(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
莢膜多糖／付着因子を調製する方法であって、以下：
粗莢膜多糖／付着因子調製物を細菌培養物から抽出する工程、
高分子量莢膜多糖／付着因子濃縮材料を、該粗莢膜多糖／付着因子調製物から単離する工程、
不純な莢膜多糖／付着因子を、該高分子量莢膜多糖／付着因子濃縮材料から沈澱させる工程、
該不純な莢膜多糖／付着因子を塩基とともにインキュベートして、半ば純粋な莢膜多糖／付着因子調製物を得る工程、
該調製物を酸で中和する工程、および
該中和された調製物をフッ化水素酸中でインキュベートして、莢膜多糖／付着因子を調製する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記莢膜多糖／付着因子が、２５，０００より大きな分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記莢膜多糖／付着因子が、３０，０００より大きな分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記莢膜多糖／付着因子が、１００，０００より大きな分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記莢膜多糖／付着因子が、ワクチンとして処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記莢膜多糖／付着因子が、１．０％未満のホスフェートを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記莢膜多糖／付着因子が、医療で用いるためのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
キャリア化合物が、前記莢膜多糖／付着因子に結合体化される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記キャリア化合物が、リンカーを介して前記莢膜多糖／付着因子に結合体化される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
莢膜多糖／付着因子に対する抗体を産生するための方法であって、以下：
粗莢膜多糖／付着因子調製物を細菌培養物から抽出する工程、
高分子量莢膜多糖／付着因子濃縮材料を、該粗莢膜多糖／付着因子調製物から単離する工程、
不純な莢膜多糖／付着因子を、該高分子量莢膜多糖／付着因子濃縮材料から沈澱させる工程、
該不純な莢膜多糖／付着因子を塩基とともにインキュベートして、半ば純粋な莢膜多糖／付着因子調製物を得る工程、
該調製物を酸で中和する工程、
該中和された調製物をフッ化水素酸中でインキュベートして、莢膜多糖／付着因子を得る工程、および、
該莢膜多糖／付着因子に対する抗体を産生する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記抗体が、前記莢膜多糖／付着因子およびアジュバントに対して惹起される、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  （発明の分野）
本発明は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染の予防のために免疫を誘導するに有用な多糖組成物に関する。本発明はまた、多糖物質および多糖物質に対する抗体を用いて、診断キットを作製および使用する方法、ならびに能動免疫および受動免疫を誘導するための方法に関する。詳細には、この多糖は、莢膜多糖／付着因子である。
【０００２】  （発明の背景）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、通常、ヒトの皮膚および粘膜（ｍｕｃｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に住み着き、そしてコロニーを形成する、グラム陽性細菌である。皮膚または粘膜が、手術または他の外傷の間に損傷を受けた場合、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは、内部組織に接近できるようになって、感染を発症させ得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓが、局所的に増殖するかまたはリンパもしくは血液系に侵入する場合、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌症に関連した合併症のような、深刻な感染合併症がもたらされ得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌血症に関連した合併症としては、敗血症性ショック、心内膜症、関節炎、骨髄炎、肺炎、および種々の器官における膿瘍が挙げられる。
【０００３】  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓとしては、遊離のコアグラーゼを生成するコアグラーゼ陽性生物およびこの遊離のコアグラーゼを生成しないコアグラーゼ陰性生物の両方が挙げられる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、最も普通のコアグラーゼ陽性形態のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは一般に、感染を、脈管外または脈管内のいずれかの局所部位で引き起こし、これは最終的に菌血症をもたらし得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓはまた、急性骨髄炎の主な原因であり、そして少数のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ肺炎感染を引き起こす。さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、約１〜９％の細菌性髄膜炎の症例および１０〜１５％の脳膿瘍の原因である。少なくとも２１種の公知のコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓが存在し、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｓａｐｒｏｐｈｉｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ、およびＳ．ｃａｐｉｔｉｓが挙げられる。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、静脈内アクセスデバイスに関連した最も頻繁な感染原因因子であり、そして一次院内菌血症において最も頻繁な単離体である。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓはまた、補てつ弁心内膜炎に関連する。
【０００４】  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓはまた、動物における一般的な細菌感染源である。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ乳腺炎は、ウシ、ヒツジおよびヤギを含む反芻動物における共通の問題である。この疾患は一般に、感染を減少させるために抗生物質を用いて処置されるが、この処置は費用のかかる手順であり、そしてさらに乳汁生産の損失をもたらす。今日までに同定された最も有効なワクチンは、皮下投与される、生のインタクトなＳ．ａｕｒｅｕｓワクチンである。しかし、生ワクチンの投与は、感染の危険を伴う。この理由から、多くの研究者は、死菌Ｓ．ａｕｒｅｕｓワクチンを生成することおよび／またはＳ．ａｕｒｅｕｓに対する免疫を誘導する莢膜多糖もしくは細胞壁成分を単離することを試みてきた。しかし、これらの試みはいずれも成功しなかった。
【０００５】  Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、この生物が不利な浸透条件下で生存するのを可能にする、ペプチドグリカン複合体から構成される細胞壁成分を含み、そしてまた、このペプチドグリカンに連結した独特のテイコ酸を含む。細胞壁に対して外側に、薄い多糖莢膜が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの大部分の単離体を覆う。この血清学的に異なる莢膜は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの種々の単離体を血清型に分類するために用いられ得る。臨床的に有意な単離体の多くは、２つの莢膜型ＣＰ５およびＣＰ８を含むことが示されている。
【０００６】  ＣＰ５型は、以下の化学構造を有する：
→４）−β−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃＡ３Ａｃ−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃｐＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃｐＮＡｃ−（１→。
【０００７】  ＣＰ８型は、以下の化学構造を有する：
→３）−β−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃＡ４Ａｃ−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃｐＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃｐＮＡｃ−（１→。
【０００８】  １６００を超えるＳ．ａｕｒｅｕｓ単離体についての研究は、９３％が、５型または８型の莢膜多糖のいずれかのものであることを示した。さらに、乳腺炎を有するヒツジ、ヤギおよびウシ、ならびに骨髄炎を有するニワトリから単離された、８０％を超えるＳ．ａｕｒｅｕｓは、これらの２つの莢膜型のうちの少なくとも１つを含むことが実証された。ＣＰ５およびＣＰ８は構造的に類似するが、これらは免疫学的に異なることが実証されている。
【０００９】  （発明の要旨）
本発明は、コアグラーゼ陰性およびコアグラーゼ陽性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染に対する、ヒトおよび動物の受動免疫および能動免疫のための方法および生成物に関する。本発明によれば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの真の「莢膜」は、ＣＰ５層もしくはＣＰ８層を超えて外に広がるか、またはＣＰ５層もしくはＣＰ８層の代わりに生成されることが見出された。この物質は、莢膜多糖／付着因子（ＰＳ／Ａ）抗原であり、ほぼ均質になるまで精製され、そしてその構造が同定された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓのようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓから単離され得るネイティブなＰＳ／Ａ抗原は、コハク酸残基で高度に置換されている高分子量ポリグルコサミンであり、そしてポリ−β−１−６−Ｄ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）と呼ばれる。単離および精製されたＰＳ／Ａ抗原は、インビボで高度に免疫原性であることが見出された。
【００１０】  １つの局面では、本発明は、以下の構造：
【００１１】
【化５】
0005490341.tif 000002
を有する純粋なＰＳ／Ａの組成物であり、
ここで、ｎは、３以上の整数であり、Ｒは、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ2からなる群より選択され、ｍは２〜５であり、そしてこのＲ基のうちの少なくとも１０％は、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択される。他の好ましい実施態様では、このＲ基のうちの少なくとも５０％、７５％、または９０％が、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択される。この組成物は、１つの実施態様では、ワクチンとして処方される。好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、少なくとも９５％、９７％または９９％純粋である。好ましい骨格結合は、β１−６結合である。
【００１２】  好ましい実施態様では、ＰＳ／Ａのモノマー単位は、スクシネートで置換される。この実施態様では、このＲ基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨである。他の実施態様では、このＲ基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2からなる群より選択される。このＰＳ／Ａは、一種類のＲ基置換基で置換されてもよいし、または１より多くの種類のＲ基置換基で置換されてもよい。ＰＳ／Ａが一種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａは、ホモ置換ポリマーである。ＰＡ／Ｓが１より多くの種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａはヘテロ置換ポリマーである。
【００１３】  本発明のＰＳ／Ａは、３以上の反復モノマー単位のポリマーであり、それゆえ、低分子量を有し得る。本発明の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、２５，０００より大きな分子量を有する。別の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、３０，０００より大きな分子量を有する。なお別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、１００，０００より大きな分子量を有する。
【００１４】  この組成物はまた、このＰＳ／Ａに結合体化されたキャリア化合物を含み得る。このＰＳ／Ａがワクチンとして用いられ、そしてこのＰＳ／Ａが低分子量を有する場合、このＰＳ／Ａは、キャリア化合物に結合体化されることが好ましい。１つの実施態様では、このキャリア化合物は、リンカーを介してＰＳ／Ａに結合体化される。
【００１５】  別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、実質的にホスフェートを含まない。なお別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、テイコ酸を実質的に含まない。
【００１６】  別の局面では、本発明は、以下の構造：
【００１７】
【化６】
0005490341.tif 000003
を有するＰＳ／Ａの組成物であり、
ここで、ｎは、３以上の整数であり、Ｒは、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）3〜5−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ2からなる群より選択され、ｍは２〜５であり、そしてこのＲ基のうちの少なくとも１０％は、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）3〜5−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択される。他の好ましい実施態様では、このＲ基のうちの少なくとも５０％、７５％、または９０％が、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）3〜5−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択される。この組成物は、１つの実施態様では、ワクチンとして処方される。好ましい骨格結合は、β１−６結合である。
【００１８】  １つの実施態様では、このＰＳ／Ａは、一種類のＲ基置換基で置換されてもよいし、または１より多くの種類のＲ基置換基で置換されてもよい。ＰＳ／Ａが一種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａは、ホモ置換ポリマーである。ＰＳ／Ａが１より多くの種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａはヘテロ置換ポリマーである。
【００１９】  本発明の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、２５，０００より大きな分子量を有する。別の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、３０，０００より大きな分子量を有する。なお別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、１００，０００より大きな分子量を有する。
【００２０】  この組成物はまた、このＰＳ／Ａに結合体化されたキャリア化合物を含み得る。このＰＳ／Ａがワクチンとして用いられ、そしてこのＰＳ／Ａが低分子量を有する場合、このＰＳ／Ａは、キャリア化合物に結合体化されることが好ましい。１つの実施態様では、このキャリア化合物は、リンカーを介してＰＳ／Ａに結合体化される。
【００２１】  別の局面によれば、本発明は、以下の構造：
【００２２】
【化７】
0005490341.tif 000004
を有するＰＳ／Ａの組成物であり、
ここで、ｎは、３以上の整数であり、Ｒは、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨおよび−ＮＨ2からなる群より選択され、そしてこのＲ基のうちの１０％と９０％との間の％は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨである。他の好ましい実施態様では、このＲ基のうちの２０％と８０％との間の％、３０％と７０％との間の％、または４０％と６０％との間の％が、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨである。この組成物は、１つの実施態様では、ワクチンとして処方される。好ましい骨格結合は、β１−６結合である。
【００２３】  １つの実施態様では、このＰＳ／Ａは、一種類のＲ基置換基で置換されてもよいし、または１より多くの種類のＲ基置換基で置換されてもよい。ＰＳ／Ａが一種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａは、ホモ置換ポリマーである。ＰＡ／Ｓが１より多くの種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａはヘテロ置換ポリマーである。
【００２４】  本発明の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、２５，０００より大きな分子量を有する。別の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、３０，０００より大きな分子量を有する。なお別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、１００，０００より大きな分子量を有する。
【００２５】  この組成物はまた、このＰＳ／Ａに結合体化されたキャリア化合物を含み得る。このＰＳ／Ａがワクチンとして用いられ、そしてこのＰＳ／Ａが低分子量を有する場合、このＰＳ／Ａが、キャリア化合物に結合体化されることが好ましい。１つの実施態様では、このキャリア化合物は、リンカーを介してＰＳ／Ａに結合体化される。
【００２６】  本発明のなお別の局面によれば、反復モノマー単位から構成されるＰＳ／Ａの組成物であって、ここでこのモノマー単位は、β−１−６ポリグルコース、α−１−４ポリグルコース、α−１−３ポリグルコース、β−１−４ポリグルコース、β−１−３ポリグルコースおよびα−１−４ポリガラクトサミンからなる群より選択され、このモノマー単位のＣ２は、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ2からなる群より選択されるＲ基によって置換されており、ｍは２〜５であり、そしてこのＲ基のうちの少なくとも１０％は、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択される、組成物が提供される。この組成物は、１つの実施態様では、ワクチンとして処方される。
【００２７】  好ましくは、このモノマー単位は、β−１−６ポリグルコース、α−１−４ポリグルコース、α−１−３ポリグルコース、β−１−４ポリグルコースおよびβ−１−３ポリグルコースからなる群より選択される。好ましくは、このポリグルコースの骨格は、α−１−６フォーメーションにある。別の実施態様では、このポリグルコースの骨格は、β−１−４フォーメーションにある。別の実施態様によれば、このポリグルコースの骨格は、β−１−３フォーメーションにある。
【００２８】  好ましい実施態様によれば、このＲ基のうちの少なくとも５０％、７５％、または９０％が、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択される。
【００２９】  好ましい実施態様では、ＰＳ／Ａのモノマー単位は、スクシネートで置換される。この実施態様では、このＲ基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨである。他の実施態様では、このＲ基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2からなる群より選択される。このＰＳ／Ａは、一種類のＲ基置換基で置換されてもよいし、または１より多くの種類のＲ基置換基で置換されてもよい。ＰＳ／Ａが一種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａは、ホモ置換ポリマーである。ＰＡ／Ｓが１より多くの種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａはヘテロ置換ポリマーである。
