(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１の７８番目に対応する位置でシステイン残基を有するシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと；
前記システイン残基に結合した検出可能標識と、
を含む造影剤であって、
前記造影剤はフォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合することを特徴とする、造影剤。
【請求項２】
前記シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載の造影剤。
【請求項３】
前記検出可能標識が、蛍光検出可能標識、核磁気共鳴画像法の検出可能標識、またはシンチグラフィ検出可能標識であり、随意に、前記核磁気共鳴画像法の検出可能標識が、ガドリニウム（Ｇｄ３＋）イオン等の常磁性イオンまたは超常磁性イオンであり、随意に、前記シンチグラフィ検出可能標識が、フッ素１８、ガリウム６８、および銅６４等の陽電子放出放射性同位元素、あるいはテクネチウム９９ｍまたはインジウム１１１等のガンマ放出放射性同位元素である請求項１または請求項２に記載の造影剤。
【請求項４】
前記検出可能標識が、前記シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドの前記システイン残基に結合するチオール反応基、随意にマレイミド基を含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の造影剤。
【請求項５】
二機能性リンカーをさらに含み、前記リンカーは前記シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドの前記システイン残基に結合するチオール反応基、随意にマレイミド基と、前記検出可能標識に結合する結合部分とを含む請求項１乃至３のいずれか１項に記載の造影剤。
【請求項６】
前記検出可能標識が金属イオンであり、前記結合部分が前記金属イオンと錯体化するキレート、随意にＤＯＴＡまたはＤＴＰＡである請求項５に記載の造影剤。
【請求項７】
個体内の細胞死のイメージングのための薬剤の製造における請求項１乃至６のいずれか１項に記載の造影剤の使用であって、
ここで細胞死は、前記造影剤を前記個体に投与する工程と、
前記個体内における前記造影剤の分布の１枚以上の画像を生成する工程と、
によりイメージングされることを特徴とする、使用。
【請求項８】
前記個体が１つ以上の部位の細胞死の存在によって特徴付けられる病状を有しており、前記１枚以上の画像が前記１つ以上の部位での前記造影剤の分布を示す請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記個体が腫瘍を有しており、前記１枚以上の画像が前記腫瘍の部位での前記造影剤の分布を示す請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
個体において腫瘍を治療する癌治療の効果の決定に使用するための薬剤の製造における請求項１乃至６のいずれか１項に記載の造影剤の使用であって、
ここで前記癌治療の効果は、癌治療前、癌治療中、または癌治療後に前記造影剤を前記個体に投与する工程と、
前記個体内の前記腫瘍の部位で前記造影剤の分布の１枚以上の画像を生成する工程と、
により決定され、
前記治療前に対して前記治療中または前記治療後に前記腫瘍の部位での前記造影剤の結合が増加することは、前記治療が前記個体に有効であることを示す、使用。
【請求項１１】
個体内の１つ以上の部位の細胞死によって特徴付けられる病状に対する治療の効果の決定に使用するための薬剤の製造における請求項１乃至６のいずれか１項に記載の造影剤の使用であって、
ここで前記治療の効果は、治療前、治療中、または治療後に前記造影剤を前記個体に投与する工程と、
前記個体内の細胞死の前記１つ以上の部位で前記造影剤の分布の１枚以上の画像を生成する工程と、
により決定され、
前記治療前に対して前記治療中または前記治療後に細胞死の１つ以上の部位での前記造影剤の結合が減少することは、前記治療が前記個体に有効であることを示す、使用。
【請求項１２】
前記病状が、心筋梗塞、心臓プラーク形成、炎症、または感染症からなる群から選択される請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
個体内の細胞死のイメージングに用いる医薬組成物の調製方法であって、
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の造影剤を提供する工程と、
前記造影剤を医薬的に許容される賦形剤と混合する工程と、
を含む方法。
【請求項１４】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の造影剤を含む第１の容器と、医薬的に許容される希釈剤を含む第２の容器と、を含む細胞死をイメージングするためのキット。
【請求項１５】
フローサイトメトリーまたは組織化学のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法における、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の造影剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子イメージングに用いる造影剤に関し、特に、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死の発現および範囲を検出するための造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療後の腫瘍における細胞死の発現および広がりの速度は、治療結果の良好な予後指標と考えられる。従って、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死の発現および範囲を検出することが可能な、例えば、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用の標的造影剤は、例えば、癌治療の効果を評価するのに有用である。ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死の発現および範囲の検出は、心筋梗塞、心臓プラーク、炎症、または感染症などの他の病的状態にも有用であろう。
【０００３】
死につつある細胞の表面上に外面化したフォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合するアネキシンＶは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死を検出するために造影剤に使用されている。しかしながら、アネキシンＶは、サイズが大きい（３６ｋＤａ）、ＧＭＰ産生プロセスが複雑である、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腎クリアランスが遅いなどのいくつかの制限があり、造影剤としての臨床用途が制限されている（Ｈａｎら、（２００８），Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４（３）；３４３；ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｅｌｅら、（２００３），Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２１：３４８３；Ｂｅｌｈｏｃｉｎｅら、（２００２），Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：２７６６）。
【０００４】
フォスファチジルセリン（ＰＳ）にも結合するシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインは、酸化鉄ナノ粒子で標識されて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死の検出に使用されている［Ｚｈａｏ  Ｍら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．７（１１）：１２４１，２００１］。しかしながら、このアプローチの有用性は、これらの構築物のサイズが比較的大きい（〜２５ｎｍ）ことによって、血管系からの構築物の溢出、および腫瘍からの非結合材料のクリアランスを両方とも制限し、それ故に組織コントラストの生成を制限していた。
【０００５】
ガドリニウム（Ｇｄ３＋）−キレート系ＭＲＩ造影剤は、陽性コントラストを与え、腫瘍にしばしば見られる空間的および一時的に不均一なコントラストの検出を容易にする。Ｇｄ３＋−キレート系造影剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ［Ｊｕｎｇ  ＨＩら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１５（５）：９８３，２００４］およびｉｎ  ｖｉｖｏ［Ｋｒｉｓｈａｎ  Ａら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２４６（３）：８５４，２００８］で使用されており、腫瘍治療の効果を上手く検出している。
【０００６】
（Ｇｄ３＋）−標識アビジンに結合された２つのビオチニル化された野生型Ｃ２Ａドメインに基づいた造影剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験されている［Ｎｅｖｅｓら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．７（５）：１４１９，２００７］。
【０００７】
Ｃ２Ａ−ＧＳＴ融合タンパク質は、９９ｍＴｃで標識されており、治療後における腫瘍の細胞死を検出するためにＳＰＥＣＴと一緒に使用されている［Ｗａｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３５（３）：３５９−３６４，２００８］。
【０００８】
上記の薬剤は全て、いくつかの本質的な限界を有している。野生型Ｃ２Ａのリジンイプシロンアミノ基を修飾することは、活性を部分的に喪失させる。さらに、リジン残基の修飾により、フォスファチジルセリンに対する種々の結合親和性をもつ複数のＣ２Ａ種が生成される。ビオチニル化により、野生型Ｃ２Ａを１〜３個のビオチン分子で標識することが示されている。複数種を生成することに加えて、野生型Ｃ２Ａの分子１個当たりに２個以上のビオチン分子が存在することで、複数のアビジン分子の分子間反応が促進され、高分子量複合体が生成される。これは、造影剤を使用する前に取り除く必要がある。
【０００９】
本発明者らは、修飾されたシナプトタグミンＩ  Ｃ２Ａドメインに基づいた改良型の分子造影剤を開発した。これらの薬剤は、例えば、癌治療後の腫瘍におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死の評価に有用であろう。
【発明の概要】
【００１０】
一態様において、本発明は、配列番号１の７８番目に対応する位置でシステイン残基を有するシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと；システイン残基に結合した検出可能標識とを含む造影剤を提供する。
【００１１】
造影剤は、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドを介してフォスファチジルセリン（ＰＳ）に結合する。その後、検出可能標識により、個体においてｉｎ  ｖｉｖｏで結合した薬剤の画像を生成することができる。死につつある細胞は、フォスファチジルセリン（ＰＳ）を細胞表面上に外面化するか、または、フォスファチジルセリン（ＰＳ）を細胞膜の内側膜（ｉｎｎｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）上に露出するため、得られた画像において結合造影剤の濃度が増加することは、個体内の組織または領域で細胞死が起きていることを示すものである。換言すれば、ある部位でアポトーシス細胞または壊死細胞が存在することは、個体において、他の部位に対して前記部位での造影剤の量が増すことによって示される。
【００１２】
シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、哺乳動物シナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインまたはその変異体のアミノ酸配列を含んでもよく、修飾されたアミノ酸配列は、配列番号１の７８番目に対応する位置でシステイン残基を含む。配列番号１の７８番目に対応する位置のシステイン残基は、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドにおける唯一のシステイン残基であることが好ましい。
【００１３】
配列番号１の７８番目に対応する位置でシステイン残基を有するシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、本明細書では「Ｃ２Ａｍ」と呼ぶ。
【００１４】
検出可能標識がＣ２Ａドメインのシステイン基に結合することで、フォスファチジルセリンに対して単一の結合親和性をもつ一様な形式（即ち、単一の分子種）の造影剤を生成することができる。
【００１５】
例えば、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、配列番号１の７８番目に対応する位置でシステイン残基を保持する配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含んでもよい。
【００１６】
哺乳動物シナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインの変異体は、参照する哺乳動物シナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインの配列と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有してもよい。
【００１７】
適当な参照哺乳動物シナプトタグミンＩ配列としては、ヒトシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインのアミノ酸配列（ＳＹＴ１：ＧｅｎｅＩＤ：６８５７；核酸配列ＮＭ＿００５６３９．１  ＧＩ：５０３２１３８；アミノ酸配列ＮＰ＿００５６３０．１  ＧＩ：５０３２１３９）または、ドブネズミなどの別の哺乳類種からのホモログ（Ｓｙｔ１：ＧｅｎｅＩＤ：２５７１６；アミノ酸配列Ｐ２１７０７．３  ＧＩ：９４７３０４２８またはＮＰ＿００１０２８８５２．２  ＧＩ：１４８３５６２２６；ヌクレオチド配列ＮＭ＿００１０３３６８０．２  ＧＩ：１４８３５６２２５）が挙げられる。シナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインの７８番目（配列番号１）は、完全長ドブネズミシナプトタグミンＩの２１７番目および完全長ヒトシナプトタグミンＩの２１８番目に一致する。
【００１８】
適当な参照配列としては、配列番号１に示すシナプトタグミンＩのＳ７８Ｃ変異Ｃ２Ａドメインが挙げられる。配列番号１は、ラットおよびヒトのＣ２Ａドメインアミノ酸配列（両方とも同一）に対応する。
【００１９】
アミノ酸配列同一性は、一般に、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（商標）、アクセルリス社、カリフォルニア州サンディエゴ）を参照して定義される。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））を用いて、マッチ数を最大化し、かつ、ギャップ数を最小化する２つの全配列を整列させる。一般に、ギャップ創製ペナルティ＝１２およびギャップ伸長ペナルティ＝４のデフォルトパラメータを用いる。ＧＡＰを使用することが好ましいが、他のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴもしくはＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０の方法を用いる）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８の方法を用いる）、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）を用いてもよく、これらは、一般に、デフォルトパラメータを用いる。
【００２０】
具体的なアミノ酸配列変異体は、１個のアミノ酸、２、３、４、５〜１０、１０〜２０、または２０〜３０個のアミノ酸を挿入、付加、置換、または欠失することによって、所与の配列のものとは異なり得る。
【００２１】
Ｃ２Ａドメインにおける配列番号１のシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインの７８番目に対応する位置は、ルーチンの配列分析技術を用いて、シナプトタグミンポリペプチド配列において容易に決定することができる。この位置のアミノ酸は、ルーチンの部位特異的変異導入技術を用いて、システイン残基に置き換えてもよい（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第３版、Ｒｕｓｓｅｌｌら、（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。
【００２２】
１つ以上の異種アミノ酸（例えば、異種ペプチドまたは異種ポリペプチド配列）は、本明細書に記載のＣ２Ａドメイン配列に結合または融合してもよい。例えば、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、１つ以上の異種アミノ酸に結合または融合した上述のＣ２Ａドメインポリペプチドを含んでもよい。１つ以上の異種アミノ酸は、シナプトタグミンＩタンパク質以外のソースからの配列を含んでもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態において、分子造影剤は、複数のＣ２Ａドメインを含んでもよい。例えば、造影剤は、上述の変異型Ｃ２Ａドメインに加えて、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のＣ２Ａドメインを含んでもよい。これらの追加Ｃ２Ａドメインは、薬剤中に追加の検出可能標識を組み込むために、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドの親和性を増す１つ以上の野生型Ｃ２Ａドメインと、上述の１つ以上の追加Ｓ７８Ｃ  Ｃ２Ａドメイン変異体とを含んでもよい。
【００２４】
いくつかの実施形態において、造影剤に使用されるシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子などの部位特異的プロテアーゼを用いて、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドを含む融合タンパク質を開裂することによって作ることができる。このようにして作られたシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、部位特異的プロテアーゼ認識配列の全部または一部を形成するＮまたはＣ末端で１つ以上の異種アミノ酸を含んでもよい。融合タンパク質は、精製後に部位特異的プロテアーゼによって除去される精製タグを含んでもよい。適当な精製タグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（日本住血吸蟲から）が挙げられる。シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドの作製については、以下により詳細に説明する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の分子造影剤は、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、または２０ｋＤａ未満の分子量を有する。
【００２６】
本発明の別の態様は、
配列番号１の７８番目に対応する位置でシステイン残基を有するシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと；
前記システイン残基が結合するのに適当な検出可能標識と
を含む、細胞死を検出するための造影剤に使用される単離結合部分を提供する。
【００２７】
シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、上記でより詳細に説明している。
【００２８】
シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、化学合成によって全体的または部分的に生成してもよい。例えば、ポリペプチドは、液相もしくは固相合成法を用いて；溶液中で；または、固相、液相、および溶液化学のいずれかの組み合わせによって合成することができる。例えば、最初に各々のペプチド部分を完成させ、次に、所望かつ適切ならば存在する任意の保護基を除去後、各々の炭酸もしくはスルホン酸またはそれらの反応性誘導体の反応によって残基Ｘを導入することによる。
【００２９】
