(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャリアー蛋白質とカップリングしたＦ−ａｎｔｉｇｅｎを免疫原として製造された肺炎球菌Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎを特異的に認識する抗体同士を用いたサンドイッチ免疫学的測定法により、生体由来検体中の肺炎球菌Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎを検出又は定量することを特徴とする、肺炎球菌抗原の検出又は定量方法。
【請求項２】
前記抗体がＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ抗原との交差反応性を示さない抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記抗体がＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ抗原及び肺炎球菌Ｃ−ｐｓ抗原との交差反応性を示さない抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記キャリアー蛋白質がＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ又はＡｓｃａｒｉｓ抽出物である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記生体由来検体が、中耳又は副鼻腔由来検体である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体中の肺炎球菌抗原を検出又は定量するための、免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は市中肺炎や下気道感染症の原因菌として最も検出頻度の高い菌であり、日本だけではなく全世界においても罹患率、死亡率の高い原因菌の一つである。肺炎球菌感染症は、頻度が高いだけではなく、重症化しやすいため、治療開始時の適切な抗菌薬選択が重要である。また、感染症治療の原則からみても、原因菌をできる限り早期に確定することは、的確な治療法を早期に選択することができるため、予後の改善、医療コストの削減、耐性菌発現防止につながることから、重要である。これらの背景から、肺炎球菌由来抗原を感染早期の段階で、迅速に検出する診断薬が求められている。【０００３】
肺炎球菌の構造については、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ等により詳細が報告されている（非特許文献１）。菌の最も外側には莢膜（ｃａｐｓｕｌａｒ）が位置し、莢膜には莢膜多糖と呼ばれる多糖抗原が配位する。この莢膜多糖の構造の違いに基づく、数十種類以上の血清型が報告されている。一方、莢膜の内側には細胞壁（Ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ）及び細胞膜（Ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）が順次位置しており、細胞壁にはＣ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（Ｃ−ｐｓ）が、また細胞膜にはＦ−ａｎｔｉｇｅｎと呼ばれるテイコ酸又はリポテイコ酸が、それぞれ配位している。Ｃ−ｐｓは全ての肺炎球菌で保存されている共通抗原として知られており、またＦ−ａｎｔｉｇｅｎの多糖部分はＣ−ｐｓと同じ糖の配列を有することが報告されている。【０００４】
免疫測定法を利用した肺炎球菌の抗原検出方法としては、従来、抗Ｃ−ｐｓ抗体を用いたＥＬＩＳＡにより喀痰中のＣ−ｐｓ抗原を検出する方法（非特許文献２、非特許文献３）や、莢膜多糖を対象とした免疫電気泳動法により血清中、尿中の抗原を検出する方法（非特許文献４、非特許文献５）が報告されている。【０００５】
また、既存の肺炎球菌検出キットとしては、古くは、ラテックス凝集法により、髄液、血清、尿中の肺炎球菌抗原を検出するキットが用いられていた。この方法は、莢膜多糖等の多糖部分を検出すると考えられる（非特許文献６、非特許文献７）。しかし、ラテックス凝集法を用いたキットは、操作の煩雑さや感度の問題から、現在はほとんど使用されていない。【０００６】
現在では、より簡便な検出法が用いられている。Ｂｉｎａｘ  Ｉｎｃ．の尿中抗原迅速検出キット（Ｂｉｎａｘ  ＮＯＷ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｕｒｉｎａｒｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｔｅｓｔ）は、イムノクロマトグラフィー法により、尿中のＣ−ｐｓを検出する（特許文献１）。この方法は、尿中抗原を検出するため非侵襲的であり、測定時間も１５分程度と迅速である（非特許文献８）。しかし、尿中抗原の測定の場合、肺炎球菌が治療後も長期に渡って尿中に排出され続けることにより、偽陽性が生じるという問題がある（非特許文献９）。また、乳幼児の場合、採尿が困難であること、及び常在性の肺炎球菌の影響による偽陽性が生じるという問題もある（非特許文献１０）。さらに、このキットについては、感度が若干低いとの指摘もされている（非特許文献１１）。【０００７】
より最近開発された肺炎球菌抗原検出キット（非特許文献１２）は、抗Ｃ−ｐｓポリクローナル抗体（ウサギ）を用いたイムノクロマトグラフィーにより、喀痰又は鼻腔や上咽頭のぬぐい液、又は中耳貯留液や耳漏中の肺炎球菌抗原（Ｃ−ｐｓ）を迅速に検出するものである。このキットは、上述の尿中抗原診断キットと比較して高感度であり、ぬぐい液等の臨床検体を濃縮操作なしに利用でき、さらに従来困難であった中耳貯留液からの測定を可能にし得る。また、尿検体と異なり、乳幼児からの検体採取が容易である。しかし、中耳や副鼻腔由来の検体等の一部検体については、このキットでもなお感度は十分とはいえず、さらに高感度な検出方法の開発が望まれる。【０００８】
前述のように、肺炎球菌の抗原検出キットとしては、莢膜抗原及びＣ−ｐｓを検出するものが報告されている。このうち、多様性の高い莢膜抗原は、その多様な型に応じた抗体の準備が必要となるため、簡易測定の対象としては適当でない。Ｃ−ｐｓについても、前述の既存の検出キットの結果を見る限り、さらなる高感度化が必要である。【０００９】
一方、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎは、これまでのところ、日常の臨床検査には利用されていない。抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いた免疫学的検出法により肺炎球菌抗原を含む菌を検出した報告があるが（非特許文献１３〜１５）、これらの方法は、菌種間での交差反応が生じたり偽陰性の危険があるなど、精度の面で問題があった。
