(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサチャンバの中に配置された２つの電極を有し、かつマイクロコントローラに接続された前記バイオセンサチャンバの静電容量を測定する方法であって、前記方法は、
前記バイオセンサチャンバの中で電気化学反応を開始することと、
所定の周波数の発振電圧を前記バイオセンサチャンバに印加することと、
電流出力と前記バイオセンサチャンバからの前記発振電圧との間の位相角を決定し、前記バイオセンサチャンバの静電容量を、前記電流出力と前記位相角の正弦との積を、２πかける前記周波数及び前記発振電圧の積で割ったものに基づいて計算することと、を含み、
前記計算することが、
前記バイオセンサチャンバからの複数の前記電流出力を、前記周波数の１サイクルにわたってサンプリングすることと、
サンプリングされた前記電流出力の平均を得ることと、
複数の前記電流出力の各サンプリングされた電流から前記平均を減算することと、
前記減算から全ての負値の実効値を抽出して合計電流出力を提供することと、
補間を用いて前記サンプリングから、前記電流の、負値から正値又は正値から負値への少なくとも１つの交点を決定することと、
前記少なくとも１つの交点に基づいて前記電流が正値から負値に又は負値から正値に変化する第１の位相角度を決定することと、
補間を用いて前記サンプリングからの別の交点を決定して、前記電流が正値から負値に又は負値から正値に変化する別の角度を決定することと、
前記別の角度から約１８０度を減算して第２の位相角度を提供することと、を含み、
前記減算が、前記第１の位相角度及び前記第２の位相角度の平均を計算することを更に含む、
方法。
【請求項２】
前記計算することが、静電容量を次の形の式：
【数１】
0005635631.tif 000016
（式中、
Ｃ＝静電容量、
ｉＴ＝合計電流、
φ＝合計電流と抵抗器電流との間の位相角、
ｆ＝周波数、及び
Ｖ＝電圧である）で計算することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記計算することが、発振入力電流と前記電流出力との間の角度の差を前記位相角として決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
分析物測定システムであって、
上部に試薬が配置された基材と、
バイオセンサチャンバ内の前記試薬に近接する少なくとも２つの電極と、
を含む分析物試験ストリップと、
前記２つの電極に接続するように配置されたストリップポートコネクタと、
電源と、
前記ストリップポートコネクタ及び前記電源に電気的に結合されたマイクロコントローラと、
を含む分析物測定器と、
を含み、前記マイクロコントローラは、
前記バイオセンサチャンバ内で電気化学反応を開始し、所定の周波数の発振電圧を前記バイオセンサチャンバに印加し、
電流出力と前記バイオセンサチャンバからの前記発振電圧との間の位相角を決定し、かつ
前記バイオセンサチャンバの静電容量を、前記電流出力と前記位相角の正弦との積を、２πかける前記周波数及び前記発振電圧の積で割ったものに基づいて計算する、ようにプログラムされており、
前記計算することが、
前記バイオセンサチャンバからの複数の前記電流出力を、前記周波数の１サイクルにわたってサンプリングすることと、
サンプリングされた前記電流出力の平均を得ることと、
複数の前記電流出力の各サンプリングされた電流から前記平均を減算することと、
前記減算から全ての負値の実効値を抽出して合計電流出力を提供することと、
補間を用いて前記サンプリングから、前記電流の、負値から正値又は正値から負値への少なくとも１つの交点を決定することと、
前記少なくとも１つの交点に基づいて前記電流が正値から負値に又は負値から正値に変化する第１の位相角度を決定することと、
補間を用いて前記サンプリングからの別の交点を決定して、前記電流が正値から負値に又は負値から正値に変化する別の角度を決定することと、
前記別の角度から約１８０度を減算して第２の位相角度を提供することと、を含み、
前記減算が、前記第１の位相角度及び前記第２の位相角度の平均を計算することを更に含む、
分析物測定システム。
【請求項５】
分析物測定システムであって、
上部に試薬が配置された基材と、
バイオセンサチャンバ内の前記試薬に近接する少なくとも２つの電極と、
を含む分析物試験ストリップと、
前記２つの電極に接続するように配置されたストリップポートコネクタと、
電源と、
参照並列Ｒ−Ｃ回路と比較した場合の静電容量の範囲にわたる前記分析物試験ストリップの静電容量測定の誤差百分率が約３％未満であるように、前記ストリップポートコネクタ及び前記電源に電気的に結合されたマイクロコントローラと、
を含む分析物測定器と、
を含み、
前記マイクロコントローラは、
バイオセンサチャンバ内で電気化学反応を開始し、所定の周波数の発振電圧を前記バイオセンサチャンバに印加し、
電流出力と前記バイオセンサチャンバからの前記発振電圧との間の位相角を決定し、かつ前記バイオセンサチャンバの静電容量を、前記電流出力と前記位相角の正弦との積を、２πかける前記周波数及び前記発振電圧の積で割ったものに基づいて計算する、ようにプログラムされており、
前記計算することが、
前記バイオセンサチャンバからの複数の前記電流出力を、前記周波数の１サイクルにわたってサンプリングすることと、
サンプリングされた前記電流出力の平均を得ることと、
複数の前記電流出力の各サンプリングされた電流から前記平均を減算することと、
前記減算から全ての負値の実効値を抽出して合計電流出力を提供することと、
補間を用いて前記サンプリングから、前記電流の、負値から正値又は正値から負値への少なくとも１つの交点を決定することと、
前記少なくとも１つの交点に基づいて前記電流が正値から負値に又は負値から正値に変化する第１の位相角度を決定することと、
補間を用いて前記サンプリングからの別の交点を決定して、前記電流が正値から負値に又は負値から正値に変化する別の角度を決定することと、
前記別の角度から約１８０度を減算して第２の位相角度を提供することと、を含み、
前記減算が、前記第１の位相角度及び前記第２の位相角度の平均を計算することを更に含む、
