(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノウゼンカズラ科ロウソクノキ属（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒａ）植物の抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項２】
ノウゼンカズラ科ロウソクノキ属（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒａ）植物の抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項３】
ノウゼンカズラ科ロウソクノキ属（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒａ）植物の抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項４】
ノウゼンカズラ科ロウソクノキ属（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒａ）植物の抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項５】
ノウゼンカズラ科ロウソクノキ属（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒａ）植物の抽出物を有効成分とする保湿剤。
【請求項６】
ノウゼンカズラ科ロウソクノキ属（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒａ）植物の抽出物を有効成分とする皮膚外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ノウゼンカズラ科（Ｂｉｇｎｏｎｉａｃｅａｅ）ロウソクノキ属（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒａ）植物またはその抽出物を含有する抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、保湿剤、皮膚外用剤および機能性経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索および配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類等の抽出物の皮膚外用剤、経口組成物への応用が検討されてきた。
【０００３】
例えば、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るために、真皮線維芽細胞の賦活作用を有する成分として金時草由来成分（特許文献１参照）等が、活性酸素消去作用や過酸化脂質の生成抑制作用を有する抗酸化剤を得るために、ラジカル消去作用を有する成分としてスイートピー抽出物（特許文献２参照）等がそれぞれすでに知られている。皮膚で炎症が生じるメカニズムとしては、皮膚中のヒアルロン酸がヒアルロニダーゼにより分解されることにより、皮膚等に存在する肥満細胞や血中に存在する好塩基球細胞等の炎症系細胞の透過性が高まるためと考えられており、このヒアルロニダーゼを阻害する抗炎症成分として、ゴジアオイ属シスタスインカヌス由来成分（特許文献３参照）等が知られている。また、美白剤としてはアブラナ科ケール由来成分（特許文献４参照）等が、保湿剤としてはアカザ科ソルトブッシュ由来成分（特許文献５参照）等が知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−１７４４５９号公報
【特許文献２】特開２００８−２８５６３７号公報
【特許文献３】特開２００８−８８０９７号公報
【特許文献４】特開２００４−９１３９６号公報
【特許文献５】特開２００６−２４８９３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、保湿作用を有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、従来はその効果が知られていなかったノウゼンカズラ科ロウソクノキ属植物またはその抽出物に優れた抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、保湿作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ノウゼンカズラ科ロウソクノキ属植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を含有する抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、保湿剤、皮膚外用剤および機能性経口組成物に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ノウゼンカズラ科ロウソクノキ属植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を配合することにより、優れた効果を有する抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、保湿剤、皮膚外用剤および機能性経口組成物を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明で用いるロウソクノキ属植物は、ノウゼンカズラ科に属する、原産国をパナマとする樹高３〜５ｍほどの常緑低木である。幹に直接花をつける幹生花であり、花のあとには蝋質の円柱状の大きな実をつける。特にロウソクノキ（Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒａ  ｃｅｒｅｉｆｅｒａ）では３０〜１２０ｃｍにもなる細長い実がなり、これがろうそくのようにみえることから名前の由来ともなっている。ろうそくの原料とはならない。
【００１０】
本発明は、ロウソクノキ属植物であれば特に限定されないが、本発明の効果の点から、適当なものとして、ロウソクノキが挙げられる。
【００１１】
これらロウソクノキ属植物を使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、葉、根、茎、幹、花、果実などの任意の部位を使用することができ、複数の部位を組み合わせて使用してもよいが、特に果実を使うことが好ましい。
【００１２】
抽出の際は、植物を生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
【００１３】
抽出は、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬して行うことができる。抽出溶媒は、必要に応じて加熱してもよい。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、攪拌したり抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１４】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができる。これらは、単独で用いられる他、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種または２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよい。
