(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染細胞が産生する短鎖ＲＮＡを検出するためのＨＩＶ検出キットであって、
配列番号５で表される塩基配列と、９５％以上の同一性を有するＨＩＶ検出用プライマーを含むことを特徴とするＨＩＶ検出キット。
【請求項２】
前記ＨＩＶ検出用プライマーは、配列番号５で表される塩基配列を有する請求項１に記載のＨＩＶ検出キット。
【請求項３】
更に、配列番号２で表される塩基配列を有するプローブを含む請求項１又は２に記載のＨＩＶ検出キット。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＨＩＶ検出キットを用いることを特徴とするＨＩＶ検出方法。
【請求項５】
ＨＩＶ感染細胞が産生する短鎖ＲＮＡを検出するためのＨＩＶ検出方法あって、
（ａ）核酸試料中のｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する工程と、
（ｂ）ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する工程と、
（ｃ）配列番号５で表される塩基配列と、９５％以上の同一性を有するＨＩＶ検出用プライマーと、前記アダプター配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する工程と、
（ｄ）前記標的塩基配列の増幅産物を検出する工程と、
を有することを特徴とするＨＩＶ検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；以下、ＨＩＶという。）検出用オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ検出キット、及びＨＩＶ検出方法に関する。
本願は、２０１２年１月２５日に、日本に出願された特願２０１２−０１３０８７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；以下、エイズという。）の原因であるＨＩＶ感染に対しては、ＨＩＶ感染の根本的な予防をすることと共に、万一感染した疑いが生じた場合に、感染の有無を早期に診断できる技術を確立することが重要である。
また、治療により体内からＨＩＶが消失したようにみえても、診断技術におけるウイルスの検出感度が低い場合には、体内でＨＩＶが潜伏しているにもかかわらず、体内からＨＩＶが「消失」したものと誤診されるおそれがあり、エイズ再発の禍根を残すことになる。【０００３】
ＨＩＶ感染後の急性感染期において、ＨＩＶは宿主細胞内に侵入し、自己のウイルスＲＮＡを逆転写して、ＤＮＡを合成し、該ＤＮＡを宿主細胞のＤＮＡに挿入し、プロウイルス化する。宿主細胞内で、該プロウイルスがウイルス遺伝子を発現し、自己のウイルスタンパク質がウイルスＲＮＡをパッケージングすることによりウイルス粒子が形成され、該ウイルス粒子は宿主細胞外へ出ていく。
現在、臨床における抗ＨＩＶ治療方法としては、多剤併用療法（Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｎｔｉ−Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：以下、ＨＡＡＲＴ療法という。）が一般的である。ＨＡＡＲＴ療法は、上述した急性感染期におけるウイルスＲＮＡの逆転写やウイルスＤＮＡのゲノムＤＮＡへの挿入等を阻害する複数種の阻害剤を投与する方法である。ＨＡＡＲＴ療法により、抗ＨＩＶ治療は著しい発展を遂げてきている。
一方、ＨＡＡＲＴ療法による治療過程で、一部の感染細胞は、ＨＡＡＲＴ療法に対する耐性を獲得する（以下、この感染細胞を潜伏感染細胞という。）。潜伏感染細胞においては、プロウイルスを有しているにもかかわらず、急性感染期で観察されたウイルスの生活環が休止し、ウイルスＲＮＡが産生されない。ＨＡＡＲＴ療法は、上述したようにウイルス増殖の各ステップを阻害するものであるため、ＨＡＡＲＴ療法により潜伏感染細胞からウイルスを除くことは困難である。しかし、ＨＡＡＲＴ療法を中断すると、潜伏感染細胞におけるウイルスの生活環が再始動する。
従って、潜伏感染細胞からウイルスを除去できないことが、ＨＩＶ患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）に悪影響を与えている。【０００４】
これに対して、本発明者らは、モデル細胞株を構築し、該モデル細胞株を用いて、潜伏感染細胞の表現型を解析したところ、潜伏感染細胞は、約６０塩基の短鎖ＲＮＡを産出していることを見出した（非特許文献１参照。）。【０００５】
ＨＩＶ感染の診断方法において、感染者の血液中のウイルス量を定量することは、病態の程度や治癒経過を把握する指標として重要である。
現在、リアルタイムＰＣＲ法を標的核酸の増幅・検出の原理とするＨＩＶのＲＮＡ定量法は、ＨＩＶ感染の迅速な診断方法の一つとして知られている。【０００６】
