(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫グロブリンを産生することが可能なトランスジェニック非ヒト哺乳類の調製における使用のための細菌人工染色体であって、前記細菌人工染色体は、作動可能な連結において、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子断片と、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンＤ鎖遺伝子断片と、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンＶＪ遺伝子断片と、Ｓμエンハンサ配列と、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン重鎖定常領域と、３′エンハンサ配列とを含む、細菌人工染色体。
【請求項２】
前記重鎖可変領域遺伝子配列が、ＶＨ６−１を含む、請求項１に記載の細菌人工染色体。
【請求項３】
ＶＨ遺伝子断片の数が２０であり、かつ／または、ヒトＤ遺伝子断片の数が２５であり、かつ／または、ＶＪ断片の数が６である、請求項１に記載の細菌人工染色体。
【請求項４】
前記重鎖定常領域が、μ、δ、およびγを含む、請求項１に記載の細菌人工染色体。
【請求項５】
前記γ領域が、γ３およびγ１を含む、請求項４に記載の細菌人工染色体。
【請求項６】
天然の未再構成形態での、最も近位のＶＨ６−１の５′側約２２ｋｂから開始し、ＩｇＨγ１定常領域遺伝子の３′側約８．６ｋｂの地点へと伸長するヒトＩｇＭ遺伝子座に由来する配列に続き、合成ヒト由来トリパタイトＩｇＨエンハンサを含み、約２３１ｋｂの全体のトランス遺伝子が、ＮｏｔＩ制限酵素での切断によって放出され得る、遺伝子操作した細菌人工染色体（ＶＤＪＣＥ）である、請求項１に記載の細菌人工染色体。
【請求項７】
前記ヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子断片が、未再構成である、請求項１に記載の細菌人工染色体。
【請求項８】
ＶＨ遺伝子断片の数が、１２である、請求項１に記載の細菌人工染色体。
【請求項９】
改変された請求項６に定義のＶＤＪＣＥ（Ｖ１２ＤＪＣＥ）であって、前記Ｖ１２ＤＪＣＥにおいては、前記ＶＤＪＣＥのＤ領域の上流へ未再構成形態の１２個のＶＨエレメントが挿入され、かつ、前記ＶＤＪＣＥの約２５ｋｂの配列が欠失し、前記挿入が、前記ＶＤＪＣＥの本来の５′末端に対応する約９ｋｂの上流ヒト遺伝子ＤＮＡおよびＤ領域に近接する約８ｋｂのヒト遺伝子ＤＮＡの側面に位置する、請求項８に記載の細菌人工染色体。
【請求項１０】
請求項１〜９のうちのいずれか１項に記載の前記細菌人工染色体を有する非ヒト動物。
【請求項１１】
げっ歯類である、請求項１０に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記げっ歯類が、マウスである、請求項１１に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
ヒト免疫グロブリンを産生することが可能なトランスジェニックマウスの調製における使用のための核酸であって、前記核酸は、複数のヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子断片と、請求項１に記載の前記細菌人工染色体の配列と相同の相同カセットと、を含み、前記相同カセットは、前記核酸と前記細菌人工染色体との間の相同組換えを容易にする、核酸。
【請求項１４】
前記相同カセットが、５′末端に特有の制限酵素部位をさらに含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記核酸が、プラスミドベクターである、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１６】
ヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子断片の数が、１２であり、前記１２のＶＨ遺伝子断片のそれぞれが、ＶＨコード配列の全体と、ＶＨプロモータ配列と、エンハンサ配列と、および組み換え配列とを含む、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１７】
前記ヒトＶＨ遺伝子断片が、産生される前記ヒト免疫グロブリンの所望の特徴に基づいて選択される、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１８】
前記ヒト免疫グロブリンの前記所望の特徴が、ＶＨ使用頻度、ＶＨ安定性、または結合特異性を含む、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記１２のヒトＶＨ遺伝子断片が、ＶＨ１−６９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、ＶＨ３−４８、ＶＨ４−３９、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−２１、ＶＨ１−１８、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１１、およびＶＨ３−７である、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
１２個の機能的ヒトＶＨ断片およびヒトＩｇＨ  ＢＡＣクローンＣＴＤ−２５９０Ａ７の５′末端に由来する４．９ｋｂの３′相同カセットを有する約２８ｋｂのトランス遺伝子を含むプラスミド（ｐＧＰ６９−７ＶＨＣ）である、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
前記核酸が、細菌人工染色体である、請求項１３に記載の核酸。
【請求項２２】
トランスジェニックマウスから所望の特性を有するヒト抗体を産生する方法であって、
ａ．（ｉ）作動可能な連結において、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子断片と、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンＤ鎖遺伝子断片と、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンＶＪ遺伝子断片と、Ｓμエンハンサ配列と、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリン重鎖定常領域と、エンハンサ配列とを含む細菌人工染色体、および（ｉｉ）複数のヒト免疫グロブリンＶＨ遺伝子断片と、（ｉ）の前記細菌人工染色体の核酸配列と相同の相同カセットと、を含む核酸であって、前記相同カセットが、前記核酸ベクターと前記細菌人工染色体との間の相同組換えを容易にする、核酸、をマウスに注入して、トランスジェニックマウスを産生するステップと、
ｂ．前記トランスジェニックマウスを事前に選択された抗原に接触させるステップと、
ｃ．前記事前に選択された抗原に結合する前記ヒト抗体を回収するステップと、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記複数のＶＨ遺伝子断片が、所望の特性を有する抗体の所望の特徴に基づいて選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）ｐＧＰ６９−７ＶＨＣ；（ｉｉ）ｐＶｘ６、ｐＨＣ２、及びｙＩｇＨ１０；（ｉｉｉ）ｐＨＣ２、ｙＩｇＨ１０、及びｙＩｇＨ２４ａ；（ｉｖ）ＣＴＤ−２３０４Ｉ２２、ＣＴＤ−２５７２０２、及びＣＴＤ−２１９４Ｏ１５；（ｖ）ＶＤＪＣＥ及びｙＩｇＨ２４ａ；（ｖｉ）ＶＤＪＣＥ及びＣＴＤ−３０５４Ｍ１７；（ｖｉｉ）ＶＤＪＣＥ及びｐＧＨ６９−７ ＶＨＣ；（ｖｉｉｉ）Ｖ１２ＤＪＣＥ；並びに（ｉｘ）ｐＩｇＹＢＡＣからなる群から選択される、1つ又は複数のコンストラクトに由来する核酸配列を、そのゲノムに含む、トランスジェニックマウスであって、前記ｐＧＰ６９−７は、請求項２０に定義されているものであり、前記ＶＤＪＣＥは、請求項６に定義されているものであり、前記Ｖ１２ＤＪＣＥは、請求項９に定義されているものであり、前記ｙＩｇＨ１０は、ヒト重鎖Ｉｇ  ＶＨ断片（未再構成の形態で５′末端のＶＨ４−３４から３′末端のＶＨ３−１５）を含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）であり、前記ｐＩｇＹＢＡＣは、前記で定義したｙＩｇＨ１０に由来する全ての関連するＶＨ断片及び請求項６に定義のＶＤＪＣＥの全体を含む細菌−酵母シャトルベクター（ＢＡＣ−ＹＡＣ）である、トランスジェニックマウス。
【請求項２５】
前記マウスが、Ｂａｌｂ／ｃ株に異種交配される、請求項２４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２６】
前記マウスが、ＨＣｏ７／ラムダ株である、請求項２４に記載のトランスジェニックマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異種抗体を産生することが可能なトランスジェニック非ヒト動物、そのようなトランスジェニック動物を産出するために使用されるトランス遺伝子、Ｖ−Ｄ−Ｊ組み換えにおいて異種Ｄ遺伝子を機能的に再構成することが可能なトランス遺伝子、異種抗体を産生することが可能な不死化Ｂ細胞、多重イソタイプの異種抗体を産生するための方法およびトランス遺伝子、異種抗体を産生するための方法およびトランス遺伝子であって、可変領域配列は、生殖細胞再構成可変領域配列と比較して体細胞変異を含む、方法およびトランス遺伝子、ヒト一次配列を有し、かつ、ヒト抗原に結合する抗体を産生するトランスジェニック非ヒト動物、そのようなトランスジェニック動物のＢ細胞から作製されるハイブリドーマ、ならびにそのようなハイブリドーマによって発現されるモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトにおけるモノクローナル抗体に対する体内の治療的および診断的用途の開発に直面する主な障害の１つは、非ヒト免疫グロブリンの内在免疫原性である。例えば、免疫が保たれているヒト患者に、治療量のげっ歯類モノクローナル抗体を投与する場合、患者は、げっ歯類免疫グロブリン配列に対する抗体を産生し、これらのヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）は、治療抗体を中和し、急性毒性を引き起こし得る。したがって、有望な治療および／または診断標的である特異的ヒト抗原に反応するヒト免疫グロブリンを産出することが望ましい。しかしながら、ヒト抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリンを産生することには問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５，５４５，８０６号
【特許文献２】米国特許第５，５６９，８２５号
【特許文献３】米国特許第５，６２５，１２６号
【特許文献４】米国特許第５，６３３，４２５号
【特許文献５】米国特許第５，７８９，６５０号
【特許文献６】米国特許第５，８７７，３９７号
【特許文献７】米国特許第５，６６１，０１６号
【特許文献８】米国特許第５，８１４，３１８号
【特許文献９】米国特許第５，８７４，２９９号
【特許文献１０】米国特許第５，７７０，４２９号
【特許文献１１】米国特許第５，５４５，８０７号
【特許文献１２】ＷＯ９２／０３９１８号
【特許文献１３】ＷＯ９３／１２２２７号
【特許文献１４】ＷＯ９４／２５５８５号
【特許文献１５】ＷＯ９７／１３８５２号
【特許文献１６】ＷＯ９８／２４８８４号
【特許文献１７】ＷＯ９９／４５９６２号
【特許文献１８】ＷＯ０１／１４４２４号
【特許文献１９】第ＷＯ０２／４３４７８号
【特許文献２０】米国特許第５，９３９，５９８号
【特許文献２１】米国特許第６，０７５，１８１号
【特許文献２２】米国特許第６，１１４，５９８号
【特許文献２３】米国特許第６，１５０，５８４号
【特許文献２４】米国特許第６，１６２，９６３号
【特許文献２５】ＷＯ／２００２／０９２８１２号
【特許文献２６】米国特許第５，４７６，９９６号
【特許文献２７】米国特許第５，６９８，７６７号
【特許文献２８】米国特許第５，７８９，６５０号
【特許文献２９】米国特許第５，５４５，８０６号
【特許文献３０】米国特許第５，５６９，８２５号
【特許文献３１】米国特許第５，６２５，１２６号
【特許文献３２】米国特許第５，６３３，４２５号
【特許文献３３】米国特許第５，７８９，６５０号
【特許文献３４】米国特許第５，８７７，３９７号
【特許文献３５】米国特許第５，６６１，０１６号
【特許文献３６】米国特許第５，８１４，３１８号
【特許文献３７】米国特許第５，８７４，２９９号
【特許文献３８】米国特許第５，７７０，４２９号
【特許文献３９】米国特許第５，５４５，８０７号
【特許文献４０】ＷＯ９２／０３９１８号
【特許文献４１】ＷＯ９３／１２２２７号
【特許文献４２】ＷＯ９４／２５５８５号
【特許文献４３】ＷＯ９７／１３８５２号
【特許文献４４】ＷＯ９８／２４８８４号
【特許文献４５】ＷＯ９９／４５９６２号
【特許文献４６】ＷＯ０１／１４４２４号
【特許文献４７】米国特許第５，５４５，８０６号
【特許文献４８】米国特許第５，５６９，８２５号
【特許文献４９】米国特許第５，６２５，１２６号
【特許文献５０】米国特許第５，６３３，４２５号
【特許文献５１】米国特許第５，７８９，６５０号
【特許文献５２】米国特許第５，８７７，３９７号
【特許文献５３】米国特許第５，６６１，０１６号
【特許文献５４】米国特許第５，８１４，３１８号
【特許文献５５】米国特許第５，８７４，２９９号
【特許文献５６】米国特許第５，７７０，４２９号
【特許文献５７】ＷＯ９１／１１５３５号
【特許文献５８】米国特許第０７／５３０，１６５号
【特許文献５９】ＷＯ９１／０９８６５号
【特許文献６０】ＷＯ９１／０４７５３号
【特許文献６１】ＷＯ９０／１３６４１号
【特許文献６２】欧州特許第ＥＰ３８６５６３号
【特許文献６３】ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号
【特許文献６４】米国特許第５，５４５，８０６号
【特許文献６５】米国特許第５，５４５，８０６号
【特許文献６６】米国特許第５，６２５，８２５号
【特許文献６７】米国特許第５，５４５，８０７号
【特許文献６８】ＰＣＴ出願第ＷＯ２０００／２６３７３号
【特許文献６９】米国特許第５，３９９，１６３号
【特許文献７０】米国特許第５，３８３，８５１号
【特許文献７１】米国特許第５，３１２，３３５号
【特許文献７２】米国特許第５，０６４，４１３号
【特許文献７３】米国特許第４，９４１，８８０号
【特許文献７４】米国特許第４，７９０，８２４号
【特許文献７５】米国特許第４，５９６，５５６号
【特許文献７６】米国特許第４，４８７，６０３号
【特許文献７７】米国特許第４，４８６，１９４号
【特許文献７８】米国特許第４，４４７，２３３号
【特許文献７９】米国特許第４，４４７，２２４号
【特許文献８０】米国特許第４，４３９，１９６号
【特許文献８１】米国特許第４，４７５，１９６号
【特許文献８２】米国特許第４，５２２，８１１号
【特許文献８３】米国特許第５，３７４，５４８号
【特許文献８４】米国特許第５，３９９，３３１号
【特許文献８５】ＷＯ９１／１７２７１号
【特許文献８６】ＷＯ９２／０１０４７号
【特許文献８７】ＷＯ８７／０４４６２号
【特許文献８８】ＷＯ８９／０１０３６号
【特許文献８９】欧州特許第ＥＰ３３８，８４１号
【特許文献９０】ＷＯ／２００７／０５９７８２号
【特許文献９１】米国特許第４，４０１，７９６号
【特許文献９２】米国特許第４，４５８，０６６号
【特許文献９３】米国特許第４，５００，７０７号
【特許文献９４】米国特許第ＵＳ５，４１６，０１６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９
【非特許文献２】Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１
【非特許文献３】Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３
【非特許文献４】Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６
【非特許文献６】Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４
【非特許文献７】Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３
【非特許文献８】Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２＊＊３０
【非特許文献９】Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０
【非特許文献１０】Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１
【非特許文献１１】Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１
【非特許文献１２】Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２−７２７
【非特許文献１３】Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４
【非特許文献１４】Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００３），Ｐａｕｌ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．，ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐ．Ａ．
【非特許文献１５】Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１５１７−１５２３
【非特許文献１６】Ｃｕｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（１０），１８１０−４
【非特許文献１７】Ｓａｄｏｆｓｋｙ，（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（７），１３９９−４０９
【非特許文献１８】Ｌｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ５９：１０４９−１０５９（１９８９）
【非特許文献１９】Ｈｅｎｔｇｅｓ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９７  Ｓｕｐｐｌ  １：３−９（１９９４）
【非特許文献２０】Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）
【非特許文献２１】Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６２１−６２７（１９９０）
【非特許文献２２】Ｒｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８４０−８４４（１９８９）
【非特許文献２３】Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７７０４−７７０８（１９８８）Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３０５−７３１６（１９９１）
【非特許文献２４】Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９（１９７６）
【非特許文献２５】Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）
【非特許文献２６】Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：７２７−７３８（１９８８）
【非特許文献２７】Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：８０９（１９８３）
【非特許文献２８】Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ａｌｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３３９−３６８（１９８６）Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ａｌｔ，Ｃｅｌｌ  ４０：２７１−２８１（１９８５）
【非特許文献２９】Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ，２９４，６３１−６３５
【非特許文献３０】Ｉｃｈｉｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８），ＥＭＢＯ  Ｊ．，７，４１４１−４１５０
【非特許文献３１】Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８−１２９２
【非特許文献３２】Ｊａｅｎｉｓｃｈおよび同僚（Ｚｉｊｌｓｔｒａ，ｅｔａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４３５−４３８
【非特許文献３３】Ｊｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６９（６）：８４７−５７（２００５）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，（２００２）．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．
【非特許文献３４】Ｐｅｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：７２５
【非特許文献３５】Ｈｅｌｅｎｅ．，Ｃ．  ａｎｄ  Ｔｏｕｌｍｅ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０４９：９９
【非特許文献３６】Ｓｔｏｕｔ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｃａｓｋｅｙ，Ｔ．（１９９０）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３６９
【非特許文献３７】Ｍｕｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３８３
【非特許文献３８】Ｊｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６９（６）：８４７−５７（２００５）
【非特許文献３９】Ｃｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１０００６−１００１０（１９８９）
【非特許文献４０】Ｂｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１３：６０４−６１８（１９９０）
【非特許文献４１】Ｌｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７４：５３−５６（１９９０）
【非特許文献４２】Ｊｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６９（６）：８４７−５７（２００５）
【非特許文献４３】Ｄａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４７５１
【非特許文献４４】Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７
【非特許文献４５】Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，（２００２）．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．
【非特許文献４６】Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ，（１９８８），Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．
【非特許文献４７】Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８１  ２１１
【非特許文献４８】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０
【非特許文献４９】Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９
【非特許文献５０】Ｈａｙｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０７：３３４
【非特許文献５１】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０
【非特許文献５２】Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５−８５１
【非特許文献５３】Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９
【非特許文献５４】Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８
【非特許文献５５】Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５
【非特許文献５６】Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８
【非特許文献５７】Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０
【非特許文献５８】Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０
【非特許文献５９】Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４
【非特許文献６０】Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０
【非特許文献６１】Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ、Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３
【非特許文献６２】ＪＪ．Ｋｉｌｌｉｏｎ、ＩＪ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３
【非特許文献６３】Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）
【非特許文献６４】Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）
【非特許文献６５】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献６６】Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０：６２８７（１９９２）
【非特許文献６７】Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ  Ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ（２００４）
【非特許文献６８】Ｃａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）
【非特許文献６９】Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献７０】Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７
【非特許文献７１】Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２
