(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌの前立腺カリクレインを含有するＩ型アレルギーのin vitroの診断のための診断薬。
【請求項２】
前記カリクレインが、イヌより精製される、または遺伝子組換えにより作成されることを特徴とする、請求項１に記載の診断薬。
【請求項３】
前記カリクレインが配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の診断薬。
【請求項４】
イヌの前立腺カリクレインを、アレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製されたアレルゲン成分を包含する組成物に添加するステップを包含する、アレルゲン組成物を作成するための方法。
【請求項５】
イヌの前立腺カリクレインの添加より前において、前記アレルゲン抽出物および／または少なくとも１つの精製されたアレルゲン成分を包含する組成物がカリクレインを含有しないまたはカリクレイン含有量が低いことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記イヌの前立腺カリクレインが配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
Ｉ型アレルギーのin vitroでの検出を補助する方法であって、以下のステップ
−Ｉ型アレルギーを有するのではないかと疑われる患者由来の免疫グロブリンを含有する体液サンプルを、イヌの前立腺カリクレインと接触させる；そして
−前記イヌの前立腺カリクレインに特異的に結合するＩｇＥ抗体の、サンプル中の存在を検出する、
を包含し、
ここで前記イヌの前立腺カリクレインに特異的に結合するそのようなＩｇＥ抗体の存在がＩ型アレルギーの指標となる、前記方法。
【請求項８】
前記カリクレインが、イヌより精製される、または遺伝子組換えにより作成されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記カリクレインが配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
イヌの前立腺カリクレイン、またはその１０ｋＤａサブユニットまたは１８ｋＤａサブユニットを含有するＩ型アレルギーの免疫療法に使用される治療薬であって、そのような治療に感受性である哺乳類において使用され、前記哺乳類が、ヒトを含む霊長類、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ラットまたはマウスから成る群より選択される、治療薬。
【請求項１１】
イヌの尿由来の前立腺カリクレインの単離のための方法であって、以下のステップ
−イヌの尿を濾過する；
−疎水性相互作用クロマトグラフィーに適するバッファーでバッファー交換する；
−バッファー交換した尿サンプルを濾過する；
−バッファー交換した尿サンプルを、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムにかける；そして
−前立腺カリクレインを含む素通り分画を集める、
を包含する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアレルギーの分野に関する。より特定すれば本発明は哺乳類由来の新規アレルゲンの同定、ならびに哺乳類に対するアレルギーの診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
イヌの皮屑(フケ、dander)は、鼻炎、結膜炎、呼吸器の炎症、および喘息を含む症状を伴うインドアアレルギーの一般的な原因である。イヌのアレルゲンはイヌがペットとして飼育されている家だけでなく、他の場所、例えば普段はイヌのいない学校やデイケアセンターでもまた検出され得る（１）。
【０００３】
イヌに対するアレルギーは、イヌの体毛および皮屑から放出されるタンパク質に対する感作に伴い、それらに依存する。イヌへのアレルギーが疑われる場合、臨床試験としては、イヌの被毛および/または皮屑の抽出物を使用しての、皮刺試験または特異的ＩｇＥ抗体の測定による感作の評価を含む。特異的ＩｇＥに関する検査室のイムノアッセイ、例えばPhadia ImmunoCAPは、好ましいアッセイ条件、およびアレルゲンの付着に利用できる大きな固相により、天然のイヌ皮屑抽出物を使用して、イヌに対する感作のほとんどのケースを検出することができる。
【０００４】
イヌの体毛および皮屑の抽出物は、アレルギー性および非アレルギー性のタンパク質群という複雑さを含有する（２，３）。３つのイヌのアレルゲン：Ｃａｎ  ｆ１、Ｃａｎ  ｆ２およびＣａｎ  ｆ３がこれまでに同定され、詳細に研究されてきた。Ｃａｎ  ｆ１は、リポカインタンパク質ファミリーのメンバーであり、２１−２５ｋＤと報告された分子量を有し、de Groot ら（４）により最初に精製され、後にクローン化され、リコンビナントタンパク質として発現された（５）。Ｃａｎ  ｆ２は、同じタンパク質ファミリーに属するが、Ｃａｎ  ｆ１とは別個のタンパク質である（４，５）。イヌの血清アルブミンであるＣａｎ  ｆ３は、他の哺乳類のアルブミンとの広範な交差反応性を示す比較的保存されたタンパク質である（６）。
【０００５】
公知のイヌアレルゲンのうちでＣａｎ  ｆ１はもっとも重要であり、およそ半数のイヌアレルギー被験者由来のＩｇＥ抗体に結合する（７）。イヌアレルギー被験者の約２０％は、Ｃａｎ  ｆ２へのＩｇＥの結合を示すが、これらの大半はＣａｎ  ｆ１にも感作されている。成人のイヌアレルギーの個体の３０−４０％はＣａｎ  ｆ３に結合するＩｇＥを示すと思われる（２，８）が、哺乳類の血清アルブミンの特定の臨床的関連性は明らかにされていない。
【０００６】
げっ歯類、例えばマウスおよびラットへのアレルギーに関連する主要アレルゲンは、動物の尿中に存在することが長い間知られており、これらが単離され広く特徴づけられてきた（９−１３）。ＩｇＥ抗体結合活性もまた、ネコおよびイヌを含む他の動物の尿中に存在することが報告された（１４）が、これらの動物の尿からアレルゲンは精製されておらず、分子レベルで特徴づけられてもいない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】1.  Custovic A, Green R, Taggart SCO, Smith A, Pickering CAC, Chapman MD et al. Domestic allergens in public places II: dog (Can f 1) and cockroach (Bla g 2) allergens in dust and mite, cat, dog and cockroach allergens in the air in public buildings（公共の場所における家庭内アレルゲンＩＩ：粉塵中のイヌ（Ｃａｎ  ｆ１）．およびゴキブリ（Ｂｌａ  ｇ２）のアレルゲン、および公共建造物の空気中のダニ、ネコ、イヌおよびゴキブリのアレルゲン） Clinical & Experimental Allergy 1996;26:1246-1252.
【非特許文献２】2.  Spitzauer S, Schweiger C, Anrather J, Ebner C, Scheiner O, Kraft D et al. Characterisation of dog allergens by means of immunoblotting（免疫ブロット法の手段によるイヌアレルゲンの特徴付け）. International Archives of Allergy and Immunology 1993;100:60-67.
【非特許文献３】3.  Spitzauer S. Allergy to mammalian proteins: At the borderline between foreign and self（哺乳類タンパク質に対するアレルギー：外来と自己との間の境界線にて）? [Review]. International Archives of Allergy and Immunology 1999;120:259-269.
【非特許文献４】4.  de Groot H, Goei KGH, van Swieten P, Aalberse RC. Affinity purification of a major and a minor allergen from dog extract: serologic activity of affinity-purified Can f I and of Can f I-depleted extract（イヌ由来抽出物の主要なおよびマイナーのアレルゲンのアフィニティーによる精製：アフィニティーにより精製されたＣａｎ  ｆ１およびＣａｎ  ｆ１を枯渇させた抽出物の血清学的活性）. Journal of Allergy and Clinical Immunology 1991;87:1056-1065.
【非特許文献５】5.  Konieczny A, Morgenstern JP, Bizinkauskas CB, Lilley CH, Brauer AW, Bond JF et al. The major dog allergens, Can f 1 and Can f 2, are salivary lipocalin proteins: cloning and immunological characterization of the recombinant forms（主要イヌアレルゲン、Ｃａｎ  ｆ１およびＣａｎ  ｆ２は唾液リポカリンタンパク質である：リコンビナントの形のクローン化および免疫学的特徴付け）. Immunology 1997;92:577-586.
【非特許文献６】6.  Boutin Y, Hebert H, Vrancken ER, Mourad W. Allergenicity and cross-reactivity of cat and dog allergenic extracts（ネコおよびイヌのアレルゲン抽出物のアレルゲン性および交差反応性）. Clinical Allergy 1988;18:287-293.
