(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープヘマグルチニン糖タンパク質の三次元エピトープに特異的に結合する抗体であって、以下から成る群より選択される抗体：
（ａ）  アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８２４７で寄託されたハイブリドーマ３Ｂ１により産生されるモノクローナル抗体３Ｂ１； 
（ｂ）  アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８５２７で寄託されたハイブリドーマ３Ｅ８により産生されるモノクローナル抗体３Ｅ８；および
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）の単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体。
【請求項２】
アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８２４７で寄託されたハイブリドーマ３Ｂ１により産生されるモノクローナル抗体３Ｂ１。
【請求項３】
アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８５２７で寄託されたハイブリドーマ３Ｅ８により産生されるモノクローナル抗体３Ｅ８。
【請求項４】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するための方法であって、標本を、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体と接触させ、抗体の結合を検出することを含む、前記方法。
【請求項５】
標本をトリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合する結合タンパク質と接触させることを含み、抗体は捕捉抗体であり、結合タンパク質は検出可能要素を含むかまたはそれにコンジュゲートした検出結合タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗体および結合タンパク質の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
抗体および結合タンパク質の双方がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
抗体が固体表面上に固定される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
結合タンパク質が、放射性原子を含むか、蛍光性分子にコンジュゲートしているか、または酵素にコンジュゲートしている、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的標本においてＨ５Ｎ１亜型トリインフルエンザウイルスを検出するための方法であって、標本を第１の抗体および第２の抗体と接触させることを含み、
その第１の抗体は、トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープヘマグルチニン糖タンパク質の三次元エピトープに結合し、以下から成る群より選択され：
（ａ）  アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８２４７で寄託されたハイブリドーマ３Ｂ１により産生されるモノクローナル抗体３Ｂ１；
（ｂ）  アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８５２７で寄託されたハイブリドーマ３Ｅ８により産生されるモノクローナル抗体３Ｅ８；および
（ｃ）  （ａ）または（ｂ）の単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体、そして
その第２の抗体は、トリインフルエンザウイルスのＮ１亜型のノイラミニダーゼ糖タンパク質に結合し、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８５２６で寄託されたハイブリドーマ６Ｃ６により産生されるモノクローナル抗体６Ｃ６、あるいはモノクローナル抗体６Ｃ６の単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、
前記方法。
【請求項１１】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体を、その抗体のそのエンベロープ糖タンパク質への結合を検出するための試薬と共に含む、前記キット。
【請求項１２】
トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合する結合タンパク質を更に含み、抗体は捕捉抗体であり、結合タンパク質は検出可能要素を含むかまたはそれにコンジュゲートした検出結合タンパク質である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
抗体および結合タンパク質の少なくとも一方がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
抗体および結合タンパク質の双方がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
抗体が固体表面上に固定される、請求項１２に記載のキット。
【請求項１６】
結合タンパク質が、放射性原子を含むか、蛍光性分子にコンジュゲートしているか、または酵素にコンジュゲートしている、請求項１２に記載のキット。
【請求項１７】
トリインフルエンザウイルスのＮ１亜型のノイラミニダーゼ糖タンパク質の三次元エピトープに結合し、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８５２６で寄託されたハイブリドーマ６Ｃ６により産生されるモノクローナル抗体６Ｃ６、あるいはモノクローナル抗体６Ｃ６の単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体である抗体を更に含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１８】
Ｈ５亜型トリインフルエンザウイルスに感染した対象を処理するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が、組換えモノクローナル抗体、単鎖抗体、抗体断片、キメラ抗体、またはヒト化抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体が、モノクローナル抗体３Ｂ１の可変領域またはモノクローナル抗体３Ｅ８の可変領域を含む組換えモノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２１】
Ｈ５亜型トリインフルエンザウイルスに感染した対象を処理するための医薬を製造するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項２２】
トリインフルエンザウイルスＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）株の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体３Ｂ１により認識されるその株のＨＡ配列のエピトープ内部のアミノ酸１７１に、変異体ウイルスがその抗体で中和できなくなるような変異を含み、ここで、モノクローナル抗体３Ｂ１は、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８２４７で寄託されたハイブリドーマ３Ｂ１により産生される、前記変異体。
【請求項２３】
