含量の安定性への影響を確認するため安定性試験を行った。【００６５】
これら処方は調製後、無菌濾過を行い、滅菌済みのシリンジに充填、打栓した。試験方法は実施例2の測定の方法に従った。試験に用いた処方及び試験結果を表５に示す。【００６６】
【表５】
0005553506.tif 000006
ＥＰＯ含量が1500〜108000IU/mLの処方においては、少なくとも10°C‐1年は安定であることが確認できた。さらに、本実施例においてＥＰＯ/ポロクサマー188の比率が0.017〜1.2の範囲でも安定性に問題ないことが確認できた。
*ＥＰＯ 180000IU＝1mg
実施例５：Cyanine Dye（Cy3）を用いたＥＰＯ純度試験法の検討
ＥＰＯ溶液の調製：ＥＰＯ標準品（ＥＰＯ濃度1mg/mL）に希釈緩衝液（0.005％のPolysorbate80を含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4））を加えて、各々の含量のＥＰＯ溶液を調製した。
(1)検出限界の確認
ＥＰＯ濃度16.3ng/mL〜2083.3ng/mL及びＥＰＯ二量体濃度2ng/mL〜128ng/mLの溶液60μLにCy3 stock solution（Cy3 Mono-reactive DyeのNHSタイプ 1バイアルを100μLのDMSOで溶解）を2 μL加え、約1℃で4時間反応させた。反応終了後、SDSを含むサンプルバッファーを24μL加え50℃‐15分加熱した後、15μLを電気泳動に供した。蛍光イメージアナライザーにて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限界を確認した。得られた結果を図１に示す。【００６７】
ＥＰＯにおいては、16.3ng/mL〜2083.3ng/mLの溶液（1Well換算：174pg〜22.3ng）で、良好な検量線（R2=0.9965）が得られた。また、ＥＰＯ二量体においては、2ng/mLではピークの検出ができなかったが、4ng/mL〜128ng/mL（１Well換算：43pg〜1.37ng）の溶液で、良好な検量線（R2=0.9963）が得られ、1Wellあたり43pgと非常に高感度で検出することが可能であった。
(2)精度の確認
1250IU/mLのＥＰＯ溶液に、ＥＰＯ二量体を添加し、ＥＰＯに対して0.094〜2.256%のＥＰＯ二量体を含有した溶液について、精度の確認をn=4にて実施した。得られた結果を表６に示す。【００６８】
【表６】
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0.094%でC.V.（変動係数）が約40%であったが、0.188%以上では20%以下であり、良好な精度であることが確認できた。
実施例６：Cyanine Dye（Cy3）を用いた抗体（hPM-1）純度試験法の検討
以下の試験で用いた抗体タンパク質hPM-1はヒト型化抗ＩＬ−６レセプター抗体（国際特許出願公開番号ＷＯ９２−１９７５９を参照）である。
(1)検出限界の確認
hPM-1 1.25μg/mL〜40μg/mL及びhPM-1二量体濃度2.5ng/mL〜1280ng/mLの溶液60μLにCy3 stock solution（Cy3 Mono-reactive DyeのNHSタイプ 1バイアルを100μLのDMSOで溶解）を2 μL加え、約1℃で4時間反応させた。反応終了後、SDSを含むサンプルバッファーを24μL加え50℃‐15分加熱した後、15μLを電気泳動に供した。蛍光イメージアナライザーにて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限界を確認した。得られた結果を図２に示す。【００６９】
hPM-1においては、1.25μg/mL〜20μg/mLの溶液（1Well換算：13.4ng〜214ng）で、良好な検量線（R2=0.9965）が得られた。また、hPM-1 二量体においては、5ng/mLではピークの検出ができなかったが、10ng/mL〜1280ng/mL（１Well換算：107pg〜13.7ng）の溶液で、良好な検量線（R2=0.9963）が得られ、1Wellあたり107pgと非常に高感度で検出することが可能であった。
(2)精度の確認
hPM-1濃度を10μg/mL、二量体量が0.05〜6.4％となるように調製した溶液について、精度の確認を実施した。得られた結果を表７に示す。【００７０】
【表７】
0005553506.tif 000008
最大でC.V.が約7%であり、良好な精度であることが確認できた。
実施例７：Cyanine Dye（Cy5）、Alexa 647およびHiLyte Fluor 647を用いたEPOおよびBSAの純度試験法の検討
（１）検出限界の確認
EPO 10μg/mL及びBSA 10μg/mLの溶液（それぞれ0.1MのNaHCO3で調製）100μLにCy5 stock solution（Cy5 Mono-reactive DyeのNHSタイプ 1バイアルを100μLのDMSOで溶解）を3.3 μL、Alexa 647 stock solution（Alexa 647のNHSタイプ 1バイアルを10μLのDMSOで溶解）を1 μL、またはHiLyte Fluor 647 stock solution（HiLyte Fluor 647のNHSタイプ 1バイアルを10μLのDMSOで溶解）を1 μL加え、約1℃で18時間反応させた。反応終了後、希釈緩衝液（0.005％のPolysorbate80を含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4））で公比3で6濃度0.046ng/mL〜11.1ng/mL（0.34 pg/well〜8.3 pg/wellに相当）に希釈した。希釈後、それぞれ40μL にSDSを含むサンプルバッファーを20μL加え50℃‐15分加熱した後、10μLを電気泳動に供した。蛍光イメージアナライザーにて、ゲルを読み込み、検量線を作成し、検出限界を確認した。EPOについて得られた結果を図３に、またBSAについて得られた結果を図４に示す。【００７１】
図３、図４から明らかなようにEPOおよびBSAの両方において、0.046ng/mL〜11.1ng/mLの溶液（1Well換算：0.34 pg/well〜8.3 pg/well）で、良好な検量線が得られ、何れの条件においても、1Wellあたり0.34pgと非常に高感度で検出することが可能であった。
実施例８：マイクロ電気泳動システムにおけるプレステインによる高感度化検討
（１）検出限界の確認
BSA 1mg/mLの溶液（0.1MのNaHCO3で調製）100μLにCy5 stock solution（Cy5 Mono-reactive DyeのNHSタイプ 1バイアルを100μLのDMSOで溶解）を3.3 μL、Alexa 647 stock solution（Alexa 647のNHSタイプ 1バイアルを10μLのDMSOで溶解）を1 μL、またはHiLyte Fluor 647 stock solution（HiLyte Fluor 647のNHSタイプ 1バイアルを10μLのDMSOで溶解）を1 μL加え、約1℃で18時間反応させた。反応終了後、希釈緩衝液（0.005％のPolysorbate80を含有する0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4））で公比2で10濃度0.046mg/mL〜50ng/mLに希釈した。希釈後はマイクロチップ電気泳動システムのプロトコールに従って測定を行い、同システムによって得られた値から、検量線を作成し、検出限界を確認した。Cy5 で得られた結果を図５に、Alexa 647 で得られた結果を図６に、HiLyte Fluor 647で得られた結果を図７に示す。【００７２】
図５〜７から明らかなように、全てのタイプの蛍光色素において、良好な検量線が得られた。本検討で使用したマイクロチップ電気泳動システムの測定法に従って同じBSAを測定した際の結果と比較して250倍以上の高感度化を実現し得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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