(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させる工程と、該工程で得られた酵素分解
物を、分画分子量が10,000以上である限外ろ過膜により濃縮する工程とを含む方法により調製される、カシューアップル由来プロアントシアニジンを含有する組成物。
【請求項２】
前記方法が、カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させる工程よりも後に行われ
る、ポリフェノールを濃縮または分離する工程を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記方法が、カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させる工程よりも後に行われ
る、プロアントシアニジンを濃縮または分離する工程を更に含む、請求項１または２に記
載の組成物。
【請求項４】
カシューアップルから濃縮または分離した平均重合度が２５以上のプロアントシアニジ
ンを含有する組成物。
【請求項５】
前記プロアントシアニジンがプロデルフィニジンを含有する、請求項１〜４のいずれか
１項に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を含有する飲食品組成物、化粧品組成物ま
たは医薬組成物。
【請求項７】
（エピ）ガロカテキンと、（エピ）ガロカテキンガレートとを少なくとも構成単位とし
て含む、平均重合度が２０以上である重合体であるプロアントシアニジン。
【請求項８】
構成単位として（エピ）ガロカテキンを５０〜８０モル％、（エピ）ガロカテキンガレ
ートを２０〜５０モル％含有する、請求項７記載のプロアントシアニジン。
【請求項９】
エピカテキンとエピカテキンガレートとを構成単位として更に含む、請求項７または８
に記載のプロアントシアニジン。
【請求項１０】
重合体のすくなくとも一方の末端がエピガロカテキンガレートである、請求項７〜９の
いずれか１項記載のプロアントシアニジン。
【請求項１１】
カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させ、得られた酵素分解物を分画分子量が
10,000以上である限外ろ過膜により濃縮して得られる濃縮物から分離されたプロアントシアニジンである、請求項７〜１０のいずれか１項記載のプロアントシアニジン。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項記載のプロアントシアニジンを含有する飲食品組成物、
化粧品組成物または医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜５いずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有するα-アミラーゼ阻
害剤。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する、α-アミラー
ゼ活性の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤または治療
剤。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有するリパーゼ阻害剤
。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する、リパーゼ活性
の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤または治療剤。
【請求項１７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する脂質劣化抑制剤
。
【請求項１８】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する、アクネ菌（Pr
opionibacterium acnes）に対する抗菌剤。
【請求項１９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物を有効成分として含有する、アクネ菌（Pr
opionibacterium acnes）の増殖阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは
疾患の予防剤または治療剤。
【請求項２０】
請求項７〜１１のいずれか１項記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する
α-アミラーゼ阻害剤。
【請求項２１】
請求項７〜１１のいずれか１項記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する
、α-アミラーゼ活性の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予
防剤または治療剤。
【請求項２２】
請求項７〜１１のいずれか１項記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する
リパーゼ阻害剤。
【請求項２３】
請求項７〜１１のいずれか１項記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する
、リパーゼ活性の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤ま
たは治療剤。
【請求項２４】
請求項７〜１１のいずれか１項記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する
脂質劣化抑制剤。
【請求項２５】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有す
る、アクネ菌（Propionibacterium acnes）に対する抗菌剤。
【請求項２６】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有す
る、アクネ菌（Propionibacterium acnes）の増殖阻害により症状が予防もしくは改善さ
れる状態もしくは疾患の予防剤または治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カシューアップル由来の高分子プロアントシアニジンおよびそれを含有するカシューアップル処理物、ならびにその用途を提供する。
【背景技術】
【０００２】
カシューナットノキ(Anacardium occidentale)は、ブラジル原産のウルシ科に属する常緑高木であり、花の柄が肥大し、5〜6cmの黄色い洋ナシ型になったものがカシューアップルと呼ばれ、リンゴに似た芳香があり、生食やジュースなどで食用とされることがある。この肥大した柄の先端に2〜3cm、湾曲したマガタマ状の、殻に被われた果実が実る。この殻の中に入っている仁の部分がカシューナッツである。カシューナッツは世界中で広く食用に用いられている。【０００３】
一方、アントシアニジンとはフラボノイドに属し、アントシアニンを加水分解して得られる着色したアグリコンを指し、水酸基の結合数に応じてデルフィニジン型、シアニジン型、ペラルゴニジン型の三種類に大別される。そしてプロアントシアニジンとは、酸性条件において加熱することによりアントシアニジンを生じる成分を指し、縮合型タンニン、すなわちフラバン-3-オールまたはフラバン-3，4-ジオールを構成単位として縮合もしくは重合により結合した化合物群である。酸性条件での加熱によりデルフィニジンを生じるプロアントシアニジンをプロデルフィニジン、シアニジンを生じるプロアントシアニジンをプロシアニジン、ペラルゴニジンを生じるプロアントシアニジンをプロペラルゴニジンと称する。プロデルフィニジンとしてはガロカテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートの重合体が知られており、プロシアニジンとしてはカテキン、エピカテキン、カテキンガレート、およびエピカテキンガレートの重合体が知られている。【０００４】
カシューアップル中にはアナカルド酸等の成分が含まれていることが知られているが、プロアントシアニジンの存在は報告されていない。【０００５】
特許文献1（特開平9-291039）には、タマリンド種皮抽出物から2〜80量体の重合度のプロシアニジンを有効成分とする抗肥満剤が開示されている。また、特許文献2（特開2006-151944）では、プロシアニジン類を含むリンゴ由来ポリフェノールを含有する中性脂肪代謝制御剤が報告されている。このプロシアニジンのリパーゼ阻害活性については、非特許文献2（J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4604-4609）に、リンゴ由来のプロシアニジンを精密に重合度毎に精製し、それぞれのリパーゼ阻害活性の検討を行っている。非特許文献2では、9量体以上のプロシアニジンのリパーゼ阻害IC50は、0.9μｇ/ｍｌとされており、同時に測定しているクロロゲン酸（Chlorogenic acid）は、59.8μｇ/ｍｌである。高分子プロデルフィニジンのα-アミラーゼ阻害活性及びリパーゼ阻害活性については知られていない。【０００６】
高分子プロデルフィニジンに関しては次の報告がある。特許文献3（特開2008-138129）「アミラーゼ阻害剤」では、エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキンガレート、及びエピガロカテキンからなる群から選択されるカテキン類の重合体を含有するαアミラーゼ阻害剤が報告されている。これは酵素反応によって人工的に合成された重合体であり、特許請求の範囲では数平均分子量は10000以下、重合度は2〜20とされている。実施例では全て、エピガロカテキンガレートの重合体とエピガロカテキンガレートとアルデヒドの重縮合物を合成した結果が記載されている。特許文献3からは、エピガロカテキンガレートが重合化したプロデルフィニジンにα-アミラーゼ阻害活性を有することが理解できる。しかしながら、特許文献3に記載の重合体は人工的な反応により得られる化合物であり、構造的に不明な点が多く、食用した場合の安全性についても留意をする。【０００７】
プロデルフィニジンに関する特許文献としては次のものが挙げられる。特許文献4（特開2006-16367）には、2量体の複数の分子構造を有するプロデルフィニジンのリパーゼ阻害活性が報告されている。また特許文献5（特開2006-1909）には、リパーゼ阻害活性を有する新規化合物が報告されている。これらの特許文献には、エピガロカテキンガレート（（-）-epigallocatechin 3-O-gallate）のリパーゼ阻害IC50は、0.284μM及び0.349μM（0.16μｇ/ｍｌ）とされている。非特許文献1（J.Agric.Food Chem, 2003, 51, 7513-7521）には、複数の植物のプロアントシニジンの構成成分を分析した結果が記載されている。平均重合度（mDP）が50以上のものは記載されておらず、またエピガロカテキンガレートを構成成分とするものも報告されていない。また、非特許文献1中にnuts類に「cashew」のプロアントシアニジンが（エピ）カテキンの2量体が存在することが記載されているが、カシューアップルの記載はない。【０００８】
ブドウ由来のプロアントシアニジンに関する特許文献としては次のものが挙げられる。特許文献6（特開2000-44472）に「糖尿病合併症の予防または治療薬剤」としてブドウ果実の種子、果皮などから得られるプロアントシアニジンオリゴマー（2〜30量体、好ましくは2〜10量体）が血糖値上昇抑制作用を有し、糖尿病治療薬として有効であることが報告されている。特許文献6にはアミラーゼ酵素阻害活性に関する報告は記載されていないが、プロシアニジンB-3（2量体）とプロアントシアニジン（ブドウ種子抽出物のプロアントシアニジンオリゴマー）が糖尿病ラットの血糖値を低下させる実施例が報告されている。ブドウ種子中抽出物中のプロアントシニジンはプロシアニジン（（エピ）カテキン重合体）であると考えられる（非特許文献4（香粧会誌  Vol.27, No.4  （2003））及び非特許文献1（J.Agric.Food Chem, 2003, 51, 7513-7521）参照）。【０００９】
一方、リパーゼ阻害剤としては種々の活性成分が知られている。【００１０】
特許文献7(特開2008-19180)ではフユベゴニア抽出物のリパーゼ阻害活性を、イブプロフェンピコノールおよびテトラサイクリン塩酸塩を陽性対照として比較した実験結果が記載されている。【００１１】
特許文献8(特開2005-53891)には、膵リパーゼあるいは細菌性リパーゼの阻害効果に優れ、しかも多くの植物に含有されて安全性に優れ、肥満化傾向あるいはニキビや皮膚炎などに有効性に対応できるリパーゼ阻害剤を提供することを解決課題とする発明が開示されている。特許文献8の実施例では、カフェー酸（カフェイン酸若しくは3,4ジヒドキシけい皮酸）、没食子酸、ロスマリン酸がリパーゼ阻害剤として有効であることが記載されており、その測定値も記載されている。【００１２】
特許文献9(特開2004-115466)には、プロアントシアニジンを含有するニキビ予防及び治療効果用皮膚外用剤が開示されている。特許文献9の特許請求の範囲によれば、プロアントシアニジンは、松樹皮、ブドウ、ブルーベリー、イチゴ、アボガド、ニセアカシア、コケモモの果実もしくは種子、大麦、小麦、大豆、黒大豆、カカオ、ピーナッツの薄皮、イチョウ葉に由来するものである。また実施例ではリパーゼ阻害活性に関する記載はなく、松樹皮抽出物によるアクネ菌等の最小発育阻止試験の結果を記載している。【００１３】
特許文献10(特許第3966689号)には、ベンケイ草科に属するイワベンケイ及び/又は紅景天の抽出物を含有するニキビ用皮膚疾患改善剤が記載されている。特許文献10では、複数の植物抽出物をウシ膵臓由来のリパーゼ阻害活性を実施例では検討している。その中でリパーゼ阻害活性IC50が40μｇ/ｍｌのイワベンケイと紅景天の抽出物に関して特許権が付与されている。【００１４】
一方、ニキビは主に思春期の男女の顔面などに発生する皮膚疾患のひとつである。その原因としては皮脂分泌の増加や、表皮やアクネ菌のリパーゼによって生成された脂肪酸が炎症を引き起こすことや、アクネ菌の異常増殖などが考えられている。ニキビの予防治療には従来から抗菌剤が用いられている（特許文献11、12等）。しかしながら、抗菌剤による副作用や、抗菌剤に対する耐性菌の出現などの問題や、抗菌剤による皮膚常在菌の過剰殺菌等の問題がある。安全性が高くアクネ菌の過剰な増殖を抑制する製剤が求められている。
【特許文献１】特開平9-291039号公報
【特許文献２】特開2006-151944号公報
【特許文献３】特開2008-138129号公報
【特許文献４】特開2006-16367号公報
【特許文献５】特開2006-1909号公報
【特許文献６】特開2000-44472号公報
【特許文献７】特開2008-19180号公報
【特許文献８】特開2005-53891号公報
【特許文献９】特開2004-115466号公報
【特許文献１０】特許第3966689号公報
【特許文献１１】特開2004-189656号公報
【特許文献１２】特開2006-213633号公報
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem., 2003, 51, 7513-7521
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem., 2007, 55, 4604-4609
【非特許文献３】J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 4852-4860
【非特許文献４】香粧会誌, Vol.27, No.4 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
カシューアップルはカシューナッツ採取時に廃棄されることが多い。カシューアップルの有効利用が望まれている。【００１６】
そこで本発明は、カシューアップルの有用な用途を提供することを目的とする。【００１７】
本発明はまた、天然物に由来する、α−アミラーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性、アクネ菌に対する抗菌活性等の有益な活性を有する活性成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題を解決するための手段として本発明は以下の発明を提供する。【００１９】
(1) カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させる工程と、該工程で得られた酵素分解物を、分画分子量が10,000以上である限外ろ過膜により濃縮する工程とを含む方法により調製される、カシューアップル由来プロアントシアニジンを含有する組成物。【００２０】