【００１５】
ロウソクノキ属植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間そのまま静置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。あるいは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。ロウソクノキ属植物の前記抽出物やその処理物および分画物は、各処理および分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００１６】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物は、優れた抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、保湿作用を有し、抗老化剤、抗酸化剤、抗炎症剤、美白剤、保湿剤、皮膚外用剤および機能性経口組成物として利用することができる。
【００１７】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞賦活作用およびヒト表皮角化細胞賦活作用を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００１８】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れたＤＰＰＨラジカル消去作用、ＳＯＤ様活性（スーパーオキサイドアニオン消去作用）およびヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性を有し、優れた抗酸化効果を発揮する。
【００１９】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ阻害作用を有し、優れた抗炎症効果を発揮する。
【００２０】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用およびヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用を有し、優れた美白効果を発揮する。
【００２１】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物を有効成分とする保湿剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用およびヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用を有し、優れた保湿効果を発揮する。
【００２２】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物を含有する皮膚外用剤は、優れた抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、保湿作用を発揮する。
【００２３】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物を含有する機能性経口組成物は、優れた抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、保湿作用を発揮する。
【００２４】
これらの各剤は、ロウソクノキ属植物またはその抽出物を有効成分として含む限り、その形態およびその他成分の配合の有無等については、なんら制限されない。形態については、液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等の任意の形態を、その用途等に応じて選択でき、その形態とするために必要なビヒクル（賦形剤）、溶剤、その他の一般的な添加剤（酸化防止剤、着色剤、分散剤等）を任意に含むことができる。
【００２５】
ここで、皮膚外用剤とは、化粧料、医薬部外品、外用医薬品等の、皮膚または毛髪に外用される全ての外用組成物を意味している。機能性経口組成物についても、医薬品、食品、飲料等の種類を問わず、経口により摂取される全ての組成物を意味する。
【００２６】
皮膚外用剤の剤型は任意であり、例えば、ローションなどの可溶化系やカラミンローション等の分散系、クリームや乳液などの乳化系として提供することができる。さらに、噴射剤と共に充填するエアゾール形態、軟膏剤、パップ剤などの種々の剤型で提供することもできる。
【００２７】
具体的には、乳液、クリーム、ローション、化粧水、パック、美容液、洗浄料、メイクアップ化粧料等の各種化粧料；液剤、軟膏、粉末、顆粒、エアゾール剤、貼付剤、パップ剤等の様々な形態の化粧料、医薬部外品や外用医薬品などが例示できる。
【００２８】
機能性経口組成物の形態も任意であり、特に限定されることはない。具体的には、飲料を含む一般食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤等の健康食品（サプリメント）または機能性食品；錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エキス等の経口医薬品などが例示できる。
【００２９】
皮膚外用剤または機能性経口組成物には、ロウソクノキ属植物またはその抽出物の他に、その用途と必要に応じて、医薬品、医薬部外品、皮膚化粧料、毛髪用化粧料および洗浄料等に通常配合される任意の成分、例えば水、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、可溶化剤、ゲル化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、抗炎症剤、増粘剤、ｐＨ調整剤、キレート剤、薬剤（薬効成分）、香料、樹脂、防菌防かび剤、抗酸化剤、アルコール類等を適宜配合することができる。さらに、本発明の効果を損なわない範囲において、他の保湿剤、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、抗炎症剤および痩身剤あるいはロウソクノキ属植物以外の植物またはその抽出物との併用も可能である。
【００３０】
飲食品等の経口組成物の場合も、経口用として通常用いられる各種成分との組み合わせにおいて、特に限定されるものはない。
【００３１】
ロウソクノキ属植物またはその抽出物の皮膚外用剤または機能性経口組成物への配合量は、種類や目的等によって調整することができるが、効果や安定性などの点から、全量に対して、固形分換算で、０．０００１〜１０．０質量％が好ましく、より好ましくは、０．００１〜５．０質量％であり、さらに好ましくは０．０１〜５質量％であり、一層好ましくは０．１〜５質量％である。
【実施例】
【００３２】
以下にロウソクノキ属植物抽出物の調製例、抗老化効果、抗酸化効果、抗炎症効果、美白効果、保湿効果を評価するための試験方法、皮膚外用剤、機能性食品としての処方例についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００３３】
