(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症患者が、活性化されたタンパク質Ｃまたは他の抗凝固剤または抗炎症剤の投与により、処置されるべきかまたは処置されるべきでないかを決定する方法であって、
下記工程：
ｉ）該患者からの血漿または全血液サンプル中の、活性化されたタンパク質Ｃおよび活性化されたタンパク質Ｃに結合するセルピンの複合体の濃度を決定する工程、ここで該セルピンは、タンパク質Ｃ阻害剤、α1-抗トリプシン、α2-抗プラスミンおよびＣ１-エステラーゼ阻害剤から選択される、
ｉｉ）該濃度を、健康な個体からの血漿または全血液のサンプル中の上記複合体の通常濃度の上限に相当する予め決定された第一のカットオフ値と比較する工程、
を含み、
該カットオフ値より低い濃度は、
ａ）敗血症患者についての平均よりも高い死亡率を示す、および
ｂ）該処置のための指標を提供する、
方法。
【請求項２】
活性化されたタンパク質Ｃに結合するセルピンが、タンパク質Ｃ阻害剤である、請求項１の方法。
【請求項３】
血漿中のカットオフ値が、０.２０ｎｇ／ｍＬまたは０.２０ｎｇ／ｍＬ〜０.４１ｎｇ／ｍＬの値である、請求項２の方法。
【請求項４】
患者のＡＰＡＣＨＥＩＩスコアを決定する工程をさらに含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法であって、ここでカットオフ値より低いバイオマーカーの濃度と２５と等しいかまたは２５よりも大きいＡＰＡＣＨＥＩＩスコアとの両方の存在は、
ａ）敗血症患者にとっての平均よりも高い死亡率、および
ｂ）外因性の活性化されたタンパク質Ｃまたは他の抗凝固剤または抗炎症剤の投与により患者を処置するための強力な適応指標、
に関する指標となる、方法。
【請求項５】
工程ｉ）およびｉｉ）を１回以上繰り返す工程をさらに含んでいる、請求項１の方法。
【請求項６】
２４時間以内で、工程ｉ）およびｉｉ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項５の方法。
【請求項７】
敗血症患者の処置が開始されたかまたは完了された後に工程ｉ）およびｉｉ）を繰り返す工程をさらに含む、請求項５または６の方法。
【請求項８】
活性化されたタンパク質Ｃに結合するタンパク質が、タンパク質Ｃ阻害剤である、請求項５〜７のいずれかの方法。
【請求項９】
敗血症患者が、敗血症患者についての平均よりも高い死亡率を有するかまたは有さないかを決定する方法であって、
該方法は、下記工程：
ｉ)患者からの血漿または全血液のサンプル中のタンパク質Ｃ活性化の指標となる、活性化されたタンパク質Ｃおよび活性化されたタンパク質Ｃに結合するセルピンの複合体の濃度を決定する工程、ここで該セルピンは、タンパク質Ｃ阻害剤、α1-抗トリプシン、α2-抗プラスミンおよびＣ１-エステラーゼ阻害剤から選択される、
ｉｉ)該濃度を第二のカットオフ値と比較する工程、を含む方法、
ここで、該第二のカットオフ値は、敗血症患者にとっての平均よりも低い死亡率に関連のある内因性タンパク質Ｃの中程度の活性化を排除するために選択されており、該カットオフ値を超える濃度は、敗血症患者にとっての平均よりも高い死亡率の指標となる。
【請求項１０】
活性化されたタンパク質Ｃと結合するセルピンがタンパク質Ｃ阻害剤である、請求項９の方法。
【請求項１１】
第二のカットオフ値が、０.７０ｎｇ／ｍＬまたは０.７０ｎｇ／ｍＬ〜１.０５ｎｇ／ｍＬの値である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
活性化されたタンパク質Ｃおよびその結合タンパク質の複合体が、複合体上のネオエピトープ、結合タンパク質、該結合タンパク質上のネオエピトープ、タンパク質Ｃまたは活性化されたタンパク質Ｃに特異的に結合する１以上の分子により測定される、請求項１または９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００６年１２月２０日に提出された米国仮特許出願番号６０/８７６０５９の正規出願であり、その全てを出典明示により本明細書に組み込む。
【０００２】
発明の分野
本発明は、活性化されたタンパク質Ｃ(ＡＰＣ)およびタンパク質Ｃ阻害剤(ＰＣＩ)の複合体（以降、ＡＰＣ-ＰＣＩと呼ぶ）を、血漿中での測定によりヒト疾患を診断およびモニターする方法に関する。この濃度は、全身性炎症性応答症(ＳＩＲＳ)を増大させる状態では、タンパク質Ｃ(ＰＣ)の不適切に低い活性化またはＰＣの高レベルの活性化のいずれかを示す。これは、特に敗血症、重症敗血症または敗血症ショックを有する患者に関係があり、ここで不適切に低いＰＣの活性化は、ＡＰＣの静脈投与によるか、または他の抗炎症剤および／または抗凝固剤による治療的介入のための指標を提供し得る。そのようなものとして、本発明は、国内医薬の分野、特に救命用または集中治療用医薬、感染症疾患医薬、および敗血症後の手術または外傷に関連する手術と関係がある。
【０００３】
定義
全身炎症性応答症(ＳＩＲＳ)：２以上の下記兆候をもたらす炎症系の全身活性化の影響：心拍数＞９０拍／分、体温＜３６℃または＞３８℃、呼吸速度＞２０呼気／分またはＰａＣＯ2＜３２mmHg、白血球計測値＜４x１０９または＞１２x１０９細胞/Ｌまたは＞１０％未熟好中球の存在。
【０００４】
敗血症：感染の疑いが高いか、または実証されたＳＩＲＳ。
【０００５】
