(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌患者から摘出された組織に含まれる細胞のＣＤＫ１の活性値と発現量、ＣＤＫ２の活性値と発現量、及びＫｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量を取得し、
下記式（１）に基づいて再発リスクスコアを求め、再発リスクスコアと予め設定された第１の閾値とを比較し、Ｋｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量と予め設定された第２の閾値とを比較し、
再発リスクスコア≧第１の閾値かつＫｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量≧第２の閾値であるとき、癌の再発リスクが高いと判定し、
再発リスクスコア＜第１の閾値かつＫｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量＜第２の閾値であるとき、癌の再発リスクが低いと判定し、
前記Ｋｉ６７タンパク質の発現細胞率が、下記式（２）に基づいて求められた値であることを特徴とする、癌の再発リスク判定方法。
再発リスクスコア＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）・・・（１）
（式中、ｘはＣＤＫ１の比活性を表し、このＣＤＫ１の比活性は、ＣＤＫ１の活性値／ＣＤＫ１の発現量で示される：
式中、ｙは比活性比を表し、この比活性比は、ＣＤＫ２の比活性／ＣＤＫ１の比活性で示される）
Ｋｉ６７タンパク質の発現細胞率＝Ｋｉ６７タンパク質が発現している細胞の数／測定対象の細胞の数×１００・・・（２）
【請求項２】
Ｆ（ｘ）及びＧ（ｙ）は、下記式（３）及び（４）である、請求項１に記載の癌の再発リスク判定方法。
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ））・・・（３）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ））・・・（４）
（式中、ａ〜ｃはｘと癌の再発率との相関関係から定められた定数であり、ｄ〜ｆはｙと癌の再発率との相関関係から定められた定数である）
【請求項３】
再発リスクスコア＜第１の閾値かつＫｉ６７タンパク質の発現細胞率＜第２の閾値であるとき、癌の再発リスクが低いと判定する、請求項１又は２に記載の癌の再発リスク判定方法。
【請求項４】
再発リスクスコア＜第１の閾値かつＫｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量≧第２の閾値、又は、再発リスクスコア≧第１の閾値かつＫｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量＜第２の閾値であるとき、癌の再発リスクが中程度であると判定する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の癌の再発リスク判定方法。
【請求項５】
前記Ｋｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量は、Ｋｉ６７タンパク質の発現細胞率である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の癌の再発リスク判定方法。
【請求項６】
癌患者から摘出された組織が乳腺組織である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の癌の再発リスク判定方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の癌の再発リスク判定方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の再発リスクを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の再発リスクを判定する方法として、癌患者から採取した細胞に含まれるＫｉ６７タンパク質を癌マーカーとして用いた病理学的評価方法が知られている。例えば非特許文献１には、測定細胞数に占めるＫｉ６７発現細胞数の割合と癌の組織病理学的等級とには相関があり、Ｋｉ６７が発現している細胞数の割合が高いほど癌の再発リスクが高まることが記載されている。ここでは、細胞内のＫｉ６７を特異的に染色させる試薬を用いて、Ｋｉ６７が発現している細胞のみを染色し、全細胞数に占めるＫｉ６７が発現している細胞数の割合を算出している。
また、非特許文献２には、ｋｉ６７遺伝子を含む２１の遺伝子群の発現の有無を解析して再発スコアを算出し、再発スコアの結果を３段階（再発リスクが高い、中程度、低い）に分類して、再発リスク判定を行う方法が記載されている。
この非特許文献２では、再発スコアによる分類結果の信頼性を示す指標として、統計学的手法を用いて算出されたハザードレシオ（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ：ＨＲ）が示されているが、ＨＲの改善されたさらなる判定方法が求められている。
一方、特許文献１には、サイクリン依存性キナーゼ（以下ＣＤＫとも言う）を利用した癌の再発リスクを判定する方法が記載されている。この方法では、２種類のＣＤＫの活性値と発現量に基づいて得られた再発リスクスコアと所定の閾値と比較することにより、癌の再発リスク判定を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２３２８１５号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Mark J Beresford etal Breast Cancer Research 2006,8:216
【非特許文献２】N Engl J Med 2004; 351：2817-26
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、２種類のＣＤＫの活性値と発現量に基づいて得られた再発リスクスコアと所定の閾値と比較する癌の再発リスク判定方法を用いて、より信頼性の高い癌の再発リスク判定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明によれば、
