(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン抵抗性ならびにβ−細胞機能障害の双方を付随している疾患の予防上もしくは治療上の処置において使用される、有効量の２−メチル−４，５−ジ−（メチルスルホニル）−ベンゾイル−グアニジンおよび／またはその生理学的に許容される塩および／または溶媒和物を活性成分として含む医薬組成物であり、
該活性成分は、インスリン感受性の増大、ならびに、β−細胞の機能の保持または増加のため、末梢のインスリン感作物質、もしくは、直接的なインスリン分泌促進物質として、利用され；
該活性成分の１日あたりの投与量は、０．０２〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲である
ことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項２】
薬学的に認容されるアジュバントをさらに含む、
ことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記疾患は、２型糖尿病、ないしは、２型糖尿病の進行である、
ことを特徴とする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記活性成分が、塩酸塩、メタンスルホン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘミフマル酸塩およびヘミリンゴ酸塩の群から選択される、２−メチル−４，５−ジ−（メチルスルホニル）−ベンゾイル−グアニジンの塩である、
ことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記活性成分が、２−メチル−４，５−ジ−（メチルスルホニル）−ベンゾイル−グアニジン塩酸塩の水和物である、
ことを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項６】
経口または非経口投与のための、請求項１〜５のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項７】
該活性成分の１日あたりの投与量は、２０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲である
ことを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
インスリン抵抗性ならびにβ−細胞機能障害の双方を付随している疾患の予防上もしくは治療上の処置において使用される、医薬組成物の調製における、活性成分としての、２−メチル−４，５−ジ−（メチルスルホニル）−ベンゾイル−グアニジンおよび／またはその生理学的に許容される塩および／または溶媒和物の使用であり、
該活性成分は、インスリン感受性の増大、ならびに、β−細胞の機能の保持または増加のため、末梢のインスリン感作物質、もしくは、直接的なインスリン分泌促進物質として、利用され；
該活性成分の１日あたりの投与量は、０．０２〜２００ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲である
ことを特徴とする、使用。
【請求項９】
前記β−細胞機能障害は、β−細胞の生存力および／またはβ−細胞の代謝活性の減少に起因する、低減したβ−細胞の応答性ならびに低減したインスリン濃度を有している
ことを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
該活性成分は、加齢に関連したβ−細胞機能の減少を防止するために使用される
ことを特徴とする、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
インスリン分泌に対する膵β−細胞の機能が、β−細胞機能障害を患う前のインスリン分泌に対する膵β−細胞機能の基準レベルの少なくとも７０％に保持される、
ことを特徴とする、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１２】
インスリン分泌に対する膵β−細胞の機能が、β−細胞機能障害を患う前のインスリン分泌に対する膵β−細胞機能の基準レベルの１００％に保持される、
ことを特徴とする、請求項８または９に記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも１週間の期間、前記医薬組成物が投与される
ことを特徴とする、請求項８〜１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
少なくとも４週間の期間、前記医薬組成物が投与される
ことを特徴とする、請求項８〜１３のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、糖尿病性腎症および／または糖尿病性神経障害の予防および治療のための、有効量の２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンまたはその誘導体を活性成分として含む医薬組成物に関する。本発明の別の目的は、インスリン感受性の増強およびβ−細胞代償の保持または増加のための、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンまたはその誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満、インスリン抵抗性(ＩＲ)および脂質代謝異常(dyslipidaemia)などの代謝疾患は、病的状態および死亡の主要な原因として世界的に浮上している。特にここ数十年間で、ＩＲは、一般の人々に非常によく見られる状態になり、健康保険に甚大な影響を及ぼす結果となっている。ＩＲは、インスリンの正常な作用に対する身体の減少した不適切な反応と定義される。ＩＲは、心血管疾患および２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の発症のための重要な危険因子である。加えて、ＩＲは、種々の心血管系危険因子（肥満、脂質代謝異常、高血圧および血液凝固障害）に関連しており、これは、まとめて示される場合、メタボリックシンドロームまたはシンドロームＸと呼ばれている。いまでは、ＩＲがメタボリックシンドロームの基礎となっている一体化した原因因子であり得るという考慮すべきエビデンスが存在する（Ｔｕｒｎｅｒ ＆ Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ (２００５) Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ ８(１)：１１５−１２６）。
【０００３】
組織のインスリン反応性を直接的に改善することを目指している現行の治療的介入は、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）を適用する。しかし、ＴＺＤは全身のインスリン感受性を改善することが示されているが、最近では心不全および心血管系の合併症の危険性を増加させることが知られるようになってきた。したがって、代謝障害疾患の特徴の１つがＩＲであり、その疾患の流行の拡大と闘うには、ＩＲの代替治療が必要である。
【０００４】
ＩＲに加えて、膵β−細胞機能障害は、前糖尿病状態から糖尿病状態への進行に、極めて重要な役割を果たしている。β−細胞再生を刺激し、β−細胞塊を増大させ得るエキセンジン−４（Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ(１９９９)４８(１２)：２２７０−２２７６；ＤｅＦｒｏｎｚｏ ｅｔ ａｌ．(２００５) Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２８(５):１０９２−１１００）またはシタグリプチン類似体（Ｍｕ ｅｔ ａｌ．(２００６) Ｄｉａｂｅｔｅｓ５５(６)：１６９５−１７０４）などの薬剤の最近の開発は、Ｔ２ＤＭにおける治療上の標的として、β−細胞塊にさらなる関心を集めている。
【０００５】
したがって、本発明の基礎を形成している技術的な問題は、インスリン抵抗性および／またはβ−細胞機能障害に関連する疾患の予防または治療において、効果的に適用することができる医薬組成物、特に、治療効果を高め、副作用を最小限にするような組成物を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｘｕ ｅｔ ａｌ． Ｄｉａｂｅｔｅｓ(１９９９)４８(１２)：２２７０−２２７６
【非特許文献２】ＤｅＦｒｏｎｚｏ ｅｔ ａｌ．(２００５) Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ ２８(５):１０９２−１１００
【非特許文献３】Ｍｕ ｅｔ ａｌ．(２００６) Ｄｉａｂｅｔｅｓ５５(６)：１６９５−１７０４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、インスリン抵抗性および／またはβ−細胞機能障害に関連する疾患の予防上もしくは治療上の処置および／またはモニタリングのための、有効量の２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよび／またはその生理学的に許容される塩および／または溶媒和物を活性成分として含む医薬組成物を提供することによって、この問題を解決する。
【０００８】
驚いたことに、Ｔ２ＤＭおよびその関連疾患などの医学的適応症に取り組むために、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよび前記誘導体を、医薬組成物中に活性成分として適用することができることが発明者らによって実証された。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】処置中の８〜１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットの体重を示す図である。
【図２】処置中の８〜１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットの朝のランダム血糖値を示す図である。
【図３】４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける空腹時血中グルコースレベルを示す図である。
【図４】４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける空腹時インスリンレベルを示す図である。
【図５】４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける経口グルコース負荷に対するインスリン反応を示す図である。
【図６】４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける経口グルコース負荷に対するグルコース反応を示す図である。
