(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）感染症の治療及び／または予防のための薬剤の製造における、窒素酸化物生成組成物の使用であって、
前記薬剤が、局所適用のためのものであって、且つ適用の直前の、または原位置における混合のために、（ｉ）亜硝酸塩、ならびに、（ｉｉ）酸および／または還元剤である酸性化剤からなる少なくとも２つの成分として提供され、
混合するまでは窒素酸化物が実質的に生成しないように、前記窒素酸化物生成のための必須の反応物が、前記成分中に別々に配置される、
窒素酸化物生成組成物の使用。
【請求項２】
第１の必須反応物が、製薬品として許容される亜硝酸塩であり、第２の必須反応物が、製薬品として許容される酸性化剤である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
必須反応物が、有機酸である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤が、鼻腔道、粘膜、整形外科的ピン創傷、褥瘡、カテーテル関連穿刺、火傷、及び表面外傷からなる群より選択される部位への投与のために適合する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤のｐＨが、混合直後に５未満である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
混合直後のｐＨが、４未満である、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が、アルカリ金属またはアルカリ土類金属亜硝酸塩を、該薬剤の０．００５乃至１５体積％の量で含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤が、酸性化剤を０．５乃至２２体積％の量で含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記薬剤が、混合された際に、水性である、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬剤が、溶液、洗浄液、エマルジョン、懸濁液、コロイド、泡沫、スプレー、ゲル、クリーム、軟膏、チンキ剤、ソフトワックス、ローション、包帯、及びパッチからなる群より個別に選択される形態である、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
前記薬剤の第１成分が、局所適用に好適な半固体であり、第２成分が、これによって反応物の接触が可能になるゲルを覆って適用するために好適な、必須の反応物を含むマトリックスを備えたパッチである、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
第２成分が、蟻酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、安息香酸、酒石酸、サリチル酸、アスコルビン酸、及びアスコルビルパルミテートからなる群より選択される、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
クエン酸と、亜硝酸ナトリウム及び亜硝酸カリウムのいずれかとが、１．２：１乃至２．５：１の重量モル比で使用される、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記酸及び亜硝酸塩が、１．５：１乃至２：１の比で使用される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
患者のメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）感染症の治療及び／または予防のための薬剤の製造における、窒素酸化物生成組成物の使用であって、
前記薬剤が、局所適用のためのものであって、且つ適用の直前の、または原位置における混合のために、（ｉ）亜硝酸塩、ならびに、（ｉｉ）酸および／または還元剤である酸性化剤からなる少なくとも２つの成分として提供され、
混合するまでは窒素酸化物が実質的に生成しないように、前記窒素酸化物生成のための必須の反応物が、前記成分中に別々に配置され、
前記薬剤が、感染の非耐性株の治療のために好適な、少なくとも一つの抗生物質との共投与用である、
使用。
【請求項１６】
前記抗生物質が、前記感染をＮＯ／ＮＯ２で治療するまでは前記感染がこれに対して耐性であったような抗生物質である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記抗生物質が、ペニシリンまたはセファロスポリンである、請求項１５または１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬剤の成分のための少なくとも２つの容器を備える、請求項１乃至１７のいずれか一項に定義される薬剤のためのディスペンサーであって、前記成分の同時分配に適合させた、ディスペンサー。
【請求項１９】
一つ以上の容器中に任意にプロペラントを有する、創傷への前記薬剤の適用のためのポンプ式スプレーである、請求項１８に記載のディスペンサー。
【請求項２０】
一方の容器が還元酸、例えばアスコルベートまたはアスコルビンパルミテートを含む、鼻腔スプレーの分配のための請求項１８または１９に記載のディスペンサー。
【請求項２１】
請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の使用のために好適であって、且つ局所適用に好適なパッチであって、水以外の少なくとも１つの必須反応物を含む、親水性であって水を含まないマトリックスを含み、ここでマトリックス中に存在しないあらゆる反応物の水性溶液、または水の添加により、窒素酸化物生成組成物が十分に構成される、パッチ。
【請求項２２】
乾燥粉末の形態である２つの成分が存在し、前記粉末が水の存在下で混合された際に前記窒素酸化物生成組成物が形成される、請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記薬剤の成分が、別々に配置された乾燥粉末として提供され、前記粉末が水の存在下で混合された際に窒素酸化物生成組成物が形成される、請求項２２に定義される使用のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、抗生物質耐性生物の治療、及びこうした治療における使用に好適な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】  抗生物質両方に耐性の細菌の出現は、臨床的状況において増加している問題である。耐性細菌、例えばメチシリン耐性Staphylococcus aureus (MRSA)により感染症に罹患した患者は、しばしば入院が長引き、及び／または隔離処置を受けがちであり、前記のいずれもが診療費用の増大の一因となり、患者にとっては不便且つ苦痛なものである。こうした感染症は、生命に危険を及ぼす恐れがあり、実際に多数抗生物質耐性細菌の流行が増加することにより死亡率に上昇をきたしている。この点について、「抗生物質耐性細菌」なる語には、メチシリン耐性Staphylococcus aureus (MRSA)として既知の生物及び、抗生物質療法に単一耐性または多数耐性（singly or multiply resistant）である、別の生物及び／または株が含まれる。それ自体が多数抗生物質耐性でありうるMRSAとは、これ以降、特記のない限り、別の単一及び多数抗生物質耐性生動または細菌の意味を含む。【０００３】  例えば鼻腔中または創傷中におけるMRSAの限局性感染症の排除のための既存のプロトコルは、ムピロシンまたはネオマイシンなどの抗生物質の使用に依存する。クロルヘキシジンは、日用の皮膚または頭皮の洗浄剤として適用可能である。フシジン酸またはリファンピシン等の全身性抗生物質が使用可能であるが、これらの使用は感染株の感受性に依存し、ある場合には観察される副作用のレベルに依存する。近年では、ムピロシン耐性生物が、入院患者から単離された生物に２２乃至５９％の高レベルで見出されている。
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  したがって、この社会においては、こうした危険性を有する恐れのある生物の治療的制御のための、従来の抗生物質に依存しない、代替的局所剤が緊急に求められている。また、ムピロシンは、感染した病巣に使用しうる一方、大きな領域、例えば火傷または褥瘡には適当でない。