【００３０】  本発明のＰＳ／Ａは、３以上の反復モノマー単位のポリマーであり、それゆえ、低分子量を有し得る。本発明の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、２５，０００より大きな分子量を有する。別の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、３０，０００より大きな分子量を有する。なお別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、１００，０００より大きな分子量を有する。
【００３１】  この組成物はまた、このＰＳ／Ａに結合体化されたキャリア化合物を含み得る。このＰＳ／Ａがワクチンとして用いられ、そしてこのＰＳ／Ａが低分子量を有する場合、このＰＳ／Ａは、キャリア化合物に結合体化されることが好ましい。１つの実施態様では、このキャリア化合物は、リンカーを介してＰＳ／Ａに結合体化される。
【００３２】  別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、実質的にホスフェートを含まない。なお別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、テイコ酸を実質的に含まない。
【００３３】  本発明の別の局面によれば、以下の構造：
【００３４】
【化８】
0005490341.tif 000005
を有するＰＳ／Ａの組成物であって、
ここで、ｎは、３以上の整数であり、Ｒは、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ2からなる群より選択され、ｍは２〜５であり、そしてこのＲ基のうちの少なくとも１０％は、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択され、そしてこのＰＳ／Ａがテイコ酸を実質的に含まない、組成物が提供される。他の好ましい実施態様では、このＲ基のうちの少なくとも５０％、７５％、または９０％が、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択される。この組成物は、１つの実施態様では、ワクチンとして処方される。好ましい骨格結合は、β１−６結合である。
【００３５】  好ましい実施態様では、ＰＳ／Ａのモノマー単位は、スクシネートで置換される。この実施態様では、このＲ基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨである。他の実施態様では、このＲ基は、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−（ＣＯＯＨ）2からなる群より選択される。このＰＳ／Ａは、一種類のＲ基置換基で置換されてもよいし、または１より多くの種類のＲ基置換基で置換されてもよい。ＰＳ／Ａが一種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａは、ホモ置換ポリマーである。ＰＡ／Ｓが１より多くの種類のＲ基置換基で置換される場合、このＰＳ／Ａはヘテロ置換ポリマーである。
【００３６】  本発明のＰＳ／Ａは、３以上の反復モノマー単位のポリマーであり、それゆえ、低分子量を有し得る。本発明の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、２５，０００より大きな分子量を有する。別の好ましい実施態様では、このＰＳ／Ａは、３０，０００より大きな分子量を有する。なお別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、１００，０００より大きな分子量を有する。
【００３７】  この組成物はまた、このＰＳ／Ａに結合体化されたキャリア化合物を含み得る。このＰＳ／Ａがワクチンとして用いられ、そしてこのＰＳ／Ａが低分子量を有する場合、このＰＳ／Ａは、キャリア化合物に結合体化されることが好ましい。１つの実施態様では、このキャリア化合物は、リンカーを介してＰＳ／Ａに結合体化される。
【００３８】  別の実施態様では、このＰＳ／Ａは、実質的にホスフェートを含まない。
【００３９】  別の局面では、本発明は、以下の方法に従って調製された純粋なＰＳ／Ａの多糖である：粗ＰＳ／Ａ調製物を細菌培養物から抽出する工程；高分子量ＰＳ／Ａ濃縮材料を、この粗ＰＳ／Ａ調製物から単離する工程；不純なＰＳ／Ａを、この高分子量ＰＳ／Ａ濃縮材料から沈澱させる工程；この不純なＰＳ／Ａを塩基とともにインキュベートして、半ば純粋なＰＳ／Ａ調製物を得る工程；この調製物を酸で中和する工程；およびこの中和された調製物を、フッ化水素酸中でインキュベートして純粋なＰＳ／Ａを得る工程。
【００４０】  好ましい実施態様では、この細菌培養物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ培養物である。別の好ましい実施態様では、この細菌培養物は、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ培養物である。
【００４１】  別の局面では、本発明は、被験体におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染に対する能動免疫を誘導する方法である。この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに対する能動免疫を誘導するために有効な量の、上記のいずれかの組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００４２】  １つの実施態様では、この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる感染に対する免疫を誘導するための方法である。別の実施態様では、この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓによる感染に対する免疫を誘導するための方法である。
【００４３】  本発明の別の局面によれば、被験体におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる感染に対する受動免疫を誘導する方法が提供される。この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのオプソニン作用を誘導するために有効な量の、抗ＰＳ／Ａ抗体を被験体に投与する工程を含む。
【００４４】  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓは、入院患者における細菌感染の最も普通の原因である。本発明の１つの局面によれば、被験体におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる感染に対する能動免疫を誘導する方法が提供される。この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する能動免疫を誘導するために有効な量の、ポリグルコサミン骨格を有する高分子量多糖を被験体に投与する工程を含み、ここでこのポリグルコサミン骨格の個々のグルコサミン単位のうちの少なくとも１０％が、スクシネートに結合体化されている。好ましい実施態様では、このポリグルコサミン骨格は、β−１−６フォーメーションにある。
【００４５】  純粋な多糖を調製する方法もまた、本発明の別の局面である。本方法は、粗ＰＳ／Ａ調製物を細菌培養物から抽出する工程、高分子量ＰＳ／Ａ濃縮材料を、この粗ＰＳ／Ａ調製物から単離する工程、不純なＰＳ／Ａを、この高分子量ＰＳ／Ａ濃縮材料から沈澱させる工程、この不純なＰＳ／Ａを塩基または酸とともにインキュベートして、半ば純粋なＰＳ／Ａ調製物を得る工程、この調製物を中和する工程、およびこの中和された調製物を処理して、純粋なＰＳ／Ａを得る工程を含む。
【００４６】  いくつかの実施態様では、この不純なＰＳ／Ａは、塩基とともにインキュベートされ、酸で中和され、次いでフッ化水素酸で処理されて純粋なＰＳ／Ａを生成する。他の実施態様では、この純粋なＰＳ／Ａは、塩基または酸とともにインキュベートされ、そしてそれぞれ、酸または塩基で中和される。次いで、この調製物は、脱イオン水に対する透析によって処理され、凍結乾燥され、そして緩衝液中に再懸濁される。
【００４７】  本発明の別の局面では、純粋な多糖を調製する別の方法が提供される。この方法は、細菌培養物を、強塩基または強酸とともにインキュベートすることによって酸または塩基の溶液を調製する工程を含む。次いで、この酸または塩基の溶液は、ｐＨ７へと中和して、粗抗原懸濁液を生成する。粗抗原懸濁液は、脱イオン水のような溶液に対して透析され、そして不溶性粗抗原が収集され得る。いくつかの実施態様では、この不溶性粗抗原が、凍結乾燥され得、次いで緩衝液中に再懸濁され得る。いくつかの実施態様では、この緩衝液は、５０ｍＭ  ＰＢＳと１５０ｍＭ  ＮａＣｌを有する１００ｍＭ  Ｔｒｉｓとからなる群より選択される。他の実施態様では、強塩基または強酸は、１Ｍより大きいＮａＯＨまたはＨＣｌである。他の実施態様では、強塩基または強酸は、５Ｍ  ＮａＯＨまたはＨＣｌである。別の実施態様では、細菌培養抽出物は、強塩基または強酸中で、１８〜２４時間攪拌される。なお別の実施態様では、この強塩基抽出または強酸抽出が繰り返される。
【００４８】  別の局面では、本発明は、抗ＰＳ／Ａ抗体の組成物であり、ここでこの抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのオプソニン作用を誘導し、そしてこの抗体は、不純なＰＳ／Ａ調製物と交叉反応しない。好ましい実施態様では、抗ＰＳ／Ａ抗体は、モノクローナル抗体である。別の好ましい実施態様では、抗ＰＳ／Ａ抗体は、ポリクローナル抗体である。
【００４９】  本発明の各々の限定は、本発明の種々の実施態様を包含し得る。それゆえ、いずれか１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の各々の限定が、本発明の各々の局面において含まれ得ることが予想される。
【００５０】  （配列の簡単な説明）
配列番号１は、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号Ｕ４３３６６の下で寄託したｉｃａ遺伝子座の核酸配列である（先行技術）。
【００５１】  配列番号２は、ｉｃａについての正方向プライマー配列である。
【００５２】  配列番号３は、ｉｃａについての逆方向プライマー配列である。
【００５３】  （発明の詳細な説明）
本発明は、細菌感染に対する免疫を誘導するため、そしてまた診断および治療の目的のための抗体を生成するために有用であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌由来のマイクロカプセルに関する。このマイクロカプセルは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓもしくはコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓから単離され得るか、またはデノボで合成され得る、ＰＳ／Ａ調製物である。ＰＳ／Ａは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ細胞外層の成分であるとは以前には同定されていない。本発明の前には、２つの化学的に関連する血清型の莢膜（莢膜多糖ＣＰ５およびＣＰ８と呼ばれる）がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株のうちの９０％によって生成されることが実証されていた。これらの莢膜多糖は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの免疫認識を誘導することの原因であると考えられていた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ＣＰ５層またはＣＰ８層を超えて外に広がるかまたはそれらを置換するかのいずれかである真の莢膜を含み、そして免疫応答を誘発することの原因であることが本発明に従って見出された。本明細書中に提示される実施例において実証されるように、このＰＳ／Ａ抗原は、インビボで投与される場合、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに対するオプソニン防御性抗体を生成し得る。
【００５４】  本発明の前には、本願の発明者は、ＰＳ／Ａであるコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの莢膜の一部の同定および特徴付けを行った（Ｇｅｒａｌｄ  Ｂ．Ｐｉｅｒに対して発行された米国特許第５，０５５，４５５号）。コアグラーゼ陰性ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのＰＳ／Ａが、細胞表面および生体膜（ｂｉｏｆｉｌｍ）層の一成分であり、そして細菌細胞を宿主防御（例えば、オプソノファゴサイトーシス（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ））から保護することに関与することが見出された（Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．，Ｍ．Ｔｏｊｏ，Ｄ．Ａ．Ｇｏｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ｄ．ＴｏｓｔｅｓｏｎおよびＧ．Ｂ．Ｐｉｅｒ．（１９９０）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１６２：４３５．Ｔｏｊｏ，Ｍ．，Ｎ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｄ．Ａ．ＧｏｌｄｍａｎｎおよびＧ．Ｂ．Ｐｉｅｒ．（１９８８）Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１５７：７１３．Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｄ．Ａ．およびＧ．Ｂ．Ｐｉｅｒ．（１９９３）Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６：１７６）。しかし、ＰＳ／Ａの化学構造は、単離されたＰＳ／Ａを精製することに関連する困難性によって、同定されなかった。約９０％の純度の調製物を達成することのみが可能であった。本発明の方法に従って、ＰＳ／Ａ抗原が単離され、そして精製されて、純粋なＰＳ／Ａ調製物が達成された。
【００５５】  本明細書中で用いられる場合、「純粋な莢膜多糖／付着因子」は、単離または合成され、そして９２％より高い純度で夾雑物を含まない、ＰＳ／Ａ調製物である。好ましくは、この物質は、９５％より高い純度で、さらには９７％または９９％より高い純度で夾雑物を含まない。このＰＳ／Ａ抗原の純度の程度は、当該分野で公知の任意の手段によって評価され得る。例えば、この純度は、この物質の構造的局面を立証するために化学分析アッセイならびにガスクロマトグラフィーおよび核磁気共鳴によって評価され得る。
【００５６】  先行技術のＰＳ／Ａ抗原の１つの主要な夾雑物は、リン酸含有テイコ酸であった。先行技術の抗原のテイコ酸夾雑物は、この抗原の化学的特徴付けおよび免疫原性の両方を妨害した。ＰＳ／Ａを単離するために先行技術において用いられる手順は、夾雑しているテイコ酸をＰＳ／Ａ調製物から除去するためには充分ではなく、ＰＳ／Ａ抗原の化学的特徴付けを不可能にした。本明細書中に記載される本発明の方法は、テイコ酸を実質的に含まない、単離されたＰＳ／Ａ抗原調製物を生成し得る。テイコ酸を実質的に含まないＰＳ／Ａ調製物は、１．０％未満のホスフェートを有するものである。いくつかの実施態様では、テイコ酸を実質的に含まないＰＳ／Ａ調製物は、０．１％未満のホスフェートを有するものである。このサンプル中に存在するホスフェートの量は、当該分野で公知の任意の手段によって評価され得る。以下の実施例に記載されるように、ホスフェート夾雑物量は、本明細書中に参考として援用されるＫｅｌｅｔｉ，Ｇ．およびＷ．Ｈ．Ｌｅｄｅｒｅｒ（１９７４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される方法を用いて評価され得る。手短には、このアッセイは以下の通りに行われる：１００μｇのサンプルに対して、４３．５ｍｌの水、６．５ｍｌの７０％過塩素酸（ＨＣＬＯ4）および５０ｍｌの２０Ｎ硫酸（Ｈ2ＳＯ4）を一緒に添加することにより作製される１００μｌの溶液を添加する。これを、大理石をチューブの頂部においた状態でチューブ中で９５℃にて２時間加熱する。次いで、この混合物を１６５℃のオーブン中に配置し、そしてさらに２時間加熱し、次いで室温まで冷ます。次いで、１ｍｌの試薬５（以下の方法により作製される）をこのサンプルに添加する：
試薬１：１０ｍｌの水に溶解した１．３６ｇの酢酸ナトリウム．３Ｈ2Ｏ；
試薬２：２０ｍｌの水中に溶解した５００ｍｇモリブデン酸アンモニウム；
試薬３：２ｍｌの試薬１、２ｍｌの試薬２および１６ｍｌの水；
試薬４：使用の直前に調製した、２０ｍｌの水に溶解した２ｇのアスコルビン酸；
試薬５：氷浴中で９ｍｌの試薬３および１ｍｌの試薬４を添加する。
【００５７】  試薬５を添加した後、このチューブを徹底的に混合し、そして光学密度を分光光度計で８２０ナノメートルで読み取る。第一リン酸ナトリウム（チューブ１本当り０．１〜５μｇの範囲）からなる標準曲線を用いて、試験サンプル中に存在するホスフェートの量を算出する（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．，Ｎ．Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．Ｙ．Ｌｅｉｎｅｒ，Ｍ．Ｌ．ＷｕおよびＡ．Ｌ．Ｆａｒｒ．，（１９５４）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０７，１）。
【００５８】  １つの局面では、本発明は、以下の構造：
【００５９】
【化９】
0005490341.tif 000006
を有する純粋なＰＳ／Ａの組成物であり、
ここで、ｎは、３以上の整数であり、Ｒは、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、および−ＮＨ2からなる群より選択され、ｍは２〜５であり、そしてこのＲ基のうちの少なくとも１０％は、−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、−ＮＨ−（ＣＨ2）m−（ＣＯＯＨ）2、および−ＮＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨからなる群より選択される。ネイティブな物質は、β１−６結合を有する。これは、本発明のＰＳ／Ａ抗原における好ましい骨格結合である。
【００６０】  本発明のこの局面では、ＰＳ／Ａ抗原は、互いに連結された少なくとも部分的に置換されたグルコサミン残基のホモポリマーである。グルコサミン残基のうちの少なくとも１０％は、一般式ＣＯＯＨ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨ、ＣＨ3−（ＣＨ2）m-1−（ＣＯＯＨ）2、またはＣＨ3−（ＣＨ2）m-1−ＣＯＯＨの短鎖脂肪酸基で置換され、ここでｍ＝２〜５である。他の実施態様では、このガラクトサミン残基は、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％または１００％の上記に提供された式の短鎖脂肪酸で置換され得る。好ましくは、このグルコサミン残基は、式ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m−ＣＯＯＨのジカルボン酸で置換される。より好ましくは、このグルコサミン残基は、コハク酸で置換される。この置換は、ホモ置換またはヘテロ置換であり得る。ホモ置換は、グルコサミン残基が一種類の置換基で置換されているものである。例えば、グルコサミン残基は、コハク酸残基のみで置換され得る。ヘテロ置換では、このグルコサミン残基は、１より多くの種類の置換基で置換され得る。例えば、一部のグルコサミン残基はコハク酸で置換され得、そして他のグルコサミン残基は酪酸で置換され得る。本発明によるＰＳ／Ａの組成物としては、全てのホモ置換ＰＳ／Ａ分子もしくは全てのヘテロ置換ＰＳ／Ａ分子、またはそれらの組合せが挙げられる。
【００６１】  このＰＳ／Ａは、好ましくは、以下の化学構造から選択されるモノマーから構成されるポリマーである：
【００６２】
【化１０】
0005490341.tif 000007
【００６３】
【化１１】
0005490341.tif 000008
別の局面による本発明は、ネイティブな抗原とは置換の程度および型が異なる合成ＰＳ／Ａを含む。ネイティブなＰＳ／Ａ抗原は、コハク酸でほぼ１００％置換されている（１グルコサミン：１コハク酸）。本発明による１つの型のＰＳ／Ａ抗原は、グルコサミン残基のうちの１０％と９５％との間の％が、コハク酸で置換された抗原を含む。本発明はまた、１０％と１００％との間の、コハク酸以外の短鎖脂肪酸での置換、または短鎖脂肪酸およびコハク酸の混合物での置換を有するＰＳ／Ａ抗原を含む。
【００６４】  ネイティブなＰＳ／Ａ抗原は、１００，０００ダルトンよりも大きな高分子量ホモポリマーである。しかし、本発明の組成物は、置換されたモノマーの低分子量および高分子量のホモポリマーを含む。本発明に従う有用な多糖のサイズは大いに変動する。５００ダルトンと２０，０００，０００ダルトンとの間の多糖が代表的である。治療剤または診断剤として用いられる場合、より小さな分子量の多糖は、キャリアに対して結合体化され得るか、または単独で使用され得る。好ましくは、本発明の多糖組成物は、少なくとも２５，０００ダルトンの分子量、より好ましくは少なくとも３０，０００ダルトンの分子量を有する。
【００６５】  ネイティブな物質は、β−１−６結合によって一緒に連結されたグルコサミンモノマーを含む。しかし、本発明の多糖は、α−またはβ−の１−６、１−４または１−３結合のいずれかまたはそれらの組合せによって一緒に連結されたモノマーを含む。好ましい実施態様では、この多糖は、β−１−６結合によって一緒に連結される。
