(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、ポリ(プロピレングリコール)-、フェニル-、またはブチル-疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
イミダゾールまたはヒスチジンを含む溶液で、該疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する段階、およびそれによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階
を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製するための方法。
【請求項２】
ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、
ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、細胞または／および培養培地から回収する段階、
以下の工程：
ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、ポリ(プロピレングリコール)-、フェニル-、またはブチル-疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする工程と、
イミダゾールまたはヒスチジンを含む溶液で、該疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する工程、およびそれによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する工程と
を含む疎水性相互作用クロマトグラフィー法でヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階
を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産するための方法。
【請求項３】
前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、疎水性リガンドが付加されているアガロースのマトリクスを含むことを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
リガンドがフェニル-リガンドであり、かつ回収段階における溶液がさらに2-プロパノールを含むことを特徴とする、請求項3記載の方法。
【請求項５】
第1の溶液を、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、該疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
イミダゾールまたはヒスチジンを含む第4の溶液で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する段階、およびそれにより該ポリペプチドを生産または精製する段階
を含む請求項1または2に記載の方法であって、
第1の溶液が第1の緩衝物質を含み、第2の溶液が第2の緩衝物質を含み、かつ第4の溶液が、イミダゾールまたはヒスチジンである第4の緩衝物質を含み、かつ、第2の緩衝物質および第4の緩衝物質が、異なる緩衝物質である、前記方法。
【請求項６】
第2の溶液をアプライする段階の後および回収する段階の前に、
第3の溶液を、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階
を含むことを特徴とする請求項5記載の方法であって、第3の溶液が第3の緩衝物質を含み、第2の緩衝物質および第3の緩衝物質および第4の緩衝物質が、すべて異なる緩衝物質である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液でのクロマトグラフィー材料からのポリペプチドの溶出による、ヒスチジンタグを含むポリペプチドの精製のための疎水性相互作用クロマトグラフィー法が報告される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
タンパク質は、今日の医学的ポートフォリオにおいて重要な役割を果たす。組み換えポリペプチドの生産のための発現系は、最先端技術において周知である。薬学的応用における使用のためのポリペプチドは、主に、大腸菌（E.coli）などの原核細胞、および、CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6（登録商標）細胞などのような哺乳動物細胞において生産される。
【０００３】
ヒトへの応用のために、あらゆる薬学的物質は明確な基準を満たす必要がある。生物薬剤のヒトに対する安全性を保証するため、例えば、重大な損害を引き起こすと考えられる核酸、ウイルス、および宿主細胞タンパク質は除去されなければならない。規制上の規格を満たすために、一つまたは複数の精製段階が、製造過程に続く必要がある。とりわけ、純度、処理量、および収率が、適切な精製過程を決定するのに重要な役割を果たす。
【０００４】
微生物タンパク質を用いる親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインAまたはプロテインG親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（スルホプロピルまたはカルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合様式イオン交換）、チオフィリック（thiophilic）吸着（例えば、β-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル-セファロース、アザ-アレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例えば、Ni(II)-およびCu(II)-親和性材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）などの様々な方法が、タンパク質精製のために十分に確立されており、かつ広範に使用される（例えば、Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102（非特許文献1）を参照されたい）。
【０００５】
Mateo, C.らは、ポリヒスチジンタグが付加された酵素の親和性クロマトグラフィーについて報告している（J. Chrom. 915 (2001) 97-106（非特許文献2））。WO 02/37100（特許文献1）において、ニッケルニトリロ三酢酸（NI-NTA）樹脂の新規の応用が報告されている。hisタグが付加されたタンパク質を精製するための方法およびキットが、WO 2005/035092（特許文献2）において報告されている。WO 98/06739（特許文献3）において、組み換えタンパク質の精製のための方法が報告されている。
【０００６】
溶出剤としてアミノ酸模倣薬を含む親和性精製法が、WO 94/07912（特許文献4）において報告されている。US 2004/0152076（特許文献5）において、固定化された金属親和性クロマトグラフィーを用いた核酸分離が報告されている。第VIII因子の精製のための過程が、US 6,005,082（特許文献6）において報告されている。US 2007/0037966（特許文献7）において、第VII因子ポリペプチドの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO 02/37100