【図７】４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける重水素化グルコース処理試験によって定量化された膵臓の代償を示す図である。
【図８】４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける重水素化グルコース処理試験によって定量化されたインスリン感受性を示す図である。
【図９】薬物処置期間中のＺｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａラットおよび痩せた対照ラットの体重を示す図である。
【図１０】週１回、およそ午前９時に決定されたランダム血糖値を示す図である。
【図１１】４週間の薬物処置中における、グルコメーターの表示値によって決定された４時間空腹時血中グルコース濃度を示す図である。
【図１２】１週間おきに決定した、４時間絶食後のインスリン濃度を示す図である。
【図１３】前処置に関し、薬物処置開始前のＧＤＴ中、グルコースチャレンジに反応した血中グルコース濃度およびインスリン濃度を示す図である。
【図１４】２週間の薬物処置に関し、薬物処置開始後２週目のＧＤＴ中、グルコースチャレンジに反応した血中グルコース濃度およびインスリン濃度を示す図である。
【図１５】４週間の薬物処置に関し、薬物処置開始後４週目に行った３回目のＧＤＴ中、グルコースチャレンジに反応した血中グルコース濃度およびインスリン濃度を示す図である。
【図１６】前処置、処置開始後２週間および処置開始後４週間にグルコースチャレンジに反応したインスリン感受性および膵臓の代償を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本出願を申請する前には、スルホニルベンゾイル−グアニジンが細胞のＮａ+／Ｈ+交互輸送機構の阻害剤であること、すなわち、それらが細胞のＮａ+／Ｈ+交換機構を阻害し、それによって優れた抗不整脈薬であり、特に、酸素欠乏の結果として発生する不整脈の治療に適していることは、ＥＰ０７５８６４４Ｂ１からのみ知られている。これらの物質は、優れた心臓保護作用を発揮し、それ故に急性心筋梗塞の治療、梗塞予防、梗塞後の治療、慢性心機能不全および狭心症の治療に適している。さらに、それらはすべての病的な低酸素性および虚血性の障害に対抗し、それによって１次的または２次的に引き起こされる疾病を治療することができる。病的な低酸素性または虚血性の局面におけるこれらの物質の保護作用のおかげで、外科的介入で、供給が一時的に減じられた状態の臓器を保護するために、臓器移植で、取り除かれた臓器を保護するために、血管形成術の血管介入または心臓介入において、神経系の虚血において、ショック状態の治療において、および本態性筋緊張亢進を予防するためにさらに適用される。加えて、本化合物は、例えば赤血球、血小板または白血球におけるＮａ+／Ｈ+交互輸送機構の活性の増加に伴う疾病を認識するための診断上の使用に適している。先行技術は、動脈硬化、糖尿病および糖尿病の後期合併症、特に肺、肝臓および腎臓の腫瘍疾病、線維性疾病ならびに臓器肥大および過形成などの細胞増殖によって引き起こされる疾病において、これらの物質を治療薬として用いることをさらに示唆している。
【００１１】
しかし今や、本発明は、全身のＩＲが増加する一方で、β−細胞代償が同時に保持されることを明らかにする。これらの現象は、化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンの影響力によって刺激され、Ｔ２ＤＭおよびメタボリックシンドロームなどのような特定の臨床像のための本発明の療法の基礎を形成している。
【００１２】
前述の化合物は、優れた忍容性とともに、非常に価値がある薬理学的特性を発揮する。体重増加、空腹時血中グルコースレベルまたはランダム血糖値(random blood glucose level)は、臨床試験において検討されたいずれの用量でも変化しない。これとは対照的に、空腹時インスリンは、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンによる処置前と比較して減少する。インスリン濃度曲線下面積(ＡＵＣ)値も、経口グルコース負荷後に減少するが、グルコース負荷に対して反応するＡＵＣは、処置前および処置後で類似した状態のままである。しかし、本発明の化合物は、β−細胞反応を維持するかまたは増加させもするので、より低いインスリンレベルが、β−細胞機能の年齢に関連した低下から生じないということは、予期せぬ発見である。それ故に、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンは、末梢のインスリン感受性を著しく増強する。
【００１３】
本発明の化合物の前記生物活性は、当業者に知られている技術によって決定され得る。適した実験動物は、例えば、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、類人猿またはブタである。ＩＲのインビボ評価のゴールドスタンダードは、オイグリセミック−高インスリン血症グルコースクランプ(euglycemic-hyperinsulinemic glucose clamp)である。他のツールは、定常状態血漿グルコース(steady-state plasma glucose)（ＳＳＰＧ）試験または頻回採血静脈内耐糖能試験(frequently sampled intravenous glucose tolerance test)である。インビボ膵β−細胞増殖を測定するのに利用できる技術には、[3Ｈ]チミジン(3ＨｄＴ)手法または５−ブロモデオキシウリジン(ＢｒｄＵ)手法が含まれる。インスリン感受性およびβ−細胞力学の変化を決定するのに適した技術は、感度が良く、再現可能であり、操作上、簡単であり比較的高スループットでなければならない。
【００１４】
前述のように、インスリン抵抗性は、２型糖尿病および心血管疾患の発症のための重要な危険因子である。２型糖尿病の病因は、インスリン抵抗性のみならず、進行性の膵機能不全も含む。信頼性があり、容易に行われる定量試験が開発されている。この重水素化グルコース処理試験(deuterated-glucose disposal test)（2Ｈ−ＧＤＴ）を用いて、２型糖尿病の両方の様相を定量化することができる。
【００１５】
骨格筋などの末梢組織によるグルコース負荷の解糖処理は、輸送、リン酸化および解糖経路に属する酵素の通過を含む、インスリン依存性の多くのステップによって決まる。加えて、グルコース有効性、グルコース自体が肝臓のグルコース産生を抑制し、組織へのグルコースの取り込みを加速させる両方の作用も、経口グルコース負荷の処理に寄与する。2Ｈ−ＧＤＴは、グルコースの取り込み、リン酸化および解糖代謝の比率を測定し、ひいてはインスリン抵抗性(ＩＲ)および膵β−細胞代償の適切さの両方を定量化するために使用することができる。2Ｈ−ＧＤＴは、経口重水素化グルコースチャレンジ、続いて重水(2Ｈ2Ｏ)生成量および血漿中インスリン濃度の測定からなる。グルコースの解糖代謝中にＨ原子が組織液中に放出されるので、2Ｈ2Ｏ生成量の測定値が、全身のグルコースの解糖処理率を表す。周囲のインスリン濃度について補正された2Ｈ2Ｏ生成量(すなわちインスリンの単位当たりの解糖代謝)は、組織のインスリン感受性を明らかにする。血糖可動域について補正されると(グルコース有効性の寄与を説明するために)、膵臓の代償は、解糖代謝(絶対2Ｈ2Ｏ生成量)がインスリン感受性に適合する程度を明らかにする。インスリン抵抗性の状態では、膵臓の代償は不十分であり、耐糖能は異常である。
【００１６】
詳細には、全身の解糖の安定な同位体質量分析評価を含む、最近開発された重水素化グルコース処理試験(2Ｈ−ＤＧＴ)は、血漿中インスリン×グルコースの単位当たりの2Ｈ2Ｏ生成量を測定することによって、ＩＲの評価を可能にし、これは、動物または個人の重水素化［６,６'−2Ｈ2］グルコースでの(経口)負荷からの重水素(2Ｈ)の放出率および決定された血漿中インスリン濃度に基づいている(Ｔｕｒｎｅｒ ＆ Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ (２００５) Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐ ８(１):１１５−１２６)。加えて、ＩＲに対する膵β−細胞代償の程度は、[６,６'−2Ｈ2]グルコース負荷後に達成される絶対2Ｈ2Ｏ生成量を測定することによって評価することができる。膵臓の代償の適切さは、周囲のインスリンの単位当たりの解糖処理（インスリン感受性を反映している）と達成されるグルコース利用の絶対率(ＩＲに対する膵臓の代償を反映している)とを識別することによって評価することができる。
【００１７】
2Ｈ−ＧＤＴは、以下の原則を厳守してデザインされる：ｉ)周囲のグルコース濃度およびインスリン濃度は、生理学的に関係のある代謝状態を反映すべきであり、ｉｉ)試験は、組織による、インスリンが介在したグルコース利用を測定し、確立されたモデルにおいてＩＲを明らかにすべきであり、ｉｉｉ)方法は、心血管系の転帰およびＴ２ＤＭの危険性に関して予測的であることが証明されているＩＲについての他の試験のように、比較可能な代謝状態を反映すべきである。基礎グルコース利用状態と最大グルコース利用状態との間の「ダイナミックレンジ」での血清中インスリン濃度は、これらの基準を満たす（Ｂｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ．(２００７) Ｄｉａｂ Ｃａｒｅ ３０：１１４３−１１４９）。さらに、定量的なやり方で動物またはヒトにおける全身の解糖を測定する2Ｈ−ＧＤＴは、オイグリセミック−高インスリン血症グルコースクランプ試験またはＳＳＰＧ試験と強く相関する。本発明の範囲において、特に比較的高スループットで、一般的に使用される多くの前臨床動物モデルを対象に、薬剤がインスリン感受性およびインスリン代償反応に及ぼすインビボ効果を決定するためには、前記動的アッセイの利用は、結果として好ましい。加えて、2Ｈ−ＧＤＴは、簡単さおよびスループットの類似の程度を有する臨床設定に完全に変換される。
【００１８】
本発明による医薬組成物の活性成分は、有効量の化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンまたはその薬学的に使用される誘導体である。そのような誘導体は、例として、適合する化合物、塩またはプロドラッグの溶媒和物であり得る。好ましくは、溶媒和物および／または生理学的に許容される塩である。
【００１９】
本発明の意味における「医薬組成物」は、医学分野における任意の薬剤であって、１種または複数の物質またはその製剤を含み、インスリン抵抗性および／またはβ−細胞機能障害に関連する疾患に罹患している患者の全体的な状態のまたは生体の特定領域の状態の病原性変異が少なくとも一時的に安定することができるように、予防、治療、経過観察またはアフターケアに使用することができる薬剤である。
