(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
G1ロタウイルス血清型並びにG2、G3及びG9血清型より成る群から選択される少なくとも2種の非G1ロタウイルス血清型によるロタウイルス感染に対する免疫応答を誘導するための組成物の製造における、G1血清型由来の弱毒化ロタウイルス株の使用であって、該ロタウイルス株がECACC寄託99081301で特定されるロタウイルス株である、前記使用。
【請求項２】
上記組成物がG1血清型並びにG2、G3及びG9血清型に対する免疫応答を誘導することが可能である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
上記組成物が、ワクチン接種した個体の集団において、少なくとも2種の非G1血清型のロタウイルスの感染によって生じる下痢及び/又は胃腸炎及び/又は重篤な胃腸炎に対して少なくとも50％保護的である、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
上記組成物が、ワクチン接種した個体の集団において、少なくとも2種の非G1血清型のロタウイルスの感染によって生じる下痢に対して最大60％保護的である、請求項１又は２記載の使用。
【請求項５】
上記組成物が、少なくとも2種の非G1血清型のロタウイルスの感染によって生じる胃腸炎に対して最大81％保護的である、請求項１又は２記載の使用。
【請求項６】
上記組成物が、ワクチン接種した個体の集団において、G2、G3及びG9より成る群から選択される少なくとも2種の非G1血清型のロタウイルスの感染によって生じる重篤な胃腸炎に対して最大83％保護的である、請求項１又は２記載の使用。
【請求項７】
上記胃腸炎が、G2、G3及びG9の3種の非G1血清型のロタウイルスの感染によって生じる、請求項３、５及び６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
上記組成物を2回投与方式で投与する、請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
上記弱毒化ロタウイルス株が、適切な製薬担体もしくは制酸緩衝液又はその両方と共に製剤化される、請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はロタウイルスワクチン製剤に関する。本発明は、1種のロタウイルス血清型由来の弱毒化ロタウイルス集団の、他のロタウイルス血清型によるロタウイルス感染と関連する疾患の予防における使用に関する。特に、本発明は、G1血清型由来の弱毒化ロタウイルス集団の、非G1血清型によるロタウイルス感染と関連する疾患の予防における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
急性感染性の下痢は世界の様々な地域における疾患および死因の主要な原因である。発展途上国では下痢疾患の影響は驚くほどである。アジア、アフリカおよびラテンアメリカについては、毎年30〜40憶の下痢の症例が存在し、その内の約500〜1000万の症例が死をもたらすと予想されている（Walsh, J.A.ら: N. Engl. J. Med., 301:967-974 (1979)）。
【０００３】
ロタウイルスは幼児および幼い子供における重篤な下痢の最も主要な原因の一つとして認識されている（Estes, M.K.  Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology,第3版, Fieldsら編, Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。ロタウイルス疾患は、年間100万を超える死因であると予想される。ロタウイルスに誘導される病気は、最も一般的には6〜24月齢の子供に発症し、この疾患の罹患率のピークは、温暖な気候においては涼しい季節の間、および熱帯においては一年を通じて生じる。ロタウイルスは典型的には、約1〜約3日の潜伏期を有し、糞口経路によってヒトからヒトへ伝染する。6月〜24月齢群における感染と異なり、新生児は一般的には無症候であるかまたは軽い疾患のみを有する。幼い子供が一般的に直面する重篤な疾患とは対照的に、大部分の成人は以前のロタウイルス感染の結果として保護され、そして大部分の成人感染は軽度であるかまたは無症候である（Offit, P.A.ら. Comp. Ther., 8(8):21-26, 1982）。
【０００４】
ロタウイルスは一般的に球形であり、その名前は、その特徴的な内側殻と外側殻のまたは二重殻（double-shelled）キャプシド構造に由来している。典型的に、ロタウイルスの二重殻キャプシド構造はゲノムを含む内部タンパク質シェル（protein shell）またはコアを囲んでいる。ロタウイルスのゲノムは11個の二本鎖RNAのセグメントからなり、これらは少なくとも11個の別個のウイルスタンパク質をコードする。VP4およびVP7と称するこれらのウイルスタンパク質の内の2つは、二重殻キャプシド構造の外側に配置される。ロタウイルスの内側殻には一つのタンパク質が存在する（これはVP6と称するロタウイルスタンパク質である）。ロタウイルス感染を追跡する免疫応答を誘起する際におけるこれら3種の特定のロタウイルスタンパク質の相対的な重要性は依然として明らかではない。それにもかかわらず、VP6タンパク質は群抗原または亜群抗原を決定し、VP4およびVP7タンパク質は血清型特異性の決定因子である。
【０００５】
現在までに、少なくとも14種のロタウイルスG血清型および11種のロタウイルスP血清型が同定されている（Linhares A.C. & Bresse J.S., Pan. Am. J. Publ. Health 2000, 9, 305-330）。特に、10種のG血清型および6種のP血清型がヒトロタウイルスの間で同定されている。
【０００６】
VP7タンパク質は38,000 MWの糖タンパク質であり（非グリコシル化される際には34,000 MW）、これは株に応じてゲノムセグメント7、8または9の転写産物である。このタンパク質はロタウイルス感染後に中和抗体の形成を刺激する。VP4タンパク質は約88,000 MWの非グリコシル化タンパク質であり、ゲノムセグメント4の転写産物である。このタンパク質もロタウイルス感染後に中和抗体を刺激する。
【０００７】
VP4およびVP7タンパク質は、中和抗体が標的とするウイルスタンパク質であり、ロタウイルス疾患に対する保護を与えるロタウイルスワクチンの開発のための第1候補であると考えられている。
【０００８】
幼児期におけるロタウイルスの自然感染が防御免疫を誘起することが知られている。したがって、弱毒化生ロタウイルスのワクチンが非常に望ましい。これを経口ワクチンとすることが好ましい。というのも、これはウイルスの通常の感染経路だからである。
【０００９】
ロタウイルス感染を予防するためのワクチンの初期開発は、このウイルスの発見後の1970年代に開始した。最初は、動物およびヒト由来の弱毒化株が調査され、これは斑があるまたは期待はずれの結果であった。より最近では、より好結果をもたらしているヒト-動物再集合体（reassorant）を焦点とすることに努力が注がれてきた。
【００１０】
89-12として知られるロタウイルス株は、Ward（米国特許第5,474,773号およびBernstein, D.L.ら, Vaccine, 16 (4), 381-387, 1998）によって記載されてきた。89-12株は、1988年に天然のロタウイルス疾患に罹患した14月齢の子供から収集した便試料から単離された。米国特許第5,474,773号によるHRV 89-12ヒトロタウイルスは、その後、Wardによって記載されるように（J. Clin. Microbiol., 19, 748-753, 1984）初代アフリカミドリザル腎臓（AGMK）細胞中で2回の継代、およびMA-104細胞中で4回の継代によって培養適応化（culture-adapted）された。次いでHRV 89-12ヒトロタウイルスは、これらの細胞中でさらに2回継代された後（9回目の継代までに）MA-104細胞中で3回プラーク精製され、増殖された。ATCCへの寄託用にさらに1回の継代が行われた(12回目の継代)（受託番号ATCC VR 2272）。寄託された株は89-12C2として知られている。
【００１１】
1998年のBernsteinらによるVaccine中の論文は、下記でVaccine(1998)と称する。この論文は、経口的に投与された生ヒトロタウイルスワクチン候補の安全性および免疫原性を記載する。このワクチンは、初代AGMK細胞中でプラーク精製をすることなく26回継代し、その後、確立したAGMK細胞系でさらに7回継代することによって（合計で33回の継代）弱毒化した89-12株から得られた。
【００１２】
以下、連続して26回継代されている上述の物質をP26と称し、連続的に33回継代されている物質をP33と称することとする。一般的に、89-12をn回継代することによって誘導されたロタウイルスはPnと称することとする。
【００１３】
P33物質をその後さらにVero細胞上で5回継代した例においては、これをP38と称する。
【００１４】
Vaccine(1998)論文に記載されたP26およびP33単離体は、菌株保存機関に寄託されなかったばかりか、その遺伝的特性を確立するための分析もなされなかった。
【００１５】
現在では、文献に記載されたP26集団が変異体の混合物を含むことが見出されている。以下に記載されるように、これは遺伝子の特徴付けによって確立されてきた（実施例参照）。したがって、P26は、追加の継代、特にワクチンロットの製造に信頼の置ける一貫性のある集団ではない。同様に、P33は変異体の混合物を含み、ワクチンロットの製造に信頼の置ける一貫性はない。
