(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）、HNRPL-501（配列番号１４）、CypB-129（配列番号１５)、β-tublin5-154（配列番号１８）、Lck-90（配列番号１９）、およびIEX1-47（配列番号２２）からなる群から選択される１以上のペプチドを含み、HLA-A24陽性患者群において癌の処置または予防のために用いられる、細胞傷害Tリンパ球（CTL）誘導剤組成物。
【請求項２】
Lck-488（配列番号３）、SART3-109（配列番号８）、Lck-90（配列番号１９）、SART3-511（配列番号２３）、およびPAP-155(配列番号２６)からなる群から選択される１以上のペプチドを含み、HLA-A2陽性患者群において癌の処置または予防のために用いられる、CTL誘導剤組成物。
【請求項３】
EGFR-800（配列番号１）、Lck-208（配列番号２）、SART2-93（配列番号７）、SART3-109（配列番号８）、SART3-302（配列番号９）、Lck-246（配列番号１０）、ppMAPkkk-432（配列番号１１）、WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）、HNRPL-501（配列番号１４）、CypB-129（配列番号１５)、およびLck-422（配列番号１６）からなる群から選択される１以上のペプチドを含み、HLA-A3スーパータイプ陽性患者群において癌の処置または予防のために用いられる、CTL誘導剤組成物。
【請求項４】
SART3-109（配列番号８）、ppMAPkkk-432（配列番号１１）、およびHNRPL-501（配列番号１４）からなる群から選択される１以上のペプチドを含み、HLA-A26陽性患者群において癌の処置または予防のために用いられる、CTL誘導剤組成物。
【請求項５】
WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）、HNRPL-501（配列番号１４）、およびCypB-129（配列番号１５)からなる群から選択される１以上のペプチドを含み、HLA-A24陽性患者群およびHLA-A3スーパータイプ陽性患者群の処置または予防のために用いられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
HNRPL-501（配列番号１４）のペプチドを含み、HLA-A24陽性患者群およびHLA-A26陽性患者群の処置または予防のために用いられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
SART3-109（配列番号８）のペプチドを含み、HLA-A2陽性患者群およびHLA-A26陽性患者群の処置または予防のために用いられる、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
SART3-109（配列番号８）のペプチドを含み、HLA-A3スーパータイプ陽性患者群およびHLA-A2陽性患者群の処置または予防のために用いられる、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
SART3-109（配列番号８）、ppMAPkkk-432（配列番号１１）、およびHNRPL-501（配列番号１４）からなる群から選択される１以上のペプチドを含み、HLA-A3スーパータイプ陽性患者群およびHLA-A26陽性患者群の処置または予防のために用いられる、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
HNRPL-501（配列番号１４）のペプチドを含み、HLA-A24陽性患者群、HLA-A3スーパータイプ陽性患者群、およびHLA-A26陽性患者群の処置または予防のために用いられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
SART3-109（配列番号８）のペプチドを含み、HLA-A2陽性患者群、HLA-A3スーパータイプ陽性患者群、およびHLA-A26陽性患者群の処置または予防のために用いられる、請求項２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は異なるHLAタイプを有する複数の患者群においてがんあるいはC型肝炎ウイルス関連疾患の処置または予防に有用なペプチドを含むＣＴＬ誘導剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は日本人の死亡原因の第1位を占め年間約31万人が死亡している。世界では年間約600万人が癌で死亡している。癌治療においては、外科的切除、抗がん剤および放射線療法などが行われている。しかしながらかかる療法には再発やＱＯＬの問題、さらにはこれらの治療法が受けられない進行がんである場合の選択肢が無い等の問題がある。癌に対する免疫療法（ワクチン療法）は長い間第4の治療法として待望されおり、ヒトがん抗原ペプチドが同定可能になった1990年からペプチドワクチン臨床研究が世界中で開始された。しかし、ペプチド単独投与もしくは併用療法での臨床研究成果のまとめによれば1000例以上にて奏効率2.7%（Nature Immunology、2004）であり、医薬品化は困難であることが判明しつつある。【０００３】
一方、本発明者らは患者のHLAタイプおよび特異的免疫応答をあらかじめ検査して投与するペプチドワクチンを選択するテーラーメイド型のペプチドワクチン療法を実施して、安全性および効果を確認している。具体的にはテーラーメイド型ペプチドワクチンの単独投与にて脳腫瘍および子宮頸がんに対する臨床効果を確認した（非特許文献１〜３）。更には抗がん剤との併用により前立腺がん、すい臓がんにおいて医薬品化可能のレベルの優れた臨床効果並びに安全性を達成している（非特許文献４、５）。【０００４】
