(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置するための使用のための、少なくとも１つの化学療法用の抗腫瘍薬剤、少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）、及び少なくとも１つのシクロデキストリンを含むナノ粒子であって、少なくとも２時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与され、少なくとも１つの化学療法用の抗腫瘍薬剤が、ドキソルビシン又はその任意の医薬的に許容可能な塩である、ナノ粒子。
【請求項２】
ナノ粒子が２〜２４時間の間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与される、請求項１記載のナノ粒子。
【請求項３】
ナノ粒子が４〜１２時間の間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与される、請求項１又は２記載のナノ粒子。
【請求項４】
ナノ粒子が、６時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与される、請求項１〜３のいずれか一項記載のナノ粒子。
【請求項５】
少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）が、ポリイソヘキシルシアノアクリレートである、請求項１〜４のいずれか一項記載のナノ粒子。
【請求項６】
ナノ粒子が、ナノ粒子の０．０１〜２００mg/gの濃度の少なくとも１つの化学療法剤、０．１〜７０％w/wの少なくとも１つのシクロデキストリン、及び１〜２５％w/wの少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）を含む、請求項１〜５のいずれか一項記載のナノ粒子。
【請求項７】
ドキソルビシンの投与量が１０〜７５mg/m2である、請求項１〜６のいずれか一項記載のナノ粒子。
【請求項８】
ドキソルビシンの投与量が１０〜４５mg/m2である、請求項１〜７のいずれか一項記載のナノ粒子。
【請求項９】
ドキソルビシンの投与量が１０〜３０mg/m2である、請求項１〜８のいずれか一項記載のナノ粒子。
【請求項１０】
ドキソルビシンの投与量が２０〜３０mg/m2である、請求項１〜９のいずれか一項記載のナノ粒子。
【請求項１１】
癌が、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、小細胞肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸部癌、頭頸部癌、脳腫瘍、ブレード癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ユーイング（Ｅｄｗｉｎｇ）肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、甲状腺癌、前立腺癌、胃癌、腎芽腫、カポジ肉腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される固形腫瘍又は造血腫瘍である、請求項１〜１０のいずれか一項記載のナノ粒子。
【請求項１２】
癌が肝細胞癌である、請求項１〜１１のいずれか一項記載のナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、医学、特に腫瘍学の分野に関する。それは、少なくとも１つの化学療法用の抗腫瘍薬物を充填したナノ粒子を用いた、癌、特に肝細胞癌の処置に関する。
【０００２】
発明の背景
癌は、悪性の挙動（浸潤及び転移）と連関する、細胞の制御されない成長により特徴付けられる。それは、大半の先進国における死亡の主要な原因である。癌処置の異なる方法を使用することができる：化学療法、放射線療法、外科手術、免疫療法、及びホルモン療法。
【０００３】
化学療法は、癌を処置するための化学療法用の抗腫瘍薬剤の使用と定義することができる。広範には、大半の化学療法用の抗腫瘍薬剤は、有糸分裂（細胞分裂）又はＤＮＡ合成を損なうことにより働き、急速に分裂する細胞を効果的に標的化する。
【０００４】
化学療法用の抗腫瘍薬剤は、最もしばしば非経口的に、注目すべきは、静脈内（ＩＶ）又は動脈内（ＩＡ）に送達される。ＩＶ又はＩＡ化学療法は、薬物及び処置される癌の型に依存して、異なる時間の量にわたり与えることができる。
【０００５】
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、男性において５番目に多い癌であり（世界中で５２３，０００症例）、女性において７番目である（世界中で２２６，０００症例）。負担の大半が、開発途上国においてであり、そこでは、症例のほぼ８５％が生じ、特に男性において生じる：全体的な男女比率は約４／１である。高発生率の地域は、東及び東南アジア、中央及び西アフリカであるが、しかし、また、メラネシア、及びミクロネシア／ポリネシアでもある。低率が先進地域において推定されているが、南ヨーロッパは例外であり、そこでは、男性における発症率（１０万人当たりＡＳＲ１０．５）は、他の先進地域よりも有意に高い（Globocan 2008, WHO, International Agency for Research on Cancer -IARC -, Cancer Incidence and Mortality Worldwide 2008）。
【０００６】
２００８年における肝臓癌からの推定６９４，０００例の死亡（男性における４７７，０００、女性における２１７，０００）があったが、その高い致死率（死亡率と発生率の全体的な比率０．９３）のため、肝臓癌は、世界中の癌からの死亡の３番目に最も多い原因である。死亡率の地理的分布は、発生率について観察されたものと同様である（Globocan 2008, WHO, International Agency for Research on Cancer -IARC -, Cancer Incidence and Mortality Worldwide 2008）。
【０００７】
ＨＣＣは、通常、肝硬変又は慢性肝疾患（ＣＬＤ）に苦しんでいる人々において生じる。ＣＬＤ又は肝硬変の発生を支持する全ての因子は、結果的に、ＨＣＣについてのリスク因子である。主な病因学的な因子は、Ｂ型肝炎ウイルス感染（ＨＢＶ；５３％）、Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ；２５％）、アルコール性肝疾患（ＡＬＤ；１５〜４３％）、又は代謝異常疾患、例えば非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ；２０％）、肥満、及び糖尿病などである。他の因子は、あまり高頻度ではない：ヘモクロマトーシス、他の慢性胆汁性又は炎症性肝疾患。アフラトキシンは、穀物、ピーナッツ、及び他の食品上に成長した真菌アスペルギルス・フラバス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）及びアスペルギルス・パラジチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）により産生され、肝毒性物質であり、これらのマイコトキシンへの慢性暴露は、ＨＣＣの発生に導く。化学物質の影響は、依然として議論されており、顕著ではない。
【０００８】
ＨＣＣについての現在の治療戦略は、根治処置、例えば外科的介入（腫瘍切除及び肝臓移植）など、経皮的介入（エタノール注射、ラジオ波熱焼灼）、又は緩和処置、例えば経動脈的介入（主に経動脈的化学塞栓術又はＴＡＣＥ）など、全身治療、及び実験戦略などに分けることができる（H.C. Spangenberg, R. Thimine, H.E. Blum, Biologics: Targets & Therapy, 2008, 2(3), 453）。注意深く選択された患者において、切除及び肝臓移植によって、６０％〜７０％の５年生存が可能である。残念なことに、欧米諸国における大半の患者は、診断時に中程度又は進行性ＨＣＣを呈し、これらの根治処置を使用することが結果的に不能である（L. Faloppi, M. Scartozzi, E. Maccaroni, P.M. Di Pietro, R. Berardi, M. Del Prete, S. Cascinu, Cancer Treat.Rev., 2011, 37(3), 169）。
【０００９】
緩和処置の間で、化学塞栓術（ＴＡＣＥ）を用いた動脈内アプローチは、患者の１６〜５５％において客観的応答を誘導することが示されているが、多くの無作為化試験では、任意の生存利益は示されなかった。残念なことに、ＴＡＣＥは、しばしば、肝不全又は腎機能障害のような重度の副作用を伴うことが公知である（K. Kamada, T. Nakanishi, M. Kitamoto, H. Aikata, Y. Kawakami, K. Ito, T. Asahara, G. Kajiyama, J. Vasc. Interv. Radiol., 2001, 12(7), 847）。
【００１０】
最近まで、進行性ＨＣＣを伴う患者のために、全生存（ＯＳ）を延長する治療は利用可能ではなく、新たな標的治療についての必要性があった（H.C. Spangenberg, R. Thimine, H.E. Blum, Biologics: Targets & Therapy, 2008, 2(3), 453）。２００７年には、最初に、ソラフェニブ（Nexavar（登録商標））（マルチキナーゼ阻害剤）が、切除不能なＨＣＣを伴う患者において、プラセボを上回る、中程度ではあるが、全生存の増加を示した。この薬剤の他、種々の異なる分子が、現在、進行期ＨＣＣにおいてテストされており、それらの間で、ブリバニブ（別の経口マルチキナーゼ阻害剤）が、現在、いくつかの第ＩＩＩ相試験においてテストされている（H.C. Spangenberg, R. Thimine, H.E. Blum, Biologics: Targets & Therapy, 2008, 2(3), 453 - K. Almhanna,  PA Philip, Onco. Targets Ther., 2009, 18(2), 261）。
【００１１】
ソラフェニブは、進行期ＨＣＣのためのケアの標準であり、制限を伴わず、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）及び食品医薬品局（ＦＤＡ）により、ＨＣＣの処置のために登録されているにもかかわらず、臨床試験での狭い包含基準は、それらの病期に関して、証明された有効な処置を伴わない多くの患者を残す。さらに、処置の失敗が、ソラフェニブを受けている一部の患者において起こるため、処置効力、薬物処方計画、及び全体的な耐容性を改善するための、及び、抵抗性を克服するための、これらの患者についての医学的必要性が依然として残存する（M. Peck-Radosavljevic, Therap. Adv. Gastroenterol. 2010, 3(4), 259）。
【００１２】
ＨＣＣは、高い程度の薬剤耐性により特徴付けられる血管過多の固形癌として公知である（T. Wakamatsu, Y. Nakahashi, D. Hachimine, T. Seki, K. Okazaki, Int. J. Oncol., 2007, 31(6), 1465）。ＨＣＣにおけるこの化学療法抵抗性の機構は、複数ある。しかし、より一般的な機構は、多剤耐性（ＭＤＲ）トランスポーター、Ｐ−ｇｐ及びＭＲＰポンプに関連する（D. M. Bradshaw, R. J. Arceci, J. Clin. Oncol., 1998, 16(11), 3674. Review. Erratum in: J. Clin. Oncol., 1999, 17(4), 1330）。これらのポンプは、腫瘍細胞が、異なる型の化学療法剤を細胞外環境中へ排出することを許す（Y. Chen, S. M. Simon, J. Cell Biol. 2000, 148(5), 863）。ＭＤＲ表現型に関連する化学療法抵抗性は、内因性でありうる、又は、化学療法の間に獲得されうる。化学療法抵抗性は、自発性又は獲得性かを問わず、癌処置における重大な懸念である。ＨＣＣは、しばしば、内因的に化学療法抵抗性であり、それは、その治療の失敗についての主要な原因である（R. Perez-Tomas, Curr Med Chem., 2006, 13(16), 1859, Review）。これは、癌のための化学療法における大きな障害を提起する。なぜなら、より高い用量の薬物が投与される必要があり、次に、重度の有害作用の原因となりうるからである（F. Yan, X. M. Wang, Z. C. Liu, C. Pan, S. B. Yuan, Q. M. Ma, Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. 2010, 9(3), 287）。化学療法抵抗性は、主要な化学療法剤及び特にアントラサイクリン（ドキソルビシンなど）、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、又はタキサンに影響する。ＭＤＲ遺伝子の過剰発現に起因する化学療法剤の不良な効力は、ＨＣＣのための新たな処置戦略を開発する必要性を強調し、それは抵抗性の問題を考慮に入れうる。
【００１３】
ドキソルビシンは化学療法用の化合物であり、その効力は、ＨＣＣを含むいくつかの癌において示されてきた。しかし、ＨＣＣにおけるドキソルビシンのＩＶ注入は、中程度であり、客観的応答率５〜１０％を伴う。大規模な無作為化多施設臨床試験では、ＩＶ経路を通じて投与されたドキソルビシン６０mg/m2及びｔｈｙｍｉｔａｑ（直接的なチミジル酸（ｔｈｙｍｉｄｉｌａｔｅ）シンターゼ阻害剤）の効力を比較した（Porta C., 2006）。切除不能なＨＣＣを伴う４４６人の無作為化された患者において、ドキソルビシンの効果は中程度であることが見出された。ＨＣＣ患者におけるドキソルビシンの中程度の効果は、ＰｇＰ及びＭＲＰ細胞ポンプの過活性に関連する多剤耐性（ＭＤＲ）機構に起因すると仮定される。多くの戦略が、抵抗性の問題を克服するために評価されており、Ｐｇｐ及びＭＲＰ阻害剤の使用を含む。これらの薬物の開発は、それらの安全性プロファイルのため、中止されてきた。