【００１６】
P26物質は少なくとも3種のVP4遺伝子変異体の混合物であることがわかっている。P33およびP38は同様に2種の変異体の混合物である。これらの変異体は、これらの変異体に対するP33でワクチン接種された幼児由来の血清の中和抗体力価を評価する場合に、中和エピトープに関してATCCに寄託された89-12C2株と抗原的に異なっているようである。
【００１７】
さらに、P33物質が幼児に投与される際に、同定された2種の変異体が複製され、排泄されることが分かっている。100人のワクチン接種された幼児の内、わずかに2人がロタウイルス感染に起因する胃腸炎の徴候を示し、一方、プラセボ群の20％は感染した。これらの知見は、同定された変異体がロタウイルス疾患からの保護に関与していることを示唆する。
【００１８】
WO 0112797は、ロタウイルス変異体を分離する方法、およびクローン化（均一）ヒトロタウイルス株から誘導された改良型弱毒化生ロタウイルスワクチンを開示する。また、単一の変異体または実質的に単一の変異体を含み、該変異体がVP4およびVP7と称する主要なウイルスタンパク質の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列によって定義されることを特徴とする弱毒化ロタウイルス集団（分離株）も開示される。G9異種株に対する上記経口弱毒化ヒトロタウイルスワクチンの予防効果はラテンアメリカの幼児で報告されている（Perezら. 42nd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC 2002) 27-30 September 2002, San Diego）。WO 0112797の全体の内容は参照により本明細書に組み入れる。
【発明の開示】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明で、本発明者らは、単一の変異体または実質的に単一の変異体を含み、該変異体がVP4およびVP7と称する主要なウイルスタンパク質の少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列によって定義されることで特徴付けられる弱毒化ロタウイルス集団をワクチンとして用いて、ワクチンで使用されるものと異なる血清型のロタウイルス感染によって生じる疾患に対する交差防御を与えることができることを確定した。
【００２０】
特に、G1ロタウイルス集団（例えばブタペスト条約に従って1999年8月13日にEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomに寄託された寄託番号99081301）を、G1と少なくとも1種の非G1ロタウイルス血清型（G2、G3、G4およびG9ロタウイルス血清型等）との両者によって生じる疾患を予防することに使用できる。
【００２１】
したがって、本発明は、1種のロタウイルス血清型由来の弱毒化ロタウイルス集団の、他のロタウイルス血清型によるロタウイルス感染に関連する疾患の予防における使用であって、該血清型が好ましくはロタウイルスGタンパク質の配列を参照することによって定義される、上記使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
ロタウイルス集団が、VP4およびVP7と称する主要なウイルスタンパク質の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列によって定義される、単一の変異体または実質的に単一の変異体を含む点で、特徴付けられることが好ましい。
【００２３】
ロタウイルス集団が、交差防御作用を提供するのに適切な、ECACC寄託99081301由来のVP4および/またはVP7ウイルスタンパク質を含むことが好ましい。
【００２４】
弱毒化ロタウイルス血清型がG1であり、G1および非G1ロタウイルス血清型（G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13およびG14よりなる群から選択された血清型等）によって生じる疾患に対する交差防御を提供できることが好ましい。
【００２５】
特に、G1弱毒化ロタウイルス集団（例えばブタペスト条約に従って1999年8月13日にEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomに寄託された寄託番号99081301）を、G1、ならびにG2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13およびG14よりなる群から選択された非G1ロタウイルス血清型の少なくとも1種、好ましくは少なくとも2種、より好ましくは少なくとも3種、最も好ましくは少なくとも4種によって生じる疾患を予防することに使用できる。特に好適な態様では、2以上のロタウイルス非G1血清型、典型的にはG2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13およびG14よりなる群から選択された任意の血清型に対して免疫応答が誘導される。ワクチン組成物のものと異なるこれらの血清型の少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、より好ましくは少なくとも5種以上に対する異種防御（heterotypic protection）を有することが好ましい。免疫応答が同種（G1）防御に加えて、非G1血清型であるG2、G3、G4およびG9の少なくとも1種、好ましくは少なくとも2種、より好ましくは少なくとも3種、最も好ましくは少なくとも4種に対して、誘導されることが最も好ましい。
【００２６】
特に、本発明に従って、G1またはG9ではないロタウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物の製造における、G1血清型由来の弱毒化ロタウイルス株の使用が提供される。好適な態様では、G9血清型および/またはG1血清型によるロタウイルス感染に対して免疫応答がさらに誘導される。特に好適な態様では、血清型がG1またはG9ではない2種以上のロタウイルス血清型に対して免疫応答が誘導される。典型的にはG1またはG9以外の任意の血清型が、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G10、G11、G12、G13およびG14よりなるリストから選択される。ワクチン組成物のものと異なる血清型の少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、より好ましくは少なくとも5種以上に対する異種防御を有することが好ましい。非G1血清型であるG2、G3、G4およびG9の全てに対して免疫応答が誘導されることが最も好ましい。
【００２７】
本発明はまた、あるロタウイルス血清型によるロタウイルス感染に対する免疫応答を誘導する方法であって、異なる血清型由来の弱毒化ロタウイルスワクチンを含む組成物を被験者に投与することを含む上記方法に関する。
【００２８】
この方法が、ロタウイルス非G9血清型に対する免疫応答を誘導する方法であって、単一の変異体または実質的に単一の変異体（本明細書で定義される）を含むロタウイルスG1血清型ワクチンを含む組成物を被験者に投与することを含む、上記方法であることが好ましい。
【００２９】
ワクチン組成物中のロタウイルス集団が、G1P1A P[8]特異性のものであることが好ましい。ロタウイルス集団が、免疫応答を誘導し、かつ典型的には交差防御作用を提供するのに適切なECACC寄託99081301由来のVP4および/またはVP7ウイルスタンパク質を含むことがより好ましい。使用されるロタウイルスワクチンがECACC寄託99081301であるか、または該寄託物から誘導されることが好ましい。
【００３０】
一実施形態では、本発明は、G9血清型のみに対する免疫応答を誘導するための上記方法または使用において、ECACC 99081301に対応するロタウイルス株の使用を除外するが、他のG血清型に対する免疫応答の誘導と組合せてG9に対する免疫応答を誘導するための上記G1株の使用は一般的には除外されない。
【００３１】
適切な本発明は、上述される方法または使用におけるG1P8ロタウイルス株に関する。
【００３２】
ワクチンは2回投与方式で使用されることが好ましい。
【００３３】
ワクチンが胃腸炎に対する交差防御を提供することが好ましい。したがって、別の態様では、本発明に従って、組成物がワクチン接種された個体の集団において該組成物中に存在する弱毒化ロタウイルスのものと異なる型のロタウイルスの感染によって生じる下痢に対して最大60％保護的である方法が提供される。別の態様では、本発明に従って、組成物が該組成物中に存在する弱毒化ロタウイルスのものと異なる型のロタウイルスの感染により生じる胃腸炎に対して最大81％保護的である方法が提供される。さらに別の態様では、本発明に従って、組成物がワクチン接種された個体の集団において少なくとも2種の非G1血清型のロタウイルスの感染により生じる重篤な胃腸炎に対して最大83％保護的であるG1ロタウイルス株を含む方法が提供される。
【００３４】
組成物中に存在する弱毒化ロタウイルスのものと異なる型のロタウイルスに感染したワクチン接種された個体の集団で達成される下痢および/または胃腸炎および/または重篤な胃腸炎に対する保護率が、10〜90％、より好ましくは20〜80％、最も好ましくは少なくとも50％であることが好ましい。
【００３５】
交差防御を与えるために使用されるロタウイルスワクチンは以下の好適な特徴を有する。
【００３６】
本発明によるロタウイルス集団がクローン化変異体であることが好ましい。
【００３７】
