(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0005523095.tif 000012
式中、Ｒ１が、直鎖もしくは分岐Ｃ３〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ＦもしくはＨであり、もし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の全てがＨであれば、この時、Ｒ１は、
【化２】
0005523095.tif 000013
である、化合物。
【請求項２】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の１つだけがＦである、請求項１の化合物。
【請求項３】
Ｒ２がＦである、請求項２の化合物。
【請求項４】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の全てがＨである、請求項１の化合物。
【請求項５】
Ｒ２がＦである、請求項１の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、化合物１７であり、式
【化３】
0005523095.tif 000014
を有する、請求項１の化合物。
【請求項７】
前記化合物が、ＩＳＯ−６３であり、式
【化４】
0005523095.tif 000015
を有する、請求項１の化合物。
【請求項８】
前記化合物が、ＩＳＯ−６０であり、式
【化５】
0005523095.tif 000016
を有する、請求項１の化合物。
【請求項９】
前記化合物が、（Ｒ）異性体（アイソマー）である、請求項１〜８のいずれか１項の化合物。
【請求項１０】
前記化合物が、（Ｓ）異性体（アイソマー）である、請求項１〜８のいずれか１項の化合物。
【請求項１１】
医薬として許容可能な賦形剤中、請求項１〜１０のいずれか１項の化合物、もしくは、この医薬として許容可能な塩を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
哺乳類におけるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）活性を阻害するための、ＭＩＦにより少なくとも一部媒介される炎症サイトカインカスケードを含む病状を有するかもしくはリスクにある哺乳類を治療するための、自己免疫疾患を有するかもしくは自己免疫疾患に関するリスクにある哺乳類を治療するための、腫瘍を有する哺乳類を治療するための、又は哺乳類における炎症を治療するかもしくは防ぐための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項の化合物の使用。
【請求項１３】
前記哺乳類が、ＭＩＦにより少なくとも一部媒介される炎症サイトカインカスケードを含む病状を有するもしくはこれに関するリスクにある、請求項１２の使用。
【請求項１４】
前記病状が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックである、請求項１２の使用。
【請求項１５】
前記哺乳類が、自己免疫疾患を有するもしくは自己免疫疾患に関するリスクにある、請求項１２の使用。
【請求項１６】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リューマチ関節炎、移植片対宿主病、自己免疫性肺炎、自己免疫性脳脊髄炎、ギランバレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インシュリン依存糖尿病、クローン病、硬皮症、乾癬、シェーグレン症候群、および自己免疫性炎症眼病である、請求項１５の使用。
【請求項１７】
前記哺乳類が腫瘍を有する、請求項１２の使用。
【請求項１８】
哺乳類における炎症を治療するかもしくは防ぐための、請求項１２の使用。
【請求項１９】
Ｒ１が、
【化６】
0005523095.tif 000017
である、請求項１の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１が、
【化７】
0005523095.tif 000018
である、請求項１の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
この出願が、２００６年３月２４日出願された米国仮出願第６０／７８５，８９８号の利益を請求する。
【０００２】
（１）本発明分野
本発明が、サイトカイン阻害剤に関する。より具体的には、本発明が、マクロファージ遊走阻止因子の幾つかの阻害剤を同定し、特徴化する。
【背景技術】
【０００３】
（２）関連技術の記述
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、炎症疾患の病原に重要な関わりがある原炎症性サイトカインである（ＣａｌａｎｄｒａおよびＲｏｇｅｒ、２００３年；Ｒｉｅｄｅｍａｎｎら、２００３年）。最近の研究が、セプシスの病理生理学における重要因子としてＭＩＦを明確に定義している（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年）。セプシスの間に抗体もしくはＩＳＯ−１によるＭＩＦ活性の廃止が、心臓循環器効率を向上させ、セプシスと関連した致死性を防ぐ（Ａｌ−Ａｂｅｄら、２００５年；Ｌｉｎら、２００５年）。イソオキサゾリンたる特異的阻害剤ＩＳＯ−１が、ＭＩＦの疎水性活性部位中に適合（フィット）するように設計（デザイン）され、相互作用が、ＩＳＯ−１とのＭＩＦ複合体の結晶構造により確認された（図１、Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２年）。セプシス臨床関連モデルにおけるＩＳＯ−１投与が、中庸の保護を（８０％対４０％コントロール）授ける。これらの結果が、治療意図を有する第１のＭＩＦ原炎症活性小分子阻害剤としてＩＳＯ−１を同定し、ヒトのセプシスにおける治療介入のための新規標的（ターゲット）としてのＭＩＦ活性部位の潜在力を指し示す。上記に基づいた、ＭＩＦを阻害する他のイソキサゾリンの同定が望まれている。本発明が、そのような必要性に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、ＭＩＦ活性を阻害する幾つかの新しい化合物を同定し、特徴化させている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、これゆえ、式Ｉ：
【０００６】
【化１】
0005523095.tif 000002
【０００７】
の化合物に関する。これらの化合物では、Ｒ１が、直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ＦもしくはＨであり、式中、もし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の全てがＨであれば、この時、Ｒ１がＣＨ３でない。
【０００８】
本発明が、式ＩＩ：
【０００９】
【化２】
0005523095.tif 000003
【００１０】
の化合物にも関しており、これらの化合物では、Ｒ１が、直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ＦもしくはＨであり、但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の全てがＨにはならない。
