(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｙ及びＸが異なる式（Ｉ）の化合物を２以上含んでなる微生物又は毒素を検出する試薬を、検査サンプルと混合し、該混合物を超音波処理、高速攪拌又は遠心分離して該混合物中の沈殿を除去し、該混合物に紫外線を照射し、該混合物からの発光波長の変化を検出することを特徴とする微生物又は毒素の検出方法。
【化１】
0005605542.tif 000018
［式中（Ｉ）中、Ｘは以下の置換基
【化２】
0005605542.tif 000019
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であって、かつ、Ｘの２位及び５位のＲが同一であり、Ｙごとに以下の（ａ）〜（ｅ）に示される置換基が選択され、Ｅ１はケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、ｎは１〜４の整数である）であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、Ｒ５は炭化水素基であり、Ｅ２は炭素、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであってＥ１と同一でも異なっていてもよく、Ｙは微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である。
（ａ）Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、２−ピリジル、３−ピリジル、１−ナフチル、
（ｂ）ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、
（ｃ）ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ビフェニル、２−チアゾール
（ｄ）２−チエニル、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、２−スチリル、ｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４、
（ｅ）ビチエニル、５−（２−ベンゾ[ｂ]チエニル）２−チエニル］
【請求項２】
Ｒ２、Ｒ３及びＲ４が同一又は異なり、アミド結合を含んでもよく、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基又はアルコキシレン基（オキシアルキレン基）であり、Ｒ５がメチル基である請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
Ｙが以下の（ＩＩ）〜（ＩＶ）の置換基のいずれかである式（Ｉ）の化合物を含む請求項１又は２に記載の検出方法。
【化３】
0005605542.tif 000020
【請求項４】
ｌが０、ｍが２、ｎが４、Ｒ２及びＲ３が−Ｃ３Ｈ６−、Ｒ４が−Ｃ４Ｈ８−であり、前記式（ＩＩ）の置換基である請求項３に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の微生物を同時に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くのウィルスや細菌による感染症は、重篤な病態を引き起こすことも少なくないため、感染予防や感染後の治療は、常に重要な臨床的課題となっている。感染病原体の中でも、とりわけ危険度の高いインフルエンザウィルス、特にここ数年世界規模での蔓延が危惧されている高病原性トリインフルエンザ、ＳＡＲＳに対する予防及び治療上の対策は、早急に対応すべき重要な問題の一つである。さらに、近年の地球温暖化に伴い、熱帯地方特有の感染症（例えば、デング出血熱）が感染地域を拡大してきており、今後の対策が不可欠である。
【０００３】
ウィルスや細菌などの微生物による生体への感染経路は、各微生物によって異なるが、感染標的細胞への侵入の際には、標的細胞表層に存在する受容体上の糖鎖構造を認識し、結合することが、多くの場合において知られている。このような感染時の現象に着目して、発明者らは、ウィルスや細菌感染によって生じる疾患の予防及び治療法の開発を行ってきた。発明者らは、例えば、カルボシランデンドリマーあるいはポリマー上に糖鎖を集積させ、病原性大腸菌Ｏ−１５７の産生するベロ毒素に対して動物レベルでも強い阻害活性を示す糖鎖クラスター化合物の創製（非特許文献１及び特許文献１）、デングウィルス（非特許文献２及び特許文献２）、インフルエンザウィルスの引き起こす感染症に対し効果を示す糖鎖クラスター化合物の創製（非特許文献３、特許文献３、特許文献４及び特許文献５）など、精力的に研究を行ってきた。
このように、ウィルス又は細菌感染時の標的細胞上の糖鎖構造の認識機構は、感染症の予防又は治療方法の開発において有益な手掛かりを与えてきた。