【先行技術文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第６，８２４，９９７号
【００１１】
【非特許文献１】Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄａｎｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ４２：４７−５３（１９９５）
【非特許文献２】Ｈｏｌｍｂｅｒｇら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：１１１−１１５（１９８５）
【非特許文献３】Ｓｊｏｇｒｅｎら，Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．６：２３９−２４８（１９８７）
【非特許文献４】Ｃｏｏｎｒｏｄら，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８１：７７８−７８６（１９７３）
【非特許文献５】Ｆｅｉｇｉｎら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ８９：７７３−７７５（１９７６）
【非特許文献６】Ａｊｅｌｌｏら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１３８８−１３９１（１９８７）
【非特許文献７】Ｂａｌｌａｒｄら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．６：６３０−６３４（１９８７）
【非特許文献８】小林隆夫ら、感染症学雑誌  第７６巻第１２号：９９５−１００２（２００２）
【非特許文献９】舘田一博、モダンメディア  第５１巻第６号：１２９−１３２（２００５）
【非特許文献１０】成相昭吉ら、感染症学雑誌  第７８巻第１号：１８−２１（２００４）
【非特許文献１１】Ｔｚｅｎｇら，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．３９：３９−４４（２００６）
【非特許文献１２】東川幸嗣ら、小児科臨床  ５８（１）：１３９−１４３（２００５）
【非特許文献１３】Ｋｏｌｂｅｒｇら，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２：３２１−３２９（１９９７）
【非特許文献１４】Ｓｔｕｅｒｔｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２３４６−２３４８（１９９８）
【非特許文献１５】Ｍａｔｔｉｅら，Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．５６：１５４−１５９（２００５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、簡便、迅速且つ高感度に、生体由来検体からの肺炎球菌抗原の検出又は定量を可能にする免疫学的検出方法及びそのための抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、より高感度に肺炎球菌抗原の検出又は定量を可能にする方法について検討した。その結果、肺炎球菌の多糖抗原のうち、従来肺炎球菌抗原の検出に実際上用いられていなかった肺炎球菌Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎに着目し、これを特異的に認識する抗体を作製し、そしてこの抗体を用いた免疫学的測定方法を利用することで、生体由来検体中の肺炎球菌抗原を従来の方法よりも高感度で、簡便且つ迅速に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は、肺炎球菌Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎを特異的に認識する抗体を提供する。また、本発明は、当該抗体を用いた免疫学的測定法により、生体由来検体中の肺炎球菌Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎを検出又は定量することを特徴とする、肺炎球菌抗原の検出又は定量方法を提供する。さらに本発明は、当該抗体を含有する、肺炎球菌抗原検出キットを提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、肺炎球菌Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎを特異的に認識する新規抗体が提供される。また、当該抗体を用いた免疫学的測定方法を利用した、生体由来検体中の肺炎球菌抗原を簡便且つ迅速に検出又は定量する方法が提供される。本発明の方法によれば、肺炎球菌抗原を従来よりも高感度に検出又は定量することが可能となるため、尿、喀痰や鼻腔若しくは上咽頭ぬぐい液のみならず、従来よりも高い検出感度を要求する中耳や副鼻腔由来の検体等においても、検体の濃縮操作を要さずに、信頼性のある測定結果を得ることができる。さらに、肺炎球菌は髄膜炎、中耳炎、敗血症等の起炎菌となることから、本発明の方法は、これらの疾患の起炎菌同定の精度及び所要時間を向上させ得るという、臨床的有用性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】１０，０００倍希釈した５羽のウサギ由来の抗血清（Ｎｏ．１〜１１）のＦ−ａｎｔｉｇｅｎ固相プレート（Ｆ−Ａｇ）およびＢＳＡ固相プレート（ＢＳＡ）への反応性。
【図２】ＥＬＩＳＡ測定系の評価。Ａ：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系。Ｂ：抗Ｃ−ｐｓポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系。Ｆ−Ａｇ；Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原含有サンプル、Ｃ−ｐｓ；Ｃ−ｐｓ抗原含有サンプル。
【図３】肺炎球菌培養株（ＡＴＣＣ４９６１９）抽出液の測定による、ＥＬＩＳＡ測定系感度評価。Ｃ−ｐｓ  ＥＬＩＳＡ：抗Ｃ−ｐｓポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系、Ｆ−Ａｇ  ＥＬＩＳＡ：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系。
【図４】本発明の抗体の特異性評価。実施例１で得られた抗血清由来の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎポリクローナル抗体（Ｎｏ．１〜１１）、及び公知の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体（ＨＡＳ）の反応特異性。
