(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の抗体からの抗体の選択のための方法であって、該方法が：
−  抗原の分子量に基づく表面プラズモン共鳴の測定におけるシグナル応答を最適化すること、それによりＲｍａｘ値を測定の温度範囲において一定に保つ、
−  式（Ｉ）
（Ｉ）抗原−複合体−安定性＝（１−［ＢＬ（ＲＵ）−ＳＬ（ＲＵ）／ＢＬ（ＲＵ）］）
（抗原注入の終了直前に設定されたＢｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ参照ポイントを表わすＢＬ、複合体解離段階の終了直前に設定されたＳｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ参照ポイントを表わすＳＬを用いた表面プラズモン共鳴の測定に基づく）の抗原−複合体−安定性の計算を含む動態スクリーニング工程を実施すること、
−  ９５%超の複合体の安定性を有する抗体を選択すること、
−  １７℃、２１℃、２５℃、２９℃、３３℃、及び３７℃での表面プラズモン共鳴による温度依存的な動態データを測定すること、
−  式（ＩＩ）〜（ＸＩＩＩ）に基づく、遷移状態の熱力学的特性を計算すること
（ＩＩ）ΔＧ°  ＝  ΔＨ°  −  Ｔ＊ΔＳ°
（ＩＩＩ）ΔＧ°  ＝  −  Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ
（ＩＶ）ｌｎＫＤ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°／Ｒ）／傾き  −  （ΔＳ°／Ｒ）／切片
（Ｖ）Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ  ＝  ΔＨ°Ｔ０  −  Ｔ＊ΔＳ°Ｔ０＋ΔＣ°ｐ（Ｔ−Ｔ０）−Ｔ＊ΔＣｐ°  ｌｎ（Ｔ／Ｔ０）
（ＶＩ）ｋａ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＶＩＩ）ｌｎｋａ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡＊Ｒ  ＋  ｌｎｋｂ／ｈ）／切片
（ＶＩＩＩ）ｋａ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＩＸ）ｌｎｋａ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
（Ｘ）ｋｄ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＸＩ）ｌｎｋｄ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡／Ｒ  ＋  ｌｎｋＢ／ｈ）／切片
（ＸＩＩ）ｋｄ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＸＩＩＩ）ｌｎｋｄ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
ΔＨ°  −  標準結合エンタルピー、
ΔＳ°  −  標準結合エントロピー、
ΔＧ°  −  自由標準結合エンタルピー、
Ｔ＊ΔＳ°  −  エントロピー時間、
ΔＨ°‡ａｓｓ  −  標準会合結合エンタルピー、
ΔＳ°‡ａｓｓ  −  標準会合結合エントロピー、
ΔＧ°‡ａｓｓ  −  標準会合自由結合エンタルピー、
Ｅａ  ａｓｓ  −  会合についてのアレニウスパラメーター、
ΔＨ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離結合エンタルピー、
ΔＳ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離結合エントロピー、
ΔＧ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離自由結合エンタルピー、
Ｅａｄｉｓｓ  −  解離についてのアレニウスパラメーター、
ｋＤ  −  親和性定数、
ｋａ  −  会合速度定数、
ｋｂ  −  ボルツマン定数＝（１．３８０６５０３  ×  １０−２３m2kgs-2K-1）、
ｋｄ  −  解離速度定数、
ｈ  −  プランク定数、
Ｃｐ−  モル熱容量、
−  抗原複合体の会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］の温度依存的な増加及び一定又は減少する抗原複合体の解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］に基づき抗体を選択すること
の工程を含む、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、
−  熱力学的特性が、エンタルピー促進性のΔＨ°‡ａｓｓ抗原複合体の会合段階及び１０J/K*mol未満の結合エントロピーΔＳ°‡ａｓｓである、及び／又は
−  抗体が、負の又はほぼゼロ解離活性化エネルギー（Ｅａｄｉｓｓ［kJ/mol］）、負の解離エンタルピー（ΔＨ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］）、及び大きな負の解離エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］）を示す解離段階に基づいて選択されること
を特徴とする、方法。
【請求項３】
複数の抗体からの温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法であって、それにより抗体が、１０J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）及び１００J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー（ΔＳ°）に基づいて選択される方法。
【請求項４】
抗体が以下
ａ）１０J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）、
ｂ）１００J/mol*K以上の絶対標準解離結合エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ）、
ｃ）１００J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー（ΔＳ°）
の少なくとも２つに基づいて選択されることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）が、５J/K*mol未満であることを特徴とする、請求項３又は４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）が、０J/K*mol未満であることを特徴とする、請求項３〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
絶対標準解離結合エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ）が、１２５J/mol*K以上であることを特徴とする、請求項３〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
絶対標準解離結合エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ）が、１５０J/mol*K以上であることを特徴とする、請求項３〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
絶対標準結合エントロピー（ΔＳ°）が、１２５J/mol*K以上であることを特徴とする、請求項３〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
絶対標準結合エントロピー（ΔＳ°）が、１５０J/mol*K以上であることを特徴とする、請求項３〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、−５０kJ/mol以下の自由標準結合エンタルピー（ΔＧ°）に基づいて選択されることを特徴とする、請求項３〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、２．３を上回る標準解離自由結合エンタルピー（ΔＧ°‡ｄｉｓｓ）と標準会合自由結合エンタルピー（ΔＧ°‡ａｓｓ）の比率に基づいて選択されることを特徴とする、請求項３〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、
ａ）−８０kJ/mol以下、又は
ｂ）＋４０kJ/mol以上
の−ＴΔＳ°値に基づいて選択されることを特徴とする、請求項３〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
温度が１３〜３７℃の範囲であることを特徴とする、請求項３〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
複数の抗体からの温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法であって、以下の工程：
ｉ）温度依存的な動態データを測定すること、
ｉｉ）遷移状態（ＴＳ）の熱力学的特性を計算すること、及び
ｉｉｉ）熱力学的挙動に基づく抗体を選択すること
を含み、上記熱力学的挙動が、エンタルピー促進性のΔＨ°‡ａｓｓ抗原複合体の会合段階及び１０J/K*mol未満の結合エントロピーΔＳ°‡ａｓｓ、及び１２５J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー（ΔＳ°）であることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
熱力学的挙動が、抗原複合体の会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］の温度依存的な増加及び一定又は減少する抗原複合体の解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］であることを特徴とする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗体が、負の又はほぼゼロ解離活性化エネルギー（Ｅａｄｉｓｓ［kJ/mol］）、負の解離エンタルピー（ΔＨ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］）、及び大きな負の解離エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］）を示す解離段階に基づいて選択されることを特徴とする、請求項１５及び１６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
温度依存的な動態データの測定が、表面プラズモン共鳴により行われ、動態スクリーニング工程及び熱力学的スクリーニング工程を含むことを特徴とする、請求項３〜１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
動態スクリーニング工程が、式（Ｉ）
（Ｉ）抗原−複合体−安定性＝（１−［ＢＬ（ＲＵ）−ＳＬ（ＲＵ）／ＢＬ（ＲＵ）］）
（抗原注入の終了直前に設定されたＢｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ参照ポイントを表わすＢＬ、複合体解離段階の終了直前に設定されたＳｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ参照ポイントを表わすＳＬを用いた表面プラズモン共鳴の測定に基づく）の抗原−複合体−安定性の計算を含むことを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