癌患者から摘出された組織に含まれる細胞のＣＤＫ１の活性値と発現量、ＣＤＫ２の活性値と発現量、及びＫｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量を取得し、
下記式（１）に基づいて再発リスクスコアを求め、再発リスクスコアと予め設定された第１の閾値とを比較し、Ｋｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量と予め設定された第２の閾値とを比較し、
再発リスクスコア≧第１の閾値かつＫｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量≧第２の閾値であるとき、癌の再発リスクが高いと判定し、
再発リスクスコア＜第１の閾値かつＫｉ６７タンパク質の発現細胞率又は発現量＜第２の閾値であるとき、癌の再発リスクが低いと判定し、
前記Ｋｉ６７タンパク質の発現細胞率が、下記式（２）に基づいて求められた値であることを特徴とする、癌の再発リスク判定方法が提供される。
再発リスクスコア＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）・・・（１）
（式中、ｘはＣＤＫ１の比活性を表し、このＣＤＫ１の比活性は、ＣＤＫ１の活性値／ＣＤＫ１の発現量で示される：
式中、ｙは比活性比を表し、この比活性比は、ＣＤＫ２の比活性／ＣＤＫ１の比活性で示される）
Ｋｉ６７タンパク質の発現細胞率＝Ｋｉ６７タンパク質が発現している細胞の数／測定対象の細胞の数×１００・・・（２）
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、２種類のＣＤＫの活性値と発現量に基づいて得られた再発リスクスコアと所定の閾値と比較する癌の再発リスク判定方法を用いて、より信頼性の高い癌の再発リスク判定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】癌の再発リスク判定を実行するコンピュータにおける一実施形態を示す図である。
【図２】癌の再発リスク判定のフローを示す図である。
【図３】図３（ａ）は、複数の癌患者から得られたＣＤＫ１比活性と癌の再発率との関係を示したヒストグラムであり、図１（ｂ）は、複数の癌患者から得られたＣＤＫ１とＣＤＫ２の比活性比と癌の再発率との関係を示したヒストグラムである。
【図４】ＣＤＫ１により増殖速度を比較した結果を示すグラフである。
【図５】ＣＤＫ２により増殖速度を比較した結果を示すグラフである。
【図６】ＣＤＫ２／ＣＤＫ１により増殖速度を比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
癌患者から摘出された組織に含まれる細胞の第１のサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の活性値と発現量、第２のＣＤＫの活性値と発現量、及びＫｉ６７の発現細胞数又は発現量を取得し、取得した第１ＣＤＫの活性値と発現量、第２ＣＤＫの活性値と発現量、及びＫｉ６７の発現細胞率又は発現量に基づいて癌の再発リスクを判定することを特徴とする。
【００１０】
ここで、本明細書における「再発」とは、癌患者から悪性腫瘍を摘出するために臓器を部分切除した後、残存臓器に同じ悪性腫瘍が再現する場合、及び原発巣から腫瘍細胞が分離して遠隔組織（遠隔臓器）へ運ばれ、そこで自立的に増殖する場合（転移再発）をいうものとする。
また、本明細書における「再発リスク」とは、癌患者の身体に癌が再発する危険、または癌が再発することによって癌患者が死亡する危険を意味する。本明細書中で特に断らない限り、「再発リスク」はそのいずれも含むものとする。
【００１１】
癌患者から摘出した組織とは、癌患者の生体組織のうち、繊維性結合組織、軟骨組織、骨組織、血液やリンパ等の支持組織、上皮組織、筋組織、神経組織、外分泌組織、内分泌組織といった組織であればよく、好ましくは、乳房に存在する外分泌組織である乳腺組織である。また、これら組織は、個体としての調和を破り、増殖の制御機構に異常を来たしている腫瘍組織のように、病理的情報を得たい細胞を含む組織が好適である。例えば、癌患者から悪性腫瘍を取り除くために摘出された組織である。
【００１２】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）とは、サイクリンと結合して活性化される酵素群の総称で、単独では活性をもたないが、サイクリンと結合して活性型となる。ＣＤＫは、その種類に応じて、細胞周期の特定時期で機能している。ＣＤＫとしては、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、サイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、及びサイクリンＤ依存性キナーゼなどが挙げられる。
ここに挙げた複数種のＣＤＫから第１のＣＤＫと第２のＣＤＫとを決定し、癌患者から摘出した組織に含まれる細胞の第１ＣＤＫ及び第２ＣＤＫの活性値と発現量を測定する。
【００１３】
ＣＤＫ活性値とは、特定のサイクリンと結合して、そのサイクリンをリン酸化する基質の量から算出されるキナーゼ活性のレベル（単位をＵ（ユニット）で表す）をいう。なお、前記ＣＤＫがリン酸化する基質としては、例えば、活性型ＣＤＫ１及び活性型ＣＤＫ２については、ヒストンＨ１が挙げられ、活性型ＣＤＫ４及び活性型ＣＤＫ６については、Ｒｂ（網膜芽細胞腫タンパク質）が挙げられる。ＣＤＫ活性値は、慣用のＣＤＫ活性測定方法によって測定することができる。具体的には、測定試料の細胞溶解液から活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、試料と、３２Ｐ標識したＡＴＰ（γ−〔３２Ｐ〕−ＡＴＰ）とを用いて、基質タンパク質に３２Ｐを取り込ませ、３２Ｐ標識されたリン酸化基質の標識量を測定し、標準品で作成された検量線をもとに定量する方法がある。また放射性物質の標識を用いない方法としては、特開２００２−３３５９９７号に開示の方法が挙げられる。この方法は、検体の細胞可溶化液から、目的の活性型ＣＤＫを含む試料を調製し、アデノシン５'−Ｏ−（３−チオトリホスフェート）（ＡＴＰ−γＳ）と基質を反応させて、該基質タンパク質のセリン又はスレオニン残基にモノチオリン酸基を導入し、導入されたモノチオリン酸基の硫黄原子に標識蛍光物質又は標識酵素を結合させることによって基質タンパク質を標識し、標識されたチオリン酸基質の標識量（標識蛍光物質を用いた場合には蛍光量）を測定し、標準品で作成された検量線に基づいて定量する方法である。