【特許文献２】WO 2005/035092
【特許文献３】WO 98/06739
【特許文献４】WO 94/07912
【特許文献５】US 2004/0152076
【特許文献６】US 6,005,082
【特許文献７】US 2007/0037966
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102
【非特許文献２】Mateo, C., et al. J. Chrom. 915 (2001) 97-106
【発明の概要】
【０００９】
ヒスチジンタグを含むポリペプチドが、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得ることが見出された。本明細書において報告される方法では、選択性および収率を失わずに、2-プロパノールなどの有機溶媒を含む回収溶液が回避され得る。
【００１０】
従って、本明細書において、以下の段階を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを取得または精製するための方法が報告される：
‐ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
‐イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第2の溶液をアプライすることにより、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを取得または精製する段階。
【００１１】
本明細書において、以下の段階を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産するための方法もまた報告される：
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、細胞または／および培養培地から、任意で封入体の形態で、回収する段階、
‐任意で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを可溶化および／またはリフォールディングする段階、
‐ヒスチジンタグを含む可溶化および／またはリフォールディングされたポリペプチドを、疎水性相互作用クロマトグラフィー法で精製し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する段階。
【００１２】
一つの態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、疎水性リガンドが付加されているアガロースのマトリクスを含む。別の態様において、リガンドは、n-、イソ-、またはネオ-脂肪族またはオリゴアルキレングリコールより選択される。さらなる態様において、リガンドは、プロピル-、ブチル-、ペンチル-、ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、ポリ(エチレングリコール)-、およびポリ(プロピレングリコール)-基より選択される。さらなる態様において、リガンドは、フェニル-リガンドであり、かつ回収段階における第2の溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体に加えて2-プロパノールを含む。
[本発明1001]
ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する段階、およびそれによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階
を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製するための方法。
[本発明1002]
ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、
ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、細胞または／および培養培地から回収する段階、
以下の工程：
ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする工程と、
イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する工程、およびそれによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する工程と
を含む疎水性相互作用クロマトグラフィー法でヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階
を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産するための方法。
[本発明1003]
疎水性相互作用クロマトグラフィー材料が、疎水性リガンドが付加されているアガロースのマトリクスを含むことを特徴とする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1004]
リガンドが、プロピル-、ブチル-、ペンチル-、ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、ポリ(エチレングリコール)-、またはポリ(プロピレングリコール)-リガンドであることを特徴とする、本発明1003の方法。
[本発明1005]
リガンドがフェニル-リガンドであり、かつ回収段階における溶液がさらに2-プロパノールを含むことを特徴とする、本発明1003の方法。
[本発明1006]
第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを回収する段階、およびそれにより該ポリペプチドを生産または精製する段階
を含む前記本発明のいずれかの方法であって、
第1の溶液が第1の緩衝物質を含み、第2の溶液が第2の緩衝物質を含み、かつ第4の溶液が、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体である第4の緩衝物質を含み、かつ、第2の緩衝物質および第4の緩衝物質が、異なる緩衝物質である、前記方法。
[本発明1007]
第2の溶液をアプライする段階の後および回収する段階の前に、
第3の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階
を含むことを特徴とする本発明1006の方法であって、第3の溶液が第3の緩衝物質を含み、第2の緩衝物質および第3の緩衝物質および第4の緩衝物質が、すべて異なる緩衝物質である、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】10カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配による20 mMイミダゾールでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：混合型ピーク画分の分析用HPLCクロマトグラム。
【図２】10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配による20 mMイミダゾールでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：混合型ピーク画分の分析用HPLCクロマトグラム。
【図３】100％溶出緩衝液への段階溶出による20 mMイミダゾールでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：混合型ピーク画分の分析用HPLC。