方法が、抗原の分子量に基づく表面プラズモン共鳴の測定におけるシグナル応答を最適化する工程を含み、それによりＲｍａｘは、測定の温度範囲において一定に保たれることを特徴とする、請求項１８又は１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
表面プラズモン共鳴による測定が、以下の工程：
ａ）固体支持体表面に結合された捕捉分子によって前記固体支持体表面上での抗体を固定化すること、
ｂ）抗原を含む溶液を準備すること、
ｃ）固定化抗体に対する抗原の会合を可能にするために、前記固体支持体表面上に既知濃度の抗原を含む溶液を流入させること、
ｄ）固定化抗体からの抗原の解離を可能にするための、固体支持体表面上に抗原を含まない溶液を流入させること、
ｅ）工程ｃ）及びｄ）の間での、固体支持体表面に結合された抗原の時間依存的な量をモニタリングすること及び結合データを収集すること、ここで、工程ｃ）及びｄ）を異なる濃度の抗原で少なくとも１回繰り返す、及び
ｆ）式（ＩＩ）〜（ＸＩＩＩ）に基づき、抗原と固定化抗体の間での相互作用についての所定のモデルに、ｅ）で得られた結合データを適合することによる動態学的及び／又は熱力学的パラメーターを計算すること
（ＩＩ）ΔＧ°  ＝  ΔＨ°  −  Ｔ＊ΔＳ°
（ＩＩＩ）ΔＧ°  ＝  −  Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ
（ＩＶ）ｌｎＫＤ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°／Ｒ）／傾き  −  （ΔＳ°／Ｒ）／切片
（Ｖ）Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ  ＝  ΔＨ°Ｔ０  −  Ｔ＊ΔＳ°Ｔ０＋ΔＣ°ｐ（Ｔ−Ｔ０）−Ｔ＊ΔＣｐ°  ｌｎ（Ｔ／Ｔ０）
（ＶＩ）ｋａ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＶＩＩ）ｌｎｋａ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡＊Ｒ  ＋  ｌｎｋｂ／ｈ）／切片
（ＶＩＩＩ）ｋａ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＩＸ）ｌｎｋａ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
（Ｘ）ｋｄ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＸＩ）ｌｎｋｄ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡／Ｒ  ＋  ｌｎｋＢ／ｈ）／切片
（ＸＩＩ）ｋｄ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＸＩＩＩ）ｌｎｋｄ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
ΔＨ°  −  標準結合エンタルピー、
ΔＳ°  −  標準結合エントロピー、
ΔＧ°  −  自由標準結合エンタルピー、
Ｔ＊ΔＳ°  −  エントロピー時間、
ΔＨ°‡ａｓｓ  −  標準会合結合エンタルピー、
ΔＳ°‡ａｓｓ  −  標準会合結合エントロピー、
ΔＧ°‡ａｓｓ  −  標準会合自由結合エンタルピー、
Ｅａ  ａｓｓ  −  会合についてのアレニウスパラメーター、
ΔＨ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離結合エンタルピー、
ΔＳ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離結合エントロピー、
ΔＧ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離自由結合エンタルピー、
Ｅａｄｉｓｓ  −  解離についてのアレニウスパラメーター、
ｋＤ  −  親和性定数、
ｋａ  −  会合速度定数、
ｋｂ  −  ボルツマン定数＝（１．３８０６５０３  ×  １０−２３m2kgs-2K-1）、
ｋｄ  −  解離速度定数、
ｈ  −  プランク定数、
Ｃｐ−  モル熱容量、
を含むことを特徴とする、請求項１８〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
抗体の固定化が、種特異的な抗体捕捉分子によることを特徴とする、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
動態スクリーニングが、９５%を上回る複合体の安定性を有する抗体を選択することにより実施されることを特徴とする、請求項１５〜２２のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
抗原シグナル応答が、抗原の分子量に基づき最適化されることを特徴とする、請求項１８〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程：
ａ）各々が抗体を発現する複数の細胞を準備すること、
ｂ）異なる温度及び異なる抗体濃度で表面プラズモン共鳴によりそれぞれの抗原に結合した前記抗体の時間依存的な量を測定すること、
ｃ）式（ＩＩ）〜（ＸＩＩＩ）に基づいてｂ）で測定された時間依存的な量を用いて計算すること
（ＩＩ）ΔＧ°  ＝  ΔＨ°  −  Ｔ＊ΔＳ°
（ＩＩＩ）ΔＧ°  ＝  −  Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ
（ＩＶ）ｌｎＫＤ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°／Ｒ）／傾き  −  （ΔＳ°／Ｒ）／切片
（Ｖ）Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ  ＝  ΔＨ°Ｔ０  −  Ｔ＊ΔＳ°Ｔ０＋ΔＣ°ｐ（Ｔ−Ｔ０）−Ｔ＊ΔＣｐ°  ｌｎ（Ｔ／Ｔ０）
（ＶＩ）ｋａ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＶＩＩ）ｌｎｋａ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡＊Ｒ  ＋  ｌｎｋｂ／ｈ）／切片
（ＶＩＩＩ）ｋａ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＩＸ）ｌｎｋａ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
（Ｘ）ｋｄ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＸＩ）ｌｎｋｄ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡／Ｒ  ＋  ｌｎｋＢ／ｈ）／切片
（ＸＩＩ）ｋｄ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＸＩＩＩ）ｌｎｋｄ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
少なくとも熱力学的パラメーター
（ｉ）標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）、
（ｉｉ）標準解離結合エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ）、
（ｉｉｉ）標準結合エントロピー（ΔＳ°）、
（ｉｖ）自由標準結合エンタルピー（ΔＧ°）、
（ｖ）標準解離自由結合エンタルピー（ΔＧ°‡ｄｉｓｓ）、
（ｖｉ）標準会合自由結合エンタルピー（ΔＧ°‡ａｓｓ）、
（ｖｉｉ）−ＴΔＳ°、
（ｖｉｉｉ）解離速度定数ｋｄ、
（ｉｘ）平衡結合定数ＫＤ、及び
（ｘ）会合速度定数ｋａ
ｄ）以下の少なくとも２つを用いた抗体を産生する細胞を選択すること
ｉ）１０J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー、
ｉｉ）１００J/mol*K以上の絶対標準解離結合エントロピー、
ｉｉｉ）１００J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー、
ｅ）前記抗体の発現に適した条件下で選択された細胞を培養し、細胞又は／及び培養培地から前記抗体を回収することにより抗体を産生すること
を含む、抗体を製造するための方法。
【請求項２６】
以下：
−  ａ）の後及びｂ）の前：ａ１）ａ）の細胞を培養し、前記細胞により発現される抗体を各々が含む培養上清を準備すること、
−  工程ｄ）の後及び工程ｅ）の前：ｄ１）前記選択された細胞から前記抗体をコードする核酸を単離し、前記単離核酸に基づき、前記抗体のキメラ、ＣＤＲ移植、Ｔ細胞エピトープ欠乏及び／又はヒト化変異体をコードするさらなる核酸を準備し、発現カセット中に前記改変核酸を含む発現プラスミドを準備し、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞に前記発現プラスミドをトランスフェクションすること
の追加工程の１つ又は両方を含む、請求項２５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、抗体の熱力学的パラメーター、特に遷移状態の熱力学に基づく高親和性抗体の測定のための方法を開示し、結合エントロピー、例えば抗原結合工程中での標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）及びエントロピー負荷などを評価する。
発明の背景
【０００２】
顕著な抗原特異性及び非常に高い抗原複合体の安定性を有する高親和性抗体の生成は、診断用及び治療用抗体開発における主要な目標である。
【０００３】
タンパク質−タンパク質の相互作用の熱力学的分析に関し、普及している技術は熱量測定アッセイである（Chaires, J. B., Annu. Rev. Biophys. 37 (2008) 135-51; Perozzo, R., et al., J. Recept. Signal Transduct. Res. 24 (1-2) (2004) 1-52; Li, L., et al., Chem. Biol. Drug Des. 71(6) (2008) 529-32; Liang, Y., Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai) 40(7) (2008) 565-76; Thielges, M. C., et al., Biochemistry 47(27) (2008) 7237-47）。反応熱量測定のために要求されるサンプル量は高く、例えば少なくとも１２５μg/mlの抗体濃度及び少なくとも１５０μlのサンプル容量が必要である。さらに、反応熱量測定では高いサンプル純度が要求され、いかなるサンプル不純物又はサンプル不均一性も許容されず、サンプルバッファーは直接的に熱力学的パラメーター結果の結果に影響を与える。反応熱量測定によってしか平衡熱力学を説明できない。
【０００４】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）計測手段（Roos, H., et al., J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 204-10; Van Regenmortel, M. H., et al., J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 163-7; Gunnarsson, K., Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18 (2001) Unit 18.6; Drake, A. W., et al., Anal. Biochem. 328(1) (2004) 35-43; Kikuchi, Y., et al., J. Biosci. Bioeng. 100(3) (2005) 311-7）によって、ハイスループット様式での温度依存的な動態プロファイルの迅速な測定が可能になる（例、Canziani, G. A., et al., Anal. Biochem. 325(2) (2004) 301-7; Safsten, P., et al., Anal. Biochem. 353(2) (2006) 181-190; Leonard, P., et al., J. Immunol. Methods 323(2) (2007) 172-9を参照のこと）。
