(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一種の核酸配列と、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるために有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒と、ハイブリダイゼーション溶液を含有するハイブリダイゼーション組成物であって、前記極性非プロトン溶媒の濃度が１％から９５％（ｖ／ｖ）であり、前記極性非プロトン溶媒は環状基本構造を有し、
前記極性非プロトン溶媒が、
0005588970.tif 000036
からなる群から選択される、
ハイブリダイゼーション組成物。
【請求項２】
前記極性非プロトン溶媒が非毒性である請求項１に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項３】
但し、前記組成物が１０（ｖ／ｖ）％未満のホルムアミドを含むか、又はホルムアミドを含まない、請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項４】
前記極性非プロトン溶媒が、ラクトン、スルホン、サルファイト及び／又はカーボネートである請求項１から３の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項５】
前記極性非プロトン溶媒が、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２の範囲の分散溶解度パラメータ、１３から２３ＭＰａ１／２の範囲の極性溶解度パラメータ、及び３から１３ＭＰａ１／２の範囲の水素結合溶解度パラメータを有する請求項１から４の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項６】
緩衝剤、塩、促進剤、キレート剤、洗浄剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも一種の更なる成分を更に含む請求項１から５の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項７】
促進剤がデキストラン硫酸であり、塩がＮａＣｌ及び／又はホスフェートバッファーである請求項６に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項８】
デキストラン硫酸が１０（ｗ／ｖ）％から３０（ｗ／ｖ）％の濃度で存在し、ＮａＣｌが３００ｍＭから６００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが５ｍＭから２０ｍＭの濃度で存在する請求項７に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項９】
１５（ｖ／ｖ）％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０（ｗ／ｖ）％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのクエン酸バッファー（ｐＨ６．２）を含有する請求項１から８の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物。
【請求項１０】
ハイブリダイゼーションアッセイにおける請求項１から９の何れか一項に記載のハイブリダイゼーション組成物の使用。
【請求項１１】
核酸配列をハイブリダイズさせる方法において、
−  細胞及び組織試料中にある第一核酸配列を提供し、
−  第二核酸配列を提供し、
−  二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるために、少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有するハイブリダイゼーション組成物を提供し、及び
−  第一及び第二核酸配列とハイブリダイゼーション組成物を、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるために少なくとも十分な時間の間、組合せることを含み、
前記極性非プロトン溶媒は環状基本構造を有し、
前記極性非プロトン溶媒が
0005588970.tif 000037
からなる群から選択される、方法。
【請求項１２】
前記ハイブリダイゼーション組成物が第二核酸配列を含有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハイブリダイゼーション組成物が請求項１から９の何れか一項に定義のものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
変性及びハイブリダイゼーション工程が別個に生じる請求項１１から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリダイゼーション工程が８時間未満、又は１時間未満、又は３０分未満、又は１５分未満、又は５分未満を要する請求項１１から１４の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイゼーションに使用するため、例えばインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）に使用するための水性組成物に関する。
【０００２】
一実施態様では、本発明は、ＤＮＡ及びＲＮＡの分子的検査の分野に関する。特に、本発明は、細胞診、組織診断、及び分子生物学の分野に関する。一態様では、本発明は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡを標的にするインサイツハイブリダイゼーションにおいて、核酸間のハイブリダイゼーション中に必要とされるエネルギー（例えばインキュベーション時間と熱）に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡの二重螺旋構造は、塩基がある特定の方法（Ａ＋Ｔ又はＧ＋Ｃ）で対となる場合に反対のストランドの塩基間における水素結合によって安定化される。
【０００４】
ハイブリダイゼーションの基本的な例では、核酸断片又は配列が相補的核酸断片又は配列に結合する。例えば、ハイブリダイゼーションは、標的、例えばＤＮＡ又はＲＮＡに結合、又は「ハイブリダイズ」するように設計された核酸プローブを使用しうる。一つのタイプのハイブリダイゼーションであるインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、検体中の標的へのハイブリダイゼーションを含み、ここで、検体はインビボでも、又は例えばガラススライドに固定され又は付着されていてもよい。プローブは標識され、蛍光又は明視野顕微鏡／スキャナーの使用によってプローブ・標的ハイブリッドの同定が可能になる。断片又は配列は、典型的には二本鎖又は一本鎖核酸、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、又はアナログである。ある実施態様では、断片又は配列は、例えば３１Ｐ、３３Ｐ、又は３２Ｓのような放射標識、例えばジゴキシゲニン及びビオチンのような非放射性標識、又は蛍光標識を使用して標識されうるプローブでありうる。かかる標識プローブは標的配列中の遺伝子異常を検出するために使用することができ、例えば出生前疾患、癌、及び他の遺伝子もしくは感染疾患についての貴重な情報をもたらす。
【０００５】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイの効率と精度は、殆どは３つの主要な因子の少なくとも一つに依存する：ａ）変性（つまり、例えば二つの核酸ストランドの分離）条件、ｂ）再生（つまり、例えば二つの核酸ストランドの再アニーリング）条件、及びｃ）ハイブリダイゼーション後洗浄条件。
【０００６】
伝統的なハイブリダイゼーション実験、例えばＩＳＨアッセイは、二本鎖核酸を変性させるためにホルムアミド含有溶液を使用する。ホルムアミドは、ゆるくかつ均一に結合した水和物分子を置換することによって、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及びアナログの螺旋状態に不安定化作用を有する溶媒である。更に、ホルムアミドは、塩基のワトソン・クリック結合部位の「ホルムアミド化」により塩基のワトソン・クリック結合部位の「ホルムアミド化」によりＤＮＡ、ＲＮＡ、及びアナログのコイル状態を安定化させる。しかしながら、ホルムアミドは毒性の危険な物質であり、使用と廃棄については厳しい規制がかけられている。
【０００７】
更に、ホルムアミドの使用は、ハイブリダイゼーションの標準的な技術として受け入れられているが、使用される条件及び核酸断片又は配列に依存して、ハイブリダイゼーションを完了させるのに必要な長い時間によって妨害されている。例えば、変性工程には、例えば、伝統的な蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）プロトコルでは、１４−２４時間かかり、７２時間まででさえかかりうる長時間を費やすハイブリダイゼーション工程が続く。伝統的なハイブリダイゼーション時間の例は図１及び２に示す。
【０００８】
核酸鎖の二つの相補鎖を再アニール（つまりハイブリダイズ）する工程は、これまで、ハイブリダイゼーションを使用するアッセイの最も時間を費やす側面である。核酸塩基のワトソン・クリック結合部位と干渉し、それによって相補的核酸塩基間の水素結合を乱すホルムアミド、グアニジウム水素及びウレアのようなカオトロピック剤の使用は、相補鎖の融解温度（Ｔｍ）を低下させる唯一の方法であると今まで信じられていた。しかしながら、カオトロピック剤の使用はＴｍを低下させるが、これらの薬剤は、カオトロピック剤を含まない水溶液でのハイブリダイゼーションと比較して、ハイブリダイゼーション時間を顕著に延長するようである。更に、長い処理時間の欠点の他に、高濃度のホルムアミドの使用は、細胞、核、及び／又は染色体構造の形態的破壊を招くようである。最後に、ホルムアミドはヒトに対して毒性で危険な化学物質であると考えられる。
【０００９】
本発明は、例えば、より速いハイブリダイゼーション時間、より低いハイブリダイゼーション温度、及びより毒性の少ないハイブリダイゼーション溶媒のような、先行技術に対する幾つかの潜在的な利点を提供する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、次の利点の少なくとも一つを生じる組成物を提供することにある：高感度で、技術的に容易で、柔軟性があり、信頼性があるハイブリダイゼーション手順、及び速やかな分析。ある実施態様では、例えば、一つの利点は、従来の方法を使用して可能になるよりも更に大なる温度までハイブリダイゼーション反応の温度を変えることによってハイブリダイゼーション時間を調節できることである。例えば、ハイブリダイゼーションは室温で可能でありうる。
【００１１】
一実施態様では、本発明の組成物及び方法はハイブリダイゼーションに必要なエネルギーを低下させる。本発明の組成物及び方法は、任意のハイブリダイゼーション技術に適用可能である。本発明の組成物及び方法は、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ，及びその合成及び天然アナログのような塩基対を使用してハイブリダイズ又は結合する任意の分子系にも適用可能である。
【００１２】
生物学的試料の形態を保持するハイブリダイゼーション方法及び組成物を提供することが本発明の更なる目的である。非毒性のハイブリダイゼーション組成物及び手順を提供することが本発明の他の目的である。低蒸発のハイブリダイゼーション技術を提供することが本発明の更に他の目的である。本発明の更なる目的は、２０×対物で検出できるハイブリダイゼーション技術を提供することにある。本発明の更に他の目的は、低プローブ濃度の組成物を提供することにある。非特異的結合のブロッキングの必要性を低減及び／又は除去することが本発明の他の目的である。本発明の組成物及び方法は、生物学的試料中の例えば反復配列の結合をブロックし、除去し、又はその他無能にする必要なしで不均一なプローブの使用をまた可能にしうる。
【００１３】
一実施態様では、本発明の核酸ハイブリダイゼーション方法及び組成物は、ゲノムＤＮＡ、染色体、染色体断片、遺伝子、及び染色体異常、例えば正常な状態又は疾患に関連する転座、欠失、増幅、挿入、変異、又は逆位のインビボ又はインビトロ分析に有用である。更に、該方法及び組成物は、感染剤並びに例えばｍＲＮＡとその相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のようなＲＮＡの発現レベルの変化の検出に有用である。
【００１４】
他の用途は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルスＲＮＡ、ウイルスＤＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、非翻訳ＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ及びｒＲＮＡ）、転移メッセンジャーＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用(piwi-interacting)ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長非翻訳ＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、メチレーション及び他の塩基修飾、一塩基多型（ＳＮＰｓ）、コピー数多型（ＣＮＶｓ）、及び例えば単独で又は非抄紙機核酸と組み合わせて、放射性同位体、蛍光分子、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）又は抗原で標識された核酸のインビボ又はインビトロ分析を含む。
【００１５】
本発明の核酸ハイブリダイゼーション方法及び組成物は、ＰＣＲ、インサイツＰＣＲ、ノーザンブロット、サザンブロット、フローサイトメトリー、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡、化学発光、免疫組織化学、仮想核型、遺伝子アッセイ、ＤＮＡマイクロアレイ（例えば、アレイ比較的ゲノムハイブリダイゼーション（アレイＣＧＨ））、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子ＩＤ、タイリングアレイ、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びインサイツハイブリダイゼーション、例えばＦＩＳＨ、ＳＩＳＨ、ＣＩＳＨのような技術を使用する核酸のインビボ又はインビトロ分析に有用である。本発明の組成物及びキットは、骨髄スメア、血液スメア、パラフィン包埋組織調製物、酵素的に解離された組織試料、骨髄、羊膜細胞、サイトスピン調製物、インプリント等のようなインビトロ及びインビボ試料に使用されうる。
【００１６】
一実施態様では、本発明は少なくとも一の分子を標的にハイブリダイズさせるための方法及び組成物を提供する。本発明は、例えばホルムアミドの使用を排除し、又はそれへの依存性を低減しうる。例えば、本発明の方法及び組成物は、ホルムアミドを使用しないでハイブリダイゼーションに対するエネルギー障壁を低下させうる。より低いエネルギー障壁は、ハイブリダイゼーションに必要な時間及び／又は温度を減少させうる。例えば、本発明は、低い温度でのハイブリダイゼーションを可能にし得、又はより高い温度での速やかなハイブリダイゼーションを可能にしうる。よって、ある態様では、本発明は、ハイブリダイゼーションアッセイにおける主要な時間を要する工程を克服する。
【００１７】
本発明の一態様は、ハイブリダイゼーションにおける使用のための組成物又は溶液である。本発明に使用される組成物は、少なくとも一の核酸配列と二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含む水性組成物を含む。二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるために有効な量は、ハイブリダイゼーションを可能にする量である。例えば、極性非プロトン溶媒がハイブリダイゼーションをなすのに効果的かどうかを試験する一方法は、極性非プロトン溶媒が、例えば実施例１におけるように、ここに記載のハイブリダイゼーション方法及び組成物に使用される場合、検出可能なシグナル及び／又は増幅された核酸産物を生じるかどうかを決定することである。
【００１８】
極性非プロトン溶媒の有効量の非限定的例は、例えば約１％から約９５％（ｖ／ｖ）を含む。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は５％から６０％（ｖ／ｖ）である。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は１０％から６０％（ｖ／ｖ）である。更に他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は３０％から５０％（ｖ／ｖ）である。１％から５％、５％から１０％、１０％、１０％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、又は５０％から６０％（ｖ／ｖ）の濃度もまた適している。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒は０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するであろう。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、又は２０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在するであろう。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、極性非プロトン溶媒を含有する水性組成物は減少した毒性を有している。例えば、伝統的なハイブリダイゼーション溶液よりも毒性の少ない組成物は、組成物がホルムアミドを含まない条件、又は組成物が１０％未満、又は５％未満、又は２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満のホルムアミドを含む条件の組成物を含みうる。毒性の少ない組成物は、組成物がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含まない条件、又は組成物が１０％、５％、２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満のＤＭＳＯを含む条件の組成物を含みうる。
