(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を含む免疫原性コンジュゲートを製造するための方法であって、
（ａ）精製血清型３多糖を弱酸と反応させて加水分解された血清型３多糖にすること、
（ｂ）加水分解された血清型３多糖を、二価カチオンの存在下で酸化剤と反応させて活性化血清型３多糖にし、ここで酸化剤が過ヨウ素酸であって二価カチオンがＭｇ２＋またはＣａ２＋であること、
（ｃ）活性化血清型３多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、
（ｄ）混ぜ合わせた活性化血清型３多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲートにすること、および
（ｅ）血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドをキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすることを含む方法。
【請求項２】
多糖−タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を製造するための方法であって、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型由来の莢膜多糖を含有し、莢膜多糖が血清型３および少なくとも１種類の追加血清型から調製され、各莢膜多糖が別々に担体タンパク質にコンジュゲートしており、
（ａ）精製血清型３多糖を弱酸と反応させて加水分解された血清型３多糖にすること、
（ｂ）加水分解された血清型３多糖を、二価カチオンの存在下で酸化剤と反応させて活性化血清型３多糖にし、ここで酸化剤が過ヨウ素酸であって二価カチオンがＭｇ２＋またはＣａ２＋であること、
（ｃ）活性化血清型３多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、
（ｄ）混ぜ合わせた活性化血清型３多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させて血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲートにすること、
（ｅ）血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドをキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすること、および
（ｆ）ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を含む免疫原性コンジュゲートおよび追加ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型多糖を含む少なくとも１種類の免疫原性コンジュゲートを混ぜ合わせて多価免疫原性組成物にすることを含む方法。
【請求項３】
莢膜多糖が血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
担体タンパク質と混ぜ合わせる前に、活性化血清型３多糖を精製することをさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
還元剤と反応させる前に、混ぜ合わせた活性化血清型３多糖および担体タンパク質を共凍結乾燥することをさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
免疫原性コンジュゲートを精製することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
弱酸が酢酸である請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
担体タンパク質がＣＲＭ１９７である請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
還元剤がシアノ水素化ホウ素ナトリウムである請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
未反応アルデヒドをキャッピングすることが、血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲートを水素化ホウ素ナトリウムと反応させることを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を含む免疫原性コンジュゲートを製造するための方法であって、
（ａ）精製血清型３多糖を酢酸と反応させて加水分解された血清型３多糖にすること、
（ｂ）加水分解された血清型３多糖を、ＭｇＣｌ２の存在下で過ヨウ素酸と反応させて活性化血清型３多糖にすること、
（ｃ）活性化血清型３多糖を精製すること、
（ｄ）活性化血清型３多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、
（ｅ）混ぜ合わせた活性化血清型３多糖および担体タンパク質を共凍結乾燥すること、
（ｆ）共凍結乾燥した活性化血清型３多糖および担体タンパク質をシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させて血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲートにすること、および
（ｇ）血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドを水素化ホウ素ナトリウムでキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすることを含む方法。
【請求項１２】
多糖−タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を製造するための方法であって、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型由来の莢膜多糖を含有し、莢膜多糖が血清型３および少なくとも１種類の追加血清型から調製され、各莢膜多糖が別々に担体タンパク質にコンジュゲートしており、
（ａ）精製血清型３多糖を酢酸と反応させて加水分解された血清型３多糖にすること、
（ｂ）加水分解された血清型３多糖を、ＭｇＣｌ２の存在下で過ヨウ素酸と反応させて活性化血清型３多糖にすること、
（ｃ）活性化血清型３多糖を精製すること、
（ｄ）活性化血清型３多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、
（ｅ）混ぜ合わせた活性化血清型３多糖および担体タンパク質を共凍結乾燥すること、
（ｆ）共凍結乾燥した活性化血清型３多糖および担体タンパク質をシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させて血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲートにすること、
（ｇ）血清型３多糖：担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドを水素化ホウ素ナトリウムでキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすること、および
（ｉ）ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を含む免疫原性コンジュゲートおよび追加ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型多糖を含む少なくとも１種類の免疫原性コンジュゲートを混ぜ合わせて多価免疫原性組成物にすることを含む方法。
【請求項１３】
莢膜多糖が血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
免疫原性コンジュゲートを精製することをさらに含む請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
担体タンパク質がＣＲＭ１９７である請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１６】
活性化されたストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖を製造するための方法であって、
（ａ）精製血清型３多糖を弱酸と反応させて加水分解された血清型３多糖にすること、および
（ｂ）加水分解された血清型３多糖を、二価カチオンの存在下で酸化剤と反応させて活性化血清型３多糖にすることであって、ここで酸化剤が過ヨウ素酸であって二価カチオンがＭｇ２＋またはＣａ２＋であること、
を含む方法。
【請求項１７】
酸化の後に、活性化血清型３多糖を精製することをさらに含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
弱酸が酢酸である請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
生理学的に許容できるビヒクルと一緒に１３種類の異なる多糖−タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物を調製する方法であって、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしている異なる莢膜多糖を含有し、莢膜多糖がストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製され、
血清型３多糖−タンパク質コンジュゲートが請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法に従って製造され、
各グリココンジュゲートは精製された後に、混ぜ合わされ、免疫原性組成物が製剤化される、方法。
【請求項２０】
前記多価免疫原性組成物が、さらにアジュバントを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
アジュバントがアルミニウムベースのアジュバントである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
アジュバントが、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、医学の分野、具体的には、微生物学、免疫学、ワクチンおよび細菌性病原体による感染の免疫化による予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、世界中で乳児および幼児における髄膜炎、肺炎、および重度の侵襲性疾患の主な原因である。多価肺炎球菌多糖ワクチンは、長年にわたって認可され、高齢者および高リスク患者において肺炎球菌疾患を予防するのに有益であることを証明してきた。しかしながら、乳児および幼児は、大部分の肺炎球菌多糖にほとんど反応しない。７価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（７ｖＰｎＣ、Ｐｒｅｖｎａｒ（登録商標））は、その種の中で乳児および幼児において侵襲性疾患および中耳炎に対して免疫原性および有効性が極めて高いことが立証された最初のワクチンであった。このワクチンは、現在、世界中の多くの国で承認されている。Ｐｒｅｖｎａｒは、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来の莢膜多糖を含有し、それぞれは、ＣＲＭ１９７と呼ばれる担体タンパク質にコンジュゲートしている。Ｐｒｅｖｎａｒは、それぞれ米国、欧州、および世界の他の地域において侵襲性肺炎球菌疾患（ＩＰＤ）の約８０〜９０％、６０〜８０％、および４０〜８０％をカバーしている［１、２］。Ｐｒｅｖｎａｒの導入後何年もの間に集められたサーベイランスデータから、予想通り、米国の幼児における侵襲性肺炎球菌疾患の減少が明示されている（図１）［３、４］。
【０００３】
Ｐｒｅｖｎａｒの導入前に米国の幼児において行われたＩＰＤのサーベイランスは、血清群６および１９に起因する疾患のかなりの部分が、６Ａ（約３分の１）および１９Ａ（約４分の１）血清型に起因していることを立証した［５、６］。Ｐｒｅｖｎａｒの認可の後に米国において行われた肺炎球菌侵襲性疾患サーベイランスは、疾患の大きな負担が、依然として血清型６Ａおよび１９Ａに帰せられることを示唆している（図１）［３］。さらに、これら２種類の血清型は、血清型１、３、５、および７Ｆを合わせたよりも侵襲性疾患の症例数が多い（２歳未満の小児１０万人当たりの症例数８．２対３．３）。さらに、血清型６Ａおよび１９Ａは、高率の抗生物質耐性を伴う（図２）［７、８、９］。より多くの小児を免疫化すれば、血清群交差防御が、血清型６Ａおよび１９Ａ疾患の減少をもたらすであろうが、減少には限界があり、これらの血清型に起因する疾患のかなりの負担が残るであろうことを示唆する証拠がある（以下を参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hausdorff WP, Bryant J, Paradiso PR, Siber GR.  Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.  Clin Infect Dis 2000; 30:100-21.
【非特許文献２】Hausdorff WP, Bryant J, Kloek C, Paradiso PR, Siber GR.  The contribution of specific pneumococcal serogroups to different disease manifestations: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.  Clin Infect Dis 2000; 30:122-40.
【非特許文献３】Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al.  Decline in invasive pneumococcal disease after the introduction of protein-polysaccharide conjugate vaccine.  New Engl J Med 2003; 348(18):1737-46.
【非特許文献４】Black S, Shinefield H, Hansen J, et al.  Postlicensure evaluation of the effectiveness of seven valent pneumococcal conjugate vaccine.  Pediatr Infect Dis J 2001; 20;1105-7.
【非特許文献５】Robinson KA, Baughman W, Rothrock G, et al.  Epidemiology of invasive Streptococcus pneumoniae infections in the United States, 1995-1998:  Opportunities for prevention in the conjugate vaccine era.  JAMA 2001; 285:1729-35.
【非特許文献６】Butler J, Breiman R, Lipman H, et al.  Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae infections among preschool children in the United States, 1978-1994.  J Infect Dis 1995; 171:885-9.
【非特許文献７】Whitney CG, Farley MM, Hadler J, et al.  Increasing prevalence of multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae in the United States.  N Engl J Med 2000; 343:1917-24.
【非特許文献８】Hofmann J, Cetron MS, Farley MM, et al.  The prevalence of drug-resistant Streptococcus pneumoniae in Atlanta.  N Engl J Med 1995; 333:481-6.