単一の変異体または実質的に単一の変異体を含む集団は、異なる1種または複数の変異体を、10％より多く含まず、好ましくは5％未満、最も好ましくは1％未満で含むロタウイルス集団を意味する。ウイルス集団は、適切な細胞型上で継代することにより、または一連の1以上のクローニング工程を実施することにより均一または実質的に均一に精製することができる。
【００３８】
本発明の利点は、単一の変異体を含む集団が一貫したワクチンロットの製剤化により適切である点である。主要なウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列によって定義される特定の変異体も、ロタウイルス感染の予防における増強された有効性と関連し得る。
【００３９】
ある好適な実施形態では、本発明のロタウイルス集団中の単一または実質的に単一の変異体は、VP4遺伝子が以下の少なくとも1つを含むヌクレオチド配列を含む変異体である：開始コドンから、788位の位置のアデニン塩基（A）、802位の位置のアデニン塩基（A）、および501位の位置のチミン塩基（T）。
【００４０】
別の態様では、本発明の集団中の単一または実質的に単一の変異体は、VP7遺伝子が以下の少なくとも1つを含むヌクレオチド配列を含む変異体である：開始コドンから、605位の位置のチミン（T）、897位の位置のアデニン（A）または897位の位置のグアニン（G）。897位にアデニン（A）が存在することが好ましい。
【００４１】
好適な態様では、本発明の集団中の単一の変異体は、VP4遺伝子配列中に、開始コドンから、788位と802位の位置のアデニン（A）、501位の位置のチミン（T）を有する。
【００４２】
別の好適な態様では、本発明の集団中の単一の変異体は、VP7配列中に、開始コドンから、605位の位置のチミン（T）、および897位の位置のアデニン/グアニン（A/G）を有する。VP7配列中に897位の位置のアデニン（A）が存在することが最も好ましい。
【００４３】
特に好適な態様では、本発明の集団中の単一の変異体は、VP4遺伝子配列中に、開始コドンから、788位と802位の位置のアデニン（A）、および501位の位置のチミン（T）を有し、VP7配列中に、開始コドンから、605位の位置のチミン（T）、および897位の位置のアデニン/グアニン（A/G）を有する。VP7配列中に897位の位置のアデニン（A）が存在することが最も好ましい。
【００４４】
別の態様において、単一の変異体は、図1に示されるVP4タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および/または図2に示されるVP7タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
本発明における使用のための好適なロタウイルス集団は、
ロタウイルス調製物を適切な細胞型上で継代すること；
場合により、
a)限界希釈または、
b)個々のプラークの単離、
のいずれかの工程を用いて均一の培養物を選別すること；および、
VP4および/またはVP7遺伝子配列の該当する領域の配列決定を行うことによって実質的に単一の変異体の存在を調べること、を含む方法によって取得し得る。
【００４６】
集団が上述されるP33またはP26株から誘導されることが好ましい。
【００４７】
配列決定は、スロットブロットハイブリダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーション等の定量的または半定量的ハイブリダイゼーション技術によって適切に実行し得る。
【００４８】
選別された変異体が、開始ロタウイルス調製物がヒト被験者（特に小児）に投与される際に、複製しかつ排出される変異体であることが好ましい。
【００４９】
本発明の方法から生じるクローン化ウイルス集団は、さらに適当な細胞系上で継代することによって増幅し得る。
【００５０】
上記方法においてロタウイルス集団を継代するのに適切な細胞型には、アフリカミドリザル腎臓（AGMK）細胞が含まれ、これは確立された細胞系または初代AGMK細胞であり得る。適切なAGMK細胞系には、例えばVero(ATCC CCL-81)、DBS-FRhL-2(ATCC CL-160)、BSC-1(ECACC 85011422)およびCV-1(ATCC CCL-70)が含まれる。またMA-104(アカゲザル)およびMRC-5 (ヒト-ATCC CCL-171)細胞系も適切である。Vero細胞が増幅目的に特に好適である。Vero細胞上で継代することはウイルスの高収量をもたらす。
【００５１】
この方法から生じるウイルス集団中に単一の変異体が存在するか否かを調べる技術、およびその単一の変異体の性質を決定する技術には、当業者に周知であり、本明細書に記載される標準的な配列決定またはハイブリダイゼーション法が含まれる。
【００５２】
好適な態様では、本発明の方法は適切なロタウイルス（特に89-12株または継代されたその誘導体の特性を有するロタウイルス）を用いて実施される。
【００５３】
特に好適な単一の変異体集団はP43であり、これは一連の体外希釈クローニング工程に続いて、増幅のためにVero細胞上でクローン化物質を継代することによって（単離したヒトロタウイルスを適切な細胞型上での培養で33回継代した）P33から取得した。
【００５４】
P43集団は、ブタペスト条約に従って1999年8月13日にEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Vaccine Research and Production Laboratory, Public Health Laboratory Service, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, United Kingdomに寄託された（寄託番号99081301）。
【００５５】
一般に利用可能に示されたこの方法は、ヒトロタウイルスP43を取得する最も簡便な方法であるが、同じまたは機能が実質的に同じロタウイルスを本発明の教示を参酌してこれらの方法または他の方法によって作製し得る。かかる機能が実質的に同じロタウイルスは、本発明のヒトロタウイルスP43に対する生物学的同等物と認められ、その結果、本発明の一般的範囲内である。したがって、本発明は本明細書に記載されるP43変異体の特性を有するロタウイルス集団を含むものと理解されよう。
【００５６】
また、本発明は、寄託されたP43 ECACC 99081301を更なる処理に供することによってP43 ECACC 99081301から誘導された物質を含むものと理解されよう。上記処理には、例えば、生ウイルスを用いた追加の継代、クローニングまたは他の手法によってP43 ECACC 99081301を増殖すること、あるいは遺伝子工学技術または再集合（reassortant）技術によることを含む任意の手法でP43を改変すること等がある。上記工程および技術は当技術分野で周知である。
【００５７】
本発明に含まれる寄託されたP43由来の物質には、タンパク質および遺伝物質が含まれる。特に興味深いのはP43の少なくとも1つの抗原または少なくとも1つのセグメントを含む再集合体ロタウイルスであり、例えば、11個のゲノムセグメントの一つまたはその一部分が、P43のゲノムセグメントまたはその一部分で置換されているロタウイルスの毒性株を含む再集合体である。特に、NSP4をコードするセグメントまたは部分セグメントがP43セグメントまたはP43部分セグメントであるロタウイルス再集合体は有用な性質を有し得る。再集合体ロタウイルスおよびこれらを調製する技術は周知である（Foster, R. H.およびWagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, a review.  ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9 (2), 155-178, 1998）。
【００５８】
特に興味深い物質は、P43の子孫および免疫学的に活性なP43の誘導体である。免疫学的に活性な誘導体とは、宿主動物に注射された際にロタウイルスに対して反応する免疫応答を誘起できるP43ウイルス（特に該ウイルスの抗原）から取得できるかまたはこれを含む物質を意味する。
【００５９】
ロタウイルスを適当な細胞系、例えばVero細胞に適用する際には、あらゆる汚染物質（存在し得る外来物質等）の可能性およびその他汚染を引き起こし得る可能性を排除するために、このウイルスを処理することが必要かもしれない。エーテル感受性外来ウイルスの場合は、本明細書下記で記載されるように、これをエーテル処理によって行い得る。本発明はまた、全般的な手順中に任意工程として係るエーテル処理を含む、弱毒化生ウイルスの取得方法および該ウイルスと共に製剤化されたワクチンに関する。
【００６０】
単一のまたは実質的に単一のロタウイルス変異体を含むワクチンが好ましいが、単一の変異体または実質的に単一の変異体の使用は不可欠ではない。本発明の交差防御ロタウイルス株は、ロタウイルス感染または疾患に対する追加の防御または交差防御を与えるべく、他のロタウイルス株と組合わせることができる。
【００６１】
したがって、他のロタウイルス変異体、例えば、他のクローン化変異体または他のウイルス（特に他の弱毒化したウイルス）とP43との混合物も本発明の範囲内である。かかる混合物は本明細書下記に記載される本発明のワクチンに有用である。
【００６２】
本発明はまた、交差防御を与えることが可能な弱毒化生ロタウイルスワクチンであって、好ましくは適当なアジュバントまたは製薬担体と混合された実質的に単一の変異体集団を含む、上記ワクチンを提供する。
【００６３】
本発明のロタウイルスワクチンが単一のロタウイルス株を含む一価性ロタウイルスワクチンであることが好ましい。
【００６４】
