(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料に由来する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定方法であり、
（ａ）微生物を含むことが既知であるまたは微生物を含む可能性がある試験試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試験試料中に非微生物細胞を選択的に溶解させて溶解試料を生産するステップと、
（ｃ）前記溶解試料を容器内の密度クッション上に積層するステップと、
（ｄ）前記容器を遠心分離にかけて前記溶解試料の他の構成成分から微生物を分離して前記微生物のペレットを形成するステップと、
（ｅ）前記ペレットからの前記微生物を質量分析で解析して前記微生物の質量スペクトルを生成するステップと、
（ｆ）測定された前記質量スペクトルと、参照質量スペクトルおよび／または既知の微生物の細胞成分の既知質量もしくは予測質量と、を比較することにより前記ペレット中の前記微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うステップとを含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であり、前記ステップ（ｄ）で得られた前記微生物の前記ペレットの少なくとも一部は回収され、解析する前記ステップ（ｅ）の前に担持体上に配置されることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であり、前記質量分析は、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）質量分析、ＧＣ質量分析、ＬＣ質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析、および選択イオンフローチューブ（ＳＩＦＴ）分析を含む群から選択されることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であり、前記微生物は、１つまたは複数の表現型特徴および／または形態学的特徴に基づいてキャラクタリゼーションされることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であり、前記微生物は１つまたは複数の分類モデルにキャラクタリゼーションされ、前記分類モデルは、グラム群、臨床グラム群、治療群、および機能群を含む群から選択されることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であり、前記微生物を、属レベル、種レベルまたは株レベルまで同定されることを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であり、選択的に溶解させる前記ステップ（ｂ）は、１つまたは複数の洗浄剤並びに１つまたは複数のプロテイナーゼ及び１つまたは複数のヌクレアーゼの混合物を含む１つまたは複数の酵素を含む溶解溶液を使用して実行されることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であり、前記密度クッションは、コロイドシリカ、ヨウ化造影剤、スクロース、顕微鏡用液浸油、鉱油、シリコーン油、フルオロシリコーン油、シリコーンゲル、メトリゾエート‐Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、ジアトリゾエート‐デキストラン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド（高分子量）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、ポリアクリル酸、架橋したポリビニルアルコール、架橋したポリビニルピロリジン、ＰＥＧメチルエーテルメタクリレート、ペクチン、アガロース、キサンタン、ジェラン、Ｐｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）、ソルビトール、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、グリセロール、デキストラン、グリコーゲン、塩化セシウム、パーフルオロカーボン液、ハイドロフルオロカーボン液、およびこれらの組み合わせ、のうちの１つまたは複数を含むことを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であり、前記試験試料は微生物を含むことが既知である培養試料であることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年１０月３１日に出願した米国仮特許出願第６１／１１０，１８７号「Method and System for Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample」の恩典を主張する。この米国仮特許出願の開示内容を本明細書に援用する。
【０００２】
本発明は試料中の微生物を検出、単離および／または同定する方法およびシステムに関するものである。特に、本発明は質量分析を使用した微生物の迅速なキャラクタリゼーションおよび／または同定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
生物学的流体中の病原微生物の検出は可能な限り短い時間で行う必要があり、医師が利用できる広範な抗生物質が存在するにも関わらず依然として死亡率が高い敗血症の場合は特にそうである。患者の体液、特に血液中の微生物のような生物学的活性剤の存在は通常血液培養瓶を使用して判定される。血流感染症は高い罹患率および死亡率と関連付けられるが、培養後に生化学的同定および抗生物質感受性試験を行う現行の診断法は実施期間が数日に及ぶこともある。典型的には、臨床症状に基づく経験的治療が開始されるが、試験結果が臨床決定に影響を及ぼすのは初期治療が失敗したときだけである。陽性の血液培養結果が出てから最初の数時間以内、好ましくは１時間以内に血流感染をキャラクタリゼーションることができれば診断情報の臨床的意義が大きく高まるはずである。この必要性を満足するために分子増幅法が提案されているが、この手法にも大きな難題が残っている。陽性の血液培養ブロス自体は種々の同定（ＩＤ）試験で使用され得る微生物の自然増殖個体群である。
【０００４】
Ｖｉｔｅｋ（登録商標）、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）システムのような従来の自動化表現型ＩＤ試験、またはＡＰＩのような手動表現型試験では、強固な結果を得るために、微生物が適切な発育相にあり且つ干渉する培地および血液製剤が存在しないことが必要である。これらのシステムでは陽性ブロスから１８〜２４時間かけて平板培養培地上で培養したコロニーが使用される。しかしながら、より迅速な結果を得るための試みとして微生物を陽性血液培養瓶から隔離したシステムの使用が一部の研究室から報告されている。このようなダイレクトフロムボトル試験（direct-from-the-bottle test）は必ずしもすべての微生物（例えばグラム陽性球菌）に適しているわけではなく、試験製造業者によって検証されておらず、通常は結果が得られるまで３〜８時間かかる。陽性の培養結果が出てから最初の数時間以内、好ましくは１時間以内に臨床的に意義のある結果を医師に提供するために、より迅速かつより広範な特異的試験の提供が急務である。
【０００５】
質量分析法は、非常に迅速な微生物の同定を可能にする可能性があるが、液体微生物学的培養基中および血液のような臨床試料中またはそれらの組合せに存在する多くの化合物から干渉を受ける恐れがある。陽性血液培養ブロスから微生物を直接回収するために最も一般的に利用されている方法は、２ステップの分画遠心分離および血清分離チューブ内の遠心分離である。
【０００６】
他の微生物分離、キャラクタリゼーションおよび／または同定方法が下記の文献に記載されている。
【０００７】
米国特許第６，１７７，２６６号には、細胞タンパク質抽出物または全細胞のマトリックス支援レーザー脱離イオン化／飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ‐ＭＳ）分析によって生成される属、種および株固有のバイオマーカーによるバクテリアの化学分類方法が開示されている。
【０００８】
米国特許第７，０７０，７３９号には、２次元超遠心分離によりウイルスを含む微生物を体液または均質化組織から直接抽出、分離および浄化する方法が開示されている。第１の遠心分離ステップで、同定すべき微生物よりも沈殿速度が速い粒子がすべて除去される。第２の超遠心分離ステップで、特殊な鋸歯状の遠心チューブを使用して充填液体中で等密度バンディングを使用して広範な密度勾配を形成する。この特許によれば、核酸固有の色素を使用してバンディング粒子を光散乱または蛍光によって検出し、ウイルスタンパク質サブユニットおよび完全なウイルス粒子の質量分析、および核酸質量と制限酵素によって生産される断片の質量の両方に関する蛍光フロー血球計算測定により、非常に小さい体積のバンディング粒子を回収しキャラクタリゼーションするための分離技法を使用することができる。
【０００９】
米国特許出願第２００７／００３７１３５号には、液体中に懸濁した生物学的試料を同定および定量化するためのシステムが開示されている。このシステムは、少なくとも１つの励起光源を有する蛍光刺激モジュールと、少なくとも１つの励起光源から励起光を受け取るように生物学的試料を配置する蛍光刺激モジュールと光学的に結合した試料インターフェースモジュールと、試料インターフェースモジュールと光学的に結合した蛍光放出モジュールであって、生物学的試料の蛍光励起‐発光マトリックスを検出する少なくとも１つの検出装置を備える蛍光放出モジュールと、蛍光放出モジュールと動作可能に結合されたコンピュータモジュールとを含む。コンピュータモジュールは生物学的試料の蛍光励起‐発光マトリックスに関する多変量解析を実行して生物学的試料の同定および定量化を行う。しかしながら、米国特許出願第２００７／００３７１３５号では血液のような複雑な生物学的試料に由来する微生物の同定および定量化については論じられていない。
【００１０】
米国特許出願第２００７／０１７５２７８号には、対象試料を培養するための液体培養基の使用が記載されている。試料としては、例えば血液、尿、糞便、静脈内カテーテル等、工業生産ライン、水道システム、食品、化粧品、医薬品および法医学的試料が挙げられる。続いて、当業界で既知の方法、例えば遠心分離により液体培地から微生物を回収することができる。その後、これらの濃縮微生物を任意選択で乾燥後に担持材に移して振動スペクトルを得ることができる。この特許出願では微生物を同定および分類するためのラマン分光法のような振動分光法を含めた様々な方法が論じられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６，１７７，２６６号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０７０，７３９号明細書
【特許文献３】米国特許出願第２００７／００３７１３５号明細書
