(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＤと２５−ＯＨビタミンＤ３とを含み、ビタミンＤ対２５−ＯＨビタミンＤ３の用量比が６：１〜１：６である、ヒトで使用するのに適した医薬組成物。
【請求項２】
薬学的に許容される酸化防止剤と、少なくとも１種の薬学的に許容されるキャリアとを、錠剤、カプセルまたは注射可能な形態でさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
噴霧乾燥ビーズレット組成物またはカプセル化ビーズ組成物である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
２５−ＯＨビタミンＤ３およびビタミンＤを用いて、２５−ＯＨビタミンＤ欠乏に関連する症候を軽減するために使用する、ヒト用の薬を製造する使用法であって、ビタミンＤ対２５−ＯＨビタミンＤ３の用量比が６：１〜１：６である、使用法。
【請求項５】
２５−ＯＨビタミンＤ３及びビタミンＤを含む、ヒトで使用するのに適した栄養補給食品、栄養補助食品または食品であって、
ビタミンＤ対２５−ＯＨビタミンＤ３の用量比が６：１〜１：６である、栄養補給食品、栄養補助食品または食品。
【請求項６】
多数回分の投与量の
ａ）ビタミンＤと、
ｂ）２５−ＯＨビタミンＤ３と、
を含み、ビタミンＤ対２５−ＯＨビタミンＤ３の用量比が６：１〜１：６である、キット。
【請求項７】
容器と、組成物を投与量としてヒトに投与するための指示書とからなる群から選択される少なくとも１つの要素をさらに含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
少なくとも７回分の投与量が含まれる、請求項６又は７に記載のキット。
【請求項９】
少なくとも３０回分の投与量が含まれる、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、ビタミンＤ（コレカルシフェロール／および／またはエルゴカルシフェロール）と２５−ヒドロキシビタミンＤ３（カルシフェジオール）を含む組成物ならびに、その組成物を用いて、少なくともビタミンＤの濃度、バイオアベイラビリティ、代謝または有効性に影響を与えるための使用法に関する。
【０００２】
［背景技術］
ビタミンＤ（エルゴカルシフェロールおよびコレカルシフェロールなど）とは、それぞれの生物活性によって定義される脂溶性化合物の総称である。ビタミンＤの欠乏によって、子どもではくる病、成人では骨軟化症が起こる。しかしながら、数ヶ月間にわたって１日あたりの推奨摂取量（すなわち、ビタミンＤ５〜１５μｇまたは２００〜６００ＩＵ）の１００倍を超えて慢性的に摂取すると、毒性が生じる可能性がある。ビタミンＤの場合、「毒性の閾値は体重１ｋｇあたり１日で５００〜６００ｍｃｇである。通常、成人はＲＤＡの３倍を超えて長期間消費すべきではない」（Ｇａｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｓｏｍｅｒ，  Ｔｈｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ｐｇ．  ８２，  １９９７）。高カルシウム血症は、２５−ヒドロキシビタミンＤの血中濃度が３７５ｎｍｏｌ／Ｌを超えると生じることがある。最近になって、ビタミンＤの安全な上限レベルは少なくとも２５０μｇ／日（１０’０００ＩＵ）であることが確認された（Ｈａｔｈｃｏｃｋら  Ａｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ８５：６〜１８，  ２００７）。このような健康補助食品を摂取すると、２５−ヒドロキシビタミンＤの血中濃度が約２００ｎｍｏｌ／Ｌになることが明らかになっている。
【０００３】
ビタミンＤは、２５−ヒドロキシビタミンＤ（カルシフェジオール；２５−ＯＨビタミンＤ；２５−ＯＨ  Ｄ）を生成するのに肝臓でのヒドロキシル化が必要なプロホルモンの１つであり、この２５−ヒドロキシビタミンＤが腎臓や他の組織でさらにヒドロキシル化されて、ビタミンＤの活性ホルモン形態である１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが生成される。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、血液中に放出され、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）と結合し、標的組織まで運ばれる。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤとビタミンＤ受容体とが結合することで、この複合体が細胞核で転写因子として機能するようになる。
【０００４】
ビタミンＤ欠乏によって、骨吸収が促進されることがある。また、それによって、心臓血管系、免疫系、筋肉系の機能が調節されることもある。疫学的研究では、ビタミンＤ摂取とそれが血圧またはグルコース代謝におよぼす影響との関連性が見いだされている。ビタミンＤの活性は、副甲状腺ホルモンによる負のフィードバック制御下にある。
【０００５】
ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３は、ともに今まで医薬品として投与されてきている。ビタミンＤは、言うまでもなく、広く利用可能である。米国では以前、２５−ＯＨ  Ｄ３がオルガノン（Ｏｒｇａｎｏｎ）  ＵＳＡから「ＣＡＬＤＥＲＯＬ」という商品名で販売されていたが、現在はＦＤＡの販売中止対象薬の一覧に含まれている。これは、コーン油と２５−ＯＨ  Ｄ３を含有するゼラチンカプセルであった。
【０００６】
現在は、液状の２５−ＯＨ  Ｄ３が、スペインにてＦＡＥＳ  Ｆａｒｍａから「ＨＩＤＲＯＦＥＲＯＬ」という商品名で油性溶液として販売されている。
【０００７】
また、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３との組み合わせが、動物の飼料に用いられている。飼料用の２５−ＯＨ  Ｄ３は、ＤＳＭから「ＲＯＶＩＭＩＸ  ＨＹ−Ｄ」という商品名で市販されている。
【０００８】
５％〜５０％（ｗｔ／ｗｔ）の量で油に溶解された少なくとも２５−ＯＨ  Ｄ３と酸化防止剤、２５−ＯＨ  Ｄ３と油の液滴をカプセル化する作用剤、栄養添加剤（ビタミンＤ３など）を含む飼料プレミックス組成物が、Ｔｒｉｔｓｃｈら（米国特許出願公開第２００３／０１７０３２４号明細書）によって開示されている。このプレミックスを、家禽類、ブタ、イヌまたはネコ用の食品に添加してもよい。この組成物は、２５−ＯＨ  Ｄ３を酸化に対して安定させる。
【０００９】
２５−ＯＨビタミンＤ３とビタミンＤ３の組み合わせを動物用の飼料に添加することが、Ｓｉｍｏｅｓ−Ｎｕｎｅｓら（米国特許出願公開第２００５／００６４０１８号明細書）によって開示されている。特に、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇの２５−ＯＨビタミンＤ３と、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約４，０００ＩＵ／ｋｇのビタミンＤ３を、ブタ用の飼料に添加する。この添加によって、ブタの骨強度が改善される。
【００１０】
２５−ＯＨビタミンＤ３とビタミンＤ３の組み合わせを家禽類用の飼料に添加して、脛骨軟骨発育不全症の影響を改善することが、Ｓｔａｒｋら（米国特許第５，６９５，７９４号明細書）によって開示されている。
