(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物を含む、薬学的組成物：
0005568484.tif 000085
式中、
Ｘ１はＲ１−Ｙ１−Ａ−であり；
Ｘ２は−Ｚ１−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）２であり；
Ｘ３は水素であり；
Ａは直接結合、またはｌが１〜３０の整数である（ＣＨ２）ｌであり；
Ｙ１はｌが１〜３０の整数である（ＣＨ２）ｌであり；
Ｚ１は酸素であり；
Ｑ１およびＱ２はＨ２、＝ＮＲ４、＝Ｏおよび、Ｈと−ＮＲ５Ｒ６との組み合わせからなる群より独立して選択され；
Ｒ１は独立して、鎖内の隣接する炭素により部分的に形成される１つもしくは複数のシクロアルキルを含む直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、または鎖内の隣接する炭素により部分的に形成される１つもしくは複数のシクロアルキルを含む直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニルであり；かつ
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立して、水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニルである。
【請求項２】
シクロアルキルがシクロプロピルである、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物を含む、薬学的組成物：
0005568484.tif 000086
式中、
Ｘ１はＲ１−Ｙ１−Ａ−であり；
Ｘ２は（ＨＯ）（ＢＨ３）ＰＯ−Ｚ１−であり；
Ｘ３は水素であり；
Ａは直接結合、またはｌが１〜３０の整数である（ＣＨ２）ｌであり；
Ｙ１はｌが１〜３０の整数である（ＣＨ２）ｌであり；
Ｚ１は酸素であり；
Ｑ１およびＱ２はＨ２、＝ＮＲ４、＝Ｏおよび、Ｈと−ＮＲ５Ｒ６との組み合わせからなる群より独立して選択され；
Ｒ１は独立して、鎖内の隣接する炭素により部分的に形成されるシクロアルキルを含んでもよい直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、または鎖内の隣接する炭素により部分的に形成されるシクロアルキルを含んでもよい直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニルであり；かつ
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は独立して、水素、直鎖もしくは分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３０アルキル、または直鎖もしくは分岐鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニルである。
【請求項４】
シクロアルキルがシクロプロピルである、請求項３記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2008年3月3日出願の先に出願した米国仮特許出願第61/033,386号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、リゾホスファチジン酸(LPA)受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとしての活性を有する組成物、およびその使用のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
リゾホスファチジン酸(LPA)は、神経因性疼痛、ヒト歯根膜線維芽細胞の治癒応答、創傷治癒、放射線損傷、免疫細胞分化、細胞増殖、細胞生存および細胞遊走といった多様な代謝応答を調節する。リゾホスファチジン酸受容体が同定されており、これらの作用の一部は、LPAが結合する特異的な受容体に相関しているようである。例えば、本発明者らがLPAアゴニストまたはアンタゴニストとして同定した分子について本発明者らが既に同定した用途としては、オレオイルチオホスフェートが放射線防護剤または放射線緩和剤として与える利点がある。したがって、受容体特異的アゴニストおよびアンタゴニストを用いてLPA関係の代謝経路を調節することは、いくつかの疾患状態の治療薬を開発する刺激的な機会を与える。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、式(I)に係る化合物に関する:
0005568484.tif 000002
式中、
X1、X2およびX3のうち少なくとも1つは(HO)2PS-Z1-、(HO)(BH3)PO-Z1-または(HO)2PO-Z2-P(OH)S-Z1-であり、X1およびX2は-O-PS(OH)-O-として一緒に結合し、あるいはX1およびX3は-O-PS(OH)-NH-として一緒に結合し;
X1、X2およびX3のうち少なくとも1つはR1-Y1-A-であり、X1、X2およびX3のうち2つがR1-Y1-A-である場合、各々同一であるかまたは異なっており、あるいはX2およびX3は-N(H)-C(O)-N(R1)-として一緒に結合し;
X1、X2およびX3のうち1つはHであってもよく;
Aは直接結合、kが0〜30の整数である(CH2)k、またはOのいずれかであり;
Y1はlが1〜30の整数である-(CH2)l-、-O-、-S-、
0005568484.tif 000003
または-NR2-であり;
Z1はmが1〜50の整数である-(CH2)m-、-CF2-、-CF2(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-、-C(R3)H-、-NH-、-O-または-S-であり;
Z2はnが1〜50の整数である-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-、または-O-であり;
Q1およびQ2は独立してH2、=NR4、=O、またはHと-NR5R6との組み合わせであり;
R1は、X1、X2またはX3の各々について、独立して水素、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環の一置換基、二置換基もしくは三置換基を有するかもしくは有さない芳香環もしくは芳香族複素環、C1〜C30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
0005568484.tif 000004
であり;
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、独立して水素、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環の一置換基、二置換基もしくは三置換基を有するかもしくは有さない芳香環もしくは芳香族複素環、C1〜C30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、あるいは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【０００５】
薬学的に許容される担体および本発明の化合物を含む薬学的組成物も開示される。
【０００６】
本発明のさらなる局面は、LPA受容体に対するLPA活性を阻害する方法であって、LPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、およびLPA受容体のLPA誘導性活性を阻害するために有効な条件下でLPA受容体と化合物とを接触させる段階を含む方法に関する。
【０００７】
本発明の別の局面は、LPA受容体活性を調節する方法であって、LPA受容体アゴニストまたはLPA受容体アンタゴニストのいずれかとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、およびLPA受容体の活性を調節するために有効な条件下でLPA受容体と化合物とを接触させる段階を含む方法に関する。
【０００８】
本発明のさらに別の局面は、がんを処置する方法であって、本発明の化合物を与える段階、およびがんを処置するために有効な様式で患者に有効量の化合物を投与する段階を含む方法に関する。
【０００９】
本発明のさらに別の局面は、細胞増殖を強化する方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、および細胞のLPA受容体誘導性増殖を強化するために有効な様式で細胞上のLPA受容体と化合物とを接触させる段階を含む方法に関する。
【００１０】
本発明のさらなる局面は、創傷を処置する方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、および創傷部位に有効量の化合物を送達する段階を含む方法に関し、化合物は、創傷の治癒を促進する細胞上のLPA受容体に結合し、それによりLPA受容体アゴニスト誘導性細胞増殖を刺激して創傷治癒を促進する。細胞および組織に対する放射線損傷を予防または緩和するための方法も提供され、本発明の化合物が有効な放射線防護剤または放射線緩和剤であることがわかっている。
【００１１】
本発明のさらなる局面は、本発明の化合物を作製する方法に関する。本発明の化合物を作製するための1つのアプローチは、
Z11が、mが1〜50の整数である-(CH2)m-、CF2-、-CF2(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-、-C(R3)H-、-NH-または-S-であり;
Z12が、nが1〜50の整数である-(CH2)n-もしくは-(CH2)n-、または-O-であり、
Z13がHまたは第1の脱離基であり、あるいは-Z11-Z13が一緒になって第1の脱離基を形成し;かつ
Y2がHまたは保護基である、
(Y2O)2PO-Z11-Z13または(Y2O)2PO-Z12-P(OH)-O-Z11-Z13と、
式(IX)に係る中間体化合物とを硫黄の存在下で反応させる工程であって、
0005568484.tif 000005
式中、
X11、X12およびX13のうち少なくとも1つがR11-Y11-A-であり、X11、X12およびX13のうち2つがR11-Y11-A-である場合、各々同一であるかまたは異なっており、あるいはX12およびX13が-N(H)-C(O)-N(R11)-として一緒に結合し;
X11、X12およびX13のうち少なくとも1つがOH、NH2、SHまたは第2の脱離基であり;
X11、X12およびX13のうち1つがHであってもよく;
Aが直接結合、kが0〜30の整数である(CH2)k、またはOのいずれかであり;
Y11が、lが1〜30の整数である-(CH2)l-、-O-、
0005568484.tif 000006
-S-または-NR12-であり;
Q1およびQ2が独立してH2、=NR13、=O、Hと-NR14R15との組み合わせであり;
R11が、X11、X12またはX13の各々について、独立して水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、
と、環の一置換基、二置換基もしくは三置換基とを有するかもしくは有さない芳香環もしくは芳香族複素環、C1〜C30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
であり;
R12、R13、R14、R15、R16およびR17が、独立して水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環の一置換基、二置換基もしくは三置換基を有するかもしくは有さない芳香環もしくは芳香族複素環、C1〜C30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、あるいは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルである工程; 続いて必要に応じての脱保護工程を含み、前記反応工程および脱保護工程はいずれも、X1、X2およびX3のうち1つまたは2つが(HO)2PS-Z1-または(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-である式(I)に係る化合物を与えるために有効な条件下で行われる。
【００１２】
