(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する工程と、ｂ）４５℃〜９０℃で１０分間と１８０分の間、混合物を撹拌する工程と、ｃ）油相とガム相を分離する工程とを含む、食用油を水脱ガムする方法であって、ここで、使用される前記脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアッセイ：
ａ）５０ｍｇのコレステロールおよび４５０ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、４０℃で蒸発させる；３００ｍｇのＰＣ：コレステロール  ９：１を、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に４０℃で分散させて、基質を形成する；
ｂ）２５０μｌの基質を、４０℃で、蓋を有するガラス中に加え、２５μｌの酵素溶液を加え、４０℃で１０分間、撹拌しながらインキュベートする；
ｃ）１０分後、５ｍｌのヘキサン：イソプロパノール  ３：２を加える；
ｄ）コレステロールエステルの量を、キャリブレーションのためにステアリン酸コレステリル標準を用いるＨＰＴＬＣによって分析する；
ｅ）トランスフェラーゼ活性を、１分当たりのコレステロールエステル形成の量として計算する；
を用いて決定した場合に少なくとも２５ＴｒＵ／ｍｇの酵素タンパク質という酵素１ｍｇあたりのトランスフェラーゼ活性（ＴｒＵ）を有する、方法。
【請求項２】
ｄ）最低２時間と最高７日間の間、活性脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を含む前記ガム相をインキュベートする工程と、ｅ）前記ガム相から前記油を分離する工程とをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ガム相を処理し、そして前記ガム相から油を分離する方法であって、前記ガム相を処理することにおいて、前記ガム相を、最低２時間と最高７日間の間、単独の、または１つもしくは複数のホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素とインキュベートし、ここで、使用される前記脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアッセイ：
ａ）５０ｍｇのコレステロールおよび４５０ｍｇのダイズホスファチジルコリン（ＰＣ）をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、４０℃で蒸発させる；３００ｍｇのＰＣ：コレステロール  ９：１を、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に４０℃で分散させて、基質を形成する；
ｂ）２５０μｌの基質を、４０℃で、蓋を有するガラス中に加え、２５μｌの酵素溶液を加え、４０℃で１０分間、撹拌しながらインキュベートする；
ｃ）１０分後、５ｍｌのヘキサン：イソプロパノール  ３：２を加える；
ｄ）コレステロールエステルの量を、キャリブレーションのためにステアリン酸コレステリル標準を用いるＨＰＴＬＣによって分析する；
ｅ）トランスフェラーゼ活性を、１分当たりのコレステロールエステル形成の量として計算する；
を用いて決定した場合に少なくとも２５ＴｒＵ／ｍｇ酵素タンパク質という酵素１ｍｇあたりのトランスフェラーゼ活性（ＴｒＵ）を有する、方法。
【請求項４】
前記方法のｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０の間である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記脂質アシルトランスフェラーゼがＧＤＳｘモチーフおよび／またはＧＡＮＤＹモチーフを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である）を含む酵素として特徴付けられる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属の１つまたは複数由来の生物から獲得可能であり得る、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法：アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、デスルフォトマクルム属（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）。
【請求項８】
脂質アシルトランスフェラーゼが前記アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属）由来の生物から獲得可能である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号４９、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、以下：
ａ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列、またはそれと９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されたポリペプチド配列または配列番号６８に示されたポリペプチド配列と少なくとも９０％同一である、核酸；または
ｃ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列を含む核酸プローブとストリンジェントな条件（６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａクエン酸、ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズする核酸
の発現によって獲得されるポリペプチドである、方法。
【請求項１１】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）における前記ヌクレオチド配列の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号３８として示されるアミノ酸配列、またはそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８として示されるアミノ酸配列、またはそれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
追加として、ホスホリパーゼＣが、前記油および／または水および／または脂質アシルトランスフェラーゼと混合される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
水脱ガムプロセスの完了後の油相において油の収率を増加させるための食用油の水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、ここで、０．１〜４％ｗ／ｗの水が前記食用油と混合され；前記脂質アシルトランスフェラーゼが４５℃〜９０℃の範囲の温度で食用油に加えられ；そして前記脂質アシルトランスフェラーゼが、１０分間〜１８０分間、前記食用油と反応し、ここで、使用される前記脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアッセイ：
ａ）５０ｍｇのコレステロールおよび４５０ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、４０℃で蒸発させる；３００ｍｇのＰＣ：コレステロール  ９：１を、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に４０℃で分散させて、基質を形成する；
ｂ）２５０μｌの基質を、４０℃で、蓋を有するガラス中に加え、２５μｌの酵素溶液を加え、４０℃で１０分間、撹拌しながらインキュベートする；
ｃ）１０分後、５ｍｌのヘキサン：イソプロパノール  ３：２を加える；
ｄ）コレステロールエステルの量を、キャリブレーションのためにステアリン酸コレステリル標準を用いるＨＰＴＬＣによって分析する；
ｅ）トランスフェラーゼ活性を、１分当たりのコレステロールエステル形成の量として計算する；
を用いて決定した場合に少なくとも２５ＴｒＵ／ｍｇの酵素タンパク質という酵素１ｍｇあたりのトランスフェラーゼ活性（ＴｒＵ）を有する、使用。
【請求項１６】
水脱ガムプロセスの完了後のガム相の粘性を減少させるための食用油の水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、ここで、０．１〜４％ｗ／ｗの水が前記食用油と混合され；前記脂質アシルトランスフェラーゼが４５℃〜９０℃の範囲の温度で食用油に加えられ；そして前記脂質アシルトランスフェラーゼが、１０分間〜１８０分間、前記食用油と反応し、ここで、使用される前記脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアッセイ：
ａ）５０ｍｇのコレステロールおよび４５０ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、４０℃で蒸発させる；３００ｍｇのＰＣ：コレステロール  ９：１を、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に４０℃で分散させて、基質を形成する；
ｂ）２５０μｌの基質を、４０℃で、蓋を有するガラス中に加え、２５μｌの酵素溶液を加え、４０℃で１０分間、撹拌しながらインキュベートする；
ｃ）１０分後、５ｍｌのヘキサン：イソプロパノール  ３：２を加える；
ｄ）コレステロールエステルの量を、キャリブレーションのためにステアリン酸コレステリル標準を用いるＨＰＴＬＣによって分析する；
ｅ）トランスフェラーゼ活性を、１分当たりのコレステロールエステル形成の量として計算する；
を用いて決定した場合に少なくとも２５ＴｒＵ／ｍｇの酵素タンパク質という酵素１ｍｇあたりのトランスフェラーゼ活性（ＴｒＵ）を有する、使用。
【請求項１７】
水脱ガムプロセスの完了後の油相において油の収率を増加させるため、および／もしくはトリグリセリドレベルを増加させるため、ならびに／または水脱ガムプロセスの完了後の油相においてジグリセリドレベルを低下させるための、食用油の水脱ガムにおけるホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、ここで、０．１〜４％ｗ／ｗの水が前記食用油と混合され；前記脂質アシルトランスフェラーゼが４５℃〜９０℃の範囲の温度で食用油に加えられ；そして前記脂質アシルトランスフェラーゼが、１０分間〜１８０分間、前記食用油と反応し、ここで、使用される前記脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアッセイ：
ａ）５０ｍｇのコレステロールおよび４５０ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、４０℃で蒸発させる；３００ｍｇのＰＣ：コレステロール  ９：１を、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に４０℃で分散させて、基質を形成する；
ｂ）２５０μｌの基質を、４０℃で、蓋を有するガラス中に加え、２５μｌの酵素溶液を加え、４０℃で１０分間、撹拌しながらインキュベートする；
ｃ）１０分後、５ｍｌのヘキサン：イソプロパノール  ３：２を加える；
ｄ）コレステロールエステルの量を、キャリブレーションのためにステアリン酸コレステリル標準を用いるＨＰＴＬＣによって分析する；
ｅ）トランスフェラーゼ活性を、１分当たりのコレステロールエステル形成の量として計算する；
を用いて決定した場合に少なくとも２５ＴｒＵ／ｍｇの酵素タンパク質という酵素１ｍｇあたりのトランスフェラーゼ活性（ＴｒＵ）を有する、使用。
【請求項１８】
未処理のガムと比較して、油の収率を増加させ、および／または向上したリンレベルを有する（酸性油の分離後の）固相を生じるための、食用油の脱ガムから獲得可能であるガム相のインキュベーションにおける（単独の、またはホスホリパーゼＣと組み合わせた）脂質アシルトランスフェラーゼの使用であって、ここで、０．１〜４％ｗ／ｗの水が前記食用油と混合され；前記脂質アシルトランスフェラーゼが４５℃〜９０℃の範囲の温度で食用油に加えられ；そして前記脂質アシルトランスフェラーゼが、１０分間〜１８０分間、前記食用油と反応し、ここで、使用される前記脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアッセイ：
ａ）５０ｍｇのコレステロールおよび４５０ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、４０℃で蒸発させる；３００ｍｇのＰＣ：コレステロール  ９：１を、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に４０℃で分散させて、基質を形成する；
ｂ）２５０μｌの基質を、４０℃で、蓋を有するガラス中に加え、２５μｌの酵素溶液を加え、４０℃で１０分間、撹拌しながらインキュベートする；
ｃ）１０分後、５ｍｌのヘキサン：イソプロパノール  ３：２を加える；
ｄ）コレステロールエステルの量を、キャリブレーションのためにステアリン酸コレステリル標準を用いるＨＰＴＬＣによって分析する；
ｅ）トランスフェラーゼ活性を、１分当たりのコレステロールエステル形成の量として計算する；
を用いて決定した場合に少なくとも２５ＴｒＵ／ｍｇの酵素タンパク質という酵素１ｍｇあたりのトランスフェラーゼ活性（ＴｒＵ）を有する、使用。
【請求項１９】
前記脱ガムのプロセスのｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ１０．０の間である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
前記脂質アシルトランスフェラーゼがＧＤＳｘモチーフおよび／またはＧＡＮＤＹモチーフを含む、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である）を含む酵素として特徴付けられる、請求項１５から２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属の１つまたは複数由来の生物から獲得可能である、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の使用：アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、デスルフォトマクルム属（Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ科（Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ）、キシレラ属（Ｘｙｌｅｌｌａ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）。
【請求項２３】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが前記アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属由来の生物から獲得可能である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号４９、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、
ａ．配列番号４９として示されるヌクレオチド配列、もしくはそれと９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ．ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されるポリペプチド配列もしくは配列番号６８に示されるポリペプチド配列と少なくとも９０％同一である、核酸；または
ｃ．配列番号４９として示されるヌクレオチド配列を含む核酸プローブとストリンジェントな条件（６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａクエン酸、ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズする核酸
の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、バチルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）におけるヌクレオチド配列の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号３８として示されるアミノ酸配列、またはそれらと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含むポリペプチドである、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８として示されるアミノ酸配列、またはそれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる、請求項１５から２８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記食用油が粗製食用油である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ガム相が、脱ガムから獲得可能であるかまたは獲得される、請求項３に記載の方法。
【請求項３２】
前記ガム相が、水脱ガムもしくは酵素的脱ガムまたはそれらの組合せから獲得可能であるかまたは獲得される、請求項３または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ガム相が、水脱ガムもしくは酵素的脱ガムまたはそれらの組合せから獲得可能であるかまたは獲得される、請求項１８に記載の使用。
【請求項３４】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号４９、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から９のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、以下：
ａ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列、またはそれと９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されたポリペプチド配列または配列番号６８に示されたポリペプチド配列と少なくとも９５％同一である、核酸；または
ｃ）配列番号４９として示された前記ヌクレオチド配列を含む核酸プローブとストリンジェントな条件（６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａクエン酸、ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズする核酸
の発現によって獲得されるポリペプチドである、方法。
【請求項３６】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号３８として示されるアミノ酸配列、またはそれらと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８として示されるアミノ酸配列、またはそれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号４９、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、
ａ．配列番号４９として示されるヌクレオチド配列、もしくはそれと９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ．ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されるポリペプチド配列もしくは配列番号６８に示されるポリペプチド配列と少なくとも９５％同一である、核酸；または
ｃ．配列番号４９として示されるヌクレオチド配列を含む核酸プローブとストリンジェントな条件（６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａクエン酸、ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズする核酸
の発現によって獲得されるポリペプチドである、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３５、もしくは配列番号３８として示されるアミノ酸配列、またはそれらと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含むポリペプチドである、請求項１５から２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４１】
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８として示されるアミノ酸配列、またはそれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項１５から２７のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願への参照）
以下の関連する出願を参照する：ＵＳ２００２−０００９５１８、ＵＳ２００４−００９１５７４、国際公開第２００４／０６４５３７号、国際公開第２００４／０６４９８７号、国際公開第２００５／０６６３４７号、国際公開第２００５／０６６３５１号、２００６年２月２日に出願された米国特許出願第６０／７６４，４３０号、国際公開第２００６／００８５０８号、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００７／０００５５８号および米国特許出願第１１／６７１，９５３号。これらの出願の各々およびこれらの出願の各々において引用された文献の各々（「出願引用文献」）、ならびに該出願引用文献において参照または引用された各文献は、これらの出願の文中または実行の間のいずれかにおける、ならびにそのような実行の間に進んだ特許性のサポートにおける議論は、参考により本明細書中に援用される。種々の文献がまた、本文中で引用される（「明細書引用文献」）。明細書引用文献のそれぞれ、および明細書引用文献中で引用または参照された各文献は、参考により本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、脂質アシルトランスフェラーゼを用いる食用油（好ましくは、植物油）精製プロセスに関する。本発明はさらに、脂質アシルトランスフェラーゼを用いる、食用油（好ましくは、粗製食用油）（例えば、植物油）および／または食用油（好ましくは、植物油）のガム相を処理するプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
脂質アシルトランスフェラーゼは、食品用途において有利であることは公知である。脂質アシルトランスフェラーゼは、食材中にかなりのアシルトランスフェラーゼ活性を有することが見出されている。この活性は、食材を調製する方法において驚くべき有益な適用をもつ。
【０００４】
例えば、特許文献１は、脂質アシルトランスフェラーゼの使用による乳化剤のインサイチュー生成のための方法およびそれに関連する利点を開示する。
【０００５】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２００１／０００５５８号は、（異種性）宿主細胞における脂質アシルトランスフェラーゼの発現を教示し、参照により本明細書に組み入れられている。
【０００６】
食用油精製の目的は、質（例えば、味、香り、および外観）および貯蔵性に影響する望ましくない不純物を除去することである。
【０００７】
遊離脂肪酸、金属イオン、有色化合物、臭気、ガムなど、幅広い種類のこれらの不純物のために、一連の化学的および物理的プロセスが、通常、精製のために用いられる（例えば、非特許文献１参照）。
【０００８】
伝統的には、物理的脱ガムプロセスおよび化学的脱ガムプロセスである２つのプロセスが、油の脱ガムのために用いられている。
【０００９】
いわゆる化学的精製において、ほとんど全ての遊離脂肪酸含有量が、大過剰量のＮａＯＨでの最初の処理によって除去される。また、リン脂質含有量は、典型的には１０ｐｐｍ未満のリンレベルまで減少する。油は続いて、脱色および脱臭される。
【００１０】
いわゆる物理的精製は、一般的に、水脱ガム段階、続いて、酸脱ガム、中和、脱色、遊離脂肪酸を除去するための水蒸気蒸留、および脱臭からなる。
【００１１】
物理的精製中に酸脱ガムを用いる代わりに、酵素的脱ガムを用いるように発展した。
【００１２】
酵素的脱ガムプロセスは、膵臓ホスホリパーゼの使用に基づいて開発された。この酵素はユダヤ教の掟にかなっていなかったため、ホスホリパーゼは、結局、微生物のホスホリパーゼＡ１（Ｌｅｃｉｔａｓｅ  ＵｌｔｒａＴＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）（非特許文献２）によって置き換えられた。
【００１３】
酵素的プロセスは、費用節約、より高い収率、およびより環境に優しいプロセスを含む、化学的または物理的脱ガムプロセスに対していくつかの優位性を有する。
【００１４】
酵素的油脱ガムプロセスは、既に水脱ガムされた油へのホスホリパーゼの添加に基づいた。
【００１５】
特許文献２において、食用油の酵素的脱ガム用に、脂質アシルトランスフェラーゼが教示された。特許文献２は、水脱ガムされた油への脂質アシルトランスフェラーゼの添加、または油が水脱ガムプロセスを受ける必要のない、粗製油への脂質アシルトランスフェラーゼの添加を教示する。
【００１６】
「水脱ガムされた油」は、典型的には、１〜２％ｗ／ｗの熱い軟水を温かい（７０〜９０℃）粗製油と混合することを含む通常の「水脱ガムプロセス」によって獲得することができる（ＡＯＣＳ脂肪および油の処理入門（ＡＯＣＳ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  Ｆａｔｓ  ａｎｄ  Ｏｉｌｓ）、表８、脱ガムプロセス（Ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｏｃｓ．ｏｒｇ／ｍｅｅｔｉｎｇｓ／ｅｄｕｃａｔｉｏｎ／ｍｏｄ３ｓａｍｐｌｅ．ｐｄｆ）。粗製油に加えられる水の量が、典型的には、粗製油中のリン脂質の量とほぼ等しいことは経験則である。通常の処理時間は、３０〜６０分間である。水脱ガム段階は、水和した場合、油中で不溶性になるホスファチドおよび粘着性ガムを除去する。水和ホスファチドおよび水和ガムは、沈殿、濾過、または遠心分離によって油から分離することができ、遠心分離の実施がより普及している。前記の水脱ガムプロセスにおける本質的な目的は、水和ホスファチドを油から分離することである。上記の熱水の油への混合は、当技術分野における標準的な水脱ガム手順に従う水溶液の油への混合として、本明細書では広く理解されるべきである。
【００１７】
通常の水脱ガムプロセスにおいて、ホスファチドの主要部分は、重いガム相において除去される。水脱ガムプロセスの終わりに、油相はガム相から分離される。ガム相はさらに商品へと加工することができるが、それは、本質的に油精製の副産物としてみなされる。商業的に重要であるのは、油相である。しかしながら、ホスファチドは、良い乳化剤であり得るため、水脱ガム中のガム相において、いくらかの油が必然的に失われる。これは、水脱ガム後の油相における油の収率の低下をもたらす。
【００１８】
油価格の高騰およびバイオディーゼルのための植物油の必要性の増大で、高い油収率のために食用油の処理を最適化することが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２００４／０６４５３７号
【特許文献２】国際公開第２００６／００８５０８号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｂａｉｌｅｙ’ｓ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｏｉｌ  ａｎｄ  Ｆａｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、２００６年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、第６版
【非特許文献２】Ｏｉｌ  Ｍｉｌｌ  Ｇａｚｅｔｔｅｅｒ、１１１巻、２００５年７月、２〜４頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の態様は、特許請求の範囲および以下の解説に提示されている。
【００２２】
驚くべきことに、水脱ガムプロセスを実行する間または前に、１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼを粗製食用油に加えることによって、油相中の油の収率を有意に増加させ得ることが見出された。換言すれば、油のガム相への損失を有意に低下させることができる。
【００２３】
加えて、驚くべきことに、水脱ガムプロセスを実行する間または前に、１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼを粗製食用油に加えることによって、得られたガム相がはるかに粘性が低いことが見出された。これは、より有利な遠心分離パラメーターを可能にすることができる。
【００２４】
驚くべきことに、水脱ガムプロセスを実行する間または前に、１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼを粗製食用油に加えることによって、このプロセスから得られたガム相は、インキュベートまたは貯蔵することができ、ガム相中のリン脂質の（残存する活性脂質アシルトランスフェラーゼによる）さらなる加水分解を観察し得ることもまた見出された。その後、本発明者らは、ガム相において遊離脂肪酸（酸性油）および残存するトリグリセリドを含む油性相を単離することが可能であることを見出している。この酸性油は、食事に加えられる通常のガム相より高い価格で販売することができる。加えて、驚くべきことに、（酸性油の分離後の）残っている固相は、通常のガムよりリンレベルが高く、したがって、有機リンの供給源として用いることができることを見出している。
【００２５】
驚くべきことに、１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼおよび１つまたは複数のホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の酵素の組合せが、食用油（例えば、植物油）の脱ガムに用いられた場合、相乗効果を生じることもまた見出している。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する工程と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間と１８０分の間、前記混合物を撹拌する工程と、ｃ）油相とガム相を分離する工程とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムする方法。
（項目２）
ｄ）最低約２時間と最高７日間の間、活性脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を含む前記ガム相をインキュベートする工程と、ｅ）前記ガム相から前記油を分離する工程とをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
（好ましくは、食用油の脱ガム、例えば、水脱ガムもしくは酵素的脱ガムまたはそれらの組合せから獲得可能である、または獲得された）ガム相を処理し（前記ガム相を、最低約２時間と最高７日間の間、単独の、または１つもしくは複数のホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素とインキュベートする）、前記ガム相から前記油を分離する方法。
（項目４）
プロセスのｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ１０．０の間である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記脂質アシルトランスフェラーゼがＧＤＳｘモチーフおよび／またはＧＡＮＤＹモチーフを含む、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である）を含む酵素として特徴付けられる、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属の１つまたは複数由来の生物から獲得可能であり得、好ましくは獲得され得る、項目１から６のいずれか一項に記載の方法：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＣａｎｄｉｄａ。
（項目８）
脂質アシルトランスフェラーゼが前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号４９、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
項目１から３９のいずれか一項に記載の方法であって、ここで前記脂質アシルトランスフェラーゼが、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドであって、以下：
ａ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列、またはそれと７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ）前記ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されたポリペプチド配列または配列番号６８に示されたポリペプチド配列と少なくとも７０％同一である、核酸；
ｃ）または配列番号４９として示された前記ヌクレオチド配列を含む核酸プローブと中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸
の発現によって獲得されるポリペプチドである、方法。
（項目１１）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおけるヌクレオチド配列の発現によって獲得されるポリペプチドである、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３５として示されるアミノ酸配列、またはそれらと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８として示される前記アミノ酸配列、またはそれと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドである、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
追加として、ホスホリパーゼＣが、油および／または水および／または脂質アシルトランスフェラーゼと混合される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
水脱ガムプロセスの完了後の油相において油の収率を増加させるための食用油の水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
（項目１６）
水脱ガムプロセスの完了後のガム相の粘性を減少させるための食用油の水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
（項目１７）
水脱ガムプロセスの完了後の油相において油の収率を増加させるため、および／もしくはトリグリセリドレベルを増加させるため、ならびに／または水脱ガムプロセスの完了後の油相においてジグリセリドレベルを低下させるための食用油の水脱ガムにおけるホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
（項目１８）
未処理のガムと比較して、油の収率を増加させ、および／または向上したリンレベルを有する（酸性油の分離後の）固相を生じるための（食用油の脱ガム、例えば、水脱ガム、酵素的脱ガム、またはそれらの組合せから獲得可能であるか、または獲得された）ガム相のインキュベーションにおける（単独の、またはホスホリパーゼＣと組み合わせた）脂質アシルトランスフェラーゼの使用。
（項目１９）
０．１〜４％ｗ／ｗの水が前記食用油と混合される、項目１５から１８のいずれか一項に記載の使用。
（項目２０）
酵素が、約４５℃〜約９０℃の範囲の温度で食用油に加えられる、項目１５から１９のいずれか一項に記載の使用。
（項目２１）
脱ガムプロセスのｐＨが約ｐＨ５．０〜約ｐＨ１０．０の間である、項目１５から２０のいずれか一項に記載の使用。
（項目２２）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、約１０分間〜１８０分間、前記食用油と反応する、項目１５から２１のいずれか一項に記載の使用。
（項目２３）
前記脂質アシルトランスフェラーゼがＧＤＳｘモチーフおよび／またはＧＡＮＤＹモチーフを含む、項目１５から２２のいずれか一項に記載の使用。
（項目２４）
前記脂質アシルトランスフェラーゼ酵素が、アシルトランスフェラーゼ活性を有し、かつアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である）を含む酵素として特徴付けられる、項目１５から２３のいずれか一項に記載の使用。
（項目２５）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、以下の属の１つまたは複数由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、項目１５から２４のいずれか一項に記載の使用：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＣａｎｄｉｄａ。
（項目２６）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが前記Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の生物から獲得可能であり、好ましくは獲得される、項目２５に記載の使用。
（項目２７）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号４９、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示されるヌクレオチド配列、またはそれらと７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列のいずれか一つの発現によって獲得される、項目１５から２６のいずれか一項に記載の使用。
（項目２８）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、
ａ．配列番号４９として示されるヌクレオチド配列、もしくはそれと７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列；
ｂ．ポリペプチドをコードする核酸であって、前記ポリペプチドが、配列番号１６に示されるポリペプチド配列もしくは配列番号６８に示されるポリペプチド配列と少なくとも７０％同一である、核酸；または
ｃ．配列番号４９として示されるヌクレオチド配列を含む核酸プローブと中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸
の発現によって獲得されるポリペプチドである、項目１５から２７のいずれか一項に記載の使用。
（項目２９）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおけるヌクレオチド配列の発現によって獲得されるポリペプチドである、項目２８に記載の使用。
（項目３０）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８、配列番号１６、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、配列番号３５として示されるアミノ酸配列、またはそれらと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列のいずれか一つを含むポリペプチドである、項目１５から２９のいずれか一項に記載の使用。
（項目３１）
前記脂質アシルトランスフェラーゼが、配列番号６８として示されるアミノ酸配列、またはそれと７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである、項目１５から３０のいずれか一項に記載の使用。
（項目３２）
前記脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる、項目１５から３１のいずれか一項に記載の使用。
（項目３３）
実施例および図を参照して本明細書で一般的に定義された方法。
（項目３４）
実施例および図を参照して本明細書で一般的に定義された使用。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Ａｓｎ８０Ａｓｐの変異（特に、アミノ酸８０は成熟配列中にある）を有する変異体Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。
【図２】Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ＃７９６５）由来の脂質アシルトランスフェラーゼアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図３】データベースバージョン６からのｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号２）を示す図である。
【図４】生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から獲得したアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図５】生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（ＡＡＧ０９８４０４；ＧＩ：９９６４０１７）から獲得したアミノ酸配列（配列番号４）を示す図である。
【図６】生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＰ＿６３１５５８）から獲得したアミノ酸配列（配列番号５）を示す図である。
【図７】生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＣＡＣ４２１４０）から獲得したアミノ酸配列（配列番号６）を示す図である。
【図８】生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｐ４１７３４）から獲得したアミノ酸配列（配列番号７）を示す図である。
【図９】生物Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号：ＡＬ６４６０５２）から獲得したアミノ酸配列（配列番号８）を示す図である。
【図１０】配列番号９を示す図である。仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］を保存するＳｃｏｅ１  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ３９７０７．１  ＧＩ：４５３９１７８。
【図１１】配列番号１０として表されるアミノ酸を示す図である。仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］を保存するＳｃｏｅ２  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＣ０１４７７．１  ＧＩ：９７１６１３９。
【図１２】アミノ酸配列（配列番号１１）Ｓｃｏｅ３  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ８８８３３．１  ＧＩ：７６３５９９６  推定上の分泌タンパク質を示す図である。［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］
【図１３】アミノ酸配列（配列番号１２）Ｓｃｏｅ４  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ８９４５０．１  ＧＩ：７６７２２６１  推定上の分泌タンパク質を示す図である。［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］
【図１４】アミノ酸配列（配列番号１３）Ｓｃｏｅ５  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ６２７２４．１  ＧＩ：６５６２７９３  推定上のリポタンパク質を示す図である。［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］
【図１５】アミノ酸配列（配列番号１４）Ｓｒｉｍ１  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＡＡＫ８４０２８．１  ＧＩ：１５０８２０８８。ＧＤＳＬ−リパーゼを示す図である。［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ］
【図１６】Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ亜種Ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１５）を示す図である。
【図１７】配列番号１９を示す図である。仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］を保存するＳｃｏｅ１  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ３９７０７．１  ＧＩ：４５３９１７８。
【図１８】Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ遺伝子の変異誘発のために使用される融合構築物のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す図である。下線付きのアミノ酸はキシラナーゼシグナルペプチドである。
【図１９】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２６）を示す図である。
【図２０】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２７）を示す図である。
【図２１】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド配列（配列番号２８）を示す図である。
【図２２】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素ＧＤＳｘ  ３００アミノ酸のポリペプチド（配列番号２９）を示す図である。
【図２３】Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素ＧＤＳｘ  ２８４アミノ酸のポリペプチド（配列番号３０）を示す図である。
【図２４】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素ＧＤＳｘ  ２６９ａａのポリペプチド（配列番号３１）を示す図である。
【図２５】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素＼ＧＤＳｘ  ２６９アミノ酸のポリペプチド（配列番号３２）を示す図である。
【図２６】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のポリペプチド（配列番号３３）を示す図である。
【図２７】生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（Ｐ１０４８０；ＧＩ：１２１０５１）から獲得したアミノ酸配列（配列番号３４）を示す図である（特に、これは成熟配列である）。
【図２８】変異体Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号３５）を示す図である（特に、これは成熟配列である）。
【図２９】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｉ由来のヌクレオチド配列（配列番号３６）を示す図である。
【図３０】Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｉ由来のアミノ酸配列（配列番号３７）を示す図である。
【図３１】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ／ＧＤＳｘ  ５４８アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号３８）を示す図である。
【図３２】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ由来のヌクレオチド配列（配列番号３９）を示す図である。