リアルタイムＰＣＲ法を用いたＨＩＶのＲＮＡ定量法としては、例えば特許文献１に記載された方法が挙げられる。特許文献１に記載された方法は、ＨＩＶ−１の各種サブタイプを認識できるように設計された縮重プライマーを用いて、ゲノムに挿入されたＨＩＶ−１プロウイルスを増幅・定量する方法である。かかる方法は、日本人感染者の主な感染源であるサブタイプＢのみならず、それ以外の各種サブタイプにも対応できる点で優れている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２９５８９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】水谷ら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、第８３巻、第１１５６９〜１１５８０頁、２００９年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、ＨＩＶは、フィデリティ（正確性）の低い逆転写酵素を有しているため、非常に変異しやすいウイルスである。特許文献１に記載のＨＩＶを認識するオリゴヌクレオチドの配列は、転写開始点から約５００塩基下流に位置する構造タンパク質ＧＡＧをコードするｇａｇ遺伝子領域に由来するものであり、当該配列を用いて、変異したすべてのウイルスを高精度に検出するには不十分である。【００１０】
また、感染細胞では感染暴露日から定量的にＧＡＧ領域を含む転写伸張されたウイルスＲＮＡを検出可能にするまでにはウイルスの増殖に伴った１２日間という日数を必要とする。そのため、より早期に高感度でウイルス検出をすることができる技術が望まれている。【００１１】
更に、特許文献１に記載のオリゴヌクレオチドを用いても、上述した潜伏感染細胞が産出する短鎖ＲＮＡを検出することができず、未だ改善の余地がある。【００１２】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高精度かつ高感度に、ＨＩＶを早期検出することができるＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ検出キット、及びＨＩＶ検出方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、潜伏感染期間のＨＩＶ感染細胞において特定のＲＮＡが転写されていること、及び、ＨＩＶのウイルスＲＮＡにおいて逆転写の際に変異を受けにくい配列が存在することを見出し、本発明を完成させた。【００１４】
本発明は、下記の特徴を有するＨＩＶ検出キット、及びＨＩＶ検出方法を提供するものである。
（１）ＨＩＶ感染細胞が産生する短鎖ＲＮＡを検出するためのＨＩＶ検出キットであって、配列番号５で表される塩基配列と、９５％以上の同一性を有するＨＩＶ検出用プライマーを含むことを特徴とするＨＩＶ検出キット。
（２）前記ＨＩＶ検出用プライマーは、配列番号５で表される塩基配列を有する（１）に記載のＨＩＶ検出キット。
（３）更に、配列番号２で表される塩基配列を有するプローブを含む（１）又は（２）に記載のＨＩＶ検出キット。
（４）（１）〜（３）のいずれかに記載のＨＩＶ検出キットを用いることを特徴とするＨＩＶ検出方法。
（５）ＨＩＶ感染細胞が産生する短鎖ＲＮＡを検出するためのＨＩＶ検出方法あって、（ａ）核酸試料中のｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する工程と、（ｂ）ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する工程と、（ｃ）配列番号５で表される塩基配列と、９５％以上の同一性を有するＨＩＶ検出用プライマーと、前記アダプター配列に相補的な塩基配列を有するプライマーを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する工程と、（ｄ）前記標的塩基配列の増幅産物を検出する工程と、を有することを特徴とするＨＩＶ検出方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＨＩＶ感染細胞において、ＨＩＶに変異が生じたとしても、かかるウイルスを高精度に検出することができる。
また、本発明によれば、潜伏感染期間であっても、ＨＩＶを早期かつ高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例１、実施例２、及び比較例１における、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲを用いたＨＩＶ−１短鎖ＲＮＡの検出結果である。
【図２】実験例２における、約６０塩基の短鎖ＲＮＡの塩基配列解析結果である。
【図３】実験例３における、定量PCRの結果である。
【図４】実験例３における、検量線である。
【図５】本発明の、HIV感染細胞において産生される短鎖RNAの検出系の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［ＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド］