【０００４】
感染症自体の予防又は治療は当然のこととして、その一方で、どのような微生物感染が生じているのかを早急に突き止めることも、早期治療を行う上では非常に重要なことである。現在、主として行われている感染病原体の検査は、検査対象の病原体に特異的な抗原タンパク質を検出する方法、特定の遺伝子領域を増幅して検出する方法、あるいは、感染病原体を顕微鏡下で直接観察する方法などが行われている。これらの方法のうち、抗原タンパク質や特定遺伝子を同定する方法は、検出感度及び精度の点において優れてはいるものの、やや操作が煩雑であり、迅速な検査結果の取得の点に若干の問題がある。また、顕微鏡を用いて形態学的に感染病原体を特定する方法においては、観察対象の病原体の数がある程度高濃度でなければ検出が難しく、そのための感染病原体の増殖等に多くの時間が必要とされ、検査の迅速性に問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２８９９０７
【特許文献２】特開２００５−３０６７６６
【特許文献３】特開２００８−５０２８３
【特許文献４】特開２００８−８１４１１
【特許文献５】特開２００５−７７２７６
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２００５，１９１：２０９７−２１０５
【非特許文献２】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，２００６，３４１：４６７−４７３
【非特許文献３】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２００１，４２：３３２７−３３３０
【非特許文献４】Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｐｈｙｓ．Ｓｏｃ．２００４，４５：３２９
【非特許文献５】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００５，１２７：１１６６１
【非特許文献６】Ｓｙｎ．Ｍｅｔ．２００５，１５２：２４９
【非特許文献７】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２００７，４８：４３６５−４３６８
【非特許文献８】Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２０００，６：１６８３−１６９２
【非特許文献９】Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００９，４３３２−４３５３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記状況の中、感染症の原因病原体の検出及び同定をさらに迅速かつ正確に行うために、従来方法とは異なる方法論に基づいた新たな手法の開発に期待が寄せられている。
そこで、本発明は、感染病原体を迅速かつ正確に検出及び同定する方法、及び該方法に使用される試薬又はキットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、病原体に特異的に結合する糖鎖を担持したカルボシランデンドリマーによるＡＩＥ（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ）効果を利用して本発明を完成させた。ＡＩＥ効果とは、２，３，４，５−テトラフェニルシロール（以下、シロールと略記）など、中心の環の周りを囲むように複数のアリール基（例えば、フェニル基）が結合した分子が、液体中で互いに凝集し合い、紫外線照射により高効率発光を行う現象のことである（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８及び非特許文献９）。発明者らは、シロールと上記カルボシランデンドリマーを結合させた化合物によって引き起こされるＡＩＥ効果が、該カルボシランデンドリマーが担持する糖鎖と病原体（例えば、インフルエンザウィルスなど）又は病原体が分泌する毒素（例えば、ベロ毒素など）との結合によって消失すること初めて見出した。これまでにも、発光分子を利用して病原微生物を検出する試みが行われてはいたが、発光分子と病原微生物との結合の前後において、発光量又は色調の変化を明瞭に現出させる有効な方法が見出されていなかったため、いずれの試みも実用化には程遠い状態にあった。本発明は、ＡＩＥ効果を利用することで、シンプルかつ迅速な微生物検出を提供する点において、特別顕著な効果を有している。