ポリペプチドの化学合成は、当該技術分野で周知である（Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４）；Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ，Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｊ．Ｈ．Ｊｏｎｅｓ，Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９９１；ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＢＩ  Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ；Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ，（Ｅｄ．）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２，Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９  ａｎｄ  ｉｎ  Ｇ．Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ，（Ｅｄ．）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２８９）．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ  １９９７）。
【００３０】
シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、組み換え技術によって全体的または部分的に生成してもよい。例えば、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドでコード化した核酸は、宿主細胞で発現され、発現されたポリペプチドは、細胞培養から単離、および／または、精製してもよい。
【００３１】
上述の核酸配列および構築物は、発現ベクター内に含まれてもよい。適当なベクターは、プロモーター配列、終結フラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含んで選択または構築することができる。ベクターは、宿主細胞内の核酸の発現を駆動するための適切な調節配列を含むのが好ましい。発現系における異種核酸コード配列の発現を駆動するための適当な調節配列は、当該技術分野で周知であり、構成的プロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０などのウイルスプロモーター）、および誘導性プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−ｏｎ制御プロモーター）が挙げられる。ベクターは、大腸菌などの細菌宿主、および／または、真核細胞内で選択、複製、および発現することが可能な、複製起点および選択マーカーなどの配列も含んでよい。
【００３２】
ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、ファージ）、または必要に応じてファージミドでもよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第３版、Ｒｕｓｓｅｌｌら．、２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。細胞培養中の組み換えポリペプチドの発現、その後の単離および精製の多くの公知技術およびプロトコルは当該技術分野で周知である（例えば、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら．ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｅｄ  ＲＳ  Ｔｕａｎ（Ｍａｒ  １９９７）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃを参照されたい）。
【００３３】
いくつかの実施形態において、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、精製タグを備えた融合タンパク質として発現されてもよい。融合タンパク質は、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと精製タグの間にプロテアーゼ認識部位を含むのが好ましい。発現後、融合タンパク質は、精製タグに結合する固定化された化学物質を用いて、アフィニティクロマトグラフィーによって単離することができる。単離後、融合タンパク質は、例えば、トロンビンまたは第Ｘａ因子を用いてタンパク質分解によって開裂して、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドを生成することができる。
【００３４】
精製タグは、特異的結合対の一メンバーを形成する異種アミノ酸配列である。精製タグを含むポリペプチドは、特異的結合対の他のメンバーがポリペプチドに結合することで検出され、単離され、および／または、精製されてもよい。いくつかの好適な実施形態において、タグ配列は、抗体分子によって結合されるエピトープを形成してもよい。
【００３５】
種々の適当な精製タグは、当該技術分野で周知であり、例えば、ＭＲＧＳ（Ｈ）６、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ（商標））、Ｔ７−、Ｓ−（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ポリ−Ａｒｇ（Ｒ５−６）、ポリ−Ｈｉｓ（Ｈ２−１０）、ポリ−Ｃｙｓ（Ｃ４）、ポリ−Ｐｈｅ（Ｆ１１）、ポリ−Ａｓｐ（Ｄ５−１６）、ストレプト−タグＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ−ＨＡタグ（Ｍｕｒｒａｙ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９５）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２９，１７０−９）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグ（Ｓｔａｍｍｅｒｓ，Ｄ．Ｋ．ら（１９９１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２８３，２９８−３０２）、タグ１００（Ｑｉａｇｅｎ；哺乳類ＭＡＰキナーゼ２由来の１２ａａタグ）、Ｃｒｕｚタグ０９（商標）（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）、およびＣｒｕｚタグ２２（商標）（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。公知のタグ配列は、Ｔｅｒｐｅ（２００３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０  ５２３−５３３で概説されている。
【００３６】
いくつかの好適な実施形態において、精製タグは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである。発現後、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドとグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとを含む融合タンパク質は、固定化グルタチオンを用いてアフィニティクロマトグラフィーによって単離することができる。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の精製は、当該技術分野で周知である。単離後、融合タンパク質をタンパク質分解によって開裂し、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドを生成することができる。
【００３７】
検出可能標識は、分子イメージングモダリティによってｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能な任意の分子、原子、イオン、または基であってよい。適当な検出可能標識としては、金属、放射性同位元素および放射線不透過性剤（例えば、ガリウム、テクネチウム、インジウム、ストロンチウム、ヨウ素、バリウム、臭素、およびリンを含有する化合物）、放射線透過性剤、造影剤、および蛍光染料が挙げられる。
【００３８】
検出可能標識の選択は、使用される分子イメージングモダリティによる。使用される分子イメージングモダリティとしては、Ｘ線撮影、蛍光透視法、蛍光イメージング、高解像度超音波イメージング、生物発光イメージング、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、および核イメージング、例えば、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）および単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などのシンチグラフィ技術が挙げられる。
【００３９】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージング技術は、使用された特定の蛍光検出可能標識に適当な発光および吸光スペクトルを用いた画像の生成を伴う。画像は、従来技術によって視覚化することができ、蛍光イメージング技術としては、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）、蛍光分子トモグラフィー（ＦＭＴ）、ハイパースペクトル３Ｄ蛍光イメージング（Ｇｕｉｄｏ  Ｚａｖａｔｔｉｎｉら．Ｐｈｙｓ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．５１：２０２９，２００６）、および拡散光学分光法（Ｌｕｋｅｒ  ＆  Ｌｕｋｅｒ．Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．４９（１）：１，２００８）が挙げられる。
【００４０】
適当な蛍光検出可能標識としては、フルオレセイン、フィコエリトリン、ユーロピウム、トルレッド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒＣＰ、リサミン、ローダミン、Ｂ  Ｘ−ローダミン、ＴＲＩＴＣ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＦｌｕｏｒＸ、Ｒｅｄ６１３、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＮＢＤ、ルシファーイエロー、カスケードブルー、メトキシクマリン、アミノクマリン、テキサスレッド、ヒドロキシクマリン、アレクサフルオル（商標）染料（分子プローブ）（例えば、アレクサフルオル（商標）３５０、アレクサフルオル（商標）４８８、アレクサフルオル（商標）５４６、アレクサフルオル（商標）５６８、アレクサフルオル（商標）６３３、アレクサフルオル（商標）６４７、アレクサフルオル（商標）６６０、およびアレクサフルオル（商標）７００）、スルホネートシアニン染料（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７）、ＩＲＤ４１、ＩＲＤ７００（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＮＩＲ−Ｉ（Ｄｅｊｉｎｄｏｍ，Ｊａｐａｎ）、ラジョラブルー（Ｄｉａｔｒｏｎ）、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４０５、４８８、５４９、６３３、６４９、６８０、および８００反応性染料（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ）、またはＬＩ−ＣＯＲ（商標）染料（例えば、ＩＲＤｙｅ（商標）（ＬＩ−ＣＯＲ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。
【００４１】
他の適当な蛍光検出可能標識としては、テルビウムおよびユーロピウムなどのランタニドイオンが挙げられる。ランタニドイオンは、本明細書のどこかで説明するように、キレートによってシナプトタグミンポリペプチドに結合することができる。
【００４２】
他の適当な蛍光検出可能標識としては、量子ドット（例えば、Ｑｄｏｔ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。タンパク質を量子ドットで標識する技術は、当該技術分野で周知である（Ｍｉｃｈａｌｅｔ，Ｘ．ら．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：５３８，２００５；Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ，Ｐ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２：４７−５２，２００４）。
【００４３】
核磁気共鳴画像法ベースの技術は、特異な化学環境における水プロトンの相対緩和率（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）に基づいて画像を生成する。適当なＭＲＩ技術は、Ｇａｄｉａｎ，Ｄ．「ＮＭＲ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌｉｖｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ」．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９９５，第２版により詳細に説明されている。核磁気共鳴画像法としては、従来の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、磁化移動コントラストイメージング（ＭＴＩ）、磁気共鳴スペクトロスコピー（ＭＲＳ）、拡散強調画像法（ＤＷＩ）、および機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）（Ｒｏｖａｒｉｓら．（２００１）ＪＮｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １８６  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３−９；Ｐｏｍｐｅｒ  ＆  Ｐｏｒｔ（２０００）Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ  ８：６９１−７１３；Ｋｅａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，（１９８６）Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ）が挙げられる。
【００４４】
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）の標識として使用するのに適当な標識としては、常磁性イオンまたは超常磁性イオン、酸化鉄粒子、および水溶性造影剤が挙げられる。超常磁性イオンおよび常磁性イオンとしては、遷移元素、ランタニド元素、およびアクチニド元素（例えば、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム、およびガドリニウムなど）が挙げられる。好適な常磁性検出可能標識としては、ガドリニウムが挙げられる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、標識は、シンチグラフィ検出可能標識であってもよい。適当なシンチグラフィ検出可能標識としては、放射性同位元素（例えば、陽電子放出放射性同位元素およびガンマ放出放射性同位元素）が挙げられる。
【００４６】
シンチグラフィ画像法としては、ＳＰＥＣＴ（単一光子放射断層撮影法）、ＰＥＴ（ポジトロン断層法）、ガンマカメラ画像法、および直線走査法が挙げられる。シンチグラフィ画像法は、単一面における放射能を検出するためにガンマカメラまたは直線スキャナの使用を含んでもよい。ＳＰＥＣＴイメージングシステムは、解析対象を中心にして回転する１台以上のガンマカメラの使用に基づいてもよいため、放射能を２次元以上に統合することができる。ＰＥＴイメージングシステムは、複数次元で放射能を検出する、リング型の検出器のアレイを含んでもよい。
【００４７】
陽電子放出放射性同位元素を含むシンチグラフィ検出可能標識は、例えば、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）に有用であろう。適当な放射性同位体としては、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、フッ素−１８、ガリウム−６８、および銅−６４が挙げられる。
【００４８】
ガンマ放出放射性同位元素を含むシンチグラフィ検出可能標識は、例えば、単一光子放射断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）に有用であろう。適当な放射性同位体としては、テクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１、インジウム−１２３、ガリウム−６７、タリウム−２０１、キセノン−１２４が挙げられる。
【００４９】
上述のｉｎ  ｖｉｖｏ用途に加えて、本明細書に記載の造影剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法、例えば、フローサイトメトリーおよび組織化学アッセイにも有用であろう。
【００５０】
本明細書に記載の造影剤の生成方法は、
配列番号１の２１７番目に対応する位置でＣｙｓを有するシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドを提供する工程と；
検出可能標識をＣｙｓ残基に結合させる工程と、
を含んでもよい。
【００５１】
シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドが検出可能標識に結合するモードは、一部は、検出可能標識の化学的性質によって変化する。標準的な範囲の結合技術を用いることができる（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．，「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ、米国、１９９６を参照されたい）。
【００５２】
検出可能標識は、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドに直接結合してもよいし、または、１つ以上のリンカー分子を介して間接的に結合してもよい。
【００５３】
いくつかの好適な実施形態において、検出可能標識は、１つ以上の共有結合を介してシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドに結合してもよい。例えば、検出可能標識は、システイン残基のチオール基と反応してチオエーテルリンケージなどの共有結合を形成する反応基によって、システイン残基に結合してもよい。
【００５４】
適当なチオール反応基としては、ハロアセチルおよびハロゲン化アルキル誘導体、ヨードアセトアミド、マレイミド、アジリジン、アクリロイル誘導体、アリール化剤、およびチオール−ジスルフィド交換試薬が挙げられる。いくつかの実施形態において、フェニル水銀基が用いられる。
【００５５】
反応基はマレイミド基であるのが好ましい。
【００５６】
チオール基と反応する反応基は、検出可能標識の一部であってもよいし（即ち、検出可能標識は反応基を含んでもよい）、または、検出可能標識およびシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドに結合する二機能性試薬もしくはリンカーの一部であってもよい（即ち、検出可能標識およびシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、反応基を含む二機能性試薬またはリンカー経由で結合してもよい）。二機能性試薬は、分子間結合を形成するための２つの別個の結合基を含む。二機能性試薬は、同種官能性または異種官能性であってもよい（即ち、結合基は同じであっても異なっていてもよい）。
【００５７】
二機能性試薬は、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドおよび検出可能標識に直接結合してもよい。例えば、二機能性試薬は、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと共有結合を形成するチオール反応基と、検出可能標識に結合する第２の結合基とを含んでもよい。第２の結合基は、共有または非共有結合を介して検出可能標識に結合することができる。例えば、二機能性試薬は、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドのシステイン残基に共有結合する反応基と、金属イオン標識と錯体を形成するキレート基とを含む二機能性キレートであってもよい。
【００５８】
適当な反応基としては、上述のマレイミド基などのチオール反応基が挙げられる。
