(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＩＶ型コラーゲン又はフィブリンに対して特異的結合能を有する抗体又はその結合性断片、及び
ｂ）該抗体又はその結合性断片へ結合した抗腫瘍性部位
を含む複合体であって；
抗体又はその結合性断片と該抗腫瘍部位とがポリエチレングリコールリンカーを介して結合しており；且つ
該抗腫瘍性部位とポリエチレングリコールリンカーとが、該抗腫瘍性部位が腫瘍組織内において該複合体から徐放され得るように、エステル結合により結合している、複合体。
【請求項２】
ａ）の抗体又はその結合性断片が、フィブリンに対して特異的結合能を有する抗体又はその結合性断片である、請求項１記載の複合体。
【請求項３】
抗腫瘍性部位が抗腫瘍性化合物である、請求項１記載の複合体。
【請求項４】
抗腫瘍性部位が抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造である、請求項１記載の複合体。
【請求項５】
抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造が、抗腫瘍性化合物を含有するリポソーム又はミセルである、請求項４記載の複合体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の複合体を含む、腫瘍の治療剤。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項記載の複合体を含む、腫瘍血管形成阻害剤。
【請求項８】
腫瘍の治療において使用するための、請求項１〜５のいずれか１項記載の複合体。
【請求項９】
腫瘍血管の形成阻害において使用するための、請求項１〜５のいずれか１項記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍性化合物の腫瘍部位への送達のための、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質の使用に関する。具体的には、本発明は、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性部位（例、抗腫瘍性化合物、抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造）との複合体、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体の作製法が確立された１９７０年代後半からモノクローナル抗体に毒素や抗腫瘍性化合物などを付加して腫瘍部を選択的に攻撃するという「ミサイル療法」の研究が盛んになったが（特許文献１〜４）、その後一部のリンパ腫や白血病での認可を除き（非特許文献１、２）、肺癌、大腸癌、乳癌、胃癌など通常の固形癌でのミサイル療法の臨床的な有用性は証明されず今日まで至っている（非特許文献３〜１１）。腫瘍特異的抗原に対するモノクローナル抗体を使用したいわゆるミサイル療法の問題点として、
（１）モノクローナル抗体の適用は、特異的抗原が腫瘍細胞の膜表面に発現している腫瘍に限られること、
（２）モノクローナル抗体が、血中に遊離している抗原で中和されて肝心の腫瘍局所までデリバリーできない可能性があること、
（３）モノクローナル抗体を腫瘍局所へデリバリーできたとしても、腫瘍血管から漏出後、腫瘍血管から腫瘍細胞に到達するまでに間質が障壁となって肝心の腫瘍細胞のところまでにモノクローナル抗体が到達できない可能性があること、等が挙げられる。【０００３】
腫瘍の中でも特に、膵癌、スキルス胃癌、大腸癌、肺癌などの難治性癌は間質が豊富であることが知られている。間質に多く見られるコラーゲンは正常の生体にも存在するが、炎症を起こしている組織やそれに似通った組織系を有する腫瘍組織で発達している（非特許文献１２）。ＩＶ型コラーゲンは腫瘍血管の周囲に豊富であり、Ｉ型やＩＩＩ型コラーゲンは腫瘍細胞と腫瘍血管の間に増生している。その程度は腫瘍の種類により大きく異なるが、一般に薬剤が効きにくい難治性癌はコラーゲンに代表される間質が特に豊富である。特にマウスの腫瘍組織よりもヒトの腫瘍組織は間質が多いことが知られている。【０００４】
また、松村は、腫瘍の脈管学的特性として、腫瘍血管透過性の亢進が起きており、正常血管からは漏れにくい高分子物質も腫瘍の血管からは容易に漏出すること、また、血管新生に対してリンパ管新生に乏しいため、一旦腫瘍組織で血管から漏出した高分子物質はリンパ管にドレナージできずに長く腫瘍組織に留まるというＥＰＲ効果（enhanced permeation and retention effect）を見出している（非特許文献１３）。【０００５】
抗腫瘍性化合物ＳＮ−３８はＣＰＴ−１１というプロドラッグとして既に臨床応用されているが、低分子であるゆえに、正常組織と腫瘍組織とを区別して分布させることができない上、腫瘍に長く留まらせることもできない。従って、活性本体であるＳＮ−３８の時間依存性抗腫瘍効果を有するという特徴が生かされず、副作用が強く出るという問題が臨床上指摘されている（非特許文献１４〜１７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３９３４６号公報
【特許文献２】特表２００８−５０１０２９号公報
【特許文献３】特表２００７−５１２３２４号公報
【特許文献４】特表２００８−５２４２０２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bross PF et al. Approval summary: gemtuzumab ozogamicin in relapsed acute myeloid leukemia. Clin Cancer Res 2001: 7:1490-1496
【非特許文献２】Allen TM. Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapay. Nature Rev Cancer 2006: 2: 750-763
【非特許文献３】Omelyanenko V et al. HPMA copolymer-anticancer drug-OV-TL16 antibody conjugates. 1. influence of the method of synthesis on the binding affinity to OVCAR-3 ovarian carcinoma cells in vitro. J Drug Targeting 1996; 3: 357-73
【非特許文献４】Gilliland DG et al. Antibody-directed cytotoxic agents: use of monoclonalantibody to direct the action of toxin A chains to colorectal carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Aug;77(8):4539-43
【非特許文献５】Blythman HE et al. Immunotoxins: hybrid molecules of monoclonal antibodies and a toxin subunit specifically kill tumour cells. Nature. 1981 Mar 12;290(5802):145-6
【非特許文献６】Tsukada Y et al. Chemotherapy by intravenous administration of conjugates of daunomycin with monoclonal and conventional anti-rat alpha-fetoprotein antibodies. Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 Dec;79(24):7896-9
【非特許文献７】Hurwitz E et al. A conjugate of adriamycin and monoclonal antibodies to Thy-1 antigen inhibits humanneuroblastoma cells in vitro. Ann N Y Acad Sci. 1983;417:125-36
【非特許文献８】Gallego J et al. Preparation of four daunomycin-monoclonal antibody 791T/36 conjugates with anti-tumour activity. Int J Cancer. 1984 Jun 15;33(6):737-44
【非特許文献９】Spearman ME et al. Disposition of the monoclonal antibody-vinca alkaloid conjugate KS1/4-DAVLB (LY256787) and free 4-desacetylvinblastine in tumor-bearing nude mice. J Pharmacol Exp Ther. 1987 May;241(2):695-703
【非特許文献１０】Braslawsky GR et al. Adriamycin(hydrazone)-antibody conjugates require internalization and intracellular acid hydrolysis for antitumor activity. Cancer Immunol Immunother. 1991;33(6):367-74
【非特許文献１１】Doronina SO et al. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy. Nat Biotechnol. 2003 Jul;21(7):778-84. Epub 2003 Jun 1
【非特許文献１２】Dvorak HF. Tumors: Wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing. New Engl J Med 1986 Dec 25; 315(26): 1650-9
【非特許文献１３】Matsumura Y, Maeda H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent SMANCS. Cancer Res. 1986 Dec;46(12 Pt 1):6387-92
【非特許文献１４】Koizumi F et al. Novel SN-38-incorporating polymeric micelles, NK012, eradicate vascular endothelial growth factor-secreting bulky tumos. Cancer Res 2006 Oct 15; 66(20): 10048-56
【非特許文献１５】Sumitomo M et al. Novel SN-38-incorporated polymeric micelles, NK012, strongly suppress renal cancer progression. Cancer Res. 2008: 122: 2148-2153
【非特許文献１６】Saito Y et al. Enhanced distribution of NK012 and prolonged sustained-release of SN-38 within tumors are key strategic point for a hypovascular tumor. Cancer Sci. 2008: 90: 1258-1264
【非特許文献１７】Matsumura Y. Poly (amino acid) micellar nanocarriers in preclinical and clinical studies. Adv.Drug Del. Rev. 2008: 60: 899-914
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、間質に特異的に長時間留まり、腫瘍血管及び／又は腫瘍細胞に作用し抗腫瘍効果を発揮する複合体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、コラーゲンに代表される間質は、腫瘍周囲において豊富に存在し、抗腫瘍性化合物の腫瘍細胞へのアクセスを阻害する可能性が指摘されていたが、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性部位（例、抗腫瘍性化合物、抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造）との複合体を用いると、腫瘍細胞表面上の抗原に対する抗体と抗腫瘍性化合物との複合体よりも、腫瘍血管及び／又は腫瘍細胞に作用することにより、むしろ優れた抗腫瘍作用を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
［１］間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質及び該物質へ結合した抗腫瘍性部位を含む複合体。
［２］間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性部位とがリンカーを介して結合している、［１］記載の複合体。
［３］抗腫瘍性部位が抗腫瘍性化合物である、［１］記載の複合体。
［４］抗腫瘍性部位が抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造である、［１］記載の複合体。
［５］抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造が、抗腫瘍性化合物を含有するリポソーム又はミセルである、［４］記載の複合体。
［６］間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質が、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する抗体又はその結合性断片である、［１］記載の複合体。
［７］間質の構成因子がコラーゲンである、［１］記載の複合体。
［８］コラーゲンがＩＶ型コラーゲンである、［７］記載の複合体。
［９］間質の構成因子がフィブリンである、［１］記載の複合体。
［１０］リンカーと抗腫瘍性部位とが、エステル結合又はカルバメート結合を介して結合している、［２］記載の複合体。
［１１］リンカーと抗腫瘍性部位とが、カーボネート結合又はチオカルバメート結合を介して結合している、［２］記載の複合体。
［１２］［１］記載の複合体を含む、腫瘍の治療剤。
［１３］［１］記載の複合体を含む、腫瘍血管形成阻害剤。
［１４］哺乳動物に対して有効量の［１］記載の複合体を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍の治療方法。