さらに、発明者らは、異なる色調のＡＩＥ効果を利用して、簡易かつ迅速に複数のウィルスや微生物等を検出する方法を見出した。すなわち、シロールは、２位と５位の置換基に特徴的な色調のＡＩＥ効果を発揮することが報告されている（例えば、非特許文献８を参照）。そこで、異なる色調のＡＩＥ効果を示すシロール誘導体にデンドリマーを結合させたシロール誘導体−デンドリマー結合体を複数使用して、対象物の検出実験を行ったところ、対象物が存在する場合には、色調の変化が可視的に確認できることを初めて見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、微生物等と特異的に結合するデンドリマーとＡＩＥ効果を惹起する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法である。
より具体的には、本発明は、Ｙ及びＸが異なる式（Ｉ）の化合物を２以上含んでなる微生物又は毒素を検出する試薬及びキット、並びに該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法である（つまり、本発明の試薬又はキットに含まれる複数の式（Ｉ）の化合物（群）は、互いに、Ｙ及びＸが異なっている）。
【化１】
0005605542.tif 000002
［式中（Ｉ）中、Ｘは以下の置換基
【化２】
0005605542.tif 000003
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１はケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、ｎは１〜４の整数である）であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、Ｒ５は炭化水素基であり、Ｅ２は炭素、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであってＥ１と同一でも異なっていてもよく、Ｙは微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である］
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、複数の微生物等が含まれる混合物の中から、特定の検出対象を簡易、迅速、かつ、高精度で定性的、定量的に検出することができる。
【００１１】
また、本発明によれば、微生物等が複数存在する場合でも、蛍光強度の変化が明瞭であるため、検出対象の存在を視覚的に捉えることが可能である。
【００１２】
本発明の検出試薬又はキットは、煩雑な操作を必要とせず、また、複数の微生物等が存在する場合でも、検出対象の微生物の検出が可能であることから、迅速な感染源の特定並びに早急な感染症治療を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】デンドリマーの基本的な骨格を模式的に示した図である。
【図２】式（Ｉａ）で示される化合物の蛍光強度に対する溶媒の影響。有機溶媒（アセトン）に対する水の比率を変動させて、励起波長３６０ｎｍに対する化合物からの蛍光強度を測定した。
【図３】シロールデンドリマーとアニシルシロールデンドリマーとの混合液に、ＷＧＡを添加したときの発光波長の変化を測定した結果を示す。シロールデンドリマー（０．３５μＭ）とアニシルシロールデンドリマー（０．３５μＭ）の混合液にＷＧＡ溶液（１０μＭ）を１０μｌづつ滴下した後、励起波長３７８ｎｍでの発光波長の変化を測定した。
【図４】シロールデンドリマー（０．３５μＭ）とアニシルシロールデンドリマー（０．３５μＭ）との混合液（３ｍｌ）の色が、ＷＧＡ溶液を滴下するごとに、シアン色から青色へと変化する様子を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、微生物又は毒素と特異的に結合するデンドリマーと、ＡＩＥ効果を惹起、あるいは、発現する化合物を結合させた化合物を含む、微生物又は毒素を検出する試薬又はキット、並びに、該試薬又はキットを使用した微生物又は毒素を検出する方法に関するものである。ここで、「デンドリマー」とは、ギリシャ語の「ｄｅｎｄｒａ」（樹木）を語源とする規則正しく分岐した樹状高分子化合物の総称である。デンドリマーの形態としては、例えば、ダンベル型、ファン型、ボール型などが知られているが（図１を参照のこと）、本発明においては、ＡＩＥ効果を惹起する化合物と作用可能（即ち、ＡＩＥ効果を阻害することなく）に結合できる形態であればいずれの形態を使用することも可能であり、デンドリマーの形態の選択は、当業者であれば容易に行うことができる。本発明に使用されるデンドリマーは、微生物又は毒素と特異的に結合するものである。例えば、カルボシランデンドリマーのコア骨格に、微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖（式（Ｉ）中のＹに相当する）を結合させたデンドリマーなどを使用することができる。