【非特許文献７】7.  Saarelainen S, Taivainen A, Rytkonen-Nissinen M, Auriola S, Immonen A, Mantyjarvi R et al. Assessment of recombinant dog allergens Can f 1 and Can f 2 for the diagnosis of dog allergy（イヌアレルギーの診断のためのリコンビナントイヌアレルゲンＣａｎ  ｆ１およびＣａｎ  ｆ２の評価）. Clinical & Experimental Allergy 2004;34:1576-1582.
【非特許文献８】8.  Cabanas R, Lopez-Serrano MC, Carreira J, Ventas P, Polo F, Caballero MT et al. Importance of albumin in cross-reactivity among cat, dog and horse allergens（ネコ、イヌおよびウマのアレルゲン間の交差反応性におけるアルブミンの重要性）. Journal of Investigational Allergology & Clinical Immunology 2000;10:71-77.
【非特許文献９】9.  Bayard C, Holmquist L, Vesterberg O. Purification and identification of allergenic alpha (2u)-globulin species of rat urine（ラット尿のアレルゲン性α（２ｕ）−グロブリン種の精製および同定）. Biochim Biophys Acta 1996;1290:129-134.
【非特許文献１０】10.  Ohman JL. Allergy in man caused by exposure to mammals（哺乳類への暴露によって起こるヒトのアレルギー）. J Am Vet Med Assoc 1978;172:1403-1406.
【非特許文献１１】11.  Schumacher MJ. Characterization of allergens from urine and pelts of laboratory mice（実験用マウスの尿および生皮由来のアレルゲンの特徴付け）. Mol Immunol 1980;17:1087-1095.
【非特許文献１２】12.  Siraganian RP, Sandberg AL. Characterization of mouse allergens（マウスアレルゲンの特徴付け）. Journal of Allergy and Clinical Immunology 1979;63:435-442.
【非特許文献１３】13.Taylor AN, Longbottom JL, Pepys J. Respiratory allergy to urine proteins of rats and mice（ラットおよびマウスの尿タンパク質に対する呼吸器アレルギー）. Lancet 1977;2:847-849.
【非特許文献１４】14.  Hoffman DR. Dog and cat allergens: urinary proteins or dander proteins ?（イヌおよびネコのアレルゲン：尿のタンパク質または皮屑のタンパク質？） Annals of Allergy 1980;45:205-206.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上に述べたように、特異的ＩｇＥに関する検査室のイムノアッセイは、好ましいアッセイ条件およびアレルゲンの付着に利用できる大きな固相による、天然のイヌ皮屑抽出物を使用して、ほとんどのケースのイヌに対する感作を検出することができる。しかしながら小型化したまたは非検査室のイムノアッセイ、例えばアレルゲンマイクロアレイまたは開業医院での検査においては、より好ましくないアッセイ条件、抗体結合アレルゲン試薬としてのより低い能力、および限定された効力の天然アレルゲン抽出物といったこと組み合わせから、十分な診断感受性を得られないことが見出されている。同様な状況は、他の動物の上皮への特異的ＩｇＥに関するイムノアッセイについても存在すると思われる。したがってケースによっては、特異的ＩｇＥに関する診断検査において十分な感受性を達成するための純粋なアレルゲン性タンパク質を使用する必要がある。
【０００９】
さらに有意な比率のイヌアレルギーの個体はまた、公知の同定されたイヌアレルゲンのいずれとも反応せず、このことが最近フィンランドの集団において実証された（７）。
【００１０】
上のことから本発明者らは、さらなる、まだ同定されていないイヌアレルゲンを探すこととした。そのような新規アレルゲンは、既定の診断検査における増大された感受性としての試薬としてだけでなく、異なるタイプの成分毎に分解した(component-resolved)診断の適用における公知のイヌアレルゲンに対する補体としてもまた有用であると思われる（１５，１６）。改善された非アナフィラキシー特性をもつ純粋なアレルゲン性タンパク質、またはそのフラグメントおよびバリアントもまた、成分毎に分解した免疫療法において使用してもよい（１６−２０）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
このように新規主要アレルゲンが、イヌ尿から精製され、前立腺カリクレインとして同定された。このアレルゲンはすべての側面において、従来より知られているイヌアレルゲンとは区別される。さらに、類似または同一の、そして免疫学的に均等なアレルゲンが、イヌ皮屑の抽出物中に存在することが見出された。カリクレインは、公知のイヌアレルゲンの一覧への重要な追加となることを意味し、イヌアアレルギーの診断においても有用となるだろう。他の哺乳類、例えばネコ、ウマ、ならびにラットおよびマウスを含むげっ歯類由来の相同なタンパク質が、同様のアレルゲン特性を有し、診断上の有用性を持つことも予想される。
【００１２】
前立腺カリクレインは、イヌの尿中だけでなく皮屑の被毛中にも存在することが見出された。しかしながら、前立腺組織内に特異的に発現されるタンパク質は、オスの個体に限定されるであろうという事実は、メスイヌはこのアレルゲンを持たないであろうことを示唆する。われわれの研究室における予備的な結果は実際にこの考えを支持しており、より広範な研究の結果によって実証されれば、前立腺カリクレインのみに感作されたイヌアレルギーの個体は、メスイヌには耐容性があってよいことを意味することになるだろう。
【００１３】
最近発表された報告の中で、射精への膣の過敏症反応は、精漿中に存在するヒト前立腺特異抗原であるＰＳＡに対するＩｇＥの感作に関連することが実証された（２１）。イヌおよびヒトの前立腺カリクレイン、ならびにヒト前立腺特異抗原は部分的な配列類似性を有するため、イヌの前立腺特異的カリクレインへの感作が、そのようなアレルギー反応を発症する高められたリスクを与える可能性がある。前立腺特異的カリクレインに対するＩｇＥを介した免疫反応が、ヒトの不妊症のある種のケースにおいて一役を担っているかもしれないこともまた、想定され得る。
【００１４】
１つの側面において本発明は、Ｉ型アレルギーの診断におけるカリクレインの使用、およびＩ型アレルギーの診断のための組成物の製造のためのカリクレインの使用に関する。
【００１５】
さらなる側面において本発明は、カリクレインを“加えた”アレルゲン組成物に関する。そのようなアレルゲン組成物は、カリクレインを含有しないまたは低量含有する、アレルゲン抽出物、または精製されたもしくはリコンビナントのアレルゲン成分の混合物であってよく、その場合カリクレインは、患者のＩｇＥが組成物中の他のアレルゲン成分には結合しないまたはほとんど結合しない、患者由来のＩｇＥに結合させるために添加される。本発明のこの側面はまた、そのような組成物を作成するための方法にも関し、その方法は、アレルゲン組成物、例えばアレルゲン抽出物（所望により他の成分を加えたもの）または精製されたネイティブのまたはリコンビナントのアレルゲン成分の混合物に、カリクレインを添加するステップを包含する。
【００１６】
なおさらなる側面において本発明は、患者のＩ型アレルギーを診断するためのin vitroの診断法に関し、その場合患者由来の体液サンプル、例えば血液サンプルまたは血清サンプルを、カリクレインまたは先の側面に従っての組成物に接触させるようにし、患者のサンプルが、カリクレインに特異的に結合するＩｇＥ抗体を含有するか否かを検出する。そのような診断法は、当該技術において公知のあらゆる様式で実行してよい。カリクレインは、例えば従来の検査室の免疫アッセイ、マイクロアレイ、またはラテラルフローアッセイにおいて、例えば固相支持体上に固定化してよい。
