(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化するための方法において、該方法が、
ａ）水溶媒中で、少なくとも２個の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質を一般式Ｉのアシル化剤
0005591243.tif 000041
［上式中、
ｎは１から６であり、
ｍは１から２であり、
ｗは４から２０であり、
Ｒ１は前記アシル化剤を遊離のアミンと反応させる際に、Ｒ１に結合しているカルボニル基と前記アミンの間のアミド結合の形成を容易にする脱離基であり、
水溶媒中のｐＨがｐＨ８からｐＨ１４である
］と反応させ、
ｂ）Ｎ-アシル化ペプチド又はタンパク質を単離することを含み、
ここで、アシル化されていないか、一部だけがアシル化されている、少なくとも１の反応性求核性官能基を含む、Ｎ-アシル化ペプチド又はタンパク質を得る方法。
【請求項２】
反応性求核性官能基がアミノ基である、請求項１に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項３】
水性反応混合物のｐＨがｐＨ１０からｐＨ１２の間である、請求項１又は２の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項４】
アシル化処理の反応混合物の温度が−５℃から５０℃である、請求項１から３の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項５】
試薬が３０から６０分間の時間をかけて添加される、請求項１から４の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項６】
アシル化混合物をアシル化試薬の添加後０から２４時間反応させる、請求項１から５の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項７】
アシル化試薬の添加直後、ｐＨをｐＨ６．５から９．０に調節することによって、反応を停止させる、請求項１から６の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項８】
ペプチド又はタンパク質が少なくとも５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で反応混合物中に存在する、請求項１から７の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項９】
反応混合物がバッファーを含む、請求項１から８の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項１０】
不活性溶媒中に溶解したアシル化剤を含む溶液中に、アシル化試薬を添加する、請求項１から９の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項１１】
工程（ａ）の反応がタンパク質と式Ｉのアシル化剤を１：１から１：５のモル比で用いることによって実施される、請求項１から１０の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項１２】
アシル化されるペプチド又はタンパク質が糖尿病の治療に適したペプチド又はタンパク質である、請求項１から１１の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項１３】
アシル化されるペプチド又はタンパク質が肥満の治療に適したペプチド又はタンパク質である、請求項１から１２の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項１４】
アシル化されるペプチド又はタンパク質がグルカゴン様ペプチド又はインスリンである、請求項１から１３の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【請求項１５】
Ｎ−アシル化ペプチド又はタンパク質が、アシル化されていない少なくとも１の遊離アミノ基を含む、請求項１から１４の何れか一項に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中のアミノ基を選択的にアシル化するための方法が記載される。
【背景技術】
【０００２】
多数のペプチドが、医療において使用されることが認可されており、該ペプチドは適切な宿主細胞中で組換えＤＮＡ技術によって産生され得るか、又はよく確立したペプチド合成技術によって合成的に産生することができる。しかし、天然のペプチド並びにそのアナログは、長時間に渡って、ペプチドの高血漿濃度が必要とされる多数の臨床的特徴において許容できない高クリアランス速度を示す傾向がある。
【０００３】
ペプチド及びペプチドアナログの種々の誘導体化が、例えば、国際公開９８／０８８７１号、国際公開第９８／０８８７２号、国際公開第９９／４３７０８号、欧州特許第１２２７１０７号及び国際公開第００／５５１１９号に記載されるように、好ましい方向にあるペプチドのクリアランス速度に影響を与えることが見出されている。このような誘導体化の一つは、非アシル化ペプチドに関連する作用の望ましい長期化プロファイルを引き起こす治療用ペプチドへの親油性アシル基の導入である。したがって、治療用タンパク質の低頻度の投与は、処方された治療に対する患者のコンプライアンスを改善し、投与されるペプチドの量を減少する。
【０００４】
治療用ペプチドを商業的に実現可能にするために、ペプチド産生の費用並びにペプチドの治療的投与量が極めて重要である。治療用ペプチドの産生において主要な費用は、標的タンパク質を、標的タンパク質に密接に関連する不純物から分離するために必要な精製工程である。これらの精製工程は、通常、高価なクロマトグラフィーマトリックスと溶媒を適用するクロマトグラフィーによって実施され、全収率が減少する。
【０００５】
例えば、１個のアミンより多い、一より多い求核性原子を有する、一又は複数のペプチド又はタンパク質へのアシル基への導入は、生成物の損失並びにひいては困難な精製工程を引き起こす、粗混合物中の所望の化合物に非常に類似した生成物関連の不純物の生成物混合物を生じ得る。
【０００６】
スペーサーを介してペプチド又はタンパク質に親油性基を導入するための効率的で、堅牢な、かつ経済的な方法を提供することが本発明の目的である。前記スペーサーは、例えば、１又は複数の８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸部位及びグルタミン酸から成り得る。該方法は、より特異的で堅牢であり、したがって、高収率の結果となり、他の知られている方法よりも、密接に関連する不純物の精製が少ない。アシル化されたペプチド又はタンパク質を産生する費用の顕著な減少が達成される。より安価なアシル化ペプチドは、治療が利用可能な患者の数を最大化し、例えば、経皮、経肺又は経口送達のような、皮下注射よりも、低いバイオアベイラビリティーを有する代替の送達経路を利用するために非常に望ましい。
【０００７】
本発明は従って驚くほど高い選択性で、ペプチド又はタンパク質中のリシン残基のイプシロンアミノ基を選択的にアシル化するための方法を提供する。
【発明の概要】
【０００８】
２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の一のアミノ基を選択的にアシル化するための方法が記載される。
一態様では、該方法は、
ａ）水溶媒中で、少なくとも２個の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質を一般式Ｉ
0005591243.tif 000002
［上式中、
ｎは１から６であり、
ｍは１から２であり、
ｗは４から２０であり、
Ｒ１は前記アシル化剤を遊離のアミンと反応させる際に、Ｒ１に結合しているカルボニル基と前記アミンの間のアミド結合の形成を容易にする脱離基であり、
水溶媒中のｐＨがｐＨ８からｐＨ１４である
］のアシル化剤と反応させ、
ｂ）Ｎ-アシル化ペプチド又はタンパク質を単離することを含み、
ここで、アシル化されていないか、一部だけがアシル化されている、少なくとも１の反応性求核性官能基を含む、Ｎ-アシル化ペプチド又はタンパク質を得る方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】２２-カルボキシ-１-［（２,５-ジオキソ-１-ピロリジニル）オキシ］-１,１０,１９,２４-テトラオキソ-３,６,１２,１５-テトラオキサ-９,１８,２３-トリアザヘンテトラコンタン-４１-酸（化合物１）。添加したアシル化剤とｐＨの（２６０ｎｍにおけるＨＰＬＣによって測定した）純度依存性を示す。示したｐＨは、ｐＨ１０．００( -●- )、ｐＨ１１．２５( -■- )、及びｐＨ１２．００ ( -▲- )である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本方法は、ペプチド又はタンパク質の所望の位置における選択的なアシル化を確実にする方法を提供する。本発明のアシル化反応を行うことにより、選択的なアシル化が得られ、したがって、望まない不純物の形成が少ないアシル化反応混合物の、不純物プロファイルが、驚くべきことに示され、アシル化処理の終了後、より容易な精製と所望の選択的にアシル化された生成物の単離を可能にする。
【００１１】
また本発明によって、アシル化工程の途中又は終了後において、激しい試薬を使用しなくとも、アシル化されたペプチド又はタンパク質を得る、アシル化の方法が得られる。生成物は従って、より高い収率で、そのうえ、収束法を使用しているため、非収束法を用いる場合よりもより安価な方法によって得られる。
【００１２】
本発明によれば、ＯＥＧスペーサーが式：
0005591243.tif 000003
の８-アミノ-３,６-ジオキサオクタン酸（［２-（２-アミノエトキシ）エトキシ］酢酸とも呼ばれ得る）部位である、１から６のＯＥＧスペーサーを含むアシル化剤が使用される。
【００１３】
このようなＯＥＧスペーサーがアシル化剤中に存在し、慣例的なアシル化法が使用される場合、発明者の経験では、アシル化生成物は低収率であることが多い。本発明は、生成物が高収率で得られる、１から６個のＯＥＧスペーサーを含むアシル化剤を用いた、ペプチド又はタンパク質の効率的で堅牢なアシル化法を提供する。
【００１４】
アシル化は、化合物へのアシル基の付与処理である。「アシル化剤」は、したがって、ここでは、ペプチド又はタンパク質にアシル基を付与する化合物として定義される。
【００１５】
「選択的アシル化」又は「選択性」は、ここで、ペプチド又はタンパク質中の他の位置と比較して、アシル化されるべきペプチド又はタンパク質の一つの位置で主として反応するアシル化剤を意味する。例えば、本発明のアシル化法を用いてペプチド又はタンパク質をアシル化することによって得た生成物は、アシル化側鎖がペプチド又はタンパク質の唯一の位置に結合し、アシル化できる全ての位置で、アシル化が選択的ではないわけではない。本発明の一態様では、反応混合物中のアシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも５０％が、アシル化反応を完了する際に好ましいアシル化部位においてアシル化されるような、ペプチド又はタンパク質のアシル化が得られるような、選択性が得られる。
【００１６】
一態様では、反応混合物中の、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも６０％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。別の態様では、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも７０％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。別の態様では、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも８０％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。別の態様では、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも８５％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。別の態様では、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも９０％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。別の態様では、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも９５％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。別の態様では、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも９７％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。別の態様では、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも９８％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。別の態様では、アシル化されたペプチド又はタンパク質の少なくとも９９％が、アシル化反応の完了の際に好ましいアシル化部位でアシル化される。
【００１７】
本発明の一態様では、ペプチド又はタンパク質の好ましいアシル化部位は、選択的アシル化が、主として前記リシンのε−アミノ基上で得られるように、リシン残基のε−アミノ基である。
【００１８】
ここで使用される「ペプチド又はタンパク質」なる用語は、ペプチド結合により結合した少なくとも５つの構成アミノ酸からなる化合物を意味する。構成アミノ酸は遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群からのものであり得、また遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸でありうる。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えばγ−カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ−異性体、例えばＤ−アラニン及びＤ−ロイシン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α−アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、β−アラニン、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
【００１９】
２２のタンパク新生アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、シスチン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンである。
【００２０】
よって、非タンパク新生アミノ酸は、ペプチド結合を介してペプチド又はタンパク質に導入可能であるが、タンパク新生アミノ酸ではない部分である。例として、γ−カルボキシグルタメート、ホスホセリン、Ｄ−アミノ酸、例えばＤ−アラニン及びＤ−グルタミンがある。合成の非タンパク新生合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸を含み、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ−異性体、例えばＤ−アラニン及びＤ−ロイシン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α−アミノ酪酸）、オミチン、Ｄａｐ（２，３−ジアミノプロピオン酸）、Ｄａｂ（２，４−時アミノブタン酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸、デス−アミノ−ヒスチジン、アミノ酸のベータアナログ、例えばβ−アラニン等、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、Ｎα−アセチル−ヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン、３−ピリジルアラニン、２−ピリジルアラニン又は４−ピリジルアラニン、（１−アミノシクロプロピル）カルボン酸、（１−アミノシクロブチル）カルボン酸、(１-アミノシクロペンチル)カルボン酸、(１-アミノシクロヘキシル)カルボン酸、(１-アミノシクロへプチル)カルボン酸、（１−アミノシクロオクチル）カルボン酸である。
【００２１】
ペプチド又はタンパク質に言及してここで使用される「アナログ」なる用語は、ペプチド又はタンパク質の一又は複数のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基で置換され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が該ペプチド又はタンパク質から欠失され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が該ペプチド又はタンパク質から欠失され、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が該ペプチド又はタンパク質に付加されている修飾されたペプチド又はタンパク質を意味する。アミノ酸残基のかかる付加又は欠失は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端及び／又はペプチド又はタンパク質のＣ末端で起こりうる。アナログを記述するために簡単なシステムがしばしば使用される：例えば［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）は、８位の自然に生じたアラニンがアルファ−アミノイソブチル酸で置換され、位置３４のリシンがアルギニンで置換されているＧＬＰ−１（７−３７）アナログを意味する。光学異性体が記述されていない全てのアミノ酸は、Ｌ−異性体を意味すると理解される。本発明の態様では、最大１７のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大１５のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大１０のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大８のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大７のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大６のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大５のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大４のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大３のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大２のアミノ酸が修飾されている。本発明の態様では、最大１のアミノ酸が修飾されている。