【非特許文献９】Joloba ML, Windau A, Bajaksouzian S, Appelbaum PC Hausdorff WP, Jacobs MR.  Pneumococcal conjugate vaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates and the antimicrobial susceptibility of such isolates in children with otitis media.  Clin Infect Dis 2001; 33:1489-94.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血清型１、３、５、６Ａ、７Ｆ、および１９Ａに起因する侵襲性肺炎球菌疾患の相対的な負担および重要性を考えて、Ｐｒｅｖｎａｒ製剤にこれらの血清型を加えると、侵襲性疾患についての適用範囲が、米国および欧州においては９０％超、アジアおよびラテンアメリカにおいては７０％〜８０％まで高まるであろう。このワクチンは、Ｐｒｅｖｎａｒの適用範囲を超えて適用範囲を著しく広げ、血清型交差防御の限界に左右されない６Ａおよび１９Ａについての適用範囲を提供するであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、一般的に、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に、１３種類の異なる多糖−タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型由来の莢膜多糖を含有する多価免疫原性組成物を提供する。所望により、アルミニウムベースのアジュバントなどのアジュバントが製剤中に包含される。より具体的には、本発明は、７ｖＰｎＣワクチン中の７種類の血清型（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆ）に加えて６種類の追加血清型（１、３、５、６Ａ、７Ｆおよび１９Ａ）を含む１３価肺炎球菌コンジュゲート（１３ｖＰｎＣ）組成物を提供する。
【０００７】
本発明は、莢膜多糖がストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来であり、担体タンパク質がＣＲＭ１９７である、多価免疫原性組成物も提供する。
【０００８】
本発明は、莢膜多糖がストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆ由来であり、担体タンパク質がＣＲＭ１９７であり、アジュバントがリン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムなどのアルミニウムベースのアジュバントである、多価免疫原性組成物をさらに提供する。本発明の特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【０００９】
本発明は、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に多糖−タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型由来の莢膜多糖を含み、莢膜多糖が、血清型３および少なくとも１種類の追加血清型から調製される多価免疫原性組成物も提供する。
【００１０】
この多価免疫原性組成物の一実施形態において、追加血清型は、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆからなる群から選択される。別の実施形態において、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。さらに別の実施形態において、組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムから選択されるアルミニウムベースのアジュバントなどのアジュバントを含む。特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【００１１】
本発明は、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に多糖−タンパク質コンジュゲートを含み、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしているストレプトコッカス・ニューモニアエの異なる血清型由来の莢膜多糖を含み、莢膜多糖が、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆおよび少なくとも１種類の追加血清型から調製される多価免疫原性組成物も提供する。
【００１２】
この多価免疫原性組成物の一実施形態において、追加血清型は、血清型１、３、５、６Ａ、７Ｆ、および１９Ａからなる群から選択される。別の実施形態において、担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７である。さらに別の実施形態において、組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムから選択されるアルミニウムベースのアジュバントなどのアジュバントを含む。特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。
【００１３】
本発明は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖コンジュゲートに対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫学的に有効な量の前記免疫原性組成物のいずれかをヒトに投与することを含む方法も提供する。
【００１４】
本発明は、投与されるどの免疫原性組成物も、４μｇの６Ｂを除いて、各糖類２μｇ、ＣＲＭ１９７担体タンパク質約２９μｇ、元素アルミニウム（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）アジュバント０．１２５ｍｇ、ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように製剤化される単一０．５ｍＬ投与量であることをさらに規定する。
【００１５】
担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３（Ｐｎ  ３）多糖を含む免疫原性コンジュゲートを製造するための方法も提供される。一実施形態において、この方法は、（ｉ）精製Ｐｎ３多糖を弱酸と反応させて加水分解されたＰｎ３多糖にすること、（ｉｉ）加水分解されたＰｎ３多糖を、２価カチオンの存在下で酸化剤と反応させて活性化Ｐｎ３多糖にすること、（ｉｉｉ）活性化Ｐｎ３多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、（ｉｖ）混ぜ合わせた活性化Ｐｎ３多糖および担体タンパク質を還元剤と反応させてＰｎ３多糖：担体タンパク質コンジュゲートにすること、および（ｖ）Ｐｎ３多糖：担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドをキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエＰｎ３多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすることを含む。
【００１６】
他の実施形態において、この方法は、（ｉ）精製Ｐｎ３多糖を酢酸と反応させて加水分解されたＰｎ３多糖にすること、（ｉｉ）加水分解されたＰｎ３多糖を、ＭｇＣｌ２の存在下で過ヨウ素酸と反応させて活性化Ｐｎ３多糖にすること、（ｉｉｉ）活性化Ｐｎ３多糖を精製すること、（ｉｖ）活性化Ｐｎ３多糖を担体タンパク質と混ぜ合わせること、（ｖ）混ぜ合わせた活性化Ｐｎ３多糖および担体タンパク質を共凍結乾燥すること、（ｖｉ）共凍結乾燥した活性化Ｐｎ３多糖および担体タンパク質をシアノ水素化ホウ素ナトリウムと反応させてＰｎ３多糖：担体タンパク質コンジュゲートにすること、および（ｖｉｉ）Ｐｎ３多糖：担体タンパク質コンジュゲート中の未反応アルデヒドを水素化ホウ素ナトリウムでキャッピングして、担体タンパク質に共有結合しているストレプトコッカス・ニューモニアエＰｎ３多糖を含む免疫原性コンジュゲートにすることを含む。
【００１７】
活性化されたストレプトコッカス・ニューモニアエＰｎ３多糖を製造するための方法も提供される。この方法は、（ｉ）精製Ｐｎ３多糖を弱酸と反応させて加水分解されたＰｎ３多糖にすること、および（ｉｉ）加水分解されたＰｎ３多糖を、２価カチオンの存在下で酸化剤と反応させて活性化Ｐｎ３多糖にすることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ベースライン（１９９８年／１９９９年）から２００１年までの２歳未満の米国の小児における血清型別のＩＰＤ率の変化を示す図である。
【図２】５歳未満の小児におけるペニシリン（ＰＣＮ）に対する耐性を持つ肺炎球菌分離株の分布を示す図である（１９９８年）。
【図３】Ｄ１１８−Ｐ１６Ｐｒｅｖｎａｒ試験からの３回目投与後ＯＰＡ結果の逆累積分布曲線（ＲＣＤＣ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｐｒｅｖｎａｒ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、２３Ｆの包含
１９９５〜１９９８年の間のＩＰＤサーベイランスからのデータは、Ｐｒｅｖｎａｒ中の７種類の血清型が、２歳未満の小児におけるＩＰＤの約８２％の原因になっていると推定した［５］。有効性試験の場所である北カリフォルニアにおいて、Ｐｒｅｖｎａｒ血清型は、乳児および幼児におけるＩＰＤの全症例の９０％を占めていた［１０］。２０００年のＰｒｅｖｎａｒワクチンの導入以来、ワクチン血清型に起因する疾患の減少により、全ＩＰＤ率が著しく減少している［３、４］。したがって、現時点において、次世代の肺炎球菌コンジュゲートワクチンからＰｒｅｖｎａｒ血清型のいずれかを除去するのではなく、むしろ、より広い適用範囲を得るために血清型を追加することを正当化することはできない。
【００２０】
血清型１、３、５および７Ｆの包含
米国において、５歳未満の小児における血清型１により引き起こされるＩＰＤ率は、タイプ３および７Ｆのそれぞれについてとほぼ同じで２％未満である［１、６］。血清型１および５は、侵襲性肺炎球菌疾患の危険性の高い米国住民において高率のＩＰＤを占めている。具体的には、血清型１は、２歳未満のアラスカ先住民の小児においてＩＰＤの３．５％を、２〜４歳の小児において１８％を引き起こす［１１］。血清型１と血清型５は共に、世界の他の部分および先進国における土着住民において疾患をかなり引き起こす［１２、１３、１４］。
【００２１】
血清型１は、他の肺炎球菌血清型と比べて、より重度の疾患を伴うこともある［１５］。この知見は、米国と欧州の間の症例識別率の差、およびそれに関連した医療行為における差に基づいている。全体として、ＩＰＤの発生率は米国よりも欧州において低い。しかしながら、欧州において血清型１により引き起こされるＩＰＤの割合は、米国におけるよりも不釣り合いに高い（それぞれ６〜７％対１〜２％）。欧州では、血液培養物を、主に入院中の小児から入手する。米国では、３９℃以上の発熱および白血球数の上昇を示す小児から外来患者として血液培養物を入手することが日常の医療行為である。医療行為の差を考えると、米国において血清型１により引き起こされる疾患の低い割合は、より軽度の疾患を引き起こす高率の他の血清型により下げられているが、欧州における高い割合は、より重篤な疾患を反映していることが想定される。さらに、複雑性肺炎の小児に関する血清疫学研究は、血清型１が不釣り合いに示されることを立証している［１６、１７、１８］。このことは、血清型１の包含が、重度の肺炎球菌疾患の総計を低減するばかりでなく、侵襲性肺炎球菌疾患の全体的な低減に寄与することを示唆している。
【００２２】
血清型３および７Ｆの追加は、ＩＰＤに対する適用範囲を、世界の大部分の地域で約３％〜７％、アジアでは約９％高めるであろう。すなわち、１１価ワクチンは、アジアではＩＰＤの５０％を、すべての他の地域では約８０％をカバーするであろう［１、２］。これらの血清型は、中耳炎適用範囲に関しても重要である［１９］。中耳炎を引き起こす肺炎球菌血清型に関する多国研究において、Ｈａｕｓｄｏｒｆｆ他は、血清型３が、全体で８番目に最も一般的な中耳液分離株であることを見い出した［２０］。血清型３は、中耳炎に関係する肺炎球菌血清型の最大で８．７％を占めていた。したがって、中耳炎、ならびにＩＰＤにおけるタイプ３および７Ｆの重要性は、肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおけるそれらの包含を正当化している。
【００２３】
しかしながら、血清型３多糖に関して著しい免疫原性を示す多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンを製造する試みは成功していない。例えば、１１価肺炎球菌タンパク質Ｄコンジュゲートワクチン（１１−Ｐｎ−ＰＤ）の免疫原性および安全性に関する研究において、ワクチンの３回投与と、続く、同じワクチンか肺炎球菌多糖ワクチンのどちらかのブースター投与を受けた乳児において、血清型３についてのプライミング効果は観察されなかった（Ｎｕｒｋｋａ他（２００４）Ｐｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．Ｊ．、２３：１００８〜１０１４）。別の研究において、複数回の１１−Ｐｎ−ＰＤの投与を受けた乳児からのオプソニン食作用（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）アッセイ（ＯＰＡ）の結果は、他の試験血清型に匹敵するレベルにおいて血清型３についての抗体応答を示さなかった（Ｇａｔｃｈａｌｉａｎ他、１７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒ．Ｓｏｃ．Ｐａｅｄ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（ＥＳＰＩＤ）、Ｐｏｓｔｅｒ  Ｎｏ．４、ＰＩＡ  Ｐｏｓｔｅｒ  Ｓｅｓｓｉｏｎ  １、Ｉｓｔａｎｂｕｌ  Ｔｕｒｋｅｙ、Ｍａｒ．２７、２００１）。急性中耳炎の予防における１１−Ｐｎ−ＰＤの有効性を評価したさらに別の研究において、ワクチンは、血清型３により引き起こされるエピソードに対する防御を提供しなかった（Ｐｒｙｍｕｌａ他（２００６）Ｌａｎｃｅｔ、３６７：７４０〜７４８）。したがって、血清型３由来の莢膜多糖を含み、血清型３多糖に対する免疫原性応答を誘発することができる肺炎球菌コンジュゲートワクチンは、現状の技術を上回る著しい改善を提供する。
【００２４】
血清型６Ａおよび１９Ａの包含
ａ．血清型６Ａおよび１９Ａの疫学
文献におけるサーベイランスデータは、血清型６Ａおよび１９Ａが、血清型１、３、５、および７Ｆを合わせたものに比べて、２歳未満の米国の小児においてより多くの侵襲性肺炎球菌疾患を占めることを示唆している（図１）［１、５］。さらに、これらの血清型は、抗生物質耐性を一般的に伴い（図２）、中耳炎において重要な役割を果たす［６、１９、２０］。６Ａおよび９Ａに起因する疾患を予防する現在のＰｒｅｖｎａｒワクチンの能力は不明である。１３ｖＰｎＣワクチンにおける６Ａおよび１９Ａ成分の包含についての理論的根拠を以下で論議する。
【００２５】
ｂ．６Ｂおよび１９Ｆ多糖により誘導される６Ａおよび１９Ａに対する応答
認可されたコンジュゲートされていない肺炎球菌多糖ワクチン（少なくとも２歳のヒトで使用するための）は、６Ａまたは６Ｂ莢膜多糖を含有し、両方は含有していなかった［２１］。２３価肺炎球菌多糖ワクチンの製剤化時に作成された免疫原性データは、６Ｂ１価ワクチンが、６Ａと６Ｂ莢膜の双方に対する抗体を誘導したことを立証した。遊離多糖および肺炎球菌コンジュゲートワクチンについて様々な集団におけるＩｇＧおよびオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）応答を評価するいくつかの試験からのデータは、６Ａに対するＩｇＧ応答が、６Ｂ抗原により誘導されるが、応答は一般的に低く、６Ａ生物体によるＯＰＡ活性は、６Ｂ生物体とは異なっていることを示唆した［２２、２３、２４、２５］。さらに、高い６Ｂ抗体で応答する被験者は、６Ａに対する活性をほとんど有していないことがある。
【００２６】
高度の類似性が存在する６Ａおよび６Ｂ莢膜多糖の化学的組成とは対照的に、１９Ａおよび１９Ｆ莢膜は、１９Ａ多糖中の２種類の追加側鎖の存在によりまったく異なっている。驚くほどのことではないが、１９Ｆ多糖ワクチンで免疫化されたヒト志願者において測定された免疫応答は、１９Ｆに対する応答が、被験者の８０％において誘導されるが、１９Ａに対する応答を有するのは被験者の２０％に過ぎないことを示した［２６］。１９Ｆ多糖による免疫化の後の血清型１９Ａに対する低レベルの交差反応性のＩｇＧおよびＯＰＡ応答も、コンジュゲートワクチンによる試験において同様に立証されている［２４、２６］。
【００２７】
６Ａおよび１９Ａに対する交差反応性ＯＰＡ応答に関する内部データは、米国の乳児において行われた７ｖＰｎＣブリッジング試験（Ｄ１１８−Ｐ１６）から作成されている（図３）。これらの研究は、他の研究者の知見と一致しており、交差反応性の、低レベルではあるが、６Ｂ多糖による免疫化の後の６Ａ多糖に対する機能的抗体、および１９Ｆによる免疫化の１９Ａに対する極めてわずかの機能的抗体の誘導を立証している。
【００２８】
動物モデルにおける６Ａおよび１９Ａに対する６Ｂおよび１９Ｆ免疫化の影響
多糖免疫化による交差防御についての可能性を評価するために動物モデルが使用されてきた。Ｇｉｅｂｉｎｋ他により開発された中耳炎モデルにおいて、チンチラは、４価多糖外膜タンパク質（ＯＭＰ）コンジュゲートワクチン（６Ｂ、１４、１９Ｆ、２３Ｆ糖類を含有する）またはプラセボで免疫化された［２７］。この試験において、６Ａについて一部の交差防御が見られたが、これは、統計的有意性に達することはなく、防御のレベルは、中耳炎対する６Ｂによるよりも低かった。この同じモデルにおいて、１９Ｆ中耳炎に対する１００％の防御が存在したが、１９Ａ中耳炎に対する防御は１７％に過ぎなかった。
