(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケラタン硫酸−IIの存在下またはケラタン硫酸−IIを対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定することを特徴とする樹状細胞免疫受容体刺激剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
樹状細胞免疫受容体に対する結合性を測定する工程、及び破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を測定する工程を含む、破骨細胞形成抑制剤又は破骨細胞形成促進剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を含有する骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療剤。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項３記載の骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療剤。
【請求項５】
骨粗鬆症、骨パジェット病、変形性骨炎及び関節リウマチから選ばれる疾患の予防治療剤である請求項３又は４記載の骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療剤。
【請求項６】
破骨細胞形成抑制剤又はＴＮＦ−α産生阻害剤である請求項３〜５のいずれかに記載の骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療剤。
【請求項７】
樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞受容体に対する抗体を含有する破骨細胞形成促進剤。
【請求項８】
前記抗体が、モノクローナル抗体である請求項７記載の破骨細胞形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、樹状細胞免疫受容体（Ｄｅｎｄｒｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＤＣＩＲ）に対するリガンド、抗ＤＣＩＲ抗体及びそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｃ  Ｃｅｌｌ：ＤＣ）は主要な抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、免疫系の調節において中枢的な役割を担っている。近年、幾つかのＣ型レクチン受容体類（ＣＬＲ類）が樹状細胞の表面に発現されるとのキャラクタリゼーションがなされた。Ｉ型のＣＬＲ類メンバーであるＭＭＲ（ＣＤ２０６）及びＤＥＣ−２０５（ＣＤ２０５）は、そのＮ末端に複数のカルシウム依存性細胞外糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）を有する。樹状細胞上に発現するＣＬＲの第２のファミリーは、Ｃ末端に唯一のＣＲＤを持つＩＩ型タンパク質であり、それらはＤＣ−ＳＩＧＮ（ＣＤ２０９）、Ｌａｎｇｅｒｉｎ（ＣＤ２０７）、ＣＬＥＣ−１、Ｄｅｃｔｉｎ−１（β−ＧＲ）、Ｄｅｃｔｉｎ−２、ＤＬＥＣ、及びＤＣＩＲを含む。【０００３】
ＤＣＩＲはＬＬＩＲとも呼ばれ、ヒト及びマウスの主に樹状細胞上に発現するＩＩ型膜タンパク質である。この分子は細胞外ドメインに一つの糖鎖認識ドメイン（ＣＲＤ）を持ち、細胞内ドメインにコンセンサスＩＴＩＭを持つ。ＩＴＩＭは細胞内に抑制的シグナルを伝達するので、マウスＤＣＩＲは抑制的な受容体として働き、樹状細胞機能を調節することが示唆された。
本発明者らは、先にＤＣＩＲノックアウトマウスの作製に成功し、当該マウスを用いた検討により、ＤＣＩＲが関節炎や関節リウマチの進展に関与していることを報告した（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２９３１９号公報
【特許文献２】特開２００９−１９０４４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．２，ｐ１７６−１８０，ＦＥＢＲＵＡＲＹ  ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ＤＣＩＲに対する内因性のリガンドは未だ発見されておらず、本来の意味でのＤＣＩＲの生体内での作用メカニズムは解明されていない。また、ＤＣＩＲ刺激剤やＤＣＩＲ拮抗剤も全く見出されていない。【０００７】
従って、本発明の課題は、ＤＣＩＲのリガンドを見出し、その刺激剤及び拮抗剤を探索し、その応用を図ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、ＤＣＩＲのリガンドを見出すべく種々検討した結果、全く意外にもそのリガンドがケラタン硫酸−ＩＩ（ＫＳ−ＩＩ）であることを見出し、さらにＫＳ−ＩＩとＤＣＩＲとの結合による作用を検討したところ、ＫＳ−ＩＩはＤＣＩＲに結合することにより、骨芽細胞及び破骨細胞の機能を制御しており、特に破骨細胞形成を強く抑制しており、また炎症を抑制していることを見出した。これらの知見に基づき、さらに、ＤＣＩＲに対する抗体を作製し、その作用を検討したところ、抗ＤＣＩＲ抗体の中には、ＫＳ−ＩＩ阻害性のＤＣＩＲ拮抗作用を有する抗体だけでなく、ＫＳ−ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗体が存在することを見出した。また該ＫＳ−ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗ＤＣＩＲ抗体は優れた破骨細胞成形抑制作用、ＴＮＦ−α産生抑制作用を有し、骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患の予防治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、ＫＳ−ＩＩを有効成分とする樹状細胞免疫受容体刺激剤を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ−ＩＩの存在下またはＫＳ−ＩＩを対照として、被検物質の樹状細胞免疫受容体への結合性を測定することを特徴とする樹状細胞免疫受容体刺激剤又は樹状細胞免疫受容体拮抗剤のスクリーニング方法を提供するものである。【００１０】
また、本発明は、ＫＳ−ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体、及びこれを含有する医薬を提供するものである。
さらに本発明は、ＫＳ−ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体、及びこれを含有する医薬を提供するものである。【００１１】
また、本発明は、樹状細胞免疫受容体を刺激するために使用するＫＳ−ＩＩを提供するものである。
また、本発明は、樹状細胞免疫受容体刺激剤製造のための、ＫＳ−ＩＩの使用を提供するものである。【００１２】
また、本発明は、骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患を予防又は治療するために使用する、ＫＳ−ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を提供するものである。
また、本発明は、骨代謝異常を伴う疾患予防治療剤又は炎症性疾患予防治療剤製造のための、ＫＳ−ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体の使用を提供するものである。【００１３】
また本発明は、がん治療又は免疫賦活のために使用する、ＫＳ−ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を提供するものである。
また、本発明は、抗がん剤又は免疫賦活剤製造のための、ＫＳ−ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体の使用を提供するものである。【００１４】
また、本発明は、ＫＳ−ＩＩを投与することを特徴とする樹状細胞免疫受容体の刺激方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ−ＩＩ様の樹状細胞免疫受容体刺激作用を有する樹状細胞免疫受容体に対する抗体を投与することを特徴とする骨代謝異常を伴う疾患又は炎症性疾患の予防治療方法を提供するものである。
また、本発明は、ＫＳ−ＩＩ阻害性の樹状細胞免疫受容体拮抗作用を有する抗体を投与することを特徴とするがんの予防治療方法又は免疫賦活方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ＫＳ−ＩＩがＤＣＩＲのリガンドであることが見出され、これは破骨細胞の形成抑制作用等を有し、新たな医薬として有用である。また、抗ＤＣＩＲ抗体のうち、ＫＳ−ＩＩ様作用を有する抗体は、ＤＣＩＲ刺激作用を有し、骨代謝異常を伴う疾患、炎症性疾患等の予防治療剤として有用である。一方、ＫＳ−ＩＩ阻害作用を有する抗体は、ＤＣＩＲ拮抗作用を有し、抗がん剤、免疫賦活剤等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（ａ）Ｄｃｉｒ−／−マウスの作製における、マウスＤｃｉｒ部位（野生型アレル）、Ｄｃｉｒターゲティング構築物（ターゲティングベクター）、及び予測される変異Ｄｃｉｒ遺伝子（変異体アレル）の構造を示す模式図。エキソンは黒色のボックスで示す。Ｎｅｏ：ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＴ：ジフテリア毒素遺伝子、Ｂ：ＢａｍＨＩサイト、Ｅ：ＥｃｏＲＩサイト。図中の５’ｐｒｏｂｅ、３’ｐｒｏｂｅと表記された黒いボックスはそれぞれサザンブハイブリダイゼーションにおける５’プローブ及び３’プローブの結合位置を示す。（ｂ）〜（ｄ）ＥＳクローンのサザンブロットハイブリダイゼーション解析結果を示す図。（ｂ）：ＢａｍＨＩ切断ゲノムＤＮＡと５’プローブを用いた解析、（ｃ）：ＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡと３’プローブを用いた解析、（ｄ）：ＥｃｏＲＩ切断ゲノムＤＮＡとＮｅｏプローブを用いた解析。（ｅ）マウスのＤｃｉｒ欠損を確認するためのゲノムサザンブロット分析結果を示す図。（ｆ）ノーザンブロット解析によるマウス脾臓におけるＤｃｉｒ  ｍＲＮＡの発現を示す図。＋／＋：野生型マウス。＋／−：Ｄｃｉｒ＋／−マウス、−／−：Ｄｃｉｒ−／−マウス。