【００２２】
本発明の一態様では、本発明に記載の誘導体のＣ末端が酸又はアミドで停止され得る。一態様では、本発明の誘導体のＣ末端はアミドである。一態様では、本発明のＣ末端は酸である。
【００２３】
ペプチド又はタンパク質は、例えば、アミノ基、例えば、Ｎ−末端アミノ基及び／又は側鎖のアミノ基のような反応性求核性基を有するべきであると理解されるべきである。ペプチド又はタンパク質は、遺伝暗号にコードされない、Ｄ−アミノ酸、３−ヒドロキシプロリン、Ａｉｂ（α−アミノブチリル酸）、オルニチン、Ｄａｐ（２，３−時アミノプロピオン酸）、Ｄａｂ（２，４−時アミノブタン酸）及びペンチルグリシンのような、アミノ酸を含み得る。特に興味深いことは、リシン、オミチン、Ｄａｐ及びＤａｂアミノ酸残基のアミノ基である。該方法は、リシン残基のεアミノ基のＮ−アシル化に特に関連する。
【００２４】
ここで、ペプチド又はタンパク質の命名は、以下の原則にしたがって行われる。名前はヒトＧＬＰ−１又はヒトインスリンのような親ペプチド又タンパク質に関連する変異及び改変（アシル化）として付与される。アシル部位の命名については、ＩＵＰＡＣ命名法にしたがってなされ、その他の場合はペプチドの命名法としてなされる。例えば、アシル部位：
0005591243.tif 000004
の命名は、例えば、「オクタデカンジオイル−γ−ＯＥＧ−ＯＥＧ」、又は「１７−カルボキシヘプタデカノイル−γＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ」であり得、ここで、ＯＥＧはアミノ酸
ＯＥＧはアミノ酸-ＮＨ(ＣＨ２)２Ｏ(ＣＨ２)２ＯＣＨ２ＣＯ-の略語であり、γＧｌｕ（又はｇＧｌｕ）はアミノ酸ガンマグルタミン酸部位の略語である。
【００２５】
一態様では、本発明に記載のアシル化され得るペプチド又はタンパク質は、少なくとも２つのアシル化剤と反応し得る反応性求核性官能基を有する。別の実施態様では、ペプチド又はタンパク質は２から１０の反応性求核性官能基、例えば、２から８の反応性求核性官能基、２から６の反応請求核性官能基、２から４の反応性求核性官能基又は、２から３の反応性求核性官能基を有する。一態様では、ペプチド又はタンパク質は２の反応性求核性官能基を有する。
【００２６】
反応性求核性官能基は、ここで、与えられた条件下において、アシル化剤と反応し安定な共有結合を形成する化学的な官能基として理解され得る。このような反応性求核性官能基の例は、限定されるものではないが、例えば、チロシン（ここで、ヒドロキシル基は、アシル化剤と反応し得る）、セリン（ここで、ヒドロキシル基は、アシル化剤と反応し得る）、スレオニン（ここで、ヒドロキシル基は、アシル化剤と反応し得る）からのヒドロキシル基、例えば、システイン（ここで、チオール基は、アシル化剤と反応し得る）からのチオール基、限定されるものでは無いが、例えば、ペプチド又はタンパク質のＮα−末端アミノ基、リシン（ここで、ε−アミノ基は、アシル化剤と反応し得る）のようなアミノ基、及びペプチド又はタンパク質中の、限定されるものでは無いが、アルギニン（ここで、グアニジノ基は、アシル化剤と反応し得る）及びヒスチジン（ここで、イミダゾール基は、アシル化剤と反応し得る）のような、他の求核剤を含む。
【００２７】
一態様では、本発明に記載のアシル化され得るペプチド又はタンパク質は、少なくとも２個の遊離アミノ基を有する。別の態様では、ペプチド又はタンパク質は２から１０の遊離アミノ基、例えば、２から８個の遊離アミノ基、２から６個の遊離アミノ基、２から４個の遊離アミノ基又は２から３個の遊離アミノ基を有する。一態様では、ペプチド又はタンパク質は、２個の遊離アミノ基を有する。
【００２８】
ここで使用される場合、「遊離アミノ基」なる用語は、与えられた条件下において、共有結合を形成するアシル化剤と反応する、第一級又は第二級アミノ基を意味する。
【００２９】
「部分的にアシル化された」なる用語は、Ｎ−アシル化ペプチドの遊離アミノ基の少なくとも一と関連して使用される場合、前記Ｎ−アシル化ペプチドを含む反応混合物中、反応混合物中のペプチドの一部は、アシル化部位に結合していない少なくとも一のアミノ基を有し、ペプチドの別の一部は、アシル化部位に結合している同じ少なくとも一のアミノ基を有する。
【００３０】
アシル化され得るペプチド又はタンパク質は、一又は複数のリシン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基を含み得る。一態様では、アシル化部位の選択は、ペプチド又はタンパク質中のリシン基のε−アミノ基及びペプチド又はタンパク質のＮ−末端中のα−アミノ基からなされ、ここで、主なアシル化は、ペプチド又はタンパク質のＮ−末端のα−アミノ基よりも一又は複数のε−アミノ基で得られる。一態様では、ペプチド又はタンパク質は、一のリシン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基及び一又は複数のＮ−末端α−アミノ基を含み、ここで、アシル化は、Ｌｙｓアミノ酸のε−アミノ基上で選択的である。一の更なる態様では、ペプチド又はタンパク質は、一のリシン（Ｌｙｓ）アミノ酸残基及びＮ−末端αアミノ基を含み、ここで、アシル化は、Ｌｙｓアミノ酸のε−アミノ基上で選択的である。
【００３１】
「反応混合物」はここで、アシル化剤をペプチド又はタンパク質と反応させる際に用いられる溶媒と試薬の混合物として理解され得る。反応混合物は、水性とすべきであり、すなわち、反応混合物中に水が存在するべきである。
【００３２】
アシル化の選択性を得るために、水性反応混合物のｐＨは、ｐＨ８からｐＨ１４に調節される。一態様では、反応溶媒のｐＨは、ｐＨ９からｐＨ１３である。別の態様では、ｐＨはｐＨ１０からｐＨ１２である。別の態様では、ｐＨはｐＨ１０からｐＨ１３である。別の態様では、ｐＨはｐＨ１０．５からｐＨ１２．０又はｐＨ１１．０からｐＨ１１．５であり、更に別の態様では、ｐＨは約ｐＨ１１．０から１１．３である。更に別の態様では、ｐＨはｐＨ１１からｐＨ１２であり、例えば、ｐＨ１１．５からｐＨ１２又はｐＨ１１．５からｐＨ１１．８又はｐＨ１１．５からｐＨ１２．５である。一態様では、ｐＨは約ｐＨ１１．５である。
【００３３】
「約」又は「およそ」なる用語は、ここで使用される場合、プラス又はマイナス１０％、又はｐＨについてのプラス又はマイナス０．２のような、述べられた数値の合理的な近傍を意味する。
【００３４】
本発明にしたがってｐＨを調節することにより、驚くほど堅牢なアシル化反応が得られる。アシル化反応を指す場合、「堅牢な」又は「堅固な」は、ここで、本発明に記載のアシル化処理を用いる場合に得られる収率及び選択性が高く、アシル化剤を過剰に添加した場合（図１を参照されたい）、添加したアシル化剤の量に感受性がないことを意味する。
【００３５】
反応混合物のｐＨは、当業者に知られた方法によって制御され得る。例えば、単純なｐＨメーターを、ｐＨを測定するために使用してもよく、ｐＨを調節するために酸又は塩基を手動で添加してもよく、又は、溶液のｐＨを制御することができるフィードバック機構を有するｐＨメーターを使用してもよい。
【００３６】
ｐＨを調節するための適切な酸は、限定されるものではないが、塩酸、硫酸及び酢酸を含む。
【００３７】
ｐＨを調節するための適切な塩基は、限定されるものではないが、第三級アミン、例えば、限定されるものではないが、トリエチルアミン又はジイソプロピルアミン、Ｎ−メチルモルフォリン、アルカリ金属ヒドロキシド、例えば、限定されるものではないが、リチウムヒドロキシド、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化セシウム及びアルカリ炭酸塩、例えば、限定されるものではないが、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸リチウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム又は炭酸水素リチウムである。
【００３８】
本発明の一態様では、反応混合物はバッファーを含む。本発明の一態様では、バッファーは、リン酸バッファー、炭酸ナトリウムバッファー、ビシンＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシンバッファー、ＨＥＰＰＳバッファー（３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸バッファー）、ＨＥＰＥＳバッファー（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸酸バッファー），ＭＯＰＳバッファー（３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸バッファー）及びＴＥＡバッファー（トリエチルアミンバッファー）である。
【００３９】
アシル化剤は、好ましくは、固体として、溶液に添加するか、又は適切な不活性溶媒に溶解して溶液し、次いで溶液として添加すべきである。不活性溶媒の例としては、例えば、限定されるものではないが、Ｎ−メチルピロリジノン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、及びジメチルスルホキシドがある。アシル化剤は、アシル化され得るアミノ基のような反応性求核性官能基の数に対して、例えば、０．５から２０等量、例えば、１から２０等量、１から５等量又は１から３等量添加し得る。例えば、アシル化され得る１個のアミノ基を有する１モルのペプチド又はタンパク質を添加する場合、アシル化剤は、０．５モルから２０モル等量、例えば、１から５モル等量添加することができる。本発明に記載の方法を使用する場合、過剰量のアシル化剤を添加する場合にさえ、選択性と堅牢性が得られることが、驚くべきことに見出された。一態様では、アシル化剤は、１から４等量、又は１．２から３．０等量、又は１．４から２．０等量添加される。一態様では、アシル化剤は、約１．７５等量添加される。不活性溶媒に溶解する場合、アシル化剤は、不活性溶媒のｍｌ当たり、少なくとも１０ｍｇのアシル化剤の濃度において、添加してもよい。一態様では、不活性溶媒中のアシル化剤の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌから１０００ｍｇ／ｍｌ不活性溶媒である。別の態様では、濃度は、５０ｍｇ／ｍｌから２５０ｍｇ／ｍｌ不活性溶媒である。更に別の態様では、不活性溶媒中のアシル化剤の濃度は、約１００ｍｇ／ｍｌ不活性溶媒である。
【００４０】
アシル化処理中の反応混合物の温度は、−５℃から５０℃、例えば、０℃から５０℃であってもよい。一態様では、温度は、５℃から４０℃である。別の態様では温度は、１０℃から３０℃である。更に別の態様では、温度は約２０℃である。更に別の態様では、温度は−５℃から１０℃である。更に別の態様では、温度は０℃から５℃である。更に別の態様では温度は、２から５度である。本発明の一態様では、反応混合物は、室温に維持される。
【００４１】
アシル化剤は、かき混ぜて又は攪拌して反応混合物に、０分から４８０分間、例えば、１０から２４０分間かけて、添加し得る。一態様では、試薬は１０から１８０分かけて添加される。別の態様では、試薬は、２０から１２０分間かけて添加する。更に別の態様では、試薬は、約３０分間かけて添加する。更に別の態様では、試薬は約６０分間かけて添加する。更に別の態様では、試薬は３０から６０分間かけて添加する。
【００４２】
アシル化剤を添加後、ｐＨを約７．５から８．０又はそれより小さくすることによって反応を停止する前に、アシル化混合物は、（所望により、かき混ぜるか又は攪拌しながら）反応のために０分から１４４０分間（すなわち、２４時間）、例えば、０から７２０分間放置し得る。一態様では、アシル化混合物は、１５から２４０分間放置する。別の態様では、アシル化混合物は、０から１５分放置する。更に別の態様では、アシル化混合物は、約０分放置、すなわち、アシル化剤を添加直後に反応を停止する。更に別の態様では、アシル化混合物は約３０分間放置する。更に別の態様では、アシル化混合物は約６０分間放置する。更に別の態様では、アシル化混合物は、３０から６０分間放置する。
【００４３】
ペプチド又はタンパク質は、好ましくは、反応混合物中で、少なくとも５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在すべきである。一態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、５．０ｍｇ／ｍｌから２５０ｍｇ／ｍｌ反応混合物である。更に別の態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、１０ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌである。更に別の態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、１０ｍｇ／ｍｌから７５ｍｇ／ｍｌである。更に別の態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、１０ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌである。更に別の態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、１０ｍｇ／ｍｌから３０ｍｇ／ｍｌである。更に別の態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、１５ｍｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌである。更に別の態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、１０．０ｍｇ／ｍｌから２０．０ｍｇ／ｍｌである。更に別の態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、約１２．５ｍｇ／ｍｌである。更に別の態様では、タンパク質又はペプチドの濃度は、約２０ｍｇ／ｍｌである。
【００４４】
反応混合物は、更に成分及び／又は溶媒を含み得る。例えば、極性溶媒のような不活性溶媒は、限定されるものではないが、Ｎ−メチルピロリジノン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン及びジメチルスルホキシドを含み、反応混合物中に存在し得る。一態様では、不活性溶媒は、反応混合物の総量の０から２５％ｖ／ｖの量で存在する。別の態様では、不活性溶媒は、０から１０％ｖ／ｖ又は０から５％ｖ／ｖの量で存在する。別の態様では、不活性溶媒は、４から２０％ｖ／ｖ又は４から１０％ｖ／ｖの量で存在する。更に別の態様では、不活性溶媒は、４から５％ｖ／ｖの量で存在する。一態様では、不活性溶媒が存在し、Ｎ−メチルピロリジノンである。
【００４５】
一態様では、ペプチド又はタンパク質及びアシル化剤が反応溶媒に添加される前に、反応混合物は、アシル化され得るペプチド又はタンパク質又はアシル化剤中に存在する化合物及び／又は塩を更に含む。例えば、ペプチド又はタンパク質中に、例えば、ペプチド又はタンパク質合成の結果得られたイオン結合を介して存在する、塩又は他の化合物は、本発明に記載の方法において反応混合物中に存在し得る。そのような化合物及び／又は塩の例は、限定されるものではないが、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、酢酸、塩酸（ＨＣｌ）、クエン酸、リン酸、硫酸、ナトリウム塩、カリウム塩、及びリチウム塩を含む。
【００４６】
本発明の一態様では、ペプチド又はタンパク質のＬｙｓ残基のε−アミノ基のようなペプチド又はタンパク質に導入され得るアシル基は、アルブミン結合残基、すなわち、インビボ条件下で、ペプチド又はタンパク質に結合しているアルブミンに結合する。
【００４７】
一態様では、アルブミン結合残基は、親油性残基である。更なる態様では、親油性残基は、ペプチド又はタンパク質にリンカーを介して結合している。
【００４８】
本発明の更なる態様では、アルブミン結合残基は生理的なｐＨで負に帯電している。本発明の別の態様では、アルブミン結合残基は、負に帯電しうる基を含む。負に帯電することができる一の好ましい基は、カルボン酸基である。
【００４９】
一態様では、アルブミン結合残基は、α，ω−脂肪二酸残基である。
【００５０】
本発明の更なる態様では、親油性残基のα，ω−脂肪二酸残基は、６から４０個の炭素原子、８から２６個の炭素原子、又は８から２２個の炭素原子を有する。
【００５１】
本発明の別の態様では、アルブミン結合残基は、直鎖又は分枝アルカンα，ω−ジカルボン酸のアシル基である。更なる態様では、アルブミン結合残基は、例えば、ガンマ−Ｇｌｕ部位のようなアミノ酸部位を含む直鎖又は分枝アルカンα，ω−ジカルボン酸のアシル基である。更に別の態様では、アルブミン結合残基は、例えば、ガンマ−Ｇｌｕ部位及び８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＯＥＧ）部位のような２個のアミノ酸部位を含む直鎖又は分枝アルカンα，ω−ジカルボン酸のアシル基である。更に別の態様では、アルブミン結合残基は、例えば、１個のガンマ−Ｇｌｕ部位及び連続する８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（ＯＥＧ）部位のような更なるアミノ酸部位を含む直鎖又は分枝アルカンα，ω−ジカルボン酸のアシル基である。
【００５２】
本発明に記載の方法では、少なくとも２個の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質は一般式Ｉ
0005591243.tif 000005
ここで、
ｎは１から６又は１から３、１から２、又は２であり、
ｍは１から２又は２であり、
ｗは４から２０、又は１０から２０、又は１４から１８、又は１６であり、
Ｒ１は、前記アシル化剤が遊離アミンと反応する際に、Ｒ１に結合しているカルボニル基と前記アミンの間のアミド基の形成を容易にする脱理基である、