【図５】本発明の抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定系の特異性評価。表１に示す菌体に対する反応性。
【図６】イムノクロマトストリップの例示的構成。Ａ：使用前のストリップ。ニトロセルロース部分にラインは確認されない。Ｂ：使用後のストリップ。陰性であれば１本のライン（上段）、陽性であれば２本のライン（下段）が確認できる。Ｃ：ラミネート加工されたストリップの構成。Ｄ：ストリップを収めたプラスティックケース。
【図７】Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ検出用イムノクロマトグラフィーの感度評価及び測定態様。Ａ：検体溶液を用いた測定態様。Ｂ：種々の濃度の精製Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原を検体とするイムノクロマトグラフィー。Ｃ：種々の菌体濃度の肺炎球菌培養株（ＡＴＣＣ４９６１９）抽出液を検体とするイムノクロマトグラフィー。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本発明者らは、従来の肺炎球菌抗原検出キットでは用いられていなかったＦ−ａｎｔｉｇｅｎに新たに着目し、抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体の作製を行った。得られた本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体は、驚くべきことに、従来の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎモノクローナル抗体と異なりＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅには実質的に交差性を示さず（図４）、また本抗体により作製したＥＬＩＳＡ系も、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを含む他の多様な菌種に対してほとんど交差反応を示さなかった（図５）。更に、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎとＣ−ｐｓとが共通の多糖構造を有するとのこれまでの報告（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄａｎｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ４２：４７−５３（１９９５））にもかかわらず、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体は、Ｃ−ｐｓと実質的に反応しなかった（図２）。すなわち、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体は、従来の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体や抗Ｃ−ｐｓ抗体とは全く異なる、高度にＦ−ａｎｔｉｇｅｎ特異的であり、多糖類部分を認識する新規抗体である。さらに、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いた肺炎球菌抗原測定系の感度を測定したところ、Ｃ−ｐｓ抗体を用いた測定系と比較して、同じ検体に対して顕著に高感度であることがわかった（図３）。
【００１８】
本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体は、後述の参考例に示される方法で得ることができる。まず、公知の方法（例えば、Ｐｏｘｔｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７５：１０３３−１０４２（１９７８））によりＦ−ａｎｔｉｇｅｎを調製する。調製されたＦ−ａｎｔｉｇｅｎは、そのまま免疫原として使用することができる。好ましくは、調製されたＦ−ａｎｔｉｇｅｎを、公知の方法（例えば、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法等）に従ってキャリアー蛋白質とカップリングした後、免疫原として使用する。得られた免疫原を用いて、公知の方法により抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を得ることができる。カップリングした抗原を免疫原とすることにより、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとの交差反応性のない、より肺炎球菌に対する特異性の高い抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を得ることができる。
【００１９】
カップリングに使用されるキャリアー蛋白質としては、例えば、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、Ａｓｃａｒｉｓ抽出物（回虫粗抽出物）等が挙げられるが、これらに限定されず、通常使用されるものであればよい。キャリアー蛋白質とＦ−ａｎｔｉｇｅｎとをカップリングするための架橋剤としては、蛋白質又はペプチド同士の連結に通常使用されるものであれば特に限定されない。このうち、ＳＨ基とアミノ基を架橋するヘテロ二価反応試薬が好ましく、具体例としては、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＭＢＳ）、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スクシンイミド（ＨＭＣＳ）、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スクシンイミド（ＫＭＵＳ）、Ｎ−（（４−（２−マレイミドエトキシ）スクシニル）オキシ）スクシンイミド（ＭＥＳＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ）、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ）、Ｎ−（８−マレイミドカプリルオキシ）スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＨＭＣＳ）、Ｎ−（１１−マレイミドウンデカノイルオキシ）スルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ）、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明の抗体は、抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ応答性を有する限り、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、さらにこれらと実質的に同一なアミノ酸配列を有する抗体を包含する。本発明の抗体はまた、抗体の全体分子、その組換え体及びそれらの断片若しくは修飾物、ならびに二価抗体及び一価抗体を含む。