本発明は、弱毒化生ロタウイルスがヒトロタウイルスであり、腸重積症を生じさせない生ロタウイルスワクチンを提供する際に特に有利である。
【００６５】
本発明の弱毒化ロタウイルス株と共に使用するのに適した製薬担体には、経口投与（特に幼児への）に適切であるとして当該技術分野で公知のものが含まれる。かかる担体には、これに限定されるものではないが、炭水化物、多価アルコール、アミノ酸、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、ヒドロキシアパタイト、タルク、酸化チタン、水酸化鉄、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、ゼラチン、野菜ペプトン、キサンタン、カラゲナン（caraghenane）、アラビアガム、β-シクロデキストリンが含まれる。
【００６６】
本発明はまた、例えば、適切な安定剤の存在下でウイルスを凍結乾燥すること、あるいは本発明のウイルスを適切なアジュバントまたは製薬担体と混合することによる、ロタウイルスワクチンの調製方法を提供する。
【００６７】
本発明のウイルスを、脂質ベースのビヒクル（例えばウイロゾーム(virosome)またはリポソーム等）または水中油型乳剤中で、あるいは担体粒子と共に製剤化することが有利であり得る。代わりに、またはこれに加えて、経口ワクチン用の免疫促進剤（当技術分野で公知のもの等）が製剤中に含まれてもよい。かかる免疫促進剤には、細菌毒素、特にホロトキシン形態（完全分子）のコレラ毒素（CT）またはB鎖のみのコレラ毒素（CTB）、および大腸菌の易熱性エンテロトキシン（LT）が含まれる。天然LTよりも活性形態に変換しそうにない変異型LT（mLT）がWO 96/06627、WO 93/13202およびUS 5,182,109に記載されている。
【００６８】
有利に含まれ得る別の免疫促進剤は、QS21およびモノホスホリルリピドA等のサポニン誘導体、特に3-脱-O-アシル化モノホスホリルリピドA（3D-MPL）である。経口アジュバントとしての精製サポニンはWO 98/56415に記載されている。サポニンおよびモノホスホリルリピドAは、別々にまたは組合せて（例えば、WO 94/00153）用いてもよく、他の薬剤と共にアジュバント系中で製剤化してもよい。3D-MPLはRibi immunochem, Montanaで製造される周知のアジュバントであり、その製造物はGB 2122204に記載されている。
【００６９】
経口免疫用のビヒクルおよびアジュバントの全般的な議論は、Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, PowellおよびNewman編, Plenum Press, New York, 1995で見出すことができる。
【００７０】
本発明はまた、ヒト被験者、特に幼児にワクチン接種する方法を提供し、これは本発明のワクチン組成物の有効量をこれを必要とする被験者に投与することによる。弱毒化生ワクチンが経口投与によって投与されることが好ましい。
【００７１】
好適な態様では、本発明の弱毒化ロタウイルス株は、胃中の酸によるワクチンの不活性化が最小化されるように、制酸剤と共に製剤化される。適切な制酸剤成分には、無機制酸剤（例えば水酸化アルミニウムAl(OH)3や水酸化マグネシウムMg(OH)2）が含まれる。本発明における使用に適切な市販の制酸剤には、水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムを含むMylanta（商標）が含まれる。これらは水中で不溶性であり、懸濁液の状態で提供される。
【００７２】
水酸化アルミニウムは、制酸作用を提供することができるだけでなく、アジュバント効果をも提供することができるため、本発明のワクチン組成物の特に好適な成分である。
【００７３】
また有機酸であるカルボン酸塩等の有機制酸剤も本発明のワクチンにおける制酸剤としての使用に適している。本発明のワクチン組成物における好適な制酸剤には、有機酸であるカルボン酸塩、好ましくはクエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウム等のクエン酸の塩が含まれる。
【００７４】
本発明のワクチン組成物において使用し得る特に好適な制酸剤は、不溶性無機塩である炭酸カルシウム(CaCO3)である。炭酸カルシウムはロタウイルスと会合することができ、ロタウイルス活性は炭酸カルシウムと会合している間維持される。
【００７５】
充填（filling）工程中の炭酸カルシウムの沈殿を防止するため、粘性剤が製剤中に存在することが好ましい。
【００７６】
使用し得る有力な粘性剤には擬塑性賦形剤が含まれる。擬塑性溶液は、攪拌状態での粘性と比較して、静止状態での粘性がより高い溶液として定義される。このタイプの賦形剤は、アラビアガム、アドラガンテガム（adragante gum）、寒天、アルギナート、ペクチンなどの天然ポリマー、あるいは例えば、カルボキシメチルセルロース（Tyloses C（登録商標））、メチルセルロース（Methocels A（登録商標）、Viscotrans MC（登録商標）、Tylose MH（登録商標）およびMB（登録商標））、ヒドロキシプロピルセルロース（Klucels（登録商標））、ならびにヒドロキシプロピルメチルセルロース（Methocels E（登録商標）およびK（登録商標）、Viscontrans MPHC（登録商標））などの半合成ポリマーである。一般的にこれらの擬塑性賦形剤はチキソトロープ剤と共に用いられる。あるいは、使用し得る粘性剤は低流動性の擬塑性賦形剤である。これらのポリマーは、十分な濃度で構造流体配置を生じさせ、その結果、静止状態で低流性を有する高粘性溶液を生じる。流動および転移を可能にするためにこの系に特定量の力が与えられる必要がある。外因的な力（攪拌）は、一時的に構造流体配置を破壊して液体溶液を得るために必要とされる。
【００７７】
かかるポリマーの例はCarbopols（登録商標）およびキサンタンガムである。
【００７８】
チキソトロープ賦形剤は、静止状態でゲル構造となるが、攪拌状態では流体溶液を形成する。チキソトロープ賦形剤の例は、Veegum（登録商標）（ケイ酸マグネシウム-アルミニウム）およびAvicel RC（登録商標）（約89％微結晶性セルロースおよび11％カルボキシメチルセルロースナトリウム）である。
【００７９】
本発明のワクチン組成物が、キサンタンガムまたはデンプンから選択される粘性剤を含むことが好ましい。
【００８０】
したがって、本発明のワクチン組成物は、炭酸カルシウムおよびキサンタンガムと組合せて製剤化されることが好ましい。
【００８１】
本発明に使用される組成物の別の成分が、例えばショ糖および/または乳糖などの糖を含むことが適切である。
【００８２】
本発明のワクチン組成物は、例えば香味料（特に経口ワクチンについて）および静菌剤を含む、追加の成分を含んでもよい。
【００８３】
本発明のワクチン組成物の別の提示も予想される。
【００８４】
1つの好適な実施形態では、ワクチンは液体製剤として投与される。液体製剤が投与前に少なくとも以下の2つの成分：
i)  ウイルス成分、
ii)  液体成分、
から再構成されることが好ましい。
【００８５】
この実施形態では、ウイルス成分と液体成分は、通常は別々の容器中に存在し、この容器は、単一の導管を有する別個の小室、または最終ワクチン組成物が大気に曝露されることなく再構成されるように連結することができる別個の導管であり得ることが好都合である。
【００８６】
再構成前は、ウイルスは乾燥形態または液体形態であり得る。ウイルス成分が凍結乾燥されていることが好ましい。凍結乾燥したウイルスは、液体溶液中のウイルスよりも安定である。凍結乾燥したウイルスは、液体制酸組成物を用いて適切に再構成して、液体ワクチン製剤を作製し得る。あるいは、凍結乾燥したウイルス組成物が制酸成分を含むことが好ましい場合には、凍結乾燥したウイルスは水または水溶液によって再構成し得る。
【００８７】
ワクチン製剤が、1つの小室または導管に炭酸カルシウムおよびキサンタンガムと共に製剤化されたウイルス成分を含み、これが第2の小室または導管に存在する水または水溶液で再構成されることが好ましい。
【００８８】
別の好適な実施形態では、ワクチン組成物は固形剤、好ましくは、口の中に入れた際に即座に溶解するのに適切な凍結乾燥ケーキ（cake）であることが好ましい。凍結乾燥製剤は医薬ブリスター・パック中に錠剤の形態で都合よく提供され得る。
【００８９】
別の形態では、本発明は、経口投与のために、即時溶解性錠剤の形態でロタウイルスワクチンを提供する。
【００９０】
別の態様では、本発明は弱毒化生ロタウイルス株、特にヒトロタウイルス株を含む組成物であって、口の中に入れた際に即座に溶解可能な凍結乾燥固形物である上記組成物を提供する。
【００９１】
本発明の即時溶解性錠剤が、被験者の口の中で、未溶解で錠剤を飲み込むことを防ぐのに十分な速さで溶解することが好ましい。このアプローチは特に小児のロタウイルスワクチンに有利である。
【００９２】
ウイルスが、炭酸カルシウムなどの無機制酸剤およびキサンタンガムなどの粘性剤と共に製剤化される、弱毒化生ヒトロタウイルスであることが好ましい。
【００９３】
本発明の別の態様では、ウイルス成分が炭酸カルシウムおよびキサンタンガムと共に製剤化される任意のロタウイルス株である、凍結乾燥製剤を提供する。
【００９４】
本発明のワクチンは、典型的なワクチン接種者において、有意な副作用なくロタウイルス感染に対する効果的な保護を与えるために、適切な量の生ウイルスを用いて公知の技術によって製剤化および投与し得る。適切な生ウイルス量は、通常、1投与当たり104〜107フォーカス形成単位（ffu）であろう。ワクチンの典型的な用量は、1投与当たり105〜106ffuを含んでもよく、ある期間にわたって数回投与（例えば2ヶ月間隔で2回の投与）で与えても良い。しかし、特に発展途上国では、3回以上の投与方式、例えば3または4回投与様式によって利益を得ることができる。投与間隔はおおよそ2ヶ月の長さであり得る。単回投与または複数回投与に最適な生ウイルスの量ならびに投与の最適な時期は、抗体力価および被験者における他の反応の観察を含む標準的な調査によって確定することができる。