【図２】ａ．８週齢のＷＴマウス及びＫＯマウス大腿骨の３次元マイクロＣＴ像（上段）及び横断面（下段）。ｂ．左上：骨量対組織量比（ＢＶ／ＴＶ）、右上：骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）、左下：骨梁間隔（Ｔｂ．Ｓｐ）、右下：骨梁中心距離ｔ（Ｔｂ．Ｓｐａｃ）。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝４又は５／群）。ｃ．８週齢ＷＴマウス及びＫＯマウスの大腿骨トルイジンブルー染色切片。ｄ．成長板ｇｒｏｗｔｈ  ｐｌａｔｅ厚の定量測定値。ｅ．８週齢ＷＴマウス及びＫＯマウスの脛骨ＴＲＡＰ染色切片。ｆ．ＯＣ数（Ｎ．Ｏｃ）及びＯＣ表面対骨表面比（Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ）。ｇ．８週齢ＷＴマウス及びＫＯマウスの大腿骨の動的組織形態計測分析。ｈ．石灰化速度（ＭＡＲ）及び骨形成速度（骨梁表面）（ＢＦＲ／ＢＳ）。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝４又は６／群）。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。スケールバー＝１００μｍ．
【図３】正常高齢ＫＯマウスのマイクロＣＴ分析：ａ．ＷＴマウスと硬直症状のない１２月齢のＫＯマウスの大腿骨横断面像；ｂ．骨量対組織量比（ＢＶ／ＴＶ）。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝３／群）。
【図４】骨におけるＤｃｉｒ（Ｃｌｅｃ４ａ２）発現。ａ−ｂ．ＯＣ（骨髄由来破骨細胞）、ＯＢ（初代頭蓋冠骨骨芽細胞）、及び軟骨細胞（初代肋骨軟骨細胞）のＲＴ−ＰＣＲ解析結果。軟骨細胞（ｂ）では、Ｄｃｉｒ発現が検出できなかったため、ポジティブコントロールとしてＣｏｌ２ａ１及びＣｏｌ１０ａ１を測定した。
【図５】ＫＯマウスにおける骨発達。ａ．鼻−肛門長に基づく成長曲線。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝８／群）。ｂ．アルシアンブルーとアリザリンレッドによる新生マウスの骨染色像。
【図６】ａ．Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬで処理された骨髄細胞由来ＯＣのＴＲＡＰ染色像。ｂ．ＴＲＡＰ陽性多核細胞（ＭＮＣ；少なくとも３個（左）又は少なくとも２０個（右）の核を含む細胞）の定量測定値。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝６）。ｃ．吸収窩ｐｉｔ形成分析。ＯＣは象牙質スライス上で培養された。ｄ．吸収ピット面積の定量測定値。データは３以上の別個の実験の代表例。ｅ．ＯＣ培養物上清のＴＲＡＰ活性。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）。ｆ．ＯＣ分化をコントロールする主要転写因子（Ｎｆａｔｃ１及びＮｆａｔｃ２）ならびにＯＣマーカー（Ａｃｐ５及びＣａｓｋ）の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。ｇ．ＲＡＮＫＬ処理後の様々な時点での、骨髄由来マクロファージ（ＢＭＭ）細胞培養物におけるＭＡＰＫ（ｐ３８、ＥＲＫ及びＪＮＫ）、Ａｋｔ、及びＮＥ−κＢの活性。ｈ．ＢＭＭ細胞培養物におけるＰＬＣγ１及びＰＬＣγ２のＲＡＮＫＬ誘導性チロシンリン酸化。ｉ．２日間のインビトロ培養後の単核細胞のＴＲＡＰ染色。ｊ．ＴＲＡＰ陽性単核細胞の定量測定値。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝５又は７／群）。ｋ．Ｍ−ＣＳＦ、又はＭ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬによる刺激後のｐＯＣを用いた増殖アッセイ。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５。
【図７】ａ．Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬを含む骨髄細胞培養物からの培地におけるＧＭ−ＣＳＦ濃度。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）。ｂ．Ｍ−ＣＳＦのみ、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬ、又はＭ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦによる刺激後のｐＯＣを用いた増殖アッセイ。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝３又は７／群）。ｃ．破骨細胞形成に対するＧＭ−ＣＳＦの影響。Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含む培地に横軸に示す濃度の組換えマウスＧＭ−ＣＳＦを添加した。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝３）。ｄ．破骨細胞形成に対する抗ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体（Ａｂｓ）の影響。Ｍ−ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含む培地に抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（５μｇ／ｍＬ）を添加した。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝４）。ｅ．ｐＯＣにおけるＳｔａｔ５のＧＭ−ＣＳＦ介在性リン酸化。全細胞抽出物をＧＭ−ＣＳＦ刺激後、図示した時点で回収した。バンドの濃さはデンシトメトリーにより決定し、ウェスタンブロット像の上に示す。＊Ｐ＜０．０５，＊＊＊Ｐ＜０．００１．
【図８】ａ．ＤＣＩＲ結合性カーボハイドレイトの構造。Ｇａｌ：ガラクトース、ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｓ：硫酸基。ｂ．組換えマウスＤＣＩＲ（ｍＤＣＩＲ）とＫＳ−ＩＩとの濃度依存性結合（ｍｅａｎ±ｓ．ｄ．）。ｃ．ＫＳ−ＩＩ非存在下（ＫＳ−）及び存在下（ＫＳ＋）でのＯＣのＴＲＡＰ染色。ｄ．ＫＳ−ＩＩ（１００ｎｇ／ｍＬ）非存在下及び存在下でのＴＲＡＰ陽性ＭＮＣ（細胞あたりの核数３個以上）数（ｍｅａｎ±ｓ．ｄ．）。ｅ．糖鎖（１０ｎｇ／ｍＬ）存在下における破骨細胞形成。ＫＳ−Ｉ：角膜由来ＫＳ−Ｉ、ＫＳ−ＩＩ：軟骨由来ＫＳ−ＩＩ、ＣＳ：コンドロイチン硫酸、ＤＳ：デルマタン硫酸、ＬａｃＮＡｃ：非硫酸化ＬａｃＮＡｃ。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．。ｆ．ＫＳ−ＩＩ刺激後のｐＯＣ溶解物におけるＩＴＩＭリン酸化とＳＨＰ−１動員に関するイムノブロット分析。複合体は抗ＤＣＩＲ抗体とともに免疫沈降させた。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１．
【図９】新生マウス由来初代頭蓋冠骨ＯＢの増殖アッセイ。初代ＯＢは新生マウスの頭蓋冠骨から単離し、骨形成誘導せずに培養した。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝５／群）。
【図１０】ａ．骨形成性の分化後の複数の時点での、ＯＢにおけるＤｃｉｒ（Ｃｌｅｃ４ａ２）発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。ｂ−ｄ．頭蓋冠骨ＯＢの石灰化。骨形成性培養物のアリザリンレッド染色（ｂ）、フォン・コッサ染色（ｃ）、及びＡＬＰ染色（ｄ）。ｅ．頭蓋冠骨ＯＢの骨形成性培養物（２１日）におけるＯＢマーカーｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｒｕｎｘ２：Ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ２（Ｃｂｆａ１：Ｃｏｒｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １）、Ｏｓｘ：Ｏｓｔｅｒｉｘ（Ｓｐ７）、Ａｌｐ：Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｉｂｓｐ：Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＳＰ：ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣｏｌＩα１：Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｌｐｈａ１、Ｏｓｃ：Ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、Ｏｐｎ：Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ。ｆ．頭蓋冠骨ＯＢ石灰化に対するＫＳ−ＩＩの影響：アリザリンレッド染色（上）、ＡＬＰ染色（中、下）。ｇ．Ｄｃｉｒ−／−マウス由来のＢＭＣ及びＯＢを含む共培養系における破骨細胞形成。ｈ−ｉ．ＯＢとＢＭＣの共培養後のＴＲＡＰ陽性ＭＮＣ数。データはｍｅａｎ±ｓ．ｄ．（ｎ＝４−１１／群）。＊＊＊Ｐ＜０．００１。ｊ．頭蓋冠骨ＯＢにおけるＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ比に関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。ｋ−ｌ．ＷＴマウス（ｋ）及びＫＯマウス（ｌ）由来の頭蓋冠骨ＯＢにおけるＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ比に対するＫＳ−ＩＩの影響に関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図１１】頭蓋冠骨ＯＢにおけるＯＰＧ及びＲＡＮＫＬ発現レベルのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図１２】本発明のハイブリドーマ上清のＴＮＦ−αに対する影響を示す。
