(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
記憶部と制御部とを備えたリボ核酸同定装置であって、
上記記憶部は、
残基配列特異的な切断方法で切断されたリボ核酸に対するタンデム質量分析データから抽出されたスペクトルのピークを記憶するピーク記憶手段と、
核酸エントリー毎に核酸配列を記憶する核酸配列記憶手段と、
上記残基配列特異的な切断方法に対応する断片化規則を記憶する断片化規則記憶手段と、
を備え、
上記制御部は、
上記ピークから実測断片分子量を抽出する実測断片分子量抽出手段と、
上記断片化規則を参照して、上記核酸配列を断片化する断片化手段と、
上記断片化手段で断片化した結果得られた上記核酸配列の断片配列について計算断片分子量を算出する計算断片分子量算出手段と、
上記計算断片分子量と上記実測断片分子量とを比較することにより、上記実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出する候補計算断片分子量抽出手段と、
上記候補計算断片分子量に対応する上記断片配列である候補断片配列を、上記断片配列から抽出する候補断片配列抽出手段と、
上記断片配列について、リボース−３’Ｏ結合間とＰ−５’Ｏ結合間に開裂部位を有するとする開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出する計算プロダクトイオン質量算出手段と、
上記ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出する実測プロダクトイオン質量抽出手段と、
上記計算プロダクトイオン質量と上記実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、上記候補断片配列にスコアを付けるスコア付け手段と、
上記スコアに基づいて、上記候補断片配列から、上記リボ核酸の上記断片配列を同定する候補配列同定手段と、
検索対象として予め指定した部分集合内での上記核酸配列の上記断片配列の出現確率を算出する出現確率算出手段と、
上記出現確率に基づいて、上記候補配列同定手段で同定した上記断片配列と上記核酸配列とを比較することにより、上記核酸エントリーにマッピングスコアを付けるエントリースコア付け手段と、
上記マッピングスコアに基づいて、最も確からしい上記核酸エントリーを同定するエントリー同定手段と、
を備えたことを特徴とするリボ核酸同定装置。
【請求項２】
上記記憶部は、
上記リボ核酸の修飾規則を記憶する修飾規則記憶手段
を更に備え、
上記制御部は、
上記修飾規則を参照して、上記断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行う修飾変換手段
を更に備えたことを特徴とする請求項１に記載のリボ核酸同定装置。
【請求項３】
制御部と記憶部とを備えたリボ核酸同定装置において実行されるリボ核酸同定方法であって、
上記記憶部は、
残基配列特異的な切断方法で切断されたリボ核酸に対するタンデム質量分析データから抽出されたスペクトルのピークを記憶するピーク記憶手段と、
核酸エントリー毎に核酸配列を記憶する核酸配列記憶手段と、
上記残基配列特異的な切断方法に対応する断片化規則を記憶する断片化規則記憶手段と、
を備え、
上記制御部において実行される、
上記ピークから実測断片分子量を抽出する実測断片分子量抽出ステップと、
上記断片化規則を参照して、上記核酸配列を断片化する断片化ステップと、
上記断片化ステップで断片化した結果得られた上記核酸配列の断片配列について計算断片分子量を算出する計算断片分子量算出ステップと、
上記計算断片分子量と上記実測断片分子量とを比較することにより、上記実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出する候補計算断片分子量抽出ステップと、
上記候補計算断片分子量に対応する上記断片配列である候補断片配列を、上記断片配列から抽出する候補断片配列抽出ステップと、
上記断片配列について、リボース−３’Ｏ結合間とＰ−５’Ｏ結合間に開裂部位を有するとする開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出する計算プロダクトイオン質量算出ステップと、
上記ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出する実測プロダクトイオン質量抽出ステップと、
上記計算プロダクトイオン質量と上記実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、上記候補断片配列にスコアを付けるスコア付けステップと、
上記スコアに基づいて、上記候補断片配列から、上記リボ核酸の上記断片配列を同定する候補配列同定ステップと、
検索対象として予め指定した部分集合内での上記核酸配列の上記断片配列の出現確率を算出する出現確率算出ステップと、
上記出現確率に基づいて、上記候補配列同定ステップで同定した上記断片配列と上記核酸配列とを比較することにより、上記核酸エントリーにマッピングスコアを付けるエントリースコア付けステップと、
上記マッピングスコアに基づいて、最も確からしい上記核酸エントリーを同定するエントリー同定ステップと、
を含むことを特徴とするリボ核酸同定方法。
【請求項４】
上記記憶部は、
上記リボ核酸の修飾規則を記憶する修飾規則記憶手段
を更に備え、
上記制御部において実行される、
上記修飾規則を参照して、上記断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行う
修飾変換ステップ
を更に含むことを特徴とする請求項３に記載のリボ核酸同定方法。
【請求項５】
制御部と記憶部とを備えたリボ核酸同定装置において実行させるためのプログラムであって、
上記記憶部は、
残基配列特異的な切断方法で切断されたリボ核酸に対するタンデム質量分析データから抽出されたスペクトルのピークを記憶するピーク記憶手段と、
核酸エントリー毎に核酸配列を記憶する核酸配列記憶手段と、
上記残基配列特異的な切断方法に対応する断片化規則を記憶する断片化規則記憶手段と、
を備え、
上記制御部において実行させるための、
上記ピークから実測断片分子量を抽出する実測断片分子量抽出ステップと、
上記断片化規則を参照して、上記核酸配列を断片化する断片化ステップと、
上記断片化ステップで断片化した結果得られた上記核酸配列の断片配列について計算断片分子量を算出する計算断片分子量算出ステップと、
上記計算断片分子量と上記実測断片分子量とを比較することにより、上記実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出する候補計算断片分子量抽出ステップと、
上記候補計算断片分子量に対応する上記断片配列である候補断片配列を、上記断片配列から抽出する候補断片配列抽出ステップと、
上記断片配列について、リボース−３’Ｏ結合間とＰ−５’Ｏ結合間に開裂部位を有するとする開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出する計算プロダクトイオン質量算出ステップと、
上記ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出する実測プロダクトイオン質量抽出ステップと、
上記計算プロダクトイオン質量と上記実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、上記候補断片配列にスコアを付けるスコア付けステップと、
上記スコアに基づいて、上記候補断片配列から、上記リボ核酸の上記断片配列を同定する候補配列同定ステップと、
検索対象として予め指定した部分集合内での上記核酸配列の上記断片配列の出現確率を算出する出現確率算出ステップと、
上記出現確率に基づいて、上記候補配列同定ステップで同定した上記断片配列と上記核酸配列とを比較することにより、上記核酸エントリーにマッピングスコアを付けるエントリースコア付けステップと、
上記マッピングスコアに基づいて、最も確からしい上記核酸エントリーを同定するエントリー同定ステップと、
を含むことを特徴とするプログラム。
【請求項６】
上記記憶部は、
上記リボ核酸の修飾規則を記憶する修飾規則記憶手段
を更に備え、
上記制御部において実行させるための、
上記修飾規則を参照して、上記断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行う修飾変換ステップ
を更に含むことを特徴とする請求項５に記載のプログラム。
【請求項７】
制御部と記憶部と入力部と出力部とを備えたクライアント装置と、制御部と記憶部とを備えたサーバ装置と、から構成されるリボ核酸同定システムであって、
上記クライアント装置の上記制御部は、
残基配列特異的な切断方法で切断されたリボ核酸に対するタンデム質量分析データから抽出されたスペクトルのピークを取得し、取得した上記ピークを上記クライアント装置の上記記憶部に格納すると共に上記サーバ装置へ送信するピーク取得手段と、
上記入力部を介して入力された、上記残基配列特異的な切断方法を少なくとも指定する検索条件を、上記クライアント装置の上記記憶部に格納すると共に上記サーバ装置へ送信する検索条件入力手段と、
上記サーバ装置で同定され上記サーバ装置から送信された上記リボ核酸の断片配列を、上記出力部を介して出力する結果出力手段と、
を備え、
上記サーバ装置の上記記憶部は、
核酸エントリー毎に核酸配列を記憶する核酸配列記憶手段と、
上記残基配列特異的な切断方法に対応する断片化規則を記憶する断片化規則記憶手段と、
を備え、
上記サーバ装置の上記制御部は、
上記ピークから実測断片分子量を抽出する実測断片分子量抽出手段と、
上記断片化規則を参照して、上記検索条件に基づいて、上記核酸配列を断片化する断片化手段と、
上記断片化手段で断片化した結果得られた上記核酸配列の上記断片配列について計算断片分子量を算出する計算断片分子量算出手段と、
上記計算断片分子量と上記実測断片分子量とを比較することにより、上記実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出する候補計算断片分子量抽出手段と、
上記候補計算断片分子量に対応する上記断片配列である候補断片配列を、上記断片配列から抽出する候補断片配列抽出手段と、
上記断片配列について、リボース−３’Ｏ結合間とＰ−５’Ｏ結合間に開裂部位を有するとする開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出する計算プロダクトイオン質量算出手段と、
上記ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出する実測プロダクトイオン質量抽出手段と、
上記計算プロダクトイオン質量と上記実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、上記候補断片配列にスコアを付けるスコア付け手段と、
上記スコアに基づいて、上記候補断片配列から、上記リボ核酸の上記断片配列を同定する候補配列同定手段と、
上記候補配列同定手段で同定した上記断片配列を上記クライアント装置へ送信する結果送信手段と、
検索対象として予め指定した部分集合内での上記核酸配列の上記断片配列の出現確率を算出する出現確率算出手段と、
上記出現確率に基づいて、上記候補配列同定手段で同定した上記断片配列と上記核酸配列とを比較することにより、上記核酸エントリーにマッピングスコアを付けるエントリースコア付け手段と、
上記マッピングスコアに基づいて、最も確からしい上記核酸エントリーを同定するエントリー同定手段と、
を備えたことを特徴とするリボ核酸同定システム。
【請求項８】
上記サーバ装置の上記記憶部は、
上記リボ核酸の修飾規則を記憶する修飾規則記憶手段
を更に備え、
上記サーバ装置の上記制御部は、
上記修飾規則を参照して、上記断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行う修飾変換手段
を更に備えたことを特徴とする請求項７に記載のリボ核酸同定システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リボ核酸同定装置、リボ核酸同定方法、プログラムおよびリボ核酸同定システムに関し、特に、リボ核酸（以下、ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄの略称であるＲＮＡと記す場合がある。）の質量データ（特に、開裂により生じるプロダクトイオン質量情報）を用いて配列データベースを検索しＲＮＡを同定するリボ核酸同定装置、リボ核酸同定方法、プログラムおよびリボ核酸同定システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、質量分析によるタンパク質の同定方法が開発されている。【０００３】
例えば、分子量セットを用いる方法（ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ）、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）データを用いて配列データベースを検索する方法（ＭＳ／ＭＳイオン検索）、および、ＭＳ／ＭＳスペクトル情報のみから部分配列情報を得る方法（ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が多数開発されており、そのうちのいくつかは市販プログラムとして利用できるようになっている（非特許文献２〜６、８）。【０００４】
また、近年、タンパク質をコードしないＲＮＡ（非コードＲＮＡ）の機能に注目が集まっており、質量分析によるＲＮＡの同定方法が開発されてきている。【０００５】
例えば、比較的単純なＲＮＡ混合物から、あるＲＮＡの消化物に特有なシグニチャー質量を用いてその存在を確認する方法（非特許文献１）が報告されている。【０００６】
また、例えば、核酸についてもｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（非特許文献７）が報告されている。【０００７】
また、例えば、ＲＮＡ分子量を用いてゲノム上でＲＮＡ配列を同定する装置および方法（特許文献１）が報告されている。【０００８】
ここで、タンパク質の質量分析において、タンパク質を構成するアミノ酸残基は、ペプチド結合部分と側鎖部分とに分けられる。このうち、アミノ酸残基の種類や修飾により質量変化が起きるのは側鎖部分であり、ペプチド結合部分には通常質量変化は起こらない。【０００９】
これに対して、ＲＮＡ／ＤＮＡでは、構成ヌクレオチド残基はリン残基、リボース（または、デオキシリボース）、塩基の三つの部分から構成されており、修飾様式という観点からは、タンパク質より化学構造が複雑である。これらのうち、リボース、塩基の双方に修飾による質量変化が起こりうる。また、この構造を反映してＭＳ／ＭＳスペクトルの開裂パターンも複雑化しやすい傾向にある。また、核酸の間でもＲＮＡとＤＮＡは、開裂パターンが異なっており、ＲＮＡ／ＤＮＡの質量分析をもちいた同定法においては、それぞれの開裂経路に応じた得点配分が必要となる。【００１０】
そのため、従来の質量分析によるタンパク質の同定方法（非特許文献２〜６の技術）では、タンパク質に特化しているため、ＲＮＡには適用できなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００８−２１２６０号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｈｏｓｓａｉｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌｉｍｂａｃｈ，Ｐ．  “Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＲＮＡｓ  ｂｙ  ｔｈｅｉｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．”  ２００７，  ＲＮＡ，  １３，１−９．
【非特許文献２】Ｐｅｒｋｉｎｓ  ＤＮ，Ｐａｐｐｉｎ  ＤＪ，Ｃｒｅａｓｙ  ＤＭ，Ｃｏｔｔｒｅｌｌ  ＪＳ．  “Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｄａｔａ．”  １９９９，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  ２０，３５５１−３５６７．
【非特許文献３】Ｙａｔｅｓ  ＪＲ，Ｅｎｇ  Ｊｋ，  ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  ＡＬ，Ｓｃｈｉｅｌｔｚ  Ｄ．  “Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ．”  １９９５，  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ６７，１４２６−１４３６．