【００９５】
本発明のワクチンはまた、他の疾患（例えばポリオウイルス）に対する保護に適切な他の生ウイルスを含んでもよい。あるいは、経口投与に適切な他の生ウイルスワクチンを、本発明のロタウイルスワクチン組成物と同時に別投与で与えても良い。
【００９６】
Vaccine（1998）論文に記載されるP33物質でワクチン接種された12人の幼児（4〜6月齢）由来の血清を、P33、P38、P43および89-12C2の中和について試験した。
【００９７】
試験した全ての血清の中和力価の範囲は、P33、P38およびP43で類似している。統計学的分析は、3種全てのウイルスに対する全体的な中和力価に有意な差がないことを示している。これは、P33、P38およびP43の立体構造および非立体構造中和エピトープが、P33がワクチン接種された幼児の抗P33血清によって等しく十分に認識されることを示唆している。この観察結果は、このin vitroアッセイで明らかにされた中和エピトープがP33、P38およびP43の間で変化していなかったことを間接的に示唆している。
【００９８】
しかし、P89-12C2の中和力価の範囲は、P33、P38およびP43と有意に異なる。この観察結果は、P33、P38およびP43の立体構造および非立体構造中和エピトープが、P33がワクチン接種された幼児の抗33血清によって等しく十分に認識されないことを示唆している。この観察結果は、このin vitroアッセイで明らかにされた中和エピトープが、89-12C2と、P33、P38およびP43との間で変化していたことを間接的に示唆している。
【００９９】
本発明の非常に好適な実施形態には以下のものが含まれる：
１．G1血清型由来の弱毒化ロタウイルス株の、G1またはG9ではないロタウイルスに対する免疫応答を誘導するためのワクチン組成物の製造における使用。
【０１００】
２．免疫応答がG9血清型および/またはG1血清型によるロタウイルス感染に対してさらに誘導される1に記載の使用。
【０１０１】
３．免疫応答が、血清型がG1またはG9ではない2以上のロタウイルス血清型に対して誘導される、1または2に記載の使用。
【０１０２】
４．G1またはG9血清型以外の血清型が、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G10、G11、G12、G13およびG14よりなるリストから選択される、1〜3のいずれかに記載の使用。
【０１０３】
５．免疫応答が以下の非G1血清型の全てに対して誘導される、1〜4のいずれかに記載の使用：G2、G3、G4およびG9。
【０１０４】
６．G1ロタウイルスワクチン組成物が単一のロタウイルス変異体または実質的に単一のロタウイルス変異体を含み、該変異体がVP4およびVP7と称する主要なウイルスタンパク質の少なくとも1つをコードするヌクレオチド配列によって定義される、1〜5のいずれかに記載の使用。
【０１０５】
７．前記組成物がヌクレオチド配列中に以下の少なくとも1つを含むVP4遺伝子を有するロタウイルスを含む、6に記載の使用：開始コドンから、788位の位置のアデニン塩基（A）、802位の位置のアデニン塩基（A）、および501位の位置のチミン塩基（T）。
【０１０６】
８．VP4遺伝子が、開始コドンから、788位と802位の位置のアデニン塩基（A）、および501位の位置のチミン塩基（T）を含むヌクレオチド配列を含む、7に記載の使用。
【０１０７】
９．前記組成物がヌクレオチド配列中に以下の少なくとも1つを含むVP7遺伝子を有するロタウイルスを含む、6に記載の使用：開始コドンから、605位の位置のチミン（T）、897位の位置のアデニン（A）、および897位の位置のグアニン（G）。
【０１０８】
１０．VP7遺伝子が、開始コドンから、605位の位置のチミン（T）、および897位の位置のアデニン（A）またはグアニン（G）を含むヌクレオチド配列を含む、7に記載の使用。
【０１０９】
１１．前記組成物が、ヌクレオチド配列中に開始コドンから788位と802位の位置のアデニン（A）、および501位の位置のチミン（T）を含むVP4遺伝子を有するロタウイルスを含み、かつVP7遺伝子が、ヌクレオチド配列中に、開始コドンから605位の位置のチミン（T）および897位の位置のアデニン（A）を含む、1〜10のいずれかに記載の使用。
【０１１０】
１２．前記組成物が、該組成物中に存在するG1血清型の弱毒化ロタウイルスと異なる型のロタウイルスによる感染によって生じる胃腸炎および/または下痢に対して保護することが可能である、1〜11のいずれかに記載の使用。
【０１１１】
１３．前記組成物が、ワクチン接種した個体の集団において、該組成物中に存在するG1血清型の弱毒化ロタウイルスと異なる、少なくとも2種類の血清型のロタウイルスの感染によって生じる重篤な胃腸炎に対して最大83％保護的である、12に記載の使用。
【０１１２】
１４．重篤な胃腸炎が少なくとも4種の非G1血清型のロタウイルスの感染によって生じる、13に記載の使用。
【０１１３】
１５．非G1血清型がG2、G3、G4およびG9血清型である、14に記載の使用。
【０１１４】
１６．ロタウイルス株がECACC寄託99081301であるか、またはECACC寄託99081301から取得または誘導可能である、1〜15のいずれかに記載の使用。
【０１１５】
１７．ワクチンが2回投与方式で使用される、1〜16のいずれかに記載の使用。
【０１１６】
以下の非限定的な実施例により本発明を説明する。
【実施例】
【０１１７】
実施例１：継代26（P26）の89-12株が変異体の混合物であることの証明
異なる継代ロット由来のVP4およびVP7遺伝子の配列決定
継代P26（初代AGMK細胞）、継代P33（（初代とは対照的な）確立されたAGMK細胞系）、継代P41および継代P43由来のVP4およびVP7遺伝子の配列決定を行った。総RNA抽出物を1チューブ/1工程でPCRを介して逆転写し、増幅した。
【０１１８】
プライマーRota 5bisおよびRota 29bisは完全なVP4遺伝子を増幅し、プライマーRota 1およびRota 2bisは完全なVP7遺伝子を増幅した。PCR物質は異なるプライマーを用いて配列決定されている（表1参照）。
【０１１９】
継代P26の配列はVP4においては継代P33の配列と3塩基（開始コドンから501、788および802bpの位置）、VP7においては3塩基（開始コドンから108、605および897bp）異なっていた。
【０１２０】
継代P26配列におけるVP4およびVP7の走査は、変異位置で背後要因としての継代P33配列の存在を示している。したがって、継代P26が少なくとも2つの変異体の混合物であることを認めることができる。
【０１２１】
継代P33配列走査は、VP4においては均質であり、VP7については不均質に思われる（表2参照）。
【０１２２】
継代P38（継代33に由来）はVero細胞上で5回継代され、継代P33（AGMK細胞系）のVP4およびVP7配列の同一組を示した。このように、P33とP38との間の集団で大きな変化はなかった。
【表１】
0005588586.tif 000002
【０１２３】
【表２】
0005588586.tif 000003
【０１２４】
【表３】
0005588586.tif 000004
【０１２５】
【表４】
0005588586.tif 000005
【０１２６】
スロットブロットハイブリダイゼーション
AGMK細胞上での継代P26からP33における集団の変化はスロットブロットハイブリダイゼーションによってさらに確認されている。RT/PCRによって作製されたVP4およびVP7遺伝子断片は、各変異体に特異的なオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズした（表3.1および3.2参照）。Rota16、Rota35およびRota36とハイブリダイズし、Rota15とハイブリダイズしなかったP26とは対照的に、P33物質のVP4 PCR断片は788位と802位の位置でRota16のみとハイブリダイズし、Rota15、Rota35またはRota36の何れともハイブリダイズしなかった。これらの結果によりP26中の少なくとも3種の変異体の存在を証明した（表4参照）。
【０１２７】
P33物質のVP7 PCR断片については、897位の位置でRota41およびRota42とハイブリダイズした。これらの結果により、P33物質中の少なくとも2種の変異体の存在を証明した。
【０１２８】
実施例2：P43クローンの単離と特徴付け
均質なウイルス集団としてP33成分を単離するために、Vero細胞上でのP33/AGMKの終点希釈を3回実施し、生じたウイルスをVero細胞への感染に用いた。
【０１２９】
陽性ウェルを2つの基準を用いて選別した：増殖は、古典的になされるように、ウェル中で検出された最大数の細胞増殖巣およびプレート上で単離された最大陽性ウェルによって証明された。96ウェルマイクロタイタープレートで3回の終点希釈継代後、10個の陽性ウェルをVero細胞上で連続的に増殖し、その収量を評価した。
【０１３０】
収量に基づき、3つのクローンを生産ロットの継代レベルまで発達させた。ポリクローナル抗体による免疫認識が、3つのクローンの間およびこれらのクローンとP33との間で類似することが示された。クローンの均質性はスロットブロットハイブリダイゼーションによって評価した。単一クローンの最終選別は収量および配列を基礎とした。
【０１３１】