本発明のさらに別の局面は、アポトーシスを処置するかまたは細胞、組織もしくは臓器中の機能を保存もしくは回復する方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階; および細胞、組織もしくは臓器と、アポトーシスを処置するかまたは細胞、組織もしくは臓器中の機能を保存もしくは回復するために有効な量の化合物とを接触させる段階を含む方法に関する。
【００１３】
本発明のさらなる局面は、細胞を培養する方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有しかつ培養中にアポトーシスを予防するかまたは細胞を保存するために有効な量で存在する、本発明の化合物を含む培養培地中で、細胞を培養する段階を含む方法に関する。
【００１４】
本発明の別の局面は、臓器または組織を保存する方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階; および臓器または組織の機能を保存するために有効な量で化合物を含む溶液で臓器または組織を処置する段階を含む方法に関する。
【００１５】
本発明の関係する局面は、臓器または組織を保存する代替的な方法であって、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階; および臓器または組織の機能を保存するために有効な量の化合物を、移植された臓器または組織のレシピエントに投与する段階を含む方法に関する。
【００１６】
本発明のさらなる局面は、皮膚科学的状態を処置する方法であって、LPA受容体アゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階; および皮膚科学的状態を処置するために有効な量で存在する化合物を含む組成物を患者に局所投与する段階を含む方法に関する。
【００１７】
1つまたは複数のLPA受容体のアゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであるとして本明細書において同定されている本発明の化合物は、LPA受容体シグナル伝達が媒介する生化学的経路をそれぞれ阻害または強化するための用途を見出す。LPA受容体シグナル伝達を調節することで、アンタゴニストおよびアゴニストは、本明細書に記載の特異的かつ実質的な用途を見出す。
[本発明1001]
式(I)の化合物を含む組成物:
0005568484.tif 000007
式中、
X1はR1-Y1-A-であり;
X2は-Z1-P(S)(OH)2であり;
X3は水素であり;
Aは直接結合、またはlが1〜30の整数である(CH2)lであり;
Y1はlが1〜30の整数である(CH2)lであり;
Z1は酸素であり;
Q1およびQ2はH、=NR4、=Oまたは-NR5R6からなる群より独立して選択され;
R1は独立して、1つもしくは複数のシクロアルキルで置換されている直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、または1つもしくは複数のシクロアルキルで置換されている直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニルであり;かつ
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8は独立して、水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、または直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニルである。
[本発明1002]
シクロアルキルがシクロプロピルである、本発明1001の組成物。
[本発明1003]
式(I)の化合物を含む組成物:
0005568484.tif 000008
式中、
X1はR1-Y1-A-であり;
X2は(HO)(BH3)PO-Z1-であり;
X3は水素であり;
Aは直接結合、またはlが1〜30の整数である(CH2)lであり;
Y1はlが1〜30の整数である(CH2)lであり;
Z1は酸素であり;
Q1およびQ2はH、=NR4、=Oまたは-NR5R6からなる群より独立して選択され;
R1は独立して、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、またはシクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニルであり;かつ
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8は独立して、水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、または直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニルである。
[本発明1004]
シクロアルキルがシクロプロピルである、本発明1003の組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】脂肪酸ホスフェート(スキーム1)、脂肪酸チオホスホネート(スキーム2)およびジフルオロホスホネート(スキーム3)の調製に使用する3つの反応スキームを示す。
【図２】図2A〜Cは、オレオイルチオホスフェート(8g)が、RH7777細胞中で発現されるLPA1、LPA2およびLPA3受容体におけるアゴニストであることを示すグラフである。細胞内Ca2+トランジエントを、増加する濃度の8gの適用に応答して測定し、対応する量のLPA 18:1が誘発するトランジエントと比較した。データ点は4つの測定値の平均を表す。用量反応関係を、LPA1(図2A)、LPA2(図2B)およびLPA3(図2C)を発現するRH7777細胞中のLPA 18:1および8gについて示す。Y軸: 最大LPA応答のパーセント±標準偏差として表すカルシウム動員。X軸: 濃度(nM)。白丸はLPA 18:1についての結果を示し、正方形はオレオイルチオホスフェート(OTP、化合物8g)についての結果を示す。
【図３】FAP 18:1d9チオホスフェート(8g)が陰窩生存を強化することを示すグラフである。
【図４】FAP 18:1d9処置マウスにおける陰窩生存の用量依存的強化を示すグラフである。
【図５】FAP 18:1d9がγ照射マウスの回腸および空腸における用量依存的陰窩生存を誘発することを示すグラフである。
【図６】Y1もアルキルである場合にアリールアルキルR1基を含むチオリン酸エステルを調製するための合成スキームを示す。
【図７】カンプトテシン誘導性IEC-6細胞における指示された化合物を評価する、実施例11に記載のDNA断片化アッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明の一局面は、式(I)に係る化合物に関する:
0005568484.tif 000009
式中、
X1、X2およびX3のうち少なくとも1つは(HO)2PS-Z1-、(HO)(BH3)PO-Z1-または(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-であり、X1およびX2は-O-PS(OH)-O-として一緒に結合し、あるいはX1およびX3は-O-PS(OH)-NH-として一緒に結合し;
X1、X2およびX3のうち少なくとも1つはR1-Y1-A-であり、X1、X2およびX3のうち2つがR1-Y1-A-である場合、各々同一であるかまたは異なっており、あるいはX2およびX3は-N(H)-C(O)-N(R1)-として一緒に結合し;
X1、X2およびX3のうち1つはHであってもよく;
Aは直接結合、kが0〜30の整数である(CH2)k、または-O-のいずれかであり;
Y1はlが1〜30の整数である-(CH2)l-、-O-、
0005568484.tif 000010
-S-または-NR2-であり;
Z1はmが1〜50の整数である-(CH2)m-、-CF2-、-CF2(CH2)m-もしくは-O(CH2)m-、-C(R3)H-、-NH-、-O-または-S-であり;
Z2はnが1〜50の整数である-(CH2)n-もしくは-O(CH2)n-、または-O-であり;
Q1およびQ2は独立してH2、=NR4、=O、Hと-NR5R6との組み合わせであり;
R1は、X1、X2またはX3の各々について、独立して水素、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環の一置換基、二置換基もしくは三置換基を有するかもしくは有さない芳香環もしくは芳香族複素環、C1〜C30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
0005568484.tif 000011
であり;
R2、R3、R4、R5、R6、R7およびR8は、独立して水素、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、シクロアルキルで置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環の一置換基、二置換基もしくは三置換基を有するかもしくは有さない芳香環もしくは芳香族複素環、C1〜C30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、あるいは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【００２０】
上記で同定したR基(例えばR1〜R8)の各々について、直鎖アルキルは式-(CH2)xCH3を有し、式中、xは0〜29であり、分岐鎖アルキルは、1つまたは複数のCH2基がCHW基で置き換えられていることを除けば直鎖アルキルについて上記定義の通りである式を有し、式中、Wはアルキル側鎖であり、直鎖アルケニルは式-(CH2)XaCH=CH(CH2)XbCH3を有し、式中、XaおよびXbは各々0〜27であり、(Xa+Xb)は27を超えず、分岐鎖アルケニルは、1つまたは複数のCH2基がCHW基で置き換えられているかまたはCH基がCW基で置き換えられていることを除けば直鎖アルケニルについて上記定義の通りである式を有し、式中、Wはアルキル側鎖である。好ましい炭化水素基は、長さが約8個〜約18個の炭素原子であることが好ましく、長さが約10個〜約16個の炭素原子であることがより好ましく、1つまたは複数の二重結合を含み得る。1個または複数のシクロアルキル置換基を含んでいてもよいアルキルおよびアルケニルは、表4のRxBVG-I-93、RxBVG-II-93、RxBVG-II-22、RxBVG-II-23、RxBVG-II-34、RxBVG-II-35、RxBVG-II-36およびRxBVG-II-37の構造に示す、鎖の一部として1つまたは複数のシクロプロピル環(すなわち、鎖内の隣接する炭素により部分的に形成されるシクロプロピルなどのシクロアルキル)を含むアルキルおよび/またはアルケニル直鎖または分岐鎖を包含するように意図される。
【００２１】
芳香環または芳香族複素環としては、フェニル、インデン、ピロール、イミダゾール、オキサゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、ピロリジン、ピペリジン、チオフェン、フラン、ナフタール(napthal)、ビフェニルおよびインドールが挙げられるがそれに限定されない。芳香環または芳香族複素環は、環がR1-Y1-A-鎖のY1基に結合する場所に対する環上のオルト位、メタ位またはパラ位に位置する、環の一置換基、二置換基または三置換基を含み得る。環上の置換基としてはアルキル、アルコキシ、アミン(二級または三級アミンを含む)、アルキルアミン、アミド、アルキルアミド、酸、アルコールを挙げることができるがそれに限定されない。
【００２２】
アシル基は、アルキル、アルケニルまたは先に記載の芳香環もしくは芳香族複素環のいずれかを含み得る。
【００２３】
アリールアルキル基およびアリールオキシアルキル基としては、先に記載の直鎖または分岐鎖C1〜C30アルキル基を挙げることができるがそれに限定されず、該アルキル基はR1-Y1-A-鎖のY1基に結合している。
【００２４】
式(I)に係る例示的化合物としては、下記式(II)〜(VII)に係るサブクラス化合物がある。
【００２５】