【非特許文献４】Ｚｈａｎｇ，Ｗ．ａｎｄ  Ｃｈａｉｔ，Ｂ．  “ＰｒｏＦｏｕｎｄ：  Ａｎ  ｅｘｐｅｒｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”  ２０００，  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ７２，２４８２−２４８９．
【非特許文献５】Ｇｅｅｒ  ＬＹ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｏｐｅｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｙ  Ｓｅａｒｃｈ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ”  ２００４，  Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ３，９５８−９６４．
【非特許文献６】Ｓａｄｙｇｏｖ  ＲＧ，Ｃｏｃｉｏｒｖａ  Ｄ，Ｙａｔｅｓ  ＪＲ．  “Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ：  ｌｏｏｋｉｎｇ  ｕｐ  ｔｈｅ  ａｎｓｗｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂａｃｋ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｏｋ”  ２００４，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  １，１９５−２０２．
【非特許文献７】Ｏｂｅｒａｃｈｅｒ  Ｈ，  Ｍａｙｒ  ＢＭ，  Ｈｕｂｅｒ  ＣＧ．Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｂｙ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  ２００４  Ｊａｎ；１５（１）：３２−４２．
【非特許文献８】Ｓｉｅｇｅｌ  ＭＭ，  Ｂａｕｍａｎ  Ｎ．Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆａｓｔ  ａｔｏｍ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．  １９８８  Ｍａｒ  １５；１５（６）：３３３−４３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、従来の質量分析によるＲＮＡ同定方法では、混合物試料中の個々の成分を同定することができず、同定の特異性や信頼性が低く、転写後修飾の部位を同定出来ないという問題点があった。【００１４】
例えば、特許文献１の技術は、単一の消化オリゴヌクレオチドの分子量では、原理的に単一の配列を特定できないため、単一のＲＮＡを酵素消化して生じる複数の分子量セットを用いてデータベース検索を行っている。このため、試料中に複数のＲＮＡが混在する場合には、有効に適用することができなかった。また、ｍｉＲＮＡ等の２０数残基程度の短い分子からは酵素消化断片が数本程度しか得られない場合もあり、これらの分子量情報からのみでは、分子を同定できない可能性があり、同定の信頼性が低いという問題点があった。【００１５】
また、非特許文献１の技術は、可能性のあるＲＮＡのリストが小規模である場合のみという限られた条件下で、比較的単純なＲＮＡ混合物からＲＮＡの存在を確認できるものであり、一般的なＲＮＡの同定方法とは呼べなかった。【００１６】
また、非特許文献７の技術は、データベース検索する方法と比較して高い計算力を必要とする。非特許文献７では転写後修飾の解析については言及されていないが、特に、非コードＲＮＡでしばしば検出される転写後修飾を考慮する場合には必要な計算力が指数的に増加する。【００１７】
また、近年、ゲノムシークエンシング技術が飛躍的に加速しているため、近い将来、データベース上に分析対象となる全ての配列が存在する可能性が高く、今後は、この非特許文献７の技術のように、データベース検索なしにスペクトル解析を行う必要性は減少していくと考えられる。質量分析データをもちいてタンパク質・核酸を同定するための方法の位置づけについて図１にまとめた。【００１８】
本発明は、上記に鑑みてなされたもので、核酸残基組成しか与えない消化物分子量だけでなく、ＭＳ／ＭＳで生成する配列を含む内部構造情報を与えるプロダクトイオン質量のセットから核酸残基配列情報を得ることにより、個々の消化物の同定信頼性を飛躍的に高めることができるリボ核酸同定装置、リボ核酸同定方法、プログラムおよびリボ核酸同定システムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明においてリボ核酸を同定する目的を達成するため、本発明のリボ核酸同定装置は、記憶部と制御部とを備えたリボ核酸同定装置であって、上記記憶部は、残基配列特異的な切断方法で切断されたリボ核酸に対するタンデム質量分析データから抽出されたスペクトルのピークを記憶するピーク記憶手段と、核酸エントリー毎に核酸配列を記憶する核酸配列記憶手段と、上記残基配列特異的な切断方法に対応する断片化規則を記憶する断片化規則記憶手段と、を備え、上記制御部は、上記ピークから実測断片分子量を抽出する実測断片分子量抽出手段と、上記断片化規則を参照して、上記核酸配列を断片化する断片化手段と、上記断片化手段で断片化した結果得られた上記核酸配列の断片配列について計算断片分子量を算出する計算断片分子量算出手段と、上記計算断片分子量と上記実測断片分子量とを比較することにより、上記実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出する候補計算断片分子量抽出手段と、上記候補計算断片分子量に対応する上記断片配列である候補断片配列を、上記断片配列から抽出する候補断片配列抽出手段と、上記断片配列について、リボース−３’Ｏ結合間とＰ−５’Ｏ結合間に開裂部位を有するとする開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出する計算プロダクトイオン質量算出手段と、上記ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出する実測プロダクトイオン質量抽出手段と、上記計算プロダクトイオン質量と上記実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、上記候補断片配列にスコアを付けるスコア付け手段と、上記スコアに基づいて、上記候補断片配列から、上記リボ核酸の上記断片配列を同定する候補配列同定手段と、検索対象として予め指定した部分集合内での上記核酸配列の上記断片配列の出現確率を算出する出現確率算出手段と、上記出現確率に基づいて、上記候補配列同定手段で同定した上記断片配列と上記核酸配列とを比較することにより、上記核酸エントリーにマッピングスコアを付けるエントリースコア付け手段と、上記マッピングスコアに基づいて、最も確からしい上記核酸エントリーを同定するエントリー同定手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２１】
また、本発明のリボ核酸同定装置は、上記記載のリボ核酸同定装置において、上記記憶部は、上記リボ核酸の修飾規則を記憶する修飾規則記憶手段を更に備え、上記制御部は、上記修飾規則を参照して、上記断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行う修飾変換手段を更に備えたことを特徴とする。【００２２】
また、本発明のリボ核酸同定方法は、制御部と記憶部とを備えたリボ核酸同定装置において実行されるリボ核酸同定方法であって、上記記憶部は、残基配列特異的な切断方法で切断されたリボ核酸に対するタンデム質量分析データから抽出されたスペクトルのピークを記憶するピーク記憶手段と、核酸エントリー毎に核酸配列を記憶する核酸配列記憶手段と、上記残基配列特異的な切断方法に対応する断片化規則を記憶する断片化規則記憶手段と、を備え、上記制御部において実行される、上記ピークから実測断片分子量を抽出する実測断片分子量抽出ステップと、上記断片化規則を参照して、上記核酸配列を断片化する断片化ステップと、上記断片化ステップで断片化した結果得られた上記核酸配列の断片配列について計算断片分子量を算出する計算断片分子量算出ステップと、上記計算断片分子量と上記実測断片分子量とを比較することにより、上記実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出する候補計算断片分子量抽出ステップと、上記候補計算断片分子量に対応する上記断片配列である候補断片配列を、上記断片配列から抽出する候補断片配列抽出ステップと、上記断片配列について、リボース−３’Ｏ結合間とＰ−５’Ｏ結合間に開裂部位を有するとする開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出する計算プロダクトイオン質量算出ステップと、上記ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出する実測プロダクトイオン質量抽出ステップと、上記計算プロダクトイオン質量と上記実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、上記候補断片配列にスコアを付けるスコア付けステップと、上記スコアに基づいて、上記候補断片配列から、上記リボ核酸の上記断片配列を同定する候補配列同定ステップと、検索対象として予め指定した部分集合内での上記核酸配列の上記断片配列の出現確率を算出する出現確率算出ステップと、上記出現確率に基づいて、上記候補配列同定ステップで同定した上記断片配列と上記核酸配列とを比較することにより、上記核酸エントリーにマッピングスコアを付けるエントリースコア付けステップと、上記マッピングスコアに基づいて、最も確からしい上記核酸エントリーを同定するエントリー同定ステップと、を含むことを特徴とする。
【００２４】
また、本発明のリボ核酸同定方法は、上記記載のリボ核酸同定方法において、上記記憶部は、上記リボ核酸の修飾規則を記憶する修飾規則記憶手段を更に備え、上記制御部において実行される、上記修飾規則を参照して、上記断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行う修飾変換ステップを更に含むことを特徴とする。【００２５】
また、本発明のプログラムは、制御部と記憶部とを備えたリボ核酸同定装置において実行させるためのプログラムであって、上記記憶部は、残基配列特異的な切断方法で切断されたリボ核酸に対するタンデム質量分析データから抽出されたスペクトルのピークを記憶するピーク記憶手段と、核酸エントリー毎に核酸配列を記憶する核酸配列記憶手段と、上記残基配列特異的な切断方法に対応する断片化規則を記憶する断片化規則記憶手段と、を備え、上記制御部において実行させるための、上記ピークから実測断片分子量を抽出する実測断片分子量抽出ステップと、上記断片化規則を参照して、上記核酸配列を断片化する断片化ステップと、上記断片化ステップで断片化した結果得られた上記核酸配列の断片配列について計算断片分子量を算出する計算断片分子量算出ステップと、上記計算断片分子量と上記実測断片分子量とを比較することにより、上記実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出する候補計算断片分子量抽出ステップと、上記候補計算断片分子量に対応する上記断片配列である候補断片配列を、上記断片配列から抽出する候補断片配列抽出ステップと、上記断片配列について、リボース−３’Ｏ結合間とＰ−５’Ｏ結合間に開裂部位を有するとする開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出する計算プロダクトイオン質量算出ステップと、上記ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出する実測プロダクトイオン質量抽出ステップと、上記計算プロダクトイオン質量と上記実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、上記候補断片配列にスコアを付けるスコア付けステップと、上記スコアに基づいて、上記候補断片配列から、上記リボ核酸の上記断片配列を同定する候補配列同定ステップと、検索対象として予め指定した部分集合内での上記核酸配列の上記断片配列の出現確率を算出する出現確率算出ステップと、上記出現確率に基づいて、上記候補配列同定ステップで同定した上記断片配列と上記核酸配列とを比較することにより、上記核酸エントリーにマッピングスコアを付けるエントリースコア付けステップと、上記マッピングスコアに基づいて、最も確からしい上記核酸エントリーを同定するエントリー同定ステップと、を含むことを特徴とする。
【００２７】
また、本発明のプログラムは、上記記載のプログラムにおいて、上記記憶部は、上記リボ核酸の修飾規則を記憶する修飾規則記憶手段を更に備え、上記制御部において実行させるための、上記修飾規則を参照して、上記断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行う修飾変換ステップを更に含むことを特徴とする。【００２８】
また、本発明は記録媒体に関するものであり、上記記載のプログラムを記録したことを特徴とする。【００２９】
この記録媒体によれば、当該記録媒体に記録されたプログラムをコンピュータに読み取らせて実行することによって、上記記載のプログラムを、コンピュータを利用して実現することができ、これら各方法と同様の効果を得ることができる。【００３０】
このように、本発明のリボ核酸同定装置、リボ核酸同定方法、プログラムおよびリボ核酸同定システムは、ＲＮＡ残基配列特異的な切断方法により生じた断片のＭＳ／ＭＳにより得られる、各断片の分子量および内部構造情報を表すプロダクトイオン質量セットを用いて核酸配列データベースを検索し、候補配列に得点を与え、最も高い得点を得た候補配列のうち得点が閾値を越えたものを同定配列とし、得られた同定配列を用いてゲノム配列を含む核酸配列データベースにマッピングすることを特徴とする。ここで、「ＲＮＡ残基配列特異的な切断方法」とは、例えば、ヌクレアーゼによる酵素的な切断方法や、化学的な切断方法（文献「Ｐｅａｔｔｉｅ  ＤＡ．Ｄｉｒｅｃｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＲＮＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９７９  Ａｐｒ；７６（４）：１７６０−４．」を参照）などを含むものである。本明細書では、「ＲＮＡ」を、ＤＮＡの塩基配列を転写した情報伝達媒体として扱う場合には、ＤＮＡ同様、塩基配列で定義（規定）する。また、ＲＮＡ断片化酵素（リボヌクレアーゼ）の基質特異性は、塩基やリボース部分に修飾を含むＲＮＡを質量分析で扱う場合、また、塩基の種類だけでなく塩基部分およびリボース部分のメチル化などの修飾にも影響を受けることや、ＲＮＡ創薬では塩基、リボース、リン酸部それぞれに官能基を導入した合成ＲＮＡなどを扱う可能性があることから、塩基配列だけで規定（表現）することはできないので、本明細書では、「ＲＮＡ」を、生体分子（物（モノ））として扱う場合（塩基配列だけで規定（表現）することができない場合）には、モノヌクレオチド単位が重合した生体分子として定義（表現）し、当該ヌクレオチド単位を「残基」と定義する。なお、リン酸は、ヌクレオシドの５’末端または３’末端のどちらに含まれていても（付加しても）よい。具体的には、ポリヌクレオチドの３’末端処理において３’末端の残基がリン酸の修飾を受けていると解釈したり、また５’末端処理において５’末端の残基がリン酸の修飾を受けていると解釈したりすることで、質量計算の辻褄を合わせてもよい。
【発明の効果】
【００３１】
本発明によれば、（１）スペクトルのピークから実測断片分子量を抽出し、（２）断片化規則を参照して、核酸配列を断片化し、（３）断片化した結果得られた核酸配列の断片配列について計算断片分子量を算出し、（４）計算断片分子量と実測断片分子量とを比較することにより、実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出し、（５）候補計算断片分子量に対応する断片配列である候補断片配列を、断片配列から抽出し、（６）断片配列について、所定の開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出し、（７）ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出し、（８）計算プロダクトイオン質量と実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、候補断片配列にスコアを付け、（９）スコアに基づいて、候補断片配列から、ＲＮＡの断片配列を同定する。【００３２】
