(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖構造を含み、前記２本鎖構造が第１鎖および第２鎖を含み、前記第１鎖が連続するヌクレオチドの第１ストレッチを含み、前記第１ストレッチは標的核酸と少なくとも部分的に相補的であり、そして前記第２鎖が連続するヌクレオチドの第２ストレッチを含み、前記第２ストレッチは標的核酸と少なくとも部分的に同一である、標的遺伝子またはその誘導物の発現を阻害するためのリボ核酸であって、前記第１ストレッチおよび前記第２ストレッチが２’−位置に修飾を有する修飾ヌクレオチドの複数の群からなるパターンを含み、ストレッチ内の修飾ヌクレオチドの各群はヌクレオチドのフランキング群により片側または両側をフランキングされており、ヌクレオチドのフランキング群を形成しているフランキングヌクレオチドが非修飾ヌクレオチドまたは前記修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドであり、第１ストレッチのパターンが第２ストレッチのパターンに対し１以上のヌクレオチドによりシフトしており、ヌクレオチドのシフトの導入前の第１ストレッチおよび第２ストレッチの両方のパターンが同一および／または整合状態にあることを特徴とするリボ核酸。
【請求項２】
修飾ヌクレオチドの群および／またはフランキングヌクレオチドの群が、１ヌクレオチ
ド〜１０ヌクレオチドを含む群より選択される数のヌクレオチドを含む、請求項１に記載
のリボ核酸。
【請求項３】
第１ストレッチの修飾ヌクレオチドのパターンが第２ストレッチの修飾ヌクレオチドの
パターンと同一である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項４】
修飾がアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルを含む群より選択され
る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項５】
２本鎖構造が平滑端である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項６】
２本鎖構造が両側部において平滑端である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のリボ
核酸。
【請求項７】
２本鎖構造が、第１鎖の５’−末端および第２鎖の３’−末端により画定される２本鎖
構造上の側部において平滑端である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項８】
２本鎖構造が、第１鎖の３’−末端および第２鎖の５’−末端により画定される２本鎖
構造上の側部において平滑端である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項９】
２本鎖の少なくとも一方が５’−末端に少なくとも１ヌクレオチドの突出を有している
、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項１０】
突出が、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む群より選択される少
なくとも１つのヌクレオチドから成る、請求項９に記載のリボ核酸。
【請求項１１】
ヌクレオチドが修飾を有し、前記修飾が逆方向脱塩基であるヌクレオチド及び２’−位
置にＮＨ2−修飾を有するヌクレオチドを含む群より選択される、請求項１０に記載のリ
ボ核酸。
【請求項１２】
５’−末端の突出が第２鎖上にある、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のリボ核酸
。
【請求項１３】
第１鎖も突出を含むことを特徴とする、請求項１２に記載のリボ核酸。
【請求項１４】
第１鎖が突出を、５’−末端に含むことを特徴とする、請求項１３に記載のリボ核酸。
【請求項１５】
５’−末端の突出が第１鎖上にある、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のリボ核酸
。
【請求項１６】
第２鎖も突出を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のリボ核酸。
【請求項１７】
第２鎖が突出を、５’−末端に含むことを特徴とする、請求項１６に記載のリボ核酸。
【請求項１８】
鎖の少なくとも１つが、３’−末端に少なくとも１ヌクレオチドの突出を有する、請求
項１〜４のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項１９】
３’−末端のヌクレオチドがリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む
群より選択される、請求項１８に記載のリボ核酸。
【請求項２０】
第１鎖の３’−末端が突出を含んでいる、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項２１】
２本鎖構造の長さが１９〜２１塩基長を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載
のリボ核酸。
【請求項２２】
２本鎖構造の長さが１９塩基長を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のリボ
核酸。
【請求項２３】
第１鎖の長さ、および前記第２鎖の長さが、互いに独立に１９〜２３塩基、１９〜２１
塩基の範囲、および１９塩基を含む群から選択される、請求項１〜２２のいずれか１項に
記載のリボ核酸。
【請求項２４】
第１鎖と標的核酸間の相補性が完全である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のリ
ボ核酸。
【請求項２５】
第１鎖と標的核酸間に形成される二本鎖が少なくとも１９ヌクレオチドを含み、前記２
本鎖構造を形成している前記第１鎖と標的核酸との間に１個の不一致または２個の不一致
がある、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項２６】
修飾ヌクレオチドの各群が単一ヌクレオチドから成り、そして／またはヌクレオチドの
各フランキング群が単一ヌクレオチドから成る、請求項２〜２５のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項２７】
第１ストレッチのパターンが第２ストレッチのパターンに対し１以上のヌクレオチドによりシフトし、その結果第１鎖の修飾ヌクレオチドの群が、第２鎖のヌクレオチドのフランキング群と塩基対合している、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項２８】
修飾ヌクレオチドの各群が単一ヌクレオチドから成り、そしてヌクレオチドの各フランキング群が単一ヌクレオチドから成り、
第１ストレッチのパターンが第２ストレッチのパターンに対し１以上のヌクレオチドによりシフトし、その結果第１鎖の修飾ヌクレオチドの群が、第２鎖のヌクレオチドのフランキング群と塩基対合し、そして
２本鎖構造が平滑端である、
請求項１に記載のリボ核酸。
【請求項２９】
標的遺伝子が構造遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、転写因子、運動因子、細胞周期因
子、細胞周期インヒビター、酵素、増殖因子、サイトカインおよび腫瘍サプレッサーを含
む群から選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項３０】
第１鎖および第２鎖がループ構造で連結している、請求項１〜４のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項３１】
ループ構造が非核酸ポリマーを含んでいる、請求項３０に記載のリボ核酸。
【請求項３２】
非核酸ポリマーがポリエチレングリコールであることを特徴とする、請求項３１に記載のリボ核酸。
【請求項３３】
ループ構造が核酸を含んでいる、請求項３０に記載のリボ核酸。
【請求項３４】
第１鎖の５’−末端が第２鎖の３’−末端に連結していることを特徴とする、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項３５】
第１鎖の３’−末端が第２鎖の５’−末端に連結していることを特徴とする、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載のリボ核酸。
【請求項３６】
医薬製造のための、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸の使用。
【請求項３７】
医薬が神経膠芽腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌および白血病、糖
尿病、肥満、心臓血管病、ならびに代謝性疾患を含む群から選択される疾患または状態の
処置を目的とするものである、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸を含有する細胞。
【請求項３９】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸を含有するノックダウン細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸を含有する、ヒトを除く生物。
【請求項４１】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸を含有する、ヒトを除くノックダウン生物。
【請求項４２】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸を含有する組成物。
【請求項４３】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸および医薬的に許容可能な担体を含有する医薬組成物。
【請求項４４】
生体外において請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸を標的遺伝子の発現を阻害するのに十分な量で細胞内に導入することを含み、前記標的遺伝子が請求項１〜３５のいずれか１項に記載のリボ核酸の標的遺伝子である、生体外において細胞内での標的遺伝子またはその誘導物の発現を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は２本鎖構造が第１鎖および第２鎖を含むところの２本鎖構造物を含むリボ核酸であって、該第１鎖が連続するヌクレオチドである第１ストレッチ（stretch）を含み、そして前記第１ストレッチが標的核酸と少なくとも部分的に相補的であり、また該第２鎖が少なくとも標的核酸と少なくとも部分的に同一である連続するヌクレオチドである第２ストレッチを含んでなるリボ核酸、かかるリボ核酸の使用、かかるリボ核酸をそれぞれ含む細胞および生物、かかるリボ核酸を含有する組成物、かかるリボ核酸を含有する医薬組成物、ならびに標的遺伝子の発現を阻害する方法に関する。
【０００２】
ＲＮＡ−媒介干渉法（RNA-mediated interference：ＲＮＡｉ）は発現を抑制する遺伝子に相同な配列を持つ２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により引き起こされる転写後遺伝子サイレンシング（post-transcriptional gene silencing）メカニズムである（Fire(1999年）、Trends Genet 15、358〜63、Tuschlら(1999年）、Genes Dev 13、3191〜7、Waterhouseら(2001年）、Nature 411、834〜42、Elbashirら(2001年）、Nature 411、494〜8、レビューとしてはSharp(2001年)Genes Dev 15、485〜90、Barstead(2001年)、Curr Opin Chem Biol 5、63〜6を見よ）である。ＲＮＡｉは植物（Baulcombe(1999年)、CUrr Opin Plant Biol 2、109〜13)、線虫(Montgomeryら(1998年)、Proc Natl Acad Sci USA 95、15502〜7）、ショウジョバエ（Kennerdellら(1998年)、Cell 95、1017〜26、Kennerdellら(2000年)、Nat Biotechnol 18、896〜8）を含む様々な生物での遺伝子機能の決定に広く用いられている。線虫のC.Elegansでは、ゲノムの約３分の１が既にＲＮＡｉによる機能分析にかけられている（Kim(2001年)、Curr Biol 11、R85〜7、Madedaら(2001年)、Curr Biol 11、171〜6）。
【０００３】
最近まで初期マウス発生（Wiannyら(2000年)、Nat Cell Biol 2、70〜5）を除き、一般にはＲＮＡｉは、ほ乳動物細胞に応用できなかった。ほ乳動物細胞へ２１−ｎｔの二本鎖をトランスフェクションすると遺伝子発現は妨害されるが、長鎖のｄｓＲＮＡでよく起こる配列依存的なインターフェロン駆動性抗ウイルス反応は誘導されないことが見出され、分化したほ乳動物細胞でも新たに応用の可能性が出てきた（Elbashirら(2001年)、Nature 411、494〜8）。興味深いことに、これら小型の干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）は長いｄｓＲＮＡｓの処理産物に似ており、分化したほ乳細胞には迂回メカニズムが存在している可能性が示唆されている。ＲＮＡｓｅＩＩＩファミリーの一つであり、初期ｄｓＲＮＡ処理に必要なＤｉｃｅｒ複合体が同定されている（Bernsteinら(2001年)、Nature 409、363〜6、Billyら(2001年）、Proc Natl Acad Sci USA 98、14428〜33）。未修飾リボオリゴヌクレオチドを使用する際に経験する問題の一つは、これらが細胞内または血清含有培地においてさえ急速に分解することである（Wickstrom(1986年)、J Biochem Biophys Methods 13、97〜102、Gazenaveら(1987年)、Nucleic Acids Res 15、10507〜21）。それはトランスフェクションされたｓｉＲＮＡが誘導する各ノックダウンが長期間維持されて表現系の変化を起こすか否かは、具体的な遺伝子機能および使用するアッセイシステムに依存している。
【０００４】
本発明の根本的課題は生細胞の様な生物化学的環境内に於いて安定かつ活性である合成干渉ＲＮＡ分子を提供することである。
【０００５】
本発明の第１の局面では、この課題は２本鎖構造が第１鎖および第２鎖を含むことによる２本鎖構造を含むリボ核酸であって、該第１鎖が連続するヌクレオチドの第１ストレッチを含み、そして上記第１ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に相補的であり、また該第２鎖が少なくとも標的核酸と少なくとも部分的に同一である連続するヌクレオチドである第２ストレッチを含んでおり、また該２本鎖構造が平滑端部であるリボ核酸を提供することにより達成される。
【０００６】
第２の局面では、本発明の根本課題は第１鎖および第２鎖を含む２本鎖構造を含むリボ核酸であって、該第１鎖が連続するヌクレオチドの第１ストレッチを含み、そして上記第１ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に相補的であり、また該第２鎖が連続するヌクレオチドの第２ストレッチを含み、上記第２ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に同一であり、該第１ストレッチおよび／または該第２ストレッチが１８もしくは１９ヌクレオチド長の長さを有するリボ核酸により解決される。
【０００７】
発明の第１局面によるリボ核酸の実施態様の１つでは、第１ストレッチおよび／または第２ストレッチの長さは１８もしくは１９ヌクレオチドを有する。
【０００８】
発明の第１局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、２本鎖構造は２本鎖の両側部が平滑端である。
【０００９】
発明の第１局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、２本鎖構造は第１鎖の５’−末端および第２鎖の３’−末端により画定される２本鎖構造に平滑端を有する。
【００１０】
発明の第１局面および第２局面によるリボ核酸の更に別の実施態様では、２本鎖構造は第１鎖の３’−末端および第２鎖の５’−末端により画定される２本鎖構造に平滑端を有する。
【００１１】
第３の局面では、本発明の根本課題は第１鎖および第２鎖を含む２本鎖構造を含むリボ核酸であって、該第１鎖が連続するヌクレオチドである第１ストレッチを含み、そして上記第１ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に相補的であり、また該第２鎖が連続するヌクレオチドの第２ストレッチを含み、上記第２ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に同一であり、さらに２本の鎖の少なくとも１本が５’−末端に少なくとも１ヌクレオチドの突出を有するものであるリボ核酸により解決される。
【００１２】
本発明の第３局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、突出はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを含む群より選択される少なくとも１つのヌクレオチドから成る。