【００２１】
モノクローナル抗体は、上記免疫原を、マウスやラットの皮下、腹腔又は筋肉内に、そのまま又はフロイント等のアジュバンドと共に免疫し、免疫された個体の免疫関連細胞とミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、その中から目的の特異的抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって作製される。免疫は、例えば、０．１〜１００μｇ／ｂｏｄｙの量の抗原、あるいはカップリングに使用したキャリアー蛋白質の絶対量として０．１〜１００μｇ／ｂｏｄｙ、望ましくは１〜１０μｇ／ｂｏｄｙの量の抗原を用いて、隔週で１回から数回程度行われる。
【００２２】
ポリクローナル抗体は、上記免疫原を、ウサギやヤギの皮下にフロイント等のアジュバンドと共に免疫することで作製される。免疫は、例えば、１０〜５００μｇ／ｂｏｄｙの量の抗原、あるいはカップリングに使用したキャリアー蛋白質の絶対量として０．１〜１０００μｇ／ｂｏｄｙ、望ましくは１０〜５００μｇ／ｂｏｄｙの量の抗原を用いて、隔週で１回から数回程度行われる。免疫された個体から血液を採取し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ等を用いたアフィニティー精製やイオン交換樹脂等の公知の方法を用いることによって、ＩｇＧ画分が得られる。必要に応じて、ゲル濾過精製等の他の精製操作を組み合わせて行ってもよい。
【００２３】
「実質的に同一なアミノ酸配列を有する抗体」とは、抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ応答性を有する限りにおいて、もとの抗体のアミノ酸配列から１又は複数個（例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなる抗体をいう。特定アミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸配列を置換、欠失、挿入又は付加する技術は公知であり、例えば、部位特異的突然変異誘発などのような各種方法を利用することができる。
【００２４】
「実質的に同一なアミノ酸配列を有する抗体」としてはまた、抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ応答性を有する限りにおいて、もとの抗体のアミノ酸配列と、８０％以上の配列同一性、好ましくは８５％以上の配列同一性、より好ましくは９０％以上の配列同一性、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性を有する抗体が挙げられる。アミノ配列の同一性は、例えば、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００２５】
抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ／ｃ、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。これらの抗体断片は、抗体をパパインやペプシン等の酵素で処理するか、またはこれらの断片をコードする遺伝子を構築し、それを任意の宿主細胞中で発現させることで得ることができる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
【００２６】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。あるいは、このような連結ペプチドをコードする遺伝子を構築し、任意の宿主細胞中で発現させてもよい。抗体修飾物は、抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の組換え体は、任意の突然変異を起こさせた抗体遺伝子を宿主細胞中で発現させることによって作製することができる。抗体組換え体及び抗体修飾物を得る方法は、当該分野で周知である。
【００２７】
本発明はまた、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いた免疫学的測定法により、生体由来検体中の肺炎球菌Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎを検出又は定量することを特徴とする、肺炎球菌抗原の検出又は定量方法を提供する。本発明の検出方法は、簡便、迅速且つ高感度に肺炎球菌抗原を検出することができるので、迅速且つ的確な診断を可能にする。また、本発明の定量方法を用いることにより、肺炎球菌に起因する疾患に対する薬剤の効果等を、簡便、迅速且つ高精度に判定することができる。よって、これらの方法はいずれも、適切な治療法の早期選択に貢献する。
【００２８】
本発明の測定方法に用いられる生体由来検体としては、特に限定されるものではないが、例えば、生体由来の組織、器官又は体液（例えば、喀痰、鼻腔若しくは上咽頭ぬぐい液、中耳貯留液、耳漏、副鼻腔貯留液、脳脊髄液、尿、血液、リンパ液等）に由来する検体、及びこれらの培養物由来の検体が挙げられる。好ましくは、検体は、喀痰、鼻腔若しくは上咽頭ぬぐい液、中耳貯留液、耳漏、副鼻腔貯留液、脳脊髄液、尿、血液、リンパ液に由来する。検体は、必要に応じて、界面活性剤や酸、アルカリ処理、加熱等による抽出、濃縮、希釈等の通常の前処理を施され得る。
【００２９】
本発明の方法は従来法よりも高感度であるため、中耳貯留液、耳漏、副鼻腔貯留液、脳脊髄液、血液由来の検体等の、従来法では十分な測定感度が得られなかった検体を用いることもまた、本発明方法の好ましい態様である。例えば、肺炎球菌は髄膜炎、中耳炎、敗血症等の起炎菌となることから、中耳貯留液、耳漏、副鼻腔貯留液、脳脊髄液、血液由来の検体を本発明の方法で測定すれば、これらの疾患の起炎菌をより高精度に同定することができる。
【００３０】
本発明の方法で用いられる免疫学的測定法としては、当該分野で公知の任意の免疫測定方法を使用することができる。例示的には、ラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ等のエンザイムイムノアツセイ（ＥＩＡ）、ラテックス凝集法（ＬＴＩＡ）及びイムノクロマトグラフィーが挙げられる。検出感度の向上の点で、サンドイッチ法の使用が好ましい。また、簡便さ及び迅速さの観点では、イムノクロマトグラフィーが好ましい。イムノクロマトグラフィー法を用いる場合、ベッドサイドや患者来院中の短時間での診断が可能となる。