本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、８０％以上の同一性を有する。本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、当該同一性の範囲内において、配列番号１又は６で表される塩基配列に対して、１乃至複数の塩基が欠失、挿入、又は置換されていてもよい。
更に、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列と、９０％以上の同一性を有することが好ましく、９５％以上の同一性を有することがより好ましく、９８％以上の同一性を有することが特に好ましい。また、配列番号１又は６で表される塩基配列中の１０以上の連続した塩基からなる塩基配列を有することがより好ましい。
配列番号１（５’−ＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴ−３’：６５ｍｅｒ）で表される塩基配列及び配列番号６（５’−ＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴ−３’：７１ｍｅｒ）で表される塩基配列は、ウイルスゲノム中のＨＩＶ  ＬＴＲ（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ）内に存在するＴＡＲ（Ｔｒａｎｓ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｅｇｉｏｎ）配列の一部である。
【００１８】
ＨＩＶとしては、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２の２種類が挙げられる。本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、サブタイプに依存せずにＨＩＶ−１のみを特異的に検出することができる。
【００１９】
ＨＩＶのＴＡＲ配列は、ウイルス遺伝子の転写制御に関与し、ウイルスゲノムの５’末端及び３’末端に位置するＬＴＲ内に存在する。ＴＡＲ配列は、ＨＩＶ−１のサブタイプ間で高く保存されており、転写活性因子ｔａｔ（Ｔｒａｎｓ  ＡｃＴｉｖａｔｏｒ）が該ＴＡＲ配列に結合することにより、ウイルス遺伝子の転写が促進される。
このように、ＴＡＲ配列は、転写活性因子が結合する部位であり、ウイルス遺伝子の転写はかかる結合を介して厳密に制御されているという観点から、本発明者は、ＴＡＲ配列が変異を受けにくい箇所であることを見出した。
従って、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、ＴＡＲ配列を認識する配列を含むことにより、変異したＨＩＶをも認識することができるため、ＨＩＶを高精度に検出することができる。
【００２０】
本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡが好ましく、ＤＮＡと同様の機能を有するものであれば、天然、非天然に限られず、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の人工核酸を含むものであってもよい。
【００２１】
本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドの長さは、プライマー又はプローブとして機能するために必要な長さであれば特に限定されないが、１０〜４０塩基が好ましく、２０〜３０塩基がより好ましい。
【００２２】
上述したように、本発明者らは、モデル細胞株を構築し、該モデル細胞株を用いて、潜伏感染細胞の表現型を解析したところ、潜伏感染細胞は、約６０塩基の短鎖ＲＮＡを産出していることを見出した。
【００２３】
更に、この約６０塩基の短鎖ＲＮＡが、ＨＩＶ−１ｍＲＮＡの転写開始点から、ヌクレオチド位置５０から７０塩基で転写が止まった転写産物の複合体であることを明らかにした。また、この約６０塩基の短鎖ＲＮＡは、ＨＩＶ−１ｍＲＮＡの転写開始点から、ヌクレオチド位置５０〜７１塩基で転写が止まった転写産物の複合体であることも明らかにした。即ち、短鎖ＲＮＡがウイルスＲＮＡの５’末端に存在するＴＡＲ配列のヌクレオチド位置１（転写開始点）から、位置５０から位置７０、又は位置５０から位置７１までのｍＲＮＡに相当するものであることを明らかにした。
【００２４】
従来、ＨＩＶを認識するオリゴヌクレオチドの配列は、転写開始点から約５００塩基下流に位置する構造タンパク質ＧＡＧをコードするｇａｇ遺伝子領域に由来するものであった。かかるオリゴヌクレオチドは、潜伏感染細胞が産出する短鎖ＲＮＡを検出することができない。また、感染細胞では感染暴露日から定量的にＧＡＧ領域を含む転写伸張されたウイルスＲＮＡを検出可能にするまでにはウイルスの増殖に伴った１２日間という日数を必要とする。