これにより、核酸残基組成しか与えない消化物分子量だけでなくプロダクトイオン質量のセットから核酸残基配列情報を得ることにより、個々の消化物の同定信頼性を飛躍的に高めることができるという効果を奏する。【００３３】
また、本発明によれば、検索対象核酸配列データベース（検索対象として予め指定した部分集合）内での核酸配列の断片配列の出現確率を算出し、出現確率に基づいて、ＲＮＡの断片配列（同定断片配列）と核酸配列とを比較することにより、核酸エントリーにマッピングスコアを付け、付けたマッピングスコアに基づいて、最も確からしい核酸エントリーを同定する。【００３４】
これにより、同定配列セットのデータベースへのマッピングを定量的に評価できるという効果を奏する。【００３５】
また、本発明によれば、修飾規則を参照して、断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行う。そして、修飾を含まない配列データベースに対して、試料に含まれるＲＮＡ中の転写後修飾の存在を検出しさらには修飾部位を特定する。【００３６】
これにより、修飾を含む試料にも本発明を適用することができるという効果を奏する。【００３７】
そして、本発明によれば、上記した効果が得られる結果、混合物にも本発明を適用することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、質量分析の各種解析手法（ｍａｓｓ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ＭＳ／ＭＳ  ｉｏｎ  ｓｅａｒｃｈ，ｄｅｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）における性質の違いや、タンパク質とＲＮＡを対象試料とする場合の従来技術の有無について、まとめた図表である。
【図２】図２は、本発明が適用される本ＲＮＡ同定装置の構成の一例を示すブロック図である。
【図３】図３は、本実施の形態におけるＲＮＡ同定装置１００のＲＮＡ検索のデータフローを示すフロー図である。
【図４】図４は、本実施の形態におけるデータベース加工処理の一例を示すフローチャートである。
【図５】図５は、本実施の形態における酵素消化処理の一例を示すフローチャートである。
【図６】図６は、本実施の形態におけるＭＳ／ＭＳイオン検索処理の一例を示すフローチャートである。
【図７】図７は、本実施の形態におけるマッピング処理の一例を示すフローチャートである。
【図８】図８は、本実施の形態における出現確率算出処理の一例を示すフローチャートである。
【図９】図９は、ＲＮＡ鎖長に対して特定可能な組成および配列の種類数を示すグラフである。
【図１０】図１０は、マージデータベースに対して検索した結果の比較の一例を示す図である。
【図１１】図１１は、マージデータベースに対して検索した結果の比較の一例を示す図である。
【図１２】図１２は、ｔＲＮＡ−Ｐｈｅ  ＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図１３】図１３は、ｔＲＮＡ−ＰｈｅをＤＮＡ配列に対して検索した結果を示す図表である。
【図１４】図１４は、ＭＳ／ＭＳスペクトルとプロダクトイオンのアサインの一例を示す図である。
【図１５】図１５は、酵母  ｔＲＮＡの陰イオン交換カラムによる分取を示す図である。
【図１６】図１６は、酵母  ｔＲＮＡ，  陰イオン交換の画分Ｎｏ．１０の逆相ＬＣによる脱塩・精製を示す図である。
【図１７】図１７は、酵母ｔＲＮＡ混合物フラクション１０−２  ＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、酵母ｔＲＮＡ混合物フラクション１０−２  ＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物検索結果のマッピングスコアヒストグラムである。
【図１９】図１９は、マッピングにより同定した配列領域の一例を示す図である。
【図２０】図２０は、マッピングにより同定した配列領域の一例を示す図である。
【図２１】図２１は、マッピングにより同定した配列領域の一例を示す図である。
【図２２】図２２は、マッピングにより同定した配列領域の一例を示す図である。
【図２３】図２３は、本発明が適用される本ＲＮＡ同定システム構成の一例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
［Ｉ．本発明の概要］
質量分析データをもちいてタンパク質・核酸を同定するための方法の位置づけについて図１にまとめた。ＲＮＡのＭＳ／ＭＳイオン検索法はマスフィンガープリンティング法と比べて同定の信頼性が高いと考えられること、計算量がｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法に比べて少ないことから有用と考えられる。ＭＳ／ＭＳイオン検索は、タンパク質の同定では一般的な手法である。しかし、この方法をＲＮＡの同定に適用しようとする場合、主に３つの問題があったため、従来適用されていなかった。
【００４０】
（１）ＲＮＡは４つの残基から構成されるため２０種類のアミノ酸残基から構成されるタンパク質と比べて、配列の多様性が少ない。このため１０残基程度の単一断片配列では元のＤＮＡ／ＲＮＡを同定出来ないことがある。特にゲノムのような巨大な配列データベースに対して検索する場合には、ある断片配列がそのデータベース内でユニークになることはまれである。したがって、この構造的な制約により、ＲＮＡ同定法は後述するマッピングを備えることが望ましい。
【００４１】
（２）非コードＲＮＡにしばしば見出される転写後修飾は修飾様式がタンパク質に比べて多様である。すなわち、タンパク質の場合には、通常修飾されうるのはアミノ酸残基の側鎖だけである。これに対して、ＲＮＡの修飾は、どの塩基、リボースにも起き得ることから修飾部位の判別が難しい場合がある。また一つの塩基の複数部位に、複数の同一または別の修飾がなされる場合がある。ＲＮＡでは、４種類全てのヌクレオシドにメチル化など同じ修飾が起こりえる。このため、全ての残基に対して修飾可能性を考慮して検索を行わなければならない。また、一つの残基に複数の修飾部位がある場合があり、異なる部位に異なる官能基が修飾している例も多数報告されている。このようにＲＮＡのＭＳ／ＭＳイオン検索ではタンパク質には無い形式の修飾を扱う必要がある。
【００４２】
（３）従来からタンパク質のデータベースがよく整備されているのに対し、非コードＲＮＡではｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ以外に関するデータベースが未成熟である。非コードＲＮＡは、ゲノムのどの部位から転写されるかのルールが確立していない。したがって、現状ではゲノムや巨大な核酸配列に対して二本鎖の両側を検索する必要があり、計算量が膨大である。また、ゲノムＤＮＡの繰り返し領域を扱う必要性がある。
【００４３】
これらの問題点を解決するため、本発明は以下の２つの部分から構成される。
（１）  ＭＳ／ＭＳイオン検索・・・残基特異的断片化産物をタンデム質量分析して得られたピークのプレカーサイオンの分子量と複数のプロダクトイオン質量から断片配列を同定する。
（２）  マッピング・・・同定断片配列リストと核酸配列を比較することにより、全核酸エントリーにマッピングスコアを付け、当該スコアに基づいて、最も確からしい核酸エントリーを同定する。
【００４４】
本発明のＭＳ／ＭＳイオン検索では、後述する確率的な評価により断片の同定信頼性を高めることが出来る。本発明のＭＳ／ＭＳイオン検索では、断片配列から修飾断片配列を派生することで、しばしば非コードＲＮＡに見出される転写後修飾を考慮して検索することが出来る。
【００４５】
本発明では、ＭＳ／ＭＳイオン検索で同定した断片配列の組を検索対象データベースの各エントリーにマッピングし、確率的な評価によりエントリー同定の信頼性を高めることが出来る。
【００４６】
本発明のマッピングでは、ゲノムなどの巨大なデータベースエントリーに対応するために、エントリーを分割してサブエントリーとすることが出来る。適切な大きさのサブエントリーに分割することで、試料中のＲＮＡが由来したゲノム上の位置を同定することが出来る。サブエントリーへの分割方法としては、単純に残基数による、断片数による、繰り返しを除いた断片数によるなどの方法をもちいることが出来る。
【００４７】
本発明では、ＭＳ／ＭＳイオン検索とマッピングの両方で目的の断片配列あるいはエントリーを確率的に評価する。すなわち、個々の断片配列あるいはエントリーを偶然同定する確率を求め、この確率をもちいて同定の確からしさを評価する。確率が低いほど偶然生じる可能性が低くなるため、その同定には意味があると考える。実際には利用しやすいように、低い確率ほど高くなるようにスコア付けして評価にもちいる。しかし、一般に、ある検索対象に対する最も高いスコアが有意とは限らない。そこで、本発明では、得られたスコアの有意性を客観的に判断するために、閾値をもちいることが出来る。閾値はデータベースの大きさに依存して定まるものと、スコア自身の分布により定まるもののいずれかあるいは両方をもちいることが出来る。
【００４８】
［ＩＩ．リボ核酸同定装置の構成］
図２は、本発明が適用されるリボ核酸同定装置の構成の一例を示すブロック図である。
【００４９】
ＲＮＡ同定装置１００は、記憶部１０６と制御部１０２を備えて構成されており、これら各部は任意の通信路を介して通信可能に接続されている。
【００５０】
記憶部１０６は、データベースやテーブル（核酸配列ＤＢ１０６ａ〜同定核酸エントリー表１０６ｍ）の記憶手段である。当該記憶手段は、固定ディスク等のストレージ手段であってもよく、ＲＡＭ等のような一時的記憶手段であってもよい。また、これらの記憶手段は制御部と共用であってもよい。また、記憶部１０６は制御部１０２により加工された中間記憶データ（１０６ｅ、１０６ｉ〜１０６ｍ）を記憶してもよい。以下では、記憶部１０６の各構成要素を説明する。
【００５１】
核酸配列ＤＢ１０６ａは、核酸エントリーを記憶する核酸配列情報記憶手段である。ここで、「核酸エントリー」とは、配列の同定を行うための核酸配列の検索単位であり、配列をエントリー名と対応付けて記憶する。「エントリー名」とは、核酸エントリー毎に核酸配列に対応付けた識別番号等である。好適には、エントリー名として、同定対象である一つのＲＮＡに対応する核酸配列単位で識別番号等が付与されてもよい。また、ここで、核酸配列ＤＢ１０６ａは、所定の部分集合（ヒトゲノム配列、マウスゲノム配列、ヒト非コードＲＮＡ等）に分けて核酸配列を記憶してもよい。ここで、本発明において、部分集合とは、核酸配列ＤＢ１０６ａの部分集合を言う。部分集合は種名と分子の種類名あるいは性質などにより特定してもよい。例えば、ヒトｒｅｆｓｅｑ、哺乳類ｔＲＮＡなどである。
【００５２】
断片化規則表１０６ｂは、残基配列特異的な切断方法に対応する断片化規則を記憶する断片化規則記憶手段である。例えば、断片化規則表１０６ｂは、ＲＮａｓｅ  Ｔ１が指定される場合は、配列中のグアニン（Ｇ）の３’側を断片化部位として規定し、Ｃｏｌｉｃｉｎ  Ｅ５が指定される場合は、グアニン−ウラシル（ＧＵ）のＧの３’側を断片化部位として規定する。
【００５３】
質量定義表１０６ｃは、配列からＲＮＡの分子量を計算するために、ＲＮＡを構成するリボースやリン酸や各塩基の質量を規定した質量情報記憶手段である。例えば、質量定義表１０６ｃは、リボース：１１５．０３９５、アデニン（Ａ）：１３４．０４６７のように、ＲＮＡを構成する元素や官能基を表す記号と質量を対応付けて記憶する。
【００５４】
修飾規則表１０６ｄは、ＲＮＡ構成要素ごとに修飾しうる官能基を記憶する修飾情報記憶手段である。例えば、塩基やリボースに対するメチル化や、アデニン塩基の脱アミノ化、ウラシル塩基のジヒドロ化などがある。また、この修飾規則表１０６ｄには、各修飾様式に対応付けて修飾により変更される質量を記憶してもよい。
【００５５】
また、ピークリスト１０６ｇは、タンデム質量分析データから抽出されたピークを記憶するピーク情報記憶手段である。
【００５６】
制御部１０２は、各種の処理手順等を規定したプログラム、および所要データを格納するための内部メモリを有し、又は記憶部もしくは記憶部との共用記憶手段に記憶されているデータを認識するための手段を有し、これらのプログラム等により、種々の情報処理を行う。制御部１０２は、実測断片分子量抽出部１０２ａ、断片化部１０２ｂ、計算断片分子量算出部１０２ｃ、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅ、候補断片配列抽出部１０２ｆ、計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇ、実測プロダクトイオン質量抽出部１０２ｈ、アサインスコア算出部１０２ｉ、候補配列同定部１０２ｊ、出現確率算出部１０２ｋ、エントリースコア付け部１０２ｐ、エントリー同定部１０２ｑ、修飾変換部１０２ｎを備える。以下では、制御部１０２の各要素を説明する。
【００５７】
実測断片分子量抽出部１０２ａは、ピークリスト１０６ｇに記憶されたピークについて、プリカーサイオンに対応する実測断片分子量を抽出する実測断片分子量抽出手段である。
【００５８】
断片化部１０２ｂは、断片化規則表１０６ｂを参照して、核酸配列ＤＢ１０６ａから取得した核酸配列を断片化する断片化手段である。
【００５９】
計算断片分子量算出部１０２ｃは、断片化部１０２ｂで断片化した結果得られた核酸配列の断片配列について計算断片分子量を算出する計算断片分子量算出手段である。
【００６０】
候補計算断片分子量抽出部１０２ｅは、実測断片分子量抽出部１０２ａにより抽出された実測断片分子量と、計算断片分子量算出部１０２ｃにより算出された計算断片分子量とを比較することにより、ピークリスト１０６ｇに記憶されたピークから候補計算断片分子量を抽出する候補計算断片分子量抽出手段である。
【００６１】
候補断片配列抽出部１０２ｆは、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅにより抽出された候補計算断片分子量に対応する断片配列を候補断片配列として抽出する候補断片配列抽出手段である。
【００６２】
計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇは、与えられた断片配列について、所定の開裂規則に従って計算プロダクトイオン質量を算出する計算プロダクトイオン質量算出手段である。
【００６３】
ここで、計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇは、候補断片配列リスト１０６ｉの候補断片配列について、プロダクトイオンに対応する計算プロダクトイオン質量を算出してもよい。また、ここで、計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇは、質量定義表１０６ｃを参照して計算プロダクトイオン質量を算出してもよく、また、計算断片分子量算出部１０２ｃが計算断片分子量を算出する場合に用いた当該断片配列の構成要素（リン酸、リボース、各塩基）毎の分子量に基づいて、計算プロダクトイオン質量を算出してもよい。
【００６４】
実測プロダクトイオン質量抽出部１０２ｈは、ピークリスト１０６ｇから実測プロダクトイオン質量を抽出する実測プロダクトイオン質量抽出手段である。
【００６５】
アサインスコア算出部１０２ｉは、計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇにより算出された計算プロダクトイオン質量と、実測プロダクトイオン質量抽出部１０２ｈにより抽出された実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、候補断片配列にアサインスコアを付けるスコア付け手段である。
【００６６】
候補配列同定部１０２ｊは、アサインスコア算出部１０２ｉで付けたアサインスコアに基づいて、候補断片配列から、同定断片配列を抽出する候補配列同定手段である。
【００６７】
出現確率算出部１０２ｋは、核酸配列ＤＢ１０６ａに記憶された核酸配列集合のうち検索対象として予め指定した部分集合内での核酸配列の断片配列の出現確率を算出する出現確率算出手段である。
【００６８】
エントリースコア付け部１０２ｐは、出現確率算出部１０２ｋにより算出された出現確率に基づいて、同定断片表１０６ｋの同定断片配列と核酸配列ＤＢ１０６ａで記憶した核酸配列とを比較することにより、核酸エントリーにマッピングスコアを付けるエントリースコア付け手段である。