分析物測定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国特許法１１９条及び／又は１２０条に基づき２０１０年２月２５日に出願された先出願の米国仮特許出願第６１／３０８，１６７号の利益を主張するものであり、当該出願はその全体が参照により本出願に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
生理液、例えば血液又は血液由来の製品中の分析物を検出することが、今日の社会で今まで以上に重要性を増している。分析物検出の定量法は、臨床検査、家庭検査などを含めて、多様な用途に利用法が見出されるものであり、そのような検査の結果は、多様な病状の診断及び処置において主要な役割を果たしている。目的の分析物には、糖尿病の処置のためのグルコース、コレステロールなどが挙げられる。こうした分析物検出の重要性の高まりに応じて、臨床での使用と家庭での使用の両方に対応する多様な分析物検出の手順及びデバイスが開発されてきた。
【０００３】
分析物検出に用いられる方法の１つの種類は電気化学的方法である。かかる方法では、水性液体試料が、２つの電極、例えば対極及び作用電極を含む電気化学セルの中の試料受容チャンバに入れられる。分析物をレドックス剤と反応させて、分析物濃度に対応する量の酸化可能（又は還元可能）物質を形成する。次いで、存在する酸化可能（又は還元可能）物質の量を電気化学的に推定して、初期試料中に存在する分析物の量と関連付ける。
【０００４】
こうしたシステムは、様々なモードの無効化及び／又は誤差を受けやすい。例えば、温度の変動は、その方法の結果に影響を与え得る。このことは、家庭用途又は第三世界各国における場合によくあるように、特にその方法が制御されていない環境で行われる場合に関係がある。誤差は、試料サイズが正確な結果を得るのに十分でない場合にも生じ得る。測定試験電流は、試料で湿潤された作用電極の面積に比例するので、部分的に充填された試験ストリップは不正確な結果をもたらす可能性があり得る。したがって、部分的に充填された試験ストリップは、一定の状況下で、負にバイアスされたグルコース濃度をもたらす可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本出願人らは、充填されたバイオセンサ試験ストリップを判定する際の平行ストリップの抵抗の効果が無視されて、特により低い並列抵抗に遭遇したときに、試験ストリップの静電容量の測定値が不正確に高くなると考える。本出願人らの発明の例示的な実施形態は、この効果を考慮に入れると同時に、バイオセンサの試験チャンバ内の抵抗を測定する必要性を除去する。
【０００６】
一態様において、バイオセンサの静電容量を測定する方法が提供される。バイオセンサは、チャンバの中に配置された２つの電極を有し、かつマイクロコントローラに接続されたチャンバを含む。本方法は、バイオセンサチャンバの中で電気化学反応を開始すること、所定周波数の発振電圧をチャンバに印加すること、電流出力とチャンバからの発振電圧との間の位相角を決定することと、チャンバの静電容量を、電流出力と位相角の正弦との積を、２πかける周波数及び電圧の積で割ったものに基づいて計算することと、によって達成され得る。
【０００７】
更なる態様において、分析物試験ストリップと分析物検査計（ａｎａｌｙｔｅ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｅｒ）とを含む分析物測定システムが提供される。分析物試験ストリップは、上部に試薬が配置された基材と、試験チャンバ内の試薬に近接する少なくとも２つの電極と、を含む。分析物測定器は、２つの電極に接続するように配置されたストリップポートコネクタと、電源と、ストリップポートコネクタ及び電源に電気的に結合されたマイクロコントローラと、を含む。マイクロコントローラは、バイオセンサチャンバ内で電気化学反応を開始し、所定周波数の発振電圧をチャンバに印加し、電流出力とチャンバからの発振電圧との間の位相角を決定し、かつチャンバの静電容量を、電流出力と位相角の正弦との積を、２πかける周波数及び電圧の積で割ったものに基づいて計算するようにプログラムされる。
【０００８】
更に別の態様において、分析物試験ストリップと分析物検査計とを含む分析物測定システムが提供される。試験ストリップは、上部に試薬が配置された基材と、試験チャンバ内の試薬に近接する少なくとも２つの電極と、を含む。分析物測定器は、２つの電極に接続するように配置されたストリップポートコネクタと、電源と、参照並列Ｒ−Ｃ回路と比較した場合の静電容量の範囲にわたる試験ストリップの静電容量測定の誤差百分率が約３％未満であるように、ストリップポートコネクタ及び電源に電気的に結合されたマイクロコントローラと、を含む。
【０００９】
これら及び他の実施形態、特徴並びに利点は、以下に述べる本発明の異なる例示的な実施形態のより詳細な説明を、はじめに下記に簡単に述べる付属の図面とあわせて参照することによって当業者にとって明らかになるであろう。
【００１０】
本明細書に援用し明細書の一部をなす添付図面は、現時点における本発明の好適な実施形態を示したものであって、上記に述べた一般的説明並びに下記に述べる詳細な説明とともに、本発明の特徴を説明する役割を果たすものである（同様の数字は同様の要素を表す）。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】分析物検査計と試験ストリップとを含む例示的な分析物測定システム。
【図２】図１の測定器の例示的な回路基板の簡略化された概略図。
【図３】図１の試験ストリップの分解斜視図。
【図４】充填された試験ストリップの静電容量を測定するための構成要素の簡略図。
【図５Ａ】試験ストリップに印加される、時間経過に伴う電圧の印加を示す。
【図５Ｂ】時間経過に伴う試験ストリップからの測定電流感度を示す。
【図６Ａ】領域６０２で示される電流出力のサンプリングを示す。
【図６Ｂ】図６Ａのサンプリングされたデータから直流成分が除去された時点の交流出力を示す。
【図６Ｃ】試験ストリップに印加される交流電圧と、試験ストリップからの交流出力との間の位相角を示す。
【図６Ｄ】試験ストリップに印加される交流電圧と、試験ストリップからの交流出力との間の位相角を示す。
【図６Ｅ】図６Ｃの印加電流の交点との比較を目的として図６Ｄの交点を決定するための、サンプリングされたデータの補間を示す。
【図７】例示的な試験ストリップの静電容量を測定する方法の例示的フローチャート。