がんペプチドワクチン療法における主要なエフェクターと考えられている特異的Ｔ細胞による細胞性免疫はヒト白血球抗原（HLA）拘束性であり、特定のHLA型（HLA-A2及びHLA-A24）を有する患者のみを対象としたワクチン開発が発明者らを含めた世界中で実施されてきた。しかしながらこれら2種のHLA型の占める割合は40−75％程度であり、残りのマイナーなHLA型を有する25-60％の患者はペプチドワクチンの恩恵を受けることができない。従って、世界中のがん患者に適応可能なペプチドワクチン開発研究が必要とされている。【０００５】
既にHLA-A24、 -A2、-A26およびHLA-A3スーパータイプ（HLA-A3、-A11、-A31、-A33および-A68.1）のいずれかに結合し、それぞれのHLA拘束性にCTL誘導能を有するペプチドが同定され、かかるペプチドが癌ペプチドワクチンとして有用であることが報告されている（特許文献１〜１３および非特許文献１〜１７）。【０００６】
本発明者らが現在行っているテーラーメイドタイプのペプチドがんワクチン臨床試験ではこれらの知見に基づき、あらかじめ患者のHLAタイプを検査し、そのHLAタイプに合わせて候補ペプチドの中から最大4種類のペプチドを選別して投与している。すなわち、患者のHLAタイプがHLA-A2-A24であればHLA-A2および-A24の各セット８種類ずつ、合計16種類の中からペプチドを選別している。しかしながら、患者がHLA-A24のホモザイゴートである場合はA24の8種類の中から選ぶことになる。がんワクチンとなるペプチドの種類を新たに増やすのは非常に困難であることから、異なるグループ間でのHLA拘束性CTLの誘導が可能かどうか調べることにより、特定のHLAタイプの患者に対してペプチドの選択肢を広げることが可能である。【０００７】
一方、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染後の肝細胞障害の病因メカニズムはまだ良くわかってないが、多くの証拠からウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL)がHCV感染後の肝臓障害に重要な役割を果たしているかもしれないことが示されている（非特許文献６）。一方、CTLは感染の間にウイルスの広がりを制限し、ウイルスを排除するのに有効であると考えられている（非特許文献７）。従って、ワクチンによるＣＴＬ誘導はＨＣＶ感染に伴う疾患の管理の有望な戦略であろう。ここで、コストの低いこと、および保存が容易であることから、ＣＴＬ誘導を指向したペプチドワクチンの開発が求められている。【０００８】
本発明者らは先に、ＨＣＶコアタンパク質の配列に由来するペプチドであるＣ３５−４４プチド、配列ＹＬＬＰＲＲＧＰＲＬ（配列番号２５）がＨＬＡ−Ａ２４またはＡ３スーパータイプ陽性の患者においてＣＴＬを誘導しうることを確認している（特許文献１４）。またこれより前にこのＣ３５−４４ペプチドはHLA-A2陽性者末梢血よりウイルス排除に有効なＣＴＬを強力に誘導できることが報告されている(非特許文献８、特許文献１５）。【０００９】
本発明における引用文献は下記の通りである。下記文献は引用により本願の一部を形成する。
【特許文献１】国際公開WO2005/071075号公報
【特許文献２】国際公開WO01/011044号公報
【特許文献３】特開2003-270号公報
【特許文献４】国際公開WO2003/050140号公報
【特許文献５】特開平11-318455号公報
【特許文献６】国際公開WO00/12701号公報
【特許文献７】国際公開WO02/010369号公報
【特許文献８】国際公開WO99/67288号公報
【特許文献９】特許出願特願2007-2127179
【特許文献１０】特開2004-216号公報
【特許文献１１】国際公開WO2007/000935号公報
【特許文献１２】国際公開WO2005/075646号公報
【特許文献１３】国際公開WO2008/007711号公報
【特許文献１４】国際公開WO2007/083807号公報
【特許文献１５】国際公開WO2007/049394号公報
【非特許文献１】Yajima N et al., Clin Cancer Res. 2005 Aug 15;11(16):5900-11.
【非特許文献２】Mochizuki K et al., Int J Oncol. 2004 Jul;25(1):121-31.
【非特許文献３】Tsuda N et al., J Immunother. 2004 Jan-Feb;27(1):60-72.
【非特許文献４】Inoue Y et al., J Urol. 2001 Oct;166(4):1508-13.  Erratum in: J Urol. 2002 May;167(5):2146.
【非特許文献５】Yanagimoto H et al., Cancer Sci. 2007 Apr;98(4): 605-11. Epub 2007 Feb 19.
【非特許文献６】Chang KM et al,, Springer Semin Immunopathol. 1997; 19:57-68
【非特許文献７】Kurokohchi K et al., J. Virol. 1996; 70: 232-240
【非特許文献８】Takao Y. et al., Microbiol. Immunol., 48(7), 507-517, 2004
【非特許文献９】Yamada A et al., Cancer Res. 2001 Sep 1;61(17):6459-66
【非特許文献１０】Kobayashi K et al.,  Cancer Sci. 2003 Jul;94(7):622-7
【非特許文献１１】Nakao M et al.,  J Immunol. 2000 Mar 1;164(5):2565-74.
【非特許文献１２】Harashima N et al., Eur J Immunol. 2001 Feb;31(2):323-32
【非特許文献１３】Minami T et al., Cancer Immunol. Immunother. 2007, May 56(5) 689-98
【非特許文献１４】Matsueda S et al., Clin Cancer Res. 2005 Oct 1;11(19 Pt 1):6933-43
【非特許文献１５】Takedatsu H et al., Clin Cancer Res. 2004 Feb 1;10(3):1112-20.
