(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コハク酸を産生することができる、形質転換された微生物であって、該微生物は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの１６ＳリボソームＲＮＡと少なくとも９５％同一の１６ＳリボソームＲＮＡ配列を有し、少なくとも１つのプロモーターに作動可能に連結されたグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで形質転換されたものである、微生物。
【請求項２】
前記形質転換された微生物が、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６およびＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０からなる群より選択される、請求項１に記載の形質転換された微生物。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ酵素をコードする、請求項１に記載の形質転換された微生物。
【請求項４】
前記プロモーターが、少なくとも１つのホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーターをさらに含む、請求項１に記載の形質転換された微生物。
【請求項５】
前記形質転換された微生物が、５０ｇ／Ｌ〜１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができる、請求項４に記載の形質転換された微生物。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ酵素をコードする、請求項１に記載の形質転換された微生物。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼプロモーターに作動可能に連結されている、請求項６に記載の形質転換された微生物。
【請求項８】
前記微生物が、５０ｇ／Ｌ〜１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができる、請求項７に記載の形質転換された微生物。
【請求項９】
前記形質転換された微生物が、形質転換されていない同じ微生物よりも多くコハク酸を産生することができる、請求項１に記載の形質転換された微生物。
【請求項１０】
前記形質転換された微生物が、５０ｇ／Ｌ〜１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができる、請求項９に記載の形質転換された微生物。
【請求項１１】
前記微生物が、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６およびＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０からなる群から選択される、請求項９に記載の形質転換された微生物。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有し、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼの酵素活性を有する、請求項１に記載の形質転換された微生物。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号５と少なくとも９５％の配列同一性を有す、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼの酵素活性を有る、請求項１に記載の形質転換された微生物。
【請求項１４】
前記プロモーターが、配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記ポリヌクレオチドが、配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有す、該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドが、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼの酵素活性を有る、請求項１に記載の形質転換された微生物。
【請求項１５】
コハク酸を産生するのに十分な条件下で請求項１に記載の形質転換された微生物を培養する工程を含む、コハク酸を産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年１月２６日に提出された米国仮特許出願第６０／６４７，１４１号；および２００４年１２月２２日に提出された米国仮特許出願第６０／６３９，４４３号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張するものである。上述の出願は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
石油化学材料から現在得られている多くの化学物質は、天然に存在する炭水化物から生成することができる。特に、４炭素ジカルボン酸であるコハク酸は、消費財産業にとって多くの重要な中間体および特殊化学物質を生成し、現在、再生不可能な石油化学材料から得られた出発物質に依存している商業的プロセスのための出発物質として使用され得る大量の汎用化学物質となる潜在性を有している。例えば、汎用化学物質として、コハク酸は、多くの産業についての溶媒および出発物質として有用な１，４−ブタンジオール（ＢＤＯ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）化合物の製造に使用される石油化学の出発物質に取って代わる可能性がある。例えば、ＢＤＯおよびＴＨＦ化合物は、自動車の車体用の樹脂、家庭用器具の用途のための熱可塑物および繊維産業におけるＬｙｃｒａ（商標）などの弾性ポリマーの製造に有用である。さらに、ＢＤＯおよびＴＨＦ化合物はまた、農薬産業および医薬品産業における多くの特殊な用途を有する。特に、ＢＤＯの世界的な消費は、年間４％もの高率で増加すると予想される。
【０００３】
ＢＤＯおよびＴＨＦを生成するために現在使用されている石油化学物質としては、アセチレン、ホルムアルデヒド、ブタン、ブタジエンおよびプロピレンオキシドが挙げられる。これらのすべてが、様々な有害特性（例えば、極度の引火性、化学的不安定性および毒性）を有する。さらに、これらの材料は、石油から得られるので、再生不可能な資源を枯渇させ、処分または破棄によって、最終的に炭素を（二酸化炭素として）大気中に放出する。従って、石油化学的に得られた材料の代替物としてコハク酸を開発することは、有害な材料の取扱いおよび貯蔵を減少させ、産業的安全性および地域社会の安全性を促進し、汚染および環境コストを減少させ、そして石油への依存を減少させ得る。
【０００４】
糖の発酵によるコハク酸および他の有機化合物の製造は、経済的に実行可能である。多くの微生物が、炭素源としてコーンシュガーを使用してコハク酸を産生するために使用されてきた。従って、石油化学系出発物質の代替物としてコハク酸を開発することは、発酵性の糖を提供することができるトウモロコシおよび他の農産物ならびに／またはバイオマスについての市場を拡大し得る。
【０００５】
形式上、コハク酸生成についての生化学経路は、二酸化炭素分子を３炭素化合物であるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）に添加して４炭素化合物であるオキサロ酢酸（ＯＡＡ）を生成するものである。コハク酸への経路の次の工程は、逆向きのトリカルボン酸サイクル（ＴＣＡサイクル）の一部であり、そして２つの必須の還元工程を含む。ＯＡＡからコハク酸塩へ導く生化学プロセスにおいて、ＯＡＡは、Ｌ−リンゴ酸塩を生成するためにはじめに還元されなければならない。次いでＬ−リンゴ酸塩は、脱水されてフマル酸塩
および水を生成する。次いでフマル酸塩は、還元されてコハク酸を与える。化学分野では、「還元」とは、化合物への水素分子の付加のことをいう。
【０００６】
一般に、遊離水素分子は、細胞内の生物系に見られない。正確に言えば、還元は、水素の生化学的等価物として（すなわち、水素分子の担体として）機能し、「還元当量」とよばれる補酵素の使用を介して実施される。還元当量としては、補酵素である、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（「ＮＡＤＨ」）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（「ＮＡＤＰＨ」）、還元型フラビンアデニンジヌクレオチド（「ＦＡＤＨ２」）および還元型フラビンモノヌクレオチド（「ＦＭＮＨ」）が挙げられる。一般に、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、ピリジンジヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ酵素によって様々な微生物において相互変換され得る。
【０００７】
ＯＡＡからコハク酸塩への変換に必要とされる還元当量は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ２、ＦＡＤＨ２または他の補助因子によって提供される。十分な量の還元当量が、ＯＡＡからコハク酸塩への変換に利用可能であることが不可欠である。十分な還元当量が、利用可能でない場合、生化学経路は、効率的に機能せず、一部のＯＡＡしか所望のコハク酸塩に変換されない。
【０００８】
還元当量は、細胞代謝に通常見られる多くの生物学的プロセスにおいて生成され得る。例えば、還元当量は、ペントースリン酸サイクル（ＰＰＣ）において生じ得る。ＰＰＣでは、グルコース−６−リン酸が、Ｚｗｉｓｃｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔ酵素またはＺｗｆとしても知られるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素によってＤ−６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンに変換される。この変換の一部として、ＮＡＤＰが還元当量の受容体としてＮＡＤＰＨに変換される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
商業生産に十分な濃度のコハク酸を生成する微生物はほとんどないことがこれまで説明されてきた。このような微生物の１つが、ウシの反芻胃から単離された通性の嫌気性生物であるＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓである。この生物体は、高濃度のコハク酸を産生し、高濃度の糖に耐性である。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓは、コハク酸の最良の既知産生株の１つであるが、この株の発酵収率は、還元当量の欠如によって制限され得る。従って、発酵によって産生されるコハク酸の収率を高めるような改良が望まれ、それにはコハク酸を産生するための微生物の改良株の使用が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
概要
有機酸を産生するための組換え微生物を開示する。組換え微生物は、ペントースリン酸サイクルにおいて利用される酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドを発現する。１つの実施形態において、この酵素は、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼであり、Ｚｗｉｓｃｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔ酵素またはＺｗｆとも呼ばれる。例えば、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現し得る。１つの実施形態において、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドを発現するＤＮＡ分子で形質転換された、コハク酸を産生する微生物の組換え株である。
【００１１】
組換え微生物は、代表的には、商業生産に適したレベルで１つ以上の有機酸を産生することができる。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、コハク酸を産生する微生物である。例えば、その微生物は、商業生産に適した濃度でコハク酸を産生し得る。商業
生産に適した濃度とは、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌおよび／または１４０ｇ／Ｌであり得る。望ましくは、組換え微生物は、約５０ｇ／Ｌ〜約１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができる。
【００１２】
組換え微生物は、発酵システムにおける商業生産に適した濃度でコハク酸を産生することを促進するように、比較的高濃度のコハク酸に耐性となるように選択されてもよく、および／またはそのように組換えで操作されてもよい。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、比較的少量の望ましくない副産物（例えば、酢酸塩、ギ酸塩および／またはピルビン酸塩）（例えば、わずか約２．０ｇ／Ｌの酢酸塩、わずか約２．０ｇ／Ｌのギ酸塩および／またはわずか約３．０ｇ／Ｌのピルビン酸塩）を産生するように選択され得る。組換え微生物は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌおよび／または８ｇ／Ｌの濃度のモノフルオロ酢酸ナトリウムのレベルに耐性である株（または株の変異株）由来であってもよい。別の実施形態において、組換え微生物の変異株は、少なくとも約１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌおよび／または８ｇ／Ｌの濃度のモノフルオロ酢酸ナトリウムのレベルに耐性であるように選択され得る。
【００１３】