【０００５】  抗生物質に対するMRSAの機構は複雑であり、幾つかの成分を含む。例えば、MRSAの細胞壁は、ペニシリンを該細菌の壁に結合させ、これによりペニシリンがそのターゲットに到達することを妨げる、ペニシリン結合性タンパク質（PBP）、例えばPBP1、PBP2、PBP2'、及びPBP2aを含む点において独特である。したがって、ペニシリンは、MRSAの成長に影響を及ぼすことも、これを殺傷することもない。更に、MRSA生物の細胞壁は通常厚く、これにより毒素との接近を妨げる。
【０００６】  したがって、抗生物質耐性生物のための代替治療が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  驚くべきことに、我々はここに、MRSAが、非常に低レベルであってさえ、酸性化亜硝酸塩の反応生成物に感受性であることを見出した。
【０００８】  従って、第１の態様において、本発明は、皮膚の薬剤耐性感染症の治療及び／または予防のための薬剤の製造における、窒素酸化物生成組成物の使用であって、前記薬剤が、局所適用のためのものであって、且つ適用の直前または原位置における混合のために、少なくとも２つの成分として提供され、混合するまでは窒素酸化物が実質的に生成しないように、前記窒素酸化物生成のための必須の要素もしくは反応物が、前記成分中に別々に配置される使用を提供する。
【０００９】  「薬剤」なる語は、ここに使用されるところでは、感染症に対して静止作用または殺傷作用を有する物質に関する。細菌の場合には、例えばこうした物質は一般的に抗生物質である。「薬剤耐性」及び「多数薬剤耐性」なる語は、共同の意味を有する。
【００１０】  窒素酸化物生成組成物は、典型的には２つまたは３つの必須反応物を含み、これらは一般的に、亜硝酸塩と、酸及び／または還元剤とであろう。亜硝酸塩もしくはその好適なソースを一方の成分中に提供し、酸及び／還元剤を他方に提供して良い。酸及び還元剤の両方が存在する場合には、これらは薬剤の１つもしくは２つの成分中に別々にまたは一緒に提供されて良いが、使用前に亜硝酸塩を枯渇させることを避けるためには、亜硝酸塩と共に提供すべきでない。「必須の」反応物が、それ無しには窒素酸化物が生成されないものであること、及びこうした必須反応物が、窒素酸化物生成反応物を生成しうる、如何なる成分との組み合わせとしても提供すべきでないことが、認識されるであろう。この点について、必須反応物には水が含まれ、このため成分としての水がなくても亜硝酸塩と酸とを混合することが可能である。しかしながら、水は、潮解するか、あるいはまた成分を汚染する恐れがあり、ひいては反応を起こしうるため、これは一般的には好ましくない。
【００１１】  「要素」なる語が、周期表の元素という意味ではなく、窒素酸化物を生成させるための要素という意味で使用されていることは、認識されるであろう。
【００１２】  窒素酸化物の生成を達成するためには反応物は十分な濃度で提供される必要があるが、このレベルは、本発明の目的のためにはNO発生は低レベルで十分なので、低くてよい。酸が使用される場合には、これは最終薬剤に、少なくとも混合の直後には約４．５以下のｐＨを与えるようなレベルで提供されるべきである。しかしながら、ｐＨ要件については、以下により詳しく述べる。
【００１３】  混合は、好ましくは、該組成物により発生する窒素の酸化物を出来る限り利用するために、原位置で行われる。それにもかかわらず、例えば、クリームまたは軟膏またはハンドウォッシュの調製等においては、使用前に混合することもまた想定される。更に、該薬剤は、反応物を必ずしも含まない一つ以上の更なる成分を含んでも良いが、例えばゲル化剤等の、最終薬剤の別の構成要素を含んでも良い。
【００１４】  迅速な窒素酸化物製造を促進するために、成分を良く混合することが望ましい場合がある一方で、別の場合には、拡散により反応物が混合することに頼り、これによって該組成物が活性な時間がより長くなるように、前記成分を互いに接触させるのみで十分である。
【００１５】  使用前に窒素酸化物の幾分の発生が起こることが想定されるが、原位置で生成させうる窒素酸化物の量を最大化するために、こうした事態を最小限にするように条件を選択することが好ましい。
【００１６】  別の態様においては、本発明は、製薬品として許容されるNO/NO2ソースを含む、ヒトまたは動物の皮膚上での多数抗生物質耐性細菌の治療及び／または予防のための局所薬剤の製造における使用であって、前記ソースが皮膚への薬剤の局所投与の際に、多数抗生物質耐性細菌を殺傷する、及び／またはその成長を妨げる量で存在する使用を提供する。
【００１７】  別の態様においては、本発明は、薬剤耐性感染症の治療または予防における使用のための、窒素酸化物生成組成物を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】  酸化窒素(NO)は、抗菌作用及び創傷治癒作用を有することが周知であり[WO 95/22335; Hardwick et al., (2001), Clin. Sci., 100, 395-400参照]、更に多数の外因性条件の治療において有用であることが判明している。
【００１９】  酸化窒素は、身体内の内皮及びニューロンにおいて、並びに活性化マクロファージにおいて合成される。皮膚表面では、低レベルのNOが、汗中に存在する亜硝酸塩と皮膚の僅かに酸性のpHとの組み合わせによって産生する。如何なる作用方法が抗菌剤として／創傷治癒においてはたらくのか正確にはわかっていないが、NOが細菌のDNAを破壊し、更に金属結合酵素及びリボヌクレアーゼを阻害する幾つかのレベルで作用することが推測される。
【００２０】  酸化窒素は、酸と亜硝酸塩の反応によりもっとも簡便に製造される。これは結果として亜硝酸の分子形態の産生をもたらすが、これは水の分子と三酸化二窒素の分子とに容易に分離し、次いで後者は分離して酸化窒素及び二酸化窒素を生成する。反応は下記の通りである。
【００２１】
【化１】
0005634655.tif 000002
【００２２】  例えばアスコルビン酸の還元剤の存在下においては、酸化窒素を生成する前記三酸化二窒素の反応が、より効率よく起き、例えば下式のように表すことができる。
【００２３】
【化２】
0005634655.tif 000003
【００２４】  亜硝酸及び、続いてNO/NO2は、例えば特に生成する塩が不溶性である場合に亜硝酸塩に対する酸の作用によって適切に生成させても良い。例は、二亜硝酸バリウムと硫酸との反応であり、これは不溶性の硫酸バリウム及び亜硝酸の溶液を生じ、これらはその後以上に例示したように分解しうる。
【００２５】  酸化窒素の少なくとも１つのフラクションを提供する、あらゆる適切な窒素酸化物ソースを本発明において使用して良い一方で、一般的に、上記反応の一つ以上に従って幾らかの窒素酸化物が産生されるのが好ましいことが認識されるであろう。
【００２６】  上記反応の内容において、製薬品として許容されるNO/NO2ソースが、治療用として有用な量で局所から適用される場合には、いずれかまたは両方の化合物を生成するものであることが認識されるであろう。好適なソースを、以下により詳細に説明するが、一般的には、気体生成物の無駄な発生を回避するために原位置でまたは適用の僅か前に混合される、亜硝酸塩及び酸が含まれる。実際に、該反応は一般的に数分で完了に至り、NO及びNO2の溶液それ自体が安定でないため、これは調製の直後に使用しなくてはならない。しかしながら、驚くべきことに、いったん適用されると、２４時間後でさえも測定可能なほどの有効性を依然有することが判明している（以下の実施例２参照）。
【００２７】  WO 95/22335には、上述のもの等の酸性化亜硝酸塩が、感受性の(すなわち非耐性の)細菌のための局所的抗菌療法として、皮膚上に酸化窒素(NO)及び二酸化窒素（NO2）を遊離させるために使用可能なことが開示されている。
【００２８】  治療剤としてのNO/NO2は、抗生物質よりも一般的に特異性が低く、ターゲット生物は、幾つかの部位にて、及び／または幾つかの機構によって、影響を受けうる。これらは、例えば酸化またはニトロソ化（nitrosation）による、DNA及びRNA合成の途絶、ひいては細胞複製の阻害、細胞呼吸酵素の阻害、並びに酵素、タンパク質、及び脂質膜の破壊及び不活性化を含みうる。
【００２９】  この点について、耐性生物は高度に複雑化（sophisticated）しており、多くの場合、抗生物質などの既知の全ての特定的且つ広範な抗菌剤に耐えるために多数の機構を発達させている。更に、これらの細菌は、殺傷されることを避ける、別の多数の付加的方法を発展させており、これには細胞が低透過性であること及び厚い壁を有することが含まれる。実際に、当業者は、MRSAまたは他の耐性生物に感染した、汚染された創傷は、該創傷が治癒するまではそのままになりがちであり、すなわち、打つ手がないと考える。