【００２０】
用語「β−細胞機能障害」は、生存力および／または代謝活性が減少し、その結果β−細胞代償およびインスリンレベルの減少につながる、β−細胞の増殖および／またはそれらの細胞代謝における任意の機能不全を指す。β−細胞機能のそのような損失は、例えば年齢に関連した劣化によって引き起こされるかまたは２型糖尿病へ進行して発症する可能性があるが、他のいずれの原因も除外されないものとする。本発明の範囲において、β−細胞機能障害とインスリン抵抗性との明らかな関係が好ましいため、本発明の医薬組成物は、特に、β−細胞機能障害およびインスリン抵抗性の両方に関連する疾患を標的とする。
【００２１】
用語「有効量」、「有効用量」または「用量」は、本明細書において、相互に交換可能に使用され、疾患または病的状態に及ぼす予防的または治療的に関係のある効果を有する医薬化合物の量を表す。予防的効果は疾患の発生を防ぐ。治療的に関係のある効果は、疾患の１つまたは複数の症状をある程度緩和するか、あるいは疾患もしくは病的状態に関連するかまたはその原因となる１つまたは複数の生理学的または生化学的パラメータを一部または完全に正常に戻す。本発明による医薬組成物を投与するためのそれぞれの用量または投与量範囲は、前述の疾患、特にＴ２ＤＭおよびいずれ出現する前記他の疾患の症状を軽減する所望の予防的効果または治療的効果を達成するのに十分高い。任意の特定のヒトへの投与についての具体的な用量レベル、頻度および期間は、用いられる具体的な化合物の活性、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与時間および投与経路、排泄率、薬物の組合せならびに具体的な治療が適用される特定疾患の重症度を含む種々の因子によって決まることが理解される。よく知られている手段および方法を使用して、正確な用量を、通常の実験の問題として、当業者の１人によって決定することができる。
【００２２】
本発明のやり方で使用される化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよびその調製用の出発原料は、それぞれ、文献（例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ, Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ［有機化学の手法］, Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ, Ｓｔｕｔｔｇａｒｔなどの標準的な著作物）に記載されているような、それ自体知られている方法によって、すなわち前記反応に適した既知の反応条件下で製造される。それ自体知られている改変例も使用され得るが、本明細書においてより詳しく言及されない。必要に応じて、出発原料はまた、それらを単離しない状態で粗反応混合物中に残すが、それらをさらに本発明による化合物に直ちに変換することによって、ｉｎ−ｓｉｔｕで形成され得る。他方では、反応を段階的に実施することができる。
【００２３】
例えば、アルキルベンゾイルグアニジン誘導体の調製方法は、ＥＰ０７５８６４４Ｂ１に記載されている。加えて、ＥＰ１２８２５９８Ｂ１は、スルホニルベンゾイルグアニジウム塩の製造方法を教示しており、ここでは、化合物Ｎ−(４,５−ビス−メタンスルホニル−２−メチルベンゾイル)グアニジン塩酸塩に関する調製が特に好まれている。Ｎ−(４,５−ビス−メタンスルホニル−２−メチルベンゾイル)グアニジン塩酸塩および塩酸塩水和物を調製する別の方法は、ＤＥ１９９５１４１８Ａ１に開示されている。前述の３つの文献は、本明細書によって本発明の開示に参照として組み込まれる。
【００２４】
「溶媒和物」は、不活性な溶媒分子が化合物に結合し、それぞれの相互引力によって形成されているものと見なされる。好ましくは、溶媒和物は、一水和物、二水和物(dehydrate)またはアルコラートである。
【００２５】
塩の供給は、塩基を使用して、化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンの酸を関連した酸付加塩に変換することによって、例えば、エタノールなどの不活性溶媒中で等量の酸と塩基とを反応させた後、蒸発濃縮によって行うことができる。この反応に適した特定の塩基は、生理学的に許容される塩を生じるものである。例として、前述の化合物の酸は、塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸カリウムを使用して、相当する金属塩、特にアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩にまたは相当するアンモニウム塩に変換され得る。特に、エタノールアミンなどの生理学的に許容される塩を生じる有機塩基も、この反応に適している。
【００２６】
他方では、酸を使用して、化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンの塩基を関連した酸付加塩に変換することができ、例えば、エタノールなどの不活性溶媒中で等量の塩基と酸とを反応させた後、蒸発によって行うことができる。この反応に適した酸は、特に、生理学的に許容される酸を生じるものである。例として、使用することができるのは、無機酸、例えば硫酸、硝酸、塩酸もしくは臭化水素酸などのハロゲン化水素酸、オルトリン酸などのリン酸またはスルファミン酸、さらに有機酸、特に脂肪族、脂環式、アラリファティック、芳香族または複素環式の、一塩基または多塩基のカルボン酸、スルホン酸または硫酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、ピバル酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、メタンスルホン酸またはエタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンモノスルホン酸およびナフタレンジスルホン酸ならびにラウリル硫酸が挙げられる。生理学的に許容されない酸を有する塩、例えばピクリン酸塩は、化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンの単離および／または精製に使用され得る。
【００２７】
好ましい誘導体は、塩酸塩、メタンスルホン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘミフマル酸塩(hemi-fumerate)およびヘミリンゴ酸塩の群から選択される２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジン塩である。本発明のより好ましい実施形態では、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジン塩酸塩が、医薬組成物の活性成分を表す。
【００２８】
医薬組成物はまた、本化合物の混合物および少なくとも単一(singe)の誘導体または誘導体の混合物を含んでよく、それぞれ、例として溶媒和物および／または塩を含み得る。２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジン塩酸塩水和物を使用することが最も好ましい。
【００２９】
さらに、薬学的に使用される誘導体には、生体内で本発明の活性化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンに直ちに開裂されるプロドラッグ誘導体、すなわち追加のアルキル基、アシル基、糖分子またはオリゴペプチドを有する修飾化合物が含まれ得る。本明細書において、本発明による化合物の、例えば、Ｉｎｔ.Ｊ.Ｐｈａｒｍ.１１５,６１−６７(１９９５)に記載されているような、生物学的に分解可能なポリマー誘導体も含まれる。本発明の化合物は、それをそれらの官能性誘導体から、加溶媒分解、特に加水分解によって、または水素化分解によって遊離させることによって得ることができる。
【００３０】
本発明による活性成分はまた、目的地へと方向づけられた輸送、標的細胞内への組み込みおよび／または分布を促進する別の分子と縮合または複合体形成され得る。
【００３１】
さらに、活性成分は、単独でまたは他の治療と組み合わせて投与され得る。医薬組成物中に２種以上の化合物を使用することによって、相乗効果が達成され得る。すなわち、化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンは、グリタゾン、エキセナチド、プラムリンチドまたはＴＺＤなどの、活性成分として少なくとももう１つの薬剤と組み合わされる。本化合物は、同時にまたは逐次的に使用することができる。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、ヒトにおける医薬品および獣医薬として使用することができる。ＩＲおよび／またはβ−細胞機能障害に関連する疾患が、Ｔ２ＤＭ、メタボリックシンドローム、腎症および／または神経障害によって代表されることが特に好ましい。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の基礎となっている疾患は、Ｔ２ＤＭである。医学的適応症「Ｔ２ＤＭ」は、顕性の耐糖能異常および空腹時高血糖が表れるよりもずっと以前に、ＩＲおよび他の代謝異常の発症を伴う進行性疾患である。
【００３４】
医学的適応症「メタボリックシンドローム」は、心血管疾患を発症する危険性を増加させる医学的障害の組合せである。メタボリックシンドロームに分類するには、中心性肥満に加えて、２つのさらなる症状および特徴：空腹時高血糖(２型糖尿病、空腹時血糖異常、耐糖能異常またはインスリン抵抗性によって表される)、高血圧および脂質代謝障害(例えば、ＨＤＬコレステロールの減少および／またはトリグリセリドの上昇)が満たされていなければならない。
【００３５】
医学的適応症「腎症」は、主に非炎症的に引き起こされる、腎臓および腎機能の疾患を指す。本発明の範囲における興味深いサブタイプは、キンメルスチール−ウィルソン症候群および毛細管内糸球体腎炎としても知られている糖尿病性腎症(diabetic nephropathy、nephropatia diabetica）によって反映されている。糖尿病性腎症は、腎臓糸球体の毛細血管障害によって引き起こされ、ネフローゼ症候群および結節性糸球体硬化症を特徴とする進行性腎疾患である。長年にわたる糖尿病に起因し、多くの西洋諸国における透析の主な原因である。
【００３６】
医学的適応症「神経障害」は、通常、末梢神経障害の略である。末梢神経障害は、末梢運動神経、末梢知覚神経および自律神経の、神経全体または選択されたレベルを含む、機能障害および構造障害と定義される。神経障害は、糖尿病などの他の疾患またはアルコール乱用などの神経毒性物質から２次的に生じることが多い。
【００３７】