トリインフルエンザウイルス株Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体３Ｅ８により認識されるその株のＨＡ配列のエピトープ内部のアミノ酸２０５に、変異体ウイルスがその抗体で中和できなくなるような変異を含み、ここで、モノクローナル抗体３Ｅ８は、アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８５２７で寄託されたハイブリドーマ３Ｅ８により産生される、前記変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、トリインフルエンザウイルス（”ＡＩＶ”）の検出および処置のための抗体および関連する結合タンパク質に関する。より詳細には、この発明は、ＡＩＶの高病原性Ｈ５亜型の検出および処置に有用なモノクローナル抗体および関連する結合タンパク質に、ならびに動物およびヒトにおけるＡＩＶ感染症の診断、監視および処置のための方法および製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスは、次のインフルエンザの世界的流行（ｐａｎｄｅｍｉｃ）の原因になる可能性がある。インフルエンザＡ感染の例年の大発生は進行中の公衆衛生の脅威であり、ヒトがそれに対してほとんど免疫を持たず、結果として破壊的な世界的流行をもたらす新規のインフルエンザ株が周期的に発生する可能性がある。Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスにより引き起こされた１９１８年のスペイン風邪（”Ｓｐａｎｉｓｈ  ｆｌｕ”）の世界的流行は、世界中で４０００万人を超える人々を殺した。Ｈ１Ｎ１の起源は直接トリからヒトへ至った可能性があり、またはそれは中間宿主、例えばブタもしくは別のまだ同定されていない動物宿主における潜伏（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を含んでいた可能性がある（１）（参考文献一覧は開示の最後に提供する）。それぞれＨ２Ｎ２およびＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスにより引き起こされた１９５７年の世界的流行および１９６８年の世界的流行は、両方とも、一方、または両方のヒトに適応したウイルス表面タンパク質がトリインフルエンザ株からのタンパク質により置き換えられた再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔｓ）に由来していたようである（２）。
【０００３】
Ｈ５Ｎ１ウイルスは、肉食動物を含む前例のない範囲の宿主に感染する能力を有している。ＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１がヒトに感染する最初に確認された例は、１９９７年に起きた。高病原性Ｈ５Ｎ１感染症が家禽およびヒトの両方において発生した。これがトリインフルエンザウイルスのトリからヒトへの直接の伝染が見つかった最初の時であった。その後、世界保健機構（ＷＨＯ）によると、ヒトのＨ５Ｎ１の症例の総数は２００３年に起きた東南アジアにおける最初の大発生以来２８１件に達しており、１６９件の死亡を伴っている。インドネシアは、２００５年の６月にＨ５Ｎ１ウイルスにより引き起こされたトリインフルエンザのその最初のヒトの症例を報告した。現在までに、それは２００７年における症例を報告している唯一の国であり、２００７年３月現在で確認されたヒトの症例は８１件で、その内の６３件が死に至った。
【０００４】
インフルエンザウイルスはそれらの核タンパク質およびマトリックスタンパク質の抗原特異性に従って分類される。これらのウイルスは主にＡ、ＢおよびＣ血清型に類別され、タイプＡは８個のＲＮＡ分節を有し、それは１０個のウイルスタンパク質をコードしている。全ての既知のタイプＡインフルエンザウイルスは鳥類に由来していた。このカテゴリーのウイルスは他の種、例えばウマ、ブタ、フクロウおよびアザラシに感染することができ、ヒトにも同様に脅威を与えている（２３）。インフルエンザＡウイルスはさらにエンベロープの糖タンパク質、ヘマグルチニン類（”ＨＡ類”）、Ｈ１〜Ｈ１６、およびノイラミニダーゼ類（”ＮＡ類”）、Ｎ１〜Ｎ９（２４、２５、２６）の抗原性の性質によって亜型へと分けられる。ＨＡタンパク質のＨＡ１−ＨＡ２接合部におけるタンパク質分解による切断はトリの株における病原性と関連しており、この切断部位周辺の疎水性アミノ酸の存在はＨ５亜型に特徴的であると信じられている。加えて、ＨＡタンパク質は宿主細胞のシアロシド受容体への付着およびそれに続く膜融合による侵入を仲介していると信じられており（２７）、ＨＡタンパク質は中和抗体のための主要な標的として機能していると考えられている（２６）。
【０００５】
急性呼吸器疾患の大発生の間の検査は、インフルエンザがその原因かどうかを決定することができる。インフルエンザの季節の間、インフルエンザと矛盾しない呼吸器の疾病を示す選択された患者の検査は、インフルエンザが特定の患者集団の中に存在するかどうかを確証するのを助け、医療提供者が呼吸器の疾病を診断および処置するために彼らの臨床判断をどのように使うかを決定するのを助けることができる。迅速なインフルエンザ検査は、抗ウイルス薬物療法を使うかどうかの決定における助けとなる。一部の検査、例えばウイルス培養、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）および血清検査は決まりきった方法であるが、結果が臨床家を助けるのに時宜を得た方式で得られない可能性がある（３）。現在、一般に用いられている迅速な診断検査法のほとんどはモノクローナル抗体を基にした免疫アッセイである（３、４、５）。免疫蛍光法（蛍光抗体染色）は迅速なインフルエンザ診断検査法の選べる手段であり、それは多くの病院の実験室で用いることができ、一般に２〜４時間で検査結果を出すことができる。とりわけ、特異的なモノクローナル抗体の生成は、ほとんどの一般に用いられている迅速、高感度で費用効果のある診断法の基礎となっている。
【０００６】
地域的に異なる亜系列（ｓｕｂｌｉｎｅａｇｅｓ）の同定は、Ｈ５Ｎ１ウイルスが地理的に幅広く、大きな遺伝的および抗原性の多様性を有していることを示した。インドネシアからの全てのウイルスがＨ５Ｎ１遺伝子型Ｚウイルスの異なる亜系列を形成していることを示す系統発生的分析は、この大発生が単一の導入に由来し、それが国中くまなく広がっていることを示唆している（１４、１５）。インドネシアインフルエンザ分離株を特異的に認識する利用可能なモノクローナル抗体があれば非常に有用であろう。さらに、ベトナムおよびシンガポールインフルエンザ分離株にも及ぶ利用可能なそのｍＡｂ類があれば有用であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この発明の目的は、ＡＩＶのＨ５亜型に、特にＨ５インドネシアＡＩＶ分離株に特異的に結合するモノクローナル抗体（”ｍＡｂ類”）および関連する結合タンパク質を提供することである。モノクローナル抗体反応の特異性は、有効な診断試薬のための基礎を提供する。それらに由来するｍＡｂ類および結合タンパク質は、療法薬としても有用である可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に従って、Ｈ５亜型のヘマグルチニン糖タンパク質の三次元（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープに特異的なモノクローナル抗体および関連する結合タンパク質を提供する。三次元エピトープを標的とするｍＡｂ類は、前処理されていない組織、例えば凍結された組織標本ならびに他の生物学的組織および流体においてウイルスを検出するのに有用である。特に、３Ｂ１と名付けられたｍＡｂは、インドネシアからの２５種類の既知のＨ５  ＡＩＶ分離株全てからのＨ５Ｎ１ヘマグルチニンを標的とする。３Ｅ８と名付けられた第２のｍＡｂは、これらのＡＩＶ分離株の１種類を除く全てからのＨ５Ｎ１ヘマグルチニンを標的とする。ｍＡｂ  ３Ｂ１はＨ５Ｎ２およびＨ５Ｎ１／ＰＲ８にも結合する。
【０００９】
従って、この発明は、実質的にｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８のそれらのような三次元Ｈ５亜型ヘマグルチニンエピトープへの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含む。
別の観点において、本発明は、標本においてＨ５亜型ＡＩＶを検出するための方法であって、ＡＩＶの、実質的にｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８の免疫学的結合特性を有するｍＡｂまたは結合タンパク質との結合を検出することを含む方法を含む。特に、本発明は、その結合タンパク質を利用する免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡ法に関する。本発明はさらに、さらに加えてウイルス試料と、実質的にＮ１亜型ＡＩＶのノイラミニダーゼ糖タンパク質に結合するｍＡｂの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質との結合を検出することにより標本中のＨ５亜型ＡＩＶがＨ５Ｎ１であることを確かめるための方法を含む。
【００１０】
別の観点において、本発明は、実質的にｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含むＡＩＶの検出のためのキットに関する。そのキットはさらに、実質的にＮ１亜型ＡＩＶのノイラミニダーゼ糖タンパク質に結合するｍＡｂの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含むことができる。