【図１３】本発明のハイブリドーマ上清の破骨細胞分化に対する影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明のＤＣＩＲ刺激剤の有効成分はＫＳ−ＩＩである。ケラタン硫酸は、ガラクトース（Ｇａｌ）にＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）が結合した、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの基本構造を有する硫酸化グリコサミノグリカンである。ケラタン硫酸には、骨や軟骨由来でＯ−グリコシド結合でタンパク質と結合するＫＳ−ＩＩと、角膜由来でＮ−グリコシド結合でタンパク質と結合するＫＳ−Ｉとが存在するが、本発明ではＫＳ−ＩＩのみが使用できる。ＫＳ−Ｉには本発明の作用はない。ＫＳ−ＩＩは、炎症等に関与することが知られている（特許文献１）が、ＤＣＩＲとの関係については全く知られていなかった。
【００１８】
ＫＳ−ＩＩには、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの繰り返し数及び硫酸残基数により種々の構造のものが存在するが、本発明ではいずれのものも使用できる。
これらのＫＳ−ＩＩは、骨や軟骨由来のもの、また市販のものを使用することができる。
【００１９】
後記実施例に示すように、ＫＳ−ＩＩは、ＤＣＩＲのリガンドであり、ＤＣＩＲに結合することにより種々の作用を示す。すなわち、ＫＳ−ＩＩはＤＣＩＲに結合することにより、骨芽細胞の成熟化と骨基質形成を阻害し、オステオポンチンの生産を促進する作用を有する。一方で、ＫＳ−ＩＩは、ＤＣＩＲに結合することにより、破骨細胞の形成を強力に抑制することも判明した。また、その作用はＧＭ−ＣＳＦ依存性の破骨前駆細胞の増殖を阻害することによるものである。なお、ＫＳ−ＩはＤＣＩＲのリガンドではない。
従って、ＫＳ−ＩＩは、骨形成調節剤として有用であり、種々の骨疾患、例えば骨粗鬆症、骨パジェット病、変形性骨炎等の予防治療剤として有用である。
【００２０】
また、ＫＳ−ＩＩはＤＣＩＲのリガンドであるから、ＫＳ−ＩＩの存在下あるいはＫＳ−ＩＩを対照として、被検物質のＤＣＩＲへの結合性を測定すれば、ＤＣＩＲ刺激剤又はＤＣＩＲ拮抗剤のスクリーニングが可能である。より具体的には、ＫＳ−ＩＩ及び被検物質のＤＣＩＲへの結合性を測定し、ＫＳ−ＩＩとＤＣＩＲとの結合性と対比すれば、被検物質がＤＣＩＲの刺激剤か拮抗剤かが判定できる。ここでＤＣＩＲへの結合性の測定は、ＫＳ−ＩＩの作用、例えば破骨細胞形成能、ＴＮＦ−α産生に対する作用、Ｉ型ＩＦＮ産生に対する作用により判定してもよい。
【００２１】
ＤＣＩＲ刺激剤又はＤＣＩＲ拮抗剤のスクリーニングは、インビトロでもインビボでも行うことができる。インビボの場合には、破骨細胞形成能、ＴＮＦ−α産生に対する作用、Ｉ型ＩＦＮ産生に対する作用により判定するのが好ましい。
【００２２】
本発明の抗ＤＣＩＲ抗体には、ＫＳ−ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗ＤＣＩＲ抗体（抗ＤＣＩＲアゴニスティック抗体）と、ＫＳ−ＩＩ阻害性のＤＣＩＲ拮抗作用を有する抗ＤＣＩＲ抗体（抗ＤＣＩＲアンタゴニスティック抗体）とがある。
本発明において、ＫＳ−ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有するとは、ＫＳ−ＩＩと同様のＤＣＩＲ刺激作用を有すればよく、他の物質によりＤＣＩＲ刺激作用を有する場合も含まれる。
【００２３】
ＫＳ−ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗体のうち、ＤＣＩＲに対する結合性がＫＳ−ＩＩと同等またはそれよりも高いものが好ましく、当該結合性は１．２倍以上高いものが好ましく、２倍以上がより好ましく、５倍以上高いものがさらに好ましい。当該結合性は、ＤＣＩＲに対する結合性を直接測定してもよいが、破骨細胞形成抑制能、ＴＮＦ−α産生抑制作用などの活性を指標に測定してもよい。
【００２４】
本発明におけるＫＳ−ＩＩ様のＤＣＩＲ刺激作用を有する抗体は、破骨細胞形成抑制作用及びＴＮＦ−α産生阻害作用を有し、その作用はＫＳ−ＩＩと同等もしくはそれよりも強い。従ってＫＳ−ＩＩ様抗ＤＣＩＲ抗体は、骨吸収性疾患などの骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患等の予防治療剤として有用である。骨代謝異常を伴う疾患や炎症性疾患の例としては、例えば、骨粗鬆症、骨パジェット病、変形性骨炎、関節リウマチなどを挙げることができる。ＫＳ−ＩＩ様抗ＤＣＩＲ抗体が、これらの疾患に有効であることは、例えばコラーゲン誘発関節炎モデルを用いて確認することができる。
【００２５】
ＫＳ−ＩＩ阻害性のＤＣＩＲ拮抗作用を有する抗体のうち、ＤＣＩＲに対する結合性がＫＳ−ＩＩと同等もしくはそれよりも高いものが好ましく、当該結合性は１．２倍以上のものが好ましく、２倍以上のものがより好ましく、５倍以上のものがさらに好ましい。
【００２６】
ＫＳ−ＩＩ阻害性のＤＣＩＲ拮抗作用を有する抗体は、強い破骨細胞形成促進作用及びＴＮＦ−α産生促進作用を有する。従ってＫＳ−ＩＩ阻害性抗ＤＣＩＲ抗体は、抗がん剤、免疫賦活剤等として有用である。
【００２７】
本発明の抗ＤＣＩＲ抗体には、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、ならびに抗原決定基に特異的に結合する能力を保持している抗体及びＴ−細胞レセプターフラグメント等の、抗体の変種及び誘導体が含まれる。
【００２８】
また、本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体、トリ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。
【００２９】
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原又は所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【００３０】
また、これらの抗体は、その特性を失わない限り、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
【００３１】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
【００３２】
本発明の抗体及び抗体フラグメントは、任意の適当な方法、例えば、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、及び組換えＤＮＡ発現系により製造することができる。
【００３３】
モノクローナル抗体及びハイブリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１，１９８０）。ＤＣＩＲ又はそのフラグメントを免疫原として用いて、抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）に皮下又は腹膜内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。
【００３４】
ポリクローナル抗体は、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、又はラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。
【００３５】
モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、又はラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とする蛋白質又はそのフラグメントを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよい（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５−６を参照）。また、免疫を行わないファージディスプレイに基づいたモノクローナル抗体の作製も現在行われており、本発明の抗体はこれらの方法のいずれで製造されてもかまわない。
【００３６】
本発明の医薬は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
【００３７】
経口投与用には、ＫＳ−ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
【００３８】
非経口投与用には、ＫＳ−ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性又は水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、又は乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、ＫＳ−ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液又は懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、ＫＳ−ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体を粉末化し、ラクトース又はデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。坐剤処方は、ＫＳ−ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
【００３９】
ＫＳ−ＩＩ又は抗ＤＣＩＲ抗体の投与量は、患者の症状、投与経路、体重、年令等によっても異なるが、例えば成人１日あたり１μｇ〜５００ｍｇであるのが好ましい。
【実施例】
