(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおいて筋力若しくは筋機能を増大若しくは保持、またはその喪失を予防するための医薬品の製造における、２５−ＯＨ  Ｄ３及びビタミンＤ３の使用。
【請求項２】
ヒトが、成人または高齢の成人である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
医薬品が、癌、ＡＩＤＳ関連悪液質、脳卒中、萎縮、筋力低下、多発性筋炎、筋萎縮性側索硬化症、ボツリヌス中毒、中心核ミオパチー、筋細管ミオパチー、自律神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、低カリウム血症、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、重症筋無力症、進行性筋萎縮、脊髄性筋萎縮症、脳性麻痺、伝染性単核症、帯状疱疹、ビタミンＤ欠乏、線維筋痛症、小児脂肪便症、副腎皮質ホルモン過剰症（クッシング症候群）、低コルチゾール（アジソン病）、原発性アルドステロン症（コーン症候群）および下痢症などの二次症状が原因の運動不足からなる群から選択される筋疾患または症状に羅患している患者用である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
２５−ＯＨ  Ｄ３及びビタミンＤ３を含む、ヒトにおいて筋機能若しくは筋力を増大若しくは保持、又はその喪失を予防するための医薬品。
【請求項５】
ヒトが、成人または高齢の成人である、請求項４に記載の医薬品。
【請求項６】
癌、ＡＩＤＳ関連悪液質、脳卒中、萎縮、筋力低下、多発性筋炎、筋萎縮性側索硬化症、ボツリヌス中毒、中心核ミオパチー、筋細管ミオパチー、自律神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、低カリウム血症、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、重症筋無力症、進行性筋萎縮、脊髄性筋萎縮症、脳性麻痺、伝染性単核症、帯状疱疹、ビタミンＤ欠乏、線維筋痛症、小児脂肪便症、副腎皮質ホルモン過剰症（クッシング症候群）、低コルチゾール（アジソン病）、原発性アルドステロン症（コーン症候群）および下痢症などの二次症状が原因の運動不足からなる群から選択される筋疾患または症状に羅患している患者用である、請求項４又は５に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３（カルシフェジオール、２５−ＯＨ  Ｄ３）を使用して、筋力、筋機能またはその両方を高めることに関する。任意に、ビタミンＤ（コレカルシフェロールおよび／またはエルゴカルシフェロール）を２５−ＯＨ  Ｄ３と併用してもよい。
【０００２】
［背景技術］
ビタミンＤ（エルゴカルシフェロールおよびコレカルシフェロールなど）とは、それぞれの生物活性によって定義される脂溶性化合物の総称である。ビタミンＤの欠乏によって、子どもではくる病、成人では骨軟化症が起こる。しかしながら、数ヶ月間にわたって１日あたりの推奨摂取量（すなわち、ビタミンＤ５〜１５μｇまたは２００〜６００ＩＵ）の１００倍を超えて慢性的に摂取すると、毒性が生じる可能性がある。ビタミンＤの場合、「毒性の閾値は体重１ｋｇあたり１日で５００〜６００ｍｃｇである。通常、成人はＲＤＡの３倍を超えて長期間消費すべきではない」（Ｇａｒｒｉｓｏｎ  ＆  Ｓｏｍｅｒ，  Ｔｈｅ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  ｐｇ．  ８２，  １９９７）。高カルシウム血症は、２５−ヒドロキシビタミンＤの血中濃度が３７５ｎｍｏｌ／Ｌを超えると生じることがある。最近になって、ビタミンＤの安全な上限レベルは少なくとも２５０μｇ／日（１０’０００ＩＵ）であることが確認された（Ｈａｔｈｃｏｃｋら  Ａｍ．Ｊ  Ｃｌｉｎ．  Ｎｕｔｒ．  ８５：６〜１８，  ２００７）。このような健康補助食品を摂取すると、２５−ヒドロキシビタミンＤの血中濃度が約２００ｎｍｏｌ／Ｌになることが明らかになっている。
【０００３】
ビタミンＤは、２５−ヒドロキシビタミンＤ（カルシフェジオール；２５−ＯＨビタミンＤ；２５−ＯＨ  Ｄ）を生成するのに肝臓でのヒドロキシル化が必要なプロホルモンの１つであり、この２５−ヒドロキシビタミンＤが腎臓や他の組織でさらにヒドロキシル化されて、ビタミンＤの活性ホルモン形態である１，２５−ジヒドロキシビタミンＤが生成される。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、血液中に放出され、ビタミンＤ結合タンパク質（ＤＢＰ）と結合し、標的組織まで運ばれる。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤとビタミンＤ受容体とが結合することで、この複合体が細胞核で転写因子として機能するようになる。
【０００４】
ビタミンＤ欠乏によって、骨吸収が促進されることがある。また、それによって、心臓血管系、免疫系、筋肉系の機能が調節されることもある。疫学的研究では、ビタミンＤ摂取とそれが血圧またはグルコース代謝におよぼす影響との関連性が見いだされている。ビタミンＤの活性は、副甲状腺ホルモンによる負のフィードバック制御下にある。
【０００５】
ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３は、ともに今まで医薬品として投与されてきている。ビタミンＤは、言うまでもなく、広く利用可能である。米国では以前、２５−ＯＨ  Ｄ３がオルガノン（Ｏｒｇａｎｏｎ）  ＵＳＡから「ＣＡＬＤＥＲＯＬ」という商品名で販売されていたが、現在はＦＤＡの販売中止対象薬の一覧に含まれている。これは、コーン油と２５−ＯＨ  Ｄ３を含有するゼラチンカプセルであった。
【０００６】
現在は、液状の２５−ＯＨ  Ｄ３が、スペインにてＦＡＥＳ  Ｆａｒｍａから「ＨＩＤＲＯＦＥＲＯＬ」という商品名で油性溶液として販売されている。
【０００７】
また、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３との組み合わせが、動物の飼料に用いられている。飼料用の２５−ＯＨ  Ｄ３は、ＤＳＭから「ＲＯＶＩＭＩＸ  ＨＹ−Ｄ」という商品名で市販されている。
【０００８】
５％〜５０％（ｗｔ／ｗｔ）の量で油に溶解された少なくとも２５−ＯＨ  Ｄ３と酸化防止剤、２５−ＯＨ  Ｄ３と油の液滴をカプセル化する作用剤、栄養添加剤（ビタミンＤ３など）を含む飼料プレミックス組成物が、Ｔｒｉｔｓｃｈら（米国特許出願公開第２００３／０１７０３２４号明細書）によって開示されている。このプレミックスを、家禽類、ブタ、イヌまたはネコ用の食品に添加してもよい。この組成物は、２５−ＯＨ  Ｄ３を酸化に対して安定させる。
【０００９】
２５−ＯＨビタミンＤ３とビタミンＤ３の組み合わせを動物用の飼料に添加することが、Ｓｉｍｏｅｓ−Ｎｕｎｅｓら（米国特許出願公開第２００５／００６４０１８号明細書）によって開示されている。特に、約１０μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇの２５−ＯＨビタミンＤ３と、約２００ＩＵ／ｋｇ〜約４，０００ＩＵ／ｋｇのビタミンＤ３を、ブタ用の飼料に添加する。この添加によって、ブタの骨強度が改善される。
【００１０】
２５−ＯＨビタミンＤ３とビタミンＤ３の組み合わせを家禽類用の飼料に添加して、脛骨軟骨発育不全症の影響を改善することが、Ｓｔａｒｋら（米国特許第５，６９５，７９４号明細書）によって開示されている。
【００１１】
Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎらの米国特許第５，０４３，１７０号明細書には、産卵鶏および老齢鶏の卵殻強度および下肢強度を改善するための、ビタミンＤ３と、１−α−ヒドロキシコレカルシフェロールまたは１α，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロールのいずれかとの組み合わせが開示されている。
【００１２】
Ｃｈｕｎｇらによる国際公開第２００７／０５９９６０号パンフレットには、ビタミンＤ３と２５−ヒドロキシビタミンＤ３の両方を含有する食餌を与えられた雌ブタで、全身の健康状態、体格、産仔数と健康、その他の生産パラメータが改善されることが開示されている。また、ヒト用の２５−ＯＨ  Ｄ３栄養補助食品が開示されているが、体重１ｋｇあたり５〜１５マイクログラムというその投与量の範囲（一人あたり３００〜９００マイクログラムという極めて高い一日投与量に相当）は極めて高い。