【００１３】
本発明の第３局面によるリボ核酸のより好ましい実施態様では、ヌクレオチドは逆方向の塩基が脱落しているオリゴヌクレオチド、および２’−位置がＮＨ2−修飾されているヌクレオチドを含む群から好ましくは選択される修飾を有する。
【００１４】
本発明の第３局面によるリボ核酸の好適実施態様では、鎖の少なくとも１本は３’−末端にリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドからなる少なくとも１ヌクレオチドの突出を有している。
【００１５】
本発明の第３局面によるリボ核酸の別の好適実施態様では、第１ストレッチおよび／または第２ストレッチは１８もしくは１９ヌクレオチド長を有する。
【００１６】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、２本鎖構造は１７〜２１ヌクレオチド、好ましくは１８〜１９ヌクレオチド長を有する。
【００１７】
本発明の第３局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、５’−端の突出は第２鎖にある。
【００１８】
本発明の第３局面によるリボ核酸の好適実施態様では、第１鎖もまた突出を、好ましくは５’−末端に有している。
【００１９】
本発明の第３局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、第１鎖の３’−末端は突出を含む。
【００２０】
本発明の第３局面によるリボ核酸の別の実施態様では、５’−末端の突出は第１鎖にある。
【００２１】
その好適実施態様では、第２鎖も突出を、好ましくは５’−末端に含む。
【００２２】
本発明の第３局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、第１鎖の３’−末端は突出を含む。
【００２３】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、リボ核酸の少なくとも１ヌクレオチドが２’−位置に修飾を有しており、そして該修飾は好ましくはアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルを含む群から選択される。
【００２４】
第４の局面では、本発明の根本課題は２本鎖構造を含むリボ核酸であって、該２本鎖構造が第１鎖と第２鎖を含むものであり、該第１鎖が連続するヌクレオチドである第１ストレッチを含み、そして上記第１ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に相補的であり、また該第２鎖が連続するヌクレオチドの第２ストレッチを含み、そして上記第２ストレッチが標的核酸に対し少なくとも部分的に同一であり、
このとき
上記第１鎖および／または第２鎖は、２’−位置が修飾されている修飾ヌクレオチドの複数の群を含むものであり、また該鎖内に於いて各修飾ヌクレオチド群は片側部または両側部でヌクレオチドのフランキング群（flanking group）によりフランキングされており、ヌクレオチドのフランキング群を形成するフランキングヌクレオチドは未修飾ヌクレオチドか、または該修飾ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾を有するヌクレオチドである、リボ核酸によって解決される。
【００２５】
本発明の第４局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、リボ核酸は本発明の第１局面、第２局面または第３局面によるリボ核酸である。
【００２６】
本発明の第４局面によるリボ核酸の別の実施態様では、前記第１鎖および／または第２鎖は前記複数の修飾ヌクレオチドを含む。
【００２７】
本発明の第４局面によるリボ核酸の別の実施態様では、前記第１鎖は前記複数の修飾ヌクレオチド群を含む。
【００２８】
本発明の第４局面によるリボ核酸の更に別の実施態様では、前記第２鎖は前記複数の修飾ヌクレオチド群を含む。
【００２９】
本発明の第４局面によるリボ核酸の好適実施態様では、修飾ヌクレオチドの群および／またはフランキングヌクレオチドの群は、１〜１０個のヌクレオチドを含む群より選択される数のヌクレオチドを含む。本明細書に記載の範囲に関しては、それぞれの範囲は、上記範囲を規定している２つの数字を含め、範囲の画定に用いたそれぞれの数字の間にある個々の整数を開示すると理解するものとする。従って上記の例では、群は１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチドおよび１０ヌクレオチドを含む。
【００３０】
本発明の第４局面によるリボ核酸の別実施態様では、前記第１鎖の修飾ヌクレオチドのパターンは、前記第２鎖の修飾ヌクレオチドのパターンに同一である。
【００３１】
本発明の第４局面によるリボ核酸の好適実施態様では、前記第１鎖のパターンは前記第２鎖のパターンに整合されている。
【００３２】
本発明の第４局面によるリボ核酸の別の実施態様では、前記第１鎖のパターンは第２鎖のパターンに対し１以上の数のヌクレオチドによりシフトしている。
【００３３】
本発明の第４局面によるリボ核酸の実施態様の一つでは、修飾はアミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびアルキルを含む群より選択される。
【００３４】
本発明の第４局面によるリボ核酸の別の実施態様では、２本鎖構造は平滑端である。
【００３５】
本発明の第４局面によるリボ核酸の好適実施態様では、２本鎖構造は両側部が平滑端である。
【００３６】
本発明の第４局面によるリボ核酸の別の実施態様では、２本鎖構造は第１鎖の５’−末端および第２鎖の３’−末端により画定される２本鎖構造の側部が平滑端である。
【００３７】
本発明の第４局面によるリボ核酸の更に別の実施態様では、２本鎖構造は第１鎖の３’−末端および第２鎖の５’−末端により画定される２本鎖構造の側部が平滑端である。
【００３８】
本発明の第４局面によるリボ核酸の別の実施態様では、２本ある鎖の少なくとも１本が５’−末端に少なくとも１ヌクレオチドの突出を含む。
【００３９】
本発明の第４局面によるリボ核酸の好適実施態様では、突出は少なくとも１つのデオキシヌクレオチドから成る。
【００４０】
本発明の第４局面によるリボ核酸の別の実施態様では、少なくとも１本の鎖は３’−末端に少なくとも１つのヌクレオチドの突出を含む。
【００４１】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の１つでは、２本鎖構造の長さは１７〜２１、より好ましくは１８もしくは１９塩基である。
【００４２】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の別の実施態様では、前記第１鎖の長さ、および／または前記第２鎖の長さは互いに独立して約１５〜約２３塩基、１７〜２１塩基の範囲、および１８もしくは１９塩基を含む群から選択される。
【００４３】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の好適実施態様では、前記第１鎖と標的核酸との間の相補性は完全である。
【００４４】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の１つでは、第１鎖と標的核酸との間に形成される二本鎖は少なくとも１５ヌクレオチドを含み、そのとき上記２本鎖構造を形成する第１鎖と標的核酸の間に１個または２個の不一致がある。
【００４５】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の１つでは、第１鎖と第２鎖は共にそれぞれ修飾型ヌクレオチド群の少なくとも１つ、および少なくとも１つのヌクレオチドのフランキング群とを含み、この時修飾ヌクレオチドの各群は少なくとも１つのヌクレオチドを含み、そしてヌクレオチドの各フランキング群は少なくとも１つのヌクレオチドを含み、第１鎖の修飾ヌクレオチドの各群は第２鎖上にあるヌクレオチドのフランキング群と整合しており、そして第１鎖の５’最末端ヌクレオチドは修飾ヌクレオチド群のヌクレオチドであり、第２鎖の３’最末端ヌクレオチドはヌクレオチドのフランキング群のヌクレオチドである。
【００４６】
第４局面によるリボ核酸の好適実施態様では、修飾ヌクレオチドの各群は単一ヌクレオチドより成り、そして／または各ヌクレオチドのフランキング群は単一ヌクレオチドから成る。
【００４７】
第４局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、第１鎖に於いては、ヌクレオチドのフランキング群を形成するヌクレオチドは修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドに対し３’方向に配置されている非修飾ヌクレオチドであり、第２鎖上に於いては、修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドはヌクレオチドのフランキング群を形成するヌクレオチドに対し５’方向に配置されている修飾ヌクレオチドである。
【００４８】
第４局面によるリボ核酸の別の実施態様では、第１鎖は８〜１２、好ましくは９〜１１の修飾ヌクレオチド群を含み、この時第２鎖は７〜１１、好ましくは８〜１０の修飾ヌクレオチド群を含む。
【００４９】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の好適実施態様では、標的遺伝子は構造遺伝子、ハウスキーピング遺伝子、転写因子、運動因子、細胞周期因子、細胞周期インヒビター、酵素、成長因子、サイトカインおよび腫瘍サプレッサを含む群より選択される。
【００５０】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、第１鎖および第２鎖はリープ構造で連結している。
【００５１】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の好適実施態様では、ループ構造は非核酸ポリマーを含む。
【００５２】
非核酸ポリマーの好適実施態様はポリエチレングリコールである。
【００５３】
その別の実施態様では、ループ構造は核酸を含む。
【００５４】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の実施態様の１つでは、第１鎖の５’−末端は第２鎖の３−末端と連結している。
【００５５】
本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の更なる実施態様では、第１鎖の３’−末端は第２鎖の５’−末端に連結している。
【００５６】
第５局面では、本発明の根本課題は、標的の検証のために本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を使用することで解決される。
【００５７】
第６の局面では、本発明の根本課題は、医薬の製造のために本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を使用することで解決される。
【００５８】
本発明の第６局面による使用の好適実施態様では、医薬は神経膠芽腫、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、結腸癌、膵臓癌および白血病、糖尿病、肥満、心臓血管病、ならびに代謝性疾患を含む群から選択される疾患または状態の治療のためのものである。
【００５９】
第７の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を含有する細胞、好ましくはノックダウン細胞によって解決される。
【００６０】
第８の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を含有する生物体、好ましくはノックダウン生物体によって解決される。
【００６１】
第９の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を含有する組成物により解決される。
【００６２】
第１０の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸、および医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物により解決される。
【００６３】
第１１の局面では、本発明の根本課題は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸を標的遺伝子の発現を阻害するに十分な量で細胞内に導入することを含み、この場合標的遺伝子は本発明のいずれかの局面によるリボ核酸の標的遺伝子である、細胞内の標的遺伝子またはその誘導物の発現を阻害するための方法により解決される。
【００６４】
本発明は、生物化学アッセイもしくは細胞環境の様な生物学的システムで一般的に見られる反応条件に於いて極めて特異的且つ活性であると同時に安定でもあるように小型の干渉ＲＮＡｓを設計できるという驚くべき発見に基づいている。Tuschelら（国際特許出願ＷＯ  ０１／７５１６４）の様な従来技術に記載の各種干渉ＲＮＡｓは、２１〜２３ヌクレオチド長を有し、２本鎖ＲＮＡの３’末端が修飾されている。驚くべき事に、本明細書に於いて以後通常ＲＮＡｉと呼ぶ小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含めた干渉ＲＮＡの安定性に関する問題が、実際には従来考えられていた様なエクソヌクレアーゼによる攻撃というよりはエンドヌクレアーゼの攻撃に拠ることが発明者により見出された。この発見に基づいて発明者は本出願に係る幾つかの戦略を認知した。
【００６５】
従って本発明は、新規形態の干渉ＲＮＡに関する。ＲＮＡｉは２本鎖構造を含むリボ核酸より成る。上記２本鎖構造は第１鎖および第２鎖から形作られる。上記第１鎖は、本明細書に於いては連続ヌクレオチド第１ストレッチとも呼ばれる連続するヌクレオチドのストレッチを含み、そしてこの第１ストレッチは標的核酸と少なくとも一部が相補的である。上記第２鎖もまた連続するヌクレオチドのストレッチを含み、このとき上記第２ストレッチは標的核酸と部分的に同一である。このリボ核酸の極めて基本的な構造を図１に概略的に示す。上記第１鎖および上記第２鎖は好ましく相互にハイブリダイズして２本鎖構造を形作る。ハイブリダイゼーションは一般的にはワトソンクリックの塩基対合により生ずる。しかし、発明のリボ核酸は上記２本鎖構造に対するその長さに関し必ずしも限定されない。ＲＮＡｉを形成するそれぞれの鎖および鎖の各端部には、さらにヌクレオチドが付加されるだろう。第１ストレッチおよび第２ストレッチの具体的な配列によっては、ハイブリダイゼーションまたは塩基対合が完全もしくは完璧なものである必要はなく、即ち第１および第２ストレッチが不一致により塩基が１００％対合しなくともよい。二本鎖内に１以上の不一致があってもよい。上記不一致は１５、１６または１７個であることが好ましいぴったり合わさったヌクレオチドのストレッチの外側にある場合には、ＲＮＡｉ活性に影響しない。不一致により１５個未満の連続したぴったり合わさったヌクレオチドのみ生ずる場合、問題の標的のｍＲＮＡのダウンレギュレーションに関するＲＮＡｉ分子の活性は１７個のぴったり合わさったヌクレオチド二本鎖に比べ低いのが一般的である。
【００６６】
第１鎖の連続ヌクレオチド第１ストレッチは標的核酸に対し、より好ましくは標的核酸の一部に対し実質的に相補的である。ここで用いる相補的とは、好ましくは第１鎖のヌクレオチド配列が標的核酸配列もしくはその一部の核酸配列とハイブリダイゼーションすることを意味する。典型的には、標的核酸配列または標的核酸は、干渉リボ核酸の作用様態に応じて、単鎖ＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡである。かかるハイブリダイゼーションは最も一般的にはワトソンクリック塩基対合により生ずると思われるが、しかしそれに限定されるものではない。上記第１鎖および、より特には上記第１鎖の連続ヌクレオチドの第１ストレッチが標的核酸配列に対し相補的である程度は、最高１００％、最低８０％であり、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは８５〜１００％、最も好ましくは９０〜１００％である。最適な相補性は９５〜１００％であろう。この意味に於いて相補性とは、上記ヌクレオチドの範囲が、例えばヌクレオチドの８０〜１００％が、明示した範囲が完全にワトソンクリック塩基対合することを意味する。本発明の一局面に於いては、上記ヌクレオチドの第１ストレッチと標的ＲＮＡとの間の相補性は１８〜１９ヌクレオチドでなければならず、たった１７ヌクレオチドのストレッチでは、配列特異的突出が２つある場合でもＲＮＡｉを媒介するにおいて機能的でない。従って、二本鎖が１９ヌクレオチドまたは塩基対の長さを有している場合は、最低１７ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対が相補的であり、２ヌクレオチドが不一致であることが許容される。２０ヌクレオチドまたは塩基対より成る二本鎖の場合は、１７ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の相補性が許容可能であり、機能的であろう。同じ事は、合計１７の相補的ヌクレオチドまたは塩基対を有する２１ヌクレオチドまたは塩基対の２本鎖にもあてはまる。基本的には、２本鎖、即ち２本鎖構造の長さに対し求められる相補性の強さは、ここに記載の２本鎖構造によるか、または第１鎖の第１ストレッチと標的核酸の複合体により形成される複合体の融点にも依存する。