【００１７】
さらなる側面において本発明は、先の側面に従っての方法を実施するための診断用キットに関し、そのキットはカリクレインを含む。
【００１８】
上述の側面において、野生型カリクレイン分子は、以下に定義するように野生型カリクレインと抗体に関するエピトープを共有する、天然または人工のカリクレインのフラグメントまたはバリアントで置き換えてよい。
【００１９】
本発明はさらに、以下に説明するように、カリクレインまたは修飾された（変異した）カリクレインをＩ型アレルギーの治療を必要とする患者に投与することを包含する、そのような治療の方法に関する。本発明の側面はまた、例えば成分毎に分解した免疫療法（１６）を含むそのような免疫療法におけるカリクレインの使用に関する。この側面の１つの態様において、カリクレインは天然の形で、または天然の分子の生物学的および免疫学的特性に類似した特性を示すリコンビナントの形で使用してよい。もう１つの態様においてカリクレインは、修飾された形で、すなわちそのＩｇＥ抗体との結合能力を抑止または減弱する目的で化学的または遺伝学的に作成された形で使用してよいが、同時にその形は、好ましくは治療する個体においてＩｇＧ応答を誘発する能力を持つものとする。修飾の例として、分子のフラグメント化、切断またはタンデム化、内部のセグメント（１つまたは複数）の欠失、アミノ酸残基（１つまたは複数）の置換、ドメインの再配置、あるいは別の高分子構造へのジスルフィド架橋もしくはジスルフィド結合の破壊による、またはカルシウムイオンもしくはその他の低分子化合物に結合するタンパク質の能力の除去による、少なくとも部分的な三次元構造の破壊を含むが、これに限定されない。本側面のなおもう１つの態様において、本来の分子と比較して低減されたＩｇＥ結合活性を示す、カリクレインの個々の１０ｋＤａおよび/または１８ｋＤａのサブユニットを、修飾されたカリクレインとして使用してよい。
【００２０】
本発明の上述の側面すべてにおいて、カリクレインは、患者におけるアレルギー反応を誘発する能力のあるカリクレインを産生するあらゆる哺乳類に由来することができる。カリクレインはその天然の原料、例えば問題になっている哺乳類の尿、唾液もしくはその他の体液から、または組織、例えば体毛または皮屑から精製してよい。カリクレインはまた、リコンビナントＤＮＡ技術により生成してもよいし、または当業者に公知の方法により化学的に合成してもよい。
【００２１】
本発明はまた、診断および治療、例えばイヌに対するＩ型アレルギーの診断および治療において使用するための、イヌ前立腺カリクレインに関する。
【００２２】
本発明はまた、哺乳類の尿由来のカリクレインの精製のための方法に関し、以下の
−哺乳類の尿を濾過する；
−疎水性相互作用クロマトグラフィーに適するバッファーでバッファー交換する；
−バッファー交換した尿サンプルを濾過する；
−バッファー交換した尿サンプルを、疎水性相互作用クロマトグラフィーのカラムにかける；そして
−カリクレインを包含する素通り分画(flow through fraction)を集める、
というステップを包含する。
【００２３】
哺乳類の尿は、イヌの尿であってよい。
【００２４】
〔定義〕
カリクレインは、正常な血液および尿中に見出されるセリンエンドペプチダーゼファミリーのタンパク質分解酵素である。ＩＵＢＭＢ酵素ラベル法システムにおいて、血漿カリクレインは酵素番号ＥＣ３．４．２１．３４、および組織カリクレインは酵素番号ＥＣ３．４．２１．３５と指定されている。イヌ由来の尿カリクレインは、各々およそ１０±２および１８±２ｋＤａの２つのサブユニットを包含する２８ｋＤａヘテロダイマータンパク質であるが、本発明の目的のためこれらを各々１０および１８ｋＤａのサブユニットと呼ぶ。カリクレインは、配列番号１、GenBankアクセション番号：Ｐ０９５８２に従ってのアミノ酸配列を有し、ウマ、ウシ、ブタ、マウス、ラットおよび霊長類を含む広範囲の哺乳類の種において、相同のタンパク質が記載されている（例えばアクセション番号ＡＡＱ２３７１３−４(ウマ)、ＮＰ＿００１００８４１６(ウシ)、Ｐ００７５２(ブタ)、Ｐ００７５５−６およびＰ１５９４７(マウス)、Ｐ３６３７３およびＰ００７５８(ラット)、Ｑ２８７７３(ヒヒ)、ＸＰ＿００１１７４０２６(チンパンジー)、Ｑ０７２７６(マカク)、Ｐ２０１５１、Ｑ０７２７６およびＡＡＭ１１８７４(ヒト)）。
【００２５】
カリクレインのバリアントおよびフラグメントは、少なくとも１０アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５０、さらにより好ましくは少なくとも７５または１００アミノ酸残基、そして少なくとも５０％、好ましくは６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％を越える前記カリクレインとの配列同一性を有するタンパク質またはペプチドを意味するものと解釈されなければならない。
【００２６】
修飾されたカリクレインは本発明の文脈において、例えば本発明の免疫療法の側面に関して上に例示したように、化学的または遺伝学的に修飾されて、その免疫学的特性を変化させたカリクレインを意味するものと解釈されなければならない。
【００２７】
野生型カリクレインと抗体に関するエピトープを共有するカリクレインのバリアントおよびフラグメントは、代表的なカリクレインで感作された患者由来の血清サンプル由来のＩｇＥ抗体との結合が、カリクレインにより有意に阻害され得る、それらのフラグメントおよびバリアンドであると解釈されなければならない。そのような阻害アッセイは、例えば実施例８に開示したプロトコルに従って行ってよい。
【００２８】
低アレルゲン化修飾されたカリクレイン、またはカリクレインのバリアントもしくはフラグメントは、例えば実施例３に従ってのプロトコルにより決定されるような、代表的なカリクレインに感作された患者の血清サンプル由来のカリクレイン反応性ＩｇＥ抗体と結合する能力のない、または細胞の活性化アッセイ、例えば好塩基球のヒスタミン放出アッセイ（２２，２３）により決定されるような、生物学的アレルゲン活性を示さない、もしくは有意に低減された活性を示す、修飾されたカリクレインまたはカリクレインのバリアントもしくはフラグメントと解釈されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、サイズ排除クロマトグラフィーによるイヌ尿のタンパク質の分画を示す。図に示した３つの各ピーク（１−３とした）を包含する分画を、ＩｇＥ結合活性の分析のため示したようにプールした。
【図２】図２は、図１のピーク２由来のＩｇＥ結合タンパク質の、逆相クロマトグラフィーによる精製を示す。さらなる研究のために選択されたタンパク質を含有するピークを、矢印で示す。
【図３】図３は、サイズ排除クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーによりイヌ尿より精製された、ＩｇＥ結合タンパク質の還元(red)および非還元(ox)サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。Ｍ列は、分子量マーカータンパク質を含有する。
【図４】図４は、固定化したイヌ皮屑抽出物への特異的ＩｇＥ結合における、液相での阻害物質としてのカリクレインの効果を示す。
【図５ａ】図５ａ−ｂは、３７名のイヌアレルギー被験者の血清における、イヌ皮屑抽出物へのＩｇＥ抗体反応性の免疫ブロット分析による評価である。短冊形の膜を用いてのインキュベーション前に、血清サンプルを示したように希釈した。Ｍ列は分子量マーカータンパク質を含有する。
【図５ｂ】同上。
【図６】図６は、血清の希釈について補正した２８ｋＤａバンドの免疫ブロットシグナル強度、および実験レベルでのImmunoCAP分析により決定した場合のカリクレイン特異的ＩｇＥのレベルの比較を示す。ImmunoCAPおよび免疫ブロットの適用した検出限界を、破線で示す。免疫ブロットのシグナル強度は、任意のユニット（ＡＵ）で表示する。
【図７】図７は、精製されたイヌ尿カリクレインによる２８ｋＤａタンパク質バンドの特異的な免疫ブロットの阻害を示す。Ｍ列は分子量マーカータンパク質を含有する。
【図８】図８は、サイズ排除クロマトグラフィーによる、イヌ皮屑由来カリクレインの精製の最初のステップを示す。図に示した６つの分画（１−６とした）を、ＩｇＥ結合活性について分析した。
【図９】図９は、逆相クロマトグラフィーによる、イヌ皮屑由来カリクレインの精製の第２のステップを示す。図に示した３つのピーク（１−３とした）の先端の分画を、ＩｇＥ結合活性について分析した。