【００１３】
ＰＣＴ／ＥＰ０８／００６３５７号明細書には、仔ブタに２５−ＯＨ  Ｄ３を（妊娠した雌ブタの餌に混ぜて）出生前曝露すると、子孫の筋肉の発達がよくなることが開示されている。
【００１４】
本発明者らの知るところでは、従来技術は、２５−ＯＨビタミンＤ３または２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせをヒト用の薬として使用して、筋力、筋機能またはその両方を高めることについては、何ら教示または示唆していない。他の利点および改善点については、後述するか、あるいは本明細書の開示内容から自明であろう。
【００１５】
［発明の概要］
本発明によれば、２５−ＯＨ  Ｄ３で毎日または毎週治療すると、意外なことに同じ投与量のビタミンＤ３を摂取する場合に比して筋力および／または筋機能が改善されることが見いだされている。
【００１６】
よって、本発明の一態様は、２５−ＯＨ  Ｄ３を薬として用いて、ヒトの筋力および／または筋機能を高めることにある。この薬は、任意にビタミンＤをさらに含むものであってもよい。ヒトは、子どもや若者をはじめとして、誕生から成人まで、１８歳から８０歳まで、あるいは８０歳を超えるなど、どの年齢であってもよい。医薬組成物の形態と投与量ならびに、薬の製造方法についても開示する。
【００１７】
本発明の別の態様では、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせを使用して、ヒトの筋力および筋機能を高めることである。
【００１８】
任意に、２５−ＯＨ  Ｄ３と一緒にまたは別々に、ビタミンＤ３を投与してもよい。これについては、１日１回、１週間に１回または１ヶ月に１回投与してもよい。通常、投与期間は、筋力の変化をはっきりと確認できるように、少なくとも１ヶ月であり、好ましくは２ヶ月を超え、さらに好ましくは少なくとも４ヶ月である。筋力を測定するには、膝屈筋および伸筋力試験など、当該技術分野で認められている試験を使用してもよい。
【００１９】
別の態様では、有効量の２５−ＯＨ  Ｄ３を投与することで筋機能を高める方法が得られる。任意に、２５−ＯＨ  Ｄ３と一緒にまたは別々に、ビタミンＤを投与してもよい。これについては、１日１回、１週間に１回または１ヶ月に１回投与してもよい。筋機能は、反復座り立ちテスト、タイムアップアンドゴーテストなど、当該技術分野で認められている試験によって評価してもよい。
【００２０】
別の態様では、ビタミンＤ３と、２５−ＯＨ  Ｄ３と、薬学的に許容されるキャリアとを、筋力を高める量で含む、ヒトでの用途に適した医薬組成物が得られる。
【００２１】
さらに、本発明によれば、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせが、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３単独のどちらの存在とも関係のない多数の遺伝子をはじめとする、相乗数（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｎｕｍｂｅｒ）のビタミンＤ応答性骨格筋遺伝子を、相乗的に制御する（上方制御または下方制御のいずれか）ことが見いだされている。これは、実質的にすべてのビタミンＤが最初に２５−ＯＨ  Ｄに代謝されることを前提とし、現在のビタミンＤ代謝のモデルでは説明されていないため、意外な結果である。
【００２２】
本発明による組み合わせによって、以下の２つの大きな利点が得られる。
１）２５−ＯＨ  Ｄの迅速かつ相乗的な血漿応答が生じる。
２）予想外に顕著かつ長時間にわたる血漿２５−ＯＨ  Ｄレベルの定常化につながる。これらは、ビタミンＤ欠乏が原因となる筋障害の特に重要な治療目標すなわち、２５−ＯＨを筋組織に十分に供給するための最適以下のビタミンＤの状態と長期かつ安定した血漿濃度をすみやかに回復することである。
【００２３】
本発明の別の態様は、２５−ＯＨ  Ｄ３を含有し、好ましくはビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを含有する、筋力および筋機能を維持するのに適した、ヒトの消費用の食品、機能性食品、栄養補助食品または栄養補給食品である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】後肢負荷軽減（「ＨＵ群」）と処理群（ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３または組み合わせ）でのマウス遺伝子の発現の異なるプローブセットに関するベン図を示す。
【図２】２５−ＯＨ  Ｄ３処理群と、２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３の組み合わせを用いる処理群との間で、遺伝子の発現の異なるプローブセットに関するベン図を示す。
【図３】ビタミンＤ３処理群と、２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３の組み合わせを用いる処理群との間で、遺伝子の発現の異なるプローブセットに関するベン図を示す。
【図４】ＨＵ群と、２５−ＯＨ  Ｄ３およびビタミンＤ３の組み合わせ処理をほどこす群との間で、遺伝子の発現の異なる１７４５プローブセットの特徴抽出（ＧｅｎｅＧｏ  ＭｅｔａＣｏｒｅで実施）である。
【図５】２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３処理群における発現の異なるプローブセットと、選択した骨格筋遺伝子のプローブセットとに関するベン図を示す。
【図６】２５−ヒドロキシビタミンＤ３処理群における発現の異なるプローブセットと、選択した骨格筋遺伝子のプローブセットとに関するベン図を示す。
【図７】ビタミンＤ３処理群における発現の異なるプローブセットと、選択した骨格筋遺伝子のプローブセットとに関するベン図を示す。
【００２５】
本明細書および特許請求の範囲全体で使用する場合、以下の定義を適用する。
【００２６】
「ビタミンＤ」は、ビタミンＤ３（コレカルシフェロール）および／またはビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）のいずれかを示す。ヒトは、ビタミンＤ２（エルゴカルシフェロール）を生成できないが、これをビタミンＤ源として使うことはできる。ビタミンＤ２は、さまざまな植物によって合成可能であり、ビタミンＤに相当するものとしてサプリメントでビタミンＤに使用されることが多い。
【００２７】
「ビタミンＤ代謝物」は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３以外のビタミンＤの代謝物を意味する。
【００２８】
「２５−ＯＨ  Ｄ３」は、具体的には２５−ヒドロキシビタミンＤ３を示す。
【００２９】
「２５−ＯＨ  Ｄ」は、血漿中に見られる主要な循環型であるビタミンＤ２またはビタミンＤ３のいずれかの２５−ヒドロキシル化代謝物を示す。
【００３０】
「予防する」には、疾患の寛解、症候の重篤度の低減、早期介入、疾患の発症期間の延長を含むことを想定しており、患者がその疾患にもはや羅患しないとか、何の症候も経験しないとかいった状況に限定されることを意図したものではない。
【００３１】
別の実施形態では、多数回分の投与量のビタミンＤまたはビタミンＤ３と、ある投与量の２５−ＯＨ  Ｄ３とからなるキットが得られる。これらを瓶やブリスター包装、あるいはバイアルラックなどの容器に封入しておいてもよい。さらに、ある投与量として組成物をヒトに投与するための指示もキット内に含まれている。
【００３２】
別の実施形態では、２５−ＯＨ  Ｄ３が、単独またはビタミンＤとの組み合わせで、ヒトが消費するのに適した食品、機能性食品、栄養補助食品または栄養補給食品中、健康な筋力または筋機能を保つための有効成分である。２５−ＯＨおよび／またはＤ３の投与量は、医薬品製品に存在する場合と同じであってもよいが、好ましくは、それよりも少ない範囲になりやすい。栄養補助食品および栄養補給食品は、錠剤、カプセルまたは他の便利な剤形の形であってもよい。食品は、飲料または食品であってもよく、必要があれば、他のビタミン、ミネラルなど、栄養的に効果的な他の化合物を含有してもよい。