本発明の医薬組成物は、薬品製造工学のためのおよび適切な投与量を有する一般的な固体または液体の担体、希釈剤(diluent)および／または添加剤(additive)および通常のアジュバントを使用して、知られている方法で製造される。単回剤形を製造するために活性成分と組み合わされる賦形剤(excipient)材料の量は、治療される宿主、特定の投与方法に応じて変化する。適した賦形剤には、経腸(例えば経口)、非経口または局所適用などの種々の投与経路に適しており、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンまたはその誘導体と反応しない有機物質または無機物質が含まれる。適した賦形剤の例は、水、植物油、ベンジルアルコール、アルキレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールトリアセテート、ゼラチン、ラクトースまたはデンプンなどの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルクおよびワセリンである。
【００３８】
本発明の意味において、「アジュバント」は、同時に、同時期にまたは逐次的に投与される場合、本発明の活性成分に対する特定の反応を可能にするか、増強するかまたは変更するすべての物質を表す。注射溶液用の知られているアジュバントは、例えば、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム組成物、ＱＳ２１などのサポニン、ムラミルジペプチドもしくはムラミルトリペプチド、γ−インターフェロンもしくはＴＮＦなどのタンパク質、Ｍ５９、スクアレンまたはポリオールである。
【００３９】
当該の組成物の活性成分は、錠剤、フィルム錠、コート錠、トローチ剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、ジュース剤、点滴剤、液剤、分散剤、懸濁剤またはそのデポー剤形などの経口投与；液剤、懸濁剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、ジェル剤、乳剤またはバンドエイドなどの経皮投与；坐剤、懸濁剤、乳剤、インプラントまたは液剤、好ましくは油性または水性液剤などの非経口投与(parental administration）；特に坐剤などの直腸投与；軟膏剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、ジェル剤、スプレー剤、泡剤、エアゾール剤、液剤（例えば、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコール、アセトニトリル、ＤＭＦ、ジメチルアセトアミド、１,２−プロパンジオールまたはそれらの１つとのおよび／または水との混合物などの溶液）または散剤などの局所適用；および静脈内注入、皮下注射または筋肉内投与、後者３つの例として液剤および懸濁剤などに適した形態に適合する。活性成分は、上記所与の適切な製剤形態における経粘膜、経尿道尿管、経膣または経肺投与に適合することもできる。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、医薬組成物は、経口または非経口投与され、より好ましくは経口投与される。特に、活性成分は、薬学的に許容される塩などの水溶性の形態で提供され、この塩は、酸付加塩および塩基付加塩の両方を含むことを意味する。組成物はまた、１種または複数種の以下のもの：血清アルブミンなどの担体タンパク質、緩衝剤、安定化剤、着色剤などを含み得る。添加剤は、当技術分野においてよく知られており、それらは種々の製剤形態に使用される。
【００４１】
さらに、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよびその誘導体は、凍結乾燥されてよく、得られた凍結乾燥物(lyophilizate)は、例えば、注射用製剤を製造するために使用され得る。凍結乾燥物を得るための基本原理は、当業者に知られている。改良された希釈率を有する凍結乾燥物の製造方法は、ＤＥ１９９０３２７５Ａ１に例示的に記載されており、本明細書によって本発明の開示に参照として組み込まれる。
【００４２】
示されている製剤は滅菌され、および／または滑沢剤、保存剤、安定化剤、充填剤、キレート剤、酸化防止剤、溶媒、結合剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、塩（浸透圧に影響を及ぼすための）、緩衝物質、着色剤、着香剤および１種または複数種のさらなる活性物質、例えば１種または複数種のビタミン類などの助剤を含み得る。
【００４３】
製剤形態中の予防的にまたは治療的に活性な成分の濃度は、約０．１から１００ｗｔ％まで変化し得る。好ましくは、化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンまたはその誘導体は、用量単位当たり、およそ１から６００ｍｇまで、より好ましくは５から１００ｍｇの間の用量で投与される。一般に、そのような用量範囲は、１日の総組込み(total daily incorporation)に適している。言い換えれば、日用量は、０．０２から２００ｍｇ／ｋｇ体重との間、好ましくは２０から１００ｍｇ／ｋｇ体重との間、より好ましくはおよそ０．０２から１０ｍｇ／ｋｇ体重との間である。しかし、各患者に対する特定の用量は、本明細書において既に記載されている幅広い種類の因子によって決まる。
【００４４】
本発明はまた、インスリン抵抗性および／またはβ−細胞機能障害に関連する疾患の予防上もしくは治療上の処置および／またはモニタリングのための医薬品を製造するための、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよび／またはその生理学的に許容される塩および／または溶媒和物の使用に関する。さらに、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよび／またはその生理学的に許容される塩および／または溶媒和物は、さらなる医薬品活性成分を調製するための中間体として用いることができる。医薬品は、例えば、活性成分を、少なくとも１種の固体、流動体および／または半流動体の担体または賦形剤と組み合わせることによって、および場合によって、適切な剤形中に単一種のまたは複数種の他の活性物質と併せて、非化学的なやり方で調製されることが好ましい。
【００４５】
医薬品は、インスリン抵抗性および／またはβ−細胞機能障害に関連する疾患の開始を前もって防ぐために、または生じている症状および継続している症状を治療するために使用することができる。本発明に関するような疾患は、好ましくはＴ２ＤＭおよび／またはその関連疾患であり、後者は、メタボリックシンドローム、糖尿病性腎症および糖尿病性神経障害の群から選択されることがより好ましい。医薬組成物に関する本明細書の先行教示は、前記疾患の予防および治療のための医薬品を製造するための、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよびその誘導体の使用に制限されることなく、有効であり適用できる。
【００４６】
本発明の前述の医薬製品の用途は、特に治療上の処置に使用される。例えば、反応を促進し、疾患の症状を完全に根絶するために、化合物が明確な間隔をおいて投与されるならば、モニタリングは一種の治療と見なされる。同一の化合物または異なる化合物のいずれかが適用され得る。本発明の意味において、対象が家族性素因、遺伝的欠陥または以前に経験した疾患などの、Ｔ２ＤＭを発現するためのいずれかの前提条件を所有している場合、予防上の処置は勧めることができる。
【００４７】
本発明の目的はまた、インスリン感受性の増強および／またはβ−細胞代償の保持または増加のための、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよび／またはその生理学的に許容される塩および／または溶媒和物の使用である。本明細書において、保持とは、測定方法および生体が関与しているという事実によって引き起こされる正規の統計範囲内で、類似の値を指す。最大１０％の標準偏差は、保持と見なされるものとし、好ましくは最大わずか３％のみである。それに反して、インスリン感受性は、初期値を顕著に超える。インスリン感受性は、少なくとも２倍になり、好ましくは少なくとも３倍になり、より好ましくは少なくとも４倍になり、最も好ましくは少なくとも５倍になる。
【００４８】
本明細書の以前のパラグラフによる使用は、インビトロモデルまたはインビボモデルのいずれかで行われ得る。それらのβ−細胞は、それら自体劣化を受けやすい、すなわち、それらはそれぞれ機能を自然に損失するかもしくはアポトーシスを受けるか、または前アポトーシス物質などの年齢促進物質に曝されるかのいずれかである。同様に、体細胞は、それら自体インスリン抵抗性であり得る、すなわち、インスリンの正常量が正常なインスリン反応を起こすには不十分であるか、またはコルチゾン、ＴＮＦ−α、ＰＡｌ−１もしくはレジスチンなどのＩＲ促進薬に曝され得るかのいずれかである。防止される加齢プロセスおよび感作されるインスリン反応の両方を、本明細書の中で記載されている技術によってモニターすることができる。インビトロ使用は、Ｔ２ＤＭに罹患しているヒトのサンプルに適用されることが好ましい。化合物２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンのいくつかの具体的な誘導体を試験することによって、ヒト対象の治療に最適であり得るような活性成分が選択される。選ばれた誘導体のインビボ用量率は、有利なことに、インビトロのデータを考慮して、それぞれの具体的な細胞の劣化感受性および／またはＩＲの重症度に対して前調整される。したがって、治療効果は著しく高められる。その上、予防上もしくは治療上の処置および／またはモニタリングのための医薬品を製造するための、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよびその誘導体の使用に関する本明細書の事前教示は、得策であれば、低減されたβ−細胞代償を予防し、ＩＲを増加させるための化合物の使用に制限されることなく、有効であり適用できると見なされる。
【００４９】
本発明の別の目的は、２型糖尿病、メタボリックシンドローム、腎症および／または神経障害を治療するための方法であって、有効量の２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンおよび／またはその生理学的に許容される塩および／または溶媒和物を、そのような治療を必要とする哺乳動物に投与する方法を提供することである。治療される哺乳動物は、特にヒトである。好ましい治療は、経口または非経口投与である。Ｔ２ＤＭを有する患者またはＩＲが存在することに基づいてＴ２ＤＭを発症する危険性を負っている人々の、ＮＨＥ１阻害剤である２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンを用いた治療は、これらの個々における全身のインスリン感受性を改善し、ＩＲを好転させる。本発明およびその実施形態の先行教示は、得策であれば、治療の方法に制限されることなく、有効であり適用できる。
