(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）皮膚細胞を候補材料で処理するステップ;
（b）膜結合性タンパク質１７（ＭＡＰ１７）遺伝子の相対的発現レベルにおける減少を検出するステップ;
（c）前記ＭＡＰ１７遺伝子の発現レベルにおける減少を誘導する候補材料を、フィラグリン遺伝子の発現レベルにおける増加を誘導するための材料として選択するステップ;および
（ｄ）前記フィラグリン遺伝子の発現レベルにおける増加を誘導するための材料を、皮膚機能向上用材料として選択するステップを含む、皮膚機能向上用材料のスクリーニング（screening）方法。
【請求項２】
前記皮膚細胞は、ヒト角質細胞であることを特徴とする、請求項１記載の皮膚機能向上用材料のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記皮膚機能向上用材料は、皮膚バリア機能の向上、または皮膚の保湿の促進を行う、請求項１記載の皮膚機能向上用材料のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、皮膚機能向上用材料をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚（skin）の表皮（epidermis）は、皮膚の最外層である。角質形成細胞（keratinocyte）により構成された角質層が正常的な状態にあるとき、種々の刺激に対する体の主要なバリアとして作用し、且つ体内からの水分の発散を防ぐ。
【０００３】
角質形成細胞は、皮膚の最下層である基底層（basal layer）で増殖（proliferation）し、徐々に有棘層（spinous layer）、顆粒層（Granular layer）を経て分化する。こうした角質化過程（keratinization）を通じ、角質細胞は、天然保湿因子（ＮＭＦ；Natural Moisturizing Factor）と、脂質（セラミド、コレステロール、脂肪酸）を形成し、角質層（stratum corneum）を形成して、皮膚バリア（skin barrier）の機能を与える。
【０００４】
しかしながら、皮膚疾患およびトラブルの場合、いくつかの理由によって、皮膚角質層の正常な機能を維持できなくなる。その結果、皮膚バリアがダメージを受け、皮膚乾燥症状、および時には、炎症症状をも生ずる。
【０００５】
このような皮膚疾患の炎症反応においては、ヘルパーＴ細胞１型（T helper １:Ｔｈ１）、ヘルパーＴ細胞２型（Ｔｈ２）と、ヘルパーＴ細胞１７型（Ｔｈ１７）の細胞群が、いくつかのインターロイキン（Interleukins）を生成することにより、免疫応答を誘導する。
【０００６】
膜結合性（membrane-associated）タンパク質１７（ＭＡＰ１７）は、１７ｋＤａサイズの膜結合性タンパク質である。正常な腎臓組織（normal renal parenchyma）と比較して、腎臓癌腫（renal carcinoma）の組織において、ＭＡＰ１７遺伝子が過剰発現されたことが初めて観察された（Kocher et al., Clinical Cancer Research, Vol １:１２０９, １９９５）。ＭＡＰ１７タンパク質が癌腫組織において過剰発現されるため、それは癌腫組織の特性である過増殖（hyperproliferation）に関与するものと考えられていた。しかしながら、結腸癌腫細胞株（colon carcinoma cell line）においてＭＡＰ１７が過剰発現されるときに、インビトロ（in vitro）条件において、細胞増殖（cell proliferation）が減少し、インビボ（in vivo）条件において腫瘍の増殖が減少することが証明された。従って、ＭＡＰ１７は、細胞の増殖とは無関係であることが示された（Kocher et al., Am J Pathol, Vol. １４９:４９３,１９９６）。結論として、ＭＡＰ１７の機能は、未だ正確には知られてはいないと言える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３−０１５２９５６号明細書
【特許文献２】国際公開第ＷＯ２００７−０２３８０８号
【特許文献３】韓国公開特許第２００８−００９６０２６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】The Journal of Investigative Dermatology, Vol. 115, No. 3, Sep. 2000
【非特許文献２】Cell. 1984 Apr; 36 (4): 827-34