式(II)Aおよび(II)Bの構造において、Q1およびQ2はいずれもH2であり; X1、X2およびX3のうち1つは(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-であり、Z1およびZ2はOであり; X1、X2およびX3のうち2つはR1-Y1-A-であり、各々、Aは直接結合であり、Y1はOである。各R1は独立して式(I)について上記定義の通りである。
0005568484.tif 000012
【００２６】
式(III)の構造において、Q1はH2であり; Q2 は-O-であり: X1は(HO)2PO-Z1-であり、Z1はOであり; X2およびX3はR1-Y1-A-であり、各々、Aは直接結合であり、Y1は-NH-である。各R1は独立して式(I)について上記定義の通りである。式IIIの範囲内の好ましい種は、X3が-NH2であり、X2が-NHR1であり、R1がC10〜C18アルキル、より好ましくはC14アルキルもしくはC18アルキルのいずれかである種; または、X3が-NHR1であり、R1がアセチル基であり、X2が-NHR1であり、R1がC14アルキル基である種である。
0005568484.tif 000013
【００２７】
式(IV)の構造において、Q1は=NR4であり; Q2はH2であり; X1およびX2は-O-PO(OH)-O-として一緒に結合し; X3はR1-Y1-A-であり、Aは直接結合であり、Y1は-NH-である。R1およびR4は式(I)について上記定義の通りである。
0005568484.tif 000014
【００２８】
式(V)Aおよび(V)Bの構造において、Q1およびQ2はいずれもH2であり; X1、X2およびX3のうち2つは(HO)2PO-Z1-であり、各々、Z1はOであり; X1、X2およびX3のうち1つはR1-Y1-A-であり、Aは直接結合であり、Y1は-O-である。R1は式(I)について上記定義の通りである。式(V)Aおよび(V)Bの範囲内の好ましい種としては、R1がC21アルキルを含むアシルである化合物、またはR1がC18アルキルである化合物が挙げられる。
0005568484.tif 000015
【００２９】
式(I)に係る化合物、ならびに式(II)A、(II)B、(III)、(IV)、(V)Aおよび(V)Bに係る亜属化合物は、ホスホロアミデートまたはピロホスフェートを硫黄の存在下で(還流させながら)反応させてチオ置換誘導体を得ることができることを除けば、2001年3月19日出願のPCT/US01/08729(その全体が参照により組み入れられる)に記載の合成スキームを用いて調製することができる。
【００３０】
式(VI)に係る化合物において、Q1およびQ2はいずれもH2であり; X1およびX2のうち1つは(HO)2PS-Z1-であり、Z1はOであり; X1、X2およびX3のうち1つはR1-Y1-A-であり、Aは直接結合であり、Y1は-CH2-である。R1は式(I)について上記定義の通りである。好ましいR1基は、直鎖と分岐鎖との両方の飽和および不飽和C2〜C24炭化水素、ならびにC2〜C24炭化水素を含むアリールアルキル基であり、最も好ましいR1基は、飽和および不飽和C4〜C18炭化水素である。式VIに係る好ましい化合物はチオリン酸O-オクタデカ-9-エニルエステル(8g; FAP 18:1d9とも呼ぶ)である。
0005568484.tif 000016
【００３１】
式(VI)に係るチオホスホネートの合成を図1のスキーム2で概説する。保護チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-アルキル/アルケニルエステルはHaines et al.(1996)の方法を修正したものを用いて合成することができる。市販の脂肪アルコール(6a-g)を無水塩化メチレン中で1H-テトラゾールとビス(2-シアノエチル)-N,Nジイソプロピルホスホロアミダイトとの混合物により処理した後、元素硫黄の存在下で還流させて、ビス-シアノエチル保護脂肪アルコールチオホスフェート(7a-g)を得ることができる。これらの保護チオホスフェートをメタノール性KOHで処理した後、酸性化して所要のチオホスフェート(8a-g)を得ることができる。
【００３２】
式(VII)Aおよび(VII)Bの構造において、Q1およびQ2はいずれもH2であり; X1、X2およびX3のうち1つは(HO)2PS-Z1-であり、Z1はOであり; X1、X2およびX3のうち2つはR1-Y1-A-であり、各々、Aは直接結合であり、Y1はOである。各R1は独立して式(I)について上記定義の通りである。
0005568484.tif 000017
【００３３】
好ましいR1基は、直鎖と分岐鎖との両方の飽和および不飽和C6〜C24炭化水素であり、最も好ましいR1基は、飽和および不飽和C8〜C18炭化水素である。(VII)A基に係る2つの好ましい化合物は、R1基がいずれも飽和オクチル基である(R)および(S)鏡像異性体である。(R)鏡像異性体は部分LPA1アゴニスト(EC50: 695nM)、トランジエント部分LPA2アゴニスト(EC50: 1.02μM)および完全LPA3(EC50: 3nM)アゴニストである。(S)鏡像異性体はLPAおよびLPA3受容体のアゴニストである(LPA1についてIC50 328nM、LPAについてIC50 184nM(いずれも200nM LPA))。
【００３４】
式(VII)Aおよび(VII)Bの化合物は、ホスホロアミデートを硫黄の存在下で(還流させながら)反応させてチオ置換誘導体を得ることができることを除けば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2001年3月19日出願のPCT/US01/08729に記載の合成スキームを用いて調製することができる。
【００３５】
式(VIII)に係る化合物において、Q1およびQ2はいずれもH2であり; X1およびX2のうち1つは(HO)2PS-Z1-であり、Z1はCF2であり; X1、X2およびX3のうち1つはR1-Y1-A-であり、Aは直接結合であり、Y1は-CH2-である。R1は式(I)について上記定義の通りである。
0005568484.tif 000018
【００３６】
好ましいR1基は、直鎖と分岐鎖との両方の飽和および不飽和C2〜C20炭化水素であり、最も好ましいR1基は、飽和および不飽和C4〜C12炭化水素である。
【００３７】
式(VIII)に係るジフルオロチオホスホネートの合成を図1のスキーム3で概説する。テトラデシルジフルオロホスホネート類似体を2つの工程(スキーム3)で、ジエチルジフルオロメタンホスホネートを出発原料として用いて合成した。ジエチルジフルオロメタンホスホネートをLDAにより-78℃で処理した後、アニオンとテトラデシルブロミドとを反応させて保護ホスホネート10を得た。ブロモトリメチルシランを用いて化合物10を脱保護して所要のジフルオロホスホネート化合物(11)を得た。
【００３８】
したがって、本発明の非環式化合物は、Z11が、mが1〜50の整数である-(CH2)m、-CF2-、-CF2(CH2)mもしくは-O(CH2)m-、-C(R3)H-または-O-であり、Z12が、nが1〜50の整数である-(CH2)n-もしくは-(CH2)n-、または-O-であり、Z13がHまたは第1の脱離基であり、あるいは-Z11-Z13が一緒になって第1の脱離基を形成し、Y2がHまたは保護基である、(Y2O)2PO-Z11-Z13、(Y2O)2PO-Z12-P(OH)S-Z11-Z13と、式(IX)に係る中間体化合物とを硫黄の存在下で反応させる工程、続いて必要に応じての脱保護工程により調製することができ、いずれも、X1、X2およびX3のうち1つまたは2つが(HO)2PS-Z1-または(HO)2PS-Z2-P(OH)S-Z1-であり、Z1およびZ2が上記定義の通りである、式(I)に係る化合物を与えるために有効な条件下で行われる。
【００３９】
式(IX)の中間体化合物は以下の構造を有する:
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式中、
X11、X12およびX13のうち少なくとも1つはR11-Y11-A-であり、X11、X12およびX13のうち2つがR11-Y11-A-である場合、各々同一であるかまたは異なっており、あるいはX12およびX13は-N(H)-C(O)-N(R11)-として一緒に結合し;
X11、X12およびX13のうち少なくとも1つはOH、NH2、SHまたは第2の脱離基であり;
X11、X12およびX13のうち1つはHであってもよく;
Aは直接結合、kが0〜30の整数である(CH2)k、またはOのいずれかであり;
Y11はlが1〜30の整数である-(CH2)l-、-O-、
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-S-または-NR11R12-であり;
Q1およびQ2は独立してH2、=NR13、=O、Hと-NR14R15との組み合わせであり;
R11は、X11、X12またはX13の各々について、独立して水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環の一置換基、二置換基もしくは三置換基を有するかもしくは有さない芳香環もしくは芳香族複素環、C1〜C30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキル、
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であり;
R12、R13、R14、R15、R16およびR17は、独立して水素、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキル、直鎖もしくは分岐鎖C2〜C30アルケニル、環の一置換基、二置換基もしくは三置換基を有するかもしくは有さない芳香環もしくは芳香族複素環、C1〜C30アルキルまたは芳香環もしくは芳香族複素環を含むアシル、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールアルキル、あるいは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C30アルキルを含むアリールオキシアルキルである。
【００４０】
本発明のLPA受容体アゴニストおよびアンタゴニストを調製した後で、そのような化合物を使用して、患者の処置に好適な以下に記載の薬学的組成物を調製することができる。したがって、本発明のさらなる局面は、薬学的に許容される担体および本発明の化合物を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、好適な賦形剤または安定剤も含み得るものであり、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁液剤または乳剤などの固体形態または液体形態であり得る。典型的には、組成物は約0.01〜99パーセント、好ましくは約20〜75パーセントの活性化合物を担体、賦形剤、安定剤などと共に含む。
【００４１】
固体単位剤形は慣行的な種類のものであり得る。固体形態は、本発明の化合物ならびに担体、例えば潤滑剤、およびラクトース、スクロースまたはコーンスターチなどの不活性充填剤を含む、普通のゼラチン型などのカプセル剤であり得る。別の態様では、これらの化合物を、ラクトース、スクロースまたはコーンスターチなどの慣行的な錠剤基剤と、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンのような結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはアルギン酸などの崩壊剤、およびステアリン酸またはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤との組み合わせによって錠剤化する。
【００４２】
本発明の化合物は、薬学的担体を伴う生理学的に許容される希釈剤中のこれらの材料の溶液または懸濁液による注射用剤形または局所適用剤形として投与することもできる。そのような担体としては、界面活性剤、および補助剤、賦形剤または安定剤を含む他の薬学的かつ生理学的に許容される担体の添加を伴うかまたは伴わない、水および油などの滅菌液体が挙げられる。例示的な油としては、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、大豆油または鉱油がある。一般に、水、生理食塩水、ブドウ糖および関係する糖の水溶液、ならびにプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが、特に注射液剤用に好ましい液体担体である。