【００１１】
本発明が、医薬として許容可能な担体中、上記の化合物のいずれか、もしくは、これの医薬として許容可能な塩を含む医薬組成物にも関している。
【００１２】
本発明が、更に哺乳類におけるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）活性を阻害する方法に関する。これら方法が、当該哺乳類におけるＭＩＦ活性を阻害するに有効な量における上記の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００１３】
更に、本発明が、哺乳類における炎症を治療するか、もしくは、防ぐ方法に関する。これら方法が、当該哺乳類における当該炎症を治療するか、もしくは、防ぐのに有効な量における上の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００１４】
また、本発明は、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックを有する哺乳類を治療する方法に関する。これら方法が、当該セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックを治療するに有効な量における上記の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００１５】
本発明は、更に、自己免疫疾患を有する哺乳類を治療する方法に関する。これら方法が、当該自己免疫疾患を治療するに有効な量における上記の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００１６】
加えて、本発明は、腫瘍を有する哺乳類を治療する方法に関しており、本方法が、当該腫瘍を治療するに有効な量における上の医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明はＭＩＦ活性を阻害する幾つかの新しい化合物を与える。実施例参照。
【００１８】
本発明は、これゆえ、式Ｉ：
【００１９】
【化３】
0005523095.tif 000004
【００２０】
の化合物に関し、式中、Ｒ１が、直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ＦもしくはＨであり、ここで、もし、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の全てがＨであれば、その時、Ｒ１が、ＣＨ３でない。好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の１つだけがＦである。より好ましくは、Ｒ２がＦである。
【００２１】
ある幾つかの好ましい化合物では、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の全てがＨである。他の好ましい化合物では、Ｒ２がＦである。
【００２２】
更なる好ましい化合物中、Ｒ１が：
【００２３】
【化４】
0005523095.tif 000005
【００２４】
である。
【００２５】
より好ましい化合物が、化合物１７であり、式：
【００２６】
【化５】
0005523095.tif 000006
【００２７】
を有する。
【００２８】
更に好ましい化合物が、ＩＳＯ−６３であり、式：
【００２９】
【化６】
0005523095.tif 000007
【００３０】
を有する。
【００３１】
尚、もう１種別の好ましい化合物が、ＩＳＯ−６０であり、式：
【００３２】
【化７】
0005523095.tif 000008
【００３３】
を有する。
【００３４】
最も好ましい実施形態中、本化合物が、（Ｒ）異性体（アイソマー）である。
【００３５】
本発明に関した重要な発見は、イソキサゾリンＭＩＦ阻害剤の芳香環への１以上の弗素部分の付加が、その阻害活性を向上させることである。実施例１参照。これゆえ、米国特許出願公開第２００５−０，２５０，８２６Ａ１号明細書において開示されたもののような、他のイソキサゾリンＭＩＦ阻害剤が、その芳香環への１以上の弗素部分の付加により向上されることが期待されている。これゆえ、本発明が、式ＩＩ：
【００３６】
【化８】
0005523095.tif 000009
【００３７】
の化合物にも関し、式中、Ｒ１が、直鎖もしくは分岐Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、独立に、ＦもしくはＨであり、但し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の全てがＨにはならない。好ましくは、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の１つだけがＦである。より好ましくは、Ｒ２がＦである。Ｒ２がＦである場合、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５が、Ｈであるのが好ましい。
【００３８】
本発明が、医薬として許容可能な担体中、上記の化合物のいずれか、もしくは、これの医薬として許容可能な塩を含む医薬組成物にも関する。
【００３９】
「医薬として許容可能な」により、（ｉ）本組成物の他の成分と相溶で、その意図された目的に本組成物を不適にすることなく、（ｉｉ）本明細書において与えられたとおりの主題を有する使用に適しており、（毒性、過敏、およびアレルギー応答のような）過度の悪影響を及ぼす副作用のない素材が、意味されている。副作用が、「過度」であるのは、そのリスクが、本組成物により与えられた利益よりも重い場合である。医薬として許容可能な担体の非限定例が、限定なく、燐酸緩衝生理食塩水溶液のような標準医薬担体、水、油／水エマルション、微小（ミクロ）エマルションのようなエマルション等のいずれかを包含する。
【００４０】
上記化合物が、過度の実験なく、特定の応用に適するよう、ヒトを包含する哺乳類に対する投与用に製剤化され得る。加えて、これら組成物の適正な用量が、過度の実験なく、標準用量−応答プロトコルを使用して求められ得る。
【００４１】
従って、経口、舌、舌下、口腔、および口腔内投与用に設計（デザイン）されたこれら組成物が、過度の実験なく、当業界においてよく知られた手段、例えば、不活性稀釈剤を用いてもしくは可食担体を用いて調製され得る。これら組成物が、ゼラチンカプセル中に封じられていてもよく、錠剤（タブレット）に圧縮されていてもよい。経口治療投与目的に関し、本発明のこれら医薬組成物が、賦形剤と共に取り込まれてもよく、タブレット、トローチ、カプセル、エリキシル剤、サスペンション、シロップ、ウェーハ、チューイングガム、および同様のものの形において使用されてもよい。
【００４２】
タブレット、ピル、カプセル、トローチ、および同様のものが、バインダー、レシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、および香料も含有してよい。バインダーのある幾つかの例が、微結晶セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンを包含する。賦形剤の例が、スターチもしくはラクトースを包含する。崩壊剤のある幾つかの例が、アルギン酸、コーンスターチ、および同様のものを包含する。潤滑剤の例が、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カリウムを包含する。潤滑剤（ｇｌｉｄａｎｔ）の例が、コロイド状二酸化珪素である。甘味料のある幾つかの例が、スクロース、サッカリン、および同様のものを包含する。香料の例が、ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料、および同様のものを包含する。これらの種々の組成物を調製することにおいて使用される素材が、医薬として純粋であり、使用される量において非毒性であるべきである。