【００３３】
ビタミンＤ欠乏は、特に高齢者の個体群や、年齢とは関係なく慢性的に動けない人々の間で多く見られる症状である。これは、太陽光にあたる時間の全般的な不足、体がビタミンＤを作ったりこれを効率的に代謝したりする機能が衰えたこと、あるいは他の多数の原因による場合がある。ビタミンＤ欠乏による１つの結果に、筋力および／または筋機能の喪失がある。よって、本発明の一態様は、高齢者の個体群においてビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３との組み合わせを使用し、健康な筋力および筋機能を維持し、その喪失を予防および／またはこれを回復することにある。本明細書全体で使用する場合、「高齢者の」という表現は、６５歳を超えた個体、好ましくは７０歳を超え、さらには８０歳を超えた個体すら包含することを想定している。
【００３４】
別の実施形態では、この２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤの組み合わせが、ビタミンＤ欠乏または不足が特徴である筋力およびまたは筋機能の病気を発症する危険性のある人々で、健康な筋力および筋機能を維持し、その喪失を予防および／またはこれを回復するのに適している。これには、特に閉経後の女性（すなわち４５歳前後以上）や４５歳前後以上の男性をはじめとする成人を含み得る。これは特に、伝統的に長い衣服を着用する、日常的に屋外に出ない、太陽光にあたるときにサンスクリーン製剤を使用する、あるいは地理的に赤道から北または南に離れた太陽光がそれほど強くない地域で暮らす人々など、自然の太陽光を大量に浴びていない個体には、特に適している。
【００３５】
本発明の別の態様は、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを投与することで、（小児脂肪便症、スプルー症候群または短腸症候群に羅患しているなど）吸収不良症候群を抱え、そのためにビタミンＤ欠乏の危険性のある人において、健康な筋力および筋機能を維持し、その喪失を予防および／またはこれを回復するための方法である。
【００３６】
本発明の別の態様は、ビタミンＤを効率よく処理して２５−ヒドロキシビタミンＤに変えることのできない肝機能障害のある人において、その人にビタミンＤと２５−ヒドロキシビタミンＤ３の組み合わせを提供することで、健康な筋力および筋機能を維持し、その喪失を予防および／またはこれを回復するための方法である。
【００３７】
また、本発明の組成物は、高齢者（８０歳以下）および極めて高齢者（８０歳以上）、特に入院介護施設（病院、養護ホーム、リハビリ施設、老人ホームなど）にいる人や、筋萎縮のある人において、筋量を保持する上で有益である。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、２５−ＯＨ  Ｄ３を使用して、高齢者の筋力を維持またはその衰えを予防する方法である。筋力の衰えも、高齢者が転倒する主な原因の１つであり、病院で起こる転倒率の高さにつながっていることもある。生理的予備力が低下したが、依然として日常活動（歩行、入浴、排泄機能など）はできる高齢者では、数日間程度でも床上安静後に筋力が急激に衰えて、個々の機能が長期間にわたって失われることがある。仮にこの喪失が最終的には回復したとしても、筋肉を回復させるには衰えさせる過程よりもかなり長い時間がかかるため、リハビリには費用のかかる膨大な介入が必要となる。
【００３９】
本発明の組成物は、高齢者ではないかもしれないが、別の症状が原因で動くことができず筋量が落ちた人で、筋量を保持および／または増やす目的でも有益である。『Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｇｅｒｉａｔｒｉｃｓ』第２版：（ｐ３１６〜３１８）に説明されているように、完全に活動しなくなると、筋力は１日あたり５％ずつ低下する。若い男性ですら、床上安静後には１日あたり１．０％〜１．５％（または１週間あたり約１０％）ずつ筋力が落ちる。
【００４０】
このため、本発明の組成物は、運動量の低下により筋量が落ちた人々あるいは、動くことすらできない人にとって有益である。ここでの目標は筋量が落ちないように保護することであるため、本発明を実施するにあたって運動量が低下した原因は問題ではない。たとえば、運動量の低下が、外傷、脳卒中、ギプス包袋、パーキンソン病、多発性硬化症、重症筋無力症によるものであってもよいし、あるいはクロイツフェルト・ヤコブ病が原因であってもよい。このように、本発明の別の態様は、対麻痺または四肢麻痺の個体に本発明の化合物を投与することにある。
【００４１】
本発明の組成物は、悪液質またはサルコペニアに羅患した人々にとっても有益である。悪液質は、癌やＡＩＤＳと同時羅患する「体萎縮」症候群である。骨格筋萎縮を誘発する他の症候群または症状に、鬱血性心疾患、慢性閉塞性肺疾患、肝疾患、飢餓、火傷などがある。サルコペニアは、筋機能の年齢に伴う衰えと関連する別の症状（悪液質および萎縮とは区別される）である。正確な原因は分かっていない。
【００４２】
また、本発明は、筋力が低下した人に利益を与えることに関する。筋力の低下は、疲労の物理的部分である（医療）。筋力が低下する場所は、中枢、神経、末梢である。中枢の筋力低下は、全身での全体としての消耗であるのに対し、末梢での低下は個々の筋肉の消耗である。神経低下は、その間のどこかである。
【００４３】
筋力低下は、神経支配の問題のこともあれば、筋肉そのものが原因となることもある。後者のカテゴリには、多発性筋炎ならびに、筋萎縮性側索硬化症、ボツリヌス中毒、中心核ミオパチー、筋細管ミオパチー、自律神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、低カリウム血症、運動ニューロン疾患、筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、重症筋無力症、進行性筋萎縮、脊髄性筋萎縮症、脳性麻痺、伝染性単核症、帯状疱疹、ビタミンＤ欠乏、線維筋痛症、小児脂肪便症、副腎皮質ホルモン過剰症（クッシング症候群）、低コルチゾール（アジソン病）、原発性アルドステロン症（コーン症候群）および下痢症などの他の筋肉障害が含まれる。
【００４４】
［剤形］
ビタミンＤおよび２５−ＯＨ  Ｄ３は、どのような供給源から入手したものであってもよく、その組成物も従来の技術を用いて調製してもよい。通常、ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方の結晶を、加熱攪拌しながら（別々にまたは一緒に）油に溶解させる。好ましくは、油を容器に移して加熱する。その後、油の温度を維持または経時的に上昇させながら、ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方を容器に入れる。組成物を攪拌して、ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方の結晶を溶解させる。油に入れる前に、製粉および／または篩過によって結晶の大きさを小さくし、溶解しやすくしておいてもよい。組成物の攪拌は、かき回し、容器の回転、混合、均質化、再循環または超音波処理によって実施してもよい。好ましくは、油を容器に入れて約８０℃〜約８５℃の温度まで加熱し、大きさを揃えた結晶を容器に入れ、中身をかき回して結晶を油に溶解させる。
【００４５】
「油」は、ババス油、ココナッツ油、コフネヤシ油、ムルムル脂、パーム核油またはホシダネヤシ油など、食用油、脂質または脂肪のいずれであってもよい。油は、天然油、合成油、半合成油またはこれらの組み合わせであってもよい。天然油は、どのような供給源に由来するものであってもよい（動物、植物、真菌、海洋など）；合成または半合成油は、都合のよい技術で製造してもよい。好ましくは、油は、植物中鎖トリグリセリド、主にカプリル酸およびカプリン酸の混合物である。組成物は、任意に、たとえば、薬学的に許容される酸化防止剤、保存剤、溶解剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤または緩衝剤、湿潤剤、これらの組み合わせなどの１種類以上の他の好適な成分を含むものであってもよい。上記は、薬学的に許容されるキャリアの例である。
【００４６】