【００１４】
ＨＣＣにおいて、細胞傷害性薬剤を使用した新たな治療戦略が、全身毒性を低下させ、重要な肝腫瘍壊死を誘導し、健康な肝実質を保つために、肝動脈内（ＩＡ）注射により開発された。
【００１５】
特許ＥＰ１０５６４７７及びその米国での等価のＵＳ６８８１４２１に記載された技術では、ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ポリマーを使用し、活性成分をナノ粒子に製剤化する。ＥＰ１０５６４７７及びその米国での等価のＵＳ６８８１４２１は、粒子の形成のために必要である化学反応に対して活性成分を保護するように、ナノ粒子の調製の間に活性成分を錯体形成するための錯化剤の使用を示す。従って、活性成分は、有利には、非共有結合的な様式で粒子と会合し、反応又は分解から保護される。医薬的活性成分、ポリマー、例えばポリ（アルキルシアノアクリレート）など、及び錯化剤、例えばシクロデキストリンなど、を含むナノ粒子は、このように、ＥＰ１０５６４７７において、及びその米国での等価のＵＳ６８８１４２１において教示される。
【００１６】
前記ナノ粒子中に充填されたドキソルビシン（以下、「ドキソルビシンを充填したナノ粒子」として言及される）は、ＰＡＣＡの一種、ポリイソヘキシルシアノアクリレート（ＰＩＨＣＡ）、ナノ粒子を化学療法剤ドキソルビシンと会合させる薬物製剤である。
【００１７】
前記ナノ粒子は、以下の通りに要約することができる、ＭＤＲを迂回するための独自の機構を表す：
【００１８】
ドキソルビシンを充填したナノ粒子が、腫瘍細胞の表面に吸着し、封入されたドキソルビシンを細胞膜の近くに放出し、それは、高い局所濃度勾配に導く（Colin de Verdiere A, Cancer Chemother Pharmacol. 1994; 33(6): 504-8）。
【００１９】
ナノ粒子は、分解し、可溶性ポリシアノアクリル酸を放出し、それは、原形質膜と相互作用し、ドキソルビシンの細胞内送達を改善するために寄与しうる（De Verdiere AC, Br J Cancer. 1997; 76(2): 198-205）。
【００２０】
可溶性ポリマーは、また、ドキソルビシンの正電荷を遮蔽し、このように、Ｐｇｐによるその排出を防止し（De Verdiere 1997, Br J Cancer. 1997; 76(2): 198-205）、任意の共有結合的な連結を伴わず、イオン対として作用することができる。ＭＤＲポンプ（Ｐｇｐ及びＭＲＰ）との直接的な相互作用は、このように、回避される。
【００２１】
ヒトにおいて、肝動脈内経路を通じた、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の効力及び安全性が、２つの臨床試験において評価されている：１つの非盲検第Ｉ−ＩＩ相及び１つの無作為化第ＩＩ相臨床試験（表１）。
【００２２】
【表１】
0005523638.tif 000002
【００２３】
試験ＢＡ２００２／０３／０２（進行性肝細胞癌を伴う患者における第Ｉ／ＩＩ相試験）を、ＨＣＣに苦しむ患者における多施設非盲検用量漸増計画に従って行った。ドキソルビシンを充填したナノ粒子を、肝動脈内（ＩＡ）経路を通じて、ボーラスとして注射することになっていた。３人の患者の連続コホートに、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の単回１０、２０、及び３０mg/m2用量を注射した。３０mg/m2用量が十分に耐容されたため、プロトコールを修正し、４０mg/m2及び次に３５mg/m2を評価した。これらの２つの用量は毒性があると考えられたため、追加の患者には、３０mg/m2ドキソルビシン用量を充填したナノ粒子を１５分間与えた。２人の患者が、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の第２のＩＡ用量を受け、１人の患者が３つのＩＡ注入を受けた。
【００２４】
２０人の患者がこの試験に含まれた。３５及び４０mg/m2で報告された深刻な呼吸器ＴＥＡＥ（Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔ）は別として、耐容性は許容可能であった；ＴＥＡＥの大半が短く持続し、軽度の重症度であった。全てが、続発症を伴わず、可逆的であった。全体的に、深刻ではないＴＥＡＥの５０％が、無ドキソルビシンを用いて既に報告された通りに予測された。最も高頻度なＴＥＡＥは、白血球減少症（ｎ＝１３；６５％）、好中球減少症（ｎ＝１２；６０％）、悪心（ｎ＝１０；５%％）、貧血及び腹痛（ｎ＝９；４５％）、無力症、発熱、脱毛症（ｎ＝６；３０％）、及び咳（ｎ＝５；２５％）であった。トランスアミナーゼにおける増加が、１１人の患者（５５％）において報告され、処置効力に関連する可能性が高いとして予測された。２人の患者が、３５mg/m2のドキソルビシンを充填したナノ粒子用量で、深刻な急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）を有した。
【００２５】
効力データは、５４８及び３１５日間の生存期間の平均値及び中央値をそれぞれ伴う効力のシグナルを明らかに実証した（臨床試験の基準に従った客観的応答率６５〜８０％）。
【００２６】
これらのデータに基づき、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の肝臓ＩＡ１５分間注入での効力及び安全性を、ケア処置の標準でのそれらと比較した。
【００２７】
第２試験ＢＡ２００６／０３／０３（進行性ＨＣＣを伴う患者における第ＩＩ／ＩＩＩ相試験）を、進行性ＨＣＣに苦しむ患者における多施設比較非盲検無作為化（２／１比率を伴う）計画に従って行った。ドキソルビシンを充填したナノ粒子を、ＩＡ経路を通じて、用量３０mg/m2での１５分間注入として注射した（メチルプレドニゾンの経口前投薬に先行する及びそれに続く）。５０人の患者が、試験の第１部分に含まれることになっていた。ドキソルビシンを充填したナノ粒子の３つの注入が、４週間間隔で３３人の患者により受けられることになっていた。他の１７人の患者の各々が、疾患の重症度に適応されたケア処置の最良の標準を受けることになっていた。この第１相の終了時、ドキソルビシンを充填したナノ粒子は、患者（３ヶ月目に局所進行のない患者）の２／３において活性であると考えられた場合、次に、１５０人の追加の患者が登録されることになっていた。
【００２８】
この試験は、ドキソルビシンを充填したナノ粒子を用いて処置された２人の患者における死亡に至ったＡＲＤＳの発生のため、２８人の患者が登録された時に、早期に中止された。１７人の患者が、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の３９の注入を受け、１１人がコントロール群において無作為化された。コントロール群においてＡＲＤＳで死亡した患者はいなかった。
【００２９】
ドキソルビシンを充填したナノ粒子群における多くの患者が、試験の早期中止のため、プロトコール（４週離した３つの注入）に従った処置を完了しなかったにもかかわらず、ドキソルビシンを充填したナノ粒子群における患者の６３％で、３ヶ月目に局所進行はなかった（それに対して、コントロール群における７５％が局所進行を示した）。登録された患者がモニターされ、生存を２０１１年２月まで記録した。全生存は、コントロール群よりも、ドキソルビシンを充填したナノ粒子群において有意に長かった。この時間点で、全生存の平均値及び中央値は、ドキソルビシンを充填したナノ粒子群について９５２日で、それに対して、コントロール群について４４９日であった。
【００３０】
また、生存は、プロトコールにおいて要求される通りに、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の３コースを完了した患者において有意にずっと長かった。全生存の平均値及び中央値は、３つのＩＡ注射を受けたドキソルビシンを充填したナノ粒子群において、コントロール群の２倍長かった。同様に、生存は、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の３コースを完了した患者において、３０mg/m2のドキソルビシンを充填したナノ粒子の１又は２のＩＡ注射だけを受けた患者よりもずっと長かった。これらのデータによって、進行性ＨＣＣに苦しむ患者の処置におけるドキソルビシンを充填したナノ粒子の効力の強いシグナルが確認された。
【００３１】
故に、効力に関して非常に有望であるにも関わらず、癌処置、特にＨＣＣ処置における化学療法薬を充填したナノ粒子（例えばドキソルビシンを充填したナノ粒子など）の使用は、その重度の肺有害事象のため、現在は可能ではない。肺有害事象の発生の可能性及びそれらの重症度を、利益／リスク比率のため、許容可能な限度下に低下させる、より安全な使用を可能にする新たなアプローチが、次に必要とされる。特に、これらのナノ粒子により誘導される肺有害事象を減少させ、同時に、既に観察された良い効力を維持することが非常に有利でありうる。
【００３２】
発明の概要
本発明者らは、重度の肺有害事象についての適した動物モデルを得ることに成功し、次に、驚くべきことに、化学療法剤を充填したナノ粒子の動脈内又は静脈内投与に関連する、重度の毒物学的な副作用、特に肺損傷を、数時間にわたる前記ナノ粒子の静脈内又は動脈内注入により防止することができることを見出した。
【００３３】
これに基づき、本発明は、癌を処置するための使用のための、少なくとも１つの化学療法用の抗腫瘍薬剤、少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）、及び少なくとも１つのシクロデキストリンを含むナノ粒子であって、少なくとも２時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与される、ナノ粒子に関する。特に、ナノ粒子は、２〜２４時間の間にわたり、特に４〜１２時間の間にわたり、さらに特に約６時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与することができる。特定の実施態様において、投与は静脈内注入による。
【００３４】
好ましくは、ナノ粒子中に含まれるポリ（アルキルシアノアクリレート）ポリマーは、ポリイソヘキシルシアノアクリレートポリマーである。
【００３５】
本発明において使用されるナノ粒子は、ナノ粒子の０．０１〜２００mg/gの濃度の前記の少なくとも１つの化学療法剤、０．１〜７０％w/wの前記の少なくとも１つのシクロデキストリン、及び１〜２５％w/wの前記の少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）を含みうる。
【００３６】
ナノ粒子中に含まれる化学療法用の抗腫瘍薬剤は、アントラサイクリン、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体毒植物アルカロイド、アルキル化剤、代謝拮抗剤、エリプチシン、及びハルミン、ならびに、それらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。好ましくは、化学療法用の抗腫瘍薬剤はアントラサイクリンである。より好ましくは、化学療法剤は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、それらの任意の医薬的に許容可能な塩、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。特に好ましい実施態様において、化学療法用の抗腫瘍薬剤は、ドキソルビシン又はその任意の医薬的に許容可能な塩である。この実施態様において、ドキソルビシンの投与量は、約１０〜約７５mg/m2、約１０〜約６０mg/m2、約１０〜約４５mg/m2、約１０〜約３０mg/m2、約２０〜約３０mg/m2でありうる。特定の実施態様において、ドキソルビシンの投与量は、約２０mg/m2〜３０mg/m2でありうる。
【００３７】
ナノ粒子を用いて処置される癌は、固形腫瘍又は造血腫瘍でありえ、好ましくは、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、小細胞肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸部癌、頭頸部癌、脳腫瘍、ブレード癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ユーイング（Ｅｄｗｉｎｇ）肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、甲状腺癌、前立腺癌、胃癌、腎芽腫、カポジ肉腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択されうる。特に好ましい実施態様において、癌は肝細胞癌である。
【００３８】
別の局面において、本発明は、癌を処置するための方法であって、少なくとも２時間にわたる静脈内又は動脈内注入により、少なくとも１つの化学療法剤、少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）、及び少なくとも１つのシクロデキストリンを含むナノ粒子の治療的に効果的な量を、そのような処置を必要とする患者に投与することを含む方法に関する。好ましくは、ナノ粒子は、上に記載する通り、医薬的組成物の形態で投与される。ナノ粒子について上に開示される全ての実施態様が、この局面において包含される。特定の実施態様において、投与は静脈内注入による。
【００３９】
さらなる局面において、本発明は、癌の処置のための、少なくとも１つの化学療法剤、少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）、及び少なくとも１つのシクロデキストリンを含むナノ粒子の使用に関し、前記ナノ粒子は、少なくとも２時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与される。ナノ粒子について上に開示する全ての実施態様が、この局面において包含される。特定の実施態様において、投与は静脈内注入による。