【００６７】
本発明のリボ核酸は全て、例えば国際特許出願ＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ００／４４８９５およびＷＯ０１／７５１６４に記載されているようなＲＮＡ介在干渉を起こすこと、または関係することに好適であると理解すべきである。
【００６８】
干渉リボ核酸分子を本発明に従い設計する場合の第１戦略は、標的核酸に対し相補的である１８または１９ヌクレオチドの最適長ストレッチを有することである。１８または１９ヌクレオチドの上記最適長が、使用するＲＮＡｉの２本鎖構造の長さそのものである場合も本発明の範囲内である。この長さの要件は、例えば国際特許出願ＷＯ０１／７５１６４のような先行技術の技術教示とは明らかに異なる。本発明および先行技術に記載されている、上記の特徴の長さ、即ち１８または１９ヌクレオチドの長さを持つ干渉リボ核酸と結びつき実現できるその他設計も、本発明の範囲内である。
【００６９】
干渉リボ核酸分子を設計する場合の第２の戦略は、第１鎖に、本明細書では自由５’ＯＨ−基とも呼ばれる自由５’ヒドロキシル基を有することである。自由５’−ＯＨ基とは、第１鎖を形成している最端のヌクレオチドが、修飾されない状態、特に末端修飾されていない状態で存在していることを意味する。典型的には、第２鎖の末端の５’−ヒドロキシ基もそれぞれ非修飾の様式で存在する。より好ましい実施態様では、第１鎖および第１ストレッチの３’−末端もそれぞれ非修飾型であり、本明細書では自由３’−ＯＨ基とも呼ばれる自由ＯＨ−基を提示しており、この時５’末端のヌクレオチドの設計は前記実施態様のいずれか１項に記載のものである。かかる自由ＯＨ−基は第２鎖および第２ストレッチの３’−末端にもそれぞれ存在するのが好ましい。本発明による前記リボ核酸分子の別実施態様では、第１鎖および第１ストレッチの３’−末端それぞれ、ならびに／または第２鎖および第２ストレッチの３’−末端それぞれは３’末端に末端修飾を有しても良い。
【００７０】
本明細書では、用語自由５’ＯＨ−基及び３’ＯＨ−基は、ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端それぞれにある各最端ヌクレオチドがＯＨ−基であることも示している。かかるＯＨ−基はヌクレオチドの糖部分より、より好ましくは５’ＯＨ−基の場合には５’位置より、３’ＯＨ−基の場合には３’位置より生ずるか、または各末端ヌクレオチドの糖部分に結合したリン酸基から生ずるだろう。リン酸基は原則的にはヌクレオチドの糖部分のいずれかの５’ＯＨ−基に結合する。好ましくは、リン酸基は自由５’ＯＨ−基の場合には糖部分の５’ＯＨ−基、および／または自由３’ＯＨ−基の場合には糖部分の３’ＯＨ−基に結合するが、これらについても本明細書では自由５’または３’ＯＨ基と呼ぶ。
【００７１】
本明細書では、ここに開示したＲＮＡｉの設計のための戦略またはＲＮＡｉの実施態様により用いる場合、末端修飾という用語は第１および／または第２鎖の最端５’または３’ヌクレオチドに化学的実在が付加されることを意味する。かかる末端修飾の例としては、とりわけても欧州特許ＥＰ  ０  ５８６  ５２０Ｂ１またはＥＰ  ０  ６１８  ９２５  Ｂ１に記載の如くに逆方向（デオキシ）脱塩基（abasics）、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボン酸塩、チオアート、Ｃ1〜Ｃ10低級アルキル、置換低級アルキル、アルキアリール（alkaryl）もしくはアラルキル、ＯＣＦ3、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ3；ＳＯ2ＣＨ3；ＯＮＯ2；ＮＯ2、Ｎ3；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルキアリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノまたは置換シリルを挙げることができるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書で使用する場合、アルキルまたは「アルキル」を含む用語は、１ないし１２個、好ましくは１ないし６個、より好ましくは１ないし２個のＣ原子を含む炭素原子鎖を意味する。
【００７３】
別の末端修飾はビオチン基である。かかるビオチン基は、第１鎖および／または第２鎖の最端５’または３’ヌクレオチド、あるいはその両端に結合するのが好ましいだろう。より好ましい実施態様では、ビオチン基はポリペプチドまたはタンパク質に結合する。ポリペプチドまたはタンパク質がその他前記末端修飾のいずれかを介して結合しているものも、本発明の範囲内である。ポリペプチドまたはタンパク質は本発明の核酸分子に更なる特徴を付与してもよい。わけてもポリペプチドまたはタンパク質は他の分子に対するリガンドとして作用してもよい。前記その他分子がレセプターの場合には、レセプターの機能および活性が結合リガンドにより活性化されてもよい。レセプターは内部化（internalization）インターナリゼーション活性を示してもよく、これによりリガンドに結合した発明核酸分子の効率的なトランスフェクションを可能にするだろう。発明の核酸分子に結合させるリガンドの例はＶＥＧＦであり、それに対応するレセプターはＶＥＧＦレセプターである。
【００７４】
様々な末端修飾を有する本発明のＲＮＡｉについて考え得る各種実施態様を次表１に示す。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
ここの開示した各種末端修飾は、リボ核酸のヌクレオチドのリボース部分に位置することが好ましい。より具体的には、末端修飾は修飾されるヌクレオチドが末端ヌクレオチドであることを前提として２’ＯＨ、３’ＯＨおよび５’ＯＨを含むが、これらに限定されずにリボース部分のいずれかのＯＨ−基と結合するか、又は置換するものとする。逆方向脱塩基（inverted abasics）は、ヌクレオ塩基部分を有さないデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドである。この種の化合物は、特にSternbergerら、(2002)、Antisense.Nucl.Ac.Drug Dev、印刷中に記載されている。
【００７７】
いずれの前記末端修飾も表１に記載のＲＮＡｉの各種実施態様と結びつけて用いても良い。これに関連して、好ましくは末端修飾を有している、より好ましくは５’末端で有していることによりセンス鎖が不活性化されているここに記載のＲＮＡｉまたは実施態様は、特に有利である。この利点は、ここに記載のリボ核酸第２鎖に対応するセンス鎖の不活性化に起因するものであり、そうしない場合には細胞内にある無関係の単鎖ＲＮＡに干渉するだろう。それ故に、発現、およびより具体的には細胞のトランスクリプトームの翻訳パターンにより特異的に影響する。この効果はオフターゲット（off-target）効果とも呼ばれる。表１を見ると、実施態様７および８として描かれたこれら実施態様が上記の意味に於いて特に有利であるが、それは修飾によって−標的非特異的な−ＲＮＡｉ部分（第２鎖である）が不活性化され、その結果本発明のＲＮＡｉを用いて特定のリボ核酸およびタンパク質をそれぞれノックアウトする細胞または同様のシステムでの単鎖ＲＮＡと第２鎖との非特異的な相互作用を減らせるからである。
【００７８】
本発明に関する第３の戦略は２本鎖構造を含むリボ核酸を実現することであり、この場合の２本鎖構造は第１鎖と第２鎖とを含み、この時第１鎖は連続ヌクレオチドの第１ストレッチを含み、かつ前記第１ストレッチは少なくとも一部が標的核酸に対し相補的であり、そして第２鎖は連続ヌクレオチドの第２ストレッチを含み、この時前記第２ストレッチは少なくとも一部が標的核酸と同一であり、そして２本鎖構造の端部は平滑である。本記載と関連つけて用いる場合には、２本鎖構造という用語は二本鎖とも称される。従ってＲＮＡｉのこの設計は、例えば３’−突出を開示した国際特許出願ＷＯ  ０１／７５１６４の中に明示されている、Ｔｕｓｃｈｌらのものとは明らかに異なる。本明細書で用いる場合、突出とは一方の鎖の少なくとも一端が、共に２本鎖を形成しているもう一方の鎖、本明細書ではカウンター鎖とも呼ぶ鎖の対応する端部よりも長い２本鎖構造を表している。好ましくは、第１ストレッチは第１鎖と同一であり、第２ストレッチは第２鎖と同一である。
【００７９】
平滑端を持つＲＮＡｉの有効性および各リボ核酸のそれぞれ第１もしくは第２鎖のいずれか、または両鎖の端部修飾の利点を考慮すると、両方の設計原理を組み合わせることが好ましい。換言すると、平滑端ＲＮＡｉに表１に示したような末端修飾スキームを持たせることは、本発明の範囲内である。
【００８０】
本発明に関する第４の戦略は、リボ核酸の５’−末端に突出を持たせることである。より具体的には、かかる突出は原則的には本発明によるリボ核酸の第１鎖および第２鎖のいずれか、または両方に存在できる。前記突出の長さは、１ヌクレオチドと短いもの、および２ないし８ヌクレオチド長、好ましくは２、４、６または８ヌクレオチドである。５’突出が本明細書によるリボ核酸の第１鎖および／または第２鎖上にある場合も、本発明の範囲内である。突出を形成するヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはその連続物でよい。
【００８１】
突出は少なくとも１つデオキシリボヌクレオシドを含むことが好ましく、前記１つのデオキシリボヌクレオチドはその最５’末端にあるのが好ましい。発明のリボ核酸の各カウンター鎖の３’末端が突出、より好ましくはデオキシリボ核酸の突出を有しないことも本発明の範囲内である。この場合も、発明のリボ核酸は表１に関係し概要を示した末端修飾スキームおよび／またはここに概要を示した末端修飾を含んでもよい。
【００８２】
本出願の干渉リボ核酸の設計に関する第５の戦略は、少なくとも１つの鎖、より具体的には本発明のリボ核酸の連続ヌクレオチドのストレッチの１つの上に特定パターンの修飾ヌクレオチドを形成せしめることである。前記ヌクレオチドの修飾の種類は、ここに開示した干渉ＲＮＡを設計するために他の戦略と関係して論じたものと同一でもよく、そしてより具体的には末端修飾のために、または末端修飾としてここに記載した種類の修飾、例えば本出願によるリボ核酸を形成する少なくとも１ヌクレオチドのリボース部分での逆方向脱塩基、メトキシまたはアミノ等である。前記ヌクレオチドの修飾は本明細書記載のいずれかの形態の修飾でよく、より具体的には本明細書に末端修飾として記載される種類の修飾でよいが、いわゆる末端修飾は末端ヌクレオチドに局在する必要はないことに注意すべきである。むしろ修飾は末端ヌクレオチド以外に行う。かかる条件では、修飾は修飾ヌクレオチドのリボース部分に結合するのが好ましく、より更に好ましくはリボース部分の２’位置に結合する。
【００８３】
この戦略に従い設計されたリボ核酸も、ここに開示した他の設計戦略のいずれかにより、本出願のリボ核酸に付与される特徴を有することが、また本発明の範囲内である。従って、あるパターンの修飾ヌクレオチドを有する干渉リボ核酸は末端修飾を有し、末端修飾スキーム計画は平滑端であっても、または５’突出を有しても良く、あるいはこれら要素または特徴の２つ以上の組み合わせでもよい。
【００８４】
末端修飾または修飾パターンとして表される前記修飾とは別に、リボ核酸の主鎖（backbone）についてヌクレオチド間に各種連結を形成せしめることで更に修飾してもよい。かかる各種連結としては、特に欧州特許ＥＰ  ０  ５８６  ５２０  Ｂ１および欧州特許ＥＰ  ０  ６１８  ９２５  Ｂ１に記載のものがある。本発明において特に興味深いものは、リボオリゴヌクレオチドに高いヌクレアーゼ耐性を付与することが示されているリボ核酸主鎖の内部修飾である。好適実施態様では、修飾ヌクレオチドの修飾はヌクレオチドのリボース部分の２’−ＯＨ−基のメトキシル化である。
【００８５】
好適実施態様では両鎖、より具体的には第１ストレッチおよび第２ストレッチの両方が、前記鎖およびストレッチを形成するヌクレオチドにこの種の修飾が存在する。しかし、第１鎖および第１ストレッチそれぞれ、または第２鎖および第２ストレッチそれぞれ一方がこの特別なヌクレオチド修飾パターンを示す場合も、本発明の範囲内である。本明細書で用いる場合、修飾ヌクレオチド群またはヌクレオチドのフランキング群という用語は、１程度のヌクレオチド、即ち１以上のヌクレオチドを含むか、または表している。
【００８６】
連続ヌクレオチドのストレッチを考える場合、ストレッチを形成するヌクレオチドは、単一ヌクレオチドまたは標準的なリン酸ジエステル結合を介して、または少なくとも一部がホスホロチオナート結合を介して相互に共有結合しているヌクレオチド群がかかる種類の修飾を示すような修飾パターンを取ってもよい。かかるヌクレオチド、またはここでは修飾ヌクレオチド群とも呼ばれるヌクレオチド群が前記ストレッチの５’−末端または３’−末端を形成しない場合には、前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド群の修飾を持たないヌクレオチドの両側にヌクレオチドまたはヌクレオチド群が続く。しかしこの種のヌクレオチドまたはヌクレオチド群が別の修飾を有してもよいことに注意すべきである。この種のヌクレオチドまたはヌクレオチド群は、本明細書ではヌクレオチドのフランキング群ととも呼ばれる。修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド群それぞれのこの配列、および非修飾または異なる修飾が施されたヌクレオチド、あるいは非修飾または異なる修飾が成されたヌクレオチド群は１回、または複数回繰り返しても良い。好ましくは、配列は１回より多く繰り返す。より明瞭にすることを目的として、次にパターンについて、修飾ヌクレオチドの群または非修飾ヌクレオチドの群を一般的に参照しながら詳しく説明するが、この場合前記の各群は実際には１ヌクレオチド程度のヌクレオチドを含んでもよい。ここで用いる非修飾ヌクレオチドとは各ヌクレオチドまたはヌクレオチド群を形成しているヌクレオチドに前記修飾がないこと、あるいは修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド群のそれとは異なる修飾を有することを意味する。
【００８７】
非修飾ヌクレオチドが実際には修飾ヌクレオチドの修飾とは別の方法で修飾される非修飾ヌクレオチドの修飾が、前記非修飾ヌクレオチドを形成する各種ヌクレオチドまたはヌクレオチドの各種フランキング群に関し同一である場合も、または異なる場合さえも本発明の範囲内である。
【００８８】
修飾および非修飾ヌクレオチドのパターンとしては、鎖またはストレッチの５’−末端ヌクレオチドがヌクレオチド修飾群から開始しても、またはヌクレオチドの非修飾群から開始してもよい。しかし、別の実施態様では、５’−末端ヌクレオチドがヌクレオチドの非修飾群で形成することも可能である。
【００８９】
この種のパターンを、干渉ＲＮＡの第１ストレッチもしくは第２ストレッチ、またはその両方で実現してもよい。ｓｉＲＮＡの機能には、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的−相補的な鎖に５’リン酸基があることが必要であることに注意が必要であり、このことは細胞が自由５’ＯＨ（リン酸化できる）を介してｓｉＲＮＡの真偽性をチェックし、そしてそのような真性ｓｉＲＮＡのみを標的ＲＮＡの破壊に方向付けすることを示唆している（Nykanen,et al。(2001年)、Cell 107、309〜21）。
【００９０】
第１ストレッチはある種類のパターンのヌクレオチド修飾および非修飾群、即ち修飾ヌクレオチド群およびヌクレオチドのフランキング群のパターンを示し、一方第２ストレッチはこの種類のパターンを示さないことが好ましい。これは第１ストレッチが、ＲＮＡ干渉現象の基礎を成す標的−特異的分解プロセスにとって実際的により重要であり、かつ特異性の理由から第２ストレッチはＲＮＡ干渉の媒介において機能しないように化学的に修飾できる限りに於いて有用であろう。
【００９１】
しかし、第１ストレッチと第２ストレッチが共にこの種のパターンを有するものも本発明の範囲内である。修飾および非修飾のパターンは第１ストレッチおよび第２ストレッチの両方に対し同一であるのが好ましい。
【００９２】
好適実施態様では、第２ストレッチを形成し、且つ第１ストレッチのヌクレオチドの修飾群に対応しているヌクレオチドの群もまた修飾されており、一方第２ストレッチの、または第２ストレッチを形成するヌクレオチドの非修飾群は第１ストレッチの、または第１ストレッチを形成するヌクレオチドの非修飾群に対応している。この可能性を図２Ａに概略的に示した。さらには、第１ストレッチおよび第１鎖それぞれの修飾パターンが第２ストレッチおよび第２鎖それぞれの修飾パターンに対して位相シフトするものがある。好ましくは、第１鎖のヌクレオチドの修飾群が第２鎖のヌクレオチドの非修飾群と対応し、その逆もまた同じになるようにシフトするのが好ましい。この可能性を図２Ｂに示す。修飾のパターンの位相シフトが完全ではないが、図２に例示するように重複するものも、本発明の範囲内である。
【００９３】
好適実施態様では、鎖およびストレッチそれぞれの末端にある第２ヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドであるか、または非修飾ヌクレオチド群の先頭である。好ましくは、この非修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの非修飾群は第１鎖および第２鎖それぞれの５’−末端に位置しており、より好ましくは第１鎖の５’−末端に位置する。更に好適な実施態様では、非修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドの非修飾群は第１鎖および第１ストレッチそれぞれの５’−末端に位置する。好適実施態様では、修飾および非修飾ヌクレオチドは１つずつ交互に配置するパターンを構成する。