【図３３】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ／ＧＤＳｘ由来のアミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。
【図３４】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ／ＧＤＳｘ  ３００アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号４１）を示す図である。
【図３５】Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来のヌクレオチド配列（配列番号４２）を示す図である。
【図３６】Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ／ＧＤＳｘ  ２６８アミノ酸由来のアミノ酸配列（配列番号４３）を示す図である。
【図３７】Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のヌクレオチド配列（配列番号４４）を示す図である。
【図３８】Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のアミノ酸配列（配列番号４５）を示す図である。
【図３９】Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のヌクレオチド配列（配列番号４６）を示す図である。
【図４０】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ／ＧＤＳｘ由来のアミノ酸配列（配列番号４７）を示す図である。
【図４１】Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ／ＧＤＳｘ由来のヌクレオチド配列（配列番号４８）を示す図である。
【図４２】ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１およびＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓおよびＴ．ｆｕｓｃａにおいてＧＤＳＹ）、ＧＡＮＤＹボックス（ＧＧＮＤＡまたはＧＧＮＤＬのいずれかである）およびＨＰＴブロック（保存された触媒ヒスチジンと考えられる）の保存を表す、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓおよびＴ．ｆｕｓｃａ由来のＬ１３１および相同体のアラインメントを示す図である。これら３種の保存されたブロックを強調する。
【図４３】Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１７を示す図である。
【図４４】Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列である配列番号１８を示す図である。
【図４５】活性部位にグリセロールを有する１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造のリボン表示を示す図である。図はＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗ  Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ  ｖｉｅｗｅｒを使用して作成された。
【図４６】１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造を示す図である。Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗ  Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ  ｖｉｅｗｅｒを使用した側面図、活性部位にグリセロールを有する、活性部位グリセロールの１０Å内の残基を黒色にする。
【図４７】１ＩＶＮ．ＰＤＢ結晶構造を示す図である。Ｄｅｅｐ  Ｖｉｅｗ  Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ  ｖｉｅｗｅｒを使用した上面図、活性部位にグリセロールを有する、活性部位グリセロールの１０Å内の残基を黒色にする。
【図４８】アラインメント１を示す図である。
【図４９】アラインメント２を示す図である。
【図５０】Ｐ１０４８０（Ｐ１０４８０はＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ酵素についてのデータベース配列である）に対する１ＩＶＮのアラインメントを示す図であり、このアラインメントはＰＦＡＭデータベースから獲得して、モデル構築プロセスにおいて使用された。
【図５１】Ｐ１０４８０（Ｐ１０４８はＡ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ酵素についてのデータベース配列である）に対する１ＩＶＮのアラインメントを示す図であり、このアラインメントはＰＦＡＭデータベースから獲得して、モデル構築プロセスで使用された。
【図５２】Ｐ１０４８０がＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａについてのデータベース配列であるアラインメントを示す図である。この配列をモデル構築および部位選択のために使用する。全長タンパク質（配列番号２５）が示され、成熟タンパク質（配列番号３４と同じ）は残基１９から始まることを記す。Ａ．ｓａｌはＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（配列番号４）ＧＤＳＸリパーゼであり、Ａ．ｈｙｄはＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（配列番号３４）ＧＤＳＸリパーゼである。コンセンサス配列は、列挙した配列間で異なっている位置に＊を含む。
【図５３】実施例１において使用した遺伝子構築物を示す図である。
【図５４】実施例１において使用したコドン最適化遺伝子構築物（ｎｏ．０５２９０７）を示す図である。
【図５５】ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を含有するＸｈｏＩ挿入物の配列を示す図であり、−３５および−１０ボックスに下線をつける。
【図５６】１％トリブチリンアガー上、３７℃で４８時間増殖後のＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０（配列番号１６を含む−上のコロニー）およびＢＭＬ７８０（ホスト株のみ−下のコロニー）を示す図である。
【図５７】シグナル配列（プレＬＡＴ−位置１〜８７）を含むＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来のヌクレオチド配列（配列番号４９）を示す図である。
【図５８】生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａから獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５０）を示す図である。
【図５９】生物Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａから獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５１）を示す図である。
【図６０】生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００３８８８．１：８３２７４８０．．８３２８３６７）から獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５２）を示す図である。
【図６１】生物Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号ＡＬ９３９１３１．１：２６５５４８０．．２６６３６７）から獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５３）を示す図である。
【図６２】生物Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｚ７５０３４）から獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５４）を示す図である。
【図６３】生物Ｒａｌｓｔｏｎｉａから獲得した本発明による脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号５５）を示す図である。
【図６４】仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］を保存するＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ３９７０７．１  ＧＩ：４５３９１７８をコードする配列番号５６として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６５】仮説上のタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］を保存するＳｃｏｅ２  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＣ０１４７７．１  ＧＩ：９７１６１３９をコードする配列番号５７として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６６】Ｓｃｏｅ３  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ８８８３３．１  ＧＩ：７６３５９９６推定上の分泌タンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］をコードする配列番号５８として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６７】Ｓｃｏｅ４  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ８９４５０．１  ＧＩ：７６７２２６１推定上の分泌タンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］をコードする配列番号５９として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６８】Ｓｃｏｅ５  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＣＡＢ６２７２４．１  ＧＩ：６５６２７９３推定上のリポタンパク質［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）］をコードする配列番号６０として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図６９】Ｓｒｉｍ１  ＮＣＢＩタンパク質アクセションコードＡＡＫ８４０２８．１  ＧＩ：１５０８２０８８  ＧＤＳＬ−リパーゼ［Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ］をコードする配列番号６１として示されるヌクレオチド配列を示す図である。
【図７０】Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ＃７９６５）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６２）を示す図である。
【図７１】Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ亜種、Ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ＃１４１７４）由来の脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列（配列番号６３）を示す図である。
【図７２】キシラナーゼシグナルペプチドを含有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ由来の酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号２４）を示す図である。
【図７３】本明細書において配列番号１６としておよび翻訳後修飾を受けた後は配列番号６８として示すＡｓｎ８０Ａｓｐの変異（特にアミノ酸８０は成熟配列中にある）を有する変異体Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ成熟脂質アシルトランスフェラーゼ（ＧＣＡＴ）のアミノ酸配列（配列番号６８のアミノ酸残基２３５および２３６は翻訳後修飾の後に共有結合していない）を示す図である。形成された２つのペプチドは、１つまたは複数のＳ−Ｓ架橋によって保持される。配列番号６８中のアミノ酸２３６は本明細書において示す配列番号１６中のアミノ酸残基番号２７４に相当する。
【図７４ａ】粗製食用油を水脱ガム／精製するための従来プロセスを示す図である。水脱ガムの最後に油相およびガム相が分離される。この後に油相およびガム相は従来の／公知の方法によってさらに加工され得る。
【図７４ｂ】酵素で粗製食用油を水脱ガム／精製するための本発明によるプロセスを示す図である。油相とガム相とが分離される際に獲得される油相は、比較するプロセス（すなわち図７４ａに示すプロセス、すなわち酵素を加えない水脱ガム）の油相と比較してより高い収率を有する。油相および／またはガム相は、任意選択でさらなる従来の加工法などでさらに加工され得る。
【図７５】本発明による実験室規模の水脱ガムプロセスの工程系統図である。
【図７６】水脱ガムに続くガム相および油相の分析についての図解である（すなわち、図７４ａまたはｂのステップ１）。
【図７７】本発明に従った粗製ダイズ油の水脱ガム後３時間でのガム相を示すグラフである。
【図７８】粗製ダイズ油の酵素を使うおよび使わない水脱ガム後３０分間でのガム％を示すグラフである。
【図７９】粗製ダイズ油の水脱ガム後のガムの量についての水の量（１．５、２または２．５％）の効果を示すグラフである。
【図８０】酵素を使うおよび使わない粗製ダイズ油の水脱ガム後ガムの量についての、様々な量の水（１．５、２または２．５％）での脱ガムでの酵素を使うおよび使わない効果を示すグラフである。
【図８１】異なる投与量の酵素での粗製ダイズ油の水脱ガム後の油相中のリンのｐｐｍを示すグラフである。カラム１は酵素を使わない対照である。
【図８２】異なる投与量の酵素での粗製ダイズ油の水脱ガム後のガム相中のトリグリセリド％を示すグラフである。カラム１は酵素を使わない対照である。
【図８３】異なる投与量の酵素での粗製ダイズ油の水脱ガム後のガム相中の相対的ＰＡ％を示すグラフである。カラム１は酵素を使わない対照である。
【図８４】異なる投与量の酵素での粗製ダイズ油の水脱ガム後のガム相中の相対的ＰＥ％を示すグラフである。カラム１は酵素を使わない対照である。
【図８５】対照と比較して酵素的脱ガムにおいて獲得された油の収率（％）の増加を示すグラフである。油は３分間様々な相対遠心力で遠心分離される。
【図８６】異なる時間（棒の中に示す分）で遠心分離された油から獲得されたガムの含有量（％）およびガム中のトリグリセリドの量を示すグラフであり、異なる相対遠心力が示されている。バッチ３：対照  ５５℃、４：酵素（ＫＬＭ３’）使用  ５５℃。
【図８７】ずり速度の関数としての粘性を示すグラフである。測定値はバッチ１：対照  ７０℃およびバッチ２：酵素使用  ７０℃からのガムによる。
【図８８】ガムの量（酵素的試料）を減算したガムの量（対照）から算出した油の収率（％）を示すグラフである。
【図８９】ガム相のＴＬＣ分析からの結果を示すグラフである。ＮａＯＨの量を漸増させた（０、０．１、０．２、０．５、１、１．５および１．９ｍｌ  ４％溶液）脱ガムから獲得されたガム中のトリグリセリド含有量（％）。
【図９０】ＧＣ結果を示すグラフである。ＮａＯＨのｍｌ数を増加させて脱ガムした、油中のＦＦＡ、フィトステロールおよびフィトステロールエステルの含有量（％）、試料１：対照（酵素およびＮａＯＨを使わない）；試料２〜８：ＫＬＭ３’（０．１ＴＩＰＵ−ｋ／ｇ）および漸増する量のＮａＯＨ（０、０．１、０．２、０．５、１、１．５および１．９ｍｌ  ４％溶液）での酵素的試料。
【図９１】ガム相のＴＬＣ分析からの結果を示すグラフである。ガム中のリン脂質（ＰＡ、ＰＥ、ＰＣおよびＰＩ）の相対的分解。試料１：対照（酵素およびＮａＯＨを使わない）；試料２〜７：ＫＬＭ３’（０．１ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ）および漸増するｍｌ数のＮａＯＨでの酵素的試料。
【図９２】従来の水脱ガムおよび本発明による酵素的水脱ガム由来のガムの顕微鏡分析を示す図である（写真は、拡大率２００および４００倍、２５℃）。
【図９３】従来法および酵素的脱ガム由来のガム相についてのＸ線分析を示すグラフである。
【図９４】沈降漏斗（３日目）を示す図である。左：対照、右：酵素処理油
【図９５】従来および酵素的水脱ガム由来のガムについての顕微鏡分析を示す図である。
【図９６】対照と比較して酵素的脱ガムにおいて獲得された油の収率の増加を示すグラフである。
【図９７】１、１．５および２％水で実施した対照および（本発明による）酵素的水脱ガム試料における油の損失を示すグラフである。油損失の算出：（％ガム／ガム中の％トリグリセリド）×１００％
【図９８】対照（酵素を含まない）と比較した酵素的（ＫＬＭ３’）ガム試料中のホスファチジン酸およびホスファチジルエタノールアミンの相対的分解を示すグラフである。
【図９９】様々な量の水（１．２５、１．５、１．７５および２％）での脱ガムから獲得された、酵素的ガム相の粘性測定を示すグラフである。
【図１００】実施例９の表１に示す、ＫＬＭ３’を使い、かつ受容体の添加を伴う粗製ダイズの水脱ガム由来のガム相を示すグラフである。
【図１０１】ＨＰＴＬＣで分析したガム相におけるリン脂質の相対量を示すグラフである。
【図１０２】粗製ダイズ油の水脱ガム由来の油中のリンのＩＣＰ分析を示すグラフである（実施例９の表１）。
【図１０３】実施例１３、試料１〜９の３０分間インキュベーション後のＴＬＣ（ランニング緩衝液１）を示す図である。
【図１０４】実施例１３、試料１〜９の２４０分間インキュベーション後のＴＬＣ（ランニング緩衝液１）を示す図である。
【図１０５】実施例１３、試料１〜９の３０分間インキュベーション後のＴＬＣ（ランニング緩衝液６）を示す図である。ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン、ＰＡ＝ホスファチジン酸、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール、およびＰＣ＝ホスファチジルコリン
【図１０６】実施例１３、試料１〜９の２４０分間インキュベーション後のＴＬＣ（ランニング緩衝液６）を示す図である。ＰＥ＝ホスファチジルエタノールアミン、ＰＡ＝ホスファチジン酸、ＰＩ＝ホスファチジルイノシトール、およびＰＣ＝ホスファチジルコリン
【図１０７】実施例１３、粗製油の脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）での酵素処理によるリン脂質の相対的分解を示すグラフである。反応時間２４０分間。
【図１０８】実施例１３、リン脂質ジグリセリドアシルトランスフェラーゼ反応を示す図である。
【図１０９】実施例１３、粗製ダイズ油の脱ガムにおけるジグリセリド（ＤＡＧ）レベルについてのホスホリパーゼＣとＫＬＭ３’との相互作用を示すグラフである。
【図１１０】実施例１３、ＴＬＣ分析を示す図である。
【図１１１】トリグリセリドについての酵素添加の効果を示すグラフである。
【図１１２】トリグリセリドについての反応時間の効果を示すグラフである。
【図１１３】実施例１３に詳述するアシルトランスフェラーゼと３０および９０分間インキュベートしたジグリセリド／ＰＣ基質のＴＬＣ分析を示す図である。
【図１１４】実施例１３に詳述するアシルトランスフェラーゼと３０および９０分間インキュベートしたジグリセリド／ＰＣ基質のＴＬＣ分析を示す図である。
【図１１５】ジグリセリド／ＰＣ  ８０／２０の基質中でのトリグリセリド形成についてのアシルトランスフェラーゼ酵素の効果を示すグラフである。
【図１１６】ジグリセリド／ＰＣ  ８０／２０の基質中でのトリグリセリド形成についてのインキュベーション時間の効果を示すグラフである。
【図１１７】酵素的水脱ガムについての工程系統図を示す図である。
【図１１８】実施例１５に詳述する５５℃での水脱ガムおよび０ｄ、１ｄまたは７ｄのインキュベーションに続くガム相試料のＴＬＣ分析を示す図である。
【図１１９】実施例１５に詳述する４５℃での水脱ガムおよび０ｄ、１ｄまたは７ｄのインキュベーションに続くガム相試料のＴＬＣ分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の詳細な態様
本発明の第１の態様によれば、ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する段階と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する段階と、ｃ）油相とガム相を分離する段階とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセスが提供される。
【００２８】
本発明の第２の態様によれば、水脱ガムプロセスの完了後に油相中の油の収率を増加させるための食用油の水脱ガムの間（好ましくは、粗製食用油の水脱ガムの間）の脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。
【００２９】
本発明の第３の態様によれば、水脱ガムプロセスの完了後にガム相の粘性を減少させるための食用油の水脱ガムの間（好ましくは、粗製食用油の水脱ガムの間）の脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。
【００３０】
収率の増加および／または粘性の減少は、脂質アシルトランスフェラーゼの使用なしで脱ガムされた（水脱ガムされたか、または酵素的に水脱ガムされたかのいずれか）比較可能な油の油相および／またはガム相と比較した場合である。
【００３１】
第４の態様によれば、ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）および脂質アシルトランスフェラーゼと混合する段階と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する段階と、ｃ）油相とガム相を分離する段階と、ｄ）最低約２時間と最高７日間の間（適切には、約１〜２日間まで）、活性脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を含むガム相をインキュベートする段階と、ｅ）ガム相から油を（例えば、遠心分離によって）分離する段階とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセスを本発明は提供する。
【００３２】
本発明はさらに、（好ましくは、食用油の脱ガム、例えば水脱ガムもしくは酵素的脱ガムまたはそれらの組合せから獲得可能である、または獲得された）ガム相を処理し（ガム相を、最低約２時間と最高７日間の間（適切には、約１〜２日間まで）、（単独の、または１つもしくは複数のホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた）１つまたは複数の（活性）脂質アシルトランスフェラーゼ酵素とインキュベートする）、ガム相から油を（例えば、遠心分離によって）分離する方法を提供する。
【００３３】
本発明はなおさらに、油の収率を増加させるための、および／または通常のガムよりリンレベルが向上している（酸性油の分離後の）固相を生成するための、（食用油を水脱ガムすること、酵素的脱ガムすること、またはそれらの組合せなどの脱ガムすることから獲得可能な、または獲得された）ガム相のインキュベーションにおける（単独の、またはホスホリパーゼＣと組み合わせた）脂質アシルトランスフェラーゼの使用を提供する。
【００３４】
酸性油が脂肪酸製造のために用いることができるため、（１つまたは複数の）酵素の使用は、ガムと比較して、酸性油の価値を増加させる。脂肪酸は、別なふうに食事に加えられるガムより高い価値を有する。
【００３５】
向上および／または増加は、（単独の、またはホスホリパーゼＣと組み合わせた）脂質アシルトランスフェラーゼによって処理されていないガム相と比較した場合である。
【００３６】
適切には、ガム相中の１つまたは複数の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、食用油の酵素的脱ガム後にガム相に移行した可能性がある残存活性酵素を有してもよい。あるいは、ガム相中の脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、加えられた脂質アシルトランスフェラーゼ（その酵素は、ガム相のインキュベーションの始めに、または間に加えてもよい）であってもよい。
【００３７】
特に、第４の態様におけるプロセス（およびガム相の他の処理）の終わりにおける油は、「酸性油」である。この酸性油は、食事に加えられる通常のガム相より高い価格で販売することができる。（酸性油の分離後の）残っているガム相は、固相と呼ばれることがある。驚くべきことに、（酸性油の分離後の）残っている固相は、通常のガムより高いリンレベルを有することが見出されており、したがって、有機リンの供給源として用いることができる。
【００３８】
適切には、ガム相は、約３０〜約７０℃、好ましくは約４０〜約６０℃、好ましくは約４０〜約５０℃、好ましくは約４０〜約４５℃で（単独の、または１つもしくは複数のホスホリパーゼＣ酵素とのいずれかの）脂質アシルトランスフェラーゼとインキュベートすることができる。
【００３９】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼでの粗製油の酵素的水脱ガムから獲得されたガム相は、約３０〜約７０℃、好ましくは約４０〜約６０℃、好ましくは約４０〜約５０℃、好ましくは約４０〜約４５℃でインキュベートすることができる。
【００４０】
適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、酵素命名法分類で分類されたものである（Ｅ．Ｃ．２．３．１．４３）。
【００４１】
一実施形態において、好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、ホスホリパーゼＣ（Ｅ．Ｃ．３．１．４．３）と組み合わせて用いられる。
【００４２】
一つの好ましい実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．１．４３）は、ホスホリパーゼＣ（Ｅ．Ｃ．３．１．４．３）と組み合わせて用いられる。
【００４３】
したがって、本発明の一態様によれば、ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）ならびに脂質アシルトランスフェラーゼおよびホスホリパーゼＣの組合せと混合する段階と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する段階と、ｃ）油相とガム相を分離する段階とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセスが提供される。
【００４４】
理論に縛られるつもりはないが、驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドを生成するための受容体分子として（ホスホリパーゼＣの反応によって生成した）ジグリセリドを用い得ることが見出されている。したがって、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用が、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油においてトリグリセリド量の相乗的な増加を生じる。有利には、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用は、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油においてジグリセリド量の相乗的な減少を生じる。脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用は、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油において油収率の相乗的な増加を生じる。
【００４５】
ジグリセリドが油の「発煙点」にマイナスの影響を及ぼし得、および／またはより飽和した脂肪供給源の結晶化性質にマイナスの影響を及ぼし得るという理由のため、（ホスホリパーゼＣが単独で用いられた場合に起こり得る）油におけるジグリセリドの蓄積が、油にとって有害であり得るので、これらの酵素の組合せの使用は、ホスホリパーゼＣ単独の使用に対して有意な優位性を有する。
【００４６】
したがって、本発明において、脂質アシルトランスフェラーゼの使用（特に、ホスホリパーゼＣと組み合わせた場合）のもう一つの利点は、脂質アシルトランスフェラーゼなしでの比較可能な油と比較して、および／または特に、ホスホリパーゼＣ単独で処理された比較可能な油と比較して、油におけるジグリセリド量を低下させ得ることである。
【００４７】
本発明の別の態様において、水脱ガムプロセスの完了後に油相において、油の収率を増加させるための、および／またはトリグリセリドレベルを増加させるための、ならびに／または水脱ガムプロセスの完了後に油相においてジグリセリドレベルを低下させるための、食用油の水脱ガムの間（好ましくは、粗製食用油の水脱ガムの間）のホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。
【００４８】
本発明のさらに別の態様によれば、水脱ガムプロセスの完了後にガム相の粘性を減少させるための、食用油の水脱ガムの間（好ましくは、粗製食用油の水脱ガムの間）のホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用が提供される。
【００４９】
これらの増加および／または低下は、ホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼで処理されていない比較可能な脱ガムされた食用油と比較した場合である。
【００５０】
一般的に、本明細書で論じられた増加および／または低下は、（単独かまたはホスホリパーゼＣと組み合わせてのいずれかの）脂質アシルトランスフェラーゼで処理されていない比較可能なプロセスまたは比較可能な油と比較する場合である。
【００５１】
別の態様によれば、本発明は、ａ）約０．１〜５％ｗ／ｗの水を食用油（好ましくは、粗製食用油）およびホスホリパーゼＣと組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼと混合する段階と、ｂ）約４５℃〜約９０℃で約１０分間〜１８０分間、前記混合物を撹拌する段階と、ｃ）油相とガム相を分離する段階と、ｄ）最低約２時間と最高７日間の間（適切には、約１〜２日間まで）、活性脂質アシルトランスフェラーゼを含むガム相をインキュベートする段階と、ｅ）ガム相から油を（例えば、遠心分離によって）分離する段階とを含む、食用油（好ましくは、粗製食用油）を水脱ガムするプロセスを提供する。
【００５２】
リン脂質分解酵素（好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ）がホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、ホスホリパーゼＣを加えるのは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の添加の前でも、添加と同時でも、添加の後でもよい。
【００５３】
一実施形態において、好ましくは、ホスホリパーゼＣは、脂質アシルトランスフェラーゼの前に加えられる。
【００５４】
驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼおよびホスホリパーゼＣの組合せを用いることは、水脱ガムプロセスの完了後、油相において油の収率を有意に増加させることが見出されている。
【００５５】
理論に縛られるつもりはないが、ホスホリパーゼＣは、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン）をジグリセリド（例えば、１，２−ジアシルグリセロール）およびリン酸部分（例えば、コリンリン酸）へ加水分解し、その後、脂質アシルトランスフェラーゼが、ホスホリパーゼＣによって形成されたジグリセリド上へ脂肪酸を転移する−したがって、より多くのトリグリセリドを形成し、油収率を増加させることが想定される。この効果は、油収率への相乗的な（すなわち、好ましくは相加的より多い）増加をもたらす。
【００５６】
一実施形態において、適切には、本発明による食用油を脱ガムする方法および／または使用は、約４５〜９０℃、好ましくは約４５〜約７０℃で行い得る。
【００５７】
別の実施形態において、適切には、本発明による食用油プロセスを脱ガムする方法および／または使用は、約４４℃より高く、より好ましくは約４５℃より高く、より好ましくは約５０℃より高くで行い得る。
【００５８】
別の実施形態において、適切には、本発明によるプロセスおよび／または使用は、約６０℃未満、好ましくは約６５℃未満、好ましくは約７０℃未満で行い得る。
【００５９】
一実施形態において、適切には、本発明によるプロセスおよび／または使用は、摂氏約４５〜７０℃、好ましくは約４５〜６８℃、より好ましくは約５０〜６５℃で行い得る。
【００６０】
適切には、油および／または水の温度は、酵素が混合される場合の望ましい反応温度であり得る。
【００６１】
油および／または水は、酵素添加の前および／または添加中に、望ましい温度まで加熱および／または冷却してもよい。したがって、一実施形態において、本発明によるプロセスのさらなる段階は、油および／または水の冷却および／または加熱であり得ることが構想される。
【００６２】
好ましくは、本発明によるプロセスについての水含有量は、約０．１〜４％ｗ／ｗ、より好ましくは約０．１〜３％ｗ／ｗ、より好ましくは約０．５〜３％ｗ／ｗであり得る。
【００６３】
一実施形態において、本発明によるプロセスについての水含有量は、約１〜３％ｗ／ｗであり得る。
【００６４】
一実施形態において、本発明によるプロセスについての水含有量は、約３％ｗ／ｗ未満、適切には約２％未満であり得る。
【００６５】
一実施形態において、プロセスについての水含有量は、１％未満であってもよい。水の量を約１％未満まで低下させることは、結果として、水脱ガムプロセスにおいて有意な財政的な有利性を生じることができる。したがって、水の量を約１％未満まで低下させ得ることは、有意な費用削減をもたらすことができる。
【００６６】
適切には、反応時間（すなわち、混合物を撹拌する時間）は、約１０分間〜約１８０分間、好ましくは約１５分間〜約１８０分間、より好ましくは約１５分間〜６０分間、さらにより好ましくは約１５分間〜約３５分間であり得る。
【００６７】
一実施形態において、適切には、反応時間は、約３０分間〜約１８０分間、好ましくは約３０分間〜約６０分間であり得る。
【００６８】
一実施形態において、プロセスは、好ましくは、約ｐＨ４．５より高くで、約ｐＨ５より高くで、または約ｐＨ６より高くで行われる。
【００６９】
好ましくは、プロセスは、約ｐＨ４．６〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ６．０〜約ｐＨ１０．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０、より好ましくは約ｐＨ５．０〜約ｐＨ６．５、およびさらにより好ましくは約ｐＨ５．５〜ｐＨ６．０で行われる。
【００７０】
一実施形態において、プロセスは、約５．３〜８．３のｐＨで行ってもよい。
【００７１】
一実施形態において、プロセスは、約６〜６．５、好ましくは約６．３のｐＨで行ってもよい。
【００７２】
適切には、ｐＨは、本発明の方法および／または使用において中性（約ｐＨ５．０〜約ｐＨ７．０）であり得る。
【００７３】
好ましくは、酵素処理は、油および／または水のｐＨ調整なしに脱ガムプロセスにおいて起こる。それゆえに、典型的には、ｐＨは、約５．５〜７．５であろう。これは、典型的に酸性ｐＨ条件、すなわち、ｐＨ４〜５においてのみ高活性であるホスホリパーゼＡ酵素を用いる先行技術のプロセスに対して有意な優位性を生じる。それゆえに、典型的には、（例えば、ホスホリパーゼＡ酵素を用いる）先行技術のプロセスにおいて、油のｐＨは、より酸性条件へ調整しなければならない。
【００７４】
加えて、ホスホリパーゼＣ酵素との脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、ホスホリパーゼＣ酵素との前記ホスホリパーゼＡの使用と比較して、有意な利点を有し、その理由は、脂質アシルトランスフェラーゼに最適なｐＨが典型的には、ホスホリパーゼＣ酵素に最適なｐＨとはるかに良く一致するからである。それゆえに、一般的に、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせて用いられる場合、「ｐＨ矛盾」はない。これは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせたホスホリパーゼＡ酵素の使用と鋭く対照をなす。したがって、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、両方の酵素がそれらの最適なｐＨ範囲で、または同時に作用することができるので、有意な向上を提供する。
【００７５】
油相とガム相の分離は、任意の通常の分離方法によって行ってもよい。好ましくは、分離は、遠心分離によって行われる。
【００７６】
（単独か、または好ましくはホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせてのいずれかでの）脂質アシルトランスフェラーゼの使用の一つの有意な利点は、酵素処理が、遠心分離を調節して最終の油中のリンの量を制御することを可能にすることである。理論によって縛られるつもりはないが、これは、油の粘性が、（単独か、または好ましくは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせてのいずれかでの）脂質アシルトランスフェラーゼで処理されていない油と比較して、有意に低下しているために、達成可能である。これは、先行技術のプロセスに対して有意な進歩である。典型的には、通常の脱ガムプロセスにおいて、遠心分離は、約５０ｐｐｍの油中のリンのレベルを生じる。実際、食用油中のリンのレベルについての仕様ガイドは、それは２００ｐｐｍ未満であるべきということである。できる限り２００ｐｐｍレベルに近いリンレベルである油を有することが、現に、最適である。（単独か、または好ましくは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせてのいずれかでの）脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、結果として、約１００〜２００ｐｐｍ、好ましくは約１７０〜１９０ｐｐｍ、より好ましくは約１８０ｐｐｍのリンレベルまで遠心分離することができる油を生じる。これらのリンレベルを与えるような遠心分離の調節は、本発明の以前では、非常に困難であり、本発明に関しては、有意な向上を提供する。
【００７７】
適切には、水は、酵素との混合の前または同時に、食用油と混合することができる。あるいは、食用油および酵素は、水との混合前に混合してもよい。
【００７８】
一実施形態において、油、水、および酵素は、同時にまたは実質的に同時に続々と、攪拌機を通って、貯蔵タンクへとポンプで注入してもよい。
【００７９】
適切には、酵素は、プロセスの間および／または終わりに不活性化し得る。
【００８０】
酵素は、油相とガム相の分離の前または後に不活性化してもよい。
【００８１】
適切には、酵素は、７５〜８５℃、または９２℃より高くで１０分間、加熱することによって熱不活性化することができる。
【００８２】
一実施形態において、適切には、酵素はガム相において不活性化されない場合がある。したがって、ガム相が収集され、インキュベートされる場合、酵素はさらに、ガム相においてリン脂質を分解する可能性がある。ガム相の延長したインキュベーション後、ガム相からさらにより多くの油を回収するためにさらなる分離を（例えば、遠心分離によって）行ってもよい。これは、油収率をなおさらに増加させることができる。
【００８３】
理論によって縛られるつもりはないが、酵素は、ガム相においてリン脂質を遊離脂肪酸へ分解し、それにしたがって、それまでリン脂質で乳化していたトリアシルグリセリドを遊離させると考えられる。これは、ガム相の粘性を低下させ、トリアシルグリセリドおよび遊離脂肪酸を、例えば、遠心分離によって、分離することを可能にする。
【００８４】
一実施形態において、適切には、本発明のプロセスは、例えば、ＮａＯＨなどのアルカリの添加なしに、行うことができる。
【００８５】
別の実施形態において、適切には、本発明のプロセスは、例えば、ＮａＯＨなどのアルカリの存在下で行うことができる。ＮａＯＨが加えられる場合、好ましくは、それは、１００ｇの油当たり約０．２ｍｌ（４％溶液）のＮａＯＨを超える量では加えられない。
【００８６】
本発明の方法および／または使用に用いるのに適した酵素は、下記の「トランスフェラーゼアッセイ（コレステロール：リン脂質）（ＴｒＵ）」を用いて決定される脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有し得る。
トランスフェラーゼ活性の決定「トランスフェラーゼアッセイ（コレステロール：リン脂質）」（ＴｒＵ）
基質：５０ｍｇのコレステロール（Ｓｉｇｍａ  Ｃ８５０３）および４５０ｍｇの大豆ホスファチジルコリン（ＰＣ）、Ａｖａｎｔｉ  ＃４４１６０１をクロロホルムに溶解し、クロロホルムを減圧下、４０℃で蒸発させる。
【００８７】
３００ｍｇのＰＣ：コレステロール９：１を、１０ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に４０℃で分散させる。
酵素法：
２５０μｌの基質を、４０℃で、蓋を有するガラス中に加える。
【００８８】
２５μｌの酵素溶液を加え、４０℃で１０分間、撹拌しながらインキュベートする。
【００８９】
加えられた酵素は、アッセイにおいてコレステロールの２〜５％をエステル化するはずである。
【００９０】
酵素溶液の代わりに２５μｌの水を用いたブランクもまた分析する。
【００９１】
１０分後、５ｍｌのヘキサン：イソプロパノール３：２を加える。
【００９２】
コレステロールエステルの量を、キャリブレーションのためにステアリン酸コレステリル（Ｓｉｇｍａ  Ｃ３５４９）標準を用いるＨＰＴＬＣによって分析する。
【００９３】
トランスフェラーゼ活性を、アッセイ条件下での１分当たりのコレステロールエステル形成の量として計算する。
【００９４】
１トランスフェラーゼ単位（ＴｒＵ）は、上記に示されたトランスフェラーゼアッセイに従った、４０℃、ｐＨ７で、１分当たりに生成されるμモルのコレステロールエステルとして定義される。
【００９５】
好ましくは、本発明の方法および使用に用いられる脂質アシルトランスフェラーゼは、少なくとも２５ＴｒＵ／ｍｇ酵素タンパク質の１ｍｇの酵素当たりの特定のトランスフェラーゼ単位（ＴｒＵ）を有するであろう。
【００９６】
適切には、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、１ｇの油当たり０．０５〜５０ＴｒＵの量、適切には１ｇの油当たり０．５〜５ＴｒＵの量で投与され得る。
【００９７】
より好ましくは、本発明の方法および／または使用に用いるのに適した酵素は、下記のプロトコールによって定義されるような脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有する。
【００９８】
％アシルトランスフェラーゼ活性の決定のためのプロトコール
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが加えられている食用油を、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ２：１との酵素反応後、抽出することができ、脂質材料を含む有機相を単離し、本明細書の下記に詳述された手順に従ってＧＬＣおよびＨＰＬＣによって分析する。ＧＬＣおよびＨＰＬＣ分析から、遊離脂肪酸およびステロール／スタノールエステルの１つまたは複数の量を決定する。本発明による酵素が加えられていない対照食用油を同様に分析する。
計算：
ＧＬＣおよびＨＰＬＣ分析の結果から、遊離脂肪酸およびステロール／スタノールエステルの増加を計算することができる：
Δ％脂肪酸＝％脂肪酸（酵素）−％脂肪酸（対照）
Ｍｖ脂肪酸＝脂肪酸の平均分子量
Ａ＝Δ％ステロールエステル／Ｍｖステロールエステル（ただし、Δ％ステロールエステル＝％ステロール／スタノールエステル（酵素）−％ステロール／スタノールエステル（対照）、およびＭｖステロールエステル＝ステロール／スタノールエステルの平均分子量）
トランスフェラーゼ活性は、全酵素活性のパーセンテージとして計算される。
【００９９】
【数１】
0005509094.tif 000002
遊離脂肪酸が食用油において増加している場合、それらは好ましくは、実質的に、すなわち、有意な程度まで、増加していない。これによって、遊離脂肪酸の増加が食用油の質に悪影響を及ぼさないことを意味する。
【０１００】
アシルトランスフェラーゼ活性アッセイに用いられる食用油は、好ましくは、以下の方法を用いて植物ステロール（１％）およびホスファチジルコリン（２％）油を追加した大豆油である：
植物ステロールおよびホスファチジルコリンを、撹拌しながら９５℃まで加熱することによって大豆油に溶解した。その後、油を４０℃まで冷却し、酵素を加えた。水を、油相の５％の全濃度に加えた。試料を、磁力で撹拌しながら４０℃に維持し、４時間後および２０時間後、試料を取り出し、ＴＬＣによって分析した。
【０１０１】
アッセイについて、用いられる酵素用量は、好ましくは０．２ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油、より好ましくは０．０８ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油、好ましくは０．０１ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油である。油に存在するリン脂質のレベルおよび／またはステロールの％変換は、好ましくは０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、および２０時間後、より好ましくは２０時間後、決定される。
【０１０２】
用いられる酵素が脂質アシルトランスフェラーゼ酵素である場合、好ましくは、インキュベーション時間は、少なくとも５％トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１０％トランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、２６％、２８％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７５％トランスフェラーゼ活性があることを確実にするのに有効である。
【０１０３】
％トランスフェラーゼ活性（すなわち、全酵素活性のパーセンテージとしてのトランスフェラーゼ活性）は、上記で教示されたプロトコールによって決定してもよい。
【０１０４】
本発明のいくつかの態様において、本明細書に用いられる場合、用語「実質的に遊離脂肪酸を増加させることなく」とは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼで処理された食用油における遊離脂肪酸の量が、例えば、通常のホスホリパーゼ酵素、例えば、Ｌｅｃｉｔａｓｅ  ＵｌｔｒａＴＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）が用いられていた場合に生成した遊離脂肪酸の量と比較した場合など、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ以外の酵素が用いられていたときの食用油に生成した遊離脂肪酸の量より少ないことを意味する。
【０１０５】
油において％トランスフェラーゼ活性を評価すること（上記）に加えて、またはそれの代わりに、本発明の方法に用いるのに最も好ましい脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を同定するために、「本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコール」と題した以下のアッセイを用いることができる。
【０１０６】
脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコール
本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、以下を結果として生じるものである：