【００４０】
最後の局面において、本発明は、癌の処置のための医薬的調製物の製造のための、少なくとも１つの化学療法剤、少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）、及び少なくとも１つのシクロデキストリンを含むナノ粒子の使用に関し、前記医薬的組成物は、少なくとも２時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与される。ナノ粒子について上に開示する全ての実施態様が、この局面において包含される。特定の実施態様において、投与は静脈内注入による。
【００４１】
発明の詳細な説明
本発明への予備研究として、本発明者らは、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ポリマー及びシクロデキストリンを含むナノ粒子（以下、「ドキソルビシンを充填したナノ粒子」として言及する）に製剤化されたドキソルビシンの肝動脈内注入による肝細胞癌の処置について、以前の臨床試験において観察された呼吸器有害事象を研究するためのラットモデルを確立し、評価してきた。このモデルを使用し、本発明者らは、本明細書において、少なくとも２時間にわたる前記ナノ粒子の静脈内注入が、同じ用量でのボーラス静脈内注射と比較して、毒物学的な副作用、特に肺損傷を強く低下させることを可能にすることを実証している。この新たな治療アプローチは、ナノ粒子のより安全な使用を可能とし、次に、利益／リスク比率を劇的に増加させる。
【００４２】
したがって、第１の局面において、本発明は、癌を処置するための使用のための、少なくとも１つの化学療法用の抗腫瘍薬剤を含むナノ粒子であって、少なくとも２時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与されるナノ粒子に関する。
【００４３】
当業者は、少なくとも２時間にわたるそれらの静脈内注入の結果である、前記ナノ粒子により誘導される肺毒性の減少を考え、少なくとも２時間にわたるそれらの動脈内注入を用いた類似の減少を予測していたであろう。
【００４４】
実際に、ドキソルビシンの動脈内対静脈内注入についての分析モデルが、最先端において公知であり、２つのドキソルビシン濃度減衰曲線は類似していることを示す。故に、同じ理論曲線が適合され、両方の場合について使用される（"An analytical model for intra-arterial versus intravenous infusion of Adriamycin", Logan SE et al., Biomed Sci Instrum. 1989; 25: 239-46）。この論文は、これらの観察がボーラス注射について作られた場合であっても、類似の関係が連続注入について存在することを示す。実際に、連続注入は、一連の極微量ボーラス注射として理解することができ、各々の１つが前記分析モデルにおいて記載する通りに挙動する。
【００４５】
さらに、最先端では、全身静脈からドキソルビシンを受けた患者において、末梢血中の薬物レベルが、動脈内からドキソルビシンを受けた患者の末梢血から得られたものと同程度であったことが確認されている（comparison of Regional versus Systemic Chemotherapy with Adriamycin, Didolkar et al., Ann. Surg., March 1978, Vol. 187, No. 3, p. 332-336）。
【００４６】
本発明において使用するナノ粒子は、少なくとも１つの化学療法用の抗腫瘍薬剤、少なくとも１つのポリ（アルキルシアノアクリレート）ポリマー、及び化学療法用の抗腫瘍薬剤と複合体を形成することができる少なくとも１つの化合物（好ましくは、環状オリゴ糖の間より、特にシクロデキストリンの間より選ばれる）を含む。そのようなナノ粒子は、以前に、欧州特許ＥＰ  １  ０５６  ４７７及びその米国での等価のＵＳ６８８１４２１に記載されており、それらは本明細書において参照により同封される。
【００４７】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）ポリマーは、直鎖状又は分枝状、好ましくは、分岐状でありうる。ポリ（アルキルシアノアクリレート）のアルキル基は、直鎖状又は分枝状、好ましくは分枝状でありうる。特定の実施態様において、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ポリマーは、ポリ（Ｃ１−Ｃ１２アルキルシアノアクリレート）、好ましくはポリ（Ｃ４−Ｃ１０アルキルシアノアクリレート）、より好ましくはポリ（Ｃ６−Ｃ８アルキルシアノアクリレート）である。好ましい実施態様において、ポリ（アルキルシアノアクリレート）ポリマーは、ポリイソヘキシルシアノアクリレートである。後者のポリマーに対応する単量体は、例えば、Bioalliance Pharma（France）によりトレードマークMonorex（登録商標）下で利用可能である。
【００４８】
シクロデキストリンは、中性又は荷電、天然（シクロデキストリンα、β、γ、δ、ε）分岐状又は重合でありうる、あるいは、さらに、例えば、基（例えばアルキル、アリール、アリールアルキル、グリコシドなど）による１つ又は複数のヒドロキシプロピルの置換により、あるいはエステル化、アルコール又は脂肪酸を用いたエステル化により化学的に修飾されうる。上の基の間で、特定の優先度が、ヒドロキシプロピル、メチル−ｍ、及びスルホブチルエーテル基、ならびにそれらの混合物からなる群より選ばれるものに与えられる。好ましい実施態様において、シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及び／又は無作為にメチル化されたβ−シクロデキストリン、ならびにそれらの混合物からなる群より選択される。
【００４９】
本明細書において使用する通り、用語「化学療法剤」又は「化学療法用の抗腫瘍薬剤」は、癌性細胞又は未熟な前癌性細胞の成長を阻害又は停止させる、癌性細胞又は未熟な前癌性細胞を殺す、他の化学療法剤への癌性又は前癌性細胞の感受性を増加させる、及び／又は癌性細胞の転移を阻害する、抗癌活性を伴う任意の化学的化合物又は薬物を指す。
【００５０】
特定の実施態様において、化学療法剤は、アントラサイクリン、トポイソメラーゼＩ及び／又はＩＩ阻害剤、紡錘体毒植物アルカロイド、アルキル化剤、抗代謝物、エリプチシンならびにハルミンからなる群より選択される。
【００５１】
アントラサイクリン（又はアントラサイクリン抗生物質）は、ストレプトマイセス細菌に由来する。これらの化合物は、広い範囲の癌（例えば、肝細胞癌、白血病、リンパ腫、及び乳癌、子宮癌、卵巣癌、及び肺癌を含む）を処置するために使用される。アントラサイクリンは、３つの作用機構を有する：（ｉ）ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の塩基対間にインターカレートすることによるＤＮＡ及びＲＮＡ合成の阻害、このように、急速に成長する癌細胞の複製を防止すること；（ｉｉ）トポイソメラーゼＩＩ酵素の阻害、スーパーコイルＤＮＡの緩和を防止し、このように、ＤＮＡの転写及び複製を遮断する；及び（ｉｉｉ）ＤＮＡ及び細胞膜を損傷する鉄媒介性遊離酸素ラジカルの作製。アントラサイクリンは、しかし、限定しないが、ドキソルビシン（また、アドリアマイシンと名付けられる）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、及びそれらの医薬的に許容可能な塩を含む。好ましくは、アントラサイクリンは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、及びアクラルビシン、ならびにそれらの任意の医薬的に許容可能な塩を含む群より選択される。好ましい実施態様において、アントラサイクリンは、ドキソルビシン又はその任意の医薬的に許容可能な塩である。
【００５２】
トポイソメラーゼは、ＤＮＡのトポロジーを維持する必須の酵素である。Ｉ型又はＩＩ型トポイソメラーゼの阻害は、適したＤＮＡスーパーコイルを混乱させることにより、ＤＮＡの転写及び複製の両方に干渉する。一部のＩ型トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトセシン誘導体を含む。カンプトセシン誘導体は、カンプトセシンアナログ、例えばイリノテカン、トポテカン、ヘキサテカン、シラテカン、ラルトテカン、カレニテシン（ＢＮＰ１３５０）、ジャイマテカン（ＳＴ１４８１）、ベロテカン（ＣＫＤ６０２）、又はそれらの医薬的に許容可能な塩などを指す。ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤の例は、しかし、限定しないが、アムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート、及びテニポシドを含む。それらは、エピポドフィロトキシン、アメリカメイアップル（Ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｐｅｌｔａｔｕｍ）の根に自然発生するアルカロイドの半合成誘導体である。特定の実施態様において、トポイソメラーゼ阻害剤は、イリノテカン、その活性代謝物ＳＮ３８及びトポテカン、ならびにそれらの任意の医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される。好ましい実施態様において、トポイソメラーゼ阻害剤はイリノテカンである。
【００５３】
紡錘体毒植物アルカロイドは植物に由来し、細胞分裂のために必須の微小管機能を防止することにより、細胞分裂を遮断する。これらのアルカロイドは、しかし、限定しないが、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びビンポセチンなど）及びタキサンを含む。タキサンは、しかし、限定しないが、パクリタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、カバジタキセル、オルタタキセル、テセタキセル、及びそれらの医薬的に許容可能な塩を含む。好ましくは、タキサンは、パクリタキセル及びドセタキセル、ならびにそれらの任意の医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される。パクリタキセルは、本来は、タイヘイヨウイチイの木に由来する。ドセタキセルは、パクリタキセルの半合成アナログである。タキサンとは対照的に、ビンカアルカロイドは、有糸分裂紡錘体を破壊する。タキサン及びビンカアルカロイドの両方が、従って、紡錘体毒又は有糸分裂毒と名付けられるが、しかし、それらは異なる方法で作用する。
【００５４】
アルキル化剤は、細胞中に存在する条件下で、多くの電気陰性基にアルキル基を加えるそれらの能力のため、そのように名付けられる。それらは、生物学的に重要な分子中のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、及びリン酸基と共有結合を形成することにより、細胞機能を損なう。注目すべきは、それらの細胞傷害性は、ＤＮＡ合成の阻害に起因すると考えられている。アルキル化剤は、しかし、限定しないが、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド、及びプラチナ化合物（例えばオキサリプラチン、シスプラチン、又はカルボプラチンなど）を含む。
【００５５】
代謝拮抗剤は、代謝物の使用を阻害する化学物質であり、それは正常な代謝の一部である。そのような物質は、しばしば、それらが干渉する代謝物と、構造において類似している。代謝拮抗剤の存在は、細胞成長及び細胞分裂を停止させる。
【００５６】
プリン又はピリミジンアナログは、ＤＮＡ中へのヌクレオチドの取り込みを防止し、ＤＮＡ合成、このように、細胞分裂を停止させる。それらは、また、ＲＮＡ合成に影響する。プリンアナログの例は、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、及びクラドリビンを含む。ピリミジンアナログの例は、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）（チミジル酸シンテターゼを阻害する）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、及びシトシンアラビノシド（シタラビン）を含む。
【００５７】
葉酸拮抗剤は、葉酸の機能を損なう薬物である。多くが、癌の化学療法において使用されており、一部は、抗生物質又は抗原虫剤として使用される。周知の例は、メトトレキサートである。これは、葉酸アナログであり、構造的な類似性のため、それは、酵素のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）に結合し、それを阻害し、このように、テトラヒドロ葉酸の形成を防止する。テトラヒドロ葉酸は、プリン及びピリミジン合成のために必須である。これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質の阻害された産生に導く（テトラヒドロ葉酸は、また、アミノ酸、セリン及びメチオニンの合成に含まれるからである）。他の葉酸拮抗剤は、しかし、限定しないが、トリメトプリム、ラルチトレキセド、ピリメタミン、及びペメトレキセドを含む。
【００５８】
上の化学療法剤の例は、限定されない。他の薬剤をナノ粒子中に充填することができる。とりわけ、エリプチシン及びハルミンを引用することができる。
【００５９】