［抽出物１：熱水抽出物］
ロウソクノキ（部位：果実）を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の精製水を加えてオートクレーブにて２０分間、１２０度に加温して抽出した。温度の高い状態を保って吸引濾過により不溶物を取り除いた後、凍結乾燥を行って抽出物を得た。
【００３４】
［抽出物２：エタノール抽出物］
ロウソクノキ（部位：果実）を乾燥させて粉砕し、サンプル質量の２０倍量の５０容量％エタノールを加えて室温にて攪拌しながら３時間抽出した後、濾過により不溶物を取り除いた。減圧濃縮後、凍結乾燥を行って抽出物を得た。
【００３５】
上記抽出物を用いて、ロウソクノキについて抗老化効果・抗酸化効果の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊及び＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊でそれぞれ表したものである。
【００３６】
＜抗老化効果（ヒト真皮線維芽細胞賦活作用）＞
ロウソクノキ抽出物のヒト真皮線維芽細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１および抽出物２を用いた。
【００３７】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表１および表２に示す各濃度となるよう各抽出物を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。各評価結果を、試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした相対値にて表１および表２に示す。
【００３８】
【表１】
0005610846.tif 000002
【００３９】
【表２】
0005610846.tif 000003
【００４０】
表１および表２より明らかなように、ロウソクノキ抽出物には、有意なヒト真皮線維芽細胞賦活作用が認められた。
【００４１】
＜抗老化効果（ヒト表皮角化細胞賦活作用）＞
ロウソクノキ抽出物のヒト表皮角化細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１を用いた。
【００４２】
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表３に示す各濃度となるように抽出物１を添加した５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。次に１００μｇ／ｍＬとなるよう培地にて調整したＭＴＴ試薬を、上清を除いた細胞に添加し、約２時間培養した。最後に２−プロパノールにて生じたフォルマザンを抽出し、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて細胞賦活作用を評価した。評価結果を試料無添加のコントロールにおける細胞賦活作用を１００とした時の相対値にて表３に示す。
【００４３】
【表３】
0005610846.tif 000004
【００４４】
表３より明らかなように、ロウソクノキ抽出物には、有意なヒト表皮角化細胞賦活作用が認められた。
【００４５】
表１〜３に示したとおり、ロウソクノキ抽出物は、ヒト真皮線維芽細胞賦活作用およびヒト表皮角化細胞賦活作用を示すことから、優れた抗老化効果を発揮する。
【００４６】
＜抗酸化効果（ＤＰＰＨラジカル消去作用）＞
ロウソクノキ抽出物のＤＰＰＨラジカル消去作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１および抽出物２を用いた。
【００４７】
各抽出物を５０質量％エタノールにて表４および表５に示す各濃度に調製したサンプル溶液１００μＬに、０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液１００μＬを添加し、よく混合した後、室温、暗所にて１０分静置し、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を（Ａ）、試料添加時の吸光度を（Ｂ）とした時、ＤＰＰＨラジカル消去率は次式に定義される。
消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
評価結果を表４および表５に示す。
【００４８】
【表４】
0005610846.tif 000005
【００４９】
【表５】
0005610846.tif 000006
【００５０】
表４および表５より明らかなように、ロウソクノキ抽出物には、高いＤＰＰＨラジカル消去作用が認められた。
【００５１】
＜抗酸化効果（ＳＯＤ様活性〈スーパーオキサイドアニオン消去作用〉）＞
ロウソクノキ抽出物のＳＯＤ様活性（スーパーオキサイドアニオン消去作用）の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１および抽出物２を用いた。
【００５２】
各抽出物を、ＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液にて表６および表７に示す各濃度に調製したサンプル溶液２５μＬに、０．２５ｍＭのＷＳＴ−１、及び１ｍＭヒポキサンチンを含むＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液７５μＬを添加した。さらに、キサンチンオキシダーゼ２５μＬ（０．００７５Ｕｎｉｔｓ）を添加し、３７℃にて１５分間反応後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料無添加時の吸光度を（Ａ）、試料添加時の吸光度を（Ｂ）とした時、スーパーオキサイドアニオン消去率は次式に定義される。
消去率（％）＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００
評価結果を表６および表７に示す。
【００５３】
【表６】
0005610846.tif 000007
【００５４】
【表７】
0005610846.tif 000008
【００５５】
表６および表７より明らかなように、ロウソクノキ抽出物には、高いＳＯＤ様活性（スーパーオキサイドアニオン消去作用）が認められた。
【００５６】
＜抗酸化効果（ヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性）＞
ロウソクノキ抽出物のヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１および抽出物２を用いた。
【００５７】
