(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン脱炭酸酵素活性およびリジン・カダベリンアンチポーター酵素活性を増強した大腸菌を４時間から１２０時間培養し、該培養液からカダベリンを単離精製することを特徴とするカダベリンの製造方法。
【請求項２】
前記大腸菌がリジン脱炭酸酵素および／またはリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子が組み込まれた微生物である請求項１記載のカダベリンの製造方法。
【請求項３】
リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が、１または２種類以上である請求項２記載のカダベリンの製造方法。
【請求項４】
リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が、微生物由来である請求項２または３に記載のカダベリンの製造方法。
【請求項５】
リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子が大腸菌由来である請求項２〜４のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
【請求項６】
リジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子が、微生物由来である請求項２〜５のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
【請求項７】
リジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子が大腸菌由来である請求項２〜６のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
【請求項８】
リジン脱炭酸酵素遺伝子およびリジン・カダベリンアンチポーター遺伝子を同一のプロモーターの制御下に発現させることを特徴とする請求項２〜７のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、カダベリンの製造法に関するものである。カダベリンは医薬中間体などの合成原料や高分子原材料として期待され、需要が高まりつつある。
【背景技術】
【０００２】  従来、リジンを微量のテトラリン過酸化物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカダベリンが得られることが知られている（須山正,金尾清造;アミノ酸の脱炭酸（第４報）薬学雑誌,vol.85(6),P.531-533(1965)）。しかしながら大量のエネルギーおよび有機溶媒が必要であるうえに、生成効率が非常に低い（36%）。また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつある（Celia white tabor and Herbert tabor;Microbiological Reviews,vol.49,P.81-99(1985)）。植物に微生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子を導入すると、カダベリンの蓄積量が増加することが知られている（Lothar F.Fecker,Christiane Rugenhagen and Jochen Berlin;Plant Molecular Biology,vol.23,P.11-21(1993)）。また、大腸菌由来の至適pHの異なるリジン脱炭酸酵素遺伝子が知られている（Shi-yuanmeng and George N.Bennett;Journal of Bacteriology,vol.174,P.2659-2669(1992)）（Yoshimi kikuchi,Hiroyuki kojima,Takashi tanaka,Yumiko,takatsuka and Yoshiyuki kamio;Journal of Bacteriology,vol.179,P.4486-4492(1997)）。さらに、リジンを高効率で発酵法により生産できることが知られている（Schilling BM, Pfefferle W, Bachmann B, Leuchtenberger W and Deckwer W;Biotechnol Bioeng,vol64,P.599-606(1999)）。しかしながら、カダベリンの製造について実際的な製造技術は確立されておらず、効率よく、より温和な条件下でカダベリンを製造する方法の開発が望まれている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明の課題は、微生物によるカダベリンの高効率かつ高収率で、エネルギー消費が少なく、有機溶媒を必要としないカダベリンの工業的製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記問題点を解決するために、本発明者らは更に生産性の高いカダベリンの製造方法について鋭意研究を行った結果、リジン脱炭酸酵素活性およびリジン・カダベリンアンチポーター酵素活性を増強した大腸菌を４時間から１２０時間培養し、該培養液からカダベリンを単離精製することにより、培養液中のカダベリンの蓄積濃度、生成収率が著しく向上することを見出し、本発明に到達した。
【０００５】
すなわち本発明は、「リジン脱炭酸酵素およびリジン・カダベリンアンチポーターの酵素活性を増強した大腸菌を４時間から１２０時間培養し、該培養液からカダベリンを単離精製することを特徴とするカダベリンの製造方法。」に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明の好ましい態様では、リジン脱炭酸酵素およびリジン・カダベリンアンチポーターの細胞内での活性を増強した宿主を使用する。宿主細胞内でのリジン脱炭酸酵素およびリジン・カダベリンアンチポーターの細胞内での活性を増強する方法に制限はない。具体的には、例えば、リジン脱炭酸酵素およびリジン・カダベリンアンチポーターの酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられる。
【０００７】  細胞内の酵素量を増加させる手段としては、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
【０００８】  転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例えば大腸菌においては、lac、tac、trpなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体DNAのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平1-215280号公報に記載されている。