エリプチシンは、天然植物アルカロイド産物であり、キョウチクトウ科の常緑樹から単離された。エリプチシンは、細胞傷害及び抗癌活性を有することが見出された（Dalton et al., Aust. J. Chem., 1967. 20, 2715）。位置９においてヒドロキシル化されたエリプチシン誘導体（９−ヒドロキシエリプチシニウム）が、多くの実験的腫瘍に対して、エリプチシンよりも大きな抗腫瘍活性を有することが見出されている（Le Pecq et al., Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 1974, 71, 5078-5082）。研究を実施し、ヒトの治療薬のために適切であるエリプチシン誘導体を同定し、セリプチウム、又はＮ２−メチル−９−ヒドロキシエリプチシニウム（ＮＭＨＥ）の調製に至った。それらは、一部のヒト癌の処置のため、特に乳癌の骨転移の処置のために使用されてきた。他の９−ヒドロキシエリプチシン誘導体、例えば２−（ジエチルアミノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムアセテート、２−（ジイソプロピルアミノ−エチル）９−ヒドロキシ−エリプチシニウムアセテート、及び２−（βピペリジノ−２−エチル）９−ヒドロキシエリプチシニウムなどが、例えば、米国特許第４，３１０，６６７号に記載されている。
【００６０】
ハルミンは、Ｐｅｇａｎｕｍ  ｈａｒｍａｌａ種子から単離された天然植物アルカロイド産物である。Ｐｅｇａｎｕｍ  ｈａｒｍａｌａ（Ｚｙｇｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）は、中央アジア、北アフリカ、中東、及びオーストラリアの半乾燥放牧地に広く分布する植物である。Ｐ．  ｈａｒｍａｌａの薬理学的に活性な化合物は、特に種子及び根中で見出されるいくつかのアルカロイドである。これらは、３−カルボリン（例えばハルミン、ハルマリン、ハルモール、ハルマロール、及びハルマンなど）ならびにキナゾリン誘導体；バシシン及びバシシノンを含む。Ｐｅｇａｎｕｍ  ｈａｒｍａｌａアルカロイドは、有意な抗腫瘍能を持つことが見出された（Lamchouri and al., Therapie, 1999, 54(6): 753-8）。腫瘍細胞株の増殖が、有意に低下された。ハルミンは、多数のヒト腫瘍細胞株に対して強い細胞傷害性を示すことが報告された（Ishida and al, Bioorg Mad Chem Lett, 1999, 9(23): 3319-24）。ハルモール二量体の抗癌活性は、また、例えば、国際特許ＷＯ２００９０４７２９８に記載されている。
【００６１】
好ましい実施態様において、化学療法剤は、アントラサイクリンであり、好ましくは、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、アクラルビシン、デトルビシン、カルミノマイシン、モルホリノドキソルビシン、モルホリノダウノルビシン、メトキシモルホリニルドキソルビシン、及びそれらの任意の医薬的に許容可能な塩、ならびにそれらの任意の組み合わせ、より好ましくはドキソルビシン又はその任意の医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される。
【００６２】
本明細書において使用する通り、「医薬的に許容可能な塩」は、開示する化合物の誘導体を指し、それにおいて、親化合物は、その酸又は塩基塩を作ることにより修飾される。医薬的に許容可能な塩は、例えば、非毒性の無機酸又は有機酸から形成された、親化合物の従来の非毒性塩又は第４級アンモニウム塩を含む。例えば、そのような従来の非毒性塩は、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸など）に由来する塩；及び有機酸（例えば酢酸、プロピオン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸など）から調製された塩を含む。さらに、付加塩は、アンモニウム塩（例えばトロメタミン、メグルミン、又はエポラミンなど）、金属塩（例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、又はマグネシウムなど）を含む。例えば、ドキソルビシンの適した塩は、ドキソルビシン塩酸塩である。
【００６３】
特定の実施態様において、本発明において使用されるナノ粒子は、少なくとも１つの化学療法剤（好ましくはアントラサイクリンより選択される）、少なくとも１つのポリ（Ｃ１−Ｃ１２アルキルシアノアクリレート）（好ましくはポリイソヘキシルシアノアクリレート）、及び少なくとも１つのシクロデキストリン（好ましくはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン及び無作為にメチル化されたベータ−シクロデキストリンならびにそれらの混合物からなる群より選択される）を含む。特定の好ましい実施態様において、ナノ粒子は、ドキソルビシン、ポリイソヘキシルシアノアクリレート、及びヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンを含む。
【００６４】
化学療法剤は、一般的に、ナノ粒子の約０．０１〜約２００mg/g、好ましくは約１〜約５０mg/gの濃度で存在する。
【００６５】
シクロスポリンの割合は、一般的に、ナノ粒子の重量により約０．１〜約７０％、好ましくは約１〜約３０％、より好ましくは約５〜約２０％である。化学療法剤の割合及びシクロスポリンの割合は、互いに非依存的である。
【００６６】
ポリ（アルキルシアノアクリレート）ポリマーの割合は、一般的に、ナノ粒子の重量により約１〜約２５％、好ましくは約５〜約１５％である。
【００６７】
特定の実施態様において、ナノ粒子は、ナノ粒子の０．０１〜２００mg/gの濃度の化学療法剤、０．１〜７０％w/wのシクロデキストリン、及び１〜２５％w/wポリ（アルキルシアノアクリレート）、好ましくは、ポリイソヘキシルシアノアクリレートを含む。
【００６８】
本明細書において使用する通り、用語「約」は、特定の値の範囲値±１０％を指す。例えば、「約１」は、１０％を考える場合には０．９〜１．１、５％を考える場合には０．９５〜１．０５を意味する。「約」を、数値範囲、例えば、「約１〜約３」、又は「約１〜約３の間」に関連して使用する場合、好ましくは、数字について上に与える「約」の定義は、範囲の開始及び終了を別々に定義する各々の数字に適用される。好ましくは、「約」を任意の数字値に関連して使用する場合、「約」を削除することができる。
【００６９】
本発明において使用するナノ粒子は、当業者により公知の任意の方法に従って調製されうる。そのような方法は、例えば、欧州特許ＥＰ  １  ０５６  ４７７及びその米国での等価のＵＳ６８８１４２１において開示されている。
【００７０】
特に、ナノ粒子は、以下の工程
ａ）酸性水溶液中で、化学療法剤とシクロデキストリンとの複合体を調製すること；
ｂ）アルキルシアノアクリレート単量体、好ましくは、イソヘキシルシアノアクリレート単量体を、工程（ａ）で得られた溶液中に徐々に加えること；及び
ｃ）この単量体の重合を、場合により、１つ又は複数の界面活性剤及び／又は安定化剤の存在において行うこと
を含む方法により調製されうる。
【００７１】
好ましくは、重合は陰イオン性であるが、しかし、また、他の薬剤により、特に光化学薬剤により誘導可能でありうる。特定の実施態様において、重合は、界面活性剤、例えばポロキサマー又はデキストラン（例えばデキストラン７０，０００など）など、あるいは他の非イオン性界面活性剤（ポリソルベート、ソルビタンエステル、又はその他など）の存在において行う。ポロキサマーが好ましく、例えばポロキサマー４０７、ポロキサマー４０１、ポロキサマー２３７、ポロキサマー３３８、ポロキサマー３３１、ポロキサマー２３１、又はポロキサマー１８８（また、Pluronic（登録商標）F68と名付けられる）など。ポロキサマー１８８がより好ましい。
【００７２】
ナノ粒子のサイズは、約５０〜約３００nm、好ましくは約１００〜約３００nm、より好ましくは約２００nmである。これらのナノ粒子のサイズは、本質的に、シクロデキストリンの濃度に関連する。
【００７３】
上に記載する通りのナノ粒子を、前記ナノ粒子及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬的組成物の形態で投与する。
【００７４】
本明細書において使用する通り、用語「医薬的に許容可能な」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は合理的な利益／リスク比率と相応の他の問題となる合併症を伴わず、ヒト及び動物の組織への接触のために適する、それらの化合物、材料、賦形剤、組成物、又は剤形を指す。
【００７５】
前記ナノ粒子を含むこの医薬的組成物は、当業者により公知の標準的な医薬的習慣（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R.Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照のこと）に従って製剤化される。特に、可能な医薬的組成物は、静脈内、動脈内、及び腫瘍内投与のために適したものを含む。これらの製剤化のために、従来の賦形剤を、当業者により周知の技術に従って使用することができる。非経口投与のためのそのような組成物は、一般的に、生理学的に適合する滅菌用液又は懸濁液であり、それらは、場合により、固形又は凍結乾燥形態から使用直前に調製することができる。アジュバント（例えば局所麻酔剤、保存剤、及び緩衝剤など）を賦形剤中に溶解することができる。界面活性剤又は湿潤剤を組成物中に含め、ナノ粒子の均一な分布を促進することができる。
【００７６】
医薬的組成物は、１つ又はいくつかの異なる化学療法剤を含む、１つ又はいくつかの型のナノ粒子を含みうる。
【００７７】
上に記載する通りのナノ粒子に加えて、医薬的組成物は、さらに、少なくとも１つの追加の活性物質（例えばナノ粒子中に含まれる別の化学療法剤など）を含みうる。
【００７８】
本発明において使用されるナノ粒子を、それを必要とする患者に投与し、治療的に効果的な量の化学療法剤を提供する。
【００７９】
本明細書において使用する通り、用語「患者」は、癌に罹患している又は罹患する可能性がある動物、例えば、繁殖、愛玩、又は保存の目的のために価値ある動物など、あるいは、好ましくは、ヒト又はヒトの子供を指す。
【００８０】
本明細書において使用する通り、「治療的に効果的な量」は、本明細書に記載する疾患又は状態の症状を防止、低下、除去、処置、又は制御する際に効果的である化合物の量を指す。用語「制御する」は、本明細書に記載する疾患又は状態の進行の遅延、中断、抑止、又は停止がありうる全てのプロセスを指すことを意図するが、しかし、全ての疾患又は状態の症状の完全な除去を必ずしも示さず、予防的な処置を含むことを意図する。投与されるナノ粒子の量は、当業者に周知の標準的手順により決定しなければならない。特に、患者の生理学的データ（例、年齢、サイズ、及び体重）、癌の型及び局在化、化学療法剤の性質を考慮に入れて、適切な投与量を決定しなければならない。
【００８１】
特定の実施態様において、化学療法剤はドキソルビシンである。ナノ粒子を、約１０〜約７５mg/m2、好ましくは約１０〜約６０mg/m2、好ましくは約１０〜約４５mg/m2、より好ましくは約１０〜約３０mg/m2、約２０〜約３０mg/m2のドキソルビシンの投与量を提供する量で投与する。より好ましくは、ドキソルビシンの投与量は、約２０mg/m2又は３０mg/m2でありうる。
【００８２】
患者の体表面積は、患者の体重及び身長から、当業者により簡単に計算されることができる（例、約６５kgの体重は、約１．８ｍ2の体表面に対応する）。
【００８３】
本発明者らは、本明細書において、少なくとも２時間にわたるナノ粒子の静脈内又は動脈内注入が、処置の毒物学的な副作用を強く低下させることを可能とし、そして劇的に利益／リスク比率を増加させることを実証している。
【００８４】
結果的に、上に記載する通りのナノ粒子は、少なくとも２時間にわたる、好ましくは２〜２４時間の間にわたる、より好ましくは４〜１２時間の間にわたる、さらにより好ましくは約６時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与される。投与される容積及び流速は、治療的に効果的な量のナノ粒子を少なくとも２時間において注入するために、当業者により簡単に決定されうる。
【００８５】
ナノ粒子は、１を上回る処置において投与されうる。それらは、１つ又はいくつかのさらなる処置サイクル（初回処置後、即ち、第１の注入）において、処置の間の約２〜約８週間、好ましくは約３〜約４週間、より好ましくは約４週間の間隔を用いて投与されうる。実施態様において、ナノ粒子の投与は、２週間毎から８週間毎のサイクルの第１日に生じる。特定の実施態様において、ナノ粒子を、２又は３の処置において、２〜約８週間、好ましくは約４週間の各々の処置の間の間隔を用いて投与する。各々の処置サイクルにおいて投与される用量は、同一でありうる又は異なりうる。処置サイクルの数及び投与される用量は、医師により、患者の生理学的状態、及び疾患の進展に従って決定されうる。別の好ましい実施態様において、上に記載する通りの１つ又はいくつかのさらなる処置サイクルが、１〜２８ヶ月の間に与えられる。
【００８６】
本明細書において使用する通り、用語「静脈内投与」（「ＩＶ」）は、静脈中への液体物質の直接的な注入を指す。
【００８７】
この用語は、静脈内アクセスデバイスの任意の型を指す。特に、この用語は、皮下注射針を指す。それは、皮膚を通して静脈中に直接的に中空針を通すことによる、静脈内アクセスの最も単純な形態である。この針を、シリンジに直接的に接続することができる、又は、チューブの長さに接続してもよく、それ故、どちらの収集又は注入システムも望まれる。
【００８８】
最も便利な部位は、しばしば、腕、特に、手の裏の静脈、又は肘の肘正中皮静脈であるが、しかし、任意の同定可能な静脈を使用することができる。
【００８９】
それは、また、末梢カニューレを指す。末梢ＩＶライン（ＰＶＣ又はＰＩＶ）は、皮膚を通じて、末梢静脈（胸又は腹部内にない任意の静脈）中に挿入された短いカテーテル（数センチメートル長）からなる。これは、通常、カニューレ−オーバー−ニードルの形態であり、それにおいて、柔軟なプラスチックカニューレは、金属トロカール上に取り付けられて来る。一旦、針及びカニューレの先端が、静脈中に位置付けられたら、トロカールを取り除き、廃棄し、カニューレを、静脈内で、適切な位置に進めて、固定する。
