(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内に平均粒径が１０〜４０ｎｍのアミン化合物で表面が修飾された合成磁気微粒子及び／又は該合成磁気微粒子の凝集粒子を内包してなることを特徴とする磁気微粒子包含細胞。
【請求項２】
上記細胞が、免疫細胞であることを特徴とする請求項１記載の磁気微粒子包含細胞。
【請求項３】
上記アミン化合物がアルキルジアミンであることを特徴とする請求項１又は２記載の磁気微粒子包含細胞。
【請求項４】
上記合成磁気微粒子が、水溶性鉄塩を、アミン化合物を含む水溶液中で加水分解させることにより生成したマグネタイトであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の磁気微粒子包含細胞。
【請求項５】
平均粒径が１０〜４０ｎｍのアミン化合物で表面が修飾された合成磁気微粒子と、細胞とを混合して培養することにより、上記合成磁気微粒子を細胞内に導入することを特徴とする請求項１記載の磁気微粒子包含細胞の製造方法。
【請求項６】
上記細胞が、免疫細胞であることを特徴とする請求項５記載の磁気微粒子包含細胞の製造方法。
【請求項７】
上記アミン化合物がアルキルジアミンであることを特徴とする請求項５又は６記載の磁気微粒子包含細胞の製造方法。
【請求項８】
上記合成磁気微粒子が、水溶性鉄塩を、アミン化合物を含む水溶液中で加水分解させることにより生成したマグネタイトであることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項記載の磁気微粒子包含細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞療法などの医学的治療、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）などの医療診断などに用いることができる磁気微粒子包含細胞及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、磁気微粒子を、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）、核磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）、温熱療法などの医療に応用することが提案されている。そのなかでも、免疫細胞等の細胞に磁気粒子を導入又は結合させ、これを体内に導入し、免疫細胞の作用によりがん細胞等のターゲットに到達した磁気粒子に、外部から磁気を与えて、磁気誘導による発熱させてがん細胞等のターゲットを治療する手法や、体内に導入した免疫細胞の位置を、磁気粒子を利用してＭＲＩにより特定する手法などが考えられている。
【０００３】
このような手法に用いる磁気粒子は、体内での拒絶反応を避けるため細胞に内包される必要があり、細胞より小さいサイズであることが必要である。また、磁気誘導や検出に有効な磁気を有するサイズ以上であることも必要である。このようなサイズ範囲の中でより小さいものを用いることが、免疫細胞の利用効率や、体内での負荷の点からも好ましい。
【０００４】
従来、このような手法において用いることを想定した磁気微粒子包含細胞の磁気粒子としては、例えば、走磁性細菌が有するマグネトソームと呼ばれる磁気微粒子鎖を利用する方法（特開昭６２−２７５６７９号公報（特許文献１））などが報告されているが、このような生物学的手法による磁気微粒子の製造は、製造効率の点で劣っている。
【０００５】
一方、化学的合成手法により磁気粒子を製造する手法によれば、磁気粒子の大量製造は可能であるが、ミクロンからサブミクロンサイズの粒子を導入しようとすると、細胞内に効率よく分散させることができないという問題があるため、より小さい合成磁気粒子を利用することが望まれるが、分散性の高い小粒径の磁気微粒子を、粒径を制御して効率よく製造することができていなかった。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６２−２７５６７９号公報
【特許文献２】特開昭２００６−３２５６００号公報
【非特許文献１】Q A Pankhurst, et Al., J. Phys. D: Appl. Phys., 36(2003)R167-R181
【非特許文献２】Tobias Neuberger, et al., Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 293(2005)483-496
【非特許文献３】David Portet, et al., Journal of Colloid and Interface Science, 238, 37-42(2001)