一方、潜伏感染細胞におけるウイルスの生活環は、血清中でのウイルス産生が検出限界以下であるが、転写は完全に停止しておらず、転写は開始しているが、転写伸張が効率よく進んでいない状態にある。この状況は、ウイルス感染初期と似ており、ウイルス感染初期においても短鎖ＲＮＡが産出されているものと考えられる。従って、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドによれば、感染暴露から１２日経過を待たずとも、早期にウイルス検出をすることができる。
また、ＨＩＶ−１は、ウイルスゲノムの５’末端にだけでなく、３’末端にもＴＡＲ配列を有している。従って、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドによれば、短鎖ＲＮＡの検出だけでなく、ＨＩＶ−１ＲＮＡ全長の検出も可能であるため、ウイルスを高感度に検出することができる。
【００２５】
［ＨＩＶ検出方法］
≪第１実施形態≫
本実施形態のＨＩＶ検出方法は、
（ａ）核酸試料中のｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する工程と、
（ｂ）ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する工程と、
（ｃ）本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドと、前記アダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する工程と、
（ｄ）前記標的塩基配列の増幅産物を検出する工程と、を有する。
以下、各工程について説明する。
【００２６】
まず、工程（ａ）において、核酸試料中のｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する。
核酸試料は、核酸を含有する試料であれば、特に限定されないが、ＨＩＶ感染が確認されている感染者若しくはＨＩＶ感染が疑われている感染被疑者、又は抗ＨＩＶ治療を受けている患者等の被験者の血液、リンパ液、髄液、精液等のサンプルから核酸を抽出することにより得られるものであることが好ましい。これらのサンプルからの核酸抽出は、トリゾルを用いる等、定法により行うことができるが、上述した約６０塩基の短鎖ＲＮＡを検出対象とする場合には、マイクロＲＮＡ等の低分子ＲＮＡを抽出する方法を利用することが好ましい。
上述したように、潜伏感染細胞から産出される短鎖ＲＮＡは、転写が途中で止まったものであるため、３’末端にｐｏｌｙＡ配列を有しない。本実施形態においては、ｐｏｌｙＡポリメラーゼを用いて短鎖ＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加することにより、短鎖ＲＮＡを所定の塩基数からなるものにすることができる。これにより、工程（ｂ）における逆転写反応、及び工程（ｃ）における標的塩基配列の増幅反応の効率を上げることができる。
ｐｏｌｙＡの長さとしては、特に限定されないが、１０〜４０塩基が好ましく、２０〜３０塩基がより好ましい。
【００２７】
次いで、工程（ｂ）において、ｐｏｌｙＴと、該ｐｏｌｙＴの５’側にアダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドともいう。）を用いて、逆転写反応により、前記ｍＲＮＡから該ｍＲＮＡに相補するｃＤＮＡを合成する。
ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドが有するｐｏｌｙＴは、工程（ａ）においてｍＲＮＡに付加されたｐｏｌｙＡにアニールする。ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドは、３’末端に縮重配列を有していてもよく、かかる３’末端を合成起点とした逆転写反応により、前記ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが合成される。逆転写に用いられる逆転写酵素としては、従来公知のものが用いられ、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ由来の逆転写酵素等が挙げられる。
ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドが有するアダプター配列に相補的な塩基配列は、逆転写反応を阻害しないものであれば特に限定されず、生体内の既知の遺伝子に相補しないものが好ましく、ＨＩＶ遺伝子に相補しないものであることがより好ましい。
ｐｏｌｙＴオリゴヌクレオチドの長さは、通常用いられるプライマーの長さと同様、１０〜４０塩基が好ましく、２０〜３０塩基がより好ましい。
尚、工程（ａ）と工程（ｂ）は同時に行われてもよい。
また、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡは、鋳型となったｍＲＮＡとのハイブリッドを形成しているため、ＲＮａｓｅＨ等のＲＮａｓｅを用いて、工程（ｃ）の前に、予めｍＲＮＡを分解しておくことが好ましい。  
【００２８】