【００５９】
適当なキレート基は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン−５酢酸）、置換ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）、置換ＤＯＴＡ、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、置換ＥＤＴＡ、ＣＤＴＡ（トランス−１，２−シクロヘキシレンジニトリロ四酢酸）、置換ＣＤＴＡ、Ｈ４−ＴＥＴＡ（１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸）、およびＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸）からなる群から選択される。
【００６０】
いくつかの実施形態において、検出可能標識は、キレート化ペプチドを用いて、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドにキレート化してもよい。適当なキレート化ペプチド配列は、当該技術分野で周知である（例えば、国際公開第２００６／１０７７９４号；米国特許第５５９４１１５号；国際公開第１９９３／０２３４２５号；Ｓｍｉｔｈら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８）２６３  １５  ７２１１；Ｔｉａｎら  Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４５  １２  ２０７０−２０８２；Ｋｉｅｖｅｎｓら  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６４：９１９−９２４（１９９３）を参照されたい）。
【００６１】
好適な二機能性キレートとしては、マレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡが挙げられる。
【００６２】
二機能性キレートは、任意の便利な技術によって、検出可能標識およびシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと反応することができる。例えば、二機能性キレートのキレート基は、二機能性キレートの反応基がシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと反応する前、後、または該反応と同時に、金属イオン標識とキレート化して、金属キレート錯体を形成してもよい。
【００６３】
金属イオン標識がキレートに結合する手順は、使用する二機能性キレートおよび金属イオンのみならず、用途に要する比活性および量にもよる。適当な方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓｏｓａｂｏｗｓｋｉ，Ｊ．＆  Ｍａｔｈｅｒ，Ｓ．（２００６）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １（２）：９７２−６およびＣｏｏｐｅｒ  Ｍ．ら（２００６）Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １（１）：３１４−７に記載されている。例えば、１１１Ｉｎなどの三価金属イオンのＤＯＴＡによるキレート化において、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドをわずかに酸性の緩衝液に移す。三価金属同位体を加え、３７℃で１時間インキュベートし、標識反応を起こさせて、ＥＤＴＡでクエンチする。標識効率は、薄層クロマトグラフィーによって監視する。標識効率は、＞９５％であるのが好ましい。未結合金属からの標識種をさらに精製することは、例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって達成される。
【００６４】
いくつかの好適な造影剤は、
配列番号１の７８番目に対応する位置でシステイン残基を有するシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと、
システイン残基に結合した検出可能標識とを含み、
ここで、検出可能標識はガドリニウムイオンである。
【００６５】
ガドリニウムイオンは、金属キレート錯体中のＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）またはＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸）などのキレートに結合してもよい。
【００６６】
ガドリニウム−キレート錯体は、チオエーテル結合によってシステイン残基に結合してもよい。例えば、キレートは、システイン残基と反応してチオエーテル結合を形成するマレイミド基（即ち、二機能性試薬中で）をさらに含んでもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態において、二機能性試薬は、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドと、検出可能標識に結合する第２のリンカーとに結合してもよい。例えば、第２のリンカーは、ＰＥＴ同位体（例えば、フッ素−１８）で標識された化学基を含んでもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態において、クリックケミストリーを用いることができる。クリックケミストリーは、トリアゾール環を形成するために２成分（一方はアジド基、他方は末端アセチレン基を含む）間のＣｕＩ触媒カップリングを伴う。アジド基およびアルキン基は他のカップリング手順の条件に不活性であり、かつ、ペプチド内に見られる他の官能基はクリックケミストリー条件に不活性であるため、クリックケミストリーによって、ほとんどいずれのリンカーも穏やかな条件下でシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドに制御的に結合することができる。
【００６９】
例えば、シナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドのシステイン残基は、一端でチオール−特異性反応基（例えば、ヨードアセトアミド、マレイミド、またはフェニルチオスルホネート）、他端でアジドまたはアセチレンを含む二機能性試薬と反応することができる。標識基は、クリックケミストリーを用いて末端アジドまたはアセチレンに結合することができる。例えば、リンカーの一端にアセチレンまたはアジド基、他端にキレート（金属同位体用）または脱離基（ハロゲン標識用）を備えた第２のリンカー（Ｂａｓｋｉｎ，Ｊ．（２００７）ＰＮＡＳ  １０４（４３）１６７９３−９７）を用いることができる。
【００７０】
本発明の別の態様は、
上述の造影剤を個体に投与する工程と、
個体内における造影剤の分布の１枚以上の画像を生成する工程と、
を含む個体内の細胞死のイメージング方法を提供する。
【００７１】
画像は、例えば、薬剤の投与後、一定期間にわたって（即ち、一定間隔で）作製してもよい。
【００７２】
個体のある部位での造影剤の量は、その部位での細胞死の量を示す。例えば、他の部位に対して標的部位での造影剤の量が増すことは、標的部位での細胞死が増したことを示す。
【００７３】
関連態様は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死のイメージング方法に使用される造影剤と、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死のイメージング方法に使用される製剤の製造における造影剤の用途を提供する。
【００７４】
造影剤を個体に投与することについては、以下により詳細に説明する。
【００７５】
個体内における造影剤の分布の１枚以上の画像は、分子イメージング技術を用いて生成することができる。造影剤の検出可能標識を検出する任意の分子イメージング技術を用いることができる。例えば、ＭＲＩを用いて、ＭＲＩ検出可能標識を含む造影剤を検出することができる。種々の適当な分子イメージング技術は、当該技術分野で周知である。
【００７６】
フォスファチジルセリン（ＰＳ）は、細胞死が起こっている細胞の表面に外面化する。投与後、造影剤のシナプトタグミンＣ２Ａドメインポリペプチドは、細胞上に露出するフォスファチジルセリン（ＰＳ）、例えば、細胞膜表面の内側膜上に外面化または露出したＰＳに結合することで、細胞死が起こっているまたは起こった細胞を標識する。
【００７７】
適切な分子イメージング技術を用いて、薬剤の投与後の一定期間にわたる個体の全部または一部内の検出可能標識の分布を示す１枚以上の画像を生成することができる。身体の組織または領域における検出可能標識の量または濃度は、組織または領域における細胞死の量を示す。身体の組織または領域において検出可能標識の濃度が増すことは、組織または領域における細胞に起こっている細胞死が身体の他の組織または領域に対して増加していることを示す。例えば、身体の腫瘍または他の癌組織で検出可能標識の濃度が増すことは、腫瘍または他の癌組織における細胞に起こっている細胞死が身体の他の組織または領域に対して増加していることを示す。従って、本発明の造影剤は、治療後の腫瘍における細胞死のイメージングに有用であろう。
【００７８】
本発明の別の態様は、
腫瘍を有する個体に上述の造影剤を投与する工程と、
個体内の腫瘍部位で造影剤の分布の１枚以上の画像を生成する工程と、
を含む個体内の腫瘍のイメージング方法を提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、癌治療後の腫瘍における細胞死の発現および広がりの速度は、イメージングにより決定することができる。これは、例えば、癌治療の結果を予測するのに有用であろう（Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｋ．（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８（２）：９４−１０７；Ｎｅｖｅｓ，Ａ．Ａ．＆  Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｋ．Ｍ．（２００６）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７６６（２）：２４２−６１）。
【００８０】
個体内の腫瘍の治療における癌治療の効果を決定する方法は、
癌治療中または癌治療後に、個体に上述の造影剤を投与する工程と、
個体内の腫瘍部位での造影剤の分布の１枚以上の画像を生成する工程と、
を含んでもよい。
【００８１】
癌治療中または癌治療後に、個体内の腫瘍部位での造影剤の分布の１枚以上の画像を生成することができる。
【００８２】
造影剤は癌治療前に個体に投与してもよいし、個体内の腫瘍部位での造影剤の分布の１枚以上の画像を癌治療前に生成してもよい。
【００８３】
腫瘍部位での造影剤の分布の画像を用いて、造影剤が腫瘍に結合している量または範囲を決定してもよい。従来の化学療法および放射線療法は、うまくいった場合、通常は腫瘍の広範な局所的細胞死を誘導する。この細胞死は、造影剤によって画像にすることができる。癌治療後に造影剤の腫瘍への結合が増すことにより、癌治療が腫瘍の治療に有効であることを示す。
【００８４】
結合の増加は、癌治療前の腫瘍への結合、または、非腫瘍組織への結合と比較して決定される。
【００８５】
例えば、治療中または治療後の腫瘍部位での造影剤の分布は、治療前の分布と比較される。治療前に対して治療中または治療後に造影剤の密度または分布が増すことは、癌治療が腫瘍の治療に有効であることを示す。
【００８６】
適当な癌治療は、当該技術分野で周知であり、放射線治療および化学療法が挙げられる。
【００８７】
身体の組織または部位で検出可能標識の濃度が増すことは、例えば、炎症、感染症、心筋梗塞、または心臓プラーク形成などの、細胞死によって特徴付けられる病状の結果として、組織または部位の細胞に起こっている細胞死が、身体の他の組織または部位に対して増していることを示す。従って、本発明の造影剤は、かかる病状の治療後の細胞死のイメージングに有用であろう。
【００８８】
本発明の別の態様は、
個体に上述の造影剤を投与する工程と、
個体内の造影剤の分布の１枚以上の画像を生成する工程と、
を含む、個体内の細胞死の増加によって特徴付けられる病状の評価方法を提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態において、細胞死の発現および広がりの速度は、イメージングを用いて決定することができる。これは、例えば、病状の評価、例えば、病状の程度もしくは重症度、予後、および／または、治療への反応性を決定するのに有用であろう。
【００９０】
個体内の細胞死の増加によって特徴付けられる病状の治療における治療効果を決定する方法は、
治療中または治療後に個体に上述の造影剤を投与する工程と、
個体内の造影剤の分布の１枚以上の画像を生成する工程と、
を含む。
【００９１】
造影剤の分布の画像を用いて、個体内の死細胞または死につつある細胞に造影剤が結合している量または範囲を決定することができる。結合の減少、または、治療後に結合が増した部位の数が減少することは、治療が細胞死の量を減らすことに有効であり、それによって病状を治療していることを示す。
【００９２】
結合の増減は、対照に対して決定される。適当な対照実験は、当業者には明らかであり、例えば、治療前の結合、または、必要に応じて健常組織に対する結合が挙げられる。
【００９３】
本明細書に記載の造影剤を用いて、早期の臨床試験およびその後の診療で薬効を評価することができる。ここで、該造影剤は、治療を誘導するのに用いることができる。無効な治療は早期に断念することで、より効果的な薬剤を選択することができる（例えば、Ｂｒｉｎｄｌｅ，Ｋ．（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ８（２）：９４−１０７を参照されたい）。
【００９４】
個体に対する治療計画の効果を決定する方法は、
（ａ）個体に初期の治療計画を施す工程と、
（ｂ）個体内の死細胞または死につつある細胞に本明細書に記載の造影剤が結合している量または範囲を決定する工程と、
を含み、
ここで計画に応じて結合の量または範囲が変化することは、計画が個体に有効であることを示す。
【００９５】
初期の治療計画が、造影剤が結合する量または範囲を変化させるのに不十分である場合、個体内に造影剤が結合する量または範囲が変化するまで計画を変更または調整することができる。従って、方法は、
（ｃ）治療計画を変更し、変更された計画を個体に施す工程と、
（ｄ）個体内の死細胞または死につつある細胞に本明細書に記載の造影剤が結合する量または範囲を決定する工程と、
（ｅ）造影剤が結合する量または範囲に変化が観察されるまで、工程ｃ）およびｄ）を繰り返す工程と、
をさらに含み、
ここで計画に応じて造影剤が結合する量または範囲が変化することは、計画が個体に有効であることを示す。
【００９６】
いくつかの実施形態において、造影剤が結合する量または範囲が所定の値を超えて変化するまで、工程（ｅ）は、工程ｃ）およびｄ）を繰り返してもよく、
造影剤が結合する量または範囲が所定の値を超えて変化することは、計画が個体に有効であることを示す。
【００９７】
個体は、癌状態を有することがあり、治療は、放射線治療または化学療法などの癌治療である。計画に応じて腫瘍組織に造影剤が結合する量または範囲が増大することは、計画が腫瘍組織の細胞死を引き起こし、個体に有効であることを示す。
【００９８】
個体は、細胞死によって特徴付けられる病状を有することがある。計画に応じて個体内の１つ以上の疾患部位に造影剤が結合する量または範囲が減少することは、計画がその部位での細胞死を改善し、個体に有効であることを示す。
【００９９】
関連態様は、上記方法のいずれかに使用される本明細書に記載の造影剤と、上記方法のいずれかに使用される製剤の製造における本明細書に記載の造影剤の用途とを提供する。
【０１００】
造影剤を単独で投与することは可能であるが、それを１種以上の医薬的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、潤滑剤、もしくは当業者には公知の他の物質および適宜他の治療薬または予防薬とともに、上記で定義した造影剤を含む医薬組成物（例えば、製剤）として提供することが好ましい。
【０１０１】
１種以上の医薬的に許容される担体、賦形剤、緩衝剤、アジュバント、安定剤または他の物質とともに混合または製剤化された本明細書に記載の造影剤を含む医薬組成物を本明細書に記載の方法で用いてもよい。
【０１０２】
本発明の別の態様は、
上述の造影剤を提供する工程と、
造影剤を医薬的に許容される賦形剤と混合する工程と、
を含む医薬組成物の調製方法を提供する。
【０１０３】
本明細書で使用される「医薬的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、もしくは他の問題または合併症を起こさず、妥当な利益／リスク比が得られて、対象（例：ヒト）の組織との接触における使用に適した化合物、物質、組成物、および／または、剤形に関係するものである。各担体、賦形剤なども、製剤の他の成分と適合性であるという意味において「許容される」ものでなければならない。
【０１０４】
適切な担体、賦形剤などは標準的な医薬テキストに記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０を参照されたい。
【０１０５】
製剤は、単位剤形で提供することが便利であり、製薬分野で公知の任意の方法によって製造することができる。かかる方法は、１種以上の副成分を構成する担体と造影剤を組み合わせる工程を含む。一般に、製剤は、液体担体もしくは微粉砕固体担体またはその両方を活性化合物と均一かつ十分に組み合わせ、次に必要に応じて生成物を成形することにより製造される。
【０１０６】
製剤は、液体、溶液、懸濁液、乳剤、エリキシル剤、シロップ剤、錠剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、アンプル、坐剤、膣坐剤、軟膏剤、ゲル剤、ペースト、クリーム、スプレー、ミスト、泡、ローション、オイル、ボーラス、舐剤、またはエーロゾル剤の形態であってもよい。
【０１０７】
造影剤、または、造影剤を含む医薬組成物は、対象に、任意の都合のよい投与経路で、限定的ではないが、経口（例えば、摂取）；局所（例えば、経皮、鼻腔内、眼内、口腔、および舌下）；肺内（例えば、エーロゾル剤を用いて、口または鼻を経由した吸入または注入療法による）；直腸内；腟内；非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、髄腔内、脊椎内、嚢内、被覆下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、クモ膜下、および胸骨内への注入）；皮下または筋肉内へのデポー剤の埋め込みを含めて、全身的／末梢的に、または所望の作用部位に投与することができる。
【０１０８】
好適な実施形態において、造影剤、または、造影剤を含む医薬組成物は、静脈内または眼内注射によって対象に投与される。
【０１０９】
経口投与（例えば摂取による）に適当な製剤は、それぞれが既定量の活性化合物を含有するカプセル剤、カシェ剤、もしくは錠剤などの個別の単位として；粉末もしくは顆粒として；水性もしくは非水性の液体中の溶液もしくは懸濁液として；水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして；ボーラスとして；舐剤として；または、ペーストとして、提供することができる。
【０１１０】
非経口投与（例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む注射によるもの）に適当な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、防腐剤、安定剤、静菌剤、および製剤を対象とする受容者の血液と等張にする溶質を含み得る、水性および非水性の等張で、発熱物質フリーの無菌注射液；懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液；ならびに、化合物が血液成分または１つ以上の器官を標的とするように設計されるリポソームまたは他の微粒子系が挙げられる。かかる製剤に使用される適当な等張性ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンガー溶液、または乳加リンガー液が挙げられる。典型的には、溶液中の活性化合物の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌである。製剤は、単回投与量または複数回投与量を密閉した容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提供するものであってもよく、使用直前に無菌の液体担体、例えば、注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されていてもよい。
【０１１１】