［１５］哺乳動物に対して有効量の［１］記載の複合体を投与することを含む、該哺乳動物における腫瘍血管の形成を阻害する方法。
［１６］腫瘍の治療において使用するための、［１］記載の複合体。
［１７］腫瘍血管の形成阻害において使用するための、［１］記載の複合体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、間質に特異的且つ長時間留まり、優れた抗腫瘍効果を発揮する複合体が提供される。特に、本発明の複合体を用いれば、時間依存性の抗腫瘍効果を有する抗腫瘍性化合物の抗腫瘍効果を有効に発揮させることが可能となる。また、腫瘍血管及び／又は腫瘍細胞に作用するので、従来の複合体よりも著しく高い抗腫瘍効果を望める。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、典型的なヒト膵癌組織を示す図である。
【図２】図２は、フローサイトメトリーにより腫瘍細胞表面上のＥｐＣＡＭ発現を解析した結果である。
【図３】図３は、抗体の生体イメージングを示す図である。
【図４】図４は、ＳＮ−３８−ポリマー化合物と抗体との結合を示す模式図である。
【図５】図５は、各複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺細胞効果を示す図である。
【図６】図６は、各複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す図である。
【図７】図７は、抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体−ＳＮ−３８複合体投与及び未投与の腫瘍の病理組織学的特徴を示す図である。
【図８】図８は、ハイブリドーマクローン３５−４のＶＨ部位のｃＤＮＡ配列と、ｒＩｇＧ２ａクローンＢＣ０８８２４０．１の対応するｃＤＮＡ配列とのアライメントを示す図である。
【図９】図９は、ハイブリドーマクローン３５−４のＶＨ部位の推定アミノ酸配列と、ｒＩｇＧ２ａクローンＢＣ０８８２４０．１の対応するアミノ酸配列とのアライメントを示す図である。
【図１０】図１０は、ハイブリドーマクローン６−１、６−２及び５６Ｐ−１のＶＨ部位のｃＤＮＡ配列と、ＩｇＭ可変領域クローンＪ００５２９．１及びＩｇＭ定常領域クローンＶ００８２７．１の対応するｃＤＮＡ配列とのアライメントを示す図である。
【図１１】図１１は、ハイブリドーマクローン６−１、６−２及び５６Ｐ−１のＶＨ部位のアミノ酸配列と、ＩｇＭ可変領域クローンＪ００５２９．１及びＩｇＭ定常領域クローンＶ００８２７．１の対応するアミノ酸配列とのアライメントを示す図である。
【図１２】図１２は、ハイブリドーマクローン３５−４、６−１、６−２及び５６Ｐ−１のκ鎖のＶＬ部位のｃＤＮＡ配列と、κ鎖クローンＢＣ０８８２５５．１の対応するｃＤＮＡ配列とのアライメントを示す図である。
【図１３】図１３は、ハイブリドーマクローン３５−４、６−１、６−２及び５６Ｐ−１のκ鎖のＶＬ部位のアミノ酸配列と、κ鎖クローンＢＣ０８８２５５．１の対応するアミノ酸配列とのアライメントを示す図である。
【図１４】図１４は、抗フィブリン抗体−ＳＮ−３８複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質及び該物質へ結合した抗腫瘍性部位を含む複合体に関する。
【００１４】
本発明の複合体は、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質を構成因子として含むことにより、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する。また、本発明の複合体は、間質の構成因子に対して結合した状態で、抗腫瘍性化合物を徐放し得る。
【００１５】
本明細書において、「間質」とは、組織における細胞と細胞との間隙を埋める結合組織を意味する。本発明においては、間質は、特に腫瘍組織の間質を意味する。
【００１６】
間質の構成因子としては、公知の細胞外マトリクス構成成分を挙げることが出来る。該成分としては、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン等を挙げることができ、腫瘍組織中の間質を構成する成分であれば、特に限定されないが、特にコラーゲンは腫瘍組織において発達しているため好ましい。コラーゲンには数十種類の型が存在することが知られており、どの型のコラーゲンが間質中に優性に発現するかは腫瘍の種類により異なるが、一般にＩＶ型コラーゲンは腫瘍血管の周囲に豊富であり、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンは腫瘍細胞と腫瘍血管の間に増生するため、コラーゲンは、好ましくはＩ型、ＩＩＩ型又はＩＶ型であり、より好ましくはＩＶ型である。
【００１７】
新たな局面において、間質の構成因子として、癌随伴物質をもまた好ましく用いることができる。癌随伴物質とは、腫瘍組織の中で、腫瘍細胞の増殖に伴い腫瘍血管や間質において形成される物質をいう。癌随伴物質としては、例えばフィブリンが挙げられる。
【００１８】
間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質としては、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する抗体又はその結合性断片、間質の構成因子に対する可溶性の受容体又はその結合性断片、間質の構成因子に親和的なペプチド、上記の抗体、可溶性受容体、結合性断片、ペプチドを結合した高分子担体等を挙げることができる。該物質は、好ましくは、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する抗体、又はその結合性断片及びペプチドである。ここで、「特異的」とは、特定の間質の構成因子以外の成分から当該間質の構成因子を認識し得ることを意味する。
【００１９】
本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の天然型抗体；遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体；ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体が含まれるがこれらに限定されない。また、ＰＥＧ等により修飾された抗体も、本発明において用いられる抗体に包含される。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である。抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＭであり、より好ましくはＩｇＧである。
【００２０】
抗体の結合性断片とは、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する上記抗体の一部分を意味する。抗体の結合性断片としては、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ）、ｓｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製された抗体断片等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。
【００２１】
本発明のモノクローナル抗体は、自体公知の方法により作製することができ、例えば、ハイブリドーマ法［Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁（１９７５年）］を用いても、組換えＤＮＡ法（Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４８１６５６７号）を用いても作製することができる。
例えば、間質コラーゲンを市販のアジュバントと共にマウスに２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８など）を細胞融合して間質コラーゲンに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法［J. Immunol. Methods, 81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡ又はＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、又はマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清及び動物の腹水から取得することができる。
【００２２】
本発明のモノクローナル抗体は、全長抗体（抗体全体）、抗体断片（抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’)２、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）等）、誘導体化抗体又は修飾化抗体等が使用可能であるが、全長抗体が好ましい。
【００２３】
キメラ抗体は、前記のようにして得たモノクローナル抗体のＶ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
【００２４】
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ １２５０２３号公報、ＷＯ ９６／０２５７６号公報参照）。
【００２５】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲ及びＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ  ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
【００２６】
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856）。
【００２７】
キメラ抗体及びヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
【００２８】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域及びＣ領域とからなる。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明に使用する抗体として有用である。
【００２９】
生体内での安定性を向上させるため、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質は修飾されていてもよい。例えば、該物質をＰＥＧにより修飾し、チャージをなくすことにより、マクロファージ等による貪食から該物質を保護することが出来る。
【００３０】
本発明において使用可能な抗腫瘍性化合物は、抗癌剤、低分子分子標的剤放射線核種などの生体内において腫瘍細胞を殺傷する活性を有する化合物であれば、臨床や臨床試験において使用されている抗腫瘍性化合物、将来開発される抗腫瘍性化合物を含む全ての化合物を、限定することなく使用することができる。好ましくは時間依存性に抗腫瘍効果を発揮する化合物が使用される。
【００３１】
本明細書において抗腫瘍性部位とは、抗腫瘍活性を有する機能性構造を意味する。抗腫瘍性部位としては、抗腫瘍性化合物、抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造等を挙げることが出来る。
【００３２】
本発明の複合体において抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物を用いる場合、該抗腫瘍性化合物の分子量は特に限定されないが、本発明の複合体が腫瘍組織中の間質へ送達された後で、該部位において複合体から遊離し、腫瘍組織内を移動して腫瘍組織全体にいきわたり、腫瘍細胞に到達できる程度に低分子量であることが好ましい。このような分子量は、例えば１５０００Ｄａ以下、好ましくは１００００Ｄａ以下、より好ましくは５００Ｄａ以下である。また、抗腫瘍性化合物の分子量は、例えば１００Ｄａ以上、好ましくは３００Ｄａ以上である。従って、抗腫瘍性化合物の好ましい分子量範囲としては、３００〜５００Ｄａが例示される。
【００３３】
抗腫瘍性化合物は、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質又はリンカー（後述）との結合を容易にならしめるため、水酸基、カルボキシル基又はアミノ基を有する化合物であることが好ましい。
【００３４】
抗腫瘍性化合物は、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質又はリンカーと結合した状態では、結合していない状態と比較して、その抗腫瘍活性（毒性）が減弱されている、すなわちプロドラッグの状態であることが好ましい。
【００３５】
本発明の複合体は、生体へ投与されると、腫瘍組織中の間質へ送達され、該部位にとどまり、抗腫瘍性化合物が該複合体から長期間にわたり徐放されると考えられる。従って、抗腫瘍性化合物として、時間依存性の抗腫瘍効果を有する化合物を使用することで、より高い抗腫瘍効果を期待することができる。ここで「抗腫瘍効果の時間依存性」とは、腫瘍細胞への持続的暴露時間が長いほど、抗腫瘍効果が増大することを意味する。
【００３６】
本発明において使用することのできる抗腫瘍性化合物としては、例えば、ＳＮ−３８（１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン）、アドリアマイシン、タキソール、５−フルオロウラシル、ニムスチン、ラミニスチン等のアルキル化剤、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミドなどの代謝拮抗剤、エトポシド、ビンクリスチンなどの植物アルカロイド、マイトマイシン、ブレオマイシンなどの抗癌性抗生物質、シスプラチンなどのプラチナ製剤、ソラフェニブ、エルロチニブ等の分子標的剤、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、シクロフォスファミド、イフォスファマイド、ブスルファンなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＳＮ−３８は特に、血中では分解されにくいため本発明への使用に適している。
【００３７】
上記化合物のうち、時間依存性の抗腫瘍性化合物としては、ＳＮ−３８、タキソール、ビンクリスチン、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン等が挙げられる。
【００３８】
また、濃度依存性の抗腫瘍性化合物も、腫瘍組織中に存在する腫瘍細胞への高濃度の抗腫瘍剤の暴露という観点から、本発明に好ましく用いられる。ここで「濃度依存性の抗腫瘍性化合物」とは、時間よりも、より高濃度の抗腫瘍剤の暴露により殺細胞効果が左右されるという性質を有する抗腫瘍性化合物を意味する。上記化合物のうち、５−フルオロウラシル、シクロフォスファミド、イフォスファマイド、ブスルファン等が挙げられる。