アシル化剤と反応する。
【００５３】
アシル化剤は、キラルアミノ基部位の立体配置がＤ又はＬ（又はＲ／Ｓ用語を用いる場合、Ｒ又はＳである）である、純粋なエナンチオマーの形態であり得るか、又は、エナンチオマーの混合物（Ｄ及びＬ／Ｒ及びＳ）であり得る。本発明の一態様では、アシル化剤は、エナンチオマーの混合物の形態である。アシル化剤の一態様は、純粋なエナンチオマーの形態である。一態様では、アシル化剤のキラルアミノ酸部位は、Ｄ形態である。一態様では、アシル化剤のキラルアミノ酸部位は、Ｌ形態である。
【００５４】
式ＩのＲ１は、アシル化剤をフリーのアミンと反応させる場合に、Ｒ１に結合しているカルボニル基とアミンの間にアミド結合が形成するように、脱理基として作用する任意の基であり得る。
【００５５】
一態様では、Ｒ１が結合しているカルボニル基を伴う式ＩのＲ１は、活性化エステル又は活性化Ｎ−ヒドロキシイミドエステルのようなエステルを意図する。これらのエステルのそれぞれは、本発明の態様の代替の態様を構成する。
【００５６】
活性化エステル及び活性化Ｎ−ヒドロキシイミドエステルは、アミノ、チオ及びヒドロキシ基のアシル化の際に使用される官能基として有機化学（特にペプチド化学）の分野でよく知られている。本発明の文脈において、「活性化エステル又は活性化Ｎ−ヒドロキシイミドエステル」なる用語は、アミン、好ましくは第一級アミンのアシル化に適したカルボン酸基のエステルで機能化された形態を意味する。したがって、第一級アミンのアシル化の選択性は、ヒドロキシ及びチオ基のアシル化において好ましいことが理解されるべきである。活性化Ｎ−ヒドロキシイミドエステルが特に好ましい。
【００５７】
「活性化された」アシル化剤なる用語は、例えば“Amide bond formation and peptide coupling”[Tetrahedron 61(46), 10827-10852 (2005)]に記載されているような一般的技術を使用して活性化されたアシル化剤を意味する。
【００５８】
活性化されたエステルの例には、限定されないが、酸塩化物、酸臭化物、酸フッ化物、対称無水物、混合無水物、一般的なカルボジイミド、例えば限定されないが、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して活性化されたカルボン酸が含まれる。更に含まれるものは、限定されないが、上述のカルボジイミドと添加剤を使用するカルボン酸、例えば限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール、６−クロロ−Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＤｈｂｔＯＨ）又はｐ−ニトロフェノール（ＰＮＰ）である。また含まれるものは、限定されないが、ウロニウム塩又はホスホニウム塩で活性化されたカルボン酸、例えば限定されないが、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、（２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート）（ＴＣＴＵ）、２−（１Ｈ−７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２−（３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＤＢＴＵ）、２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＳＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）、２−（エンド−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロフォスフェート（ＨＮＴＵ）、１−ベンゾトリアゾリオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）又はベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰＹＢＯＰ）である。他の活性化されたエステルには、限定されないが、文献 (Organic Synthesis on solid Phase, Florencio Zaragoza Dorwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000), (Novabiochem Catalog, Merck Biosciences 2006/2007)及び(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, W.C. Chan及びP.D. White編, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5)に記載された反応条件を使用するＮ−ヒドロキシスクシンイミドのエステル（ＮＨＳエステル）、ペンタフルオロフェノールエステル（ＰｆＰ−エステル）、２，４−ジニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）又はＮ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネート（ＮＥＰＩＳ）、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−ニトロフェノール又はＨＯＢｔエステル又はその誘導体が含まれる。
【００５９】
式Ｉのアシル化剤は、アシル化され得るペプチド又はタンパク質のアミノ基の数に比べて、わずかに少ないか、等量か、又はわずかに過剰に使用される。比率は、例えば、手順に従ってアシル化され得るアミノ基のような反応性求核性官能基の数に対して１：０．５であってもよく、典型的には、等量又は過剰のアシル化剤を用いる、１：１から１：２０であり、その代わりに、手順に従ってアシル化されるアミノ基のような反応性求核性官能基の数に対して１：１．１から１：５であってもよい。アシル化剤は、固体として反応混合物に添加され得るか、又は溶液として反応混合物に添加されてもよい。アシル化剤が溶液として添加される場合は、アシル化剤は不活性溶媒に溶解し、ここで、「不活性」なる用語は、アシル化剤に対して不活性であることを意味する。アシル化剤の安定性は、酸を添加することによって改善（すなわち、安定化）され得る。
【００６０】
方法の一態様では、アシル化剤は、反応混合物に固体として添加される。
【００６１】
方法の一態様では、工程ａ）の開始物質として使用される前記ペプチド又はタンパク質は、ＨＰＬＣによって決定された、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９７％の純度のペプチド又はタンパク質純度を有する。
【００６２】
典型的な例としては、工程（ａ）における反応は、ペプチド又はタンパク質及び１：１から１：５のモル比の式Ｉのアシル化剤を用いて実施される。ペプチド又はタンパク質は、典型的には、水中に−１０から３０℃、例えば、０から３０℃で、プレ溶解し、ｐＨは、アルカリ金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウム）又は第三級アミン塩基（例えば、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）を用いて所望のｐＨに調整される。ｐＨ値は、更に酸（例えば、塩酸、硫酸又は酢酸）を用いて調整され得るが、温度は、好ましくは、上記の範囲内である。その代わりに、ペプチド又はタンパク質は、適切な量の関連する酸又は塩基を含む水溶液に直接プレ溶解する。アシル化剤は、その次に固体又はよう的として添加される。反応は、例えば、塩酸、硫酸又は酢酸を添加して、ｐＨ６．５から９．０、例えば、ｐＨ７．５から８．０にする前の、直後から２４時間以内に典型的には得られる完了まで典型的には進行させる（ＨＰＬＣによって決定で確認できる）。生成物は典型的には、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣによって単離、精製され、及び／又は等電点のｐＨで沈殿させる。
【００６３】
本発明は特に例えば、糖尿病の治療のための、グルカゴン様ペプチド又はインスリンのような、ペプチド又はタンパク質のアシル化に適している。
【００６４】
一態様では、アシル化され得るペプチド又はタンパク質は、グルカゴン様ペプチドである。
【００６５】
ここで使用される「グルカゴン様ペプチド」なる用語は、ペプチドのグルカゴンファミリー、エキセンジン及びそのアナログを意味する。ペプチドのグルカゴンファミリーは、プレプログルカゴン遺伝子にコードされ、高度なホモロジーを有する３個の小ペプチド、すなわち、グルカゴン（１−２９）、ＧＬＰ−１（１−３７）及びＧＬＰ−２（１−３３）を含む。エキセンジンは、トカゲで発現するペプチドであり、ＧＬＰ−１のように、インスリン分泌性である。エキセンジンの例として、エキセンジン−３及びエキセンジン−４がある。
【００６６】
ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、エキセンジン−３及びエキセンジン−４なる用語は、当業者に知られている。例えば、ここで使用される「ＧＬＰ−１化合物」又は「ＧＬＰ−１ペプチド」は、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）、そのインスリン分泌性アナログ、そのインスリン分泌性油動態を意味する。ＧＬＰ−１アナログの非限定的な例は、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｉｂ８Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド及びＶａｌ８Ａｓｐ２２−ＧＬＰ−１（７−３７）である。ＧＬＰ−１誘導体の非限定的な例は、デスアミノ−Ｈｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３４（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎε−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３７）、デスアミノ−Ｈｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３４（Ｎε−オクタノイル）−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ａｒｇ２６，３４、Ｌｙｓ３８（Ｎε−（ω−カルボキシペンタデカノイル））−ＧＬＰ−１（７−３８）、Ａｒｇ２６，３４、Ｌｙｓ３６（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎε−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３６）及びＡｒｇ３４、Ｌｙｓ２６（Ｎε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎε−ヘキサデカノイル）））−ＧＬＰ−１（７−３７）である。
【００６７】
一態様では、本発明に記載のグルカゴン様ペプチドは、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶである。別の態様では、本発明に記載のＧＬＰ−１アナログは、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ保護されている。
【００６８】
ここで使用される「ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ保護された」なる用語は、天然化合物、例えばＧＬＰ-１(７-３７)よりも、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ(ＤＰＰ-ＩＶ)に対して耐性がある化合物、例えばＧＬＰ-１アナログを意味する。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによる分解に対するＧＬＰ-１化合物の耐性は、次の分解アッセイにより測定される：
【００６９】
０．１Ｍのトリエチルアミン-ＨＣｌバッファー１００μＬ、ｐＨ７．４において、ＧＬＰ-１化合物のアリコート(５ｎｍｏｌ)を、５ｍＵ酵素活性に相当する１μＬの精製されたジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶと共に、３７℃で１０−１８０分インキュベートする。１０％のトリフルオロ酢酸５μＬを添加することにより、酵素反応を終結させ、ペプチド分解産物を分離し、ＨＰＬＣ分析を使用して定量する。この分析を実施するための一方法は次の通りである：Siegelら,  Regul. Pept. 1999；79；93-103及びMentleinら, Eur. J. Biochem. 1993；214：829-35に従って、混合物をＶｙｄａｃ Ｃ１８ワイドポア(３０ｎｍ細孔、５μｍの粒子)２５０×４．６ｍｍのカラムに加え、０．１％のトリフルオロ酢酸に線形段階的勾配をつけてアセトニトリルが入ったもの(３分間は０％のアセトニトリル、１７分間は０−２４％のアセトニトリル、１分間は２４−４８％のアセトニトリル)を、１ｍｌ／分の流量で溶離させる。ペプチドとその分解産物は、２２０ｎｍ(ペプチド結合)又は２８０ｎｍ(芳香族アミノ酸)の吸光度をモニターし、標準体に対するそれらのピーク領域を積分することにより定量する。ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶによるＧＬＰ-１化合物の加水分解速度はインキュベーション時間で推定され、加水分解されるＧＬＰ-１化合物の１０％未満になる。
【００７０】
ペプチド又は化合物に言及してここで使用される「インスリン分泌性」なる用語は増加した血糖値に応答して、インスリンの分泌を刺激する能力を意味する。インスリン分泌性ペプチド及び化合物は、ＧＬＰ-１レセプターのアゴニストである。化合物のインスリン分泌特性は、当該分野で知られているインビトロ又はインビボアッセイによって決定することができる。ペプチド等の化合物のインスリン分泌性を測定するために、以下のインビトロアッセイを使用してもよい。好ましくは、インスリン分泌性化合物は、以下のアッセイで５ｎＭ未満のＥＣ５０値、さらに好ましくは５００ｐＭ未満のＥＣ５０値を示す。
【００７１】
クローン化ヒトＧＬＰ-１レセプター(ＢＨＫ４６７-１２Ａ)を発現するベビーハムスター腎臓(ＢＨＫ)細胞を、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μＬ／ｍＬのストレプトマイシン、１０％の仔ウシ血清及び１ｍｇ／ｍＬのジェネテシンＧ-４１８(Life Technologies)が添加されたＤＭＥＭ培地で増殖させる。さらに５ｍｇ／ｍＬのロイペプチン(Sigma)、５ｍｇ／Ｌのペプスタチン(Sigma)、１００ｍｇ／Ｌのバシトラシン(Sigma)、及び１６ｍｇ／Ｌのアプロチニンを含有する、バッファー(１０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、３０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ７．４においてホモジナイズすることにより、細胞膜を調製する(Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA))。ホモジネートを４１％ Ｗ７ｖスクロースの層の上で遠心分離した。２層間の白色の帯状部をバッファーに希釈し、遠心分離した。使用するまで、細胞膜を−８０℃で保存した。
【００７２】
機能的レセプターアッセイを、インスリン分泌性ペプチド又はインスリン分泌性化合物による刺激に対する応答として、ｃＡＭＰを測定することにより実施する。全容量１４０ｍＬの９６-ウェルマイクロタイタープレートにおいて、次の最終濃度：５０ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＳＯ４、１．７ｍＭのＡＴＰ、２０ｍＭのＧＴＰ、２ｍＭの３-イソブチル-１-メチルキサンチン(ＩＢＭＸ)、０．０１％ｗ／ｖのトゥイーン-２０、ｐＨ７．４と共に、インキュベートを実施する。化合物を溶解させ、バッファーで希釈する。各実験用に、ＧＴＰを新たに調製する：２．５μｇの膜を各ウェルに添加し、暗所で振揺しつつ、混合物を室温で９０分インキュベートする。２５ｍＬの０．５Ｍ ＨＣｌを添加することにより、反応を停止させる。形成されたｃＡＭＰをシンチレーション近接アッセイにより測定する(RPA 542, Amersham, UK)。化合物について用量応答曲線をプロットし、GraphPad Prismソフトウェアを使用し、ＥＣ５０値を算出する。
【００７３】
ここで使用される「インスリン分泌性化合物のプロドラッグ」なる用語は、患者への投与後に、インスリン分泌性化合物に転換する、化学的に修飾された化合物を意味する。このようなプロドラッグは、典型的にはアミノ酸が伸長した変形体、又はインスリン分泌性化合物のエステルである。
【００７４】
ここで使用される「エキセンディン-４化合物」なる用語は、エキセンディン-４(１-３９)(配列番号：２)、そのインスリン分泌性フラグメント、そのインスリン分泌性アナログ、及びそのインスリン分泌性誘導体と定義される。エキセンディン-４のインスリン分泌性フラグメントはインスリン分泌性ペプチドであり、全配列は、エキセンディン-４(配列番号：２)の配列に見出すことができ、少なくとも一の末端アミノ酸が欠失している。エキセンディン-４(１−３９)にインスリン分泌性フラグメントの例は、エキセンディン-４(１-３８)及びエキセンディン-４(１-３１)である。化合物のインスリン分泌性は当該技術でよく知られているインビボ又はインビトロアッセイにより測定されてもよい。例えば、化合物を動物に投与し、インスリン濃度を経時的にモニターしてもよい。エキセンディン-４(１-３９)にインスリン分泌性アナログは、一又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置き換えられている、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基が欠失している、一又は複数のアミノ酸残基が付加されている、それぞれの分子を称し、但し、該アナログは、インスリン分泌性であるか、インスリン分泌性化合物のプロドラッグである。エキセンディン-４(１-３９)のインスリン分泌性アナログの例は、Ｓｅｒ２Ａｓｐ３-エキセンディン-４(１-３９)であり、ここで２及び３位のアミノ酸残基は、それぞれセリン及びアスパラギン酸で置き換えられている(この特定のアナログは、エキセンディン-３として、当該技術で公知である)。エキセンディン-４(１-３９)のインスリン分泌性誘導体及びそのアナログは、当業者がこれらのペプチドのアナログであることを認めたもの、すなわち、親ペプチドに存在しない少なくとも一の置換を有するものであり、但し、該誘導体は、インスリン分泌性であるか、インスリン分泌性化合物のプロドラッグである。置換基の例は、アミド類、炭水化物、アルキル基、エステル、及び脂質親和性置換基である。エキセンディン-４(１-３９)のインスリン分泌性誘導体及びそのアナログの例は、Ｔｙｒ３１-エキセンディン-４(１-３１)-アミドである。
