(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体におけるポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムを予防、抑制又は低減するための医薬組成物であって、活性成分として、バイオフィルム形成及び／又はバイオフィルム発達を調節するポリペプチドの阻害剤を含む、医薬組成物において、
該阻害剤がオキサンテル、モランテル又はチアベンダゾールから成る群から選択される、医薬組成物。
【請求項２】
被験体におけるポルフィロモナス・ジンジバリス感染症及び／又は歯周病を予防、抑制又は治療するための医薬組成物であって、活性成分として、バイオフィルムの形成及び／又は発達を調節するポリペプチドの阻害剤を含む、医薬組成物において、
該阻害剤がオキサンテル、モランテル及びチアベンダゾールから成る群から選択される、医薬組成物。
【請求項３】
阻害剤がオキサンテルである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
阻害剤がモランテルである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
阻害剤がチアベンダゾールである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
抗生物質をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
被験体におけるポルフィロモナス・ジンジバリス感染症及び／又は歯周病を予防、抑制又は治療するための医薬組成物を製造するための、オキサンテル、モランテル及びチアベンダゾールから成る群から選択されるバイオフィルム形成及び／又はバイオフィルム発達を調節するポリペプチドの阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）を含有する細菌性バイオフィルム等の、細菌性バイオフィルムの形成及び／又は発達を予防又は変更する組成物及び方法に関する。特に本発明は、バイオフィルムの形成及び／又は発達を調節するための、バイオフィルムとしての又はヘム制限（haem-limitation）下での増殖のために重要なポリペプチドの使用及び阻害に関する。本発明はまた、細菌性酵素の調節を含む、バイオフィルムの形成及び／又は発達の調節のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの細菌性治療が、浮遊状態（planktonic state）にある細菌を対象とする。しかし、細菌性の病態は、バイオフィルム状態にある細菌を含む。例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリスは、慢性の歯周病（periodontal disease）の主要な原因となる作用因子であると考えられている。該疾患と関連する組織損傷は、歯の表面上で多微生物性の細菌性バイオフィルムの一部分として増殖するポルフィロモナス・ジンジバリスに対する宿主免疫応答の調節不全により引き起こされる。細菌性バイオフィルムは、自然界にどこにでも存在し、互いに対して及び／又は表面若しくは界面に対して接着性の、マトリクスに囲まれた細菌集団と定義される（１）。成熟バイオフィルムとして表面に接着し該表面上で増殖するこれらの固着性の細菌細胞は、抗菌剤の存在、せん断力及び栄養枯渇を含み得る厳しい環境で生存することができる。
【０００３】
疾病対策予防センターは、ヒトの細菌性感染の６５％がバイオフィルムを含むと見積もっている。バイオフィルムは、免疫系から細菌を保護することにより、抗生物質の有効性を減少させ、再感染を助け得る離れた部位に浮遊細胞を分散させることで、慢性感染症の治療を複雑にすることが多い（２、３）。歯垢は、種の多様性の高さにより歯の表面上で増殖する異質な多微生物性バイオフィルムが形成される、細菌性バイオフィルムの古典的な例である。歯の表面は、人体では唯一の、硬く、永続的な、脱落しない表面であるので、特有の微生物生息環境である。このことは、上皮細胞の脱落がバイオフィルムの発達を制限する粘膜表面とは対照的に、長期間にわたる実質的な細菌性バイオフィルムの付着を可能にする。したがって、浮遊状態とバイオフィルム状態との間に生じるポルフィロモナス・ジンジバリスのプロテオームに対する変化は、慢性の歯周病の進行についての理解にとって重要である。
【０００４】
ポルフィロモナス・ジンジバリスは、動物病変モデルにおいて浸潤性であると説明されているＷ５０及びＷ８３を含む菌株と、一方で、非浸潤性であると説明されている３８１及びＡＴＣＣ３３２７７を含む菌株とを有する２つの広い菌株群に分類されている（４、５）。Griffen et al.（６）は、Ｗ８３／Ｗ５０様菌株が、３８１様菌株を含む他のポルフィロモナス・ジンジバリス株よりも、ヒトの歯周病との関連性が高いことを見出したが、その一方でCutler et al.（７）は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの浸潤性菌株は非浸潤性菌株よりも貪食に対して抵抗性が高いことを実証した。配列決定したポルフィロモナス・ジンジバリスＷ８３株と、基準株ＡＴＣＣ３３２７７との比較は、３３２７７株では遺伝子の７％が存在しないか、又は高度に異なっていることを示し、菌株間にかなりの差異が存在することを示した（８）。興味深いことに、ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０株は、容易にバイオフィルムを形成する３３２７７株と比較して、ほとんどの環境下でわずかにしかバイオフィルムを形成しない（９）。この結果として、ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０によるバイオフィルムの形成について行われた研究の数は比較的少ない。
【０００５】
定量的なプロテオーム研究が、ゲル染色強度に基づきタンパク質の比を算出する二次元ゲル電気泳動アプローチを使用して、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、大腸菌及びストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）等の、浮遊状態からバイオフィルム状態への、ヒトの細菌性病原体のプロテオームの変化を決定するために採用されている（１０〜１２）。代替手段は、ＭＳ定量法と共に、ＩＣＡＴ、ｉＴＲＡＱ又は重水（Ｈ２１８Ｏ）等の安定な同位体で標識化する技法を使用することである（１３）。Ｈ２１８Ｏ標識化の基礎は、タンパク質の加水分解時に、トリプシン等のエンドペプチダーゼが、得られたペプチドのＣ末端に２個の１８Ｏ原子を組み込むことが実証されていることである（１４、１５）。タンパク質の相対存在量の決定における使用（１６〜１９）に加えて、プロテオミクスにおいて１８Ｏ標識化は、タンパク質のＣ末端の同定、グリカンの酵素的除去後のＮ結合型付加糖鎖の同定、ＭＳ／ＭＳのデータ解釈の単純化のためにも、より最近ではリン酸化部位の確認のためにも、使用されている（２０〜２３）。タンパク質の相対存在量を測定するための１６Ｏ／１８Ｏタンパク質分解標識化法は、一方の試料をＨ２１６Ｏ中で、他方の試料をＨ２１８Ｏ中で、消化することを含む。消化物はその後、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳによる分析の前に組み合わされる。ＬＣカラムから溶出するペプチドは、ＭＳモードにおいてペプチドイオン対の相対シグナル強度を測定することにより、定量することができる。トリプシンにより消化されたペプチドのＣ末端への２個の１８Ｏ原子の組込みは、同位体の対の同定を可能にする＋４ｍ／ｚの質量シフトをもたらす。
【０００６】
プロテオームの複雑性のために、予備分画工程が、ペプチド及びタンパク質の同定数を増大させるために有利である。ほとんどの予備分画工程は、溶液内消化後のペプチドレベルでの二次元ＬＣアプローチを含む（２４、２５）。しかし、タンパク質溶液の初期脱水工程時に試料が減少する可能性があるため、タンパク質レベルでのＳＤＳ  ＰＡＧＥ予備分画と、その後のゲル内消化時の１６Ｏ／１８Ｏ標識化とがうまく実施されている（２６〜２９）。１６Ｏ／１８Ｏタンパク質分解標識化は高度に特異的且つ多用途の方法論であるが、大規模な確認研究の実施数は少ない（３０）。優れた確認研究がQian et al（１８）により実施されたが、彼らは、２つの同様の一定分量の血清タンパク質を１：１の比で標識化し、８９１種類のペプチドから１．０２±０．２３の平均比を得た。Lane et al（２６）によるより最近の研究は、逆標識化戦略を使用して、ヒト腫瘍を移植した、対照マウスとチトクロムＰ４５０誘導因子で処理したマウスとの間における１７種類のチトクロムＰ４５０タンパク質の相対存在量を決定し、１６Ｏ／１８Ｏ法の実行可能性をさらに実証した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０が連続培養で増殖し、長期間にわたりケモスタット容器中の垂直の表面上で成熟バイオフィルムが発達する系を使用した。最終的なバイオフィルムは、疾患進行の条件下で見られるバイオフィルムと類似しており、したがってバイオフィルム細胞と浮遊細胞との間の直接的な比較を可能にする。逆標識化戦略を使用する１６Ｏ／１８Ｏタンパク質分解標識化を、ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞外被画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの予備分画と、その後の、同定及び定量のためのオフラインＬＣ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳとの結合の後に実施した。同定した１１６種類のタンパク質のうち、８１種類は２つの独立の連続培養研究において一貫して見出された。様々な機能を有する４７種類のタンパク質のバイオフィルム細胞中の存在量が一貫して増大又は減少することが見出され、バイオフィルム制御戦略のための潜在的な標的をもたらした。これらの４７種類のタンパク質のうち、本発明者らは、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染症の治療及び／又は予防における標的として特に有用と考える２４種類のタンパク質を選択した。これらを下記の表４内に列挙している。
【０００８】
したがって本発明は、細菌によるバイオフィルム形成を調節する単離、精製又は組換え細菌性ポリペプチドを提供する。好ましくは、細菌は嫌気性である。一実施形態では細菌は、ポルフィロモナス属の細菌のように、フマル酸レダクターゼ（Ｆｒｄ）依存性である。好ましい細菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリスである。
【０００９】
ポルフィロモナス・ジンジバリスに関する本発明によるポリペプチドは、表４に列挙した配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を有する。本発明は、これらと少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列に及ぶ。
【００１０】
本発明の別の態様は、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染症に関して被験体を予防又は治療する方法であって、バイオフィルム形成、特に細菌性バイオフィルム形成から生じる又はこれと関連するポルフィロモナス・ジンジバリス感染を調節するポリペプチドの阻害剤を含む医薬組成物を該被験体に投与することを含む、方法である。歯周病に関して被験体を予防又は治療する方法であって、バイオフィルム形成、特に細菌性バイオフィルム形成から生じる又はこれと関連する歯周病を調節するポリペプチドの阻害剤を含む医薬組成物を該被験体に投与することを含む、方法も提供される。典型的にはポリペプチドは、ポリペプチドの活性の抑制がバイオフィルムの形成及び／又は発達を低減又は抑制するという意味で、バイオフィルム発達のために重要又は必要である。
【００１１】
歯周病を予防又は治療するための薬物の製造における、バイオフィルム形成を調節するポリペプチドの阻害剤の使用も提供される。
【００１２】
本発明の別の態様は、歯周病の予防又は治療に有用な組成物であって、本発明の第１の態様のポリペプチドのアンタゴニスト又はアンタゴニストの組合せ等の阻害剤を含む、組成物である。典型的には、組成物は、薬学的に許容される担体も含む。組成物は、アンタゴニスト（複数可）が感染症を抑制するように投与される。
【００１３】
任意に、組成物は、グラム陰性嫌気性細菌に対して毒性を有する、又はその増殖を抑制する１つ又は複数の抗生物質をさらに含み得る。任意の静菌性又は殺菌性の抗生物質を、本発明の組成物に使用することができる可能性がある。好ましくは、適切な抗生物質は、アモキシシリン、ドキシサイクリン又はメトロニダゾールを含む。
【００１４】
本発明の別の態様は、口腔における使用のための、歯周病又はポルフィロモナス・ジンジバリス感染症の予防、抑制又は治療に有用な組成物である。
【００１５】
本発明の別の態様は、口腔において使用する場合の、歯周病又はポルフィロモナス・ジンジバリス感染症の予防、抑制又は治療に有用な組成物である。
【００１６】
経口組成物が、歯上に若しくは歯肉上に、又はその両方に、沈着し得る。
【００１７】
ポリペプチドは酵素であり得る。好ましくは酵素は、有機酸代謝、より好ましくはグルタミン酸／アスパラギン酸異化に関与する。一実施形態では、ポリペプチドはフマル酸レダクターゼである。
【００１８】
本発明の別の態様は、バイオフィルムの形成又は発達を調節するポリペプチドの阻害剤を活性成分として含む、ポルフィロモナス・ジンジバリス感染症の治療のための組成物である。
【００１９】
本発明の別の態様では、各鎖中に少なくとも１９塩基対の二本鎖領域を含む干渉ＲＮＡ分子であって、二本鎖領域の鎖の一方が上述のようにバイオフィルム形成を調節するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの領域と実質的に相補的である、干渉ＲＮＡ分子が提供される。一実施形態では、鎖の一方が、表４に列挙した配列のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの領域と相補的である。
【００２０】
一実施形態では阻害剤は、ポリペプチドのアンタゴニストである。ポルフィロモナス・ジンジバリスに関しては、ポリペプチドはフマル酸レダクターゼであってもよく、そのアンタゴニストはフマル酸レダクターゼの阻害剤の１つ又は複数から選択される。付加的な適切な阻害剤は、デクルシン（decursin）、ベルチシピロン（verticipyrone）、パシラミノール（paecilaminol）、ストレプトマイセス種由来の５−アルケニル−３，３（２Ｈ）−フラノン、ナフレジン（nafuredin）、メサコン酸、ロテノンを含むがこれらに限定されない天然生成物、並びにこれらの天然、半合成及び合成の類似体を含む。別の態様では、本発明の阻害剤は、２−置換４，６−ジニトロフェノール；メルカプトピリジン  Ｎ−オキシド；Ｌ−０９２２０１（Merck Sharpe and Dohme）；フェクスインダゾール（fexindazole）、メガゾール（megazol）、ベンズニダゾール（benznidazole）、ＭＫ−４３６、Ｌ−６３４５４９、ミソニダゾール等のニトロ−イミダゾール；又はアルベンダゾール、カンベンダゾール、メベンダゾール、オキシフェンダゾール、パルベンダゾール（parebendazole）及びチアベンダゾール等のベンズイミダゾール；又はオキサンテル若しくはモランテルを含むがこれらに限定されない合成化合物であり得る。好ましい阻害剤は、オキサンテル、モランテル又はチアベンダゾールである。特に好ましい阻害剤は、オキサンテルである。
【００２１】
阻害剤の選択は、該阻害剤が或る臨床設定における使用にとって適当であるか否かを決定する多数の臨床的な因子に依存することを、当業者は理解するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】特定のＢＳＡ比の１６Ｏ／１８Ｏ定量を示す図である。既知量のＢＳＡの定量を、バイオフィルム試料及び浮遊試料に関して、実験手順において報告したのと同じ方法で実施し、方法論をバリデーションした。簡潔には、所定量のＢＳＡをＮｕＰＡＧＥゲルの隣接レーンにロードし、その後、等サイズのバンドの切り出しと、通常の又は逆のタンパク質分解標識化と、ナノＨＰＬＣと、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳとを行った。（Ａ）１６Ｏ及び１８Ｏで標識化したペプチドに関する特徴的なダブレット同位体エンベロープを示す、既知の１６Ｏ：１８Ｏ標識化比（１：１（ｉ）、２：１（ｉｉ）、１：５（ｉｉｉ）及び１０：１（ｉｖ））でのＢＳＡトリプシンペプチドＲＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲのＭＳスペクトル（Ｓ０、Ｓ２及びＳ４は、同位体ピークの測定強度である）。（Ｂ）定量手順のために使用した既知のＢＳＡ比のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル。
【図２】ポルフィロモナス・ジンジバリス試料から得た、典型的な、順方向及び逆方向のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。（ｉ、ｉｉ）通常の及び逆の標識化を行ったＰＧ２０８２に属するペプチドＧＮＬＱＡＬＶＧＲの［Ｍ＋Ｈ］＋親前駆体イオンを示し、且つ１：１比で典型的な４Ｄａの質量差を示す、マススペクトルの拡大部分。（ｉｉｉ、ｉｖ）通常の及び逆の標識化を行ったＰＧ０２３２に属するペプチドＹＮＡＮＮＶＤＬＮＲの［Ｍ＋Ｈ］＋親前駆体イオンを示し、且つ２：１比で典型的な４Ｄａの質量差を示す、マススペクトル。（ｖ、ｖｉ）全Ｙイオンの４Ｄａシフトを特徴とする、重標識化（＋２  １８Ｏ）ＹＮＡＮＮＶＤＬＮＲペプチド及び非標識化ＹＮＡＮＮＶＤＬＮＲペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトル。
【図３】通常の／逆の標識化を行った技術的反復測定結果の相関を示す図である。両方の生物学的反復測定結果について、通常の（バイオ１８、浮遊１６）及び逆の（浮遊１８、バイオ１６）標識化のペプチド存在量の比の、底を１０として対数変換した散布図比較。逆標識化ペプチドの存在量比は、直接の比較に関しては逆数をとった。（Ａ）生物学的反復測定結果１。（Ｂ）生物学的反復測定結果２。