【特許文献４】米国特許出願第２００７／０１７５２７８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、これらの方法は血液含有培養基のような複雑な試料から微生物を分離しキャラクタリゼーションを行おうとするときにいくつかの欠点を有する。結果として得られる微生物製剤がしばしば赤血球、血小板、脂質粒子、血漿酵素および細胞残屑の汚染を伴い、それによって思わしくない結果を招く恐れがある。また、これらの方法は、使用者が潜在的に危険な病原体のエアロゾルに曝される恐れがあるステップが存在する故に非常に労働集約的であり安全性も欠く。血液培養ブロスおよび他の複雑な試料から微生物を単離するために、上記のような干渉材料が存在せず且つ迅速同定技術に適合した単純で安全な信頼性のある方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、試料中の微生物の単離、キャラクタリゼーションおよび／または同定方法を提供する。これらの方法を用いると、微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を従来技術よりも迅速に行うことができ、それにより（例えば敗血症を患うまたはその疑いがある被験者の）より迅速な診断が可能となり、また（例えば食品および医薬品の）汚染材料の特定も可能となる。試料の採取から微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定に至る本発明の方法に含まれる各ステップを非常に短い時間枠、例えば約１２０分未満で実行して臨床的に意義のある実用的な情報を生成することができる。
【００１４】
一態様において、本発明は試験試料に由来する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定方法であって、
（ａ）微生物を含むことが既知であるまたは微生物を含む可能性がある試験試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試験試料中に非微生物細胞を選択的に溶解（lysing）させて溶解試料を生産するステップと、
（ｃ）前記溶解試料の他の構成成分から微生物を分離して前記微生物の単離試料を形成するステップと、
（ｄ）前記微生物の前記単離試料を質量分析で解析して前記微生物の質量スペクトルを生成するステップと、
（ｅ）測定された前記質量スペクトルと、参照質量スペクトルおよび／または既知の微生物の細胞成分の既知質量もしくは予測質量と、を比較することにより前記単離試料中の前記微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うステップとを含む方法に関するものである。
【００１５】
一態様において、本発明は血液培養物に由来する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定方法であって、
（ａ）微生物を含むことが既知であるまたは微生物を含む可能性がある血液培養物から試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試料中に非微生物細胞を選択的に溶解させて溶解試料を生産するステップと、
（ｃ）前記溶解試料を封止容器内の密度クッション上に積層するステップと、
（ｄ）前記容器を遠心分離にかけて前記試料の他の構成成分から微生物を分離し微生物ペレットを形成するステップと、
（e）前記微生物の単離試料を質量分析で解析して前記微生物の質量スペクトルを生成するステップと、
（ｆ）測定された前記質量スペクトルと、参照質量スペクトルおよび／または既知の微生物の細胞成分の既知質量もしくは予測質量とを比較することにより前記単離試料中の前記微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うステップとを含む方法に関するものである。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定方法であって、
（ａ）微生物を含むことが既知であるまたは微生物を含む可能性がある試験試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試験試料を容器内の密度クッション上に積層するステップと、
（ｃ）前記容器を遠心分離して、前記微生物を前記試験試料の他の構成成分から分離して微生物ペレットを形成するステップと、
（ｄ）前記ペレットを質量分析で解析して前記微生物の質量スペクトルを生成するステップと、
（ｅ）測定された前記質量スペクトルと、参照質量スペクトルおよび／または既知の微生物の細胞成分の既知質量もしくは予測質量と、を比較することにより前記単離試料中の前記微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うステップとを含む方法に関するものである。
【００１７】
一実施形態において、前記分離は前記試験試料を容器内の密度クッション上に積層し、前記試験試料の培地が前記密度クッションの頂部に残っている間に容器を遠心分離にかけて微生物をペレット化することによって実行される。
【００１８】
一実施形態において、本方法は、前記微生物ペレットを回収するステップと、前記微生物を再懸濁するステップと、ケンダク液からサンプルを取り出して質量分析計に導入するステップと、前記試料の質量分析を行うステップとを含む。
【００１９】
他の実施形態では、前記方法は更に、前記微生物ペレットを回収し、前記微生物を再懸濁し、更なる同定またはキャラクタリゼーション試験（例えば薬剤耐性、毒性因子（virulence factor）、耐性記録）を実行するステップを含む。
【００２０】
以下、添付図面を参照しながら本発明の詳細な説明を行う。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】血液培養から処理および回収された様々な微生物の質量スペクトルを示す図である。
【図２】血液培養ブロスから処理および回収された５つの単離Ｓ．ａｕｒｅｕｓ質量スペクトルを示す図である。
【図３】寒天プレートから直接得たＥ．ｃｏｌｉの質量スペクトルと、本発明によって、血液培養ブロスから処理したＥ．ｃｏｌｉの質量スペクトルとの比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は様々な形態で実施することができる。本発明は本明細書に記載した実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。そうではなく、これらの実施形態は本開示が詳細で完全なものとなり、本発明の範囲が当業者に十分伝わるようにするために提示するものである。例えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の一実施形態に関して例示した特徴をその実施形態から削除することもできる。また、本開示に照らせば、本明細書に示した実施形態に対する本発明から逸脱しない様々な変更および追加が当業者には理解されるであろう。
【００２３】
別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、発明の説明で使用する用語は特定の実施形態を説明するためのものであって本発明を限定するものではない。
【００２４】
［定義］
本明細書で使用する「a」、「an」または「the」は１つまたは２つ以上のものを意味する可能性がある。例えば「細胞（a cell）」という場合は単一の細胞を意味することも複数の細胞を意味することもある。
【００２５】
また、本明細書で使用する「および／または（and/or）」という表現は、列挙した関連アイテムの１つまたは複数を対象とする任意の可能な組合せに加えて選択肢（「または（or）」）として解釈した場合の組合せの欠如も指し、それらをすべて包含するものである。
【００２６】
更に、本明細書で使用する「約（about）」という用語は、本発明の化合物または作用物質の量、投与量、時間、温度といった測定可能な値を指すときは、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％または±０．１％のばらつきを含むものとする。
【００２７】
本明細書で使用する「微生物」という用語は、一般に単細胞であり、研究室で繁殖および取扱い可能な有機体を包含する。このような有機体としてはグラム陽性またはグラム陰性バクテリア、イースト、カビ、寄生虫およびモリキューテスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のグラム陰性バクテリアの非限定的な例としては下記の属のバクテリアが挙げられるが、これらに限定されるものではない：シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ステノトロフォモナス属、ブレブンディモナス属、ラルストニア属、アクロモバクター属、フゾバクテリウム属、プレボテラ属、ブランハメラ亜属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属、アエロモナス属、モラクセラ属、ブルセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属およびレジオネラ属。本発明のグラム陽性バクテリアの非限定的な例は、以下の属のバクテリアを含む：腸球菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス属、パエニバチルス属、乳酸桿菌属、リステリア属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ガードネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス、マイコバクテリウム属およびコリネバクテリウム属。本発明のイーストおよびカビの非限定的な例としては下記の属のイーストおよびカビが挙げられるが、これらに限定されるものではない：カンジダ属、クリプトコックス属、ノカルジア属、アオカビ属、アルタナリア属、ロドトルラ属、アスペルギルス属、フザリウム属、サッカロミセス属およびトリコスポロン属。本発明の寄生虫の非限定的な例としては下記の属の寄生虫が挙げられるが、これらに限定されるものではない：トリパノソーマ属、バベシア属、リーシュマニア属、マラリア原虫属、ブケリア属（Wucheria）、ブルギア属、オンコセルカ属およびネグレリア属。本発明のモリキューテスの非限定的な例としてはマイコプラズマ属およびウレアプラズマ属のモリキューテスが挙げられる。
【００２８】