重症敗血症：新たな臓器機能不全、低血圧症、または循環不全を合併する敗血症。
【０００６】
敗血症ショック：持続する動脈血低血圧症となる他の病因によっては説明のつかない急性循環不全による敗血症(体液蘇生法にもかかわらず、収縮期血圧＜９０mmHg、または基底値より＞４０mmHg低下)。
【背景技術】
【０００７】
発明の背景
近年、敗血症における治療的介入の可能性は、炎症および凝固系統の全身活性化を調節する生物学的治療剤の開発により拡張されてきた。２つのかかる治療剤は、組換えＤＮＡ技術により調製されたヒトＡＰＣであり、またヒト血漿から精製されたアンチトロンビンである。両方の薬剤は、イン・ビトロ試験系または動物モデルにおける抗凝固性および抗炎症活性を示す。しかしながら、非選択的敗血症患者をこれらの薬剤により処置した結果は、生存率の増加に関して不十分(ＡＰＣ)であるか、または検出不可能（アンチトロンビン)であった。ＡＰＣの場合において、生存率に対する有利な効果は、重症敗血症かつ２５以上のＡＰＡＣＨＥＩＩスコアを有する患者群のみに見られた(Bernard et al.、2001)。ＡＰＡＣＨＥＩＩは、疾患の重症度の分類体系であり、これは１２の所定の生理学的測定値の初期値、年齢および以前の健康状態を基にしたポイントスコアを使用して一般的な測定単位を提供するもので、院内死亡のリスクと相関する０〜７１の範囲のスコアとする(Knaus et al.、1985)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、この問題は、この処置から最も恩恵を受けうる患者達がその処置を受け、恩恵を受け得ないような患者には処置を施与しないように、ＡＰＣによる処置のための敗血症患者の選択を改善する方法である。後者の検討事項が重要であるのは、ＡＰＣの投与は、費用が高く、望ましくない効果、特に頭蓋内の大出血などの重大な出血事象の高い発生率とも関連することを理由とする。処置のために患者をＡＰＡＣＨＥＩＩスコアにより選択することは、かかる選択に対してなんらかの方法を継続させる場合に、本発明の目的は、内因性ＰＣの不十分な活性化を測定することにより、ＡＰＣのための患者の要件を提示することに基づくＡＰＣ処置のための患者を選択する改良方法を提供することである。この方法は、患者がＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＜２５を示していても処置のために患者を選択でき、また内因性ＰＣの活性化の適切なレベルを既に示していることを理由としてＡＰＡＣＨＥ スコア＞２５の患者を排除してもよい。
【０００９】
ＰＣは、４６１個のアミノ酸残基の一本のポリペプチド鎖として、肝臓によりビタミン-Ｋ−依存様式にて合成されるタンパク質である。それは、一つのジスルフィド架橋により結合した２６２個のアミノ酸残基の重鎖と１５５個のアミノ酸残基の軽鎖へと切断され、両鎖がグリコシル化される。該タンパク質は、Ｎ末端ペプチドにより保護された重鎖中に活性部位を有するセリンプロテアーゼ酵素前駆体であり、これは活性化中に切断される。成熟ＰＣは、およそ６２ｋＤａの分子量であり、およそ２３％がグリコシル化される。血漿中のその濃度は３-５μｇ／ｍＬであり、循環中のその半減期は６-８時間である。ＰＣは、トロンビンによりゆっくりと活性化され、該レセプターであるトロンボモジュリンとの複合体においては内皮細胞の血管表面にてトロンビンにより１０００倍以上急速に活性化される。ここで、ＰＣの活性化は、ＰＣが内皮ＰＣ受容体(ＥＰＣＲ)と結合することによりさらに２０倍増強される。ＰＣは、マムシヘビ毒（Agkistrodon snake venom）由来のセリンプロテアーゼにより薬理学的に活性化され得る。
【００１０】
ＰＣの活性化により生成したＡＰＣは、共同因子としてタンパク質Ｓおよび血液凝固因子Ｖをもちいて血液凝固因子ＶａおよびＶＩＩＩａを分割するセリンプロテアーゼである。それにより、膜結合因子ＶａおよびＶＩＩＩａの周辺にて血液凝固を制限する。ＡＰＣは、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-１を阻害すること、また活性化されたスロンビン活性化可能な線維素溶解阻害剤の生成を制限することにより間接的な線維素溶解活性も有し得る。ＡＰＣは、単球により腫瘍壊死因子の産生を阻害すること、セレクチンへの白血球の付着を遮断すること、およびスロンビン誘導性内皮炎症応答を制限することにより抗炎症性作用を有し得る。さらに、ＡＰＣはアポトーシスに対する阻害効果を有することが示されている。
【００１１】
ＡＰＣは、およそ５５ｋＤａの分子量を有し、血漿中のその通常濃度は、溶解状態で１-３ng/mL (１.１９ ±標準偏差、０.４１ng/mL)の範囲と推定されている。ヒト循環血液中でのＡＰＣの半減期は短く、２０分(Dahlback and Villoutreix、2003)または４５分(Macias WL et al.、2002)と推定されている。定位静脈点滴の間、定常濃度は２時間後に到達され、また点滴が停止されると、血漿中のＡＰＣの濃度は２時間以内に１０ｎｇ／ｍＬ以下となる。ここで使用した免疫酵素アッセイ(Gruber and Griffin、1992)により測定できるＡＰＣの内因性血漿濃度は、実際にはたった３.３％の敗血症患者において通常達成された検出限界(１０ｎｇ／ｍＬ)を超える。
【００１２】