【図４】生物学的反復測定結果のタンパク質存在量の分布及び相関を示す図である。（Ａ）両方の生物学的反復測定において同定した８１種類の定量化可能なタンパク質に関する正規化した平均フォールド変化は、ガウス様分布を示した。各タンパク質の存在量比を、０に対してさらに正規化し（Ｒ−１）、１より小さい比は逆数をとり（１−（１／Ｒ））として算出した（１８）。各生物学的反復測定から得られた８１種類の定量化可能なタンパク質の全てを、比（バイオフィルム／浮遊）の増大により選別し、等数のタンパク質を有する６つの群（Ａ−Ｆ）に等しく分割した。Ｃ群及びＤ群は、有意に調節されない（１．０から３ＳＤ未満）タンパク質を表す。（Ｂ）順位付けに基づくタンパク質の分布。挿入表：両方の生物学的反復測定結果の間の類似性の決定のための順位付け表。タンパク質を、両方の生物学的反復測定結果が同じ群内に入る場合には１が最も高い類似性を有するものとして、また６が最も低い類似性を有するものとして、降順に順位付けした。
【図５】一方又は両方の生物学的反復測定結果での同定に基づき本研究で同定した１１６種類のタンパク質の分解（Breakdown）と、同定した特有のペプチドの数とを示す図である。両方の生物学的反復測定から同定したタンパク質（８１種類）を、表２に示す。説明書きは、タンパク質１種類当たりの同定した特有のペプチドの数を示す。
【図６】ポルフィロモナス・ジンジバリスにおけるグルタミン酸及びアスパラギン酸発酵に関する異化経路を示す図である。各工程を触媒する同定した酵素は、表３に示すそのＴＩＧＲアクセッション番号により表される。下線を付したアクセッション番号は、別のプロテオーム解析では検出されたがＩＣＡＴ研究では検出されなかった酵素を示す。
【図７】ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（Ａ）及びＡＴＣＣ３３２７７（Ｂ）の５０時間にわたる細胞増殖に対するオキサンテルの効果を示す図である。使用した濃度は、１５．６２５μＭ〜１０００μＭであった。使用した陰性対照は、４μＬのＤＭＳＯであった。ポルフィロモナス・ジンジバリス（P.ginvigalis）のＭＩＣ及びＭＧＴは、表７及び表８に示したようなものであった。結果は、異なる日に実施した２つの生物学的反復測定の平均を示す（ｎ＝１０）。
【００２３】
【化１】
0005476297.tif 000002
【図８】ポルフィロモナス・ジンジバリスの５０時間にわたる細胞増殖に対するモランテルの効果を示す図である。使用した濃度は、１５．６２５μＭ〜１０００μＭであった。使用した陰性対照は、４μＬのＤＭＳＯであった。ポルフィロモナス・ジンジバリスのＭＩＣ及びＭＧＴは、表７に示したようなものであった。
【００２４】
【化２】
0005476297.tif 000003
【図９】ポルフィロモナス・ジンジバリスの５０時間にわたる細胞増殖に対するチアベンダゾールの効果を示す図である。使用した濃度は、３１．２５μＭ〜４０００μＭであった。使用した陰性対照は、４μＬのＤＭＳＯであった。ポルフィロモナス・ジンジバリスのＭＩＣ及びＭＧＴは、表７に示したようなものであった。
【００２５】
【化３】
0005476297.tif 000004
【図１０】ポルフィロモナス・ジンジバリス３３２７７株によるバイオフィルム形成（（Ａ）２４時間時点でのバイオフィルム、（Ｂ）４８時間時点でのバイオフィルム）に対するオキサンテルの効果を示す図である。アッセイの生物学的反復測定を実施し、エラーバーは両方の生物学的反復測定結果（ｎ＝１２）の標準偏差を表す。
【図１１】水のみで処理し、Ｂａｃｌｉｇｈｔで染色した対照ＡＴＣＣ３３２７７のＣＬＳＭ像を示す図である。画像は、２μｍの間隔で得た全ｚ−ｓｔａｃｋの最大の投影像である。スケールバー（白色）＝１０μｍ。
【図１２】１２５μＭのオキサンテルで処理し、Ｂａｃｌｉｇｈｔで染色したＡＴＣＣ３３２７７のＣＬＳＭ像を示す図である。画像は、２μｍの間隔で得た全ｚ−ｓｔａｃｋの最大の投影像である。スケールバー（白色）＝１０μｍ。
【図１３】１２．５μＭのオキサンテルで処理し、Ｂａｃｌｉｇｈｔで染色したＡＴＣＣ３３２７７のＣＬＳＭ像を示す図である。画像は、２μｍの間隔で得た全ｚ−ｓｔａｃｋの最大の投影像である。スケールバー（白色）＝１０μｍ。
【図１４】静的２４ウェルアッセイに基づく、オキサンテル処理後のポルフィロモナス・ジンジバリスのコロニー形成単位を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
プロテオーム戦略を使用して、本発明者らは、１１６種類のポルフィロモナス・ジンジバリス細胞外被タンパク質の、バイオフィルム状態と浮遊状態との間の存在量の変化をうまく同定及び定量し、大部分のタンパク質が複数のペプチドヒットにより同定された。本発明者らは、ＲｇｐＡ、ＨａｇＡ、ＣＰＧ７０及びＰＧ９９を含む、細胞表面に位置するＣ末端ドメインファミリータンパク質の大群の発現の増強を実証した。存在量の有意な変化を示す他のタンパク質は、輸送関連タンパク質（ＨｍｕＹ及びＩｈｔＢ）と、代謝酵素（ＦｒｄＡ及びＦｒｄＢ）と、免疫原性タンパク質と、今のところ機能が未知の多数のタンパク質とを含んでいた。
【００２７】
したがって、本発明は、表４に列挙したアクセッション番号に対応する配列と、それらと少なくとも９５％の同一性を有する配列とから成る群から選択されるアミノ酸配列を有する、ポルフィロモナス・ジンジバリスの単離ポリペプチドを提供する。
【００２８】
好ましくは、単離ポリペプチドは、表４に列挙したアクセッション番号に対応する配列のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する。
【００２９】
「ペプチド、タンパク質及びポリペプチド」という用語は、本明細書では交換可能な用語として使用される。本発明のポリペプチドは、融合ポリペプチド等の組換えポリペプチドを含み得る。融合ポリペプチドを作製する方法は、当業者に既知である。
【００３０】
当業者には十分に理解されるように、表４に列挙したアクセッション番号に対応するアミノ酸配列に対して変更が行われ得る。これらの変更は、アミノ酸残基の欠失、挿入又は置換であり得る。変更されたポリペプチドは、天然（すなわち、天然の供給源から精製若しくは単離した）又は合成（例えば、コードするＤＮＡに対する部位特異的な突然変異誘発による）のいずれかであり得る。表４に列挙したアクセッション番号に対応する配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するこのような変更されたポリペプチドは、本発明の範囲内であることが意図される。これらの変更されたポリペプチドに対して産生される抗体も、表４に列挙したアクセッション番号に対応する配列の１つを有するポリペプチドと結合する。
【００３１】
保存的置換の概念は当業者により十分に理解されるが、明確化のために、保存的置換は以下のように記述される：
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ；
Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；及び
Ｐｒｏ、Ｎα−アルキル（alkal）アミノ酸。
【００３２】
本発明の実施は、他に特に指示がなければ、当業者に既知の化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の従来の技法を使用する。このような技法は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons （1984） 、J. Sambrook et Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press （1989） 、T. A. Brown （editor）, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press （1991）、D. M. Glover and B. D. Hames （editors）, DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press （1995 and 1996） 及びF. M. Ausubel et al. （Editors）, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience （1988、現在までの全ての更新情報を含む） のような出典の文献全体に記載及び説明されている。これらのテキストの開示は、参照により本明細書中で援用される。
【００３３】
「単離ポリペプチド」とは、本明細書中で使用する場合、それが天然に生じるか、又はそれを使用してポリペプチド若しくはペプチドが合成的に合成され得る他のタンパク質、脂質及び核酸から分離されたポリペプチドを表す。好ましくはポリペプチドは、それを精製するために使用される物質（例えば抗体又はゲルマトリックス（例えばポリアクリルアミド））からも分離される。好ましくはポリペプチドは、精製した調製物の乾燥重量の少なくとも１０％、２０％、５０％、７０％及び８０％を構成する。好ましくは調製物は、タンパク質シーケンシングを可能にするのに十分な量（即ち、少なくとも１ｍｇ、１０ｍｇ又は１００ｍｇ）のポリペプチドを含有する。
【００３４】
本明細書中に記載される単離ポリペプチドは、標準技法、例えばカラムクロマトグラフィ（タンパク質生成物と相互作用する様々なマトリクス、例えばイオン交換マトリクス、疎水性マトリクス等を使用する）、アフィニティークロマトグラフィ（タンパク質又はタンパク質と結合する他のリガンドに特異的な抗体を利用する）により精製され得る。
【００３５】
「連続アミノ酸配列」は、本明細書中で使用する場合、アミノ酸の連続するストレッチを表す。
【００３６】
「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術の使用を含むプロセスにより産生されるポリペプチドである。
【００３７】
２つのアミノ酸配列が特定の百分率限界内に入るか否かを決定する際には、当業者は、配列を並べて比較すること、又は配列の多重アラインメントを実行することが必要であることに気づくだろう。このような比較又はアラインメントでは、アラインメントを実施するために使用するアルゴリズムによって、非同一残基の位置決めにおいて差異が生じる。本発明との関連では、２つ以上のアミノ酸配列間の同一性又は類似性の百分率への言及は、当業者に既知の任意の標準アルゴリズムを使用して決定されるような上記配列間のそれぞれ同一及び類似の残基の数を表すと解釈される。例えばアミノ酸配列の同一性又は類似性は、ＧＡＰプログラムを使用して算出することができ、及び／又はComputer Genetics Group, Inc., University Research Park, Madison, Wisconsin, United States of America （Devereaux et al et al., 1984）のＰＩＬＥＵＰプログラムを使用して整列させることができる。ＧＡＰプログラムは、Needleman and Wunsch（1970）のアルゴリズムを利用して同一／類似の残基の数を最大化し、アラインメント中の配列ギャップの数及び長さを最小化する。代替的に又は付加的に、２つより多いアミノ酸配列が比較される場合、Thompson et al, （1994）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムが使用される。
【００３８】
本発明の一態様は、歯周病に関して被験体を予防又は治療する方法であって、本発明による医薬組成物を該被験体に投与することを含む、方法である。
【００３９】
一方法では被験体は、歯周病に関する予防的治療を含む治療を受ける。歯周病は、単純な歯肉の炎症から、歯を支持する軟組織及び骨に大きな損傷を引き起こす重度の疾患までに及ぶ。歯周病は、歯肉炎（gingivitis）及び歯周炎（periodontitis）を含む。ポルフィロモナス・ジンジバリス等の細菌は、「歯肉炎」と呼ばれる歯肉の炎症を引き起こす。歯肉炎では、歯肉が赤くなり、膨潤し、容易に出血する可能性がある。歯肉炎を治療しないと、「歯周炎」（「歯の周囲の炎症」を意味する）に進行する可能性がある。歯周炎では、歯肉が歯から離れ、感染の対象となる「ポケット」を形成する。歯垢が歯肉線の下に広がり成長するにつれて、身体の免疫系は細菌と戦う。治療しないと、歯を支持する骨、歯肉及び結合組織が破壊される。歯は最終的に緩くなり、抜かなければならない場合がある。
【００４０】
本発明は、歯周病の予防又は治療に有用な組成物であって、免疫原として有効量の少なくとも１つの本発明の第１の態様のポルフィロモナス・ジンジバリスのポリペプチドのアンタゴニストと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物も提供し、該アンタゴニストはポルフィロモナス・ジンジバリス感染症を抑制する。
【００４１】
上で言及した医薬組成物を含有する本発明の経口組成物は、歯磨きペースト、歯磨き粉及び液体歯磨き剤（liquid dentifrices）、洗口剤、トローチ、チューインガム、歯科用ペースト、歯肉用マッサージクリーム、うがい用錠剤、乳製品、並びに他の食料品を含む歯磨き剤等の口に適用可能な様々な形態で調製及び使用され得る。本発明による経口組成物は、特定の経口組成物の種類及び形態に応じて、付加的な既知の成分をさらに含み得る。
【００４２】
本発明の或る特定の好ましい形態では、経口組成物は、洗口剤又はリンス剤のように、その特徴として実質的に液体であり得る。このような調製物中では、ビヒクル（vehicle）は典型的には水−アルコール混合物であり、望ましくは以下で説明する保湿剤を含む。概して、水対アルコールの重量比は、約１：１から約２０：１までの範囲である。この種類の調製物中における水−アルコール混合物の総量は、典型的には調製物の約７０重量％〜約９９．９重量％の範囲である。アルコールは典型的にはエタノール又はイソプロパノールである。エタノールが好ましい。
【００４３】
本発明のこのような液体及び他の調製物のｐＨは、概して約５〜約９の、典型的には約５．０〜７．０の範囲である。ｐＨは、酸（例えばクエン酸若しくは安息香酸）若しくは塩基（例えば水酸化ナトリウム）で制御され得るか、又は（クエン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、炭酸ナトリウム若しくは重炭酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等で）緩衝され得る。
【００４４】
本発明の他の望ましい形態では、医薬組成物は、歯磨き粉、歯科用錠剤若しくは歯磨きペースト（歯科用クリーム）又はゲル歯磨き剤のように、その特徴として実質的に固体又はペースト状であり得る。このような固体又はペースト状の経口調製物のビヒクルは、概して歯科用に許容される研磨材料を含有する。
【００４５】
歯磨きペーストでは、液体ビヒクルは、典型的には調製物の約１０重量％〜約８０重量％の範囲の量で、水及び保湿剤を含み得る。グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール及びポリプロピレングリコールは、適切な保湿剤／担体の範例である。水、グリセリン及びソルビトールの液体混合物も有利である。屈折率が重要な検討事項である透明なゲルでは、約２．５重量％〜３０重量％の水と、０重量％〜約７０重量％のグリセリンと、約２０重量％〜８０重量％のソルビトールとが、好ましくは利用される。
【００４６】
歯磨きペースト、クリーム及びゲルは典型的には、天然の又は合成の濃厚剤又はゲル化剤を、約０．１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．５重量％〜約５重量％の割合で含有する。適切な濃厚剤は、合成ヘクトライト（hectorite）、例えばLaporte Industries Limitedにより市販されているＬａｐｏｎｉｔｅ（例えばＣＰ、ＳＰ２００２、Ｄ）として入手可能な、合成コロイド性ケイ酸マグネシウムアルカリ金属錯体粘土である。Ｌａｐｏｎｉｔｅ  Ｄは、およそ５８．００重量％のＳｉＯ２と、２５．４０重量％のＭｇＯと、３．０５重量％のＮａ２Ｏと、０．９８重量％のＬｉ２Ｏと、幾らかの水と、微量金属とである。その真の比重は２．５３であり、水分８％で１．０ｇ／ｍｌの見かけの容積密度（bulk density）を有する。
【００４７】
他の適切な濃厚剤は、アイリッシュ・モス、イオタカラギーナン、トラガカント・ゴム、デンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルプロピルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース（例えば、Ｎａｔｒｏｓｏｌとして入手可能）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び微粉砕Ｓｙｌｏｉｄ（例えば２４４）等のコロイド性シリカを含む。プロピレングリコール、ジプロピレングリコール及びヘキシレングリコール等の保湿性ポリオール、メチルセロソルブ及びエチルセロソルブ等のセロソルブ、オリーブ油、ヒマシ油及びワセリン等の直鎖中に少なくとも約１２個の炭素を含有する植物油及びワックス、並びに酢酸アミル、酢酸エチル及び安息香酸ベンジル等のエステル等の可溶化剤も含まれ得る。
【００４８】
従来のように、経口調製物は、適切なラベルを付した包装品で販売されるか、又はその他の方法で配布されるのが通常であることが理解される。したがって、マウスリンスのボトルは、それがマウスリンス又は洗口剤であることを十分に説明し、且つ使用のための指示を有するラベルを有し；歯磨きペースト、クリーム又はゲルは、押し出しチューブ（典型的にはアルミニウムの、鉛ライニングを付した、若しくはプラスチックの）、又は内容物を量り取るための他のスクイーズ容器、ポンプ若しくは加圧ディスペンサに入っており、それが歯磨きペースト、ゲル又は歯科用クリームであることを十分に説明するラベルを有することが通常である。
【００４９】