【００１１】
本発明はさらに、Ｈ５  ＡＩＶ株、例えばＨ５Ｎ１  ＡＩＶ株に感染した対象を処置する方法であって、その対象に有効量の実質的にｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８の免疫学的結合特性を有する１種類以上の組み換えモノクローナル抗体または結合タンパク質またはそれらの断片を投与することを含む方法に関する。その組み換え抗体または抗体断片は、ｍＡｂ類３Ｂ１または３Ｅ８の可変領域を含むが恒常領域を含まないのが望ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１に感染したＭＤＣＫ細胞をウイルス感染無しのＭＤＣＫ細胞に対して比較した代表的なＩＦＡ画像である。図１Ａは、ＭＤＣＫ細胞においてＨ５Ｎ１が検出されている画像である。図１Ｂでは、紫外線と通常の光の合併が、感染していない細胞と比較した、ウイルスに感染した個々の細胞を示した。図１Ｃに示したように、ウイルス感染の無いＭＤＣＫ細胞には蛍光シグナルは無い。図１Ｄは、図１Ｃと同じ細胞における紫外線と通常の光の合併を示す。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＭＤＣＫ細胞における、モノクローナル抗体のインフルエンザウイルスの中和活性を示す。図２Ａでは、ＭＤＣＫ細胞はモノクローナル抗体がＨ５Ｎ１ウイルス感染を中和した後ＦＩＴＣ蛍光で染色された。図２Ｂでは、ＭＤＣＫ細胞はモノクローナル抗体のＨ５Ｎ１ウイルス感染の中和無しにＦＩＴＣ蛍光で染色された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ＡＩＶのＨ５亜型のヘマグルチニンエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合するｍＡｂ類および関連する抗原結合タンパク質に向けられている。特に、そのｍＡｂまたは関連する抗原結合タンパク質は、次のものの免疫学的結合特性を有する：２００７年３月２０日にアメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８２４７を割り当てられた、ハイブリドーマ３Ｂ１により産生されるｍＡｂ  ３Ｂ１、または２００７年７月１０日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８５２７を割り当てられた、ハイブリドーマ３Ｅ８により産生されるｍＡｂ  ３Ｅ８。本発明はさらに、これらのハイブリドーマを包含し、本発明のｍＡｂ類および結合タンパク質の継続的な源を提供する。本発明はさらに、Ｈ５亜型ＡＩＶの感染の検出および診断のための方法ならびに本発明のｍＡｂ類または結合タンパク質を含むアッセイキットに関する。好ましい態様において、本発明はさらに、Ｈ５亜型ＡＩＶの感染がＨ５Ｎ１亜型ＡＩＶの感染であることを確かめるための方法およびその決定をするためのアッセイキットに関する。その診断法は、ｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８の免疫学的結合特性を有するｍＡｂまたは関連する抗原結合タンパク質の、Ｎ１亜型ＡＩＶのノイラミニダーゼ糖タンパク質を認識するｍＡｂまたは関連する抗原結合タンパク質と組み合わせた使用を含むことができる。全て、または本質的に全てのインドネシアからのＨ５Ｎ１分離株からのノイラミニダーゼの三次元エピトープに結合する１種類のｍＡｂは、２００７年７月１０日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８５２６を割り当てられた、ｍＡｂ  ６Ｃ６である。キットは、Ｈ５亜型ヘマグルチニン糖タンパク質に結合する本発明のｍＡｂまたは結合タンパク質およびＮ１亜型ノイラミニダーゼ糖タンパク質に結合するｍＡｂまたは結合タンパク質を含むことができる。
【００１４】
本発明はさらに、有効量の本発明の１種類以上の抗体または関連する結合タンパク質の可変領域を含む抗体断片または組み替え抗体の投与により、Ｈ５ＡＩＶ株に感染した対象を処置する方法に関する。特に、この態様において、対象はＡＩＶのＨ５Ｎ１亜型のインドネシア分離株に感染している。この発明の抗体は、起こり得るインフルエンザの大発生の到来の際に予防策として対象に投与することもできる。この場合、投与される有効量の抗体は、Ｈ５  ＡＩＶ感染症を処置するのに用いられる量の約半分である。
【００１５】
様々な用語が本明細書で用いられ、それは下記の意味を有する：
ｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の”免疫学的結合特性”という用語は、その文法形式の全てにおいて、ｍＡｂまたは結合タンパク質のその抗原に対する特異性、親和性および交叉反応性を指す。
【００１６】
用語”三次元エピトープ”は、Ｈ５亜型ヘマグルチニン糖タンパク質の中に、その未変性の三次元の形で存在する、ｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の結合部位を指す。
用語”結合タンパク質”は、本発明のｍＡｂまたは本発明のｍＡｂの免疫学的結合特性を有するｍＡｂの抗原結合部位を含むタンパク質を指し、下記で記述するそれらを含む。
【００１７】
本発明は好都合なことに、動物をＡＩＶ亜型Ｈ５Ｎ１のインドネシア分離株で免疫することによりｍＡｂ  ３Ｂ１の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製する、または動物をＡＩＶ亜型Ｈ５Ｎ１のインドネシア分離株で免疫することによりｍＡｂ  ３Ｅ８の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製するための方法を提供する。あらゆるその抗原は、望まれる免疫学的結合特性を有する抗体を生じさせるための免疫原として用いることができる。その抗体には、ｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８の抗原結合配列を含むモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびタンパク質が含まれるが、それらに限定されない。
【００１８】
本発明のｍＡｂ類は、培養中の連続継代性細胞株（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）による抗体分子の産生を提供するあらゆる技法により産生することができる。その方法には、元は１９７５年にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたハイブリドーマの技法(Nature 256:495-497)、さらにトリオーマの技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマの技法(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマの技法(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1985)における)が含まれるが、それらに限定されない。ヒトの抗体を用いることができ、それはヒトのハイブリドーマを用いることにより(Cote et al., 1983, Proc. Nat ’l. Acad. Sci. U.S.A., 80:2026-2030)、またはインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスを用いて形質転換することにより(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96における)得ることができる。さらに、本発明のマウス抗体分子、例えばｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８からの配列を導入して適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にすることによる”キメラ抗体”または”ヒト化抗体”の産生のために開発された技法(Morrison et al., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)を用いることができる。キメラ抗体は、ヒトのＦｃ部分およびマウス（または他のヒト以外）のＦｖ部分を含む抗体である。ヒト化抗体は、マウス（または他のヒト以外）の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体の中に組み込まれた抗体である。キメラおよびヒト化抗体は共にモノクローナルである。そのヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾患または障害のインビボ診断または療法における使用に好ましい。