一実施形態では、以下で詳細するように、試料または培養培地に由来する微生物を分離および解析して該試料中に存在する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うことができる。本明細書で使用する「分離（separate）」という用語は、それ自体の初期状態すなわち培養培地または培養基から除去、濃縮または他の方法で切り離された微生物の任意の試料を包含するものとする。例えば、本発明によれば、通常ならキャラクタリゼーションおよび／または同定に干渉する恐れがある非微生物または非微生物構成成分から微生物を（例えば分離試料として）分離することができる。この用語は、他の２層に挟まれた微生物、例えば遠心分離後に高密度クッションの頂部に集められた微生物の層、または固体表面（例えばフィルター膜）上に集められた微生物の層を含む。この用語は、ある層（例えば密度クッション）を部分的に通過した一群の微生物も含む可能性がある。したがって、分離する微生物試料は、当初の試料よりも濃縮されたまたは当初の試料から切り離された一群または一層の微生物および／または微生物の構成成分を含む可能性があり、微生物が密集した高密度凝集塊から微生物の拡散層に及ぶ様々なものが存在する可能性がある。分離フォームまたは分離試料に含まれ得る微生物構成成分としては線毛、鞭毛、フィムブリエおよびカプセルの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。微生物から分離する非微生物構成成分は非微生物細胞（例えば血球および／または他の組織細胞）および／またはそれらの任意の構成成分を含む可能性がある。
【００２９】
また別の実施形態では、以下で詳述するように、試料または培養培地に由来する微生物を単離および解析して該試料中に存在する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うことができる。本明細書で使用する「単離（isolated）」という用語は、それ自体の初期状態すなわち培養培地もしくは培養基から少なくとも部分的に浄化された微生物の任意の試料、および任意の非微生物もしくはそれらに含まれる非微生物構成成分を包含するものとする。例えば、本発明によれば、分離しない場合はキャラクタリゼーションおよび／または同定に干渉する恐れがある非微生物または非微生物構成成分から微生物を（例えば分離試料として）分離することができる。微生物から分離する非微生物構成成分は非微生物細胞（例えば血球および／または他の組織細胞）および／またはそれらの任意の構成成分を含む可能性がある。
【００３０】
また別の実施形態では、以下で詳述するように、試料または培養培地に由来する微生物をペレット化し解析して試料中に存在する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うことができる。本明細書で使用する「ペレット（pellet）」という用語は、一塊の微生物として圧縮または堆積した微生物の任意の試料を包含するものとする。例えば、ある試料に由来する微生物を遠心分離または当業界で知られる他の方法によりチューブの底部に一塊に圧縮または堆積させることができる。この用語は、遠心分離後の容器の底部および／または側面上に存在する一群の微生物（および／またはその構成成分）を含む。ペレットに含まれ得る微生物構成成分としては線毛、鞭毛、フィムブリエおよびカプセルの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明によれば、通常ならキャラクタリゼーションおよび／または同定に干渉する恐れがある非微生物または非微生物構成成分から微生物を（例えばほぼ浄化された微生物ペレットとして）切り離してペレット化することができる。微生物から分離する非微生物構成成分は非微生物細胞（例えば血球および／または他の組織細胞）および／またはそれらの任意の構成成分を含む可能性がある。
【００３１】
本明細書で使用する「密度クッション（density cushion）」という用語は、全体的に均質な密度を有する溶液を指す。
【００３２】
本発明は、試料中の微生物の単離、キャラクタリゼーションおよび／または同定方法を提供する。更に、本方法は、特に血液含有培養基のような複雑な試料に由来する微生物の分離、キャラクタリゼーションおよび／または同定に有用である可能性がある。これらの迅速な方法を用いると、微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を従来技術よりも迅速に行うことができ、それにより（例えば敗血症を患っているまたはその疑いがある被験者の）より迅速な診断が可能となり、また（例えば食品および医薬品の）汚染材料の特定も可能となる。試料の採取から微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定に至る本発明の方法に含まれる各ステップを非常に短い時間枠で実行して臨床的に意義のある実用的な情報を生成することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法を約１２０分未満、例えば約１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３、２または１分未満で実行することができる。従来方法よりも優れた本発明の方法の改良点はこの迅速さにある。これらの方法を使用して本明細書に記載した任意の微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うことができる。一実施形態おいて、微生物はバクテリアである。別の実施形態において、微生物はイーストである。別の実施形態では、微生物はカビである。他の一実施形態において、微生物は寄生虫である。別の実施形態において、微生物はモリキューテスである。また、本発明の方法は完全に自動化することもでき、それにより感染性材料を取り扱うリスクおよび／または試料を汚染するリスクを低減することができる。
【００３３】
一態様において、本発明は試験試料に由来する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定方法であって、
（ａ）微生物を含むことが既知であるまたは微生物を含む可能性がある試験試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試験試料中に非微生物細胞を選択的に溶解させて溶解試料を生産するステップと、
（ｃ）前記溶解試料の他の構成成分から微生物を分離して微生物の単離試料を形成するステップと、
（ｄ）前記微生物の前記単離試料を質量分析で解析して前記微生物の質量スペクトルを生成するステップと、
（ｅ）測定された前記質量スペクトルと、参照質量スペクトルおよび／または既知の微生物の細胞成分の既知質量もしくは予測質量と、を比較することにより前記単離試料中の前記微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うステップとを含む方法に関するものである。
【００３４】
一態様において、本発明は血液培養物に由来する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定方法であって、
（ａ）微生物を含むことが既知であるまたは微生物を含む可能性がある血液培養から試料を採取するステップと、
（ｂ）前記試験試料を容器内の密度クッション上に積層するステップと、
（ｃ）前記容器を遠心分離して、前記微生物を前記試験試料の他の構成成分から分離して微生物ペレットを形成するステップと、
（ｄ）前記ペレットを質量分析で解析して前記微生物の質量スペクトルを生成するステップと、
（ｅ）測定された前記質量スペクトルと、参照質量スペクトルおよび／または既知の微生物の細胞成分の既知質量もしくは予測質量と、を比較することにより前記単離試料中の前記微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定を行うステップとを含む方法に関するものである。
【００３５】
本発明の別の実施形態において、上記の方法は、微生物の解析に先立って分離ステップの間に形成された微生物のペレットまたはその一部分を分離容器から回収するステップを含む。例えば、ペレット形成後にペレットから流体を吸い出し、ペレットを適切な培地（例えば微生物が生存可能な媒体）に再懸濁することができる。再懸濁した微生物を分離容器から取り出すことができる。次いで、これらの微生物をキャラクタリゼーションおよび／または同定のために例えば懸濁液中でまたは再ペレット化後に解析することができる。他の実施形態では、再懸濁した微生物を例えば懸濁液中でまたは再ペレット化後に分離容器内で解析することができる。別の実施形態では、ペレットから回収した微生物を再懸濁することなく更なる解析に直接使用することができる（例えば、質量分析）。
【００３６】
［試料］
本発明の方法によって試験可能な試料（すなわち試験試料）は、微生物の存在および／または増殖が疑われるまたは疑われる可能性がある臨床試料と非臨床試料の両方を含み、また微生物の有無を定期的にまたは臨時に検査する材料の試料も含む。利用する試料の量は方法の汎用性および／または感度に応じて大きく変化する可能性がある。試料調製は当業者に既知の任意の数の技法を利用して実行することができるが、本発明の１つの効果は、複雑な試料タイプ、例えば血液、体液および／または他の不透明物質等を、多くの前処理を殆どまたはまったく伴わないシステムを利用して直接試験することができる点にある。一実施形態では、培養物から試料を採取する。別の実施形態では、微生物学的培養物（例えば血液培養物）から試料を採取する。別の実施形態では、試料が微生物を含むことが疑われるまたは微生物を含むことが既知である。
【００３７】
試験可能な臨床試料としては、典型的には臨床検査室または研究所で試験される任意のタイプの試料が含まれ、例えば血液、血清、血漿、血液分画、関節液、尿、精液、唾液、糞便、脳脊髄液、胃内容物、膣分泌物、組織ホモジェネート、骨髄穿刺液、骨ホモジェネート、痰、吸引液、ぬぐい液（swab）およびぬぐい液残滓（swab rinsate）、他の体液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。別の実施形態では、臨床試料を培養し、培養試料を使用することができる。
【００３８】
本発明は研究用途ならびに獣医学および医学用途に適用される。臨床試料が採取可能な適切な被検者は一般には哺乳類の被験者であるが、どのような動物であってもよい。本明細書で使用する「哺乳類」という用語には、それらに限らないが、人間、人間以外の霊長類、牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯動物（例えばラットまたはマウス）等が含まれる。人間の被験者には新生児、乳児、幼児、成人および老人の被験者を含む。試料が採取可能な被験者としては哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類および魚類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
また、試験可能な非臨床試料としては、食品、飲料、医薬品、化粧品、水（例えば飲料水、非飲料水および廃水）、海水バラスト、空気、土壌、汚水、植物材料（例えば種、葉、茎、根、花、果実）、血液製剤（例えば血小板、血清、血漿、白血球分画等）、ドナー臓器または組織試料、生物戦試料（biowarfare sample）等を含めた物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本方法は工業環境の汚染レベル、工程管理、品質管理等をモニタリングするための実時間試験にも特に適している。別の実施形態では、非臨床試料を培養し、培養試料を使用することができる。
【００４０】