【００３９】
本発明の複合体において、抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造を用いる場合、該抗腫瘍性化合物としては、抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物自体を用いる場合と同一のものを使用することが出来る。
【００４０】
抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造としては、抗腫瘍性化合物を含有するリポソーム又はミセル等を挙げることができる。
【００４１】
リポソームとは、水性の内部を有する脂質二重膜の小胞である。リポソームとしては、脂質二重膜が何枚もタマネギ状に重なった多重膜リポソームと単膜リポソームが挙げられる。リポソームを構成する脂質は、通常リン脂質である。リン脂質としては、レシチン、リゾレシチン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジル酸等の酸性リン脂質、又はこれらのアシル基をラウロイル基、ミリストイル基、オレオイル基等に置換したリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質等がある。また、コレステロール等を添加することもできる。抗腫瘍性化合物を含有するリポソームは、例えば精製したリン脂質の薄膜を抗腫瘍性化合物を含有する溶液に懸濁し、超音波処理等を施して製造することができる。抗腫瘍化合物を含有するリポソームの製造方法については、当該技術分野において周知である。該製造方法については、例えばAnnals of Oncology, vol.15, pp.517-525, 2004；Cancer Science, vol.95, pp.608-613, 2004等を参照のこと。
【００４２】
ミセルとは、溶液中で溶質がある濃度以上に達した場合に自己会合して形成された会合体である。抗腫瘍性化合物を含有するミセルは、例えば、ブロックコポリマーと抗腫瘍性化合物とを有機溶媒（例えばＣＨＣｌ３）に溶解し、溶媒を蒸発させた後で、水性溶媒を添加し、混合物を超音波処理に付すことにより得ることが出来る。或いは、ブロックコポリマーの疎水性ポリマー部分に抗腫瘍性化合物を化学的に共有結合させ、得られた融合分子を水性溶媒中で自己会合を起こさせることにより得ることが出来る。ここで、ブロックコポリマーとは、互いに非相溶なポリマー鎖を末端で結合させたポリマーである。本発明において有用なブロックコポリマーとしては、ポリエチレングリコール−ポリ（グルタミン酸）ブロックコポリマー、ポリエチレングリコール−ポリ（アスパラギン酸）ブロックコポリマー等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。ミセルに含有される抗腫瘍性化合物としては、水に不溶性又は難溶性のものが好ましい。抗腫瘍化合物を含有するミセルの製造方法については、当該技術分野において周知である。該製造方法については、例えばCancer Research, vol. 66, pp. 10048-10056, 2006等を参照のこと。
【００４３】
生体内での安定性を向上させるため、リポソーム及びミセルは修飾されていてもよい。例えば、リポソーム又はミセルをＰＥＧにより修飾し、チャージをなくすことにより、マクロファージ等による貪食から該物質を保護することが出来る。
【００４４】
リポソーム及びミセルの粒径は特に限定されないが、本発明の複合体がＥＰＲ効果を発揮できるように設定されることが好ましい。そのような粒子径としては、リポソームでは１００〜４５０ｎｍ、ミセルでは１０〜８０ｎｍである。なお、本明細書において、リポソーム及びミセルの粒子径は、ＰＢＳ中、２５℃で、Particle Sizer NICOMP 380ZLS (Particle Sizing Systems)を用いて動的光散乱法を用いて測定した場合のメジアン径を意味する。
【００４５】
本発明の複合体において、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と抗腫瘍性部位とは、直接的に又は間接的に結合している。該結合は通常共有結合である。「間接的な結合」とは、リンカーを介した結合を意味する。
【００４６】
本発明の複合体においては、好ましくは、抗腫瘍性部位がリンカーを介して間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質へ結合している。該リンカー（特にＰＥＧ）を介して２つの分子が結合することにより、本発明の間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質の抗原性を減弱できるという効果を有する。
【００４７】
リンカーを介して抗腫瘍性部位と間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質とを連結する技術は、当該技術分野において周知である。リンカーについての一般的な技術については、Hermanson, G.T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press；Harris, J.M. and Zalipsky, S., Eds (1997). Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications, ACS Symposium Series；Veronese, F. and Harris, J.M., Eds. (2002). Peptide and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Review 54(4)等を参照のこと。
【００４８】
リンカーとは、２つの化合物を連結する２価以上（好ましくは２価）の基を意味する。本発明において使用することのできるリンカーの種類は、特に限定されないが、ポリアルキレングリコールリンカー、アルキレン基、ペプチド、糖鎖、その他高分子担体等を挙げることができる。ポリアルキレングリコールリンカーの構成単位であるアルキレングリコールのアルキレン部分は、通常炭素数１〜３０００、好ましくは炭素数２〜１０００、より好ましくは炭素数２〜１００である。ポリアルキレングリコールリンカーの分子量は通常３０〜５万Ｄａ、好ましくは５００〜３万Ｄａである。ポリアルキレングリコールリンカーは、好ましくはポリエチレングリコールリンカーである。アルキレン基は、直鎖状又は分岐状のいずれであってもよい。アルキレン基は、通常は炭素数２〜３５００、好ましくは炭素数１００〜２０００、より好ましくは炭素数５００〜１０００である。
リンカーの分子量は、後述する本発明の複合体の分子量との関係等に基づいて、当業者であれば適宜調整することができる。
【００４９】
リンカーには、直鎖状のリンカー（２価のリンカー）と分岐状のリンカー（３価以上のリンカー）が含まれる。直鎖状のリンカーは、その一端に間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質へ結合する部位を有し、他の一端に抗腫瘍性化合物へ結合する部位を有する。分岐状のリンカーは、通常、その一端に間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質へ結合する部位を有し、該部位へ分岐部位が連結し、該分岐部分の各枝へ直鎖状のリンカー（ポリアルキレングリコール鎖、アルキレン鎖、ペプチド鎖、糖鎖等が）が連結し、そのリンカーの先端に抗腫瘍性化合物へ結合する部位を有する。
【００５０】
間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質とリンカーとの結合は、共有結合又は非共有結合（イオン結合、疎水結合等）であるが、好ましくは共有結合である。該結合は、本発明の複合体を腫瘍患者へ投与した場合に、血液中においては切断され難く、且つ腫瘍組織中の間質へ送達され、該部位に複合体が結合した後においても切断され難い態様であることが好ましい。このような結合としては、マレイミド基とチオール基との結合、ハロエステルとチオールを反応させて得られる結合、カルボキシル基とアミノ基とのアミド結合、チオール基とチオール基のジスルフィド結合、アミノ基とアルデヒド基によるシッフ塩基、チオール基とカルボン酸とのチオエステル結合、水酸基とカルボキシル基とのエステル結合、アミノ基とスクアリン酸誘導体（例えば、ジメチルスクアリン酸）による結合、ジエニルアルデヒド基とアミノ基との結合等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。該結合のより具体的な態様としては、リンカーの一端に設けられたマレイミド基と間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質中のシステイン残基に含まれるチオール基との結合、リンカーの一端に設けられたスクシンイミド基と間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質中のリジン残基に含まれるアミノ基との脱水置換結合（例えば、ＷＯ  ２００８／０９６７６０号公報参照）、リンカーの一端に設けられたアミノ基と間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質中のアスパラギン酸やグルタミン酸に含まれるカルボン酸との脱水縮合結合（例えば、ＷＳＣＤＩを使用する）等を挙げることができる。また、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質のアミノ基とリンカーの一端に設けられたジエニルアルデヒド基によるペリ環状反応によりピリジン誘導体として結合させることもできる。また、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質がＮ末端にシステイン残基を有する場合（例えば、遺伝子改変により、Ｎ末端にシステイン残基を導入した場合）、当該システイン残基のアミノ基とチオエステル型であるリンカーとをアミド結合を介して連結することが出来る（例えば、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1997, 36, No.10, pp.1069-1071参照）。また、インテイン（タンパク質スプライシング、あるいはタンパク質イントロン）を用いて合成することも考えられる。
【００５１】
間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質とリンカーとの結合の具体的態様の例を以下に示す。
【００５２】
【表１】
0005593488.tif 000002
【００５３】
間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質又はリンカーと抗腫瘍性部位との結合は、共有結合又は非共有結合（イオン結合、疎水結合等）であるが、好ましくは共有結合である。特に、抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物を用いる場合には、該結合は、本発明の複合体を腫瘍患者へ投与した場合に、血液中においては切断され難いが、腫瘍間質へ送達され、該部位に複合体が結合した後で、抗腫瘍性部位が該複合体から徐放され得るような態様であることが好ましい。このような観点から、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質又はリンカーと抗腫瘍性部位との結合は、好ましくはエステル結合、カルバメート結合、より好ましくはエステル結合であるが、これらに限定されるものではない。カーボネート結合やチオカルバメート結合等も、また好ましい。エステル結合の場合は、腫瘍組織内のカルボキシルエステラーゼにより、又は非酵素的に結合が加水分解されて、徐放的に抗腫瘍性部位が遊離されることが期待される。カルバメート結合の場合は、細胞内に抗体複合体のままエンドサイトーシスされた後、細胞内のカルボキシルエステラーゼで切断され、徐放的に抗腫瘍性部位が遊離されることが期待される。カーボネート結合の場合は、非酵素的に結合が加水分解されて、徐放的に抗腫瘍性化合物が遊離されることが期待される。チオカルバメート結合の場合は、非酵素的に結合が加水分解されて、徐放的に抗腫瘍性化合物が遊離されることが期待される。
【００５４】
また、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質又はリンカーと抗腫瘍性部位との結合としては、ヒドラゾン（カルボニルとヒドラジンの脱水縮合体）、チオエステル等を介した結合もまた好ましい。
【００５５】
尚、抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物を含有するリポソーム又はミセルを用いる場合には、その構造に起因してリポソーム又はミセルから徐放的に抗腫瘍化合物が遊離され得る。従って、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質又はリンカーとリポソーム又はミセルとの結合は、本発明の複合体を腫瘍患者へ投与した場合に、血液中及び腫瘍間質のいずれにおいても切断され難い態様であってよい。そのような結合の種類としては、例えば、ＷＯ  ００／６４４１３号公報に記載されたような結合を挙げることが出来る。
【００５６】
直鎖状のリンカーの具体的な例としては、式：
【００５７】
【化１】
0005593488.tif 000003
【００５８】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖を、ｎ及びｍはエチレングリコール単位の数であり、独立して５〜１００の整数を示す）で表されるリンカーを挙げることが出来る。該リンカーは、通常、スクシンイミジル基を有する末端において間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と連結し、他の末端において抗腫瘍性化合物と連結する。
【００５９】
さらに、直鎖状のリンカーの具体的な例としては、式：
【００６０】
【化２】
0005593488.tif 000004
【００６１】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖を、ｘはエチレングリコール単位の数であり、５〜１００の整数を示す）で表されるリンカーを挙げることができる。該リンカーは、通常、スクシンイミジル基を有する末端において間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と連結し、他の末端において抗腫瘍性化合物と連結する。
【００６２】
分岐状のリンカーの具体的な例としては、式：
【００６３】
【化３】
0005593488.tif 000005
【００６４】