【００２０】
本発明の一態様では、本発明での使用のために適した極性非プロトン溶媒は、そのハンセン溶解度パラメータに基づき選択されうる。例えば、適切な極性非プロトン溶媒は、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２の分散溶解度パラメータ、１３から２３ＭＰａ１／２の極性溶解度パラメータ、及び３から１３ＭＰａ１／２の水素結合溶解度パラメータを有しうる。
【００２１】
本発明の一態様によれば、本発明において使用される適切な極性非プロトン溶媒は環状化合物である。環状化合物は環状基本構造を有する。例にはここに開示された環状化合物を含む。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は以下の式１−４から選択されうる：
0005588970.tif 000002
ここで、ＸはＯであり、Ｒ１はアルキルジイルである。
【００２２】
本発明の他の態様によれば、本発明において使用される適切な極性非プロトン溶媒は以下の式５から選択されうる：
0005588970.tif 000003
ここで、Ｘは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され；
Ｚは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され；
Ａ及びＢは独立してＯ又はＮ又はＳ又はアルキルジイルの一部又は第１級アミンであり；
Ｒはアルキルジイルであり；
ＹはＯ又はＳ又はＣである。
【００２３】
式５に記載の適切な極性非プロトン溶媒の例を以下の式６−９に提供する：
0005588970.tif 000004
【００２４】
本発明の更に他の実施態様によれば、極性非プロトン溶媒はラクトン、スルホン, ニトリル, サルファイト,又はカーボネート官能性を有する。かかる化合物は、その比較的高い比誘電率、高い双極子モーメント及び水への溶解度によって区別される。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、ラクトン官能性を有する極性非プロトン溶媒はγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）であり、スルホン官能性を有する極性非プロトン溶媒はスルホラン（ＳＬ）であり、ニトリル官能性を有する極性非プロトン溶媒はアセトニトリル（ＡＮ）であり、サルファイト官能性を有する極性非プロトン溶媒はグリコールサルファイト／エチレンサルファイト（ＧＳ）であり、カーボネート官能性を有する極性非プロトン溶媒はエチレンカーボネート（ＥＣ）、プロピレンカーボネート（ＰＣ）、又はエチレンチオカーボネート（ＥＴＣ）である。
【００２６】
また別の態様によれば、本発明は、核酸をハイブリダイズする方法において、
−  第一核酸配列を提供し、
−  第二核酸配列を提供し、
−  少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量で含有する水性組成物を提供し、
−  第一及び第二核酸配列と水性組成物を、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せ
ることを含む方法を開示する。
一実施態様では、第一及び第二核酸をハイブリダイズさせるのに十分な量のエネルギーが提供される。
一実施態様では、第二核酸配列への第一核酸配列のハイブリダイゼーションは８時間未満、例えば６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、又は１時間未満に生じる。
【００２７】
該方法は、例えば、
−  第一核酸配列を提供し、
−  第二核酸配列と少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量で含有する水性組成物を上記第一核酸配列に、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用する
ことを含みうる。
一実施態様では、第一及び第二核酸をハイブリダイズさせるのに十分な量のエネルギーが提供される。
一実施態様では、第二核酸配列への第一核酸配列のハイブリダイゼーションは８時間未満、例えば６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、又は１時間未満に生じる。
【００２８】
本発明の更に他の態様によれば、ハイブリダイゼーションエネルギーは、水性組成物と核酸配列を加熱することにより提供される。よって、ハイブリダイズ工程は、水性組成物と核酸配列を加熱し冷却する工程を含みうる。
本発明の他の態様によれば、変性及びハイブリダイゼーション工程は別個に生じうる。例えば、標本は、プローブなしの溶液を用いて変性され、その後にプローブとハイブリダイズされうる。
【００２９】
本発明の更なる態様は、核酸をハイブリダイズさせるのに十分な量のエネルギーを提供する工程が、マイクロ波、熱浴、ホットプレート、電熱線、ペルチェ素子、誘導加熱又は加熱ランプの使用により実施される加熱工程を含む方法を含む。
他の態様では、本発明はハイブリダイゼーションが１時間未満で起こる方法に関する。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは３０分未満で起こる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは１５分未満で起こる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは５分未満で起こる。
【００３０】
更なる態様によれば、本発明はハイブリダイゼーションアッセイにおける１から９５％（ｖ／ｖ）の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含有する組成物の使用に関する。
また別の態様によれば、本発明はハイブリダイゼーションアッセイに使用するための本発明に記載された水性組成物を含む組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋組織片（組織検体）での一次標識ＦＩＳＨプローブを用いた単一遺伝子座検出の典型的な時間経過を示す。バーは、伝統的な溶液（上）を使用して実施されたハイブリダイゼーションと、本発明の組成物（下）を使用して実施されたハイブリダイゼーションに対する典型的な時間経過を表す。各時間経過中の左側の最初のバーは脱パラフィン工程を表し；二番目のバーは加熱前処理工程を表し；三番目のバーは消化工程を表し；四番目のバーは変性及びハイブリダイゼーション工程を表し；五番目のバーはストリンジェンシー洗浄工程を表し；六番目のバーはマウント工程を表す。
【図２】図２は、細胞検体での一次標識ＦＩＳＨプローブを用いた単一遺伝子座検出の典型的な時間経過を示す。バーは、伝統的な溶液（上）を使用して実施されたハイブリダイゼーションと、本発明の組成物（下）を使用して実施されたハイブリダイゼーションに対する典型的な時間経過を表す。各時間経過中の左側の最初のバーは固定工程を表し；二番目のバーは変性及びハイブリダイゼーション工程を表し；三番目のバーはストリンジェンシー洗浄工程を表し；四番目のバーはマウント工程を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ａ．定義
本発明の文脈において、次の用語は次の通りに理解されなければならない：
「生物学的試料」は、一又は複数の細胞又は細胞断片の任意のインビボ、インビトロ、又はインサイツ試料として理解されなければならない。これは、例えば単細胞又は多細胞生物、組織片、細胞試料、染色体スプレッド、精製核酸配列、例えば生物学ベースのシステム又は化学合成、マイクロアレイ、又は核酸チップの他の形態によって作製された人工的に作製された核酸配列でありうる。一実施態様では、試料は哺乳動物試料、例えば ヒト、マウス、ネコ、ラット、又はイヌ試料である。
【００３３】
「核酸」、「核酸鎖」、及び「核酸配列」は、天然に生じるヌクレオチドから形成された骨格を有するオリゴマー又はポリマー及び／又は非標準核酸塩基及び／又は非標準骨格を含む核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸（ＬＮＡ））、又は核酸の任意の誘導体化形態を含む、塩基対形成を使用して結合又はハイブリダイズする任意のものを意味する 。
【００３４】
ここで使用される場合、「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」なる用語は、限定するものではないが、例えば全てが出典明示によりここに援用される米国特許第５５３９０８２号、第５５２７６７５号、第５６２３０４９号、第５７１４３３１号、第５７１８２６２号、第５７３６３３６号、第５７７３５７１号、第５７６６８５５号、第５７８６４６１号、第５８３７４５９号、第５８９１６２５号、第５９７２６１０号、第５９８６０５３号、第６１０７４７０号、第６２０１１０３号、第６２２８９８２号及び第６３５７１６３号、国際公開第９６／０４０００号又はそこで引用されている文献の任意のものにおいてペプチド核酸として言及され又は請求項に記載されたオリゴマー又はポリマーセグメントの任意のものを含むペンダント核酸塩基と共にポリアミド骨格を有する合成ポリマー（天然に生じるもの及び修飾されたもの）を意味する。例えばＰＮＡ上のプリン又はピリミジン塩基のようなペンダント核酸塩基は、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３又はそこに引用された文献の任意のものに教示されているリンカーの一つのようなリンカーを介して骨格に連結されうる。一実施態様では、ＰＮＡはＮ−（２−アミノエチル）−グリシン）骨格を有している。ＰＮＡは、ＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３又はそこに引用された文献の任意のものに教示されているようにして合成され（場合によっては標識され）うる。ＰＮＡは、ＰＮＡ骨格が変わらないので、ＤＮＡ及びＲＮＡと堅固にかつ高い配列特異性をもってハイブリダイズする。よって、短いＰＮＡプローブは長いＤＮＡ又はＲＮＡプローブに匹敵する特異性を示しうる。ＰＮＡプローブはまた相補ＤＮＡ又はＲＮＡへの結合において大なる特異性を示しうる。
【００３５】
ここで使用される場合、「ロックド核酸」又は「ＬＮＡ」なる用語は、少なくとも一又は複数のＬＮＡサブユニットを含むオリゴマー又はポリマーを意味する。ここで使用される場合、「ＬＮＡサブユニット」なる用語は、リボースの２’−酸素を４’−炭素と結合させるメチレン架橋を含むリボヌクレオチドを意味する。一般に、Kurreck, Eur. J. Biochem., 270:1628-44 (2003)を参照のこと。
【００３６】
核酸及び核酸アナログの例はまた二本鎖及び一本鎖デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、そのα−アノマー型、その合成及び天然アナログ等々を含むヌクレオチドモノマーのポリマーを含む。核酸鎖は全体がデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、その合成又は天然アナログ、又はその混合物から構成されうる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はここに定義される他の核酸を本発明の方法及び組成物において使用することができる。
【００３７】
「極性非プロトン溶媒」は、雰囲気温度又はその近傍、例えば約２０℃で、少なくとも５％（体積）の水溶性、約２デバイ単位以上の双極子モーメントを有し、略中性のｐＨ、つまりｐＨ５から９の範囲、又は６から８の範囲で有意な水素交換を受けない有機溶媒を意味する。極性非プロトン溶媒は以下に検討される ハンセン溶解度パラメータに従って定義されるものを含む。
【００３８】
「アルキルジイル」は、親のアルカン、アルケン、又はアルキンの二つの異なった炭素原子から一つの水素原子を除去することによって誘導された二つの一価ラジカル中心を有する飽和又は不飽和、分枝、直鎖又は環状炭化水素基を意味する。
【００３９】
「水溶液」は、例え少量の水でさえ、水を含む溶液として理解されなければならない。例えば、１％の水を含む溶液は水溶液として理解されなければならない。
【００４０】
「ハイブリダイゼーション」は、別の定義がなされない限り、ハイブリダイゼーション手順の変性及び再アニーリング工程を双方とも含むものと理解されなければならない。
【００４１】
「ハイブリダイゼーション組成物」は、例えば核酸配列にプローブを結合させるためにハイブリダイゼーション手順を実施するための本発明の水溶液を意味する。ハイブリダイゼーション組成物は、例えば少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、少なくとも一つの核酸配列、及びハイブリダイゼーション溶液を含みうる。ハイブリダイゼーション組成物は、酵素又は例えば生物学的試料中の核酸を増幅させるためのデオクシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）のような他の成分を含まない。
【００４２】
「ハイブリダイゼーション溶液」は、本発明のハイブリダイゼーション組成物において使用される水溶液を意味する。ハイブリダイゼーション溶液は以下に詳細に検討され、例えば緩衝剤、促進剤、キレート剤、塩、洗浄剤、及びブロッキング剤を含みうる。
【００４３】
「ＰＣＲ組成物」は、核酸配列を増幅させるためにハイブリダイゼーション手順を実施するための本発明の水溶液を意味する。ＰＣＲ組成物は、例えば少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、核酸を増幅させるための少なくとも一種の酵素、核酸オリゴヌクレオチドプライマーのセット、ｄＮＴＰｓの混合物、及びＰＣＲ溶液溶液を含みうる。
【００４４】
「ＰＣＲ溶液」は本発明のＰＣＲ組成物において使用される水溶液を意味する。ＰＣＲ溶液は例えば緩衝剤、促進剤、キレート剤、塩及び洗浄剤を含みうる。
【００４５】
「ハンセン溶解度パラメータ」及び「ＨＳＰ」は次の凝集エネルギー（溶解度）パラメータを意味する：（１）原子間力から誘導された非極性相互作用を測定する分散溶解度パラメータ（ｄＤ、「Ｄパラメータ」）；（２）永久双極子−永久双極子相互作用を測定する極性溶解度パラメータ（ｄＰ、「Ｐパラメータ」）；及び（３）電子交換を測定する水素結合溶解度パラメータ（ｄＨ、「Ｈパラメータ」）。ハンセン溶解度パラメータは更に以下に定義する。
【００４６】
「反復配列」は、哺乳動物ゲノムの成分を急速に再アニールする（およそ２５％）及び／又は中間的に再アニールする（およそ３０％）ことを意味するものと理解されなければならない。急速に再アニールする成分は、通常はタンデムで見出される（例えばサテライトＤＮＡ）小さい（数ヌクレオチド長）高度に反復性の配列を含む一方、中間的に再アニールする成分は散在反復ＤＮＡを含む。散在反復配列はＳＩＮＥｓ（短い散在反復配列）又はＬＩＮＥｓ（長い散在反復配列）の何れかとして分類され、その双方が霊長類においてレトロトランスポゾンとして分類される。ＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓは、限定しないが、Ａｌｕ−リピート、Ｋｐｎ−リピート、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ペンタヌクレオチドリピート及びヘキサヌクレオチドリピートを含む。ＡｌｕリピートはヒトＳＩＮＥｓの大部分を構成し、ヘッドトゥーテール二量体として配された二つの類似配列からなるおよそ２８０から３００ｂｐのコンセンサス配列によって特徴付けられる。ＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓに加えて、リピート配列は染色体の末端の染色体テロメア及び染色体セントロメアにもまた存在し、これは、染色体の中心領域にのみ存在する別のリピート配列を含む。しかしながら、ゲノム全体にわたって無作為に分散しているＳＩＮＥｓ及びＬＩＮＥｓとは異なり、テロメア及びセントロメアリピート配列は染色体のある領域内に局在化している。
【００４７】
「非毒性」及び「減少した毒性」は、ホルムアミドの毒性標識に関して、"Directive 1999/45/EC of the European Parliament and of the Council of 31 May 1999 concerning the approximation of the laws, regulations及びadministrative provisions of the Member States relating to the classification, packaging, and labelling of dangerous preparations" (ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf) (「Directive」)に従って定義される。Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅに従えば、毒性は次の分類順を使用して定義される：Ｔ＋「非常に毒性」；Ｔ「毒性」、Ｃ「腐食性」、Ｘｎ「有害」、Ｘｉ「刺激性」。リスクフレーズ（「Ｒフレーズ」）は分類された毒性のリスクを記述する。ホルムアミドはＴ（毒性）及びＲ６１（胎児に害を及ぼしうる）としてリストされている。次の化学物質の全てがホルムアミドよりも毒性が少ないものとして分類されている：アセトニトリル（Ｘｎ、Ｒ１１、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ３６）；スルホラン（Ｘｎ、Ｒ２２）；γ−ブチロラクトン（Ｘｎ、Ｒ２２、Ｒ３２）；及びエチレンカーボネート（Ｘｉ、Ｒ３６、Ｒ３７、Ｒ３８）。本出願の出願時には、エチレントリチオカーボネート及びグリコールサルファイトは現在は分類されていない。