１つの実施形態において、組換え微生物は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ（すなわち、「Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ」）またはＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓに関連する微生物の株由来である。Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの１つの適切な株は、ＡＴＣＣアクセッション番号５５６１８としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されたＢａｃｔｅｒｉｕｍ  １３０Ｚである。Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １３０Ｚおよび他の適切な株の説明については、米国特許第５，５０４，００４号を参照のこと。
【００１４】
他の適切な微生物は、組換え微生物を調製するために選択されてもよく、そして１６Ｓ
ｒＲＮＡ内の配列同一性によって決定されるようにＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓに関連する微生物を含んでもよい。例えば、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓに関連する適切な微生物は、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡに対して実質的な配列同一性を示す１６Ｓ  ｒＲＮＡを有し得る（すなわち、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡに対して少なくとも約９０％の配列同一性を示す１６Ｓ  ｒＲＮＡを有する微生物またはより適切には、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡに対して少なくとも約９５％の配列同一性を示す微生物）。Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科の多くの代表的な微生物は、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  １６Ｓ  ｒＲＮＡに対して少なくとも約９０％の配列同一性を示す１６Ｓ  ｒＲＮＡを有する。例えば、Ｇｕｅｔｔｌｅｒら，ＩＮＴ’Ｌ  Ｊ．ＳＹＳＴＥＭＡＴＩＣ  ＢＡＣＴ．（１９９９），４９，２０７〜２１６の２０９頁、表２を参照のこと。適切な微生物としては、Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６およびＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０などの微生物を挙げることができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、組換え微生物は、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ以外の生物体から調製することができる。例えば、組換え微生物は、有機酸を産生するための発酵システムにおける用途に適切な任意の微生物から調製することができる。適切な微生物としては、Ｅ．ｃｏｌｉを挙げることができる。Ｅ．ｃｏｌｉの適切な株は、当該分野で公知である。
【００１６】
モノフルオロ酢酸ナトリウムに耐性である微生物の変異株はまた、組換え微生物を調製するのに適切であり得る。例えば、米国特許第５，５２１，０７５号および同第５，５７３，９３１号を参照のこと。１つの実施形態において、組換え微生物は、少なくとも約１ｇ／Ｌのモノフルオロ酢酸ナトリウムに耐性であるＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの変異
株から調製される。１つの適切な変異株は、ＦＺ４５である。米国特許第５，５７３，９３１号を参照のこと。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２５５として寄託された組換え微生物は、少なくとも約１ｇ／Ｌのモノフルオロ酢酸ナトリウムに耐性であるＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの変異株（すなわち、ＦＺ４５）由来である。
【００１７】
組換え微生物は、代表的には、ペントースリン酸サイクルにおいて利用される酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換される。例えば、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素の生化学活性（すなわち、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性および／またはＮＡＤＰレダクターゼ活性）の１つ以上を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換することができる。望ましくは、そのポリヌクレオチドは、ＮＡＤＰからＮＡＤＰＨへの変換を促進するポリペプチドをコードする。そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その微生物に対して内因性であってもよく、またはその微生物に通常存在する遺伝子または酵素由来であってもよい。いくつかの実施形態において、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その微生物の内因性の遺伝子または酵素に相同であり得る。他の実施形態において、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、異種であり得る（すなわち、その微生物に通常存在しない遺伝子または酵素由来であり得るか、またはその微生物以外の供給源由来であり得る）。
【００１８】
組換え微生物は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変体および／またはそのポリペプチドの改変体を発現し得る。そのポリヌクレオチドが、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性（例えば、ＮＡＤＰレダクターゼ活性）を有するポリペプチドをコードする場合、そのポリヌクレオチドの改変体は、そのポリヌクレオチドに対して少なくとも約９０％の配列同一性または望ましくは、そのポリヌクレオチドに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。そのポリペプチドがＺｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性（例えば、ＮＡＤＰレダクターゼ活性）を有する場合、改変体は、そのポリペプチドに対して少なくとも約９０％の配列同一性、または望ましくは、そのポリペプチドに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み得る。従って、そのポリペプチドがＮＡＤＰレダクターゼ活性を有する場合、適切なポリヌクレオチドは、選択されたＺｗｆ酵素に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【００１９】
組換え微生物が、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチドで形質転換されない微生物よりも高いＺｗｆ酵素活性を示す場合、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチドで形質転換されているかもしれない。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチドで形質転換されていない微生物よりも、少なくとも約５倍（５×）高いＺｗｆ酵素活性（または望ましくは少なくとも約１０倍（１０×）高いＺｗｆ酵素活性、もしくはより望ましくは少なくとも約５０倍（５０×）高いＺｗｆ酵素活性）を示す。Ｚｗｆ酵素活性としては、ＮＡＤＰレダクターゼ活性を挙げることができる。Ｚｗｆ酵素活性は、（例えば、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドを発現するポリヌクレオチドで形質転換されていない微生物と比べる場合）組換え微生物に存在するＮＡＤＰＨのレベルを計測することによって測定することができる。
【００２０】
組換え微生物は、Ｚｗｆ遺伝子などのＺｗｆ酵素をコードするポリヌクレオチドを発現し得る。ポリヌクレオチドの改変体は、Ｚｗｆ遺伝子に対して少なくとも約９０％の配列同一性、または望ましくはＺｗｆ遺伝子に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有し、かつＺｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドの改変体は、そのポリヌクレオチドの核酸フラグメントを含み得る。例えば、フラグメントは、Ｚｗｆ遺伝子の少なくとも約９０％またはＺｗｆ遺伝子の少なくとも約９５％を含み得る。核酸フラグメントは、任意の適切な長さで
あり得る。例えば、核酸フラグメントは、少なくとも約１０、５０、１００、２５０、５００、１０００および／または１４００のヌクレオチドを含み得る。フラグメントは、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドをコードし得る。
【００２１】
適切なＺｗｆ遺伝子は、組換え微生物の内因性または天然のＺｗｆ遺伝子（すなわち、組換え微生物が由来する微生物に通常存在するＺｗｆ遺伝子）またはそれらの改変体を含み得る。他の適切なＺｗｆ遺伝子は、微生物に対して異種のＺｗｆ遺伝子（すなわち、組換え微生物を調製するために使用した微生物に通常存在しないか、またはそれ以外の供給源から得られたＺｗｆ遺伝子）またはそれらの改変体を含み得る。適切なＺｗｆ遺伝子は、選択されたＺｗｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性（好ましくは、選択されたＺｗｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性）を有する改変体を含み得、そしてＺｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性（すなわち、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性および／またはＮＡＤＰレダクターゼ活性）を有するポリペプチドをコードし得る。
【００２２】
適切なＺｗｆ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子またはその改変体を含み得る。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、アクセッション番号ＮＣ＿０００９１３として、ヌクレオチド１，９３２，８６３〜１，９３４，３３８（配列番号１）の逆相補鎖およびアクセッション番号Ｍ５５００５としてヌクレオチド７０８〜２１８０（配列番号２）がＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子の適切な改変体は、配列番号１（または配列番号２）のポリヌクレオチドに対して少なくとも約９０％の配列同一性（望ましくは少なくとも約９５％の配列同一性）を有するポリヌクレオチドを含み得るので、そのポリヌクレオチドは、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性（すなわち、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性および／またはＮＡＤＰレダクターゼ活性）を有するポリペプチドをコードする。
【００２３】
適切なＺｗｆ遺伝子は、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ遺伝子またはその改変体を含み得る。Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  １３０Ｚのドラフトゲノム配列は、最近確立され、構築された。そしてエネルギー省のウェブサイトであるＪｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで２００５年９月には公的に利用可能となった。Ｚｗｆ遺伝子は、「グルコース−６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ」と注釈をつけられており、コンティグ１１５、ヌクレオチド８７３８〜１０２２５（すなわち、配列番号５）上に存在する。コードされるポリペプチド（すなわち、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ酵素）の予測アミノ酸配列は、配列番号６として存在する。Ｚｗｆ酵素は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトで入手可能な「ＢＬＡＳＴ」アラインメントアルゴリズムバージョンＢＬＡＳＴＰ２．２．１２、ＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用したところ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ酵素に対して４３％のアミノ酸配列同一性および６０％のアミノ酸相同性を示す。Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ遺伝子の適切な改変体は、配列番号５のポリヌクレオチドに対して少なくとも約９０％の配列同一性（望ましくは少なくとも約９５％の配列同一性）を有するポリヌクレオチドを含み得るので、そのポリヌクレオチドは、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性（すなわち、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性および／またはＮＡＤＰレダクターゼ活性）を有するポリペプチドをコードする。
【００２４】
組換え微生物は、内因性Ｚｗｆ酵素（すなわち、組換え微生物が由来する微生物内に存在するＺｗｆ酵素）またはその改変体を発現し得る。他の実施形態において、組換え微生物は、微生物に対して異種であるＺｗｆ酵素（すなわち、組換え微生物が由来する微生物に存在しないか、または発現しないＺｗｆ酵素）またはその改変体を発現し得る。適切なＺｗｆ酵素は、選択されたＺｗｆ酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％アミノ