【０００５】
Wassaf, D., et al.（Anal. Biochem. 351 (2006) 241-253）は、表面プラズモン共鳴マイクロアレイを使用して、抗体のハイスループット親和性順位を報告している。バイオセンサー技術を用いたタンパク質相互作用の熱力学的分析が、Roos, H., et al., J. Mol. Recognit. 11 (1998) 204-210において報告されている。
発明の概要
【０００６】
本発明は、温度非依存的な抗原複合体の安定性を有する高親和性抗体の選択のための方法を提供し、エンタルピー促進性の抗原会合、負のエントロピー負荷、及び抗原解離の間での大きなエントロピー変化により特徴付けられる。
【０００７】
本発明の第１の態様は、抗原に結合する複数の抗体からの抗体の選択のための方法であって、前記方法が以下：
−  抗原の分子量に基づく表面プラズモン共鳴の測定におけるシグナル応答の最適化（それによりＲｍａｘを測定の温度範囲において一定に保つ）、
−  動態スクリーニング工程の実施（式（Ｉ）
（Ｉ）抗原−複合体−安定性＝（１−［ＢＬ（ＲＵ）−ＳＬ（ＲＵ）／ＢＬ（ＲＵ）］）
（抗原注入の終了直前に設定されたＢｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ参照ポイントを表わすＢＬ、複合体解離段階の終了直前に設定されたＳｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ参照ポイントを表わすＳＬを用いた表面プラズモン共鳴の測定に基づく）の抗原−複合体−安定性の計算を含む）、
−  ９５%超の複合体の安定性を有する抗体の選択、
−  １７℃、２１℃、２５℃、２９℃、３３℃、及び３７℃での表面プラズモン共鳴による温度依存的な動態データの測定、
−  遷移状態の熱力学的特性の計算、
−  抗原複合体の会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］の温度依存的な増加及び一定又は減少する抗原複合体の解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］に基づく抗体の選択
の工程を含む。
【０００８】
この局面の一実施態様において、
−  表面プラズモン共鳴の測定及び抗体濃度１０７nMでは１７℃、７８nMでは２１℃、７０nMでは２５℃、６４nMでは２９℃、５８nMでは３３℃、及び５３nMでは３７℃で実施された熱力学的スクリーニングを用いた前記抗体の熱力学的特性の計算に基づく温度依存的な動態データを作成すること、及び／又は
−  熱力学的特性が、エンタルピー促進性のΔＨ°‡ａｓｓ抗原複合体の会合段階及び１０J/K*mol未満の結合エントロピーΔＳ°‡ａｓｓであること、及び／又は
−  負の又はほぼゼロ解離活性化エネルギー（Ｅａｄｉｓｓ［kJ/mol］）、負の解離エンタルピー（ΔＨ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］）、及び大きな負の解離エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］）を示す解離段階を用いて抗体を選択することである。
【０００９】
本発明の一局面は、以下の工程：
ａ）複数の細胞、好ましくはハイブリドーマ細胞又はＢ細胞（各々が抗体を発現する）の準備、
ｂ）異なる温度及び異なる抗体濃度で表面プラズモン共鳴によりそれぞれの抗原に結合した前記抗体の時間依存的な量の測定、
ｃ）式（ＩＩ）〜（ＸＩＩＩ）に基づいてｂ）で測定された時間依存的な量を用いた計算
（ＩＩ）ΔＧ°  ＝  ΔＨ°  −  Ｔ＊ΔＳ°
（ＩＩＩ）ΔＧ°  ＝  −  Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ
（ＩＶ）ｌｎＫＤ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°／Ｒ）／傾き  −  （ΔＳ°／Ｒ）／切片
（Ｖ）Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ  ＝  ΔＨ°Ｔ０  −  Ｔ＊ΔＳ°Ｔ０＋ΔＣ°ｐ（Ｔ−Ｔ０）−Ｔ＊ΔＣｐ°  ｌｎ（Ｔ／Ｔ０）
（ＶＩ）ｋａ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＶＩＩ）ｌｎｋａ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡＊Ｒ  ＋  ｌｎｋｂ／ｈ）／切片
（ＶＩＩＩ）ｋａ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＩＸ）ｌｎｋａ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
（Ｘ）ｋｄ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＸＩ）ｌｎｋｄ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡／Ｒ  ＋  ｌｎｋＢ／ｈ）／切片
（ＸＩＩ）ｋｄ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＸＩＩＩ）ｌｎｋｄ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
少なくとも熱力学的パラメーター
（ｉ）標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）、
（ｉｉ）標準解離結合エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ）、
（ｉｉｉ）標準結合エントロピー（ΔＳ°）、
（ｉｖ）自由標準結合エンタルピー（ΔＧ°）、
（ｖ）標準解離自由結合エンタルピー（ΔＧ°‡ｄｉｓｓ）、
（ｖｉ）標準会合自由結合エンタルピー（ΔＧ°‡ａｓｓ）、
（ｖｉｉ）−ＴΔＳ°、
（ｖｉｉｉ）解離速度定数ｋｄ、
（ｉｘ）平衡結合定数ＫＤ、及び
（ｘ）会合速度定数ｋａ、
ｄ）以下の少なくとも２つを用いた抗体を産生する細胞の選択：
ｉ）１０J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー、
ｉｉ）１００J/mol*K以上の絶対標準解離結合エントロピー、
ｉｉｉ）１００J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー、
ｅ）前記抗体の発現に適した条件下で前記の選択された細胞を培養し、細胞又は／及び培養培地から前記抗体を回収することによる抗体の製造
を含む抗体を産生するための方法である。
【００１０】
一実施態様において、方法は、以下：
−  ａ）の後及びｂ）の前：ａ１）ａ）の細胞を培養し、前記細胞により発現される抗体を各々が含む培養上清を準備すること、
−  工程ｄ）の後及び工程ｅ）の前：ｄ１）前記の選択された細胞から前記抗体をコードする核酸を単離し、前記の単離核酸に基づき、前記抗体のキメラ、ＣＤＲ移植、Ｔ細胞エピトープ欠乏及び／又はヒト化変異体をコードするさらなる核酸を準備し、発現カセット中に前記の改変核酸を含む発現プラスミドを準備し、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞に前記の発現プラスミドをトランスフェクトすること
の追加工程の１つ又は両方を含む。
【００１１】
本発明の別の態様は、複数の抗体からの例えば治療処置用の温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法であって、それにより抗体は、１０J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）に基づいて選択される。
【００１２】
この態様の一実施態様において、抗体は、以下
ａ）１０J/K*mol未満の標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）、
ｂ）１００J/mol*K以上の絶対標準解離結合エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ）、
ｃ）１００J/mol*K以上の絶対標準結合エントロピー（ΔＳ°）
の少なくとも２つに基づいて選択される。
【００１３】
本発明の方法の一実施態様において、標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）は、５J/K*mol未満である。別の実施態様において、標準会合結合エントロピー（ΔＳ°‡ａｓｓ）は、０J/K*mol未満である。さらなる実施態様において、絶対標準解離結合エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ）は、１２５J/mol*K以上である。さらなる実施態様において、絶対標準解離結合エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ）は、１５０J/mol*K以上である。別の実施態様において、絶対標準結合エントロピー（ΔＳ°）は、１２５J/mol*K以上である。さらなる実施態様において、絶対標準結合エントロピー（ΔＳ°）は、１５０J/mol*K以上である。
【００１４】
本発明の一実施態様において、本方法は、抗体が、−５０kJ/mol以下の自由標準結合エンタルピー（ΔＧ°）に基づいて選択されることを特徴とする。さらなる実施態様において、本発明の方法は、抗体が、２．３を上回る標準解離自由結合エンタルピー（ΔＧ°‡ｄｉｓｓ）と標準会合自由結合エンタルピー（ΔＧ°‡ａｓｓ）の比率に基づいて選択されることを特徴とする。さらなる実施態様において、方法は、抗体が、以下
ａ）−８０kJ/mol以下、又は
ｂ）＋４０kJ/mol以上
の−ＴΔＳ°値に基づいて選択されることを特徴とする。
【００１５】
本発明の別の態様は、複数の抗体からの（例、医薬組成物中での使用のため）温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法であって、温度増加に伴い同じ桁で一定、又は、２桁まで減少する解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）に基づいて抗体を選択する工程を含む。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、複数の抗体からの（例、医薬組成物中での使用のため）温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法であって、温度増加に伴い一定で又は減少する平衡結合定数ＫＤ（Ｍ）に基づいて抗体を選択する工程を含む。
【００１７】
本発明の方法の一実施態様において、温度は１３〜３７℃の範囲である。
【００１８】
本発明の追加の態様は、複数の抗体からの（例、医薬組成物中での使用のため）温度非依存的な抗原結合抗体の選択のための方法であって、以下
ｉ）温度依存的な動態データの測定、
ｉｉ）遷移状態（ＴＳ）の熱力学的特性の計算、及び
ｉｉｉ）熱力学的挙動に基づく抗体の選択
の工程を含む。
【００１９】