【００９０】
任意のアクセス可能な静脈を使用することができるが、腕及び手の静脈が最も一般的に使用され、脚及び足の静脈は、ずっと低い程度で使用される。
【００９１】
この用語は、また、カテーテルを通じた中心ＩＶライン流を指すことができ、その先端は、大静脈、通常は、上大静脈又は下大静脈内、又は心臓の右心房内にある。これは、末梢ＩＶを上回るいくつかの利点を有する：
−  それは、それらの濃度又は化学組成のために末梢静脈にとって過度に刺激になりうる液体及び医薬を、送達することができる。これらは、一部の化学療法薬及び完全非経口栄養を含む。
−  医薬は直ちに心臓に達し、身体の残りに迅速に分配される。
【００９２】
カテーテルが身体の外側から静脈に取る経路に依存して、中心ＩＶのいくつかの型がある。
【００９３】
それは、また、末梢挿入中心カテーテル（ＰＩＣＣ）を指しうるが、それは、静脈内アクセスが長期間にわたり要求される場合、又は、注入される材料が末梢ＩＶの迅速な傷害及び早期の失敗を起こしうる場合、及び、従来の中心ラインが試みるには危険すぎるであろう場合に使用される。ＰＩＣＣのための典型的な使用は、長期の化学療法計画、延長した抗生物質治療、又は完全非経口栄養を含む。
【００９４】
ＰＩＣＣラインは、通常は腕において、鞘を通じて、末梢静脈中に挿入し、次に、カテーテルが上大静脈又は右心房中にあるまで、注意深く上向きに進める。
【００９５】
静脈内アクセスデバイスは、また、中心静脈ラインでありうる。中心静脈中へのより直接的な経路を取るいくつかの型のカテーテルがある。これらは、集合的に、中心静脈ラインと呼ばれる。最も単純な型の中心静脈アクセスにおいて、カテーテルを、鎖骨下、内頸、又は（あまり一般的ではない）大腿静脈中に挿入し、それが上大静脈又は右心房に達するまで、心臓に向けて進める。
【００９６】
この用語は、また、移植可能なポート（しばしば、商標名、例えばPort-a-Cath又はMediPortなどにより言及される）を指し、それは、外部コネクターを有さない中心静脈ラインである；代わりに、それは、シリコーンゴムを用いて覆われ、皮膚下に移植される小さなリザーバーを有する。医薬は、皮膚を通して小さな針を配置し、シリコーンを刺すことにより、リザーバー中に断続的に投与される。ポートを患者の身体において長年にわたり残すことが可能である；これを行う場合、しかし、ポートに月１回アクセスしなければならない。
【００９７】
動脈内への治療用薬剤の送達は、選択的な血管カテーテル法を要求し、それは、カテーテル配置を血管解剖へ合わせることにより達成される。
【００９８】
本明細書において使用する通り、用語「動脈内投与」は、直接的な動脈中への液体物質の注入を指す。この用語は、任意の型の動脈内アクセスデバイスを指す。
【００９９】
この用語は、動脈ライン、又はａｒｔライン、又はａラインを指しうるが、それは、動脈中に挿入された細いカテーテルである。動脈ラインは、通常、手首（橈骨動脈）中に挿入される；しかし、また、肘（上腕動脈）、鼠径部（大腿動脈）、足（足背動脈）中に挿入することができる。
【０１００】
この用語は、小さな注入ポンプ（一部は注入及び取り除き能力を含む）であるシリンジドライバー又はシリンジポンプを指しうるが、少量の液体を患者に徐々に投与するために使用される、又は、化学及び生化学研究における使用のためである。シリンジドライバーは、また、医薬を数分間にわたり送達するために有用である。数分間の経過にわたりゆっくりと押すべき医薬の場合において、このデバイスは、スタッフの時間を節約し、間違いを低下させる。
【０１０１】
この用語は、また、カテーテル−ポートシステムを指す。化学療法剤の長期間投与を促進するために、経皮的に移植可能なカテーテル−ポートシステムが、長期間の使用のために開発されている。これらのシステムは、注入治療において、容器に多くの害を起こすことなく、簡単な反復穿刺を許し、それらの使用は患者にとって快適である。カテーテルシステムは、胃十二指腸動脈中、又は鎖骨下、腋窩、もしくは上腕動脈を介して、総肝動脈中に、又は大腿動脈中に外科的に移植することができる。使用するカテーテルの配置は、患者の血管解剖に依存した。標準的なカテーテル−ポートデバイスは、穿刺部位にシリコーンゴムメンブレンを伴うチタンポートリザーバー及びシリコーンカテーテルを滑らせるための横方向ステムからなった。シリコーンカテーテルと診断血管造影カテーテルの間の接続を、小さな金属カニューレを用いて補強した（Liver Intraarterial Chemotherapy: Use of the Femoral Artery for Percutaneous Implantation of Catheter-Port Systems, Karin Anna Herrmann et al. April 2000 Radiology, 215, 294-299）。
【０１０２】
この用語は、また、動脈内化学療法（ＩＡＣ）を指しうるが、それは、肝臓癌、ならびに肝臓に広がった癌、例えば転移性膵臓癌などを処置するために使用される革新的な化学療法の方法である。ＩＡＣを使用して、動脈中に置かれたカテーテルを通じて、腫瘍中に直接的に化学療法を送る。ＩＡＣの目標は、腫瘍内部に薬物を濃縮し、健康な組織への曝露を最小限にすることである。ＩＡＣの間に、細いカテーテルを、右脚における大腿動脈を通じて挿入する。血管造影を実施し、動脈の「ロードマップ」を得る。このロードマップを次に使用し、ラインを冠動脈中に挿入し、それは、肝臓に血液を送達する主な血管である。ラインが正しい位置にあることを確かめるためにシリンジからの色素を使用し、化学療法薬又は薬物を、動脈中に直接的に注射する。
【０１０３】
本明細書において使用する通り、用語「癌」は、癌の原因となる細胞の典型的な特徴（例えば無制御な増殖、不死、転移能、急速な成長及び増殖率、ならびに特定の特徴的な形態学的特色など）を持つ細胞の存在を指す。この用語は、任意の型の悪性度（原発性又は転移）を指す。特に、この用語は、任意の悪性増殖性細胞障害、例えば固形腫瘍又は造血腫瘍（癌腫、肉腫、リンパ腫、幹細胞腫瘍、芽細胞腫を含む）などを指す。好ましくは、癌は、肝癌、特に、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肺癌、特に、小細胞肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸部癌、頭頸部癌、脳腫瘍、ブレード癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ユーイング（Ｅｄｗｉｎｇ）肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、甲状腺癌、前立腺癌、胃癌、腎芽腫、カポジ肉腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。より好ましくは、癌は、肝細胞癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、小細胞肺癌、乳癌、卵巣癌、ブレード癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、ユーイング（Ｅｄｗｉｎｇ）肉腫、骨肉腫、軟部組織肉腫、甲状腺癌、前立腺癌、胃癌、腎芽腫、カポジ肉腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。好ましい実施態様において、癌は肝癌、好ましくは肝細胞癌である。
【０１０４】
特定の実施態様において、ナノ粒子は、肝細胞癌を処置するための使用のための、ドキソルビシン、ポリイソヘキシルシアノアクリレート、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及び／又は無作為にメチル化されたベータ−シクロデキストリンを含み、少なくとも２時間にわたる静脈内又は動脈内注入により投与される。
【０１０５】
以下の実施例を、例示の目的のために与え、限定のためではない。
【０１０６】
実施例
実施例１：ドキソルビシンを充填したナノ粒子の製造（ドキソルビシンを充填したナノ粒子）
開発された、ドキソルビシンを充填したナノ粒子産物が、活性成分としての塩酸ドキソルビシン及び他の賦形剤（ナノ粒子ポリマーＰＩＨＣＡを含む）を含む注射可能な懸濁液のための無菌の凍結乾燥物として提示される。薬物充填ナノ粒子は、活性成分ドキソルビシン及び他の賦形剤を含むバルク溶液中に滴下したイソヘキシルシアノアクリレート（ＩＨＣＡ）単量体の水性乳剤重合により得られる（P. Couvreur, B. Kante, M. Roland, P. Guiot, P. Baudhuin, P. Speiser, J. Pharm.Pharmacol., 1979, 31, 331）。重合の終了時、ドキソルビシンを捕捉したナノ粒子の安定な懸濁液が得られる。ナノ粒子の平均サイズは、１００nm〜３００nmの間に含まれる。ナノ粒子懸濁液を、次に、ろ過し、ガラスバイアル中に無菌的に満たし、凍結乾燥した。ドキソルビシンを充填したナノ粒子凍結乾燥産物を、安定目的のために、光及び湿気から保護して保ち、２℃〜８℃の間の冷蔵庫中に保存しなければならない。
【０１０７】
原材料
１００mlの全容積の重合媒体について：
【０１０８】
【表１０１】
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【０１０９】
１００mlの重合媒体を調製するための方法（ｐＨは３と４の間を含む）
・  賦形剤を約７５mlのＨ２Ｏに加える。
・  賦形剤を、磁気撹拌バーを用いて溶解する。
・  １００ml容積を得るまで、Ｈ２Ｏを用いて完了。
・  ｐＨを、最終的に、クエン酸１Mを用いて調整する。
【０１１０】
ドキソルビシンを充填したナノ粒子を調製するための方法（５mlバッチ）
−  １０mlフラスコ中：
−  重合媒体を４．６２５ml加える。
−  １０mg/mlのドキソルビシン溶液を３７５μl加える。
−  磁気撹拌バーを用いて混合する。
−  純粋ＩＨＣＡ溶液（ＩＨＣＡの密度＝０．９８０）を５０μl加える。
−  重合を２時間３０分の時間又はそれ以上まで、磁気撹拌及び室温の下で生じさせる。
−  ２μmフィルター上でのろ過。
【０１１１】
実施例２：健康なウィスターラットにおけるドキソルビシンを充填したナノ粒子の単回静脈内ボーラス注射後に誘導される有害作用のモデルの評価
上に記載された、動脈内経路による進行性肝細胞癌におけるドキソルビシンを充填したナノ粒子を評価する無作為化多施設第２〜３相は、処置された患者における重度の又は致死的な呼吸促迫のために２００８年に中止している。
【０１１２】
今回のインビボ試験の目的は、前記の臨床試験において観察された重度の肺の有害事象と類似の毒物学的徴候及び肺損傷を誘導することができるラットモデルを確立及び評価することであった。本発明者らは、初期（２４時間、４８時間、７２時間）及び後期（７日）モニタリング時間での、健康なウィスターラットに対する、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の臨床バッチの単回ボーラスＩＶ注射の毒物学的効果を試験した。
【０１１３】
５、７．５、及び１０mg/kgの用量レベルを、以前のインビボ試験に従って選んだ。それらは、それぞれ、３０mg/m2、４５mg/m2、及び６０mg/m2ヒト用量に対応する。
【０１１４】
薬物投与
試験には、最終的に、１２３匹の雄ウィスターラットが含まれた。
【０１１５】
ラットは、体重を量り、それらの個々の体重に従って分配され、ＩＶ処置の日に、２４匹のラットの５群を形成した。
【０１１６】
ＩＶ用量を、陰茎静脈中に、約１０００μl/分又は３７００μgドキソルビシン−ＨＣl/分の速度で、軽いイソフルラン麻酔下で、ボーラスとして投与した。
・  １〜４群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の単回ＩＶ注射（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）を、５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、２５０gのラットに、３．７１mg/ml懸濁液の用量容積３４０μlを投与するようにした。
・  ５〜８群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶ注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、２５０gのラットに、３．７１mg/ml懸濁液の用量容積５１０μlを投与するようにした。
・  ９〜１２群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶ注射を、１０mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、２５０gのラットに、３．７１mg/ml懸濁液の用量容積６７０μlを投与するようにした。
・  １３〜１６群からのラットは、ドキソルビシンの単回ＩＶ注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。溶液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、２５０gのラットに、３．５５mg/ml懸濁液の用量容積５３０μlを投与するようにした。
・  １７〜２０群（賦形剤コントロール群）からのラットは、１０mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子で処置された群と同じ容積の賦形剤溶液の単回ＩＶ投与を受けた。溶液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、２５０gのラットに、用量容積６７０μl溶液を投与するようにした。
・  ２１群（未処置コントロール群）からのラットは、処置を受けなかった。処置割り付けは、無作為に決定され、表２に開示する通りであった。
【０１１７】
【表２】