酸配列同一性（望ましくは選択されたＺｗｆ酵素に対して少なくとも約９５％アミノ酸配列同一性）を有し、そしてＺｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性（例えば、ＮＡＤＰレダクターゼ活性および／またはグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ活性）を有する改変体を含み得る。適切なＺｗｆ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ酵素（例えば、配列番号３、ＮＣ＿０００９１３のヌクレオチド１，９３２，８６３〜１，９３４，３３８のヌクレオチド配列の逆相補鎖によってコードされるポリペプチド）またはその改変体およびＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ酵素（例えば、配列番号６）またはその改変体を含み得る。
【００２５】
改変体ポリペプチドは、Ｚｗｆ酵素のフラグメントを含み得る。例えば、フラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列の少なくとも約９０％、またはより望ましくは配列番号３のアミノ酸配列の少なくとも約９５％を含み得る。他の実施形態において、フラグメントは、配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも約９０％、またはより望ましくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも約９５％を含み得る。ポリペプチドフラグメントは、任意の適切な長さであり得る。例えば、ポリペプチドフラグメントは、（例えば、配列番号３または配列番号６の）少なくとも約１０、５０、１００、２００および／または３００のアミノ酸を含み得る。ポリペプチドフラグメントは、代表的にはＺｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有する。
【００２６】
組換え微生物は、内因性（すなわち、天然）Ｚｗｆ酵素をコードする内因性（すなわち、天然）Ｚｗｆ遺伝子を発現するポリヌクレオチドで形質転換されたコハク酸を産生する微生物を含み得る。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、異種Ｚｗｆ酵素をコードする異種Ｚｗｆ遺伝子を発現するポリヌクレオチドで形質転換されたコハク酸を産生する微生物を含み得る。ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２５５としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された組換え微生物は、異種Ｚｗｆ酵素をコードする異種Ｚｗｆ遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子）を発現するコハク酸を産生する微生物（すなわち、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）の組換え株である。
【００２７】
組換え微生物は、比較的高レベルのＺｗｆ酵素活性を有するポリペプチドを発現し得る（すなわち、そのポリペプチドが「過剰発現」し得る）。例えば、組換え微生物は、非組換え微生物と比べて比較的高レベルな内因性Ｚｗｆ酵素を発現し得る。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、ＤＮＡ分子で形質転換されていない組換え微生物と比べて比較的高レベルな内因性Ｚｗｆ酵素を発現するＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）で形質転換され得る。
【００２８】
Ｚｗｆ遺伝子などのポリヌクレオチドは、組換え微生物が由来する選択された微生物における発現に最適化され得る。例えば、異種Ｚｗｆ遺伝子は、非天然微生物における発現に最適化され得る。いくつかの実施形態において、Ｚｗｆ遺伝子は、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓまたはＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６もしくはＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０などの微生物における発現に最適化され得る。他の実施形態において、Ｚｗｆ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化され得る。
【００２９】
Ｚｗｆ遺伝子などのポリヌクレオチドは、任意の適切なストラテジによって組換え微生物における発現に最適化され得る。例えば、Ｚｗｆ遺伝子は、組換え微生物におけるＺｗｆ遺伝子の発現を促進するプロモーター配列にＺｗｆ遺伝子を作動可能に連結することによって組換え微生物における発現に最適化され得る。このプロモーター配列は、組換え微生物における比較的高レベルな発現を促進するために最適化され得る（すなわち、「過剰発現」を促進するために最適化され得る）。Ｚｗｆ遺伝子は、微生物にとって内因性であるプロモーター配列（すなわち、微生物にとって天然なプロモーター）または微生物にと
って異種であるプロモーター配列（すなわち、微生物には通常存在しないかまたはそれ以外の供給源由来であるプロモーター）に作動可能に連結されていてもよい。適切なプロモーターは、選択されたＺｗｆ遺伝子に対して天然でないプロモーターであるプロモーター（すなわち、微生物にとって内因性であってもよく、または微生物にとって異種であってもよい非Ｚｗｆ遺伝子プロモーター）を含み得る。適切なプロモーターとしては、誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターを挙げることができる。適切なプロモーターは、コハク酸を産生する微生物のプロモーター由来であり得る。
【００３０】
他の実施形態において、Ｚｗｆ遺伝子の発現は、翻訳レベルで最適化され得る。例えば、異種Ｚｗｆ遺伝子は、遺伝子にとって天然ではない宿主として組換え微生物が由来する微生物における好ましい使用頻度を証明するコドンを含むように改変され得る。
【００３１】
別の実施形態において、Ｚｗｆ遺伝子などのポリヌクレオチドの発現は、組換え微生物において比較的コピー数の多いポリヌクレオチドを提供することによって最適化され得る。例えば、Ｚｗｆ遺伝子は、組換え微生物において比較的コピー数が多くなるように複製することができる後成的エレメント（例えば、プラスミド）上に存在し得る。
【００３２】
いくつかの実施形態において、組換え微生物は、Ｚｗｆ遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ分子で形質転換された、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓまたは関連微生物などのコハク酸を産生する微生物の組換え株である。Ｚｗｆ遺伝子は、内因性または異種のＺｗｆ遺伝子由来であり得、例えば、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ遺伝子（例えば、配列番号５）およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子（例えば、配列番号１および２）を含み得る。他のＺｗｆ遺伝子は、公知であり、それらのポリヌクレオチド配列は、公開されている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋを参照のこと）。コハク酸を産生する微生物の適切な内因性または天然プロモーター配列は、例えば、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーター配列を含み得る。Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーター配列は、ヌクレオチド１〜２５８（配列番号４）であるアクセッション番号ＡＹ３０８８３２としてＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーターは、Ｚｗｆ遺伝子について適切な異種プロモーター（すなわち、非Ｚｗｆ遺伝子プロモーター）であり得る。
【００３３】
本明細書に記載するように、組換え微生物は、後成的エレメントとして組換えＤＮＡ分子を含み得、そして／または組換えＤＮＡ分子は、（例えば、組換えの適切な方法によって）微生物のゲノムに組み込まれ得る。特定の実施形態において、ＤＮＡ分子は、プラスミド、組換えバクテリオファージ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）および／またはＥ．ｃｏｌｉＰ１人工染色体（ＰＡＣ）である。ＤＮＡ分子は、選択可能なマーカーを含み得る。適切な選択可能なマーカーとしては、カナマイシン耐性、アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性に対するマーカーおよびこれらの選択可能なマーカーの組み合わせを含み得る。１つの実施形態において、選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性である。
【００３４】
本明細書に記載するように、組換えＤＮＡ分子は、組換え微生物（例えば、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）においてポリヌクレオチドを発現するための、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された適切なプロモーターを含み得る。そのプロモーターは、コハク酸を産生する微生物においてポリペプチドを発現するのに適切であり得る。いくつかの実施形態において、組換えＤＮＡ分子は、（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子またはＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ遺伝子などの異種Ｚｗｆ遺伝子を含み得る）Ｚｗｆ遺伝子またはその改変体に作動可能に連結されたホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーター
（例えば、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーター）を含む。例えば、ＤＮＡ分子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３として寄託されたＤＮＡ配列のヌクレオチド１，９３２，８６３〜１，９３４，３３８の逆相補鎖（配列番号１）に作動可能に連結されたか；またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ５５００５として寄託されたＤＮＡ配列（配列番号２）に作動可能に連結されたか；または配列番号５のＤＮＡ配列に作動可能に連結された、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３０８８３２として寄託されたＤＮＡ配列のヌクレオチド１〜２５８（配列番号４）またはその改変体を含み得る。いくつかの実施形態において、そのプロモーターは、配列番号４のポリヌクレオチドに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有し、かつ組換え微生物においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドを含み得る。
【００３５】
組換えＤＮＡ分子を含む組換え微生物は、発酵システムにおいて有機酸（例えば、コハク酸または乳酸）を産生するのに適切であり得る。組換えＤＮＡ分子を含む組換え微生物は、組換えＤＮＡ分子を含まない微生物に対して、発酵システムにおいて高レベルな有機酸（例えば、コハク酸または乳酸）を産生し得る。
【００３６】
１つ以上の上述の組換えＤＮＡ分子を含むＤＮＡプラスミドもまた開示される。このＤＮＡプラスミドは、選択可能なマーカーを含み得る。適切な選択可能なマーカーとしては、適切なプロモーター（例えば、構成的プロモーター）に作動可能に連結された、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性、カナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性およびスルホンアミド耐性の１以上の遺伝子を挙げることができる。１つの実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、カナマイシン耐性についての遺伝子を含む。
【００３７】
ＤＮＡプラスミドは、１以上の適切な宿主細胞においてプラスミドを維持および／または複製するために必要な配列を含み得る。１つの実施形態において、ＤＮＡプラスミドは、適切な宿主細胞間のシャトルベクターとして機能することができる。ＤＮＡプラスミドは、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓとＥ．ｃｏｌｉとの間のシャトルベクターとして機能することができ得る。
【００３８】
１以上の上述のＤＮＡ分子を含む宿主細胞もまた開示される。例えば、その宿主細胞は、ＤＮＡ分子を含むＤＮＡプラスミドを含み得る。宿主細胞は、ＤＮＡ分子を含むＤＮＡプラスミドを産生および単離するのに適切であり得る。
【００３９】
宿主細胞は、発酵システムにおいて１以上の有機酸を産生するのに適切であり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、発酵システムにおいて１以上の有機酸（例えば、コハク酸または乳酸）の産生を促進するのに適切なレベルでＺｗｆ遺伝子（およびそれに続いてＺｗｆ酵素）を発現する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、宿主細胞における還元当量（例えば、ＮＡＤＰＨ）の濃度を高めるのに適切なレベルでＺｗｆ遺伝子（およびそれに続いてＺｗｆ酵素）を発現し得る。宿主細胞は、その株における還元当量（例えば、ＮＡＤＰＨ）の濃度を高めるのに適切なレベルでＺｗｆ遺伝子（およびそれに続いてＺｗｆ酵素）を発現するＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株を含み得る。このような株は、発酵システムにおいて組換えＤＮＡ分子を含まない株と比べて高レベルなコハク酸を産生するのに適切であり得る。
【００４０】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、（例えば、発酵システムにおいて）少なくとも約２０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌ、１４０ｇ／Ｌおよび／または１６０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができる。特定の実施形態において、宿主細胞は、約５０ｇ／Ｌ〜約１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸
を産生することができる。望ましくは、宿主細胞は、実質的な濃度でコハク酸以外の選択された有機酸を産生しない。宿主細胞がコハク酸以外の有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、ピルビン酸およびそれらの混合物）を産生する場合、望ましくはコハク酸以外の有機酸は、わずか約３０ｇ／Ｌ、より望ましくはわずか約２０ｇ／Ｌ、より望ましくはわずか約１０ｇ／Ｌ、そしてなおもより望ましくはわずか約５ｇ／Ｌの濃度で産生する。
【００４１】
上述の組換え微生物は、１以上の有機酸を産生するために栄養培地を発酵させる工程を含む方法において使用され得る。いくつかの実施形態において、この方法は、Ｚｗｆ遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子）を発現する組換え微生物によって栄養培地を発酵する工程を含み得る。この方法によって産生された有機酸は、コハク酸および乳酸を含み得る。さらなる実施形態において、この方法は、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２０ｇ／Ｌおよび／または１６０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生するのに適している。
【００４２】
特に、この方法は、有機酸（例えば、コハク酸）の産生を促進するのに適切なレベルでＺｗｆ遺伝子（およびそれに続いてＺｗｆ酵素）を発現するＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株を用いて栄養培地を発酵させる工程を含み得る。Ｚｗｆ遺伝子は、異種Ｚｗｆ遺伝子を含み得る。異種Ｚｗｆ遺伝子（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子）を発現するＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２５５として寄託されている。特定の実施形態において、組換え微生物は、有機酸（例えば、コハク酸）の産生を促進するのに適切なレベルでＺｗｆ遺伝子（異種であり得る）を発現する、Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６またはＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０などの微生物の組換え株である。適切な組換え微生物はまた、有機酸（例えば、乳酸）の産生を促進するのに適切なレベルでＺｗｆ遺伝子（異種であり得る）を発現するＥ．ｃｏｌｉの組換え株を含み得る。
【００４３】
この方法において、比較的高レベルな選択された有機酸（例えば、コハク酸および／または乳酸など）を産生する組換え微生物を用いて栄養培地を発酵させることが望ましいことがある。従って、選択された組換え微生物は、高レベルな有機酸（例えば、コハク酸および／または乳酸）に耐性であり得る。組換え微生物はまた、比較的低レベルな他の望ましくない副産物を産生するように選択され得る。例えば、組換え微生物は、比較的低レベルな酢酸塩、ギ酸塩、ピルビン酸塩およびそれらの混合物（例えば、わずか約２．０ｇ／Ｌ、わずか約２．０ｇ／Ｌのギ酸塩および／またはわずか約３．０ｇ／Ｌのピルビン酸塩）を産生し得る。約１ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌおよび／または８ｇ／Ｌの濃度のモノフルオロ酢酸ナトリウムに耐性である上記の組換え微生物は、この方法に適切である。
【００４４】
この方法において、栄養培地は、代表的には発酵性の炭素源を含む。発酵性の炭素源は、発酵性のバイオマスによって提供され得る。１つの実施形態において、発酵性の炭素源は、糖作物、デンプン作物および／またはセルロース作物残渣を含む供給材料由来である。一般に、発酵性の炭素源は、グルコースなどの糖である。発酵性の炭素源はまた、糖アルコールを含み得る。適切な実施形態において、この方法によりグルコース（ｇ）に対して少なくとも約１００％のコハク酸収量（ｇ）を生じる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
好ましい実施形態の詳細な説明
本明細書中に開示されるのは、ペントースリン酸サイクルにおいて利用される酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドを発現する組換え微生物である。本明細書中で使用されるとき、「微生物」は、任意の適切な単細胞生物（例えば、細菌、菌類および酵母）を含む。本明細書中で使用されるとき、「組換え微生物」とは、天然に存在しない微生物を生じる様式で改変された微生物のことを意味する。「組換え微生物」は、ＤＮＡ分
子（例えば、組換えＤＮＡ分子）で形質転換された微生物を含み得る。
【００４６】
組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドを発現するＤＮＡ分子で形質転換された微生物を含み得る。ペントースリン酸サイクルは、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ（Ｚｗｉｓｃｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔ酵素またはＺｗｆとも呼ばれる）；６−ホスホグルコノラクトナーゼ；６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇｎｄとも呼ばれる）；リボース−５−リン酸イソメラーゼＡおよびＢ；リブロースリン酸−３−エピメラーゼ；トランスケトラーゼＩおよびＩＩ；ならびにトランスアルドラーゼＡおよびＢを含むいくつかの酵素を利用する。これらの酵素のうち、ＺｗｆおよびＧｎｄは、ＮＡＤＰＨの形態の２つの水素等価物を生成する。
【００４７】
組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性（例えば、グルコース−６−リン酸−１−デヒドロゲナーゼ活性およびＮＡＤＰレダクターゼ活性）を有する任意の適切なポリペプチドまたはそれらの改変体を発現し得る。例えば、１つの適切なＺｗｆ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ酵素またはその改変体である。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、非組換え微生物に存在するレベルと比べて高いレベルでＺｗｆ酵素を発現（すなわち、その酵素を「過剰発現」）し得る。
【００４８】
組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性、およびより望ましくはＺｗｆ酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する改変体ポリペプチドを発現し得る。適切な実施形態において、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素に対して少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＺｗｆ酵素の改変体を発現し得る。望ましくは、改変体ポリペプチドは、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有する。改変体ポリペプチドは、Ｚｗｆ酵素のフラグメントを含み得る。適切なＺｗｆ酵素としては、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ酵素、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ酵素およびそれらの改変体が挙げられる。
【００４９】
組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、Ｚｗｆ遺伝子またはその改変体）を発現し得る。例えば、組換え微生物は、Ｚｗｆ遺伝子、またはＺｗｆ遺伝子に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む改変体、およびより望ましくはＺｗｆ遺伝子に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む改変体を発現し得る。適切な実施形態において、組換え微生物は、Ｚｗｆ遺伝子に対して少なくとも約９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含むＺｗｆ遺伝子の改変体を発現し得る。望ましくは、改変体ポリヌクレオチドは、Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドをコードする。改変体ポリヌクレオチドは、Ｚｗｆ遺伝子のフラグメントを含み得る。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子またはそれらの改変体を発現し得る。
【００５０】
組換え微生物は、任意の適切な微生物由来であり得る。代表的には、その微生物は、商業生産に適切なレベルで有機酸を産生することができる。本明細書中で使用されるとき、「有機酸」は、少なくとも１つのカルボキシル基を含む。例えば、「有機酸」は、コハク酸および乳酸を含む。本明細書中で使用されるとき、有機酸は、有機酸アニオンまたはその塩によって代替的に意味され得る。例えば、「コハク酸」は、「コハク酸塩」のことをいうことがあり；「乳酸」は、「乳酸塩」のことをいうことがあり；「ギ酸」は、「ギ酸塩」のことをいうことがあり；そして「ピルビン酸」は、「ピルビン酸塩」のことをいうことがある。
【００５１】
本明細書中に説明されるような組換え微生物を調製するための適切な微生物としては、
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属のメンバー；Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６；Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０；Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ；Ｅ．ｃｏｌｉ；Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ；Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ；Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｘｔｒｉｎｏｓｏｌｖｅｎｓ；Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ；およびコリネ型細菌（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖａｒｉｃａｔｕｍ）；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属のメンバー；酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属のメンバー）；およびそれらの任意の部分集合を挙げることができるが、これらに限定されない。本明細書中に説明されるような組換え微生物を調製するための適切な微生物は、コハク酸を産生する微生物を含み得る。
【００５２】
組換え微生物は、代表的には異種Ｚｗｆ遺伝子であり得るＺｗｆ遺伝子を発現する。Ｚｗｆ遺伝子は、組換え微生物における発現に最適化され得る。例えば、Ｚｗｆ遺伝子は、非組換え微生物と比べて組換え微生物においてその遺伝子の過剰発現を促進するプロモーターに作動可能に連結されてもよい。このプロモーターは、微生物にとって内因性（すなわち、組換え微生物が由来する微生物にとって天然）または微生物にとって異種（すなわち、組換え微生物が由来する微生物にとって天然でないか、またはその微生物以外の供給源由来である）であってもよい。このプロモーターは、Ｚｗｆ遺伝子にとって内因性であってもよく、またはＺｗｆ遺伝子にとって異種（すなわち、非Ｚｗｆ遺伝子プロモーター）であってもよい。このプロモーターは、Ｚｗｆ遺伝子の構成的発現および／または誘導性発現を促進してもよく、そして／またはこのプロモーターは、Ｚｗｆ遺伝子の構成的発現および／または誘導性発現を促進するように適切な方法によって改変されてもよい。
【００５３】
Ｚｗｆ遺伝子は、対応するｍＲＮＡの翻訳を促進するように改変されてもよい。例えば、Ｚｗｆ遺伝子は、内因性遺伝子または天然の遺伝子に存在しないコドンを含むように改変されてもよい。これらの非内因性コドンは、組換え微生物におけるコドン使用頻度を反映するように選択されてもよい。コドン使用表は、多くの微生物について作成されており、そして当該分野で公知である。Ｚｗｆ遺伝子は、以下に提供されるようなＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓについてのコドン使用頻度を反映して改変されてもよい：
Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓについての例示的なコドン使用頻度
出典：ＧｅｎＢａｎｋ発表１４４．０［２００４年１１月１２日］
【００５４】
【表１】
0005634659.tif 000002
【００５５】
組換え微生物は、Ｚｗｆ遺伝子（例えば、内因性Ｚｗｆ遺伝子および／またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子などの異種Ｚｗｆ遺伝子）を発現するＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株を含み得る。組換え微生物を生成するための他の適切な微生物としては、Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６（スウェーデンのＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｅｔｅｂｏｒｇ（ＣＣＵＧ）にアクセッション番号１５５６８として寄託されている）；Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０（ＣＣＵＧアクセッション番号１５５７２として寄託されている）；およびＥ．ｃｏｌｉの任意の適切な株（これについて多くの株が当該分野で公知である）が挙げられる。組換え微生物は、高レベルな１つ以上の有機酸（例えば、コハク酸および乳酸など）を産生する株由来であってもよく、そして／または組換え微生物は、非組換え微生物と比べて高レベルまたは促進されたレベルの１つ以上の有機酸（例えば、コハク酸および乳酸など）を産生するように選択および／または操作されてもよい。