【００４３】
エアロゾルとしての使用では、溶液または懸濁液中の本発明の化合物を、慣行的な補助剤を伴う好適な噴霧剤、例えばプロパン、ブタンまたはイソブタンのような炭化水素噴霧剤と共に、加圧エアロゾル容器中に包装することができる。本発明の材料は、ネブライザーまたはアトマイザー中などの非加圧形態で投与することもできる。
【００４４】
実行される処置に応じて、本発明の化合物を経口的に、局所的に、経皮的に、非経口的に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、鼻腔内滴下により、腔内もしくは膀胱内滴下により、眼内に、動脈内に、病巣内に、または鼻、咽頭および気管支の粘膜などの粘膜に対する適用により、投与することができる。
【００４５】
本発明の範囲内の組成物は、本発明の化合物がその意図される目的を実現するために有効な量で含まれるすべての組成物を含む。個々の必要は異なるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当技術分野の技能の範囲内である。典型的な投与量は約0.01〜約100mg/kg体重を含む。好ましい投与量は約0.1〜約100mg/kg体重を含む。最も好ましい投与量は約1〜約100mg/kg体重を含む。本発明の化合物の投与のための処置レジメンも、当業者は容易に決定することができる。
【００４６】
本発明のある種の化合物がLPA受容体のアゴニストとして有用であることがわかっている一方、本発明の他の化合物はLPA受容体のアンタゴニストとして有用であることがわかっている。各種化合物は、それらの活性の差により、異なる用途を見出す。本発明の好ましい動物対象は哺乳動物である。本発明はヒト対象の処置に特に有用である。
【００４７】
本発明の一局面は、LPA受容体活性を調節する方法であって、LPA受容体アゴニストまたはLPA受容体アンタゴニストのいずれかとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、およびLPA受容体の活性を調節するために有効な条件下でLPA受容体と化合物とを接触させる段階を含む方法に関する。
【００４８】
LPA受容体アゴニストは、LPA受容体からのLPA様活性を特徴的に誘導し、これは、例えば卵母細胞中のCa2+もしくはCl-電流により化学的に、または細胞形態、細胞移動度、細胞増殖などの変化を検査することで測定可能である。対照的に、LPA受容体アンタゴニストは、LPA受容体からのLPA様活性を特徴的に遮断する。これも、例えば卵母細胞中のCa2+もしくはCl-電流により化学的に、または細胞形態、細胞移動度、細胞増殖などの変化を検査することで測定可能である。
【００４９】
LPA受容体アンタゴニストとして作用する本発明の化合物によって、本発明はまた、LPA受容体に対するLPA誘導性活性を阻害する方法に関する。この方法は、LPA受容体アンタゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、およびLPA受容体のLPA誘導性活性を阻害するために有効な条件下でLPA受容体と化合物とを接触させる段階を含む。LPA受容体は、受容体を正常に発現するかまたは受容体を非相同的に発現する細胞上に存在する。LPA受容体と本発明の化合物とを接触させる段階はインビトロまたはインビボのいずれかで行うことができる。
【００５０】
本発明の一局面は、がんを処置する方法であって、本発明の化合物を与える段階、およびがんを処置するために有効な様式で患者に有効量の化合物を投与する段階を含む方法に関する。本発明の化合物で処置可能ながんの種類としては、その挙動がLPA媒介性活性に少なくとも部分的に起因し得るがん細胞を特徴とするがんが挙げられる。典型的には、これらの種類のがんは、1つまたは複数の種類のLPA受容体を発現するがん細胞を特徴とする。がんの例示的な形態としては前立腺がん、卵巣がんおよび膀胱がんが挙げられるがそれに限定されない。
【００５１】
がんの処置に特に有用な本発明の化合物はLPA受容体アンタゴニストである。
【００５２】
本発明の化合物を投与する場合には、全身投与することができ、あるいは、がん細胞が存在する特定部位に直接投与することもできる。したがって、がん細胞に化合物を送達するために有効な任意の様式で投与を達成することができる。LPA受容体アンタゴニストは、LPA受容体に結合する時点で、がん細胞の増殖もしくは転移を阻害するかまたはそれらのがん細胞を破壊する。本発明者らが合成したいくつかのLPAアンタゴニスト化合物は、先に記載の種類の1つまたは複数のLPA受容体を発現する前立腺がん細胞系に対して細胞毒性があることが実証されている。
【００５３】
本発明のLPAアンタゴニスト化合物または薬学的組成物を投与してがんを処置する場合、薬学的組成物は、各種のがんの処置用で現在公知であるかまたは今後開発される他の治療薬または処置レジメンも含み得るか、またはそれらとの組み合わせで投与することができる。
【００５４】
がん浸潤は、個々の細胞または細胞集団が原発腫瘍から離れ、体循環またはリンパ管に到達して異なる臓器に拡散するという、複雑な多段階プロセスである。がん細胞は、その浸潤に血清因子を必要とし、LPAは、無血清系内の腫瘍細胞浸潤可能性を回復できる重要な血清成分である。
【００５５】
本発明の別の局面は、細胞増殖を強化する方法に関する。細胞増殖を強化するこの方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、および細胞のLPA受容体誘導性増殖を強化するために有効な様式で細胞上のLPA受容体と化合物とを接触させる段階を含む。
【００５６】
がん細胞活性の調節においてLPAが果たす役割に加えて、LPAが自然創傷治癒における生理学的役割も有することを示唆する強力な証拠が存在する。創傷部位では、活性化した血小板に由来するLPAは、損傷および炎症の部位での細胞増殖を、おそらくは他の血小板由来因子と同期して刺激することを、少なくとも部分的に担っていると考えられる。LPAは単独で血小板凝集を刺激することができ、血小板凝集は、初期凝集応答に対する正のフィードバックの要素を開始させる因子であり得る。
【００５７】
細胞増殖におけるLPAの役割を理由として、LPA受容体アゴニスト活性を有する化合物を、創傷治癒を促進するために有効な様式で使用することができる。したがって、本発明の別の局面は、創傷を処置する方法に関する。この方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、および創傷部位に有効量の化合物を送達する段階により行われ、化合物は、創傷の治癒を促進する細胞上のLPA受容体に結合し、それによりLPA受容体アゴニスト誘導性細胞増殖を刺激して創傷治癒を促進する。
【００５８】
創傷治癒に有効な本発明の化合物は、組み合わせで、すなわち本発明の薬学的組成物として投与するか、または異なる経路を経由して、抗菌薬、抗ウイルス薬、抗真菌薬、抗寄生虫薬、抗炎症薬、鎮痛薬、鎮痒薬もしくはその組み合わせからなる群より選択される薬物と共に同時投与することもできる。
【００５９】
創傷治癒では、好ましい投与形式は局所経路によるものである。しかし、代わりにまたは同時に、薬剤を非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路または経皮経路で投与することができる。代わりにまたは同時に、投与は経口経路によるものであり得る。投与される投与量は、レシピエントの年齢、健康および体重、もしあれば同時処置の種類、処置の頻度、ならびに所望の作用の性質に依存する。
【００６０】
特に創傷を有するヒトおよび動物の処置用の好ましい局所適用では、創傷領域、例えば皮膚表面に有効量の本発明に係る化合物を投与することが好ましい。一般に、この量は、処置される領域、症状の重症度、および使用する局所媒体の性質に応じて、適用1回当たり約0.001mg〜約1gの範囲である。好ましい局所製剤は軟膏剤であり、PEG-1000などの軟膏基剤1ml当たり有効成分約0.01〜約50mgが使用される。
【００６１】
本発明は、アポトーシスを阻害するかまたは細胞、組織もしくは臓器の機能を保存もしくは回復する方法をさらに提供する。この方法は、LPA受容体のアゴニストとしての活性を有する本発明の化合物を与える段階、および細胞、組織もしくは臓器と、アポトーシスを阻害するかまたは細胞、組織もしくは臓器中の機能を保存または回復するために有効な量の化合物とを接触させる段階により行われる。接触段階は、インビトロで(すなわち、細胞培養または臓器移動もしくは組織移動中に)、またはインビボで(すなわち、以下に示すように有効量の化合物を患者に投与することで)行うことができる。
【００６２】
処置可能な各種徴候としては、アポトーシス、虚血、外傷および再灌流傷害に関係するものが挙げられるがそれに限定されない。アポトーシスに関係する状態としては、加齢による皮膚科学的作用、虚血性事象後の再灌流の作用、免疫抑制、胃腸攪乱、心血管障害、組織移植拒絶、創傷治癒およびアルツハイマー病が挙げられるがそれらに限定されない。処置は、ウイルス感染症、化学療法薬、放射線および免疫抑制薬に関連するアポトーシス関係の問題を減少させることもできる。これらの刺激は、消化管組織の障害を含むがそれに限定されない種々の障害におけるアポトーシスの引き金を引く。
【００６３】
本明細書の実施例に記載のように、特に化学療法薬または放射線誘導性のアポトーシスに対する、胃腸管系および造血系の組織などの組織の保護に関して、本発明のこの局面を実践するために好ましい化合物は、化合物8gである。
【００６４】
処置は臓器移植のすべての相の間においても好適である。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、臓器を安定化させるかまたは保存するために有効な量の化合物をドナーに投与することで臓器を準備するために使用することができる。化合物を含有するOPS中で臓器を灌流および/または保存することができる。次に、臓器の安定性および機能を強化するために有効な量の化合物を、臓器レシピエントに投与することができる。組成物は、移植に関係するものであれ、他の外科的介入に関係するものであれ、心筋保護の処置における使用にも特に好適である。
【００６５】
胃腸組織傷害としては、腸の裏層に対する傷害、重度の慢性潰瘍、大腸炎、放射線誘導性傷害、化学療法誘導性傷害、ならびに、寄生生物、および任意の他の原因による下痢が引き起こす胃腸管の攪乱が挙げられるがそれに限定されない。各種のウイルス感染症および細菌感染症は胃腸攪乱を生じさせることが知られている。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物は、これらの感染症に関連する副作用の処置における使用にも好適である。そのような化合物は、化学療法に関連する胃腸障害の寛解における使用に特に好適である。したがって、そのような化合物は、化学療法に関連する下痢だけでなく悪心の予防における使用に好適である。
【００６６】
これらの化合物は、家畜および家畜化動物を含むがそれに限定されない動物における各種の胃腸状態の処置に特に好適である。そのような状態、特に下痢は、脱水および栄養不良による多くの仔ウシおよび仔イヌの損失の原因となる。胃腸状態の処置は胃腸投与によるものであることが好ましい。ウシおよび家畜化動物の場合、有効量のこれらの化合物を好都合に餌に混合することができる。ヒトにおいては、投与は、当技術分野で公知の任意の胃腸投与方法によるものであり得る。投与は経口的であることが好ましい。
【００６７】
さらに、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を免疫不全患者、特にHIV陽性患者に投与することで、AIDSの患者に見られる免疫不全の増悪を生じさせる、その状態に関連するT細胞のアポトーシス性死を予防または少なくとも緩和することができる。LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を投与することで、冠動脈閉塞; 大脳梗塞; 脊髄/頭部外傷および随伴性の重度麻痺を含むがそれに限定されない種々の状態に関与する再灌流傷害; 凍傷、冠動脈形成術、血管付着、四肢付着、臓器付着および腎臓再灌流などの他の侵襲による再灌流傷害に関連するアポトーシスを処置することもできる。
【００６８】