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【０１１８】
結果
最初に、本発明者らは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の最も高い用量（７．５mg/kg及び１０mg/kg）で、重要な数の死亡を、追跡調査の最初の２日間に観察した。これらの死亡は、以下：
−  肺の肉眼的修飾
−  滲出液の存在
−  肺重量における増加
−  浮腫、肺胞炎
により特徴付けられる肺損傷と密接に関連した。
【０１１９】
死亡又は肺損傷のいずれも、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（５mg/kg）、７．５mg/kgの遊離ドキソルビシンのＩＶボーラス注射を用いて、又はナノ粒子賦形剤を用いて処置された群において観察されなかった。
【０１２０】
このように、この試験は、ドキソルビシンを充填したナノ粒子のＩＶボーラス投与後の肺損傷のラットモデルを確立し、これらの深刻な有害事象の防止を試験することを可能とする。
【０１２１】
これらの有害事象の防止におけるさらなる研究のために、用量７．５mg/kgを、２日目まで肺損傷を追跡することを可能とする用量として選び、１０mg/kg用量との比較において、限定された予定外の死亡を伴った。
【０１２２】
実施例３：健康なウィスターラットにおけるドキソルビシンを充填したナノ粒子の単回ＩＶ注射の耐容性に対する投与スピードの影響の研究
ドキソルビシンを充填したナノ粒子を用いた臨床試験において観察された呼吸器の有害事象を研究するために、肺損傷のラットモデルを設定してきた。以前の試験（実施例２）では、健康なウィスターラットへの用量７．５mg/kgでのドキソルビシンを充填したナノ粒子のＩＶボーラス投与によって、主要な毒物学的効果が誘導され、肺損傷及び呼吸促迫を伴うことが示された。さらに、注射から４８時間後、注射されたラットの６３％において、死亡が観察され、主要な肺損傷と相関した。
【０１２３】
本試験の目的は、単回ボーラス注射（１０００μl/分又は３６６０μgドキソルビシンＨＣl/分）により又は２時間の灌流（４．３μl/分又は１５．６μgドキソルビシンＨＣl/分）により静脈内に注射された７．５mg/kgの同じ用量レベルでの、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（臨床バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の耐容性を比較することであった。単回ボーラスＩＶ注射により投与された５mg/kg（ヒトにおける３０mg/m2に対応する）の用量レベル（１０００μl/分又は３６６０μgドキソルビシンＨＣl/分）を、以前の試験の結果に基づき、安全なボーラス用量として選んだ：死亡及び肺損傷は、この用量で観察されなかった。ラットの安楽死を、処置から４８時間後に、以前の試験において観察された毒物学的効果の想定内の外観に従って実施した。
【０１２４】
薬物投与
試験には、３２匹の雄ウィスターラットが含まれた。
【０１２５】
ラットは、体重を量り、それらの個々の体重に従って分配され、第１のＩＶ処置の日に、ＩＶボーラスについて６匹のラット又はＩＶ灌流について８匹のラットの５群を形成した。
【０１２６】
ＩＶ注射を、軽いイソフルラン麻酔下で、２５０gラットについて、灌流の場合において大腿静脈を介して４．３μl/分（１５．６μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分に対応する）の速度で（３．６６mg/ml懸濁液）、及び、ボーラス注射の場合において陰茎静脈により約１０００μl/分（３６６０μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分に対応する）の速度で実施した。
【０１２７】
実際の投与用量を決定するために、各々のシリンジ及びカテーテルについて、処置の前後に重さを量った。
・  １群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶ灌流注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．６６mg/ml懸濁液の用量容積２．０５ml/kgを投与するようにした。灌流速度を、２５０gラットについて、４．３μl/分（１５．６μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した（２時間灌流）。
・  ２群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ボーラスＩＶ注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．６６mg/ml懸濁液の用量容積２．０５ml/kgを投与するようにした。注射速度を、１０００μl/分（３６６０μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した。
・  ３群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶボーラス注射を、５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．６６mg/ml懸濁液の用量容積１．３７ml/kgを投与するようにした。注射速度を、１０００μl/分（３６６０μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した。
・  ４群（賦形剤コントロール群）からのラットは、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子で処置された群と同じ容積の賦形剤溶液の単回ＩＶ投与を受けた。溶液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、用量容積２．０５ml/kgを投与するようにした。
・  ５群（麻酔／外科手術コントロール）からのラットを麻酔し、生理食塩水を満たし、生理食塩水のシリンジに接続したカテーテルを、大腿静脈中に挿入した。ラットを、麻酔下で、外科手術後２時間の間、維持した。処置割り付けは、以下の通りに、それらの個々の体重に従って決定された：
【０１２８】
【表３】
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【０１２９】
結果
・死亡
７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶボーラス群において、２匹のラットが、ボーラス注射後の１日目に死んでいるのが見出され、２匹のラットが２日目に死んでいるのが見出され、試験の終了時での４／６の処置ラット（６６．７％）の死亡率に対応する。
【０１３０】
７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶ灌流群において、最初の処置ラットが、処置後の２日目に死んでいるのが見出され、試験の終了時での１／８の処置ラット（１２．５％）の死亡率に対応する。
【０１３１】
５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶボーラス群において、死亡は、試験の終了時まで観察されなかった。
【０１３２】
賦形剤コントロール群において及び麻酔／外科手術コントロール群において、死亡は、試験の終了時まで観察されなかった。
【０１３３】
【表４】
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【０１３４】
・肺検査
主要な肺損傷が、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶボーラス処置群において、死亡ラット（２／２）又は安楽死ラット（３／４）を問わず、観察された。これらの生理学的変化は、胸腔における滲出液の存在、肺重量の増加、及び暗い斑点を伴う出血肺により特徴付けられた。
【０１３５】
７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶ灌流処置群において、本発明者らは、１匹のラットの胸腔における滲出液；２日目に死んでいるのが見出されたラット番号１を観察した。さらに、このラットは、出血肺を示した。本発明者らは、この群の他のラットについて胸腔において滲出液を観察しなかった。しかし、本発明者らは、安楽死前のその全身健康状態の減少を示したラット番号２について肺出血を観察した。それは、ラット番号３及び番号４の肺の色が一様ではなかったことに注目することである。８匹の動物のこの灌流群での最後の４匹のラットは、任意の肺変化を示さなかった。
【０１３６】
本発明者らは、５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶボーラス処置群において、賦形剤コントロール群及び麻酔／外科手術コントロール群において、胸腔におけるいかなる滲出液及びいかなる肉眼的肺変化をも観察しなかった。
【０１３７】
【表５】
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【０１３８】
結論
本発明者らは、以前に、用量レベル７．５mg/kg（等価のヒト用量−ＥＨＤ−  ＝  ４５mg/m2）でのドキソルビシンを充填したナノ粒子のＩＶボーラス注射（１０００μl/分又は３６６０μgドキソルビシンＨＣl/分）後の肺損傷のラットモデルを記載した。本発明者らは、処置から４８時間後、高い死亡率（処置動物の６２．５％）及び胸腔における滲出液を伴う強い肺損傷、暗い斑点を伴う肺出血、及び肺重量の有意な増加（９８％対コントロール群）を観察した。
【０１３９】
この試験において、本発明者らは、最初に、用量レベル７．５mg/kgでのドキソルビシンを充填したナノ粒子のＩＶボーラス注射（１０００μl/分又は３６６０μgドキソルビシン−ＨＣl/分）の肺毒性を確認し、類似の肺肉眼的観察（胸腔における滲出液、暗い斑点を伴う肺出血）、肺重量の増加（１１６．６％対コントロール群、ｐ＝０．００３８）、及び関連する死亡（処置動物の６６．７％）を伴った。
【０１４０】
さらに、本試験は、驚くべきことに、用量レベル７．５mg/kgでのドキソルビシンを充填したナノ粒子の遅い灌流（２時間灌流、４．３μl/分又は１５．６μgドキソルビシン−ＨＣl/分）が、同じ用量でのボーラスＩＶ注射と比較して、投与から４８時間後に、これらの毒物学的な副作用を強く低下させることを示した。実際に、死亡は、灌流群において顕著に低下した。なぜなら、ラットの８７．５％が、依然として、処置から４８時間後に生きていたからである（同じ用量レベルでのボーラス群における３３．３％と比較して）。肉眼的肺損傷も灌流群において低下した。なぜなら、わずか２／８のラットが出血肺を示したのに対し、５／６のラットが、同じ用量レベルでのボーラス群において正常な肺を示したからである。同じ方法において、肺重量の増加は、灌流群において、ボーラス群（７５．４％）と比較して、より弱く、有意ではなかった。
【０１４１】
実施例４：ドキソルビシンを充填したナノ粒子の単回静脈内注射後の健康なラットの肺及び心臓の組織学的評価。ＩＶボーラスと灌流投与の間の比較試験
以前の試験では、健康なウィスターラットへの用量７．５mg/kgでのドキソルビシンを充填したナノ粒子のＩＶボーラス投与によって、主要な毒物学的効果が誘導され、肺損傷及び呼吸促迫を伴うことが示された。さらに、処置されたラットの６３〜６７％において、死亡が、注射後４８時間以内に観察され、主要な肺損傷と相関した（実施例２）。さらなる研究では、用量レベル７．５mg/kgでのドキソルビシンを充填したナノ粒子の遅いＩＶ投与が、同じ用量でのボーラスＩＶ注射と比較して、毒物学的な副作用を強く低下させることが実証された。死亡又は肉眼的肺損傷のいずれも、処置から４８時間後に、灌流群において、ボーラス群（死亡及び肺損傷の８７．５％）と比較して、観察されなかった。肺重量の増加も、ボーラス群（１６６％）と比較して、灌流群（１２％）において有意により弱かった。これらの試験は、また、より低い用量レベル５mg/kgでのドキソルビシンを充填したナノ粒子のＩＶボーラス注射が安全であり、十分に耐容され、死亡又は肺損傷を伴わないことを実証した（実施例３）。
【０１４２】
薬物誘導性の肺毒性の分野において報告された主要な有害効果は、肺実質、胸膜、気道、肺血管系、及び縦隔における組織学的変化である。組織学的病変は、肺変化、例えば肺胞損傷、線維症、及び炎症性浸潤からなる（Pereverzeva E et al., Influence of the formulation on the tolerance profile of nanoparticle-bound doxorubicin in healthy rats: focus on cardio- and testicular toxicity. Int J Pharm. 2007, 337(1-2): 346-56）。血管周囲浮腫は、肺毒性の評価における、特に過敏性における主要なパラメーターであることが公知である（Tigani B et al., Resolution of the oedema associated with allergic pulmonary inflammation in rats assessed noninvasively by magnetic resonance imaging. British Journal of Pharmacology. 2003, 140, 2, 239-246）。データは、ドキソルビシンの肺毒性についての文献において、ほとんど利用可能ではない。
【０１４３】
観察された肺損傷をさらに研究するために、健康なウィスターラットにおいて静脈内注入された、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の肺及び心臓のＨＥＳ（ヘマトキシリン−エリスロシン−サフラン）染色後の組織学的評価を実施した。試験した組織学的変化は、特に、肺血管周囲浮腫、肺胞損傷、胸膜炎、及び細胞浸潤であった。
【０１４４】
処置／薬物投与
２つの実験を、この組織学的試験について行ってきた。