【００３０】  しかしながら、我々はここに、生体内と試験管内との療法の研究を通して、例えばメチシリン耐性Staphylococcus aureusが、特に亜硝酸塩ソースと酸、好ましくは有機酸との皮膚上での混合によって、酸性化亜硝酸塩から誘導された場合に、NO/NO2を用いて容易に殺傷されうることを示した。MRSAの他のあらゆる抗生物質を用いる治療は、困難であって、時に不可能であるため、NO及びNO2がMRSA感染症の治療において有効なことは、全く予想外である。
【００３１】  驚くには当たらないが、MRSAは、本発明の組成物のように単純なものに感受性であり、今日までに試験した全ての株は、少なくとも感受性株と同程度に感受性である。実際に、驚くべきなのは、MRSAの幾つかの株は、実際にMSSA(メチシリン感受性S. aureus)よりも感受性であり、このため、MRSA感染症の治療及び予防において、本発明は特に有用になる。
【００３２】  驚くべきことに、我々は、生体内における有効性を、生物がそれに対して耐性である、まさにその抗生物質の使用によって向上させうることを見出した。例えば、フシジン酸耐性MRSAを含む臨床状況において、完全な回復は、局所的な酸性化亜硝酸と全身的なフシジン酸との組み合わせを使用して得られた。したがって、本発明の組成物の更なる利益は、これにより治療を受けた患者を、例えばペニシリン及びセファロスポリンなどの、前記患者が以前には反応しなかった、別の抗生物質で治療しても良いことである。
【００３３】  上記のように、NOの抗生物活性の機構は、完全には説明されていないが、これが他の抗生物質と相乗的に作用することを推測する理由はなかった。例えばfem要素での妨害は、例えば、MRSAを抗生物感受性状態に回復させがちであることが知られている(Ehlert, K., Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus, Curr. Pharm. Des., 1999; 5 : 45-55)が、NOは、細菌DNAの破壊、及び金属酵素及びリボヌクレアーゼの阻害と、前に関連していたのみである。
【００３４】  したがって、好ましい態様において、本発明は、抗生物耐性感染症の治療及び／または予防における、窒素酸化物生成組成物の使用であって、前記治療または予防が、前記感染症の非耐性株に対する使用のために好適な抗生物質の使用を更に含むことを特徴とする使用を提供する。特に、前記抗生物質は、NO/NO2で治療するまでは該感染症がこれに対して耐性であったものである。前記抗生物質は、NO生成ソースと同時に、または相次いで投与して良く、あるいまた、所望により局所的または全身的に投与して良い。
【００３５】  本発明による治療または予防に適当な薬剤耐性感染症は、少なくとも１つの既知の抗生物質に対して耐性である、あらゆる真菌、細菌、または原生動物感染症であって良い。しばしば、こうした感染症は、一つ以上の抗生物質に耐性であり、こうした多数耐性感染症は、本発明の好ましいターゲットである。更に好ましいのは、staphylococci等の細菌であり、S. aureus、とりわけ、メチシリン耐性S. aureus (MRSA)の一般名で認識されるクラスのものが特に好ましいターゲットである。本発明が有用に応用可能な別の感染症には、バンコマイシン耐性腸球菌であってよい。
【００３６】  真菌ターゲットには、カンジダ及び白癬が含まれる一方で、アメーバ感染症は、原生動物感染症ターゲットの例である。
【００３７】  NOを使用する治療の更なる利益は、これが、感染症を治療しようとする皮膚または創傷中に迅速に拡散することができる気体化合物であって、従来の抗生物質よりも迅速に皮膚または創傷中に拡散することであるが、このことは溶液中の比較的大きな分子に依存する傾向がある。創傷感染症の予防は、これが致死性であり得る全身性の感染症を予防するために、特に重要である。
【００３８】  ここに使用されるように、「皮膚」なる語には、例えば粘膜、並びに創傷及び外傷などの切り傷が含まれる。更に、本発明においては、NO及び／またはNO2なる語はまた、別の窒素中間体を含む。本発明が主として皮膚上での使用に関するにも関わらず、別の身体表面に見出される抗生物耐性生物が、本発明の組成物によって殺傷されるか、またはその成長が阻害されることがあり得る。非身体表面の消毒を、以下に説明する。
【００３９】  MRSAを含む耐性細菌に対する、本発明の化合物の広範な活性は、これが手の消毒剤として、及び外科手術創傷の治療において、及び別の危険性の高い環境、例えば火傷、免疫異形個体において、及び、例えば看護婦及び医療スタッフなどの無兆候性キャリアの治療において、使用可能であることを意味する。
【００４０】  試験管内テストにより、全コアグラーゼ陰性Staphylococcus aureus生物が、NOに感受性であることが立証された。特に驚くべきことは、MRSAが実際に、通常の感受性株よりもNOに対して感受性になりうることである。さらには、NOは驚くほど少量で有効である。したがって、MRSAの殺傷または制御に十分な量が存在することを前提とすれば、大量の気体NOを製造することは必須でない。したがって、本発明の組成物は、例えば創傷に、または鼻腔中において、または単に標準的なハンドウォッシュとして使用して良い。
【００４１】  更に一般的に、本発明の組成物は、耐性生物による感染症を治療または予防するために適当な、あらゆる方法で適用して良い。適当な製剤は、治療しようとする位置または領域、及び所望の特徴に依存するであろう。
【００４２】  本発明による治療に好適な皮膚状態には、例えば、整形外科的ピン創傷、褥瘡、カテーテル関連穿刺、火傷、及び表面外傷が含まれる。ピン部位の周辺及びカテーテル関連感染症などの皮膚穿通は、挿入の前と除去の後との両方に治療または予防して良い。
【００４３】  特に、本発明の組成物は、特に：
1)開放創に（驚くべきことに、本発明の、クリームなどの製剤が、こうした創傷に対して刺激性でないことが判明しているため）；
2)危険性のある患者の医療という状況で、MRSA予防のため；
3)従来の抗生物質と共に相乗剤として（驚くべきことに、酸化窒素療法に続いて、従来の抗生物質が如何なる残留感染症も排除しうることが判明しているため）；及び
4)酸性レベルが、ｐＨ約２未満であることが必要でない状況において；
使用して良い。
【００４４】  実験条件下では、pH 3.5にて1 mmolの亜硝酸塩を用いてインキュベートすることにより、MRSA成長が阻害され、生物が殺傷される。pH 4.5では、MRSAは、10 mmolの亜硝酸塩を用いる２時間のインキュベートによって、同様に阻害される。pHの範囲及び亜硝酸塩濃度は、先行技術の指示よりも著しく広い。
【００４５】  したがって、好ましい実施態様においては、本発明は、酸化窒素(NO)及び／または二酸化窒素(NO2)、好ましくは酸性化亜硝酸塩由来のものを用いる、更に好ましくは５未満のpHにおける、更に好ましくはより低いpH、例えば4.5または4における、多数抗生物耐性生物の治療に関連する。
【００４６】  製薬品として許容されるNO及び／またはNO2ソースは、好ましくは皮膚上または皮膚付近の、製薬品として許容される亜硝酸塩、及びこれに混合した製薬品として許容される酸性化剤であって、該ソースは投与まで、または投与の直前までは、別々に保持される。
【００４７】  好ましくは、混合直後のpHは７未満であるが、より好ましくは５未満、特に好ましくは４未満である。しかしながら、過剰な酸性によって引き起こされる刺激を避けるために、pHが2より大なることも好ましい。
【００４８】  一般的に、亜硝酸塩には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の亜硝酸塩が、例えば溶液においては下限0.005%の量で、例えばクリームにおいては上限12%、あるいは更に多量に含まれることが好ましい。好ましい範囲は、ソースの0.005乃至10体積%である。酸性化剤は、好ましくは有機酸である。酸性化剤の好ましい量は、下限0.5%乃至上限22%、あるいは更に多量であり、好ましい範囲は、0.5乃至15体積%である。
【００４９】  別の態様においては、本発明はメチシリン耐性Staphylococcus aureus(MRSA)感染症の治療のための局所用薬剤の製造における、製薬品として許容される酸性化剤と製薬品として許容される亜硝酸塩ソースとの使用であって、前記剤及び前記ソースの両方が、これらのための製薬品として許容される担体もしくは希釈剤中にそれぞれ別個に配置され、前記酸性化剤が、皮膚への前記ソースと前記剤との投与の際に、酸性pHを誘発する、使用を提供する。