好適な酸化防止剤としては、トコフェロール、混合トコフェロール、天然または合成供給源由来のトコフェロール、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ローズマリー抽出物のような天然酸化防止剤、没食子酸プロピル、ヒト用医薬品の製造に用いられる他の任意の酸化防止剤があげられる。好ましくは、酸化防止剤がトコフェロールである。好適な保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、安息香酸、これらの組み合わせがあげられる。好適な溶解剤としては、アルコール、塩素化炭化水素、これらの組み合わせなどの無機溶媒または有機溶媒があげられる。好適な界面活性剤は、パルミチン酸アスコルビル、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、これらの組み合わせなど、アニオン系、カチオン系または非イオン系であってもよい。好適なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、クエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸−リン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム、これらの組み合わせがあげられる。好適な湿潤剤としては、グリセロール、ソルビトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、これらの組み合わせがあげられる。
【００４７】
油組成物を形成したら、これを他のさまざまな有用な組成物に取り込むことができる。そのうちのいくつかを、以下にあげておく。たとえば、エマルションを形成してもよく、これを任意にカプセル化または噴霧乾燥させてもよい。上述した非水性組成物を水性組成物と組み合わせることで、多岐にわたるエマルションを調製できる。エマルションは、どのようなタイプであってもよい。好適なエマルションとしては、水中油滴型エマルション、油中水滴型エマルション、無水エマルション、固体エマルション、マイクロエマルションがあげられる。エマルションの調製には、都合のよい任意の技術を使用してもよい。エマルションは、水性組成物と非水性（油など）組成物を含有し、後者は、油組成物の総重量に対して約３重量％〜約５０重量％の量で油に溶解されたビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方を（別々にまたは一緒に）含む。本明細書で使用する場合、「水性組成物」および「水性相」は同義に用いられる。通常、エマルションは約２０％〜約９５％の水性組成物と、約５％〜約８０％の非水性組成物とを含み得る。しかしながら、好ましくは、エマルションが約８５％〜約９５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の水性組成物と、約５％〜約１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の非水性組成物とを含有する。都合のよいことに、非水性組成物が液滴として水性組成物中に分散していてもよい。たとえば、液滴の平均直径が水性組成物中で約５００ｎｍ未満であってもよい。都合のよいことに、液滴の平均直径が約１５０ｎｍ〜約３００ｎｍである。
【００４８】
特に有利な実施形態では、エマルションは、後にエマルションをさらに処理する（噴霧乾燥など）際に、油組成物のカプセル化を容易にするカプセル化剤を含有する。カプセル化剤は、油組成物をカプセル化できる食用物質であれば何でもよい。好ましくは、カプセル剤が主にコロイド状物質である。このような物質としては、デンプン、動物供給源由来のタンパク質（ゼラチンを含む）、植物供給源由来のタンパク質、カゼイン、ペクチン、アルギン酸塩、寒天、マルトデキストリン、リグニンスルホン酸塩、セルロース誘導体、糖質、糖類、ソルビトール、ゴム、これらの組み合わせがあげられる。
【００４９】
好適なデンプンとしては、植物デンプン（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ＆  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹのＣＡＰＳＵＬ（登録商標）またはＨＩ−ＣＡＰ（登録商標）など）、他の食品用化工デンプン、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、デンプンがＣＡＰＳＵＬ（登録商標）化工植物デンプンである。動物供給源由来の好適なタンパク質としては、ゼラチン（ウシゼラチン、ブルーム強度の異なるブタゼラチン（Ａ型またはＢ型）、魚ゼラチンなど）、脱脂乳タンパク質、カゼイン塩、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、動物タンパク質がゼラチンである。植物供給源由来の好適なタンパク質としては、ジャガイモタンパク質（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ  Ｐｒｅｒｅｓ  Ｓｏｃｉｅｔｅ  Ａｎｏｎｙｍｅ，  Ｌｅｓｔｒｅｍ，ＦｒａｎｃｅのＡＬＢＵＲＥＸ（登録商標）など）、マメタンパク質、ダイズタンパク質、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、植物タンパク質がＡＬＢＵＲＥＸ（登録商標）ジャガイモタンパク質である。デキストロース当量の異なる好適なマルトデキストリンとして、マルトデキストリン５、マルトデキストリン１０、マルトデキストリン１５、マルトデキストリン２０、マルトデキストリン２５、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、マルトデキストリンが、マルトデキストリン１５である。好適なセルロース誘導体として、エチルセルロース、メチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、これらの組み合わせがあげられる。好適な糖類として、ラクトース、スクロースまたはこれらの組み合わせがあげられる。好ましくは、糖類がスクロースである。好適なゴムとして、アカシア、ローカストビーン、カラギーナン、これらの組み合わせがあげられる。好ましくは、ゴムがアカシアゴムである。
【００５０】
エマルションがカプセル化剤を含む場合、このカプセル化剤を都合のよい技術で水に分散させ、水性相を形成してもよい。水性相は、選択した成分の特性に応じて、溶液であっても混合物であってもよい。選択した成分の分散には、均質化、混合、乳化、再循環、静的混合、超音波処理、かき混ぜ、加熱またはこれらの組み合わせをはじめとする都合のよい技術を用いればよい。その後、得られる水性相の粘度を、必要に応じて水を加えて調整してもよい。エマルションの水性組成物は、非水性組成物に関して上述したものを含むがこれに限定されるものではない、他の好適な物質を任意に含むものであってもよい。好ましくは、水性組成物は、カプセル化剤、成膜剤、可塑剤、保存剤、酸化防止剤またはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。好適な保存剤として、メチルパラベン、プロピルパラベン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、これらの組み合わせがあげられる。好適な酸化防止剤として、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、クエン酸、これらの組み合わせがあげられる。
【００５１】
好ましくは、水性相が、オクテニルスクシニルデンプン（ＣＡＰＳＵＬ（登録商標））、マルトデキストリン、アスコルビン酸ナトリウムなどの食品用化工デンプンを含有する。別の好ましい水性相は、ジャガイモタンパク質（ＡＬＢＵＲＥＸ（登録商標））、マルトデキストリン２０、アスコルビン酸ナトリウムを含有する。選択した成分を水に溶解させるには、都合のよい技術、好ましくはかき混ぜを使用してもよい。混合物を、好ましくはこれが均一で塊のないものになるまで均質化する。好ましくは、約５０℃〜約７５℃の温度で均質化を実施する。その後、得られる水性相の最終粘度を、好ましくは約２５０ｃｐ〜約４５０ｃｐ、一層好ましくは約３００ｃｐ〜約４００ｃｐ、なお一層好ましくは約３８５ｃｐの所望の粘度に調整してもよい。
【００５２】