【００７５】
ここで使用される「安定したエキセンディン-４化合物」なる用語は、化学的に修飾されたエキセンディン-４(１-３９)、つまり一般的な方法によって定量して、ヒトにおいて少なくとも１０時間のインビボ血漿排出半減期を示すアナログ又は誘導体を意味する。
【００７６】
ここで使用される場合「ジペプチジルアミノペプチダーゼインビボ保護されたエキセンディン-４化合物」なる用語は、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ保護されたＧＬＰ-１化合物の定義下において、記載されたアッセイにより測定した場合に、エキセンディン-４(配列番号：２)よりも血漿ペプチダーゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ(ＤＰＰ-ＩＶ)に対する耐性があるエキセンディン-４化合物を意味する。
【００７７】
ＧＬＰ-１アナログは、ＧＬＰ-１(７-３７)の３４位にある自然に生じたＬｙｓが、Ａｒｇで置換されているようなものでありうる。
【００７８】
また、インスリン分泌性ペプチドの前駆体又は中間体の誘導体も、本発明でカバーされる。
【００７９】
本発明の一態様では、グルカゴン様ペプチドはインスリン分泌性である。さらなる態様では、インスリン分泌性グルカゴン様ペプチドは、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-２、エキセンディン-４、エキセンディン-３、及びそのアナログ及び誘導体からなる群から選択される。  
【００８０】
タンパク質の立体安定性をベースにした薬剤は、変性及びフィブリル化による構造の不可逆的損失を最小にするため、また生物活性を維持するために重要である。特に大きなポリペプチド及びタンパク質は、複雑な折り畳みパターンの故に、立体構造の変化に関して不安定である。また、既知のフィブリル化の経緯を持つインスリン分泌性ペプチド、例えばＧＬＰ-１は、三次構造の不安定化（つまり、溶融球状状態の形成）に対して特に感受性である。
【００８１】
一態様では、本発明に記載のグルカゴン様ペプチドの構成アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるアミノ酸の群から選択され得、遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸、並びに合成アミノ酸でありうる。遺伝暗号によりコードされない天然アミノ酸は、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、オルニチン、ホスホセリン、Ｄ−アラニン及びＤ−グルタミンである。合成アミノ酸は、化学合成により製造されたアミノ酸、すなわち遺伝暗号によりコードされるアミノ酸のＤ−異性体、例えばＤ−アラニン及びＤ−ロイシン、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ａｂｕ（α−アミノ酪酸）、Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルグリシン）、β−アラニン、３−アミノメチル安息香酸、アントラニル酸を含む。
【００８２】
本発明の一態様では、本発明に記載のアシルされ得るグルカゴン様ペプチドは、ＧＬＰ−１ペプチドである。別の態様では、ＧＬＰ−１ペプチドは、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２  Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｐｈｅ（ｍ−ＣＦ３）２８］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２０、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｔｈｒ（Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ）３３、］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３０］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３１］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２０、Ａｒｇ２６、２−ナフチルアラニン２８、Ｇｌｕ３０、］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２０、Ａｒｇ２６、２−ナフチルアラニン１２、Ｇｌｕ３０、］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３１、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−アミド、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ１８、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２６］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３４）、
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３５）、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ３３、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３４）、
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）Ｌｙｓ、
［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２０、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）Ｌｙｓ、
［Ａｉｂ８、Ａｉｂ３５］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（（７−３７）Ｌｙｓ、及び
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）
からなる群から選択される。
【００８３】
一態様では、アシル化されたグルカゴン様ペプチドは、本発明の方法によって得られる。別の態様では、本発明の方法によって得られたアシル化されたグルカゴン様ペプチドは、アシル化されたＧＬＰ−１ペプチドである。更に別の態様では、アシル化されたＧＬＰ−１ペプチドは、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−（２−（２−［２−（２−［４−（１５−カルボキシペンタデカノイルアミノ）−４（Ｓ）−カルボキシブチリルアミノ）エトキシ）エトキシ］アセチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−（２−（２−［２−（２−［４−（１６−カルボキシヘキサデカノイルアミノ）−４（Ｓ）−カルボキシブチリルアミノ）エトキシ）エトキシ］アセチル）アミノ）エトキシ）エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）−４（Ｓ）−カルボキシブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（１８−カルボキシオクタデカノイルアミノ）−４（Ｓ）−カルボキシブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（１９−カルボキシノナデカノイルアミノ）−４（Ｓ）−カルボキシブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（２０−カルボキシエイコサノイルアミノ）−４（Ｓ）−カルボキシブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（２０−カルボキシウネエイコサノイルアミノ）−４（Ｓ）−カルボキシブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）−４（Ｒ）−カルボキシブチリルアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−［２−（２−［２−（２−［４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）−４（Ｓ）−カルボキシｐｒｏｐｙｌアミノ］エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ］エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド
Ｎ−イプシロン３７−｛２−（２−（２−（２−［２−（２−（４−（ヘキサデカノイルアミノ）−４−カルボキシブチリルアミノ）エトキシ）エトキシ］アセチル）エトキシ）エトキシ）アセチル）｝−［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］（ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
Ｎ−イプシロン３７−｛２−（２−（２−（２−［２−（２−（４−（ヘキサデカノイルアミノ）−４−カルボキシブチリルアミノ）エトキシ）エトキシ］アセチル）エトキシ）エトキシ）アセチル）｝−［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］（ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、
Ｎ−イプシロン３７−（２−（２−（２−（２−（２−（２−（２−（２−（２−Ｏｃｔａデカノイルアミノ）エトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ）アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ）アセチル）［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
Ｎ−イプシロン３６−（２−（２−（２−（（２−［２−（２−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）エトキシ）エトキシ］アセチルアミノ）エトキシ）エトキシ）アセチル）［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｌｙｓ３６］ＧＬＰ−１−（７−３７）Ｇｌｕ−アミド、
Ｎ−イプシロン３７−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１９−カルボキシノナデカノイルアミノ）ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチル］［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、及び
Ｎ−イプシロン３１−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシ−ヘプタデカノイルアミノ）ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチル］［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３１］ＧＬＰ−１−（７−３７）．
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシ−ヘプタデカノイル−アミノ）ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アクチルアミノ］エトキシ｝エトキシ）−アセチル］［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチドＧＬＰ−１−（７−３７）ペプチド、
Ｎ−イプシロン２６−［２−（２−｛２−［（Ｓ）−４−カルボキシ−４−（１７−カルボキシヘプタデカノイルアミノ）ブチリルアミノ］エトキシ｝エトキシ）アセチル］Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド
からなる群から選択される。
【００８４】
本発明はまた特にインスリン及びそのアナログのアシル化に適している。
【００８５】
本発明の一態様では、本発明に記載のアシル化され得るインスリンは、ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログである。本発明に記載のヒトインスリンアナログは、１又は複数のアミノ酸が、他のアミノ酸残基で置換されているか、挿入されているか、インスリンから欠失しているか、及び／又はヒトインスリンと比較して付加されている。一態様では、１から５、１から４、１から３又は１から２個のアミノ酸が、ヒトインスリンのアミノ酸配列と比較して、置換、挿入、欠失及び／又は付加されている。
【００８６】
本発明に記載のインスリンアナログの例は、Ｂ鎖の一２８のプロリンが、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａに変位するか、及び／又は位置Ｂ２９のＬｙｓがＰｒｏ、Ｇｌｕ又はＡｓｐに変位している。更に、位置Ｂ３のＡｓｎは、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ又はＡｓｐに変位し得る。位置Ａ２１のアミノ酸残基は、Ｇｌｙに変位し得る。位置Ｂ１のアミノ酸は、Ｇｌｕに変位し得る。位置Ｂ１６のアミノ酸は、Ｇｌｕ又はＨｉｓに変位し得る。インスリンアナログの更なる例は、欠失アナログであり、例えば、ヒトインスリンアナログ中のＢ３０アミノ酸が欠失しているアナログ（デス（Ｂ３０）ヒトインスリン）、ヒトインスリン中のＢ１アミノ酸が欠失しているインスリンアナログ（デス（Ｂ１）ヒトインスリン）、デス（Ｂ２８−Ｂ３０）ヒトインスリン及びデス（Ｂ２７）ヒトインスリンがある。Ｂ鎖のＣ末端に２個のアルギニン残基が付加されるような、Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＮ末端伸長を有するインスリンアナログ及びＡ鎖及び／又はＢ鎖がＣ末端伸長を有するインスリンアナログもまたインスリンアナログの例である。インスリンアナログの更なる例は、言及した変位の組み合わせを含む。位置Ａ１４のアミノ酸がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ又はＨｉｓであり、位置Ｂ２５のアミノ酸がＨｉｓであり、一又は複数の付加的な変位を更に含んでもよいインスリンアナログが、インスリンアナログの更なる例である。位置Ａ２１のアミノ酸残基がＧｌｙであり、インスリンアナログが２個のアルギニン残基でＣ末端が更に伸長されたヒトインスリンアナログのインスリンアナログもまたインスリンアナログの例である。
【００８７】
一態様では、インスリンは
ヒトインスリン、
ＤｅｓＢ３０ヒトインスリン、
ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、
ＡｓｐＢ２８、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９ヒトインスリン、
ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、
ＧｌｙＡ２１、ＡｒｇＢ３１、ＡｒｇＢ３２ヒトインスリン、
ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５ヒトインスリン、
ＨｉｓＡ１４、ＨｉｓＢ２５ヒトインスリン、
ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＨｉｓＡ１４、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、デスＢ２７、デスＢ２８、デスＢ２９、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、ＧｌｕＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ１６、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＨｉｓＡ１４、ＨｉｓＢ１６、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＨｉｓＡ８、ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、ＧｌｕＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、デスＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＧｌｕＡ１４、ＧｌｙＡ２１、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、ＬｙｓＢ２７、デスＢ２８、デスＢ２９、デスＢ３０ヒトインスリン、
ＨｉｓＡ８、ＧｌｕＡ１４、ＧｌｕＢ１、ＧｌｕＢ１６、ＨｉｓＢ２５、ＧｌｕＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン、及び
ＨｉｓＡ８、ＧｌｕＡ１４、ＧｌｕＢ１６、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン
から成る群から選択される。
【００８８】
一態様では、アシル化されたインスリンペプチドは、本発明の方法によって得られる。別の態様では、本発明の方法によって得たアシル化されたインスリンペプチドは、
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン），
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）、
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（（Ｎεエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン）、