(2) 前記方法が、カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させる工程よりも後に行われる、ポリフェノールを濃縮または分離する工程を更に含む、(1)に記載の組成物。【００２１】
(3) 前記方法が、カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させる工程よりも後に行われる、プロアントシアニジンを濃縮または分離する工程を更に含む、(1)または(2)に記載の組成物。【００２２】
(4) 前記プロアントシアニジンがプロデルフィニジンを含有する、(1)〜(3)のいずれかに記載の組成物。【００２３】
(5) (1)〜(4)のいずれかに記載の組成物を含有する飲食品組成物、化粧品組成物または医薬組成物。【００２４】
(6) （エピ）ガロカテキンと、（エピ）ガロカテキンガレートとを少なくとも構成単位として含む、平均重合度が２０以上である重合体であるプロアントシアニジン。【００２５】
(7) 構成単位として（エピ）ガロカテキンを５０〜８０モル％、（エピ）ガロカテキンガレートを２０〜５０モル％含有する、(6)記載のプロアントシアニジン。【００２６】
(8) エピカテキンとエピカテキンガレートとを構成単位として更に含む、(6)または(7)記載のプロアントシアニジン。【００２７】
(9) 重合体のすくなくとも一方の末端がエピガロカテキンガレートである、(6)〜(8)のいずれかに記載のプロアントシアニジン。【００２８】
(10) カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させ、得られた酵素分解物を分画分子量が10,000以上である限外ろ過膜により濃縮して得られる濃縮物から分離されたプロアントシアニジンである、(6)〜(9)のいずれかに記載のプロアントシアニジン。【００２９】
(11) (6)〜(10)のいずれかに記載のプロアントシアニジンを含有する飲食品組成物、化粧品組成物または医薬組成物。【００３０】
(12) (1)〜(4)のいずれかに記載の組成物を有効成分として含有するα-アミラーゼ阻害剤。【００３１】
(13) (1)〜(4)のいずれかに記載の組成物を有効成分として含有する、α-アミラーゼ活性の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤または治療剤。【００３２】
(14) (1)〜(4)のいずれかに記載の組成物を有効成分として含有するリパーゼ阻害剤。【００３３】
(15) (1)〜(4)のいずれかに記載の組成物を有効成分として含有する、リパーゼ活性の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤または治療剤。【００３４】
(16) (1)〜(4)のいずれかに記載の組成物を有効成分として含有する脂質劣化抑制剤。【００３５】
(17) (1)〜(4)のいずれかに記載の組成物を有効成分として含有する、アクネ菌（Propionibacterium acnes）に対する抗菌剤。【００３６】
(18) (1)〜(4)のいずれかに記載の組成物を有効成分として含有する、アクネ菌（Propionibacterium acnes）の増殖阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤または治療剤。【００３７】
(19) (6)〜(10)のいずれかに記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有するα-アミラーゼ阻害剤。【００３８】
(20) (6)〜(10)のいずれかに記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する、α-アミラーゼ活性の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤または治療剤。【００３９】
(21) (6)〜(10)のいずれかに記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有するリパーゼ阻害剤。【００４０】
(22) (6)〜(10)のいずれかに記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する、リパーゼ活性の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤または治療剤。【００４１】
(23) (6)〜(10)のいずれかに記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する脂質劣化抑制剤。【００４２】
(24) (6)〜(10)のいずれかに記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する、アクネ菌（Propionibacterium acnes）に対する抗菌剤。【００４３】
(25) (6)〜(10)のいずれかに記載のプロアントシアニジンを有効成分として含有する、アクネ菌（Propionibacterium acnes）の増殖阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤または治療剤。【００４４】
本発明は以下のように記載することもできる。【００４５】
上記プロアントシアニジンを、組成物全重量に対して0.025重量％以上、より好ましくは0.05重量％以上含有する、飲食品組成物、化粧品組成物、又は医薬品組成物。【００４６】
分画分子量が10,000以上である限外ろ過膜を通過するカシューアップル由来プロアントシアニジンを含有せず、分画分子量が10,000以上である限外ろ過膜を通過しないカシューアップル由来プロアントシアニジンを含有する、飲食品組成物、化粧品組成物、又は医薬品組成物。【００４７】
In vivo またはin vitroにおいて上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの付与によりα-アミラーゼを阻害する方法。【００４８】
生体内または生体外のα-アミラーゼ存在環境に上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンを付与することによりα-アミラーゼを阻害する方法。【００４９】
In vivo またはin vitroにおけるα-アミラーゼ阻害剤としての使用のための上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジン。【００５０】
In vivo またはin vitroにおけるα-アミラーゼ阻害剤の製造のための上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。【００５１】
上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンを患者（ヒト等）に投与することを含む、α-アミラーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防または治療方法。上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンは、当該状態または疾患の予防または治療のための有効量で投与される。患者は、当該状態または疾患の予防または治療を必要とする患者である。投与経路としては経口投与が好ましい。【００５２】
α-アミラーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防薬又は治療薬として使用するための、上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジン。【００５３】
α-アミラーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防又は治療のための医薬の製造のための、上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。【００５４】
α-アミラーゼを阻害するための飲食品組成物における、α-アミラーゼを阻害する十分な量の上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの非医療的使用。前記飲食品組成物は、典型的には、それを摂取した人において、α-アミラーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患のリスクを低下するための飲食品組成物、或いは、前記状態もしくは疾患の予防もしくは治療の基礎となる生理的効果を惹き起すための飲食品組成物である。【００５５】
α-アミラーゼを阻害するための医療的な飲食品組成物の製造のための、α-アミラーゼを阻害する十分な量の上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。前記医療的な飲食品組成物は、典型的には、それを摂取した人において、α-アミラーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防又は治療のための飲食品組成物である。【００５６】
In vivo またはin vitroにおいて上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの付与によりリパーゼを阻害する方法。【００５７】
生体内または生体外のリパーゼ存在環境に上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンを付与することによりリパーゼを阻害する方法。【００５８】
In vivo またはin vitroにおけるリパーゼ阻害剤としての使用のための上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジン。【００５９】
In vivo またはin vitroにおけるリパーゼ阻害剤の製造のための上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。【００６０】
上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンを患者（ヒト等）に投与することを含む、リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防または治療方法。上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンは、当該状態または疾患の予防または治療のための有効量で投与される。患者は、当該状態または疾患の予防または治療を必要とする患者である。投与経路としては経口投与または経皮投与が好ましい。【００６１】
リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防薬又は治療薬として使用するための、上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジン。【００６２】
リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防又は治療のための医薬の製造のための、上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。【００６３】
上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンを含有する、脂質劣化抑制剤。【００６４】
生体内または生体外の脂質存在環境（皮膚や脂質含有組成物等）に上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンを付与することにより脂質の劣化を抑制する方法。【００６５】
脂質劣化を抑制するための、上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。【００６６】
リパーゼを阻害するための飲食品組成物における、リパーゼを阻害する十分な量の上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの非医療的使用。前記飲食品組成物は、典型的には、それを摂取した人において、リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患のリスクを低下するための飲食品組成物、或いは、前記状態もしくは疾患の予防もしくは治療の基礎となる生理的効果を惹き起すための飲食品組成物である。【００６７】
リパーゼを阻害するための医療的な飲食品組成物の製造のための、リパーゼを阻害する十分な量の上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。前記医療的な飲食品組成物は、典型的には、それを摂取した人において、リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防又は治療のための飲食品組成物である。【００６８】
リパーゼを阻害するための化粧品組成物における、リパーゼを阻害する十分な量の上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの非医療的使用。前記化粧品組成物は、典型的には、それを使用した人において、リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患のリスクを低下するための化粧品組成物、或いは、前記状態もしくは疾患の予防もしくは治療の基礎となる生理的効果を惹き起すための化粧品組成物である。【００６９】
リパーゼを阻害するための医療的な化粧品組成物の製造のための、リパーゼを阻害する十分な量の上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。前記医療的な化粧品組成物は、典型的には、それを使用した人において、リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防又は治療のための化粧品組成物である。【００７０】
In vivo またはin vitroにおけるアクネ菌に対する抗菌剤としての使用のための上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジン。【００７１】
In vivo またはin vitroにおけるアクネ菌に対する抗菌剤の製造のための上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。【００７２】
上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンを患者（ヒト等）に投与することを含む、アクネ菌の増殖の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防または治療方法。上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンは、当該状態または疾患の予防または治療のための有効量で投与される。患者は、当該状態または疾患の予防または治療を必要とする患者である。投与経路としては経皮投与が好ましい。【００７３】
アクネ菌の増殖の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防薬又は治療薬として使用するための、上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジン。【００７４】
アクネ菌の増殖の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防又は治療のための医薬の製造のための、上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。【００７５】
アクネ菌の増殖を阻害するための化粧品組成物における、アクネ菌の増殖を阻害する十分な量の上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの非医療的使用。前記化粧品組成物は、典型的には、それを使用した人において、アクネ菌の増殖の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患のリスクを低下するための化粧品組成物、或いは、前記状態もしくは疾患の予防もしくは治療の基礎となる生理的効果を惹き起すための化粧品組成物である。【００７６】
アクネ菌の増殖を阻害するための医療的な化粧品組成物の製造のための、アクネ菌の増殖を阻害する十分な量の上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジンの使用。前記医療的な化粧品組成物は、典型的には、それを使用した人において、アクネ菌の増殖の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防又は治療のための化粧品組成物である。【００７７】