【００４８】
Ｂ．溶媒選択
本発明に使用される適切な極性非プロトン溶媒は、そのハンセン溶解度パラメータに基づいて選択することができる。ある溶媒に対してＨＳＰを実験的に決定し及び／又は計算するための方法は当該分野で知られており、ＨＳＰは１２００を越える化学物質に対して報告されている。
【００４９】
例えば、Ｄパラメータは、屈折率に基づいて合理的な精度で計算することができ、又は臨界温度及びモル体積を樹立した後、類似のサイズ、形状、及び組成の既知の溶媒と比較したチャートから誘導することができる。Ｐパラメータは、式１を使用して既知の双極子モーメント（例えば、McClellan A.L., Tables of Experimental Dipole Moments (W.H. Freeman 1963)を参照）から推定することができる：
式１：δＰ＝３７．４(双極子モーメント)／Ｖ１／２
ここで、Ｖはモル体積である。Ｈパラメータを計算するための式はない。その代わりに、Ｈパラメータは通常グループ寄与に基づいて決定される。
【００５０】
ＨＳＰ特徴付けは、球の中心の実験的に決定された適切な参照溶媒のＨＳＰを用いて、簡便には球標示を使用して可視化される。球半径（Ｒ）は、「良好な」相互作用が起こるのを尚可能にする参照溶媒のＨＳＰからの最大の許容可能な変動を示す。良好な溶媒は球の内部にあり悪いものは外である。その各ＨＳＰ値に基づく２つの溶媒間の距離 Raは、式２を使用して決定することができる：
式２：(Ｒａ)２＝４(δＤ１−δＤ２)２＋(δＰ１−δＰ２)２(δＨ１−δＨ2)２
ここで、添え字１は参照試料を示し、添え字２は試験化学物質を示し、全ての値はＭＰａ１／２である。良好な溶解度は、Ｒａが溶解度球の実験的に決定された半径Ｒｏよりも少ないことを必要とする。２つの溶媒間の相対的なエネルギー差、つまりＲＥＤ数は、式３に示すように、Ｒｏに対するＲａの比をとることによって計算することができる。
式３：ＲＥＤ＝Ｒａ／Ｒｏ
１．０未満のＲＥＤ数は高親和性を示し；１．０に等しいか近いＲＥＤ数は境界条件を示し；漸次高くなるＲＥＤ数は漸次低くなる親和性を示している。
【００５１】
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＤパラメータは、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２である。このような相対的に高いＤパラメータは一般に環状構造及び／又は硫黄又はハロゲンを持つ構造の溶媒に関連する。直鎖状化合物は本発明で使用されるための最も適した溶媒にはなり得ないが、そのＰ及びＨパラメータが以下に検討する範囲内にあれば考慮されうる。Ｄパラメータは式２において４倍されているので、限界はＲｏの半分である。また、約２１又はそれ以上のＤ値はしばしば固体の特徴であることに留意されなければならない。
【００５２】
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＰパラメータは１３から２３ＭＰａ１／２である。そのような指数的に高いＰパラメータは、一般に、高い双極子モーメント及びおそらくは相対的に低いモル体積を有する溶媒に関連する。例えば、６０ｃｃ／モルに近いＶでは、双極子モーメントは４．５と３．１の間である。９０ｃｃ／モルに近いＶでは、双極子モーメントは５．６と３．９の間でなければならない。
【００５３】
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒のＨパラメータは３から１３ＭＰａ１／２である。一般に、アルコール基を有する極性非プロトン溶媒は、かかる溶媒のＨパラメータが余りに高いので、本発明の組成物及び方法においては有用ではない。
【００５４】
極性非プロトン溶媒のモル体積は、それが３つのハンセン溶解度パラメータ全ての評価に入るので、また関係している。モル体積が小さくなるにつれて、液体は急速に蒸発する傾向にある。モル体積が大きくなるにつれ、液体が上述のＤ及びＰパラメータの範囲の固体領域に入る傾向がある。よって、本発明の極性非プロトン溶媒は、ＨＳＰ空間における液体／固体境界にむしろ近い。
【００５５】
ある実施態様では、本発明の極性非プロトン溶媒は、ラクトン、スルホン、ニトリル、サルファイト、及び／又はカーボネート官能性を有する。かかる化合物は、その相対的に高い比誘電率、高い双極子モーメント、及び水への溶解度によって区別される。ラクトン官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）であり、スルホン官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はスルホラン（ＳＬ；テトラメチレンスルフィド−ジオキシド）であり、ニトリル官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はアセトニトリル（ＡＮ）であり、サルファイト官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はグリコールサルファイト／エチレンサルファイト（ＧＳ）であり、カーボネート官能性を有する例示的な極性非プロトン溶媒はエチレンカーボネート（ＥＣ）、プロピレンカーボネート（ＰＣ）、又はエチレントリチオカーボネート（ＥＴＣ）である。これらの例示的な溶媒の構造を以下に提供し、そのハンセン溶解度パラメータ、ＲＥＤ数、及びモル体積を表１にまとめる。
【００５６】
0005588970.tif 000005
0005588970.tif 000006
【００５７】
本発明で使用されうる他の適切な極性非プロトン溶媒は環状化合物、例えばε−カプロラクトンある。また、置換ピロリジノン及び５−又は６−員環の窒素を含む関連構造、及び二つのニトリル基、又は一つの臭素及び一つのニトリル基を持つ環状構造がまた本発明の使用に適している場合がある。例えば、Ｎ−メチルピロリドン（以下に示す）は本発明の方法及び組成物における使用に適している極性非プロトン溶媒でありうる。
0005588970.tif 000007
他の適切な極性非プロトン溶媒は環ウレタン基（ＮＨＣＯＯ−）を含みうる。しかしながら、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノンは本発明のハイブリダイゼーション組成物において使用される場合シグナルを生じないので、必ずしも全てのかかる化合物が適切な訳ではない。当業者はここに記載の本発明の組成物及び方法に有用な化合物をスクリーニングしてもよい。本発明における使用に適していよう例示的な化学物質を以下の表２及び３に記載する。
【００５８】
0005588970.tif 000008
0005588970.tif 000009
【００５９】
表２はそのハンセン溶解度パラメータに基づき本発明の組成物及び方法において使用される潜在的な化学物質の例示的なリストを記載する。勿論、他の化合物もこれらの要件を満たしうる。これらの化学物質の幾らかは先行技術においてハイブリダイゼーション及び／又はＰＣＲ溶液中に使用されている（例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）はハイブリダイゼーション及びＰＣＲ溶液に使用されており、スルホラン（ＳＬ）はＰＣＲ溶液に使用されている）が、殆どは使用されていない。しかしながら、先行技術には、これらの化合物が、本願に開示したように、ハイブリダイゼーション時間及び／又は温度を低減させるために有利に使用することができることは認識されてはいなかった。
【００６０】
0005588970.tif 000010
【００６１】
表２及び３に列挙される化学物質の必ずしも全てが本発明の組成物及び方法での使用に適しているものではない。例えば、そのハンセン溶解度パラメータ（ＨＳＰｓ）が上に記載の範囲に入っているので、ＤＭＳＯが表２に列挙されているが、本発明の組成物及び方法において、ＤＭＳＯはハイブリダイゼーション時間及び／又は温度を減少させるように機能しない。よって、ある実施態様では、水性組成物は極性非プロトン溶媒としてＤＭＳＯを含んでいない。しかしながら、提供された実施例の一つにおける化合物の試験を含むここで提供されるガイドを使用して適切な化合物をスクリーニングすることは当業者の技量の範囲である。例えば、ある実施態様では、適切な極性非プロトン溶媒は、上に記載された範囲のＨＳＰｓと上記の式１−９に示された構造を有している。
【００６２】
Ｃ．組成物、バッファー、及び溶液
（１）ハイブリダイゼーション溶液
伝統的なハイブリダイゼーション溶液は当該分野で知られている。かかる溶液は、例えば緩衝剤、促進剤、キレート剤、塩、洗浄剤、及びブロッキング剤を含みうる。
例えば、緩衝剤は、ＳＳＣ、ＨＥＰＥＳ、ＳＳＰＥ、ＰＩＰＥＳ、ＴＭＡＣ、ＴＲＩＳ、ＳＥＴ、クエン酸、リン酸バッファー、例えばリン酸カリウム又はピロリン酸ナトリウム等を含みうる。緩衝剤は０．５ｘから５０ｘの濃度で存在しうる。典型的には、緩衝剤は２ｘから１０ｘの濃度で存在する。
【００６３】
促進剤は、ポリマー、例えばＦＩＣＯＬＬ、ＰＶＰ、ヘパリン、デキストラン硫酸、タンパク質、例えばＢＳＡ、グリコール、例えばエチレングリコール、グリセロール、１，３プロパンジオール、プロピレングリコール、又はジエチレングリコール、その組合せ、例えばデンハート溶液及びＢＬＯＴＴＯ，及び有機溶媒、例えばホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ等を含みうる。促進剤は、１％から８０％又は０．１ｘから１０ｘの濃度で存在しうる。典型的には、ホルムアミドは２５％から７５％の濃度で存在する一方、ＤＭＳＯ、デキストラン硫酸，及びグリコールは５％から１０％の濃度で存在する。
【００６４】
キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等を含みうる。キレート剤は０．１ｍＭから１０ｍＭの濃度で存在しうる。典型的には、キレート剤は０．５ｍＭから５ｍＭの濃度で存在する。
塩は塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸マグネシウム等を含みうる。塩は１ｍＭから７５０ｍＭの濃度で存在しうる。典型的には、塩は１０ｍＭから５００ｍＭの濃度で存在する。
【００６５】
洗浄剤は、Ｔｗｅｅｎ、ＳＤＳ、トリトン、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸等を含みうる。洗浄剤は０．０１％から１０％の濃度で存在しうる。典型的には、洗浄剤は０．１％から１％の濃度で存在する。
核酸ブロッキング剤は、酵母ｔＲＮＡ、ホモポリマーＤＮＡ、変性サケ精液ＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、全ヒトＤＮＡ、ＣＯＴ１ ＤＮＡ等を含みうる。ブロッキング核酸は、０．０５ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在しうる。
【００６６】
伝統的なハイブリダイゼーション溶液に関する文献には様々な変形例が存在している。例えば、伝統的なハイブリダイゼーション溶液は５ｘ又は６ｘのＳＳＣ、０．０１ＭのＥＤＴＡ、５×デンハート液、０．５％のＳＤＳ、及び１００ｍｇ／ｍＬの剪断変性サケ精液ＤＮＡを含みうる。他の伝統的なハイブリダイゼーション溶液は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ＭのＮａＣｌ、及び０．２ｍＭのＥＤＴＡを含みうる。ＲＮＡ検出のための生物学的検体でのＦＩＳＨの典型的な．ハイブリダイゼーション溶液は、例えば２ｘＳＳＣ、１０％のデキストラン硫酸、２ｍＭのバナジル−リボヌクレオシド複合体、５０％のホルムアミド、０．０２％のＲＮＡｓｅ不含有ＢＳＡ、及び１ｍｇ／ｍＬの大腸菌ｔＲＮＡを含みうる。ＤＮＡ検出のための生物学的検体でのＦＩＳＨの典型的なハイブリダイゼーション溶液は、例えば２ｘＳＳＣ、１０％のデキストラン硫酸、５０％のホルムアミド、及び例えば０．３ｍｇ／ｍＬのサケ精液ＤＮＡ又は０．１ｍｇ／ｍＬのＣＯＴ１ ＤＮＡを含みうる。他の典型的なハイブリダイゼーション溶液は、４０％のホルムアミド、１０％のデキストラン硫酸、３０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、Ａｌｕ−ＰＮＡ（ブロッキングＰＮＡ）又はＣＯＴ−１ ＤＮＡを含み得、ある場合には０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ（ＴＨＤ）を含みうる。
【００６７】
本発明の組成物は、上述の伝統的なハイブリダイゼーション溶液の成分の何れかを少なくとも一種の極性非プロトン溶媒と組み合わせて含有するハイブリダイゼーション溶液を含みうる。伝統的な成分は伝統的なハイブリダイゼーション溶液において使用されるものと同じ濃度で存在し得、又はより高いかもしくはより低い濃度で存在し得、あるいは完全に省かれてもよい。
例えば、本発明の組成物がＮａＣｌのような塩及び／又はリン酸バッファーを含む場合、塩は、０−１２００ｍＭのＮａＣｌ及び／又は０−２００ｍＭのリン酸バッファーの濃度で存在しうる。ある実施態様では、塩の濃度は、例えば３００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのリン酸バッファー、又は６００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのリン酸バッファーでありうる。
【００６８】
本発明の組成物がデキストラン硫酸、グリコール、又はＤＭＳＯのような促進剤を含む場合、デキストラン硫酸は５％から４０％の濃度で存在し得、グリコールは０．１％から１０％の濃度で存在し得、ＤＭＳＯは０．１％から１０％でありうる。ある実施態様では、デキストラン硫酸の濃度は１０％又は２０％であり得、エチレングリコール、１，３プロパンジオール、又はグリセロールの濃度は１％から１０％でありうる。ある実施態様では、ＤＭＳＯの濃度は１％でありうる。ある実施態様では、水性組成物は促進剤としてＤＭＳＯを含まない。ある実施態様では、水性組成物は促進剤としてホルムアミドを含まず、又はホルムアミドを含むが、但し、１０％未満、又は５％未満、又は２％未満、又は１％未満、又は０．５％未満、又は０．１％未満、又は０．０５％未満、又は０．０１％未満である。
【００６９】
本発明の組成物がクエン酸を含む場合、濃度は１ｍＭから５０ｍＭの範囲であり得、ｐＨは５．０から８．０の範囲であり得る。ある実施態様では、クエン酸の濃度は１０ｍＭ及びｐＨは６．２でありうる。
本発明の組成物は、例えば細胞膜への非特異的結合を減少させる薬剤、例えばサケ精液又は少量の全ヒトＤＮＡを含み得、又は例えばそれらは標的への例えば反復配列の結合をブロックするためのブロッキング剤、例えば多量の全ヒトＤＮＡ又はリピートリッチ化ＤＮＡ又は特異的ブロッキング剤、例えばＰＮＡ又はＬＮＡ断片及び配列を含みうる。これらの薬剤は０．０１−１００μｇ／μＬ又は０．０１−１００μＭの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、これらの薬剤は０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ、又は０．１μｇ／μＬの非ヒトＤＮＡ、例えばニシン精液、サケ精液、又はウシ胸腺ＤＮＡ、又は５μＭのブロッキングＰＮＡであろう。
【００７０】
本発明の一態様はハイブリダイゼーションに使用される組成物又は溶液である。本発明において使用される組成物は、核酸配列及び二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含む水性組成物を含む。二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量がハイブリダイゼーションを可能にする量である。例えば、極性非プロトン溶媒の量がハイブリダイゼーションを可能にするのに有効かどうかを試験する一方法は、実施例１のようにここに記載のハイブリダイゼーション方法及び組成物に使用される場合、極性非プロトン溶媒が検出可能なシグナル及び／又は増幅された核酸産物を生じるかどうかを決定することである。
【００７１】
極性非プロトン溶媒の有効量の非限定的な例は、例えば約１％から約９５％（ｖ／ｖ）を含む。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は５％から６０％（ｖ／ｖ）である。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は１０％から６０％（ｖ／ｖ）である。更に他の実施態様では、極性非プロトン溶媒の濃度は３０％から５０％（ｖ／ｖ）である。１％から５％、５％から１０％、１０％、１０％から２０％、２０％から３０％、３０％から４０％、４０％から５０％、又は５０％から６０％（ｖ／ｖ）の濃度がまた適切である。ある実施態様では、極性非プロトン溶媒は０．１％、０．２５％、０．５％、１％、２％、３％、４％、又は５％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。他の実施態様では、極性非プロトン溶媒は７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１０．５％、１１％、１１．５％、１２％、１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、又は２０％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。
【００７２】