【００５０】  更に別の態様においては、本発明は、多数抗生物耐性細菌の細胞死の誘発または細胞複製の予防のための組成物の製造における、製薬品として許容される酸性化剤と製薬品として許容される亜硝酸塩ソースとの使用であって、前記剤及び前記ソースの両方が、これらのための製薬品として許容される担体もしくは希釈剤中にそれぞれ別個に配置される、使用を提供する。
【００５１】  本発明の組成物は、窒素酸化物を提供するために適当な、どのようなものであってもよい。理論に限定されることなく、酸化窒素(NO)は活性であると認識される。したがって、該組成物によって生成される窒素酸化物の少なくとも一部が、酸化窒素であるべきことが好ましい。更に好ましくは、本発明の組成物によって生成する酸化窒素の割合は、少なくとも50%、更に好ましくは少なくとも80%であることが好ましい。使用される唯一の酸が還元性酸である場合には、この割合は、生成する窒素酸化物の酸化窒素含量が上限100%となるような如何なる値でも良い。
【００５２】  上記議論においては、その一部が酸化窒素である窒素酸化物には、三酸化二窒素が含まれず、これは酸化窒素及び二酸化窒素の生成における中間体と考えられることが理解されるであろう。
【００５３】  「窒素酸化物生成」とは、本発明の組成物が、原位置、即ち感染の、または感染の恐れのある部位における窒素酸化物の放出に役立つことを意味する。最も単純な場合には、これは軟膏またはゲルを含んで良く、実際に、例えば気体酸化窒素が溶解した他のあらゆる適当な局所用媒体そ含んで良く、これはいったん適用されると、酸化窒素を放出するものである。
【００５４】  有効であるために少量の酸化窒素が必要とされるのみであるとすれば、適用の部位にある以外の酸化窒素が漏れ出たとしても無関係である。殺傷もしくは静止作用を有するためには、非常に少量のみで十分である。
【００５５】  窒素酸化物生成組成物は、あらゆる適当な形態を取りうる。しかしながら、窒素酸化物の生成が活性な場合には、実際に窒素酸化物が必要とされるまで、反応物を互いに別々に維持すべきである。これが一般に好ましいとはいえ、常にそうとはいえない。例えば、閉鎖パッチは、ゲル、またはマトリックスから構成され、ここに窒素酸化物生成成分を含ませてよく、該パッチは適当なウェブで保護される。好適なゲルは、ヒドロゲルである。
【００５６】  好ましくは、前記マトリックスまたはゲルは付着性であり、付着強度は、窒素酸化物が漏れ出てウェブを押しのける傾向を完全に打ち負かすために十分なものであるが、該付着強度は、パッチの適用を行うための前記ウェブの除去が、十分にできないようなものであるべきではない。更にまた、酸化窒素の耐用期間延長またはこれが産生される速度を低下させるために、該ゲルまたはマトリックス中に適当な安定化剤、例えばキレート剤を提供することが好ましい。更にまた、酸化窒素が非水性且つ脂質の物質中に可溶性であるため、治療にこうした物質を加えることによって、適用部位への酸化窒素の送達及び活性が延長されうる。
【００５７】  それにも関わらず、既に遊離の酸化窒素を含む組成物は、一般的に、長期間に亘って安定ではなく、好ましくは調製後できる限り迅速に患者によって使用されるべきである。
【００５８】  より好ましいのは、本発明の組成物を多数の部分として提供することである。これらの部分は、混合すれば窒素酸化物の生成に役立つ活性剤または反応物を、それぞれ別個に含んで良い。従って、第１組成物は、適当な媒体中とした適当な亜硝酸塩を含んで良い。第２組成物は、好適な酸を含んで良い。前記２つの組成物を、その後混合し、好ましくは十分に混合し、その後該当部位に適用することができるが、原位置で混合しても良い。一般的に、最終的な窒素酸化物生成組成物を達成するために混合することが必要な成分の数を最少化することが望ましいが、如何なる数を提供してもよいことが理解されるであろう。好ましくは、特に、例えば還元性酸を含む第３組成物を提供してもよい。しかしながら、アスコルベート等の還元性酸が使用される場合には、一般的に、本来の酸として使用するか、または亜硝酸塩とは別個の組成物中に第１の酸と共に提供することが好ましい。
【００５９】  ここでは本発明を、一般的に、２つの組成物を混合して最終的な窒素酸化物生成組成物を提供することに関して説明しているが、明記もしくは特記のない限りにおいては、こうした言及には２つ以上の開始組成物の意味が含まれることが理解されるであろう。
【００６０】  本発明の組成物は、混合のためのあらゆる適当な媒体を含んで良い。重要なのは、酸及び亜硝酸塩もしくは亜硝酸塩前駆体が、所望の窒素酸化物を生成するような方法で反応しうることである。従って、最終組成物を提供する、開始組成物の少なくとも１つが、窒素酸化物生成反応を起こすために、好ましくは水性成分を含むべきである。更に好ましくは、開始組成物の両方が、前記成分の混合を促進するために水性成分を含むべきであるが、前記成分が遅く反応すべきことが望ましい場合には、前記開始組成物の１つまたは両方において、水の量は最少化されて良い。
【００６１】  最終組成物を達成するために混合して良い開始組成物のタイプには、制限はないが、但し、前記最終組成物が窒素酸化物の生成を成すものであることを条件とする。この点について、また全体として、「窒素酸化物」なる呼称には、酸化窒素100%の意味が含まれることが理解されるであろう。
【００６２】  例えば、開始組成物は、如何なる好適な形態、例えば液体、ゲル、または固体であってよいが、一方が固体である場合には、他方は好ましくは液体またはゲルである。固体が一般的に好ましい。液体のカテゴリーには、溶液、懸濁液、及びコロイドが含まれ、こうした考察は、ここに使用するところの、一般的に液体と固体との間のあらゆる状態を含むゲルにも応用される。
【００６３】  とりわけ、ここでのゲルとの呼称は、別の半固体状態、例えばクリーム、軟膏、チンキ剤、ソフトワックス、ローションの意味を含む。但し、その特性によって、前記ローションは液体の範疇に入りうる。前記液体、ゲル、または固体が、活性剤のための媒体として作用することを前提として、特定の排除はないことが理解されるであろう。
固体の媒体は、例えばパッチにおけるマトリックスを含みうる。
【００６４】  開始組成物は、最終組成物を提供して窒素酸化物を生成させるために、適用前または原位置において混合して良い。こうした混合物は、例えば簡単なゲル／ゲル混合物であって良く、皮膚に適用可能であって、且つその場に残すことが可能なものである。これらはまた、２つの液体、２つのゲル、または液体とゲルとを含んで良く、これらの間で、例えばゲルが形成されるか、あるいはまた酸化窒素を生成させ、保持し、更に分配するための保護的環境を形成する。
【００６５】  １つの好ましい実施態様においては、ゲルを当該部位に適用した後、別の活性剤を含むマトリックスを担持する、絆創膏等のパッチを適用して良く、いったん接触させると、前記活性剤はゆっくりと相互作用して窒素酸化物を生成する。
【００６６】  別の好ましい実施態様においては、パッチまたは絆創膏のマトリックスは非水性であるが、親水性であって、且つ実質的に乾燥形態の活性剤の混合物を含む。この場合には、「乾燥形態」なる語は、例えば結晶化した水を包含する結晶を含んで良い。従って、両方の活性剤がパッチまたは絆創膏のマトリックス中に存在するにも関わらず、これらは適当な量の水の存在無しには反応することができない。パッチまたは絆創膏の適用が望まれる場合には、如何なる保護的ウェブも除去し、適当な量、例えば数滴の水をマトリックスに適用して有効成分を活性化させることができる。活性化したパッチは、その後皮膚に適用して窒素酸化物がその効果を奏するようにしてよい。
【００６７】  パッチの活性化は、一方の活性成分の溶液を、もう一方の活性剤を含む、ヒドロゲルなどのマトリックスを既に含むパッチに加えることによって行って良い。前記マトリックスが、それほど水で飽和しておらず、活性剤の更なる溶液が容易に取り込まれるべきことは理解されるであろう。実際に、マトリックスは、上述のように実質的に乾燥していても良い。
【００６８】  実質的に乾燥した組成物を提供して、ここに水を加えるというこの原理は、もう一方の組成物にも応用して良い。こうした場合において、「乾燥」なる語は、水含量を意味するものであって、このため組成物が例えばゲルでありうる一方で、水含量は極めて低く、例えば1%または更に低くなるであろう。こうした組成物は、実質的に無水であることが好ましい。
