(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パールカンのドメインＶのアミノ酸配列を有するエンドレペリンタンパク質を含む、脳血管の生成を刺激または増強することによる患者の治療のための医薬組成物であって、経口、皮下、静脈内または腹腔内投与される、医薬組成物。
【請求項２】
医薬組成物が、経口投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬組成物が、患者の体重あたり０．１mg/kg〜約１０mg/kgの量で投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
医薬組成物が、腹腔内投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項５】
医薬組成物が、静脈内投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項６】
医薬組成物が、皮下投与される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
脳卒中回復を改善するための使用のための、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項８】
脳卒中後の血管新生を刺激するための、そして、脳卒中後の神経新生に必要で神経芽細胞遊走に向けられた神経血管微小環境の形成を成長させるための使用のための、請求項１記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本国際出願は、現在は放棄されている、２００８年１２月３１日に出願された、米国仮特許出願第６０／２０４，０６４号の米国特許法第１１９（ｅ）条下の優先権の利益を主張し、この出願のその全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、脳卒中および血管新生の分野に関する。より具体的には、本発明は、脳卒中によって生じる血管新生の増強剤およびその使用に関する。
【０００３】
関連技術分野の説明
脳卒中からの脳の回復は、患部への血液供給の回復（血管新生）およびニューロンの回復（神経新生）を含む複雑なシステムである。血管新生のために、内皮細胞の増殖が、早くも１２〜２４時間で起こり得る。その後、これらの新たに生成された細胞は、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの多くの内皮細胞マイトジェンに応答して虚血脳領域の方へと遊走し、そして３〜７日後には梗塞周辺皮質において新たな血管を形成する。その後、血管新生は、少なくとも２１日間続く。重要なことには、げっ歯類において脳卒中後の血管新生を増加させる薬物であるナイアスパンは、脳卒中からの機能的な回復を改善し、このことは、脳卒中後の脳の血管新生の増強により、脳卒中の予後は改善され得ることを示唆する。さらに、脳の血管新生は、血液脳関門の形成、ニューロングリア環境への包埋、異なるマトリックスレセプター発現、および発生後の血管新生が比較的に難しいことを含む、脳の脈管構造の独特な特性に因り、脳以外の血管新生とは異なっている。
【０００４】
Ohab et al. （１）は、げっ歯類において、脳卒中後に遊走する未成熟のニューロン（神経芽細胞）が、必然的に修復的な血管新生と神経新生とを連関させる「神経血管微小環境」において、再構築中の血管と会合することを実証した。新たに産生された脈管構造は種々の成長因子の産生によって神経新生を促進し、そしてこれは、新生ニューロンのための足場として作用し、梗塞組織の方へと新生ニューロンが遊走することを可能とするようである。ニューロンおよび内皮細胞の成熟に加えて、神経血管微小環境は、血管新生中に分泌されそして活発に再構築される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を含み、この細胞外マトリックスは、細胞の遊走および血管の形態形成を可能にする。このような細胞外マトリックス成分の１つであるパールカンは、神経血管微小環境にとって必須である。マウスにおいて、パールカンの欠損により重度に神経新生が損なわれ、これは、神経新生の支持のためにパールカンが提供する、神経新生性因子の捕捉がなされない事に因る。
【０００５】
脳卒中の最中および脳卒中後のマトリックス再構築は、損傷および修復後の脳修復の重要な部分であり、このことはさらに、パールカンの重要性を指摘する。脳卒中においては、死に行く炎症細胞および浸潤性の炎症細胞が、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を放出し、これは、血液脳関門を撹乱しそして細胞外マトリックスをタンパク質分解的にプロセシングする。細胞外マトリックスの初期のプロセシングおよび分解が、主たる脳卒中の悪影響として考えられるが、マトリックスタンパク質分解の１つの影響は、生物活性なマトリックスフラグメントの生成である。実際に、多くのマトリックス成分が、そのＣ末端領域において生物活性なマトリックスフラグメントを有し、これは、中枢神経系以外では血管新生を阻害し得ることが知られている（２−３）。パールカンは、脳卒中後に最も感受性が高くそして急速にプロセシングされるマトリックス成分であるという特徴を有する。パールカンのタンパク質分解は、非ヒト霊長類において中大脳動脈の閉塞から２時間以内に起こり、そして少なくとも７日間持続する。
【０００６】
パールカンは、５つのドメインから構成され、その各々が、他のタンパク質に対する配列相同性を有する。ドメインＶ（ＤＶまたはエンドレペリン）として知られるパールカンのＣ末端フラグメントは、３つのラミニン球状（ＬＧ）ドメインからなり、これは各々が２つの上皮成長因子（ＥＧ）様ドメインによって隔てられている。ドメインＶおよびそのＬＧ３フラグメントは、通常、ヒトの尿、血液および脳脊髄液プロテオームに見られる。ドメインＶは、α２β１インテグリンのα２サブユニットに結合することによって、遊走および毛細血管の形態形成を含む、脳以外の内皮細胞のいくつかの血管新生機能を阻害する。ドメインＶとα２β１との相互作用は、血管新生促進性のコラーゲンとα２β１との相互作用とは異なり、逆の結果をもたらすようである。ドメインＶは、脳以外の起源のいくつかの内皮細胞型においては、抗血管新生性として特徴付けられている（４−５）。
【０００７】
これにも関わらず、先行技術では、血管新生増強剤が、不十分である。本発明は、当技術分野におけるこの昔から現存する必要性を充足する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ドメインＶが、脳の血管新生、および神経血管微小環境における内皮細胞とニューロンとの間の相互作用を増強することを示す。ドメインＶは、α５β１インテグリンと相互作用し、α５β１インテグリンの細胞内分布に影響を及ぼし、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮する。これらの観察は、ドメインＶと抗血管新生性のα２β１インテグリンの脳内皮細胞発現の欠如と一致し、そして、脳の血管新生は、脳以外の血管新生とは異なって調節され得るという概念と一致する。それ故、本発明は、パールカンの増加しかつ持続したタンパク質分解によって脳卒中後に生成したドメインＶが、脳卒中後の血管新生を刺激し、脳卒中後の神経新生および定方向の神経芽細胞の遊走に必要な神経血管微小環境の形成を育成し、そしてその結果として前記ドメインＶが、脳の自己修復機序の一成分であり、治療的に活用することができ、脳卒中からの回復を改善することを示す。
【０００９】
本発明の１つの態様において、患者における血管新生を刺激または増強する方法が提供され、これは、前記患者に、治療有効量のエンドレペリンタンパク質を投与する工程、ここで前記エンドレペリンタンパク質は、パールカンのドメインＶまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログのアミノ酸配列を有する；および血管の生成を刺激または増強する工程を含む。
【００１０】
本発明の別の関連した態様において、患者における血管新生を刺激または増強する方法が提供され、これは、前記患者に、治療有効量のエンドスタチンタンパク質、またはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログを投与する工程；および血管の生成を刺激または増強する工程を含む。
【００１１】
本発明の別の態様において、パールカンのドメインＶまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログ、スタチン、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、医薬組成物が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様において、エンドスタチンまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログ、スタチン、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、医薬組成物の方法が提供される。
【００１３】
添付の図面は、前記に列挙した本発明の特徴、利点および目的が明瞭となるように、そして詳細に理解できるようにするために本明細書に含まれている。これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい態様を説明するものであり、本発明の範囲を制限するものと考えるべきではないことを注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｂは、脳卒中が、脳内ドメインＶレベルの増加を引き起こすことを示す。Harlan Sprague Dawleyラットに、エンドセリン−１の定位的注入を行ない、中大脳動脈（ＭＣＡｏ）を閉塞させた。ラットに、ケタミンおよびキシラジンを用いて麻酔をかけ、そして頭蓋を曝した後、十字縫合に対して前方＋０．９mm、外側に＋３．４mm、そして硬膜表面から８．５mmの深さの定位座標で左に小さな穴をドリルで開けた後、３mlのエンドセリン−１（１mg/ml、American Peptide Company, CA）を注入した。図１Ａ：脳卒中から７日後の同じ単一ラットからの脳卒中を起こした（２）および脳卒中を起こしていない（１）大脳半球に由来するドメインＶおよびＧＡＰＤＨ（ローディングする対照）についての代表的なウェスタンブロット。脳卒中を起こした大脳半球は、ＧＡＰＤＨに対して正規化しそして図１Ｂの（ＤＶが示されている）吸光度測定法を介して分析したところ、脳卒中を起こしていない半球よりも、多くの（ｐ＜０．０００１）ドメインＶ（８５ｋＤａバンド）およびそのＬＧ３（２６ｋＤａバンド）成分（ｐ＜０．００１）を含んでいた。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｂは、脳卒中が、脳内ドメインＶレベルの増加を引き起こすことを示す。Harlan Sprague Dawleyラットに、エンドセリン−１の定位的注入を行ない、中大脳動脈（ＭＣＡｏ）を閉塞させた。ラットに、ケタミンおよびキシラジンを用いて麻酔をかけ、そして頭蓋を曝した後、十字縫合に対して前方＋０．９mm、外側に＋３．４mm、そして硬膜表面から８．５mmの深さの定位座標で左に小さな穴をドリルで開けた後、３mlのエンドセリン−１（１mg/ml、American Peptide Company, CA）を注入した。図１Ａ：脳卒中から７日後の同じ単一ラットからの脳卒中を起こした（２）および脳卒中を起こしていない（１）大脳半球に由来するドメインＶおよびＧＡＰＤＨ（ローディングする対照）についての代表的なウェスタンブロット。脳卒中を起こした大脳半球は、ＧＡＰＤＨに対して正規化しそして図１Ｂの（ＤＶが示されている）吸光度測定法を介して分析したところ、脳卒中を起こしていない半球よりも、多くの（ｐ＜０．０００１）ドメインＶ（８５ｋＤａバンド）およびそのＬＧ３（２６ｋＤａバンド）成分（ｐ＜０．００１）を含んでいた。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂは、ドメインＶが、脳内皮細胞毛細血管の形成を増強することを示す。図２Ａ：細胞インキュベーター（NuAire, Plymouth, MN）中の、１０％ウシ胎児血清、ヘパリン１０mg/ml、および酸性ＦＧＦ５０ng/mlを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で慣用的に増殖および継代したラット脳内皮細胞（８）を、３０分間かけて、マトリゲルでコーティングしたウェル（ドメインＶ±機能遮断ａ５ｂ１抗体（１０mg/ml）とのプレインキュベーションを含むまたは含まない）に加えた。図２Ｂ：９時間後、ドメインＶで処置した細胞は、対照よりも多くの（＊＊ｐ＜０．０００１）細管を形成し、これは次いで、抗ａ５ｂ１抗体によって有意に遮断された（＊ｐ＜０．００１、ＤＶによる処置と比較）。エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３回の実験、ＨＰＦ＝高倍率視野。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、ドメインＶが、脳内皮細胞毛細血管の形成を増強することを示す。図２Ａ：細胞インキュベーター（NuAire, Plymouth, MN）中の、１０％ウシ胎児血清、ヘパリン１０mg/ml、および酸性ＦＧＦ５０ng/mlを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で慣用的に増殖および継代したラット脳内皮細胞（８）を、３０分間かけて、マトリゲルでコーティングしたウェル（ドメインＶ±機能遮断ａ５ｂ１抗体（１０mg/ml）とのプレインキュベーションを含むまたは含まない）に加えた。図２Ｂ：９時間後、ドメインＶで処置した細胞は、対照よりも多くの（＊＊ｐ＜０．０００１）細管を形成し、これは次いで、抗ａ５ｂ１抗体によって有意に遮断された（＊ｐ＜０．００１、ＤＶによる処置と比較）。エラーバー＝標準偏差、ｎ＝３回の実験、ＨＰＦ＝高倍率視野。
【図３】図３は、ドメインＶが、脳内皮細胞毛細血管の形成およびニューロンとの相互作用を刺激することを示す。ラット脳内皮細胞（赤色、抗フォン・ヴィルブランド因子抗体を用いて染色、Dako）を、小脳顆粒ニューロン（緑色、抗ＴＵＪ１抗体を用いて染色、Dako）の層に加え、そしてその後、ドメインＶ（３００nM）またはビヒクル対照で処置した。対照においては、内皮細胞は、ニューロンから離れて、別個の島を形成するが、一方、ドメインＶによる処置は、ニューロン付近に毛細血管を形成した。