【００２９】
Ｓａｅｌａｎｄ他は、８価肺炎球菌破傷風コンジュゲートワクチン（６Ｂおよび１９Ｆを含有する）で免疫化された乳児からの血清を使用し、肺感染モデルにおいて、６Ａ生物体による鼻腔内チャレンジの前にマウスを受動的に免疫化した［２８］。５９の血清サンプルのうち、５３％が、６Ｂによる菌血症に対してマウスを防御し、３７％が、６Ａに対して防御した。１１価肺炎球菌コンジュゲートワクチン（破傷風トキソイドにコンジュゲートしている１９Ｆを含有する）の４回投与で免疫化された乳児からの血清で受動的に免疫化されたマウスに、同じモデルにおいて、１９Ａ生物体による鼻腔内チャレンジを与えた［２９］。受動的に免疫化され、次いで、チャレンジされた１００匹のマウスのうち、６０匹のマウスは、肺組織で検出される１９Ａ生物体を有していなかったが、生理食塩水プラセボを与えられたすべてのマウスでは生物体が識別された。しかしながら、受動免疫化は、このモデルにおいて１９Ｆ生物体によるチャレンジに対して防御しなかった。したがって、血清群１９についてのモデルの妥当性は疑わしい。一般に、これらのモデルは、６Ａ生物体に対する６Ｂ免疫化の一部の生物学的影響の証拠を提供するが、異種血清型に対する効果は、同種血清型について観測されたものほど大きくなかった。１９Ａ生物体に対する１９Ｆ免疫化の影響は、これらのモデルからは十分に理解されない。
【００３０】
有効性／有用性試験における６Ａおよび１９Ａ疾患に対する６Ｂおよび１９Ｆ多糖コンジュゲート免疫化の影響
７ｖＰｎＣおよび９ｖＰｎＣ（７ｖＰｎＣに血清型１および５を加える）有効性試験における６Ｂ、６Ａ、１９Ｆ、および１９Ａ血清型に起因する疾患の症例数を表１に示す［３０、１０、３１］。侵襲性疾患症例の数は、少な過ぎて、血清型６Ａおよび１９Ａについていかなる結論も出すことができない。しかしながら、フィンランド中耳炎試験は、多数の肺炎球菌分離株をもたらした［３２］。パープロトコル解析において、７ｖＰｎＣは、血清型６Ｂに起因する中耳炎に対して８４％（９５％ＣＩ  ６２％、９３％）有効であり、血清型６Ａに起因する中耳炎に対して５７％（９５％ＣＩ  ２４％、７６％）有効であった（表１）。対照的に、７ｖＰｎＣによる血清型特異的有効性は、１９Ｆか１９Ａのどちらかに起因する中耳炎については立証されなかった。
【００３１】
【表１】
0005523836.tif 000002
【００３２】
市販後ＩＰＤサーベイランスデータも、Ｐｒｅｖｎａｒの有用性を評価するためにＣｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌにより行われた症例対照試験から入手可能である［３３］。生後３〜２３ヶ月の小児で発生した侵襲性肺炎球菌疾患の症例は、サーベイランス研究室において識別され、年齢および郵便番号により３つの対照症例に対応付けられた。同意を得た後に、病歴および免疫化歴（被験者は、Ｐｒｅｖｎａｒの少なくとも１回の投与を受けていた場合に免疫化されていると見なされた）は、症例および対照について、両親および医療提供者から入手された。予備結果は、２００３年のＩＣＡＡＣミーティングで提示された。６Ｂ、１９Ｆ、１９Ａ、および６Ａ疾患についての知見の要約を表２に示す。これらのデータは、Ｐｒｅｖｎａｒが、血清型６Ｂ疾患よりもいくらか低いレベルであるが、６Ａに起因する疾患を予防できることを示している。これらのデータは、１９Ａに起因する侵襲性疾患についての交差防御が制限されていることも示している。
【００３３】
【表２】
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【００３４】
Ｐｒｅｖｎａｒの使用に関する公表された分析［３］は、血清型６Ｂおよび１９Ｆが、２歳未満の小児の中で血清型６Ａおよび１９Ａにより引き起こされるＩＰＤの中等度減少をもたらすことも示した（［３］の表１）。血清型６Ａ、９Ａ、９Ｌ、９Ｎ、１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｆ、１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、２３Ａおよび２３Ｂ（「すべてのワクチン関連血清型」）により引き起こされる非免疫化成人の中の疾患率は、いくらか軽減された（［３］の表２）。これらのデータは、２歳未満の小児におけるＰｒｅｖｎａｒの使用からの集団免疫は、血清型６Ａおよび１９Ａについて適度であることを立証し、本発明の１３ｖＰｎＣワクチンにおける血清型６Ａおよび１９Ａの包含の根拠を提供する。
【００３５】
６Ａおよび１９Ａの追加についての結論
７ｖＰｎＣワクチンについて図１および表２に述べられている市販後サーベイランスデータおよび症例対照試験結果は、上記に記載されている動物モデルにおける免疫応答および免疫性能に関する他の情報と一致して、６Ａ疾患に対する一部の交差防御があっても、６Ｂ疾患に対するよりも少ない程度であることを示唆している。さらに、１９Ａに対する防御が制限されているように見える。したがって、血清型６Ａおよび１９Ａを含有する１３ｖＰｎＣワクチンは、血清型６Ｂおよび１９Ｆによる血清群交差防御の限界に左右されない適用範囲を提供する。
【００３６】
したがって、本発明は、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に、１３種類の異なる多糖−タンパク質コンジュゲートを含む多価免疫原性組成物であって、コンジュゲートのそれぞれが、担体タンパク質にコンジュゲートしている異なる莢膜多糖を含有し、莢膜多糖が、ストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製される組成物を提供する。１つのそのような担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７と呼ばれるジフテリアトキソイドである。免疫原性組成物は、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、および水酸化アルミニウムなどのアルミニウムベースのアジュバントなどのアジュバントをさらに含むことがある。
【００３７】
莢膜多糖は、当業者に知られている標準的技法により調製される。本発明において、莢膜多糖は、ストレプトコッカス・ニューモニアエの血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆから調製される。これらの肺炎球菌コンジュゲートは、別々のプロセスにより調製され、単回投与製剤に製剤化される。例えば、一実施形態において、各肺炎球菌多糖血清型は、大豆ベースの培地中で成育される。次いで、個々の多糖は、遠心分離、沈殿、限外濾過、およびカラムクロマトグラフィーにより精製される。精製した多糖は、担体タンパク質と反応することができる糖類を製造するために化学的に活性化される。
【００３８】
活性化されたらすぐに、各莢膜多糖は、別々に担体タンパク質にコンジュゲートされ、グリココンジュゲートを形成する。一実施形態において、各莢膜多糖は、同じ担体タンパク質にコンジュゲートされる。この実施形態において、コンジュゲーションは、還元アミノ化により行われる。
【００３９】
多糖の化学的活性化と、続く担体タンパク質とのコンジュゲーションは、従来の手段により行われる。例えば、米国特許第４，６７３，５７４号および第４，９０２，５０６号を参照されたい［３４、３５］。
【００４０】
担体タンパク質は、無毒性かつ非反応原性（ｎｏｎ−ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）であり、十分な量および純度で得られるタンパク質であることが好ましい。担体タンパク質は、標準的なコンジュゲーション手順に適していなければならない。本発明の特定の実施形態において、ＣＲＭ１９７が担体タンパク質として使用される。
【００４１】
ＣＲＭ１９７（Ｗｙｅｔｈ、Ｓａｎｆｏｒｄ、ＮＣ）は、カザミノ酸および酵母エキスベースの培地中で成育されたコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）Ｃ７株（β１９７）の培養物から単離されるジフテリア毒素の無毒性変異体（すなわち、トキソイド）である。ＣＲＭ１９７は、限外濾過、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製される。代替方法として、ＣＲＭ１９７は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５，６１４，３８２号に従って組換え技術により調製される。他のジフテリアトキソイドも、担体タンパク質として使用するのに適している。
【００４２】
他の適当な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１［３８］に記載されているような）、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｉｌ）ＬＴ、エシェリヒア・コリＳＴ、およびシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａなどの不活化細菌毒素を包含する。外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）などの細菌外膜タンパク質、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌アドヘシンタンパク質（ＰｓａＡ）、Ａ群もしくはＢ群ストレプトコッカス由来のＣ５ａペプチダーゼ、またはヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄも使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）などの他のタンパク質も担体タンパク質として使用することができる。
【００４３】
莢膜多糖の担体タンパク質とのコンジュゲーションの後に、多糖−タンパク質コンジュゲートを、様々な技法により精製する（多糖−タンパク質コンジュゲートの量に関して富化される）。これらの技法は、濃縮／透析濾過操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過を包含する。以下の実施例を参照されたい。
【００４４】
個々のグリココンジュゲートを精製した後に、それらを混ぜ合わせ、ワクチンとして使用することができる本発明の免疫原性組成物を製剤化する。本発明の免疫原性組成物の製剤化は、当技術分野において知られている方法を使用して行うことができる。例えば、１３種類の個々の肺炎球菌コンジュゲートを、生理学的に許容できるビヒクルと一緒に製剤化し、組成物を調製することができる。そのようなビヒクルの例は、水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびブドウ糖溶液を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
特定の実施形態において、免疫原性組成物は、１種類または複数のアジュバントを含むであろう。本明細書で定義されるように、「アジュバント」は、本発明の免疫原性組成物の免疫原性を高める役割を果たす物質である。すなわち、アジュバントは、免疫応答を高めるために与えられることが多く、当業者にはよく知られている。組成物の有用性を高めるのに適しているアジュバントは、
（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのアルミニウム塩（ミョウバン）、
（２）水中油型エマルジョン製剤（ムラミルペプチド（以下で定義される）または細菌細胞壁成分などの他の特異的免疫刺激剤を含むまたは含まない）、例えば、
（ａ）モデル１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された、スクアレン５％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．５％、およびＳｐａｎ８５  ０．５％（所望により、様々な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する（以下を参照、必要とされないにしても））を含有するＭＦ５９（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４８３７号）、
（ｂ）サブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化されるか、より大きい粒径のエマルジョンを作成するためにボルテックスされた、スクアレン１０％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．４％、プルロニック−ブロックドポリマーＬ１２１  ５％、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照）を含有するＳＡＦ、ならびに
（ｃ）スクアレン２％、Ｔｗｅｅｎ８０  ０．２％、ならびに米国特許第４，９１２，０９４号（Ｃｏｒｉｘａ）に記載されている３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１種類または複数の細菌細胞壁成分、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有するＲｉｂｉ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、
（３）Ｑｕｉｌ  ＡまたはＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）などのサポニンアジュバント（米国特許第５，０５７，５４０号）が使用されることがあり、またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）などのそれらから作成される粒子、
（４）Ｃｏｒｉｘａから入手可能であり、米国特許第６，１１３，９１８号に記載されている、細菌性リポ多糖、アミノアルキルグルコサミンホスフェート化合物（ＡＧＰ）、またはそれらの誘導体もしくは類似体などの合成脂質Ａ類似体；１つのそのようなＡＧＰは、５２９（以前は、ＲＣ５２９として知られている）としても知られており、水性形態または安定なエマルジョンとして製剤化される２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］エチル  ２−デオキシ−４−Ｏ−ホスホノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイル］−２−［（Ｒ）−３−テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ］−ｂ−Ｄ−グルコピラノシド、１個または複数のＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（米国特許第６，２０７，６４６号）であり、
（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、共刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２などのサイトカイン、
（６）野生型か、アミノ酸２９位のグルタミン酸が、公開済み国際特許出願第ＷＯ００／１８４３４号（ＷＯ０２／０９８３６８およびＷＯ０２／０９８３６９も参照）に従って別のアミノ酸、好ましくは、ヒスチジンにより置き換えられている突然変異形態のどちらかのコレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはエシェリヒア・コリ易熱性毒素（ＬＴ）、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照）などの細菌性ＡＤＰ−リボシル化毒素の無毒化突然変異体、ならびに
（７）組成物の有効性を高めるための免疫刺激剤として作用する他の物質を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４６】
ムラミルペプチドは、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニン−２−（１'−２'ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などを包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明のワクチン製剤は、全身経路または粘膜経路を介してワクチンを投与することにより、肺炎球菌感染を起こしやすいヒトを予防または治療するために使用することができる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路を介する注射、または口道／消化管、気道もしくは尿生殖路への粘膜投与を包含することができる。一実施形態において、鼻腔内投与が、肺炎または中耳炎を治療するために使用される（肺炎球菌の鼻咽頭保菌をより効果的に予防し、その最初期段階で感染を軽減することができるため）。
【００４８】
各ワクチン投与におけるコンジュゲートの量は、著しい副作用なしに免疫防御応答を誘導する量として選択される。そのような量は、肺炎球菌血清型に応じて変わることがある。一般的に、各投与は、多糖０．１〜１００μｇ、詳細には、０．１〜１０μｇ、より詳細には、１〜５μｇを含むであろう。
【００４９】