ヒト表皮角化細胞ＨａＣａＴを１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には１０質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間後、１０質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地にて表８および表９に示す各濃度に調整したサンプル培養液に交換し、さらに２４時間培養した。任意濃度のｔ−ブチルヒドロペルオキシドを添加したＨＡＮＫ’Ｓ（＋）溶液に交換し、２時間培養した。さらに、１５０μｇ／ｍＬニュートラルレッドを含有するＰＢＳ（−）に交換し、３７℃にて２時間培養した。次に１容量％酢酸を含む５０容量％エタノール水溶液に交換し、細胞内に取りこまれたニュートラルレッドを抽出し、抽出液の５４０ｎｍの吸光度を測定した。評価結果をｔ−ブチルヒドロペルオキシド無添加のコントロールにおける細胞生存率を１００としたときの相対値にて表８および表９に示す。
【００５８】
【表８】
0005610846.tif 000009
【００５９】
【表９】
0005610846.tif 000010
【００６０】
表８および表９より明らかなように、ロウソクノキ抽出物には、有意なヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性が認められた。
【００６１】
表４〜表９に示したとおり、ロウソクノキ抽出物は、ＤＰＰＨラジカル消去作用、ＳＯＤ様活性（スーパーオキサイドアニオン消去作用）およびヒト表皮角化細胞過酸化脂質耐性を示すことから、優れた抗酸化効果を発揮する。
【００６２】
＜抗炎症効果（ヒアルロニダーゼ阻害作用）＞
ロウソクノキ抽出物のヒアルロニダーゼ阻害作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１および抽出物２を用いた。
【００６３】
ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるよう０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、基質溶液とした。ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５３００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるよう０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、酵素溶液とした。各抽出物を緩衝液にて表１０および表１１に示す各濃度に調製したサンプル溶液０．１ｍＬ及び酵素溶液０．０３ｍＬを試験管にとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４ＮのＮａＯＨを０．０６ｍＬ加え、反応停止後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸後さらに氷冷した。ｐ−ＤＡＢＡ溶液を２．０ｍＬ添加し、３７℃で２０分間反応させた後、反応溶液を９６ウェルマイクロプレートに移し、５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、試料無添加の緩衝溶液を用い、ポジティブコントロールにはグリチルリチン酸２カリウムを１１．７５ｍｇ／ｍＬとなるように添加した緩衝溶液を用いた。ヒアルロニダーゼの活性が阻害されると分解産物であるＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなる。ヒアルロニダーゼ阻害作用は次式に定義される。
阻害率（％）＝（コントロール吸光度−サンプル吸光度）／コントロール吸光度×１００
評価結果を表１０および表１１に示す。
【００６４】
【表１０】
0005610846.tif 000011
【００６５】
【表１１】
0005610846.tif 000012
【００６６】
表１０〜表１１に示したとおり、ロウソクノキ抽出物は、高いヒアルロニダーゼ阻害作用を示すことから、優れた抗炎症効果を発揮する。
【００６７】
＜美白効果（Ｂ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用）＞
ロウソクノキ抽出物のＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１を用いた。
【００６８】
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ０細胞）を１ディッシュ当り１８０００個となるように９０ｍｍディッシュに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表１２に示す各濃度となるように抽出物１を添加した５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、トリプシン処理にて細胞をはがし、１．５ｍＬマイクロチューブに移して遠心操作して細胞沈殿物を得た。得られた沈殿物は下記判定表を基にその黒化状況を肉眼判定した。評価ではネガティブコントロールに５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地、ポジティブコントロールに５０ｍＭ乳酸ナトリウムを含有する５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。これらの目視判定結果は判定５、及び判定１とし、サンプル判定の指標とした。目視判定は表１３に示す通り、５段階評価した。評価結果を表１２に示す
【００６９】
【表１２】
0005610846.tif 000013
【００７０】
【表１３】
0005610846.tif 000014
【００７１】
表１２に示したとおり、ロウソクノキ抽出物には、高いＢ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用が認められた。
【００７２】
＜美白効果（ヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用）＞
ロウソクノキ抽出物のヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１および抽出物２を用いた。
【００７３】
正常ヒト表皮メラニン細胞を１ウェル当り３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＭｅｄｉｕｍ  ２５４Ｓを用いた。２４時間培養後、表１４および表１５に示す各濃度となるように各抽出物を添加したＭｅｄｉｕｍ  ２５４Ｓに交換し、さらに４８時間培養した。次に１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含有するリン酸緩衝液７５μＬに交換し、細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に基質となる５０μＬの０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液を加え、３７℃で２時間静置した。基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量は両測定値の差を次式に導入して求めた。
生成されたドーパメラニン量＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）−２．１６６｝／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのドーパメラニン生成量と比較し、表１４および表１５に示す。