【非特許文献１６】Naito M et al., Br J Cancer. 2007 Dec 17;97(12):1648-54. Epub 2007 Nov 27.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は複数のHLAタイプに拘束性にＣＴＬ誘導能を有するペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、既にHLA-A24、HLA-A2またはHLA-A3スーパータイプのいずれかに拘束性にＣＴＬ誘導能を有することが報告されている公知のペプチドであって、既に報告されている以外のHLAタイプを含む２以上のHLAタイプに拘束性にＣＴＬを誘導可能なペプチドを含むＣＴＬ誘導剤組成物を提供することを目的とする。【００１２】
即ち本発明はEGFR-800(配列番号１）、Lck-208（配列番号２）、Lck-488（配列番号３）、MRP3-1293（配列番号４） 、PAP-213（配列番号５）、 PSA-248（配列番号６）、SART2-93（配列番号７）、SART3-109（配列番号８）、SART3-302（配列番号９）、Lck-246（配列番号１０）、ppMAPkkk-432（配列番号１１）、WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）、HNRPL-501（配列番号１４）、CypB-129（配列番号１５）、Lck-422（配列番号１６）、Lck-449（配列番号１７）、β-tubulin5-154（配列番号１８）、Lck-90（配列番号１９）、PSA-16（配列番号２０）、PAP-248（配列番号２１）、IEX1-47（配列番号２２）SART3-511（配列番号２３）SART3-734（配列番号２４）、C35-44（配列番号２５）、PAP-155（配列番号２６）およびβ−tubuline309（配列番号２７）からなる群から選択される１以上のペプチドを含み、HLA-A2陽性患者群、HLA-A24陽性患者群、HLA-A26陽性患者群およびHLA-A3スーパータイプ陽性患者群からなる群から選択される２以上の患者群における、癌および／またはＣ型肝炎ウイルスに起因する疾患の処置または予防のために用いうる、ＣＴＬ誘導剤組成物を提供する。【００１３】
本発明はまた、EGFR-800(配列番号１）、Lck-208（配列番号２）、Lck-488（配列番号３）、MRP3-1293（配列番号４） 、PAP-213（配列番号５）、 PSA-248（配列番号６）、SART2-93（配列番号７）、SART3-109（配列番号８）、SART3-302（配列番号９）、Lck-246（配列番号１０）、ppMAPkkk-432（配列番号１１）、WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）、HNRPL-501（配列番号１４）、CypB-129（配列番号１５）、Lck-422（配列番号１６）、Lck-449（配列番号１７）、β-tubulin5-154（配列番号１８）、Lck-90（配列番号１９）、PSA-16（配列番号２０）、PAP-248（配列番号２１）、IEX1-47（配列番号２２）SART3-511（配列番号２３）SART3-734（配列番号２４）、PAP-155（配列番号２６）およびβ−tubuline309（配列番号２７）からなる群から選択される１以上のペプチドを含む組成物は、HLA-A2陽性患者群、HLA-A24陽性患者群、HLA-A26陽性患者群およびHLA-A3スーパータイプ陽性患者群からなる群から選択される２以上の患者群における、癌の処置または予防のために用いうる、医薬組成物を提供する。【００１４】
本発明の組成物のうち、EGFR-800（配列番号１）、Lck-488（配列番号３）、SART2-93（配列番号７）、SART3-109（配列番号８）、WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）、HNRPL-501（配列番号１４）、CypB-129（配列番号１５）、およびPAP-155（配列番号２６）からなる群から選択される１以上のペプチドを含むものは、HLA-A24およびHLA-A2の両方に拘束性にCTLを誘導でき、HLA-A24陽性癌患者群およびHLA-A2陽性癌患者群の処置または予防のために用いうる。【００１５】
本発明の組成物のうち、EGFR-800(配列番号１）、SART2-93（配列番号７）、SART3-109（配列番号８）、WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）、HNRPL-501（配列番号１４）、β-tubulin5-154（配列番号１８）、Lck-90（配列番号１９）および、IEX1-47（配列番号２２）、PAP-155(配列番号２６)およびβ-tubuline-309（配列番号２７）からなる群から選択される１以上のペプチドを含むものは、HLA-A24およびHLA-A3スーパータイプの両方に拘束性にＣＴＬを誘導でき、HLA-A24陽性癌患者群およびHLA-A3スーパータイプ陽性癌患者群の処置または予防のために用いうる。【００１６】
本発明の組成物のうち、SART2-93（配列番号７）、SART3-109（配列番号８）、Lck-246（配列番号１０）、ppMAPkkk-432（配列番号１１）、WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）、HNRPL-501（配列番号１４）Lck-422（配列番号１６）、Lck-90（配列番号１９）、およびSART3-511（配列番号２３）からなる群から選択されるペプチドを含むものは、HLA-A2およびHLA-A3スーパータイプの両方に拘束性にCTLを誘導でき、HLA-A2陽性癌患者群およびHLA-A3スーパータイプ陽性癌患者群の処置または予防のために用いうる。【００１７】
本発明の組成物のうち、SART2-93（配列番号７）、SART3-109（配列番号８）、WHSC2-103（配列番号１２）、UBE-43（配列番号１３）およびHNRPL-501（配列番号１４）からなる群から選択される１以上のペプチドを含むものは、HLA-A2、HLA-A24およびHLA-A3スーパータイプに拘束性にCTLを誘導でき、HLA-A2陽性癌患者群、HLA-A24陽性癌患者群およびHLA-A3スーパータイプ陽性癌患者群の処置または予防のために用いうる。【００１８】