一実施態様において、本発明の方法は、前記の熱力学的挙動が、抗原複合体の会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］の温度依存的な増加及び一定又は減少する抗原複合体の解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］であることを特徴とする。さらなる実施態様において、前記の熱力学的挙動は、エンタルピー促進性のΔＨ°‡ａｓｓ抗原複合体の会合段階及び１０J/K*mol未満の結合エントロピーΔＳ°‡ａｓｓである。別の実施態様において、抗体は、負の又はほぼゼロ解離活性化エネルギー（Ｅａｄｉｓｓ［kJ/mol］）、負の解離エンタルピー（ΔＨ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］）、及び大きな負の解離エントロピー（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］）を示す解離段階に基づいて選択される。
【００２０】
さらなる実施態様において、温度依存的な動態データの測定は表面プラズモン共鳴により行い、動態スクリーニング工程及び熱力学的スクリーニング工程を含む。一実施態様において、前記の動態スクリーニング工程は、式（Ｉ）
（Ｉ）抗原−複合体−安定性＝（１−［ＢＬ（ＲＵ）−ＳＬ（ＲＵ）／ＢＬ（ＲＵ）］）
（抗原注入の終了直前に設定されたＢｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ参照ポイントを表わすＢＬ、複合体解離段階の終了直前に設定されたＳｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ参照ポイントを表わすＳＬを用いた表面プラズモン共鳴の測定に基づく）の抗原−複合体−安定性の計算を含む。さらなる実施態様において、本方法は、抗原の分子量に基づく表面プラズモン共鳴の測定におけるシグナル応答を最適化する工程を含み、それによりＲｍａｘは、測定の温度範囲において一定に保たれる。
【００２１】
さらなる実施態様において、本発明の方法は、表面プラズモン共鳴による前記の測定が以下の工程：
ａ）固体支持体表面に結合された捕捉分子による前記固体支持体表面上での抗体の固定化、
ｂ）抗原を含む溶液の準備、
ｃ）固定化抗体への抗原の会合を可能にするための、固体支持体表面上に既知濃度の抗原を含む溶液の流入、
ｄ）固定化抗体からの抗原の解離を可能にするための、固体支持体表面上に抗原を含まない溶液の流入、
ｅ）工程ｃ）及びｄ）の間での、固体支持体表面に結合された抗原の時間依存的な量のモニタリング及び結合データの収集（それにおいて工程ｃ）及びｄ）を異なる濃度の抗原で少なくとも１回繰り返す）、及び
ｆ）式（ＩＩ）〜（ＸＩＩＩ）に基づく、抗原と固定化抗体の間での相互作用についての所定のモデルに、ｅ）で得られた結合データを適合することによる動態学的及び／又は熱力学的パラメーターの計算
を含むことを特徴とする。
【００２２】
一実施態様において、抗体の前記固定化は、種特異的な抗体捕捉分子による。
【００２３】
本発明の態様は、本発明の方法を用いて産生された抗体を含む医薬組成物である。
【００２４】
一実施態様において、動態スクリーニングにおける抗体の選択は、９５%を上回る複合体の安定性を有する抗体を選択することにより実施される。さらなる別の実施態様において、抗原シグナル応答は、抗原の分子量に基づき最適化される。
【００２５】
本発明の別の態様は、表面プラズモン共鳴による抗体の選択のための方法であって、それにおいて温度依存的な動態データが、遷移状態（ＴＳ）の熱力学的特性を計算するために作成され、抗体が熱力学的挙動に基づいて選択され、それにより、温度依存的な動態データの前記作成は、表面プラズモン共鳴の測定及び抗体濃度１０７nMでは１７℃、７８nMでは２１℃、７０nMでは２５℃、６４nMでは２９℃、５８nMでは３３℃、及び５３nMでは３７℃で実施された熱力学的スクリーニングを用いた前記抗体の熱力学的特性の計算に基づく。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、抗原に対する抗体結合の選択のための方法を報告し、その温度依存的な動態データは、遷移状態（ＴＳ）の熱力学的特性を計算するために作成され、抗体は、熱力学的挙動に基づいて選択されることを特徴とする。
【００２７】
表面プラズモン共鳴ベースの動態学的方法は、従来の熱量測定アッセイに優るいくつかの利点：
−  ハイスループットプロセッシングが可能である、
−  低いサンプル消費、
−  結合力の代わりに親和性の測定、及び
−  粗細胞上清又は複合体培養混合物の使用
を有することが見出されている。
【００２８】
表面プラズモンバイオセンサー表面は親和性マトリクスであり、それは、例えば、細胞培養上清から抗体を捕捉するために使用する。このように、粗細胞上清及び複合体混合物をサンプルとして使用することができる。相互作用パートナーの１つがセンサー表面上に固定化され、第２の化合物が流動システム中に注入されるため、平衡及び遷移状態の熱力学の測定が可能になる。なぜなら、ＦＩＡ（フローインジェクション分析）システムでは複合体の会合及び解離段階を別々にモニターすることができるからである。この技術を用いて、以下の熱力学的パラメーター
−  自由標準結合エンタルピー  ΔＧ°、
−  標準結合エンタルピー  ΔＨ°、
−  標準結合エントロピー  ΔＳ°、
及び以下の遷移状態パラメーター
−  自由標準会合エンタルピーΔＧ°‡ａｓｓ、
−  標準会合エンタルピーΔＨ°‡ａｓｓ、
−  標準会合エントロピーΔＳ°‡ａｓｓ、
−  活性化エネルギーＥａａｓｓ、
−  自由標準解離エネルギーΔＧ°‡ｄｉｓｓ、
−  標準解離エンタルピーΔＨ°‡ｄｉｓｓ、
−  標準解離エントロピーΔＳ°‡ｄｉｓｓ、及び
−  解離エネルギーＥａｄｉｓｓの計算が可能である。非線形のファントホッフ式を使用する場合において、ΔＣｐ値を決定する。
【００２９】
本発明の一態様は、それらの熱力学的な特徴に基づく抗体の選択のための方法である。
【００３０】
一般的に、ＳＰＲベースの動態抗体スクリーニング（例、Steukers, M., et al., J. Immunol. Methods 310(1-2) (2006) 126-35; Rich, R. L., et al., Anal. Biochem. 361(1) (2007) 1-6を参照のこと）の後により高分解能の熱力学的ＳＰＲ分析の第２工程が続く。
【００３１】
本発明の方法を用いて、抗体を選択することができ、それらは高温度で少なくとも一定の又は増加する親和性、即ち、高温度で少なくとも一定の又は増加する抗原複合体の安定性を有する。抗原複合体の安定性は、抗体スクリーニングプロセスにおける主要な選択基準である。初代細胞培養（２５℃又は３７℃で抗原と高安定な複合体を形成する抗体をそれぞれ産生する）だけを選択する。
【００３２】
抗体産生細胞の培養物を産生し、一実施態様において、ハイスループット分析に供し、それにおいて、遷移状態（ＴＳ）の熱力学的特性を計算するために、温度依存的な動態データを生成する。本発明の方法に従った抗体の選択は、その熱力学的挙動に基づいて行われる。
【００３３】
この態様の一実施態様において、選択された抗体は、抗原複合体の会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］の温度依存的増加及び一定又は減少した抗原複合体の解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］により特徴付けられる。そのような抗体は、典型的には、エンタルピー促進性のΔＨ°‡ａｓｓ抗原複合体の会合段階及び負の結合エントロピーΔＳ°‡ａｓｓ（本願において「エントロピー負荷」を表わす）により特徴付けられる。本発明の方法を用いて選択された抗体は、抗原相互作用機構により特徴付けられ、それは結合平衡における大きなエントロピー変化を示す。このエントロピーの寄与は、抗体−抗原複合体解離工程に由来し、それにおいて解離エントロピーΔＳ°‡ｄｉｓｓの大きな正の又は大きな負の変化が起こる。さらに、本発明の方法を用いて選択された抗体は、抗原解離段階から生じる特異な熱力学的性質を有することができる。そこでは解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］が、驚くべきことに、温度増加に伴い予想外に減少する。そのような抗体は、熱力学的パラメーター、例えばｉ）負の又はほぼゼロ解離活性化エネルギーＥａｄｉｓｓ［kJ/mol］、ｉｉ）負の解離エンタルピーΔＨ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］、及びｉｉｉ）大きな負の解離エントロピーΔＳ°‡ｄｉｓｓ［kJ/mol］を示す解離段階などにより特徴付けられる。これは、この効果の完全に理論上の処理であることを指摘しなければならない。
【００３４】
このように、本発明の方法によって、熱力学的パラメーター（選択された抗体と抗原との相互作用の様式についての基礎を提供する。即ち、抗体が抗原の体構造変化を誘導する、又は、抗体がそれ自体で立体構造変化を受ける）に基づき、多数の高親和性抗体からの抗体の選択が可能になる。このように、本方法は、高い抗原複合体の安定性を有する抗体を産生する細胞の選択のために有用である。
【００３５】
一実施態様において、本発明の方法は、動態スクリーニング工程及び熱力学的スクリーニング工程を含む。動態スクリーニングのために、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ（ＢＬ）参照ポイントを抗原注入の終了直前に設定し、Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ（ＳＬ）参照ポイントを複合体解離段階の終了直前に設定する。一実施態様において、ＢＬ及びＳＬデータを、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ参照ポイントの応答単位（ＲＵ）での値を示すＸ軸及びＲＵでのＳｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ参照ポイントについての値を示すＹ軸のＸ−Ｙプロットによりグラフ化している（例示的なプロットについては、図１を参照のこと）。追加で、抗原−複合体−安定性をＢＬ及びＳＬデータに基づく式（Ｉ）：
抗原−複合体−安定性＝（１−［ＢＬ（ＲＵ）−ＳＬ（ＲＵ）／ＢＬ（ＲＵ）］）（Ｉ）
に従って計算することができる。
【００３６】
別の実施態様において、ＢＬ及び抗原−複合体−安定性データを、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ参照ポイントの応答単位（ＲＵ）での値を示すＸ軸及び複合体の安定性についてのパーセンテージでの値を示すＹ軸のＸ−Ｙプロットによりグラフ化している（例示的なプロットについては、図２を参照のこと）。一実施態様において、動態スクリーニング工程を２５℃で実施する。別の実施態様において、動態スクリーニングを３７℃で実施する。別の実施態様において、動態スクリーニングを１３℃〜４２℃の間の一組の２つ以上の異なる温度で実施する。
【００３７】
熱力学的スクリーニングの前に、単一細胞の寄託クローンを、一実施態様において、１００mlスピナー培養フラスコ中でＲＰＭＩ  １６４０培地を使用して培養する。別の実施態様において、抗体を、熱力学的スクリーニングの前にProtein A Sepharose（商標）カラムクロマトグラフィーにより上清から精製する。一実施態様において、システムバッファーは熱力学的スクリーニング用のＨＢＳ−ＥＰである。別の実施態様において、サンプルバッファーに１mg/mlのカルボキシメチルデキストランを添加し、非特異的なセンサーマトリクス効果を低下させる。
【００３８】
本発明の方法は、例として抗ヒトＰＴＨ抗体の分析を使用して、以下において記載される。この例は、本発明の方法を制限するものとして解釈してはならず、それは、実際には、本発明の方法の教示を例示するために提示される。本願の範囲を特許請求の範囲において示す。