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的の一つは、皮膚バリア機能の向上、皮膚の保湿促進または皮膚の老化防止のための皮膚機能向上用材料を、効率的にスクリーニングすることができる新規なスクリーニング方法を提供することに向けられている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
このような目的を達成するために、本発明に係る皮膚機能向上用材料のスクリーニング（screening）方法は、以下を含む：
（ａ）皮膚細胞を候補材料で処理するステップ；（ｂ）膜結合性タンパク質１７（ＭＡＰ１７）遺伝子の相対的発現レベルにおける変化を検出するステップ;および（c）前記遺伝子の発現レベルにおける変化を誘導する候補材料を、皮膚機能向上用材料として選択するステップ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、皮膚バリア機能の向上、皮膚の保湿促進または皮膚の老化防止に有用な皮膚機能向上用材料を効率的にスクリーニングすることができる新規なスクリーニング方法を提供する。このようにしてスクリーニングされた材料は、皮膚機能改善用組成物の有効成分に適した材料として使用することができる。
【００１２】
ここに開示された例示的な実施態様の、上記および他の側面（aspects）、特徴および有利性は、添付の図面を参照しつつ、以下の詳細な説明から、更に明確にされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）、ヘルパーＴ細胞２型（Ｔｈ２）およびヘルパーＴ細胞１７型（Ｔｈ１７）の細胞群由来の種々のインターロイキンによる、ヒト角質細胞における未処理群と比較した際の、ＭＡＰ１７遺伝子の発現増加（図１Ａ）およびフィラグリンの遺伝子の発現減少（図１Ｂ）を示す図である。
【図２】ＭＡＰ１７遺伝子をクローニング（Cloning）する過程（図２Ａ）と、全長ＭＡＰ１７と、カルボキシル末端（Ｃ末端）ＭＡＰ１７のフラグメント（図２Ｂ）を示す模式図である。
【図３】ヒト角質細胞株（HaCaT cell line）においてＭＡＰ１７を過剰発現させたときの、ＭＡＰ１７遺伝子（図３Ａ）とフィラグリン遺伝子（図３Ｂ）の発現を示す図である。
【図４】ジンセノイド-Re（Ginsenoid-Re）で処理した、または処理しない正常ヒト角質細胞における、ＭＡＰ１７遺伝子（図４Ａ）とフィラグリン遺伝子（図４Ｂ）の発現に対する、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す図である。
【００１４】
例示的な態様は、添付の図面を参照しつつ、以下において例示的な態様が詳細に記述される。この開示は、しかしながら、多くの異なる形態において具体化することができ、その中で述べられる例示的な態様に限られるように、解釈されるべきでない。むしろ、これらの例示的な態様は、この開示が詳細且つ完全であるように、当業者に対してこの開示の範囲を充分に伝えるように提供される。この記述において、周知の特徴と技術の詳細は、提示された態様を必要以上に不明瞭にすることを避けるために、省略される可能性がある。
【００１５】
ここに使われる用語は、特定の態様を記述する目的ためのみで使用され、この開示に制限されることを意図しない。ここに使用されるように、文脈が明らかに指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数形も含むことを意図する。更に、「ａ」、「ａｎ」等の語の使用において量の規制を意味せず、関連するアイテムの「少なくとも1つ」の存在をむしろ意味する。「第１」、「第２」、等の使用は、如何なる特定の順序も意味せず、それらは、個々の要素を特定するために含まれる。更に、第１、第２、等の使用は、如何なる順序または重要性をも意味せず、むしろ、第１、第２、等の用語は、１つの要素と他のものを区別するのに用いられる。この明細書で使用されるとき、「含む」（comprise, and/or comprising, or include and/or including）は、言及された特徴、部分、整数、ステップ、作動、要素および／又は成分の存在を指定するが、それは、更に１以上の他の特徴、部分、整数、ステップ、作動、要素、成分および／又はグループの追加を排除しないように理解される。
【００１６】
特に限定しない限り、ここに使用される用語（技術的および専門的で科学的な語を含む）は、当業者によって一般に理解されるようなものと、同じ意味を有する。一般的に用いられる辞書で定められるもののような用語は、関連する技術および本開示の文脈における、それらの意味と整合するように解釈されるべきであり、ここにおいて明確に定義されない限り、理想化された、または過度に形式的に解釈されるべきでない。