ＡＰＣは、循環血液中で生成されるとすぐに、血中にも存在するセルピン(セリンプロテアーゼ阻害剤)と反応することにより不活性化をうける。これらは、ＰＣＩ、α1-抗トリプシン(ＡＡＴ)、α2-抗プラスミンおよびＣ１-エステラーゼ阻害剤(二次速度定数の程度の低下にて)を含む。このなかで、ＰＣＩは最も生理学的に重要であると考えられる。ＰＣＩは、分子量約５７ｋＤａの一本鎖タンパク質であり、血漿中のその通常濃度は、約５μg/mLである。ウサギにおいて測定された循環中のその半減期は、約２４時間である(Laurell et al.、1990)。ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体は、１３x１０３ M-1s-1の二次速度定数にて形成され（Marlar RA et al., 1993）、検出限界循環中のその半減期はウサギでは約２０分であり(Laurell et al.、1990)、ヒヒにおいては４０分である(Espana F et al.、1991)。ＡＡＴは、分子量約５４(５０-６０)ｋＤａの一本の鎖タンパク質であり、血漿中のその通常濃度は、約２.５mg/mLであって、ＰＣＩのものよりも約５００倍高い。ウサギにおいて測定した循環中のその半減期は６２時間である(Laurell et al.、1990)。ＡＰＣ-ＡＡＴ複合体は、１５M-1s-1の二次速度定数にて形成され(Marlar et al.、1993)、循環中のその半減期は、ウサギでは７２分であり(Laurell et al.、1990)、ヒヒにおいては１４０分である(Espana et al.、1991)。
【００１３】
ＡＰＣ-ＡＡＴ複合体形成についての速度定数は、ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体形成についての速度定数の約１０００分の１であるが、これは血漿中のＰＣＩよりもＡＡＴの５００倍高い濃度まで部分的に補償されることが判っている。加えて、循環中のＡＰＣ-ＡＡＴ複合体の半減期は、ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の半減期よりも３倍から４倍長い。このことにより、血漿中でＡＰＣ-ＰＣＩ複合体よりもＡＰＣ−ＡＡＴ複合体がより高い濃度となる。
【００１４】
ＡＰＣは、４１０M-1s-1の二次速度定数にてα2-抗プラスミンと複合体も形成でき、もしくはＣ１-エステラーゼ阻害剤(＜６M-1s-1二次速度定数)と共に非常にゆっくりと複合体を形成できる。これらの複合体の起こり得る形態は、生理学的に有意であるとは見なされない。
【００１５】
サンプル採取後にさらなる複合体形成を防止するために、０.５Ｍ クエン酸塩緩衝液（ｐＨ４.３、０.５ｍＬ）を含有する真空チューブ（５ml）中に健康なボランティアから採取した血液由来のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の平均血漿濃度は、０.０７-０.２６ ng/mL (Strandberg et al.、2003)の範囲にて、０.１３ｎｇ／ｍＬであった。１８人の敗血症患者において、血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の平均濃度(さらなる複合体形成の阻害剤として５０ｍＭベンスアミジンを含有する)は、酵素結合免疫吸着剤アッセイ(Alcaraz et al.、1995)により評価した３ｎｇ／ｍＬ±標準偏差(ＳＤ)２ｎｇ／ｍＬであった。これらの患者におけるＡＰＣ-ＡＡＴ複合体の平均濃度は、２６ｎｇ／ｍＬ±ＳＤ１５ｎｇ／ｍｌであった。１日目のＰＣ血漿中の平均レベルは、平均の通常コントロール値の６９％±ＳＤ２８％であり、ＰＣＩの平均レベルは、コントロール値の３３％±２２％であり、敗血症におけるＰＣＩの活性化を理由とするこれらの成分の消費を示す。
【００１６】
重症敗血症患者は、ＡＰＣを生成させる能力を顕著に変化させる(Liaw et al.、2004)。ＰＣ、トロンボモジュリンおよびＥＰＣＲの有効な活性化のために重要である内皮レセプターは、敗血症では下位調節され得る。例えば、トロンボモジュリンおよびＥＰＣＲのレベルは、重篤な髄膜炎菌性の敗血症罹患小児の内皮中では低下され(Faust et al.、2001)、またイン・ビトロの試験ではトロンボモジュリンおよびＥＰＣＲが炎症性サイトカインにより下位調節されることが示されている(Esmon、2004)。この下位調節の程度は変化しやすく、この事は免疫酵素アッセイの改良版により測定された場合に、数人の敗血症患者が内因性ＡＰＣのレベルが低いこと、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコアと相関しない現象(Liaw、2004)を示すということを意味する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の概要）
我々は、上記したとおりＡＰＡＣＨＥＩＩスコア単独を用いるよりも不適切な処置を回避する際により効果的であると考えられる、ＡＰＣ処置のために敗血症患者を選択する方法を発明した。この新規方法は、内因性ＰＣの高い活性化を既に有する患者にはＡＰＣ投与が有益ではないようであるという考察に基づいており、またＰＣ活性化において増加を示さない敗血症患者は、敗血症患者よりも全体として死亡率が高いという新たな所見に基づいている。
【００１８】
好ましい実施形態において、該方法は、下記工程；