本発明の組成物がハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用される場合、それらは一又は複数の核酸プローブを更に含みうる。プローブは直接的に又は間接的に検出可能な化合物、例えば酵素、発色団、蛍光色素、及びハプテンで標識されうる。ＤＮＡプローブは０．１から１００ｎｇ／μＬの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、プローブは１から１０ｎｇ／μＬの濃度で存在しうる。ＰＮＡプローブは０．５から５０００ｎＭの濃度で存在しうる。例えば、ある実施態様では、プローブは５から１０００ｎＭの濃度で存在しうる。
【００７３】
一実施態様では、本発明の組成物は、４０％の極性非プロトン溶媒（ｖ／ｖ）（例えばエチレンカーボネート、「ＥＣ」）、１０％のデキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、及び１−１０ｎｇ／μＬプローブの混合物を含有する。本発明の他の例示的な組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、及び０．１μｇ／μｌの全ヒトＤＮＡの混合物を含有する。更に他の例示的な組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸ｐＨ６．２、及び０．１μｇ／μＬの非ヒトＤＮＡ（例えばニシン精子、サケ精液、又はウシ胸腺）又は０．５％ホルムアミド又は１％グリコール（例えばエチレングリコール、１，３プロパンジオール、又はグリセロール）を含む。
【００７４】
（２）極性非プロトン溶媒
異なった極性非プロトン溶媒は本発明の組成物に異なった性質を付与しうる。例えば、極性非プロトン溶媒の選択は、ある種の極性非プロトン溶媒は経時的に分解しうるので、組成物の安定性に寄与しうる。例えば、極性非プロトン溶媒のエチレンカーボネートは比較的安定な分子であるエチレングリコールと、水と相互作用して炭酸を形成しうる二酸化炭素に分解し、本発明の組成物の酸性を変える。理論に拘束されるものではないが、エチレンカーボネートの分解時のｐＨ変化は本発明の組成物をハイブリダイゼーションに対して効果的ではないものにすると思われる。しかしながら、安定性は、典型的には約ｐＨ７．４で使用される伝統的なリン酸バッファーの代わりにｐＨ６．２のバッファーとしてクエン酸を添加し、及び／又は例えば０．１％から１０％、又は０．５％から５％、例えば１％、２％、３％等の濃度でエチレングリコールを添加することにより、組成物のｐＨを減少させることによって改善することができる。例えば、１０ｍＭのクエン酸バッファーでは、本発明の組成物はおよそ８ヶ月の間、２−８℃で安定している。安定性はまた組成物を低い温度（例えば−２０℃）に保存すると、改善されうる。
【００７５】
また、ある種の極性非プロトン溶媒は、ある条件下で本発明の組成物を多相系に分離せしめうる。多相系が得られる条件は、異なった極性非プロトン溶媒に対して異なりうる。しかしながら、一般に、極性非プロトン溶媒の濃度が増加すると、相の数が増加する。例えば、低濃度のエチレンカーボネート（つまり、２０％未満）を含む組成物は一相として存在しうるが、より高濃度のエチレンカーボネートを含有する組成物は二、又は三相にさえ分離しうる。例えば、１５％のエチレンカーボネートを半有する組成物は室温で単一相として存在するが、４０％のエチレンカーボネートを含有する組成物は室温で粘性のある下相（全容量のおよそ２５％）と粘性の少ない上相（全容量のおよそ７５％）からなる。
他方、ある種の極性非プロトン溶媒は低濃度においてさえ二相で存在しうる。例えば、スルホラン、γ−ブチロラクトン、エチレントリチオカーボネート、グリコールサルファイト、及びプロピレンカーボネートは、室温で１０、１５、２０、又は２５％（２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸バッファー）の濃度で二相として存在する。
【００７６】
本発明の組成物の温度を調節することにより相の数を変更することもまたできうる。一般に、温度が上昇すると、相の数は減少する。例えば、２−８℃では、４０％のエチレンカーボネートを含有する組成物は三相系に分離しうる。
組成物中のデキストラン硫酸及び／又は塩の濃度を調節することにより相の数を変更することもまたできうる。一般に言えば、デキストラン硫酸濃度（伝統的な濃度が１０％である）及び／又は塩濃度の低下は相の数を減少させうる。しかしながら、組成物中の特定の極性非プロトン溶媒及びその濃度に応じて、単一相をたとえ高濃度の塩及びデキストラン硫酸ででも製造できる。例えば、低量のＥＣ（例えば１５％、１０％、又は５％）を含有する組成物は、デキストラン硫酸及び塩濃度を増加させることにより、一相系を尚維持しながら、良好に作用しうる。特定の実施態様では、ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ、ＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭのリン酸バッファーを含有する組成物は、−２０℃で凍結されている。他の実施態様では、組成物は−２０℃で液体である。
【００７７】
ある極性非プロトン溶媒は、ある相又は他の相に強いシグナルを生じうる。例えば、４０％のグリコールサルファイトは下相に強いシグナルを生じ、上相にシグナルを生じない。同様に、あるタイプのプローブはある相又は他の相に強いシグナルを生じうる。例えば、ＰＮＡプローブは上相より下相に強いシグナルを示す傾向がある。
従って、本発明の多相系は、試料の異なった側面を簡便に検査するために使用することができる。例えば、二相系を使用して、ＤＮＡプローブで標識された試料からＰＮＡプローブで標識された試料を分離することができよう。他には、単離された相が単一相系として使用できるようなある種のハイブリダイゼーションの利点を示す特定の相の単離が含まれる。プローブ及び／又は試料は特定の相の単離の前、又は後に加えることができる。
【００７８】
ハイブリダイゼーションは、本発明の一相組成物を用いて、本発明の多相組成物の個々の相を用いて、又は本発明の多相組成物中の相の何れか一又は複数の混合物で実施されうる。例えば、一相系では、ある容量の試料がハイブリダイゼーションにおいて使用するために抽出されうる。多相系では、ハイブリダイゼーションに使用するために関心のある相（例えば上、下、又は中間相）からある容量の試料を抽出することができる。あるいは、多相系中の相を、ハイブリダイゼーションでの使用に対して混合試料のある容量を抽出する前に混合することができる。しかしながら、多相系は、組成物に応じて、強く不均等な局所的バックグラウンド染色を生じうる。低量のホルムアミドの添加は一相系におけるバックグラウンドを低減させる一方、高濃度（例えば４０％）の極性非プロトン溶媒を含む多相系には殆ど効果がない。また、ホルムアミドの濃度が増加するにつれて、より高濃度のプローブ及び／又はより長いハイブリダイゼーション時間が強いシグナル強度を維持するために必要とされる。
【００７９】
（３）特定の応用に対する最適化
本発明の組成物は、特定の応用に対して結果を最適化するために変更しうる。例えば、極性非プロトン溶媒、塩、促進剤、ブロッキング剤、及び／又は水素イオン（つまりｐＨ）の濃度を、特定の応用に対する結果を改善するために変更しうる。
例えば、極性非プロトン溶媒の濃度を、シグナル強度及びバックグラウンド染色を改善するために変更しうる。一般に、極性非プロトン溶媒の濃度が増加するにつれて、シグナル強度が増加し、バックグラウンド染色が減少する。例えば、１５％のＥＣを含有する組成物は、５％のＥＣを含有する組成物より強いシグナルと少ないバックグラウンドを示す傾向がある。しかしながら、シグナル強度は、塩及び／又はデキストラン硫酸の濃度が増加させられる場合、低濃度の極性非プロトン溶媒（例えば０％から２０％）を有する組成物に対して改善されうる。例えば、塩濃度が伝統的な塩濃度（つまり、およそ１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸バッファー）のおよそ８から１６倍上昇させられると、５％から１０％のＥＣで強いシグナルが観察されうる。同様に、低濃度の極性非プロトン溶媒が使用されると、高濃度のデキストラン硫酸が良好なシグナル及びバックグラウンド強度を維持するために一般に必要とされる。
【００８０】
従って、塩及びデキストラン硫酸の濃度を、シグナル強度及びバックグラウンド染色を改善するためにまた変更しうる。一般に、塩及びデキストラン硫酸の濃度が増加すると、シグナル強度が増加し、バックグラウンドが減少する。例えば、伝統的な濃度（つまり３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー）のおよそ２から４倍の塩濃度は、強いシグナルと低いバックグラウンドを生じる。しかしながら、驚いたことに、ハイブリダイゼーションは、たとえ塩が完全に存在しない場合にでも本発明の組成物を使用して生じる。シグナル強度は、促進剤及び／又は極性非プロトン溶媒の濃度を増加させることによって非塩条件下で改善することができる。
【００８１】
同様に、シグナル強度は、デキストラン硫酸濃度が０％から２０％まで増加すると増加する。しかしながら、良好なシグナルは０％のデキストラン硫酸濃度においてさえ観察されうる。シグナル強度は、極性非プロトン溶媒及び／又は塩濃度を増加させることによって低デキストラン硫酸条件下で改善することができる。
また、本発明の組成物において使用されるプローブのタイプを、結果を改善するために変更しうる。例えば、本発明のある態様では、ＤＮＡ／ＤＮＡプローブの組合せが、本発明の組成物におけるＤＮＡ／ＰＮＡプローブの組合せより少ないバックグラウンドを示し得、又はその逆もしかりである。他方、ＰＮＡプローブは、低塩及び／又は低極性非プロトン溶媒濃度下でＤＮＡプローブよりも強いシグナルを示す傾向がある。実際、ＰＮＡプローブは極性非プロトン溶媒が存在しない場合にもシグナルを示す一方、ＤＮＡプローブは、極性非プロトン溶媒がないと弱いシグナルを示すかシグナルを示さない。
【００８２】
Ｄ．応用、方法、及び用途
（１）分析試料
本発明の方法及び組成物は、細胞診、組織診断、又は分子生物学の分野における全てのタイプのハイブリダイゼーション用途において完全に又は部分的に使用されうる。一実施態様によれば、本発明の方法における第一又は第二の核酸配列が生物学的試料中に存在する。かかる試料の例は、組織試料、細胞調製物、細胞断片調製物、及び単離された又はリッチ化された細胞成分調製物を含む。試料は、様々な組織、例えば乳房、結腸直腸、前立腺、肺、頭頸部、胃、膵臓、食道、肝臓、及び膀胱、又は他の関連する組織及びその腫瘍、任意の細胞懸濁液、血液試料、細針生検、腹水、痰、腹膜洗浄液、尿、糞便、細胞掻爬、細胞スミア、サイトプシン又は細胞プレップ細胞から由来しうる。
【００８３】
試料は標準的なプロトコルを使用して単離され、プロセシングされうる。細胞断片調製物は、例えば細胞ホモジナイズ、凍結融解処理又は細胞溶解により得ることができる。単離された試料は、試料を得る目的に応じてまた部位に常套的な手段に応じて、多くの異なった方法で処理されうる。しばしば、試料は後での試料分析のために組織を保存するために様々な試薬を用いて処理され、あるいは、試料は直接分析されうる。試料を保存するために広く使用されている方法の例は、ホルマリン固定とそれに続くパラフィン包埋及び凍結保存である。
【００８４】
分裂中期スプレッドでは、細胞培養物を、一般に、コルセミド、又は他の適切な紡錘極破壊剤で処理して、分裂中期における細胞サイクルを停止させる。ついで、細胞を固定し、顕微鏡スライド上に染みつけ、ホルムアルデヒドで処理し、洗浄し、エタノールで脱水する。ついで、プローブを加え、以下に検討する技術の何れかによって試料を分析する。
【００８５】
細胞診は生物学的試料からの個々の細胞及び／又は染色体スプレッドの検査を含む。試料の細胞診は、細胞の検体を得ることで始まり、これは、典型的には、頸部検体の場合におけるように、擦過し、拭き取り、又は領域をブラシでこすることにより、又は胸部腔、 膀胱、又は脊柱から得られるもののように、体液を集めることにより、又は内部の腫瘍の場合のように、穿刺吸引又は細針生検により、なすことができる。一般的な手作業での細胞調製では、試料は液体懸濁材料に移され、液体中の細胞がついで直接又は遠心分離ベースのプロセシング工程によってガラス顕微鏡スライド上へ検査のために移される。典型的な自動化された細胞調製では、フィルターアセンブリが液体懸濁液に配され、フィルターアセンブリが細胞を分散させると共にフィルター上の細胞を捕捉する。ついで、フィルターを除去し、顕微鏡スライドに接触させて位置させる。ついで、細胞を、以下で検討する技術の何れかによる分析前に顕微鏡スライドに固定する。
【００８６】
細胞試料を使用する伝統的なハイブリダイゼーション実験では、検体を含むスライドをホルムアルデヒドバッファー中に浸漬し、洗浄し、ついでエタノールで脱水する。ついで、プローブを加え、検体をカバーガラスで覆う。スライドを検体中の任意の核酸を変性させるのに十分な温度でインキュベートした後（例えば８２℃で５分）、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な温度でインキュベートする（例えば４５℃で一晩）。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを取り除き、検体に高ストリンジェントな洗浄（例えば６５℃で１０分）と続く一連の低ストリンジェントな洗浄（例えば室温で２×３分）を施す。ついで、試料を脱水し、分析のためにマウントする。
【００８７】
組織診断は組織の薄いスライス中の細胞の検査を含む。組織検査のための組織試料を調製するには、組織片を適切な固定液、典型的にはアルデヒド、例えばホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドで固定し、ついで、融解パラフィンロウに包埋する。ついで、組織試料を含むロウブロックをミクロトームで切断し、典型的には２から１０ミクロン厚の組織を含む薄いパラフィンスライスを得る。ついで、検体スライスを顕微鏡スライドに適用し、空気乾燥させ、加熱して、検体をガラススライドに付着させる。ついで、残留パラフィンを適切な溶媒、典型的にはキシレン、トルエン又は他のもので溶解させる。ついで、これらのいわゆる脱パラフィン化溶媒を、以下に検討される技術の何れかによる試料の分析の前に、洗浄-脱水タイプの試薬を用いて除去する。別法では、スライスを凍結検体から調製し、１０％ホルマリン又は他の適切な固定液に簡単に固定し、ついで試料の分析前に脱水試薬を注入する。
【００８８】
組織試料を使用する伝統的なハイブリダイゼーション実験では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織検体を２−６μｍの切片に切断しスライド上に集める。パラフィンを溶かし（例えば６０℃で３０−６０分）、ついでキシレン（又はキシレン代替物）で、例えば２×５分洗浄することによって除去（脱パラフィン化）する。試料を再水和させ、洗浄し、ついで前処理する（例えば９５−１００℃で１０分）。スライドを洗浄し、ついでペプシン又は他の適切な透過剤で、例えば３７℃で３−１５分、処理する。スライドを洗浄し（例えば２×３分）、脱水し、プローブを適用する。検体をカバーガラスで覆い、スライドを検体中の任意の核酸を変性させるのに十分な温度でインキュベートした後（例えば８２℃で５分）、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な温度でインキュベートする（例えば４５℃で一晩）。ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを取り除き、検体に高ストリンジェントな洗浄（例えば６５℃で１０分）と続く一連の低ストリンジェントな洗浄（例えば室温で２×３分）を施す。ついで、試料を脱水し、分析のためにマウントする。
【００８９】
（２）ハイブリダイゼーション技術
本発明の組成物及び方法は、細胞及び組織試料に対して当該分野で知られている全てのタイプの核酸ハイブリダイゼーション技術において完全に又は部分的に使用することができる。かかる技術は、例えばインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；多色ＦＩＳＨ、Ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨ等を含む）、発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、銀インサイツハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、染色体彩色、及びアレイインサイツを含む。
【００９０】
本発明のハイブリダイゼーションに使用するのに適した分子プローブは、例えば出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２００５／０２６６４５９号に記載されている。一般に、プローブは、プローブは、化学合成により、又はクローニングにより特異的ＤＮＡ配列を増幅させ、ベクター中にＤＮＡを挿入し、ベクターを適切な宿主細胞中で増幅させることにより、調製することができる。一般的に使用されるベクターは細菌プラスミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣｓ）、ＰＩ転用人工染色体（ＰＡＣｓ）、又は酵母人工染色体（ＹＡＣｓ）を含む。ついで、増幅されたＤＮＡは抽出され、プローブとしての使用のために精製される。プローブを調製し及び／又は合成するための方法は、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３に開示されているように、当該分野で知られている。
【００９１】