【００１７】
本発明に係る皮膚機能向上用材料のスクリーニング（screening）方法は、（ａ）皮膚細胞を候補材料で処理するステップ；（ｂ）膜結合性タンパク質１７（ＭＡＰ１７）遺伝子の相対的発現レベルにおける変化を検出するステップ;および（c）前記遺伝子の発現レベルにおける変化を誘導する候補材料を、皮膚機能向上用材料として選択するステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記ステップ（a）において、皮膚細胞は候補材料で処理される。候補材料の外部刺激に対する防御、水分発散防止および皮膚バリア機能の維持の効果を評価するために、前記皮膚細胞としては、例えば、ヒトの皮膚新生角質細胞（Human Epidermal Neonatal Keratinocyte Cells）を使用することができる。
【００１９】
前記ステップ（b）において、候補材料によって、ＭＡＰ１７遺伝子の相対的発現レベルが変化したか否かが検出される。
【００２０】
前記の相対的発現レベルは、候補材料を処理していない皮膚細胞群と比較した、候補材料で処理した皮膚細胞群において発現する遺伝子の発現レベルである。本明細書全体において、発現レベルは、遺伝子の相対的発現レベルを意味してもよい。
【００２１】
本発明者らは、遺伝子（特に、ＭＡＰ１７遺伝子をマーカー（marker）として）の発現レベルにおける変化を測定することにより、皮膚機能向上用材料をスクリーニングできることを確認した。
【００２２】
前記ＭＡＰ１７遺伝子は、例えば、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）由来インターフェロン-ガンマ（ＩＦＮ−γ:interferon-gamma）、ヘルパーＴ細胞２型（Ｔｈ２）由来インターロイキン-４（ＩＬ−４:interleukin-４）、ヘルパーＴ細胞１７型（Ｔｈ１７）細胞由来インターロイキン-１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ:interleukin-１７Ａ）、インターロイキン-１７Ｆ（ＩＬ−１７F:interleukin-１７F）、インターロイキン-２２（ＩＬ−２２:interleuin-２２）およびインターロイキン-６（ＩＬ−６:interleukin-６）からなる群から選択された１以上のインターロイキンによって発現レベルが増加し得る。
【００２３】
本発明者らは、下記実験例を通じて立証されたように、皮膚保湿因子の減少、皮膚バリア機能の損傷、皮膚の防御能力減少、および炎症反応と関連した、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）、ヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２）およびヘルパーＴ細胞１７型（Ｔｈ１７）細胞由来インターロイキンにより、前記ＭＡＰ１７遺伝子の発現が顕著に増加することを確認した。
【００２４】
これを通じ、前記ＭＡＰ１７遺伝子は、皮膚の炎症または皮膚バリアのダメージにおいて増加するインターロイキンにより調節される遺伝子であることを立証された。前記ＭＡＰ１７が皮膚の炎症や皮膚バリアのダメージにおいて、重要な役割を果たすタンパク質であり得ることを確認した。
【００２５】
従って、候補材料で処理した皮膚細胞からのＭＡＰ１７遺伝子発現レベルの有意な（significant）減少は、候補材料が皮膚バリア機能の向上、皮膚の保湿促進、または皮膚の老化防止に有効に適用され得ること示す。よって、前記ＭＡＰ１７遺伝子の発現レベルにおける変化の検出は、皮膚機能向上用材料のスクリーニングのために有用である。
【００２６】
他の態様においては、フィラグリン遺伝子をマーカーとして使用することもできる。この場合においては、前記スクリーニング方法は、フィラグリン遺伝子の発現レベルにおける変化を検出するためのステップを更に含むことができる。候補材料で皮膚細胞を処理する場合、候補材料の未処理皮膚細胞群と比較して、前記フィラグリン遺伝子発現レベルが増加し得る。
【００２７】
前記フィラグリン遺伝子の発現レベル増加は、皮膚バリア機能の改善に有意な効果を表し得る。前記フィラグリンタンパク質は、転写後修飾（post-transcriptional modification）過程を経て、いくつかの親水性アミノ酸（hydrophilic amino acid）に分解することができる。これらのアミノ酸プール（pool）が天然保湿因子（ＮＭＦ）を構成して、角質層の保湿維持を助長する。しかしながら、フィラグリン遺伝子の突然変異により、皮膚保湿因子の減少、皮膚バリア機能の損傷、皮膚の防御能力低下を起こす可能性があり、ヘルパーＴ細胞群の活性化による、急性（acute）、または慢性炎症（chronic inflammation）の反応が示され得ることが、最近見出された。