選別したクローンはVero細胞上での連続的な継代によって増幅し、マスターシード、ワーキングシードおよび最終生産ロットを生じた。
【０１３２】
選別したクローンを、VP4およびVP7の配列決定（同一性）、ならびにPCR増幅した物質のVP4およびVP7の特異的スロットブロットハイブリダイゼーション（均質性）によって異なる継代レベルで遺伝的に特徴付けた。P43物質のVP4およびVP7遺伝子の配列はそれぞれ図1および図2に提供され、これはP41と同一である。
【０１３３】
選別したクローンの均質性は、P26/初代AGMKの配列決定中に同定した各変異体におけるVP4および/またはVP7領域中のヌクレオチド変化を識別するオリゴヌクレオチドプローブを用いた選択的ハイブリダイゼーションによって評価した(表4参照)。
【０１３４】
VP4断片は、Rota16とハイブリダイズしたが、Rota15、Rota35またはRota36とはハイブリダイズしなかった。VP7断片はRota41とハイブリダイズしたがRota42とはハイブリダイズしなかった。
【０１３５】
これらの結果により、P43が均質な集団であることを確認した。
【０１３６】
実施例3：外来ウイルスの可能性の除去
エーテルをP33（AGMK増殖）に20％の最終濃度まで1時間添加した。次いで、エーテルをN2で35分間バブルアウト（bubble out）した。P33シードの力価に対する影響は観察されなかった。
【０１３７】
実施例4：生弱毒化ワクチンの製剤化
上述の生産ロットは以下の方法によって幼児への経口投与用に製剤化される。
【０１３８】
１．凍結乾燥ウイルス
ウイルス薬を調製するために標準的な技術が用いられる。凍結精製したウイルスバルクが解凍され、適当な培地組成物(この場合、ダルベッコ改変型イーグル培地）で所望の標準ウイルス濃度まで（この場合は106.2 ffu/ml）希釈される。次いで、希釈されたウイルスは、凍結乾燥安定剤（ショ糖4％、デキストラン8％、ソルビトール6％、アミノ酸4％）で、目的のウイルス力価まで（この場合は1投与当たり105.6 ffu）さらに希釈される。安定化したウイルス組成物の0.5mlアリコートを3mlのバイアルに無菌的に移す。次いで、各バイアルはゴム栓で部分的に閉じられ、サンプルは真空下で凍結乾燥される。その後、バイアルは完全に閉じられ、アルミニウムキャップがストッパーを定位置に維持するためにバイアルの周囲の位置にクリンプ（crimped）される。
【０１３９】
使用のために、ウイルスは以下の制酸再生剤の一つを用いて再構成される。
【０１４０】
(a)クエン酸塩再構成
クエン酸ナトリウムは水中で溶解され、濾過によって殺菌され、1.5ml用量当たり544mgのクエン酸ナトリウム2水和物の濃度で、1.5ml量の再構成容器に無菌的に移される。再構成容器は、例えば3mlバイアルもしくは4mlバイアル、または2ml注射器、あるいは経口投与用の軟プラスチックスクイーズカプセル（soft plastic squeezable capsule）であり得る。あるいは、滅菌条件下で滅菌成分を維持する代わりに、最終容器を高圧滅菌することができる。
【０１４１】
(b)Al(OH)3再構成
無菌性水酸化アルミニウム懸濁液（Mylanta（商標））は滅菌水で無菌的に希釈され、それぞれ48mgのAl(OH)3を含むように2ml量の再構成容器（例えば2mlの注射器または軟プラスチックスクイーズカプセル）に無菌的に移される。滅菌成分を滅菌条件下で使用する代替法は、水酸化アルミニウム懸濁液を（好ましくは希釈段階で）γ線照射することである。
【０１４２】
懸濁液が沈殿するのを妨げるための標準的な成分が含まれる。かかる標準的な成分には、例えば、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロースおよびシリコーンポリマーが含まれる。また、食物に用いられる静菌剤（例えばブチルパラベン、プロピルパラベンまたは他の標準的な静菌剤）および香味料を含んでもよい。
【０１４３】
２．Al(OH)3を含む液体製剤中の凍結乾燥ウイルス
ウイルス薬を調製するために標準技術が用いられる。凍結精製したウイルスバルクが解凍され、適当な培地組成物(この場合、ダルベッコ改変型イーグル培地）で所望の標準ウイルス濃度まで（この場合は106.2 ffu/ml）希釈される。水酸化アルミニウム懸濁液が一投与当たり48mgの最終量に達するように添加され、ウイルス組成物は凍結乾燥安定剤（ショ糖4％、デキストラン、8％、ソルビトール6％、アミノ酸4％）で、目的のウイルス力価（この場合は、一投与当たり105.6 ffu）まで希釈される。安定化したウイルス組成物の0.5mlアリコートは3mlのバイアルに無菌的に移される。次いで、バイアルの凍結乾燥および閉鎖がパート1に記載されるように行われる。
【０１４４】
３．Al(OH)3を含むブリスター提供用の凍結乾燥ウイルス
ウイルス薬を調製するために標準技術が用いられる。凍結精製したウイルスバルクが解凍され、適当な培地組成物(この場合、ダルベッコ改変型イーグル培地）で所望の標準ウイルス濃度まで（この場合は106.2 ffu/ml）希釈される。水酸化アルミニウム懸濁液が一投与当たり48mgの最終量に達するように添加され、ウイルス組成物は凍結乾燥安定剤（ショ糖、デキストランもしくはアミノ酸4％、またはゼラチン、または野菜ペプトン、またはキサンタンであり得る）で、一投与当たり105.6 ffuの目的のウイルス力価まで希釈される。無菌的充填操作により0.5mlの用量または好ましくはブリスターの窩未満で移される。この組成物は凍結乾燥され、ブリスターの窩が熱シーリングによって密閉される。
【０１４５】
場合により、水酸化アルミニウム懸濁液が沈殿するのを妨げる標準的な成分が含まれる。かかる標準的な成分には、例えばステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、およびシリコーンポリマーが含まれる。また、香味料が含まれてもよい。
【０１４６】
実施例5：種々の製剤についてのロタウイルスのウイルス滴定
5.1:乳糖系製剤とショ糖系製剤との間の比較
【表５】
0005588586.tif 000006
【０１４７】
P43ロタウイルスは、上記の表に示されるように、ショ糖または乳糖のいずれかと共に製剤化した。
【０１４８】
凍結乾燥前のウイルス滴定は、凍結乾燥工程なく完成した調剤液（ショ糖、デキストラン、ソルビトール、アミノ酸を含む）中のウイルス力価である。
【０１４９】
良好な結果は、凍結乾燥工程で0.5 log未満の減少および「37℃で1週間」の間に0.5 log未満の減少（加速安定性試験）が達成されるものである。ウイルス滴定の精度は約±0.2 logである。
【０１５０】
この結果は、ショ糖を乳糖の代わりに使用し得ることを示している。
【０１５１】
5.2：アルギニンの効果とマルチトールによるソルビトールの置換
【表６】
0005588586.tif 000007
【０１５２】
この結果は、（凍結乾燥中のウイルスの安定性を改善することが知られ、かつ胃酸性度を補正するための塩基性媒質を提供する）アルギニンの付加がウイルス力価を維持することを立証する。
【０１５３】
ソルビトールは凍結乾燥ケーキのガラス転移温度をあまりにも大きな程度で減少させる傾向がある。これは、上述されるようにソルビトールの代わりにマルチトールを用いることによって回避することができ、かつウイルス力価も依然として維持される。
【０１５４】
5.3：種々の製剤組成
この実験は多くの製剤が可能であることを立証する。
【表７】
0005588586.tif 000008
【０１５５】
5.4：ロタウイルスとAl(OH)3制酸剤との会合
【表８】
0005588586.tif 000009
【０１５６】
Al(OH)3は制酸剤として使用される。これは、Al(OH)3と一緒に遠心分離されるので（上清におけるウイルス活性の減少）、ロタウイルスが不溶性無機塩（Al(OH)3）と会合することを示している。
【０１５７】
5.5：クエン酸ナトリウムによるウイルス滴定前のAl(OH)3制酸剤の溶解
【表９】
0005588586.tif 000010
【０１５８】
ロタウイルスがAl(OH)3と会合する際、（Al(OH)3を含む）全てを凍結乾燥することが可能である。凍結乾燥後、クエン酸ナトリウム中でAl(OH)3を溶解することによってロタウイルスの再生が可能である。この工程はロタウイルスを損傷せず、この溶解工程後にその活性を維持する。
【０１５９】
5.6：Al(OH)3-ロタウイルス会合体の放出(liberation)後のロタウイルスの感染性
ウイルス放出の機構（担体の溶解による）は、in vivoで非常に十分に起こり得る。実際に、pH6以下で水酸化アルミニウムは完全に可溶性となり、その結果、ロタウイルスは胃中で放出されるだろう。
【０１６０】
0005588586.tif 000011
【０１６１】
胃でAl+++イオンは吸収されない（J.J. Powell, R.JugdaohsinghおよびR.P.H. Thompson, The regulation of mineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153）。腸で、pHの増加に起因して、不溶形態のアルミニウムが沈殿し（Al(OH)3またはAlPO4）、自然な形で排除される。新しく生じたAl(OH)3（またはAlPO4）沈殿物が遊離のロタウイルスと会合することができるか否かは知られていない。これによりAl(OH)3-ロタウイルス会合体自体の感染性の問題が生じる。
【０１６２】
別の機構によるAl(OH)3-ロタウイルス会合体からのロタウイルスの放出も可能である。例えば、リシンはAl(OH)3へのウイルスの吸着を妨げる。ボレート、スルフェート、カルボネートおよびホスフェートなどの他の陰イオンも水酸化アルミニウムに特異的に吸着することが知られており、その結果、理論的には、Al(OH)3-ロタウイルス会合体から（吸着部位の競合によって）ロタウイルスを放出させることが可能なはずである。