【００１９】
本発明に従って、単鎖抗体の産生に関して記述された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の単鎖抗体を提供するように適合させることができる。本発明の追加の態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して記述された技法(Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281)を利用して、本発明の抗体、またはその誘導体、もしくは類似体に望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とする。
【００２０】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は既知の技法により生成することができる。例えば、その断片は次のものを含むがそれらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるＦａｂ’断片、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成することができるＦａｂ断片。その抗体断片は、本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれから生成することもできる。
【００２１】
抗体の産生において、望ましい抗体のスクリーニングは当分野で既知の技法、例えば放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着アッセイ）、”サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、インサイチュ免疫アッセイ（例えば金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、免疫蛍光アッセイおよび免疫電気泳動アッセイ等により成し遂げることができる。１態様において、抗体の結合は一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の態様において、一次抗体は二次抗体または他の試薬の一次抗体への結合を検出することにより検出される。さらに別の態様において、二次抗体は標識されている。免疫アッセイにおいて結合を検出するための手段は当分野で既知であり、本発明の範囲内である。
【００２２】
前述の抗体を、ＡＩＶのＨ５亜型の検出または位置測定に関して当分野で既知の方法、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、および同様のものにおいて用いることができる。本明細書で開示される技法は、ＡＩＶのＨ５亜型の質的および定量的測定に、ならびにそのウイルスに感染した動物またはヒトの診断および監視に適用することができる。
【００２３】
本発明には、ＡＩＶのＨ５亜型の質的および／または定量的測定のためのアッセイおよび検査キットも含まれる。そのアッセイ系および検査キットは、例えば放射性原子、蛍光性の基または酵素を用いた標識、本発明のｍＡｂもしくは関連する結合タンパク質への、またはその結合パートナーへの標識のカップリングにより調製される標識された構成要素を含んでいてよい。そのアッセイまたは検査キットは、さらに使用のための免疫アッセイの技法の技術者に周知の試薬、希釈剤および説明書を含んでいてよい。
【００２４】
本発明の特定の態様において、そのキットは、選択された方法、例えば”競合的”、サンドウィッチ””、”ＤＡＳＰ”および同様のものに依存して、少なくとも本発明のｍＡｂまたは関連する結合タンパク質、生物学的試料中のＡＩＶへのそのｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の免疫特異的結合の検出のための手段、および使用のための説明書を含むであろう。キットは陽性および陰性対照を含んでいてもよい。それらは自動化された分析器または自動化された免疫組織化学的スライド染色機器と共に使用されるように設計されてもよい。
【００２５】
本発明のアッセイキットはさらに二次抗体または結合タンパク質を含んでいてよく、それは標識してよく、または固体支持体への付着のために提供して（または固体支持体に付着させて）よい。その抗体または結合タンパク質は、例えば、ＡＩＶに結合するものであってよい。その二次抗体または結合タンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。
【００２６】
Ｈ５亜型ヘマグルチニンタンパク質に対するモノクローナル抗体は、動物をＡＩＶまたはＨ５タンパク質またはそれらの断片で免疫することにより調製してよい。好ましい方法には、Ｈ５亜型ＨＡ１遺伝子の増幅とそれに続く遺伝子の発現、Ｈ５亜型組み換えタンパク質の回収および精製ならびに精製したタンパク質の免疫原としての使用が含まれる。例えば、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶを、ニワトリ胚にそのウイルスの利用可能な株を接種することにより増殖させ、続いてウイルスＲＮＡを分離する。ＨＡ１遺伝子を逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅し、次いでバキュロウイルスベクターの中にクローン化することができ、それを昆虫細胞中でＨ５タンパク質を発現させるために用いる。そのように生成されたタンパク質を、次いでマウスまたは他のハイブリドーマの生成に適した種を免疫するのに用いることができる。
【００２７】
ハイブリドーマを、Ｈ５タンパク質に特異的に結合することができ、それらを他のＡＩＶ亜型から識別する高親和性ｍＡｂ類を産生するそれらの能力に関してスクリーニングする。本発明に従って、ウイルス中和能力を有する抗体はＨ５亜型ヘマグルチニンタンパク質中の三次元エピトープを認識することができることが見出だされた。この発見は、それぞれの中和ｍＡｂの存在下でのメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞またはニワトリ胚における１〜２回の選択の後の、ウイルスの回避変異体の発生の結果であった。ＨＡ１遺伝子をこれらの中和回避変異体からＲＴ−ＰＣＲによりクローニングし、配列決定して点変異を同定した。このグループの抗体において、ｍＡｂ類３Ｂ１および３Ｅ８において２種類の中和エピトープが見つかった。中和回避能力は血球凝集阻害アッセイを用いて確認した。
【００２８】
ＨＡ１は３３８アミノ酸を含む。タンパク質上の線状エピトープの分布を研究するためには、切り詰めた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、および変異導入した断片を、ｍＡｂ類との結合に関して、例えばウェスタンブロットまたは類似の技法により試験するのが好都合である。線状エピトープは、変性したＨ５亜型タンパク質、例えばホルマリン固定された組織において生じる変性したＨ５亜型タンパク質の、免疫組織化学的染色法を用いた検出において優れた性能を示すｍＡｂ類の結合標的として同定することができる。Ｈ５亜型ｍＡｂ類のこの方式でのマッピングは、感染性Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶのさらなる研究およびより有効な臨床診断のためのプラットホームを提供する。
【００２９】
本発明はまた、ＡＩＶのＨ５亜型のヘマグルチニン分子の抗原構造のよりよい理解を提供した。本発明のｍＡｂ類および関連する結合タンパク質は、凍結切片および生物学的標本においてこの高病原性ウイルスを検出するための手段を提供する。
【００３０】
ｍＡｂ類３Ｂ１および３Ｅ８は凍結組織切片に対して非常に有効であるが、ホルマリン固定された組織中の抗原は検出しない。エピトープマッピングによって、モノクローナル抗体３Ｂ１および３Ｅ８はＨ５Ｎ１ウイルスの三次元エピトープを標的としていることが明らかになった。これらの抗体は、組織切片への事前の処理無しでこれらのウイルス抗原に結合し、認識することができた。
【００３１】
この発明は、Ｈ５亜型ＡＩＶを検出するための便利で非常に特異的かつ感度の高い手段を提供する。その手段の１つはＥＬＩＳＡ形式である。ｍＡｂ  ３Ｂ１および３Ｅ８のそれぞれは捕捉抗体として、単独または組み合わせで用いることができる。単独で用いられるなら、選択された抗体を捕捉抗体として用いることができ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたその同じ抗体を検出抗体として用いることができる。