【００２８】
これと関連して、本発明者らは、下記実施例を通じて立証されたように、フィラグリン遺伝子の発現が、ＭＡＰ１７遺伝子の発現レベルと関連することを初めて明らかにした。ＭＡＰ１７遺伝子の発現が増加すると、フィラグリン遺伝子の発現レベルは減少し得ることをも、本発明者らは確認した。
【００２９】
前記ＭＡＰ１７の構造は、以下の通りである。アミノ末端（NH３-terminal）には、膜結合性部位（membrane binding site）が存在し、カルボキシ末端（C-terminal）には、ＰＤＺドメイン付着部位（PDZ（post synaptic density protein（PSD９５）,Drosophila disc large tumor suppressor（DlgＡ）、およびzonula occludens-１ protein（zo-１））domain binding site）が存在する。前記ＭＡＰ１７のカルボキシ末端（C-terminal）のＰＤＺドメイン付着部位は、いくつかのタンパク質-タンパク質相互作用（protein-protein interaction）を与える可能性が存在し、これを通じて細胞信号伝達（signaling transduction）が可能である。
【００３０】
本発明者らは、特に、全長ＭＡＰ１７（Full length ＭＡＰ１７）遺伝子が過剰発現された場合に比べて、ＭＡＰ１７遺伝子のＣ末端フラグメント（C-terminal fragment）が過剰発現されると、ＭＡＰ１７遺伝子の発現は更に増大し得えて、且つ、これにより前記フィラグリン遺伝子の発現レベルが著しく減少し得ることを明らかにした。
【００３１】
前記皮膚バリア機能と関連したフィラグリン遺伝子の発現レベルが、ＭＡＰ１７遺伝子の発現によって直接的および／又は間接的に調節され得るため、前記ＭＡＰ１７遺伝子の発現レベル調節もまた、皮膚バリアの改善と密接な関連があり、この発現レベル調節が、皮膚機能向上のための材料の効率的なスクリーニングに効率的に使用できることが確認された。
【００３２】
前記ステップ（c）において、ＭＡＰ１７遺伝子の発現レベルにおける変化を誘導する候補材料を、皮膚機能向上用材料として選択するステップである。
【００３３】
本発明者らは、ＭＡＰ１７遺伝子の発現レベルにおける変化と、皮膚機能向上の関係を確認し、前記ＭＡＰ１７遺伝子を皮膚機能材料のスクリーニングに使用され得るマーカーとして選定した。前記ステップ（c）においては、例えば、皮膚細胞を候補材料で処理した場合、ＭＡＰ１７遺伝子の発現レベルを減少させる候補材料を、皮膚機能向上用材料として選択することができる。
【００３４】
前記皮膚機能向上は、ＭＡＰ１７遺伝子の発現レベルを減少させることによる、例えば、皮膚バリア機能の向上、皮膚の保湿促進、皮膚の老化防止または皮膚トラブルの軽減（amelioration）をも言うことができる。
【００３５】
以下に実施例を記載する。下記の実施例は、本発明を例示するためのものであるに過ぎず、本発明の範囲がこれらのみに限定されることを意図するものではない。
【００３６】
実施例１:炎症関連インターロイキンによるＭＡＰ１７遺伝子の発現変化
ヒトの皮膚新生角質細胞（Human Epidermal Neonatal Keratinocyte Cells）は、商用的に確保され推奨される方法で、ロンザ社（Lonza,Inc.Walkersville,MD,USA）から購入し、継代培養した。これらの細胞をＣＯ２培養器（CO２ incubator）において、３７℃、５％ＣＯ２条件下で細胞を培養した。細胞培養液は、ロンザ社（Lonza, Inc. Walkersville,MD, USA）の指針書に従って、５００mlのＫＢＭ−２（Clonetics CC-３１０３）培地に、ＫＧＭ-２ブレットキット（Bullet kit:ウシ脳下垂体抽出物（BPE: Bovine pituitary extract:２ml）、ヒト上皮成長因子（hEGF: human epidermal growth factor:０.５ml）、インスリン（Insulin:０.５ml）、ヒドロコルチゾン（Hydrocortisone:０.５ml）、トランスフェリン（Transferrin:０.５ml）、エピネフリン（Epinephrine:０.５ml）、ゲンタマイシン硫酸塩＋アムホテリシン-Ｂ（Gentamycin Suflate+Amphotericin-B:GA-１０００, ０.５ml））を添加して調製した。
【００３７】