【図４】20カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配による100 mMヒスチジンでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：混合型ピーク画分の分析用HPLCクロマトグラム。
【図５】20カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配による20 mMヒスチジンでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：混合型ピーク画分の分析用HPLC。
【図６】10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配による20 mMイミダゾールでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ブチルリガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：ピーク画分の分析用HPLCクロマトグラム。
【図７】10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配による20 mMリン酸カリウム緩衝液での溶出を用いた、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：フロースルー画分の分析用HPLCクロマトグラム。
【図８】10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配による5 mMイミダゾールでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（フェニルリガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：ピーク画分の分析用HPLCクロマトグラム。
【図９】30カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配による1.5 M塩化ナトリウムでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体；小さな画像：混合型ピーク画分の分析用HPLCクロマトグラム。
【図１０】10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配による20 mMイミダゾールでの溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体。
【図１１】20カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配による20 mMリン酸カリウム緩衝液での溶出を用いた、本明細書において報告される方法についての、疎水性相互作用材料（ポリ(プロピレングリコール)リガンド）溶出クロマトグラム全体。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドの精製のために結合・溶出モードで操作される拡大縮小可能な疎水性相互作用クロマトグラフィー法が報告され、本方法では、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からのポリペプチドの回収が、イミダゾール、またはヒスチジンなどのイミダゾール誘導体を含む溶液を伴う。この溶出系を用いることにより、選択性および収率を失わずに、2-プロパノールのような有機溶媒を含有する溶出緩衝液の実施が回避され得る。
【００１５】
「〜にアプライする」という用語およびその文法上の相当語句は、精製されるべき関心対象の物質を含有する溶液を固定相と接触させる、精製法の部分的な段階を意味する。これは、a）固定相が配置されているクロマトグラフィー装置に溶液を添加すること、またはb）関心対象の物質を含む溶液に固定相を添加すること、を意味する。a）の場合、精製されるべき関心対象の物質を含有する溶液が、固定相を通過し、固定相と溶液中の物質との間の相互作用を可能にする。例えば、pH、伝導性、塩濃度、温度、および／または流速などの条件に応じて、溶液のいくつかの物質は固定相に結合し、および従って、溶液から除去される。他の物質は、溶液中にとどまる。溶液中にとどまる物質は、フロースルーにおいて見出され得る。「フロースルー」とは、その起源に関係なく、クロマトグラフィー装置の通過後に得られる溶液を意味する。フロースルーは、関心対象の物質を含有するアプライされた溶液、または、カラムを洗い流すために使用されるか、もしくは固定相に結合した一つまたは複数の物質の溶出を引き起こすために使用される緩衝液のいずれかであり得る。一つの態様において、クロマトグラフィー装置は、カラムまたはカセットである。関心対象の物質は、精製された形態、または一様で実質的に均質の形態において関心対象の物質を得るために、例えば、沈殿、塩析、限外濾過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、親和性クロマトグラフィー、または溶媒容積削減などの、当業者になじみ深い方法により、精製段階後に溶液から回収され得る。b）の場合、固定相が、例えば固体として、精製されるべき関心対象の物質を含有する溶液に添加され、固定相と溶液中の物質との間の相互作用を可能にする。相互作用後、例えば濾過により固定相が除去され、関心対象の物質は、固定相に結合してそれと共に溶液から除去されるか、または固定相に結合せずに溶液中にとどまるかのいずれかである。
【００１６】
本出願中で使用される「緩衝化された」という用語は、酸性または塩基性物質の添加または放出によるpHの変化が、緩衝物質によって平均化される溶液を意味する。そのような効果をもたらす任意の緩衝物質が使用され得る。一つの態様において、緩衝物質は、リン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、モルホリン、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸もしくはその塩、イミダゾールもしくはその塩、ヒスチジンもしくはその塩、グリシンもしくはその塩、またはトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（TRIS）もしくはその塩より選択される。一つの態様において、緩衝物質は、イミダゾールもしくはその塩、またはヒスチジンもしくはその塩より選択される。任意で、緩衝溶液はまた、追加的な無機塩を含んでもよい。一つの態様において、無機塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸カリウムより選択される。
【００１７】
「ポリペプチド」とは、天然に生産されていようとまたは合成的に生産されていようと、ペプチド結合により連結されたアミノ酸からなるポリマーである。約20アミノ酸残基未満のポリペプチドを「ペプチド」と呼んでもよく、他方で、二つもしくはそれ以上のポリペプチドからなる分子、または100アミノ酸残基より多い一つのポリペプチドを含む分子を「タンパク質」と呼んでもよい。ポリペプチドはまた、炭水化物基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含んでもよい。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが発現される細胞により付加され得、かつ細胞のタイプと共に変動し得る。ポリペプチドは、本明細書において、そのアミノ酸バックボーン構造または同一物をコードする核酸に関して定義される。炭水化物基などの付加物は、一般に特定されないが、それにもかかわらず存在する場合もある。