【図８Ａ】既知のシステム及び本出願人らの他の関連技術と対比した例示的な実施形態の誤差百分率を示す。
【図８Ｂ】例示的な試験ストリップの抵抗の範囲にわたる、それぞれの静電容量測定技術の静電容量の分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下の詳細な説明は、図面を参照しつつ読まれるべきもので、異なる図面中、同様の要素は同様の参照符号にて示してある。図面は必ずしも一定の縮尺を有さず、選択した実施形態を示したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。詳細な説明は本発明の原理を限定するものではなく、あくまでも例として説明するものである。この説明文は、当業者による発明の製造及び使用を明確に可能ならしめるものであり、出願時における発明を実施するための最良の形態と考えられるものを含む、発明の複数の実施形態、適応例、変形例、代替例、並びに使用例を述べるものである。
【００１３】
本明細書で任意の数値や数値の範囲について用いる「約」又は「およそ」という用語は、構成要素の部分又は構成要素の集合が、本明細書で述べるその所望の目的に従って機能することを可能とするような適当な寸法の許容誤差を示すものである。更に、本明細書で用いる「患者」、「ホスト」、「ユーザー」、及び「被験者」という用語は任意のヒト又は動物患者を指し、システム又は方法をヒトにおける使用に限定することを目的としたものではないが、ヒト患者における本発明の使用は好ましい実施形態を代表するものである。
【００１４】
本発明のシステム及び方法は、多種多様な試料中の多種多様な分析物の測定で使用するのに好適であり、全血、血漿、血清、間質液、又はそれらの類縁体中の分析物の測定で使用するのに特に好適である。例示的な実施形態において、対向する電極を有する薄層セル設計及び速い（例えば、約５秒の分析時間）３つのパルス電気化学設計に基づくグルコース試験システムが必要とするのは、少量の試料（例えば、約０．４μＬ（マイクロリットル））であり、血液グルコース測定の改善された信頼性及び精度を提供することができる。反応セルでは、試料中のグルコースは、グルコースデヒドロゲナーゼを使用してグルコノラクトンに酸化することができ、電気化学的に活性である媒介物質は、酵素から作用電極に電子をシャトル輸送するために使用することができる。３つのパルスの電位波形を作用電極及び対電極に印加するために定電位を利用することができ、結果として、グルコース濃度を計算するために使用される試験電流遷移を生じる。更に、試験電流遷移から得られる追加的な情報は、試料マトリックス間の区別、及びヘマトクリット値、温度変化、電気化学的活性成分による血液試料の変動性の補正、並びに起こり得るシステムエラーの同定のために使用され得る。
【００１５】
標記方法は、原理的には、離間された第１及び第２の電極と試薬層とを有する任意のタイプの電気化学セルと共に使用することができる。例えば、電気化学セルは、試験ストリップの形状であることができる。一態様では、試験ストリップは、試料受容チャンバ又は試薬層が配置される領域を画定するために、薄いスペーサにより分離された２つの対向する電極を含んでもよい。例えば、同一平面上の電極を有する試験ストリップなどの他の種類の試験ストリップを、本明細書に記載される方法と共に使用してもよいことを、当業者なら理解するであろう。
【００１６】
図１は、糖尿病データ管理ユニット１０と、グルコース試験ストリップ８０の形態のバイオセンサとを含む糖尿病管理システムを示す。糖尿病データ管理ユニット（ＤＭＵ）は、分析物測定及び管理ユニット、グルコース測定器、測定器、及び分析物測定デバイスと呼ばれる場合もあることに留意されたい。一実施形態において、ＤＭＵは、インスリン送達デバイス、追加の分析物試験デバイス、及び薬物送達デバイスと組み合わされてもよい。ＤＭＵは、ケーブル又は好適な無線技術、例えば、ＧＳＭ（登録商標）、ＣＤＭＡ、ＢｌｕｅＴｏｏｔｈ（登録商標）、ＷｉＦｉ等を介して、コンピュータ２６又はサーバ７０に接続されてもよい。
【００１７】
図１に戻って参照すると、グルコース測定器１０は、ハウジング１１、ユーザーインターフェースボタン（１６、１８、及び２０）、ディスプレイ１４、及びストリップポート開口２２を含むことができる。ユーザーインターフェースボタン（１６、１８、及び２０）は、データの入力、メニューのナビゲーション、及びコマンドの実行を可能とするように構成することができる。ユーザーインターフェースボタン１８は、２方向トグルスイッチの形態であることができる。データには、分析物濃度及び／又は個々の日常の生活習慣に関連した情報を表す値を挙げることができる。日常の生活習慣に関連した情報には、食物の摂取、薬の使用、健康診断の実施、並びに個々の一般的な健康状態及び運動レベルを挙げることができる。
【００１８】
測定器１０の電子構成要素は、ハウジング１１内部の回路基板３４上に配置することができる。図２は、回路基板３４の上面上に配置された電子構成要素を（概略的な形で）示す。上面上の電子構成要素としては、ストリップポート開口３０８、マイクロコントローラ３８、不揮発性フラッシュメモリ３０６、データポート１３、リアルタイムクロック４２、及び複数のオペアンプ（４６〜４９）が挙げられる。底面上の電子構成要素としては、複数のアナログスイッチ、バックライトドライバ、及び電気的消却・プログラム可能型読取専用メモリ（ＥＥＰＲＯＭ、図示せず）が挙げられる。マイクロコントローラ３８は、ストリップポート開口３０８、不揮発性フラッシュメモリ３０６、データポート１３、リアルタイムクロック４２、複数のオペアンプ（４６〜４９）、複数のアナログスイッチ、バックライトドライバ、及びＥＥＰＲＯＭに電気的に接続され得る。
【００１９】