【００３２】
Ｈ５ウイルスを検出するための他の免疫学的方法には、例えばドットブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーション形式が含まれる。
この発明の好ましいＥＬＩＳＡ検査は、Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスに感染しているインドネシアの家禽およびヒトからのＨＡ抗原を検出することが可能であり、これはトリおよびヒト両方のＨ５感染症の検出に本発明が有用であることを示す。
【００３３】
この発明のＨ５亜型ｍＡｂ類は、診断の手段として他の一般に行われている方法に対して利点を有する。第１に、そのｍＡｂ類は高感染性Ｈ５亜型ＡＩＶに高度に特異的である。その高度に特異的なモノクローナル抗体は、トリインフルエンザの診断の分野における画期的躍進を表す。本発明の前に、全て、またはほぼ全てのインドネシアＨ５Ｎ１ウイルスを検出することができるモノクローナル抗体は報告されていなかった。本発明のモノクローナル抗体は、この２年間以内にインドネシアにおいて集められたＨ５Ｎ１ウイルスの全て、または本質的に全てを認識することができる。加えて、これらのｍＡｂ類は、Ｈ５  ＡＩＶの検出に安全かつ便利な診断アプローチを提供する。凍結切片のスライドは、極低温で長期間保管することができ、感染症のさらなる診断および監視を容易にする。その抗体は診断のために、および処置のための組み換え抗体の調製のために有用であり、そのようなものとして、可能性のあるインフルエンザの世界的流行の抑制における非常に有用な手段であろう。
【００３４】
本発明の別の態様は、Ｈ５トリインフルエンザの中和回避変異体に関する。用語”中和回避変異体”は、Ｈ５ウイルスにおいて抗原連続変異を引き起こし、中和エピトープに影響を及ぼす、ヘマグルチニンをコードする遺伝子における点変異により高められた（ｒａｉｓｅｄ）変異ウイルスを指す。中和回避変異体は、その親ウイルスを中和するのに有効な特定のモノクローナル抗体による中和を逃れることができる。回避変異体の手動のスクリーニングでは、親ウイルスを特定の中和抗体と共に保温し、宿主、例えばＭＤＣＫ細胞またはニワトリ胚の中に接種する。２〜３回のスクリーニングの後、その中和ｍＡｂに関する回避変異体をクローニングし、ＨＡ１遺伝子の配列決定を行う。変異したアミノ酸は親ウイルスの配列とのアラインメントにより決定され、変異した部位は中和ｍＡｂにより認識される中和エピトープを構成するアミノ酸の１個を示す。
【００３５】
本発明において、３Ｂ１回避変異体はＨ５Ｎ１  ＡＩＶ（Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６  （Ｈ５Ｎ１））（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＣＹ０１４４８１；  ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  ＃  １１３４９７１５５）から、３Ｂ１中和モノクローナル抗体により生じる。３Ｅ８回避変異体はＨ５Ｎ１  ＡＩＶの同じ株から３Ｅ８中和抗体により生じる。変異部位を下記の実施例３、表４にリストする。
【００３６】
中和回避変異体は、それらが親ウイルスに特異的に結合する特定の中和抗体ではもはや認識することができない点においてそれらの親ウイルスと異なる。これゆえに、これらの変異体は上記の教えに従う新規モノクローナル抗体の産生のためにマウスを免疫するのに用いることができる。新規ｍＡｂ類の中から、変異したエピトープを正確に認識するモノクローナル抗体を選別することができ、次いでそれを用いて親ウイルス以外のトリインフルエンザウイルスへの相補的監視（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）を提供することができる。この過程を数世代通して繰り返すことにより、さらなる回避変異体を見つけることができ、さらなる中和抗体を得ることができる。これらの抗体を本発明の方法において用いることができる。
【００３７】
本発明の別の態様において、本発明の抗体および関連する結合タンパク質は、Ｈ５  ＡＩＶ感染症、特にＡＩＶのＨ５Ｎ１亜型からの感染症を患う対象を処置するために投与することができる。本発明の抗体および関連する結合タンパク質は、インフルエンザの世界的流行または世界的流行の前兆の場合に予防措置として対象に投与することもできる。抗体および関連する結合タンパク質は、１回量で、または繰り返しの投与で、場合により放出が遅い形で投与することができる。投与は処置される対象の体におけるその作用部位に抗体を到達させることのできるあらゆる手段により、例えば静脈内に、筋肉内に、皮内に、経口で、または鼻に、なされることができる。通常は、抗体は医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤー、例えば無菌の水溶液中で投与され、組成物はさらに１種類以上の安定化剤、抗原性補強剤、可溶化剤、緩衝液等を含むことができる。厳密な投与の方法、組成物および個別の投与量は、治療の時に、対象の個々の必要性に依存して、対象の年齢、体重、全身の健康、ならびに彼のまたは彼女の症状の性質および程度、さらに与える処置の頻度のような要素を考慮して決定され、調整されるであろう。一般に、抗体がＨ５  ＡＩＶ感染症を患う患者を処置するために投与される場合、投与される抗体の投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。通常、予防措置として投与される場合、投与量は約半分、すなわち約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内に低減される。
【００３８】
本発明の単一の組み換え抗体または結合タンパク質を療法上の目的のために投与することができ、または２種類以上の組み合わせを投与することができる。もし１世代以上の中和回避変異体に対する抗体が産生された場合、その抗体および上記の３Ｂ１および／または３Ｅ８抗体を治療用の抗体のカクテルとして投与することができる。
【００３９】
下記の実施例を、本発明を実行する好ましい方式を説明するために提供する。本発明は実施例の詳細に限定されるのではなく、添付した特許請求の範囲の全範囲と等しい。
【実施例】
【００４０】
実施例１
ハイブリドーマの生成
Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８以外の全ての生きたＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスをインドネシアから得た。Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８は疾病対策センター（米国）から得た。それは非病原性組み換えウイルスであり、それはベトナムでヒトに感染したＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１ウイルス（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）のＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む。Ｈ５Ｎ２（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９８）およびＨ７Ｎ１（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９４）を、シンガポールの農産食品＆家畜管理局（ＡＶＡ）から得た。これらのウイルスストックを用いて９〜１１日齢の発育鶏卵（Ｃｈｅｗ’ｓ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｆａｒｍ，シンガポール）に感染させ、２世代複製させた。次いで尿膜腔液を吸出し、ヘマグルチニンアッセイ（ＨＡ）を用いてウイルスの力価を測定した。不活化したＨ５Ｎ１（Ａ／ガチョウ／広東／９７）をＲＮＡ抽出のために用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＨＡ１遺伝子を増幅した。メイディン・ダービー腎臓細胞（ＭＤＣＫ，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）細胞は、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２において増殖させた。
【００４１】
ウイルスの精製は、ウイルスを含む尿膜腔液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して破片を除去し、続いて上清を４０，０００ｒｐｍで３時間超遠心することにより実施した。ウイルスのペレットをＰＢＳ中で懸濁した。