【００６９】
エントリー同定部１０２ｑは、エントリースコア付け部１０２ｐで付けたマッピングスコアに基づいて、尤もらしい（例えば、最も確からしい）核酸エントリーを同定するエントリー同定手段である。
【００７０】
修飾変換部１０２ｎは、修飾規則表１０６ｄに記憶された修飾規則を参照して、断片配列において、修飾配列と未修飾配列との変換を行う修飾変換手段である。ここで、修飾変換部１０２ｎは、修飾の無い核酸配列に修飾を付加してもよく、また、修飾を含む同定断片配列を元の核酸エントリーの配列に対応付けるために、断片配列から修飾を除去してもよい。
【００７１】
［ＩＩＩ．本ＲＮＡ同定装置１００の処理］
次に、このように構成された本実施の形態におけるＲＮＡ同定装置１００の処理の一例について、図２および図３を参照して説明する。図３は、本実施の形態におけるＲＮＡ同定装置１００のＲＮＡ検索のデータフローを示すフロー図である。
【００７２】
なお、以下に示すＲＮＡ同定装置１００の処理の順序は一例であり、この説明の順序に限られるものではない。特に、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅの処理までの、実測側の処理（実測断片分子量抽出部１０２ａの処理）および計算側の処理（断片化部１０２ｂ〜計算断片分子量算出部１０２ｃの処理）は、いずれが先に実行されてもよく、また同時に並行して処理が行われてもよいものである。同様に、アサインスコア算出部１０２ｉの処理までの、実測側の処理（実測プロダクトイオン質量抽出部１０２ｈの処理）および計算側の処理（断片化部１０２ｂ〜計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇの処理）は、いずれが先に実行されてもよく、また同時に並行して処理されてもよいものである。また、更には、計算側（断片化部１０２ｂ、計算断片分子量算出部１０２ｃ、計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇ）の各処理による計算結果は、予めデータベース化されて、記憶部１０６の断片配列表１０６ｅや計算プロダクトイオン表１０６ｊ等に格納されていてもよいものである。また、出現確率の算出は、断片化部１０２ｂで行なってもよく、断片化後からエントリースコア付け部１０２ｐの直前までどのタイミングで行なってもよい。
【００７３】
図２の断片化部１０２ｂは、核酸配列ＤＢ１０６ａから核酸エントリー毎に核酸配列を取得して、断片化規則表１０６ｂに記憶された指定された切断方法に対応する断片化規則に基づいて、当該核酸配列を断片配列に断片化する。ここで、断片化部１０２ｂは、断片化結果を断片配列表１０６ｅに一時的に格納してもよい。また、断片化部１０２ｂは、指定された部分集合の核酸配列について断片化を実行してもよい。また、ここで、修飾変換部１０２ｎは、修飾規則表１０６ｄを参照して、修飾の無い断片配列に修飾を付加してもよい。
【００７４】
また、ここで、出現確率算出の一部を行ってもよく、出現確率算出部１０２ｋは、核酸配列ＤＢ１０６ａに記憶された核酸配列のうち検索対象として予め指定された核酸配列の部分集合（例えば、ヒトｒｅｆｓｅｑや酵母ｔＲＮＡデータベース等）内での当該断片配列の出現確率を算出し、断片配列表１０６ｅに断片配列と出現確率とが対応付けられる形式で格納してもよい。
【００７５】
そして、計算断片分子量算出部１０２ｃは、断片化部１０２ｂによって断片化された断片配列について、質量定義表１０６ｃを参照して、計算断片分子量を算出し、当該断片配列と対応付ける。ここで、計算断片分子量算出部１０２ｃは、断片配列表１０６ｅに断片配列と当該計算断片分子量とを対応付けられる形式で格納してもよい。
【００７６】
一方、検索クエリは所定の切断方法で切断されたＲＮＡのタンデム質量分析データから抽出されたピークリスト１０６ｇである。タンデム質量分析データからのピーク抽出は質量分析計メーカーが提供するソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｃｈｅｒ社，  Ｘｃａｌｉｂｕｒ；Ｗａｔｅｒｓ社，Ｍａｓｓｌｙｎｘなど（会社名））あるいは市販のソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社，  Ｍａｓｃｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒなど（会社名））により行うことが出来る。典型的なピークリストは以下に示すように、断片の分子量とプロダクトイオンの質量および強度を対応付けて記憶する。
【００７７】
断片１分子量
プロダクトイオン１質量，プロダクトイオン１強度
プロダクトイオン２質量，プロダクトイオン２強度
プロダクトイオン３質量，プロダクトイオン３強度
・・・
プロダクトイオンＭ質量，プロダクトイオンＭ強度
【００７８】
断片２分子量
プロダクトイオン１質量，プロダクトイオン１強度
プロダクトイオン２質量，プロダクトイオン２強度
プロダクトイオン３質量，プロダクトイオン３強度
・・・
プロダクトイオンＮ質量，プロダクトイオンＮ強度
【００７９】
ピークリストは上記の他に断片イオンの質量、電荷、強度、溶離時間、スキャン番号、コメントなどの付加情報を含んでもよい。一つのピークリストに複数のＭＳ／ＭＳに相当するピークが含まれていてもよい。この場合にはピークとピークは適当な区切り文字により区切られていてもよい。なお、上の例では空行により区切っている。ここで、ピークリストは、ピークごとにファイルを分けてもよい。また、複数のピークリストファイルを一つのピークリストとみなして、一回のデータベース検索にもちいてもよい。
【００８０】
実測断片分子量抽出部１０２ａは、図３に示すように、ピークリスト１０６ｇから実測断片分子量を抽出する。
【００８１】
そして、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅは、抽出された実測断片分子量を、計算断片分子量と比較することにより、候補計算断片分子量を抽出する。
【００８２】
そして、候補断片配列抽出部１０２ｆは、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅにより抽出された候補計算断片分子量に対応する断片配列を、候補断片配列として断片配列表１０６ｅから抽出する。候補断片配列抽出部１０２ｆは、抽出した候補断片配列を候補断片配列リスト１０６ｉに記憶してもよい。
【００８３】
そして、計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇは、候補断片配列について、所定の開裂規則に従って、計算プロダクトイオン質量を算出し、候補となる断片配列と、後述する各プロダクトイオンのイオン名（「ａ１」，「ｗ３」など）と、計算プロダクトイオン質量とを対応付けて記憶する計算プロダクトイオン表１０６ｊを作成する。
【００８４】
ここで、ＲＮＡは、主鎖がリン酸、リボースという二つの要素から構成され、さらに側鎖である塩基がリボースに結合した構造を有する。この構造に起因してペプチドと異なり低エネルギーでも開裂部位が二箇所（５’側：リボース−↓−３’Ｏ−Ｐ−↓−５’Ｏ−リボース：３’側（ここで、矢印「↓」は開裂部位を示す））に存在する。リボース−３’Ｏ結合間で開裂した場合、５’末端側のプロダクトイオンはａ系列と呼ばれ、３’末端側のプロダクトイオンは、ｗ系列と呼ばれる。また、Ｐ−５’Ｏ結合間で開裂した場合、５’末端側のプロダクトイオンはｃ系列と呼ばれ、３’末端側のプロダクトイオンは、ｙ系列と呼ばれる。５’末端を含むａ，ｃ系列は５’側から、例えばａ１，ａ２，ａ３・・・と数える。これに対して３’末端を含むｗ，ｙ系列は３’側から数える。
【００８５】
そして、実測プロダクトイオン質量抽出部１０２ｈは、ピークリスト１０６ｇから実測プロダクトイオン質量を抽出する。例えばイオン強度が閾値以上のピークの実測プロダクトイオン質量を抽出する。ここで、実測プロダクトイオン質量抽出部１０２ｈは、実測断片分子量抽出部１０２ａにより抽出された実測断片分子量に基づいて、プリカーサイオンに対応するピークを、抽出する実測プロダクトイオン質量から除去してもよい。
【００８６】
そして、アサインスコア算出部１０２ｉは、計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇにより算出された計算プロダクトイオン表１０６ｊの計算プロダクトイオン質量と、実測プロダクトイオン質量抽出部１０２ｈにより抽出された実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、候補断片配列にアサインスコアを付ける。
【００８７】
そして、候補配列同定部１０２ｊは、アサインスコア算出部１０２ｉによりスコア付けされたアサインスコアに基づいて、候補断片配列リスト１０６ｉの候補断片配列から、ＲＮＡの断片配列を同定断片配列として同定する。ここで、候補配列同定部１０２ｊは、当該同定断片配列とアサインスコアとを対応付けて同定断片表１０６ｋに格納してもよい。出現確率算出部１０２ｋは、核酸配列ＤＢ１０６ａに記憶された核酸配列のうち検索対象として予め指定された核酸配列の集合（例えば、ヒトゲノム配列等）内での断片配列の出現確率を算出する。当該断片配列と対応付けて同定断片表１０６ｋに格納してもよい。また、ここで、断片配列表１０６ｅの断片配列、および、同定断片表１０６ｋの同定断片には、後述の修飾変換処理、重複除去、切れ残り断片派生の各処理が行われてもよい。
【００８８】
そして、エントリースコア付け部１０２ｐは、同定断片表１０６ｋの出現確率に基づいて、同定断片表１０６ｋの同定断片配列と核酸配列ＤＢ１０６ａに記憶された核酸配列とを比較して、核酸エントリーにマッピングスコアを付け、同定核酸エントリー表１０６ｍを作成する。例えば、エントリースコア付け部１０２ｐは、出現確率が高い同定断片配列については、同定対象のＲＮＡに対する信頼性が低いと評価して、マッピングスコアを低く見積もる。以上により、同定核酸エントリー表１０６ｍには、核酸エントリーに対応する、エントリー名とマッピングスコアと同定断片配列リスト（核酸エントリーの核酸配列由来の複数の同定断片配列）が格納される。
【００８９】
そして、エントリー同定部１０２ｑは、エントリースコア付け部１０２ｐによりスコア付けされたマッピングスコアに基づいて、尤もらしい（例えば、最も確からしい）核酸エントリーを同定する。例えば、エントリー同定部１０２ｑは、エントリースコア付け部１０２ｐで求められた複数のマッピングスコアについて標準偏差を求め、ｚ−スコアが所定の閾値以上の核酸エントリーを同定結果として出力してもよい。
【００９０】
以上で、ＲＮＡ同定装置１００の全体的な処理フローの説明を終える。次に、上述したＲＮＡ同定装置１００の各構成（実測断片分子量抽出部１０２ａ〜修飾変換部１０２ｎ）の処理において、更に詳細化した処理について、以下に図４〜図８を参照して説明する。
【００９１】
［検索条件設定処理］
ＲＮＡ同定装置１００は、以下の（１）〜（８）を含む検索条件に基づき検索を行う。ＲＮＡ同定装置１００は、検索条件をあらかじめ記憶しておいてもよいし、利用者に入力装置を介して指定させるよう制御してもよい。
（１）生物種：例えば、ヒト、酵母、哺乳類、全て等
（２）データベース種類：例えば、ゲノム配列、ｒｅｆｓｅｑ等
（３）切断方法：例えば、ＲＮａｓｅ  Ｔ１，Ｕ２，Ａ等のヌクレアーゼ名、化学的切断方法等
（４）考慮する最大の切れ残り：例えば、０〜３程度
（５）考慮する最大修飾数：例えば、０〜３程度
（６）許容質量誤差：質量分析計の精度に応じて、例えば、１０〜５００ｐｐｍ程度、タンデム質量分析計の種類によりプリカーサイオン、プロダクトイオンの質量精度が異なる場合がある。この場合にはそれぞれについて別の許容質量誤差を指定することが出来る。
（７）末端官能基：例えば、リン酸基、水酸基、キャップ（５’のみ）、２’，３’−環状リン酸（３’のみ）など
（８）質量テーブル（質量定義表１０６ｃに格納される。）：残基毎に単同位体質量を算出したテーブル
【００９２】
［断片化処理］
核酸断片ＤＢ１０６ａに記憶された核酸配列はＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列である。ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を含むＦａｓｔａ形式ファイルを断片化の対象データベース（ＤＢ）としてもよい。
【００９３】
核酸断片ＤＢ１０６ａに記憶された核酸配列がＲＮＡ配列である場合、上述したように、断片化部１０２ｂは、断片化規則表１０６ｂに記憶された、利用者に指定された切断方法に対応する断片化規則を参照して、核酸配列ＤＢ１０６ａから取得した核酸配列を断片化する。しかしながら、核酸断片ＤＢ１０６ａに記憶された核酸配列がＤＮＡ配列である場合、そのままでは生体内に存在するＲＮＡの配列と対応しないため、以下に示すように、ＤＮＡ配列からＲＮＡ配列への変換である転写処理（Ｔ→Ｕ）を行う必要がある。また、核酸配列ＤＢ１０６ａに格納された核酸配列がゲノムＤＮＡである場合には、二本鎖の双方からＲＮＡが産出される場合を想定して相補鎖を派生する必要がある。
【００９４】
すなわち、図４に示すように、断片化部１０２ｂは、利用者に指定された検索条件［生物種］および［データベース種類］に基づいて、核酸配列ＤＢ１０６ａから指定の核酸配列の集合の核酸エントリーを読み込む（ステップＳＡ−１）。ここで、断片化部１０２ｂは、核酸配列ＤＢ１０６ａがゲノムＤＢ等であり、一つのエントリーが巨大な場合には、この一つの核酸エントリーを核酸サブエントリーに分割してもよい。例えば、サブエントリーへの分割方法としては、単純に残基数による、断片数による、繰り返しを除いた断片数によるなどの方法をもちいることが出来る。
【００９５】
そして、断片化部１０２ｂは、読み込んだ核酸配列がＤＮＡ配列であるかを判断する（ステップＳＡ−２）。
【００９６】
そして、断片化部１０２ｂは、ＤＮＡ配列であると判断した場合（ステップＳＡ−２：Ｙｅｓ）、転写処理を行う（ステップＳＡ−３）。
【００９７】
断片化部１０２ｂは、ＤＮＡ配列でない、すなわちＲＮＡ配列と判断した場合（ステップＳＡ−２：Ｎｏ）、または、転写処理（ステップＳＡ−３）を終えた場合、読込元の核酸配列ＤＢ１０６ａがゲノムＤＢであるか判断する（ステップＳＡ−４）。
【００９８】
そして、断片化部１０２ｂは、ゲノムＤＢであると判断した場合（ステップＳＡ−４：Ｙｅｓ）、相補鎖派生処理を行う（ステップＳＡ−５）。ここで、相補ＤＮＡを派生した後に転写処理を行ってもよく、逆にまず転写処理を行ってから相補ＲＮＡを派生してもよい。
【００９９】
断片化部１０２ｂは、読込元の核酸配列ＤＢ１０６ａがゲノムＤＢでないと判断した場合（ステップＳＡ−４：Ｎｏ）、または、以上の相補鎖派生処理を終えた場合（ステップＳＡ−５）、以上の処理で取得したＲＮＡ配列について、以下の残基配列特異的断片化処理を行う（ステップＳＡ−６）。ここで、図５は、本実施の形態における断片化処理の一例を示すフローチャートである。なお、以下の例では、残基配列特異的な切断方法として１塩基認識酵素であるリボヌクレアーゼＴ１（ＲＮａｓｅ  Ｔ１）を用いた場合について説明するが、本実施の形態は、１塩基認識酵素に限られず、２塩基以上を認識する酵素を用いてもよい。また、酵素的な切断方法に限らず、化学的な切断方法などを用いてもよい。
【０１００】
（酵素消化処理）
図５に示すように、まず、断片化部１０２ｂは、カウンタｉと断片ｊを０にセットする（ステップＳＡ−６１）。
【０１０１】
そして、断片化部１０２ｂは、入力されたＲＮＡ配列からｉ文字目の配列を読み込む（ステップＳＡ−６２）。
【０１０２】
そして、断片化部１０２ｂは、ｉ文字目を断片ｊに付加する（ステップＳＡ−６３）。
【０１０３】
そして、断片化部１０２ｂは、ｉ文字目が特異的な残基配列であるかを判断する（ステップＳＡ−６４）。
【０１０４】
そして、断片化部１０２ｂは、ｉ文字目が特異的な残基配列であると判断した場合（ステップＳＡ−６４：Ｙｅｓ）、断片ｊを断片配列表１０６ｅの断片配列リストに付加する（ステップＳＡ−６５）。一方、断片化部１０２ｂが、ｉ文字目は特異的な残基配列でないと判断した場合（ステップＳＡ−６４：Ｎｏ）、ステップＳＡ−６７の処理へ進む。
【０１０５】
そして、断片化部１０２ｂは、断片ｊを１つインクリメントする（ｊ＋＋）（ステップＳＡ−６６）。
【０１０６】
そして、断片化部１０２ｂは、カウンタｉを１つインクリメントする（ｉ＋＋）（ステップＳＡ−６７）。
【０１０７】
そして、断片化部１０２ｂは、読み込んだｉ文字目がＲＮＡ配列の総文字数Ｎより小さいか否かを判断する（ステップＳＡ−６８）。
【０１０８】