図２に戻って参照すると、複数のオペアンプは、利得段オペアンプ（４６及び４７）、トランスインピーダンスオペアンプ４８、及びバイアスドライバオペアンプ４９を含み得る。複数のオペアンプは、ポテンシオスタット機能及び電流測定機能の一部を提供するように構成され得る。ポテンシオスタット機能とは、試験ストリップの少なくとも２つの電極間に試験電圧を印加することを指し得る。電流機能とは、印加された試験電圧によって生じる試験電流を測定することを指し得る。電流測定は、電流電圧変換器によって行うことができる。マイクロコントローラ３８は、例えばＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＭＳＰ  ４３０などの混合シグナルマイクロプロセッサ（ＭＳＰ）の形態であってよい。ＭＳＰ  ４３０は、ポテンシオスタット機能及び電流測定機能の一部を行うように構成することもできる。更に、ＭＳＰ  ４３０は、揮発性及び不揮発性メモリも含むことができる。別の実施形態において、電子構成要素の多くを特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）の形態でマイクロコントローラに組み込むことができる。
【００２０】
ストリップポートコネクタ３０８は、ストリップポート開口２２に近接して位置決めされ、かつ試験ストリップと電気的接続を形成するように構成されることができる。ディスプレイ１４は、測定された血糖値を報告し、生活習慣に関連した情報の入力を容易にするための、液晶ディスプレイの形態であってよい。ディスプレイ１４は、任意にバックライトを有してよい。データポート１３は、接続リード線に取り付けられた適当なコネクタを受容することにより、グルコース測定器１０をパーソナルコンピュータなどの外部デバイスに接続することができるようになっている。データポート１３は、例えば、シリアル、ＵＳＢ、又はパラレルポートなど、データ送信が可能な任意のポートであってもよい。
【００２１】
リアルタイムクロック４２は、ユーザーが位置する地理的領域に関連する現在時刻を維持し、また時間を計測するように構成され得る。リアルタイムクロック４２は、クロック回路４５、クリスタル４４、及び超コンデンサ４３を含んでもよい。ＤＭＵは、例えば、電池などの電源に電気的に接続されるように構成され得る。超コンデンサ４３は、電力供給障害があった場合にリアルタイムクロック４２に電力供給するために、長時間電力供給するように構成され得る。したがって、電池が放電する又は交換されるときに、ユーザーがリアルタイムクロックを固有時間に再設定する必要がない。リアルタイムクロック４２を超コンデンサ４３と一緒に使用することによって、ユーザーがリアルタイムクロック４２を誤って再設定するかもしれないリスクを軽減することができる。
【００２２】
図３は例示的な試験ストリップ８０を示しており、そのストリップ８０は、遠位端８０から近位端８２まで延びかつ側縁部を有する細長い本体を含む。ここで示されるように、試験ストリップ８０はまた、第１の電極層６６ａと、絶縁層６６ｂと、第２の電極層６４ａと、絶縁層６４ｂと、２つの電極層６４ａ及び６６ａの間に挟まれたスペーサ６０とを含む。第１の電極層６６ａは、第１の電極６７ａと、第１の接続トラック７６と、第１の接触パッド４７とを含むことができ、図３及び図４に示されるように、第１の接続トラック７６は、第１の電極層６６ａを第１の接触パッド６７に電気的に接続する。第１の電極６７ａは、試薬層７２の直下にある第１の電極層６６ａの一部であることに留意されたい。同様に、第２の電極層６４ａは、第２の電極６７ｂと、第２の接続トラック７８と、第２の接触パッド７８とを含むことができ、図３及び図４に示されるように、第２の接続トラック７８は、第２の電極６７ｂを第２の接触パッド７８に電気的に接続する。第２の電極は、試薬層７２の上方にある第２の電極層６４ａの一部を含むことに留意されたい。
【００２３】
図３に示されるように、試料受容チャンバ６１は、第１の電極、第２の電極、及び試験ストリップ８０の遠位端８０近傍のスペーサ６０によって画定される。第１の電極６７ａ及び第２の電極６７ｂは、それぞれ、試料受容チャンバ６１の底部及び上部を画定することができる。スペーサ６０の切欠き領域６８は、試料受容チャンバ６１の側壁を画定することができる。一態様において、試料受容チャンバ６１は、試料入口及び／又は通気口を提供するポート７０を含むことができる。例えば、ポートの１つは流体試料が入るのを可能にし、他のポートは空気が出るのを可能にし得る。１つの例示的な実施形態において、第１の電極層６６ａ及び第２の電極層６４ａは、それぞれ、スパッタされたパラジウム及びスパッタされた金から作製することができる。スペーサ６０として使用することができる好適な材料としては、例えば、プラスチック（例えば、ＰＥＴ、ＰＥＴＧ、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレン）、シリコン、セラミック、ガラス、接着剤、及びこれらの組み合わせなどの様々な絶縁材料が挙げられる。一実施形態において、スペーサ６０は、ポリエステルのシートの両面にコーティングされた両面接着剤の形態であってもよく、その場合、接着剤は、感圧性接着剤又は加熱活性化接着剤であってもよい。
【００２４】
図３に戻って参照すると、第１の電極及び第２の電極の面積は、２つの側縁部及び切欠き領域６８によって画定され得る。この面積は、液体試料によって湿潤される電極層の表面として定義され得ることに留意されたい。一実施形態において、スペーサ６０の接着剤部分は、接着剤が第１の電極層６６Ａと結合を形成するように、試薬層に混ざる及び／又は部分的に溶解することができる。このような接着結合は、液体試料によって湿潤され得る電極層の一部分を画定するのを助け、更には媒介物質を電解酸化又は電解還元するのを助ける。
【００２５】
第１の電極又は第２の電極のいずれかは、印加された試験電圧の大きさ及び／又は極性に応じて、作用電極の機能を実行することができる。作用電極は、還元された媒介物質の濃度に比例する限界試験電流を測定することができる。例えば、電流制限種が還元された媒介物質（例えば、ヘキサシアノ鉄酸塩）の場合、第２の電極に関して試験電圧が酸化還元媒介物質の電位よりも十分に低い限り、その媒介物質は第１の電極で酸化されることができる。このような状況では、第１の電極は作用電極の機能を果たし、第２の電極は対電極／参照電極の機能を果たす。当業者は、対電極／参照電極を単に参照電極又は対電極として参照してもよいことに留意すべきである。制限酸化は、測定された酸化電流が、バルク溶液から作用電極表面へ拡散する還元された媒介物質の流量に比例するように、全ての還元された媒介物質が作用電極面で枯渇したときに生じる。バルク溶液という用語は、枯渇領域内に還元された媒介物質が存在しない、作用電極から十分に離れた溶液の一部を指す。試験ストリップ８０に関して特に明記しない限り、以下、検査計１０により印加された電位は全て、第２の電極に関して記述されるものであることに留意するべきである。同様に、試験電圧が酸化還元媒介物質の電位より十分に高い場合、その還元された媒介物質は、制限電流として第２の電極で酸化され得る。このような状況では、第２の電極は作用電極の機能を実行し、第１の電極は対電極／参照電極としての機能を実行する。例示的な試験ストリップ、ストリップの操作、及び検査計に関する詳細は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、写しが付属書類に添付される、米国特許出願公開第２００９０３０１８９９号に見出される。