【００４３】
本発明の化合物が、容易に、例えば、静脈内、筋内、くも膜下、もしくは皮下注射により、非経口投与され得る。非経口投与が、これら化合物を溶液もしくは懸濁液（サスペンション）中に取り込ませることにより達成され得る。このような溶液もしくは懸濁液は、注射用水、生理食塩水溶液、固定化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくは他の合成溶媒のような無菌稀釈剤も包含してよい。非経口製剤が、例えば、ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンのような抗菌剤、例えば、アスコルビン酸もしくは重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化剤、ならびに、ＥＤＴＡのようなキレート化剤も包含してよい。酢酸塩、クエン酸塩、もしくは燐酸塩のような緩衝剤（バッファー）、ならびに、塩化ナトリウムもしくはデキストロースのような浸透圧調整剤も加えられてよい。本非経口調製品が、アンプル、使い捨て可能なシリンジ、またはガラスもしくはプラスチックから調製された多数回用量バイアル中に、封じられ得る。
【００４４】
直腸投与が、直腸もしくは大腸中に医薬組成物中の本化合物を投与することを包含する。これが、坐薬もしくは浣腸を使用して達成され得る。坐薬製剤が、容易に、当業界において知られる方法により調製され得る。例えば、坐薬製剤が、グリセリンを約１２０℃に熱し、本組成物をそのグリセリンに溶かし、その熱せられたグリセリンを混ぜ、その後、精製水が加えられてもよく、そしてその熱い混合物を坐薬型中に注いでいくことにより調製され得る。
【００４５】
経皮投与が、皮膚を通る本組成物の経皮吸収を包含する。経皮製剤が、パッチ（よく知られたニコチンパッチのような）、外用薬、クリーム、ジェル、軟膏、および同様のものを包含する。
【００４６】
本発明の化合物が、鼻投与用にも調製され得る。本明細書中、使用されたとおり、鼻投与が、その患者の鼻道もしくは鼻腔の粘膜に本化合物を投与することを包含する。本化合物の鼻投与用医薬組成物が、例えば、鼻スプレー、点鼻薬、懸濁、ジェル、外用薬、クリーム、もしくは粉末として投与されるよく知られた方法により調製された本化合物の治療有効量を包含する。本化合物の投与が、鼻タンポンもしくは鼻スポンジを使用して行われてもよい。
【００４７】
本発明のこれら化合物が、これら自体（原液、ニート）、または医薬として許容可能な塩の形態で投与されてもよい。医学において使用された場合、これら塩が薬理学的におよび医薬として両方許容可能であるべきであるが、医薬として許容不可能な塩が、便利に、遊離の活性化合物もしくはこの医薬として許容可能な塩を調製するために使用されてよい。薬理学的におよび医薬として許容可能な塩が、以降の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、燐酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、琥珀酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸から調製されるものを包含するが、これらに限られない。また、医薬として許容可能な塩が、そのカルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩、もしくはカルシウム塩のようなアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類塩として調製され得る。
【００４８】
本発明が、更に、哺乳類におけるマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）活性を阻害する方法に関する。これら方法が、当該哺乳類におけるＭＩＦ活性を阻害するに有効な量で上記医薬組成物のいずれかを当該哺乳類に投与することを含む。
【００４９】
これらの方法が、如何なる哺乳類上でも使用され得る。好ましくは、該哺乳類はヒトである。該哺乳類は、ＭＩＦにより少なくとも一部媒介されている炎症サイトカインカスケードを含む病状を有するか、または、これに関するリスクにあることも好ましい。このような病状の非限定例が、増殖脈管疾患、急性呼吸困難症候群、サイトカイン媒介毒性、乾癬、インターロイキン−２毒性、虫垂炎、消化潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍結腸炎、偽膜結腸炎、急性結腸炎、および虚血結腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、炎症腸疾患、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合病、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素ショック、悪液質（カケクシア）、超高熱、好酸性肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症性流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞線維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、ＲＳウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）、疣、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化、血栓静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血心不全、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄傷害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種異系移植片拒絶、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、バージャー病、１型糖尿、２型糖尿、バージャー病、ルティエ症候群、およびホジキン病を包含する。好ましいこのような病状が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）および／または内毒素ショックである。
【００５０】