【図１０】図１０は、イヌ皮屑抽出物、精製された尿カリクレイン、および部分的に精製されたイヌ皮屑由来カリクレインに結合する、特異的ＩｇＥ抗体の免疫ブロット比較分析を示す。カリクレイン反応性の２つの血清（Ｎｏ．６および８）ならびにカリクレイン非反応性の１つの血清（Ｎｏ．１１）を使用した。図中の説明文に示したように、還元および非還元の双方の形のアレルゲン調製物質について分析した。Ｍ列は、分子量マーカータンパク質を含有する。
【図１１】図１１は、精製されたリコンビナントイヌ尿カリクレインのＳＤＳ  Ｐａｇｅ分析を示す。
【図１２】図１２は、精製されたリコンビナントイヌ尿カリクレインの分析的ゲル濾過分析を示す。
【図１３】図１３は、天然およびリコンビナントのイヌ尿カリクレインの特異的ＩｇＥ抗体結合活性の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下の実施例は、イヌ由来カリクレインの単離および使用をもって本発明を説明する。実施例は単なる説明に過ぎず、本発明を限定するものとして考慮すべきではなく、本発明は付記した請求項の範囲により定義される。
【実施例】
【００３１】
実施例１：イヌ尿由来ＩｇＥ結合タンパク質の検出および単離
イヌの尿がヒトのイヌアレルギーに関するアレルゲンを含有する可能性があるかどうかを調べるため、以下の実験を行った。尿は、７歳オスのシベリアンハスキーおよびポインター間交雑種より集めた。０．４５μｍセルロース混合エステル製フィルターを通しての濾過の後、１０ｍＬの尿を、２０ｍＭ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．６、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ＭＢＳ）で平衡化したSuperdex７５サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（ＸＫ２６／１００、Ｖｔ＝５０５ｍＬ、GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)にのせ、同じバッファーで２ｍＬ/分の流速で溶出を行った。３つのピークの分画を、図１に示したクロマトグラムに示したようにプールし、アレルゲン活性について分析した。各分画のタンパク質含有物を、ImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)固相上に固定化し、そのＩｇＥ抗体結合活性を、イヌ皮屑により感作された個体由来の８血清を使用して検査した。これらの血清のほとんどはイヌ皮屑抽出物への高いＩｇＥ結合を有するが、ｒＣａｎ  ｆ１、ｒＣａｎ  ｆ２およびｎＣａｎ  ｆ３に対しては相対的に低い結合を有するものとして選択した。検査した３つのピークの内ピーク２は、圧倒的に最も高レベルのＩｇＥ結合活性を含有することが見出された（表１）。ピーク２の還元サンプルの、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＥＳバッファー系(１０％  ＮｕＰＡＧＥゲル、Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いてのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、各々およそ１０および１８ｋＤａの明確な分子量を有する２つの際立ったタンパク質のバンドを明らかにした（示していない）。
【００３２】
ピーク２に対応するプールからのさらなるタンパク質の精製を、Source１５逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）カラム (ＳＴ４．６／１００、Ｖｔ＝１．６６  ｍＬ、GE Healthcare Biosciences)を使用して行った。最終濃度０．０６５％までトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えた後、プール液をカラムにのせ、続いてカラム容積の９倍量の水中０．０６５％ＴＦＡで洗浄した。溶出は、０．０５％ＴＦＡを含有する水中アセトニトリルの０−４５％直線勾配にて行い、１つの特徴的な、しかし多少非対称なピーク（図２、ピークを矢印で示す）を得た。このピークを含有する分画の還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、一見したところ分離されていない１０および１８ｋＤａの双方のバンドの存在を明らかにした（図３）。それ故ピーク全体をカバーする分画を、図２の水平線で示したようにプールした。このプールの非還元サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、２８ｋＤａのさらなるバンド、そして１０ｋＤａおよび１８ｋＤａのバンドの移動度のわずかなシフトを明らかにした（図３）。およそ５５ｋＤａのタンパク質の薄いバンドもまた、非還元状態で見られるが、これは２８ｋＤａのダイマーであると思われる。非還元状態での２８ｋＤａバンドの出現は、このタンパク質が１つまたはそれより多くのシステイン架橋により共に結合した、１０および１８ｋＤａのポリペプチドから構成されると思われることを示唆した。後の線形質量分析（データは示していない）が、還元時およびアルキル化時の２８ｋＤａの成分の解離を示したという事実は、この考えにさらなるエビデンスを加えることとなった。
【００３３】
実施例２：イヌ尿由来ＩｇＥ結合タンパク質の、前立腺カリクレインとしての同定
質量分析およびＮ末端配列決定を使用して、イヌ尿より単離したＩｇＥ結合タンパク質の同定を決定した。
【００３４】
〔ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるペプチドマスフィンガープリント法〕
ＲＰＣにより精製した尿タンパク質の溶液内消化のため、サンプルにＤＴＴおよびヨードアセトアミドを各々およそ４５倍および１００倍モル過剰濃度で順次加えることにより、還元およびアルキル化を行った。その後トリプシン消化を、ブタトリプシン（Trypsin Gold、質量分析計グレード、Promega, Madison, WI, USA）を使用して、一晩、３７℃で行った。消化したペプチドを含有するサンプルをＭＡＬＤＩ標的プレート上にスポットし、５０％アセトニトリル、１０ｍＭ  ＮＨ４［Ｈ２ＰＯ４］、０．１％  ＴＦＡ中のα−シアノマトリクスを加えた。溶媒を蒸発させた後、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）をBruker Daltonics Autoflex 2 装置(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)にて行った。得られたＰＭＦの結果とマッチするタンパク質を同定するため、ＭＳＤＢデータベースからMascot サーバー(Matrixscience, London, UK)を使用して検索した。ポストソース分解（Post source decay (PSD)）分析を、選択されたペプチドについて行った。ペプチドキャリブレーションスタンダード(Bruker Daltonics)を使用して外部較正を行った。
【００３５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる個々のタンパク質のバンドのゲル内消化分析は、本質的にはShevchenko（２４）に従って行った。まとめると、上の実施例１に記載した１０、１８、および２８ｋＤａのバンドを、クマシーブリリアントブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出した。ゲル小片を、５０％アセトニトリルを含有する５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウムで順次洗浄し、続いて純粋なアセトニトリル中で収縮させた。５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウムによるゲル小片の再水和の後、アセトニトリルを５０％まで加え、続いて２回目のアセトニトリル洗浄のステップを行い、ゲル小片を真空遠心にて乾燥させた。５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の４５ｍＭ  ＤＴＴおよび１００ｍＭ  ヨードアセトアミドを順に使用して、還元およびアルキル化を行った。５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の５０％アセトニトリルを用いて繰り返し洗浄し、最終的に１００％アセトニトリルで洗浄した後、ゲル粒子を真空遠心にて再度乾燥させた。トリプシン消化を、上に記載したブようにブタトリプシンを使用して、一晩、３７℃で行った。その後消化したサンプルを超音波処理し、０．１％ＴＦＡを含有する５０％アセトニトリル中で、ゲル粒子からペプチドを抽出した。サンプルの調製およびペプチドマスフィンガープリンティングを、上に記載したように行った。