【００６６】  本発明の組成物は、天然の供給源から単離され得るかまたは合成され得る。本発明は、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓからＰＳ／Ａ抗原を単離および精製するための方法を含む。本発明の１つの方法は、粗ＰＳ／Ａ調製物を細菌培養物から抽出する工程、高分子量ＰＳ／Ａ濃縮材料を、この粗ＰＳ／Ａ調製物から単離する工程、不純なＰＳ／Ａを、この高分子量ＰＳ／Ａ濃縮材料から沈澱させる工程、この不純なＰＳ／Ａを塩基とともにインキュベートして、半ば純粋なＰＳ／Ａ調製物を生成する工程、この調製物を酸で中和する工程、およびこの中和された調製物を、フッ化水素酸中でインキュベートして純粋なＰＳ／Ａを生成する工程を含む。粗ＰＳ／Ａ調製物を抽出する工程、ならびに不純なＰＳ／Ａ抗原調製物を単離および沈澱させる工程は、米国特許第５，０５５，４５５号を含む方法のような、当該分野で公知の任意の方法によって行われる。次いで、この不純な物質は精製されて、本発明の組成物を生成する。精製工程は、不純なＰＳ／Ａ抗原を塩基（例えば、ＮａＯＨ）とともにインキュベートし、次いで酸（例えば、ＨＣｌ）で中和することによって達成される。次いで、中性の物質が、フッ化水素酸中でインキュベートされて、本発明の純粋なＰＳ／Ａ抗原を生成する。本発明の別の方法は、細菌を強塩基または強酸とともにインキュベートすることによって粗抗原懸濁物を細菌培養物から抽出する工程を含む。好ましくは、この細菌は、強塩基または強酸中で少なくとも２時間、そしてより好ましくは少なくとも５、１０、１５、１８または２４時間攪拌される。強塩基または強酸は、任意の型の強塩基または強酸であり得るが、好ましくは、１モル濃度のＮａＯＨまたはＨＣｌよりも大きい。いくつかの実施態様では、この強塩基または強酸は、５モル濃度のＮａＯＨまたはＨＣｌである。次いで、この酸溶液または塩基溶液は、遠心分離に供されて、細胞本体が収集される。いくつかの実施態様では、この抽出手順は何回か繰り返される。得られる酸溶液または塩基溶液は、ｐＨ７になるように中和され、次いで透析されて不溶性の粗抗原を生成する。ＰＳ／Ａは、ｉｃａ遺伝子座を発現する任意の細菌株から精製され得る。これらの株としては、例えば、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、およびｉｃａ遺伝子座中の遺伝子で形質転換されたＳ．ｃａｒｎｏｓｕｓのような他の株が挙げられる。詳細には、純粋なＰＳ／Ａは、特定の株（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ＲＰ６２Ａ（ＡＰＣＣ番号：３５９８４）、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ＲＰ１２（ＡＰＣＣ番号：３５９８３）、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  Ｍ１８７、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｉｓ  ＴＭ３００（ｐＣＮ２７）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０（ｐＣＮ２７）およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８ムコイドを含む）から単離および精製されている。
【００６７】  本発明に従って有用なＰＳ／Ａはまた、ネイティブなＰＳ／Ａの置換されたモノマー単位を保有しない天然に存在する多糖から合成され得る。例えば、本発明のＰＳ／Ａ抗原は、ポリグルコサミン様モノマー残基のポリマーを、これらの残基がコハク酸および／または短鎖脂肪酸で置換されるように化学的に改変することによって合成され得る。得られる多糖は、ポリグルコースのＣ２原子にて置換を有する、β１−６，α１−６、α１−４、α１−３、β１−４、およびβ１−３のポリグルコースからなる群より選択されるモノマー反復単位のポリマーである。例えば、特定の天然に存在する多糖は、Ｎ−アセチル部分の反復単位をポリグルコースモノマー上に有する。このような多糖は、脱Ｎ−アセチル化されて、Ｎ−アセチル部分を遊離アミノ部分へと変換され得、この遊離アミノ部分は、上記に提供される式の脂肪酸構造で誘導体化され得、それによって必要な構造モチーフを作製する。他の天然に存在する多糖は、遊離アミノ部分を形成するように還元され得、誘導体化され得、それによって必要な構造モチーフを作製するイミン基を含む。
【００６８】  これらの合成反応のために有用である化合物は、本明細書中に開示されるＰＳ／Ａ構造を考慮すれば当業者に分かる。このような化合物としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：キチン、キトサン、ポリグルコース（すなわち、デキストラン）、ポリグルコサミンおよびポリグルコサミノウロン酸（ｐｏｌｙｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｏｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）。例えば、キチンは、以下の構造を有するβ−１−４結合を有するポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンである：
【００６９】
【化１２】
0005490341.tif 000009
キチンのＮ−アセチル基は、塩基を用いる処理（例えば、１．０〜５．０Ｍ  ＮａＯＨで、９５℃にて１時間）によって容易に除去されて、以下の構造を有するβ−１−４結合を有するポリグルコサミンであるキトサンを生成し得る：
【００７０】
【化１３】
0005490341.tif 000010
次いで、この化合物の遊離のアミノ基は、この酸を、キトサン物質とともに、遊離アミノ基の遊離カルボキシル基へのカップリングを促進する水溶性カルボジイミド試薬の存在下でインキュベートすることによってスクシネートまたは任意の他の短鎖脂肪酸で置換され得る。
【００７１】  デキストランは、以下の構造を有するα−１−６結合を有するポリグルコース分子である：
【００７２】
【化１４】
0005490341.tif 000011
記載されるＰＳ／Ａ抗原によって包含されない種々の置換基を有するポリグルコサミンはまた、改変されて本発明のＰＳ／Ａ抗原を生成し得る。例えば、多糖細胞間付着因子（ＰＩ／Ａ）は、アミン基がアセテートで置換されたβ−１−６結合されたグルコサミン残基のポリマーである。このアセテートを除去して、遊離アミン基を生成し得、次いでこのアミン基を置換して本発明のＰＳ／Ａを生成し得る。ＰＩ／Ａは以下の構造を有する：
【００７３】
【化１５】
0005490341.tif 000012
ポリグルコサミノウロン酸はまた改変されて、本発明のＰＳ／Ａ抗原を生成し得る。ポリグルコサミノウロン酸は、ネイティブの供給源から合成または単離され得る。
【００７４】  他の実施態様では、ポリガラクトサミノウロン酸はまた改変されて、本発明のＰＳ／Ａ抗原を生成し得る。例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの莢膜多糖（Ｖｉ抗原）は、完全に、ガラクトサミノウロン酸のα−１−４結合されたモノマーの反復から形成される。この酸は、改変されて遊離アミノ基を生成し得るＮ−アセチル部分を含み、この遊離アミノ基は改変されてＰＳ／Ａの置換基を付加し得る。このウロン酸のカルボキシル基はまた、ＣＨ2ＯＨ基へと改変され得、これは、水溶性カルボジイミド（実施例２に記載される）を用いて容易に達成される。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉの莢膜Ｖｉ抗原の単離および調製は、Ｓｚｕ，Ｓ．Ｃ．，Ｘ．Ｌｉ，Ａ．Ｌ．ＳｔｏｎｅおよびＪ．Ｂ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．５９：４５５５−４５６１（１９９１）に記載される。このＶｉ抗原は以下の構造を有する：
【００７５】
【化１６】
0005490341.tif 000013
一般に、脱Ｎ−アセチル化は、当業者に周知の従来の化学技術によって達成され得る。１つの適切な方法は、水素化ホウ素ナトリウムを含むかまたは含まないアルカリの使用を含む。２０ｍｇの多糖を、２Ｍ  ＮａＯＨ（３ｍｌ）中に溶解し、そして水素化ホウ素ナトリウムを添加する（５０ｍｇ）。この溶液を１００℃になるように５時間加熱する。酸での中和の後、この溶液を、低温中で、蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥する（ＤｉＦａｂｉｏ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｉｃｈｏｎ，Ｆ．，Ｂｒｉｓｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｍ．Ｒ．Ｂｅｎｅｄｉ，Ｖ．Ｊ．，Ｋａｓｐｅｒ、Ｄ．Ｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ｇｒｏｕｐｓ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ．１９８９．Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６７：８７７−８８２）。
【００７６】  イミン部分（Ｃ−ＮＨ）を含む多糖に関しては、遊離アミノ基は、当業者に公知の従来の化学技術によって形成され得る。１つの適切な方法は、水素化ホウ素ナトリウムの使用を含む。このイミン基は、水素化ホウ素ナトリウムで還元されて、遊離のアミノ基を生成し得る。このことは、過剰の５ｍｇの水素化ホウ素を、室温にて２時間、攪拌しながら、蒸留水中に溶解した多糖へと添加することによって行われる。次いでこの混合物は、水に対して透析され、そして凍結乾燥される（ＤｉＦａｂｉｏ，Ｊ．Ｌ．ら，同書）。
【００７７】  １つの局面では、本発明は、この分子が完全にはＮ−スクシニル化されていないように脂肪酸基（例えば、スクシニル）がアミノ基から部分的に除去された場合、正に荷電した基（アミノ）および負に荷電した基（スクシニルのような脂肪酸）を含むポリマーの組成物である。このポリマーは、上記の通りのポリグルコサミン骨格を有し、そしてまた上記の通りの短鎖脂肪酸基で部分的に置換されている。短鎖脂肪酸基で置換されない他の骨格モノマーは、アミンで置換される。このアミンは正に荷電しており、そして脂肪酸は負に荷電している。その結果は、いくつかの負電荷およびいくつかの正電荷で置換されたポリマーである。この電荷は、ブロックで存在し得る。例えば、１００個の連続するモノマーは、アミノ置換を有し得、そして１００個の連続するモノマーは、脂肪酸置換を有し得る。あるいは、この電荷は、ランダムに混合され得るか、または繰返しパターンであり得るか、あるいは１つおきのモノマーが、アミノ基を有し得、そしてこのモノマーは、脂肪酸基を有するモノマーの間に存在し得る。
【００７８】  本発明の組成物は、感染のような病的状態のインビトロ、インサイチュおよびインビボでの診断を含む種々の異なる適用において有用である。さらに、これらの組成物を用いて、インビボで被験体を免疫して、感染を予防し得る。この組成物をまた用いて、本発明のＰＳ／Ａ組成物と同じ目的のために有用である、抗体および他の結合ペプチドを開発し得る。従って、本発明は、ＰＳ／Ａに特異的であって感染性障害の診断および処置において使用され得る抗体を生成するための方法を含む。
【００７９】  本発明によって有用な抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれかであり得る。ポリクローナル抗体は、一般に、抗原およびアジュバントの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって、動物において惹起される。ＰＳ／Ａ抗原に対するポリクローナル抗体は、ＰＳ／Ａ抗原を単独で、もしくはアジュバントと組合せて注射することによって、またはキャリア化合物に結合体化したＰＳ／Ａを注射することによって生成され得る。例えば、ＰＳ／Ａ抗原を、免疫される動物種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）に結合体化することが有用であり得る。
【００８０】  多糖をタンパク質に結合体化するための多くの方法が当該分野で公知である。一般に、この多糖は、活性化されるべきであるかまたは他の点で結合体化が実行可能にされるべきである。すなわち、少なくとも１つの部分が、タンパク質または他の分子に共有結合し得るようにされねばならない。このような多くの方法は当該分野で公知である。例えば、Ｊｅｎｎｉｎｇｓに対して発行された米国特許第４，３５６，１７０号は、多糖上でアルデヒド基を生成するための過ヨウ素酸の使用を記載し、次いでシアノ水素化ホウ素（ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）を用いる還元的アミノ化を行う。Ｔｓａｙらに対して発行された米国特許第４，６６３，１６０号はまた、過ヨウ素酸を用いて、アルデヒド基を生成したが、次いで多糖を、４〜１２炭素部分（縮合剤の存在下で調製される）を用いて誘導体化したタンパク質に、Ｓｃｈｉｆｆ塩基反応を用いて還元剤（例えば、シアノ水素化ホウ素）の存在下で連結した。Ｇｏｒｇｏｎに対して発行された米国特許第４，６１９，８２８号は、臭化シアンを用いて多糖を活性化し、次いでこれを４〜８炭素原子のスペーサー架橋を通してタンパク質へと結合体化させた。ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＣｌｅｍｅｎｔｓに対して発行された米国特許第４，８０８，７００号では、多糖を改変して、ペリオデートによる制限された酸化的切断、グリコシダーゼによる加水分解、または酸加水分解を用いて少なくとも１つの還元末端を生成し、そしてシアノ水素化ホウ素の存在下で還元的アミノ化を通してタンパク質へと結合体化した。ＰｏｒｒｏおよびＣｏｓｔａｎｔｉｎｏに対して発行された米国特許第４，７１１，７７９号は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いる末端還元基への一級アミノ基の導入による多糖の活性化、続いてアジピン酸誘導体存在下でのエステルへの変換、およびジメチルスルホキシドのような有機溶媒の存在下でのトキソイドへの結合体化を記載した。結合体化の他の多くの方法は当該分野で公知である。
【００８１】  キャリア化合物は、ＰＳ／Ａ抗原へと直接連結され得るか、またはリンカーもしくはスペーサーを介してＰＳ／Ａ抗原へと連結され得る。多糖は、当該分野で公知の任意の手段によって、例えば、多糖の遊離還元末端を用いて、リンカーまたはスペーサーへとカップリングされて、スペーサーまたはリンカーとの共有結合を生成し得る。共有結合は、ＰＳ／Ａ抗原の遊離還元末端を、遊離１−アミノグリコシドへと変換することによって生成され得、遊離１−アミノグリコシドは続いて、アシル化によってスペーサーへと共有結合され得る（Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら，Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０：３７７（１９９１））。あるいは、ＰＳ／Ａ抗原は、スペーサー上の活性化基としてＮ−ヒドロキシスクインイミド活性エステルを用いてスペーサーへと共有結合され得る（Ｋｏｃｈｅｔｋｏｗ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４６：Ｃ１（１９８６））。ＰＳ／Ａ抗原の遊離還元末端はまた、ヨウ素および水酸化カリウムを用いてラクトンへと変換され得る（Ｉｓｅｂｅｌｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６２））。このラクトンは、スペーサーまたはリンカー上の一級アミノ基によってスペーサーへと共有結合され得る。ＰＳ／Ａ抗原の遊離の還元末端はまた、還元的アミノ化を用いてリンカーまたはスペーサーへと共有結合され得る。
【００８２】  ＰＳ／Ａ抗原へと連結されるキャリア化合物は、免疫学的に活性かまたは不活性なタンパク質であり得る。タンパク質としては、例えば、血漿タンパク質（例えば、血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質およびトランスフェリン）、細菌ポリペプチド（例えば、ＴＲＰＬＥ、β−ガラクトシダーゼ）、ポリペプチド（例えば、ヘルペスｇＤタンパク質、アレルゲン、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイド、サルモネラフラジェリン、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓピリン、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓの１５ｋＤａ、２８〜３０ｋＤａ、および４０ｋＤａの膜タンパク質、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、熱不安定性エンテロトキシンｌｔｂ、コレラトキシンならびにウイルスタンパク質（ロタウイルスＶＰならびにＲＳウイルスｆタンパク質およびｇタンパク質を含む））が挙げられる。本発明によって有用であるタンパク質としては、哺乳動物への投与が安全であり、そして免疫学的に有効なキャリアタンパク質として作用する、任意のタンパク質が挙げられる。
【００８３】  ポリクローナル抗体を調製するために、ＰＳ／Ａ抗原または抗原結合体は、一般に、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバントまたは他のアジュバント（ウサギまたはマウスについては、３容量のＦｒｅｕｎｄ中でそれぞれ、１ｍｇまたはμｇの結合体）と合わされ、そして皮内に複数の部位で注射される。約１ヶ月後、この動物は、Ｆｒｅｕｎｄ完全アジュバント中の抗原または抗原結合体の元の量の１／５〜１／１０で、複数の部位での皮下注射によって追加免疫される。１〜２週間後、この動物が採血され、そして血清が、抗体の存在についてアッセイされる。この動物は、抗体力価がプラトーに達するまで繰返し追加免疫され得る。この動物は、ＰＳ／Ａ抗原単独で、ＰＳ／Ａ抗原結合体で、または異なるキャリア化合物に結合体化されたＰＳ／Ａで追加免疫され得る。凝集因子（例えば、ミョウバン）もまた、免疫応答を増強するために用いられ得る。
【００８４】  ポリクローナル抗体の供給源を供給することに加えて、免疫された動物は、ＰＳ／Ａ抗原特異的モノクローナル抗体を生成するために用いられ得る。本明細書中で用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ＰＳ／Ａの１つのエピトープ（すなわち、抗原決定基）に特異的に結合する免疫グロブリンの均質集団をいう。モノクローナル抗体は、当該分野で公知の任意の方法によって、例えば、免疫された動物から単離された脾細胞を、例えば、骨髄腫細胞との融合またはエプスタイン−バーウイルスでの形質転換によって不死化し、そして所望の抗体を発現するクローンについてスクリーニングすることによって調製され得る。モノクローナル抗体を調製および使用するための方法は当該分野で周知である。
【００８５】  マウス抗ＰＳ／Ａモノクローナル抗体は、ＰＳ／Ａを免疫原として利用するこれらの方法のいずれかによって作製され得る。抗ＰＳ／Ａモノクローナル抗体を開発するための方法についての以下の記載は例示であり、そして説明の目的のためにのみ提供される。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中の約７５〜１００μｇの精製されたＰＳ／Ａを用いて腹腔内免疫される。不完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中での約２５〜５０μｇのＰＳ／Ａの追加免疫注射は、初回注射の約１５日後および約３５日後に投与される。６０〜６５日目に、このマウスは、アジュバントの非存在下での約２５μｇのＰＳ／Ａの追加免疫注射を受ける。３日後、このマウスを殺し、そして単離された脾細胞を、Ｏｉ（Ｏｉ  ＶＴ：Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｈｅｚｅｎｂｅｒｇ  ＬＡ（編）：ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ，Ｆｒｅｅｍａｎ（１９８０））によって記載された手順のような手順によってポリエチレングリコールを用いてマウス骨髄腫ＮＳ−１細胞に融合する。ハイブリドーマ細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを用いて選択し、そして培養して増殖させる。融合の１４〜１５日後、抗ＰＳ／Ａモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を、固相放射免疫アッセイを用いて、抗ＰＳ／Ａ抗体を、固定化ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて馴化培地から捕獲し、続いて特異的に結合した125Ｉ標識ＰＳ／Ａを定量することによって同定する。ＰＳ／Ａに対する抗体について陽性と試験されるハイブリドーマを、限界希釈によってサブクローン化し、そして再度試験する。次いで、このハイブリドーマについての腹水を、プリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）で処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに約１×１０6細胞／マウスを注射することによって調製する。選択されたモノクローナル抗体が濃縮された濃縮物を、Ｓ−２００でのゲル濾過によって腹水から生成し、そして（ＮＨ4）ＳＯ4を用いて濃縮する。このペレットを適切な保存溶液（例えば、５０％グリセロール／Ｈ2Ｏ）中に溶解し、そして４℃にて保存する。
【００８６】  本明細書中で用いられる「抗ＰＳ／Ａ抗体」としては、ヒト化抗体および抗体フラグメント、ならびにインタクトなモノクローナル抗体およびインタクトなポリクローナル抗体が挙げられる。
【００８７】  好ましい実施態様では、本発明の方法に従って有用な抗ＰＳ／Ａ抗体は、単離された形態または薬学的調製物中のインタクトなヒト化抗ＰＳ／Ａモノクローナル抗体である。本明細書中に用いられる場合、「ヒト化モノクローナル抗体」は、ヒトモノクローナル抗体、またはヒトの定常領域およびヒト以外の哺乳動物種由来のＰＳ／Ａ結合領域を有する、その機能的に活性なフラグメントである。
【００８８】  ヒトモノクローナル抗体は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋらに対して発行された米国特許第５，５６７，６１０号、Ｏｓｔｂｅｒｇに対して発行された米国特許第５，５６５，３５４号、Ｂａｋｅｒらに対して発行された米国特許第５，５７１，８９３号、Ｋｏｚｂｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）およびＢｏｅｒｎｅｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６−９５（１９９１）に開示される方法のような、当該分野で公知の任意の方法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体を調製するための従来の方法に加えて、このような抗体はまた、ヒト抗体を生成し得るトランスジェニック動物を免疫することによって調製され得る（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）、Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）およびＬｏｂｅｒｇに対して発行された米国特許第５，５６９，８２５号）。