有機界面活性剤は、予防的作用の増大を達成し、口腔全体にわたる活性作用物質の徹底的且つ完全な分散を達成する際に助けとなり、本発明の組成物をより化粧品として許容されるものとするために、本発明の組成物中で使用され得る。有機界面活性材料は好ましくは本来的に陰イオン性、非イオン性又は両性であり、好ましくは活性作用物質と相互作用しない。組成物に洗浄特性及び発泡特性を付与する洗浄材料を、界面活性剤として利用することが好ましい。陰イオン性界面活性剤の適切な例は、硬化ココナッツ油脂肪酸のモノ硫酸化モノグリセリドのナトリウム塩等の高級脂肪酸モノグリセリドモノ硫酸塩の水溶性塩、ラウリル硫酸ナトリウム等の高級アルキル硫酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等のアルキルアリールスルホン酸塩、高級アルキルスルホ酢酸塩、１，２−ジヒドロキシプロパンスルホン酸塩の高級脂肪酸エステル、及び脂肪酸、アルキル基又はアシル基等に１２個〜１６個の炭素を有するもののような低級脂肪族アミノカルボン酸化合物の実質的に飽和した高級脂肪族アシルアミドである。最後に言及したアミドの例は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、並びにセッケン又は類似の高級脂肪酸材料を実質的に含まないＮ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン又はＮ−パルミトイルサルコシンのナトリウム、カリウム及びエタノールアミン塩である。本発明の経口組成物におけるこれらのサルコナイト（sarconite）化合物の使用は、これらの材料は酸溶液中の歯のエナメル質の溶解性の幾らかの低減を発揮するのに加えて炭水化物の分解による口腔における酸形成の抑制における顕著な効果の延長を示すので、特に有利である。使用に適切な水溶性非イオン性界面活性剤の例は、疎水性長鎖（例えば、炭素原子数約１２〜２０の脂肪族鎖）を有する、エチレンオキシドと、それと反応性を有する様々な反応性水素含有化合物との縮合生成物であり、該縮合生成物（「エトキサマー（ethoxamers）」）は、ポリ（エチレンオキシド）と、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、多価アルコール（例えばモノステアリン酸ソルビタン）及びポリプロピレンオキシド（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ材料）との縮合生成物等の、親水性のポリオキシエチレン部分を含有する。
【００５０】
界面活性剤は、典型的には約０．１重量％〜５重量％の量で存在する。界面活性剤が、本発明の活性作用物質を溶解する際に助けとなり得ること、及びそれにより可溶化保湿剤の必要量を減少することは、注目に値する。
【００５１】
白色化剤、保存料、シリコン、クロロフィル化合物、及び／又は尿素、リン酸二アンモニウム等のアンモニア化物質、並びにこれらの混合物等の様々な他の材料が、本発明の経口調製物中に組み込まれ得る。これらの補助剤は、存在する場合には所望の特性及び特徴にほとんど悪影響を及ぼさない量で、調製物中に組み込まれる。
【００５２】
任意の適切な香味材料又は甘味材料も利用され得る。適切な香味構成要素の例は、香味油（例えば、スペアミント油、ペパーミント油、ウインターグリーン油、ササフラス油、クローブ油、セージ油、ユーカリ油、マジョラム油、シナモン油、レモン油及びオレンジ油）、並びにサリチル酸メチルである。適切な甘味料は、スクロース、ラクトース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、シクラミン酸ナトリウム、ペリラルチン（perillartine）、ＡＭＰ（アスパルチルフェニルアラニン、メチルエステル）、サッカリン等を含む。適切には、香料及び甘味料は、各々又は共に、調製物の約０．１％〜５％以上（more）含み得る。
【００５３】
本発明の組成物は、ロゼンジ中に、又はチューインガム若しくは他の製品中に、例えば、加温したガム基剤中に撹拌すること、又はガム基剤の外表面にコーティングすることにより、組み込むこともでき、ここでこれらの基剤は例示的に、従来の可塑剤又は軟化剤、砂糖又は他の甘味料すなわち例えばグルコース、ソルビトール等を有することが望ましい、ジェルトン、ゴムラテックス、ビニライト樹脂等である。
【００５４】
さらなる一態様では、本発明は、（ａ）ポリペプチド阻害剤の組成物と、（ｂ）薬学的に許容される担体とを含む、部分のキットを提供する。望ましくは該キットは、このような治療を必要としている患者におけるバイオフィルム形成を抑制するためのその使用のための取扱説明書をさらに含む。
【００５５】
経口使用を意図する組成物は、医薬組成物の製造のための当該技術分野で既知の任意の方法に従い調製することができ、このような組成物は、薬学的に洗練され且つ風味の良い調製物を提供するために、甘味料、香料、着色料及び保存料から成る群から選択される１つ又は複数の作用物質を含有し得る。錠剤は、錠剤の製造に適した毒性を有しない薬学的に許容される賦形剤を有する混合物中に、活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム等）、造粒剤及び崩壊剤（例えば、コーンスターチ又はアルギン酸）、結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン又はアカシア）並びに滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルク）であり得る。錠剤はコーティングされていなくてもよく、又は胃腸管における崩壊及び吸収を遅延させることにより長期間にわたり持続的な作用をもたらすために既知の技法によりコーティングされていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリン又はジステアリン酸グリセリン等の時間遅延材料が、利用され得る。
【００５６】
経口使用のための処方物は、不活性な固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリン）と共に活性成分が混合されるハードゼラチンカプセルとして、又は水若しくは油媒体（例えばピーナッツ油、液体パラフィン若しくはオリーブ油）と共に活性成分が混合されるソフトゼラチンカプセルとして、提供することもできる。
【００５７】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤を有する混合物中に活性材料を含有する。このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ハイドロプロピル（hydropropyl）メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカント・ゴム及びアカシア・ゴムであり、分散剤又は湿潤剤は天然のリン脂質、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール（hexitol）から得られる部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から得られる部分エステルとの縮合生成物、例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンであり得る。
【００５８】
水性懸濁液は、また、１つ又は複数の保存料（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル若しくはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル等の安息香酸塩）と、１つ又は複数の着色料と、１つ又は複数の香料と、１つ又は複数の甘味料（例えばスクロース又はサッカリン）とを含有し得る。
【００５９】
油性懸濁液は、植物油（例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油若しくはココナッツ油）中に、又は鉱物油（例えば液体パラフィン）中に活性成分を懸濁することにより処方され得る。油性懸濁液は、濃厚剤（例えば蜜ろう、固形パラフィン又はセチルアルコール）を含有し得る。上述したもののような甘味料と、香料とが、風味の良い経口調製物を提供するために添加され得る。これらの組成物は、アスコルビン酸等の酸化予防剤の添加により保存され得る。
【００６０】
バイオフィルム状態としての増殖と浮遊状態としての増殖との間のポルフィロモナス・ジンジバリスのタンパク質の存在量の比較は、この病原性細菌のプロテオームに対する多くの変化、特にグルタミン酸／アスパラギン酸異化に必須のフマル酸レダクターゼ酵素の存在量の低下を明らかにした。ヘム制限及びヘム過剰のポルフィロモナス・ジンジバリスのプロテオーム変化を比較することを含む別々の研究において、酢酸産生の増大をもたらし、且つポルフィロモナス・ジンジバリスの主要な異化経路の酵素の存在量の協調的な変化と一致するヘム制限時の発酵パターンにおける観察可能なシフトが存在した。ヘム制限及びバイオフィルム増殖時のフマル酸レダクターゼ酵素の存在量の一貫した低下には、特に関心が持たれる。本発明者らはその後、ポルフィロモナス・ジンジバリスの生存に対する３種類のＦｒｄ阻害剤（オキサンテル、モランテル及びチアベンダゾール）の有用性と、バイオフィルムの正常な発達を妨げる最小抑制濃度以下の濃度（ｓｕｂＭＩＣ）とを実証した。
【００６１】
本明細書中で使用する場合、「アンタゴニスト」という用語は、対象のポリペプチドの生物学的活性を抑制する核酸、ペプチド、抗体、リガンド又は他の化学的実体を表す。特定のタンパク質の適切なアンタゴニストを試験及び選択する技法は当業者に既知であり、このような技法は結合アッセイを含み得る。
【００６２】
本発明の抗体及びアンタゴニストは多数の用途を有し、例えば、それらは、歯垢の抑制と齲歯及び歯周病に関連する病原体の抑制とのための口腔ケア製品（練り歯磨き及び洗口液）における抗菌保存料として使用することができる。本発明の抗体及びアンタゴニストは、薬学的調製物（例えば、局所用及び全身用抗感染薬）にも使用され得る。
【００６３】
本発明は、本発明の第１の態様のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子に対して標的とされる干渉ＲＮＡ分子も提供する。したがって本発明の第７の態様では、各鎖中に少なくとも１９塩基対の二本鎖領域を含む干渉ＲＮＡ分子であって、二本鎖領域の鎖の一方が本発明の第１の態様のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子の領域と相補的であり、又は通常の細胞内条件下で該領域とハイブリダイズすることが可能である、干渉ＲＮＡ分子が提供される。
【００６４】
いわゆるＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉは既知であり、ＲＮＡｉに関するさらなる情報は、Hannon （2002） Nature 418: 244-251及びMcManus & Sharp （2002） Nature Reviews: Genetics 3（10）: 737-747（これらの開示は参照により本明細書中で援用される）に提供されている。
【００６５】
本発明は、ｓｉＲＮＡの安定性を増強し、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの使用を支持するｓｉＲＮＡの化学的修飾（複数可）も意図する（例えばShen et al. （2006）Gene Therapy 13: 225-234を参照されたい）。これらの修飾は、センス鎖オリゴヌクレオチドの５’末端及び３’末端での逆方向脱塩基部分と、アンチセンス鎖の３’末端での最後の２つのヌクレオチド間の単一ホスホルチオエート（phosphorthioate）結合を含み得る。
【００６６】
干渉ＲＮＡの二本鎖領域は、二本鎖領域の各鎖中に少なくとも２０塩基対、好ましくは少なくとも２５塩基対、最も好ましくは少なくとも３０塩基対を含むことが好ましい。本発明は、歯周病に関する被験体を治療する方法であって、本発明の干渉ＲＮＡ分子のうち少なくとも１つを被験体に投与することを含む方法も提供する。
【００６７】
本明細書を通じて、「含む（comprise）」という単語、又は「含む（comprises）」若しくは「含む（comprising）」等の変化形は、上述の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を含むが、任意の他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を排除しないことを示唆すると理解される。
【００６８】
本明細書で言及される全ての刊行物が、参照により本明細書に援用される。本明細書に含まれている文書、法令、材料、装置、論文等のいかなる議論も、単に本発明との関連を提示することのみを目的とする。これらの事項のいずれか又は全てが、従来技術の基礎の一部を形成する、又は本出願の各請求項の優先日前にオーストラリア若しくは他の場所に存在する本発明と関連する技術分野における共通の一般的な知識であったと認めるものと解釈すべきではない。
【００６９】
特定の実施形態に示した発明に対して、広く説明される本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、多数の変形形態及び／又は修正形態が作られ得ることが当業者により理解される。本発明の実施形態は、したがって、全ての観点において、例示的なものであって限定的なものではないと考えられるべきである。本発明は、具体的には、本明細書に記載した特徴の全ての組合せを含む。
【００７０】
本発明の性質をより明らかに理解することができるように、ここで、本発明の好ましい態様を以下の組成物の表及び実施例を参照しながらより詳細に説明する。
バイオフィルム対（v）浮遊の研究のためのポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖及び回収
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０（ＡＴＣＣ５３９７８）を、４００ｍＬの作業容積を有するｍｏｄｅｌ  Ｃ−３０  ＢｉｏＦｌｏ  ｃｈｅｍｏｓｔａｔ（New Brunswick Scientific）を使用する連続培養で増殖させた。培養容器及び培地貯蔵槽の両方を、１０％ＣＯ２及び９０％Ｎ２で連続的に通気した。増殖温度は３７℃であり、脳心臓点滴増殖培地（Oxoid）をｐＨ７．５に維持した。全増殖を通じて、酸化還元電位は−３００ｍＶに維持した。希釈率は０．１ｈ−１であり、６．９ｈの平均世代時間（ＭＧＴ）をもたらした。滅菌システイン−ＨＣｌ（０．５ｇ／Ｌ）及びヘミン（５ｍｇ／Ｌ）を添加した。培養は接種後約１０日で定常状態に到達し、バイオフィルムの厚層が容器の垂直面上に発達するまでさらに３０日間維持した。
【００７１】
全ての細菌細胞の操作は、氷上で又は４℃で実施した。回収時に、浮遊細胞を清潔な容器中に静かに移し、バイオフィルムをＰＧＡ緩衝液（５Ｍ  ＮａＯＨにより３７℃でｐＨを７．５に調整した、１０．０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０．０ｍＭ  ＫＣｌ、２．０ｍＭ  クエン酸、１．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５．０ｍＭ  ＺｎＣｌ２、５０．０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５．０ｍＭ  ＣｕＣｌ２、１０．０ｍＭ  ＣｏＣｌ２、５．０ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４、１０ｍＭ  システイン−ＨＣｌ）で穏やかに２回洗浄し、その後５０ｍＬ遠心分離チューブ中にバイオフィルムを回収した。
【００７２】
浮遊細胞及びバイオフィルム細胞を、その後ＰＧＡ緩衝液で３回（７０００ｇ）洗浄し、両試料を最終体積３０ｍＬまで洗浄緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０、プロテイナーゼ阻害剤（Sigma））で再懸濁し、Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ（SLM、AMINCO）を１３８ＭＰａで３回通過させることにより溶解した。溶解した細胞を２０００ｇで３０分間遠心分離し、いずれかの破壊されていない細胞を除去した。上清をさらに１０００００ｇで１時間遠心分離し、溶解した細胞を可溶性画分と不溶性（細胞外被）画分とに分離した。細胞外被画分を、洗浄緩衝液でさらに３回、１０００００ｇで２０分間洗浄し、各々、いずれかの可溶性汚染を除去した。全試料を、その後−８０℃で凍結及び貯蔵した。
ヘム制限及びヘム過剰の研究のためのポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖及び回収
４００ｍＬの作業容積を有するＢｉｏｆｌｏ  １１０  ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ／ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（New Brunswick Scientific）を使用して、ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０を連続培養で増殖させた。増殖培地は、５ｍｇ／ｍＬの濾過滅菌した塩酸システイン、５．０μｇ／ｍＬのヘミン（ヘム過剰）又は０．１μｇ／ｍＬのヘミン（ヘム制限）を添加した３７ｇ／Ｌの脳心臓点滴培地（Oxoid）であった。同一培地（ヘム過剰）中で増殖させたポルフィロモナス・ジンジバリスの２４時間バッチ培養液（１００ｍＬ）を培養容器に接種することにより増殖を開始した。２４時間のバッチ培養増殖後、培地貯蔵槽ポンプを作動させて、培地流を調整して、０．１ｈ−１の希釈率（６．９時間の平均世代時間（ＭＧＴ））をもたらした。容器の温度を３７℃に維持し、ｐＨを７．４±０．１に維持した。９５％Ｎ２中の５％ＣＯ２で、培養液を連続的に通気した。定常状態増殖時に細胞を回収し、５０００ｇで３０分間、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で３回洗浄し、１３８ＭＰａでＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｃｅｌｌ（SLM、AMINCO）を３回通過させることにより破砕した。次に溶解した細胞を２０００ｇで３０分間遠心分離して、破壊されていない細胞を除去し、その後１０００００ｇで超遠心分離して、可溶性（上清）画分及び膜画分を生成した。全ての分画を氷上で実施した。
１８Ｏタンパク質分解標識化バイオフィルム細胞及び浮遊細胞の外被画分の調製及び分析
細胞外被画分を、最初に、２％ＳＤＳを含有する氷冷した洗浄緩衝液１ｍＬ中に再懸濁し、その後ペレットの再懸濁を促すために超音波処理及びボルテックス処理を実施した。再懸濁における最終工程は、粒子の破砕を助けるための２９ゲージのインスリンニードルの使用を含んでいた。混合物をその後４００００ｇで遠心分離して不溶性粒子を除去し、上清のタンパク質濃度を製造業者の取扱説明書に従ってＢＣＡ  ｒｅａｇｅｎｔ（Pierce）を使用して決定した。
【００７３】