【図４】図４は、ドメインＶが、α５β１インテグリンの再分布を引き起こすことを示す。ラミニン上の脳内皮細胞を、ドメインＶ（３００nM）またはビヒクル対照を用いて２時間かけて処置した。その後、細胞を固定し、そしてα５β１インテグリン（緑色）およびＤＡＰＩ核対比染色（青色）について免疫染色し、そして共焦点顕微鏡によって可視化した。ドメインＶによる処置により、血管新生内皮細胞において一般的に見られる細胞表面突起へのα５β１の再分布がもたらされた。
【図５】図５は、ドメインＶが、脳内皮細胞の接着を支持することを示す。脳内皮細胞（α５β１機能遮断抗体とのプレインキュベーションを含むまたは含まない）を、１％ＢＳＡまたはドメインＶでコーティングしたウェルに加え、その後、固定し、染色し、そしてＯＤ５６０での分光測定を行なった。有意により多い（＃、ｐ＜０．００１）脳内皮細胞が、ＢＳＡよりもドメインＶに接着し、これは次いで、ａ５ｂ１機能遮断抗体の添加によって有意に（＊、ｐ＜０．００１）阻害された。ｎ＝３。エラーバー＝標準偏差。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｂは、周産期の動脈性虚血性脳卒中（ＰＡＳ）後のドメインＶによる処置により、脳の表面および脳卒中の境界域の脈管構造が増加することを示す。７日齢のラットにおいて一過性の中大脳動脈閉塞を、エンドセリン−１の定位的注入を介して誘導した。その後、動物は、脳卒中から２４時間後および７２時間後に、０．５mg/kgの滅菌ろ過したドメインＶまたはＰＢＳビヒクル対照の腹腔内注入を受けた。脳卒中から５日後に、動物の脳を取り出し、そして脳卒中を起こした脳表面の脈管構造を画像撮影し、その後、凍結組織切片のフォン・ヴィルブランドによる免疫組織化学を行なって、境界域の脈管構造を分析した。ドメインＶによる処置により、脳表面の血管過多、および脳卒中の境界域の脈管構造の有意な（ｐ＜０．００１）増加がもたらされた。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｂは、周産期の動脈性虚血性脳卒中（ＰＡＳ）後のドメインＶによる処置により、脳の表面および脳卒中の境界域の脈管構造が増加することを示す。７日齢のラットにおいて一過性の中大脳動脈閉塞を、エンドセリン−１の定位的注入を介して誘導した。その後、動物は、脳卒中から２４時間後および７２時間後に、０．５mg/kgの滅菌ろ過したドメインＶまたはＰＢＳビヒクル対照の腹腔内注入を受けた。脳卒中から５日後に、動物の脳を取り出し、そして脳卒中を起こした脳表面の脈管構造を画像撮影し、その後、凍結組織切片のフォン・ヴィルブランドによる免疫組織化学を行なって、境界域の脈管構造を分析した。ドメインＶによる処置により、脳表面の血管過多、および脳卒中の境界域の脈管構造の有意な（ｐ＜０．００１）増加がもたらされた。
【図７】図７は、投与したドメインＶが、免疫組織化学によって脳卒中および梗塞周辺組織に局在することを示す。ドメインＶまたはＰＢＳビヒクル対照で処置した脳卒中を起こした動物由来の凍結組織切片を、フォン・ヴィルブランド因子およびＨＩＳエピトープに対して向けられた抗体を用いた免疫組織化学を介して処理して、それぞれ血管および投与したドメインＶを可視化した。脳卒中を起こした組織および脳卒中の梗塞周辺の脳組織において、ドメインＶが豊富であった。ここでドメインＶは、血管周囲の分布域に蓄積した。これに対し、ドメインＶは、同じドメインＶで処置した動物の対応する脳卒中を起こしていない反対側の脳組織には全く検出されず、このことは、ドメインＶが、脳卒中を起こした組織および梗塞周辺の脳組織へと特異的に向かうことを示唆する。
【図８】図８は、投与したドメインＶが、ウェスタンイムノブロットによって脳卒中の脳組織に局在することを示す。ＰＢＳまたはドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした同側（Ｉ）の脳組織または対応する反対側（Ｃ）の脳卒中を起こしていない組織の溶解液を、ドメインＶに対する抗体（内因性および投与したＤＶを検出する）、ＨＩＳに対する抗体（投与したドメインＶのみを検出する）およびＧＡＰＤＨタンパク質ローディング対照に対する抗体を用いてのウェスタンブロットによって分析した。８５ｋＤａのバンドが抗ドメインＶおよび抗ＨＩＳについて示されている。ＰＢＳ（ｐ＜０．００１）およびドメインＶ（ｐ＜０．００００１）で処置した動物の両方において（後者の方が、外的に投与したドメインＶに因りさらにより多くのドメインＶが検出された）、ＧＡＰＤＨローディング対照に対して正規化した場合、反対側の組織と比較して脳卒中を起こした組織において、有意により多くのドメインＶが検出された。抗ＨＩＳ抗体によって検出される投与したドメインＶは、ドメインＶで処置された動物の脳卒中を起こした皮質に由来する溶解液中にのみ検出することができた。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、ドメインＶによる処置により、梗塞周辺脳組織において新生ニューロンの数が増加することを示す。図９Ａ：凍結組織切片を、新生ニューロンのマーカーであるダブルコルチンについて免疫染色し、そしてＰＢＳおよびドメインＶで処置した動物の梗塞周辺脳組織における１つの高倍率視野（ＨＰＦ、１匹の動物あたり２０画像）あたりのダブルコルチン陽性なピクセルの平均％を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて定量した。有意により多くのダブルコルチンのピクセルを、ドメインＶで処置された動物において検出した（＊＝ｐ＜０．０００１）。図９Ｂ：抗ＨＩＳ抗体（赤色）を用いて検出される密接に会合した投与ドメインＶを有する、梗塞周辺血管と密接に会合したいくつかの異なるダブルコルチン（緑色）陽性ニューロンを示すドメインＶ処置動物の免疫組織化学。細胞核を、ＤＡＰＩ（青色）を用いて対比染色する。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｂは、ドメインＶによる処置により、梗塞周辺脳組織において新生ニューロンの数が増加することを示す。図９Ａ：凍結組織切片を、新生ニューロンのマーカーであるダブルコルチンについて免疫染色し、そしてＰＢＳおよびドメインＶで処置した動物の梗塞周辺脳組織における１つの高倍率視野（ＨＰＦ、１匹の動物あたり２０画像）あたりのダブルコルチン陽性なピクセルの平均％を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて定量した。有意により多くのダブルコルチンのピクセルを、ドメインＶで処置された動物において検出した（＊＝ｐ＜０．０００１）。図９Ｂ：抗ＨＩＳ抗体（赤色）を用いて検出される密接に会合した投与ドメインＶを有する、梗塞周辺血管と密接に会合したいくつかの異なるダブルコルチン（緑色）陽性ニューロンを示すドメインＶ処置動物の免疫組織化学。細胞核を、ＤＡＰＩ（青色）を用いて対比染色する。
【図１０】図１０は、ドメインＶが、皮質ニューロンの遊走を増強することを示す。胎生１５日齢のＣ５７Ｂｌ６マウスの皮質ニューロン（１００nMまたは２００nMのドメインＶとの３０分間のプレインキュベーションを含むまたは含まない）を、改変ボイデンチャンバーの上のウェル（３×１０３個／ウェル）に加え、そしてＩ型コラーゲンでコーティングされたポリカーボネート膜を横切って８時間かけて（３７℃で）、何も含まないか（遊走対照）または神経成長因子（ＮＧＦ、１ウェルあたり４nM）を含む下のウェルに向けて遊走させた。各々の条件についてＮ＝３。ドメインＶのプレインキュベーションは、有意にそして用量依存的に、皮質ニューロンの遊走を増強させ、このことは、前記ドメインＶが、ニューロンに対して直接的で潜在的な治療効果を有し得ることを示唆する。＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＝ｐ＜０．０００１。バーは標準誤差である。
【図１１】図１１は、ドメインＶが、エンドセリン−１動物脳卒中モデルにおいて機能的／運動的予後を改善することを示す。脳卒中を起こした動物または偽の手術対照を、直径２０cm×高さ３５cmの透明な円柱に３分間入れて、肢の優先性およびいずれかの前肢で体重を支えるその能力を試験した（６）。動物が後足で立ち、環境を探索するようになると、両足の着地の回数、病変と同側（右）の足の着地の回数、および病変とは反対側（左）の足の着地の回数を計測する。足の接触をビデオテープに撮り、そして後で分析した。同側の肢の使用率を、同側接触／（同側の接触＋反対側の接触）×１００の式を使用して計算した。１つの処置群あたりＮ＝５匹、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１、脳卒中を起こしたドメインＶで処置したものと、脳卒中を起こしたＰＢＳで処置したものとを比較。脳卒中後の３日目以降から、偽の対照とドメインＶで処置した脳卒中を起こした動物との間の統計学的な差異はなかった。ドメインＶで処置した動物を、脳卒中後の１、３、５、７日目に０．５mg/kgで処置した。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＢＤＮＦに対するドメインＶの効果を示す。図１２Ａ：２４時間の経過におよぶ、脳内皮細胞＋／−ドメインＶ＋／−α５β１抗体（α５リガンド結合ドメインに対して作られた）＋／−ＳＮＡＫＡ５１（α５β１活性化抗体）に由来する馴化培地のＢＤＮＦのＥＬＩＳＡ。これは、ドメインＶ（＊＊ｐ＝０．００２５）、α５β１抗体（＊ｐ＝０．０００１）およびＳＮＡＫＡ５１（＃ｐ＝０．０００７）全てにより、ＢＤＮＦレベルが有意に増加することを実証する。α５β１抗体およびドメインＶの同時添加により基線のＢＤＮＦ放出レベルが得られ、一方、ＳＮＡＫＡ５１およびドメインＶにより、ＢＤＮＦレベルがさらに増加するが、この増加は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．０６）。図１２Ｂ：脳卒中後３日目および７日目におけるＰＢＳビヒクル対照またはドメインＶで処置した動物における、同側脳卒中脳組織の代表的なＢＤＮＦウェスタンブロット。図１２Ｃ：ＰＢＳ処置動物の対応する日と比較した場合の、ドメインＶ処置による脳卒中後３日目および７日目における脳卒中後のＢＤＮＦレベルの有意な増加（＊ｐ＝０．００６、＊＊ｐ＝０．０００１）を実証する、ＢＤＮＦウェスタンブロットの定量、３回の別々のウェスタンブロットからの平均値±標準誤差が示されている。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＢＤＮＦに対するドメインＶの効果を示す。図１２Ａ：２４時間の経過におよぶ、脳内皮細胞＋／−ドメインＶ＋／−α５β１抗体（α５リガンド結合ドメインに対して作られた）＋／−ＳＮＡＫＡ５１（α５β１活性化抗体）に由来する馴化培地のＢＤＮＦのＥＬＩＳＡ。これは、ドメインＶ（＊＊ｐ＝０．００２５）、α５β１抗体（＊ｐ＝０．０００１）およびＳＮＡＫＡ５１（＃ｐ＝０．０００７）が全てにより、ＢＤＮＦレベルが有意に増加することを実証する。α５β１抗体およびドメインＶの同時添加により基線のＢＤＮＦ放出レベルが得られ、一方、ＳＮＡＫＡ５１およびドメインＶにより、ＢＤＮＦレベルがさらに増加するが、この増加は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．０６）。図１２Ｂ：脳卒中後３日目および７日目におけるＰＢＳビヒクル対照またはドメインＶで処置した動物における、同側脳卒中脳組織の代表的なＢＤＮＦウェスタンブロット。図１２Ｃ：ＰＢＳ処置動物の対応する日と比較した場合の、ドメインＶ処置による脳卒中後３日目および７日目における脳卒中後のＢＤＮＦレベルの有意な増加（＊ｐ＝０．００６、＊＊ｐ＝０．０００１）を実証する、ＢＤＮＦウェスタンブロットの定量、３回の別々のウェスタンブロットからの平均値±標準誤差が示されている。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｂは、ＢＤＮＦに対するドメインＶの効果を示す。図１２Ａ：２４時間の経過におよぶ、脳内皮細胞＋／−ドメインＶ＋／−α５β１抗体（α５リガンド結合ドメインに対して作られた）＋／−ＳＮＡＫＡ５１（α５β１活性化抗体）に由来する馴化培地のＢＤＮＦのＥＬＩＳＡ。これは、ドメインＶ（＊＊ｐ＝０．００２５）、α５β１抗体（＊ｐ＝０．０００１）およびＳＮＡＫＡ５１（＃ｐ＝０．０００７）が全てにより、ＢＤＮＦレベルが有意に増加することを実証する。α５β１抗体およびドメインＶの同時添加により基線のＢＤＮＦ放出レベルが得られ、一方、ＳＮＡＫＡ５１およびドメインＶにより、ＢＤＮＦレベルがさらに増加するが、この増加は統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．０６）。図１２Ｂ：脳卒中後３日目および７日目におけるＰＢＳビヒクル対照またはドメインＶで処置した動物における、同側脳卒中脳組織の代表的なＢＤＮＦウェスタンブロット。図１２Ｃ：ＰＢＳ処置動物の対応する日と比較した場合の、ドメインＶ処置による脳卒中後３日目および７日目における脳卒中後のＢＤＮＦレベルの有意な増加（＊ｐ＝０．００６、＊＊ｐ＝０．０００１）を実証する、ＢＤＮＦウェスタンブロットの定量、３回の別々のウェスタンブロットからの平均値±標準誤差が示されている。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｈは、ドメインＶが、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示す。図１３Ａ；固定したＢＳＡ（陰性対照）またはドメインＶ＋／−α５β１機能遮断抗体（１０mg/ml）に対する代表的な脳内皮細胞接着アッセイの定量であって、これは、ドメインＶが、ＢＳＡと比較して有意により多くの細胞接着を支持し（＊＊ｐ＜０．００００５）、これはα５β１機能遮断抗体によって有意に（＊ｐ＝０．０００７）阻害され得ることを実証する。図１３Ｂ：α５β１−ＤＶ ＥＬＩＳＡは、ドメインＶが、用量依存的に、約３０nMのＫｄで、固定したα５β１インテグリンに結合することを実証する。Ｔｗｅｅｎ２０陰性対照も、示されている。図１３Ｃ：３％ウシ胎児血清（対照）またはＤＶ＋／−α５β１１−ＧＳＴまたはフィブロネクチン−ＧＳＴ（陰性対照（ケモアトラクタントを全く含まない）に対して正規化されている）に向かって遊走する細胞の定量であって、これは、ドメインＶが、３％血清と同じくらいに強力なケモアトラクタントであり、これはα５β１−ＧＳＴ（＊ｐ＝０．０２）またはフィブロネクチン−ＧＳＴ（＊＊ｐ＝０．０１）によって有意に阻害され得ることを実証し、エラーバーは標準偏差である。