造影剤、および造影剤を含有する組成物の適切な投与量が患者によって異なり得ることは理解されるであろう。最適な投与量の決定は、一般に、投与における何らかのリスクまたは有害な副作用に対する治療効果のレベルのバランスが関係するであろう。選択される投与量のレベルは、限定するものではないが、投与経路、投与時間、造影剤の排出速度、必要な造影剤の量、併用される他の薬物、化合物、および／または物質、患者の年齢、性別、体重、症状、全身の健康状態、既往歴を含む、様々な要因に依存するであろう。造影剤の量および投与経路は、最終的には医師の裁量となるが、一般的には、投与量は、部位（例えば、腫瘍、対象組織、または全身）で、実質的に有害または有毒な副作用を引き起こさずに造影することが可能な造影剤の濃度を達成し得るものであろう。
【０１１２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与は、単回投与で、連続的または断続的に（例えば、適当な間隔をおいた分割用量で）実施することができる。最も効果的な投与手段および投与量の決定方法は、当業者に周知であり、治療に用いる製剤、治療の目的、治療される標的細胞、および治療される対象によって異なるであろう。単回または複数回投与は、医師によって選択される投与レベルおよびパターンで実施することができる。
【０１１３】
上述のように、造影剤、および造影剤を含む組成物は、治療の効果を評価するために、癌治療前、癌治療と併用して、または癌治療後に投与してもよい。個体の治療、例えば、癌治療の効果を評価するための適当な投与計画は、治療する医師が選択することができる。
【０１１４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞死をイメージングするためのキットを提供する。キットは、（ａ）第１のバイアルが凍結乾燥された造影剤を含み、（ｂ）第２のバイアルが医薬的に許容される希釈剤を含む、本明細書に記載の凍結乾燥された造影剤と水性希釈剤との二室バイアルシステムを含んでもよい。
【０１１５】
キットは、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死のイメージング方法で造影剤を用いる取扱説明書を含んでもよい。
【０１１６】
本発明の種々のさらなる態様および実施形態は、本開示から当業者には明らかになるであろう。本明細書で引用した全ての文献は、その内容全体を参照によって組み込んだものとする。
【０１１７】
本明細書で使用される「および／または」は、他のものを含むかまたは含まない、２つの特定の特徴または成分の各々の具体的な開示として理解すべきである。例えば「Ａおよび／またはＢ」は、各々が個別に記載されるかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、（ｉｉｉ）ＡおよびＢ、の各々の具体的な開示であると理解されたい。
【０１１８】
特に明記しない限り、上述した特徴の説明および定義は、本発明の任意の具体的な態様または実施形態に限定するものではなく、記載される全ての態様および実施形態に等しく適用される。
【０１１９】
以下の図および表を参照しながら本発明のある態様および実施形態について一例として示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】発現ベクター（ｐＧＥＸ−２Ｔ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中のプラスミド制限部位（Ａ）を示し、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメイン（シアン色）を示し、かつ、リンカー（濃緑色）およびＣ２Ａｍ（黄色）を挿入したベクターマップを示す。
【０１２１】
【図２】３つの元の候補となる突然変異の配置を左から右（Ｇｌｎ１５４、Ｓｅｒ２１７、およびＡｓｎ２４８）に示すシナプトタグミンＩのＣ２Ａドメイン（ドブネズミ由来）構造の概略図を示す。
【０１２２】
【図３】ＩＰＴＧによる誘導前後の、３つの元の候補ＧＳＴ−Ｃ２Ａ変異体（Ｓ２１７Ｃ、Ｎ２４８Ｃ、およびＱ１５４Ｃ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ゲルは、全ての形質転換菌が変異タンパク質をある程度過剰発現するが、Ｓ２１７Ｃをより過剰に発現することをはっきりと示している。
【０１２３】
【図４】過剰発現が異なる誘導ＯＤ（０．６、０．８、１．０）で起こることを示す、３つの元の候補ＧＳＴ−Ｃ２Ａ変異体（変異体１つ当たり２つのクローン）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【０１２４】
【図５】ＧＳＴ−Ｃ２Ａ精製のＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。レーン（Ａ）：ＧＳＴカラム上の溶解細胞の非結合画分、（Ｂ）：ＧＳＴ−Ｃ２Ａのトロンビン開裂後のＧＳＴおよびＣ２Ａ、（Ｃ）：ＨｉＴｒａｐセファロースカラムの非結合画分、（Ｄ）ＨｉＴｒａｐセファロースカラムからの溶出Ｃ２Ａｍ、（Ｅ）野生型Ｃ２Ａ。
【０１２５】
【図６】Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＦ（第１カラム）またはアネキシンＶ−ＡｌｘＦ（ＡｎｘＶ−ＡｌｘＦ）（第２カラム）（ＡｌｘＦ＝アレクサフルオル４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識したＥＬ４細胞の二重散布図を示す。（Ａ）ＳＹＴＯＸ（商標）赤色蛍光（細胞死マーカー；Ｅｘｃ、λ＝６３３ｎｍ；Ｅｍ、λ＝６７０ｎｍ）対Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＦまたはＡｎｘＶ−ＡｌｘＦ（Ｅｘｃ、λ＝４８８ｎｍ；Ｅｍ、λ＝５１９ｎｍ）のプロット。（Ｂ）ＳＹＴＯＸ（商標）赤色蛍光対ＵＶ自己蛍光プロット（アポトーシス細胞集団（黄色）は、ＵＶ自己蛍光が低いことを表し；この現象は、細胞におけるＮＡＤ（Ｈ）プールのポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）−介在欠乏の結果であり得る）。Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＦおよびＡｎｘＶ−ＡｌｘＦは０．２μＭで用いた。Ｒ１（緑色）＝生存細胞；Ｒ２（黄色）＝初期アポトーシス細胞；Ｒ３（橙色）＝後期アポトーシス細胞；Ｒ４（赤色）＝壊死細胞。
【０１２６】
【図７】Ｃ２Ａｍ−ＡＩｘＦで標識したＥＬ４細胞の二重散布図を示す。（Ａ）ＳＹＴＯＸ（商標）赤色蛍光（細胞死マーカー；Ｅｘｃ、λ＝６３３ｎｍ；Ｅｍ、λ＝６７０ｎｍ）対Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＦ（Ｅｘｃ、λ＝４８８ｎｍ；Ｅｍ、λ＝５１９ｎｍ）のプロット。（Ｂ）ＳＹＴＯＸ（商標）赤色蛍光対ＵＶ自己蛍光のプロット。Ｃ２Ａｍ−ＡＩｘＦは、０．２、０．５、または２μＭで用いた。Ｒ１（緑色）＝生存細胞；Ｒ２（黄色）＝初期アポトーシス細胞；Ｒ３（橙色）＝後期アポトーシス細胞；Ｒ４（赤色）＝壊死細胞。
【０１２７】
【図８】野生型Ｃ２Ａ（Ａ）およびＣ２Ａｍ（Ｂ）のフォスファチジルセリン被覆チップとの相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーグラムを示す。ＳＰＲは任意単位で応答。時間は秒である。二重曲線。一連のタンパク質濃度：９５、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、５ｎＭ。野生型Ｃ２Ａ（Ａ）およびＣ２Ａｍ（Ｂ）のフォスファチジルセリンへの結合に対するＳＰＲセンサーグラムに由来する熱平衡データを用いた。ＳＰＲは任意単位で応答。線は、一対一ラングミュア結合モデルへのフィッティングに対応する。得られた対応する解離定数（ＫＤ）は、４８．５±３．５ｎＭ（Ｃ２Ａ野生型）および４９．４±４．９ｎＭ（Ｃ２Ａｍ）であった。各濃度のデータは二重である。
【０１２８】
【図９】Ｃ２Ａ野生型（図９）、Ｃ２Ａｍ（図１０）、Ｃ２Ａｍ−アレクサフルオル４８８（図１１）、およびＣ２Ａｍ−ＤＯＴＡ（図１２）の質量分析（ＥＳＩ）を示す。
【０１２９】
【図１０】Ｃ２Ａ野生型（図９）、Ｃ２Ａｍ（図１０）、Ｃ２Ａｍ−アレクサフルオル４８８（図１１）、およびＣ２Ａｍ−ＤＯＴＡ（図１２）の質量分析（ＥＳＩ）を示す。
【０１３０】
【図１１】Ｃ２Ａ野生型（図９）、Ｃ２Ａｍ（図１０）、Ｃ２Ａｍ−アレクサフルオル４８８（図１１）、およびＣ２Ａｍ−ＤＯＴＡ（図１２）の質量分析（ＥＳＩ）を示す。
【０１３１】
【図１２】Ｃ２Ａ野生型（図９）、Ｃ２Ａｍ（図１０）、Ｃ２Ａｍ−アレクサフルオル４８８（図１１）、およびＣ２Ａｍ−ＤＯＴＡ（図１２）の質量分析（ＥＳＩ）を示す。
【０１３２】
【図１３】死につつある細胞のＣ２Ａｍ−ＡＦ６４７またはＡｎｘＶ−ＡＦ６４７標識を示す。Ｃ２Ａｍ（Ａ）またはＡｎｘＶ（Ｂ）標識（アレクサフルオル（登録商標）６４７チャネル；Ｅｘｃ、λ＝６４７；Ｅｍ、λ＝６７０ｎｍ、ｘ軸）の関数としての細胞生存度（Ｓｙｔｏｘ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ核染色、細胞死マーカー；Ｅｘｃ、λ＝５０４；Ｅｍ、λ＝５２３ｎｍ、ｙ軸）の二重散布図である。代表的なプロットは、エトポシド（５μＭ）で１６時間処理したＥＬ４細胞で得た。（Ａ）および（Ｂ）の象限（赤十字）は、壊死細胞（ｎ）、アポトーシス細胞（ａ）、および生存細胞（ｖ）を示す。ＮＡＤＨ自己蛍光（Ｅｘｃ、λ＝３５０；Ｅｍ、λ＝４７５ｎｍ、ｘ軸）の関数としてのＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（ｙ軸）の二重散布図も、薬物療法（１６時間）後の同一時点の（Ｃ）で示す。Ｃ２Ａｍ（Ｄ）またはＡｎｘＶ（Ｅ）を用いたＥＬ４細胞死検出の経時変化を示す。試料を２時間ごとに回収し、フローサイトメトリーによって分析した。各タンパク質によって表示された集団分離に基づいた４象限ゲートを用いて、生存細胞、アポトーシス細胞、および壊死細胞の画分割合を算出した。実験を３回行い、示したデータは、代表的なデータセット（各時点で三重）に対応する。示したデータは、各時点の平均±ＳＥＭ（ｎ＝３重、誤差棒は、見えない場合にはマーク内にある）である。［Ｃ２Ａｍ］＝０．２μＭ、［ＡｎｘＶ］＝４ｎＭ。各象限の出隅の数字は、細胞画分の各割合を示す。
【０１３３】
【図１４】Ｃ２Ａｍ（Ａ）またはＡｎｘＶ（Ｂ）を用いたＥＬ４細胞の蛍光標識の経時変化を示す。Ｃ２Ａｍ（黒三角）およびＡｎｘＶ（黒四角）で標識した、生存細胞（Ａ）、壊死細胞（Ｂ）、およびアポトーシス細胞（Ｃ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）である。データは図１３と同様にゲートした。実験を３回行い、示したデータは、代表的なデータセット（各時点で三重）に対応する。示したデータは、各時点の平均±ＳＥＭ（ｎ＝３重、誤差棒は、見えない場合にはマーク内にある）である。［Ｃ２Ａｍ］＝０．２μＭ、［ＡｎｘＶ］＝４ｎＭ。＋Ｐ＜０．０００１で、生存細胞は常に、壊死細胞はｔ≦６時間で、アポトーシス細胞はｔ＝４、６、１０、１２、１６〜２４時間、＊Ｐ＜０．００１で、アポトーシス細胞はｔ＝１４時間である。任意単位の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、各チャネルの自己蛍光レベルに標準化した。Ｃ２Ａｍ（Ｄ）またはＡｎｘＶ（Ｅ）を用いた死につつあるＥＬ４細胞対生存細胞の選択的標識の経時変化を示す。データは、壊死細胞／生存細胞（Ｄ）およびアポトーシス細胞／生存細胞（Ｅ）のＭＦＩ比として示す。実験を３回行い、示したデータは、代表的なデータセット（各時点で三重）に対応する。示したデータは、各時点の平均±ＳＥＭ（ｎ＝３重、誤差棒は、見えない場合にはマーク内にある）である。［Ｃ２Ａｍ］＝０．２μＭ、［ＡｎｘＶ］＝４ｎＭ。＋Ｐ＜０．０００１で、壊死細胞／生存細胞比はｔ＞１０時間で、アポトーシス細胞／生存細胞比はｔ＝０、４〜２０時間であり、＊＊Ｐ＜０．００１で、アポトーシス細胞／生存細胞比は２２時間で、壊死細胞／生存細胞比は６〜８時間であり、＊Ｐ＜０．０５で、壊死細胞／生存細胞比は０時間で、アポトーシス細胞／生存細胞比は２時間である。
【０１３４】
【図１５】未処理細胞およびエトポシドで１６時間処理したＥＬ４細胞における、Ｃ２Ａｍ（Ａ）またはＡｎｘＶ（Ｂ）標識（アレクサフルオル（登録商標）６４７；Ｅｘｃ、λ＝６４７；Ｅｍ、λ＝６７０ｎｍ、ｘ軸）の関数としての活性カスパーゼ標識（ポリカスパーゼＦＬＩＣＡ（登録商標）カルボキシフルオレセイン；Ｅｘｃ、λ＝４９０；Ｅｍ、λ＝５３０ｎｍ、ｙ軸）の二重散布図を示す。未処理コホートまたは処理コホートのいずれかにおけるアポトーシス細胞および壊死細胞を、それぞれ、最大２倍および１６倍以上にＦＬＩＣＡで染色し、生存細胞と比較した。（Ａ）および（Ｂ）の象限（赤十字）は、壊死細胞（ｎ）、アポトーシス細胞（ａ）、および生存細胞（ｖ）を示す。各象限の出隅の数字は、細胞画分の各割合を示す。
【０１３５】
【図１６】ＥＬ４細胞を示し、これは、死につつある細胞（Ｂ）にはＣ２ｍ−ＡＦ６４７結合しているが、生存細胞（Ａ）にはＣ２ｍ−ＡＦ６４７結合していないことを示す。対応するＥＬ４細胞の明視野画像（左側パネル、チャネルＣｈ２の下）および蛍光画像ＥＬ４細胞（右側パネル、チャネルＣｈ６の下）を得た。Ｃ２Ａｍで染色されなかった細胞（Ａ）の画像は、対応する明視野画像において、丸い正常な形態で生存可能であると示された。Ｃ２Ａｍでポジティブ染色された細胞（Ｂ）は、異常な形態をもち、対応する明視野画像において、細胞死を起こしていることを示した。
【０１３６】
【図１７】Ｃ２Ａｍ（黒三角）またはＡｎｘＶ（黒四角）を用いたＥＬ４細胞の標識におけるプローブ濃度の効果を示す。試験した濃度範囲は、Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶに対して、それぞれ、０．０５〜１．０μＭおよび１〜２０ｎＭであった。Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶで標識したＥＬ４細胞の生存細胞（ａ）、壊死細胞（ｂ）、およびアポトーシス細胞（ｃ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）データを示す。任意単位の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、各チャネルの自己蛍光レベルに標準化した。データは、壊死細胞／生存細胞（ｄ）およびアポトーシス細胞／生存細胞（ｅ）のＭＦＩ比としても表される。データは、図１３Ｃと同様にして、ＮＡＤ（Ｈ）自己蛍光レベルを用いてゲートした。実験を３回行い、示したデータは、全実験からの平均結果に対応する（一連の各濃度は二重に行った）。データは、各濃度の平均±ＳＥＭ（ｎ＝３重、誤差棒は、見えない場合にはマーク内にある）として示す。＊Ｐ＜０．０５。
【０１３７】
【図１８】２つのプローブがＥＬ４細胞のアポトーシス細胞および壊死細胞に結合するカルシウム依存性の研究を示す。カルシウムの存在下（白色棒）または非存在下（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；灰色棒）におけるアポトーシス細胞／生存細胞および壊死細胞／生存細胞のＭＦＩ比を示す。カルシウムの非存在下で得られた比率は、カルシウムの存在下で得られた比率（棒の上の縦軸ラベル）のａ％としても示す。
【０１３８】
【図１９】Ｃ２Ａｍ（Ｃ）またはＡｎｘＶ（Ｂ）を用いたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の蛍光標識の経時変化を示す。データは、生存細胞（青色）、アポトーシス細胞（黄色）、および壊死細胞（赤色）のＮＡＤ（Ｈ）自己蛍光プロファイル（Ａ）に基づいて、図１３と同様にしてゲートした。示したデータは、代表的なデータセットである。［Ｃ２Ａｍ］＝０．２μＭ、［ＡｎｘＶ］＝４ｎＭ。アポトーシス細胞／生存細胞（Ｄ）および壊死細胞／生存細胞（Ｅ）のＭＦＩ比を示す。
【０１３９】
表１は、図１４で示したデータからＮＡＤ（Ｈ）ＵＶ自己蛍光を測定することで決定された、Ｃ２ＡｍまたはＡｎｘＶによって特定されたＥＬ４細胞死の程度の比較を示す。ｘおよびｙは、それぞれ、ＮＡＤ（Ｈ）自己蛍光の測定から決定された、各タンパク質で検出された細胞画分のベストフィットラインの勾配および切片を表し；１未満の勾配（ｘ）の値は、所与の細胞画分の過小評価値を示す。Ｒ２は、分析範囲におけるベストフィットの相関係数である（％細胞）。
【０１４０】
表２は、非修飾タンパク質Ｃ２Ａｍおよび修飾後のタンパク質（Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＡＦ６４７）に対するＳＰＲデータの親和性および動態解析から得られた解離定数（Ｋｄ）を示す。Ｃ２Ａｍ（二重注入）に対する親和性分析により、Ｋｄはおよそ５５±３．５ｎＭと示された。動態解析は、非常に似た値であった。修飾タンパク質Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＡＦ６４７は、親和性分析によれば７１±６．９ｎＭ、動態解析によれば８７．９ｎＭと僅かに高いＫｄを示した。動態および親和性の分析は似た値であった。分析により、タンパク質の活性は化学修飾後に多く保たれることが示唆された。
【０１４１】
配列番号１は、Ｓｅｒ７８Ｃｙｓ変異型Ｃ２Ａドメインのアミノ酸配列を示す。
【０１４２】
配列番号２は、Ｓｅｒ７８Ｃｙｓ変異型Ｃ２Ａドメイン（Ｃ２Ａｍ）でコードされたヌクレオチド配列を示す。
【０１４３】
配列番号３は、ＧＳＴ／Ｃ２Ａドメイン融合が挿入されたｐＧＥＸ−２Ｔベクターのヌクレオチド配列を示す。ｐＧＥＸ−２Ｔ配列、ヌクレオチド１〜２５７および１３７４〜６３７９；ＧＳＴドメイン：ヌクレオチド２５８〜９１７；リンカー：ヌクレオチド９１８〜９７０；Ｃ２ドメイン：ヌクレオチド９７１〜１３６４（変異：１２１３〜１２１４）；アーチファクト：ヌクレオチド１３６５〜１３７３；ＧＳＴ  ｌａｃプロモーター：−１０：ヌクレオチド２０５〜２１１；−３５：ヌクレオチド１８３〜１８８；ｌａｃオペレーター＝ヌクレオチド２１７〜２３７；リボゾーム結合部位＝２４４  開始コドン＝２５８。
【０１４４】
実験
材料および方法
全ての組織培養用試薬、ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ死細胞染色、アネキシンＶ−アレクサフルオル６４７（商標）（ＡｎｘＶ−ＡｌｘＦ６４７）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｐａｉｓｌｅｙ、Ｒｅｎｆｒｅｗｓｈｉｒｅ、ＵＫ）から入手した。グリーンポリカスパーゼＦＬＩＣＡ（登録商標）キットは、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＬＣ（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＮ、ＵＳＡ）から入手した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＡｎｘＶ−ＡｌｘＦ６４７調製物の分析は、３７ｋＤａよりも僅かに小さな質量をもつバンドを示した。これは、６３３ｎｍの光を照射した際に蛍光を発した唯一のバンドであった。クマシー染色ゲルのデンシトメトリーにより、このバンドは、Ｎｏｎ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）により１６μｇ／ｍｌまたは〜４６０ｎＭのＡｎｘＶ−ＡｌｘＦ６４７を含有すると示されたゲルにおいて全タンパク質質量の〜２％を表すことを示した。全ての化学物質は、他に指定しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．Ｌｔｄ（Ｐｏｏｌｅ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）が提供する分析グレードであった。エトポシド（ＥＰＯＳＩＮ）は、ＰＣＨ  Ｐｈａｒｍａｃｈｅｍｉｅ（Ｈａａｒｌｅｍ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から入手した。マウスリンパ腫（ＥＬ−４）細胞およびヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）から入手した。
【０１４５】
部位特異的変異
ドブネズミシナプトタグミン配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋサービス（配列同一性  ＮＭ＿００１０３３６８０；ＮＭ＿００１０３３６８０．２）を用いて取得し、この配列からＣ２Ａドメインを選択した。３つの候補のシステイン変異体には、Ｓｅｒ２１７、Ｇｌｎ１５４、Ａｓｎ２４８を選択した（図２を参照）。変異誘発に適切なプライマーは、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎソフトウェアを用いて設計した。Ｃ２Ａ含有ｐＧＥＸ−２Ｔベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈａｌｆｏｎｔ  Ｓｔ  Ｇｉｌｅｓ、ＵＫ）をＢＬ２１大腸菌細胞から単離し、二重制限消化を行い、その同一性を確認した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異性変異誘発キットによって変異誘発を行った。大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞を熱ショックによって変異プラスミドで形質転換し、増幅ベクターを単離し、シーケンシングを行った。最後に、大腸菌ＢＬ２１細胞をエレクトロポレーションによってベクターで形質転換した。