医薬としての使用のための、上記プロアントシアニジン含有組成物または上記プロアントシアニジン。
【発明の効果】
【００７８】
本発明により、従来廃棄されることの多かったカシューアップルの有効活用が可能になる。【００７９】
また本発明により、天然物に由来する、安全性の高い、α−アミラーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性、アクネ菌に対する抗菌活性等の有益な活性を有する活性成分が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】カシューアップル由来プロアントシアニジンの酸性条件での加熱処理物のHPLC分析結果を示す。
【図２】NBP-A（100K以上分画物）のチオール分解後のHPLC分析結果を示す。
【図３】NBP チオール分解精製品Peak 1 のESI(+)-MS スペクトル
【図４−１】NBP チオール分解精製品Peak 1 の1H NMR スペクトル
【図４−２】NBP チオール分解精製品Peak 1 の1H NMR スペクトル（図４−１つづき）
【図５−１】NBP チオール分解精製品Peak 1 の1H NMRスペクトル（拡大図）
【図５−２】NBP チオール分解精製品Peak 1 の1H NMRスペクトル（拡大図）（図５−１つづき）
【図６−１】NBP チオール分解精製品Peak 1 の13C NMR スペクトル
【図６−２】NBP チオール分解精製品Peak 1 の13C NMR スペクトル（図６−１つづき）
【図７−１】NBP チオール分解精製品Peak 1 の13C NMRスペクトル（拡大図）
【図７−２】NBP チオール分解精製品Peak 1 の13C NMRスペクトル（拡大図）（図７−１つづき）
【図８】NBP チオール分解精製品Peak 2 のESI(+)-MS スペクトル
【図９−１】NBP チオール分解精製品Peak 2 の1H NMRスペクトル
【図９−２】NBP チオール分解精製品Peak 2 の1H NMRスペクトル（図９−１つづき）
【図１０−１】NBP チオール分解精製品Peak 2 の1H NMRスペクトル（拡大図）
【図１０−２】NBP チオール分解精製品Peak 2 の1H NMRスペクトル（拡大図）（図１０−１つづき）
【図１１−１】NBP チオール分解精製品Peak 2 の13C NMRスペクトル
【図１１−２】NBP チオール分解精製品Peak 2 の13C NMRスペクトル（図１１−１つづき）
【図１２−１】NBP チオール分解精製品Peak 2 の13C NMRスペクトル（拡大図1）
【図１２−２】NBP チオール分解精製品Peak 2 の13C NMRスペクトル（拡大図1）（図１２−１つづき）
【図１３−１】NBP チオール分解精製品Peak 2 の13C NMRスペクトル（拡大図2）
【図１３−２】NBP チオール分解精製品Peak 2 の13C NMRスペクトル（拡大図2）（図１３−１つづき）
【図１４】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液のHPLC クロマトグラム
【図１５】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液のHPLC クロマトグラムとTIC [ESI(+)]
【図１６−１】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(1)のLC-MS 測定結果
【図１６−２】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(1)の精密質量スペクトル
【図１６−３】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(1)（m/z 459.0922）の組成演算結果
【図１６−４】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(1)（m/z 459.0922）の組成演算結果（つづき）
【図１７−１】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(2)のLC-MS 測定結果
【図１７−２】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(2)の精密質量スペクトル
【図１７−３】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(2)（m/z 413.1041）の組成演算結果
【図１７−４】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(2)（m/z 413.1041）の組成演算結果（つづき）
【図１８−１】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(3)のLC-MS 測定結果
【図１８−２】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(3)の精密質量スペクトル
【図１８−３】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(3)（m/z 565.1229）の組成演算結果
【図１８−４】NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液，ピーク(3)（m/z 565.1229）の組成演算結果（つづき）
【図１９】三種類のペクチナーゼ製剤を使用して処理したピューレ抽出物のα−アミラーゼ阻害活性を示す。
【００８１】
本明細書は本願の優先権の基礎である国際出願PCT/JP2008/073843の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８２】
1. カシューアップル
本発明にはカシューアップルとして、カシューナットノキの柄が肥大した黄色い洋ナシ型部位を用いることができる。この部位の先端に実るカシューナッツおよびその殻は除去して使用する。【００８３】
本発明において「カシューアップル」とは、カシューアップルの元の形状をとどめているものだけでなく、カシューアップルの粉砕物、ピューレ、果汁、果汁搾汁残渣などの、カシューアップルを物理的に処理したものも包含される。なかでもカシューアップルのピューレが本発明の用途には好ましい。ピューレとは、殻の部分が除去された熟したカシューアップルを粉砕機やブレンダーなどで粉砕処理して液状化したものである。熟したカシューアップルは果肉が非常に柔らかく、容易に液状化することができる。【００８４】
高分子量のプロアントシアニジンは、カシューアップルにペクチナーゼ等の植物繊維分解酵素を作用することにより、ペクチン等の水不溶性成分から分離される可能性がある。そこで、植物繊維分解酵素を作用させる場合には、「カシューアップル」として果汁搾汁残渣等のカシューアップルの水不溶性成分も使用できる。【００８５】
2. カシューアップルの処理物
本発明者らは、カシューアップルの植物繊維分解酵素による分解物が高いα-アミラーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性、アクネ菌に対する抗菌活性を有することを見出した。そしてこれらの活性に、新規構造を有する高分子量のプロアントシアニジンが関与すると推定した。そこで以下に、カシューアップルの植物繊維分解酵素分解物等のプロアントシアニジン含有組成物、およびプロアントシアニジンについて詳細に説明する。【００８６】
2.1. カシューアップル由来プロアントシアニジン含有組成物
本発明において「プロアントシアニジン含有組成物」または「プロアントシアニジンを含有する組成物」とは、カシューアップル（粉砕物、ピューレ、果汁、水不溶性成分（果汁搾汁残渣）等も包含する）に植物繊維分解酵素を作用させて得られた植物繊維分解酵素分解物に、更に限外ろ過膜による濃縮処理を施して得られた、プロアントシアニジンを作用可能な状態で含有する濃縮物、および該濃縮物に精製等の更なる処理を施して調製された、カシューアップル由来のプロアントシアニジンを含有する、カシューアップル処理物である組成物を指す。【００８７】
カシューアップル由来のプロアントシアニジンは、プロデルフィニジンを主成分として含む。典型的には、カシューアップル由来のプロアントシアニジンは、構成単位のうち７０〜１００モル％がプロデルフィニジン（（エピ）ガロカテキンおよび（エピ）ガロカテキンガレート）である。【００８８】
「植物繊維分解酵素」としては、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、β−アミラーゼ、またはこれらの酵素活性を２つ以上有する酵素、あるいはこれらの酵素の混合物が好ましく、特にペクチナーゼが好ましい。ペクチナーゼは果汁清澄化作用を有することが知られている。本発明では植物繊維分解酵素として市販の酵素製剤を使用することができる。ペクチナーゼとして市販されている酵素製剤だけでなく、セルラーゼなどの他の活性を有する酵素として市販されているがペクチナーゼとして使用することが可能である酵素製剤も、本発明においてペクチナーゼとして使用することができる。【００８９】
植物繊維分解酵素の処理条件については、使用する酵素製剤および酵素濃度に応じて適宜決定すればよく、特に限定されない。酵素処理物が、固形分を遠心分離処理等で容易に沈降できる状態あるいはろ過により容易に分離可能な状態にまで酵素処理を行うことが好ましい。例えば酵素処理時のｐＨ条件は３〜５の範囲とすることができ、温度条件は５０〜６０℃とすることができ、処理時間は１〜２４時間とすることができる。【００９０】
植物繊維分解酵素は、カシューアップルピューレまたは水不溶性成分に作用させることが好ましい。カシューアップルピューレは更に水等の溶媒で希釈されていてもよい。果汁搾汁残渣等の水不溶性成分を使用する実施形態は、廃棄物の有効利用という観点からも好ましい。【００９１】
植物繊維分解酵素作用工程により得られた酵素分解物はそのまま以後の更なる処理に供することができるが、液体部分にプロアントシアニジンが溶出していることから、遠心分離やろ過などの通常の分離手段により液体部分のみを分離して、以後の更なる処理に供することができる。【００９２】
更に、植物繊維分解酵素作用工程により得られた酵素分解物に限外ろ過膜による濃縮処理（以下「限外ろ過工程」と称することがある）、ポリフェノールの濃縮または分離処理（以下「ポリフェノール分離工程」と称することがある）、プロアントシアニジンの濃縮または分離処理（以下「プロアントシアニジン分離工程」と称することがある）などの処理を施すことが好ましい。【００９３】
限外ろ過膜による濃縮処理により、カシューアップルに含まれる果糖やブドウ糖などの単糖類および二糖類を除去することが可能であり、カシューアップル植物繊維分解酵素分解物のカロリーや甘味を抑制することができる。また限外ろ過膜による濃縮処理により濃縮される高分子成分には高分子量のプロアントシアニジンが含まれるため、当該処理による濃縮物はα-アミラーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性、およびアクネ菌に対する抗菌活性が高い。【００９４】
限外ろ過膜は一般に0.1μｍ〜2 nｍ（分子量数百〜数百万）の範囲の粒子や高分子を阻止する膜である。本発明に使用する限外ろ過膜としては、単糖類および二糖類を除去することが可能である分画分子量を有する膜が好ましく、公称されている分画分子量が10,000以上の膜が好ましく、30,000以上の膜がより好ましく、50,000以上の膜が更に好ましい。例えば公称されている分画分子量が10,000〜200,000の膜や、10,000〜100,000の膜を使用することができる。【００９５】
限外ろ過の条件は特に限定されない。限外ろ過膜の構成材料も特に限定されず、ポリエーテルスルホン系材料の膜でも、セルロース系材料の膜でも好適に使用できる。【００９６】
限外ろ過膜による濃縮物はそのまま、あるいは更に濃縮または乾燥させて本発明の用途に使用することができる。【００９７】
ポリフェノールの濃縮または分離処理としては、ポリフェノールを吸着する合成吸着剤を使用して、植物繊維分解酵素作用工程により得られた酵素分解物または上記限外ろ過工程後の濃縮物中のポリフェノールを濃縮または分離する処理が挙げられる。特に、上記限外ろ過工程後の濃縮物に対してポリフェノールの濃縮または分離処理を施すことが好ましい。使用できる合成吸着剤としては、マイクロポアーを有する不溶性の三次元架橋構造ポリマーの、比表面積が高い樹脂であって、樹脂の化学組成が芳香族（スチレン−ジビニルベンゼン）系のものが挙げらる。具体的な市販品としては、ダイヤイオン セパビーズHP-20（登録商標）（三菱化学株式会社製）等が挙げられる。さらに、上記芳香族系の樹脂に化学的な修飾を施したものや、マイクロポアーのサイズを変更したものも好適に使用することが可能である。さらに、結合型シリカゲルに官能基としてオクタデシル（Ｃ１８）やオクチル（Ｃ８）を導入した樹脂を用いてポリフェノールの濃縮または分離処理を行うこともできる。【００９８】
合成吸着剤を用いたポリフェノールの濃縮または分離処理の手順は特に限定されない。例えば合成吸着剤を充填したカラムに、植物繊維分解酵素作用工程により得られた酵素分解物、または上記限外ろ過工程後の濃縮物を通液させ、水などの洗浄液により洗浄し、続いて、アセトン、アルコール水溶液などの溶出液によりポリフェノールを溶出させることにより行うことができる。溶出物は適宜濃縮または乾燥させることができる。こうして得られたポリフェノール成分には、後述するプロアントシアニジンが粗精製物として含まれる。【００９９】
プロアントシアニジンの濃縮または分離処理は、プロアントシアニジンを吸着する合成吸着剤を使用して、植物繊維分解酵素作用工程により得られた酵素分解物、上記限外ろ過工程後の濃縮物、あるいは上記ポリフェノール分離工程で得られたポリフェノール濃縮物または分離物中のプロアントシアニジンを濃縮または分離する処理が挙げられる。特に、ポリフェノール濃縮物または分離物に対してプロアントシアニジンの濃縮または分離処理を施すことが好ましい。使用できる合成吸着剤としては、ヒドロキシプロピル化されたデキストランをベースにした樹脂が挙げられ、特に、乾燥時の粒子径が１８〜１１１μｍ、メタノールによる膨潤時の粒子径が２７〜１６３μｍで、水、塩溶液、有機溶媒および変性剤に安定な性質を有するものが好ましい。具体的な市販品としては、Sephadex LH-20樹脂（GE Helthcare製）が挙げられる。【０１００】
合成吸着剤を用いたプロアントシアニジンの濃縮または分離処理の手順は特に限定されない。例えば合成吸着剤を充填したカラムに、植物繊維分解酵素作用工程により得られた酵素分解物、上記限外ろ過工程後の濃縮物、あるいは上記ポリフェノール分離工程で得られたポリフェノール濃縮物または分離物を通液させ、水などの洗浄液により洗浄し、続いて、アセトン、アルコールなどの溶出液によりプロアントシアニジンを溶出させることにより行うことができる。溶出物は適宜濃縮または乾燥させることができる。こうして得られたプロアントシアニジン成分には、後述するプロアントシアニジンが実質的に精製された状態で存在する。本発明の「プロアントシアニジンを含有する組成物」の範囲には、このような実質的に精製された状態で存在するプロアントシアニジンも包含される。【０１０１】
上記手順を経て得られたポリフェノール濃縮物または分離物、あるいはプロアントシアニジンの濃縮物または分離物は、更に、限外ろ過膜により分子量に応じて分画することもできる。このときに使用する限外ろ過膜の種類および限外ろ過の条件は、上述と同様のものが採用できる。【０１０２】
上記手順により得られるカシューアップル由来プロアントシアニジン含有組成物は、従来存在しない新規組成物であり、なお且つα-アミラーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性、およびアクネ菌に対する抗菌活性が高いという有利な特徴を有する。【０１０３】
本発明のプロアントシアニジン含有組成物は、カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させる植物繊維分解酵素作用工程と、植物繊維分解酵素作用工程で得られた酵素分解物を上記限外ろ過膜により濃縮する限外ろ過工程を含む方法により調製される組成物である。植物繊維分解酵素作用工程に使用するカシューアップルは、ペクチン等の水不溶性成分を少なくとも含んでいることが好ましい。【０１０４】
本発明のプロアントシアニジン含有組成物は、より好ましくは、前記植物繊維分解酵素作用工程と、前記限外ろ過工程と、限外ろ過工程により得られた濃縮物からポリフェノールを濃縮または分離するポリフェノール分離工程とを含む方法により調製される組成物である。【０１０５】