【００１４】
活性測定に供する試料は、測定対象となる細胞を含む組織の可溶化液から目的のＣＤＫを特異的に採集することにより調製する。この場合、試料は目的のＣＤＫに特異的な抗ＣＤＫ抗体を用いて調製してもよいし、特定のサイクリン依存性キナーゼ（例えばサイクリンＡ依存性キナーゼ、サイクリンＢ依存性キナーゼ、サイクリンＥ依存性キナーゼ）活性測定の場合には、抗サイクリン抗体を用いて調製してもよい。いずれの場合も活性型ＣＤＫ以外のＣＤＫが試料に含まれることになる。例えばサイクリン・ＣＤＫ複合体にＣＤＫインヒビターが結合した複合体も含まれる。また、抗ＣＤＫ抗体を用いた場合には、ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体などが含まれる。従って、活性値は、活性型、不活性型、各種競合反応が混在する状態下で、リン酸化された基質を定量することで活性型の存在量（Ｕ）として測定される。
【００１５】
ＣＤＫ発現量とは、測定対象である細胞を緩衝液等に懸濁して作成された細胞可溶化液に含まれる目的のＣＤＫ量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物から目的のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。例えば、ＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロット法などを使用してもよいし、特開２００３−１３０８７１号に開示の方法で測定することもできる。目的のタンパク質（ＣＤＫ）は、特異的抗体を用いて捕捉すればよい。例えば、抗ＣＤＫ１抗体を用いることにより、細胞内に存在するＣＤＫ１のすべて（ＣＤＫ単体、ＣＤＫとサイクリン及び／又はＣＤＫインヒビターの複合体、ＣＤＫとその他の化合物との複合体を含む）を捕捉できる。
【００１６】
再発リスクスコアとは、第１ＣＤＫ及び第２ＣＤＫの活性値及び発現量から得られる値である。再発リスクスコアとしては、活性値及び発現量の何れかを単独で用いてもよいし、活性値と発現量とを加減乗除などして計算される値を用いても良いが、活性値と発現量との比を用いることが好ましい。活性値と発現量との比としては、活性値を発現量で除することにより得られる値（活性値／発現量＝比活性）、発現量を活性値で除することにより得られる値（発現量／活性値＝比活性の逆数）などを用いることができる。
【００１７】
例えば、再発リスクスコアとしては、下記式 （５）乃至（７）に基づいて得られた値を用いることができる。
再発リスクスコアＲＲＳ＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）・・・（５）
Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ））・・・（６）
Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ））・・・（７）
（式中、ａ〜ｆは定数）
上記式において、ｘは第１ＣＤＫの比活性を表し、ｙは比活性比を表す。ここで、ＣＤＫ比活性は、ＣＤＫ活性値／ＣＤＫ発現量で示され、比活性比は、第２ＣＤＫ比活性／第１ＣＤＫ比活性で示される。
【００１８】
ここで、上記式（５）乃至（７）によって再発リスクスコアを算出しうる根拠を説明する。  まず、ＣＤＫ比活性と、比活性比の意義について説明する。
ＣＤＫ比活性は、ＣＤＫの発現量に対する活性値の比である。ＣＤＫ比活性は、試料に含まれる単位ＣＤＫタンパク質量あたりのＣＤＫ酵素活性を反映する値であって、細胞に存在しているＣＤＫのうちの活性を示すＣＤＫの割合に相当し、判定対象である腫瘍細胞の増殖状態に基づくＣＤＫ活性レベルを示す。
【００１９】
また、比活性比は、第１ＣＤＫの比活性に対する第２ＣＤＫの比活性の比である。ＣＤＫ比活性比は、特定の細胞周期において活性を示す二種類のＣＤＫの活性レベルの比であり、癌患者の細胞においていずれのＣＤＫ活性が優位であるか（細胞周期のいずれの時期にある細胞割合がどの程度であるか）を反映する値である。
一般に、癌細胞は正常な増殖制御を逸脱して増殖が活発に行われていることから、ＤＮＡの複製期であるＳ期と、ＤＮＡ合成の終了から有糸分裂の開始の間であるＧ２期にある細胞の割合が多い場合に、その細胞が癌化しているものと考えることができる。また、癌細胞に見られる異数倍体性は、細胞分裂期であるＭ期を異常な状態で経過した場合や、又はＭ期を経ずにＧ１期に進み、そのままＳ期に移行したときに発生するものと考えられるため、Ｍ期に存在する細胞割合が少ない場合にも、その細胞が癌化していると考えることができる。
【００２０】
そこで、例えば、第１ＣＤＫとして細胞周期のＧ２期からＭ期に移行する際に活性を示すＣＤＫ１を、第２ＣＤＫとして細胞周期のＧ１期からＳ期に移行する際に活性を示すＣＤＫ２を使用し、これらに基づいてＣＤＫ比活性比を求めた場合には、得られるＣＤＫ比活性比は、Ｓ期またはＧ２期にある細胞が、Ｍ期にある細胞に比べてどれだけ多く存在するかを反映する数値であり、細胞の増殖速度を示す指標となることがわかる。すなわち、再発リスクスコアは細胞の増殖速度を示す指標となる値である。
【００２１】
次に、再発リスクスコアを算出するための式（５）乃至（７）について説明する。
上記において例示したように、第１ＣＤＫ比活性と、第２ＣＤＫ比活性とに基づくＣＤＫ比活性比を得ることにより、細胞の増殖速度（癌の再発リスク）に相関する値を得ることができる。
しかし、ＣＤＫ１比活性が異常に大きい場合には、ＣＤＫ比活性比が細胞の増殖速度に相関しない場合がありうる。例えば、上記において例示したように、第１ＣＤＫとしてＣＤＫ１を、第２ＣＤＫとしてＣＤＫ２を用いてＣＤＫ比活性比を求めたとき、ＣＤＫ１比活性が異常に大きい場合には、ＣＤＫ比活性比の値は小さくなる。これは別の観点からみれば、ＣＤＫ１と複合体を形成するサイクリンが高発現し、ＣＤＫ１が異常に活性化されているとも考えられる。細胞は、ある細胞周期に活性化するＣＤＫが少なくても、他の特定のＣＤＫが代償的に働くことによって増殖することが可能であるとも考えられており、特定のＣＤＫが異常に活性化されている場合にも、細胞動態に異常を来たしていると考えることができる。
【００２２】