次いで、工程（ｃ）において、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドと、前記アダプター配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、アダプター配列認識オリゴヌクレオチドともいう。）を用いて、前記ｃＤＮＡから、ＨＩＶのｃＤＮＡの配列を有する標的塩基配列を増幅する。
本発明において、前記標的塩基配列とは、詳細には、ＴＡＲ配列のｃＤＮＡの一部の塩基配列を有するものをいう。
アダプター配列認識オリゴヌクレオチドの長さは、通常のプライマーと同様、１０〜４０塩基が好ましく、２０〜３０塩基がより好ましい。
標的配列の増幅方法としては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃａｌ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＳＭＡＰ（ＳＭａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）、ＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等、従来公知の方法が挙げられる。
【００２９】
ＤＮＡポリメラーゼとはプライマーがアニールした鋳型ＤＮＡと相補的な塩基配列を持つＤＮＡ鎖を合成する酵素の総称である。
本発明に用いられるＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されないが、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。工程（ｃ）において、後述するリアルタイムＰＣＲを行う場合には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用することが特に好ましい。
【００３０】
標的塩基配列の増幅方法としてＰＣＲを例に挙げると、工程（ｂ）において合成されたｃＤＮＡの３’末端側に、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドがアニールし、伸長反応が行われ、前記ｃＤＮＡの相補鎖（以下、伸長産物Ａという。）が合成される。
次いで、伸長産物Ａの３’末端側に、アダプター配列認識オリゴヌクレオチドがアニールし、伸長反応が行われ、伸長産物Ａの相補鎖（以下、伸長産物Ｂという。）が合成される。
次いで、伸長産物Ｂの３’末端側に、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドがアニールし、伸長反応が行われ、伸長産物Ｂの相補鎖（以下、伸長産物Ｃという。）が合成される。
以後、伸長産物Ｂが合成される工程と、伸長産物Ｃが合成される工程と、を繰り返すことにより、標的塩基配列が増幅される。
尚、ＰＣＲにおける温度等の増幅プログラムの設定については定法により行うことができる。
【００３１】
本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド又はアダプター配列認識オリゴヌクレオチドが、標的塩基配列にアニールする反応条件は、特に限定されるものではなく、各オリゴヌクレオチドのＴｍ値等を考慮した上で、温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の通常の条件下で設定することができる。
【００３２】
本実施形態においては、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドと、アダプター配列認識オリゴヌクレオチドとからなるプライマーセットが用いられる。上述したように、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドは、変異を受けにくい箇所を認識するものである。更に、前記プライマーセットは、ＨＩＶの認識サイトを１箇所のみ有するため、ウイルスＲＮＡの変異による影響を受けにくい。
従って、本実施形態によれば、変異したすべてのウイルスを高精度に検出することができる。
【００３３】
次いで、工程（ｄ）において、前記標的塩基配列の増幅産物を検出する。
工程（ｄ）における代表的な検出方法としては、反応後に標的塩基配列が増幅したか否かを評価するエンドポイントアッセイと、標的塩基配列の増幅を経時的（リアルタイム）に測定するリアルタイムアッセイが挙げられる。
【００３４】
エンドポイントアッセイとしては、標的塩基配列の増幅を電気泳動により評価する方法が挙げられる。この方法は、標的塩基配列の増幅産物及び核酸分子量マーカーに対して、電気泳動を行い、両者の泳動度を対比することにより、所定の分子量を有する標的塩基配列が増幅された否かを評価する方法である。
電気泳動による検出に用いる試薬としては、二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発する臭化エチジウムやサイバーグリーンが好ましい。
【００３５】
リアルタイムアッセイとしては、リアルタイムＰＣＲ装置を用いた評価方法が挙げられる。リアルタイムＰＣＲは、段階希釈した既知量のＤＮＡをスタンダードとして用い、ＰＣＲによるスタンダードＤＮＡ及び標的塩基配列の増幅を経時的に測定し、スタンダードＤＮＡの増幅が指数関数的に起きる分子数の範囲内で、核酸試料中に存在する標的塩基配列の分子数を定量する方法である。