ＭＩＦが、自己免疫疾患における重要な役割を果たすことが示されている。例えば、Ｃｖｅｔｊｏｖｉｃら、２００５年参照。本方法は、これゆえ、自己免疫疾患治療において有用であると思われる。これゆえ、該方法のある態様において、本哺乳類が、自己免疫疾患を有するかもしくはこれに関するリスクにある。このような自己免疫疾患の非限定例が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リューマチ関節炎、移植片対宿主病、自己免疫性肺炎、自己免疫性脳脊髄炎、ギランバレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インシュリン依存糖尿、クローン病、硬皮症、乾癬、シェーグレン症候群、および自己免疫性炎症眼病である。
【００５１】
ＭＩＦも、腫瘍の浸潤および転移を促進させると知られている。例えば、Ｓｕｎら、２００５年参照。本方法が、これゆえ、腫瘍を有する哺乳類の治療に有用であると思われる。
【００５２】
本発明が、哺乳類における炎症を治療するかもしくは防ぐ方法にも関する。当該方法が、当該哺乳類における炎症を治療するかもしくは防ぐのに有効な量の上記医薬組成物を当該哺乳類に投与することを含む。
【００５３】
これらの方法に関し、当該哺乳類が、好ましくはヒトである。当該哺乳類が、炎症、例えば、増殖脈管疾患、急性呼吸困難症候群、サイトカイン媒介毒性、乾癬、インターロイキン−２毒性、虫垂炎、消化潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍結腸炎、偽膜結腸炎、急性結腸炎、および虚血結腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、炎症腸疾患、クローン病、腸管炎、ホウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合病、臓器虚血、再灌流傷害、臓器壊死、枯草熱、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、内毒素ショック、悪液質（カケクシア）、超高熱、好酸性肉芽腫、肉芽腫症、類肉腫症、敗血症性流産、副睾丸炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、嚢胞線維症、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、ＲＳウィルス感染、ヘルペス感染、ＨＩＶ感染、Ｂ型肝炎ウィルス感染、Ｃ型肝炎ウィルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、糸状虫症、アメーバ症、包虫嚢胞、火傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣、膨疹、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、粥状（アテローム）硬化、血栓静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リューマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギランバレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄傷害、麻痺、葡萄膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、リューマチ関節炎、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種異系移植片拒絶、移植片対宿主病、強直性脊椎炎、バージャー病、１型糖尿、２型糖尿、バージャー病、ルティエ症候群、もしくはホジキン病に関与する病を有し得るか、もしくは、これらの病に関するリスクにあり得る。好ましくは、本哺乳類が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックを有するか、あるいは、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックに関するリスクにある。
【００５４】
これらの方法が、当該哺乳類に対する第２の抗炎症剤の投与を包含し得る。このような第２の抗炎症剤の例が、ＮＳＡＩＤｓ、サリチラート、ＣＯＸ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、およびステロイドである。好ましくは、本哺乳類が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックに関するリスクを有するか、または、リスクにあり、第２の治療が、ムスカリンアゴニスト、アドレノメデュリン、アドレノメデュリン結合蛋白、乳脂球状表皮成長因子ＶＩＩＩ、活性化蛋白Ｃ、もしくはα２Ａ−アドレナリン作動アンタゴニストの投与である。
【００５５】
本発明が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックを有する哺乳類を治療する方法にも関する。当該方法が、セプシス、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、および／または内毒素ショックを治療するのに有効な量で当該哺乳類に上記医薬組成物を投与することを含む。
【００５６】
本発明が、更に、自己免疫疾患を有する哺乳類を治療する方法に関する。これら方法が、当該自己免疫疾患を治療するに有効な量で当該哺乳類に上記医薬組成物を投与することを含む。このような自己免疫疾患の例が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、リューマチ関節炎、移植対宿主疾患、自己免疫性肺炎、自己免疫性脳脊髄炎、ギラン−バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、インシュリン依存糖尿病、クローン病、硬皮症、乾癬、シェーグレン症候群、および自己免疫性炎症眼病を包含する。
【００５７】
加え、本発明が、腫瘍を有する哺乳類を治療する方法に関しており、本方法は当該腫瘍を治療するに有効な量で当該哺乳類に上記の医薬組成物を投与することを含む。
【００５８】
これらの化合物が、有効に経口投与され得る。これゆえ、上の方法のいずれにおいても本発明の医薬組成物が経口投与され得る。あるいは、本発明の医薬組成物が非経口投与され得る。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態が、以降の実施例において記載される。本明細書中の請求項の範囲内の他の実施形態が、本明細書の考慮、もしくは、本明細書に開示されたとおりの本発明の実際から、当業者に対して明らかとなる。本発明の範囲および意図は、これら請求項により指し示されており、これら実施例と一緒に、本願明細書は、単なる例示とみなされることが、意図されており、これら実施例に伴う。
【実施例】
【００６０】
実施例１．ＩＳＯ−１骨格（scaffold）重要な修飾が、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）活性のその有効な阻害を向上させる
実施例の要約
【００６１】
原炎症サイトカインＭＩＦ阻害剤たる（Ｓ，Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ジヒドロ−５−イソキサゾール酢酸メチルエステル（ＩＳＯ−１）の骨格に基づいて、不斉分割および２回の重要な修飾が、その阻害の有効性を有意に向上させている。（Ｒ）−１７が、ＩＳＯ−１よりも２０倍有効であり、５５０ｎＭのＩＣ５０を有し、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性を阻害する。