ｉ）（以下の方法を用いる：植物ステロールおよびホスファチジルコリンを、撹拌しながら９５℃まで加熱することによって大豆油に溶解した。その後、油を４０℃まで冷却し、酵素を加えた。試料を、磁力で撹拌しながら４０℃に維持し、０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、および２０時間後、試料を取り出し、ＴＬＣによって分析した）植物ステロール（１％）およびホスファチジルコリン（２％）油を追加した大豆油に存在するリン脂質の除去；
ならびに／または
ｉｉ）（上記のｉ）に教示された方法を用いる）加えられたステロールのステロールエステルへの変換（％変換）。実施例２に教示されているように、ステロールおよびステロールエステルのレベルを決定するためのＧＬＣ方法を用いてもよい。
【０１０７】
アッセイについて、用いられる酵素用量は、０．２ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油、好ましくは０．０８ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油、好ましくは０．０１ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油であり得る。油に存在するリン脂質のレベルおよび／またはステロールの変換（％変換）は、好ましくは０．５時間後、１時間後、２時間後、４時間後、および２０時間後、より好ましくは２０時間後、決定される。
【０１０８】
脂質アシルトランスフェラーゼを同定するためのプロトコールにおいて、酵素処理後、好ましくは、５％の水を加え、油と十分に混合する。その後、油を、遠心分離を用いて油相と水相へ分離し（Ｂｕｃｈｏｌｄ，  Ｈ．およびＬａｕｒｇｉ  Ａ．−Ｇ．による「Ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  ｏｉｌｓ」、Ｆｅｔｔ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ（１９９３年）、９５巻（８号）、３００〜４頁、ＩＳＳＮ：０９３１−５９８５参照）、その後、油相を、以下のプロトコール（「リン含有量についてのアッセイ」）を用いてリン含有量について分析することができる：
リン含有量についてのアッセイ
水脱ガム後の油に存在するリン脂質のレベルは、ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ９９９．１０（＞Ｌｅａｄ，  Ｃａｄｍｉｕｍ，  Ｚｉｎｃ，  Ｃｏｐｐｅｒ，  ａｎｄ  Ｉｒｏｎ  ｉｎ  Ｆｏｏｄｓ  Ａｔｏｍｉｃ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ  ａｆｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，  Ｆｉｒｓｔ  Ａｃｔｉｏｎ  １９９９  ＮＭＫＬ−ＡＯＡＣ  Ｍｅｔｈｏｄ）に教示された試料調製に従って油試料を最初に調製することによって決定される。その後、油中のリン脂質量を、ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃａ  ２０−９９：Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｉｎ  ｏｉｌ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｍｉｓｓｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙに従って脱ガム後の油試料におけるリン含有量を分析することによって測定する。
【０１０９】
本発明を用いた後の油相に存在するリンの量は、典型的には、通常の水脱ガム（すなわち、酵素なし）後の油相におけるリン含有量と有意には異ならない。
【０１１０】
本発明を用いる油相における本発明を用いる油収率は、通常の水脱ガムプロセス（すなわち、酵素なし）を用いた後の油相と比較して実質的に増加している。適切には、本発明によるプロセスおよび／または使用は、酵素の添加なしに同じ水脱ガムプロセスを受けている同じ油と比較して、約０．２５〜３％、または約０．５〜２％、または約１〜２％などの約０．２５〜７％、収率が向上する。
【０１１１】
驚くべきことに、本発明によるプロセスにおける酵素の添加は、酵素の添加なしであることを除いて比較可能な水脱ガムプロセスを用いて得られた比較可能な油相と比較して、油相のリン含有量を必ずしも有意に低下させることなく、油相における、有意により高い油収率を提供することが見出された。
【０１１２】
適切には、油が本発明のプロセスまたは使用に従って処理されている場合の油相中のリンの量は、酵素の添加なしであることを除いて比較可能な水脱ガムプロセスを用いて得られた油相のリン含有量より０〜８０％、適切には０〜５０％、適切には０〜１０％、適切には０〜１％少なくあり得る。
【０１１３】
特に、本発明によるプロセスで得られた油相は、ホスファチドおよび／またはリン脂質を除去するためにさらに脱ガムしてもよい。例えば、油相は、酵素的脱ガムおよび／または酸脱ガムを受けることができる。
【０１１４】
油に存在するステロールの％変換は、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％である。
【０１１５】
一実施形態において、油中に存在するステロールの％変換は、少なくとも５％、好ましくは少なくとも２０％である。
【０１１６】
いくつかの態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘモチーフおよび／またはＧＡＮＤＹモチーフを含み得る。
【０１１７】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素、およびアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸ（Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である）を含む酵素として特徴付けられる。
【０１１８】
適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列、または脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の属の１つまたは複数由来の生物体から獲得可能、好ましくは獲得され得る：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、およびＣａｎｄｉｄａ。好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属由来の生物体から獲得可能であり、好ましくは獲得される。
【０１１９】
本発明のいくつかの態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５として示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列におけるＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１２０】
本発明のいくつかの態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３５として示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列におけるＮ−８０に対応する位置にアスパラギン酸残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１２１】
加えて、または代替として、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６として示されたアミノ酸配列、またはそれと７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６として示されたアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１２２】
加えて、または代替として、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６８として示されたアミノ酸配列、またはそれと７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６８として示されたアミノ酸配列を含み得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０１２３】
一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１６もしくは配列番号６８に示されたアミノ酸配列を有し、またはそれらと少なくとも７５％同一性、好ましくは、それらと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１２４】
一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４９に示されたヌクレオチド配列によってコードされ、またはそれと少なくとも７５％同一性、好ましくは、それと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１２５】
一実施形態において、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを配列番号１に示されたヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも７５％同一性（より好ましくは、それと、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％同一性）を有するヌクレオチド配列で形質転換し、前記Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓを培養し、そこに産生された（１つまたは複数の）脂質アシルトランスフェラーゼを単離することによってＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに発現している脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０１２６】
本明細書に用いられる場合、用語「食用油」は、植物油を含み得る。
【０１２７】
好ましくは、本発明による処理の前の食用油は、約５０〜３０００ｐｐｍ、より好ましくは約５０〜１４００ｐｐｍの範囲、より好ましくは約２００〜１４００ｐｐｍの範囲、およびさらにより好ましくは約４００〜１２００ｐｐｍの範囲の非水和可能リン含有量を含む粗製食用油である。
【０１２８】
一態様において、粗製食用油は、本発明の方法を行う前に、３５０ｐｐｍより高い、より好ましくは４００ｐｐｍより高い、さらにより好ましくは５００ｐｐｍより高い、最も好ましくは６００ｐｐｍより高いリン含有量を有する。
【０１２９】
好ましくは、食用油は植物油である。
【０１３０】
本発明による方法によって含まれる油として、大豆油、キャノーラ油、コーン油、綿実油、パーム油、ココナッツ油、米糠油、ピーナッツ油、オリーブ油、紅花油、パーム核油、菜種油、およびヒマワリ油の１つまたは複数を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。
【０１３１】
好ましくは、油は、大豆油、コーン油、ヒマワリ油、およびナタネ油（キャノーラ油と呼ばれることもある）の１つまたは複数である。
【０１３２】
より好ましくは、油は、大豆油、ヒマワリ油、またはナタネ油の１つまたは複数である。
【０１３３】
最も好ましくは、油は大豆油である。
【０１３４】
本明細書で用いられる場合、「粗製油」（本明細書では、非脱ガム油とも呼ばれる）は、圧搾油もしくは抽出油、またはそれらの混合物であり得る。
【０１３５】
粗製油中のホスファチド含有量は、２００〜１２００ｐｐｍの範囲、より好ましくは２５０〜１２００ｐｐｍの範囲のリン含有量に対応する０．５〜３％ｗ／ｗまで様々であり得る。
【０１３６】
ホスファチドは別として、粗製油はまた、低濃度の炭水化物、糖化合物、ならびにＣａ、Ｍｇ、およびＦｅの金属／ホスファチド酸複合体を含み得る。
【０１３７】
有利には、本発明の方法および使用は、低水（＜５％、好ましくは２％未満、より好ましくは１％未満）環境において食用油の脱ガムを可能にする。したがって、水脱ガムは、通常の水脱ガムプロセスを用いる場合より少ない水を加えることで行うことができる。
【０１３８】
本発明のさらなる利点は、油相におけるステロールエステルの生成である。
【０１３９】
適切には、酵素は、約０．０１〜１０ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油の範囲で投与することができ、適切には、酵素は、約０．０５〜１．５ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油の範囲、より好ましくは０．２〜１ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ油で投与することができる。
【０１４０】
酵素が脂質アシルトランスフェラーゼである場合、適切には、それは、約０．０１ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油〜５ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。一実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、約０．１〜約１ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができ、より好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、約０．１〜約０．５ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができ、より好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、約０．１〜約０．３ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。
【０１４１】
酵素がホスホリパーゼである場合、適切には、それは、約０．５〜１０ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。一実施形態において、ホスホリパーゼは、約０．５〜５ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができ、好ましくは、ホスホリパーゼは、約０．５〜１．５ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。適切には、ホスホリパーゼは、約１．０〜３ＴＩＰＵ−Ｋ単位／ｇ油の範囲で投与することができる。
【０１４２】
ホスホリパーゼ活性、ＴＩＰＵ−Ｋ：
基質：５０ｍｍのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．０に溶解した、１．７５％のＬ−植物ホスファチジルコリン９５％（４４１６０１、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、６．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（＃Ｔ９２８４、Ｓｉｇｍａ）、および５ｍＭ  ＣａＣｌ２。
アッセイ手順：試料、キャリブレーション、および対照を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（＃Ｔ９２８４、Ｓｉｇｍａ）に希釈した。分析をＫｏｎｅｌａｂ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて行った。アッセイを、３０Ｃで実行した。４μＬの試料を加える前に、３４μＬの基質を１８０秒間、サーモスタットで調温した。酵素法は６００秒間続いた。酵素法中に遊離した遊離脂肪酸の量を、ＮＥＦＡ  Ｃキット（９９９−７５４０６、ＷＡＫＯ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。５６μＬのＮＥＦＡ  Ａを加え、その混合物を３００秒間インキュベートした。後で、１１３μＬのＮＥＦＡ  Ｂを加え、その混合物を３００秒間インキュベートした。その後、ＯＤ５２０ｎｍを測定した。酵素活性（μモルＦＦＡ／分・ｍＬ）を、標準酵素調製に基づいて計算した。
【０１４３】
酵素活性ＴＩＰＵ−Ｋを、アッセイ条件下で１分当たり生成されるマイクロモル遊離脂肪酸（ＦＦＡ）として計算した。
【０１４４】
本発明において、プロセスは、好ましくは、腐食性中和プロセスではない（すなわち、酸性水脱ガムプロセスではなく、および／または酸腐食性脱ガムプロセスではない）。換言すれば、プロセスは、好ましくは、（リン酸、クエン酸、アスコルビン酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、塩酸、および／または酢酸などの）酸または（ＫＯＨおよびＮａＯＨなどの）腐食剤の添加を含まず、または相当量の酸もしくは腐食剤の添加を含まない。換言すれば、酸および／または腐食剤が本発明のプロセスで加えられる場合、それらは０．００４％未満で加えられる。
【０１４５】
参照を容易にするために、これらおよび本発明のさらなる態様は、今、適当なセクション見出しの下、論じられている。しかしながら、各セクション下の教示は、必ずしもそれぞれの特定のセクションに限定されるわけではない。
【０１４６】
ホスホリパーゼＣ
上記で述べたように、リン脂質分解酵素（好ましくは脂質アシルトランスフェラーゼ）は、ホスホリパーゼＣ（Ｅ．Ｃ．３．１．４．３）と組み合わせて用いることができる。
【０１４７】
ホスホリパーゼＣは任意の入手可能なホスホリパーゼＣ酵素であってもよく、以下のホスホリパーゼＣ酵素の１つまたは複数から選択してもよい：Ｐｕｒｉｆｉｎｅ（登録商標）（Ｖｅｒｅｎｉｕｍ、ＵＳから入手可能）；（Ｓｉｇｍａから入手可能なホスホリパーゼＣ、Ｒｅｆ  Ｐ７６３３などの）Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のホスホリパーゼＣ；（Ｓｉｇｍａから入手可能なホスホリパーゼＣ、Ｒｅｆ  Ｐ６６２１などの）Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来のホスホリパーゼＣ；（参照により本明細書に組み入れられている）ＷＯ２００８／０３６８６３に教示されたホスホリパーゼＣ酵素。
【０１４８】
利点
本発明の一つの利点は、油収率の増加が水脱ガムプロセスの終わりに得られることである。油収率の増加は、本発明による酵素の添加がないことを除いて比較可能な水脱ガムプロセスと比較される。
【０１４９】
理論によって縛られるつもりはないが、収率の増加は、リン脂質のガム相への除去によって引き起こされる乳化効果の減少による可能性がある。リン脂質は良い乳化剤であり、トリアシルグリセリドと乳化している可能性があり、それゆえに、リン脂質がガム相へ除去された場合、トリアシルグリセリド（油）の形をとる一部の油もまた除去される。リン脂質の分解によるガム相の粘性の低下が、ガム相への油の損失を防ぐのを助ける（ガム相と油の分離がはるかに容易であるため）。
【０１５０】
（理論によって縛られるつもりはないが、）加えて、または代替として、脂質アシルトランスフェラーゼが本発明に従って用いられる場合、脂肪酸部分をリン脂質からステロールへ転移することによってステロールエステルが形成される。脂質アシルトランスフェラーゼ酵素反応によるステロールにエステル化されるこの脂肪酸部分は、油相に見出され、ガム相には見出されない。通常の水脱ガムプロセス（脂質アシルトランスフェラーゼの添加なし）において、これらの脂肪酸部分はガム相へと失われる。
【０１５１】
本発明のさらなる利点は、脂質アシルトランスフェラーゼが用いられた場合、水脱ガムプロセスにおけるｐＨ（約ｐＨ５．０または５．５〜約ｐＨ６．５または７）を調整する必要がないことである。このｐＨは、脂質アシルトランスフェラーゼの高反応性をもたらす。
【０１５２】
脂質アシルトランスフェラーゼを用いた場合の本発明のもう一つの利点は、リン脂質由来の脂肪酸が、ステロール上に転移され、ステロールエステルを形成することである。これは、それ自体で、油相における収率の０．１〜０．１５％の増加に寄与し得る。
【０１５３】
本発明のさらなる利点（特に、脂質アシルトランスフェラーゼを用いた場合）は、ガム相が、本発明による酵素の添加がないことを除いて比較可能な水脱ガムプロセスからのガム相と比較して、粘性が低いことである。ガム相におけるより低い粘性は、結果として、油相から分離すること、すなわち、遠心分離によって分離することがより容易であることをもたらす。
【０１５４】
加えて、ガム相は、水含有量がより少ない可能性があり、それゆえに、完全に乾燥させることがより容易であり得る。
【０１５５】
本発明のなおさらなる利点は、ガム相においてトリグリセリド濃度の低下があることである。
【０１５６】
本発明のプロセスは、結果として、処理工場における汚れの減少をもたらすことができる。これは、工場の清掃がより容易であり得ることを意味する。
【０１５７】
理論によって縛られるつもりはないが、驚くべきことに、脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドを生成するための受容体分子として、（ホスホリパーゼＣの反応によって生成した）ジグリセリドを用い得ることを見出している。したがって、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用が、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油においてトリグリセリドの量の相乗的な増加を生じる。脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣと組み合わせて用いられる場合、これらの酵素間の相互作用が、いずれかの酵素のみを含む比較可能な油または酵素を含まない比較可能な油と比較して、両方の酵素を含む油における油収率の相乗的な増加を生じる。
【０１５８】
ジグリセリドが油の「発煙点」にマイナスの影響を及ぼし得、および／またはより飽和した脂肪供給源の結晶化性質にマイナスの影響を及ぼし得るという理由のため、（ホスホリパーゼＣが単独で用いられた場合、起こり得る）油におけるジグリセリドの蓄積が油にとって有害であり得るので、これらの酵素の組合せの使用は、ホスホリパーゼＣ単独の使用に対して有意な優位性を有する。
【０１５９】
したがって、本発明において、脂質アシルトランスフェラーゼの使用（特に、ホスホリパーゼＣと組み合わせた場合）のもう一つの利点は、脂質アシルトランスフェラーゼなしでの比較可能な油と比較して、および／または特に、ホスホリパーゼＣ単独で処理された比較可能な油と比較して、油におけるジグリセリド量を低下させ得ることである。
【０１６０】
本発明による（１つまたは複数の）酵素の使用は、プロセスにおいて必要とされる水の量を約１％未満まで低下させることができる。これは、水脱ガムプロセスにおいて有意な財政的利点を生むことができる。それゆえに、水の量を約１％未満まで低下させ得ることは、有意な費用低減をもたらすことができる。
【０１６１】
好ましくは、酵素処理は、油および／または水のｐＨ調整なしに脱ガムプロセスで起こる。これは、典型的には酸性ｐＨ条件においてのみ高活性であるホスホリパーゼＡ酵素を用いる先行技術のプロセスに対する有意な優位性を生じる。典型的には、（例えば、ホスホリパーゼＡ酵素を用いる）先行技術のプロセスにおいて、油のｐＨは、脱ガムプロセスの前および／または間に調整されなければならない。これは本発明に関して必要ではない。
【０１６２】
加えて、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、ホスホリパーゼＣ酵素との前記ホスホリパーゼＡの使用と比較して、有意な利点を有し、その理由は、脂質アシルトランスフェラーゼに最適なｐＨが典型的には、ホスホリパーゼＣ酵素に最適なｐＨとはるかに良く一致するからである。それゆえに、一般的に、脂質アシルトランスフェラーゼがホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせて用いられる場合、「ｐＨ矛盾」はない。これは、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせたホスホリパーゼＡ酵素の使用と鋭く対照をなす。したがって、ホスホリパーゼＣ酵素と組み合わせた脂質アシルトランスフェラーゼの使用は、両方の酵素がそれらの最適なｐＨ範囲で、または同時に作用することができるので、有意な向上を提供する。
【０１６３】
特に、ガム相の（単独かまたはホスホリパーゼＣと組み合わせてのいずれかの）脂質アシルトランスフェラーゼでの処理を含む方法において、このプロセスの終わりに生成する「酸性油」は、食事に加えられる通常のガム相より高い価格で販売することができる。加えて、（酸性油の分離後の）残っているガム相は、驚くべきことに、通常のガムより高いリンレベルを有することが見出されており、したがって、有機リンの供給源として用いることができる。
【０１６４】
宿主細胞
宿主生物体は、原核生物または真核生物であり得る。
【０１６５】
本発明の一実施形態において、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、宿主細胞、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主細胞などの細菌細胞に発現する。
【０１６６】
代替の宿主細胞は、例えば、真菌、酵母、または植物であってもよい。
【０１６７】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主細胞の使用によって、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの他の生物体と比較した場合、脂質アシルトランスフェラーゼの発現の増加がもたらされることが見出されている。
【０１６８】
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ、それぞれにおける発現に最適であるように設計されたいくつかの通常の発現ベクターへ挿入されている。しかしながら、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓにおいては、非常に低いレベルのみが検出された。発現レベルは１μｇ／ｍｌより低く、商業的製造を開始するのに十分なタンパク質を生じる細胞を選択することは不可能であった（結果示さず）。対照的に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓは、経済的に実行可能な製造として魅力があるタンパク質レベルを産生することができた。
【０１６９】
特に、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおける発現は、ａｐｒＥプロモーターの調節下のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおける発現より約１００倍高く、またはＡ４プロモーターの調節下で、かつセルロースに融合したＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓにおける発現より約１００倍高い（本明細書では結果を示さず）ことが見出されている。
【０１７０】
宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ以外の任意のＢａｃｉｌｌｕｓ細胞であってもよい。好ましくは、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、以下の種の１つ由来である：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、またはＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ。
【０１７１】
本発明に関しての用語「宿主細胞」は、本明細書に定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列かまたは本明細書に定義されているような発現ベクターのいずれかを含む任意の細胞を含み、それは、本明細書に定義されているような特定の性質を有する脂質アシルトランスフェラーゼの組換え産生に用いられる。
【０１７２】
適切には、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損もしくはプロテアーゼマイナス菌株、および／またはα−アミラーゼ欠損もしくはα−アミラーゼマイナス菌株であってもよい。
【０１７３】
本明細書に用いられる場合、用語「異種性」とは、別々の遺伝源または種由来の配列を意味する。異種性配列は、非宿主配列、改変配列、異なる宿主細胞菌株由来の配列、または宿主細胞の異なる染色体位置由来の同種配列である。
【０１７４】
「同種」配列は、同じ遺伝源または種に見出される配列である、すなわち、それは宿主細胞の関連種に自然発生している。
【０１７５】
本明細書に用いられる場合、用語「組換え脂質アシルトランスフェラーゼ」とは、脂質アシルトランスフェラーゼが、遺伝子組換えによって産生されていることを意味する。例えば、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、クローニングベクターへ挿入されており、その結果として、異種性脂質アシルトランスフェラーゼの存在によって特徴付けられたＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ細胞を生じる。
【０１７６】
制御配列
適用によっては、本発明の方法および／または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼ配列は、選択された宿主細胞（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ細胞など）によるなどのヌクレオチド配列の発現を提供する能力がある制御配列に、それをコードするヌクレオチド配列を作動可能に連結することによって、得ることができる。
【０１７７】
例として、そのような制御配列に作動可能に連結された本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、すなわち、そのベクターは発現ベクターであり、それを用いることができる。
【０１７８】
用語「作動可能に連結された」とは、記載された構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある近位を指す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が、調節配列と適合性の条件下で達成されるような方法でライゲーションされる。
【０１７９】
用語「制御配列」は、プロモーターおよびエンハンサーおよび他の発現制御シグナルを含む。
【０１８０】
用語「プロモーター」は、当技術分野の通常の意味で用いられ、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位である。
【０１８１】
本明細書で定義されているような特定の性質を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の発現の増強はまた、制御領域の選択、例えば、天然ではその酵素をコードするヌクレオチド配列についての制御領域ではないプロモーター、分泌リーダー、および終結領域によって達成してもよい。
【０１８２】
適切には、本発明のヌクレオチド配列を、少なくともプロモーターに作動可能に連結することができる。
【０１８３】
適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、終結配列をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。本発明のベクター、宿主細胞、方法、および／または使用のいずれか一つに用いる適切な終結配列の例として、α−アミラーゼ終結配列（例えば、
【０１８４】
【化１】
0005509094.tif 000003
−配列番号６４）、アルカリプロテアーゼ終結配列（例えば、
【０１８５】
【化２】
0005509094.tif 000004
−配列番号６５）、グルタミン酸特異的終結配列（例えば、
【０１８６】
【化３】
0005509094.tif 000005
−配列番号６６）、レバナーゼ終結配列（例えば、
【０１８７】
【化４】
0005509094.tif 000006
−配列番号６７）、およびスブチリシンＥ終結配列（例えば、
【０１８８】
【化５】
0005509094.tif 000007
）が挙げられる。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼターミネーターなどのα−アミラーゼターミネーターに作動可能に連結してもよい。
【０１８９】
プロモーター
本発明に従って用いられるプロモーター配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列と異種性でも同種性でもよい。
【０１９０】
プロモーター配列は、最適な宿主細胞において脂質アシルトランスフェラーゼの発現を指示する能力がある任意のプロモーター配列であってもよい。
【０１９１】
適切には、プロモーター配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓと同種であり得る。好ましくは、プロモーター配列は最適な宿主細胞と同種である。
【０１９２】
適切には、プロモーター配列は、宿主細胞と同種であり得る。「宿主細胞と同種の」とは、その宿主生物体内から生じること；すなわち、その宿主生物体で自然に見出されるプロモーター配列を意味する。
【０１９３】
適切には、プロモーター配列は、α−アミラーゼプロモーター、プロテアーゼプロモーター、スブチリシンプロモーター、グルタミン酸特異的プロテアーゼプロモーター、およびレバンスクラーゼプロモーターをコードするヌクレオチド配列からなる群から選択することができる。
【０１９４】
適切には、プロモーター配列は、ＬＡＴ（例えば、ＡｍｙＬとしても公地である、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のα−アミラーゼプロモーター）、ＡｐｒＬ（例えば、スブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇプロモーター）、ＥｎｄｏＧｌｕＣ（例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のグルタミン酸特異的プロモーター）、ＡｍｙＱ（例えばＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓα−アミラーゼプロモーター由来のαアミラーゼプロモーター）、およびＳａｃＢ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼプロモーター）をコードするヌクレオチド配列であり得る。
【０１９５】
本発明の方法において核酸配列の転写を指示するのに適したプロモーターの他の例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓアルカリプロテアーゼ遺伝子のプロモーター（ａｐｒＨ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓα−アミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成型アミラーゼ遺伝子のプロモーター（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子のプロモーター（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター、ならびに／またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ亜種ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ  ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【０１９６】
好ましい実施形態において、プロモーター配列は、（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼプロモーターなどの）α−アミラーゼプロモーターである。好ましくは、プロモーター配列は、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼプロモーターの−３５〜−１０配列を含む−図５３および５５参照。
【０１９７】
「−３５〜−１０配列」は、転写開始部位に対する位置を記載する。「−３５」および「−１０」は、ボックス、すなわち、いくつかのヌクレオチドであり、それぞれが６個のヌクレオチドを含み、これらのボックスは１７個のヌクレオチドによって隔てられている。これらの１７個のヌクレオチドは、「スペーサー」と呼ばれることが多い。これは、図５５に示されており、図中、−３５ボックスおよび−１０ボックスは下線が引かれている。誤解を避けるために言えば、「−３５〜−１０配列」が本明細書に用いられる場合、それは、−３５ボックスの始めから−１０ボックスの終わりまで、すなわち、−３５ボックス、１７ヌクレオチド長のスペーサー、および−１０ボックスを含む配列を指す。
【０１９８】
シグナルペプチド
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現による宿主細胞によって産生される脂質アシルトランスフェラーゼは、用いられる配列および／もしくはベクターに依存して、分泌されてもよいし、細胞内に含まれてもよい。
【０１９９】
シグナル配列は、特定の細胞膜を通ってのコード配列の分泌を指示するために用いることができる。シグナル配列は、脂質アシルトランスフェラーゼコード配列にとって天然でも外来でもよい。例えば、シグナルペプチドコード配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のアミラーゼ遺伝子またはプロテアーゼ遺伝子から得ることができる。
【０２００】
適切なシグナルペプチドコード配列は、以下の遺伝子の１つまたは複数から得ることができる：マルトース生成型α−アミラーゼ遺伝子、スブチリシン遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、中性プロテアーゼ遺伝子、ｐｒｓＡ遺伝子、および／またはアシルトランスフェラーゼ遺伝子。
【０２０１】
好ましくは、シグナルペプチドは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓアシルトランスフェラーゼ（例えば、ｍｋｋｗｆｖｃｌｌｇｌｉａｌｔｖｑａ−配列番号２１）、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓスブチリシン（例えば、ｍｒｓｋｋｌｗｉｓｌｌｆａｌｔｌｉｆｔｍａｆｓｎｍｓａｑａ−配列番号２２）、またはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン（例えば、ｍｍｒｋｋｓｆｗｆｇｍｌｔａｆｍｌｖｆｔｍｅｆｓｄｓａｓａ−配列番号２３）のシグナルペプチドである。適切には、シグナルペプチドは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓα−アミラーゼのシグナルペプチドであり得る。
【０２０２】
しかしながら、最適なＢａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞（好ましくは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主細胞）の分泌経路へ発現した脂質アシルトランスフェラーゼを向ける能力がある任意のシグナルペプチドコード配列を用いてもよい。
【０２０３】
本発明のいくつかの実施形態において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、最適な脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結してもよい。
【０２０４】
最適な脂質アシルトランスフェラーゼを、融合タンパク質として、本明細書に定義されているような宿主細胞で発現させてもよい。
【０２０５】
発現ベクター
用語「発現ベクター」は、インビボまたはインビトロの発現の能力がある構築物を意味する。
【０２０６】
好ましくは、発現ベクターは、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ宿主などの生物体のゲノムに組み入れられる。用語「組み入れられる」とは、好ましくは、ゲノムへの安定的な組み入れを網羅する。
【０２０７】
本明細書に定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列はベクターに存在してもよく、そのベクター内では、制御配列が、（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどの）適切な宿主生物体によってヌクレオチド配列の発現を提供することができるように、ヌクレオチド配列が制御配列に作動可能に連結されている、すなわち、そのベクターは発現ベクターである。
【０２０８】
本発明のベクターは、本明細書に定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの発現を提供するように上記のような適切な宿主細胞へ形質転換することができる。
【０２０９】
ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターまたはファージベクター、ゲノム挿入断片の選択は、それが導入されることになっている宿主細胞に依存することが多いであろう。本発明は、等価な機能の働きをし、かつ当技術分野において公知である、または公知になる発現ベクターの他の形を網羅することができる。
【０２１０】
いったん最適な宿主細胞へ形質転換されたならば、ベクターは、宿主細胞のゲノムとは無関係に複製および機能してもよいし、ゲノム自体へと統合されてもよい。
【０２１１】
ベクターは、抗生物質抵抗性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン抵抗性を与える遺伝子などの１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含んでもよい。あるいは、選択は、（ＷＯ９１／１７２４３に記載されているように）同時形質転換によって達成してもよい。
【０２１２】
ベクターは、例えば、ＲＮＡの産生のためにインビトロで用いてもよいし、宿主細胞をトランスフェクションまたは形質転換するために用いてもよい。
【０２１３】
ベクターは、そのベクターが問題の宿主細胞において複製することを可能にするヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。そのような配列の例は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１、およびｐＩＪ７０２の複製起点である。
【０２１４】
脂質アシルトランスフェラーゼ
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、天然の脂質アシルトランスフェラーゼをコードしてもよいし、変種脂質アシルトランスフェラーゼをコードしてもよい。
【０２１５】
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、天然の脂質アシルトランスフェラーゼでも、変種の脂質アシルトランスフェラーゼでもよい。
【０２１６】
例えば、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ＷＯ２００４／０６４５３７、ＷＯ２００４／０６４９８７、ＷＯ２００５／０６６３４７、またはＷＯ２００６／００８５０８に記載されているようなものであってもよい。これらの文書は参照により本明細書に組み入れられている。
【０２１７】
本明細書に用いられる場合、用語「脂質アシルトランスフェラーゼ」は、好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素（一般的には、Ｅ．Ｃ．２．３．１．ｘ．、例えば、２．３．１．４３として分類される）を意味し、その活性によって酵素は、アシル基を脂質から以下のうちの１つまたは複数などの１つまたは複数の受容体基質へ転移させる能力がある：ステロール、スタノール、炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、アスコルビン酸および／またはグリセロールなどの糖アルコール−好ましくは、グリセロールおよび／またはコレステロールなどのステロール。
【０２１８】
好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を（本明細書に定義されているような）リン脂質から、アスコルビン酸および／またはグリセロールおよび／またはステロール、好ましくはグリセロールまたはステロール、最も好ましくはステロール（例えば、コレステロール）などの糖アルコールへ転移させる能力がある脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２１９】
いくつかの態様について、本発明による「アシル受容体」は、例えば、多価アルコールなどのヒドロキシ基（−ＯＨ）を含む任意の化合物であってもよく、それらには、グリセロール；ステロール；スタノール；炭水化物；フルーツ酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、およびアスコルビン酸を含むヒドロキシ酸；タンパク質、または例えば、アミノ酸、タンパク質加水分解産物、およびペプチド（部分的に加水分解されたタンパク質）などのそれらのサブユニット；ならびにそれらの混合物および誘導体が挙げられる。好ましくは、本発明による「アシル受容体」は水ではない。
【０２２０】
アシル受容体は、好ましくは、モノグリセリドではない。
【０２２１】
一実施形態において、アシル受容体はジグリセリドであり得る。
【０２２２】
一態様において、本発明の方法および／または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくは、アシル基を脂質からステロールおよび／またはスタノールへ転移させることができる。
【０２２３】
別の態様において、本発明の方法および／または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基を脂質からステロールおよび／またはスタノールへ転移させることができるだけでなく、加えて、アシル基を脂質から以下のうちの１つまたは複数へ転移させることができる：炭水化物、タンパク質、タンパク質サブユニット、グリセロール、脂肪アルコール。
【０２２４】
適切には、アシル受容体は、油において自然に見出すことができる。あるいは、アシル受容体を油に付加してもよい（例えば、アシル受容体は油にとって外来性であってもよい）。例えば、いくつかの実施形態において、ステロールおよび／またはスタノールは、脱ガムプロセスの前または間に油に付加してもよい。これは、アシル受容体の量がアシルトランスフェラーゼ反応への律速である場合には、特に重要である。アシル受容体の添加は、アシル受容体が添加されない場合の油と比較して、遊離脂肪酸の低下および／またはアシル受容体エステルのより高い形成をもたらすことができる。
【０２２５】
好ましくは、脂質アシルが作用する脂質基質は、以下の脂質の１つまたは複数である：レシチン、例えば、ホスファチジルコリンおよび／またはホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質。
【０２２６】
この脂質基質は、本明細書では、「脂質アシル供与体」と呼ぶ場合がある。本明細書で用いられる場合、用語「レシチン」は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールを含む。
【０２２７】
本発明に用いる好ましい脂質アシルトランスフェラーゼは、油環境におけるリン脂質への高いリン脂質加水分解性活性または高いリン脂質トランスフェラーゼ活性などの高活性を有するものとして同定され、最も好ましくは、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、リン脂質からステロールへの高いトランスフェラーゼ活性を有する。
【０２２８】
上記で詳述しているように、本発明の方法に用いるのに適した他のアシルトランスフェラーゼは、ｐＦａｍ００６５７コンセンサス配列（配列番号１）のアラインメントおよび／またはＧＤＳｘアシルトランスフェラーゼ、例えば、配列番号２８に対するアラインメントによってＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ、およびＨＰＴブロックの存在を同定することにより同定することができる。脱ガムについてのそれらの適合性を評価する、すなわち、全酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９８％のトランスフェラーゼ活性を有する酵素を同定するために、そのようなアシルトランスフェラーゼは、本明細書の上記に詳述された「％アシルトランスフェラーゼ活性の決定のためのプロトコール」アッセイを用いて試験される。
【０２２９】