【０００９】  遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えDNAを作製し、該組換えDNAを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（Berg, D. E. and Berg. C. M., Bio/Technol., vol.1, P.417(1983)）やMuファージ（特開平2-109985号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。
【００１０】  蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物においてはSD配列（Shine, J. and Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342-1346 (1974)）、真核生物では Kozak のコンセンサス配列（Kozak, M., Nuc. Acids Res., Vol.15, p.8125-8148(1987)）を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭59-125895）などが挙げられる。
【００１１】
リジン脱炭酸酵素およびリジン・カダベリンアンチポーターの細胞内での比活性を上昇させる手段としては、酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、より比活性の上昇した酵素を選択する方法が挙げられる。
【００１２】  遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（Kramer,W. and frita,HJ., Methods in Enzymology,vol.154,P.350(1987)）リコンビナントPCR法（PCRTechnology,Stockton Press(1989)、特定の部分のDNAを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。
【００１３】  宿主が、リジンモノオキシゲナーゼ、リジンオキシダーゼおよびリジンムターゼなどのカダベリン以外へのリジン代謝系を持つ場合、カダベリンを選択的に産生させるために、リジンモノオキシゲナーゼ遺伝子、リジンオキシダーゼ遺伝子およびリジンムターゼ遺伝子などを破壊してもよい。
【００１４】  リジン脱炭酸酵素遺伝子およびリジン・カダベリンアンチポーター遺伝子の取得方法としては特に制限はなく、PCR法、ゲノムライブラリーやcDNAライブラリーからのスクリーニング法などが用いられる。本発明において、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。
【００１５】  取得した遺伝子は適当な発現ベクターに組み込み、宿主内に導入する。
【００１６】  用いられる発現ベクターのタイプについては宿主細胞中で安定に維持されるものであれば特に制限はない。例えば大腸菌においては大腸菌内において複製可能なpBR322、pUC19などをベクターとして用いることが可能である。
【００１７】  作製される発現ベクターについては、特に制限はない。宿主内で複製可能な１種類の発現ベクターに、１種類のリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み発現させても良い。また、１種類の発現ベクターに、２種類以上のリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み、同一のプロモーターまたは異なるプロモーターの制御下に発現させても良い。さらに、異なる複製起点を持ち異なるプロモーターを有する発現ベクターを２種類以上を使用し、それぞれに異なるリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み異なるプロモーターの制御下で、それぞれを発現させても良い。
【００１８】  ２種類以上リジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込む際、それぞれの酵素の至適pHの異なるリジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込むことが好ましい。
【００１９】  更に好ましくは、これらリジン脱炭酸酵素発現ベクターと同一の発現ベクターにリジン・カダベリンアンチポーターを組み込み同一のプロモーターの制御下に発現させても良い。また、これらリジン脱炭酸酵素発現ベクターと異なる複製起点を持ち異なるプロモーターを有する発現ベクターにリジン・カダベリンアンチポーター遺伝子を組み込み、異なるプロモーターの制御下でリジン脱炭酸酵素およびリジン・カダベリンアンチポーターをそれぞれ発現させても良い。
【００２０】  導入方法としては特に制限はないが、例えば細菌の場合は、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
【００２２】
宿主は大腸菌が用いられる。
【００２３】  また、宿主に、薬剤に対する耐性、栄養要求性などの性質があってもよい。
【００２４】  宿主に組み込むべきリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子およびリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子は、宿主によって発現され、リジン脱炭酸酵素およびリジン・カダベリンアンチポーターとしての活性が保持されるならば特に制限はなく、微生物、動物、植物または昆虫由来のもが使用できるが、微生物由来のリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子およびリジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子が好ましい。
【００２５】
微生物のリジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子としては、細菌由来のものが好ましく、大腸菌、バシラス・ハロドゥランス（Bacillus halodurans）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtilis）、セレノモナス・ルミナンチウム（Selenomonas ruminantium）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Streptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・ピロサス（Streptomyces pilosus）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella corrodens）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Eubacterium acidaminophilum）、サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、ハフニア・アルベイ(Hafniaalvei)、ナイセリア・メニンギチデス（Neisseria meningitidis）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）またはピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）などの由来の遺伝子が知られており、これらが好ましく用いられる。さらに好ましくは大腸菌由来の遺伝子（cadA、ldc）が用いられる。