【００６２】
結果および議論
ＩＳＯ−１の有効性を向上させるのに、ＩＳＯ−１の構造−活性相関が、探された。以前、そのパラ−ヒドロキシル官能基のメチル化、イソキサゾールへの４，５−ジヒドロイソキサゾールの酸化、または、アルコールへのメチルエステルの還元におけるそのＭＩＦ阻害効果の消失により証明されたように、重要な複数の官能基が、ＩＳＯ−１骨格内で同定された。（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２年）。本明細書中、ＩＳＯ−１のフェノール基のオルト位上へのモノ弗素化が、４１％にまでもＭＩＦ活性阻害を向上させたことが、発見された（図３）。また、ＩＳＯ−１のアルキル尾部が、種々のエステル類似体（アナローグ）および種々のアミド類似体（アナローグ）を用いて調べられた。この新しい合成経路（ルート）が、大規模（ラージスケール）においてその前駆体（ＩＳＯ−１−酸）を提供する（図２）。ＩＳＯ−１−酸とアルコール（もしくはアミン）との間でのエステル化およびアミド形成が、標準ＤＣＣカップリングプロトコール（ＤＣＣ、ＤＭＡＰ、もしくはＨＯＢｔ）を使用して達成された（表１）。
【００６３】
【表１】
0005523095.tif 000010
【００６４】
表１および表２において要約されたとおり、我々は、これらエステル類似体（アナローグ）が、その（対応）アミド同等体よりも有効な阻害剤であることを見出した（例えば、化合物１４（ＩＣ５０＝２．５μＭ）対化合物６（ＩＣ５０＝２４μＭ）および化合物３（ＩＣ５０＝８．５μＭ）対化合物７（ＩＣ５０＝２６μＭ））。我々は、ＭＩＦ活性を阻害する有効性へのこのエステル基の嵩高さの影響を更に調査した。ＩＳＯ−１−酸のエステル化プロセスが、以降のアルコール：エタノール、１０；１−プロパノール、１１；２−プロパノール、１２；１−ブタノール、１３；シクロヘキサノール、１４；シクロヘキシルメタノール、１５；およびネオペンチルアルコール、１６を使用して、ＴＭＳＣｌを用いて達成された（表２）。表３において示されたとおり、最も嵩高いアルコール（化合物１６、ネオペンチルエステル類似体（アナローグ））が、より優れた阻害活性（ＩＣ５０＝１．５μＭ）を示し、ＩＳＯ−１よりも約１０倍有効である。
【００６５】
【表２】
0005523095.tif 000011
【００６６】
ＭＩＦ／ＩＳＯ−１錯体結晶構造解析が、ＩＳＯ−１の（Ｒ）−異性体（アイソマー）が、（Ｓ）−異性体（アイソマー）よりも良くその電子密度（電子雲）中に適合（フィット）することを予示し、該（Ｒ）−異性体（アイソマー）が、ＭＩＦ活性部位に対するより高い親和性（アフィニティー）で結合することがあることを示唆する（Ｄｉｏｓら、２００２）。以前、そのアミノ酸シッフ塩基（ベース）の絶対配置の重要さが、ＭＩＦ阻害効果に関し示された（Ｌｕｂｅｔｓｋｙら、２００２）。してみると、この光学活性ＩＳＯ−１の分割およびその阻害活性の決定が、各異性体（アイソマー）に関し、必要とされた。不斉分割が、メチル化ＩＳＯ−１−酸ジアステレオマーシンコニジン塩の分別結晶を通し、以前記載されたとおり達成された（図３、Ｗｉｔｙａｋら、１９９７）。それらの（Ｓ）−配置の塩が、より可溶性でないと見出され、その不斉混合物から析出された。これら（Ｓ）および（Ｒ）−配置の塩が、次いで、１規定（Ｎ）塩酸（ＨＣｌ）により酸性化され、ＢＢｒ３を用いて脱メチル化され、そしてメタノール（ＭｅＯＨ）中、ＴＭＳＣｌを用いてエステル化され、（Ｓ）−ＩＳＯ−１（９０％ｅｅ）および（Ｒ）−ＩＳＯ−１（９０％ｅｅ）を得た。両異性体（アイソマー）が、ＭＩＦドーパクローム互変化酵素（トートメラーゼ）アッセイにおいて活性に関してテストされた。（Ｒ）−ＩＳＯ−１が、約７μＭのＩＣ５０を有し、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性を阻害したが、（Ｓ）−ＩＳＯ−１が、約１３μＭのＩＣ５０を有し、活性が５０％少なかった（図３）。
【００６７】
最も有効な特異的な小分子ＭＩＦ阻害剤を得るに当たり、３回の重要な工程（ステップ）が、本ＩＳＯ−１骨格中に組み込まれることが必要である：
（１）ＩＳＯ−１のフェノール基の弗素化、好ましくは、該フェノール基のオルト位（ｏ−）上にモノ弗素化；
（２）ＩＳＯ−１のメチルエステルを置換するネオペンチルエステルのようなより嵩高い官能基；および
（３）（Ｒ）−異性体を得る不斉分割。
こうして、化合物１７（図３）が最適化され、７５０ｎＭのＩＣ５０を有する、ＭＩＦ活性潜在的阻害剤である。古典的な不斉分割後、（Ｒ）−１７が、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性を阻害し、５５０ｎＭのＩＣ５０を有し、一方、（Ｓ）−１７が、５０％活性でなかったが、約１．１μＭのＩＣ５０を有した（図３）。化合物（Ｒ）−１７が、その親化合物ＩＳＯ−１よりも２０倍有効である。
【００６８】
ＩＳＯ−１骨格での重要な２回の修飾後、我々が、ナノモーラー濃度（５５０ｎＭ）にまで、ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性阻害を向上させており、ＩＳＯ−１よりも約２０倍有効である。
【００６９】
材料および方法
ＭＩＦ互変化酵素（トートメラーゼ）活性が、ＵＶ−可視記録分光器（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＵＶ１６００Ｕ）により、測定された。Ｌ−ドーパクロームメチルエステルの保管未使用溶液が、過沃素酸ナトリウムを用いたＬ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステルの酸化を通し、２．４ｍＭで調製された。ＭＩＦ溶液（８００〜９００ｎｇ／ｍＬ）１μＬおよび本酵素阻害剤の種々の濃度を有するＤＭＳＯ溶液１μＬが、０．７ｍＬアッセイ用緩衝液（バッファー、５０ｍＭ燐酸カリウム、ｐＨ７．２）を含有するプラスチックセル（ｃｕｖｅｔｔｅ、１０ｍｍ、１．５ｍＬ）中に加えられた。次いで、Ｌ−ドーパクロームメチルエステル溶液（０．３ｍＬ）が、該アッセイ用緩衝液（バッファー）の混合物に加えられた。活性が室温（ＲＴ）において求められ、それらの分光測定が、標準溶液に比べ、Ｌ−ドーパクロームメチルエステル脱色速度をモニターすることにより、２０秒間、λ＝４７５ｎｍにおいてなされた。
【００７０】
全ての溶媒が、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＨＰＬＣ等級（グレード）であった。シリカゲル（Ｓｅｌｅｃｔｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３２〜６３μｍ平均粒子サイズ）が、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＦＣＣ）用に使用された。２５４ｎｍ蛍光指示器ＴＬＣ板（プレート）と共にアルミニウム焼成シリカゲル６０が使用された。ＴＬＣ板（プレート）上のスポットが、短波長ＵＶ灯（ランプ）下、視覚化されるか、あるいは、Ｉ２蒸気を用いて染色された。ＮＭＲスペクトルが、１Ｈ ＮＭＲスペクトルに関し２７０ＭＨｚでおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルに関し、６７．５ＭＨｚで、Ｊｅｏｌ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ２７０分光器で行われた。重水素化溶媒のピークに相対し、カップリング定数が、ヘルツ（Ｈｚ）単位で報告されており、化学シフト（ケミカルシフト）が、ｐｐｍ単位で報告される。これらカップリング定数（Ｊ）が、ヘルツ（Ｈｚ）単位で測定されており、シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、マルチプレット（ｍ）、およびブロード（ｂｒ）として帰属されている。低分解能質量スペクトルが、陰イオンもしくは陽イオンのモードを有するＴｈｅｒｍｏｆｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ＤｅｃａＸＰｐｌｕｓ４極イオン捕捉器（トラップ）ＭＳを使用して、獲得された。