一般に、プローブのタイプが、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて検出しうる特徴のタイプを決定する。例えば、全核又はゲノムＤＮＡを種特異的プローブとして使用することができる。染色体彩色は、単一の染色体タイプから誘導されたＤＮＡ配列の収集物であり、分裂中期及び静止期の核中のその特定の染色体を同定でき、ある種の染色体の数を計数し、転座を示し、又はクロマチンの染色体外断片を同定しうる。異なった染色体タイプは、また、特定の染色体を検出し計数するために、プローブハイブリダイゼーションの標的とされうる独特の反復配列を有する。独特の単一コピー配列を標的とするために大きな挿入プローブを使用することができる。これらの大きなプローブでは、ハイブリダイゼーション効率はプローブサイズに逆比例する。より小さいプローブをまた欠失、増幅、逆位、複製、及び異数性のような異常を検出するために使用することもできる。例えば、異なった色になった遺伝子座特異的プローブを使用して、スプリットシグナルインサイツハイブリダイゼーションを介して転座を検出することができる。
【００９２】
一般に、密接に関連した配列を区別する能力は、プローブ長が増加するにつれて熱安定性の差が野生型と変異複合体間で減少するので、ハイブリダイゼーションプローブの長さに逆比例する。１０ｂｐ長より大きいプローブが、一般に、関心ある独特の生物又は臨床状態を正しく同定するのに必要な配列多様性を得るのに必要とされる。他方、非常に短いオリゴマー（＜１０塩基対）における単一の塩基（点突然変異）のような微妙な配列差は、非標的配列と比較した相補的核酸標的配列へのハイブリダイゼーションの識別を可能にするのに十分であり得る。
【００９３】
一実施態様では、インサイツハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一セットは、出典明示によりここに援用される米国特許第７１０５２９４号に記載されているように、一又は複数のＰＮＡプローブを含みうる。ＰＮＡプローブを合成する方法はＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３に記載されている。あるいは、又は加えて、上で検討された技術の何れかにおけるハイブリダイゼーションプローブの少なくとも一セットは、出典明示によりここに援用される国際公開第９９／１４２２６号に記載されているように、一又は複数のロックド核酸（ＬＮＡ）プローブを含みうる。ＬＮＡ骨格は、２’及び４’炭素間に更なる架橋結合があるため、ハイブリダイゼーションに対して事前組織化される。ＬＮＡ／ＤＮＡ及びＬＮＡ／ＲＮＡ相互作用は、高融解温度によって示されるように、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ及びＤＮＡ／ＲＮＡ相互作用より強い。よって、ハイブリダイゼーションに対して必要とされるエネルギーを減少させる本発明の組成物及び方法は、ＬＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションに対して特に有用である。
【００９４】
一実施態様では、プローブは、出典明示によりここに援用される米国特許出願公開第２００５／０２６６４５９号に記載されているように、検出可能な標識（プローブ・標的ハイブリッドの検出を可能にする分析によって同定可能なシグナルを与える分子）を含みうる。検出可能な標識は、プローブに直接的に結合されてもよいし、又は例えばリンカーを使用してプローブに間接的に結合されてもよい。酵素的及び化学的プロセスを含む当業者に知られている任意の標識法を使用して、本発明の方法及び組成物において使用されるプローブを標識することができる。他の実施態様では、プローブは標識されない。
【００９５】
一般に、ＣＧＨ、ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのようなハイブリダイゼーション技術は、細胞の染色体中の遺伝子又は遺伝子断片に変動するストリンジェンシーでハイブリダイズする大きな主に特定されない核酸プローブを用いる。かかるプローブは、コズミッククローン、ＹＡＣクローン、又は他のクローン化ＤＮＡ断片から誘導されうる。大きなプローブの使用はインサイツハイブリダイゼーション技術を非常に高感度なものにする。しかしながら、伝統的なハイブリダイゼーションアッセイにおける大きなゲノムプローブの使用の成功は、ゲノム中に存在している例え名反復配列から誘導された望まれないバックグラウンド染色をブロックすることに依存している。かかるブロッキング工程は時間を費やし高価である。ここで検討されるように、本発明の方法及び組成物は、有利なことに、かかるブロッキング工程の必要性を減少させ及び／又は排除する。しかしながら、一実施態様では、例えばＰＣＴ／ＵＳ０２／３０５７３に開示されているように、当該分野で知られている方法によって反復配列を抑制することもできる。
【００９６】
結合したプローブは、細胞及び組織試料中において直接的に又は蛍光色素（例えばＦＩＳＨ）、有機色素原（例えばＣＩＳＨ）、銀粒子（例えばＳＩＳＨ）、又は他の金属粒子（例えば金支援蛍光インサイツハイブリダイゼーション、ＧＯＬＤＦＩＳＨ）で間接的に検出することができる。よって、検出方法に依存して、試験される試料から得られた細胞集団は蛍光顕微鏡又は一般的な明視野光学顕微鏡を介して可視化されうる。
細胞及び組織試料でのハイブリダイゼーションアッセイは、特異的ＤＮＡ配列の数、サイズ、及び／又は位置を決定するための重要なツールである。例えば、ＣＧＨでは、全ゲノムが染色され、異常なコピー数の領域の検出に対して、正常な参照ゲノムと比較される。典型的には、患者組織及び正常なコントロール組織からのＤＮＡが異なった色のプローブで標識される。ＤＮＡのプールが混合され、正常な染色体の分裂中期スプレッドに（又はアレイ−又はマトリックス−ＣＧＨでは、マイクロアレイチップに）加えられる。ついで、異常なコピー数を持つ領域を同定するために色の比が比較される。
【００９７】
ＦＩＳＨは、典型的には、複数のカラー画像処理が必要とされるとき、及び／又はプロトコルがシグナルの定量を求めるときに使用される。該技術は、一般に、細胞試料を調製し、プローブを標識し、標的染色体及びプローブを変性させ、プローブを標的配列にハイブリダイズさせ、及びシグナルを検出することを必要とする。典型的には、ハイブリダイゼーション反応は、標的にされた配列を蛍光的に染色する結果、その位置、サイズ、又は数を、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、又は他の適切な機器を使用して決定することができる。全ゲノムから数キロベースの範囲のＤＮＡ配列を、ＦＩＳＨを使用して研究することができる。ＦＩＳＨはまた分裂中期スプレッド及び静止期核について使用することもできる。
【００９８】
ＦＩＳＨは、分裂中期染色体、静止期核、クロマチン線維、及びネイキッドＤＮＡ分子上の反復及び単一コピーＤＮＡのマッピングに対して、また大きな反復ファミリー、典型的にはリボソームＤＮＡ及び主要なタンデムアレイファミリーの局在化を通しての染色体同定及び核型解析に対して成功裏に使用されている。ＦＩＳＨの最も重要な応用の一つは、単一コピーＤＮＡ配列、特にヒト及び他の真核生物モデル種における疾患関連遺伝子の検出、及び感染薬剤の検出にあった。ＦＩＳＨは、例えば出生前診断における染色体異数性、血液学的癌、及び固形腫瘍；遺伝子異常性、例えば癌遺伝子増幅、遺伝子欠失、又は遺伝子融合；染色体構造異常性、例えば転座、複製、挿入、又は逆位；近接遺伝子症候群、例えば微小欠失症候群；様々な治療法の遺伝子効果；体細胞におけるウイルス核酸及び染色体中のウイルス組込み部位等々を検出するために使用することができる。多色ＦＩＳＨでは、各染色体が別個の色で染色され、異常な染色体が誘導された正常な染色体を決定することが可能になる。かかる技術は、多重ＦＩＳＨ（ｍ−ＦＩＳＨ）、スペクトル核型決定（ＳＫＹ）、総合二値化標識（ＣＯＢＲＡ）、色変化核型決定、異種間色バンド形成、高分解能多色バンド形成、テロメア多重ＦＩＳＨ（ＴＭ−ＦＩＳＨ）、スプリットシグナルＦＩＳＨ（ｓｓＦＩＳＨ）、及びヒュージョンシグナルＦＩＳＨを含む。
【００９９】
ＣＩＳＨ及びＳＩＳＨは、ＦＩＳＨと同じ用途の多くに使用することができ、例えば病理組織学的用途において、根底にある組織形態の分析を可能にするという更なる利点を有している。ＦＩＳＨが実施される場合は、出典明示によりここに援用される米国特許第６７３０４７４号に記載されているように、ハイブリダイゼーション混合物は、別個のバランスがとれた対のプローブのセットを含みうる。ＣＩＳＨでは、ハイブリダイゼーション混合物は、一又は複数の一般的な有機色素原での検出に対して構成された少なくとも一のセットのプローブを含み得、Powell RD等, "Metallographic in situ hybridization"に記載されたように、ＳＩＳＨに対しては、ハイブリダイゼーション混合物は、銀粒子での検出に対して構成された
【０１００】
本発明の組成物はまたブロッティング及びプロービング（例えばサザン、ノーザン等）、アレイ、及び伝統的なＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、変異ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、多重ＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、及びインサイツＰＣＲを含む増幅技術を含むハイブリダイゼーションを含む分子生物学技術の全てのタイプにおいて完全に又は部分的に使用することができる。インサイツＰＣＲは、スライド上の細胞、例えば上述の細胞診及び組織診断試料の内部で起こるポリメラーゼ連鎖反応である。典型的には、試料を顕微鏡スライドに接着させた後、細胞を再水和させ、透過させ、ついで ポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ、及びプライマーを含むＰＣＲ試薬の適切な混合物と組み合わせる。ＰＣＲは、例えばＧｅｎｅＡｍｐインサイツＰＣＲシステム１０００（Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA）のような専用の機器で実施することができ、増幅された産物は、標識プローブを使用し又は増幅中に標識ｄＮＴＰｓを導入することにより検出されうる。本発明の組成物は、増幅サイクルを実施するために必要とされる変性及びハイブリダイゼーション温度及び／又は時間を減少させることにより、伝統的なインサイツＰＣＲ解析の効果を改善する。
【０１０１】
（３）ハイブリダイゼーション条件
本発明の方法は核酸鎖のハイブリダイゼーションにおいて極性非プロトン溶媒を使用することを含む。本発明の組成物は特に上記方法に有用である。
本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーション方法は、殆どは二本鎖の形態である標的核酸配列を含む試料に組成物を適用することを含みうる。通常、標的配列とハイブリダイズするプローブへのアクセスを確保するために、試料及び組成物を加熱して標的核酸を変性させる。変性中、極性非プロトン溶媒は配列と相互作用し、標的の変性と標的に対するプローブの再アニーリングを容易にする。本発明において特定された極性非プロトン溶媒は、このプロセスをかなり速くし、ホルムアミドと比較してハイブリダイゼーション条件の厳しさ及び毒性を低減する。
【０１０２】
本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーションは、伝統的な溶液で実施されるハイブリダイゼーションと同じアッセイ法を使用して実施することができる。しかしながら、本発明の組成物は、より短いハイブリダイゼーション時間を可能にする。例えば、加熱前処理、消化、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄、及びマウント工程は、容積、温度、試薬及びインキュベーション時間について伝統的な溶液に対してと同じ条件を使用することができる。当該分野で知られている伝統的なハイブリダイゼーションプロトコルには多大な変形例が存在する。例えば、あるプロトコルは、次のハイブリダイゼーション工程の前に、プローブの存在なしで、潜在的な二本鎖ヌクレオチドの別個の変性工程を特定する。本発明の組成物は、当該分野で知られている伝統的なハイブリダイゼーションプロトコルの任意のものにおいて使用することができる。
【０１０３】
別法では、本発明の組成物を使用するアッセイは、例えばハイブリダイゼーション時間を減少させ、変性及び／又はハイブリダイゼーション温度を増加又は減少させ、及び／又はハイブリダイゼーション体積を増加又は減少させることによって、伝統的な方法から変化せしめられ得、最適化されうる。
【０１０４】
例えば、ある実施態様では、本発明の組成物は、変性温度が６０から１００℃であり、ハイブリダイゼーション温度が２０から６０℃である場合に、強いシグナルを生じる。他の実施態様では、本発明の組成物は、変性温度が６０から７０℃、７０から８０℃、８０から９０℃又は９０から１００℃であり、ハイブリダイゼーション温度が２０から３０℃、３０から４０℃、４０から５０℃、又は５０から６０℃のときに強いシグナルを生じる。他の実施態様では、本発明の組成物は、変性温度が７２、８２、又は９２℃であり、ハイブリダイゼーション温度が４０、４５、又は５０℃であるとき、強いシグナルを生じる。
【０１０５】
他の実施態様では、本発明の組成物は、変性時間が０から１０分で、ハイブリダイゼーション時間が０分から２４時間のとき強いシグナルを生じる。他の実施態様では、本発明の組成物は、変性時間が０から５分で、ハイブリダイゼーション時間が０分から８時間のとき、強いシグナルを生じる。他の実施態様では、本発明の組成物は、変性時間が０、１、２、３、４、又は５分で、ハイブリダイゼーション時間が０分、５分、１５分、３０分、６０分、１８０分、又は２４０分であるときに強いシグナルを生じる。例えばＲＮＡ検出のような、ある場合には、変性工程が必要とされないことは当業者には理解されるであろう。
【０１０６】
従って、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーションは、８時間未満で実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、６時間未満で実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、４時間以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、３時間以内に実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、２時間以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、１時間以内に実施することができる。更に他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは、３０分以内に実施することができる。他の実施態様では、ハイブリダイゼーションは１５分以内に生じうる。ハイブリダイゼーションは１０分以内又は５分未満でさえ生じうる。図１及び２は、伝統的な組成物を使用するハイブリダイゼーションと比較して、本発明の組成物を使用して、組織及び細胞試料それぞれについて実施したハイブリダイゼーションの典型的な時間経過を例証している。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション時間が変化すると、プローブの濃度はまた強いシグナルを生じさせ及び／又はバックグラウンドを減少させるために変更されうる。例えば、ハイブリダイゼーション時間が減少すると、シグナル強度を改善するためにプローブの量が増加させられうる。他方、ハイブリダイゼーション時間が減少すると、バックグラウンド染色を改善するためにプローブの量が減少させられうる。
【０１０８】
本発明の組成物は、驚いたことに、標的ＤＮＡに対する例えば反復配列の結合をブロックすることによってシグナル及びバックグラウンド強度を改善することにより、ハイブリダイゼーション中のブロッキング工程の必要性を除去する。よって、ブロッキング剤として全ヒトＤＮＡ、ブロッキング−ＰＮＡ、ＣＯＴ−１ ＤＮＡ、又は任意の起源由来のＤＮＡを使用する必要性はない。しかしながら、バックグラウンドレベルを、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーション反応に、少量の全ヒトＤＮＡ又は非ヒト由来ＤＮＡ（例えばサケ精液ＤＮＡ）のような、例えば細胞膜への非特異的結合を減少させる薬剤を添加することによって、更に低減させることができる。
【０１０９】
本発明の水性組成物は、組成物に含められる核酸配列の濃度をかなり低減させる可能性を更にもたらす。一般に、プローブの濃度は、伝統的な濃度と比較して２から８倍、減少されうる。例えば、ＨＥＲ２ ＤＮＡプローブ及びＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブが本発明の組成物において使用される場合、その濃度は、伝統的なハイブリダイゼーション溶液中におけるその濃度と比較して、それぞれ１／４及び１／２減少されうる。この特徴は、ブロッキング−ＰＮＡ又はＣＯＴ１のようにＤＮＡブロッキングの必要性がない点と共に、伝統的な組成物系において使用される伝統的な１０μＬ体積と比較して自動化機器システムにおいて増大されたプローブ体積を可能にし、これが、以下に更に詳細に検討されるように、蒸発による損失を低減させる。
【０１１０】
プローブ濃度の減少はまたバックグラウンドを減少させる。しかしながら、プローブ濃度の減少はハイブリダイゼーション時間に逆に相関する、つまり、濃度が低くなると、必要とされるハイブリダイゼーション時間が長くなる。にもかかわらず、極端に低濃度のプローブが本発明の水性組成物と共に使用されたときでさえ、ハイブリダイゼーション時間は伝統的な組成物の場合よりも尚短い。
【０１１１】
本発明の組成物はしばしば伝統的なハイブリダイゼーション組成物よりも良好なシグナル・ノイズ比を可能にする。例えば、ある種のプローブでは、本発明の組成物での一時間のハイブリダイゼーションは、伝統的な組成物の一晩のハイブリダイゼーションと同様のバックグラウンドとより強いシグナルを生じる。バックグラウンドはプローブが添加されない場合は見られない。
【０１１２】