【００３１】
上記免疫学的測定において使用される標識としては、当該分野で使用される任意の標識が挙げられる。例示的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリフオスファターゼ、βガラクトシダーゼ等の酵素、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ又は３Ｈ等のラジオアイソトープ（ＲＩ）、ＦＩＴＣ、テトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、ケミルミネッセンス等の発光物質、及び金コロイド、着色ラテックス粒子等の可視化物質が挙げられる。さらに、ビオチンで一次標識後、上記標識により標識されたアビジンを用いる増感系や、ジゴキシゲニン等の低分子物質で一次標識後、上記標識により標識された抗体等の当該低分子物質に親和性を有する物質を用いる検出法も挙げられる。
【００３２】
上記本発明の検出又は定量方法を利用した、肺炎球菌抗原を検出するキットもまた提供される。本発明のキットは、肺炎球菌Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎを特異的に認識する抗体を含み得る。また本発明のキットは、免疫測定に使用する他の試薬や材料を含み得る。例えば、本発明のキットは、本発明の抗体とともに、イムノクロマト、ＥＬＩＳＡ又はラテックス凝集法のための固相（例えば、ストリップ、プレート、ビーズ等）、及び標識物質等の試薬などを含み得る。
【実施例】
【００３３】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３４】
（参考例１：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体作製用の免疫原の調製）
１）Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原の調製
Ｐｏｘｔｏｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７５：１０３３−１０４２（１９７８））を参考に、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎの調製を行った。まず羊血液寒天培地や、ブレインハートインヒュージョン液体培地を用いて肺炎球菌を培養し、掻き取り法や遠心法により肺炎球菌のペレットを回収した。回収したペレットを、適量の精製水に懸濁後、超音波破砕した。加温処理後、遠心操作によりペレットを回収した。精製水への懸濁、超音波破砕、遠心を数回繰り返し、水溶性成分を十分に除いた。得られた水不溶性のペレットをＢｏｉｌｅｄ  ＳＤＳに加え、終濃度２．５％  ＳＤＳに調整後、室温で数時間攪拌した。遠心後、ペレットを水で洗浄した。遠心・水洗浄を数回繰り返し、不溶性成分を回収した。不溶性成分は終濃度１０％  ＴＣＡ溶液として冷蔵下で数時間以上攪拌した。遠心後上清を回収し、ジエチルエーテル等でＴＣＡを除いた後、精製水に対して透析した。本溶液を凍結乾燥後、白色の粉末が得られた。この白色粉末は、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎと核酸の混合物と考えられたが、核酸は免疫原性を有しないため、本粉末を抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体作製用の抗原（Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原）として、後の工程で使用した。【００３５】
２）Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原の純度評価
本白色粉末の１ｍｇを採取し超純水１ｍＬに溶解後、市販の蛋白定量キット（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ法：ＢＣＡ測定キット、Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて蛋白質の混在を評価した。検出感度３１．２５μｇ／ｍＬ以下であり、蛋白質の混在は極めて低いことが示された。【００３６】
３）免疫原の調製
Ｓｚｕらの報告（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５４：４４８−４５５（１９８６））を参考に、得られたＦ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原をキャリアー蛋白質（ＫＬＨ（カブトガニヘモシアニン）もしくは市販のＡｓｃａｒｉｓ抽出物（製造元エル・エス・エル、発売元コスモ・バイオ株式会社））にカップリングした。キャリアー蛋白質とカップリングした抗原及びカップリングなしの抗原（Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ単独）を、各々免疫原として使用した。換言すると、以下の手順を行った。
１：リン酸緩衝液に懸濁したキャリアー蛋白質をジチオスレイトールや２−メルカプトエタノール等のＳＨ基還元剤で処理した。処理後、ゲル濾過や透析等の手法を用いてリン酸緩衝液に置き換えた。
２：上記操作と並行して、適量のＦ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原をリン酸緩衝液に溶解した。続いて遊離ＳＨとアミノ基を架橋する二価反応試薬（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ又はｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ）をＦ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原１ｍｇに対し０．１〜２ｍｇ（好ましくは０．２〜１ｍｇ）の割合で溶解液に添加した。
３：室温で反応後、透析やゲル濾過等の手法により過剰量の二価反応試薬を除去した。
４：１の操作により得たＳＨ還元キャリアー蛋白質１ｍｇ当たりに、２の操作で得た二価反応試薬処理Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗原を０．１〜１０ｍｇ（好ましくは０．５〜５ｍｇ）の範囲で添加した。
５：冷蔵下で十分な時間反応後、再度透析処理を行った。本溶液をＦ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体作製用の免疫原として使用した。【００３７】
（実施例１：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体の作製）
１）抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎポリクローナル抗体の作製