【００７１】
４−メトキシベンズアルデヒドオキシム調製。
４−メトキシベンズアルデヒド（５．０ｇ、３６．８ミリモル）メタノール（３００ｍＬ）溶液に、塩酸ヒドロキシルアミン（７．６ｇ、１１０．４ミリモル）および２規定（Ｎ）水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ、３７ｍＬ、７３．６ミリモル）が加えられた。この混合物が、６時間、室温（ＲＴ）において攪拌された。この混合物が、１規定（Ｎ）塩酸（ＨＣｌ）を使用することにより、ｐＨ４にまで中和された。過剰のメタノールが、真空下で除かれ、そのオキシム体を沈澱させ切る。沈澱が濾過され、水洗された。生成物が、真空下で乾燥され、白色固体を得た（４．９ｇ、８８％）：１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．０７（ｓ、１Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、６．９５（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、２Ｈ）、３．８２（ｓ、３Ｈ）。
【００７２】
ＩＳＯ−１−酸調製。
４−メトキシベンズアルデヒドオキシム（４グラム（ｇ）、２６ミリモル）無水ＤＭＦ（５００ｍＬ）溶液に、ＮＣＳ（５．２ｇ、３９ミリモル）が加えられた。この反応混合物が、塩化オキシム（クロロオキシム）を与えながら、室温（ＲＴ）において５時間攪拌された。この溶液にビニル酢酸（６．６ｍＬ、７８ミリモル）が加えられ続いてＤＭＦ（５０ｍＬ）中トリエチルアミン（５．５ｍＬ、３９ミリモル）を滴下した。この反応混合物が、４８時間、室温（ＲＴ）においてＮ２下、攪拌された。溶媒が真空中で除かれ、残渣がＥｔＯＡｃ中で回収された。このＥｔＯＡｃ溶液が、０．５規定（Ｎ）ＨＣｌ、水、（飽和）食塩水洗浄され、無水ＭｇＳＯ４（硫酸マグネシウム、硫マグ）乾燥された。最終溶液が、真空中濃縮され、真空ポンプ下で乾燥されて、定量的な収率において１を与える。１（乾いたジクロロメタン中、４０〜５０ミリモル（ｍＭ））溶液が、Ｎ２下、０℃において過剰（８〜１０当量）の三臭化硼素（１Ｍジクロロメタン溶液、アルドリッチカタログ＃：２１１２２２）を用いて処理された。この反応混合物が、５〜６時間に亘り、室温（ＲＴ）に達するようにされ、次いで、飽和ＮａＨＣＯ３水を用いて反応停止（クウェンチ）された（注意：ＢＢｒ３が、水と激しく反応する！！！）。この混合物が１／２時間攪拌され、次いで水およびＣＨ２Ｃｌ２を用いて稀釈された。その有機層が、その水層から分離され、廃棄された。この水の部分が、ｐＨ４にまで１規定（Ｎ）塩酸（ＨＣｌ）を用いて中和され、ＥｔＯＡｃ抽出された。ＥｔＯＡｃ溶液の組み合わせが、（飽和）食塩水洗浄され、無水ＭｇＳＯ４（硫酸マグネシウム、硫マグ）乾燥されて、良好な収率（７５％）において薄黄色粉末としてＩＳＯ−１−酸を与える。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ１０．６５（ｂｒ、１Ｈ）、８．７５（ｓ、１Ｈ）、７．５２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．０１（ｍ、１Ｈ）、３．５０（ｍ、１Ｈ）、３．０５（ｍ、１Ｈ）、２．６８（ｍ、２Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ  ２２０（Ｍ−）。
【００７３】
エステルもしくはアミドの形成への一般的なＤＣＣカップリング手順。
ＩＳＯ−１−酸（乾燥ジクロロメタン中、１００ミリモル（ｍＭ））が、１．１当量のＤＣＣ、０．２当量のＤＭＡＰ、および１．５当量のアルコール（もしくは、０．２当量のＨＯＢｔおよび１．５当量のアミン）を用いて処理された。この混合物が、室温（ＲＴ）において８時間、攪拌された。形成された白色沈澱が、濾過され取り除かれ、ＣＨ２Ｃｌ２洗浄されて、その濾液が乾燥するまでエバポレーションされた。その残渣が、シリカゲルで精製され（ヘキサン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）／ＭｅＯＨ ４／３／１）、白色固体としてこれらエステルもしくはアミドを与える。
化合物２（６５％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７５（ｂｒ、１Ｈ）、７．５４（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３８（ｍ、２Ｈ）、７．２２（ｍ、１Ｈ）、７．１１（ｍ、２Ｈ）、６．８６（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．１０（ｍ、１Ｈ）、３．５４（ｍ、１Ｈ）、３．２７（ｍ、１Ｈ）、２．９６（ｍ、２Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２９６（Ｍ−）
化合物３（６０％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７８（ｓ、１Ｈ）、７．５２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．０２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．９０（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８６（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．１０（ｍ、１Ｈ）、３．７６（ｓ、３Ｈ）、３．５３（ｍ、１Ｈ）、３．２５（ｍ、１Ｈ）、２．７６（ｍ、２Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３２６（Ｍ−）
化合物４（４０％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７５（ｂｒ、１Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．３９（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．０３（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．１１（ｍ、１Ｈ）、３．５５（ｍ、１Ｈ）、３．２３（ｍ、１Ｈ）、２．９５（ｍ、２Ｈ）、１．３０（ｓ、９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３５２（Ｍ−）