【非特許文献４】Akira Ito, et al., Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 100, No.1, 1-11.2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、免疫細胞療法などの医学的治療、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）などの医療診断などにおいて有効に用いることができる磁気微粒子包含細胞、及びこのような磁気微粒子包含細胞を効率よく製造することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、平均粒径が１０〜４０ｎｍの合成磁気微粒子と、免疫細胞等の細胞とを混合して培養することによって、上記合成磁気微粒子を細胞内に導入することにより、合成磁気微粒子が効率よく、また分散性よく細胞内に内包され、平均粒径が１０〜４０ｎｍの合成磁気微粒子及び／又は該合成磁気微粒子の凝集粒子を内包した磁気微粒子包含細胞を製造することができることを見出し、本発明をなすに至った。
【０００９】
従って、本発明は、下記の磁気微粒子包含細胞及びその製造方法を提供する。
請求項１：
細胞内に平均粒径が１０〜４０ｎｍのアミン化合物で表面が修飾された合成磁気微粒子及び／又は該合成磁気微粒子の凝集粒子を内包してなることを特徴とする磁気微粒子包含細胞。
請求項２：
上記細胞が、免疫細胞であることを特徴とする請求項１記載の磁気微粒子包含細胞。
請求項３：
上記アミン化合物がアルキルジアミンであることを特徴とする請求項１又は２記載の磁気微粒子包含細胞。
請求項４：
上記合成磁気微粒子が、水溶性鉄塩を、アミン化合物を含む水溶液中で加水分解させることにより生成したマグネタイトであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の磁気微粒子包含細胞。
請求項５：
平均粒径が１０〜４０ｎｍのアミン化合物で表面が修飾された合成磁気微粒子と、細胞とを混合して培養することにより、上記合成磁気微粒子を細胞内に導入することを特徴とする請求項１記載の磁気微粒子包含細胞の製造方法。
請求項６：
上記細胞が、免疫細胞であることを特徴とする請求項５記載の磁気微粒子包含細胞の製造方法。
請求項７：
上記アミン化合物がアルキルジアミンであることを特徴とする請求項５又は６記載の磁気微粒子包含細胞の製造方法。
請求項８：
上記合成磁気微粒子が、水溶性鉄塩を、アミン化合物を含む水溶液中で加水分解させることにより生成したマグネタイトであることを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項記載の磁気微粒子包含細胞の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、免疫細胞療法などの医学的治療、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）などの医療診断などにおいて有効に用いることができる磁気微粒子包含細胞として、小粒径の微粒子及び／又はその凝集粒子が分散性よく内包された磁気微粒子包含細胞を提供することができ、また、このような磁気微粒子包含細胞を効率よく製造することができる。本発明の磁気微粒子包含細胞は、磁気誘導を利用した温熱療法等にも応用が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の磁気微粒子包含細胞は、細胞内に合成磁気微粒子を内包するものであり、合成磁気微粒子は、平均粒径が１０〜４０ｎｍの合成磁気微粒子の単一粒子として、また上記合成磁気微粒子の凝集粒子、例えば、平均長さが１μｍ以下、好ましくは０．１〜１μｍの鎖状等の凝集体として内包されている。
【００１２】
本発明において対象とする細胞としては、例えば免疫細胞が好適であり、免疫細胞としては、腫瘍抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ細胞）、活性化リンパ球、正常リンパ球等のリンパ球細胞、樹状細胞、Ｂ細胞などを挙げることができる。このような免疫細胞にマグネタイト等の磁気微粒子を取り込ませることにより、例えば、マグネタイトを内包した高機能性がん特異的キラー細胞を製造し、磁力によりがん局所へ集積させることによる治療効果が期待できる。また磁気微粒子を取り込んだキラー細胞のがん局所への集積により、磁気微粒子をがん局所へ到達させ、磁気誘導を利用した誘導加熱により、局所的にがん細胞のみを死滅させる高効率ながん免疫細胞療法も可能となる。また、磁気微粒子を内包したキラー細胞が到達したがん部位を、磁性微粒子をマーカーとして、ＭＲＩによりモニタリングすることが可能であり、これにより発見が難しい微小ながんの早期発見も可能である。