そこで、癌の再発リスクが、（Ａ）第１ＣＤＫの比活性、（Ｂ）第１ＣＤＫと第２ＣＤＫの比活性比の二つのリスク要素によって規定されるものと考え、これらのリスク要素に基づいて癌の再発リスクを評価する。上記（Ａ）、（Ｂ）の各リスク要素に基づいて癌が再発する確率を、数値的に評価する尺度を用いて、それぞれリスクスコアＲＳ（Ａ）、リスクスコアＲＳ（Ｂ）とする。さらに、上記（Ａ）、（Ｂ）のリスク要素によって結果的に癌が再発する確率を、数値的に評価する尺度を用いて、再発リスクスコアＲＲＳとする。結果的に癌が再発する確率、すなわち再発リスクは、上記（Ａ）、（Ｂ）の二つのリスク要素によって癌が再発する確率の積によって与えられるので、再発リスクスコアＲＲＳは、リスクスコアＲＳ（Ａ）とリスクスコアＲＳ（Ｂ）の積に比例する値で与えられる。したがって、
ＲＲＳ＝ＲＳ（Ａ）×ＲＳ（Ｂ）・・・（８）
が成り立つ。
【００２３】
リスクスコアＲＳ（Ａ）及びリスクスコアＲＳ（Ｂ）は、以下のようにして求められる。
図３（ａ）は、複数の癌患者から得られたＣＤＫ１比活性と癌の再発率との関係を示したヒストグラムであり、図３（ｂ）は、複数の癌患者から得られたＣＤＫ１とＣＤＫ２の比活性比と癌の再発率との関係を示したヒストグラムである。同図においては、複数の癌患者を、当該癌患者から得られたＣＤＫ１比活性、又はＣＤＫ１とＣＤＫ２の比活性比に基づいて階級分けし、各階級に含まれる症例の総数を白抜きの棒グラフで、各階級に含まれる再発症例を網掛けの棒グラフで示した。さらに、各階級における癌の再発確率（再発症例数／症例総数）を求め、折れ線で示した。
【００２４】
同図からも明らかなように、癌の再発確率は、ＣＤＫ１比活性、又はＣＤＫ１とＣＤＫ２の比活性比に伴って単調に増加することがわかる。したがって、各階級ごとの癌の再発確率を近似することにより、ＣＤＫ１比活性をリスク要素とするリスクスコアＲＳ（Ａ）、及びＣＤＫ１とＣＤＫ２の比活性比をリスク要素とするリスクスコアＲＳ（Ｂ）を得ることができる。そこで、ＣＤＫ１比活性の値をｘ、ＣＤＫ１とＣＤＫ２の比活性比をｙとして、各階級ごとの癌の再発確率をロジスティック関数によって近似し、リスクスコアＲＳ（Ａ）及びリスクスコアＲＳ（Ｂ）を下記式として得た。
ＲＳ（Ａ）；Ｆ（ｘ）＝ａ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−ｂ）×ｃ））・・・（９）
ＲＳ（Ｂ）；Ｇ（ｙ）＝ｄ／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−ｅ）×ｆ））・・・（１０）
（式中、ａ〜ｆは定数）
以上より、再発リスクスコアＲＲＳは、
ＲＲＳ＝Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）・・・（１１）
によって表され、上記式（５）を導くことができる。
【００２５】
Ｋｉ６７とは、細胞内において、細胞周期Ｇ０期では発現していないが、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期では発現しているタンパク質である。このタンパク質が発現している細胞は、その細胞が増殖期（増殖状態）にあるということがわかる。癌患者から摘出した組織に含まれる細胞において、Ｋｉ６７が発現している細胞の数が多いほど、その摘出した組織が癌化している可能性があるということが示唆される。このため、Ｋｉ６７を細胞増殖と細胞周期のマーカーとして利用できることが知られている。
【００２６】
Ｋｉ６７の発現細胞率は、癌患者から摘出された組織に含まれる細胞のうち、Ｋｉ６７が発現している細胞数の割合から求めることができる。Ｋｉ６７発現細胞数は、Ｋｉ６７と特異的に結合する抗体に色素を結合させたものを用いて細胞内のＫｉ６７を染色し、染色された細胞を計数することにより求めることができる。
Ｋｉ６７発現細胞数の割合から求められるＫｉ６７発現細胞率は、Ｋｉ６７が発現している細胞の数を測定対象の細胞の数で除することにより求めることができる（下記式（１２））。
Ｋｉ６７発現細胞率＝Ｋｉ６７が発現している細胞の数／測定対象の細胞の数×１００・・（１２）
なお、Ｋｉ６７発現細胞率は、癌患者から悪性腫瘍を取り除くために摘出した組織に含まれる細胞の数のうち、Ｋｉ６７が発現している細胞の割合とすることが好ましい。
【００２７】
上記のＫｉ６７発現細胞率を求める方法の一例としては、まずＫｉ６７と特異的に結合するＭＩＢ抗体などを用いて、癌患者から摘出された組織に含まれる細胞に免疫学的染色を施す。この免疫学的染色は従来公知の方法で行うことができる。そして、染色された細胞をスライドグラス上に固定し、測定試料中の細胞数のうち染色された細胞数の割合を画像解析装置により算出して求めることができる。なお、上記測定試料は、癌患者から悪性腫瘍を取り除くために摘出した組織であることが好ましい。
【００２８】
Ｋｉ６７の発現量としては、癌患者から摘出した組織に含まれる細胞に含まれるＫｉ６７量（分子個数に対応する単位）であって、タンパク質混合物からＫｉ６７に特異的な抗体を用いてＫｉ６７のタンパク質量を測定する従来公知の方法で測定できる。また、Ｋｉ６７と特異的に結合する抗体に色素を結合させたものを用いて細胞内のＫｉ６７を染色し、染色された細胞の染色強度を測定することにより、Ｋｉ６７の発現量を求めることもできる。さらに、細胞中のｋｉ６７遺伝子の発現レベルをＫｉ６７の発現量とすることもできる。このＫｉ６７遺伝子の発現レベルは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析、ｍＲＮＡの発現を定量化するノーザンブロッティングやＲＴ−ＰＣＲ等といった従来公知の遺伝子発現分析法により測定できる。
【００２９】
上記において取得した、第１ＣＤＫの活性値と発現量、第２ＣＤＫの活性値と発現量、及びＫｉ６７の発現細胞率又は発現量とに基づいて癌の再発リスクを判定することができる。再発リスクを判定する方法としては、例えば、上記において説明した再発リスクスコア及びＫｉ６７発現細胞率と、予め設定された閾値とを比較することによって判定することができる。
具体的には、癌患者の再発リスクスコアと第１の閾値とを比較し、癌患者のＫｉ６７発現細胞率と第２の閾値とを比較して、癌患者の再発リスクスコアが第１の閾値より高い、かつＫｉ６７発現細胞率が第２の閾値より高い場合には、再発リスクが高いと判定することができる。
【００３０】
なお、再発リスクスコアが第１の閾値より低くかつＫｉ６７発現細胞率が第２の閾値より低い場合には、再発リスクが低いと判定するようにしてもよい。また、再発リスクスコアは第１の閾値より高いがＫｉ６７発現細胞率は第２の閾値より低い場合、及び再発リスクスコアは第１の閾値より低いがＫｉ６７発現細胞率は第２の閾値より高い場合には、再発リスクは中程度であると判定するようにしてもよい。