微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖としては、限定はしないが、例えば、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７が産生するベロ毒素と特異的に結合するグロボ３糖（Ｇｂ３、Ｇａｌα１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−）、インフルエンザウィルス等のウィルス表面に存在するヘマグルチニンと特異的に結合するシアリルラクトース、デング熱ウィルスのスパイク糖タンパク質と特異的に結合するラクトネオテトラオースなど、本発明で使用可能な糖鎖はこれまでに数多く同定されており、検出対象の微生物又は毒素に適した糖鎖を選択することは当業者であれば容易である。本発明で使用可能な糖鎖と該糖鎖が認識する微生物の組合せの一例を表１〜５に示す。
【００１５】
【表１】
0005605542.tif 000004
【表２】
0005605542.tif 000005
【表３】
0005605542.tif 000006
【表４】
0005605542.tif 000007
【表５】
0005605542.tif 000008
【００１６】
本発明の実施形態の１つは、Ｙ及びＸが異なる式（Ｉ）の化合物を２以上含んでなる微生物又は毒素を検出する試薬である。
【化３】
0005605542.tif 000009
［式中（Ｉ）中、Ｘは以下の置換基
【化４】
0005605542.tif 000010
（但し、Ｒは同一でも異なってもよいアリール基であり、Ｅ１はケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、ｎは１〜４の整数である）であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、Ｒ５は炭化水素基であり、Ｅ２は炭素、ケイ素又はゲルマニウムのいずれかであってＥ１と同一でも異なっていてもよく、Ｙは微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である］
本実施形態は、式（Ｉ）で示されるデンドリマーであって、式（Ｉ）中のＸの部分がＡＩＥ効果を発現するシロール基及びその誘導体であり、Ｙの部分には、種々のウィルス、微生物又は毒素に特異的に存在する物質と結合する糖鎖（表１〜表５を参照のこと）を担持した化合物を含む試薬である。
式（Ｉ）の化合物は、Ｙと特異的に結合する物質の非存在下においては、互いに凝集し合い、Ｒに特徴的な特定の波長の発光を行う。一方、Ｙが特異的に結合する物質の存在下においては、凝集状態が崩壊し、特定の波長の発光が消失する。本実施形態は、Ｙが特異的に結合する物質の存在（すなわち、Ｙが特異的に結合する物質を有するウィルス、微生物又は毒素の存在）を、ＡＩＥ効果の有無により確認するものである。すなわち、Ｘの置換基Ｒが異なれば、ＡＩＥ効果によって惹起される発光の波長も異なるため、検査対象の特異性を決定するＹごとに異なる発光を誘起するＸを使用すると、検査対象に特徴的なＡＩＥ効果の消失が確認される。従って、異なる色のＡＩＥを惹起する式（Ｉ）の化合物を複数使用すると、検査サンプル中にその検査対象が存在する式（Ｉ）の化合物からの発光が消失し、どの検査対象が存在しているのかを確認することが可能となる。例えば、ＡＩＥによる発光色が、青、緑、赤である式（Ｉ）の化合物が、各々、Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３の糖鎖を担持しているとする。これら３種類の式（Ｉ）の化合物を含む本発明の試薬の色は、当初白色（無色）であるが、例えば、Ｙ１と結合する微生物等の存在下では青色のみが消失し、無色から緑と赤の合成色（黄色）へと変化する。あるいは、同じ試薬を、Ｙ２と結合する微生物等の存在下では、赤色のみが消失し、無色から青と緑の合成色（シアン）に変化することになる。
以上のように、検査対象に特徴的な発光色を示す式（Ｉ）の化合物を複数含んでなる本発明の試薬は、複数の検査対象の存在を色の変化によって可視的に確認することを可能にするものである。
【００１７】
式（Ｉ）の化合物において、Ｅ１及びＥ２は、同一又は相異なるケイ素又はゲルマニウムのいずれかであり、特にケイ素が好ましい。また、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は酸素、窒素又はカルボニル基を含んでもよい同一又は異なった炭化水素鎖を示し、アミド結合を含んでもよく、例えば、炭素数１〜６の直鎖アルキル基、アルキレン基、アルケニレン基又はアルコキシレン基（オキシアルキレン基）などが好ましく、Ｒ５は炭化水素基を示し、メチル基などが好ましい。また、ｌ及びｍはｌ＋ｍ＝２を満たす整数である。