一般に、心筋梗塞および脳梗塞(脳卒中)は、塞栓、血栓、または、肉眼で見える壊死領域を生成する圧力による、動脈または静脈の血液供給の突発性の不全により引き起こされ、心臓、脳、脾臓、腎臓、腸、肺および精巣が影響を受けやすい。その領域に対する血液の再灌流の時点で、梗塞を取り囲む組織において細胞死が生じ、したがって、組成物は、梗塞の開始時、灌流中、またはその直後に投与する場合に有効である。本発明は、再灌流傷害を処置する方法であって、そのような治療を必要とする患者に治療的有効量のLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を投与することによって行う方法を含む。
【００６９】
本発明は、心臓発作および脳卒中の高い危険性を有する患者について、心筋梗塞および脳梗塞に関連する傷害を減少させる方法であって、そのような治療を必要とする患者に治療的有効量のLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を投与することによって行う方法をさらに包含する。好ましくは、そのような傷害の処置はそのような化合物の非経口投与による。しかし、任意の他の好適な方法、例えば心筋梗塞の場合の直接心臓注射を使用することができる。そのような注射用の装置、例えばAboject心臓用シリンジは当技術分野で公知である。
【００７０】
本発明は、哺乳動物の臓器、組織および細胞の培養または維持中に、細胞におけるアポトーシスを制限および予防するか、そうでなければ細胞を保存する方法であって、有効量のLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を、哺乳動物の臓器、組織および細胞を培養または維持する技術分野で使用される任意の培地または溶液に加えることによって行う方法をさらに提供する。
【００７１】
本発明は、哺乳動物の臓器、組織および細胞を培養および維持する技術分野で公知の培地および溶液であって、培養中に細胞、組織もしくは臓器の機能を保存もしくは回復するかまたは細胞のアポトーシスを制限もしくは予防するために有効な量の、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を含む培地および溶液をさらに包含する。本発明のこれらの局面は、有効量のLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する少なくとも1つの化合物を含む哺乳動物細胞培養培地、および、哺乳動物細胞の培養中に細胞、組織もしくは臓器の機能を保存もしくは回復するかまたはアポトーシスを制限もしくは予防するためのそのような培地の使用を包含する。有効量は、アポトーシスの速度を低下させかつ/または細胞、組織もしくは臓器を保存する量である。そのような化合物は、アポトーシスを通常は刺激するであろう軽度の外傷に細胞が供される状況下で、アポトーシスを制限または予防することができる。例示的な外傷としては低レベル照射、凍結細胞ストックの解凍、培養培地の温度、pH、浸透圧モル濃度またはイオン濃度の急速な変化、培養培地の非最適な温度、pH、浸透圧モル濃度またはイオン濃度に対する長期の露出、細胞毒に対する露出、初代細胞培養物の調製における無傷の組織からの細胞の解離、および、血清の欠乏(または無血清培地中での成長)を挙げることができるがそれに限定されない。
【００７２】
本発明は、組織培養培地と、有効量のLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物とを含む組成物を包含する。本発明は、移植前に哺乳動物の臓器を維持するための溶液であって、有効量のLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を含む溶液、ならびに、処置される哺乳動物の臓器において、移植前のその外科的な除去および取扱い中に臓器の機能を保存もしくは回復するかまたはアポトーシスを制限もしくは予防するためのそのような溶液の使用をさらに包含する。この溶液は臓器を急送、灌流および/または保管するために使用することができる。すべての場合で、臓器に対する傷害を制限または予防するために必要な化合物(LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する)の濃度は、当技術分野で公知の方法により当業者が経験的に決定することができる。
【００７３】
上記に加えて、LPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物を皮膚に局所適用して、種々の皮膚科学的状態を処置することができる。これらの状態としては年齢および/または光傷害による脱毛およびしわが挙げられるがそれに限定されない。したがって、本発明は皮膚科学的状態を処置する方法も包含する。各種の皮膚科学的状態は、有効量のLPA受容体に対するアゴニスト活性を有する化合物(またはそれを含む組成物)の局所適用により処置することが好ましい。そのような化合物の有効量は、皮膚科学的状態の症状を寛解または減弱させる量である。処置により皮膚科学的状態の消散または正常な皮膚機能の回復が生じることが好ましいが、本発明は症状の任意の寛解または低減を包含する。
【実施例】
【００７４】
以下の実施例は、添付の特許請求の範囲において開示される本発明の範囲を例示するが限定はしないように意図されている。
【００７５】
一般的方法
すべての試薬をSigma-Aldrich Chemical Co.、Fisher Scientific(ペンシルベニア州ピッツバーグ)、Bedukian Research(コネチカット州ダンベリー)およびToronto Research Chemicals(カナダ・オンタリオ州ノースヨーク)より購入し、さらに精製せずに使用した。ホスホネート類似体をLancaster(ニューハンプシャー州ペラム; n-デシル-ホスホネート(9a))、PolyCarbon(マサチューセッツ州デベンス; n-ドデシル-ホスホネート(9b))、Alfa Aesar(マサチューセッツ州ワードヒル; n-テトラデシル-ホスホネート(9c)およびn-オクタデシル-ホスホネート(9d))より購入した。LPA 18:1、DGPP、Ser-PAおよびTyr-PAをAvanti Polar Lipids(アラバマ州アラバスター)より得た。融点をThomas-Hoover毛細管融点装置上で決定し、未補正とした。日常的な薄層クロマトグラフィー(TLC)を、ガラスで裏打ちした250μM UNIPLATES(デラウェア州ニューアーク、Analtech)上で行った。フラッシュクロマトグラフィーを、予め充填したシリカゲルカラム上で、Horizon HPFCシステム(バージニア州シャーロッツビル、Biotage)を用いて行った。1Hおよび31P NMRスペクトルを、Bruker AX 300(マサチューセッツ州ビルリカ)分光計上で得た。1H NMRの化学シフトをTMSに対する百万分率(ppm)として報告する。31P NMRの化学シフトをCDCl3中0.0485Mトリフェニルホスフェートに対する百万分率(ppm)として報告する。質量スペクトルデータを、Bruker ESQUIREエレクトロスプレー/イオン捕捉機器上で、正イオンモードおよび負イオンモードで収集した。元素分析をジョージア州ノークロス、Atlantic Microlab Inc.により行った。
【００７６】
実施例1
リン酸ジ-tert-ブチルエステルアルケニルエステル(4a-f)の合成
市販の不飽和脂肪アルコール(3a-f)を出発原料として使用した。アルコール(2.5mmol)およびジ-tert-ブチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(1.51g、4mmol)の塩化メチレン(60mL)中攪拌溶液に1H-テトラゾール(578mg、8.25mmol)を加えた。30分攪拌後、混合物を0℃に冷却し、50%過酸化水素0.3mLを加えた。混合物を1時間攪拌し、塩化メチレン(100mL)で希釈し、10%二亜硫酸ナトリウム(2x50ml)、飽和炭酸水素ナトリウム(2x50ml)、水(50ml)およびブライン(50ml)で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。得られた粗生成物を、ヘキサン/酢酸エチル(7:3)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物ジ-t-Boc保護脂肪アルコールホスフェート(4a-f)を溶出させた。
【００７７】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルデカ-9-エニルエステル(4a): 透明油状物として単離(収率75%)。
0005568484.tif 000022
【００７８】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルデカ-4-エニルエステル(4b): 透明油状物として単離(収率68%)。
0005568484.tif 000023
【００７９】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルドデカ-9-エニルエステル(4c): 透明油状物として単離(収率70%)。
0005568484.tif 000024
【００８０】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルテトラデカ-9-エニルエステル(4d): 透明油状物として単離(収率68%)。
0005568484.tif 000025
【００８１】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルテトラデカ-11-エニルエステル(4e): 透明油状物として単離(収率82%)。
0005568484.tif 000026
【００８２】
リン酸ジ-tert-ブチルエステルオクタデカ-9-エニルエステル(4f): 透明油状物として単離(収率72%)。
0005568484.tif 000027
【００８３】
実施例2
リン酸モノアルケニルエステル(5a-f)の合成
Boc保護FAP(4a-f)をTFAで脱保護して対応する不飽和FAP(5a-f)を得た。1a-6a 100mgの塩化メチレン(20mL)溶液にトリフルオロ酢酸(0.3mL)を加えた。混合物を4時間攪拌し、TLCは反応の完了を示した。溶媒を蒸発させ、残渣を塩化メチレン(2x20mL)で洗浄し、減圧濃縮して所望のリン酸モノアルケニルエステルを無色油状物として得た。
【００８４】
リン酸モノデカ-9-エニルエステル(5a): 油状物として単離(85%)。
0005568484.tif 000028
【００８５】
リン酸モノデカ-4-エニルエステル(5b): 油状物として単離(78%)。
0005568484.tif 000029
【００８６】
リン酸モノドデカ-9-エニルエステル(5c): 油状物として単離(82%)。
0005568484.tif 000030
【００８７】
リン酸モノテトラデカ-9-エニルエステル(5d): 油状物として単離(84%)。
0005568484.tif 000031
【００８８】
リン酸モノテトラデカ-11-エニルエステル(5e): 油状物として単離(78%)。
0005568484.tif 000032
【００８９】
リン酸モノオクタデカ-9-エニルエステル(5f): 油状物として単離(86%)。
0005568484.tif 000033
【００９０】
実施例3
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-アルキル/アルケニルエステル(7a-g)の合成
市販の飽和または不飽和脂肪アルコール(6a-g)を出発原料として使用した。アルコール(2.0mmol)、ビス-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(1.085g、4mmol)および1H-テトラゾール(420mg、6mmol)の溶液を室温で30分間攪拌した後、元素硫黄(200mg)を加え、混合物を2時間還流させた。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧蒸発させた。酢酸エチル(30mL)を加えて析出させた過剰の硫黄を濾去し、溶媒を蒸発させて粗混合物を得た。混合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物を無色油状物として得た。