【００１８】
「結合・溶出モード」という用語は、クロマトグラフィー精製法を行う手段を意味する。本明細書において、精製されるべき関心対象のポリペプチドを含有する溶液は、固定相、特に固体相にアプライされ、それにより関心対象のポリペプチドは固定相と相互作用し、かつその上に保持される。関心対象でない物質は、それぞれフロースルーまたは上清と共に除去される。関心対象のポリペプチドはその後、溶出溶液をアプライすることにより第2の段階において固定相から回収される。
【００１９】
「単量体形態におけるポリペプチド」という用語は、第2のポリペプチド分子と会合していない、すなわち、同じ種類または異なる種類のいずれかの別のポリペプチド分子に、共有結合でも非共有結合でも結合していないポリペプチドを意味する。「凝集形態におけるポリペプチド」という用語は、少なくとも一つの追加的なポリペプチドと共有結合または非共有結合のいずれかで会合しており、かつサイズ排除クロマトグラフィーカラムから単一のピークで溶出されるポリペプチドを意味する。「単量体形態における」という用語は、ポリペプチドの100％（サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された際）が単量体形態において存在することを必ずしも意味しない。さらに、ポリペプチドが本質的に単量体形態である、すなわち、ポリペプチドの少なくとも90％（サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された際）が単量体形態であるか、またはポリペプチドの少なくとも95％が単量体形態であるか、またはポリペプチドの少なくとも98％が単量体形態であるか、またはポリペプチドの少なくとも99％が単量体形態であるか、または特に、ポリペプチドの99％より多く（サイズ排除クロマトグラフィーにより測定された際）が単量体形態であることを意味する。「単量体形態および凝集形態における」という用語は、他のポリペプチド分子と会合していないポリペプチド分子と、他のポリペプチド分子と会合しているポリペプチド分子との混合物を意味する。この混合物において、単量体形態または凝集形態のいずれも排他的には存在しない。
【００２０】
「封入体」という用語は、原核細胞のすべての細胞成分を含む細胞タンパク質全体の有意な部分を構成する、凝集した関心対象のポリペプチドの、高密度の細胞内の塊を意味する。
【００２１】
「変性された」という用語は、ポリペプチドの形態であって、天然のものではない二次構造、三次構造、および／または四次構造を有する形態を意味する。この非天然形態におけるポリペプチドは、可溶性であるが、同時に生物学的に不活性の立体配座であってもよい。または、ポリペプチドは、不溶性であり、かつ、例えば不適切なまたは形成されていないジスルフィド結合を伴う生物学的に不活性の立体配座であってもよい。この不溶性のポリペプチドは、封入体中に含有される可能性があるが、含有されている必要はない。
【００２２】
「リフォールディングされた」という用語は、変性された形態から取得されるポリペプチドを指す。典型的に、リフォールディングの目標は、タンパク質がリフォールディング段階なしで生産された場合に有するであろうよりも高いレベルの活性を有するタンパク質を生産することである。フォールディングされたタンパク質分子は、最小の自由エネルギーを有する立体配座において最も安定である。大抵の水溶性タンパク質は、疎水性アミノ酸の大部分が水から離れて分子の内側部分にある様式で、フォールディングする。タンパク質を結びつける弱い結合は、ポリペプチドをアンフォールディングさせる、すなわち変性させる多数の処理により破壊され得る。フォールディングされたタンパク質は、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、水素結合、ジスルフィド結合、および共有結合を含む、アミノ酸自体とその環境との間のいくつかのタイプの相互作用の産物である。
【００２３】
本明細書において使用される「変性した」または「変性された」という用語は、天然またはリフォールディングされた状態において分子に存在するイオン結合および共有結合、ならびにファンデルワールス相互作用が破壊されているポリペプチドを指す。ポリペプチドの変性は、例えば、8 M尿素、メルカプトエタノールなどの還元剤、熱、pH、温度、および他の化学物質での処理により達成され得る。8 M尿素などの試薬は、水素結合および疎水結合の両方を破壊し、かつメルカプトエタノールも添加された場合、システイン間に形成されているジスルフィド架橋（S-S）は二つの-S-H基に還元される。天然またはリフォールディングされた状態においてジスルフィド結合を含有するポリペプチドのリフォールディングはまた、タンパク質がジスルフィド結合を再形成するようにシステイン残基上に存在する-S-H基の酸化を含んでもよい。
【００２４】
一般に、疎水性相互作用クロマトグラフィーの位置は、ポリペプチドの多段階の精製配列において可変である。
【００２５】
ポリペプチドを精製するための方法は、十分に確立されており、かつ広範に使用される。それらは、単独または組み合わせのいずれかで使用される。そのような方法は、例えば、複合した金属イオンを伴うチオールリガンドを使用する親和性クロマトグラフィー（例えば、Ni(II)-およびCu(II)-親和性材料を用いる）、または微生物由来タンパク質を使用する親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインAまたはプロテインG親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合様式交換クロマトグラフィー）、チオフィリック吸着（例えば、β-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル-sepharose、アザ-アレノフィリック樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに調製用電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）である。
【００２６】
免疫グロブリンの精製過程は、一般に、多段階のクロマトグラフィー部分を含む。第1の段階において、免疫グロブリンでないポリペプチドおよびタンパク質が、例えばプロテインAを用いる親和性クロマトグラフィーにより免疫グロブリン画分から分離される。その後、イオン交換クロマトグラフィーが行われて、個々の免疫グロブリンクラスを分離し、かつ第1のカラムから共溶出された微量のプロテインAを除去することができる。最終的に、免疫グロブリンの単量体を同一のクラスの多量体および断片から分離するために、第3のクロマトグラフィー段階が必要である。時々、凝集体の量が高く（5％またはそれ以上）、かつ第3の精製段階において効率よく分離できず、さらなる精製段階を必要とする。
【００２７】
ヒスチジンタグを含むポリペプチドが、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得ることが見出された。イミダゾールまたはイミダゾール誘導体は一般に、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からではなく、金属親和性クロマトグラフィー材料からヒスチジンタグが付加されたポリペプチドを回収するように使用されるため、この知見は非常に驚くべきことであった。すべての異なる形態は、ヒスチジンタグを含み、かつ金属親和性クロマトグラフィー材料に結合するため、金属親和性クロマトグラフィー材料を使用することによっては、正確にフォールディングされたポリペプチド形態、凝集したポリペプチド形態、部分的にフォールディングされたポリペプチド形態、およびアンフォールディングされたポリペプチド形態を区別できない。しかしながら、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を使用することにより、これらの密接に関連したポリペプチド形態を分解できることが見出された。同時に、このクロマトグラフィー材料は、工業生産規模の分離に十分な結合能力を有する。