本発明のプロアントシアニジン含有組成物は、より好ましくは、前記植物繊維分解酵素作用工程と、前記限外ろ過工程と、限外ろ過工程により得られた濃縮物からプロアントシアニジンを濃縮または分離するプロアントシアニジン分離工程とを含む方法により調製される組成物である。【０１０６】
本発明のプロアントシアニジン含有組成物は、より好ましくは、前記植物繊維分解酵素作用工程と、前記限外ろ過工程と、限外ろ過工程により得られた濃縮物からポリフェノールを濃縮または分離するポリフェノール分離工程と、ポリフェノール分離工程により得られたポリフェノール含有組成物からプロアントシアニジンを濃縮または分離するプロアントシアニジン分離工程とを含む方法により調製される組成物である。【０１０７】
植物繊維分解酵素作用工程により得られた植物繊維分解酵素分解には、カシューアップル中のプロアントシアニジンを、活性を発揮することができる状態で含有していると考えられる。【０１０８】
限外ろ過工程を経て得られた組成物は、プロアントシアニジンのうち、限外ろ過膜を通過しない高分子量の成分を高められた濃度で含有していると考えられる。【０１０９】
ポリフェノール分離工程を経て得られた組成物は、プロアントシアニジンを他のポリフェノール画分とともに含有していると考えられる。当該組成物はプロアントシアニジンの粗精製物に該当する。【０１１０】
プロアントシアニジン分離工程を経て得られた組成物は、プロアントシアニジンを更に高められた濃度で含有していると考えられる。当該組成物はプロアントシアニジンの精製物に該当する。【０１１１】
2.2. プロアントシアニジン
カシューアップルに植物繊維分解酵素を作用させる工程を含む方法により調製されるカシューアップル植物繊維分解酵素分解物から分離されたプロアントシアニジンは新規化合物である。そして当該プロアントシアニジンは、実施例に示されるように、α-アミラーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性、およびアクネ菌に対する抗菌活性が高いという有利な特徴を有する。すなわち本発明は、新規プロアントシアニジンをも提供する。【０１１２】
本発明のプロアントシアニジンは、ガロカテキンまたはエピガロカテキン（本明細書では「（エピ）ガロカテキン」と記載する）と、ガロカテキンガレートまたはエピガロカテキンガレート（本明細書では「（エピ）ガロカテキンガレート」と記載する）とを少なくとも構成単位として含む、平均重合度が２０以上である重合体である。平均重合度は、２５以上が好ましく、２５〜１００の範囲がより好ましく、２５〜７５の範囲が特に好ましい。本発明のプロアントシアニジンは、エピカテキンとエピカテキンガレートとを構成単位として更に含むことが好ましい。【０１１３】
本発明のプロアントシアニジンは、構成単位として（エピ）ガロカテキンを５０〜８０モル％、（エピ）ガロカテキンガレートを２０〜５０モル％含有することが好ましく、（エピ）ガロカテキンを５０〜７５モル％、（エピ）ガロカテキンガレートを２０〜４５モル％、エピカテキンを３〜１０モル％、エピカテキンガレートを０．５〜５モル％含有することがより好ましい。本発明のプロアントシアニジンは（エピ）ガロカテキンと（エピ）ガロカテキンガレートとを主成分として含有することから、本明細書では「プロデルフィニジン」と称されることもある。【０１１４】
本発明のプロアントシアニジンの構成単位（繰り返し単位）は式：
【化１】
0005591122.tif 000002
【０１１５】
［式中、
（エピ）ガロカテキンでは、R1は水酸基であり、R2は水素原子であり、クロマン環上の2位の置換基と3位の-OR2基とはシス配置またはトランス配置であり；
（エピ）ガロカテキンガレートでは、R1は水酸基であり、R2は：
【化２】
0005591122.tif 000003
【０１１６】
で表される基（ガレート基）であり、クロマン環上の2位の置換基と3位の-OR2基とはシス配置またはトランス配置であり；
エピカテキンでは、R1は水素原子であり、R2は水素原子であり、クロマン環上の2位の置換基と3位の-OR2基とはシス配置であり；
エピカテキンガレートでは、R1は水素原子であり、R2は上記ガレート基であり、クロマン環上の2位の置換基と3位の-OR2基とはシス配置である。］
で表される。【０１１７】
本発明のプロアントシアニジンは、構成単位であるフラボノイド骨格のクロマン環の4位炭素と、隣接する構成単位における他の部位（クロマン環の8位炭素または6位炭素と推定される）との間との間に共有結合が形成されて重合されている。そしてカシューアップル中において、プロアントシアニジンは4位炭素側末端の繰り返し単位（下端ユニット）がエピガロカテキンガレートである。すなわち本発明のプロアントシアニジンの構造は以下の通りであると推定される：
【化３】
0005591122.tif 000004
【０１１８】
（式中、8位炭素上の破線および6位炭素上の破線の一方は隣接する繰り返し単位の4位炭素に連結された結合であり、他方は水素であり、R1、およびR2、ならびに-OR2基の立体配置は上記で定義したとおりであり、下端ユニットではR1は水酸基であり、R2はガレート基であり、クロマン環上の2位の置換基と3位の-OR2基とはシス配置であり、繰り返し単位の数ｎ（重合度）は、２０以上が好ましく、２５以上が好ましく、２５〜１００の範囲がより好ましく、２５〜７５の範囲が特に好ましい。）
本発明において、構成単位の比率および平均重合度は、プロアントシアニジンを、酸性条件下でベンジルメルカプタンと反応させることにより、チオール分解させ、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)や質量分析法等の機器分析により分析するチオール分解法（非特許文献3および実施例5参照）により測定される、分解産物に含まれる構成単位の種類および各構成単位のモル濃度に基づいて算出された値を指す。分解産物中においてベンジルチオエーテル誘導体を形成していない構成単位が下端ユニットを構成している構成単位であると判断する。【０１１９】
本発明のプロアントシアニジンは、前記植物繊維分解酵素作用工程と、前記限外ろ過工程と、前記ポリフェノール分離工程と、前記プロアントシアニジン分離工程とを含む方法により、カシューアップルから調製することができる。【０１２０】
3. 用途
以下に、カシューアップル由来プロアントシアニジンが有する有利な活性およびその活性を利用した用途について説明する。【０１２１】
3.1. α−アミラーゼ阻害作用
カシューアップル由来プロアントシアニジンはα-アミラーゼ阻害作用を有する。α-アミラーゼを阻害することにより、食後の急激な血糖上昇を緩和することができる。よってカシューアップル由来プロアントシアニジンは、α-アミラーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患（血糖値上昇抑制剤、糖尿病、肥満等）の予防剤又は治療剤の有効成分として用いることができる。【０１２２】
本発明のα-アミラーゼ阻害剤、ならびに、α-アミラーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤又は治療剤は医薬品、食品等の任意の形態であってよい。すなわち本発明は、α-アミラーゼ阻害作用、あるいは、α-アミラーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防または治療作用、前記状態もしくは疾患のリスクを低下する作用、或いは、前記状態もしくは疾患の予防もしくは治療の基礎となる生理的効果を惹き起す作用を有する飲食品組成物または医薬品組成物を提供する。上記のアミラーゼ阻害剤、予防剤又は治療剤は、飲食品組成物、或いは、経口投与される形態の医薬組成物として提供されることが好ましい。【０１２３】
例えばカシューアップルのピューレまたは水不溶性成分に植物繊維分解酵素を作用させ、次いで限外ろ過膜による濃縮処理を行って得られた処理物は、それ自体がα-アミラーゼ阻害作用またはそれに関連する作用を有する飲食品組成物または医薬品組成物として利用可能である。【０１２４】
カシューアップル由来プロアントシアニジンが、一食あたり2.2 mg以上、好ましくは7.5 mg以上、より好ましくは25mg以上、特に好ましくは50mg以上摂取できるように配合された飲食品組成物はα-アミラーゼ阻害作用またはそれに関連する作用を有する飲食品組成物として有用である。カシューアップル由来プロアントシアニジンの量の上限は特に限定されないが、通常は一食あたり10 g以下である。また、一食分の飲食品組成物とは例えば100gの飲食品組成物を指す。【０１２５】
3.2. リパーゼ阻害作用
カシューアップル由来プロアントシアニジンはリパーゼ阻害作用を有する。カシューアップル由来プロアントシアニジンは膵臓由来のリパーゼだけでなく、細菌が産生するリパーゼに対しても既知の有効成分等と比較して有効な阻害活性を有する。リパーゼ活性を阻害することにより、脂質摂取後の脂質の体内吸収を抑制して、肥満や高脂血症を予防又は治療することができる。またリパーゼ活性を阻害することにより、食品等の脂質を含む飲食品や化粧品中に微生物が混入した場合の微生物が産生するリパーゼによる脂質の分解を抑制し、変敗臭等の脂質の劣化を抑制することができる。更に、皮膚表面に存在する細菌が産生するリパーゼの作用を阻害することができ、それによって、リパーゼによる酵素活性に起因するニキビ等の皮膚疾患を予防または治療することが可能となる。よってカシューアップル由来プロアントシアニジンは肥満、高脂血症、ニキビ等の、リパーゼ活性の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤もしくは治療剤、あるいは、脂質劣化抑制剤の有効成分として有用である。【０１２６】
本発明のリパーゼ阻害剤、脂質劣化抑制剤、ならびに、リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤又は治療剤は、医薬品、化粧品、食品等の任意の形態であってよい。すなわち本発明は、リパーゼ阻害作用、脂質劣化抑制作用、あるいは、リパーゼの阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防または治療作用、前記状態もしくは疾患のリスクを低下する作用、或いは、前記状態もしくは疾患の予防もしくは治療の基礎となる生理的効果を惹き起す作用を有する飲食品組成物、化粧品組成物または医薬品組成物を提供する。上記のリパーゼ阻害剤、脂質劣化抑制剤、予防剤又は治療剤は、飲食品組成物、皮膚に適用される形態の医薬品組成物又は化粧品組成物、或いは、経口投与される形態の医薬組成物として提供されることが好ましい。【０１２７】
カシューアップル由来プロアントシアニジンが好ましくは0.001重量％〜10重量％、より好ましくは0.01重量％〜5重量％、より好ましくは0.025重量％〜5重量％、特に好ましくは0.05重量％〜5重量％配合された飲食品組成物、化粧品組成物または医薬品組成物は、リパーゼ阻害作用またはそれに関連する作用を有する飲食品組成物、化粧品組成物または医薬品組成物として特に有用である。【０１２８】
3.3. 抗菌作用
カシューアップル由来プロアントシアニジンは、大腸菌（Escherichia coli）、緑濃菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）及びアクネ菌（Propionibacterium acnes）に抗菌性を示すが、特にアクネ菌に対して高い増殖抑制活性を有する。従ってカシューアップル由来プロアントシアニジンは、アクネ菌の増殖阻害により症状が予防もしくは改善される症状または疾患、例えばニキビの治療または予防の用途に有効である。【０１２９】
本発明のアクネ菌に対する抗菌剤、ならびに、アクネ菌の増殖の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防剤又は治療剤は医薬品、化粧品等の任意の形態であってよい。すなわち本発明は、アクネ菌に対する抗菌作用、あるいは、アクネ菌の増殖の阻害により症状が予防もしくは改善される状態もしくは疾患の予防または治療作用、前記状態もしくは疾患のリスクを低下する作用、或いは、前記状態もしくは疾患の予防もしくは治療の基礎となる生理的効果を惹き起す作用を有する化粧品組成物または医薬品組成物を提供する。上記抗菌剤、予防剤又は治療剤は、皮膚に適用される形態の化粧品組成物または医薬品組成物として提供されることが好ましい。【０１３０】
上記の化粧品組成物又は医薬品組成物中のカシューアップル由来プロアントシアニジンの量は、剤型や期待する効果の程度により異なるが、通常、0.0001重量％以上、好ましくは0.001〜10重量％程度、より好ましくは0.025重量％〜10重量％、特に好ましくは0.05重量％〜10重量％配合することが好ましい。【０１３１】
3.4. 組成物の形態
本発明のカシューアップル由来プロアントシアニジン、またはそれを含有するカシューアップル処理物は飲食品組成物、化粧品組成物、医薬品組成物に配合して使用することができる。【０１３２】
飲食品組成物の形態としては、飲料、固形食品、半固形食品等が挙げられ、特定保健用食品にもなり得る。飲料としては、具体的には、果汁飲料、清涼飲料、アルコール飲料等が挙げられる。また、摂取時に水等を用いて希釈して摂取される形態であってもよい。固形食品としては、例えば、飴、トローチ等を含む錠剤（タブレット）や糖衣錠の形態、顆粒の形態、粉末飲料、粉末スープ等の粉末の形態、ビスケット等のブロック菓子類の形態、カプセル、ゼリー等の形態等、種々の形態が挙げられる。半固形食品としては、例えばジャムのようなペーストの形態、チューイングガムのようなガムの形態が挙げられる。これらの飲食品組成物には本発明のカシューアップル由来プロアントシアニジン、またはそれを含有するカシューアップル処理物のほかに、本発明の所望の効果が損なわれない範囲で、食品原料として通常用いられる種々の成分を配合することができる。他の成分としては例えば水、アルコール類、甘味料、酸味料、着色料、保存剤、香料、賦形剤等が挙げられる。これらの成分は単独で、または組み合わされて使用され得る。本発明の飲食品組成物中のカシューアップル由来プロアントシアニジンの量は、摂食によりα−アミラーゼ阻害活性、またはリパーゼ阻害活性を奏する有効量が好ましい。【０１３３】
化粧品組成物としては通常の形態、例えば化粧用クリーム、乳液、化粧水、美容エッセンス、パック剤、パウダー、スキンケア化粧料、リップクリーム、口紅、アンダーメイクアップ、ファンデーション、サンケア、浴用剤、ボディシャンプー、ボディローション、洗浄料、軟膏、ゼリー剤、エアゾール剤等の形態で用いることができる。化粧品組成物には本発明のカシューアップル由来プロアントシアニジン、またはそれを含有するカシューアップル処理物のほかに、本発明の所望の効果が損なわれない範囲で、水、油剤、界面活性剤、潤滑剤、アルコール類、水溶性高分子剤、ゲル化剤、保湿剤、緩衝剤、防腐剤、抗炎症剤、増粘剤、香料、ビタミン類、抗酸化剤、紫外線吸収剤、顔料、色素などを適宜添加することができる。本発明の化粧品組成物中のカシューアップル由来プロアントシアニジンの量は、化粧品としての使用によりリパーゼ阻害活性、またはアクネ菌に対する抗菌活性を奏する有効量が好ましい。【０１３４】
医薬品組成物としては種々の投与形態用に製剤化されたものを使用することができる。製剤形態は特に制限はなく、必要に応じ適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、エリキシル剤等の経口剤、又は注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経粘膜吸収剤、経鼻剤、経腸剤、皮膚外用剤（例えば経皮吸収剤、貼付剤、軟膏剤）等の非経口剤として、症状に応じて単独で、又は組み合わせて使用される。α−アミラーゼ阻害剤としては経口剤の形態が好ましく、リパーゼ阻害剤としては経口剤又は皮膚外用剤の形態が好ましい。アクネ菌に対する抗菌剤としては皮膚外用剤の形態が好ましい。【０１３５】
上記製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料等を使用して常法により調製することができる。【０１３６】
特に、皮膚外用剤として製剤化する場合には、界面活性剤、油脂類、ロウ類、炭化水素類、アルコール類、シリコーン油、水溶性高分子、溶剤、色素、顔料、香料、抗酸化剤、保湿剤、ビタミン、ビタミン誘導体、動植物抽出物、無機塩類、ｐＨ調整剤、殺菌剤、紫外線吸収剤などの成分を、必要に応じて適宜配合することができる。【０１３７】
製剤の投与量は、患者の年令、体重、疾患の程度、投与経路に応じた、α−アミラーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性またはアクネ菌に対する抗菌活性を奏する有効量である。
【実施例】
【０１３８】
本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。【０１３９】
実施例1: 植物繊維分解酵素処理の有効性
(1) 検体の調製