【００３１】
閾値は、種々の方法によって設定することができる。例えば、再発リスクスコアにおいては、癌の悪性度についての病理医の判定が既知である複数の癌患者から摘出された組織の腫瘍細胞のそれぞれについて、上記の再発リスクスコアＲＳＳの式に基づいて再発リスクスコアを算出し、癌の再発が認められた患者群と、癌の再発が認められなかった患者群の２集団に分類しうるような値を閾値として設定することができる。あるいは、再発リスクが高い、中程度、低い等、異なる範囲ごとに閾値を複数設定し、癌の再発リスクを段階的に評価、判定するようにしてもよい。
Ｋｉ６７発現細胞率においても同様に閾値を設定することができる。例えば、癌の悪性度についての病理医の判定が既知である複数の癌患者から摘出された組織の腫瘍細胞のそれぞれについて、上記（１２）式に基づいてＫｉ６７発現細胞率を算出し、癌の再発が認められた患者群と、癌の再発が認められなかった患者群の２集団に分類しうるような値を閾値として設定することができる。
なお、Ｋｉ６７発現量においても上記と同様に閾値を設定することができ、再発リスクスコア及びＫｉ６７発現量と、予め設定された閾値とを比較することによって癌の再発リスクを判定するようにしてもよい。
【００３２】
上記の実施形態の癌の再発リスク判定方法における各工程は、コンピュータにおいて実施させることができる。以下、本発明の癌の再発リスク判定方法を実施するための一実施形態であるコンピュータを図１に示す。
【００３３】
コンピュータ１００は、本体１１０と、表示部１２０と、入力デバイス１３０とから主として構成されている。本体１１０は、ＣＰＵ１１０ａと、ＲＯＭ１１０ｂと、ＲＡＭ１１０ｃと、ハードディスク１１０ｄと、読出装置１１０ｅと、入出力インターフェイス１１０ｆ、及び画像出力インターフェイス１１０ｈは、お互いにバス１１０ｉによってデータ通信可能に接続されている。
【００３４】
ＣＰＵ１１０ａは、ＲＯＭ１１０ｂに記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ１１０ｃにロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。
ＲＯＭ１１０ｂは、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等によって構成されており、ＣＰＵ１１０ａに実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
ＲＡＭ１１０ｃは、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭ等によって構成されている。ＲＡＭ１１０ｃは、ＲＯＭ１１０ｂ及びハードディスク１１０ｄに記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ１１０ａの作業領域として利用される。
【００３５】
ハードディスク１１０ｄは、オペレーティングシステム及びアプリケーションシステムプログラム等、ＣＰＵ１１０ａに実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。後述するアプリケーションプログラム１４０ａも、このハードディスク１１０ｄにインストールされている。
【００３６】
読出装置１１０ｅは、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によって構成されており、可搬型記憶媒体１４０に記録されたコンピュータプログラム又はデータを読み出すことができる。また、可搬型記憶媒体１４０には、コンピュータに判定に係るアプリケーションプログラム１４０ａが格納されており、ＣＰＵ１１０ａが可搬型記憶媒体１４０から当該アプリケーションプログラム１４０ａを読み出し、アプリケーションプログラム１４０ａをハードディスク１１０ｄにインストールすることも可能である。
【００３７】
また、ハードディスク１１０ｄには、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）などのグラフィカルユーザインターフェイス環境を提供するオペレーションシステムがインストールされている。以下の説明においては、上述した判定に係るアプリケーションプログラム１４０ａは、当該オペレーティングシステム上で動作するものとしている。
【００３８】
入出力インターフェイス１１０ｆは、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃ等のシリアルインターフェイス、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４等のパラレルインターフェイス、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインターフェイス等から構成されている。入出力インターフェイス１１０ｆには、キーボード及びマウスからなる入力デバイス１３０が接続されており、ユーザが当該入力デバイス１３０を使用することにより、コンピュータ本体１１０にデータを入力することが可能である。
【００３９】
また、入出力インターフェイス１１０ｆには、ＣＤＫの活性値と発現量、Ｋｉ６７の発現細胞数、及び測定対象の細胞数を測定する測定装置２００が接続されている。これにより、コンピュータ本体１１０は、測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介して、ＣＤＫ１比活性及びＣＤＫ２比活性／ＣＤＫ１比活性から算出された再発リスクスコアと、測定対象の細胞の数及びＫｉ６７が発現している細胞の数から算出されたＫｉ６７発現細胞率を取得することができる。
【００４０】
画像出力インターフェイス１１０ｈは、ＬＣＤまたはＣＲＴ等で構成された表示部１２０に接続されており、ＣＰＵ１１０ａから与えられた画像データに応じた映像信号を表示部１２０に出力するようになっている。表示部１２０は、入力された映像信号にしたがって、画像データを出力する。また、表示部１２０は、後述するＣＰＵ１１０ａから与えられた判定結果を出力する。
【００４１】
図２は、上記の癌の再発リスク判定を実行するためのアプリケーションプログラム１４０ａの動作を示すフローチャートである。
【００４２】