いくつかの態様について、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドおよび／または１−モノグリセリドおよび／または２−モノグリセリドに作用する能力がない、または実質的に能力がない脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２３０】
いくつかの態様について、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さない、または有意なトリアシルグリセロールリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）を示さない脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２３１】
トリグリセリドを加水分解する能力（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３活性）は、オリーブ油およびｐＨ６．５の代わりに、ヒマワリ油およびｐＨ５．５へと改変されたＦｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｄｅｘ（第３版、１９８１年、４９２〜４９３頁）に従って決定されるリパーゼ活性によって決定することができる。リパーゼ活性は、ＬＵＳ（リパーゼ単位ヒマワリ）として測定され、１ＬＵＳは、上記のアッセイ条件下で、ヒマワリ油から１分間当たり１μモルの脂肪酸を遊離することができる酵素量として定義される。あるいは、ＷＯ９８４５４５３に定義されているようなＬＵＴアッセイを用いてもよい。この参考文献は、参照により本明細書に組み入れられている。
【０２３２】
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドに作用する能力が実質的にない脂質アシルトランスフェラーゼであり得、１０００未満のＬＵＳ／ｍｇ、例えば、３００ＬＵＳ／ｍｇ未満などの５００ＬＵＳ／ｍｇ未満、好ましくは２００ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは１００ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは５０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは２０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは、５ＬＵＳ／ｍｇ未満、２ＬＵＳ／ｍｇ未満などの１０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは１ＬＵＳ／ｍｇ未満を有し得る。あるいは、ＬＵＴ／ｍｇ活性は、３００ＬＵＳ／ｍｇ未満などの５００ＬＵＳ／ｍｇ未満、好ましくは２００ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは１００ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは５０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは２０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは、５ＬＵＳ／ｍｇ未満、２ＬＵＳ／ｍｇ未満などの１０ＬＵＳ／ｍｇ未満、より好ましくは１ＬＵＳ／ｍｇ未満である。
【０２３３】
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、モノグリセリドに作用する能力が実質的にない脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。これは、ＬＵＳアッセイにおいてヒマワリ油の代わりに、モノオレエート（Ｍ７７６５  １−オレオイル−ｒａｃ−グリセロール９９％）を用いることによって決定することができる。１ＭＧＨＵは、アッセイ条件下でモノグリセリドから１分間当たり１μモルの脂肪酸を遊離することができる酵素量として定義される。
【０２３４】
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドに作用する能力が好ましくは実質的にない脂質アシルトランスフェラーゼであり、５０００未満のＭＧＨＵ／ｍｇ、例えば、１０００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、例えば、３００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満などの５００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、好ましくは２００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは１００ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは５０ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは２０ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは、５ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、２ＭＧＨＵ／ｍｇ未満などの１０ＭＧＨＵ／ｍｇ未満、より好ましくは１ＭＧＨＵ／ｍｇ未満を有し得る。
【０２３５】
適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、その脂質アシルトランスフェラーゼ活性に加えて、以下のホスホリパーゼ活性の１つまたは複数も示し得る脂質アシルトランスフェラーゼである：ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）および／またはホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）。脂質アシルトランスフェラーゼはまた、ホスホリパーゼＢ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．５）を有してもよい。
【０２３６】
適切には、いくつかの態様について、脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基をリン脂質からスタノールおよび／またはステロール、好ましくはコレステロールへ転移させる能力があり得る。
【０２３７】
いくつかの態様について、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、アシル基をリン脂質からステロールおよび／またはスタノールへ転移させ、少なくともステロールエステルおよび／またはスタノールエステルを形成する能力がある脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
【０２３８】
したがって、一実施形態において、本発明による「アシル受容体」は、植物ステロール／スタノールであり得る。
【０２３９】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の判定基準を用いて特徴付けることができる：
酵素は、脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する；および
酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、ただし、Ｘが以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である。
【０２４０】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、ＬまたはＹである。より好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸは、Ｌである。したがって、好ましくは、本発明による酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＬを含む。
【０２４１】
ＧＤＳＸモチーフは、４個の保存されたアミノ酸で構成される。好ましくは、モチーフ内のセリンは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の触媒性セリンである。適切には、ＧＤＳＸモチーフのセリンは、ＢｒｕｍｌｉｋおよびＢｕｃｋｌｅｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９６年４月、１７８巻７号、２０６０〜２０６４頁）に教示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＳｅｒ−１６に対応する位置にあり得る。
【０２４２】
タンパク質が本発明によるＧＤＳＸモチーフを有するかどうかを決定するために、配列は、好ましくは、参照により本明細書に組み入れられている、ＷＯ２００４／０６４５３７またはＷＯ２００４／０６４９８７に教示された手順に従ってｐｆａｍデータベースの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）と比較される。
【０２４３】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列を用いて整列させることができる（十分な説明として、ＷＯ２００４／０６４５３７またはＷＯ２００４／０６４９８７参照）。
【０２４４】
好ましくは、ｐｆａｍ００６５７ドメインファミリーの隠れマルコフモデルプロファイル（ＨＭＭプロファイル）との正の一致は、本発明によるＧＤＳＬまたはＧＤＳＸドメインの存在を示す。
【０２４５】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列させた場合、本発明の方法または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、以下、ＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、ＨＰＴブロックの少なくとも１個、好ましくは１個より多く、好ましくは２個より多くを有することができる。適切には、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘブロックおよびＧＡＮＤＹブロックを有することができる。あるいは、酵素は、ＧＤＳｘブロックおよびＨＰＴブロックを有してもよい。好ましくは、酵素は、少なくともＧＤＳｘブロックを含む。さらなる詳細について、ＷＯ２００４／０６４５３７またはＷＯ２００４／０６４９８７参照。
【０２４６】
好ましくは、ＧＡＮＤＹモチーフの残基は、ＧＡＮＤＹ、ＧＧＮＤＡ、ＧＧＮＤＬから選択され、最も好ましくはＧＡＮＤＹである。
【０２４７】
好ましくは、Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列した場合、本発明の方法または使用に用いる酵素は、参照Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａポリペプチド配列、すなわち、配列番号１と比較した場合の以下のアミノ酸残基：２８ｈｉｄ、２９ｈｉｄ、３０ｈｉｄ、３１ｈｉｄ、３２ｇｌｙ、３３Ａｓｐ、３４Ｓｅｒ、３５ｈｉｄ、１３０ｈｉｄ、１３１Ｇｌｙ、１３２Ｈｉｄ、１３３Ａｓｎ、１３４Ａｓｐ、１３５ｈｉｄ、３０９Ｈｉｓの少なくとも１個、好ましくは１個より多く、好ましくは２個より多く、好ましくは３個より多く、好ましくは４個より多く、好ましくは５個より多く、好ましくは６個より多く、好ましくは７個より多く、好ましくは８個より多く、好ましくは９個より多く、好ましくは１０個より多く、好ましくは１１個より多く、好ましくは１２個より多く、好ましくは１３個より多く、好ましくは１４個より多くを有する。
【０２４８】
ｐｆａｍ００６５７ＧＤＳＸドメインは、このドメインを有するタンパク質を他の酵素から区別する独特な識別子である。
【０２４９】
ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列は、配列番号２として図３に提示されている。これは、ｐｆａｍファミリー００６５７、データベースバージョン６の同定に由来しており、それはまた、本明細書では、ｐｆａｍ００６５７．６と呼ばれることもある。
【０２５０】
コンセンサス配列は、ｐｆａｍデータベースのさらなるリリースを用いることによってアップデートすることができる（例えば、ＷＯ２００４／０６４５３７またはＷＯ２００４／０６４９８７参照）。
【０２５１】
一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の判断基準を用いて特徴付けることができる脂質アシルトランスフェラーゼである：
（ｉ）酵素は、脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する；
（ｉｉ）酵素は、アミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含み、ただし、Ｘが以下のアミノ酸残基Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数である；
（ｉｉｉ）酵素は、Ｈｉｓ−３０９を含み、または図２および４（配列番号１または配列番号３）に示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＨｉｓ−３０９に対応する位置にヒスチジン残基を含む。
【０２５２】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのアミノ酸残基はＬである。
【０２５３】
配列番号３または配列番号１において、最初の１８個のアミノ酸残基は、シグナル配列を形成する。シグナル配列を含むタンパク質である完全長配列のＨｉｓ−３０９は、そのタンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＨｉｓ−２９１と等しい。
【０２５４】
一実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の触媒性三連構造：Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、およびＨｉｓ−３０９を含み、または図４（配列番号３）もしくは図２（配列番号１）に示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、およびＨｉｓ−３０９に対応する位置に、それぞれ、セリン残基、アスパラギン酸残基、およびヒスチジン残基を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。上記で述べているように、配列番号３または配列番号１に示された配列において、最初の１８個のアミノ酸残基はシグナル配列を形成する。シグナル配列を含むタンパク質である完全長配列のＳｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、およびＨｉｓ−３０９は、そのタンパク質の成熟部分、すなわち、シグナル配列を含まない配列のＳｅｒ−１６、Ａｓｐ−２８８、およびＨｉｓ−２９１と等しい。図３（配列番号２）に示されているように、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列において、活性部位残基は、Ｓｅｒ−７、Ａｓｐ−３４５、およびＨｉｓ−３４８に対応する。
【０２５５】
一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の判断基準を用いて特徴付けることができる脂質アシルトランスフェラーゼである：
酵素は、第１の脂質アシル供与体の本来のエステル結合のアシル部分がアシル受容体に転移されて、新しいエステルを形成するエステル転移活性として定義され得るアシルトランスフェラーゼ活性を有する；および
酵素は、少なくともＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−１３４、およびＨｉｓ−３０９を含み、または配列番号３もしくは配列番号１に示されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素におけるＧｌｙ−３２、Ａｓｐ−３３、Ｓｅｒ−３４、Ａｓｐ−３０６、およびＨｉｓ−３０９、それぞれに対応する位置にグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸、およびヒスチジン残基を含む。
【０２５６】
適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のヌクレオチド配列の１つによってコードすることができる：
（ａ）配列番号３６として示されたヌクレオチド配列（図２９参照）；
（ｂ）配列番号３８として示されたヌクレオチド配列（図３１参照）；
（ｃ）配列番号３９として示されたヌクレオチド配列（図３２参照）；
（ｄ）配列番号４２として示されたヌクレオチド配列（図３５参照）；
（ｅ）配列番号４４として示されたヌクレオチド配列（図３７参照）；
（ｆ）配列番号４６として示されたヌクレオチド配列（図３９参照）；
（ｇ）配列番号４８として示されたヌクレオチド配列（図４１参照）；
（ｈ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列（図５７参照）；
（ｉ）配列番号５０として示されたヌクレオチド配列（図５８参照）；
（ｊ）配列番号５１として示されたヌクレオチド配列（図５９参照）；
（ｋ）配列番号５２として示されたヌクレオチド配列（図６０参照）；
（ｌ）配列番号５３として示されたヌクレオチド配列（図６１参照）；
（ｍ）配列番号５４として示されたヌクレオチド配列（図６２参照）；
（ｎ）配列番号５５として示されたヌクレオチド配列（図６３参照）；
（ｏ）配列番号５６として示されたヌクレオチド配列（図６４参照）；
（ｐ）配列番号５７として示されたヌクレオチド配列（図６５参照）；
（ｑ）配列番号５８として示されたヌクレオチド配列（図６６参照）；
（ｒ）配列番号５９として示されたヌクレオチド配列（図６７参照）；
（ｓ）配列番号６０として示されたヌクレオチド配列（図６８参照）；
（ｔ）配列番号６１として示されたヌクレオチド配列（図６９参照）；
（ｕ）配列番号６２として示されたヌクレオチド配列（図７０参照）；
（ｖ）配列番号６３として示されたヌクレオチド配列（図７１参照）；
（ｗ）または
配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、もしくは配列番号６３として示された配列のいずれか一つと７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列。
【０２５７】
適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号３６、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、または配列番号６３として示された配列のいずれか一つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有し得る。
【０２５８】
一実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、および配列番号６３として示された配列のいずれか一つと７０％以上、好ましくは７５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。適切には、ヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号６２、および配列番号６３として示された配列のいずれか一つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有し得る。
【０２５９】
一実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４９として示された配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列である。
【０２６０】
適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１つまたは複数を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る：
（ｉ）配列番号６８として示されたアミノ酸配列
（ｉｉ）配列番号３として示されたアミノ酸配列
（ｉｉｉ）配列番号４として示されたアミノ酸配列
（ｉｖ）配列番号５として示されたアミノ酸配列
（ｖ）配列番号６として示されたアミノ酸配列
（ｖｉ）配列番号７として示されたアミノ酸配列
（ｖｉｉ）配列番号８として示されたアミノ酸配列
（ｖｉｉｉ）配列番号９として示されたアミノ酸配列
（ｉｘ）配列番号１０として示されたアミノ酸配列
（ｘ）配列番号１１として示されたアミノ酸配列
（ｘｉ）配列番号１２として示されたアミノ酸配列
（ｘｉｉ）配列番号１３として示されたアミノ酸配列
（ｘｉｉｉ）配列番号１４として示されたアミノ酸配列
（ｘｉｖ）配列番号１として示されたアミノ酸配列
（ｘｖ）配列番号１５として示されたアミノ酸配列
（ｘｖｉ）配列番号１６として示されたアミノ酸配列
（ｘｖｉｉ）配列番号１７として示されたアミノ酸配列
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１８として示されたアミノ酸配列
（ｘｉｘ）配列番号３４として示されたアミノ酸配列
（ｘｘ）配列番号３５として示されたアミノ酸配列、または
配列番号６８、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、もしくは配列番号３５として示された配列のいずれか一つと７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０２６１】
適切には、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６８、もしくは配列番号３、もしくは配列番号４、もしくは配列番号１、もしくは配列番号１５、もしくは配列番号１６、もしくは配列番号３４、もしくは配列番号３５として示されたアミノ酸配列を含むか、または配列番号６８として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号３として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号４として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号１として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号１５として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号１６として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号３４として示されたアミノ酸配列、もしくは配列番号３５として示されたアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むかのいずれかである脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２６２】
適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号６８、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号３４、または配列番号３５として示された配列のいずれか一つと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２６３】
適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１つまたは複数を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る：
（ａ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基１〜１００位として示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基１０１〜２００位として示されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基２０１〜３００位として示されたアミノ酸配列；または
（ｄ）上記の（ａ）〜（ｃ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか一つに対して７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０２６４】
適切には、本発明の方法および使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下のアミノ酸配列の１つまたは複数を含み得る：
（ａ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基２８〜３９位として示されたアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基７７〜８８位として示されたアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基１２６〜１３６位として示されたアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基１６３〜１７５位として示されたアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号３もしくは配列番号１のアミノ酸残基３０４〜３１１位として示されたアミノ酸配列；または
（ｆ）上記の（ａ）〜（ｅ）に定義されたアミノ酸配列のいずれか一つに対して７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
【０２６５】
一態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ＥＰ１２７５７１１に教示されているようなＣａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来の脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。したがって、一態様において、本発明の方法および使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１７または配列番号１８に教示されたアミノ酸配列の１つを含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２６６】
非常に好ましくは、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１６として示されたアミノ酸配列、または配列番号１６に対して７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。この酵素は、変種酵素とみなすことができる。
【０２６７】
一態様において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、レシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）またはその変種（例えば、分子進化によって生じた変種）であり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２６８】
適切なＬＣＡＴは、当技術分野において公知であり、例えば、以下の生物体、哺乳動物、ラット、マウス、ニワトリ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａを含む植物、線虫、真菌、ならびに酵母の１つまたは複数から得ることができる。
【０２６９】
一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、それぞれ、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１２０４およびＮＣＩＭＢ  ４１２０５として、２００３年１２月２２日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｍａｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）、２３  Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ  Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＧＢにおいて特許手続きのための微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下、Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ  １、ＤＫ−１００１  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ｋ、ＤｅｎｍａｒｋのＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓによって寄託されたｐＰｅｔ１２ａＡｈｙｄｒｏおよびｐＰｅｔ１２ａＡＳａｌｍｏを有するＥ．ｃｏｌｉ菌株ＴＯＰ  １０から獲得可能な、好ましくは獲得された脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２７０】
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、リン脂質グリセロールアシルトランスフェラーゼであってもよい。リン脂質グリセロールアシルトランスフェラーゼとして、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ種、好ましくは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａもしくはＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、最も好ましくはＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａから単離されたもの、またはそれらの変種が挙げられる。
【０２７１】
本発明に用いる最も好ましい脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１、３、４、１５、１６、３４、および３５によってコードされる。アシルトランスフェラーゼのシグナルペプチドがトランスフェラーゼの発現中に切断されていることが好ましいことを、当業者は認識しているであろう。配列番号１、３、４、１５、および１６のシグナルペプチドは、アミノ酸１〜１８位である。それゆえに、最も好ましい領域は、配列番号１および配列番号３（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）についてのアミノ酸１９〜３３５位、ならびに配列番号４、配列番号１５、および配列番号１６（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）についてのアミノ酸１９〜３３６位である。アミノ酸配列の相同性または同一性を決定するために用いる場合、本明細書に記載されているようなアラインメントは、成熟配列を用いることが好ましい。
【０２７２】
一実施形態において、適切には、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号１６に示されたアミノ酸配列を含み（またはアミノ酸配列からなり）、または配列番号１６に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（またはアミノ酸配列からなる）。
【０２７３】
一実施形態において、適切には、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号６８に示されたアミノ酸配列を含む（またはアミノ酸配列からなる）、または配列番号６８に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む（またはアミノ酸配列からなる）アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【０２７４】
したがって、相同性（同一性）を決定するための最も好ましい領域は、配列番号１および配列番号３（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ）についてのアミノ酸１９〜３３５位、ならびに配列番号４、１５、および１６（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）についてのアミノ酸１９〜３３６位である。配列番号３４および３５は、さらなる翻訳後修飾を受ける場合もあるし、受けない場合もある、それぞれ、Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａおよびＡ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ由来の脂質アシルトランスフェラーゼの成熟タンパク質配列である。
【０２７５】
本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、好ましくはＴ．ｆｕｓｃａからも単離することができる脂質アシルトランスフェラーゼであり得、最も好ましくは配列番号２８によってコードされたものである。
【０２７６】
本発明に従って、および／または本発明の方法において用いる適切な脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列のいずれか一つを含み得、および／または以下のヌクレオチド配列によってコードされ得る：
ａ）脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードし、かつ配列番号１６に示されたポリペプチド配列と、または配列番号６８に示されたポリペプチドと少なくとも７０％同一（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一）である核酸；
ｂ）配列番号１６もしくは配列番号６８に示されたアミノ酸配列、または配列番号１６もしくは配列番号６８と少なくとも７０％同一（好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一）であるアミノ酸配列を含む（またはアミノ酸配列からなる）（単離された）ポリペプチド；
ｃ）脂質アシルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、配列番号４９として示されたヌクレオチド配列、または配列番号４９として示されたヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一（好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一）であるヌクレオチド配列を含む（またはヌクレオチド配列からなる）核酸；
ｄ）配列番号４９として示されたヌクレオチド配列を含む核酸プローブに中程度または高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつ脂質アシルトランスフェラーゼ活性を示すポリペプチドをコードする核酸；
ｅ）ａ）、ｃ）、またはｄ）に特定された核酸配列の断片である核酸；または
ｆ）ｂ）に特定されたポリペプチドの断片であるポリペプチド。
【０２７７】
本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、好ましくはＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｓからも単離することができる脂質アシルトランスフェラーゼであり得、最も好ましくは、配列番号３２によってコードされたものである。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ由来の本発明に用いる他の可能な酵素として、配列番号５、６、９、１０、１１、１２、１３、１４、３１、および３３によってコードされたものが挙げられる。
【０２７８】
本発明に用いる酵素は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、好ましくはＣ．ｅｆｆｉｃｉｅｎｓからも単離することができ、最も好ましくは、配列番号２９によってコードされたものである。
【０２７９】
適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３７、３８、４０、４１、４３、４５、もしくは４７として示されたアミノ酸配列のいずれか一つ、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得、または配列番号３６、３９、４２、４４、４６、もしくは４８として示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２８０】
一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列は、以下からなる群から選択される：
ａ）配列番号３６に示されたヌクレオチド配列を含む核酸；
ｂ）遺伝暗号の縮重によって配列番号のヌクレオチド配列に関連している核酸；および
ｃ）配列番号３６に示されたヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。
【０２８１】
一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３７に示されたアミノ酸配列、またはそれに対して少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼである。
【０２８２】
さらなる実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３７、３８、４０、４１、４３、４５、もしくは４７として示されたアミノ酸配列のいずれか一つ、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得、または配列番号３９、４２、４４、４６、もしくは４８として示されたヌクレオチド配列のいずれか一つ、またはそれらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【０２８３】
さらなる実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号３８、４０、４１、４５、もしくは４７として示されたアミノ酸配列のいずれか一つ、または本明細書に記載された使用のための、それらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２８４】
さらなる実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３８、４０、もしくは４７として示されたアミノ酸配列のいずれか一つ、または本明細書に記載された使用のための、それらと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２８５】
より好ましくは一実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４７として示されたアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２８６】
別の実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４３もしくは４４として示されたアミノ酸配列、またはそれらと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２８７】
別の実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号４１として示されたアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、もしくは９８％同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２８８】
一実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、以下からなる群から選択される核酸によってコードされ得る：
ａ）配列番号３６に示されたヌクレオチド配列を含む核酸；
ｂ）遺伝暗号の縮重によって配列番号３６のヌクレオチド配列に関連している核酸；および
ｃ）配列番号３６に示されたヌクレオチド配列と少なくとも７０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。
【０２８９】
一実施形態において、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、それぞれ、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ  ４１２２６およびＮＣＩＭＢ  ４１２２７として、２００４年６月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ，Ｍａｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（ＮＣＩＭＢ）、２３  Ｓｔ．Ｍａｃｈａｒ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ  Ｓｃｏｔｌａｎｄ、ＧＢにおいて特許手続きのための微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下、Ｌａｎｇｅｂｒｏｇａｄｅ  １、ＤＫ−１００１  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ｋ、ＤｅｎｍａｒｋのＤａｎｉｓｃｏ  Ａ／Ｓによって寄託されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株Ｌ１３０またはＬ１３１から獲得可能な、好ましくは獲得された脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２９０】
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする適切なヌクレオチド配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド（配列番号１６または配列番号６８）をコードし得、または脂質アシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列（配列番号１６または配列番号６８）をコードし得る。
【０２９１】
本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる適切な脂質アシルトランスフェラーゼは、デフォルト設定を用いるＶｅｃｔｏｒＮＴＩのＣｌｕｓｔａｌＷペアワイズアラインメントアルゴリズムという、Ａｌｉｇｎ  Ｘを用いるＬ１３１（配列番号３７）配列に対するアラインメントによって同定することができるアミノ酸配列であり得る。
【０２９２】
Ｌ１３１と、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓおよびＴ．ｆｕｓｃａ由来の相同体とのアラインメントにより、ＧＤＳｘモチーフ（Ｌ１３１およびＳ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓおよびＴ．ｆｕｓｃａにおけるＧＤＳＹ）、ＧＧＮＤＡかまたはＧＧＮＤＬのいずれかであるＧＡＮＤＹボックス、および（保存された触媒性ヒスチジンであると考えられる）ＨＰＴブロックの保存が示されている。これらの３つの保存されたブロックは、図４２に強調表示されている。
【０２９３】
（ＷＯ０４／０６４９８７に記載されているような）ｐｆａｍ  Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列および／または本明細書に開示されたＬ１３１配列（配列番号３７）に対して整列させた場合、３つの保存された領域、ＧＤＳｘブロック、ＧＡＮＤＹブロック、およびＨＴＰブロックを同定することが可能である（さらなる詳細についてはＷＯ０４／０６４９８７参照）。
【０２９４】
（ＷＯ０４／０６４９８７に記載されているような）ｐｆａｍ  Ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列および／または本明細書に開示されたＬ１３１配列（配列番号３７）に対して整列させた場合、
ｉ）本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘモチーフ、より好ましくは、ＧＤＳＬもしくはＧＤＳＹモチーフから選択されたＧＤＳｘモチーフを有する脂質アシルトランスフェラーゼであり得、
ならびに／または
ｉｉ）本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＡＮＤＹブロック、より好ましくは、アミノＧＧＮＤｘ、より好ましくはＧＧＮＤＡもしくはＧＧＮＤＬを含むＧＡＮＤＹブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼであり得、
ならびに／または
ｉｉｉ）本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、好ましくはＨＴＰブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼであり得、
ならびに、好ましくは、
ｉｖ）本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、ＧＤＳｘもしくはＧＤＳＹモチーフ、およびアミノＧＧＮＤｘ、好ましくはＧＧＮＤＡもしくはＧＧＮＤＬを含むＧＡＮＤＹブロック、およびＨＴＰブロック（保存されたヒスチジン）を好ましくは有する脂質アシルトランスフェラーゼであり得る。
【０２９５】
一実施形態において、本発明による酵素は、好ましくは、Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２として分類されるホスホリパーゼＡ１またはＥ．Ｃ．３．１．１．４として分類されるホスホリパーゼＡ２などのホスホリパーゼ酵素でなくてもよい。
【０２９６】
変種脂質アシルトランスフェラーゼ
好ましい実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、変種脂質アシルトランスフェラーゼである脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
【０２９７】
加水分解活性の増加および／またはトランスフェラーゼ活性の増加、好ましくはリン脂質へのトランスフェラーゼ活性の増加などのリン脂質への活性が増加している変種を用いることができる。
【０２９８】
好ましくは、変種脂質アシルトランスフェラーゼは、本明細書の上記で定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼの１つまたは複数のアミノ酸改変によって調製される。
【０２９９】
適切には、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、変種脂質アシルトランスフェラーゼであり得る脂質アシルトランスフェラーゼであり得、その場合、その酵素は、酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含む点で特徴付けることができ、ただし、Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数であり、かつ変種酵素は、（ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記に定義されているような）セット２、またはセット４、またはセット６、またはセット７に定義されたアミノ酸残基の任意の１つまたは複数において、親配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
【０３００】
例えば、変種脂質アシルトランスフェラーゼは、その酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含むことを特徴とすることができ、ただし、Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数であり、かつ変種酵素は、親配列を本明細書で定義されたＰ１０４８０の構造モデルと構造的に整列させることによって同定され、好ましくは、ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記に定義されているような１ＩＶＮ．ＰＤＢおよび／または１ＤＥＯ．ＰＤＢでのＰ１０４８０結晶構造座標の構造アラインメントによって得られる、（ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記に定義されているような）セット２またはセット４またはセット６またはセット７に詳述されたアミノ酸残基の任意の１つまたは複数において、親配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