エマルションを形成するには、均質化、ロータ−ステータ剪断、高圧剪断およびキャビテーション、高速「カウリング」または剪断攪拌、これらの組み合わせをはじめとする任意の手段で、非水性組成物と水性相を乳化してもよい。エマルションの容量および粘度については、好ましくは、乳化後に水を加えて調整してもよい。好ましくは、非水性組成物および水性組成物を均質化によって乳化する。好ましくは、エマルションは、鉱物、遷移金属またはペルオキシドを含有しないものとする。
【００５３】
上述したように、他の有用な組成物、特に噴霧乾燥粉末などのカプセル化油の製造時に、エマルションを取り込むかまたは利用してもよい。通常、カプセル化油は、油組成物と、油組成物をカプセル化するカプセル剤とを含み、この場合の油組成物は、油に溶解されたビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３またはその両方を、油組成物の総重量に対して約３重量％〜約５０重量％の量で含有する。カプセル化油の製造には、噴霧乾燥、フリーズドライ、流動床乾燥、トレイ乾燥、吸着、これらの組み合わせをはじめとする従来の技術による上述したエマルションの乾燥など、都合のよい任意の技術を用いればよい。好ましくは、カプセル剤を含有する上記の水性相を有するエマルションを噴霧乾燥してカプセル化油を生成する。噴霧乾燥のパラメータは、最終的なカプセル化油に望ましい物理的特徴に左右される。このような物理的パラメータとしては、粒度、粉末の形状とフロー、水分含有量があげられる。好ましくは、油が、カプセル化油の総重量に対して約３０重量％未満、約２０重量％未満、約１０重量％未満または約５重量％未満の量である。カプセル化油は流動性に優れたものでなければならず、ビタミンＤ３および／または２５−ＯＨ  Ｄ３が組成物全体に均一に分散しなければならない。都合のよいことに、カプセル化油が粉末である。他の好適な添加剤をカプセル化油に加えてもよい。このような添加剤の１つが、カプセル化油の流動性を高めるための二酸化ケイ素などのフロー剤であってもよい。
【００５４】
この組成物は、錠剤、カプセル（硬質または軟質など）または注射液（油またはエマルションなど）の形で提供できるものである。これらを１日の単回用量ごとに包装してもよい。
【００５５】
［投与量］
毎日．２種類の有効成分を別々に投与する場合の本発明による組成物は、ビタミンＤまたは２５−ＯＨ  Ｄ３を、約１μｇ〜約５０μｇ、好ましくは約５μｇおよび２５μｇの量で含有する。あるいは、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の両方を含む１日の単回投与量に、各有効成分を、約１μｇ〜約５０μｇ、好ましくは約５μｇおよび２５μｇの量で含有する。
【００５６】
ビタミンＤ対２５−ＯＨ  Ｄ３の用量比については、約５０：１〜約１：５０であってもよく、一層好ましくは約２５：１〜約１：２５、なお一層好ましくは約６：１〜約１：６であってもよい。
【００５７】
別個の複数の投与量を単一のキット（または容器）に梱包してもよい。たとえば、１日の投与量３０組を、両方の活性成分を別々に分けて（すなわち別々の６０の投与量）キットを構成してもよいし、混合（すなわち両方の有効成分を含有する３０の投与量）して構成してもよい。この投与量をヒトに投与するための指示をキットに入れておいてもよい。
【００５８】
毎週．１週間の単回投与量には、ビタミンＤまたは２５−ＯＨ  Ｄ３を約７μｇ〜約３５０μｇ、好ましくは約３５〜１７５μｇの量で含有する。あるいは、１週間の単回投与量が、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の両方をそれぞれ約７μｇ〜約３５０μｇ、好ましくは約３５〜１７５μｇの量で含有してもよい。ビタミンＤ対２５−ＯＨ  Ｄ３の用量比については、約５０：１〜約１：５０であってもよく、一層好ましくは約２５：１〜約１：２５、なお一層好ましくは約６：１〜約１：６であってもよい。
【００５９】
毎月．１ヶ月の単回投与量には、ビタミンＤまたは２５−ＯＨ  Ｄ３を３０μｇ〜約１５００μｇ、好ましくは約７５μｇ〜約５００μｇの量で含有する。あるいは、１ヶ月の単回投与量が、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の両方をそれぞれ、３０μｇ〜約１５００μｇ、好ましくは約７５μｇ〜約５００μｇの量で含有してもよい。１週間または１ヶ月の投与量を１組、２組、３組、４組、５組、６組、７組、８組、９組、１０組、１１組または１２組でキットを構成してもよい。
【００６０】
ビタミンＤ対２５−ＯＨ  Ｄ３の用量比については、５０：１〜約１：５０の範囲とし、一層好ましくは約２５：１〜約１：２５、なお一層好ましくは約６：１〜約１：６の範囲とする。
【００６１】
［遺伝子解析］
この組み合わせの生物活性の増加を実証するために、ビタミンＤ、２５−ＯＨ  Ｄ３、組み合わせに曝露した筋肉組織の遺伝子チップ解析を実施した。詳細については、マウス後肢懸垂モデルを用いて実施例２にあげておく。ここから分かるように、２つの組み合わせを送達すると、個々に投与した場合よりも活性化または制御される（上方制御または下方制御のいずれか）遺伝子数が劇的に増加する。現時点で、ビタミンＤの大部分が摂取および肝臓での処理時に２５−ＯＨ  Ｄに変換されると考えられているため、これは意外な結果である。
【００６２】
このように、本発明の別の態様は、ビタミンＤと２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせを人に投与することを含む、ビタミンＤおよび２５−ＯＨ  Ｄ応答性ヒト筋肉関連遺伝子を活性化または制御するための方法である。
【００６３】
以下の非限定的な実施例は、本発明を一層よく例示するために示すものである。
【００６４】
［実施例］
［実施例１］
［治験］
［製剤］
［材料および方法］
２５−ＯＨ  Ｄ３の噴霧乾燥製剤を粉末として提供した。要約すると、２５−ＯＨ  Ｄ３およびＤＬ−α−トコフェロールを中鎖トリグリセリドの油に溶解させた後、化工デンプン、スクロース、アスコルビン酸ナトリウムの水溶液に乳化した。このエマルションを二酸化ケイ素の存在下にて噴霧乾燥器で微粒化した。水分含有量（ＬＤＯ）が４％未満になったら、得られた粉末を回収し、４００μｍで篩過した。これをアルミ製の袋に包装して封止した後、１５℃未満の乾燥した場所で保管し、製造から１２ヶ月以内に使用した。
【００６５】
３種類のロットを製造した。詳しく説明すると、アンカー型攪拌羽根を備えるＦＲＹＭＩＸプロセスユニットで、７０℃にて真空下で１２０分間混合してマトリクスを生成した。
・１７．３００ｋｇの水（ＷＢＩ）
・１３．４６０ｋｇの食品用化工デンプン（ＣＡＰＳＵＬ  ＨＳ）
・３．２７０ｋｇのスクロース
・０．７３０ｋｇのアスコルビン酸ナトリウム
【００６６】
プロペラスターラーを備える二重壁容器で、８２℃にて３５分間混合して、油相を調製した。
・０．５５０ｋｇのＢＥＲＧＡＢＥＳＴ  ＭＣＴ油６０／４０
・０．０４９ｋｇのカルシフェジオール（ＨＹ−Ｄ  ＵＳＰ）
・０．１８３ｋｇのＤＬ−α−トコフェロール
【００６７】
油相をＦＲＹＭＩＸプロセスユニット内のマトリクスに移し、内部のコロイドミル（６０分、７０℃）で事前乳化させた。この事前乳化物を高圧ホモジナイザに循環させた（２０分）。７０℃での粘度が６０ｍＰａ・ｓ〜９０ｍＰａ・ｓのエマルションを高圧ポンプでスプレーノズルまで送った。流動化剤として、二酸化ケイ素（ＳＩＰＥＲＮＡＴ  ３２０  ＤＳ）を塔に供給した。噴霧乾燥パラメータを以下にあげておく。
【００６８】
【表１】
0005593550.tif 000002
【００６９】
３ロットの２５−ＯＨ  Ｄ３それぞれについて、２５−ＯＨ  Ｄ３含有量約０．２５％の噴霧乾燥粉末平均８．４ｋｇを得た。製剤の他の成分は、食品用化工デンプン７３．２％、スクロース１７．６％、アスコルビン酸ナトリウム４．０％、中鎖トリグリセリド３．０％、二酸化ケイ素１．０％、ＤＬ−α−トコフェロール１．０％である。
【００７０】
ビタミンＤ３の噴霧乾燥製剤を粉末として提供した。要約すると、ビタミンＤ３およびＤＬ−α−トコフェロールを中鎖トリグリセリドの油に溶解させた後、化工デンプン、スクロース、アスコルビン酸ナトリウムの水溶液に乳化した。このエマルションを二酸化ケイ素の存在下にて噴霧乾燥器で微粒化した。水分含有量（ＬＯＤ）が４％未満になったら、得られた粉末を回収し、篩過して大きな塊を取り除いた。これを１５℃未満の乾燥した場所で保管し、製造から１２ヶ月以内に使用した。
【００７１】
［治験］
［被験者］