【００８９】  ＰＳ／Ａと相互作用するヒト化モノクローナル抗体を調製するための方法についての以下の実施例は、例示であり、そして実証の目的のために提供するだけである。ヒト化モノクローナル抗体は、例えば、元々の抗体のエピトープ特異性を保持しながらも、非ヒト哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域を、ヒト抗体の類似の領域で置換することによって構築され得る。例えば、非ヒトＣＤＲおよび必要に応じていくつかのフレームワーク領域は、ヒトのＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合されて、機能的抗体を生成し得る。米国には、特定のマウス抗体領域から商業的にヒト化抗体を合成する実体（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））が存在する。
【００９０】  欧州特許出願０２３９４００（その内容全体は、本明細書中に参考として援用される）は、マウス（または他の非ヒト哺乳動物）抗体の少なくともＣＤＲ領域がヒト化抗体中に含まれている、ヒト化モノクローナル抗体の生成および使用の例示的な教示を提供する。手短には、以下の方法は、マウスＣＤＲの少なくとも一部分を含むヒト化ＣＤＲモノクローナル抗体を構築するために有用である。Ｉｇ重鎖またはＩｇ軽鎖の少なくとも可変ドメイン、およびヒト抗体由来のフレームワーク領域を含む可変ドメイン、ならびにマウス抗体のＣＤＲ領域をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された適切なプロモーターを含む第１の複製可能な発現ベクターが調製される。必要に応じて、それぞれ、相補的なヒトＩｇ軽鎖またはヒトＩｇ重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結された適切なプロモーターを含む、第２の複製可能な発現ベクターが調製される。次いで、細胞株が、これらのベクターで形質転換される。好ましくは、この細胞株は、リンパ系起源の不死化された哺乳動物細胞株（例えば、骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）またはクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）の細胞株）であるか、ウイルスでの形質転換によって不死化された正常リンパ系細胞である。次いで、形質転換された細胞株は、当業者に公知の条件下で培養されて、ヒト化抗体を生成する。
【００９１】  欧州特許出願０２３９４００に示されるように、複製可能なベクター中に挿入されるべき特定の抗体ドメインを作製するためのいくつかの技術が当該分野において周知である（好ましいベクターおよび組換え技術は、以下でより詳細に考察される）。例えば、このドメインをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成によって調製され得る。あるいは、４つのフレームワーク領域が連結部で適切な制限部位と一緒に融合されている、ＣＤＲ領域を欠く合成遺伝子が、その結果、二本鎖の合成ＣＤＲ活性カセットまたは粘着末端を有する制限処理されたサブクローン化ＣＤＲカセットが、このフレームワーク領域の連結部で連結され得る。別の方法は、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発による、可変ＣＤＲ含有ドメインをコードするＤＮＡ配列の調製を含む。これらの方法の各々は、当該分野で周知である。それゆえ、当業者は、そのエピトープに対する抗体の特異性を破壊することなく、マウスＣＤＲ領域を含むヒト化抗体を構築し得る。
【００９２】  ヒト化抗体は、これらがＰＳ／Ａを特異的に認識するが、抗体自体に対してヒトにおいて免疫応答が惹起されないという点で特定の臨床的有用性を有する。最も好ましい実施態様では、マウスＣＤＲは、ヒト抗体のフレームワーク領域に移植されて、「ヒト化抗体」が調製される。例えば、Ｌ．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２、３２３（１９８８）；Ｍ．Ｓ．Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４、２６８（１９８５）およびＥＰＡ  ０  ２３９  ４００（１９８７年９月３０日公開）を参照のこと。
【００９３】  ＰＳ／Ａ結合抗体フラグメントもまた、本発明によって包含される。当該分野で公知であるように、抗体分子の小さい一部分（パラトープ）しかそのエピトープへの抗体の結合に関与しない（一般に、Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７版，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）。例えば、この抗体のｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された抗体、またはｐＦｃ’領域を伴わずに生成された抗体（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントと称される）は、インタクトな抗体の両方の抗原結合部位を保持する。単離されたＦ（ａｂ’）2フラグメントは、その２つの抗原結合部位のおかげで二価のモノクローナルフラグメントと呼ばれる。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断される抗体、またはＦｃ領域を伴わずに生成された抗体（Ｆａｂフラグメントと称される）は、インタクトな抗体分子の一方の抗原結合部位を保持する。さらに進んで、Ｆａｂフラグメントは、共有結合された抗体軽鎖およびＦｄ（重鎖可変領域）と称される抗体重鎖の一部分からなる。Ｆｄフラグメントは、主要な抗原特異性決定基であり（単一のＦｄフラグメントが、抗体特異性を変更することなく、１０までの異なる軽鎖と会合し得）、そしてＦｄフラグメントは、エピトープ結合能力を分離して保持する。
【００９４】  用語Ｆａｂ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖは、いずれかの標準的な免疫学的意味で用いられる［Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８２）；Ｃｌａｒｋ，Ｗ．Ｒ．（１９８６）Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．（１９９１）Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第７版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）］。周知の機能的に活性な抗体フラグメントとしては、抗体のＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメントが挙げられるがこれらに限定されない。インタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠くこれらのフラグメントは、インタクトな抗体よりも迅速に循環から浄化され、そしてインタクトな抗体よりも低い非特異的組織結合を有する（Ｗａｈｌら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３））。例えば、単鎖抗体は、Ｌａｄｎｅｒに対する米国特許第４，９４６，７７８号に記載される方法に従って構築され得る。このような単鎖抗体としては、可撓性リンカー部分によって連結された軽鎖および重鎖の可変領域が挙げられる。単離された可変重鎖単一ドメインを含む単一ドメイン抗体（「Ｆｄ」）を得るための方法もまた報告されている（例えば、その標的エピトープに対する充分な親和性を有して、単離された形態でそれに結合する、抗体重鎖可変領域（ＶH単一ドメイン抗体）をスクリーニングして同定するための方法を開示する、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：６４４−６４６（１９８９）を参照のこと）。公知の抗体重鎖および抗体軽鎖の可変領域の配列に基づく、組換えＦvフラグメントを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｍｏｏｒｅら、米国特許第４，４６２，３３４号に記載されている。抗体フラグメントの使用および生成を記載する他の参考文献としては、例えば、Ｆａｂフラグメント（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５））、Ｆｖフラグメント（Ｈｏｃｈｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｉｌｃｈら，米国特許第４，３５５，０２３号）、および抗体分子の一部分（Ａｕｄｉｌｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，米国特許第４，４７０，９２５号）が挙げられる。従って、当業者は、ＰＳ／Ａエピトープについての抗体の特異性を破壊することなく、抗体フラグメントを、インタクトな抗体の種々の部分から構築し得る。
【００９５】  本発明の抗体フラグメントはまた、「ヒト化抗体フラグメント」を包含する。当業者が認識するように、このようなフラグメントは、インタクトなヒト化抗体の伝統的な酵素的切断によって調製され得る。しかし、インタクトな抗体が、含まれる構築物の性質によってこのような切断を受けない場合、上記の構築物は、出発物質として用いられる免疫グロブリンフラグメントを用いて調製され得るか；または組換え技術が用いられる場合、このＤＮＡ配列はそれ自体が、所望の「フラグメント」をコードするように調製され得、このフラグメントは、発現された場合、化学的手段または生物学的手段によってインビボまたはインビトロで合わされて、最終的な所望のインタクトな免疫グロブリンフラグメントを調製し得る。
【００９６】  以下に示す、本発明の診断方法のためのＰＳ／Ａについての結合特異性を有する抗体フラグメントおよび他のＰＳ／Ａ結合ポリペプチドはまた、本発明によって包含される。いくつかの慣用的アッセイを用いて、このようなペプチドを容易に同定し得る。本発明のペプチドを同定するためのスクリーニングアッセイは、例えば、Ｈａｒｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８（１９９４）に記載される手順のようなファージディスプレー手順を用いて行われる。Ｈａｒｔらは、哺乳動物細胞レセプターについての新規なペプチドリガンドを同定するための糸状ファージディスプレーライブラリーを報告する。一般に、例えば、Ｍ１３またはｆｄファージを用いる、ファージディスプレーライブラリーは、上記の参考文献において記載される手順のような従来の手順を用いて調製される。このライブラリーは、４〜８０アミノ酸残基を含む挿入物を提示する。この挿入物は必要に応じて、完全に縮重したまたは偏ったペプチドアレイを提示する。ＰＳ／Ａに選択的に結合するリガンドは、表面にＰＳ／Ａに結合するリガンドを発現するファージを選択することによって入手される。次いで、これらのファージは、何回かの再選択に供されて、最も有用な結合特性を有するペプチドリガンド発現ファージが同定される。代表的には、最良の結合特性（例えば、最大の親和性）を示すファージは、核酸分析によってさらに特徴付けられて、ファージ表面上に発現されるペプチドの特定のアミノ酸配列、およびＰＳ／Ａに対する最適結合を達成するために最適の発現ペプチド長が同定される。あるいは、このようなペプチドリガンドは、１以上のアミノ酸を含むペプチドのコンビナトリアルライブラリーから選択され得る。天然に存在する対応物と比較して酵素分解にあまり供されない非ペプチド性合成部分を含むこのようなライブラリーはさらに合成され得る。
【００９７】  ペプチドがＰＳ／Ａに結合するか否かを決定するために、任意の公知の結合アッセイが用いられ得る。例えば、ペプチドは、表面に固定化され得、次いで標識されたＰＳ／Ａと接触させ得る。次いで、このペプチドと相互作用するＰＳ／Ａの量またはこのペプチドに結合しなかった量が定量されて、このペプチドがＰＳ／Ａに結合するか否かが決定される。抗ＰＳ／Ａ抗体が固定された表面は、ポジティブコントロールとして役立ち得る。
【００９８】  本発明の組成物は、インビボおよびインビトロでの多くの目的のために有用である。例えば、本発明の組成物は、抗体応答を生成するために、例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染およびＰＳ／Ａ抗原を作製する他の細菌種によって引き起こされる感染を予防するためのヒトおよび動物の能動免疫のためのワクチンとして；他のヒトまたは動物に投与されてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染を予防または処置し得る抗ＰＳ／Ａ抗体を生成するためのヒトまたは動物の免疫のワクチンとして；重要な生物学的因子（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染を予防し得るモノクローナル抗体、抗体の作製に関与する遺伝子のライブラリー、またはペプチド模倣物）についてスクリーニングするための抗原として；Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染およびＰＳ／Ａ抗原を作製する他の細菌種によって引き起こされる感染についての診断試薬として；ならびにＳ．ａｕｒｅｕｓ感染およびＰＳ／Ａ抗原を作製する他の細菌種によって引き起こされる感染に対する感受性に関して、ヒトまたは動物の免疫学的状態を決定するための診断試薬として、有用である。
【００９９】  本発明のＰＳ／Ａは、被験体におけるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染に対する能動免疫を誘導することによって、ＰＳ／Ａ莢膜をその表面に有する細菌での感染に対して被験体を防御するために用いられ得る。この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに対する能動免疫を誘導するために有効な量の、上記の本発明の任意のＰＳ／Ａ組成物を被験体に投与することにより達成される。
【０１００】  本明細書中で用いられる場合、「能動免疫」は、抗原が、抗体を生成する細胞へのいくつかのリンパ系細胞の分化および記憶細胞への他のリンパ系細胞の分化を引き起こすような、被験体への抗原の導入を含む。この記憶細胞は、抗体を分泌しないが、むしろ、抗原が再度身体に投与された場合にその抗原を感知するために、抗体をその膜に取り込む。
【０１０１】  この方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染に対する免疫を誘導するために有用である。本明細書中で用いられる場合、「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ」とは、ＰＳ／Ａ含有莢膜を発現する全てのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌種をいう。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓとして分類される細菌は、当業者に周知であり、そして微生物学の文献に記載される。ＰＳ／Ａ含有莢膜を発現するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓとしては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＲＰ６２Ａ（ＡＴＣＣ番号：３５９８４）、ＲＰ１２（ＡＴＣＣ番号：３５９８３）、およびＭ１８７を含む）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＲＮ４２２０（ｐＣＮ２７）およびＭＮ８ムコイドを含む）、ならびにｉｃａ遺伝子座における遺伝子（ＴＭ３００（ｐＣＮ２７）を含む）で形質転換されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓのような株が挙げられるがこれらに限定されない。ＰＳ／Ａ含有莢膜を発現する他の細菌株は、当業者によって容易に同定され得る。例えば、ｉｃａ遺伝子座を発現するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌は、ＰＳ／Ａ含有莢膜を発現する。当業者は、ｉｃａ遺伝子座に関連したｍＲＮＡまたはタンパク質の発現について容易にスクリーニングし得る。なぜなら、ｉｃａ遺伝子座の核酸配列は公知であるからである（配列番号１、そしてＨｅｉｌｍａｎｎ，Ｃ．，Ｏ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｃ．Ｇｅｒｋｅ，Ｎ．Ｖａｎｉｔｔａｎａｋｏｍ，Ｄ．ＭａｃｋおよびＦ．Ｇｏｔｚ（１９９６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ．Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：１０８３に元々記載される）。Ｈｅｉｌｍａｎｎの刊行物は、ｉｃａ遺伝子座の核酸配列を記載するが、この刊行物は、この遺伝子座が、ＰＩＡ抗原の生成をコードすると誤って述べている。ｉｃａが、実際にＰＳ／Ａの生成に関与するタンパク質をコードすることが本発明によって見出された。ＰＳ／Ａ含有莢膜を発現する細菌株もまた、以下の実施例６に記載される通りに、抗ＰＳ／Ａ抗体を用いる免疫電子顕微鏡（または他の免疫アッセイ）によって同定されて、細菌の表面上の莢膜の存在を検出し得る。さらに、細菌株の莢膜は、実施例１に記載の通りに単離され得、そして以下の実施例４に記載の通りに液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を用いて分析され得る。
【０１０２】  本明細書中で記載される場合、「被験体」は、温血哺乳動物であり、そして例えば、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、イヌおよびネコを含む。
【０１０３】  本発明のＰＳ／Ａは、抗原に対する免疫応答を誘導し得る任意の被験体に投与され得るが、免疫応答を誘導し得、かつＳａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染を発症する危険性がある被験体において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる全身感染に対する能動免疫を誘導するために特に適応される。免疫応答を誘導し得、かつＳａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染を発症する危険性がある被験体は、環境のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓに曝露される危険性のある、正常な健常な免疫系を保有する哺乳動物である。例えば、他の点では免疫無防備状態にない入院患者は、病院の環境におけるこの細菌への曝露の結果として、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染を発症する危険性がある。詳細には、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる感染を発症することについての危険性が高い集団としては、例えば、透析される腎臓疾患患者、および危険性の高い手術を受ける個体が挙げられる。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによる感染を発症する危険性が高い集団としては、例えば、留置医療デバイスを有する患者が挙げられる。なぜなら、臨床的単離体は、しばしば、生体膜またはスライムと呼ばれる細胞外物質の結果として、プラスチック表面に対して高度に接着性であるからである。
【０１０４】  本発明のＰＳ／Ａは、抗体応答を誘導するために有効な量で被験体に投与される。本明細書中で用いられる場合、「抗体応答を誘導するために有効な量」は、以下を行うに充分であるＰＳ／Ａの量である：（ｉ）例えば、被験体における抗ＰＳ／Ａ抗体の生成を誘導すること、記憶細胞の生成を誘導すること、細胞傷害性リンパ球反応を誘導することなどによって、それ自体の免疫防御を生成することにおいて被験体を補助すること、および／または（ｉｉ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに曝露された被験体において引き起こされるのを防御すること。
【０１０５】  当業者は、当該分野で公知の慣用方法によって、ＰＳ／Ａの量が、能動免疫を誘導するために充分であるか否かを評価し得る。例えば、特定の抗原が哺乳動物において抗体を生成する能力は、マウスまたは他の被験体においてＰＳ／Ａ抗原をスクリーニングすることによって評価され得る。
【０１０６】  本発明の好ましい方法は、被験体において特にＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる感染に対する能動免疫を誘導するための方法である。本発明の前には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓが、その表面にＰＳ／Ａを発現することは公知でなかった。ＣＰ５およびＣＰ８がＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの外部莢膜を構成し、そしてこれらの莢膜が免疫を誘導するための有用な抗原であり得ると考えられていた。しかし、本発明によって、ＰＳ／Ａが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる感染に対する能動免疫を誘導する際に抗原として有用であることが見出された。それゆえ、本発明は、ポリグルコサミン骨格を有する高分子量多糖を被験体に投与することにより免疫を誘導する方法を含み、ここでこのポリグルコサミン骨格の個々のグルコサミン単位の少なくとも１０％は、Ｃ２原子のアミンを通してスクシネートに結合体化されている。