【００９４】
本発明のこの局面に関する更に好適な実施態様では、問題の干渉リボ核酸は２本の鎖を含み、このとき２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチド、好ましくは２’−Ｏ−メチル修飾されていないヌクレオチドが両方の鎖に、交互になるように組み込まれており、即ち１ヌクレオチド毎に２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとなる。換言すると、第１鎖では１つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドの後に非修飾ヌクレオチドが続き、その次に２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが続き、これを繰り返すことを意味している。２’−Ｏ−メチル修飾および非修飾から成る同一の配列が第２鎖にも存在しており、この時第１鎖の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが第２鎖の非修飾ヌクレオチドと塩基対合し、その逆も同様になるような位相シフトがあることが好ましい。この特別な配置、即ち両鎖の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとが塩基対合することは、短い干渉リボ核酸、即ち短い塩基対合２本鎖リボ核酸の場合には特に好ましいが、それは本発明を特定の理論と結びつけることを望むわけではないが、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドが２塩基対合するとその間に特別な反発力が働き、かかる二本鎖、特に短い二本鎖を不安定にすると推定されるからである。前記特別な配置に関しては、アンチセンス鎖が５’端について２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドから開始し、従って第２ヌクレオチドが非修飾型の場合は、第３、第５、第７といったヌクレオチドは再び２’−Ｏ−メチル修飾されており、一方、第２、第４、第６、第８といったヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドである。この場合も特別な理論と結びつけることを望まないが、修飾を含まないとするアンチセンス鎖の５’末端にある第２、場合によっては第４、第６、第８および／または同様の位置は特別重要であるのに対し、５’最末端ヌクレオチド、即ちアンチセンス鎖の最初の５’末端ヌクレオチドはかかる修飾を示すものであり、アンチセンス鎖の第１、場合により第３、第５および同様の奇数位置は修飾されると考えられる。別の実施態様では、修飾および非修飾ヌクレオチドそれぞれの修飾および非修飾それぞれは、本明細書に記載のいずれのものでもよい。
【００９５】
これに限定されないが、発明のリボ核酸の、二本鎖とも呼ばれる２本鎖構造は、第１鎖および第２鎖それぞれによって、または連続ヌクレオチドの第１および第２ストレッチによって形成される。第１ストレッチおよび第２ストレッチそれぞれの長さは、典型的には約１５〜約２３、好ましくは約１７〜２１、より好ましくは１８もしくは１９塩基である。これに関連して、３０ヌクレオチド未満の長さ、好ましくは２１ヌクレオチド未満の長さは、基本的にＲＮＡ干渉およびインターフェロン反応を示すことができ、インターフェロン反応を発生できる生物学的システムをもたらすことはない。その理由は、３０塩基対より長い２本鎖RNAが結合し、プロテインキナーゼＰＫＲおよび２’、５’−オリゴアデニニレート合成酵素を活性化した時に、ある種の細胞が大きな生理学的変化を被ったという観察に基づいている。活性化ＰＫＲはｅＩＦ２ａのリン酸化を介して翻訳を停止、活性化２’，５’−ＡＳはｍＲＮＡの分解を引き起こす。これら作用は、標的特異的な表現形のノックダウンの効果を無効にしてしまうため、標的の検証および動物モデルについては望ましくない。
【００９６】
本発明の干渉リボ核酸の設計に関する第６の戦略によれば、リボ核酸は２本鎖構造を含み、このとき２本鎖構造は第１鎖および第２鎖を含むものであって、第１鎖は連続ヌクレオチドの第１ストレッチを含み、そして前記第１ストレッチは少なくとも一部が標的核酸に対し相補的であり、そして第２鎖は連続ヌクレオチドの第２ストレッチを含み、前記第２ストレッチは少なくとも一部が標的核酸と同一であり、そして第１鎖の末端の１つと第２鎖の末端の１つがループ構造により連結している。
【００９７】
実施態様の１つでは、ループ構造は非核酸ポリマーを含む。かかる非核酸ポリマーはポリエチレングリコールまたは同様のポリマーでもよい。非核酸ポリマーは、原則的にはポリヌクレオチドを含まず、そして連結する２本の鎖を実際に相互にハイブリダイゼーションさせることができるポリマーを含む群から選択されるだろう。かかるハイブリダイゼーションを可能にするために、相互にハイブリダイゼーションする２本のストレッチを連結する分子またはその部分は、分子が曲がれるようにして２本のストレッチが接近できるようにし、且つハイブリダイゼーション可能な３次元的に配置できる特定の分子構造または分子柔軟性を持たなければならない。この種の分子または分子部分は実際にはヒンジとして機能する。原則的には、この条件を満たす分子であればいずれの分子も本発明に用いることができるだろう。ポリエチレングリコール以外にはアミノ酸をベースとする分子を使用してもよい。この種のアミノ酸をベースとする分子はホモポリマーまたはヘテロポリマーのいずれでもよい。有用例は７個のグリシン残基から成るホモポリマーであり、これらグリシン残基は２本のストレッチを必用に応じて近接させてハイブリダイゼーションさせるのに必用なヒンジを生成できる。このグリシンをベースとするヒンジは、例えばGuan K.L.とDixon J.E.(1991年)、Anal Biochem.192、262に記載されている。別の実施態様では、ヒンジは当分野既知のクラウンエーテルにより形作られても良い。
【００９８】
別実施態様では、ループは核酸を含む。本明細書で使用する場合、ElayadiとCorey(2001年)Curr Opin Investig Drugs.2(4):558〜61.総説；Orum and Wengel(2001)Curr Opin Mol Ther.3(3):239〜43；に記載されているＬＮＡ、およびＰＮＡは核酸と見なされ、そしてループ形成ポリマーとして用いても良い。基本的には第１鎖の５’−末端は第２鎖の３’−末端と連結するだろう。あるいは、第１鎖の３’−末端が第２鎖の５’−末端に連結してもよい。前記ループ構造を形成しているヌクレオチドの配列は一般的には重要とは考えられていない。しかし、かかるループを形成するヌクレオチド配列の長さは立体上の理由から重要と思われている。従って必用とされるループ構造を形成するのに適当な最低長は４ヌクレオチドと考えられている。原則的には、ヒンジまたはハイブリダイゼーションする両ストレッチ間のヒンジまたは連結を形作るヌクレオチドの最大数に制限はない。しかし、ポリヌクレオチドが長くなるほど、二次および三次構造が形成されやすくなり、その結果ストレッチに求められる方向性に影響が出てくる。好ましくはヒンジを形成するヌクレオチドの最大数は約１２ヌクレオチドである。上記いずれかの設計と上記６つの戦略とを組み合わせること、即ち２本の鎖をループ構造または同様の構造を通して折り返す（ループ）ことができる様に共有結合により連結することもまた本明細書の開示の範囲内である。
【００９９】
本発明者は驚くべきことにループをアンチセンス鎖、即ち本発明のリボ核酸の第１鎖の３’に配置すると、この種のＲＮＡの活性がアンチセンス鎖の５’にループを配置した場合に比べ高くなることを見いだした。従って、アンチセンス鎖およびセンス鎖、即ちそれぞれ第１鎖および第２鎖に対する特別なループの配置が重要であり、従ってこのことは方向性が重要ではないという従来表明されていた考え方とは対照的である。しかし、このことは、ここに示す実験結果を考えれば真実ではないと考えられる。先行技術での理解は、ＲＮＡｉがその間にループによらず連結されるＲＮＡｉが生成されるプロセッシングにかけられることを想定していた。しかし、たとえそうであっても、アンチセンスの３’に配置されたループを有する構造に明瞭に観察される活性増加を説明できない。この限りに於いては、この種の小型干渉ＲＮＡｉの５’から３’方向における好ましい配置は、第２鎖−ループ−第１鎖である。各構築物は好適ベクターシステム内に組み込んでも良い。好ましくは、ベクターはＲＮＡｉの発現に関するプロモータを含む。好ましくは、各プロモータはpol IIIであり、より好ましくは、プロモータはGood et al.(1997年)Gene Ther、4、45〜54に記載のＵ６、Ｈ１、７ＳＫプロモータである。
【０１００】
干渉ＲＮＡ、従ってｍＲＮＡの様なコーディングヌクレオチドのノックダウンもしくはノックアウトの概念の応用性が広範であるが故に、かかるＲＮＡを生ずる遺伝子を、本発明のリボ核酸分子の何れかを用いその発現を修飾してもよい。このメカニズムは基本的かつ広く応用できるため、このメカニズムに基づいて、遺伝子のノックダウンまたはノックアウトを包含する応用を実現できる。好ましい応用は、発明のリボ核酸を標的の検証に使用することである。本明細書で使用する場合、標的の検証とはあるＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質分子が生物学的プロセスに直接関係していることを証明するためのステップをとることを包含している工程を意味し、好ましくは病気または標準的でない−原因的な−状態に関わるプロセスであり、従って好適な標的は新規の治療化合物の開発である。配列の相同性研究により遺伝子を標的のファミリーに分類することに成功している。病気に関して重要な役割を果たすものがこれら標的のどれであるか解明すること、続く医薬品開発に利用すべきものを解明するための厖大な作業は効率的に行う必用がある。それ故に遺伝子発現のノックダウンは５０〜１００％、好ましくは９０％に下げて、表現形への有意な影響を調べる必用がある。その他の例では、遺伝子によっては、表現形の発生にせいぜい２０％のノックアウトでも十分な場合がある。表現形は機能的ＲＮＡｉ分子を含む細胞を、機能的でないＲＮＡｉ分子を含む細胞とを比較し画定できる。これにより、タンパク質の機能が一部のみ阻害された状態でも、有意な読み出しが保障されるだろう。一般的には、ｍＲＮＡの減少と表現形の変化の大きさとの間に直線的な関連性はない。一部のタンパク質に関しては、タンパク質が約２０％減少しただけでも表現形に大きな変化が生じるが、一方他の遺伝子およびＲＮＡでは、それぞれ５ないし１０％程度のタンパク質が残っていても観察される表現形は十分維持される。
【０１０１】
本発明のリボ核酸分子の更なる用途は、医薬の製造への使用、または医薬としての使用である。かかる医薬は、遺伝子およびその産物が病気の発症、原因または進行と関係している、例えば癌の様な病気または状態の治療および／または予防のいずれかに使用できる。更に、かかる医薬は遺伝子産物の存在または過剰発現が病理学的表現形の原因である病気の処置にも用いることができる。好適実施態様では、病気は対応する生物学的に活性であるＲＮＡｉの適用または投与により機能を獲得することを特徴とし、そして処置される。ここに開示したリボ核酸を含む医薬により処置される病気または状態は、癌、心臓病、代謝疾患、皮膚疾患、炎症性疾患、免疫系障害、および自己免疫疾患を含む群から選択されてもよいだろう。各種形態の癌としては、固形癌および膠芽腫の様な造血系の腫瘍、前立腺癌、乳癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌および白血病を挙げられるが、これらに限定されない。代謝疾患としては肥満および糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。皮膚疾患としては乾癬があげられるが、これに限定されない。
【０１０２】
別の局面では、本発明のリボ核酸分子は診断、好ましくは上記の疾患および状態に関連して特定される病気の診断に用いられる。この様な診断は、細胞を含むことが好ましいサンプルに本発明のリボ核酸分子を適用したときの、サンプル発現パターンの変化を観察することに基づくだろう。かかるサンプルは前記の治療対象となる病気又は状態を罹っているか、またはそれに関する素因を有すると思われる被験者に由来する細胞を含むことが好ましい。
【０１０３】
本発明の核酸の更なる応用は、医薬的に活性な化合物のスクリーニングおよび／または最適化への使用である。後者は低分子等の候補薬物の効果をモニタリングまたは決定し、前記候補薬物が発揮する効果と、ここに開示した原則に基づき設計された特異的ＲＮＡｉ投与時に観察される効果とを比較するようにして行われる。こうすることでスクリーニング工程から標的外作用を有する候補薬物を排除でき、同時に同様または同一の表現系を作り出す候補薬物は有望なリード化合物と見なすことができ、場合によってはそれ自体が医薬的に活性な化合物であることもあるだろう。この方法では、高い特異性を有するＲＮＡｉ分子は、候補薬物の測定に於けるゴールドスタンダードとして機能する。
【０１０４】
別の局面では、発明はここに開示のリボ核酸を含有する細胞、好ましくはノックダウン細胞に関する。かかる細胞は単離された、または生体内に再度戻されないことが好ましい、組織内または器官内に含まれる細胞であることが好ましい。しかし、細胞は生体内に含まれるものでもよい。細胞は発明のリボ核酸による処置の対象となる病気または状態に関係する細胞であることが好ましい。この種のノックダウン細胞は、機能的な関連性を評価する、または下流の標的を決定するために、例えばｍＲＮＡもしくはタンパク質に基づく発現プロフィールを作製するのに使用してもよい。
【０１０５】
別の局面では、発明はここに開示のリボ核酸を含む生物に関する。好ましくは、かかる生物は脊椎動物であり、より好ましくは該脊椎動物は哺乳動物である。ここでいう哺乳動物とは、とりわけてもサル、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、モルモット、ウサギ、マウス、ラットおよびヒトであるが、これらに限定されない。
【０１０６】
さらに別の局面では、本発明は本発明のリボ核酸を含む組成物に関する。好ましくは、かかる組成物は陰性および陽性コントロールと有効なリボ核酸とを組み合わせた形態、または別々の形態で含んでいる。かかる組成物はさらに溶媒、好ましくは緩衝液を含んでも良い。
【０１０７】
別の局面では、本発明は本発明のリボ核酸および医薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物に関する。医薬的に許容可能な担体は当業者公知であり、とりわけ希釈剤、緩衝剤等を含む。医薬組成物はさらに医薬的に活性な化合物を含んでも良い。本発明のリボ核酸分子を用いた処置の対象が病気または状態である場合、前記化合物は既に前記の病気または状態の処置に関連して用いられているものであることが好ましい。本発明のリボ核酸と、先行技術の前記病気および状態の処置に用いられている医薬の作用モードが異なる場合には、相乗効果が得られることもあるだろう。
【０１０８】
次に発明を、本発明のその他特徴、実施態様および利点を表す図面および実施例を参照しながら詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本明細書で用いた用語を規定する概略図。２本ある鎖の内、上の鎖は第１鎖であり、ｍＲＮＡの様な標的となる核酸のアンチセンス鎖である。第２鎖は標的となる核酸に実質的に対応する配列を持つ鎖であり、従ってセンス鎖を形作っている。両鎖、即ち第１鎖と第２鎖は、典型的にはワトソンクリック塩基対合により２本鎖構造を形成する。
【図２Ａ】本明細書に於いて修飾パターンとも呼ばれる、ヌクレオチドの修飾群および非修飾群のパターンを有する本発明リボ核酸分子の幾つかの実施態様を表している。本明細書では、ヌクレオチドの修飾群はまた修飾ヌクレオチド群とも呼ばれる。非修飾ヌクレオチドまたは本明細書に於いてヌクレオチドのフランキング群とも呼ばれるヌクレオチドの非修飾群は、本明細書で使用する時ここに開示した修飾を１または複数個有しても良いが、前記修飾は修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドの修飾とは異なるものである。図２Ａでは、ヌクレオチドの修飾および非修飾群、即ち第１ストレッチおよび第２ストレッチの両ストレッチ上の修飾ヌクレオチド群およびヌクレオチドのフランキング群がストレッチの対応する部分に配置されており、それにより互いに整合されている（第１鎖の修飾ヌクレオチドの群が第２鎖の修飾ヌクレオチドの群と並び、第１鎖のヌクレオチドのフランキング群は第２鎖のヌクレオチドのフランキング群と並んでいる）、一方図２Ｂでは第１鎖上で実現されたパターンが第２鎖上でも実現されるが、その位相は第１ストレッチのヌクレオチド修飾群が第２ストレッチのヌクレオチド非修飾群と塩基対合し、その逆も同様になるようにシフトしており、その結果第１鎖の修飾ヌクレオチドの群は、第２鎖のヌクレオチドのフランキング群と並ぶ。図２Ｃにはヌクレオチド修飾群および非修飾群について考え得る別の配置が実現されている。第１ストレッチのパターンが第２ストレッチのパターンと無関係であり、そして両パターンが塩基対合により画定する２本鎖構造内において互いの相対位置という観点で部分的に重複する場合も、本発明の範囲内である。別の実施態様では、この重複の範囲はストレッチおよび鎖それぞれの長さを超えて変化できる。