【００２６】
図３を参照すると、試験ストリップ８０は、１つ以上の作用電極と対電極とを含むことができる。試験ストリップ８０は、更に複数の電気的接触パッドを有することができ、その場合、各電極は少なくとも１つの電気的接触パッドと電気的に導通することができる。ストリップポートコネクタ３０８は、電気的接触パッドと電気的にインターフェースして、電極と電気的導通を形成するように構成され得る。試験ストリップ８０は、少なくとも１つの電極上に配置されている試薬層を含むことができる。試薬層は、酵素及び媒介物質を含み得る。試薬層に使用するのに適した例示的な酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ（ピロロキノリンキノン補因子「ＰＱＱ」とともに）、及びグルコースデヒドロゲナーゼ（フラビンアデニンジヌクレオチド補因子「ＦＡＤ」とともに）が挙げられる。試薬層に使用するのに適した例示的な媒介物質としては、フェリシアニドがあり、この場合では酸化型である。試薬層は、グルコースを酵素的副産物に物理的に変換させ、その過程でグルコース濃度に比例した所定量の還元された媒介物質（例、ヘキサシアノ鉄酸塩）を生成するように構成することができる。この後、作用電極によって還元された媒介物質の濃度を電流の形態で測定することができる。次いで、グルコース測定器１０は電流の大きさをグルコース濃度に変換することができる。好ましい試験ストリップの詳細は、米国特許第６１７９９７９号、同第６１９３８７３号、同第６２８４１２５号、同第６４１３４１０号、同第６４７５３７２号、同第６７１６５７７号、同第６７４９８８７号、同第６８６３８０１号、同第６８９０４２１号、同第７０４５０４６号、同第７２９１２５６号、同第７４９８１３２号に提供されており、当該特許の全ては、参照によりそれら全てが本明細書に組み込まれる。
【００２７】
図４は、静電容量の測定のために使用される種々の機能的構成要素を概略的な形で示す。具体的には、構成要素はマイクロコントローラ３００を含む。マイクロコントローラ３００の好ましい実施形態は、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔから超低電力マイクロコントローラ  モデルＭＳＰ４３０として入手可能である。マイクロコントローラ（「ＭＣ」）３００は、ＤＡＣ出力及び内蔵Ａ−Ｄ変換器を備えていてもよい。ＭＣ  ３００は、液晶ディスプレイ画面３０４に好適に接続されて、検査結果又は検査結果に関連したその他の情報の表示を提供する。メモリ３０６は、検査結果、感度電流、及び他の必要な情報又はデータを保存するために、ＭＣ  ３００に電気的に接続される。試験ストリップは、試験測定のためにストリップポートコネクタ（「ＳＰＣ」）３０８を介して連結され得る。ＳＰＣ  ３０８は、試験ストリップが、第１の接触パッド４７ａ、４７ｂ及び第２の接触パッド４３を介してＭＣ  ３００とインターフェースをとるのを可能にする。図４に示されるように、第２の接触パッド４３を使用して、検査計に対する電気的接続を、Ｕ字形の切欠き部４５を介して確立することができる。ＳＰＣ  ３０８には、電極コネクタ３０８ａ及び３０８ｃもまた備わっていてもよい。第１の接触パッド４７は、４７ａ及び４７ｂで表わされるプロングを含むことができる。１つの例示的な実施形態において、第１の電極コネクタ３０８ａ及び３０８ｃは、それぞれ、プロング４７ａ及び４７ｂに別々に接続される。第２の電極コネクタ３０８ｂは、第２の接触パッド４３に接続することができる。検査計１０は、試験ストリップ８０が検査計１０に電気的に接続されているか否かを判定するために、プロング４７ａと４７ｂとの間の抵抗又は電気的導通を測定することができる。
【００２８】
図４を参照すると、ＳＰＣ  ３０８はスイッチ３１０に接続される。スイッチ３１０はバイアスドライバ３１２に接続される。バイアスドライバ３１２には、ＤＡＣ信号３１２ａ、カレントドライブ３１２ｂ、及びスイッチ信号３１２ｃが供給される。ＭＣ  ３００はＤＡＣ信号３１２ａを提供し、その信号は、０からＶｒｅｆ（例えば、約２．０４８Ｖ）の範囲のアナログ電圧を包含する。バイアスドライバ３１２は、定電圧又は定電流の２つのモードで動作することができる。カレントドライバライン３１２ｂは、バイアスドライバ３１２のモードを制御する。ライン３１２ｂを低く設定することで、バイアスドライバ３１２のオペアンプを電圧フォロワー増幅器とする。ＤＡＣ信号３１２ａ出力は、Ｖｒｅｆ／２＋／−４００ｍＶフルスケールにスケーリングされる。バイアスドライバのオペアンプは、この電圧をライン・ドライバ−ライン３１２ｄとしてＭＣ  ３００に直接出力する。ライン３１２ｄの電圧は、Ｖｒｅｆ／２仮想接地に対して生成される。好適なバイアス（例えば、約２０ｍＶのバイアス）で駆動するために、ＤＡＣは（好適なスケーラを介して）約１．０４４Ｖで駆動する必要がある。約＋３００ｍＶのバイアスで駆動するために、ＤＡＣは、通常、約１．３２４Ｖを提供する必要があり、−３００ｍＶのバイアスでは、ＤＡＣは通常、約０．７２４Ｖを提供する必要がある。バイアスドライバ回路３１２はまた、１０９Ｈｚの正弦波を生成し、静電容量測定によって充填を検出するために使用される。
【００２９】
一方、バイアスドライバ３１２に対するカレントドライブ信号３１２ａが高く保たれる場合、ＤＡＣ出力は、約０〜約６０ｍＶフルスケールにスケーリングされる。スイッチ信号３１２ｃも給電されて、試験ストリップを通る電流路をバイアスドライバ３１２の抵抗器を通って迂回させることができる。バイアスドライバ３１２のオペアンプは、抵抗器にわたる電圧降下が、スケーリングされたＤＡＣドライブと同じとなるように制御することを試み、この場合には約６００ｎＡの電流を生成する。この電流は、試験測定を開始するために、試料検出に使用される。