化合物５（３０％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７５（ｓ、１Ｈ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．１７（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８６（ｓ、２Ｈ）、５．１０（ｍ、１Ｈ）、３．５５（ｍ、１Ｈ）、３．２５（ｍ、１Ｈ）、２．９６（ｍ、２Ｈ）、２．０５（ｓ、９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３３８（Ｍ−）
化合物６（８０％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７９（ｓ、１Ｈ）、７．５２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、７．００（ｂｒ、１Ｈ）、６．８５（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．９４（ｍ、１Ｈ）、３．６４（ｍ、１Ｈ）、３．４２（ｍ、１Ｈ）、３．１０（ｍ、１Ｈ）、２．５２（ｍ、１Ｈ）、２．３７（ｍ、１Ｈ）、１．９０〜１．００（ｍ、１０Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３０１（Ｍ−）
化合物７（８８％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ９．１０（ｂｒ、１Ｈ）、８．８０（ｂｒ、１Ｈ）、７．５３（ｍ、４Ｈ）、６．８４（ｍ、４Ｈ）、５．０６（ｍ、１Ｈ）、３．７２（ｓ、３Ｈ）、３．４９（ｍ、１Ｈ）、３．１７（ｍ、１Ｈ）、２．７３（ｍ、１Ｈ）、２．６０（ｍ、１Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３２５（Ｍ−）
化合物８（９５％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ７．５２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８８（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．０７（ｂｒ、１Ｈ）、５．０２（ｍ、１Ｈ）、３．４６（ｍ、１Ｈ）、３．１３（ｍ、５Ｈ）、２．５６（ｍ、２Ｈ）、１．５１（ｍ、４Ｈ）、１．３８（ｓ、９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ４１４（Ｍ＋Ｎａ＋）
化合物９（９０％収率）：１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．６３（ｂｒ、１Ｈ）、７．５２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８７（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．０４（ｍ、１Ｈ）、３．８４（ｍ、２Ｈ）、３．２８（ｍ、３Ｈ）、２．５８（ｍ、３Ｈ）、１．８６（ｍ、２Ｈ）、１．６５（ｍ、２Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２９２（Ｍ＋）
【００７４】
一般的なＴＭＳＣｌエステル化手順。
ＩＳＯ−１−酸（５０ミリグラム、０．２３ミリモル）３ｍＬアルコール（エタノール、１０；１−プロパノール、１１；２−プロパノール、１２；１−ブタノール、１３；シクロヘキサノール、１４；シクロヘキシルメタノール、１５；およびネオペンチルアルコール、１６）溶液に０．１ｍＬのＴＭＳＣｌが、加えられた。この混合物が、２時間、室温（ＲＴ）において（１４、１５、および１６に関し：５０℃において３時間）攪拌された。この混合物が、乾燥するまでエバポレーションされ、その残渣が、シリカゲルで精製されて（ヘキサン／酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）４／３）、定量的な収率で、白色固体もしくは薄黄色油（オイル）を得た。
化合物１０：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７４（ｓ、１Ｈ）、７．５２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．９７（ｍ、１Ｈ）、４．１０（ｑ、２Ｈ）、３．５１（ｍ、１Ｈ）、３．１２（ｍ、１Ｈ）、２．６６（ｍ、２Ｈ）、１．１９（ｔ、３Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２４８（Ｍ−）
化合物１１：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７５（ｓ、１Ｈ）、７．５１（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８６（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．９８（ｍ、１Ｈ）、４．０１（ｔ、２Ｈ）、３．５１（ｍ、１Ｈ）、３．１５（ｍ、１Ｈ）、２．６６（ｍ、２Ｈ）、１．６０（ｍ、２Ｈ）、０．８９（ｔ、３Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２６２（Ｍ-）
化合物１２：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７４（ｓ、１Ｈ）、７．５１（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８５（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．９７（ｍ、２Ｈ）、４．７２（ｍ、１Ｈ）、３．５１（ｍ、１Ｈ）、３．１２（ｍ、１Ｈ）、２．６３（ｍ、２Ｈ）、１．１８（ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、６Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２６２（Ｍ−）
化合物１３：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７８（ｓ、１Ｈ）、７．５２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８６（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．９９（ｍ、１Ｈ）、４．０５（ｔ、２Ｈ）、３．５１（ｍ、１Ｈ）、３．１２（ｍ、１Ｈ）、２．６８（ｍ、２Ｈ）、１．１０〜１．６０（ｍ、４Ｈ）、０．８８（ｔ、３Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２７６（Ｍ−）