伝統的なアッセイ法は、システムがマニュアルか、半自動か、又は自動化されているかどうかに応じて、本発明の組成物を使用するときに、また変更され、最適化されうる。例えば、半自動又は自動化システムは、本発明の組成物で得られた短いハイブリダイゼーション時間から恩恵を受けるであろう。短いハイブリダイゼーション時間は、伝統的な組成物がかかるシステムで使用される場合に遭遇する困難性を低減しうる。例えば、半自動及び自動化システムでの一つの問題は、かかるシステムが小さな試料体積（例えば１０−１５０ｍＬ）、上昇した温度、及び拡張されたハイブリダイゼーション時間（例えば１４時間）を必要とするので、試料の有意な蒸発がハイブリダイゼーション中に起こりうる。よって、伝統的なハイブリダイゼーション組成物中における成分の割合はかなり不変である。しかしながら、本発明の組成物はより速やかなハイブリダイゼーションを可能にするので、蒸発が減少させられ、半自動及び自動化システムにおいて使用されるハイブリダイゼーション組成物における成分割合の柔軟性を増大させる。
【０１１３】
例えば、二つの自動化機器を使用して、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーションを実施した。４０％のエチレンカーボネートを含有する組成物をＰＣＴ出願ＤＫ２００８／０００４３０に開示された装置に使用されており、１５％のエチレンカーボネート（ｖ／ｖ）を含有する組成物がＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ ＨＳ−３００（Ａｌｏｋａ ＣＯ． ＬＴＤ、Ｊａｐａｎ）で使用されている。本発明の組成物がＨＹＢＲＩＭＡＳＴＥＲ ＨＳ−３００で使用される場合、該機器は、伝統的な毒性のあるホルムアミドミックスの代わりに水を用いて迅速なＦＩＳＨハイブリダイゼーションを実施することができ、よって安全性を改善し、蒸発を減少させる。例えば出典明示によりここに援用される米国特許出願第１１／０３１５１４号に記載されているように、水で湿らされたストリップがＡｌｏｋａ機器の反応ユニット（ハイブリダイゼーションチャンバー）の内方部の蓋に付設される場合は、蒸発はまた更に減少させられる。
【０１１４】
自動化された画像解析に伴う他の問題は、必要とされる画像の数、必要とされる保存場所の莫大な量、及び画像を撮るのに必要とされる時間である。本発明の組成物は、伝統的な組成物と比較して非常に強いシグナルを生じせしめることによって課題に対処している。本発明の組成物によって生じせしめられる非常に強いシグナルのため、画像処理を、伝統的な組成物に必要なものよりも低い倍率でなすことができ、尚も検出し、例えばアルゴリズムによって解析できる。焦点面は低い倍率では広くなるので、本発明の組成物は連続試料切片を採取する必要性を低減又は解消する。その結果、本発明の組成物は連続切片が少ないか又は含まず、各画像が大きな面積をカバーするので、全体の画像処理が更に速い。加えて、分析のための全体の時間は、全画像ファイルが小さいので、より速い。
よって、本発明の組成物及び方法は、伝統的なハイブリダイゼーション溶液及び方法に関連する問題の多くを解決する。
【０１１５】
本開示は、開示に従う組成物の好ましい実施態様を構成する以下の非限定的実施例を参照してより明確に理解されうる。実施例における以外、又は別の定義がない限り、明細書及び特許請求の範囲において使用される成分、反応条件等等の量を表す全ての数は、全ての場合に「約」なる用語によって修飾されているものと理解されなければならない。従って、別の定義をしていない限り、次の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、ここで得ることが求められている所望の性質に応じて変動しうる近似値である。最低限でも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する意図ではないが、各数値パラメータは有効桁数及び通常の丸めアプローチに鑑みて解釈されなければならない。
【０１１６】
広い範囲を定める数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に記載した数値はできる限り正確に報告している。しかしながら、全ての数値は、その各試験測定に見出される標準偏差から必然的に生じるある程度の誤差を本来的に含んでいる。以下の実施例は本発明を例証するもので、本発明を限定するものと決して考えてはいけない。
【実施例】
【０１１７】
以下、本発明の特定の実施態様を詳細に参照する。本発明をこれら実施態様との関連で説明するが、それらは本発明をその実施態様に限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。反対に、本発明は、添付の特許請求の範囲によって定まる本発明に含められうる代替物、変形例、及び均等物をカバーすることが意図される。
【０１１８】
次の実施例で使用される試薬は、Ｄａｋｏの組織診ＦＩＳＨアクセサリーキット（Ｋ５５９９）及び細胞診ＦＩＳＨアクセサリーキット（Ｋ５４９９）（Dako Denmark A/S, Glostrup Denmark）からのものである。キットは、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織片献体に対するＦＩＳＨ手順を完了させるのに必要なプローブを除く全ての重要な試薬を含んでいる。全ての試料は製造者の記述に従って調製した。Ｄａｋｏハイブリダイザー（S2450, Dako）を消化、変性、及び及びハイブリダイゼーション工程に使用した。
【０１１９】
ＦＩＳＨスライドの評価は、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、テキサスレッド単一フィルター及びＦＩＴＣ／テキサスレッド二重フィルターを備えたＬｅｉｃａ ＤＭ６０００Ｂ蛍光顕微鏡を使用して、１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、及び１００ｘオイル対物下で、ハイブリダイゼーションから一週間以内に実施した。
ＣＩＳＨスライドの評価は、オリンパスＢＸ５１光学顕微鏡を使用して、４ｘ、１０ｘ、２０ｘ、４０ｘ、及び６０ｘの対物下で実施した。
【０１２０】
以下の実施例において、「デキストラン硫酸」は分子量Ｍｗ＞５０００００のデキストラン硫酸のナトリウム塩（Ｄ８９０６，Ｓｉｇｍａ）を意味する。極性非プロトン溶媒の全ての濃度はｖ／ｖパーセントとして与えられる。ホスフェートバッファーは、ＮａＨ２ＰＯ４，２Ｈ２Ｏ（リン酸ナトリウム二塩基二水和物）及びＮａ２ＨＰＯ４，Ｈ２Ｏ（リン酸ナトリウム一塩基一水和物）を含むリン酸緩衝溶液を意味する。シトレートバッファーは、クエン酸ナトリウム（Ｎａ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７，２Ｈ２Ｏ；１．０６４４８，Ｍｅｒｃｋ）及びクエン酸一水和物（Ｃ６Ｈ８Ｏ７，Ｈ２Ｏ；１．００２４４，Ｍｅｒｃｋ）を含むクエン酸緩衝溶液を意味する。
【０１２１】
一般的組織診断ＦＩＳＨ／ＣＩＳＨ手順（実施例１−２０）
ヒト（扁桃腺、乳癌、腎臓及び結腸）由来の切断されたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）複数組織アレイ片を有するスライドを、６０℃で３０−６０分べークし、キシレン浴で脱パラフィンし、エタノール浴で再水和させ、ついで、洗浄バッファーに移した。ついで、試料を前処理溶液中で最小９５℃で１０分間前処理し、２×３分洗浄した。ついで、試料を３７℃でペプシンＲＴＵを用いて３分間、消化させ、２×３分洗浄し、一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。ついで、試料を、個々の実験で記載されたようにして１０μＬのＦＩＳＨプローブと共にインキュベートした。ついで、試料を６５℃で１０分ストリンジェントな洗浄によって洗浄した後、２×３分洗浄し、ついで一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。最後に、スライドを１５μＬのアンチフェードマウント培地にマウントした。染色が完了したところで、染色スライドのシグナル強度、形態、及びバックグラウンドを評価するために訓練を受けた観察者がスコア付けを実施した。
【０１２２】
一般的な細胞診ＦＩＳＨ手順（実施例２１−２２）
分裂中期調製物のスライドを、３．７％のホルムアルデヒドに２分間固定し、２×５分洗浄し、一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。ついで、試料を、個々の実験で記載されたようにして１０μＬのＦＩＳＨプローブと共にインキュベートした。ついで、試料を６５℃で１０分ストリンジェントな洗浄によって洗浄した後、２×３分洗浄し、ついで一連のエタノール蒸発で脱水し、空気乾燥させた。最後に、スライドを１５μＬのアンチフェードマウント培地にマウントした。染色が完了したところで、染色スライドのシグナル強度及びバックグラウンドを評価するために訓練を受けた観察者が、組織片のスコア付けガイドラインに記載されたようにしてスコア付けを実施した。
【０１２３】
組織切片のスコア付けガイドライン
シグナル強度は０−３のスケールで評価され、０はシグナルなし、３は強いシグナルとした。細胞／組織構造は０−３スケールで評価し、０は構造なしで核境界なしを意味し、３はインタクトな構造と明確な核境界とした。０と３の間には、観察者がシグナル強度、組織構造、及びバックグラウンドを評価できる０．５離れた更なるグレードがある。
【０１２４】
シグナル強度を等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０          シグナルは見られない。
１          シグナル強度は弱い。
２          シグナル強度は中程度である。
３          シグナル強度は強い。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
【０１２５】
組織及び核構造を等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０          組織構造及び核境界は完全に破壊されている。
１          組織構造及び／又は核境界は乏しい。このグレードは、幾つかの領域が空の核である状況を含む。
２          組織構造及び／又は核境界が見られるが、核境界は不明瞭である。このグレードは数個の核が空である状況を含む。
３          組織構造及び核境界は無傷で明瞭である。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
【０１２６】
バックグラウンドを等級システムに従って０−３スケールでスコア付けする。
０          見られるバックグラウンドは少しないしはない。
１          幾つかのバックグラウンド。
２          中程度のバックグラウンド。
３          高いバックグラウンド。
スコア付けシステムは１／２グレードの使用を許容する。
【０１２７】
実施例１
この実施例は、本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度及び細胞形態を変性温度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％デキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのリン酸バッファー、４０％のホルムアミド（１５５１５−０２６，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ（Kirsten Vang Nielsen等, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Chapter 10 (Franck Pellestor ed.) (Nova Science Publishers, Inc. 2006)を参照）、１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１１４３Ｅ２０，サイズ１９２ｋｂ）。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％デキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート（０３５１９，Ｆｌｕｋａ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１１４３Ｅ２０，サイズ１９２ｋｂ）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを示したように５分間変性し、４５℃で６０分間ハイブリダイズした。
0005588970.tif 000011
実施例２
この実施例は、本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンド染色をハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のホルムアミド，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で１４時間、４時間、２時間、６０分、３０分、１５分、０分、インキュベートした。
0005588970.tif 000012
【０１２８】
実施例３
この実施例は、異なった極性非プロトン溶媒を有する本発明の組成物又は伝統的なハイブリダイゼーション溶液で処理した試料からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のホルムアミド，５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート（ＥＣ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のプロピレンカーボネート（ＰＣ）（５４００１３，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のスルホラン（ＳＬ）（Ｔ２２２０９，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｖ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のアセトニトリル（ＡＮ）（Ｃ０２ＣＩＩＸ，Ｌａｂ−Ｓｃａｎ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＶＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のγ−ブチロラクトン（ＧＢＬ）（Ｂ１０３６０８，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
0005588970.tif 000013
【０１２９】
実施例４
この実施例は、異なった濃度の極性非プロトン溶媒を有する本発明の組成物で処理した試料からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１０−６０％のエチレンカーボネート（標示通り），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＩＧＫ−定常ＤＮＡ遺伝子プローブ（（ＣＴＤ−３０５０Ｅ１５，ＲＰ１１−１０８３Ｅ８；サイズ２２７ｋｂ）及び７．５ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ標識ＩＧＫ−可変遺伝子ＤＮＡプローブ（ＣＴＤ−２５７５Ｍ２１，ＲＰ１１−１２２Ｂ６，ＲＰ１１−３１６Ｇ９；サイズ３５０及び４２９ｋｂ）。  
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
0005588970.tif 000014
【０１３０】
実施例５
この実施例は、ＰＮＡブロッキングを伴う及び伴わない組成物で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンド強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
0005588970.tif 000015
【０１３１】
実施例６  
この実施例は本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度をプローブ濃度及びハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，及び１０、７．５、５又は２．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ（標記の通り）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で３時間、２時間及び１時間、インキュベートした。
0005588970.tif 000016
【０１３２】
実施例７
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、塩、ホスフェート、及びバッファー濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，（［ＮａＣｌ］，［リン酸バッファー］，［ＴＲＩＳバッファー］結果に示した通り），４０％のエチレンカーボネート，７．５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。
0005588970.tif 000017
【０１３３】
実施例８
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度をデキストラン硫酸濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：０、１、２、５、又は１０％のデキストラン硫酸（標記の通り），３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，５ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＳＩＬ−ＴＡＬ１遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１−２７８Ｏ１３；サイズ６７ｋｂ）及び６ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ ＳＩＬ−ＴＡＬ１（ＩＣＲＦｃ１１２−１１２Ｃ１７９４，ＲＰ１１−１８４Ｊ２３，ＲＰ１１−８Ｊ９，ＣＴＤ−２００７Ｂ１８，１３３Ｂ９；サイズ５６０ｋｂ）。