【図２Ｂ】本明細書に於いて修飾パターンとも呼ばれる、ヌクレオチドの修飾群および非修飾群のパターンを有する本発明リボ核酸分子の幾つかの実施態様を表している。本明細書では、ヌクレオチドの修飾群はまた修飾ヌクレオチド群とも呼ばれる。非修飾ヌクレオチドまたは本明細書に於いてヌクレオチドのフランキング群とも呼ばれるヌクレオチドの非修飾群は、本明細書で使用する時ここに開示した修飾を１または複数個有しても良いが、前記修飾は修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドの修飾とは異なるものである。図２Ａでは、ヌクレオチドの修飾および非修飾群、即ち第１ストレッチおよび第２ストレッチの両ストレッチ上の修飾ヌクレオチド群およびヌクレオチドのフランキング群がストレッチの対応する部分に配置されており、それにより互いに整合されている（第１鎖の修飾ヌクレオチドの群が第２鎖の修飾ヌクレオチドの群と並び、第１差のヌクレオチドのフランキング群は第２鎖のヌクレオチドのフランキング群と並んでいる）、一方図２Ｂでは第１鎖上で実現されたパターンが第２鎖上でも実現されるが、その位相は第１ストレッチのヌクレオチド修飾群が第２ストレッチのヌクレオチド非修飾群と塩基対合し、その逆も同様になるようにシフトしており、その結果第１鎖の修飾ヌクレオチドの群は、第２鎖のヌクレオチドのフランキング群と並ぶ。図２Ｃにはヌクレオチド修飾群および非修飾群について考え得る別の配置が実現されている。第１ストレッチのパターンが第２ストレッチのパターンと無関係であり、そして両パターンが塩基対合により画定する２本鎖構造内において互いの相対位置という観点で部分的に重複する場合も、本発明の範囲内である。別の実施態様では、この重複の範囲はストレッチおよび鎖それぞれの長さを超えて変化できる。
【図２Ｃ】本明細書に於いて修飾パターンとも呼ばれる、ヌクレオチドの修飾群および非修飾群のパターンを有する本発明リボ核酸分子の幾つかの実施態様を表している。本明細書では、ヌクレオチドの修飾群はまた修飾ヌクレオチド群とも呼ばれる。非修飾ヌクレオチドまたは本明細書に於いてヌクレオチドのフランキング群とも呼ばれるヌクレオチドの非修飾群は、本明細書で使用する時ここに開示した修飾を１または複数個有しても良いが、前記修飾は修飾ヌクレオチド群を形成するヌクレオチドの修飾とは異なるものである。図２Ａでは、ヌクレオチドの修飾および非修飾群、即ち第１ストレッチおよび第２ストレッチの両ストレッチ上の修飾ヌクレオチド群およびヌクレオチドのフランキング群がストレッチの対応する部分に配置されており、それにより互いに整合されているが（第１鎖の修飾ヌクレオチドの群が第２鎖の修飾ヌクレオチドの群と並び、第１差のヌクレオチドのフランキング群は第２鎖のヌクレオチドのフランキング群と並んでいる）、一方図２Ｂでは第１鎖上で実現されたパターンが第２鎖上にも実現されるが、その位相は第１ストレッチのヌクレオチド修飾群が第２ストレッチのヌクレオチド非修飾群と塩基対合し、その逆も同様になるようにシフトしており、その結果第１鎖の修飾ヌクレオチドの群は、第２鎖のヌクレオチドのフランキング群と並ぶ。図２Ｃにはヌクレオチド修飾群および非修飾群について考え得る別の配置が実現されている。第１ストレッチのパターンが第２ストレッチのパターンと無関係であり、そして両パターンが塩基対合により画定する２本鎖構造内において互いの相対位置という観点で部分的に重複する場合も、本発明の範囲内である。別の実施態様では、この重複の範囲はストレッチおよび鎖それぞれの長さを超えて変化できる。
【図３Ａ】様々な末端保護基を持つＲＮＡｉ分子を用いたノックダウン実験の結果。より具体的には図３Ａは各種形状の末端を保護されたＲＮＡｉ分子がＰＴＥＮ  ｍＲＮＡのノックダウンに機能しうることを示している。
【図３Ｂ】様々な末端保護基を持つＲＮＡｉ分子を用いたノックアウト実験の結果。結果が図３Ａに描かれている、実験に使用した各種ＲＮＡｉ分子の配列を表している。
【図３Ｃ】様々な末端保護基を持つＲＮＡｉ分子を用いたノックアウト実験の結果。ＰＴＥＮ特異的アンチセンス構築物と比較した、修飾ＲＮＡｉ分子で処理した後のＰＴＥＮタンパク質のイムノブロット分析結果を表している。
【図４Ａ】ＲＮＡｉ分子の３’突出がＲＮＡ干渉にとって重要ではないことを示す。より具体的には図４Ａは、各種ＲＮＡｉ分子の用量反応曲線を示す。
【図４Ｂ】ＲＮＡｉ分子の３’突出がＲＮＡ干渉にとって重要ではないことを示す。図４Ｂは、結果が図４Ａに示されている実験に使用したＲＮＡｉ分子の配列を示す。
【図５Ａ】ＲＮＡｉ分子の二本鎖長は少なくとも１８〜１９ヌクレオチドでなければならないことを示す。より具体的には図５Ｂは図５Ａにその結果が用量依存曲線として描かれている実験に使用したＰＴＥＮ特異的ＲＮＡｉ分子の配列である。
【図５Ｂ】ＲＮＡｉ分子の二本鎖長は少なくとも１８〜１９ヌクレオチドでなければならない。より具体的には図５Ｂは図５Ａにその結果が用量依存曲線として描かれている実験に使用したＰＴＥＮ特異的ＲＮＡｉ分子の配列を示す。
【図６Ａ】末端に４個の不一致ヌクレオチドを有する１９ヌクレオチド長のＲＮＡｉ分子はＡｋｔ１ノックダウンを媒介するにおいて機能を依然有していることを示す。より具体的には図６Ｂは図６Ａに結果が描かれている実験に使用したＲＮＡｉ分子の配列である。
【図６Ｂ】末端に４個の不一致ヌクレオチドを有する１９ヌクレオチド長のＲＮＡｉ分子はＡｋｔ１ノックダウンを媒介するにおいて機能を依然有している。より具体的には図６Ｂは図６Ａに結果が描かれている実験に使用したＲＮＡｉ分子の配列である。
【図７Ａ】ｓｉＲＮＡの二本鎖長に関する必要条件および突然変異に関する許容度についてのさらなる結果。より具体的には図７Ａは、使用した各種構築体（左パネル）と表示量の各ｓｉＲＮＡ分子を用いた時のｐ１１０αの発現に対するＨｅＬａ細胞内でのＡｋｔ１  ｍＲＮＡの発現阻害に及ぼすそれぞれの影響（右パネル）。不一致ｓｉＲＮＡ分子内のヌクレオチドの変化は矢印で示されている；３’デオキシヌクレオチドは、在る場合には大文字で表されている。
【図７Ｂ】ｓｉＲＮＡの二本鎖長に関する必要条件および突然変異に関する許容度についてのさらなる結果。各種ＰＴＥＮ特異的ｓｉＲＮＡ（左パネル）と各種ｓｉＲＮＡ量に於けるＰＥＴＮ／ｐ１１０α比の形で表したＨｅＬａ細胞でのＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ発現阻害である。
【図７Ｃ】ｓｉＲＮＡの二本鎖長に関する必要条件および突然変異に関する許容度についてのさらなる結果。ローディングコントロール（loading control）としてｐ１００αを用いた、それぞれ４８時間および９６時間後に、ＰＴＥＮ特異的ｓｉＲＮＡ（３０ｎＭ）および各不一致ｓｉＲＮＡによるＰＴＥＮタンパク質の発現阻害を表すウエスタンブロット分析。
【図８】２’−Ｏ−メチル化によるＲＮＡｉ分子への血清中での安定性付与に関する研究の結果、および末端修飾がＲＮＡｉ安定性に何らの有益な効果も有していないことを示す。具体的には、８Ａには８Ｂに示した各種ＲＮＡｉ分子を、ウシ胎児血清とのインキュベーションにかけたもののゲル電気泳動の結果を示す。
【図９Ａ】アミノ末端修飾による活性消失を示す図。図９Ｂは図９Ａの中でその結果をＰＴＥＮ／ｐ１１０α発現レベル比として表した実験に実際に使用したＲＮＡｉ分子である。図９Ｃは図９Ａに示した結果より演繹されるデザイン原理を表している。図９Ｃで使用する場合、機能的という用語は、実施例に具体的に記載されているアッセイシステムに於いて機能的に作用することを意味しており、「機能的でない（非機能的）」とは、前記システムで機能的に作用しないことを意味する。
【図９Ｂ】アミノ末端修飾による活性消失を示す図。図９Ｂは図９Ａの中でその結果をＰＴＥＮ／ｐ１１０α発現レベル比として表した実験に実際に使用したＲＮＡｉ分子である。図９Ｃは図９Ａに示した結果より演繹されるデザイン原理を表している。図９Ｃで使用する場合、機能的という用語は、実施例に具体的に記載されているアッセイシステムに於いて機能的に作用することを意味しており、「機能的でない（非機能的）」とは、前記システムで機能的に作用しないことを意味する。
【図９Ｃ】アミノ末端修飾による活性消失を示す図。図９Ｂは図９Ａの中でその結果をＰＴＥＮ／ｐ１１０α発現レベル比として表した実験に実際に使用したＲＮＡｉ分子である。図９Ｃは図９Ａに示した結果より演繹される設計原理を表している。図９Ｃで使用する場合、機能的という用語は、実施例に具体的に記載されているアッセイシステムに於いて機能的に作用することを意味しており、「機能的でない（非機能的）」とは、前記システムで機能的に作用しないことを意味する。
【図１０Ａ】２’−Ｏ−アルキル（メチル）修飾がＲＮＡｉ分子を安定化するが、またそれら分子の活性も低下させることを示す。より具体的には図１０Ｃはその結果が図１０Ａの中に用量反応曲線として描かれている実験に使用したＲＮＡｉの配列を表している。図１０Ｂは、ウシ胎児血清と２時間インキュベーションした、図１０Ｃに示された各種ＲＮＡｉ分子のゲル電気泳動の結果を表している。
【図１０Ｂ】２’−Ｏ−アルキル（メチル）修飾がＲＮＡｉ分子を安定化するが、またそれら分子の活性も低下させることを示す。より具体的には図１０Ｃはその結果が図１０Ａの中に用量反応曲線として描かれている実験に使用したＲＮＡｉの配列を表している。図１０Ｂは、ウシ胎児血清と２時間インキュベーションした、図１０Ｃに示された各種ＲＮＡｉ分子のゲル電気泳動の結果を表している。
【図１０Ｃ】２’−Ｏ−アルキル（メチル）修飾がＲＮＡｉ分子を安定化するが、またそれら分子の活性も低下させることを示す。より具体的には図１０Ｃはその結果が図１０Ａの中に用量反応曲線として描かれている実験に使用したＲＮＡｉの配列を表している。図１０Ｂは、ウシ胎児血清と２時間インキュベーションした、図１０Ｃに示された各種ＲＮＡｉ分子のゲル電気泳動の結果を表している。
【図１１Ａ】２’−Ｏ−メチル修飾でブロックしたＲＮＡｉ分子の効率に関する実験の結果であり、図１１Ａは前記実験結果を用量反応曲線として表したものであり、図１１Ｃは前記実験で実際に使用したＲＮＡｉ分子の配列を示している。図１１Ｂはウシ胎児血清と２時間インキュベーションした、図１１Ｃに示した各種ＲＮＡｉ分子のゲル電気泳動の結果である。
【図１１Ｂ】２’−Ｏ−メチル修飾でブロックしたＲＮＡｉ分子の効率に関する実験の結果であり、図１１Ａは前記実験結果を用量反応曲線として表したものであり、図１１Ｃは前記実験で実際に使用したＲＮＡｉ分子の配列を示している。図１１Ｂはウシ胎児血清と２時間インキュベーションした、図１１Ｃに示した各種ＲＮＡｉ分子のゲル電気泳動の結果である。
【図１１Ｃ】２’−Ｏ−メチル修飾でブロックしたＲＮＡｉ分子の効率に関する実験の結果であり、図１１Ａは前記実験結果を用量反応曲線として表したものであり、図１１Ｃは前記実験で実際に使用したＲＮＡｉ分子の配列を示している。図１１Ｂはウシ胎児血清と２時間インキュベーションした、図１１Ｃに示した各種ＲＮＡｉ分子のゲル電気泳動の結果である。
【図１２Ａ】各種２’−Ｏ−メチル修飾がもたらす修飾ＲＮＡｉ分子活性と  非修飾型の活性との比較した。より具体的には、図１２Ｂは図１２Ａにその結果を示した実験に使用したＲＮＡｉ分子の配列を示している。図１２Ｃは、２時間血清中でインキュベーションした後の前記ＲＮＡｉ分子の安定性を表しており、一方図１２ＤはＨｅＬａ細胞に各種ＲＮＡｉ分子を作用した場合のＰＴＥＮタンパク質に関するイムノブロットを表している。これから分かるように、各種修飾されたＲＮＡｉ分子はエンドヌクレアーゼによる分解に対し安定化し、そしてＰＴＥＮタンパク質のノックダウンを媒介するにおいて活性である。
【図１２Ｂ】各種２’−Ｏ−メチル修飾がもたらす修飾ＲＮＡｉ分子活性と  非修飾型の活性との比較した。より具体的には、図１２Ｂは図１２Ａにその結果を示した実験に使用したＲＮＡｉ分子の配列を示している。図１２Ｃは、２時間血清中でインキュベーションした後の前記ＲＮＡｉ分子の安定性を表しており、一方図１２ＤはＨｅＬａ細胞に各種ＲＮＡｉ分子を作用した場合のＰＴＥＮタンパク質に関するイムノブロットを表している。これから分かるように、各種修飾されたＲＮＡｉ分子はエンドヌクレアーゼによる分解に対し安定化し、そしてＰＴＥＮタンパク質のノックダウンを媒介するにおいて活性である。
【図１２Ｃ】各種２’−Ｏ−メチル修飾がもたらす修飾ＲＮＡｉ分子活性と  非修飾型の活性との比較した。より具体的には、図１２Ｂは図１２Ａにその結果を示した実験に使用したＲＮＡｉ分子の配列を示している。図１２Ｃは、２時間血清中でインキュベーションした後の前記ＲＮＡｉ分子の安定性を表しており、一方図１２ＤはＨｅＬａ細胞に各種ＲＮＡｉ分子を作用した場合のＰＴＥＮタンパク質に関するイムノブロットを表している。これから分かるように、各種修飾されたＲＮＡｉ分子はエンドヌクレアーゼによる分解に対し安定化し、そしてＰＴＥＮタンパク質のノックダウンを媒介するにおいて活性である。
【図１２Ｄ】各種２’−Ｏ−メチル修飾がもたらす修飾ＲＮＡｉ分子活性と  非修飾型の活性との比較した。より具体的には、図１２Ｂは図１２Ａにその結果を示した実験に使用したＲＮＡｉ分子の配列を示している。図１２Ｃは、２時間血清中でインキュベーションした後の前記ＲＮＡｉ分子の安定性を表しており、一方図１２ＤはＨｅＬａ細胞に各種ＲＮＡｉ分子を作用した場合のＰＴＥＮタンパク質に関するイムノブロットを表している。これから分かるように、各種修飾されたＲＮＡｉ分子はエンドヌクレアーゼによる分解に対し安定化し、そしてＰＴＥＮタンパク質のノックダウンを媒介するにおいて活性である。
【図１３】ＰＴＥＮタンパク質ノックダウンの経時変化を決定するためのウエスタンブロッティング分析の結果を示す。カチオン性脂質を用いて、細胞に２’−Ｏ−メチル修飾または非修飾ＲＮＡｉ分子を７２時間、連続的にトランスフェクションした。４８時間および１２０時間後にタンパク質溶解物を調製してイムノブロッティングで分析した。９６および１２０時間後に細胞を分割し、プレーティングしなおし、ＲＮＡｉ分子なしで更に２４および４８時間インキュベーションした。
【図１４】各種修飾ＲＮＡｉ分子を用いた持続的なＰＴＥＮのタンパク質ノックダウンと非修飾ＲＮＡｉ分子を用いた場合とを比較したウエスタンブロッティングを示す。トランスフェクションは５時間のみ実施し、トランスフェクション試薬を含まない新しい培地を加えた。溶解物を、表示したＲＮＡｉ分子トランスフェクション後７２時間および９６時間目にイムノブロッティングにより分析した。
【図１５Ａ】特徴ある２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾を持つｓｉＲＮＡ分子は血清中では安定性を増し、ＨｅＬａ細胞内ではタンパク質ノックダウンを媒介する。より具体的には、図１５Ａは使用した各種ＳｉＲＮＡ分子構築物を示しており（左パネル）、配列内の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾箇所は下線を付け太字で表している。表示量の修飾ｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞でのＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ発現の阻害はＰＴＥＮ／ｐ１１０α比として表し、右パネルに示している。
【図１５Ｂ】特徴ある２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾を持つｓｉＲＮＡ分子は血清中では安定性を増し、ＨｅＬａ細胞内ではタンパク質ノックダウンを媒介する。図１５Ｂは左パネルに使用した各種ｓｉＲＮＡ構築物を示し、右パネルには血清中でインキュベーション後の修飾および非修飾ｓｉＲＮＡ分子のＰＡＡゲル電気泳動を示している；２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを持つ各種構築物には下線を付け、太字で表している。
【図１５Ｃ】特徴ある２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾を持つｓｉＲＮＡ分子は血清中では安定性を増し、ＨｅＬａ細胞内ではタンパク質ノックダウンを媒介する。図１５Ｃは、図１５Ａおよび図１５Ｂにそれぞれ示した各種ｓｉＲＮＡ構築物（３０ｎＭ）を用いたＰＴＥＮタンパク質発現阻害を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づくイムノブロッティングを示している。ここでもローディングコントロールとしてｐ１１０αを用いている。
【図１５Ｄ】特徴ある２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾を持つｓｉＲＮＡ分子は血清中では安定性を増し、ＨｅＬａ細胞内ではタンパク質ノックダウンを媒介する。図１５Ｄは、長期間のタンパク質ノックダウン、即ち特徴ある２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾を持つｓｉＲＮＡ分子（３０ｎＭ）投与による、４８および１２８時間後のＰＴＥＮタンパク質発現阻害を示すイムノブロッティングである。図１５Ｃ同様にローディングコントロールとしてｐ１１０αを用いている。
【図１６Ａ】Ａｋｔ１およびｐ１１０β  ｍＲＮＡに特異的な、特徴ある２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾を持つｓｉＲＮＡ分子は、血清中では安定性を増し、ＨｅＬａ細胞内ではタンパク質ノックダウンを媒介する。より具体的には、図１６Ａは左パネルに使用した各種構築物を示しており、ここでも２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドには下線を付け太字で示している。血清中インキュベーション後の、表示ｓｉＲＮＡ分子の健全性を右パネルに示している。