【００１３】
本発明において、磁性微粒子としては、酸化鉄、特に、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）が好適である。平均粒径が１０〜４０ｎｍのマグネタイトは、例えば、水溶性鉄塩を、アミン化合物を含む水溶液中で加水分解させることにより製造することができる。
【００１４】
この場合、水溶性鉄塩としては、硫酸鉄［ＩＩ］（ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏなど）、硫酸鉄［ＩＩＩ］（Ｆｅ2（ＳＯ4）・ｎＨ2Ｏ）、塩化鉄［ＩＩ］（ＦｅＣｌ2・４Ｈ2Ｏなど）、塩化鉄［ＩＩＩ］（ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏなど）などを用いることができる。
【００１５】
一方、加水分解反応においてアルカリとして作用するアミン化合物としては、１，６−ヘキサンジアミン等のアルキルジアミンなどを用いることができる。アミン化合物は、生成したマグネタイト微粒子の表面を修飾して粒子同士の凝集を抑制する作用も有し、これにより、マグネタイト粒子をより分散性よく生成させることが可能となる。
【００１６】
本発明においては、水溶性鉄塩とアミン化合物とを混合した水溶液を、必要に応じて攪拌しながら２０〜２５℃程度の温度で２０〜２４時間程度熟成することによりマグネタイトを生成させることが可能である。例えば、水溶性鉄塩水溶液の濃度を０．０４〜０．０６ｍｏｌ／Ｌ、アミン化合物水溶液の濃度を０．２４〜０．２６ｍｏｌ／Ｌとして、水溶性鉄塩に対してアミン化合物を５当量程度となるように両水溶液を混合すればよい。
【００１７】
生成したマグネタイト粒子は、必要に応じて、ろ過、洗浄、乾燥等の工程を経て、回収される。このような方法でマグネタイトを製造すれば、平均粒径が１０〜４０ｎｍのマグネタイトを分散性よく製造することができ、また、例えば、水溶性鉄塩（Ｆｅイオン）の濃度を調整することにより、所望の平均粒径のマグネタイト微粒子を製造することが可能である。
【００１８】
このような方法でマグネタイト微粒子を製造すれば、４０〜９０ｅｍｕ／ｇ（Ａ・ｍ2／ｋｇ）、特に７０〜９０ｅｍｕ／ｇ（Ａ・ｍ2／ｋｇ）の飽和磁化、１０〜１００Ｏｅ、特に５０〜１００Ｏｅの保磁力を示す良好な磁気特性を示すマグネタイト微粒子を得ることができる。
【００１９】
次に、磁性微粒子を細胞に導入する方法について説明する。例えば、上述した方法により製造した平均粒径が１０〜４０ｎｍの合成磁気微粒子及び／又は該合成磁気微粒子の凝集粒子を用い、この合成磁気微粒子（凝集粒子）を、リン酸緩衝生理食塩水等の生理食塩水中に、必要に応じて超音波等を使用して、分散させて分散液を調製し、この分散液と、従来公知の方法で採取、調製したリンパ球細胞等の免疫細胞と、必要に応じて生理食塩水とを混合し、磁気微粒子が１００〜２００μｇ／ｍｌ程度、免疫細胞が１×１０6〜２×１０6個／ｍｌ程度の混合液とし、これを例えばヒトの免疫細胞であればその体温前後の温度、例えば３７℃程度の温度で、磁性微粒子の内包に必要な所定時間、例えば４時間程度培養すれば、磁性微粒子を細胞に導入することが可能である。特に、上述した方法により製造した合成磁気微粒子（凝集粒子）は、合成磁気微粒子（凝集粒子）であるが、免疫細胞との適合性がよく、粒子の内包がスムーズに進行すると共に、粒子の内包によって免疫細胞自身の機能（活性）が損なわれることがない。
【００２０】
このような方法により、本発明の磁気微粒子包含細胞を製造することが可能であるが、培養の条件を変更、例えば、濃度を変更したり、培養温度や培養時間を選択したりすることにより、得られた磁気微粒子包含細胞の細胞内に、平均粒径が１０〜４０ｎｍの合成磁気微粒子が単一で分散したもの、平均粒径が１０〜４０ｎｍの合成磁気微粒子が、平均長さが１μｍ以下、特に０．１〜１μｍの鎖状等の凝集粒子として分散したもの、双方が分散したものを製造することが可能である。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００２２】
［実施例１］
水溶性鉄塩として、硫酸鉄［ＩＩ］を０．０５ｍｏｌ／Ｌで含有する水溶液１００ｍｌに、１，６−ヘキサンジアミンを０．２５ｍｏｌ／Ｌで含有する水溶液１００ｍｌを加え、２５℃で２４時間強攪拌することにより、黒色の沈殿物を得た。得られた沈殿物をろ過により分離し、水洗後、室温で乾燥して微粒子を得た。
【００２３】