【非特許文献７２】Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０３：３１８５−３１９１（１９８１）
【非特許文献７３】Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４：１−１７（１９８２）
【非特許文献７４】Ｇａｉｔ，ｅｄ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８４）におけるＪｏｎｅｓ，ｃｈａｐｔｅｒ  ２、Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｃｈａｐｔｅｒ  ３
【非特許文献７５】Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｃｈａｐｔｅｒ  ４、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２７：４６９−４７２（１９８６）
【非特許文献７６】Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７（１９８６）
【非特許文献７７】Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２４：５８４３−５８４６（１９８３）
【非特許文献７８】Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：４５３９−４５５７（１９８４）
【非特許文献７９】Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１
【非特許文献８０】Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
機能的異種（例えば、ヒト）免疫グロブリントランス遺伝子を有するトランスジェニック動物の作成は、自己抗原と反応する抗体が産生される一方法である。しかしながら、治療的に有用な抗体またはそのような抗体を産生するハイブリドーマクローンの発現を得るために、トランスジェニック動物は、Ｂリンパ球発達経路により成熟することが可能なトランスジェニックＢ細胞を産生しなければならない。その経路により成熟することが可能であり、それにより、組み換え多様性および結合多様性の両方を有する抗体を生成するように機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再構成を受けるトランスジェニックマウスのいくつかの例があるが、そのような多様性は、任意の特定の種の全ゲノム潜在力と比較して制限される。
【０００６】
そのような制限を踏まえると、全ゲノム重鎖および軽鎖可変領域レパートリのさらに高い画分を組み込む、さらに高い多様性を有する異種抗体、例えば、第２の種において産生される第１の種の遺伝子配列によってコードされる抗体を効率的に産生する方法の明確な必要性が存在する。このために設計される、特定の種における治療的または診断的使用のために、そのようなさらに高い多様性を有するモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマを作製するために使用することができるＢ細胞源の必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前述の目的によると、重鎖および軽鎖可変領域レパートリのさらに高い画分を組み込む、ヒト抗体等の異種抗体を産出することが可能なトランスジェニック非ヒト動物が提供される。
【０００８】
さらに、異種抗体を発現することが可能なそのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞を提供することが目的であり、そのようなＢ細胞は、特定の抗原に特異的なモノクローナル抗体源を提供するように不死化される。
【０００９】
この前述の目的によると、そのような異種モノクローナル抗体を産生することが可能なハイブリドーマ細胞を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１０】
さらに、前述の非ヒトトランスジェニック動物を産生するために有用な異種未再構成免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランス遺伝子を提供することが、本明細書における目的である。
【００１１】
さらに、トランスジェニック動物における内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊する方法を提供することが、本明細書における目的である。
【００１２】
さらに、前述のトランスジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導する方法を提供することが、本明細書における目的である。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、本発明の１つもしくは複数のトランス遺伝子を構成するために使用される免疫グロブリン可変領域遺伝子断片レパートリを生成する方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ミニ遺伝子座トランス遺伝子の概略図  天然ゲノムヒトＩｇ重鎖遺伝子座は、約１．４Ｍｂ領域として描かれ、４つの機能サブ領域に分割される。可変（Ｖｈ）領域、多様性領域（Ｄ）、結合領域（Ｊ）、および定常領域＋エンハンサを示す。（Ａ）においては、ＨＣ２ミニ遺伝子は、すべての４つの機能サブ領域からの不連続結合フラグメントに由来する。示されるように、それは、４つのＶｈ、１５のＤ、６つのＪ、２つの定常領域、およびラット３′免疫グロブリンエンハンサを含有する。（Ｂ）においては、１２の選択されたＶｈ断片は、ゲノムＤＮＡ鋳型のＰＣＲ増幅に由来し、生殖細胞の順序において頭尾的に集合し、トランス遺伝子の間の組み換えを容易にするために使用される免疫グロブリン遺伝子座由来フラグメントが付加された。
【図１Ｂ】ミニ遺伝子座トランス遺伝子の概略図  天然ゲノムヒトＩｇ重鎖遺伝子座は、約１．４Ｍｂ領域として描かれ、４つの機能サブ領域に分割される。可変（Ｖｈ）領域、多様性領域（Ｄ）、結合領域（Ｊ）、および定常領域＋エンハンサを示す。（Ａ）においては、ＨＣ２ミニ遺伝子は、すべての４つの機能サブ領域からの不連続結合フラグメントに由来する。示されるように、それは、４つのＶｈ、１５のＤ、６つのＪ、２つの定常領域、およびラット３′免疫グロブリンエンハンサを含有する。（Ｂ）においては、１２の選択されたＶｈ断片は、ゲノムＤＮＡ鋳型のＰＣＲ増幅に由来し、生殖細胞の順序において頭尾的に集合し、トランス遺伝子の間の組み換えを容易にするために使用される免疫グロブリン遺伝子座由来フラグメントが付加された。
【図２】ヒトＩｇ重鎖ゲノムクローンの概略図  図１のように、示された機能領域とともに、ヒト重鎖Ｉｇ遺伝子座が上記に描かれる。ＹＡＣクローンＩｇＨ２４ａおよびＩｇＨ１０を正確な縮尺で示し、Ｖｈ領域内のそれらの相対位置および境界を反映する。ヒトＩｇＨ  ＢＡＣクローンを、それらの相対位置および境界において下部に示し、これらは、定常領域Ｉｇα１を含むところまでの全Ｖｈ領域、Ｄ、およびＪ領域にわたる。
【図３Ａ】ハイブリッドトランス遺伝子概略図  図３Ａは、ＢＡＣクローンおよびＢＡＣ  ＶＤＪＣＥを含むＩｇ領域を示す。下流ＩｇエンハンサＬＣＲ２からのトライパタイトエンハンサとともにＢＡＣクローンＣＴＤ−２５９０Ａ７およびＣＴＤ−２１９４Ｏ１５から構成され、コンストラクトは、機能的ミニ遺伝子に必要なすべての要素を含有する。図３Ｂは、Ｖｈ領域を覆うＢＡＣクローンを、どのようにして統合し、修飾して、全Ｖｈレパートリを覆うＢＡＣクローンの極小集合を形成することができるかを示し、それぞれのＢＡＣクローンへの３′ＶＨＣ相同カセットの付加は、トランス遺伝子の間の組み換えを容易にすることを意味する。図３Ｃは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥを、どのようにしてプラスミドｐＧＰ６９−７ＶＨＣから１２のＶｈ領域を取り込むように修飾して、ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥを形成したかを示す。図３Ｄは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥおよびＹＡＣＩｇＨ１０を、どのようにして組み替えて、トランス遺伝子ｐＩｇＹＢＡＣを形成することができるかを示し、これは、酵母菌および細菌の両方において繁殖することができる修飾シャトルベクターにおいて行われる。
【図３Ｂ】ハイブリッドトランス遺伝子概略図  図３Ａは、ＢＡＣクローンおよびＢＡＣ  ＶＤＪＣＥを含むＩｇ領域を示す。下流ＩｇエンハンサＬＣＲ２からのトライパタイトエンハンサとともにＢＡＣクローンＣＴＤ−２５９０Ａ７およびＣＴＤ−２１９４Ｏ１５から構成され、コンストラクトは、機能的ミニ遺伝子に必要なすべての要素を含有する。図３Ｂは、Ｖｈ領域を覆うＢＡＣクローンを、どのようにして統合し、修飾して、全Ｖｈレパートリを覆うＢＡＣクローンの極小集合を形成することができるかを示し、それぞれのＢＡＣクローンへの３′ＶＨＣ相同カセットの付加は、トランス遺伝子の間の組み換えを容易にすることを意味する。図３Ｃは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥを、どのようにしてプラスミドｐＧＰ６９−７ＶＨＣから１２のＶｈ領域を取り込むように修飾して、ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥを形成したかを示す。図３Ｄは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥおよびＹＡＣＩｇＨ１０を、どのようにして組み替えて、トランス遺伝子ｐＩｇＹＢＡＣを形成することができるかを示し、これは、酵母菌および細菌の両方において繁殖することができる修飾シャトルベクターにおいて行われる。
【図３Ｃ】ハイブリッドトランス遺伝子概略図  図３Ａは、ＢＡＣクローンおよびＢＡＣ  ＶＤＪＣＥを含むＩｇ領域を示す。下流ＩｇエンハンサＬＣＲ２からのトライパタイトエンハンサとともにＢＡＣクローンＣＴＤ−２５９０Ａ７およびＣＴＤ−２１９４Ｏ１５から構成され、コンストラクトは、機能的ミニ遺伝子に必要なすべての要素を含有する。図３Ｂは、Ｖｈ領域を覆うＢＡＣクローンを、どのようにして統合し、修飾して、全Ｖｈレパートリを覆うＢＡＣクローンの極小集合を形成することができるかを示し、それぞれのＢＡＣクローンへの３′ＶＨＣ相同カセットの付加は、トランス遺伝子の間の組み換えを容易にすることを意味する。図３Ｃは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥを、どのようにしてプラスミドｐＧＰ６９−７ＶＨＣから１２のＶｈ領域を取り込むように修飾して、ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥを形成したかを示す。図３Ｄは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥおよびＹＡＣＩｇＨ１０を、どのようにして組み替えて、トランス遺伝子ｐＩｇＹＢＡＣを形成することができるかを示し、これは、酵母菌および細菌の両方において繁殖することができる修飾シャトルベクターにおいて行われる。
【図３Ｄ】ハイブリッドトランス遺伝子概略図  図３Ａは、ＢＡＣクローンおよびＢＡＣ  ＶＤＪＣＥを含むＩｇ領域を示す。下流ＩｇエンハンサＬＣＲ２からのトライパタイトエンハンサとともにＢＡＣクローンＣＴＤ−２５９０Ａ７およびＣＴＤ−２１９４Ｏ１５から構成され、コンストラクトは、機能的ミニ遺伝子に必要なすべての要素を含有する。図３Ｂは、Ｖｈ領域を覆うＢＡＣクローンを、どのようにして統合し、修飾して、全Ｖｈレパートリを覆うＢＡＣクローンの極小集合を形成することができるかを示し、それぞれのＢＡＣクローンへの３′ＶＨＣ相同カセットの付加は、トランス遺伝子の間の組み換えを容易にすることを意味する。図３Ｃは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥを、どのようにしてプラスミドｐＧＰ６９−７ＶＨＣから１２のＶｈ領域を取り込むように修飾して、ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥを形成したかを示す。図３Ｄは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥおよびＹＡＣＩｇＨ１０を、どのようにして組み替えて、トランス遺伝子ｐＩｇＹＢＡＣを形成することができるかを示し、これは、酵母菌および細菌の両方において繁殖することができる修飾シャトルベクターにおいて行われる。
【図４】ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１２×Ｂａｌｂ／ｃハイブリッドマウスの比較  混合株背景のＨＣｏ１２マウスを、ベースラインヒト免疫グロブリンガンマ（ｈｕＩｇＧ）および破傷風トキソイド（ＴＴ）特異的ｈｕＩｇＧに関して、ＨＣｏ１２×Ｂａｌｂ／ｃハイブリッドマウスと比較した。コホート（ｎ＝各群１２）を、０日目に出血させ、次いで、ＴＴで２回免疫化し、免疫化後２８日目に出血させた。血清力価を、両マウスに対して判定し、ｂａｌｂ／ｃ背景のＨＣｏ１２マウスは、親ＨＣｏ１２混合背景マウスと比較して、ベースライン総ｈｕＩｇＧおよびＴＴ特異的ｈｕＩｇＧの両方の有意な上昇を示した。平均血清免疫グロブリンレベル（μｇ／ｍｌ）を各群に対して示す。
【図５】ハイブリッドトランス遺伝子の概略図：ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏ  図５は、ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥに存在する１２Ｖｈ可変領域遺伝子断片の約１０ｋｂ上流にある二重の原核生物および真核性プロモータ／エンハンサ要素に機能的に連結される、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（以下「ｎｅｏ」と称される）から選択可能な耐性マーカの挿入を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
本明細書で使用される「抗体」という用語は、少なくとも２つの軽ポリペプチド鎖および２つの重ポリペプチド鎖を含む糖タンパク質を指す。重および軽ポリペプチド鎖は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する可変領域（概して、ポリペプチド鎖のアミノ末端部分）をそれぞれ含有する。重および軽ポリペプチド鎖は、免疫系の種々の細胞、いくつかの食細胞、および古典的補体系の第１の成分（ＣＩｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができるポリペプチド鎖（概して、カルボキシル末端部分）の定常領域もそれぞれ含む。
【００１６】
本明細書で使用される「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。それは、トランスジェニック非ヒト動物から成らず、概して、トランスジェニック非ヒト動物の種以外の種からの生物で見られるものに対応するアミノ酸配列またはアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する抗体として定義される。
【００１７】
本明細書で使用される「異種ハイブリッド抗体」は、異なる生物由来の軽および重鎖を有する抗体を指す。例えば、マウス軽鎖に関連するヒト重鎖を有する抗体は、異種ハイブリッド抗体である。
【００１８】
本明細書で使用される「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【００１９】
本明細書で使用される「イソタイプスイッチ」は、抗体のクラスつまりイソタイプが、１つのＩｇクラスから他のＩｇクラスの１つに変化する現象を指す。
【００２０】
本明細書で使用される「非変換イソタイプ」は、イソタイプスイッチが行われていない場合に産生される重鎖の同形クラスを指し、非変換イソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、典型的には、機能的に再構成されたＶＤＪ遺伝子からすぐ下流にある第１のＣＨ遺伝子である。
【００２１】
本明細書で使用される「スイッチ配列」という用語は、スイッチ組み換えを担うＤＮＡ配列を指す。「スイッチドナー」配列、典型的には、μスイッチ領域は、スイッチ組み換えの間に欠失するコンストラクト領域の５′側（すなわち、上流）にある。「スイッチアクセプター」領域は、欠失するコンストラクト領域および置換定常領域（例えば、γ、ε等）の間にある。組み換えが常に生じる特定の部位が存在しないため、最終遺伝子配列は、典型的には、コンストラクトから予測することができない。
【００２２】
本明細書で使用される「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より具体的には、免疫グロブリンタンパク質に共有結合される炭水化物単位のパターンとして定義される。異種抗体のグリコシル化パターンは、当業者が、異種抗体のグリコシル化パターンを、トランス遺伝子のＣＨ遺伝子が由来する種よりも、非ヒトトランスジェニック動物の種におけるグリコシル化のパターンの方により類似していると認識する場合、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体に対して自然に生じるグリコシル化パターンと実質的に同様であると特徴付けることができる。
【００２３】
本明細書で使用される「特異的結合」は、（１）少なくとも１×１０７Ｍ−１の親和性を有する所定の抗原に結合し、（２）所定の抗原または密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するためのその親和性より少なくとも２倍の親和性を有する所定の抗原に優先的に結合する抗体の特性を指す。
【００２４】
対象に適用され、本明細書で使用される「自然発生」という用語は、対象が自然において見られるという事実を指す。例えば、自然源から単離することができる生物（ウイルスを含む）に存在し、実験室で人によって意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然発生のものである。
【００２５】
本明細書で使用される「再構成」という用語は、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指し、Ｖ断片は、完全ＶＨまたはＶＬドメインを本質的にそれぞれコードする配座におけるＤ−ＪまたはＪ断片に直接隣接して配置される。再構成免疫グロブリン遺伝子座は、生殖細胞ＤＮＡとの比較によって特定することができ、再構成遺伝子座は、少なくとも１つの組み換え七量体／九量体相同要素を有する。
【００２６】
Ｖ断片に関連して本明細書で使用される「未再構成」または「生殖細胞構成」という用語は、Ｖ断片が組換えられておらず、ＤまたはＪ断片のすぐ隣にあるような立体配置を指す。
【００２７】
核酸に対して、「本質的相同」という用語は、適切なヌクレオチド挿入または欠損を有する２つの核酸、またはそれらの指定配列が、最適にアライメントされ、比較される場合、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常、ヌクレオチドの少なくとも約９０％〜９５％、より好ましくは、少なくとも約９８〜９９．５％において同一であることを示す。代替として、本質的相同は、数断片が、選択的ハイブリダイゼーション条件下で、当該鎖の相補配列にハイブリダイズする場合に存在する。核酸は、全細胞においてか、細胞溶解物においてか、もしくは部分的に精製される形態、または実質的に純粋な形態で存在することができる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣＩ分別、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野で周知の他の技術を含む、標準的技術によって、他の細胞成分または他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸またはタンパク質から精製される場合、「単離される」か、または「実質的に純粋にされる」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照されたい。
【００２８】
ｃＤＮＡ、ゲノム、または混合物のいずれかからの本発明の核酸組成物は、しばしば、その天然配列（修飾制限部位等を除いて）にある間に、遺伝子配列を提供するための標準的技術に従って変異され得る。コード配列に対して、これらの変異は、必要に応じてアミノ酸配列に影響を与える可能性がある。特に、天然Ｖ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチ、および本明細書で記載される他のそのような配列と実質的に同種であるか、またはそれらに由来するＤＮＡ配列が意図される（「由来する」は、配列が同一であるか、または別の配列から修飾されることを示す）。
【００２９】
核酸は、別の核酸配列との機能的な関係に配置される場合、「機能的に連結される」。例えば、プロモータまたはエンハンサは、該配列の転写に影響を与える場合、コード配列に機能的に連結される。転写調節配列に対して、機能的に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が隣接し、２つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合、リーディングフレームにおいて隣接していることを意味する。
【００３０】
異種抗体を産生することが可能なトランスジェニック非ヒト動物
上記で論じられるように、有望な治療および／または診断標的である特異的ヒト抗原に反応するヒト免疫グロブリンを産生することが望ましい。しかしながら、ヒト抗原に特異的に結合するヒト免疫グロブリンを産生することには問題がある。
【００３１】
まず、Ｂ細胞源として機能する免疫動物は、提示抗原に対して免疫応答しなければならない。動物が免疫応答するには、提示される抗原は、外来でなければならず、動物は、抗原に対して耐性を有してはならない。したがって、例えば、ヒトタンパク質に結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗体を産生することが望ましい場合、免疫原性であり得る抗原の唯一のエピトープがヒト集団内にあるタンパク質の多型性から生じるもの（同種エピトープ）であるため、自己寛容は、免疫があるヒトがヒトタンパク質に対して相当の免疫応答を行うことを阻止する。
【００３２】
次に、ハイブリドーマを形成するためのＢ細胞源として機能する動物（説明のために与えられた例におけるヒト）が、真正自己抗原に対して免疫応答する場合、重度の自己免疫疾患が、動物において引き起こされる可能性がある。ヒトが、ハイブリドーマのためのＢ細胞源として使用される場合、そのような自己免疫化は、現代の標準によって非倫理的であると見なされる。したがって、所定のヒト抗原に対する抗体応答を引き起こすことができるヒト抗体分泌Ｂ細胞の信頼できる供給源が必要であるため、所定のヒト抗原に特異的に反応するヒト免疫グロブリン鎖を分泌するハイブリドーマを開発することには問題がある。
【００３３】
これらの課題を克服することが可能なマウスの例としては、本明細書においてＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）とそれぞれ称されるトランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスが挙げられ、本明細書において集合的に「ヒトＩｇマウス」と称される。
【００３４】
ＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ（登録商標），Ｉｎｃ．）は、内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と合わせて、未再構成ヒト重（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を含有する（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭまたはκの低い発現を示し、免疫化に応じて、導入ヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生成するためにクラススイッチおよび体細胞変異を受ける（上記のＬｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３、ならびにＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６において再検討される）。ＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（登録商標）の調製および使用、ならびにそのようなマウスが有するゲノム修飾は、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２＊＊３０、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１、およびＦｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１にさらに記載され、これらのすべての内容は、参照することによって、その全体として本明細書に具体的に組み込まれる。さらに、すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、および同第５，７７０，４２９号、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙのＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９７／１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、および同第ＷＯ９９／４５９６２号、ならびにＫｏｒｍａｎらのＰＣＴ出願第ＷＯ０１／１４４２４号を参照されたく、これらの各内容も、参照することによって組み込まれる。
【００３５】
別の実施形態では、ヒト抗体は、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス染色体を有するマウス等、トランス遺伝子およびトランス染色体上にヒト免疫グロブリン配列を有するマウスを使用して増加させることができる。このマウスは、本明細書において「ＫＭ  ｍｏｕｓｅ（登録商標）」と称され、ＩｓｈｉｄａらのＰＣＴ出願第ＷＯ０２／４３４７８号に詳述される。
【００３６】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランスジェニック動物系は、当技術分野で利用可能である。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．）と称される代替のトランスジェニック系を使用することができ、そのようなマウスは、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの米国特許第５，９３９，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１５０，５８４号、および同第６，１６２，９６３号に記載される。
【００３７】
さらに、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する代替のトランス染色体動物系は、当技術分野で利用可能であり、最適な標的に対する抗体を産生させるために使用することができる。例えば、「ＴＣマウス」と称される、ヒト重鎖トランス染色体およびヒト軽鎖トランス染色体の両方を有するマウスを使用することができ、そのようなマウスは、Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：７２２−７２７に記載される。さらに、ヒト重鎖および軽鎖トランス染色体を有するウシが、当技術分野（Ｋｕｒｏｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：８８９−８９４）およびＰＣＴ出願第ＷＯ／２００２／０９２８１２号で記載され、本発明の抗体を産生させるために使用することができる。