特定のワクチンについての成分の最適量は、被験者における適切な免疫応答の観察が関わる標準的研究により確定することができる。最初のワクチン接種の後に、被験者は、十分に間隔をおいた１回または数回のブースター免疫化を受けることができる。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、１３ｖＰｎＣワクチンは、個々にＣＲＭ１９７にコンジュゲートしている血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆの肺炎球菌莢膜多糖の滅菌液体製剤である。各０．５ｍＬ投与量は、４μｇの６Ｂを除き、各糖類２μｇ、ＣＲＭ１９７担体タンパク質約２９μｇ、元素アルミニウム０．１２５ｍｇ（リン酸アルミニウム０．５ｍｇ）アジュバント、ならびに賦形剤としての塩化ナトリウムおよびコハク酸ナトリウム緩衝液を含有するように製剤化される。液体は、保存剤なしで単回投与シリンジに充填される。振盪した後に、ワクチンは、筋肉内投与が可能な状態の均一な白色の懸濁液である。
【００５１】
１３ｖＰｎＣワクチンについての投与量レベルの選択は、市販の７ｖＰｎＣワクチン（Ｐｒｅｖｎａｒ）と同様である。１投与当たり４μｇの６Ｂを除き、すべての血清型について糖類２μｇの投与量レベルが選択された。７ｖＰｎＣワクチンは、血清型４、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆについては２μｇの糖類投与量レベルで、６Ｂについては４μｇの投与量で、ＩＰＤに対する望ましい安全性、免疫原性、および有効性を示した。
【００５２】
免疫スケジュールは、７ｖＰｎＣワクチンに合わせて設計されたスケジュールに従うことができる。例えば、１３ｖＰｎＣワクチンに包含される血清型に起因するストレプトコッカス・ニューモニアエにより引き起こされる侵襲性疾患に対する乳児および幼児のための通常のスケジュールは、生後２、４、６、および１２〜１５ヶ月である。本発明の組成物は、より年長の小児、青少年、および成人での使用にも適している。
【００５３】
本発明の組成物は、他の細菌の感染により引き起こされる中耳炎に対して使用するための１種類または複数の追加抗原をさらに包含することがある。そのような細菌は、型別不能なヘモフィルス・インフルエンザ、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）（以前は、ブランハメラ・カタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）として知られている）およびアロイオコッカス・オティティディス（Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｔｉｔｉｄｉｓ）を包含する。
【００５４】
包含に適している型別不能なヘモフィルス・インフルエンザ抗原の例は、タンパク質「ｅ」としても知られているＰ４タンパク質（米国特許第５，６０１，８３１号；国際特許出願ＷＯ０３／０７８４５３）、ＰＡＬまたはＰＢＯＭＰ−１タンパク質としても知られているＰ６タンパク質（米国特許第５，１１０，９０８号；国際特許出願ＷＯ０１００７９０）、Ｐ５タンパク質（米国再発行特許第３７，７４１号）、ヘモフィルス接着および透過タンパク質（米国特許第６，２４５，３３７号および第６，６７６，９４８号）、ＬＫＰ先端アドヘシンタンパク質（米国特許第５，６４３，７２５号）、およびＮｕｃＡタンパク質（米国特許第６，２２１，３６５号）を包含する。
【００５５】
包含に適しているモラクセラ・カタラーリス抗原の例は、ＵｓｐＡ２タンパク質（米国特許第５，５５２，１４６号、第６，３１０，１９０号）、ＣＤタンパク質（米国特許第５，７２５，８６２号）、Ｅタンパク質（米国特許第５，９４８，４１２号）および７４キロダルトン外膜タンパク質（米国特許第６，８９９，８８５号）を包含する。
【００５６】
包含に適しているアロイオコッカス・オティティディス抗原の例は、国際特許出願ＷＯ０３／０４８３０４に規定されているものを包含する。
【００５７】
本発明の組成物は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の１種類または複数のタンパク質を包含することもある。包含に適しているストレプトコッカス・ニューモニアエタンパク質の例は、国際特許出願ＷＯ０２／０８３８５５に規定されているもの、ならびに国際特許出願ＷＯ０２／０５３７６１に記載されているものを包含する。
【００５８】
本発明の組成物は、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｂ型由来の１種類または複数のタンパク質をさらに包含することがある。包含に適しているナイセリア・メニンジティディスＢ型タンパク質の例は、国際特許出願ＷＯ０３／０６３７６６、ＷＯ２００４／０９４５９６、ＷＯ０１／８５７７２、ＷＯ０２／１６６１２およびＷＯ０１／８７９３９に規定されているものを包含する。
【００５９】
コンジュゲーションのためのストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３多糖の活性化
多糖中の炭水化物の部分酸化を効果的に利用してアルデヒド基を作成し、次いで、担体タンパク質のリシン残基に連結させ、免疫原性コンジュゲート（すなわち、脊椎動物において特異的免疫応答を刺激または誘発するのに有用な、ワクチンなどの組成物）を作成した。多くの応用例について、汎用酸化剤過ヨウ素酸ナトリウムは、担体タンパク質とのコンジュゲーション前に、多糖中の炭水化物の効果的な酸化を提供する。しかしながら、過ヨウ素酸ナトリウムによるＰｎ３多糖の直接酸化は、残ったアルデヒドがわずかしか存在しない分解多糖をもたらすことがある。代替酸化手順は、二価カチオン（例えば、Ｍｇ２＋またはＣａ２＋）存在下の過ヨウ素酸を取り入れ、Ｐｎ３多糖の効果的な酸化を提供する（表３）
【００６０】
【表３】
0005523836.tif 000004
【００６１】
粘度および関連濾過問題を低減するために、Ｐｎ３多糖を、まず、酢酸、クエン酸または炭酸などの弱酸を使用して加水分解／脱重合にかける。「活性化」Ｐｎ３多糖を製造するための部分酸化を、制御された量の酸化剤を使用して加水分解／脱重合の後に行う。特異的糖酸化酵素を包含する、末端ヒドロキシル基を酸化してアルデヒドにする任意の選択的酸化剤を使用することができる（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムもしくはカリウム、または過ヨウ素酸）。上記で議論されているように、好ましい酸化剤は、二価カチオン存在下の過ヨウ素酸である。次いで、活性化Ｐｎ３多糖を所望により精製する（例えば、緩衝生理食塩水に対する透析濾過により）。
【００６２】
活性化Ｐｎ３多糖を、担体タンパク質と混ぜ合わせることができる。担体タンパク質は、結合したＰｎ３多糖の免疫原性を高め、かつ／または診断上、分析上、および／または治療上有益である担体タンパク質に対する抗体を誘発するように選択される。抗原性分子（例えば、多糖）の担体との共有結合は、免疫原性およびＴ細胞依存性の増強を付与する（Ｐｏｚｓｇａｙ他（１９９９）ＰＮＡＳ、９６：５１９４〜９７；Ｌｅｅ他（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１６：１７１１〜１８；Ｄｉｎｔｚｉｓ他（１９７６）ＰＮＡＳ、７３：３６７１〜７５）。本明細書に記載されているように、有用な担体タンパク質は、破傷風トキソイド、百日咳トキソイド、コレラトキソイド（例えば、国際特許出願ＷＯ２００４／０８３２５１に記載されているような）、エシェリヒア・コリＬＴ、エシェリヒア・コリＳＴ、およびシュードモナス・エルギノーサ由来の外毒素Ａなどの不活化細菌毒素を包含する。外膜複合体ｃなどの細菌外膜タンパク質、ポーリン、トランスフェリン結合タンパク質、ニューモリシン、肺炎球菌表面タンパク質Ａ、肺炎球菌アドヘシンタンパク質、Ａ群もしくはＢ群ストレプトコッカス由来のＣ５ａペプチダーゼ、またはヘモフィルス・インフルエンザタンパク質Ｄも使用することができる。オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体などの他のタンパク質も担体タンパク質として使用することができる。好ましい担体タンパク質は、突然変異ジフテリアトキシンＣＲＭ１９７である。担体タンパク質と混ぜ合わせた後に、活性化Ｐｎ３多糖／タンパク質混合物を所望により凍結し（例えば、シェル凍結し）、共凍結乾燥する。
【００６３】
コンジュゲーションを、活性化Ｐｎ３多糖／タンパク質混合物を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤と反応させることにより行う。次いで、未反応アルデヒドを、水素化ホウ素ナトリウム還元を介してキャッピングする。コンジュゲートを精製すると（例えば、リン酸塩緩衝液と、続く、緩衝生理食塩水に対する透析濾過により）、緩衝生理食塩水中のグリココンジュゲートの最終バッチ濃縮物が得られる。
【００６４】
上記の開示は、一般的に、本発明について記載している。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することにより得ることができる。これらの実施例は、例示の目的のみで記載されており、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【００６５】
実施例１
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型１の調製
マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型１をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ、６３０１株から入手した。数世代のシードストックを、株を増やして動物由来成分を除去するために作成した（Ｆ１、Ｆ２、およびＦ３世代）。２つの追加世代のシードストックを製造した。第１の追加世代をＦ３バイアルから製造し、次の世代を、第１の追加世代のバイアルから製造した。シードバイアルを、冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に冷凍保存した（−７０℃未満）。冷凍バイアルの他に、凍結乾燥バイアルをＦ４世代について調製した。セルバンク調製については、すべての培養物を大豆ベースの培地中で成育させた。冷凍する前に、細胞を遠心分離により濃縮し、使用済み培地を除去し、細胞ペレットを、合成グリセロールなどの冷凍保存剤を含有する新鮮な培地中に再懸濁した。
【００６６】
発酵および集菌
ワーキングセルバンクからの培養物を使用し、大豆ベースの培地を含有するシードボトルに接種した。ボトルを、成育要件が満たされるまで、かき混ぜずに３６℃±２℃にてインキュベートした。シードボトルを使用し、大豆ベースの培地を含有するシード発酵槽に接種した。約７．０のｐＨを、滅菌炭酸ナトリウム溶液で維持した。目標光学密度に達した後に、シード発酵槽を使用し、大豆ベースの培地を含有する生産発酵槽に接種した。ｐＨを、滅菌炭酸ナトリウム溶液で維持した。発酵を、成育の停止の後にまたは発酵槽の作業容量に達した場合に終了させた。適切な量の滅菌１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加し、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖を遊離させた。溶解した後に、発酵槽内容物を冷却した。溶解した培養ブロスのｐＨを、酢酸で約ｐＨ６．６に調整した。溶解物を、連続流遠心分離と、続いて、深層濾過および０．４５μｍ精密濾過により清澄化した。
【００６７】
代替プロセスにおいて、約７．０の発酵ｐＨを、３Ｎ  ＮａＯＨで維持した。目標光学密度に達した後に、シード発酵槽を使用し、大豆ベースの培地を含有する生産発酵槽に接種した。ｐＨを、３Ｎ  ＮａＯＨで維持した。発酵を、成育の停止の後にまたは発酵槽の使用容量に達した場合に終了させた。適切な量の滅菌１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加し、ブロス中０．１２％濃度とし、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖を遊離させた。溶解させた後に、発酵槽内容物を、かき混ぜながら、７℃〜１３℃の温度にて８〜２４時間の時間間隔にわたって保持し、完全な細胞溶解および多糖遊離が起こったことを保証した。この保持時間中のかき混ぜは、発酵槽壁およびｐＨプローブ上に溶解物堆積物が沈着するのを防ぎ、それによって、ｐＨプローブ保全を維持した。次に、溶解した培養ブロスのｐＨを、５０％酢酸で約ｐＨ５．０に調整した。１５℃〜２５℃の温度にて１２〜２４時間の時間間隔にわたるかき混ぜない保持時間の後に、これまでは可溶性のタンパク質のかなりの部分が、固体沈殿物として溶液から落下し、溶液中に残っている多糖の損失と分解はほとんどなかった。次いで、沈殿物を含む溶液を、連続流遠心分離と、続く、深層濾過および０．４５μｍ精密濾過により清澄化した。
【００６８】
精製
肺炎球菌多糖の精製は、いくつかの濃縮／透析濾過操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過工程からなっていた。すべての手順は、特別の定めのない限り、室温にて行った。
【００６９】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型１の発酵槽培養物からの清澄化ブロスを、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ（キロダルトン分子量カットオフ）フィルターを使用して濃縮および透析濾過した。透析濾過は、中性ｐＨにてリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行った。透析濾過は、核酸、タンパク質および多糖などの高分子量バイオポリマーから低分子量培地成分を除去した。
【００７０】
多糖を、ストック溶液からのヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＢ）を添加して１％ＨＢ（ｗ／ｖ）の最終濃度とすることにより、濃縮および透析濾過した溶液から沈殿させた。多糖／ＨＢ沈殿物をデプスフィルター上に捕捉し、濾液を廃棄した。多糖沈殿物を、沈殿物を含有するデプスフィルターに通して塩化ナトリウム溶液を再循環することにより再可溶化および溶出した。次いで、フィルターを、追加の塩化ナトリウム溶液ですすいだ。
【００７１】
ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を、ストックＮａＩ溶液ストック溶液から多糖溶液に添加して０．５％の最終濃度とし、ＨＢを沈殿させた。沈殿物を深層濾過により除去した。濾液は、目標多糖を含有している。沈殿容器およびフィルターをＮａＣｌ／ＮａＩ溶液ですすぎ、すすぎ液を、部分的に精製した多糖溶液と合わせた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖を、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【００７２】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて濃縮し、塩化ナトリウム溶液で透析濾過した。
【００７３】
部分的に精製した多糖溶液を、活性炭を含浸させたデプスフィルターに通して濾過することによりさらに精製した。濾過の後に、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖溶液と合わせ、次いで、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【００７４】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて濃縮し、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で調整して０．０２５Ｍリン酸ナトリウムの最終濃度とした。ｐＨをチェックし、７．０±０．２に調整した。
【００７５】
セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して適切な伝導率（１５μＳ未満）とした。次いで、多糖溶液を、カラム上にロードした。これらの条件下で、樹脂および多糖に結合している不純物を、カラムからのフロースルー中に回収した。多糖溶液を、カラムの前後に位置する０．２μｍ直列フィルターに通して濾過した。
【００７６】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮した。次いで、濃縮物を、注射用水（ＷＦＩ）で透析濾過した。
【００７７】
透析濾過した多糖溶液を、０．２μｍ膜フィルターに通してポリプロピレンボトル中に濾過した。サンプルを、遊離試験のために取り出し、精製多糖を−２５℃±５℃にて冷凍保存した。
【００７８】
キャラクタリゼーション
１Ｈ−ＮＭＲデータは、多糖分子のプロトンに割り当てられたシグナルの帰属により化学構造と一致した。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、多糖中のＯ−アセチル官能基を定量化するための一連のよく分離したシグナル（メチル基由来のプロトン）を示した。
【００７９】
１価多糖の同一性は、特異抗血清を使用する向流免疫電気泳動により確認された。