i)サンプル採取後にさらなるＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の形成を防止する薬剤を含むチューブに、患者から血液サンプルを採取する工程、
ii)該血漿を分離する工程、
iii)該血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の濃度を測定する工程、
iv)該濃度を、０.７５〜１.５の間の修正係数を乗じた健康な個体由来の血漿サンプル中で見出されたＡＰＣ-ＰＣＩ濃度の上限に相当するカットオフ値と比較する工程、
により、敗血症患者における本来のＰＣの活性化状態を決定することを含むもので、
ここで該カットオフ値より低い濃度は、内因性ＰＣの適切な活性化がないことを示し、また外因性ＡＰＣの投与による処置に対する指標を提供するものである。
【００１９】
健康な個体において見出された値の上限からのカットオフ値を計算するために０.７５〜１.５の間の修正倍率を適用する必要性は、使用した測定方法に依存し、該修正係数の値は、敗血症患者および健康なボランティアに対する測定方法の臨床評価の結果により実験的に決定される。
【００２０】
また、血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩの濃度を測定するために使用した方法の技術詳細によっては、全血液を上記した一般方法においても使用できる。
【００２１】
もし、血漿ＡＰＣ-ＰＣＩ濃度に加えて、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコアが検討されれば、ひいては該カットオフ値よりも低い血漿ＡＰＣ-ＰＣＩ濃度とＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５との両方を有する患者は、非常に高い死亡率を示し、このサブサブグループにおいて生じるこの死亡数は、カットオフ値以下の血漿ＡＰＣ-ＰＣＩ値を有するサブグループにおいて圧倒的な死亡数を構成する。この患者のサブグループは、特に外因性ＡＰＣの投与による処置を検討されるべきである。以下に提供したデータに示したとおり、ＡＰＣ投与をこの患者のサブグループに限定することにより、救命のために処置されるべき患者の数は、患者がＡＰＡＣＨＥＩＩスコア単独による処置のために選択される場合に見出される患者数の３分の１に減少する。加えて、内因性ＰＣが既に適切に活性化されている場合に外因性ＡＰＣ投与が有益な効果をほとんど示さないかまたは全く示さないならば、高い血漿ＡＰＣ-ＰＣＩ濃度を有する患者を処置しない結果として、いずれの生命をも失うとは考えられない。このようにしてＡＰＣ処置について敗血症患者を選択することは、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア単独により患者を選択することに比べて、費用便益の関係では約３倍の改善をもたらすと考え得る。
【００２２】
ＡＰＣ処置について敗血症患者を選択するこの方法は、内因性ＰＣ活性化の状態を測定するいずれの特定方法にも依存しないことは明らかである。これを、免疫化学的、免疫酵素分析的またはあらゆる他の方法により、血液または血漿中の内因性ＡＰＣを測定すること、または内因的に形成されたＡＰＣと阻害剤とにより形成されたあらゆる複合体を測定することにより定量できる、ここで該阻害剤はセルピン（例えばＰＣＩ、ＡＡＴまたは他のセルピン等）またはＡＰＣを結合できるその他の分子である。本方法は、ＡＰＣ-阻害剤複合体を測定するいずれの特定方法にも依存しない。各場合において、カットオフ値を、既知の凝固障害がない健康な個体からのサンプルに選択した方法を用いることにより得た値の上限０.７５〜１.５の間にある係数を乗じて決定した。好ましい実施形態において、ＰＣ活性化の状態は、免疫化学的方法によりＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の血漿サンプル中の濃度を測定することにより決定される。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明の好ましい実施形態において、我々は、血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の濃度を決定するための免疫化学的方法を開発し、病院の集中治療施設に入院した１３５人の継続患者のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体を測定するために本方法を用いた。実施例１に提示したこの試験の結果は以下のとおりである。驚くべきことに、入院中に、通常の上限に近い値と等しいかまたは高い血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の濃度を生成するに十分なＰＣの活性化を示さなかった敗血症患者のサブグループは、全敗血症患者よりも高い死亡率を示したことが判った。高い死亡率および低い死亡率の患者間の適切な区別を提供するカットオフ値は、通常の上限付近であって、また通常濃度の上限に関して１付近の係数を乗じて規定できた。入院中にＰＣの中程度の活性化を示した患者のサブグループは、全敗血症患者の死亡率よりも低い死亡率を示した。一方で、入院中にＰＣの高い活性化を示した患者のサブグループはまた全敗血症患者よりも高い死亡率を示した。
【００２４】