培養したヒト角質細胞を未処理群（control）として使用した。実験群の場合、ヒト角質細胞培養液にＩＦＮ−γ（２００unit/ml）,ＩＬ−４,ＩＬ−６,ＩＬ−１７Ａ,ＩＬ−１７ＦまたはＩＬ−２２（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加した後、２４時間細胞を培養した。複数のヘルパーＴ細胞（Th）群由来インターロイキンは、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems、Minneapolis, MN, USA）から購入し、製造社の指針書に従って溶液に調製した。
【００３８】
インターロイキン処理２４時間後、１０ｍｌのリン酸塩緩衝液（Phosphate Buffered Saline, PBS）で細胞を２回洗浄し、トライゾール（TRIzol reagent,Invitrogen,Carlsbad, CA, USA）を使用して、細胞内のトータルRNA（total RNA）を分離した。分離されたＲＮＡは、キアゲン社のＲＮＡキット（Qiagen RNeasy kit,Qiagen,Valencia, CA）を使用して再度精製した後、アジレントテクノロジーズ社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Agilent ２１００ BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて、ＲＮＡの質（quality）を確認した。前記分離されたＲＮＡから、インビトロゲン社の逆転写キット（Superscript Reverse Transcriptase（RT）II kit, Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてｃＤＮＡを合成し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（real time-reverse transcription polymerase chain reaction、Q-RT-PCR）法により、ＭＡＰ１７とフィラグリン遺伝子の発現を定量的に分析した。ＭＡＰ１７（Hs００１７３７７９_m１）とヒト角質細胞の分化マーカー遺伝子であるフィラグリン（Hs００８５６９２７_g１）の発現パターンの変化は、アプライドバイオシステムズ社のタックマン遺伝子発現システム（TaqMan Gene Expression Assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて評価し、図１に示した。
【００３９】
図１に示すように、ヘルパーＴ細胞１型（Ｔｈ１）、ヘルパーＴ細胞２型（Ｔｈ２）とヘルパーＴ細胞１７型（Ｔｈ１７）由来の種々のインターロイキンは、共通してＭＡＰ１７遺伝子の発現を確然と増加させる（図１Ａ）。これに対し、それらインターロイキンは、フィラグリン遺伝子の発現を抑制した（図１Ｂ）。
【００４０】
実施例２:ＭＡＰ１７の過剰発現によるフィラグリン遺伝子発現の定量的確認
ＭＡＰ１７遺伝子を有するクローン（Clone id:hmu００１９８８）を、コリア・ユニゲン（KOREA unigene, ２１C Human Gene Bank, Genome Research Center, KRIBB, Deajeon, Korea）で購入した。ＭＡＰ１７遺伝子を哺乳類細胞（Mammalian cell）で発現させるために、ＭＡＰ１７全長遺伝子（Full length, １-３４５ base pair, １１５ amino acid）とカルボキシ末端（Carboxy-terminal）部位（C-terminal fragment, １７７-３４５塩基対, ５５アミノ酸）のみをＰＣＲ（Polymerase chain reaction）法で増幅させた。全長遺伝子（Full length）のアミノ末端（N-terminal）塩基配列に使用されたプライマー（Primer）は、EcoR1制限酵素部位を含め、５’-GAA GAA TTC ATG TCG GCC CTC AGC-３’、カルボキシ末端（Carboxy-terminal）部位（C-terminal fragment）のみを増幅したとき、アミノ末端（N-terminal）塩基配列に使用されたプライマー（Primer）は、EcoRI制限酵素部位を含め、５’-GAA GAA TTC GAG CCT GCA CAC ATG-３’であった。ＭＡＰ１７全長遺伝子（Full length）とカルボキシ末端（Carboxy-terminal）の部位（C-terminal fragment）のカルボキシ末端（Carboxy-terminal）のプライマー（Primer）は、XhoI制限酵素部位を含め、５’-GAA CTC GAG TTA CAT CGG GGT GCT-３’であった。