【００３６】
溶液内消化した尿タンパク質のＰＭＦ分析は、イヌ由来前立腺カリクレイン（アクセション番号Ｐ０９５８２）と非常に有意にマッチする（ｐ＜０．０５）という結果を得た。１８ｋＤａバンドのゲル内消化分析においても存在した、ｍ/ｚ＝１２２４．６およびｍ/ｚ＝１６３２．８の２つのペプチドのＰＳＤ分析は、同じタンパク質のデータべースエントリーの各々１９４−２０４残基および１１７−１３０残基に対応する、アミノ酸配列ＦＭＬＣＡＧＶＬＥＧＫおよびＳＨＤＬＭＬＬＨＬＥＥＰＡＫとの有意なデータべースのマッチを得た。
【００３７】
ゲル内消化したタンパク質のバンドの分析から、２８ｋＤａバンドのＰＭＦもまた、イヌ由来カリクレイン（Ｐ０９５８２）との非常に有意なデータベースのマッチ（ｐ＜０．０５）を得たとの、確証する結果が得られた。単離した尿タンパク質のアイデンティティーへのさらなるエビデンスが、１０ｋＤａバンドのケル内消化サンプルの分析から得られ、ペプチドｍ/ｚ＝１００４．５のＰＳＤ分析は、Ｐ０９５８２の９５−１０２残基に対応するアミノ酸配列ＳＦＩＨＰＬＹＫとの非常に有意な（ｐ＜０．０５）データベースのマッチを得た。
【００３８】
〔Ｎ末端アミノ酸配列決定〕
Ｎ末端配列決定のため、還元された１０ｋＤａおよび１８ｋＤａのタンパク質バンドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルより別々に切り出し、均一にするためにプラスチック棒を使用して、６Ｍ  グアにジニウム−ＨＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ中に抽出した。抽出された１０ｋＤａおよび１８ｋＤａバンドのＮ末端配列分析は、Hewlett-Packard Ｇ１０００Ａ装置(Hewlett-Packard, Palo Alto, CA)を使用して行い、各々アミノ酸配列ＩＩＧＧＲＥＸＬＫＮおよびＡＶＩＲＰＧＥＤＲＳを得たが、この配列は、アクセション番号Ｐ０９５８２のイヌ前立腺カリクレイン前駆体の配列の２５−３４残基および１０８−１１７残基にマッチすることが見出された。
【００３９】
まとめると、本実施例に記載した結果は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析における１０および１８ｋＤａのバンドに対応する、精製されたイヌ尿タンパク質の主要な構成物が、イヌ由来前立腺カリクレインと同一であることを実証した。さらにこの観察結果は、１０および１８ｋＤａのポリペプチドが一次遺伝子産生物の翻訳後開裂により形成され、ジスルフィド架橋により合わせてまとめられて、ヒトカリクレインについて従来より記載されてきたタンパク質（２５）に類似する、非還元条件下で見られた２８ｋＤａタンパク質を形成することを示唆した。
【００４０】
前立腺カリクレインはまた、アルギニンエステラーゼとしても知られており、ＮＰ＿００１００３２８４、ＣＡＡ６８７２０およびＡＡＡ３０８３１を含む同一またはほぼ同一のアミノ酸配列を記載する、データベースエントリー内での表記を持つ。さらに我々は、腎臓、膵臓および唾液腺の組織内で発現されるカリクレインのもう１つのバリアントが、イヌにおいて同定されており（アクセション番号ＣＡＡ５３２１０）、前立腺カリクレインと６８％のアミノ酸の同一性を共有することに注目している。
【００４１】
実施例３：カリクレイン、ｒＣａｎ  ｆ１、ｒＣａｎ  ｆ２およびｎＣａｎ  ｆ３のＩｇＥ結合活性の評価
精製されたリコンビナントまたは天然のイヌアレルゲンのin vitroＩｇＥ結合活性を、アトピー性アレルギーの臨床診断における特異的ＩｇＥ抗体の測定用に使用されるイムノアッセイシステムであるImmunoCAP（登録商標）(Phadia, Uppsala, Sweden)を使用して調べた。リコンビナントのＣａｎ  ｆ１およびＣａｎ  ｆ２（５）は、本質的には記載されている（２６）ように、大腸菌内でクローン化し、発現させた。イヌアルブミンは、本質的には記載されている（２７）ように、陰イオン交換クロマトグラフィーグラフィーおよびBlue Sepharoseアフィニティークロマトグラフィーを使用して、血清より精製した。実験レベルでのImmunoCAP検査は、記載されている（２６）ように血清分析用に調製し、使用した。
【００４２】
スウェーデン（ｎ＝９）、スペイン（ｎ＝２３）、北米（ｎ＝４）からのイヌアレルギー患者３７名由来の血清を、試験に使用した。すべての患者は、イヌ皮屑抽出物に関する皮刺検査陽性、ならびに喘息、鼻結膜炎および/または蕁麻疹の症状を伴うイヌアレルギーとの医師の診断を有した。血清はすべて、イヌ皮屑抽出物に対する特異的ＩｇＥ検査（ImmunoCAP）陽性であった。
【００４３】
イヌ皮屑抽出物、ｒＣａｎ  ｆ１、ｒＣａｎ  ｆ２、ｎＣａｎ  ｆ３、および精製カリクレインに対する特異的ＩｇＥのレベルを表２に示し、結果のまとめを表３に示す。検査した血清のうち２９血清はカリクレインに対するＩｇＥ反応性を示し、１８血清はｒＣａｎ  ｆ１に対する反応性を示した。ｒＣａｎ  ｆ２およびｎＣａｎ  ｆ３双方については、３７血清中各々わずか８および６血清のみがＩｇＥと結合するにとどまり、試験を行った被験者のなかではマイナーのアレルゲンのようである。３７血清のうち１４血清（３８％）はカリクレインのみに反応した。カリクレイン反応性の血清の平均において、カリクレインへのＩｇＥ結合のレベルは、イヌ皮屑へのＩｇＥ結合の６４％に達する。ｒＣａｎ  ｆ１、ｒＣａｎ  ｆ２、およびｎＣａｎ  ｆ３への対応するＩｇＥ結合の相対レベルは、それらのアレルゲンに対して特異的に反応する血清の中で、各々４５％、２５％および４７％であった。検査した３７血清の内わずか２血清のみが、４つのイヌアレルゲンすべてに対してＩｇＥ反応性を示さなかった。カリクレインに対するＩｇＥ結合は、他のイヌアレルゲンのいずれとも相関を示さず、カリクレインへの免疫反応が独立した変数であり、ｒＣａｎ  ｆ１、ｒＣａｎ  ｆ２、またはｎＣａｎ  ｆ３への交差反応性の結果ではないことを実証した。
【００４４】
得られた結果は、イヌ由来前立腺カリクレインが、本明細書で試験したイヌアレルギー被験者の中で、主要かつ特有なアレルゲンであることを明確に実証した。ＩｇＥ結合の有病率および強度の双方により、被験者の３分の１以上はカリクレインに反応したが、検査した他のアレルゲンのいずれとも反応せず、カリクレインが、これまで記載してきた、そして試験を行った被験者の中で最も重要なイヌアレルゲンであることが見出された。
【００４５】
実施例４：イヌ皮屑抽出物におけるカリクレイン特異的ＩｇＥ抗体結合活性の実証
ＩｇＥ阻害実験を行い、イヌ皮屑が、カリクレイン反応性ＩｇＥ抗体に結合する能力のあるエピトープを含有するかどうかを調べた。イヌに感作されている３名の被験者（Ａ−Ｃ）由来の、カリクレインへのＩｇＥ反応性を有する血清サンプルを、最初に、最終濃度１００μｇ/ｍＬの精製されたカリクレインと共に、そして並行してネガティブコントロールとして血清希釈液または大腸菌の非アレルギー性マルトース結合プロテイン（ＭＢＰ）と共に、室温で２時間インキュベーションした。次にすべてのサンプルを、固定化したイヌ皮屑抽出物を保有するImmunoCAP検査へのＩｇＥの結合についてダブルで分析し、カリクレインとのプレインキュベーションが固相に付着させた皮屑タンパク質へのＩｇＥの結合を特異的に妨げるかことになるどうかを研究した。阻害物質としてのカリクレインの特異性に関するコントロールとして、Ｃａｎ  ｆ１およびＣａｎ  ｆ２に感作されているが、カリクレインには感作されていない被験者（Ｄ）由来の血清を、実験において他の血清と平行して含めた。
【００４６】
阻害実験の結果を図４に示す。イヌ尿より精製されたカリクレインは、３つのカリクレイン反応性血清のうちの２つ（ＡおよびＢ）の、イヌ皮屑へのＩｇＥ結合を完全に阻害し、そして他のイヌアレルゲンにも反応性があることが分かっている３番目の血清（Ｃ）の結合を、部分的に阻害することが見出された。ネガティブコントロールタンパク質であるＭＢＰは、血清希釈液と比較して有意な阻害効果は示さなかった。加えてＣａｎ  ｆ１−およびＣａｎ  ｆ２−反応性の血清（Ｄ）のＩｇＥ結合においては、カリクレインによる阻害は観察されなかった。
【００４７】
結果は、カリクレイン反応性ＩｇＥ抗体に結合する能力のあるエピトープ構造が、イヌ皮屑中に存在し、故に尿に限定されないことを実証した。
【００４８】
実施例５：免疫ブロット分析を使用してのイヌ皮屑抽出物由来カリクレイン様２８ｋＤａタンパク質へのＩｇＥの結合の評価