【００２８】
そのため、本明細書において、第1の局面として、以下の段階を含む、ヒスチジンタグを有するポリペプチドを精製するための方法が報告される：
‐ヒスチジンタグを有するポリペプチドを含む溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、ならびに
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で回収し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製する段階。
【００２９】
イミダゾールまたはイミダゾール誘導体が、結合したポリペプチドの回収に使用されるため、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライされるポリペプチドを含む溶液は、イミダゾールおよびいずれのイミダゾール誘導体も無い状態である。疎水性相互作用クロマトグラフィー材料上に保持されたポリペプチドは、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液で回収される。本方法は、結合・溶出モードで操作され、すなわち、ヒスチジンタグを含むポリペプチドは、最初に疎水性相互作用クロマトグラフィー材料に結合され、およびその後、さらなる段階において、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収される。間欠的な洗浄段階が、本明細書において報告される方法に含まれ得る。これらの洗浄段階において、アプライされる溶液は、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体が無い状態である。
【００３０】
本明細書中で報告される方法において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収するための溶液以外のすべての溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体が無い状態であり、すなわちそれらを含有しない。一つの態様において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液は、水溶液である。さらなる態様において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液は、有機溶媒および／または脂肪族アルコールを含まない、すなわちそれらが無い状態である。さらなる態様において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む溶液は、水、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体、緩衝物質、および任意で、一つまたは二つまたは三つの無機塩からなる。
【００３１】
「イミダゾールまたはイミダゾール誘導体」という用語は、イミダゾール、置換されたイミダゾール、ヒスチジン、およびヒスチジン誘導体より選択される化合物を意味する。一つの態様において、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体は、イミダゾールおよびヒスチジンより選択される。
【００３２】
一つの態様における疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、疎水性リガンドが共有結合で連結されているアガロースのマトリクスを含む。さらなる態様において、リガンドは、n-、イソ-、もしくはネオ-脂肪族リガンド、またはオリゴ(アルキレングリコール)-リガンドである。さらなる態様において、リガンドは、プロピル-、ブチル-、ペンチル-、ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-、ポリ(エチレングリコール)-、またはポリ(プロピレングリコール)-リガンドである。一つの態様において、リガンドは、ポリ(プロピレングリコール)-リガンドである。別の態様において、リガンドは、フェニル-リガンドであり、かつ回収段階における溶液は、さらに2-プロパノールを含む。
【００３３】
「ヒスチジンタグを含む」または「ヒスチジンタグが付加された」という用語は、ポリペプチドのC末端またはN末端のいずれかの、ヒスチジン残基の連続した配列の存在を意味する。ヒスチジンタグは、それぞれの末端に直接的であってもよいし、または最高でそれぞれの末端の10残基以内であってもよい。ヒスチジンタグにおけるヒスチジン残基の数は、3残基から10残基まで、すなわち、3、または4、または5、または6、または7、または8、または9、または10残基である。一つの態様において、ヒスチジン残基の数は、4残基から8残基までである。
【００３４】
本明細書中で報告される局面の一つの態様において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製または取得するための方法は、以下の段階を含む：
‐調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を生じるように、第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐任意で、第3の溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを精製または取得する段階。
【００３５】
第1〜第3の溶液は、イミダゾールおよびいずれのイミダゾール誘導体も無い状態である。
【００３６】
ヒスチジンタグを含むポリペプチドは、CHO細胞、HEK細胞、および大腸菌など真核細胞および原核細胞において組み換えにより生産され得る。ポリペプチドが原核細胞において生産される場合、一般に、不溶性の封入体の形態で取得される。封入体は、原核細胞および培養培地から容易に回収され得る。封入体において不溶性形態で取得されたポリペプチドは、精製および／またはリフォールディング手順が実施され得る前に、可溶化されなければならない。一般に、金属親和性クロマトグラフィーは、例えば、可溶化および／またはリフォールディング後に取得された、溶液中に含有される正確にフォールディングされたポリペプチド形態、凝集したポリペプチド形態、部分的にフォールディングされたポリペプチド形態、およびアンフォールディングされたポリペプチド形態を区別できない。これは、異なるポリペプチド形態がすべて、金属親和性クロマトグラフィー材料との相互作用を担うヒスチジンタグを含むという事実のためである。疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含有する溶液が回収に使用される際、これらの異なるが密接に関連したポリペプチド形態を分離できることが見出された。イミダゾールおよびイミダゾール誘導体は一般に、ヒスチジンタグを含むポリペプチドをキレートクロマトグラフィー材料から回収するように使用されるため、この知見は全く予想外であった。ヒスチジンタグを欠如するポリペプチドでの対照は、イミダゾールにより誘導される回収の効果は、ヒスチジンタグを含むポリペプチドに特異的であることを示した。