カシューアップルのピューレの果汁とこれをペクチナーゼ処理して得られた果汁のα-アミラーゼ阻害活性について比較検討を行った。未処理果汁の調製は、解凍したピューレを18000rpm、20分、20℃で遠心分離処理を行い、その上清を0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）を用いてろ過し、ろ過液を未処理果汁とした。【０１４０】
ペクチナーゼ処理果汁は、ペクチナーゼA「アマノ」（天野エンザイム製）をピューレ重量の0.5％を添加し、50℃で90分しんとう混合させた。この酵素処理液を18000rpm、15分、20℃で遠心分離処理を行い、その上清を0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）を用いてろ過し、ろ過液をペクチナーゼ処理果汁とした。カシューアップルのピューレは、遠心分離のみでは十分に沈殿させることができないため、ペクチナーゼ処理することでろ過が容易になった。【０１４１】
比較対照として、市販されている茶飲料（蕃爽麗茶（登録商標）（ヤクルト製））のα-アミラーゼ阻害活性も測定した。当該茶飲料には分子量5,000 〜30,000に分布する複合タンニン様物質を含有するグァバ葉ポリフェノールが配合されている。食べ物として体内に入った糖質は消化酵素によって消化・分解され、ブドウ糖となって腸から吸収される。グァバ葉ポリフェノールは、ショ糖、デンプンなどの糖質をブドウ糖などに分解する糖質分解酵素の働きを抑え、その結果、糖の血液中への吸収を遅らせ食後の血糖値の上昇をゆるやかにする効果がある。当該茶飲料は、この効能効果が認められ、日本国厚生労働省から特定保健用食品としての認可を2000年3月28日に受けている。【０１４２】
(2) α-アミラーゼ阻害活性の測定
上記三種の検体各々について、精製水で希釈した試料溶液50μｌと豚膵臓由来α−アミラーゼ（SIGMA社製）/0.25Mリン酸緩衝液（ｐH7.0）50μｌを加えて混合した後、37℃で10分間プレインキュベートした。これに試料溶液群に0.5％でんぷん/リン酸緩衝液100μｌを加えて反応を開始させた。37℃で30分のインキュベートの後、各試験管に0.1M塩酸を1ｍｌ加え、酵素反応を停止させた。これらの反応液を十分に混合した後、96wellプレートに各反応液100μｌを入れ、これに0.01Mヨウ素溶液100μｌを加え未分解のでんぷんを発色させ、プレートリーダーにより660ｎｍの吸光度を測定した。酵素阻害率は、ブランクとしての対照溶液との比較で次の式により算出した。各試料のブランクとして、0.5％でんぷん/リン酸緩衝液100μｌの添加時期をプレインキュベート後ではなく塩酸による酵素反応停止後に添加した試験を行った。すなわち各試料のブランク試験では、酵素溶液と各試料を同様に混合し、37 ℃で10分間プレインキュベートした後にさらに30分間のインキュベートを行い、その後に各試験管に0.1M塩酸を1ml加えて混合した後、0.5％でんぷん/リン酸緩衝液100μｌを添加した。また、各試料の代わりに、酵素活性を阻害しない精製水を用いた以外は試料溶液の試験と同様の手順で吸光度を測定した（精製水ブランク）。【０１４３】
＜計算式＞
α−アミラーゼ阻害活性（％）＝（1−（A−B）/（C−D））ｘ100
A：試料溶液のブランクの吸光度
B：試料溶液の吸光度
C：精製水のブランクの吸光度
D：精製水の吸光度
また各試料溶液の酵素阻害活性は、複数の濃度で測定し、α-アミラーゼ酵素を50％阻害する濃度（IC50）を算出した。【０１４４】
(3) 試験結果
カシューアップル未処理果汁、カシューアップルペクチナーゼ処理果汁、茶飲料のそれぞれの希釈前の濃度を100％濃度として比較した結果を以下に示す。
【表１】
0005591122.tif 000005
【０１４５】
茶飲料（蕃爽麗茶（登録商標））は、2.5％濃度（40倍希釈液）でα-アミラーゼ活性を50％阻害した。一方、カシューアップルペクチナーゼ処理果汁のIC50は、0.3％濃度（約333倍希釈液）であったが、未処理果汁では5.4％（約18.5倍希釈液）と非常に阻害活性は弱かった。本試験に用いた茶飲料は、ヒトに対する血糖値上昇抑作用が効能として認められて特定保健用食品としての認可を受けている。カシューアップルペクチナーゼ処理果汁は当該茶飲料と比較してα−アミラーゼ阻害活性がIC50値において8倍以上強いことからヒトに対しても同様な効果が期待できる。【０１４６】
また、本発明品のカシューアップル由来プロアントシアニジンは、分子量1万の限外ろ過膜で濃縮できることから、このカシューアップルペクチナーゼ処理果汁を分子量1万の限外ろ過で濃縮し、低分子成分である果糖やぶどう糖を除去した濃縮液を利用することも可能である。【０１４７】
実施例2：有効成分（カシューアップル由来高分子プロアントシアニジン）の精製
カシューアップルのピューレ4773ｇに0.5％分（23.9ｇ）のペクチナーゼA「アマノ」を添加し、50℃で2.5時間攪拌した。このペクチナーゼ処理液を4200rpm、60分、20℃で遠心分離処理し、この上清を0.2μｍのフィルター（SUPORLIFE（登録商標） DCF, PALL社製）でろ過して、ペクチナーゼ処理果汁4230ｇを回収した。このペクチナーゼ処理果汁から主にぶどう糖及び果糖を除去することを目的として、分画分子量1万の限外ろ過膜（ハイドロザルト（登録商標）10KDa、ザルトリウス社製）を用いて限外ろ過濃縮を行い、濃縮液729ｇ（固形分26.4ｇ）を回収した。また分子量1万以下の画分には、α−アミラーゼ阻害活性は検出されなかった。この濃縮液からポリフェノール成分を精製することを目的として、ダイヤイオン  セパビーズHP-20（登録商標）（三菱化学株式会社製：約500ｍｌ）で処理を行った。方法は定法に従い、カラムに充填した樹脂に濃縮液を通液させ、成分を吸着させた後に精製水で樹脂を十分に洗浄し、50％（W/W）のエタノール水溶液で溶出させ成分を回収した。この溶出液は減圧蒸留濃縮器により乾固させた。固形分として3.7ｇを回収した。【０１４８】
このHP-20樹脂で精製した成分（HP-20樹脂精製品）に対して、プロアントシアニジンの分離でよく行われるSephadex  LH-20樹脂（GE  Healthcare製）による再精製を実施した。50％（W/W）メタノール水溶液で膨潤させた樹脂500ｍｌをカラムに充填し、50％（W/W）メタノール水溶液で溶解させたHP-20樹脂精製品をカラムに通液し、未吸着成分を十分な量の50％（W/W）メタノール水溶液で洗浄した。有効成分は、100％メタノールで溶出させた画分を減圧蒸留乾固させNBP-M（仮称）として226.2ｍｇを回収した。さらに、メタノール溶出後の樹脂に対して70％（V/V）アセトン水溶液で溶出を行い成分を回収し、減圧蒸留乾固させた。NBP-A（仮称）として823.7ｍｇを回収した。精製方法から、NBP-MおよびNBP-Aは高分子量のプロアントシアニジンであると推定される。【０１４９】
実施例3: 有効成分の分子量とα-アミラーゼ阻害活性
(1) 有効成分の分子量分画
LH-20樹脂で精製したカシューアップル高分子プロアントシアニジン（仮称：NBP-M及びNBP-A）の分子の大きさの分布を検討するために、遠心型限外ろ過器であるAmicon Ultra-15(登録商標)(Millipore製)を用いて分子量分画処理を行った。試験は、NBP-M及びNBP-A をそれぞれ精製水で溶解させ、それを分画分子量10万の限外ろ過膜（Ultracel-100K (登録商標)）に負荷し、それを通過した溶液を分画分子量5万の限外ろ過膜（Ultracel-50K (登録商標)）、その通過液を分画分子量３万の限外ろ過膜（Ultracel-30K (登録商標)）、その通過液を分画分子量1万の限外ろ過膜（Ultracel-10K (登録商標)）にかけて分画物を調製し、それぞれの画分を凍結乾燥処理して各分子量分画の重量分布率を検討した。その結果、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンの多くは、分画分子量5万以上の分画に存在することが判明した。
【表２】
0005591122.tif 000006
【０１５０】
(2) 各画分のα-アミラーゼ阻害活性
各分子量分画の分布率とα-アミラーゼ阻害活性のIC50を測定した（実施例1(2)と同一の手順により測定）。結果を以下の表に記載する。
【表３】
0005591122.tif 000007
【０１５１】
(3) 結果まとめ
アセトン溶出画分（NBP-A）については分子量が5万以上の画分にNBP-Aの88.6％が存在し、α-アミラーゼ阻害活性も分子量が大きくなることほど強くなる傾向があることが確認された。しかし、分子量が30K〜10Kの分画物でも3.0μｇ/ｍｌという強い活性を示した。【０１５２】
メタノール溶出画分（NBP-M）では、分画分子量が大きくなるほどα-アミラーゼ阻害活性が強くなる傾向はあるが大きな差ではなかった。【０１５３】
実施例4: 有効成分の分子構造の解析1
(1) 背景
プロアントシアニジンは、各種の植物体に存在する縮合型タンニン、すなわちフラバン-3-オールまたはフラバン-3，4-ジオールを構成単位として縮合もしくは重合により結合した化合物群を意味している。そのため、プロアントシアニジンは、酸性条件下において加熱することによりシアニジンを生成するプロシアニジン（下記式のR1〜R3の内、2個が水酸基（OH）、1個が水素（H））、デルフィニジンを生成するプロデルフィニジン（下記式のR1〜R3の内、3個が水酸基（OH））、ペラルゴニジンを生成するプロペラルゴニジン（下記式のR1〜R3の内、1個が水酸基（OH）、2個が水素（H））等の分子構造が異なる多くのポリフェノールの総称である。そのため、塩酸/ブタノール溶液中で加熱し、そのシアニジンの種類を分析することにより、R1〜R3の水酸基の数とプロアントシアニジンの種類の推定が可能である。
【化４】
0005591122.tif 000008
【０１５４】
(2) 目的
カシューアップルピューレより得られたNBP-Aの、プロアントシアニジンの種類を分析した。比較のために、エピカテキンとエピカテキンガレートから構成されるブドウ種子由来プロシアニジンであるグラヴィノール（登録商標）（キッコーマン製）についても同様の手順で分析を行った。【０１５５】
(3) 方法
(i) 各検体の0.1％（W/V）50％エタノール水溶液を調製し、0.45μｍフィルターろ過を行った
(ii) 5％（V/V）塩酸/ブタノール溶液と同量混合し、95℃で1時間加熱した。【０１５６】
(iii) HPLC（ODS-3カラム）により分析した。検出波長は532ｎｍで分析を行った。【０１５７】
(iv) 試薬のシアニジン及びデルフィニジン（生化学工業製）の0.1％濃度以下の検体を調製し、同じ条件でHPLC分析を行い、検量線を作成した。【０１５８】
(v) 各検体のアントシアニジン類量を検量線より算出した。【０１５９】
(4) 実験結果
試薬のデルフィニジン及びシアニジンの分析結果を図1aに示す。図1aにおいて、30.826minのピークがデルフィニジンであり、33.088分のピークがシアニジンである。【０１６０】
NBP-Aの分析結果を図1bに示す。30.871minのピークがデルフィニジンであり、33.145minのピークがシアニジンであることから、NBP-Aは、プロデルフィニジンを主成分とし、プロシアニジンを若干量含有することが判明した。【０１６１】
グラヴィノール（登録商標）（ブドウ種子）の分析結果を図1cに示す。33.140minのピークがシアニジンである。この結果は、グラヴィノール（登録商標）がプロシアニジンであることと合致する。【０１６２】
(5) 各種検体からのデルフィニジン及びシアニジン生成
実施例3で調製された、NBP-M及びNBP-Aの分子量分画物のそれぞれについて、上記(3)と同様の手順により酸性条件下での加熱処理を行いデルフィニジン濃度およびシアニジン濃度を測定した。【０１６３】
以下の表に各検体の酸性条件下で生成されたデルフィニジン濃度、シアニジン濃度と生成比率を記載する。
【表４】
0005591122.tif 000009
【０１６４】
実施例5: 有効成分の分子構造の解析2
6個以上のフラバン−3−オール類が結合した高重合度のプロアントシアニジンは複雑な構造のため高精度なMS分析やNMR分析によって構造を解析することができない。そのため、プロアントシアニジンの構造を分析する方法として、酸性条件下でベンジルメルカプタン:
【化５】
0005591122.tif 000010
【０１６５】
と反応させることにより、チオール分解させ、その分解産物を解析する手法が用いられている。以下に分解反応略図を示す。
【化６】
0005591122.tif 000011
【０１６６】
上記概略図ではカテキンの縮合物をチオール分解させた場合について説明しているが、（エピ）ガロカテキンまたは（エピ）ガロカテキンガレートの縮合物をチオール分解させた場合でも同様の分解物が形成される。【０１６７】
本分解反応では縮合型タンニンの下端ユニット（Lower unit）はそのままの状態（Catechin, Epicatechin：一部はエピマー化）で遊離し、下端ユニット以外はそれぞれベンジルチオエーテルとして誘導体化される。得られたベンジルチオエーテル誘導体の構造を分析することにより、縮合型タンニンの構成ユニットを解析することが可能である。【０１６８】
非特許文献3には、ブルーベリー等のプロアントシアニジンをチオール分解させ、HPLCにより分析した例が示されている。本文献によるとココア、きびの1種（brown sorghum bran）、野生種のブル−ベリーの1種（lowbush blueberry）及びクランベリーのプロアントシニジンのチオール分解物からはベンジルチオエーテル誘導体としてはエピカテキンベンジルチオエーテルしか検出できなかったことが報告されている。また本文献には、カテキンおよびエピカテキンの重合物の平均重合度（mean DP (degree of polymerization)）を算出する方法について記載されている。280ｎｍでのHPLC分析を行い、それぞれのピークの面積から平均重合度が計算されている。【０１６９】
mDP={カテキンベンジルチオエーテルおよびエピカテキンベンジルチオエーテルの総面積}/{カテキンおよびエピカテキンの総面積}+1
(1)カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンのチオール分解物のHPLC分析
実施例3で得たNBP-M及びNBP-A分画物についてチオール分解を行い、構成成分の相違について検討を行った。チオール分解は、0.2％（W/V）濃度でメタノールに溶解させた検体250μｌと3.3％（V/V）塩酸/メタノール溶液250μｌを混合し、これに5％ベンジルメルカプタン/メタノール溶液を500μｌ加え、チューブを密閉して、40℃で30分加温後、室温で10時間反応させた。分析は、HPLCでカラムはODS-3（4.6ｘ250ｍｍ、ジーエルサイエンス製）を用いた。流速1ｍｌ/minで0.05％TFAを添加した精製水/メタノールのリニアグラジエントにより分析した。NBP-A（100K以上分画物）のチオール分解後のHPLC分析結果（検出波長280ｎｍ）を、チオール分解後のHPLC分析結果を図2に示す。実施例3で調製した、NBP-A（100K以上分画物）以外の他のNBP-M及びNBP-A分画物からも、図2とほぼ同様のクロマトグラムが得られた。【０１７０】
本検討の結果、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンのチオール分解物は主に5成分（図2のクロマトグラムにおける36分のピーク、38分のピーク、24分のピーク、40分のピーク、41分のピーク）から構成されていること、ならびに36分のピークおよび38分のピークに対応する成分が主成分であることが判明した。【０１７１】
試薬、プロシアニジンC1（エピカテキンの3量体）のチオール分解物、ならびにエピカテキンとエピカテキンガレートから構成されるブドウ種子由来プロシアニジンであるグラヴィノール（登録商標）（キッコーマン製）のチオール分解物のHPLC分析結果との比較から、36分のピークおよび38分のピークは、プロシアニジンC1（エピカテキンの3量体）やグラヴィノール（登録商標）のチオール分解物には含まれない成分に対応することが判明した。更に、24分のピークはエピガロカテキンガレートに、40分のピークはエピカテキンのベンジルチオエーテル誘導体に、41分のピークはエピカテキンガレートのベンジルチオエーテル誘導体にそれぞれ対応すると推定された。【０１７２】
(2) カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンの主構成成分の構造分析
カシューアップル由来の高分子プロアントシアニジンの主な構成成分を明らかにするために上記(1)で行ったチオール分解法により、実施例3で精製・分離したNBP-Aの限外ろ過分画100K以上の検体を分解し、36分のピークの成分（peak1成分）と38分のピークの成分（peak2成分）の精製を行い、ESI-MSおよびNMRにより構造解析を実施した。【０１７３】