まず、測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介してＣＤＫ１の活性値と発現量、ＣＤＫ２の活性値と発現量、Ｋｉ６７が発現している細胞数、及び測定対象の細胞数が取得されると、ＣＰＵ１１０ａがＣＤＫ１の活性値と発現量、ＣＤＫ２の活性値と発現量、Ｋｉ６７が発現している細胞数、及び測定対象の細胞数をそれぞれＲＡＭ１１０ｃに記憶させる。そして、ＣＰＵ１１０ａは、ＲＡＭ１１０ｃに記憶されているＣＤＫ１の活性値と発現量、ＣＤＫ２の活性値と発現量、Ｋｉ６７が発現している細胞数、及び測定対象の細胞数から再発リスクスコア及びＫｉ６７発現細胞率を算出する。（ステップＳ１）。
【００４３】
ＣＰＵ１１０ａは、予めアプリケーションプログラム１４０ａのデータとしてメモリ１１０ｄに記憶させていた第１の閾値及び第２の閾値を呼び出して、第１の閾値と再発リスクスコア、及び第２の閾値とＫｉ６７発現細胞率との比較を実行する。
再発リスクスコアが第１の閾値以上かつＫｉ６７発現細胞率が第２の閾値以上の場合、癌の再発リスクが「高い」と判定する（ステップＳ２）。再発リスクスコアが第１の閾値未満またはＫｉ６７発現細胞率が第２の閾値未満の場合、ステップＳ３へ進む。
【００４４】
ステップＳ３では、再発リスクスコアが第１の閾値未満かつＫｉ６７発現細胞率が第２の閾値未満であるか否かが判断され、再発リスクスコアが第１の閾値未満かつＫｉ６７発現細胞率が第２の閾値未満の場合には、癌の再発リスクが「低い」と判定され、それ以外の場合には、癌の再発リスクが「中程度」と判定する。
【００４５】
そして、ＣＰＵ１１０ａは、上記の判定結果を、ＲＡＭ１１０ｃに格納するとともに画像出力インターフェイス１１０ｈを介して、表示部１２０に出力する（ステップＳ４）。
【００４６】
なお、本実施形態において、ＣＤＫ１の活性値と発現量、ＣＤＫ２の活性値と発現量、Ｋｉ６７が発現している細胞数、及び測定対象の細胞数は、測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介して取得するようにしていたが、これに限定されるものではなく、例えば、ＣＤＫ１の活性値と発現量、ＣＤＫ２の活性値と発現量、Ｋｉ６７が発現している細胞数、及び測定対象の細胞数を入力デバイス１３０により入力しインターフェイス１１０ｆを介して取得するようにしてもよい。
【００４７】
本実施形態において、再発リスクスコア及びＫｉ６７発現細胞率は、ＲＡＭ１１０ｃに記憶されているＣＤＫ１の活性値と発現量、ＣＤＫ２の活性値と発現量、Ｋｉ６７が発現している細胞数、及び測定対象の細胞数から、ＣＰＵ１１０ａによって算出されるようにしていたが、これに限定されるものではなく、再発リスクスコア及びＫｉ６７発現細胞率を測定装置２００から入出力インターフェイス１１０ｆを介して取得するようにしてもよい。また、再発リスクスコア及びＫｉ６７発現細胞率を入力デバイス１３０により入力し、入出力インターフェイス１１０ｆを介して取得するようにしてもよい。
【００４８】
本実施形態において、癌の再発リスクを「高い」「低い」「中程度」と判定しているが、これに限定されるものではなく、癌の再発リスクを「高い」「低い」と判定してもよい。例えば、再発リスクスコアが閾値以上、かつＫｉ６７発現細胞率が閾値以上である場合には癌の再発リスクが「高い」と判定し、再発リスクスコアが閾値未満、またはＫｉ６７発現細胞率が閾値未満である場合には、癌の再発リスクが「低い」と判定するようにしてもよい。
【実施例】
【００４９】
実施例１：ＣＤＫの活性値を用いた癌細胞の増殖速度の測定
乳癌細胞株をヌードマウスの皮下に移植し、担癌マウスを作成した。移植後、１６日〜４２日目に腫瘍を摘出し、各腫瘍の重量と、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の比活性比（ＳＡ）を測定した。
【００５０】
（１）担癌マウスの作成
１９種類の乳癌細胞株を、３７度のＣＯ２インキュベーターで培養し細胞を回収した（Ｃａ．７０％Ｃｏｎｆｌｉｅｎｃｙ）。各細胞株の培養条件については下記の表１に示す。
回収した各細胞株を１×１０８個／ｍＬになるように懸濁し、高濃度マトリジェルで２倍希釈したのち、１００ｕＬずつヌードマウスの皮下に移植した。
各細胞株を移植後、１６日〜４２日後に摘出して重量を測定した後に液体窒素にて凍結保存した。このとき、下記の表１に示すＨＣＣ１８０６については増殖速度が速く１６日目に摘出したが、その他の細胞株については、２８日〜４２日の間で腫瘍細胞が十分な大きさに達したものから摘出した。
【００５１】
【表１】
0005553661.tif 000002
【００５２】
摘出した腫瘍細胞の重量をマウスに移植してから細胞を採取するまでの日数で除した値を増殖速度として算出した。また、各培養細胞株における、再発リスクスコアＲＲＳも同時に算出した。
算出した値を下記の表２に示す。
【００５３】
【表２】
0005553661.tif 000003
【００５４】
（２）ＣＤＫ１、及びＣＤＫ２の活性値と発現量の測定
摘出した各腫瘍細胞のCDK1及びＣＤＫ2の活性値と発現量を測定した。
「測定用試料の調製」
摘出した腫瘍細胞と、緩衝液Ａ（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０（カルビオケム社）、５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム及び１００μｌ／ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む）を、腫瘍細胞の濃度が約１５０ｍｇ／ｍｌとなるように懸濁し、チューブに収容した。
そしてチューブ内の腫瘍細胞を電動ホモジナイザを用いてホモジナイズし、腫瘍細胞を破砕して細胞可溶化液を調製した。次に、細胞可溶化液を４℃で１５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、上清を測定用試料として用いた。
【００５５】
「ＣＤＫ１及びＣＤＫ２発現量の測定」