【００５６】
組換え微生物は、比較的高レベルの望ましくない副産物に耐性である株および／または比較的低レベルの望ましくない副産物を産生する微生物の株由来であってもよい。望ましくない副産物としては、ギ酸塩（またはギ酸）、酢酸塩（または酢酸）および／またはピルビン酸塩（またはピルビン酸）を挙げることができる。低レベルの酢酸を産生する株を選択するための方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，５２１，０７５号および同第５，５７３，９３１号を参照のこと。これらは、本明細書中に参考として援用される。例えば、比較的低レベルの酢酸塩を産生する微生物の株は、約１．０〜約８．０ｇ／Ｌの濃度のモノフルオロ酢酸ナトリウムなどの有毒な酢酸誘導体の存在下で微生物
を生育することによって選択することができる。選択された株は、グルコース発酵において比較的低レベルの酢酸塩（例えば、約２．０ｇ／Ｌ未満）、ギ酸塩（例えば、約２．０ｇ／Ｌ未満）および／またはピルビン酸塩（例えば、約３．０ｇ／Ｌ未満）を産生し得る。組換え微生物を生成するための１つの適切なモノフルオロ酢酸耐性株は、ＡＴＣＣアクセッション番号５５６１８として寄託されたＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの誘導体であるＦＺ４５と呼ばれるＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの株である。モノフルオロ酢酸塩に耐性である微生物株を調製するために適切な方法を記載している米国特許第５，５７３，９３１号を参照のこと。
【００５７】
組換え微生物は、比較的高レベルの望ましくない副産物に耐性であるように、そして／または比較的低レベルの望ましくない副産物を産生するように選択および／または操作されてもよい。例えば、形質転換後、組換え微生物の集団を、比較的高レベルの酢酸塩に耐性である株および／または比較的低レベルの酢酸塩を産生する株を選択するためにモノフルオロ酢酸ナトリウムの存在下で生育してもよい。
【００５８】
Ｚｗｆ酵素の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、当該分野で公知である方法（例えば、適切なプライマーを用いたＺｗｆ遺伝子のＰＣＲ増幅および適切なＤＮＡベクターへのクローニング）を使用することによって得ることができる。適切なＺｗｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、開示されている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋを参照のこと）。例えば、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  Ｚｗｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列は、公開されている（配列番号５および６）（エネルギー省のウェブサイトのＪｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３（配列番号１）およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ５５００５（配列番号２）として）寄託されている。Ｚｗｆ遺伝子またはその改変体は、適切なプライマーを用いた微生物のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって得ることができる。
【００５９】
ＤＮＡベクターは、組換え微生物においてその遺伝子を発現するための適切な任意のベクターであってもよい。適切なベクターとしては、プラスミド、人工染色体（例えば、細菌人工染色体）および／または改変バクテリオファージ（例えば、ファージミド）が挙げられる。ベクターは、後成的エレメントとして存在するように設計されてもよく、そして／またはベクターは、微生物のゲノムと組み換えるように設計されてもよい。
【００６０】
ＤＮＡ分子は、代表的にはＺｗｆ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、組換え微生物が由来する微生物にとって内因性または天然であってもよく、またはその微生物にとって異種であってもよい（すなわち、組換え微生物以外の供給源由来であってもよい）。さらに、プロモーターは、選択されたＺｗｆ遺伝子にとって天然プロモーターであっても、または選択されたＺｗｆ遺伝子に対して天然プロモーター以外のプロモーター（すなわち、非Ｚｗｆ遺伝子プロモーター）であってもよい。組換え微生物が、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの株である場合、適切な内因性または天然プロモーターは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３０８８３２として寄託された、ヌクレオチド１−２５８を含むＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーター（配列番号４）またはその改変体である。プロモーターは、当該分野で公知であるクローニング方法を使用してＺｗｆ遺伝子に作動可能に連結することができる。例えば、プロモーターおよびＺｗｆ遺伝子は、適合した制限酵素認識部位を含むプライマーを使用してＰＣＲによって増幅することができる。次いで増幅されたプロモーターおよび遺伝子を、酵素で消化し、そして適切なマルチクローニングサイトを含む適切なベクターにクローニングすることができる。
【００６１】
さらに、ＤＮＡ分子は、選択可能なマーカーを含んでもよい。選択可能なマーカーは、１つ以上の抗生物質製剤に対する耐性を付与することができる。例えば、選択可能なマーカーとしては、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性、カナマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性、スルホンアミド耐性に対する遺伝子またはこれらのマーカーの組み合わせを挙げることができる。代表的には、選択可能なマーカーは、そのマーカーの発現を促進するプロモーターに作動可能に連結されている。選択可能なマーカーを含むプラスミドおよび他のクローニングベクターは、当該分野で公知である。
【００６２】
ＤＮＡ分子は、代表的には、宿主細胞を形質転換するために使用される。適切な宿主細胞は、ＤＮＡ分子を保存および／または産生するために有用である任意の細胞を含む。
【００６３】
適切な宿主細胞は、ＤＮＡ分子上に存在する任意の遺伝子を発現する細胞を含んでいてもよい。適切な宿主細胞はまた、発酵プロセスにおいて商業生産に適した濃度（例えば、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、より適切には少なくとも約５０ｇ／Ｌ、およびより適切には少なくとも約１００ｇ／Ｌ）のコハク酸などの有機酸を産生することができる細胞を含んでいてもよい。
【００６４】
有機酸を産生するための方法は、代表的にはＺｗｆ遺伝子を発現する組換え微生物を用いて栄養培地を発酵させる工程を含む。例えば、この方法は、Ｚｗｆ遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子などの異種Ｚｗｆ遺伝子）を発現する組換えＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを用いて栄養培地を発酵させる工程を含んでいてもよい。発酵において産生された有機酸は、コハク酸を含み得る。この方法に適した１つの組換え微生物は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２５５として寄託された、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子を発現するＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株である。この方法はまた、コハク酸を産生するためにＺｗｆ遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子などの異種Ｚｗｆ遺伝子）を発現するＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６またはＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０の組換え株を用いて栄養培地を発酵させる工程を含んでいてもよい。この方法はまた、乳酸などの１つ以上の有機酸を産生するためにＺｗｆ遺伝子を発現する（またはＺｗｆ遺伝子を過剰発現する）Ｅ．ｃｏｌｉの組換え株を用いて栄養培地を発酵させる工程を含んでいてもよい。
【００６５】
この方法では、比較的高レベルの産生された有機酸（例えば、コハク酸）に耐性である組換え微生物を使用してもよい。この方法ではまた、比較的高レベルの望ましくない副産物に耐性である微生物の株および／または比較的低レベルの望ましくない副産物を産生する微生物の株を使用してもよい。
【００６６】
栄養培地は、代表的には発酵性の炭素源を含む。発酵性の炭素源は、発酵性のバイオマスによって提供され得る。発酵性のバイオマスは、糖作物（例えば、糖、ビート、サトウモロコシ、サトウキビ、飼料用ビート）；デンプン作物（例えば、穀物（例えば、トウモロコシ、コムギ、モロコシ、オオムギ）および塊茎（例えば、ジャガイモおよびサツマイモ））；セルロース作物（例えば、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、コムギわらおよび飼料（例えば、スーダングラス飼料およびモロコシ））を含む種々の作物および／または供給原料由来であってもよい。このバイオマスは、発酵性の炭素源（例えば、糖）の放出を促進するように処理されてもよい。例えば、このバイオマスは、単糖を放出するように酵素（例えば、セルラーゼおよび／またはキシラナーゼ）で処理されてもよい。発酵性の炭素源は、単糖および糖アルコール（例えば、グルコース、マルトース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ガラクトース、キシロース、アラビノースおよびそれらの混合物）を含み得る。
【００６７】
この方法は、代表的にはグルコースなどの投入炭素源に対して比較的高い収率のコハク酸を生じる。例えば、この方法は、グルコース投入量（ｇ）に対して少なくとも約９０％のコハク酸収率（ｇ）を有してもよい。あるいは、収率は、％コハク酸収量（ｍｏｌ）／グルコース投入量（ｍｏｌ）として計算されてもよい。従って、この方法は、グルコース投入量（ｍｏｌ）に対して少なくとも約１４０％のコハク酸収率（ｍｏｌ）を有してもよい。望ましくは、この方法は、グルコース投入量（ｍｏｌ）に対して少なくとも約１３０％または少なくとも約１７０％のコハク酸収率（ｍｏｌ）を有してもよい。
【００６８】
この方法はまた、代表的には（例えば、発酵に非組換え微生物を使用する方法と比べて）比較的高濃度のコハク酸を産生する。例えば、発酵は、少なくとも約５０ｇ／Ｌコハク酸の濃度に達し得る。望ましくは、発酵は、少なくとも約９０ｇ／Ｌのコハク酸の濃度、またはより望ましくは少なくとも約１３０ｇ／Ｌのコハク酸の濃度に達し得る。いくつかの実施形態において、発酵は、代表的には実質的なレベル（例えば、わずか約２．０ｇ／Ｌの酢酸塩、わずか約２．０ｇ／Ｌのギ酸塩および／またはわずか約３．０ｇ／Ｌのピルビン酸塩）の望ましくない副産物（例えば、酢酸塩、ギ酸塩、ピルビン酸塩およびそれらの混合物）を産生しない。
【００６９】
この方法を、（例えば、発酵に非組換え微生物を使用する方法と比べて）比較的高濃度の乳酸を産生するために使用してもよい。例えば、組換え微生物を、少なくとも約２５ｇ／Ｌの濃度で乳酸を産生する発酵に使用してもよい。１つの実施形態において、発酵収量は、グルコース１グラムあたり乳酸約０．５ｇであり得る。乳酸を産生するための方法は、Ｚｗｆ遺伝子の１つ以上の生化学活性を有するポリペプチドを発現（または過剰発現）する組換えＥ．ｃｏｌｉを用いて適切な炭素源を発酵させる工程を含んでもよい。例えば、この方法は、プラスミドなどの後成的エレメントからＥ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子を発現する組換えＥ．ｃｏｌｉを用いて適切な炭素源を発酵させる工程を含んでもよい。
【００７０】
実施形態の説明
１つの実施形態において、組換え微生物は、異種Ｚｗｆ遺伝子を発現するＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株である。異種Ｚｗｆ遺伝子は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓにおける発現に最適化されていてもよい。異種Ｚｗｆ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ酵素をコードし得る。組換え株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２５５として寄託された組換えＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを含み得る。組換え株は、（例えば、適切な炭素源を利用する発酵システムにおいて）約５０ｇ／Ｌ〜約１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができてもよい。組換え株は、少なくとも約１ｇ／Ｌのモノフルオロ酢酸ナトリウムのレベルに耐性であってもよい。
【００７１】
いくつかの実施形態において、組換え株は、異種Ｚｗｆ遺伝子を発現するＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６またはＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０に属する微生物の組換え株である。異種Ｚｗｆ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ酵素をコードし得る。
【００７２】