【００３０】
バイアスドライバ３１２は、トランスインピーダンス増幅回路（「ＴＩＡ回路」）３１４にも接続される。ＴＩＡ回路３１４は、ストリップの電極層６６ａ（例えば、パラジウム）を通って電極層６４ａ（例えば、金）接点まで流れる電流を電圧に変換する。全体的な利得は、ＴＩＡ回路３１４の抵抗器によって制御される。ストリップ８０は高容量性負荷であるので、標準的な低オフセット増幅器は振動する傾向がある。このため、低価格のオペアンプがＴＩＡ回路３１４にユニティ・ゲイン・バッファとして提供され、全体のフィードバックループ内に組み込まれる。機能ブロックとして、回路３１４は、高い駆動能力及び低電圧オフセットの両方を備えたデュアルオペアンプシステムとしての機能を果たす。ＴＩＡ回路３１４はまた、仮想接地（又は仮想アース）を利用して、ＳＰＣ  ３０８の電極層６４ａ（例えば、金）接点上に１．０２４Ｖのバイアスを生成する。回路３１４は、Ｖｒｅｆ増幅回路３１６にも接続される。この回路は、電流測定モードのとき、Ｖｒｅｆ／２（約１．０２４Ｖ）に設定された仮想接地レールを使用し、正電流及び負電流の両方を測定できるようにする。この電圧は利得増幅段３１８の全てに供給される。あらゆる回線負荷がこの電圧を「引き上げる」のを防止するため、ユニティ・ゲイン・バッファ増幅器をＶｒｅｆ増幅回路３１６内で使用してもよい。
【００３１】
ＴＩＡ回路３１４からのストリップ電流信号３１４ａ及び電圧基準増幅器３１６からの仮想接地レール３１６ａ（〜Ｖｒｅｆ／２）は、試験測定サイクルの種々の段階での必要性に応じてスケールアップされる。例示的な実施形態において、ＭＣ  ３００には、試験ストリップから感知された増幅信号の４つの回線が備わっており、分析物アッセイ中の試験ストリップの測定サイクルの異なる段階での必要性に応じて感度電流の増幅は変化する。
【００３２】
一実施形態において、検査計１０は、試験ストリップ８０の第１の接触パッド４７と第２の接触パッド４３との間に、試験電圧及び／又は電流を印加することができる。ストリップ８０が挿入されたことを検査計１０が認識した時点で、検査計１０のスイッチが入り、流体検出モードを開始する。一実施形態において、測定器は、ストリップ８０を通って小電流（例えば、０．２〜１μＡ）を駆動するように試みる。試料が存在しない場合、抵抗は数メガオームを超えるので、電流を印加しようとするオペアンプの駆動電圧はレールに進む。試料が導入されると、抵抗は急激に低下し、駆動電圧がそれに続く。駆動電圧が所定の閾値未満に降下すると、試験手順が開始される。
【００３３】
図５Ａは、電極間に印加される電圧を示す。時間ゼロは、試料が最初にストリップを充填し始めたことを試料検出方法が検出した時刻とする。図５Ａにおいて約１．３秒に示される正弦波成分は、図示の目的で正確なタイムスケールで描かれていないことに留意されたい。
【００３４】
試料が試験ストリップチャンバ６１の中で検出された後、ストリップ電極間の電圧は、ミリボルトの大きさで好適な電圧まで増大されて、一定時間、即ち、約１秒維持され、より高い電圧まで増大されて一定時間保持され、次に正弦波電圧をＤＣ電圧の先端に一定時間印加し、次にＤＣ電圧が更なる時間印加され、その後負電圧に反転されて一定時間保持される。次に、この電圧はストリップから切断される。この一連の印加電圧は、図５Ｂに示されるもののような電流トランジェントを生成する。
【００３５】
図５Ｂにおいて、約０から約１秒までの電流信号（及びその後の電流試料）は、エラーチェックのため、かつ対照溶液試料を血液試料と区別するために使用され得る。約１秒から約５秒までの信号を分析して、グルコース結果を得る。この期間の信号は、様々な誤差に関しても分析される。約１．３秒から１．４秒までの信号を使用して、センサが完全に試料で充填されているか否かを検出する。１．３秒から１．３２秒までの電流は、ここではトレース５００として示されており、約１５０マイクロ秒間隔でサンプリングされて、十分な量の生理液が試験ストリップのチャンバ６１を充填したか否かを判定する。
【００３６】
十分な量かどうかをチェックする一実施形態では、静電容量測定を用いて、試験ストリップ８０のチャンバ６１の十分な分析物充填を推測する。静電容量の大きさは、試料流体で覆われた電極の面積に比例し得る。静電容量の大きさを測定した時点で、その値が閾値よりも大きく、したがって正確な測定のために十分な量の液体を試験ストリップが有する場合、グルコース濃度が出力され得る。しかしながら、その値が閾値以下である場合には、試験ストリップが有する液体の量が正確な測定のために不十分であることを示し、エラーメッセージが出力され得る。
【００３７】
静電容量を測定するための１つの方法では、定数成分と振動成分とを有する試験電圧が試験ストリップに印加される。そのような場合、得られる試験電流は、以下により詳細に記載されるように、静電容量値を決定するために数学的に処理され得る。
【００３８】
本出願人らは、電極層を備えるバイオセンサの試験チャンバ６１は、表１に示されるような並列抵抗器及びコンデンサを有する回路の形態にモデリングされ得ると考える。
【００３９】
【表１】
0005635631.tif 000002
【００４０】
表１のこのモデルにおいて、Ｒは、電流が遭遇する抵抗を表し、Ｃは、電極に電気的に結合された生理液と試薬との組み合わせから生じる静電容量を表す。チャンバの静電容量の測定を開始するために、チャンバの中に配置されたそれぞれの電極間に交流バイアス電圧を印加することができ、チャンバからの電流が測定される。チャンバ６１の充填物は、一般に静電容量のみの測定値であると考えられるので、例えば、Ｒなどのあらゆる寄生抵抗を、静電容量のあらゆる決定又は計算に含めるべきではない。したがって、電流を測定又は検知する上で、あらゆる寄生抵抗は、測定電流に影響を与えると考えられる。しかしながら、本出願人らは、上記でモデリングされたようなチャンバを通る抵抗の利用又は知識を必要とせずに静電容量を得るための技術を発見した。この技術を更に説明するために、この技術の根底にある数学的基礎の短い説明を提供する。
【００４１】
キルヒホッフの法則によると、表１の回路を通る合計電流（ｉＴ）は、抵抗器（ｉＲ）及びコンデンサ（ｉＣ）を流れる電流のほぼ合計である。交流電圧Ｖ（ＲＭＳとして測定）が印加されると、抵抗器電流（ｉＲ）は次の式１で表わすことができる。