インフォームドコンセントを用いて健康な閉経後の女性（５０〜７０歳）を募集し、以下の基準でふるい分けた。血清２５−ＯＨ  Ｄ３が２０ｎｍｏｌ／Ｌ〜５０ｎｍｏｌ／Ｌ、肥満度指数１８ｋｇ／ｍ２〜２７ｋｇ／ｍ２、血圧１４６／９５ｍｍ  Ｈｇ未満、血清カルシウム２．６ｎｍｏｌ／Ｌ未満、空腹時グルコース１００ｍｇ／ｄｌ未満、１週間に３回を超えて激しい運動をしない、高血圧症の治療歴なし、骨代謝に影響する高用量ビタミンＤまたはカルシウムサプリメントまたは薬物（ビスホスホネート、カルシトニン、エストロゲン受容体調節因子、ホルモン補充療法、副甲状腺ホルモン）の使用歴なし、研究中は「日当たりの良い」場所に足を運ばない。
【００７２】
被験者を７つの処理群（すなわち、毎日、毎週、一用量でのボーラス、組み合わせ用量でのボーラス）に無作為に振り分けた。各群を被験者５名ずつで構成した。彼らをスイスのチューリッヒで冬季に４ヶ月間追跡する。
【００７３】
［臨床研究］
目的は、ヒトに投与したビタミンＤ３および２５−ＯＨ  Ｄ３の薬物動態特性を研究および比較することであった。両方の物質を等モル量で調査した。レジメンは、２５−ＯＨ  Ｄ３を２０μｇ／日（またはそれに相当する量を週ベースで）とする。２５−ＯＨ  Ｄ３の既存の最大基線濃度が５０ｎｍｏｌ／Ｌになったら、Ｃａ２＋恒常性の乱れが観察される範囲に被験者が近づくとは思われない。比較目的で、等モル量のビタミンＤ３または２５−ＯＨ  Ｄ３のいずれかを投与する必要がある。ビタミンＤ３の投与に関しては、バックグラウンドのばらつきに影響されず、参加者にとっての有効用量を提供するのに十分な用量であると思われる。
【００７４】
毎日：１２０回投与
１．  ２５−ＯＨ  Ｄ３    ２０μｇ
２．  ビタミンＤ３    ２０μｇ（８００ＩＵ）
毎週：１６回投与
３．  ２５−ＯＨ  Ｄ３    １４０μｇ
４．  ビタミンＤ３    １４０μｇ（５６００ＩＵ）
ボーラス：単回投与
５．  ２５−ＯＨ  Ｄ３    １４０μｇ
６．  ビタミンＤ３    １４０μｇ（５６００ＩＵ）
ボーラス：組み合わせ投与
７．  Ｄ３および２５（ＯＨ）Ｄ３  １４０μｇ（５６００ＩＵ）＋１４０μｇ
【００７５】
ハードゲルカプセル（瓶入り）には、噴霧乾燥ビタミンＤ３または２５−ＯＨ  Ｄ３のいずれかが１カプセルあたり２０μｇまたは１４０μｇのいずれかで含まれている。各投与量を朝食時に経口摂取する。研究期間は、「毎日」および「毎週」群で４ヶ月である。「ボーラス」群に登録された被験者は、２回目の研究での来訪時に単一投与量を経口摂取する。
【００７６】
この投与量を摂取後、さまざまな時点で被験者から試料を入手して、２５−ＯＨ  Ｄ３の血漿濃度（ピークおよび定常状態など）を求める。スクリーニング目的と基線値を確立するために、研究への参加前に血液試料を採取し、臨床検査室で、血清中のビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３、カルシウム、クレアチニン、アルブミン、空腹時グルコースを測定する。研究１週目の月曜日に、血清ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の薬物動態；血清マーカー（すなわち、ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３、カルシウム、クレアチニン、アルブミン、ＰＴＨ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロール、ｂＡＬＰ、空腹時グルコース）；尿マーカー（すなわち、カルシウム、クレアチニン、ＤＰＤ）を２４時間かけて評価する。１週目の残りの日と２週目の月曜日の１日試料を採取して、血清ビタミンＤ３および２５−ＯＨ  Ｄ３、血清マーカー（すなわち、カルシウム、クレアチニン、アルブミン）、尿マーカー（すなわち、カルシウム、クレアチニン）を評価する。３、５、７、９、１１、１３、１５週目の月曜日にも評価を継続する。１６週目の月曜日には、試料を採取して、血清ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３；血清マーカー（すなわち、ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３、カルシウム、クレアチニン、アルブミン、ＰＴＨ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＡＬＰ、トリグリセリド、ＨＤＬ、ＬＤＬ、総コレステロール、ｂＡＬＰ、空腹時グルコース）；尿マーカー（すなわち、カルシウム、クレアチニン、ＤＰＤ）の薬物動態を評価する。
【００７７】
以下の標準的なパフォーマンス検査で筋力および筋機能を評価した。１週目の２回目の来訪（基線）と研究の最後における１５回目の来訪時に、膝の屈筋力および伸筋力、反復座り立ち試験、タイムアップアンドゴー（ＴＵＧ）。筋力については、膝の伸筋および屈筋をニュートン（キロポンド）単位で測定した。ＴＵＧは、筋力、歩行速度、バランスを含む機能的運動性を示す指標の１つであり、秒単位で評価される。反復座り立ちは機能試験であり、秒単位で測定される。
【００７８】
［結果］
表１に、２５−ＯＨ  Ｄ３で毎日および毎週治療後（１日あたり２０μｇ；１週間あたり１４０μｇ）またはビタミンＤ３で毎日および毎週治療後（１日あたり２０μｇ；１週間あたり１４０μｇ）の筋力の変化を示す。治療期間は４ヶ月とした。値については、４ヶ月後の変化対基線（治療開始前）としてあげておく。
【００７９】
【表２】
0005593550.tif 000003
【００８０】
表２は、ビタミンＤ３で毎日および毎週治療（１日あたり２０μｇ；１週間あたり１４０μｇ）した場合との比較で、２５−ＯＨ  Ｄ３で毎日および毎週治療後（１日あたり２０μｇ；１週間あたり１４０μｇ）の筋力の相対変化を示す。治療期間は４ヶ月とした。値は、２５−ＯＨ  Ｄ３対ビタミンＤ３の基線での力、年齢、肥満度指数に合わせて調整した、ＧＬＭ（一般線形モデル）の最小二乗平均を改善率の％単位で示したものである。
【００８１】
【表３】
0005593550.tif 000004
【００８２】
表３は、２５−ＯＨ  Ｄ３で毎日および毎週治療後（１日あたり２０μｇ；１週間あたり１４０μｇ）またはビタミンＤ３で毎日および毎週治療後（１日あたり２０μｇ；１週間あたり１４０μｇ）の筋機能の変化を示す。治療期間は４ヶ月とした。値は、４ヶ月後対基線（治療開始前）でタスクを終えるのに必要な時間（単位は秒）で示したものである。
【００８３】
【表４】
0005593550.tif 000005
【００８４】
表４は、ビタミンＤ３で毎日および毎週治療（１日あたり２０μｇ；１週間あたり１４０μｇ）した場合との比較で、２５−ＯＨ  Ｄ３で毎日および毎週治療後（１日あたり２０μｇ；１週間あたり１４０μｇ）の筋機能の相対変化を示す。治療期間は４ヶ月とした。値は、２５−ＯＨ  Ｄ３対ビタミンＤ３の基線での機能、年齢、肥満度指数に合わせて調整した、ＧＬＭ（一般線形モデル）の最小二乗平均をタスクを終えるのに必要な時間の％単位で示したものである。
【００８５】
【表５】
0005593550.tif 000006
【００８６】
これらのデータから、２５−ＯＨ  Ｄ３で毎日または毎週治療すると、意外なことに同じ投与量のビタミンＤ３を摂取する場合に比して筋力および筋機能がかなり大きく改善されることが分かる。２５−ＯＨ  Ｄ３での治療後、被験者は治療前やビタミンＤ３で治療した場合よりも膝の屈伸がよくできるようになった。２５−ＯＨ  Ｄ３対ビタミンＤ３で治療した被験者における筋力の相対的な改善は３〜１８％であったが、これは臨床的に意義があり、なおかつあらゆる年齢層、特に閉経後の女性の被験者で有意な利益を表すエフェクトサイズである。
【００８７】
標準的なパフォーマンス検査（反復座り立ち、タイムアップアンドゴー）で判断した筋機能は、同じ投与量のビタミンＤ３での治療に比して、２５−ＯＨ  Ｄ３で治療した被験者のほうがよかった。２５−ＯＨ  Ｄ３での治療後、治療対象となった被験者は、治療前やビタミンＤ３での治療時に比して、短時間でパフォーマンス検査を終えた。２５−ＯＨ  Ｄ３対ビタミンＤ３での治療後における筋機能の相対的な改善は８〜１４％であったが、これは臨床的に意義があり、なおかつあらゆる年齢層、特に閉経後の女性の被験者で有意な利益を表すエフェクトサイズである。
【００８８】