そして、断片化部１０２ｂは、読み込んだｉ文字目がＲＮＡ配列の総文字数Ｎより小さい場合（ステップＳＡ−６８：Ｙｅｓ）、ステップＳＡ−６２に戻り、以上のステップＳＡ−６２〜６８の処理を繰り返す。
【０１０９】
そして、断片化部１０２ｂは、読み込んだｉ文字目が配列総文字数Ｎ以上である場合（ステップＳＡ−６８：Ｎｏ）、利用者により指定された検索条件［末端官能基］に従って、断片ｊに末端を付加する（ステップＳＡ−６９）。
【０１１０】
また、断片化部１０２ｂは、指定された検索条件［考慮する最大の切れ残り］に従って、切れ残り断片を派生させる（ステップＳＡ−７０）。例えば、最大切れ残りが１箇所と設定された場合、断片化部１０２ｂは、上述の処理で検索した特異的残基のうち１箇所について断片化しない断片配列についても、断片配列表１０６ｅに格納する。
【０１１１】
再び図４に戻り、以上のように、断片化部１０２ｂは、酵素消化処理において、読み込んだ配列を全て断片化するまで処理を続け、断片配列リストを作成し断片配列表１０６ｅに格納する（ステップＳＡ−６）。なお、核酸配列ＤＢ１０６ａに記憶された配列が、塩基を特定できなかった場合のシンボル（例えば、一文字表記Ｎ）を含む場合は、分子量計算が不可能なので、断片配列リストを作成する際に排除してもよい。また、ここで、修飾変換部１０２ｎは、指定された検索条件［考慮する最大修飾数］に従って、修飾規則表１０６ｄを参照して、修飾の無い断片配列に修飾を付加してもよい。また、ここで後述の通り出現確率算出の一部を行ってもよい。
【０１１２】
［ＭＳ／ＭＳイオン検索処理］
断片化されたＲＮＡ配列について、ＲＮＡ同定装置１００は、以下のＭＳ／ＭＳイオン検索処理を実行する。ＭＳ／ＭＳイオン検索処理の前半工程（ステップＳＢ−１〜４）は、実測断片分子量抽出部１０２ａ、計算断片分子量算出部１０２ｃ、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅ、および、候補断片配列抽出部１０２ｆによって実行される、プリカーサイオンについての質量検索である。一方、ＭＳ／ＭＳイオン検索処理の後半工程（ステップＳＢ−５〜１１）は、プロダクトイオンについての質量検索である。ここで、図６は、本実施の形態におけるＭＳ／ＭＳイオン検索処理の一例を示すフローチャートである。
【０１１３】
まず、計算断片分子量算出部１０２ｃは、断片化部１０２ｂにより作成された断片配列表１０６ｅの断片配列リストの各断片配列について、質量定義表１０６ｃを参照して、プリカーサイオンに対応する計算断片分子量を算出して、計算断片分子量リストを作成し、ＲＮＡ同定装置１００は、計算断片分子量リストを読み込む（ステップＳＢ−１）。
【０１１４】
そして、実測断片分子量抽出部１０２ａは、タンデム質量分析データから抽出したピークを記憶するピークリスト１０６ｇのうち、ＭＳ１スペクトルのピークについての質量値（ｍ／ｚ）および電荷（ｚ）を参照して、プリカーサイオンに対応する実測断片分子量を読み込む（ステップＳＢ−２）。
【０１１５】
そして、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅは、読み込んだ実測断片分子量（プリカーサイオンに対応する質量）に関して、計算断片分子量リストに対して質量検索を行う（ステップＳＢ−３）。なお、検索結果が空集合の場合は「外れ」となる。
【０１１６】
そして、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅは、検索結果の計算断片分子量が、利用者に指定された検索条件［許容質量誤差］の許容誤差範囲内にあるか否かを判断する（ステップＳＢ−４）。
【０１１７】
そして、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅは、許容誤差範囲内にないと判断した場合（ステップＳＢ−４：Ｎｏ）、ステップＳＢ−２に戻り、他のファイルのピークリスト１０６ｇに記憶された実測プロダクトイオン質量を読み込んで、ステップＳＢ−２〜４の処理を繰り返す。
【０１１８】
一方、候補計算断片分子量抽出部１０２ｅは、許容誤差範囲内にあると判断した場合（ステップＳＢ−４：Ｙｅｓ）、当該計算断片分子量に対応する断片配列を断片配列表１０６ｅから取得して候補断片配列とし、候補断片配列リスト１０６ｉを作成して、次のステップＳＢ−５へ進む。
【０１１９】
そして、実測プロダクトイオン質量抽出部１０２ｈは、ピークリスト１０６ｇに記憶されたＭＳ２スペクトルのピークについて、実測プロダクトイオン質量の組を抽出し、一方、計算プロダクトイオン質量算出部１０２ｇは、候補断片配列リスト１０６ｉの各候補断片配列について、所定の開裂規則に従って、各系列のプロダクトイオンに対応する計算プロダクトイオン質量の組を算出し、計算プロダクトイオン表１０６ｊを作成する（ステップＳＢ−５）。
【０１２０】
そして、アサインスコア算出部１０２ｉは、実測プロダクトイオン質量に関して、計算プロダクトイオン表１０６ｊに対して質量検索を行う（ステップＳＢ−６）。
【０１２１】
そして、アサインスコア算出部１０２ｉは、検索結果の計算プロダクトイオン質量と実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、候補断片配列にアサインスコアを付けるアサインスコア算出処理を実行する（ステップＳＢ−７）。
【０１２２】
そして、アサインスコア算出部１０２ｉは、アサインスコア算出処理を行ったピークリスト１０６ｇが、最後のピークリストのファイルであるかを判断する（ステップＳＢ−８）。
【０１２３】
そして、アサインスコア算出部１０２ｉは、最後のピークリストのファイルでないと判断した場合は（ステップＳＢ−８：Ｎｏ）、ステップＳＢ−２の処理へ戻り、他のファイルのピークリスト１０６ｇについて、以上のステップＳＢ−２〜８の処理を繰り返す。
【０１２４】
一方、アサインスコア算出部１０２ｉは、最後のピークリストのファイルであると判断した場合は（ステップＳＢ−８：Ｙｅｓ）、候補配列同定部１０２ｊは、閾値を算出する（ステップＳＢ−９）。
【０１２５】
そして、候補配列同定部１０２ｊは、アサインスコア算出部１０２ｉで付けたアサインスコアに基づいて、候補断片配列リスト１０６ｉの候補断片配列から、ＲＮＡの断片配列を同定断片配列として同定し、算出した閾値以上のアサインスコアに基づいて整列（例えば、降順にソート）させた同定断片表１０６ｋを作成する（ステップＳＢ−１０）。ここで、候補配列同定部１０２ｊは、候補断片配列の全ての開裂断片に対してスコア付けが終わったら、各アサインスコアを閾値と比較し、比較の結果、閾値よりこのスコアが高ければ、このアサインスコアを与えた候補断片配列を同定断片配列とする。なお、最高のアサインスコアを与える配列が複数存在する場合には、その全てを同定断片配列とみなしてもよい。
【０１２６】
ここで、同定断片表１０６ｋに基づいて出力されるデータには、同定断片配列の組および属性値（例えば、分子量、アサインスコア、閾値、ＭＳ２アサインリストなど）等が含まれてもよい。
【０１２７】
そして、ＲＮＡ同定装置１００は、マッピング処理を続けて行わない場合、候補配列同定部１０２ｊの処理により、同定断片表１０６ｋに基づいて、同定断片配列のセットおよび属性値を整形した結果を出力する。以上で、ＭＳ／ＭＳイオン検索処理の一例の説明を終える。
【０１２８】
以下では本発明のＲＮＡ同定装置が採用している確率モデルについて説明する。実測プロダクトイオン質量について設定した許容質量誤差範囲内に計算プロダクトイオン表１０６ｊに含まれる計算プロダクトイオン質量が存在する場合、この実測プロダクトイオン質量はマッチしたという。
【０１２９】
本実施の形態においては、計算量を少なくするため、マッチを独立試行とし、個々のマッチ確率は等しいと仮定した単純な確率モデルをもちいる。なお、この実施の形態に限られず、マッチを独立試行とせず（例えば、ｙ系列プロダクトイオンのマッチとｗ系列プロダクトイオンのマッチが相関する等）、等確率でない確率モデルを設定してもよい。
【０１３０】
本実施の形態の確率モデルによれば、あるＲＮＡ断片のＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて、マッチを評価したピークをｎ本、そのうちヒットしたものをｘ本とすると、これらの事象が同時に起こる確率Ｐａｓｓｉｇｎは、
Ｐａｓｓｉｇｎ＝ｎＣｍ＊ｐｘ＊（１−ｐ）（ｎ−ｘ）
となる。
ここで、「ｎＣｍ」は、ｎからｍを選ぶ組み合わせの場合の数である。これは、ｎ回サイコロを投げてｘ回同じ目（例えば一の目）が出る確率と同様に考えることができる。
【０１３１】
また、「ｐ」は、個々のプロダクトイオンが偶然にマッチする確率である。サイコロの例えでは何面体のサイコロをもちいるかに対応する。
ｐ＝Ｍｔｏｌ＊Ｍｃｅｎｔｅｒ／（Ｍｍａｘ−Ｍｍｉｎ）
である。
ここで、「Ｍｔｏｌ」は、相対値（例えば、％，ｐｐｍなど）で表した許容質量誤差であり、「Ｍｃｅｎｔｅｒ」は、測定質量範囲の中心値であり、「Ｍｍａｘ」および「Ｍｍｉｎ」は、測定質量範囲のそれぞれ上下限値である。
【０１３２】
なお、確率値Ｐａｓｓｉｇｎは、信頼性の高い結果では非常に小さくなり直感的な相互比較が難しいため、本実施の形態においては、−ｌｏｇＰａｓｓｉｇｎをアサインスコアとする。
【０１３３】
一方、アサインスコア算出部１０２ｉにより算出されたアサインスコアのうち有意なものを評価するための閾値は、候補配列同定部１０２ｊによって、一例として以下のように求められる。
【０１３４】
すなわち、候補配列同定部１０２ｊは、本実施の形態において、アサインスコアの閾値として、「データベースの大きさに依存した閾値」および／または「スコア分布に依存した閾値」を以下のように算出する。
【０１３５】
ここで、「データベースの大きさに依存した閾値」とは、設定した危険率で偶然生じてしまう場合のアサインスコアを閾値とするものである。具体的には、ある候補を偶然同定する確率を「Ｐ」（ここで、ランダムであるのでどの候補を同定する確率も同じであると考える）とし、候補断片配列の数を「Ｎ」、全候補から一つでも偶然同定する確率、すなわち危険率を「ｐ」とすると、
ｐ＝１−（１−Ｐ）Ｎ
となる。
【０１３６】
これをＰについて解くと、
Ｐ＝１−（１−ｐ）１／Ｎ
となる。
ここで、危険率ｐとしては、通常０．０５をもちいるが、解析目的やもちいる質量分析計の質量精度に応じて、０．０１など異なる値をもちいてもよい。
【０１３７】
したがって、Ｐ以下の確率で、断片配列を同定することができれば、その同定はランダムではないといえる。
【０１３８】
すなわち、上述のアサインスコアと同様に対数で表すと、アサインスコア算出部１０２ｉによってスコア付けされたアサインスコアである「−ｌｏｇＰａｓｓｉｇｎ」が、候補配列同定部１０２ｊにより算出された閾値である「−ｌｏｇＰ」よりも大きければ、有意な同定であると評価でき、候補配列同定部１０２ｊは、当該候補断片配列を候補断片配列として同定断片表１０６ｋに格納する。
【０１３９】
ここで、他の同定評価方法として、「スコア分布に依存した閾値」を用いてもよい。「スコア分布に依存した閾値」としては、例えば、あるアサインスコアが、不正解である大多数の断片配列に対するアサインスコアの分布からどの程度離れているかを示す指標を用いる。例えば、スコア分布が正規分布とみなせる場合には、以下の計算式によるｚ−スコアＺを用いてもよい。
Ｚ＝（ｓ−Ｓｍｅａｎ）／σ
ここで、ｓはある断片配列のスコア、Ｓｍｅａｎは全ての断片配列に対するスコアの平均値、σはスコアの標準偏差である。
【０１４０】
なお、ｚ−スコアの閾値としては、スコア付け方法やデータベースの種類などにより異なるため、実験条件に応じて指定してもよい。
【０１４１】
［マッピング処理］
次に、マッピング処理について、以下に図７および図８を参照して詳細に説明する。
【０１４２】
ここで、マッピング処理において、核酸配列に含まれる断片配列の種類と数に基づいてマッピングを行ってもよい。なお、各断片配列の出現確率を数え上げによる算出に限らず、長さ毎の平均出現確率やその他の推定出現確率を用いてもよい。
【０１４３】
出現確率算出部１０２ｋは、核酸配列ＤＢ１０６ａに記憶された核酸配列のうち検索対象として予め指定した核酸配列の集合内での断片配列の出現確率を算出し、エントリースコア付け部１０２ｐは、出現確率算出部１０２ｋにより算出された出現確率に基づいて、同定断片表１０６ｋの同定断片配列と、核酸配列ＤＢ１０６ａから取得した核酸配列を比較することにより、核酸エントリーにマッピングスコアを付ける。エントリー同定部１０２ｑは、これらのマッピングスコアに基づいて、尤もらしい（例えば、最も確からしい）核酸エントリーを同定する。ここで、図７は、本実施の形態におけるマッピング処理の一例を示すフローチャートである。
【０１４４】
図７に示すように、まず、エントリースコア付け部１０２ｐは、断片配列表１０６ｅの断片配列リストを読み込む（ステップＳＣ−１）。
【０１４５】
そして、エントリースコア付け部１０２ｐは、候補配列同定部１０２ｊが出力した同定断片配列リストを読み込む（ステップＳＣ−２）。
【０１４６】
ここで、断片配列表１０６ｅの断片配列、および、同定断片表１０６ｋの同定断片には、次の処理が行われていてもよい。すなわち、修飾変換部１０２ｎは、核酸配列ＤＢ１０６ａの核酸配列がＤＮＡ配列等であり、修飾がない場合には、同定断片配列から修飾を除き、修飾を除いた元の配列としてもよい。また、修飾変換部１０２ｎは、修飾を取った同定断片配列リストに重複が生じた場合には、重複を取り除いてもよい。また、断片化部１０２ｂは、各核酸エントリー（またはサブエントリー）を、仮想的に断片化して生じる断片配列が重複する場合、重複を取り除いてもよい。また、断片化部１０２ｂは、指定された検索条件［考慮する最大の切れ残り］に従って、切れ残り断片を派生させた断片についても（最大切れ残りが１箇所と指定された場合、特異的残基のうち１箇所について断片化しない断片配列についても）、予め断片配列表１０６ｅに格納してもよい。
【０１４７】
そして、出現確率算出部１０２ｋは、以下の出現確率算出処理を行う（ステップＳＣ−３）。ここで、図８は、本実施の形態における出現確率算出処理の一例を示すフローチャートである。
【０１４８】
すなわち、図８に示すように、出現確率算出部１０２ｋは、断片配列表１０６ｅの断片配列リスト（ＤＢ）に対して（ステップＳＣ−３１）、断片配列リスト（ＤＢ）の各断片配列が、同定断片表１０６ｋの同定断片リストにマッチするかを判断する（ステップＳＣ−３２）。
【０１４９】
そして、出現確率算出部１０２ｋは、同定断片配列リストにマッチすると判断した場合（ステップＳＣ−３２：Ｙｅｓ）、各断片のマッチ数を断片ごとにカウントする（ステップＳＣ−３３）。
【０１５０】
一方、出現確率算出部１０２ｋは、同定断片配列リストにマッチしないと判断した場合（ステップＳＣ−３２：Ｎｏ）、該当する断片配列を非同定断片として、その総数をカウントする（ステップＳＣ−３４）。
【０１５１】
そして、出現確率算出部１０２ｋは、ステップＳＣ−３１〜ステップＳＣ−３５の処理をループさせ（ステップＳＣ−３５）、断片配列表１０６ｅの全断片配列についてカウントする。
【０１５２】
そして、出現確率算出部１０２ｋは、断片配列表１０６ｅの全断片数を算出する（ステップＳＣ−３６）。
【０１５３】
そして、出現確率算出部１０２ｋは、全断片数に対する各同定断片数の割合をその同定断片の出現確率として算出する（ステップＳＣ−３７）。ここで、全断片数に対する非同定断片の総数の割合をそれぞれの非同定断片の出現確率とする。
【０１５４】
なお、出現確率算出部の一部を候補配列同定部より前に行う場合は、ここで同定断片リストを参照して全非同定断片の出現確率の和を求めて、これをそれぞれの非同定断片の出現確率とする。
【０１５５】
［ＭＳ／ＭＳイオン検索処理］の候補配列同定部１０２ｊで１つのピークリストのプリカーサイオンから複数の断片配列が同じアサインスコアで同定された場合、これらの断片配列は区別ができないため、複数の断片配列の出現確率の和を算出し、これをそれぞれの断片配列の出現確率としてもよい。
【０１５６】
再び図７に戻り、エントリースコア付け部１０２ｐは、核酸エントリー（サブエントリーを含む。）のマッピングスコア算出処理を行う（ステップＳＣ−４）。
【０１５７】
マッピングスコアの算出においては、同定断片配列と断片配列の対応付けを行い、マッチしたものとマッチしなかったものを、それぞれカウントすることにより、出現確率を考慮してマッピングスコアを算出する。すなわち、本実施の形態においては、マッチは独立事象とするが、マッチ確率は一定と仮定せず、各断片配列の実際のデータベース内での出現確率に従ってマッピングスコアを算出する。換言すれば、エントリースコア付け部１０２ｐの処理により、個々の断片配列はランダムかつ独立に出現すると仮定して、ある核酸エントリーの核酸配列に断片配列の組が偶然共存する確率を算出する。そして、エントリースコア付け部１０２ｐは、核酸エントリーから生じる各断片配列の出現確率を乗じることでこの選択確率（確率を−ｌｏｇを取ってスコア化してもよい）を算出する。この偶然共存する確率が小さく起こりにくい場合ほどそのエントリーが元の試料に含まれていた可能性が高いと考える。