【数１】
0005635631.tif 000003
【００４２】
コンデンサの電流（ｉＣ）は次の式２で表わすことができる。
【数２】
0005635631.tif 000004
（式中、
ｊは、コンデンサ内の電流が電圧より約９０度進んでいることを示す虚数演算子であり、
ωは、角周波数
【数３】
0005635631.tif 000005
である（式中、ｆは、ヘルツ（Ｈｚ）単位で示した周波数である））。
【００４３】
これら構成要素の概略は、表１のフェーザ図に示されている。フェーザ図において、Φは、出力と比べた場合の入力の位相角を表す。位相角Φは、次の三角関数によって決定される。
【数４】
0005635631.tif 000006
【００４４】
ピタゴラスの定理により、合計電流ｉＴの２乗は次の式４のように計算される。
【数５】
0005635631.tif 000007
【００４５】
式４を再整理し、式３を代入すると、次の式５が得られる。
【数６】
0005635631.tif 000008
【００４６】
コンデンサの電流ｉＣを解いて式２と組み合わせる。
【数７】
0005635631.tif 000009
【００４７】
Ｃを再整理し、ωを展開すると、静電容量は次の式７になる。
【数８】
0005635631.tif 000010
【００４８】
式７を単純化すると、次の式８が得られる。
【数９】
0005635631.tif 000011
【００４９】
式８は抵抗器電流に言及していないことがわかる。その結果、システムが、周波数ｆ及び実効（「ＲＭＳ」）振幅Ｖの交流電圧を駆動し、かつ合計電流ｉＴをＲＭＳ値及び位相角Φとして測定する場合、試験チャンバ６１の静電容量Ｃを、バイオセンサの試験チャンバの抵抗を測定する必要なく正確に計算することができる。バイオセンサのストリップの抵抗は測定が困難であり、５秒アッセイ時間にわたって変化するので、このことは大きな利点であると考えられる。抵抗は、所与の電気バイアス（電圧）でストリップを流れることができる電荷担体の数によって生じると考えられており、したがって反応依存性である。抵抗は、アッセイの１．３秒の時点で、１０ｋΩから、ことによると１００ｋΩまでのいずれかとなることが見込まれる。したがって、バイオセンサチャンバの抵抗、又は更にはセンサ抵抗器など測定回路の抵抗を測定する必要がないことによって、本出願人らの発明は、試験ストリップ全体を改善することに関して現況技術を前進させている。
【００５０】
式８に基づいて静電容量Ｃを決定するための例示的な技術の実施は、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｅ、及び図７に関連させて理解することができる。図５Ａ及び図７の工程７０２に示されるように、約１０９ＨｚのＡＣ試験電圧（．±０．５０ｍＶピークトゥピーク）を、約１〜１．３秒の間に２サイクル、又は工程７０４で示されている少なくとも１サイクルの間印加することができる。好ましい実施形態において、第１のサイクルは調整パルスとして用いることができ、第２のサイクルは、静電容量を測定するために用いることができる。交流試験電圧は、例えば、ピークが約５０ミリボルトの約１０９ヘルツの正弦波といった、好適な波形であることができる（図６Ｃ）。サンプリングは、例えば、図６Ａに示される１サイクル当たり約６４〜６５といったように、１サイクル当たり好適な任意の試料量であり得る。したがって、各試料は、約５．６度の例示的な正弦波を示す。
【００５１】
図６Ａでは、システムは交流バイアスに直流電圧オフセットを加え、したがって、図６Ａで測定された試料は、直流オフセットも有することになり、これは、出願人らの技術の一例に従って合計電流ｉＴを測定するために、工程７０６及び７０８を介して除去されなければならない。
【００５２】
この技術では、図６Ａにおいて６０２で表わされる６５個の試料全ての平均が工程７０６で得られ、これは試料の交流成分のゼロ電流に対する閾値を提供する。これを得ることの利点は、試料にわたるノイズが平均されることである。各試料ポイントに関し、工程７０８で平均値が各サンプリングされたポイントから減算され、これにより、ここでは図６Ｂに示されるように交流成分を分離する結果となる。したがって、工程７１０で全ての負値のＲＭＳ値が取られて、合計電流ｉＴのほぼ正確な大きさが得られる。正値のＲＭＳ値をとることもできるが、本出願人らは、正値は、サイクル全体の第１象限及び第４象限にわたって分割されるのでまとまりがなく、したがって負値が好ましいと考えることを指摘しておく。ＤＣオフセットを除去するために試料６０２を操作し終わった時点で、ここでは図６Ｂにおいて６０４で表わされるように、試料をプロットして時間経過に伴う電流の出力を示すことができる。
【００５３】
位相角を決定するために、適切にプログラムされたシステム又はＭＣは、ここでは図６Ｃに示される発振入力電圧を発振出力電流と比較して、工程７１４で位相角を決定することができる。好ましい実施形態において、サンプリングされたデータ６０４を分析して、正電流と負電流の交点を判定する。サンプリングは離散的な数の試料に基づいているので、図６Ｅにおいて出力電流がゼロ電流ラインを超えるのが実質的にいつであるかを決定するために補間を用いることができ、ここでは、補間された交点は６０８で表わされている。ここで記載される実施形態では、位相角Φは、９０度未満及び約８７度である。精度を上げるために、第２の補間点６１０から約１８０度を減算して、この別の交点６１０で補間を行うことができる。これら２つの補間値は２〜３度以内でなければならず、精度を高めるために平均化されてもよい。
【００５４】
位相角が得られたら、式８を用いて静電容量を計算することができる。しかしながら、実際には、トランスインピーダンス増幅器３１４及び利得増幅器の実装により、追加位相シフトがシステムに導入されていることが判っている。この追加位相シフトは、使用時にストリップなしでシステムの静電容量を測定することによって補償値
【数１０】
0005635631.tif 000012
を導入することによりオフセットされ得る。
【００５５】
【数１１】
0005635631.tif 000013
【００５６】
好ましい実施形態において、補償位相角
【数１２】
0005635631.tif 000014
は、約５〜約７度の範囲である。
【００５７】