【００４０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
（実験方法）
全ての動物実験は、東京大学医科学研究所動物使用委員会の承認を得、動物実験のための安全ガイドライン及び遺伝子複製実験のための倫理ガイドラインに従って行われた。【００４１】
１．Ｄｃｉｒノックアウト（ＫＯ）マウスの作製
Ｄｃｉｒ−／−（ＫＯ）マウスは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ  １４，ｎｏ  ２：１７６−１８０に記載される手順に従って、通常の遺伝子ターゲティング法によって作製した。
５’末端相同領域、ＢａｍＨＩサイト、ＥｃｏＲＩサイト、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏ）、３’末端にネガティブセレクションのためのジフテリア毒素遺伝子（ＤＴ）を含むターゲティングベクターを作製した。これを用いて、マウス由来ＥＳ細胞のＤｃｉｒ遺伝子のエキソン１及び２をＮｅｏで置換することにより、ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ）を含む細胞質領域及び膜貫通ドメインの大部分をコードするゲノム配列を欠損させた（図１ａ）。ＥＳクローンからの遺伝子をＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ処理した後、サザンブロットハイブリダイゼーション解析によってスクリーニングし、５’プローブ（図１ｂ）、３’プローブ（図１ｃ）及びＮｅｏプローブ（図１ｄ）を用いて遺伝子の欠損を確認した。Ｄｃｉｒ欠損ＥＳクローンを用いてＤｃｉｒ＋／−マウスを作製し、Ｄｃｉｒ＋／−マウスの交配によりＤｃｉｒ−／−マウスを作製した。Ｄｃｉｒ−／−マウスは実験に用いる前に、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＳＬＣ）と８〜９世代戻し交配させた。
マウスにおけるＤｃｉｒ遺伝子の欠損は、ゲノムサザンブロット解析によって確認した（図１ｅ）。ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析によって脾臓におけるＤｃｉｒ  ｍＲＮＡの発現が欠損していることを確認した（図１ｆ）。【００４２】
２．骨表現型の解析
マウス骨表現型の解析は、以下の方法によって行った。
（１）コンピュータ断層撮影（ＣＴ）
、大腿部及び関節部の３次元マイクロＣＴによる解析は、Ｒ＿ｍＣＴ（理学メカトロニクス社製）を使用して行なった。また、大腿部の２次元マイクロＣＴによる解析及び定量化は、Ｓｃａｎ  Ｘｍａｔｅ−Ａ０９０Ｓ（コムスキャンテクノ社製）及びＴＲＩ／２Ｄ−ＢＯＮシステム（ラトックシステムエンジニアリング社製）を使用して行なった。さらに、大腿部の末梢骨定量ＣＴ（ＰＱＣＴ）による解析及び定量化は、ＸＣＴ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＡ＋システム（Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ社製）を用いて行なった。【００４３】
（２）組織学的検査
大腿部のＨＥ染色は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ  １４，ｎｏ  ２：１７６−１８０に記載されている方法に従って行なった。関節部はトルイジンブルー（ＴＢ）染色及びフォン・コッサ染色を行い、脛骨部はＴＢ及びＴＲＡＰ染色を行った。染色は、試料を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、それを脱灰なしでグリコールメタクリル樹脂又はパラフィンで処理した後、３μｍ切片にスライスした。脛骨近位端における成長板及び骨梁の組織形態学的解析をＯｓｔｅｏｐｌａｎ  ＩＩ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を使用して行なった。動的組織形態計測（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）のため、カルセイン（１．６ｍｇ／ｋｇ体重）を３日おきに２回皮下注射した。最初の注射から４日後、脛骨部を細分化し、７０％エタノールで固定した。５μｍ厚の非脱灰凍結切片をＬｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ  ｃｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて作製した。骨石灰化速度及び骨形成速度は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｋｏｐ及びＯｓｔｅｏｐｌａｎ  ＩＩ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を使用して解析した。【００４４】
３．骨発達の解析
マウスの鼻−肛門（ｎａｓｏａｎａｌ）長を週２回測定し、成長曲線を作成した。新生マウスを１００％エタノールで４日間固定し、その後アセトン溶液に移し、３日後水で洗浄し、０．１％アリザリンレッドＳ（Ｓｉｇｍａ社製）／９５％エタノール１重量部、０．３％アルシアンブルー６ＧＸ（Ｓｉｇｍａ社製）／７０％エタノール１重量部、１００％酢酸１重量、及びエタノール１７重量部からなる染色液で１０日間染色した。９６％エタノールで洗浄した後、骨格形成が明らかに視認できるまで標本を２０％グリセロール／１％水酸化カリウム中に室温で保存し、その後１００％グリセロールに移して保存した。【００４５】
４．インビトロ破骨細胞形成及びピット形成アッセイ
非接着骨髄細胞をウェルプレート（２４ウェルプレート中５×１０５細胞／ウェル、又は６ウェルプレート中３×１０６細胞／ウェル）の中に播種し、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含有するα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。２日後、非接着細胞（リンパ球を含む）を洗い流し、残った接着細胞を骨髄由来マクロファージ（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＢＭＭ）として使用した。これらの破骨前駆細胞（ｐＯＣ）を１００ｎｇ／ｍＬ溶解性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製又はＯｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦの存在下でさらに培養することにより、破骨細胞を得た。３日後、破骨細胞を１０％中性緩衝ホルマリン中で３分間固定し、さらにエタノール／アセトン混合液（５０：５０ｖ：ｖ）中で１分間保存した後、ＴＲＡＰ染色液（Ｎａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＭＸリン酸塩５ｍｇ；Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ  ０．５ｍＬ；ｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ塩３０ｍｇ；５０ｍＭ酒石酸ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＬ）中で室温でインキュベートした。ＴＲＡＰ陽性多核細胞（ＭＮＣ；≧３核））を計数した。
ピット形成アッセイにおいては、破骨細胞を３０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦの存在下で２日間にわたって生成させ、その後、３０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦ及び１５０ｎｇ／ｍＬ  ＲＡＮＫＬによりさらに３日間処理した。その後、トリプシンを使って細胞を回収し、回収した細胞を播種し（９６ウェルプレート中１×１０５細胞／ウェル）、象牙質スライス上で３０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦ及び１５０ｎｇ／ｍＬ  ＲＡＮＫＬを用いて２日間培養した。試料を１モルＮＨ４ＯＨ中で超音波処理し、ヘマトキシリンで染色した。ＴＲＡＰ陰性ＭＮＣ、及び吸収ピットによって浸蝕された領域を、Ｂｉｏｒｅｖｏ  ＢＺ−９０００（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）を使って観測、測定した。
ＧＭ−ＣＳＦが破骨細胞形成に及ぼす影響を調べるため、ｍｏｕｓｅ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）、組換えＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、抗マウスＧＭ−ＣＳＦ中和抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。さらに増殖アッセイを行なうため、ｐＯＣを播種し（９６ウェルプレート中１×１０４細胞／ウェル）、１０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦのみにより、又は、Ｍ−ＣＳＦ＋１００ｎｇ／ｍＬ  ＲＡＮＫＬ若しくは２０ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦにより３日間培養した。その後、細胞を［３Ｈ］ＴｄＲ（０．５μＣｉ／ｍＬ）で一晩曝露した。【００４６】
５．骨芽細胞の分化及び石灰化の検出
（１）初代骨芽細胞の培養
初代骨芽細胞を新生マウスの頭蓋冠から単離した。頭蓋冠をＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン及び２ｍｇ／ｍＬ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｐ（Ｒｏｃｈｅ社製）を含有するα−ＭＥＭ中、３７℃で２０分間消化した。上清を除去した後、細胞をさらに６０分間消化した。