【００３７】
従って、本明細書において報告される第2の局面は、以下の段階を含む、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産するための方法である：
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、原核細胞もしくは真核細胞または／および培養培地から、原核細胞の場合は任意で封入体の形態で、回収する段階、
‐任意で、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを可溶化および／またはリフォールディングする段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを、本明細書において報告される疎水性相互作用クロマトグラフィー法で精製し、それによりヒスチジンタグを含むポリペプチドを生産する段階。
【００３８】
一つの態様において、疎水性相互作用クロマトグラフィー法は、
‐調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料を生じるように、第1の溶液を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液を、調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐任意で、第3の溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする段階、
‐イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む第4の溶液で、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドを取得する段階
を含み、ここで、第1〜第3の溶液は、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体が無い状態である。
【００３９】
以下に、先に報告されたすべての局面の様々な態様が提示される。
【００４０】
一つの態様において、第1の溶液は第1の緩衝物質を含み、第2の溶液は第2の緩衝物質を含み、第3の溶液は第3の緩衝物質を含み、および第4の溶液は第4の緩衝物質を含み、ここで、少なくとも第2の緩衝物質および第3の緩衝物質および第4の緩衝物質がすべて異なる緩衝物質であるという条件で、第4の緩衝物質は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体である。一つの態様において、第1の溶液および／または第2の溶液および／または第3の溶液は、イミダゾールおよびイミダゾール誘導体が無い状態である。別の態様において、第1の溶液をアプライする段階は、3〜20カラム容積である。別の態様において、第1の溶液をアプライする段階は、3〜10カラム容積である。一つの態様において、第2の溶液をアプライする段階は、1〜10カラム容積である。別の態様において、第3の溶液をアプライする段階は、1〜10カラム容積である。
【００４１】
疎水性相互作用クロマトグラフィー材料は、第1の段階において、緩衝溶液で調整される。この溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含まない。調整用の第1の緩衝溶液の緩衝物質は、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液の緩衝物質と同一であり得るか、または異なり得る。
【００４２】
その後、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の溶液が、調整された疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライされる。この段階において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドは、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料上に保持される。この溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含まない。ローディング用、すなわち第2の緩衝溶液の緩衝物質は、第3の溶液の緩衝物質と同一であり得るか、または異なり得る。
【００４３】
ヒスチジンタグを含むポリペプチドでのクロマトグラフィー材料のローディングの後、任意で、洗浄用、すなわち第3の溶液が、ローディングされた疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライされ得る。この溶液は、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含まない。
【００４４】
最終的に、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収するために、イミダゾールまたはイミダゾール誘導体を含む回収用、すなわち第4の溶液が、クロマトグラフィー材料にアプライされる。
【００４５】
一つの態様において、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを精製または取得するための方法は、カラムクロマトグラフィー法である。
【００４６】
異なる段階において疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライされる容積は、互いに独立して、3〜20カラム容積であり、一つの態様において、4〜10カラム容積である。一つの態様において、第1の溶液の伝導性は、ヒスチジンタグを含むポリペプチドを含む第2の容積の伝導性と同一かもしくはそれより高く、ならびに／または、第3の溶液の伝導性および／もしくは第4の溶液の伝導性よりも高い。
【００４７】
本明細書において報告される方法における溶液のpH値は、pH 5〜pH 8である。本明細書において報告される方法は、インスリン様成長因子-1およびヒスチジンタグの結合体を用いて実施例において例証される。その調製法は、例えばWO 2008/025527（参照により本明細書に組み入れられる）において報告されている。このデータは、本方法を例証するためだけに提示され、かつ本発明の限定として扱われるべきではない。
【００４８】
以下の実施例および図面は、本発明の理解を手助けするために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の趣旨から逸脱することなく、示される手順を改変できることが理解される。
【実施例】
【００４９】
実施例1
材料および方法：
他の方法で示されない場合、クロマトグラフィー材料製造業者の取扱説明書に従って、様々なクロマトグラフィー法が行われた。
【００５０】
組み換えDNA技術：
Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているような標準的な方法を使用して、DNAを操作した。製造業者の指示書に従って、分子生物学用試薬を使用した。
【００５１】
タンパク質の測定：
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、320 nmの参照波長と共に280 nmの光学密度（OD）を測定することにより、タンパク質濃度を測定した。
【００５２】
サイズ排除-HPLC：