【０１０７】  本発明の抗ＰＳ／Ａ抗体は、感染性因子への曝露の危険性がある被験体における全身感染の発症を予防することにより、被験体における受動免疫を誘導するために有用である。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓによる感染に対する受動免疫を誘導するための方法は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのオプソニン作用を誘導するために有効な量の抗ＰＳ／Ａ抗体を被験体に投与することによって行われる。
【０１０８】  本明細書中で用いられる場合、「受動免疫」は、被験体への抗体の投与を含み、ここでこの抗体は、異なる被験体（同種および異種の被験体を含む）において生成され、その結果、この抗体はこの細菌の表面に付着し、そしてこの細菌を食菌させる。
【０１０９】  本発明の抗ＰＳ／Ａ抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染を発症する危険性のある任意の被験体に対して投与されて、受動免疫を誘導し得る。抗ＰＳ／Ａ抗体は、抗原に対する免疫応答を誘導できない被験体に対してさらに投与され得る。ＰＳ／Ａ抗原でのワクチン接種は危険性の高い免疫無防備状態の被験体においては有効でないかもしれないが、これらの被験体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して惹起された抗体調製物での処置によって利益を受ける。免疫応答を誘導できない被験体は、免疫無防備状態の被験体（例えば、化学療法を受けている患者、ＡＩＤＳ患者など）または免疫系がまだ発達していない被験体（例えば、早産児）である。抗ＰＳ／Ａ抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染を発症する危険性のある被験体に投与されて、感染性因子が身体中で増殖するのを予防し得るか、または感染性因子を殺傷し得る。抗ＰＳ／Ａ抗体はまた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによって引き起こされる感染を既に有する被験体に投与されて、感染性因子が身体中で増殖するのを予防し得るか、または感染性因子を殺傷し得る。
【０１１０】  本発明の抗ＰＳ／Ａ抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を誘導するに有効な量で被験体に投与される。本明細書中で用いられる場合、「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を誘導するために有効な量」は、以下を行うに充分であるＰＳ／Ａの量である：（ｉ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓによる感染が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに曝露された被験体において引き起こされるのを防御すること；（ｉｉ）感染が発症するのを阻害すること、すなわち、その発症を阻止または遅延させること；および／または（ｉｉｉ）感染を軽減すること、すなわち、この感染を引き起こす細菌の根絶。
【０１１１】  当業者に公知の慣用手順を用いて、抗ＰＳ／Ａ抗体の量が、「Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓに対する免疫応答を誘導するために有効な量」であるか否かを、抗体のオプソニン作用の程度を示す、インビトロでのオプソニン作用アッセイにおいて決定し得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌にオプソニンを作用させる抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌のサンプルに添加された場合にこの細菌のファゴサイトーシスを引き起こす抗体である。オプソニン作用アッセイは、比色アッセイ、化学発光アッセイ、蛍光または放射標識取り込みアッセイ、細胞媒介殺菌アッセイまたは物質のオプソニン能を測定する他のアッセイであり得る。例えば、以下のオプソニン作用アッセイを用いて、抗ＰＳ／Ａ抗体の有効量を決定し得る。この抗ＰＳ／Ａ抗体は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ菌および真核生物ファゴサイト性細菌、ならびに必要に応じて補体タンパク質とともにインキュベートされる。抗ＰＳ／Ａ抗体のオプソニン作用能力は、インキュベーション後に残存するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの量に基づいて決定される。このことは、生存するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの数を２つの類似のアッセイ（一方のみがオプソニンを作用させる免疫グロブリンを含む）の間で比較することにより、またはアッセイの前および後で生存Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの数を測定することにより、達成され得る。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの数の減少は、オプソニン作用を示す。
【０１１２】  本発明の方法はまた、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのオプソニン作用を誘導するために有効な量の抗ＰＳ／Ａpure抗体を被験体に投与することによって、被験体においてコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに対する受動免疫を誘導するために有用である。コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓから単離されたＰＳ／Ａに対する抗体は当該分野で開発されており、かつコアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓに対する受動免疫を誘導するために用いられているが、抗ＰＳ／Ａpure抗体は、以前にはこの目的のために用いられていない。本明細書中で用いられる場合、抗ＰＳ／Ａpure抗体は、本発明の純粋なＰＳ／Ａ抗原と特異的に相互作用する抗体であって、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのオプソニン作用を誘導するが、先行技術のＰＳ／Ａの不純な調製物とは相互作用しない抗体である。上記で考察されるように、先行技術の不純なＰＳ／Ａ調製物は、テイコ酸が混入しており、テイコ酸は、この抗原の免疫原性を妨害した。本発明の抗ＰＳ／Ａpure抗体は、テイコ酸が混入したＰＳ／Ａ調製物と相互作用しない。当業者は、慣用的な結合アッセイを用いることにより、抗ＰＳ／Ａ抗体が、不純なＰＳ／Ａ調製物と交叉反応しない抗ＰＳ／Ａpure抗体であるか否かを容易に同定し得る。例えば、抗ＰＳ／Ａ抗体を、表面に固定化し得、次いで標識された不純なＰＳ／Ａ調製物または標識された純粋なＰＳ／Ａ調製物と接触させ得る。次いで、この抗体と相互作用するＰＳ／Ａ調製物（純粋な調製物対不純な調製物）の量、または抗体に結合しない量を定量して、この抗体が不純なＰＳ／Ａ調製物に結合するか否かを決定し得る。この抗体が純粋なＰＳ／Ａ調製物と相互作用するが不純なＰＳ／Ａ調製物と相互作用しないならば、この抗体は、本発明の抗ＰＳ／Ａpure抗体である。
【０１１３】  Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓによる感染を発症する高い危険性を有する被験体としては、早産児、化学療法を受けている患者、および留置医療デバイスを有する他の患者が挙げられる。臨床的単離体はしばしば、それらが生体膜またはスライムと呼ばれる細胞外物質を合成する結果として、プラスチック表面に対して高度に接着性である。
【０１１４】  ＰＳ／Ａ抗原を用いて細菌感染を予防する場合、ＰＳ／Ａ抗原はワクチンとして処方される。ワクチンを処方するために適切なキャリア媒体としては、リン酸ナトリウム緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）またはｐＨ６でリン酸ナトリウム緩衝化生理食塩水中に懸濁した０．１２５Ｍリン酸アルミニウムゲル、および従来の他の媒体が挙げられる。一般に、ワクチンは、約５μｇ〜約１００μｇを含み、好ましくは約１０μｇ〜約５０μｇの抗原が、温血哺乳動物においてＰＳ／Ａ抗原に対する有効なレベルの抗体を惹起するために適切である。ワクチンとして投与される場合、ＰＳ／Ａは、必要に応じてアジュバントを含み得る。
【０１１５】  用語「アジュバント」は、本発明のＰＳ／Ａ中に取り込まれるか、または本発明のＰＳ／Ａと同時に投与される、被験体における免疫応答を増強する任意の物質を含むことが意図される。アジュバントとしては、アルミニウム化合物（例えば、ゲル、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム）、ならびにＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントまたはＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバント（ここで、ＰＳ／Ａ抗原は、パラフィンオイルエマルジョン中の安定化された水の水相において取り込まれる）が挙げられる。このパラフィンオイルは、異なる型のオイル（例えば、スクアレンまたはラッカセイオイル）で置換され得る。アジュバント特性を有する他の物質としては、ＢＣＧ（弱毒化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、リン酸カルシウム、レバミゾール、イソプリノシン（ｉｓｏｐｒｉｎｏｓｉｎｅ）、ポリアニオン（例えば、ポリＡ：Ｕ）、レンチナン、百日咳毒素、リピドＡ、サポニン、およびペプチド（例えば、ムラミルジペプチド）が挙げられる。希土類塩（例えば、ランタンおよびセリウム）もまたアジュバントとして用いられ得る。アジュバントの量は、被験体および用いられる特定のＰＳ／Ａ抗原に依存し、そして過度の実験を伴わずに当業者によって容易に決定され得る。
【０１１６】  一般に、治療目的で投与される場合、本発明の処方物は、薬学的に受容可能な溶液中で適用される。このような調製物は、慣用的に、薬学的に受容可能な濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性のキャリア、アジュバントおよび必要に応じて他の治療成分を含み得る。
【０１１７】  本発明の組成物は、それ自体（ニート）で、または薬学的に受容可能な塩の形態で投与され得る。医療で用いられる場合、この塩は、薬学的に受容可能であるべきであるが、薬学的に受容可能でない塩も便利に用いられて、その薬学的に受容可能な塩を調製し得、そして薬学的に受容可能でない塩は、本発明の範囲から除外されない。このような薬理学的および薬学的に受容可能な塩としては、以下の酸から調製される塩が挙げられるがこれらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、蟻酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、薬学的に受容可能な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類塩（例えば、カルボン酸基のナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩）として調製され得る。
【０１１８】  適切な緩衝剤としては、酢酸および塩（１〜２％  Ｗ／Ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％  Ｗ／Ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％  Ｗ／Ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％  Ｗ／Ｖ）が挙げられる。適切な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％  Ｗ／Ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％  Ｗ／Ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％  Ｗ／Ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％  Ｗ／Ｖ）が挙げられる。
【０１１９】  本発明は、本発明のＰＳ／Ａを１以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療成分とともに含む医学的使用のための薬学的組成物を提供する。本明細書中で使用され、そして以下でより充分に記載される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、ヒトまたは他の動物への投与のために適切である、１以上の適合性の固形または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。本発明では、用語「キャリア」は、適用を促進するために活性成分が合わされる、天然または合成の、有機成分または無機成分を示す。薬学的組成物の成分はまた、所望の薬学的効率を実質的に損なう相互作用が存在しない様式て本発明のＰＳ／Ａ抗原と、および互いに、混合され得る。
【０１２０】  非経口投与に適切な組成物は便利に、レシピエントの血液と等張であり得る、多糖の無菌の水性調製物を含む。用いられ得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、Ｒｉｎｇｅｒ溶液および等張の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁培地として従来通りに用いられる。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意のブレンド不揮発性油が用いられ得る。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射可能物質の調製において用途を見出す。皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内などでの投与に適切なキャリア処方物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍｅｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出され得る。
【０１２１】  本発明の調製物は、有効量で投与される。上記の通り、有効量は、単独で、またはさらなる用量と一緒に、それぞれ能動免疫または感染性細菌のオプソニン作用を誘導する、ＰＳ／Ａ抗原または抗ＰＳ／Ａ抗体の量である。１ナノグラム／キログラム〜１００ミリグラム／キログラムの範囲の用量が、投与の態様に依存して有効であると考えられる。好ましい範囲は、５００ナノグラム／キログラムと５００ミリグラム／キログラムとの間であり、最も好ましくは１マイクログラム／キログラムと１００マイクログラム／キログラムとの間であると考えられる。絶対量は、投与が、まだ細菌に感染していない、危険性の高い被験体について行われるか、または既に感染を有する被験体について行われるか、同時処置、用量の数、および個々の患者のパラメーター（年齢、身体状態、大きさおよび体重を含む）を含む種々の因子に依存する。これらは、当業者に周知の因子であり、そして単なる慣用実験によって取り組まれ得る。最大用量、すなわち、信頼できる医学的判断による最大の安全な用量が用いられることが一般に好ましい。
【０１２２】  本発明の薬学的組成物の複数用量が意図される。全身免疫スキームは、高用量の抗原の投与、続いて、数週間の期間をあけた後の引き続くより低用量の抗原の投与を含む。さらなる用量も投与され得る。受動免疫のための投薬スケジュールは、必要な場合、より頻繁な投与を伴い、全く異なる。細菌感染および／またはその後の感染からの防御に対して増強された免疫応答をもたらす任意のレジメンが用いられ得る。特定のＰＳ／Ａの複数用量の送達のための所望の時間間隔は、単なる慣用実験を用いて当業者によって決定され得る。
【０１２３】  種々の投与経路が利用可能である。選択される特定の形態は、もちろん、選択される特定のＰＳ／Ａ、処置される特定の状態、および治療の効力に必要とされる投薬量に依存する。本発明の方法は、一般的に言って、医学的に受容可能である任意の投与形態を用いて実施され得、このことは、臨床的に受容できない有害な効果を引き起こすことなく、有効レベルの免疫応答を生じる任意の形態を意味する。好ましい投与形態は、非経口経路である。用語「非経口」は、皮下注射、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨下での注射または注入技術を含む。
【０１２４】  この組成物は、単位投薬形態で便利に存在し得、そして薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。全ての方法は、活性なＰＳ／Ａを、１以上の補助成分を構成するキャリアと会合させる工程を含む。一般に、この組成物は、このポリマーを、液体キャリア、微細に分割した固形キャリアまたは両方と均質かつ密接に会合させ、次いで、必要な場合は製品に成形することによって調製される。このポリマーは、凍結乾燥されて保存され得る。
【０１２５】  他の送達系は、時間放出（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）送達系、遅延性（ｄｅｌａｙｅｄ）放出送達系または持続性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）放出送達系を含み得る。このような系は、本発明の多糖の反復投与を回避し得、被験体および医師への利便性を増加する。多くの型の放出送達系が、当業者に利用可能であり、そして公知である。これらとしては、ポリマー（例えば、ポリ乳酸およびポリグリコール酸、ポリ無水物およびポリカプロラクトン）ベースの系；脂質（ステロール（例えば、コレステロール）、コレステロールエステルおよび脂肪酸または中性脂肪（例えば、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド）を含む）である非ポリマー系；ヒドロゲル放出系；シラスティック系；ペプチドベースの系；ロウ被覆剤、従来の結合剤および賦形剤を使用する圧縮錠剤、部分的に融合した移植物などが挙げられる。特定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号（Ｋｅｎｔ）；同第４，６６７，０１４号（Ｎｅｓｔｏｒら）；ならびに同第４，７４８，０３４号および同第５，２３９，６６０号（Ｌｅｏｎａｒｄ）に見出される、多糖がマトリクス中の形態に包含されている侵食性の系、ならびに（ｂ）米国特許第３，８３２，２５３号（Ｈｉｇｕｃｈｉら）および同３，８５４，４８０号（Ｚａｆｆａｒｏｎｉ）に見出される、活性成分が制御された速度でポリマーを透過する拡散系。さらに、ポンプベースのハードウェア送達系が使用され得、そのいくつかは移植に適合される。
【０１２６】  本発明のＰＳ／Ａ抗原は、それ自体がアジュバント特性を有することもまた、当業者に理解される。本明細書中に記載の多糖がヒト免疫応答を強化する程度に、この多糖は、他の材料と組み合わせてアジュバントとして使用され得る。
【０１２７】  本発明のＰＳ／Ａ抗原および抗ＰＳ／Ａ抗体は、別の抗菌性抗生物質薬物と組合せてか、または抗菌性抗生物質カクテルの形態で、または他の細菌抗原もしくは細菌抗体とともに送達され得る。抗菌性抗生物質カクテルは、本発明による有用な任意の組成物と、抗菌性抗生物質薬物との混合物である。細菌感染の処置における抗生物質の使用は慣用的である。能動免疫を誘導するための抗原の使用、および受動免疫を誘導するための抗体の使用もまた、慣用的である。本実施態様において、一般的投与ビヒクル（例えば、錠剤、移植物、注入可能な溶液など）は、本発明において有用な組成物と、抗菌性抗生物質薬物および／または抗原／抗体との両方を含み得る。あるいは、抗菌性抗生物質薬物および／または抗原／抗体は、別々に投与され得る。
【０１２８】  抗菌性抗生物質薬物は周知であり、以下が挙げられる：ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、アンピシリン、アモキシシリン、バカンピシリン、シクラシリン（ｃｙｃｌａｃｉｌｌｉｎ）、エピシリン、ヘタシリン、ピバンピシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、カルベニシリン、チカルシリン、アブロシリン（ａｖｏｌｏｃｉｌｉｎ）、メズロシリン、ピペラシリン、アムジノシリン、セファレキシン、セフラジン、セファドキシル（ｃｅｆａｄｏｘｉｌ）、セファクロル、セファゾリン、セフロキシムアキセチル、セファマンドール、セフォニシド、セフォキシチン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフメノキシム（ｃｅｆｍｅｎｏｘｉｎｅ）、セフトリアキソン、モキサラクタム、セフォテタン、セフォペラゾン、セフタジジム、イミペネム、クラブラネート、チメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）、スルバクタム、ネオマイシン、エリスロマイシン、メトロニダゾール、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、バンコマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、アミノグリコシド、キノロン、テトラサイクリンおよびリファンピシン（ｒｉｆａｍｐｉｎ）。（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ’ｓ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｃｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、１９９３、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  １ｎｃ．を参照のこと）。