観察されたカリクレイン様アレルゲン活性が起因すると思われるイヌ皮屑中に存在するタンパク質を同定する目的で、公知のレベルのカリクレイン反応性ＩｇＥを有する３７血清を、免疫ブロット実験において使用した。免疫ブロット分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１２．５％ Excel 2-D gel, GE Healthcare Biosciences)により分離した非還元イヌ皮屑抽出物において行い、ニトロセルロース膜(Hybond ECL, GE Healthcare Biosciences)上に電気的にブロッティングした。タンパク質のブロットは、ブロッキングバッファー（５０ｍＭ  リン酸塩  ｐＨ７．４、０．１％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、０．９％（ｗ/ｖ）ＮａＣｌ、０．３％（ｗ/ｖ）デキストランＴ１０）を使用して、室温で１時間ブロックした後、ブロッキングバッファー中で１．５倍から２０倍希釈した各患者の血清と共に、一晩インキュベーションした。各血清の希釈倍数は、図５の対応する短冊状の膜の上端の括弧内に表示する。膜は、０．５％（ｖ/ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むブロッキングバッファー中で洗浄した後、ブロッキングバッファー中で１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体と共に、室温で４時間インキュベーションし、その後ストレージホスファスクリーン(storage phosphor screen)およびVariable Mode Imager, Typhoon 9410 (GE Healthcare Biosciences)を使用して、Ｘ線撮影により検出した。
【００４９】
実験の結果を図５ａ−ｂに示す。使用した３７血清のうち、３０血清は２８ｋＤａタンパク質へのＩｇＥ結合を示し、一方２１血清は、Ｃａｎ  ｆ１および/またはおそらくＣａｎ  ｆ２に対応する２３ｋＤａバンドへのＩｇＥの結合を示した。免疫ブロット法のシグナル強度は、Phoretix 1D ソフトウェア(Nonlinear Dynamics Ltd, Newcastle upon Tyne, UK)を使用して定量した。個々のバンドに対する各血清中のＩｇＥ反応性のレベルは、シグナル強度を血清希釈倍数と掛け合わせることにより算出した。図６は、免疫ブロット分析における２８ｋＤａバンドへのＩｇＥ結合のレベル、および上の実施例３に記載したカリクレインのImmunoCAP測定との比較を示すが、密接な相関を明らかにしている。
【００５０】
尿カリクレインと、イヌ皮屑中の２８ｋＤａバンド間の関連性を直接調べるため、免疫ブロット阻害実験を行った。２８ｋＤａバンドに対してのみ反応性のある(mono-reactive)血清を、精製された尿カリクレインもしくはｒＣａｎ  ｆ１のいずれか（双方とも最終濃度１００μｇ/ｍＬ）、または血清希釈液と共に、室温で２時間プレインキュベーションした。次に免疫ブロットした非還元イヌ皮屑抽出物を保有する短冊状の膜を、プレインキュベーションした血清サンプルと接触させ、上に記載したようにＩｇＥ結合を分析した。実験は、イヌ皮屑中の２８ｋＤａバンドへのＩｇＥの結合は、カリクレインとの血清のプレインキュベーションにより完全に消滅されたが、一方ｒＣａｎ  ｆ１およびバッファー単独の双方とのプレインキュベーションによっては、影響されないままであったことを明らかにした（図７）。
【００５１】
まとめると、本実施例に記載した結果は、電気泳動によるおよび免疫学的な尿カリクレインとの密接な類似性を表すタンパク質が、イヌ皮屑抽出物中に存在することを実証した。
【００５２】
実施例６：イヌ皮屑中のカリクレインの部分的な精製および同定
イヌ皮屑由来カリクレイン様タンパク質を、生化学的同定のためＳＥＣおよびＲＰＣにより精製した。３グラムのイヌの皮屑(Allergon, Valinge, Sweden)から、１００ｍＬのＭＢＳ中で転倒式回転により３時間、室温で抽出した。２０，０００×ｇでの遠心、およびAmicon フィルター(PM-10, Millipore, Billerica, MA, USA)を使用しての濃縮の後、抽出物をＸＫ５０/１００Superdex ７５カラム(GE Healthcare Biosciences)にのせ、ＭＢＳを使用して溶出した（図８）。６つのピーク（図８において１−６と示した）からの分画をプールし、アレルゲン活性について分析した。各分画のタンパク質含有物をImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)固相上に固定化し、そのＩｇＥ抗体結合活性をイヌ皮屑に感作された個体由来の８血清を使用して、表４に示したように検査した。これら血清のほとんどは、イヌ皮屑への高いＩｇＥ結合を有するが、ｒＣａｎ  ｆ１、ｒＣａｎ  ｆ２、およびｎＣａｎ  ｆ３のいずれかに対しては相対的に低い結合を有するものとして選択した。表４から、ＳＥＣ分離によるピーク３が、検査した６つのピークの中で最も高レベルのＩｇＥ結合活性を含有していたことは、明らかである。このプールをさらなる精製のために選択した。
【００５３】
プール液に最終濃度０．０６５％までＴＦＡを加えた後、ＳＴ４．６/１００ Source １５ＲＰＣカラム(GE Healthcare Biosciences)にのせ、０．０５％ＴＦＡを含有する水中アセトニトリルの、直線的な０−５４％濃度勾配を使用して溶出を行った（図８）。図９に示した３つのピークのアレルゲン反応性の分析を、上に記載した基準により選択した５血清を使用して行った。分析の結果（表５）は、ピーク１が最も高レベルのＩｇＥ抗体結合を含有することを示した。このピークの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、１０ｋＤａ、１８ｋＤａおよび２３ｋＤａのタンパク質バンドの存在を明らかにした（示していない）。
【００５４】
ピーク１中に存在する３つのバンドをゲルから切り出し、上の実施例２に記載したように、ゲル内消化および質量分析計の分析を行った。２３ｋＤａのバンドはＣａｎ  ｆ１と同定されたが、１０ｋＤａおよび１８ｋＤａのバンドは、各々選択されたペプチドｍ/ｚ＝１００４．５２およびｍ/ｚ＝１６３２．９８のＰＳＤ分析の後、双方ともイヌ前立腺カリクレイン（アクセション番号Ｐ０９５８２）と同定された。
【００５５】
さらに２つの１０ｋＤａおよび１８ｋＤａのバンドを切り出したゲルバンドから溶出させ、Ｎ末端アミノ酸配列決定を行った。得られた配列、ｘＩＧＧＲＥｘＬＫＮおよびＡＶｘＲＰＧＥＤＲｘ（ここで“ｘ”は解明されていない残基を表す）は、イヌ前立腺カリクレイン前駆体配列であるアクセション番号Ｐ０９５８２の２５−３４残基および１０８−１１７残基とマッチした。
【００５６】
本実施例に記載した結果は、前立腺カリクレインと同一なまたは密接に関連する一次構造をもったタンパク質が、イヌの皮屑中に存在することを実証した。
【００５７】
実施例７：イヌの皮屑および尿由来のカリクレインに対する、類似するＩｇＥ抗体反応性
イヌの尿および皮屑由来のカリクレインのＩｇＥ抗体結合活性を比較するため、カリクレイン反応性の２つの血清（表２の血清Ｎｏ．６および８）、ならびにカリクレイン非反応性の１つの血清（Ｎｏ．１１）を、イヌ皮屑抽出物、精製された尿カリクレイン、および部分的に精製されたイヌ皮屑由来カリクレインの、非還元サンプルの免疫ブロット分析において使用した（図１０）。すべての３つの調製物において、カリクレイン反応性の２つの血清は、２８ｋＤａバンドへのＩｇＥの結合を表し、イヌ皮屑抽出物中の２８ｋＤａへのＩｇＥの結合がカリクレインによるものであることを示した。加えて、精製された尿カリクレイン中の２８ｋＤａバンドへの支配的な反応性は、同じ調製物のクマシー染色したタンパク質バンドと一致することが明らかになった。非還元カリクレイン調製物中の約５５ｋＤａのバンドへのＩｇＥ結合は、カリクレインの推定ダイマーという、上の実施例１の考え方と一致する。ImmunoCAPによりカリクレイン非反応性であった血清は、分析した３つのアレルゲン調製物のいずれにおいても２８ｋＤａバンドに対するＩｇＥの結合は示さなかった。
【００５８】
還元カリクレイン含有サンプルに対する免疫ブロット法の反応性は、非還元サンプルに対するよりかなり弱かった。分析を行った他の調製物より高いカリクレイン濃度を有する精製尿カリクレイン調製物のみが、還元時に形成される１８ｋＤａバンドへの検出可能レベルのＩｇＥ結合を示したにすぎない。
【００５９】