【００９１】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-デシルエステル(7a): 無色油状物として単離(収率72%)。
0005568484.tif 000034
【００９２】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-ドデシルエステル(7b): 無色油状物として単離(収率84%)。
0005568484.tif 000035
【００９３】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-テトラデシルエステル(7c): 透明油状物として単離(収率82%)。
0005568484.tif 000036
【００９４】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-デカ-9-エニルエステル(7d): 透明油状物として単離(収率76%)。
0005568484.tif 000037
【００９５】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-ドデカ-9-エニルエステル(7e): 透明油状物として単離(収率80%)。
0005568484.tif 000038
【００９６】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-テトラデカ-9-エニルエステル(7f): 透明油状物として単離(収率75%)。
0005568484.tif 000039
【００９７】
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-オクタデカ-9-エニルエステル(7g): 透明油状物として単離(収率72%)。
0005568484.tif 000040
【００９８】
実施例4
チオリン酸O-アルキル/アルケニルエステル(8a-g)の合成
チオリン酸O,O'-ビス-(2-シアノ-エチル)エステルO''-アルキル/アルケニルエステル(7a-7g)を出発原料として使用した。7a-7g 100mgのメタノール性KOH(10mL)溶液を2時間攪拌し、TLCは反応の完了を示した。溶媒を蒸発させて得た粗生成物を水(20mL)に溶解させ、HClで酸性化した。水性混合物を酢酸エチル(2x50mL)で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して所望の化合物を淡黄色油状物として得た。
【００９９】
チオリン酸O-デシルエステル(8a): 淡黄色油状物として単離(収率80%)。
0005568484.tif 000041
【０１００】
チオリン酸O-ドデシルエステル(8b): 淡黄色油状物として単離(収率73%)。
0005568484.tif 000042
【０１０１】
チオリン酸O-テトラデシルエステル(8c): 淡黄色油状物として単離(収率70%)。
0005568484.tif 000043
【０１０２】
チオリン酸O-デカ-9-エニルエステル(8d): 淡黄色油状物として単離(収率76%)。
0005568484.tif 000044
【０１０３】
チオリン酸O-ドデカ-9-エニルエステル(8e): 淡黄色油状物として単離(収率80%)。
0005568484.tif 000045
【０１０４】
チオリン酸O-テトラデカ-9-エニルエステル(8f): 淡黄色油状物として単離(収率72%)。
0005568484.tif 000046
【０１０５】
チオリン酸O-オクタデカ-9-エニルエステル(8g): 淡黄色油状物として単離(収率82%)。
0005568484.tif 000047
【０１０６】
実施例5
(1,1-ジフルオロ-ペンタデシル)ホスホン酸ジエチルエステル(10)の合成
ジエチルジフルオロメタンホスホネート(1.0g、5.316mmol)のTHF(50mL)溶液に2M LDA(626mg、5.847mmol)を-78℃で加え、30分間攪拌した。THF(10mL)中テトラデシルブロミド(1.474g、5.316mmol)を混合物に-78℃で加え、反応混合物を終夜攪拌した。THFを蒸発させ、ヘキサン中30%酢酸エチルを溶離液として用いるフラッシュクロマトグラフィーで残留油状物を精製して、化合物10 817mg(40%)を無色油状物として得た。
0005568484.tif 000048
【０１０７】
実施例6
(1,1-ジフルオロ-ペンタデシル)ホスホン酸(11)の合成
減圧乾燥10(225mg、0.585mmol)の塩化メチレン(5mL)溶液にブロモトリメチルシラン(895mg、5.85mmol)を加え、混合物を室温で攪拌した。6時間後、TLCは反応の完了を示した。溶媒を減圧除去し、残渣を95%メタノール(3mL)中で1時間攪拌した。混合物を減圧濃縮し、減圧乾燥させて150mg(78%)の11を淡黄色固体として得た。融点66〜69℃;
0005568484.tif 000049
【０１０８】
実施例7
LPA受容体アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関する化合物の分析
化合物の試験を、LPA1、LPA2およびLPA3受容体を安定して発現するRH7777ラット肝細胞腫細胞において、およびLPA1〜3を内在的に発現するPC-3において、LPA誘導性カルシウムトランジエントを誘導または阻害するその能力について、FlexStation II自動化蛍光光度計(カリフォルニア州サニーベール、Molecular Devices)を用いて行った。
【０１０９】
LPA1、LPA2もしくはLPA3またはPC-3細胞のいずれかを安定して発現するRH7777細胞を、ポリ-Dリジンでコーティングした黒色壁で透明底の96ウェルプレート(カリフォルニア州サンノゼ、Becton Dickinson)上に細胞50000個/ウェルの密度でプレーティングし、終夜培養した。次に、培養培地(10% FBS含有DMEM)を変法クレブス溶液(120mM NaCl、5mM KCl、0.62mM MgSO4、1.8mM CaCl2、10mM HEPES、6mMグルコース、pH 7.4)で置き換え、細胞を6〜8時間(PC-3細胞について12時間)血清欠乏させた。変法クレブス培地中で細胞にFura-2 AMを35分間添加した。Fura-2を除去した後、変法クレブス培地100μl/ウェルで培地を再度置き換えることで、FlexStation機器中でプレートに添加を行った。プレートを機器中で4分間インキュベートして37℃に昇温させた。それぞれ340nmおよび380nm波長の光による励起に応答する520nmでの発光強度の比を測定することで、細胞内Ca2+濃度の変化をモニタリングした。各ウェルを80〜120秒間モニタリングした。測定開始15秒後に、試験化合物(変法クレブス中3xストック溶液)50μlを各ウェルに自動的に加えた。SoftMax Proソフトウェア(カリフォルニア州サニーベール、Molecular Devices)を用いて時間経過を記録した。各ウェルについて最大比値とベースライン比値との間の差を計算することで、Ca+トランジエントを自動的に定量化した。
【０１１０】
選択した化合物をCV1細胞中のPPARγ活性化について試験し、アシル-コエンザイムAオキシダーゼ-ルシフェラーゼ(PPRE-Acox-Rluc)レポーター遺伝子構築物をそれらに形質移入した。簡潔に言えば、CV-1細胞を、96ウェルプレートにおいて(ウェル1つ当たり細胞5x103個)、10%ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地中にプレーティングした。翌日、pGL3-PPRE-Acox-Rluc 125ng、pcDNAI-PPARγ 62.5ngおよびpSV-β-ガラクトシダーゼ(ウィスコンシン州マジソン、Promega)12.5ngを細胞に、LipofectAMINE 2000(Invitrogen)を用いて一過性に形質移入した。システム(Promega)およびGalacto-Light Plus(商標)システム(カリフォルニア州フォスターシティ、Applied Biosystems)の各24時間後、試料を四つ組で実行し、平均±標準誤差を計算した。データは少なくとも2つの独立した形質移入を表す。スチューデントt検定を帰無仮説試験に使用し、P<0.05を形質移入と見なし、DMSO、またはDMSOに溶解した10μM試験化合物を含有する1% FBS補充OptiMEMI(Invitrogen)で細胞を20時間処理した。ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性を、Steady-Glo(登録商標)ルシフェラーゼアッセイにより有意なものとして測定した。
【０１１１】
一連の、側鎖の異なる位置に不飽和を有するFAP類似体(5a-f)、チオホスフェート(8a-g)およびホスホネート(9ad、11)を合成した。これらの新規類似体をLPA1〜3に関してアゴニストおよびアンタゴニストとして評価した。LPA1〜3受容体を形質移入したRH7777細胞においてCa2+トランジエントを誘導する能力(アゴニズム)、および同一細胞においてLPA誘導性Ca2+トランジエントを阻害する能力(アンタゴニズム)について、各FAP類似体を試験した。非形質移入RH7777細胞において最大30μMの濃度で適用した場合に、この試験で検査した化合物はいずれも細胞内Ca2+トランジエントを誘導しなかった。異なる位置での不飽和、不飽和を有する/有さないホスホネート、ジフルオロホスホネートおよびチオホスフェートによる頭部基の修飾の作用は、LPA1〜3受容体に対するFAPの薬理特性を劇的に変化させた。一不飽和FAP類似体(5a-e)は、LPA2およびLPA3受容体におけるアゴニストまたはアンタゴニストとしてのそのリガンド特性を変化させることなく、C-10類似体を除く飽和類似体に比べて増加した効力および/または有効性の傾向を示した。二重結合の位置も活性に対する影響を有した。デセニル位置異性体5aと5bとの間の活性の比較は、LPA 18:1に見られるC9=C10二重結合がC4=C5よりもLPA2受容体の活性化において好ましかった(5aについてEC50=3800nM対5bについて10000nM超)ことを示唆している。5b(Ki=370nM)は5a(Ki=504nM)よりも活性が中程度に高かったが、二重結合位置に関するこの選好はLPA3受容体の阻害についてはそれほど明白ではなかった。
【０１１２】
同様に、LPA2受容体はテトラデセニル異性体5d(EC50=397nM)と5e(EC50=4100nM)との間でC9=C10不飽和の選好を示し、LPA3は二重結合位置に関する有意な選好を示さなかった。対照的に、5d(Ki=1146nM)と5e(Ki=457nM)との間ではLPA1はC9=C10に対するC11=C12の選好を示した。これは、3つのLPA受容体の各々について側鎖での立体構造上の異なる要求がある可能性を示している。不飽和系列では、テトラデセニル化合物(5d、5e)のみがLPA1受容体においてLPA応答に拮抗した。
【０１１３】
10-、12-および14-炭素飽和FAP類似体(8a-c)における頭部基としてホスフェートをチオホスフェートで置き換えることは、全3種のLPA受容体サブタイプでのそれらのアゴニスト/アンタゴニスト特性に対する有意な影響を有していた。LPA1では、チオホスフェート修飾は、当初のFAP類似体の阻害作用を完全に無効にした。他方で、LPA2では、チオホスフェートは、当初のFAPの有効性を100%まで一定に増加させた。LPA3受容体では、飽和チオホスフェートFAP類似体は、当初のFAPに比べて向上したLPA応答の阻害を一貫して示した。ドデシルチオホスフェート(8b)は、LPA2(EC50=1000nM)およびLPA3(Ki=14nM)におけるそれぞれ強力なアゴニストおよびアンタゴニストである。
【０１１４】
オレオイルチオホスフェート(8g)は、LPA1(EC50(Emax)=193nM(80%))およびLPA3(EC50(Emax)=546nM(78%))における部分アゴニスト、ならびにオレオイルLPA(EC50=300nM)のそれより小さいEC50 244nM(Emax=LPA応答の175%)を有するLPA2における強力な完全アゴニストであった。
【０１１５】
実施例8
放射線または化学療法誘導性アポトーシスに対する腸上皮細胞の保護に関する化合物8gのインビトロ評価