クロマトグラフィーを、ASI-100 HPLCシステム（Dionex, Idstein, Germany）上でTosoh Haas TSK 3000 SWXLカラムを用いて行った。溶出ピークを、UVダイオードアレイ検出器（Dionex）により280 nmでモニタリングした。濃い試料を1 mg/mlに溶解した後、安定なベースラインが達成されるまで、200 mMリン酸二水素カリウムおよび250 mM塩化カリウム pH 7.0からなる緩衝液でカラムを洗浄した。分析ランを、アイソクラティック条件下で0.5 ml/分の流速を用いて、30分間室温で行った。クロマトグラムを、手動でChromeleon（Dionex, Idstein, Germany）に取り込んだ。
【００５３】
逆相HPLC（RP-HPLC）:
純度を、RP-HPLCにより分析する。アッセイを、アセトニトリル／水性TFA勾配を用いてPhenomenex C18カラム上で行う。溶出プロファイルを、215 nmでのUV吸光度としてモニタリングする。溶出された物質のパーセンテージを、溶出されたタンパク質のピーク領域全体に基づいて計算する。
【００５４】
DNA閾値系：
例えば、Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照されたい。
【００５５】
宿主細胞タンパク質の測定：
マイクロタイタープレートのウェルの壁を、血清アルブミンおよびストレプトアビジンの混合物でコーティングする。HCPに対するヤギ由来のポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄段階の後、マイクロタイタープレートの異なるウェルを、異なる濃度のHCP較正配列および試料溶液と共にインキュベーションする。インキュベーションの後、緩衝溶液での洗浄により、結合していない試料材料を除去する。検出のために、ウェルを抗体ペルオキシダーゼ結合体と共にインキュベーションし、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定したペルオキシダーゼ活性を、ABTSとのインキュベーションおよび405 nmでの検出により検出する。
【００５６】
DNAの測定：
ビオチンをマイクロタイタープレートに結合させた。ストレプトアビジン、一本鎖DNA、およびビオチン化一本鎖DNA結合タンパク質の反応混合物を添加した。結合タンパク質はDNAに結合することができ、かつビオチン化されていた。この様式において、試料混合物からDNAを特異的に除去することができた。ストレプトアビジンは、マイクロタイタープレート上のビオチン、および一本鎖DNA結合タンパク質に連結したビオチンに結合した。ウレアーゼに連結したDNA特異的抗体を、この複合体全体に添加した。尿素の添加が尿素の加水分解をもたらし、pHの局所的な変化を引き起こした。この変化を、変化した表面電位として検出することができる。表面電位における変化は、結合したDNAの量に比例していた。一本鎖DNAは、プロテイナーゼK消化およびSDSでの変性により取得した。
【００５７】
封入体からのペプチドの単離、可溶化、およびリフォールディングのための一般的方法：
封入体の調製は、引用された文献において行われている方法に加えて、例えば、Rudolphらによる方法に従って行われ得る（Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach, 57-99 (1997)）。封入体を-70℃で保存した。封入体の可溶化は同様に、Rudolphらによる方法に従って行われ得る（Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: T.E. Creighton (ed.): Protein function: A Practical Approach (1997) 57-99）。
【００５８】
実施例2
イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂：  TOYOPEARL（登録商標）Polypropylenglycol-600；TOYOPEARL（登録商標）PPG-600M（Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany）
ローディング：  a）118 mgポリペプチド
b）1034 mgポリペプチド
c）1034 mgポリペプチド
カラム寸法：  a）高さ13 cm、総容積11 ml
b）高さ22 cm、総容積108 ml
c）高さ22 cm、総容積108 ml
平衡化緩衝液／第1の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1／第2の溶液：  1 M TRIS-HCl、0.15 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液2／第3の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液／第4の溶液：  20 mMイミダゾール、pH 9.7
溶出法：  a）20カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配
b）10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配
c）100％溶出緩衝液への段階溶出
結果：
図1〜3より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-I分子は、3種類の使用された溶出法のうち任意のもので、ポリ(プロピレングリコール)疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。
【００５９】
実施例3
ヒスチジン溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂：  TOYOPEARL（登録商標）Polypropylenglycol-600；TOYOPEARL（登録商標）PPG-600M（Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany）
ローディング：  123 mgポリペプチド
カラム寸法：  高さ13 cm、総容積11 ml
平衡化緩衝液／第1の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1／第2の溶液：  1 M TRIS-HCl、0.15 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液2／第3の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液／第4の溶液：  a）100 mMヒスチジン、pH 9.7
b）20 mMヒスチジン、pH 9.7
溶出法：  20カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配
結果：
図4および5より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-I分子は、2種類の使用された溶出溶液のうち任意のもので、ポリ(プロピレングリコール)疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。
【００６０】
実施例4
イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂：  Capto（商標）Butyl（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）
ローディング：  104 mgポリペプチド
カラム寸法：  高さ13.5 cm、総容積10.7 ml