【００３８】
ヒトモノクローナル抗体も、ヒト抗体応答が免疫化の際に生成され得るように、ヒト免疫細胞が再構成されているＳＣＩＤマウスを使用して調製することができる。そのようなマウスは、例えば、Ｗｉｌｓｏｎらの米国特許第５，４７６，９９６号および同第５，６９８，７６７号に記載される。
【００３９】
異種抗体レパートリによる外来抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒト動物の設計は、トランスジェニック動物内に含有される異種免疫グロブリントランス遺伝子が、Ｂ細胞の発生経路全体にわたって正確に機能することを必要とする。したがって、本発明のトランス遺伝子は、以下のうちの１つもしくは複数を産生するように構成される。（１）高レベルおよび細胞型特異的発現、（２）機能遺伝子再構成、（３）対立遺伝子排除の活性化およびそれに対する応答、（４）十分な一次レパートリの発現、（５）信号伝達、（６）体細胞超変異、および（７）免疫応答の間のトランス遺伝子抗体遺伝子座の優性。
【００４０】
以下の開示から明らかとなるように、前述の基準のすべてが満たされる必要はない。例えば、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊されるそれらの実施形態では、トランス遺伝子は、対立遺伝子排除を活性化する必要はない。さらに、トランス遺伝子が、機能的に再構成された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含むそれらの実施形態では、機能遺伝子再構成の第２の基準は、少なくとも、既に再構成されるそのトランス遺伝子に対して不必要である。分子免疫学に関する背景に関して、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００３），Ｐａｕｌ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．，ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐ．Ａ．を参照されたい。
【００４１】
本発明のトランス遺伝子は、少なくとも１つの可変遺伝子断片と、１つの多様性遺伝子断片と、１つの結合遺伝子断片と、少なくとも１つの定常領域遺伝子断片をコードするＤＮＡと、を含む重鎖トランス遺伝子を含む。免疫グロブリン軽鎖トランス遺伝子は、少なくとも１つの可変遺伝子断片と、１つの結合遺伝子断片と、少なくとも１つの定常領域遺伝子断片と、をコードするＤＮＡを含む。軽および重鎖遺伝子断片をコードする遺伝子断片は、トランスジェニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子断片をコードするＤＮＡに由来するか、または対応するという点において、トランスジェニック非ヒト動物と異種である。本発明の一態様では、トランス遺伝子は、個々の遺伝子断片が未再構成、すなわち、機能的免疫グロブリン軽または重鎖をコードするように再構成されないように構成される。そのような未再構成トランス遺伝子は、Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子断片（機能的再構成）を支持し、好ましくは、抗原に曝される場合、トランスジェニック非ヒト動物内の得られた再構成免疫グロブリン重鎖においてＤ領域遺伝子断片のすべてまたは一部の取り込みを支持する。
【００４２】
代替の実施形態では、トランス遺伝子は、未再構成「ミニ遺伝子座」を含む。そのようなトランス遺伝子は、典型的には、Ｃ、ＤおよびＪ断片のかなりの部分、およびＶ遺伝子断片のサブセットを含む。そのようなトランス遺伝子コンストラクトでは、種々の調節配列、例えば、プロモータ、エンハンサ、クラススイッチ領域、ＲＮＡプロセシングのための接合ドナーおよび接合アクセプター配列、組み換え信号等は、異種ＤＮＡに由来する対応する配列を含む。そのような調節配列は、本発明において使用される非ヒト動物の同一または関連種からのトランス遺伝子に取り込まれることができる。例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子断片は、トランスジェニックマウスにおける使用のため、トランス遺伝子においてげっ歯類免疫グロブリンエンハンサ配列と組み合わせることができる。代替として、合成調節配列は、トランス遺伝子に取り込まれることができ、そのような合成調節配列は、哺乳類のゲノムにおいて自然発生することが周知の機能的ＤＮＡ配列に相同ではない。合成調節配列は、例えば、接合アクセプター部位またはプロモータ／エンハンサモチーフの許容配列を特定するもの等、コンセンサス規定に従って設計される。例えば、ミニ遺伝子座は、自然発生の生殖細胞Ｉｇ遺伝子座と比較して、非必須ＤＮＡ部分（例えば、介在配列、イントロンまたはその部分）の少なくとも１つの内部（すなわち、部分の末端にない）欠損を有するゲノム免疫グロブリン遺伝子座の一部を含む。
【００４３】
本発明は、重および軽トランス遺伝子を有する生殖系列細胞を含有するトランスジェニック動物も含み、該トランス遺伝子のうちの１つは、未再構成遺伝子断片を含有する他のものを有する再構成遺伝子断片を含有する。好ましい実施形態では、再構成トランス遺伝子は、軽鎖免疫グロブリントランス遺伝子であり、未再構成トランス遺伝子は、重鎖免疫グロブリントランス遺伝子である。
【００４４】
抗体の構造および生成
すべての免疫グロブリンの基本構造は、２つの軽ポリペプチド鎖および２つの重ポリペプチド鎖から成る単位に基づく。各軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領域として周知の２つの領域を含む。同様に、免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖領域および定常重鎖領域に指定される２つの領域を含む。
【００４５】
重鎖または軽鎖に対する定常領域は、重または軽定常領域遺伝子（ＣＨ）断片と称されるゲノム配列によってコードされる。特定の重鎖遺伝子断片の使用は、免疫グロブリンのクラスを定義する。例えば、ヒトにおいて、μ定常領域遺伝子断片は、抗体のＩｇＭクラスを定義するが、γ、またはγ２、またはγ３、またはγ４定常領域遺伝子断片の使用は、抗体のＩｇＧクラス、およびＩｇＧ１〜ＩｇＧ４のＩｇＧサブクラスを定義する。同様に、α１またはα２定常領域遺伝子断片の使用は、抗体のＩｇＡクラス、およびＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスを定義する。δおよびε定常領域遺伝子断片は、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体クラスをそれぞれ定義する。
【００４６】
重および軽免疫グロブリン鎖の可変領域は、合わせて、抗体の抗原結合ドメインを含有する。広範囲の抗原への結合を許可する抗体のこの領域における多様性が必要なため、初回または一次レパートリ可変領域をコードするＤＮＡは、特定の可変領域遺伝子断片の種族に由来するいくつかの異なるＤＮＡ断片を含む。軽鎖可変領域の場合、そのような種族は、可変（Ｖ）遺伝子断片および結合（Ｊ）遺伝子断片を含む。したがって、軽鎖の初期可変領域は、１つのＶ遺伝子断片および１つのＪ遺伝子断片によってコードされ、それぞれ、生物体のゲノムＤＮＡに含有されるＶおよびＪ遺伝子断片の種族より選択される。重鎖可変領域の場合、重鎖の初回または一次レパートリ可変領域をコードするＤＮＡは、１つの重鎖Ｖ遺伝子断片、１つの重鎖多様性（Ｄ）遺伝子断片、および１つのＪ遺伝子断片を含み、それぞれ、ゲノムＤＮＡにおける免疫グロブリン遺伝子断片の適切なＶ、ＤおよびＪ種族より選択される。
【００４７】
抗体結合部位の形成に貢献する配列の多様性を増加させるために、重鎖トランス遺伝子が、再構成Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列におけるＤ領域遺伝子配列のすべてまたは一部を取り込むことができる機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再構成を支持するシス作用配列を含むことが好ましい。典型的には、発現トランス遺伝子コード重鎖（またはｍＲＮＡ）の少なくとも約１パーセントが、Ｖ領域における認識可能なＤ領域配列を含む。好ましくは、トランス遺伝子コードＶ領域の少なくとも約１０パーセントが、認識可能なＤ領域配列を含み、より好ましくは、少なくとも約３０パーセント、最も好ましくは、５０パーセント以上が、認識可能なＤ領域配列を含む。
【００４８】
認識可能なＤ領域配列は、概して、重鎖トランス遺伝子のＤ領域遺伝子断片にある配列および／またはそのようなＤ領域ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に対応する少なくとも約８つの連続ヌクレオチドである。例えば、トランス遺伝子が、Ｄ領域遺伝子ＤＨＱ５２を含む場合、Ｖ遺伝子断片配列とＪ遺伝子断片配列との間のＶ領域に位置する配列５′−ＣＴＡＡＣＴＧＧＧＧＡ−３′を含有するトランス遺伝子コードｍＲＮＡは、Ｄ領域配列、具体的には、ＤＨＱ５２配列を含有するとして認識可能である。同様に、例えば、トランス遺伝子が、Ｄ領域遺伝子ＤＨＱ５２を含む場合、Ｖ遺伝子断片アミノ酸配列とＪ遺伝子断片アミノ酸との間のＶ領域に位置するアミノ酸配列−ＬＴＧ−を含有するトランス遺伝子コード重鎖ポリペプチドは、Ｄ領域配列、具体的には、ＤＨＱ５２配列を含有するとして認識可能であり得る。しかしながら、Ｄ領域断片は、種々の程度で種々のリーディングフレームにおいてＶＤＪ結合に取り込まれることができるため、トランス遺伝子にあるＤ領域断片との重鎖可変領域のＤ領域の部分の比較は、特定のＤ断片の取り込みを判断するために必要である。さらに、組み換えの間の潜在的エクソヌクレアーゼによる消化は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組み換えの間の不明確なＶ−ＤおよびＤ−Ｊ結合につながり得る。
【００４９】
しかしながら、体細胞変異およびＮ領域の付加のため、いくつかのＤ領域配列は、認識可能であり得るが、トランス遺伝子における連続Ｄ領域配列に同一に対応しない可能性がある。例えば、ＸがＡまたはＴまたはＧであり、重鎖Ｖ領域に位置し、両側にＶ領域遺伝子配列およびＪ領域遺伝子配列が配置されるヌクレオチド配列５′−ＣＴＡＡＸＴＧＧＧＧＡ−３′は、ＨＱ５２配列５′−ＣＴＡＡＣＴＧＧＧＡ−３′に対応すると認識することができる。同様に、例えば、Ｖ領域に位置し、アミノ末端側にトランス遺伝子Ｖ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列が配置され、カルボキシ末端側にトランス遺伝子Ｊ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列が配置されるポリペプチド配列−ＬＮＧ−、または−ＬＩＧ−、または−ＬＳＧ−、または−ＫＷＧ−、または−ＮＷＧ−は、Ｄ領域配列として認識可能である。
【００５０】
したがって、体細胞変異およびＮ領域の付加は、トランス遺伝子Ｄ領域に由来する配列において変異を産生することができるため、以下の定義が、認識可能なＤ領域配列の存在を判定するためのガイドとして提供される。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は、以下の場合にＤ領域配列として認識可能である。（１）該配列が、Ｖ領域に位置し、一方の側にＶ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推測されたアミノ酸配列）が配置され、他方の側にＪ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推測されたアミノ酸配列）が配置される、および（２）該配列が、周知のＤ遺伝子配列（ヌクレオチド配列またはコードされたアミノ酸配列）と実質的に同一であるか、または実質的に同様である。
本明細書で使用される「実質的に同一」という用語は、ポリペプチド配列または核酸配列の特徴を意味し、該ポリペプチド配列は、参照配列と比較して、少なくとも５０パーセントの配列同一性、しばしば、少なくとも約８０％の配列同一性、時折、約９０％以上の配列同一性を有し、該核酸配列は、参照配列と比較して、少なくとも７０パーセントの配列同一性を有する。配列同一性の割合は、合計で参照配列の３５パーセント以下となる小さい欠損または付加を除外して計算される。参照配列は、Ｄ遺伝子の全体等の大きい配列のサブセットであり得るが、参照配列は、ポリヌクレオチドの場合、少なくとも８ヌクレオチドの長さであり、ポリペプチドの場合、少なくとも３つのアミノ残渣の長さである。典型的には、参照配列は、少なくとも８〜１２ヌクレオチド、または少なくとも３〜４つのアミノ酸であり、好ましくは、参照配列は、１２〜１５ヌクレオチド以上、または少なくとも５つのアミノ酸である。
【００５１】
「本質的に同様」という用語は、ポリペプチド配列の特徴を意味し、該ポリペプチド配列は、参照配列と少なくとも８０パーセントの類似性を有する。配列類似性の割合は、同一のアミノ酸、または位置的保存アミノ酸置換を類似しているとして記録することによって計算する。位置的保存アミノ酸置換は、単一のヌクレオチド置換から生じるものであり、第１のアミノ酸は、第１のアミノ酸に対するコドンおよび第２のアミノ酸に対するコドンが単一のヌクレオチド置換によって異なり得る第２のアミノ酸によって置換される。したがって、例えば、配列−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−は、コドン配列−ＡＡＡ−ＧＡＡ−ＡＧＡ−ＧＵＵ−が、４つの本来のコドンのうちの３つにおける単一のヌクレオチド置換である３つの置換変異のみを導入することによって−ＡＡＣ−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＧＵＵ−に変異することができるため、配列−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−と実質的に同様である。該参照配列は、Ｄ遺伝子の全体等の大きい配列のサブセットであり得るが、該参照配列は、少なくとも４つのアミノ残渣の長さである。典型的には、該参照配列は、少なくとも５つのアミノ酸であり、好ましくは、該参照配列は、６つのアミノ酸以上である。
【００５２】
一次レパートリ
重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡを生成するためのプロセスは、主に、Ｂ細胞を成長させる際に生じる。種々の免疫グロブリン遺伝子断片の結合の前に、Ｖ−Ｄ−Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子断片が見られ、大部分は、一次レパートリＢ細胞の前駆体におけるＶ−Ｄ−ＪおよびＣ遺伝子断片のクラスタにおいて見られる。概して、重鎖または軽鎖の遺伝子断片はすべて、単染色体上の比較的近くに位置する。種々の免疫グロブリン遺伝子断片の組み換え前のそのようなゲノムＤＮＡは、本明細書において「未再構成」ゲノムＤＮＡと称される。Ｂ細胞分化の間、Ｖ−Ｄ−Ｊ（または、軽鎖遺伝子の場合、ＶおよびＪのみ）遺伝子断片の各適切な種族メンバーのうちの１つは、機能的に再構成された重および軽免疫グロブリン遺伝子を形成するように組み換えられる。そのような機能的再構成は、機能可変領域をコードするＤＮＡを形成する可変領域断片のものである。この遺伝子断片再構成プロセスは、順次的であるように思われる。まず、重鎖Ｄ〜Ｊ結合が行われ、その後、重鎖Ｖ〜ＤＪ結合、軽鎖Ｖ〜Ｊ結合が行われる。軽および／または重鎖における機能可変領域のこの初期形態をコードするＤＮＡは、「機能的に再構成されたＤＮＡ」または「再構成ＤＮＡ」と称される。重鎖の場合、そのようなＤＮＡは、「再構成重鎖ＤＮＡ」と称され、軽鎖の場合、そのようなＤＮＡは、「再構成軽鎖ＤＮＡ」と称される。本発明のトランス遺伝子の機能的再構成を説明するために同様の言語が使用される。
【００５３】
機能的重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子断片の組み換えは、組み換え的に有能なＶ、ＤおよびＪ断片の側にある組み換え信号配列（ＲＲＳ）によって媒介される。ＲＳＳは、組み換えを管理するために必要かつ十分であり、二重対称七量体、高ＡＴ九量体、および１２または２３のいずれかの塩基対の介在スペーサ領域を含む。これらの信号は、Ｄ−Ｊ（またはＶ−Ｊ）組み換えを実行する異なる遺伝子座および種の間で保存され、機能的に交換可能である。参照することによって、その全体として本明細書に組み込まれる、Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８，１５１７−１５２３、Ｃｕｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２（１０），１８１０−４、Ｓａｄｏｆｓｋｙ，（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９（７），１３９９−４０９を参照されたい。該七量体は、未保存配列のスペーサ、次いで、配列ＡＣＡＡＡＡＡＣＣまたはその類似体を有する九量体が続く、配列ＣＡＣＡＧＴＧまたはその類似体を含む。これらの配列は、Ｊ遺伝子断片上、または各ＶおよびＤ遺伝子断片の下流側上で見られる。生殖細胞ＤおよびＪ断片の直前には、再度、２つの組み換え信号配列があり、最初は、九量体であり、次いで、再度、未保存配列によって分離される七量体である。ＶＬまたはＶＨまたはＤ断片に続く七量体および九量体配列は、それらが組み換えられるＪＬまたはＤまたはＪＨ断片に先行する配列に相補的である。七量体と九量体配列との間のスペーサは、１２塩基対の長さであるか、または２２〜２４塩基対の長さのいずれかである。
【００５４】
Ｖ、ＤおよびＪ断片の再構成に加え、さらなる多様性が、軽鎖におけるＶとＪ断片との間および重鎖におけるＤとＪ断片との間の可変組み換えのために、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリにおいて生成される。そのような可変組み換えは、そのような断片が結合する正確な位置における変異によって生成される。軽鎖におけるそのような変異は、典型的には、Ｖ遺伝子断片の最後のコドンおよびＪ断片の最初のコドン内で生じる。結合における同様な不明確性は、ＤとＪＨ断片との間の重鎖染色体上で生じ、１０ヌクレオチドにも広がり得る。さらに、いくつかのヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡによってコードされないＤとＪＨおよびＶＨとＤ遺伝子断片との間に挿入することができる。これらのヌクレオチドの付加は、Ｎ領域多様性として周知である。
ＶＪおよび／またはＶＤＪの再構成の後、再構成可変領域から下流に位置する再構成可変領域および１つもしくは複数の定常領域遺伝子断片の転写は、適切なＲＮＡスプライシング後に完全長重または軽免疫グロブリン鎖をコードするｍＲＮＡをもたらす一次ＲＮＡ転写物を産生する。そのような重鎖および軽鎖は、Ｂ細胞の膜貫通領域を介する分泌および／またはＢ細胞の膜貫通領域への免疫グロブリンの挿入を引き起こすリーダー信号配列を含む。この信号配列をコードするＤＮＡは、重または軽免疫グロブリン鎖の可変領域を形成するために使用されるＶ断片の第１のエクソン内に含有される。適切な調節配列も、互いの適切な会合後に抗体分子を形成するコード重および軽免疫グロブリンポリペプチドを産生するために、該ｍＲＮＡの翻訳を制御するように該ｍＲＮＡに存在する。
【００５５】
可変領域遺伝子断片におけるそのような再構成、およびそのような結合の間に生じ得る可変組み換えの全体の効果は、一次抗体レパートリの産生である。概して、この段階まで分化した各Ｂ細胞は、単一の一次レパートリ抗体を産生する。この分化プロセスの間、機能的に再構成されたＩｇ遺伝子内に含有されるもの以外の遺伝子断片の機能的再構成を抑制する細胞的事象が生じる。二倍体Ｂ細胞がそのような単一特異性を維持するプロセスは、対立遺伝子排除と称される。
【００５６】
二次レパートリ
一次レパートリを含む配列のセット内から免疫グロブリンを発現するＢ細胞クローンは、外来抗原に応答するのに直ちに利用可能である。単純なＶＪおよびＶＤＪ結合によって生成される多様性の制限のため、いわゆる一次応答によって産生される抗体は、親和性が比較的低い。一次抗体形成細胞の前駆体、および二次レパートリＢ細胞の前駆体の２つの異なる種類のＢ細胞は、この初期応答を構成する（Ｌｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ５９：１０４９−１０５９（１９８９）、およびＨｅｎｔｇｅｓ，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９７  Ｓｕｐｐｌ  １：３−９（１９９４）、これら両方の内容は、参照することによって、その全体として本明細書に組み込まれる）。第１の種類のＢ細胞は、ある種の抗原に応じてＩｇＭ分泌プラズマ細胞に成熟する。他方のＢ細胞は、Ｔ細胞依存性成熟経路に侵入することによる抗原への初期暴露に応答する。
【００５７】
抗原刺激Ｂ細胞クローンのＴ細胞依存性成熟の間、細胞表面上の抗体分子の構造は、二通りに変化し、定常領域は、非ＩｇＭサブタイプに変換し、可変領域の配列は、より高い親和性の抗体分子を産生するように複数の単一のアミノ酸置換によって修飾することができる。
【００５８】
前述したように、重または軽Ｉｇ鎖の各可変領域は、抗原結合ドメインを含有する。二次応答の間の体細胞変異が、超可変領域１、２、および３としても称される、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含むＶ領域全体にわたって生じることは、アミノ酸および核酸配列によって決定されている（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１）Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、可変遺伝子断片内に位置するが、ＣＤＲ３は、多いに、ＶとＪ遺伝子断片、またはＶ、ＤとＪ遺伝子断片との間の組み換えの結果である。ＣＤＲ１、または２、または３から成らない可変領域のそれらの部分は、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と指定されるフレームワーク領域と称される。
【００５９】
超変異の間、再構成ＤＮＡは、変化したＩｇ分子を有する新しいクローンを引き起こすように変異する。外来抗原に対するより高い親和性を有するそれらのクローンは、ヘルパーＴ細胞によって選択的に拡大し、発現抗体の親和性成熟を引き起こす。クローン選択は、典型的には、ＣＤＲ１、２、および／または３領域内に新しい変異を含有するクローンの発現をもたらす。しかしながら、これらの領域外での変異も生じ、抗原結合ドメインの特異性および親和性に影響を与える。
【００６０】
異種抗体を産生することが可能なトランスジェニック非ヒト動物
本発明の一態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、本発明の免疫グロブリントランス遺伝子（以下で論じられる）のうちの少なくとも１つを非ヒト動物の接合体または初期胚へ導入することによって産生される。本発明において使用される非ヒト動物は、概して、一次抗体応答を産生するように免疫グロブリン遺伝子断片を再構成することが可能な任意の哺乳類を含む。そのような非ヒトトランスジェニック動物としては、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニック畜牛、および他のトランスジェニック動物種、特に、当技術分野で周知の哺乳類種を含むことができる。特に好ましい非ヒト動物は、マウス、またはげっ歯類種族の他のメンバーである。
【００６１】
しかしながら、本発明は、マウスの使用に限定されない。むしろ、一次および二次抗体応答を開始することが可能な任意の非ヒト哺乳類を使用することができる。そのような動物としては、チンパンジー、ウシ、ヒツジ、およびブタ等の非ヒト霊長類、げっ歯類種族の他のメンバー、例えば、ラット、およびウサギおよびモルモットが挙げられる。特に好ましい動物は、マウス、ラット、ウサギ、およびモルモット、最も好ましくは、マウスである。
【００６２】
本発明の一実施形態では、ヒトゲノムからの種々の遺伝子断片が、未再構成形態で重鎖および軽鎖トランス遺伝子において使用される。本実施形態では、そのようなトランス遺伝子が、マウスに導入される。軽および／または重鎖トランス遺伝子の未再構成遺伝子断片は、マウスゲノムにおける内因性免疫グロブリン遺伝子断片と区別可能な、ヒト種に固有のＤＮＡ配列を有する。それらは、Ｂ細胞から成らない生殖細胞および体細胞において未再構成形態で、およびＢ細胞において再構成形態で、容易に検出することができる。
【００６３】
本発明代替の実施形態では、トランス遺伝子は、再構成重および／または軽免疫グロブリントランス遺伝子を含む。機能的に再構成されたＶＤＪまたはＶＪ断片に対応するそのようなトランス遺伝子の特定の断片は、同様にマウスにおける内因性免疫グロブリン遺伝子断片と明らかに区別可能な免疫グロブリンＤＮＡ配列を含有する。
ＤＮＡ配列におけるそのような相違は、マウスＢ細胞によってコードされるアミノ酸配列と比較して、そのようなヒト免疫グロブリントランス遺伝子によってコードされるアミノ酸配列においても反映される。したがって、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列は、ヒト免疫グロブリン遺伝子断片によってコードされる免疫グロブリンエピトープに特異的な抗体によって、本発明のトランスジェニック非ヒト動物において検出することができる。
【００６４】
ヒトまたは他の種からの未再構成トランス遺伝子を含有するトランスジェニックＢ細胞は、機能的に再構成された軽および重鎖可変領域を形成するように適切な遺伝子断片を機能的に組み換える。そのような再構成トランス遺伝子によってコードされる抗体は、本発明を実施するために使用される非ヒト動物において通常見られるものと異種であるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を有する。
【００６５】
未再構成トランス遺伝子
本明細書で使用される「未再構成免疫グロブリン重鎖トランス遺伝子」は、少なくとも１つの可変遺伝子断片と、１つの多様性遺伝子断片と、１つの結合遺伝子断片と、１つの定常領域遺伝子断片と、をコードするＤＮＡを含む。前記重鎖トランス遺伝子の各遺伝子断片は、前記トランス遺伝子が導入される、非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖遺伝子断片をコードするＤＮＡに由来するか、またはそれに対応する配列を有する。同様に、本明細書で使用される「未再構成免疫グロブリン軽鎖トランス遺伝子」は、少なくとも１つの可変遺伝子断片と、１つの結合遺伝子断片と、少なくとも１つの定常領域遺伝子断片と、をコードするＤＮＡを含み、前記軽鎖トランス遺伝子の各遺伝子断片は、前記軽鎖トランス遺伝子が導入される、非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン軽鎖遺伝子断片をコードするＤＮＡに由来するか、またはそれに対応する配列を有する。
【００６６】
本発明のこの態様におけるそのような重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、未再構成形態での上記で特定された遺伝子断片を含有する。したがって、適切な組み換え信号配列（ＲＳＳ）が、重鎖トランス遺伝子におけるＶ、ＤとＪ断片との間、および軽鎖トランス遺伝子上のＶとＪ断片との間に介在する。さらに、そのようなトランス遺伝子は、定常領域遺伝子断片をＶＪまたはＶＤＪ再構成可変領域に結合するための適切なＲＮＡスプライシング信号も含む。
【００６７】