【００７４】
【表１４】
0005610846.tif 000015
【００７５】
【表１５】
0005610846.tif 000016
【００７６】
表１４および表１５に示したとおり、ロウソクノキ抽出物には、有意なヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用が認められた。
【００７７】
表１２、表１４および表１５に示したとおり、ロウソクノキ抽出物は、Ｂ１６マウスメラノーマ細胞メラニン産生抑制作用およびヒト表皮メラニン細胞チロシナーゼ活性阻害作用を示すことから、優れた美白効果を発揮する。
【００７８】
＜保湿効果（ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用）＞
ロウソクノキ抽出物のヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１および抽出物２を用いた。
【００７９】
正常ヒト真皮線維芽細胞を１ウェル当り２．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いた。２４時間培養後、表１６および表１７に示す各濃度となるように各抽出物を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２日間培養した。培養上清中に分泌されたヒアルロン酸の定量には、ヒアルロン酸結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、最後はアビジン化ホースラディッシュペルオキシダーゼに対し３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し反応させた。１０〜１５分後１Ｎの塩酸で反応を停止させた後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのヒアルロン酸産生量を１００とした相対値にて表１６および表１７に示す。
【００８０】
【表１６】
0005610846.tif 000017
【００８１】
【表１７】
0005610846.tif 000018
【００８２】
表１６および表１７に示したとおり、ロウソクノキ抽出物には、高いヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用が認められた。
【００８３】
＜保湿効果（ヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用）＞
ロウソクノキ抽出物のヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、抽出物１および抽出物２を用いた。
【００８４】
正常ヒト表皮角化細胞ＮＨＥＫを１ウェル当り２．０×１０４個となるようにコラーゲンコートされた９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地にはＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地（クラボウ社製のＮＨＥＫ増殖培地）を用いた。２４時間培養後、表１８および表１９に示す各濃度となるように各抽出物を添加した、１．２ｍＭのＣａＣｌ２を含むＫＧ２培地（分化誘導培地）に交換し、さらに９日間培養した。培地交換は３日に１回のペースで行った。培養上清中に分泌された尿素の定量には、尿素窒素Ｂ−テストワコー（和光純薬）を用いた。アルギナーゼはアルギニンを加水分解し、オルニチン、尿素を生成する。尿素はウレアーゼによってアンモニアに分解され、アンモニアはペンタシアノニトロシル鉄（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物（ニトロプルシッドナトリウム）存在下でサリチル酸、次亜塩素酸と反応し、インドフェノールが生成する。アルカリ性条件下でインドフェノールに由来する５７０ｎｍの吸光度を測定し、尿素濃度を求め、アルギナーゼ活性の定量を行った。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を求めた。評価結果を試料無添加のコントロールにおける単位タンパク量当りのアルギナーゼ活性を１００とした時の相対値にて表１８および表１９に示す。
【００８５】
【表１８】
0005610846.tif 000019
【００８６】
【表１９】
0005610846.tif 000020
【００８７】
表１８および表１９に示したとおり、ロウソクノキ抽出物には、有意なヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用が認められた。
【００８８】
表１６〜表１９に示したとおり、ロウソクノキ抽出物は、ヒト真皮線維芽細胞ヒアルロン酸産生促進作用およびヒト表皮角化細胞アルギナーゼ活性促進作用を示すことから、優れた保湿効果を発揮する。
【００８９】
続いて、上記各調製方法で得られたロウソクノキ抽出物を配合した皮膚外用剤および機能性経口組成物の処方例を示す。
【００９０】
［実施例１］乳液
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）メチルフェニルポリシロキサン                      ４．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）モノステアリン酸ポリオキシエチレン
ソルビタン（２０Ｅ．Ｏ．）      １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        １．０
（７）グリセリン                                        ４．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）カルボキシビニルポリマー                          ０．１５
（１０）精製水                                      １００とする残部
（１１）アルギニン（１質量％水溶液）                  ２０．０
（１２）抽出物１                                        ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。冷却後４０℃にて、（１１）と（１２）を順次加え、均一に混合する。
【００９１】
［実施例２］化粧水
（１）エタノール                                      １５．０（質量％）
（２）ポリオキシエチレン（４０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    ０．３
（３）香料                                              ０．１
（４）精製水                                        １００とする残部