5%ウシ胎仔血清、インスリン(10μg/ml)、硫酸ゲンタマイシン(50μg/ml)を補充したDMEM培地中でIEC-6細胞を成長させ、加湿90%空気-10% CO2雰囲気下、37℃でインキュベートした。培地を隔日に交換した。サブコンフルエント細胞を2回洗浄し、実験前夜に血清を有さないDMEMで置き換えた。
【０１１６】
傷害およびIEC-6細胞アポトーシスを、γ線照射または化学療法のいずれかを経由して誘導した。20グレイの単一線量の[137Cs]線源のγ線照射を全実験において使用した。血清欠乏IEC-6細胞を、LPA、FAP12または化合物8g(FAP 18:1d9)で15分間前処理した後、回転プラットフォーム上でMark Iモデル25γ線照射装置(カリフォルニア州サンフェルナンド、J. L. Shepherd & Associate)により416R/分の速度で4.81分間照射した。いくつかの実験では、照射前または照射後の異なる時点でLPAを加えた。20μMカンプトテシンによるIEC-6細胞の処理は、処理の16時間後にELISAアッセイで測定されるDNA断片化を誘導する。Boehringer(インディアナ州インディアナポリス)からの細胞死検出ELISAキットを用い、製造者の説明書に従って、DNA断片化を定量化した。試料を三つ組で実行した。二つ組の試料を使用して、Pierce(イリノイ州ロックフォード)からのBCAキットによりタンパク質濃度を定量化した。DNA断片化を1分当たりタンパク質1μg当たりの吸光度単位として表した。
【０１１７】
LPAおよびFAP 12(いずれも10μM)は、IEC-6細胞におけるカンプトテシン誘導性(20μM)DNA断片化を阻害した。FAPの作用は、FAP 18:1d9チオホスフェート(8g)について示すように用量依存性であり、LPAのそれに匹敵するが、3μMを超える濃度ではそれを超える。
【０１１８】
実施例9
放射線または化学療法誘導性アポトーシスに対する腸上皮細胞の保護に関する化合物8gのインビボ評価
12時間の明暗サイクルの、そうでなければ標準飼料で自由に維持した、ICR系統の雄マウス(Harlan Laboratories、体重30〜33g)を、処置前に16時間飢餓状態にした。Cs137線源を用い、1分当たり1.9グレイの線量速度で12グレイまたは15グレイの線量によりWBIを行った。4匹のマウスの群は、ハンクス基礎塩類溶液に溶解させた100μM BSAと複合化した1mM LPA 250μl、または単独のBSA媒体のいずれかを、照射の2時間前に受け取った。
【０１１９】
アポトーシス小体の検出のために、照射の4時間後に二酸化炭素吸入によりマウスを安楽死させ、小腸を解剖し、中性リン酸緩衝等張10%ホルマリン中で固定した。小腸からの4つの約3〜4mmの長いセグメントをパラフィン中に埋め込み、5μM厚の切片を切断し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。照射の3.5日後に生存陰窩の数を計数した。
【０１２０】
FAP 18:1d9(照射の2時間前に胃に200μM)は、照射した動物において陰窩生存を有意に(P>0.01)強化した(図3)。FAPの作用は用量依存性であった(図4)。FAP 18:1d9の作用は空腸および回腸において存在し、LPAのそれを超えていた(図5)。
【０１２１】
実施例10
チオホスフェートおよびボラノホスフェート
すべての試薬および出発原料をSigma-Aldrich Chemical Co.、Fisher Scientific、Nu-Chek Prep Inc(ミネソタ州エリシアン)およびToronto Research Chemicals(カナダ・オンタリオ州ノースヨーク)より購入し、さらに精製せずに使用した。日常的な薄層クロマトグラフィー(TLC)を、ガラスで裏打ちした250ミクロンUNIPLATES(デラウェア州ニューアーク、Analtech)上で行った。フラッシュクロマトグラフィーを200〜425メッシュシリカゲル(Fisher Scientific)上で行った。1H NMRスペクトルを、Bruker AX 300(マサチューセッツ州ビルリカ)分光計上で得た。1H NMRの化学シフトをTMSに対する百万分率(ppm)として報告する。質量スペクトルデータを、Bruker ESQUIREエレクトロスプレー/イオン捕捉機器上で、正イオンモードおよび負イオンモードで収集した。元素分析をジョージア州ノークロス、Atlantic Microlab Inc.により行った。
【０１２２】
化合物8gについて使用した同様の合成に従って、化合物RxBVG-I-67、RxBVG-I-77、RxBVG-I-81、RxBVG-I-82、RxBVG-I-83を調製した(下記スキーム4参照)。対応するアンモニウム塩を無色粉末として得た。
0005568484.tif 000050
(a)(1)ビス(シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト、1H-テトラゾール、CH2Cl2、(2)硫黄、還流; (b) KOH、MeOH
【０１２３】
アンモニウムチオホスホリル-O-オクタデカ-9E-エニルエステル(RxBVG-I-67): 無色粉末として単離(収率90%)。
0005568484.tif 000051
【０１２４】
アンモニウムチオホスホリル-O-エイコサ-11Z-エニルエステル(RxBVG-I-77): 無色粉末として単離(収率90%)。
0005568484.tif 000052
【０１２５】
アンモニウムチオホスホリル-O-ヘキサデカ-9Z-エニルエステル(RxBVG-I-81): 無色粉末として単離(収率90%)。
0005568484.tif 000053
【０１２６】
アンモニウムチオホスホリル-O-ペンタデカ-10Z-エニルエステル(RxBVG-I-82): 無色粉末として単離(収率70%)。
0005568484.tif 000054
【０１２７】
アンモニウムチオホスホリル-O-オクタデカ-9Z,12Z-ジエニルエステル(RxBVG-I-83): 無色粉末として単離(収率80%)。
0005568484.tif 000055
【０１２８】
0005568484.tif 000056
(a)2,4,6-トリクロロフェノール、Et2Zn、CH2I2、CH2Cl2; (b)(1)ビス(シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト、1H-テトラゾール、CH2Cl2、(2)硫黄、還流; (c)KOH、MeOH
【０１２９】
スキーム5
スキーム5のシクロプロピル類似体の合成
市販の不飽和脂肪アルコール(1a-h)を出発原料として使用した。2,4,6-トリクロロフェノール(7.4mmol)のジクロロメタン(25mL)中攪拌溶液にジエチル亜鉛(7.4mmol)を-40℃で加えた。15分後、アルコール(1.86mmol)を加え、攪拌を室温で終夜続けた。反応混合物を冷10% HCl水溶液、水、ブラインで順次洗浄し、乾燥させ(Na2SO4)、溶媒を減圧除去した。得られた粗生成物を、ヘキサン/酢酸エチル(9:1)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物2a-hを溶出させた。
【０１３０】
シクロプロピルアルコール(2.0mmol; 2a-h)、ビス-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(1.085g、4mmol)および1H-テトラゾール(420mg、6mmol)の溶液を室温で30分間攪拌した後、元素硫黄(200mg)を加え、混合物を2時間還流させた。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧蒸発させた。酢酸エチル(30mL)を加えて析出させた過剰の硫黄を濾去し、溶媒を蒸発させて粗混合物を得た。混合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物(3a-h)を無色油状物として得た。
【０１３１】
3a-3h 100mgのメタノール性KOH(10mL)溶液を2時間攪拌し、TLCは反応の完了を示した。溶媒を蒸発させて得た粗生成物を水(20mL)に溶解させ、HClで酸性化した。水性混合物を酢酸エチル(2x50mL)で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して所望の化合物を淡黄色油状物として得た。対応するアンモニウム/カリウム塩を、チオリン酸とNH4OHまたはKOHとを混合することで調製し、CHCl3/MeOH/NH3(5:3:1)で溶出するC18カラム上で精製した。
【０１３２】
O-[8-(2-オクチル-cis-シクロプロピル)-オクチル-オール](2c): 無色油状物として単離(収率68%)。
0005568484.tif 000057
【０１３３】
チオリン酸O,O'-ビス(2-シアノエチル)エステルO''-[8-(2-オクチル-cis-シクロプロピル)-オクチル]エステル(3c): 無色油状物として単離(収率80%)。
0005568484.tif 000058
【０１３４】
アンモニウムチオホスホリル-O-[8-(2-オクチル-cis-シクロプロピル)-オクチル]エステル(RxBVG-I-93): 無色粉末として単離(収率78%)。
0005568484.tif 000059
【０１３５】
カリウムチオホスホリル-O-(8-シクロプロピル-オクチル)エステル(RxBVG-II-23): 無色粘着性固体として単離(収率88%)。
0005568484.tif 000060
【０１３６】
アンモニウムチオホスホリル-O-[8-(2-ヘキシル-シクロプロピル)-オクチル]エステル(RxBVG-II-22): 無色粘着性固体として単離(収率83%)。
0005568484.tif 000061
【０１３７】
アンモニウムチオホスホリル-O-[8-(2-オクチル-trans-シクロプロピル)-オクチル]エステル(RxBVG-II-3): 無色固体として単離(収率90%)。
0005568484.tif 000062
【０１３８】
カリウムチオホスホリル-O-[10-(2-ヘキシル-シクロプロピル)-デシル]エステル(RxBVG-II-34): 無色固体として単離(収率79%)。
0005568484.tif 000063
【０１３９】
カリウムチオホスホリル-O-{8-[2-(2-ペンチル-シクロプロピルメチル)-シクロプロピル]オクチル}エステル(RxBVG-II-35): 無色固体として単離(収率73%)。
0005568484.tif 000064
【０１４０】
カリウムチオホスホリル-O-[10-(2-オクチル-シクロプロピル)-デシル]エステル(RxBVG-II-36): 無色固体として単離(収率71%)。
0005568484.tif 000065
【０１４１】
カリウムチオホスホリル-O-(8-{2-[2-エチル-シクロプロピルメチル)-シクロプロピルメチル]-シクロプロピルメチル}-オクチル)エステル(RxBVG-II-37): 無色固体として単離(収率67%)。
0005568484.tif 000066
【０１４２】
0005568484.tif 000067
(a)(1)ビス(シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト、1H-テトラゾール、CH2Cl2、(2)BH3-DMS; (b)KOH、MeOH
【０１４３】
スキーム6
ボラノホスフェート類似体の合成(スキーム6)
市販のアルコール(4a-4d)を出発原料として使用した。アルコール(0.74mmol; 2a-h)、ビス-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(0.4g、2.3mmol)および1H-テトラゾール(155mg、1.48mmol)の溶液を室温で30分間攪拌した。反応混合物を氷浴中で冷却した後、BH3を加えた。DMS(2.3mmol)および混合物を45分間攪拌した。溶媒を減圧蒸発させて粗混合物を得た。混合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物(5a-d)を無色油状物として得た。
【０１４４】
5a-5d 100mgのメタノール性KOH(10mL)溶液を2時間攪拌し、TLCは反応の完了を示した。溶媒を蒸発させて得た粗生成物を、CHCl3/MeOH/NH3(5:3:1)を用いるC18カラム上で精製した。
【０１４５】
カリウムボラノホスホリルモノオクチルエステル(RxBVG-II-13): 無色粉末として単離(収率80%)。