参考例１で得られた免疫原を、ウサギ（ｎ＝１１）の皮下にフロイント等のアジュバンドと共に免疫した。免疫量は、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ単独で免疫した場合は１０〜５００μｇ／ｂｏｄｙを、キャリアー蛋白質とカップリングした場合はカップリングに使用したキャリアー蛋白質の絶対量として０．１〜１０００μｇ／ｂｏｄｙ、望ましくは１０〜５００μｇ／ｂｏｄｙを用い、隔週で１回から数回程度行った。抗血清を部分採取し、免疫に用いた抗原に対する反応性を確認した後、大量採血もしくは全採血を行った。大量採血の場合は、免疫を継続しながら、個体に負担の掛からない範囲で数回の大量採血を行った。得られた全血を遠心分離後、抗血清として凍結保管した。抗血清を適量解凍し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ等を用いたアフィニティー精製やイオン交換樹脂等により精製して、ＩｇＧ画分を得た。また、必要に応じてゲル濾過精製を組み合わせた。【００３８】
２）抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎモノクローナル抗体の作製
参考例１で得られた免疫原をマウス又はラットの皮下、腹腔又は筋肉内にそのまま、もしくはフロイント等のアジュバンドと共に免疫する。免疫量は、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ単独で免疫した場合は０．１〜１００μｇ／ｂｏｄｙを、キャリアー蛋白質とカップリングした場合はカップリングに使用したキャリアー蛋白質の絶対量として０．１〜１００μｇ／ｂｏｄｙ、望ましくは１〜１０μｇ／ｂｏｄｙを用い、隔週で１回から数回程度の免疫を行う。抗血清を部分採取し、免疫に用いた抗原に対する反応性を確認した後、脾臓、胸腺やリンパ節を摘出し、そこから得られた免疫関連細胞とＰ３Ｕ１等のマウスミエローマ細胞株とをポリエチレングリコール法など公知の方法で融合し、ハイブリドーマを作製する。作製されたハイブリドーマの中から、限界希釈法により目的とする抗原に反応するハイブリドーマを選択する。選択されたハイブリドーマの培養上清や腹水からＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ等を用いたアフィニティー精製やイオン交換樹脂等により、モノクローナル抗体を精製する。また、必要に応じてゲル濾過精製を組み合わせて行う。【００３９】
（実施例２：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体の力価）
実施例１で作製した１１個体のウサギから得られた抗血清（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．５：ＫＬＨをキャリアー蛋白としｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣで架橋した抗原を免疫した５羽、Ｎｏ．６〜Ｎｏ．９：Ａｓｃａｒｉｓ抽出物をキャリアー蛋白としｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳで架橋した抗原を免疫した４羽、Ｎｏ．１０，１１：Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ単独で免役した２羽）を、適宜希釈（Ｎｏ．１〜５：５０，０００倍、Ｎｏ．６〜９：５０，０００倍、Ｎｏ．１０，１１：１，０００倍）後、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原固相化プレートに反応させ、抗血清の力価を評価した。結果を図１に示す。１１個体全ての抗血清がＦ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原固相化プレートに強く反応することが確認された。また、本抗血清はコントロールにおいた牛血清アルブミン（ＢＳＡ）固相化プレートには全く反応しないことも確認された。これらの結果から、上記方法で作製された全ての抗血清は、強い抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ応答性を示すことが明らかとなった。【００４０】
（実施例３：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの抗原反応性）
実施例１の抗血清のうちＮｏ．１及びＮｏ．５から、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ精製及びゲル濾過精製によりＩｇＧ画分を得た後、これらのポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡによる測定系を構築し、その性能を評価した。換言すると、Ｎｏ．５血清由来の精製抗体を固定した固相プレートに、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原又はＣ−ｐｓを含むサンプル（０．０４１〜１０ｎｇ／ｍＬ）を各々添加し、抗体と反応させた。抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いた測定系では、プレートを洗浄後、ビオチン標識したＮｏ．１血清由来の精製抗体を添加し、サンプルと反応させた。プレートを再度洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識したストレプトアビジンを加えてビオチンと反応させた。続いて、ＨＲＰの発色を吸光度計により測定した。同様の手法により、市販Ｃ−ｐｓを用いて作製した抗Ｃ−ｐｓポリクローナル抗体によるサンドイッチ測定系を構築し、ＨＲＰの発色を測定した。【００４１】
測定された吸光度に基づいて、両測定系の性能を評価した。これまでの報告において、Ｃ−ｐｓとＦ−ａｎｔｉｇｅｎとは共通の多糖構造を有することが示されていた（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄａｎｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ４２：４７−５３（１９９５））ことから、両測定系ともにＣ−ｐｓとＦ−ａｎｔｉｇｅｎとに交差反応することが予想された。しかし、図２に示すように、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系は、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原は検出するがＣ−ｐｓは全く検出しなかった（図２Ａ）。同様に、Ｃ−ｐｓを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系は、Ｃ−ｐｓは検出するがＦ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原は全く検出しなかった（図２Ｂ）。【００４２】