図１３Ｄ：１２時間後のマトリゲル上の脳内皮細胞、＋／−ドメインＶ＋／−α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）の代表的な画像であって、これは、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣが、ＤＶによる細管様構造形成の増強を阻害することを実証する。図１３Ｅ：（図１３Ｄ）におけるマトリゲル細管実験の定量であって、これは、細管様構造の形成を有意に（＊ｐ＝０．０００３）増強したドメインＶが、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣによって有意に（＊＊ｐ＝０．００１）阻害されたことを実証する。図１３Ｆ：８時間にわたり＋／−ドメインＶを用いた、血清を欠乏させたコンフルエントな脳内皮細胞の代表的なａ５ｂ１のウェスタンブロット（ＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、全細胞のα５β１レベルが、対照においては８時間かけて消失するが、一方、ドメインＶは、α５β１レベルを維持することを実証する。図１３Ｇ：脳内皮細胞のａ５ｂ１免疫細胞化学であって、これは、ドメインＶへの曝露が、α５β１の局在を、均一な細胞内分布から表面／葉状仮足へとシフトさせることを実証する。図１３Ｈ：ＰＢＳでおよびドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした（Ｉ）および反対側（Ｃ）の脳卒中後の３日目の脳組織の代表的なウェスタンブロット（対応するＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、ドメインＶでの処置による、脳卒中を起こした全体の脳内α５β１レベルの有意な増加を実証する。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｈは、ドメインＶが、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示す。図１３Ａ；固定したＢＳＡ（陰性対照）またはドメインＶ＋／−α５β１機能遮断抗体（１０mg/ml）に対する代表的な脳内皮細胞接着アッセイの定量であって、これは、ドメインＶが、ＢＳＡと比較して有意により多くの細胞接着を支持し（＊＊ｐ＜０．００００５）、これはα５β１機能遮断抗体によって有意に（＊ｐ＝０．０００７）阻害され得ることを実証する。図１３Ｂ：α５β１−ＤＶ ＥＬＩＳＡは、ドメインＶが、用量依存的に、約３０nMのＫｄで、固定したα５β１インテグリンに結合することを実証する。Ｔｗｅｅｎ２０陰性対照も、示されている。図１３Ｃ：３％ウシ胎児血清（対照）またはＤＶ＋／−α５β１１−ＧＳＴまたはフィブロネクチン−ＧＳＴ（陰性対照（ケモアトラクタントを全く含まない）に対して正規化されている）に向かって遊走する細胞の定量であって、これは、ドメインＶが、３％血清と同じくらいに強力なケモアトラクタントであり、これはα５β１−ＧＳＴ（＊ｐ＝０．０２）またはフィブロネクチン−ＧＳＴ（＊＊ｐ＝０．０１）によって有意に阻害され得ることを実証し、エラーバーは標準偏差である。図１３Ｄ：１２時間後のマトリゲル上の脳内皮細胞、＋／−ドメインＶ＋／−α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）の代表的な画像であって、これは、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣが、ＤＶによる細管様構造形成の増強を阻害することを実証する。図１３Ｅ：（図１３Ｄ）におけるマトリゲル細管実験の定量であって、これは、細管様構造の形成を有意に（＊ｐ＝０．０００３）増強したドメインＶが、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣによって有意に（＊＊ｐ＝０．００１）阻害されたことを実証する。図１３Ｆ：８時間にわたり＋／−ドメインＶを用いた、血清を欠乏させたコンフルエントな脳内皮細胞の代表的なａ５ｂ１のウェスタンブロット（ＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、全細胞のα５β１レベルが、対照においては８時間かけて消失するが、一方、ドメインＶは、α５β１レベルを維持することを実証する。図１３Ｇ：脳内皮細胞のａ５ｂ１免疫細胞化学であって、これは、ドメインＶへの曝露が、α５β１の局在を、均一な細胞内分布から表面／葉状仮足へとシフトさせることを実証する。図１３Ｈ：ＰＢＳでおよびドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした（Ｉ）および反対側（Ｃ）の脳卒中後の３日目の脳組織の代表的なウェスタンブロット（対応するＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、ドメインＶでの処置による、脳卒中を起こした全体の脳内α５β１レベルの有意な増加を実証する。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｈは、ドメインＶが、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示す。図１３Ａ；固定したＢＳＡ（陰性対照）またはドメインＶ＋／−α５β１機能遮断抗体（１０mg/ml）に対する代表的な脳内皮細胞接着アッセイの定量であって、これは、ドメインＶが、ＢＳＡと比較して有意により多くの細胞接着を支持し（＊＊ｐ＜０．００００５）、これはα５β１機能遮断抗体によって有意に（＊ｐ＝０．０００７）阻害され得ることを実証する。図１３Ｂ：α５β１−ＤＶ ＥＬＩＳＡは、ドメインＶが、用量依存的に、約３０nMのＫｄで、固定したα５β１インテグリンに結合することを実証する。Ｔｗｅｅｎ２０陰性対照も、示されている。図１３Ｃ：３％ウシ胎児血清（対照）またはＤＶ＋／−α５β１１−ＧＳＴまたはフィブロネクチン−ＧＳＴ（陰性対照（ケモアトラクタントを全く含まない）に対して正規化されている）に向かって遊走する細胞の定量であって、これは、ドメインＶが、３％血清と同じくらいに強力なケモアトラクタントであり、これはα５β１−ＧＳＴ（＊ｐ＝０．０２）またはフィブロネクチン−ＧＳＴ（＊＊ｐ＝０．０１）によって有意に阻害され得ることを実証し、エラーバーは標準偏差である。図１３Ｄ：１２時間後のマトリゲル上の脳内皮細胞、＋／−ドメインＶ＋／−α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）の代表的な画像であって、これは、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣが、ＤＶによる細管様構造形成の増強を阻害することを実証する。図１３Ｅ：（図１３Ｄ）におけるマトリゲル細管実験の定量であって、これは、細管様構造の形成を有意に（＊ｐ＝０．０００３）増強したドメインＶが、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣによって有意に（＊＊ｐ＝０．００１）阻害されたことを実証する。図１３Ｆ：８時間にわたり＋／−ドメインＶを用いた、血清を欠乏させたコンフルエントな脳内皮細胞の代表的なａ５ｂ１のウェスタンブロット（ＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、全細胞のα５β１レベルが、対照においては８時間かけて消失するが、一方、ドメインＶは、α５β１レベルを維持することを実証する。図１３Ｇ：脳内皮細胞のａ５ｂ１免疫細胞化学であって、これは、ドメインＶへの曝露が、α５β１の局在を、均一な細胞内分布から表面／葉状仮足へとシフトさせることを実証する。図１３Ｈ：ＰＢＳでおよびドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした（Ｉ）および反対側（Ｃ）の脳卒中後の３日目の脳組織の代表的なウェスタンブロット（対応するＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、ドメインＶでの処置による、脳卒中を起こした全体の脳内α５β１レベルの有意な増加を実証する。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｈは、ドメインＶが、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示す。図１３Ａ；固定したＢＳＡ（陰性対照）またはドメインＶ＋／−α５β１機能遮断抗体（１０mg/ml）に対する代表的な脳内皮細胞接着アッセイの定量であって、これは、ドメインＶが、ＢＳＡと比較して有意により多くの細胞接着を支持し（＊＊ｐ＜０．００００５）、これはα５β１機能遮断抗体によって有意に（＊ｐ＝０．０００７）阻害され得ることを実証する。図１３Ｂ：α５β１−ＤＶ ＥＬＩＳＡは、ドメインＶが、用量依存的に、約３０nMのＫｄで、固定したα５β１インテグリンに結合することを実証する。Ｔｗｅｅｎ２０陰性対照も、示されている。図１３Ｃ：３％ウシ胎児血清（対照）またはＤＶ＋／−α５β１１−ＧＳＴまたはフィブロネクチン−ＧＳＴ（陰性対照（ケモアトラクタントを全く含まない）に対して正規化されている）に向かって遊走する細胞の定量であって、これは、ドメインＶが、３％血清と同じくらいに強力なケモアトラクタントであり、これはα５β１−ＧＳＴ（＊ｐ＝０．０２）またはフィブロネクチン−ＧＳＴ（＊＊ｐ＝０．０１）によって有意に阻害され得ることを実証し、エラーバーは標準偏差である。図１３Ｄ：１２時間後のマトリゲル上の脳内皮細胞、＋／−ドメインＶ＋／−α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）の代表的な画像であって、これは、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣが、ＤＶによる細管様構造形成の増強を阻害することを実証する。図１３Ｅ：（図１３Ｄ）におけるマトリゲル細管実験の定量であって、これは、細管様構造の形成を有意に（＊ｐ＝０．０００３）増強したドメインＶが、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣによって有意に（＊＊ｐ＝０．００１）阻害されたことを実証する。図１３Ｆ：８時間にわたり＋／−ドメインＶを用いた、血清を欠乏させたコンフルエントな脳内皮細胞の代表的なａ５ｂ１のウェスタンブロット（ＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、全細胞のα５β１レベルが、対照においては８時間かけて消失するが、一方、ドメインＶは、α５β１レベルを維持することを実証する。図１３Ｇ：脳内皮細胞のａ５ｂ１免疫細胞化学であって、これは、ドメインＶへの曝露が、α５β１の局在を、均一な細胞内分布から表面／葉状仮足へとシフトさせることを実証する。図１３Ｈ：ＰＢＳでおよびドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした（Ｉ）および反対側（Ｃ）の脳卒中後の３日目の脳組織の代表的なウェスタンブロット（対応するＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、ドメインＶでの処置による、脳卒中を起こした全体の脳内α５β１レベルの有意な増加を実証する。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜１３Ｈは、ドメインＶが、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示す。図１３Ａ；固定したＢＳＡ（陰性対照）またはドメインＶ＋／−α５β１機能遮断抗体（１０mg/ml）に対する代表的な脳内皮細胞接着アッセイの定量であって、これは、ドメインＶが、ＢＳＡと比較して有意により多くの細胞接着を支持し（＊＊ｐ＜０．００００５）、これはα５β１機能遮断抗体によって有意に（＊ｐ＝０．０００７）阻害され得ることを実証する。図１３Ｂ：α５β１−ＤＶ ＥＬＩＳＡは、ドメインＶが、用量依存的に、約３０nMのＫｄで、固定したα５β１インテグリンに結合することを実証する。Ｔｗｅｅｎ２０陰性対照も、示されている。図１３Ｃ：３％ウシ胎児血清（対照）またはＤＶ＋／−α５β１１−ＧＳＴまたはフィブロネクチン−ＧＳＴ（陰性対照（ケモアトラクタントを全く含まない）に対して正規化されている）に向かって遊走する細胞の定量であって、これは、ドメインＶが、３％血清と同じくらいに強力なケモアトラクタントであり、これはα５β１−ＧＳＴ（＊ｐ＝０．０２）またはフィブロネクチン−ＧＳＴ（＊＊ｐ＝０．０１）によって有意に阻害され得ることを実証し、エラーバーは標準偏差である。図１３Ｄ：１２時間後のマトリゲル上の脳内皮細胞、＋／−ドメインＶ＋／−α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）の代表的な画像であって、これは、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣが、ＤＶによる細管様構造形成の増強を阻害することを実証する。図１３Ｅ：（図１３Ｄ）におけるマトリゲル細管実験の定量であって、これは、細管様構造の形成を有意に（＊ｐ＝０．０００３）増強したドメインＶが、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣによって有意に（＊＊ｐ＝０．００１）阻害されたことを実証する。図１３Ｆ：８時間にわたり＋／−ドメインＶを用いた、血清を欠乏させたコンフルエントな脳内皮細胞の代表的なａ５ｂ１のウェスタンブロット（ＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、全細胞のα５β１レベルが、対照においては８時間かけて消失するが、一方、ドメインＶは、α５β１レベルを維持することを実証する。図１３Ｇ：脳内皮細胞のａ５ｂ１免疫細胞化学であって、これは、ドメインＶへの曝露が、α５β１の局在を、均一な細胞内分布から表面／葉状仮足へとシフトさせることを実証する。図１３Ｈ：ＰＢＳでおよびドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした（Ｉ）および反対側（Ｃ）の脳卒中後の３日目の脳組織の代表的なウェスタンブロット（対応するＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、ドメインＶでの処置による、脳卒中を起こした全体の脳内α５β１レベルの有意な増加を実証する。