【０１４６】
タンパク質過剰発現の試験
３つの変異体のタンパク質の過剰発現量を評価するために、変異型Ｃ２Ａベクターを含有する大腸菌ＢＬ２１（各変異体に２つのクローン）を、２Ｌ型三角フラスコ中のＬＢ培地（Ｍｅｒｃｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で増殖させた。変異体の発現を、対照として野生型ＧＳＴ−Ｃ２Ａ−発現細菌と比較した。細胞培養は、光学密度（６００ｎｍでのＯＤ）が０．６、０．８、および１．０であった場合に、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって誘導を行った。誘導前、および、誘導後一時間ごとに試料を回収し、その後、細胞溶解を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、３つの変異体全て（図３）に対して４２ｋＤａの期待分子量（ＧＳＴ−Ｃ２Ａｍ）のバンドを示し、３つの誘導時間での発現量に著しい違いはないことを示した。
【０１４７】
異なる変異体の相対発現量を比較するために、変異体１つ当たり１つのクローンで実験を繰り返し、０．７〜０．８のＯＤで誘導を行い、３時間増殖させた。細胞ペレットを溶解させ、最終体積を均一にした。これらの細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。
【０１４８】
変異Ｓｅｒ２１７Ｃｙｓの選択
Ｃ２Ａの最もよく発現した部位特異性変異体としてＳ２１７Ｃ（Ｃ２Ａドメインの７８番目；完全長シナプトタグミンＩの２１７番目）変異体（Ｃ２Ａｍ）を選択した。
【０１４９】
Ｃ２Ａｍタンパク質は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現した。ＧＳＴ−Ｃ２Ａの精製は参照文献２に記載されている。簡潔に言えば、ＧＳＴ−アフィニティクロマトグラフィー（ＧＳＴｐｒｅｐカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってＧＳＴ−Ｃ２Ａｍを溶解細胞から抽出し、トロンビンと共にインキュベートし、ＨｉＴｒａｐセファロースカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。図５は、これらの精製工程のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを示す。レーンＡは、ＧＳＴカラム上の溶解細胞の非結合（「フロースルー」）画分を示す。レーンＢは、Ｃ２Ａドメインを表す１６ｋＤａバンドと、ＧＳＴドメインの２６ｋＤａバンドとを示す。これは、ＧＳＴ−Ｃ２Ａｍのトロンビン開裂の結果である。レーンＣは、ＨｉＴｒａｐセファロースカラムのフロースルーを示し、レーンＤは、溶出Ｃ２Ａｍドメインを表す。最後に、レーンＤおよびＥは、Ｃ２ＡｍおよびＣ２Ａの分子量が同じであることを示す。
【０１５０】
変異Ｃ２Ａの精製
Ｃ２Ａｍタンパク質は、ＩＰＴＧによる誘導の後、４２ｋＤａのＧＳＴタグ融合タンパク質として発現し、Ｓ７８Ｃ変異体は、アフィニティクロマトグラフィーを用いて精製した。５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含有するＬＢ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ＿Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で細胞を３７℃で培養した。ＧＳＴ−Ｃ２Ａｍの発現は、ｃａ．１〜１．２  Ｏ．Ｄ．単位の光学密度（６００ｎｍ）で、０．１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって誘導された。誘導を５時間進行させた後、遠心分離（１５０００ｇ、３０分、４℃）によって細胞を採取し、凍結ペレットとして−２０℃で２４時間保持した。２ｍＭの４−（２−アミノエチル）ベンジルスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ、Ｍｅｌｆｏｒｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｈｅｌｓｗｏｒｔｈ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＵＫ）とプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．、Ｌｅｗｅｓ、Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）とを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｏｘｏｉｄ  ＵＳＡ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）中で細胞ペレットを再懸濁させた。水冷ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ−Ｃ５ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ、Ｏｔｔａｗａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）によって、１，０００バールでの３フローサイクルを用いて細胞を壊した後、ＤＮＡｓｅ  Ｉ（ｃａ．２５０μｇ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびオクチルフェノールエトキシレート（トリトンＸ−１００（商標）、最終濃度０．１％）を穏やかに攪拌しながら加えた（１５分、４℃）。遠心分離（４００００ｇ、３０分、４℃）によって細胞の破片を除去し、０．２２μｍの低タンパク質結合フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を通して残りの上清を濾過し、クロマトグラフィーで精製した。添加液および溶出緩衝液として、それぞれ、ＰＢＳ、および、ｐＨ８．０の５０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（Ｔｒｉｚｍａ（商標）塩基、Ｓｉｇｍａ）中の２５ｍＭグルタチオン（Ｍｅｌｆｏｒｄ）を用いて、ＧＳＴＰｒｅｐ（商標）ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）でＦＰＬＣによって初期精製を行った。添加液および溶出緩衝液として、それぞれ、２ｍＭのＣａＣｌ２、または１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）のいずれかを含有するＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）−緩衝生理食塩水（ＨＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて、第２のタンパク質精製をＨｉＰｒｅｐ（商標）ＳＰ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で行った。最後に、１０ｋＤａ濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標）、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ、Ｅｄｇｅｗｏｏｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用いて精製タンパク質（ＧＳＴ−Ｃ２Ａｍ）を濃縮し、緩衝液をＨＢＳに交換した。この細菌発現システムにより、１Ｌの培地当たり約６０〜８０ｍｇの組換えＧＳＴ−Ｃ２Ａｍを一貫して得た。ＧＳＴ−Ｃ２Ａｍ１ｍｇ当たり２ＮＩＨ単位のトロンビン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をもつＨＢＳ中で２２℃にて１６時間インキュベーションすることによって、ＧＳＴタグを融合タンパク質（およそ１０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度）から除去した。酵素消化物を０．２２μｍの低タンパク質結合フィルターを通して濾過し、Ｃ２Ａｍに特異的に結合するＨｉＰｒｅｐ（商標）ＳＰ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて開裂ＧＳＴタグを除去した。Ｐｒｅ−ｃａｓｔ  ＮＵＰＡＧＥ（商標）４〜１２％勾配ゲル、試料緩衝液、分子量マーカー、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）からのＮｏｖｅｘ（商標）ゲルタンクを用いて、精製の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１５１】
タンパク質濃度の推定
Ｎｏｎ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（商標）キット（ＮＩＰＡ）（Ｍｅｒｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ）を用いて、非修飾および修飾タンパク質の濃度を推定した。これは、銅イオンがペプチドバックボーンに特異的に結合することに基づいている。市販のアネキシンＶ−アレクサフルオル６４７（商標）（０．１％  ＢＳＡも含有）中のアネキシンＶの濃度を測定するために、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。励起波長６３３ｎｍによるＴｙｐｈｏｏｎ蛍光ゲルスキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、対応ゲルの蛍光についてもチェックした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のアネキシンＶの分子量に対応するタンパク質バンドは、蛍光した唯一のバンドとして確認された。デンシトメトリーを用いてバンドを定量化した。これにより、光学密度を測定することによって、他の全てのバンドにおける割合として対象のバンドの強さが得られる。全タンパク質濃度を示した、試料のデンシトメトリーおよびＮＩＰＡアッセイを用いて、アネキシンＶのおおよその濃度を算出した。
【０１５２】
蛍光標識タンパク質の生成
変異タンパク質（Ｃ２Ａｍ）は、システイン−７８残基とアレクサフルオル６４７  Ｃ２マレイミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマレイミド基との反応を介して、蛍光色素アレクサフルオル６４７（ＡｌｘＡＦ６４７）と共有結合的に標識した。簡潔に言えば、１０ｍＭのＤＴＴを用いて、タンパク質を３０分間室温で還元した。その後、ＨＮＥ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中の５ＫＤａビバスピン濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｅｐｓｏｍ、ＵＫ）でタンパク質を洗浄した。これにより、共役反応を妨害する任意の残渣ＤＴＴを除去した。タンパク質を５０〜１００μＭの濃度範囲に保持し、およそ１０倍のモル過剰の蛍光マレイミド色素を加えた。マグネチックスターラー上で４℃にて一晩反応を進行させた。ゲル濾過を用いて、修飾タンパク質を未反応色素から分離した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析を用いて、タンパク質の修飾がうまくいったことを確認した。これにより、およそ１７２０４Ｄａの単一種（Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＡＦ６４７）が得られた。アネキシンＶ−アレクサフルオル６４７（商標）のＥＳＩ質量分析も行った。簡潔に言えば、ミリポアジップチップｍＣ１８を用いて試料を脱塩し、５０％ＭｅＣＮ／０．２％ギ酸で溶出した。移動相として７０％ＭｅＯＨ／０．２％ギ酸を用いて、１．７ｍｌ／分の流量でＷａｔｅｒｓ  ＱｔｏｆＭｉｃｒｏに直接注入することによって試料を分析した。標準設定（キャピラリー３０００Ｖ、コーン９０Ｖ、キャピラリー温度８０℃、脱溶媒温度１５０℃、ミオグロビンおよび／またはトリプシノーゲンによる較正）は同一ファイルに後で収集した。Ｗａｔｅｒｓ  ＭａｓｓＬｙｎｘ  ＭａｘＥｎｔ  １ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ  Ｌｔｄ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）を用いてデコンボリューションを行った。
【０１５３】
フローサイトメトリーを用いたアポトーシス細胞結合の実証
変異タンパク質（Ｃ２Ａｍ）は、上述の蛍光標識アポトーシス検出プローブ（Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＦ）を作製するために、システイン−２１７残基を介して蛍光色素アレクサフルオル４８８−マレイミド（ＡｌｘＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。
【０１５４】
マウスリンパ腫ＥＬ４細胞を化学療法剤（エトポシド、１５μＭ）で１４時間処理し、アポトーシスを誘導させた。氷冷の細胞標識緩衝液１００μＬ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中で再懸濁した、試料１つ当たり１０６個の細胞を、ＳＹＴＯＸ（商標）Ｒｅｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；試料１つ当たり１．５μＬ）およびＣ２Ａｍ−Ａｌｘ（０．２、０．５、もしくは２μＭ）またはアネキシンＶ−アレクサフルオル４８８（ＡｎｘＶ−ＡｌｘＦ；０．１もしくは０．２μＭ）のいずれかで室温にて１５分間インキュベートした。試料を細胞標識緩衝液で１０００μＬに希釈した。結果を図６に示す。４８８ｎｍでの蛍光強度の増加が、初期アポトーシス細胞（黄色）、後期アポトーシス細胞（橙色）、および壊死細胞（赤色）で観察された。このシフトは、同一濃度（０．２μＭ）でＡｎｘＶ−ＡｌｘＦよりもＣ２Ａｍ−ＡｌｘＦを用いることでより顕著であった（図６Ａを参照）。
【０１５５】
４８８ｎｍでの蛍光強度の増加は、プローブ濃度が増加するにつれて観察された（図７）。この増加した標識は、初期および後期のアポトーシス細胞および壊死細胞で主に見られた。
【０１５６】
一連の濃度試験において、細胞ペレット（１０６個の細胞）を１％ウシ胎仔血清を有する氷冷ＨＥＰＥＳ−緩衝生理食塩水（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で洗浄し、Ｃ２ｍ−ＡＦ６４７またはアネキシンＶ−アレクサフルオル６４７（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する同じ緩衝液１００μＬ（ＳＹＴＯＸ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；５０ｎＭ）と組み合わせて、０．０５〜１．０μＭの全タンパク質濃度範囲において用いた）で再懸濁し、３７℃で１５分間インキュベートした。得られた混合物を２回洗浄し、氷上に短時間保持した後、ＬＳＲＩＩ細胞計（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ  ＵＳＡ）で分析した。１回当たり２０，０００個の細胞がカウントされた。時間経過データにおいて、処理誘導時点から２時間ごとにＥＬ４細胞を回収し、処理し、上で略述したプロトコルに従って分析した。タンパク質は、各時点でＣ２ＡｍおよびＡｎｘＶを、それぞれ、０．２μＭおよび４ｎＭの固定濃度で用いた。試料は三重に分析した。プローブへの結合のカルシウム依存性を試験するため、タンパク質は、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水中でＣ２ｍおよびＡｎｘＶを、それぞれ、０．１μＭおよび２ｎＭの固定濃度で用いた。いくつかの実験において、緩衝液中のＣａ２＋は１０ｍＭ  ＥＤＴＡで置き換えた。インキュベーション後に、同じ緩衝液で洗浄も行った。
【０１５７】
活性カスパーゼを検出するため、処理ＥＬ４細胞および未処理ＥＬ４細胞を洗浄した後、グリーンポリカスパーゼＦＬＩＣＡ（登録商標）で３７℃にて３０分間インキュベートした（３００倍に希釈したストック）。別の洗浄工程を行い、Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶでインキュベートした。他の全てのフローサイトメトリー試験と同様に、同じ洗浄工程を適用した。
【０１５８】
ヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−１７５）を化学療法剤（ドキソルビシン、１μｇ／ｍＬ）で９６時間処理し、アポトーシスを誘導させた。６ウェルプレート（０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）からトリプシン処理した、試料１つ当たり１０６個の細胞を、ＳＹＴＯＸ（商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；５０ｎＭ）およびＣ２Ａｍ−ＡＦ６４７（０．２μＭ）またはＡｎｘＶ−ＡＦ６４７（０．００４μＭ）のいずれかを含有する１００μＬの氷冷した細胞標識緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、３７℃にて２０分間インキュベートした。試料を細胞標識緩衝液で１０００μＬに希釈し、フローサイトメトリー分析を行った。結果を図１９に示す。６４７ｎｍでの蛍光強度の増加が、Ｃ２Ａｍ−ＡＦ６４７（図１９Ｃ）を用いて、アポトーシス細胞（黄色）および壊死細胞（赤色）対生存細胞（青色）で観察された。ＡｎｘＶ−ＡＦ６４７も生存細胞よりもアポトーシス細胞および壊死細胞でより標識されたが、薬物療法の９６時間後には、ＡｎｘＶ−ＡＦ６４７で染色したアポトーシス細胞および生存細胞のＭＦＩに違いはほとんどなかった（図１９Ｂ）。
【０１５９】
表面プラズモン共鳴分析
大きな多層膜ベシクル（ＬＭＶ）は、３種類のリン脂質（フォスファチジルセリン、ＰＳ；ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥ、およびホスファチジルコリン、ＰＣ、アバンティポーラーリピッド、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いて調製した。２．６μｍｏｌのリン脂質（クロロホルム中のＰＳ：ＰＥ：ＰＣ混合物；モル比３５：５０：１５）の試料に窒素を穏やかに３０分間吹きつけて乾燥させ、強い渦混合によって、２．６ｍＬのＣ２Ａ結合緩衝液（ＨＢＳ＝２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有）中に再懸濁させた。これにより、ＬＭＶの混濁状の懸濁液が形成された。これを完全に清澄するまで氷上で超音波破砕し（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ、ＵＳＡからのＵｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ＸＬ  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒで３サイクル、３０秒パルス、パルス間１０秒間隔、低出力）、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）の形成が示唆された。
【０１６０】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システム（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｌ１センサーチップ上で行った。
【０１６１】
いくつかの実験において、チップフローセルをイソプロパノール／ＮａＯＨ５０ｍＭの混合物（２：３体積）２分パルスで５μＬ／分で洗浄し、その１つを１ｍＭのリン脂質を含有するＳＭＶの懸濁液５μＬで被覆し（１μＬ／分）、約２，０００ＲＵ（相対単位）の平均相対応答を得た。水酸化ナトリウム（５０ｍＭ、２０μＬ／分）の２０秒再生パルスを３回印加することによって、未結合の多層材料をＳＭＶ注入後にチップから除去した。
【０１６２】
他の実験において、チップフローセルを２０ｍＭの３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ、３０μＬ／分）の２回の３０秒パルスで洗浄し、リン脂質１ｍＭ（５μＬ／分）を含有する試験ＳＭＶ（ＰＳ：ＰＥ：ＰＣ）の懸濁液で１つのフローセル（試験）を被覆し、約５，０００ＲＵ（相対単位）の平均相対応答に達した。水酸化ナトリウム（５０ｍＭ、３０μＬ／分）の３０秒パルスを２回印加することによって、未結合の多層材料をＳＭＶ注入後に脂質二重層から除去した。
【０１６３】
別のフローセルは対照パスとして被覆しないでおいた。いくつかの実験において、リン脂質１ｍＭ（５μＬ／分）を含有する対照ＳＭＶ（ＰＥ：ＰＣ）の懸濁液で別のフローセル（対照）を被覆し、約５，０００ＲＵ（相対単位）の平均相対応答を得た。ＰＥおよびＰＣ（モル比７７：２３）を用いて対照ＳＭＶを調製し、非結合材料を上述のように除去した。
【０１６４】