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ２８、デスＢ２９、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ２８、デスＢ２９、デスＢ３０ヒトインスリン）、
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２７Ｅ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）、
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ２７、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ２７、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）、
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（（Ｎεエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（（Ｎεエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）、
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）、ａｎｄ
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）
から成る群から選択される。
【００８９】
ペプチドとタンパク質の産生は、当該分野で知られている。ペプチド又はタンパク質は、例えば、古典的なペプチド合成、例えば、ｔ−Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ化学又は他の良く確立された技術を用いた固相ペプチド合成によって産生し得、例えば、Greene and Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, “Organic Synthesis on solid Phase”, Florencio Zaragoza Dorwald, Wiley-VCH Verlag GmbH, D-69469 Weinheim, 2000, “Novabiochem Catalog”, Merck Biosciences 2006/2007 及び “Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, Edited by W.C. Chan and P.D. White, Oxford University Press, 2000, ISBN 0-19-963724-5を参照されたい。ペプチド又はタンパク質は、ペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み、ペプチド又はタンパク質の発現を許容する条件下で、適切な栄養培地中で発現することができる、宿主細胞の培養を含む方法によってまた産生されてもよい。非天然アミノ酸残基を含むペプチド又はタンパク質については、組換え細胞は、非天然アミノ酸が、例えば、ｔＲＮＡ変異体の使用によって、ペプチド又はタンパク質に組み込まれるように改変されるべきである。
【００９０】
以下は、本発明に更に含まれる態様の限定されないリストである：
１．２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の一のアミノ基を選択的にアシル化するための方法において、該方法が、
ａ）水溶媒中で、少なくとも２個の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質を一般式Ｉ
0005591243.tif 000006
［上式中、
ｎは１から６であり、
ｍは１から２であり、
ｗは４から２０であり、
Ｒ１は前記アシル化剤を遊離のアミンと反応させる際に、Ｒ１に結合しているカルボニル基と前記アミンの間のアミド結合の形成を容易にする脱離基であり、
水溶媒中のｐＨがｐＨ８からｐＨ１４である
］のアシル化剤と反応させ、
ｂ）Ｎ-アシル化ペプチド又はタンパク質を単離することを含み、
ここで、アシル化されていないか、一部だけがアシル化されている、少なくとも１の反応性求核性官能基を含む、Ｎ-アシル化ペプチド又はタンパク質を得る方法。
【００９１】
２．反応性求核性官能基が、ヒドロキシル基、チオール基及びアミノ基からなる群から選択される、態様１に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【００９２】
３．反応性求核性官能基がアミノ基である、態様１又は３に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。  
【００９３】
４．Ｎ-アシル化ペプチド又はタンパク質を得、アシル化がリシンのε-位で起こり、ペプチド又はタンパク質の少なくとも１個の遊離アミノ基は、アシル化されない、態様１から３の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【００９４】
５．式ＩのＲ１がＲ１に結合しているカルボニルと一緒になってエステルを形成する、態様１から４の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【００９５】
６．式ＩのＲ１がＲ１に結合しているカルボニルと一緒になって活性化エステルを形成する、態様１から４の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【００９６】
７．式ＩのＲ１がＲ１に結合しているカルボニルと一緒になって活性化Ｎ-ヒドロキシイミドエステルを形成する、態様１から４の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【００９７】
８．ｎは１から５、又は１から２、１から３若しくは１から４、又は２である、態様１から７の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【００９８】
９．ｍは１から２、又は２である、態様１から８の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【００９９】
１０．ｗは４から２０、又は１０から２０、又は１４から１８、又は１４、又は１６又は１８である、態様１から９の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１００】
１１．水性反応混合物のｐＨがｐＨ９からｐＨ１３の間である、態様１から１０の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０１】
１２．水性反応混合物のｐＨがｐＨ１０からｐＨ１２の間である、態様１から１１の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０２】
１３．水性反応混合物のｐＨがｐＨ１０．５からｐＨ１１．５の間である、態様１から１２の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０３】
１４．水性反応混合物のｐＨがｐＨ１１からｐＨ１２の間である、態様１から１３の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０４】
１５．水性反応混合物のｐＨがｐＨ１１．５からｐＨ１２の間である、態様１から１４の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０５】
１６．水性反応混合物のｐＨが約１１．５である、態様１から１５の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０６】
１７．水性反応混合物のｐＨが、ｐＨ１１．０から１１．５の間又はｐＨ１１．０から１１．３の間のような、ｐＨ１１から１２の間である、態様１から１６の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０７】
１８．水性反応混合物のｐＨが、約１１．３である、態様１から１７の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０８】
１９．アシル化処理中の反応混合物の温度が、０℃から５０℃のような、−５℃から５０℃の間である、態様１から１８の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１０９】
２０．アシル化処理中の反応混合物の温度が、約２０℃又は室温のような、１０℃から３０℃の間である、態様１から１９の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１０】
２１．アシル化処理中の反応混合物の温度が、２℃から５℃の間のような、０℃から５℃の間である、態様１から２０の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１１】
２２．アシル化処理中の反応混合物の温度が、約２０℃又は室温のような、１０℃から３０℃の間である、態様１から２１の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１２】
２３．試薬が３０から６０分の時間をかけて添加される、態様１から２２の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１３】
２４．アシル化混合物が、アシル化剤の添加後、０から２４時間、反応のために放置される、態様１から２３の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１４】
２５．反応をアシル化剤を添加した直後に、例えば、ｐＨ７．５から８．０のような、ｐＨ６．５から９．０のｐＨに調節することによって停止する、態様１から２４の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１５】
２６．アシル化混合物が、アシル化剤の添加後、３０から６０分間、反応のために放置される、態様１から２５の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１６】
２７．ペプチド又はタンパク質が、少なくとも５．０ｍｇ／ｍｌの濃度で反応混合物中に存在する、態様１から２６の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１７】
２８．ペプチド又はタンパク質の濃度が、１０．０ｍｇ／ｍｌから２０．０ｍｇ／ｍｌである、態様１から２７の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１８】
２９．ペプチド又はタンパク質の濃度が、約１２．５ｍｇ／ｍｌである、態様１から２８の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１１９】
３０．ペプチド又はタンパク質の濃度が、約２０ｍｇ／ｍｌである、態様１から２９の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２０】
３１．反応混合物がバッファーを含む、態様１から３０の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２１】
３２．反応混合物が、リン酸バッファー、炭酸ナトリウムバッファー、ビシンバッファー（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシンバッファー）、ＨＥＰＥＳバッファー（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸バッファー）、ＭＯＰＳバッファー（３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸バッファー）又はＴＥＡバッファー（トリエチルアミンバッファー）からなる群から選択される、態様１から３１の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２２】
３３．反応混合物がリン酸バッファーであるバッファーを含む、態様１から３２の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２３】
３４．アシル化剤が溶液に固体として添加される、態様１から３３の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２４】
３５．アシル化剤が、不活性溶媒中に溶解したアシル化剤を含む溶液に添加される、態様１から３４の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２５】
３６．不活性溶媒がＮ−メチルピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びアセトニトリルからなる群から選択される、態様１から３５の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２６】
３７．アシル化剤が、１０ｍｇ／ｍｌから２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で反応混合物に添加される、態様１から３６の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２７】
３８．工程（ａ）の反応が、タンパク質と１：１から１：５のモル比の式Ｉのアシル化剤を用いて実施される、態様１から３７の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２８】
３９．ペプチド又はタンパク質が、水中に−１０から３０℃で、プレ溶解し、ｐＨは、アルカリ金属水酸化物、アルカリ炭酸塩又は第三級アミン塩基を用いて、アシル化剤を添加する前に、所望のレベルに調整される、態様１から３８の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１２９】
４０．アシル化され得るペプチド又はタンパク質が、糖尿病の治療に適切である、態様１から３９の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３０】
４１．アシル化され得るペプチド又はタンパク質が、肥満の治療に適切である、態様１から４０の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３１】
４２．アシル化され得るペプチド又はタンパク質が、グルカゴン様ペプチド又はインスリンである、態様１から４１の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３２】
４３．アシル化され得るペプチド又はタンパク質が、グルカゴン様ペプチドである、態様４２に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３３】
４４．グルカゴン様ペプチドがジペプチジルアミノペプチダーゼＩＶ保護されている、態様４３に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３４】
４５．グルカゴン様ペプチドがグルカゴンペプチド、ＧＬＰ−１ペプチド、ＧＬＰ−２ペプチド、エキセンジン−３ペプチド及びエキセンジン−４からなる群から選択される、態様４３又は４４に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３５】
４６．グルカゴン様ペプチドがＧＬＰ−１ペプチドである、態様４５に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３６】
４７．ＧＬＰ−１ペプチドが
ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＰ−１（７−３６）アミド、Ｇｌｙ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｖａｌ８−ＧＬＰ−１（７−３６）−アミド及び［Ｖａｌ８Ａｓｐ２２］−ＧＬＰ−１（７−３７）、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｐｈｅ（ｍ−ＣＦ３）２８］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２０、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｔｈｒ（Ｏ−ｂｅｎｚｙｌ）３３、］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３０］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３１］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２０、Ａｒｇ２６、２−ナフチルアラニン２８、Ｇｌｕ３０、］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、］ＧＬＰ−１−（７−３７）−Ｌｙｓ、［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２０、Ａｒｇ２６、２−ナフチルアラニン１２、Ｇｌｕ３０、］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｌｙｓ３１、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）、
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）−アミド、［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ１８、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２６］ＧＬＰ−１（７−３７）アミド、
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３４）、［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３５）、［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ３３、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３４）、