【００１１】
Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎらの米国特許第５，０４３，１７０号明細書には、産卵鶏および老齢鶏の卵殻強度および下肢強度を改善するための、ビタミンＤ３と、１−α−ヒドロキシコレカルシフェロールまたは１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールのいずれかとの組み合わせが開示されている。
【００１２】
Ｃｈｕｎｇらによる国際公開第２００７／０５９９６０号パンフレットには、ビタミンＤ３と２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を含有する食餌を与えられた雌ブタで、全身の健康状態、体格、産仔数と健康、その他の生産パラメータが改善されることが開示されている。また、ヒト用の２５−ＯＨ  Ｄ３栄養補助食品が開示されているが、体重１ｋｇあたり５〜１５マイクログラムというその投与量の範囲（一人あたり３００〜９００マイクログラムという極めて高い一日投与量に相当）は極めて高い。
【００１３】
上述した文献には、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを、ヒト用の医薬品、食品または栄養補給食品として使用すること、あるいはそれがヒトの健康に対しておよぼす影響については、教示も示唆もされていなかった。この組成物の形態と投与量によって、ヒトによるビタミンＤの使用（薬物動態など）に対する望ましい効果が得られる。ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の両方を用いる場合のヒトでの投薬の動態は、本発明者らが知るかぎり、過去には研究されていない。他の利点および改善点については、後述するか、あるいは本明細書の開示内容から自明であろう。
【００１４】
［発明の詳細な説明］
ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを人に投与した場合、意外なことに血漿２５−ＯＨ  Ｄの増加によって相乗的に増加することが見いだされている。この効果は短時間で観察され、最初の６時間程度が最も顕著である。さらに、血漿レベルの増加は約２０６時間にわたって持続する。このため、本発明は、ヒトの医薬品として使用する、ビタミンＤ（コレカルシフェロールおよび／またはエルゴカルシフェロール）と２５−ＯＨ  Ｄ３（カルシフェジオール）の組み合わせを含む。このような組成物の１つの考えられる用途に、抗骨粗鬆症薬としての使い方があるが、本発明の組み合わせは、ビタミンＤまたは２５−ＯＨ  Ｄ欠乏が関連している徴候であれば、どのようなものに対しても適している。
【００１５】
さらに、本発明によれば、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせが、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３単独のどちらの存在とも関係のない多数の遺伝子をはじめとする、相乗数（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｎｕｍｂｅｒ）のビタミンＤ応答性遺伝子を、相乗的に制御する（上方制御または下方制御のいずれか）ことが見いだされている。これは、実質的にすべてのビタミンＤが最初に２５−ＯＨ  Ｄに代謝されることを前提とし、現在のビタミンＤ代謝のモデルでは説明されていないため、意外な結果である。
【００１６】
本発明による組み合わせによって、以下の２つの大きな利点が得られる。
１）２５−ＯＨ  Ｄの迅速かつ相乗的な血漿応答が生じる。
２）予想外に顕著かつ長時間にわたる血漿２５−ＯＨ  Ｄレベルの定常化につながる。これらは、ビタミンＤ欠乏の特に重要な治療目標すなわち、すべてのビタミンＤ依存性組織の十分な供給を保証するための最適以下のビタミンＤの状態と長期かつ安定した血漿濃度を速やかに回復することである。
【００１７】
本発明の別の態様は、２５−ＯＨ  Ｄ３を含有し、好ましくはビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを含有する、ヒトの消費に適した食品、機能性食品、栄養補助食品または栄養補給食品である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】後肢負荷軽減（「ＨＵ群」）と処理群（ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３または組み合わせ）でのマウス遺伝子の発現の異なるプローブセットに関するベン図を示す。
【図２】２５−ＯＨ  Ｄ３処理群と、２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３の組み合わせを用いる処理群との間で、遺伝子の発現の異なるプローブセットに関するベン図を示す。
【図３】ビタミンＤ３処理群と、２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３の組み合わせを用いる処理群との間で、遺伝子の発現の異なるプローブセットに関するベン図を示す。
【図４】ＨＵ群と、２５−ＯＨ  Ｄ３およびビタミンＤ３の組み合わせ処理をほどこす群との間で、遺伝子の発現の異なる１７４５プローブセットの特徴抽出（ＧｅｎｅＧｏ  ＭｅｔａＣｏｒｅで実施）である。
【図５】２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３処理群における発現の異なるプローブセットと、選択した骨格筋遺伝子のプローブセットとに関するベン図を示す。
【図６】２５−ヒドロキシビタミンＤ３処理群における発現の異なるプローブセットと、選択した骨格筋遺伝子のプローブセットとに関するベン図を示す。
【図７】ビタミンＤ３処理群における発現の異なるプローブセットと、選択した骨格筋遺伝子のプローブセットとに関するベン図を示す。
【００１９】
本明細書および特許請求の範囲全体で使用する場合、用語「ビタミンＤ」は、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）および／またはビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）のいずれかを示す。ヒトは、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）を生成できないが、これをビタミンＤ源として使うことはできる。ビタミンＤ２は、さまざまな植物によって合成可能であり、ビタミンＤ３に相当するものとしてサプリメントでビタミンＤに使用されることが多い。
【００２０】
「ビタミンＤ代謝物」は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３以外のビタミンＤの代謝物を意味する。
【００２１】
「２５−ＯＨ  Ｄ３」は、具体的には２５−ヒドロキシビタミンＤ３を示す。
【００２２】
「２５−ＯＨ  Ｄ」は、血漿中に見られる主要な循環型であるビタミンＤ２またはビタミンＤ３のいずれかの２５−ヒドロキシル化代謝物を示す。
【００２３】
一実施形態では、ビタミンＤと、２５−ＯＨ  Ｄ３と、薬学的に許容される酸化防止剤と、少なくとも１種の薬学的に許容されるキャリアとを、錠剤、カプセルまたは注射可能な形態で含む、ヒトで使用するのに適した医薬組成物が得られる。