【０１２９】  他の多糖抗原および抗体が、当該分野で周知である。例えば、以下の多糖抗原および／またはそれに対する抗体が、ＰＳ／Ａ抗原および／または抗体と組合せて投与され得る：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ莢膜Ｖｉ抗原（Ｓｚｕ，Ｓ．Ｃ．、Ｘ．Ｌｉ，Ａ．Ｌ．ＳｔｏｎｅおよびＪ．Ｂ．Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｉ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、５９：４５５５〜４５６１（１９９１））；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ５莢膜（Ｖａｎｎ，Ｗ．、Ｍ．Ａ．Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｂ．ＪａｎｎおよびＫ．Ｊａｎｎ、Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（Ｋ５  ａｎｔｉｇｅｎ）ｏｆ  ｕｒｉｎａｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，０１０：Ｋ５：Ｈ４．Ａ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｄｅｓｕｌｆｏ−ｈｅｐａｒｉｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１１６：３５９〜３６４（１９８１））；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ５型莢膜（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．−Ｍ．、Ｋ．Ｈａｎｎｏｎ、Ｍ．Ｍｏｒｅａｕ、Ｗ．Ｗ．ＫａｒａｋａｗａおよびＷ．Ｆ．Ｖａｎｎ、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ５  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐａｒｉｓ）．１３８：５６１〜５６７（１９８７））；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｒｉ  エキソポリサッカリド（ｅｘｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）ＩＩ（Ｇｌａｚｅｂｒｏｏｋ，Ｊ．およびＧ．Ｃ．Ｗａｌｋｅｒ、ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃａｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｎ  ｎｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｆａｌｆａ  ｂｙ  Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ，Ｃｅｌｌ．６５：６６１〜６７２（１９８９）；Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ（Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ｍ．Ｒ．、Ｖ．Ｐｏｚｓｇａｙ、Ｄ．Ｌ．ＫａｓｐｅｒおよびＨ．Ｊ．Ｊｅｎｎｉｎｇｓ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｕｎｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２６２：８２６２〜８２６７（１９８７））；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｆｉｓｈｅｒ  ７  Ｏ特異的側鎖（Ｋｎｉｒｅｌ，Ｙ．Ａ．、Ｎ．Ａ．Ｐａｒａｍｏｎｏｖ、Ｅ．Ｖ．Ｖｉｎｏｇｒａｄｏｖ、Ａ．Ｓ．Ｓｈａｓｈｋｏｗ、Ｂ．Ａ．Ｎ．Ｋ．Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖ、Ｅ．Ｓ．ＳｔａｎｉｓｌａｖｓｋｙおよびＥ．Ｖ．Ｋｈｏｌｏｄｋｏｖａ、Ｓｏｍａｔｉｃ  ａｎｔｉｇｅ���ｓ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  Ｏ３（Ｌａｎｙｉ），０２５（Ｗｏｋａｔｓｃｈ）ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｙｐｅ  ３  ａｎｄ  ７、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１６７：５４９（１９８７））；Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  Ｏ特異的側鎖（Ｋｅｎｎｅ，Ｌ．、Ｂ．ＬｉｎｄｂｅｒｇおよびＫ．Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｄｅ−ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７８：１１９〜１２６（１９８０））；Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｉ型莢膜（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｂ．、Ｌｉｎｄｑｖｉｓｔ，Ｂ．、Ｌｏｎｎｇｒｅｎ，Ｊ．、Ｐｏｗｅｌｌ，Ｄ．Ａ．、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｔｙｐｅ  １、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．７８：１１１〜１１７（１９８０））；ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  グループ抗原（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊ．、Ｃ．ＬｕｇｏｗｓｋｉおよびＮ．Ｍ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｃ−ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｔｙｐｅ  １、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９：４７１２〜４７１９（１９８０））。
【０１３０】  他の非ポリペプチド抗原およびそれに対する抗体が、当業者に周知であり、そして本発明のＰＳ／Ａ組成物と共に使用され得る。
【０１３１】  ＰＳ／Ａ抗原および抗体はまた、被験体またはサンプルの免疫学的状態を決定するための診断アッセイに有用であるか、あるいは免疫アッセイにおける試薬として使用され得る。例えば、抗体は、表面上にＰＳ／Ａ抗原を有する細菌の、サンプル中での存在を検出するために使用され得る。その細菌がサンプル中に存在する場合、抗体は、感染した被験体を処置するために使用され得る。抗体はまた、ＰＳ／Ａ抗原の存在について細菌をスクリーニングするため、そしてＰＳ／Ａ抗原およびＰＳ／Ａ抗原を含む細菌を複雑な混合物から単離するために使用され得る。
【０１３２】  上記のアッセイおよび当該分野で公知の他の任意のアッセイは、ＰＳ／Ａまたは抗体を標識することによって、そして／あるいはＰＳ／Ａまたはその抗体を不溶性マトリクス上に固定することによって、達成され得る。ＰＳ／Ａまたは抗体を使用する分析方法および診断方法は、以下の試薬のうちの少なくとも１つを使用する：標識された分析物アナログ、固定された分析物アナログ、標識された結合パートナー、固定された結合パートナー、および立体結合体。使用される標識は、分析物とその結合パートナーとの結合に干渉しない、任意の検出可能な官能基であり得る。免疫アッセイにおけるこのような使用のための多数の標識が公知である。例えば、直接検出可され得る化合物（例えば、蛍光色素標識、化学発光標識、および放射性標識）ならびに反応または誘導体化を通じて検出され得る化合物（例えば、酵素）。これらの型の標識の例として、以下が挙げられる：32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、および131Ｉ放射性同位体、発蛍光団（例えば、希土類キレートまたはフレオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号））、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラビンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ）およびグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）。過酸化水素を使用して色素前駆体を酸化する酵素（例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ）とカップリングされたヘテロサイクリックオキシダーゼ（例えば、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン、アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、および安定なフリーラジカル。
【０１３３】  標識は、当業者に公知の方法によってＰＳ／Ａまたは抗体に結合体化され得る。例えば、米国特許第３，９４０，４７５号および同３，６４５，０９０号は、発蛍光団および酵素の、抗体への結合体化を示す。抗原および抗体と一般的に使用されると伝えられ、そして本発明に従って、使用され得る他のアッセイは、競合アッセイおよびサンドイッチアッセイを含む。
【０１３４】  先行技術は、多糖の生成をもたらすと報告されているタンパク質（多糖細胞内付着因子（ＰＩ／Ａ）として公知）をコードするいくつかの遺伝子を記載している。これらの遺伝子は、クローンニングされ、そしてｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの他の種で発現されている。しかし、ＰＳ／Ａの発達を生じ、そしてＰＩ／Ａの発達を生じないタンパク質の生成をこれらの遺伝子が実際にコードすることは、本発明により発見された。従って、本発明は、ＰＳ／Ａを発現する宿主細胞を生成し、そしてＰＳ／Ａ抗原を単離することによって、ＰＳ／Ａ抗原を調製する方法を含む。
【０１３５】  ＰＳ／Ａ宿主細胞は、細胞を、ｉｃａ遺伝子をコードする核酸（配列番号１）でトランスフェクションまたは形質転換することによって、調製され得る。この細胞は、真核生物細胞であっても原核生物細胞であってもよいが、好ましくは細菌細胞である。より好ましくは、この細胞は、通常はＰＳ／Ａを発現しないｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓである。
【０１３６】  １つの実施態様において、ｉｃａ核酸は、真核生物細胞または原核生物細胞内でのｉｃａ核酸の発現を指向する遺伝子発現配列に作動可能に連結される。この「遺伝子発現配列」は、これが作動可能に連結されているｉｃａ核酸の効率的な転写および翻訳を容易にする、任意の調節ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサーの組合せ）である。この遺伝子発現配列は、例えば、哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーター（例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター）であり得る。構成的哺乳動物プロモーターとしては、以下の遺伝子のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、およびβ−アクチン。細胞中で構成的に機能する例示的ウイルスプロモーターとしては、例えば、以下に由来するプロモーターが挙げられる：シミアンウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターはまた、誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、誘導物質の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で、転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターが、当業者に公知である。
【０１３７】  一般に、これらの遺伝子発現配列は、必要な場合、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する、５’非転写配列および５’非翻訳配列を含む。このような５’非転写配列は、作動可能に連結されたｉｃａ核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。この遺伝子発現配列は、必要に応じて、所望するように、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含む。
【０１３８】  ｉｃａ核酸配列および遺伝子発現配列は、これらが、ｉｃａコード配列の転写および／または翻訳を遺伝子発現配列の影響または制御下に置くような様式で共有結合されている場合、「作動可能に連結」されていると言われる。ｉｃａ配列が機能性タンパク質への翻訳されることが所望されるならば、以下の場合に、２つのＤＮＡ配列は、作動可能に連結されていると言われる：５’遺伝子発現配列中のプロモーターの誘導がｉｃａ配列の転写を生じ、そしてこの２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、(１）フレームシフト変異の誘導を生じず、（２）プロモーター領域がｉｃａ配列の転写を指向する能力に干渉せず、（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質へと翻訳される能力に干渉もしない場合。従って、遺伝子発現配列は、その遺伝子発現配列がｉｃａ核酸配列の転写をもたらし得、その結果、生じた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドへと翻訳され得る場合に、そのｉｃａ核酸配列に作動可能に連結されている。
【０１３９】  本発明のｉｃａ核酸は、宿主細胞単独でか、またはベクターと会合して送達され得る。その最も広い意味において、「ベクター」とは、以下を容易にし得る任意のビヒクルである：（１）ＰＳ／Ａ分子を合成するタンパク質の生成をコードする、ｉｃａ遺伝子座中の遺伝子を含む核酸分子の送達、または（２）ＰＳ／Ａ分子を合成するタンパク質の生成をコードするｉｃａ遺伝子座中の遺伝子を含む核酸分子の、標的細胞による取り込み。好ましくは、ベクターは、ｉｃａ分子を標的細胞へと輸送し、そのベクターの非存在下で生じる分解の程度と比較して、分解が減少している。一般的に、本発明において有用なベクターは、２つのクラス（生物学的ベクターおよび化学的／物理学的ベクター）に分けられる。生物学的ベクターは、ｉｃａ核酸の、標的細胞への送達／標的細胞による取り込みに有用である。化学的／物理学的ベクターは、ｉｃａ核酸またはｉｃａポリペプチドの、標的細胞への送達／標的細胞による取り込みに有用である。
【０１４０】  生物学的ベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：プラスミド、ファージミド、ウイルス、本発明の核酸配列の挿入または組み込みにより操作されたウイルス供給源または細菌供給源に由来する他のビヒクル、ならびに本発明の核酸配列に結合され得る遊離核酸フラグメント。ウイルスベクターは、生物学的ベクターの好ましい型であり、そして以下のウイルス由来の核酸配列を含むが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス；ハーベイマウス肉腫ウイルス：マウス乳ガンウイルス；ラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス；アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにＲＮＡウイルス（例えば、任意のレトロウイルス）のようなレトロウイルス。当業者は、名を挙げていないが当該分野で公知の他のベクターを容易に使用し得る。
【０１４１】  好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子が目的の遺伝子で置換されている非細胞障害性真核生物ウイルスに基く。非細胞障害性ウイルスは、レトロウイルスを含み、その生活環は、ゲノムウイルスＲＮＡからＤＮＡへの逆転写、続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルス組み込みを含む。一般的に、このレトロウイルスは、複製欠損性である（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向し得るが、感染性粒子を生成し得ない）。複製欠損性レトロウイルスを生成する標準的プロトコル（プラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み工程、プラスミドでのパッケージング細胞株のトランスフェクション工程、このパッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの生成工程、組織培養培地からのウイルス粒子の収集工程、およびウイルス粒子による標的細胞の感染工程を包含する）が、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．、「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）およびＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．編、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第７巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｆｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に提供されている。
【０１４２】  特定の適用に好ましい別のウイルスは、アデノ随伴ウイルス（二本鎖ＤＮＡウイルス）である。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性であるように操作され得、そして広い範囲の細胞型および種に感染し得る。アデノ随伴ウイルスは、さらに利点を有し、それは例えば、熱および脂質溶媒安定性；多様な系統の細胞における高い形質導入頻度；ならびに重感染阻害の欠失により複数系列の形質導入が可能であることである。報告されることによると、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的様式でヒト細胞ＤＮＡに組み込み得、それにより挿入変異誘発の可能性および挿入された遺伝子発現の多様性が最小になる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において、選択圧の非存在下で１００継代を超える間追跡され、このことは、アデノ随伴ウイルスゲノムの組み込みが比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の様式で機能し得る。
【０１４３】  生物学的ベクターに加えて、化学的／物理学的ベクターが使用されて、ｉｃａ分子が標的細胞へと送達され得、そしてその結果、取り込みが容易になり得る。本明細書中で使用される場合、「化学的／物理学的ベクター」とは、天然分子または合成分子をいい、これは、細菌学的供給源またはウイルス供給源に由来するもの以外であり、ｉｃａ分子を細胞に送達し得る。
【０１４４】  本発明の好ましい化学的／物理学的ベクターは、コロイド状分散系である。コロイド状分散系は、脂質ベースの系（水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む）を含む。本発明の好ましいコロイド状の系は、リポソームである。リポソームは、インビボまたはインビトロで送達ベクターとして有用な人工的膜管である。大きな単ラメラの管（ＬＵＶ）（サイズ０．２〜４．０μｍの範囲）は、大きな高分子をカプセル化し得ることが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよびインタクトなビリオンは、水性内部中にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、（１９８１）６：７７）。リポソームが効率的な遺伝子移入ベクターであるために、以下のうちの１つ以上の特徴が存在すべきである：（１）生物学的活性を保持しながらの高効率での目的遺伝子のカプセル化；（２）高効率での標的細胞細胞質への小胞の水性内容物の送達；ならびに（３）遺伝情報の正確かつ有効な発現。
【０１４５】  リポソームは、例えば、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬから、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮTMおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥTMとして市販されており、これらは、カチオン性脂質（例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ））から構成される。リポソームを作製する方法は、当該分野で周知であり、そして多くの刊行物に記載されている。リポソームはまた、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５）３：２３５〜２４１に概説されている。
【０１４６】  圧縮（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）剤もまた、単独か、または本発明の生物学的ベクターもしくは化学的／物理学的ベクターと組合せて使用され得る。「圧縮剤」とは、本明細書中で使用される場合、核酸上の負電荷を中和し、それによりその核酸を微小の顆粒へと圧縮することを可能にする、ヒストンのような薬剤をいう。核酸の圧縮は、標的細胞によるその核酸の取り込みを容易にする。圧縮剤はまた、単独で（すなわち、細胞によって、より効率良く取り込まれる形態でｉｃａ分子を送達するために）か、あるいはより好ましくは、１つ以上の上記のベクターと組合せて使用され得る。