【００５０】
本発明の範囲において、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンは、インスリン抵抗性および／またはβ−細胞機能障害に関連するヒトの疾患の予防上もしくは治療上の処置および／またはモニタリングに、初めて使用される。本発明は、長期のインスリン抵抗性に反応して、β−細胞代償の役割に対処する。前述の効果は、２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジンが、末梢のインスリン感作物質として（膵臓に負わせる分泌の義務を軽減することによって、β−細胞機能を２次的に保持すること）もしくは直接的なインスリン分泌促進物質として(組織へのインスリン投与(insulinization)を増加することによって、インスリン感受性を２次的に改善すること)のいずれかまたはその両方として働くように相互に関係付けられる。本発明による医薬組成物を提供する結果として、インスリン感受性が増加すると同時に、年齢に関連したβ−細胞機能(代償)の減少を防ぐが、逆にはなり得ない。その使用は、症状の直接的および即時の軽減をもたらす広範囲の治療に対する有望な新規アプローチである。その影響力は、Ｔ２ＤＭおよびＴ２ＤＭから生じる疾病と効率良く闘うには特に利益となる。本化合物およびその誘導体は、高い特異性および安定性；低い製造コストおよび取り扱いの都合良さを特徴とする。これらの特徴が、交差反応性および副作用がないことを含む再生可能な作用のためのならびに適合する標的構造との安全で信頼性がある相互作用のための基礎を形成している。
【００５１】
本発明は、本明細書に記載されている特定の医薬組成物、使用および方法に限定されず、そのような事柄自体は、言うまでもなく、変化し得るということが理解されるべきである。また、本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、添付の特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定することを目的としたものではないということも理解されるべきである。添付の特許請求の範囲を含む本明細書において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」などの、語の単数形は、その状況が他に明確に規定しない限り、相当するそれらの複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「活性成分」への言及は、単一のまたはいくつかの異なる活性成分を含み、「方法」への言及は、当技術分野における普通の技術者に知られている複数の同等のステップおよび方法などへの言及を含む。他に特に定義しない限り、本明細書において使用される科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野における普通の技術者によって共通に理解されているものと同じ意味を有する。
【００５２】
本明細書において記載されているものと類似のまたは同等の方法および原料を、本発明の診療または試験に使用することができるが、適した例を以下に記載する。以下の例は、例証として提供されるものであり、限定するためのものではない。例の中では、（実際にはいつでも）汚染活動がない標準試薬および緩衝剤が使用される。
【００５３】
図１は、処置中の８〜１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットの体重を示す（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝１２）。
【００５４】
図２は、処置中の８〜１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットの朝のランダム血糖値を示す（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝１２、*ｐ＜０．０５）。４週目のデータは、ＧＤＴ群由来の４時間絶食後のグルコース表示値である。
【００５５】
図３は、４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける空腹時血中グルコースレベルを示す（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝６）。
【００５６】
図４は、４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける空腹時インスリンレベルを示す（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝６、*ｐ＜０．０１）。
【００５７】
図５は、４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける経口グルコース負荷に対するインスリン反応（インスリンＡＵＣ）を示す（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝６、ＧＤＴ、*ｐ＜０．０１  対処置前）。
【００５８】
図６は、４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける経口グルコース負荷に対するグルコース反応（グルコースＡＵＣ）を示す（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝６、ＧＤＴ）。
【００５９】
図７は、４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける重水素化グルコース処理試験（2Ｈ−ＧＤＴ；９０分％Ｄ2Ｏ回収率）によって定量化された膵臓の代償を示す（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝６、ＧＤＴ群、*ｐ＜０．０１）。
【００６０】
図８は、４週間の処置の後、１２週齢のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットにおける重水素化グルコース処理試験（2Ｈ−ＧＤＴ；％Ｄ2Ｏ回収率／インスリンＡＵＣ）によって定量化されたインスリン感受性を示す（平均＋／−ＳＤ、ｎ＝６、*ｐ＜０．０１）。
【００６１】
図９は、薬物処置期間中のＺｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａラットおよび痩せた対照ラットの体重を示す。データは、平均＋／−標準偏差；ｎ＝６／群（エラーバーは、印によって隠されている）；対照ｆａ／ｆａラットとは*ｐ＜０．０１である。
【００６２】
図１０は、週１回、およそ午前９時に決定されたランダム血糖値を示す。各群間に有意差はなかった。データは、平均＋／−標準偏差；ｎ＝６／群である。
【００６３】
図１１は、４週間の薬物処置中における、グルコメーターの表示値によって決定された４時間空腹時血中グルコース濃度を示す。データは、平均＋／−標準偏差；ｎ＝６／群；＃痩せた対照とは異なっている(ボンフェローニ(Bonferroni)の事後検定)。
【００６４】
図１２は、１週間おきに決定した、４時間絶食後のインスリン濃度を示す。データは、平均＋／−標準偏差；ｎ＝６／群；*ｆａ／ｆａ固形飼料（媒体）対照とは有意に異なっている。
【００６５】
図１３は、前処置に関し、薬物処置開始前のＧＤＴ中、グルコースチャレンジに反応した血中グルコース濃度およびインスリン濃度を示す。データは、平均＋／−標準偏差（エラーバーは、いくつかの群の印によって隠されている）；化合物Ａ８０ｍｇ／ｋｇおよび痩せた対照についてはｎ＝６；ｆａ／ｆａ媒体、化合物Ａ４０ｍｇ／ｋｇ、化合物Ｂ４０ｍｇ／ｋｇについてはｎ＝５；化合物Ｂ８０ｍｇ／ｋｇについてはｎ＝４；*ｆａ／ｆａ媒体対照とは異なっている；＃痩せた媒体とは有意に異なっている。図１３ａは、グルコースチャレンジに反応した連続時点での濃度を示す。図１３ｂは、図１３ａにグラフで示したグルコース反応の濃度曲線下面積（ＡＵＣ６０分）を示す。図１３ｃは、グルコースチャレンジに反応した連続時点での濃度を示す。図１３ｄは、図１３ｃにグラフで示したインスリン反応のＡＵＣ６０分を示す。図１３ｂおよび１３ｄについては、異なる群が棒によって表されており、左から右へ：痩せた媒体、ｆａ／ｆａ−媒体、化合物Ａ４０ｍｐｋ、化合物Ａ８０ｍｐｋ、化合物Ｂ４０ｍｐｋ、化合物８０ｍｐｋである。
【００６６】
図１４は、２週間の薬物処置に関し、薬物処置開始後２週目のＧＤＴ中、グルコースチャレンジに反応した血中グルコース濃度およびインスリン濃度を示す。データは、平均＋／−標準偏差（エラーバーは、いくつかの群の印によって隠されている）；ｆａ／ｆａ媒体、化合物Ａ４０ｍｇ／ｋｇ、化合物Ａ８０ｍｇ／ｋｇ、化合物Ｂ４０ｍｇ／ｋｇおよび痩せた対照についてはｎ＝６；化合物Ｂ８０ｍｇ／ｋｇについてはｎ＝４；*ｆａ／ｆａ固形飼料媒体とは異なっている；＃痩せた媒体とは有意に異なっている。図１４ａは、グルコースチャレンジに反応した連続時点でのグルコースの濃度を示す。図１４ｂは、図１４ａにグラフで示したグルコース反応の濃度曲線下面積（ＡＵＣ６０分）を示す。図１４ｃは、グルコースチャレンジに反応した連続時点でのインスリンの濃度を示す。図１４ｄは、図１４ｃにグラフで示したインスリン反応のＡＵＣ６０分を示す。図１４ｂおよび１４ｄについては、異なる群が棒によって表されており、左から右へ：痩せた媒体、ｆａ／ｆａ−媒体、化合物Ａ４０ｍｐｋ、化合物Ａ８０ｍｐｋ、化合物Ｂ４０ｍｐｋ、化合物８０ｍｐｋである。
【００６７】
図１５は、４週間の薬物処置に関し、薬物処置開始後４週目に行った３回目のＧＤＴ中、グルコースチャレンジに反応した血中グルコース濃度およびインスリン濃度を示す。データは、平均＋／−標準偏差（エラーバーは、いくつかの事例において印によって隠されている）；ｆａ／ｆａ固形飼料、化合物Ａ４０ｍｇ／ｋｇ、化合物Ｂ４０ｍｇ／ｋｇおよび痩せた対照についてはｎ＝６；化合物Ａ８０ｍｇ／ｋｇ、化合物Ｂ８０ｍｇ／ｋｇについてはｎ＝５；*ｆａ／ｆａ固形飼料媒体とは異なっている；＃痩せた対照とは異なっている。図１５ａは、グルコースチャレンジに反応したグルコースの濃度を示す。図１５ｂは、図１５ａにグラフで示したグルコース反応の濃度曲線下面積（ＡＵＣ６０分）を示す。図１５ｃは、グルコースチャレンジに反応した連続時点でのインスリンの濃度を示す。図１５ｄは、図１５ｃにグラフで示したインスリン反応のＡＵＣ６０分を示す。図１５ｂおよび１５ｄについては、異なる群が棒によって表されており、左から右へ：痩せた媒体、ｆａ／ｆａ−媒体、化合物Ａ４０ｍｐｋ、化合物Ａ８０ｍｐｋ、化合物Ｂ４０ｍｐｋ、化合物８０ｍｐｋである。
【００６８】