骨形成を誘導するため、初代骨芽細胞（９６ウェルプレート中２×１０４細胞／ウェル、２４ウェルプレート中５×１０４細胞／ウェル、又は６ウェルプレート中２×１０５細胞／ウェル）をコンフルエントまで培養し、１０ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  及び５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸を添加した培地に置き換えた。培地は２１日間で３回交換した。
２１日間培養した骨芽細胞の、アリザリンレッド染色、フォン・コッサ染色、及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色を行った。
（２）アリザリンレッド染色
２１日間培養した骨芽細胞をＰＢＳで溶液を取り除いた後、３．７％ホルマリン溶液（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）にて１０分間固定した。その後ＰＢＳでもう１度洗い、ＡＬＰ染色液（０．１ｍｇ／ｍＬ  Ｎａｐｈｔｏｌ  ＡＳ−ＭＸ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、０．６ｍｇ／ｍＬアゾイックジアゾコンポーネント２０（ＴＧＩ）、５μＬ／ｍＬ  Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ（ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ）、７．５ｍＬ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（１．５Ｍ、ｐＨ８．８）（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ））にて２０分間反応させた。反応溶液を取り除きＰＢＳで洗った後、乾燥させＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影を行った。
（３）フォン・コッサ染色
２１日間培養した骨芽細胞をイオン交換水で溶液を取り除いた後、３．７％ホルマリン溶液にて３０分間固定した。その後イオン交換水でもう１度洗い、５％硝酸銀溶液（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を直射日光下１５分間反応させた。反応を停止させるため５％硝酸銀溶液を取り除き５％チオ硫酸ナトリウム（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）を加え２分間静置した。５％チオ硫酸ナトリウムをイオン交換水で洗浄し、乾燥させた後ＢＩＯＲＥＶＯ（ＫＥＹＥＮＣＥ）にて撮影を行った。
（４）ＡＬＰ染色
初代骨芽細胞を９６ウェルプレートにて２１日間培養し、ＴＲＡＣＰ＆ＡＬＰ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ）を用い測定を行った。培養細胞上清を回収し、原液及び１０倍希釈液をテンプレートとした。テンプレート５０μｌに反応基質溶液を加え、３７℃で１５分間反応させた。反応停止液５０μｌを加えて反応を停止させた後、ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ  ＲＥＡＤＥＲ  ＭＴＰ−３００（ＣＯＲＯＮＡ  ＥＬＥＣＴＲＩＣ）を用いＯＤ４０５にて活性の測定を行った。【００４７】
６．初代骨芽細胞及び骨髄細胞（ＢＭＣ）の共培養
初代骨芽細胞及びＢＭＣ（それぞれ４８ウェルプレート中３×１０３細胞／ウェル、２×１０５細胞／ウェル）は、１０−３Ｍ  １．２５（ＯＨ）２Ｄ３（Ｓｉｇｍａ社製）及び１０−７Ｍ  ＰＧＥ２（Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）中で８日間培養した。培地は、２日ごとに交換した。ＴＲＡＰ染色を行ない、ＭＮＣを計数した。【００４８】
７．ＲＴ−ＰＣＲ解析
半定量ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、若干変更を加えたものの、基本的にはＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ  １４，ｎｏ  ２：１７６−１８０及びＡｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ，２００６，８，Ｒ１００，１−１３に記載の方法に従って行った。トータルＲＮＡを標準的なグアニジノ酢酸チオシアン酸塩／フェノールクロロホルム法、又はＳｅｐａｓｏｌ−ＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ社製）を使用する方法によって調製した。調製したＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使って逆転写し、ｃＤＮＡを調製した。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲは、上記で調製したｃＤＮＡを鋳型として行った。反応液は１試料あたり２０μｌとし、１０×ＰＣＲ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）２μｌ、ｄＮＴＰｓ（Ｒｏｃｈｅ）１．６μｌ、表１に記載のプライマー０．４μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）０．２μｌ、ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ  １μｌとなるように調整した後、ｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて増幅反応を行った。ＰＣＲ後の反応溶液は、１．５％アガロースゲルを用いて、定電圧１００Ｖ、３０分間の電気泳動により分離し、１５分間（０．０５μｇ／ｍＬ）エチジウムブロマイドで染色後、ＵＶイルミネ−ター（ＢＡＳ−ＩＩＩ）でＤＮＡ断片を検出した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、表１に記載のプライマー、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）及びｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を使用して行った。【００４９】
【表１】
0005641508.tif 000002
【００５０】
８．イムノブロット
（１）ウエスタンブロット
ウエスタンブロットは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ  １４，ｎｏ  ２：１７６−１８０に記載された方法に従って行った。ＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）をメタノールで浸し、電気転写用緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、１５ｍｇ／ｍＬ  Ｇｌｙｃｉｎｅ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、２０％メタノール（Ｗａｋｏ）に移し変え、３０分程度浸透させて前処理を行った。ＴＲＡＮＳ−ＢＬＯＴＳＤ  ＳＥＭＩ−ＤＲＹ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＣＥＬＬ（ＢｉｏＲａｄ）を用い、ゲル面積１ｃｍ２あたり２ｍＡで１時間通電し、ＰＶＤＦ膜に転写した。転写後、一次抗体として以下のタンパクに特異的な抗体を使用して、ＰＶＤＦ膜をブロットした。
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）；
ｐ３８  ＭＡＰＫ；
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）；
ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（１３７Ｆ５）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５：８１Ｅ１１）；
ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（５６Ｇ８）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ａｋｔ（Ｔｈｒ３Ｏ８；Ｃ３１Ｅ５）；
Ａｋｔ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ｓｅｒ５３６；９３Ｈ１）；
ＮＦ−κＢ  ｐ６５（Ｃ２２Ｂ４）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＬＣγ１（Ｔｙｒ７８３）；
ＰＬＣγ１；
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＰＬＣγ２（Ｔｙｒ７５９）；
ＰＬＣγ２；β−ｔｕｂｕｌｉｎ（Ａｂｃａｍ）；
Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ５（Ｔｙｒ６９４）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；
Ｓｔａｔ５（Ｃ１７）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｌｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）
二次抗体には抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた。膜を洗浄後、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて発光させ、ＦＬＡ−５０００（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）で解析を行った。
（２）免疫沈降分析