【図１６Ｂ】Ａｋｔ１およびｐ１１０β  ｍＲＮＡに特異的な、特徴ある２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾を持つｓｉＲＮＡ分子は、血清中では安定性を増し、ＨｅＬａ細胞内ではタンパク質ノックダウンを媒介する。図１６Ｂはｐ１１０をローディングコントロールに用い、表示のｓｉＲＮＡ（３０mM）を細胞にトランスフェクションした時のＡｋｔ１、Ａｋｔ２およびＡｋｔリン酸化のイムノブロッティングを示している。
【図１６Ｃ】Ａｋｔ１およびｐ１１０β  ｍＲＮＡに特異的な、特徴ある２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾を持つｓｉＲＮＡ分子は、血清中では安定性を増し、ＨｅＬａ細胞内ではタンパク質ノックダウンを媒介する。図１６Ｃは各種ｐ１１０β特異的ｓｉＲＮＡ構築物を示しており（左パネル）、図内２’−Ｏ−メチル修飾には下線を付け、太字で表示している。また前記ｓｉＲＮＡ構築物による、下流にあるキナーゼＡｋｔ１のリン酸化の阻害に関するイムノブロッティング分析の結果も示している（右パネル）。ｐ１１０αをローディングコントロールに用いている。
【図１７】用量反応曲線の形で表した、ヘアピン構造を持つ各種ＲＮＡｉ分子の有効性を示す。１７Ｂは、その結果を図１７Ａに示した前記ＲＮＡｉ分子の構造を示している。様々なループを持つ合成ｓｉＲＮＡが、ｐ１１０β、Ａｋｔ１およびＡｋｔ２発現を低下させる機能を示す。（１４Ａ）ｓｉＲＮＡトランスフェクションＨｅＬａ細胞でのｐ１１０β  ｍＲＮＡ発現の阻害。サンプルを、表示したｓｉＲＮＡトランスフェクション後２４時間目にｐ１１０β  ｍＲＮＡ発現レベルについて同時に分析した。トランスフェクションした２分子型ｓｉＲＮＡ（２１ｍｅｒの長さで、３’ＴＴ突出を持つ、分子１ＡＢ）またはループ構造を持つモノ分子ｓｉＲＮＡを図示している。アンチセンス配列に対するループ（ＨＩＶ由来ｐＡ−ループ；（Ａ）12−ループ）の位置が３Ａ、４Ａのものが３Ｂ、４Ｂのものと逆になっていることに注意。２ＡＢのｓｉＲＮＡ分子は２１ｍｅｒ二本鎖の中に６個の不一致を含んでおり、未処理サンプルと共に陰性コントロールとして役立つ。ＲＮＡを調製し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）分析にかけた。ｐ１１０β  ｍＲＮＡレベルは、内部コントロールとして用いたｐ１１０αのｍＲＮＡレベルと比較する形で示している。各バーは３回のトランスフェクション（±標準偏差）を表している。集密度５０％（２５００細胞／９６ウエル）のＨｅＬａ細胞に、表示濃度のｓｉＲＮＡを増殖培地中でトランスフェクションした。
【図１８Ａ】用量反応曲線の形で表した、分子間および分子内ループ構造を持つ各種ＲＮＡｉ分子の有効性を示す。（１８Ａ）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞でのＡｋｔ１  ｍＲＮＡ発現の阻害。サンプルを、表示したｓｉＲＮＡをトランスフェクションしてから２４時間後に、Ａｋｔ１及びＡｋｔ２  ｍＲＮＡ発現レベルについて同時に分析した。各種ループ（Ａ−ループ；ＧＡＧＡ−ループおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−リンカー）およびその推定二次構造を図示した。ｓｉＲＮＡ分子９ＡはＡｋｔ２に特異的であり、陰性コントロールとして用いた。１０Ａおよび１０Ｂは自己相補的配列を含んでおらず、組み合わせてトランスフェクションしたことに注意。Ａｋｔ１  ｍＲＮＡレベルは、内部コントロールとして用いたｐ１１０αのｍＲＮＡレベルと比較する形で示している。（１８Ｂ）  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞でのＡｋｔ２  ｍＲＮＡ発現の阻害。Ａｋｔ２  ｍＲＮＡレベルは、ｐ１１０βのｍＲＮＡレベルと比較する形で示している。Ａｋｔ１特異性分子７Ａをここで陰性コントロールとして用いた。
【図１８Ｂ】用量反応曲線の形で表した、分子間および分子内ループ構造を持つ各種ＲＮＡｉ分子の有効性を示す。（１８Ａ）ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞でのＡｋｔ１  ｍＲＮＡ発現の阻害。サンプルを、表示したｓｉＲＮＡをトランスフェクションしてから２４時間後に、Ａｋｔ１及びＡｋｔ２  ｍＲＮＡ発現レベルについて同時に分析した。各種ループ（Ａ−ループ；ＧＡＧＡ−ループおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−リンカー）およびその推定二次構造を図示した。ｓｉＲＮＡ分子９ＡはＡｋｔ２に特異的であり、陰性コントロールとして用いた。１０Ａおよび１０Ｂは自己相補的配列を含んでおらず、組み合わせてトランスフェクションしたことに注意。Ａｋｔ１  ｍＲＮＡレベルは、内部コントロールとして用いたｐ１１０αのｍＲＮＡレベルと比較する形で示している。（１８Ｂ）  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞でのＡｋｔ２  ｍＲＮＡ発現の阻害。Ａｋｔ２  ｍＲＮＡレベルは、ｐ１１０βのｍＲＮＡレベルと比較する形で示している。Ａｋｔ１特異性分子７Ａをここで陰性コントロールとして用いた。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、各種ループを有する合成ｓｉＲＮＡの機能性を示すＡｋｔタンパク質における、特異的Ａｋｔ１およびＡｋｔ２の発現阻害についてのウエスタンブロッティング分析を示す。Ａｋｔ１およびＡｋｔ２タンパク質発現の阻害はイムノブロッティングにより分析した。細胞は、表示のヘアピン型ｓｉＲＮＡ（２０ｎＭ）をトランスフェクションした後４８時間目に集めた。細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗−ｐ１１０抗体、抗Ａｋｔ１／２を用いたイムノブロッティングで分析した。同様の結果は、Ａｋｔ１のリン酸化型に特異的な抗体でも得られた。ローディングコントロールとして用いたＰＩ  ３−キナーゼの別の触媒サブユニットであるｐ１１０α、ならびにＡｋｔ１、Ａｋｔ２およびリン酸化Ａｋｔ（Ｐ＊−Ａｋｔ）の位置を左側に示した。
【図１９】３’−ＯＨ末端ヌクレオチドまたは５’末端ヌクレオチドに存在する可能性のある、本明細書でアミノ修飾とも呼ばれる、ＮＨ2修飾を示す。アミノ基はリン酸基に結合し、さらにこのリン酸基は１〜８、好ましくは６個のＣ原子のアルキル鎖を含むアルキル基を介して糖部分のＯＨ基に結合しており、この時リン酸基に近い２番目のＣ原子はリン酸基に結合するＣＨ２ＯＨ基を有している。あるいはエーテルによりリンカーを形成してもよく、この時エーテルは２つのアルコールを含むものであって、１つのアルコールはアミノアルコールであり、もう一つのアルコールは１つのアルコール基がエーテル基の形成に関係し、もう一つのアルコール基がいずれかのＣ原子、好ましくはリン酸基に対し２番目になるＣ原子に配置されたＯＨ基であるエーテルである。
【実施例１】
【０１１０】
合成二本鎖ＲＮＡｉ分子の用量反応
本実施例では、２本鎖ＲＮＡｉ分子の活性に及ぼすＮＨ2末端保護基の影響を調べた。合成ｓｉＲＮＡはBiospring(Frankfurt、Germany）より購入した。リボ−オリゴヌクレオチドを、ＲＮａｓｅを含まないＴＥに最終濃度５０μＭになるように懸濁した。２分子型ｓｉＲＮＡの場合は、等量（１００μM）を組み合わせて最終濃度を５０μＭとした。分子間二本鎖を形成する場合には、ｓｉＲＮＡを５０℃で２分間、アニーリング緩衝液（２５mM  ＮａＣｌ；５mM  ＭｇＣｌ2）の中でインキュベーションしてから室温まで冷却した。トランスフェクションは、オリゴフェクタミン（Oligofectamine）、リポフェクタミン（Lipofectamine(Life Technologies)）、NC388(Ribozyme Pharmaceuticals、Inc.,CO）またはFuGene 6(Roche）といった各種カチオン性脂質を製造元指示書に従って使用し、９６ウエルまたは１０−cmプレートの中で（３０〜５０％集密度）行った。ＲＮＡｉ分子のトランスフェクションは、前もって無血清培地に５倍濃度で調製しておいたアニーリング済みＲＮＡｉと脂質との複合物を、完全培地中の細胞に加える形で実施した。トランスフェクション前、９６ウエル形式でのトランスフェクションを行う１５〜１８時間前に、ウエル当たり２５００個のＨｅＬａ細胞をプレーティングした。
【０１１１】
全トランスフェクション容積は、９６ウエルにプレーティングした細胞の場合は１００μl、１０cmプレートの細胞の場合には１０mlであった。最終脂質濃度は細胞密度に応じて０．８〜１．２μg/mlであった；ＲＮＡｉ濃度は実験毎に表示する。
【０１１２】
３０分間、３７℃で複合体を形成させた。複合体を細胞に加えて、脂質およびＲＮＡｉを最終的に１倍濃度にした。トランスフェクション後に実施する分析に応じ、即ちＲＮＡ分析の場合にはトランスフェクション２４〜４８時間後に、そしてウエスタンブロットによるタンパク質分析の場合にはトランスフェクション４８〜７２時間後に、細胞をタンパク質抽出用の標準的な細胞溶解緩衝液を用いて溶解するか（Klippel、A.、Escobedo、J.A.、Hirano、M.およびWilliams、L.T.(1994年).Mol Cell Biol 14、2675〜2685）、またはＲＡＮ単離キット（Invitek、Berlin(Germany)）のＲＮＡ単離用変性緩衝液を用いて溶解した。
【０１１３】
Ｔａｑｍａｎ分析によるＲＮＡレベルの相対量測定：
９６ウエル内でトランスフェクションした細胞のＲＮＡを、トランスフェクション２４時間後にＩｎｖｉｓｏｒｂ  ＲＮＡ  ＨＴＳ９６キット（ＩｎＶｉｔｅｋ  ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｌｉｎ）を用いて単離、精製した。ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ発現の阻害は、３００ｎＭのＰＴＥＮ５’プライマーＣＡＣＣＧＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＡ、３００ｎＭのＰＴＥＮ３’プライマーＡＡＧＧＧＴＴＴＧＡＴＡＡＧＴＴＣＴＡＧＣＴＧＴおよび１００ｎＭのＰＴＥＮ  ＴａｑｍａｎプローブＦａｍ−ＴＧＣＡＣＡＧＴＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＣＡＴＡＡＣＣＣＡ−Ｔａｍｒａを、４０ｎＭのβ−アクチン５’プライマーＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡ、４０ｎＭのβ−アクチン３’プライマーＧＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＣＡおよび１００ｎＭのβ−アクチンＴａｑｍａｎプローブＶｉｃ−ＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＴＧ−Ｔａｍｒａと組み合わせて用いるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Taqman）分析により検出した。Ａｋｔプライマーおよびプローブは、Sternberger et al.(Sternberger、a.a.O）で決定されたものであり、製造元指示書（Applied Biosystem;Amplicon Setを使用）に従い使用した。前記プライマーおよびプローブはPrimer Express(Applied Biosystem）を用いて設計してもよい。反応は５０μlで実施され、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００シーケンス検出装置（Applied Biosystems）を製造元の指示書に従い用いて、以下の条件で行った：４８℃３０分間、９５℃１０分間の後に９５℃１５秒および６０℃１分間を４０サイクル。
【０１１４】
ＲＮＡノックダウンは、非修飾および５’末端をＮＨ2または逆方向脱塩基（inverted Abasics）基で修飾した２１ｎｔ長のｓｉＲＮＡ二本鎖分子を、脂質担体濃度１．０μg/mlでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析して行った。細胞密度は２０００細胞／ウエルであった。３’−末端の修飾はＲＮＡ突出、アミノ基を持ったＲＮＡ−突出、またはＤＮＡ突出のいずれかであった。
【０１１５】
細胞抽出物の調製およびイムノブロッティング．細胞を冷リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗った後、４℃にて２０mMのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１３７mMのＮａＣｌ、１５％（容積／容積）グリセロール、１％（容積／容積）Nonidet P-40、２mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、アプロチニン１０mg/ml、２０mMのロイペプチン、２mMベンズアミジン、１mMバナジウム酸ナトリウム、２５mMβグリセロールリン酸、５０mMのＮａＦおよび１０mMのＮａＰＰｉを含有する溶解緩衝液内に溶解した。溶解物を１４、０００×ｇ、５分間遠心分離にかけて清浄化し、等量のタンパク質を含有する小分けした細胞抽出物をウエスタンブロッティングによるタンパク質発現の分析にかけた：サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してからニトロセルロースフィルター（Schleicher & Schull）に写し取った。ドライミルクを５％（重量／容積）含有するＴＢＳＴ緩衝液（１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５％（容積／容積）Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％（重量／容積）アジ化ナトリウム）でフィルターをブロッキングした。各抗体を適当な希釈度でＴＢＳＴに加えた。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス−または抗ウサギ抗体（Transduction Laboratories）を用いてＴＢＳＴ中で検出し、洗浄後、SuperSignal West Dura(Pierce）またはＥＣＬ（Amersham）化学発光基質（次項参照、Sternbergere al(2002)。Antisense. Nucl. Ac. Drug Dev. 印刷中）を用いて現像した。
【０１１６】
抗体．マウスモノクローナル抗−ｐ１１０抗体Ｕ３Ａおよびマウスモノクローナル抗ｐ８５抗体Ｎ７Ｂについては報告されている（Klippel et al.、1994年、aaO）。ウサギポリクローナル抗−Ａｋｔおよび抗−ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）抗体はCell Signaling Technologyより得た。マウスモノクローナル抗−ＰＴＥＮ抗体はSanta Cruz Biotechnologyより得た。ＰＴＥＮ  ５３特異的アンチセンス分子、即ちgeneBlocは、Sternberg らが記載しており(Sternberger、上記）、以下の配列を有している（ｕｃｕｃｃｕｕＴＴＧＴＴＴＣＴＧｃｕａａｃｇａ）が、この場合小文字で書かれたヌクレオチドはリボヌクレオチドであり、大文字で書かれたヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドである。このアンチセンス分子はＴＴを除いてＲＮＡｉ１Ａと同一である。
【０１１７】
結果は図３Ａに示し、またＰＴＥＮのｍＲＮＡを標的とする各ＲＮＡｉ分子を図３Ｂｂに示した。小文字で書かれたヌクレオチドはリボヌクレオチドを表し、大文字でかかれたものはデオキシリボヌクレオチドを表す。用語ＮＨ２はリボヌクレオチドの３’−位置がアミノ基で修飾されていることを示す。本実施例および本明細書に開示する他実施例で用いるＲＮＡｉ分子は、小型干渉ＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡと呼ぶこともある。本明細書内の図面では、上側の鎖が干渉ＲＮＡ分子のアンチセンスまたは第１鎖であり、下側の鎖がセンスまたは第２鎖であることに注意する。
【０１１８】
図３Ａから明らかなように、アミノ修飾の様なアミノ末端修飾およびヌクレオチドの末端ＯＨ基の逆方向脱落塩基は、修飾がアンチセンス鎖の３’末端に位置する場合には非修飾端になる可能性がある（図８Ａ；８Ｂも参照）。従って安定化またはその他特性（配送）を目的とした化学修飾は、それが３’ＯＨに配置される場合；特に３’ＯＨが突出するヌクレオチドに在る場合には許容され、活性を損なうことはないだろう。
【０１１９】
図３Ｃに示す実験については、上記と同様の条件が用いられた。ＲＮＡｉの第１鎖および第２鎖は、リボース部分の３’−位置にあるＮＨ２基、または前記位置にある逆方向脱塩基により修飾された。第１構築物はｓｉＲＮＡ−ＮＨ2（３Ａ３Ｂ）として、第２鎖はｓｉＲＮＡ−ｉＢ（４Ａ４Ｂ）としてデザインされた。両分子の配列を図３Ｂに示す。用語３Ａ３Ｂは、干渉リボ核酸がアンチセンスとしての鎖３Ａとセンス鎖としての鎖３Ｂとから成ることを意味している。比較のために、同様にＰＴＥＮ  ｍＲＮＡを標的としたＧＢ５３と名付けられたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Steinberger et al. 上記）を作製した。後者の実験の詳細を以下説明する。