２つ以上のＣ領域遺伝子断片、例えば、ヒトゲノムのＣμおよびＣγ１を含有する重鎖トランス遺伝子内におけるイソタイプスイッチを容易にするためには、以下で説明される「スイッチ領域」は、免疫グロブリンクラススイッチ、例えば、ＩｇＭからＩｇＧを可能にするためのそのような定常領域の間の組み換えを許可するために、各定常領域遺伝子断片から上流に、および可変領域遺伝子断片から下流に組み込まれる。そのような重および軽免疫グロブリントランス遺伝子は、典型的には、ＴＡＴＡモチーフを含有する可変領域遺伝子断片から上流に位置するプロモータ領域を含む転写制御配列も含む。プロモータ領域は、下流配列に機能的に連結される場合に下流配列の転写を産生することができるＤＮＡ配列として、大まかに定義することができる。プロモータは、効率的な転写を産生するために、付加的な結合シス作用配列の存在を必要とする場合がある。さらに、無菌転写物の転写に関与する他の配列が、好ましくは、含まれる。無菌転写物の転写に関与する配列の実施例は、各内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：６２１−６２７（１９９０）、Ｒｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８４０−８４４（１９８９）、Ｓｔａｖｎｅｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７７０４−７７０８（１９８８）、およびＭｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７３０５−７３１６（１９９１）を含む、既刊文献で見ることができる。これらの配列は、典型的には、スイッチ領域のすぐ上流に少なくとも約５０ｂｐを、好ましくは、スイッチ領域の上流に少なくとも約２００ｂｐを、より好ましくは、スイッチ領域の上流に少なくとも約２００〜１０００ｂｐまたはそれ以上を含む。適切な配列は、ヒトＳγ１、Ｓγ２、Ｓγ３、Ｓγ４、Ｓα１、Ｓα２、およびＳεスイッチ領域のすぐ上流で生じ、ヒトＳγ１およびＳγ３スイッチ領域のすぐ上流の配列は、概して、好ましくはＳγ１と併せて、利益を得るために使用することができる。代替として、または組み合わせて、マウスＩｇスイッチ配列を使用することができ、トランスジェニック非ヒト動物と同一の種のＩｇスイッチ配列を使用することが頻繁に
有利であり得る。さらに、ＩＦＮ−誘導性エンハンサ等のインターフェロン（ＩＦＮ）誘導性転写調節要素は、好ましくは、トランス遺伝子スイッチ配列のすぐ上流に含まれる。
【００６８】
プロモータに加え、Ｂ系細胞において機能する他の調節配列が主に使用される。したがって、例えば、好ましくは、軽鎖トランス遺伝子上にあるＪと定常領域遺伝子断片との間に位置する軽鎖エンハンサ配列は、トランス遺伝子発現を強化するために使用され、それにより、対立遺伝子排除を容易にする。重鎖トランス遺伝子の場合、調節エンハンサも使用される。そのような調節配列は、対立遺伝子排除を誘導し、比較的に高いレベルのトランス遺伝子発現を提供するように、トランス遺伝子の転写および翻訳を最大にするために使用される。
【００６９】
前述のプロモータおよびエンハンサ調節制御配列を一般的に説明したが、そのような調節配列は、異種トランス遺伝子免疫グロブリン遺伝子断片が得られるゲノムＤＮＡに由来する非ヒト動物と異種であり得る。代替として、そのような調節遺伝子断片は、重および軽トランス遺伝子を含有する、非ヒト動物または密接に関連する種のゲノム内の対応する調節配列に由来する。
【００７０】
好ましい実施形態では、遺伝子断片は、ヒトに由来する。そのような重および軽トランス遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物は、そのような動物に投与する特異性抗原に対するＩｇ媒介免疫応答を開始することが可能である。異種ヒト抗体を産生することが可能なＢ細胞は、そのような動物内で産生される。不死化させた後、および適切なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）、例えば、ハイブリドーマの選択後、治療ヒトモノクローナル抗体源が提供される。そのようなヒトＭａｂは、治療のためにヒトに投与した場合、著しく低い免疫原性を有する。
【００７１】
好ましい実施形態は、ヒト遺伝子断片を含有する重および軽トランス遺伝子の構成を開示するが、本発明はそれほど制限されない。この点において、本明細書に記載される教示が、ヒト以外の種からの免疫グロブリン遺伝子断片を使用するために容易に採用することができることを理解されたい。例えば、本発明の抗体によるヒトの治療法に加え、適切な遺伝子断片によってコードされる治療抗体は、獣医学における使用のためのモノクローナル抗体を生成するために使用することができる。
【００７２】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、当業者に周知の種々の技術によって得ることができる。簡潔に述べると、所望の抗原の免疫を有する動物からの脾臓細胞は、一般的に、骨髄腫細胞との融合によって不死化される（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１−５１９（１９７６）を参照）。不死化の代替の方法としては、エプスタインバーウイルス、癌遺伝子、またはレトロウイルスによる形質転換、もしくは当技術分野で周知の他の方法が挙げられる。単一の不死化細胞から発生するコロニーは、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生に対してスクリーニングされ、そのような細胞によって産生されるモノクローナル抗体の産出量は、脊椎動物宿主の腹腔への注入を含む、種々の技術によって高めることができる。免疫グロブリンを産生するための動物の免疫化、モノクローナル抗体の産生、プローブとしての使用のための免疫グロブリンの標識化、免疫親和性精製、および免疫学的検定を含む、これらの術において有用な種々の技術は、例えば、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）で論じられる。
【００７３】
トランスジェニック一次レパートリ
Ａ．ヒト免疫グロブリン遺伝子座
トランス遺伝子機能のための重要な要件は、広範囲の抗原に対する二次免疫応答を誘引するために十分に多様な一次抗体レパートリの生成である。再構成重鎖遺伝子は、信号ペプチドエクソン、可変領域エクソン、およびタンデム配列の多重ドメイン定常領域から成り、多重ドメイン定常領域のそれぞれがいくつかのエクソンによってコードされる。各定常領域遺伝子は、免疫グロブリンの異なるクラスの定常部分をコードする。Ｂ細胞の成長の間、Ｖ領域近位定常領域は削除され、新しい重鎖クラスの発現につながる。各重鎖クラスに対して、ＲＮＡスプライシングの代替のパターンは、膜貫通および分泌免疫グロブリンの両方を生じさせる。
【００７４】
ヒト重鎖遺伝子座は、２Ｍｂにわたる約２００Ｖ遺伝子断片（現在のデータは、約５０〜１００Ｖ遺伝子断片の存在を支持する）、約４０ｋｂにわたる約３０のＤ遺伝子断片、３ｋｂの範囲内に群がる６つのＪ断片、および約３００ｋｂにわたって広がる９つの定常領域遺伝子断片から成ると予測される。該遺伝子座の全体は、染色体１４の長腕の遠位部分の約２．５Ｍｂにわたる。
【００７５】
Ｂ．遺伝子フラグメントトランス遺伝子
１．重鎖トランス遺伝子
好ましい実施形態では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランス遺伝子は、ヒトからの未再構成ゲノムＤＮＡを含む。重鎖の場合、好ましいトランス遺伝子は、６７０〜８３０ｋｂの長さを有するＮｏｔＩフラグメントを含む。このフラグメントは、周知のＶＨファミリーの６つすべてのメンバー、ＤおよびＪ遺伝子断片、およびμ、δ、γ３、γ１、およびα１定常領域を含有する（参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：７２７−７３８（１９８８））。このトランス遺伝子を含有するトランスジェニックマウス株は、ほとんどの抗原に対して二次応答を誘引するための可変領域の十分に大きいレパートリと併せて、Ｂ細胞成長に必要な重鎖クラス（ＩｇＭ）、および少なくとも１つのスイッチ重鎖クラス（ＩｇＧ１）を正確に発現する。
【００７６】
「好ましい実施形態」と題する項目で詳述されるように、重遺伝子配列を含む好ましいトランス遺伝子として、ｐＨＣ２、ｐＧＰ６９−７ＶＨＣ、ｐＶｘ６、ＶＤＪＣＥ、Ｖ１２ＤＪＣＥ、ＣＴＤ−３０５４Ｍ１７、ＢＡＣ融合＃１、ＢＡＣ融合＃２、ＢＡＣ融合＃３、ＢＡＣ融合＃４、ＢＡＣ融合＃５、ｙＩｇＨ２４ａ、ｙＩｇＨ１０、およびｐＩｇＹＢａｃの挿入物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
２．軽鎖トランス遺伝子
ヒト軽鎖遺伝子座からの必要遺伝子断片および調節配列のすべてを含有するゲノムフラグメントは、同様に構成することができる。そのようなトランス遺伝子は、実施例、および「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．」と題される米国特許第５，７８９，６５０号に記載されるように構成される。
【００７８】
Ｃ．ミニ遺伝子座トランス遺伝子
本明細書で使用される「免疫グロブリンミニ遺伝子座」という用語は、ＤＮＡ配列が、少なくとも１つの本質的な不連続部（例えば、同種ゲノムＤＮＡ配列に対して、通常、少なくとも約２〜５ｋｂ、好ましくは、１０〜２５ｋｂ以上の欠損）を含有するように、機能可変（Ｖ）遺伝子断片、機能結合（Ｊ）領域断片、少なくとも１つの機能定常（Ｃ）領域遺伝子断片、および重鎖ミニ遺伝子座である場合、機能多様性（Ｄ）領域断片のうちの少なくとも１つずつを含有する、通常、約１５０ｋｂ未満、典型的には、約２５〜１００ｋｂのＤＮＡ配列（より長い配列内にあり得る）を指す。軽鎖ミニ遺伝子座トランス遺伝子は、少なくとも２５ｋｂ、典型的には、５０〜６０ｋｂの長さである。重鎖トランス遺伝子は、スイッチ領域に機能的に連結される２つの定常領域を有する、約７０〜８０ｋｂ、好ましくは、少なくとも約６０ｋｂの長さである。さらに、ミニ遺伝子座の個々の要素は、好ましくは、生殖細胞構成であり、ミニ遺伝子座の要素によって全体的にコードされる多様な抗原特異性を有する機能抗体分子を発現するように、トランスジェニック動物のプレＢ細胞において遺伝子再構成を受けることが可能である。さらに、少なくとも２つのＣＨ遺伝子および必要なスイッチ配列を含む重鎖ミニ遺伝子座は、異なる免疫グロブリンクラスの機能抗体分子が生成されるように、典型的には、イソタイプスイッチを受けることが可能である。そのようなイソタイプスイッチは、トランスジェニック非ヒト動物内に存在するＢ細胞において体内で生じることができるか、またはトランスジェニック非ヒト動物から移植されたＢ細胞系統の培養細胞において生じることができる。
【００７９】
代替の好ましい実施形態では、免疫グロブリン重鎖トランス遺伝子は、各ＶＨ、ＤおよびＪＨ遺伝子断片のうちの１つもしくは複数およびＣＨ遺伝子のうちの２つ以上を含む。各適切な種類の遺伝子断片のうちの少なくとも１つは、ミニ遺伝子座トランス遺伝子に組み込まれる。重鎖トランス遺伝子に対するＣＨ断片に関して、該トランス遺伝子が、少なくとも１つのμ遺伝子断片および少なくとも１つの他の定常領域遺伝子断片、より好ましくは、γ遺伝子断片、最も好ましくは、γ３またはγ１を含有することが好ましい。この選択は、コード免疫グロブリンのＩｇＭとＩｇＧ形態との間のクラススイッチ、および選択可能な形態の高親和性非ＩｇＭ免疫グロブリンの産生を可能にするためである。ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥの産生のためにコードするもの等、他の定常領域遺伝子断片も使用することができる。
【００８０】
当業者も、重鎖ＣＨ遺伝子の発生順序が、ＣＨ遺伝子のドナーとして機能する種の生殖細胞で見られる自然発生の空間的順序と異なる、トランス遺伝子を構成する。
加えて、当業者は、種の２つ以上の個体（例えば、同種ＣＨ遺伝子）からＣＨ遺伝子を選択し、イソタイプスイッチを受けることが可能な過剰ＣＨ遺伝子としてトランス遺伝子に前記遺伝子を組み込むことができ、次いで、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、いくつかの実施形態では、トランス遺伝子ＣＨ遺伝子が得られた種において提示されるすべてのアロタイプを含む、種々のクラスの抗体を作製することができる。
さらに、当業者は、トランス遺伝子に取り込むために、異なる種からＣＨ遺伝子を選択することができる。機能スイッチ配列は、各ＣＨ遺伝子とともに含まれるが、使用されるスイッチ配列は、ＣＨ遺伝子に隣接して自然に発生するものである必要はない。種間ＣＨ遺伝子での組み合わせは、種々の種からのＣＨ遺伝子に対応する種々のクラスの抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物を産生する。種間ＣＨトランス遺伝子を含有するトランスジェニック非ヒト動物は、家畜への使用のためのモノクローナルを産生するハイブリドーマを構成するためのＢ細胞源として機能することができる。
【００８１】
ヒトにおける重鎖Ｊ領域断片は、ＤＮＡの３ｋｂの範囲に群がる６つの機能Ｊ断片および３つの偽遺伝子を含む。その比較的に小さいサイズ、および単一の２３ｋｂのＳＦｉｌ／Ｓｐｅｌフラグメント上にあるμ遺伝子、およびδ遺伝子の５′部分と併せて、これらの断片を単離する能力（参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｓａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５４：２６４２７１（１９８８））を踏まえると、Ｊ領域遺伝子断片のすべてが、ミニ遺伝子座コンストラクトにおいて使用されることが好ましい。このフラグメントは、μとδ遺伝子との間の領域にわたるため、μ発現に必要な３′シス結合調節要素のすべてを含む可能性がある。さらに、このフラグメントは、Ｊ領域の全体を含むため、重鎖エンハンサおよびμスイッチ領域を含有する（参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０６：８０９（１９８３）、Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ａｌｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３３９−３６８（１９８６））。それは、一次レパートリＢ細胞を形成するようにＶＤＪ結合を誘引する転写開始部位も含有する（参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ａｎｄ  Ａｌｔ，Ｃｅｌｌ  ４０：２７１−２８１（１９８５））。代替として、Ｄ領域の一部を含む３６ｋｂのＢｓｓＨＩＩ／Ｓｐｅｌｌフラグメントは、２３ｋｂのＳｆｉｌ／Ｓｐｅｌｌフラグメントの代わりに使用することができる。そのようなフラグメントの使用は、効率的なＤ−から−Ｊへの結合を容易にするために５′フランキング配列の量を増加させる。
【００８２】
ヒトＤ領域は、タンデムに結合する４つの同種９ｋｂサブ領域から成る（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ，２９４，６３１−６３５）。各サブ領域は、最大１０の個々のＤ断片を含有する。２つの異なる戦略が、ミニ遺伝子座Ｄ領域を生成するために使用される。第１の戦略は、反復Ｄサブ領域のうちの１つまたは２つを含むＤＮＡの短い接触している範囲に位置するそれらのＤ断片のみを使用するステップを含む。候補は、１２の個々のＤ断片を含有する単一の１５ｋｂフラグメントである。このＤＮＡ断片は、２つの接触しているＥｃｏＲＩフラグメントから成り、完全に配列決定されている（Ｉｃｈｉｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８），ＥＭＢＯ  Ｊ．，７，４１４１−４１５０）。１２のＤ断片は、一次レパートリに対して十分でなければならない。しかしながら、Ｄ領域の分散性を踏まえると、代替の戦略は、より多くの断片を有するＤＮＡのより小さい部分を産生するために、いくつかの非隣接のＤ断片を含むフラグメントを連結させることである。付加的なＤ断片遺伝子は、例えば、上記の特徴的フランキング九量体および七量体配列の存在、および文献を参照することによって同定することができる。
【００８３】
少なくとも１つ、好ましくは、２つ以上のＶ遺伝子断片が、重鎖ミニ遺伝子座トランス遺伝子を構成するために使用される。フランキング配列を有するか、または有しない再構成または未再構成Ｖ断片、Ｄ断片、Ｊ断片、およびＣ遺伝子は、それぞれの内容は、参照することによって組み込まれる、すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、および同第５，７７０，４２９号、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、すべてＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙのＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９７／１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、および同第ＷＯ９９／４５９６２号、およびＫｏｒｍａｎらのＰＣＴ出願第ＷＯ０１／１４４２４号に記載されるように単離することができる。
【００８４】
ミニ遺伝子座軽鎖トランス遺伝子は、ヒトλまたはκ免疫グロブリン遺伝子座から同様に構成することができる。したがって、例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊおよび定常領域配列をコードする、例えば、約７５ｋｂの免疫グロブリン重鎖ミニ遺伝子座トランス遺伝子コンストラクトは、複数のＤＮＡフラグメントから形成することができ、各配列は、実質的にヒト遺伝子配列と相同である。好ましくは、該配列は、転写調節配列に機能的に連結され、再構成を受けることが可能である。２つ以上の適切に配置された定常領域配列（例えば、μおよびγ）およびスイッチ領域により、スイッチ組み換えも生じる。例示的な軽鎖トランス遺伝子コンストラクトは、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、および同第５，７７０，４２９号に記載されるように、ヒトＤＮＡと実質的に相同であり、再構成を受けることが可能な複数のＤＮＡフラグメントから同様に形成することができる。
【００８５】
Ｄ．内因性免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊
首尾よく再構成された免疫グロブリン重および軽トランス遺伝子の発現は、トランスジェニック非ヒト動物における内因性免疫グロブリン遺伝子の再構成を抑制することによる優性効果を有すると予期される。しかしながら、内因性抗体を欠いている非ヒト動物を生成するための別の方法は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を変異させることによる。胚幹細胞技術および相同組換えを使用して、内因性免疫グロブリンレパートリを容易に排除することができる。以下に、マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的説明を記載する。しかしながら、開示されるベクターおよび方法は、他の非ヒト動物における使用のために容易に採用することができる。
【００８６】
簡潔に述べると、この技術は、生殖細胞組織に分化することが可能な多能性細胞株における、相同組換えによる遺伝子の不活性化を含む。マウス免疫グロブリン遺伝子の変化したコピーを含有するＤＮＡコンストラクトは、胚幹細胞の核に導入される。該細胞の一部においては、導入された該ＤＮＡは、マウス遺伝子の内因性コピーと再結合し、それを、変化したコピーと置換する。新しく設計された遺伝子病変を含有する細胞は、レシピエント雌に再移植される宿主マウス胚に注入される。これらの胚のいくつかは、全体的に変異細胞株に由来する生殖細胞を有するキメラマウスへと成長する。したがって、キメラマウスを繁殖させることによって、導入遺伝子病変を含有するマウスの新しい株を得ることが可能である（Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８−１２９２によって再検討される）。
【００８７】
マウスλ遺伝子座は、免疫グロブリンの５％のみに貢献するため、重鎖および／またはκ軽鎖遺伝子座の不活性化は十分である。これらの遺伝子座のそれぞれを破壊する方法は３つある。Ｊ領域の欠損、Ｊ−Ｃイントロンエンハンサの欠損、および終止コドンの導入による定常領域コード配列の破壊がある。最後の選択は、ＤＮＡコンストラクトの設計に関して、最も直接的である。μ遺伝子の排除は、Ｂ細胞の成熟を破壊し、それにより、任意の機能重鎖断片へのクラススイッチを防止する。これらの遺伝子座をノックアウトするための戦略を以下に概説する。
【００８８】
マウスμおよびκ遺伝子を破壊するためには、標的化ベクターが、マウスβ２−ミクログロブリン遺伝子の破壊を成功させるために、Ｊａｅｎｉｓｃｈおよび同僚（Ｚｉｊｌｓｔｒａ，ｅｔａｌ．（１９８９），Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４３５−４３８）によって使用される設計に基づいて使用される。プラスミドｐＭＣＩｎｅｏからのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）は、標的遺伝子のコード領域に挿入される。該ｐＭＣＩｎｅｏ挿入物は、ハイブリッドウイルスプロモータ／エンハンサ配列を使用してｎｅｏ発現を促進する。このプロモータは、胚幹細胞において活性を有する。したがって、ｎｅｏは、ノックアウトコンストラクトの組み込みのために、選択可能なマーカとして使用することができる。ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子は、無作為な挿入事象に対する陰性選択マーカとしてコンストラクトの末端に付加される（上記のＺｉｊｌｓｔｒａ，ｅｔ  ａｌ．）。
【００８９】
重鎖遺伝子座を破壊するための好ましい戦略は、Ｊ領域の排除である。この領域は、マウスにおいて極めて小さく、１．３ｋｂにしか及ばない。遺伝子標的化ベクターを構成するためには、マウスゲノムライブラリからの分泌ＩｇＡ定常領域エクソンのすべてを含有する１５ｋｂのＫｐｎＩフラグメントが単離される。該１．３ｋｂのＪ領域は、ｐＭＣＩｎｅｏからの１．１ｋｂの挿入物と置換される。次いで、該ＨＳＶｔｋ遺伝子は、ＫｐｎＩフラグメントの５′末端に付加される。相同組換えを介するこのコンストラクトの正確な組み込みは、ｎｅｏ遺伝子でマウスＪＨ領域を置換することを引き起こす。組み換え型は、ｎｅｏ遺伝子に基づくプライマーおよびＤ領域におけるＫｐｎＩ部位のマウス配列５′と相同のプライマーを使用して、ＰＣＲによってスクリーニングされる。
【００９０】
代替として、重鎖遺伝子座は、μ遺伝子のコード領域を破壊することによってノックアウトされる。この方法は、前述の方法において使用される同一の１５ｋｂのＫｐｎＩフラグメントを含む。ｐＭＣＩｎｅｏからの該１．１ｋｂの挿入物は、エクソンＩＩにおける特有のＢａｍＨＩ部位に挿入され、該ＳＨＶｔｋ遺伝子は、３′ＫｐｎＩ末端に付加される。次いで、該ｔｋ遺伝子を排除する、ｎｅｏ挿入物のいずれかの側でのダブルクロスオーバー事象が選択される。これらは、ＰＣＲ増幅によって選択されたクローンのプールから検出される。ＰＣＲプライマーの一方は、ｎｅｏ配列に由来し、他方は、標的化ベクターの外部のマウス配列に由来する。
【００９１】
Ｅ．内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現の抑制
内因性Ｉｇ遺伝子座の機能破壊に加え、内因性Ｉｇ遺伝子座の発現を防止するための代替の方法は、抑制である。内因性Ｉｇ遺伝子の抑制は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによって、および／または１つもしくは複数の内因性Ｉｇ鎖に特異的な抗血清の投与によって、１つもしくは複数の組み込まれたトランス遺伝子から産生されるアンチセンスＲＮＡによって達成することができる。
【００９２】
アンチセンスポリヌクレオチド
アンチセンスＲＮＡトランス遺伝子を使用して、特異遺伝子の発現を部分的または完全にノックアウトすることができる（Ｊｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６９（６）：８４７−５７（２００５）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，（２００２）．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｐｅｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：７２５、Ｈｅｌｅｎｅ．，Ｃ．  ａｎｄ  Ｔｏｕｌｍｅ，Ｊ．（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０４９：９９、Ｓｔｏｕｔ，Ｊ．  ａｎｄ  Ｃａｓｋｅｙ，Ｔ．（１９９０）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３６９、Ｍｕｎｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ．Ｇｅｎｅｔ．１６：３８３、それぞれの内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる）。
【００９３】
「アンチセンスポリヌクレオチド」は、（１）内因性ＩｇＣＨまたはＣＬ領域の配列等の参照配列のすべてまたは一部に相補的であり、（２）染色体の遺伝子座またはＩｇＭＲＮＡ等の相補的標的配列に特異的にハイブリダイズする、ポリヌクレオチドである。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、該標的配列に特異的なハイブリダイゼーションが、ポリヌクレオチドの機能特性として保持される限り、ヌクレオチドの置換、または付加、または欠損、または転移を含むことができる。相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、個々のｍＲＮＡ種に特異的にハイブリダイズし、ｍＲＮＡ種の転写および／またはＲＮＡプロセシングおよび／またはコードポリペプチドの翻訳を阻止することができる可溶性アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む（Ｊｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６９（６）：８４７−５７（２００５）、Ｃｈｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１０００６−１００１０（１９８９）、Ｂｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１３：６０４−６１８（１９９０）、Ｌｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２７４：５３−５６（１９９０）、Ｈｏｌｃｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第ＷＯ９１／１１５３５号、米国特許第０７／５３０，１６５号（「Ｎｅｗ  Ｈｕｍａｎ  ＣＲＩＰＴＯ  ｇｅｎｅ」）、国際公開第ＷＯ９１／０９８６５号、同第ＷＯ９１／０４７５３号、同第ＷＯ９０／１３６４１号、および欧州特許第ＥＰ３８６５６３号、それぞれの内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる）。アンチセンス配列は、少なくとも約１５の連続ヌクレオチドの長さ、典型的には、少なくとも２０〜３０ヌクレオチドの長さ、好ましくは、約３０ヌクレオチド以上の長さの少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝子配列に相補的なポリヌクレオチド配列である。しかしながら、いくつかの実施形態では、アンチセンス配列は、特異的ハイブリダイゼーションが、アンチセンスポリヌクレオチドの特性として保持される限り、相補的免疫グロブリン遺伝子配列と比較して置換、または付加、または欠損を有することができる。概して、アンチセンス配列は、免疫グロブリン鎖をコードするか、またはＤＮＡ再構成後に免疫グロブリン鎖をコードする潜在力を有する内因性免疫グロブリン遺伝子配列に相補的である。ある場合には、免疫グロブリン遺伝子配列に対応するセンス配列は、特に、転写に干渉することによって発現を抑制するように機能することができる。