本発明の組成物のうち、EGFR-800(配列番号１、ppMAPkkk-432（配列番号１１）、HNRPL-501（配列番号１４）およびSART3-109（配列番号８）からなる群から選択される１以上のペプチドを含むものは、HLA-A26に拘束性にCTLを誘導でき、上記に加えてHLA-A26陽性癌患者群の処置または予防のためにも用いうる。【００１９】
本発明の組成物のうち、C35-44(配列番号25)で表わされるペプチドを含む組成物は、HLA-A24陽性、HLA-A2陽性、HLA-A3スーパータイプ陽性およびHLA-A26陽性患者におけるC型肝炎ウイルス関連疾患、即ちHCV感染肝炎、肝硬変、肝臓癌患者群の処置または予防のために用いうる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のCTL誘導剤組成物に含まれるペプチドは複数のタイプのHLA拘束性にCTLを誘導する能力を有していることから、従来知られていた以外のHLAタイプの患者における癌やC型肝炎感染関連疾患の処置または予防のために用いることができる。本発明により、各HLAタイプの患者に対するペプチド選択の幅が広がり、テーラーメイドがんワクチン療法においてより効率的な治療が可能となる。【００２１】
また、C35-44(配列番号25)で表わされるペプチドを含むCTL誘導剤組成物はHLA-A24陽性、HLA-A2陽性、HLA-A3スーパータイプ陽性およびHLA-A26陽性患者のいずれにおいてもCTLを誘導することができ、C型肝炎ウイルス関連疾患の処置または予防のために用いうる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】HLA-A24結合性SART3-109を用いてHLA-A11陽性癌患者PBMCを刺激して得たCTLの細胞傷害活性を示す。
【図２】種々の結合性を有するペプチドのHLA-A26陽性細胞への結合能を示す。
【図３】ペプチドで刺激したHLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者からのPBMCの細胞傷害活性。HLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者からのPBMCをペプチドで刺激し、該PBMCの複数の標的細胞に対する細胞傷害活性を６時間51Cr遊離アッセイにて調べた。HLA-A3スーパータイプアレル陽性健常者ボランティアからのPHA刺激幼若化T細胞ブラストをコントロールとして用いた。* p<0.05
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
「HLA-A24、HLA-A2、HLA-A3スーパータイプおよびHLA-A26からなる群から選択される２以上のHLA分子に結合性」とは、ペプチドがHLA-A24分子、HLA-A2分子、HLA-A3スーパータイプ、HLA-A26分子に含まれる分子からなる群から選択される、２以上のHLA分子と複合体を形成し細胞表面に提示されうることを意味する。【００２４】
本発明においてペプチド特異的CTL誘導能とは、例えば、末梢血単核細胞（PBMC）をペプチドで刺激し、そのペプチド刺激PBMCが対応ペプチドをパルスした抗原提示細胞に反応してサイトカイン（例えばIFN-γ）を産生するかをELISA法等により測定して調べることができる。また、51Cr放出測定法等により、誘導されたCTLの細胞傷害活性を確認することができる。【００２５】
本発明のペプチドは、通常のペプチド合成により製造することができる。そのような方法として、例えば、Peptide Synthesis, Interscience, New York，1966； The Proteins, Vol2, Academic Press Inc.,New York, 1976；ペプチド合成、丸善（株）、1975；ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）、1985；医薬品の開発続 第十四巻・ペプチド合成、広川書店、1991）などに記載されている方法が挙げられる。【００２６】
本発明のCTL誘導剤組成物に含有されるペプチドは、本発明のペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドが細胞内で断片化されることで生じる場合もある。本発明は、そのような態様で本発明のペプチドを利用することも包含する。本発明のペプチドを提供できる限り、ポリペプチドのアミノ酸残基数およびアミノ酸配列は任意である。【００２７】
本発明のCTL誘導剤組成物に含有されるペプチドは、HLA-A24、HLA-A2、HLA-A3スーパータイプおよびHLA-A26からなる群から選択される２以上のHLAタイプ陽性患者群において癌細胞を特異的に傷害するCTLを効率的に誘導し増殖させることができ、幅広い癌患者の治療に有用である。【００２８】
本発明は、上記に特定したペプチドを含む、癌を処置または予防するための医薬組成物を提供する。本発明の癌を処置または予防するための医薬組成物は、１種類のペプチドを含むものであってもよく、２種類以上のペプチドおよび／または誘導体を組み合わせて含んでも良い。癌患者のCTLは相異なる癌抗原ペプチドを認識する細胞の集合なので、複数種類のペプチドおよび／また誘導体を組み合わせて使用するとさらに効果的である。本発明のペプチド以外の癌抗原ペプチドと組み合わせても良い。【００２９】
本発明の癌を処置または予防するための医薬組成物は、テーラーメイド型の治療に用いるべく、本発明のペプチドを含む複数種、例えば８種類のペプチドを個別に含む製剤を含むものであってよい。【００３０】
本発明の医薬組成物は、ペプチドに加えて、医薬上許容される担体などを含むことができる。担体としては、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が使用できる。本発明の医薬組成物は、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤などであってもよい。また、免疫応答が効果的に成立するように、従来からワクチン投与に用いられることが知られているアジュバントとともに投与することもできる。投与方法は、例えば皮内投与または皮下投与などである。【００３１】