【０１２０】
図３Ｃからわかる如く、図３Ｂに示す末端保護されたＲＮＡｉ分子はＰＴＥＮタンパク質のノックダウン成立に機能した。
【０１２１】
本実施例より、両端保護基がＲＮＡｉ分子にＰＴＥＮタンパク質をノックダウンする活性を付与することがわかった。この阻害はアンチセンス構築物による阻害と同等に効果的であったが、より低濃度を使用したことから、既存の極めて強力なアンチセンス技術に比べても有利であることは明瞭である。
【実施例２】
【０１２２】
インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＲＮＡｉ二本鎖活性に関する突出の必要性
実験手法は、干渉ＲＮＡｉ分子を標的とするＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの設計が異なる外は実施例１の説明と同じであった。結果は図４Ａに用量反応曲線の形で示し、図４Ｂに図４Ａに示したデータを得るのに用いた干渉ＲＮＡｉ分子の具体的な配列および修飾を示した。表記法は、例えばＲＮＡｉ１８はアンチセンス鎖としての鎖１８Ａと、センス鎖としての鎖１８Ｂとから成ることを示すものである。
【０１２３】
ＨｅＬａ細胞内でＰＴＥＮ  ｍＲＮＡをノックダウンする活性について、平滑端分子と、３’−突出（ＲＮＡｉ１８）および５’−突出（ＲＮＡｉ３０およびＲＮＡｉ３１）を持つ分子とを比較した。平滑端分子（ＲＮＡｉ２８）および５’−突出を持つ分子の活性は、３’−突出を持つ分子の活性と同等であった。このことは、３’−突出がＲＮＡｉ活性に必須ではないことを表している。
【実施例３】
【０１２４】
インビボでのＲＮＡｉ活性に関する干渉ＲＮＡ分子二本鎖長の条件
実験方法は、干渉ＲＮＡ分子がＡｋｔ１のｍＲＮＡを標的とする外は、実施例１に概要示したものと同様であった。ＲＮＡｉ分子の特異性を示すための陰性コントロールは、ここでもｐ１１０  ｍＲＮＡであった。実験結果を図５Ａに示し、図５Ｂには用いた干渉ＲＮＡｉ分子の詳細を示した。図７Ａ、左パネルに示した別のｓｉＲＮＡ構築物についても同様の実験を実施したが、この場合不一致を矢印で示し、デオキシリボヌクレオチドは大文字で表した。表示量のｓｉＲＮＡ分子をトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞でのＡｋｔ１  ｍＲＮＡ発現の阻害を図７Ａの右パネルに示した。
【０１２５】
各種ＲＮＡｉ分子をトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞からのＡｋｔ  ＲＮＡに関するＴａｑｍａｎ分析からは、ｓｉＲＮＡの２本鎖二本鎖分子が活性を示すには１７塩基対より長くなくては成らず、一方１７塩基対長以下の二本鎖分子は、配列特異的突出が付加されていても機能的でないことが示された。試験が成功した最短のＲＮＡｉ分子は１８〜１９ヌクレオチドまたは塩基対長であった。ＲＮＡｉ５１と称する干渉ＲＮＡ分子５１Ａ／５１Ｂの設計は、国際特許出願ＷＯ０１／７５１６４に記載されたものに対応することに注意。ＲＮＡｉ分子５５Ａ／５５Ｂは１７ヌクレオチドのストレッチを含み、Ａｋｔ１  ｍＲＮＡの分解に関する活性が明瞭に低下している。
【０１２６】
図７Ａから明らかなように、１９ｎｔ長の二本鎖は３’突出の性質（デオキシ−またはリボヌクレオチド）とは無関係にＡｋｔ１  ｍＲＮＡレベルを極めて効率的に低下させた（分子１ＡＢ、２ＡＢ、３ＡＢ、４ＡＢに比較して）。１７ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡ（分子５ＡＢ）はサイレンシング活性（silencing activity）の大きな低下を示し、活性ｓｉＲＮＡ二本鎖が少なくとも１８ｎｔまたはそれ以上でなければならないという上記見解が確認された。いずれの理論にも結びつけることなしに、この結果は２種類の条件により機械的に説明されるだろう。第１の条件はｓｉＲＮＡのアンチセンスと標的ｍＲＮＡとの間に最低１８ｎｔの塩基対合が必要であるというものであり、第２の条件はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）への取り込みに最低長のｓｉＲＮＡ二本鎖が必要であるというものである。この疑問に答えるために、野生型配列に対して１および２個の末端突然変異（ＣＧおよびＵＡ逆位）を有する１９ｎｔ長のｓｉＲＮＡ二本鎖分子を合成した（分子６ＡＢおよび７ＡＢ）。両分子は標的ｍＲＮＡと１５ｎｔ塩基ストレッチだけ対合する分子であるが、Ａｋｔ１  ｍＲＮＡレベル誘導には機能的であった。従って、アンチセンスｓｉＲＮＡと標的ｍＲＮＡとの塩基対合の長さではなく、二本鎖のそのものの長さが機能的ｓｉＲＮＡの最低長を決定すると結論できるだろう。このことは、ＲＩＳＣ複合体への取り込みに関しては、２本鎖螺旋の長さが重要決定因子であることを示唆している。二本鎖ｓｉＲＮＡ末端への不一致導入は、ＲＮＡ干渉にほとんど影響しなかった。
【０１２７】
上記実験結果を考慮すると、ＲＮＡｉが媒介する最適な干渉に必要な最低の二本鎖長は、平滑端または５’−突出の様なＲＮＡｉ分子に関するさらなる設計、あるいはここに開示したその他形態とは無関係に１８または１９ヌクレオチドであり、このことはＲＮＡｉ分子に一般的に当てはまる。しかし、ＲＮＡｉ分子の特別な設計は前記分子に更に別の利点、例えば高い効率および高い安定性を付与することがあることを認識すべきである。
【実施例４】
【０１２８】
インビボでのＲＮＡｉに関する標的−アンチセンス相同性条件
実験構成は実施例１に記載のものと同等であるが、この場合ＲＮＡｉはＡＫｔ１特異的である。さらにＰＴＥＮ特異的干渉ＲＮＡ分子を設計し、陰性コントロールに用いた。結果は図６Ａおよび図６Ｂに示した。図７Ｂに示す更に別のｓｉＲＮＡ分子を用いて、基本的には同一な実験を行い、その結果をそれぞれ図７Ｂ（右パネル）および図７Ｃに示した。
【０１２９】
機能的ｓｉＲＮＡ分子の最低二本鎖長が１８または１８ヌクレオチド以上であることを確定した後に、サイレンシング活性にとって標的ｍＲＮＡとｓｉＲＮＡ間でどれだけの数のヌクレオチドが一致する必要があるか調べた。Ａｋｔ１  ＲＮＡのＴａｑｍａｎ分析で示される様に標的ＲＮＡに、この例ではＡｋｔ１に１９〜１５ヌクレオチドのストレッチが完全に一致していればＲＮＡｉ活性の媒介に十分であった。ＰＴＥＮ特異的ＲＮＡｉ分子はＡＫｔ１のＲＮＡ量を下げなかったことから、この方法が特異的であることが確認された。鎖のいずれか一方または両方の端部にある１個または２個のヌクレオチド不一致が機能していることから、遺伝子サイレンシングにとっては標的ｍＲＮＡとＲＮＡｉ間に１５ｎｔの相同的ストレッチがあれば十分であることが示唆された。これらのデータより、非特異的遺伝子サイレンシング無関係な標的に非特異的に結合することによって偶然に起こり得ると結論できた。このことは、１５〜１７個塩基対が一致するストレッチは単一遺伝子に特異的ではなく、脊椎動物のゲノムまたはトランスクリプトゾームの複雑性とサイズとを考えると偶然起こりえるという理解に基づいている。前記実験とは別に、不一致の位置についても分析した。そのためにＰＴＥＮ  ｍＲＮＡを標的とする１９ｎｔ長の平滑ｓｉＲＮＡを用いた。一方のｓｉＲＮＡ鎖の配列変化に合わせてもう一方の鎖も相補的に変更して補償し、二本鎖が破壊されないようにした。図７ＢおよびＣそれぞれから分かる様に、分子中央に点突然変異を１個だけ持つｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡおよびタンパク質発現のレベルで使用するには能力において大きく譲歩していた。この結果は、ＲＮＡ機構が二本鎖中心部での標的ｍＲＮＡとｓｉＲＮＡ間の塩基対合が完全であるか、不完全であるかにより大きく異なることを示している。この標的およびｓｉＲＮＡ間が完全に相補的であることに強く依存することは、ショウジョウバエ系でのＲＮＡｉ干渉については既に報告されていたが、ＨｅＬａの様なほ乳動物系での報告はなかった。
【０１３０】
この観察に基づいて、本発明は２つの方法によりｓｉＲＮＡの標的外問題（off-target problem）を軽減している。第１はｓｉＲＮＡ分子の分子長を最低条件（１８〜１９ｎｔ）まで短くし、それにより標的外のものと相同になる機会を減らす方法である。第２は、センス鎖を不活性化することにより、センス鎖が無関係の標的ＲＮＡとが偶然に相補的になることによって望まないＲＮＡサイレンシングが起こるのを防ぐことである（実施例６も参照せよ）。
【実施例５】
【０１３１】
血清中の修飾ＲＮＡｉ分子の安定性
オリゴヌクレオチドをヒト血清中で１５分間および２時間インキュベーションし、未処理のコントロールと共に１０％ポリアクリルアミドゲルにかけた。結果は図８Ａに示した。使用した各種ＲＮＡｉ分子を図８Ｂに示し、詳しく説明した。
【０１３２】
本実施例より、全ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル基で修飾されたＲＮＡ分子のＲＮＡｉ二本鎖（ＲＮＡｉ分子７９Ａ７９Ｂおよび２８Ａ２８Ｂ）が血清中で高い安定性を有することが分かった。さらに平滑端二本鎖は突出を持つ二本鎖分子に比べより安定であることも示された。これより、末端保護（例えばｉＢまたはアミノ）は血清中の安定性を高めないと結論できるだろう。
【０１３３】
更に、本明細書出願以前の当該技術分野での理解とは逆に、ＲＮＡｉ分子の保護にとってはエクソヌクレアーゼよりもエンドヌクレアーゼがより重要であるとも結論できる。
【０１３４】
上記を考慮すると、本明細書に開示した発明のＲＮＡｉ分子の各種修飾または設計に加えて、更なるまたは追加のヌクレオチド修飾としてエンドヌクレアーゼ機能を阻害するためにＲＮＡｉ分子の完全または部分的ホスホロチオアート主鎖を用いてもよいだろう。完全なホスホロチオアート主鎖とは、全てのヌクレオチドがホスホロチオアート基を持つものを意味し、部分的ホスホロチオアート主鎖とはＲＮＡｉ分子を形成するヌクレオチドのうちホスホロチオアート修飾されているものが一部であることを意味する。この修飾はＲＮＡｉ分子のさらなる設計とは無関係にＲＮＡｉ分子の寿命を延長するのに好適である。これに関して、部分的または完全ホスホロチオアート修飾ＲＮＡｉは、本発明の課題に従い、本明細書に開示する干渉ＲＮＡ分子の設計に関する様々な戦略と結びついて、または当分野周知の設計と結びついて実現してもよい。
【実施例６】
【０１３５】
５’および３’末端のＮＨ2末端保護基によるセンス鎖の不活性化
実験構成は実施例１に関連して記載したものと同等であるが、この場合の標的核酸配列はＰＴＥＮ  ｍＲＮＡである。ＨｅＬａ細胞濃度は２，０００細胞／ウエルであった。ＰＴＥＮのＲＮＡは、各種修飾ＲＮＡｉ分子トランスフェクション後にＴａｑｍａｎアッセイにて分析した。用いた各種干渉ＲＮＡ分子は図９Ｂに示し、実験結果は図９Ａに示した。
【０１３６】
図８Ａに示した各種ＲＮＡｉ分子の用量反応曲線から分かるように、ＲＮＡｉ分子はセンス鎖、即ち第２鎖の両端がアミノ基で修飾されている時に機能する。特に効果的なＲＮＡｉ分子は２０Ａ２６Ｂ、１８Ａ２６Ｂおよび２８Ａ２６Ｂであった。最も低い活性はＲＮＡｉ分子２６Ａ２６Ｂに認められたが、この分子は二本鎖の４つの端部全てが端修飾されている分子である（Ｔｕｓｃｈｌは１８ＡＢ）。
【０１３７】
しかしＲＮＡｉ活性はアンチセンス鎖、即ち第１鎖が３’端のみ修飾され、５’端には自由ＯＨ基が残されている場合にも得られた（ＲＮＡｉ構築物２２Ａ２６Ｂ；２０Ａ２６Ｂ）。アンチセンス鎖が５’および３’両端についてアミノ基で修飾されている場合（２６Ａ２６B)には活性はなかった。このことから、アンチセンス鎖のいずれかの端、より具体的にはアンチセンス鎖の５’端は修飾せずにそのまま残すべきであると結論した。更に、ＮＨ2端修飾を用いてセンス鎖を５’および３’端で不活性化でき、これにより不活性化されない場合に機能的であるセンス鎖が媒介する標的外作用を軽減することができ、その結果ＲＮＡｉ分子の特異性を大きく上昇させるので、標的評価ならびにＲＮＡｉ分子の医薬使用にとって有利である。
【０１３８】
本実験の結果を更に一般化したものを図９Ｃに示した。これによれば機能的に活性なＲＮＡｉは、アンチセンス鎖にアミノ修飾を有さないか、または、アンチセンス鎖の３’末端にのみアミノ修飾を有するものであり、一方アンチセンス鎖の両端がアミノ修飾されたものは機能的でなく、即ち標的ｍＲＮＡをノックダウンしない。
【実施例７】
【０１３９】
エンドヌクレアーゼ保護に関するＲＮＡｉ分子の２’−Ｏ−メチル修飾の影響
ＲＮＡノックダウンを再度示すために、図１０Ａに示すようなＰＴＥＮ  ｍＲＮＡを標的としたＲＮＡｉ二本鎖分子をトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。実験手法は基本的には実施例１に記載の手順に同じである。図１０Ａに示す、研究対象のＲＮＡｉ分子の構造およびその用量反応は図１０Ｃに示した。太字で示したヌクレオチドは２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドである。
【０１４０】
図１０Ａに各種ＲＮＡｉ分子について示した用量反応曲線から、内部の２’−Ｏ−アルキル基がＲＮＡｉ活性を下げることが示された。この種の２’−Ｏ−アルキル基は２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−エチル基であることが好ましい。しかし非修飾ヌクレオチドと２’−Ｏ−アルキル修飾とを組み合わせ持つ分子は著しい活性を示した。同様に１０Ａに示すように、アンチセンス鎖が全て２’−Ｏ−メチル基で修飾されており、さらにセンス鎖が修飾されていない場合（後述する、例えばＲＮＡｉ分子７９Ａ２８Ｂ）には活性は認められなかった。図１０Ｂに示すような、血清中で各種ＲＮＡｉ分子をインキュベーションするような安定性試験の結果から、２’−Ｏ−アルキル修飾がＲＮＡｉを分解に対し安定化することが分かった。しかしこの明確な有利な作用は、２’−Ｏ−アルキル修飾が一般にはノックダウン活性を低下させるという作用によって少なくとも在る範囲で相殺される。従ってＲＮＡｉ分子の設計は安定性と活性とのバランスを取るものでなければならない、そしてこれには本出願で開示された各種設計原理を認識することが重要となる。
【実施例８】
【０１４１】
内部２’−Ｏ−メチル修飾のブロックが血清中でのＲＮＡｉ分子の安定性に及ぼす影響
本試験に関する実験方法は、実際的には実施例１に記載の方法と同一であった。ここでもＰＴＥＮ  ＲＮＡは、各種用量のＲＮＡｉ分子をトランスフェクションした密度２０００細胞／ウエルのＨｅＬａ細胞にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い分析した。ＲＮＡｉ分子を血清中で２時間インキュベーションし、１０％ポリアクリルアミドゲルで分析した。本試験の結果を図１１Ａ〜１１Ｃに示すが、図１１Ａは図１１Ｃに示した各種ＲＮＡｉ分子の用量反応を表しており、図１１Ｂは図１１Ｃに示したＲＮＡｉ分子の幾つかを用いた安定性試験の結果を示している。図１１Ｃに太字で書かれたヌクレオチドは修飾を有するヌクレオチドであり、本例での修飾はリボース部分の２’−Ｏ−メチル修飾である。
【０１４２】
非修飾ＲＮＡｉ分子による用量依存的な阻害が見られた。さらに中心の９ヌクレオチドが２’−Ｏ−メチル修飾されるとＲＮＡｉは血清中で安定化し、そしてＰＴＥＮ  ｍＲＮＡを分解に導く干渉現象を媒介する二本鎖活性を発揮できることが示された。センス鎖全体を修飾すると、ＲＮＡｉ分子は血清中で安定化し、特定の活性を発揮できた。
【０１４３】
５ヌクレオチドを２’−Ｏ−メチル修飾して交互にブロックすると、ＲＮＡｉ分子に血清中での安定性を付与し、そしてＰＴＥＮ  ＲＮＡに対する活性を発揮できることが、ＲＮＡｉ二本鎖を血清中で２時間インキュベーションしてから１０％ポリアクリルアミドゲルにかけることで示された。図１１Ｂから分かるように、鎖８０Ａおよび８０Ｂを含む二本鎖は血清中で２時間インキュベーションすることで強く分解された。鎖８２Ａおよび８２Ｂからなる二本鎖より、アンチセンス鎖を含む第１鎖の５’末端は５’−末端ヌクレオチドで修飾してはならないことが確認できた（８２Ａ８２Ｂと逆向きの８１Ａ８１Ｂとを比較する）。このことは、鎖８６Ａおよび８６Ｂから成る二本鎖は、血清中で活性且つ安定するという結果からも確認される。アンチセンス鎖の５’末端に非修飾ブロックを持つ分子はより活性であり、このとき５’末端のＯＨ基が誘導されていないことが好ましいということは注目に値する。
【０１４４】
ヌクレオチドの２’−Ｏ−メチル修飾について異なる修飾パターンを用い、更に実験を行った。その結果を図１２Ａ〜１２Ｃに示し、本明細書の実施例９で詳しく説明する。
【実施例９】
【０１４５】
内部２’−Ｏ−メチル交互修飾がＲＮＡｉ分子の血清中安定性に及ぼす影響
この種の試験の実施に関する実験構成は、実施例１および実施例８にそれぞれ記載した試験に関係し使用した構成と同一であり、今回も標的核酸はＰＴＥＮ  ｍＲＮＡであった。ＨｅＬａ細胞に図１２Ｂに記載の各種ＲＮＡｉ分子をトランスフェクションし、ＰＴＥＮ  ＲＮＡを対象に用量依存的に行ったリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡのノックダウンを実証した（図１２Ａ）。３７℃、血清中、１５分および２時間後の各種ＲＮＡｉ分子の安定性を図１２Ｃに、各種ＲＮＡｉ分子の標的タンパク質としてのｐ１１０およびＰＴＥＮに関するウエスタンブロットを図１２Ｄに示すが、図１２Ｃおよび図１２Ｄの基礎となる両実験で試験したＲＮＡｉ分子は同じものである。