【００９４】
したがって、アンチセンスポリヌクレオチドは、コードされたポリペプチドの産生を阻害する。この点において、１つもしくは複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の転写および／または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、非ヒト動物の、内因性Ｉｇ遺伝子座によってコードされる免疫グロブリン鎖を産生する能力および／または特異性を変更することができる。
【００９５】
アンチセンスポリヌクレオチドは、個体またはトランスジェニック非ヒト動物の造血幹細胞集団のすべてまたは一部を再構成するために使用されるトランスジェニック多能性造血幹細胞等のトランスフェクタント細胞またはトランスジェニック細胞における異種発現カセットから産生することができる。代替として、該アンチセンスポリヌクレオチドは、体外の培養媒体または体内の循環系または間質液のいずれかにおける外部環境に投与する可溶性オリゴヌクレオチドを含むことができる。外部環境に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは、細胞質へのアクセスを得、特定のｍＲＮＡ種の翻訳を阻害することが示されている。いくつかの実施形態では、該アンチセンスポリヌクレオチドは、メチルホスホン酸部分を含み、代替として、ホスホロチオラートまたはＯ−メチルリボヌクレオチドを使用することができ、キメラオリゴヌクレオチドも使用することができる（Ｊｕｌｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１６９（６）：８４７−５７（２００５）、Ｄａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４７５１）。いくつかの用途のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ポリアミド核酸を含むことができる（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７）。アンチセンスポリヌクレオチドに関連する一般的方法に関しては、両方の内容は、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，（２００２）．Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ，Ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ，（１９８８），Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
１つもしくは複数の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、同族ｍＲＮＡ種の転写、ＲＮＡプロセシング、および／または翻訳を阻害するために使用され、それにより、それぞれのコードポリペプチドの量の低下をもたらす。そのようなアンチセンスポリヌクレオチドは、体内の１つもしくは複数の内因性Ｉｇ鎖の形成を阻害することによって治療機能を提供することができる。
【００９６】
アンチセンストランス遺伝子から転写される可溶性アンチセンスオリゴヌクレオチドとしてか、またはアンチセンスＲＮＡとしてかにかかわらず、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、体内の生理学的状態で内因性Ｉｇ配列に優先的にハイブリダイズするように選択される。最も典型的には、選択された該アンチセンスポリヌクレオチドは、本発明の重または軽鎖トランス遺伝子によってコードされる異種Ｉｇ配列に著しくハイブリダイズされない（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、トランス遺伝子Ｉｇ発現を約２５〜３５パーセント以上阻害しない）。
【００９７】
抗血清抑制
内因性Ｉｇ鎖発現の一部または完全抑制は、１つもしくは複数の内因性Ｉｇ鎖に対する抗血清をマウスに注入することによって産生することができる（参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８１  ２１１）。抗血清は、１つもしくは複数の内因性（例えば、マウス）Ｉｇ鎖と特異的に反応するが、本発明のＩｇトランス遺伝子によってコードされる異種Ｉｇ鎖との交差反応を最低限でか、または全く有しないように選択される。したがって、Ｗｅｉｓｓらの計画に代表される計画に従う選択された抗血清の投与は、内因性Ｉｇ鎖発現を抑制するが、本発明のトランス遺伝子によってコードされる異種Ｉｇ鎖の発現を許可する。抗体に対する適切な抗体源は、（１）マウスμ、またはγ、またはκ、またはλ鎖に特異的に結合するが、本発明のヒトＩｇトランス遺伝子によってコードされるヒト免疫グロブリン鎖と反応しないモノクローナル抗体等のモノクローナル抗体、（２）そのようなモノクローナル抗体の混合物であって、該混合物は、内因性Ｉｇ鎖の単一種上にある複数のエピトープ、複数の内因性Ｉｇ鎖（例えば、マウスμおよびマウスγ）、または複数のエピトープおよび複数の鎖または内因性免疫グロブリンに結合するような混合物、（３）ポリクローナル抗血清またはそれらの混合物であって、典型的には、そのような抗血清は、内因性Ｉｇ鎖の単一種（例えば、マウスμ、マウスγ、マウスκ、マウスλ）または内因性Ｉｇ鎖の多重種への結合に対して単一特異的であるポリクローナル抗血清またはそれらの混合物であり、最も好ましくは、そのような抗血清は、本発明のトランス遺伝子によってコードされるヒト免疫グロブリン鎖への極わずかな結合を有し、および／または（４）内因性Ｉｇ鎖の単一または多重種に結合し、最も好ましくは、本発明のトランス遺伝子によってコードされるヒト免疫グロブリン鎖への極わずかな結合を有するポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体の混合物、を含む。概して、ポリクローナル抗体が好ましく、そのような実質的に単一特異的なポリクローナル抗体は、非ヒト動物種（例えば、マウス）に由来する抗体による前吸着および／または例えば、固定化ヒトＩｇを含有する親和性樹脂に対する抗血清またはその精製画分の親和性クロマトグラフィによって、ヒト免疫グロブリンに対してもたらされる抗血清から有利に産生することができる（結合分画は、抗血清における所望の抗ヒトＩｇに対して強化され、該結合分画は、典型的には、低ｐＨの条件またはカオトロピック塩溶液で溶出される）。
細胞分離および／または補体結合は、内因性（例えば、マウス）免疫グロブリン鎖を発現するリンパ球の抗体介在性細胞枯渇の強化を提供するために使用することができる。一実施形態では、例えば、抗体は、マウスＩｇ発現移植造血細胞および／または  ヒトＩｇトランス遺伝子を有するトランスジェニックマウスから得られるＢ系リンパ球の体外での枯渇のために使用される。したがって、造血細胞および／またはＢ系リンパ球は、ヒトＩｇトランス遺伝子を有する（好ましくは、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子の両方を有する）トランスジェニック非ヒト動物から移植され、該移植細胞は、（１）内因性免疫グロブリン（例えば、マウスμおよび／またはκ）に結合し、（２）トランス遺伝子によってコードされるヒト免疫グロブリン鎖への実質的な結合を欠く、一つもしくは複数の抗体で培養される。そのような抗体は、明確にするために、「抑制抗体」と称される。移植細胞集団は、抑制抗体に結合する細胞を選択的に枯渇し、そのような枯渇は、（１）非結合細胞から抑制抗体結合細胞を除去する物理的分離（例えば、抑制抗体は、抑制抗体に結合する細胞を固定および除去するように固体支持体または電磁ビードに結合することができる）、（２）抑制抗体によって結合する細胞の抗体依存性細胞の死滅（例えば、ＡＤＣＣ、補体結合、または抑制抗体に結合する毒素によって）、および（３）抑制抗体によって誘導されるクローンアネルギー、等の種々の方法によって行うことができる。
【００９８】
頻繁に、内因性Ｉｇ鎖産生の抗体抑制のために使用される抗体は、相補体を固定することが可能である。そのような抗体が、ウサギまたはモルモット相補体等の体外／体外枯渇に対する好都合な相補体源とよく反応するように選択することができることが、頻繁に好ましい。体内枯渇に対して、サプレッサ抗体が、非ヒトトランスジェニック動物種においてエフェクタ機能を有することが、概して好ましく、したがって、マウスエフェクタ機能（例えば、ＡＤＣＣおよび補体結合）を含む抑制抗体が、概して、トランスジェニックマウスにおける使用に好ましい。
【００９９】
１つの変異において、所定の内因性免疫グロブリン鎖に特異的に結合する抑制抗体は、内因性免疫グロブリンを発現するリンパ球の体外枯渇のために使用される。ヒト免疫グロブリントランス遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物からの細胞外植片（例えば、リンパ球サンプル）は、抑制抗体と接触し、抑制抗体に特異的に結合する細胞は、枯渇し（例えば、固定化、補体結合等によって）、したがって、内因性（非ヒト）免疫グロブリンを発現する細胞（例えば、マウスＩｇを発現するリンパ球）において枯渇する細胞サブ集団を生成する。得られた枯渇リンパ球集団（Ｔ細胞、ヒトＩｇ陽性Ｂ細胞等）は、同一種の、内因性抗体（例えば、ＳＣＩＤマウス、ＲＡＧ−１、またはＲＡＧ−２ノックアウトマウス）を産生することが実質的に不可能な免疫適合性（すなわち、ＭＨＣ適合性）非ヒト動物に転移することができる。次いで、再構成動物（マウス）は、高親和性（親和性成熟した）抗体およびそのような抗体を産生するＢ細胞を得るように、抗原で免疫化する（または外植片が得られたドナー動物に免疫化するために使用された抗原で再度免疫化する）ことができる。そのようなＢ細胞は、従来の細胞融合によってハイブリドーマを生成するために使用され、スクリーニングすることができる。抗体抑制は、他の内因性Ｉｇ不活性化／抑制方法（例えば、ＪＨノックアウト、ＣＨノックアウト、Ｄ領域切断、アンチセンス抑制、代償性フレームシフト不活性化）と組み合わせて使用することができる。
【０１００】
完全内因性Ｉｇ遺伝子座不活性化
ある実施形態では、ヒト可変領域および非ヒト（例えば、マウス）定常領域を含有するハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成されることがないように（例えば、トランス遺伝子と内因性Ｉｇ配列とのトランススイッチによって）、内因性Ｉｇ遺伝子座の完全不活性化を引き起こすことが望ましい。ＪＨ領域のみにおいて機能的に破壊される内因性重鎖対立遺伝子を持つノックアウトマウスは、頻繁にトランススイッチを示し、他のトランス変換された結合は、可能であるが、典型的には、トランス遺伝子によってコードされる再構成ヒト可変領域（ＶＤＪ）は、内因性マウス定常領域に結合する融合タンパク質として発現される。この潜在的課題を克服するためには、以下の方法を含む（ただし、これらに限定されない）任意の種々の方法によって内因性重鎖遺伝子座を完全に不活性化することが、概して望ましい。（１）内因性重鎖定常領域遺伝子のうちの少なくとも１つ、好ましくは、すべての相同組換えによって機能的に破壊および／または削除する、（２）切断またはフレームシフト生成物（トランス変換される場合）を産生するための終止コドン（またはフレームシフト）をコードする内因性重鎖定常領域遺伝子のうちの少なくとも１つ、好ましくは、すべてを変異させる、および当業者に明らかな他の方法および戦略。重鎖定常領域遺伝子および／またはＤ領域遺伝子の相当な部分またはすべての欠損は、特に、「ヒットエンドラン」型等の相同組換え標的化ベクターによる順次的欠損を含む、種々の方法によって行うことができる。同様に、内因性軽鎖定常領域遺伝子を切断するための少なくとも１つの内因性軽鎖遺伝子座（例えば、κ）の機能的破壊および／または欠損がしばしば好ましい。
【０１０１】
好ましい実施形態では、該破壊が、内因性マウス重鎖およびκ軽鎖免疫グロブリン遺伝子の両方のものであるのは、そのような破壊を有するマウスにおいて生成され、発現される抗体は、導入トランス遺伝子に由来する傾向があるからである。κ軽鎖遺伝子座を破壊する好ましい方法は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０に記載され、この内容は、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる。
【０１０２】
重鎖遺伝子座のホモ接合型破壊のための好ましい方法としては、ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載されるｍｕ重鎖遺伝子の破壊（一般的にＭまたはＣＭＤ破壊と称される）および米国特許第５，５４５，８０６号に記載されるＪ重鎖遺伝子破壊（一般的にＪまたはＪＨＤ破壊と称される）が挙げられる。
【０１０３】
頻繁に、フレームシフトトランス遺伝子を使用することが望ましく、異種トランス遺伝子は、Ｊ断片におけるフレームシフト、およびトランス遺伝子定常領域遺伝子のうちの１つもしくは複数（好ましくは、すべて）の初期領域（すなわち、アミノ末端コード部分）における代償性フレームシフト（すなわち、本来のリーディングフレームを再生成するため）を含む。内因性ＩｇＨ遺伝子座定常遺伝子（代償性フレームシフトを含まない）へのトランススイッチは、削除されるか、選択されないトランス変換Ｂ細胞をもたらす切断またはミスセンス生成物を引き起こし、したがって、トランス変換表現型を抑制する。
【０１０４】
アンチセンス抑制および抗体抑制も、内因性Ｉｇ遺伝子産物発現（例えば、マウス重鎖および軽鎖配列）および／またはトランス変換抗体（例えば、ヒト可変／マウス定常キメラ抗体）の実質的に完全な機能不活性化を引き起こすために使用することができる。
不活性化および抑制戦略の種々の組み合わせを、内因性（例えば、マウス）Ｉｇ鎖発現の本質的に完全な抑制を引き起こすために使用することができる。
【０１０５】
異種エンハンサ
ヒト免疫グロブリン（例えば、重鎖）をコードすることが可能な異種トランス遺伝子は、有利には、マウスゲノムに由来せず、および／または異種トランス遺伝子のエクソンとシスに自然に関係しないシス結合エンハンサを含む。例えば、ヒトκトランス遺伝子（例えば、κミニ遺伝子座）は、有利には、ヒトＶκ遺伝子、ヒトＪκ遺伝子、ヒトＣκ遺伝子、および異種エンハンサを含むことができ、典型的には、該異種エンハンサは、ヒト重鎖イントロンエンハンサおよび／または典型的には、Ｊκ遺伝子とＣκ遺伝子との間に位置するか、Ｃκ遺伝子の下流に位置するマウス重鎖イントロンエンハンサを含む。例えば、マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサ（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９）は、プラスミドｐＫＶｅ２の０．９ｋｂのＸｂａＩフラグメント上で単離することができる（以下を参照）。ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサ（Ｈａｙｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ  ３０７：３３４）は、１．４ｋｂのＭｌｕＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして単離することができる（以下を参照）。シスにおいてマウスＪ−μイントロンエンハンサに結合するヒトＪ−μイントロンエンハンサから本質的に成る組み合わされた異種エンハンサ等の転写活性のある異種エンハンサのトランス遺伝子への付加は、特に、前記トランス遺伝子が、ヒトκ等の軽鎖をコードする場合、該トランス遺伝子を高レベルに発現することができる。同様に、ラット３′エンハンサは、ヒト重鎖をコードすることが可能なミニ遺伝子座コンストラクトに有利に含まれることができる。
【０１０６】
特定の好ましい実施形態
本発明の好ましい実施形態は、表１に特定されるコンストラクトのうちの１つもしくは複数の使用を含む。
【０１０７】
【表１Ａ】
0005588866.tif 000002
【表１Ｂ】
0005588866.tif 000003
【０１０８】
上述のコンストラクトのうちの１つもしくは複数を含む、そのような実施形態の特定の例としては、ＨＣｏ２０、ＨＣｏ２７、ＨＣｏ２８、ＨＣｏ３０、ＨＣｏ３１、ＨＣｏ３２、ＨＣｏ３３、およびＨＣｏ３４が挙げられ（ただし、これらに限定されない）、それぞれ、以下に含まれる実施例に詳述される。
【０１０９】
付加的な実施形態は、図２において描かれる生殖細胞ヒトＩｇＨ  ＢＡＣクローンに由来する任意の単一の挿入物と同時注入される、表１に記載されるＶＤＪＣＥ  ＢＡＣまたはＶ１２ＤＪＣＥ挿入物の使用を含む。さらなる実施形態は、ＶＤＪＣＥまたはＶ１２ＤＪＣＥ挿入物のいずれかと同時注入される複数の生殖細胞ヒトＩｇＨ  ＢＡＣ構造挿入物を使用する。代替として、該ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣまたはＶ１２ＤＪＣＥ挿入物は、「ＢＡＣ融合」コンストラクト（表１に特定されるＢＡＣ融合＃１〜５）に由来する任意の単一の挿入物と同時注入することができる。さらに、ＩｇＨ  ＢＡＣコンストラクトの場合と同様に、複数のＢＡＣ融合構造挿入物をＶＤＪＣＥまたはＶ１２ＤＪＣＥ挿入物のいずれか一方と同時注入することができる。さらに、該ＢＡＣ融合コンストラクトは、３′末端でのＶＨＣ相同カセットの包含を伴うか、または伴わずに、単離および注入することができる。さらに、ｙＩｇＨ１０およびｙＩｇＨ２４ａ挿入物のいずれか一方、または両方は、ＶＤＪＣＥまたはＶ１２ＤＪＣＥ挿入物のいずれか一方と同時注入することができる。同様に、ｐＩｇＹＢａｃは、再度、ＢＡＣ融合コンストラクトの３′末端にＶＨＣカセットを伴うか、または伴わずに、図２および表１に記載される生殖細胞ヒトＩｇＨ  ＹＡＣクローン、ヒトＩｇＨ生殖細胞ＢＡＣクローン挿入物、またはＢＡＣ融合構造挿入物の任意の組み合わせと同時注入することができる。
【０１１０】
表１に列記され、図２に含まれる、接頭辞「ＣＴＤ−」で特定されるＢＡＣクローンは、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＨｉｒｏａｋｉ  Ｓｈｉｚｕｙａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで作製され、Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販される「ＣＴＤ」ヒトゲノムＢＡＣライブラリに由来する。ＢＡＣクローンの対象および構成に関する詳細な情報は、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙのウェブサイト、ｉｎｆｏｒｍａ．ｂｉｏ．ｃａｌｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ｉｄｘ＿ｗｗｗ＿ｔｒｅｅ．ｈｔｍｌで見ることができ、この内容は、参照することにより、その全体として本明細書に組み込まれる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、所定の抗原型に対する抗体応答において表されるＶ遺伝子の選択を制限する所定のレパートリを有するマウスを生成することが好ましい場合がある。所定のレパートリを有する重鎖トランス遺伝子は、例えば、ヒトにおける所定の抗原型に対する抗体応答において優先的に使用されるヒトＶＨ遺伝子を含むことができる。代替として、いくつかのＶＨ遺伝子は、種々の理由で（例えば、所定の抗原に対する高親和性Ｖ領域をコードする尤度が低い、体細胞変異および親和性鮮鋭化を受ける傾向が低い、または、あるヒトに対して免疫原性を有する）、明確なレパートリから除外される場合がある。
【０１１２】
したがって、種々の重鎖または軽鎖遺伝子断片を含むトランス遺伝子の再構成の前に、そのような遺伝子断片は、例えば、ハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ塩基配列決定法によって、トランスジェニック動物以外の生物体の種からとして容易に特定することができる。
【０１１３】
本発明のトランスジェニックマウスは、膜貫通タンパク質、または細胞表面高分子、またはヒト抗体が望ましい他の適切な抗原（例えば、ＴＮＦ、ＬＰＳ等）等の所定の抗原で免疫化することができる。当該マウスは、トランス遺伝子内スイッチ組み換え（シススイッチ）を介してクラススイッチを実施し、所定の抗原に反応する免疫グロブリンを発現するＢ細胞を産出する。該免疫グロブリンは、ヒト配列抗体であり得、重鎖および軽鎖ポリペプチドは、体細胞変異およびＶ領域組み換え結合に由来する配列、および生殖細胞コード配列を含むことができる、ヒトトランス遺伝子配列によってコードされ、他の非生殖細胞配列が、体細胞変異および差別的Ｖ−ＪおよびＶ−Ｄ−Ｊ組み換え結合の結果として存在し得るが、これらのヒト配列免疫グロブリンは、ヒトＶＬまたはＶＨ遺伝子断片およびヒトＪＬまたはＪＬ断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であると称することができる。そのようなヒト配列抗体に対して、各鎖の可変領域は、ヒト生殖細胞Ｖ、Ｊ、および重鎖の場合はＤ遺伝子断片によって典型的には、少なくとも８０パーセントコードされ、頻繁に、可変領域の少なくとも８５パーセントは、トランス遺伝子上に存在するヒト生殖細胞配列によってコードされ、しばしば、可変領域配列の９０または９５パーセント以上は、トランス遺伝子上に存在するヒト生殖細胞配列によってコードされる。しかしながら、いくつかの非生殖細胞配列は、体細胞変異ならびにＶＪおよびＶＤＪ結合によって導入され、ヒト配列抗体は、マウスの生殖細胞におけるヒトトランス遺伝子で見られるヒトＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子断片によってコードされないいくつかの可変領域配列を頻繁に有する（定常領域配列はそれほど頻繁ではない）。典型的には、そのような非生殖細胞配列（または個々のヌクレオチド位置）は、ＣＤＲＳ内または付近で、もしくは体細胞変異が群がることが周知の領域において群がる。
【０１１４】
そのようなマウスからのＢ細胞が、ＣＤ４等のヒトタンパク質を含む、種々の抗原に対するモノクローナル高親和性（２×１０９Ｍ−１以上）ヒト配列抗体を発現するハイブリドーマを生成するために使用することができる。これらのハイブリドーマは、所定のヒト抗原に結合するための少なくとも２×１０９Ｍ−１の親和性定常（Ｋａ）を有する免疫グロブリンを含む組成物を生成するために使用することができ、該免疫グロブリンは、（１）ヒトＶＬ遺伝子断片およびヒトＪＬ断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と、（２）ヒトＣＬ遺伝子断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する軽鎖定常領域と、から成るヒト配列軽鎖と、（１）ヒトＶＨ遺伝子断片、随意に、Ｄ領域、およびヒトＪＨ断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、（２）ヒトＣＨ遺伝子断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する定常領域と、から成るヒト配列重鎖と、から成る。
【０１１５】
しばしば、ヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖は、マウス細胞ゲノムに組み込まれる、ヒト重鎖トランス遺伝子およびヒト軽鎖トランス遺伝子によってそれぞれ別々にコードされる。しかしながら、両鎖は、単一のトランス遺伝子上でコードされ得、一方または両方の鎖は、複数のトランス遺伝子上でコードされ得る。
【０１１６】
一実施形態では、本発明は、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合性対と、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合性対と、異種免疫グロブリン軽鎖トランス遺伝子の少なくとも１つのコピーと、および異種免疫グロブリン重鎖トランス遺伝子の少なくとも１つのコピーと、を含むトランスジェニックマウスを提供し、該動物は、ヒト抗原での免疫化後に抗体応答し、該抗体応答は、所定のヒト抗原に結合するための少なくとも２×１０９Ｍ−１の親和性定常（Ｋａ）を有する免疫グロブリンを含み、該免疫グロブリンは、（１）ヒトＶＬ遺伝子断片およびヒトＪＬ断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域と、（２）ヒトＣＬ遺伝子断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する軽鎖定常領域と、から成るヒト配列軽鎖と、（１）ヒトＶＨ遺伝子断片、随意に、Ｄ領域、およびヒトＪＨ断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、（２）ヒトＣＨ遺伝子断片によってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるポリペプチド配列を有する定常領域と、から成るヒト配列重鎖と、から成る。
【０１１７】
好ましい実施形態では、本発明のトランス遺伝子は、ＨＣｏ７／ラムダマウスに導入される。そのようなＨＣｏ７／ラムダマウスでは、内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０に記載されるように、ホモ接合性に破壊されているだけではなく、内因性マウス重鎖遺伝子は、ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載されるようにもホモ接合性に破壊されている。さらに、そのようなマウスは、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５−８５１に記載されるヒトカッパ軽鎖トランス遺伝子であるＫＣｏ５、および米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、および同第５，５４５，８０７号に記載されるヒト重鎖トランス遺伝子であるＨＣｏ７を有する。当該マウスは、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０００／２６３７３号に記載される、ヒトＩｇラムダ遺伝子座のほとんどを含有する酵母人工染色体から成るヒトラムダ軽鎖トランス遺伝子も有する。選択的繁殖により、重鎖および軽鎖の両方のホモ接合性遺伝子破壊を有し、ヒト重鎖トランス遺伝子を含有し、軽鎖トランス遺伝子に関しては、κおよびλ軽鎖トランス遺伝子の両方、κ軽鎖トランス遺伝子のみ、またはλ軽鎖トランス遺伝子のみのいずれかを含有するマウスを再生することができる。すべて３つの遺伝子型は、免疫化およびヒト抗体の再生のために使用することができる。
【０１１８】
内因性重鎖および／または軽鎖遺伝子座破壊を有するマウスを使用することに加え、所定の抗原に対する高親和性ヒト配列抗体の開発は、組み込まれたヒト免疫グロブリントランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスにおいてヒト可変領域遺伝子断片のレパートリを拡大するための方法によって容易になる。これを行うための好ましい一方法は、既に組み込まれたヒト免疫グロブリントランス遺伝子に存在しないＶ領域遺伝子断片を含むＶ遺伝子トランス遺伝子を該ゲノムに導入するステップを含む。しばしば、該Ｖ領域トランス遺伝子は、ヒトゲノムにおいて自然発生することができるように、または組み換え方法によって別々に合わせて接合することができるように、異なる順序のまたは省略されたＶ遺伝子断片を含む場合がある、ヒトＶＨまたはＶＬ（Ｖκ）遺伝子断片アレイの一部を含む。しばしば、少なくとも５、１０、２０以上の機能的Ｖ遺伝子断片が、この方法によって導入される。そのようなトランス遺伝子の例としては、上述のｐＨＣ２、ｐＧＰ６９−７ＶＨＣ、ｐＶｘ６、ＶＤＪＣＥ、Ｖ１２ＤＪＣＥ、ＣＴＤ−３０５４Ｍ１７、ＢＡＣ融合＃１、ＢＡＣ融合＃２、ＢＡＣ融合＃３、ＢＡＣ融合＃４、ＢＡＣ融合＃５、ｙＩｇＨ２４ａ、ｙＩｇＨ１０、およびｐＩｇＹＢａｃの挿入物が挙げられる。そのような変異では、Ｖレパートリ拡大方法によって産生されるトランスジェニックマウスを作製することが可能であり、該マウスは、Ｖ領域トランス遺伝子上に存在するＶ領域遺伝子断片によってコードされる可変領域配列、およびヒトＩｇトランス遺伝子上でコードされるＣ領域を含む免疫グロブリン鎖を発現する。Ｖレパートリ拡大方法によって、少なくとも５つの区別できるＶ遺伝子を有するトランスジェニックマウスを、少なくとも約２４以上のＶ遺伝子を含有するマウスで可能なように、生成することができる。当然ながら、いくつかのＶ遺伝子断片は、非機能的であり得（例えば、偽遺伝子等）、これらの断片は、保持することができるか、または所望に応じて、当業者に対して利用可能な組み換え方法によって選択的に削除することができる。