（５）クエン酸                                          ０．０２
（６）クエン酸ナトリウム                                ０．１
（７）グリセリン                                        １．０
（８）ヒドロキシエチルセルロース                        ０．１
（９）抽出物２                                          １．０
製法：（１）に（２）および（３）を溶解する。さらに（４）〜（８）を順次添加した後、十分に攪拌し、（９）を加え、均一に混合する。
【００９２】
［実施例３］クリーム
（１）スクワラン                                      １０．０（質量％）
（２）ステアリン酸                                      ２．０
（３）水素添加パーム核油                                ０．５
（４）水素添加大豆リン脂質                              ０．１
（５）セタノール                                        ３．６
（６）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（７）グリセリン                                      １０．０
（８）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（９）アルギニン（２０質量％水溶液）                  １５．０
（１０）精製水                                      １００とする残部
（１１）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）    １５．０
（１２）抽出物１                                        ５．０
製法：（１）〜（６）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（７）〜（１０）の水相成分を８０℃にて加熱溶解する。これに前記油相成分を攪拌しながら加え、ホモジナイザーにより均一に乳化する。（１１）を添加して攪拌後、冷却し４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【００９３】
［実施例４］美容液
（１）精製水                                        １００とする残部（質量％）
（２）グリセリン                                      １０．０
（３）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（４）カルボキシビニルポリマー（１質量％水溶液）      １７．５
（５）アルギン酸ナトリウム（１質量％水溶液）          １５．０
（６）モノラウリン酸ポリグリセリル                      １．０
（７）マカデミアナッツ油脂肪酸フィトステリル            ３．０
（８）Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸
ジ（フィトステリル−２−オクチルドデシル）        ２．０
（９）硬化パーム油                                      ２．０
（１０）スクワラン（オリーブ由来）                      １．０
（１１）ベヘニルアルコール                              ０．７５
（１２）ミツロウ                                        １．０
（１３）ホホバ油                                        １．０
（１４）１，３−ブチレングリコール                    １０．０
（１５）Ｌ−アルギニン（１０質量％水溶液）              ２．０
（１６）抽出物２                                        ３．０
製法：（１）〜（６）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。次いで、上記水相成分に油相成分を添加して予備乳化を行った後、ホモミキサーにて均一に乳化する。冷却後５０℃にて（１５）を、４０℃にて（１６）を加え、均一に混合する。
【００９４】
［実施例５］水性ジェル
（１）カルボキシビニルポリマー                          ０．５（質量％）
（２）精製水                                        １００とする残部
（３）水酸化ナトリウム（１０質量％水溶液）              ０．５
（４）エタノール                                      １０．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（６）香料                                              ０．１
（７）抽出物２                                          ０．５
（８）ポリオキシエチレン（６０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油    １．０
製法：（１）を（２）に加え、均一に攪拌した後、（３）を加える。均一に攪拌した後、（４）に予め溶解した（５）を加える。均一に攪拌した後、予め混合しておいた（６）〜（８）を加え、均一に攪拌混合する。
【００９５】
［実施例６］クレンジング料
（１）スクワラン                                      ８１．０（質量％）
（２）イソステアリン酸ポリオキシエチレングリセリル    １５．０
（３）抽出物１                                          ４．０
製法：（１）と（２）を均一に溶解する。これに、（３）を加え、均一に混合する。
【００９６】
［実施例７］洗顔フォーム
（１）ステアリン酸                                    １６．０（質量％）
（２）ミリスチン酸                                    １６．０
（３）親油型モノステアリン酸グリセリン                  ２．０
（４）グリセリン                                      ２５．０
（５）水酸化ナトリウム                                  ７．５
（６）ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイン                １．０