Ｒは、同一又は相異なるアリール基であり、好ましくは、３位及び４位がフェニル基であり、及び／又は、２位及び５位が同一のアリール基である。Ｒは、Ｘが誘起するＡＩＥの色を特徴付ける上で重要な役割を果たしており、発光波長が異なるようにＲを選択した複数の化合物（Ｉ）が含まれる本発明の試薬は、同一のサンプル中に存在する複数の検出対象を同定することが可能となる。Ｒは、異なるＹを担持する化合物（Ｉ）ごとに、例えば、クロロホルム中で測定したときの最大発光波長が、４３０ｎｍ〜４７０ｎｍ（例えば、Ｒが表６に示すグループａの置換基）、４７０ｎｍ〜４９０ｎｍ（例えば、Ｒが表６に示すグループｂの置換基）、４９０ｎｍ〜５１０ｎｍ（例えば、Ｒが表６に示すグループｃの置換基）、５１０ｎｍ〜５５０ｎｍ（例えば、Ｒが表６に示すグループｄの置換基）、５５０ｎｍ〜６１０ｎｍ（例えば、Ｒが表６に示すグループｅの置換基）のいずれかの波長領域に含まれる発光を誘起するように選択すると、最大で５種類の検査対象の存在を確認することが可能となる。あるいは、Ｒは、異なるＹを担持する化合物（Ｉ）ごとに、（ａ）Ｃ６Ｈ５、ｐ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、ｍ−ＦＣ６Ｈ４、ｍ−Ｆ３ＣＣ６Ｈ４、２−ピリジル、３−ピリジル、１−ナフチルからなる青色系の発光グループ、（ｂ）ｍ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４、ｐ−ＣＨ３Ｃ６Ｈ４からなるシアン系の発光グループ、（ｃ）ｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４、ビフェニル、２−チアゾールからなる緑系の発光グループ、（（ｄ）２−チエニル、ｐ−（ＮＯ２）Ｃ６Ｈ４、２−スチリル、ｐ−（（ＣＨ３）２Ｎ）Ｃ６Ｈ４からなる黄色系の発光グループ、（ｅ）ビチエニル、５−（２−ベンゾ[ｂ]チエニル）２−チエニルからなる赤色系の発光グループのいずれかに含まれる置換基を選択してもよい。
なお、ＡＩＥの発光色とＲとして選択される置換基との関係については、例えば、非特許文献８、非特許文献９などの公知の文献を参考にして当業者であれば容易に選択することができる。
【００１８】
【表６】
0005605542.tif 000011
【００１９】
Ｙは検出対象の微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であり、検出対象の微生物又は毒素に応じて選択するができ、かかる選択は当業者であれば容易に行うことができる。特に限定はしないが、例えば、式（Ｉ）で示される化合物は、Ｙが以下の式（ＩＩ）の糖鎖の場合、ベロ毒素を、式（ＩＩＩ）の糖鎖の場合、インフルエンザウィルスを、式（ＩＶ）の糖鎖の場合、デング熱ウィルスの検出に使用することができる。
【化５】
0005605542.tif 000012
【００２０】
また、検出対象がインフルエンザウィルスの場合、トリインフルエンザウィルスのヘマグルチニンが認識する糖鎖構造であるシアリルα（２→３）ラクトース（又はガラクトース）などを本発明の糖鎖として使用すればトリインフルエンザウィルスを特異的に検出することができ（例えば、ＷＯ０２／００２５８８を参照のこと）、ヒトインフルエンザウィルスのヘマグルチニンが認識する糖鎖構造であるシアリルα（２→６）ラクトース（又はガラクトース）などを本発明の糖鎖として使用すればヒトインフルエンザウィルスを特異的に検出することができる（例えば、特開２００８−３１１５６を参照のこと）。
【００２１】
式（Ｉ）中のＹは、１分子中の全てのＹの位置が微生物又は毒素と特異的に結合する糖鎖であることが望ましいが、必ずしも、全てのＹが上記置換基である必要はなく、例えば、水素、Ｃ＝Ｃ二重結合、水酸基などであってもよく、当該技術分野における通常の合成方法により、Ｙの位置に結合し得ると当業者が予測可能な如何なる置換基であってもよい。
なお、本明細書においては、「微生物」にはウィルスを含むものとする。また、「微生物等」には、微生物そのものの他、微生物上に存在する毒素などが含まれるものとする。
【００２２】
本発明で使用される式（Ｉ）で示される化合物として、例えば、以下に示す化合物（Ｉａ）（シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３）を使用することができる（合成方法の詳細については、例えば、非特許文献７などを参照のこと）。
【化６】
0005605542.tif 000013
【００２３】
本発明の試薬は、式（Ｉ）で示される化合物を複数含む他、当業者において微生物又は毒素の検出において必要と思われる物質、又は、当該検出に対し効果的に作用する物質など、他の添加物質を含んでもよい。このような添加物質としては、限定はしないが、例えば、界面活性剤、安定化剤、防腐剤、キレート剤などを使用することができる。また、本発明の検出試薬は、本発明の試薬を適当な溶媒、例えば、水溶液、有機溶媒等に溶解させた状態で提供することもできる。適切な溶媒は、当業者において容易に選択可能である。