存在する場合、異なった粘度の相を使用前に混合した。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
0005588970.tif 000018
【０１３４】
実施例９
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、デキストラン硫酸、塩、ホスフェート、及び極性非プロトン溶媒濃度の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉａ：３４％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉｂ：３４％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉｃ：３４％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩａ：３２％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩｂ：３２％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ．  
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩｃ：３２％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ．  
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩａ：３０％のデキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩｂ：３０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩｃ：３０％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，１０％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ．  
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶａ：２８％デキストラン硫酸，０ｍＭのＮａＣｌ，０ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶｂ：２８％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶｃ：２８％のデキストラン硫酸，６００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭのリン酸バッファー，１５％のエチレンカーボネート，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ（サイズ２１８ｋｂ）及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ参照Ｖ：ブロッキングＰＮＡを含むＨＥＲ２ ＰｈａｒｍＤｘプローブミックス（Ｋ５３３１，Ｄａｋｏ）の標準販売バイアル。２０時間の一晩のハイブリダイゼーション。
全組成物は単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、ブロッキングなしでインキュベートしたが、ＦＩＳＨプローブ参照Ｖは、ＰＮＡブロッキングし、２０時間ハイブリダイズした。
0005588970.tif 000019
【０１３５】
実施例１０
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度を、高塩（４×正常）条件下で極性非プロトン溶媒及びデキストラン硫酸濃度の関数として比較する。  
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：０％のエチレンカーボネート，２９％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：５％のエチレンカーボネート，２７％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：１０％のエチレンカーボネート，２５％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は単一相であった。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＶ（試験せず）：２０％のエチレンカーボネート，２１％のデキストラン硫酸，１２００ｍＭのＮａＣｌ，２０ｍＭのリン酸バッファー，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び５０ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−７ ＰＮＡプローブ。組成物は二つの相を有していた。
0005588970.tif 000020
【０１３６】
実施例１１
この実施例は、本発明の組成物の異なった相で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレンカーボネート，８ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＨＥＲ２遺伝子ＤＮＡプローブ及び６００ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−１７ ＰＮＡプローブ。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
0005588970.tif 000021
【０１３７】
実施例１２
この実施例は前の実施例と同様であるが、異なったＤＮＡプローブ及びＥＣの代わりにＧＢＬを使用している。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のＧＢＬ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ及び６００ｎＭのＦＩＴＣ標識ＣＥＮ−１７ ＰＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分間、インキュベートした。ブロッキングなし。
0005588970.tif 000022
【０１３８】
実施例１３
この実施例は、本発明の組成物中の相の数を、極性非プロトン溶媒及びデキストラン硫酸濃度の関数として調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１０又は２０％のデキストラン硫酸；３００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのリン酸バッファー；０、５、１０、１５、２０、２５、３０％のＥＣ；１０ｎｇ／μＬのプローブ．  
0005588970.tif 000023
【０１３９】
実施例１４
この実施例は、本発明の異なった組成物で処理した試料からのシグナル強度及びバックグラウンドをプローブ濃度及びハイブリダイゼーション時間の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度）及び標準濃度のＣＥＮ７ ＦＩＴＣ標識ＰＮＡプローブ（５０ｎＭ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／２）及び標準濃度（５０ｎＭ）のＦＩＴＣ標識ＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び１／２の標準濃度（２５ｎＭ）のＣＥＮ７ ＰＮＡプローブ；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー。
組成物Ｉ−ＩＩＩは単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で３時間、２時間及び１時間、インキュベートした。
0005588970.tif 000024
【０１４０】
実施例１５
この実施例は、本発明の組成物で処理された試料からのシグナル強度及びバックグラウンドを、ブロッキング剤の関数として比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー；２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）及び標準濃度の１／２の（３００ｎＭ）ＦＩＴＣ標識ＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ。試料は、本発明の組成物を使用するハイブリダイゼーション前に、（ａ）なし；（ｂ）０．１μｇ／μＬのＣＯＴ１（１５２７９−０１１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；（ｃ）０．３μｇ／μＬのＣＯＴ１；又は（ｄ）０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡでブロックした。
全ての試料は単一相として存在していた。ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
0005588970.tif 000025
【０１４１】
実施例１６
この実験は、本発明の組成物を使用してバックグラウンド染色を除去する異なった方法を比較する。
全ての組成物は、１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、２．５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）、３００ｎＭのＣＥＮ１７ ＰＮＡプローブ（標準濃度の１／２）、及び次のバックグラウンド低減剤の一つを含んでいた：
Ａ）５ｍＭのブロッキング−ＰＮＡ（Kisrsten Vang Nielsen等, PNA Suppression Method Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH) Technique inPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation, Chapter 10 (Franck Pellestor編）  (Nova Science Publishers, Inc. 2006)を参照）
Ｂ）０．１μｇ／μＬのＣＯＴ−１ ＤＮＡ
Ｃ）０．１μｇ／μＬの全ヒトＤＮＡ（ＴＨＤ）（超音波処理未標識ＴＨＤ）
Ｄ）０．１μｇ／μＬの剪断サケ精液  ＤＮＡ（ＡＭ９６８０，Ａｍｂｉｏｎ）
Ｅ）０．１μｇ／μＬのウシ胸腺  ＤＮＡ（Ｄ８６６１，Ｓｉｇｍａ）
Ｆ）０．１μｇ／μＬのニシン精液ＤＮＡ（Ｄ７２９０，Ｓｉｇｍａ）
Ｇ）０．５％のホルムアミド
Ｈ）２％のホルムアミド
Ｉ）１％のエチレングリコール（１．０９６２１，Ｍｅｒｃｋ）
Ｊ）１％のグリセロール（１．０４０９５，Ｍｅｒｃｋ）
Ｋ）１％の１，３−プロパンジオール（５３３７３４，Ａｌｄｒｉｃｈ）
Ｌ）１％のＨ２Ｏ（コントロール）
全ての試料は単一相として存在していた。プローブを８２℃で５分間、ついでＦＦＰＥ組織片上で４５℃で６０分及び１２０分、インキュベートした。
0005588970.tif 000026
【０１４２】
実施例１７  
この実験は、二つの異なった極性非プロトン溶媒を使用する上相及び下相からのシグナル強度を比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のエチレントリチオカーボネート（ＥＴ）（Ｅ２７７５０，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：１０％のデキストラン硫酸，３００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのリン酸バッファー，４０％のグリコールサルファイト（ＧＳ）（Ｇ７２０８，Ａｌｄｒｉｃｈ），５μＭのブロッキングＰＮＡｓ，１０ｎｇ／μＬのテキサスレッド標識ＣＣＮＤ１遺伝子ＤＮＡプローブ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
0005588970.tif 000027
【０１４３】
実施例１８
この実験は一相系を形成する様々な極性非プロトン溶媒の能力を調べる。
全ての組成物は、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸バッファー、及び１０、１５、２０、又は２５％の次の極性非プロトン溶媒の一つを含んでいた：
スルホラン
γ−ブチロラクトン
エチレントリチオカーボネート
グリコールサルファイト  
プロピレンカーボネート
結果：  調べた全ての濃度で極性非プロトン溶媒の全てが使用された組成物において少なくとも２相系をつくり出した。しかしながら、これは、これらの化合物が他の組成物条件下で一相系をつくることができることを排除しない。
【０１４４】
実施例１９
この実験は、複数のＦＦＰＥ組織切片に対する発色性インサイツハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）解析における本発明の組成物の使用を調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：４．５ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）（ＲＰ１１−６５４Ａ２，ＲＰ１１−２４６Ａ２，ＣＴＰ−２３５５Ｌ２１，ＲＰ１１−１５８Ｇ６，ＲＰ１１−７８０Ｍ２，ＲＰ１１−４８１Ｃ１４；サイズ１０１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：４．５ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）（サイズ１０１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケＤＮＡ精子。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩＩ：３００ｎＭの各個々のＦＩＴＣ標識ＰＮＡ ＣＥＮ１７プローブ（標準濃度の１／２）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
全ての試料は、Ｄａｋｏ ＤｕｏＣＩＳＨプロトコル（ＳＫ１０８）及びスプリットプローブの組成物を使用して分析したが、但し、ストリンジェントな洗浄を１０分の代わりに２０分間実施され、ＤｕｏＣＩＳＨレッド色素原工程は使用しなかった。
0005588970.tif 000028
【０１４５】
実施例２０  
この実施例は、二つのＤＮＡプローブを持つ本発明の組成物で処理されたＦＦＰＥ組織切片からのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：９ｎｇ／μＬのＩＧＨ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（ＲＰ１１−１５１Ｂ１７，ＲＰ１１−１１２Ｈ５，ＲＰ１１−１０１Ｇ２４，ＲＰ１１−１２Ｆ１６，ＲＰ１１−４７Ｐ２３，ＣＴＰ−３０８７Ｃ１８；サイズ６１２ｋｂ）；６．４ｎｇ／μＬのＭＹＣ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（ＣＴＤ−２１０６Ｆ２４，ＣＴＤ−２１５１Ｃ２１，ＣＴＤ−２２６７Ｈ２２；サイズ４１８ｋｂ）；１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：９ｎｇ／μＬのＩＧＨ ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ；６．４ｎｇのＭＹＣ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ；１５％のＥＣ、２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケ精液ＤＮＡ。
0005588970.tif 000029
【０１４６】
実施例２１
この実験は細胞試料での本発明の組成物の使用を調べる。
ＦＩＳＨプローブ組成物：１５％のＥＣ；２０％のデキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのリン酸バッファー；５ｎｇ／μＬのＨＥＲ２ ＴｘＲｅｄ標識ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／２）及び１／２の標準濃度のＣＥＮ７（２５ｎＭ）。
ＦＩＳＨプローブを、全てブロッキングなしで、分裂中期染色体スプレッド上で８２℃で５分間、ついで４５℃で３０分間、インキュベートした。
0005588970.tif 000030
典型的にはＲバンド形成を示す伝統的なＩＳＨ溶液と比較して、本発明の組成物では、染色体バンド形成（Ｒバンド形成パターン）は観察されなかった。静止期核及び分裂中期の低い均一な赤いバックグラウンド染色が観察された。
【０１４７】
実施例２２  
この実施例は、細胞診試料、分裂中期スプレッド上での、ブロッキングを伴い、またブロッキングなしでの、ＤＮＡプローブからのシグナル強度及びバックグラウンドを比較する。
ＦＩＳＨプローブ組成物Ｉ：６ｎｇ／μＬのＴＣＲＡＤテキサスレッド標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度）（ＣＴＰ−３１６６６Ｋ２０，ＣＴＰ−２３７３Ｎ７；サイズ３０１ｋｂ）及び４．５ｎｇ／μＬのＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）；  １５％ＥＣ、２０％デキストラン硫酸；６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０。  