［Ａｉｂ８、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド、［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３６）アミド、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）Ｌｙｓ、［Ａｉｂ８、Ｌｙｓ２０、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［デスアミノＨｉｓ７、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４、Ｌｙｓ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）アミド、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（７−３７）Ｌｙｓ、［Ａｉｂ８、Ａｉｂ３５］ＧＬＰ−１−（７−３７）、Ａｒｇ３４ＧＬＰ−１−（７−３７）、［Ａｉｂ８、Ｇｌｕ２２、Ａｒｇ２６、Ｇｌｕ３０、Ｐｒｏ３７］ＧＬＰ−１−（（７−３７）Ｌｙｓ、及び［Ａｉｂ８、Ａｒｇ２６、Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１−（７−３７）
からなる群から選択される、態様４６に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３７】
４８．アシル化され得るペプチド又はタンパク質がインスリンである、態様４２に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３８】
４９．ヒトインスリンアナログが、１から５個のアミノ酸が他のアミノ酸残基によって置換されるか、挿入されるか、インスリンから欠失しているか、及び／又はヒトインスリンと比較して付加されている、態様４８に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１３９】
５０．インスリンが、
ヒトインスリン、デスＢ３０ヒトインスリン、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、ＡｓｐＢ２８、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、ＬｙｓＢ３、ＧｌｕＢ２９ヒトインスリン、ＬｙｓＢ２８、ＰｒｏＢ２９ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１、ＡｒｇＢ３１、ＡｒｇＢ３２ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５ヒトインスリン、ＨｉｓＡ１４、ＨｉｓＢ２５ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、ＨｉｓＡ１４、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、デスＢ２７、デスＢ２８、デスＢ２９、デスＢ３０ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、ＧｌｕＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン、ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ１６、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、ＨｉｓＡ１４、ＨｉｓＢ１６、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン、ＨｉｓＡ８、ＧｌｕＡ１４、ＨｉｓＢ２５、ＧｌｕＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン、ＨｉｓＡ８、ＧｌｕＡ１４、ＧｌｕＢ１、ＧｌｕＢ１６、ＨｉｓＢ２５、ＧｌｕＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン、及びＨｉｓＡ８、ＧｌｕＡ１４、ＧｌｕＢ１６、ＨｉｓＢ２５、デスＢ３０ヒトインスリン
からなる群から選択される、態様４９に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１４０】
５１．Ｎ−アシル化ペプチド又はタンパク質が、アシル化されていない少なくとも一の遊離アミノ基を含んで得られる、態様１から５０の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【０１４１】
５２．アシル化され得るペプチド又はタンパク質が、２個の遊離アミノ基を有し、唯一のアミノ基がアシル化される、態様１から５１の何れか一に記載の２以上の反応性求核性官能基を有するペプチド又はタンパク質中の１のアミノ基を選択的にアシル化する方法。
【実施例】
【０１４２】
実施例１：１，１８−オクタデカン二酸モノベンジルエステルの調製
0005591243.tif 000007
トルエン（２．７５Ｌ）中の１，１８−オクタデカン二酸（７５ｇ、０．２４ｍｏｌ）、ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（２．２７ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）及びベンジルアルコール（２０．７ｇ、０．１９ｍｏｌ）の溶液を３時間加熱還流した。水を環流中共沸蒸留によって除いた。セライト（２５ｇ）を添加し、混合物を４０℃まで冷却し、更なる時間攪拌した。混合物をトルエンを移動相として用い、シリカを通してプラグ濾過によって精製した。１，１８−オクタデカン酸モノベンジルエステルを含む画分を回収し、７５℃における真空濾過によって体積を減少させた。溶液を５０℃まで冷却し、ヘプタンを添加し、混合物を３５℃まで冷却した。再結晶の際、更なるヘプタンを１５分間かけて添加し、最終的に混合物を更なる時間１０℃まで冷却した。生成物を濾過して回収し、ヘプタンで洗浄し、真空で乾燥した。１，１８−オクタデカン酸モノベンジルエステルの収率は３４ｇ（３５％）であった。
【０１４３】
実施例２：ベンジル  １８−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１８−オキソオクタデカネートの調製
0005591243.tif 000008
１，１８−オクタデカン二酸モノベンジルエステル（１２０ｇ、０．３ｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（４１ｇ、０．３６ｍｏｌ）をＮＭＰ（１２００ｍｌ）に溶解し、６０℃で２．５時間加熱した。反応混合物を２５℃まで冷却し、沈殿を濾過して除き、水（４．７Ｌ）で洗浄した。粗沈殿を２−プロパノール（１２５０ｍｌ）で再結晶化し、ベンジル  １８−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１８−オキソオクタデカネートを得た。収量は１３８ｇ（９２％）。
【０１４４】
実施例３：ベンジル  １８−（｛（１Ｓ）−１−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−４−オキソブチル｝アミノ）−１８−オキソオクタデカノエートの調製
0005591243.tif 000009
ベンジル  １８−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１８−オキソオクタデカノエート（３０ｇ、６０ｍｍｏｌ）及びＬ−グルタミン酸アルファ−ベンジルエステル（１５ｇ、６２．８ｍｍｏｌ）をＮＭＰに溶解し５０℃で４時間加熱した。水（７００ｍｌ）、ＫＨＳＯ４（１００ｍｌ、０．５Ｍ水溶液）及び酢酸エチル（２２０ｍｌ）を２５℃で添加した。有機相をＫＨＳＯ４（水溶液、１５０ｍｌ、０．１７Ｍ）で２回洗浄し、真空で濃縮した。混合物をＮＭＰ（２２５ｍｌ）に再溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１１ｇ、９５．７ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１６ｇ、７７．７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を１６時間攪拌した。沈殿を濾過して除き、水（１Ｌ）で洗浄した。粗沈殿を２−プロパノールで再結晶化し、ベンジル  １８−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１８−オキソオクタデカノエートを得た。収量は３２．７ｇ（７６％）。
【０１４５】
実施例４：（２２Ｓ）−２２−カルボキシ−１−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，１０，１９，２４−テトラオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８，２３−トリアザヘンテトラコンタン−４１−酸（化合物１）の調製
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ベンジル１８−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１８−オキソオクタデカノエート（１００ｇ、１３８．７ｍｍｏｌ）及び１７−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９−アザヘプタデカン−１−酸（４４．９ｇ、１４５．６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１Ｌ）に懸濁した。トリエチルアミン（２０．８ｍｌ、１５０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１６時間攪拌した。水（３Ｌ）、ＫＨＳＯ４（水溶液０．５Ｍ、１Ｌ）、及び酢酸エチル（１Ｌ）を添加した。有機相を真空で濃縮し、トルエン（２ｘ３００ｍｌ）で共沸した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１７．６ｇ、１５３ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（３１．９ｇ、１６６．５ｍｍｏｌ）及び２−プロパノール（１Ｌ）を添加し、溶液を１６時間攪拌した。ジクロロメタン（１Ｌ）、水（３Ｌ）及びＫＨＳＯ４（水溶液０．５Ｍ、１Ｌ）を添加した。有機相を回収し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空で濃縮し、トルエン（２ｘ３００ｍｌ）で共沸した。２−プロパノール（１３００ｍｌ）及びＰｄ／Ｃ（１４ｇ）を添加し、混合物を２時間水素化した。混合物を３９℃で加熱し、濾過した。溶液を冷却し、沈殿を濾過して回収した。収量は１００ｇ（８７％）。
【０１４６】
実施例５：分析ＨＰＬＣ
以下のＨＰＬＣ勾配を得られたアシル化生成物の分析に用いた。
バッファーＡ：１８００ｍｌミリＱ水、２００ｍｌアセトニトリル及び２ｍｌＨ３ＯＰ４
バッファーＢ：１８００ｍｌアセトニトリル、２００ｍｌミリＱ水及び２ｍｌＨ３ＯＰ４
カラム：ジュピター４μＰｒｏｔｅｏ  ９０Ａ  ｋｏｌｏｎｎｅ  ｆｒａ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ
勾配は表５．１に示した。
表５．１
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【０１４７】
実施例６：２２−カルボキシ−１−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，１０，１９，２４−テトラオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８，２３−トリアザヘンテトラコンタン−４１−酸（化合物１）を用いた［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）のアシル化
一般的な実験：マグネチックスターラーバーを備えた丸底フラスコ中に、ペプチド中間体［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７） ペプチド及びミリＱ水を添加し、表６．１に示す濃度を有する懸濁液を得た。丸底フラスコを大きな（２Ｌ）の水槽に沈め、Julabo HL-4加熱循環器によって、２０度の固定温度まで調節した。放射計PHM290 pH-stat調節器を２個の別のＩＵＰＡＣ標準バッファー（ｐＨ９．１８及び１２．４５）で標準化し、ＮａＯＨ水溶液（０．１Ｍ）の溶液を備える放射計ABU901オートビュレット（２ｍｌ）に接続した。電極を混合物（典型的にはｐＨ＝２．５）に浸した。４ＭのＮａＯＨを固定したｐＨ設定点に添加した（ｐＨの詳細については表６．１を参照されたい）。アシル化剤（化合物１）を使用前に内部標準を用いて１Ｈ−ＮＭＲで評価した。シリンジポンプは、ＮＭＰ（ペプチド中間体に対して約３等量）中の１０％ｗ／ｗのアシル化剤の溶液を含むシリンジを備え、６０分間かけてペプチド中間体を溶液に連続的に滴下して添加した（すなわち、２０分間に約１等量のアシル化剤）ｐＨをPHM290調節器によって調節点に固定した。ＩＰＣは適切な間隔で採り、ＨＰＬＣ（２６０ｎｍ、実施例５）で解析し、％面積を表６．１に示した。
表６．１
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【０１４８】
実施例７：２２−カルボキシ−１−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，１０，１９，２４−テトラオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８，２３−トリアザヘンテトラコンタン−４１−酸（化合物２）を用いた［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）のアシル化
［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド（１０．０ｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を水に懸濁し、濃度を約１５ｇ／ｌとし、ｐＨをＮａＯＨ（水溶液、１Ｍ）で１１．２５に調整し、水を最終のペプチド濃度が約１２．５ｇ／Ｌとなるまで添加した。アシル化剤２２−カルボキシ−１−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，１０，１９，２４−テトラオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８，２３−トリアザヘンテトラコンタン−４１−酸（化合物１、３．７ｇ、４．４１ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（１０％ｗ／ｖ）に溶解し、水溶液に滴下して添加した。ｐＨを反応の間ＮａＯＨ（水溶液、１Ｍ）を連続して添加することにより１１．１から１１．３の一定に維持した。サンプルを回収し、ＲＰ  ＨＰＬＣ（実施例５の勾配に従って）で反応の間解析した。アシル化剤の添加が終わった後、硫酸（水溶液、１Ｍ）を添加して、ｐＨを約７．５に調整する前に、反応混合物を更に６０分間攪拌した。ＨＰＬＣ（２６０ｎｍ、実施例５）、面積％９２．６％、標準を用いたアッセイ滴定による収量は９１．５％。
【０１４９】
実施例８：２２−カルボキシ−１−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，１０，１９，２４−テトラオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８，２３−トリアザヘンテトラコンタン−４１−酸（化合物１）を用いた［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）のアシル化
実験：マグネチックスターラーバーを備えた丸底フラスコ中に、ペプチド中間体［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７） ペプチド（２３４ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）及びミリＱ水（１８．３ｍｌ）を添加し、懸濁液を得た。ｐＨメーターを、２個の別のＩＵＰＡＣ標準バッファー（ｐＨ９．１８及び１２．４５）で標準化し、溶液中に沈めた。Ｅｔ３ＮをｐＨ１０になるまで添加した。化合物１を使用前に内部標準を用いて１Ｈ−ＮＭＲで評価した。シリンジポンプは、ＮＭＰ（ペプチド中間体に対して約３等量）中の１０％ｗ／ｗのアシル化剤（化合物１、１２０ｍｇ、０．１４４ｍｍｏｌ）の溶液を含むシリンジを備え、溶液を連続してペプチド中間体の溶液に滴下して添加した。ｐＨをＡｃＯＨで７．２に調整し、ＨＰＬＣ（２６０ｎｍ）で解析した％面積は、下の表に示した。
0005591243.tif 000013
【０１５０】
実施例９：１，１６−ヘキサデカン二酸モノベンジルエステルの調製
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ヘキサデカン二酸（２０．０ｇ、６９．８ｍｍｏｌ）及びDowex（登録商標）をｎ−オクタンに懸濁し、還流まで加熱した。６時間後、更にギ酸ベンジル（２２．０ｇ、１６２ｍｍｏｌ）を添加した。加熱を５０時間続けた。反応混合物を８０℃で濾過した。濾液を２０℃まで冷却し、濾過による沈殿は回収した。粗生成物（２０．２ｇ）をジクロロメタン（２２０ｍｌ）に２０℃で４時間懸濁した。懸濁液を濾過し、濾液を２０から３０℃で濃縮して乾燥した。得た固体（１３．９ｇ）は２−プロパノール（１４０ｍｌ）で再結晶化した。
【０１５１】
生成物を濾過して単離し、減圧下、３０から４０℃において、一定の重量になるまで乾燥した。収量：白色物質が１０．２ｇ（３９％）。
【０１５２】
実施例１０：（Ｓ）−２−（１５−ベンジルオキシカルボニル−ペンタデカノイルアミノ）−ペンタン二酸５−ベンジルエステル１−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）エステルの調製