リアルタイムＰＣＲは、ＨＩＶ感染の有無だけではなく、ＨＩＶ感染者又はＨＩＶ患者の血液中のウイルス量を定量することにより、病態の程度や治癒経過を把握することができる点で優れている。
【００３６】
リアルタイムＰＣＲにおける定量方法としては、蛍光色素を用いた方法が挙げられ、具体的には、二本鎖ＤＮＡに特異的にインターカレートして蛍光を発するサイバーグリーン等の色素を用いる方法と、増幅するＤＮＡに特異的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法が挙げられる。標的塩基配列の増幅をより特異的に検出する観点から、後者の方法が好ましく挙げられる。
後者の方法に用いられるプローブは、標的塩基配列の一部にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドの両端を、それぞれ蛍光物質及び消光物質で修飾したものである。かかるプローブにおいては、蛍光物質と消光物質は近接しているため、蛍光物質の有する蛍光シグナルを発する機能が、消光物質によって妨げられている。
前記工程（ｃ）において、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドが標的塩基配列にアニールする条件下で、プローブは標的塩基配列にハイブリダイズする。続いて、伸長反応の過程で、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブは分解される。その結果、プローブに修飾されていた蛍光物質及び消光物質は、相互に空間的に分離され、蛍光物質は蛍光シグナルを発することができる。かかる蛍光シグナルは、増幅された標的塩基配列の分子数に比例する。
【００３７】
蛍光物質としては、ＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）、ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’,５’−ジクロロ２’ ,７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＴＥＴ（テトラクロロフルオレセイン）、ＨＥＸ（５'−ヘキサクロロ−フルオレセイン−ＣＥホスホロアミダイト）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ５６８等が挙げられる。
また、消光物質としては、ＴＡＭＲＡ（テトラメチル−ローダミン）、４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、ＢＨＱ等が挙げられる。
【００３８】
プローブとして用いられるオリゴヌクレオチドの塩基配列としては、ＴＡＲ配列を認識し得るもの、又はＴＡＲ配列に相補する配列にハイブリダイズし得るものであれば特に限定されないが、好ましい塩基配列として配列番号２（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’：２４ｍｅｒ）で表される塩基配列が挙げられる。
かかるプローブを用いることにより、標的塩基配列の増幅をより特異的に検出することができる。
【００３９】
工程（ｄ）におけるその他の検出方法としては、特に限定されるものではなく、蛍光色素等によるオリゴヌクレオチドの標識、高速液体クロマトグラフィー、マススペクトル、融解曲線分析、増殖曲線分析等が挙げられる。
【００４０】
蛍光色素等によるオリゴヌクレオチドの標識としては、例えば、ＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチド、又はアダプター配列認識オリゴヌクレオチドを、標識物質により標識しておく方法が挙げられる。かかる方法により、標識物質を指標として標的塩基配列の増幅を検出することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光色素、エネルギー吸収性物質、ラジオアイソトープ、化学発光体、酵素、抗体等が挙げられる。かかる標識物質を用いて、オリゴヌクレオチドを標識する位置については、特に限定するものではないが、伸長反応を阻害しないような位置が好ましい。
【００４１】
本実施形態のＨＩＶ検出方法は、核酸試料中のＨＩＶ由来ｍＲＮＡの３’末端にｐｏｌｙＡを付加する工程（ａ）を有しているが、ＨＩＶのＲＮＡ全長を検出対象とする場合には、既にその３’末端にｐｏｌｙＡが付加されているため、工程（ａ）を有しなくともよい。
また、ＨＩＶのＲＮＡ全長を検出対象とする場合には、工程（ｃ）において、アダプター配列認識オリゴヌクレオチドに代えて、ＨＩＶ由来の塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、またはＨＩＶ由来の塩基配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを用いてもよい。