（式中、ＰＥＧはポリエチレングリコール鎖を、ｎ、ｍ及びｑはエチレングリコール単位の数であり、独立して５〜１００の整数を示す）で表されるリンカーを挙げることが出来る。該リンカーは、通常、スクシンイミジル基を有する末端において間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質と連結し、他の複数の末端において抗腫瘍性化合物と連結する。この分岐状のリンカーは、例えば、ピアス社から入手可能である。
【００６５】
本発明の複合体において抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物自体を用いる場合、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質１分子へ結合する抗腫瘍性化合物の数は、理論的には特に限定されないが、複合体の安定性や製造容易性等の観点から、通常１〜１０個、好ましくは１〜８個である。
また、複合体中のリンカー部分と抗腫瘍性化合物部分とのモル比は、通常１：１であるが、リンカー部分１モルに対して抗腫瘍性化合物が数モルであっても良い。
【００６６】
本発明の複合体において抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造（例、リポソーム、ミセル）を用いる場合、該機能性構造へ結合する間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質の比は、理論的には特に限定されないが、複合体の安定性や製造容易性等の観点から、Y. Matsumura et al. Phase I and pharmacokinetic study of MCC-465, a doxorubicin (DXR) encapsulated in PEG immunoliposome, in patients with metastatic stomach cancer. Annals of Oncology. 2004: 15: 517-525、F. Koizumi et al. Novel SN-38-Incorporating Polymeric Micelles, NK012, Eradicate Vascular Endothelial Growth Factor-Secreting Bulky Tumors. Cancer Res. 2006: 66 (20): 10048-10056、T. Hamaguchi et al. Antitumor effect of MCC-465, pegylated liposomal doxorubicin tagged with newly developed monoclonal antibody GAH, in colorectal cancer xenografts. Cancer Sci. 2004: 95: 608-613に記載の複合体に準じて決定される。
また、複合体中のリンカー部分と該機能性構造部分とのモル比は、通常１：１であるが、リンカー部分１モルに対して該機能性構造が数モルであっても良い。
【００６７】
腫瘍の脈管学的特性として、腫瘍血管透過性の亢進が起きており、正常血管からは漏れにくい高分子物質も腫瘍の血管からは容易に漏出すること、また、血管新生に対してリンパ管新生に乏しいため、一旦腫瘍組織で血管から漏出した高分子物質はリンパ管にドレナージできずに長く腫瘍組織に留まるというＥＰＲ効果（enhanced permeation and retention effect）が報告されている。本発明の複合体の大きさ（分子量等）は、特に限定されないが、ＥＰＲ効果を発揮させるものであることが好ましい。
【００６８】
抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物自体を用いる場合、ＥＰＲ効果を発揮できる複合体の分子量の範囲は例えば、５０，０００Ｄａ以上、好ましくは７０，０００Ｄａ以上が挙げられるが、ＥＰＲ効果が発揮できるものであればこれに限定されない。分子量が５０，０００Ｄａを下回ると、分子が腎臓から尿中へ排泄されてしまい、ＥＰＲ効果が弱くなるリスクが高くなる。一方、分子量が大きすぎると、該分子が異物として認識されてマクロファージにより貪食されてしまうリスクが高くなるので、本発明の複合体の分子量は通常２００，０００Ｄａ以下である。したがって、本発明の複合体の分子量の範囲としては、好ましくは１０〜１８万Ｄａ、より好ましくは１２〜１６万Ｄａ、更に好ましくは１５万Ｄａが例示される。一般的に、ＥＰＲ効果を好適に良好に示すタンパク質の分子量は７０，０００〜２００，０００Ｄａであることが知られている。
【００６９】
抗腫瘍性部位として抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造（例、リポソーム、ミセル）を用いる場合、ＥＰＲ効果を発揮できる複合体の粒径は、該機能性構造の種類により異なっている。例えば、リポソームを用いる場合、ＥＰＲ効果を発揮できる複合体の粒子径は、通常１００〜４５０ｎｍである。ミセルを用いる場合、ＥＰＲ効果を発揮できる複合体の粒子径は、通常１０〜８０ｎｍである。なお、本明細書において、複合体の粒子径は、ＰＢＳ中、２５℃で、Particle Sizer NICOMP 380ZLS (Particle Sizing Systems)を用いて動的光散乱法を用いて測定した場合のメジアン径を意味する。
【００７０】
間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質、リンカー、抗腫瘍性化合物又は該抗腫瘍性化合物を徐放できる機能性構造の各分子量（又は粒子径）は、特に限定されないがこれらの分子量は本発明の複合体がＥＰＲ効果を発揮できるように設定されることが好ましい。間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質の分子量は、該物質がタンパク質である場合、例えば、５０，０００Ｄａ以上、好ましくは７０，０００Ｄａ以上が挙げられるが、ＥＰＲ効果が発揮できるものであればこれに限定されない。分子量が５０，０００Ｄａを下回ると、分子が腎臓から尿中へ排泄されてしまい、ＥＰＲ効果が弱くなるリスクが高くなる。例えば、分子量２５，０００ＤａのＦ（ａｂ）は腎臓から容易に排出されるので腫瘍への集積性が限られる場合がある。一方、分子量が大きすぎると、該分子が異物として認識されてマクロファージにより貪食されてしまうリスクが高くなり、例えば、分子量９００，０００ＤａのＩｇＭ抗体は大きすぎて腫瘍血管から漏れにくく、肝臓などの網内系で捕獲されやすいことがある。間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質の分子量は、該物質がタンパク質である場合、通常２００，０００Ｄａ以下である。一般的に、ＥＰＲ効果を好適に良好に示すタンパク質の分子量は７０，０００〜２００，０００Ｄａであることが知られている（非特許文献１３、１７）。このような観点からも、本発明に使用する抗体としては、ＩｇＧ（分子量約１５０，０００Ｄａ）が好ましい。
【００７１】
本発明の複合体は、抗腫瘍性部位へ間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質を結合させることにより製造することが出来る。２者の結合にリンカーを用いる場合には、抗腫瘍性部位にリンカーを結合させ、更にこれを間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質へ結合させることにより製造することが出来る。なお、各部分を結合させる順は、この順に特定されるものではない。
【００７２】
例示的に抗腫瘍性部位としてＳＮ−３８（１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン）を、リンカーとしてポリエチレングリコールリンカーを、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質として抗体を使用する場合に基づき、以下説明するが、他の３者の組み合わせを用いた場合であっても、当業者であれば適宜反応条件を変更することにより、目的とする本発明の複合体を製造することができる。
【００７３】
（Ｉ）先ず、一方の端にカルボキシル基を有し、他の一方の端にＢｏｃ、Ｆｍｏｃ等で保護されたアミノ基を有するポリエチレングリコールとＳＮ−３８とを脱水縮合させ、ＳＮ−３８の水酸基にポリエチレングリコールリンカーを導入する。
【００７４】
（ＩＩ）一方の端にスクシンイミド基を有し、他の一方の端にマレイミド基を有するポリエチレングリコールと（Ｉ）の生成物とを混合し、スクシンイミド基と（Ｉ）の生成物のアミノ基とを反応させることにより、ポリエチレングリコールリンカーへマレイミド基を導入する。
【００７５】
（ＩＩＩ）（ＩＩ）の生成物と抗体を混合し、（ＩＩ）の生成物中のマレイミド基と抗体中のチオール基とを反応させ、（ＩＩ）の生成物と抗体とを結合させることにより、本発明の複合体を得る。
【００７６】
本発明の複合体は、腫瘍組織内の間質に結合し、長い期間腫瘍組織内に留まり、長い期間抗腫瘍効果を発揮し続けるという特徴を有するので、本発明の複合体の有効量を哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物における腫瘍を予防又は治療することができる。さらに、本発明の複合体は、長い期間腫瘍組織内に留まり、腫瘍の境界領域で腫瘍に栄養を与える血管の形成を阻害することによっても、長い期間抗腫瘍効果を発揮し得る。従って、本発明は、上記本発明の複合体を含む腫瘍の予防又は治療剤、腫瘍血管阻害剤（以下、これらを本発明の剤とも呼ぶ）を提供するものである。
【００７７】
腫瘍の種類は、特に限定されないが、前記特徴を最大限に発揮させる観点から、固形癌、好ましくは間質を有する固形癌である。固形癌の種類としては、骨肉腫、食道癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、膵癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、脳腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、腎癌、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、甲状腺癌、睾丸腫瘍、カポジ肉腫、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、筋肉腫、皮膚癌等を挙げることができるが、これらに限定されない。特に、本発明の複合体は、間質の多い腫瘍（例えば、膵癌、胃癌（スキルス胃癌）、大腸癌、肺癌などの難治性癌）の予防や治療、腫瘍に栄養を与える血管の形成阻害に有利である。
【００７８】
本発明の剤は、任意の哺乳動物の腫瘍に適用することができる。哺乳動物の種類としては、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることができる。マウス等のげっ歯類の腫瘍組織と比較して、ヒト等の霊長類の腫瘍組織の方が一般的に間質に富んでいるので、本発明の剤は、霊長類、特にヒトの腫瘍の予防又は治療、腫瘍血管の形成阻害に有利である。
【００７９】
本発明の剤は、単独で、又は薬理学上許容可能な担体、香味剤、賦形剤、防腐剤、懸濁化剤、溶剤、溶解補助剤、等張化剤、膨化剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、結合剤などの添加剤と共に常套手段に従って製剤化し、経口剤あるいは非経口剤として使用することができる。
【００８０】
結合剤としては、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴム、α化デンプン、ショ糖、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、トレハロース、デキストリン、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
賦形剤としては、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、デンプン、α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アラビアゴム、プルラン、軟質無水ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどが挙げられる。
潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
甘味剤としては、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。
香味剤としては、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーが挙げられる。
防腐剤としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸が挙げられる。
崩壊剤としては、乳糖、白糖、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、軟質無水ケイ酸、炭酸カルシウムなどが挙げられる。
懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子；ポリソルベート類、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。
溶剤の好適な例としては、注射用水、生理食塩水、リンゲル液、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油などが挙げられる。
溶解補助剤の好適な例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、トレハロース、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。
等張化剤の好適な例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ブドウ糖、キシリトール、果糖などが挙げられる。
【００８１】
また、本発明の剤は、例えば、緩衝剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤、着色剤などと配合してもよい。
緩衝剤としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。
無痛化剤としては、プロピレングリコール、塩酸リドカイン、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどが挙げられる。
安定化剤としては、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。
保存剤としては、ベンジルアルコール、フェノールなどが挙げられる。