本発明の一実施形態では、微生物感染症を患うまたはその疑いがある被験者（例えば患者）から試料を採取する。一実施形態において、被験者は敗血症、例えば菌血症または真菌血症を患っているまたはその疑いがある。試料は、被験者に直接由来する血液試料であってよい。試料は、患者の血液の試料から培養した血液培養物、例えばＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）血液培養物に由来するものであってもよい。血液培養試料は陽性血液培養物、例えば微生物の存在を示す血液培養物に由来するものであってよい。いくつかの実施形態では、陽性血液培養物が陽性になった時点から短い時間のうちに、例えば約６時間以内、例えば約５、４、３もしくは２時間以内、または約６０分以内、例えば約５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２もしくは１分以内に、該陽性血液培養物から試料を採取する。一実施形態では、微生物が対数増殖期にある培養物から試料を採取する。別の実施形態では、微生物が定常期にある培養物から試料を採取する。
【００４１】
本発明は、微生物の検出、キャラクタリゼーションおよび／または同定の高い感度をもたらす。これにより、最初に微生物を単離するステップを経る必要のない検出、キャラクタリゼーションおよび／または同定が可能となる。このような検出、キャラクタリゼーションおよび／または同定は、固体または半固体培地上で微生物を培養し、培養したコロニーをサンプリングすることにより実現される。したがって、本発明の一実施形態において、試料は固体または半固体表面上で培養した微生物（例えばバクテリア、イーストまたはカビ）のコロニーに由来するものではない。したがって、本発明の一実施形態において、試料は固体または半固体表面上で培養した微生物（例えばバクテリア、イーストまたはカビ）のコロニーに由来するものではない。
【００４２】
試料の体積は、本発明の方法における分離／単離ステップを実行した後に解析され得る単離微生物試料または微生物ペレットを生産するのに十分大きいものとする必要がある。適切な体積は試料のソースおよび試料中の予想微生物レベルに依存する。例えば、陽性血液培養物の体積当たりの微生物レベルが汚染の有無を検査すべき飲料水試料よりも高く、したがって飲料水試料に比べて小さい体積の血液培養基が必要となる可能性もある。一般に、試料サイズは約５０ｍｌ未満とすることができ、例えば約４０、３０、２０、１５、１０、５、４、３または２ｍｌ未満とすることができる。いくつかの実施形態では、試料サイズを約１ｍｌとすることができ、例えば約０．７５、０．５または０．２５ｍｌとすることができる。分離をマイクロスケールで実行するいくつかの実施形態では、試料サイズを約２００μｌ未満とすることができ、例えば約１５０、１００、５０、２５、２０、１５、１０または５μｌ未満とすることができる。いくつかの実施形態（例えば試料が少数の微生物を含むことが予想される場合）では、試料サイズを約１００ｍｌ以上とすることができ、例えば約２５０、５００、７５０または１０００ｍｌ以上とすることができる。
【００４３】
［任意選択の溶解ステップ］
いくつかの実施形態では、試料を採取した後に実行する本発明の方法の次のステップは、試料、例えば血球および／または組織細胞中に存在し得る望ましくない細胞を選択的に溶解させるステップである。細胞を溶解させることにより試料の他の構成成分からの微生物の分離を可能にすることができる。他の構成成分からの微生物の分離により解析ステップ中の干渉を防止する。非微生物細胞が試料中に存在することが予想されない場合、または非微生物細胞が解析ステップに干渉することが予想されない場合は、溶解ステップの実行が必要なくなる可能性がある。一実施形態において、溶解すべき細胞は試料中に存在する非微生物細胞であり、試料中に存在し得る微生物細胞は溶解させない。しかしながら、実施形態によっては特定のクラスの微生物を選択的に溶解させることが望ましい可能性がある。それ故、このような選択的な溶解を本明細書に記載する方法および当業界で周知の方法に従って実行することができる。例えば、あるクラスの望ましくない微生物を選択的に溶解させることができ、例えばイーストは溶解させるがバクテリアは溶解させないこと、またはその逆が可能である。他の実施形態では、微生物の特定の細胞下構成成分、例えば細胞膜または細胞小器官を分離するために所望の微生物を溶解させる。一実施形態では、非微生物細胞をすべて溶解させる。他の実施形態では、非微生物細胞の一部分、例えば解析ステップに対する干渉を防止するのに十分な細胞を溶解させる。細胞の溶解は、微生物を溶解させるか否かに関わらず、当業界で細胞を選択的に溶解させるのに効果的であることが知られる任意の方法によって実行することができる。このような方法としては溶解溶液の添加、超音波処理、浸透圧衝撃処理、化学処理および／またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
溶解溶液は、細胞、例えば非微生物細胞を（例えば真核細胞膜の可溶化により）溶解させること、および／または微生物細胞を溶解させることができる溶液である。一実施形態において、溶解溶液は１つ以上の洗浄剤、１つ以上の酵素または１つ以上の洗浄剤と１つ以上の酵素の組合せを含むことができ、更に付加的な作用物質も含むことができる。一実施形態において、洗浄剤は非変性溶解洗浄剤、例えばＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１００‐Ｒ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ‐１１４、ＮＰ‐４０、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ‐１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ‐１００、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＡ  ６３０、Ａｒｌａｓｏｌｖｅ（商標）２００、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６／９７、ＣＨＡＰＳ、オクチルβ‐Ｄ‐グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（Ｃ１２Ｅ９、ポリドカノール）等とすることができる。任意選択で下記のような変性溶解洗浄剤を含めることもできる：ナトリウムドデシルサルフェート、Ｎ‐ラウロイルサルコシン、ナトリウムデオキシコレート、胆汁酸塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ＳＢ３‐１０、ＳＢ３‐１２、アミドスルホベタイン‐１４およびＣ７ＢｚＯ。任意選択で下記のような可溶化剤を含めることもできる：Ｂｒｉｊ（登録商標）９８、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８４、非洗浄剤スルホベタイン（ＮＤＳＢ  ２０１）、アンフィポル（amphipol）（ＰＭＡＬ‐Ｃ８）およびメチル‐β‐シクロデキストリン。典型的には、非変性洗浄剤および可溶化剤をそれぞれの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を上回る濃度で使用しながら、変性洗浄剤をそれぞれのＣＭＣを下回る濃度で添加することができる。例えば、非変性溶解洗浄剤は約０．０１０％〜約１０％の濃度、例えば約０．０１５％〜約１．０％、例えば約０．０５％〜約０．５％、例えば約０．１０％〜約０．３０％の濃度（試料で希釈した後の最終濃度）で使用することができる。別の実施形態では、ポリオキシエチレン洗浄剤洗浄剤が好ましい可能性もある。ポリオキシエチレン洗浄剤は構造Ｃ１２‐１８／Ｅ９‐１０を有することができる［ただし、Ｃ１２‐１８は炭素原子数１２〜１８の炭素鎖長を示し、Ｅ９‐１０は９〜１０のオキシエチレン親水性頭部基を示す］。例えば、ポリオキシエチレン洗浄剤は、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）９６Ｖ、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｃ‐１００、Ｇｅｎａｐｏｌ（登録商標）Ｘ‐１００、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（ポリドカノール）またはそれらの組合せから成る群から選択することができる。
【００４５】
溶解溶液中で使用可能な酵素としては、それらに限らないが、核酸および他の膜汚染材料を消化する酵素（例えばプロテイナーゼＸＸＩＩＩ、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ノイラミニダーゼ、ポリサッカリダーゼ、Ｇｌｕｃａｎｅｘ（登録商標）およびＰｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標））が挙げられる。使用可能な他の添加剤としては、それらに限らないが、２‐メルカプトエタノール（２‐Ｍｅ）やジチオスレイトール（ＤＴＴ）のような還元剤、およびマグネシウム、ピルビン酸塩、湿潤剤のような安定化剤が挙げられる。溶解溶液は、所望の細胞を溶解させるのに適した任意のｐＨで緩衝することができ、複数の因子に依存する。これらの因子としては、それらに限らないが、試料のタイプ、溶解すべき細胞および使用する洗浄剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｐＨ範囲を約２〜約１３とすることができ、例えば約６〜約１３、例えば約８〜約１３、例えば約１０〜約１３とすることができる。適切なｐＨ緩衝液には所望の範囲、例えば約０．０５Ｍ〜約１．０Ｍ  ＣＡＰＳのｐＨを維持することができる任意の緩衝液が含まれる。
【００４６】
一実施形態では、試料および溶解溶液を混合し、次いで細胞膜の溶解および可溶化が生起するのに十分な時間、例えば約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは６０秒間、または約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５もしくは２０分間またはそれ以上の時間、例えば約１秒〜約２０分間、約１秒〜約５分間または約１秒〜約２分間温置（incubate）する。温置時間は溶解溶液の強度、例えば洗浄剤および／または酵素の濃度に依存する。一般に、弱い溶解緩衝液ほど非微生物細胞を完全に可溶化するのに多くの時間を要し、試料のより高い希釈が必要となる。溶解溶液の強度は、試料中に存在することが既知であるまたは試料中に存在することが疑われる微生物に基づいて選択することができる。溶解の影響を受けやすい微生物ほど弱い溶解溶液を使用することができる。溶解は約２℃〜約４５℃の温度、例えば約１５℃〜約４０℃、例えば約３０℃〜約４０℃の温度で生起させることができる。一実施形態では、溶解溶液を注射器に充填し、その後注射器に試料を吸引することができる。これにより混合および温置を注射器内で生起させる。一実施形態では、溶解溶液を注射器に充填し、その後注射器に試料を吸引することができる。これにより混合および温置を注射器内で生起させる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、試料中の微生物の一部または全部を殺すのに十分な溶解条件（例えば溶液または温置時間）ならびに分離および／または解析ステップとすることができる。本発明の方法は汎用性が高く、また単離および同定を行う上で必ずしもすべての微生物が生存している必要はない。いくつかの実施形態では、本方法の各ステップの実行前、実行中および／または実行後に微生物の一部または全部が死んでいてもよい。