【０１４６】
図１２Ａおよび図１２Ｃに示す通り、２’−Ｏ−メチル基で修飾されたヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドが交互に並ぶとＲＮＡｉ分子は血清中で安定化すると同時に、標的ｍＲＮＡに対する干渉について活性になった。ＲＮＡｉ二本鎖分子を血清中で１５分間および２時間インキュベーションすると、非修飾二本鎖と５’−位置側の１０ヌクレオチドが非修飾である二本鎖が分解されることが分かった。
【０１４７】
図１２Ｂに示すＲＮＡｉ分子には、様々な修飾ヌクレオチドおよび非修飾ヌクレオチドのパターンが描かれている。ＲＮＡｉ分子９４Ａ１／９４Ｂ１は修飾ヌクレオチドが修飾ヌクレオチドによりフランキングされ、そして第１鎖の５’末端に非修飾ヌクレオチドが配置される構造を含んでいる。鎖９４Ａ２および９４Ｂ２を含むＲＮＡｉ分子は別の例で、第１鎖および第２鎖で修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドが反対側に配置されている。これとは逆に、鎖９４Ａ１および９４Ｂ２を含むＲＮＡｉ分子は、同じ修飾および非修飾ヌクレオチドのパターンを有する。しかしこの例では修飾ヌクレオチドが非修飾ヌクレオチドと塩基対合を形成するように位相シフトされている。鎖９４Ａ１および９４Ｂ１、ならびに鎖９４Ａ２および９４Ｂ２を含む２種類のＲＮＡｉ分子は互いに、前者では第１鎖が非修飾ヌクレオチドから開始し、そして対応する第２鎖の最初のヌクレオチド、即ち第２鎖の３’末端のヌクレオチドは非修飾ヌクレオチドから始まるが、９４Ａ２および９４Ｂ２を含むＲＮＡｉ分子ではこの配置が逆になる点で異なる。
【０１４８】
更に、図１２Ｂに示した交互に修飾されるＲＮＡｉ分子は、図１２Ｄに示すようにＰＴＥＮタンパク質ノックダウンの媒介に機能的であるが、第２鎖の５’末端および第２鎖の３’末端ヌクレオチドが修飾されていない場合（９４Ａ２９４Ｂ１および９４Ａ２９４Ｂ２参照）のみである。これらデータ全てから、最も安定および最も活性なＲＮＡｉ分子は２’アルキル修飾と非修飾ヌクレオチド残基を交互に持つことが分かる。これら分子が、血清中で安定であり、取扱性が向上または容易である非修飾ｓｉＲＮＡ分子と比べた時に、よく似たｍＲＮＡ低下を示すことに注意すべきである。
【実施例１０】
【０１４９】
内部修飾ＲＮＡｉ分子が媒介する機能的タンパク質ノックダウン
実験方法は実施例１で概要説明した方法と同様であった。
【０１５０】
図１２Ｂに示した交互修飾型ＲＮＡｉ分子をトランスフェクションした後様々な時点（４８、７２、９６および１２０時間）で集めたＨｅＬａ細胞にウエスタンブロットを実施した。実験上の理由から、９６時間の時点で細胞を二分割して、半分をプレーティングし直した。各種ＲＮＡｉ分子を合計４０ｎＭ細胞に作用させた。細胞は実施例１記載のカチオン性脂質を用いて、７２時間、連続してトランスフェクションした；続いてトランスフェクション剤なしにプレーティングし直した。
【０１５１】
トランスフェクションはオリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Life Technologies）、ＮＣ３８８、Ｌ８（Atugen、Berlin）といった各種カチオン性脂質を用いて、９６ウエルまたは１０−cmプレートの中で（３０〜５０％集密度）行い、ＲＮＡｉを前もって５倍濃度で調製しておいたｓｉＲＮＡと脂質との複合物の無血清培地液を完全培地中の細胞に加えることでトランスフェクションした。トランスフェクションの全容積は９６ウエルにプレーティングした細胞の場合は１００μlであり、１０cmプレートの細胞では１０mlであった。最終脂質濃度は細胞密度に応じて０．８〜１．２μg/mlであった；ｓｉＲＮＡの濃度は実験毎に示す。
【０１５２】
ウエスタンブロットの結果を図１３に示す。この図から分かるように、９４Ａ２Ｂ１および９４Ａ２Ｂ２型の修飾ＲＮＡｉ分子は非修飾分子と同様に、持続的なＰＴＥＮタンパク質ノックダウンを生じた。本実験では、図１２でも観察された９４Ａ１Ｂ１および９４Ａ１Ｂ２型分子がタンパク質ノックダウンを示さないことも確認された。非修飾分子（８０ＡＢ）には、細胞を連続的にトランスフェクションしない場合には、強力なタンパク質ノックダウンを長時間維持する能力はなかった。
【実施例１１】
【０１５３】
ＲＮＡｉ分子の２’−Ｏ−メチル交互修飾による持続的ＰＴＥＮタンパク質ノックダウン
実験方法は、トランスフェクションを５時間後にトランスフェクション培地を新規培地と交換することで停止した以外は実施例１０に概要を示した方法と同様であった。プロトコールを若干変更し、各ＲＮＡｉ分子の濃度が、実施例１に関し記載した１μｇＲＮＡｉ／mlカチオン脂質の保存液を用いて４０ｎＭになるようにした。トランスフェクション後５時間目に、培地を取り去り、新鮮なＥＭＥＭを加えた。７２時間後に細胞を分割し、半分を溶解し、残り半分は新たにプレーティングしてから２４時間後（トランスフェクション後９６時間目）に溶解した。３種類のＲＮＡｉ分子（８０ＡＢ、９４Ａ１／Ｂ２、９４Ａ２／Ｂ１）を用いたウエスタンブロットの結果を図１４に示す。陽性コントロールとして、未処理細胞を用いた。図１４は７２時間および９６時間後それぞれのＰＴＥＮの発現を示している。該各種ＲＮＡｉ分子の構造特性を考慮すると、図１４からは、非修飾ＲＮＡｉ分子（例えば８０ＡＢ）およびＲＮＡｉ分子９４Ａ１Ｂ２に対し、９２Ａ２Ｂ１のような交互型分子では、細胞分割、再プレーティング後９６時間においてもタンパク質ノックダウンが持続することが分かる。
【０１５４】
図１５Ａ（左パネル）に示したｓｉＲＮＡ構築物を用いて更に実験を行った。試験システムに加えられたｓｉＲＮＡ構築物の各種濃度でのＰＴＥＮ／ｐ１１０αｍＲＮＡ分解比として表された結果から、一方または両方の鎖が２’−Ｏ−メチル残基から成るｓｉＲＮＡ分子はほ乳動物ではＲＮＡ干渉を誘導できないことが分かる（図１５Ａ、分子Ｖ２、Ｖ５、Ｖ６）。しかし鎖の一部でも修飾を受けると活性の低下はより小さくなった。興味深いことに、非修飾アンチセンス鎖（特に指示しない場合には、本明細書を通して上側の鎖を指す）および完全修飾センス鎖とを有する分子は、逆の型（図５Ａ、分子Ｖ５およびＶ６）の分子に比べ顕著に活性が高かった。この結果は、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がより重要であり、そして修飾に対し感受性であることを示唆している。ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡ誘導に最も効果的な分子は、５’末端を未修飾の状態、または両鎖共に交互の位置で修飾されている修飾ストレッチだけを有していた（図１５Ａ、分子Ｖ１０、Ｖ１２）。
【０１５５】
ヌクレアーゼ耐性を試験するために、様々な型のｓｉＲＮＡを血清中でインキュベーションし、続いてＰＡＡゲル電気泳動にかけた。結果を図１５Ｂに示した（図１５Ｂの右パネル、左パネルには各種配列を示している）。前述した通り、非修飾リボヌクレオチド型の平滑端ｓｉＲＮＡ分子は非常に速やかに分解されたのに対し、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで完全に置換されたものは、血清由来ヌクレアーゼに対し耐性を示した（図１５Ｂ、分子ＡＢとV1を比較）。部分的に２’−Ｏ−メチル修飾されたｓｉＲＮＡ分子も同様に、非修飾ｓｉＲＮＡに比べ安定性が増していた。特に両鎖が交互に修飾されている分子は安定性が顕著に増加していた（図１５Ｂ、分子Ｖ１３、Ｖ１４、Ｖ１５およびＶ１２）。より重要なことは、これら分子のうちの３種類をＨｅＬａ細胞内にトランスフェクションしたところ、図１５Ｃ（長さ６、９および１０）に示すようにＰＴＥＮタンパク質の発現が明らかなダウンレギュレーションを受けたことである。このＲＮＡ干渉活性アッセイでは、予想外にもアンチセンス鎖の５’最末端のヌクレオチドより始まり、１つおきにヌクレオチドが修飾されている分子が好ましかった。アンチセンス鎖５’末端側２番目のヌクレオチドから修飾が開始する分子はより安定であったが、遺伝子サイレンシング活性は大きく低下していた（分子Ｖ１３、Ｖ１４）。この結果は、関係する酵素とｓｉＲＮＡ二本鎖内の特定ヌクレオチドとの間で極めて特異的な相互作用があることを示している。ここに示したデータをまとめると、ｓｉＲＮＡ二本鎖内の特に選ばれた位置の２’−Ｏ−メチル修飾はヌクレアーゼ耐性を高めることができ、ＲＮＡｉを必ずしも完全には破壊しない。
【０１５６】
合成ｓｉＲＮＡの安定性増加はインビボでの応用にとって重要な意味を持つが、特定の修飾が細胞培養系におけるタンパク質ノックダウンも促進するか分析した。そのためにＨｅＬａ細胞を各種ＰＴＥＮ特異的ｓｉＲＮＡを用いて、６時間、一過的にトランスフェクションした。次に脂質ｓｉＲＮＡ複合体を洗い流し、４８時間および１２０時間後にＰＴＥＮタンパク質ノックダウンを分析した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションを継続しないノックダウン実験は、その期間中にトランスフェクションしていない細胞が急速に増殖して極めて一過的なノックダウンを生じせしめることから複雑になるが、本発明者は記載の２’−Ｏ−メチル修飾により安定化したｓｉＲＮＡ分子を用いて、長期間のＰＴＥＮタンパク質ノックダウンを実証できた。トランスフェクション後４８時間の時点では、非修飾ｓｉＲＮＡ（ＡＢ）は最大のＰＴＥＮタンパク質レベル減少を示したが、トランスフェクション後１２０時間の時点ではＰＴＥＮタンパク質発現の減少は、２’−Ｏ−メチル交互修飾により安定化したｓｉＲＮＡがより優れていた（図１５Ｄ、レーン２とレーン５、６および７とを比較）。
【０１５７】
この結果より、むしろ交互修飾の開始ヌクレオチド位置が重要である思われることも分かる。このことを詳細試験するために、２種類のｓｉＲＮＡシリーズ、１つはキナーゼＡｋｔ１に特異的であり、もう一つはＰＩ（３−）キナーゼの２つある触媒サブユニットの１つであるｐ１１０βに特異的であるものを追加合成した。具体的な構造を図１６Ａに示す。これより明らかなように、修飾されていないか、または１ヌクレオチドおきに２’−Ｏ−メチル修飾されている１９ｎｔ長のｓｉＲＮＡ二本鎖のみを使用した。Ａｋｔ１を標的に用いた時、平滑な非修飾ｓｉＲＮＡで効果的なタンパク質ノックダウンならびにリン酸−Ａｋｔレベルが大きく低下するのが観察された（図１６Ａ、右パネル）。１ヌクレオチドおきに修飾された様々な型の分子では、１種類だけが効率的にＲＮＡｉを媒介した（図１６Ａ、分子Ｖ５）このｓｉＲＮＡ分子は最末端の５’および３’ヌクレオチドが修飾されたアンチセンス鎖を含んでいた。センス鎖は最末端位置が非修飾ヌクレオチドで始まるために、両鎖の修飾および非修飾リボヌクレオチドが向合う構造となる。予想通り、この分子もまた、図１６Ｂに示すように（分子Ｖ５）血清由来ヌクレアーゼから保護された。
【０１５８】
興味深いことに、アンチセンス鎖の第２ヌクレオチドから修飾が始まる、極めて類似した１９ｎｔ長のｓｉＲＮＡ分子（Ｖ４）は用いたアッセイではＲＮＡ干渉活性を示さなかった。アンチセンス鎖の修飾ヌクレオチドがセンス鎖の修飾ヌクレオチドと向合っているＶ６型もまた、今回の実験で不活性であった。ｐ１１０βに特異的である１９ｎｔ長の同シリーズのｓｉＲＮＡ分子についても、図１６Ｃに示す様に、この観察結果が確認された。さらに、同様の修飾ｓｉＲＮＡ分子（Ｖ５）が最も活性でることが、ｐ１１０βレベルの低下によるＰ（Ｉ）−３キナーゼ活性の低下の指標である、Ａｋｔリン酸化の低下から示された。分子Ｖ６の活性が低いことは、２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡを用いたＰＴＥＮノックダウン実験で同構造体が活性を有していたことから、二本鎖の安定性の低下から説明できるだろう。対面する両鎖が２’−Ｏ−メチル修飾されると核酸二本鎖の安定性は低下するが、ｓｉＲＮＡ分子Ｖ４とＶ５の間の差は（図１６ＢおよびＣ）は、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチド間の塩基対合数がおなじであることから、二本鎖の安定性の違いに拠るものではないだろう。活性のこの差は、標的ｍＲＮＡの分解に関係する相互作用タンパク質に於ける特異条件に拠るものであろう。また、これら実験よりアンチセンス鎖の最末端ヌクレオチドを２’−ＯＨ−基位置で修飾すると、サイレンシング活性を大きく消失できることが分かる。
【実施例１２】
【０１５９】
各種ループ構造がＲＮＡ干渉の媒介で機能する。ＲＮＡｉ分子、好ましくは自己相補的構造を持つ合成ＲＮＡｉ分子が標準の２本鎖ｓｉＲＮＡ分子と同様に効率的に遺伝子発現を阻害できるか試験するために、ＨｅＬａ細胞にｐ１１０β特異的合成ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクションは、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Life Technologies）、といった各種カチオン性脂質を用いて、９６ウエルまたは１０−cmプレートの中で（３０〜５０％集密度）行い、GeneBlocsは前もって５倍濃度で調製しておいたＧＢと脂質との複合物の無血清培地液を完全培地中の細胞に加えることでトランスフェクションした。トランスフェクションの全容積は９６ウエルにプレーティングした細胞の場合は１００μlであり、１０cmプレートの細胞では１０mlであった。最終脂質濃度は細胞密度に応じて０．８〜１．２μg/mlであった；ｓｉＲＮＡの濃度は実験毎に示す。
【０１６０】
用量依存力価測定からは、リアルタイムＰＣＲ（Taqman）で分析した場合に、標準的な２分子型の２本鎖２１ｍｅｒと対応する１分子型分子により達成されるｍＲＮＡノックダウンの効率に有意な差は示されなかった（図１７Ａ）。２種類のループ構造、（Ａ）12ループおよびＨＩＶ由来のｐＡループも平行して試験したが、結果は同様であった。アンチセンス配列の相対的な位置とループ構造とを比較すると、アンチセンス配列がループに対し３’側に位置したときにノックダウン効率が向上した（図１７Ｂ：構築物３Ａ、３Ｂと４Ａ、４Ｂを比較せよ）。
【実施例１３】
【０１６１】
各種分子内ヘアピンループおよび分子内「バブル」の効果に関する試験
ｍＲＮＡおよびタンパク質発現阻害に及ぼす各種ループ構造の影響を試験した。これら実験については、標的としてＡｋｔ１およびＡｋｔ２を選択した。実験方法は実施例１２に記載の方法と同様であった。
【０１６２】
図１８Ａおよび図１８Ｂに示すＡｋｔ１  ｍＲＮＡの減少、ならびに図１８Ｃに示すＡｋｔ１タンパク質レベルの低下は、明らかに、試験したループ構造と完全に独立していた（分子５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａを比較せよ）（試験したＲＮＡｉ分子の構造は棒グラフの下に示している）。ループとしてポリエチレングリコールリンカー（ＰＥＧ）の様な非生理学的構造を含む分子でさえＡｋｔ１の発現を効率的に下げたことから、ループのサイズおよびヌクレオチド配列は重要でないことが示された（図１８Ａ；分子８Ａ）。Ａｋｔ２特異的合成ｓｉＲＮＡ分子（９Ａ）を用いて特異性をコントロールしたが、図１５Ａに示すようにＡｋｔ１レベルには影響しなかった。しかしこの分子は、Ａｋｔ２の発現を効果的に抑制した（図１８Ｂ；図１８Ｃ）。ループ構造を持った自己相補的ＲＮＡ分子は、生理学的ハイブリダイゼーション条件に於いてアニーリングし、１分子または２分子構造における２本鎖を形成する可能性がある（図１８Ｂ、ループまたはバブル構造）。ｓｉＲＮＡ分子が、分子内ループまたは分子間「バブル」（図１８Ｂに図示した）を採ることでその機能を発揮するのかという疑問に答えるために、それ自身に折り戻ることができない２つの分子をトランスフェクションした。これら構築物は同一分子内にＡｋｔ１−およびＡｋｔ２−特異的配列を含有しており（図１８Ｄ、構築物１０Ａ、１０Ｂ）、２分子型二本鎖（「バブル」）を形成するように制限されている。驚くべき事にこの分子は、両鎖をアニーリングした後トランスフェクションするとＡｋｔ１およびＡｋｔ２  ｍＲＮＡのノックダウンだけでなくタンパク質のノックダウンも効率的に媒介した。
【０１６３】
現時点では、ループおよびバブル構造が実際にＲＮＡプロセッシング酵素、例えばＤｉｃｅｒの基質であるか否かについては不明である。Ｐａｄｄｉｓｏｎと共同研究者による最近の研究は、ヘアピン含有ｓｉＲＮＡは２本鎖ｓｉＲＮＡよりもＤｉｃｅｒ活性により依存的であることを示している。しかし、ＰＥＧリンカー分子を用いたＲＮＡ干渉活性を証明したこれらデータは、リンカーの配列は無関係であるらしいことを示している。
【０１６４】
明細書、特許請求の範囲、および／または図面に開示した本発明の特徴は、単独または組み合わせた、様々な形での本発明実現化の素材とするものである。
【図１】
0005490655.tif 000003
【図２Ａ】
0005490655.tif 000004
【図２Ｂ】
0005490655.tif 000005
【図２Ｃ】
0005490655.tif 000006
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
0005490655.tif 000009
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
0005490655.tif 000045
【図１９】
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【配列表】
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