平衡化緩衝液／第1の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1／第2の溶液：  1 M TRIS-HCl、0.35 M NaCl、20 mMクエン酸、pH 3.5
洗浄緩衝液2／第3の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液／第4の溶液：  20 mMイミダゾール、pH 9.7
溶出法：  10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配
結果：
図6より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iは、溶出緩衝液でブチル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収され得る。
【００６１】
実施例5
比較実施例‐リン酸溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂：  TOYOPEARL（登録商標）Ether-650M（Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany）
ローディング：  102 mgポリペプチド
平衡化緩衝液／第1の溶液：  20 mM KH2PO4、1 M NaCl、pH 7.0
洗浄緩衝液1／第2の溶液：  20 mM KH2PO4、1 M NaCl、pH 7.0
溶出緩衝液／第4の溶液：  20 mM KH2PO4、pH 7.0
溶出法：  100％溶出緩衝液への段階溶出
結果：
図7より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-I分子は、リン酸を含有する緩衝液単独では、エーテル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収できない。
【００６２】
実施例6
比較実施例‐異なる溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂：  a）Phenyl Sepharose（商標）（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）
b）TOYOPEARL（登録商標）PPG-600M（Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany）
ローディング：  80 mgポリペプチド
カラム寸法：  高さ14 cm、総容積11 ml
平衡化緩衝液／第1の溶液：  a）20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
b）20 mM KH2PO4、1.5 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1／第2の溶液：  a）1 M TRIS-HCl、0.35 M NaCl、20 mMクエン酸、pH 3.5
b）-
洗浄緩衝液2／第3の溶液：  a）20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
b）20 mM KH2PO4、1.5 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液／第4の溶液：  a）5 mMイミダゾール、20％（v/v）2-プロパノール、pH 7.0
b）1.5 M NaCl、20％（v/v）2-プロパノール、pH 3.5
溶出法：  a）10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配
b）30カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配
結果：
図8より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iは、イミダゾールおよび2-プロパノールを含有する溶出緩衝液で、Phenyl Sepharose（商標）疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から急なピークで回収され得る。これは、イミダゾールを含まない溶出緩衝液では達成できない（図9を参照されたい）。
【００６３】
実施例7
比較実施例‐イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iの精製
樹脂：  Capto（商標）Phenyl（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）
ローディング：  117 mgポリペプチド
カラム寸法：  高さ13.5 cm、総容積10.7 ml
平衡化緩衝液／第1の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1／第2の溶液：  1 M TRIS-HCl、0.35 M NaCl、20 mMクエン酸、pH 3.5
洗浄緩衝液2／第3の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
溶出緩衝液／第4の溶液：  20 mMイミダゾール、pH 9.7
溶出法：  10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配
結果：
図10より見られ得るように、ヒスチジンタグが付加されたIGF-Iは、溶出緩衝液でフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー材料から回収できない。
【００６４】
実施例8
比較実施例‐イミダゾール溶出を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム上での、Herceptin（登録商標）の精製
培養上清を、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料にアプライする前に、pH 3.5および0.8モル/lのNaCl濃度に調整し、かつSartobran Pフィルターで濾過する。
樹脂：  TOYOPEARL（登録商標）Polypropylenglycol-600；TOYOPEARL（登録商標）PPG-600M（Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany）
ローディング：  189 mgポリペプチド
カラム寸法：  高さ16 cm、総容積12.6 ml
平衡化緩衝液／第1の溶液：  20 mM KH2PO4、0.8 M NaCl、pH 3.5
洗浄緩衝液1／第2の溶液：  1 M TRIS-HCl、0.35 M NaCl、20 mMクエン酸、pH 3.5
溶出緩衝液／第4の溶液：  a）20 mMイミダゾール、pH 9.7
b）20 mM KH2PO4、pH 8.9
溶出法：  a）10カラム容積における50％溶出緩衝液への直線勾配
b）20カラム容積における100％溶出緩衝液への直線勾配
結果：
Herceptin（登録商標）の画分は、イミダゾール溶出によりフロースルーにおいて見出され得る。さらなる画分が、溶出の初めに小さなピークとしてカラムから回収され得る。それと対照的に、図11に示されるように、リン酸緩衝溶液での溶出により、Herceptin（登録商標）は急なピークとして取得され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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