【００２４】
また、本発明は、有効成分が本質的にビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせからなり、一層好ましくは、有効成分が本質的にビタミンＤ３と２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせからなる、ヒト用の医薬組成物にも関する。
【００２５】
別の実施形態では、多数回分の投与量のビタミンＤまたはビタミンＤ３と、ある投与量の２５−ＯＨ  Ｄ３とからなるキットが得られる。これらを瓶やブリスター包装、あるいはバイアルラックなどの容器に封入しておいてもよい。さらに、ある投与量として組成物をヒトに投与するための指示もキット内に含まれている。
【００２６】
別の実施形態では、少なくとも２５−ＯＨ  Ｄ３の噴霧乾燥製剤と薬学的に許容される酸化防止剤とで構成される、ヒトで使用するのに適した組成物が得られる。この組成物はさらに、ビタミンＤまたはビタミンＤ３の噴霧乾燥製剤で構成されるものであってもよい。あるいは、組成物は、ビタミンＤまたはビタミンＤ３および２５−ＯＨ  Ｄ３と、噴霧乾燥製剤の調製元となった薬学的に許容される酸化防止剤との混合物であってもよい。あるいは、別々に、少なくともビタミンＤまたはビタミンＤ３の噴霧乾燥製剤と薬学的に許容される酸化防止剤からなる第１の組成物と、少なくとも２５−ＯＨ  Ｄ３の噴霧乾燥製剤からなる第２の組成物とで構成されるキットが得られる。
【００２７】
さらに別の態様では、噴霧乾燥製剤の製造方法が得られる。少なくともビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方を、中鎖トリグリセリド、ココナッツ油またはパーム油などの好適な油に溶解させ、非水性相を得る。非水性相と水性相を乳化させる。このエマルションを噴霧乾燥させ、粉末にする。あるいは、ビタミンＤまたはビタミンＤ３および２５−ＯＨ  Ｄ３を別々に噴霧乾燥して粉末にした後、互いに混合する。
【００２８】
別の態様では、ビタミンＤおよび２５−ＯＨ  Ｄ３をヒトに投与する方法が得られる。これによって、血液、血漿または血清中の２５−ＯＨ  Ｄの濃度を上昇または維持することができる。血液、血漿または血清で、２５−ＯＨ  Ｄの定常状態の濃度を達成できる。２５−ＯＨ  Ｄの血漿または血清濃度の予測可能性も高めることができる。
【００２９】
このような投与によって達成される２５−ＯＨ  Ｄのピーク濃度は、３０ｎｍｏｌ／Ｌ〜３７５ｎｍｏｌ／Ｌであればよく、好ましくは約１２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜約３００ｎｍｏｌ／Ｌである。このような投与によって達成される２５−ＯＨ  Ｄの定常状態の濃度は、好ましくは６０ｎｍｏｌ／Ｌを超える値からである。
【００３０】
別の実施形態では、２５−ＯＨ  Ｄ３が、単独またはビタミンＤとの組み合わせで、ヒトが消費するのに適した食品、機能性食品、栄養補助食品または栄養補給食品の有効成分である。２５−ＯＨおよび／またはＤ３の投与量は、医薬品製品に存在する場合と同じであってもよいが、好ましくは、それよりも少ない範囲になりやすい。栄養補助食品および栄養補給食品は、錠剤、カプセルまたは他の便利な剤形の形であってもよい。食品は、飲料または食品であってもよく、必要があれば、他のビタミン、ミネラルなど、栄養的に効果的な他の化合物を含有してもよい。
【００３１】
ビタミンＤ欠乏は、特に高齢者の個体群や、年齢とは関係なく慢性的に動けない人々の間で多く見られる症状である。これは、太陽光にあたる時間の全般的な不足、体がビタミンＤを作ったりこれを効率的に代謝したりする機能が衰えたこと、あるいは他の多数の原因による場合がある。このように、本発明の一態様は、高齢者の個体群でビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを使用することである。本明細書全体で使用する場合、「高齢者の」という表現は、６５歳を超えた個体、好ましくは７０歳を超え、さらには８０歳を超えた個体すら包含することを想定している。
【００３２】
別の実施形態では、この２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせが、ビタミンＤの欠乏または不足を特徴とする症状を発症する危険性のある人々に適している。これには、特に閉経後の女性（すなわち４５歳前後以上）や４５歳前後以上の男性をはじめとする成人を含み得る。これは特に、伝統的に長い衣服を着用する、日常的に屋外に出ない、太陽光にあたるときにサンスクリーン製剤を使用する、あるいは地理的に赤道から北または南に離れた太陽光がそれほど強くない地域で暮らす人々など、自然の太陽光を大量に浴びていない個体には、特に適している。
【００３３】
ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせについては、１日１回、１週間に１回または１ヶ月に１回投与すればよい。本発明によれば、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを送達すると、意外なことに２５−ＯＨ  Ｄの血漿レベルが相乗的に上昇することが見いだされている。この効果は短時間で観察され、最初の６時間程度が最も顕著である。さらに、血漿レベルの増加は少なくとも約２０６時間にわたって持続する（低めであるにもかかわらず、依然として臨床的に有効なレベル）。よって、本発明は、単一ビタミンＤ形態での従来の治療に対して２つの明確な利点を提供するものである。高めの血漿レベルの持続によって長時間のバイオアベイラビリティを保ちつつ、迅速な効果によって急唆な（ａｃｕｔｅ）バイオアベイラビリティが得られる。
【００３４】
さらに別の態様では、少なくとも２５−ＯＨ  Ｄ３の噴霧乾燥製剤をヒトに投与することで、これを使用する方法が得られる。
【００３５】
本発明の別の態様は、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを投与することで、吸収不良症候群（小児脂肪便症、スプルー症候群または短腸症候群に羅患しているなど）のあるヒトに、ビタミンＤまたはその代謝物を提供する方法である。
【００３６】
本発明の別の態様は、ビタミンＤを効率よく処理して２５−ヒドロキシビタミンＤに変えることのできない肝機能障害のあるヒトに、その人にビタミンＤと２５−ヒドロキシビタミンＤ３の組み合わせを提供することで、ビタミンＤ代謝物を提供する方法である。
【００３７】
ビタミンＤおよび２５−ＯＨ  Ｄ３は、どのような供給源から入手したものであってもよく、その組成物も従来の技術を用いて調製してもよい。通常、ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方の結晶を、加熱攪拌しながら（別々にまたは一緒に）油に溶解させる。好ましくは、油を容器に移して加熱する。その後、油の温度を維持または経時的に上昇させながら、ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方を容器に入れる。組成物を攪拌して、ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方の結晶を溶解させる。油に入れる前に、製粉および／または篩過によって結晶の大きさを小さくし、溶解しやすくしておいてもよい。組成物の攪拌は、かき回し、容器の回転、混合、均質化、再循環または超音波処理によって実施してもよい。好ましくは、油を容器に入れて約８０℃〜約８５℃の温度まで加熱し、大きさを揃えた結晶を容器に入れ、中身をかき回して結晶を油に溶解させる。