【００８０】
屈折率検出器および多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器と連結している高速ゲル濾過クロマトグラフィーを、サンプル濃度と連動して使用し、分子量を計算した。
【００８１】
サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用し、多糖の相対的分子サイズ分布をプロファイルした。
【００８２】
実施例２
血清型１肺炎球菌多糖−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
精製多糖の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、０．２Ｍ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．０を、５０℃にて３時間にわたる部分的脱アセチル化（加水分解）のために添加した。反応物を２０℃まで冷却し、中和を、０．２Ｍ酢酸により行った。過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を、２〜８℃におけるインキュベーションにより行い、混合物を１５〜２１時間にわたって撹拌した。
【００８３】
活性化反応混合物を、３０Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用して０．９％ＮａＣｌで１０倍に濃縮および透析濾過した。保持液を、０．２μｍ濾過した。活性化糖類を、１００ｍＬガラス凍結乾燥ボトルに充填し、−７５℃にてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【００８４】
「シェル凍結」は、凍結乾燥（フリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ））用のサンプルを調製するための方法である。フラスコを、アルコールまたはその他の適切な流体を含有する冷蔵浴中でモーター駆動のローラーにより自動的に回転させる。生成物の薄い被膜がフラスコの内面「シェル」の周りに均等に凍結され、各フリーズドライ実行中に多量の材料を安全に処理すること可能である。これらの自動冷蔵ユニットは、一度に多くのフラスコを予め冷凍する簡単かつ効率的な手段を提供し、望ましい被膜を内側に作り出し、効率的なフリーズドライにとって十分な表面積を提供する。
【００８５】
凍結乾燥材料のボトルを室温にし、２：１の糖類／タンパク質比でＣＲＭ１９７溶液中に再懸濁した。糖類／タンパク質混合物に、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を添加し、最終０．２Ｍイオン強度および７．５のｐＨ７．５とし、次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を１８時間にわたって２３℃にてインキュベートし、続いて、７２時間にわたって３７℃にて２回目のインキュベーションを行った。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を冷たい生理食塩水で希釈し、続いて、１Ｍ炭酸ナトリウムを添加して反応混合物をｐＨ９．０に調整した。未反応アルデヒドを、３〜６時間にわたる２３℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【００８６】
反応混合物を生理食塩水で２倍に希釈し、０．４５〜５μｍプレフィルターに通して保持液容器中に移した。反応混合物を、０．１５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ６で３０倍に、生理食塩水で２０倍に透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【００８７】
コンジュゲート溶液を、０．９％生理食塩水中で０．５ｍｇ／ｍＬの目標まで希釈し、次いで、クラス１００フード内の最終バルク濃縮物（ＦＢＣ）容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを２〜８℃にて保存した。
【００８８】
キャラクタリゼーション
サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用し、コンジュゲートの相対的分子サイズ分布をプロファイルした。
【００８９】
コンジュゲートの同一性は、特異抗血清を使用するスロット−ブロットアッセイにより確認された。
【００９０】
糖類濃度およびタンパク質濃度は、それぞれウロン酸およびローリーアッセイにより決定した。共有結合したコンジュゲート複合体中のタンパク質に対する糖類の比は、計算：
【００９１】
【数１】
0005523836.tif 000005
【００９２】
Ｏ−アセチル含有量は、Ｈｅｓｔｒｉｎ法（Ｈｅｓｔｒｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９４９、１８０、ｐ．２４９）により測定した。総糖類濃度に対するＯ−アセチル濃度の比から、糖類１ｍｇ当たりのＯ−アセチルのマイクロモルが得られた。
【００９３】
実施例３
ストレプトコッカス・ニューモニアエ筴膜多糖血清型３の調製
マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３は、Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ａｕｓｔｒｉａｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｉｎａから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例１を参照されたい。
【００９４】
発酵および集菌
ワーキングセルバンクからの培養物を使用し、大豆ベースの培地を含有するシードボトルに接種した。ボトルを、成育要件が満たされるまで、かき混ぜずに３６℃±２℃にてインキュベートした。シードボトルを使用し、大豆ベースの培地を含有するシード発酵槽に接種した。約７．０のｐＨを、滅菌炭酸ナトリウム溶液で維持した。目標光学密度に達した後に、シード発酵槽を使用し、中間シード発酵槽に接種した。目標光学密度に達した後に、中シード発酵槽を使用し、生産発酵槽に接種した。ｐＨを、滅菌炭酸ナトリウム溶液で維持した。発酵を、発酵槽の作業容量に達した場合に終了させた。適切な量の滅菌１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加し、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖を遊離させた。溶解した後に、発酵槽内容物を冷却した。溶解した培養ブロスのｐＨを、酢酸で約ｐＨ６．６に調整した。溶解物を、連続流遠心分離と、続いて、深層濾過および０．４５μｍ精密濾過により清澄化した。
【００９５】
精製
肺炎球菌多糖の精製は、いくつかの濃縮／透析濾過操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過工程からなっていた。すべての手順は、特別の定めのない限り、室温にて行った。
【００９６】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型３の発酵槽培養物からの清澄化ブロスを、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮および透析濾過した。透析濾過は、中性ｐＨにてリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行った。透析濾過は、核酸、タンパク質および多糖などの高分子量バイオポリマーから低分子量培地成分を除去した。
【００９７】
ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（ＨＢ）の添加前に、計算した容量のＮａＣｌストック溶液を、濃縮および透析濾過した多糖溶液に添加して０．２５Ｍ  ＮａＣｌの最終濃度とした。次いで、多糖を、ストック溶液からのＨＢを添加して１％ＨＢ（ｗ／ｖ）の最終濃度とすることにより沈殿させた。多糖／ＨＢ沈殿物を、デプスフィルター上に捕捉し、濾液を廃棄した。多糖沈殿物を、沈殿物を含有するデプスフィルターに通して塩化ナトリウム溶液を再循環することにより再可溶化および溶出した。次いで、フィルターを、追加の塩化ナトリウム溶液ですすいだ。
【００９８】
ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を、ストックＮａＩ溶液から多糖溶液に添加して０．５％の最終濃度とし、ＨＢを沈殿させた。沈殿物を深層濾過により除去した。濾液は、目標多糖を含有していた。沈殿容器およびフィルターをＮａＣｌ／ＮａＩ溶液ですすぎ、すすぎ液を、部分的に精製した多糖溶液と合わせた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖を、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【００９９】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて濃縮し、塩化ナトリウム溶液で透析濾過した。
【０１００】
部分的に精製した多糖溶液を、活性炭を含浸させたデプスフィルターに通して濾過することによりさらに精製した。濾過の後に、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖溶液と合わせ、次いで、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１０１】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて濃縮し、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で調整して０．０２５Ｍリン酸ナトリウムの最終濃度とした。ｐＨをチェックし、７．０±０．２に調整した。
【０１０２】
セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して適切な伝導率（１５μＳ）とした。次いで、多糖溶液を、カラム上にロードした。これらの条件下で、樹脂および多糖に結合している不純物を、カラムからのフロースルー中に回収した。多糖溶液を、緩衝液と共にカラムに通して流し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１０３】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮した。次いで、濃縮物を、ＷＦＩで透析濾過した。
【０１０４】
透析濾過した多糖溶液を、０．２μｍ膜フィルターに通してステンレス鋼容器中に濾過した。サンプルを、遊離試験のために取り出し、精製多糖を−２５℃±５℃にて冷凍保存した。
【０１０５】
キャラクタリゼーション
１Ｈ−ＮＭＲデータは、多糖分子のプロトンに割り当てられたシグナルの帰属により化学構造と一致した。
【０１０６】
１価多糖の同一性は、特異抗血清を使用する向流免疫電気泳動により確認された。
【０１０７】
屈折率検出器および多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）検出器と連結している高速ゲル濾過クロマトグラフィーを、サンプル濃度と連動して使用し、分子量を計算した。
【０１０８】
サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用し、多糖の相対的分子サイズ分布をプロファイルした。
【０１０９】
実施例４
血清型３肺炎球菌糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
精製した血清型３糖類の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、ＷＦＩおよび２Ｍ酢酸を添加して０．２Ｍおよび２ｍｇ／ｍＬ糖類の最終濃度とした。溶液の温度を１時間にわたって８５℃まで上げ、多糖を加水分解した。反応物を２５℃以下まで冷却し、１Ｍ塩化マグネシウムを添加して０．１Ｍの最終濃度とした。過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を、２３℃にて１６〜２４時間にわたるインキュベーションにより行った。
【０１１０】
活性化反応混合物を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用してＷＦＩで１０倍に濃縮および透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１１１】
混ぜ合わせる場合、０．２Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を、活性化糖類に添加して１０ｍＭの最終濃度および６．０〜６．５のｐＨとした。ＣＲＭ１９７担体タンパク質を、ＣＲＭ１９７１ｇ当たり糖類２ｇの比まで糖類溶液と混合した。合わせた糖類／タンパク質溶液を、５０ｍＬ目標充填で１００ｍＬガラス凍結乾燥ボトルに充填し、−７５℃にてシェル凍結し、凍結乾燥させた。
【０１１２】
共凍結乾燥した糖類／タンパク質材料のボトルを室温にし、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０中に再懸濁して２０ｍｇ／ｍＬの最終糖類濃度とした。ｐＨを６．５に調整し、次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム０．５モル当量を添加した。反応物を、４８時間にわたって３７℃にてインキュベートした。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を、冷たい５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水緩衝液で希釈した。未反応アルデヒドを、水酸化ホウ素ナトリウムの添加および３〜６時間にわたる２３℃におけるインキュベーションによりクエンチした。反応混合物を、０．４５〜５μｍプレフィルターに通して保持液容器中に移した。
【０１１３】
反応混合物を、０．１Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ９）で３０倍に、０．１５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６）で２０倍に、５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水で２０倍に透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１１４】
コンジュゲート溶液を、０．５ｍｇ／ｍＬの糖類目標まで希釈し、次いで、クラス１００フード内のＦＢＣ容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを２〜８℃にて保存した。
【０１１５】
キャラクタリゼーション
サイズ排除クロマトグラフィー媒体（ＣＬ−４Ｂ）を使用し、コンジュゲートの相対的分子サイズ分布をプロファイルした。
【０１１６】
コンジュゲートの同一性は、特異抗血清を使用するスロット−ブロットアッセイにより確認された。
【０１１７】
糖類濃度およびタンパク質濃度は、それぞれアントロンおよびローリーアッセイにより決定した。共有結合したコンジュゲート複合体中のタンパク質に対する糖類の比は、計算：
【０１１８】
【数２】
0005523836.tif 000006
により得られた。
【０１１９】
実施例５
ストレプトコッカス・ニューモニアエ筴膜多糖血清型５の調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型５は、Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋのＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ  Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例１を参照されたい。多糖の発酵、集菌、精製、およびキャラクタリゼーションについては、実施例１を参照されたい。
【０１２０】
代替発酵プロセス
ワーキングセルバンクからの培養物を使用し、大豆ベースの培地および１０ｍＭ滅菌ＮａＨＣＯ３溶液を含有するシードボトルに接種した。ボトルを、成育要件が満たされるまで、かき混ぜずに３６℃±２℃にてインキュベートした。シードボトルを使用し、大豆ベースの培地および１０ｍＭ滅菌ＮａＨＣＯ３溶液を含有するシード発酵槽に接種した。約７．０のｐＨを、３Ｎ  ＮａＯＨで維持した。目標光学密度に達した後に、シード発酵槽を使用し、１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３濃度の大豆ベースの培地を含有する生産発酵槽に接種した。ｐＨを、３Ｎ  ＮａＯＨで維持した。発酵を、成育の停止の後にまたは発酵槽の作業容量に達した場合に終了させた。適切な量の滅菌１２％デオキシコール酸ナトリウムを培養物に添加し、ブロス中０．１２％濃度とし、細菌細胞を溶解し、細胞関連多糖を遊離させた。溶解した後に、発酵槽内容物を、かき混ぜながら、７℃〜１３℃の温度にて８〜２４時間の時間間隔にわたって保持し、完全な細胞溶解および多糖の遊離が起こったことを保証した。この保持時間中のかき混ぜは、発酵槽壁およびｐＨプローブ上に溶解物堆積物が沈着するのを防ぎ、それによって、ｐＨプローブ保全を維持した。次に、溶解した培養ブロスのｐＨを、５０％酢酸で約ｐＨ４．５に調整した。１５℃〜２５℃の温度にて１２〜２４時間の時間間隔にわたるかき混ぜない保持時間の後に、これまでは可溶性のタンパク質のかなりの部分が、固体沈殿物として溶液から落下し、溶液中に残っている多糖の損失と分解はほとんどなかった。次いで、沈殿物を含む溶液を、連続流遠心分離と、続く、深層濾過および０．４５μｍ精密濾過により清澄化した。