【０１１９】
マウス生殖細胞が、拡大Ｖ断片レパートリを含有するように一旦操作されると、特質が伝播され得、拡大Ｖ断片レパートリが、異なるヒトＩｇトランス遺伝子を有するマウス生殖細胞に繁殖する背景を含む、他の遺伝的背景に繁殖する。複数の拡大Ｖ断片レパートリは、ヒトＩｇトランス遺伝子（または複数のヒトＩｇトランス遺伝子）とともに作用するように生殖細胞に繁殖させることができる。
【０１２０】
本発明は、ヒトＩｇトランス遺伝子、随意に、拡大Ｖ断片レパートリも有するトランスジェニックマウスを繁殖させるステップを含む、ヒト配列免疫グロブリン発現の特質を伝播する方法も提供する。ＶＨおよびＶＬ遺伝子断片の両方は、拡大Ｖ断片レパートリに存在し得る。該トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇトランス遺伝子、および／または他のヒトリンパ球タンパク質をコードするトランス遺伝子を含む、他のヒトトランス遺伝子を有する背景を含む、実行者にとって所望の任意の背景で繁殖することができる。さらに、トランスジェニックマウスは、機能が抗体応答またはリンパ球機能を変化させるように作用することができる他の非免疫グロブリン遺伝子の遺伝子破壊を有するマウスとの交配によって繁殖させることができる。
【０１２１】
好ましい実施形態では、そのような繁殖は、実施例１２に詳述されるＢａｌｂ／ｃ株への繁殖を含む。
【０１２２】
医薬組成物
別の形態では、本発明は、薬学的に許容される担体と合わせて製剤化される、本発明の１つのモノクローナル抗体、またはそれらの組み合わせ、またはそれらの抗原結合部分を含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【０１２３】
本発明の医薬組成物は、併用療法、すなわち、他の薬剤と併用して投与することもできる。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症性または免疫抑制剤と組み合わせた本発明の抗体を含むことができる。併用療法において使用することができる治療薬の実施例は、本発明の抗体の使用に関するセクションにおいて、以下により詳述される。
【０１２４】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」としては、生理学的に適合性の任意およびすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤等が挙げられる。好ましくは、当該担体は、静脈、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射によってか、または注入において）に適切である。投与経路に応じて、共役抗体およびパートナー分子は、酸の作用、および化合物を不活性化することができる他の自然条件から化合物を保護するような材料で被覆することができる。
本発明の医薬化合物は、１つもしくは複数の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し、いかなる望ましくない毒性効果をも与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の非毒性無機酸に由来するもの、および脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族、および芳香族スルホン酸等の非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属に由来するもの、およびＮ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
【０１２５】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される抗酸化物質も含むことができる。薬学的に許容される抗酸化物質の例としては、（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化物質、（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロール等の油溶性抗酸化物質、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が挙げられる。
【０１２６】
本発明の医薬組成物において使用することができる適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチン等の被覆材料の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。
【０１２７】
これらの組成物は、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤等のアジュバントも含有することができる。微生物の存在の防止は、上記の滅菌処理、および例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等の種々の抗細菌および抗真菌薬の包含の両方によって確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含むことも望ましい場合がある。さらに、注射用医薬品形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤の包含によってもたらされ得る。
【０１２８】
薬学的に許容される担体としては、滅菌溶液または分散液、および注射用滅菌溶液または分散液の即時調整のための滅菌粉末が挙げられる。薬学的に活性を有する物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合ではない限り、本発明の医薬組成物におけるそれらの使用が意図される。補助的に活性を有する化合物も、組成物に組み込むことができる。
【０１２９】
医薬組成物は、典型的には、製造および保存条件下では無菌および安定していなければならない。該組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に適切な他の秩序構造物として製剤化することができる。該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、ならびにそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等の被覆剤の使用により、分散液の場合には必要な粒径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含むことによってもたらすことができる。
【０１３０】
注射用滅菌溶液は、上記で列挙される１つの成分またはそれらの組み合わせを有する適切な溶媒に、必要量の活性化合物を組み込み、必要に応じて、その後、滅菌精密ろ過を行うことによって調製することができる。概して、分散液は、塩基性分散媒体および上記で列挙されるものからの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに該活性化合物を組み込むことによって調製される。注射用滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分の粉末、さらにその既に滅菌されたろ過溶液からの任意の付加的な所望の成分を産出する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１３１】
単回の剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象者、および投与の特定の方法によって異なる。単回の剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、概して、治療効果をもたらす組成物のその量である。概して、１００パーセント中、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、活性成分の約０．０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは、約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、活性成分の約１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０１３２】
投薬計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスを投与することができるか、いくつかの分割量を経時的に投与することができるか、または用量を治療状況の緊急事態によって指示されるように比例的に増減することができる。投与の容易性および用量の均一性のために、用量単位形態で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態は、治療される対象者に対する一体型用量として適切な物理的に不連続な単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された活性化合物の所定の量を含有する。本発明の用量単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成される特定の治療効果、および（ｂ）個人における感受性の治療に対するそのような活性化合物を化合する技術に固有の制限によって左右され、直接依存する。
【０１３３】
抗体の投与に対して、用量は、対象者の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常は、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、用量は、体重１ｋｇあたり０．３ｍｇ、または体重１ｋｇあたり１ｍｇ、または体重１ｋｇあたり３ｍｇ、体重１ｋｇあたり５ｍｇ、または体重１ｋｇあたり１０ｍｇ、もしくは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な治療計画は、週に１回、２週ごとに１回、３週ごとに１回、４週ごとに１回、１ヶ月に１回、３ヶ月ごとに１回、または３〜６ヶ月ごとに１回の投与を必要とする。本発明の抗体に対する好ましい投薬計画としては、以下の服薬スケジュールのうちの１つを使用して与えられる抗体の静脈投与による体重１ｋｇあたり１ｍｇまたは体重１ｋｇあたり３ｍｇが挙げらる：（ｉ）４週ごと６回の投与、次いで、３ヶ月ごと、（ｉｉ）３週ごと、（ｉｉｉ）体重１ｋｇあたり３ｍｇを１回、その後、体重１ｋｇあたり１ｍｇを３週ごと。
【０１３４】
いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２つ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、その場合、投与する各抗体の用量は、示された範囲に該当する。抗体は、通常、複数回で投与する。１回の投薬の間の間隔は、例えば、週ごと、月ごと、３ヶ月ごと、または年ごとであり得る。間隔は、患者における標的抗原に対する抗体の血液濃度を測定することによって示されるように不定期でもあり得る。いくつかの方法では、用量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌの血漿抗体濃度を達成するように調整され、いくつかの方法では、約２５〜３００μｇ／ｍｌである。
【０１３５】
代替として、抗体は、徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に応じて異なる。一般に、ヒト抗体は、最も長い半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体と続く。投与の用量および頻度は、治療が予防的であるか、または治療的であるかに応じて異なり得る。予防的用途においては、比較的に低い用量を、長期間にわたって比較的頻繁ではない間隔で投与する。患者の中には、残りの生涯にわたって治療を受け続ける患者もいる。治療用途においては、疾患の進行が低下するか、または停止するまで、好ましくは、患者が、疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔での比較的に高い用量が、時折必要とされる。その後、該患者に予防養生法を与えることができる。
【０１３６】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の用量レベルは、患者に対する毒性を伴わずに、特定の患者、組成物、および投与の方法に対する所望の治療応答に到達するために有効な活性成分の量を得るように異なり得る。選択された用量レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、もしくはそのエステル、塩、またはアミド、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄率、治療の期間、他の薬物、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、体重、病状、健康状態、および既往歴、ならびに医術で周知の同様の要因を含む、種々の薬物動態学的要因による。
【０１３７】
本発明の抗体の「治療有効用量」は、好ましくは、病徴の重症度の低下、病徴のない期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による障害または廃疾の予防をもたらす。例えば、腫瘍の治療に対して、「治療有効用量」は、好ましくは、未治療の対象者に対して、細胞増殖つまり腫瘍増殖を少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％阻害する。化合物の腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデルシステムにおいて評価することができる。代替として、組成物のこの特性は、化合物の細胞増殖を阻害する能力を検査することによって評価することができ、そのような阻害は、当業者周知の検定によって体外で測定することができる。治療化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを減少させことができ、そうでなければ、対象者の症状を改善することができる。当業者は、対象者のサイズ、対象者の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路等のそのような要因に基づいて、そのような量を決定することができる。
【０１３８】
本発明の組成物は、当技術分野で周知の種々の方法のうちの１つもしくは複数を使用して１つもしくは複数の投与経路を介して投与することができる。当業者によって認識されるように、投与の経路および／または方法は、所望の結果によって異なる。本発明の抗体に対する好ましい投与経路としては、例えば、注射によるか、または点滴における、静脈投与、筋肉内投与、皮内投与、腹腔内投与、皮下投与、脊髄投与、または他の非経口の投与経路が挙げられる。本明細書で使用される「非経口投与」という語句は、通常、注入による、腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、静脈、筋肉内、動脈内、鞘内、関節包内、眼窩内、心腔内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内注入および点滴を含むが、これらに制限されない。
【０１３９】
代替として、本発明の抗体は、局所、表皮、または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口で、経膣的、直腸内、舌下、または局所での非経口ではない経路を介して投与することができる。
【０１４０】
該活性化合物は、移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達システムを含む、放出制御製剤等の、急速な放出から該化合物を保護する担体で調製することができる。エチレン酢酸ビニール、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は、特許権を有するか、または概して当業者に周知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１４１】
医薬組成物は、当技術分野で周知の医療デバイスで投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイス等の無針皮下注射デバイスで投与することができる。本発明において有用な周知の移植片およびモジュールの例としては、制御された速度で薬を分注するための植え込み型微小点滴ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号、正確な点滴速度で薬物を送達するための薬物点滴ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、継続的薬物送達のための植え込み型変流量点滴装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、複数のチャンバ区画を有する浸透性薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透性薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は、参照することによって本明細書に組み込まれる。多くの他のそのような移植片、送達システム、およびモジュールは、当業者に周知である。
【０１４２】
ある実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、体内での適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を除外する。本発明の治療化合物がＢＢＢ（所望に応じて）を確実に通過させるために、それらは、例えば、リポソーム中に製剤化することができる。リポソームを製造する方法に関しては、例えば、米国特許第ＵＳ４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号、および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。該リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に運搬され、したがって、標的薬物送達を強化する１つもしくは複数の部分を含むことができる（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。例示的な標的部分としては、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第ＵＳ５，４１６，０１６号を参照）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）、サーファクタントタンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）、ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられ、また、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ、Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３、ＪＪ．Ｋｉｌｌｉｏｎ、ＩＪ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３を参照されたい。
【０１４３】
本発明のヒト配列モノクローナル抗体は、それらが対象とする所定の抗原に特異的に結合するため、一部分において有用である。所定の抗原がヒト抗原（すなわち、ヒトタンパク質またはそのフラグメント）である場合、本発明のヒト免疫グロブリンも非ヒト動物、特に、薬物検査（例えば、生物活性、薬物動態および安全性の前臨床試験）のために頻繁に使用される動物において見られる同族抗原に結合するのであれば、それは時折有利である。これらの動物としては、マウス、ウサギ、ラット、イヌ、ブタ、および特に、チンパンジー、類人猿、およびサル（例えば、赤毛猿およびカニクイザル）等の非ヒト霊長類が挙げられる。実験動物において抗原を認識する能力は、免疫グロブリンの生体内分布に対する特異的結合の効果を判定するために特に有用である。同族抗原は、（ｉ）ヒト抗原と実質的に同様の構造（例えば、アミノ酸配列）を有し（すなわち、動物同属タンパク質のアミノ酸配列は、典型的には、ヒトタンパク質と少なくとも約５０％同一、通常、少なくとも約７０％同一、しばしば、少なくとも約８０％以上同一である）、（ｉｉ）ヒト抗原と実質的に同一の機能を有し、（ｉｉｉ）ヒト抗原と同一の細胞内コンパートメントにおいてしばしば見られる。ヒトおよび動物同族抗原は、典型的には（必ずではないが）、同一の名称を有する。同族抗原の例としては、ヒトチューブリンおよびマウスチューブリン、ヒトＣＤ４および赤毛猿ＣＤ４、ならびにヒトＩｇＧおよびラットＩｇＧが挙げられる。
【０１４４】
抗体の選択および操作
本発明は、ヒト定常領域配列へのポリペプチド結合におけるヒトＶＤＪ配列から本質的に成るヒト免疫グロブリン鎖を含むモノクローナル抗体を分泌する候補ハイブリドーマを特定するための方法を提供する。そのような候補ハイブリドーマは、（１）ヒトＶＤＪ領域およびヒト定常領域から本質的に成る免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローンと、（２）ヒトＶＤＪ領域およびマウス定常領域から本質的に成る異種ハイブリッド免疫グロブリン鎖を発現するトランス変換ハイブリドーマと、を含むハイブリドーマクローンのプールから特定される。個々またはプールされたハイブリドーマクローンの上清は、所定の抗原結合特異性を有する抗体を選択するための結合条件下で、所定の抗原、典型的には、固体基材（例えば、マイクロタイターウェル）への吸着によって固定化される抗原と接触する。ヒト定常領域に特異的に結合する抗体は、抗体が、選択的に少なくとも１つのヒト定常領域エピトープに結合するが、マウス定常領域エピトープに実質的に結合しないように、結合条件下でハイブリドーマ上清および所定の抗原とも接触し、したがって、所定の抗原、およびヒト定常領域に特異的に結合する抗体（検出可能な標識またはレポータで標識化することができる）に結合するハイブリドーマ上清（トランスジェニックモノクローナル抗体）から本質的に成る複合体を形成する。そのような複合体の形成の検出は、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローンまたはプールを示す。
【０１４５】
本発明の好ましい実施形態では、スクリーニングにおいて使用される抗ヒト定常領域免疫グロブリンは、具体的には、非μ、非δイソタイプ、好ましくは、αまたはε、より好ましくは、γイソタイプ定常領域を認識する。γイソタイプのモノクローナル抗体は、（ｉ）ＩｇＧ免疫グロブリンの特徴がいくつかの治療用途のためにＩｇＭ免疫グロブリンより好ましく（例えば、ＩｇＭ五量体と比べてＩｇＧのサイズが小さいため）、（ｉｉ）体細胞変異のプロセスがμ定常領域から非μ（例えば、γ）定常領域へのクラススイッチと相関するため、好ましい。クラススイッチを受けた免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）の集団より選択される免疫グロブリンは、クラススイッチを受けていない集団（例えば、ＩｇＭ）より選択される免疫グロブリンより高い親和性を有する抗原に結合する傾向がある。例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。
【０１４６】
一実施形態では、候補ハイブリドーマは、まず、γイソタイプ定常領域に対してスクリーニングされ、次いで、ＩｇＧ発現ハイブリドーマのプールが所定の抗原への特異的結合に対してスクリーニングされる。
【０１４７】
したがって、該方法に従って、本発明のトランスジェニックマウスは、免疫応答を誘導するように所定の抗原で免疫化される。Ｂ細胞は、該マウスから採取され、ハイブリドーマを産生するために不死細胞と融合される。該ハイブリドーマは、まず、非μ、非δイソタイプのＩｇ（例えば、ＩｇＧ）を分泌する個々のハイブリドーマを特定するためにスクリーニングされる。次いで、このセットの該ハイブリドーマが、対象の所定の抗原への特異的結合に対してスクリーニングされる。スクリーニングは、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）に記載される標準的技術を使用して行われる。この方法を使用して、実用的に、かつ効率的に高親和性免疫グロブリン（例えば、約１０７Ｍ−１以上のＫａ）を特定することが可能である。
【０１４８】
他の態様においては、本発明は、人工遺伝子によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを含む抗原結合ヒトモノクローナル抗体を提供する。人工遺伝子は、細胞由来鋳型核酸鎖（例えば、細菌性細胞または免疫細胞またはハイブリドーマ細胞に由来する核酸鋳型）および人工遺伝子の子孫（複製による）、すなわち全合成核酸、を必要としない化学的または酵素的方法によって体外で合成されるポリペプチドコード核酸断片を含む。
【０１４９】
プライマー、リンカー等として短合成核酸を使用することは、遺伝子工学において日常的であるが、長さが３０、５０、またはそれ以上の塩基である全合成タンパク質コードを産生することも、化学的および／または酵素的手段によって可能である。本発明の人工遺伝子は、合成核酸領域および細胞由来核酸領域の両方を含むことができる。該人工遺伝子の合成核酸領域は、概して、少なくとも約５０塩基の長さ、しばしば、少なくとも約１００塩基、典型的には、少なくとも約２００塩基、より頻繁に、少なくとも約２５０塩基、通常３００塩基または４００塩基以上の長さである。典型的には、該合成核酸領域は、可変遺伝子断片またはその一部、例えば、ＣＤＲ領域をコードし、定常領域は、細胞由来核酸によってコードされる。免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖）は、ポリペプチドをコードする人工遺伝子を使用して便宜的に発現することができる。通常、該人工遺伝子は、転写プロモータ配列、例えば、免疫グロブリン遺伝子またはウイルス（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＨＩＶ、ＲＳＶ）に由来するプロモータ配列、もしくはハイブリッドプロモータに機能的に連結される。該人工遺伝子は、他の配列、例えば、ポリアデニル化配列およびイントロンにも連結することができる。免疫グロブリンポリペプチドを発現するための一方法は、免疫グロブリンポリペプチド（例えば、可変領域またはその一部）の１つの領域をコードする合成核酸の、免疫グロブリン鎖の残存断片または部分（例えば、μ、γ、γ２、γ３、γ４、δ、ε、α．ｓｕｂ．１またはα．ｓｕｂ．２定常領域）をコードするベクター、および随意に、プロモータ（例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモータ）、ポリアデニル化または他の配列への挿入に関与する。そのようなベクターは、細胞への導入の際にベクター配列の細胞転写および翻訳が、免疫グロブリンポリペプチドをもたらすように、構成される。
【０１５０】