酸化防止剤としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸塩などが挙げられる。
着色剤の好適な例としては、水溶性着色タール色素（例、食用赤色２号及び３号、食用黄色４号及び５号、食用青色１号及び２号などの食用色素）、不溶性レーキ色素（例、前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩）、天然色素（例、β−カロチン、クロロフィル、ベンガラ）などが挙げられる。
【００８２】
また、投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、例えば、経口製剤、注射剤又は経皮製剤で投与可能である。経口製剤としては、錠剤（舌下錠、口腔内崩壊剤を含む）、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。また、注射剤としては、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、脊髄腔内注射、硬膜外注射、局所注射などが挙げられる。また、経皮製剤としては、貼付剤、軟膏剤、散布剤などが挙げられる。これらの製剤は、速放性製剤又は徐放性製剤などの放出制御製剤（例、徐放性マイクロカプセル）であってもよい。
【００８３】
本発明の剤は、好適には注射剤として処方される。注射剤のための無菌組成物は、活性物質をビヒクル（注射用水溶液；胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油など）中に溶解又は懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。注射剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００８４】
本発明の剤における本発明の複合体の含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対して約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、更に好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
【００８５】
本発明の剤の投与量は、投与対象の種類、投与方法、抗腫瘍剤の種類、腫瘍細胞の種類、部位等を考慮して適宜決定することができるが、ヒト固形癌に対して静脈投与により投与する場合、体重１ｋｇ当たり本発明の複合体の量として５〜５００ｍｇが好ましく、１０〜５００ｍｇであることがより好ましく、１０〜３００ｍｇであることが更に好ましい。これらの有効量は、一回又は数回に分けて投与することができる。
【００８６】
本発明は、別の実施態様として、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質、及びリンカーを介して該物質へ結合した標識化合物からなる複合体を提供する。
標識化合物としては、放射性同位体、蛍光物質又は酵素などが挙げられるがそれらに限定されない。
具体的には、３Ｈ、１４Ｃ、１２５Ｉや１３１Ｉ等の放射性同位体、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フルオロセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネートやＥｕ３＋等の蛍光物質、メチルクマリン系化合物、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素等のような酵素が標識化合物として挙げられる。
酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。
前記間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質、リンカーの定義は前述の通りである。
また、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質とリンカーの結合様式は前述の通りであり、リンカーと標識化合物は前述のリンカーと抗腫瘍性化合物の結合様式に準じて適宜決定することができる。
複合体の粒子径、複合体全体、間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質、リンカー、標識化合物の分子量も前述の通りである。
本発明の複合体は前述の製造方法に準じて得ることができる。
該複合体は、長時間腫瘍組織の間質部分に留まることができるため、そのまま、あるいは後記添加剤と共に製剤化して、腫瘍の有無、サイズ、イメージング等の診断薬として使用することができる。
本発明はまた、前記複合体を対象に使用することを含む、腫瘍の診断方法を提供する。
【００８７】
また、診断薬における本発明の複合体の含有量は、製剤の形態によって相違するが、前記治療剤における本発明の複合体の含有量に準じて決定することができる。また、本発明の診断薬の使用量も、前記治療剤の投与量に準じて決定することができる。これらは一回又は数回に分けて使用することができる。
【００８８】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれに限定されない。
【実施例】
【００８９】
（参考例１）
ヒト膵癌の手術標本を図１に示す。腫瘍血管は乏しく、腫瘍組織塊の中に一部腫瘍細胞が存在するだけで、血管周囲はコラーゲンを含めた間質で充満されていた。【００９０】
一方、ヌードマウスに皮下移植されたヒト膵癌株ＰＳＮ１、又はＳＵＩＴ２により生じた腫瘍中の間質コラーゲンの分布を、ＥｐＣＡＭをマウス抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（Ｂ８−４、国立がんセンター作成）と抗マウスＡｌｅｘａ４８８標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、コラーゲンタイプ４をラット抗マウスコラーゲン４抗体（１−４、国立がんセンター作成）と抗ラットＡｌｅｘａ５５５標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、細胞核をＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）で３重染色を行い、蛍光顕微鏡ＢＺ９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で撮影することにより観察した。ヒト膵癌ほどではないが、間質に豊富なコラーゲンが認められた。また、ＰＳＮ１よりもＳＵＩＴ２でより多くの間質コラーゲンが認められた。【００９１】
膀胱癌細胞株ＵＭＵＣ３を陰性コントロールにして、膵癌細胞株にＰＳＮ１とＳＵＩＴ２についてＥｐＣＡＭの発現をフローサイトメーターで測定した。具体的には、各々細胞株にマウス抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（Ｂ８−４）を一次抗体として、ＡＰＣ標識抗マウス抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を二次抗体として、更に、死細胞測定除去用にＰＩ（プロピジウムアイオダイド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて共染色した後、フローサイトメーターＦＡＣＳＣａｒｉｂｕｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で測定した。解析は解析ソフトＦｌｏｗｊｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）で行った。結果を図２に示す。この結果から、ヒト膵癌株ＳＵＩＴ２はＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）陽性細胞であることは明らかである。【００９２】
（参考例２）
抗体の生体イメージング
ヒトＢ細胞に対するモノクローナル抗体である抗ヒトＣＤ２０抗体（ヒト膵癌株ＳＵＩＴ２とは反応しない抗体、Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、中外製薬）をコントロールとして用い、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（Ｂ８−４）、抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体（３５−４）の腫瘍集積性を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（メス、６週齢）背部にＰＳＮ１又はＳＵＩＴ２を移植し、移植１０日後に各抗体（ＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉ−Ｃｏｒ）により標識化）をマウス尾静脈より投与した。投与１日後、３日後、７日後、１４日後の抗体の分布を生体イメージング装置ＯＶ１１０（Ｏｌｙｍｐｕｓ）により解析した。
結果を図３に示す。図中、ＣＤ２０は抗ヒトＣＤ２０抗体を、ＥｐＣＡＭは抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体を、Ｃｏｌ．４は抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体を示す。
抗ヒトＣＤ２０抗体は、抗原・抗体反応は起きないが、ＥＰＲ効果により腫瘍組織に選択的に集積した。しかしながら、抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体よりも早く腫瘍組織から消失した。抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体も腫瘍組織に集積していたことは認められたが、ＳＵＩＴ２腫瘍特異的であるにもかかわらず、抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体より早く消失した。抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体は、中和抗原であるマウスＩＶ型コラーゲンがマウス血中に存在しているにもかかわらず、他の２抗体より長期間腫瘍組織に集積したことから、腫瘍への集積性が高いことが示された。【００９３】
以上の結果から、腫瘍細胞表面抗原に対する抗体をターゲッティングに用いた場合よりも、むしろ腫瘍組織中の間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質をターゲッティングに用いた場合の方が、腫瘍組織中に抗腫瘍性化合物を長期間留まらせておくことが可能であることが示唆された。【００９４】
（実施例１）
ＳＮ−３８−リンカー−抗体複合体の製造
１．ポリマーとＳＮ−３８との結合
抗腫瘍性化合物ＳＮ−３８をリンカーへ結合させた。【００９５】
【化４】
0005593488.tif 000006
【００９６】
１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（１０２．１ｍｇ、０．２６０ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ−ＰＥＧ２７−ＣＯＯＨ（４０７．１ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（１５．９ｍｇ、０．１３０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）中に、ＷＳＣＤＩ（ｗａｔｅｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ：５４．８ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で１９時間攪拌し、反応混合物をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＬＨ２０  ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１５：１−９：１）により精製し、無色油状物としてエステルを得た（４２０．１ｍｇ、９０％）。
1H-NMR δ (CD3OD) 8.20 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 7.99 (s, 1H), 7.66 (m, 2H), 5.60 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 5.40 (d, J = 16.5 Hz, 1H), 5.32 (M, 2H), 3.93 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.96 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 1.97 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.40 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1,02 (t, J = 7.8 Hz, 3H);13C-NMR (DMSO-d6) δ164.8, 161.9, 149.2, 148.5, 143.1, 142.7, 141.3, 138.2, 137.7, 137.5, 122.4, 119.5, 118.9, 117.2, 110.7, 106.5, 89.7, 70.4, 64.6, 62.3, 62.0, 62.0, 62.0, 61.9, 61.8, 61.8, 61.7, 61.5, 58.1, 58.0, 57.1, 41.2, 40.1, 31.8, 28.1, 26.3, 19.4, 14.4, 4.9, -1.1.【００９７】
２．リンカーへのマレイミド基の導入【００９８】
【化５】
0005593488.tif 000007
【００９９】
更に、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中Ｂｏｃ−ＰＥＧ２７−カンプトテシン（２２１．５ｍｇ、０．１２３ｍｍｏｌ）溶液に、室温でＴＦＡ（１ｍＬ）を添加した。混合物を１．５時間攪拌した後、真空内で除去し、トルエンを添加した。蒸発後、残渣を高真空下で乾燥させた。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）及びＭＡＬ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ（１２８．２ｍｇ、０．１４８ｍｍｏｌ）に溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（４８μＬ、０．２４６ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。３０分後、混合物をゲルろ過カラムクロマトグラフィー（ＬＨ−２０、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ＯＨ＝１：１）、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、無色油状物として目的物を得た（２７６．０ｍｇ、９１％）。