免疫沈降分析においては、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、マウスＤＣＩＲ特異抗体（３２０５１１：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｙｒ（４Ｇ１０：ミリポア社製）、及びＳＨＰ−１（ＨＧ２１３；Ｕｐｓｔａｔｅ）を使用した。また、ウサギＩｇＧ特異的ＨＲＰ−結合ポリクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）又はラットＩｇＧ特異的ＨＲＰ−結合ポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を二次抗体として使用した。【００５１】
９．糖鎖及び糖鎖結合アッセイ
牛関節軟骨由来ケラタン硫酸（ＫＳ−ＩＩ）精製物は、Ｋ．Ｙｏｓｈｉｄａ（理研）及びＡ．Ｔａｗａｚａ（Ｈｙｄｒｏｘ  Ｉｎｃ．）より入手した。他の糖鎖（牛角膜由来ケラタン硫酸、クジラ関節由来コンドロイチン硫酸Ａ、豚皮膚由来コンドロイチン硫酸（デルマタン硫酸）、及びＮ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）は、Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｂｉｏｂｕｓｉｎｅｓｓ社より購入した。
糖鎖結合アッセイは、Ｊ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ，２００４，２７９，２９０４３−２９０４９に記載された方法に従って実施した。ＫＳ−ＩＩを１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）によって２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、氷上で１時間、２ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化を行ない、反応性アルデヒド基を得た。さらに希釈を行なった後、ＫＳ−ＩＩをＣｏｖａｌｉｎｋ  ＥＬＩＳＡプレート上で４℃で一晩インキュベートし、その後、ＫＳ−ＩＩを室温で１．５時間、０．３％シアン化ホウ化水素ナトリウムによる還元反応によって共有結合させた。プレートを洗浄し、２％ウシ血清アルブミン（ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ：Ｓｉｇｍａ社製）により３７℃で２時間ブロッキングした。細胞外ドメイン（９９〜２３８番残基）を含む組み換えマウスＤＣＩＲ（ｍＤＣＩＲ）を、ｐＧＭＴ７プラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの封入体として発現させ、標準的希釈法によってリフォールドしたブロッキングしたプレートで、ｍＤＣＩＲを４℃で一晩インキュベートした。タンパク質の結合は、ＴＭＢ基質（Ｄａｋｏ社製）の存在下で抗ＤＣＩＲ抗体（３２０５０７及び３２０５１１の混合物：Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びＨＲＰ−結合ラットＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社製）を使用して検出した。【００５２】
実施例１  Ｄｃｉｒ−／−（ＫＯ）マウスにおける骨形成
Ｄｃｉｒ−／−（ＫＯ）マウスは、加齢に伴い、付着部炎に由来する硬直症ｅｎｔｈｅｓｉｔｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｋｙｌｏｓｉｓを発症するとの報告があるが（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ  １４，ｎｏ  ２：１７６−１８０）、硬直症状が未発症の若齢ＫＯマウス（８週齢）、及び硬直症状を示さない正常な高齢ＫＯマウス（１２月齢）の骨量を３次元マイクロＣＴ測定し、野生型と比較したところ、若齢ＫＯマウス、及び正常高齢ＫＯマウスの骨量は、野生型（ＷＴ）に比べて増加していた（図２ａ，ｂ及び図３）。従って、骨形成は、穏やかな骨硬化症を示すＤｃｉｒ−／−マウスにおいては促進されることが示された。【００５３】
次いで、マウスの骨におけるＤＣＩＲの発現をＰＴ−ＰＣＲにより測定した。ＤＣＩＲは、骨髄由来破骨細胞（ＯＣ）及び初代骨芽細胞（ＯＢ）において発現していたが、初代軟骨細胞では発現していなかった（図４）。この結果からも、Ｄｃｉｒの骨代謝への関与が支持される。鼻−肛門（ｎａｓｏａｎａｌ）長に基づく成長曲線、及びアリザリンブルー及びアリザリンレッドによる新生マウスの骨染色の結果からは、Ｄｃｉｒ−／−マウスにおいても骨は正常に発達することが示された（図５）。【００５４】
骨硬化症は、軟骨細胞、ＯＣ又はＯＢの異常を有する動物において観察される（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ，１９９９，１３，３０３７−３０５１）。Ｄｃｉｒ−／−マウスにおける骨硬化症の原因を解明するため、組織形態計測によりマウスの骨を調べた。脛骨成長板近位部における増殖層の厚さは、ＷＴとＫＯマウスとで差がなかったことから、軟骨細胞はＫＯマウスにおいても正常に形成されることが示された（図２ｃ、ｄ）。
ＴＲＡＰ陽性ＯＣの数及び骨梁におけるＯＣ表面積は、ＫＯマウスにおいて有意に増加していた（図２ｅ、ｆ）。硬直変化を示さないＫＯマウスで骨形成が増加していたことを考慮すると、この結果は予想外である。
次に、これらのマウスにおける骨ターンオーバーを調べるため、生後８週のマウスにおいて新たに形成された骨を動的組織形態計測（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって計測した。すなわち、マウスに３日おきに２回カルセインを投与して骨を標識し、その間に形成された骨を測定した。ＫＯマウスの脛骨の形成速度及び石灰化は、ＷＴマウスと比較して高かった（図２ｇ、ｈ）。従って、Ｄｃｉｒ−／−マウスでは、破骨細胞骨吸収及び骨芽細胞による骨形成とがともに増進しており、骨ターンオーバーがより高まっていることが示された。Ｄｃｉｒ−／−マウスでは全体としては骨密度が増大していたことから、生理的条件下では骨吸収に対する影響よりも骨形成に対する効果が上回ると考えられる。【００５５】
実施例２  破骨細胞形成におけるＤＣＩＲの役割
上記の実験からは、Ｄｃｉｒ−／−マウスが破骨細胞（ＯＣ）を多く有していたことが示された。そこで、破骨細胞形成におけるＤＣＩＲの役割について調べた。ＷＴ及びＫＯマウス由来初代骨髄細胞（ＢＭＣ）を、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及び核因子κＢリガンドの受容体活性化因子（ＲＡＮＫＬ）を用いた標準インビトロＯＣ分化系で培養し、ＯＣ分化を誘導した。その結果、Ｄｃｉｒ−／−ＢＭＣ培養物においては、ＴＲＡＰ陽性多核ＯＣへの分化が有意に増加した（図６ａ，ｂ）。多くのＫＯ由来ＯＣは多核であり、骨ページェット病患者の骨の表現型に似ていた。Ｄｃｉｒ−／−ＯＣのでは、骨吸収によってできた穴（ｐｉｔ）のサイズが拡大しており、Ｄｃｉｒ−／−ＯＣの骨吸収活性が大きく増強されたことが明らかとなった（図６ｃ，ｄ）。また、Ｄｃｉｒ−／−細胞を含む培地においてはＴＲＡＰ活性が上昇した（図６ｅ）。これらの結果から、ＤＣＩＲがＢＭＣからの成熟ＯＣの分化に関与していることが示された。【００５６】
次いで、ＤＣＩＲの多核ＯＣ形成に対する影響を評価するため、Ｄｃｉｒ−／−ＯＣにおけるＴ細胞活性化核因子１（Ｎｆａｔｃ１）とＴ細胞活性化核因子２（Ｎｆａｔｃ２）の発現量を調べた。Ｎｆａｔｃ  １及びＮｆａｔｃ  ２は、ともにＯＣ成熟のための主要な調節因子であり、Ａｃｐ５（ＴＲＡＰ）やＣｔｓｋ（カテプシンＫ）と同様に、ＯＣ特異的なマーカーである。Ｎｆａｔｃ  １及びＮｆａｔｃ  ２遺伝子の発現量は、野生型ＯＣと同等であった（図６ｆ）。従って、ＤＣＩＲはＮＦＡＴ発現に影響しないことが示された。【００５７】
ＢＭＣからのＯＣ分化はＲＡＮＫ及びｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ  ｈａｒｂｏｒｉｎｇ  ａｄａｐｔｏｒ（ＩＴＡＭ保有アダプタ）により活性化されるシグナル伝達経路により制御されることから（Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４２８，７５８−７６３）、これらの細胞におけるＲＡＮＫの下流のシグナル伝達について調べた。ＭＡＰＫ（ｐ３８、ＥＲＫ、ＪＮＫ）、Ａｋｔ及びＮＦ−κＢ（全てＴＲＡＦ６の下流に位置する）のＲＡＮＫＬ誘導性の活性化は正常であり、またＰＬＣγ１とＰＬＣγ２のＲＡＮＫＬ誘導性ＩＴＡＭ保有アダプタ依存性チロシンリン酸化も、ＷＴと成熟ＯＣにおいて変化がなかった（図６ｇ，ｈ）。これらのデータは、ＤＣＩＲがＯＣ前駆細胞（ｐＯＣ）からのＲＡＮＫＬ依存性のＯＣ分化に影響しないことを示す。
ＯＣ分化の初期段階におけるＤｃｉｒ欠損の影響をみるため、インビトロ培養２日後の、ＴＲＡＰ陽性単核ＯＣの数を計測した。単核ＯＣの数は、Ｍ−ＣＳＦで処理したＤｃｉｒ−／−ＢＭＣにおいて有意に増加し（図６ｉ，ｊ）、ＤＣＩＲが、ＯＣ分化の初期段階で機能していることが示された。一方、ＷＴとＤｃｉｒ−／−ｐＯＣをＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬとで処理した場合の増殖反応には差は見られなかった（図６ｋ）。この結果は、破骨細胞形成の主要シグナル伝達カスケードと考えられているＲＡＮＫＬ依存性シグナル伝達を阻害することなく、ＤＣＩＲがＯＣ形成をネガティブに制御することを示している。【００５８】
さらに、ＧＭ−ＣＳＦに対するｐＯＣの反応を調べた。従来の報告では、ＧＭ−ＣＳＦが骨髄細胞前駆体の樹状細胞への分化を促進することから、ＧＭ−ＣＳＦがＯＣの発現を抑制することが示されていた（Ｂｌｏｏｄ，２００１，９８，２５４４−２５５４）。しかし最近、ＧＭ−ＣＳＦが、特定の条件下で、ｐＯＣの分化、増殖、生存及び融合を促進することが報告された（Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ，２００４，１９，１９０−１９９、Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２００７，１３，６２−６９、Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２００８，１４，８１−８７、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，１８３，３３９０−３３９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００８，３６７，８８１−８８７）。そこで、培養細胞を用いてＧＭ−ＣＳＦの破骨細胞形成に対する影響を調べた。