化合物１４：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．８４（ｂｒ、１Ｈ）、７．５２（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８６（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、４．９８（ｍ、１Ｈ）、４．７２（ｍ、１Ｈ）、３．５１（ｍ、１Ｈ）、３．１５（ｍ、１Ｈ）、２．６６（ｍ、２Ｈ）、１．９０〜１．２０（ｍ、１０Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３０２（Ｍ−）
化合物１５：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７８（ｓ、１Ｈ）、７．５５（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８８（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．０２（ｍ、１Ｈ）、３．９０（ｄ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．５１（ｍ、１Ｈ）、３．１５（ｍ、１Ｈ）、２．７２（ｍ、２Ｈ）、１．８０〜０．９０（ｍ、１１Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ３０２（Ｍ−）
化合物１６：１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、アセトン−ｄ６）δ８．７９（ｓ、１Ｈ）、７．５４（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、６．８８（ｄ、Ｊ＝８．７Ｈｚ、２Ｈ）、５．０５（ｍ、１Ｈ）、３．８２（ｍ、２Ｈ）、３．５２（ｍ、１Ｈ）、３．１８（ｍ、１Ｈ）、２．７５（ｍ、２Ｈ）、０．９６（ｓ、９Ｈ）；ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ ２９２（Ｍ＋）
【００７５】
これらシンコニジン塩の結晶化経由の酸１の古典的分割。
（Ｒ，Ｓ）−１（１．３グラム、５．５ミリモル）が熱アセトン（２５ｍＬ）に溶解され、シンコニジン（１．６１グラム、５．５ミリモル）が加えられ、そしてこの溶液が室温（ＲＴ）まで冷やされ、終夜、−２０℃におかれた。この結果得られる白色固体が濾過されて、（Ｓ）−１塩を与える。濾液が真空下で濃縮されて、（Ｒ）−１塩を与える。（Ｒ）−１塩もしくは（Ｓ）−１塩（２００ミリグラム、０．４ミリモル）のクロロホルム（３ｍＬ）溶液にエーテル（３ｍＬ、３ミリモル）中１規定（１Ｎ）塩酸（塩化水素、ＨＣｌ）が、加えられた。この結果得られる白色沈澱が、濾過して除かれ、濾液が、真空下で濃縮されて、定量的な収率で、（Ｒ）−１もしくは（Ｓ）−１を得た。
【００７６】
実施例２．急性炎症に対する応答における白血球動員へのイソキサゾリンＭＩＦ阻害剤の効果。
空気（エア）パウチは、スイスウェブスター（Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ）雄マウス（複数、２５〜３０ｇ）において標準手順（Ｇａｒｃｉａ−Ｒａｍａｌｌｏら、２００２）に従って、０日目（６ｍＬ）および３日目（３ｍＬ）、無菌空気（エア）を皮下注射することにより調製された。６日目、複数の動物が、ビヒクル（２０％ＤＭＳＯ３５０μＬ）、ＩＳＯ−１（４０ｍｇ／ｋｇ）、もしくはＩＳＯ−６３（４０ｍｇ／ｋｇ）を用いる単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射と共に治療された。１５分後、これら動物が、該空気（エア）パウチの空洞中に（ＰＢＳ中）１％カラゲナン１ｍＬを注射することにより刺激された。ガラゲナン注射５時間後、これら動物は殺処分され、これらパウチがＰＢＳ洗浄され、滲出物が回収され、そして浸潤細胞合計数が定量された。
【００７７】
図５が、このアッセイの結果を要約する。ＩＳＯ−６３の治療は、急性炎症に対する応答における白血球の動員における有意な抑制を引き起こしたが、ＩＳＯ−１治療は、そうでなかった。
【００７８】
実施例３．マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）中へのリューマチ関節炎線維芽細胞様滑膜細胞（ＲＡ−ＦＬＳ）の浸潤へのイソキサゾリンＭＩＦ阻害剤の効果。
浸潤が、マトリゲル浸潤チャンバー（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＭＡ）を通して細胞浸潤を測定することによりアッセイされた。２５μＭのＩＳＯ−１もしくは１００ｎＭのＩＳＯ−６３を用いるＲＡ−ＦＬＳ治療１日後、４×１０４個の細胞が、無血清培地中の上方のチャンバーに入れられた。１０％ＦＢＳおよび１０％ヒト血清を含有する５００μＬの全培地が、底の方のチャンバーに加えられた。３７℃でのインキュベート２４時間後、フィルターの上方の表面上の細胞が、Ｑ−チップを用いて拭き取られ、該フィルターが、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中に固定された。クリスタルヴァイオレットを用いて染色した後、転移した細胞が、倒立顕微鏡を使用して計数された。
【００７９】
図６が、このアッセイの結果を要約する。ＩＳＯ−６３治療が、ＩＳＯ−１治療よりも遙かに大きい程度にまで、細胞浸潤を抑えた。
【００８０】
参照
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米国特許出願第２００５−０，２５０，８２６Ａ１号明細書
【００８１】
上の観点中、本発明の幾つかの利点が達成されており、他の利点が達成されたことが分かる。
【００８２】
本発明範囲から逸脱することなく、上の方法および上の組成物において種々の変更がなされ得るので、上の記載において含有され且つ添付図面において示された全事項が、例示として、限定的な意味ではなく解釈されるべきであると意図される。
【００８３】
この明細書において引用された全参照が、本明細書により援用される。本明細書におけるこれら参照の議論が、単にその著者らによりなされた主張を要約すると意図されており、如何なる参照も先行技術を構成することは全く認められていない。出願人は、これら引用参照の正確さおよび適切さに挑むに当たっての権利を保留する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）に関与する化学経路を示し、ＭＩＦが、ドーパクロームメチルエステルをおよびＭＩＦ阻害剤ＩＳＯ−１の構造をも互変異性化させることを示す。
【図２】ＩＳＯ−１−酸の合成のための化学スキームを示す。
【図３】ＩＳＯ−１および化合物１７の立体異性体（ステレオアイソマー）の合成のための化学スキームを示す。これら同定された化合物のＭＩＦ阻害活性も提供する。
【図４】２種のジイソプロピルメチルエステルイソキサゾリン化合物の合成のための化学スキームを示す。これら同定された化合物のＭＩＦ阻害活性も提供する。
【図５】ＩＳＯ−６３が、急性炎症の樹立されたモデルにおける白血球動員を阻害することを示している複数の実験結果のグラフである。＊＊ビヒクル単独に相対し、ｐ＜０．００７（ｎ＝７）。
【図６】ＩＳＯ−６３が、マトリゲル中へのリューマチ関節炎線維芽細胞様滑膜細胞（ＲＡ−ＦＬＳ）の浸潤を阻害することを示す複数の実験結果のグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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