再懸濁した試料を、いずれかのタンパク質分解活性を不活性化することをさらに促す−２０℃で、５倍量の氷冷したアセトンを終夜使用して沈殿させた。アセトン沈殿の後、両方の試料を、断続的超音波処理と、ボルテックス処理と、２９ゲージのインスリンニードルの使用とにより支援した２５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）及び１％のＳＤＳで最終濃度３ｍｇ／ｍＬまで再懸濁した。２回目のＢＣＡタンパク質アッセイをその後実施し、最終タンパク質量を標準化した。
【００７４】
ＮｕＰＡＧＥゲル上でのゲル電気泳動を、ＭＯＰｓ  ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（NuPAGE、Invitrogen）を使用して、ＭＯＰｓをランニング緩衝液として用いる１０ウェルの１０％ＮｕＰＡＧＥゲル上にロードする前に試料を９９℃で５分間煮沸した以外は製造業者のプロトコルに従って、実施した。バイオフィルム試料及び浮遊試料（各々３０μｇ）を、ゲル上の隣接レーンにロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、その後、色素の前面がゲルの底部から約１ｃｍになるまで、４℃、１２６Ｖ（定圧）で実施した。生物学的反復測定のために、使用したゲルは、ランニング緩衝液としてＭＯＰｓを使用する４％〜１２％のＮＵＰＡＧＥ勾配ゲルであり、２つの画分に分離されているタンパク質のバンドの変化の可能性を克服するために、類似するが正確ではない分離パターンをもたらした。染色を、クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０（３１）中で終夜実施し、その後、超純水中で終夜脱染した。
【００７５】
２つのゲルレーンを、特注のステンシルを使用して１０個の等サイズのゲルバンドに分割し、各切片を約１ｍｍ３の立方体にカットした。脱染を、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／ＡＣＮ（１：１）溶液中で３回実施した。脱染後、ゲル立方体を１００％ＡＣＮで脱水し、その後ＡＢＣ緩衝液（５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）中の１０ｍＭのジチオスレイトール溶液で５６℃で３０分間、再水和／還元した。過剰の溶液を除去した後、暗所中、室温で６０分間、ＡＢＣ緩衝液中の５５ｍＭのヨードアセトアミドを添加した。アルキル化反応後、ゲル立方体をＡＢＣ緩衝液中で３回洗浄し、その後１００％のＡＣＮ中で１０分間、２回脱水した。ｓｐｅｅｄｖａｃを使用する９０分間の遠心分離下で、ゲル立方体をさらに乾燥した。ゲル切片１個当たり６０μＬの、ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｇｒａｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ（Promega）２μｇと、Ｈ２１６Ｏ又はＨ２１８Ｏ（Ｈ２１８Ｏ、純度＞９７％、Marshall Isotopes）のいずれかにおいて調製された１／２の強度のＡＢＣ緩衝液とを含有する溶液中で、３７℃で２０時間、消化を実施した。消化後、各５分間の超音波処理により、それぞれの水（Ｈ２１６Ｏ／Ｈ２１８Ｏ）における５０％  ＡＣＮ／０．１％  ＴＦＡの溶液と、０．１％  ＴＦＡとを使用して、ゲルからペプチドを２回抽出した。プールした抽出物を、トリプシンを不活性化させるために９９℃で５分間煮沸し、その後４８時間凍結乾燥を行った。
【００７６】
凍結乾燥したペプチドを、ナノＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ分析を使用する分析の直前に、それぞれの水（Ｈ２１６Ｏ／Ｈ２１８Ｏ）中の５％  ＡＣＮ／０．１％  ＴＦＡの溶液中に再懸濁した。ペプチド溶液（２０μＬ）をその後、ＦＡＭＯＳ  ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（LC Packings）をアドバンストμＬピックアップモードで使用してＵｌｔｉｍａｔｅ  Ｎａｎｏ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（LC Packings）上にロードした。試料を最初に、２００μＬ／分で５分間、捕捉カラム（内径３００μｍ×５ｍｍ）上にロードした。分離は、逆相カラム（LC Packings、Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００、内径７５μｍ×１５ｃｍ、３μｍ、１００Å）を使用して３００ｎＬ／分の流量で達成し、０分〜５分（０％）、５分〜１０分（０％〜１６％）、１０分〜９０分（１６％〜８０％）、９０分〜１００分（８０％〜０％）のＡＣＮグラジエントを用いて０．１％ギ酸中で溶出した。
【００７７】
溶出液を、３０秒の間隔で、Ｐｒｏｔｅｉｎｅｅｒ  Ｆｃ  ｒｏｂｏｔ（Bruker Daltonics）を使用して、プレスポット済みａｎｃｈｏｒｃｈｉｐ  ｐｌａｔｅｓ（Bruker Daltonics）上に垂直にスポットした。スポットする前に、各スポット位置に０．２μＬの超純水をプレスポットし、マトリクスでの結晶化プロセス時のアセトニトリル濃度を低減した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ（Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＬＩＦＴ  ＩＩ  ｕｐｇｒａｄｅ、Bruker Daltonics）を使用する自動化分析の前に、プレートを１０ｍＭ  リン酸アンモニウム及び０．１％  ＴＦＡで洗浄し、風乾した。消化物のＭＳ分析を最初にリフレクトロンモードで実施し、２５ｋＶの加速電圧を使用して８００Ｄａから３５００Ｄａまで測定した。全てのＭＳスペクトルを８組の３０のレーザーショットから生成した（各組はシグナル対ノイズ比Ｓ／Ｎが６より大きく、分解能（Resolution）が３０００より大きいことが含まれることを必要とした）。機器の較正を、４つの試料の各群に関して、プレスポットした内部標準（アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩ、ニューロテンシン、レニン基質及びＡＣＴＨクリップ）の［Ｍ＋Ｈ］＋イオンで外部から行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦに関するＬＩＦＴモードを、Ｆｌｅｘｃｏｎｔｒｏｌ及びＷａｒｐＬＣソフトウェア（Bruker Daltonics）を使用して、完全に自動化したモードで実施した。ＴＯＦ１段階では、全イオンを８ｋＶまで加速し、その後ＬＩＦＴ細胞中で１９ｋＶまで上昇させ、全てのＭＳ／ＭＳスペクトルを、蓄積している５５０の連続レーザーショットから生成した。
【００７８】
親前駆体の選択を、ＬＣ  ＭＡＬＤＩ  ＳＩＬＥ（安定同位体標識化実験）のワークフローと共に、ＷａｒｐＬＣソフトウェア（第１．０版）を使用して実施した。４Ｄａで分離された各々の重い対又は軽い対の最も豊富なピークのみが選択され、そのＳ／Ｎは５０より大きかった。６個未満のＬＣ  ＭＡＬＤＩ画分により分離された化合物は同じものとみなされたので、１度しか選択されなかった。
【００７９】
ピークのリストは、Ｓ／Ｎ＞６でＡｐｅｘピークファインダーアルゴリズムを用いるＦｌｅｘａｎａｌｙｓｉｓ  ２．４  Ｂｕｉｌｄ  １１（Bruker Daltonics）を使用して生成した。ＭＳスキャンは、０．２ｍ／ｚの幅を使用するＳａｖｉｔｚｋｙ  Ｇｏｌａｙアルゴリズムを用いて１回スムージングし、基準線の差し引きは、０．８のフラットネスでＭｅｄｉａｎアルゴリズムを使用して行った。
【００８０】
タンパク質の同定を、ゲノム研究所（ＴＩＧＲ）ウェブサイト（www.tigr.org）から得るポルフィロモナス・ジンジバリスデータベースに対して問い合わせが行われるＭＳ／ＭＳデータに関してＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（ＭＡＳＣＯＴ  ２．１．０２版、Matrix Science）を使用して行った。ＭＡＳＣＯＴ検索パラメータは以下の通りであった：荷電状態１＋、プロテアーゼとしてトリプシン、１の切断ミス（missed cleavage）が許容される、並びにＭＳに対しては２５０ｐｐｍのトレランス、及びＭＳ／ＭＳピークに対しては０．８ｍ／ｚ。固定修飾をシステインのカルバミドメチルに対して設定し、変動修飾はＣ末端の１８Ｏ標識化リシン残基及びアルギニン残基であった。
【００８１】
以前に説明した（３２）逆データベース戦略を、単一ペプチド同定に関する偽陽性を除去するために必要な最小ペプチドＭＡＳＣＯＴスコアを決定するために、採用した。簡潔には、そのデータベースは、予測される全てのその通常の方向のポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質と、その逆の配列（３８８０配列）を有する同じタンパク質との両方の配列から成る。その後全体のＭＳ／ＭＳのデータ組を、組み合わせたデータベースに対して検索し、０％の偽陽性をもたらす最も低いＭａｓｃｏｔスコアを決定した。偽陽性は、逆配列（太字・赤字、及び上記ペプチド閾値スコア）との正の適合と定義された。単一のヒットペプチドに対する偽陽性率は０．５％であると決定され、Ｍａｓｃｏｔペプチドイオンスコアは閾値より大きく２５より小さかった。Ｍａｓｃｏｔペプチドイオンスコアが３０より大きい場合には、逆データベースとの適合はなかった。単一のヒットペプチドに関する同定の信頼性を増大させるために、本発明者らは、Ｍａｓｃｏｔスコアリングアルゴリズムに従い、スコア３０を使用した場合よりも２桁低い誤同定の確率を与える５０より大きい最小のＭａｓｃｏｔペプチドイオンスコアを使用した。
【００８２】
適合したペプチドを、以下の基準を使用して評価した。ｉ）０．０５より小さいｐ値に対応する確率基準のスコアを有する少なくとも２つの特有のペプチドは、正に同定された（所要の太字・赤字の適合）とみなされた（ここで、スコアは−ｌｏｇＸ１０ｌｏｇ（Ｐ）であり、Ｐは観察された適合が無作為な事象である確率である（３３））、ｉｉ）特定のタンパク質の同定の際に特有のペプチドを１つだけ使用した場合（重標識化又は軽標識化ペプチドのいずれかの同定が１つとみなされる）には、ＭＡＳＣＯＴペプチドイオンスコアは５０を超えていなければならず、又はそのペプチドは４つの独立の実験（２つの生物学的反復測定、及び２つの技術的反復測定）の１つより多くにおいて同定される。
【００８３】
ペプチド中への１つ又は２つの１８Ｏ原子の混合的な組込みのために、１８Ｏ同位体の天然存在量とＨ２１８Ｏの純度（ａ＝０．９７）との寄与、ペプチドの比Ｒを、以下の式：
【００８４】
【数１】
0005476297.tif 000005
【００８５】
を使用して数学的に補正した。
【００８６】
Ｉ０、Ｉ１及びＩ２は、以下の式に従って算出した（２７）：
【００８７】
【数２】
0005476297.tif 000006
【００８８】
【数３】
0005476297.tif 000007
【００８９】
【数４】
0005476297.tif 000008
【００９０】
ここでＳ０、Ｓ２及びＳ４は、それぞれ、１８Ｏ標識を有しないペプチドについてのモノアイソトピックピーク、モノアイソトピックピークより２Ｄａ高いピーク、及びモノアイソトピックピークより４Ｄａ高いピークの測定強度である（図１Ａ）。Ｊ０、Ｊ２及びＪ４は、ＭＳ−Ｉｓｏｔｏｐｅ（http://prospector.ucsf.edu）から算出したペプチドの同位体エンベロープの対応する理論相対強度である。しかし第２の同位体ピーク（Ｓ１及びＳ５）の強度が第１の同位体ピーク（Ｓ０及びＳ４）より強い場合には、比は単純にＳ１をＳ５で除したものとして算出した。１６Ｏ標識化ペプチドの第５の同位体ピークのＳ４ピークに対する寄与が顕著になる場合には、特に２０００ｍ／ｚを超える大きなペプチドについては、これは真であった。混合的な１６Ｏ１８Ｏの組込みの算出は、実験的なＳ４の百分率としての実験的なＳ２と理論的なＳ２（Ｊ２）との差異により決定した。
【００９１】
タンパク質存在量の比を、同じタンパク質が２つ以上のゲル切片で同定された場合であっても、同じタンパク質の全ての同定したペプチドを平均することにより決定した。各「通常の」反復測定からのデータを、それぞれの「逆の」反復測定からの逆数をとった比と組み合わせ、各生物学的反復測定における各タンパク質についての平均比と、標準誤差とを提供した。過去に報告した（３４、３５）ものと同様に、両方の生物学的反復測定結果の正規化を、その後実施した。簡潔には、各生物学的反復測定について平均した比に因子を乗じ、該比の幾何学平均が１に等しくなるようにした。
ＩＣＡＴ標識化ヘム制限細胞及びヘム過剰細胞の調製及び分析
タンパク質の標識化及び分離は、ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ＩＣＡＴ  ｒｅａｇｅｎｔ（Applied Biosystems）を使用するｇｅＬＣ−ＭＳ／ＭＳアプローチ（Li et al., 2003）を基礎にした。別のプロテオームアプローチは、国際出願ＰＣＴ／ＡＵ２００７／０００８９０号明細書（参照により本明細書中で援用される）において行われている。ＴＣＡ（１６％）を使用してタンパク質を先ず沈殿させて、６Ｍ  尿素、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  ＳＤＳ、及び５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）を使用して可溶化した。ＢＣＡタンパク質試薬を使用してタンパク質濃度を決定し、１ｍｇ／ｍｌに調整した。各増殖条件由来のタンパク質１００μｇを、個々に、５０ｍＭのトリス（２−カルボキシ−エチル）ホスフィン塩酸塩２μＬを使用して、３７℃で１時間、還元した。次にヘム制限増殖条件由来の還元タンパク質をＩＣＡＴｈｅａｖｙ試薬で、ヘム過剰増殖条件由来のタンパク質をＩＣＡＴｌｉｇｈｔ試薬でアルキル化した。次に２つの試料を組み合わせ、プレキャストＮｏｖｅｘ  １０％ＮＵＰＡＧＥゲル（Invitrogen）上におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Invitrogen）を使用して５分間染色し、その後、水で脱染した。次に、ゲルレーンを、ゲルの上部から色素の前面まで、切除して２０個の切片とした。
【００９２】
切除した切片をさらにさいの目に切って１ｍｍ３の立方体とし、終夜ゲル内消化し、上記手順に従い２回抽出した。プールした上清を減圧下で乾燥して約５０μＬとし、その後、５００μＬのアフィニティーローディング緩衝液と混合した後、製造業者の取扱説明書（Applied Biosystems）に従ってアフィニティーカラム上にロードした。溶出したペプチドを乾燥し、ビオチンタグを、３７℃で２時間、無希釈の（neat）ＴＦＡで切断し、その後減圧下で乾燥した。乾燥した試料を、０．１％のＴＦＡ中の５％のアセトニトリル３５μＬ中に懸濁した。
【００９３】
ＵｌｔｉＭａｔｅ  Ｎａｎｏ  ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（LC Packings - Dionex）と連結したＥｓｑｕｉｒｅ  ＨＣＴ  ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Bruker Daltonics）を使用して、ＭＳを実施した。LC Packings逆相カラム（Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００、内径７５μｍ×１５ｃｍ、３μｍ、１００Å）を使用して分離を達成し、以下のアセトニトリルグラジエントを用いて０．１％ギ酸で溶出した：０分〜５分（０％）、５分〜１０分（０％〜１０％）、１０分〜１００分（１０％〜５０％）、１００分〜１２０分（５０％〜８０％）、１２０分〜１３０分（８０％〜１００％）。
【００９４】
ＬＣ出力を、ナノスプレーイオン源と直接接続した。１００ｍｓの最大蓄積時間で、３００〜１５００のｍ／ｚ範囲で、１０００００のイオン荷電制御下で、ＭＳの取得を行った。ＧＰＦを使用する場合、３つの付加的なｍ／ｚ範囲（３００〜８００、７００〜１２００及び１１００〜１５００）を使用して前駆体イオンに関して選択し、各ｍ／ｚ範囲を二連で実施して、同定されるペプチドの数を増大させた。ＭＳ／ＭＳの取得を、１００ｍ／ｚ〜３０００ｍ／ｚの質量範囲にわたり得て、初期完全プロテオーム分析に関しては最大１０個の前駆体で、２分の能動排除時間を有する最も強度の大きい多重荷電イオンについてのＩＣＡＴ分析に関しては３個の前駆体で実施した。
【００９５】
化合物検出閾値１００００及びシグナル対ノイズ閾値５で、Ａｐｅｘピークファインダーアルゴリズムを使用するＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ  ３．２（Bruker Daltonics）を使用して、ピークリストを生成した。エクスポートしたデータに関して、＋２及び＋３という全体的負荷制限を設定した。ゲノム研究所（ＴＩＧＲ）ウェブサイト（www.tigr.org）から得られるポルフィロモナス・ジンジバリスデータベースに対して問い合わせが行われるＭＳ／ＭＳデータに関してＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（ＭＡＳＣＯＴ２．１．０２、Matrix Science）を使用して、タンパク質同定を達成した。以下の基準を使用して、適合したペプチドをさらに評価した：ｉ）最大でも０．０５のｐ値に対応する確率基準のＭｏｗｓｅスコアを有するペプチドは、正に同定されたとみなされた（ここで、該スコアは−ｌｏｇＸ１０（ｌｏｇ（Ｐ））でありＰは観察された適合が無作為な事象である確率である）、ｉｉ）特定のタンパク質の同定に１つのペプチドだけを使用し、ＭＡＳＣＯＴスコアが３０より低い場合、スペクトルの手作業での確認を行った。特に単一ペプチドヒットを有するものに関するＩＣＡＴ標識化タンパク質の同定における信頼性を増大させるために、付加的なフィルターを以下のように適用した：ｉ）ＩＣＡＴ対の重ペプチド及び軽ペプチドは、それらの抽出したイオンクロマトグラムから決定されるような溶出ピークを密接に示していなければならない、ｉｉ）単一の特有のペプチドを有するタンパク質に関しては、このペプチドは（例えば、異なるＳＤＳ−ＰＡＧＥ画分で、又は軽ＩＣＡＴ形態及び重ＩＣＡＴ形態の両方で）２回以上同定されていなければならない、ｉｉｉ）単一ペプチドが（ｉｉ）の基準を満たさない場合、ＭＡＳＣＯＴスコアは２５以上でなければならず、期待値≦０．０１、及びＭＳ／ＭＳスペクトルは、強いイオンが説明されている「ｂ」型イオン又は「ｙ」型イオンの連続シリーズを示していなければならない。偽陽性の判定は上述の通りである。