【０１２１】
実施例６
血清型５肺炎球菌糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型５糖類の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、０．１Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．７を添加し、続いて、２３℃にて１６〜２２時間にわたるインキュベーションによる過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を行った。
【０１２２】
活性化反応混合物を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用し、ＷＦＩで１０倍に濃縮および透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１２３】
血清型５活性化糖類を、０．８：１の比でＣＲＭ１９７と合わせた。合わせた糖類／タンパク質溶液を、１００ｍＬガラス凍結乾燥ボトル（５０ｍＬ目標充填）に充填し、−７５℃にてシェル凍結し、共凍結乾燥した。
【０１２４】
共凍結乾燥材料のボトルを室温にし、０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５中に再懸濁し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応物を７２時間にわたって３０℃にてインキュベートし、続いて、シアノ水素化ホウ素の２回目の添加を行い、２０〜２８時間にわたって３０℃にてインキュベートした。
【０１２５】
シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を生理食塩水で２倍に希釈し、０．４５〜５μｍプレフィルターに通して保持液容器中に移した。反応混合物を、０．０１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ８で３０倍に、０．１５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ６で２０倍に、生理食塩水で２０倍に透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１２６】
コンジュゲート溶液を希釈し、０．５ｍｇ／ｍＬの糖類目標とし、次いで、クラス１００フード内のＦＢＣ容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを２〜８℃にて保存した。
【０１２７】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例２を参照されたい。
【０１２８】
実施例７
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型６Ａの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型６Ａは、Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋのＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ  Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例１を参照されたい。多糖の発酵、集菌、および精製については、精製中に、クロマトグラフィー工程の前に、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯ濃縮工程を省略することを除き、実施例１を参照されたい。
【０１２９】
実施例８
血清型６Ａ肺炎球菌糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型６Ａ多糖は、酸化前にサイズを縮小しなければならなかった高分子量ポリマーである。血清型６Ａ糖類の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。容器に、６０℃にて１．５時間にわたる加水分解のために、２Ｍ酢酸を添加して０．１Ｍの最終濃度とした。反応物を２３℃まで冷却し、中和を、反応混合物を１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ６に調整することにより行った。過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を、１４〜２２時間にわたる２３℃におけるインキュベーションにより行った。
【０１３０】
活性化反応混合物を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用し、ＷＦＩで１０倍に濃縮および透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１３１】
血清型６Ａを、ショ糖と混ぜ合わせ、１００ｍＬガラス凍結乾燥ボトル（５０ｍＬ目標充填）に充填し、−７５℃にてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【０１３２】
凍結乾燥した材料のボトルを室温とし、１：１の糖類／タンパク質の比でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に再懸濁した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加の後に、反応混合物を１８時間にわたって２３℃にてインキュベートした。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を冷たい生理食塩水で希釈した。未反応アルデヒドを、３〜２０時間にわたる２３℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【０１３３】
希釈した反応混合物を、５μｍプレフィルターに通して保持液溶液中に移した。反応混合物を、０．９％ＮａＣｌで１０倍に、およびコハク酸塩−緩衝ＮａＣｌで３０倍に透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１３４】
コンジュゲート溶液を希釈し、０．５ｍｇ／ｍＬの糖類目標とし、次いで、クラス１００フード内のＦＢＣ容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを２〜８℃にて保存した。
【０１３５】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例２を参照されたい。
【０１３６】
実施例９
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型７Ｆの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型７Ｆは、Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋのＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ  Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。セルバンクシステムの調製、ならびに多糖の発酵および集菌については、実施例３を参照されたい。代替発酵プロセスおよび集菌プロセスについては、実施例１に記載されている代替プロセスを参照されたい。
【０１３７】
精製
肺炎球菌多糖の精製は、いくつかの濃縮／透析濾過操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過工程からなっていた。すべての手順は、特別の定めのない限り、室温にて行った。
【０１３８】
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型７Ｆの発酵槽培養物からの清澄化ブロスを、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮および透析濾過した。透析濾過は、中性ｐＨにてリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行った。透析濾過は、核酸、タンパク質および多糖などの高分子量バイオポリマーから低分子量培地成分を除去した。
【０１３９】
血清型７Ｆは、ＨＢと沈殿物を形成しない。その代わり、不純物を、ストック溶液からのＨＢを添加して１％ＨＢの最終濃度とすることにより、濃縮および透析濾過した溶液から沈殿させた。沈殿物をデプスフィルター上に捕捉し、フィルターを廃棄した。多糖は、濾液中に含有されていた。
【０１４０】
ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を、ストックＮａＩ溶液から多糖溶液に添加して０．５％の最終濃度とし、ＨＢを沈殿させた。沈殿物を深層濾過により除去した。濾液は、目標多糖を含有していた。沈殿容器およびフィルターをＮａＣｌ／ＮａＩ溶液ですすぎ、すすぎ液を、部分的に精製した多糖溶液と合わせた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖を、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１４１】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて濃縮し、塩化ナトリウム溶液で透析濾過した。
【０１４２】
部分的に精製した多糖溶液を、活性炭を含浸させたデプスフィルターに通して濾過することによりさらに精製した。濾過の後に、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖溶液と合わせ、次いで、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１４３】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて濃縮し、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液で調整して０．０２５Ｍリン酸ナトリウムの最終濃度とした。ｐＨをチェックし、７．０±０．２に調整した。
【０１４４】
セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムを、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化して適切な伝導率（１５μＳ）とした。次いで、多糖溶液を、カラム上にロードした。これらの条件下で、樹脂および多糖に結合している不純物を、カラムからのフロースルー中に回収した。多糖を、緩衝液と共にカラムに通して流し、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１４５】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮した。次いで、濃縮物を、ＷＦＩで透析濾過した。
【０１４６】
透析濾過した多糖溶液を、０．２μｍ膜フィルターに通してステンレス鋼容器中に濾過した。サンプルを、遊離試験のために取り出し、精製多糖を２℃〜８℃にて保存した。
【０１４７】
多糖のキャラクタリゼーションについては、実施例３を参照されたい。
【０１４８】
実施例１０
血清型７Ｆ肺炎球菌糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
過ヨウ素酸ナトリウム存在下の酸化を、２３℃における１６〜２４時間にわたるインキュベーションにより行った。
【０１４９】
活性化反応混合物を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用して１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５で１０倍に濃縮および透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１５０】
血清型７Ｆを、１００ｍＬガラス凍結乾燥ボトル（５０ｍＬ目標充填）に充填し、−７５℃にてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【０１５１】
凍結乾燥した血清型７ＦおよびＣＲＭ１９７のボトルを室温とし、１．５：１の糖類／タンパク質の比でＤＭＳＯ中に再懸濁した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムの添加の後に、反応物を８〜１０時間にわたって２３℃にてインキュベートした。未反応アルデヒドを、１６時間にわたる２３℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【０１５２】
反応混合物を冷たい生理食塩水で１０倍に希釈し、５μｍプレフィルターに通して保持液容器中に移した。反応混合物を、０．９％生理食塩水で１０倍に、コハク酸塩−緩衝生理食塩水で３０倍に透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１５３】
コンジュゲート溶液を希釈し、０．９％生理食塩水１ｍＬ当たり０．５ｍｇの糖類目標として、次いで、クラス１００フード内のＦＢＣ容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを２〜８℃にて保存した。
【０１５４】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例４を参照されたい。
【０１５５】
実施例１１
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型１９Ａの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型１９Ａは、Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎｅｗ  ＹｏｒｋのＤｒ．Ｇｅｒａｌｄ  Ｓｃｈｉｆｆｍａｎから入手した。セルバンクシステムの調製については、実施例１を参照されたい。多糖の発酵、集菌、および精製については、実施例７を参照されたい。キャラクタリゼーションについては、実施例３を参照されたい。
【０１５６】
実施例１２
血清型１９Ａ肺炎球菌糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
活性化およびコンジュゲーション
血清型１９Ａ糖類の容器を解凍し、反応容器中で合わせた。酢酸ナトリウムを添加して１０ｍＭ（ｐＨ５．０）とし、酸化を、２３℃における１６〜２４時間にわたるインキュベーションにより過ヨウ素酸ナトリウムの存在下で行った。
【０１５７】
活性化反応混合物を、１００Ｋ  ＭＷＣＯ膜を使用して１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．０で１０倍に濃縮および透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１５８】
活性化糖類をショ糖と混ぜ合わせ、続いてＣＲＭ１９７を添加した。血清型１９Ａ活性化糖類およびＣＲＭ１９７混合物（０．８：１比）を、１００ｍＬガラス凍結乾燥ボトル（５０ｍＬ目標充填）に充填し、−７５℃にてシェル凍結し、凍結乾燥した。
【０１５９】
凍結乾燥した材料のボトルを室温とし、ＤＭＳＯ中に再懸濁した。糖類／タンパク質混合物に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した。反応物を１５時間にわたって２３℃にてインキュベートした。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、未反応アルデヒドを、３〜２０時間にわたる２３℃におけるインキュベーションにより、水素化ホウ素ナトリウムの添加によりクエンチした。
【０１６０】
反応混合物を冷たい生理食塩水で１０倍に希釈し、５μｍプレフィルターに通して保持液容器中に移した。反応混合物を、０．４５μｍフィルターで濾過した０．９％ＮａＣｌで１０倍に、５ｍＭコハク酸／０．９％ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ６を使用する透析濾過で３０倍に透析濾過した。保持液を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１６１】
コンジュゲート溶液を、５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水を使用して０．５ｍｇ／ｍＬの目標まで希釈し、次いで、クラス１００フード内のＦＢＣ容器中に滅菌濾過した。コンジュゲートを２〜８℃にて保存した。