1H-NMR (CD3OD) δ 8.20 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.00 (s, 1H), 7.66-7.64 (m, 2H), 6.83 (s, 2H), 5.60 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.41 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 5.34 (s, 1H), 3.93 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.49-2.45 (m, 4H), 2.00-1.98 (m, 2H), 1.41 (t, J = 7.6 Hz, 3H), 1.02 (t, J = 7.6 Hz, 3H); 13C-NMR (DMSO-d6) δ 172.1, 170.4, 169.8, 169.7, 169.1, 156.5, 151.7, 149.7, 148.9, 146.2, 145.6, 145.0, 134.3, 131.1, 128.4, 126.8, 125.3, 118.8, 115.0, 96.5, 72.3, 69.9, 69.6, 69.5, 69.4, 69.0, 68.9, 66.7, 65.8, 65.1, 49.5, 36.0, 34.8, 34.1, 33.9, 31.6, 30.3, 25.4, 22.3, 13.9, 7.8. 【０１００】
３．ＳＮ−３８−ポリマー化合物と抗体との結合
国立がんセンターで作成した抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体（Ｂ８−４）、抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体（３５−４）、抗ヒトＣＤ２０抗体（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、中外製薬）を、それぞれの抗体がＰＢＳ中で濃度１．０ｍｇ／ｍｌになるよう調整した。ＤＴＴ（ジチオトレイトール）（Ｓｉｇｍａ）をファイナル１０ｍＭになるように加え、３７℃で３０分反応させ、限外ろ過（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｇｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ）で反応試薬を除去した。得られた反応物を、Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＳＣＲＵＭ  Ｉｎｃ.）で吸収測定したところ抗体の回収率は約８０％であった。ＤＮＴＢ（Ｄｉｎｉｔｒｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｅｎｅ、Ｗａｋｏ）法によるＳＨ基の定量結果から、１抗体あたり抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体は８．７個、抗ヒトＣＤ２０抗体は７．２個、抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体は７．７個のＳＨ基が得られたと考えられた。次に、タンパク質濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように１００ｍＭリン酸緩衝液＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ６．０）に上記反応物を溶解し、モル比で抗体１に対しマレイミド化合物４の割合で混合した後、室温で１時間、その後４℃で一晩反応させた。限外ろ過で反応試薬を除去した後、ＰＢＳに置換した。蛋白質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ、５００−０００６ＪＡ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。蛋白の回収率はＥｐＣＡＭ抗体は５１％、ＣＤ２０抗体は７７％、３５−４抗体は５１％の回収率であり、抗体１個あたりＥｐＣＡＭ抗体は８．４個、ＣＤ２０抗体は６．７個、抗コラーゲン抗体は７．２個のＳＮ−３８が付加された。計算は同じくＤＮＴＢ法で行った。得られた複合体の模式図を図４に示す。【０１０１】
（実施例２）
in vitro殺細胞効果
実施例１で作製した、抗ヒトＣＤ２０抗体−ＳＮ−３８複合体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体−ＳＮ−３８抗体及び抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体−ＳＮ−３８複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの殺細胞効果を、フリーのＳＮ−３８及びＣＰＴ−１１と比較した。
９６穴細胞プレートにＰＳＮ１もしくはＳＵＩＴ２癌細胞を３０００個撒き、２４時間後に各複合体を添加し、その４８時間後の細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用いたＷＳＴ−８法にて測定した。結果を図５に示す。
その結果、抗ヒトＣＤ２０抗体−ＳＮ−３８複合体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体−ＳＮ−３８抗体及び抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体−ＳＮ−３８複合体の抗腫瘍効果は、フリーのＳＮ−３８よりも減弱していたが、ＣＰＴ−１１を上回る抗腫瘍効果を維持していた。３種の複合体の間では抗腫瘍効果に差が認められなかった。【０１０２】
（実施例３）
in vivo抗腫瘍効果
ＰＳＮ１又はＳＵＩＴ２をヌードマウスに皮下移植して、腫瘍径が６ｍｍに達したとき、抗ヒトＣＤ２０抗体−ＳＮ−３８複合体、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体−ＳＮ−３８抗体又は抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体−ＳＮ−３８複合体を静脈内投与し（ＳＮ−３８換算で各３ｍｇ／ｋｇ）、腫瘍塊の大きさをモニターした。結果を図６に示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは３種の複合体の間で抗腫瘍効果に差が認められなかったが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体−ＳＮ−３８複合体が最も高い抗腫瘍効果を示した。【０１０３】
以上の結果から、腫瘍細胞表面抗原に対する抗体をターゲッティングに用いた場合よりも、むしろ腫瘍間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質をターゲッティングに用いた場合の方が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては高い抗腫瘍効果を達成し得ることが示唆された。【０１０４】
（実施例４）
腫瘍細胞と腫瘍血管への作用
ＳＵＩＴ２をヌードマウスに皮下移植して、腫瘍径が６ｍｍに達したとき、抗マウスＩＶ型コラーゲン抗体−ＳＮ−３８複合体を静脈内投与し（ＳＮ−３８換算で各３ｍｇ／ｋｇ）、病理組織学的特徴をモニターした。以下に詳細を示す。【０１０５】
（材料及び方法）
抗体／薬物及び試薬
抗ＥｐＣＡＭ抗体（クローンＢ８−４）を製造するハイブリドーマを、組換え蛋白質（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ＭＮ、ＵＳＡ）を免疫したマウスから得た。抗コラーゲンＩＶ抗体（クローン３５−４）を製造するハイブリドーマを、精製蛋白質を免疫したラットから得た。免疫したマウスから得た脾臓細胞を骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）と融合させた。ハイブリドーマクローンを製造する特定の抗体は、ＥＬＩＳＡを使用して結合する組換え蛋白質を選択した。抗ヒトＣＤ２０抗体（リツキシマブ）は、第一三共（東京、日本）から購入した。免疫組織化学では、ポリクローナル抗コラーゲンＩＶ抗体（ＬＳＬ−ＬＢ−１４０３）とモノクローナル抗ＣＤ３１抗体（ＭＥＣ１３．３）をそれぞれコスモバイオ（東京、日本）及びベクトン・ディッキンソン（フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。ＳＮ−３８及びＣＰＴ−１１（イリノテカン）は、それぞれ東京化成工業株式会社（東京、日本）及びヤクルト（東京、日本）から購入した。【０１０６】
細胞株
ヒト膵臓癌細胞株ＰＳＮ１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ロックビル、ＭＤ、ＵＳＡ）から購入した。ＳＵＩＴ２は奥博士（静岡大学、静岡、日本）から提供された。両方の細胞株は、１０％胎児ウシ血清（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフォテリシンＢ（シグマ）を添加したＤＭＥＭ（シグマ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）中で５％ＣＯ２雰囲気下３７℃で維持した。【０１０７】
リンカー−ＳＮ−３８複合体、免疫抱合体
実施例１と同様に作成し、抗体−プロドラッグ複合体の濃度を、ブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ、５００−０００６ＪＡ、バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）を使用して決定した。チオール残基の数を、ＤＮＴＰで定量した。各薬物（ＳＮ−３８）／抗体の割合を、遊離チオールとチオール残基の数を比較することにより決定した（範囲は６．７〜８．４）。【０１０８】
免疫組織化学
切除した組織を、４℃で５時間１％パラホルムアルデヒド溶液中で固定した。組織をＰＢＳで洗浄し、室温で１時間、ブロッキング溶液（０．１％ウシ血清アルブミン及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を含むＰＢＳ）でブロックした。ヒト試料は、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．（ロックビル、ＭＤ、ＵＳＡ）とＢｉｏＣｈａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（ヘイワード、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。組織を、一次抗体として抗ＥｐＣＡＭ抗体（Ｂ８−４）と抗コラーゲンＩＶ抗体（３５−４またはＬＳＬ−ＬＢ−１４０３）と一緒に室温で９０分インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体としてＡｌｅｘａ  ４８８標識抗マウスＩｇＧ（インビトロジェン）及びＡｌｅｘａ  ５５５標識抗ラットＩｇＧ（インビトロジェン）と一緒に室温で６０分インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ（インビトロジェン）を含有するＰＢＳでインキュベートした。Ａｌｅｘａ  ５５５標識抗ラットＩｇＧ（インビトロジェン）又は抗ヒトＩｇＧ（インビトロジェン）を、腫瘍に注射された抗体プロドラッグＳＮ−３８を検出するために使用した。組織をマウンティング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）中でカバースリップで覆った。蛍光イメージを、ｄｉｇｉｔａｌ  ｈｉｇｈ−ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＺ−９０００（株式会社キーエンス、大阪、日本）又はレーザースキャン顕微鏡システムＬＳＭ  ７１０（カールツァイス）を用いて得た。【０１０９】
動物モデルと抗腫瘍作用
メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５週齢）をＳＬＣ  Ｊａｐａｎ（静岡、日本）から購入した。マウスには２×１０６個の細胞を脇腹に皮下接種した。腫瘍の大きさ（長さ（Ｌ）と幅（Ｗ））を４日ごとに測定し、腫瘍体積は（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて計算した。全ての動物処理は国立がんセンターの動物実験委員会により確立された実験動物の管理及び使用に関するガイドラインを遵守して行った。このガイドラインは法的に要求される倫理基準に見合うものであり、日本における実験動物の使用のためのガイドラインを満たすものである。平均腫瘍体積が約９０ｍｍ３（ＰＳＮ１）又は約７０ｍｍ３（ＳＵＩＴ２）になったとき、マウスを各５匹からなる４群に無作為に分けた。免疫抱合体は、尾静脈注射当日に投与した。ＳＮ−３８用量に等しい抗体−ＳＮ−３８プロドラッグの注射用量を、各薬物（ＳＮ−３８）／抗体の割合に基づいて計算して決定した。【０１１０】
（結果）
結果を図７に示す。図７中、Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇは複合体を投与していない腫瘍であり、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈは複合体投与３ヶ月後の腫瘍を示す。Ａ〜Ｄはヘマトキシリン及びエオシンで染色したＳＵＩＴ２腫瘍であり、Ｂで点線で囲まれた部分は生存している細胞を含む。Ｄで黒三角の先端で示した間の部分は形成された繊維性被膜の幅を示す。腫瘍の成長はＫｉ６７免疫化学的染色を用いて調べ、Ｅ及びＦに示す。ＧとＨの腫瘍血管及びその跡をＣＤ３１とコラーゲンＩＶのダブル染色で調べた。主な陽性部分を点線で囲んだ。
ネズミの異種移植モデルでしばしば見られるようにどちらの腫瘍も血流の減少により中央壊死が生じたが、コントロールの腫瘍は成長していたのに対し、複合体を投与した腫瘍は成長していなかった（Ａ、Ｂ参照）。複合体を投与された腫瘍だけで大きな壊死病斑と濃い繊維性被膜の形成が見られた（Ｃ、Ｄ参照）。Ｋｉ６７陽性の成長した腫瘍のほとんどはコントロールの境界上で見られたが、複合体投与された腫瘍の中央にも少しだけ見られた（Ｅ、Ｆ参照）。さらに、ＣＤ３１陽性内皮細胞は境界領域で腫瘍に栄養を与える血管（tumor feeding vessel）を形成するが、コントロールとは違って複合体投与された腫瘍では観察されなかった。コラーゲン陽性の円形の環が血管の痕跡として、複合体投与された腫瘍の境界領域で見られた（Ｇ、Ｈ参照）。