免疫ブロット分析における精製尿カリクレインへの免疫反応が、２８ｋＤａの主要タンパク質バンドに対して方向づけられたという観察結果は、そのＩｇＥの結合が、使用したタンパク質調製物の不純物によって引き起こされたのではないという、実験レベルでのカリクレインのImmunoCAP検査の妥当性を支持する裏付けとなった。この結果はさらに、２８ｋＤａの非還元分子と比較して、１０ｋＤａおよび１８ｋＤａのサブユニットへのより弱い抗体の結合によって示されたように、カリクレイン上の少なくともいくつかのＩｇＥ結合エピトープが分子の還元に対して感受性があることを示す。
【００６０】
実施例８：修飾されたカリクレイン、またはカリクレインのバリアントもしくはフラグメント（分析物）のＩｇＥ結合特性の評価
分析物を、固体支持体、例えばImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)に固定化する。関連種に感作され、その種由来のカリクレインへのＩｇＥ反応性を示す、少なくとも３名の代表的なヒト患者由来の血清サンプルを、最終濃度１００μｇ/ｍＬのカリクレインと共に、そして並行してネガティブコントロールとして、バッファー単独および大腸菌の非アレルギー性マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）と共に、室温で３時間インキュベーションする。次にサンプルを、固定化した分析物を保有するImmunoCAP (Phadia, Uppsala, Sweden)検査でのＩｇＥの結合について分析して、カリクレインとのプレインキュベーションがＩｇＥの結合を特異的に阻害する、または有意に低下させるかどうかの研究を行う。
【００６１】
実施例９：疎水性相互作用クロマトグラフィー[ＨＩＣ]による、イヌ尿由来カリクレインの精製
イヌの尿のプールしたサンプルを、窒素圧下で、５μｍおよび０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。すべてのクロマトグラフィーの操作は、AKTA Explorer 100 Air システム (GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)を用いて行った。１２０ｍｌの濾過したイヌの尿の４つのアリコートを、Sephadex Ｇ−２５カラム(GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden) (カラム容積  ４６１ｍｌ)を使用して、検体をカラムに通す毎にカラム洗浄して、バッファー交換した。使用したバッファー：５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２％  ＮａＮ３、ｐＨ＝７。次にサンプル（約５０５ｍｌ）を、０．４５μｍフィルターを通して濾過し、ＨＩＣカラム(HiPrep Phenyl FF (high sub)、２０ｍｌ、GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)にかけた。ＨＩＣ分離に使用したバッファーは：Ａ）５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０２％  ＮａＮ３、ｐＨ＝７、およびＢ）５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．０２％  ＮａＮ３、ｐＨ＝７、であった。素通り分画（カリクレインを含有する）を流速５ｍｌ/分で、１０ｍｌずつの分画（９５０分画）にて集めた後、素通り分画をプールした。吸着された材料は、１００％バッファーＢを使用して段階的勾配にて溶出させた。
【００６２】
分画を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイ、ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元サンプル、銀染色）を使用して分析した。非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、さらなる処置のためにこのようにプールした素通り分画中にカリクレインが見出されたことを明らかにした。
【００６３】
プールしたＨＩＣ素通り分画のうち、約１２５ｍｌの２つのアリコートおよび約８７ｍｌの１つのアリコートを、Sephadex Ｇ−２５ ＳＦカラム(GE Healthcare Biosciences, Uppsala, Sweden)を用いて、２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．０２％ＮａＮ３、ｐＨ＝８の組成物を含むバッファーに、バッファー交換した。次にカリクレインのプール（４５６ｍｌ）をAmicon cell (３５０ｍｌ、ミリポアフィルター、ＰＢＣＣ、カットオフ５０００ｋＤａ、直径７６ｍｍ)上で、約４３ｍｌの容積にまで濃縮した。ＢＣＡアッセイを使用して、最終プール中のタンパク質濃度が、０．９ｍｇ/ｍｌ（４３ｍｌ中＝総計３８．７ｍｇ）であることが決定された。ＨＩＣカラムにかけたサンプルは、１０１ｍｇのタンパク質を含有しており、ＨＩＣ精製後のカリクレインの回収率は３８％であった。
【００６４】
カリクレイン調製物の純度は、AKTA 精製XT10システムのSuperdex ７５ ＨＲ １０／３０カラム上での分析用ゲル濾過により評価した。この実験に関してサンプル容積は１００μｌ、バッファーは１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＮａＮ３，ｐＨ＝７．４であった。
【００６５】
実施例１０：電気泳動および質量分析の使用によるイヌ尿由来カリクレインの同定および特徴づけ
電気泳動を使用して以下のサンプルについて、同一ゲル上で、コロイド状のクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色法を適用して比較した：
１．標準分子量マーカー
２．イヌの尿
３．ＨＩＣ溶出材料（還元）
４．ＨＩＣ素通り分画（還元）
５．ＨＩＣ素通り分画（非還元）
６．ＨＩＣ溶出材料（非還元）
サンプル２、３および６に関しては、多数のタンパク質が検出された。しかしながらサンプル４（還元ＨＩＣ素通り分画）においては、２つの主要なバンドしか認められなかった。これら２つのバンドは後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（−ＴＯＦ）分析（以下参照）の使用により、（アルギニンエステラーゼ活性によるＲ１０７でのタンパク質分解の結果として）カリクレインタンパク質の２つの異なるバリアントに対応することが見出された。サンプル５（非還元ＨＩＣ素通り分画）では７つの個別のバンドが検出され、すべてのバンドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（−ＴＯＦ）分析（以下参照）の使用により、カリクレインタンパク質の異なるバリアントに対応することが見出された。カリクレインは１２のシステイン残基を包含しており、それ故異なるバリアンドの形成は、非還元条件下ではシステインシステイン架橋の形成により可能である。したがって例えばダイマー、トリマーなどの形成が、非還元条件下で起こる可能性は高い。
【００６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件、トリプシン消化、および、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ分析：
希釈サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製キットを使用して、供給元(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)のマニュアルに推奨されている方法に従って調製した。ゲルはＭＥＳバッファー中、２００Ｖで、３５分間流した。還元サンプルおよび非還元サンプルは別々のまとまりとして流した。染色は、コロイドＣＢＢを用いて一晩行った（脱染色は後に水に約５時間浸して行った）。サンプルは、ピペットの先端部を使用して手動でゲルから採取し、標準的なプロトコル（アセトニトリルの代わりにエタノールを使用して）に従って処理し、１２．５ｎｇ/μｌのトリプシンと共に３７℃で一晩インキュベーションした。消化されたサンプルのうち０．５μｌを、ＭＡＬＤＩシステム用の標的プレートにのせ、０．５μｌ  ＭＡＬＤＩマトリクス溶液（５０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中のＨＣＣの飽和溶液）と混合した。すべてのサンプルはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＴＯＦ(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)質量分析計を使用して分析した。得られたＰＭＦの結果とマッチするタンパク質を同定するため、Mascot サーバー(Matrixscience, London, UK)を使用してＭＳＤＢデータベースを検索した。選択されたペプチドについてＭＳ−ＭＳ分析を行った。ペプチドキャリブレーションスタンダード(Bruker Daltonics)を使用して、外部較正を行った。データベースの検索は、以下の検索基準を使用して実行した：