【００４２】
モノクローナル抗体を、透明になった流体から、プロテインＡ親和性カラム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；米国ミズーリ州セントルイス）およびＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）  ＩｇＭ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；米国イリノイ州ロックフォード）を用いて、製造者の説明書に従って精製した。抗体の濃度を、ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；米国デラウェア州ウィルミントン）を用いることにより測定した。
【００４３】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、０．２ｍｌの体積中の、オイルアジュバントＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５６３（Ｓｅｐｐｉｃ，フランス）と一緒の不活化したＡ／インドネシア／ニワトリ／Ｈ５Ｎ１のトリインフルエンザウイルスを用いて免疫した。腹腔内注射を０、１４、２８および４２日目において行った。Ｄｅ  Ｓｔ．  ＧｒｏｔｈおよびＳｃｈｅｉｄｉｇｇｅｒが記述したように、免疫したマウスからの脾細胞および骨髄腫細胞（ＳＰ２／０）を集めて融合させてハイブリドーマを生成した（１６）。ピポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地を用いた選択の後、１４日後に有意な増殖を示しているハイブリドーマからの培地を、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により、Ａ／インドネシア／ニワトリ／Ｈ５Ｎ１に感染したＭＤＣＫ細胞に対する特異的な抗体の存在に関して検査した。選択されたハイブリドーマを限界希釈によりクローニングし、再同定し、二度目のクローニングを行い、ＩＦＡにより再検査した。一度確立されると、ハイブリドーマ株は組織培養で増殖され、将来の使用のために液体Ｎ２中で凍結された。
【００４４】
実施例２
ＩＦＡによるｍＡｂ類のスクリーニング
免疫蛍光アッセイを用いて、抗体と抗原標的の間の相互作用を確かめた。９６ウェルプレートにおいて、インフルエンザウイルス分離株Ａ／インドネシア／ニワトリ／Ｈ５Ｎ１で一夜感染させたＭＤＣＫ細胞をＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ  ７．４）ですすいだ。細胞を、あらかじめ冷却した１００％エタノール中でそれらを１０分間保温することにより固定した。細胞をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、次いで１％ＢＳＡ、ＰＢＳ−Ｔ中で３０分間保温して抗体の非特異的な結合を遮断した。次いでそれらを９６ウェルプレートのウェル中で１００μｌのハイブリドーマ培養液と共に室温で２時間、または４℃で一夜保温した。細胞をＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１％ＢＳＡ、ＰＢＳ−Ｔ中１：１００希釈の二次抗体、蛍光標識したヤギ／ウサギ抗マウス抗体（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，米国）と共に室温で６０分間保温した。ウェルをＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ＰＢＳ−Ｔを除去し、ＰＢＳ中５０％グリセロールを添加した。蛍光シグナルを、顕微鏡下で紫外線を用いてチェックした。
【００４５】
感染していないＭＤＣＫ細胞を、陰性対照として用いた。不活化したＨ５Ｎ１ウイルスで免疫したマウスからの血清を陽性抗体対照として用いた。それぞれのハイブリドーマの上清と共に保温したＭＤＣＫ細胞を対照と比較することにより、陽性の染色結果を与えるハイブリドーマの上清を、限界希釈によるクローニングのために選択した。安定したｍＡｂ産生ハイブリドーマをこの手順により得た。
【００４６】
ｍＡｂ３Ｂ１と名づけられた抗体は、全ての２５種類のインドネシアからの分離株からのＨ５Ｎ１ヘマグルチニンに結合することが分かった。ｍＡｂ  ３Ｅ８は、それらの分離株の１種類、Ａ／インドネシア／ＣＤＣ５９４／２００６（Ｈ５Ｎ１）を除く全てに結合することが分かった。ｍＡｂ  ３Ｂ１は、Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８およびＨ５Ｎ２を用いたＩＦＡにおいても陽性であった。これらのｍＡｂ類と反応するＡＩＶ株を、実施例の節の最後の表６においてリストする。
【００４７】
代表的なＩＦＡ画像を図１に示す。
実施例３
Ｈ５およびＮ１亜型ｍＡｂ類の特性づけ
ｍＡｂ類のアイソタイプ同定。ｍｏｕｓｅ  ｍＡｂ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，イギリス）を用いてアイソタイプ同定を実施した（データは示していない）。ｍＡｂ  ３Ｂ１および３Ｅ８は両方ともＩｇＭであると決定された。
【００４８】
血球凝集阻害試験（ＨＩ）。一定量の血球凝集（ＨＡ）抗原を微量定量プレート（ＮＵＮＣ）中のそれぞれのウェルに添加した。次いで検査する抗体を１番目のウェル中に入れ、系列希釈した。プレートを１時間保温し、次いでニワトリの赤血球（ＲＢＣ）をそれぞれのウェルに添加した。もし抗体が検査血清中に存在したならば、ＲＢＣはＨＡ抗原と共に凝集しなかったであろう。ＨＩ陰性のウェルは、ウェルの底を覆う凝集したＲＢＣの広がったシートを有したであろう。ＨＩ陽性のウェルは、凝集していないＲＢＣの十分に境界を定められたボタン（ｗｅｌｌ−ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｂｅｄ  ｂｕｔｔｏｎ）を有したであろう。
【００４９】
培養液中のｍＡｂ  ３Ｂ１は、様々なインドネシアのＨ５Ｎ１分離株について、およびＨ５Ｎ２について、１６から３２まで、ならびにＨ５Ｎ１／ＰＲ８についてわずか約２のＨＩ活性を有していた。ｍＡｂ  ３Ｅ８はインドネシア分離株ＣＤＣ５９４、Ｈ５Ｎ２またはＨ５Ｎ１／ＰＲ８についてＨＩを有していなかったが、全ての他のインドネシアＨ５Ｎ１分離株について１６〜３２の範囲内のＨＩを有していた。
【００５０】
ウイルスマイクロ中和アッセイ。ＭＤＣＫ細胞を、５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の決定に用いた。２倍系列希釈した抗体を９６ウェル細胞培養プレートに入れた。希釈した抗体を、インフルエンザウイルスを１００ＴＣＩＳ５０／ウェルで含む等体積の希釈液と混合した。５％ＣＯ２の湿気のある雰囲気中で３７℃において２時間保温した後、１．５×１０５/ｍｌのＭＤＣＫ細胞１００μｌをそれぞれのウェルに添加した。プレートを３７℃および５％ＣＯ２において１８時間保温した。単層をＰＢＳで洗浄し、１００％エタノール中で１０分間固定した。ウイルスタンパク質の存在を、インフルエンザＨ５Ｎ１に対するマウス血清を用いるＥＬＩＳＡにより検出した。
【００５１】
ＥＬＩＳＡを室温で実施した。固定されたプレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）で３回洗浄した。１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ−Ｔ中で１／５００希釈したマウス血清抗体をそれぞれのウェルに添加し、室温で１時間保温した。プレートを洗浄緩衝液中で４回洗浄し、１／２０００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）１００μｌをそれぞれのウェルに添加した。プレートを室温で１時間保温し、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄した。１００μｌの新しく調製した基質（０．０３％過ホウ酸ナトリウムを含むｐＨ５．０の０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液２０ｍｌにつき１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温でおおよそ５分間保温した。反応を５０μｌの２Ｎ硫酸で停止した。吸光度を４９０ｎｍにおいて（Ａ４９０）、自動化されたプレート分光光度計（Ｍｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて測定した。
【００５２】
表１
【００５３】
【表１】
0005490695.tif 000002