【０１６２】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例４を参照されたい。
【０１６３】
実施例１３
ストレプトコッカス・ニューモニアエ莢膜多糖血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆの調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエシード培養物の調製
ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆは、Ｄｒ．Ｇｅｒａｌｄ  Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ、Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから入手した。ストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型１４は、ＡＴＣＣ、６３１４株から得た。
【０１６４】
別々に、ストレプトコッカス・ニューモニアエの望ましい血清型のそれぞれの１つのバイアルを使用し、発酵バッチを開始した。大豆ベースの培地およびフェノールレッドを含有する２つのボトルを、炭酸ナトリウムを使用して７．４±０．２のｐＨ範囲に調整し、次いで、必要容量の５０％ブドウ糖／１％硫酸マグネシウム溶液をボトルに添加した。２つのボトルに、異なる量のシードを接種した。ボトルを、培地が黄色に変わるまで、３６℃±２℃にてインキュベートした。インキュベーションの後に、サンプルを、各ボトルから取り出し、光学密度（ＯＤ）（０．３〜０．９）およびｐＨ（４．６〜５．５）について試験した。２つのボトルのうちの１つを、シード発酵槽の接種用に選択した。
【０１６５】
大豆ベースの培地をシード発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の５０％ブドウ糖／１％硫酸マグネシウム溶液を発酵槽に添加した。シード発酵槽のｐＨおよびかき混ぜをモニターおよび制御した（ｐＨ６．７〜７．４）。温度を３６℃±２℃に維持した。シード接種物（ボトル）を、シード発酵槽と無菌的に連結し、接種物を移した。発酵槽をｐＨ制御で維持し、サンプルを定期的に取り出し、ＯＤおよびｐＨについて試験した。６００ｎｍにて０．５の望ましいＯＤに達した場合、中間発酵槽に、シード発酵槽からの発酵ブロスを接種した。
【０１６６】
大豆ベースの培地を中間発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の５０％ブドウ糖／１％硫酸マグネシウム溶液を発酵槽に添加した。中間発酵槽のｐＨおよびかき混ぜをモニターおよび制御した（ｐＨ６．７〜７．４）。温度を３６℃±２℃に維持した。シード発酵槽の内容物を中間発酵槽に移した。発酵槽をｐＨ制御で維持し、サンプルを定期的に取り出し、ＯＤおよびｐＨについて試験した。６００ｎｍにて０．５の望ましいＯＤに達した場合、生産発酵槽に、中間発酵槽からの発酵ブロスを接種した。
【０１６７】
大豆ベースの培地を生産発酵槽に移し、滅菌した。次いで、ある容量の５０％ブドウ糖／１％硫酸マグネシウム溶液を発酵槽に添加した。生産発酵槽のｐＨおよびかき混ぜをモニターおよび制御した（ｐＨ６．７〜７．４）。温度を３６℃±２℃に維持した。発酵が終了するまで、発酵槽をｐＨ制御で維持し、サンプルを定期的に取り出し、ＯＤおよびｐＨについて試験した。
【０１６８】
デオキシコール酸ナトリウムを発酵槽に添加して約０．１２％ｗ／ｖの最終濃度とした。培養物を最短で３０分にわたって混合し、温度設定点を１０℃まで下げた。培養物を一夜にわたってインキュベートし、不活化を確認した後に、培養物のｐＨを、必要に応じて、５０％酢酸で６．４〜６．８に調整した。発酵槽の温度を２０℃±５℃まで上げ、内容物を清澄化保持タンクに移した。
【０１６９】
清澄化保持タンクの内容物（細胞残屑を包含する）を、１時間当たり２５〜６００リットルの流量にて遠心機により処理した（細胞残屑を廃棄し、流量を１時間当たり２５〜２５０リットルに固定した血清型４を除いて）。上清のサンプルを取り出し、ＯＤについて試験した。遠心分離中の望ましいＯＤを０．１５以下とした。
【０１７０】
初めに、上清を、０．０５±０．０３のＯＤが得られるまで、デプスフィルターアセンブリに通して再循環した。次いで、上清を、デプスフィルターアセンブリおよび０．４５μｍ膜フィルターに通して    濾液保持タンクに移した。
【０１７１】
続いて、生成物を、閉管に通して処理用の精製領域に移した。
【０１７２】
上記の操作（遠心分離、濾過および移送）はすべて、１０℃〜３０℃にて行った。
【０１７３】
血清型４および６Ｂについての代替発酵プロセスおよび集菌プロセスについては、実施例１に記載されている代替プロセスを参照されたい。
【０１７４】
精製
各肺炎球菌多糖の精製は、いくつかの濃縮／透析濾過操作、沈殿／溶出、カラムクロマトグラフィー、および深層濾過工程からなっていた。すべての手順は、特別の定めのない限り、室温にて行った。
【０１７５】
望ましいストレプトコッカス・ニューモニアエ血清型の発酵槽培養物からの清澄化ブロスを、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮および透析濾過した。透析濾過は、９．０未満のｐＨにてリン酸ナトリウム緩衝液を使用して行った。透析濾過は、核酸、タンパク質、および多糖などの高分子量バイオポリマーから低分子量培地成分を除去した。
【０１７６】
多糖を、ストック溶液からのＨＢを添加して１％ＨＢ（ｗ／ｖ）の最終濃度とすることにより、濃縮および透析濾過した溶液から沈殿させた（２．５％の最終濃度であった血清型２３Ｆを除いて）。多糖／ＨＢ沈殿物をデプスフィルター上に捕捉し、濾液を廃棄した（注：血清型１４は沈殿しない。したがって、濾液を保持した）。多糖沈殿物を、沈殿物を含有するデプスフィルターに通して塩化ナトリウム溶液を再循環することにより再可溶化および溶出した。次いで、フィルターを、追加の塩化ナトリウム溶液ですすいだ。
【０１７７】
ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を、ストックＮａＩ溶液から多糖溶液に添加して０．５％の最終濃度とし、ＨＢを沈殿させた（０．２５％の最終濃度であった血清型６Ｂを除いて）。沈殿物を深層濾過により除去した。濾液は、目標多糖を含有していた。フィルターを廃棄した。次いで、多糖を０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１７８】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて濃縮し、塩化ナトリウム溶液で透析濾過した。
【０１７９】
部分的に精製した多糖溶液を、活性炭を含浸させたデプスフィルターに通して濾過することによりさらに精製した。濾過の後に、炭素フィルターを塩化ナトリウム溶液ですすいだ。すすぎ液を多糖溶液と合わせ、次いで、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１８０】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて濃縮し、フィルターを、塩化ナトリウム溶液ですすいだ。ｐＨをチェックし、７．０±０．３に調整した。
【０１８１】
セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）カラムを、ｐＨが７．０±０．３になり伝導率が２６±４μＳになるまで、塩化ナトリウムを含有するリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化した。次いで、多糖溶液をカラム上にロードした。これらの条件下で、樹脂および多糖に結合している不純物を、カラムからのフロースルー中に回収した。多糖溶液を、０．２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１８２】
多糖溶液を、３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルターを使用して濃縮した。次いで、濃縮物を、伝導率が１５μＳ未満になるまで、ＷＦＩで透析濾過した。
【０１８３】
透析濾過した多糖溶液を、０．２μｍ膜フィルターに通してバルク容器中に濾過し、２℃〜８℃にて保存した。
【０１８４】
実施例１４
肺炎球菌糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲートの調製
血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆについて
活性化プロセス
異なる血清型糖類は、この実施例に記載されているように、活性化（活性化前に加水分解するかまたは加水分解しない）およびコンジュゲーション（水性またはＤＭＳＯ反応）のための異なる経路に従う。
【０１８５】
多糖を、バルク容器から反応器に移した。次いで、多糖を、ＷＦＩおよびリン酸ナトリウム中で希釈して１．６〜２．４ｍｇ／ｍＬの最終濃度範囲とした。
【０１８６】
工程１．
血清型６Ｂ、９Ｖ、１４、１９Ｆ、および２３Ｆについては、ｐＨをｐＨ６．０±０．３に調整した。
【０１８７】
血清型４については、塩酸（最終酸濃度０．０１Ｍ）を添加し、溶液を４５℃±２℃にて２５〜３５分にわたってインキュベートした。加水分解を、２１〜２５℃まで冷却し、１Ｍリン酸ナトリウムを添加してｐＨ６．７±０．２の目標とすることにより停止させた。インプロセス試験を行い、適切なレベルの脱ピルビル化を確認した。
【０１８８】
血清型１８Ｃについては、氷酢酸（０．２Ｍ最終酸濃度）を添加し、溶液を９４℃±２℃にて２０５〜２１５分にわたってインキュベートした。次いで、温度を２１〜２５℃まで下げ、１〜２Ｍリン酸ナトリウムを添加してｐＨ６．８±０．２の目標とした。
【０１８９】
工程２：過ヨウ素酸反応
肺炎球菌糖類活性化に必要とされる過ヨウ素酸ナトリウムモル当量は、総糖類含有量を使用して決定した（血清型４を除いて）。血清型４については、糖類１モル当たり過ヨウ素酸ナトリウム０．８〜１．２モルの比を使用した。十分に混合しながら、酸化反応を、温度が１５℃以下である１９Ｆを除くすべての血清型について、２１〜２５℃にて１６〜２０時間で進行させた。
【０１９０】
工程３：限外濾過
酸化した糖類を、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター（１８Ｃについては５ｋＤａウルトラフィルター）上にてＷＦＩ（血清型１９Ｆについては０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０）で濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄し、保持液を０．２２μｍフィルターに通して濾過した。
【０１９１】
工程４：凍結乾燥
血清型４、９Ｖ、および１４については、濃縮糖類をＣＲＭ１９７担体タンパク質と混合し、ガラスボトルに充填し、シェル凍結し、−６５℃以下にて保存した。凍結した濃縮糖類−ＣＲＭ１９７を凍結乾燥し、次いで、−２５℃±５℃にて保存した。
【０１９２】
血清型６Ｂ、１９Ｆ、および２３Ｆについては、コンジュゲーション反応混合物中で５％±３％ショ糖濃度となるように計算された指定量のショ糖を添加した。血清型１８Ｃは、ショ糖添加を必要としなかった。次いで、濃縮糖類をガラスボトルに充填し、シェル凍結し、−６５℃以下にて保存した。凍結した濃縮糖類を凍結乾燥し、次いで、−２５℃±５℃にて保存した。
【０１９３】
コンジュゲーションプロセス
２種類のコンジュゲーションプロセス、すなわち、血清型４、９Ｖ、１４および１８Ｃについては水性コンジュゲーション、血清型６Ｂ、１９Ｆおよび２３ＦについてはＤＭＳＯコンジュゲーションを使用した。
【０１９４】
水性コンジュゲーション
工程１：溶解
血清型４、９Ｖ、および１４については、凍結乾燥した活性化糖類−ＣＲＭ１９７混合物を解凍し、室温にて平衡化した。次いで、凍結乾燥した活性化糖類−ＣＲＭ１９７を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で、
・血清型４および９Ｖについては、糖類１６〜２４ｇ当たり緩衝液１Ｌ
・血清型１４については、糖類６〜１０ｇ当たり緩衝液１Ｌ
の典型的な比で再構成した。
【０１９５】
反応混合物を、完全に溶解するまで、血清型９Ｖについては３７℃±２℃にて、血清型４および１４については２３℃±２℃にてインキュベートした。
【０１９６】
血清型１８Ｃについては、凍結乾燥した糖類を、ＣＲＭ１９７溶液１Ｌ当たりリン酸ナトリウム０．１１Ｌの典型的な比で、１Ｍ第二リン酸ナトリウム中のＣＲＭ１９７の溶液中で再構成した。反応混合物（８〜１２ｇ／Ｌ糖類濃度）を、完全に溶解するまで、２３℃±２℃にてインキュベートした。
【０１９７】
ｐＨは、この段階でインプロセスコントロールとして試験した。
【０１９８】
工程２：コンジュゲーション反応
血清型４および９Ｖについては、コンジュゲーション反応を、シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加して糖類１モル当たりシアノ水素化ホウ素ナトリウム１．０〜１．４モルとすることにより開始させた。反応混合物を３７℃±２℃にて４４〜５２時間にわたってインキュベートした。次いで、温度を２３℃±２℃まで下げ、塩化ナトリウム０．９％を反応器に添加した。水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加して糖類１モル当たり水素化ホウ素ナトリウム１．８〜２．２モル当量とした。混合物を２３℃±２℃にて３〜６時間にわたってインキュベートした。混合物を塩化ナトリウム０．９％で希釈し、反応器をすすいだ。希釈したコンジュゲーション混合物を、１．２μｍのプレフィルターを使用して保持容器中に濾過した。
【０１９９】
血清型１４および１８Ｃについては、コンジュゲーション反応を、シアノ水素化ホウ素溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加して糖類１モル当たりシアノ水素化ホウ素ナトリウム１．０〜１．４モルとすることにより開始させた。反応混合物を２３℃±２℃にて１２〜２４時間にわたってインキュベートした。温度を３７℃±２℃まで上げ、反応物を７２〜９６時間にわたってインキュベートした。次いで、温度を２３℃±２℃まで下げ、０．９％塩化ナトリウムを反応器に添加した。水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加して糖類１モル当たり水素化ホウ素ナトリウム１．８〜２．２モル当量とした。混合物を２３℃±２℃にて３〜６時間にわたってインキュベートした。混合物を０．９％塩化ナトリウムで希釈し、反応器をすすいだ。次いで、希釈したコンジュゲーション混合物を、１．２μｍプレフィルターを使用して保持容器中に濾過した。
【０２００】
工程３：限外濾過１００ｋＤａ
希釈したコンジュゲーション混合物を、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯウルトラフィルター上にて最少で１５容量（血清型４）か４０容量（血清型９Ｖ、１４、および１８Ｃ）のどちらかの０．９％塩化ナトリウムで濃縮および透析濾過した。
【０２０１】
浸透液を廃棄した。
【０２０２】
血清型４については、保持液を０．４５μｍフィルターに通して濾過した。
【０２０３】
インプロセスコントロール（糖類含有量）は、この工程で行った。
【０２０４】
工程４：ＨＡカラム精製
この工程は、血清型４コンジュゲートについてのみ行った。
【０２０５】
ＨＡカラムを、まず、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液を使用して中和し（ｐＨ７．０±０．３）、次いで、０．９％の塩化ナトリウムで平衡化した。濾過した保持液（血清型４）を、１．０Ｌ／分の流量にてカラムにロードした。カラムを、２．０Ｌ／分以下の流量にて０．９％塩化ナトリウムで洗浄した。次いで、生成物を、２．０Ｌ／分以下の流量にて０．５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液で溶出した。
【０２０６】
次いで、ＨＡ画分を、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜上にて最少で２０容量の０．９％塩化ナトリウムで濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄した。
【０２０７】
工程５：滅菌濾過
１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析濾過の後の保持液を０．２２μｍフィルターに通して濾過した。インプロセスコントロール（糖類含有量、遊離タンパク質、遊離糖類およびシアン化物）を、濾過した生成物について行った。濾過した保持液に対するインプロセスコントロールを行い、ＦＢＣ目標を満たすために追加の濃縮、透析濾過、および／または希釈が必要か否かを決定した。これらの試験および追加試験をＦＢＣサンプルで繰り返した。
【０２０８】
必要に応じて、濾過したコンジュゲートを、０．９％塩化ナトリウムで希釈して０．５５ｇ／Ｌ未満の最終濃度とした。糖類含有量、タンパク質含有量および糖類：タンパク質比についての遊離試験をこの段階で行った。