図１６は、前処置（ａ、ｂ）、処置開始後２週間（ｃ、ｄ）および処置開始後４週間（ｅ、ｆ）にグルコースチャレンジに反応したインスリン感受性（ａ、ｃ、ｅ）および膵臓の代償（ｂ、ｄ、ｅ）を示す。*媒体処置（固形飼料）ｆａ／ｆａとは有意に異なっている；＃痩せた対照とは有意に異なっている（ＡＮＯＶＡ後のチューキー（Ｔｕｋｅｙ）検定）。図１６ａ〜１６ｆについては、異なる群が棒によって表されており、左から右へ：痩せた媒体、ｆａ／ｆａ−溶媒、化合物Ａ４０ｍｐｋ、化合物Ａ８０ｍｐｋ、化合物Ｂ４０ｍｐｋ、化合物８０ｍｐｋである。
【実施例】
【００６９】
薬理学的研究報告Ｉ
研究デザイン
肥満したインスリン抵抗性のＺＦ（ｆａ／ｆａ）ラットを、８から１２週齢まで処置する、ＩＲモデルとして使用した。特に断りのない限り、ラットは１２時間点灯／１２時間消灯のサイクルで飼育し、飼料および水を自由に摂取させた。研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。研究には、合計１８匹の動物（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒによって供給された８週齢の雄）がいた。研究開始時のランダム血糖値に基づいて、動物を３群（媒体群、化合物Ａ群、化合物Ｂ群、各群ｎ＝６）にランダム化した。
【００７０】
グループ１：ＺＦラット（ｆａ／ｆａ）（ｎ＝６）、化合物Ａ（強制飼養によって１５０ｍｇ／ｋｇ）
グループ２：ＺＦラット（ｆａ／ｆａ）（ｎ＝６）、化合物Ｂ（固形飼料への混合物として４０ｍｇ／ｋｇ／日）
グループ３：ＺＦラット（ｆａ／ｆａ）（ｎ＝６）、媒体処置（対照固形飼料、溶媒強制飼養）。
【００７１】
グループ１および３の動物に、化合物Ａまたは媒体（水）を、４週間（８から１２週齢まで）経口強制飼養によって１日２回処置した。化合物Ｂを含む固形飼料をグループ２に自由に与えた。グループ１およびグループ３には、化合物Ｂを含まない固形飼料を自由に与えた。
【００７２】
化合物Ａは、カリポリドに相当する。化合物Ｂは、２−メチル−４，５−ジ−（メチルスルホニル）−ベンゾイル−グアニジン塩酸塩水和物に相当する。
【００７３】
血液採取および血漿中グルコースおよびインスリンアッセイ
朝のランダムな血液を、飼料を自由に与えられたラットから、尾の先端の小さな切り口によって採取した。血液は、ヘパリン添加チューブに収集した。血中グルコース濃度を、研究デザイン毎として、Ｏｎｅ−Ｔｏｕｃｈグルコメーター（Ｌｉｆｅｓｃａｎ  Ｉｎｃ、Ｍｉｌｐｔｉａｓ、ＣＡ）を使用して測定した。血液サンプルを氷上に設置して遠心分離し、インスリンをアッセイするまで、血漿を−２０℃で保管した。ラットにおける血漿中インスリン濃度を、ラット特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｃ、Ｄｏｗｎｅｒｓ  Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を用いて測定した。
【００７４】
2Ｈ−ＧＤＴ
ラットを４時間絶食させた。2Ｈ−ＧＤＴチャレンジより１時間前に、ラットに１．７５ｍｇ／ｇ体重のＨ2Ｏ18（１０％18Ｏ、Ｓｐｅｃｔｒａ、Ｘ  ＸＸ）を経口強制飼養によって投与して、以前に記載されているような体内総水分量の測定を可能にした。ｔ＝０において、血中グルコース濃度をグルコメーターを用いて決定し、血液サンプルを得、ベースラインとなるインスリンおよびＨ2Ｏ18希釈度を決定した。次いで、動物に、[６,６'−2Ｈ]グルコース（２ｇ／ｋｇ体重、水中５０％、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ．、Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）を経口強制飼養によって投与した。ラットプロトコルにおいて使用した２ｇ／ｋｇ経口グルコース負荷は、所望のダイナミックレンジの範囲内またはその付近のグルコースレベルを達成した。２回目の血液サンプルをｔ＝３０分に収集し、グルコース濃度およびインスリン濃度ならびに2Ｈ2Ｏ含有量を決定した。
【００７５】
重水標識化プロトコル
動物に、０．９％ＮａＣｌ中９９％重水を腹腔内ボーラス投与(０．３５μｌ／ｇ体重)し、大体５％(体重の６０％を水と推定して使用)の体内水分強化量に到達させ、次いで、研究の最後の４週間に飲料水中８％2Ｈ2Ｏを投与した。このプロトコルによると、齧歯動物において、体内水分2Ｈ2Ｏ強化量は、２、３日以内に安定な定常状態値に到達する。
【００７６】
ＩＲＭＳ分析
血漿サンプルの１００マイクロリットルアリコートをバイアルの突端部(cape)の内側に入れ、これを逆さにして、ガラス玉で充填されている加熱ブロックに、７０℃で一晩置き、バイアルの内部の留出水分を収集した。血漿サンプルにおける血液の重水素および酸素−１８同位体比は、Ｃｏｎｆｌｏ−ＩＩＩ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅを介してＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ  ２５３  ＩＲＭＳと連結したＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ／Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して決定した。以前のサンプル由来のヒステリシス効果を最小限に抑えるために、最初の２回の測定値を廃棄した。重水素同位体存在量は、最初に、国際ＶＳＭＯＷ標準に対してδ２Ｈ値で算出され、次いで、既知の強化量を有する標準の検量線を使用することによって、ＡＰＥに変換された。2Ｈ2Ｏ強化量を、グルコース負荷後３０分に、ラットについて算出した。強化量にＴＢＷプールサイズを掛け、２０(ＭＷ  2Ｈ2Ｏ)で割ることによって、2Ｈ2Ｏ強化量をｍｍｏｌｅに換算した。生成した総2Ｈ2Ｏを、所与の[６,６'−2Ｈ2]グルコース負荷の百分率として算出した。血漿インスリン(ＩＮＳ ＡＵＣ)およびグルコース(ＧＬＵ ＡＵＣ)の濃度曲線下面積は、台形法を使用して算出した。２つの2Ｈ−ＧＤＴパラメータを算出した：１）2Ｈ2Ｏ生成量（％負荷）／ＩＮＳ  ＡＵＣ×ＧＬＵ  ＡＵＣおよび２）2Ｈ2Ｏ生成の絶対率（％負荷）。
【００７７】
結果
体重
体重に関して（図１）、媒体処置群、化合物Ａ処置群または化合物Ｂ処置群との間に有意差はなかった。
【００７８】
朝のランダム血糖値
朝のランダム血糖値を、毎週午前９時から１１時の間に測定した。この研究の４週間の間、朝のランダム血糖値に関して、化合物Ｂ処置群と媒体処置群との間に有意差はなかった（図２）。しかし、化合物Ａ処置群は、他の２群と比較して、本研究の終わりまでに、より低い血糖値へと向かう傾向にあった。
【００７９】
空腹時グルコースレベルおよび空腹時インスリンレベル
研究終了時、ラットを４時間絶食させ、グルコースレベルおよびインスリンレベルを測定した。化合物Ａ処置動物および化合物Ｂ処置動物における空腹時グルコースレベルは、処置後により低い値へと向かう傾向にあったが、媒体処置群では、治療前と治療後で有意差はなかった（図３）。化合物Ａ処置動物および化合物Ｂ処置動物の両方において、それらの処置前のレベルと比較して、空腹時インスリンレベルが有意により低かった（図４）。
【００８０】
ＧＤＴ
すべての動物は４週処置前および処置後の両方で2Ｈ−ＧＤＴを受けた。2Ｈ−ＧＤＴのために動物を４時間絶食させた。2Ｈ−ＧＤＴチャレンジより１時間前に、ラットに１．７５ｍｇ／ｇ体重のＨ218Ｏを経口強制飼養によって処置して、総水分含量の測定を可能にした。ｔ＝０分において血液サンプルを得、ベースラインのインスリン、グルコースおよびＨ218Ｏ希釈度を決定した。次いで、[６,６'−2Ｈ2]グルコース（２ｇ／ｋｇ体重、水中５０％）を動物に経口強制飼養によって処置した。グルコース濃度およびインスリン濃度ならびに2Ｈ2Ｏ含有量のために、９０分時点で連続的に血液サンプルを採取した。膵臓の代償の適切さは、達成されたグルコース利用の絶対率（ＩＲに対する膵臓の代償を反映している）と周囲のインスリンの単位当たりの処置グルコースの解糖処理（インスリン感受性を反映している）とを識別することによって評価した。β−細胞代償を、経口[６,６'−2Ｈ2]グルコース負荷後の％2Ｈ2Ｏ回収率として表し、インスリン感受性をインスリンＡＵＣ当たりの％2Ｈ2Ｏ回収率として表す。
【００８１】
インスリンＡＵＣレベル（図５）またはグルコースＡＵＣレベル（図６）に関して、処置前または処置後のいずれも３群間に有意差はなかった。経口グルコース負荷中のグルコースＡＵＣは、空腹時グルコースレベルと類似の傾向に従った。図を見ても分かるように、大きな標準偏差が見られたが、これは生理学的な変動を表していると思われる。しかし、処置後すべてのインスリンＡＵＣレベルが、処置前と比較して有意により低かった。媒体処置動物における低下は、ＺＦラットの加齢（８から１２週齢まで）によるβ−細胞劣化の自然な過程を表していると思われる。
【００８２】
化合物Ａ処置動物および化合物Ｂ処置動物におけるインスリンＡＵＣの変化は、年齢に関連した劣化によって引き起こされ得るかまたはインスリン感受性が改善されたためにインスリン必要性が低減されたことによって引き起こされ得るかのいずれかであるので、その理由をＧＤＴ測定によって明らかにした。膵臓の代償に関して、処置前および処置後の両方とも、各群間に有意差はなかった。しかし、処置前および処置後の代償を各群内で比較したところ、媒体群および化合物Ａ群の両方が処置後に膵臓のより低い代償を示しており(図７)、これは、ＺＦラットにおけるβ−細胞機能障害の自然な進行のためである可能性が最も高いことが明らかとなった。これとは対照的に、化合物Ｂを処置したＺＦラットは、ベースラインに存在したのと同程度の膵臓の代償を維持していた。これらの結果は、化合物Ｂ処置のみに反応したβ−細胞機能の保持を示唆している。
【００８３】
これらの所見と一致して、ＧＤＴによって測定したインスリン感受性(図８)は、化合物Ｂ処置動物が、処置前の値と比較して、インスリン感受性を有意に増加させる(約４倍)一方で、処置後のインスリン感受性に関して、媒体処置群および化合物Ａ処置群に、処置前と比較して有意な変化はないが、両群で増加値へと向かう傾向にあることを示した。したがって、化合物Ｂによって表されている２−メチル−４,５−ジ−(メチルスルホニル)−ベンゾイル−グアニジン塩酸塩水和物は、インスリン感受性を有意に増加させ、β−細胞代償における年齢に関連した低減を防ぎ、このことは、処置後のインスリンＡＵＣの減少は化合物Ｂ処置動物に生理学的であることを示した。これらの結果はまた、インスリン抵抗性のモデルにおいて、インスリン濃度を評価する場合に、インスリン感受性を特徴づける必要性を強調した。
【００８４】
薬理学的研究報告ＩＩ
研究デザイン