【００３９】
第１の工程において、ハイブリドーマ上清の動態スクリーニングを実施した。いくつかの免疫化及び融合操作による５４９の初代ハイブリドーマ培養液からのＢｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅデータ及びＳｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅデータを、図１に図解する。十分な抗原応答（ＢＬ）及び遅い抗原複合体解離（ＳＬ）に基づいてハイブリドーマ細胞を、さらなるスクリーニング工程のために選択した。例えば、１２３、１１９、４９９、１３３、及び２９５と番号付けられた細胞を続く処理に使用し（図１の丸を参照のこと）、１８９、２６３、及び３４１と番号付けられた細胞は、不十分な複合体の安定性のため処理に用いなかった（図１の枠を参照のこと）。
【００４０】
高い抗原応答及び高い複合体の安定性を有する抗体の同定を容易にするために、結果として得られる複合体の安定性（［%］）を結合遅延応答シグナル上にプロットしたダイアグラムを使用することができる（例、図２を参照のこと）。一実施態様において、動態スクリーニングにおける抗体の選択のために、複合体の安定性９５%以上の高い抗原複合体の安定性結合剤を選択した。
【００４１】
ＳＰＲベースの測定を使用した大半の論文では、センサー表面提示技術として抗体捕捉システムを使用しない。通常、抗体又はそのフラグメントを、センサー上に共有結合的に固定化する。この技術は、ハイスループットフォーマットでは使用することができない。なぜなら、表面が多目的の抗体提示に適さず、しかし、それは、技術的に、リガンドと共に固定化されるセンサーの数により制限されるからである。
【００４２】
熱力学的測定のための捕捉システムを使用した場合、抗体捕捉レベルは、動態の温度感受性に起因して変動する（図１５を参照のこと）。熱力学のための抗体捕捉システムを使用するために、均一な温度非依存的な抗体捕捉レベルを保証することが絶対的に必要である。
【００４３】
低温での熱力学的測定について２つの主な問題がある。第１に、抗体捕捉システムの動態は、低温で分析のために十分な二次抗体を捕捉するには遅すぎる。第２に、抗原−抗体相互作用の動態も減速する。動態は、４℃及び１１℃での遅い動態に起因してアッセイ分解能が大きく減少する。平衡は、全温度範囲において達成することはできない。Ｒｍａｘ値は、その温度勾配において小さく、不均一である。温度増加に伴い、捕捉されたｍＡｂの量は、二次抗体のより速い会合速度に起因して絶えず増加する。抗原動態も増加し、抗原Ｒｍａｘ値が温度増加に伴い増加する。平衡に達しないため、これらの推定Ｒｍａｘ値にはかなり誤差が多い。不均一なセンサー性能が、熱力学的な計算での高い誤差の原因となる。計算したパラメーターの９５%有意性を達成することができない。
【００４４】
従って、実験において使用する温度勾配ならびにセンサー表面の調製を最適化する必要がある。センサー性能は、主に、抗体捕捉システムの温度依存的な滴定により、及び、最適化された温度勾配及び適応された注入時間を使用し（完全実行においてＲｍａｘ値が一定になるように）、最適化されることが見出されている。結果を図１５で比較する。Ｒｍａｘ平均は３５ＲＵ＋／−３ＲＵである。平衡には温度＞３０℃で達した。ここで使用される最低温度は１５℃である。表１では、平衡（線形のファントホッフ）、会合段階（アイリング及びアレニウス）、及び解離段階（アイリング及びアレニウス）についての熱力学的パラメーターの計算を、従来のアッセイ対最適化アッセイを使用して比較している。
【００４５】
【表１】
0005634996.tif 000002
【００４６】
列「最適化されていない」のデータが高い誤差（ＳＥ）を示しているのに対し、「最適化された」データはずっと低い誤差を示す。「最適化されていない」アッセイの全てのＲ２値は、９５%未満の有意性であるのに対し、最適化されたアッセイはＲ２＞９５%を示す。
【００４７】
焦点はΔＳ°‡ａｓｓ値にあり、そこでは非最適化システムが５５%の誤差を示すのに対し、最適化アッセイはわずか５%の誤差を示す。
【００４８】
捕捉動態の適切な温度範囲、会合時間、及び滴定（「温度滴定」）は、ハイスループットフォーマットにおいて熱力学的測定を正常に実現するために重要なパラメーターである。これらのパラメーターは、実証可能な誤差でＳＰＲベースの抗体抗原相互作用を測定するために最適化された。
【００４９】
熱力学的スクリーニングを実施するために、適切な温度依存的な二次抗体複合体の安定性に基づく種特異的な捕捉システムが確立しなければならなかった。従って、バイオセンサーを、最適化手順を使用することにより較正し、それは本発明の第２の態様である。この手順を用いて、ハイスループットフォーマットにおいて変動するエピトープ特異性を伴うマウス抗ＰＴＨ  ＩｇＧ抗体の結合特徴を決定することが可能であった。熱力学的スクリーニングは、温度依存的な一組のデータを提供する（図３を参照のこと）。低温度では、より少ない反応が観察された。なぜなら、捕捉システムの会合速度が低下するからである（実施例５、表２を参照のこと）。高温度では、会合速度が増加し、一実施態様において、過剰な抗体を捕捉しないために、問題となっている抗体の濃度及び／又は注入時間を低下しなければならなかった。一実施態様において、抗原シグナル応答は、抗原の分子量に基づいて最適化される。例えば、ＰＴＨ分子量（９．４kDa）に応じて、Ｒｍａｘでの抗原シグナル応答が最適化され、２５ＲＵを超えなかった。
【００５０】
従って、熱力学的特性に基づく抗体の選択のための方法の一実施態様において、熱力学的スクリーニング工程は、（二次）抗体濃度１０７nMでは１７℃、７８nMでは２１℃、７０nMでは２５℃、６４nMでは２９℃、５８nMでは３３℃、及び５３nMでは３７℃で実施される。抗ＰＴＨ抗体について、ハイブリドーマ上清を使用し、センサー表面上で一定の抗体反応レベル３２０ＲＵをとらえ、それにより３２０ＲＵ抗体は、Ｒｍａｘで２０ＲＵでの全長９．４kDaのＰＴＨ分析物を捕捉した。本発明の方法の別の実施態様において、Ｒｍａｘ値は、１３℃〜３７℃までの温度範囲で、抗原の重量に基づく、表面プラズモン共鳴チップに適用される溶液中での抗体濃度の最適化により一定に保たれる。
【００５１】
熱力学的パラメーターを計算するために、可能な限り正確に温度依存的なＫＤを測定することが不可欠であることが見い出されている。また、驚くべきことに、算出された熱力学的パラメーターの誤差は、包括的な、即ち、一定した、ラングミュアモデルに従ったＫＤ評価のためのＲｍａｘ値を計算するために複合体会合の間での分析物−リガンド飽和が達成される場合、劇的に低下させることができることが見出されている。さらに、温度１３℃未満で、捕捉システムの会合動態が十分な抗体反応のために遅すぎることが見出されている。１３℃未満及び３７℃超で、抗体の抗原結合動態の測定によって、ファントホッフ式、アイリング及びアレニウスの式に従った非線形化データが提供される。
【００５２】
一実施態様において、熱力学的スクリーニングを温度１３℃又は１７℃と３７℃の間で実施する。この温度範囲において、ファントホッフ式の線形形態に従った熱力学的平衡データの単純計算ならびに線形のアイリング及び線形のアレニウスの式に従った遷移状態の熱力学の単純計算が可能であることが見出されている（Wear, M. A., et al., Anal. Biochem. 359(2) (2006) 285-7；図５も参照のこと）。一実施態様において、全ての測定は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を実証可能にするために同じ条件下で実施される。
【００５３】
計算のために、以下
ａ）ファントホッフ計算：
（ＩＩ）ΔＧ°  ＝  ΔＨ°  −  Ｔ＊ΔＳ°
（ＩＩＩ）ΔＧ°  ＝  −  Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ
（ＩＶ）ｌｎＫＤ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°／Ｒ）／傾き  −  （ΔＳ°／Ｒ）／切片
（Ｖ）Ｒ＊Ｔ＊ｌｎＫＤ  ＝  ΔＨ°Ｔ０  −  Ｔ＊ΔＳ°Ｔ０＋ΔＣ°ｐ（Ｔ−Ｔ０）−Ｔ＊ΔＣｐ°  ｌｎ（Ｔ／Ｔ０）
ｂ）アイリング会合段階：
（ＶＩ）ｋａ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＶＩＩ）ｌｎｋａ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡＊Ｒ  ＋  ｌｎｋｂ／ｈ）／切片
（ＶＩＩＩ）ｋａ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＩＸ）ｌｎｋａ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
ｃ）アイリング解離段階：
（Ｘ）ｋｄ  ＝  （ｋｂ＊Ｔ／ｈ）＊ｅ（−ΔＧ°‡／Ｒ＊Ｔ）
（ＸＩ）ｌｎｋｄ／Ｔ  ＝  −１／Ｔ  ＊  （ΔＨ°‡／Ｒ）／傾き  ＋  （ΔＳ°‡／Ｒ  ＋  ｌｎｋＢ／ｈ）／切片
（ＸＩＩ）ｋｄ  ＝  Ａ＊ｅ−Ｅａ／Ｒ＊Ｔ
（ＸＩＩＩ）ｌｎｋｄ  ＝  ｌｎＡ／切片  −  （１／Ｔ＊Ｅａ／Ｒ）／傾き
ΔＨ°  −  標準結合エンタルピー、
ΔＳ°  −  標準結合エントロピー、
ΔＧ°  −  自由標準結合エンタルピー、
Ｔ＊ΔＳ°  −  エントロピー時間、
ΔＨ°‡ａｓｓ  −  標準会合結合エンタルピー、
ΔＳ°‡ａｓｓ  −  標準会合結合エントロピー、
ΔＧ°‡ａｓｓ  −  標準会合自由結合エンタルピー、
Ｅａ  ａｓｓ  −  会合についてのアレニウスパラメーター、
ΔＨ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離結合エンタルピー、
ΔＳ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離結合エントロピー、
ΔＧ°‡ｄｉｓｓ  −  標準解離自由結合エンタルピー、
Ｅａｄｉｓｓ  −  解離についてのアレニウスパラメーター、
ｋＤ  −  親和性定数、
ｋａ  −  会合速度定数、
ｋｂ  −  ボルツマン定数＝（１．３８０６５０３  ×  １０−２３m2kgs-2K-1）、
ｋｄ  −  解離速度定数、
ｈ  −  プランク定数、
Ｃｐ−  モル熱容量
の式が使用されている。
【００５４】
驚くべきことに、２５℃周辺の対称的な温度範囲を使用し、＋４℃の工程において（一実施態様において、１３℃、１７℃、２１℃、２５℃、２９℃、３３℃、３７℃の工程において）、絶対誤差ΔＨ°、ΔＨ°‡ａｓｓ、ΔＨ°‡ｄｉｓｓ及びΔＳ°、ΔＳ°‡ａｓｓ、ΔＳ°‡ｄｉｓｓを低下させることが可能であることが見出されている（Zhukov, A., et al., J. Mol. Recognit. 20(5) (2007) 379-385）。例えば、表２の値を参照のこと。
【００５５】
【表２】
0005634996.tif 000003
【００５６】
自由結合エンタルピーΔＧ°の温度依存性を、１３℃〜３７℃の範囲における各温度について、式ΔＧ°  ＝  −  Ｒ＊Ｔ＊ｌｎ  ＫＤを用いて計算する。値が一定である場合、ファントホッフ式の線形形態が使用される。ΔＧ°が変化する場合、非線形形態が好ましい。
【００５７】
異なる抗ＰＴＨ抗体の異なる特徴が、ダイアグラムから見ることができ、以下のパラグラフにおいて説明される：
【００５８】