【０２０９】
最後に、コンジュゲートを濾過し（０．２２μｍ）、２．６４ｇ／キャニスターの典型的な量で１０Ｌステンレス鋼キャニスターに充填した。この段階で、収率、糖類含有量、タンパク質含有量、ｐＨ、糖類：タンパク質比、およびリシン含有量を、インプロセスコントロールとして行った。遊離試験（外観、遊離タンパク質、遊離糖類、内毒素、分子サイズ決定、残留シアン化物、糖類同一性、ＣＲＭ１９７同一性）をこの段階で行った。
【０２１０】
ＤＭＳＯコンジュゲーション
工程Ｉ：溶解
凍結乾燥した活性化糖類血清型６Ｂ、１９Ｆ、２３Ｆ、および凍結乾燥したＣＲＭ１９７担体タンパク質を室温にて平衡化し、ＤＭＳＯ中で再構成した。溶解濃度は、典型的には、ＤＭＳＯ１リットル当たり糖類２〜３グラム（２〜２．５ｇタンパク質）の範囲であった。
【０２１１】
工程ＩＩ：コンジュゲーション反応
活性化糖類およびＣＲＭ１９７担体タンパク質を、血清型６Ｂおよび１９ＦについてはＣＲＭ１９７１ｇ当たり糖類０．６〜１．０ｇの比範囲で、または血清型２３ＦについてはＣＲＭ１９７１ｇ当たり糖類１．２〜１．８ｇの比範囲で、２３℃±２℃にて６０〜７５分にわたって混合した。
【０２１２】
コンジュゲーション反応を、活性化糖類１モルに対するシアノ水素化ホウ素ナトリウム０．８〜１．２モル当量の比でシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加することにより開始させた。ＷＦＩを、反応混合物に添加して１％（ｖ／ｖ）の目標とし、混合物を、２３℃±２℃にて４０時間以上にわたってインキュベートした。
【０２１３】
水素化ホウ素ナトリウム溶液、１００ｍｇ／ｍＬ（典型的には、活性化糖類１モル当たり水素化ホウ素ナトリウム１．８〜２．２モル当量）およびＷＦＩ（目標５％ｖ／ｖ）を反応物に添加し、混合物を２３℃±２℃にて３〜６時間にわたってインキュベートした。この手順は、糖類上に存在する未反応アルデヒドを減らした。次いで、反応混合物を、１５℃未満にて０．９％塩化ナトリウムを含有する希釈タンクに移した。
【０２１４】
工程ＩＩＩ：１００ｋＤａ限外濾過
希釈したコンジュゲート混合物を、１．２μｍフィルターに通して濾過し、１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜上にて最少で１５容量の０．９％塩化ナトリウム（血清型２３Ｆについては、０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．０５ＭＮａＣｌ緩衝液を使用した）で濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄した。保持液を０．４５μｍフィルターに通して濾過した。インプロセス糖類含有量サンプルをこの段階で採取した。
【０２１５】
工程ＩＶ：ＤＥＡＥカラム精製
この工程は、血清型２３Ｆについてのみ行った。
【０２１６】
ＤＥＡＥカラムを、０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で平衡化した。濾過した保持液（血清型２３Ｆ）をカラム上にロードし、０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．０５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で洗浄した。次いで、カラムを、０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．９％ＮａＣｌ緩衝液で洗浄した。次いで、生成物を、０．０１Ｍリン酸ナトリウム／０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液で溶出した。
【０２１７】
工程Ｖ：１００ｋＤａ限外濾過
６Ｂおよび１９Ｆからの保持液を、少なくとも３０容量の０．９％塩化ナトリウムで濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄した。
【０２１８】
血清型２３Ｆからの溶出液を、最少で２０容量の０．９％塩化ナトリウムで濃縮および透析濾過した。浸透液を廃棄した。
【０２１９】
工程ＶＩ：滅菌濾過
１００ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析濾過の後の保持液を、０．２２μｍフィルターに通して濾過した。インプロセスコントロール（糖類含有量、遊離タンパク質、遊離糖類、残留ＤＭＳＯおよび残留シアン化物）を、濾過した生成物で行った。濾過した保持液に対するインプロセスコントロールを行い、ＦＢＣ目標を満たすために追加の濃縮、透析濾過、および／または希釈が必要か否かを決定した。これらの試験および追加試験を、ＦＢＣサンプルで繰り返した。
【０２２０】
必要に応じて、濾過したコンジュゲートを０．９％塩化ナトリウムで希釈して０．５５ｇ／Ｌ未満の最終濃度とした。糖類含有量、タンパク質含有量、および糖類：タンパク質の比についての遊離試験をこの段階で行った。
【０２２１】
最後に、コンジュゲートを濾過し（０．２２μｍ）、２．６４ｇ／キャニスターの量で１０Ｌステンレス鋼キャニスターに充填した。この段階で、収率、糖類含有量、タンパク質含有量、ｐＨ、糖類：タンパク質比およびリシン含有量を、インプロセスコントロールとして行った。遊離試験（外観、遊離タンパク質、遊離糖類、内毒素、分子サイズ決定、残留シアン化物、糖類同一性、ＣＲＭ１９７同一性）をこの段階で行った。
【０２２２】
実施例１５
多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンの製剤化
１３種類のコンジュゲートの最終バルク濃縮物は、０．８５％塩化ナトリウムを含有する。タイプ３、６Ａ、７Ｆ、および１９Ａバルク濃縮物は、ｐＨ５．８の５ｍＭコハク酸ナトリウム緩衝液も含有する。バルク濃縮物の必要容量を、バッチ容量およびバルク糖類濃度に基づいて計算した。０．８５％塩化ナトリウム（生理食塩水）の８０％および必要量のコハク酸塩緩衝液を、予め標識した製剤化容器に添加した後に、バルク濃縮物を添加した。次いで、調製物を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｄｕｒａｐｏｒｅ膜フィルターユニットを使用することにより０．２２μｍ膜に通して第２の容器中に滅菌濾過した。第１の容器を、０．８５％塩化ナトリウムの残りの２０％で洗浄し、溶液を同じフィルターに通過させ、第２の容器中に集めた。製剤化したバルクを、バルクリン酸アルミニウムの添加の間および添加の後に穏やかに混合した。必要に応じて、ｐＨをチェックし調整した。製剤化したバルク生成物を２〜８℃にて保存した。
【０２２３】
製剤化したバルク生成物を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎから入手したタイプ１ホウケイ酸塩ガラスシリンジに充填した。ワクチンを、濁度について一定の間隔をおいてモニターし、充填操作の均一性を確保した。充填したワクチン（最終製品）を２〜８℃にて保存した。
【０２２４】
実施例１６
１３価コンジュゲートワクチンの免疫原生
今日まで、１３ｖＰｎＣワクチンに関する前臨床研究をウサギで行ってきた。研究＃ＨＴ０１−００２１および＃ＨＴ０１−００３６は、ストレプトコッカス・ニューモニアエ由来の莢膜多糖（ＰＳ）のＣＲＭ１９７との化学的コンジュゲーションの効果、およびウサギにおける１３ｖＰｎＣワクチンへの免疫応答に対するリン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）アジュバントの効果を独立して調べるために設計された。これらの効果を、血清ＩｇＧ濃度については抗原特異的ＥＬＩＳＡにより、抗体機能についてはオプソニン食作用アッセイ（ＯＰＡ）により特徴付けた。
【０２２５】
研究＃ＨＴ０１−００２１
研究＃ＨＴ０１−００２１は、ＡｌＰＯ４アジュバントを含む１３ｖＰｎＣワクチンがワクチン血清型特異的免疫応答を誘発する能力を調べた。１３ｖＰｎＣワクチンで表される肺炎球菌血清型は、タイプ１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆおよび２３Ｆを包含する。第２の目的は、抗体応答の動力学および持続時間の評価を包含していた。ニュージーランド白色ウサギを、ＡｌＰＯ４（１００μｇ／投与量）と共に、またはＡｌＰＯ４なしで製剤化された各多糖の計画的ヒト臨床投与量（６Ｂの４μｇを除いて、各ＰＳ  ２μｇ）で０週目および２週目に筋肉注射で免疫化した。血清を様々な時点で集めた。血清型特異的ＩｇＧをＥＬＩＳＡにより測定し、機能的活性をＯＰＡにより評価した。
【０２２６】
表４は、１３ｖＰｎＣワクチンの２回投与の後に、プールした血清サンプルにおいて得られた幾何平均力価（ＧＭＴ）を示している。ＩｇＧ  ＧＭＴの比を使用し、４週目から０週目までの応答を比較した。これらのデータは、１３ｖＰｎＣ製剤におけるＡｌＰＯ４の包含が、アジュバントのない同じワクチンと比べ、より高いレベルのＩｇＧ抗体を誘発したことを立証している。抗体応答は、ＡｌＰＯ４が製剤中に包含された場合により大きいが、これらの増加は、統計的に有意ではなかった。
【０２２７】
機能的抗体応答も、２種類の１３ｖＰｎＣ製剤による免疫化の後にウサギで評価した（表５）。アジュバントを含む、またはアジュバントを含まないワクチン製剤を比較すると、より高いＯＰＡ  ＧＭＴは、１３ｖＰｎＣ＋ＡｌＰＯ４ワクチン処置群で観測された。ＯＰＡ力価は、両グループにおけるすべてのワクチン血清型に対して４週目の血清プールで検出された。血清型の大部分について、４週目に測定されたＯＰＡ力価は、０週目（ベースライン）のＯＰＡ力価に比べて少なくとも４倍高かった。
【０２２８】
１３ｖＰｎＣワクチン血清型のそれぞれに対する動力学的応答を、両処置群の血清プールから評価した。各血清型に対するＩｇＧ力価を、０週目ならびに、１、２、３、４、８、１２、２６、および３９週目における採血から測定し、次いで、比較した。血清型１を除いて、アジュバント化ワクチンを受けた動物における抗体応答は、非アジュバント化ワクチンを受けた動物を上回り、免疫化スケジュールの２週目でピークに達した（データ省略）。
【０２２９】
全体として、データは、リン酸アルミニウムと共に製剤化された１３ｖＰｎＣワクチンが、ウサギにおいて免疫原性であり、ワクチンに含有される肺炎球菌莢膜多糖に対して実質的な抗体応答を誘発し、これらの応答が、機能的活性に関係していることを示している。１３ｖＰｎＣ＋ＡｌＰＯ４による免疫化の後に７種類の中核血清型に対して観測された応答は、７価製剤に対するウサギの過去の応答と一致している。
【０２３０】
【表４】
0005523836.tif 000007
【０２３１】
【表５】
0005523836.tif 000008
【０２３２】
研究＃ＨＴ０１−００３６
研究＃ＨＴ０１−００３６は、ＣＲＭ１９７タンパク質とのコンジュゲーションを含む、または含まない１３ｖＰｎＣワクチンによる免疫化の後の、ワクチンに含有される多糖（ＰＳ）に対するウサギ免疫応答を比較した。ニュージーランド白色サギを、各ＰＳ２．２μｇ（６Ｂの４．４μｇを除いて）の投与量で、０週目および２週目に筋肉注射で免疫化した。動物は、３種類のワクチン調製物、すなわち、（ａ）１３ｖＰｎＣ（ＣＲＭ１９７に直接コンジュゲートしているＰＳ）、（ｂ）１３ｖＰｎＰＳ（遊離ＰＳ）、または（ｃ）１３ｖＰｎＰＳ＋ＣＲＭ１９７（ＣＲＭ１９７と混合された遊離ＰＳ）のうちの１つを受けた。すべてのワクチン調製物は、１２５μｇ／投与量でアジュバントとしてのＡｌＰＯ４を含有していた。
【０２３３】
すべてのワクチン調製物についての血清型特異的免疫応答を、ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡおよび機能的抗体を測定する補体仲介性ＯＰＡで評価した。免疫応答を処置群間で比較した。
【０２３４】
表６は、抗原特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡで分析した４週目の血液から得られたＧＭＴデータを示している。追加分析は、０週目に対する４週目のＧＭＴ値の比を示している。データは、コンジュゲートワクチン調製物が、遊離ＰＳまたは遊離ＰＳ＋ＣＲＭ１９７ワクチンよりも高い血清ＩｇＧ力価を誘発したことを示している。ストレプトコッカス・ニューモニアエタイプ１４を除いて、１３ｖＰｎＣワクチンは、ＯＰＡにおいてストレプトコッカス・ニューモニアエの代表的な株に対する機能的抗体を誘導することができた（表７）。１３ｖＰｎＰＳか１３ｖＰｎＰＳ＋ＣＲＭ１９７ワクチンのどちらかによる２種類の免疫化の後に、どちらも、測定した１３種類のうちの１０種類の血清型について、０週目に比べて４週目に８倍以上のＯＰＡ力価を誘導することはできなかった（表７）。
【０２３５】
結論として、これらの結果は、１３価肺炎球菌ワクチン多糖のコンジュゲーションが、遊離多糖単独または非コンジュゲートＣＲＭ１９７と混合された遊離多糖で見られるよりも高い血清ＩｇＧ力価および全体的な大きい機能的抗体活性を生み出すことを示している。
【０２３６】
【表６】
0005523836.tif 000009
【０２３７】
【表７】
0005523836.tif 000010
【０２３８】
実施例１７
血清型３肺炎球菌糖類−ＣＲＭ１９７コンジュゲーションについての代替手順
【０２３９】
精製多糖の容器を解凍し、反応容器中で合わせ、８５℃の温度まで加熱した。混合物の温度が、温度上昇中に約３５℃に達した場合、２Ｍ酢酸を添加して０．１Ｍ酢酸濃度とした。混合物の温度が８５℃に達した場合、１時間にわたってこの温度に維持し、加水分解／脱重合を行った。加水分解／脱重合した多糖を２３℃まで冷却し、１Ｍ  ＭｇＣｌ２を添加して０．１Ｍ  ＭｇＣｌ２濃度とした。酸化を、ＷＦＩ中の５０ｍｇ／ｍＬ溶液として添加する過ヨウ素酸１〜１．２５モル当量を使用して行った。混合物を２３℃で１６〜２４時間インキュベートした。
【０２４０】
反応混合物を、１００Ｋ  ＭＷＣＯポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を使用して１０倍容量のＷＦＩに対する透析濾過により精製した。精製した活性化多糖を、０．２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を使用して６．０のｐＨに調整し、２：１の多糖／タンパク質比でＣＲＭ１９７と混ぜ合わせ、−７５℃にてシェル凍結し、７１時間にわたって共凍結乾燥した。共凍結乾燥の後に、多糖／ＣＲＭ１９７混合物を、コンジュゲーションまで−２５°±５℃にて保存した。コンジュゲーションについては、共凍結乾燥した多糖／ＣＲＭ１９７混合物を、２０ｍｇ／ｍＬ多糖の濃度で０．１Ｍリン酸塩緩衝液に溶かし、ｐＨを、０．２Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ４．６と１Ｍ  ＮａＯＨの組合せで６．２に調整し、続いて、０．１５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．５中の１００ｍｇ／ｍＬ溶液としてシアノ水素化ホウ素ナトリウム０．５モル当量を添加した。反応混合物を、４４時間にわたって３７℃にて撹拌およびインキュベートした。シアノ水素化ホウ素インキュベーションの後に、反応混合物を、冷たい（２〜８℃）０．９％生理食塩水で１倍に希釈し、続いて、ＷＦＩ中の１００ｍｇ／ｍＬ溶液として水素化ホウ素ナトリウム１モル当量を添加し、３〜６時間にわたって２３℃にて未反応アルデヒドをキャッピングした。
【０２４１】
反応混合物を、０．４５〜５μｍプレフィルターに通して保持液容器中に移し、次いで、１００Ｋ  ＭＷＣＯ再生セルロース膜を使用する透析濾過により精製した。次いで、反応混合物を、０．１Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ９．０に対して３０倍に、および０．１５Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０に対して２０倍に透析濾過した。最終２０倍透析濾過を、５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０に対して行った。透析濾過したコンジュゲートを０．２μｍフィルターに通して濾過し、糖類含有量についてアッセイした。糖類分析に基づき、コンジュゲート溶液を、０．５ｍｇ／ｍＬの目標まで５ｍＭコハク酸塩／０．９％生理食塩水、ｐＨ６．０で希釈し、再び滅菌濾過（０．２μｍ）すると、最終バッチ濃縮物コンジュゲートが得られた。コンジュゲートを２〜８℃にて保存した。
【０２４２】
コンジュゲートのキャラクタリゼーションについては、実施例４を参照されたい。
【０２４３】
上記の議論および実施例は、単に、特定の実施形態の詳細な説明を提示するものであることが理解されるべきである。したがって、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更形態および等価形態を製造することができることが当業者に明らかにされるべきである。
【０２４４】
本特許出願に規定されているすべての学術論文、他の参考文献、特許および特許出願は、全体として参照により組み込まれるものとする。
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【図１】
0005523836.tif 000011
【図２】
0005523836.tif 000012
【図３】
0005523836.tif 000013