【００６９】  １つの実施態様においては、亜硝酸塩と酸とが、当該部位に直接適用するために粉末として提供される。得られる領域に水をスプレーすることが可能な一方で、こうした混合物を、例えば発汗等により既に湿った領域に、または自ずから湿性もしくは滲出性である創傷または外傷、例えば火傷、開放潰瘍、及び開放創等に使用することが好ましい。湿った環境は、そこで反応の開始に必要な水を提供する。
【００７０】  この治療の形態は、最も単純であり、単に1つの亜硝酸塩と1つの酸である２つの別々の粉末を含むが、望ましくは乾燥剤、増量剤、ゲル化剤、及び保存料等の別の物質を導入してよいことは理解されるであろう。
【００７１】  本発明の組成物の有効成分は、当業者には明らかであるようにあらゆる適当な量で存在してよい。一般的に、亜硝酸塩の量は、最終組成物のおよそ0.5乃至30重量%であることが好ましい。更に好ましくは、亜硝酸塩またはその前駆体の量が、1乃至15％、とりわけ1乃至10％または5乃至10％である。クリームにおいては、適切な製剤によればより高レベルが許容されうるが、上限が約10％であると推定される。
【００７２】  前記酸は、前記亜硝酸塩またはその前駆体との対比で、少なくとも化学量論的量にて存在することが好ましい。更に好ましくは、十分量の亜硝酸塩が酸化窒素を生成するための酸性環境を確保するために十分な、化学量論的過剰量で前記酸が存在する。全亜硝酸塩が窒素酸化物を生成させることが必要ではないが、あまりに多量の亜硝酸塩を未反応のままにするのは、一般的に不十分であり、亜硝酸塩の大部分が窒素酸化物に転換されることが好ましい。
【００７３】  一般的に、前記酸は最終組成物が５以下のｐＨ、とりわけｐＨ4以下になるような十分量で存在することが好ましい。しかしながら、窒素酸化物生成反応は、より高いｐＨ値にて、特に過剰な還元性酸の存在下で起こりうるため、最終組成物のｐＨが本発明の必須部分を形成するのでないことは、理解されるであろう。
【００７４】  亜硝酸塩は、その単純さのために、一般的には無機であり、且つ少なくとも部分的には水溶性である。特に可溶性について適切であれば、遷移金属化合物等の別の適当な亜硝酸塩もまた使用してよいが、好ましいのは、アルカリ金属亜硝酸塩及びアルカリ土類金属亜硝酸塩である。とりわけ、ナトリウム、カリウム、及びバリウム化合物を使用してよく、費用と入手可能性の観点から、ナトリウム化合物が一般的に好ましい。
【００７５】  適当な酸性化剤には無機酸が含まれるが、これらが一般的に製薬品として許容されないことから、一般的には好ましくない。したがって、より好ましいのは有機酸であり、特に水と溶液を形成することができ、４未満のｐＨを生じるものである。こうした酸には、蟻酸、酢酸、リンゴ酸、乳酸、クエン酸、安息香酸、酒石酸、及びサリチル酸が含まれるが、このリストが、排他的というよりも包括的であることが理解されるであろう。別の好適な剤は、還元剤である。これらは必ずしも酸ではなく、また適当な還元剤には、必ずしもこうした酸性溶液を形成しないアスコルビン酸及びアルコルビルパルミテートが含まれ、これらは、還元剤であって、且つ発生する酸化窒素の量を増大させるという利点を有し、且つ、これらはまた、いったん生成した酸化窒素の安定化に寄与しうる。所望であれば、二つのタイプの剤を一緒に使用してもよい。
【００７６】  還元酸の有利な品質のために、一つの実施態様においては、最終組成物を形成する場合に、第１の酸に加えて還元酸を提供することが好ましい。還元酸には特定の割合はないが、第１の酸の5乃至40％、とりわけ10乃至20％であることが好ましい。
【００７７】  本発明の組成物は、あらゆる適当な手段で調製されて良い。該組成物が水性成分を含む場合には、有効成分を水、または水性調製物に溶解させることが好ましく、その後これを、必要になるまで別の活性剤とは隔離しておいてよい。乾燥製剤は実質的に全成分を含んで製造され、当該組成物の活性化を望む際に加えることとする水の添加を待ってよい。
【００７８】  最終組成物が液体またはゲルを含む場合、これらは手動の攪拌を含むあらゆる適当な手段によって適用してよい。別の手段は、例えば二連シリンジ（double barrelled syringe）または二系統作動ディスペンサー（dual actuated dispenser）を使用し、最終的攪拌を指またはスパチュラ、またはあらゆる別の適当な手段で行うことを含んでも良い。
【００７９】    従来は、製薬品として許容される亜硝酸塩には、0.005乃至10体積％のアルカリ金属（例えばナトリウム）亜硝酸塩が含まれるが、あらゆる別の有効なアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の亜硝酸塩が使用される。アルカリ金属またはアルカリ土類金属についての好適な範囲は、0.005乃至5体積％である。そうでなければ、3乃至8体積％である。製薬品として許容される酸性化剤、好ましくは有機酸について好適な範囲は、0.5乃至15％、好ましくは3乃至10％である。別の適当な範囲は、1乃至96％である。便宜的な有機酸は、クエン酸または他の非還元性の有機または無機酸である。
【００８０】  クエン酸及び、ナトリウムもしくはカリウムの亜硝酸塩は、本発明の好ましい製剤中における重量またはモル比として、1.2：1乃至2.5：1、好ましくは約1.5：1または2：1、またはこれらの間の比率で使用される。とりわけ好ましい範囲は、クエン酸13.5％及び亜硝酸ナトリウム9％、または亜硝酸ナトリウム3％及びクエン酸4.5％であり、これらは、前記酸と前記亜硝酸塩とが使用の環境において混合される限りにおいては、上記に沿って製薬品として許容される担体または希釈剤として作用するクリーム、軟膏、ローション、洗浄剤、エマルジョン、水性溶液中などに配置してよい。
【００８１】  アスコルビン酸等の還元性酸を使用する場合には、亜硝酸塩ソースと酸（有機酸の場合）との反応の速度は低いであろうが、有効なｐＨは、ｐＨ４より大なりｐＨ７までであってよい。当業者に知られた、NO及びNO2の別のソースを使用してもよい。
【００８２】  本発明の組成物は、耐性細菌に感染した皮膚に適用するか、または感染が予想される場合、例えば抗生物質に反応しない皮膚感染において、または抗生物質耐性感染によって瀕死の、危険性の高い患者において、または感染した皮膚にさらされうる臨床スタッフのために、予防剤として使用してもよい。こうした生物を細菌として治療することが一般的に好ましいが、通常の耐性真菌、例えば所定のカンジダ株感染もまた、本発明による治療または予防に適当であることが理解されるであろう。有効成分が低濃度でも実現可能性を有するために、敏感な身体部分、例えば鼻腔及び別の粘膜及び創傷への適用が可能である。
【００８３】  特に有機または無機の塩の形態の亜硝酸塩供与体は、NOまたはNO2部分の遊離気体及び/またはイオン化形態を発生させうる。これらは、クリーム、軟膏、または水溶液などの製薬品として許容される担体または希釈剤中としてよい。同様に、前記ソースと共に投与するために適合させた酸は、有機または無機であってよく、実質的にクリーム、軟膏、ローション、洗浄剤、エマルジョン、水溶液などの、製薬品として許容される担体または希釈剤中に配置してよい。
【００８４】  本発明による欠点は、ほとんどなく、もしあるとすれば賦形剤が必要とされることである。実際、本発明の好ましい製剤は、亜硝酸ナトリウムとクエン酸とを含み、NO/NO2生成反応の妨害または亜硝酸塩の酸性化（実質的に亜硝酸塩成分の貯蔵寿命を短縮することになる）を防ぐために一般的に賦形剤を最少限に留めることが望ましい。したがって、亜硝酸塩成分が水性条件において貯蔵される場合、これは使用まで、ｐＨ5.5より大に、通常は少なくとも7に、好ましくは約7.5または8に維持することが好ましい。前記酸成分は、混合に際して前記亜硝酸塩のこうしたｐＨを考慮し、好適に調製してよい。
【００８５】  一般的に水中に亜硝酸ナトリウムを溶解させ、任意にプロピレングリコールなどの保存料を共溶媒として、あるいは、好ましくは、一般的により刺激性の低いポリエチレングリコールを、加えることが好ましい。いずれも水と混和性である。グリセリンは、例えばチキソトロピー剤として加えてよい。生成物はまた、柔らかな石鹸の形態であってよい。好ましい製剤は、創傷への適用のための、プロペラントの有無によらない標準的なポンプ式スプレーである。
【００８６】  例えば、本発明の組成物は、ハンドウォッシュまたはボディウォッシュとして適用してよく、この場合は亜硝酸塩、好適には亜硝酸ナトリウムまたは亜硝酸カリウムが、第１調製物として水に溶解されていて良い。好適な酸、例えばクエン酸またはサリチル酸が第２水溶液中に適用されてよく、前記２つの溶液は、例えばツインバレルディスペンサー（twin barrelled dispenser）中に提供してよい。蛇口をひねるか、あるいは前記溶液を分配し、そこで双方の所定量を任意に一つの流れとして使用者に提供してハンドウォッシュとして利用できる。手をこすり合わせることは更なる溶液の混合、よってNOの放出に役立つ。