【０１５８】
すなわち、本実施の形態におけるマッピングスコアは、次のように求められる。検索対象核酸配列データベース内でのマッチ断片の出現確率をそれぞれｐＡ、ｐＢ、ｐＣ、・・・、マッチしない断片の出現確率の和をｐｎｏｔとし、あるエントリーの全断片数をＮ、マッチ断片数をａ、ｂ、ｃ、・・・、マッチしない断片の総数をｎｎｏｔとすると、そのエントリーが偶然に同定される確率Ｐｅｎｔｒｙは、
Ｐｅｎｔｒｙ＝Ｎ！／（ａ！＊ｂ！＊ｃ！＊・・ｎｎｏｔ！）＊ｐＡ＾ａ＊ｐＢ＾ｂ＊ｐＣ＾ｃ＊・・・・ｐｎｏｔ＾ｎｎｏｔ
となる。
【０１５９】
ここで、繰り返し配列の重みを考慮し、エントリー内での各断片を重複を除いたユニークなものとして考えると、あるエントリーの全断片数は断片の種類数となるのでこれをＭとし、マッチ断片数はそれぞれ１となるので、Ｐｅｎｔｒｙは、次式で求められる。
Ｐｅｎｔｒｙ＝Ｍ！／（ｎｎｏｔ！）＊ｐＡ＊ｐＢ＊ｐＣ＊・・・・（ｐｎｏｔ）＾ｎｎｏｔ
この選択確率Ｐｅｎｔｒｙの−ｌｏｇを取ってスコア化したものをマッピングスコアとしてもよい。
【０１６０】
再び図７に戻り、エントリー同定部１０２ｑは、エントリースコア付け部１０２ｐで付けたマッピングスコアに基づいて、核酸エントリーを整列化（例えば、降順にソート）する（ステップＳＣ−５）。
【０１６１】
そして、エントリー同定部１０２ｑは、マッピングスコアの閾値を算出する（ステップＳＣ−６）。ここで、エントリースコア付け部１０２ｐは、データベースの大きさに依存した閾値を算出してもよい。すなわち、エントリースコア付け部１０２ｐは、全ての核酸エントリーのマッピングスコアについて、上述のようにｚ−スコアを算出してもよい。
【０１６２】
そして、エントリー同定部１０２ｑは、所定の閾値（例えば、利用者に検索条件として指定させた閾値）以下のマッピングスコアを有する核酸エントリーについて排除して、同定核酸エントリー表１０６ｍを作成する。すなわち、エントリー同定部１０２ｑは、所定の閾値よりスコアが高ければ、このスコアを与えた核酸エントリーを同定核酸エントリーとする。
【０１６３】
［ＩＶ．実施例］
（実施例１）
ここで、配列と分子量の情報量の差について図９を参照して説明する。従来の断片分子量の組をもちいてゲノム上の位置を同定する方法と本発明の断片配列の組をもちいてゲノム上の位置を同定する方法との識別能力の差を簡単な計算に見積る。
【０１６４】
ＡＣＵＧＡＵＣＧＣＵＡＧというＲＮＡだけからなるデータベースの存在を仮定する。このＲＮＡをＲＮａｓｅ  Ｔ１で消化したときに生じる断片配列は｛ＡＣＵＧ，  ＡＵＣＧ，  ＣＵＡＧ｝であり、分子量はどの配列も１３０３．１７５なので｛１３０３．１７５｝となる。ただし、断片の５’末端はＯＨ、３’末端は環状リン酸基とする。この例の場合、配列からは３つの断片をそれぞれ識別出来るのに対して、分子量は全て同じ値となるため分子量からではどの断片かを識別出来ない。このように、あるデータベース、断片化条件を設定したときに生じうる断片配列数および断片分子量数を比較すれば配列と分子量を同定にもちいる際の識別能力の差を見積もることが出来る。
【０１６５】
まず原理的に可能なＲＮＡ断片について考える。断片化法としてはＲＮａｓｅ  Ｔ１を仮定し、断片化は完全に進行すると仮定する。
【０１６６】
次に、実際の生物ゲノムでは構造的、生理的なバイアスが掛かるため、原理的に可能な全ての配列が現れるわけではない。したがって、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムから生じうるＲＮａｓｅ  Ｔ１断片ヌクレオチドを考える。ゲノムを裏表双方向で転写して生成したＲＮＡをさらにＲＮａｓｅＴ１で断片化して生じる断片について配列、組成を数え上げた。
【０１６７】
実施例１において、一般的なＲＮａｓｅ  Ｔ１断片の配列は、ＸのＮ−１回の繰り返し・Ｇと表現できる。ここで、ＸはＡ，Ｃ，Ｕ残基のいずれかを表し、Ｎは鎖長を表す。このとき鎖長Ｎの断片配列数は３Ｎ−１となる。４〜１９残基の断片について鎖長ごとの配列数を図９に示した（配列１）。図９の横軸は鎖長、縦軸はｌｏｇ１０変換した種類数である。
【０１６８】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムをＲＮａｓｅ  Ｔ１で断片化した結果、４〜１９残基の断片について３６０７２６種類の断片配列が生成した。これらの断片について鎖長ごとに配列数を数え図９に示した（配列２）。鎖長が１０以上では予想通り原理的に可能な配列数と実際にゲノム上に現れる配列数は乖離した。したがって、１０残基を超える鎖長では、可能な全ての配列を考慮しなければならないｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇに対して、実際にゲノム上に現れる配列とその派生物のみを考えればよいＭＳ／ＭＳイオン検索の方が必要とする計算量が少ない。
【０１６９】
（比較例）
上記実施例と同じ場合について考える。まず、分子量の意味について確認すると、誤差無しで分子量を決めた場合に得られる最も意味のある構造上の情報は、断片の残基組成である。そこで、簡単のため本比較例では断片分子量数の代わりに断片残基組成数をもちいて、断片配列数と比較することにする。
【０１７０】
上述の一般的なＲＮａｓｅ  Ｔ１断片配列から組成数を算出すると、断片の長さをＮ残基とすれば３’末端Ｇを除いた鎖長Ｎ−１部分ではＧ以外の３種類の残基｛Ａ，Ｃ，Ｕ｝が考えられるので、３種類の残基から重複を許してＮ−１個を取り出す組み合わせ（３＋Ｎ−２）ＣＮ−１となる。この式から算出した４〜１９残基の断片について鎖長ごとの組成数を図９に示した（組成１）。全ての鎖長で実施例の配列種類数の方が多く、識別能力が高いことがわかった。また、鎖長が長くなるに伴い配列と組成数の差は増大した。１０残基程度の鎖長では数百倍の違いがあった。
【０１７１】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノムをＲＮａｓｅ  Ｔ１で断片化した結果、４〜１９残基の断片について１２２３種類の塩基組成（分子量も１２２３種類）が得られた。したがって、平均的には配列は組成の３００倍程度種類数があった。これらの断片について鎖長ごとに組成数を数え図９に示した（組成２）。組成は鎖長が１０以上でも原理的に可能な配列数と実際にゲノム上に現れる組成数の乖離が少なかった。８残基以上のどの鎖長でも配列数は組成数の数百倍であった。
【０１７２】
（実施例２）
以下に、本ＲＮＡ同定装置１００にかかる実施例２−１〜３を、図１０〜図２２を参照して説明する。ここで、図１０は、無細胞合成アフリカツメガエルサイクロフィリンＡ（ｘＣｙＰＡ）  ｍＲＮＡ  ＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ結果を本発明により検索したスコアヒストグラムである。図１１は、正解データベースに対して検索した結果の比較の一例を示す図である。また、図１２は、ｔＲＮＡ−Ｐｈｅ  ＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。また、図１３は、ｔＲＮＡ−ＰｈｅをＤＮＡ配列に対して検索した結果を示す図である。また、図１４は、ＭＳ／ＭＳスペクトルとプロダクトイオンのアサインの一例を示す図である。また、図１５は、酵母  ｔＲＮＡ混合物をイオン交換クロマトグラフィーで分取する際のクロマトグラムを示す図である。また、図１６は、酵母  ｔＲＮＡ，  陰イオン交換の画分Ｎｏ．１０の逆相ＬＣによる脱塩・精製を示す図である。また、図１７は、酵母  ｔＲＮＡ混合物フラクション１０−２  ＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムである。また、図１８は、酵母  ｔＲＮＡ混合物フラクション１０−２  ＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物検索結果のスコアヒストグラムである。また、図１９〜図２２は、マッピングにより同定した配列領域の一例を示す図である。
【０１７３】
＜材料・方法＞
ここで、本実施例２−１〜３において用いた材料および方法を以下（１）〜（９）に示す。
【０１７４】
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
実施例２−１において、Ａｍｂｉｏｎ（会社名）社のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキットを用いて、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ  Ａ（ＣｙｐＡ）  ｃＤＮＡ（ｒｅｆ｜ＮＭ＿００１０８９１９０．１｜）、および、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ  ＦＫ５０６結合タンパク質（ｘＦＫＢＰ）遺伝子を、それぞれグロビン遺伝子の３´ＵＴＲ領域に挿入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＮ３  ｖｅｃｔｏｒ（浅島誠博士からの提供）を作成した。そして、作成したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＮ３−ｘＣｙｐＡ  ｖｅｃｔｏｒ、および、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＲＮ３−ＸＦＫＢＰ  ｖｅｃｔｏｒを鋳型として、無細胞転写系で、グロビン由来の配列にｘＣｙＰＡ配列またはｘＦＫＢＰ配列を含むｍＲＮＡを合成した。合成したｍＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（商品名）により精製し、純度をポリアクリルアミドゲル電気泳動法により確認した。
【０１７５】
（２）ＲＮＡ
実施例２−２，３において、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡ−Ｐｈｅ、および、酵母  ｔＲＮＡ混合物（ｔＲＮＡ  ｔｙｐｅＸ，  ｆｒｏｍ  ｂａｋｅｒ’ｓ  ｙｅａｓｔ）は、Ｓｉｇｍａ（会社名）から購入した。ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔ１（ＲＮａｓｅ  Ｔ１）はＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（会社名）から購入した。
【０１７６】
（３）イオン交換クロマトグラフィーによる未知ＲＮＡの精製
実施例２−３において、ｔＲＮＡ混合物１００ｕｇをイオン交換クロマトグラフィーで分離し、各ピークを分取した（図１５）。そして、４８分付近のフラクション（図１５のフラクション１０）全量をさらに逆相ＨＰＬＣで精製した。分取したフラクション（図１６のフラクション１０−２）は、凍結乾燥またはエタノール沈殿で溶媒を除去し、−２０℃で保存した。
【０１７７】
（４）ＲＮａｓｅ  Ｔ１消化
ＲＮａｓｅ  Ｔ１は使用前に硫安を除去するために、逆相カラムで精製・凍結乾燥した。その後、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅが混入していない（「ｆｒｅｅ」の）滅菌水（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（会社名））で再溶解した。試料ＲＮＡを消化緩衝液（１０ｍＭ  酢酸アンモニウムバッファー（ｐＨ５．３））に０．２５ｕｇ／ｕＬになるように溶解した後、１／５００量（重量比）のＲＮａｓｅ  Ｔ１を添加して３７℃で３０分間、断片化した。酵素消化物は、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）で直ぐに分析した。
【０１７８】
（５）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳには、プロテオミクス用のナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステム（Ｔ．  Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００２，  ７４，  ４７２５−４７３３）を用いた。ただし、以下に示す各項目（ａ）〜（ｄ）はＲＮＡ用に変更した。
（ａ）カラム充填剤：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３（野村化学（会社名））、カラムサイズ：１００μｍＩＤｘ５０ｍｍＬ
（ｂ）溶媒Ａ：１０ｍＭ  トリエチルアミン−酢酸水溶液（ＴＥＡ−ＡＡ）  ｐＨ７．０、Ｂ：メタノール（ＭｅＯＨ）
（ｃ）溶離条件：流速１００ｎＬ／ｍｉｎでＢ１０−４０％まで６０分で直線的に上昇させた。
（ｄ）質量分析装置：Ｑ−Ｔｏｆ  Ｕｌｔｉｍａ（ウォーターズ（会社名））、イオン化電圧：−１２００Ｖ（ネガティブモード）、測定質量範囲（ｍ／ｚ）：４００−１６００
【０１７９】
（６）ＭＳ／ＭＳイオン検索
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果から、ＭａｓｓＬｙｎｘ（ウォーターズ（会社名））およびＳｐｉｃｅＣｍｄ（三井情報システム（会社名））を用いてピークリストを作成した。
【０１８０】
（７）Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ合成ｍＲＮＡ用の検索条件等
実施例２−１において、ｘＣｙｐＡおよびｘＦＫＢＰ合成ｍＲＮＡのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析結果を、ｘＣｙｐＡおよびｘＦＫＢＰ配列のみを含む核酸配列ＤＢ、または、ヒト参照配列（ｒｅｆｓｅｑ＿ｈｕｍａｎ（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２７，  ２００８−０２−１８  ｄｏｗｎｌｏａｄ，  Ｈ．  ｓａｐｉｅｎｓ  ３８，８６４  ｅｎｔｒｉｅｓ））にｘＣｙｐＡおよびｘＦＫＢＰ配列を加えた核酸配列ＤＢ（マージＤＢ）に対して検索した。なお、ヒト参照配列に対して、ｘＣｙｐＡおよびｘＦＫＢＰ配列をクエリーとしてｂｌａｓｔ検索して有意な相同性を持つｍＲＮＡは検出されなかったので、ヒト参照配列にｘＣｙｐＡおよびｘＦＫＢＰ同定の際に偽陽性がでないことを確かめるために使用できることを確認した。すなわち、全てのＭＳ／ＭＳはｘＣｙｐＡあるいはｘＦＫＢＰを一位として同定することが期待出来る。本実施例では、ｘＣｙｐＡおよびｘＦＫＢＰのみの核酸配列ＤＢで同定されたヌクレオチドの結果を複数の研究者により目視で確認し、同定に問題が無いことを確認した。次にこのデータセットをマージＤＢに対してＭＳ／ＭＳイオン検索後、マッピングした。マッピングによりヒト参照配列由来のエントリーを同定した場合には、そのエントリーは不正解と判定した。
【０１８１】
（８）Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡ−Ｐｈｅ用の検索条件等
実施例２−２において、ｔＲＮＡ用の核酸配列ＤＢは、Ｇ  ｔＲＮＡ  ｄｂ（ｈｔｔｐ：／／ｌｏｗｅｌａｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ＧｔＲＮＡｄｂ／）から、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＤＮＡ配列をダウンロードして用いた。修飾条件は、ＡＣＧＵ４種類の塩基、または、糖２’ＯＨへのメチル化およびＵに対するジヒドロ化を考慮した。また、一つの断片に同時に生じる最大修飾数は「２」とした。また、最大切れ残りは「２」とした。そして、ＭＳ／ＭＳイオン検索で修飾を含む断片配列を同定した場合には、これらの断片から修飾を除去した元の配列に戻して核酸配列ＤＢへのマッピングを行った。修飾を除去した結果、切れ残り断片になってしまう場合には、さらに完全消化断片の組に変換してからマッピングした。
【０１８２】
（９）Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡ混合物用の検索条件等
実施例２−３において、混合物について用いる核酸配列ＤＢは、ｍＮＣＢＩ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／Ｆｕｎｇｉ／Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ＿ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ／）から、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノム配列をダウンロードして用いた。３残基以下の断片は無視し、サブエントリー長は１００断片、切れ残りおよび修飾は考慮せず検索した。