さらに、４つの下肢試験（膝伸長、膝屈曲、タイムアップアンドゴー、反復座り立ち）に対する未調整の解析によって、２５−ＯＨ  Ｄ３で治療した被験者のほうが、同じ投与量のビタミンＤ３で治療した被験者よりも下肢の力と機能を維持または改善する尤度が２．８倍高いことが明らかになった。この効果は、統計的に有意かつ臨床的に意義があり、骨格筋の筋力と機能の維持または改善を目指した治療に２５−ＯＨ  Ｄ３が好適であることを示している。
【００８９】
［実施例２］
［遺伝子チップデータ］
この研究の目的は、尾部懸垂が動物の負荷軽減した後肢の骨格筋萎縮につながる、ＢａｌｂＣマウスを用いる骨格筋萎縮モデルにおいて、ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３、ビタミンＤ３と２５−ＯＨ  Ｄ３の組み合わせによる効果を試験することであった。当初、このモデルはヒトの宇宙飛行を模するためにラットで確立され、他の科学技術分野でも骨格筋質量または骨の喪失の研究に一般に用いられている。結果は、サルコペニア（加齢に伴う骨格筋の質量と力の変性喪失）または骨格筋の運動不足（骨折、外科手術または外傷による長期の床上安静後など）などのヒトでの症状を示すものとみなされる。
【００９０】
方法  本発明者らの研究のために、研究の最初に９ヶ月齢のメスのＢａｌｂＣマウスを無作為に１群あたり動物１０匹で４群に分けた。
１．対照群：後肢負荷軽減（ＨＵ）
２．ビタミンＤ３群：ＨＵ＋ビタミンＤ３での処理
３．２５−ＯＨ  Ｄ３群：ＨＵ＋２５−ＯＨ  Ｄ３での処理
４．ビタミンＤ＋２５−ＯＨ  Ｄ３群：ＨＵ＋ビタミンＤ３および２５−ＯＨ  Ｄ３（組み合わせ）での処理
【００９１】
動物を７日間にわたって特別なケージに入れておいた。すべてのマウスを別々に分けて収容し、水と餌をいつでも自由に摂取できるようにしておいた。すべての動物を実験開始時と切開３時間前の２回、経管栄養で処理した。
１．対照群はビヒクル（ゼラチン）を摂取
２．Ｄ３群はビタミンＤ３（５０μｇ／ｋｇ／ｂｗ）を摂取
３．２５−ＯＨ  Ｄ３群は２５−ＯＨ  Ｄ３（５０μｇ／ｋｇ／ｂｗ）を摂取
４．組み合わせ群はビタミンＤ３＋２５−ＯＨ  Ｄ３（５０＋５０μｇ／ｋｇ／ｂｗ）を摂取
【００９２】
研究終了時、腓腹筋を採取し、以後の解析用に液体窒素で直接凍結させた。遺伝子発現の変化を確認し、腓腹筋のｍＲＮＡレベルのシフトを解析するために、本発明者らは、このアレイタイプ用にＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから入手したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  ４３０−２マイクロアレイをバージョン２７（２００８年１２月）のアノテーションファイルと一緒に用いた。アレイには、「３４，０００を超える十分にキャラクタライズされたマウス遺伝子およびＵｎｉＧｅｎｅクラスター由来の３９，０００を超える転写物と変異体の発現レベルを分析するための４５，０００のプローブセット」を含む（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、２００９）。
【００９３】
一般に用いられているＴｒｉｚｏｌプロトコールを使って全ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを分光光度解析によって定量化した。全ＲＮＡ試料の完全性もＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで定性的に評価した。次に、１サイクルのｃＤＮＡ合成用にＲＮＡを調製した。このステップには、ポリ−ＡＲＮＡ対照を使用して、真核標的標識プロセス全体をモニタするための外来の陽性対照を得る。第１のｃＤＮＡ合成を実施し、第２鎖ｃＤＮＡ合成後、二本鎖ｃＤＮＡからｃＤＮＡをクリーンアップする。次に、ビオチン標識ｃＲＮＡを合成し、クリーンアップし、分光光度計を用いて２６０／２８０ｎｍで定量化する。最適なアッセイ感度を得るには、Ｇｅｎｅチッププローブアレイへのハイブリダイゼーション前にｃＲＮＡ標的を断片化しておくことが重要である。断片化後、チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  ４３０−２チップ）でプローブをハイブリダイズする。チップを洗浄し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの流体ステーションにて染色し、遺伝子チップスキャナでスキャンする。次に、Ｇｅｎｅｄａｔａ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  ５．０：  Ｒｅｆｉｎｅｒ  Ａｒｒａｙ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｔ）から入手したソフトウェアを用いてさらに解析するために、データをスキャナから転送する。データの解釈とパス解析については、ＧｅｎｅＧｏ  Ｍｅｔａｃｏｒｅパッケージ（Ｖ５．２  ｂｕｉｌｄ  １７３８９）のオンライン版を用いて実施した。
【００９４】
一層精密なアレイで、品質に関する事項についてマイクロアレイデータを評価し、問題のある測定にフラグを立てる。これによって、生のマイクロアレイデータを以後の統計解析用に自動的に前処理してまとめるための一組の正規化アルゴリズムと有効な簡略化方法が得られる。
【００９５】
マイクロアレイデータを解析したところ、ＨＵ群とＨＵ＋処理群（ビタミンＤ３、２５−ＯＨ  Ｄ３または組み合わせ）とで発現の異なる遺伝子（ｍＲＮＡ）が明らかになった。
【００９６】
本発明者らによる重要な所見は、以下のとおりである。
１．２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤ３とを組み合わせると、２５−ＯＨ  Ｄ３よりも多くの遺伝子のプローブセットが変化する。結果として、ビタミンＤ３（表）よりも多くの遺伝子のプローブセットが変化する。
ａ．ＨＵ対照群と比較して、組み合わせ処理（Ｄ３＋２５−ヒドロキシビタミンＤ３）を実施した群では、２５−ＯＨ  Ｄ３だけで処理を実施した群（１２６３）よりも有意に多くの遺伝子のプローブセットが変化した（１７４５）。
ｂ．ＨＵ対照群と比較して、２５−ＯＨ  Ｄ３で処理した群では、ビタミンＤ３での処理を実施した群（３８５）よりも有意に多くの遺伝子のプローブセットが変化した（１２６３）エラー！参照ソース見つからず）
【００９７】
２．２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３の組み合わせ処理では、ビタミンＤ３での処理よりも２５−ＯＨ  Ｄ３での処理のほうが、共通の遺伝子の発現の異なるプローブセットが多い。
ａ．２５−ＯＨ  Ｄ３群で発現の異なる約６１％の遺伝子のプローブセットが、２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３群でも発現が異なる（１２６３のうち７６９、図２）
ｂ．ビタミンＤ３群で発現の異なる約４６％の遺伝子のプローブセットが、２５−ＯＨ  Ｄ３＋ビタミンＤ３群でも発現が異なる（３８５のうち１７７、図３）
ｃ．図４、図６、図７に示すように、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤ３の組み合わせ処理が、筋肉発達過程の遺伝子に最も有意な影響がある。
ｄ．関与する遺伝子は、骨格筋における以下のメインカテゴリのうちの一部である：筋肉収縮、筋肉発達、筋肉維持（表）。
【００９８】
３．骨格筋の選択した遺伝子のプローブセットについては、２５−ＯＨ  Ｄ３とビタミンＤ３での組み合わせ処理で、ビタミンＤ３のみまたは２５−ＯＨ  Ｄ３のみでの処理より発現が多い（表）。
【００９９】
【表６】
0005593550.tif 000007
【０１００】
【表７】
0005593550.tif 000008
【０１０１】
【表８】
0005593550.tif 000009
【０１０２】
［特定の選択した遺伝子に関する考察］
ヒトの寿命までの間、骨格筋は運動やトレーニングなどの異なる刺激に対してのみならず、運動不足にも永久に順応しつづける。骨格筋は、肥大または萎縮という形で応答する。骨格筋の発達と順応は複雑なプロセスである。簡単に説明すると、サテライト細胞−いわゆる骨格筋の幹細胞−が刺激を受け取り、未分化の筋芽細胞を形成する。これが融合して筋管−新たな筋肉繊維が形成される。
【０１０３】
骨格筋の移動と順応のためには、収縮が重要である。骨格筋の収縮は、サルコメアに組織された２種類の主な骨格筋繊維であるミオシン（太いフィラメント）とアクチン（細いフィラメント）の相互滑走である。ミオシンとアクチンは、顕微鏡で観察すると骨格筋の横紋構造をなしている。