機能的ヒト配列免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子およびポリペプチドは、人工遺伝子を使用して構成することができ、所定の抗原への特異的結合等の所望の特異性を有する免疫グロブリンを産生するために使用することができる。これは、所定の抗原で免疫化されるトランスジェニック動物に由来する細胞またはハイブリドーマによって発現されるポリペプチドと実質的に同様な免疫グロブリンポリペプチドをコードする人工遺伝子を構成することによって行われる。したがって、本発明は、免疫グロブリンポリペプチドをコードする人工遺伝子、および一つまたは複数の人工遺伝子を使用してヒト配列免疫グロブリンを産生するための方法を提供する。
【０１５１】
この方法に従って、トランスジェニック動物（例えば、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合性対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合性対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランス遺伝子の少なくとも１つのコピー、およびヒト免疫グロブリン重鎖トランス遺伝子の少なくとも１つのコピーを有するトランスジェニックマウス）を所定の抗原、例えば、ヒトタンパク質で免疫化する。次いで、核酸、好ましくは、ｍＲＮＡを免疫グロブリン遺伝子の再構成が行われた細胞または細胞の集団から採取または単離し、免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖（特に、Ｖ断片）をコードする核酸の配列、またはその一部を決定する。この配列情報が、人工遺伝子の配列に対する基盤として使用される。
【０１５２】
配列決定は、概して、対象の遺伝子またはｃＤＮＡの少なくとも一部、例えば、再構成ヒトトランス遺伝子または免疫グロブリンポリペプチドをコードする対応するｃＤＮＡの一部の単離を必要とする。通常、これは、ヒト免疫グロブリンポリペプチドをコードするＤＮＡまたは好ましくは、ｍＲＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）のクローニングを必要とする。クローニングは、標準的技術を使用して行われる（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照）。例えば、ｃＤＮＡライブラリは、ポリＡ＋ｍＲＮＡ、好ましくは、膜結合性ｍＲＮＡの逆転写によって構成することができ、該ｃＤＮＡライブラリに、ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを使用してスクリーニングを実施できる。しかしながら、好ましい実施形態においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、対象の免疫グロブリン遺伝子断片例えば、軽鎖可変断片）をコードするｃＤＮＡ（または完全長ｃＤＮＡの部分）を増幅するために使用される。該ヒト免疫グロブリンポリペプチド遺伝子の配列は、当業者とって容易に利用可能であるため、ヒト免疫グロブリン遺伝子またはその断片に特異的にハイブリダイズするか、または増幅させるプローブまたはＰＣＲプライマーを容易に設計することができる。例えば、参照することによって組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０：６２８７（１９９２）を参照されたい。さらに、トランスジェニックマウスのヒトトランス遺伝子の配列は、しばしば、実行者にとって周知であり、該トランス遺伝子の適切な領域にハイブリダイズするプライマー配列を選択することができる。該増幅配列は、任意の適切なベクター、例えば、発現ベクター、またはミニ遺伝子ベクター、またはファージ提示ベクターに容易にクローン化することができる。対象の免疫グロブリンポリペプチドのいくつかの部分の配列を決定することができる限り、使用されるクローニングの特定の方法は重要ではないことを理解されるであろう。本明細書で使用されるように、対象の核酸の配列を決定することができるように、クローン化され、増幅され、標識が付いたか、またはそうでなければ背景核酸から区別される核酸は、単離していると考えられる。クローン化および配列するために使用される一ＲＮＡ源は、トランスジェニックマウスからＢ細胞を得、該Ｂ細胞を不死細胞と融合させることによって産生されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用することの利点は、それらを容易にスクリーニングすることができ、対象のヒトモノクローナル抗体を産出するハイブリドーマを容易に選択することができることである。代替として、ＲＮＡは、免疫化動物のＢ細胞（または全脾臓）から単離することができる。ハイブリドーマ以外の供給源が使用される場合、特異的結合特徴を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチドをコードする配列に対してスクリーニングすることが好ましい場合がある。そのような��クリーニングのための一方法は、ファージ提示技術である。ファージ提示法は、例えば、それぞれの内容は、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ  Ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＵＳＡ（２００４）、Ｄｏｗｅｒら、国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、同第ＷＯ９２／０１０４７号、およびＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載される。ファージ提示法を使用する一実施形態では、免疫化トランスジェニックマウスからのｃＤＮＡ（例えば、全脾臓ｃＤＮＡ）が単離され、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して免疫グロブリンポリペプチドの一部、例えば、ＣＤＲ領域をコードするｃＤＮＡ配列が増幅され、該増幅配列がファージベクターに挿入される。対象のペプチド、例えば、所望の結合特徴を有する可変領域ペプチドをコードするｃＤＮＡは、パニング等の標準的技術によって特定される。
【０１５３】
次いで、増幅またはクローン化核酸の配列が決定される。典型的には、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の全体をコードする配列が決定されるが、しかしながら、時折、可変領域の一部、例えば、ＣＤＲコード部分のみを配列決定することが適度である。典型的には、該配列決定される部分は、少なくとも３０塩基の長さであり、より頻繁に、可変領域の長さの少なくとも約３分の１または少なくとも約半分に対するベースコードが配列決定される。
【０１５４】
配列決定は、ｃＤＮＡライブラリから単離されるクローンに対して、或いはＰＣＲが使用される場合、増幅配列をサブクローン化した後または増幅断片の直接ＰＣＲ配決定によって、行うことができる。配列決定は、標準的技術を使用して行われる（例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｏｌｓ１−３，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、およびＳａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−５４６７を参照）。該クローン化核酸の配列をヒト免疫グロブリン遺伝子およびｃＤＮＡの公表された配列と比較することによって、当業者は、配列決定された領域に応じて、（ｉ）ハイブリドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のイソタイプを含む）の生殖細胞断片使用、および（ｉｉ）Ｎ−領域付加および体細胞変異のプロセスから生じる配列を含む、重鎖および軽鎖可変領域の配列、を容易に決定することができる。免疫グロブリン一遺伝子配列情報源は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄである。
【０１５５】
代替の実施形態では、対象の免疫グロブリンのアミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定によって決定することができる。
【０１５６】
免疫グロブリン発現遺伝子（すなわち、再構成トランス遺伝子）の少なくとも一部と同一であるか、または実質的に同様の配列を有する人工遺伝子を構成することができる。同様に、該人工遺伝子は、該再構成トランス遺伝子の配列決定された部分によってコードされるポリペプチドと同一であるか、または本質的な類似性を有するポリペプチドをコードすることができる。遺伝コードの縮退は、同一のポリペプチドが、複数の核酸配列によってコードされるようにする。時折、例えば、制限部位を導入するように、または特定の発現系を反映するためのコドン使用を変化さえるように、またはグリコシル化部位を除去するように、核酸配列を変化させることが好ましい。さらに、ハイブリドーマ配列における変化は、免疫グロブリンの特徴（例えば、結合特徴）を変化させるように導入することができる。例えば、変化は、所定の抗原のための免疫グロブリンの親和性を増加させるように、特に、重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲ領域に導入することができる。
【０１５７】
合成核酸を構成するための方法は、周知である。完全な化学合成は可能であるが、一般に、化学合成オリゴヌクレオチドを連結反応および／またはポリメラーゼ連鎖反応において使用して、より長いポリヌクレオチドを作製する化学酵素混合合成が行われる。好ましい実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応は、増幅の結果が、人工遺伝子に対して所望の配列を有するＤＮＡであるように選択される重複プライマーを使用して行われる。本発明のオリゴヌクレオチドは、固体相または溶液において合成することができる。概して、固体相合成は、好ましい。ホスファイトトリエステル、リン酸トリエステル、およびＨ−ホスホン酸化学によるオリゴヌクレオチドの固体相合成のための手順の詳細な説明は、幅広く利用可能である。例えば、参照することによって本明細書に組み込まれる、Ｉｔａｋｕｒａ，米国特許第４，４０１，７９６号、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、米国特許第４，４５８，０６６号および同第４，５００，７０７号、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−１８６２、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１０３：３１８５−３１９１（１９８１）、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４：１−１７（１９８２）、Ｇａｉｔ，ｅｄ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８４）におけるＪｏｎｅｓ，ｃｈａｐｔｅｒ  ２、Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｃｈａｐｔｅｒ  ３、およびＳｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｃｈａｐｔｅｒ  ４、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２７：４６９−４７２（１９８６）、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：５３９９−５４０７（１９８６）、Ｓｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，２４：５８４３−５８４６（１９８３）、ならびにＳｉｎｈａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：４５３９−４５５７（１９８４）を参照されたい。
【０１５８】
当該人工遺伝子は、細胞に導入され、免疫グロブリンポリペプチドを産出するように発現され得る。発現のための細胞型の選択は、多くの要因（例えば、望ましいタンパク質のレベル）に依存するが、ヒト免疫グロブリンを分泌することが可能な細胞が好ましい。特に好ましい細胞としては、ＣＨＯ細胞およびＳＰ２０およびＮＳＯ細胞株等の骨髄腫由来細胞が挙げられる。本発明の組み換え抗体を発現するための好ましい哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されるＤＨＦＲ選択可能マーカと併用された、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞との併用に対して、別の好ましい発現系は、国際公開第ＷＯ８７／０４４６２号（Ｗｉｌｓｏｎ）、同第ＷＯ８９／０１０３６号（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）、および欧州特許第ＥＰ３３８，８４１号（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、該抗体は、宿主細胞における該抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞が増殖する培養媒体への該抗体の分泌を可能にするために十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。数抗体が、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養媒体から再生することができる。核酸、例えば、人工遺伝子の導入のための方法は、周知であり、トランスフェクション（例えば、電気穿孔法またはリポソーム媒介による）および形質転換が挙げられる。導入Ｄ遺伝子の発現のための系統は、概して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載される。
【０１５９】
別の実施形態では、該抗体は、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ／２００７／０５９７８２号に記載されるＵｎｉＢｏｄｙとして産生される。
【０１６０】
免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ分子）が体内で産生されるように、同一の細胞において２つの免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、重鎖および軽鎖）を発現することが、しばしば好ましい。したがって、２つの人工遺伝子（すなわち、重鎖をコードする人工遺伝子、軽鎖をコードする人工遺伝子）を細胞に導入することが、時折好ましい（２つの人工遺伝子は、単一のベクターで導入することができる）。代替として、１つの免疫グロブリンポリペプチドをコードする１つの人工遺伝子は、他の免疫グロブリンポリペプチドを発現するように遺伝子操作された細胞に導入することができる。
【０１６１】
人工遺伝子が導入される細胞が繁殖するので、人工遺伝子の全合成核酸部分が複製および転写のための鋳型として作用することは明らかである。それでもなお、子孫遺伝子は、合成核酸（すなわち、細胞由来鋳型核酸鎖を必要としない化学的または酵素的方法によって体外で合成されるポリペプチドコード核酸分子）に由来し、本明細書で使用されるように、人工遺伝子とも見なされる。したがって、人工遺伝子の合成部分とハイブリドーマの発現トランス遺伝子との関係は、情報リンク（すなわち、配列情報）は存在するが、直接的物理的リンクは存在しない関係である。
【実施例】
【０１６２】
実施例１．ｐＧＰ６９−７ＶＨＣの調製
ｐＧＰ６９−７ＶＨＣを構成するために、ＶＨＣ生殖細胞Ｖｈ領域を、まず、特異的ヒトＩｇＨＢＡＣコンストラクトを増幅のための鋳型材料として使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、個々のＶｈ領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎのＡｃｃｕｐｒｉｍｅ  ＰｆｘポリメラーゼＳｕｐｅｒｍｉｘを使用して該反応を行った。以下の表に、特異的オリゴヌクレオチド、および使用した同族ＢＡＣ鋳型を列記する。プライマー対は、各Ｖｈ断片のコード領域の両側に７００〜１０００ｂｐの５′および３′ゲノム配列（それぞれ、イニシエータメオチニンおよび終止コドンに対する）の両方が配置されるように設計され、関連プロモータ、八量体エンハンサ、ならびに七量体および九量体組み換え信号が各単位複製配列に存在することを確実にした。以下の表では、下線が引かれているヌクレオチドは、対象のＶｈ領域に特異的であり、下線が引かれていない文字は、重複ＰＣＲのための付加ヌクレオチドまたは特異的制限部位の付加に対応する。センスオリゴヌクレオチドを最初に表に列記し、次いで、アンチセンスを列記する。
【０１６３】
【表２】
0005588866.tif 000004
【０１６４】
標準的な分子生物学的方法を使用して、生成物単位複製配列を、頭尾的方法で生殖細胞配向に結合し、「ＶＨＣ相同カセット」と称される４．９ｋｂフラグメントと合わせてプラスミドベクターｐＧＰ２−１に組み込んだ。ＶＨＣ相同カセットは、ヒトＩｇＨＢＡＣクローンＣＴＤ−２５９０Ａ７の５′末端に由来し、Ｖｈミニ遺伝子クラスタの３′末端に付加される。この４．９ｋｂフラグメントは、以下のセンスおよびアンチセンスプライマーをそれぞれ使用して、ＢＡＣ  ＣＴＤ−２５９０Ａ７からＰＣＲ増幅される。５′ＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＣＴＧＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴ３′、５′ＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＴＣＣＴＡＧＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧ３′（下線が引かれている配列は、ＢＡＣ  ＣＴＤ−２５９０Ａ７に特異的であるが、５′末端にある８ｎｔは、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ制限部位をそれぞれコードする）。ＶＨＣ相同カセットは、ＢＡＣ  ＣＴＤ−２５９０Ａ７およびＢＡＣ  ＶＤＪＣＥの５′末端と配列において同一であり、したがって、ｐＧＰ６９−７ＶＨＣをこれらのコンストラクトのいずれかとともに同時注入する場合、重複は、頭尾的方法で相同組換えおよび同時の組込みに有利に働く。最終ｐＧＰ６９−７ＶＨＣコンストラクトは、３１ｋｂのサイズであり、ベクター（３ｋｂ）および挿入物（２８ｋｂ）は、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩの二重消化によって互いから放出することができる。
【０１６５】
実施例２：ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥの構成
ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥは、３つの一次要素から成る。１番目の要素は、ＩｇＨα２の下流にある領域に由来する合成三部分ヒト免疫グロブリンエンハンサであるが、２番目および３番目の要素は、ヒトＩｇＨＢＡＣクローンＣＴＤ−２１９４０１５およびＣＴＤ−２５９０Ａ７にそれぞれ由来する。ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥは、ｒｅｄ／ＥＴ遺伝子組換工学技術（参照することによって全体として本明細書に組み込まれる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ２１，ｐｐ４４３−４４７，（２００３）に記載される）等の標準的な分子生物学技術を使用して構成される。
【０１６６】
トライパタイトヒトエンハンサは、Ｈｕら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，ｖｏｌ．１６４，ｐｐ  ６３８０−８６，（２０００））によって行われたエンハンサ分析に基づいて設計した。３つの別々のエンハンサ要素であるＨｓ３、Ｈｓ１，２、およびＨｓ４は、以下の３つのプライマー対を使用して、それぞれ増幅した（すべて、５′から３′の配向）。
ＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＣＣＴおよびＧＴＣＧＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＡＧ  ＣＴＧＡ、ＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＧＧＣＴＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴおよびＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣ、ＣＣＣＧＧＧＡＣＧＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＣ、ならびにＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＧＧ。下線が引かれている配列は、遺伝子特異的領域に対応するが、下線が引かれていない配列は、制限酵素クローニング部位を作製するように付加した。約７２０、約１１０７、および約４９１ｂｐの３つの単位複製配列は、鋳型材料としてヒトゲノムＤＮＡまたはＢＡＣ  ＰＲ１１−７３１Ｆ５のいずれかを使用して、ＰＣＲ増幅によって生成した。これらを、ＰＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）にすべて別々にクローン化した。プライマー５′末端配列によって作製される特有の制限酵素部位を使用して、タンデム生殖細胞配向でＨｓ３、Ｈｓ１，２、およびＨｓ４を含んだ単一の統合プラスミドコンストラクトを生成した（ＰＣＲＨｓ３／１，２／４と称される）。
【０１６７】
ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣのための遺伝子組換工学の第１ステップは、ｒｅｄ／ＥＴベースの組み換え、およびＰＣＲＨｓ３／１，２／４におけるＨｓ４エンハンサの下流にあるゼオシン耐性遺伝子をコードする発現カセットの挿入を含めて、プラスミドＰＣＲＨｓ３／１，２／４ゼオを作製した。ＰＣＲＨｓ３／１，２／４ゼオからのエンハンサ、さらにゼオシン耐性遺伝子を含有する該フラグメントのＰＣＲ増幅を、ＢＡＣ  ＣＴＤ−２１９４０１５の３′末端と相同なプライマー配列が両側に配置された遺伝子特異的プライマーを使用して行った。ゼオシン選択下でのエンハンサゼオシンカセットの挿入は、ヒトＩｇＨγ１に対する終止コドンの下流にある約８．５ｋｂの領域において、このフラグメントのＢＡＣ  ＣＴＤ−２１９４０１５への取り込みをもたらした。その結果、本来、エンハンサゼオシンカセットの挿入部位の下流にあるＣＴＤ−２１９４０１５にあった約２８ｋｂのヒト配列が削除された。このコンストラクトは、本明細書において、「下流ＢＡＣ」と称される。
【０１６８】
ＢＡＣ  ＣＴＤ−２５９０Ａ７をｒｅｄ／ＥＴ遺伝子組換工学によっても修飾し、カナマイシン耐性カセットをベクター骨格内に取り込んだ。次いで、この遺伝子組換ＢＡＣを、「上流ＢＡＣ」と称した。
【０１６９】
下流ＢＡＣをＰｍｅＩ＋ＮｒｕＩ制限酵素で消化させ、８５ｋｂの放出フラグメントを単離し、精製し、このフラグメントは、ＩｇＨδ定常領域ドメインの下流約２４ｋｂからゼオシン耐性遺伝子カセットを含む領域にわたった。その５′末端では、それは、上流ＢＡＣに含有される挿入物の３′末端への約４ｋｂの重複を含有し、その３′末端では、それは、ＢＡＣベクター配列への約１．３ｋｂの重複を含有した。次いで、下流ＢＡＣフラグメントと上流ＢＡＣとの間のＲｅｄ／ＥＴベースの組み換えを行い、カナマイシンおよびゼオシンを用いて二重選択を行い、両成分が最終コンストラクトに存在することを確実にした。この遺伝子組換工学の最終生成物であるＶＤＪＣＥを、関連結合のＰＣＲ増幅および選択された結合の直接配列決定によって検証した。要約すると、該ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥコンストラクトは、ヒトＩｇＨ遺伝子座からの以下の配列を含有する。（１）このコンストラクトの５′範囲は、最も近位のＶｈ断片６−１の約２２ｋｂ上流にある地点から開始し、野生型の生殖細胞において、ＩｇＨγ１定常領域遺伝子の約８．６ｋｂの３′の地点へ下流に伸展する（組み換え交差結合の不確実性のため、上流ＢＡＣと下流ＢＡＣとの間の結合は、ＩｇＨδ定常領域の約２４〜２８ｋｂ下流から開始する約４ｋｂの領域にある）。この生殖細胞由来断片の後に、合成ヒト由来トライパタイトＩｇＨエンハンサが続く。ゼオシンおよびカナマイシン選択マーカの両方は、本来のＢＡＣベクター骨格（ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１）に付加されているが、それらは、トランス遺伝子機能に対して重要ではない。ヒトベースのトランス遺伝子の全体は、ＮｏｔＩ制限酵素による消化により放出され得、約２３１ｋｂの挿入物を放出する。
【０１７０】
実施例３：ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥの構成
このＢＡＣは、ｒｅｄ／ＥＴ遺伝子組換工学（参照することによって全体として本明細書に組み込まれる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ２１，ｐｐ４４３−４４７，（２００３）に記載される）等の標準的な分子クローニング方法を使用して作製することができるＢＡＣ  ＶＤＪＣＥの誘導体である。簡単な場合では、ｐＧＰ６９−７ＶＨＣに存在する１２Ｖｈ可変領域遺伝子断片を、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥに組み換え、同時に、Ｄ断片の上流にある約２５ｋｂのＤＮＡを削除した。
【０１７１】
ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥの構成における第１ステップでは、ＶＨＣ相同カセット、およびベクター骨格に存在する隣接するアンピシリン耐性マーカの代わりに、ｒｅｄ／ＥＴ遺伝子組換工学を使用して、最も近位のＶｈ要素３−７の下流にあるクロラムフェニコール耐性カセットをｐＧＰ６９−７ＶＨＣに挿入した。該プロセスにおいては、ＶＤＪＣＥ配列と相同の５０ｂｐの配列を、Ｖｈ３−７とクロラムフェニコール耐性遺伝子との間に挿入した。これは、クロラムフェニコール耐性、かつアンピシリン感受性のプラスミドをもたらした。
【０１７２】
ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥの構成における第２のステップは、最も遠位のＶｈ要素１−６９の上流にあるアンピシリン耐性カセットの挿入を含んだ。アンピシリン耐性カセットのいずれかの側に、ｆｌｐリコンビナーゼ特異的ＦＲＰ組み換え信号、およびＢＡＣ  ＶＤＪＣＥと相同の付加された相同の付加的なフランキングアームを配置した。プラスミド挿入物をこのコンストラクトから精製した。該挿入配列は、ＦＲＰが両側に配置されたアンピシリン耐性カセット、およびすべての１２のＶｈ領域を含有し、ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣと相同の約５０ｂｐの配列をいずれかの端部に配置し、ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣへの組み換えのためにＰｍｅＩ＋ＡｓｃＩ制限消化によって単離した。
【０１７３】
このプロセスにおける第３のステップは、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥへの上述の約２５ｋｂのＰｍｅＩ＋ＡｓｃＩプラスミド挿入物の組み換えを含んだ。Ｒｅｄ／ＥＴ媒介組み換えは、取り込みの成功をもたらし、得られた組み換え産物を、アンピシリン（プラスミド挿入物から）およびカナマイシン（ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥから）下での成長に対して選択した。
【０１７４】