【００３８】
「油」は、ババス油、ココナッツ油、コフネヤシ油、ムルムル脂、パーム核油またはホシダネヤシ油など、好適な食用油、脂質または脂肪のいずれであってもよい。油は、天然油、合成油、半合成油またはこれらの組み合わせであってもよい。天然油は、どのような供給源に由来するものであってもよい（動物、植物、真菌、海洋など）；合成または半合成油は、都合のよい技術で製造してもよい。好ましくは、油は、植物中鎖トリグリセリド、主にカプリル酸およびカプリン酸の混合物、あるいはパーム油もしくはココナッツ油またはそれらの混合物である。組成物は、任意に、たとえば、薬学的に許容される酸化防止剤、保存剤、溶解剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤、湿潤剤、これらの組み合わせなどの１種類以上の他の好適な成分を含むものであってもよい。上記は、薬学的に許容されるキャリアの例である。
【００３９】
好適な酸化防止剤としては、トコフェロール、混合トコフェロール、天然または合成供給源由来のトコフェロール、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ローズマリー抽出物のような天然酸化防止剤、没食子酸プロピル、ヒト用医薬品の製造に用いられる他の任意の酸化防止剤があげられる。好ましくは、酸化防止剤がトコフェロールである。好適な保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸、これらの組み合わせがあげられる。好適な溶解剤としては、アルコール、塩素化炭化水素、これらの組み合わせなどの無機溶媒または有機溶媒があげられる。好適な界面活性剤は、パルミチン酸アスコルビル、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、これらの組み合わせなど、アニオン系、カチオン系または非イオン系であってもよい。好適なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸−リン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム、これらの組み合わせがあげられる。好適な湿潤剤としては、グリセロール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、これらの組み合わせがあげられる。
【００４０】
油組成物を形成したら、これを他のさまざまな有用な組成物に取り込むことができる。そのうちのいくつかを、以下にあげておく。たとえば、エマルションを形成してもよく、これを任意にカプセル化または噴霧乾燥させてもよい。上述した非水性組成物を水性組成物と組み合わせることで、多岐にわたるエマルションを調製できる。エマルションは、どのようなタイプであってもよい。好適なエマルションとしては、水中油滴型エマルション、油中水滴型エマルション、無水エマルション、固体エマルション、マイクロエマルションがあげられる。
【００４１】
エマルションの調製には、都合のよい任意の技術を使用してもよい。エマルションは、水性組成物と非水性（油など）組成物を含有し、後者は、油組成物の総重量に対して約３重量％〜約５０重量％の量で油に溶解されたビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方を（別々にまたは一緒に）含む。本明細書で使用する場合、「水性組成物」および「水性相」は同義に用いられる。通常、エマルションは約２０％〜約９５％の水性組成物と、約５％〜約８０％の非水性組成物とを含み得る。しかしながら、好ましくは、エマルションが約８５％〜約９５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の水性組成物と、約５％〜約１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の非水性組成物とを含有する。都合のよいことに、非水性組成物が液滴として水性組成物中に分散していてもよい。たとえば、液滴の平均直径が水性組成物中で約５００ｎｍ未満であってもよい。都合のよいことに、液滴の平均直径が約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍである。
【００４２】
特に有利な実施形態では、エマルションは、後にエマルションをさらに処理する（噴霧乾燥など）際に、油組成物のカプセル化を容易にするカプセル化剤を含有する。カプセル化剤は、油組成物をカプセル化できる食用物質であれば何でもよい。好ましくは、カプセル剤が主にコロイド状物質である。このような物質としては、デンプン、動物供給源由来のタンパク質（ゼラチンを含む）、植物供給源由来のタンパク質、カゼイン、ペクチン、アルギン酸塩、寒天、マルトデキストリン、リグニンスルホン酸塩、セルロース誘導体、糖質、糖類、ソルビトール、ゴム、これらの組み合わせがあげられる。
【００４３】
好適なデンプンとしては、植物デンプン（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ＆  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹのＣＡＰＳＵＬ（登録商標）またはＨＩ−ＣＡＰ（登録商標）など）、他の食品用化工デンプン、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、デンプンがＣＡＰＳＵＬ（登録商標）化工植物デンプンである。動物供給源由来の好適なタンパク質としては、ゼラチン（ウシゼラチン、ブルーム強度の異なるブタゼラチン（Ａ型またはＢ型）、魚ゼラチンなど）、脱脂乳タンパク質、カゼイン塩、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、動物タンパク質がゼラチンである。植物供給源由来の好適なタンパク質としては、ジャガイモタンパク質（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ  Ｐｒｅｒｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｅ  Ａｎｏｎｙｍｅ，  Ｌｅｓｔｒｅｍ，ＦｒａｎｃｅのＡＬＢＵＲＥＸ（登録商標）など）、マメタンパク質、ダイズタンパク質、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、植物タンパク質がＡＬＢＵＲＥＸ（登録商標）ジャガイモタンパク質である。デキストロース当量の異なる好適なマルトデキストリンとして、マルトデキストリン５、マルトデキストリン１０、マルトデキストリン１５、マルトデキストリン２０、マルトデキストリン２５、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、マルトデキストリンが、マルトデキストリン１５である。好適なセルロース誘導体として、エチルセルロース、メチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、これらの組み合わせがあげられる。好適な糖類として、ラクトース、スクロースまたはこれらの組み合わせがあげられる。好ましくは、糖類がスクロースである。好適なゴムとして、アカシア、ローカストビーン、カラギーナン、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、ゴムがアカシアゴムである。