【０３０１】
さらなる実施形態において、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、その酵素がアミノ酸配列モチーフＧＤＳＸを含むことを特徴とすることができる変種脂質アシルトランスフェラーゼであり得、ただし、Ｘは、以下のアミノ酸残基、Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｍ、またはＳの１つまたは複数であり、かつ変種酵素は、ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記に定義されているように、親配列をｐｆａｍコンセンサス配列（配列番号２−図３）に対して整列させ、最良適合重複を保証するようにＰ１０４８０の構造モデルに従って改変した場合に同定されたセット２に教示されるアミノ酸残基の任意の１つまたは複数において、親配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸改変を含む。
【０３０２】
適切には、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、配列番号３４との配列アラインメントによって同定された（ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記に定義されているような）セット２またはセット４またはセット６またはセット７に定義されたアミノ酸残基の任意の１つまたは複数において１つまたは複数のアミノ酸改変を除けば、配列番号６８、配列番号１６、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含み得る変種脂質アシルトランスフェラーゼ酵素であり得る。
【０３０３】
あるいは、脂質アシルトランスフェラーゼは、親配列を本明細書で定義されたＰ１０４８０の構造モデルと構造的に整列させることによって同定され、好ましくは、ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記内に教示されているような１ＩＶＮ．ＰＤＢおよび／または１ＤＥＯ．ＰＤＢでのＰ１０４８０結晶構造座標の構造アラインメントによって得られる、ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記に定義されているようなセット２またはセット４またはセット６またはセット７に定義されたアミノ酸残基の任意の１つまたは複数における１つまたは複数のアミノ酸改変を除けば、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号１６、配列番号６８、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含む変種脂質アシルトランスフェラーゼ酵素であり得る。
【０３０４】
あるいは、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記内に教示されているように、親配列をｐｆａｍコンセンサス配列（配列番号２）に対して整列させ、最良適合重複を保証するようにＰ１０４８０の構造モデルに従って改変した場合に同定されたセット２に教示されるアミノ酸残基の任意の１つまたは複数における１つまたは複数のアミノ酸改変を除けば、配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号１６、配列番号６８、または配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含む変種脂質アシルトランスフェラーゼ酵素であり得る。
【０３０５】
好ましくは、親酵素は、配列番号３４および／または配列番号１５および／または配列番号３５として示されたアミノ酸配列を含む、またはアミノ酸配列と相同である酵素である。
【０３０６】
好ましくは、脂質アシルトランスフェラーゼは、ＷＯ２００５／０６６３４７および本明細書の下記に定義されているようなセット２またはセット４またはセット６またはセット７に定義されたアミノ酸残基の任意の１つまたは複数における１つまたは複数のアミノ酸改変を除けば、配列番号３４または配列番号３５として示されるアミノ酸配列を含む変種酵素であり得る。
【０３０７】
セットの定義
アミノ酸セット１：
アミノ酸セット１（これらは１ＩＶＮ（図５３および図５４）におけるアミノ酸であることに留意されたい）
Ｇｌｙ８、Ａｓｐ９、Ｓｅｒ１０、Ｌｅｕ１１、Ｓｅｒ１２、Ｔｙｒ１５、Ｇｌｙ４４、Ａｓｐ４５、Ｔｈｒ４６、Ｇｌｕ６９、Ｌｅｕ７０、Ｇｌｙ７１、Ｇｌｙ７２、Ａｓｎ７３、Ａｓｐ７４、Ｇｌｙ７５、Ｌｅｕ７６、Ｇｌｎ１０６、Ｉｌｅ１０７、Ａｒｇ１０８、Ｌｅｕ１０９、Ｐｒｏ１１０、Ｔｙｒ１１３、Ｐｈｅ１２１、Ｐｈｅ１３９、Ｐｈｅ１４０、Ｍｅｔ１４１、Ｔｙｒ１４５、Ｍｅｔ１５１、Ａｓｐ１５４、Ｈｉｓ１５７、Ｇｌｙ１５５、Ｉｌｅ１５６、Ｐｒｏ１５８
ＧＤＳｘおよび触媒性残基などの高度に保存されたモチーフをセット１から除外した（下線を引いた残基）。誤解を避けるために言えば、セット１は、１ＩＶＮモデルの活性部位におけるグリセロールの中央の炭素原子の１０Å以内のアミノ酸残基を定義する。
【０３０８】
アミノ酸セット２：
アミノ酸セット２（アミノ酸の番号付けは、Ｐ１０４８０成熟配列におけるアミノ酸を参照していることに留意されたい）
Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、およびＶａｌ２９０。
【０３０９】
セット２と比較したセット１における選択された残基の表
【０３１０】
【表９−１】
0005509094.tif 000008
【０３１１】
【表９−２】
0005509094.tif 000009
アミノ酸セット３：
アミノ酸セット３は、セット２と同一であるが、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ（配列番号４）コード配列を参照する、すなわち、これが、シグナル配列を含むタンパク質（配列番号２５）と比較しての成熟タンパク質（配列番号３４）におけるアミノ酸番号付けの間での違いを反映しているため、アミノ酸残基番号はセット３において１８大きい。
【０３１２】
Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  ＧＤＳＸ（配列番号４）およびＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ  ＧＤＳＸ（配列番号３４）の成熟タンパク質は、５個のアミノ酸で異なる。これらは、Ｔｈｒ３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１８２Ｌｙｓ、Ｇｌｕ３０９Ａｌａ、Ｓｅｒ３１０Ａｓｎ、およびＧｌｙ３１８−であり、ただし、ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ残基が最初に挙げられ、ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ残基が最後に挙げられている。ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａタンパク質は、３１７アミノ酸長のみで、位置３１８において残基を欠く。Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ  ＧＤＳＸは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａタンパク質よりガラクト脂質基質などの極性脂質へのかなり高い活性を有する。部位スキャニングを、全ての５個のアミノ酸位置について行った。
【０３１３】
アミノ酸セット４：
アミノ酸セット４はＳ３、Ｑ１８２、Ｅ３０９、Ｓ３１０、および−３１８である。
【０３１４】
アミノ酸セット５：
Ｆ１３Ｓ、Ｄ１５Ｎ、Ｓ１８Ｇ、Ｓ１８Ｖ、Ｙ３０Ｆ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６Ｅ、Ｄ１５７Ｎ、Ｙ２２６Ｆ、Ｄ２２８Ｎ、Ｙ２３０Ｆ。
【０３１５】
アミノ酸セット６：
アミノ酸セット６は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８である。
【０３１６】
セット６におけるアミノ酸の番号付けは、Ｐ１０４８０におけるアミノ酸残基（配列番号２５）を参照する−他の配列バックボーンにおける対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０および／または１ＩＶＮに対する相同性アラインメントおよび／または構造アラインメントによって決定することができる。
【０３１７】
アミノ酸セット７：
アミノ酸セット７は、Ｓｅｒ３、Ｌｅｕ１７、Ｌｙｓ２２、Ｍｅｔ２３、Ｇｌｙ４０、Ａｓｎ８０、Ｐｒｏ８１、Ｌｙｓ８２、Ａｓｎ８７、Ａｓｎ８８、Ｔｒｐ１１１、Ｖａｌ１１２、Ａｌａ１１４、Ｔｙｒ１１７、Ｌｅｕ１１８、Ｐｒｏ１５６、Ｇｌｙ１５９、Ｇｌｎ１６０、Ａｓｎ１６１、Ｐｒｏ１６２、Ｓｅｒ１６３、Ａｌａ１６４、Ａｒｇ１６５、Ｓｅｒ１６６、Ｇｌｎ１６７、Ｌｙｓ１６８、Ｖａｌ１６９、Ｖａｌ１７０、Ｇｌｕ１７１、Ａｌａ１７２、Ｔｙｒ１７９、Ｈｉｓ１８０、Ａｓｎ１８１、Ｇｌｎ１８２、Ｍｅｔ２０９、Ｌｅｕ２１０、Ａｒｇ２１１、Ａｓｎ２１５、Ｌｙｓ２８４、Ｍｅｔ２８５、Ｇｌｎ２８９、Ｖａｌ２９０、Ｇｌｕ３０９、Ｓｅｒ３１０、−３１８、Ｙ３０Ｘ（ＸはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷから選択される）、Ｙ２２６Ｘ（ＸはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷから選択される）、Ｙ２３０Ｘ（ＸはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷから選択される）、Ｓ１８Ｘ（ＸはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、またはＹから選択される）、Ｄ１５７Ｘ（ＸはＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹから選択される）である。
【０３１８】
セット７におけるアミノ酸の番号付けは、Ｐ１０４８０におけるアミノ酸残基（配列番号２５）を参照する−他の配列バックボーンにおける対応するアミノ酸は、Ｐ１０４８０および／または１ＩＶＮに対する相同性アラインメントおよび／または構造アラインメントによって決定することができる。
【０３１９】
適切には、変種酵素は、親酵素と比較して以下のアミノ酸改変の１つまたは複数を含む：
Ｓ３Ｅ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｍ、Ｙ、Ｒ、Ｐ、Ｎ、Ｔ、またはＧ
Ｅ３０９Ｑ、Ｒ、またはＡ、好ましくはＱまたはＲ
−３１８Ｙ、Ｈ、Ｓ、またはＹ、好ましくはＹ。
【０３２０】
好ましくは、ＧＤＳＸモチーフのＸはＬである。したがって、好ましくは、親酵素はアミノ酸モチーフＧＤＳＬを含む。
【０３２１】
適切には、前記の最初の親の脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列のいずれか一つを含み得る：配列番号３４、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３５。
【０３２２】
適切には、前記の第２の関連脂質アシルトランスフェラーゼは、以下のアミノ酸配列のいずれか一つを含み得る：配列番号３、配列番号３４、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、または配列番号３５。
【０３２３】
変種酵素は、親酵素と比較して少なくとも１個のアミノ酸改変を含まなければならない。いくつかの実施形態において、変種酵素は、親酵素と比較して少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも６個、好ましくは少なくとも７個、好ましくは少なくとも８個、好ましくは少なくとも９個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸改変を含んでもよい。
【０３２４】
本明細書において特定のアミノ酸残基に言及する場合、番号付けは、配列番号３４または配列番号３５として示された参照配列との変種配列のアラインメントから得られるものである。
【０３２５】
一態様において、好ましくは、変種酵素は、以下のアミノ酸置換の１つまたは複数を含む：
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｌ１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｓ１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｙ３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、もしくはＷ；および／または
Ｇ４０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｋ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｗ１１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ａ１１４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｙ１１７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、もしくはＷ；および／または
Ｌ１１８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｐ１５６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｇ１５９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｑ１６０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｎ１６１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｐ１６２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｓ１６３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ａ１６４Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｒ１６５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｓ１６６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｑ１６７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｋ１６８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｖ１６９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｖ１７０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｅ１７１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ａ１７２Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、もしくはＷ；および／または
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｎ１８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｑ１８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ、好ましくはＫ；および／または
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｙ２２６Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、もしくはＷ；および／または
Ｙ２３０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、もしくはＷ；および／または
Ｋ２８４Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｍ２８５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｖ２９０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ；および／または
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、もしくはＹ。
【０３２６】
それらに加えて、またはそれらの代替として、１個または複数のＣ末端伸張があってもよい。好ましくは、追加のＣ末端伸張は、１個または複数の脂肪族アミノ酸、好ましくは非極性アミノ酸、より好ましくはＩ、Ｌ、Ｖ、またはＧで構成される。したがって、本発明はさらに、以下のＣ末端伸張、３１８Ｉ、３１８Ｌ、３１８Ｖ、３１８Ｇの１つまたは複数を含む変種酵素を提供する。
【０３２７】
好ましい変種酵素は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質に対する加水分解性活性が減少し得、またリン脂質からのトランスフェラーゼ活性が増加し得る。
【０３２８】
好ましい変種酵素は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）などのリン脂質からのトランスフェラーゼ活性が増加し得、これらはまた、リン脂質に対する加水分解性活性が増加し得る。
【０３２９】
以下の残基の１つまたは複数の改変は、リン脂質に対する絶対的トランスフェラーゼ活性が増加している変種酵素を生じることができる：
Ｓ３、Ｄ１５７、Ｓ３１０、Ｅ３０９、Ｙ１７９、Ｎ２１５、Ｋ２２、Ｑ２８９、Ｍ２３、Ｈ１８０、Ｍ２０９、Ｌ２１０、Ｒ２１１、Ｐ８１、Ｖ１１２、Ｎ８０、Ｌ８２、Ｎ８８；Ｎ８７
リン脂質からのトランスフェラーゼ活性が向上している変種酵素を提供することができる特定の好ましい改変は、以下の１つまたは複数から選択することができる：
Ｓ３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、Ａ、Ｐ、またはＭ、最も好ましくは、Ｓ３Ａ
Ｄ１５７Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｄ１５７Ｓ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｑ、Ｋ、またはＣ
Ｓ３１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｓ３１０Ｔ
−３１８Ｅ
Ｅ３０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｅ３０９Ｒ、Ｅ、Ｌ、Ｒ、またはＡ
Ｙ１７９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、またはＷ；好ましくは、Ｙ１７９Ｄ、Ｔ、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、Ｑ、またはＳ、より好ましくは、Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、またはＱ
Ｎ２１５Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｎ２１５Ｓ、Ｌ、Ｒ、またはＹ
Ｋ２２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｋ２２Ｅ、Ｒ、Ｃ、またはＡ
Ｑ２８９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｑ２８９Ｒ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、またはＮ
Ｍ２３Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｍ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、またはＳ
Ｈ１８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｈ１８０Ｑ、Ｒ、またはＫ
Ｍ２０９Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｍ２０９Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ａ、Ｎ、Ｙ、Ｅ、Ｖ、またはＬ
Ｌ２１０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｌ２１０Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、Ｉ、Ｗ、またはＭ
Ｒ２１１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｒ２１１Ｔ
Ｐ８１Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｐ８１Ｇ
Ｖ１１２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｖ１１２Ｃ
Ｎ８０Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｎ８０Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｄ、Ｐ、Ｔ、Ｅ、Ｖ、Ａ、またはＧ
Ｌ８２Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｌ８２Ｎ、Ｓ、またはＥ
Ｎ８８Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｎ８８Ｃ
Ｎ８７Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、またはＹ；好ましくは、Ｎ８７Ｍ、またはＧ
以下の残基の１個または複数の好ましい改変は、リン脂質に対する絶対的トランスフェラーゼ活性が増加している変種酵素を生じる：
Ｓ３Ｎ、Ｒ、Ａ、Ｇ
Ｍ２３Ｋ、Ｑ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｓ
Ｈ１８０Ｒ
Ｌ８２Ｇ
Ｙ１７９Ｅ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ｋ、またはＱ
Ｅ３０９Ｒ、Ｓ、Ｌ、またはＡ
一つの好ましい改変はＮ８０Ｄである。これは、特に、参照配列の配列番号３５をバックボーンとして用いる場合である。したがって、参照配列は、配列番号１６であってもよい。この改変は、１つまたは複数のさらなる改変と組み合わせてもよい。それゆえに、本発明の好ましい実施形態において、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３５、または配列番号３５に対して７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
【０３３０】
上記で述べたように、本明細書で特定のアミノ酸残基に言及する場合、番号付けは、配列番号３４または配列番号３５として示された参照配列との変種配列のアラインメントから得られるものである。
【０３３１】
非常に好ましくは、本発明の方法および使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６として示されたアミノ酸配列、または配列番号６８として示されたアミノ酸配列、または配列番号１６もしくは配列番号６８に対して７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む脂質をコードし得る。この酵素は変種酵素とみなすことができる。
【０３３２】
本発明の目的にとって、同一性の程度は、同じである配列要素の数に基づいている。アミノ酸配列についての本発明による同一性の程度は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）などの当技術分野において公知のコンピュータプログラムを用いて適切に決定することができる。ペアワイズアラインメントについて、用いられるスコアは、好ましくは、１０．０のギャップ開始ペナルティおよび０．１のギャップ伸張ペナルティでのＢＬＯＳＵＭ６２である。
【０３３３】
適切には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、少なくとも２０個の連続したアミノ酸に対して、好ましくは少なくとも３０個の連続したアミノ酸に対して、好ましくは少なくとも４０個の連続したアミノ酸に対して、好ましくは少なくとも５０個の連続したアミノ酸に対して、好ましくは少なくとも６０個の連続したアミノ酸に対して、決定される。
【０３３４】
適切には、アミノ酸配列に関する同一性の程度は、配列全体に対して決定することができる。
【０３３５】
適切には、本発明に用いる、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列または脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の属の１つまたは複数由来の生物体から獲得可能、好ましくは獲得することができる：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｘｙｌｅｌｌａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ。
【０３３６】
適切には、本発明に用いる、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列または脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、以下の生物体の１つまたは複数から獲得可能、好ましくは獲得することができる：Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｘｙｌｅｌｌａ  ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ。
【０３３７】
一態様において、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ種、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、またはＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの１つまたは複数から獲得可能、好ましくは、獲得され、またはそれらに由来する、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ酵素をコードする。
【０３３８】
一態様において、好ましくは、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ種、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ、またはＡｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａの１つまたは複数から獲得可能、好ましくは、獲得され、またはそれらに由来する脂質アシルトランスフェラーゼ酵素である。
【０３３９】
本明細書に用いられる場合、用語「トランスフェラーゼ」は、用語「脂質アシルトランスフェラーゼ」と交換可能である。
【０３４０】
適切には、本明細書で定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の反応、エステル交換、エステル転移、加アルコール分解、加水分解の１つまたは複数を触媒する。
【０３４１】
用語「エステル交換」とは、脂質供与体と脂質受容体との間でのアシル基の酵素触媒転移を指し、ただし、その脂質供与体は遊離アシル基ではない。
【０３４２】
本明細書で用いられる場合、用語「エステル転移」とは、（遊離脂肪酸以外の）脂質供与体から（水以外の）アシル受容体へのアシル基の酵素触媒転移を意味する。
【０３４３】
本明細書で用いられる場合、用語「加アルコール分解」とは、アルコールＲＯＨとの反応による酸誘導体の共有結合の酵素的切断を指し、その生成物の一方がアルコールのＨと結合し、他方の生成物がアルコールのＯＲ基と結合している。
【０３４４】
本明細書に用いられる場合、用語「アルコール」とは、ヒドロキシル基を含むアルキル化合物を指す。
【０３４５】
本明細書に用いられる場合、用語「加水分解」とは、脂質から水分子のＯＨ基へのアシル基の酵素触媒転移を指す。
【０３４６】
本明細書に用いられる場合、用語「遊離脂肪酸を増加させることなく、または実質的に増加させることなく」とは、好ましくは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼが１００％トランスフェラーゼ活性を有する（すなわち、加水分解活性なしで、アシル基の１００％をアシル供与体からアシル受容体上へ転移させる）ことを意味する；しかしながら、その酵素は、脂質アシル供与体に存在するアシル基の１００％未満をアシル受容体へ転移させてもよい。その場合、好ましくは、アシルトランスフェラーゼ活性は、全酵素活性の少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、およびより好ましくは少なくとも９８％を占める。％トランスフェラーゼ活性（すなわち、全酵素活性のパーセンテージとしてのトランスフェラーゼ活性）は、上記で示された「トランスフェラーゼ活性のアッセイ」に従うことによって、決定することができる。
【０３４７】
本発明のいくつかの態様において、本明細書に用いられる場合、用語「遊離脂肪酸を実質的に増加させることなく」とは、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼで処理された食用油における遊離脂肪酸量は、例えば、通常のホスホリパーゼ酵素、例えば、Ｌｅｃｉｔａｓｅ  ＵｌｔｒａＴＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）が用いられた場合に生成した遊離脂肪酸量と比較した場合など、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼ以外の酵素が用いられたときに食用油に生成した遊離脂肪酸量より少ないことを意味する。
【０３４８】
生成物または組成物に言及するとき、本明細書に用いられる場合の用語「本質的になる」とは、好ましくは、生成物または組成物が、他の生成物または組成物からなる可能性があるが、最高濃度、好ましくは１０％、例えば５％、例えば３％、例えば２％もしくは１％、または０．５％もしくは０．１％までだけであることを意味する。
【０３４９】
一つの好ましい実施形態において、脂質アシルトランスフェラーゼは、以下の酵素活性の１つまたは複数を有するリパーゼと組み合わせて用いられる：グリコリパーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．２６）、ホスホリパーゼＡ２活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４）、またはホスホリパーゼＡ１活性（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３２）。適切には、リパーゼ酵素は、当技術分野内で周知であり、例として、以下のリパーゼが挙げられる：ホスホリパーゼＡ１  ＬＥＣＩＴＡＳＥ（登録商標）  ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ホスホリパーゼＡ２（例えば、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ製のＬＩＰＯＭＯＤＴＭ２２Ｌ、Ｇｅｎｅｃｏｒ製のＬＩＰＯＭＡＸＴＭおよびＬｙｓｏＭａｘ  ＰＬＡ２ＴＭからのホスホリパーゼＡ２）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）。
【０３５０】
いくつかの実施形態において、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＢ、ホスホリパーゼＣ、および／またはホスホリパーゼＤなどのホスホリパーゼと脂質アシルトランスフェラーゼの使用を組み合わせることは、有益であり得る。
【０３５１】
組み合わされた使用は、連続的に行っても、同時に行ってもよい、例えば、脂質アシルトランスフェラーゼ処理は、さらなる酵素処理の前に起こっても、またはその間に起こってもよい。あるいは、さらなる酵素処理が、脂質アシルトランスフェラーゼ処理の前に起こっても、その間に起こってもよい。
【０３５２】
連続的酵素処理の場合、いくつかの実施形態において、第２（および／または第３など）の酵素での処理の前に、例えば、熱不活性化によって、または固定化酵素の使用によって、用いられた第１の酵素を除去することが有利の場合がある。
【０３５３】
転写後および翻訳後改変
適切には、本発明による脂質アシルトランスフェラーゼは、本明細書に教示されたヌクレオチド配列のいずれか一つによってコードされ得る。
【０３５４】
用いられる宿主細胞に依存して、転写後および／または翻訳後改変を行ってもよい。本発明の方法および／または使用に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、転写後および／または翻訳後改変を受けている脂質アシルトランスフェラーゼを含むことが構想される。
【０３５５】
ほんの一例として、（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどの）宿主細胞における配列番号４９（図５７参照）として本明細書に示されたヌクレオチド配列の発現は、配列番号６８（図７３参照）として本明細書に示されたアミノ酸配列をもたらす転写後および／または翻訳後改変を生じる。
【０３５６】
配列番号６８は、配列番号６８が、３８個のアミノ酸を除去する転写後および／または翻訳後改変を受けていることを除いて、（本明細書の図１に示された）配列番号１６と同じである。
【０３５７】
単離
一態様において、脂質アシルトランスフェラーゼは、回収された／単離された脂質アシルトランスフェラーゼである。したがって、産生された脂質アシルトランスフェラーゼは単離された形であり得る。
【０３５８】
別の態様において、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、単離された形であり得る。
【０３５９】
用語「単離された」とは、配列またはタンパク質が、その配列またはタンパク質が、本来かつ天然で見出される場合、自然に付随している少なくとも１つの他の成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する。
【０３６０】
精製
一態様において、脂質アシルトランスフェラーゼは、精製された形であり得る。
【０３６１】
別の態様において、本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、精製された形であり得る。
【０３６２】
用語「精製された」とは、配列が、相対的に純粋な状態−例えば、少なくとも約５１％純粋、または少なくとも約７５％純粋、または少なくとも約８０％純粋、または少なくとも約９０％純粋、または少なくとも約９５％純粋、または少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
【０３６３】
本発明によるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のクローニング
本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドかまたは改変に適しているポリペプチドかのいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを産生する任意の細胞または生物体から単離することができる。ヌクレオチド配列の単離のための様々な方法が、当技術分野内で周知である。
【０３６４】
例えば、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーは、そのポリペプチドを産生する生物体由来の染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを用いて構築することができる。そのポリペプチドのアミノ酸配列が公知である場合には、標識オリゴヌクレオチドプローブを合成し、それらを用いて、その生物体から調製されたゲノムライブラリーからポリペプチドコード化クローンを同定することができる。あるいは、別の公知のポリペプチド遺伝子と相同の配列を含む標識オリゴヌクレオチオドプローブを用いて、ポリペプチドコード化クローンを同定することができる。後者の場合、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が用いられる。
【０３６５】
あるいは、ポリペプチドコード化クローンは、ゲノムＤＮＡの断片をプラスミドなどの発現ベクターへ挿入し、酵素陰性細菌をその生じたゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換し、その後、形質転換された細菌を、そのポリペプチドによって阻害される酵素を含む寒天上に蒔き、それにより、そのポリペプチドを発現するクローンが同定されるのを可能にすることによって、同定することができる。
【０３６６】
なおさらなる代替として、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、確立された標準方法、例えば、Ｂｅｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．ら（１９８１年）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２巻、１８５９〜１８６９頁に記載されたホスホラミダイト方法、またはＭａｔｔｈｅｓら（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．、３巻、８０１〜８０５頁に記載された方法によって合成的に調製してもよい。ホスホラミダイト方法において、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動ＤＮＡ合成機で合成され、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適当なベクター内でクローン化される。
【０３６７】
ヌクレオチド配列は、標準技術に従って、（必要に応じて）合成起源、ゲノム起源、またはｃＤＮＡ起源の断片をライゲーションすることによって調製されるゲノム起源と合成起源の混合、合成起源とｃＤＮＡ起源の混合、またはゲノム起源とｃＤＮＡ起源の混合であってもよい。それぞれのライゲーションされた断片は、ヌクレオチド配列全体の様々な部分に対応する。ＤＮＡ配列はまた、例えば、ＵＳ４，６８３，２０２またはＳａｉｋｉ  Ｒ  Ｋら（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８年）、２３９巻、４８７〜４９１頁）に記載されているように、特定のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって調製してもよい。
【０３６８】
ヌクレオチド配列
本発明はまた、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。本明細書に用いられる場合、用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、ならびに（その部分などの）それの変種、相同体、断片、および誘導体を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源でも、合成起源でも、組換え起源でもよく、それが、二本鎖でも、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖にかかわらず、一本鎖でもよい。
【０３６９】
本発明に関しての用語「ヌクレオチド配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。好ましくは、それは、ＤＮＡ、より好ましくはコード配列についてのｃＤＮＡを意味する。
【０３７０】
好ましい実施形態において、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列自体は、それが、それの／それらの天然環境下においても存在するその自然に付随した（１つまたは複数の）配列に連結している場合のそれの天然環境下における天然ヌクレオチド配列を網羅しない。参照しやすいように、本発明者らは、この好ましい実施形態を「非天然ヌクレオチド配列」と呼ぶことにする。この関連において、用語「天然ヌクレオチド配列」は、それの天然環境下にあり、かつそれが自然に付随しているプロモーター全体に作動可能に連結している場合のヌクレオチド配列全体を意味し、そのプロモーターもまたそれの天然環境下にある。したがって、本発明のポリペプチドは、それの本来の生物体においてであるが、そのヌクレオチド配列が、それがその生物体内で自然に付随しているプロモーターの制御下ではない場合において、ヌクレオチド配列によって発現することができる。
【０３７１】
好ましくは、ポリペプチドは天然ポリペプチドではない。この関連において、用語「天然ポリペプチド」は、それの天然環境下にあり、かつそれがそれの天然ヌクレオチド配列によって発現している場合のポリペプチド全体を意味する。
【０３７２】
典型的には、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（すなわち、組換えＤＮＡ）を用いて調製される。しかしながら、本発明の代替の実施形態において、ヌクレオチド配列は、当技術分野において周知の化学的方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨら（１９８０年）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２１５〜２３頁、およびＨｏｍ  Ｔら（１９８０年）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓｙｍｐ  Ｓｅｒ  ２２５〜２３２頁参照）を用いて、全部または一部において、合成することができる。
【０３７３】
分子進化
いったん酵素コード化ヌクレオチド配列が単離されたならば、または推定の酵素コード化ヌクレオチド配列が同定されたならば、選択されたヌクレオチド配列を改変することが望ましい場合があり、例えば、本発明による酵素を調製するためにその配列を突然変異させることが望ましい場合がある。
【０３７４】
突然変異は、合成オリゴヌクレオチドを用いて導入してもよい。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチド配列を含む。
【０３７５】
適切な方法は、Ｍｏｒｉｎａｇａら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８４年）２巻、６４６〜６４９頁）に開示されている。突然変異を酵素コード化ヌクレオチド配列に導入する別の方法は、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８９年）、１８０巻、１４７〜１５１頁）に記載されている。
【０３７６】
上記などの部位特異的突然変異誘発の代わりに、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＧｅｎｅＭｏｒｐｈ  ＰＣＲ突然変異誘発キット、またはＣｌｏｎｔｅｃｈ製のＤｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲランダム突然変異誘発キットなどの市販のキットを用いて、ランダムに突然変異を導入することができる。ＥＰ０５８３２６５は、ＰＣＲに基づいた突然変異誘発を最適化する方法に言及しており、その方法はまた、ＥＰ０８６６７９６に記載されたものなどの変異原性ＤＮＡ類似体の使用と組み合わせることができる。エラープローンＰＣＲテクノロジーは、好ましい特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼの変種の産生に適している。ＷＯ０２０６４５７は、リパーゼの分子進化に言及している。
【０３７７】
新規の配列を得るための第３の方法は、制限酵素をいくつでもか、またはデオキシリボヌクレアーゼＩなどの酵素かのいずれかを用いることによって、非同一ヌクレオチド配列を断片化することであり、機能性タンパク質をコードする完全ヌクレオチド配列を再構成する。あるいは、１つまたは複数の非同一ヌクレオチド配列を用い、完全ヌクレオチド配列の再構成中に突然変異を導入することができる。ＤＮＡシャッフリングおよびファミリーシャッフリングテクノロジーは、好ましい特性を有する脂質アシルトランスフェラーゼの変種の産生に適している。「シャッフリング」を行うための適切な方法は、ＥＰ０７５２００８、ＥＰ１１３８７６３、ＥＰ１１０３６０６に見出すことができる。シャッフリングはまた、ＵＳ６，１８０，４０６およびＷＯ０１／３４８３５に記載されているような他の型のＤＮＡ突然変異誘発と組み合わせることができる。
【０３７８】
したがって、インビボまたはインビトロのいずれでも、多数の部位特異的またはランダム突然変異をヌクレオチド配列に引き起こすこと、およびその後、様々な手段によってコード化ポリペプチドの機能性の向上についてスクリーニングすることが可能である。例えば、コンピュータ内およびエキソ媒介性組換え方法（ＷＯ００／５８５１７、ＵＳ６，３４４，３２８、ＵＳ６，３６１，９７４参照）を用いて、生じた変種が、公知の酵素またはタンパク質との相同性が非常に低く保持されている、分子進化を実行することができる。それにより得られたそのような変種は、公知のトランスフェラーゼ酵素に対して有意な構造的類似性を有し得るが、アミノ酸配列相同性が非常に低い。
【０３７９】
非限定的例として、加えて、ポリヌクレオチド配列の突然変異体または天然変種は、野生型かまたは他の突然変異体かまたは天然変種かのいずれかと組み換えて、新しい変種を生じることができる。そのような新しい変種もまた、コード化ポリペプチドの機能性の向上についてスクリーニングすることができる。
【０３８０】
上記および類似した分子進化方法の適用によって、タンパク質構造または機能のいかなる予備知識もなしに、好ましい特性を有する本発明の酵素の変種の同定および選択が可能になり、予測不可能であるが、有益な突然変異体または変種の作製が可能になる。当技術分野において、酵素活性の最適化または変化のための分子進化の適用の多数の例があり、そのような例として、以下の１つまたは複数が挙げられるが、それらに限定されるわけではない：宿主細胞またはインビトロにおける発現および／または活性の最適化、酵素活性の増加、基質および／または生成物特異性の変化、酵素的または構造的安定性の増加または減少、好ましい環境条件、例えば、温度、ｐＨ、基質における酵素活性／特異性の変化。
【０３８１】
当業者には明らかなように、分子進化ツールを用いて、酵素を変化させ、酵素の機能性を向上させることができる。
【０３８２】
適切には、本発明に用いられる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、変種脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる、すなわち、脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、欠失、または付加を含むことができる。変種酵素は、親酵素との少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９９％相同性を保持する。適切な親酵素として、エステラーゼまたはリパーゼ活性を有する任意の酵素を挙げることができる。好ましくは、親酵素は、ｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列と整列する。
【０３８３】
好ましい実施形態において、変種脂質アシルトランスフェラーゼ酵素は、ＧＤＳｘ、ＧＡＮＤＹ、およびＨＰＴブロックに見出されるｐｆａｍ００６５７コンセンサス配列アミノ酸残基の少なくとも１つまたは複数を保持し、または組み入れる。
【０３８４】
水性環境において脂質アシルトランスファラーゼ活性がないまたは低い、リパーゼなどの酵素は、分子進化ツールを用いて突然変異させて、トランスフェラーゼ活性を導入または増強し、それによって、本発明の組成物および方法に用いるのに適した有意なトランスフェラーゼ活性を有する脂質アシルトランスフェラーゼ酵素を生じることができる。
【０３８５】