【００４８】
本発明の実施に当たって使用が予定される溶解バッファについての更なる詳細及び詳述は、２００９年１０月３０日に出願された、継続中の米国特許出願第ｘｘｘｘｘ号「Methods for Isolation and Identfication of Microorganisms」に開示されている。この出願の内容は参照により本明細書に組み込む。
【００４９】
［分離ステップ］
本発明の方法の次のステップ（例えば溶解ステップを実行する場合は試料を溶解させた後のステップ）は分離ステップである。分離ステップを実行することにより、試料の他の構成成分（例えば非微生物またはそれらの構成成分）から微生物を分離し、同定およびキャラクタリゼーションのために解析可能なペレットに微生物を濃縮することができる。分離は必ずしも完全なものである必要はない。すなわち、必ずしも１００％の分離を行う必要はない。ここで必要なことは、他の構成成分による実質的な干渉がない微生物の解析が可能となる程度まで、試料の他の構成成分から微生物を分離することである。例えば、分離によって少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％またはそれ以上の純度の微生物ペレットを得ることができる。
【００５０】
一実施形態では、この分離を遠心分離ステップによって実行する。遠心分離ステップでは、試料（例えば溶解試料）を分離容器内の密度クッションの頂部に配置し、この容器を微生物の単離が可能となる条件下で遠心分離にかける（例えば微生物は容器の底部および／または側面にペレットを形成する可能性がある）。本実施形態によれば、試料の他の構成成分（例えば試料培地中に存在し得る非微生物またはそれらの構成成分）は密度クッションの頂部上または密度クッションの頂部内に留まる。一般には、任意の既知の容器を分離ステップに使用することができる。一実施形態では、分離容器を２００９年１０月３０日に出願した関連米国特許出願第ｘｘｘｘｘ号「Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms」に開示されている分離装置とする。この分離ステップは試料中の材料、例えば培地、細胞残屑および／または微生物の解析に（例えば固有蛍光によって）干渉する可能性がある他の構成成分から微生物を単離する。一実施形態では、密度クッションは生きている微生物を死んだ微生物（密度クッションを通過しない微生物）から分離する働きもする。別の実施形態では、密度クッションは遠心分離前または遠心分離後に密度勾配を有さない。換言すれば、密度クッションを構成する材料が密度勾配を形成するに足る量の時間および／または加速度に至るまで分離容器を遠心分離にかけることはしない。
【００５１】
クッションの密度は、試料中の微生物はクッションを通過するが、試料の他の構成成分（例えば血液培養ブロス、細胞残屑）はクッションの頂部に残るまたは密度クッションを完全には通過しないような密度を選択する。密度クッションは、生きている微生物（クッションを通過する微生物）を死んだ微生物（クッションを通過しない微生物）から分離するように選択することもできる。適切な密度は密度クッションで使用する材料および分離すべき試料に依存する。一実施形態では、クッションの密度を約１．０２５〜約１．１２０ｇ／ｍｌの範囲とし、例えば約１．０３０〜約１．０７０ｇ／ｍｌ、約１．０４０〜約１．０６０ｇ／ｍｌまたは約１．０２５〜約１．１２０ｇ／ｍｌの任意の範囲とする。他の実施形態では、クッションの密度を約１．０２５、１．０３０、１．０３５、１．０４０、１．０４５、１．０５０、１．０５５、１．０６０、１．０６５、１．０７０、１．０７５、１．０８０、１．０８５、１．０９０、１．０９５、１．１００、１．１０５、１．１１０、１．１１５または１．１２０ｇ／ｍｌとする。
【００５２】
密度クッション用の材料は、本発明の方法に適した密度範囲を有する任意の材料とすることができる。一実施形態において、材料はコロイドシリカである。コロイドシリカは非被覆とすることも（例えばＬｕｄｏｘ（登録商標）（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ社（コネティカット州））、例えばシランで被覆することも（例えばＰｕｒｅＳｐｅｒｍ（登録商標）（Ｎｉｄａｃｏｎ  Ｉｎｔ’ｌ社（スウェーデン））またはＩｓｏｌａｔｅ（登録商標）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（カリフォルニア州サンタアナ）等）、ポリビニルピロリドンで被覆することもできる（例えばＰｅｒｃｏｌｌ（商標）またはＰｅｒｃｏｌｌ（商標）Ｐｌｕｓ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社（ミズーリ州セントルイス））。一実施形態では、分光解析で最小干渉を示したコロイドシリカ、例えば最も低い固有蛍光を有する材料を選択する。このコロイドシリカを適切な密度を形成するのに適した任意の培地、例えば平衡塩類溶液、生理的食塩水および／または０．２５Ｍスクロースで希釈することができる。適切な密度は約１５〜約８０ｖ／ｖ％の濃度、例えば約２０〜約６５ｖ／ｖ％の濃度のコロイドシリカで得ることができる。密度クッションに適した別の材料はヨウ化造影剤、例えばイオヘキソール（Ｏｍｎｉｐａｑｕｅ（商標）ＮｙｃｏＰｒｅｐ（商標）またはＮｙｃｏｄｅｎｚ（登録商標））およびイオジキサノール（Ｖｉｓｉｐａｑｕｅ（商標）またはＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標））である。適切な密度は、血液培養試料の場合は約１０〜約２５ｗ／ｖ％の濃度、例えば約１４〜約１８ｗ／ｖ％の濃度のイオヘキソールまたはイオジキサノールで得ることができる。スクロースは、血液培養物試料の場合は約１０〜約３０ｗ／ｖ％の濃度、例えば約１５〜約２０ｗ／ｖ％の密度クッションとして使用することができる。密度クッションの調製に使用可能な他の適切な密度クッションとしては低粘度且つ高密度の油、例えば当業界で周知のとおり、顕微鏡用液浸油（例えばＣａｒｇｉｌｌｅ  Ｌａｂｓ社（ニューヨーク州）のＴｙｐｅ  ＤＦ）、鉱油（例えばＰｅｎｒｅｃｏ社（ペンシルバニア州）のＤｒａｋｅｏｌ（登録商標）５、Ｄｒａｋｅｔｅｘ  ５０、Ｐｅｎｅｔｅｃｋ（登録商標））、シリコーン油（ポリジメチルシロキサン）、フルオロシリコーン油、シリコーンゲル、例えば血液培養試料の場合は約７５〜約１００％の濃度のメトリゾエート‐Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）（ＬｙｍｐｈｏＰｒｅｐ（商標））、例えば血液培養試料の場合は約２５〜約５０％の濃度のジアトリゾエート‐デキストラン（ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｏＰｒｅｐ（商標））、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリエチレンオキシド（高分子量）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）化合物の混合物、ポリアクリル酸、架橋したポリビニルアルコール、架橋したポリビニルピロリジン、ＰＥＧメチルエーテルメタクリレート、ペクチン、アガロース、キサンタン、ジェラン、Ｐｈｙｔａｇｅｌ（登録商標）、ソルビトール、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）（例えば血液培養試料の場合は約１０〜約１５％の濃度のＦｉｃｏｌｌ（登録商標）４００）��グリセロール、デキストラン（例えば血液培養試料の場合は約１０〜約１５％の濃度）、グリコーゲン、塩化セシウム（例えば血液培養試料の場合は約１５〜約２５％の濃度）、パーフルオロカーボン液（例えばパーフルオロ‐ｎ‐オクタン）、ハイドロフルオロカーボン液（例えばＶｅｒｔｒｅｌ  ＸＦ）等が挙げられる。一実施形態において、密度クッションはコロイドシリカ、イオジキサノール、イオヘキソール、塩化セシウム、メトリゾエート‐Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、ジアトリゾエート‐デキストラン、スクロース、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）４００および／またはデキストランの任意の組合せのうちの１つまたは複数から選択される。密度クッションは材料の組合せ、例えばコロイドシリカと油の組合せで構成することもできる。上記の化合物のいくつかの組合せは、本発明の分離および読み取りステップに有用である可能性がある。
【００５３】
密度クッションの体積／高さは、他の試料構成成分からの微生物の分離を実現するのに十分なものとする必要がある。体積は分離容器のサイズおよび形状に依存する。一般には約０．１〜約５ｍｌの体積を使用することができ、例えば約０．２〜約１ｍｌ、例えば約０．２ｍｌ〜約０．５ｍｌの体積を使用することができる。分離をマイクロスケールで実行する場合は、密度クッションの体積を約１μｌ〜約１００μｌ、例えば約５μｌ〜約５０μｌとすることができる。密度クッションの頂部に積み上がるまたは積層する試料の体積は、解析に適したペレットを生産するのに十分な微生物を得るに足る大きさにする必要がある。一般には容器に収まる任意の体積を使用することができる。例えば、約０．１ｍｌ〜約５ｍｌの体積を使用することができ、例えば約０．２ｍｌ〜約１ｍｌ、例えば約０．２ｍｌ〜約０．５ｍｌの体積を使用することができる。分離をマイクロスケールで実行する場合は、試料の体積を約１μｌ〜約１００μｌ、例えば約５μｌ〜約５０μｌとすることができる。容器内の試料の利用可能なスペースは容器のサイズおよび形状に依存する。いくつかの実施形態では、密度クッションと試料の混合を防止するために、試料が積み上がる前または積層する前に密度クッションの頂部に中間層（液体または固体）を配置することができる。一実施形態では、中間層をポリエチレンビーズとすることができる。他の実施形態では、密度クッションと試料の間に小気泡を配置して混合を防止することができる。別の実施形態では、微生物が分離中に密度クッションを通過し、密度クッションと高密度材料の間の界面に集まるように高密度材料（例えばペルフルオロカーボン液）の頂部に密度クッションを積層することができる。
【００５４】