この試験から、カットオフ値と同じかまたは低いＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の血漿極大濃度からも明らかなように、敗血症におけるＰＣの不活性化は、適切な保護的ＰＣ活性化応答がないことを示しており、高い相対死亡率に関連がある。ＰＣ活性化が適切である場合、ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の血漿濃度の中程度の上昇を反映して、相対死亡率が低下した。
【００２５】
従って、我々は、ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の血漿濃度が通常範囲内(または、実験的に決定した修正係数を乗じた通常の上限以下)に維持されている敗血症患者は、ＡＰＣの静脈投与により処置されるべき患者群であると提言する。実施例１で説明したこの試験の結果に従って、この方法は、ＰＣ活性化がないサブグループのものよりも中程度のＰＣ活性化を有するサブグループの低い死亡率が、専ら循環中のＡＰＣの効果によると極端に仮定すれば、最良の場合において４４％から１３％へ死亡率が低下する可能性を提供するはずである。起こり得る死亡率低下作用の全体に対するＡＰＣの寄与率により、実際にどの程度の死亡率の低下を得ることができるかが決まる。
【００２６】
もし、血漿ＡＰＣ-ＰＣＩ濃度に加えて、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコアが考慮されれば、敗血症患者のいずれのサブグループにおいても圧倒的に高い死亡率が、ＰＣ活性化がなく、かつＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５のサブグループにおいて認められた。このサブグループは非常に高い死亡率(７１％)を示した。
【００２７】
従って、我々は、ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の血漿濃度がカットオフ値と等しいかまたは低く維持され、かつＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５を有する敗血症患者は、ＡＰＣの静脈投与による処置を特別に考慮されるべき敗血症患者であるという点を提言する。この試験の結果に従って、ＰＣ活性化がないサブグループよりも、中程度のＰＣ活性化を有するサブグループの低い死亡率が、専ら循環中のＡＰＣの効果によるものであると仮定すれば、最良の場合において、このサブグループの患者の死亡率を７１％から２５％に低下させる可能性を提供するはずである。
【００２８】
低いＡＰＣ-ＰＣＩレベルおよびＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５を根拠としてＡＰＣ処置のために敗血症患者を選択する主な有利な利点は、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア単独を根拠として処置を選択する人数と比較して、救命のために処置されるべき患者の人数が劇的に低下すると考え得る点である。試験した敗血症患者群のうち、２２人はＡＰＡＣＨＥＩＩスコアを基にしてＡＰＣ処置のために選択された。この患者のうち１０人が死亡した。内因性ＰＣ活性化の状態に関わらず、ＡＰＣ処置がこれらの死亡を予防する際に全体的に有効であると仮定すると、最良の症例の計算は、２.２(２２／１０)人の患者が救命のために処置されるべきであろう。ＰＣ活性化がなく、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５を示す７人の患者のサブグループ中では５人が死亡した。ＡＰＣ処置が、内因性ＰＣ活性化がない患者においてのみ唯一有効であるだけでなく、全体的に有効であると仮定すれば、４.４(２２／５)人の患者が救命のために処置されるべきであろう。しかし、ＡＰＣ処置を、ＰＣ活性化がなくかつＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５を有する患者のサブグループに限定すれば、同じ仮定では１.４(７／５)人の患者だけが、救命のために処置されるべきである。全体として、これらの計算は、ＡＰＣが内因性ＰＣ活性化のない患者においてのみ有効であるならば、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア単独による選択とは対照的に、低いＡＰＣ-ＰＣＩおよびＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５を基にして患者を選択することにより、救命のために処置されるべき患者の数を３分の１に低下せしめることができることを示す。これは、広く適用されるＡＰＣ処置の方策について、費用効率において３倍の改善を示す。実際にはこの症例となるように、ＡＰＣ処置の有益な効果がただ部分的であった場合、費用有効性において同様の改善があてはまる。さらに、内因性ＰＣの十分な活性化があればＡＰＣ投与は有益ではないというこの仮定が実際に事実であれば、ひいてはこの排除された患者を処置しない結果として、さらなる死亡が生じないと考えられる；それどころか、上掲の病因レベルに到達する不適切なＡＰＣ投与の副作用が、多くの患者で回避されるであろう。これらの副作用には出血症状の出現が挙げられ、間接的神経障害を伴う頭蓋内大出血も含む。
【００２９】