【０１８３】
＜結果＞
上記材料および方法を用いて、以下の実施例２−１〜３に示す結果を得た。
（実施例２−１）無細胞合成ｍＲＮＡを用いたＭＳ／ＭＳイオン検索の有効性の確認と混合物への適用
ｘＣｙｐＡ  ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ  Ｔ１消化物のＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータから抽出したピークリストについて、ｘＣｙｐＡのみの核酸配列ＤＢに対して検索を行った。検索条件の消化時の許容最大切れ残りは「０」または「２」とした。
【０１８４】
本発明のＭＳ／ＭＳイオン検索により許容最大切れ残りは「０」、「２」いずれの場合でも同じ６６種類の断片を同定した。この同定断片配列リストに対応する断片のプリカーサイオンの単同位体選択、プリカーサイオンの電荷、主要なプロダクトイオンのアサインについて目視で確認して、６６種類全てを正解と判定した。計算上、ｘＣｙｐＡをＲＮａｓｅ  Ｔ１で消化した場合に生じる断片は８７種類であり、このうち今回のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定質量範囲に含まれる４残基以上は７５種類である。したがって、正解は全体の８８％を含んでいた。
【０１８５】
また、これらをマージＤＢに対して検索した結果、１．変化無し（ｘＣｙｐＡを１位で同定）は５７種類、２．データベースが大きくなったため閾値が上がり同定ではなくなったものは０種類、３．ｘＣｙｐＡ以外の配列を同定としたものは９種類であった。
【０１８６】
ここで、上述の質量（ＭＳ／ＭＳ）検索により同定断片配列リストを用いて、エントリースコア付け部１０２ｐおよびエントリー同定部１０２ｑにより核酸配列ＤＢにマッピングする２段階検索した。２段階検索（１段階目：断片に対するアサイン、２段回目：核酸配列ＤＢに対するマッピング）により、１段階目のＭＳ／ＭＳイオン検索結果に不正解が含まれていた場合でも、２段階目で正しいＲＮＡを同定することが可能であった。
【０１８７】
同様に、ｘＦＫＢＰのＲＮａｓｅ  Ｔ１断片のＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータから抽出したピークリストをｘＦＫＢＰ配列のみのＤＢに対して検索した結果、８０％以上の配列網羅率が得られた。次に同様にマージＤＢに対して２段階検索したところ、ｘＣｙｐＡ同様、１段回目のＭＳ／ＭＳイオン検索結果に不正解が含まれている場合でもｘＦＫＢＰを正しく同定することが可能だった。
【０１８８】
次に、本発明が混合物に適用できるかどうか検討した。
【０１８９】
２つの遺伝子それぞれのピークリストを混合して、本評価で用いるピークリストとした。
【０１９０】
このピークリストを、マージＤＢに対して検索した結果を解析することで、混合物試料中で正解同士を区別する能力、正解と不正解を区別する能力をそれぞれ評価出来ると考えた。
【０１９１】
図１０および図１１にマージＤＢに対して検索して、ｘＣｙＰＡとｘＦＫＢＰの混合物から、それぞれを同定した結果を示す。図１０はマッピングスコアを横軸に、ｌｏｇ１０変換したスコア頻度を縦軸としたマッピングヒストグラムである。図１１に示すように、ＣｙＰａおよびＦＫＢＰそれぞれのマッピングスコア、同定断片数、指定した断片化法（本実施例ではＲＮａｓｅ  Ｔ１）により生じうる断片数、同定断片がＲＮＡ中で生じる位置を示す断片番号が示されている。なお、グロビン由来の配列はｃｙｐａ転写物およびＦＫＢＰ転写物の両者に含まれるため両者で重複しているため、グロビン由来の断片オリゴヌクレオチドの共通部分は混合物中で区別できないが、ｃｙｐａ，ＦＫＢＰ遺伝子本来の配列間には有意な相同性が無い。このように本発明の二段階検索をもちいることで、相同な部分を含むＲＮＡの混合物であってもそれぞれのＲＮＡを同定可能だった。
【０１９２】
（実施例２−２）修飾を伴う条件でＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔＲＮＡ−Ｐｈｅのゲノム配列データベースに対する検索による同定
以下に、実施例２−２として、転写後修飾された試料において検討した結果の詳細を示す。機能性ＲＮＡは、しばしば転写後にメチル化などの修飾を受ける。これらの修飾は、ＲＮＡの機能発現に重要な役割を担っている場合もあり、ＲＮＡ解析方法では、修飾を含む配列も同定出来ることが望ましい。本実施例では、修飾テーブル（修飾種およびその質量の対応表）、および、最大許容修飾数を設定することで、ＤＮＡ配列データベースのような修飾情報を含まない核酸配列ＤＢに対して検索する場合でも、検索時に動的に修飾配列を生成して実測データとの照合を行うことが可能となることを示す。以下では、この修飾を伴う条件でＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｔＲＮＡ−Ｐｈｅを解析した例を示す。
【０１９３】
まず、本検索において、検索条件として適切な設定修飾パラメータ値を見積もるために修飾の種類と頻度を調べた。調査対象ＲＮＡは、最も修飾頻度が高いｔＲＮＡを用い、修飾を含む配列情報はｔＲＮＡ  ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎデータベースから取得した。各ｔＲＮＡ配列はＲＮａｓｅ  Ｔ１断片化したオリゴヌクレオチドとし、重複したオリゴヌクレオチドは削除した。
【０１９４】
その結果、Ｅ．  ｃｏｌｉでは２３２種類、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは２２９種類の対象核酸配列を得た。これらのオリゴヌクレオチドを下記分類規則（ａ）〜（ｃ）に従って分類した（下表参照）。
（ａ）未修飾または質量変化無
質量分析で検出しうる修飾は質量変化を伴うものだけなので、最も多い修飾種である偽ウリジンは修飾無しの通常塩基と同じ分類とした。
（ｂ）メチル化またはジヒドロ化
次に多い修飾種はメチル化、ジヒドロ化の順であった。検索条件として設定するためには個々の修飾毎に上限値を定めるのではなく全部の修飾数として設定出来ることが望ましい。このため、これらの修飾はまとめて扱い、それらの合計数で分類した。
（ｃ）その他
偽ウリジン化、メチル化、ジヒドロ化以外の修飾はまとめて扱い、合計数をその他とした。
【表１】
0005610347.tif 000002
【０１９５】
種により修飾種や数が異なっていたが、修飾種として修飾無し、偽ウリジン化、メチル化、ジヒドロ化を考え、メチル化またはジヒドロ化の最大数を「２」とすれば、Ｅ．  ｃｏｌｉで１７８種類（全体の７７％）、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで１８９種類（全体の８３％）を含むので、ＲＮＡの同定には十分と考えた。すなわち、最大修飾数を「３」、「４」と増やしても、計算量は急激に増加するのに対し、対応出来る配列数はほとんど増えないので、この点からも最大修飾数は「２」で十分と考えた。さらに、多くの修飾を含む配列を対象とするためには、対象修飾種をメチル化、ジヒドロ化とし最大修飾数を「２」として通常のデータベースで検索した結果得られたＲＮＡ配列のみを検索対象として、さらに多くの修飾条件を設定して検索することが有効と考える。
【０１９６】
また、切断部位の修飾に伴い切れ残り断片が生成する（多くの修飾塩基はＲＮａｓｅに認識されない）ので、併せて最大許容切れ残り数も検索条件として設定出来るようにした。この検索条件は、消化状況に合わせて最大修飾数と同じかそれ以上の値を設定することが好ましい。
【０１９７】
上記調査の結果、今回の検索では、考慮する修飾種をメチル化、ジヒドロ化とし、最大修飾数を「２」とし、最大許容切れ残り数を（最大修飾数に合わせて）「２」とした。
【０１９８】
続いて、上述の検索条件を用いて、市販のｔＲＮＡ−ＰｈｅをＲＮａｓｅ  Ｔ１で消化し、５００ｆｍｏｌを上述の方法によりＬＣ−ＭＳ／ＭＳ測定した（図１２参照）。得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、目視でｔＲＮＡ−Ｐｈｅ由来の配列と照合して、複数の研究者が確認して同定した（図１３参照）。そして、これらのＭＳ／ＭＳピークリストを評価用ピークリストセットとした。
【０１９９】
検索する核酸配列ＤＢとして、Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔＲＮＡ  ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｌｏｗｅｌａｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ＧｔＲＮＡｄｂ／）から取得したＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡに関する、２７５種類中の同一配列を同じ核酸配列エントリーに整理した７２種類の配列を用いた。評価用ピークリストセットを、この核酸配列ＤＢに対して検索した。主な検索条件として、許容質量誤差（プリカーサイオン）は５００ｐｐｍ、許容質量誤差（プロダクトイオン）は５００ｐｐｍ、最大修飾数は２、ヌクレアーゼはＲＮａｓｅ  Ｔ１、最大切れ残り数は「２」、考慮する最小ヌクレオチドは「４塩基以上」を設定した。
【０２００】
図１３に、ｔＲＮＡ−Ｐｈｅ遺伝子のＤＮＡ配列を転写したＲＮＡ配列を、ＲＮａｓｅ  Ｔ１で消化して得られた断片配列のリストを示す。図１３に示すように、完全消化断片の全てとともに、同定した切れ残り断片を示す。なお、ｙＷ修飾に伴う配列削除部分はコメントに記した。また、ＭＳ／ＭＳスペクトルから目視により同定した断片は、丸印または二重丸印で示した１２種類であった。このうち、本実施例における検索対象としては、２５−３０番（ジメチル化を含む）および３１−６０番（配列の切断・繋ぎ換えとｙＷを含む）を除く１０種類であり、そのうち９種類のヌクレオチドが同定できた。同定できたヌクレオチドのうち修飾を含む断片は６種類（５修飾部位）であった。
【０２０１】
なお、図１３に示すように、本実施例２−２において同定出来なかったヌクレオチドは、６４ＧＵＣＣＵ６９Ｇ（６４  ｍ７Ｇ）であった。このヌクレオチドはＬＣ−ＭＳでピーク強度が弱く、ＭＳ／ＭＳスペクトルの質が低かった。ｍ７Ｇは、ｐＨ中性で正電荷を持つためイオン化効率あるいはプロダクトイオンの生成効率が通常のヌクレオチドより低く、同定出来なかった可能性がある。
【０２０２】
図１４に、本発明のＭＳ／ＭＳイオン検索により修飾を含む配列ＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡ（部位：５−１５、１０Ｇのメチル化）を同定したＭＳ／ＭＳスペクトル（上図）とプロダクトイオンのアサイン（下図）を示す。図１４中に、同定配列から予想される各プロダクトイオンの質量を示す。例えば、ｃ１−系列（１−はネガティブモードの一価イオンを表す）の＃１は、ｃ１−１のプロダクトイオンに対応する計算プロダクトイオン質量が「３２８．０４５」であることを示している。
【０２０３】
また、図１４の計算プロダクトイオン表中の下線は、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータから抽出された実測プロダクトイオン質量の値とマッチしたことを示す。この結果が示す通り、例えば、５´側からｃ１−１〜ｃ１−５までのプロダクトイオンの質量が一致し、一方、３´側からｙ１−１〜ｙ１−７までのプロダクトイオンの質量が一致していることがわかるので、５´側から６番目のＧが修飾を受けていることがわかる。すなわち、同定したＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧの６番目のＧがメチル化していることを特定した。
【０２０４】
このように、ＭＳ／ＭＳスペクトルデータを用いて検索することにより、修飾の有無だけでなく修飾部位を同定することが可能である。なお、この６番目のＧ（ｔＲＮＡ全体では１０番）は、２−メチル化していることが知られており、上記ＭＳ／ＭＳスペクトル検索の結果と一致していた（文献「ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ＬＷ，  Ｃｒａｍｅｒ  Ｆ，  Ｓｐｒｉｎｚｌ  Ｍ．  “Ｒａｐｉｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔＲＮＡｐｈｅ  ｆｒｏｍ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｆｔｅｒ  ＲＮａｓｅ  Ｔ１  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｓｉｌｉｃａ  ａｎｄ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  Ｃ１８−ｓｉｌｉｃａ．”  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９８１  Ｍａｒ  １５；１１２（１）：６０−９．」を参照）。
【０２０５】
以上、実施例２−２によれば、転写後修飾を含む試料を、修飾無しの核酸配列ＤＢに対して検索することにより、ＲＮＡと共にその修飾部位を同定することができることが分かった。すなわち、実施例２−２によれば、記憶した修飾規則を参照して、断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行い、修飾を含まない配列データベースに対して、試料に含まれるＲＮＡ中の転写後修飾の存在を検出しさらには修飾部位を特定することが出来ることが示された。
【０２０６】
（実施例２−３）Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｔＲＮＡ混合物中の未知ＲＮＡのゲノム配列データベースに対する検索による同定
つづいて、ｔＲＮＡ混合物中の未知試料を同定した実施例２−３を示す。このＲＮＡは市販のＲＮＡ混合物中に混在していたＲＮＡであり、ｔＲＮＡとは明らかに大きさが異なっていた。このＲＮＡを同定するために、ゲノム配列データベースに対して検索を行った。
【０２０７】
図１５に酵母（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）  ｔＲＮＡ混合物のイオン交換クロマトグラフィーの溶出プロファイル（Ａ２６０）を示した。大部分のＲＮＡは、約２２〜４５分までに一群となって溶離された。これらは相互に似た構造を持つｔＲＮＡと考えた。一方、図１５のフラクション１０に示すように４８分付近にもピークが検出された。イオン交換クロマトグラフィーでは核酸の鎖長が長いものほど保持が大きいことが知られているので、このＲＮＡは通常のｔＲＮＡより大きいことが予想された。
【０２０８】
つぎに、このフラクション１０を分取し、さらに逆相クロマトグラフィーで精製した（図１６のフラクション１０−２）。このピークの成分は、電気泳動で通常のｔＲＮＡより移動度が低くかった（すなわち分子量が大きかった）。この結果はイオン交換クロマトグラフィーの結果を支持する結果である。
【０２０９】
このことから、フラクション１０−２は、ｔＲＮＡ混合物に混入したｔＲＮＡ以外のＲＮＡであると考え、この試料をＲＮａｓｅ  Ｔ１で消化して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。図１７に、分析結果のＬＣ−ＭＳ／ＭＳクロマトグラムを示す。
【０２１０】
そして、この未知ＲＮＡのＭＳ／ＭＳピークリストについて、ｔＲＮＡ  核酸配列ＤＢに対してＭＳ／ＭＳイオン検索およびマッピングを行ったが、予想通り有意な同定結果が得られなかった。そこで、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノム配列に対してＭＳ／ＭＳイオン検索を行った。ここで、ゲノムの各染色体について重複を除いた１００断片ずつをサブエントリーとして分割した。
【０２１１】
その結果、図１８に示すように、染色体ＸＩＩ番の６つのサブエントリーが有意に同定された（図１８のマッピングスコア３５〜５５の範囲、縦軸はｌｏｇ１０）。これらのサブエントリー内で同定された配列近傍を比較すると、相互に高い相同性を持っていた。連続して断片が同定されている範囲をクエリーとして、ｂｌａｓｔ検索をＮＣＢＩｎｒに対して行うと、５Ｓ  ｒＲＮＡ（ｇｉ｜１７６４０５｜）と一致した。
【０２１２】