(2-1) 分析試料
カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンであるNBP-A (100K以上)（分析結果の説明および図中では「NBP」と表記する） 179ｍｇを上記(1)と同様なチオール分解を行い、精製水で5倍に希釈し、C18 Cartriges(Sep-Pak Vac 35cc、Waters製)に負荷し、未吸着成分を十分な精製水で洗浄する。このC18樹脂に結合した成分を50％メタノールで溶出させた。これを減圧蒸留器により濃縮し、分取用HPLCカラム（ODS-3：20ｘ250ｍｍ、ジーエルサイエンス製）により分取した。精製物は最終的にpeak１成分を29.5ｍｇ、peak2成分を27.2ｍｇ回収した。【０１７４】
得られたpeak１成分およびpeak2成分を検体として以下の分析を行った。【０１７５】
(2-2) 分析項目
(i) ESI-MS
(ii) 1H NMR，13C NMR
(2-3) 分析方法
(i) ESI-MS
以下のESI-MS 条件で測定した。
【表５】
0005591122.tif 000012
【０１７６】
(ii) 1H NMR，13C NMR
以下のNMR 条件で測定した。
【表６】
0005591122.tif 000013
【０１７７】
(2-4) 分析結果
(i) NBP チオール分解精製品Peak 1 のESI(+)-MS スペクトルを図3、1H NMR スペクトルを図4-1〜5-2、13C NMR スペクトルを図6-1〜7-2 に、データを表7〜9、推定構造式1 に示す。
【表７】
0005591122.tif 000014
【表８】
0005591122.tif 000015
【表９】
0005591122.tif 000016
【化７】
0005591122.tif 000017
【０１７８】
(ii) NBP チオール分解精製品Peak 2 のESI(+)-MS スペクトルを図8、1H NMR スペクトルを図9-1〜10-2、13C NMR スペクトルを図11-1〜13-2 に、データを表10〜12、推定構造式2 に示す。
【表１０】
0005591122.tif 000018
【表１１】
0005591122.tif 000019
【表１２】
0005591122.tif 000020
【化８】
0005591122.tif 000021
【０１７９】
(2-5) 結果解析
(i) NBP チオール分解精製品Peak 1 は、ESI(+)-MS でm/z 429 [(M+H)+] とm/z 451 [(M+Na)+]に擬似分子イオンピークが観測された。ESI(+)-MS、1H NMR、13C NMR のデータより、分子組成がC22H20O7S であることが推測できた（表7）。また、 1H NMR スペクトルの解析から、9 個の芳香属プロトン［δ5.914 (1H), 6.033 (1H), 6.574 (2H), 7.234 (1H), 7.323 (2H), 7.465 (2H)］、5個の非芳香属プロトン［δ3.994〜4.039 (3H), 4.081 (1H), 5.221 (1H)］の存在が明らかとなった（表 8）。9個の芳香属プロトンの中で、5 個はベンジルプロトン［δ7.234 (1H), 7.323 (2H), 7.465 (2H)］であることも明らかとなった。さらに、13C NMR スペクトルの解析から、14 種（炭素18 個と推定する）の芳香属炭素（δC 95.71, 96.73, 99.90, 106.90, 127.72, 129.28, 129.82, 131.24, 132.98, 139.86, 146.20, 157.10, 158.41, 158.89）、4 種の非芳香属炭素（δC 37.14, 43.19, 71.20, 75.42）の存在が明らかとなった（表9）。以上のデータを詳細に解析した結果、NBP チオール分解精製品Peak 1 の平面構造が推定構造式1のとおり推定された。すなわち、Peak 1成分は（エピ）ガロカテキンのベンジルチオエーテル誘導体であると推定された。以後、「（エピ）ガロカテキンベンジルチオエーテル誘導体」または「（エピ）ガロカテキン誘導体」と称する場合がある。【０１８０】
(ii) NBPチオール分解精製品Peak 2は、ESI(+)-MSでm/z 581 [(M+H)+] とm/z 603 [(M+Na)+]に擬似分子イオンピークが観測された。ESI(+)-MS、1H NMR、13C NMRのデータより、分子組成がC29H25O11Sであることが推測できた（表10）。NBPチオール分解精製品Peak 1と比較すると、両者のNMRスペクトルが類似している。1H NMRスペクトルの解析から、11個の芳香属プロトン［δ 6.036(1H), 6.050 (1H), 6.614 (2H), 7.001 (2H),7.233 (1H), 7.319 (2H), 7.514 (2H)］、5個の非芳香属プロトン［δ4.112 (1H), 4.205 (1H), 4.247 (1H), 5.474 (1H), 5.506 (1H)］の存在が明らかとなった（表11）。さらに、13C -NMRスペクトルの解析から、18種（炭素24個と推定する）の芳香属炭素（δC 95.70, 97.06, 98.89, 106.74, 110.02, 121.22, 127.76, 129.23, 129.94, 130.08, 133.29, 139.09, 139.70, 145.94, 146.39, 156.99, 158.22, 159.22）、5種の非芳香属炭素（δC 37.02, 40.76, 72.77, 74.26, 166.17）の存在が明らかとなった（表 12）。以上のデータを詳細に解析した結果、NBPチオール分解精製品Peak 2の平面構造が推定構造式2のとおり推定された。すなわち、Peak 2成分は（エピ）ガロカテキンガレートのベンジルチオエーテル誘導体であると推定された。以後、「（エピ）ガロカテキンガレートベンジルチオエーテル誘導体」または「（エピ）ガロカテキンガレート誘導体」と称する場合がある。【０１８１】
(3) NBPの他の構成成分の構造分析
上記(1)に記載の通り、NBPのチオール分解物のHPLC分析結果と、試薬、プロシアニジンC1（エピカテキンの3量体）のチオール分解物、ならびにエピカテキンとエピカテキンガレートから構成されるブドウ種子由来プロシアニジンであるグラヴィノール（登録商標）（キッコーマン製）のチオール分解物のHPLC分析結果との比較から、NBPのチオール分解物は、主要な二成分（peak 1成分およびpeak 2成分）のほかに、エピガロカテキンガレート、エピカテキンのベンジルチオエーテル誘導体、およびエピカテキンガレートのベンジルチオエーテル誘導体である三成分により構成されることが推定された。【０１８２】
そこで実施例3で調製されたNBP-Aの10K画分を上記(1)で行ったチオール分解法により分解し溶液を分析試料とし、以下の分析を行った。【０１８３】
(3-1) 目的
LC-MS測定により分析試料の質量スペクトルを取得し、分子量を確認する。【０１８４】
(3-2) 分析試料
NBP-Aの10K画分のチオール分解溶液
(3-3) 分析項目
質量分析(LC-MS)
(3-4) 分析方法
以下のLC-MS条件により測定を行った。
【表１３】
0005591122.tif 000022
【０１８５】
(3-5) 結果
得られたLC-MS 測定結果を表14 にまとめる。【０１８６】
TIC で検出されたそれぞれのピークにつき、表14 に示すMS 検出ピークの精密なm/z 値より元素組成演算を行った。
【表１４】
0005591122.tif 000023
【０１８７】
LC-MS分析では実施例5(1)と同じカラムを使用しているが分析装置が異なるため図2とは若干溶出時間が異なった。他のピークとの関係より図2における24分のピークがLC-MSでの26分のピーク(1)、図2での40分のピークがLC-MSでの42分のピーク(2)、図2での41分のピークがLC-MSでの43分のピーク(3)にそれぞれ対応する。本LC-MS測定ではプロトン化分子イオン（[M+H]+）の質量電荷比(m/z)が測定されるため、LC-MSでのピーク(1)が分子量458であるエピガロカテキンガレートに、ピーク(2)が分子量412であるエピカテキンのベンジルチオエーテル誘導体に、ピーク(3)が分子量564であるエピカテキンガレートのベンジルチオエーテル誘導体とそれぞれ一致することが確認された。ピーク(2)がエピカテキンのベンジルチオエーテル誘導体であることは、プロシアニジンＣ１のチオール分解後のHPLC分析結果との比較により確認した。ピーク(3)がエピカテキンガレートのベンジルチオエーテル誘導体であることは、グラヴィノール（登録商標）のチオール分解後のHPLC分析結果との比較により確認した。また、ピーク(1)が誘導体化されていないエピガロカテキンガレートであることは、エピガロカテキンガレートの市販試薬のHPLC分析結果との比較により確認した。【０１８８】
(4) 構成成分分析まとめ
本発明のカシューアップル由来プロアントシアニジンの、酸性条件下でベンジルメルカプタンを作用させて得られるチオール分解物は、推定構造式1の構造を有すると推定される化合物（表5に示す条件によるESI-MS分析により表7に示すマスピークが検出され、表6に示す条件による 1H NMRおよび13C NMR分析により表8および9に示す化学シフト値のピークが検出される化合物）と、推定構造式2の構造を有すると推定される化合物（表5に示す条件によるESI-MS分析により表10に示すマスピークが検出され、表6に示す条件による 1H NMRおよび13C NMR分析により表11および12に示す化学シフト値のピークが検出される化合物）と、エピカテキンのベンジルチオエーテル誘導体と、エピカテキンガレートのベンジルチオエーテル誘導体と、エピガロカテキンガレートとを含む。このことから、カシューアップル由来プロデルフィニジンは（エピ）ガロカテキン、（エピ）ガロカテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレート、およびエピガロカテキンガレートを構成成分とし、下端ユニットがエピガロカテキンガレートである縮合物であると推定される。【０１８９】
構成単位であるフラボノイド骨格のクロマン環の4位炭素と、隣接する構成単位における他の部位（クロマン環の8位炭素または6位炭素と推定される（非特許文献1等参照））との間に共有結合が形成されて重合されていることが、チオール分解物におけるベンジルチオエーテルの結合位置が4位炭素であることから確認された。【０１９０】
下端ユニットがエピガロカテキンガレートであることが、チオール分解物においてベンジルチオエーテルにより誘導体化されていない成分がエピガロカテキンガレートのみであることから確認された。【０１９１】
実施例6:カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンの重合度
実施例5ではカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンを構成する成分および下端ユニットが推定された。本実施例では重合度を推定する。【０１９２】
プロアントシアニジンの重合度を推定するために非特許文献1（J.Agric.Food Chem, 2003, 51, 7513-7521）や他の書籍に記載されている方法により検討を行った。これは、実施例5で行ったチオール分解処理物のHPLC分析（検出波長280ｎｍ）により、下端ユニットのカテキン類とその他のカテキン類ベンジルチオエーテル誘導体の面積比により重合度を算出する方法である。【０１９３】
非特許文献1等の論文では、多くの植物からカテキン若しくはエピカテキンの誘導体しか検出されていない為、構造が異なる他のカテキン類にはそのままの計算式は適用できない。そこで、以下の手順により平均重合度および構成成分比率を算出した。【０１９４】
(1) 分析手順
(i) カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンの実施例3で調製された8つの限外ろ過分画物について実施例5記載の手順でチオール分解処理を実施した。【０１９５】
(ii) チオール分解物を、実施例5と同じ条件でHPLC（カラムODS-3、4.6ｘ250ｍｍ）により分析し、280ｎｍでの各ピーク面積を測定した。【０１９６】
(iii) 和光純薬製のエピカテキン（純度98％以上）、エピガロカテキン（純度98％以上）、エピガロカテキンガレート（純度90％以上）、エピカテキンガレート（純度98％以上）を標準品として、複数の濃度でのHPLC分析（実施例5と同条件）を実施した。【０１９７】
(iv) 各標準品の280ｎｍでのピーク面積から、各カテキン類化合物の濃度対ピーク面積の検量線を作成した。【０１９８】
(v) チオール分解物中での、エピガロカテキンガレート、（エピ）ガロカテキンベンジルチオエーテル誘導体、（エピ）ガロカテキンガレートベンジルチオエーテル誘導体、エピカテキンベンジルチオエーテル誘導体、およびエピカテキンガレートベンジルチオエーテル誘導体の濃度を、該当するカテキン類化合物の検量線より算出し、算出された濃度を分子量に基づきモル濃度に換算した。【０１９９】
(vi) モル濃度の比率から以下の計算式により平均重合度（mDP）を算出した。計算式：
平均重合度＝{[（エピ）ガロカテキン誘導体モル濃度]+[（エピ）ガロカテキンガレート誘導体モル濃度]+[エピカテキン誘導体モル濃度]+[エピカテキンガレート誘導体モル濃度]}/{エピガロカテキンガレートのモル濃度}+1
(vii) 含有比率は、モル濃度の比率である。
【表１５】
0005591122.tif 000024
【表１６】
0005591122.tif 000025
【０２００】
本プロアントシアニジンは、下端ユニットがエピガロカテキンガレートで、誘導体と記載されている成分が重合化したものである。また平均重合度は25〜73量体であり、主成分の（エピ）ガロカテキンが58.5〜61.6％、（エピ）ガロカテキンガレートが28.5〜30.4％であることが判明した。このような天然物由来の高分子プロアントシアニジンは報告されていないため、カシューアップル特有の高分子プロアントシアニジンと考えられる。【０２０１】
実施例7: カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンと他のα-アミラーゼ阻害成分の活性比較
カシューアップル由来高分子プロアントシアニジン、他のα-アミラーゼ阻害活性成分、およびグラヴィノール（登録商標）（ブドウ種子由来プロアントシアニジン）に関してα-アミラーゼ阻害活性のIC50（最終検体濃度）を測定し、活性の比較検討を行った。測定は実施例1(2)と同じ方法で行い、全ての検体の測定は同一日に実施した。【０２０２】
各検体の調製法を以下に示す。【０２０３】
(i) 蕃爽麗茶（登録商標）由来C18結合ポリフェノール成分
グァバ葉ポリフェノール配合茶飲料（蕃爽麗茶（登録商標）(ヤクルト製））500ｇをC18 Cartriges (Sep-Pak Vac 35cc、Waters製)に負荷し、未吸着成分を十分な精製水で洗浄する。このC18樹脂に結合した成分をメタノールで溶出させ、減圧蒸留乾固させて、蕃爽麗茶（登録商標）由来C18結合ポリフェノール（蕃爽麗茶PP）を363ｍｇ回収した。この0.2％蕃爽麗茶PP水溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。【０２０４】
(ii) グラヴィノール（登録商標）（ブドウ種子由来プロアントシアニジン）
グラヴィノール（登録商標）(Gravinol、ブドウ種子抽出物、キッコーマン製)の0.2％水溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。【０２０５】
(iii) アカルボース
アカルボースは、グルコシダーゼ阻害作用を有する血糖値上昇抑制剤（医薬品）として用いられている。またα-アミラーゼ阻害活性を有することから比較対照品として用いた。実験にはアカルボース試薬(LKT Laboratories,Inc.)の0.4％水溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。【０２０６】
(iv) カシューアップル由来高分子プロアントシアニジン
実施例3で調製したカシューアップル由来NBP-Aの限外ろ過100K以上画分の0.1％水溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。【０２０７】
測定結果を以下の表に示す。
【表１７】
0005591122.tif 000026
【０２０８】