本発明の一実施形態では、分離容器をスウィングアウトローターの遠心分離にかけ、微生物が容器の底部直上にペレットを形成するようにする。この容器を、試料の他の構成成分から微生物を分離するに足る（例えばペレットを形成するのに十分な）加速度および時間にわたって遠心分離にかける。遠心加速度は約１，０００×ｇ〜約２０，０００×ｇとすることができ、例えば約２，５００×ｇ〜約１５，０００×ｇ、例えば約７，５００×ｇ〜約１２，５００×ｇ等とすることができる。遠心時間は約３０秒〜約３０分とすることができ、例えば約１分〜約１５分、例えば約１分〜約５分とすることができる。遠心分離は約２℃〜約４５℃の温度で実行することができ、例えば約１５℃〜約４０℃、例えば約２０℃〜約３０℃の温度で実行することができる。一実施形態において、分離容器は閉鎖部を備え、この閉鎖部を遠心分離に先立って容器に取り付けることで気密シールを形成する。閉鎖部の存在により、感染性および／または有害性を有する恐れがある微生物を取り扱うリスクと共に試料の汚染リスクも低減する。本発明の方法の１つの利点は、微生物を封止容器（例えば密封容器）内に入れた状態で本方法の１つまたは複数の任意のステップ（例えば溶解、分離、解析および／または同定）を実行することができる点である。本方法は、直接試験で実施される試料からの微生物の回収のような毒性の高い微生物の取扱いに関連する健康および安全上のリスクを、自動化システムを利用して回避するものである。一実施形態では、密度クッションに密度勾配が生じるのに十分な時間にわたって且つ／またはそのような力をもって容器を遠心分離にかけることはしない。本発明は試料の超遠心分離、例えば約１００，０００×ｇを超える力の遠心分離を必要としない。更に、本発明は等密度（平衡）沈殿またはバンディングも必要としない。
【００５５】
分離容器は密度クッションおよび試料を保持するのに十分な容積を有する任意の容器であってよい。なお、本発明を実施する際は、２００９年１０月３０日に出願した関連米国特許出願第ｘｘｘｘｘ号「Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms」に開示されている分離装置を使用することができる。一実施形態では、容器が遠心ローターに嵌合する、または容器をそのように嵌合させることができる。容器の容積は約０．１ｍｌ〜約２５ｍｌとすることができ、例えば約１ｍｌ〜約１０ｍｌ、例えば約２ｍｌ〜約８ｍｌとすることができる。分離をマイクロスケールで実行する場合は、容器の容積を約２μｌ〜約１００μｌ、例えば約５μｌ〜約５０μｌとすることができる。一実施形態において、容器は試料および密度クッションの大部分を保持するために上部の内径が広くなっており、微生物のペレットを集める下部の内径は狭くなっている。狭い部分の内径は約０．０４〜約０．１２インチ（約０．１０１６〜０．３０４８ｃｍ）とすることができ、例えば約０．０６〜約０．１０インチ（約０．１５２４〜約０．２５４０ｃｍ）、例えば約０．０８インチ（約０．２０３２ｃｍ）とすることができる。広い部分の内径は約０．３２〜約０．４０インチ（約０．８１２８〜約１．０１６０ｃｍ）とすることができ、例えば約０．３４〜約０．３８インチ（約０．８６３６〜約０．９６５２ｃｍ）、例えば約０．３６インチ（約０．９１４４ｃｍ）とすることができる。マイクロスケール分離の場合は内径を更に小さくすることができる。例えば、狭い部分の内径を約０．００１〜約０．０４インチ（約０．００２５４〜約０．１０１６０ｃｍ）とすることができ、例えば約０．００２〜約０．０１インチ（約０．００５０８〜約０．０２５４０ｃｍ）とすることができる。テーパ内径部を上側および下側の各部分に接続することができる。テーパ部分の角度は約２０〜約７０度、例えば約３０〜約６０度とすることができる。一実施形態において、下側の狭い部分は容器の全高の半分未満、例えば容器の全高の約４０％、３０％、２０％または１０％未満とする。容器には閉鎖具を取り付けることができ、または閉鎖具（例えば蓋）を受け入れるように容器をねじ切りすることができ、それにより遠心分離中の容器の密封が可能となる。いくつかの実施形態では、微生物試料またはペレットを分離直後に手動でまたは自動的に（技術者が容器の内容物に曝されないような形で）容器から回収することまたは採取すなわち取り出すことができるように容器を設計する。例えば、容器はペレットを収容し容器の残部から分離できる取り外し可能部分または離脱部分を備えることができる。別の実施形態では、容器は分離後にペレットにアクセスするための手段、例えば注射器または他のサンプリング装置を挿入するための、またはペレットを取り出すための１つまたは複数のポートまたは浸透性表面を備える。一実施形態では、容器をチューブ、例えば遠心チューブとすることができる。別の実施形態では、容器をチップまたはカードとすることができる。一実施形態では、容器を独立容器、すなわち単一の試料を分離する装置とする。他の実施形態では、容器を２つ以上の分離容器を備え複数の試��を同時に分離することができる装置の一部とする。一実施形態において、この装置は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、３０、３６、４２、４８、６０、７２、８４、９６またはそれ以上の分離容器を備える。
【００５６】
他の実施形態では、分離を濾過ステップによって実行する。この場合は、微生物を保持する細孔径を有する選択性フィルタまたはフィルタセットを装着した装置内に試料（例えば溶解試料）を配置する。保持された微生物は、フィルタに適切な緩衝液をゆっくりと通すことにより洗浄することができる。その後、フィルタの表面を直接サンプリングすることにより、またはフィルタを適切な水性緩衝液で逆洗することにより、洗浄した微生物をフィルタ上で直接解析することおよび／または解析のために回収することができる。
【００５７】
［解析ステップ］
一実施形態では、試料またはペレットを解析に先立って回収および／または再懸濁し、任意選択で分離容器から取り出す。別の実施形態では、試料またはペレットをインサイチュ解析後に回収および／または再懸濁し、その後更なる解析を実行する。例えば、微生物ペレット以外の単離微生物に適用可能なラテックス凝集試験または自動化した表現型同定試験のような技法を回収および／または再懸濁した微生物に対して実行することができる。
【００５８】
サンプルを再懸濁した後、懸濁液からサンプルの一部を取り出して、質量分析計に導入するためにプレート上に配置する。吸光性の高い物質が試料表面に堆積する（例えば、マトリックス）、そして、この材料はサンプルをイオン化するために用いられるレーザー波長に対して非常に高い光学吸光係数を有する（例えば、窒素レーザーについては、発光波長は３３７ｎｍであり、吸光性材料は波長３３７ｎｍにて高い吸光係数を有する）。試料及び吸光性物質を乾燥した後、プレートを質量分析計に導入する。試料をポンプダウンするために要する時間の後（すなわち、大気を試料から除いて試料を１０−５ｔｏｒｒ〜１０−７ｔｏｒｒの環境に置く）、試料を質量分析計のイオン化チャンバに導入する。試料をシステムに対して位置調整する。光学的な位置調整が完了すると、窒素レーザーが出力される。マトリックスがレーザーエネルギーを吸収すると、エネルギー蓄積が大きくなるため、マトリックスはプレート表面から除去される。副作用として、この処理の間に微生物細胞も部分的に蒸発及びイオン化されてしまう。これらのイオンは、プレートと質量分析計の飛行チューブへの入口との間に電場が生成されることによって、既知の運動エネルギーまで加速される（すなわち、このようなシステムの構成部は、質量／荷電弁別器である）。全ての一価のイオンは、質量に関わらず、飛行チューブへの入口にて同一の運動エネルギーを有するが、それらのイオンは、それぞれの質量に反比例する速度を有する。ここから、イオンは飛行チューブ内を降下し、検出器へと向かい、比較的軽いイオンが比較的重いイオンよりも前に検出器に到達する（飛行チューブは質量／荷電弁別器である）。検出器は、イオンが検出器に衝突する度に電荷を生成する。検出器の出力はデジタル化され、出力結果は、１方の軸を質量/荷電率とし、他方の軸を衝突数として示す。他の実施形態では、ペレット内の微生物を、ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ質量分析、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）質量分析、ＧＣ質量分析、ＬＣ質量分析、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析、選択イオンフローチューブ（ＳＩＦＴ）分析等の質量分析技法を使用して解析することができる。
【００５９】
本発明によれば、対照測定値（control measurement）を既知の微生物と見なし、したがって測定したテストデータと該当する微生物のキャラクタリゼーションとの相関付けを当業者に既知の様々な数学的方法を使用して行うことが可能となる。例えば、当業者に既知のソフトウェアシステムを利用して試料からのデータとベースラインすなわち対照測定値とを比較することができる。より詳細には、データの分析をいくつかの多変量分析法、例えば一般判別分析（ＧＤＡ）、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳＤＡ）、部分最小二乗回帰、主成分分析（ＰＣＡ）、平行因子分析（ＰＡＲＡＦＡＣ）、ニューラルネットワーク分析（ＮＮＡ）および／またはサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によって行うことができる。これらの方法を使用することにより、先述したような有機体のモニタリング、検出および／またはキャラクタリゼーションを行うシステムを設計する際に、該当する未知の微生物を有機体の代謝、病原性および／または毒性に基づいて既存の命名法に基づく関連群および／または天然群に分類することができる。
【００６０】
また別の実施形態では、検出システムからの検出時間や培養率のような非分光測定値を、単離試料またはペレットに由来する微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定に役立てることができる。更に、分離装置の下部領域の写真像から得られる測定値は、ペレットサイズ、形状、色、密度といった分離株（isolate）の同一性に関する有益な情報をもたらすことができる。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態では、単離試料またはペレット中の微生物のキャラクタリゼーションおよび／または同定において必ずしも正確な種の同定を行う必要はない。キャラクタリゼーションは、生物学的粒子の広範なカテゴリ分けまたは分類だけでなく単一の種の実際の同定も包含する。単離試料またはペレットに由来する微生物の分類は、微生物の表現型および／または形態学的特徴の決定を含む可能性がある。例えば、生物学的粒子のキャラクタリゼーションは組成、形状、サイズ、クラスタリングおよび／または代謝のような観察可能な差異に基づいて達成することができる。いくつかの実施形態では、該当する生物学的粒子の分類を行うにあたって所与の生物学的粒子の特徴に関する予備知識の必要をなくすことができるが、経験的測定値との一貫性のある相関付けが必要となる。このため、本方法は特定の結合事象または代謝反応に基づく方法よりも汎用性が高くなり、容易に適合可能となる。本明細書で使用する「同定」とは、未知の微生物がどの科、属、種および／または株に属するのか判定すること、例えば未知の微生物を科、属、種および／または株レベルで同定することを意味する。
【００６２】
いくつかの例において、キャラクタリゼーションはアクションを起こすのに十分有用な情報をもたらす分類モデルを包含する。本明細書で使用する好ましい分類モデルは、（１）グラム群、（２）臨床グラム群、（３）治療群、および（４）機能群のうちの１つまたは複数の群への分類を含む。
【００６３】