【００８７】  いずれかまたは両方の溶液が増粘されているか、液体石鹸として提供されていて良い。実際に、亜硝酸塩は固体石鹸として提供されてさえよく、手が希酸の流れの下に洗浄される。
【００８８】  本発明の組成物を、スプレー形態の使用のために適用することも好ましい。
溶液については、同様の考えで混合が行われ、例えばツイン容器が溶液のエアロゾルを提供する。生じる混合物が、単に治療領域から流れ落ちてしまわないように、一方または両方が、チキソトロピー剤を含んでよい。
【００８９】  こうしたスプレーは、鼻腔適用においても有用でありうる。こうした場合には、約ｐＨ5等の高めのＰＨのものが、敏感な鼻腔粘膜を刺激しないために使用可能であることから、還元性酸、特にアスコルベート、またはアスコルビンパルミテートを酸性化剤として使用することが一般的に好ましい。
【００９０】  本発明の組成物は、例えば火傷及び褥瘡等の大領域に使用することが特に好ましい。こうした場合に、チキソトロピースプレーを使用しても、または該組成物はゲル、クリーム、軟膏（unguents、ointments）または別の非固体形態として適用してもよく、前記亜硝酸塩及び酸は、必ずしもそれぞれが同タイプの製剤として提供されずともよい。例えば、亜硝酸塩ゲルを適用し、その後この領域にクエン酸または別の酸の適当な溶液をスプレーしてよい。そしてこれは、クリーム上にすり込んでも、または単にそのまま拡散させても良い。
【００９１】  泡沫、ゲル、及びスプレーが、本発明の好ましい製剤である。これらは、MRSAの治療または予防において使用しても、外科手術後の創傷等におけるコロニー形成（colonisation）の予防において使用してもよい。
【００９２】  本発明における使用のための、一般的に好適な製剤または投薬形態を、下記の表に示す。
【００９３】
【表１】
0005634655.tif 000004
【００９４】  水性溶液の場合には、例えばこれらはスプレーまたは洗浄剤とすることができ、粘度を調整するため、所望により賦形剤を加えてよいことが理解されるであろう。
同様の考えが、一般的にハンドウォッシュに応用される。
【００９５】  本発明の組成物を、皮膚または別の対象に、例えば外科手術用具または作業表面などに使用してよいことが理解されるであろう。
【００９６】  製薬品として許容される酸性化剤及び製薬品として許容される亜硝酸塩ソースは、使用環境にて混合されるまで、別個の位置に維持される。
本発明を、以下の実施例を参照して、詳説の目的にのみここに説明する。
【実施例】
【００９７】（実施例１）
この研究は、酸性化亜硝酸塩によって生成したNO/NO2が、コロニー形成した創傷からMRSAを排除することができるか否かをアッセイするためのものであった。プロトコルは、地元のGrampian Combined Ethical Committee及びInfection Control Committeesにより承認された。【００９８】  MRSA陽性の創傷培養組織及び陰性の咽喉及び/または喀痰培養組織を有する入院患者を、該研究のために集めた。妊婦及び授乳中の女性及び、MRSAを鼻腔保菌するのみの患者は、全身性抗生物質を摂取していたため該研究から除外した。更に、上述のように、酸、特に有機酸と亜硝酸塩、例えば亜硝酸ナトリウムとが混合される場合には、これらは反応して酸化窒素(NO)及び二酸化窒素(NO2)を放出する。【００９９】  該研究は、皮膚の特定のターゲット領域、例えば創傷における感染症の治療に制限した。使用に際しては、亜硝酸塩ソース(すなわち3%の亜硝酸ナトリウム)を含むクリームと4.5%のクエン酸を含むクリームを、一日に2度、5日間に亘って創傷または障害上で混合し、その後スワブ採取し、48時間後に繰り返し、結果を表にまとめた。混合の後、耐久性吸収性包帯で混合物及び創傷を覆った。【０１００】  前記鼻、咽喉、腋、会陰、及び他のあらゆる未治癒の創傷のスワブから、手順どおりスワブ採取して該研究のための適格性をアッセイし、これらのスワブ採取は、基線にて、治療の５日目に、更に再発をアッセイするために治療の終了２日及び４日後に、繰り返した。該研究中にMRSAの鼻腔保菌を発生した患者は、ムピロシンで治療した。【０１０１】  各患者からの、S. aureus及びMRSAの最初の単離物を、分類し、その患者からの感染の代表的サンプルとして貯蔵した。再培養に際し、メチシリン耐性が確認された。各単離物は、下記の96ウェルプレートアッセイ方法を用いて、酸性化亜硝酸塩に対する感受性について試験した。【０１０２】  単離物を、適当な成長培地中で、その成長速度に関して安定状態に達するまで培養した。実験は、無菌の96ウェルプレート中で行った。亜硝酸カリウム溶液をｐＨ７に調製し、滴定して、培地ウェル中の最終亜硝酸塩濃度を、該プレートの列毎に１ml当たり0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、及び30ミクロモルとした。ｐＨを、カラムでの分配で、それぞれ1.7、2、2.3、3、3.3、3.6、4、4.5、5、5.5、及び6のｐＨに調整した。同一の接種材料を各ウェルに接種し、その後の細菌成長を光学密度を読み取ることでカウントした。各実験を５回繰り返した。７つのMRSA単離物を、標準の非耐性Staphylococcus aureusと比較した。線形回帰分析によって、水素または窒素イオンの増加に正比例して、MRSAの阻害及び殺傷が増加することは、亜硝酸塩の酸性化が、MRSAの阻害または殺傷の原因であることを示唆している。【０１０３】  上記試行の結果を、下記の表２に示す。【０１０４】  他の場所にスワブ陰性を伴う創傷のコロニー形成を、９名の患者に確認したが、そのうち７名は１つ以上のコロニー形成した創傷を有していた。酸性化亜硝酸塩での治療の後、３名の患者から感染が解消され、５日後にも再発はなかった。３名が部分的反応(1つの創傷の解消)を示した。１７の感染した創傷のうち、８つがMRSAコロニー形成を解消した。開始時には陰性だったにも関わらず、鼻及び咽喉等の、別の未処置の身体部位に、調査中にスワブ陽性を発生した���者が５名いた。これが起こった患者のうち、２名は反応し（すなわち、再発なしに全ての創傷が完治した）、２名は反応せず、さらに１名は部分的反応を示した。【０１０５】
【表２】
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【０１０６】  臨床試行の制限的性質のために、耐性感染症の１００％の完治を達成することは不可能であった。倫理上の理由のため、どの患者についても１名につき選択された領域を治療することしかできなかった。したがって、本発明に従って治療が成功した領域を、別の感染位置が再感染させうることは起こりえた。それにもかかわらず、本発明が、こうした制限的条件下においてさえ、薬剤耐性感染症の治療において有効であることは明白である。【０１０７】  したがって、本発明は、NO及び/またはNO2によるMRSAの治療において、また、MRSAを含む創傷及び障害であって、皮膚表面にある創傷または障害の治癒を改善する方法のために、有用である。したがって、本発明はまた、MRSAソースに接触した恐れのある皮膚の、特に使用環境にて亜硝酸塩ソースと酸とを投与することにより発生するNO及び／またはNO2を、ここに適用することによる消毒においても有用である。【０１０８】  （実施例２：MRSA及び MRSSAのNOに対する感受性）
この研究の目的は、MRSA及びMSSA (メチシリン感受性S. aureus)に対する酸性化亜硝酸塩の抗菌活性を調査することである。これは、既知のMSSA株及び様々なMRSA株に対して、酸性化亜硝酸塩の最小阻害濃度（Minimum Inhibition Concentration (MlC)）及び最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration(MBC)）を測定し、MICとpHとの関係及びMBCとpHとの関係、及び曝露時間を考慮することにより評価した。【０１０９】（方法）
（使用した細菌株）