ａ）図４ａ）に描写する抗ＰＴＨ抗体Ｍ  Ｄ１．１は、高い親和性及び１７℃でのナノモル以下の親和性から３７℃でのナノモル親和性までの典型的な温度誘導性の親和性減少（ＫＤ）を示す。これは、主に、高温度での減少する抗原複合体の安定性に起因する。解離速度は、複合体の安定性における２桁の減少に及ぶ。会合速度定数及び解離速度定数の両方が増加し、即ち、会合及びまた解離が加速し、全体的に低い結合親和性がもたらされる。図７ａ）において、抗ＰＴＨ抗体Ｍ  Ｄ１．１の会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］、解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］、及び温度［℃］がプロットされている。抗体は熱力学的に規則正しく振舞う。会合速度定数及び解離速度定数の両方が、温度増加に伴い増加する。親和性を、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤの商として計算する。結果は、指数関数的に減少する親和性ＫＤ［Ｍ］である。グラフの傾きは負である。この抗体は、本発明の方法を用いて選択されないであろう。
【００５９】
ｂ）図４ｂ）に描写する抗ＰＴＨ抗体Ｍ  ９．３．１は、温度増加に伴いわずかな親和性減少（ＫＤ）を示し、それは同じ桁で一定する。会合速度定数ｋａが増加し、大きく増加した解離速度定数ｋｄはＫＤにそれほど影響を及ぼすことはできない。抗体Ｍ  ９．３．１はナノモル以下の親和性を一方で有するが、しかし、それは高温度で抗原−抗体−複合体安定性が不十分である。この抗体は、本発明の方法を用いて選択されない抗体についての典型的な例である。図７ｂ）において、抗体Ｍ  ９．３．１についての会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］、解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］、及び温度［℃］が示されている。抗体は熱力学的に規則正しく振舞う、それは、会合速度定数及び解離速度定数の両方が、温度増加に伴い増加することを意味する。親和性を、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤの商として計算する。結果は、指数関数的に減少する親和性ＫＤ［Ｍ］である。この抗体は、本発明の方法を用いて選択されないであろう。
【００６０】
ｃ）図６ａ）に描写する抗ＰＴＨ抗体Ｍ  ９．１０．２０は、温度増加に伴う会合速度定数ｋａの増加、即ち、会合速度の増加を示す。会合速度定数が２桁に及ぶのに対し、解離速度定数は１桁内にとどまる。全範囲の動態検出力は、最終的に、３７℃前では達しない。解離速度定数ｋｄは中程度にだけ増加するため、抗体Ｍ  ９．１０．２０は、本発明の方法を用いて選択されうる抗体についての例である。抗体は３７℃で高い複合体の安定性を提供する。図８ａ）において、抗体Ｍ  ９．１０．２０の会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］、解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］、及び温度［℃］がプロットされている。抗体は熱力学的に規則正しく振舞うが、しかし、親和性は１３℃〜２９℃の間隔において一定に保たれており、２９℃〜３７℃の間隔においてわずかにだけ減少する。解離速度は高温度でわずかに増加するが、この抗体は、しかしながら、３７℃で依然として高い抗原複合体の安定性を示し、従って、本発明の方法を用いて得られるポジティブスクリーニングの結果である。
【００６１】
ｄ）図６ｂ）に描写する抗ＰＴＨ抗体Ｍ  １Ｆ８は、高温度で極めて高い抗原−抗体−複合体の安定性（ｋｄ）に起因する温度増加に伴う親和性−増加（減少ＫＤ）を示す。会合速度定数ｋａが増加し、解離速度定数ｋｄが減少する、即ち、減速するため、高温での増加した親和性を決定することができる。抗体は、１７℃でＫＤ＝１．７nM及び３７℃でＫＤ＝０．４nMを有する。解離速度定数ｋｄは減少するため、抗ＰＴＨ抗体Ｍ  １Ｆ８は、本発明の方法のポジティブなスクリーニング結果についての例である。この抗体は、３７℃で最も高い抗原−抗体−複合体の安定性を提供する。図８ｂ）において、抗体Ｍ  １Ｆ８の会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］、解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］、及び温度［℃］がプロットされている。この抗体は特異な熱力学的性質を示す。会合速度定数は温度増加に伴い増加するが、しかし、抗体Ｍ  ９．３．１、Ｍ  Ｄ１．１、及びＭ  ９．１０．２０とは対照的に、解離速度は温度増加に伴い低下する。これは、温度増加に伴う親和性増加をもたらす。曲線の傾きは正になる。この抗体は、本発明の方法を用いて得られる典型的なポジティブなスクリーニング結果である。
【００６２】
熱力学的スクリーニングにおいて得られるデータは、図９ａ）に描写する両対数プロットにおいて可視化することができ、それにおいて、動態速度定数（ｋｏｎ）ｋａ［１／Ｍｓ］及び（ｋｏｆｆ）ｋｄ［１／ｓ］をそれぞれＸ軸及びＹ軸に表わす。等軸線（実線）は同じ親和性の面積を示し、それはダイアグラムの右側にボールド体でプロットされる。ｋｄ／ｋａの商は平衡定数ＫＤ［Ｍ］を提供するため、各データポイントはそれぞれの温度で親和性と等価である。上の矢印は、それぞれ１３℃又は１７℃で開始し、３７℃で終了する＋４℃の工程における温度勾配を表す。
【００６３】
各抗体の温度依存的な親和性傾向が、線により連結されている。温度依存的な親和性スクリーンは、３４個の描写した抗体から、わずか１つの抗体が、探された温度依存的な挙動を示すことを示す（黒ひし形）。そのような抗体は、本発明の方法を用いて選択される。３個の例示的な親和性傾向を図９ｂ）に示す。この速度マップにおいて、３個の例の抗体の＋４℃の工程におけるＫＤを示しており、その１つは温度増加に伴い親和性が増加する抗体であり、１つは温度増加に伴って親和性が一定の抗体であり、１は温度増加に伴い親和性が減少する抗体である。大半の抗体は、抗原複合体の安定性の欠如に起因する親和性の減少を示す（図９ｂ）において四角により表示するものなど）。親和性は、ｋｏｎ及びｋｏｆｆが増加する場合（丸）、一定のままである。このように、本発明の方法の一実施態様において、温度増加に伴うｋｏｎ及びｋｏｆｆにおける増加を示す抗体が選択される。一実施態様において、ｋｏｎは増加し、ｋｏｆｆは減少し、親和性が増加し、複合体は高温で安定性を得る（黒丸）。このように、本方法の一実施態様において、１７℃〜３７℃の温度範囲での温度増加に伴うｋｏｎの増加及びｋｏｆｆの減少を示す抗体が選択される。温度安定性の抗体抗原相互作用のハイスループットスクリーニングは、記載されるハイスループット方法の中心となる。本発明の方法の一実施態様において、１７℃〜３７℃の温度範囲において抗原に対して増加する又は一定の親和性を有する抗体が選択される。本発明の方法において、これらのような抗体が選択される。本発明の方法の別の実施態様において、１７℃〜３７℃の温度範囲において親和性が増加する抗体が選択される。温度依存的な動態を使用し、増強した抗原複合体の安定性を有する抗体を選択する。
【００６４】
図９に示す温度依存的な動態のモニタリングは、本発明の方法を用いた温度非依存的な又は温度増加する抗原複合体の安定性を有する抗体の選択のための基礎である。
【００６５】
既に上で概説した通り、抗体Ｍ  ９．１０．２０及びＭ  １Ｆ８が、温度依存的な複合体の安定性を示し、本発明の方法を用いて選択されうる。図１０ａ）において、抗体の３７℃での親和性（ＫＤ）を２５℃での親和性の上にプロットする。そのわずか１つの抗体（Ｎｏ．  ８：抗ＰＴＨ抗体Ｍ  １Ｆ８）が、温度増加に伴う親和性の増加を示す。他の抗体の親和性は一定のままであるか又は減少する。図１０ｂ）を見ると、親和性指標が、なぜ記載する方法のわずか１つの項目であるのかが明白になる。図１０ｂ）において、１３の抗ＰＴＨ抗体の２つが、十分な抗原複合体の安定性を示す（Ｎｒ．８：抗ＰＴＨ抗体Ｍ  １Ｆ８及びＮｒ．１３：抗ＰＴＨ抗体Ｍ  ９．１０．２０）。これらの抗体は、本発明の方法を用いて選択されうる。このように、抗体Ｍ  ９．１０．２０は、親和性指標に注目しただけでは選択されなかったであろう。なぜなら、それは、図１０ａ）の左側の親和性プロットの相関通路に集中するからである。
【００６６】
図５左側において、抗ＰＴＨ抗体Ｍ  Ｄ１．１についての熱力学的計算の例示的なデータプロットを示す。図５の右側では、対応する式を示す。例としての抗体Ｍ  Ｄ１．１は規則正しく振舞い、それは、全ての線形化の負の傾きにより検証される。
【００６７】
表２は、抗体Ｍ  ９．１０．２０は、高い結合エンタルピー（ΔＨ°  ＝  −１００kJ/mol）を有するエンタルピー結合剤を示している。大きな負のエントロピー値（ΔＳ°  ＝  −１８０J/mol*K）が、解離段階において生じる（ΔＳ°‡ｄｉｓｓ  ＝  １６０J/K*mol）。抗体Ｍ  １Ｆ８は、エントロピー力により平衡に促進される（ΔＨ°  ＝  ５３  kJ/mol、ΔＳ°  ＝  ３５０J/mol*K）。抗体Ｍ  １Ｆ８は温度増加に伴いその親和性が増加するため、パラメーターΔＨ°‡ｄｉｓｓ、ΔＳ°‡ｄｉｓｓ、及びＥａｄｉｓｓが負の値になる（表２、右欄、最後５列を参照のこと）。実際に、それは、Ｍ１Ｆ８／ＰＴＨ複合体を冷却し、解離しなければならないことを意味する。これは、特異な熱力学的性質として見ることができる。従って、解離段階からの抗体Ｍ  １Ｆ８についての値は、対応する式の形式的な正確さだけと関係している。しかしながら、両方の抗体が同じ自由結合エンタルピー（ΔＧ°  ＝  −５１kJ/mol）を示す。平衡における大きなエントロピー変化にもかかわらず、両方の抗体がエンタルピー会合段階及び負のエントロピー負荷を示す（Ｍ  ９．１０．２０  ΔＳ°‡ａｓｓ  ＝  −１４J/K*mol、Ｍ  １Ｆ８  ΔＳ°‡ａｓｓ  ＝  −３５J/K*mol）。一実施態様において、エンタルピー会合段階及び負のエントロピー負荷に基づいて抗体が選択される。両方の場合において、相互作用、抗体−抗原の律速段階は解離段階である（Ｍ  ９．１０．２０  ΔＧ°‡ｄｉｓｓ  ＝  １００kJ/mol；  Ｍ  １Ｆ８  ΔＧ°‡ｄｉｓｓ  ＝  ９４kJ/mol）。これらの値はΔＧ°‡ａｓｓ値の２倍以上であり、動態スクリーニング及び抗原複合体の安定性に従った選択を反映する。従って、本方法の一実施態様において、スクリーニングの目的は、少なくとも２．３以上のΔＧ°‡ｄｉｓｓ  ／ΔＧ°‡ａｓｓ比に基づいて抗体を選択することである。本発明の方法の一実施態様において、抗体は、律速解離段階に基づいて又は８０kJ/mol以上のΔＧ°‡ｄｉｓｓに基づいて選択される。
【００６８】
図１１において、１２の例示的な抗ＰＴＨ抗体の平衡熱力学的パラメーター（ファントホッフ式（ＩＩＩ）に従って計算される）を示す。抗体Ｍ  １Ｆ８（左）及びＭ  ９．１０．２０（右）は熱力学的平衡パラメーターを示し、それらによって本発明の方法に従ってこれらの抗体が選択される。図１１において例示された抗体の内、抗体Ｍ  １Ｆ８及びＭ  ９．１０．２０は高い−ＴΔＳ°値を有する。抗原相互作用に対して抗体Ｍ  １Ｆ８は最も大きな正のエントロピー寄与を示し、抗体Ｍ  ９．１０．１２は最も大きな負のエントロピー寄与を示す。このように、本発明の方法の一実施態様において、抗体は、ファントホッフ式（ＩＩＩ）に従って、ａ）−８０kJ/mol以下あるいはｂ）＋４０kJ/mol以上の−ＴΔＳ°値に基づいて選択される。図１１の番号２−１０を持つ抗体は、この方法により選択されなかったであろう。
【００６９】