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【０１４６】
カリウムボラノホスホリルモノドデシルエステル(RxBVG-II-11): 無色粉末として単離(収率80%)。
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【０１４７】
カリウムボラノホスホリルモノテトラデシルエステル(RxBVG-II-9): 無色粉末として単離(収率95%)。
0005568484.tif 000070
【０１４８】
カリウムボラノホスホリルモノオクタデシルエステル(RxBVG-II-7): 無色粉末として単離(収率100%)。
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【０１４９】
スキーム7
0005568484.tif 000072
(a)NaBH4、MeOH; (b)(1)ビス(シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト、1H-テトラゾール、CH2Cl2, (2)30% H2O2、室温または硫黄、還流; (c)KOH、MeOH
【０１５０】
分岐類似体の合成(スキーム7)
ケトン6(1g、4.4mmol)のメタノール(20mL)溶液に0℃でNaBH4を少しずつ加え、周囲温度で2時間攪拌した。反応混合物を氷水中に注ぎ、クロロホルム(3x30mL)で抽出した。一緒にした抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ(無水Na2SO4)、溶媒を減圧除去して7を得た(100%)。アルコール7(150mg、0.6mmol)およびジ-tert-ブチル-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(320mg、1.2mmol)の塩化メチレン(15mL)中攪拌溶液に1H-テトラゾール(136mg、1.9mmol)を加えた。30分攪拌後、混合物を0℃に冷却し、30%過酸化水素0.2mLを加えた。混合物を1時間攪拌し、塩化メチレン(50mL)で希釈し、10%二亜硫酸ナトリウム、飽和炭酸水素ナトリウム、水およびブラインで順次洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。得られた粗生成物を、ヘキサン/酢酸エチル(7:3)を用いるシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、所望の生成物8(0.25g、90%)を溶出させた。
【０１５１】
120mgの8の塩化メチレン(15mL)溶液にトリフルオロ酢酸(1.5mL)を加えた。混合物を2時間攪拌し、TLCは反応の完了を示した。溶媒を蒸発させ、残渣をトルエン(15mL)で共蒸発させ、CHCl3/MeOH/NH3(5:3:1)を用いるC18カラム上で精製してRxBVG-I-27を得た。
【０１５２】
アンモニウムホスホリル-モノ-(1-ヘプチル-オクチル)エステル(RxBVG-I-27): 無色粉末として単離(収率100%)。
0005568484.tif 000073
【０１５３】
アルコール7(150mg、0.6mmol)、ビス-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(350mg、1.3mmol)および1H-テトラゾール(136mg、1.9mmol)の溶液を室温で30分間攪拌した後、元素硫黄(62mg)を加え、混合物を2時間還流させた。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧蒸発させた。酢酸エチル(15mL)を加えて析出させた過剰の硫黄を濾去し、溶媒を蒸発させて粗混合物を得た。混合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物9(280mg、96%)を無色油状物として得た。
【０１５４】
250mgの9のメタノール性KOH(10mL)溶液を2時間攪拌し、TLCは反応の完了を示した。溶媒を蒸発させて得た粗生成物を水(20mL)に溶解させ、HClで酸性化した。水性混合物を酢酸エチル(2x20mL)で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して所望の化合物を得た。
【０１５５】
チオリン酸O-(1-ヘプチル-オクチル)エステル(RXBVG-I-28): 無色油状物として単離(収率93%)。
0005568484.tif 000074
【０１５６】
スキーム8
0005568484.tif 000075
(a)NaH、THF; (b)KOH、MeOH
【０１５７】
ジカルボン酸誘導体の合成(スキーム8)
NaH(100mg、1.1mmol)のTHF(10mL)懸濁液にマロン酸ジエチル(3.8mmol)を加え、10分間攪拌した後、ブロモテトラデカン10(1g、3.6mmol)を加え、6時間還流させた。反応混合物を減圧濃縮し、水(5mL)を加え、酢酸エチル(3x20mL)で抽出した。一緒にした抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ(無水Na2SO4)、溶媒を除去した。粗残渣を、酢酸エチル/ヘキサン(1:24)で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーで精製して11を得た。
【０１５８】
11(200mg、0.5mmol)、水酸化カリウム(100mg、1.5mmol)およびエタノール/水(3/1 mL)の混合物を3時間還流させた。反応混合物を室温に冷却し、減圧濃縮した。残渣を水中に取り込み、冷10% HCl(水溶液)で酸性化した。析出した固体を濾過し、乾燥させてRxBVG-I-8を得た。
【０１５９】
2-テトラデシル-ジエチルマロネート(11): 無色油状物として単離(収率68%)。
0005568484.tif 000076
【０１６０】
2-テトラデシル-マロン酸(RxBVG-I-8): 白色固体として単離(収率90%)。
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【０１６１】
スキーム9
0005568484.tif 000078
(a)NaH、THF; (b) LiAlH4、Et2O; (c)(1)ビス(シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト、1H-テトラゾール、CH2Cl2、(2)硫黄、還流; (c)KOH、MeOH
【０１６２】
RxBVG-I-64の合成(スキーム9)
NaH(170mg、1.1mmol)のTHF(15mL)懸濁液にマロン酸ジエチル(6.2mmol)を加え、10分間攪拌した後、臭化オレイル(1.76g、5.3mmol)を加え、6時間還流させた。反応混合物を減圧濃縮し、水(5mL)を加え、酢酸エチル(3x20mL)で抽出した。一緒にした抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ(無水Na2SO4)、溶媒を除去した。粗残渣を、酢酸エチル/ヘキサン(1:24)で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーで精製して13を得た。
【０１６３】
LiAlH4(17.1mmol)の乾燥エーテル(20mL)懸濁液に0℃で13(1g、2.8mmol)のエーテル5mL溶液をゆっくりと加え、反応混合物を室温に昇温し、1時間攪拌した。湿潤エーテルをゆっくりと加え、2N HClで洗浄した。水性部分を酢酸エチル(3x15mL)で抽出した。一緒にした抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥させ(無水Na2SO4)、溶媒を減圧除去した。粗残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して14(90%)を得た。
【０１６４】
ジオール14(100mg、0.3mmol)、ビス-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホロアミダイト(330mg、1.2mmol)および1H-テトラゾール(126mg、1.8mmol)の溶液を室温で30分間攪拌した後、元素硫黄(38mg)を加え、混合物を2時間還流させた。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧蒸発させた。酢酸エチル(15mL)を加えて析出させた過剰の硫黄を濾去し、溶媒を蒸発させて粗混合物を得た。混合物をフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物(82%)を無色油状物として得た。この油状物170mgのメタノール性KOH(10mL)溶液を2時間攪拌し、TLCは反応の完了を示した。溶媒を蒸発させて得た粗生成物を水(20mL)に溶解させ、HClで酸性化した。水性混合物を酢酸エチル(2x20mL)で抽出し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮して得た所望の化合物を、CHCl3/MeOH/NH3(5:3:1)を用いるC18カラム上で精製してRxBVG-I-64を得た。
【０１６５】
2-オクタデカ-9-エニル-ジエチルマロネート(13): 無色油状物として単離(収率65%)。
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【０１６６】
2-オクタデカ-9-エニル-1,3-ジオール(14): 無色油状物として単離(収率80%)。
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【０１６７】
アンモニウムチオホスホリル-O-(2-チオホスホノオキシメチル-エイコシル)エステル(RxBVG-I-64): 無色粘着性固体として単離(収率78%)。
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【０１６８】
実施例11
DNA断片化アッセイ
IEC-6細胞を、American Type Culture Collection(バージニア州マナサス)より得て、加湿90%空気/10% CO2雰囲気下、10%ウシ胎仔血清、10μg/mlインスリンおよび50μg/ml硫酸ゲンタマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中37℃で成長させた。培地を隔日に交換した。継代15代と21代との間の細胞を実験に使用した。0.003〜3μMの範囲の用量の新たに合成したRxBio類似体を使用してIEC-6細胞を15分間前処理した。前処理の後、20μMカンプトテシンによりアポトーシスを誘導した。カンプトテシン処理の6時間後、酵素結合免疫吸着検定法により、Roche(インディアナ州インディアナポリス)からの細胞死検出ELISAPLUSキットを製造者の説明書に従って使用してDNA断片化を測定した。簡潔に言えば、細胞を回収し、DNA溶解緩衝液に30分間溶解させた。200rpmで10分間の遠心分離後、試料可溶化液を収集した。ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレート中に上澄み液10μlを個々に添加し、免疫試薬(抗ヒストン-ビオチンおよび抗DNAペルオキシダーゼ抱合抗体)と共にシェーカー上で2時間インキュベートした。次に反応液を廃棄し、各ウェルをインキュベーション緩衝液で2回洗浄した。基質緩衝液100μlを各ウェルに加えて色を発色させた。DNA吸光度をマイクロプレートリーダー(コネチカット州シェルトン、PerkinElmer)中、405nMで読み取った。試料のアリコートを使用して、ビシンコニン酸キット(イリノイ州ロックフォード、Pierce)によりタンパク質濃度を定量化した。
【０１６９】
図7に示すように、非常に有効な放射線防護剤および放射線緩和剤であることが証明されているオレオイルチオホスフェートよりも、RxBVG-I-93はいっそう大きな有効性を示した。
【０１７０】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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