７つの臨床的に単離したメチシリン耐性Staphylococcus aureus (MSRA)株(A695, A713, A852, A977, A992, Al 124, and A1350)及び、１つのメチシリン感受性Staphylococcus aureus (MSSA)及び、MRSA制御株を、the Department of Microbiology, Aberdeen Royal Infirmary (Aberdeen, Scotland UK)から得た。MRSA単離物を、実施例１の予備実験において治療したMRSA患者由来の当初培養から誘導した。株は、-24℃にて、保護バイアル中に維持した(Bacterial Preservers, Technical Service LTD, UK)。【０１１０】（混濁度対細胞密度の成長曲線及び検定曲線の準備）
（成長曲線の準備）
普通寒天培地由来の単一コロニー（37℃にて一晩培養）を、250mlフラスコ中で、75mlの普通液体培地を用いて接種した。該フラスコをフォームストッパーで再密閉し、120rpmのシェーカーで18時間に亘り37℃にてインキュベートした。細胞培養の試料240μlを、基線(0時間)にて、及びその後2時間毎にとり、安定な成長段階に達するまでミクロウェルプレートのウェルに移動させた。その後、ミクロウェルプレートリーダー(Dynatech Laboratories MRX)を使用して光学密度を測定した。3度の反復実験を、研究した各株について行った。【０１１１】（コロニー形成ユニット（cfu）の数対細胞混濁度の検定曲線の準備）
各細菌株を、定常期に達するまで上述のように培養した。ミクロウェルプレートリーダー(Dynatech Laboratories MRX)を使用し、240μlの細菌懸濁液をμウェルプレートのウェル中にピペットで滴下することにより、570nmにて光学密度を測定した。普通液体培地(5x10-1、2x10-1、1x10-1)を使用して一連の希釈液を調製し、相当する光学密度を測定した。ミクロウェルプレートの１つのウェルにおいて、24μlの懸濁液を216μlの普通液体培地中に移すことにより、5x10-1及び2x10-1の懸濁液に始まり、希釈倍率の下限を10-8とする、更に２組の一連の希釈液を調製した。異なる希釈段階にある10μlの細胞懸濁液3滴を、普通寒天プレートにピペットでおいた。プレートを37℃にて24時間に亘りインキュベートした。cfuの数を数えた。元々の懸濁液中における細菌の数を、希釈倍率によって計数した。【０１１２】  cfuの数を570nmでの光学密度に関連づけて、検定曲線を各様について作成した。そこで、この曲線を、以降全ての実験について使用し、定常期培地を新たな普通液体培地で希釈することによって8x107 ml-1の標準細胞接種材料を調製した。【０１１３】（様々なｐＨ調節点で普通液体培地を変性させるための滴定曲線の準備）
アッセイのためにｐＨを様々に調節した普通液体培地を調製するために、普通液体培地と混合した酸溶液のｐＨについての滴定曲線(v/v)を、普通液体培地と0.5MのHC1とを混合することによって得た。【０１１４】  酸性化亜硝酸塩の抗菌活性を、240μlの体積を有するミクロ滴定プレートのウェル中で作用させた。こうした少量でｐＨを測定するのではなく、滴定曲線のための0.5MのHC1と普通液体培地混合物の総体積を100倍した。ｐＨを、HC1と普通液体培地とを様々な比率で混合し、ガラスユニバーサル中において最終体積24mlとした後に、ｐＨメーター(CD720 WPA UK)を使用して測定した。【０１１５】  酸溶液と普通液体培地混合物との各比率についてのｐＨ値を、５回の反復実験から得た。測定した平均ｐＨ及び該ｐＨに達するために必要とされた0.5MのHC1の体積に従い、滴定曲線をプロットした。この滴定曲線を、24mlの普通液体培地を所定のｐＨに調節するために必要な0.5M HC1の体積の算出に使用した。ミクロ滴定プレートアッセイにおいて、240μlの普通液体培地の調整に必要とされる、0.5M HC1の実際の体積は、24mlについて算出された値を100で割ることによって得た。【０１１６】（酸性化亜硝酸塩の抗菌活性の決定）
無菌の96ミクロ滴定（ウェル）プレート(Camlab, Cambridge, UK)中において実験を行った。3つの別々に調製した普通液体培地溶液を、マルチチャンネルピペットを用いるピペット移動によって、ミクロウェル中で混合することにより、反応プレートを調製した。インキュベートの間に、ウェルはフタで覆うのみ（フィルムなし）であった。【０１１７】  各ウェル中において、以下の溶液を用いた。
1. 亜硝酸カリウム調整普通液体培地*：                          60μl
2. 細菌接種材料を含む普通液体培地**：                         60μl
3. ｐＨ調整した普通液体培地***：                              120μl
* 亜硝酸カリウムを、蒸留水中に調製し、別々にオートクレーブにかけた。これを濃縮普通液体培地（採用した濃度は、混合の際に亜硝酸塩溶液の希釈を補うため）と、アッセイの直前に混合して、通常の普通液体培地濃度及び様々な亜硝酸塩濃度を作り出した。
**細菌接種材料を、適切な混濁度曲線に関して所望の密度に希釈した。
***最終ｐＨを達成するために、滴定曲線に関して3つ全ての溶液を考慮して、pH調製した普通液体培地を見積もった。普通液体培地を、酸との混合の際の希釈を補うために濃縮して、ｐＨに、1.7、2、2.3、3、3.3、3.6、4、4.5、5、5.5、6、及び7.0の最終傾斜を得た。
曝露プレートは、下記のように配置した。【０１１８】
【表３】
0005634655.tif 000006
【０１１９】  90rpmのシェーカーで37℃にて酸性化亜硝酸塩に最初に曝露した後、0.5、2、及び24時間の間隔で、各ミクロウェル由来の20μlの懸濁液を、ミクロプレート中の回復培地（普通液体培地）180μlに移し、普通液体培地を用いて回復培地の更なる10倍希釈を行った。ミクロウェル回復プレートを、上記の通りインキュベートした。細胞成長に対する酸性化亜硝酸塩の阻害作用を、ミクロウェルプレートリーダー(MRX Microplate Reader, Dynatech Products Limited, UK)を使用してウェルの光学密度(570nm)を測定することによって決定した。最小阻害濃度(MIC)及び最小殺菌濃度(MBC)または各株を、5回の反復実験によって決定した。【０１２０】  酸性化亜硝酸塩の最小阻害濃度(MIC)は、これによれば、24時間後にも所与のｐＨにおいて微生物の成長が全く起こらない最低の亜硝酸塩濃度と定義される。最小殺菌濃度(MBC)は、これによれば、回復培地への移動の後にも微生物の成長が全く起こらない最低の亜硝酸塩濃度と定義される。【０１２１】（結果）
（MIC）
図１には、pH5.5(◆)、pH5.0(○)、及びpH4.5(▲)での、全て臨床的に単離されたMRSA株、MRSA制御株、及びMSSA制御株の平均最小阻害濃度を示す。各記号の脇の数字は、試験した株を表す：１はStaph. aureus (メチシリン感受性)、２乃至８の数はMRSA株A695、A762、A852、A977、A992、Al124、及びA1350をそれぞれ表し、数字９は、ＭＲＳＡ制御株を表す。５測定値の平均である。【０１２２】  図２は、亜硝酸塩(log10μM)の最小阻害濃度と、曝露酸(pH)との間の相乗関係を示す。試験した8株の平均である。【０１２３】  ANOVAでは、試験した全ての株のMIC間に著しい相違は見られなかったが(図1、p≧0.05)、MICは実質的にpHで変化した(図1、p≦0.001)。フィッシャーのLSD試験により、試験した全株のMICは、pHが5.5から4.5に著しく減少するにつれて著しく減少することが確認された(図2、p≦0.05)。【０１２４】  亜硝酸塩の対数変換したMICと酸(pH)との間には、相乗関係があった(図2、r=0.97、p≦0.05)。【０１２５】（MBC）