かかる場合、増幅効率の観点から、本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドはウイルスゲノムの３’末端に位置するＴＡＲ配列を認識することが好ましい。
【００４２】
［ＨＩＶ検出キット］
本発明のＨＩＶ検出キットは、上述した本発明のＨＩＶ検出用オリゴヌクレオチドを含む。更に、本発明のＨＩＶ検出キットは、核酸試料前処理用の細胞破壊試薬や、上述した本発明のＨＩＶ検出方法の各工程において説明された試薬を含んでいてもよい。
このように、本発明のＨＩＶ検出方法に必要な試薬等をキット化することにより、より簡便にかつ短時間でＨＩＶの検出をすることができる。
【００４３】
以上、本発明において、ＨＩＶのウイルスＲＮＡ中に、逆転写の際に変異を受けにくい配列が存在することが見出された。かかる配列をＨＩＶ診断に用いることにより、ＨＩＶ感染細胞において、ＨＩＶに変異が生じたとしても、ＨＩＶを高精度に検出することができる。
また、本発明において、潜伏感染期間のＨＩＶ感染細胞において特定のＲＮＡが転写されていることが見出され、ＨＩＶが発現する初期転写産物の検出方法が確立された。これにより、ＨＩＶ検出期日を短縮し、高感度の検出を可能なものとし、ＨＩＶ感染の早期診断に貢献することができる。更に、早期診断により、エイズ発症に対する病態発症時期及び治療開始時期を遅らせることができる。
本発明において抗ウイルス薬投与下のエイズ治療中の患者体内からのウイルスの再活性化を早期に判断することが可能となる。
また、本発明のＨＩＶ検出方法の原理を、他の潜伏感染することが知られているウイルス等の検出に応用することが可能である。
【実施例】
【００４４】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４５】
［実験例１］
（短鎖ＲＮＡの検出）
ＨＩＶ感染細胞において産生される短鎖ＲＮＡの検出系を、定量ＰＣＲを用いて構築した（図５）。定量ＰＣＲ試薬として、ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘｔａｑ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いた。
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号３（５’−ＧＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧ−３’ ：２１ｍｅｒ）で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＰｒｉｍｅｒとしてｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに添付のアダプター配列認識オリゴヌクレオチドを用いた。Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅとして配列番号２（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’：２４ｍｅｒ）で示されるオリゴヌクレオチドの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＴＡＭＲＡを修飾したものを用いた。これらのオリゴヌクレオチドの合成をオリゴハウス社に受託した。
上記定量ＰＣＲ試薬と、上記オリゴヌクレオチドと、１ウェル当たり７５ｎｇのｃＤＮＡと、の混合溶液１０μｌを、９６プレートの各ウェルに分注した。
定量ＰＣＲ装置として、ＡＢＩ７３００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用し、９５℃３０秒の反応後、９５℃５秒、６０℃３４秒の２ステップ反応を４０サイクル行った。
スタンダードＤＮＡとして、ＧＡＰＤＨを用い、定量ＰＣＲを行い、標準曲線を作製した。【００４６】
〈実施例１〉
Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、第８３巻、第１１５６９〜１１５８０頁、２００９年に記載された方法に従って、ＨＩＶ−１のＲＮＡの転写開始点から、位置６１のウラシルで転写が止まった転写産物を発現するベクターをＪ  Ｖｉｒｏｌ．、第７２巻、第１６６６〜１６７０頁、１９９８年に公表されている、ＨＩＶ−１の潜伏感染細胞のモデル細胞、Ｕ１細胞株に導入し、安定株Ｕ１−ｍＵ６−ＴＡＲを作製した。ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いて、この細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて、Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ中の短鎖ＲＮＡから、ｃＤＮＡを合成した。
このｃＤＮＡを用いて、定量ＰＣＲを行い、安定株Ｕ１−ｍＵ６−ＴＡＲ中の標的塩基配列のコピー数を定量した。【００４７】
〈実施例２〉
Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．、第７２巻、第１６６６〜１６７０頁、１９９８年に公表されている潜伏感染細胞のモデル細胞として、野生型のＨＩＶ−１を有するＵ１細胞株から、実施例１と同様の方法にてｃＤＮＡを合成し、Ｕ１細胞株中の標的塩基配列のコピー数を定量した。【００４８】
〈比較例１〉
ｃＤＮＡの溶解液に代えて、滅菌水を用いた以外は、実施例１と同様の方法で定量ＰＣＲを行った。【００４９】
実施例１〜２、及び比較例１における、定量ＰＣＲ装置を用いた測定結果を図１に示す。図１に示されるように、実施例１〜２における反応は、サイクル数の増加とともにシグナルが増強していることが確認された。一方、反応系中にｃＤＮＡを有しない比較例１においては、サイクル数を増加してもシグナルの増強が確認されなかった。
標準曲線を用いた算出結果から、実施例１で用いられた安定株Ｕ１−ｍＵ６−ＴＡＲでは、実施例２で用いられた潜伏感染細胞株Ｕ１と比較し、およそ８倍のコピー数のｓｈｏｒｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔが確認された。
以上、実施例１及び２の結果から、本発明によれば、感染細胞中に産生される短鎖ＲＮＡを定量できることが確認された。このことから、感染初期のＨＩＶを早期に発見できることが分かった。【００５０】
［実験例２］
（短鎖ＲＮＡの同定）
実施例２のＰＣＲ産物を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ ＧＡＩＩｘ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）によるＤｅｅｐ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析を行い、約６０塩基の短鎖ＲＮＡの塩基配列を解析した。結果を図２に示す。
図２に示されるように、この約６０塩基の短鎖ＲＮＡは、ＨＩＶ−１のＲＮＡの転写開始点から、位置５０から７０塩基で転写が止まった転写産物であることが明らかになった。また、この約６０塩基の短鎖ＲＮＡは、ＨＩＶ−１のＲＮＡの転写開始点から、位置５０から７１塩基で転写が止まった転写産物であることも明らかになった。【００５１】
［実験例３］
（短鎖ＲＮＡのコピー数の定量）
スタンダードＲＮＡとして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成した配列番号４（５’−ＧＧＴＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＡＡＣＣＣ−３’：５８ｍｅｒ）を用い、実施例１と同様の方法にてｃＤＮＡを１０８コピー〜１０コピーまで１０倍希釈の希釈系列を作製し、以下の通りに定量ＰＣＲを行い、検量線を作製した。
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒとして配列番号５（５’−ＣＴＧＧＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣ−３’：２２ｍｅｒ）で示されるオリゴヌクレオチドを用い、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ＰｒｉｍｅｒとしてｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔに添付のアダプター配列認識オリゴヌクレオチドを用いた。Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅとして配列番号２（５’−ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧ−３’：２４ｍｅｒ）で示されるオリゴヌクレオチドの５’末端にＦＡＭを、３’末端にＢＨＱ−１を修飾したものを用いた。これらのオリゴヌクレオチドの合成をオリゴハウス社に受託した。
上記定量ＰＣＲ試薬と、上記オリゴヌクレオチドと、１ウェル当り７５ｎｇのｃＤＮＡと、の混合溶液２０μｌを、９６プレートの各ウェルに分注した。
定量ＰＣＲ装置として、ＣＦＸ−９６（ＢＩＯ  ＲＡＤ社製）を使用し、９５℃３０秒の反応後、９５℃５秒、６０℃１０秒の２ステップ反応を５０サイクル行った。
定量ＰＣＲの結果を図３、検量線を図４に示す。１０８コピー〜１００コピーのＲＮＡから定量性をもってシグナルを検出することができる。
以上の結果から、本発明によれば、高精度かつ高感度に、ＨＩＶを早期検出することができることが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明によれば、ＨＩＶ感染細胞において、ＨＩＶに変異が生じたとしても、かかるウイルスを高精度に検出することができ、また、潜伏感染期間であっても、ＨＩＶを早期かつ高感度に検出することができるので、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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