本発明の癌を処置または予防するための医薬組成物は、がんワクチンとして使用可能である。投与量は、疾患の状態、個々の患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常医薬組成物中のペプチドの量は、０．０００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ、より一層好ましくは０．１〜５ｍｇまたは０．５〜３ｍｇである。これを数日、数週または数ヶ月に１回、反復投与することが好ましい。【００３２】
本発明はまた、HLA-A24、HLA-A2、HLA-A26またはHLA-A3スーパータイプ陽性の癌患者群より採取された末梢血単核細胞（PBMC）を本発明のペプチドと接触させることを含む、癌反応性CTLを誘導する方法を提供する。本発明のペプチドは上記のうち２以上の癌患者群のPBMCからCTLを誘導することができる。CTLについて「癌反応性」とは、標的癌細胞上の癌抗原ペプチドとHLA分子との複合体を認識し、その細胞を傷害する能力を有することを意味する。CTLの誘導は、例えば、HLA-A24陽性悪性脳腫瘍患者から採取されたPBMCを、in vitroで本発明のペプチドの存在下培養することにより行う。本発明のCTL誘導方法は、PBMCを採取した患者の体内に誘導したCTLを戻して癌細胞を傷害する養子免疫療法に有用である。【００３３】
本発明はまた、前記CTL誘導方法を実施するために用いられるCTL誘導キットを提供する。本発明のキットは、本発明のペプチドを１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含む場合もある。【００３４】
本発明はまた、HLA-A24、HLA-A2、HLA-A26およびHLA-A3スーパータイプ陽性癌細胞からなる群から選択される癌細胞に対して細胞を傷害するCTLを誘導しうる抗原提示細胞を調製する方法を提供する。本発明の抗原提示細胞調製方法は、例えば、HLA-A24陽性癌患者由来の抗原提示能を有する細胞を本発明のペプチドとともに培養し、そのペプチドをHLA-A24分子に結合および提示させることにより行う。あるいはそのようなペプチドを発現可能なベクターを、HLA-A24陽性癌患者由来の抗原提示能を有する細胞に導入し発現させてもよい。抗原提示能を有する細胞は、例えば樹状細胞である。患者由来の樹状細胞は、例えば、患者より採取したPBMCから培養プレート接着細胞を分離し、その細胞をIL-4およびGM-CSFの存在下で約１週間培養することで得られる。本発明の方法により調製された抗原提示細胞は、HLA-A24、HLA-A2およびHLA-A3スーパータイプ陽性癌細胞からなる群から選択される２種以上の細胞においてその細胞表面に提示するペプチドと当該HLAとの複合体を特異的に認識するCTLを誘導することができ、癌患者に投与された場合患者体内で癌反応性CTLの誘導を促進することができる。つまり本発明の方法により調製される抗原提示細胞は、癌を処置または予防するための医薬として使用可能である。【００３５】
本発明はまた、前記抗原提示細胞調製方法を実施するために用いられる抗原提示細胞調製キットを提供する。本発明のキットは、本発明のペプチドおよび／または誘導体を１または２種類以上含み、さらに適当な緩衝液や培地などを含む場合もある。【００３６】
本発明はまた、C35-44（配列番号２５）のペプチドを含み、HLA-A24、HLA-A2、HLA-A3スーパータイプおよびHLA-A26陽性患者におけるＣ型肝炎ウイルス関連疾患の処置および／または予防に有用なＣＴＬ誘導剤組成物を提供する。本発明いおいて「Ｃ型肝炎ウイルス関連疾患」とはＣ型肝炎のみならず、肝硬変、肝臓癌等のＨＣＶ感染に起因して生じるあらゆる疾患を含むものとする。【００３７】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれら実施例により制限されるものではない。【００３８】
本発明者らは、HLA-A24、HLA-A2、HLA-A26およびHLA-A3スーパータイプのいずれかに拘束性にＣＴＬ誘導能を有することが知られているペプチドそれぞれ１３、９、１２種類、合計３４種類につき、他のHLAタイプに対する結合能を調べた。
本発明者らが調べたペプチド並びに公知のHLA結合特性を表１に示す。【００３９】
【表１】
0005568309.tif 000002
【００４０】
ペプチド
表１に示す各ペプチドを用意した。
ペプチドは全て純度＞90％であり、Biologica Co.（Nagoya, Japan）より購入した。HLA-A2タイプに結合する対照ペプチドとしてGag 77-85（SLYNTVATL）（配列番号３５）を、HLA-A24タイプに結合する対照ペプチドとしてはenv-GP （RYLRDQQLL）（配列番号３６）を、HLA-A26タイプに結合する対照ペプチドとしてはHIV-Gag167-175 EVIPMFSAL（配列番号３７）、またHLA-A3スーパータイプアレル分子に結合する対照ペプチドとして、HIV由来ペプチド（RLRDLLLIVTR）（配列番号３８）を使用した。ペプチドは全てジメチルスルホキシドを用いて10μg/mlの用量で溶解した。【００４１】
HLA-A3 スーパータイプに含まれる５種類のHLA-Aアレルは結合モチーフを共有するがHLA-A3またはHLA-A68.1陽性の日本人は非常に稀なことから、本研究ではHLA-A11、-A31および-A33分子に対する結合能を検討した。
患者（PT)
HLA-A2、HLA-A24、HLA-A26, HLA-A11、HLA-A31およびHLA-A33の各HLA陽性がん患者が含まれた。
健常人（HD)
健常人としては、HLA-A2陽性、HLA-A24陽性、HLA-A26陽性、 HLA-A11陽性、HLA-A31陽性、HLA-A33陽性患者が含まれた。
PBMCを採取した患者および健常人はいずれもHIV非感染であった。患者／健常人より末梢血20mlを採取し、フィコール・コンレイ比重遠心法によりPBMCを調製した。試料は全て実験で使用するまで低温にて保存した。PBMC上のHLA-A2, HLA-A24, HLA-A11、-A31および-A33分子の発現は、以下の抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した：抗HLA-A24モノクローナル抗体（ｍAb)、抗HLA-A2 mAb、抗HLA-A26mAb、抗HLA-A11 ｍAb、抗HLA-A31 mAb、抗HLA-A33 mAb (いずれも One Lambda, CA, USA)；およびFITC結合抗マウスイムノグロブリンG (IgG) mAb。【００４２】