【０１４５】
２つの実験について、ＩＶ注射を、軽いイソフルラン麻酔下で、灌流の場合において大腿静脈を介して４．３μl/分の速度で、及び、ボーラス注射の場合において陰茎静脈により約１０００μl/分の速度で実施した。実際の投与用量を決定するために、各々のシリンジ及びカテーテルについて、処置の前後に重さを量った。
【０１４６】
第１実験（ＢＡ００３−ＰＫＴ−０１０Ｒｖ０１）
第１実験には、１６匹の雄ウィスターラットが含まれた。ラットは、体重を量り、それらの個々の体重に従って分配され、ＩＶボーラスについて３匹のラット及びＩＶ灌流について４匹のラットの５群を形成した。
・  １群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（臨床バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ボーラスＩＶ注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受けた。注射速度を、１０００μl/分（３６６０μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した。
・  ２群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（臨床バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶ灌流注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受けた。灌流速度を、４．３μl/分（１５．６μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した（２時間灌流）。
・  ３群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（臨床バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶボーラス注射を、５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受けた。注射速度を、１０００μl/分（３６６０μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した。
・  ４群（麻酔／外科手術コントロール）からのラットを麻酔し、生理食塩水を満たし、生理食塩水のシリンジに接続したカテーテルを、大腿静脈中に挿入した。ラットを、麻酔下で、外科手術後２時間の間、維持した。
・  ５群（賦形剤コントロール群）からのラットは、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子で処置された群と同じ容積の賦形剤溶液の単回ＩＶ投与を受けた。
【０１４７】
処置割り付けを、以下の通りに実施した：
【０１４８】
【表６】
0005523638.tif 000008
【０１４９】
第２実験（ＢＡ００３−ＰＫＴ−０１１Ｒｖ０１）
第２実験には、１４匹の雄ウィスターラットが含まれた。ラットは、体重を量り、それらの個々の体重に従って分配され、ＩＶボーラスについて４匹のラット又はＩＶ灌流について３匹のラットの４群を形成した。
・  １群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（臨床バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ボーラスＩＶ注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受けた。注射速度を、１０００μl/分（３６６０μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した。
・  ２群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（臨床バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶ灌流注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受けた。灌流速度を、４．３μl/分（１５．６μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した（２時間灌流）。
・  ３群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（臨床バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶボーラス注射を、５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受けた。注射速度を、１０００μl/分（３６６０μg（Ｄｏｘ−ＨＣｌ）/分）として定義した。
・  ４群（賦形剤コントロール群）からのラットは、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子で処置された群と同じ容積の賦形剤溶液の単回ＩＶ投与を受けた。
【０１５０】
処置割り付けを、以下の通りに実施した：
【０１５１】
【表７】
0005523638.tif 000009
【０１５２】
結果
両方の実験において、ラットを、過量のペントバルビタールのＩＶ静脈内注射による、産物の投与から４８時間後に安楽死させた。
【０１５３】
第１実験において、１／３のラットが、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子のＩＶボーラス投与から２４時間後に死んでいるのが見出された。第２実験において、３／４のラットが、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子のＩＶボーラス投与の投与から２４時間又は４８時間後に死んでいるのが見出された。これらの観察は、以下の組織学的観察の解釈において考慮に入れなければならない。
【０１５４】
健康なウィスターラットにおけるドキソルビシンを充填したナノ粒子の臨床バッチの静脈内注射をテストする、これらの２つの実験において、組織学的変化が観察され、変動する強度の肺血管周囲浮腫、偶発的な肺胞損傷、及びわずかな胸膜炎からなった。処置動物において観察された主な特色は、浮腫面からなる血管周囲面積の拡大であった。
【０１５５】
主要な肺及び心臓損傷が、約１０００μl/分（又は３７００μgドキソルビシンＨＣl/分）のボーラス速度での、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子を受けた群において観察され、動物の死亡を起こした。主要な血管周囲浮腫が、７．５mg/kgのボーラス処置群において観察された：２１．８（ｐ＝０．００６５）の比率の増加が、コントロール群と比較して、この群において観察された。
【０１５６】
７．５mg/kg用量は、約４．３μl/分（又は１５．６μgドキソルビシンＨＣl/分）の速度での灌流手順を通じて投与された場合、ボーラス注射として投与された同じ用量レベルとは対照的に、軽度又は中程度の肺組織学的病変を誘導し、心臓病変は誘導しなかった。
【０１５７】
５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶボーラス群中の動物は、軽度の肺病変だけを示した。肺血管周囲浮腫は、５mg/kgのボーラス群及び７．５mg/kgの灌流群において類似していたが、７．５mg/kgのボーラス処置群と比較して、強く低下した。
【０１５８】
全体では、これらの結果は、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の注入速度の低下が、主に、肺血管周囲浮腫により特徴付けられる、健康なラットにおける致死的な呼吸促迫の発生率を顕著に減少させることを実証した。
【０１５９】
実施例５：健康なウィスターラットにおけるドキソルビシンを充填したナノ粒子の単回静脈内灌流の潜在的な、遅延した毒物学的効果の研究。
ドキソルビシンを充填したナノ粒子（３．７mg/ml懸濁液について４．２μl/分又は１５．６μgドキソルビシンＨＣl/分）の２時間のＩＶ灌流は、単回ボーラスＩＶ注射と比較した場合、この用量レベルでの毒物学的効果の重要な減少を誘導することが示された。死亡の減少が観察された（ボーラス群における処置から２日後の死んだラットの７９％に対して灌流群における６．７％）。さらに、肺損傷の顕著な低下が、灌流処置から２日後に観察された（実施例３及び４）。
【０１６０】
これらの試験において、安楽死は、常に、ボーラス処置群又は灌流処置群を問わず、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の投与から２日後に実施した。
【０１６１】
本試験の目的は、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の２時間灌流後の潜在的な、遅延した毒物学的効果を研究することである。この方法において、用量レベル７．５mg/kgで、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の灌流により処置されたラットを、以前の試験において実施された通りに４８時間後に安楽死させたラットと比較して、処置から７日後に安楽死させる。
【０１６２】
処置薬物／投与
試験には、３４匹の雄ウィスターラットが含まれた。
【０１６３】
ラットは、体重を量り、分配され、６〜８匹のラットの５群を形成した。ＩＶ注射を、軽いイソフルラン麻酔下で、２５０gラットについて、２時間灌流の場合において大腿静脈を介して４．２μl/分又は１５．６μgドキソルビシンＨＣl/分の速度で３．６９mg/ml懸濁液で実施した。陰茎静脈を介したボーラス注射の場合において、注射速度は約１０００μl/分又は３６６０μgドキソルビシンＨＣl/分であった。
【０１６４】
実際の投与用量を決定するために、各々のシリンジ及びカテーテルについて、処置の前後に重さを量った。
・  １群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶボーラス注射を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受ける。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．６９mg/ml懸濁液の用量容積２．０４ml/kgを投与するようにした。注射速度を、１０００μl/分又は３６６０μgドキソルビシンＨＣl/分として定義した。
・  ２群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶ灌流を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受ける。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．６９mg/ml懸濁液の用量容積２．０４ml/kgを投与するようにした。灌流速度を、２５０gラットについて、４．２μl/分又は１５．６μgドキソルビシンＨＣl/分として定義した（２時間灌流）。ラットを、処置から４８時間後に安楽死させた。
・  ３群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶ灌流を、７．５mg/kgと等価のドキソルビシンＨＣｌで受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．６９mg/ml懸濁液の用量容積２．０４ml/kgを投与するようにした。灌流速度を、２５０gラットについて、４．２μl/分又は１５．６μgドキソルビシンＨＣl/分として定義した（２時間灌流）。ラットを、処置から７日後に安楽死させた。
・  ４群（賦形剤コントロール群）からのラットは、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子で処置された群と同じ容積の賦形剤溶液の単回ＩＶ投与を受けた。溶液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、用量容積２．０４ml/kgを投与するようにした。注射速度を、１０００μl/分として定義した。ラットを、処置から４８時間後に安楽死させた。
・  ５群（賦形剤コントロール群）からのラットは、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子で処置された群と同じ容積の賦形剤溶液の単回ＩＶ投与を受けた。溶液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、用量容積２．０４ml/kgを投与するようにした。注射速度を、１０００μl/分として定義した。ラットを、処置から７日後に安楽死させた。
【０１６５】
処置割り付けを、以下の通りに実施した：
【０１６６】
【表８】
0005523638.tif 000010
【０１６７】
・死亡
ボーラス群において、３匹のラットが、処置から２４時間後に死んでおり（注射されたラットの５０％）、１匹のラットが、処置から４８時間後に死んでいるのが見出され、モニタリングの終了時での死亡率６６．７％に対応した。
【０１６８】
灌流群において、２匹のラットが、灌流の終了時に死んでおり、１匹のラットが、処置から２４時間後に死んでいるのが見出された。死亡率は、７日目でのモニタリングの終了時、０日目に注入された全てのラットを考慮し、約２０％であった。
【０１６９】
死亡は、賦形剤コントロール群において観察されなかった。
【０１７０】
【表９】
0005523638.tif 000011
【０１７１】
・肉眼的肺検査
主要な肺損傷が、死んだラット又は２匹の生存ラットの１匹を問わず、７．５mg/kg  ＩＶボーラス処置群において観察された（５／６ラット）。これらの生理学的変化は、胸腔における液体の存在、肺重量の増加、ならびに暗い斑点を伴う出血肺及び／又は肺により特徴付けられた。
【０１７２】