【００２４】
本発明の試薬は、適当な容器又はパック中に使用説明書と共に含めてキットとして提供することもできる。本発明の試薬がキットとして供給される場合、活性構成成分の機能低下を回避するなどの必要に応じて、各構成成分を別々に包装してもよい。キット中に含まれる試薬を収納する容器は、構成成分を吸着せず、また、構成成分の活性が長期間有効に持続するような材質のものが好ましい。また、キットに使用説明書が添付される場合、その使用説明は、紙又は他の材質上に印刷されて供給されてもよく、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。あるいは、キットの製造者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、上述の本発明の試薬又はキットを使用した、微生物又は毒素の検出方法である。
本発明の式（Ｉ）の化合物によるＡＩＥ効果の発現は、該化合物の構造に適した溶媒環境において、発光強度が異なってくる。従って、使用する式（Ｉ）の化合物のＡＩＥ効果に適した溶媒環境において検出を実施することが望ましい。このような、検出環境に最も適する溶媒環境の選択は、当業者において通常の試行錯誤の範囲内の予備実験等で容易に設定することができる。例えば、本発明の式（Ｉ）の化合物が式（Ｉａ）で示される化合物の場合、測定を行う溶媒中の有機溶媒に対する水の比率が約２０％以下又は約７０％以上になると、発光効率が上昇する（図２を参照のこと）。よって、式（Ｉａ）の化合物の発光効率は、例えば、有機溶媒中（例えば、アセトンなど）あるいは水中において発光効率が最大になる。また、測定に使用される測定環境は、検出対象の微生物又は毒素の安定性も考慮して、塩濃度、ｐＨなど至適な条件を選択することが望ましく、かかる選択は当業者にとって容易に行うことができる。また、検出対象物によっては、試薬に含まれる化合物（Ｉ）同士が凝集して沈殿などが生じる場合もあるが、このような場合には、試薬等を超音波処理、高速撹拌、遠心分離など行うことで、沈殿の解消又は除去が可能である。
また、ＡＩＥ効果は、式（Ｉ）の化合物に紫外線を照射することによる発光として可視的に検出することができる。紫外線の照射はＵＶランプなど通常利用可能な線源を利用して容易に行うことができる。
【００２６】
式（Ｉａ）の化合物は、適当な測定溶媒（例えば、水）中において紫外線を照射すると強く青色発光を発する。この状態に、検出対象微生物又は毒素、例えば、ベロ毒素を添加すると、式（Ｉａ）の化合物とベロ毒素が結合することによって、式（Ｉａ）の化合物の凝集が崩壊することでＡＩＥ効果が阻害され、青色発光が消失する。これに対し、ベロ毒素以外の式（Ｉａ）の化合物に担持される糖鎖とは結合しない微生物又は毒素を添加した場合には、ＡＩＥ効果の阻害は起こらず、青色発光には影響を与えない。従って、式（Ｉａ）に示す化合物を本発明の検出化合物として使用する場合には、検出対象であるベロ毒素を検出環境中に添加した場合にのみ、青色発光が消失するため、ベロ毒素の存在を確認することができる。
以上のことは、式（Ｉａ）以外の式（Ｉ）の化合物を用いた場合にも同様に起こる現象であることから、ベロ毒素以外の微生物又は毒素が検出対象である場合、該検出対象に特異的に結合する糖鎖を担持した本発明の化合物を使用すれば、ベロ毒素以外の微生物又は毒素を容易に検出することができる。
本発明の化合物による発光強度は、検出対象の微生物又は毒素の量に依存して変動するため、検出対象微生物又は毒素を定量的に測定することも可能である。
【００２７】
以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００２８】
１．シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３（化合物（Ｉａ））の合成
本発明の化合物の１例であるシロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３の合成を下記のスキームに示す。
【化７】
0005605542.tif 000014
Ｊ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔ．Ｃｈｅｍ．，１９９０、３９１：２７を参考に、１、１−ジクロロー２、３、４、５−テトラフェニルシロールをジフェニルアセチレン（もしくはトラン）のリチウムの還元、それによるテトラクロロシランとの環化反応により合成した。その後のカルボシランデンドリマーの世代拡張反応、末端官能基化反応、糖鎖導入反応はいずれも特許文献１と全て同じ反応条件により合成することができる。