ＰＶＤＦメンブレン（ミリポア社製）をセットしたブロッターの各ウェルに、測定用試料を５０μｌずつ収容し、ウェルの底面、すなわちメンブレンの裏面から負圧約２５０ｍｍＨｇで約３０秒間吸引してメンブレンに測定用試料中のタンパク質を吸着させた。ウェルに洗浄液Ｂ（２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。洗浄後、ブロッキング試薬Ｂ（４％のＢＳＡ、２５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び１５０ｍＭのＮａＣｌを含む）を各ウェルに４０μｌ収容し、１５分間静置した後、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンをブロッキングした。
ブロッキング後、ウェルにＣＤＫ１に特異的に結合するウサギ抗ＣＤＫ１抗体（一次抗体）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンのＣＤＫ１と一次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。ウェルにビオチン化した抗ウサギＩｇＧ−Ｂ抗体（二次抗体）溶液４０μｌを収容し、室温で約３０分間静置してメンブレンの一次抗体と二次抗体とを反応させた後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。ウェルに洗浄液Ｂを１００μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引してメンブレンを洗浄した。ウェルにＦＩＴＣで標識したストレプトアビジンを含む標識溶液５０μｌを収容し、室温で３０分間静置して、メンブレンの二次抗体をＦＩＴＣで標識した後、ウェル底面から負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。
ウェルに洗浄液Ｂを５０μｌ収容し、負圧５００ｍｍＨｇで１５秒間吸引した。これを５回繰り返し、メンブレンを洗浄した。
メンブレンをブロッターからとりはずし、２０％メタノールで５分間濯ぎ、２０分間室温で乾燥させた後、メンブレンに吸着されたタンパク質の蛍光強度を、蛍光イメージアナライザによって分析、測定した。測定値は、検量線をもとに算出した。
検量線は、０．００５％のノニデットＰ−４０及び５０μｇ／ｍｌのＢＳＡを含む洗浄液Ｂ中に、５種類の濃度の組換えＣＤＫ１を溶解した溶液を、上記と同様に処理したウェルに５０μｌずつ注入し、上記と同様の実験手順でＦＩＴＣ標識し、蛍光強度を測定して、蛍光強度とＣＤＫ１発現量との関係を表したものである。
そして、ＣＤＫ２発現量の測定は、一次抗体としてウサギ抗ＣＤＫ１抗体ではなくウサギ抗ＣＤＫ２抗体を用いること以外は上述のＣＤＫ１の発現量測定と同様の実験手順で行なった。
【００５６】
「ＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性測定」
１．５ｍｌエッペンドルフチューブに緩衝液Ａを５００μｌ収容し、さらに測定用試料を添加した。測定用試料は、チューブに収容した混合液中の全タンパク質量が１００μｇとなるように調節して添加された。ここに抗ＣＤＫ１抗体２μｇ及び２０μｌのプロテインＡをコートしたセファロースビーズを加えて４℃、１時間静置してＣＤＫ１と抗ＣＤＫ１抗体とを反応させた。反応後、ビーズをビーズ洗浄用緩衝液（０．１ｗ／ｖ％のノニデットＰ−４０及び５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．０）を含む）で三回洗浄し、１５μｌの溶解緩衝液Ａ中に再懸濁させて、抗ＣＤＫ１抗体を介してＣＤＫ１が結合したセファロースビーズを含む試料を得た。
この試料に、ＣＤＫ１の基質溶液（１０μｇヒストンＨ１１０μｇ、５ｍＭのＡＴＰ−γＳ（シグマ社）、２０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．４）及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）を添加した。基質溶液は、チューブに収容した混合液の総量が５０μｌとなるように調節して添加された。これを３７℃で１０分間震蕩してキナーゼ反応を行ない、ヒストンＨ１にモノチオリン酸基を導入した。
キナーゼ反応後、２０００ｒｐｍで２０秒間遠心分離してビーズを沈殿させ、上清１８μｌを採取した。この上清に、結合緩衝液（１５０ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ９．２）及び５ｍＭのＥＤＴＡを含む）１５μｌと、１０ｍＭのヨードアセチルビオチン溶液（１００ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ７．５）及び１ｍＭのＥＤＴＡを含む）とを添加して９０分間、室温、暗所で静置することにより、モノチオリン酸基を導入された基質（モノチオリン酸化基質）の硫黄原子にヨードアセチルビオチンを結合させた。尚、ヨードアセチルビオチンとモノチオリン酸基との反応の停止は、２−メルカプトエタノールの添加により行なった。ヨードアセチルビオチンが結合したモノチオリン酸化基質０．４μｇを含む試料を、スロットブロッターを用いてＰＶＤＦメンブレン上にブロットした。
このＰＶＤＦメンブレンを１ｗ／ｖ％のＢＳＡを含む溶液でブロッキングし、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（ベクター社）を添加して３７℃で一時間反応させた。反応後、ＰＶＤＦメンブレンを５０ｍＭの洗浄液Ｂで三回洗浄した。洗浄後、蛍光イメージアナライザを用いてＰＶＤＦメンブレンの蛍光分析を行なった。活性値は、検量線に基づいて算出された。
ここで検量線は、活性型ＣＤＫ１リコンビナント分子の段階希釈を試料とし、上記測定方法を用いて作成することができる。従って、測定されるＣＤＫ１の活性１Ｕ（ユニット）は、活性型リコンビナント分子（約１ｎｇ）のときに与えられるリン酸化基質量蛍光量と同等である。
ＣＤＫ２の活性値は、抗ＣＤＫ１抗体、及び活性型ＣＤＫ１リコンビナント分子ではなく、抗ＣＤＫ２抗体及び活性型CDK２リコンビナント分子を用いること以外はＣＤＫ１の活性値の測定と同様にして測定された。
【００５７】
測定後得られたＣＤＫ１及びＣＤＫ２の活性値と発現量からＣＤＫ１の比活性比、ＣＤＫ２の比活性比、及びＣＤＫ２の比活性比／ＣＤＫ１の比活性比（以降、比活性比をＳＡとも言う）を算出した。各細胞株を各パラメータ（ＣＤＫ１のＳＡ、ＣＤＫ２のＳＡ、ＣＤＫ２のＳＡ／ＣＤＫ１のＳＡ）の中央値で２群に分類し、増殖速度（腫瘍細胞重量／移植後の日数）を比較した。比較した結果を表３に示す。また、表３の各パラメータの結果をグラフ化したものをそれぞれ図２（ＣＤＫ１）、図３（ＣＤＫ２）、及び図４（ＣＤＫ２／ＣＤＫ１）に示す。