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１，１６−ヘキサデカン二酸モノベンジルエステル（２０．０ｇ、５３．１ｍｍｏｌ）をアセトンに３５から４０℃で溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６．４２ｇ、５５．８ｍｍｏｌ）を添加した。得られた溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１２．１ｇ、５８．４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３５℃で３から４時間攪拌した。得られた懸濁液に、トリエチルアミン（７．４０ｍｌ、５３．１ｍｍｏｌ）及びＬ−グルタミン酸α−ベンジルエステル（１２．６ｇ／５３．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３５から４０℃で８から１６時間攪拌した。反応混合物を２０から２５℃に冷却した。メタンスルホン酸（３．４５ｍｌ、５３．１ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（１２．１ｇ、５３．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２０から２５℃で８から１６時間攪拌した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮して乾燥した。残渣を水（１００ｍｌ）とトルエン（２００ｍｌ）で分離した。トルエン相を蒸留して水を除くことで乾燥した。シリカゲル（２０ｇ）を残渣に添加した。懸濁液を３０分間２０から２５℃で攪拌し、次いで濾過した。濾液の体積を減圧下濃縮することにより約１００から１２０ｍｌまで減少した。Ｎ−ヘプタン（１５０ｍｌ）を１５から３０分かけて添加した。得た懸濁液を２時間かけて攪拌した。生成物を濾過して単離し、２０から２５℃の減圧下で一定の重量になるまで乾燥した。収量：白色物質が２１ｇ（５８％）。
【０１５３】
実施例１１：（２２Ｓ）−２２−カルボキシ−１−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−１，１０，１９，２４−テトラオキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９，１８，２３−トリアザヘンジコンタン−３９−酸（化合物２）の調製
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（Ｓ）−２−（１５−ベンジルオキシカルボニル−ペンタデカノイルアミノ）−ペンタン二酸５−ベンジルエステル１−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）エステル（４ｇ、５．７７ｍｍｏｌ）及び１７−アミノ−１０−オキソ−３，６，１２，１５−テトラオキサ−９−アザヘプタデカン−１−酸（１．８ｇ、５．９５ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２０ｍｌ）に懸濁し、混合物を１６時間攪拌した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．９４ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２．１５、１０ｍｍｏｌ）を添加し、得た溶液を約１６時間攪拌した。水（１５０ｍｌ）及び酢酸エチル（３０ｍｌ）を添加し、有機相を回収し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。半固体をアセトンに再溶解し、Ｐｄ／Ｃ（０．５ｇ）を添加し、混合物を２時間水素化した。混合物を濾過し、真空で濃縮した。収量３．６９ｇ（８８％）。
【０１５４】
実施例１２： 化合物２を用いた［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）の選択的アシル化
アシル化は実施例６に記載した通り一般的なアシル化法において記載した通り実施される。
使用される条件は、
0005591243.tif 000017
【０１５５】
実施例１３：アシル化剤化合物３−５の固相合成
化合物３から５は、下に記載の工程を用いて固相上で合成された。
ローディング：機械的に中央に位置するテフロン被覆されたスターラーを備える固相ペプチド反応器中で、２−塩化クロロトリチル樹脂をＤＣＭで膨張させた。ＤＣＭ中のＦｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサン酸（１等量）及びＤＩＰＥＡ（１．１等量）の溶液を添加し、得た混合物を室温で１６時間攪拌した。樹脂を排水し、樹脂上の未反応部位をＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ（８０：１５：５）の混合物で被覆し、次いでＤＣＭ及びＮＭＰで洗浄した。
伸長：
１）脱保護処理：樹脂上のＦｍｏｃ基の脱保護；樹脂はＮＭＰ（２０％溶液）中のピペラジンで処理し、ＮＭＰで洗浄した。
２）次のカップリング処理：アミノ酸又はベンジル１８−（｛（１Ｓ）−１−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−４−オキソブチル｝アミノ）−１８−オキソオクタデカノエート（元の樹脂ローディングに比較して２等量）をＮＭＰに溶解した。アミノ酸をＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）とＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）で１５から３０分間プレ活性化するか又はアミノ酸又はベンジル１８−（｛（１Ｓ）−１−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−４−オキソブチル｝アミノ）−１８−オキソオクタデカノエートのスクシンイミドエステルをＮＭＰに溶解し、次いで樹脂に添加した。３０から６０分後、ＤＩＰＥＡを添加し、混合物を１時間から１６時間室温で攪拌してもよい。遊離アミンの試験が陰性（Ｋａｉｓｅｒ試験）ならば、カップリングは終了しており、ＮＭＰを用いて樹脂を洗浄し、連続した周回工程に移行する準備がなされた。
切断処理：樹脂をＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１：１）、ＤＣＭで洗浄し、ＤＣＭ：ＴＩＰＳ：ＴＦＡ（９５．５：２．５：２）の混合物で１０分間処理し、切断混合物をＤＩＰＥＡ中に移し、ｐＨ＞７の溶液を得た。切断処理を繰り返した。粗溶液をクエン酸（水溶液１０％３Ｘ）、食塩水（１Ｘ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空で濃縮した。油性残基はトルエンで２回共沸した。
活性化：得られた残基とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１．１等量）をＥｔＯＡｃに溶解した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（１．３等量）を添加し、混合物を約１６時間攪拌した。混合物を濾過し、真空で濃縮した。
ｔｅｒｔ−ブチルエステルの脱保護：半固体をＴＦＡ及びＤＣＭに溶解し、２時間攪拌し、次いで真空で濃縮し、トルエンで２回共沸した後、２−プロパノールで再結晶した。
ベンジルエステルの脱保護：半固体を２−プロパノールに溶解し、Ｐｄ／Ｃを添加し、得た混合物を２時間水素化し、４５℃まで加熱し、濾過し、５℃まで冷却した。得た結晶を濾過して回収した。
【０１５６】
実施例１４：化合物３：１９−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸の調製
0005591243.tif 000018
化合物は、１，２０−エイコサン二酸モノｔ−ブチルエステル、Ｎ−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−Ｌ−グルタミン酸α−ｔ−ブチルエステル及び８−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−アミノ）−３，６−ジオキソオクタン酸を用いて、実施例１３に記載の一般的な方法に従って固相上で調製される。
【０１５７】
実施例１５：化合物３を用いた［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの選択的アシル化
アシル化は、実施例６に記載の一般的なアシル化法に記載の通り実施された。
用いた条件：
0005591243.tif 000019
【０１５８】
実施例１６：化合物４  １７−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−プロピルカルバモイル）−ヘプタデカノン酸の調製
0005591243.tif 000020
化合物は、ベンジル１８−（｛（１Ｓ）−１−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−４−オキソブチル｝アミノ）−１８−オキソオクタデカノエート及び８−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−アミノ）−３，６−ジオキソオクタン酸を用いて、実施例１３に記載の一般的な方法に従って固相上で調製された。 
【０１５９】
実施例１７：化合物４を用いた［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの選択的アシル化
アシル化は、実施例６に記載の一般的なアシル化法に記載の通り実施された。
用いた条件：
0005591243.tif 000021
【０１６０】
実施例１８：化合物５  １７−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−メトキシ）−エトキシ］−エチルカルバモイル｝−プロピルカルバモイル）−ヘプタデカン酸の調製
0005591243.tif 000022
化合物は、ベンジル  １８−（｛（１Ｓ）−１−［（ベンジルオキシ）カルボニル］−４−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−４−オキソブチル｝アミノ）−１８−オキソオクタデカノエート  ａｎｄ  ８−（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−アミノ）−３，６−ジオキソオクタン酸を用いて、実施例１３に記載の一般的な方法に従って固相上で調製された。
【０１６１】
実施例１９：化合物５を用いた［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの選択的アシル化
アシル化は、実施例６に記載の一般的なアシル化法に記載の通り実施された。
用いた条件：
0005591243.tif 000023
【０１６２】
実施例２０：化合物６の調製。
0005591243.tif 000024
化合物は実施例１４に記載の通り調製された。
【０１６３】
実施例２１：化合物６を用いた［Ａｉｂ８，Ａｒｇ３４］ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチドの選択的アシル化
アシル化は、実施例６に記載の一般的なアシル化法に記載の通り実施された。
用いた条件：
0005591243.tif 000025
【０１６４】
実施例２２：（Ｓ）−２−（１５−カルボキシ−ペンタデカノイルアミノ）−ペンタン二酸５−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）エステルの調製
（Ｓ）−２−（１５−ベンジルオキシカルボニル−ペンタデカノイルアミノ）−ペンタン二酸５−ベンジル  エステル  １−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）  エステル  （５．０  ｇ，  ７．３  ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（９５μｌ）を含むアセトン（９５ｍｌ）に溶解した。水素の消費が停止した場合、反応混合物を濾過した。濾液を２０℃まで冷却し、ｎ−ヘプタン（１４０ｍｌ）を１５から３０分間かけて添加した。得た懸濁液を０から５℃まで２から３時間かけて冷却した。生成物は濾過して単離し、２０から２５℃において、減圧下で一定の重量となるまで乾燥した。収量白色物質の３ｇ（８４％）。
生成物をアセトン−ｄ６を溶媒として用いたプロトンＮＭＲ（Bruker 600 MHz）で解析した。
１Ｄスペクトル（内部標準はＴＭＳδ０．０ｐｐｍ）からのプロトンＮＭＲ割り当て：
0005591243.tif 000026
0005591243.tif 000027
【０１６５】
実施例２３：（Ｓ）−２−（１５−カルボキシペンタデカノイルアミノ）ペンタン二酸５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステルを用いたヒトインスリンデスＢ３０の位置Ｂ２９のリシンのε−アミノ基のアシル化
デスＢ３０ヒトインスリンの４ｇを６４ｇの精製水に懸濁した。１．８５ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加し、デスＢ３０ヒトインスリンを溶解し、ｐＨを１１．４から１２．０まで上げた。溶液を２から５℃まで冷却した。
４４８ｍｇのＬ−２−（１５−カルボキシ−ペンタデカノイルアミノ）−ペンタン二酸５−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）エステルを１０から１５％の硫酸で安定化した３．５ｇＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）に溶解した。
デスＢ３０ヒトインスリン溶液を攪拌し、（Ｓ）−２−（１５−カルボキシ−ペンタデカノイルアミノ）ペンタン二酸５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステルの溶液を２０分間かけて添加し、低い温度に維持した。
（Ｓ）−２−（１５−カルボキシ−ペンタデカノイルアミノ）ペンタン二酸５−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）エステルを添加した後、反応混合物を２．５重量のトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（２０ｍｍｏｌ／ｋｇ）、酢酸アンモニウム（３０ｍｍｏｌ／ｋｇ），  エタノール４２．５％  ｗ／ｗ、残りの精製水、ｐＨ  ７．５からなる溶液で希釈した。
希釈後、ｐＨを攪拌しながら、１Ｍの酢酸をゆっくりと添加することにより７．５に調整した。ＨＰＬＣによる解析は、１４．２２％の残りのデスＢ３０ヒトインスリンを伴う、７２．１１％のＬｙｓＢ２９（  Ｎε−ヘキサデカノイル−γ−グルタミル）デス（Ｂ３０）ヒトインスリンの形成を示す。
【０１６６】
実施例２４：１５−［３−（２，５−Ｄｉｏｘｏピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−プロピルカルバモイル］ペンタデカノン酸を用いた位置Ｂ２９のリシンのヒトインスリンデスＢ３０ε−アミノ基のアシル化
３５ｇのデスＢ３０ヒトインスリンを５３９ｇの冷却した１４ｍＭのＥＤＴＡに懸濁した。溶液を２から５℃まで冷却した。１５．６ｇの４ＭのＮａＯＨと２１．９ｇのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加し、デスＢ３０ヒトインスリンを溶解し、ｐＨを１２．７まで上げた。
４．１ｇの１５−［３−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−プロピルカルバモイル］ペンタデカノン酸を８２．１ｇの１０μｌの５％硫酸で安定化したＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン）に溶解した。
デスＢ３０ヒトインスリン溶液を攪拌し、１５−［３−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシカルボニル）−プロピルカルバモイル］ペンタデカン酸の溶液を低温を維持しながら２０分間かけて添加した。
１５−（３−カルボキシプロピルカルバモイル）ペンタデカン酸ベンジルエステルを添加した後、反応混合物を２．５重量のトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（２０ｍｍｏｌ／ｋｇ）、酢酸アンモニウム（３０ｍｍｏｌ／ｋｇ）、エタノール４２．５％ｗ／ｗ、残りの部分は精製水、ｐＨ７．０。
希釈後、攪拌し、温度を室温に上昇させながら、ゆっくりと１Ｍの酢酸を添加することにより、ｐＨを７．６に調節した。
ＨＰＬＣによる解析は、６８．１％のＬｙｓＢ２９（Ｎε−ヘキサデカンジオイル−γ−グルタミル）デス（Ｂ３０）ヒトインスリンの形成を示した。
【０１６７】
実施例２５：分析ＨＰＬＣ
１５０Ｘ４．６ｍｍのＩ．Ｄ．カラムを、約１００Åのポアサイズ及び約３．５μｍの粒子直径を有するオクチルジメチルシリル置換シリカで充填し、１）水性バッファー中のＮａＯＨでｐＨ５．９に調節した２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏと１００ｍｍｏｌのＮａ２ＳＯ４のバッファーと、２）２５％（ｗ／ｗ）のアセトニトリルを調製するための４２．８％ｗ／ｗのアセトニトリルを含むアセトニトリル溶媒からなる混合物を用いた１ｍｌ／分の流速で、４０℃において平衡化した。
解析する際、約２０分後にカラムからＬｙｓＢ２９（  Ｎε−ヘキサデカンジオイル−γ−グルタミル）デス（Ｂ３０）ヒトインスリンが生じた。解析する際、約６分後にカラムからデスＢ３０ヒトインスリンが生じた。
【０１６８】
実施例２６：１９−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸（代替名：エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）溶液相法の調製
ＬＣＭＳ法（ＬＣＭＳ）：
Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＺＱ質量分析計をＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＴ  ＨＰＬＣシステムからの溶出後のサンプルの質量を同定するために使用した。
溶離液：
Ａ：０．１％の水中トリフルオロ酢酸
Ｂ：０．１％のアセトニトリル中トリフルオロ酢酸
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４  ５０  Ｘ  ４．６０ｍｍ、ｉｄ：５μｍ
勾配：１．０ｍｌ／分において７．５分かけて１０％−９０％
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  ５μ  Ｃ４  ３００Å  ５０  ｘ  ４．６０ｍｍ
ＬＣ法：  １０−９０％Ｂ  １０分：  Ａ：０．１％  ＣＨ３ＣＮ  Ｂ：  ＣＨ３ＣＮ：
０−７．５分：１０−９０％Ｂ    
７．５−８．５分：９０−１０％Ｂ
８．５−９．５分１０％Ｂ  
流速：１ｍｌ／分
９．５−１０．００分１０％Ｂ