【図１３Ｆ】図１３Ａ〜１３Ｈは、ドメインＶが、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示す。図１３Ａ；固定したＢＳＡ（陰性対照）またはドメインＶ＋／−α５β１機能遮断抗体（１０mg/ml）に対する代表的な脳内皮細胞接着アッセイの定量であって、これは、ドメインＶが、ＢＳＡと比較して有意により多くの細胞接着を支持し（＊＊ｐ＜０．００００５）、これはα５β１機能遮断抗体によって有意に（＊ｐ＝０．０００７）阻害され得ることを実証する。図１３Ｂ：α５β１−ＤＶ ＥＬＩＳＡは、ドメインＶが、用量依存的に、約３０nMのＫｄで、固定したα５β１インテグリンに結合することを実証する。Ｔｗｅｅｎ２０陰性対照も、示されている。図１３Ｃ：３％ウシ胎児血清（対照）またはＤＶ＋／−α５β１１−ＧＳＴまたはフィブロネクチン−ＧＳＴ（陰性対照（ケモアトラクタントを全く含まない）に対して正規化されている）に向かって遊走する細胞の定量であって、これは、ドメインＶが、３％血清と同じくらいに強力なケモアトラクタントであり、これはα５β１−ＧＳＴ（＊ｐ＝０．０２）またはフィブロネクチン−ＧＳＴ（＊＊ｐ＝０．０１）によって有意に阻害され得ることを実証し、エラーバーは標準偏差である。図１３Ｄ：１２時間後のマトリゲル上の脳内皮細胞、＋／−ドメインＶ＋／−α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）の代表的な画像であって、これは、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣが、ＤＶによる細管様構造形成の増強を阻害することを実証する。図１３Ｅ：（図１３Ｄ）におけるマトリゲル細管実験の定量であって、これは、細管様構造の形成を有意に（＊ｐ＝０．０００３）増強したドメインＶが、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣによって有意に（＊＊ｐ＝０．００１）阻害されたことを実証する。図１３Ｆ：８時間にわたり＋／−ドメインＶを用いた、血清を欠乏させたコンフルエントな脳内皮細胞の代表的なａ５ｂ１のウェスタンブロット（ＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、全細胞のα５β１レベルが、対照においては８時間かけて消失するが、一方、ドメインＶは、α５β１レベルを維持することを実証する。図１３Ｇ：脳内皮細胞のａ５ｂ１免疫細胞化学であって、これは、ドメインＶへの曝露が、α５β１の局在を、均一な細胞内分布から表面／葉状仮足へとシフトさせることを実証する。図１３Ｈ：ＰＢＳでおよびドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした（Ｉ）および反対側（Ｃ）の脳卒中後の３日目の脳組織の代表的なウェスタンブロット（対応するＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、ドメインＶでの処置による、脳卒中を起こした全体の脳内α５β１レベルの有意な増加を実証する。
【図１３Ｇ】図１３Ａ〜１３Ｈは、ドメインＶが、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示す。図１３Ａ；固定したＢＳＡ（陰性対照）またはドメインＶ＋／−α５β１機能遮断抗体（１０mg/ml）に対する代表的な脳内皮細胞接着アッセイの定量であって、これは、ドメインＶが、ＢＳＡと比較して有意により多くの細胞接着を支持し（＊＊ｐ＜０．００００５）、これはα５β１機能遮断抗体によって有意に（＊ｐ＝０．０００７）阻害され得ることを実証する。図１３Ｂ：α５β１−ＤＶ ＥＬＩＳＡは、ドメインＶが、用量依存的に、約３０nMのＫｄで、固定したα５β１インテグリンに結合することを実証する。Ｔｗｅｅｎ２０陰性対照も、示されている。図１３Ｃ：３％ウシ胎児血清（対照）またはＤＶ＋／−α５β１１−ＧＳＴまたはフィブロネクチン−ＧＳＴ（陰性対照（ケモアトラクタントを全く含まない）に対して正規化されている）に向かって遊走する細胞の定量であって、これは、ドメインＶが、３％血清と同じくらいに強力なケモアトラクタントであり、これはα５β１−ＧＳＴ（＊ｐ＝０．０２）またはフィブロネクチン−ＧＳＴ（＊＊ｐ＝０．０１）によって有意に阻害され得ることを実証し、エラーバーは標準偏差である。図１３Ｄ：１２時間後のマトリゲル上の脳内皮細胞、＋／−ドメインＶ＋／−α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）の代表的な画像であって、これは、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣが、ＤＶによる細管様構造形成の増強を阻害することを実証する。図１３Ｅ：（図１３Ｄ）におけるマトリゲル細管実験の定量であって、これは、細管様構造の形成を有意に（＊ｐ＝０．０００３）増強したドメインＶが、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣによって有意に（＊＊ｐ＝０．００１）阻害されたことを実証する。図１３Ｆ：８時間にわたり＋／−ドメインＶを用いた、血清を欠乏させたコンフルエントな脳内皮細胞の代表的なａ５ｂ１のウェスタンブロット（ＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、全細胞のα５β１レベルが、対照においては８時間かけて消失するが、一方、ドメインＶは、α５β１レベルを維持することを実証する。図１３Ｇ：脳内皮細胞のａ５ｂ１免疫細胞化学であって、これは、ドメインＶへの曝露が、α５β１の局在を、均一な細胞内分布から表面／葉状仮足へとシフトさせることを実証する。図１３Ｈ：ＰＢＳでおよびドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした（Ｉ）および反対側（Ｃ）の脳卒中後の３日目の脳組織の代表的なウェスタンブロット（対応するＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、ドメインＶでの処置による、脳卒中を起こした全体の脳内α５β１レベルの有意な増加を実証する。
【図１３Ｈ】図１３Ａ〜１３Ｈは、ドメインＶが、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示す。図１３Ａ；固定したＢＳＡ（陰性対照）またはドメインＶ＋／−α５β１機能遮断抗体（１０mg/ml）に対する代表的な脳内皮細胞接着アッセイの定量であって、これは、ドメインＶが、ＢＳＡと比較して有意により多くの細胞接着を支持し（＊＊ｐ＜０．００００５）、これはα５β１機能遮断抗体によって有意に（＊ｐ＝０．０００７）阻害され得ることを実証する。図１３Ｂ：α５β１−ＤＶ ＥＬＩＳＡは、ドメインＶが、用量依存的に、約３０nMのＫｄで、固定したα５β１インテグリンに結合することを実証する。Ｔｗｅｅｎ２０陰性対照も、示されている。図１３Ｃ：３％ウシ胎児血清（対照）またはＤＶ＋／−α５β１１−ＧＳＴまたはフィブロネクチン−ＧＳＴ（陰性対照（ケモアトラクタントを全く含まない）に対して正規化されている）に向かって遊走する細胞の定量であって、これは、ドメインＶが、３％血清と同じくらいに強力なケモアトラクタントであり、これはα５β１−ＧＳＴ（＊ｐ＝０．０２）またはフィブロネクチン−ＧＳＴ（＊＊ｐ＝０．０１）によって有意に阻害され得ることを実証し、エラーバーは標準偏差である。図１３Ｄ：１２時間後のマトリゲル上の脳内皮細胞、＋／−ドメインＶ＋／−α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）の代表的な画像であって、これは、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣが、ＤＶによる細管様構造形成の増強を阻害することを実証する。図１３Ｅ：（図１３Ｄ）におけるマトリゲル細管実験の定量であって、これは、細管様構造の形成を有意に（＊ｐ＝０．０００３）増強したドメインＶが、ＣＲＲＥＴＡＷＡＣによって有意に（＊＊ｐ＝０．００１）阻害されたことを実証する。図１３Ｆ：８時間にわたり＋／−ドメインＶを用いた、血清を欠乏させたコンフルエントな脳内皮細胞の代表的なａ５ｂ１のウェスタンブロット（ＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、全細胞のα５β１レベルが、対照においては８時間かけて消失するが、一方、ドメインＶは、α５β１レベルを維持することを実証する。図１３Ｇ：脳内皮細胞のａ５ｂ１免疫細胞化学であって、これは、ドメインＶへの曝露が、α５β１の局在を、均一な細胞内分布から表面／葉状仮足へとシフトさせることを実証する。図１３Ｈ：ＰＢＳでおよびドメインＶで処置した動物に由来する脳卒中を起こした（Ｉ）および反対側（Ｃ）の脳卒中後の３日目の脳組織の代表的なウェスタンブロット（対応するＧＡＰＤＨローディング対照を含む）であって、これは、ドメインＶでの処置による、脳卒中を起こした全体の脳内α５β１レベルの有意な増加を実証する。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｂは、Ｃ５７細胞におけるＤＶの細胞増殖活性に対するα２β１の効果を示す。図１４Ａ：細胞培地対照と比較したところ、ＤＶにより、マウス脳内皮細胞の増殖が増加し、これは、ＶＥＧＦ中和抗体またはα５β１インテグリン機能遮断抗体の添加によって遮断され得る。図１４Ｂ：細胞にα２β１インテグリンを添加すると、細胞の増殖は、増加するよりもむしろ抑制される。バーは、平均値＋／−標準偏差である（図１４Ｂ）。＊＊ｐ＜０．０１。＃＃ｐ＜０．０１。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｂは、Ｃ５７細胞におけるＤＶの細胞増殖活性に対するα２β１の効果を示す。図１４Ａ：細胞培地対照と比較したところ、ＤＶにより、マウス脳内皮細胞の増殖が増加し、これは、ＶＥＧＦ中和抗体またはα５β１インテグリン機能遮断抗体の添加によって遮断され得る。図１４Ｂ：細胞にα２β１インテグリンを添加すると、細胞の増殖は、増加させるよりもむしろ抑制される。バーは、平均値＋／−標準偏差である（図１４Ｂ）。＊＊ｐ＜０．０１。＃＃ｐ＜０．０１。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃ（図１５Ａ）およびＣ５７Ｂｌ６（図１５Ｂ）系のマウスにおける血管間空間に対するＤＶの効果を示す。図１５Ａ：ＤＶの非存在下（０時間の対照）および存在下（８時間および２４時間）において測定した、ＢＡＬＢ／ｃ系における［３Ｈ］マンニトールおよび［１４Ｃ］スクロースのＲ組織値。［３Ｈ］マンニトールおよび［１４Ｃ］スクロースの両方についての３つの実験群間の差異は、領域中の差異の影響を可能とさせた後に偶然に期待されるであろうものよりも大きくない（＊Ｐ＞０．０５；２要因の分散分析）。各々の群についてｎ＝４。平均値±ＳＥＭ。図１５Ｂ：Ｃ５７Ｂｌ６系におけるＤＶの非存在下（０時間の対照）および存在下（２時間）において測定した、［３Ｈ］マンニトールおよび［１４Ｃ］スクロースのＲ組織値。［３Ｈ］マンニトールおよび［１４Ｃ］スクロースの両方についての実験群間の差異は、領域中の差異の影響を可能とさせた後に偶然に期待されるであろうものよりも大きくない（＊Ｐ＞０．０５；２要因の分散分析）。各々の群についてｎ＝５。平均値±ＳＥＭ。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｂは、Ｂａｌｂ／ｃ（図１５Ａ）およびＣ５７Ｂｌ６（図１５Ｂ）系のマウスにおける血管間空間に対するＤＶの効果を示す。図１５Ａ：ＤＶの非存在下（０時間の対照）および存在下（８時間および２４時間）において測定した、ＢＡＬＢ／ｃ系における［３Ｈ］マンニトールおよび［１４Ｃ］スクロースのＲ組織値。［３Ｈ］マンニトールおよび［１４Ｃ］スクロースの両方についての３つの実験群間の差異は、領域中の差異の影響を可能とさせた後に偶然に期待されるであろうものよりも大きくない（＊Ｐ＞０．０５；２要因の分散分析）。各々の群についてｎ＝４。平均値±ＳＥＭ。図１５Ｂ：Ｃ５７Ｂｌ６系におけるＤＶの非存在下（０時間の対照）および存在下（２時間）において測定した、［３Ｈ］マンニトールおよび［１４Ｃ］スクロースのＲ組織値。［３Ｈ］マンニトールおよび［１４Ｃ］スクロースの両方についての実験群間の差異は、領域中の差異の影響を可能とさせた後に偶然に期待されるであろうものよりも大きくない（＊Ｐ＞０．０５；２要因の分散分析）。各々の群についてｎ＝５。平均値±ＳＥＭ。［発明の詳細な説明］
【００１５】
特許請求の範囲および／または明細書中の「含む」という用語と共に使用されている場合の「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語の使用は、「１つの
（ｏｎｅ）」を意味し得るが、しかしそれはまた「１つ以上」、「少なくとも１つの」、および「１つまたは１つより多くの」の意味とも一致する。本発明のいくつかの態様は、本発明の１つ以上の要素、方法の工程、および／または方法からなり得るか、または本質的にそれからなり得る。本明細書に記載した任意の方法または組成物を、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に対して実行することができると考えられる。
【００１６】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢の一方のみを指すかまたは選択肢は互いに排他的であると特記されていない限り、開示物が、選択肢の一方のみおよび「および／または」を指す定義を支持していても、「および／または」を意味するために使用される。
【００１７】
本発明は、患者における血管新生を刺激または増強する方法を提供し、これは、前記患者に、治療有効量のエンドレペリンタンパク質を投与する工程（前記エンドレペリンタンパク質は、パールカンのドメインＶまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログのアミノ酸配列を有する）；および血管の生成を刺激または増強する工程を含む。好ましくは、パールカンのドメインＶのフラグメントは、パールカンのドメインＶに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を有する。パールカンのドメインＶまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログを、当業者によって容易に決定できるような任意の有用な方法によって投与し得る。さらに、パールカンのドメインＶまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログを、患者の体重あたり約０．１mg/kgから約１０mg/kgの量で投与し得る。典型的には、投与により、ニューロン内の脳内皮細胞毛細血管形成、および／または脳内皮細胞中の血管新生促進性α５β１インテグリンの発現増加が起こる。