適切には、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、親酵素と比較した場合、極性脂質、好ましくはリン脂質および／または糖脂質への酵素活性が増強している変種であり得る脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。好ましくは、そのような変種はまた、極性リゾ脂質への活性が低いまたはない。極性脂質、リン脂質、および／または糖脂質への活性の増強は、加水分解および／もしくはトランスフェラーゼ活性、または両方の組合せの結果である可能性がある。
【０３８６】
変種脂質アシルトランスフェラーゼは、親酵素と比較して、トリグリセリドおよび／またはモノグリセリドおよび／またはジグリセリドへの活性が減少している場合がある。
【０３８７】
適切には、変種酵素は、トリグリセリドおよび／またはモノグリセリドおよび／またはジグリセリドへの活性を含み得ない。
【０３８８】
あるいは、変種酵素は熱安定性が増加している場合がある。
【０３８９】
変種酵素は、以下、極性脂質、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、糖脂質、ジガラクトシルモノグリセリド、モノガラクトシルモノグリセリドの１つまたは複数への活性が増加している場合がある。
【０３９０】
脂質アシルトランスフェラーゼの変種は公知であり、そのような変種の１つまたは複数は、本発明による方法および使用に、ならびに／または本発明による酵素組成物に用いるのに適している可能性がある。ほんの一例として、脂質アシルトランスフェラーゼの変種は、以下の参考文献に記載されており、本発明に従って用いられる可能性がある：ＨｉｌｔｏｎおよびＢｕｃｋｌｅｙ  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９１年１月１５日、２６６巻（２号）：９９７〜１０００頁；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９４年１月２１日、２６９巻（３号）：２１４６〜５０頁；Ｂｒｕｍｌｉｋら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９９６年４月、１７８巻（７号）：２０６０〜４頁；Ｐｅｅｌｍａｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  １９９８年３月、７巻（３号）：５８７〜９９頁。
【０３９１】
アミノ酸配列
本発明はまた、本発明の方法および／または使用のいずれか一つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の使用を含む。
【０３９２】
本明細書に用いられる場合、用語「アミノ酸配列」は、用語「ポリペプチド」および／または用語「タンパク質」と同義である。場合によっては、用語「アミノ酸配列」は、用語「ペプチド」と同義である。
【０３９３】
アミノ酸配列は、適切な供給源から調製／単離してもよいし、合成的に作製してもよいし、組換えＤＮＡ技術の使用によって調製してもよい。
【０３９４】
適切には、アミノ酸配列は、標準技術によって、本明細書に教示された単離ポリペプチドから得ることができる。
【０３９５】
単離ポリペプチドからアミノ酸配列を決定するための一つの適切な方法は以下の通りである：
精製されたポリペプチドを凍結乾燥し、１００μｇのその凍結乾燥材料を８Ｍの尿素および０．４Ｍの炭酸水素アンモニウムの５０μｌの混合物、ｐＨ８．４の５０μｌに溶解することができる。溶解したタンパク質を、窒素でのオーバーレイおよび５μｌの４５ｍＭのジチオスレイトールの添加後、５０℃で１５分間、変性および還元することができる。室温まで冷却後、５μｌの１００ｍＭのヨードアセトアミドを加えて、窒素の存在下、暗闇中、室温で１５分間、システイン残基を誘導体化することができる。
【０３９６】
１３５μｌの水および５μｌの水中５μｇのエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを上記反応混合物に加え、窒素の存在下、３７℃で２４時間、消化を行うことができる。
【０３９７】
生じたペプチドを、溶媒Ａ：水中０．１％ＴＦＡおよび溶媒Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡを用いてＶＹＤＡＣ  Ｃ１８カラム（０．４６×１５ｃｍ；１０μｍ；Ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）での逆相ＨＰＬＣによって分離することができる。選択されたペプチドを、Ｎ末端シーケンシングの前に、同じ溶媒系を用いてＤｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ１８カラムで再びクロマトグラフ分析を行うことができる。シーケンシングは、製造会社の使用説明書（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）に従って、パルス液体高速サイクルを用いるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７６Ａシーケンサーを用いて行うことができる。
【０３９８】
配列同一性または配列相同性
本明細書では、用語「相同体」は、本アミノ酸配列および本ヌクレオチド配列とある特定の相同性を有する実体を意味する。本明細書では、用語「相同性」は、「同一性」と同等とみなすことができる。
【０３９９】
相同的なアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列は、機能的活性を保持し、および／または酵素の活性を増強するポリペプチドを提供および／またはコードするはずである。
【０４００】
本コンテクストにおいて、相同配列は、本配列と少なくとも７５％、８５％、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一であり得るアミノ酸配列を含むものと解釈される。典型的には、相同体は、本アミノ酸配列と同じ活性部位などを含むであろう。相同性はまた、類似性に関して考えることもできるが（すなわち、類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）、本発明のコンテクストにおいては、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
【０４０１】
本コンテクストにおいて、相同配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（本配列）と少なくとも７５％、８５％、または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９８％同一であり得るヌクレオチド配列を含むと解釈される。典型的には、相同体は、活性部位などをコードする、本配列と同じ配列を含むであろう。相同性はまた、類似性に関して考えることもできるが（すなわち、類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）、本発明のコンテクストにおいては、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
【０４０２】
相同性比較は、目によって、またはより通常には、容易に利用可能なアラインメントプログラムの助けを借りて、行うことができる。これらの市販されているコンピュータプログラムは、２つ以上の配列の間の％相同性を計算することができる。
【０４０３】
％相同性は、連続した配列に対して計算することができる、すなわち、一方の配列を、他方の配列と整列させ、一方の配列における各アミノ酸を、他方の配列における対応するアミノ酸と、１残基ずつ、直接比較する。これは、「非ギャップド」アラインメントと呼ばれる。典型的には、そのような非ギャップドアラインメントは、比較的少ない数の残基に対してのみ実行される。
【０４０４】
これは非常に単純かつ一貫性のある方法であるが、例えば、他の点では同一の配列のペアにおいて、１つの挿入または欠失が、それに次に続くアミノ酸残基をアラインメントから締め出し、全体的なアラインメントが実行された場合、％相同性の大きな低下を生じる可能性があることを考慮することができない。それゆえに、たいていのアラインメント方法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティを科すことなく、可能性のある挿入および欠失を考慮する最適なアラインメントを生じるように設計される。これは、局所的相同性を最大にするように試みるために配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０４０５】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントに生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当て、その結果、同数の一致アミノ酸について、できる限りギャップが少ない−２つの比較された配列の間のより高い関連性を反映する−配列アラインメントは、多いギャップを有するものより高いスコアに達するであろう。典型的には、ギャップおよびギャップ中の各後続残基のより小さいペナルティの存在について比較的高いコストを負担させる「アフィンギャップコスト」が用いられる。これは、最も一般的に用いられるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、もちろん、ギャップがより少ない最適化アラインメントを生じるであろう。たいていのアラインメントプログラムについては、ギャップペナルティを改変することは可能である。しかしながら、アラインメントのためにそのようなソフトウェアを用いる場合、デフォルト値を用いることが好ましい。
【０４０６】
それゆえに、最高％相同性の計算は、まず、ギャップペナルティを考慮する、最適なアラインメントの作成を必要とする。そのようなアラインメントを実行するための適切なコンピュータプログラムはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）である。アラインメントを実行することができる他のソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版−１８章参照）、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４０３〜４１０頁）が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ＢＬＡＳＴもＦＡＳＴＡも、オフライン検索およびオンライン検索として利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９年、７−５８〜７−６０頁参照）。しかしながら、一部の適用については、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムを用いることが好ましい。ＢＬＡＳＴ２配列と呼ばれる新しいツールもまた、タンパク質配列およびヌクレオチド配列を比較するのに利用できる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、１９９９年、１７４巻（２号）：２４７〜５０頁；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ、１９９９年、１７７巻（１号）：１８７〜８頁およびｔａｔｉａｎａ＠ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）。
【０４０７】
最終％相同性は、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセスはそれ自体、典型的には、全か無かのペア比較に基づいていない。代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいて、各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる目盛りのある類似性スコアマトリックスが一般的に用いられる。よく用いられるそのようなマトリックスの例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−ＢＬＡＳＴプログラム一式についてのデフォルトマトリックス−である。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩプログラムは、一般的に、公開デフォルト値かまたは供給されている場合にはカスタムシンボル比較表のいずれかを用いる（さらなる詳細についてはユーザーマニュアル参照）。一部の適用については、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩパッケージについてのデフォルト値を用いることが好ましい。
【０４０８】
あるいは、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＤＧおよびＳｈａｒｐ  ＰＭ（１９８８年）、Ｇｅｎｅ、７３巻（１号）、２３７〜２４４頁）に類似したアルゴリズムに基づいて、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）においてマルチプルアラインメント機構を用いて計算してもよい。
【０４０９】
いったんソフトウェアが最適なアラインメントを作成したならば、％相同性、好ましくは％配列同一性を計算することが可能である。典型的には、ソフトウェアは、アラインメントの一部としてこれを行い、数値結果を生み出す。
【０４１０】
配列同一性を決定するとき、ギャップペナルティが用いられたならば、好ましくは、以下のパラメーターがペアワイズアラインメントに用いられる：
【０４１１】
【表１０】
0005509094.tif 000010
一実施形態において、好ましくは、ヌクレオチド配列についての配列同一性は、ギャップペナルティおよびギャップ伸張が上記に定義されているように設定されたＣＬＵＳＴＡＬを用いて決定される。
【０４１２】
適切には、ヌクレオチド配列に関しての同一性度は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドに対して、好ましくは少なくとも３０個の連続したヌクレオチドに対して、好ましくは少なくとも４０個の連続したヌクレオチドに対して、好ましくは少なくとも５０個の連続したヌクレオチドに対して、好ましくは少なくとも６０個の連続したヌクレオチドに対して、好ましくは少なくとも１００個の連続したヌクレオチドに対して、決定される。
【０４１３】
適切には、ヌクレオチド配列に関しての同一性度は、配列全体に対して決定され得る。
【０４１４】
一実施形態において、本発明によるアミノ酸配列同一性度は、適切には、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  １０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）などの当技術分野において公知のコンピュータプログラムを用いて決定され得る。ペアワイズアラインメントについて、用いられるマトリックスは、好ましくは、１０．０のギャップ開始ペナルティおよび０．１のギャップ伸張ペナルティを用いるＢＬＯＳＵＭ６２である。
【０４１５】
適切には、アミノ酸配列に関しての同一性度は、少なくとも２０個の連続したアミノ酸に対して、好ましくは少なくとも３０個の連続したアミノ酸に対して、好ましくは少なくとも４０個の連続したアミノ酸に対して、好ましくは少なくとも５０個の連続したアミノ酸に対して、好ましくは少なくとも６０個の連続したアミノ酸に対して、決定される。
【０４１６】
適切には、アミノ酸配列に関しての同一性度は、配列全体に対して決定され得る。
【０４１７】
配列はまた、サイレント変化を起こし、結果として、機能的に等価の物質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、または置換を有してもよい。計画的なアミノ酸置換は、物質の二次結合活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて、実施されてもよい。例えば、負荷電アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる；正荷電アミノ酸として、リシンおよびアルギニンが挙げられる；ならびに、類似した親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸として、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが挙げられる。
【０４１８】
保存的置換は、例えば、下記の表に従って、実施することができる。第２列において同じブロックにあり、かつ好ましくは第３列において同じ行にあるアミノ酸はお互いに置換することができる：
【０４１９】
【表１１】
0005509094.tif 000011
本発明はまた、起こり得る相同的置換（置換も取り換えも、本明細書では、現存するアミノ酸残基の代替残基での交換を意味するように用いられる）、すなわち、塩基性に対して塩基性、酸性に対して酸性、極性に対して極性などの同種置換を含む。非相同的置換、すなわち、１つのクラスの残基から別のクラスの残基へ、あるいはオルニチン（以下、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以下、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、およびフェニルグリシンなどの非天然アミノ酸の包含を含むこともまた起こってもよい。
【０４２０】
取り換えもまた、非天然アミノ酸によって行われてもよい。
【０４２１】
変種アミノ酸配列は、グリシンまたはβ−アラニン残基などのアミノ酸スペーサーに加えてメチル基、エチル基、またはプロピル基などのアルキル基を含む配列の任意の２個のアミノ酸残基の間に挿入することができる適切なスペーサー基を含んでもよい。ペプトイドの形をとる１個または複数のアミノ酸残基の存在を含むさらなる型のバリエーションは、当業者には十分理解されているであろう。誤解を避けるために言えば、「ペプトイドの形」は、α−炭素置換基がα−炭素よりむしろ残基の窒素原子上にある変種アミノ酸残基を指すように用いられる。ペプトイドの形をとるペプチドを調製するためのプロセスは、当技術分野において公知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ  ＲＪら、ＰＮＡＳ（１９９２年）８９巻（２０号）、９３６７〜９３７１頁、およびＨｏｒｗｅｌｌ  ＤＣ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５年）１３巻（４号）、１３２〜１３４頁である。
【０４２２】
本発明に用いる、または本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それらの内に合成または改変ヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドへのいくつかの異なる型の改変は、当技術分野において公知である。これらには、メチルホスホン酸バックボーンおよびホスホロチオエートバックボーン、ならびに／または分子の３’末端および／もしくは５’末端におけるアクリジンもしくはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本発明の目的にとって、本明細書に記載されたヌクレオチド配列は、当技術分野において利用可能な任意の方法によって改変され得ることは理解されるべきである。そのような改変は、ヌクレオチド配列のインビボの活性または寿命を増強するために行うことができる。
【０４２３】
本発明はまた、本明細書で考察された配列、またはそれらの任意の誘導体、断片、もしくは誘導体に相補的であるヌクレオチド配列の使用を含む。配列がその断片に相補的である場合には、その配列は、他の生物体などにおいて類似したコード配列を同定するためのプローブとして用いることができる。
【０４２４】
本発明の配列と１００％相同ではないが、本発明の範囲内にあるポリヌクレオチドは、いくつかの方法で得ることができる。本明細書に記載された配列の他の変種は、例えば、様々な個体、例えば、異なる集団からの個体から作製されたＤＮＡライブラリーを探索することによって、得ることができる。加えて、他のウイルス／細菌の相同体、または細胞の相同体、特に哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシ、および霊長類の細胞）に見出される細胞の相同体を獲得してもよく、そのような相同体およびそれらの断片は、一般的に、本明細書に列挙された配列に示される配列に選択的にハイブリダイズする能力がある。そのような配列は、他の動物種から作製されたｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを探索し、中程度から高度のストリンジェンシーの条件下で添付の配列表における配列のいずれか１つの全部または一部を含むプローブでそのようなライブラリーを探索することによって得ることができる。本発明のポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の種相同体および対立遺伝子多型を得ることに同様の考慮が適用される。
【０４２５】
変種および菌株／種相同体はまた、本発明の配列内の保存的アミノ酸配列をコードする、変種および相同体内の配列を標的にするように設計されたプライマーを用いる縮重ＰＣＲを用いて得ることもできる。保存的配列は、例えば、いくつかの変種／相同体由来のアミノ酸配列を整列させることによって、予測することができる。配列アラインメントは、当技術分野において公知のコンピュータソフトウェアを用いて実行することができる。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＰｉｌｅＵｐプログラムは広く用いられている。
【０４２６】
縮重ＰＣＲに用いられるプライマーは、１つまたは複数の縮重位置を含み、公知の配列に対する単一配列プライマーで配列をクローン化するのに用いられるものより低いストリンジェンシー条件で用いられる。
【０４２７】
あるいは、そのようなポリヌクレオチドは、特徴付けられた配列の部位特異的突然変異誘発によって得ることができる。これは、例えば、サイレントコドン配列変化が、ポリヌクレオチド配列が発現することになっている特定の宿主細胞についてのコドン選択を最適化することを必要とする場合に有用であり得る。他の配列変化は、制限酵素ポリペプチド認識部位を導入するために、またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質もしくは機能を変化させるために望まれる場合がある。
【０４２８】
本発明のポリヌクレオチド（ヌクレオチド配列）は、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマー、代替の増幅反応のプライマー、例えば放射性もしくは非放射性標識を用いる通常の手段によって顕色性標識で標識されたプローブを作製するために用いてもよいし、そのポリヌクレオチドをベクターへクローン化してもよい。そのようなプライマー、プローブ、および他の断片は、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、または４０ヌクレオチド長であり、また、本明細書に用いられる場合の本発明のポリヌクレオチドという用語によって含まれる。
【０４２９】
本発明によるＤＮＡポリヌクレオチドおよびプローブなどのポリヌクレオチドは、組換えで、合成的に、または当業者に利用可能な任意の手段によって作製することができる。それらはまた、標準技術によってクローン化することができる。
【０４３０】
一般的に、プライマーは、１ヌクレオチドずつの所望の核酸配列の段階的製造を含む合成手段によって作製される。自動化技術を用いてこれを達成するための技術は、当技術分野において容易に利用できる。
【０４３１】
より長いポリヌクレオチドは、一般的に、組換え手段、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）クローニング技術を用いて、作製される。これは、クローン化することが望まれる脂質標的配列の領域に隣接する（例えば、約１５〜３０ヌクレオチドの）プライマー対を作製する段階、そのプライマーを動物細胞またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと接触させる段階、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実行する段階、増幅された断片を（例えば、その反応混合物をアガロースゲル上で精製することによって）単離する段階、および増幅されたＤＮＡを回収する段階を含む。増幅ＤＮＡを適切なクローニングベクターへクローン化することができるように、適切な制限酵素認識部位を含むようにプライマーを設計してもよい。
【０４３２】
ハイブリダイゼーション
本発明はまた、本発明の配列に相補的である配列、または本発明の配列かもしくはそれらと相補的である配列かのいずれかにハイブリダイズする能力がある配列の使用を含む。
【０４３３】
本明細書で用いられる場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸鎖が塩基対形成を通して相補鎖と接合するプロセス」、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）テクノロジーで実行されるような増幅のプロセスを含むものとする。
【０４３４】
本発明はまた、本明細書で考察された本配列、またはそれらの任意の誘導体、断片、もしくは誘導体に相補的である配列にハイブリダイズする能力があるヌクレオチド配列の使用を含む。
【０４３５】
本発明はまた、本明細書で考察されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力がある配列に相補的である配列を含む。
【０４３６】
ハイブリダイゼーション条件は、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ（１９８７年、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）に教示されているように、ヌクレオチド結合複合体の融解温度（Ｔｍ）に基づいており、下記で説明されているように、定義された「ストリンジェンシー」を与える。
【０４３７】
最高ストリンジェンシーは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こる；高ストリンジェンシーは、Ｔｍより約５℃〜１０℃低くで；中間ストリンジェンシーは、Ｔｍより約１０℃〜２０℃低くで；および低ストリンジェンシーは、Ｔｍより約２０℃〜２５℃低くで起こる。当業者には理解されているように、最高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、同一のヌクレオチド配列を同定または検出するために用いることができ、一方、中間（または低）ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、類似したまたは関連したポリヌクレオチド配列を同定または検出するために用いることができる。
【０４３８】
好ましくは、本発明は、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件または中間ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする能力がある配列に相補的である配列の使用を含む。
【０４３９】
より好ましくは、本発明は、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に高ストリンジェンシー条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ｛１×ＳＳＣ＝０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５ＭのＮａクエン酸、ｐＨ７．０｝）下でハイブリダイズする能力がある配列に相補的である配列の使用を含む。
【０４４０】
本発明はまた、（本明細書で考察されたものの相補的配列を含む）本明細書に考察されたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用に関する。
【０４４１】
本発明はまた、（本明細書で考察されたものの相補的配列を含む）本明細書に考察されたヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列に相補的であるヌクレオチド配列の使用に関する。
【０４４２】
中間から最高のストリンジェンシーの条件下で本明細書で考察されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする能力があるポリヌクレオチド配列の使用もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０４４３】
好ましい態様において、本発明は、本明細書で考察されたヌクレオチド配列またはその相補体にストリンジェントな条件（例えば、５０℃および０．２×ＳＳＣ）下でハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用を網羅する。
【０４４４】
より好ましい態様において、本発明は、本明細書で考察されたヌクレオチド配列またはその相補体に高ストリンジェンシーの条件（例えば、６５℃および０．１×ＳＳＣ）下でハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列の使用を網羅する。
【０４４５】
ポリペプチドの発現
本発明に用いるヌクレオチド配列、または本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするためのヌクレオチド配列は、組換えの複製可能なベクターへ組み入れることができる。ベクターは、適合性の宿主細胞中に、および／またはその宿主細胞から、ポリペプチドの形で、ヌクレオチド配列を複製および発現させるために用いることができる。発現は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現制御シグナルを含む調節配列を用いて調節することができる。原核生物のプロモーター、および真核細胞において機能し得るプロモーターを用いてもよい。組織特異的または刺激特異的プロモーターを用いてもよい。上記の２つ以上の異なるプロモーター由来の配列エレメントを含むキメラプロモーターもまた、用いてもよい。
【０４４６】
ヌクレオチド配列の発現によって宿主組換え細胞により産生されたポリペプチドは、用いられる配列および／またはベクターに依存して、分泌されてもよいし、細胞内に含まれてもよい。コード配列は、特定の原核細胞膜または真核細胞膜を通して物質コード配列の分泌を指示するシグナル配列と共に設計することができる。
【０４４７】
構築物
用語「構築物」−「コンジュゲート」、「カセット」、および「ハイブリッド」などの用語に関する同義語である−は、プロモーターに直接的または間接的に付着した、本発明に従って用いる、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接的付着の例は、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列の間に入る、Ｓｈ１イントロンまたはＡＤＨイントロンなどのイントロン配列などの適切なスペーサー群の供給である。直接的または間接的付着を含む本発明に関しての用語「融合した」についても同じである。場合によっては、それらの用語は、野生型遺伝子プロモーターと通常付随したタンパク質をコードするヌクレオチド配列で、かつそれらがどちらもそれらの天然環境下にある場合のその天然の組合せを網羅しない。
【０４４８】
構築物は、遺伝子構築物の選択を可能にするマーカーをさらに含み、または発現させてもよい。
【０４４９】
一部の適用については、好ましくは、構築物は、少なくとも本発明のヌクレオチド配列、またはプロモーターに作動可能に連結された、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０４５０】
生物体
本発明に関しての用語「生物体」は、本発明によるヌクレオチド配列、もしくは本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／またはそれらから得られる産物を含み得る任意の生物体を含む。
【０４５１】
本発明に関しての用語「トランスジェニック生物体」は、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および／もしくはそれから得られる産物を含む任意の生物体を含み、ならびに／またはプロモーターが、前記生物体内で本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にすることができる。好ましくは、ヌクレオチド配列は、生物体のゲノムに組み入れられている。
【０４５２】
用語「トランスジェニック生物体」は、天然環境下における天然のヌクレオチドコード配列であって、また天然環境下にあるそれらの本来のプロモーターの調節下にある場合の天然ヌクレオチドコード配列を網羅しない。
【０４５３】
それゆえに、本発明のトランスジェニック生物体として、本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、本明細書に定義されているような構築物、本明細書に定義されているようなベクター、本明細書に定義されているようなプラスミド、本明細書に定義されているような細胞、またはそれらの産物のいずれか１つ、またはそれらの組合せを含む生物体が挙げられる。例えば、トランスジェニック生物体はまた、天然で脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列と付随していないプロモーターの調節下で本明細書で定義されているような特定の性質を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。
【０４５４】
宿主細胞／生物体の形質転換
宿主生物体は、原核生物または真核生物であり得る。
【０４５５】
適切な原核生物宿主の例として、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、好ましくはＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓなどの細菌が挙げられる。
【０４５６】
原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当技術分野において十分、文書化されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照されたい。原核生物宿主が用いられる場合には、ヌクレオチド配列は、形質転換の前に、イントロンの除去によるなどの適切に改変される必要がある可能性がある。
【０４５７】
別の実施形態において、トランスジェニック生物体は酵母であり得る。
【０４５８】
糸状菌細胞は、当技術分野において公知の様々な方法−公知の様式における、プロトプラスト形成およびプロトプラストの形質転換、続いて細胞壁の再生を含むプロセスなど−を用いて形質転換することができる。宿主微生物としてのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの使用は、ＥＰ０２３８０２３に記載されている。
【０４５９】
別の宿主生物体は植物であり得る。植物を形質転換するために用いられる一般的な技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１年］４２巻：２０５〜２２５頁）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  １９９４年３月／４月、１７〜２７頁）による論文に見出すことができる。植物形質転換に関するさらなる教示は、ＥＰ−Ａ−０４４９３７５に見出すことができる。
【０４６０】
真菌、酵母、および植物の形質転換に関する一般的な教示は、以下のセクションに提示されている。
【０４６１】
形質転換真菌
宿主生物体は、糸状菌などの真菌であってもよい。適切なそのような宿主の例として、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属などに属する任意のメンバーが挙げられる。
【０４６２】
糸状菌を形質転換することに関する教示は、糸状菌の形質転換およびその真菌を培養することについての標準的技術は当技術分野において周知であると述べているＵＳ−Ａ−５７４１６６５に概説されている。Ｎ．ｃｒａｓｓａに適用されているような広範囲に及ぶ技術の概説は、例えば、Ｄａｖｉｓおよびｄｅ  Ｓｅｒｒｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９７１年）１７Ａ巻：７９〜１４３頁に見出される。
【０４６３】
糸状菌を形質転換することに関するさらなる教示は、ＵＳ−Ａ−５６７４７０７に概説されている。
【０４６４】
一態様において、宿主生物体は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属であり得る。
【０４６５】
本発明によるトランスジェニックＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓはまた、例えば、Ｔｕｒｎｅｒ  Ｇ．  １９９４年（Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ  Ｓ．Ｄ．、Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  Ｊ．Ｒ．（編）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ：  ５０  ｙｅａｒｓ  ｏｎ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２９巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９９４年、６４１〜６６６頁）の教示に従うことによって調製することもできる。
【０４６６】
糸状菌における遺伝子発現は、Ｐｕｎｔら（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００２年５月、２０巻（５号）：２００〜６頁、ＡｒｃｈｅｒおよびＰｅｂｅｒｄｙ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７年）１７巻（４号）：２７３〜３０６頁に概説されている。
【０４６７】
形質転換酵母
別の実施形態において、トランスジェニック生物体は酵母であり得る。
【０４６８】
酵母における異種性遺伝子発現の原理の概説は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（１９９５年）、４９巻：３４１〜５４頁、およびＣｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９７年）１０月、８巻（５号）：５５４〜６０頁に提供されている。
【０４６９】
この関連において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉ種またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ種などの酵母（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ（２０００年  ２４巻（１号）：４５〜６６頁）参照）は、異種性遺伝子発現のための媒体として用いることができる。
【０４７０】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける異種性遺伝子発現および遺伝子産物の分泌の原理の概説は、Ｅ  Ｈｉｎｃｈｃｌｉｆｆｅ  Ｅ  Ｋｅｎｎｙ（１９９３年、「Ｙｅａｓｔ  ａｓ  ａ  ｖｅｈｉｃｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅｓ」、Ｙｅａｓｔｓ、５巻、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｈ  ＲｏｓｅおよびＪ  Ｓｔｕａｒｔ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ編、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）によって提供されている。
【０４７１】
酵母の形質転換について、いくつかの形質転換プロトコールが開発されている。例えば、本発明によるトランスジェニックＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、Ｈｉｎｎｅｎら（１９７８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ、７５巻、１９２９頁）、Ｂｅｇｇｓ，  Ｊ  Ｄ（１９７８年、Ｎａｔｕｒｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ、２７５巻、１０４頁）、およびＩｔｏ，  Ｈら（１９８３年、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３巻、１６３〜１６８頁）の教示に従うことによって調製することができる。
【０４７２】
形質転換酵母細胞は、栄養要求性マーカー、ドミナント抗生物質抵抗性マーカーなどの様々な選択マーカーを用いて選択することができる。
【０４７３】
適切な酵母宿主生物体は、生物工学的に関連した酵母種から選択することができ、例えば、Ｐｉｃｈｉａ種、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ種、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ種、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｐｏｍｂｅを含むＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ種から選択される酵母種などであるが、それらに限定されるわけではない。
【０４７４】
メチロトローフの酵母種の菌株、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを宿主生物体として用いてもよい。
【０４７５】
一実施形態において、宿主生物体は、（ＷＯ０１／３９５４４に記載されているような）Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどのＨａｎｓｅｎｕｌａ種であってもよい。
【０４７６】
形質転換植物／植物細胞
本発明に適した宿主生物体は植物であり得る。一般的な技術の概説は、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ（Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ［１９９１年］４２巻：２０５〜２２５頁）およびＣｈｒｉｓｔｏｕ（Ａｇｒｏ−Ｆｏｏｄ−Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｈｉ−Ｔｅｃｈ  １９９４年３月／４月  １７〜２７頁）による論文、またはＷＯ０１／１６３０８に見出すことができる。トランスジェニック植物は、例えば、植物ステロールエステルおよび植物スタノールエステルのレベルの増強を生じることができる。
【０４７７】
それゆえに、本発明はまた、本明細書に定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼを（特に、本明細書に定義されているような脂質アシルトランスフェラーゼを含む発現ベクターまたは構築物を）植物細胞に形質転換する段階、および形質転換植物細胞から植物を生長させる段階を含む、植物ステロールエステルおよび植物スタノールエステルのレベルが増強しているトランスジェニック植物の作製のための方法に関する。
【０４７８】
分泌
しばしば、ポリペプチドが発現宿主から培地へ分泌されることが望ましくあり、その酵素はより容易にその培地から回収することができる。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づいて選択することができる。ハイブリッドシグナル配列もまた、本発明のコンテクストに関して、用いてもよい。
【０４７９】
天然で脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と付随していない分泌リーダー配列の典型的な例は、真菌アミログルコシダーゼ（ＡＧ）遺伝子（ｇｌａＡ−例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ由来の、１８アミノ酸型および２４アミノ酸型の両方）、ａ因子遺伝子（酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、およびＨａｎｓｅｎｕｌａ）、またはα−アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するものである。
【０４８０】
検出
アミノ酸配列の発現を検出および測定するための様々なプロトコールは当技術分野において公知である。例として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０４８１】
幅広い種類の標識およびコンジュゲーション技術は当業者に公知であり、様々な核酸およびアミノ酸アッセイに用いることができる。
【０４８２】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、およびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）などのいくつかの会社が市販のキットおよびこれらの手順についてのプロトコールを供給している。
【０４８３】
適切なレポーター分子または標識として、それらの放射性核種、酵素、蛍光性、化学発光性、または発色性作用物質、加えて、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などが挙げられる。そのような標識の使用を教示する特許として、ＵＳ−Ａ−３，８１７，８３７、ＵＳ−Ａ−３，８５０，７５２、ＵＳ−Ａ−３，９３９，３５０、ＵＳ−Ａ−３，９９６，３４５、ＵＳ−Ａ−４，２７７，４３７、ＵＳ−Ａ−４，２７５，１４９、およびＵＳ−Ａ−４，３６６，２４１が挙げられる。
【０４８４】
また、組換え免疫グロブリンを、ＵＳ−Ａ−４，８１６，５６７に示されているように産生することができる。
【０４８５】
融合タンパク質
本発明に用いる脂質アシルトランスフェラーゼは、例えば、その抽出および精製を助けるために、融合タンパク質として産生されてもよい。融合タンパク質パートナーの例として、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合ドメインおよび／または転写活性化ドメイン）、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。融合タンパク質配列の除去を可能にするために融合タンパク質パートナーと対象となるタンパク質配列との間にタンパク質分解性切断部位を含むことも便利である場合がある。好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げないようにする。
【０４８６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子融合発現系は、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５年）６巻（５号）：５０１〜６頁に概説されている。
【０４８７】
本明細書に定義されているような特定の性質を有するポリペプチドのアミノ酸配列を、非天然配列に連結して、融合タンパク質をコードしてもよい。例えば、その物質の活性に影響する能力がある作用物質についてのペプチドライブラリーのスクリーニングについて、市販されている抗体によって認識される非天然エピトープを発現するキメラ物質をコードすることが有用である場合がある。
【０４８８】
これから、本発明を、ほんの一例として、以下の図および実施例を参照して記載するつもりである。
【実施例】
【０４８９】
（実施例１）
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおけるＫＬＭ３’の発現
脂質アシルトランスフェラーゼ（配列番号１６、本明細書以下においてＫＬＭ３’とする）をコードするヌクレオチド配列（配列番号４９）をＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓにおいて、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ［α］−アミラーゼ（ＬＡＴ）のシグナルペプチドとの融合タンパク質として発現させた（図５３および５４を参照されたい）。Ｂａｃｉｌｌｕｓにおける最適な発現のために、コドン最適化遺伝子構築物（ｎｏ．０５２９０７）をＧｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。
【０４９０】