【０１０４】
細いフィラメントと太いフィラメント以外に、骨格筋にはタイチンおよびネブリンもあり、さらにトロポミオシンなどのサルコメアタンパク質もある。骨格筋の機能は、アクチンフィラメントとミオシンフィラメントならびに、α−アクチニン、ミオメシン、Ｍ−タンパク質、タイチン、デスミンおよびミオシン結合タンパク質などのアクセサリータンパク質の厳密な配置に左右される。
【０１０５】
ミオメシンとＭ−タンパク質がタイチンおよびミオシンフィラメント系を結合でき、太いフィラメントを集合サルコメアに取り込む際にミオメシンが何らかの役割を果たすのではないかと示唆されている。タイチンは、巨大なタンパク質であり、筋原線維で連続フィラメント系を形成する。横紋筋の優勢な中間フィラメントタンパク質はデスミンであり、筋原線維の完全性と配列の維持に寄与している。
【０１０６】
いくつかのタンパク質成分（ミオシン重鎖、アクチン、トロポミオシンなど）ならびにサルコメアタンパク質（タイチン、デスミンなど）の変異が、筋疾患／ミオパチーと関連している。
【０１０７】
トロポミオシン１、α（Ｔｐｍ１）：
ウィキペディアに記載されているように、
「トロポミオシンは、アクチンの働きを調節するアクチン結合タンパク質である。これは特に、筋収縮のために重要である。トロポミオシンは、トロポニン複合体と一緒に筋繊維のアクチンと連動し、ミオシンの結合を調節することで筋収縮を調節する。安静時の筋肉では、トロポミオシンがアクチン上のミオシン結合部位をふさぎ、トロポニンＴ（トロポミオシン結合トロポニン）およびトロポニンＩ（抑制性トロポニン）によってこの位置に「係止」される。筋小胞体からカルシウムが放出されると、カルシウムがトロポニンＣ（カルシウム結合トロポニン）と結合する。これによってトロポミオシンがアクチンから「離脱」され、結合溝から外れて動くことができるようになる。これでミオシンの頭部はアクチンの結合部位に結合できる状態になる。ミオシンの頭部が１つ結合すると、それによってトロポミオシンが完全にずれて別のミオシンの頭部が結合できるようになり、筋肉の短縮および収縮が開始される。細胞質からカルシウムがポンプ輸送され、カルシウムレベルが正常値に戻ると、トロポミオシンが再びアクチンと結合して、ミオシンが結合するのを防止する。」
【０１０８】
トロポミオシン１αは、発達と筋機能（筋収縮など）に必要な遺伝子である。通常、筋特異的トロポミオシンはアクチン−ミオシン相互作用を調節し、よって収縮する。コードされたタンパク質は、横紋筋の優勢トロポミオシンを形成するα螺旋鎖の一タイプであり、筋収縮時にアクチンおよびミオシンのカルシウム依存性相互作用を調節するようトロポニン複合体との連動でも機能する（ＮＣＢＩ）。
【０１０９】
【表９】
0005593550.tif 000010
【０１１０】
［２５−ヒドロキシビタミンＤ３処理群からの例］
ミオシン、軽鎖キナーゼ（ＭＹＬＫ）：
ウィキペディア：
「Ｍｙｌｋはヒト遺伝子である。この遺伝子は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリに属する筋肉メンバであり、カルシウム／カルモジュリン依存性酵素であるミオシン軽鎖キナーゼをコードする。このキナーゼはミオシン調節軽鎖をリン酸化して、収縮活性を得るためのアクチンフィラメントとの間のミオシン相互作用を容易にする。この遺伝子は、平滑筋と非筋肉アイソフォームの両方をコードする。また、３’領域のイントロンにおける別のプロモーターを使用して、この遺伝子はテロキンをコードする。テロキンは、平滑筋にて独立に発現され、未リン酸化ミオシンフィラメントを安定化させるよう機能するミオシン軽鎖キナーゼのＣ末端と配列が同一の小タンパク質である。第３番染色体のｐ腕に偽遺伝子が存在する。カルシウム／カルモジュリン依存性酵素の４つのアイソフォームを生成する４つの転写変異体ならびに、テロキンの２つのアイソフォームを生成する２つの転写物が同定されている。別の変異体も同定されているが、全長転写物が欠けている。」
【０１１１】
【表１０】
0005593550.tif 000011
【０１１２】
［ビタミンＤ３＋２５−ヒドロキシビタミンＤ３処理群からの例］
ウィキペディア：
ミオメシンは、Ｍ線の一部であるエンドライン（）タンパク質である。Ｍ線でミオシンの太いフィラメントを結合する。
【０１１３】
【表１１】
0005593550.tif 000012
【０１１４】
ウィキペディア：
「タイチンは、コネクチンとしても知られ、横紋筋組織の収縮において重要なタンパク質である。タイチンは、横紋筋に豊富に存在する大きなタンパク質である。このタンパク質は、２つの領域に分けられる。
Ｎ末端Ｉ帯は、分子の弾性部分であり、プロリン、グルタミン酸、バリン、リシンを豊富に含むＰＥＶＫ領域の両側に、免疫グロブリンドメインが直列した２つの領域を含む。
Ｃ末端Ａ帯は、タンパク質の定規として作用すると考えられており、免疫グロブリンとフィブロネクチンの反復領域が混在し、キナーゼ活性を有する。
Ｎ末端Ｚ盤領域およびＣ末端Ｍ線領域は、それぞれサルコメアのＺ線およびＭ線と結合するため、タイチン分子１つがサルコメアの長さの半分にまでおよぶ。タイチンは、筋肉関連タンパク質への結合部位も含むため、筋細胞における収縮機構の会合のための接着型枠として機能する。また、染色体の構造タンパク質としても同定されている。タイチンのＩ帯、Ｍ線、Ｚ盤領域にはかなりのばらつきが存在する。Ｉ帯領域のばらつきは、タイチンアイソフォームごとの弾性の違いを生み、したがって、タイプの異なる筋肉の弾性の違いを生む。同定された多くのタイチン変異体のうち、完全な転写情報が入手可能な５つについて説明する。」
【０１１５】
タイチンは、
Ｚ線領域：テレソニンおよびα−アクチニン
Ｉ帯領域：カルパイン−３およびオブスクリン
Ｍ線領域：ミオシン結合タンパク質Ｃ、カルモジュリン１、ＣＡＰＮ３、ＭＵＲＦ１
を含む多くのサルコメアタンパク質と相互作用する。
【０１１６】
【表１２】
0005593550.tif 000013
【０１１７】
［実施例３］
［マウスモデル］
この研究の目的は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの持久運動能試験および筋肥大モデルにおいて２５−ＯＨ  Ｄ３の作用を試験することであった。腓腹筋を除去すると、筋力改善と脚力につながる複数の機序によってヒラメ筋および足底筋で代償性肥大が誘発されることが、当該技術分野において認識されている。
【０１１８】
動物１０匹からなる２群を麻酔し、動物の左後肢を固定した。すべての動物に鎮痛剤を与えた。腓腹筋上の皮膚に小さな切開創を作った。腓腹筋と腱全体を露出させた。腓腹筋の両方の頭部を、下にある無傷の筋肉から慎重に切り離し、神経と血管を破断しないよう注意を払った。絹の縫合糸で皮膚を閉じ、動物をケージに戻した。麻酔が切れた後、動物はケージの中で何ら問題なく直接動くことができた。動物に経管栄養で１日投与量５０μｇ／ｋｇの２５−ＯＨ  Ｄ３を与え、対照群にはビヒクルを与えて３週間処理した。研究終了時、齧歯類用のトレッドミルですべての動物の持久運動能を試験した。
【０１１９】
２５−ＯＨ  Ｄ３で処理した動物で、対照動物よりもヒラメ筋と足底筋の湿重量が増えた（表８）。さらに、筋重量を体重との比較でマウスの体重に正規化すると、２５−ＯＨ  Ｄ３で処理した動物に、ヒラメ筋−足底筋重量／体重比の増加が認められた（表８）。筋肉および全下肢部分のコンピューター断層撮影法測定によって、２５−ＯＨ  Ｄ３での処理が骨格量を増すことが確認された（表８）。２５−ＯＨ  Ｄ３を摂取した動物に、対照マウスに比して走行距離と走行時間が長くなることで示された持久運動能の増加が認められた（表８）。
【０１２０】
表８は、投与量５０μｇ／ｋｇ／日の２５−ＯＨ  Ｄ３または偽薬（対照）で３週間処理したマウスの筋重量、筋重量／体重比、全下肢および筋肉断面積、走行距離、走行時間を示す。
【０１２１】
【表１３】
0005593550.tif 000014
【図１】
0005593550.tif 000015
【図２】
0005593550.tif 000016
【図３】
0005593550.tif 000017
【図４】
0005593550.tif 000018
【図５】
0005593550.tif 000019
【図６】
0005593550.tif 000020
【図７】
0005593550.tif 000021