安定なベースラインが達成された後、３０μＬ／分で２分間（会合相）および１分間（解離相）、または、４０μＬ／分で３７℃にて６０秒間（会合相）、タンパク質を２つの対象フローセルのチップ表面と順次相互作用させた。各個体に注入後、４０μＬ／分で１０ｍＭ  ＮａＥＤＴＡを含有するＨＢＳまたは（ＨＢＳ、２０ｍｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）の１５秒または２０秒パルスを用いてリン脂質二重層を再生した。
【０１６５】
各タンパク質溶液は、自動混合の画分調合液を用いて、０〜１００ｎＭまたは５ｎＭ〜７５ｎＭに濃度を変えるシステムで自動的に調製し、全注入は、３０μＬ／分の流量かつ３７℃でＣ２Ａ結合緩衝液において二重に行った。全濃度は二重に分析した。対応する相互作用センサーグラムの会合相が終わる前に応答値（４秒）から得られた熱平衡親和性の解離定数（ＫＤ）を推定することによって、ＰＳのタンパク質親和性を評価した（図８）。二重参照分析、およびＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェア（バージョン１．１．１）（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
【０１６６】
細胞培養
ＥＬ４マウスリンパ腫およびＭＤＡ−ＭＢ−１７５ヒト乳癌細胞を、１０％ウシ胎仔血清および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で増殖させた。５％ＣＯ２を含有する湿気のある環境で３７℃にて細胞を継代培養した。トリパンブルー色素染色を用いて細胞の数および生存度をモニタリングした。５μＭのエトポシドを１６時間加えることでＥＬ４細胞死を誘発させ、１μｇ／ｍＬのドキソルビシンを最長で９６時間まで加えることでＭＤＡ−ＭＢ−１７５細胞死を誘発させた。
【０１６７】
蛍光造影用のＣ２Ａｍベースプローブ
蛍光標識アポトーシス検出プローブ（Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＦ）を作製するために、変異タンパク質（Ｃ２Ａｍ）をシステイン２１７残基を介して蛍光色素アレクサフルオル４８８−マレイミド（ＡｌｘＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。同様のプロトコルを用いて市販のアネキシンＶも比較用に標識した。質量分析（エレクトロスプレーイオン化法、またはＥＳＩ）を用いてＣ２ＡｍおよびＣ２Ａｍ−ＡｌｘＦを特徴付けた。
【０１６８】
簡潔に言えば、両方のタンパク質を１〜１００μＭの濃度で保持し、蛍光マレイミド色素を１〜１０ｍＭの濃度で保持した。０．２５ｍｇのアレクサフルオルマレイミド４８８ｎｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５０μＬのミリＱ水に溶解した。２０μｇのＡｎｘ−Ｖを５００μＬのＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水：２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＝４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）（１μＭ）に溶解した。０．５６ｍｇのＣ２Ａｍを５００ｕＬのＨＢＳ（６９μＭ）に溶解した。ＤＴＴの０．５Ｍ原液をミリＱ水で作製した。１０ｍＭのＤＴＴをタンパク質に加え、マグネチックスターラー上に室温で３０分間置いた。タンパク質をＨＮＥ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）中で３回、５ＫＤａビバスピン濃縮器で洗浄した。これにより、共役反応を妨害する残渣ＤＴＴを除去する。０．５ｍｌに沈降させると、タンパク質を７ｍＬのビジューフラスコに移した。およそ１０倍モル過剰の色素をタンパク質に加えた（Ａｎｘ−Ｖには２．９ｕｌ、Ｃ２Ａｍには４７．１μｌの色素ストック）。両方のビジューを暗闇で保持した。マグネチックスターラー上で４℃にて一晩反応を進行させた。タンパク質を５ＫＤａビバスピン中のＨＢＳで４回十分に洗浄した。最終希釈標準溶液は、Ｃ２Ａｍ−ＡｌｘＦには２８μＭ（１．１ｍｌ）、ＡｎｘＶ−ＡｌｘＦには０．８３μＭ（０．６ｍＬ）であった。
【０１６９】
質量分析結果を図９乃至図１２に示す。
【０１７０】
ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ用のＣ２Ａｍベースプローブ
ＳＰＥＣＴイメージングに使用される１１１インジウム標識アポトーシス検出プローブ（Ｃ２Ａｍ−ＤＯＴＡ−１１１Ｉｎ）を作製するために、システイン２１７残基を介してＣ２Ａｍを二機能性キレート（ＢＦＣ）マレイミド−モノ−アミド−ＤＯＴＡ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）で修飾した。
【０１７１】
簡潔に言えば、５ｍｇのＣ２Ａｍを２ｍＬのＨＢＳ（１５４μＭ）に溶解した。ＤＴＴの０．５Ｍ原液をミリＱ水で作製した。１０ｍＭ  ＤＴＴをタンパク質に加え、マグネチックスターラー上に室温で３０分間置いた。ＨＮＥ緩衝液を用いて、タンパク質を５ＫＤａビバスピン濃縮器で３回洗浄し、残渣ＤＴＴ（ジチオスレイトール）を除去した。沈降させた後に、タンパク質を１８００μＬのＨＮＥ緩衝液中に再懸濁させ、７ｍｌのビジューフラスコに移した。１０倍モル過剰のＢＦＣを２００μＬ  ＤＭＳＯに溶解し、タンパク質に加えた。マグネチックスターラー上で、ｐＨ７．４で４℃にて一晩反応を進行させた。５ＫＤａビバスピン中のＨＢＳでタンパク質を十分に洗浄し、残渣ＢＦＣを除去した。試料をエレクトロスプレーイオン化質量分析で分析し、共役がうまくいったかを確認した。質量分析によって試料の均一性を確認した（ＥＳＩ；図１１を参照）。
【０１７２】
得られた共役材料を１１１Ｉｎで放射標識し、適当な腫瘍モデルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏ（細胞結合アッセイ）およびｉｎ  ｖｉｖｏで確認してもよい。処理ＥＬ４腫瘍および未処理ＥＬ４腫瘍に結合したＣ２Ａｍ−ＤＯＴＡ−１１１ＩｎのＳＰＥＣＴイメージングを比較してもよい。
【０１７３】
同様のアプローチの後、細胞死のＰＥＴイメージングのために、Ｃ２ＡｍをＢＦＣで修飾し、陽電子放出放射性同位元素で放射標識してもよい。
【０１７４】
結果
Ｃ２（Ｓ７８Ｃ）の調製
部位特異性変異誘発を用いて、シナプトタグミンＩのＣ２Ａドメインの７８番目（シナプトタグミンＩの２１７番目）のセリン残基をシステイン残基に置換した。３つの候補アミノ酸残基を置換用に選択した：Ｓｅｒ２１７、Ｇｌｎ１５４、Ａｓｎ２４８。３つのＧＳＴ−Ｃ２Ａ変異体（Ｓ２１７Ｃ、Ｎ２４８Ｃ、およびＱ１５４Ｃ）のＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて、ＩＰＴＧ誘導前後の発現レベルを評価した。全てのベクター形質転換菌は変異タンパク質をある程度発現したが、はるかに高い過剰発現がＳ２１７Ｃで得られた。単離したＣ２ドメイン［Ｃ２（Ｓ７８Ｃ）］を上述のように調製した。
【０１７５】
Ｃ２（Ｓ７８Ｃ）−アレクサフルオル（登録商標）６４７の合成
上述のように、Ｃ２（Ｓ７８Ｃ）をアレクサフルオル（登録商標）６４７のマレイミド誘導体と反応させた。修飾タンパク質（以下、「Ｃ２Ａｍ」という）は、エレクトロスプレーイオン化質量分析で単一ピークが得られ、修飾タンパク質の期待質量は１７２０４Ｄａであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、共役に期待されるものと同様の質量をもつ単一バンドも示した。タンパク質修飾はＰＳの親和性にはほとんど影響しなかった。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定を用いた親和性分析により、ＰＳの２つのタンパク質で同様の解離定数（Ｋｄ）が得られ、非修飾種および修飾種に対して、それぞれ、５５．４±３．５ｎＭおよび７１．０±６．９ｎＭであった。これらの解離定数は、ＳＰＲデータの動態解析によって確認された（表２）。
【０１７６】
フローサイトメトリーおよびＣ２Ａｍを用いた細胞死の検出
フローサイトメトリーを用いて薬剤処理したマウスリンパ腫細胞株（ＥＬ４）中の細胞死をＣ２Ａｍが検出する能力を、同じ蛍光体（以下、「ＡｎｘＶ」という）で標識した市販のアネキシンＶ製剤を用いた検出と比較した。エトポシドによる処理によって細胞死を誘導し、薬物療法後２４時間の間でフローサイトメトリー分析を２時間ごとに行った。Ｓｙｔｏｘ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（細胞壊死のマーカー）で標識した細胞対Ｃ２ＡｍまたはＡｎｘＶで標識した細胞の、薬物療法１６時間後の代表的な散布図を図１３に示す。両方の薬剤は、３つ異質な細胞集団（図１３Ａおよび図１３Ｂ）：壊死細胞（ｎ、ｘおよびｙ軸正方向）、アポトーシス細胞（ａ、ｘ軸正方向、およびｙ軸負方向）、および生存細胞（ｖ、ｘ軸およびｙ軸負方向）を示した。時間経過を通して各々がこれら３つのグループに分類する細胞集団の割合をＣ２Ａｍ（図１３Ｄ）およびＡｎｘＶ（図１３Ｅ）に対して示す。薬物療法後２４時間を通じてＣ２ＡｍおよびＡｎｘＶによって特定された細胞画分間には良好な相関があった（生存細胞、Ｒ２＝０．９９５６、アポトーシス細胞、Ｒ２＝０．９７５８、壊死細胞、Ｒ２＝０．９９５７；ｎ＝１３）。
【０１７７】
エトポシドなどのＤＮＡ傷害剤による細胞処理は、ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性化をもたらし、かつ、ＮＡＤ＋はＰＡＲＰの基質であるため、細胞ＮＡＤ（Ｈ）プールの枯渇をもたらす１３。その結果、ＮＡＤＨ自己蛍光はエトポシドを用いた細胞死の誘導時にかなり減少し、ＥＬ４細胞では薬物療法後の比較的早期にこの減少が起こる１４。従って、ＮＡＤＨ  ＵＶ自己蛍光の変化によって特定されたものとＣ２ＡｍおよびＡｎｘＶを用いて特定した細胞集団を相関させることによって、Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶを用いて特定した細胞集団を確認した（図１３Ｃ）。これらの相関を表１に示す。Ｃ２ＡｍまたはＡｎｘＶ蛍光によって特定された細胞集団対ＮＡＤＨ自己蛍光によって特定された細胞集団のプロットにおいて、両方のタンパク質によって特定された生存細胞集団と高いＮＡＤＨ自己蛍光によって特定された生存細胞集団との間の線形相関（ＡｎｘＶおよびＣ２Ａｍに対して、それぞれ、Ｒ２＝０．９９６およびＲ２＝０．９９９）と、両方のタンパク質によって特定された壊死細胞集団と低いＮＡＤＨ自己蛍光によって特定された壊死細胞集団との間の線形相関（ＡｎｘＶおよびＣ２Ａｍに対して、それぞれ、Ｒ２＝０．９９８およびＲ２＝０．９９９）は良好であった。しかしながら、ＡｎｘＶは、生存細胞の画分を僅かに低く算定し（Ｃ２Ａｍの勾配＝０．９９４に対して勾配＝０．９４２）、アポトーシス細胞の画分は明らかに低く算定した（Ｃ２Ａｍの勾配＝０．８８４に対して勾配＝０．７２７）。しかしながら、ＮＡＤ（Ｈ）レベルによる相関はＣ２Ａｍよりも僅かに良好であった（ＡｎｘＶおよびＣ２Ａｍに対して、それぞれ、Ｒ２＝０．９９４およびＲ２＝０．９７５）。
【０１７８】
２つのタンパク質による各細胞集団の標識の程度についても分析した（図１４）。ここで、これらの細胞集団は、高いＮＡＤＨ自己蛍光（生存細胞）、低いＮＡＤＨ自己蛍光（アポトーシス細胞）、低いＮＡＤＨ自己蛍光、および高いＳｙｔｏｘ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ結合（壊死細胞）から独立して特定されている。生存細胞（図１４Ａ）は、５０倍低い濃度（４ｎＭ  ＡｎｘＶおよび２００ｎＭ  Ｃ２Ａｍ）を用いたにも拘らず、Ｃ２Ａｍと比較して、ＡｎｘＶ（〜４倍；Ｐ＜０．０００１）で一貫して高い染色を示した。壊死細胞（図１４Ｂ）も、薬物療法後の最初の６時間ではＡｎｘＶでより有意に標識されることを示したが（Ｐ＜０．０００１）、それ以後はそうではなく、Ｃ２Ａｍによるアポトーシス細胞の標識は、ほとんどの時間経過で高かった（図１４Ｃ、Ｐ＜０．００１）。壊死細胞の染色レベルは、薬物療法後、ほとんどの時間経過にわたって両方のタンパク質で同様であり、生存細胞のものよりもかなり高かった（〜１０倍）。
【０１７９】
死につつある細胞対生存細胞の薬剤特異性の測定として、壊死細胞／生存細胞（図１４Ｄ）およびアポトーシス細胞／生存細胞（図１４Ｅ）比も薬物療法後の時間経過を通して算出した。Ｃ２Ａｍは、アポトーシス細胞に対してより大きな特異性を示した（Ｐ＜０．０１）。比率は〜５倍高かった。壊死細胞（Ｐ＜０．０１）に対して、比率はＡｎｘＶよりも〜３倍高かった。
【０１８０】
フローサイトメトリーを用いて、薬剤処理されたヒト乳癌細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）における細胞死を検出するＣ２Ａｍの能力についても評価し、ＡｎｘＶを用いた検出と比較した。細胞死はドキソルビシンによる処理で誘導され、フローサイトメトリー分析は、薬物療法後、９６時間にわたって２４時間ごとに行った。Ｓｙｔｏｘ（登録商標）ｇｒｅｅｎ（細胞壊死のマーカー）で標識した細胞対Ｃ２Ａｍ（Ｃ）またはＡｎｘＶ（Ｂ）で標識した細胞の、薬物療法の４８、７２、９６時間後の代表的な散布図を図１９に示す。両方の薬剤とも３つの異なる細胞集団を示した。これは、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎ対ＮＡＤ（Ｈ）自己蛍光の二重散布図（図１９Ａ）において：壊死細胞（赤色）、アポトーシス細胞（黄色）、および生存細胞（青色）と特定されている。Ｃ２Ａｍは、治療の時間経過を通して、３つの細胞集団（生存細胞、アポトーシス細胞、および壊死細胞）の明確な分離をもたらした（図１９Ｃ）。Ｃ２Ａｍとは異なり、ＡｎｘＶが３つの集団を区別する能力は低かった（図１９Ｃ）。これは、処理誘導後７２時間で特に明白であった。死につつあるＭＤＡ細胞対生存ＭＤＡ細胞の薬剤特異性の測定として、アポトーシス細胞／生存細胞（図１９Ｄ）および壊死細胞／生存細胞（図１９Ｅ）比も薬物療法後の時間経過を通して算出した。Ｃ２Ａｍは、アポトーシス細胞に対してより大きな特異性を示した。比率は〜２倍高かった。壊死細胞に対して、比率はＡｎｘＶよりも〜６倍高かった。
【０１８１】
Ｃ２ＡおよびＡｎｘＶで標識した細胞とカスパーゼ活性化との比較
細胞死の別の独立した測定として、緑色（カルボキシフルオレセイン）蛍光体に結合するカスパーゼ阻害剤に基づく、ポリカスパーゼＦＬＩＣＡ（登録商標）（カスパーゼの蛍光標識阻害剤）キットを用いてカスパーゼ活性化を評価した。ＦＬＩＣＡは、細胞浸透性であり、細胞内の活性カスパーゼにのみ結合する。カスパーゼ活性化は、この細胞株内のエトポシド誘導細胞死における比較的早期のイベントである１４。ＦＬＩＣＡおよびＣ２ＡｍまたはＡｎｘＶのいずれかで染色した処理細胞および未処理細胞の二重散布図を図１５に示す。未処理細胞または処理細胞のいずれかにおけるアポトーシス細胞および壊死細胞を、生存細胞と比較した際に、それぞれ、ＦＬＩＣＡで最大２倍までと１６倍以上で染色した。これらのプロットにより、Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶの両方とも生存細胞への結合レベルは低いが（ＦＬＩＣＡ陰性）、これらの細胞へのＡｎｘＶ結合はＣ２Ａｍのものよりも高いことが確認される。
【０１８２】
Ｃ２Ａｍで染色した死につつある細胞のイメージング
Ｃ２Ａｍの結合レベルに従って分類された薬剤処理細胞から画像を取得した。明視野画像および対応する蛍光画像を図１６に示す。Ｃ２Ａｍ（Ａ）で染色されず、その結果、蛍光を示さなかった細胞は、明視野画像で生存の円形形態および無傷膜を有していた。一方、Ｃ２Ａｍ（Ｂ）で染色され、その結果、蛍光を発した細胞は、対応する明視野画像で不規則かつブレブ形成の細胞膜であった。
【０１８３】
選択性および特異性におけるプローブ濃度の効果
試験した濃度範囲は、Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶで、それぞれ、０．０５〜１．０μＭおよび１〜２０ｎＭであった。プローブ濃度は変化していたため、ＮＡＤ（Ｈ）自己蛍光を用いて３つの細胞集団をゲートした。ＡｎｘＶで染色された生存細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、Ｃ２Ａｍで染色したものよりもかなり高かった（図１７Ａ）。ＡｎｘＶ染色レベルは、全ての細胞集団において、Ｃ２Ａｍよりも一貫して高かった（図１７Ａ乃至図１７Ｃ）。しかしながら、アポトーシス細胞／生存細胞（図１７Ｅ）および壊死細胞／生存細胞（図１７Ｄ）の細胞染色比は、Ｃ２Ａｍでより高く、アポトーシス細胞（Ｐ＜０．０５；［Ｃ２Ａｍ］≦０．５μＭ、［ＡｎｘＶ］≦０．０１ｎＭ）および壊死細胞（Ｐ＜０．０５、［Ｃ２Ａｍ］＝０．１μＭ、［ＡｎｘＶ］＝２ｎＭ）の両方のより特異的な標識を示した。
【０１８４】
死につつある細胞へのＣ２ＡｍおよびＡｎｘＶ結合のＣａ２＋依存性
死につつある細胞上に露出したＰＳへのＣ２ＡｍおよびＡｎｘＶの結合は、カルシウム依存性である。しかしながら、両方のタンパク質は、Ｃａ２＋非依存的に他の細胞膜リン脂質に結合することも知られている１５。薬剤処理細胞をＣａ２＋（２ｍＭ）またはＥＤＴＡ（１０ｍＭ）の存在下でインキュベートし、Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶの結合をフローサイトメトリーで評価した。アポトーシス細胞対生存細胞および壊死細胞対生存細胞への結合に対する平均蛍光強度比を図１８に示す。アポトーシス細胞への結合は、両方のタンパク質に対して大きくＣａ２＋依存的であった。Ｃａ２＋の非存在下での残留結合レベルは、Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶに対して、それぞれ、４．４％および１２．４％であった。しかしながら、Ｃ２Ａｍは、壊死細胞にＣａ２＋非依存的に結合することがより顕著に示された（ＡｎｘＶの１６．１％に対して５２．４％）。
【０１８５】
上記の試験により、ＡｎｘＶ１６と比較して、シナプトタグミンＩ７、１９のＣ２Ａドメインに基づいて細胞死を検出するための新規の分子プローブを評価する。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでアポトーシス細胞死を検出するための一般に使用されているプローブである１１、１８。単一のシステイン残基Ｃ２（Ｓ７８Ｃ）を含有するＣ２Ａの部位特異性変異体は、単一の化学種（Ｃ２Ａｍ）を得るために、化学量論的に蛍光体で標識した。Ｃ２Ａｍは、アポトーシスマウスリンパ腫細胞および壊死マウスリンパ腫細胞上のＰＳを検出することを示す。同様に標識したＡｎｘＶ誘導体よりも感度は低かったが、Ｃ２Ａｍは、生存細胞への結合が弱いことを示した。その結果、アポトーシスおよび壊死の検出に対してはより良い特異性を示した。
【０１８６】
臨床的に用いられる化学療法剤（エトポシド、２型トポイソメラーゼ阻害剤）によるマウスリンパ腫細胞株（ＥＬ４）の処理によって、アポトーシスの誘導をもたらした。Ｃ２ＡｍおよびＡｎｘＶによって検出された生存リンパ腫細胞、アポトーシスリンパ腫細胞、および壊死リンパ腫細胞のレベルは同様であり、ＮＡＤ（Ｈ）自己蛍光によって測定された同じ細胞集団と良い相関を示した。しかしながら、アポトーシス細胞および壊死細胞に対する特異性は、アポトーシス細胞／生存細胞および壊死細胞／生存細胞の比率によってそれぞれ定義されるように、ＡｎｘＶよりもＣ２Ａｍに対してより高かった。これは、ＡｎｘＶが生存細胞集団により強く結合することによるところが大きかった（図１４および図１７を参照）。ヒト乳癌接着細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対しても同様の結果が得られた。生存細胞へのＡｎｘＶの明らかな結合をさらに調べるために、活性カスパーゼの蛍光標識した一般的阻害剤（ＦＬＩＣＡ（商標）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＬＣ）を用いて、この細胞集団が本当に生存細胞であり、アポトーシス細胞経路にすでに入っていたかもしれない細胞を含有していなかったことを確認した。カスパーゼ活性化は、これらの細胞におけるアポトーシス誘導後の比較的早期のイベントである１４。この細胞集団は、アポトーシス細胞および壊死細胞と比較して、それぞれ、ＦＬＩＣＡ（商標）での標識は２倍および１６倍低かったため、これは本当に生存細胞集団であることが確認された。これにも拘わらず、この細胞集団は、Ｃ２ＡｍよりもＡｎｘＶではるかに高い標識（〜５倍）を示した。
【０１８７】
本明細書に記載のシナプトタグミンＩ（Ｓ７８Ｃ）のＣ２Ａドメインの部位特異性変異体の化学的に明確に規定され標識された誘導体は、同様に標識されたアネキシンＶ誘導体よりも生存細胞への結合は弱かったことを示したため、細胞死を検出するのにより良い特異性を有している。生存細胞への結合の弱さは、ＰＳに対するＣ２Ａの親和性が低いことによるのであろう。これは、アネキシンＶの放射性核種標識誘導体で観察された非特異的な組織内蓄積を減らし得るため、このタンパク質の放射性核種誘導体を用いてｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞死を検出する場合には、特に有用であろう。
【表１】
0005539324.tif 000002
【表２】
0005539324.tif 000003
【０１８８】
参照文献