これらの結果から、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体が、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎのみを特異的に認識することが示された。また、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体は、Ｃ−ｐｓとの交差反応を全く示さないことから（図２）、従来使用されてきた抗Ｃ−ｐｓ抗体とは全く異なる新規なものであることが示唆された。【００４３】
（実施例４：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの菌体反応性）
実施例３で作製した２種類のサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系の、肺炎球菌菌体抽出液に対する反応性を調べた。菌体抽出液には、培養により得た肺炎球菌（ＡＴＣＣ４９６１９）を界面活性剤又は超音波等を用いて破砕した溶液を使用した。図３に示すように、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いた測定系は、抗Ｃ−ｐｓ抗体を用いた測定系よりも１００倍高感度に、肺炎球菌菌体抽出液から肺炎球菌抗原を検出した。このことから、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定系により、従来使用されているＣ−ｐｓ測定系よりも顕著に高感度に、生体由来検体中の肺炎球菌を検出できることが確認された。なお、図２に示すように、精製抗原を測定した場合の感度は両測定系でほぼ同等（０．１ｎｇ／ｍＬ程度）であることから、生体由来検体での感度差が肺炎球菌における両抗原の発現量の差に起因する可能性が示唆される。【００４４】
（実施例５：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの菌体特異性）
公知の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体やＦ−ａｎｔｉｇｅｎ検出系（Ｋｏｌｂｅｒｇら，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２：３２１−３２９（１９９７）又はＳｔｕｅｒｔｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２３４６−２３４８（１９９８））では、ホスホリルコリン部分をエピトープとして利用する。したがって、これらの抗体や検出系には、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ以外にもＣ−ｐｓ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ等に強い交差反応性を有するという欠点があることが示唆される。
そこで、実施例１で得られた抗血清（Ｎｏ．１〜１１）由来の本発明の抗Ｆ−Ａｎｔｉｇｅｎポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ測定系の菌種間での交差反応性を調べた。比較のため、ホスホリルコリンをエピトープとするマウスモノクローナル抗体ＨＡＳ（Ｓｔａｔｅｎｓ  ｓｅｒｕｍ  ｉｎｓｔｉｔｕｔ，Ｄｅｎｍａｒｋ、参考文献：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９８４；４３：８７６−８７８，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９９３；１４：２９９−３０５）を用いて同様の実験を行った。【００４５】
１）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとの間の交差反応性の比較
肺炎球菌（ＡＴＣＣ４９６１９）及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｔｙｐｅ  Ｂ，ＡＴＣＣ３１４４１）の培養菌体を超音波破砕後、市販の蛋白定量キット（Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ法：ＢＣＡ測定キット、Ｐｉｅｒｃｅ社）により蛋白定量を行い、Ｄ−ＰＢＳ希釈後１．０μｇ／ｍＬの濃度でＥＬＩＳＡ用プレートに一晩固相化した。一般的手法によりブロッキング後、適宜希釈した実施例１で作製した各抗血清（Ｎｏ．１〜５：５０，０００倍、Ｎｏ．６〜９：５０，０００倍、Ｎｏ．１０，１１：１，０００倍）または、上記ＨＡＳ抗体の希釈液（１２５倍）を反応させた。続いて、ＨＲＰ標識した抗ウサギＩｇＧ抗体またはＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＭ抗体により発色させ、ＨＲＰの発色を吸光度計により測定した。なお、コントロールプレートとしてＢＳＡ固相プレートを使用した。結果を図４に示す。【００４６】
Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ単独抗原を免疫して得られたＮｏ．１０，１１の両抗血清、及びホスホコリンをエピトープとするＨＡＳ抗体は、肺炎球菌破砕抗原にもＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ破砕抗原にも反応した。一方、カップリング抗原を免疫して得られた抗血清Ｎｏ．１〜Ｎｏ．９では、Ｎｏ．８のみに弱い交差があったものの、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅには反応性を示さず、高度に肺炎球菌特異的であった。したがって、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎをキャリアー蛋白に架橋することで作製される抗原を免疫原として用いて得られた抗体は、ＨＡＳ抗体のようなＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとの交差反応を起こさないことから、ホスホコリンを認識しない抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体であることが示
唆される。一方、キャリアー蛋白質とカップリングされていないＦ−ａｎｔｉｇｅｎ抗原を免疫原として得られた抗血清は、ＨＡＳ抗体と同様のホスホリルコリンをエピトープとする抗体を含有することが明らかになった。【００４７】
２）多菌種間での交差反応性の比較