従って、本発明は、敗血症患者からの血漿サンプル中のＰＣ活性化状態の指標となるバイオマーカー分子の濃度を測定することにより、敗血症患者におけるＰＣ活性化の状態を決定することに関する。バイオマーカーの濃度が、実験的に決定した修正係数０.７５〜１.５、例えば０.８〜１.４、例えば０.８５〜１.３、例えば０.９〜１.２、例えば０.９５〜１.１を乗じた、既知の凝固障害のない健康なボランティアからの血漿中に見出された濃度範囲の上限に等しいカットオフ値を超えなければ、ＰＣ活性化の状態が不適切に低い状態であると決定され、外因性ＡＰＣを投与することにより該患者を処置するための明白な指標を提供する。また、この患者が一般的な敗血症患者よりも高い死亡率のリスクを有することも示す。ＰＣ活性化が不適切に低い状態の患者が、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５もまた示すならば、これはＡＰＣ投与のための指標をさらに強調するものであり、非常に高い死亡率を示すカテゴリーにこの患者を位置づける。
【００３０】
一実施形態において本発明の方法は、敗血症患者からの血漿サンプル中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の濃度を測定する工程、そしてこの測定した濃度を、上記に規定したように実験的に決定した修正係数を乗じた、現行疾患が知られていないヒトにおいて見出される血漿濃度（以後通常値と呼ぶ）の上限に等しくなるように決定された選択されたカットオフ値と比較する工程を含む。本研究の方法により、最も区別するカットオフ値を与えた修正係数の値を、０.９６であると決定したが、他の分析方法および他の患者集団により、若干異なる修正係数が決定されてもよい。しかし、全ての場合において、理論的検討により、修正係数がほぼ一貫しているという予測が得られた。通常の上限は、この目的のためには、９７.５％の通常値がそれを下まわる最小値と規定される。測定したＡＰＣ-ＰＣＩ濃度がカットオフレベル以下であれば、患者が敗血症への応答における不適切なＰＣ活性化不全を有するという指標となる。
【００３１】
ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の血漿レベルがＰＣ活性化不全の指標となるカットオフレベル以下は、ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の測定技術により変化し得、好ましくは０.２０ng/mL以上のレベルであり、０.２０ng/mL〜０.４１ng/mL、例えば０.２１ng/mL、０.２２ng/mL、０.２３ng/mL、０.２４ng/mL、０.２５ng/mL、０.２６ng/mL、０.２７ng/mL、０.２８ng/mL、０.３０ng/mL、０.３５ng/mL、または０.４０ng/mLのようなレベルである。
【００３２】
本発明のさらなる局面は、該方法を使用して、敗血症に対するＰＣ活性化の応答の推移、または外因性ＡＰＣ投与後のＡＰＣ-ＰＣＩレベルの上昇および低下、またはＡＰＣ投与ではない敗血症に関する別の処置に対する応答をモニターすることができる。血漿レベルをモニターするために血液を採血する時間間隔は、医者が適切に考察できる程度の短時間であってよいが、外因性ＡＰＣを投与されていない患者からの血漿中の内因性ＡＰＣ-ＰＣＩレベルを追跡するには、２４時間よりも長くない間隔で実施されるのが好ましい。ＡＰＣ投与または他の処置の後のＡＰＣ-ＰＣＩレベルをモニターするために、１時間またはさらに短時間の提案期間までのさらに短い時間間隔を、医者の決定により用いてもよい。
【００３３】
本発明のさらなる局面は、内因性ＡＰＣ-ＰＣＩレベルが決定される場合に、第二のより高いカットオフ値を超えるレベルも、一般的な敗血症患者よりも高い死亡率の予測となることである。死亡率が上昇する第二のより高いカットオフレベルは、好ましくは０.７０ng/mL以上のレベルであって、かかる値０.７０ng/mL〜１.０５ng/mL、例えば０.７１ng/mL、０.７２ng/mL、０.７３ng/mL、０.７４ng/mL、０.７５ng/mL、０.８０ng/mL、０.８５ng/mL、０.９０ng/mL、０.９５ng/mL、または１.００ng/mL等のレベルである。
【００３４】
内因性ＡＰＣ-ＰＣＩレベルは患者におけるＰＣ活性化の状態を示すため、同様に決定された第二のより高いカットオフ値を超えるＰＣ活性化の他のバイオマーカーの上昇したレベルもまた、一般的な敗血症患者よりも高い死亡率の予測となることは明らかである。
【００３５】
血漿サンプル中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の測定を、満足のいく分析学的な、特異性、感受性および精度を提供するあらゆる方法により行うことができる。好ましい方法は、ヒトＡＰＣ-ＰＣＩの成分に特異的な１以上の結合分子を用いる結合アッセイである。かかる結合分子は、ＡＰＣ-ＰＣＩ複合体上のネオエピトープ、ＰＣＩまたはセリンプロテアーゼと反応したＰＣＩ、およびＰＣまたはＡＰＣに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、あるいは他の手段により生成したこれらの成分に特異的な結合分子を包含するが、これらに限定するものではない。
【００３６】