【０１６３】
0005588586.tif 000012
【０１６４】
このように、ロタウイルスはロタウイルス-Al(OH)3会合体から放出することができ、放出したロタウイルスは活性を維持する。
【０１６５】
この放出は、Al(OH)3の溶解（胃中のHCl、またはin vitroにおけるクエン酸ナトリウムによって）、または塩基性アミノ酸（リシン）によるロタウイルスの放出のいずれかによって成すことができる。
【０１６６】
5.7：Al(OH)3-ロタウイルス会合体の感染性
凍結乾燥したロタウイルスの単回用量を水で再構成し、二つに分けた。一方は参照として考慮し、追加量の水を加えた。もう一方は0.240mlの水で懸濁した24mgのAl(OH)3を添加した（臨床前ウイルス滴定）。
【０１６７】
0005588586.tif 000013
【０１６８】
Al(OH)3が存在する際、ロタウイルスは活性であり、かつウイルス滴定値は参照サンプルに比べて高い。
【０１６９】
この実験は、凍結乾燥用量を分けることなく、そして12mgのAl(OH)3または24mgのAl(OH)3を添加することによって反復した。
【０１７０】
ここで参照サンプルはクエン酸-重炭酸バッファーで再構成したものであった。その結果、ウイルス力価はこの場合もやはりAl(OH)3の存在下でより高い。
【０１７１】
0005588586.tif 000014
【０１７２】
上の実施例のように、ウイルスは遠心分離によって取り去ることができるので、ロタウイルスはAl(OH)3粒子と会合する。DRVC003A46は凍結乾燥した製剤化ロタウイルスである（ショ糖：2％；デキストラン：4％；ソルビトール：3％；アミノ酸：2％）。
【０１７３】
0005588586.tif 000015
【０１７４】
上清で実施したウイルス滴定に従えば、ロタウイルスの吸着に必要なAl(OH)3の量は低いようである（ある乾燥凍結用量5.7 logではじめ、ウイルス滴定を拡大した）：
【表１０】
0005588586.tif 000016
【０１７５】
ロタウイルスのAl(OH)3への吸着に必要な時間は短いようである：ある用量の凍結乾燥ロタウイルスを24mgのAl(OH)3の存在下で再構成し、0、15、60分および24時間後に遠心分離した。「キュロット(culot)」はウイルス滴定前にSDSAA中で再懸濁した：
【表１１】
0005588586.tif 000017
【０１７６】
5.8：制酸剤としてのCaCO3の使用
ワクチン中のアルミニウムを回避するために、制酸剤Al(CO)3を別の不溶性無機塩CaCO3（炭酸カルシウム）と取り替えた。
【０１７７】
CaCO3によって観察された現象は、Al(OH)3について記載されたものに沿うものである：
-ロタウイルスと無機塩との会合
-無機塩と会合した際のロタウイルス活性の維持
-酸による無機塩の溶解による、会合体からのロタウイルスの放出の可能性
-制酸剤とロタウイルスとの共凍結乾燥の可能性。
【０１７８】
CaCO3とロタウイルスの会合
第1の試みでは、凍結乾燥したロタウイルス（ウイルス力価5.7）を水中のCaCO3の懸濁液（1.5ml中50mg）で再構成し、その後遠心分離し、上清のウイルス力価をペレットと比較した。
【０１７９】
0005588586.tif 000018
【０１８０】
これは90％以上のロタウイルスがCaCO3と会合することを示している。
【０１８１】
また、ウイルスが会合した際、滴定を実現することおよび最初のウイルス量を再生することが可能であった。
【０１８２】
また、ウイルス力価はCaCO3なしに取得されたものよりもわずかに高い。
【０１８３】
0005588586.tif 000019
【０１８４】
CaCO3の量、およびロタウイルス会合
凍結乾燥したロタウイルスを水（1.5ml）中：
10mg
50mg
100mg
のCaCO3の懸濁液で再構成し、次いで遠心分離し、上清のウイルス力価をキュロットと比較した。
【表１２】
0005588586.tif 000020
【０１８５】
その結果、より多くのCaCO3がより多くのウイルスと会合するほど、上清では少なくなることがはっきりとわかる。
【０１８６】
しかし、総量は完全には再生されていない（より早く取得される際、全体で少なくとも5.3またはちょうど5.8が期待された-上記参照）。
【０１８７】
乳児Rossett-Rice制酸剤滴定中のロタウイルスのCaCO3保護
凍結乾燥ロタウイルス（DRVC003A46）の10回量および50mgのCaCO3を用いて、2つの型の幼児Rossett-Rice滴定を実施した。
【０１８８】
古典的なRossett-Rice滴定では、制酸剤はロタウイルスと混合され、HClがこの媒質に注がれる。
【０１８９】
「逆」幼児Rossett-Riceでは、状況は逆転している。すなわち（in vivoで生じるように）制酸剤がHClプールに滴下される。
【表１３】
0005588586.tif 000021
【０１９０】
このように、このin vitro実験では、炭酸カルシウムはHClの存在から約20％のロタウイルスを保護することができるが、水酸化アルミニウムは保護することができない。
【０１９１】
5.9：CaCO3制酸剤の存在下でのロタウイルスの凍結乾燥
【表１４】
0005588586.tif 000022
【０１９２】
これは同一のバイアルにおけるロタウイルスおよび制酸剤（CaCO3）の「一体の」凍結乾燥である。充填工程中のCaCO3の沈殿を防止するために、粘性剤が必要とされる。かかる粘性剤の例には、キサンタンガムおよびデンプンが含まれる。ロタウイルス活性は、キサンタンガムおよびデンプンの存在下でさえ維持される。
【０１９３】
5.10  口に入れた際に迅速に分解する凍結乾燥錠剤
以下の製剤が「lyoc」の概念、すなわち、口中での凍結乾燥ケーキの迅速な溶解を説明する。
【表１５】
0005588586.tif 000023
【０１９４】
「lyocの概念」において、キサンタンおよびデンプンの何れをも（凍結乾燥ケーキの迅速な溶解性を維持するために）用いることができる。
【０１９５】
実施例6：ロタウイルスワクチン組成物のための、制酸剤としての炭酸カルシウムの使用
水中のCaCO3の懸濁液がロタウイルス用の制酸剤として使用される際には、かさ粉末密度値が2.6に近似し、平均粒子サイズが30μmであるため、水中環境で炭酸カルシウム粒子が急速に沈殿するという問題がある。この沈殿は、
１．周囲媒質の密度を増加させること
２．周囲媒質の粘性を増加させること
３．粒子サイズを縮小すること
４．粒子を互いに接近させないこと
によって遅くすることができる。
【０１９６】
6.1：周囲媒質の密度の増加
CaCO3-水懸濁液が（注射器中で）凍結乾燥ケーキ（ショ糖2％、デキストラン4％、ソルビトール4％、アミノ酸2％を含有）に適用される際に、周囲媒質の密度が増加するが、CaCO3沈殿の速度はCaCO3-水懸濁液とそれほど変わらない。
【０１９７】
6.2：周囲媒質の粘性の増加
擬塑性溶液は、攪拌状態での粘性と比較して、静止状態での粘性がより高い溶液として定義される。
【０１９８】
このタイプの一般的な賦形剤は、
天然ポリマー、例えば：
アラビアガム
アドラガンテガム
寒天
アルギナート
ペクチン
半合成ポリマー、例えば：
カルボキシメチルセルロース（Tyloses C（登録商標））
メチルセルロース（Methocels A（登録商標）、Viscotrans MC（登録商標）、Tylose MH（登録商標）およびMB（登録商標））
ヒドロキシプロピルセルロース（Klucels（登録商標））
ヒドロキシプロピルメチルセルロース（Methocels E（登録商標）およびK（登録商標）、Viscontrans MPHC（登録商標））
である。
【０１９９】
一般的に、これらの擬塑性賦形剤はチキソトロープ剤と一緒に使用される。
【０２００】
低流動性の擬塑性賦形剤
これらのポリマーは、十分な濃度で構造流体配置を生じ、その結果、静止状態で低流性を有する高粘性溶液を生じる。流動および転移を可能にするためにこの系に特定量の力が与えられる必要がある。外因的な力（攪拌）は、一時的に構造流体配置を破壊して液体溶液を得るために必要とされる。
【０２０１】
係るポリマーの例はCarbopols（登録商標）およびキサンタンガムである。
【０２０２】
チキソトロープ賦形剤
これらの賦形剤により、静止状態でゲル構造が取得される一方、攪拌状態で液体溶液が取得される。
【０２０３】
チキソトロープ賦形剤の例は、Veegum（登録商標）（ケイ酸マグネシウム-アルミニウム）およびAvicel RC（登録商標）（約89％微結晶性セルロースおよび11％カルボキシメチルセルロースナトリウム）である。
【０２０４】
6.3  粒子サイズの縮小
CaCO3粒子サイズの縮小は、この化合物の制酸性の減少を引き起こした。
【０２０５】
6.4  粒子を互いに接近させない
これは凝集を防ぐためにCaCO3粒子より小さな（約1μm）不溶性粒子がCaCO3粒子間に置かれるVeegum（登録商標）およびAvicel（登録商標）のケースである。
【０２０６】
実施例７：製品設計
以下のスキームは可能な製品設計の例を説明する。
【０２０７】
7.1  注射器中のCaCO3
凍結乾燥バイアル中にロタウイルスの臨床的バッチを事前に用意し、制酸剤を注射器に含まれる再構成液中に配置させることができる。
【０２０８】
0005588586.tif 000024
【０２０９】
7.2  凍結乾燥バイアル中のCaCO3
0005588586.tif 000025
【０２１０】
7.3  ブリスターにおける凍結乾燥