PCR反応混合液は、０.１μgのＤＮＡ鋳型（DNA template）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０.２μMの両方向プライマー（primer）と、０.５ユニットの（unit）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Taq DNA polymerase, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）が使用された（図２Ａ）。
【００４１】
PCR反応条件は、９５℃で１分、１回行い、次いで、９５℃で１分、５５℃で３０秒、７２℃で１分行う過程を３０回繰り返し、７２℃で更に５分行った。PCR反応物は、クイックPCR精製キット（QIA quick PCR purification kit, Qiagen, USA）を用いて精製し、ｐｃＤＮＡ４／Ｈｉｓベクター（pcDNA （登録商標）4/His vector、Invitrogen, Carlsbad, CA）とともに、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限酵素により３７℃で２時間切断した。プラスミド接合（Plasmid Ligation）は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（T４ DNＡ polymerase）を用いて、１６℃で一晩反応させた。プラスミド接合（Plasmid Ligation）の後、反応物は、DH５アルファ（DH５α）細胞に形質転換させ、５０μgml-１のアムピシリン（ampicillin）を含むＬＢアガー（Luria-Bertani (LB） agar）培地で成長させた。育ったコロニー（colony）から新たに組み換えられたプラスミド（plasmid）を準備し、結果はＤＮＡシークエンス（DNA sequencing）法で確認した（図２Ｂ）。
【００４２】
ヒト角質細胞株（HaCaT cell lines, 入手先:Dr.N.E. Fusenig, Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Germany）は、DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）培地に、１０%のＦＢＳ（fetal bovine serum）、１%の抗生物質（antibiotics, Cambrex, Walkersville, MD, USA）培地を用いて、３７℃、５%CO２条件下で細胞を培養した。前記ＨａＣａＴ細胞を６ウェルプレート（６ well plate）に２×１０４cells/cm２の条件で培養し、２４時間後に１μgのＭＡＰ１７全長プラスミド（Full length plasmid）とカルボキシ末端部分プラスミド（Carboxyl-terminal frangment plasmid）をFuGENE６トランスフェクション（FuGENE６ transfection reagent）試薬を用いて、トランスフェクション（transfection）させた。２４時間後、細胞培養液を交換し、トランスフェクション７２時間後に１０mlのリン酸塩緩衝液（Phosphate Buffered Saline, PBS）で細胞を２回洗浄し、トライゾール（TRIzol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて, 細胞内のトータルＲＮＡ（total RNA）を分離した。分離したＲＮＡを、キアゲン社のＲＮＡキット（Qiagen RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して再度精製した後、アジレントテクノロジーズ社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて、ＲＮＡの質（quality）を確認した。インビトロゲン社の逆転写キット（Superscript Reverse Transcriptase（RT）II kit, Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて分離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、これをリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR）法により定量的に分析した。ＭＡＰ１７（Hs００１７３７７９_m１）とヒト角質細胞の分化マーカー遺伝子であるフィラグリン（Hs００８５６９２７_g１）の発現パターンの変化は、アプライドバイオシステムズ社のタックマン遺伝子発現システム（TaqMan Gene Expression Assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて評価し、図３に示した。