（１）グラム群：このグラム群分類では、各微生物をそれぞれのグラム染色反応および全体のサイズに基づいて３種類の広範な分類カテゴリのうちの１つに含めることができる。前記群は下記のうちの１つまたは複数から選択される。（ａ）グラム染色で紺青色に染色するグラム陽性微生物、（ｂ）グラム染色で赤に染色するグラム陰性微生物および（ｃ）グラム染色で紺青色に染色するイースト細胞（ただし、形態学的特徴およびサイズによってバクテリアと区別される非常に大きい円形の細胞）。
【００６４】
（２）臨床グラム群：このグラム群は形態学的特徴によって区別されるいくつかのサブカテゴリに更に分割することができる。これらのサブカテゴリは熟練した研究室技術者から報告された臨床的に意義のある情報をすべて含むため、陽性または陰性グラム反応よりも高いレベルの同定を実現する。この特定の分類は下記の理由で非常に有用である。すなわち、グラム染色の品質および／またはスミアを読み取る技術者の技術レベルに左右される懸念が、臨床的に意義のある等価な情報に自動化システムを導入することによって解消されるからである。より詳細には、この分類モデルに基づく微生物のサブカテゴリは下記のうちの１つまたは複数から選択することができる：（ａ）球菌（小さい円形細胞）、（ｂ）双球菌（互いに結合した２つの小さい円形細胞）、（ｃ）矩形の桿菌（ｒｏｄｓ）および（ｄ）桿状の桿状菌（bacilli）。付加的な形態学的情報によって確認可能なサブカテゴリの例としては下記が挙げられる：（ｉ）グラム陽性球菌、（ｉｉ）鎖状のグラム陽性球菌、（ｉｉｉ）房状（すなわち「ブドウのような」房状）のグラム陽性球菌、（ｉｖ）グラム陽性双球菌、（ｖ）グラム陽性桿菌、（ｖｉ）内生胞子を含むグラム陽性桿菌、（ｖｉｉ）グラム陰性桿菌、（ｖｉｉｉ）グラム陰性球桿菌、（ｉｘ）グラム陰性双球菌、（ｘ）イーストおよび（ｘｉ）糸状の菌類。
【００６５】
（３）治療群：治療群は、特定の標本タイプから単離したときに同じクラスの抗生物質または抗生物質の混合物（例えば「Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008」参照）で処置される複数の微生物種を含む。多くの場合、臨床医が初期の経験的治療を標的療法に近付ける上で種レベルまでの同定は必要ない。というのも、２つ以上の種を１つ（または複数）の同じ抗生物質で処置することができるからである。この分類レベルはこれらの「同じ処置の」微生物を単一の治療カテゴリに適宜含める。このキャラクタリゼーションレベルの例としては、高度耐性腸内細菌（ＥＢ）種と感受性ＥＢ種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．（エンテロバクター種）とＥ．ｃｏｌｉ（エシェリキアコリ））を区別する能力や、フルコナゾール耐性カンジダ種（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ（カンジダグラブラータ）およびＣ．ｋｒｕｚｅｉ（カンジダクルセイ））と感受性カンジダ種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダアルビカンス）およびＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（カンジダパラプシロシス））を区別する能力等が挙げられる。
【００６６】
（４）機能群：本発明によれば、代謝、毒性および／または表現型特徴の組合せに基づくいくつかの群に微生物を含めることもできる。非発酵性の有機体を発酵性の有機体と明確に区別することができる。更に、溶血素を生産する微生物種を非溶血性種と別々に分類することができる。場合によっては、これらの群は属レベル（例えば腸球菌属、カンジダ属）と、より種に近いレベル（例えばコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、α溶連菌、β溶連菌、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌すなわちＳ．ａｕｒｅｕｓ（スタフィロコッカスアウレウス））とを区別して属レベル（例えば大腸菌、グラム陰性の非発酵性桿菌）よりも広範なカテゴリとなる。
【００６７】
同定を目的とする微生物の固有特性の測定に加えて、本発明の方法は更に、分離および／または同定プロセスに役立つ付加的な同定作用物質（identifier agent）の使用を含むことができる。親和性配位子のような特定の微生物と結合する作用物質を使用することにより、微生物の分離、微生物のクラスまたは種の同定（例えばユニークな表面タンパク質または受容体との結合を利用）、および／または微生物の特徴（例えば抗生抵抗）の同定を行うことができる。有用な同定作用物質としては、それらに限らないが、単クローンおよび多クローン抗体ならびにそれらの断片（例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ同定のためのａｎｔｉ‐Ｅａｐ）、核酸プローブ、抗生物質（例えばペニシリン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ）、アプタマー、ペプチド模倣体、ファージ由来の結合タンパク質、レクチン、宿主先天性免疫バイオマーカー（急性期タンパク質、ＬＰＳ結合タンパク質、ＣＤ  １４、マンノース結合レクチン、トール様受容体）、宿主防御ペプチド（例えばデフェンシン、カテリシジン、プロテオグリン（proteogrin）、マガイニン）、バクテロシン（bacterocin）（例えばランチビオティクス（例えばナイシン、メルサシジン、エピデルミン、ガリデルミンおよびプランタリシンＣおよびクラスＩＩペプチド）、バクテリオファージおよび核酸、脂質、炭水化物、多糖類、カプセル／粘液（slime）もしくはタンパク質またはそれらの任意の組合せに対して選択的な色素が挙げられる。作用物質自体が検出可能なシグナルを示さない場合は、作用物質をマトリックスに適合する化合物と共役させること等により、作用物質を標識して検出可能なシグナルが提供されるようにすることができる。作用物質は、本発明の方法の任意のステップ、例えば試料を溶解中および／または分離中に採取するときに微生物に添加することができる。いくつかの実施形態では、ペレット中の作用物質の存在をペレットの解析中に判定することができる。他の有用な同定作用物質としては、微生物酵素の基質、キレート剤、および毒性化合物が挙げられる。
【００６８】
本発明の一態様において、本方法は更に微生物ペレットを回収し付加的な試験を実行するステップを含むことができる。一実施形態では、ペレットを試料培地および密度クッションから吸い出すことによって回収することができる。別の実施形態では、注射器を容器に挿入し、試料培地および密度クッションをそのままの状態に保持したままペレットを吸い出すことにより、ペレットを回収することができる。その後、回収したペレットを適切な培地、例えば食塩水中に再懸濁させることができる。再懸濁の際は、微生物を更に当業者に知られる上述の所望の試験にかけることができる。特に、清浄な微生物試料を必要とする任意の試験を再懸濁させた微生物に対して実行することができる。いくつかの実施形態では、付加的な同定試験を実行することができる。同定試験の例としては、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）２、増殖および非増殖核酸試験（nucleic acid test：ＮＡＴ）、色素産生およびラテックス接着アッセイ、イムノアッセイ（例えば標識した抗体および／または他のリガンドを利用）、質量分析（例えばＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析）および／または赤外分光法（ＦＴＩＲ）やラマン分光法のような他の光学的技法が挙げられる。抗生物質および／または他の薬剤に対する耐性のような付加的なキャラクタリゼーション試験も実行することができる。付加的なキャラクタリゼーションは、本方法の最初の分離および同定ステップ中に開始した試験の一部とすることもできる。例えばメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出では、まず、微生物の分離に先立って標識したペニシリンを試料に加えることができる。ペレットを回収し再懸濁させると、結合した標識のレベルを判定することができる。
【００６９】
本発明の一態様では、方法ステップの一部又は全部を自動化することができる。本方法のステップを自動化することにより、より多くの試料をより迅速に試験できるようになるだけでなく、有害性および／または感染性のある微生物を含む恐れがある試料を操作する際の人為的ミスのリスクを低減することが可能となる。
【００７０】
本発明の幾つかの実施形態では、本方法は、試験試料内の微生物の存在を検出するためにも利用することができる。これらの実施形態では、本方法は
（ａ）試験サンプルを取得するステップと、
（ｂ）前記試験試料に細胞を溶解し、溶解試料を生成する任意のステップと、
（ｃ）前記溶解試料の他の構成成分から微生物を分離して、微生物ペレットを形成するステップとを含み、
ペレットの存在により、前記試験試料中に微生物が存在することが示される、方法である。一実施形態では、ペレットは裸眼で検査可能である。他の実施形態では、本明細書にて記載したように、ペレットを再懸濁し、取り出し、質量分析計によって解析することができる。
【００７１】
幾つかの実施形態では、例えば、食料品、薬品、飲料水について、試料の微生物による汚染を監視するために検出方法が用いられる。一実施形態では、上記方法を反復実施して、コンスタントに、例えば、月一回、週一回、一日一回、一時間に一回、または、その他のあらゆる時間パターンで、汚染を監視する。他の実施形態では、例えば、汚染が疑わしいときなど、必要に応じて試料を試験することができる。更なる実施形態では、検査方法を用いて医療試料、例えば、血液培養物に微生物が存在するかを検出することができる。例えば、一定時点で試料を血液培養物から取り出して、当該試料に対して上述の検査方法を実施して血液培養物が陽性か判定することができる。一実施形態では、試料を接種後に設定時間（例えば、接種後２４時間）に取得し、血液培養物が陽性か判定することができる。他の実施形態では、試料を定期的に（例えば、１２、６、４、または２時間おき、または６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５分おきに）血液培養物から取得して、検出可能となってから短時間で、陽性血液培養物を同定することができる。検査方法の幾つかの実施形態では、検査ステップに続いて、本明細書で記載したような同定方法を行うことができる。
【００７２】
本発明の一態様では、方法ステップの一部または全部を自動化することができる。方法ステップを自動化することによってより多くの試料をより能率的に試験することが可能となり、有害性および／または感染性のある微生物を含む恐れがある試料を取り扱う際の人為的ミスのリスクを低減することができる。しかしながら、自動化のより重要な点は、昼夜を問わず任意の時間に遅滞なく重要な結果を示すことができることである。いくつかの研究結果から、敗血症の原因となる有機体の同定を迅速化することが患者ケアの改善、病院滞在期間の短縮および全体的なコストの削減につながることが証明されている。
【００７３】