【００４４】
エマルションがカプセル化剤を含む場合、このカプセル化剤を都合のよい技術で水に分散させ、水性相を形成してもよい。水性相は、選択した成分の特性に応じて、溶液であっても混合物であってもよい。選択した成分の分散には、均質化、混合、乳化、再循環、静的混合、超音波処理、かき混ぜ、加熱またはこれらの組み合わせをはじめとする都合のよい技術を用いればよい。その後、得られる水性相の粘度を、必要に応じて水を加えて調整してもよい。エマルションの水性組成物は、非水性組成物に関して上述したものを含むがこれに限定されるものではない、他の好適な物質を任意に含むものであってもよい。好ましくは、水性組成物は、カプセル化剤、成膜剤、可塑剤、保存剤、酸化防止剤またはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。好適な保存剤として、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、これらの組み合わせがあげられる。好適な酸化防止剤として、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、クエン酸、これらの組み合わせがあげられる。
【００４５】
好ましくは、水性相が、オクテニルスクシニルデンプン（ＣＡＰＳＵＬ（登録商標））、マルトデキストリン、アスコルビン酸ナトリウムなどの食品用化工デンプンを含有する。別の好ましい水性相は、ジャガイモタンパク質（ＡＬＢＵＲＥＸ（登録商標））、マルトデキストリン２０、アスコルビン酸ナトリウムを含有する。選択した成分を水に溶解させるには、都合のよい技術、好ましくはかき混ぜを使用してもよい。混合物を、好ましくはこれが均一で塊のないものになるまで均質化する。好ましくは、約５０℃〜約８０℃の温度で均質化を実施する。その後、得られる水性相の最終粘度を、所望の粘度、好ましくはビーズレット製造であれば約２５０ｍＰａ・ｓ〜約４５０ｍＰａ・ｓ、一層好ましくは約３００ｍＰａ・ｓ〜約４００ｍＰａ・ｓ、なお一層好ましくは約３８５ｍＰａ・ｓ、噴霧乾燥製剤であれば６０ｍＰａ・ｓ〜３００ｍＰａ・ｓに調整してもよい。
【００４６】
エマルションを形成するには、均質化、ロータ−ステータ剪断、高圧剪断およびキャビテーション、高速「カウリング」または剪断攪拌、これらの組み合わせをはじめとする任意の手段で、非水性組成物と水性相を乳化してもよい。エマルションの容量および粘度については、好ましくは、乳化後に水を加えて調整してもよい。好ましくは、非水性組成物および水性組成物を均質化によって乳化する。好ましくは、エマルションは、鉱物、遷移金属またはペルオキシドを含有しないものとする。
【００４７】
上述したように、他の有用な組成物、特に噴霧乾燥粉末などのカプセル化油の製造時に、エマルションを取り込むかまたは利用してもよい。通常、カプセル化油は、油組成物と、油組成物をカプセル化するカプセル剤とを含み、この場合の油組成物は、油に溶解されたビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方を、油組成物の総重量に対して約５重量％〜約５０重量％の量で含有する。カプセル化油の製造には、噴霧乾燥、フリーズドライ、流動床乾燥、トレイ乾燥、吸着、これらの組み合わせをはじめとする従来の技術による上述したエマルションの乾燥など、都合のよい任意の技術を用いればよい。好ましくは、カプセル剤を含有する上記の水性相を有するエマルションを噴霧乾燥してカプセル化油を生成する。噴霧乾燥のパラメータは、最終的なカプセル化油に望ましい物理的特徴に左右される。このような物理的パラメータとしては、粒度、粉末の形状とフロー、水分含有量があげられる。好ましくは、油が、カプセル化油の総重量に対して約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満または約５重量％未満の量である。カプセル化油は流動性に優れたものでなければならず、ビタミンＤおよび／または２５−ＯＨ  Ｄ３が組成物全体に均一に分散しなければならない。都合のよいことに、カプセル化油が粉末である。他の好適な添加剤をカプセル化油に加えてもよい。このような添加剤の１つが、カプセル化油の流動性を高めるための二酸化ケイ素などのフロー剤であってもよい。
【００４８】
この組成物は、錠剤、カプセル（硬質または軟質など）または注射液（油またはエマルションなど）の形で提供できるものである。これらを１日の単回用量ごとに包装してもよい。
【００４９】
［投与量］
毎日．２種類の有効成分を別々に投与する場合の本発明による組成物は、ビタミンＤまたは２５−ＯＨ  Ｄ３を、約１μｇ〜約５０μｇ、好ましくは約５μｇおよび２５μｇの量で含有する。あるいは、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の両方を含む１日の単回投与量に、各有効成分を、約１μｇ〜約５０μｇ、好ましくは約５μｇおよび２５μｇの量で含有する。
【００５０】
ビタミンＤ対２５−ＯＨ  Ｄ３の用量比については、約５０：１〜約１：５０であってもよく、一層好ましくは約２５：１〜約１：２５、なお一層好ましくは約６：１〜約１：６であってもよい。
【００５１】
別個の複数の投与量を単一のキット（または容器）に梱包してもよい。たとえば、１日の投与量３０組を、両方の活性成分を別々に分けて（すなわち別々の６０の投与量）キットを構成してもよいし、混合（すなわち両方の有効成分を含有する３０の投与量）して構成してもよい。この投与量をヒトに投与するための指示をキットに入れておいてもよい。
【００５２】
毎週．１週間の単回投与量には、ビタミンＤまたは２５−ＯＨ  Ｄ３を約７μｇ〜約３５０μｇ、好ましくは約３５〜１７５μｇの量で含有する。あるいは、１週間の単回投与量が、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の両方をそれぞれ約７μｇ〜約３５０μｇ、好ましくは約３５〜１７５μｇの量で含有してもよい。ビタミンＤ対２５−ＯＨ  Ｄ３の用量比については、約５０：１〜約１：５０であってもよく、一層好ましくは約２５：１〜約１：２５、なお一層好ましくは約６：１〜約１：６であってもよい。
【００５３】
毎月．１ヶ月の単回投与量には、ビタミンＤまたは２５−ＯＨ  Ｄ３を３０μｇ〜約１５００μｇ、好ましくは約７５μｇ〜約５００μｇの量で含有する。あるいは、１ヶ月の単回投与量が、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の両方をそれぞれ、３０μｇ〜約１５００μｇ、好ましくは約７５μｇ〜約５００μｇの量で含有してもよい。１週間または１ヶ月の投与量を１組、２組、３組、４組、５組、６組、７組、８組、９組、１０組、１１組または１２組でキットを構成してもよい。
【００５４】
ビタミンＤ対２５−ＯＨ  Ｄ３の用量比については、５０：１〜約１：５０の範囲とし、一層好ましくは約２５：１〜約１：２５、なお一層好ましくは約６：１〜約１：６の範囲とする。
【００５５】
血漿２５−ＯＨ  Ｄレベルを速やかに（すなわち数時間以内）上昇させ、高めのレベルのまま維持するには、約１：６の２５−ＯＨ  Ｄ３対Ｄ３用量比が特に有益であることが見いだされている。
【００５６】