別の実施形態において、組換え株は、異種Ｚｗｆ遺伝子に作動可能に連結されたＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓに対する転写プロモーターを含むＤＮＡ分子を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株である。転写プロモーターとしては、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーターまたはその改変体（例えば、ポリヌクレオチドが、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーター活性を有する場合、配列番号４のポリヌクレオチドまたは配列番号４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド）を挙げることができる。異種Ｚｗｆ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｉｓｃｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔ酵素ま
たはその改変体（例えば、ポリヌクレオチドがＥ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｉｓｃｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔ酵素活性を有する場合、配列番号１のポリヌクレオチドまたは配列番号１に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド）をコードし得る。異種Ｚｗｆ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子を含んでもよい。必要に応じて、Ｚｗｆ遺伝子は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓにおける発現に最適化されてもよい。ＤＮＡ分子は、後成的であってもよい（例えば、プラスミド上に存在してもよい）。ＤＮＡ分子としては、選択可能なマーカー（例えば、カナマイシン耐性、アンピシリン耐性、ストレプトマイシン耐性、スルホンアミド耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性またはその組み合わせ）を挙げることができる。
【００７３】
別の実施形態において、組換え株は、異種Ｚｗｆ酵素を含むＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株である。異種Ｚｗｆ酵素は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓにおける発現に最適化されたＺｗｆ遺伝子から発現されてもよい。異種Ｚｗｆ酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｉｓｃｈｅｎｆｅｒｍｅｎｔ酵素を含み得る。組換え株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２５５として寄託された組換えＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓを含み得る。組換え株は、約５０ｇ／Ｌ〜約１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができ得る。必要に応じて、組換え株は、少なくとも約１ｇ／Ｌのモノフルオロ酢酸ナトリウムのレベルに耐性である。
【００７４】
１つの実施形態において、コハク酸を産生するための方法は、異種Ｚｗｆ遺伝子を発現する組換え微生物を用いて栄養培地を発酵させる工程を含む。組換え微生物としては、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株（例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２５５として寄託されたＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ組換え株）を挙げることができる。組換え微生物は、Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６の組換え株またはＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０の組換え株を含んでもよい。異種Ｚｗｆ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子を含み得る。必要に応じて、組換え株は、少なくとも約１ｇ／Ｌのモノフルオロ酢酸ナトリウムのレベルに耐性である。必要に応じて、組換え株は、約５０ｇ／Ｌ〜約１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができる。栄養培地は、発酵性の糖（例えば、グルコース）を含んでいてもよい。代表的には、この方法によってグルコース（ｇ）に対して少なくとも約１００％のコハク酸収率（ｇ）を生じる。
【００７５】
１つの実施形態において、組換えＤＮＡ分子は、異種Ｚｗｆ遺伝子に作動可能に連結されたＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓについての転写プロモーターを含む。例えば、この転写プロモーターとしては、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーターまたはその改変体（例えば、ポリヌクレオチドがＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーター活性を有する場合、配列番号４のポリヌクレオチドまたは配列番号４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチド）を挙げることができる。
【００７６】
１つの実施形態において、組換えＤＮＡ分子は、ＤＮＡプラスミド中に存在する。代表的には、ＤＮＡプラスミドは、選択可能なマーカー（例えば、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性、ストレプトマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、クロラムフェニコール耐性、スルホンアミド耐性およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子）を含む。ＤＮＡプラスミド中に存在し得るＤＮＡ分子は、宿主細胞中に存在し得る。宿主細胞は、発酵システムにおいて約５０ｇ／Ｌ〜約１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができ得る。
【００７７】
１つの実施形態において、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドを発
現するＤＮＡ分子で形質転換された、コハク酸を産生する微生物の組換え株である。ＤＮＡ分子は、ＮＡＤＰレダクターゼ活性を含んでもよいＺｗｆ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ＤＮＡ分子は、ポリペプチドがＺｗｆ酵素活性（例えば、ＮＡＤＰレダクターゼ活性）を有する場合、Ｚｗｆ酵素のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性（または望ましくは少なくとも約９５％の配列同一性）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、配列番号３または配列番号６）を含んでもよい。ＤＮＡ分子は、ポリヌクレオチドがＺｗｆ酵素活性を有するポリペプチドをコードする場合、Ｚｗｆ遺伝子のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約９０％の配列同一性（または望ましくは少なくとも約９５％の配列同一性）を有するポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号１；配列番号２；または配列番号５）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組換え株は、その１６Ｓ  ｒＲＮＡがＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する微生物由来であり得る。例えば、組換え株は、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６またはＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０の株由来であり得る。
【００７８】
別の実施形態において、組換え微生物は、異種Ｚｗｆ遺伝子で形質転換されたコハク酸を産生する微生物の組換え株である。異種Ｚｗｆ遺伝子は、その微生物における発現に最適化されてもよい。いくつかの実施形態において、異種Ｚｗｆ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ酵素をコードし得る。いくつかの実施形態において、Ｚｗｆ遺伝子は、ポリヌクレオチドがＺｗｆ酵素活性を有する場合、配列番号１に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００７９】
別の実施形態において、組換え微生物は、Ｚｗｆ酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼに対する転写プロモーターを含むＤＮＡ分子で形質転換されたコハク酸を産生する微生物の組換え株である。転写プロモーターとしては、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーターを挙げることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ポリヌクレオチドがプロモーター活性を有する場合、配列番号４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含み得る。
【００８０】
別の実施形態において、組換え微生物は、後成的であるＤＮＡ分子で形質転換された組換え株である。そのＤＮＡ分子は、プラスミド上に存在してもよい。
【００８１】
別の実施形態において、組換え微生物は、約５０ｇ／Ｌ〜約１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができる組換え株である。
【００８２】
組換え株は、少なくとも約１ｇ／Ｌのモノフルオロ酢酸ナトリウムのレベルに耐性であり得る。いくつかの実施形態において、組換え株は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−６２５５として寄託された組換えＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓである。
【００８３】
別の実施形態において、組換え微生物は、組換え微生物を用いて栄養培地を発酵させる工程を含む方法においてコハク酸を産生するために使用される。栄養培地は、代表的には、グルコースなどの発酵性の糖を含む。この方法は、グルコース（ｇ）に対して少なくとも約１００％のコハク酸収率（ｇ）を生じ得る。
【００８４】
いくつかの実施形態において、コハク酸を産生する微生物に対する転写プロモーターを含むＤＮＡ分子は、異種Ｚｗｆ遺伝子に作動可能に連結される。転写プロモーターは、ホ
スホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーターを含んでもよい。いくつかの実施形態において、このプロモーターは、ポリヌクレオチドがプロモーター活性を有する場合、配列番号４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。このＤＮＡ分子は、プラスミド内に存在してもよい。このＤＮＡ分子は、宿主細胞（例えば、約５０ｇ／Ｌ〜約１３０ｇ／Ｌの濃度でコハク酸を産生することができる宿主細胞）内に存在してもよい。
【００８５】
実施例
微生物株およびプラスミド
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＺ４５株は、モノフルオロ酢酸ナトリウムに耐性であるＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  １３０Ｚの安定な細菌の変異株である。Ｇｕｅｔｔｌｅｒら，ＩＮＴ’Ｌ  Ｊ．ＳＹＳＴ．ＢＡＣＴ．（１９９９）４９：２０７〜２１６；および米国特許第５，５７３，９３１号を参照のこと。Ｅ．ｃｏｌｉ−Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓシャトルベクターｐＬＳ８８（ＡＴＣＣアクセッション番号８６９８０としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託）をカナダのマニトバ大学のＬｅｓｌｉｅ  Ｓｌａｎｅｙ博士より入手した。プラスミドｐＬＳ８８は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉから単離されたと説明されており、スルホンアミド、ストレプトマイシンおよびカナマイシンに対する耐性を与えることができる。
【００８６】
遺伝子操作
組換えＤＮＡ操作は、概して当該分野で説明されている方法に従った。プラスミドＤＮＡをアルカリ溶菌法によって調製した。１．５ｍｌの培養物から抽出された多コピープラスミドに対する代表的な再懸濁体積は、５０μｌであった。大量のＤＮＡ調製には、製造者の指示書に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｉｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｘｉキットを使用した。制限エンドヌクレアーゼ、分子量スタンダードおよび着色済マーカーを、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入し、消化は、約５倍過剰量の酵素を使用した以外は製造者の推奨のとおりに実施した。ＤＮＡをエチジウムブロマイド存在下のＴｒｉｓ−酢酸−アガロースゲル上で解析した。ＤＮＡをアガロースゲルから抽出し、製造者の指示書に従ってＱｉａｇｅｎゲル抽出キットを使用して精製した。ＤＮＡを、制限酵素消化物と組み合わせてエビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して脱リン酸化した。ホスファターゼを１５分間７０℃で加熱不活性化した。ライゲーションを、２０μｌ反応体積中のベクターＤＮＡに対して３〜５倍過剰モル量の挿入物および１μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して２５℃で１時間実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した「ｌｉｂｒａｒｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙコンピテント細胞」を使用して製造者の指示書に従って実施した。