得られた微粒子は、Ｘ線回折法により酸化鉄（マグネタイト）であることが確認された。また、微粒子の粒径を透過型電子顕微鏡像から計測したところ、平均粒子径が４０ｎｍのナノ粒子であることが確認された。更に、得られたマグネタイトの飽和磁化は８７Ａ・ｍ2／ｋｇ、保磁力は６６Ｏｅであり、良好な磁気特性を有する磁気粒子であることが確認された。
【００２４】
次に、得られた酸化鉄（マグネタイト）ナノ粒子を、リン酸緩衝生理食塩水中に１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように混合し、超音波処理により分散させた分散液を調製した。その後、２×１０6個／ｍｌのヒト由来正常リンパ球細胞に対して、マグネタイトの添加量が２００μｇ／ｍｌとなるように混合（リン酸緩衝生理食塩水により希釈）し、緩やかに撹拌しながら、３７℃で４時間培養することによって、リンパ球細胞に酸化鉄（マグネタイト）ナノ粒子を導入する処理を実施した。
【００２５】
培養後の培養液よりリンパ球細胞のみを遠心分離によって分離し、細胞内に取り込まれた鉄イオン濃度より、マグネタイトナノ粒子の取り込み量を見積もったところ、添加量に対して１０〜２０質量％のマグネタイトナノ粒子がリンパ球細胞中に取り込まれていることが確認された。
【００２６】
更に、リンパ球細胞中へのマグネタイトナノ粒子の取り込みを確認するために、透過型電子顕微鏡による細胞観察を行った。その結果、図１に示されるように、リンパ球中へベシクルの形成（図中の矢印で示した部分）を伴って、マグネタイトナノ粒子が数マイクロメートルのベシクル中に凝集体として取り込まれている様子が確認された。
【００２７】
［実施例２］
実施例１と同様の方法により得た酸化鉄（マグネタイト）ナノ粒子を用い、ヒト由来正常リンパ球細胞の代わりに、メラノーマ抗原であるｇｐ１００−Ａ２ペプチド（ｇｐ１００209-217:ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ）に特異的なＣＴＬ  ｌｉｎｅ（ＣＴＬ細胞株：ｇｐ１００ペプチド  ＨＬＡ−Ａ２  ｔｅｔｒａｍｅｒ  ４４％）を用いて、ＣＴＬ細胞に酸化鉄（マグネタイト）ナノ粒子を導入する処理を実施した。
【００２８】
培養後の培養液よりリンパ球細胞のみを遠心分離によって分離し、細胞内に取り込まれた鉄イオン濃度より、マグネタイトナノ粒子の取り込み量を見積もったところ、添加量に対して３回の平均で２７．６質量％のマグネタイトナノ粒子がＣＴＬ細胞中に取り込まれていることが確認された。
【００２９】
更に、リンパ球細胞中へのマグネタイトナノ粒子の取り込みを確認するために、透過型電子顕微鏡による細胞観察を行った。その結果、ＣＴＬ細胞中へベシクルの形成を伴って、マグネタイトナノ粒子が数マイクロメートルのベシクル中に凝集体として取り込まれている様子が確認された。
【００３０】
次に、マグネタイトナノ粒子を取り込んだＣＴＬ細胞株をｇｐ１００−Ａ２ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）にて処理したＴ２細胞（ヒトＴ／Ｂ細胞のハイブリッドであり、ＨＬＡ−Ａ２分子のみ発現する細胞株）と２４時間インキュベートした。細胞数は、１×１０5ずつに調整（９６−ｗｅｌｌマイクロプレート）し、培地はＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳを用いた。培養後、上澄みを回収し産生されたＩＦＮ−γの量を測定した。
【００３１】
マグネタイトナノ粒子を取り込んだＣＴＬ細胞株は、ｇｐ１００−Ａ２ペプチドに特異的に反応し、高濃度のＩＦＮ−γを産生した。マグネタイトナノ粒子を取り込ませていない細胞との比較では、明らかな差は認められなかった。結果を図２に示す。これによりマグネタイトナノ粒子を取り込んだＣＴＬ細胞において、ペプチド特異的な細胞障害活性は損なわれないことが確認された。なお、ペプチドの陰性コントロールとして同じＨＬＡ−Ａ２拘束性をもつインフルエンザＭＰペプチド（Ｆｌｕ−ＭＰ58-66:ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）を使用して評価した。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１において得られたマグネタイトを取り込んだリンパ球の透過型電子顕微鏡像である。
【図２】実施例２において得られたマグネタイトを取り込んだＣＴＬ細胞の刺激時のＩＦＮ−γ産生量を示すグラフである。
【図２】
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【図１】
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