この場合、ロタウイルス、CaCO3およびキサンタンガムは共にブリスター中で直接凍結乾燥される。  
0005588586.tif 000026
【０２１１】
実施例8：異なるロタウイルス株の凍結乾燥
【表１６】
0005588586.tif 000027
【０２１２】
株DS-1、PおよびVA70は、「Fields」Raven press 1990、第2版の第1361頁に、それぞれ血清型G2、G3およびG4についてのヒトロタウイルス参照株として記載されている。
【０２１３】
この実験では、異なるロタウイルス株が凍結乾燥されている。
【０２１４】
結局、いずれのウイルス力価も凍結乾燥の間維持されており、増進した安定性（37℃で1週間）を示している。
【０２１５】
実施例9：ロタウイルスワクチンの1回経口投与の成人における第1相安全性試験
第1相試験を実施して、18〜45歳の健康な成人におけるP43ワクチンの単回経口投与（106.0ffu)の安全性および反応性（reactogenicity）を評価した。
【０２１６】
臨床試験は二重盲式かつ無作為であった。これにはプラセボ対照および自己対照が含まれた。この試験はベルギーの単一の総合施設で行われた。
【０２１７】
試験集団
総勢33人の被験者（11人がプラセボ群、22人がワクチン群）が参加し、その全員がこの試験を履行した。志願者の全ては白人であった。その平均年齢はワクチン接種時で35.3歳であり、18〜44歳の範囲であった。試験は1月に開始し、ちょうど1ヶ月にわたって実施した。
【０２１８】
材料
ワクチン
P43ワクチンの臨床ロットを、医薬品製造管理に従って作製し、精製し、製剤化しかつ凍結乾燥した。このロットは品質管理および品質保証によって公表された。ワクチンの各バイアルは以下の成分を含んだ：
有効成分：
P43株                Min. 105.8 ffu
賦形剤、安定剤：
ショ糖              9mg
デキストラン        18mg
ソルビトール        13.5mg
アミノ酸            9mg
【０２１９】
プラセボ
プラセボのバイアルが調製され、かつ公表された。プラセボの各バイアルは以下の成分を含んだ：
賦形剤、安定剤：
ショ糖              9mg
デキストラン        18mg
ソルビトール        13.5mg
アミノ酸            9mg
【０２２０】
希釈剤
注射用の水を希釈剤として用いてワクチンおよびプラセボを再構成した。
【０２２１】
投与
ワクチンまたはプラセボ投与の約10〜15分前に、両群の被験者に10mlのMylanta（登録商標）を経口的に与えた。Mylanta（登録商標）は公認の制酸剤である。制酸剤は胃を通過する間に胃のpHを増加し、ロタウイルスの不活化を防止する。
【０２２２】
ワクチンを調製するために、バイアル当たり105.8ffuを含む2バイアルの凍結乾燥P43を1.5mlの注射用希釈水で再構成した。これにより算出した1用量当たり106.1ffuのウイルス価を達成した。再構成したワクチンは単回経口用量として直ちに投与した。
【０２２３】
プラセボを調製するために、2バイアルの凍結乾燥プラセボを1.5mlの注射用水で再構成し、単回用量として経口投与した。
【０２２４】
安全性および反応性
以下の安全性および反応性の基準を適用した：
応答型の全身症状は、発熱、下痢、嘔吐、吐き気、腹痛および食欲低下であった。これらは投与後8日間の間記録した。非応答型の症状は投与後30日間の間記録した。深刻な有害反応は全試験期間の間記録した。下痢サンプルは投与後8日間の間収集することになっていた。
【０２２５】
結果は以下の通りである：
それぞれ観察期間の間に、応答型症状、非応答型症状および深刻な有害反応は報告されなかった。  
下痢の症状は報告されなかった。
【０２２６】
結論
SB生物学的P43ワクチンは、106.1ffuの用量の単回投与として、18〜44歳の健康な成人志願者に二重盲式で経口投与した際に、プラセボと相対して安全であった。
【０２２７】
実施例10  G1および非G1（G9）ロタウイルスに起因する胃腸炎を防止する際の、ヒト単価ロタウイルスワクチン(RotarixTM)の2回投与の有効性
無作為の、二重盲式プラセボ-対照第2相試験を実施し、G1Pヒト89-12株由来のワクチンの保護効果を幼児免疫化について評価した。
【０２２８】
具体的に用いたワクチンはRotarixTMと称した。これはECACC寄託99081301として寄託された弱毒化G1ヒト株をロタウイルス成分として含む。
【０２２９】
493人の健康な幼児に、RotarixTMをウイルス濃度（106 ffu）で、またはプラセボ(504)を、DTPw-HBVおよびHibワクチンと同時に2回投与し（2および4月齢時）、OPVは2週間隔で投与した。下痢サンプルはロタウイルスの存在について試験し（ELISA）、血清型を陽性サンプルで決定した（RT-PCR）。第2投与の2週後に報告された下痢症状を有効性の分析に考慮した。重篤性は20段階評価を用いて決定した（RuuskaおよびVesikari, 1990）。11以上のスコアを重篤な疾患であると定義した。
【０２３０】
結果
有効性の中間分析を上記の群で実施した。単離した血清型はG1およびG9であり、ほぼ均一に分布した。プラセボ群における全体的な発病率は、6ヶ月の観察期間の間、G1については4.8％、G9については3.6％と異なった。106ffuのRotarixTMの2回投与は、G1によって引き起こされる全ての型の下痢に対して83％の有効性（95％ Cl：50.4-95.7）で保護し、重篤な胃腸炎に対しては92％の有効性（95％ Cl:47.6-99.8）であった。下痢がG9によって引き起こされた場合、全ての型の下痢に対する保護は60％であり（95％ Cl:0.2-86.0）、重篤な胃腸炎に対しては81％であった（95% Cl:33.0-96.4）。これらの各有効性の指標に関して、プラセボ群と比較してHRV群で下痢症状が統計的に有意に減少した（p<0.05、フィッシャーの両側正確確率検定）。
【０２３１】
結論
これらの結果は、同種G1株に対する幼児の保護およびG9株に対する交差防御における、単価HRVワクチンであるRotarixTMの2回投与の有効性をかなり支持している。
【０２３２】
実施例11  G1および非G1（G2、G3、G4、G9）ロタウイルスに起因する胃腸炎の防止における、3つの異なるウイルス濃度で投与されたヒト単価ロタウイルスワクチン（RotarixTM）の2回投与の有効性
無作為の、二重盲式プラセボ-対照第2相試験を実施し、G1Pヒト89-12株に由来するワクチンの、入院に対する保護効果および有効性を幼児免疫化について評価した。
【０２３３】
具体的に使用したワクチンはRotarixTMと称した。これはECACC寄託99081301として寄託された弱毒化G1ヒト株をロタウイルス成分として含む。
【０２３４】
健康な幼児に、3つの異なるウイルス濃度のRotarixTM（468人が104.7ffu、460人が105.2ffu、464人が105.8ffuを受けた）、またはプラセボ(454人)を、DTPw-HBVおよびHibワクチンと併用して2回投与し（2および4月齢時）、OPVは2週間隔で投与した。下痢サンプルはロタウイルスの存在について試験し（ELISA）、血清型を陽性サンプルで決定した（RT-PCR）。第2投与後2週間から被験者が1歳になるまでに報告された下痢症状を有効性の分析に考慮した。重篤性は20段階評価を用いて決定した（RuuskaおよびVesikari, 1990）。11以上のスコアは重篤な疾患であると定義した。
【０２３５】
結果
結果は下記の表に示される。ワクチン群の幼児は、プラセボ群の子供よりもロタウイルス胃腸炎症状が有意に低かった（P<0.001、フィッシャーの両側正確確率検定）。用量に応じて、重篤なロタウイルス胃腸炎に対する保護効果は86％（95％Cl:63％-96％）に達し、任意のロタウイルス胃腸炎に対しては70％（95％Cl、46％-84％）に達した。これらの各有効性の指標に関して、プラセボ群と比較してHRV群で下痢症状が統計的に有意に減少した（p＜0.001、フィッシャーの両側正確確率検定）。複数のロタウイルス血清型（G1、G2、G3、G4およびG9）を胃腸炎の便から同定し（ELISAおよびRT-PCR）、非G1血清型に対するワクチンの有効性の推定をも可能にした。表19から理解できるように、特に非G1血清型（G2、G3、G4およびG9）について、用量に応じて重篤なロタウイルス胃腸炎に対する効果は83％（95％Cl:40％-97％）に達し、G1ベースの単価G1P1A P[8]ヒトロタウイルスワクチンが異種（すなわち非G1）株に対する交差防御を誘発するという概念の裏付けを提供した。
【表１７】
0005588586.tif 000028
【０２３６】
【表１８】
0005588586.tif 000029
【０２３７】
【表１９】
0005588586.tif 000030
【０２３８】
結論
これらの結果は、同種のG1株によって引き起こされる任意のおよび重篤なロタウイルス胃腸炎に対する幼児の保護、ならびに異種株、すなわちG2、G3、G4およびG9に対する広範な交差防御における、単価HRVワクチン（RotarixTM）の2回投与の有効性をかなり支持している。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】図１は、P43のVP4タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【図２】図2は、P43のVP7タンパク質をコードするヌクレオチド配列である。
【図１】
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【図２】
0005588586.tif 000032