【００５４】
表２
【００５５】
【表２】
0005490695.tif 000003
【００５６】
表１および表２は、ｍＡｂ３Ｂ１およびｍＡｂ  ３Ｅ８が感染したＭＤＣＫ細胞においてＨ５Ｎ１分離株を中和したことを示す。モノクローナル抗体の存在下で、ＥＬＩＳＡの読みの結果は、抗体の非存在下のそれらと比較しておおよそ２分の１減少しており、これは感染したＭＤＣＫ細胞上でウイルス粒子が中和されていたことを示唆している。
【００５７】
ＥＬＩＳＡの読みが高いバックグラウンドを有していた一方でＩＦＡは視認できるので、モノクローナル抗体の中和能力を確証するため、ＩＦＡの検出法によりＭＤＣＫ細胞上で中和試験を行った。ｍＡｂ  ３Ｂ１は全てのＨ５Ｎ１分離株の感染を中和することができ、一方でｍＡｂ  ３Ｅ８は５９４を除く全ての分離株を中和することができた。これらの結果はＩＦＡおよびＨＩの試験結果と一致していた。
【００５８】
図２Ａおよび２Ｂは、ＡＩＶに感染したＭＤＣＫ細胞上でのｍＡｂの中和活性を図説している。図２Ａおよび２Ｂはそれぞれ、ｍＡＢのウイルス感染の中和の後に、およびｍＡｂの中和無しで、ＦＩＴＣ蛍光で染色したＭＤＣＫ細胞を示している。
【００５９】
ＭＤＣＫ細胞上での、およびニワトリ胚中でのウイルス中和の力価測定（Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）。ＭＤＣＫ細胞および１０日齢の胚を、それぞれ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）および５０％胚感染量（ＥＩＤ５０）の測定のために用いた。ＭＤＣＫ細胞（２ｘ１０４／ｍｌ）を、７０％〜９０％コンフルエンスまで増殖させた。ニワトリ胚を、１０−１から１０−８までの一連の希釈比を用いてそれぞれのウイルスに感染させ、その後の尿膜腔液を、ＴＣＩＤ５０およびＥＩＤ５０に関して検査した。次いでそのウイルスを、それらの対数期（ウイルス感染に最も感受性が高い）にあるＭＤＣＫ細胞および１０日齢のニワトリ胚の両方に感染させるのに用いた。感染していないＭＤＣＫ細胞および尿膜腔液を陰性対照として用いた。細胞を３５℃で培養し、ＣＰＥを観察した。ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの数学的技法（１７）を用いて、感染価をＴＣＩＤ５０／１００μｌおよび１０００ＥＩＤ５０／２００μｌとして表し、それぞれのウイルスを、それぞれ５０μｌおよび１００μｌ中に１００ＴＣＩＤ５０および５００ＥＩＤ５０を有するようにそれぞれ希釈した。系列希釈したｍＡｂ類３Ｂ１および３Ｅ８は、終濃度１００ＴＣＩＤ５０および５００ＥＩＤ５０のウイルス（例えばＡ／インドネシア／ＤＣＤ６６９／Ｈ５Ｎ１）に感染したＭＤＣＫ細胞および胚を中和することができた。表３参照。表３における数は、感染したＭＤＣＫ細胞およびニワトリ胚中でウイルスの終濃度１００ＴＣＩＤ５０および５００ＥＩＤ５０において、ｍＡｂがウイルスをなお検出および中和することができた最も高いＨ５Ｎ１ウイルスの希釈率を表している。
【００６０】
表３
【００６１】
【表３】
0005490695.tif 000004
【００６２】
エピトープマッピング。
１．線状エピトープまたは三次元エピトープの決定。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロッティングを用いてモノクローナル抗体の線上エピトープを同定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングは、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．により記述された（１８）ように実施した。ＧＳＴタグを有する、Ｈ５Ｎ１からの組み換えＨＡ１を発現させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで処理した。組み換えＨＡ１は約３２ｋＤであり、発現したＧＳＴタグを有するＨＡ１は約５７ｋＤである。タンパク質試料を試料緩衝液と混合することによりタンパク質試料を調製し、１００℃で５分間加熱した。短時間の遠心分離の後、全細胞溶解産物をロードした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質を、クマシーブルー（０．２５％クーマシーブリリアントブルーＲ−２５０、４０％メタノールおよび１０％氷酢酸）での３０分間の染色により可視化し、次いで脱染溶液（４０％メタノールおよび１０％氷酢酸）中で一夜脱染した。ウェスタンブロットのため、Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてタンパク質をゲルからニトロセルロース膜に転写した。電気転写（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）の後、膜をＰＢＳ−Ｔ中５％脱脂乳でブロッキングし、上記のドットブロットと同じ方式で処理した。膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ｔ）中５％脱脂乳（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，カナダ）で６０分間ブロッキングした。ブロッキングの後、希釈していないｍＡｂ類を含むハイブリドーマ培養液を膜と一緒に６０分間保温し、ＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いでヤギ抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（１：２０００希釈）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と一緒に６０分間保温した。膜を洗浄し、次いでＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて現像し、ＫＯＤＡＫ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｉｌｍ（ＫＯＤＡＫ  ＢｉｏＭＡＸ  米国ミシシッピ州）に感光させた。
【００６３】
ｍＡｂ  ３Ｂ１またはｍＡｂ  ３Ｅ８のどちらも組み換えＨＡ１と反応せず、それはこれらのｍＡｂ類のエピトープが三次元であることを示していた。
２．Ｈ５亜型ｍＡｂ類の回避変異体の選択および三次元／中和エピトープのマッピング。親ウイルスＡ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／２００６（Ｈ５Ｎ１）の１０倍系列希釈液を等体積のｍＡｂと混合した。室温で１時間保温した後、混合物を２００μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ）および０．００１％  ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地中のＭＤＣＫ細胞の単層の上に接種した。３５℃において７日間の後、ウイルス上清を集めてさらなる選択を行った。回避変異体をクローニングし、ＲＮＡ抽出のために集めた。ｍＡｂによる中和に対する耐性の原因である点変異を、親ウイルスとの配列アラインメントにより決定した。変異体ウイルスがｍＡｂによる中和を逃れることを可能にするこの変異の能力を、中和アッセイおよびヘマグルチニン阻害アッセイにより確かめた。
【００６４】
中和ｍＡｂ  ３Ｅ８を用いて回避変異体を選択した。回避変異体をクローニングし、ＲＮＡ抽出のために集めた。配列によると、点変異はＨＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋで入手可能な配列；ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＣＹ０１４４８１；ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＩ  ＃  １１３４９７１５５）のヌクレオチド６１４において起きている。ヌクレオチド６１４”Ｇ”は”Ａ，”に変わっており、それは結果としてアミノ酸２０５におけるアルギニンからリシンへの変異をもたらす。その変異は、変異体ウイルスがｍＡｂ  ３Ｅ８からの抗体による中和を逃れることを可能にし、それは中和アッセイおよびヘマグルチニン阻害アッセイにより確かめられる。この結果は、ｍＡｂ  ３Ｅ８がヘマグルチニン上のアミノ酸２０５を含むエピトープを標的としていることを示した。ｍＡｂ  ３Ｂ１に関して同じ方法を用いて別の中和回避変異体を同定した。結果を表４に示し、それはＡＩＶ（Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニン分子上のｍＡｂ中和エピトープの位置を示す。
【００６５】