本発明者らは、７．５mg/kgドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶ灌流群において、胸腔中の任意の滲出液を観察しなかった。しかしながら、２匹のラットが、肺色における変化を示した。ラット番号１２が１日目に死んでいた（暗い出血肺を伴う）。ラット番号４が７日目に安楽死された（暗い斑点を伴う明るい肺）。
【０１７３】
それは、賦形剤コントロール群が、以前の試験と比較して、均一ではない色を伴う肺を示したことに注目することである。
【０１７４】
【表１０】
0005523638.tif 000012
【０１７５】
・肺重量
各々のドキソルビシンを充填したナノ粒子処置群の平均肺重量を、賦形剤コントロール群の平均肺重量と比較した。
【０１７６】
７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶボーラス群における肺重量の増加は、重要であり、賦形剤コントロール群と比較して統計的に有意であった（１３１％、ｐ＝０．００３）。
【０１７７】
コントロール群と比較した、肺重量の増加は、７．５mg/kg  ＩＶ灌流群において、２日目に、より低く、有意ではなかった（３１％、ｐ＝０．１５４）。７日目に、コントロール群と比較した、灌流群における肺重量のこの増加は、２日目に観察されたものと類似していた（４０％、ｐ＝０．１７８）。
【０１７８】
結論
本試験において、本発明者らは、用量レベル７．５mg/kgでのドキソルビシンを充填したナノ粒子の２時間の灌流が、処置から７日後に遅延した毒物学的効果を誘導しないことを示した。実際に、ラットの大半が、処置から７日後に、灌流群において、肺損傷を示さなかった（注射されたラットの８６％）。さらに、差は、灌流による処置投与から２日後又は７日後に、種々の観察された臓器において観察されなかった。
【０１７９】
実施例６：健康なウィスターラットにおけるドキソルビシンを充填したナノ粒子の１５０分の単回ＩＶ灌流後の毒物学的効果の研究。
本発明者らは、以前に（実施例３）、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の約１２０分の遅い灌流速度（４．３μl/分又は１５．６μg  Ｄｏｘｏ  ＨＣl/分）が、同じ用量レベルでのＩＶボーラス注射と比較して、毒物学的な副作用を強く低下させることを記載した。
【０１８０】
本試験の目的は、耐容性及び肺毒性に対する、用量レベル７．５mg/kgでのドキソルビシンを充填したナノ粒子懸濁液の灌流スピードの影響を比較することであった。
【０１８１】
この方法において、ドキソルビシンを充填したナノ粒子を、ＩＶ灌流により、速度１２．５μg/分（２５０gラットについて、及び、３．７mg/ml  Ｄｏｘｏ  ＨＣｌ等価でのドキソルビシンを充填したナノ粒子の懸濁液について１５０分の灌流に対応する）で投与した。ラットの安楽死を、処置から４８時間後に、観察された毒物学的効果の想定内の外観に従って実施した。
【０１８２】
薬物投与
試験には、４１匹の雄ウィスターラットが含まれた。
【０１８３】
ラットを無作為に分配し、６匹のラット（ボーラス注射群）、１２匹のラット（ドキソルビシンを充填したナノ粒子灌流群）、及び４匹のラット（賦形剤溶液灌流）の６群を、最初のＩＶ処置の日に形成した。
【０１８４】
ＩＶ注射を、軽いイソフルラン麻酔下で、２５０gラット及び３．７０mg/mlでの懸濁液について、灌流の場合において大腿静脈を介して１２．５μg  Ｄｏｘｏ  ＨＣl/分又は３．４μl/分の速度での１５０分で実施した。陰茎静脈を介したボーラス注射の場合において、注射速度は約１０００μl/分又は３６６０μg  Ｄｏｘｏ  ＨＣl/分であった。
【０１８５】
実際の投与用量を決定するために、各々のシリンジ及びカテーテルについて、処置の前後に重さを量った。
・  １群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶ灌流注射を、７．５mg/kgと等価のＤｏｘｏ  ＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．７０mg/ml懸濁液の用量容積２．０２ml/kgを投与するようにした。灌流速度を、２５０gラットについて、３．４μl/分又は１２．５μg  Ｄｏｘ−ＨＣl/分として定義した（１５０分灌流）。
・  ２群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ボーラスＩＶ注射を、７．５mg/kgと等価のＤｏｘｏ  ＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．７０mg/ml懸濁液の用量容積２．０２ml/kgを投与するようにした。注射速度を、１０００μl/分又は３６６０μg  Ｄｏｘ−ＨＣl/分として定義した。
・  ３群からのラットは、ドキソルビシンを充填したナノ粒子（バッチＢＡ００３−０７Ｃ００１ＰＨ）の単回ＩＶボーラス注射を、５mg/kgと等価のＤｏｘｏ  ＨＣｌ（Ｑ１Ｄｘ１）で受けた。薬物懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、３．７０mg/ml懸濁液の用量容積１．３４ml/kgを投与するようにした。注射速度を、１０００μl/分又は３６６０μg  Ｄｏｘ−ＨＣl/分として定義した。
・  ４群（ナノ粒子群）からのラットは、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子で処置された群と同じ容積のナノ粒子の単回ＩＶ投与を受けた。懸濁液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与し、用量容積２．０２ml/kgを投与するようにした。注射速度を、１０００μl/分として定義した。
・  ５及び６群からのラットは、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子で処置された群と同じ容積の賦形剤溶液の単回ＩＶ投与を、１０００μl/分（賦形剤ボーラスコントロール群）のボーラス速度で、ならびに、３．４及び４．２μl/分（賦形剤灌流コントロール群）の灌流速度で受けた。溶液を、投与の直前に決定した、ラットの体重に従って投与した。
【０１８６】
処置割り付けを、以下の通りに実施した：
【０１８７】
【表１１】
0005523638.tif 000013
【０１８８】
・死亡
死亡が、７．５mg/kg  ＩＶボーラス処置群だけにおいて観察された。４匹のラットが、処置の４８時間後に死んでいるのが見出された（注射されたラットの６６．７％）。
【０１８９】
賦形剤コントロール群、７．５mg/kg  ＩＶ灌流群、５mg/kgボーラス群、及びナノ粒子群の間に、生存における差はなかった。
【０１９０】
【表１３】
0005523638.tif 000014
【０１９１】
・肉眼的肺検査
主要な肺損傷が、７．５mg/kg  ＩＶボーラス処置群において観察された。これらの生理学的変化は、胸腔における液体の存在、肺重量の増加、及び死んだマウスについての出血肺により特徴付けられた。非均質な色を伴い、及び、黒色の斑点を伴う肺が、１匹の生存ラット／２について観察された。本発明者らは、胸腔における任意の滲出液及び肉眼的肺変化を、７．５mg/kgドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶ灌流群、５mg/kg  ＩＶボーラス処置群、ナノ粒子群において、及び賦形剤コントロールボーラス群において観察しなかった。それは、肺が、これらの群において、非均質な色を呈することに注目することである。
【０１９２】
巨視的な肺変化は、処置直後に安楽死された賦形剤コントロール灌流群（３．４又は４．２μl/分）において観察されなかった。
【０１９３】
【表１４】
0005523638.tif 000015
【０１９４】
・肺重量
各々のドキソルビシンを充填したナノ粒子の平均肺重量を、賦形剤ボーラスコントロール群の平均肺重量と比較した。
【０１９５】
７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子ＩＶボーラス群における肺重量の増加は、賦形剤ボーラスコントロール群と比較して重要であった（１２４．２％、ｐ＝０．００７）。肺重量の増加は、コントロール群と比較して、７．５mg/kgのドキソルビシンを充填したナノ粒子灌流群において観察されなかった（２．１％、ｐ＝０．４７２）。さらに、５mg/kg群及びナノ粒子群における肺重量の増加は、賦形剤ボーラスコントロール群と比較して小さく、それぞれ５．４％（ｐ＝０．３４９）及び７．９％（ｐ＝０．０５１）を伴った。
【０１９６】
結論
本試験は、１５．６μg  Ｄｏｘｏ  ＨＣl/分から１２．５μg／分に灌流スピードを減少させることによって、依然として、肺に対する処置の影響を低下させることを示した。なぜなら、死亡は灌流群において観察されず、平均肺重量はコントロール賦形剤群と類似していたからである。比較において、平均肺重量は、７．５mg/kgボーラス群において１２４％増加した。
【０１９７】
実施例７：臨床試験第ＩＩＩ相
試験は、主に、進行性ＨＣＣを伴う患者におけるドキソルビシンを充填したナノ粒子の遅いＩＶ注入の効力を実証することを目的とする。
【０１９８】
試験計画
試験は、ソラフェニブへの失敗又は不耐性後の進行性肝細胞癌（ＨＣＣ）に苦しむ患者におけるＢｅｓｔ  Ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  Ｃａｒｅ（ＢＳＣ）の患者への、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の２用量（２０mg/m2及び３０mg/m2）の遅い反復静脈内注入の効力及び安全性を比較する多施設無作為化対照非盲検試験である。試験を、肝硬変を伴う又は伴わないＨＣＣを伴う患者を管理する複数の肝臓学又は腫瘍学センターで行う。第ＩＩ相臨床試験において得られた生存データに基づき、ドキソルビシンを充填したナノ粒子２０mg/m2及びドキソルビシンを充填したナノ粒子３０mg/m2の効力をＢＳＣのものと適切に比較するために、３９０人の患者が含まれなければならないと計算されている。安全性評価を、定期的に、少なくとも年２回、Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）により、２５人の患者毎に、又は、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の５０注入毎に（いずれでも最初に来る方）行う。包含／除外基準を満たす患者を、１：１：１比率に従って無作為化し、ドキソルビシンを充填したナノ粒子の２０mg/m2又はドキソルビシンを充填したナノ粒子の３０mg/m2、又はＢｅｓｔ  Ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  Ｃａｒｅ（ＢＳＣ）を受ける。生存期待値が２ヶ月より長く、１を上回るドキソルビシンを充填したナノ粒子注入を受けうる患者だけを含みうる。
【０１９９】
各々の患者についての試験継続期間は、無作為化前の最大２８日間のスクリーニング期間を含む。患者は、次に、無作為化され、ドキソルビシンを充填したナノ粒子２０mg/m2又はドキソルビシンを充填したナノ粒子３０mg/m2のいずれかを６時間にわたりＩＶ経路を通じて注入される、又は、ＢＳＣを与えられる。患者は、明白な腫瘍進行（治験責任医師により評価）、治癒、又は許容可能ではない毒性の発生まで、可能な限り多くのサイクルを受ける。彼らは、効力評価のために、２ヶ月毎に評価される。
【０２００】
ドキソルビシンを充填したナノ粒子群において無作為化された患者を、処置の各々のサイクルの０日目から入院させ、３日目に退院させる。試験処置（ドキソルビシンを充填したナノ粒子の２０又は３０mg/m2）を、注入により、６時間にわたり、静脈内経路を通じて、１日目に投与し、明白な進行（治験責任医師により評価）又は毒性まで４週間毎に反復する。試験訪問は、各々のサイクルの１４日目に実施する。最後の試験薬物投与から２ヶ月後、試験訪問の終了を実施する。
【０２０１】
コントロール群（「Ｂｅｓｔ  ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｃａｒｅ」群）において無作為化された患者は、通常通り処置を受け、センターの通常の習慣に従って、追跡調査される。各々のサイクルの１日目及び１４日目の試験訪問は、強制的である。
【０２０２】
ドキソルビシンを充填したナノ粒子群において無作為化された患者について、ドキソルビシンの全用量は、４５０mg/m2を超えない。
【０２０３】
全ての患者（早期に止めた患者を含む）の追跡調査生存状態を、死亡まで、３ヶ月毎に維持する。
【０２０４】
被験者の選択
包含基準
試験に含まれた全ての患者が、試験における包含のための以下の基準を満たさなければならない：
１．男性又は非妊娠、非授乳女性；
２．年齢≧１８歳；
３．以下を伴う患者
−  ソラフェニブ治療下で進行した（ＲＥＣＩＳＴ基準）又はソラフェニブへの不耐性の進行性ＨＣＣ（ＢＣＬＣ病期分類に従ったＢＣＬＣ−Ｃ）、又は；
−  経動脈的化学塞栓術（ＴＡＣＥ）に不適又は非応答性で、ソラフェニブ治療下で進行した、又は、それに不耐性である中等度ＨＣＣ（ＢＣＬＣ−Ｂ）。
４．ＡＡＳＬＤ基準に従って診断されたＨＣＣ：
−  細胞組織学基準；
−  非侵襲的基準：
−  結節≧２０mm：動脈増強を示すＭＲＩ及びＣＴスキャンの間の１つの画像技術；
−  結節１０〜２０mm：動脈増強及び門脈流出を示す２つの画像技術；
５．肝硬変を伴わない又は非代償性でない肝硬変を伴う及びＣｈｉｌｄ−ＰｕｇｈスコアＡ５からＢ７を含む；
６．ＥＣＯＧ全身状態０又は１；
７．以下の通りの臨床検査：
−  血小板≧５０，０００/mm3
−  好中球数≧１０００/mm3
−  ヘモグロビン≧１０g/dL
−  血清トランスアミナーゼ＜５ＵＬＮ（ＮＣＩ／ＣＴＣグレード０、１、又は２）
−  アルカリフォスファターゼ＜５ＵＬＮ（ＮＣＩ／ＣＴＣグレード０、１、又は２）
−  血清ビリルビン＜３５μM/L（又は２．０mg/dL）；
８．署名及び日付入りの書面のインフォームドコンセント用紙