【００４３】
図３に見られるように、全長ＭＡＰ１７（Full length ＭＡＰ１７）とカルボキシ末端部位（C-terminal fragment）を過剰発現させたとき、ＭＡＰ１７遺伝子の発現が更に増加することを確認することができる（図３Ａ）。これに対し、全長ＭＡＰ１７（Full length ＭＡＰ１７）よりもカルボキシ末端のＭＡＰ１７（ＭＡＰ１７ C-terminal fragment）を過剰発現させた場合、フィラグリン遺伝子の発現を著しく減少させることを確認することができる（図３Ｂ）。
【００４４】
実施例３:ジンセノイド-Re（Ginsenoid-Re）材料に対するＭＡＰ１７およびフィラグリン遺伝子の発現調節の確認
種々のヒト角質細胞の種々の材料で処理してＭＡＰ１７とフィラグリン遺伝子との発現の違いを確認し、高麗人参の実由来ジンセノイドの一つであるジンセノサイド-Re（Ginsenoside-Re）材料を通じてＭＡＰ１７およびフィラグリン遺伝子の発現調節を確認した。ヒトの皮膚角質細胞は、ロンザ社（Lonza, Inc.Walkersville, MD, USA）から購入し、３７℃、５％ＣＯ２条件下、CO２培養器（CO２ incubator）でＫＢＭ−２（Clonetics CC-３１０３）培地に培養した。
【００４５】
ヒト角質細胞を培養した未処理群（control）と実験群の場合、ヒト角質細胞培養液にジンセノサイド−Ｒｅ（１０μm）を添加し、細胞を２４時間培養した。ジンセノサイド-Reは、和光純薬工業（神奈川、日本）で購入し、製造社の指針書に従って溶液に調製してから使用した。ジンセノサイド-Re処理２４時間後、１０mlのリン酸塩緩衝液（Phosphate Buffered Saline, PBS）で細胞を２回洗浄し、トライゾール（TRIzol reagent, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を使用して、細胞内のトータルＲＮＡ（total RNA）を分離した。
【００４６】
分離したＲＮＡをキアゲン社のＲＮＡキット（Qiagen RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA）を使用して再度精製した後、アジレントテクノロジーズ社のバイオアナライザー２１００モデル機器（Agilent 2100 BioAnalyzer, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）を用いて、ＲＮＡの質（ｑｕａｌｉｔｙ）と濃度を確認した。前記分離されたＲＮＡから、インビトロゲン社の逆転写キット（Superscript Reverse Transcriptase（RT）II kit, Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてｃＤＮＡを合成し、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR）法により遺伝子の発現変化を定量的に分析した。ＭＡＰ１７（Hs００１７３７７９_m１）とフィラグリン（Hs００８５６９２７_g１）の発現パターンの変化は、アプライドバイオシステムズ社のタックマン遺伝子発現システム（TaqMan Gene Expression Assay kit, Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて評価し、図４に示した。
【００４７】
図４に見られるように、ジンセノサイド-Reは、ヒト角質細胞において、ＭＡＰ１７遺伝子の発現を確然と減少させる（図４Ａ）。これに対し、前記ジンセノサイド-Reは、ヒト角質細胞において、フィラグリン遺伝子の発現を増加させることを確認した（図４Ｂ）。
【００４８】
本発明が属する分野における通常の知識を有する者であれば、前記内容を基に、本発明の範疇内において種々の応用および変形を行うことが可能であろう。
【図１】
0005457459.tif 000002
【図２Ａ】
0005457459.tif 000003
【図２Ｂ】
0005457459.tif 000004
【図３】
0005457459.tif 000005
【図４】
0005457459.tif 000006
【配列表】
0005457459000001.app