（７）精製水                                        １００とする残部
（８）抽出物２                                          ０．１
製法：（１）〜（４）の油相成分を８０℃にて加熱溶解する。一方（５）〜（７）の水相成分を８０℃にて加熱溶解し、油相成分と均一に混合攪拌する。冷却後４０℃にて（８）を加え、均一に混合する。
【００９７】
［実施例８］メイクアップベースクリーム
（１）スクワラン                                      １０．２（質量％）
（２）セタノール                                        ２．０
（３）グリセリントリ−２−エチルヘキサン酸エステル      ２．５
（４）親油型モノステアリン酸グリセリル                  １．０
（５）プロピレングリコール                            １１．０
（６）ショ糖脂肪酸エステル                              １．３
（７）精製水                                        １００とする残部
（８）酸化チタン                                        １．０
（９）ベンガラ                                          ０．１
（１０）黄酸化鉄                                        ０．４
（１１）香料                                            ０．１
（１２）抽出物１                                        ３．０
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（５）〜（７）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（８）〜（１０）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散させる。この水相成分に前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１１）と（１２）の成分を加え、均一に混合する。
【００９８】
［実施例９］乳液状ファンデーション
（１）メチルポリシロキサン                              ２．０（質量％）
（２）スクワラン                                        ５．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル                      ５．０
（４）セタノール                                        １．０
（５）ポリオキシエチレン（２０Ｅ．Ｏ．）
ソルビタンモノステアリン酸エステル              １．３
（６）モノステアリン酸ソルビタン                        ０．７
（７）１，３−ブチレングリコール                        ８．０
（８）キサンタンガム                                    ０．１
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（１０）精製水                                      １００とする残部
（１１）酸化チタン                                      ９．０
（１２）タルク                                          ７．４
（１３）ベンガラ                                        ０．５
（１４）黄酸化鉄                                        １．１
（１５）黒酸化鉄                                        ０．１
（１６）香料                                            ０．１
（１７）抽出物２                                        ０．５
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解する。一方、（７）〜（１０）の水相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解し、これに（１１）〜（１５）の顔料を加え、ホモミキサーにて均一に分散する。油相成分を加え、乳化を行う。冷却後４０℃にて（１６）と（１７）の成分を順次加え、均一に混合する。
【００９９】
［実施例１０］油中水型エモリエントクリーム
（１）流動パラフィン                                  ３４．０（質量％）
（２）マイクロクリスタリンワックス                      ２．０
（３）ワセリン                                          ５．０
（４）ジグリセリンオレイン酸エステル                    ５．０
（５）塩化ナトリウム                                    １．３
（６）塩化カリウム                                      ０．１
（７）プロピレングリコール                              ３．０
（８）１，３−ブチレングリコール                        ５．０
（９）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（１０）抽出物１                                        ３．０
（１１）精製水                                      １００とする残部
（１２）香料                                            ０．１
製法：（５）と（６）を（１１）の一部に溶解して５０℃とし、５０℃に加熱した（４）に攪拌しながら徐々に加える。これを混合した後、７０℃にて加熱溶解した（１）〜（３）に均一に分散する。これに（７）〜（１０）を（１１）の残部に７０℃にて加熱溶解したものを攪拌しながら加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１２）を加え、均一に混合する。
【０１００】
［実施例１１］パック
（１）精製水                                        １００とする残部（質量％）
（２）ポリビニルアルコール                            １２．０