分類学：哺乳類
質量の誤差範囲：１００ｐｐｍ
メチオニンの酸化および１回の開裂失敗を考慮する
データベースからのカリクレインの配列：
ＭＷＦＬＡＬＣＬＡＭＳＬＧＷＴＧＡＥＰＨＦＱＰＲＩＩＧＧＲＥＣＬＫＮＳＱＰＷＱＶＡＶＹＨＮＧＥＦＡＣＧＧＶＬＶＮＰＥＷＶＬＴＡＡＨＣＡＮＳＮＣＥＶＷＬＧＲＨＮＬＳＥＳＥＤＥＧＱＬＶＱＶＲＫＳＦＩＨＰＬＹＫＴＫＶＰＲ−−−−−−−−−
ＡＶＩＲＰＧＥＤＲＳＨＤＬＭＬＬＨＬＥＥＰＡＫＩＴＫＡＶＲＶＭＤＬＰＫＫＥＰＰＬＧＳＴＣＹＶＳＧＷＧＳＴＤＰＥＴＩＦＨＰＧＳＬＱＣＶＤＬＫＬＬＳＮＮＱＣＡＫＶＹＴＱＫＶＴＫＦＭＬＣＡＧＶＬＥＧＫＫＤＴＣＫＧＤＳＧＧＰＬＩＣＤＧＥＬＶＧＩＴＳＷＧＡＴＰＣＧＫＰＱＭＰＳＬＹＴＲＶＭＰＨＬＭＷＩＫＤＴＭＫＡＮＴ (配列番号: 1)
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（／ＴＯＦ）ＭＳ（／ＭＳ）により同定されたペプチド配列を下線で示す）
実施例１１：メタノール資化酵母（Pichia pastoris）において発現させるリコンビナントイヌカリクレインのクローン化、精製、およびＩｇＥ結合活性の評価
イヌアレルゲンとしての尿カリクレインの同定および重要性を検証するため、メタノール資化酵母を発現ホストとして使用して、リコンビナントアレルゲンとしてタンパク質を作成し、精製し、そしてＩｇＥ抗体結合活性について分析した。
【００６７】
〔イヌ尿カリクレインをコードする合成遺伝子コンストラクトの調製〕
成熟タンパク質に対応するイヌの前立腺アルギニンエステラーゼ（尿カリクレイン、アクセション番号Ｐ０９５８２）の報告されているアミノ酸配列の一部を、ヌクレオチド配列中に逆翻訳することにより、合成のイヌ尿カリクレイン遺伝子をデザインした。ヌクレオチド配列は、最適なコドンが利用されるようにデザインし、二次構造を最小化し、所望のように制限酵素を削除または付加するため、同義となるように調整した。最終コード配列に対応するオリゴヌクレオチドを得、これを組み立て、そして完全長の合成遺伝子をＰＣＲにより増幅し、金属イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるタンパク質の精製を可能にするＣ末端のヘキサヒスチジンタグを加えて、ベクターｐＰＩＣＺ  Ａ(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)のＸｈｏＩ部位およびＳａｌＩ部位内にクローン化した。プラスミドＤＮＡコンストラクトをSac I消化により直線化し、染色体のＡＯＸ１遺伝子座内への相同なリコンビナント化のため、メタノール資化酵母株Ｘ−３３内に形質転換した。
【００６８】
〔リコンビナントイヌカリクレイン−２の発現および精製〕
リコンビナントタンパク質は、メタノール資化酵母株Ｘ−３３(Invitrogen)において、７Ｌバイオリアクター(Belach Bioteknik, Solna, Sweden)を使用して作成した。rich broth培地（２０ｇ/Ｌ  ペプトン、１０ｇ/Ｌ  酵母抽出物、３．４ｇ/Ｌ  酵母窒素ベース、１０ｇ/Ｌ  硫酸アンモニウム、０．４ｍｇ/Ｌ  ビオチン、および０．１Ｍ  リン酸カリウム）を使用し、培養は３０℃で行った。培養液にメタノールを０．１％（ｖ/ｖ）の定常状態の濃度で与えることにより、発現を誘発、維持した。７０時間の発酵後、培養液から＋４℃、１００００ｇ、１０分間の遠心により収穫し、上清をタンパク質の精製のため回収した。
【００６９】
上清に、イミダゾールを５ｍＭまで、ＮａＣｌを０．１５Ｍまで加え、Ｔｒｉｓ塩基（１つまたは複数種）を使用してｐＨ７．２に調整することにより精製のための条件を整え、その後Streamline ２５キレートカラム(GE Healthcare Biosciences)にのせ、製造元の推奨に従ってＮｉＳＯ４でチャージした。カラムに注いだ後、カラムを２０ｍＭおよび６０ｍＭのイミダゾールを用いて別々に段階的に洗浄し、その後リコンビナントタンパク質を５００ｍＭイミダゾールで溶出させた。溶液はすべて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０および０．１５Ｍ  ＮａＣｌで構成されたバッファーにて作成した。
【００７０】
リコンビナントタンパク質のさらなる精製は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して行った。リコンビナントカリクレインを含有するＩＭＡＣ分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールし、２倍量の２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０を用いて希釈した。ｐＨを６．０に調整後、希釈したプール液をＸＫ２６/１００  ＳＰセファロースＦＦカラム(GE Healthcare Biosciences)にのせた。その後カラムを、カラムの２倍容量の２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．０中の０．１５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、同バッファー中の０．３０Ｍ  ＮａＣｌでリコンビナントタンパク質を溶出させた。タンパク質濃度は、吸光計数計算値、１ｍｇ/ｍＬ当たり１．４６を使用して、２８０ｎｍの吸光度から決定した。
【００７１】
合成カリクレイン遺伝子コンストラクトは、１本鎖ポリペプチドの作成を方向付けるようにデザインしたが、培養培地から精製されたタンパク質は、天然の尿カリクレインのプロセシングと同様に１８ｋＤａおよび１２ｋＤａのペプチド鎖への部分的な開裂が起こっていることが見出された（図１１）。事実Ｎ末端の配列決定は、リコンビナントカリクレインが天然の分子と同じ位置で開裂されていたことを明らかにした（データは示していない）。
【００７２】
生理学的条件下でのリコンビナントタンパク質の凝集状態および統合を評価するため、調製物のサンプルを分析用サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。図１２に示したように、ＬＭＷキャリブレーションキット(GE Healthcare Biosciences)により定義した場合、クロマトグラムは３４ｋＤａの分子量に対応する１本の対称なピークにより支配された。リコンビナントタンパク質はその部分的なプロセシングにもかかわらず、溶液中では１つにまとまり、均一な、おそらくモノマーの凝集状態で存在することが実証された。
【００７３】
〔リコンビナントカリクレインのＩｇＥ結合活性〕
作成されたリコンビナントカリクレインの免疫学的活性を、イヌ尿より精製された天然のタンパク質と比較して評価した。２つのタンパク質をImmunoCAP（登録商標）固相上に別々に固定化し、それらのin vitroでのＩｇＥ結合能を、上の実施例３に記載したイヌアレルギー被験者由来の３７血清サンプルを使用して調べた。
【００７４】
図１３に見られるように、２つのデータセットは非常に強い相関（ｒ＝０．９９８８）を示し、作成されたリコンビナントカリクレインはＩｇＥ抗体の結合に関して、天然の尿カリクレインに極めて似ていることが実証された。リコンビナントタンパク質調製物中にはいかなる他のイヌ由来タンパク質も全く含まれないことから推し測って、この結果は、これまでの実施例に記載した天然のカリクレイン調製物の活性成分のアイデンティティーとして、いかなる疑念の可能性もさしはさまないことを、さらに強調することができる。
【００７５】
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【図１】
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【図２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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