【００５８】
【表３】
0005553661.tif 000004
【００５９】
この結果、表１、及び図１〜３に示すように、各パラメータにおいて、パラメータ高値群の方がパラメータ低値群と比較して腫瘍の増殖速度が有意に早いことが示された。このことから、腫瘍のＣＤＫ１のＳＡ、ＣＤＫ２のＳＡ、及びＣＤＫ２のＳＡ／ＣＤＫ１のＳＡは、腫瘍の増殖速度を反映することが強く示唆された。
【００６０】
実施例２：Ｋｉ６７の発現細胞数とＣＤＫの発現量及び活性値に基づく、癌の再発リスク判定方法の検証
本実施形態による判定方法を用いた癌患者の再発リスク判定について検証した。
【００６１】
（１）ＣＤＫ１、ＣＤＫ２の活性値及び発現量の測定
表４に示す条件を満たした乳癌患者１３３名から摘出された各乳腺組織に含まれる細胞のＣＤＫ１、ＣＤＫ２の発現量と活性値を測定した。なお、細胞のＣＤＫ１及びＣＤＫ２の発現量と活性値については、腫瘍細胞の代わりに各乳腺組織を用いた以外は、実施例１と同様の方法で測定した。
【００６２】
【表４】
0005553661.tif 000005
【００６３】
得られたＣＤＫ１、ＣＤＫ２の発現量及び活性値を用いて、下記式（１３）乃至（１５）に基づいて再発リスクスコアＲＲＳを算出した。
ＲＳ１；Ｆ（ｘ）＝０．１５／（１＋Ｅｘｐ（−（ｘ−１．６）×７） ・・・（１３）
ＲＳ２；Ｇ（ｙ）＝０．２５／（１＋Ｅｘｐ（−（ｙ−１．０）×６） ・・・（１４）
ＲＲＳ＝３０００×Ｆ（ｘ）×Ｇ（ｙ）・・・（１５）
ｘ＝ＣＤＫ１活性値／ＣＤＫ１発現量
ｙ＝（ＣＤＫ２活性値×ＣＤＫ１発現量）／（ＣＤＫ２発現量×ＣＤＫ１活性値）
【００６４】
次に、各症例から得られた再発リスクスコアＲＲＳを下記の条件と比較して、癌患者を再発率リスクの高い群（Ｈｉｇｈグループ）、再発リスクの低い群（Ｌｏｗグループ）の２つの患者群に分類した。分類した結果、Ｈｉｇｈグループに該当した患者数は３０人、Ｌｏｗグループに該当した患者数は１０３人であり、各患者群において５年以内に癌が再発した患者数はそれぞれ７人、４人であった（表５）。
Ｈｉｇｈグループ：    ＲＲＳ≧３．０
Ｌｏｗグループ：      ＲＲＳ＜３．０
【００６５】
【表５】
0005553661.tif 000006
【００６６】
（２）Ｋｉ６７が発現している細胞の数の測定
上記の乳癌患者１３３人から摘出された各乳腺組織に含まれる細胞を用いて、Ｋｉ６７が発現している細胞数の割合を測定した。
測定は、上記採取された細胞をＫｉ６７抗原に対するＭＩＢ抗体を用いて標識し、自動免疫装置によって染色し、全細胞における染色された細胞数の数を画像解析装置で測定する方法を用いた。
ＭＩＢ抗体による標識は、ダコ Ｍ７２４０，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ Ｋｉ−６７ ａｎｔｉｇｅｎ（ｄａｋｏ社製）を用い、染色検出については、免疫染色用検出キットとして、ダコ Ｋ４０６１，ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋ＤｕａｌＬｉｎｋ（ｄａｋｏ社製 ）及びダコ Ｋ３４６８，ＤＡＢ＋（ｄａｋｏ社製）を用いた。
また、自動免疫染色機は、Ｓ３４００ Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（ｄａｋｏ社製）を用い、画像解析は、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ ＣＳ ｓｙｓｔｅｍ （Ａｐｅｒｉｏ社製）及び画像解析ソフト Ｎｕｃｌｅａｒ ｖ９ を用いた。なお、上記の標識、染色検出、及び解析に関しては、添付のプロトコールに沿って行った。
【００６７】
画像解析の結果、測定細胞数における染色された細胞数の割合（ＭＩＢ陽性細胞率）が３０％以上の検体をＨｉｇｈリスク群、ＭＩＢ陽性率が３０％未満の検体をＬｏｗリスク群として分類した。分類した結果、Ｈｉｇｈグループに該当した患者数は５４人、Ｌｏｗグループに該当した患者数は７９人であり、各患者群において５年以内に再発した患者数はそれぞれ８人、３人であった（表６）。
【００６８】
【表６】
0005553661.tif 000007
【００６９】
（３）再発リスク判定
上記で求めたＣＤＫに基づく再発リスクスコアによる再発リスク判定と、Ｋｉ６７発現細胞数に基づく再発リスク判定とを組み合わせて、検体をＨｉｇｈリスクとＬｏｗリスクに分類した。分類は、再発リスクスコアに基づく再発リスク判定とＫｉ６７発現細胞数に基づく再発リスク判定共にＨｉｇｈと判定された検体をＨｉｇｈリスク群とし、共にＬｏｗリスク群と判定された検体をＬｏｗリスク群とし、その他の検体をＩｎｔ．リスク群として分類した。分類した結果を表７に示す。
【００７０】
【表７】
0005553661.tif 000008
【００７１】
上記で算出した、ＣＤＫに基づく再発リスク判定（表５）、Ｋｉ６７に基づく再発リスク判定（表６）、並びにＣＤＫ及びＫｉ６７に基づく再発リスク判定（表７）について、Ｈｉｇｈリスク群とＬｏｗリスク群に分類された２群間における累積再発確率（ｐ ｖａｌｕｅ）をカプランマイヤー法により解析した。また、Ｃｏｘの比例ハザードモデルによる多変量解析で得られるハザード比（Ｈａｚａｒｄ Ｒａｔｉｏ）も算出した。なお、Ｐ値は、ログランク検定による２群間の有意確率である。
各判定における累積再発確率、及びハザード比を算出した結果を表８に示す。
【００７２】
【表８】
0005553661.tif 000009
【００７３】
表８に示すように、ＣＤＫ及びＫｉ６７に基づく再発リスク判定は、ＣＤＫに基づく再発リスク判定、及びＫｉ６７に基づく再発リスク判定に比べて、Ｌｏｗリスクと判定された群の累積生存率が有意に高かった。
また、ＨＲ（ハザードレシオ）の値は、ＣＤＫ及びＫｉ６７に基づく再発リスク判定は、ＣＤＫに基づく再発リスク判定、及びＫｉ６７に基づく再発リスク判定に比べて、顕著に高いことが分かる。このことから、ＣＤＫ及びＫｉ６７に基づく再発リスク判定の結果は、ＣＤＫに基づく再発リスク判定、及びＫｉ６７に基づく再発リスク判定と比較して、非常に高い信頼性のある判定結果であることがわかる。
【図１】
0005553661.tif 000010
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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