【０１４７】  ｉｃａ核酸の標的細胞による取り込みを容易にするために使用され得る他の例示的組成物は、リン酸カルシウムおよび細胞内輸送の他の化学的媒介物質、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションおよび相同組換え組成物（例えば、ｉｃａ核酸を標的細胞染色体内の所定の位置に組み込むため）を含む。
【０１４８】  （実施例）
（実施例１：ＰＳ／Ａ抗原の精製）
ＰＳ／Ａがｉｃａ遺伝子座を発現する任意の細菌株から精製され得ることが、本発明に従って発見されている。詳細には、これらの細菌としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、および他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株（例えば、ｉｃａ遺伝子座中の遺伝子で形質転換されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ）が挙げられる。ＰＳ／Ａを精製するために、本発明に従って用いられた、以下の特定の株としては、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＲＰ６２Ａ（ＡＴＣＣ番号：３５９８４）、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ＲＰ１２（ＡＴＣＣ番号：３５９８３）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  Ｍ１８７、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ  ＴＭ３００（ｐＣＮ２７）、Ｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＲＮ４２２０（ｐＣＮ２７）、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８ムコイドが挙げられる。
【０１４９】  （１．ＰＳ／Ａを合成するのに必要であるタンパク質の産生をコードするｉｃａ遺伝子座を含有するコアグラーゼ陰性ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓからのＰＳ／Ａの精製方法）
出発材料を、ｉｃａ遺伝子を発現するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株の増殖を支持する任意の増殖培地においてこの細菌を増殖させることにより、このＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの培養物から調製した。好ましい培地は、オートクレーブ処理による滅菌を可能にするように改変されたＲＰＭＩ−１６４０調製物である、ＲＰＭＩ−１６４０  ＡＵＴＯ−ＭＯＤ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（開始ベースとして）から構成される、出発ベースとして化学的に規定された培地（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ：ＣＤＭ）（Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｇ．Ｍ．ＨａｓｔｉｎｇｓおよびＰ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ．１９９１．「Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｓｌｉｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：１４３）である。フェノールレッドは、省略した。なぜなら、それは、精製されたＰＳ／Ａに容易に結合するからである。このＣＤＭに、さらなるアミノ酸、ビタミンおよびヌクレオチドを補充し、これを他の場所（Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｇ．Ｍ．ＨａｓｔｉｎｇｓおよびＰ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ．１９９１「Ａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｓｌｉｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：１４３）で記載されたのと類似の最終組成物とする。この培地に、デキストロースおよびショ糖をさらに補充した；それぞれは、別々にオートクレーブし、次いで、最終濃度１％になるように添加した。
【０１５０】  培養物に、トリプチカーゼ（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）ダイズ寒天のような寒天プレート（３７℃で一晩インキュベートした）からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの単一コロニーを接種した（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｅ．，Ｊ．Ｈｕｅｂｎｅｒ，Ｎ．Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｓ．Ｔａｋｅｄａ、Ｄ．Ａ．ＧｏｌｄｍａｎｎおよびＧ．Ｂ．Ｐｉｅｒ．１９９３．「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ／ａｄｈｅｓｉｎ  ａｎｄ  ｓｌｉｍｅ」Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６１：５５１）。スパージャーからの２ＬのＯ2／分のバブリングをし、ｐＨ滴定機で自動的に５Ｍ  ＮａＯＨを添加することによりｐＨを７．０に維持しながら、３７℃での激しく撹拌しながら培養物を増殖させた。ｐＨを７．０に維持するためのＮａＯＨの添加が不要になるまで培養物を増殖させた（すなわち、４８〜７２時間）。
【０１５１】  粗抗原を、二価のカチオン、低ｐＨ、および熱の使用により、細菌細胞から直接培養上清に抽出した。好ましい方法は、最終濃度１００ｍＭになるように培養物にＭｇＣｌ2を添加することであり、そしてｐＨを５．０に調節することである。次いで、この培養物を加熱し、そして撹拌した。９０分間６５℃の温度が十分であった。細胞本体を９０００×ｇにて１５分間で沈殿させた。上清を接線流（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ−ｆｌｏｗ）濾過（１０，０００分子量（ＭＷ）カットオフフィルター）で約１０００ｍｌに濃縮し、そして溶液を濾過デバイスの中においたまま、以下の緩衝液交換および処理を行った：この緩衝液は、ｐＨ５．０に調節された脱イオンＨ2Ｏで交換した（過剰のＭｇ2+イオンを除くため）。次に、０．１Ｍ  ＴＲＩＳ−０．１５Ｍ  ＮａＣｌを用いてｐＨを７．４に調整し、そしてこの溶液をそれぞれ５ｍｇのＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅを用いて室温で４時間処理し、次いで５ｍｇのトリプシンを用いて２時間処理した。この緩衝液を接線流デバイスで、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．６）に交換し、そしてデオキシコール酸（ＤＯＣ）ナトリウムを最終濃度が３％になるように添加した。
【０１５２】  本発明の多糖抗原を単離するための別の好ましい方法は、５モル濃度のＮａＯＨまたはＨＣｌのような強塩基または強酸との細菌のインキュベートを含む。細菌を強塩基または強酸中で１８〜２４時間、撹拌する。次いで細胞本体を遠心分離により収集し、そしてさらに２回再抽出する。それぞれの抽出からの上清をプールし、酸または塩基を用いてｐＨ７になるように中和する。得られた粗抗原懸濁物を２〜２４時間脱イオン水に対して透析する。残りの不溶性の粗抗原を遠心分離により収集する。上清を公知のアッセイ（例えば、免疫学的手段）により可溶性抗原の存在について試験する。上清が可溶性抗原について陽性である場合、上清を凍結乾燥し、そして再抽出してさらなる粗抗原を入手し得る。不溶性の粗抗原を５０ｍＭ  ＰＢＳまたは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有）の緩衝溶液に再懸濁する。
【０１５３】  この懸濁した粗抗原を３７℃で４時間、それぞれ５ｍｇのＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅで処理し、次いで５ｍｇのトリプシンで２時間処理した；この細胞を沈殿させ、そしてこの上清を、トリプシンで処理しながら、濃縮した培養上清に添加した。残りの細胞本体を１０ｍＭのＥＤＴＡ／３％  ＤＯＣ（ｐＨ８．６）に再懸濁した；２時間撹拌しそして３回目に沈殿させた。得られた上清を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／３％  ＤＯＣ（ｐＨ８．６）で処理しながら、濃縮した培養上清に添加した。別の代替物は、ｐＨ＞１０の緩衝液である。好ましい緩衝液は、ｐＨ１１の、０．４Ｍ  炭酸アンモニウムである。最終的に、プールした上清を、例えば、３０，０００ＭＷのカットオフ膜フィルターを用いる、撹拌された細胞の濾過により濃縮した。粒子状物質または不溶性物質を２，０００×ｇで３０分間の遠心分離により沈殿させ、上清を保持した。
【０１５４】  溶解された粗抗原を得るための上記の抽出およびＤＯＣ緩衝液を用いる代替物として、粗抗原をまた、抽出物のｐＨを塩基（例えば、水酸化ナトリウム）を用いて８．０より大きく調節し、エタノールのようなアルコールの４容量を添加し、遠心分離により沈殿物を回収し、そして０．１Ｍ  ＨＣｌまたはｐＨが４．０未満の任意の緩衝液中での沈殿物の再溶解により、細胞の初回抽出物から得た。
【０１５５】  次に、高分子量ＰＳ／Ａ濃縮材料を分子ふるいクロマトグラフィーにより、粗スライム抽出物から単離した。５．０ｃｍ×１００ｃｍのカラムにＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）または匹敵する分子ふるいゲルを充填し、そして１％ＤＯＣ（ｐＨ８．６）を含有する１０ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄した。代替物として、ｐＨ４．０未満の緩衝液が時々用いられる。好ましい緩衝液は、ｐＨ２．０の０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌであった。粗スライムを１０〜２０ｍｌの容積で適用し、そしてＰＳ／Ａ含有画分を２０６ｎｍでのＵＶ光の吸収の測定、およびＰＳ／Ａ抗原に特異的なポリクローナルウサギ抗血清を用いたイムノドットブロット分析により同定した。
【０１５６】  ＤＯＣを基礎とする緩衝液を用いるカラムのボイド容積画分中に溶出する物質（ＭＷ＞１００，０００ダルトン）をプールし、そしてプロテイナーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍｌ）（１％ＤＯＣ中でタンパク質分解性が活性である）で処理した；この物質を、同時に、撹拌セル濾過ユニット（３０，０００ＭＷカットオフ膜）を用いて１００ｍｌに濃縮した。低ｐＨ緩衝液（＜４．０）を用いて分子ふるいカラムのボイド容積中に溶出する物質をプールし、少なくとも０．１Ｍの最終濃度でかつ少なくとも８．０のｐＨになるように２塩基性リン酸ナトリウムを添加し、次いで、４容積のアルコール（例えば、９５％エタノール）を添加し、ＰＳ／Ａ抗原を沈殿させた。
【０１５７】  ＤＯＣカラムから回収された物質のさらなる精製には、調製物中に存在するアルカリ不安定性細胞壁抗原の残留物を破壊する工程を用いた。プロテイナーゼＫで消化した物質をＮａＯＨの添加により処理して５００ｍＭの最終濃度にし、そしてこの混合物を２２℃で２時間撹拌し、次いでＨＣｌで中和した。ＰＳ／Ａをアルコール（例えば、５０％ｖ／ｖに添加されたメタノール）沈殿により回収し、そして３０，０００×ｇで３０分間の遠心分離により沈殿させた。残留ＤＯＣおよび不純物を、純粋メタノールでの沈殿物の多数の洗浄により除去した。
【０１５８】  ＤＯＣ緩衝液系または低ｐＨ緩衝液系のいずれかを用いて流れたカラムのボイド容積中に回収された物質からの残留テイコ酸の除去のために、アルコール沈殿物を、４℃で４８時間、２４％（ｖ／ｖ）フッ化水素酸（ＨＦ）に懸濁した。このＨＦ溶液を１２％ＨＦの濃度になるように水中に希釈し、次いで、ＮａＯＨで中和し、そして流水に対して透析した。ＰＳ／Ａは、この点で最も不溶性であった。残留する可溶性ＰＳ／Ａを５０％になるようなメタノールの添加により全て沈殿させ、このペレットを純粋メタノールで３〜５回洗浄し、脱イオンＨ2Ｏに懸濁し、凍結し、そして凍結乾燥した。
【０１５９】  （２．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓからのＰＳ／Ａの精製）
ＰＳ／Ａをまた、コアグラーゼ陰性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓについての上記手順または上記手順の変法のいずれかを用いてＳ．ａｕｒｅｕｓから精製した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓからのＰＳ／Ａの回収を、好ましくはＭＮ８ムコイド株のようなＰＳ／Ａを構成的に作製する株を用いることにより促進した。このような株を、それらの増殖を支持する任意の培地において増殖させ得るが、好ましい培地はコロンビアブロス（ｃｏｌｕｍｂｉａ  ｂｒｏｔｈ）である。あるいは、インタクトなｉｃａ遺伝子座を有する任意のＳ．ａｕｒｅｕｓ株が０．２５％（ｖ／ｖ）以上のグルコースが補充された脳心臓滲出物ブロス（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｂｒｏｔｈ）中で増殖され、ＰＳ／Ａを生成し得る。
【０１６０】  培養物に、３７℃で一晩インキュベートされた任意の適切な培地からＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの単一コロニーを接種した。スパージャーから２ＬのＯ2／分のバブリングをし、ｐＨ滴定機で自動的に５Ｍ  ＮａＯＨを添加することによりｐＨを７．０に維持しながら、３７℃で激しく撹拌そながら培養物を増殖させた。ｐＨ７．０に維持するためのＮａＯＨの添加が不要になるまで培養物を慣用的に増殖させた（すなわち、４８〜７２時間）。
【０１６１】  次いで、細菌細胞を遠心分離により培養物から回収し、そして緩衝化生理食塩水に再懸濁した。次いで、リゾチームおよびリソスタフィン酵素を０．１ｍｇ／ｍｌより高い濃度になるように添加した。この懸濁物を３７℃で２〜２４時間撹拌し、その後プロテアーゼを添加した。好ましいプロテアーゼは、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの濃度のプロテイナーゼＫであったが、他のプロテイナーゼ（例えば、プロナーゼＥまたはトリプシン）が使用され得る。この混合物を少なくとも２時間３７℃で撹拌した。次いで、この懸濁物のｐＨをＨＣｌのような酸を用いて、４．０未満に（しかし好ましくは２．０になるように）低下させた。不溶性物質を遠心分離により取り出し、そして沈殿物を、低ｐＨ（＜４．０、好ましくは２．０）溶液における再懸濁、次いで、１０分以上撹拌することおよび不溶性物質を取り出すための遠心分離により３回再抽出した。低ｐＨ抽出物をプールし、０．１Ｍ以上の濃度になるようなリン酸ナトリウムおよび水酸化ナトリウムのような塩基の両方を添加することによりｐＨを８．０より高く上昇させ、次いで、９５％エタノールのような４容積のアルコールを添加した。別の代替物は、ｐＨが１０を越える緩衝液である。好ましい緩衝液はｐＨ１１の０．４Ｍ  炭酸アンモニウムである。
【０１６２】  本発明の多糖抗原を単離するための別の好ましい方法は、５Ｍ  ＮａＯＨまたはＨＣｌのような強塩基または強酸との細菌のインキュベートを含む。細菌を強塩基または強酸中で１８〜２４時間、撹拌する。次いで細胞本体を遠心分離により収集し、そしてさらに２回の再抽出する。それぞれの抽出からの上清をプールし、酸または塩基を用いてｐＨ７に中和する。得られた粗抗原懸濁物を２〜２４時間脱イオン水に対して透析する。残りの不溶性の粗抗原を遠心分離により収集する。この上清を公知のアッセイ（例えば、免疫学的手段）により可溶性抗原の存在について試験する。この上清が可溶性抗原について陽性である場合、この上清を凍結乾燥し、そして再抽出してさらなる粗抗原を入手し得る。不溶性の粗抗原を５０ｍＭ  ＰＢＳまたは１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有）の緩衝溶液に再懸濁する。次いで、この物質を、コアグラーゼ陰性ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓからのＰＳ／Ａの精製方法に関して上記されたのと同じ酵素処理に供した。
【０１６３】  次いで、この不溶性物質を遠心分離により回収し、低ｐＨ（＜４．０、好ましくは１．０）溶液に再溶解し、不溶性物質を遠心分離により除去し、そして、可溶性画分中の高分子量の物質をｐＨ４．０未満の緩衝液中で平衡化された分子ふるいカラムへの適用により回収した。好ましい緩衝液は、ｐＨ２．０の０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌであった。代表的分子ふるいカラムは、２．６×１００ｃｍの寸法を有し、そしてこのカラムにＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−５００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のようなゲルを充填した。ＰＳ／Ａ含有画分を２０６ｎｍでのＵＶ光の吸収の測定、およびＰＳ／Ａに対するポリクローナルウサギ抗血清を用いたイムノドットブロット分析により同定した。高分子量（＞１００，０００）の範囲に溶出する免疫学的反応性の画分をプールし、０．１Ｍ以上の濃度になるようなリン酸ナトリウムおよび塩基（例えば、水酸化ナトリウム）の両方の添加によりｐＨを＞８に上昇させ、次いで４容積のアルコール（例えば、エタノール）を添加し、得られた沈殿物を遠心分離で回収した。次に、このアルコール沈殿物を、４℃で４８時間、２４％（ｖ／ｖ）フッ化水素酸（ＨＦ）に懸濁した。このＨＦ溶液を１２％ＨＦの濃度になるように水中に希釈し、次いで、ＮａＯＨで中和し、そして流水に対して透析した。ＰＳ／Ａは、この点で最も不溶性であった。残留する可溶性ＰＳ／Ａを最終濃度＞５０％になるようなアルコールの添加により全て沈殿し、このペレットをアルコール（例えば、９５％エタノールまたは純粋メタノール）で３〜５回洗浄し、そしてこのペレットを脱イオンＨ2Ｏに懸濁し、凍結し、そして凍結乾燥した。
【０１６４】  （実施例２：ＰＳ／Ａ抗原の化学合成）
（方法：）
ＰＳ／Ａは、キチン（β−１−４結合を有するポリ−Ｎ−アセチル−グルコサミン）およびキトサン（β−１−４結合を有するポリ−グルコサミン）に化学的に類似している。キチンのＮ−アセチル基を、温和な塩基で処理（１．０Ｍ  ＮａＯＨ、９５℃、１時間）することにより容易に除去して、キトサンを生じる。次いで、遊離のアミノ基を、遊離のカルボキシル基への遊離のアミノ基のカップリングを促進する水溶性のカルボジイミド試薬の存在下でこれらの物質へ添加したコハク酸を用いて、スクシネートで置換した。
【０１６５】  １０ｍｇのキトサンを、１．０の０．１Ｍ  ＨＣｌに懸濁し、そしてゲル様懸濁物が得られるまで撹拌した。次いで、１００ｍｇのコハク酸を、その後、７５ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド−ＨＣｌ（ＥＤＣ、Ｓｉｇｍａ）を添加し、そしてこの懸濁物を室温で２日間撹拌した。次いで、この溶液を２Ｍの水酸化ナトリウムで中和し、水に対して透析して未結合コハク酸および遊離ＥＤＣを除去し、そしてスクシニル化したキトサンを凍結乾燥した。
【０１６６】  （結果：）
得られた物質は、ＰＳ／Ａの天然のポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミンと類似しており、個々のグルコサミン残基の間の結合の性質が異なっていた。しかし、本発明者らは、ＰＳ／Ａに対して惹起された抗体が、Ｎ−スクシニル化キトサンに反応することを本発明に従って、見出した。これは、キチンおよびキトサンの適切な化学的修飾がＰＳ／Ａに対する抗体を惹起する能力を有する分子を生じることを示す。
【０１６７】  （実施例３：ＰＳ／Ａ抗原の分析）
混入物を分解するための塩基（ＮａＯＨ）およびフッ化水素酸の両方の処理の使用は、以前に得られた先行技術の調製物を上回ってＰＳ／Ａの純度を有意に改善する。ＰＳ／Ａは、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂカラムの高分子量のボイド容積画分（＞１００，０００ｋＤａ）に溶出し、そして、以前に示されたように、免疫拡散において単一の沈降バンドを与えた（Ｔｏｊｏ，Ｍ．，Ｎ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｄ．Ａ．ＧｏｌｄｍａｎｎおよびＧ．Ｂ．Ｐｉｅｒ．１９８８「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ／ａｄｈｅｓｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ」Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１５７：７１３）。さらに、０．０２μｇ／ウェルまでＰＳ／Ａの希釈物でのＥＬＩＳＡウェルの感作は、免疫前血清の結合よりも、有意に大きい精製されたＰＳ／Ａに対する抗体の１：５００希釈物の結合を生じた。精製の間にＰＳ／Ａを可溶化するための３％ＤＯＣまたは低ｐＨ（＜４．０）緩衝液の使用は、重要であることが見出されたが、一旦ＰＳ／Ａが、メタノールによりこれらの溶液から沈殿されれば、それはＤＯＣ緩衝液中でさえ、４．０を超えるｐＨでは再溶解され得ない。ＰＳ／Ａは、５０％プロパノール−５０％ブタノールにおいて、およびピリジンにおいてわずかに可溶性であった（約５００μｇ／ｍｌ）。このＰＳ／Ａ抗原は、検出可能なリン酸を欠いていた（＜０．０１％）（Ｋｅｌｅｔｉ、Ｇ．およびＷ．Ｈ．Ｌｅｄｅｒｅｒ．１９７４．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１６８】  （実施例４：ＰＳ／Ａの化学的特性の分析）