ANOVAでは、試験した株によりMBCの著しい相違が見られた(p≦0.001)。フィッシャーのLSD試験により、Staphylococcus aureus (メチシリン感受性)に対しての酸性化亜硝酸塩のMBCが、2つのMRSA株に対してよりも著しく高い(A713及びA852−p≦0.05)一方で、他の全ての株の間に著しい相違はないことが確認された。【０１２６】  全ての株について、亜硝酸塩の対数変換した最小殺菌濃度(MBC)とpHとの間には、相乗関係があったが、低いｐＨ(Staphylococcus aureusについては1.7乃至2.0のpH、その他全ての株については1.7乃至2.3のpH)では、この関係は観察されず、なぜなら、低いpH範囲では亜硝酸塩の添加なくしてさえ細菌が殺傷されたためである。全ての株について、対数変換MBCとpHとの間に線形相乗関係が見られた(pH2.3-4.5、亜硝酸塩86-4556μM-図3)。図3には、亜硝酸塩の最小殺菌濃度(log10μと曝露酸(pH)との間の相乗関係が示される。全9株の5測定値の平均である。pH設定2.3、3.0、3.3、3.6、4.0、4.5のMBCのみを、数値のプロットに用いた。【０１２７】  ANOVAはまた、各株についての異なる曝露時間の間に、MBCの著しい相違を示した(p≦0.001)。図4には、試験した全ての株について様々な曝露時間での酸性化亜硝酸のMBCが対比される。9株について5測定値の平均である。この図は、全ての株についての、MBC、pH、及び様々な曝露時間の間の関係を示す。フィッシャーのLSD試験により、全ての株について、酸性化亜硝酸塩のMBCが0.5h＞2h＞24hの順に従うことが確認された(図4−p≦0.05)。図５には、亜硝酸塩の最小殺菌濃度(log10μM)と曝露酸(pH)との間の相乗関係が示される。全9株について5測定値の平均である。pH設定2.3乃至5.5のMBCのみを数値のプロットに用いた。【０１２８】  MSSA、MRSA臨床単離物、及びMRSA制御株についての酸性化亜硝酸塩の最小阻害濃度に、著しい相違はない。これらの結果は、酸性化亜硝酸塩が、MSSA株と同じく有効にMRSA株を阻害できることを示す。全MRSA株が、MSSA株についてのMBCよりも低いかまたは同等の最小殺菌濃度(MBC)を必要とし、これによって酸性化亜硝酸塩が、MSSA株を殺傷する以上ではないにせよ、少なくともこれと同程度の有効性を示す。【０１２９】  異なる曝露時間についての酸性化亜硝酸塩のMBCは、著しく相違し、一般的に曝露時間がより長いと、酸性化亜硝酸塩のMBCはより低くなる。【０１３０】  ほとんどのNO生成が1時間後には完了するため、2時間及び24時間の時点での殺傷の増大は予期されていなかったので、これは驚くべきことであった。この時間依存性は、NO供与体が形成され、これに続きゆっくりとNOが放出されるという、シンク効果（sink effect）を示しうる。【０１３１】（実施例３）
（製剤）
1. 亜硝酸ナトリウム0.5乃至9%及びクエン酸0.75乃至13.5%のクリーム製剤
【表４】
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1−亜硝酸ナトリウム
2−クエン酸一水和物【０１３２】（亜硝酸ナトリウム製剤）
（ワックス相の調製）
下記を70乃至80℃にて溶解させる。
セチルアルコール
Arlatone 983S【０１３３】  前記混合物のおよそ95%が溶解したところで初めて、穏やかに撹拌しつつ以下の成分を加える。
ジメチコーン
重質流動パラフィン
白色ソフトパラフィン
プロピレングリコール
ここで、温度は60乃至70℃に維持する。
全成分が溶解した後、均一になるまで撹拌する。【０１３４】（水性相の調製）
以下を70乃至80℃に加熱した。
水
亜硝酸ナトリウム
亜硝酸ナトリウムを水に加え、該水性相を、ワックス相と混合するまでこの温度に維持する。
両方の相の準備が整ったらこれらを混合し、Silversonミキサーを使用して該クリームベースがca 60℃に冷却されるまで継続して均一化する。
Silversonミキサーまたは同等物を使用して均一化する一方で、該クリームを水性相に加える。均一化を10分間に亘って継続する。
該クリームを小型のHobartに移し、該クリームが固化するまで低速で撹拌を続ける。
完成した製品を、二系統ディスペンサーに充填するために用意した適当な容器に移す。【０１３５】（クエン酸製剤）
上述の亜硝酸ナトリウム成分と同様に調製される。【０１３６】2. 軟膏
【表５】
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【０１３７】（製造方法）
（ワックス相の調製）
下記を60乃至70℃にて溶解させる。
セチルアルコール
Cetomacrogol 1000
前記混合物のおよそ95%が溶解したところで初めて、穏やかに撹拌しつつ以下の成分を加える。
流動パラフィン及び白色ソフトパラフィン
ここで、温度は60乃至70℃に維持する。
全成分が溶解した後、均一になるまで撹拌する。【０１３８】（水性相の調製）
水を60乃至70℃に加熱し、亜硝酸ナトリウムまたはクエン酸一水和物を適宜ゆっくりと加え、該水性相を、ワックス相と混合するまでこの温度に維持する。
両方の相の準備が整ったらこれらを混合し、Silversonミキサーを使用して該クリームベースがca 60℃に冷却されるまで継続して均一化する。
Silversonミキサーまたは同等物を使用して均一化する一方で、該クリームを水性相に加える。均一化を10分間に亘って継続する。
該クリームを小型のHobartに移し、該クリームが固化するまで低速で撹拌を続ける。【０１３９】3. ローション
【表６】
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水を加熱して亜硝酸ナトリウムまたはクエン酸一水和物を添加する。【０１４０】4. 溶液
【表７】
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【０１４１】（製造方法）
水を約50℃に加熱し、亜硝酸ナトリウム及びパラベンを加えて溶解させる。【０１４２】5. ワックス
ワックス製剤の２つの成分を、下記のように調製した（重量％）。
A) 10%アスコルビルパルミテート
（成分）
アスコルビルパルミテート                                    10%
白色ソフトパラフィン                                        25%
軽質流動パラフィン                                          20%
硬質パラフィン                                              20%
Arlacel 165                                                 15%
セトステアリルアルコール                                    10%【０１４３】（方法）
1. 全ての成分を容器に計りとる。
2. 前記容器を加熱し、全ての成分が溶解して該混合物が均一になるまで該混合物を撹拌する。
3. 溶解したワックスをジャーに注入し、室温に冷却する。【０１４４】B) 10% 亜硝酸ナトリウムワックス
（成分）
（A相）
軽質流動パラフィン                                              7.5%
白色ソフトパラフィン                                            20%
Arlacel 582                                                     10%
セトステアリルアルコール                                        10%
フェノキシエタノール                                            1%
（B相）
亜硝酸ナトリウム                                                10%
精製水                                                          20%【０１４５】（方法）
1. Ａ相の成分を容器に計り、70℃に加熱して均一になるまで撹拌する。
2. Ｂ相の成分を別の容器に計り、70℃に加熱して撹拌し、全ての亜硝酸ナトリウムを確実に溶解させる。
3. 両方の相が70℃に達したところで、Ａ相をＢ相に加え、5分間均一化させる。
4. 溶解したワックスをジャーに注入し、室温に冷却する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、pH5.5、5.0、及び4.5での、臨床的に単離されたMRSA株、MRSA制御株、及びMSSA制御株の平均最小阻害濃度を示す図である。
【図２】  図２は、亜硝酸塩(log10μM)の最小阻害濃度と、曝露酸(pH)との間の相乗関係を示す図である。
【図３】  図3は、亜硝酸塩の最小殺菌濃度(log10μM)と曝露酸(pH)との間の相乗関係を示す図である。
【図４】  図4は、試験した全ての株について、様々な曝露時間での酸性化亜硝酸のMBCを対比した図である。
【図５】  図５は、亜硝酸塩の最小殺菌濃度(log10μM)と曝露酸(pH)との間の相乗関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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