【００２６】  リジン・カダベリンアンチポーターをコードする遺伝子としては、大腸菌、テルモプラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilum）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）などの遺伝子が知られており、これらが好ましく用いられる。さらに好ましくは大腸菌由来の遺伝子（cadB）が用いられる。
【００２７】
本発明における培養方法について説明する。培地は炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成分を含有する通常の培地が使用可能であり、カダベリンが産生される限り特に制限はない。
【００２８】  炭素源としてはグルコース、フラクトース、糖蜜などの糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類などを１〜１５％、窒素源として酢酸アンモニウムなどの有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水、尿素などを０．１％〜４．０％、有機微量成分としてはピリドキサルリン酸やビオチンなどの被要求性物質が０．００００００１％〜０．１％、それぞれ適当量含有する培地が用いられる。
【００２９】  これらの他にリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第１鉄などが微量物質として必要に応じて添加される。さらにチアミン、ナイアシンなどの要求ビタミン、又はこれらを含有する酵母エキス、コーンスティープリカー、その他天然物を適当量含有した培地を用いることもできる。
【００３０】  培養は通常、好気的条件下で行うが、カダベリンの生成に応じて嫌気的条件下で行うことが可能である。培養中はカダベリンの生成蓄積に応じて、培地のｐＨ上昇が起こるので、塩酸、硫酸などの酸でｐＨ４〜ｐＨ８に調節することが有効である。好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件の安定化を図る。培養温度は１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜３７℃が用いられる。
【００３１】  これらの条件の下に４〜１２０時間振とうまたは撹拌培養することで好ましい結果が得られる。
【００３２】
培養液中に生成したカダベリンは、菌体を遠心分離などで除去した後、常法により単離精製される。
【実施例】
【００３３】以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
（実施例１）
リジン脱炭酸酵素遺伝子およびリジン・カダベリンアンチポーター遺伝子のクローニングおよび同一プロモーター制御下発現ベクターの作製
宿主細胞の生産するリジンからカダベリンを産生させるために、リジン脱炭酸酵素遺伝子およびリジン・カダベリンアンチポーター遺伝子のクローニングを行った。【００３４】  データベース（GenBank）に登録されているリジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）およびリジン・カダベリンアンチポーター遺伝子（cadB）（Accession No.M76411）の塩基配列を元に、ＰCRプライマーを設計した。その塩基配列を配列表１、配列表２に示した。PCR用プライマーの末端にはHindIII切断部位とXbaI切断部位がそれぞれ付加されている。【００３５】  これらのプライマーを用い、大腸菌K12株（ATCC10798）のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、3,622塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片をHindIIIおよびXbaIにより切断後、pUC19（宝酒造社製）のHindIII／XbaI切断部位に導入し、リジン脱炭酸酵素発現ベクターpCAD1を作製した（図▲１▼）。pCAD1においてクローン化したcadAおよびcadBは、pUC19が持つlacプロモーターの制御下に発現される。
（実施例２）
宿主への発現ベクターの導入
実施例１で作製した発現ベクターpCAD1を大腸菌JM109株に導入した。導入後、組換え大腸菌の選択は抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転換体を得た。この形質転換株を大腸菌CAD1株と命名した。
（実施例３）
形質転換株によるカダベリンの発現
親株である大腸菌JM109株およびこの形質転換株の培養は以下のように行った。JM109株、およびこのCAD1株を培養した。すなわち、これらの菌株を各々ＬＢ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振とうして前培養した。【００３６】  次に、ＬＢ培地４５ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れ、予め１１５℃、１０分間蒸気滅菌した。この培地に前培養した上記菌株を植え継ぎ、４時間後に1mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)を添加し、５０時間培養した。【００３７】  培養終了後、菌体を除去した培養上清中のカダベリン濃度を（Phan,A.P.H.,T.T.Ngo and H.M.Lenhoff;Anal.Biochem.,vol120,P.193-197(1982)）に記載の方法に従って測定した。その結果を以下に示した。【００３８】                            カダベリン濃度
大腸菌JM109株             0.01g/L
大腸菌CAD1株              1.22g/L
コントロールである大腸菌JM109株に比較して組換え株である大腸菌CAD1株ではカダベリンの蓄積量増加が見られた。
【発明の効果】
【００３９】  本発明によれば、発酵法によりカダベリンを培養液中に生産すると、既存の方法に比較してより経済的なカダベリンの生産が可能となる。
【００４０】
【配列表】
0005553394.tif 000002
0005553394.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【図１】  リジン脱炭酸酵素およびリジン・カダベリンアンチポーター発現ベクターpCAD1のフィジカルマップを示す図である。
【図１】
0005553394.tif 000004