このため、本発明の別の態様は、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを投与することで、基線レベルよりも上で少なくとも６０ｎｍｏｌ／Ｌの２５−ＯＨ  Ｄの長時間にわたる血漿レベルを維持する方法である。好ましくは、ビタミンＤがビタミンＤ３である。
【００５７】
本出願および特許請求の範囲全体で使用する場合、「長時間にわたる」とは、ビタミンＤおよび２５−ＯＨ  Ｄ３の摂取後４時間の時点から始まって、少なくとも１２時間は継続する時間を意味する。
【００５８】
本発明の別の態様は、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせを投与することで、少なくとも１週間、基線レベルよりも少なくとも３０ｎｍｏｌ／Ｌ上に２５−ＯＨ  Ｄの高めの血漿レベルを維持する方法である。好ましくは、ビタミンＤがビタミンＤ３である。
【００５９】
本発明の別の態様は、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせを投与することで、少なくとも１週間、基線レベルよりも少なくとも３０ｎｍｏｌ／Ｌ上まで２５−ＯＨ  Ｄの血漿レベルを高める方法である。好ましくは、ビタミンＤがビタミンＤ３である。
【００６０】
本発明の別の態様は、急激にすなわち２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせの投与後２時間以内に、基線レベルよりも少なくとも３０ｎｍｏｌ／Ｌ上まで２５−ＯＨ  Ｄの血漿レベルを高め、基線よりも少なくとも３０ｎｍｏｌ／Ｌ上の血漿レベルを少なくとも１週間維持する方法である。好ましくは、ビタミンＤがビタミンＤ３である。
【００６１】
ここから分かるように、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤ、好ましくはビタミンＤ３の両方を投与することの利点の１つに、２５−ＯＨ  Ｄの循環量が短時間で増加し、この増加が維持されることがある。毎日のレジメで推奨されている量などの少なめの投与量を投与する場合、言うまでもなく血漿の絶対的増加は実施例での高めの用量で示した場合よりは少ないすなわち、増え方が３０ｎｍｏｌ／ｌより少なくなる。しかしながら、全体としての応答パターンは同じすなわち、短時間での増加があり、基線上の増加が維持される長い安定期がある。応答の大きさは小さめでも、依然として血漿レベルが１日を通して安定しているという利点がある。このため、すべての組織に２５−ＯＨ  Ｄが最適に供給される。
【００６２】
本発明の別の利点は、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３、好ましくはビタミンＤ３の両方を投与することで、２５−ＯＨ  Ｄの循環レベルを一層容易に所定のレベルにすることができ、この所定のレベルを予測可能な時間にわたって持続させることができる。このため、ビタミンＤ療法に応答しない個体の数を最小限にすることが可能である。たとえば、肝機能障害または同様の症状のある個体でも、一層正常な２５−ＯＨ  Ｄレベルとなり得る。
【００６３】
［遺伝子解析］
この組み合わせの生物活性の増加を実証するために、ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３、組み合わせに曝露した筋肉組織の遺伝子チップ解析を実施した。詳細については、マウス後肢懸垂モデルを用いて実施例２にあげておく。ここから分かるように、２つの組み合わせを送達すると、個々に投与した場合よりも活性化または制御される（上方制御または下方制御のいずれか）遺伝子数が劇的に増加する。現時点で、ビタミンＤの大部分が摂取および肝臓での処理時に２５−ＯＨ  Ｄに変換されると考えられているため、これは意外な結果である。
【００６４】
このように、本発明の別の態様は、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを人に投与することを含む、ビタミンＤおよび２５−ＯＨ  Ｄ応答性ヒト遺伝子を活性化または制御するための方法である。
【００６５】
以下の非限定的な実施例は、本発明を一層よく例示するために示すものである。
【００６６】
［実施例］
［実施例１］
［製剤および治験］
［製剤］
［材料および方法］
２５−ＯＨ  Ｄ３の噴霧乾燥製剤を粉末として提供した。要約すると、２５−ＯＨ  Ｄ３およびＤＬ−α−トコフェロールを中鎖トリグリセリドの油に溶解させた後、化工デンプン、スクロース、アスコルビン酸ナトリウムの水溶液に乳化した。このエマルションを二酸化ケイ素の存在下にて噴霧乾燥器で微粒化した。水分含有量（ＬＤＯ）が４％未満になったら、得られた粉末を回収し、４００μｍで篩過した。これをアルミ製の袋に包装して封止した後、１５℃未満の乾燥した場所で保管し、製造から１２ヶ月以内に使用した。
【００６７】
３種類のロットを製造した。詳しく説明すると、アンカー型攪拌羽根を備えるＦＲＹＭＩＸプロセスユニットで、７０℃にて真空下で１２０分間混合してマトリクスを生成した。
・１７．３００ｋｇの水（ＷＢＩ）
・１３．４６０ｋｇの食品用化工デンプン（ＣＡＰＳＵＬ  ＨＳ）
・３．２７０ｋｇのスクロース
・０．７３０ｋｇのアスコルビン酸ナトリウム
【００６８】
プロペラスターラーを備える二重壁容器で、８２℃にて３５分間混合して、油相を調製した。
・０．５５０ｋｇのＢＥＲＧＡＢＥＳＴ  ＭＣＴ油６０／４０
・０．０４９ｋｇのカルシフェジオール（ＨＹ−Ｄ  ＵＳＰ）
・０．１８３ｋｇのＤＬ−α−トコフェロール
【００６９】
油相をＦＲＹＭＩＸプロセスユニット内のマトリクスに移し、内部のコロイドミル（６０分、７０℃）で事前乳化させた。この事前乳化物を高圧ホモジナイザに循環させた（２０分）。７０℃での粘度が６０ｍＰａ・ｓ〜９０ｍＰａ・ｓのエマルションを高圧ポンプでスプレーノズルまで送った。流動化剤として、二酸化ケイ素（ＳＩＰＥＲＮＡＴ  ３２０  ＤＳ）を塔に供給したが、他の二酸化ケイ素形態も適している場合があることが想定される。噴霧乾燥パラメータを以下にあげておく。
【００７０】
【表１】
0005509503.tif 000002
【００７１】
３ロットの２５−ＯＨ  Ｄ３それぞれについて、２５−ＯＨ  Ｄ３含有量約０．２５％の噴霧乾燥粉末平均８．４ｋｇを得た。製剤の他の成分は、食品用化工デンプン７３．２％、スクロース１７．６％、アスコルビン酸ナトリウム４．０％、中鎖トリグリセリド３．０％、二酸化ケイ素１．０％、ＤＬ−α−トコフェロール１．０％である。
【００７２】
ビタミンＤ３の噴霧乾燥製剤を粉末として提供した。要約すると、ビタミンＤ３およびＤＬ−α−トコフェロールを中鎖トリグリセリドの油に溶解させた後、化工デンプン、スクロース、アスコルビン酸ナトリウムの水溶液に乳化した。このエマルションを二酸化ケイ素の存在下にて噴霧乾燥器で微粒化した。水分含有量（ＬＯＤ）が４％未満になったら、得られた粉末を回収し、篩過して大きな塊を取り除いた。これを１５℃未満の乾燥した場所に保管した。安定性は良好で、保管寿命を１２ヶ月より長く延ばすことが可能である。
【００７３】
［治験］
［被験者］
インフォームドコンセントを用いて健康な閉経後の女性（５０〜７０歳）を募集し、以下の基準でふるい分けた。血清２５−ＯＨ  Ｄが２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜５０ｎｍｏｌ／Ｌ、肥満度指数１８ｋｇ／ｍ２〜２７ｋｇ／ｍ２、血圧１４６／９５ｍｍ  Ｈｇ未満、血清カルシウム２．６ｎｍｏｌ／Ｌ未満、空腹時グルコース１００ｍｇ／ｄｌ未満、１週間に３回を超えて激しい運動をしない、高血圧症の治療歴なし、骨代謝に影響する高用量ビタミンＤまたはカルシウムサプリメントまたは薬物（ビスホスホネート、カルシトニン、エストロゲン受容体調節因子、ホルモン補充療法、副甲状腺ホルモン）の使用歴なし、研究中は「日当たりの良い」場所に足を運ばない。