本検討の結果、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンが強いα-アミラーゼ阻害活性を有することが判明した。本カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンは、蕃爽麗茶PPより33倍活性が強いことになる。蕃爽麗茶（登録商標）は食事毎に70ｍｇ以上（グァバ葉ポリフェノール換算）を摂取することで所定の効果が認められ、日本の厚生労働省により特定保健用食品として認可されていることを鑑みれば、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンを食事毎に2.2ｍｇ以上摂取すれば同等の血糖値上昇抑制効果が達成される可能性がある。すなわち、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンを精製水220ｇに僅か0.0001％またはそれ以上含有させることでα-アミラーゼ阻害活性を有する飲料組成物が提供できると期待される。また配合させた加工食品及び飲料などの風味等への影響が少ないことも期待できる。【０２０９】
表17に示されるように、プロシアニジンであるグラヴィノール（登録商標）と比較して、プロデルフィニジンを主成分とする本発明のカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンが高いα−アミラーゼ阻害活性を有していた。このことから、プロデルフィニジン成分を含んだ高分子プロアントシアニジンがプロシアニジンよりも高いα−アミラーゼ阻害活性を有していると結論付けられる。【０２１０】
実施例8: カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンと他のリパーゼ阻害成分の活性比較
肥満を抑制するためには、脂質の吸収を抑制することも有効であることが知られており、多くのリパーゼ活性阻害成分が研究開発されている。茶飲料である商品名「黒烏龍茶」（サントリー製）は、烏龍茶ポリフェノールが配合されており、当該烏龍茶ポリフェノールの働きによりリパーゼが阻害され脂質の吸収を抑制するという効果に基づき日本の厚生労働省により特定保健用食品として認可されている。【０２１１】
本実施例では、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジン、当該茶飲料の成分、およびその他のリパーゼ活性阻害成分についてリパーゼ活性阻害のIC50（最終検体濃度）を測定し、阻害活性の比較検討を行った。【０２１２】
測定は、非特許文献2（J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4604-4609）に準じて行った。蛍光測定用96wellプレートに、検体溶液を25μｌ/wellで添加した。これに、本検群にPBS(-)で調製したリパーゼ酵素溶液（Lipase from porcine pancreas Type II、SIGMA製）を25μｌ/well、盲検群にはPBS(-)を25μｌ/wellで添加した。それらにPBS(-)で調製した0.1ｍMの蛍光基質溶液（4-methylumbelliferyl oleate、Fluka製）を50μｌ/wellを添加した後20分反応させた。反応停止液として0.1Mクエン酸ナトリウム溶液（ｐH4.2）を100μｌ/well添加し、蛍光測定用プレートリーダー（Ex365ｎｍ  Ｅｍ450ｎｍ）で蛍光強度の測定を行った。ブランク試験としては、「検体溶液」に代えて、各検体溶液の調製に用いられた溶媒を同量使用した以外は上記と同様の手順で本検群および盲検群の試料を調製し蛍光強度を測定した。リパーゼ阻害率は以下の式から算出した。【０２１３】
＜計算式＞
リパーゼ阻害活性（％）＝（1−（A−B）/（C−D））ｘ100
A：試料溶液の盲検の蛍光強度
B：試料溶液の本検の蛍光強度
C：ブランク溶液（希釈溶媒）の盲検の蛍光強度
D：ブランク溶液（希釈溶媒）の本検の蛍光強度
また各試料溶液の酵素阻害活性は、複数の濃度で測定し、リパーゼ酵素を50％阻害する濃度（IC50）を算出した。【０２１４】
以下に本検討に用いた各検体の種類と検体溶液の調製法について示す。【０２１５】
(i) 黒烏龍茶由来C18結合ポリフェノール成分
市販の茶飲料である黒烏龍茶（サントリー製）500ｇをC18 Cartriges(Sep-Pak Vac 35cc、Waters製)に負荷し、未吸着成分を十分な精製水で洗浄した。このC18樹脂に結合した成分をメタノールで溶出させ、減圧蒸留乾固させて、黒烏龍茶由来C18結合ポリフェノール（黒烏龍茶PP）を442.9ｍｇ回収した。本来、経口用には精製水で溶解できなければ適切ではないが、精製した黒烏龍茶PPは、精製水にほとんど溶解しないため、50％（W/W）メタノール水溶液で1.0％溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。また検体溶液の希釈は精製水で行った。検体の希釈率と同様に50％メタノール水溶液のリパーゼ阻害活性も測定したが、リパーゼ阻害活性は認められなかった。【０２１６】
(ii) エピガロカテキンガレート
特許文献5（特開2006-1909号公報）「リパーゼ阻害活性を有する新規化合物」にリパーゼ阻害活性を有することが記載されているため、エピガロカテキンガレート（和光純薬）の0.2％水溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。【０２１７】
(iii) グラヴィノール（登録商標）（ブドウ種子由来プロアントシアニジン）
グラヴィノール（登録商標）(Gravinol、ブドウ種子抽出物、キッコーマン製)の0.2％水溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。【０２１８】
(iv) クロロゲン酸
リパーゼ測定法を記載する非特許文献2に記載されているクロロゲン酸（MP Biomedicals, Ins.）の1.0％水溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。【０２１９】
(v) カシューアップル由来高分子プロアントシアニジン
実施例3で調製したカシューアップル由来NBP-Aの限外ろ過100K以上画分の0.2％水溶液を調製し、0.22μｍのフィルター（マイレクスGP、ミリポア社製）でろ過した溶液を検体とした。【０２２０】
測定結果を以下の表に示す。
【表１８】
0005591122.tif 000027
【０２２１】
カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンのIC50は、0.5μｇ/ｍｌで同時に測定したクロロゲン酸は77.5μｇ/ｍｌであった。非特許文献2では、9量体以上のプロシアニジンのリパーゼ阻害IC50は、0.9μｇ/ｍｌとされており、同時に測定しているクロロゲン酸（Chlorogenic acid）は、59.8μｇ/ｍｌである。これらのことから、カテキン及びエピカテキン重合体であるプロシアニジンより、プロデルフィニジン成分を含んだ高分子プロアントシアニジンの活性が十分に強いと考えられる。【０２２２】
また、表18に示されるように、プロシアニジンであるグラヴィノール（登録商標）と比較して、プロデルフィニジンを主成分とする本発明のカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンが高いリパーゼ阻害活性を有していた。このことから、プロデルフィニジン成分を含んだ高分子プロアントシアニジンがプロシアニジンよりも高いリパーゼ阻害活性を有しているといえる。【０２２３】
以上の結果からカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンは非常に強いリパーゼ阻害活性を有することが判明した。黒烏龍茶PPは、精製水では十分に溶解しないため水溶液では不溶性の沈殿を生じる可能性もある。カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンは文献値より小さい値を示したことから、非常に強いリパーゼ阻害活性を有するといえる。黒烏龍茶の特定保健用食品としての摂取量は、70ｍｇである。本測定結果から同等の活性を示すカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンは、7.5ｍｇとなる。すなわち、加工食品または飲料100g中にカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンを僅か0.0075％またはそれ以上含有させることでリパーゼ阻害作用を有する飲食品組成物が提供されることが期待される。【０２２４】
実施例9: 細菌性リパーゼ阻害活性の測定
細菌性リパーゼは、皮膚表層に存在する、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes：通称アクネ菌)、マイクロコッカス属の細菌(Micrococcus sp.)、シュードモナス属の細菌（Pseudomonas sp.）などの細菌類が産生することが知られている。特にはアクネ菌については、そのリパーゼによって生成される遊離脂肪酸により細菌数増加や皮膚炎症反応の惹起について研究が進められており、それらに対してリパーゼ阻害剤が有効であることも知られている。【０２２５】
本発明品と公知の複数の成分のリパーゼ阻害活性を広く評価するために、市販されているシュードモナス属の細菌（Pseudomonas sp.）由来のリパーゼを用いた。シュードモナス属は、グラム陰性で好気性真性細菌の一属である。代表的な菌としては緑膿菌 (P. aeruginosa)が良く知られている。実験ではシグマ  アルドリッチ  ジャパン社のLipase from Pseudomonas sp.(Type XIII,≧15units/solid、L9518)を用いた。本リパーゼは、非常に強力な酵素である。予備検討から阻害活性試験では0.1μｇ/ｍｌのリパーゼ溶液を使用した。実験では、本発明品のカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンを含む実施例2及び3で得られた各分画物について測定した。また、比較対照品としては、以下の試薬を用いてリパーゼ阻害活性を測定した。【０２２６】
＜細菌性リパーゼ活性阻害試験の被検物質：本発明品＞
(1) 本発明品のカシューアップルピューレ由来10K限外ろ過膜濃縮物の凍結乾燥品
カシューアップルピューレ4773ｇから、実施例2に記載の手順の分子量1万の限外ろ過膜（ハイドロザルト（登録商標）10KDa、ザルトリウス社製）による限外ろ過濃縮処理までを行い、濃縮液を凍結乾燥処理し、26.4ｇの粉末を得た。【０２２７】
(2) 本発明品のカシューアップル由来HP-20樹脂精製処理物の凍結乾燥粉品
上記(1)で得られた10K限外ろ過濃縮物の凍結乾燥品約26ｇを試料として、実施例2に記載されている手順と同様の手順でHP-20樹脂精製処理を行い、凍結乾燥処理により3.7ｇの粉末を得た。【０２２８】
(3) 本発明品のカシューアップル由来高分子プロアントシアニジン（NBP-M水溶液）
実施例2でLH-20樹脂カラム分画処理し、メタノールで溶出させ、実施例3の手順で限外ろ過膜により分画した4種の分画物の凍結乾燥物をそれぞれ0.1％水溶液に調製したものを、各画分の重量比率で混合した溶液をNBP-M水溶液とした。【０２２９】
(4) 本発明品のカシューアップル由来高分子プロアントシアニジン（NBP-A水溶液）
実施例2でLH-20樹脂カラム分画処理し、70％アセトン水溶液で溶出させ、実施例3の手順で限外ろ過膜により分画した4種の分画物の凍結乾燥物をそれぞれ0.1％水溶液に調製したものを、各画分の重量比率で混合した溶液をNBP-A水溶液とした。【０２３０】
＜細菌性リパーゼ活性阻害試験の被検物質：比較対照品＞
(5) テトラサイクリン塩酸塩（和光純薬工業製、生化学用、純度90％以上、205-08591）
テトラサイクリン系に属する抗生物質である。微生物のタンパク質合成を阻害し、広範囲な抗菌スペクトルを示す。リパーゼ阻害活性による内服及び外用剤としてテトラサイクリン系の抗生物質は広く使用されている。特許文献7(特開2008-19180号公報)などにもリパーゼ阻害活性の比較物質として記載されている。【０２３１】
(6) 3,4ジヒドキシけい皮酸（カフェイン酸、カフェー酸：和光純薬工業製、和光一級、純度98％以上）
特許文献8（特開2005-53891号公報）に細菌性リパーゼ阻害活性成分として記載。【０２３２】
(7) 没食子酸（没食子酸1水和物、和光純薬工業製、和光一級）
特許文献8（特開2005-53891号公報）に細菌性リパーゼ阻害活性成分として記載。【０２３３】
(8) クロロゲン酸（Chlorogenic acid,MP Biomedicals Inc.製、和光純薬工業輸入・販売）
非特許文献2（J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4604-4609）に膵臓由来リパーゼ阻害活性成分として記載。【０２３４】
(9) （-）-没食子酸エピガロカテキン（エピガロカテキンガレート、和光純薬工業製、生化学用、純度90％以上）
膵臓由来リパーゼ阻害活性成分として報告されている。また本発明品の高分子プロアントシアニジンの主要な構成成分の一部である可能性が高い。【０２３５】
＜リパーゼ阻害活性試験方法＞
測定は、非特許文献2（J. Agric. Food Chem. 2007, 55, 4604-4609）に準じて行った。蛍光測定用96wellプレートに、検体希釈溶液及びブランク溶液（検体希釈溶液）を25μｌ/wellで添加する。これに、本検群にPBS(-)で調製したリパーゼ酵素溶液（Lipase from Pseudomonas sp. TypeXIII、SIGMA製）を25μｌ/well、盲検群にはPBS(-)を25μｌ/wellで添加する。それらにPBS(-)で調製した0.1ｍMの蛍光基質溶液（4-methylumbelliferyl oleate、Fluka製）を50μｌ/wellを添加した後20分反応させる。反応停止液として0.1Mクエン酸ナトリウム溶液（ｐH4.2）を100μｌ/well添加し、蛍光測定用プレートリーダー（Ex365ｎｍ  Ｅｍ450ｎｍ）で蛍光強度の測定を行った。リパーゼ阻害率は以下の式から算出した。尚、3,4ジヒドキシけい皮酸と没食子酸は、10％メタノール水溶液で溶解し、ブランク溶媒も同じ濃度のメタノール水溶液で測定を行った。【０２３６】
＜計算式＞
リパーゼ阻害活性（％）＝（1−（A−B）/（C−D））ｘ100
A：試料溶液の盲検の蛍光強度
B：試料溶液の本検の蛍光強度
C：ブランク溶液（希釈溶媒）の盲検の蛍光強度
D：ブランク溶液（希釈溶媒）の本検の蛍光強度
また各試料溶液の酵素阻害活性は、複数の濃度で測定し対数プロットした測定点より最小二乗法によりリパーゼ酵素を50％阻害する濃度（IC50）を算出した。【０２３７】
(1)〜(9) の検体の測定結果を次表に示す。
【表１９】
0005591122.tif 000028
【０２３８】
この結果から、NBP-M及びNBP-A水溶液は、細菌性リパーゼに対して非常に強い阻害活性を有することが判明した。また、(1) 10K限外ろ過濃縮物でもテトラサイクリン塩酸塩や3,4ジヒドキシけい皮酸などより強い阻害活性を有することから、本発明品の高分子プロアントシアニジンを含む粗精製物でも十分に作用が期待できることが判明した。【０２３９】
実施例10: カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンの限外ろ過分画物の細菌性リパーゼ阻害活性
実施例3で限外ろ過分画し凍結乾燥処理した粉末を用いて、分子量と細菌性リパーゼ阻害活性について検討を行った。リパーゼ阻害活性試験は、実施例9の方法で行った。その結果を次表に示す。
【表２０】
0005591122.tif 000029
【０２４０】
この結果から、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンの分子量が大きくなるほど細菌性リパーゼ阻害活性が強くなる傾向があることが判明した。このことから、分子量１万よりも大きな限外ろ過膜で処理を行うことにより、粗精製物の細菌性リパーゼ阻害活性がより強くなることが考えられる。これは、最終製品に求められるリパーゼ阻害活性の強さと生産効率の観点から限外ろ過膜の種類を選択することが可能であることを意味している。しかし、本発明品において限外ろ過膜処理は、必須ではなく、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジンを十分な量を含んでいることが、リパーゼ阻害剤として最も重要な要素である。【０２４１】