構築物ｎｏ．０５２９０７は、不完全なＬＡＴプロモーター（−１０配列のみ）をＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子の前に、およびＬＡＴ転写物（Ｔｌａｔ）をＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子の下流に含む（図５３および５５を参照されたい）。完全なＬＡＴプロモーターに隣接するＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を５’末端に、およびＬＡＴターミネーターを３’末端に含有するＸｈｏＩ断片を作製するために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅をプライマーＰｌａｔ５ＸｈｏＩ＿ＦＷおよびＥＢＳ２ＸｈｏＩ＿ＲＶならびに鋳型としての遺伝子構築物０５２９０７で実施した。
Ｐｌａｔ５ＸｈｏＩ＿ＦＷ：
【０４９１】
【化６】
0005509094.tif 000012
ＥＢＳ２ＸｈｏＩ＿ＲＶ：
【０４９２】
【化７】
0005509094.tif 000013
ＰＣＲを製造者の説明書に従ってサーモサイクラー上でＰｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ  ＯＹ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）で実施した（アニーリング温度、５５℃）。
【０４９３】
得られたＰＣＲ断片を供給者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ）の説明書に従って制限酵素ＸｈｏＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでＸｈｏＩ消化ｐｌＣａｔＨに連結した。
【０４９４】
連結混合物を米国特許出願ＵＳ２００２０１８２７３４（国際公開ＷＯ０２／１４４９０）に記載の通りＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＣ６．１株に導入し形質転換した。ＬＡＴ−ＫＬＭ３’前駆体遺伝子を含有するＸｈｏＩ挿入物の配列をＤＮＡ配列決定（ＢａｓｅＣｌｅａｒ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって確認し、正しいプラスミドクローンの１つをｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１）と名付けた（図５３）。ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１）を許容温度（３７℃）でＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＢＭＬ７８０株（ＢＲＡ７およびＢＭＬ６１２の派生物、ＷＯ２００５１１１２０３を参照されたい）に導入し形質転換した。
【０４９５】
ネオマイシン耐性（ｎｅｏＲ）かつクロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）の形質転換体を選択し、ＢＭＬ７８０（ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１））と名付けた。ＢＭＬ７８０（ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１））中のプラスミドをＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓゲノム上のｃａｔＨ領域に、株を５［ｍｕ］ｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含む培地で非許容温度（５０℃）で増殖させることによって組み込んだ。ＣｍＲ耐性クローン１個を選択し、ＢＭＬ７８０−ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１）と名付けた。ＢＭＬ７８０−ｐｌＣａｔＨ−ＫＬＭ３’（ｏｒｉ１）をベクター配列を外に出すために、抗生物質を含ませずに再び許容温度で数世代増殖させ、次いでネオマイシン感受性（ｎｅｏＳ）、ＣｍＲクローン１個を選択した。このクローンでは染色体上のｐｌＣａｔＨのベクター配列は（ネオマイシン耐性遺伝を含んで）切り出され、ｃａｔＨ−ＬＡＴＫＬＭ３’カセットだけが残る。次に染色体上のｃａｔＨ−ＬＡＴＫＬＭ３’カセットを、株をクロラムフェニコールの濃度を漸増させた培地中／上で増殖させることによって増幅させた。様々な回数の増幅後、クローン（５０［ｍｕ］ｇ／ｍｌクロラムフェニコールに対して耐性）１個を選択し、ＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０と名付けた。ＫＬＭ３’発現を確認するためにＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０およびＢＭＬ７８０（形質転換していない宿主株）を４８時間、３７℃で、１％トリブチリンを含むＨｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（Ｂａｃｔｏ）アガープレート上で増殖させた。脂質アシルトランスフェラーゼの活性を示す透明な領域がＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０コロニーの周囲に明らかに観察されたが、宿主株ＢＭＬ７８０の周囲ではされなかった（図５６を参照されたい）。この結果は相当量のＫＬＭ３’がＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ株ＢＭＬ７８０−ＫＬＭ３’ＣＡＰ５０で発現され、これらのＫＬＭ３’分子が機能性であることを示している。
【０４９６】
（比較実施例１）
ベクター構築
プラスミド構築物は、ＡｓｎからＡｓｐへの置換を位置８０（ＫＬＭ３’）に有する天然Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａグリセロリン脂質−コレステロールアシルトランスフェラーゼの成熟形態をｐ３２プロモーターの支配下にＣＧＴａｓｅシグナル配列と共にコードする配列を保持しているｐＣＣｍｉｎｉ派生物であるｐＣＳ３２ｎｅｗ  Ｎ８０Ｄである。
【０４９７】
発現のために使用した宿主株は、ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＯＳ２１ΔＡｐｒＥ株である。
【０４９８】
発現レベルはトランスフェラーゼ活性として測定し、エステル化されたコレステロールの％として表し、供与体としてのＰＣ（Ｔｐｃ）と受容体分子としてのコレステロールとの反応においての、参照試料中の遊離コレステロールと酵素試料中の遊離コレステロールとの差異から算出する。
【０４９９】
培養条件
５０ｍｇ／ｌカナマイシンを補充したＬＢブロス５ｍｌ（１０ｇ／ｌ酵素消化カゼイン、５ｇ／ｌ低ナトリウム酵母エキス、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、２ｇ／ｌ  Ｉｎｅｒｔ錠剤化補助剤）に単一コロニーを接種し、３０℃、６時間、２０５ｒｐｍでインキュベートした。この培養物０．７ｍｌを、５０ｍｇ／ｌカナマイシンおよび高マルトースデンプン加水分解物溶液（６０ｇ／ｌ）を補充したＳＡＳ培地（１０ｇ／ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４  、４０ｇ／ｌ  ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、５滴／ｌ消泡剤（Ｓｉｎ  ２６０）、２０ｇ／ｌ脱脂ダイズ粉、２０ｇ／ｌバイオスプリンガー１０６（１００％ｄｗ  ＹＥ））５０ｍｌに接種するために使用した。インキュベーションは、１９０００ｒｐｍ、３０分間の遠心分離によって培養上清を分離する前に４０時間、３０℃、１８０ｒｐｍで継続した。上清を清浄なチューブに移し、トランスフェラーゼ活性の測定に直接使用した。
【０５００】
基質の調製および酵素反応
ＰＣ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  ＃４４１６０１）およびコレステロール（Ｓｉｇｍａ  Ｃ８５０３）を９：１の比で秤量し、クロロホルムに溶解し、乾燥のために蒸発させた。
基質は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液ｐＨ７中に、３％  ＰＣ：コレステロール  ９：１を分散させることによって調製した。
基質溶液０．２５０ｍｌをスクリュー蓋付きの３ｍｌガラス試験管に移した。培養上清０．０２５ｍｌを加え、混合物を４０℃、２時間インキュベートした。酵素の代わりに水を含む参照試料も調製した。反応混合物を沸騰水浴中で１０分間加熱し、酵素反応を停止させた。コレステロールアッセイ分析に供する前に、９９％エタノール２ｍｌを反応混合物に加えた。
【０５０１】
コレステロールアッセイ
０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．６および０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ｘ−１００）中に１．４Ｕ／ｍｌコレステロール酸化酵素（ＳＥＲＶＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ＧｍｂＨ  ｃａｔ．Ｎｏ１７１０９）、０．４ｍｇ／ｍｌ  ＡＢＴＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−１８８８）、６Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  ６７８２）を含有する基質１００μｌを、酵素反応試料５μｌを加えて混合する前に３７℃、５分間インキュベートした。反応混合物をさらに５分間インキュベートし、ＯＤ４０５を測定した。コレステロール含有量を、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．２０ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌおよび０ｍｇ／ｍｌのコレステロールを９９％ＥｔＯＨ中に含有するコレステロールの標準溶液の分析から算出した。
【０５０２】
結果
表は別々の８個の発現培養物の平均を示す。
【０５０３】
【表１２】
0005509094.tif 000014
（実施例２）
水脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼの使用
材料および方法
酵素
ＫＬＭ３’：配列番号６８（本明細書において「Ｋ９３２」とも称する）を有する実施例１で説明した脂質アシルトランスフェラーゼ−１１２８ＴＩＰＵ／ｍｌ。
【０５０４】
油：
ＳＢＯ  １：Ｓｏｌａｅ、Ａａｒｈｕｓ、ＤＫ．２７．０９．２００７  Ｄｅｌｉｔｅ（カナダ産のマメに由来）からの粗製ダイズ油
ＳＢＯ  ２：ブラジル産の粗製ダイズ油
ＲＳＯ  ３：Ａａｒｈｕｓ  Ｋａｒｓｌｈａｍｎ産の粗製抽出ナタネ油
ＲＳＯ  ４：Ｓｃａｎｏｌａ、Ａａｒｈｕｓ、ＤＫ産の粗製圧搾ナタネ油
ＳＰｅｃｔｒａ  Ｌｉｐｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙからのダイズレシチン混合標準物（ＳＴ１６）
方法：
ＨＰＴＬＣ：
アプリケーター：Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ＴＬＣ  Ｓａｍｐｌｅｒ４、ＣＡＭＡＧ
ＨＰＴＬＣプレート：２０×１０ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ  ｎｏ．１．０５６４１  使用前に１６０℃で１０分間活性化。
【０５０５】
添加：
油相：クロロホルム：メタノール  ２：１中の油の８％溶液５μｌをＡｕｔｏｍａｔｉｃ  ＴＬＣ  Ｓａｍｐｌｅｒを使用してＨＰＴＬＣプレートに添加した。
ガム相：油１０グラムからのガム相をクロロホルム：メタノール  ２：１の７．５ｍｌに溶解した。
【０５０６】
試料１μｌをＨＰＴＬＣプレートに添加した。
【０５０７】
ＴＬＣアプリケーター
ランニング緩衝液６：クロロホルム：１−プロパノール：酢酸メチル：メタノール：水中の０．２５％ＫＣｌ  ２５：２５：２５：１０：９
ランニング緩衝液５：Ｐ−エーテル：ＭＴＢＥ  ３０：７０
溶出：プレートをＣａｍａｇからのＡｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ＡＤＣ２を使用して７ｃｍ溶出させた。
【０５０８】
発色：
プレートをオーブンで１６０℃、１０分間乾燥させ、冷却し、１６％Ｈ３ＰＯ４中の６％酢酸銅（ＩＩ）に浸した。さらに１６０℃で１０分間乾燥させ、直接評価した。
発色後、プレートをＣａｍａｇ  Ｓｃａｎｎｅｒ上で走査し、ＴＬＣプレート上の各成分（スポット）の面積を算出した。
【０５０９】
算出
油相：
油相中のリン脂質の量を、公知の濃度のリン脂質（ＰＥ、ＰＡ、ＰＩ、ＰＣ、ＰＳ）を含む標準レシチンを様々な濃度で油試料と同じＴＬＣプレート上で分析することによって算出した。標準混合物に基づいて各リン脂質についての検量線を作成し、油試料中の各リン脂質のリン脂質濃度の算出のために使用した。分子量に基づいてリン脂質の濃度をｐｐｍ  Ｐ（リン）に換算した。
【０５１０】
ガム相：
ガム相中のトリグリセリドの含有量を、ガム相と同じプレート上で標準精製植物油を分析することに基づいて算出した。植物油の分析に基づいて検量線を作成し、ガム相中のトリグリセリドの算出のために使用した。
ガム相中のリン脂質の分析は、対照（酵素を添加しない）から様々な容量のガム相を他のガム相と同じプレート上に添加することに基づいた。対照ガム相中のリン脂質（ＰＥおよびＰＡ）の分析に基づいて検量線を作成し、１００％と定義した対照中のリン脂質の量と比較した酵素処理試料中のリン脂質の量の算出のために使用した。
【０５１１】
ｐＨ測定
油脱ガム由来試料のｐＨを、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．３ｉ−ｕｓａ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｈｙｄｒｏｐ  ｍａｎ．ｐｄｆに記載の蛍光法によって分析した、すなわちｐＨ測定は、Ｐｒｅｓｅｎｓ、Ｊｏｓｅｆ  Ｅｎｇｅｒｔ  Ｓｔｒ．１１、Ｄ−９３０５３  Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ＧｅｒｍａｎｙからのＨｙｄｒｏＰｌａｔｅ（登録商標）ＨＰ９６Ｃを使用することによって実行した。
ＨｙｄｒｏＰｌａｔｅ（登録商標）は、９６個の統合されたセンサーを備える通常の９６ウェル形式の滅菌済み、ポリスチレンマイクロタイタープレートである。センサーは各ウェルの底に固定されている。センサーは、底側から読み取ることができる。これは、ほとんどの市販の蛍光プレートリーダーによって実行できる。アッセイは、２つの異なる蛍光色素：ｐＨ感受性指示薬および不活性参照色素による。この組合せは、実験の最も厳密な結果を達成するための正確な内部参照シグナルを保証する。
【０５１２】
ｐＨは、代替えとしてＢｏ  Ｙａｎｇら、ＪＡＯＣＳ、８３巻、７号（２００６年）６５３〜６５８頁によりｐＨ電極を使用しても測定できる。
【０５１３】
油中の水の定量
油中の残存水をＡＯＣＳ法Ｃａ  ２ｃ−２５または同等法によって定量する。
【０５１４】
ＧＬＣ分析
ＷＣＯＴ溶融シリカカラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ×０．１μフィルム厚  ５％フェニル−メチル−シリコン（ＣｈｒｏｍｐａｃｋからのＣＰ  Ｓｉｌ  ８  ＣＢ）を備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ  ９０００  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ。
【０５１５】
キャリアガス：ヘリウム
インジェクター、ＰＳＳＩ  ｃｏｌｄ  ｓｐｌｉｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（初期温度５０℃を３８５℃に加熱）、容量１．０μｌ
検出器ＦＩＤ：３９５℃
【０５１６】
【表１３】
0005509094.tif 000015
試料調製：試料５０ｍｇを内部標準ヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含有するピリジン１２ｍｌに溶解した。次いで試料溶液５００μｌをクリンプバイアルに移し、ＭＳＴＦＡ：ＴＭＣＳ−９９：１（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオラセアミド）１００μｌを加え、２０分間、６０℃で反応させた。
【０５１７】
算出：ステロール、パルミチン酸ステロールおよびステアリン酸ステロールに対する応答計数を純粋な参照物質（純物質８〜１０ｍｇを、内部標準ヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含有する１２ｍｌピリジン中に秤量する）から決定した。
【０５１８】
酵素アッセイ：ＴＩＰＵ
基質
０．６％Ｌ−αホスファチジルコリン  ９５％Ｐｌａｎｔ（Ａｖａｎｔｉ  ＃４４１６０１）、０．４％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｓｉｇｍａ  Ｘ−１００）および５ｍＭ  ＣａＣｌ２を０．０５Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７に溶解した。
【０５１９】
アッセイ手順
基質３４μｌをＫｏｎｅＬａｂ自動化分析機を使用してキュベットに加えた。Ｔ＝０分に酵素溶液４μｌを加えた。酵素の代わりに水を用いたブランクも分析した。試料を混合し、３０℃で１０分間インキュベートした。
試料の遊離脂肪酸含有量をＷＡＫＯ  ＧｍｂＨからのＮＥＦＡ  Ｃキットを使用して分析した。
酵素活性ＴＩＰＵ  ｐＨ７をアッセイ条件下で１分間に生成された脂肪酸のマイクロモル数として算出した。
【０５２０】
実験室規模での脱ガム手順
粗製ダイズ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５０℃または５５℃または６０℃または６５℃または７０℃に加熱した。
次いで水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーで３０秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌した。
３０、１２０または１８０分後、油１０ｍｌを１２ｍｌ遠心チューブ（予め秤量した）に移した。油を沸騰水浴中で９７℃に１０分間加熱し、次いで５０００ｇで５分間直ちに遠心分離した。
油をガム相からデカントし、チューブを３０分間ドレインし、両方の相の重量を測定した（図７５を参照されたい）。
油相を遊離ステロール、ステロールエステルおよび遊離脂肪酸についてＧＬＣで分析し、油相もＴＬＣによって分析した（図７６を参照されたい）。
【０５２１】
結果
（実施例２ａ）
この実験においてＫＬＭ３’を粗製ＳＢＯ１の水脱ガムプロセスにおいて検査した。
【０５２２】
油１ｇ当たり０．１〜０．５ＴＩＰＵの異なる投与量のＫＬＭ３’を検査し、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ混合の影響も検査した。
【０５２３】
下の表は図７７と共に、ＫＬＭ３’で処理した試料でのガム相の明確な減少および油の収率（油相中の）の向上を示す。
【０５２４】
約２％の油の増加が観察され、収率の増加は酵素投与量を増加させることによって獲得された傾向があった。
【０５２５】
混合もガム相に影響を有した。酵素添加直後の油の３０秒間のＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ処理は、より少ないガム相を生じたが、酵素添加の効果はＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ混合を行っても行わなくてもほとんど同じであったことが観察された。産業においては、水の添加後にスタティックミキサーまたはダイナミックミキサーを介して油を押し出すことは普通のことであり、これを実験室規模で模倣するためにＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ混合を使用することを決めた。
【０５２６】
【表１４】
0005509094.tif 000016
（実施例２ｂ）
２種の異なる粗製ＳＢＯを、ＫＬＭ３’酵素の添加を行うまたは行わない標準的手順による水脱ガムにおいて検査した。酵素投与量は０．２５ＴＩＰＵ／ｇであった。
【０５２７】
【表１５】
0005509094.tif 000017
下の表に示す結果は、反応時間３０分間後および１２０分間後の両方でガム相の明確な減少を示し、それは、より多い油の収率に対応する。油相中のステロールおよびステロールエステルの分析は、酵素処理試料中でのステロールからステロールエステルへのより高い転換を示した。加水分解活性も生じていたことから遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の量が増加したことも観察される。
【０５２８】
【表１６】
0005509094.tif 000018
（実施例２ｃ）
この実験において異なる投与量のＫＬＭ３’を５０℃でのＳＢＯ  ２の水脱ガムにおいて検査した。異なるレベルの水、すなわち１．５％、２％および２．５％も酵素の添加を行うまたは行わないプロセスで検査した。
【０５２９】
【表１７】
0005509094.tif 000019
表ならびに下の図７８、図７９、図８０、図８１、図８２、図８３および図８４において示す結果は、ガム相の量の減少を明確に表し、ガム相と油相との合計が１００％であることから、アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）が油相中での油の収率の向上に寄与することが結論される。
【０５３０】
ガム相中のリン脂質の含有量が酵素処理試料において減少したことが観察された。ガム相においてホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）の両方が、酵素処理をしていないガム相におけるこれらのリン脂質の量と比較して減少していた。ガム相中のトリグリセリドの量も、酵素処理したガム相において少なく、これも酵素処理試料における油の収率（油相での）の増加を確認する。
【０５３１】
予想された通り、粗製ダイズ油に添加した水の量もガム相の量に影響を示したが、結果は酵素添加を行わない対照と比較してでの、水の異なる添加量での収率におけるアシルトランスフェラーゼの効果も確認した（図８０を参照されたい）。
【０５３２】
水脱ガム実験において、ｐＨは５．５〜６の範囲であり、それは低い投与量での高い酵素活性およびステロールからステロールエステルへの高い転換を説明する。
【０５３３】
【表１８】
0005509094.tif 000020
分析は２回反復で実施し、結果をＳｔａｔＧｒａｐｈｉｃ  Ｓ  Ｐｌｕｓソフトウェアを使用する結果の統計的評価のために使用した。
【０５３４】
（実施例２ｄ）
異なる温度での油の収率へのＫＬＭ３’の効果を調査するために、酵素を５５、６０、６５および７０℃でのＳＢＯ２の水脱ガムにおいて検査した。
【０５３５】
【表１９】
0005509094.tif 000021
下の表に示す結果は、ガム相の量へのＫＬＭ３’の効果を明確に表す。油１ｇ当たり０．１ＴＩＰＵの投与量は、全ての温度においてガムの量の有意な減少をもたらした。０．２および０．３への酵素量の増加は、ガム相をさらに少し減少させた。
【０５３６】
結果
異なる温度、反応時間および酵素投与量でのＳＢＯ  ２の水脱ガムによる％ガム相
【０５３７】
【表２０】
0005509094.tif 000022
（実施例３）
パイロットプラントでの酵素的水脱ガム
処方
試験的水脱ガム試験において適用した成分
バッチ１：対照、７０℃
バッチ２：酵素使用（すなわち、配列番号６８として本明細書に示すアミノ酸配列を有する脂質アシルトランスフェラーゼＫ９３２（本明細書においてＫＬＭ３’とも称する））、７０℃
バッチ３：対照、５５℃、および
バッチ４：酵素使用（すなわち、配列番号６８として本明細書に示すアミノ酸配列を有する脂質アシルトランスフェラーゼＫ９３２（本明細書においてＫＬＭ３’とも称する））、５５℃
【０５３８】
【表２１】
0005509094.tif 000023
水脱ガムパイロットプラント手順
５０リットルタンク中で油を最初にＮ２カバーおよび撹拌下で加熱した。その後水（および酵素）を油に加えた。最初の実験（バッチ１および２）においては、水および酵素の添加後に油をホモジナイザー（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ、Ｃｈｅｓｈａｍ  Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して再循環させた。バッチ３および４においては、タンク中の撹拌を低下させるために再循環ポンプだけを使用した。
【０５３９】
酵素活動の３０分後に実験室での分析のために油試料を回収し（バッチ１〜４）、酵素を不活性化するために沸騰水浴中に置いた（１０分間）。タンク中の残りの油の不活性化を、油を（撹拌下で）７５℃に加熱することによって実施した。続いて予熱した（温水）遠心機（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ）で遠心分離を実施し、油相をバケットに移し、秤量した。異なる遠心分離能力の調整を検査した、遠心機の容量が油の量と比較して大きすぎたことから分離されたガム相をモニターすることはできなかった。したがってガム相は、それが溜まった遠心機の蓋から回収した。
【０５４０】
実験室での水脱ガムおよび遠心分離
粗製ダイズ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱した。水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーを使用して３０秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌した。３０分後、油１０ｍｌを１２ｍｌ遠心チューブ（予め秤量した）に移した。油を沸騰水浴中で９７℃に１０分間加熱し、次いで様々な相対遠心力（５００、１０００、２５００および５０００）で様々な時間（３、６および１０分間）直ちに遠心分離した。
【０５４１】
油をガム相からデカントし、チューブを１５分間ドレインし、両方の相の重量を測定した。油相を遊離フィトステロール、ステロールエステルおよび遊離脂肪酸についてＧＬＣで分析し、油相をＨＰＴＬＣによって分析した。
【０５４２】
結果および考察
油の収率
図８５は、本発明による粗製ダイズ油の酵素的脱ガムから獲得された油の収率の増加を対照と比較して示す。油を漸増する相対遠心力（ｒｃｆ）（５００、１０００、２５００および５０００）で３分間遠心分離し、酵素的試料中のガム量を減算した対照中のガムの量（％）から油の収率を算出する。
【０５４３】
対照と比較して酵素的脱ガムにおいて油の収率が増加し、ｒｃｆの減少と共に油の収率が増加することが明確に観察される。
【０５４４】
遠心分離の効果
様々な時間（棒の中の分）遠心分離した油試料から獲得されたガム中のトリグリセリドの量およびガムの量をバッチ３および４について図８６に示す。
【０５４５】
結果は、ｒｃｆが従来法の脱ガム（青い棒）から獲得されたガムの量（％）に影響することを示す。最初に、低いｒｃｆ（５００〜１０００）で、ガムの量は、２５００から５０００の相対遠心力で獲得された量と比較して多い（高トリグリセリド含有量）。遠心時間（３、６および１０分間）は、少なくとも５０００ｒｃｆで遠心分離した場合はガムの量に影響しないようである。
【０５４６】
本発明による酵素的脱ガムから獲得されたガムを精査すると、量はｒｃｆおよび時間に影響されないようである。理論に縛られなければ、これは従来法と本発明による酵素的脱ガムとから獲得されるガムの間の粘性における差異によって説明できる。図８７にガム相での粘性の測定値が示されている。粘性は、両方の種類のガムについてずり速度の増大と共に減少するが、しかし粘性は本発明による酵素的脱ガムから獲得されたガムにおいてより大きく減少する。
【０５４７】
さらに、本発明によって達成された油の収率の増加、粘性の減少は、産業用水脱ガム加工について他の利益も有する可能性がある。それは生産能力が増大し得ることであろう。
【０５４８】
（実施例４）
粗製ダイズ油の水脱ガムにおけるＮａＯＨの評価
処方
【０５４９】
【表１−１】
0005509094.tif 000024
水脱ガムの実験室用手順
粗製ダイズ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱した。水およびＮａＯＨを油に加え、続いて酵素を加えた。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーを使用して３０秒間均質化し、磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌した。３０分後、油およそ１０ｍｌを１２ｍｌ遠心チューブ（予め秤量した）に移した。油を沸騰水浴中で９７℃に１０分間加熱した。
【０５５０】
結果と考察
油の収率の分析
図８８は、ＫＬＭ３’（すなわち、配列番号６８として本明細書に示すアミノ酸配列を有する脂質アシルトランスフェラーゼＫ９３２（本明細書においてＫＬＭ３’とも称する））（０．１ＴＩＰＵ−ｋ／ｇ）および漸増する量のＮａＯＨ（０、０．１、０．２、０．５、１、１．５および１．９ｍｌ  ４％溶液）での酵素的脱ガムから獲得した油の収率の増加を示す。算出は、酵素的試料中のガム量を減算した対照におけるガム量に基づく。
【０５５１】
油の収率の最も高い増加は、ＮａＯＨを使用しない酵素的脱ガムによって達成され、一般に油の収率（％）の増加は、ＮａＯＨの量の増加と共に減少する。これは、ＮａＯＨの量の増加に伴うトリグリセリドのけん化の増加から説明できるであろう。しかし対照および酵素的脱ガム試料中のトリグリセリドを精査すると（図８９）、ＮａＯＨを使用せずに通常観察されるものと比べてＮａＯＨ処理されたガムにおいて含有量は顕著には高くない。ＮａＯＨを使用しない酵素的試料におけるトリグリセリドのレベルもまた、それまでの観察と同程度である。
【０５５２】
油中の脂肪酸、フィトステロールおよびフィトステロールエステルの分析
対照および酵素的脱ガム油中のフィトステロール、フィトステロールエステルおよび脂肪酸の含有量を図９０に示す。フィトステロールエステルの含有量は、０．１９％（対照）から０．４２％（ＮａＯＨ  ０．２ｍｌ）に増加し、最大に達する。この時点後、フィトステロールエステルは０．１５％に減少する。したがって０．３％から０．１２％へのフィトステロールの最初の減少に続いて、０．１２％から０．２８％への増加が観察される。
【０５５３】
ＦＦＡは、同様にｐＨ６．３（ＮａＯＨ  ０．２ｍｌ）まで、主にけん化の増加によって増加する。
【０５５４】
結果は、より高いｐＨでの水脱ガムの実行は脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’のトランスフェラーゼ活性を増大させることを明確に示す。ｐＨにおけるわずかな上昇でさえ（例えばＮａＯＨ  ０．１ｍｌ）、油中のＦＦＡの形成にほとんど影響することなく（０．０２％増加）フィトステロールエステルの形成をおよそ５０％増加させる。ＦＦＡが脱臭ステップにおいて蒸発し、したがって油の損失とみなされることからＦＦＡにおける増加は考慮すべき重要なことである。
【０５５５】
油中のリン脂質含有量の分析
表２は、漸増する量のＮａＯＨ（０、０．１、０．２、０．５、１および１．９ｍｌ）で脱ガムした油中（対照および酵素的試料）のリン脂質（ホスファチジル−エタノールアミンおよびホスファチジン酸）の含有量（ｐｐｍ）を示す。
【０５５６】
【表２−１】
0005509094.tif 000025
リンの最も大きな減少（４０．２ｐｐｍ）は、ＮａＯＨ  ０．１ｍｌ（ｐＨ６．３）で脱ガムした油で観察されるが、同様の含有量が通常の脱ガム条件下（ＮａＯＨ  ０ｍｌ）でも獲得される。したがって、ｐＨの１．０単位の上昇が、ＫＬＭ３’の加水分解活性に影響するようである。６．３より高いｐＨ（＞０．２ｍｌ  ＮａＯＨ）では、「通常の」酵素的条件と比較してリン脂質分解の減少が観察される。
【０５５７】
ガム中のリン脂質含有量の分析
図９１は、対照と比較して酵素的ガム試料におけるホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）の相対的分解を示す。対照でのリン脂質の分解を１００％と設定し、酵素的試料中の含有量を対照と比較して算出する。
【０５５８】
ＮａＯＨ  ０、０．１および  ０．２ｍｌでの酵素的試料におけるリン脂質の分解は、類似している。それゆえに、０．２ｍｌ未満の量でのＮａＯＨの添加は、ＫＬＭ３’だけでの酵素的脱ガムと比較してリン脂質の分解を改善しない。対照的に分解の減少が、ＮａＯＨをより多い量（０．５、１および１．９ｍｌ）で添加した油において観察される。
【０５５９】
結論
予測された通り、粗製ダイズ油の水脱ガムにおけるＮａＯＨでのｐＨの上昇は、ＫＬＭ３’の活性の増大を生じた。フィトステロールエステルの形成は、ＮａＯＨの量の増加とともに増加した。最大フィトステロールエステルレベル（０．４２％）はｐＨ６．３（ＮａＯＨ  ０．２ｍｌ）で獲得され、その後連続的に減少した。油中のＦＦＡについて同様の傾向が観察され、対照の０．４６％からＮａＯＨ  ０．２ｍｌで脱ガムした油中での０．６０％に増加し、その後減少した。
【０５６０】
ＮａＯＨ  ０および０．１ｍｌで脱ガムした油中で同程度のレベルのリン脂質が観察されたように、少量のＮａＯＨは、ＫＬＭ３’の加水分解活性に影響しなかった。ガム相中のリン脂質の分解は７．５を超えるｐＨ（ＮａＯＨ  ＞０．５ｍｌ）で通常の酵素的脱ガム（ＫＬＭ３’のみ）と比較して低下していた。
【０５６１】
油の収率の最も高い増加は、ＮａＯＨを使用しない酵素的脱ガムによって達成され、一般に油の収率の増加％は、ＮａＯＨの量の増加と共に減少する。
【０５６２】
本実験の結論は、水脱ガムにおけるフィトステロールエステルの形成のためには少量のＮａＯＨは有利であり得るが、しかしＮａＯＨは油の収率およびリン脂質の分解のためには積極的には添加されない。
【０５６３】
（実施例５）
酵素的水脱ガム由来のガム相の分析−顕微鏡およびＸ線分析
【０５６４】
【表２２】
0005509094.tif 000026
水脱ガムの実験室用手順
粗製ダイズ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱した。水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーを使用して３０秒間均質化し、磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌した。３０分後、油を遠心分離（２０００ｒｃｆ、３分間）した。ガム相を顕微鏡およびＸ線分析のために採取した。
【０５６５】
結果および考察
顕微鏡／Ｘ線分析
対照および酵素的水脱ガム試験（後者は本発明による）からのガムを顕微鏡およびＸ線分析のために回収した。ガム相を様々な温度（２５、３５、４５、５５および６５℃）で顕微鏡（直線偏光）で検査した。図９２で対照および酵素的試料（２５℃）について見られる通り全ての温度においてガムは、ラメラ相（水層によって分離された脂質二重層）になっていた。
【０５６６】
対照と酵素的試料との間にいくつかの差異が見られる。対照ガムは、本発明による酵素的ガム試料よりも粗く見える。対照と酵素的試料との間の差異は、図９３において見られる通りＸ線分析からも観察できる。
【０５６７】
酵素処理試料と比較して、対照におけるおよそ２０Åのより大きな間隙は、脂肪酸（Ｃ１８）の長さに相当する。間隙は、水とリン脂質の層を表しており、したがって、対照におけるより大きな間隙は、対照が脂肪酸の追加的な単層を含有することまたはガム相でより多くの水が吸収されていることを説明できる。
【０５６８】
（実施例６）
沈降検査
【０５６９】
【表２３】
0005509094.tif 000027
手順
粗製ダイズ油２００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱した。水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーを使用して３０秒間均質化し、磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌した。３０分後、試料を分液漏斗に入れた。ガム相の写真を１、３および６日後に撮った。６日後ガムを顕微鏡分析のために採取した。
【０５７０】
結果
ガム相／顕微鏡の写真
図９４において、油相およびガム相が対照および酵素的試料について観察できる。重力による沈降を３日間実施した。油相およびガム相の両方から見られる通り、対照と酵素的試料との間に明らかな差異が存在する。
【０５７１】
酵素処理した（すなわち本発明によって処理した）油の油相は、対照より澄んでおり、対照と比較してガム相の量の減少が観察される。結果は、顕微鏡分析からも説明できる（図９５）。酵素処理ガムは乳濁液として観察されるが、対照ガムはラメラ相である。
【０５７２】
（実施例７）
粗製ダイズ油の酵素的脱ガムにおける水量の変動の評価
【０５７３】
【表２４】
0005509094.tif 000028
水脱ガムの実験室用手順
粗製ダイズ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱した。水を油に加え、続いて酵素を加えた。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーで３０秒間均質化し、磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌した。３０分後、油およそ１０ｍｌを１２ｍｌ遠心チューブ（予め秤量した）に移した。油を沸騰水浴中で９７℃に１０分間加熱した。チューブを３００ｒｃｆで３分間遠心分離した。油をガム相からデカントし、チューブを逆さまにして１５分間ドレインした。ガム相の重量に基づいて油の収率を算出した。
【０５７４】
結果および考察
油の収率
図９６は、様々な量の水での粗製ダイズ油の酵素的水脱ガムから獲得された油の収率の増加を示す。油の収率の増加は、酵素的試料でのガムの量を減算した対照でのガムの量から算出する。
【０５７５】
酵素的脱ガムは、対照と比較して増加した油の収率によると考えられ、油の収率は水の量の減少と共に増加するようである。水を２％から１％に減少させると油の収率は対照と比較して酵素的脱ガムにおいておよそ５０％増加する。
【０５７６】
これらの計算は、ガムの量に基づいており、したがってガム相中のトリグリセリド含有量も含んでいる。正確な油の損失を（ガムの量およびガム中のトリグリセリド含有量に基づいて）精査すると（図９７）、油の損失は水含有量の増加とともに対照において減少する。しかし酵素的脱ガムにおいて油の損失は水の量によっていくらも影響されない。対照における３．５〜６．５％と比較して酵素的脱ガムにおいてはおよそ２％の油が失われる。
【０５７７】
酵素的水脱ガムにおける水の量の減少は、産業用に（より少ない処理水）、およびおそらくガム相の乾燥の際のエネルギー節約に関しても財政上の有利点になり得る。
【０５７８】
ガム相におけるリン脂質分解
対照と比較した酵素的ガム相中のホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）の相対的分解（％）を図９８に示す。
【０５７９】
ＫＬＭ３’でのリン脂質の分解は、低い水濃度でより表されていると考えられる。ＫＬＭ３’での酵素的脱ガム全体において、２％水での脱ガムと比較して１％水がリン脂質の分解に関して有利であるようである。
【０５８０】
ガム相での粘性測定
様々な量の水での脱ガム由来の酵素（ＫＬＭ３’  ０．２ＴＩＰＵ−Ｋ／ｇ）的ガム相の粘性を図９９に示す。粘性は異なる水含有量によって顕著には影響されない。低いずり速度（およそ１０まで）では、粘性は全ての試料についてある程度類似しているが、この時点以降では、水の量が最も少ない（１．２５％）試料の粘性は増加し、一方水の量が最も多い（２％）ガム試料は増加する。
【０５８１】
（実施例８）
粗製トウモロコシ油の水脱ガム
要約
脂質アシルトランスフェラーゼ、ＫＬＭ３’（Ｋ９３２とも称し、配列番号６８として本明細書に示すアミノ酸配列を有するを粗製トウモロコシ油について、この油の水脱ガムにおける油の収率への効果を研究する目的で検査した。
【０５８２】
材料および方法
酵素：
ＫＬＭ３’Ｋ９３２  １１２８ＴＩＰＵ／ｇ
油：
Ｃａｒｇｉｌｌ  ２００８年５月産の粗製トウモロコシ油
脱ガム手順：
粗製トウモロコシ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップ付きフラスコに秤量し、５５℃に加熱した。
水および酵素を加え、油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーで３０秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌した。
【０５８３】
３０分後、油１０ｍｌを、風袋を量った１２ｍｌ遠心チューブに移し、油の重量に注目した。油を沸騰水浴中で９７℃に１０分間加熱し、次いで３０００ｒｃｆで３分間、直ちに遠心分離した。
油をガム相からデカントし、チューブを逆さまにして１５分間ドレインした。ガム相の重量に基づいて油の収率を酵素で処理していない油と比較して算出した。
次いでガム相をＨＰＴＬＣで分析し、ガム相中のリン脂質の分解を算出した。
【０５８４】
結果
油の脱ガムプロセスを様々な濃度のＫＬＭ３’で実施した。
【０５８５】
【表１−２】
0005509094.tif 000029
試料を「脱ガム手順」に記載の通り処理し、湿ったガムの量を２回反復で定量し、結果を下に示す。
【０５８６】
【表２−２】
0005509094.tif 000030
表２における結果から、ＫＬＭ３’が粗製トウモロコシ油の水脱ガムによるガム相の量の減少に寄与することがわかる。ガム相の減少量は、油相の０．２８から０．４４％への増加に対応する。
【０５８７】
粗製トウモロコシ油の水脱ガムから単離されたガム相をＴＬＣによって分析し、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジン酸の減少を酵素処理しないガム中の量と比較して算出した（表３）。
【０５８８】
【表３−１】
0005509094.tif 000031
表３からの結果は、粗製トウモロコシ油中のリン脂質でのＫＬＭ３’の活性を示す。酵素活性の増大が油１ｇ当たり０．１ＴＩＰＵの投与量まで見られる。より高い酵素投与量では、リン脂質での活性は横ばいになる。
【０５８９】
（実施例９）
粗製ダイズ油の水脱ガム、および受容体の添加
脂質アシルトランスフェラーゼ、ＫＬＭ３’をＳｏｌａｅ産の粗製ダイズ油において、酵素ＫＬＭ３’に対する受容体基質を添加することの効果を研究する目的で検査した。
この研究において、Ｈｅｎｋｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙからのフィトステロール製品Ｇｅｎｅｒｏｌ  １２２、および脂肪アルコール、ラウリルアルコールを検査した。
油へのフィトステロールの添加は、遊離脂肪酸形成の低下を伴ってより多いステロールエステルを産生した。より多い受容体基質が利用可能である場合は、より高い程度のリン脂質転換が脂肪酸産生の増大を伴わずに達成できることが結論される。
【０５９０】
材料および方法
酵素：
ＫＬＭ３’Ｋ９３２（配列番号６８として示されるアミノ酸配列を有する−１１２８ＴＩＰＵ／ｇ
ダイズ由来フィトステロール：Ｇｅｎｅｒｏｌ  １２２Ｎ、Ｇｒｕｎａｕ、Ｉｌｌｅｒｔｉｓｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから
ラウリルアルコール：Ｓｉｇｍａ  Ｌ−５３７５
油：
Ｓｏｌａｅ、２００８年１月産、粗製ダイズ油
Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｌｉｐｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙからのダイズレシチン混合標準物（ＳＴ１６）
脱ガム手順
粗製ダイズ油１００ｇ、フィトステロールおよびラウリルアルコールを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱した。さらなる加工の前にフィトステロールを油に完全に溶解した。
水および酵素を加え、油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーで３０秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌した。
【０５９１】
３０分後、油１０ｍｌを、風袋を量った１２ｍｌ遠心チューブに移し、油の重量に注目した。油を沸騰水浴中で９７℃に１０分間加熱し、次いで直ちに３０００ｒｃｆで３分間遠心分離した。
油をガム相からデカントし、チューブを逆さまにして１５分間ドレインした。ガム相の重量に基づいて油の収率を算出した。
次いで油相およびガム相をＨＰＴＬＣで分析し、ガム相中のトリグリセリドの量および油相中のリン脂質の分解を算出した。
【０５９２】
結果
油の脱ガムプロセスを様々な濃度のＫＬＭ３、フィトステロールおよび脂肪アルコールで表１に示す通り実施した。
【０５９３】
【表１−３】
0005509094.tif 000032
試料を「脱ガム手順」に記載の通り処理し、湿ったガムの量を２回反復で定量し、結果を図１００に示す。
【０５９４】
フィトステロールの添加量の増加は、ガム％のいかなる減少にも寄与せず、ｐＨ調製（試験６）は、この検査においてはより多いガムとなる傾向はあるが、ガムの量にいかなる顕著な効果も有さなかった。ＫＬＭ３’の０．２ＴＩＰＵ／ｇでの添加は、ガム含有量に顕著な効果を有し、１ＴＩＰＵ／ｇへの増量がガムの量をさらに減少させたことが示された。ラウリルアルコールはガムの量にいかなる効果も有さなかった。
【０５９５】
ガムから分離された油相を遊離脂肪酸、ステロールおよびステロールエステルについてＧＬＣによって分析した。
【０５９６】
表２における結果は、０．２ＴＩＰＵ／ｇでの酵素処理による０．０９％の遊離脂肪酸の増加を示す（試料２）が、フィトステロールレベルを増加させた試料３〜５は、より少ない遊離脂肪酸を含有することが観察される。１ＴＩＰＵ／ｇで処理した試料７および８においても、より多いステロールを油に添加する場合、遊離脂肪酸の減少が観察される。これらの結果は、油中のステロールの量の増加と共に加水分解反応が減少することを示す。
【０５９７】
したがって、ステロールエステルの量は油中のステロールの増加と共に増加することが予測される。これは試料３についても見られるが、ステロールの量が増加しても（試料４および５）ステロールエステルの量は変化しない。試料５においてステロールエステルの量が減少する傾向さえ観察されるが、これは実験誤差の範囲内である。しかし、ＮａＯＨの添加によるｐＨの調整は、既に見られた通りステロールエステルの形成に強い効果を有する。酵素の量の増加（試料７および８）もステロールエステルの形成の増加に寄与する。
【０５９８】
【表２−３】
0005509094.tif 000033
試料（表１）の水脱ガムによって単離されたガム相をＨＰＴＬＣによって分析し、特定のリン脂質ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）の分解を対照試料番号１と比較して定量した（図１０１）。
【０５９９】
図１０１における結果は、０．２５％のステロールを添加する場合のＰＡおよびＰＥの分解の増加を示している。
【０６００】
しかし投与量の増加（０．５％および０．７５％ステロール）は、さらなるリン脂質の分解には寄与しない。これは、ステロールエステル形成への効果についての観察と一致する（表２を参照されたい）。ＮａＯＨでのｐＨ調整もリン脂質の分解に強い効果を有するが、これはｐＨ上昇に伴う酵素活性の増大に関連する。
【０６０１】
１ＴＩＰＵ／ｇへの酵素投与量の増加がリン脂質をさらに分解することも見られる。
【０６０２】
水脱ガムから単離された油相を油中の残存リンの量を分析する目的でＩＣＰによって分析した。
【０６０３】
図１０２における結果は、油中のリンのレベルは油中のステロールの量にあまり依存しないことを示しているが、結果は、酵素投与量の増加（１ＴＩＰＵ／ｇ）がリンレベルに効果を有することを示している。ラウリルアルコール（Ｃ１２−アルコール）の添加は油相中のリンのレベルに負の効果を有する。
【０６０４】
結論
粗製油への脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’の添加は、ステロールエステルの形成の際に脂肪酸成分のリン脂質からステロールへの移動を触媒する。分子レベルでは、ステロールの量は粗製ダイズ油においてリン脂質の量の１／３未満である。アシル受容体ステロールが粗製ダイズ油におけるＫＬＭ３’についての制限因子であることから、加水分解反応は酵素投与量および反応時間に依存して生じ得る。
この研究において、油を脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’で処理する場合に、粗製油へのより多いステロールの添加がより多いステロールエステルを生じ、形成される脂肪酸の量はステロールを添加しない場合の油と比較して減少することが見出された。
【０６０５】
追加のステロールの添加は、水脱ガム後の油相中のリンのレベルにあまり影響を有さないが、ＫＬＭ３’の投与量の増加が油相中のリンのレベルを低下させることが観察された。０．５％ラウリルアルコールの添加は、遊離脂肪酸のレベルにあまり影響を有さず、ＧＬＣ分析によってラウリルアルコールエステルは観察されなかった。
【０６０６】
（実施例１０）
脂質アシルトランスフェラーゼとホスホリパーゼＣとの組合せ
材料および方法
酵素：