【００７４】
被験者を７つの処理群（すなわち、毎日、毎週、一用量でのボーラス、組み合わせ用量でのボーラス）に無作為に振り分けた。各群を被験者５名ずつで構成した。彼らをスイスのチューリッヒで冬季に４ヶ月間追跡する。
【００７５】
［臨床研究］
目的は、ヒトに投与したビタミンＤおよび２５−ＯＨ  Ｄ３の薬物動態特性を研究および比較することであった。両方の物質を等しい量で調査した。レジメンは、２５−ＯＨ  Ｄ３を２０μｇ／日（またはそれに相当する量を週ベースで）とする。２５−ＯＨ  Ｄの既存の最大基線濃度が５０ｎｍｏｌ／Ｌになったら、Ｃａ２＋恒常性の乱れが観察される範囲に被験者が近づくとは思われない。比較目的で、等モル量のビタミンＤまたは２５−ＯＨ  Ｄ３のいずれかを投与する必要があった。ビタミンＤの投与に関しては、バックグラウンドのばらつきに影響されず、参加者にとっての有効用量を提供するのに十分な用量であると思われる。
【００７６】
毎日：１２０回投与
１．  ２５−ＯＨ  Ｄ３    ２０μｇ
２．  ビタミンＤ３    ２０μｇ（８００ＩＵ）
毎週：１６回投与
３．  ２５−ＯＨ  Ｄ３    １４０μｇ
４．  ビタミンＤ３    １４０μｇ（５６００ＩＵ）
ボーラス：単回投与
５．  ２５−ＯＨ  Ｄ３    １４０μｇ
６．  ビタミンＤ３    １４０μｇ（５６００ＩＵ）
ボーラス：組み合わせ投与
７．  Ｄ３および２５（ＯＨ）Ｄ３  １４０μｇ（５６００ＩＵ）＋１４０μｇ
【００７７】
ハードゲルカプセル（瓶入り）には、噴霧乾燥ビタミンＤ３または２５−ＯＨ  Ｄ３のいずれかが１カプセルあたり２０μｇまたは１４０μｇのいずれかで含まれている。各投与量を朝食時に経口摂取する。研究期間は、「毎日」および「毎週」群で４ヶ月である。「ボーラス」群に登録された被験者は、２回目の研究での来訪時に単一投与量を経口摂取し、さらに４ヶ月間追跡する。。
【００７８】
この投与量を摂取後、さまざまな時点で被験者から試料を入手して、２５−ＯＨ  Ｄの血漿濃度（ピークおよび定常状態など）を求めた。スクリーニング目的と基線値を確立するために、研究への参加前に血液試料を採取し、臨床検査室で、血清中のビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３、カルシウム、クレアチニン、アルブミン、空腹時グルコースを測定する。研究１週目の月曜日に、血清ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの薬物動態；血清マーカー（すなわち、ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ、カルシウム、クレアチニン、アルブミン、ＰＴＨ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロール、ｂＡＬＰ、空腹時グルコース）；尿マーカー（すなわち、カルシウム、クレアチニン、ＤＰＤ）を２４時間かけて評価する。１週目の残りの日と２週目の月曜日の１日試料を採取して、血清ビタミンＤおよび２５−ＯＨ  Ｄ、血清マーカー（すなわち、カルシウム、クレアチニン、アルブミン）、尿マーカー（すなわち、カルシウム、クレアチニン）を評価する。３、５、７、９、１１、１３、１５週目の月曜日にも評価を継続する。１６週目の月曜日には、試料を採取して、血清ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ；血清マーカー（すなわち、ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ、カルシウム、クレアチニン、アルブミン、ＰＴＨ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロール、ｂＡＬＰ、空腹時グルコース）；尿マーカー（すなわち、カルシウム、クレアチニン、ＤＰＤ）の薬物動態を評価する。
【００７９】
［結果］
表１に、投与量１４０μｇの２５−ＯＨ  Ｄ３、投与量１４０μｇのビタミンＤまたは併用投与量１４０μｇの２５−ＯＨ  Ｄ３＋１４０μｇのビタミンＤ後の血漿２５−ＯＨ  Ｄレベルの増加を示す。血液試料については、表記の時間スケジュールで採取した。
【００８０】
【表２】
0005509503.tif 000003
【００８１】
上述したように、１４０μｇの２５−ＯＨ  Ｄ３＋１４０μｇのビタミンＤを併用投与後に、血漿２５−ＯＨ  Ｄ応答の相乗的な増加があった。この効果は最初の６時間に特に顕著であった。さらに、併用投与によって、２〜２０６時間（すなわち８．５日目まで、あるいは１週間を超えて）血漿２５−ＯＨ  Ｄレベルが少なくとも３０ｎｍｏｌ／Ｌずつ持続的に増加した。１４０μｇの２５−ＯＨ  Ｄ３を投与後、４〜４９時間の間のみ少なくとも３０ｎｍｏｌ／Ｌの血漿２５−ＯＨ  Ｄレベルの増加が観察されたのに対し、１４０μｇのビタミンＤ単独の投与後にはその大きさの増加は観察されなかった。
【００８２】
したがって、１４０μｇの２５  ＯＨ  Ｄ＋１４０μｇのビタミンＤ３の併用投与によって、２つの有意な利点が得られる。これは、２５−ＯＨ  Ｄの迅速かつ相乗的な血漿応答を生じ、なおかつ予想外に顕著かつ長時間にわたる血漿２５−ＯＨ  Ｄレベルの安定化につながる。これらは、ビタミンＤ欠乏の特に重要な治療目標すなわち、すべてのビタミンＤ依存性組織の十分な供給を保証するための最適以下のビタミンＤの状態と長期かつ安定した血漿濃度を速やかに回復することである。
【００８３】
［実施例２］
［遺伝子チップデータ］
この研究の目的は、尾部懸垂が動物の負荷軽減した後肢の骨格筋萎縮につながる、ＢａｌｂＣマウスを用いる骨格筋萎縮モデルにおいて、ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３、ビタミンＤ３と２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせによる効果を試験することであった。当初、このモデルはヒトの宇宙飛行を模するためにラットで確立され、他の科学技術分野でも骨格筋質量または骨の喪失の研究に一般に用いられている。結果は、サルコペニア（加齢に伴う骨格筋の質量と力の変性喪失）または骨格筋の運動不足（骨折、外科手術または外傷による長期の床上安静後など）などのヒトでの症状を示すものとみなされる。
【００８４】
方法  本発明者らの研究のために、研究の最初に９ヶ月齢のメスのＢａｌｂＣマウスを無作為に１群あたり動物１０匹で４群に分けた。
１．対照群：後肢負荷軽減（ＨＵ）
２．ビタミンＤ３群：ＨＵ＋ビタミンＤ３での処理
３．２５−ＯＨ  Ｄ３群：ＨＵ＋２５−ＯＨ  Ｄ３での処理
４．ビタミンＤ＋２５−ＯＨ  Ｄ３群：ＨＵ＋ビタミンＤ３および２５−ＯＨ  Ｄ３（組み合わせ）での処理
【００８５】
動物を７日間にわたって特別なケージに入れておいた。すべてのマウスを別々に分けて収容し、水と餌をいつでも自由に摂取できるようにしておいた。すべての動物を実験開始時と切開３時間前の２回、経管栄養で処理した。
１．対照群はビヒクル（ゼラチン）を摂取
２．Ｄ３群はビタミンＤ３（５０μｇ／ｋｇ／ｂｗ）を摂取