以前の2Ｈ−ＧＤＴ研究(薬理学的研究報告Ｉ)では、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａラットにおいて、化合物Ｂはインスリン感受性(ＳＩ)を増加させ、β−細胞反応性(膵臓の代償)を増加または維持した。しかし、この研究では、ベースラインの空腹時インスリンレベルは各群間で異なった。ランダム血糖、空腹時グルコースまたはグルコースＡＵＣに関して、処置群のいずれにも変化がなかったという事実にもかかわらず、空腹時インスリンレベルおよびインスリンＡＵＣに関して、全群の動物に全体的な減少が見られた。本研究の目的は、化合物ＡおよびＢがＳＩおよび膵臓の代償(ＰＣ)に及ぼす効果の、最初の観察結果を確認することであった。第２の目的は、経口グルコース負荷に対するグルコースおよびインスリンの反応に及ぼす薬物の効果の経時的変化をより十分に明確にすることであった。以前の研究から多くの変更を行った。
【００８５】
１．化合物ＡおよびＢは、毎日の経口強制飼養のストレスを除去するために、飼料と混合した。食餌中に薬物が存在しても、摂餌量に悪影響を及ぼさず、血漿中の薬物の許容される濃度を与えるであろう。
【００８６】
２．最終結果における偏りの可能性を除去するために、Ｚｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａラットを、体重、空腹時グルコース濃度および空腹時インスリン濃度ならびにグリコシル化ヘモグロビンＡ１ｃレベル（Ｇｌｙ−ＨｂＡ１ｃ）の予備測定の結果に基づいて、処置群に割り付けた。
【００８７】
３．空腹時グルコース濃度および空腹時インスリン濃度を毎週決定した。
【００８８】
４．2Ｈ−ＧＤＴは、０、１４および２８日目に実施した。加えて、インスリンおよびグルコース反応の両方をより十分に明確にするために、2Ｈ−ＧＤＴ中、血中グルコースレベルおよびインスリンレベルを、０、１５、３０、６０および９０分に決定した。
【００８９】
５．処置によって達成されるグルコース恒常性の全体的な改善については、いずれも追加の評価を提供するために、グリコシル化ＨｂＡ１ｃレベルを、０および２８日目に決定した。
【００９０】
６．痩せた対照群を、本研究に含めた。
【００９１】
対象
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手した３６匹の肥満したＺｕｃｋｅｒ  ｆａ／ｆａおよび６匹の痩せたＺｕｃｋｅｒ  ｆａ／？雄ラットを、通常の動物施設条件化で、１２時間点灯／１２時間消灯のサイクルで飼育した。ラットをケージに２匹ずつ飼育し、毎週４時間の絶食中を除き、飼料および水を自由に摂取できるようにした。水は、これらの絶食中にも摂取できる状態にし続けた。
【００９２】
薬物
化合物Ａは、カリポリドに相当する。化合物Ｂは、２−メチル−４，５−ジ−（メチルスルホニル）−ベンゾイル−グアニジン塩酸塩水和物に相当する。化合物ＡおよびＢは、Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏによって散剤形態で供給された。薬物は、およそ４０または８０ｍｇ／ｋｇの用量を得るために、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、ｌｎｃ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）によって、ペレット状の食餌（ＬａｂＤｉｅｔ、５００１）に食餌１ｋｇ当たり０．４４ｇまたは０．８８ｇの濃度で組み込まれた。濃度は、３００ｇのラットは約３０ｇ／ｄの固形飼料を食べるであろうという仮定に基づいて算出された。同一の固形飼料であるが薬物を含まないものを、痩せた対照群動物およびｆａ／ｆａ対照群動物の両方のラットに与えた。
【００９３】
群割り付け
研究開始より１週間前に、すべてのラットの体重を測定した。４時間の絶食後、血液サンプルを得、血中グルコース、インスリンおよびグリコシル化ヘモグロビンレベル(ＨｂＡ１ｃ)を決定した。次いで、動物を、これらのパラメータに基づいて、下記に掲載されている群に分けた。ラットは、処置開始時に８週齢であった。
【００９４】
処置群：
１．ＺＦラット（ｆａ／ｆａ）（ｎ＝６）薬物を含まない固形飼料
２．ＺＦラット（ｆａ／ｆａ）（ｎ＝６）化合物Ａ（４０ｍｇ／ｋｇ／日）
３．ＺＦラット（ｆａ／ｆａ）（ｎ＝６）化合物Ａ（８０ｍｇ／ｋｇ／日）
４．ＺＦラット（ｆａ／ｆａ）（ｎ＝６）化合物Ｂ（４０ｍｇ／ｋｇ／日）
５．ＺＦラット（ｆａ／ｆａ）（ｎ＝６）化合物Ｂ（８０ｍｇ／ｋｇ／日）
６．痩せたＺｕｃｋｅｒラット（ｆａ／？）（ｎ＝６）薬物を含まない固形飼料。
【００９５】
投与計画
処置に適切な固形飼料は、１週間に１回行われる予定された４時間の絶食中を除いて、４週間継続的に摂取可能であった。
【００９６】
体重および摂餌量
個々の体重を１週間に１回決定した。ケージ当たりの平均摂餌量も１週間に１回決定し、個々のラットの摂餌量は、ケージ平均を２で割る(１ケージ当たり２匹のラットが飼育されている)ことによって算出した。
【００９７】
グルコースレベルおよびインスリンレベル
ランダム血糖値および空腹時（４時間）血中グルコースレベルの決定は、尾の毛細血管サンプルから得られた血液上で、手持ち式グルコメーター（ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｕｌｔｒａ、Ｌｉｆｅｓｃａｎ、Ｉｎｃ．Ｍｉｌａｐｉｔａｓ、ＣＡ）を使用して行った。血漿中インスリンレベルを、ラット特異的ＥＬＩＳＡ（Ｕｌｔｒａ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｒａｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ、Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）によって決定した。４時間の絶食期間は、午前９時に開始し、午後１時に血液採取後、終了した。
【００９８】
ＨｂＡ１ｃレベル
ＨｂＡ１ｃレベルの決定は、研究開始より前および４週目の処置期間終了時に再度、ＤＣＡ２０００分析器（Ｂａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＬＣ、Ｅｌｋｈａｒｔ  ＩＮ）を使用して行った。
【００９９】
2Ｈ−ＧＤＴ
インスリン感受性(ＳＩ)および膵臓の代償(ＰＣ)は、０、１４および２８日目に2Ｈ−グルコース処理試験を行うことによって測定した。
【０１００】
時間−４ｈ：ＧＤＴの朝に絶食を開始する前に、血液サンプルを採取してランダム血糖値(上記参照)を決定した。追加の血液サンプルを収集し、ベースラインの2Ｈ2Ｏおよび18Ｏ強化量を決定した。ラットの体重を測定し、４時間の絶食を開始した。水は絶食中に摂取可能であった。
【０１０１】
時間−３ｈ：絶食開始後１時間目に、１．７５ｍｇ／ｇ体重の１０％Ｈ218Ｏを経口強制飼養によって処置した（Ｓｐｅｃｔｒａからの2Ｈ2Ｏ−遊離Ｈ2Ｏ18水；１０％18Ｏ原子；カタログ番号５１３５０）。
【０１０２】
時間０：絶食開始後４時間目に、血中グルコースレベルおよびインスリンレベルを決定した。ラットに４ｍｌ／ｋｇの５０％グルコース溶液（２５％[６,６−2Ｈ2]グルコースおよび２５％Ｄ−グルコースを含む）を経口強制飼養によって処置した。
【０１０３】
グルコースチャレンジ後の時間１５、３０、６０および９０分目に、血中グルコース濃度を、尾静脈血からグルコメーター表示値によって再度決定した。追加の血液サンプルを収集し、インスリンを決定した。グルコースチャレンジ後６０および９０分に、全血を収集し、2Ｈ2ＯおよびＨ218Ｏ強化量を決定した。すべての血液サンプルを遠心分離し、血漿をアッセイするまで−２０℃で保管した。体内水分の重水素および酸素−１８同位体強化量を、血漿サンプルの留出水分のＩＲＩＳ分析によって決定した。
【０１０４】
算出
強化量（2Ｈ2Ｏ  ＡＰＥ）に体内総水分量プールサイズを掛け、２０（2Ｈ2Ｏの分子量）で割ることによって、2Ｈ2Ｏ強化量をｍｍｏｌに換算した。生成した総2Ｈ2Ｏを、処置した［６,６'−2Ｈ2］グルコース負荷の百分率として算出した。血漿インスリンおよびグルコースの濃度曲線下面積（ＡＵＣ  ６０分）は、台形法を使用して算出した（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｓｉｍ）。
【０１０５】
２つのパラメータを2Ｈ−ＧＤＴから算出した
１．インスリン感受性指数（ＳＩ）＝2Ｈ2Ｏ生成量（％負荷）／（グルコースＡＵＣ×インスリンＡＵＣ）。
【０１０６】
２．膵臓の代償（ＰＣ）＝総[６,６'−2Ｈ2]グルコース負荷の百分率としての絶対2Ｈ2Ｏ生成量（％負荷）／積分されたグルコース反応（グルコースＡＵＣ；インスリン非依存性の利用について補正するため）。
【０１０７】
統計
グルコースおよびインスリン測定の全体的な結果を、要因として薬物および時間(反復)を使用する二元配置反復測定ＡＮＯＶＡによって分析した。最初の分析の後に、ボンフェローニの事後検定を行い、全群を比較した。データは、ｐ＜０．０５で有意であると見なす。グルコースおよびインスリンのＡＵＣ６０分値を、一元配置ＡＮＯＶＡによって分析した後、チューキーの全群比較を行った。
【０１０８】
データ除外
2Ｈ−ＧＤＴ中、グルコース投与の失敗または部分的な失敗が原因で、強化が十分でないことが示されたデータを除外した。
【０１０９】
結果
研究前の群割り付け
研究開始時にｆａ／ｆａ群間に有意差はなかった。予想通り、痩せた動物の体重および空腹時インスリンレベルは、すべてのｆａ／ｆａ動物とは有意に異なった。グリコシル化ヘモグロビンおよび空腹時グルコースレベルは、痩せた動物においてやや低かったものの、これらの値が他の処置群の値と有意に異なっていなかった（表１）。
【０１１０】
【表１】
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【０１１１】
体重および摂餌量
すべての動物は、実験期間中に体重が増え続け、このことは、薬物が良好に忍容されたということを示した（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ後、ボンフェローニの事後検定：時間：Ｆ(4,136)＝１４８８．４１、ｐ＜０．０００１；処置：Ｆ(6,36)＝３１．０２、ｐ＜０．０００１、交互作用  処置×時間：Ｆ(24,136)＝１２．６９、ｐ＜０．０００１）。４週間の処置期間にわたって、体重に関する有意差は、ｆａ／ｆａ群間に認められなかったが（図９）、痩せた対照群と比べて増加した。化合物Ａ群および化合物Ｂ群の平均週間摂餌量は、痩せた対照と比較して増加したが、固形飼料を与えたｆａ／ｆａ対照の摂餌量とは有意に異なっていなかった（表２）。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
ランダム血糖値