脂質アシルトランスフェラーゼ  ＫＬＭ３’Ｋ９３２．１１２８ＬＡＴＵ／ｇ（本明細書において配列番号６８として示されるアミノ酸配列を有する）
ホスホリパーゼＣ、Ｓｉｇｍａ  Ｐ７６３３  １５単位／ｍｇ
油：
Ｓｏｌａｅ、Ａａｒｈｕｓ、ＤＫからの粗製ダイズ油
脱ガム手順
粗製ダイズ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱する。５０％クエン酸１水和物０．１４ｍｌを加える。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーで３０秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、１５分間撹拌する。１Ｎ  ＮａＯＨ  ０．３６７ｍｌに続いて２．５％水および油１ｇ当たり５単位のホスホリパーゼＣを加える。油を再びＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーで３０秒間均質化し、磁気攪拌機で４５０ｒｐｍで撹拌した。反応時間２時間の後、油１ｇ当たり０．２ＬＡＴＵの酵素脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’を加え、撹拌しながらさらに１時間反応を継続する。
【０６０７】
油を沸騰水浴中で９７℃に１０分間加熱し、次いで３０００ｒｃｆで３分間、直ちに遠心分離する。
【０６０８】
油をガム相からデカントする。ガム相油相の重量を測定する。
【０６０９】
油相をＴＬＣによって残存リン脂質について分析し、リンｐｐｍをＩＣＰによって分析する。遊離ステロール、ステロールエステル、遊離脂肪酸およびジグリセリドをＧＬＣによって分析する。
【０６１０】
ガム相をトリグリセリド、ジグリセリド、残存リン脂質および遊離脂肪酸について分析する。
【０６１１】
ガム相におけるリン脂質の分解をＴＬＣで分析する。
【０６１２】
結果
脂質アシルトランスフェラーゼとホスホリパーゼＣとの組合せでの脱ガムプロセスは、酵素処理しない油と比較して２％を超えて油の収率を増加させると予測される。最初の研究はジグリセリドが酵素処理試料の油相中において産生されていることを示唆している。
【０６１３】
遠心分離後の油相ではステロールの大部分がエステル化されている。
【０６１４】
予備調査は、リンレベルが油相中で５ｐｐｍを下回ること、およびガム相におけるリン脂質の強い分解（すなわち、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）のほぼ完全な消失ならびにホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）の強い分解）を示す。
【０６１５】
（実施例１１）
ホスホリパーゼＣとの組合せでの脂質アシルトランスフェラーゼ
材料および方法
酵素：
脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’Ｋ９３２．１１２８ＬＡＴＵ／ｇ
ホスホリパーゼＣ  Ｓｉｇｍａ  Ｐ７６３３  １５単位／ｍｇ
油：
Ｓｏｌａｅ、Ａａｒｈｕｓ、ＤＫからの粗製ダイズ油
脱ガム手順
粗製ダイズ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱する。
【０６１６】
３％水に続いて、油１ｇ当たり０．１単位のアシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’およびホスホリパーゼＣ  ５単位を加える。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーで３０秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、３０分間撹拌する。
【０６１７】
３０分後、油１０ｍｌを、風袋を量った１２ｍｌ遠心チューブに移し、油の重量に注目する。油を１０分間沸騰水浴中で９７℃に加熱し、次いで直ちに３０００ｒｃｆで３分間遠心分離する。
【０６１８】
油をガム相からデカントし、チューブを逆さまにして１５分間ドレインする。ガム相の重量に基づいて油の収率を算出する。油相をＴＬＣおよびＩＣＰによって残存リン脂質について分析する。遊離ステロール、ステロールエステル、遊離脂肪酸およびジグリセリドをＧＬＣによって分析する。
【０６１９】
ガム相をトリグリセリド残存リン脂質および遊離脂肪酸について分析する。
【０６２０】
結果
予備調査は、脂質アシルトランスフェラーゼとホスホリパーゼＣとの組合せでの水脱ガムプロセスは、酵素処理を行わない油と比較して２％を超える油の収率の顕著な増加を生じることを示唆する。最初の研究は、ジグリセリドが油相中で産生され、油相中のステロールの大部分がエステル化されることを示している。
【０６２１】
（実施例１２）
脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）での酵素的脱ガム
材料および方法
酵素：
脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’Ｋ９３２．１１２８ＬＡＴＵ／ｇ
ホスホリパーゼＣ  Ｓｉｇｍａ  Ｐ７６３３  １５単位／ｍｇ
油：
Ｓｏｌａｅ、Ａａｒｈｕｓ、ＤＫからの粗製ダイズ油
脱ガム手順
粗製ダイズ油１００ｇを蓋付きの２５０ｍｌ青キャップフラスコに秤量し、５５℃に加熱する。
【０６２２】
３％水に続いて、油１ｇ当たり５単位のホスホリパーゼＣを加える。ｐＨをＮａＯＨで５．５に調整する。油をＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘミキサーで３０秒間均質化し、次いで磁気攪拌機で４５０ｒｐｍ、１５分間撹拌する。１５分後試料を取り出し、油１ｇ当たり０．１単位のアシルトランスフェラーゼを加える。油をさらに１５分間、５５℃で撹拌する。
【０６２３】
２×１５分間の反応時間後、油１０ｍｌを風袋を量った１２ｍｌ遠心チューブに移し、油の重量に注目する。油を沸騰水浴中で９７℃に１０分間加熱し、次いで直ちに３０００ｒｃｆで３分間遠心分離する。
【０６２４】
油をガム相からデカントし、チューブを逆さまにして１５分間ドレインする。ガム相の重量に基づいて油の収率を算出する。
【０６２５】
油相をＴＬＣおよびＩＣＰによって残存リン脂質について分析する。遊離ステロール、ステロールエステル、遊離脂肪酸およびジグリセリドをＧＬＣによって分析する。
【０６２６】
ガム相をトリグリセリド残存リン脂質および遊離脂肪酸について分析する。
【０６２７】
結果
最初の調査は、脂質アシルトランスフェラーゼとホスホリパーゼＣとの組合せを使用する水脱ガムプロセスは、酵素処理を行わない油と比較して２．５％を超えて油の収率を増加させることを示唆している。予備調査は、ジグリセリドが油相中で１５分後に産生されていることを示唆している。
【０６２８】
油相中のステロールの大部分は、エステル化される。
【０６２９】
予備調査は、１５分後にホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルコリン（ＰＣ）の大部分は消失するが、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）には活性があまり見られない場合があることを示している。３０分後かつ遠心分離後の試料においてもＰＩおよびＰＡの大部分が消失している。
【０６３０】
（実施例１３）
脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）での酵素的脱ガム
脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’およびＳｉｇｍａからのホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を粗製ダイズ油の水脱ガムにおいて単独でおよび組合せで検査した。油の脱ガムにおいてホスホリパーゼＣは油中のリン脂質からジグリセリドを産生した。ＫＬＭ３’がトリグリセリドの産生の際にジグリセリドを受容体分子として使用できることが驚くべきことに示された。ジグリセリドおよびホスファチジルコリンを含有する基質でのモデル実験は、脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）が、トリグリセリドの産生の際にリン脂質からジグリセリドへの脂肪酸成分の移動反応を触媒することを確認した。
【０６３１】
結果の商業的妥当性
この研究は、ＫＬＭ３’とホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）との組合せが、粗製植物油の脱ガムの際に非常に有利であることを示す目的で始めた。
【０６３２】
Ｖｅｒｅｎｉｕｍ、Ｕ．Ｓ．からのホスホリパーゼＣ（すなわちＰｕｒｉｆｉｎｅ（登録商標））が油の脱ガムにおける使用のために紹介されている（ＷＯ２００８／０３６８６３）。
【０６３３】
この酵素は、粗製油中のリン脂質（ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンなど）に活性であり、ジグリセリド（ジアシルグリセロール）およびリン−コリン、−エタノールアミン、−イノシトールまたは−酸を形成する。このプロセスにおいて産生されるジグリセリドは、油の脱ガムプロセスにおいて油の一部を形成し、したがって油の収率の向上に寄与する。
【０６３４】
本発明者らは、脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’など）が、ステロールエステル形成を伴うリン脂質の修飾による油脱ガムでの収率の向上に寄与できることを示している。
【０６３５】
脂質アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’など）は、ステロールをアシル受容体としておよび脂肪アルコールを含むアルコールなどの他の受容体として使用できる。
【０６３６】
本研究の目的は、脂質アシルトランスフェラーゼ（例えばＫＬＭ３’）をホスホリパーゼＣとの組合せで使用した場合の相乗効果を調査することであった。
【０６３７】
材料および方法
・ＫＬＭ３’：グリセロリン脂質コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＦｏｏｄＰｒｏ  ＬｙｓｏＭａｘ  Ｏｉｌ）（Ｋ９３２）（配列番号６８）
Ｌｏｔ  ｎｏ  １０２６２９６００．活性１１２８ＬＡＴＵ／ｇ
・ホスホリパーゼＣ  Ｐ７６３３  Ｓｉｇｍａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来、１３５．３ｍｇ
固体：固体１ｍｇ当たり３．８単位、タンパク質１ｍｇ当たり１３．２単位
・ホスホリパーゼＣ  Ｐ６６２１  Ｓｉｇｍａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来、２５０単位
ジグリセリド、サンフラワー油由来の蒸留ジグリセリド、Ｊｏｕｒ２６４１／０６４
ホスファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ＃４４１６０１
モノ−ジ−トリグリセリド：ＧＲＩＮＤＳＴＥＤ（登録商標）ＭＯＮＯ−ＤＩ  Ｒ５０／Ｄ
粗製ダイズ油  ｎｏ  １８：アルゼンチン産
ＨＰＴＬＣ分析
酵素処理試料からのガム相におけるリン脂質の分解をＨＰＴＬＣによって分析した。
【０６３８】
アプリケーター：Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ＴＬＣ  Ｓａｍｐｌｅｒ４、ＣＡＭＡＧ
ＨＰＴＬＣプレート：２０×１０ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ  ｎｏ．１．０５６４１  使用前に１６０℃で１０分間活性化
添加：
油１０グラムからのガム相をヘキサン：イソプロパノール  ３：２  ７．５ｍｌに溶解した。
試料１μｌをＨＰＴＬＣプレートに添加した。
【０６３９】
リン脂質標準物（０．５％リン脂質（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｌｉｐｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し（０．１、０．３、０．５、０．８および１．５μｌ）、ガム中の個々のリン脂質の算出に使用した。
いくつかの添加についてリン脂質含有量は、酵素処理していない対照ガムと比較して算出した。この対照試料を０．１−０．３−０．５−０．８−１μｌ添加し、検量線を作成するために使用した。
油相。およそ９０ｍｇを秤量し、ヘキサン：イソプロパノール  ３：２  １ｍｌに溶解した。
試料５μｌをＨＰＴＬＣプレートに添加した。公知の濃度の５ｍｇ／ｍｌモノ−ジグリセリドを０．１−０．３−０．５−０．８−１．５μｌで添加し、個々のグリセリド成分の算出のために使用した。
【０６４０】
ＴＬＣアプリケーター
ランニング緩衝液ｎｏ．１：Ｐ−エーテル：メチルターシャリーブチルケトン：酢酸  ５０：５０：１
ランニング緩衝液ｎｏ．６：クロロホルム：１−プロパノール：酢酸メチル：メタノール：水中０．２５％ＫＣｌ  ２５：２５：２５：１０：９
溶出：プレートをＣａｍａｇからのＡｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ＡＤＣ２を使用して７ｃｍ溶出させた。
【０６４１】
発色：
プレートをＣａｍａｇ  ＴＬＣ  Ｐｌａｔｅ  Ｈｅａｔｅｒ  ＩＩＩで６分間、１６０℃で乾燥させ、冷却し、１６％Ｈ３ＰＯ４中の６％酢酸銅（ＩＩ）に浸した。さらに１６０℃で１０分間乾燥させ、直接評価した。
ＴＬＣプレート上の成分の濃さをＣａｍａｇ  ＴＬＣ  Ｓｃａｎｎｅｒ３によって分析した。
【０６４２】
ガスクロマトグラフィー
ガム相中の遊離脂肪酸をＧＬＣによって分析した。
油相のモノ−ジ−トリグリセリド、ステロールおよびステロールエステルもＧＬＣで分析した。
装置：
・ＷＣＯＴ溶融シリカカラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ×０．１μフィルム厚  ５％フェニル−メチル−シリコン（ＣｈｒｏｍｐａｃｋからのＣＰ  Ｓｉｌ  ８  ＣＢ）を備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ  ９０００  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ。
・キャリアガス：ヘリウム
・インジェクター：ＰＳＳＩ  ｃｏｌｄ  ｓｐｌｉｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（初期温度５０℃を３８５℃に加熱）、容量１．０μｌ
検出器ＦＩＤ：３９５℃
【０６４３】
【表２５】
0005509094.tif 000034
試料調製：
試料を内部標準ヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含有するヘプタン：ピリジン  ２：１  １２ｍｌに溶解した。試料溶液５００μｌをクリンプバイアルに移し、ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオラセアミド）１００μｌを加え、１５分間、６０℃で反応させた。
【０６４４】
算出：
ステロール、ステロールエステル、遊離脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリグリセリドに対する応答計数を純粋な参照物質に基づいて決定した。
【０６４５】
実験
アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’およびＰＬＣを粗製ダイズ油を表１に示す処方で使用する水脱ガムプロセスにおいて検査した。
【０６４６】
【表１−４】
0005509094.tif 000035
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来、ホスホリパーゼＣ  Ｐ７６３３  Ｓｉｇｍａ  １３５．３ｍｇ  固体：固体１ｍｇ当たり３．８単位、水０．５ｍｌ中に酵素３２．９ｍｇ
ホスホリパーゼＣ  Ｐ６６２１  Ｓｉｇｍａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来  水１ｍｌに溶解した２５０単位
１０  ＬＡＴＵ／ｍｌに希釈したアシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’（Ｋ９３２）
粗製ダイズを２０ｍｌ  Ｗｈｅａｔｏｎ  ｇｌａｓｓ中で４５℃に加熱した。水および酵素を加えた。
試料を高せん断混合で３０秒間均質化した。
試料を４５℃の加熱ブロックに置き、磁気撹拌した。
試料１ｍｌを３０および２４０分後にエッペンドルフチューブに採取し、酵素を９７℃、１０分間不活性化させた。特に、実験においては酵素の不活性化が実施されるが、これは産業での実施においては一般に実施されない。不活性化は、酵素分解の正確な分析のために本明細書の実験においてだけ実施される。
試料を３０００ｒｃｆで３分間遠心分離した。油相をガム相から分離し、両方の相をＴＬＣおよびＧＬＣで分析した。
【０６４７】
結果
ＴＬＣ分析
３０分後および２４０分後に採取した試料をＴＬＣで分析し、結果を図１０３〜１０６に示す。
【０６４８】
ＴＬＣプレート（図１０３および図１０４）を走査し、１，２ジグリセリド（ＤＡＧ  ｓｎ１，２）の定量的決定のために使用し、結果を下の表２および３に示す。
【０６４９】
リン脂質の相対的な分解を図１０７に示す。
【０６５０】
【表２−４】
0005509094.tif 000036
【０６５１】
【表３−２】
0005509094.tif 000037
上の表２および３からの結果は、リン脂質のＰＬＣ分解によって生じるジグリセリドの形成を明確に示す。使用したＰＬＣの投与量でｓｎ  １，２ジグリセリドの形成が反応時間３０分後で既に最大に達していることが観察される。ＰＬＣとの組合せで使用する場合はＫＬＭ３’の投与量の増加に伴ってｓｎ  １，２ジグリセリドの量が減少することも観察される。
【０６５２】
この効果は、両方のホスホリパーゼＣ酵素について観察されたが、ＫＬＭ３’がＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のホスホリパーゼＣ  Ｐ７６３３  Ｓｉｇｍａと組み合わされた場合に効果が最も発揮された。これは、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のＰＬＣがリン脂質の一部分だけを分解し、ゆえにより多い基質がＫＬＭ３’に利用可能であったという事実よっておそらく説明される。
【０６５３】
図１０７の結果は、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のホスホリパーゼＣ  Ｐ７６３３  Ｓｉｇｍａが主にホスファチジルコリン（ＰＣ）において活性であり、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ由来のホスホリパーゼＣ  Ｐ６６２１  Ｓｉｇｍａがホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に主な活性を有し、ホスファチジン酸（ＰＡ）およびホスファチジルイノシトール（ＰＩ）にはより少ない活性を有することを明確に示す。結果は、ＫＬＭ３’が４種全てのリン脂質を使用できることも証明する。
【０６５４】
したがって、アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’がｓｎ  １，２ジグリセリドを受容体分子として使用でき、図１０８における反応を触媒すると結論される。
【０６５５】
ＧＬＣ分析
表１における実験からの油相、試料番号１〜６をＧＬＣによっても分析した。
【０６５６】
総ジグリセリド（ＤＡＧ）、ステロールステロールエステルおよびＦＦＡのＧＬＣ分析を下の表４に列挙する。
【０６５７】
【表４】
0005509094.tif 000038
反応時間３０および２４０分間後に採取した試料のＧＬＣ分析は、ＴＬＣ分析によって既に観察された、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ由来のホスホリパーゼＣ  Ｐ７６３３  Ｓｉｇｍａが油中のリン脂質からジグリセリドを産生したことを確認した。結果は、ホスホリパーゼＣをＫＬＭ３’と組み合わせる場合の相乗効果もジグリセリドの量の減少によって確認した。ジグリセリドの量についてのＰＬＣとＫＬＭ３’との効果のＳｔａｔｇｒａｐｈｉｃソフトウェアを使用するＡＮＯＶＡによる統計的評価は、これら２つの酵素の間の相互作用効果を明確に示している、図１０９を参照されたい。
【０６５８】
ＰＬＣは、油中のステロールに顕著な効果を有さなかったが、ＫＬＭ３’は遊離ステロールをステロールエステルに転換する。ステロールはＫＬＭ３’に対してＤＡＧよりも良い受容体分子であり、したがって反応混合物中のＤＡＧの１０〜１５％だけがトリグリセリドに転換された。
【０６５９】
ＰＬＣは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）のレベルにあまり影響を有さないが、高投与量のＫＬＭ３’および反応時間の延長は、ＦＦＡレベルの増加に寄与することが観察される。
【０６６０】
文献２４６０−２２４：
理論に縛られなければ、アシルトランスフェラーゼ（ＫＬＭ３’）とホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）とを組合せることによるジグリセリドの減少は、２つの酵素が一緒に使用される場合の基質（リン脂質）競合によって生じる可能性がある。
【０６６１】
ＫＬＭ３’がジグリセリドを受容体として使用でき、かつ図１０８において述べる反応を触媒できることを証明するために、下の表５に示す処方でのモデル実験を実施した。
【０６６２】
【表５】
0005509094.tif 000039
サンフラワー油からの蒸留ジグリセリドとホスファチジルコリン（ＰＣ）とを、ＰＣがジグリセリドに溶解するまで８０℃に加熱および撹拌して混合した。
【０６６３】
基質をネジ蓋付き７ｍｌ  Ｄｒａｍ  Ｇｌａｓｓに秤量し、５５℃に加熱した。酵素、緩衝液および水を加え、試料を磁気攪拌機で４５０ｒｐｍで撹拌した。
【０６６４】
３０および１８０分後に試料を採取し、ＴＬＣで分析した（図１１０）。
【０６６５】
ＴＬＣプレートを走査し、試料中のトリグリセリド含有量を、キャノーラ油の分析から作成した標準曲線から定量し、結果を下の表６に示す。
【０６６６】
【表６】
0005509094.tif 000040
表６に示す結果をＳｔａｔｇｒａｐｈｉｃソフトウェアを使用するＡＮＯＶＡによって統計学的に分析し、結果を図１１１および１１２に示す。
【０６６７】
表６からのトリグリセリドの結果の統計学的評価は、ジグリセリドおよびホスファチジルコリンを含有する基質へのアシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’の添加によるトリグリセリドの量の有意な増加を確認する。
【０６６８】
文献２４６０−２２８
上の表５に記載の実験を、トリグリセリドの形成の際にリン脂質からジグリセリドへの脂肪酸成分の移動反応についての、より高いレベルの水の効果をさらに詳細に調査するために研究した。実験の設定を下の表７に列挙する。
【０６６９】
【表７】
0005509094.tif 000041
サンフラワー油からの蒸留ジグリセリドとホスファチジルコリン（ＰＣ）とを、ＰＣがジグリセリドに溶解するまで８０℃に加熱および撹拌して混合した。
【０６７０】
基質をネジ蓋付き７ｍｌ  Ｄｒａｍ  Ｇｌａｓｓに秤量し、５５℃に加熱した。酵素、緩衝液および水を加え、試料を磁気攪拌機で４５０ｒｐｍで撹拌した。
【０６７１】
３０、９０および２４０分後に試料を採取し、ＴＬＣで分析した。
【０６７２】
ＴＬＣクロマトグラムを図１１３および図１１４に示す。
【０６７３】
ＴＬＣプレートを走査し、試料中のトリグリセリド含有量を、トリグリセリド（キャノーラ油）から作成した標準曲線に基づいて算出した。トリグリセリド定量の結果を表８に示す。
【０６７４】
【表８】
0005509094.tif 000042
表８の結果をＳｔａｔｇｒａｐｈｉｃソフトウェアを使用するＡＮＯＶＡによって統計学的に分析し、結果を図１１５および１１６に示す。
【０６７５】
表８ならびに図１１５および図１１６からの結果は、ジグリセリドおよびホスファチジルコリンの基質からトリグリセリドを産生するアシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’の能力を明確に示す。
【０６７６】
結論
脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、植物油の脱ガムにおける油の収率の増加に寄与することが公知である。
【０６７７】
油の脱ガムにおける脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’の効果は、リゾリン脂質およびステロールエステル産生の際のリン脂質からステロールへの脂肪酸成分の移動反応に基づいている。
【０６７８】
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の効果は、ジグリセリドおよび水溶性リン誘導体へのリン脂質の転換に依存している。この反応において産生されるジグリセリドは、脱ガムプロセスによって油相に蓄積するが、それが油の煙点に影響を与え、より飽和している脂肪源の結晶化特性にも影響を有することから油中に多量のジグリセリドを含むことは、必ずしも好ましくない。
【０６７９】
本研究において、脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’およびホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を単独でおよび組合せで水脱ガムプロセスにおいて検査した。実験は、ダイズ油の水脱ガムにおいてＰＬＣが油相の一部を形成するジグリセリドを産生することを示した。ＰＬＣをＫＬＭ３’との組合せで使用する場合、ＫＬＭ３’がトリグリセリド形成の際にリン脂質からジグリセリドへの脂肪酸成分の移動反応を触媒することから、これらの２種の酵素間での相乗効果を示唆して、ＰＬＣによって産生されたジグリセリドの量が低下し、かつステロールがステロールエステルに転換されたことが驚くべき事に示された。
【０６８０】
トリグリセリド形成の際にＫＬＭ３’によって触媒されるリン脂質からジグリセリドへの脂肪酸成分の移動反応は、ジグリセリドとリン脂質とからなるモデル系において確認された。
【０６８１】
結果は、検査した２種のリン脂質は全種類のリン脂質に同じ活性を有さないが、ＫＬＭ３は粗製ダイズ油に見出される４種類のリン脂質の全てにほぼ同じ活性を有することも示した。これは、リン脂質のさらなる転換を得るためにホスホリパーゼＣをＫＬＭ３’との組合せで使用する可能性も開く。
【０６８２】
（実施例１４）
粗製ダイズ油の水脱ガムにおけるＫＬＭ３’の使用
ダイズ油を含む植物油は、１〜３％のリン脂質を含有しており、油の脱ガムプロセスによって除去される。油の脱ガムプロセスは、通常、水脱ガムプロセスと中和プロセスとに分けられる。１〜３％のリン脂質を含む粗製ダイズ油は、水脱ガム粗製油についての規格に適合させるためにリンのレベルをリン２００ｐｐｍリンまたはそれ未満に低下させる目的での水脱ガムを行わずには輸出用に出荷できない。
【０６８３】
リンのレベルが２００ｐｐｍより十分に低い場合は、これは不利益となり得る。典型的には従来の脱ガムプロセスは、遠心分離後で約５０ｐｐｍのリンのレベルをもたらす。これは、２００ｐｐｍ未満であるができるだけこのレベルに近いリンのレベルを生じるように遠心分離を管理することができないためである。
【０６８４】
対照的に本発明の場合では、脂質アシルトランスフェラーゼ使用の水脱ガムした油は、好ましくは約１８０ｐｐｍのリンに調整できる。
【０６８５】
本発明の酵素的水脱ガムプロセスにおけるリンのレベルの調整は、好ましくは少し多いリン脂質を油相に得るために遠心分離中のガムと油との間の相間を調整することによって行われ得る。しかし従来の水脱ガムプロセスにおいては、ガム相は非常に厚く粘稠であり、したがって遠心分離において相間を調整することは容易ではない。
【０６８６】
本発明者らは、脂質アシルトランスフェラーゼ（例えばＫＬＭ３’）を水脱ガムプロセスにおいて使用する場合、相間は遠心機で問題なく調整でき、リン最大２００ｐｐｍの規格により近い脱ガム油を産生できたことを驚くべきことに見出した。
【０６８７】
実験
脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’（配列番号６８）を図１１７に概説するプロセスでの粗製ダイズ油の水脱ガムにおいて使用した。
【０６８８】
リン１１００ｐｐｍを含有する粗製ダイズ油を図１１７に示す水脱ガムプロセスにさらした。最初の実験において脱ガムプロセスは酵素を添加せずに実施した。第２の実験では、酵素ＫＬＭ３’を加え、水脱ガムした油のリン含有量を分析した後、遠心機でのガムと油との間の相間を遠心機の中央に調整した。プロセスが不安定な場合は、リンを再度分析した。
【０６８９】
試験からの結果を下の表１に示す：
【０６９０】
【表１−５】
0005509094.tif 000043
結論
ＫＬＭ３’を使用する酵素的水脱ガムでの実験において、遠心分離における油とガムとの間の相間を規格に近いレベルのリンを含む（すなわち２００ｐｐｍに近いがそれ未満の）水脱ガム油を産生するために容易に調整、または管理できることが示された。
【０６９１】
従来の水脱ガム条件下では、ガム相の稠度（高粘性）がそのような調整を許さないことから相間を調整することは必ずしも容易ではない。
【０６９２】
（実施例１５）
植物油の酵素的水脱ガム後の「ガム相」における酵素反応
脂質アシルトランスフェラーゼ、ＬｙｓｏＭａｘ  Ｏｉｌ（ＫＬＭ３’）を粗製ダイズ油の水脱ガムにおいて検査した。特に、酵素は酵素的水脱ガムプロセスの最後で不活性化されなかった−産業での実施において慣例である通り。したがって酵素的水脱ガムプロセスは下に示す実験手順書に従って実施した。特に酵素を脱ガム後に不活性化しなかった。
【０６９３】
このプロセスから単離されたガム相を４０℃でインキュベートし、ガム相でのリン脂質のさらなる分解を分析した。結果は、酵素がリン脂質をリゾリン脂質および遊離脂肪酸にさらに加水分解したことを驚くべきことに示した。これは、ガム相が遠心分離によって油相から分離される際に酵素がガム相に付随するという事実によって説明される。
【０６９４】
同様にリゾ−リン脂質は、保存中に加水分解され、７日間の保存後でほとんど全てのリン脂質がガム相から消失した。
【０６９５】
結果の商業的妥当性
ＫＬＭ３’でのダイズ油の酵素的な油の脱ガムは、油の収率を０．５％から１．５％に向上できることを示している。このプロセスから単離されたガム相は、典型的にはいくらかの油およびリン脂質をまだ含有している（ＥＰ１６２４０４７）。ガム相の加水分解によって油相がガムから分離でき、遠心分離または他の分離手段によって単離できることは公知である。高レベルの遊離脂肪酸を含有する油相は、ミールに加えられる通常のガム相よりも高価値で酸性油として販売できる。
【０６９６】
さらなる態様は、酸性油の分離後に残った固相は通常のガムよりも高いリンレベルを有し、原料または有機リンとして使用できることである。
【０６９７】
序論
本発明者らは、脂質アシルトランスフェラーゼＬｙｓｏＭａｘ  Ｏｉｌ（ＫＬＭ３’）が粗製ダイズ油の酵素的水脱ガムから単離されたガム相中で活性であることを驚くべきことに示している。したがって、遠心分離によってガム相中の残存トリグリセリドと共に酸性油として単離され得る遊離脂肪酸に酵素がリン脂質をさらに分解できるかどうかが推側された。
【０６９８】
この研究において様々な酵素投与量および水脱ガム温度のガム相中のリン脂質分解についての効果を検討した。
【０６９９】
材料および方法
・ＫＬＭ３’：グリセロリン脂質コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＦｏｏｄＰｒｏ  ＬｙｓｏＭａｘ  Ｏｉｌ）（Ｋ９３２）
Ｌｏｔ  ｎｏ  １０２６２９６００．１  活性  １１２８ＬＡＴＵ／ｇ
粗製ダイズ油  ｎｏ  １８：アルゼンチン産
ＨＰＴＬＣ分析
酵素処理試料からのガム相中のリン脂質の分解をＨＰＴＬＣで分析した。
【０７００】
アプリケーター：Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ＴＬＣ  Ｓａｍｐｌｅｒ４、ＣＡＭＡＧ
ＨＰＴＬＣプレート：２０×１０ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ  ｎｏ．１．０５６４１  使用前に１６０℃で１０分間活性化。
【０７０１】
添加：
油１０グラムからのガム相をヘキサン：イソプロパノール  ３：２の７．５ｍｌに溶解した。
試料１μｌをＨＰＴＬＣプレートに添加した。
リン脂質標準物（０．５％リン脂質（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｌｉｐｉｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加し（０．１、０．３、０．５、０．８および１．５μｌ）、ガム中の個々のリン脂質の算出に使用した。
【０７０２】
いくつかの添加においてリン脂質含有量は、酵素処理していない対照ガムと比較して算出した。この対照試料を０．１−０．３−０．５−０．８−１μｌ添加し、検量線の作成のために使用した。
【０７０３】
油相。およそ９０ｍｇを秤量し、ヘキサン：イソプロパノール  ３：２  １ｍｌに溶解した。
試料５μｌをＨＰＴＬＣプレートに添加した。公知の濃度の５ｍｇ／ｍｌモノ−ジグリセリドを０．１−０．３−０．５−０．８−１．５μｌで添加し、個々のグリセリド成分の算出のために使用した。
【０７０４】
ＴＬＣアプリケーター
ランニング緩衝液ｎｏ．１：Ｐ−エーテル：メチルターシャリーブチルケトン：酢酸  ５０：５０：１
ランニング緩衝液６：クロロホルム：１−プロパノール：酢酸メチル：メタノール：水中０．２５％ＫＣｌ  ２５：２５：２５：１０：９
溶出：プレートをＣａｍａｇからのＡｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ＡＤＣ２を使用して７ｃｍ溶出させた。
【０７０５】
発色：
プレートをＣａｍａｇ  ＴＬＣ  Ｐｌａｔｅ  Ｈｅａｔｅｒ  ＩＩＩで１６０℃、１０分間乾燥させ、冷却し、１６％Ｈ３ＰＯ４中の６％酢酸銅（ＩＩ）に浸した。さらに１６０℃で１０分間乾燥させ、直接評価した。
【０７０６】
ＴＬＣプレート上の成分の濃さをＣａｍａｇ  ＴＬＣ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３で分析した。
【０７０７】
ガスクロマトグラフィー
ガム相中の遊離脂肪酸をＧＬＣによって分析した。
油相のステロール、ステロールエステルおよびモノ−ジ−トリグリセリドもＧＬＣで分析した。
【０７０８】
装置
・ＷＣＯＴ溶融シリカカラム１２．５ｍ×０．２５ｍｍ  ＩＤ×０．１μフィルム厚  ５％フェニル−メチル−シリコン（ＣｈｒｏｍｐａｃｋからのＣＰ  Ｓｉｌ  ８  ＣＢ）を備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｕｔｏｓｙｓｔｅｍ  ９０００  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ。
・キャリアガス：ヘリウム
・インジェクター、ＰＳＳＩ  ｃｏｌｄ  ｓｐｌｉｔ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（初期温度５０℃を３８５℃に加熱）、容量１．０μｌ
検出器ＦＩＤ：３９５℃
【０７０９】
【表２６】
0005509094.tif 000044
試料調製
試料を内部標準ヘプタデカン０．５ｍｇ／ｍｌを含有するヘプタン：ピリジン  ２：１  １２ｍｌに溶解した。試料溶液５００μｌをクリンプバイアルに移し、ＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリル−トリフルオラセアミド）１００μｌを加え、１５分間、６０℃で反応させた。
【０７１０】
算出
遊離脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリグリセリドに対する応答計数を純粋な参照物質に基づいて決定した。
【０７１１】
実験：
脂質アシルトランスフェラーゼＫＬＭ３’を下の表１に示す処方で粗製ダイズ油において検査した。
【０７１２】
表１の脱ガム実験は、４５および５５℃の両方で実施した。
【０７１３】
【表１−６】
0005509094.tif 000045
粗製ダイズを２０ｍｌ  Ｗｈｅａｔｏｎ  ｇｌａｓｓで５５℃（または４５℃）に加熱した。水および酵素を加えた。試料を高せん断混合で３０秒間均質化した。試料を磁気撹拌（４５０ｒｐｍ）付きの５５℃（または４５℃）の加熱ブロックに置いた。３０分間のインキュベーション後、試料を３０００ｒｃｆで３分間遠心分離した。
【０７１４】
チューブを１５分間逆さまにすることによって油相をガム相から分離し、ガム相はチューブに残った。
【０７１５】
次いで試料１〜４のそれぞれからのガム相を直ちに凍結した。
【０７１６】
試料５〜８のそれぞれからのガム相を４０℃で１日間インキュベートし、次いで凍結した。
【０７１７】
試料９〜１２のそれぞれからのガム相を４０℃で７日間インキュベートした。
【０７１８】
全ての試料をＴＬＣおよびＧＬＣによって同時に分析した。
【０７１９】
結果
５５℃での脱ガム由来のガム相試料のＴＬＣ分析を図１１８に示し、４５℃での脱ガム由来の試料を図１１９に示す。
【０７２０】
ＴＬＣクロマトグラムの走査に基づいて、酵素処理していないガム相と比較して、酵素処理したガム相におけるリン脂質の相対的含有量を算出した（下の表２および３を参照されたい）。
【０７２１】
【表２−５】
0005509094.tif 000046
【０７２２】
【表２−６】
0005509094.tif 000047
０日目からガム相試料を脱ガム反応および遠心分離の直後に採取した。この時点で既にリン脂質の大部分は分解されており、リゾ−リン脂質の量が増加していることが見られる（表２）。ガム相のインキュベーションの際にリン脂質のさらなる加水分解が生じるが、リゾ−リン脂質も加水分解される。
【０７２３】
ガム相をＧＬＣによって遊離脂肪酸（ＦＦＡ）およびトリグリセリドについて分析した（下の表３を参照されたい）。
【０７２４】
ガム相の画分をヘキサン  イソプロパノール２：１で２回抽出し、不溶性部分を乾燥させ、重量測定で定量した。
【０７２５】
【表３−３】
0005509094.tif 000048
表３に示す結果は、ガム相の４０℃、７日間までの保存の際に酵素加水分解が継続することを明確に確認している。
【０７２６】
有機溶媒（ヘキサン：イソプロパノール  ２：１）で抽出できないガム相の含有量は、ガム相中の固体の量についての尺度である。ガム相中のリン脂質がＦＦＡとホスファチジルグリセロールに加水分解される場合、ヘキサン：イソプロパノール中に溶解しない物質の量は増加する。７日間のインキュベーション後、ガム相の９０％超はＦＦＡ、トリグリセリドおよびホスファチジルグリセロールからなっており、リン脂質はガム相に残っていない。インキュベーション後のガム相の組成は、ガム中に乳化剤（リン脂質およびリゾリン脂質）が残っていないことから油相と固体／水溶性相とに、より容易に分離されるようになる。
【０７２７】
結論
脂質アシルトランスフェラーゼ（例えばＫＬＭ３’）での酵素的脱ガムの際に、活性な酵素を含有するガム相が単離される。ガム相の４０℃でのインキュベーションはガム相中のリン脂質をさらに加水分解する。酵素の投与量に依存して、全てのリン脂質およびリゾ−リン脂質は脂肪酸およびホスファチジルグリセロールに加水分解される。ガム相中のリン脂質の排除は、遊離脂肪酸を含有する油相とガム相中に残ったトリグリセリドとの単離を可能にする。
【０７２８】
４５℃での実験の実施よりも、５５℃で実施された脱ガム実験において、より高いレベルのリン脂質分解が観察された。両方の実験において酵素は分離後にガム相において活性であり、水脱ガムが５５℃で実施された場合に４０℃での保存の際に加水分解が全体的に高い程度である傾向があった。
【０７２９】
上記明細書において記載の全ての文献を本明細書に参照として組み込む。記載した本発明の方法および系の種々の改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は具体的な好ましい実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本発明がそのような具体的な実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。確かに、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連する技術分野における当業者に明らかである本発明を実行するための記載された様式についての種々の改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であると意図される。
【０７３０】
【数２】
0005509094.tif 000049
【０７３１】
【数３】
0005509094.tif 000050
【０７３２】
【数４】
0005509094.tif 000051
【０７３３】
【数５】
0005509094.tif 000052
【０７３４】
【数６】
0005509094.tif 000053
【０７３５】
【数７】
0005509094.tif 000054
【０７３６】
【数８】
0005509094.tif 000055
【０７３７】
【数９】
0005509094.tif 000056
【０７３８】
【数１０】
0005509094.tif 000057
【０７３９】
【数１１】
0005509094.tif 000058
【０７４０】
【数１２】
0005509094.tif 000059
【０７４１】
【数１３】
0005509094.tif 000060
【図１】
0005509094.tif 000061
【図２】
0005509094.tif 000062
【図３】
0005509094.tif 000063
【図４】
0005509094.tif 000064
【図５】
0005509094.tif 000065
【図６】
0005509094.tif 000066
【図７】
0005509094.tif 000067
【図８】
0005509094.tif 000068
【図９】
0005509094.tif 000069
【図１０】
0005509094.tif 000070
【図１１】
0005509094.tif 000071
【図１２】
0005509094.tif 000072
【図１３】
0005509094.tif 000073
【図１４】
0005509094.tif 000074
【図１５】
0005509094.tif 000075
【図１６】
0005509094.tif 000076
【図１７】
0005509094.tif 000077
【図１８】
0005509094.tif 000078
【図１９】
0005509094.tif 000079
【図２０】
0005509094.tif 000080
【図２１】
0005509094.tif 000081
【図２２】
0005509094.tif 000082
【図２３】
0005509094.tif 000083
【図２４】
0005509094.tif 000084
【図２５】
0005509094.tif 000085
【図２６】
0005509094.tif 000086
【図２７】
0005509094.tif 000087
【図２８】
0005509094.tif 000088
【図２９】
0005509094.tif 000089
【図３０】
0005509094.tif 000090
【図３１】
0005509094.tif 000091
【図３２】
0005509094.tif 000092
【図３３】
0005509094.tif 000093
【図３４】
0005509094.tif 000094
【図３５】
0005509094.tif 000095
【図３６】
0005509094.tif 000096
【図３７】
0005509094.tif 000097
【図３８】
0005509094.tif 000098
【図３９】
0005509094.tif 000099
【図４０】
0005509094.tif 000100
【図４１】
0005509094.tif 000101
【図４２】
0005509094.tif 000102
【図４３】
0005509094.tif 000103
【図４４】
0005509094.tif 000104
【図４５】
0005509094.tif 000105
【図４６】
0005509094.tif 000106
【図４７】
0005509094.tif 000107
【図４８】
0005509094.tif 000108
【図４９】
0005509094.tif 000109
【図５０−１】
0005509094.tif 000110
【図５０−２】
0005509094.tif 000111
【図５１】
0005509094.tif 000112
【図５２】
0005509094.tif 000113
【図５３】
0005509094.tif 000114
【図５４】
0005509094.tif 000115
【図５５】
0005509094.tif 000116
【図５６】
0005509094.tif 000117
【図５７】
0005509094.tif 000118
【図５８】
0005509094.tif 000119
【図５９】
0005509094.tif 000120
【図６０】
0005509094.tif 000121
【図６１】
0005509094.tif 000122
【図６２】
0005509094.tif 000123
【図６３】
0005509094.tif 000124
【図６４】
0005509094.tif 000125
【図６５】
0005509094.tif 000126
【図６６】
0005509094.tif 000127
【図６７】
0005509094.tif 000128
【図６８】
0005509094.tif 000129
【図６９】
0005509094.tif 000130
【図７０】
0005509094.tif 000131
【図７１】
0005509094.tif 000132
【図７２】
0005509094.tif 000133
【図７３】
0005509094.tif 000134
【図７４ａ】
0005509094.tif 000135
【図７４ｂ】
0005509094.tif 000136
【図７５】
0005509094.tif 000137
【図７６】
0005509094.tif 000138
【図７７】
0005509094.tif 000139
【図７８】
0005509094.tif 000140
【図７９】
0005509094.tif 000141
【図８０】
0005509094.tif 000142
【図８１】
0005509094.tif 000143
【図８２】
0005509094.tif 000144
【図８３】
0005509094.tif 000145
【図８４】
0005509094.tif 000146
【図８５】
0005509094.tif 000147
【図８６】
0005509094.tif 000148
【図８７】
0005509094.tif 000149
【図８８】
0005509094.tif 000150
【図８９】
0005509094.tif 000151
【図９０】
0005509094.tif 000152
【図９１】
0005509094.tif 000153
【図９２】
0005509094.tif 000154
【図９３】
0005509094.tif 000155
【図９４】
0005509094.tif 000156
【図９５】
0005509094.tif 000157
【図９６】
0005509094.tif 000158
【図９７】
0005509094.tif 000159
【図９８】
0005509094.tif 000160
【図９９】
0005509094.tif 000161
【図１００】
0005509094.tif 000162
【図１０１】
0005509094.tif 000163
【図１０２】
0005509094.tif 000164
【図１０３】
0005509094.tif 000165
【図１０４】
0005509094.tif 000166
【図１０５】
0005509094.tif 000167
【図１０６】
0005509094.tif 000168
【図１０７】
0005509094.tif 000169
【図１０８】
0005509094.tif 000170
【図１０９】
0005509094.tif 000171
【図１１０】
0005509094.tif 000172
【図１１１】
0005509094.tif 000173
【図１１２】
0005509094.tif 000174
【図１１３】
0005509094.tif 000175
【図１１４】
0005509094.tif 000176
【図１１５】
0005509094.tif 000177
【図１１６】
0005509094.tif 000178
【図１１７】
0005509094.tif 000179
【図１１８】
0005509094.tif 000180
【図１１９】
0005509094.tif 000181
【配列表】
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