細胞株
HLA-A2を発現するT2細胞はATCC(CRL-1992)より入手した。C1R-A24、C1R-A26, C1R-A11、C1R-A31およびC1R-A33は、C1R親細胞株に、HLA-A24、HLA-A26、HLA-A11、HLA-A31およびHLA-A33遺伝子をそれぞれトランスフェクトして対応するHLA分子を発現するようにしたものである（Takedatsu et al., Clin Cancer Res 2004;10:111220)。C1R親細胞はヒトBリンパ芽球化細胞（HMy2．CIR: Human B lymphoblast; ATCC CRL-1993）であり、HMy.2 B lymphoblastoid cell lineをγ線照射し、抗体と補体によってMHCクラスI-Cw4は発現するものの、HLA-クラスI-Aと-Bは欠失した細胞を選別して得られた細胞株である(Storkus WJ, Alexander J, Payne JA, Dawson JR, and Cresswell P, Procnatl acad sci USA, 86: 2361-2364、1989)。
RMA-S-A2601はRMA-S細胞（細胞膜上でのMHCクラスI分子の発現が低い変異RMA細胞として分離された細胞：Karre K, Ljunggren H-G, Piontek G, and Kiessling R. 1986, Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggest alternative immune defence strategy. Nature (Lond) 319: 675）.）にHLA-A2601遺伝子を導入したステイブル・トランスフェクタント細胞。【００４３】
PC-93は前立腺肉腫（prostate sarcoma）細胞株、HLA-A11陰性。TSU-PRは前立腺癌細胞株、HLA-A11陽性。SQ-1は肺がん細胞株、HLA-A11陰性、COLO-201は、大腸がん細胞株、HLA-A11陽性、LC-1は肺がん細胞株、HLA-A31/HLA-A33陽性、全ての腫瘍細胞株は全て10％FCS含有RPMI 1640（Invitrogen）で培養した。【００４４】
PBMCからのペプチド反応性CTLの誘導
ペプチド反応性CTLは既報の方法に一部変更を加えて検出した（Hida N, Maeda Y, Katagiri K, Takasu H, Harada M, Itoh K., Cancer Immunol Immunother 2002;51:219-28.）。各患者（PT)並びに健常人（HD)末梢血より常法により得たPBMCをin vitroにて各種ペプチドまたは対照ペプチドで刺激した。得られたペプチド刺激PBMCを、PBMCへのペプチド刺激に用いたものと同じペプチドをパルスしたT2, C1R-A24, -A26, -A11、C1R-A31またはC1R-A33細胞と共に培養し、産生されるIFN-γを測定してCTL誘導の指標とした。【００４５】
詳細には、U底96ウェルマイクロカルチャープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）において培養液200μl中で、PBMC（1 x 105 細胞／ウェル）を各ペプチド（10μl／ml）と共に４ウェル一組にてインキュベートした。本培養液は45% RPMI 1640、45% AIM-V培地（Gibco-BRL, Gaithersburg, MD）、10% FCS、100 U/ml インターロイキン-2（IL-2）および0.1mM MEM 非必須アミノ酸溶液（Gibco-BRL）より構成された。3日毎に培養液の半分を除去して対応ペプチド（10μg/ml）を含む新しい培養液と交換した。培養15日目に、培養細胞の半分を対応ペプチドをパルスしたT2, C1R-A24, -A26, -A11、C1R-A31またはC1R-A33細胞と混合し、残りの半分は対照ペプチドをパルスしたT2, C1R-A24, -A26, -A11、C1R-A31またはC1R-A33細胞と混合した。各混合培養物をさらに18時間インキュベートした後上清を回収し、上清中のインターフェロン（IFN）-γのレベルを酵素結合免疫測定法（ELISA）により測定した。ペプチド反応性CTLの誘導は、P値が0.05未満であり、かつ各対照ペプチドをパルスした細胞と比較して対応ペプチドをパルスした細胞に応答して50 pg/mlを超えるIFN-γが産生された場合に陽性と判断した。【００４６】
細胞傷害活性の測定
HLA-A11陽性細胞株TSU-PRおよびHLA-A11陰性細胞株PC93に対するペプチド刺激PBMCの細胞傷害活性は、標準的6時間51Cr放出測定法により測定した。HLA-A11陽性健常人より誘導したフィトヘマグルチニン（PHA）活性化T細胞を陰性対照標的細胞として使用した。丸底96ウェルプレートにおいて各ウェルにつき2000個の51Cr標識標的細胞を、示したエフェクター細胞／標的細胞の比率でエフェクター細胞とともに培養した。エフェクター細胞としては、ペプチド刺激PBMC細胞から細胞傷害活性測定実験の直前にCD8陽性T細胞をCD8 Positive Isolation Kit （Dynal, Oslo, Norway）により単離したものを用いた。特異的51Cr放出は、試験におけるc.p.m.から自然放出によるc.p.m.を差し引いて計算した。エフェクター細胞なしでインキュベートした試料の上清より自然放出を決定し、その後試料を1% Triton X（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）とインキュベートして全放出を決定した。【００４７】
ペプチドのHLA-A26分子への結合試験
HLA−A2601遺伝子を導入したRMA-S細胞(RMA-S-A2601)を26℃で20時間培養した後、0.1-100 μMの濃度の各種ペプチドおよびヒトβ2-ミクログロブリンと共に26℃で2時間培養後、さらに37℃で3時間培養した。細胞をPBSで洗浄後至適濃度の抗ヒトMHCクラスI抗体、あるいはHLAタイプ特異的抗体を加えて30分間氷中に靜置した。細胞を2回PBSで洗浄後Alexa Fluor 488 標識ヤギ抗マウスIgGを加えて30分間氷中に靜置した。フローサイトメーターで測定後、蛍光強度を比較した。【００４８】