以上の結果から、ターゲッティング物質を使用せずに抗腫瘍性化合物を投与した場合よりも、腫瘍間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質（例えば抗体コラーゲンＩＶ抗体）と、それに結合した抗腫瘍性化合物を含む複合体を投与した場合の方が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて高い抗腫瘍効果を達成し得ることが示唆された。また、腫瘍間質の構成因子に対して特異的結合能を有する物質（例えば抗体コラーゲンＩＶ抗体）と、それに結合した抗腫瘍性化合物を含む複合体を投与することにより、腫瘍の境界領域で腫瘍に栄養を与える血管の形成が抑制されることが示された。【０１１１】
（実施例５）
分岐状のリンカーの合成
（工程１）【０１１２】
【化６】
0005593488.tif 000008
【０１１３】
1-((5-(3-(allyloxy)-2-(allyloxymethyl)-2-((but-3-enyloxy)methyl)propoxy)pentyloxy)methyl)-4-methoxybenzene
3-(allyloxy)-2-(allyloxymethyl)-2-((but-3-enyloxy)methyl)propan-1-ol（１４．８５ｇ、３１．１７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液にＮａＨ（２．３１ｇ、１６０ｍｍｏｌ）を室温で添加した。１時間後、臭化物1-((5-bromopentyloxy)methyl)-4-methoxybenzene（１６．７ｇ、５８．０４ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコをＤＭＦ（３ｍＬ）で２回洗浄した。混合物を５５℃で１時間攪拌した。室温まで冷却した後、Ｎ，Ｎ−ジメチル  １，３−プロパンジアミン（１０ｍＬ）を添加した。１時間後、混合物を飽和ＮＨ４Ｃｌ及びＥｔＯＡｃで希釈した。水性層をＥｔＯＡｃで抽出した。混合した層を飽和食塩水で洗浄した。有機層はＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。蒸発後、残渣をシリカゲルカラム（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ  ９：１−４：１）で精製して無色油状物として上記式のエーテル化合物（８．６０ｇ、５８％）を得た。
1H-NMR d 7.23 (dd, J = 6.4 Hz, 2.4 Hz, 2H), 6.5 (dd, J = 6.4 Hz, 2.4 Hz, 2H), 5.85 (m, 3H), 5.23 (d, J = 17.2 Hz, 3H), 5.11 (d, J = 10.4 Hz, 3H), 4.41 (s, 2H), 3.93 (m, 6H), 3.78 (s, 3H), 3.42 (s, 8H) 3.39-3.36 (m, 4H), 1.60-1.51 (m, 4H), 1.38 (m, 2H), 13C-NMR d 135.21, 129.11, 115.97, 113.69, 72.53, 72.26, 71.33, 7.13, 69.60, 69.42, 55.30, 45.44, 29.65, 29.50, 22.94.【０１１４】
（工程２）【０１１５】
【化７】
0005593488.tif 000009
【０１１６】
2,2'-(2-((2-hydroxyethoxy)methyl)-2-((5-(4-methoxybenzyloxy)pentyloxy)methyl)propane-1,3-diyl)bis(oxy)diethanol
工程１で得たトリアリル化合物1-((5-(3-(allyloxy)-2-(allyloxymethyl)-2-((but-3-enyloxy)methyl)propoxy)pentyloxy)methyl)-4-methoxybenzene（８．６０ｇ、１８．０６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）及びＭｅＯＨ（２００ｍＬ）溶液に、反応混合物が薄い青色になるまで−７８℃でオゾンを通気した。オゾンを酸素ガスに置換した後、ＮａＢＨ４（８．６０ｇ、２１０ｍｍｏｌ）を数回に分けて添加した。反応混合物を徐々に温めた後、一晩室温で攪拌した。反応液を濃縮後、混合物をＣＨＣｌ３と飽和ＮＨ４Ｃｌとの間で分液した。水性層をＣＨＣｌ３で抽出した。混合した層を飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧除去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  ９：１）で精製し、上記式のトリオール化合物（８．５６ｇ  ｑｕａｎｔ．）を得た。
1H-NMR d 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.41 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.79 (s like, 6H), 3.53 (m, 6H), 3.48 (s like, 8H), 3.43-3.37 (m, 4H), 2.86 (s, 3H), 1.58-1.53 (m, 4H), 1.39 (m, 2H); 13C-NMR d 129.16, 113.69, 72.56, 72.50, 71.67, 70.46, 70.05, 70.00, 61.4, 55.30, 45.40, 29.56, 29.32, 22.92.【０１１７】
（工程３）【０１１８】
【化８】
0005593488.tif 000010
【０１１９】
1-((5-(3-(2-bromoethoxy)-2,2-bis((2-bromoethoxy)methyl)propoxy)pentyloxy)methyl)-4-methoxybenzene
工程２で得たトリオール化合物（2,2'-(2-((2-hydroxyethoxy)methyl)-2-((5-(4-methoxybenzyloxy)pentyloxy)methyl)propane-1,3-diyl)bis(oxy)diethanol （２．９１ｇ、６．１４ｍｍｏｌ）及びＰＰｈ３（６．４３g、２４．５１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に、ＣＢｒ４（８．１４ｇ、２４．５１ｍｍｏｌ）を０℃で数回に分けて添加した。混合物を一晩室温で攪拌した。ジエチルエーテルを混合物に添加し、沈殿物を濾過した。濾液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ  ９：１−４：１）で精製して上記式の三臭化物（３．４８ｇ、８６％）を得た。
1H-NMR d 7.25 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.42 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.74-3.71 (m, 6H), 3.47 (s, 8H), 3.47-3.38 (m, 6H), 1.7-1.50 (m, 4H), 1.40 (m, 2H); 13C-NMR d 129.12, 113.66, 72.53, 71.33, 71.14, 70.08, 69.38, 68.88, 55.29, 45.72, 30.82, 29.63, 22.97.【０１２０】
（工程４）【０１２１】
【化９】
0005593488.tif 000011
【０１２２】
1-((5-(3-(2-azidoethoxy)-2,2-bis((2-azidoethoxy)methyl)propoxy)pentyloxy)methyl)-4-methoxybenzene
工程３で得た三臭化物（1-((5-(3-(2-bromoethoxy)-2,2-bis((2-bromoethoxy)methyl)propoxy)pentyloxy)methyl)-4-methoxybenzene （３．４８ｇ、５．２７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、ＮａＮ３（５．２７ｇ、８１．０８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を５０℃で４時間攪拌した。混合物をＥｔＯＡｃ及び飽和ＮａＨＣＯ３で希釈した。水性層をＥｔＯＡｃで抽出した。混合した層を飽和食塩水で洗浄した。Ｎａ２ＳＯ４で混合物を乾燥後、溶媒を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ  ７：３）で精製し、上記式のトリアジド化合物（２．８４ｇ、９８％）を得た。
1H-NMR d 7.23 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.41 (s, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.59 (t, J = 4.8 Hz, 6H), 3.47 (s, 8H), 3.44-3.28 (m, 10H), 1.61-1.55 (m, 4H), 1.39 (m, 2H); 13C-NMR d 129.04, 113.63, 72.53, 71.32, 70.46, 70.13, 69.71, 68.85, 55.32, 50.86, 45.12, 29.70, 23.04.【０１２３】
（工程５）【０１２４】
【化１０】
0005593488.tif 000012
【０１２５】
5-(3-(2-azidoethoxy)-2,2-bis((2-azidoethoxy)methyl)propoxy)pentan-1-ol
工程４で得たＰＭＢエーテル（２．６３ｇ、４．７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２０ｍＬ）溶液に、ＤＤＱ（１．３０ｇ、５．７５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。添加後、氷浴を取り除き、室温で撹拌した。５時間後、反応をクエン酸緩衝液で停止させ、水性層をＥｔＯＡｃで抽出した。混合した層を飽和ＮａＨＣＯ３及び飽和食塩水で洗浄した。有機層はＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、溶媒を除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ  １：１）で精製し、上記式のアルコール化合物（１．５５ｇ、７５％）を得た。
1H-NMR d 3.64-3.58 (m, 8H), 3.46 (s, 6H), 3.41-3.38 (m, 4H), 3.31-3.28 (m, 6H), 1.57-1.55 (m, 4H), 1.41 (m, 2H); 13C-NMR d 71.20, 70.46, 69.67, 68.84, 62.92, 50.86, 45.08, 32.57, 29.36, 22.56.【０１２６】
（工程６）【０１２７】
【化１１】
0005593488.tif 000013
【０１２８】
5-(3-(2-azidoethoxy)-2,2-bis((2-azidoethoxy)methyl)propoxy)pentanoic acid
工程５で得たアルコール化合物（１．５５ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）のアセトン（２０ｍＬ）溶液に、ジョーンズ試薬を０℃で添加した。過剰のジョーンズ試薬をｉＰｒＯＨで破壊し、沈殿物を濾過した。濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ  ７：３−１：１）で精製し、上記式の酸（１．３７ｇ、８６％）を得た。
1H-NMR d 3.72 (t, J = 6.0 Hz, 3H), 3.60 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 3.47 (s, 8H), 3.44-3.40 (m, 4H), 3.32 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 2.83 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 1,70 (m, 2H), 1.60 (m, 2H); 13C-NMR d177.69, 77.21, 70.77, 70.48, 69.68, 68.96, 50.87, 45.11, 33.55, 28.93, 21.81.【０１２９】
（工程７）【０１３０】
【化１２】
0005593488.tif 000014
【０１３１】
tert-butyl 5-(5-(3-(2-azidoethoxy)-2,2-bis((2-azidoethoxy)methyl)propoxy)pentanamido)pentylcarbamate
工程６で得た酸（１．６５ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）、N-(tert-butoxycarbonyl)-1,5-diaminopentane（１．５６ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）及びＨＯＢｔ（１．０３ｇ、７．６０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液に、ＷＳＣＤＩ（１．４７ｇ、７．６９ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を一晩室温で攪拌し、ＣＨＣｌ３及び飽和ＮＨ４Ｃｌで希釈した。水性層をＣＨＣｌ３で抽出した。混合した層を飽和ＮａＨＣＯ３及び飽和食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＥｔＯＡｃ  １：１-EtOAc only）で精製し、上記式のアミド化合物（２．１８ｇ、９０％）を得た。
1H-NMR d 5.60 (bs, 1H), 4.55 (bs, 1H), 3.72 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.62 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.47-3.41 (m, 12H), 3.30 (t, J = 4.8 Hz, 4H), 3.22 (q, J = 6.4 H, 2H), 3.10 (m, 2H), 2.17 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 1.70-1.46 (m, 7H), 1.43 (s, 9H), 1.34 (m, 3H), 13C-NMR d172.64, 155.87, 77.21, 71.15, 71.13, 70.99, 70.94, 70.50, 69.73, 69.69, 69.36, 68.97, 50.91, 45.35, 45.11, 40.35, 39.36, 36.56, 31.00, 29.88, 20.40, 29.23, 28.55, 24.09, 22.77.【０１３２】