ＷＴ  ｐＯＣではなくＤｃｉｒ−／−ｐＯＣの分化が、ＧＭ−ＣＳＦによって有意に上昇した（図７ａ）。ＧＭ−ＣＳＦ濃度は、ＷＴとＤｃｉｒ−／−マウスの培養物との間で変化がなかった（図７ｂ）。ＷＴ  ＢＭＣと比較すると、Ｄｃｉｒ−／−ＢＭＣからのＯＣ分化は、０．１ｎｇ／ｍＬの組換えＧＭ−ＣＳＦ存在下で有意に上昇したが、１ｎｇ／ｍＬ以上では上昇が見られなかった（図７ｃ）。対照的に、抗ＧＭ−ＣＳＦ中和抗体による処理によって、Ｄｃｉｒ−／−マウスの破骨細胞形成は顕著に抑制された（図７ｄ）。また、ＧＭ−ＣＳＦ刺激後のＤｃｉｒ−／−ｐＯＣにおけるシグナル伝達因子と転写因子５（Ｓｔａｔ５）活性化因子のリン酸化について調べたところ、Ｄｃｉｒ−／−細胞のＧＭ−ＣＳＦ誘導型Ｓｔａｔ−５リン酸化が顕著にアップレギュレートされた（図７ｅ）。これらの結果からは、ＤＣＩＲはＧＭ−ＣＳＦシグナル伝達の阻害によってｐＯＣ増殖を抑制していることが示された。【００５９】
実施例３  ＤＣＩＲリガンドの同定
ＤＣＩＲのリガンドはこれまで報告されていなかった。そこで本発明者らは、破骨細胞形成に関与する生体内のＤＣＩＲリガンドを同定するため、公共のグリカンアレイデータベースを用いてＤＣＩＲに結合する糖鎖を検索した。その結果、ＤＣＩＲリガンドとして、硫酸化ガラクトースβ１−４  Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（Ｎ−アセチルラクトサミン又はＬａｃＮＡｃ）構造（図８ａ）を有する糖鎖が特定された。硫酸化ｐｏｌｙ−ＬａｃＮＡｃは、主に角膜（Ｎ結合型ＫＳ−Ｉ）や関節軟骨（Ｏ結合型ＫＳ−ＩＩ）に存在するケラタン硫酸（ＫＳ）の内部にプロテオグリカンの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）側鎖として存在する分子である。そこでマウスの関節や骨髄細胞（ＢＭＣ）おけるＫＳの発現を調べたところ、これらの領域でＫＳが発現されていることを確認した。また、ＤＣＩＲとＫＳとの結合をＥＬＩＳＡ法を利用した糖鎖結合アッセイにより調べた結果、組換えマウスＤＣＩＲはウシ関節軟骨由来のＫＳ−ＩＩと濃度依存的に結合することがわかった（図８ｂ）。
さらに、ＫＳのＯＣ分化への影響を、インビトロでＴＲＡＰ陽性ＯＣの数を計測することにより評価した。ＫＳ−ＩＩは、野生型（ＷＴ）骨髄細胞培養物におけるＯＣ形成を著しく阻害したが、Ｄｃｉｒ−／−の培養細胞では阻害しなかった（図８ｃ及びｄ）。ＯＣ分化は、角膜由来のＫＳ−Ｉ、非硫酸化ＬａｃＮＡｃ、又はコンドロイチン硫酸（ＣＳ）やデルマタン硫酸（ＤＳ）といった他の硫酸化グリコサミノグリカンには影響を受けなかった（図８ｅ）。次に、ＤＣＩＲがＫＳにより活性化されることを確認するため、免疫沈降分析を行った。その結果、ＤＣＩＲにおけるｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｍｏｔｉｆ（ＩＴＩＭ）のリン酸化、及びチロシンホスファターゼＳＨＰ−１動員は、ＫＳ−ＩＩによって濃度依存的に増加することが分かった（図８ｆ）。これらの結果は、ＫＳ−ＩＩがＤＣＩＲに特異的なリガンドであり、ＤＣＩＲの活性化を介して破骨細胞形成の阻害に関与していることを示している。【００６０】
実施例４  骨芽細胞（ＯＢ）形成におけるＤｃｉｒの役割
骨芽細胞（ＯＢ）形成におけるＤｃｉｒの役割を調べた。初代頭頂骨ＯＢの増殖は、ＷＴマウスにおいてもＤｃｉｒ−／−マウスにおいても同様であった（図９）。頭蓋冠骨由来のＯＢにおいて、Ｄｃｉｒは、β−グリセロリン酸とアスコルビン酸による骨形成分化の誘導後に発現し、その発現は石灰化過程の間中続いた（図１０ａ）。Ｄｃｉｒ−／−ＯＢにおいて、カルシウム（図１０ｂ）やリン酸カルシウム付加（図１０ｃ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）発現（図１０ｄ）は、培養初期（１４日）に亢進されていたことから、石灰化はＷＴのＯＢに比べＤｃｉｒ−／−ＯＢで促進されていることが分かった。これらの結果より、ＤＣＩＲが末端ＯＢ分化と石灰化基質形成に関与していることが示唆された。
Ｒｕｎｘ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、ＡＬＰといったＯＢマーカー、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）、Ｉ型コラーゲン（ＣｏｌＩ）、オステオカルシンといった骨基質タンパク質をコードする遺伝子の発現量は、Ｄｃｉｒ−／−マウスで高かった（図１０ｅ）。また、骨吸収に必要なオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現量が、ＷＴの骨芽細胞に比べＤｃｉｒ−／−の骨芽細胞で顕著に低くなっていた。これらのデータにより、ＤＣＩＲが骨芽細胞の成熟化と骨基質形成を阻害し、ＯＰＮの生産を促進することで、骨形成を負に制御していることが示唆された。さらに、骨形成性培養物のアリザリンレッド染色及びＡＬＰ染色より、ＫＳ−ＩＩ存在下でＷＴのＯＢでは石灰化が抑制されたのに対し、Ｄｃｉｒ−／−ＯＢでは抑制がみられないことが分かった（図１０ｆ）。【００６１】
次に、破骨細胞形成の制御における骨芽細胞の役割を、Ｄｃｉｒ−／−マウス由来のＢＭＣとＯＢとの共培養系において調べた。Ｄｃｉｒ−／−ＢＭＣとＷＴのＯＢの共培養物では、通常の破骨細胞形成がみられた（図１０ｇ，ｈ）。一方、ＷＴのＢＭＣとＤｃｉｒ−／−ＯＢの共培養物では、破骨細胞形成が大きく減少した（図１０ｇ，ｉ）。この結果より、ＤＣＩＲが骨芽細胞と破骨細胞との正常なカップリングに関与していることが示された。ＯＣ形成は、骨芽細胞由来のＲＡＮＫＬとオステオプロテジェリン（ＯＰＧ）により制御されるので、Ｄｃｉｒ−／−ＯＢにおけるこれらの発現量を調べた。ＲＡＮＫＬの発現量には実質的な差はみられなかったが、ＯＰＧの発現量はＷＴのＯＢに比べてＤｃｉｒ−／−ＯＢで有意に増加し、変異骨芽細胞のＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ比を増加させた（図１０ｊ、図１１）。さらに、ＫＳ−ＩＩ処理は、ＷＴのＯＢでのみＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ比を減少させたことから（図１０ｋ，ｌ）、ＫＳ−ＩＩがＯＰＧの生産をＤＣＩＲ依存的に制御することが示された。従って、ＤＣＩＲは、ＯＰＧの発現を抑制することで破骨細胞形成を促進しているようである。また、ＤＣＩＲは破骨細胞だけでなく骨芽細胞でも機能し、生体の骨のターンオーバーを制御していると考えられる。【００６２】
実施例５  抗ＤＣＩＲ抗体の作製
（１）ＤＣＩＲ発現細胞の作製
Ｄｃｉｒ遺伝子を含む発現ベクターはＤｃｉｒ遺伝子を含む配列（ＮＭ＿０１１９９９）の１３７番目から９８９番目のヌクレオチドをＰＣＲ法により増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターに挿入して調製し、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン）を用いて２９３Ｔ細胞及びＣＯＳ７細胞に形質導入した。約４８時間後、細胞を回収し凍結保存した。
（２）ＤＣＩＲの発現確認
（１）で作製した一過性発現細胞について、抗ＤＣＩＲ抗体を用いたウエスタンブロットをＤＣＩＲ発現細胞及びその野生株について行い、ＤＣＩＲ発現細胞特異的に予想される３５ｋＤａ付近にバンドが検出できるか確認することにより、ＤＣＩＲの発現確認を行い、ＤＣＩＲ発現細胞株を取得した。
（３）マウスへのｆｏｏｔ  ｐａｄ法による免疫
アジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＲＥＵＮＤ）三菱化学ヤトロン  ＲＭ６０６−１）とＰＢＳを混ぜたエマルジョンを、マウス（４匹）の片足の裏に免疫した。１週間後、（２）で得たＤＣＩＲ発現細胞株でマウスを免疫した。毎週１回、計５回の免疫を行った。【００６３】
（４）細胞融合
５回目の免疫の３日後に、免疫したマウスの両足から肥大したリンパ節を取り出し、その中から細胞を回収した。培養フラスコ（培地：１０％ＦＢＳ−ＲＰＭＩ）でミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を増殖させ、細胞を回収した。回収したリンパ節由来細胞とミエローマ細胞を混和し、遠心した。ペレットにＰＥＧ（ＰＥＧ４０００：ＭＥＲＣＫ  Ｃａｔ  Ｎｏ  １０９７２７０１００、ＲＰＭＩで等量希釈）を加え、細胞融合を行った。ＲＰＭＩ血清無添加培地（ＲＰＭＩ１６４０、ＳＩＧＭＡ、Ｃａｔ  Ｎｏ  Ｒ８７５８）で細胞を洗浄後、１５％ＦＢＳ−ＨＡＴ培地（ＨＡＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５０×）：ＧＩＢＣＯ  Ｃａｔ  Ｎｏ  ２１０６０−０１７、初期の不安定なハイブリドーマをレスキューするためｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔを添加）で懸濁し、９６ウェルプレート４枚に播種した。播種より３日後に培地を交換し、ハイブリドーマのコロニー形成が確認された後（２〜３週間後）、ウェルプレートから培養上清を採取し、１次スクリーニングを行った。【００６４】
（５）ハイブリドーマの１次スクリーニング
Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ／フローサイトメトリー法（ＦＣＭ）を用いてハイブリドーマを１次スクリーニングした。
Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ）凍結ストックの細胞（トランスフェクタント）を起眠させ、０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳに懸濁し、Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ用プレート（ＮＵＮＣ  ２４９５７０  ９６Ｖ  ＮＷ  ＰＳ）に１００μＬ／ウェル分注した。９６ウェルプレート１枚あたり１×１０７個の細胞を使用した。２０００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心後、上清を捨て、（４）で採取した培養上清を５０μＬ／ウェル加え、室温で３０分間反応させた。０．５％ＢＳＡ／２ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳで２回洗浄後（２０００ｒｐｍ、４℃で２分間遠心後、上清捨てる）、Ｇｏａｔ抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識（ＭＢＬ製品  Ｃｏｄｅ．３３０）をＢｕｆｆｅｒ（ＭＢＬ製希釈液）で１０，０００倍希釈したものを加え、室温で３０分間反応させた。３回洗浄後、発色基質を加え５〜１０分間発色させた。４５０−６２０ｎｍで吸光度測定を行った。【００６５】
ＦＣＭ）Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡで陽性の可能性のあるクローンの培養上精について、（２）で得たＤＣＩＲ発現細胞との反応性をＦＣＭにより確認した。培養上清原液を細胞と室温で３０分間反応させ、２回洗浄後、ＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＭＢＬ製品  ＩＭ−０８１９）を１００倍希釈で３０分間反応させた。２回洗浄後、４００μｌのｂｕｆｆｅｒで懸濁し、ＦＣ５００（ベックマンコールター）で測定した。洗浄及び細胞の懸濁Ｂｕｆｆｅｒは０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５％ＢＳＡ  ＰＢＳを使用した。擬陽性等のアーティファクトを除くため、継代培養を行いながら何度か反応性を確認した。【００６６】
（６）単クローン化
（５）の１次スクリーニングで陽性と判断されたハイブリドーマの培養上清から選択されたハイブリドーマに対して、単クローン化を行った。
対数増殖期のハイブリドーマをパスツールピペットでピペッティングした後採取し、培地で希釈後、１ウェルあたりの細胞数が１〜３２，０００個になるように細胞濃度を調整し、９６ウェルプレートに播種した。ハイブリドーマのシングルコロニーの形成が確認された後（１〜２週間後）、ウェルプレートから培養上清を採取し、（５）の方法に従って活性を確認した。
（７）単クローナル（アイソタイプ）の確認
培養上清をＰＢＳで１００倍希釈したものをディベロップメントチューブに滴下し、着色ラテックスビーズを再懸濁する。チューブにアイソタイプ用ストリップ（Ｉｓｏ  Ｓｔｒｉｐ  マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット：Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１−４９３−０２７）を浸漬し、５分後、特定のサブクラス部分に検出されたバンドを確認し、クローンを選択した。
（８）単クローン化ハイブリドーマの凍結
単クローン化されたハイブリドーマを９６ウェルプレート１穴から、４８ウェルプレート、２４ウェルプレート、１２ウェルプレートまで継代培養した。１ウェルの細胞を遠心回収し、セルバンカー（十慈フィールド、Ｃａｔ  Ｎｏ  ＢＬＣ−１）５００μＬで懸濁し、ストックチューブ（ＳＵＭＩＬＯＮ、Ｃａｔ  Ｎｏ  ＭＳ−４６０１Ｗ）１本に入れ−８０℃で保存した。凍結時に回収した培養上清を最終評価培地として各１０ｍＬの作製を行った。最終評価用培養上清を提供し、目的の活性が保持されているかどうかを最終確認した。【００６７】
実施例６  抗ＤＣＩＲ抗体の評価
実施例４で作製されたハイブリドーマ由来の抗ＤＣＩＲ抗体の、ＤＣＩＲに対する結合能を評価した。ＤＣＩＲは免疫反応の抑制に関与することが示されているため（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８，ｖｏｌ  １４，ｎｏ  ２：１７６−１８０）、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の発現を基準に抗体のＤＣＩＲ結合能を評価した。
実施例４で作製したハイブリドーマをＣｐＧ（濃度１μＭ）を含む培地で１２時間培養し、培養上清を回収した。同様に、ＣｐＧ  ＯＤＮ  １６６８株（オペロン社）を同じ培地、又はさらにケラタン硫酸（ＫＳ−ＩＩ；１０ｎｇ／ｍＬ）を含む同じ培地で培養し、上清を回収した。コントロールとしてＣｐＧ非含有培地で細胞を培養した（ＮＴ）。上清中のＴＮＦ−α産生量をＥＬＩＳＡ法によって測定した。
結果を図１２に示す。ＣｐＧ含有培地で細胞を培養することにより、ＴＮＦ−α産生が誘導された（ＣｐＧ）。ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ−ＩＩを培地に添加した場合、ＴＮＦ−α産生は抑制された（ＣｐＧ＋ＫＳ）。複数のハイブリドーマ培養上清において、ＫＳ−ＩＩ添加の場合よりもＴＮＦ−α産生が抑制された（図１２中の３、４、５株）。これらのハイブリドーマ由来の抗体は、ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ−ＩＩよりも高いＤＣＩＲ結合能を有しており、ＤＣＩＲの活性を促進するＤＣＩＲアゴニストとして有用である。一方、一部のハイブリドーマ培養上清においては、逆にＫＳ−ＩＩ添加の場合よりもＴＮＦ−α産生が促進された（図１２中の１、２株）。これらのハイブリドーマ由来の抗体は、ＤＣＩＲの活性を抑制するＤＣＩＲアンタゴニストとして有用である。
また、上記結果に示されるように、ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ−ＩＩのＤＣＩＲに対する作用を指標として、ＤＣＩＲを特異的に活性化又は抑制することができる物質を評価又は選択することができる。【００６８】
実施例７  破骨細胞生成に対する抗Ｄｃｉｒ抗体の影響
さらに、ケラタン硫酸の作用を指標に、上記抗体の破骨細胞形成に対する作用を評価した。非接着骨髄細胞をウェルプレート（９６ウェルプレート中１×１０５細胞／ウェル）の中に播種し、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含有するα−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で培養した。２日後、非接着細胞（リンパ球を含む）を洗い流し、残った接着細胞を骨髄由来マクロファージ（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，ＢＭＭ）として使用した。これらの破骨前駆細胞（ｐＯＣ）を１００ｎｇ／ｍＬ溶解性ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製又はＯｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｓｔ社製）及び１０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦの存在下でさらに培養することにより、破骨細胞を得た。培養期間中ハイブリドーマ上清（１０分の１量）又はケラタン硫酸（ＫＳ−ＩＩ；１０ｎｇ／ｍＬ）を加えた。３日後、細胞を回収し、ＴＲＡＰ染色を行い、ＴＲＡＰ陽性破骨細胞（核数３個以上）の数を計測した。未処理細胞をコントロールとした（ＮＴ）。
結果を図１３に示す。ネイティブなＤＣＩＲリガンドであるＫＳ−ＩＩを添加した場合、破骨細胞への分化は抑制された（ＫＳ）。実施例５でケラタン硫酸よりも高いＤＣＩＲ結合能を示したハイブリドーマ上清（ＤＣＩＲアゴニスト（図１３中３、４、５株））は、ケラタン硫酸に比べて破骨細胞分化を抑制した。実施例５でＤＣＩＲアンタゴニスト活性を示したハイブリドーマ上清は（図１３中１、２株）、ケラタン硫酸に比べて破骨細胞分化を促進した。
これらの結果から、本発明のハイブリドーマ由来の抗体のようなＤＣＩＲアゴニストは、破骨細胞分化を抑制することにより骨量を増加させる作用を有し、骨粗鬆症等の骨減少性疾患、又は骨折などの骨の障害の治療に有用であることが示された。また、本発明の別のハイブリドーマ由来の抗体のようなＤＣＩＲアンタゴニストも、破骨細胞分化を促進することにより骨量を調整させる作用を有するので、各種骨疾患の治療に有用であることが示唆される。【００６９】
試験例
コラーゲン誘発関節炎に対する効果は、以下のようにして確認することができる。
材料と方法：
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）（Ｈ−２ｂ）
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）：
完全プロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、２０ｍＬのＩＦＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に１００ｍｇの結核菌加熱死菌体（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｈ３７Ｒａ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）を破砕して調製する。エマルジョンは、２ｍｇ／ｍＬチック（ｃｈｉｃｋ）ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍＭ酢酸に４℃で一晩溶解し、等容量のＣＦＡに混ぜて調製する。該混合物を、シリンジ−シリンジ法を用いて乳化させる。ＣＩＩ溶液及びそのＣＦＡエマルジョンは、常に新しいものを調製する。マウスは、尾部近傍の背基部の数か所に、総量で１００μｇのＣＩＩ及び２５０μｇの結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有１００μｌエマルジョンを皮内注射する。この注射を２１日間繰り返す。
関節炎の臨床的評価：
動物について、肢の赤みと腫れについて評価する。
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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