【００９６】
同位体的に重い１３Ｃ  ＩＣＡＴ標識化ペプチド対軽い１２Ｃ  ＩＣＡＴ標識化ペプチドの比率を、ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ（Bruker Daltonics）からのスクリプトを使用して決定し、単一ＭＳスペクトルでのモノアイソトピックピーク強度の測定値（シグナル強度及びピーク面積）に基づいて、手作業で確認した。定量のために使用される親イオンの最小イオンカウントは２０００であったが、重及び軽前駆体イオンの両方の９６％超が、１００００を超えた。低分解度のスペクトルの場合、親イオンの再構成抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）の面積から、比率を決定した。単一親タンパク質由来の複数のペプチドに関して平均を算定し、外れ値を、α＝０．０５でＧｒｕｂｂ検定を使用して除外した。
【００９７】
ＣＥＬＬＯ（http://cello.life.nctu.edu.tw（３６））を使用してポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質の細胞局在性を予測した。細胞外、外膜、内膜及びペリプラズムに予測されたものは、外被画分由来であると考えられた。
【００９８】
無細胞培養上清（無接種、ヘム過剰及びヘム制限）中の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の濃度を、Richardson et al.（３７）の誘導体化法に基づくキャピラリガスクロマトグラフィにより決定した。
【００９９】
両方の生物学的反復測定結果の間の相関係数（ｒ）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌのＰｅａｒｓｏｎの相関係数機能を使用して、評価した。変動係数（ＣＶ）を、ペプチド存在量比の標準偏差を平均値で除することにより算出し、百分率として表した。
トランスクリプトーム解析のための核酸の抽出
ＲＮＡを、ケモスタットから直接回収したポルフィロモナス・ジンジバリス細胞の５ｍＬの試料から抽出した。各試料に０．２倍量のＲＮＡ安定化試薬（無水エタノール中の５％ｖ／ｖフェノール）を添加した。細胞を、遠心分離（９０００ｇ、５分間、２５℃）によりペレットにし、直ぐに液体窒素中で凍結し、後の処理のために−７０℃で保存した。凍結した細胞を、細胞数１×１０１０個当たり１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ  ｒｅａｇｅｎｔ（Invitrogen）中に懸濁し、その後Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂ  ｇｌａｓｓ  ｂｅａｄｓ（MP Biomedicals）及びＰｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４  ｈｏｍｏｇｅｎｉｓｅｒ（Bertin Technologies、France）を使用して破砕した。ガラスビーズを遠心分離により除去し、ＲＮＡ沈殿段階でイソプロパノールではなくエタノールを（最終濃度３５％で）添加した以外はＴＲＩｚｏｌの製造業者（Invitrogen）のプロトコルに従ってＲＮＡ画分を精製し、その後Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＲＮＡｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（GE Healthcare）から入手したスピンカラムに試料を移した。任意の残りのＤＮＡを除去するためのオンカラムＤＮＡｓｅ処理を含む前方への結合工程から、製造業者の取扱説明書に従ってＲＮＡを精製した。ＲＮＡの完全性を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ自動化電気泳動ステーション（Bio-Rad）を使用して決定した。
【０１００】
ゲノムＤＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Qiagen）を使用して、連続培養で増殖するポルフィロモナス・ジンジバリス細胞から抽出した。
マイクロアレイの設計、ハイブリダイゼーション及び解析
マイクロアレイスライドは、オーストラリアゲノム研究所（Australian Genome Research Facility）によりプリントされ、ロスアラモス国立研究所Ｏｒａｌｇｅｎプロジェクト（Los Alamos National Laboratory Oralgen project）により予測された付加的なタンパク質コード領域を含むポルフィロモナス・ジンジバリスＷ８３ゲノムの予測タンパク質コード領域に関する１９７７個の特注設計の６０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドプローブから成るものであった。強度依存性の正規化の助けとするために、マイクロアレイ試料プール（ＭＳＰ）対照プローブを含むものとした。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＵｌｔｒａＧＡＰＳコーティングスライド上へ、マイクロアレイスライド１枚当たり３回、総数のプローブをプリントした。
【０１０１】
スライドを、Ｃｙ５で標識化したユニバーサルゲノムＤＮＡ基準（GE Lifesciences）と組み合わせて、Ｃｙ３で標識化したヘム過剰又はヘム制限試料を使用してハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡ合成反応の開始のための５μｇのランダムヘキサマー（Invitrogen）と共にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｐｌｕｓ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ｃＤＮＡ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を使用して、１０μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣｙＤｙｅ  ｐｏｓｔ−ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｄｙｅ  ｐａｃｋ（GE Lifesciences）を使用してｃＤＮＡをＣｙ３で標識化し、Invitrogen標識化システムの精製モジュールを使用して精製した。ＢｉｏＰｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓ  Ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）を使用して、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ標識化ゲノムｃＤＮＡを４００ｎｇのＤＮＡから同様に合成した。
【０１０２】
ハイブリダイゼーションの前に、ブロッキング溶液（３５％  ホルムアミド、１％  ＢＳＡ、０．１％  ＳＤＳ、５×ＳＳＰＥ［１×ＳＳＰＥは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ］）中でマイクロアレイスライドを４２℃で１時間浸漬した。ブロッキング後、Ｈ２Ｏでその後９９％エタノールでスライドを簡単に洗浄し、その後遠心分離により乾燥した。標識化したｃＤＮＡを、５５μＬのハイブリダイゼーション緩衝液（３５％  ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ  サケ精子ＤＮＡ）中に再懸濁し、９５℃で５分間変性させ、その後スライドに適用し、ＬｉｆｔｅｒＳｌｉｐｓ（Erie Scientific）でカバーした。ハイブリダイゼーションを４２℃で１６時間行った。ハイブリダイゼーション後、スライドを、２×ＳＳＣを加えた０．１％のＳＤＳ［１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム］（４２℃で５分、さらなる洗浄の全てを室温で行った）、０．１×ＳＳＣを加えた０．１％  ＳＤＳ（１０分）、０．１×ＳＳＣ（洗浄４回、各１分）中で続けて洗浄し、その後迅速に０．０１×ＳＳＣ、その後９９％エタノール中に浸漬し、遠心分離を利用してスライドを乾燥した。
【０１０３】
スライドを、ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｃａｎｎｅｒを使用して走査し、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して画像を解析した。３回の生物学的反復測定を表す各処理（ヘム制限又はヘム過剰）のために、３枚のスライドを使用した。
【０１０４】
画像解析を、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して行い、さらなる解析におけるバックグラウンド評価値として、「モルフ（morph）」バックグラウンド値を使用した。差示的に発現した遺伝子を同定するために、ＬＩＭＭＡソフトウェアパッケージを、Ｐ＜０．００５のカットオフ値で使用した。ＭＳＰ対照スポットを介して全体的なｌｏｅｓｓ曲線をフィッティングすること、及び他の全スポットに該曲線を適用することにより、アレイ内で正規化を行った。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を使用して、複数の試験について補正するための偽の発見率を制御した。
【０１０５】
遺伝子予測は、ゲノム研究所（ＴＩＧＲ、www.tigr.org）から得られるポルフィロモナス・ジンジバリスＷ８３のゲノム注釈を基礎とした。オペロン予測は、Microbesonlineのウェブサイト（http://microbesonline.org）から行った。
ＤＮＡマイクロアレイ解析を使用して決定した、ヘム制限に対するポルフィロモナス・ジンジバリスの応答
ポルフィロモナス・ジンジバリスの全体的な遺伝子発現に及ぼすヘム制限増殖の影響のＤＮＡマイクロアレイ解析を、プロテオーム解析のために採用した同一の増殖条件下で実施した。３つの生物学的反復測定からのデータ解析により、ヘム過剰とヘム制限との間において統計的に有意な差示的な調節を示す総数１６０種類の遺伝子が同定され、これらの遺伝子の大部分はヘム制限の条件下で発現レベルの増大を示し、下向き調節されたのは８種類の遺伝子のみであった。上向き調節された遺伝子の多くはオペロン中に存在すると予測され、これらの大部分は転写レベルで同様の変化を示した（表３及び表５）。ヘム制限に対する差示的な調節が観察された場合には、トランスクリプトームデータとプロテオームデータとの間に広範な一致が存在し、２つのデータ組の間に有意な相関が存在した［Ｓｐｅａｒｍａｎの相関  ０．６３６４、ｐ＜０．０５］。しかしプロテオーム解析からの存在量の差異を示す幾つかのタンパク質に関しては、対応する遺伝子のトランスクリプトーム解析は、ｍＲＮＡの存在量においては統計的に有意な差異を全く検出しなかった。マイクロアレイ解析は、プロテオーム解析により決定されたような存在量の大きな変化を有するタンパク質をコードするこれらの遺伝子のみを同定する傾向があった（表３及び表５）。タンパク質と同じ遺伝子からの転写産物とがヘム制限により有意に調節されることが見出された場合には、その大部分は同じ調節方向を示した。例外は、ＰＧ００２６（ＣＴＤファミリー推定細胞表面プロテイナーゼ）及びＰＧ２１３２（フィンブリリン（ＦｉｍＡ））という２種類の遺伝子産物であった。これらのタンパク質は、ヘム制限下でプロテオーム解析では存在量が減少したが、トランスクリプトーム解析により上向き調節されることが予測された。これらのタンパク質の両方が細胞表面に位置し、細胞表面から放出されるか、又は翻訳後に修飾され、それがプロテオーム解析において上向き調節されたと同定されることを妨げた可能性が非常に高い。
ポルフィロモナス・ジンジバリスのＦｒｄ阻害剤に対する感受性
ポルフィロモナス・ジンジバリスに対するＦｒｄ阻害剤の効果の評価を、液体培養で実施した。簡潔には、２００ｍＬのＢＨＩ培地中でＯＤが０．６（〜２．９×１０８ｃｆｕ／ｍＬ）になるまで、Ｗ５０を培養した。その後細胞を、新たな増殖培地中に再懸濁し、最終濃度を２．５×１０７ｃｆｕ／ｍＬとした。パモ酸（pamonate）オキサンテル、クエン酸モランテル及び及びチアベンダゾール（Sigma）をＤＭＳＯ中に溶解し、ストック溶液の濃度を２５０ｍＭとした。その後、４μＬの試験溶液を１９６μＬの細胞懸濁液と混合し、９６ウェルの平底プレートに移し、その後嫌気的条件下において３７℃でインキュベートし、ｉＥＭＳ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Labsystems OY Research Technologies Division）を使用して培養液の光学密度を６２０ｎｍで測定することにより５０時間にわたり毎時間モニタリングした。様々な阻害剤の存在下でのポルフィロモナス・ジンジバリスの平均世代時間を、倍加時間［（Ｌｏｇ１０Ｎｔ−Ｌｏｇ１０Ｎ０）／Ｌｏｇ１０２］を時間（Ｎｔ−Ｎ０）で除することにより算出した（ここでＮｔ及びＮ０は、それぞれ時間ｔ及び時間０での細胞集団である。）。
ポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムに対するＦｒｄ阻害剤の効果
静的９６ウェルモデルでの４８時間にわたるポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルム形成を、上記で説明したように決定した。簡潔には、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７細胞を、試験物質と混合する前に最終細胞密度が２．５×１０７となるように再懸濁し、その後９６ウェルの平底プレートに移し、３７℃で嫌気的にインキュベートした。バイオフィルム塊の評価を、２４時間及び４８時間に、２５０μＬの超純水で細胞を２回洗浄して緩く接着した細胞を除去しその後３７℃で３時間乾燥させることにより、実施した。その後乾燥したバイオフィルムを、０．１％のクリスタルバイオレット溶液中で１５分間染色し、２５０μＬの超純水で２回洗浄した。その後、６２０ｎｍでの光学密度の測定のために新たな９６ウェルプレートに移す前に、ピペット操作の繰り返しにより８０％エタノール及び２０％アセトンの溶液を２分間使用して、クリスタルバイオレット染色剤をバイオフィルムから溶解した。
フローセル（Flowcell）バイオフィルム培養及びＣＳＬＭ分析
フローセル中でのポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７のバイオフィルム培養は、上記で説明したものと類似しており且つ幾つかの修正を加えたものであった。３−チャネルフローセルシステム（Stovall Life Science、USA）を、嫌気チャンバー（ＭＫ３  Ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ、Don Whitley Scientific Ltd.）中に設置し、細菌性バイオフィルムの接種、試験及び染色のためのシリコンポンプチューブ（Gilson、France）及び栓で改造した。全てのパーツを組み立て、０．５％の次亜塩素酸ナトリウムをシステムにポンプで注入し、終夜放置し、システムを滅菌した。その後増殖培地添加の前に、滅菌水（２００ｍＬ）を使用しシステムを洗い流した。システムに、ＯＤ６００が０．１となるように希釈した、指数関数的に増殖しているポルフィロモナス・ジンジバリスの希釈液１ｍＬを接種した。０．１ｇ／Ｌのシステインと、１ｍｇ／Ｌのヘミンと、１ｍｇ／ＬのビタミンＫとを添加した５倍希釈のＢＨＩ（Oxoid）を定速（０．２ｍＬ／分）で流す前に、システムを１時間インキュベートした。１８時間後に、１２５μＭ若しくは１２．５μＭのオキサンテル又は滅菌水１ｍＬをシステムの各チャネルに注入し、３０分間インキュベートした。培地をさらに１０分間再び流し、試験により結合していない細胞を洗い落とした。その後ＢａｃＬｉｇｈｔ  ｓｔａｉｎ（Molecular Probes）を、ｉｎ  ｓｉｔｕでバイオフィルムを染色するために使用した（以下を参照されたい）。
【０１０６】
倒立型ステージを有するＭｅｔａ  ５１０  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Zeiss）上で、細菌性バイオフィルムの共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）を実施した。水平の（ｘｙ）オプトディジタルセクション、全厚にわたり各２μｍ厚のバイオフィルム（ｚ）を、１４３．８６μｍ（ｘ）×１４３．８６μｍ（ｙ）の各フレームにおいて５１２×５１２ピクセル（１ピクセル当たり０．２８μｍ）で、６３×対物レンズを使用して撮像した。バイオフィルム全体の再現性を決定するために、２つの生物学的反復測定の各々から無作為の位置における５つの画像を、各チャネルに関して４８８ｎｍ及び５６８ｎｍの波長で、取得した。取得した全画像を、ＣＯＭＳＴＡＴソフトウェアを使用して解析した。微小コロニーを、５００を超えるピクセル数の細胞のクラスターと定義した。
オキサンテル処理により分散した細胞の生存度
オキサンテル処理により分散した細胞の生存度を試験するために、上述したものにわずかに修正を加えて、静的バイオフィルムアッセイを行った。簡潔には、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ３３２７７）を、１８時間のインキュベート後に、２４ウェルのマイクロプレート中でバイオフィルムを形成させた。自由に浮いている浮遊細胞を初めに除去し、バイオフィルムをＰＢＳで１回洗浄した。１２５μＭ若しくは１２．５μＭのオキサンテル又は滅菌水（陽性対照）１ｍＬを各ウェルに添加し、３０分間インキュベートした。まだ生存する分散したポルフィロモナス・ジンジバリス細胞の数を、ＢＨＩでの段階希釈後のウマ血寒天プレート上での培養分析により決定した。
統計解析
両方の生物学的反復測定結果の間の相関係数（ｒ）を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌのＰｅａｒｓｏｎの相関係数機能を使用して、評価した。変動係数（ＣＶ）を、ペプチド存在量比の標準偏差を平均値で除することにより算出し、百分率として表した。
連続培養及びバイオフィルム形成
ポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０を４０日の期間にわたる連続培養で培養し、その間該培養液の細胞密度は、最初の１０日目の後は一定のままであり、生物学的反復測定１及び２について、ＯＤ６５０はそれぞれ２．６９±０．２１及び２．８０±０．５２であった。これは１ｍＬ当たり〜３ｍｇの細胞乾燥重量の細胞密度に等しい。この期間中、ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞のバイオフィルムが、発酵槽容器の垂直ガラス壁上に発達した。このバイオフィルムは、回収の時点で〜２ｍｍの厚さであった。
ＢＳＡを使用する１６Ｏ／１８Ｏ定量法のバリデーション
１６Ｏ／１８Ｏの定量法の正確度及び再現性を決定するために、既知量のＢＳＡを隣接ゲルレーンにロードし、その比を１：１、１：２、１：５及び１０：１とした。（図１Ｂ）。Ｈ２１６Ｏ又はＨ２１８Ｏの存在下でバンドをゲル内トリプシン消化に供し、混合し、その後ＬＣ  ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。単一のＢＳＡトリプシンペプチドに関するスペクトルの典型的な組は、４つの比を通じて２つの１８Ｏ原子の選択的組込みを示し、そのことは１０：１のＢＳＡ比において＋４Ｄａピークが優勢であることにより最も明らかに見られ、１：１スペクトルにおけるほぼ対称的な二重ピーク（doublet）により、定量及び同定の両方を単純化する（図１Ａ）。単一の１８Ｏ原子の平均的組込みは、１：１標識化を基準として７％未満であると評価された（補足表）。全ての同定されたＢＳＡペプチドに関して算出された平均比は、１：１（三連）、２：１（及び１：２）、１：５及び１０：１の比に関してそれぞれ０．９８±０．１２、２．２２±０．２６、４．９０±０．７５及び１０．７４±２．０４であり、良好なダイナミックレンジと、±２％〜１１％の高い正確度と、１１．７５％〜１８．９５％の範囲の低いＣＶを示した（表１）。１：１混合物（三連で行った）の再現的正確度（reproducible accuracy）は、標識化の偏りが非常に低かったことを示唆する。このことを、両方の実験で同定したペプチドのみを使用して、２：１の比での通常の及び逆の標識化ＢＳＡを比較することによりさらに確認した。通常の比は２．１１±０．３３と決定されたのに対して、逆の比は２．３０±０．２０と決定された（表１）。
バイオフィルム試料及び浮遊試料の定量的分析のための実験デザイン
本研究のデザインは、２つの独立した連続培養であり、各々の培養液を容器の壁から得たバイオフィルム試料と容器の流体内容物から得た浮遊試料とに分割する、２つの生物学的反復測定結果の使用を含むものとした。各生物学的反復測定に関して２つの技術的反復測定を行い、本発明者らはＢＳＡでは顕著な標識化の偏りが存在しないことを示したが、複雑な生物学的試料に対しては１６Ｏ／１８Ｏ標識化の確認研究は行われていないので、本発明者らは逆標識化戦略を利用することを選択した（３０）。したがって全部で４つの実験があり、各々が、２×１０個のゲル切片から生じる１０回のＬＣ−ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳの運転から成っていた。
【０１０７】
図２は、典型的な逆標識化パターンを例示する、バイオフィルム試料／浮遊試料由来の２つの通常の及び逆の標識化ペプチドの典型的なＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。ＢＳＡデータと同様に、高レベルの二重の１８Ｏ組込みが存在することを見ることができ平均の混合的な組込みが全ペプチドに関して１５％未満であると算出され、１６Ｏ／１８Ｏタンパク質分解標識化法が複雑な試料でも効果的であることが確認された（データは示していない）。二重標識化ペプチドが優勢であることは、＋２Ｄａ種に対するＭａｓｃｏｔヒットが相対的に少数であることにより、さらに確認された。重標識化ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｙイオンにおいて期待される＋４Ｄａシフトをさらに明らかにした（図２）。
技術的反復測定結果の間の相関
生物学的データの技術的反復測定結果を比較するために、通常の及び逆の標識化実験の各々の対のタンパク質存在量比の、底を１０として対数変換したものを、互いに対してプロットした（図３）。これらのプロットの線形回帰は、生物学的反復測定１及び２に関してそれぞれ０．９２及び０．８２のＲ２値で、各々の対が高い相関を有することを示した。各線形近似曲線（linear fit）の傾きは、また、生物学的反復測定１及び２に関してそれぞれ０．９７及び０．９３であって期待値１．０と類似しており、技術的反復測定結果の間に標識化の偏りがないことを示した（図３）。技術的反復測定結果からのタンパク質存在量比を平均し、各生物学的反復測定結果に対する単一の比をもたらした。
生物学的反復測定結果の相関
２つの生物学的反復測定に関する平均データを比較する前に、各生物学的反復測定結果のタンパク質存在量比を正規化し、１．０の平均比（average mean ratio）をもたらした。両方の生物学的反復測定結果からの正規化したタンパク質存在量比のプロットは、他者が説明した（４０、４１）のと同様に、ゼロで中央近くとなるガウス様分布を示す（図４Ａ）。２つの生物学的反復測定結果の間には有意な正の相関が存在し（Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数ｒ＝０．７０１、ｐ＜０．０００１）、バイオフィルム培養物／浮遊培養物の増殖と、試料の下流の処理の全てとが、満足なレベルまで再現され得ることを示した。どのタンパク質が２つの生物学的反復測定において一貫して調節されたかを決定するために、簡単な順位付けチャートを構築し、該チャートではタンパク質をその存在量比に従って６つの群（Ａ〜Ｆ）に分割し、次に群を基準とした相関に従って１〜６の順位付けを行い、或るタンパク質が両方の生物学的反復測定から同じ群内に入った場合には最も高い類似性を有するものとして１に順位付けした（図４Ｂ）。順位付けチャートを使用して、本発明者らは、両方の反復測定から同定したタンパク質８１種類のうち、無作為の相関に関する期待値（１７％（すなわち１／６）である）よりもかなり高い、３４種類（４２％）が１番に順位付けされることを決定することができた。残りのタンパク質の大部分は２番に順位付けされ、したがって全部で７０種類（８６．４％）のタンパク質が、２つの実験の間で同様に調節される（１又は２に順位付けされる；表２）と考えられた。
【０１０８】
２：１のＢＳＡ標識化実験（表１）で測定された標準偏差（±０．２６）に基づき、標準偏差の３倍を超えるだけ１．０から異なる場合（１．７８より大きいか、又は０．５６より小さいかのいずれか）には、タンパク質存在量の変化は生物学的に有意であると考えられた（１８、４２）。この基準を使用すると、両方の反復測定で同定された８１種類のタンパク質のうち４７種類の存在量は有意に変化しており（平均比に基づき）、またこれらのうち、４２種類は１又は２に順位付けされた（表２）。１及び２に順位付けされた４２種類のタンパク質のうち、２４種類は存在量が有意に増大し、１８種類は存在量が減少した。
協調した調節を示す代謝経路の酵素
グルタミン酸／アスパラギン酸の異化に関与する２０種類のタンパク質を、ＩＣＡＴ標識化戦略を使用するヘム制限対ヘム過剰の研究において同定した（表３）。これらのうち、グルタミン酸の酪酸への異化に直接関与する８つの工程のうちの６つを触媒する酵素が同定され、ヘム制限下で１．８倍〜４倍増大したことが見出された（図６、表３）。他の２種類の触媒酵素（ＰＧ０６９０（４−ヒドロキシ酪酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ）及びＰＧ１０６６（酪酸−アセト酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ））はＩＣＡＴを使用して検出されなかったが、それらは別々の定量的研究において、表３で報告したこれらのタンパク質に匹敵する高いイオン強度で存在し（示していない）、上向き調節されることが示されたオペロンに属することが見出された。一方、アスパラギン酸異化経路の酵素の存在量に及ぼすヘム制限の影響は混合的であり、酸化的分解経路においてアスパラギン酸のオキサロ酢酸への分解を触媒する酵素は変化せず、ピルビン酸の酢酸への変換に関与する酵素は２倍〜４．４倍の増大を示した。
【０１０９】
アスパラギン酸からの還元経路を介するフマル酸のコハク酸への変換を共に触媒する、２種類の鉄含有フマル酸レダクターゼ酵素ＦｒｄＡ（ＰＧ１６１５）及びＦｒｄＢ（ＰＧ１６１４）の存在量は、ヘム制限下で培養した細胞中において有意に低減した（図６、表３）。オペロン中にコードされている（Baughn et al., 2003）これらの２つのタンパク質は、ヘム制限に対する応答下で存在量の同様の変化を示す（ＦｒｄＡ  Ｌ／Ｅ＝０．３５；ＦｒｄＢ  Ｌ／Ｅ＝０．２５）。
有機酸最終生成物の分析
ヘム制限下で増殖したポルフィロモナス・ジンジバリスの使用済みの培養培地中の酢酸、酪酸及びプロピオン酸の量は、それぞれ、細胞乾燥重量１ｇ当たり１３．０９ミリモル±１．８２ミリモル、７．７７ミリモル±０．４０ミリモル及び０．７１ミリモル±０．０５ミリモルであった。ヘム過剰下で増殖したポルフィロモナス・ジンジバリスの使用済みの培養培地中の酢酸、酪酸及びプロピオン酸のレベルは、それぞれ、細胞乾燥重量１ｇ当たり６．００ミリモル±０．３６ミリモル、６．５１ミリモル±０．０４ミリモル及び０．６６ミリモル±０．０７ミリモルであった。
ポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖に対するＦｒｄ阻害剤の効果
様々な濃度の３種類の駆虫剤オキサンテル、モランテル及びチアベンダゾールの、５０時間にわたるポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０の増殖に対する効果を、図７、図８及び図９に示した。増殖に対するＤＭＳＯの効果は、以前に報告した研究でのポルフィロモナス・ジンジバリスの、及びＷ５０単独の類似のＭＧＴに見られた（４３、４４）ように、無視できる程度であった。これらの３種類の阻害剤のうち、ポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖に対する最も深い効果が見られたのは、オキサンテルである（図７）。増殖曲線から、ポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖に対して、１５μＭを超える濃度でオキサンテルの正の抑制が存在することが明らかである。上記で説明した（４５）ように、オキサンテルの最小抑制濃度（ＭＩＣ）を１１２μＭと決定した。オキサンテルのｓｕｂＭＩＣに関して見られるように、オキサンテルの濃度の増大とＭＧＴの増大との間の顕著な相関も存在した（図７Ａ）。モランテルの殺菌効果はオキサンテルよりも比較的低く、ＭＩＣは〜３ｍＭであったが、ｓｕｂＭＩＣでも顕著な抑制効果を示す（図８）。チアベンダゾールは、ポルフィロモナス・ジンジバリスの増殖に対してそれほど顕著な抑制効果を有しないようであり、増殖に対するわずかな抑制効果のために１ｍＭを超える濃度を明らかに必要とする（図９）。結論として、様々なＦｒｄ阻害剤の抑制効果を、オキサンテル＞＞モランテル＞チアベンダゾールの順であると評価した。
バイオフィルム形成に対する最小抑制濃度以下の濃度のオキサンテルの効果
ポルフィロモナス・ジンジバリス増殖に対する最も深い効果を有するオキサンテルを、バイオフィルムの形成に対するその効果を研究するために使用した。Ｗ５０はほとんどの環境下でわずかにしかバイオフィルムを形成しないので、バイオフィルム試験では、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ３３２７７株をＷ５０の代わりに使用した。ＡＴＣＣ３３２７７株に対するオキサンテルの増殖抑制効果は１２５μＭでの浮遊アッセイにおけるＷ５０に類似している（図７Ｂ）ので、したがってバイオフィルム形成に対するオキサンテルの効果を研究するための良好なモデルを表す。０．１μＭもの低さの、最小抑制濃度以下の濃度（ＳｕｂＭＩＣ）のオキサンテルは、２４時間でバイオフィルム塊を顕著に低減した（図１０Ａ）が、４８時間でバイオフィルム塊に対する抑制効果を有するためには３．９μＭ以上の濃度が必要であった（図１０Ｂ）。
バイオフィルム分散に対するオキサンテルの効果
ＳｕｂＭＩＣのオキサンテルの効果をより詳しく研究するために、ポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルムに対してフローセル培養システムを使用した。成熟バイオフィルムをオキサンテルで処理したときには、バイオフィルムの深さと微小コロニーのサイズとが有意に低減した（Ｐ＜０．０１）が、対照試料と処理試料との間における微小コロニーの数には有意な差異はなかった（図１１〜図１３、表６）。
【０１１０】
バイオフィルムから放出されたポルフィロモナス・ジンジバリス細胞は、特に１２．５μＭのオキサンテルで処理したバイオフィルムに関しては、生存したままであった（図１４）。非処理の対照細胞は、オキサンテルで処理した細胞と比較して分散に対して抵抗性がより高いようであった。バイオフィルムから回収した細胞の数も、ＣＬＳＭ下で見られたもの（図１１〜図１３）と一致し、対照試料中では細胞数が顕著に多かった。
【０１１１】
上記結果は、浮遊ポルフィロモナス・ジンジバリス細胞が固体表面に接着し成熟単一種バイオフィルムの一部分として増殖する場合に起こる、タンパク質存在量の変化を例示する。現在までに公表された他のこのような研究の全てが二次元ゲル電気泳動に基づく方法を利用していた（１０〜１２）ので、タンパク質存在量の変化を決定するためにGygiのグループのｇｅＬＣ  ＭＳアプローチ（４６）、又は１６Ｏ／１８Ｏタンパク質分解標識化法を利用することは、細菌性バイオフィルム増殖対浮遊増殖の最初の比較研究である。２つの技術的反復測定と２つの生物学的反復測定１６Ｏ／１８Ｏ逆標識化アプローチとをうまく採用し、タンパク質存在量の変化を定量及び確認した。
ポルフィロモナス・ジンジバリスの連続培養
本研究ではポルフィロモナス・ジンジバリスＷ５０を、より伝統的な方法論であるバッチ培養とは対照的に、連続培養で培養した。バッチ培養は、バッチ間の変数（例えば、接種菌液の大きさ及び生存度、細菌の回収時の厳密な増殖段階、培地中における利用可能な栄養素のレベル、並びに培地の酸化還元電位等の因子）のために、細菌分析に広い範囲及び程度の変化を導入する。連続培養では細菌は、増殖速度、細胞密度、栄養素濃度、温度、ｐＨ及び酸化還元電位を含む厳密に制御された条件下で、多世代にわたり増殖する（４４、４７、４８）。過去の研究は、様々な研究室においてケモスタット中で連続培養したサッカロミセス・セレビシエのトランスクリプトーム解析の高レベルの再現性を実証した（４９）。さらに本発明者らの研究では、バイオフィルム細胞及び浮遊細胞の両方の増殖が単一の発酵容器中で実施され、分離培養と比較して変動（variability）が低減した。本研究で見られた同定したタンパク質（１及び２に順位付けされた）の８６．４％の生物学的反復測定の間におけるポルフィロモナス・ジンジバリス細胞外被タンパク質存在量の一貫した変化は、ポルフィロモナス・ジンジバリスのプロテオームに及ぼすバイオフィルム増殖の影響の解析に対する、連続培養システムと、１６Ｏ／１８Ｏタンパク質分解標識化戦略との利用可能性を例示する。
１８Ｏ標識化の効率
本研究で採用した基礎的なプロテオミクスの方法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法がもたらす膜タンパク質の高い分解能及び溶解性のために、ｇｅＬＣ  ＭＳ法であった（４６、５０）。この方法は、他者が説明した（２６〜２９）手順と同様のゲル内消化手順時に、単一の１８Ｏ標識化反応と組み合わされた。効率的な標識化は、各ペプチドのＣ末端への２個の１８Ｏ原子の組込みをもたらすものであり、１６Ｏとの再交換（back-exchange）に抵抗性を有するものと考える。これは、単一の１８Ｏ原子の組込みのレベルが７％未満であると評価され、様々なＢＳＡ実験に関して得られた平均比が１６Ｏを有意に選好しないことが見出された（表１）、本発明者らのＢＳＡでの研究におけるケースであることが見出され、通常の水との再交換は問題ではないことが示唆された。同様の結果が、生物学的試料に関しても得られた。効率的な１８Ｏ標識化のための重要なステップには、「一回消化（single-digestion）」法を採用するトリプシン消化の前の、天然のＨ２１６Ｏの完全な除去と、その後のＨ２１８Ｏ中でのタンパク質の再可溶化とが必要であった。多数の研究が「二回消化（double digestion）」法を使用している（５１、５２）が、二回消化法ではトリプシンペプチドの中には初回の消化後に１８Ｏ原子の代わりにそのＣ末端の１６Ｏ原子のいずれかを交換することができないものがあったので、一回消化法は、より高い１８Ｏ標識化の効率をもたらすという利点を有する（５３）。本発明者らは、任意の標準的なゲル内消化プロトコルのように、有機溶媒を使用する初期脱水工程時にゲルマトリクス中にタンパク質を保持するゲル内消化法をさらに利用した。任意の微量天然Ｈ２１６Ｏの完全な除去は、初期凍結乾燥工程時のさらなる吸着ロスを予防するためにタンパク質がまだゲルマトリクス内に存在する状態で、真空下での遠心分離による凍結乾燥を介して達成した。またＨ２１８Ｏ中で再構成した大過剰のトリプシンを含有するＨ２１８Ｏ中で再水和及びゲル内消化を実施した。消化手順時に、第１の１８Ｏ原子の組込み後にゲルから遊離したトリプシンペプチドは、過剰のトリプシンにより媒介される第２のカルボニル酸素交換プロセスの対象となり得る。遊離したペプチドは、タンパク質よりも高い溶解性を有することにより、より高いレベルの二重に１８Ｏ標識化したトリプシンペプチドをもたらすので、これは第２のカルボニル酸素の置換を促進するはずである（図１及び図２；（５４））。通常の水との再交換を予防するために、効果的であることが以前に示されている（５１、５４）煮沸を行うことにより、トリプシンを非活性化した。加えて、乾燥した、非活性化した混合物はｎａｎｏＬＣ上への注入の直前に、再懸濁及び混合のみを行い、自発的な交換を最小化したが、この自発的交換は低いことが分かっている（１５、４０）。
逆標識化