本発明の方法に従い、エントロピー寄与の原因は解明されなくてはならない。これは、遷移状態の熱力学的パラメーターの計算により行われる。時間分解された遷移状態の熱力学ひいては熱力学的な促進力の原因を、温度非依存的な結合特性を有する抗体を選択するために、解明しなければならないことが見い出されている。これは、結合エントロピーΔＳ°‡ａｓｓの測定による潜在的な混在抗原結合傾向のリスクを評価するために、特に重要である。例えば、エントロピー促進性の結合平衡を示すにもかかわらず、抗体Ｍ  １Ｆ８はエンタルピー促進性の会合段階により特徴付けられる（図１２及び表２を参照のこと）。抗体Ｍ  ９．１０．２０もまた、エンタルピー促進性の会合段階により特徴付けられる（図１２及び表２を参照のこと）。図１３に既に示した通り、抗体Ｍ  １Ｆ８及びＭ  ９．１０．２０の両方が負のエントロピー負荷ΔＳ°‡ａｓｓを示す。このエントロピー負荷は、対応する抗体がエンタルピー的に、即ち、高特異的な様式で抗原に会合することを表わすことが見出されている。エンタルピー促進性の会合段階は、抗原との非共有結合的な相互作用、例えばＨ結合、イオン相互作用、ファンデルワールス相互作用などの形成により特徴付けられるが、しかし、アミノ酸側鎖の運動又は分子の周囲の水和物層の集中的な再構成に起因するものではない。負のエントロピー負荷は、システムの立体構造的な自由度が低下することを示す。抗原結合時、免疫複合体は、構造調整に起因して、又は、水分子の規則的な再配置に起因して、複合体の形成前よりも強固になる。この特徴は、抗体の非常に低い交差反応性又は交差反応性が無い場合において見ることができる。このように、本発明の方法の一実施態様は、低い又は無の交差反応性を伴うエンタルピー促進性の会合段階に基づく抗体の選択である。結合平衡に対するエントロピー寄与は、会合段階から生じないため、それらは解離段階に由来しているはずである（図１４を参照のこと）。抗体Ｍ  １Ｆ８及びＭ  ９．１０．２０の両方が、抗原解離段階から生じる大きなエントロピー変化ΔＳ°‡ｄｉｓｓを示す。このように、本発明の方法の一実施態様において、抗体を、解離段階に由来する大きなエントロピー変化に基づいて選択する。抗体Ｍ  １Ｆ８は特異な熱力学的性質を示し、負のエントロピー変化ΔＳ°‡ｄｉｓｓ  ＝  −３８０J/K*molにより特徴付けられる。抗体Ｍ  ９．１０．２０は大きな正のエントロピー変化ΔＳ°‡ｄｉｓｓ  ＝  ＋１６０J/K*molを示す。このように、本発明の方法の一実施態様において、抗体は、１００J/K*mol以上の絶対ΔＳ°‡ｄｉｓｓ値に基づいて選択される。一実施態様において、抗体は、１５０J/K*mol以上の絶対ΔＳ°‡ｄｉｓｓ値に基づいて選択される。一実施態様において、絶対ΔＳ°‡ｄｉｓｓ値は、１００J/K*mol〜１０００J/K*molの範囲にある。抗原会合段階の間での負の結合エントロピーΔＳ°‡ａｓｓ、エントロピー負荷は、速い複合体の会合速度及び低い活性化エネルギーＥａａｓｓ（高度に進化した成熟抗体について典型的である）と相関する（Thorpe, I. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(21) (2007) 8821-6）。このように、一実施態様において、本発明の方法に従い選択される抗体は、立体構造エピトープに結合する抗体で���る。
【００７０】
このように、本発明の方法を用いて、異なる種の同じ抗原又は密接に関連する抗原（例えばＩＬ−１ａ及びＩＬ−１ｂなど）のいずれかの異なる抗原に対する交差反応性を有する抗体を選択することも可能である。また、抗原において立体構造変化を誘導する抗体（例、触媒抗体として有用である）を選択することが可能である。
【００７１】
本発明の抗体を産生することができる。抗体の組換えの産生のための方法が、最先端技術において公知であり、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質発現を含み、続く抗体の単離及び通常は医薬的に許容可能な純度までの精製を伴う。宿主細胞における上記の抗体の発現のために、それぞれの軽鎖及び重鎖をコードする核酸を、標準方法により発現ベクターに挿入する。発現は、適切な原核宿主細胞又は真核宿主細胞（ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（Ｒ）細胞、酵母、又はＥ．  ｃｏｌｉ細胞）において実施され、そして抗体を細胞（溶解後の上清又は細胞）から回収する。抗体の組換え産生のための一般的方法が、最先端技術において周知であり、例えば、総説文献Makrides, S. C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880において記載されている。
【００７２】
本願において使用する「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体を産生するために操作することができる任意の種類の細胞系を表わす。一実施態様において、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞を宿主細胞として使用する。本明細書において使用する通り、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という表現は互換的に使用され、全てのそのような呼称は子孫を含む。このように、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という単語は、形質転換の数にかかわらず、初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。また、全ての子孫が、意図的な又は偶発性の突然変異に起因して、ＤＮＡ含量において正確に同一でなくてもよいことが理解される。最初の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。
【００７３】
ＮＳ０細胞における発現が、例えば、Barnes, L. M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L. M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270により記載されている。一過性発現が、例えば、Durocher, Y., et al., Nucl. Acids Res. 30 (2002) E9. Cloning of variable domains is described by Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87により記載されている。一過性発現系（ＨＥＫ  ２９３）が、Schlaeger, E. -J., and Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199により報告されている。
【００７４】
以下の実施例及び図を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲が添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に改変を施すことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】例示的な抗ＰＴＨ抗体のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ（ＢＬ）及びＳｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ（ＳＬ）データの図解。
【図２】５４９のハイブリドーマ初代培養のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ／複合安定性プロット：丸で囲んだデータスポットが、十分な抗原応答シグナル及び１００%の複合体安定性を示すのに対し、フレームで囲んだデータスポットは十分な抗原応答を示さない。
【図３】２５nM、５０nM、７５nM、及び１００  nMならびに温度増加での＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ抗体捕捉システムの分析物モノクローナル抗ＴＳＨ抗体に対する二次抗体反応。
【図４】ａ）抗体Ｍ  Ｄ１．１の温度依存的な抗体−ＰＴＨ相互作用の例示的な濃度依存的なセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）。動態を、ＨＢＳ−ＥＰ  ｐＨ  ７．４中で、２５℃で、３分間の会合時間、５分間の解離時間で測定し、ラングミュアに従い適合させた；ｂ）抗体Ｍ  ９．３．１の温度依存的な抗体−ＰＴＨ相互作用の例示的な濃度依存的なセンサーグラム。動態を、ＨＢＳ−ＥＰ  ｐＨ  ７．４中で、２５℃で、３分間の会合時間、５分間の解離時間で測定し、ラングミュア１．１．モデルに従い適合させた。
【図５】ファントホッフ、アイリング及びアレニウスの線形式に従った熱力学的パラメーターの計算。抗体Ｍ  Ｄ１．１について示した例示的なプロット。
【図６】ａ）抗体Ｍ  ９．１０．２０の温度依存的な抗体−ＰＴＨ相互作用の例示的な濃度依存的なセンサーグラム。動態を、ＨＢＳ−ＥＰ  ｐＨ  ７．４中で、２５℃で、３分間の会合時間、１５分間の解離時間で測定し、ラングミュアに従い適合させた；ｂ）抗体Ｍ  １Ｆ８の温度依存的な抗体−ＰＴＨ相互作用の例示的な濃度依存的なセンサーグラム。動態を、ＨＢＳ−ＥＰ  ｐＨ  ７．４中で、２５℃で、３分間の会合時間、５分間の解離時間で測定し、ラングミュア１．１．モデルに従い適合させた。
【図７】ａ）抗体Ｍ  Ｄ１．１のデータの三次元速度マップ；ｂ）抗体Ｍ  ９．３．１のデータの三次元速度マップ。
【図８】ａ）抗体Ｍ  ９．１０．２０のデータの三次元速度マップ；ｂ）抗体Ｍ  １Ｆ８のデータの三次元速度マップ。
【図９】ａ）３４個の例示的な抗体の温度依存的な特徴の両対数プロット；ｂ）３個の例示的な抗体の温度依存的な特徴の両対数プロット：黒丸  −  温度増加に伴い増加する親和性を有する抗体、白丸  −  温度増加に伴う一定の親和性を有する抗体、四角  −  温度増加に伴う減少する親和性を有する抗体。
【図１０】ａ）２５℃（Ｘ軸）及び３７℃（Ｙ軸）で親和性を示すＰＴＨスクリーニングからの１３個の抗ＰＴＨ抗体の親和性プロット；ｂ）ａ）２５℃（Ｘ軸）及び３７℃（Ｙ軸）と同じ抗体の解離速度定数プロット。
【図１１】ファントホッフに従って計算された１２個の例示的な抗ＰＴＨ抗体の平衡熱力学プロット。
【図１２】アイリング式に従って計算された、１２個の例示的な抗ＰＴＨ抗体の活性化エンタルピーΔＨ°‡ａｓｓの遷移状態の熱力学的プロット。
【図１３】アイリング式に従って計算された、活性化エントロピーΔＳ°‡ａｓｓ（エントロピー負荷）の遷移状態の熱力学的プロット。
【図１４】アイリング式に従って計算された、１３個の例示的な抗ＰＴＨ抗体の解離エントロピーΔＳ°‡ｄｉｓｓの遷移状態の熱力学的プロット。
【図１５】相互作用の温度及び濃度依存的な測定：ａ）温度勾配における不均一な捕捉動態に起因して、ＲＭＡＸ値が変動し、平衡が、異なるセンサーグラムの会合段階の間で任意の温度工程で達成されなかった；ｂ）適応されたｍＡｂ濃度及び長期の会合段階に起因して、ＲＭＡＸ値は均一であり、平衡が温度＞３５℃で達成された。
【００７６】
実施例１
マウスの免疫化
【００７７】
８〜１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、完全フロイトアジュバント中にＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）融合物として作製した１００μgのヒト組換えＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）誘導体を用いた腹腔内免疫化に供した。組換えＮ末端及びＣ末端ＰＴＨフラグメントならびに全長（１〜８４）ＰＴＨを抗原として使用した。ＰＴＨ誘導体をペプチド合成により合成した。
【００７８】
免疫化を４回実施した：最初の追加免疫、最初の追加免疫から６週後、１０週後、及び１４週後。２回目と３回目の免疫化を、不完全フロイトアジュバントを使用して行った。最終の追加免疫を、静脈内に、１００μgの抗原を使用して、ハイブリドーマ融合が起こる３日前に行った。ハイブリドーマ初代培養物の産生は、Kohler 及び Milstein(Kohler, G., et al., Nature 256(5517) (1975) 495-497)に従って行った。ハイブリドーマを限界希釈により９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中で単離し、そして製造者のマニュアルに従いＥＬＩＳＡ方法により抗原結合についてスクリーニングした。初代ハイブリドーマ細胞培養物は、ＥＬＩＳＡでの抗原結合時にポジティブな発色を示し、動態スクリーニングプロセスに移された。