各種ペプチドが複数のHLAタイプ拘束性CTL誘導能を有する可能性の検討
これまですでに同定されているがんペプチドワクチンのための候補ペプチドのうち、HLA-A2, -A24および-A3スーパータイプ結合性ペプチドをそれぞれ9、13、および10種類、合計34種類を選び、もともと結合することが証明されているHLAとタイプの異なるHLAに拘束したCTLの誘導能を調べた。各種HLAタイプの患者末梢血をそれぞれのペプチドで刺激し、各種タイプHLA遺伝子を移入して作成したC1Rトランスフェクタントに対応するペプチドをパルスした細胞を標的としてCTL誘導能を調べた。【００４９】
HLA-A24結合性ペプチドのうち配列番号１〜８までのペプチドについてまず交叉反応性を調べた。EGFR-800（配列番号１）はHLA-A11、 Lck-488（配列番号３）はHLA-A2、SART2-93（配列番号７）はHLA-A2と‐A11、SART3-109（配列番号８）はHLA-A2, -A11, -A31拘束性にCTLを誘導した（表２）。表中、数字はIFN-γのレベル（ng/ml)で、50ng/ml以上を有意とした。記載無しは実施せず、マイナス（−）はIFN-γが検出限界以下であることを示す。【００５０】
【表２】
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【００５１】
同様にHLA-A2結合性ペプチドのうち配列番号９〜１６のペプチドについて調べた。CypB-128（配列番号１５）はHLA-A24、Lck-246（配列番号１０）はHLA-A11と -31、Lck-422（配列番号１６）はHLA-A31、ppMAPkkk（配列番号１１）はHLA-11とHLA-A31、WHSC2-103（配列番号１２）はHLA-A24と-A31、UBE-43（配列番号１３）はHLA-A24と-A31、およびHNRPL-501（配列番号１４）はHLA-A24と‐A11拘束性にCTL誘導能が認められた（表３）。表中、数字はIFN-γのレベル（ng/ml)で、50ng/ml以上を有意とした。【００５２】
【表３】
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【００５３】
さらに、HLA-A3スーパータイプ結合性ペプチドのうち配列番号１７〜２４のペプチドについて調べた。β-tubulin5-154（配列番号１８）はA24、 Lck-90（配列番号１９）はA2、IEX1-47（配列番号２２）はA24, およびSART3-511（配列番号２３）はA2拘束性にCTL誘導能が認められた（表４）。表中、数字はIFN-γのレベル（ng/ml)で、50ng/ml以上を有意とした。【００５４】
【表４】
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【００５５】
異なるHLA-A3スーパータイプ拘束性細胞傷害活性
HLA-A24結合性であることが知られているSART3-109（配列番号８）ペプチドを用いて、HLA-A11陽性の前立腺がん患者PBMCを刺激してCTLを誘導した。得られたCTLの細胞傷害活性をクロム遊離反応で確認した。HLA-A11陽性細胞株TSU-PRに対する細胞傷害活性は、HLA-A11陰性細胞株PC93およびHLA-A11陽性健常人由来PHA刺激リンパ芽球に対して有意にクロム遊離率が高値を示した（図１）。【００５６】
ペプチド−HLA-A26結合試験
RMA-S-A2601に対する各種ペプチド結合能を調べた。ペプチドはDMSOに溶解して用いた。陰性コントロールとしては、DMSO単独で用いた。この実験結果から、HLA-A24拘束性CTL誘導能を有するSART3-109(配列番号８)が、全く異なるHLAスーパータイプに属するHLA-A26にも結合することが示された。また、同じくHLA-A24拘束性EGFR-800（配列番号１）も、弱いながらもHLA-A26分子に結合することが示唆された（図２）。【００５７】
Lck-90およびLck-449ペプチドのHLA-A3スーパータイプアレルへの結合能
特許文献９に開示したLck-90（配列番号１９）およびLck-449（配列番号１７）のHLA-A3スーパータイプアレルへの結合能を示すデータは下記のとおりである。
Lck-90およびLck-449ペプチドについて、HLA-A3前立腺癌患者の血漿中に該ペプチド反応性IgGが高頻度に観察されることを確認した。またHLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者PBMCからのLck-90およびLck-449ペプチド特異的CTLの誘導能を上記の方法で確認した。Lck-90およびLck-449ペプチドは、7名のHLA-A11陽性癌患者中それぞれ５および２名の、５名のHLA-A31陽性癌患者のうちそれぞれ３および３名の、５名のHLA-A33陽性癌患者のうちそれぞれ２および３名のPBMCから対応ペプチド反応性CTLを誘導した。【００５８】
In vitroにおいてHLA-A3スーパータイプアレル陽性前立腺癌患者由来のPBMCをLck-90（配列番号１９）またはLck-449（配列番号１７）ペプチドにて刺激し、それにより誘導されたペプチド反応性CTLが癌細胞に対して細胞傷害活性を示すかどうかを調べた。Lck-90およびLck-449ペプチドのそれぞれにて刺激したHLA-A11陽性患者由来のPBMCは、HLA-A11陰性COLO201細胞および陰性対照であるHLA-A11陽性健常人由来PHA刺激幼若化Ｔ細胞ブラストに対してより、HLA-A11陽性SQ-1細胞に対してのほうが高いレベルの細胞傷害活性を示した。同様に、これらペプチドは、HLA-A31陽性患者およびHLA-A33陽性患者のPBMCからLC-1（HLA-A31+/-A33+）反応性CTLを誘導する能力を有していた。各ペプチド特異的CTLはCOLO201細胞または幼弱化Ｔ細胞に対するより、LC-1細胞に対して強い細胞傷害活性を示した。即ち、インビトロでLck-90およびLck-449ペプチドに刺激されたPBMCは癌細胞に対してHLA-A11、-A31、および-A33それぞれに拘束性に細胞傷害活性を発揮することが示された。【００５９】
細胞傷害活性の測定
各HLAタイプを有する癌患者由来のPBMCをペプチドで刺激して、該ペプチド各HLAタイプに対するCTL誘導能を調べた。それぞれの患者のHLAタイプに対応するHLAタイプを有するがん細胞株を標的細胞として用い、各標的細胞に対する細胞傷害活性を標準的6時間51Cr放出測定法により測定した。【００６０】