１．Ｄｏｗｓｅｔｔ  Ｍら、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｌａｔ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９９；６：２５−２８。
２．Ｗｈｅｅｌｅｒ  ＪＡら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ．１９９５；３２：１４８７−１４９３。
３．Ｓａｖｉｌｌ  Ｊら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１９９３；１４：１３１−１３６。
４．Ｂｅｌｈｏｃｉｎｅ  Ｔら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２；８：２７６６−２７７４。
５．Ｋｅｍｅｒｉｎｋ  ＧＪら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２００１；４２：３８２−３８７。
６．Ｂｏｅｒｓｍａ  ＨＨら、Ｂｒ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ．２００３；７６：５５３−５６０。
７．Ｄａｖｌｅｔｏｖ  ＢＡら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９３；２６８：２６３８６−２６３９０。
８．Ｓｕｄｈｏｆ  ＴＣら、Ｃｅｌｌ．１９９３；７５：１−４。
９．Ｋｒｉｓｈｎａｎ  ＡＳら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．２００８；２４６：８５４−８６２。
１０．Ｚｈａｏ  Ｍら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００１；７：１２４１−１２４４。
１１．Ｚｈａｏ  Ｍら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２００６；４７：１３６７−１３７４。
１２．Ｎｅｖｅｓ  ＡＡら、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００７；７：１４１９−１４２３。
１３．Ｓｉｍｓ  ＪＬら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９８３；２２：５１８８−５１９４。
１４．Ｗｉｔｎｅｙ  ＴＨら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ、ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．２００９。
１５．Ａｌｍｅｉｄａ  ＰＦら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５；４４：１０９０５−１０９１３。
１６．ｖａｎ  Ｇｅｎｄｅｒｅｎ  Ｈら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１：３６３−３６７。
１７．Ｐｅｔｒｏｖｓｋｙ  Ａら、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３；６３：１９３６−１９４２。
１８．Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  ＥＡら、Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．２００３；５：１８７−１９２。
１９．Ｓｕｔｔｏｎ  ＲＢら、Ｃｅｌｌ．１９９５；８０：９２９−９３８。
２０．ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅ  ＳＭら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１９９７；２９：３１３−３２０。
２１．Ｋｕｏ  Ｗ、Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．２００９。
２２．Ｅｍｏｔｏ  Ｋら、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９９７；２３２：４３０−４３４。
２３．Ｓｈａｏ  Ｘら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９８；３７：１６１０６−１６１１５。
２４．Ｌｉｅｍａｎｎ  Ｓら、１９９７；５３：５１６−５２１。
２５．Ｓｉｌｖｅｓｔｒｏ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９９；３８：１１３−１２１。
２６．Ｃｏｎｃｈａ  ＮＯら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３；２６１：１３２１−１３２４。
２７．Ｔａｉｔ  ＪＦら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９２；２９８：１８７−１９１。
２８．Ｃｏｎｃｈａ  ＮＯら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９２；３１４：１５９−１６２。
２９．Ａｐｐｅｌｔ  Ｕら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２００５；１２：１９４−１９６。
【０１８９】
配列：
ＥＫＬＧＫＬＱＹＳＬ  ＤＹＤＦＱＮＮＱＬＬ  ＶＧＩＩＱＡＡＥＬＰ  ＡＬＤＭＧＧＴＳＤＰ  ＹＶＫＶＦＬＬＰＤＫ  ＫＫＫＦＥＴＫＶＨＲ  ＫＴＬＮＰＶＦＮＥＱ  ＦＴＦＫＶＰＹＣＥＬ  ＧＧＫＴＬＶＭＡＶＹ  ＤＦＤＲＦＳＫＨＤＩ  ＩＧＥＦＫＶＰＭＮＴ  ＶＤＦＧＨＶＴＥＥＷ  ＲＤＬＱＳＡＥＫ
配列番号１：シナプトタグミンＩの変異型Ｃ２Ａドメイン。
ＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＣＴＧＧＡＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＧＣＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＧＧＧＧＴＡＣＡＴＣＣＧＡＴＣＣＡＴＡＣＧＴＣＡＡＡＧＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＴＧＡＧＡＣＴＡＡＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＴＣＴＴＣＡＡＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＴＡＣＣＣＴＡＣＴＧＣＧＡＡＴＴＡＧＧＴＧＧＣＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＧＡＴＣＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＣＡＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＧＧＡＧＡＧＴＴＣＡＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＣＴＧＡＧＡＡＡ
配列番号２：変異型Ｃ２Ａドメインコード配列
１  ＡＣＧＴＴＡＴＣＧＡ  ＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧ  ＣＡＣＣＡＡＴＧＣＴ  ＴＣＴＧＧＣＧＴＣＡ  ＧＧＣＡＧＣＣＡＴＣ  ＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧ
６１  ＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴ  ＧＣＡＧＧＴＣＧＴＡ  ＡＡＴＣＡＣＴＧＣＡ  ＴＡＡＴＴＣＧＴＧＴ  ＣＧＣＴＣＡＡＧＧＣ  ＧＣＡＣＴＣＣＣＧＴ
１２１  ＴＣＴＧＧＡＴＡＡＴ  ＧＴＴＴＴＴＴＧＣＧ  ＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴ  ＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧ  ＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣ  ＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣ
１８１  ＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴ  ＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧ  ＣＴＣＧＴＡＴＡＡＴ  ＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴ  ＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴ  ＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡ
２４１  ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣ  ＡＧＴＡＴＴＣＡＴＧ  ＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣ  ＴＡＧＧＴＴＡＴＴＧ  ＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧ  ＧＧＣＣＴＴＧＴＧＣ
３０１  ＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧ  ＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧ  ＧＡＡＴＡＴＣＴＴＧ  ＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡ  ＴＧＡＡＧＡＧＣＡＴ  ＴＴＧＴＡＴＧＡＧＣ
３６１  ＧＣＧＡＴＧＡＡＧＧ  ＴＧＡＴＡＡＡＴＧＧ  ＣＧＡＡＡＣＡＡＡＡ  ＡＧＴＴＴＧＡＡＴＴ  ＧＧＧＴＴＴＧＧＡＧ  ＴＴＴＣＣＣＡＡＴＣ
４２１  ＴＴＣＣＴＴＡＴＴＡ  ＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴ  ＧＡＴＧＴＴＡＡＡＴ  ＴＡＡＣＡＣＡＧＴＣ  ＴＡＴＧＧＣＣＡＴＣ  ＡＴＡＣＧＴＴＡＴＡ
４８１  ＴＡＧＣＴＧＡＣＡＡ  ＧＣＡＣＡＡＣＡＴＧ  ＴＴＧＧＧＴＧＧＴＴ  ＧＴＣＣＡＡＡＡＧＡ  ＧＣＧＴＧＣＡＧＡＧ  ＡＴＴＴＣＡＡＴＧＣ
５４１  ＴＴＧＡＡＧＧＡＧＣ  ＧＧＴＴＴＴＧＧＡＴ  ＡＴＴＡＧＡＴＡＣＧ  ＧＴＧＴＴＴＣＧＡＧ  ＡＡＴＴＧＣＡＴＡＴ  ＡＧＴＡＡＡＧＡＣＴ
６０１  ＴＴＧＡＡＡＣＴＣＴ  ＣＡＡＡＧＴＴＧＡＴ  ＴＴＴＣＴＴＡＧＣＡ  ＡＧＣＴＡＣＣＴＧＡ  ＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡ  ＡＴＧＴＴＣＧＡＡＧ
６６１  ＡＴＣＧＴＴＴＡＴＧ  ＴＣＡＴＡＡＡＡＣＡ  ＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧ  ＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴ  ＡＡＣＣＣＡＴＣＣＴ  ＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴ
７２１  ＴＧＴＡＴＧＡＣＧＣ  ＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴ  ＧＴＴＴＴＡＴＡＣＡ  ＴＧＧＡＣＣＣＡＡＴ  ＧＴＧＣＣＴＧＧＡＴ  ＧＣＧＴＴＣＣＣＡＡ
７８１  ＡＡＴＴＡＧＴＴＴＧ  ＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡ  ＣＧＴＡＴＴＧＡＡＧ  ＣＴＡＴＣＣＣＡＣＡ  ＡＡＴＴＧＡＴＡＡＧ  ＴＡＣＴＴＧＡＡＡＴ
８４１  ＣＣＡＧＣＡＡＧＴＡ  ＴＡＴＡＧＣＡＴＧＧ  ＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧ  ＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣ  ＣＡＣＧＴＴＴＧＧＴ  ＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣ
９０１  ＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡ  ＡＴＣＧＧＡＴＣＴＧ ＧＴＴＣＣＧＣＧＮＧ ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ ＡＡＴＴＴＣＣＧＧＴ ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧ
９６１  ＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡ ＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧ  ＧＡＧＡＡＡＣＴＧＧ  ＧＡＡＡＧＣＴＣＣＡ  ＡＴＡＴＴＣＡＣＴＧ  ＧＡＣＴＡＴＧＡＣＴ
１０２１  ＴＣＣＡＧＡＡＴＡＡ  ＣＣＡＧＣＴＧＴＴＧ  ＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡ  ＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣ  ＴＧＡＡＣＴＧＣＣＣ  ＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡ
１０８１  ＴＧＧＧＧＧＧＴＡＣ  ＡＴＣＣＧＡＴＣＣＡ  ＴＡＣＧＴＣＡＡＡＧ  ＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴ  ＧＣＣＴＧＡＣＡＡＡ  ＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴ
１１４１  ＴＴＧＡＧＡＣＴＡＡ  ＡＧＴＣＣＡＣＣＧＧ  ＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡ  ＡＴＣＣＡＧＴＣＴＴ  ＣＡＡＴＧＡＡＣＡＡ  ＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡ
１２０１  ＡＧＧＴＡＣＣＣＴＡ  ＣＴＧＣＧＡＡＴＴＡ  ＧＧＴＧＧＣＡＡＡＡ  ＣＣＣＴＧＧＴＧＡＴ  ＧＧＣＴＧＴＧＴＡＴ  ＧＡＣＴＴＴＧＡＴＣ
１２６１  ＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡ  ＧＣＡＣＧＡＣＡＴＣ  ＡＴＣＧＧＡＧＡＧＴ  ＴＣＡＡＡＧＴＴＣＣ  ＴＡＴＧＡＡＣＡＣＣ  ＧＴＧＧＡＴＴＴＴＧ
１３２１  ＧＣＣＡＴＧＴＧＡＣ  ＣＧＡＧＧＡＧＴＧＧ  ＣＧＣＧＡＴＣＴＣＣ  ＡＧＡＧＣＧＣＴＧＡ  ＧＡＡＡＴＡＡＧＣＴ  ＴＡＡＴＴＣＡＴＣＧ
１３８１  ＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧ  ＡＣＧＡＴＣＴＧＣＣ  ＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴ  ＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣ  ＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣ  ＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴ
１４４１  ＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧ  ＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡ  ＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴ  ＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴ  ＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡ  ＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧ
１５０１  ＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧ  ＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧ  ＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧ  ＴＣＧＧＧＧＣＧＣＡ  ＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣ  ＡＧＴＣＡＣＧＴＡＧ
１５６１  ＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡ  ＧＴＧＴＡＴＡＡＴＴ  ＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧ  ＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣ  ＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣ  ＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡ
１６２１  ＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣ  ＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡ  ＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡ  ＧＡＣＧＴＣＡＧＧＴ  ＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣ  ＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴ
１６８１  ＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣ  ＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴ  ＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡ  ＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡ  ＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣ  ＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧ
１７４１  ＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣ  ＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣ  ＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡ  ＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧ  ＡＡＧＡＧＴＡＴＧＡ  ＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡ
１８０１  ＴＴＴＣＣＧＴＧＴＣ  ＧＣＣＣＴＴＡＴＴＣ  ＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣ  ＧＧＣＡＴＴＴＴＧＣ  ＣＴＴＣＣＴＧＴＴＴ  ＴＴＧＣＴＣＡＣＣＣ
１８６１  ＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧ  ＧＴＧＡＡＡＧＴＡＡ  ＡＡＧＡＴＧＣＴＧＡ  ＡＧＡＴＣＡＧＴＴＧ  ＧＧＴＧＣＡＣＧＡＧ  ＴＧＧＧＴＴＡＣＡＴ
１９２１  ＣＧＡＡＣＴＧＧＡＴ  ＣＴＣＡＡＣＡＧＣＧ  ＧＴＡＡＧＡＴＣＣＴ  ＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴ  ＣＧＣＣＣＣＧＡＡＧ  ＡＡＣＧＴＴＴＴＣＣ
１９８１  ＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣ  ＡＣＴＴＴＴＡＡＡＧ  ＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧ  ＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡ  ＴＴＡＴＣＣＣＧＴＧ  ＴＴＧＡＣＧＣＣＧＧ