流速：０．１ｍｌ／分 
【０１６９】
エイコサン二酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル：
0005591243.tif 000028
エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５ｇ、１２．５４ｍｍｏｌ）及びＴＳＴＵ（４．５３ｇ、１５．０５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で混合し、ＤＩＰＥＡ（２．６２ｍＬ）を添加し、得た粗混合物を室温で２時間攪拌し、次いでＤＭＦ（３０ｍＬ）を添加し、得た透明溶液を更に終夜攪拌した。得た混合物を殆ど乾燥するまで濃縮し、残渣を冷アセトニトリルと混合し、沈殿物が沈殿させた。これを濾過して除き、終夜真空で濃縮し、６．０１ｇ（９７％）のイコサン二酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを得た。
質量（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：４４０（Ｍ−５６（ｔＢｕ））。
【０１７０】
（Ｓ）−２−（１９−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ）ペンタン二酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
0005591243.tif 000029
エイコサン二酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル  ２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル  エステル（６．０１ｇ、１２．１２４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１５０ｍＬ）に溶解し、Ｈ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ（２．７１ｇ、１３．３３ｍｍｏｌ）のスラリーと混合した。これから加熱して３時間室温で攪拌する透明の溶液となるゲル様の溶液が得られた。溶液を濃縮し、１００ｍＬの水を添加し、混合物を６０℃まで加熱し、冷却することで結晶化する溶液を得た。沈殿をアセトニトリルで再結晶化し、結晶を真空で乾燥した。収量６．８２ｇ（９６％）。
質量（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ５８４（Ｍ＋１）。
【０１７１】
（Ｓ）−２−（１９−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ）ペンタン二酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステル
0005591243.tif 000030
（Ｓ）−２−（１９−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルノナデカノイルアミノ）ペンタン二酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（６．５２ｇ、１１．１７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（２．１４ｍＬ）を添加した後、アセトニトリル（２５ｍＬ）中のＴＳＴＵ（３．７０ｇ、１２．２９ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。混合物を室温で終夜攪拌し、次いで濃縮し、アセトニトリルから再結晶化した褐色の残渣を得た。終夜５℃で冷却後、粉末が形成した。これをＴＨＦに溶解し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過して濃縮し６．１７ｇ（８１％）の標題の化合物を得た。
質量（エレクトロスプレー）：ｍ／ｚ：６８１（Ｍ＋１）。
【０１７２】
１９−｛（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−［２−（２−｛［２−（２−カルボキシメトキシエトキシ）エチルカルバモイル］メトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］プロピルカルバモイル｝ノナデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（代替名：ｔＢｕ−エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＨ）。
0005591243.tif 000031
エタノール（４０ｍｌ）中の２−（１９−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔオキシカルボニルノナデカノイルアミノ）ペンタン二酸１−ｔｅｒｔ−ブチルエステル  ５−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステル（２．５０ｇ）と［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］酢酸（代替名：  Ｈ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＨ）（１．４７ｇ）の溶液にＤＩＰＥＡ（１．２６ｍｌ）を添加した。混合物は、室温で終夜攪拌し、次いで真空で濃縮した。残渣に０．１ＮのＨＣｌ（１５０ｍｌ）と酢酸エチル（２００ｍｌ）を添加した。相を分離し、水相を酢酸エチル（１００ｍｌ）で抽出した。集めた有機相を水及び食塩水で洗浄し、乾燥し（硫酸マグネシウム）、真空で濃縮し、油を得、これを放置して結晶化した。収量９６％（３．１ｇ）。ＬＣＭＳ：理論質量：８７４．２。計測値：８７４．４９。
【０１７３】
１９−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（代替名：ｔＢｕ−エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）。
0005591243.tif 000032
アセトニトリル（５０ｍｌ）中の１９−｛（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔオキシカルボニル−３−［２−（２−｛［２−（２−カルボキシメトキシエトキシ）エチルカルバモイル］メトキシ｝エトキシ）エチルカルバモイル］プロピルカルバモイル｝ノナデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３．１ｇ）の溶液にＴＳＴＵ（１．３９ｇ）とＤＩＰＥＡ（０．９１ｍｌ）を添加した。混合物を室温で終夜攪拌し、次いで真空で濃縮した。残渣に０．１ＮのＨＣｌ（１００ｍｌ）水溶液と酢酸エチル（２００ｍｌを添加した。相を分離し、水相を酢酸エチル（５０ｍｌ）で抽出した。集めた有機相を水、食塩水で洗浄し、乾燥し（硫酸マグネシウム）、真空で濃縮して油を得た。収量９９％（３．４ｇ）。
ＬＣＭＳ：理論質量：９７１．２計測値：９７１．８。
【０１７４】
１９−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸（代替名：エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）
0005591243.tif 000033
１９−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）−エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３．４ｇ）をＴＦＡ（７５ｍｌ）中で４５分間攪拌し、真空で濃縮した。残渣をトルエンで３回共濃縮し、固体を得た。残渣を２−プロパノールで結晶化し、濾過して白色結晶の化合物を得た。収量８０％（２．４ｇ）。ＬＣＭＳ：理論質量：８５９．０３測定値：８５９．４４。
その代わりに、アシル化剤は国際公開第２００９／０２２００５号に記載の通り中間体１９−（（Ｓ）−１−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（代替名：ｔＢｕ−エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＨ）を調製した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとして活性化し、ＴＦＡ切断（上の最後の２工程）を行う固相法によって調製できる。
【０１７５】
実施例２７：試薬１９−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸（代替名：  エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）を用いたＡ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリンのアシル化
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（（Ｎ（ｅｐｓ）エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎ？エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリン）の調製
0005591243.tif 000034
１ｇ（０．１８ｍｍｏｌ）のＡ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ２７、デスＢ３０ヒトインスリンを炭酸ナトリウム水溶液（１００ｍＭ、３５ｍＬ）に溶解した。ｐＨを１ＮのＮａＯＨを用いて１０．２９から１０．４５に調整した。ＮＭＰ（３．３ｍＬ）に溶解した１９−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸（代替名：エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）（１９０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で５０分間攪拌した。水（５０ｍＬ）を添加し、ｐＨを１Ｎの塩酸で４．４に調整した。沈殿を遠心して単離し、上清をデカントした。
沈殿した生成物のＨＰＬＣ−ＭＳは、２６．９％が不変のインスリン、６１．７％がモノアシル化された所望の生成物（Ｂ２９−アシル化）及び１１％がジアシル化された生成物であることを示した。このＨＰＬＣ−ＭＳ法を用いたＡ１−モノアシル化生成物（Ｂ２９アシル化生成物の前に溶出）は存在しなかった。
沈殿は次いで１％のＴＦＡ、及びアセトニトリルを含む水に溶解し、ＲＰ  ＨＰＬＣ（カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｇｅｍｉｎｉ、５μ、Ｃ１８、１１０Ａ、２５０ｘ３０ｍｍ）で精製した。純粋な画分を集め凍結乾燥した。凍結乾燥した粉末を水に溶解し、ｐＨを０．１ＮのＮａＯＨを用いて８．０に調整した。凍結乾燥によって標題のインスリンを得た。
生成物のＨＰＬＣ−ＭＳは、１００％の純度で、モノアシル化された所望の生成物（Ｂ２９−アシル化）だけを示した。
【０１７６】
実施例２８：試薬１７−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ヘプタデカン酸（代替名：オクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）を用いたｐＨ１１．５及び室温におけるＡ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ３０ヒトインスリンのアシル化
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）の調製
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ３０ヒトインスリンを水に溶解し室温で濃度２０ｇ／ｌとした。固体のリン酸ナトリウムを添加し、濃度１５ｍＭとし、ｐＨをＮａＯＨで１１．５に調節した。アシル化剤（オクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）をＮＭＰに溶解し、濃度を０．２ｇ／ｍｌとし、攪拌しながらインスリン溶液に徐々に添加した。ｐＨは反応中ＮａＯＨを連続的に添加することによって１１．５に維持した。サンプルを回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって反応中解析した。結果を表２８．１に示す。
表２８．１：Ｂ２９ＭＡ及びＡ１ＭＡは、それぞれ、Ｂ２９Ｋ及びＡ１のＮ末端アミノ基の位置におけるモノアシル化の省略名である。
0005591243.tif 000035
【０１７７】
実施例２９：２℃、ｐＨ１１．２５；１１．５０及び１１．７５における試薬１７−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ヘプタデカン酸（代替名：オクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）を用いたＡ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ３０のアシル化
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）の調製
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ３０ヒトインスリンを水に溶解し３つの異なる実験で濃度を２０ｇ／ｌとし、ｐＨをＮａＯＨを用いてそれぞれ、１１．２５、１１．５０及び１１．７５とした。アシル化剤（オクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）をＮＭＰに溶解し、濃度を０．２ｇ／ｍｌとし、攪拌しながらインスリン溶液に徐々に添加した。ｐＨは反応中ＮａＯＨを連続的に添加することによってそれぞれのｐＨ値に維持した。サンプルを回収し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって反応中解析した。結果をそれぞれ２９．１、２９．２、及び２９．３に示す。
表２８．１：Ｂ２９ＭＡ及びＡ１ＭＡは、それぞれ、Ｂ２９Ｋ及びＡ１のＮ末端アミノ基の位置におけるモノアシル化の省略名である。
表２９．１：ｐＨ１１．２５アシル化
0005591243.tif 000036
表２９．２：ｐＨ１１．５０アシル化
0005591243.tif 000037
表２９．３：ｐＨ１１．７５アシル化
0005591243.tif 000038
【０１７８】
実施例３０：試薬１７−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ヘプタデカン酸（代替名：オクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）を用いたｐＨ１１．５及び室温におけるＡ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ３０ヒトインスリンのアシル化
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎεオクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）の調製
Ａ１４Ｅ、Ｂ１６Ｈ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ３０ヒトインスリンを水に溶解し、室温で濃度を２０ｇ／ｌとした。固体リン酸ナトリウムとＥＤＴＡをそれぞれ、１５ｍＭ及び４ｍＭの濃度で添加した。ｐＨはＮａＯＨで１１．５に調節した。アシル化試薬（オクタデカンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）をＮＭＰに溶解して濃度を０．２ｇ／ｍｌとし、攪拌しながらインスリン溶液に滴下して添加した。ｐＨは反応の間ＮａＯＨを連続的に添加することにより１１．５に維持した。サンプルを回収し、反応の間ＲＰ−ＨＰＬＣで解析した。結果を下の表３０．１に示す。
表３０．１：
0005591243.tif 000039
【０１７９】
実施例３１：試薬１９−（（Ｓ）−１−カルボキシ−３−｛２−［２−（｛２−［２−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルオキシカルボニルメトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝メトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル｝プロピルカルバモイル）ノナデカン酸（代替名：  エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ−ＯＳｕ）を用いたｐＨ１１．５及び室温におけるＡ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ３０ヒトインスリンのアシル化
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（（Ｎ  エイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−［２−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］アセチルアミノ｝エトキシ）エトキシ］アセチル））、デスＢ３０ヒトインスリン（代替名：Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｋ（Ｎエイコサンジオイル−ｇＧｌｕ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）、デスＢ３０ヒトインスリン）の調製
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、デスＢ３０ヒトインスリンを水に溶解し、室温で２０ｇ／ｌの濃度にした。固体リン酸ナトリウムとＥＤＴＡをそれぞれ、１５ｍＭ及び４ｍＭの濃度で添加した。ｐＨはＮａＯＨで１１．５に調節した。アシル化試薬（エイコサンジオイル−γＧＬＵ−ＯＥＧ−ＯＥＧ）をＮＭＰに溶解して濃度を０．２ｇ／ｍｌとし、攪拌しながらインスリン溶液に滴下して添加した。ｐＨは反応の間ＮａＯＨを連続的に添加することにより１１．５に維持した。サンプルを回収し、反応の間ＲＰ−ＨＰＬＣで解析した。結果を下の表３１．１に示す。
表３１．１：
0005591243.tif 000040
【図１】
0005591243.tif 000042