試験ストリップ８０の静電容量を判定したら、２点較正を行って、静電容量値を、アナログ構成要素（例えば、抵抗器、コンデンサ、オペアンプ、スイッチ等）のあらゆる公差と無関係である値に正規化する。簡潔に述べると、並列抵抗が３０ｋの５５０ｎＦのコンデンサを測定入力にわたって設置し、静電容量を測定するように測定器に指示し、生成された値を記録する；並列抵抗が３０ｋの８００ｎＦのコンデンサを測定入力にわたって設置し、静電容量を測定するように測定器に指示し、生成された値を記録する、ことによって２点較正を行う。これら２点は、この特定のハードウェアインスタンス（設計ではない）の測定性能の利得及びオフセットの指標を提供する。次に、測定誤差から傾斜及びオフセットを計算し、測定器のメモリに保存する。ここで測定器が較正される。
【００５８】
ストリップが挿入されて試料が提供されると、静電容量が測定され、保存された傾斜及びオフセットが適用されて測定値を補正する。
【００５９】
デバイスの較正の完了後、試験チャンバ６１が試験流体で十分に充填されているか否かを判定するための評価が行われる。この評価は、良好に充填された試験ストリップの大きな試料から得た平均静電容量値の少なくとも６５％〜８５％である静電容量の大きさに基づくことができる。
【００６０】
この例示的な技術のロバスト性を試験するために、本出願人らは、システムにノイズを意図的に導入して、参照並列Ｒ−Ｃ回路と比較した場合の誤差百分率を判定した。次の表２では、アナログ・デジタル変換器（「ＡＤＣ」）ノイズカウント数が導入されたが、電流、位相角、及び静電容量に関する誤差は１％未満であった。
【００６１】
【表２】
0005635631.tif 000015
【００６２】
例示的な技術を他の技術と比較して、本出願人らの技術の精度が高いことを確認する。例えば、図８Ａにおいて、静電容量は、ストリップの試料から約３５０〜約８００ナノファラッドの範囲内で測定される。完全に充填されたストリップは、対照溶液又は血液が使用されているか否かに応じて、６００〜７００ｎＦの範囲の静電容量を有する。部分的に充填されたストリップは、当然ながらより低い静電容量を示す。対象実施形態で静電容量を測定して、参照並列Ｒ−Ｃ回路からのパーセント偏差を決定する。市販のＬＣＲメータを使用して較正されたいくつかの「金製の」Ｒ−Ｃの組み合せを有することによって、パーセント誤差を計算する。こうしたＲ−Ｃの組み合せ（一般に誤差のないサンプル（Ｅｘｅｍｐｌａｒｓ）であることが見出されており、したがって「金製」である）を、ストリップコネクタに順に提供し、システムに静電容量を読み取るように命令する。この試験を、システムの他のいくつかの試料を使用して繰り返し、測定技術の精度及び信頼性を判定する。基準曲線８００は例示的な技術を示しており、基準データを基にした誤差率は、約３５０ナノファラッド〜約８５０ナノファラッドの範囲の静電容量にわたって３％未満である。これに対し、ＬｉｆｅＳｃａｎ  Ｉｎｃ．（ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手可能な既存の測定器システムにおける静電容量測定は、この範囲の静電容量にわたって、２％未満から１０％超過に及ぶ誤差曲線８０６を示す。本出願人らに関連した静電容量測定技術８０２及び８０４は、既存の分析物測定システムによって設定された上方境界８０６と、例示的な技術によって設定された下方境界８００との間に位置する。
【００６３】
例示的な実施形態、方法、及びシステムが血糖ストリップに関して記載されてきたが、本明細書に記載される原理は、少なくとも２つの電極間に配置された試薬上の生理液を使用するあらゆる分析物測定ストリップにも同様に適用することができる。
【００６４】
上述のように、本明細書に記載する様々なプロセスの工程を一般に実施するように、マイクロコントローラをプログラムすることができる。このマイクロコントローラは、例えば、グルコース測定器、インスリンペン、インスリンポンプ、サーバ、携帯電話、パーソナルコンピュータ、又は移動携帯型デバイスなどの特定のデバイスの一部であり得る。更に、本明細書に記載する様々な方法を用いて、例えば、Ｃ＋、Ｃ＋＋、若しくはＣ−Ｓｈａｒｐなどの、例えば、Ｃ又はＣの変形などの既製のソフトウェア開発ツールを用いて、ソフトウェアコードを生成することができる。しかしながら、これらの方法は、こうした方法をコードするための新しいソフトウェア言語の必要条件及び入手可能性に応じて、他のソフトウェア言語に変換することもできる。更に、本明細書に記載する様々な方法は、好適なソフトウェアコードに一旦変換されれば、好適なマイクロコントローラ又はコンピュータによって実行される際に、これらの方法において記載された工程をあらゆる他の必要な工程とともに実行するように動作する、任意のコンピュータ読み取り可能な記憶媒介物質として実施することができる。
【００６５】
本発明を特定の変形例及び説明図に関して述べたが、当業者には本発明が上述された変形例又は図に限定されないことが認識されよう。更に、上述の方法及び工程が特定の順序で起こる特定の事象を示している場合、当業者には特定の工程の順序が変更可能であり、そうした変更は本発明の変形例に従うものである点が認識されよう。更に、こうした工程のうちのあるものは、上述のように順次行われるが、場合に応じて並行したプロセスで同時に行われてもよい。したがって、開示の趣旨又は本発明の同等物の範囲内にある本発明の変形が存在する範囲では、本「特許請求の範囲」がこうした変形例をも包含することが意図されるところである。
【図１】
0005635631.tif 000017
【図２】
0005635631.tif 000018
【図３】
0005635631.tif 000019
【図４】
0005635631.tif 000020
【図５Ａ】
0005635631.tif 000021
【図５Ｂ】
0005635631.tif 000022
【図６Ａ】
0005635631.tif 000023
【図６Ｂ】
0005635631.tif 000024
【図６Ｃ】
0005635631.tif 000025
【図６Ｄ】
0005635631.tif 000026
【図６Ｅ】
0005635631.tif 000027
【図７】
0005635631.tif 000028
【図８Ａ】
0005635631.tif 000029
【図８Ｂ】
0005635631.tif 000030