【００７９】
実施例２
ＣＭ５センサーチップの調製
【００８０】
制御Software V.1.1を使用してBIAcore A100システムを以下の通りに準備した：BIAcore CM5センサー（シリーズＳ）をシステムに搭載し、製造者の推奨事項に従って流体力学的検討を行った。３０μg/mlのポリクローナルウサギＩｇＧ抗体（<IgGFCγM>R, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA）を、製造者の取扱説明書に従い、前濃縮バッファーとして１０mM酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５を使用し、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を介し、フローセル１、２、３、及び４におけるスポット１、２、４、及び５上に１０，０００ＲＵで固定化した。センサー表面を、最終的に、エタノールアミンを用いてブロックした。
【００８１】
実施例３
初代ハイブリドーマ培養上清の動態スクリーニング
【００８２】
実施例１に従い行なわれた異なるＰＴＨ免疫化操作によるハイブリドーマ培養上清を、以下に概説する通りに処理した。
【００８３】
実施例２に従って得られたセンサーチップのスポット２及び４を、参照として使用した（１−２、５−４）。センサー表面上で抗体を捕捉するために、ハイブリドーマ培養上清を、ランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ（１０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、１mM  ＥＤＴＡ、０．０５%  Ｐ２０、BIAcore）を用いて１：５に希釈し、そして３０μl/分で１分間注入した。続いて、それぞれの抗原を、３０μl/分で２分間の会合時間注入した。解離段階を５分間にわたりモニターした。最終的に、表面を、１００mMリン酸の２分間の注入により再生した。
【００８４】
センサーを、抗体の捕捉及び再生の反復サイクルによりプレコンディショニングした。モノクローナルマウス抗体ｍＡｂ＜ＴＳＨ＞Ｍ−１．２０  ＩｇＧ１ｋ（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）をＨＢＳ−ＥＰ中５０nMで３０μl/分で２分間にわたり繰り返し注入し、チップを、１００mMのＨ３ＰＯ４を使用し、３０μl/分で２分間の注入により再生した。
【００８５】
初代ハイブリドーマの選択のために、以下の手順を使用した：Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｌａｔｅ（ＢＬ）参照ポイントを、抗原注入の終了直前に設定した。Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｔｅ（ＳＬ）参照ポイントを、複合体の解離段階の終了直前に設定した。ＢＬ及びＳＬデータをグラフ化した（図１）。データを使用し、式（Ｉ）：
（Ｉ）  （１−［ＢＬ（ＲＵ）−ＳＬ（ＲＵ）／ＢＬ（ＲＵ）］
（図２を参照のこと）を使用して抗原複合体の安定性を計算した。例えば、丸で囲んだデータスポットが、十分な抗原応答シグナル及び１００%複合体の安定性を示すのに対し、フレームで囲んだデータスポットは十分な抗原応答を示さない。
【００８６】
このように、抗原応答シグナル及び複合体の安定性に従った上位１０%のハイブリドーマを選択している。
【００８７】
実施例４
ハイブリドーマクローニング及び抗体産生
【００８８】
抗ＰＴＨ抗体産生ハイブリドーマ初代培養物は、実施例３で選択され、制御ソフトウェアV4.1.2下でセルソーターFACSAria（Becton Dickinson）を使用してサブクローニングされた。沈着した単一クローンを、２４ウェルプレート中でさらなる増殖のために適した条件下でインキュベートし、続いて、製造者の取扱説明書に従ってＥＬＩＳＡ方法を使用して溶液中で抗体濃度を測定した後に、実施例５に従った熱力学的スクリーニングプロセスに移した。
【００８９】
実施例５
二次ハイブリドーマ培養上清の熱力学的スクリーニング
【００９０】
動態スクリーニング（高い抗体−抗原−複合体の安定性を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞が同定されている）に続き、分泌された抗体を、さらに、抗原−抗体複合体の熱安定性を決定するために、及び、熱力学的特性を計算するために、温度依存的な動態の決定を用いて、熱力学的スクリーニングにより特性付けした。
【００９１】
ＣＭ５センサーシリーズＳを、制御ソフトウェアV1.1.1下で駆動する、BIAcore T100システムに搭載し、０．１%  ＳＤＳ、５０mM  ＮａＯＨ、１０mM  ＨＣｌ、及び１００mM  Ｈ３ＰＯ４を含む混合物を１００μl/分で１分間注入することによりプレコンディショニングされた。
【００９２】
マウス由来のスクリーニング抗体の場合において、３０μg/mlのポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（<IgGFCγM>R, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA）を、製造者の取扱説明書に従い、前濃縮バッファーとして１０mM酢酸ナトリウムバッファーｐＨ４．５を使用し、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学を用いて、フローセル１、２、３、及び４上に６，０００ＲＵで固定化した。最終的に、センサー表面を、エタノールアミンを用いてブロックした。
【００９３】
参照抗体として、モノクローナルマウス抗ＴＳＨ抗体１．２０（ＩｇＧ１ｋ、マウス）を、上で準備した捕捉システム上で、異なる濃度で温度依存的に滴定し、システムの捕捉能力を決定した（図３を参照のこと）。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
モノクローナルマウス抗ＴＳＨ抗体１．２０のこれらの濃度値を、異なる温度で同様の二次抗体反応レベルを達成するために、ハイブリドーマ培養物からの抗体捕捉の計算のための参照として使用した。異なる温度での動態測定を２０μl/分で実施し、流速はそれぞれ３０μl/分、５０μl/分、１００μl/分であった。組換え体合成の全長ＰＴＨ  １−８４（９．４kDa）のサンプル注入をそれぞれ３０秒、９０秒、１８０秒で、又は、複合体会合段階の間にリガンド飽和又は結合平衡への移行を達成するために、他の適した注入回数で行った（図４ａを参照のこと）。解離速度を、最初に、３００秒まで、さらに１５分間モニターした（図４ｂを参照のこと）。ＰＴＨ注入を、少なくとも５つの濃度の異なる濃度工程で反復した。コントロールとして、１つの濃度工程を２回分析し、アッセイの再現性を制御した。フローセル１が参照としての役割を果たす。バッファー注入を抗原注入の代わりに使用し、参照を２つにし、バッファーシグナルサブトラクションによりデータを得た。捕捉システムを、１００μl/分で２分間注入することにより１００mM  Ｈ３ＰＯ４を使用して再生した。再生手順を最適化し、１３℃、１７℃、及び２１℃でも定量的な表面再生を保証した。これらの温度で、再生溶液を３回注入するのに対し、２５℃、２９℃、３３℃、及び３７℃で再生溶液を１回注入した。
【００９６】
得られたデータを、異なる温度での会合速度定数ｋａ［１／Ｍｓ］、解離速度定数ｋｄ［１／ｓ］、及び結果として得られる親和性定数ＫＤ［Ｍ］を計算するために、１：１二成分ラングミュア相互作用モデルに従って評価した。熱力学的平衡データを、線形形態のファントホッフ式に従って計算した。遷移状態の熱力学を、アイリング及びアレニウスの式に従い、例えば、BIAcore T100評価ソフトウェアV.1.1.1又はプログラムOrigin 7sri v. 7.0300を使用して計算した。
【００９７】
実施例６
均一なＲＭＡＸ値を調整する必要性についての例
【００９８】
BIAcore T100装置にCM5シリーズS BIAcoreセンサーを搭載し、６０００ＲＵの＜ＩｇＧＦＣγＭ＞Ｒ（Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., USA）を、各フローセル上で、製造者の取扱説明書に従って固定化した。非最適化実験では、４０nMの捕捉抗体を２０μl/分で、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（０．０５%  Ｐ２０）中で使用した。サンプルバッファーは、１mg/ml  ＣＭＤを添加したシステムバッファーである。
【００９９】
抗原を、６つの濃度工程１．２nM、４nM、１１nM、３３nM、１００nM、及び３００nMにおいて二次抗体の捕捉後に注入するのに対し、１１nMを二重コントロールとして使用し、０nMを参照として使用した。抗原を、１００μl/分で、２分間の会合及び５分間の解離で注入し、３０μl/分で１５分間のＨＢＳ−ＥＰ洗浄及び３μl/分で３分間の１０mMグリシンｐＨ  １．７を用いた再生が続く。濃度依存的な測定を４℃、１１℃、１８℃、２５℃、３２℃、及び４０℃で行った。
【０１００】
最適化したシステムを上に記載した通りに使用したが、しかし、例外は、捕捉すべき抗体を３分間の会合時間にわたり、異なる濃度工程（１５℃で１００nM、２０℃で８０nM、２５℃で６０nM、３０℃で５０nM、３５℃で４０nM、及び４０℃で４０nM）で注入することであった。
【０１０１】
最終的に、動態及び熱力学を、BIAcore評価ソフトウェアを使用して決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ）】
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【図４ｂ）】
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【図５】
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【図６ａ）】
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【図６ｂ）】
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【図７ａ）】
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【図７ｂ）】
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【図８ａ）】
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【図８ｂ）】
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【図９】
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【図１０ａ）】
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【図１０ｂ）】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ）】
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【図１５ｂ）】
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