【００１８】
本発明はまた、患者における血管新生を刺激または増強する方法を提供し、前記患者に、治療有効量のエンドスタチンタンパク質、またはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログを投与する工程；および血管の生成を刺激または増強する工程を含む。好ましくは、エンドスタチンのフラグメントは、エンドスタチンに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるアミノ酸配列を有する。一般的に、当業者は、有用なフラグメントまたは誘導体を容易に誘導することができるだろう。エンドスタチンまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログを、当業者によって容易に決定できるような任意の有用な方法によって投与し得る。一般的に、エンドスタチンまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログを、患者の体重あたり約０．１mg/kgから約１０mg/kgの量で投与し得る。投与により、ニューロン内の脳内皮細胞毛細血管形成が起こる。
【００１９】
本発明はまた、パールカンのドメインＶまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログ、スタチン化合物、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、医薬組成物も提供する。
【００２０】
本発明はまた、エンドスタチンまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログ、スタチン化合物、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００２１】
本発明はまた、エンドスタチンまたはそのフラグメントまたはその誘導体、アナログ、スタチン、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００２２】
本明細書において開示した組成物を、単独でまたは別の薬物もしくは化合物と組み合わせてのいずれかで投与し得る。このような薬物または化合物を、本明細書において開示した組成物と同時にまたは連続的に投与し得る。組成物との共投与の効果は、処置される疾病に対して少なくとも最小限の薬理学的または治療的な効果を及ぼすことが知られる、通常必要とされる薬物または化合物の用量を下げることである。
【００２３】
本明細書において記載した組成物および薬物または化合物を、独立して、全身的にまたは局所的にのいずれかで、当技術分野において公知の任意の方法によって、例えば、皮下、静脈内、非経口、腹腔内、皮内、筋肉内、局所的、腸内、直腸内、鼻腔内、頬側内、膣内、または吸入スプレーによって、薬物ポンプによって、または経皮パッチもしくはインプラント内に含ませて投与し得る。本明細書に記載した組成物の投与製剤は、投与法に適した従来の無毒性で生理学的にまたは薬学的に許容可能な担体もしくはビヒクルを含み得る。
【００２４】
本明細書において記載した組成物および薬物または化合物を、独立的に１回以上投与し、治療効果を達成、維持または改善してもよい。用量を決定すること、あるいは組成物および薬物もしくは化合物のいずれかまたは両方の適切な投与量が、単回投与量または複数回投与量を含むかどうかを決定することは十分に当業者の技能範囲内である。
【００２５】
当技術分野においては周知のように、任意の特定の患者に対して生じるそのこのような組成物の具体的な用量レベルは、使用する具体的な化合物の活性、年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時刻、投与経路、排泄速度、薬物併用、および療法を受ける特定の疾病の重篤度を含む、多種多様な因子に依存する。投与責任者が、個々の対象のための適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、FDA Office of Biologics standardsによって要求されるような無菌性、発熱物質非含有性、全般的な安全性および純度基準を満たすべきである。
【００２６】
患者または対象への本発明の組成物の投与は、組成物中および／または併用療法の態様における成分の毒性（存在する場合）を考慮に入れて、脳血管疾病または疾患の処置に使用される療法の投与のための一般的なプロトコールに従う。処置サイクルを、必要に応じて繰り返すことが考えられる。また、種々の標準療法並びに手術的介入も、記載の療法と組み合わせて適用し得ることが考えられる。
【００２７】
当業者には公知のように、本明細書に記載の組成物を、公知の任意の薬理学的に許容可能な担体と共に投与し得る。さらに、前記組成物を、皮下、鼻腔内または粘膜などの公知の任意の投与経路を介して投与することができる。さらに、投与しようとする組成物の用量を、当業者には公知であるような実験を実施することによって決定することができる。
【００２８】
以下の実施例は、本発明の種々の態様を説明する目的で示され、いずれにしても本発明を制限する意味はない。当業者は、目的を実施しそして記載の結論および利点を得るように本発明を上手に適応させること、並びに、本明細書に固有のそのような目的、結論および利点を容易に理解するだろう。特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神内に包含される本明細書における変更および他の使用が、当業者には考えられるだろう。
【００２９】
実施例１
内皮細胞
ヒト臍静脈（ＨＵＶＥＣ）および脳微小血管内皮細胞を、それぞれLonza（Basel, Switzerland）およびCell Systems（Kirkland, WA）から購入し、そして業者の指示通りに継代した。マウスおよびラットの脳微小血管内皮細胞は、Jane Welsh, Texas A&M Universityによって提供され、そして記載（５）の通りに継代した。
【００３０】
実施例２
ドメインＶおよびエンドスタチン
ヒトエンドスタチンを、Cell Sciences, Inc.（Canton, MA）およびSigma Chemical（St. Louis, MO）から購入した。ドメインＶ（ＤＶ）を、ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングし、そしてトランスフェクションされた２９３ＦＴ（ATCC, Manassas, VA）細胞から、そのＣ末端６×ＨｉｓタグおよびＮｉ−ＡＴＡアガロースビーズ（Qiagen, Valencia, CA）カラムクロマトグラフィーを介して精製した。透析したＤＶ（ＰＢＳに対して）の純度を、抗ＤＶ抗体（R&D systems, Minneapolis, MN）および抗ｈｉｓ抗体（EMD Chemicals, Gibbstown, NJ）を用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを介して確認した。以前に実証された抗血管新生性濃度のＤＶ（２５０nM）およびエンドスタチン（６００ng/ml）および熱で失活させた対照（１００℃で３０分間）を用いての３０分間の前処置を、全ての実験について使用した。全ての記載した実験について、Ｎ＝１５である（５つの別々の実験、各々の条件は３重に実施した）。Sigmastatソフトウェアパッケージを用いてのスチューデント独立ｔ検定によって、全ての実験についての統計学的有意性（ｐ＜０．０５）を決定した。
【００３１】
実施例３
エンドセリン−１による中大脳動脈ｉｎ  ｖｉｖｏ脳卒中モデル
Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝１０）に、エンドセリン−１（American Peptide Company, Sunnyvale, CA）またはＰＢＳ注入を用いて中大脳動脈閉塞の定位的手術を行なった。ラットを、手術から３日後または７日後に絶ち、そして脳組織をドメインＶおよびＧＡＰＤＨウェスタンイムノブロット分析のために処理した。
【００３２】
実施例４
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血管新生アッセイ
マトリゲル実験を、記載（７）の通りに実施した。１２〜１８時間後、細胞を撮影し、そして細管形成をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳを用いて定量した（細管のピクセル／高倍率視野、１つの条件につき１０箇所の領域）。細胞の遊走を、製造業者の指示に従って、改変ボイデンチャンバー（NeuroProbe, Gaithersburg, MD）を用いて評価した。Ｉ型コラーゲンでコーティングされたポリカーボネート膜を横切って、無血清培地＋／−３％ウシ胎児血清の方へと向かう遊走を、６〜８時間後に評価した。ＭＴＳ溶液と共にＶＥＧＦ２０ng/mlを含む無血清培地（Promega, Madison, WI）中で製造業者の指示に従って４８時間後に増殖を評価した。
【００３３】
実施例５
ニューロン−脳内皮細胞の共培養細管形成アッセイ
生後８日目のラットから単離した大脳顆粒ニューロンを、ラミニン（Invitrogen）でプレコーティングしたチャンバースライドに加え、そして一晩増殖させた。その後、脳内皮細胞を一晩かけて加え、その後、無血清培地中で２〜６時間かけて実験的な処置を行なった。固定した細胞を、共焦点顕微鏡（Zeiss, New York, NY）のために抗フォン・ヴィルブランド因子抗体（Dako, Denmark）または抗ＴＵＪ１抗体（Neuromics, Edina, MN）および適切な蛍光色素でタグ化した二次抗体（Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA）を用いて免疫染色した。
【００３４】
実施例６
結果
ピークの梗塞周囲の血管新生は、３〜７日後に始まるので、同じ動物に由来する、脳卒中を起こしたおよび脳卒中を起こしていない対照の大脳半球を、ドメインＶレベルについて、脳卒中から３日後および７日後にウェスタンイムノブロットによって調べた（各時点についてｎ＝５）。脳卒中の誘発から３日後に、脳卒中を起こした大脳半球におけるドメインＶの５３０％±２０％（標準偏差）の増加を、ＧＡＰＤＨローディング対照に対して正規化しそして光学密度測定法（ＩｍａｇｅＪ, NIHソフトウェア）によって定量して実証した（スチューデント独立ｔ検定によってｐ＜０．００１）（図１Ａ〜１Ｂ）。
【００３５】
ＤＶが脳の血管新生に影響を及ぼす能力、およびこの過程におけるａ５ｂ１インテグリンの関与を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける毛細血管アッセイを使用して調べた。ラット脳微小血管内皮細胞（５０，０００個の細胞／ウェル、Jane Welsh, Texas A&Mによって提供）（８）を、マトリゲル（毛細血管形成を刺激する血管基底膜に似た物質、２５ml／ウェル、BD Biosciences）でコーティングされた２４ウェルプレートのウェルに加えた（ＤＶ（２００nM）±機能的遮断α５β１抗体（１０mg/ml、図２Ａ）とのプレインキュベーションを含むまたは含まない）。９時間後、ＤＶで処置した脳内皮細胞は、非処置対照と比較して有意により多くの毛細血管を形成した（ｐ＜０．０００１）。この効果は、次いで、抗α５β１抗体によって有意に遮断された（ｐ＜０．００１、ＤＶ処置のみと比較して、図２Ｂ）。抗α５β１遮断抗体のみを用いての前処置では、細管形成は有意な影響を受けなかった（ｐ＝０．３）。
【００３６】
次に、ＤＶが脳内皮細胞とニューロンとの間の相互作用、すなわち神経血管微小環境に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、生後８日目のラット大脳（これにより９５％を超える純粋な新生顆粒ニューロンの培養（１０）が得られた）から得た一次ニューロンの層に脳内皮細胞を加えた、脳内皮細胞顆粒ニューロン共培養アッセイを開発した。。ニューロン（５×１０４個の細胞／ウェル）を、ラミニンでプレコーティングした８つのチャンバーウェルスライドに加え、そして３７℃で一晩増殖させた。次の日、脳内皮細胞を加え（３×１０４個の細胞／ウェル）、そして一晩増殖させ、その後、無血清培地中で６時間かけてＤＶを用いて処置した。このアッセイにおいて、脳内皮細胞は、急速に（２〜３時間以内に）ニューロンから離れ、別個の内皮細胞島を形成する。ＤＶによる処置により、ニューロン内で劇的な脳内皮細胞の毛細血管形成が行なわれた（図３）。
【００３７】
ドメインＶが脳内皮細胞における血管新生促進性α５β１インテグリンの発現に影響を及ぼすかどうかを実証するために、処置していないおよびドメインＶに曝した培養ラット脳内皮細胞におけるａ５ｂ１インテグリンの細胞内局在を、免疫細胞化学および共焦点顕微鏡を介して分析した。図４は、ＤＶによる処置により、細胞質内における散在から、一般的に血管新生性内皮細胞に見られる細胞表面突起へとα５β１インテグリンの再分布が行なわれたことを示す。
【００３８】
ドメインＶがα５β１インテグリンを介して脳内皮細胞接着を支持し得るかどうかを決定するために、細胞接着アッセイを、１％ＢＳＡ（接着対照）またはドメインＶ（４０μg/ml）でコーティングしそして細胞を加えた（α５β１機能遮断抗体（１０μg/ml）のプレインキュベーションを含むまたは含まない）ウェルを用いて行なった。図５は、ドメインＶが、ＢＳＡよりも有意により多くの脳内皮細胞接着を支持し（ｐ＜０．００１）、そしてα５β１機能遮断抗体が、ＤＶへの脳内皮細胞の接着を有意に（ｐ＜０．００１）阻害したことを実証し、このことは、ＤＶが、α５β１インテグリンにより媒介される脳内皮細胞接着を支持し得るという可能性を示唆する。
【００３９】
これらの結果は、脳内ドメインＶが、脳卒中後に増加し、そしてニューロン環境における血管新生、および脳内皮細胞とニューロンとの間の相互作用の両方を増強することを実証する。さらに、これらの効果は、α５β１インテグリンとの相互作用を必要とする。重要なことには、これらの結果は、パールカンの生物活性フラグメント（ＤＶ）を生成することによって脳卒中後に脳が自己修復し、そして、この脳修復機序を治療的に活用することができるという見解を支持する。
【００４０】
実施例７