好ましい方法において、セリンプロテアーゼとの複合体中のＰＣＩおよびＰＣ各々に対して生じたモノクローナル抗体を使用した。第一の抗体をサンプルからのＡＰＣ-ＰＣＩを捕捉するために固体支持体に結合し、一方で別のものを、当業者には既知のあらゆる方法により検出できる標識、例えば染料複合体、フルオロファア、電気化学的に活性化されたシグナル伝達物質基、常磁性体基、ビオチンまたは酵素等に結合させる。該固体支持体は、例えば酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ)のためのポリスチレンまたは塩化ポリビニル表面、またはラテックス(ポリスチレン)または他の粒子、または圧縮されたポリエチレン粒子から構成されるフィルターフリット、または多孔質ニトロセルロースマトリクス、または実際に免疫化学分析で使用されるあらゆる好適な支持体であってもよい。
【００３７】
上記方法によりＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の測定のための血漿サンプルは、好ましくはエチレンジアミン四酢酸塩(ＥＤＴＡ)またはクエン酸塩である抗凝固剤、およびイン・ビトロでＡＰＣ-ＰＣＩ複合体のさらなる形成を即時に防止する十分量の薬剤、例えばベンスアミジンまたはクエン酸ナトリウム塩（pH 4.3）を含有する貯蔵容器中に採取された血液から調製されるべきである。
【００３８】
下記実施例は、病院の集中治療施設に入院した非選択患者に関する臨床試験に適用した本発明の診断方法を説明するものである。
【００３９】
実施例１
集中治療に入院した非選択患者の臨床試験
本発明の好ましい実施形態において、我々は、血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の濃度を決定するためのサンドイッチ酵素結合免疫吸着剤アッセイ法(ＥＬＩＳＡ)(実施例２)を開発し、これを用いて、入院期間中病院の集中治療室に入院した１３５人の患者中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体を測定した。５３人の患者は、入院期間中(敗血症群)、ある段階にて敗血症を示し、また８２人は示さなかった(非敗血症群)。入院期間中に通常の上限に近い値と同等またはよりも高い血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の濃度となるように十分なＰＣの活性化を示さなかった敗血症患者のサブグループは、全敗血症患者の死亡率(３２％)よりも高い死亡率(４４％)を示し、相対死亡率１３６％を示した。この場合において、最適な識別を示すカットオフ値は、０.２６ｎｇ／ｍＬである通常値の上限に近い０.２５ｎｇ／ｍＬであることが判った。通常の上限が最良のカットオフを見出すために乗じられるべき係数は０.２５／０.２６または０.９６であった。血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の最高記録濃度を０.２６-０.７２ng/mLの範囲とするに十分なＰＣの中程度の活性化を入院中に示した患者のサブグループは、相対死亡率４１％を示す全ての敗血症患者よりも低い死亡率を示した(１３％)。一方で、入院中に、０.７２ng/mLを超える血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の最高記録濃度をもたらすに十分なＰＣの高い活性化を示した患者のサブグループは、全ての敗血症患者の死亡率よりも高い死亡率（５０％)を示し、１５６％の相対死亡率を示した。
【００４０】
敗血症のない患者群では、高い死亡率がＰＣ活性化と関連があったということを示唆する有意な傾向はなかった。敗血症がなく、通常の範囲のＡＰＣ-ＰＣＩ値を有する患者の院内死亡率は０％であるが、中程度または高いＰＣ活性化のいずれかを示す患者において死亡率は１５％であった。通常のＡＰＣ-ＰＣＩ値は、敗血症のない患者において良好な予後診断に関連があるが、敗血症患者においては高い相対死亡率と関連するという点で、敗血症のない患者は敗血症患者とは顕著に異なる。
【００４１】
これらのデータを表１に要約した。
【００４２】
表１.病院内の、ＰＣ活性化サブグループにより集中治療室に入院した患者の敗血症(ｎ＝５３)および非敗血症(ｎ＝８２）群の絶対および相対死亡率
【表１】
0005439187.tif 000002
【００４３】
ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアを、敗血症群において５１人の患者に用いた。血漿ＡＰＣ-ＰＣＩ濃度に加えて、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコアを考慮すると、あらゆる敗血症患者のサブグループにおいて非常に高い最高死亡率を、ＰＣ活性化がなく、かつＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５を有するこのサブグループにて認めた。このサブグループは７１％の死亡率であった。このＰＣ活性化がなく、かつＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＜２５を有するサブグループは、１１％のみの死亡率しか示さなかった。中程度のレベルのＰＣ活性化を有する敗血症患者において、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＞２５に関わる患者の死亡率は２５％であったが、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア＜２５と関連のあった患者の死亡率は８％であった。ＰＣ活性化が高レベルを有する患者において、ＡＰＡＣＨＥＩＩスコア２５の前後では、死亡率についての有意差はなかった(４３％および５７％各々)。