ＦＩＳＨプローブ組成物ＩＩ：６ｎｇ／μＬ  ＴＣＲＡＤ  テキサスレッド標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度）（サイズ３０１ｋｂ）及び４．５  ｎｇ／μＬ  ＦＩＴＣ標識遺伝子ＤＮＡプローブ（標準濃度の１／４）；１５％ＥＣ、２０％デキストラン硫酸；  ６００ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのクエン酸バッファー，ｐＨ６．０；０．１ｕｇ／ｕＬの剪断サケ精液ＤＮＡ。
ＦＩＳＨプローブを８２℃で５分間、ついで４５℃で６０分、インキュベートした。
0005588970.tif 000031
再び、染色体バンド（Ｒ−バンドパターン）は本発明の組成物では観察されなかった。加えて、静止期核又は分裂中期染色体のバックグラウンド染色は観察されなかった。
【０１４８】
更なる実施態様
実施態様１．  少なくとも一種の核酸配列と、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒と、ハイブリダイゼーション溶液を含有し、極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではない、ハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２．  極性非プロトン溶媒の濃度が約１％から９５％（ｖ／ｖ）である実施態様１に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３．  極性非プロトン溶媒の濃度が５％から１０％（ｖ／ｖ）である実施態様１又は２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様４．  極性非プロトン溶媒の濃度が１０％から２０％（ｖ／ｖ）である実施態様１又は２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様５．  極性非プロトン溶媒の濃度が２０％から３０％（ｖ／ｖ）である実施態様１又は２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様６．  極性非プロトン溶媒が非毒性である実施態様１から５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様７．  但し、組成物がホルムアミドを含んでいない実施態様１から６の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様８．  但し、組成物が１０％未満のホルムアミドを含む実施態様６に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様９．  但し、組成物が２％未満のホルムアミドを含む実施態様８に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１０．  但し、組成物が１％未満のホルムアミドを含む実施態様９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１１．  極性非プロトン溶媒が、ラクトン、スルホン、ニトリル、サルファイト及び／又はカーボネート官能性を有している実施態様１から１０の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１２．  極性非プロトン溶媒が、１７．７から２２．０ＭＰａ１／２の範囲の分散溶解度パラメータ、１３から２３ＭＰａ１／２の範囲の極性溶解度パラメータ、及び３から１３ＭＰａ１／２の範囲の水素結合溶解度パラメータを有する実施態様１から１１の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１３．  極性非プロトン溶媒が環状塩基構造を有する実施態様１から１２の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１４．  極性非プロトン溶媒が
0005588970.tif 000032
（ここで、ＸがＯであり、Ｒ１がアルキルジイルである）、及び
0005588970.tif 000033
（ここで、Ｘは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
Ｚは任意であり、存在する場合は、Ｏ又はＳから選択され、
Ａ及びＢは独立してＯ又はＮ又はＳ又はアルキルジイルの一部又は第１級アミンであり、
Ｒはアルキルジイルであり、
ＹはＯ又はＳ又はＣである）
から選択される実施態様１から１３の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。実施態様１５．  極性非プロトン溶媒が、アセトアニリド、アセトニトリル、Ｎ−アセチルピロリドン、４−アミノピリジン、ベンズアミド、ベンズイミダゾール、１，２，３−ベンゾトリアゾール、ブタジエンジオキシド、２，３−ブチレンカーボネート、γ−ブチロラクトン、カプロラクトン（イプシロン）、クロロ無水マレイン酸、２−クロロシクロヘキサノン、クロロエチレンカーボネート、クロロニトロメタン、無水シトラコン酸、クロトンラクトン、５−シアノ−２−チオウラシル、シクロプロピルニトリル、硫酸ジメチル、ジメチルスルホン、１，３−ジメチル−５−テトラゾール、１，５−ジメチルテトラゾール、１，２−ジニトロベンゼン、２，４−ジニトロトルエン、ジフェイニルスルホン、１，２−ジニトロベンゼン、２，４−ジニトロトルエン、ジフェイニルスルホン、イプシロン−カプロラクタム、エタンスルホニルクロリド、エチルエチルホスフィネート、Ｎ−エチルテトラゾール、エチレンカーボネート、エチレントリチオカーボネート、エチレングリコールサルフェート、グリコールサルファイト、フルフラール、２−フロニトリル、２−イミダゾール、イサチン、イソキサゾール、マロノニトリル、４−メトキシベンゾニトリル、１−メトキシ−２−ニトロベンゼン、メチルαブロモテトロネート、１−メチルイミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、３−メチルイソキサゾール、Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド、メチルフェニルスルホン、Ｎ−メチルピロリジノン、メチルスルホラン、メチル−４−トルエンスルホネート、３−ニトロアニリン、ニトロベンズイミダゾール、２−ニトロフラン、１−ニトロソ−２−ピロリジノン、２−ニトロチオフェン、２−オキサゾリジノン、９，１０−フェナントレンキノン、Ｎ−フェニルシドノン、無水フタル酸、ピコリノニトリル（２−シアノピリジン）、１，３−プロパンスルトン、β−プロピオラクトン、プロピレンカーボネート、４Ｈ−ピラン−４−チオン、４Ｈ−ピラン−４−オン（γ−ピロン），ピリダジン、２−ピロリドン、サッカリン、スクシノニトリル、スルファニルアミド、スルホラン、２，２，６，６−テトラクロロシクロヘキサノン、テトラヒドロチアピランオキシド、テトラメチレンスルホン（スルホラン）、チアゾール、２−チオウラシル、３，３，３−トリクロロプロペン、１，１，２−トリクロロプロペン、１，２，３−トリクロロプロペン、トリメチレンスルフィド−ジオキシド，及びトリメチレンサルファイトからなる群から選択される実施態様１から１４の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１６．  極性非プロトン溶媒が、
0005588970.tif 000034
からなる群から選択される実施態様１から１４の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１７．  極性非プロトン溶媒が、
0005588970.tif 000035
からなる群から選択される実施態様１から１４の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１８．  緩衝剤、塩、促進剤、キレート剤、洗浄剤、及びブロッキング剤からなる群から選択される少なくとも一種の更なる成分を更に含む実施態様１から１７の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様１９．  促進剤がデキストラン硫酸であり、塩がＮａＣｌ及び／又はホスフェートバッファーである実施態様１８に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２０．  デキストラン硫酸が、５％から４０％の濃度で存在し、ＮａＣｌが０ｍＭから１２００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが０ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する実施態様１９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２１．  デキストラン硫酸が１０％から３０％の濃度で存在し、ＮａＣｌが３００ｍＭから６００ｍＭの濃度で存在し、及び／又はホスフェートバッファーが５ｍＭから２０ｍＭの濃度で存在する実施態様２０に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２２．  促進剤が、ホルムアミド、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールからなる群から選択され、緩衝剤がクエン酸バッファーである実施態様１８に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２３．  ホルムアミドが０．１−５％の濃度で存在し、グリセロール、プロピレングリコール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、エチレングリコール、グリコール、及び１，３プロパンジオールが０．１％から１０％の濃度で存在し、クエン酸バッファーが１ｍＭから５０ｍＭの濃度で存在する実施態様２２に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２４．  ブロッキング剤が、全ヒトＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、サケ精液ＤＮＡ、及びウシ胸腺ＤＮＡからなる群から選択される実施態様１８に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２５．  全ヒトＤＮＡ、ニシン精液ＤＮＡ、サケ精液ＤＮＡ、及びウシ胸腺ＤＮＡが０．０１から１０μｇ／μＬの濃度で存在する実施態様２４に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２６．  ４０％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、１０％のデキストラン硫酸、３００ｍＭのＮａＣｌ、及び５ｍＭのホスフェートバッファーを含有する実施態様１から２５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２７．  １５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのホスフェートバッファー、及び０．１μｇ／μｌの全ヒトＤＮＡを含有する実施態様１から２５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２８．  １５％の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒、２０％のデキストラン硫酸、６００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸バッファーｐＨ６．２，及び０．１μｇ／μＬのニシン精液ＤＮＡ、又はサケ精液ＤＮＡ、又はウシ胸腺ＤＮＡ、又は０．５％のホルムアミド、又は１％のエチレングリコール、又は１％の１，３プロパンジオールを含有する実施態様１から２５の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様２９．  室温で一を越える相を含む実施態様１から２８の何れか一に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３０．  室温で二相を含む実施態様２９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３１．  室温で三相を含む実施態様２９に記載のハイブリダイゼーション組成物。
実施態様３２．  核酸配列をハイブリダイズさせる方法において、
−  第一核酸配列を提供し、
−  第二核酸配列を提供し、
−  少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量で含有するハイブリダイゼーション組成物を提供し、
−  第一及び第二核酸配列とハイブリダイゼーション組成物を、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せ
ることを含み、
ここで極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではない方法。
実施態様３３．  核酸配列をハイブリダイズさせる方法において、
−  インサイツ生物学的試料中に第一核酸配列を提供し、
−  第二核酸配列と少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を、二本鎖ヌクレオチド配列を変性させるのに有効な量で含有するハイブリダイゼーション組成物を上記第一核酸配列に、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用する
ことを含み、
ここで極性非プロトン溶媒がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ではない方法。
実施態様３４．  核酸配列をハイブリダイズさせる方法において、
−  第一核酸配列を提供し、
−  第二核酸配列を提供し、
−  実施態様１−３１の何れかに記載のハイブリダイゼーション組成物を提供し、
−  第一及び第二核酸配列とハイブリダイゼーション組成物を、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、組合せる
ことを含む方法。
実施態様３５．  核酸配列をハイブリダイズさせる方法において、
−  第一核酸配列を提供し、
−  実施態様１−３１の何れかに記載のハイブリダイゼーション組成物を上記第一核酸配列に、第一及び第二核酸配列をハイブリダイズさせるのに少なくとも十分な時間の間、適用する
ことを含む方法。
実施態様３６．  極性非プロトン溶媒が実施態様２−６又は１１−１７の何れかに記載された通りである実施態様３０又は３１に記載の方法。
実施態様３７．  第一及び第二核酸にハイブリダイズするのに十分な量のエネルギーが提供される実施態様３０−３６の何れか一に記載の方法。
実施態様３８．  エネルギーがハイブリダイゼーション組成物及び核酸配列を加熱することにより提供される実施態様３７に記載の方法。
実施態様３９．  加熱工程が、マイクロ波、熱浴、ホットプレート、電熱線、ペルチェ素子、誘導加熱又は加熱ランプの使用により実施される実施態様３８に記載の方法。
実施態様４０．  第一核酸配列が二本鎖であり、第二核酸配列が一本鎖である実施態様３２−３９の何れか一に記載の方法。
実施態様４１．  変性及びハイブリダイゼーション工程が別個に生じる実施態様３２−４０の何れか一に記載の方法。
実施態様４２．  ハイブリダイゼーション工程がハイブリダイゼーション組成物及び核酸配列を加熱及び冷却する工程を含む実施態様３２−４１の何れか一に記載の方法。
実施態様４３．  ハイブリダイゼーション工程が８時間未満を要する実施態様３２−４２の何れか一に記載の方法。
実施態様４４．  ハイブリダイゼーション工程が１時間未満を要する実施態様４３に記載の方法。
実施態様４５．  ハイブリダイゼーション工程が３０分未満を要する実施態様４４に記載の方法。
実施態様４６．  ハイブリダイゼーション工程が１５分未満を要する実施態様４５に記載の方法。
実施態様４７．  ハイブリダイゼーション工程が５分未満を要する実施態様４６に記載の方法。
実施態様４８．  冷却工程が１時間未満を要する実施態様３２−４７の何れか一に記載の方法。
実施態様４９．  冷却工程が３０分未満を要する実施態様４８に記載の方法。
実施態様５０．  冷却工程が１５分未満を要する実施態様４９に記載の方法。
実施態様５１．  冷却工程が５分未満を要する実施態様５０に記載の方法。
実施態様５２．  第一核酸配列が生物学的試料中にある実施態様３２−５１の何れか一に記載の方法。
実施態様５３．  生物学的試料が細胞又は組織試料である実施態様５２に記載の方法。
実施態様５４．  ハイブリダイゼーション組成物が室温で一相を含む実施態様３２−５３の何れか一に記載の方法。
実施態様５５．  ハイブリダイゼーション組成物が室温で複数相を含む実施態様３２−５３の何れか一に記載の方法。
実施態様５６．  ハイブリダイゼーション組成物が室温で二相を含む実施態様５５に記載の方法。
実施態様５７．  ハイブリダイゼーション組成物の相が混合される実施態様５５又は５６に記載の方法。
実施態様５８．  ブロッキング工程を更に含む実施態様３２−５７の何れか一に記載の方法。
実施態様５９．  ハイブリダイゼーションアッセイにおける１％から９５％（ｖ／ｖ）の少なくとも一種の極性非プロトン溶媒を含むハイブリダイゼーション組成物の使用。
実施態様６０．  ハイブリダイゼーション組成物が実施態様１から３１の何れか一に記載のものである実施態様５９に記載の組成物の使用。
【図１】
0005588970.tif 000038
【図２】
0005588970.tif 000039