医薬品である「ステデルム  軟膏クリーム（鳥居薬品）」には、特許文献7（特開2008-19180号公報）にも記載されているイブプロフェンピコノールが、リパーゼ阻害剤として5％配合されている。このため、本発明品の10K限外ろ過濃縮物の粗精製物でも5％以下の含有量で効果が期待できることが推定される。更に、精製された100K NBP-Aであれば0.05％以上を含有すれば十分な効果が期待できることが推測される。なぜなら、リパーゼ阻害活性のIC50を比較すると、100K NBP-Aは、イブプロフェンピコノールと同等のリパーゼ阻害活性を有するテトラサイクリン塩酸塩の100倍以上のリパーゼ阻害活性を有すると言えるからである。これらのことから、本発明品であるカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンを0.001％〜10％、望ましくは0.01％〜5％含有する組成物は、リパーゼ阻害性組成物として有効であると期待できる。【０２４２】
参考実験: DPPHラジカル消去による抗酸化活性測定
安定なラジカルであるDiphenyl-p-picrylhydradil (DPPH)のエタノール液を用いて、抗酸化活性を評価した。250mM酢酸緩衝液(pH=5.5) 1600μlにエタノール 1200μl、検体 400μl(任意の濃度に調整)を混合し、30℃、5分間プレインキュベートした。この液に500μM DPPH/エタノール溶液を800μl添加混合し30℃、30分間放置後、517nmの吸光度を測定した。エタノールで溶解した比較対照品を検体とする場合には、エタノール800μｌ、検体のエタノール溶液400μｌ、精製水400μｌを混合し、30℃、5分間プレインキュベートした。この液に500μM DPPH/エタノール溶液を800μl添加混合し30℃、30分間放置後、517nmの吸光度を測定した。コントロールには、精製水を用いて同様の操作を行ったものを用いた。測定された吸光度から、次式によりラジカル消去率を算出した。【０２４３】
消去率(%) = (1 − [試料の吸光度] / [コントロールの吸光度]) × 100
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記消去率の測定を行い、DPPHラジカルの消去率が50%になる試料溶液の濃度を求め、DPPHラジカル50%消去濃度とした。よって、この数値が低いほど、ラジカル消去能が高い。以下に試験に使用した検体と測定結果を表に示す。【０２４４】
測定検体
＜本発明品：実施例9で調製したものと同じ検体＞
(1) 本発明品のカシューアップルピューレ由来10K限外ろ過膜濃縮物の凍結乾燥品（10K限外ろ過濃縮物）
(2) 本発明品のカシューアップル由来HP-20樹脂精製処理物の凍結乾燥粉品（HP-20樹脂精製品）
(3) 本発明品のカシューアップル由来高分子プロアントシアニジン（NBP-M水溶液）
(4) 本発明品のカシューアップル由来高分子プロアントシアニジン（NBP-A水溶液）
＜比較対照品：実施例9で使用した試薬と同じ＞
(5) 3,4ジヒドキシけい皮酸（カフェイン酸、カフェー酸：和光純薬工業製、和光一級、純度98％以上）：エタノールに溶解後実験に使用
(6) 没食子酸（没食子酸1水和物、和光純薬工業製、和光一級）：エタノールに溶解後実験に使用
(7) （-）-没食子酸エピガロカテキン（エピガロカテキンガレート、和光純薬工業製、生化学用、純度90％以上）：精製水に溶解後実験に使用
(8) L(+)-アスコルビン酸（関東化学製、特級）：精製水に溶解後使用
【表２１】
0005591122.tif 000030
【０２４５】
本測定の結果、本発明品の精製物である (3) NBP-M水溶液及び (4) NBP-A水溶液には、抗酸化成分であるアスコルビン酸と同等な十分な抗酸化性があることが判明した。また、粗精製物である10K限外ろ過濃縮物及びHP-20樹脂精製品にも抗酸化性があることが確認された。これらの結果によるとリパーゼ阻害活性とラジカル消去活性は相関するものではない。本発明品は、リパーゼ阻害能力と抗酸化能力を独立して有する。【０２４６】
実施例11: 各種ペクチナーゼ処理とアミラーゼ阻害活性の検討
(1) 実験目的
上記実施例ではペクチナーゼとしてペクチナーゼA「アマノ」（天野エンザイム社）を使用している。本実施例では、他のペクチナーゼ製品（同社製のペクチナーゼG「アマノ」及びペクチナーゼPL「アマノ」）を使用した場合にも、上記活性を有するカシューアップルピューレ処理物が得られることを確認する。【０２４７】
(2) カシューアップルピューレ原料
実施例1〜10において使用した原料とは異なるロットのカシューアップルピューレ原料を使用した。【０２４８】
(3) 実験手順
(i) カシューアップルピューレを50ｍｌ遠心管に各20ｇ3本に分注した。【０２４９】
(ii) カシューアップルピューレ20ｇにペクチナーゼA「アマノ」、ペクチナーゼG「アマノ」及びペクチナーゼPL「アマノ」を各0.1ｇ添加し、50℃の恒温槽で1時間加温処理した。これを3000rpm, 20分, 20℃で遠心分離処理し、処理後の上清を0.22μｍフィルター（マイレクスGP、ミリポア製）1個を用いてろ過し、得られたフィルターろ過液を調製し検体とした。【０２５０】
(iii) 検体を精製水で希釈して20％、10％、5％、2.5％、1.25％水溶液を調製し、ブタ膵臓由来のα−アミラーゼ阻害活性を測定した。【０２５１】
(4) 実験結果
図19にα−アミラーゼ阻害活性の測定結果を示す。【０２５２】
全ての酵素処理液でアミラーゼ阻害活性が確認できた。【０２５３】
(5) 実験結果の考察
ペクチナーゼA「アマノ」には、ペクチナーゼ45％、β-アミラーゼ25％、珪藻土30％が含まれている。ペクチナーゼG「アマノ」には、ペクチナーゼ90％及び珪藻土10％が含まれている。またペクチナーゼPL「アマノ」には、ペクチナーゼ70％を主成分としているが、ペクチナーゼ活性と繊維消化力を有する。これらの組成が異なる三種のペクチナーゼ製剤のいずれを使用しても本発明のカシューアップルピューレ処理物が得られた。従って、ペクチナーゼ活性を有する食品工業用のペクチナーゼ酵素であれば問題なく使用可能である。【０２５４】
実施例12
(1)目的
本試験は、カシューアップルピューレ、および遠心分離残渣を原料とした場合のαアミラーゼ阻害活性を確認することを目的とする。【０２５５】
(2)手順
実験手順は以下の通りである。【０２５６】
(i) カシューアップルピューレ40.82ｇを3000rpm20分20℃で遠心分離処理を行った。【０２５７】
(ii) ピューレの遠心処理の沈殿物5.6ｇに精製水14.4ｇを加え懸濁し、ペクチナーゼA「アマノ」を0.1ｇ添加し、50℃の恒温槽で1時間加温処理した。これを3000rpm20分20℃で遠心分離処理後の上清を0.22μｍフィルター（マイレクスGP、ミリポア製）1個を用いてフィルターろ過液を調製し検体1とした。【０２５８】
(iii) カシューアップルピューレ20ｇにペクチナーゼA「アマノ」を0.1ｇ添加し、50℃の恒温槽で1時間加温処理した。これを3000rpm20分20℃で遠心分離処理後の上清を0.22μｍフィルター（マイレクスGP、ミリポア製）1個を用いてフィルターろ過液を調製し検体2とした。【０２５９】
(iv) 検体1〜5を精製水で希釈して25％、10％、5％水溶液を調製し、ブタ膵臓由来のα−アミラーゼ阻害活性を測定した。【０２６０】
(3)実験結果
以下の表にα−アミラーゼ阻害活性の測定結果を示す。
【表２２】
0005591122.tif 000031
【０２６１】
ピューレの遠心沈殿物及びピューレのペクチナーゼ処理フィルターろ過液には、アミラーゼ阻害活性が確認できた。【０２６２】
実施例13: アクネ菌に対する抗菌活性の測定
(1) 目的
本発明のカシューアップル由来高分子プロアントシアニジンのアクネ菌（Propionibacterium acnes）に対する抗菌活性を確認した。抗菌活性の評価のために、カシューアップル由来高分子プロアントシアニジン含有試験品のアクネ菌に対する最小発育阻止濃度（MIC）を日本化学療法学会標準法1993年改訂版に準拠して測定した。【０２６３】
(2) 試験品
カシューアップル由来高分子プロアントシアニジン含有試験品として、NBPおよびNBP-A(100K)を用いた。【０２６４】
NBPとは、実施例2において、カシューアップルピューレのペクチナーゼ処理物を分画分子量1万の限外ろ過膜により濃縮し、得られた濃縮物をHP-20樹脂により精製して得られたHP-20樹脂精製品を指す。【０２６５】
NBP-A(100K)とは、実施例2において上記NBPを更にLH-20樹脂により精製して得られた画分であるNBP-Aを、実施例3において分画分子量10万の限外ろ過膜により濃縮して得られた画分を指す。【０２６６】
(3) 試薬等
試験菌としてPropionibacterium acnes JCM 6425Tを用いた。【０２６７】
試験菌前培養用培地として変法GAM寒天培地（日水製薬）を用いた。【０２６８】
試験菌調製液及び感受性測定用培地としてMueller-Hinton broth (BBL)を用いた。【０２６９】
(4) 試験方法
日本化学療法学会標準法に準じて行った。【０２７０】
(4-1) 試験菌液の調製
凍結保存された菌株を36±1℃で48時間嫌気培養した。発育したコロニーをかき取り、試験菌調製液に懸濁後、脱脂綿でろ過した。菌液を約107 CFU/mLに調製し、試験菌液とした。【０２７１】
(4-2) 試験品希釈列の作成
滅菌精製水で3200μg/mLに希釈した試験品0.8mLを滅菌イオン水0.8mLに加えて2倍希釈した。以下同様に2倍希釈を繰り返し、試験品希釈列を合計10段階（試験品濃度: 1600、800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/mL）作成した。【０２７２】
(4-3) 培地の混合
あらかじめ分注しておいた2倍濃度の感受性測定用培地と試験品希釈列の各液を等量混合した。この混合の結果、試験品溶液は2倍希釈され（試験品濃度: 800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625 μg/mL）、また培地も2倍希釈されて通常濃度となった。培地と混合した試験品希釈列をU字型ウェルのマイクロプレートに0.1mL/ウェルずつ必要列分注した。【０２７３】
(4-4) 試験操作
マイクロプレートの各ウェルに試験菌液を5μLずつ滴下し、36±1℃で48時間嫌気培養した。菌を滴下しないものを陰性対照として、菌発育（沈殿）の有無を肉眼で判定し、菌発育の見られない最小濃度をMIC値とした
(5) 試験結果
試験品であるNBP及びNBP-A(100K)の発育試験結果及びMIC値を下記表に示す。【０２７４】
なお試験菌液の菌数は2.3×107 CFU/mL であり、各ウェルに滴下した菌数は1.1×105 CFU/ウェルであった。
【表２３】
0005591122.tif 000032
【０２７５】
(6) 考察
NBPのMIC値が50μg/mLであり、NBP-A(100K) のMIC値が12.5μg/mLであった。このことから高分子プロアントシアニジンの精製度が高い試料ほどアクネ菌に対する抗菌活性が高いことが確認された。【０２７６】
本試験に用いたアクネ菌であるPropionibacterium acnes JCM 6425Tは、特許文献11及び12においてアクネ菌増殖抑制成分の評価に用いられている。特許文献11には100μg/mL (0.01%)のイソプロピルメチルフェノールと100μg/mL (0.01%)のシス-6-ヘキサデセン酸を組み合わせることによりアクネ菌の増殖を抑制する方法が記載されている。特許文献12には1250μg/mLのパラオキシ安息香酸メチルにdl-α-トロフェリルリン酸ナトリウムを63μg/mLの濃度で組み合わせることによりアクネ菌の発育を阻止する方法が記載されている。【０２７７】
NBP及びNBP-A(100K)のPropionibacterium acnes JCM 6425Tに対するMIC値は、特許文献11及び12に記載された成分よりもNBP及びNBP-A(100K)が高い抗菌性を有することを示している。【０２７８】
処方例1；化粧水
高分子プロアントシアニジンを含有する本発明のカシューアップル由来10K限外ろ過濃縮物（実施例9(1)で調製されたもの）を配合した化粧水を表24に示す組成及び製法で調整することが可能である。
【表２４】
0005591122.tif 000033
【０２７９】
（製法）
１）成分（１）〜（５）を混合して、（７）で８０にし、５０℃で攪拌しながら溶解する。【０２８０】
２）成分（８）〜（11）を混合して、５０℃で攪拌しながら溶解する。【０２８１】
３）１）に２）を少量ずつ加えて、５０℃で混和攪拌する。【０２８２】
４）均一に混和したら、更に攪拌しながら５０℃から３０℃に下げる。【０２８３】
５）３０℃になったら攪拌を止め、（６）を加え（７）で１００に合わせる。【０２８４】
６）再度、混和攪拌し、均一に混和された化粧水を得る。【０２８５】
処方例２；乳液
高分子プロアントシアニジンを含有する本発明のカシューアップル由来10K限外ろ過濃縮物（実施例9(1)で調製されたもの）を配合した乳液を表25に示す組成及び製法で調整することが可能である。
【表２５】
0005591122.tif 000034
【０２８６】
（製法）
１）成分（１）、（８）を混合して、（９）で７０にし、８０℃で加温する。【０２８７】
２）成分（２）、（３）を（９）と混合して、常温で攪拌しながら溶解する。【０２８８】
３）成分（４）、（５）を（９）と混合して、常温で攪拌しながら溶解する。【０２８９】
４）成分（６）、（７）を（９）と混合して、常温で攪拌しながら溶解する。【０２９０】
５）（９）に１）を少量ずつ加え、８０℃で混和攪拌する。【０２９１】
６）更に攪拌しながら、５）に２）、３）の順に加える。【０２９２】
７）均一に混和したら、攪拌しながら５０℃に下げる。【０２９３】
８）５０℃になったら、４）を加え（９）で１００に合わせる。【０２９４】
９）再に攪拌しながら３０℃に下げる。【０２９５】
１０）３０℃になったら攪拌を止め、均一に混和された乳液を得る。【０２９６】
処方例３；クリーム
高分子プロアントシアニジンを含有する本発明のカシューアップル由来10K限外ろ過濃縮物（実施例9(1)で調製されたもの）を配合したクリームを表26に示す組成及び製法で調整することが可能である。
【表２６】
0005591122.tif 000035
【０２９７】
（製法）
１）成分（１）〜（９）を混合して、８０℃で攪拌しながら溶解する。【０２９８】
２）成分（10）〜（12）を混合して、８０℃で攪拌しながら溶解する。【０２９９】
３）２）に１）を少量ずつ加え、乳化する。【０３００】
４）攪拌しながら冷却し、４０℃に下げる。【０３０１】
５）４０℃になったら攪拌を止め、均一に混和されたクリームを得る。【０３０２】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
0005591122.tif 000036
【図２】
0005591122.tif 000037
【図３】
0005591122.tif 000038
【図４−１】
0005591122.tif 000039
【図４−２】
0005591122.tif 000040
【図５−１】
0005591122.tif 000041
【図５−２】
0005591122.tif 000042
【図６−１】
0005591122.tif 000043
【図６−２】
0005591122.tif 000044
【図７−１】
0005591122.tif 000045
【図７−２】
0005591122.tif 000046
【図８】
0005591122.tif 000047
【図９−１】
0005591122.tif 000048
【図９−２】
0005591122.tif 000049
【図１０−１】
0005591122.tif 000050
【図１０−２】
0005591122.tif 000051
【図１１−１】
0005591122.tif 000052
【図１１−２】
0005591122.tif 000053
【図１２−１】
0005591122.tif 000054
【図１２−２】
0005591122.tif 000055
【図１３−１】
0005591122.tif 000056
【図１３−２】
0005591122.tif 000057
【図１４】
0005591122.tif 000058
【図１５】
0005591122.tif 000059
【図１６−１】
0005591122.tif 000060
【図１６−２】
0005591122.tif 000061
【図１６−３】
0005591122.tif 000062
【図１６−４】
0005591122.tif 000063
【図１７−１】
0005591122.tif 000064
【図１７−２】
0005591122.tif 000065
【図１７−３】
0005591122.tif 000066
【図１７−４】
0005591122.tif 000067
【図１８−１】
0005591122.tif 000068
【図１８−２】
0005591122.tif 000069
【図１８−３】
0005591122.tif 000070
【図１８−４】
0005591122.tif 000071
【図１９】
0005591122.tif 000072