そして、今度は逆に、この５Ｓ  ｒＲＮＡ配列（配列番号１）をクエリーとして、Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅゲノム配列に対してｂｌａｓｔ検索すると、図１９〜図２２に示すように、染色体ＸＩＩ番に相同性９８％以上の配列領域を６つ検出した（順に配列番号２〜７）。この配列領域は、ＭＳ／ＭＳイオン検索結果のマッピングにより同定した配列領域であった。５Ｓ  ｒＲＮＡは約１２０残基とｔＲＮＡ（７０〜８０残基）よりも鎖長が長く、クロマトグラフィー、電気泳動の結果とも一致していた。
【０２１３】
以上、実施例２−３によれば、ＭＳ／ＭＳイオン検索結果を用いることで、未知ＲＮＡのゲノム上の位置を特定することが可能であることが分かった。このように、ゲノムのような大きなデータベースにも適用できることは、タンパク質とは異なりデータベースが未だよく整備されていないＲＮＡの検索・同定の分野において極めて有用であり、本ＲＮＡ同定装置１００が優位な効果を奏するものであることを示すものである。
【０２１４】
（実施例３）
次に、ＲＮＡ同定装置１００をサーバ装置４００とし、同定結果をサーバ装置４００からクライアント装置２００へ返すように構成したＲＮＡ同定システムの実施例を、図２３を参照して説明する。ＲＮＡ同定装置１００は、ルータ等の通信装置および専用線等の有線または無線の通信回線を介して、ネットワークに通信可能に接続されてもよい。
【０２１５】
本実施例にかかるＲＮＡ同定システムは、クライアント装置２００とサーバ装置４００とから構成され、これら装置はネットワーク３００を介して有線又は無線で通信可能に接続されている。クライアント装置２００は、ピーク取得部２０２ａ、検索条件入力部２０２ｐおよび結果出力部２０２ｑ等を備える制御部２０２と、ピークリスト、検索結果および結果レポート等を記憶する記憶部２０６と、入力部２１２と、出力部２１４と、を備える。クライアント装置２００は、制御部２０２で、タンデム質量分析データ（タンデム型質量分析器１０で生成された質量分析データ）を取得する。サーバ装置４００は、制御部４０２と記憶部（内部ＤＢ）４０６とを備え、核酸エントリー毎に核酸配列を記憶する外部データベース（核酸配列ＤＢ）５００とネットワーク６００を介して有線又は無線で通信可能に接続されている。
【０２１６】
ここで、図２３に示す各部は、検索条件入力部２０２ｐおよび結果出力部２０２ｑ並びに結果送信部４０２ｒを除いて図２の同名の各部と共通するため、本実施例では、当該共通するこれら各部の説明を省略する。
【０２１７】
検索条件入力部２０２ｐは、入力部２１２を介して入力された検索条件（残基配列特異的な切断方法等を少なくとも指定したもの）を、記憶部２０６に格納すると共にサーバ装置４００へ送信する検索条件入力手段である。結果出力部２０２ｑは、サーバ装置４００から送信された同定断片配列リスト（候補配列同定部４０２ｊで同定した断片配列である同定断片配列を含むもの）を、結果レポートとして記憶部２０６に格納すると共に出力部２１４を介して出力する結果出力手段である。
【０２１８】
制御部４０２は、ＤＢ加工部と、ＭＳ／ＭＳイオン検索部と、マッピング部と、整形・出力部とから構成される。ＤＢ加工部は、断片化部４０２ｂ、出現確率算出部４０２ｋおよび修飾変換部４０２ｎを備える。ＭＳ／ＭＳイオン検索部は、図示の如く、計算断片分子量算出部４０２ｃから候補配列同定部４０２ｊまでを備える。マッピング部は、エントリースコア付け部４０２ｐおよびエントリー同定部４０２ｑを備える。整形・出力部は、結果送信部４０２ｒを備える。結果送信部４０２ｒは、同定断片配列リストをクライアント装置２００へ送信する結果送信手段である。
【０２１９】
次に、このように構成された本実施例のＲＮＡ同定システムで行われる処理を以下に説明する。
【０２２０】
まず、ピーク取得部２０２ａは、残基配列特異的な切断方法（例えば、ヌクレアーゼによる酵素的な切断方法や、化学的な切断方法）で切断された同定対象のＲＮＡに対するタンデム質量分析データからピークを抽出することによりピークリストを作成し、作成したピークリストを記憶部２０６に格納すると共にサーバ装置４００へ送信する。また、検索条件入力部２０２ｐは、入力部２１２を介して入力された検索条件を記憶部２０６に格納すると共にサーバ装置４００へ送信する。
【０２２１】
そして、断片化部４０２ｂは、外部データベース５００に記憶された核酸配列エントリーリストに含まれる核酸配列をネットワーク６００経由で読み込む。そして、断片化部４０２ｂは、読み込んだ核酸配列を、記憶部４０６に記憶された断片化規則（残基配列特異的な切断方法に対応するもの）を参照して、クライアント装置２００から送信された検索条件に基づいて断片化することにより、当該核酸配列の断片配列を含む断片配列リストを作成する。ここで、ＤＢ加工部の処理として、出現確率算出部４０２ｋは、外部データベース５００に記憶された核酸配列エントリーリストから検索対象として予め指定した部分集合内での核酸配列の断片配列の出現確率を算出してもよい。また、ＤＢ加工部の処理として、修飾変換部４０２ｎは、修飾規則を参照して、断片配列において修飾配列と未修飾配列との変換を行ってもよい。具体的には、修飾変換部４０２ｎは、修飾の無い核酸配列に修飾を付加（断片配列ごとに修飾規則に基づいて修飾を付加した断片配列を生成）してもよく、また、同定断片配列を元の核酸エントリーの配列に対応付けて、核酸エントリーを同定するために同定した修飾付加断片配列から修飾を取ってもよい。
【０２２２】
そして、計算断片分子量算出部４０２ｃは、断片化部４０２ｂで作成した断片配列リストの全断片配列について計算断片分子量を算出することにより、当該計算断片分子量を含む計算断片分子量リストを作成する。一方、実測断片分子量抽出部４０２ｄは、クライアント装置２００から送信されたピークリストの各ピークから実測断片分子量を抽出することにより、当該実測断片分子量を含む実測断片分子量リストを作成する。
【０２２３】
そして、候補計算断片分子量抽出部４０２ｅは、計算断片分子量算出部４０２ｃで作成した計算断片分子量リストに含まれる計算断片分子量と、実測断片分子量抽出部４０２ｄで作成した実測断片分子量リストに含まれる実測断片分子量とを比較して、各ピークの実測断片分子量に対応する候補計算断片分子量を抽出することにより、当該候補計算断片分子量を含む候補計算断片分子量リストを作成する。
【０２２４】
そして、候補断片配列抽出部４０２ｆは、候補計算断片分子量抽出部４０２ｅで作成した候補計算断片分子量リストに含まれる各候補計算断片分子量に対応する断片配列である候補断片配列を、断片化部４０２ｂで作成した断片配列リストから抽出することにより、各ピークに対応する候補断片配列リスト（当該候補断片配列を含むもの）を作成する。
【０２２５】
そして、計算プロダクトイオン質量算出部４０２ｇは、断片化部４０２ｂで作成した断片配列リストに含まれる各断片配列について、所定の開裂規則に従って生成する各プロダクトイオンに対応する計算プロダクトイオン質量を算出することにより、当該計算プロダクトイオン質量を含む計算プロダクトイオン表を作成する。一方、実測プロダクトイオン質量抽出部４０２ｈは、クライアント装置２００から送信されたピークリストの各ピークから実測プロダクトイオン質量を抽出することにより、当該実測プロダクトイオン質量を含む実測プロダクトイオンリストを作成する。
【０２２６】
そして、アサインスコア算出部４０２ｉは、計算プロダクトイオン質量算出部４０２ｇで作成した計算プロダクトイオン表に含まれる計算プロダクトイオン質量と、実測プロダクトイオン質量抽出部４０２ｈで作成した実測プロダクトイオンリストに含まれる実測プロダクトイオン質量とを比較することにより、候補断片配列抽出部４０２ｆで作成した候補配列断片リストに含まれる全候補断片配列にスコアを付ける。
【０２２７】
そして、候補配列同定部４０２ｊは、アサインスコア算出部４０２ｉで全候補断片配列に付されたスコアに基づいて、候補断片配列抽出部４０２ｆで作成した候補断片配列リストに含まれる候補断片配列から、同定対象のＲＮＡの断片配列を同定することにより、当該同定した断片配列である同定断片配列を含む同定断片配列リストを作成する。ここで、エントリースコア付け部４０２ｐは、出現確率算出部４０２ｋで算出した断片配列の出現確率に基づいて、候補配列同定部４０２ｊで作成した同定断片配列リストに含まれる各同定断片配列と外部データベース５００で記憶した核酸配列とを比較することにより各核酸エントリーにマッピングスコアを付け、エントリー同定部４０２ｑは、付けたマッピングスコアに基づいて最も確からしい核酸エントリーを同定してもよい。
【０２２８】
そして、結果送信部４０２ｒは、候補配列同定部４０２ｊで作成した同定断片配列リストをクライアント装置２００へ送信する。なお、結果送信部４０２ｒは、エントリー同定部４０２ｑの処理結果もクライアント装置２００へ送信してもよい。
【０２２９】
そして、結果出力部２０２ｑは、サーバ装置４００から送信された同定断片配列リストを出力部２１４を介して出力する。なお、結果出力部２０２ｑは、クライアント装置２００から送信されたエントリー同定部４０２ｑの処理結果も出力部２１４を介して出力してもよい。
【０２３０】
［Ｖ．他の実施の形態］
本発明は、上述した実施の形態以外にも、特許請求の範囲に記載した技術的思想の範囲内において種々の異なる実施の形態にて実施されてよいものである。例えば、実施の形態において説明した各処理のうち、自動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を手動的に行うこともでき、あるいは、手動的に行われるものとして説明した処理の全部または一部を公知の方法で自動的に行うこともできる。この他、上記文献中や図面中で示した処理手順、制御手順、具体的名称、各処理の登録データや検索条件等のパラメータを含む情報、画面例、データベース構成については、特記する場合を除いて任意に変更することができる。
【０２３１】
また、上述した各装置に関して、図示の各構成要素は機能概念的なものであり、必ずしも物理的に図示の如く構成されていることを要しない。更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じて、または、機能負荷に応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。例えばＲＮＡ同定装置１００、クライアント装置２００およびサーバ装置４００の各装置が備える処理機能（特に制御部にて行われる各処理機能）については、その全部または任意の一部を、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｕｎｉｔ）および当該ＣＰＵにて解釈実行されるプログラムにて実現することができ、さらにはワイヤードロジックによるハードウェアとして実現することも可能である。なお、プログラムは、後述する記録媒体に記録されており、必要に応じて各装置に機械的に読み取られる。すなわち、ＲＯＭやＨＤなどの記憶部などは、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）として協働してＣＰＵに命令を与え、各種処理を行うためのコンピュータプログラムが記録されている。このコンピュータプログラムは、ＲＡＭにロードされることによって実行され、ＣＰＵと協働して制御部を構成する。
【０２３２】
また、このコンピュータプログラムは、各装置に対して任意のネットワークを介して接続されたアプリケーションプログラムサーバに記憶されていてもよく、必要に応じてその全部または一部をダウンロードすることも可能である。また、本発明にかかるプログラムを、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に格納することもできる。ここで、この「記録媒体」とは、フレキシブルディスク、光磁気ディスク、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤ、ＨＤＤ等の任意の「可搬用の物理媒体」、あるいは、ＬＡＮ、ＷＡＮ、インターネットに代表されるネットワークを介してプログラムを送信する場合の通信回線や搬送波のように、短期にプログラムを保持する「通信媒体」を含むものとする。また、「プログラム」とは、任意の言語や記述方法にて記述されたデータ処理方法であり、ソースコードやバイナリコード等の形式を問わない。なお、「プログラム」は必ずしも単一的に構成されるものに限られず、複数のモジュールやライブラリとして分散構成されるものや、ＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）に代表される別個のプログラムと協働してその機能を達成するものをも含む。なお、実施の形態に示した各装置において記録媒体を読み取るための具体的な構成、読み取り手順、あるいは、読み取り後のインストール手順等については、周知の構成や手順を用いることができる。
【０２３３】
記憶部に格納される各種のデータベース等は、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ装置、ハードディスク等の固定ディスク装置、フレキシブルディスク、光ディスク等のストレージ上に実現される論理的記憶手段であり、各種処理やウェブサイト提供に用いる各種のプログラムやテーブルやデータベースやウェブページ用ファイル等を格納する。また、上述した各装置に、既知のパーソナルコンピュータやワークステーション等の情報処理装置を接続し、本発明の方法を実現させるソフトウェア（プログラム、データ等を含む）を当該情報処理装置に実装することにより実現してもよい。
【０２３４】
更に、装置の分散・統合の具体的形態は図示するものに限られず、その全部または一部を、各種の付加等に応じて、または、機能負荷に応じて、任意の単位で機能的または物理的に分散・統合して構成することができる。
【産業上の利用可能性】
【０２３５】
以上詳述に説明したように、本発明にかかるリボ核酸同定装置、リボ核酸同定方法、プログラムおよびリボ核酸同定システムは、核酸残基組成しか与えない消化物分子量だけでなく、プロダクトイオン質量のセットから核酸残基配列情報を得ることにより、個々の消化物の同定信頼性を飛躍的に高めることができ、例えば医療や製薬、創薬、生物学研究、臨床検査などの様々な分野において極めて有用である。
【符号の説明】
【０２３６】
１００  リボ核酸同定装置
１０２  制御部
１０２ａ  実測断片分子量抽出部
１０２ｂ  断片化部
１０２ｃ  計算断片分子量算出部
１０２ｅ  候補計算断片分子量抽出部
１０２ｆ  候補断片配列抽出部
１０２ｇ  計算プロダクトイオン質量算出部
１０２ｈ  実測プロダクトイオン質量抽出部
１０２ｉ  アサインスコア算出部
１０２ｊ  候補配列同定部
１０２ｋ  出現確率算出部
１０２ｐ  エントリースコア付け部
１０２ｑ  エントリー同定部
１０２ｎ  修飾変換部
１０６  記憶部
１０６ａ  核酸配列ＤＢ
１０６ｂ  断片化規則表
１０６ｃ  質量定義表
１０６ｄ  修飾規則表
１０６ｇ  ピークリスト
１０６ｅ  断片配列表
１０６ｉ  候補断片配列リスト
１０６ｊ  計算プロダクトイオン表
１０６ｋ  同定断片表
１０６ｍ  同定核酸エントリー表
１０    タンデム型質量分析器
２００  クライアント装置
２０２ａ  ピーク取得部
２０２ｐ  検索条件入力部
２０２ｑ  結果出力部
２１２  入力部
２１４  出力部
３００  ネットワーク
４００  サーバ装置
４０２ｒ  結果送信部
４０６    内部ＤＢ
５００  外部データベース
６００  ネットワーク
【図１】
0005610347.tif 000003
【図２】
0005610347.tif 000004
【図３】
0005610347.tif 000005
【図４】
0005610347.tif 000006
【図５】
0005610347.tif 000007
【図６】
0005610347.tif 000008
【図７】
0005610347.tif 000009
【図８】
0005610347.tif 000010
【図９】
0005610347.tif 000011
【図１０】
0005610347.tif 000012
【図１１】
0005610347.tif 000013
【図１２】
0005610347.tif 000014
【図１３】
0005610347.tif 000015
【図１４】
0005610347.tif 000016
【図１５】
0005610347.tif 000017
【図１６】
0005610347.tif 000018
【図１７】
0005610347.tif 000019
【図１８】
0005610347.tif 000020
【図１９】
0005610347.tif 000021
【図２０】
0005610347.tif 000022
【図２１】
0005610347.tif 000023
【図２２】
0005610347.tif 000024
【図２３】
0005610347.tif 000025
【配列表】
0005610347000001.app