脳血管新生および神経血管微小環境の形成に対するＤＶの効果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける脳血管新生におけるドメインＶの役割を実証するために、マトリゲル毛細血管アッセイ、細胞遊走アッセイ、および細胞増殖アッセイを含む血管新生アッセイを、微小血管脳内皮細胞およびヒト組換えドメインＶを用いて実施する。ニューロン−脳内皮細胞の共培養毛細血管アッセイを使用して、より脳に似た環境における毛細血管形成に対するドメインＶの効果を研究し、並びに、神経血管微小環境の形成を研究する。前記の研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける焦点性虚血をモデリングするために、酸素およびグルコースを欠乏させた環境（ＯＧＤ）中で実施する。ＤＶは、有意に、そして用量依存的に、正常な条件およびＯＧＤ条件の両方において、脳血管新生、並びにニューロンと内皮細胞との相互作用を増強するだろう。
【００４１】
実施例８
ＤＶのクローニングおよび精製
ドメインＶを、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクター（Invitrogen）にクローニングし、これによりＤＶのＣ末端に６×Ｈｉｓタグを付加した。プラスミドを、リポフェクトアミン（Invitrogen）を介して２９３ＦＴ（ATCC, Manassas, VA）細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション後、無血清の馴化培地（細胞の分泌したＤＶを含む）を回収し、そしてＤＶを、Ｎｉ−ＡＴＡアガロースビーズカラムクロマトグラフィーを介して４℃で精製した。溶出したＤＶを、１×ＰＢＳに対して透析し、そして、ブリリアントブルーＧコロイド液を用いて染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＤＶＣ）を介して、並びに抗ＤＶ抗体（示されている）および抗Ｈｉｓ抗体を用いてのウェスタンブロット分析（ＤＶＷＢ）によって、純度について評価した。ＤＶを、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ｄｙｅ試薬を用いて定量した。
【００４２】
実施例９
内皮細胞増殖に対するＤＶの効果
内皮細胞の増殖は、血管新生における重要な初期の工程である。内皮細胞に対するドメインＶの増殖効果を評価するために、マウスおよびラットの両方に由来する微小血管脳内皮細胞を、種特異的な差異を除外するためと、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける脳卒中モデルにおけるラットの使用に対応するための両方のために使用する。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Lonza, Basel, Switzerland）を対照として使用し、そしてヒト脳微小血管内皮細胞（Cell Systems, Kirkland, WA）を使用して、ドメインＶの効果が、ヒトにも適用可能であり得るかどうかを決定する。増殖アッセイについて、細胞を、トリプシン０．２５％（Invitrogen）を用いて収集し、２０ng/mlのＶＥＧＦを含む無血清培地中のビヒクル対照または種々の濃度のＤＶ（１〜４５０nMの濃度を、全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける血管新生実験について使用）懸濁液を用いて３０分間かけて前処置し、そしてその後、５×１０３個の細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに加える。その後、細胞を、正常な増殖条件下において４８時間かけてインキュベーションする。その後、ＭＴＳ溶液を、１時間かけて加え（２０ml／ウェル）、その後、プレート解読機で４９０nmにおける吸光度を解読する。
【００４３】
実施例１０
内皮細胞遊走に対するＤＶの効果の決定
血管新生性の内皮細胞が増殖するにつれて、それらは、血管を要求する組織によって放出されるケモアトラクタントに応答して、新たな血液の供給を必要とする組織領域へと向かって遊走し始める。ＤＶが内皮細胞の遊走に影響を及ぼし得るかどうかを評価するために、細胞を収集し、そして改変ボイデンチャンバー（NeuroProbe, Gaithersburg, MD）の上のチャンバーにローディングし（３７℃で種々のＤＶ懸濁液濃度を有する適切な無血清培地中での３０分間のプレインキュベーションを含むまたは含まない）、そしてＩ型コラーゲン、ラミニンまたはフィブロネクチンでコーティングされたポリカーボネート膜を横切って、３７℃の下のチャンバー中の無血清培地＋／−３％ＦＢＳに向けて６〜８時間かけて遊走させる。重要なことには、これらの細胞外マトリックスは、それぞれ、脳内皮細胞の中性の、抗血管新生性のおよび血管新生促進性の基質を示し（１１）、そしてその使用により、ＤＶの作用がＥＣＭ特異的であるかどうかを決定することが可能となる。その後、膜（遊走細胞を含む）をアセトンで固定し、そして細胞をクリスタルバイオレット（Sigma）で染色し、そして顕微鏡下で計測する。さらに、ＤＶが、ＶＥＧＦ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）および塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む種々のケモアトラクタントへの方への遊走に異なって影響を及ぼすのうかどうかを決定する。
【００４４】
実施例１１
内皮細胞のマトリゲルによって誘発される細管形成に対するＤＶの効果の決定
一旦、内皮細胞が、新たな血液供給を要求する目的の組織ターゲットに到達すると、細胞は毛細血管形態形成を受けて、新たな血管を作る。マトリゲル細管形成アッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて内皮細胞毛細血管形態形成を研究するための十分に確立された技術である（１２）。この目的を達成するために、これらのアッセイを前記したように実施（種々のＤＶ濃度と内皮細胞とのプレインキュベーションを含むまたは含まない）する。細胞を種々の時点で観察し、その後、１２〜１８時間後に４％パラホルムアルデヒド中で固定する。標準的な画像取得ソフトウェアを使用して、倒立顕微鏡に取り付けたＣＣＤカメラを用いて画像を獲得する。細管形成を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳを用いて定量する（細管のピクセル／顕微鏡視野、１つの条件あたり１０箇所の視野）。
【００４５】
実施例１２
共培養液中における内皮細胞の細管形成およびニューロンとの相互作用に対するＤＶの効果の決定
マトリゲルよりも脳に似た環境において脳内皮細胞毛細血管形成をドメインＶがモデュレーションする能力を調査するために、大脳顆粒ニューロンと脳内皮細胞からなる共培養アッセイシステムを開発した。生後８日目のラット大脳を、それが脳内皮細胞と相互作用する新生ニューロンの容易に入手可能でかつ豊富な入手源であることからニューロン入手源として選択した（１３）。ラミニンに加えて、ニューロンを、コラーゲンＩまたはフィブロネクチンでプレコーティングしたウェルに加えて、内皮細胞細管形成に対する各々の基底にある基質の相対的な重要性を決定する。内皮細胞細管形成の程度に対する種々の濃度のドメインＶの効果を、種々のインキュベーション期間（１、３、６、９時間）について決定する。細管形成に対するドメインＶの用量依存的な増強作用を、実証する。
【００４６】
本明細書におけるデータは、ドメインＶの非存在下においては脳内皮細胞はニューロンから離れるが、一方でドメインＶは、ニューロン間の毛細血管形成を促進することを示唆する。それ故、毛細血管の形成の研究に加えて、この共培養系は、内皮細胞とニューロンとＥＣＭとの間の動的相互作用に対するＤＶの効果を調べることを可能とする。第一に、共焦点顕微鏡を使用して、抗フォン・ヴィルブランド因子、抗ＴＵＪ１、抗α５β１、タイトジャンクションタンパク質のクローディン−５および抗ＥＣＭ成分（フィブロネクチン、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンを含む）について免疫染色された固定細胞のZ-stack画像を回収することによって、脳内皮細胞とニューロンと周辺のＥＣＭとの間の３次元相互作用に対する種々の時点におけるドメインＶの効果を調べる。これらの研究において、ＤＶが、周辺のＥＣＭに関連してα５β１インテグリンの内皮細胞における分布に影響を及ぼすかどうか、並びに、ＤＶが、クローディン−５の発現および細胞内分布における変化によって測定されるような内皮細胞同型相互作用の変化、および内皮細胞−ニューロンの近さの変化によって測定されるような異型ニューロン相互作用の変化を決定するのかどうかを示す。
【００４７】
生細胞用顕微鏡（ＣＣＤカメラおよびＭｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトウェアを含むＰＣに接続された電動ステージ、および加熱型ＣＯ２ステージを有するNikon顕微鏡）を使用して、長時間にわたり、それぞれｄｉＩおよびｄｉＯで蛍光標識されたニューロンおよび内皮細胞（１４）の相互作用（ＤＶ療法を含むまたは含まない）を画像撮影する。ドメインＶの処置は、脳内皮細胞とニューロンとの間の可視的な物理的接触を増加させ、従って、脳卒中の回復中の神経血管微小環境の形成を促進および増強する。内皮細胞−ニューロンの接触を、１時間あたり１つの顕微鏡視野あたりの可視的な内皮細胞−ニューロンの接触数として定量する。個々の内皮細胞が１時間あたりにニューロンと接触する程度も定量する。
【００４８】
最後に、ニューロンまたはその分泌されるＥＣＭ／成長因子の存在が、ＤＶの毛細血管促進作用にとって必要であるかどうかを決定するために、いくつかの実験においてニューロンを、非酵素的分離溶液であるＣｅｌｌｓｔｒｉｐｐｅｒを用いて除去し、ニューロンにより分泌されるマトリックスをウェルの底に残し（ＥＣＭ抗体によって確認される）、その後、脳内皮細胞の添加±ＤＶ処置を行なう。他の実験においては、ニューロン馴化培地を、ラミニン上に培養された内皮細胞に加える。データは、内皮細胞細管形成にとってニューロン−内皮細胞の相互作用が必要であることを示す。
【００４９】
実施例１３
ＤＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける酸素−グルコース欠乏（ＯＧＤ）の効果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血モデル（１５）におけるドメインＶの効果を、低酸素チャンバー中の低グルコース培地（１ｇ/Ｌ）中の前記の血管新生アッセイを使用して示す。各アッセイについて、低グルコース培地±ＤＶ中の培養液を、９５％Ｎ２／５％ＣＯ２を１時間流した低酸素チャンバー中に入れ、その後、各血管新生アッセイについて前記した実験持続時間かけてチャンバーに封をする。ＯＧＤのみで、脳内皮細胞血管新生が増加し、そしてこれはさらにＤＶによって増強される。
【００５０】
実施例１４
脳内皮細胞におけるａ５ｂ１インテグリンおよびＤＶの血管新生促進作用
ＤＶの血管新生促進作用にα５β１が必要であることは、α５β１の遮断および／またはα５β１の減少が、ドメインＶの血管新生促進作用を軽減または阻害することを意味する。それ故、遊走、増殖および細管形成アッセイにおける、ＤＶで処置および非処置の脳内皮細胞に対する、それぞれ、機能的遮断抗体およびＩｇＧ対照（Millipore、１０〜２０mg/ml、細胞と共にプレインキュベーション）を用いてのａ５ｂ１インテグリンの機能的阻害の効果、並びに、ｓｉＲＮＡ（Accellの予め設計されたｓｉＲＮＡ、Dharmacon, Chicago, IL）を用いてのα５β１レベルの減少の効果を示す。ａ５ｂ１ノックダウンは、ウェスタンブロットを介して確認される。
【００５１】
実施例１５
内皮細胞のａ５ｂ１の表面局在化に対するＤＶの効果の決定
ＤＶへの曝露に応答した脳内皮細胞のα５β１インテグリンの表面局在化を直接測定するために、Milner et al. （１５）の方法を使用して、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Becton-Dickinson）ＭｏｄＦｉｔ  ＬＴ（Verity）ソフトウェアを含むBecton-Dickinson ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ機器を使用したフローサイトメトリーのために、プラスチックまたは種々の基質（ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチンまたは固定したＤＶ、４℃で一晩かけてウェルに４０mg/mlで加える）（ＤＶへの曝露を含むまたは含まない）上で増殖させた細胞を調製する。
【００５２】
実施例１６
ＤＶとα５β１インテグリンとの相互作用およびＤＶによるα５β１インテグリンの活性化の決定
ＤＶがａ５ｂ１インテグリンと結合しそして活性化し、その結果、ＲＧＤフィブロネクチン／α５β１結合モチーフを介してフィブロネクチンに対する脳内皮細胞の親和性が増加する。固定したフィブロネクチンへの脳内皮細胞の接着増加に対するＤＶの効果、および、ＲＧＤ配列ＧＲＧＤＳ（配列番号１）ｖｓ対照ペプチドＳＤＧＲＧ（配列番号２）を示す。
【００５３】
細胞接着アッセイを、ＤＶ（４０μg/ml）、フィブロネクチン（１０μg/ml）、ＧＲＧＤＳもしくはＳＤＧＲＧペプチド（０．１μg/ml）、または１％ＢＳＡでコーティングしたウェルにおいて前記した通りに行なった。ＤＶへの細胞接着がα５β１依存性であることを示すために、α５β１の機能または発現が阻害される接着研究を実施する。細胞を、製造業者の指示に従ってα５β１ｓｉＲＮＡで処置し、そしてα５β１ノックダウン効率を、ウェスタンイムノブロットを介して確認する。あるいは、細胞を、接着アッセイ前に抗α５β１遮断抗体と共にプレインキュベーションする。α５β１の機能または発現の阻害により、ＤＶへの脳内皮細胞の接着が減少または阻害されることを示す。ＤＶによりフィブロネクチンへの脳内皮細胞の接着が増強し、そしてＧＲＧＤＳペプチドおよびα５β１ｓｉＲＮＡ処置により、固定したドメインＶへの脳内皮細胞の接着が阻害され、そして添加したＤＶにより、フィブロネクチンおよびＧＲＧＤＳへの脳内皮細胞の接着が増強されることを示す。
【００５４】
実施例１７
脳卒中によって生じるＤＶ
ＤＶを脳卒中後に投与し、そして脳卒中の病態および機能的回復に対するその効果を示す。脳卒中後の血管新生は、神経血管微小環境の形成のようにｉｎ  ｖｉｖｏにおける脳卒中においてＤＶ投与後に増加し、そしてラットにおける病的および機能的脳卒中の予後が、改善する。ＤＶ療法は、動物において十分に耐容性がある。
【００５５】
実施例１８
エンドセリン−１によるｉｎ  ｖｉｖｏにおける脳卒中モデルおよびＤＶ療法
Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、前記したようにエンドセリン−１（またはＰＢＳ偽対照）によって誘発される中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）を行なう。血流中断を、レーザードプラ流速測定計（ＢＰＭ２モデル, Vasamedics Inc, St. Paul, MN）を使用して確認する（１６）（４９）。ＭＣＡｏから２４時間後、動物を無作為に２つの群に分け、一方には、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注入によって２〜６mg/kgのろ過したＤＶ（公開（７）されているように腫瘍血管新生を阻害するに十分な量）の注入を施し（処置群）、そして一方には２週間におよび２日間毎にビヒクル対照を施す。また、ＭＣＡｏから２４時間後に開始して、ラットに、毎日（１４日間）、新たに合成されたＤＮＡを標識するためのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ；１００mg/kg；Sigma）の腹腔内注入を施し、回復中のラット脳における新生ニューロンを同定する。
【００５６】
実施例１９
脳卒中組織の免疫組織化学およびウェスタンイムノブロット
ラットにおける脳卒中後の血管新生および神経血管微小環境の形成±ＤＶ療法を評価するために、脳卒中を起こした動物および偽の脳卒中を起こした動物からの新鮮な脳組織を液体窒素中で凍結する。血管新生の免疫組織化学について、Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ  ５５０クライオスタット（Walldorf, Germany）を用いて得えた脳卒中を起こした大脳半球の凍結切片を、血管抗原すなわちＣＤ３１およびフォン・ヴィルブランド因子に対する抗体（Dako）を用いてプローブする。ＢｒｄＵ＋ニューロンと血管との相互作用の程度を評価し、そしてＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳを用いて定量する。さらに、脳卒中の組織による注入ＤＶの取り込みおよび分布を、ＤＶの６×ＨＩＳタグに対する抗体（EMD）を用いて示す。非処置の脳卒中を起こした動物と比較して、ＤＶ療法により、脳卒中を起こした脳組織周辺において、血管が増加、すなわちＣＤ３１および／またはフォン・ヴィルブランド陽性細胞が増加し、これはまた、α５β１インテグリン発現が増加し、およびこれらの血管とＢｒｄＵ＋ニューロンとの間の相互作用が増加しているであろう。投与したＤＶは脳卒中部位に局在し、そしてその結果、梗塞サイズが縮小する。
【００５７】
実施例２０
脳卒中によって誘発される脳性麻痺のためのパールカンドメインＶ療法
胎児期または新生児期の間に起こる脳血管事象である、周産期の虚血性脳卒中（ＰＡＳ）は、乳児脳性麻痺の主要な原因である。残念なことに、ＰＡＳは、典型的には遡及的に診断され、すなわち傷害が起こった後に、そして組織プラスミノーゲンアクチベーターなどの伝統的な脳卒中の療法には遅すぎる時期に診断される。それ故、成功裏の脳性麻痺療法は、脳の自己修復機序を活用すべきである。残念なことに、脳の自己修復は十分に解明されていないが、血管再建（血管新生）および神経再増殖（神経新生）の神経血管微小環境において起こるようである。これらの両方の過程には、結果が未知である、プロテアーゼによって駆動される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の再構築が関与する。脳卒中後の脳血管新生および神経血管微小環境の形成は、一部には、ＥＣＭであるパールカンの生物活性フラグメントの生成によって刺激され、そして、この自己修復機序を、ＰＡＳによって誘発される脳性麻痺療法のために活用する。脳卒中は、急速にパールカン（これは、研究されている最もプロテアーゼに対して感受性の高いＥＣＭ成分である）の生物活性フラグメントを生成し、そしてパールカンは、血管新生および神経新生の両方に必要とされる。さらに、パールカンフラグメントであるドメインＶ（ＤＶ、またエンドレペリンとしても知られる）は、α２β１インテグリンを通して脳以外の系においては血管新生を阻害することができる。
【００５８】
本発明は、ＤＶが、脳卒中後に脳においてアップレギュレーションされ、そして意外なことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて脳卒中後に、おそらく脳内皮細胞におけるα２β１インテグリンの不在のために、脳の血管新生を増強することを示す。ＤＶは、血管新生促進性のα５β１インテグリンを通して脳内皮細胞においてその効果を発揮し、そしてニューロンと内皮細胞との間の相互作用を増強する。まとめると、これらの結果は、脳がＤＶ産生を通して自己修復することができ、そしてこれを治療的に活用することができることを示唆する。
【００５９】
ＰＡＳのためのＤＶ療法の有用性を実証するために、エンドセリン−１を使用して、７日齢のラットにおいて一過性の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡｏ）脳卒中を誘発した。その後、動物に、脳卒中から２４時間後および７２時間後に、０．５mg/kgの無菌ＤＶまたはＰＢＳビヒクル対照の腹腔内注入をほどこした。ピークの境界域の（脳卒中組織のすぐ周辺の領域）血管新生が３〜７日後に始まるので、脳卒中を起こした脳の脈管構造を、脳卒中の５日後に調べた。ＤＶで処置した動物には脳卒中皮質の表面上に血管過多が存在したが、これは反対側の皮質またはＰＢＳで処置した脳卒中を起こした動物においては明白ではなかった（図６Ａ〜６Ｂ）。さらに、これらの脳の凍結組織切片を血管マーカーであるフォン・ヴィルブランド因子で免疫染色すると、ＰＢＳで処置した対照と比較して、ＤＶ処置動物においては脳卒中の境界域の脈管構造の有意な増加が明らかとなった（図６Ａ〜６Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＤＶが、ＰＡＳ後の血管新生を増加させ得ることを示唆する。
【００６０】
実施例２１
投与したＤＶは、脳卒中および梗塞周辺組織に局在化する
脳組織を免疫組織化学によって分析して、投与したＤＶ（組換えＤＶのｃ末端上のＨＩＳエピトープタグ）並びに血管（フォン・ヴィルブランド因子）を検出して、投与したＤＶが、脳卒中を起こした脳組織において検出され得るかどうか、そしてそれがどこに局在化し得るかを決定した。図７は、投与したＤＶが、脳卒中を起こした脳組織に豊富に見られ、そして梗塞周辺皮質においてはより少ない程度で見られたが、同じ動物の反対側の脳卒中を起こしていない皮質には見られなかったことを実証する。さらに、投与したＤＶの実質的に全てが、梗塞周辺皮質の血管周辺分布域に蓄積し、そしてより少ない程度で脳卒中組織に蓄積し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその脳血管促進効果および活性化固形腫瘍の血管周囲にターゲティングするその能力と一致する。重要なことには、このことは、ＤＶが、少なくとも反管腔側の血管周囲領域に限り、以前として不明である機序を介して血液脳関門を通過することができ、そこでアストロサイトおよびニューロンなどの他の細胞型に曝されそして効果を発揮することができることを示唆する。図８は、それぞれＰＢＳおよびＤＶで処置した脳卒中を起こした動物の、脳卒中を起こした皮質および反対側の皮質から得た、溶解液のウェスタンブロット分析による類似の結果を実証する。
【００６１】
実施例２２
投与したＤＶは、脳卒中および梗塞周辺組織に局在する
ＤＶ療法が、梗塞脳組織のすぐ近くに隣接する脳領域として定義された、梗塞周辺脳組織中を遊走する神経芽細胞の程度に影響を及ぼし得るか、そしてこれにより新たなニューロンを用いての、脳卒中を起こした脳組織の再増殖に影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、ＰＢＳおよびＤＶで処置した脳卒中を起こした動物からの脳切片のダブルコルチン免疫組織化学を使用し（図９Ａ）、そしてそれぞれの脳卒中梗塞周辺組織における高倍率視野（ＨＰＦ、１匹の動物あたりｎ＝２０の画像）あたりのダブルコルチンのピクセル平均数を定量した。ＤＶ処置動物におけるダブルコルチン陽性ピクセルの有意な増加を認めた。さらに、ＤＶは神経血管微小環境の形成を育成するという仮定に一致するように思われることに、有意に（ｐ＜０．００１）より高い比率の同定されたダブルコルチン陽性細胞を、梗塞周辺脳組織におけるＰＢＳ処置対照（６０％＋／−３％）と比較してＤＶ処置動物（９０％＋／−５％、１匹の動物あたりｎ＝２０の画像）において、フォン・ヴィルブランド抗体またはＨＩＳ抗体に対する抗体によって同定したところ（図９Ｂ）、血管のすぐ近くに認めた。
【００６２】
実施例２３
ＤＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて皮質ニューロンの遊走を増強する
前記の結果によって示唆されるように、脳内皮細胞に対する効果を通して神経血管微小環境の形成を育成することによって、ＤＶは、神経保護性であり得、神経新生および神経遊走を増強し得る。さらに、ＤＶが、血液脳関門を通過するならば、それはまたニューロンに対して直接的な作用を有し得る。ＤＶが、脳卒中に対するその治療能力と一致し得る、直接的な神経作用を有し得るかどうかを決定した。この目的を達成するために、胎生１５日齢のＣ５７Ｂｌ６マウスからのマウス一次皮質ニューロンを、特に髄膜を除去することに注意を払いながら一次細胞単離のための慣用的な無菌的な解剖技術を使用して単離して、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける遊走アッセイを、これらの細胞を用いて実施した。
【００６３】
使用前に、ニューロンの同一性を、ＴＵＪ−１免疫細胞化学を用いて確認した。改変ボイデンチャンバー（NeuroProbe, Gaithersburg, MD）の上のチャンバーにニューロン（３×１０３個／ウェル）をローディングし（３７℃での１００nMまたは２００nMのＤＶ懸濁液を含む適切な無血清培地中での３０分間のプレインキュベーションを含むまたは含まない）、そしてその後、Ｉ型コラーゲンでコーティングしたポリカーボネート膜を横切って８時間かけて３７℃で、ケモアトラクタントである神経成長因子（ＮＧＦ、下の１つのウェルあたり４nM）に向けて遊走させた。その後、膜（遊走細胞を含む）をアセトンで固定し、そして細胞をクリスタルバイオレット（Sigma）で染色し、そして顕微鏡下で計測した。図１０は、ＤＶ処置により、有意に、そして用量依存的に、ＮＧＦに向けての皮質ニューロン遊走が増強した（両方のＤＶ濃度についてｐ＜０．０００１）ことを実証することによって、ＤＶが皮質ニューロン遊走を増強することを示し、ＤＶは、ニューロンに対して直接的で治療的な効果を有し得ることを示唆する。
【００６４】
ＤＶ療法は、機能上の脳卒中の予後を改善する
図１１は、脳卒中後の３日目以降に、偽対照とドメインＶで処置した脳卒中を起こした動物との間に統計学的な差異が全くなかったことを示す。ドメインＶ処置動物を、脳卒中後１、３、５、７日目に０．５mg/kgを用いて処置した。
【００６５】
実施例２４
ドメインＶは、ＢＤＮＦの遊離を誘発する
本明細書におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの結果は、ＤＶによる処置が、神経血管脳修復を助け、これは、一部には、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの神経血管促進因子のＤＶにより誘発される遊離に起因し得ることを示唆する。図１２Ａは、２４時間後、ＤＶにより、有意に（＊＊ｐ＝０．００２５）脳微小血管内皮細胞によるＢＤＮＦの遊離が増強することを実証する。同様に、脳卒中後のＤＶによる処置により、ＰＢＳ処置対照と比較して、脳卒中から３日後および７日後に脳卒中を起こした脳のＢＤＮＦレベルが有意に増加した（図１２Ｂ〜１２Ｃ）。さらに、一次単離ラットアストロサイトまたは皮質ニューロンへのＤＶの添加によるＢＤＮＦレベルに対する効果は全く見られず、このことは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける脳ＢＤＮＦレベルに対するＤＶの効果は、主に、脳内皮細胞により媒介される効果であり得ることを示唆する。
【００６６】
実施例２５
ドメインＶは、α５β１インテグリンと相互作用し、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮する
脳微小血管内皮細胞は、以前に同定されたＤＶレセプターα２β１インテグリンを発現しないので、脳内皮細胞に対するＤＶの血管新生促進作用は、α２β１の不在および別個の血管新生促進性ＤＶレセプターの存在の両方に起因し得る。α５β１は、血管の発達にとって非常に重要であり、そして脳卒中後の脳の血管新生を促進するが、それ以外では、低酸素症後に脳内皮細胞において再発現されるまでは成熟脳においてはダウンレギュレーションされている。血管新生促進成長因子のアンジオポエチン１の単量体変異体は、α５β１インテグリンに結合し、そしてα５β１インテグリンを介して血管の安定化を促進し、このことは、血管新生および血管再構築におけるこのレセプターの重要性をさらに強調する。
【００６７】
α５β１インテグリンの特異的活性化が、ＢＤＮＦレベルに影響を及ぼし得るかどうかが初めて決定された。図１２Ａは、ａ５リガンド結合ドメインを特異的に認識するα５β１抗体を用いての細胞の処置により、単独で、ＢＤＮＦの遊離が増加することができたことを実証する。さらに、リガンド結合ドメインの外の領域に結合し、これによりα５β１がリガンドに結合するように刺激することによってα５β１インテグリンを活性化する抗体であるＳＮＡＫＡ５１により、ＢＤＮＦレベルが有意に増加した（ｐ＝０．０００７）。興味深いことに、α５β１抗体とＤＶとの同時添加はＢＤＮＦの遊離を阻害したが、ＤＶとＳＮＡＫＡ５１との同時添加はＢＤＮＦレベルをさらに増加させた（ｐ＝０．０６）。これは、ＤＶが、α５リガンド結合ドメインに結合することによってＢＤＮＦの遊離を増加させるという仮定と一致する。
【００６８】
ＤＶへの脳微小血管内皮細胞の接着が、α５β１に依存し得るかどうかを、α５リガンド結合ドメインに対して作られたα５β１抗体が、固定したＤＶへのその接着を防ぎ得ることを実証することによって調べた（図１２Ａ）。組換えα５β１インテグリンを用いてのＥＬＩＳＡによって、ＤＶが、α５β１に用量依存的に約３０nMのＫＤで結合することが実証された（図１３Ｂ）。ＤＶの血管新生促進作用とα５β１とをさらに関連づけるために、ＤＶに向かう脳内皮細胞の遊走が、フィブロネクチン−ＧＳＴおよび可溶性α５β１−ＧＳＴの両方によって阻害され得ることが実証された（図１３Ｃ）。さらに、α５β１特異的結合ペプチドＣＲＲＥＴＡＷＡＣ（配列番号３）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて脳内皮細胞細管形成に対するＤＶの効果を有意に（ｐ＝０．００１）阻害することができた（図１３Ｄ〜１３Ｅ）。