ランダム血糖値を、絶食していないラットにおいて、１週間に１回、およそ午前９時に決定した。固形飼料ｆａ／ｆａ群と他の処置群とのランダム血糖値の間には有意差はなかった（図１０）（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ後、ボンフェローニの事後検定：処置Ｆ6,136＝０．９３；ｐ＝０．４８ｎｓ；時間：Ｆ4,136＝３．２５、ｐ＝０．０１；交互作用Ｆ24,136＝０．９７、ｐ＝０．５１ｎｓ）。
【０１１４】
空腹時血中グルコースレベル
空腹時血中グルコースを、１週間に１回、４時間の絶食後に決定した（午前９時に絶食、午後１時にサンプル採取）。種々の薬物処置群におけるグルコースレベルは、対照ｆａ／ｆａ群とは有意に異なっていなかった（図１１）。化合物Ａの４０ｍｇ／ｋｇ用量は、４週間の投与の後に空腹時グルコース濃度が増加した（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ後、ボンフェローニの事後検定：処置Ｆ6,136＝５．２６；ｐ＝０．０００６；時間：Ｆ4,136＝７．６８、ｐ＝０．０００１；交互作用Ｆ24,136＝０．９７、ｐ＝０．５１ｎｓ）。
【０１１５】
空腹時インスリン濃度
ベースラインおよび処置４週後の空腹時インスリン濃度を、表３にまとめる（二元配置反復測定ＡＮＯＶＡ後、ボンフェローニの事後検定：処置Ｆ6,36＝１１．２４、ｐ＜０．０００１；時間：Ｆ6,36＝９．４８、ｐ＜０．０００１；交互作用Ｆ24,136＝３．２１、ｐ＜０．０００１）。痩せた対照のインスリン濃度は、固形飼料を与えたｆａ／ｆａ対照の濃度とは、３週目以外の各週で有意に異なっていた。処置４週目までに、８０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａは両方とも、ｆａ／ｆａ媒体対照と比べて、空腹時インスリンを有意に減少させた。しかし、これらの値は、痩せた対照の値を超えたままであった（図１２）。
【０１１６】
グリコシル化ヘモグロビン
ＨｂＡ１ｃレベルは、経時的な血糖コントロールを反映している。ベースラインでは、すべてのｆａ／ｆａ群の平均ＨｂＡ１ｃレベルは、有意にとはいえなかったが、痩せた対照のレベルをやや超えていた。４週目では、ｆａ／ｆａ対照群および化合物Ｂ８０ｍｇ／ｋｇ群のＨｂＡ１ｃレベルは、痩せた対照のレベルを有意に超えていた（表３）。４週間の処置期間にわたって、ＨｂＡ１ｃの変化は、いずれの処置群間でも統計的に有意ではなかった（表３）。
【０１１７】
【表３】
0005634985.tif 000004
【０１１８】
2Ｈ−グルコース処理試験
化合物ＡおよびＢが膵臓の機能およびインスリン感受性に及ぼす効果を決定するために、動物を離乳させ薬物を含む固形飼料に切り替える前、次いで薬物処置２週後および４週後に、ラットを2Ｈ−ＧＤＴに供した。
【０１１９】
処置前2Ｈ−ＧＤＴグルコースおよびインスリン反応
薬物処置開始前のグルコースチャレンジに反応して、血中グルコース濃度は、痩せた対照に比べて、すべてのｆａ／ｆａラットにおいて増加した（図１３ａ）。６０分の時点では、割り付けられることになる４０および８０ｍｇ／ｋｇ化合物Ａ群の両方のグルコースレベルが、ｆａ／ｆａ媒体に割り付けられることになる動物のレベルを超えて増加した。しかし、グルコースＡＵＣ（６０分）は、ｆａ／ｆａラットの全群が、痩せた対照に比べて、類似の程度の経口耐糖能異常を有することを示した（図１３ｂ）。ベースラインでは、2Ｈ−ＧＤＴチャレンジ中、すべてのｆａ／ｆａ動物は、痩せた対照と比較して、類似の程度の障害された高インスリン血症を示した（図１３ｃ、ｄ）。
【０１２０】
２週目の2Ｈ−ＧＤＴグルコースおよびインスリン反応
薬物処置開始後２週目に、すべてのｆａ／ｆａ動物は、痩せた対照に比べて、血中グルコース濃度が有意に増加した（図１４ａ、ｂ）。同様に、すべてのｆａ／ｆａ動物は、痩せた対照に比べて、インスリン濃度が増加した（図１４ｃ、ｄ）。化合物ＡおよびＢは、処置２週後のグルコースまたはインスリン反応に影響を及ぼさなかった。
【０１２１】
４週目のＧＤＴグルコースおよびインスリン反応
薬物処置開始後４週目に、化合物Ａ（４０および８０ｍｇ／ｋｇ）および化合物Ｂ（４０および８０ｍｇ／ｋｇ）を処置したラットは、血中グルコース濃度およびインスリン濃度が上昇し続けた（図１５ａ、ｂ、ｃ、ｄ）。実際に、９０分時点では、グルコースレベルは、化合物Ａ４０ｍｇ／ｋｇ処置群において、ｆａ／ｆａ媒体処置ラットのレベルを超えて上昇した。８０ｍｇ／ｋｇでは、化合物Ｂは、血中グルコースレベルをわずかに減少させたが、この値は、痩せた媒体ラットまたはｆａ／ｆａ媒体対照のレベルと有意に異なっていないレベルであった。インスリン濃度は、８０ｍｇ／ｋｇ化合物Ｂ群において、上昇したままであった。
【０１２２】
膵臓機能およびインスリン感受性
前処置
ベースラインで決定したインスリン感受性および膵臓の代償は、すべてのｆａ／ｆａ群において類似しており（図１６ａ、ｂ）、痩せた対照と比較して有意に減少した。このことは、ｆａ／ｆａラットがそれらの重症のインスリン抵抗性に対して代償する能力は不十分であり、それらの耐糖能に寄与することを示している。後に８０ｍｇ／ｋｇの化合物Ｂを処置される動物群に見られた、膵臓の代償に関する明白な減少は、実験的な人為現象であると見なされ得る。その理由として、この減少は後の時点では見られず、同時に行われた他の尺度（例えば、体重、空腹時グルコースまたはインスリン濃度）で、これらの動物には差がなかったためである。ＰＣに関するＡＮＯＶＡの結果：Ｆ6,29＝３３．０２、ｐ＜０．０００１；ＳＩに関しては：Ｆ6,29＝３５．８、ｐ＜０．０００１。
【０１２３】
２週間の処置
２週間の処置の後、化合物Ｂにおける膵臓の代償は、８０ｍｇ／ｋｇ群が痩せた対照群とｆａ／ｆａ対照群との中間にあった（図１６ｃ、ｄ）。ＰＣに関するＡＮＯＶＡの結果：Ｆ6,32＝９．１２１、ｐ＜０．０００１；ＳＩに関しては：Ｆ6,32＝１３２．７、ｐ＜０．０００１。
【０１２４】
４週間の処置
４週間の薬物処置の後の結果は、２週間のものと類似していた（図１６ｅ、ｆ）。８０ｍｇ／ｋｇ化合物Ｂ群におけるインスリン感受性は、有意には改善されなかったものの、膵臓の代償に関してわずかな改善が見られた。ＰＣに関するＡＮＯＶＡの結果：Ｆ6,32＝６．１７、ｐ＝０．０００２；ＳＩに関しては：Ｆ6,32＝３５．０１、ｐ＜０．０００１。
【０１２５】
結論
ベースラインでは、体重、摂餌量、ＨｂＡ１ｃ、ランダム血糖値、空腹時血中グルコース濃度またはインスリン濃度に関して、ｆａ／ｆａ群間に有意差はなかった。同様に、グルコースチャレンジに反応して、ｆａ／ｆａ群は、グルコースＡＵＣ（６０分）またはインスリンＡＵＣ（６０分）においてお互いに差はなかったが、痩せた対照とは有意に異なっていた。インスリン感受性および膵臓の代償の両方は、ベースラインでは、他の群と比べて低下していた化合物Ｂ（８０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）群を除くすべてのｆａ／ｆａラットにおいて類似していた。４週間の処置の後に、８０ｍｇ／ｋｇの化合物Ａは、空腹時インスリン濃度を減少させたが、他のパラメータに及ぼす効果は全くなかった。化合物Ａの用量は、（空腹時またはチャレンジに反応した）グルコースレベルもインスリン感受性も膵臓の代償も有意には改善しなかった。本実験における化合物Ｂの効果は、中等度であった。８０ｍｇ／ｋｇ／ｄでの４週間の処置の後に、化合物Ｂは、グルコースチャレンジに反応してグルコースＡＵＣ６０分を減少させた。グルコース濃度は、痩せた媒体対照の濃度とｆａ／ｆａ媒体対照の濃度との中間にあったが、いずれからもわずかに異なっていた。実際には、インスリンＡＵＣ６０分に及ぼす効果も、インスリン感受性（ＳＩ）のコンピュータ測定に及ぼす効果もなかった。膵臓の代償は、２週間の処置の後および４週間の処置の後の両方でわずかに改善されているように思われ、痩せた媒体対照またはｆａ／ｆａ媒体対照のいずれか一方とわずかに異なっていた。しかし、この群における膵臓の代償は、ベースラインの他の群のものに比べて低い（悪い）ように思われたことが留意される。４週間の化合物Ａの処置は、耐糖能を改善しなかったか、または高インスリン血症を有意には改善せず、過度のインスリン反応がｆａ／ｆａラットにおいて見られた。高用量の化合物Ｂは、ｆａ／ｆａ対照と比べて、膵臓の代償において劣化を弱めた。化合物Ｂは、インスリン感受性を効果的には増加させないにしても、膵臓機能にプラスの効果をもたらす。
【０１２６】
医薬製剤に関連した例
例Ａ：注射バイアル
本発明による活性成分１００ｇおよびリン酸水素二ナトリウム５ｇの再蒸留水３ｌ中溶液を、２Ｎ塩酸を使用してｐＨ６．５に調整し、除菌し、注射バイアル中に移し、無菌条件下で凍結乾燥し、無菌条件下で密封する。各注射バイアルは、５ｍｇの活性成分を含む。
【０１２７】
例Ｂ：坐剤
本発明による活性成分２０ｇと、１００ｇの大豆レシチンおよび１４００ｇのカカオバターとの混合物を融解させ、金型に注入し、冷却する。各坐剤は、２０ｍｇの活性成分を含む。
【０１２８】
例Ｃ：液剤
本発明による活性成分１ｇ、９．３８ｇのＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、２８．４８ｇのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏおよび０．１ｇの塩化ベンザルコニウムから、再蒸留水９４０ｍｌ中溶液を調製する。ｐＨを６．８に調整して、溶液を１ｌにし、照射によって滅菌処理する。この液剤は、点眼剤の形態で使用され得る。
【０１２９】
例Ｄ：軟膏剤
本発明による活性成分５００ｍｇを、９９．５ｇのワセリンと無菌条件下で混合する。
【０１３０】
例Ｅ：錠剤
本発明による活性成分１ｋｇ、４ｋｇのラクトース、１．２ｋｇのジャガイモデンプン、０．２ｋｇのタルクおよび０．１ｋｇのステアリン酸マグネシウムの混合物を、従来のやり方で、各錠剤が１０ｍｇの活性成分を含むように圧縮して錠剤を得る。
【０１３１】
例Ｆ：コート錠
例Ｅと同じように錠剤を圧縮し、続いて、従来のやり方で、ショ糖、ジャガイモデンプン、タルク、トラガカントおよび色素のコーティングでコートする。
【０１３２】
例Ｇ：カプセル剤
本発明による活性成分２ｋｇを、従来の方法で、各カプセル剤が２０ｍｇの活性成分を含むように硬ゼラチンカプセルに導入する。
【０１３３】
例Ｈ：アンプル剤
本発明による活性成分１ｋｇの再蒸留水６０ｌ中溶液を、除菌し、アンプル中に移し、無菌条件下で凍結乾燥し、無菌条件下で密封する。各アンプルは、１０ｍｇの活性成分を含む。
【０１３４】
例Ｉ：吸入スプレー
本発明による活性成分１４ｇを１０ｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶かし、ポンプ機構を備えた市販のスプレー容器に溶液を移す。溶液は、口または鼻に噴霧され得る。１回の噴霧ショット（約０．１ｍｌ）は、約０．１４ｍｇの用量に相当する。
【図１】
0005634985.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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