本発明者らが、高温（９５〜１００℃）での１４時間の４Ｍ  ＨＣｌ酸における加水分解後、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  Ｍ１８７、Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ（ｐＣＮ２７）およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８ムコイドから単離されたＰＳ／Ａを分析したとき、本発明者らは、気−液クロマトグラフィー−質量分析法（ＧＬＣ−ＭＳ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）の組み合わせを用いて、グルコサミンが、ＰＳ／Ａにおける単一の糖成分であることを見出した。例示的ＮＭＲスペクトルは図１に示される。さらに、高品質のスクシネート（グルコサミンとほぼ等モル濃度）をまた、調製物中に同定した。スクシネートは、９５℃で１０分以上の５Ｍ  ＮａＯＨにおける加水分解により抗原から遊離したが、同じ条件下での１Ｍ  ＮａＯＨでは遊離しなかった。より低い量のＮａＯＨは、カルボキシルエステル連結スクシネートを容易に遊離させる。ＮＭＲの結果とともに、これは、スクシネートがグルコサミンのアミノ基に連結しており、グルコサミンのヒドロキシル基に連結していないことを確認する。オゾンによるＰＳ／Ａの少糖フラグメントへの加水分解およびＮＭＲによる分析は、糖間の連結がβ結合であると確認した。これらの株から単離されたＰＳ／Ａは、過ヨウ素酸ナトリウムでの処理（０．２Ｍで１４時間）後、血清学的な反応性、およびＧＬＣ−ＭＳにより検出可能な化学的特性を消失する。このことは、グルコサミン残基の間の１−６結合を示す。また、５Ｍ  ＮａＯＨでの５分を越える加水分解は、血清学的活性を破壊する。
【０１６９】  従って、天然のＰＳ／Ａ物質は、β１−６結合で互いに連結するＮ−スクシニルＤ−グルコサミン残基の高分子量（＞１００，０００ダルトン）ホモポリマーである。このグルコサミンのアミノ基上のスクシネート基の置換のレベルは、ネイティブな分子において１００％にほぼ等しい。
【０１７０】  （実施例５：精製されたＰＳ／Ａでの免疫は、この抗原と反応性の抗体を惹起する）
（方法：）ウサギの免疫によりＰＳ／Ａに対する抗体を惹起するための、以前に記載された方法（Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．，Ｍ．Ｔｏｊｏ，Ｄ．Ａ．Ｇｏｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ｄ．ＴｏｓｔｅｓｏｎおよびＧ．Ｂ．Ｐｉｅｒ．１９９０．「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ／ａｄｈｅｓｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｒａｂｂｉｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃａｔｈｅｔｅｒ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｃｏａｇｕｌａｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１６２：４３５；Ｔｏｊｏ，Ｍ．，Ｎ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｄ．Ａ．ＧｏｌｄｍａｎおよびＧ．Ｂ．Ｐｉｅｒ．１９８８．「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ／ａｄｈｅｓｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ」Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１５７：７１３；Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．，Ｇ．Ｂ．Ｐｉｅｒ，Ｙ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｍ．Ｔｏｊｏ，Ｅ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｔ．ＴｏｓｔｅｓｏｎおよびＤ．Ａ．Ｇｏｌｄｍａｎｎ．１９９１．「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｄｕｅ  ｔｏ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ／ａｄｈｅｓｉｎ．」Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．８４：２５３９）を、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  Ｍ１８７およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８ムコイドから単離された抗原から抗血清を調製するために用いた。
（結果：）両方の細菌株由来の調製物により惹起された抗体は、両方の抗原に対して同等の力価の抗体を誘導した（表１）。
【０１７１】
【表１】
0005490341.tif 000014
（実施例６：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株におけるＰＳ／Ａ抗原の物理的位置）
（方法：）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８ムコイドおよびＲＮ４２２０（ｐＣＮ２７）をトリプチカーゼダイズ寒天上で増殖させ、そしてＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＭＮ８を０．２５％以上のグルコースを補充した脳心臓滲出物ブロス中で増殖させた。次いで、この細胞をＰＳ／Ａに対するポリクローナルウサギ抗血清でまずプローブし、次いで、金標識したプロテインＡ、または金標識した抗ウサギＩｇＧでプローブし、そして顕微鏡写真を得た。
【０１７２】  ＰＳ／Ａは、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの細菌莢膜を表すことが以前に示されている。本発明者らはｉｃａ遺伝子座を保有する株が莢膜に包まれているか否かを免疫電子顕微鏡を用いて試験した。以下の一連の免疫電子顕微鏡写真を撮った：（ａ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８ムコイド上のＰＳ／Ａ莢膜と抗ＰＳ／Ａ抗体との相互作用；（ｂ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８ムコイドの正常ウサギ血清（ＮＲＳ）染色を用いるネガティブコントロール；（ｃ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＲＮ４２２０（ｐＣＮ２７）上のＰＳ／Ａ莢膜と抗ＰＳ／Ａ抗体との相互作用；（ｄ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＲＮ４２２０のＮＲＳ染色を用いるネガティブコントロール；（ｅ）０．２５％グルコースを補充した脳心臓滲出物ブロス中で増殖したＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８と抗ＰＳ／Ａ抗体との相互作用；および（ｆ）０．２５％グルコースを補充した脳心臓滲出物ブロス中で増殖させたＳ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８のＮＲＳ染色を用いたネガティブコントロール。この顕微鏡写真は、ＰＳ／Ａに対する抗体が、これらの株における細胞外莢膜に結合することを実証する。
【０１７３】  （実施例７：Ｓ．ａｕｒｅｕｓのヒト臨床単離体によるＰＳ／Ａ抗原の発現）
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの多数のヒト臨床単離体は、ＰＳ／Ａ抗原を構成的に（すなわち、種々の増殖条件下で常に）発現する。また、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのいくつかの株（すなわち、ＭＮ８ムコイド）も、同じく発現する。しかし、ほとんどのヒト臨床単離体は、正常な実験条件下で増殖させた場合、それほどＰＳ／Ａを発現しない。本発明者らは、これらのＳ．ａｕｒｅｕｓ株を、０．２５％以上のグルコースを含有する脳心臓滲出物ブロス培地中で増殖させれば、ＰＳ／Ａの発現は、ＥＬＩＳＡ阻害アッセイのような血清学的手段により検出され得ることを見出した（図２に示す）。さらに、本発明者らは、マウスの感染の前に検出可能なＰＳ／Ａを発現しないＳ．ａｕｒｅｕｓの単離体が、腎臓のような感染組織から回収された場合、ＰＳ／Ａを生成することが示され得ることを見出した。従って、特定のインビトロ条件下、または動物での実験的感染後、他の場合には検出可能なＰＳ／Ａを生成しないＳ．ａｕｒｅｕｓの株が、ここでＰＳ／Ａを生成する。別の培地では、本発明者らは、インビトロにおいてＰＳ／Ａ発現を増強するのはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ１１０培地であることを見出した。
【０１７４】  ＰＳ／Ａ発現を検出するために寒天から新鮮に単離し、そして（ａ）抗ＰＳ／Ａ抗体で染色したヒト臨床単離体（ＡＳＥＡＮ）、または（ｂ）ＮＲＳコントロールで染色したヒト臨床単離体（ＡＳＥＡＮ）の免疫電子顕微鏡写真を撮影した。本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのヒト臨床単離体は、この株を、液体または組織のサンプルにおける感染を検出するために最初に用いられた寒天プレートからの透過型電子顕微鏡により試験した場合、ＰＳ／Ａを発現することを見出した。従って、もしヒト臨床単離体が、実験培地での細菌の過度の継代なしに、ＰＳ／Ａ発現について試験されれば、それらはＰＳ／Ａ抗原を生成することが示され得る。
【０１７５】  （実施例８：Ｓ．ａｕｒｅｕｓの動物単離体によるＰＳ／Ａ抗原の発現）
Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、動物における乳腺炎感染の主な原因であり、かなりの経済的損失を生じる。本発明者らはまた、ＰＳ／Ａの発現について、動物（ウシおよびヒツジ）からのＳ．ａｕｒｅｕｓ単離体を分析した。本発明者らは、血清学的試験によって決定した場合、分析された単離体の多くが、ＰＳ／Ａ抗原を生成することを見出した。試験した４０の動物単離体のうち２３がＰＳ／Ａに対する抗体を用いたイムノドットブロットにおいて強力な反応を有した。これは、単離体が、たとえヒト単離体について行わねばならないようなＰＳ／Ａの生成を増強する特別の培地での増殖をさせていない場合であっても検出可能であった（ので）。従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのヒト臨床単離体と異なり、多数の動物単離体は、構成的にＰＳ／Ａを生成し得るようである。
【０１７６】  （実施例９：ＰＳ／Ａに対する抗体によるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する防御）
（方法：）ＰＳ／Ａ抗原１〜１００μｇ（好ましくは１００μｇ／マウス）を用いて、マウスを免疫し、抗体を惹起した。次いで、このマウスに、生きたＳ．ａｕｒｅｕｓ菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＲｅｙｎｏｌｄｓまたはＭＮ８株のいずれか）をチャレンジした。そしてＰＳ／Ａに対する抗体を有するマウスは感染に対して防御されたことが示された。
【０１７７】  （結果：）マウスをＰＳ／Ａで能動免疫し、続いてＳ．ａｕｒｅｕｓで静脈内チャレンジすることは、動物を殺傷しそして試験した場合、５日後の腎臓中の菌数を減少させた（図３）。
【０１７８】  同様に、ウサギ中でＰＳ／Ａ抗原に対して惹起した抗体をマウスに与えること、続いてＳ．ａｕｒｅｕｓ株でこのマウスをチャレンジすることは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対してこのマウスを防御する（図４）。このようにＰＳ／Ａに対する抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に対してマウスを防御する。上記のように、非免疫コントロールマウスの感染腎臓から回収された単離体の分析は、動物における感染の間、感染がＰＳ／Ａの発現を誘導していたことを示した。
【０１７９】  （実施例１０：Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離体におけるＰＳ／Ａ産生遺伝子の検出）
（方法：細菌からのＤＮＡ抽出、ＰＣＲ分析およびサザンブロット分析：）
ＤＮＡ調製：細菌を１０−２−ｍｌのトリプチカーゼソイブロス（ＴＸＢ）に接種し、そして３７℃で一晩増殖させた。得られる増殖物を遠心分離により回収した。細菌細胞を溶解緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３００ｍＭスクロース）に再懸濁した。次いで、細胞を、リソスタフィン（０．２ｍｇ／ｍｌ）およびリゾチーム（２ｍｇ／ｍｌ）とともに、３７℃で１〜３時間インキュベートした。この酵素消化の後、４５％エタノール中の５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を０．５ｍｌ添加し、ボルテックスし、そして室温で３０分間インキュベートした。次いで、１ｍｌの緩衝化フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２７：１２：１の容積比）を添加し、その後ボルテックスおよび遠心分離（１５分、５０００ｒｐｍ、４℃）した。上部の水層を取り出し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１比）に添加した。再度、これを遠心分離（１５分、５０００ｒｐｍ、４℃）した。上部の水層中のＤＮＡを回収し、次いで、出発容積の２に等しい量の９５％エタノールの添加により沈殿させ、そして沈殿したＤＮＡをガラス棒上に巻き付けた。次いで、このＤＮＡを蒸留水に溶解した。
【０１８０】  サザンブロット分析のためのＤＮＡの制限酵素消化を製造業者（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）のプロトコールに従って行った。ＤＮＡのプローブを、製造業者の指示書に従って、ＥＣＬプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて標識した。
【０１８１】  ＰＣＲをタッチダウン（ｔｏｕｃｈ  ｄｏｗｎ）プロトコールを用いて実行した。手短には、プライマー（配列番号２〜３）をＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ株から得たＤＮＡに添加し（最終濃度２００ｎＭ）、そしてサーマルサイクラーをプログラムして、９５℃でのＤＮＡ融解を実施し、そして６０℃でポリメラーゼ伸長を開始し、４５℃に達するまで各サイクルでアニーリング温度を０．５℃ずつ下げた。
【０１８２】  （結果：）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの単離体がＰＳ／Ａを生成する遺伝子を有することを示した。これらの遺伝子は、ｉｃａと名付けられた遺伝子座に含まれ、そしてＨｅｉｌｍａｎｎらにより初めて単離および配列決定された（Ｈｅｉｌｍａｎｎ，Ｃ．，Ｏ．Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，Ｃ．Ｇｅｒｋｅ，Ｎ．Ｖａｎｉｔｔａｎａｋｏｍ，Ｄ．ＭａｃｋおよびＦ．Ｇｏｔｚ．１９９６．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｆｉｌｍ−ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ．」Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０：１０８３）。本明細書において、本発明者らは、ｉｃａ遺伝子座が、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン分子ＰＳ／Ａを合成するタンパク質をコードし、ＰＩＡと名付けられたポリ−Ｎ−アセチル化ポリグルコサミン分子を合成するタンパク質をコードするのではないことを実証する。
【０１８３】  プライマーをｉｃａ遺伝子の配列に基いて、ＰＣＲ分析のために設計し、２．７ｋＢのＤＮＡフラグメントを増幅した（配列番号２および３）。これらのプライマーを、ｉｃａ遺伝子がもともとクローニングされたＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株ＲＰ６２Ａ由来のＤＮＡとともに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８、ＭＮ８ムコイド、ＲＮ４５０、Ｂｅｃｋｅｒ、Ｒｅｙｎｏｌｄｓおよび１Ａから単離したＤＮＡと混合し、そしてＰＣＲ反応に用いた場合、本発明者らはＳ．ａｕｒｅｕｓ株のすべてがｉｃａ遺伝子座を有することを見出した（図５）。増幅された２．７ｋＢのフラグメントを標識し、これらのＳ．ａｕｒｅｕｓ株から抽出されたＤＮＡのサザンブロット反応にプローブとして用いて、本発明者らはまた、ｉｃａ遺伝子座中の遺伝子の存在を検出した（図６）。このように、本発明者らは、ＰＳ／Ａ抗原を合成するタンパク質を生成するために必要な遺伝子がＳ．ａｕｒｅｕｓ中に存在することを示した。
【０１８４】  前述の明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするに十分であると考えられる。本発明は、提供された実施例による範囲内に限定されない。なぜなら、実施例は、本発明の１つの局面の単一の例示として意図され、そして他の機能的に等価な実施態様は本発明の範囲内であるからである。本明細書に示され、そして記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が前述の記載から当業者に明白となり、そして特許請求の範囲の範囲内に入る。本発明の利点および目的は、本発明のそれぞれの実施態様により必らずしも包含されない。
【０１８５】  本出願に引用される全ての参考文献、特許、および特許出願は、その全体が参考として本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８からのＰＳ／ＡのＮＭＲスペクトルである。
【図２】  図２は、０．５％グルコースを補充した脳心臓滲出物ブロス中で一晩、２回増殖させた、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの種々の株が、ＥＬＩＳＡプレートを感作したＰＳ／Ａ抗原に結合する抗体を除去する能力を示す、ＥＬＩＳＡ阻害の結果を表すグラフである（斑点の棒）。感度についてのコントロールとして、別個のアリコートの同じ細菌を、０．４Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウムで処理して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株の表面上のＰＳ／Ａ抗原を破壊した（灰色の棒）。結合阻害百分率を、試験株に吸着されたＰＳ／Ａに対する抗体、および公知のＰＳ／Ａ陰性株（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｓｎ−３）に吸着したＰＳ／Ａに対する抗体を用いて達成された光学密度の比から決定した。
【図３】  図３は、ＰＳ／Ａ抗原が、マウスにおいてＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する能動免疫を誘導する能力を示すグラフである。
【図４】  図４は、抗ＰＳ／Ａ抗体が、マウスにおいてＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する受動免疫を誘導する能力を示すグラフである。
【図５】  図５は、ＰＣＲフラグメントゲルの写真を示す。
【図６】  図６は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおけるｉｃａ（細胞間付着因子遺伝子座）遺伝子のサザンブロットの写真を示す。ＰＣＲを、コントロールおよびＳ．ａｕｒｅｕｓの８つの単離体からの染色体ＤＮＡについて行った（１）分子量マーカー、（２）Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ  ＴＭ３００（ネガティブコントロール）、（３）Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ＲＰ６２ＡからのポジティブコントロールＤＮＡ、（４）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、（５）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株ＭＮ８、（６）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株５８２７、（７）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株Ｓ８３６、（８）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株Ｖａｓ、（９）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株ＶＰ、（１０）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株２６５、（１１）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株Ｐｏｒ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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