表４
【００６６】
【表４】
0005490695.tif 000005
【００６７】
表４．ＭＡｂ類によるＡＩＶ（Ａ／インドネシア／ＣＤＣ６６９／Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニン分子上の中和エピトープの位置決定。
予防および療法。ＭＤＣＫ細胞およびニワトリ胚上でのＨ５Ｎ１に対する中和能力に基づいて、ｍＡｂ  ３Ｂ１およびｍＡｂ  ３Ｅ８は予防のために用いることができる。抗ヘマグルチニンモノクローナル抗体の可変領域、例えばＦａｂも、療法的な活性を有する可能性がある（２１、２２）。ｍＡｂ  ３Ｂ１およびｍＡｂ  ３Ｅ８からの組み換え抗体は、予防的および療法的効力の両方を有する可能性がある。
【００６８】
下記のように、ｍＡｂ  ３Ｂ１の可変領域を含む組み換え抗体を発現させ、ＨＩ試験において用いた：
ヒトＩｇＧ１に関する発現ベクターの設計は、Ｊｏｓｔｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２８）により記述されたそれを基にした  合成分泌リーダーおよびｐＩＲＥｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からの脳心筋炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を用いて多重クローニング部位、ｍｙｃタグおよび恒常領域を置き換え、カッパ軽鎖（クローンＩＤ  ６２７９９８６）およびＩｇＧ１重鎖（クローンＩＤ  ６２８１２４８）をコードするｃＤＮＡクローン（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｃＤＮＡクローン［Ｌｅｎｎｏｎ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２９）］）を増幅させて挿入させた。
【００６９】
ｍＡｂ  ３Ｂ１の可変領域をコードするｃＤＮＡを単離するため、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製し、ランダムヘキサヌクレオチドを用いたファーストストランドｃＤＮＡ（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）の合成に用いた。次いで全ｃＤＮＡを、マウスｓｃＦｖ組み換え抗体ファージシステム(Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州ピスカタウェイ）のプライマーおよびプロトコルを用いて可変重および軽鎖の両方を増幅させるための反応における鋳型として用いて、得られた生成物を配列決定のためにｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の中にクローニングした。可変領域特異的プライマーを用いて重および軽鎖の可変領域の両方を増幅させて、上記の構築された発現ベクターの中にクローニングした。得られたコンストラクトの発現は、マウスの可変領域およびヒトの恒常領域を含むキメラ抗体を生じさせた。
【００７０】
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（登録商標）２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールスバッド）を用いてキメラ抗体を発現させ、規定無血清培地中で産生された抗体を得た。キメラＩｇＧ１をコードするコンストラクトを２９３−Ｆ細胞の中に、２９３  ｆｅｃｔｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の使用により形質移入した。形質移入の１２０時間後に上清を集め、タンパク質をｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。ＩｇＧの純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて確かめた。
【００７１】
ヒトのＩｇＧ１恒常領域およびｍＡＢ３Ｂ１からのマウスの可変領域を有する精製したキメラ抗体をＨＩおよびＨ５Ｎ１において試験した。ＨＩ活性を下の表５に示した：
表５
精製した組み換えｍＡｂ  ３Ｂ１のＨＩ活性試験
【００７２】
【表５】
0005490695.tif 000006
【００７３】
ｍＡｂ  ３Ｂ１からの可変領域を有するキメラ抗体は、ＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１に対する親和性を維持している。元のマウスの抗体の利点に加え、ヒトの恒常領域を有するＩｇＧ１亜型のキメラ抗体は、Ｈ５亜型ＡＩＶ感染に対する療法的処置のためにヒトに投与することができる。
【００７４】
実施例４
Ｎ−１亜型に対するｍＡｂ  ６Ｃ６およびＨ５亜型に対するｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８の組み合わせを用いる、Ｈ５Ｎ１亜型ＡＩＶの同定のための抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣ−ＥＬＩＳＡ）
Ｈ５ウイルスを含む試料は、ｍＡｂ  ３Ｂ１またはｍＡｂ  ３Ｅ８およびｍＡｂ  ６Ｃ６の組み合わせの使用により、Ｈ５Ｎ１であると確かめることができる。ＡＣ−ＥＬＩＳＡはＨ５Ｎ１ウイルスを検出するために設計されている。ｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８を、９６ウェルプレート（Ｕ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＮＵＮＣ−ｉｍｍｕｎｏ  ｐｌａｔｅ）中における１００μｌ  ＰＢＳ中の０．５μｇ／ウェルで、４℃において一夜保温する。プレートをＰＢＳ−Ｔですすいだ後、コートしたプレートを１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で、室温において１時間ブロッキングする。次いでブロッキング溶液を除去し、１００μｌ中２０ＨＡ単位でＰＢＳ中で希釈した不活化したＨ５Ｎ１分離株をそれぞれのウェルに添加し、２時間保温する。プレートを洗浄緩衝液ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、１００μｌの１／５００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ｍＡｂ  ６Ｃ６をそれぞれのウェルに添加する。プレートをさらに室温で１時間保温し、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄する。１００μｌの新しく調製した基質（０．０３％過ホウ酸ナトリウムを含むｐＨ５．０の０．０５Ｍリン酸クエン酸緩衝液２０ｍｌにつき１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを室温でおおよそ５分間保温する。反応を５０μｌの２Ｎ硫酸で停止する。吸光度を４９０ｎｍにおいて（Ａ４９０）、自動化されたプレート分光光度計（Ｍｉｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて測定する。有意なＡ４９０の読みは、そのウイルスが亜型Ｈ５Ｎ１であることを示す。Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶを含む試料は、ｍＡｂ  ３Ｂ１または３Ｅ８およびｍＡｂ  ６Ｃ６を別々に用いて同定することができるが、抗体を組み合わせて用いることは、より少ないウイルス試料を用いる決定を提供する。
【００７５】
補遺
表６
ＩＦＡによりｍＡｂ  ３Ｂ１およびｍＡｂ  ３Ｅ８を試験するのに用いられたトリインフルエンザウイルスＡ分離株
【００７６】
【表６−１】
0005490695.tif 000007
【００７７】
【表６−２】
0005490695.tif 000008
【００７８】
注釈：”＋”は陽性を意味し、”−”は陰性を示す。
参考文献
【００７９】
【化１】
0005490695.tif 000009
【００８０】
【化２】
0005490695.tif 000010
【００８１】
【化３】
0005490695.tif 000011
【００８２】
【化４】
0005490695.tif 000012
【００８３】
【化５】
0005490695.tif 000013
【図１Ａ】
0005490695.tif 000014
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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