【００８７】
ライゲーション混合物を使用した形質転換体を、適切な抗生物質を含む標準的なＬＢプレート上に希釈することなく播いた。ＰＣＲ増幅をガイドラインとしてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒマニュアルを使用して実施した。プライマー設計は、（米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）データベースに提供されるような）公開された配列に基づいた。プライマーには、設計された制限酵素認識部位を含んだ。ベクターＮＴＩプログラムを使用してダイマーおよびヘアピン形成ならびに融解温度についてプライマーを分析した。すべてのプライマーは、Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙへ注文した。ＰＣＲ増幅は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍａｓｔｅｒ  ＣｙｃｌｅｒまたはＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒを用いて実施した。各プライマー対について、ベクターＮＴＩプログラムを使用して開始アニーリング温度を決定した。増幅産物を消化するための制限酵素をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購
入した。
【００８８】
プラスミドｐＪＲ７６２．５５
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼプロモーター配列（ｐｐｅｐｃｋ、配列番号４、ヌクレオチド１−２５８を含むＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３０８８３２）を、以下のプライマー：順方向、５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＣＧＧＧＡＣ（配列番号７）；および逆方向５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＡＣＴＴＣＡＣＣＴＣＡＴＴＧＡＴ（配列番号８）を使用してＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＺ４５ゲノムＤＮＡから増幅した。ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ制限配列（下線のヌクレオチド）をクローニングを促進するために含め、生じた０．２７−ｋｂ  ＰｐｅｐｃｋフラグメントをｐＬＳ８８にＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩフラグメントとして挿入してプラスミドｐＪＲ７６２．５５を生成した。
【００８９】
プラスミドｐＪＲ７６２．７３
Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＺｗｆ遺伝子を、以下のプライマー：順方向、５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＴＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＧＣ（配列番号９）；および逆方向５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣＴＣＡＴＴＣＣＡＧＧ（配列番号１０）を使用してＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣアクセッション番号ＮＣ＿０００９１３）から増幅した。ＸｈｏＩ制限配列（下線のヌクレオチド）をクローニングを促進するために含め、生じた１．５ｋｂのＺｗｆフラグメントをｐＪＲ７６２．５５のＳａｌＩ部位に挿入してプラスミドｐＪＲ７６２．７３を生成した。
【００９０】
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの形質転換
エレクトロポレーションのためのＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓコンピテント細胞をトリプシン大豆肉汁培地（ｔｒｙｐｔｉｃ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ  ｍｅｄｉｕｍ）（ＴＳＢ）中で細胞をＯＤ６００が約０．６になるまで生育することによって調製した。細胞を遠心分離し、滅菌水で２回、１０％ｖ／ｖグリセロールで２回洗浄し、１０％グリセロールで０．０１×元の培養体積に再懸濁した。細胞を急速冷凍し、マイナス８０℃で保存した。約４０μｌの解凍した細胞を、４００Ｗ、２５ｍＦおよび１．８ｋＶに設定されたＢｉｏＲａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒを用いて０．１ｃｍキュベット内でエレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーション後、１ｍｌの室温ＴＳＢ培地をすぐに加えて、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。細胞溶液を、カナマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＴＳＢ寒天プレート上に播いた。
【００９１】
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの光学密度測定
マグネシウムで中和した発酵物由来のサンプルを、４２０×ｇで２分遠心分離してＭｇＣＯ３を沈殿させ、任意の残存する沈殿物を可溶化するために０．５Ｎ  ＨＣｌで希釈した後、ＯＤ６６０を測定した。
【００９２】
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの回分発酵
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの発酵は、別途特定されないかぎり、以下の培地：グルコース８０ｇ／Ｌ、液体飼料シロップ（ＬＦＳ）８５ｇ／Ｌ、ビオチン０．２ｍｇ／Ｌ、５ｍＭ  リン酸、酵母抽出物３ｇ／Ｌ、Ｓｅｎｓｉｅｎｔ  ＡＧ９００を含む５１個の発酵槽中で実施した。ｐＨは、Ｍｇ（ＯＨ）２を用いて７．０に維持した。撹拌は２５０ｒｐｍ、温度３８℃に設定し、二酸化炭素を０．０２５ｖ．ｖ．ｍの割合で散布した。上で記載した培地を含む血清バイアル中で生じさせた発酵体を、１．２５％接種菌液を用いて接種した。Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓの組換え株のための発酵培地は、１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んだ。
【００９３】
ＬＦＳの精製
光学密度測定を介した増殖の測定を必要とする発酵のために、ＬＦＳの冷水抽出物を使用した。懸濁された固体および少量の油をＳｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローターで９，０００ｒｐｍ、２０分間ＬＦＳを遠心分離することによって除去した。上清を分離漏斗で、室温で３時間沈殿させた。下部の水相は、代表的には粗ＬＦＳの５７％（ｗ／ｖ）を示した。
【００９４】
Ｚｗｆ発現を確認するための生化学アッセイ
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼアッセイは、Ｃｈｏｉら、２００３によって説明されているように実施した（Ｃｈｏｉ，Ｊａｅ−Ｃｈｕｌｋ，Ｓｈｉｎ，Ｈｙｕｎ−Ｄｏｎｇ，Ｌｅｅ，Ｙｏｎｇ−Ｈｙｕｎ（２００３）Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２，ｐ．１７８〜１８５；“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ  ｍｏｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｌｙ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｖａｌｅｒａｔｅ）  ｕｓｉｎｇ  Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ  ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ｐｈｂＣ  ａｎｄ  ＮＡＤＰＨ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  Ｚｗｆ  ｇｅｎｅｓ”を参照のこと）。Ｄ−６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンの形成速度は、ＮＡＤＰＨの増加によって測定した。この測定は、３４０ｎｍの吸光度を測定することによって定量した。各アッセイは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ５０μｌ［１Ｍ］、ｐＨ７．５、ＭｇＣｌ２  ２００μｌ［５０ｍＭ］、ＮＡＤＰ  １００μｌ［１０ｍＭ］、グルコース−６−リン酸  １００μｌ［１０ｍＭ］、Ｈ２Ｏ  ４５０μｌおよび細胞抽出物  １００μｌを含む１ｍｌ中で実施した。特異的な活性は：特異的活性＝ｄＡ／ｄｔ／０．６２３×（タンパク質濃度）またはμｍｏｌ／分ｍｇ−１として計算した。高いＺｗｆ活性が、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓＰＥＰＣＫプロモーター由来のＥ．ｃｏｌｉ  Ｚｗｆ遺伝子を発現するプラスミド  ｐＪＲ７６２．７３を含むすべての組換え株で観察された。プラスミドｐＪＲ７６２．７３を保持する形質転換されたＡｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ株（ＦＺ４５）ならびにＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６（ＢＴ６）およびＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０（ＢＴ１０）の形質転換株において高い活性が観察された。これらの結果を、図３に示す。
【００９５】
Ｅ．ｃｏｌｉ発酵
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α／ｐＪＲ７６２．７３（Ｚｗｆ）、ＤＨ５α／ｐＪＲ７６２．１７（Ｚｗｆ）およびＤＨ５α／ｐＬＳ８８を、４リットルの以下の培地：９００ＡＧ酵母抽出物  １５ｇ；トウモロコシ・スティープ・リカー  １５ｇ；Ｎａ２ＨＰＯ４  １．１６ｇ；ＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ  ０．８４ｇ：（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３ｇ；ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ，０．６１；ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇおよびグルコース  ４５ｇ／リットルを使用してＮＢＳ５リットルＢｉｏｆｌｏ  ＩＩＩ発酵槽中で生育させた。ｐＨは、Ｋ２ＣＯ３（３．３Ｎ）の自動添加によって６．７に制御した。発酵は、１．２５％接種材料でそれぞれ開始した。条件は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の迅速な生育に好都合な好気性で開始し；５００ｒｐｍで撹拌し、培地を０．５リットル／リットル分で空気の注入散布（ｓｐａｒｇｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｉｒ）した。細胞密度が、ＯＤ６６０単位の最小値６．２に達したとき発酵槽の状態を有機酸産生に好都合な嫌気性にし；次いで培地にＣＯ２とＨ２との混合物（９５：５）を０．２リットル／リットル分で散布し、そして撹拌を２５０ｒｐｍに減速した。定期的にサンプルを回収し、有機酸生成物および残留グルコース濃度をＨＰＬＣを用いて測定した。
【００９６】
発酵ブロスの解析
３５℃に設定されたＷａｔｅｒｓ７１７オートサンプラーおよびＷａｔｅｒｓ２４１４屈折率検出器を備えたＷａｔｅｒｓ１５１５アイソクラティックポンプを使用して逆相高圧液体クロマトグラフフィ（ＨＰＬＣ）によってコハク酸、グルコース、乳酸、ピルビン酸塩、エタノールおよびギ酸濃度を測定した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｂｒｅｅｚｅソフトウェア（バージョン３．３）を使用してＨＰＬＣシステムを制御し、データを収集、処理した。
Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）カラムを５５℃に保たれたカチオンＨガードカラムとともに使用した。移動相は、０．５ｍｌ／分で移動する０．０２１Ｎ硫酸であった。サンプルを０．４５μｍフィルターに通して濾過し、５．０μｌをカラムに注入した。実行時間は、３０分であった。
【００９７】
ＣＯ２測定
発酵槽散布システムをモニタリングし１００ｍｌ／分でＣＯ２を供給するために質量流量制御装置（Ｂｒｏｏｋｓモデル５８５０Ｉ）を使用した。排気冷却システムを通って発酵槽に存在するＣＯ２を測定するために質量流量計（Ｂｒｏｏｋｓモデル５８６０Ｉ）を使用した。４−２０ｍａ  Ｂｉｏ−Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅを介して２つのＣＯ２流量計をコンピュータに接続した。ＢｉｏＣｏｍｍａｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇソフトウェアは、６０秒毎に入口および出口のＣＯ２流量を記録した。ＣＯ２消費の速度（ｍｌ／分）を、任意の所定の分にわたる入口と出口との間の速度の差として表した（ＣＯ２利用＝ＣＯ２入口−ＣＯ２出口）。任意の所定の発酵間隔の間に消費されるＣＯ２の体積は、その間隔の各分の合計速度である。消費されたＣＯ２のモルは、理想気体の法則を使用して計算した（消費リットル／（２２．４リットル／モル）＝消費モル）。
【００９８】