ここで用いた標的細胞は、PC93(A68)、 KE4(A24/A26)、KE5(A1101/)、PC93-A24(A24/A68)、PC93-A33(A33/A68)、PC93-A31(A31/A68)、COLO201(A0101/0201)、11-18 (A0201/A2402)、TSU-PR (A11)、LC-1 (A3101/A3303)、Panc-1 (A0201/A1101)、LC-1 (A3101/A3303)、 LC65A(1101/2402)、LNCap-A11(A11/A0101/0201)、 KNS42 (A 2402/2601)、 LNCap-A24(A24/A0101/0201)およびLNCap-A31(A31/A0101/0201)の各癌細胞株である。また、陰性対照としてQG56 (A2601)、PC93(A68)、LNCap(A0101/0201)、 LC-1 (A3101/A3303)、 COLO201 (A0101/0201)、 COLO320(A2402/)、 およびK562を用いた。カッコ内は各細胞株のHLAタイプを示す。ここで、PC93（WT）はHLA-A68を発現しているが、例えばPC93-A24と標記したものはHLA-A24をコードする遺伝子を導入して作成したステイブル・トランスフェクタントを意味する。全ての腫瘍細胞株は全て10％FCS含有RPMI 1640（Invitrogen）で培養した。なお結果を示す表５中にはトランスフェクタントについてのみHLAを記載し、改変していないものについては（WT）と記載した。
PBMCが由来する癌患者のHLAタイプとは相違するHLAタイプを有する腫瘍細胞株を陰性対照標的細胞として同様にペプチド活性化PBMCによる細胞傷害活性を調べ、陰性対照標的細胞に対する細胞傷害活性に比してHLAマッチ標的細胞に対して統計学的に有意な細胞傷害活性が認められた場合に、当該HLAタイプ拘束性に細胞傷害活性の誘導があったと認定し、結果を示す表５に「＋」を付した。なお、表５には試験に用いたHLAマッチ標的細胞と対照標的細胞を記載するが、表中に係る細胞の記載が無く、「＋」を付しているものは、既に当該ペプチドにおいて表示したHLA型に拘束性のCTL誘導活性が知られていることを意味する。【００６１】
ただしHCV由来ペプチドであるC35-44(配列番号２５）のペプチド特異的CTL活性は、HCV感染患者由来PBMCをC35-44 ペプチド刺激した細胞を用い、標的細胞としてC35-44をパルスしたそれぞれの対応するHLA遺伝子を安定的に導入したC1R細胞をHLAマッチ標的細胞として用い、C1R（WT)を対照標的細胞として用い、常法によりクロム遊離反応で測定した。【００６２】
丸底96ウェルプレートにおいて各ウェルにつき2000個の51Cr標識標的細胞を、エフェクター細胞／標的細胞４０となる比率でエフェクター細胞とともに培養した。エフェクター細胞としては、細胞傷害活性測定実験の直前にペプチド活性化PBMCよりCD8陽性T細胞をCD8 Positive Isolation Kit （Dynal, Oslo, Norway）により単離したものを用いた。。特異的51Cr放出は、試験におけるc.p.m.から自然放出によるc.p.m.を差し引いて計算した。エフェクター細胞なしでインキュベートした試料の上清より自然放出を決定し、その後試料を1% Triton X（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan）とインキュベートして全放出を決定した。
誘導されたCTLのHLA拘束性およびペプチド特異性は、HLA-クラスIおよびCD8に対するモノクローナル抗体による特異的抑制実験および非標識標的細胞を用いたコールドターゲット抑制実験にて、それぞれ確認した。実験をトリプリケイトで行い、陰性コントロールと比較して有意（P<0.05）に抗体あるいはコールドターゲット(同位元素で標識していない標的細胞)で抑制が見られたものを陽性とし、＋で示した。【００６３】
結果
HLA-A2結合ペプチド
C35-44（配列番号２５）は、HLA-A2402、 A2601、 A3101、 A3303、およびA1101拘束性にCTL誘導能が確認された。
CypB-129（配列番号１５）、Lck-422（配列番号１６）、 SART3-302（配列番号９）、UBE-43（配列番号１３）、 およびWHSC2-103（配列番号１３）はHLA-A3101拘束性CTL誘導能が確認された。また、HNRPL-501（配列番号１４）およびppMAPkkk-432（配列番号１１）にHLA-2601拘束性CTL誘導能が確認された。【００６４】
HLA-A24結合ペプチド
SART3-109（配列番号はHLA-A3101、A3303、およびA1101拘束性に、Lck208はHLA-A1101拘束性に、EGRF-800はHLA-A0201拘束性に、SART2-93はHLA-A0201およびA0207拘束性に、それぞれCTL誘導能が確認された。【００６５】
HLA-A3結合ペプチド
PAP-155はHLA-A0201およびA2402に、β-tubline-309およびLck-90はHLA−A2402拘束性にCTL誘導能があることが示された。結果を表５にまとめた。【００６６】
【表５−１】
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【００６７】
【表５−２】
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【００６８】
以上の結果からわかるように、本発明において特定される配列番号１〜２７に記載のペプチドは、HLA-A2、HLA-A24、HLA-A26およびHLA-A3スーパータイプ陽性患者からなる群から選択される、２以上の群の患者においてHLA特異的にCTLを誘導することができ、かかる患者のの処置または予防に好適に用いられる。本発明の配列番号１〜２４および２６−２７に記載のペプチドは癌ペプチドワクチンの有効成分として、特に好適に用いられ、本発明の配列番号２５に記載のペプチドはC型肝炎ウイルス関連疾患の処置または予防に好適に用いられる。
【図１】
0005568309.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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