【００６９】
ＤＶが、脳内皮細胞によるα５β１の発現を増加させることによって一部には脳血管新生を増加させるかどうかに対処するために、８時間かけてのコンフルエントな脳内皮細胞単層のＤＶによる処置は、完全なα５β１タンパク質レベルを維持したが、これはさもなければ無血清対照条件においては有意に消失した（図１３Ｆ）。さらに、プラスチック上で増殖させた脳内皮細胞のＤＶによる処置により、α５β１インテグリンは表面／葉状仮足へと有意に再分布したが（図１３Ｇ）、アストロサイトまたは一次皮質ニューロンにおけるα５β１の表面発現は全く影響を受けなかった。最後に、ＤＶがｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもα５β１インテグリンレベルに影響を及ぼし得るかどうかを決定するために、脳卒中後３日目の動物＋／−ＤＶ処置の脳卒中を起こした半球および反対側の半球からの脳溶解液のウェスタンブロット分析を実施し（図１３Ｈ）、そしてＤＶで処置した動物の脳卒中を起こした脳組織において有意により多いα５β１インテグリンを観察した（ｐ＝０．００００４、定量は示していない）。まとめると、これらの結果は、ＤＶがα５β１インテグリンに結合し、α５β１インテグリンの発現に影響を及ぼし、そしてα５β１インテグリンを介してその血管新生促進作用を発揮することを示唆する。
【００７０】
α２β１インテグリンは、ＤＶの細胞増殖活性を逆転させる
Ｃ５７マウス脳内皮細胞へのα２β１インテグリンの添加は、ドメインＶの細胞増殖活性を逆転させる。ＤＶは、α２β１インテグリン（抗血管新生性レセプター）およびα５β１インテグリン（血管新生促進性レセプター）の両方を発現する大半の内皮細胞において抗血管新生性であるので、ＤＶは、α５β１インテグリン（Ｋｄは１６０nM）を超えるα２β１インテグリン（Ｋｄは約３０nM）に対するその増加した親和性に因りこれらの細胞において抗血管新生性であると考えられた。α２β１インテグリンを、通常はこのレセプターを発現しないマウス脳微小血管内皮細胞にトランスフェクションした。これは、Ｃ末端ＲＦＰ融合タンパク質（Texas A&M University Biomedical Engineering）を含むα２−サブユニットインテグリンをコードする配列を含むプラスミドベクター（ｐＥＧＦＰ−Ｎ２, Clontech）を用いてのトランスフェクションによって達成され、空のベクターを、対照として使用した。細胞を、抗生物質を全く含まない培地中で２４時間の間に回復させた。倒立蛍光顕微鏡を使用して２４時間後にトランスフェクション効率を評価した。細胞増殖を、製造業者の指示に従ってＭＴＳ溶液（Promega, Madison, WI）を含む無血清培地中で４８時間後に評価した。ＤＶにより、細胞培地対照と比較して、マウス脳内皮細胞の増殖は増加し、これは、ＶＥＧＦ中和抗体またはα５β１インテグリン機能遮断抗体の添加によって遮断され得る（図１４Ａ）。α２β１インテグリンの細胞への添加により、細胞の増殖は増加するよりもむしろ抑制され、このことは、α２β１インテグリンのマウス脳内皮細胞への添加は、ＤＶを、増殖性から抗増殖性へと変換することを実証する。バーは、平均値＋／−標準偏差である（図１４Ｂ）。＊＊ｐ＜０．０１。＃＃ｐ＜０．０１。
【００７１】
Ａ５へのＤＶの結合の動態
結合アッセイを、記載（１７）のように光学バイオセンサー（ＩＡｓｙｓ; Affinity Sensors, UK）を使用して実施した。簡潔に言うと、センサーの表面上の、アクセプターと称されるＡ５ドメインに共有結合させるために、表面上に存在するカルボン酸基を、０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドと０．４ＭのＮ−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Pierce）の１：１混合物の注入によって活性化した。その後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に溶解したアクセプターを、応答プラトーに到達するまで活性化表面に結合させた。残留活性基を、１００μLの１Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の注入によって遮断した。
【００７２】
固定したＡ５を有するキュベットを、１０分間かけて２５℃の結合緩衝液（１５０mM ＮａＣｌ、２５mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４および１mM ＭｎＣｌ２）を用いて予備刺激した。結合緩衝液中に溶解した遊離ＤＶ相互作用物を含む１００μLの試料をキュベットに加え、その後、会合相を記録した。続いて、試料を取り除き、分析物の含まれていない緩衝液をキュベットに加え、そして解離相を記録した。各アッセイの後、キュベットの表面を、１００mMグリシン（ｐＨ＝４）を用いて簡潔に洗浄し、その後、結合緩衝液を用いて平衡化することによって再生した。再生サイクル中に表面に結合した分析物の完全な除去に注意を払い、そして基線値に等しい応答に到達するまで洗浄を続けた。
【００７３】
結合アッセイのために、８．０×１０−８Ｍから４．０×１０−７Ｍの範囲の濃度で遊離ＤＶを加えた。バイオセンサーからのデータを、記載（１８）のようにグローバルフィッティング法によって分析した。各アッセイについて、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）を得、そして平衡解離定数（Ｋｄ）値を、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比から計算した。さらに、８．０×１０−７（ＤＶの最高濃度の２倍）のモル濃度におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の対照結合も実施した。表１に示したように、ＤＶは、α５β１インテグリンに結合する。
【００７４】
【表１】
0005591825.tif 000002
【００７５】
これらの研究は、細胞外マトリックス由来の血管新生阻害剤であるパールカンＤＶは、脳卒中で損傷された脳において安定かつ慢性的に生成されることを実証する。極めて意外なことに、投与したＤＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて脳の血管新生を阻害するのではなくむしろ増強する。ＤＶは、それぞれラットおよびマウスのエンドセリン−１および直列型同側ＣＣＡ＆ＭＣＡ脳卒中モデルにおいて、脳卒中および梗塞周辺脳組織に向かい、少なくとも一部には増強されたＢＤＮＦ遊離に因り神経血管微小環境の形成を増強し、そして最終的には基線の脳卒中前のレベルにまで機能的運動的予後を改善する。最後に、ＤＶは、α５β１インテグリンを介して、α２β１インテグリンの非存在下において脳内皮細胞の血管新生を増強する。
【００７６】
ニューロン、アストロサイトおよび内皮細胞によって合成および分泌されるパールカンは（後者の場合にはＶＥＧＦ１６５によって誘発される）、脳卒中後に最も感受性が高くそして急速にプロセシングされるマトリックス成分であるという特徴を有する。カテプシンＬによるパールカンのタンパク質分解は、非ヒト霊長類において中大脳動脈の閉塞から２時間以内に起こり、そして数日間持続する。脳卒中後の数日間におよぶパールカンの持続的なプロセシングは、脳損傷後のニューロンおよびアストロサイトにおけるパールカンの産生の増加を実証する研究と一致する。本研究においては、急速なパールカンＤＶレベルの増加が見られ、これは７日間の経過をかけて上昇したレベルで次第にプラトーに達し、この時間的なパターンは、非ヒトの霊長類の脳卒中後のパールカンのタンパク質分解プロファイルとよく相関している。
【００７７】
抗血管新生性細胞外マトリックスフラグメントが脳血管新生を促進する能力は、内皮異質性の概念に起因し得、異なる血管床の内皮細胞は（この場合には脳ｖｓ脳以外）、血管調節因子に対して異なって応答する。この異なった応答は、それぞれの微小環境の差異、発現されるレセプターの差異、例えばα２β１インテグリンの存在もしくは不在、またはシグナル伝達成分の差異に起因し得る。さらに、ＸＶＩＩＩ型コラーゲン由来の血管新生阻害剤のエンドスタチンは、分化した胚幹細胞から派生した未成熟内皮細胞において血管新生を促進し、このことは、血管新生性脳内皮が、未成熟な内皮のように機能または挙動する可能性をもたらす。実際に、新たな血管新生性の脳内皮は、脳低酸素症後に、成熟したインテグリンレセプターから、発達性のインテグリン発現へ、特にα５β１インテグリンへと戻る、インテグリンレセプターのスイッチを受ける。
【００７８】
α５β１インテグリンの脳卒中後の増強された発現はまた、ＤＶが、脳卒中および梗塞周辺皮質脈管構造へと向かう能力を説明し得、これはちょうど、α２β１を発現している腫瘍脈管構造がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＤＶのターゲティングを支持するのと同じである。さらに、脳卒中のほぼ直後のパールカンのタンパク質分解およびＤＶの生成は、インテグリンレセプタースイッチのトリガーの一部として作用し得る。これは、ＤＶにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける脳内皮細胞上のａ５ｂ１インテグリンの発現総量、および脳卒中後の脳組織のα５β１インテグリンレベルが増加したという観察によって支持される。
【００７９】
本発明はまた、ＤＶが、ＢＤＮＦの遊離を刺激することを示す。ＢＤＮＦは、血管新生促進性かつ神経保護性の両方であり、そして神経の遊走および神経幹細胞の複製を刺激する。ＢＤＮＦは、ラットにおける脳卒中後のリハビリテーションによって誘導される回復にとって必須である。
【００８０】
局所脳虚血は、血液脳関門の破壊を引き起こし、これは微小血管完全性の消失および血管外空間への血漿構成成分の漏出として顕現する。さらに、透過性の早期上昇の予防は、損傷の予後にとって有益であり得る。ｎＤＶは、この機能を実施し得、そしておそらくさらにはこの時間枠内で関門の機能を改善し、従って損傷度を低減させ得る。興味深いことに、血管細胞外マトリックスを破壊し、そして急性の脳卒中の血管漏出の直接的な原因となる同じタンパク質分解過程もまた、ＤＶを生成し、このことは、脳卒中によって誘発される血管マトリックスのタンパク質分解は、完全に有害ではないことを示唆する。８時間後の後続のＤＶによって誘発される透過性は、酸素送達のための定常状態の迅速な再確立に寄与する早期の血管再構築における役割を示し得る。特に、ＤＶによって誘発される微小血管透過性増加の後に、脳卒中モデルに見られる２４〜４８時間後の第二相の関門漏出が起こり、このことはさらにこの可能性に説得力を与える。
【００８１】
実施例２６
ＤＶは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血液脳関門の透過性に有意に影響を及ぼさない
ＤＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて脳内皮細胞におけるＴＥＥＲを減少させ得ることが実証されたので（血液脳関門の透過性がすでにマイナスに影響を受けている場合の脳卒中後の潜在的に懸念される作用である）、ＤＶが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血液脳関門の透過性に対して任意の作用を及ぼしたかどうかを決定した。
【００８２】
材料および方法
［３Ｈ］マンニトール（１４．２Ci/mmol）および［１４Ｃ］スクロース（４１２mCi/mmol）をMoravek Biochemicals（USA）から購入した。残りの化学品は、Sigma Chemical Company（UK）から購入した。マウスは、Harlan, UKから購入した。
【００８３】
全ての実験は、Animals Scientific Procedures Act（1986, UK）のガイドライン内で実施した。成体雄ＢＡＬＢ／ｃ（２７．３±０．３ｇ）およびＣ５７Ｂｌ６（２７．９±０．６ｇ）マウスを麻酔し（腹腔内にメデトミジン塩酸塩（２mg/kg）およびケタミン（１５０mg/kg））、そしてヘパリン処置し（１００Ｕ、腹腔内）、そしてin situにおける脳灌流技術を、Sanderson et al., 2007によって記載のように、心臓の左心室へのカニューレ挿入および右心房の切開によって実施した。人工血漿は、［３Ｈ］マンニトール（３５．２nM；１８２Ｄａ；半径＝３．６Å）および［１４Ｃ］スクロース（１．１mM；３４２Ｄａ；半径４．６Å）を含み、そして灌流は１０分間であった。その後、動物を断頭し、そして脳領域（前頭皮質、後頭皮質、尾状核、海馬、視床下部、視床、小脳、脳橋）を液体シンチレーション計測のために採取した。組織放射能の量を、人工血漿中におけるその比率として表現し、そしてＲ組織％と称した（ml.１００ｇ−１）。マウスの別々の群に、ＰＢＳビヒクルに溶解したＤＶ（１mg/kg）を投与し、そしてin situにおける脳灌流手順を、注入から２、８および２４時間後に実施した。これらの実験群を、ビヒクルのみを受けた動物と比較した。脳（前方中央の回）水分含量に対するＤＶの効果も、試験した時点において調べた。２要因の分散分析または１要因の分散分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアパッケージ（GraphPad Software Inc.）を使用してデータに適用した。
【００８４】
マウスにおける血管空間に対するＤＶの効果
ＢＡＬＢ／ｃ系においては、［１４Ｃ］スクロースおよび［３Ｈ］マンニトールによって測定した全ての脳領域における血管空間は、ＤＶ（１mg/kg、図１５Ａ）の腹腔内注入の８時間後または２４時間後に有意に影響を受けなかった。さらに、脳の水分含量は０時間目において７３．３±１．３％であり、そしてＤＶ（１mg/kg）の腹腔内注入によって８時間後（６４．６±３．４％）または２４時間後（７２．８±２．９％）に有意に影響を受けなかった（１要因の分散分析）。Ｃ５７Ｂｌ６系においては、［１４Ｃ］スクロースおよび［３Ｈ］マンニトールによって測定した全ての脳領域における血管空間は、ＤＶ（１mg/kg、図１５Ｂ）の腹腔内注入から２時間後に有意に影響を受けなかった。
【００８５】
以下の参考文献を本明細書において引用する。
【表２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【配列表】
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