安定な同位体の標識化とＭＳを使用する定量との場合には、誤差が、標識化及びイオン化のプロセス時に導入される可能性がある。これらの誤差は、標識の親和性の潜在的な差異と、ＭＡＬＤＩプロセス時の重又は軽標識化ペプチドの考え得る抑制効果とを含む（１３、５５）。同じ標識化を繰り返すことを含む伝統的な技術的反復測定は、特定の標識に対する未補正の偏り、又はピークを汚染することによる特定のペプチドの無作為誤差の増大をもたらし得る。本発明者らの通常の及び逆の標識化技術的反復測定は、生物学的反復測定１及び２に関してそれぞれ０．９７（Ｒ２＝０．９２）及び０．９３（Ｒ２＝０．８２）の散布図の勾配（標識化しない場合の偏りに関する期待される比は１．０に近い）を有する、高度の相関を実証した（図３）。これらの勾配は、その方法が、タンパク質の評価と、ゲルのロードと、ゲルの切り出しと、ゲル内消化とに関して再現性を有していたことも示す。偏りが無いことは、マイクロアレイ実験で日常的に使用されるダイスワップ法又はＬＯＷＥＳＳデータ正規化等の正規化ルーティン（３５）が不必要であり得ることを示唆する。しかし、本研究で使用した細菌細胞外被よりも大幅に複雑な試料は、微量汚染ペプチドが１８Ｏ／１６Ｏ比の算出に及ぼす影響と、極端な変化を有するペプチドを確認する必要性とを考えると、逆標識化の確認をさらに必要とし得る。ＭＳ／ＭＳ取得法は断片に対する各重／軽対における最も強力なペプチドのみを選択したので、系統誤差を補正する評価及び手段を提供することに加えて、逆標識の設計は、重及び軽標識化ペプチドの両方を容易に同定することを可能にするというさらなる利点を有するものであった。このように、誤った割り当ての可能性は低減する。本発明者らの知識では、これは、１７種類のチトクロムＰ４５０タンパク質の最近の定量以外では複雑な生物学的試料における逆１６Ｏ／１８Ｏ標識化の最初の報告である（２６、３０）。
バイオフィルム対浮遊培養
本発明者らは、生物学的反復測定の間の強力な正の相関（ｒ＝０．７０１、ｐ＜０．０００１）を実証し、バイオフィルムの形成及び発達に再現性があることを示した。このことは、８１種類の定量化可能なタンパク質のうち７０種類が、両方の生物学的反復測定において同様の比を示すことが観察されるという知見によっても見られた（表２、１又は２に順位付けされる）。本研究で同定されたポルフィロモナス・ジンジバリスタンパク質の４分の３超が、３種類以上の特有のペプチドにより同定され、この標識化手順の同定及び定量の信頼性がさらに増大した。両方の生物学的反復測定から一貫して同定された８１種類のタンパク質のうち、４７種類は浮遊状態からバイオフィルム状態まで存在量が有意に変化した。特に細胞外被において、検出されたプロテオームの存在量の百分率の変化は、検出されたプロテオームの５０％超が浮遊と成熟バイオフィルムとの増殖期の間に存在量の顕著な変化を示すことが示された、シュードモナス・エルギノーサ等のバイオフィルム形成細菌についての他の研究（１２）と一致する。本発明者らは、バイオフィルムとしての増殖に対するポルフィロモナス・ジンジバリスの細胞外被プロテオームにおける広範な応答をさらに観察した。バイオフィルム培養に対する応答下で存在量が変化することが以前に実証された多数のタンパク質は、本発明者らの研究において、存在量が変化することも見出された。注目すべきことに、幾つかのタンパク質では最大５倍存在量が変化することが観察され（表２）、バイオフィルム培養に応答したプロテオームの幾つかの主要なシフトが示唆された。
代謝
ポルフィロモナス・ジンジバリスに関する主要なエネルギー源は、宿主タンパク質のタンパク質分解性加水分解によりペプチド形態で得られるアミノ酸の発酵に由来する（４７、８０、８１）。ポルフィロモナス・ジンジバリスの主要な異化経路は、グルタミン酸及びアスパラギン酸の発酵であり、該発酵ではグルタミン酸は酪酸、プロピオン酸及びアンモニアに代謝され、アスパラギン酸は酪酸、プロピオン酸、酢酸及びアンモニアに代謝される（図６）。以前の報告は、ポルフィロモナス・ジンジバリスが、培養培地からアスパラギン酸／アスパラギン、グルタミン酸／グルタミン、トレオニン、セリン、ロイシン及びバリンを選択的に利用することを示している（４７、８１、８２）。
【０１１２】
グルタミン酸異化に関与するポルフィロモナス・ジンジバリスの２種類のタンパク質であるＰＧ１０７６（Ｌ／Ｅ＝１．８）及びＰＧ１０７８（Ｌ／Ｅ＝２．０）は、ヘム制限時に存在量が有意に増大した。これらのタンパク質は、１５種類の遺伝子の、予測される大きなオペロン中に配置される遺伝子によりコードされる。これらの遺伝子の上流は、その存在量がヘム制限時にも増大した仮説タンパク質及び保存仮説タンパク質（それぞれ、ＰＧ１０６７、Ｌ／Ｅ＝２．４、及びＰＧ１０６８、Ｌ／Ｅ＝１．７）をコードする２つの遺伝子である。この大きなオペロンの解析は、多数の鉄調節性遺伝子に特徴的な推定Ｆｕｒコンセンサス結合領域（８３）の存在をさらに明らかにし、発現が鉄の利用能により制御され得ることを示唆している。本発明者らは１つのオペロン中にコードされる全てのタンパク質のフォールド変化が同じであると予想したが、転写産物のレベルはタンパク質のレベルと相関しないことがあるので（８４）、これは必ずしも全ての例に当てはまるわけではない。このことは、転写産物の翻訳後修飾又は安定性のためであることがあり、ｍＲＮＡ存在量が見かけ上変化することなく、細胞の事象の実質的な調節がタンパク質レベルで起こることを可能にする。
【０１１３】
アスパラギン酸からの経路によるコハク酸へのフマル酸の変換は、２種類の細胞質酵素ＦｒｄＡ（１６１５）及びＦｒｄＢ（１６１４）と、膜貫通型ＦｒｄＣ（１６１６）とから成るヘテロ三量体のコハク酸−キノンオキシドレダクターゼ（ＳＱＯＲ）複合体により触媒される。２種類の細胞質フマル酸レダクターゼ酵素、ＦｒｄＡ（ＰＧ１６１５）及びＦｒｄＢ（ＰＧ１６１４）の存在量は、ヘム制限（それぞれ、３倍及び４倍）並びにバイオフィルム増殖（それぞれ、１７倍及び５．９倍）で培養した細胞中で、有意に低減した。オペロン中にコードされる（８５）これらの２種類のタンパク質は、ヘム制限（ＦｒｄＡ  Ｌ／Ｅ＝０．３５、ＦｒｄＢ  Ｌ／Ｅ＝０．２５）並びにバイオフィルム増殖（ＦｒｄＡ  Ｂ／Ｐ＝０．０６、ＦｒｄＢ  Ｂ／Ｐ＝０．１７）に応答して存在量が類似した変化を示す。バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）における以前の研究は、チトクロム−ｂ−依存性Ｆｒｄ複合体の合成のためにヘムが要求されることを示唆している（８６）。したがって、それが新規にＰＰＩＸを合成することができないことを考慮すると、ポルフィロモナス・ジンジバリスにおいてヘム制限増殖条件時のＦｒｄのレベルの低さが見られることは驚くべきことではない。バクテロイデス・フラジリス及びポルフィロモナス・ジンジバリスの両方の増殖研究は、それらが増殖のためにヘムを要求すること、及びこの要求性が外来のコハク酸により部分的に置換され得ることを示している（８７、８８）。この観察は、その増殖がヘムによっては刺激されずコハク酸の添加により刺激されたバクテロイデス・フラジリスＦｒｄ欠損変異株を使用して、確認された（８５）。モル増殖収量研究は、バクテロイデス・フラジリスＦｒｄ欠損突然変異体が、ヘム制限下の野生株のＡＴＰ収量と同様のＡＴＰ収量を有することをさらに示した。最適増殖時に、エネルギー産生経路に入れるため、又は必須アミノ酸（リシン及びメチオニン）の生合成のために、コハク酸はサクシニル−ＣｏＡに変換される。これらの研究は、均衡のとれた増殖のための、アスパラギン酸のコハク酸への変換の重要性を証明する。ヘム過剰条件下では、ポルフィロモナス・ジンジバリスにより異化されたアスパラギン酸の部分は最初に、フマル酸レダクターゼ酵素（ＦｒｄＡ及びＦｒｄＢ）によりコハク酸に還元され、その後グルタミン酸経路を介して異化され酪酸を産生する（図６）。ヘム制限時のこれらのフマル酸レダクターゼ酵素の存在量の３倍〜４倍の減少は、グルタミン酸異化経路に入るアスパラギン酸がより少なくなり、この結果として異化されたアスパラギン酸のほとんどが、酸化経路を介して酢酸に変換されることを示す（図６）。この仮説を検証するために、本発明者らは、連続培養で増殖したポルフィロモナス・ジンジバリス由来の使用済みの培養培地に対して有機酸分析を実施した。これは、他の主要な最終産物である酪酸及びプロピオン酸のレベルは両増殖条件下で類似していたのに対して、ヘム過剰下（細胞乾燥重量１ｇ当たり６．００ミリモル±０．３６ミリモル）で産生されるレベルと比較してヘム制限下（細胞乾燥重量１ｇ当たり１３．０９ミリモル±１．８２ミリモル）では産生される酢酸が２倍高いレベル���あることを示した。このことは、アスパラギン酸発酵のために使用される経路のシフトの、本発明者らの仮説と一致する。ピルビン酸の酢酸への変換を触媒する酵素（酢酸キナーゼＰＧ１０８１、ホスホトランスアセチラーゼＰＧ１０８２及びピルビン酸フェレドキシンＰＧ０５４８）の存在量の増大も、使用済みの培養培地で見出される酢酸の量の増大と一致する（表２、図６）。
【０１１４】
したがってこれらの結果は、この繊細な代謝調節経路の抑制により細菌を制御する方法についての調査に、本発明者らを駆り立てた。
増殖に対するフマル酸レダクターゼ阻害剤の効果
本発明者らは、ヘム制限増殖時のＦｒｄＡ及びＦｒｄＢの３倍及び４倍の低減よりもさらに大きい、ポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルム増殖時のＦｒｄ複合体（それぞれ、ＦｒｄＡ及びＦｒｄＢ）の存在量の１７．０倍及び５．９倍の低減を示した。Ｆｒｄ複合体の一貫してより低い存在量は、バイオフィルム及びヘム制限の両方の増殖条件時の、ヘムの制限と関連する該細菌の増殖の減弱と相関する。Smith et al.（８９）は、カンピロバクター（Campylobacter）種のＦｒｄ活性が指数関数的に増殖中の培養物においてより高いが、定常期に入ると減少することを以前に証明した。したがって、これは、Ｆｒｄ活性が増殖速度を制限することを示唆しており、それが魅力的で新規な治療標的であることを強調している。フマル酸呼吸は最も広範な種類の嫌気呼吸であり、電子１個当たり〜０．５個のＡＴＰを産出する電子受容体として働き最終産物としてコハク酸を形成することが知られている唯一の代謝中間体である（９０）。Shah and William（９１）は、ポルフィロモナス・ジンジバリスがアスパラギン酸（asparatate）からコハク酸を産生することを報告し、Takahashi et al.（８１）は、産生されたコハク酸がサクシニル−ＣｏＡに変換され、その後酪酸又はプロピオン酸に変換されることを提唱した。
【０１１５】
動物及びヒトにおける蠕虫感染症を治癒させるために通常使用される駆虫剤が、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）及びカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）に対して抑制効果及び殺菌効果を有することが実証された（８９、９４）。これらの薬剤の１つであるオキサンテルは、推定では未知のメカニズムを介しＦｒｄ複合体の親水性サブユニット上において、ヘリコバクター・ピロリ及びカンピロバクター・ジェジュニにおけるフマル酸レダクターゼ酵素の阻害剤であることが示されている（９４〜９６）。
【０１１６】
興味深いことに、全ての嫌気性細菌がＦｒｄを有するわけではなく、Ｆｒｄを有する細菌の中にはＦｒｄが抑制された場合の生存のために代替的な生化学的経路を有するものがある（９７、９８）。したがって、Ｆｒｄ阻害剤の存在下でポルフィロモナス・ジンジバリスの生存度が著しく影響を受けるという発見（図７〜図１０）は、増殖とアスパラギン酸経路からのＡＴＰの寄与とのために絶対必須である酵素がポルフィロモナス・ジンジバリスの生存において重要な役割を果たし得ることを示唆する。ヒト及び他の動物にはＦｒｄ複合体が存在しない（９２、９３）ので、Ｆｒｄ阻害剤は、病原体、特にＦｒｄに対して必須の要求性を有する病原体により引き起こされる疾患に対する標的を提供する。
バイオフィルム形成に対するフマル酸レダクターゼ阻害剤の効果
以下は、ポルフィロモナス・ジンジバリスのバイオフィルム形成能力に対するＦｒｄ阻害剤の効果を例示する。ｓｕｂＭＩＣオキサンテル濃度でのバイオフィルム塊の低減は、最適なバイオフィルム形成のために要求される最小量のＦｒｄ又はエネルギーが存在することを示唆するので、非常に興味深い。
【０１１７】
ｓｕｂＭＩＣ濃度のＦｒｄ阻害剤によるＦｒｄの部分的な抑制は、栄養の乏しい環境におけるようなものと類似のシグナルとして翻訳され得る。例えば、炭素調節性バイオフィルム形成は、シュードモナス・エルギノーサ及び大腸菌を含む多数の細菌において十分に裏付けられており、栄養制限時にＲｐｏＳ、Ｃｒｃ及びＣｓｒＡ等の転写調節因子により媒介される（９９〜１０１）。大腸菌ではｃｓｒＡ遺伝子は、グリコーゲン合成及び糖新生等の或る特定の代謝経路を抑制する、グローバル調節タンパク質ＣｓｒＡ（炭素貯蔵調節因子）をコードする（１０１、１０２）。大腸菌におけるｃｓｒＡの破壊はバイオフィルム形成の増強を引き起こし（１０１、１０３）、興味深いことに、ネズミチフス菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）におけるＣｓｒＡホモログの活性化は、他の標的に対するＣｓｒＡの効果のために、上皮細胞の浸潤の増大を引き起こした（１０４、１０５）。したがって、ヘム制限下のポルフィロモナス・ジンジバリスはＦｒｄ活性の低減の結果としてのＡＴＰレベルの低さのためにバイオフィルムを形成する可能性が低く、それによりインターナリンを含む宿主細胞浸潤タンパク質が栄養枯渇の終了までの上皮細胞中への逃避を促すために上向き調節されると推測することは非常に魅力的である。
【０１１８】
浮遊状態と比較してバイオフィルム状態時では、解糖酵素グリセルアルデヒド３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）はより高い存在量で存在し、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）及びシュードモナス・エルギノーサに関して得られた以前の結果と一致する（１２、１０６）。ＧＡＰＤＨは解糖及び糖新生に関与する四量体ＮＡＤ結合酵素として分類されるがこのタンパク質が多機能性であるという多数の報告が存在しており、グラム陽性細菌の細胞表面で発現する場合には、プラスミン、プラスミノーゲン及びトランスフェリンの結合に関与するようである（１０７、１０８）。興味深いことに、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）とポルフィロモナス・ジンジバリス３３２７７との間における共凝集が、ポルフィロモナス・ジンジバリスの線毛とストレプトコッカス・オラリスのＧＡＰＤＨとの相互作用により媒介されることが示されている（１０９）。しかし、ポルフィロモナス・ジンジバリスでの基質結合におけるＧＡＰＤＨの正確な役割は、存在するとしても、それについてはまだ答えが得られていない。
バイオフィルム形成
ユニバーサルストレスタンパク質（ＵｓｐＡ）は、バイオフィルム細胞と比較して浮遊細胞において顕著に高い存在量で存在していた。様々な細菌中でのＵｓｐの産生は、定常期に入ること、或る特定の栄養素の欠乏、酸化剤、及び他の刺激等の多様な条件により刺激されることが見出された（１１０、１１１）。浮遊期の細胞における存在量の増大は、ポルフィロモナス・ジンジバリスがバイオフィルムの一部分として進展して増殖するという事実、及び浮遊期がよりストレスが多いと思われるという事実と一致する。ＵｓｐＡの不活性化は浮遊細胞による初期バイオフィルム形成の減少をもたらしたので、ポルフィロモナス・ジンジバリスにおけるＵｓｐＡの発現は、バイオフィルム形成と関連すると考えられる（１１２）。本研究ではバイオフィルムは確立され成熟に到達しているので、自由に浮いている浮遊細胞と比較してＵｓｐＡに対する必要性はより低いようである。
【０１１９】
インターナリンファミリータンパク質ＩｎＩＪ（ＰＧ０３５０）のホモログで、バイオフィルム状態時の存在量がより高いことが観察された。ＰＧ０３５０は、遺伝子の不活性化がバイオフィルム形成の低減をもたらしたので、ポルフィロモナス・ジンジバリス３３２７７のバイオフィルム形成にとって重要であることが示されている（３９）。バイオフィルムにおけるより高いレベルのＰＧ０３５０は、このタンパク質が初期バイオフィルム形成のためのみに要求され得るのではなく、ポルフィロモナス・ジンジバリスを互いと、又はバイオフィルム内の細胞外基質と結合させるアドヘシンに作用することを示唆し得た。
機能が未知のタンパク質
本研究で同定した最大のタンパク質群は、本研究で最初に同定した４種類のタンパク質を含む機能が未知の４１種類のタンパク質であった（表２）。同定した４１種類のタンパク質のうち３７種類は細胞外被由来であると予測され、この群内で１７種類のタンパク質はバイオフィルム細胞と浮遊細胞との間において有意な変化を示す。これらのタンパク質の大部分は、名称は定義されているが機能は十分に定義されていないＧｅｎＢａｎｋのタンパク質と相同性を有する。バイオフィルム状態において存在量が実質的に増大することが一貫して見出された複数のタンパク質、すなわちＰＧ０１８１、ＰＧ０６１３、ＰＧ１３０４、ＰＧ２１６７及びＰＧ２１６８に特に関心がもたれる。
【０１２０】
上記結果は、複雑な混合物に適用される１６Ｏ／１８Ｏタンパク質分解標識化法の大規模の確認を表すものであり、細菌のバイオフィルム増殖状態と浮遊増殖状態との比較のためにこのアプローチを使用した最初のものである。様々な機能を有する相当数のタンパク質が、バイオフィルム細胞中の存在量において一貫して増大又は減少することが見出され、細胞がどのようにしてバイオフィルム条件に適応するのかを示し、また、バイオフィルム制御戦略のための潜在的な標的をもたらした。
【実施例】
【０１２１】
治療を対象とする本発明の一態様を具体化する組成物の例示を助けるために、以下の実例の処方が提供される。
【０１２２】
以下は、練り歯磨き処方の例である。
成分                                                          重量％
リン酸二カルシウム二水和物                                  ５０．０
グリセロール                                                ２０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                          １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                                        １．５
ラウロイルサルコシンナトリウム（Sodium lauroyl sarconisate）  ０．５
香料                                                          １．０