（３）エタノール                                      １７．０
（４）グリセリン                                        ９．０
（５）ポリエチレングリコール（平均分子量１０００）      ２．０
（６）抽出物２                                          １．０
（７）香料                                              ０．１
製法：（２）と（３）を混合し、８０℃に加温した後、８０℃に加温した（１）に溶解する。均一に溶解した後、（４）と（５）を加え、攪拌しながら冷却する。４０℃にて（６）と（７）を加え、均一に混合する。
【０１０１】
［実施例１２］入浴剤
（１）香料                                              ０．３（質量％）
（２）抽出物１                                          ３．０
（３）炭酸水素ナトリウム                              ５０．０
（４）硫酸ナトリウム                                  ４６．７
製法：（１）〜（４）を均一に混合する。
【０１０２】
［実施例１３］ヘアーワックス
（１）ステアリン酸                                      ３．０（質量％）
（２）マイクロクリスタリンワックス                      ２．０
（３）セチルアルコール                                  ３．０
（４）高重合メチルポリシロキサン                        ２．０
（５）メチルポリシロキサン                              ５．０
（６）ポリ（オキシエチレン・オキシプロピレン）
メチルポリシロキサン共重合体              １．０
（７）パラオキシ安息香酸メチル                          ０．１
（８）１，３−ブチレングリコール                        ７．５
（９）アルギニン                                        ０．７
（１０）精製水                                      １００とする残部
（１１）抽出物２                                        ２．０
（１２）香料                                            ０．１
製法：（１）〜（６）の油相成分を混合し、７５℃にて加熱溶解後する。一方、（７）〜（１０）の水相成分を７５℃にて加熱溶解し、前記油相成分を加え、ホモミキサーにて乳化する。冷却後４０℃にて（１１）と（１２）の成分を加え、均一に混合する。
【０１０３】
［実施例１４］ヘアートニック
（１）エタノール                                      ５０．０（質量％）
（２）精製水                                        １００とする残部
（３）抽出物１                                          ３．０
（４）香料                                              ０．１
製法：（１）〜（４）の成分を混合、均一化する。
【０１０４】
［実施例１５］錠剤
（１）コーンスターチ                                  ４４．０（質量％）
（２）結晶セルロース                                １００とする残部
（３）カルボキシメチルセルロースカルシウム              ５．０
（４）無水ケイ酸                                        ０．５
（５）ステアリン酸マグネシウム                          ０．５
（６）抽出物１                                          ５．０
製法：（１）〜（６）を均一に混合し、打錠機にて圧縮成型して、１錠２００ｍｇの錠剤を得る。
【０１０５】
［実施例１６］散剤
（１）ケイ酸アルミン酸マグネシウム                    ９５．３（質量％）
（２）カルボキシメチルセルロースカルシウム          １００とする残部
（３）抽出物１                                          ４．０
製法：（１）〜（３）の粉体を混合後、粉砕機にて粉砕し、均一に分散する。
【０１０６】
［実施例１７］キャンデー
（１）白糖                                            ６０．０（質量％）
（２）水飴                                          １００とする残部
（３）抽出物１                                          ５．０
（４）香料                                              適量
製法：（１）と（２）を加熱混合・均一化した後冷却し、７０℃にて成分（３）と（４）を添加し、混合均一化した後成型する。
【０１０７】
［実施例１８］ドリンク剤
（１）アミノエチルスルホン酸                            １０００ｍｇ
（２）硝酸チアミン                                          １０ｍｇ
（３）リン酸リボフラビンナトリウム                            ５ｍｇ
（４）塩酸ピリドキシン                                      １０ｍｇ
（５）無水カフェイン                                        ５０ｍｇ
（６）クエン酸                                            ２５０ｍｇ
（７）Ｄ−ソルビトール液                                      ８ｍｇ
（８）抽出物１                                          １０００ｍｇ
（９）香料                                                  微量
（１０）精製水                                            １００ｍＬとする残部
製法：（１）〜（９）を順次（１０）に添加し、均一化する。
【０１０８】
実施例１〜実施例１４に示した皮膚外用剤は、抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、保湿作用を有する組成物であった。また実施例１５〜実施例１８に示した機能性経口組成物は抗老化作用、抗酸化作用、抗炎症作用、美白作用、保湿作用を有する組成物であった。