３．２５−ＯＨ  Ｄ３群は２５−ＯＨ  Ｄ３（５０μｇ／ｋｇ／ｂｗ）を摂取
４．組み合わせ群はビタミンＤ３＋２５−ＯＨ  Ｄ３（５０＋５０μｇ／ｋｇ／ｂｗ）を摂取
【００８６】
研究終了時、腓腹筋を採取し、以後の解析用に液体窒素で直接凍結させた。遺伝子発現の変化を確認し、腓腹筋のｍＲＮＡレベルのシフトを解析するために、本発明者らは、このアレイタイプ用にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから入手したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  ４３０−２マイクロアレイをバージョン２７（２００８年１２月）のアノテーションファイルと一緒に用いた。アレイには、「３４，０００を超える十分にキャラクタライズされたマウス遺伝子およびＵｎｉＧｅｎｅクラスター由来の３９，０００を超える転写物と変異体の発現レベルを分析するための４５，０００のプローブセット」を含む（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、２００９）。
【００８７】
一般に用いられているＴｒｉｚｏｌプロトコールを使って全ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを分光光度解析によって定量化した。全ＲＮＡ試料の完全性もＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで定性的に評価した。次に、１サイクルのｃＤＮＡ合成用にＲＮＡを調製した。このステップには、ポリ−ＡＲＮＡ対照を使用して、真核標的標識プロセス全体をモニタするための外来の陽性対照を得る。第１のｃＤＮＡ合成を実施し、第２鎖ｃＤＮＡ合成後、二本鎖ｃＤＮＡからｃＤＮＡをクリーンアップする。次に、ビオチン標識ｃＲＮＡを合成し、クリーンアップし、分光光度計を用いて２６０／２８０ｎｍで定量化する。最適なアッセイ感度を得るには、Ｇｅｎｅチッププローブアレイへのハイブリダイゼーション前にｃＲＮＡ標的を断片化しておくことが重要である。断片化後、チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  ４３０−２チップ）でプローブをハイブリダイズする。チップを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの流体ステーションにて染色し、遺伝子チップスキャナでスキャンする。次に、Ｇｅｎｅｄａｔａ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  ５．０：  Ｒｅｆｉｎｅｒ  Ａｒｒａｙ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｔ）から入手したソフトウェアを用いてさらに解析するために、データをスキャナから転送する。データの解釈とパス解析については、ＧｅｎｅＧｏ  Ｍｅｔａｃｏｒｅパッケージ（Ｖ５．２  ｂｕｉｌｄ  １７３８９）のオンライン版を用いて実施した。
【００８８】
一層精密なアレイで、品質に関する事項についてマイクロアレイデータを評価し、問題のある測定にフラグを立てる。これによって、生のマイクロアレイデータを以後の統計解析用に自動的に前処理してまとめるための一組の正規化アルゴリズムと有効な簡略化方法が得られる。
【００８９】
マイクロアレイデータを解析したところ、ＨＵ群とＨＵ＋処理群（ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３または組み合わせ）とで発現の異なる遺伝子（ｍＲＮＡ）が明らかになった。
【００９０】
本発明者らによる重要な所見は、以下のとおりである。
１．２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤ３とを組み合わせると、２５−ＯＨ  Ｄ３よりも多くの遺伝子のプローブセットが変化する。結果として、ビタミンＤ３（表１）よりも多くの遺伝子のプローブセットが変化する。
ａ．ＨＵ対照群と比較して、組み合わせ処理（Ｄ３＋２５−ヒドロキシビタミンＤ３）を実施した群では、２５−ＯＨ  Ｄ３だけで処理を実施した群（１２６３）よりも有意に多くの遺伝子のプローブセットが変化した（１７４５）。
ＨＵ対照群と比較して、２５−ＯＨ  Ｄ３で処理した群では、ビタミンＤ３での処理を実施した群（３８５）よりも有意に多くの遺伝子のプローブセットが変化した（１２６３）エラー！参照ソース見つからず。
【００９１】
２．２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３の組み合わせ処理では、ビタミンＤ３での処理よりも２５−ＯＨ  Ｄ３での処理のほうが、共通の遺伝子の発現の異なるプローブセットが多い。
ａ．２５−ＯＨ  Ｄ３群で発現の異なる約６１％の遺伝子のプローブセットが、２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３群でも発現が異なる（１２６３のうち７６９、図２）
ｂ．ビタミンＤ３群で発現の異なる約４６％の遺伝子のプローブセットが、２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３群でも発現が異なる（３８５のうち１７７、図３）
ｃ．図４、図６、図７に示すように、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤ３の組み合わせ処理が、筋肉発達過程の遺伝子に最も有意な影響がある。
ｄ．関与する遺伝子は、骨格筋における以下のメインカテゴリのうちの一部である：筋肉収縮、筋肉発達、筋肉維持（表）。
【００９２】
３．骨格筋の選択した遺伝子のプローブセットについては、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤ３での組み合わせ処理で、ビタミンＤ３のみまたは２５−ＯＨ  Ｄ３のみでの処理より発現が多い（表３）。
【００９３】
【表３】
0005509503.tif 000004
【００９４】
【表４】
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【００９５】
【表５】
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【００９６】
本明細書にて説明かつ権利請求している本発明は、本明細書に含まれる特定の実施形態によってその範囲が限定されるものではない。これらの実施形態は、本発明のいくつかの態様を例示することを意図したものだからである。等価な実施形態も本発明の範囲に含まれることを想定している。特に、本明細書で示して説明したもの以外にも、上記の説明を読めば、本発明のさまざまな改変が当業者には自明となろう。このような改変も、添付の特許請求の範囲に包含されることを想定している。矛盾が生じた場合は、定義を含めて本開示が優先するものとする。
【図１】
0005509503.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
0005509503.tif 000010
【図５】
0005509503.tif 000011
【図６】
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【図７】
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