サッカリンナトリウム                                          ０．１
グルコン酸クロルヘキシジン                                  ０．０１
デキストラナーゼ                                            ０．０１
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．２
水                                                    残り（balance）
以下は、練り歯磨き処方の例である。
成分                                                          重量％
リン酸二カルシウム二水和物                                  ５０．０
ソルビトール                                                １０．０
グリセロール                                                １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                          １．０
ラウリル硫酸ナトリウム                                        １．５
ラウロイルサルコシンナトリウム                                ０．５
香料                                                          １．０
サッカリンナトリウム                                          ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                  ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                  ０．０１
デキストラナーゼ                                            ０．０１
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．２
水                                                              残り
以下は、練り歯磨き処方の例である。
成分                                                          重量％
リン酸二カルシウム二水和物                                  ５０．０
ソルビトール                                                １０．０
グリセロール                                                １０．０
カルボキシメチルセルロースナトリウム                          １．０
ラウロイルジエタノールアミド                                  １．０
モノラウリン酸スクロース                                      ２．０
香料                                                          １．０
サッカリンナトリウム                                          ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                  ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                  ０．０１
デキストラナーゼ                                            ０．０１
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．１
水                                                              残り
以下は、練り歯磨き処方の例である。
成分                                                          重量％
ソルビトール                                                ２２．０
アイリッシュ・モス                                            １．０
水酸化ナトリウム（５０％）                                    １．０
Ｇａｎｔｒｅｚ                                              １９．０
水（脱イオン化）                                            ２．６９
モノフルオロリン酸ナトリウム                                ０．７６
サッカリンナトリウム                                          ０．３
ピロリン酸                                                    ２．０
水和アルミナ                                                ４８．０
フレーバーオイル                                              ０．９５
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．３
ラウリル硫酸ナトリウム                                      ２．００
以下は、液体練り歯磨き（liquid toothpaste）処方の例である。
成分                                                          重量％
ポリアクリル酸ナトリウム                                    ５０．０
ソルビトール                                                １０．０
グリセロール                                                ２０．０
香料                                                          １．０
サッカリンナトリウム                                          ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                  ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                  ０．０１
エタノール                                                    ３．０
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．２
リノール酸                                                  ０．０５
水                                                              残り
以下は、洗口剤処方の例である。
成分                                                          重量％
エタノール                                                  ２０．０
香料                                                          １．０
サッカリンナトリウム                                          ０．１
モノフルオロリン酸ナトリウム                                  ０．３
グルコン酸クロルヘキシジン                                  ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド                                  ０．３
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．２
水                                                              残り
以下は、洗口剤処方の例である。
成分                                                          重量％
Ｇａｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｓ−９７                            ２．５
グリセリン                                                  １０．０
フレーバーオイル                                              ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム                                ０．０５
グルコン酸クロルヘキシジン                                  ０．０１
ラウロイルジエタノールアミド                                  ０．２
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．３
水                                                              残り
以下は、ロゼンジの処方の例である。
成分                                                          重量％
砂糖                                                      ７５〜８０
コーンシロップ                                              １〜２０
フレーバーオイル                                            １〜２
ＮａＦ                                            ０．０１〜０．０５
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．３
ステアリン酸Ｍｇ                                              １〜５
水                                                              残り
以下は、歯肉用マッサージクリームの処方の例である。
成分                                                          重量％
白色ワセリン                                                  ８．０
プロピレングリコール                                          ４．０
ステアリルアルコール                                          ８．０
ポリエチレングリコール４０００                              ２５．０
ポリエチレングリコール４００                                ３７．０
モノステアリン酸スクロース                                    ０．５
グルコン酸クロルヘキシジン                                    ０．１
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．３
水                                                              残り
以下は、歯周ゲルの処方の例である。
成分                                                                  重量％
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７（BASFから入手）                          ２０．０
ステアリルアルコール                                                  ８．０
パモ酸オキサンテル                                                    ３．０
コロイド性二酸化ケイ素（Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標）２００（商標）等）  １．０
グルコン酸クロルヘキシジン                                            ０．１
水                                                                      残り
以下は、チューインガムの処方の例である。
成分                                                          重量％
ガム基剤                                                    ３０．０
炭酸カルシウム                                                ２．０
結晶性ソルビトール                                          ５３．０
グリセリン                                                    ０．５
フレーバーオイル                                              ０．１
バイオフィルム阻害剤（パモ酸オキサンテル）                    ０．３
水                                                              残り
【０１２３】
【表１−１】
0005476297.tif 000009
【０１２４】
【表１−２】
0005476297.tif 000010
【０１２５】
【表２−１】
0005476297.tif 000011
【０１２６】
【表２−２】
0005476297.tif 000012
【０１２７】
【表２−３】
0005476297.tif 000013
【０１２８】
【表２−４】
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【０１２９】
【表２−５】
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【０１３０】
【表２−６】
0005476297.tif 000016
【０１３１】
【表３−１】
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【０１３２】
【表３−２】
0005476297.tif 000018
【０１３３】
【表３−３】
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【０１３４】
【表４−１】
0005476297.tif 000020
【０１３５】
【表４−２】
0005476297.tif 000021
【０１３６】
【表５】
0005476297.tif 000022
【０１３７】
【表６】
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【０１３８】
【表７】
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【０１３９】
【表８】
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【０１４０】
【表９−１】
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【０１４１】
【表９−２】
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【０１４２】
【表９−３】
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【０１４３】
【表９−４】
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【０１４４】
【表９−５】
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【図１】
0005476297.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005476297.tif 000036
【図７】
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【図８】
0005476297.tif 000038
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
0005476297.tif 000042
【図１３】
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【図１４】
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