このように合成したシロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３がＡＩＥ効果を示すことを確認した。
【００２９】
２．シロール−ダンベル（１）６−Ｇｂ３（化合物（Ｉａ））とベロ毒素のＳｔｘ１及びＳｔｘ２との接着能
ベロ毒素にはＳｔｘ１とＳｔｘ２の２種類の毒素があり、それぞれに対し結合親和性の測定を２種類（ＫＤ及びＲＵｍａｘ）ずつ行なった。いずれも、それらの値が小さいほどベロ毒素に対する接着能が高いことを示している。これによると、シロールダンベル（１）６−Ｇｂ３の値は、ダンベル（１）６−Ｇｂ３やボール（１）１２−Ｇｂ３のそれに比べるとやや大きな数値（ＫＤ値で一桁）を示すが、ファン（０）３−Ｇｂ３より遥かに低い値を示した。このことから、シロールダンベル（１）６−Ｇｂ３はベロ毒素に対する接着能を有していることが分かる。
【表７】
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【実施例２】
【００３０】
本実施例は、発光色が異なる式（Ｉ）の化合物の混合物を検出試薬として使用した場合、これら化合物の１つと特異的に結合する検査対象の検出を行った１例を示すものである。
本実施例において、植物由来のレクチンであるＷＧＡとＰＮＡを、各々、認識する２種類の式（Ｉ）の化合物からなる試薬を用いて、ＰＮＡが特異的に検出されるかどうかを検討した。ＰＮＡと特異的に結合する糖鎖であるラクトース（Ｌａｃ）を担持した式（Ｉ）の化合物（シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃ）は、Ｘの２位及び５位にフェニル基を有し、ＡＩＥにより青色の発光を呈する。一方、ＷＧＡと特異的に結合する糖鎖であるラクトリアオース（Ｌｃ３）を担持した式（Ｉ）の化合物（アニシル−シロール−ダンベル（１）６−Ｌｃ３）は、Ｘの２位及び５位にｐ−ＣＨ３ＯＣ６Ｈ４を有し、ＡＩＥにより緑色の発光を呈する。これら２種類の化合物を混合した試薬は、シアン系の色の発光を呈する（図４）。
【００３１】
１．シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃの合成
シロール−ダンベル（１）６−Ｌａｃは、以下に示すスキームのように合成を行った。
【化８】
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【００３２】
２．アニシル−シロール−ダンベル（１）６−Ｌｃ３の合成
アニシル−シロール−ダンベル（１）６−Ｌｃ３は、以下に示すスキームのように合成を行った。
【化９】
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【００３３】
３．２種の式（Ｉ）の化合物を使用した、色調変化による検出対象の同定
まず、シロール−ダンベル（１）６−ＬａｃのＰＢＳバッファー溶液（０．３５μＭ）とアニシルシロールダンベル（１）６−Ｌｃ３のＰＢＳバッファー溶液（０．３５μＭ）を同量混合した。この混合液は、シロールの青色発光（ＰＢＳ中での最大発光波長；４７６ｎｍ、励起波長；３６０ｎｍ）とアニシルシロールからの緑色発光（ＰＢＳ中での最大発光波長；４９４ｎｍ、励起波長；３８２ｎｍ）が合成されたシアン色（ＰＢＳ中での最大発光波長；４８６ｎｍ、励起波長；３７８ｎｍ）を呈していた（図４参照）。この混合液（３ｍｌ）にＷＧＡのＰＢＳバッファー溶液（１０μＭ）（１０μｌ）を滴下し、５℃で３０分静置した後、１０分間超音波照射を行った。再び、５℃で３０分静置後、孔径０．１μｍのフィルターでろ過して、ろ液を５℃で蛍光高度計（ＰＬ）で測定した。以下、滴下総量が５０μｌになるまでＷＧＡ溶液を１０μｌづつ混合液に滴下し、滴下する毎に同様の処理をして、ＰＬ測定を行った。励起波長３７８ｎｍにおける発光波長の変化を図３に示す。
アニシル−シロール−ダンベル（１）６−Ｌｃ３が、ＷＧＡと結合することにより、アニシル−シロールによるＡＩＥ効果が消失し、発光波長が４８６ｎｍから４７６ｎｍへと変化することが確認された。また、色調もＷＧＡ溶液を滴下するごとにシアン色から青色へと変化した。（図４）
以上、発光色（発光波長）の異なる式（Ｉ）の化合物を複数組み合わせて使用すると、発光色の色調の変化から、検出対象の存在を確認できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明は、複数の微生物及び／又は毒素の検出を迅速かつ簡便に行うことを可能ならしめるものであり、微生物等の検出技術の向上に貢献するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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