さらに、多菌種間での交差反応性を調べた。表１の菌を用いる以外、本実施例の１）と同様の方法を用いて、本発明の抗体の反応性を測定した。結果を図５に示す。本発明の抗体は、Ｓｔｕｅｒｔｚら（Ｓｔｕｅｒｔｚら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２３４６−２３４８（１９９８））の抗体と同様、Ｓ．ｍｉｔｉｓとの交差反応性を有するものの、他の菌種との間には全く交差反応を示さなかった。【００４８】
【表１】
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【００４９】
本発明の多糖類部分を認識する抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体は、従来知られたホスホリルコリンをエピトープとする抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体と比較して、高度に肺炎球菌特異的であった。さらに、本発明の抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体は、臨床的に肺炎球菌との混合感染を起こしやすいＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとの反応性を有さないことから、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅによる影響を受けない点で臨床検査に有用である。また、上述の実施例３で示した本発明抗体を用いたＥＬＩＳＡ測定系の感度（０．０４１〜１０ｎｇ／ｍＬ）は、従来報告されているＥＬＩＳＡ測定系の感度（例えば上述のＳｔｕｅｒｔｚらにおける３．１〜５０ｎｇ／ｍＬ）と比較して、顕著に高い（約７５倍）。【００５０】
（参考例２：イムノクロマトグラフィーの構成）
イムノクロマトグラフィーは、一般的手法に従って行う事ができる。例示的には、図６に示すようなストリップ等の構成を用いることができる。例えば、当該構成は、プラスティック台紙等の基板上の片側末端にサンプルアプライ部分（サンプルパッド）を、続いて標識抗Ｆ−Ａｎｔｉｇｅｎ抗体を乾燥保持させた部分（コンジュゲートパッド）、ニトロセルロース部分、および過剰なサンプルを吸収する部分（吸収パッド）を備える。標識抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体の溶液をサンプルとともにサンプルパッドから吸収させる場合には、コンジュゲートパッドは必要ない。サンプルパッド、コンジュゲートパッド及び吸収パッドとしてはガラス繊維、セルロース若しくはコットン等、又はそれらの混合体から形成される多孔質素材（例えば、濾紙）が望ましく、ニトロセルロースは、ポアサイズ１．０〜２０μｍ（好ましくは５．０〜１５．０μｍ）のものが望ましい。【００５１】
ニトロセルロースには、上記の精製抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎポリクローナル抗体を０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ（好ましくは０．２〜５ｍｇ／ｍＬ）の濃度で塗布し（テストライン）、さらに、テストラインと別の位置に抗ウサギＩｇＧ活性を有するヤギやマウスのＩｇＧ等を０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で塗布する（コントロールライン）。乾燥後、蛋白や高分子等でブロッキングを行う。ブロッキングにはスキムミルク、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質や、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子が使用可能である。【００５２】
抗体の標識としては、２０〜１５０ｎｍのサイズ（好ましくは３０〜１００ｎｍ）の金コロイドが望ましく、さらには着色Ｌａｔｅｘ粒子や他の貴金属コロイドも使用可能である。これらの標識は、コロイドやＬａｔｅｘ粒子への直接的な吸着や他の蛋白等を介した共有結合、更にＬａｔｅｘ上の官能基を介した共有結合等の適切な方法により、抗体に結合させる。標識のブロッキングはニトロセルロース同様にスキムミルク、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質や、ＰＶＡ、ＰＶＰ、ＰＥＧ等の高分子が使用可能である。上記方法により作製した標識抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎポリクローナル抗体は、スキムミルク、ＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質や、ＰＶＡ、ＰＶＰ、ＰＥＧ等の高分子および糖類などと共に上記で述べた多孔質素材に含浸させた後に乾燥させて、コンジュゲートパッドとする。このコンジュゲートパッド、サンプルパッド、吸収パッドおよび上記のとおり作製したニトロセルロースを基板に貼り付けて組み立てたイムノクロマトストリップは、プラスティックケース内に納めて、またはラミネートシールを貼ることによってストリップ単体で、使用可能である（図６Ｃ及びＤ）。【００５３】
（実施例６：抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を用いたサンドイッチイムノクロマトグラフィーの性能評価）
金コロイド標識抗Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ抗体を乾燥保持させたコンジュゲートパッドを備えるイムノクロマトストリップを作製した。界面活性剤を含有するリン酸緩衝液等で中耳炎、肺炎および髄膜炎等に由来する浸出液、拭い液、喀痰、血液、髄液、尿等のサンプルを希釈後、その希釈液（検体抽出液）にストリップを挿入し、サンプルを展開した（図７Ａ）。展開開始後１５分で、陽性・陰性の判定を目視で行った。結果、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原が１０〜０．６ｎｇ／ｍＬの範囲でテストライン部位に赤色ラインが確認され、陽性と判断できた。一方、Ｆ−ａｎｔｉｇｅｎ様抗原に代えて緩衝液を供した場合にはテストライン部位には赤色ラインが確認できす陰性と判断できた（図７Ｂ）。更に同様な手法により、菌量既知の菌体抽出液を同イムノクロマトストリップにて測定した結果、緩衝液だけを流した０濃度では先と同様にテストラインは確認できなかったが、肺炎球菌抽出液では１０３ＣＦＵ／ｍｌまでテストラインを確認でき、陽性と判定できた（図７Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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