（工程８）【０１３３】
【化１３】
0005593488.tif 000015
【０１３４】
実施例１の１．で得たＳＮ３８−ＰＥＧのＢｏｃ化合物（０．５２g、０．２７０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶かし、ＴＦＡ（２ｍＬ）を加えて室温において２時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、トルエンを加え、さらに濃縮、真空下乾燥した。この残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解し、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．５７ｍｍｏｌ、３．２４ｍｍｏｌ）を０℃にて加え、無水スクシイミド（３０ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）を加え、室温にて終夜撹拌した。反応液をＬＨ２０(ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  １：１）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  ９：１−４：１）にて精製した。
一方で、工程７で合成したトリアジド（６３ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）のジオキサン（１ｍＬ）と水（１ｍＬ）の溶液にトリフェニルホスフィン（１０５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下室温にて終夜撹拌した。
反応液を濃縮し、上のカルボン酸をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶かし加え、これにＨＯＢｔ（５４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＷＳＣＤＩ（７６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を終夜室温にて撹拌し、反応液をＬＨ２０（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  １：１）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  ９：１−４：１）にて精製し、０．２２ｇを得た。これをＣＨ２Ｃｌ２（４．５ｍＬ）とＴＦＡ（０．５ｍＬ）に溶かし、１時間室温にて撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。これをＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）に溶かし、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．１ｍＬ）を加え、N-succimidyl 3-Maleimidopropionate（１３ｍｇ、０． ４７０ｍｍｏｌ）を加えた。室温にて２時間撹拌し、これをＬＨ２０（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  １：１）、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ  ９：１−４：１）にて精製し、６５ｍｇの目的物を得た。【０１３５】
（参考例３）
抗コラーゲンタイプＩＶ抗体を産生するハイブリドーマクローン３５−４（ラット抗マウスコラーゲンタイプＩＶ抗体  ＩｇＧ２ａ）、６−１（マウス抗ヒトコラーゲンタイプＩＶ抗体  ＩｇＭ）、６−２（マウス抗ヒトコラーゲンタイプＩＶ抗体  ＩｇＭ）及び５６Ｐ−１（マウス抗ヒトコラーゲンタイプＩＶ抗体  ＩｇＭ）より抗体のＶＬ及びＶＨ部位をクローニングし、ヌクレオチド配列を決定した。【０１３６】
Gillilandらの方法（Tissue Antigen 1996: 47: 1-20）を参考にして、Constant region内の特定配列を元にプライマーを設計し、５’−ＲＡＣＥ法によりＶＬおよびＶＨを取得し、プロメガ社のｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ）にクローニングした。全てのクローンに関して特異的なシングルバンドが検出されたため、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥａｓｙベクターにＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ法によりクローニングし、塩基配列を解析した。【０１３７】
（結果）
ハイブリドーマクローン３５−４から得られた重鎖Ｇ２ａのＶＨ部位の塩基配列を配列番号１に示す。ｒＩｇＧ２ａクローンＢＣ０８８２４０．１の対応するｃＤＮＡ配列（配列番号９）とのアライメントの結果を、図８に示す。
ハイブリドーマクローン３５−４から得られた重鎖Ｇ２ａのＶＨ部位の塩基配列から推定されたアミノ酸配列を配列番号１２に示す。ｒＩｇＧ２ａクローンＢＣ０８８２４０．１の対応するアミノ酸配列（配列番号２０）とのアライメントの結果を、図９に示す。【０１３８】
ハイブリドーマクローン６−１、６−２及び５６Ｐ−１から得られた重鎖ＭｕのＶＨ部位の塩基配列を、それぞれ配列番号３、５及び７に示す。ＩｇＭ可変領域クローンＪ００５２９．１及びＩｇＭ定常領域クローンＶ００８２７．１の対応するｃＤＮＡ配列（配列番号１０）とのアライメントの結果を、図１０に示す。
ハイブリドーマクローン６−１、６−２及び５６Ｐ−１から得られた重鎖ＭｕのＶＨ部位の塩基配列から推定されたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４、１６及び１８に示す。ＩｇＭ可変領域クローンＪ００５２９．１及びＩｇＭ定常領域クローンＶ００８２７．１の対応するアミノ酸配列（配列番号２１）とのアライメントの結果を、図１１に示す。【０１３９】
ハイブリドーマクローン３５−４、６−１、６−２及び５６Ｐ−１から得られたκ鎖のＶＬ部位の塩基配列を、それぞれ配列番号２、４、６及び８に示す。κ鎖クローンＢＣ０８８２５５．１の対応するｃＤＮＡ配列（配列番号１１）とのアライメントの結果を、図１２に示す。
ハイブリドーマクローン３５−４、６−１、６−２及び５６Ｐ−１から得られたκ鎖のＶＬ部位の塩基配列から推定されたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３、１５、１７及び１９に示す。κ鎖クローンＢＣ０８８２５５．１の対応するアミノ酸配列（配列番号２２）とのアライメントの結果を、図１３に示す。【０１４０】
ＶＬ及びＶＨの長さは通常１１０アミノ酸程度であることが示されており、今回５’−ＲＡＣＥ法によりクローニングされた配列の長さは同程度であったため、ＶＬ及びＶＨの全長のｃＤＮＡ配列が得られたと考えられる。この得られた配列を用いることにより、常法によりキメラ抗体やヒト化抗体を設計し、調製することが可能となる。【０１４１】
（参考例４）
ヒト膵癌の手術標本を、抗ヒトフィブリン抗体（国立がんセンター作成）で染色した。腫瘍組織内の間質に、多くのフィブリン塊が認められた。【０１４２】
一方、ヌードマウスに皮下移植されたヒト大腸癌株ＨＴ２９により生じた腫瘍中の間質フィブリンの分布を、抗マウスフィブリン抗体（国立がんセンター作成）で染色を行うことにより観察した。腫瘍組織内の間質に豊富なフィブリンが認められた。【０１４３】
（参考例５）
抗体の生体イメージング
抗マウスフィブリン抗体（国立がんセンター作成）の腫瘍集積性を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス背部にＨＴ２９を移植し、移植１０日後に抗マウスフィブリン抗体（ＩＲＤｙｅ８００（Ｌｉ−Ｃｏｒ）により標識化）をマウス尾静脈より投与した。投与後の抗体の分布を生体イメージング装置ＯＶ１１０（Ｏｌｙｍｐｕｓ）により解析した。
投与後においても、抗マウスフィブリン抗体の腫瘍組織内における集積が認められることから、抗フィブリン抗体は腫瘍への集積性が高いことが示された。【０１４４】
以上の結果から、フィブリンに対して特異的結合能を有する物質をターゲッティングに用いると、腫瘍組織中に抗腫瘍性化合物を長期間留まらせておくことが可能であることが示唆された。【０１４５】
（実施例６）
抗フィブリン抗体−ＳＮ−３８複合体（エステル結合の態様）の製造
ヒトフィブリノゲンをフィブリンに変換し、ヒトフィブリンでマウスを免疫することにより、ヒトフィブリンを特異的に認識するモノクローナル抗体を得た。本抗体はマウスフィブリンにも交差反応した。本抗体の可変部分のｃＤＮＡ配列を明らかにし、該可変領域と、ヒトＦｃ部分とを含むキメラ抗体を作成した。
実施例１と同様に、抗フィブリン抗体−ＳＮ−３８複合体を製造した。ここで得られる複合体においては、ＳＮ−３８がエステル結合を介してリンカーに結合している。得られた複合体の模式図を下に示す。【０１４６】
【化１４】
0005593488.tif 000016
【０１４７】
（実施例７）
抗フィブリン抗体−ＳＮ−３８複合体（カルバメート結合の態様）の製造【０１４８】
【化１５】
0005593488.tif 000017
【０１４９】
tert-butoxycarbonyl amino pentanamine (1.00 g, 4.95 mmol)とトリエチルアミン(1.3 mL) の塩化メチレン溶液（10 mL） にトリホスゲン（483 mg, 1.63 mmol） を数回に分けて０℃にて加えた。反応液を２時間撹拌後、沈殿物を窒素雰囲気下、セライト濾過した。ろ液をSN-38(1.21 g, 3.10 mmol) とDMAP (375 mg, 3.10 mmol) のTHF (20 mL) の懸濁液に０℃にて加えた。反応液を窒素雰囲気下、室温にて一日撹拌した。分子ふるいカラム（LH20 CHCl3:MeOH 1:1）,シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3:MeOH 20:1-10:1)により精製しカーバメート(828 mg, 43%) を無色泡状物質として得た。【０１５０】
【化１６】
0005593488.tif 000018
【０１５１】
Boc 化合物（52.0 mg, 0.084 mmol） をCH2Cl2-TFA (1:10, 1.1 mL) に溶解し、室温にて３時間撹拌した。トルエン(50 mL) 反応液を濃縮した。残さに塩化メチレン(2 mL) を加え、i-Pr2NEt (0.3 mL) と PEG-succimide (200 mg)を０℃にて加えた。室温にて３時間撹拌後、反応液をLH20 (MeOH:CHCl3 1:1) とシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3: MeOH 10:1)により精製し、111.9 mg (69%)のPEG付加体を得た。【０１５２】
【化１７】
0005593488.tif 000019
【０１５３】
Boc 体を(330 mg, 0.171 mmol)を塩化メチレン（4 mL）に溶解し、TFA (0.4 mL) を加えて、２時間撹拌した。トルエン（５０mL）を加えて、反応液を濃縮した。残さを塩化メチレン (4 mL)に溶かし、i-Pr2NEt (0.15 mL, 0.884 mmol) と MAL-PEG12-succimide (148 mg, 0.171 mmol) を0 °Cにて加えた。２時間撹拌後、反応液をSX-4 (toluene) とシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CHCl3:MeOH 20:1-10:1)により精製し、 157 mg の目的物を得た。 
ここで得られる複合体においては、ＳＮ−３８がカルバメート結合を介してリンカーに結合している。得られた複合体の模式図を下に示す。【０１５４】
【化１８】
0005593488.tif 000020
【０１５５】
（実施例８）
ｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
ヒト大腸癌ＨＴ２９をヌードマウスに皮下移植して、腫瘍径が６ｍｍに達したとき、実施例６で得られた抗フィブリン抗体−ＳＮ−３８複合体（以下Ｆｉｂ−Ｅ）、実施例７で得られた抗フィブリン抗体−ＳＮ−３８複合体（以下Ｆｉｂ−Ｎ）、又は生理食塩水（コントロール）を静脈内投与し（ＳＮ−３８換算で各３ｍｇ／ｋｇ）、投与後２０日目の腫瘍径の大きさをモニターした。結果を図１４に示す。
いずれの抗フィブリン抗体−ＳＮ−３８複合体も高い抗腫瘍効果を示したが、Ｆｉｂ−Ｅのほうが、Ｆｉｂ−Ｎよりも高い抗腫瘍効果を示した。【０１５６】
以上の結果から、フィブリンに対して特異的結合能を有する物質をターゲッティングに用いた場合においても、高い抗腫瘍効果を達成し得ることが示唆された。また、抗腫瘍化合物をエステル結合で複合体に結合させることにより、より高い抗腫瘍効果が期待できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１５７】
本発明によれば、腫瘍間質に特異的且つ長時間留まり、優れた抗腫瘍効果を発揮する複合体が提供される。特に、本発明の複合体を用いれば、時間依存性の抗腫瘍効果を有する抗腫瘍性化合物の抗腫瘍効果を有効に発揮させることが可能となる。また、腫瘍血管及び／又は腫瘍細胞に作用するので、従来の複合体よりも著しく高い抗腫瘍効果が望める。【０１５８】
本出願は、日本で出願された特願２００８−２９３９３０（出願日：２００８年１１月１７日）及び特願２００９−１２５８７１（出願日：２００９年５月２５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図８】
0005593488.tif 000021
【図９】
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【図１０】
0005593488.tif 000023
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１４】
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【配列表】
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