本発明による、微生物をキャラクタリゼーションおよび／または同定するための方法の更なる詳細及び詳述は、２００９年１０月３０日に出願された、継続中の米国特許出願第ｘｘｘｘｘ号および第ｘｘｘｘｘ号「Methods for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy」および「Method of Separation, Characterization and/or Identification of Microorganiss using Raman Spectroscopy」にそれぞれ開示されている。これらの出願の内容は参照により本明細書に組み込む。
【００７４】
下記の実施例では本発明について更に詳細に説明するが、下記の実施例は例示的なものであり本発明を決して限定するものではない。利用した技法は当業者に周知の標準的な技法または後で具体的に説明する技法である。
【実施例】
【００７５】
［実施例１］
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による血液培養物からの微生物同定のための溶解‐遠心分離法
【００７６】
微生物を１０ｍＬのヒト血液を収容したＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）ＳＡ瓶に低接種原で「播種（seeded）」した。血液培養ブロス試料は、ＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴ（登録商標）３Ｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにより陽性反応が出てから数分以内に瓶から取り出した。ブロス試料を処理して、血液由来の微生物と下記のような分析を阻害する恐れのある媒地成分とを分離した。
【００７７】
フレッシュな陽性血液培養物由来の陽性ブロス４．０ｍＬを２．０ｍＬの溶解緩衝液（０．４５ｗ／ｖ％のＢｒｉｊ（登録商標）９７＋０．３Ｍ  ＣＡＰＳ、ｐＨ１１．７）と混合し、５秒間渦混合し、次いで３７℃の水浴で９０秒間培養した。培養後、４つの１．５ｍＬ円錐遠心チューブのそれぞれについて、０．９５ｍＬの溶解物を０．５ｍＬの密度クッション（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中  １４％ｗ／ｖ  Ｉｏｈｅｘｏｌ、０．００５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ‐１０８）の表面上に積層した。その後、４つのチューブを全て、２５℃、１０，０００ｇで２分間遠心し、密度クッションを介して微生物を沈殿させた（ペレット化した）。溶解血液及び培地は、クッションの上部に留まった。
【００７８】
遠心サイクルの完了後、浮遊物を除去し、沈殿した（ペレット化した）各チューブ内の微生物を、１０μＬの純水で再懸濁した。４つのチューブ全てからの再懸濁した微生物を清潔なチューブに溜め、静かに混合した。各処理済み試料標本の量を調節して、最終的な懸濁液の光学密度６６０ｎｍ（Ａ６６０）が２０／ｃｍに等しくなるようにした。処理済み試料標本は、試験当日は２〜８℃にて保存し、あるいは、分割して、その後の試験のために−７０℃で凍結保存した。
【００７９】
［実施例２］
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による、溶解‐遠心分離法を用いて陽性血液培養物から処理した微生物片の分析
【００８０】
実施例１の手順に従って処理した標本を、（凍結の場合）３７℃で迅速に解凍し、静かに混合し、純水によって使用強度（１：４、１：８、および１：１６）まで希釈した。各希釈標本の１．０μＬを、２点に（in duplicate）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦターゲットプレートに塗布した。２点のそれぞれについて、１．０μＬの５０％ギ酸を添加した。塗布した標本を室温で乾燥させ、１．０μＬのマトリックス溶液を塗布した。マトリックスは、アルファシアノ（アルファシアノ４ヒドロキシシアン酸溶液、AnagnosTec GmbH, Germany)、および、ＤＨＢ(２，５−ジヒドロキシ安息香酸、AnagnosTec GmbH, Germany)が５０：５０で混合されてなる。
【００８１】
比較のため、対応する微生物分離株を適切な寒天培地で培養し、２点をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦターゲットプレートに直接塗布した。２点のうちの一方の微生物は、1.0μＬの純水でインサイチュで再懸濁し、その後、１．０μＬの５０％ギ酸を添加した。所与の単離株由来の両方の点（スポット）を乾燥し、それぞれに１．０μＬのマトリックス混合液を添加した。
【００８２】
全ての微生物標本を完全に乾燥した後、それぞれについて、Ａｘｉｍａ  Ａｓｓｕｒａｎｃｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｍｉｏｔｅｃｈ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）で、質量／電荷の範囲２，０００〜３４，０００で、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを取得した。
【００８３】
陽性血液培養液から回収された、選択された微生物の代表的な質量スペクトルを、図１〜３に示す。図示する質量／電荷の範囲は、明確のために狭めたが、これらの図に示される知見は、全質量範囲に当てはまる。
【００８４】
図１は、５つの臨床単離株播種血液培養物から処理された微生物のスペクトルを示す。明確な図示のため、４種それぞれのスペクトルについて平均化して示す。所与の質量／電荷比でのピークの有無についての際立った差異が容易に明らかとなり、それらの微生物の特徴となる。いずれの質量／電荷ピークも全てのスペクトルに共通して出現しない。このことは、本発明による処理を行った後には、血液又は培養培地の残存物質による、潜在的に不明りょうな質量がほとんど残らないことを示唆する。
【００８５】
図２は、図１では平均化して示した５つの単離Ｓ．ａｕｒｅｕｓ質量スペクトルのそれぞれを示す図である。５つのスペクトルは、異なる血液提供者からの血液を異なる血液培養物として培養した場合であっても、様々な臨床単離株についてのスペクトルが当該種の質量スペクトルに整合することを示す。
【００８６】
図３は、図１に示す５つの単離Ｅ．ｃｏｌｉの平均化スペクトルと、寒天培地（５％羊血含有トリプティックソイ寒天培地、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）で培養されたコロニーから直接サンプリングした、同一の５つの単離Ｅ．ｃｏｌｉのスペクトルとの比較を示す図である。質量スペクトルの類似性は、血液培養物の処理によって、本微生物固有の質量は保存されるともに、微生物由来でない材料は効率的に除去されたことを示す。
【００８７】
［実施例３］
溶解−遠心分離法で陽性血液培養物から処理された微生物標本のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および市販の微生物同定データベースによる同定
【００８８】
実施例１および２に記載のようにして、１２３の単離微生物を培養、処理、および質量分析した。微生物は、臨床血液培養物で一般的に検出されるバクテリア及び酵母のうちの１４種を占めた。
【００８９】
各質量スペクトルを取得後、質量ピークのテーブルを「Ｓａｒａｍｉｓ」微生物同定ソフトウェア（ＡｎａｇｎｏｓＴｅｃ社、Ｇｅｒｍａｎｙ）に入力して、分析した。このソフトウェアは、寒天培養微生物について収集されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルデータベースに基づいて構築されている。
【００９０】
表１は、同一の播種培養由来のものを、平行して血液培養及び寒天培地で培養した全ての単離株の結果を示す。表１には、結果を全ての培養株について一覧で示す。幾つかの単離株の最終的な懸濁液の細胞濃度は、実施例１に記載した目標濃度を下回る。細胞濃度が目標値の２０％未満であれば、その単離株は一覧から除き、残った単離株についての結果を再構成して表２に示す。実際、細胞数の少ない培養は、ペレットの再懸濁量を控えるか、または大量の培養ブロスを処理することで補償することができる。
【００９１】
表１及び２に示す「種まで同定（Ｃｏｒｒｅｃｔ  ｔｏ  Ｓｐｅｃｉｅｓ）」は、所与単離株についての一組のターゲットスポットから得られた、少なくとも１つの（通常は１よりも多い）スペクトルを、一つの種としてまたは２〜３の近縁種として、少なくとも９０％の信頼性で正確に同定された単離株の数を示す。同様に、少なくとも９０％の信頼性でスペクトルが正確な属または種とデータベースで一致した場合、種の特定までなされなくても、単離株は科または属のレベルで正確に同定されたものとする。「該当なし／誤同定」欄は、適切な同定のためには低品質すぎる質量スペクトルを示す単離株であって、信頼性の無い同定や、時には、誤同定がなされた単離株の欄である。これらの基準は本例にて合理的であったが、上述のソフトウェアによれば、当業者は個々のニーズに応じて適切な同定信頼性基準を自由に定めることができる。
【００９２】
本発明による微生物同定の成功によって、基地の処理方法で行われていた従来の研究であって、７６％未満の確度レベルの同定が報告されていた研究（例えば、MAIER, T. et. al,. 「Rapid Identification of Bacteria from Blood Cultures Using MALDI-TOF MS」, Poster ICAAC 48th Annual Meeting, 2008、や、Drake et al., 「MALDI-TOF Mass Spectrometry Based Identification of Clinically Important Microorganisms」, ASMS Poster, Philadelphia 2009参照）よりも明らかに優れている、９５％近い種の確度レベルを達成することができた。あらゆる数の数学モデル又はスペクトルデータベースを用いて、血液培養物からの微生物の同定を行うことができるが、有利なことに、これらの、商業データベースを用いた結果は、本発明による方法で血液培養物から処理された微生物は、「純粋な」コロニー由来のスペクトルの寒天培地データベースに一致させるのに十分な程度に、汚染物質の質量ピークの影響を受けないということを示す。
【００９３】
【表１】
0005509213.tif 000002
【００９４】
【表２】
0005509213.tif 000003
【００９５】
上記の説明は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本発明は添付の特許請求の範囲で定義されるものであり、各請求項には均等物も含まれる。本明細書に列挙した刊行物、特許出願、特許、特許文献および他の参考文献はすべて、参照する文および／または段落の教示内容全体が本明細書に援用されるものとする。
【図１】
0005509213.tif 000004
【図２】
0005509213.tif 000005
【図３】
0005509213.tif 000006