２０４１  ＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡ  ＣＴＣＧＧＴＣＧＣＣ  ＧＣＡＴＡＣＡＣＴＡ  ＴＴＣＴＣＡＧＡＡＴ  ＧＡＣＴＴＧＧＴＴＧ  ＡＧＴＡＣＴＣＡＣＣ
２１０１  ＡＧＴＣＡＣＡＧＡＡ  ＡＡＧＣＡＴＣＴＴＡ  ＣＧＧＡＴＧＧＣＡＴ  ＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡ  ＧＡＡＴＴＡＴＧＣＡ  ＧＴＧＣＴＧＣＣＡＴ
２１６１  ＡＡＣＣＡＴＧＡＧＴ  ＧＡＴＡＡＣＡＣＴＧ  ＣＧＧＣＣＡＡＣＴＴ  ＡＣＴＴＣＴＧＡＣＡ  ＡＣＧＡＴＣＧＧＡＧ  ＧＡＣＣＧＡＡＧＧＡ
２２２１  ＧＣＴＡＡＣＣＧＣＴ  ＴＴＴＴＴＧＣＡＣＡ  ＡＣＡＴＧＧＧＧＧＡ  ＴＣＡＴＧＴＡＡＣＴ  ＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣ  ＧＴＴＧＧＧＡＡＣＣ
２２８１  ＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴ  ＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣ  ＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡ  ＧＣＧＴＧＡＣＡＣＣ  ＡＣＧＡＴＧＣＣＴＧ  ＣＡＧＣＡＡＴＧＧＣ
２３４１  ＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧ  ＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴ  ＴＡＡＣＴＧＧＣＧＡ  ＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴ  ＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣ  ＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴ
２４０１  ＡＡＴＡＧＡＣＴＧＧ  ＡＴＧＧＡＧＧＣＧＧ  ＡＴＡＡＡＧＴＴＧＣ  ＡＧＧＡＣＣＡＣＴＴ  ＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧ  ＣＣＣＴＴＣＣＧＧＣ
２４６１  ＴＧＧＣＴＧＧＴＴＴ  ＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡ  ＡＡＴＣＴＧＧＡＧＣ  ＣＧＧＴＧＡＧＣＧＴ  ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＧ  ＧＴＡＴＣＡＴＴＧＣ
２５２１  ＡＧＣＡＣＴＧＧＧＧ  ＣＣＡＧＡＴＧＧＴＡ  ＡＧＣＣＣＴＣＣＣＧ  ＴＡＴＣＧＴＡＧＴＴ  ＡＴＣＴＡＣＡＣＧＡ  ＣＧＧＧＧＡＧＴＣＡ
２５８１  ＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧ  ＧＡＴＧＡＡＣＧＡＡ  ＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴ  ＣＧＣＴＧＡＧＡＴＡ  ＧＧＴＧＣＣＴＣＡＣ  ＴＧＡＴＴＡＡＧＣＡ
２６４１  ＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧ  ＴＣＡＧＡＣＣＡＡＧ  ＴＴＴＡＣＴＣＡＴＡ  ＴＡＴＡＣＴＴＴＡＧ  ＡＴＴＧＡＴＴＴＡＡ  ＡＡＣＴＴＣＡＴＴＴ
２７０１  ＴＴＡＡＴＴＴＡＡＡ  ＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧ  ＴＧＡＡＧＡＴＣＣＴ  ＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴ  ＣＴＣＡＴＧＡＣＣＡ  ＡＡＡＴＣＣＣＴＴＡ
２７６１  ＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴ  ＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴ  ＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡ  ＣＣＣＣＧＴＡＧＡＡ  ＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧ  ＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧ
２８２１  ＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴ  ＴＴＴＣＴＧＣＧＣＧ  ＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧ  ＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡ  ＡＡＡＡＡＡＣＣＡＣ  ＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣ
２８８１  ＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴ  ＴＴＧＣＣＧＧＡＴＣ  ＡＡＧＡＧＣＴＡＣＣ  ＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴ  ＣＣＧＡＡＧＧＴＡＡ  ＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧ
２９４１  ＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧ  ＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡ  ＣＴＧＴＣＣＴＴＣＴ  ＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧ  ＴＡＧＴＴＡＧＧＣＣ  ＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡ
３００１  ＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡ  ＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡ  ＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣ  ＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣ  ＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧ  ＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣ
３０６１  ＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴ  ＡＡＧＴＣＧＴＧＴＣ  ＴＴＡＣＣＧＧＧＴＴ  ＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡ  ＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣ  ＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣ
３１２１  ＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧ  ＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧ  ＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧ  ＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣ  ＡＧＣＴＴＧＧＡＧＣ  ＧＡＡＣＧＡＣＣＴＡ
３１８１  ＣＡＣＣＧＡＡＣＴＧ  ＡＧＡＴＡＣＣＴＡＣ  ＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴ  ＡＴＧＡＧＡＡＡＧＣ  ＧＣＣＡＣＧＣＴＴＣ  ＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧ
３２４１  ＡＡＡＧＧＣＧＧＡＣ  ＡＧＧＴＡＴＣＣＧＧ  ＴＡＡＧＣＧＧＣＡＧ  ＧＧＴＣＧＧＡＡＣＡ  ＧＧＡＧＡＧＣＧＣＡ  ＣＧＡＧＧＧＡＧＣＴ
３３０１  ＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡ  ＡＡＣＧＣＣＴＧＧＴ  ＡＴＣＴＴＴＡＴＡＧ  ＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧ  ＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣ  ＴＣＴＧＡＣＴＴＧＡ
３３６１  ＧＣＧＴＣＧＡＴＴＴ  ＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴ  ＣＧＴＣＡＧＧＧＧＧ  ＧＣＧＧＡＧＣＣＴＡ  ＴＧＧＡＡＡＡＡＣＧ  ＣＣＡＧＣＡＡＣＧＣ
３４２１  ＧＧＣＣＴＴＴＴＴＡ  ＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧ  ＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧ  ＧＣＣＴＴＴＴＧＣＴ  ＣＡＣＡＴＧＴＴＣＴ  ＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴ
３４２１  ＡＴＣＣＣＣＴＧＡＴ  ＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡ  ＡＣＣＧＴＡＴＴＡＣ  ＣＧＣＣＴＴＴＧＡＧ  ＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡ  ＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧ
３４８１  ＣＡＧＣＣＧＡＡＣＧ  ＡＣＣＧＡＧＣＧＣＡ  ＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴ  ＧＡＧＣＧＡＧＧＡＡ  ＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣ  ＧＣＣＴＧＡＴＧＣＧ
３５４１  ＧＴＡＴＴＴＴＣＴＣ  ＣＴＴＡＣＧＣＡＴＣ  ＴＧＴＧＣＧＧＴＡＴ  ＴＴＣＡＣＡＣＣＧＣ  ＡＴＡＡＡＴＴＣＣＧ  ＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡ
３６０１  ＡＴＧＧＴＧＣＡＡＡ  ＡＣＣＴＴＴＣＧＣＧ  ＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧ  ＡＴＡＧＣＧＣＣＣＧ  ＧＡＡＧＡＧＡＧＴＣ  ＡＡＴＴＣＡＧＧＧＴ
３６６１  ＧＧＴＧＡＡＴＧＴＧ  ＡＡＡＣＣＡＧＴＡＡ  ＣＧＴＴＡＴＡＣＧＡ  ＴＧＴＣＧＣＡＧＡＧ  ＴＡＴＧＣＣＧＧＴＧ  ＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡ
３７２１  ＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣ  ＣＧＣＧＴＧＧＴＧＡ  ＡＣＣＡＧＧＣＣＡＧ  ＣＣＡＣＧＴＴＴＣＴ  ＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣ  ＧＧＧＡＡＡＡＡＧＴ
３７８１  ＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧ  ＡＴＧＧＣＧＧＡＧＣ  ＴＧＡＡＴＴＡＣＡＴ  ＴＣＣＣＡＡＣＣＧＣ  ＧＴＧＧＣＡＣＡＡＣ  ＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧ
３８４１  ＣＡＡＡＣＡＧＴＣＧ  ＴＴＧＣＴＧＡＴＴＧ  ＧＣＧＴＴＧＣＣＡＣ  ＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧ  ＧＣＣＣＴＧＣＡＣＧ  ＣＧＣＣＧＴＣＧＣＡ
３９０１  ＡＡＴＴＧＴＣＧＣＧ  ＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴ  ＣＴＣＧＣＧＣＣＧＡ  ＴＣＡＡＣＴＧＧＧＴ  ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧ  ＴＧＧＴＧＴＣＧＡＴ
３９６１  ＧＧＴＡＧＡＡＣＧＡ  ＡＧＣＧＧＣＧＴＣＧ  ＡＡＧＣＣＴＧＴＡＡ  ＡＧＣＧＧＣＧＧＴＧ  ＣＡＣＡＡＴＣＴＴＣ  ＴＣＧＣＧＣＡＡＣＧ
４０２１  ＣＧＴＣＡＧＴＧＧＧ  ＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡ  ＡＣＴＡＴＣＣＧＣＴ  ＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧ  ＧＡＴＧＣＣＡＴＴＧ  ＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣ
４０８１  ＴＧＣＣＴＧＣＡＣＴ  ＡＡＴＧＴＴＣＣＧＧ  ＣＧＴＴＡＴＴＴＣＴ  ＴＧＡＴＧＴＣＴＣＴ  ＧＡＣＣＡＧＡＣＡＣ  ＣＣＡＴＣＡＡＣＡＧ
４１４１  ＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣ  ＴＣＣＣＡＴＧＡＡＧ  ＡＣＧＧＴＡＣＧＣＧ  ＡＣＴＧＧＧＣＧＴＧ  ＧＡＧＣＡＴＣＴＧＧ  ＴＣＧＣＡＴＴＧＧＧ
４２０１  ＴＣＡＣＣＡＧＣＡＡ  ＡＴＣＧＣＧＣＴＧＴ  ＴＡＧＣＧＧＧＣＣＣ  ＡＴＴＡＡＧＴＴＣＴ  ＧＴＣＴＣＧＧＣＧＣ  ＧＴＣＴＧＣＧＴＣＴ
４３２１  ＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧ  ＣＡＴＡＡＡＴＡＴＣ  ＴＣＡＣＴＣＧＣＡＡ  ＴＣＡＡＡＴＴＣＡＧ  ＣＣＧＡＴＡＧＣＧＧ  ＡＡＣＧＧＧＡＡＧＧ
４３８１  ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＴ  ＧＣＣＡＴＧＴＣＣＧ  ＧＴＴＴＴＣＡＡＣＡ  ＡＡＣＣＡＴＧＣＡＡ  ＡＴＧＣＴＧＡＡＴＧ  ＡＧＧＧＣＡＴＣＧＴ
４４４１  ＴＣＣＣＡＣＴＧＣＧ  ＡＴＧＣＴＧＧＴＴＧ  ＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡ  ＧＡＴＧＧＣＧＣＴＧ  ＧＧＣＧＣＡＡＴＧＣ  ＧＣＧＣＣＡＴＴＡＣ
４５０１  ＣＧＡＧＴＣＣＧＧＧ  ＣＴＧＣＧＣＧＴＴＧ  ＧＴＧＣＧＧＡＴＡＴ  ＣＴＣＧＧＴＡＧＴＧ  ＧＧＡＴＡＣＧＡＣＧ  ＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡ
４５６１  ＣＡＧＣＴＣＡＴＧＴ  ＴＡＴＡＴＣＣＣＧＣ  ＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣ  ＣＡＴＣＡＡＡＣＡＧ  ＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣ  ＴＧＣＴＧＧＧＧＣＡ
４６２１  ＡＡＣＣＡＧＣＧＴＧ  ＧＡＣＣＧＣＴＴＧＣ  ＴＧＣＡＡＣＴＣＴＣ  ＴＣＡＧＧＧＣＣＡＧ  ＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧ  ＧＣＡＡＴＣＡＧＣＴ
４６８１  ＧＴＴＧＣＣＣＧＴＣ  ＴＣＡＣＴＧＧＴＧＡ  ＡＡＡＧＡＡＡＡＡＣ  ＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧ  ＣＣＣＡＡＴＡＣＧＣ  ＡＡＡＣＣＧＣＣＴＣ
４７４１  ＴＣＣＣＣＧＣＧＣＧ  ＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴ  ＣＡＴＴＡＡＴＧＣＡ  ＧＣＴＧＧＣＡＣＧＡ  ＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣ  ＧＡＣＴＧＧＡＡＡＧ
４８０１  ＣＧＧＧＣＡＧＴＧＡ  ＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡ  ＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡ  ＧＴＴＡＧＣＴＣＡＣ  ＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡ  ＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴ
４８６１  ＴＡＣＡＣＴＴＴＡＴ  ＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴ  ＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴ  ＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴ  ＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡ  ＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡ
４９２１  ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ  ＣＴＡＴＧＡＣＣＡＴ  ＧＡＴＴＡＣＧＧＡＴ  ＴＣＡＣＴＧＧＣＣＧ  ＴＣＧＴＴＴＴＡＣＡ  ＡＣＧＴＣＧＴＧＡＣ
４９８１  ＴＧＧＧＡＡＡＡＣＣ  ＣＴＧＧＣＧＴＴＡＣ  ＣＣＡＡＣＴＴＡＡＴ  ＣＧＣＣＴＴＧＣＡＧ  ＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣ  ＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣ
５０４１  ＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡ  ＧＣＧＡＡＧＡＧＧＣ  ＣＣＧＣＡＣＣＧＡＴ  ＣＧＣＣＣＴＴＣＣＣ  ＡＡＣＡＧＴＴＧＣＧ  ＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴ
５１０１  ＧＧＣＧＡＡＴＧＧＣ  ＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧ  ＧＴＴＴＣＣＧＧＣＡ  ＣＣＡＧＡＡＧＣＧＧ  ＴＧＣＣＧＧＡＡＡＧ  ＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧ
５１６１  ＴＧＣＧＡＴＣＴＴＣ  ＣＴＧＡＧＧＣＣＧＡ  ＴＡＣＴＧＴＣＧＴＣ  ＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡ  ＡＣＴＧＧＣＡＧＡＴ  ＧＣＡＣＧＧＴＴＡＣ
５２２１  ＧＡＴＧＣＧＣＣＣＡ  ＴＣＴＡＣＡＣＣＡＡ  ＣＧＴＡＡＣＣＴＡＴ  ＣＣＣＡＴＴＡＣＧＧ  ＴＣＡＡＴＣＣＧＣＣ  ＧＴＴＴＧＴＴＣＣＣ
５２８１  ＡＣＧＧＡＧＡＡＴＣ  ＣＧＡＣＧＧＧＴＴＧ  ＴＴＡＣＴＣＧＣＴＣ  ＡＣＡＴＴＴＡＡＴＧ  ＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧ  ＣＴＧＧＣＴＡＣＡＧ
５３４１  ＧＡＡＧＧＣＣＡＧＡ  ＣＧＣＧＡＡＴＴＡＴ  ＴＴＴＴＧＡＴＧＧＣ  ＧＴＴＧＧＡＡＴＴ
配列番号３：Ｃ２Ａ−ＧＳＴ融合インサートを備えたｐＧＥＸ−２Ｔベクター。
【図１】
0005539324.tif 000004
【図２】
0005539324.tif 000005
【図３】
0005539324.tif 000006
【図４】
0005539324.tif 000007
【図５】
0005539324.tif 000008
【図６】
0005539324.tif 000009
【図７】
0005539324.tif 000010
【図８】
0005539324.tif 000011
【図９】
0005539324.tif 000012
【図１０】
0005539324.tif 000013
【図１１】
0005539324.tif 000014
【図１２】
0005539324.tif 000015
【図１３】
0005539324.tif 000016
【図１４】
0005539324.tif 000017
【図１５】
0005539324.tif 000018
【図１６】
0005539324.tif 000019
【図１７】
0005539324.tif 000020
【図１８】
0005539324.tif 000021
【図１９】
0005539324.tif 000022
【配列表】
0005539324000001.xml