質量流量計は、ＣＯ２の製造者によって較正されており、その精密度は、最大測定限界の１％または２ｍｌ／ｍであった。発酵設備を、ＣＯ２に５％水素を混合することによってガス漏れをモニタリングした。水素の漏出は、Ｔｉｆ８８００ＣＯ／可燃性ガス分析機器を使用して検出した。
【００９９】
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ発酵の代謝フラックス解析
Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓにおける嫌気性コハク酸産生の間の代謝フラックス分布（ＭＦＡ）を、ＦｌｕｘＡｎａｌｙｚｅｒソフトウェアパッケージを使用して解析した。ＦｌｕｘＡｎａｌｙｚｅｒパッケージは、Ｓｔｅｆｆｅｎ  Ｋｌａｍｔ教授（Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｍａｇｄｅｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、マニュアルに提供された指示に従って操作した。ＦｌｕｘＡｎａｌｙｚｅｒパッケージは、実際の数学的計算を実施するＭＡＴＬＡＢプログラム用のグラフィカルユーザーインターフェースを提供することによって代謝フラックスの解析を促進する。ＭＡＴＬＡＢソフトウェアは、Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋ  Ｉｎｃから購入した。代謝経路全体の既知構成要素および予側される構成要素の細胞外濃度の変化を測定することによって、主な細胞内代謝産物についての細胞内フラックスを、以下に説明する代謝ネットワークモデルを使用して計算した。以下に示す２０個の既知代謝産物および２７個の反応を使用して特異的なネットワーク（標識されたＡ＿ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）を構築した（バイオマス組成物および増殖速度は考慮しない）：
Ａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ代謝ネットワークモデル
グルコース（ｉｎ）→グルコース（Ｒ１）
グルコース→グルコース−６Ｐ（Ｒ２）
グルコース−６Ｐ＋２ＮＡＤ→２ＰＥＰ＋２ＮＡＤＨ（Ｒ３）
ＰＥＰ→ピルビン酸塩（Ｒ４）
ＰＥＰ＋ＣＯ２→ＯＡＡ（Ｒ５）
ピルビン酸塩→ピルビン酸塩（ｏｕｔ）（Ｒ６）
ピルビン酸塩＋ＮＡＤ→アセチルＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋ＣＯ２（Ｒ７）
ピルビン酸塩＋ＮＡＤＨ＋ＣＯ２→リンゴ酸（Ｒ８）
アセチルＣｏＡ→酢酸塩（Ｒ９）
酢酸塩→酢酸塩（ｏｕｔ）（Ｒ１０）
酢酸塩＋ＯＡＡ→クエン酸塩（Ｒ１１）
クエン酸塩＋ＮＡＤ→ＣＯ２＋ＮＡＤＨ＋α−ＫＧ（Ｒ１２）
ＯＡＡ＋ＮＡＤＨ→リンゴ酸＋ＮＡＤ（Ｒ１３）
リンゴ酸→フマル酸塩（Ｒ１４）
フマル酸塩＋ＮＡＤＨ→コハク酸＋ＮＡＤ（Ｒ１５）
コハク酸→コハク酸（ｏｕｔ）（Ｒ１６）
ＣＯ２（ｉｎ）→ＣＯ２（Ｒ１７）
グリセロール（ｉｎ）→グリセロール（Ｒ１８）
グリセロール＋２ＮＡＤ→ＰＥＰ＋２ＮＡＤＨ（Ｒ１９）
ソルビトール（ｉｎ）→ソルビトール（Ｒ２０）
ソルビトール＋ＮＡＤ→グルコース−６Ｐ＋ＮＡＤＨ（Ｒ２１）
キシロース（ｉｎ）→キシロース（Ｒ２２）
キシロース→Ｒ５Ｐ（Ｒ２３）
Ｒ５Ｐ＋５／３ＮＡＤ→５／３ＰＥＰ＋５／３ＮＡＤＨ（Ｒ２４）
グルコース−６Ｐ＋２ＮＡＤＰ→Ｒ５Ｐ＋ＣＯ２＋２ＮＡＤＰＨ（Ｒ２５）
アセチルＣｏＡ＋２ＮＡＤＨ→エタノール＋２ＮＡＤ（Ｒ２６）
エタノール→エタノール（ｏｕｔ）（Ｒ２７）
先に説明した分析方法を使用して発酵の経時変化に関して発酵サンプルを解析した。グルコース、グリセロール、アラビノース、キシロース、ソルビトール、コハク酸、酢酸、エタノール、ピルビン酸塩、乳酸の濃度および発酵体積を各サンプリング時において測定した。代謝産物の量は、式：（代謝産物，ｇ）＝Ｖ（発酵槽，ｌ）＊Ｃ（代謝産物，ｇ／ｌ）に従って計算した。ｔ０−ｔ１の間の代謝産物の消費速度または代謝産物の産生速度を、式：代謝産物の消費速度（ｍｏｌ／ｈ，ｔ０およびｔ１）＝［量（代謝産物，ｇ，ｔ０）−量（代謝産物，ｇ，ｔ１）］／［（ｔ１−ｔ０）＊代謝産物の分子量］を使用して計算した。すべての時間についての代謝フラックスの比較のために、フラックスマップにおけるグルコース消費速度を１００と仮定して、フラックスマップにおける代謝産物の消費速度または生成速度を調節した。マップ「Ｍｃｐ」における代謝産物の消費速度または生成速度を以下の式：Ｍｃｐ＝（代謝消費／または生成速度）×１００／（グルコース消費速度）に従って決定した。
【０１００】
操作指示書に従ってＦｌｕｘＡｎａｌｙｚｅｒパッケージにおける代謝ネットワークモデルに様々な代謝産物の消費速度または生成速度を入力した。「Ｃａｌｃｕｌａｔｅ／Ｂａｌａｎｃｅ  Ｒａｔｅｓ」という機能を計算可能な速度すべてを計算するために使用した。このシステムが非重複性である場合、最適化手順を開始して、線形目的関数を最小化した。このシステムが重複性である場合、３つの方法（単純な最小２乗法、分散−重みつき最小２乗法Ｉおよび分散重みつき最小２乗法ＩＩ）のうち１つ以上を速度を計算するために適用した。流動速度を、フラックスマップ上に直接示した。最終的なフラックスマップを、保存目的でＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌファイルにコピーした。
【０１０１】
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＺ４５における生化学経路の代謝フラックス解析
Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＺ４５を用いた回分発酵におけるコハク酸産生に対する異なる炭素源の効果を評価するために代謝フラックス解析を使用した。この解析により、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＺ４５におけるコハク酸産生についての主要経路が以下の様式：ホスホエノールピルビン酸塩（ＰＥＰ）→オキサロ酢酸塩（ＯＡＡ）→リンゴ酸塩→フマル酸塩→コハク酸で流れることが証明された。グリオキシル酸分路およびＰＥＰ−輸送システム（ＰＴＳ）が生物体内で実質的に使用されないようであった。グルコース発酵は、約９４％（コハク酸（ｇ）／グルコース（ｇ））の収率で６１．７ｇ／Ｌコハク酸の濃度に達した。ソルビトールなどのより少ない炭素源を使用して実施された発酵により、高収率（１０８％コハク酸（ｇ）／グルコース（ｇ））でより多量のコハク酸（７７．３ｇ／Ｌ）が産生された。このことは、還元力がグルコースの発酵の間の制限因子になり得ることを示唆する。
【０１０２】
Ｚｗｆの過剰発現によるグルコースからのコハク酸の高産生
１００μｇ／ｍｌカナマイシンを形質転換株用の発酵培地に添加した以外は標準的な産生条件下でＦＺ４５株、ＦＺ４５／ｐＬＳ８８株およびＦＺ４５／ｐＪＲ７６２．７３株を培養した。ＦＺ４５／ｐＬＳ８８は、第２のコントロールとして機能し、ＰＥＰカルボキシキナーゼプロモーターまたはＺｗｆ遺伝子を保持しないクローニングベクターを用いて形質転換する。使用した炭素源は、グルコースであった。ＦＺ４５／ｐＪＲ７６２．７３株は、コハク酸の最終濃度の増加と対応して、コントロールＦＺ４５株およびＦＺ４５／ｐＬＳ８８株を超えるコハク酸産生の増加を示した。グルコースから産生されたコハク酸の総量は、２８４ｇから３０２ｇに増加し、産生されたコハク酸のモル収率は、１４４％から１５５％に増加し（コハク酸のモル／グルコース１００モル）、重量収率は９４．７％から１０１．９％に増加し、そして発酵ブロス中のコハク酸の最終濃度は６２ｇ／Ｌから６５ｇ／Ｌに増加した。これらの結果を表１にまとめる。すべての形質転換ＦＺ４５誘導体は、非形質転換ＦＺ４５と比べて遅い増殖を示すが、これは付加的な染色体外のプラスミドＤＮＡの複製によって引き起こされた可能性がある。
【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
さらに、表２に示すように、ＦＺ４５／ｐＪＲ７６２．７３株では、酢酸およびピルビン酸の２種類の代謝産物の産生がより少なかった。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
ＦＺ４５とＦＺ４５／ｐＪＲ７６２．７３との両方の代謝フラックス解析により、ＦＺ４５／ｐＪＲ７６２．７３が、非形質転換ＦＺ４５よりも多く炭素をペントースリン酸経路に導いたことが示された（図１および図２を参照のこと）。従って、グルコースが炭素源として使用されるとき、Ｚｗｆタンパク質の過剰発現は、コハク酸の収率を増大し、他の代謝産物の産生を減少させるのに十分であった。
【０１０７】
少ない炭素源を使用したＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＺ４５／／ｐＪＲ７６２．７３による発酵
炭素源としてマンニトールを利用するＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＺ４５／ｐＪＲ７６２．７３による発酵もまた実施した。マンニトールは、グルコースよりも還元された６−炭素糖アルコールである。Ｚｗｆの発現はまた、マンニトールを使用してコハク酸産生を促進した（表３を参照のこと）。しかしながら、この糖アルコールを使用した発酵は、非形質転換ＦＺ４５株を用いても高収率であることが示された。これは、代謝の還元当量物の量の増加がコハク酸産生を促進することを示唆する。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
組換えＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６およびＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０におけるＺｗｆ発現の効果
生物体Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ６（ＢＴ６）およびＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ１０（ＢＴ１０）を使用して他の種におけるＺｗｆ発現の効果もまた試験した。両方の生物体は、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ科に属し、Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓに関連する。また、両方の生物体は、コハク酸を産生することが知られている。上で説明した方法および同じプラスミドであるｐＪＲ７６２．７３（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓＰＥＰＣＫプロモーター下にＺｗｆ遺伝子を保持する）を使用して、両方のＢｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎを形質転換した。これらの形質転換株の両方において、炭素源としてグルコースを使用したコハク酸産生が増加したことが示された。これらの結果を、以下の表４に示す。
【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
Ｂｉｓｇａａｒｄ  Ｔａｘｏｎ株を用いたこれらの発酵のフラックス解析によって、ペントースリン酸経路の利用がこのプラスミドを保持する株において実際に増加したことが示唆された。ＢＴ６／ｐＪＲ７６２．７３は、コントロールよりも多くの炭素を、ペント
ースリン酸経路を介して送った（３３ｍｏｌ％対２０ｍｏｌ％）。同様に、ＢＴ１０／ｐＪＲ７６２．７３は、コントロールのわずか５ｍｏｌ％と比べて、ペントースリン酸経路を介して３５ｍｏｌ％の炭素を送った。
【０１１２】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書中で開示される本発明に様々な置換および改変がなされ得ることは、当業者にとって容易に明らかであるだろう。例として本明細書中に記載される本発明は、本明細書中に詳細に開示されない任意の要素（単数または複数）、制限（単数または複数）なしに適切に実施することができる。使用された用語および表現は、説明の用語として使用されるのであって、限定の用語ではない。様々な改変をすることは、示され、そして説明された特徴またはそれらの一部の任意の等価物を排除するこのような用語および表現の使用において意図されないが、本発明の範囲内で可能であることが認識される。従って、本発明は特定の実施形態および任意の特徴によって説明されたが、本明細書中に開示された概念の改変および／または変更は、当業者にゆだねられ、このような改変および変更が本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０１１３】
さらに、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群または代替の他の群の形で記載される場合、当業者は、本発明がまた本明細書によってマーカッシュ群または他の群の任意の個別のメンバーまたはメンバーの部分群に関して記載されることを認識するだろう。
【０１１４】
また、反対の指示がない限り、様々な多くの値が実施形態について提供される場合、追加の実施形態が、ある範囲の終点として任意の２つの異なる値をとることによって記載される。このような範囲はまた、説明された本発明の範囲内である。
【０１１５】
本明細書中に引用されたすべての参考文献、特許および／または出願は、それぞれの参考文献が個々にそれらの全体において参考により援用されたのと同程度に、任意の表および図を含むそれらの全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】グルコースを使用したＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ変異株ＦＺ４５の回分発酵の代謝フラックス解析
【図２】グルコースを使用した組換えＡ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＦＺ４５／ｐＪＲ７６２．７３の回分発酵の代謝フラックス解析
【図３】形質転換株の細胞抽出物におけるＺｗｆ酵素活性。抽出物を、以下に記載するように調製し、Ｚｗｆ活性についてアッセイした。ｐＪＲ７６２．７３を保持するすべての株は、Ｚｗｆ活性の大規模な増加を示し、それを対数メモリ上に図示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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