Ｖ１２ＤＪＣＥの構成における第４および最終ステップは、遠位Ｖｈ要素１−６９の上流にあるアンピシリンカセットの除去を含んだ。ｆｌｐリコンビナーゼを使用して、ＦＲＰが両側に配置されたアンピシリンカセットを特異的に切除した。適切な形質転換細胞の選択は、アンピシリンの存在下ではなく、カナマイシンの存在下で成長するそれらの能力によって確実にした。したがって、最終ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥコンストラクトは、Ｄ領域の上流への１２−Ｖｈ要素の挿入によりＢＡＣ  ＶＤＪＣＥと異なったが、ＢＡＣ  ＶＤＪＣＥの約２５ｋｂの断片の欠損をもたらした。得られたコンストラクトは、天然の生殖細胞順序においてＶＤＪＣＥに挿入される１２−Ｖｈ要素を有するＢＡＣを生成し、Ｖｈ要素１−６９は、ＶＤＪＣＥの本来の５′末端に対応する約９ｋｂの上流ヒトゲノムＤＮＡを両側に配置されるが、Ｖｈ３−７は、Ｄ領域の近位にある約８ｋｂのヒトゲノムＤＮＡを下流で両側に配置される。
【０１７５】
実施例４：ＨＣｏ２０トランスジェニックマウス株の構成
ＨＣｏ２０トランスジェニックマウス株は、ミニ遺伝子座重鎖トランス遺伝子ｐＨＣ２、生殖細胞可変領域（Ｖｈ）含有ＹＡＣ  ｙＩｇＨ１０、およびミニ遺伝子座コンストラクトｐＶｘ６の同時注入の結果である。
【０１７６】
ｐＨＣ２コンストラクト単独では、機能的ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座を形成するために体内において再構成されることが十分に可能であり、ｐＶＸ６およびｙＩｇＨ１０を、付加的な生殖細胞ＶＨ多様性を与えるように付加した。ＨＣｏ２０トランスジェニックマウス株を産生するために使用したＤＮＡ混合物の個々の成分を以下に記載する。
【０１７７】
上述のｐＨＣ２挿入物は、１−６９（ＤＰ−１０）、５−５１（ＤＰ−７３）、４−３４（ＤＰ−６３）、および３−３０．３（ＤＰ−４６）の４つの機能的ヒト生殖細胞ＶＨ遺伝子断片を含有する。さらに、このコンストラクトは、１５の機能的Ｄ断片、すべて６つのＪ断片、ならびにｐ４およびｙ１定常領域断片を含むヒトゲノム配列と、機能的ｐ−Ｙ１スイッチ領域も含有する。
【０１７８】
ｐＶｘ６挿入物は、３つのヒト生殖細胞ＶＨ断片、ＶＨ１−１８（ＤＰ−１４）、ＶＨ５−５１（ＤＰ−７３）、およびＶＨ３−２３（ＤＰ−４７）を含有する。該ｐＶｘ６コンストラクトを作製するために、約２．５ｋｂの５′フランキングおよび５ｋｂの３′フランキングゲノム配列と合わせて、生殖細胞ヒトＶＨ１−１８（ＤＰ−１４）遺伝子を含む８．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ  ＤＮＡフラグメントを、まず、プラスミドベクターｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）にサブクローン化し、プラスミドｐ３４３．７．１６を生成した。次に、約５ｋｂの５′フランキングおよび１ｋｂの３′フランキングゲノム配列と合わせて、生殖細胞ヒトＶＨ５−５１（ＤＰ−７３）遺伝子を含む７ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメントを、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミドクローニングベクターｐＧＰ１ｆ（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５）にクローン化し、プラスミドｐ２５１ｆを生成した。次いで、ｐＧＰ１ｆ、ｐＧＰ１ｋに由来する新しいクローニングベクターをＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩで消化させ、約４ｋｂの５′フランキングおよび５ｋｂの３′フランキングゲノム配列と合わせて、生殖細胞ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ４７）遺伝子を含む１０ｋｂのＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントに結合した。得られたプラスミドであるｐｉ１２．２ＲＲ．７を、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化させ、ｐ２５Ｉｆの７ｋｂの精製ＢａｍＨＩ／Ｓａｌｌ挿入物で結合した。得られたプラスミドであるｐＶｘ４を、ＸｈｏＩで消化させ、ｐ３４３．７．１６の８．５ｋｂのＸｈｏｌ／Ｓａｌｌ挿入物で結合した。その後、他の２つのＶ遺伝子と同一の配向のＶＨ１−１８遺伝子を有するクローンを得た。次いで、ｐＶｘ６を指定するこのクローンを、挿入調製のためにＮｏｔＩで消化した。
【０１７９】
ＹＡＣ  ｙＩｇＨ１０は、最初は、Ｖｈ３およびＶｈ４ファミリー特異的プライマーを使用するＰＣＲスクリーニングによって特定し、Ｖｈ含有量によってヒト染色体１４にマッピングした。ｙＩｇＨ１０が、ＶｈファミリーのメンバーであるＶｈ１、Ｖｈ２、Ｖｈ３、およびＶｈ４、特に、少なくともＶｈ１−１８、Ｖｈ１−２４、Ｖｈ２−２６、Ｖｈ３−１５、Ｖｈ３−２０、Ｖｈ３−２１、Ｖｈ３−２３、Ｖｈ３−３０、Ｖｈ３−３０．５、Ｖｈ３−３０．３、Ｖｈ３−３３、Ｖｈ４−２８、Ｖｈ４−３０、Ｖｈ４−３０．４、Ｖｈ４−３０．３、Ｖｈ４−３１、およびＶｈ４−３４を含む、Ｖｈ断片を含有することが確証された。
【０１８０】
ｐＶｘ６（２６ｋｂ）、ｐＨＣ２（８０ｋｂ）、およびｙＩｇＨ１０（約３７５ｋｂ）からの精製挿入物を、１：１：１のモル比で組み合わせ、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。ｐＶｘ６、ｐＨＣ２、およびｙＩｇＨ１０からの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統を（ＨＣｏ２０）に指定した。
【０１８１】
次いで、（ＨＣｏ２０）系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【０１８２】
実施例５：ＨＣｏ２７トランスジェニックマウス株の構成
ＨＣｏ２７トランスジェニックマウス株は、ミニ遺伝子座重鎖トランス遺伝子ｐＨＣ２の生殖細胞可変領域（Ｖｈ）含有ＹＡＣ  ｙＩｇＨ２４ａおよびｙＩｇＨ１０との同時注入の結果である。
【０１８３】
上記で指摘されるように、ｐＨＣ２コンストラクト単独では、機能的ヒト重鎖免疫グロブリン遺伝子座を形成するために体内において再構成されることが十分に可能であり、ｙＩｇＨ２４およびｙＩｇＨ１０を、付加的な生殖細胞ＶＨ多様性を与えるために付加した。ＨＣｏ２７トランスジェニックマウス株を産生するために使用したＤＮＡ混合物の個々の成分を以下に記載する。
【０１８４】
ｐＨＣ２およびＹＡＣ  ＩｇＨ１０コンストラクトは、実施例４に詳述される。
酵母人工染色体（ＹＡＣ）ｙＩｇＨ２４ａは、最初は、Ｖｈ３およびＶｈ４ファミリー特異的プライマーを使用するＰＣＲスクリーニングによって特定し、Ｖｈ含有量によってヒト染色体１４にマッピングした。ｙＩｇＨ２４が、ＶｈファミリーのメンバーであるＶｈ１、Ｖｈ２、Ｖｈ３、ＶＨ４、およびＶｈ５、特に、少なくともＶＨ１−２４、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ２−２６、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３０．５、ＶＨ３−３０．３、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３０、ＶＨ４−３０．４、ＶＨ４−３０．３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、４−３９、およびＶＨ５−５１を含む、Ｖｈ断片を含有することが確証された。
【０１８５】
ｐＨＣ２（８０ｋｂ）、ｙＩｇＨ１０（約３７５ｋｂ）、およびｙＩｇＨ２４ａ（約４６０ｋｂ）からの精製挿入物を、１：１：１のモル比で組み合わせ、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。ｐＨＣ２、ｙＩｇＨ１０、およびｙＩｇＨ２４ａからの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統をＨＣｏ２７に指定した。
【０１８６】
次いで、ＨＣｏ２７系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【０１８７】
実施例６：ＨＣｏ２８トランスジェニックマウス株の構成
ＨＣｏ２８トランスジェニックマウス株は、重複ヒトＩｇ重鎖ＢＡＣクローン挿入物の本来の生殖細胞含有量から未修飾である、ＣＴＤ−２３０４Ｉ２２、ＣＴＤ−２５７２Ｏ２、およびＣＴＤ−２１９４Ｏ１５の３つの重複ヒトＩｇ重鎖ＢＡＣクローン挿入物の同時注入の結果である。合わせて、これらは、５′末端にあるＶｈ断片３−７から３′末端にあるＩｇＨα１のヒトＩｇＨ遺伝子座の領域にわたる。
【０１８８】
ＣＴＤ−２３０４Ｉ２２、ＣＴＤ−２５７２Ｏ２、およびＣＴＤ−２１９４Ｏ１５からの精製挿入物を、１：１：１のモル比でで組み合わせ、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。ＣＴＤ−２３０４Ｉ２２、ＣＴＤ−２５７２Ｏ２、およびＣＴＤ−２１９４Ｏ１５からの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統をＨＣｏ２８に指定した。
【０１８９】
次いで、ＨＣｏ２８系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【０１９０】
実施例７：トランスジェニックマウスのＨＣｏ３０株の構成
ＨＣｏ３０トランスジェニックマウス株は、ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣ挿入物および生殖細胞可変領域（Ｖｈ）含有ＹＡＣ  ｙＩｇＨ２４ａの同時注入の結果である。
【０１９１】
ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣの構成および組成物は、上記の実施例２に詳述される。酵母人工染色体ｙＩｇＨ２４ａは、上記の実施例５に詳述される。
【０１９２】
ＶＤＪＣＥ（約２３１ｋｂ）およびｙＩｇＨ２４ａ（約４６０ｋｂ）からの精製挿入物を、１：１のモル比で組み合わせ、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。ＶＤＪＣＥおよびｙＩｇＨ２４からの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統をＨＣｏ３０に指定した。
【０１９３】
次いで、ＨＣｏ３０系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【０１９４】
実施例８：ＨＣｏ３１トランスジェニックマウス株の構成
ＨＣｏ３１トランスジェニックマウス株は、ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣ挿入物およびＣＴＤ−３０５４Ｍ１７ＢＡＣ挿入物の同時注入の結果である。
【０１９５】
ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣの構成および組成物は、上記の実施例２に詳述される。ＢＡＣ  ＣＴＤ−３０５４Ｍ１７は、生殖細胞構成において、ヒト重鎖ＩｇＶｈ断片（５′末端にあるＶｈ４−３９から３′末端にあるＶｈ３−２３）を含有する−１９０ｋｂのＢＡＣクローンである。
【０１９６】
ＶＤＪＣＥ（約２３１ｋｂ）およびＣＴＤ−３０５４Ｍ１７（約１９０ｋｂ）からの精製挿入物を、１：１のモル比で組み合わせ、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。ＶＤＪＣＥおよびＣＴＤ−３０５４Ｍ１７からの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統をＨＣｏ３１に指定した。
【０１９７】
次いで、ＨＣｏ３１系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【０１９８】
実施例９：ＨＣｏ３２トランスジェニックマウス株の構成
ＨＣｏ３２トランスジェニックマウス株は、ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣ挿入物およびｐＧＰ６９−７ＶＨＣ挿入物の同時注入の結果である。
【０１９９】
ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣの構成および組成物は、上記の実施例２に詳述される。ｐＧＰ６９−７ＶＨＣの構成および組成物は、上記の実施例１に詳述される
【０２００】
ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣ（−２３１ｋｂ）およびｐＧＰ６９−７ＶＨＣ（−２８ｋｂ）からの精製挿入物を、１：１のモル比で組み合わせ、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。ＶＤＪＣＥおよびｐＧＰ６９−７ＶＨＣからの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統をＨＣｏ３２に指定した。
【０２０１】
次いで、ＨＣｏ３２系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【０２０２】
実施例１０：ＨＣｏ３３トランスジェニックマウス株の構成
ＨＣｏ３３トランスジェニックマウス株は、Ｖ１２ＤＪＣＥ  ＢＡＣ挿入物の注入の結果である。Ｄ領域から約８ｋｂ上流にあるＶＤＪＣＥ  ＢＡＣに組み込まれたｐＧＰ６９−７ＶＨＣに由来する１２のＶｈ断片を含有するＶ１２ＤＪＣＥ  ＢＡＣの構成は、上記の実施例３に詳述される。
【０２０３】
Ｖ１２ＤＪＣＥからの精製挿入物を、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。Ｖ１２ＤＪＣＥからの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統をＨＣｏ３３に指定した。
【０２０４】
次いで、ＨＣｏ３３系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【０２０５】
実施例１１：ＨＣｏ３４トランスジェニックマウス株の構成
ＨＣｏ３４トランスジェニックマウス株は、ｐＩｇＹＢＡＣ挿入物の注入の結果である。ｐＩｇＹＢＡＣコンストラクトは、ｙＩｇＨ１０、さらにＶＤＪＣＥ  ＢＡＣの全体からのすべての関連Ｖｈ断片を含有する約５００ｋｂの細菌性酵母シャトルベクターである。ＹＡＣ  ｙＩｇＨ１０は、上記の実施例５に詳述される。ＶＤＪＣＥ  ＢＡＣは、上記の実施例２に詳述される。
【０２０６】
ｐＩｇＹＢＡＣ（約５００ｋｂ）からの精製挿入物を、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。ｐＩｇＹＢＡＣからの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統をＨＣｏ３４に指定した。
【０２０７】
次いで、ＨＣｏ３４系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【０２０８】
実施例１２：Ｂａｌｂ／ｃ株の導入
原型のＨｕＭａｂマウスは、混合株背景から成り、Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ、ＣＢＡ／Ｊ、ＤＢＡ／２Ｊ、および１２９／Ｓｖ株からの遺伝的関与は、すべて、完全に機能的なＨｕＭａｂマウスの生成の間に生じていることが周知である。これらの親株に対する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプは、それぞれ、ｂ、ｋ、ｄ、およびｂである。しかしながら、ＨｕＭａｂ集団の所定の調査は、非選択的繁殖の複数の生成後の、ｂおよびｋハプロタイプの優勢を明らかにした。Ｂａｌｂ／ｃ株（ＭＨＣハプロタイプｄ）は、前述の株（例えば、Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｏｎｓ，ｖ．４ｎｏ．４，ｐｐ２７７−２８５（１９７４）を参照と比較して、抗体応答性に関して「応答性が高い者」として周知である。優れた抗体応答性に加え、Ｂａｌｂ／ｃ株の存在も、ｄ  ＭＨＣハプロタイプが存在していることを確実にする。ＭＨＣによる抗原提示は、時折、ＭＨＣハプロタイプに依存し、したがって、より高いＭＨＣ多様性を有する株は、多様な抗原を提示し、抗原特異的抗体応答を生成する態勢がより良く整っている可能性があることが周知である。既存のＨｕＭａｂ株にＢａｌｂ／ｃ背景の有利な態様を与える目的で、遺伝的交雑戦略を行った。ＫＣｏ５株（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に記載される）を、野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに繰り返して戻し交配し、５世代の戻し交配の生成後、ＫＣｏ５軽鎖トランス遺伝子、重鎖遺伝子破壊（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、およびκ軽鎖遺伝子破壊（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０号に記載される）の存在に対して選択されたマウスを交雑した。次いで、この交雑受精の子孫を、互いに交配し、重鎖およびκ軽鎖遺伝子破壊に対してホモ接合型であるマウスを生成した。得られたマウスの数匹は、ＫＣｏ５トランス遺伝子を有し、他は有さず、次いで、２つの別々の系統（一方はＫＣｏ５を含有し、他方は含有しない）を作製し、拡張し、集合的にＫＣｏ５［ＷＵＫ］（Ｂａｌｂ）と称した。Ｂａｌｂ／ｃ株の有益な効果を有するＨｕＭａｂマウスを生成するために、ＫＣｏ５［Ｍ／Ｋ］（Ｂａｌｂ）マウスを、混合株背景のＨｕＭａｂマウスと交配した。得られたマウスは、重鎖およびκ軽鎖遺伝子破壊の両方に対してホモ接合型であり、ヒト重鎖および軽鎖トランス遺伝子の少なくとも１つの染色体のコピーを含有し、遺伝的に約５０％Ｂａｌｂ／ｃである。このハイブリッド育種法は、以下を可能にする。１）混合株背景の複数の異なるＨｕＭａｂ株（ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７等）は、同一のＫＣｏ５［Ｍ／Ｋ］（Ｂａｌｂ）株と交配することができる、２）Ｂａｌｂ／ｃからのｄ  ＭＨＣハプロタイプは、最大ハプロタイプ多様性のために、ＨｕＭａｂ混合株から寄与されるｂまたはｋハプロタイプのいずれか一方に加え、すべてのハイブリッド子孫に存在する、３）ハイブリッド子孫が、遺伝的浮動の影響を受ける場合がある無向的連続的交雑受精よりも着実に代々引き継がれることを、最終遺伝的交雑が確実にするまでのＫＣ��５［Ｍ／Ｋ］（Ｂａｌｂ）集団からの混合株ＨｕＭａｂ集団の分離。
【０２０９】
上述される方法と直接的に類似している方法では、Ｂａｌｂ／ｃ遺伝的背景も、同一のκ軽遺伝子破壊を有するが、異なる重鎖遺伝子破壊（いわゆるＪまたはＪＨＤ破壊。説明に関しては、参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５４５，８０６号を参照）を有するＫＣｏ５マウスへ繁殖させた。再度、重鎖および軽鎖遺伝子破壊の両方に対してホモ接合型のＢａｌｂ／ｃマウスを作製し、数匹はＫＣｏ５トランス遺伝子を含有し、他は含有せず、集合的にＫＣｏ５［Ｊ／Ｋ］（Ｂａｌｂ）と称した。この株も、前述のようにハイブリッドを作製するように、混合株背景のＨｕＭａｂマウスのすべての型に交配することができる。
【０２１０】
図４に示されるように、ＫＣｏ５［Ｊ／Ｋ］（Ｂａｌｂ）とのＨＣｏ１２交配から得られたハイブリッドマウスは、未感作または免疫前の状態で実質的により高い総免疫グロブリンを有し、親ＨＣｏ１２株と比較して、破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原に対する高い抗原特異的免疫グロブリン力価も示す。この戦略の使用は、ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７、およびＨＣｏ２０株に対して作製されるＢａｌｂ／ｃハイブリッドをもたらし、該戦略は、さらに、本明細書に記載されるＨＣｏ２７、ＨＣｏ２８、ＨＣｏ３０、ＨＣｏ３１、ＨＣｏ３２、およびＨＣｏ３３等のすべての現在および将来のＨｕＭａｂマウス株へのハイブリッド交配を受け易い。
【０２１１】
実施例１３：ＨＣｏ７／ラムダ株の導入
ＨＣｏ７／ラムダトランスジェニックマウス株の作製は、ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）の実施例１に記載される内因性マウス重鎖遺伝子のホモ接合型破壊と、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）に記載される内因性マウスカッパ軽鎖遺伝子のホモ接合型破壊を含む。ＨＣ０７／ラムダトランスジェニックマウス株も、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：８４５−８５１（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）に記載されるヒトカッパ軽鎖トランス遺伝子であるＫＣｏ５、および米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、および同第５，５４５，８０７号（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）に記載されるヒト重鎖トランス遺伝子であるＨＣｏ７を有する。このトランスジェニックマウス株は、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０００／２６３７３号（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる）に記載されるヒトＩｇラムダ遺伝子座のほとんどを含有する酵母人工染色体から成るヒトラムダ軽鎖トランス遺伝子も有する。しかしながら、このトランスジェニックマウス株は、破壊された内因性λ軽鎖遺伝子座を有しない。選択的繁殖により、重鎖および軽鎖の両方のホモ接合性遺伝子破壊を有し、ヒト重鎖トランス遺伝子を含有し、軽鎖トランス遺伝子に関して、κおよびλ軽鎖トランス遺伝子の両方、κ軽鎖トランス遺伝子のみ、またはλ軽鎖トランス遺伝子のみのいずれかを含有する子孫が再生されている。すべて３つの遺伝子型は、上記で詳述される免疫化およびヒト抗体の再生のために使用することができる。
【０２１２】
実施例１４：ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏの構成
このＢＡＣは、ｒｅｄ／ＥＴ遺伝子組換工学（参照することによって、全体として本明細書に組み込まれる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ２１，ｐｐ４４３−４４７，（２００３）に記載される）等の標準的な分子クローニング方法を使用して作製することができるＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥの誘導体である。簡単な場合では、二重原核生物および真核性プロモータ／エンハンサ要素に機能的に連結される、ネオマイシン耐性遺伝子カセット（以下、ｎｅｏと称される）からの選択可能な耐性マーカを、ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥに存在する１２のＶｈ可変領域遺伝子断片から約１０ｋｂの上流に挿入した。
【０２１３】
ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏの構成における第１のステップでは、ｒｅｄ／ＥＴ遺伝子組換工学を使用して、Ｖ１２ＤＪＣＥにおける既存のカナマイシン耐性遺伝子の代わりに、アンピシリン耐性カセットを挿入した。
【０２１４】
ＢＡＣ  Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏの構成における第２のステップは、ＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏと称されるハイブリッドカセットに対する、第１のステップからのアンピシリン耐性カセットの交換を含んだ。この耐性カセットは、原核生物（すなわち、細菌性）および真核性細胞の両方におけるｎｅｏカセットの発現を可能にするハイブリッド原核生物／真核性プロモータを使用する。ｎｅｏカセットは、カナマイシン（原核生物選択のための）およびネオマイシン（真核性選択のために、一般的に、Ｇ４１８と取り替え可能）の両方に耐性を与える。
【０２１５】
すべての他の態様では、Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏコンストラクトは、親分子Ｖ１２ＤＪＣＥと同一であり、具体的には、免疫グロブリン遺伝子含有量は、２つのコンストラクトの間で完全に保存される。
【０２１６】
実施例１５：ＨＣｏ３７トランスジェニックマウス株の構成
ＨＣｏ３７トランスジェニックマウス株は、Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏＢＡＣ挿入物の注入またはトランスフェクトの結果である。近位のＶｈ断片１−６９の上流約１０ｋｂにあるＶ１２ＤＪＣＥ  ＢＡＣに組み込まれたＰＧＫ−ｇｂ２−ｎｅｏ耐性カセットを含有するＶ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏＢＡＣの構成は、上記の実施例１４に詳述される。Ｖ１２ＤＪＣＥからの精製挿入物を、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、半日の（ＢＤＦ１×ＫＣｏ５−ＣＭＤ−ＪＫＤ）Ｆ１胚の前核に微量注入した。Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏからの配列を含むトランスジェニックマウスの樹立系統を、注入胚から発達したマウスから確立した。この系統をＨＣｏ３７に指定した。
【０２１７】
代替の用途では、Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏコンストラクトを使用して、Ｈｏｇａｎら（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）によって記載されるように、マウス胚幹（ＥＳ）細胞をトランスフェクトする。このＤＮＡコンストラクトの安定的および永久的組み込みを行なうＥＳ細胞は、選択剤Ｇ４１８を使用して特定し、クローン増殖することができる。次いで、Ｖ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏコンストラクトを有する個々のＥＳ細胞クローンは、修飾ＥＳ細胞を桑実胚または胞胚期のマウス胚に注入し、それらを誕生させることによってキメラマウスを作製するために使用することができる。次いで、そのようなキメラマウスは、トランスフェクトＶ１２ＤＪＣＥ−ｎｅｏコンストラクトの子孫への伝達を確認するために他のマウスとの交配によって繁殖させることができる。この系統をＨＣｏ３７に指定した。
【０２１８】
次いで、ＨＣｏ３７系統を、ＣＭＤ変異（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／０９１８７号の実施例１に記載される）、ＪＫＤ変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２トランス遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含むマウスとの交配によって繁殖させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子座の破壊に対してホモ接合型の背景において、ヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖トランス遺伝子を発現する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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