【００４４】
これらのデータを表２にまとめた。
表２.ＡＰＡＣＨＥＩＩスコアおよびＰＣ活性化サブグループにより、集中治療室に入院した敗血症患者の院内死亡率
【表２】
0005439187.tif 000003
【００４５】
下記の非限定的実施例は、ヒト血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の濃度をどのように測定できるかを説明したものである。実施例２は上記実施例１に使用した分析方法である。
【００４６】
実施例２
サンドイッチＥＬＩＳＡによる血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体の決定
標準的かつ計測材料として使用するためのＡＰＣ-ＰＣＩ複合体をStrandbergら(2001)に記載した方法の改変により調製した。ヒト組換え活性化タンパク質Ｃ(Xigris; Ely Lilly)を、Strandbergら(2001)に記載の緩衝液中に、マルモ大学病院の臨床化学部（Clinical Chemistry、University Hospital of Malmoe、Sweden)から入手した精製ヒトＰＣＩの１.５倍モル過剰を用いて、室温でインキュベートした。指定時間での、インターバル時点で、GruberおよびGriffin(1992)の免疫酵素アッセイを改変して残存ＡＰＣ活性を決定した。全ての検出可能なＡＰＣ活性は、１時間までに消失した。グリセロールを、終濃度５０％v/vまで調製液に加え、該溶液のアリコートを-１３５℃で保存した。
【００４７】
ＡＰＣとの複合体中のＰＣＩに対する捕捉抗体を、Strandbergら(2001)が説明したマウス「モノクローナル」抗体Ｍ３６から得た、またこの抗体は２００５年１１月２２日に公開された米国特許６９６７０８２の対象であり、出典明示により本明細書の一部とする。該抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を使用する権利はForskarpatent i Syd AB（Lund、Sweden）から許諾された。この細胞株は、反応したＰＣＩ上のネオエピトープに対して２つの異なる抗体を実際に産生し、一つはサブクラスIgG1κであり、もう一方はサブクラスIgG2bκである。我々は該細胞株をサブクローニングし、IgG1κ抗体を産生する細胞のみを使用した。この抗体を、JST ００１-０３８と呼ぶ。検出抗体は、ビオチン化したマウスモノクローナル抗体ＨＹＢ２３７−０５Ｂであって、これはＡＰＣおよびＰＣの両方と反応する。
【００４８】
血液サンプルを、静脈穿刺によりヒトの対象から採取し、各々０.５Ｍクエン酸塩（pH 4.3）(０.５mL)(Stabilyte; Biopool、Umea、Sweden)を入れた真空チューブ（５mL）に直接注入した。この血漿を、遠心分離により４℃で分離し、分析するまで-８０℃で一定分量にて保存した。
【００４９】
ポリスチレンＥＬＩＳＡプレートを、０.０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.6）中５μg/mLの濃度にて抗体ＪＳＴ００１-０３８を用いて一晩４℃で被覆し、１００μＬ/ウェルで用いた。該ウェルを空にして、１０ｍＭリン酸塩、１４０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０.０５％ v/v Tween 20を含有するリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）の洗浄緩衝液を用いて３回洗浄し、ブロッティングした。較正溶液を、ＡＰＣ-ＰＣＩ較正貯蔵液を、希釈緩衝液［０.５％ w/v ウシアルブミンおよび０.００６％ w/v フェノールレッドを含有する洗浄緩衝液］で希釈して調製した。血漿サンプルを、サンプル希釈緩衝液［pH 7.4、10 mM リン酸塩、２００ｍＭ 塩化ナトリウム、０.２５％ v/v Tween ２０、０.５％ w/v ウシアルブミン、無関係マウスモノクローナル ＩｇＧ１κ１０μg/mL、ウシＩｇＧ １０μｇ／ｍＬ、０.００６％ w/v フェノール・レッドおよび０.０２％ w/v チメロサール］に希釈した。希釈した較正装置およびサンプルを、１００μＬ容量で該ウェルに用いて、振盪板上で１時間室温にてインキュベートした。次いで、ウェルを空にし、洗浄し、従来どおりブロッティングした。希釈緩衝液中０.５μｇ／ｍＬでビオチン化抗体ＨＹＢ２３７-０５Ｂを、各ウェルに１００μＬ/ウェルで加え、振盪台上で１時間室温でインキュベートした。次いで、該ウェルを空にし、洗浄し、従来どおりブロッティングした。希釈緩衝液にて１/２０００希釈のホースラディッシュ・ペルオキシダーゼおよびストレプトアビジン(ZyMax; Invitrogen/Zymed、San Francisco、CA)の複合体を、１００μＬ/ウェルにて各ウェルに加え、振盪板上で１時間室温でインキュベートした。次いで、該ウェルを空にして、洗浄して、従来どおりブロッティングした。次いで、テトラメチルベンジジンおよびペルオキシダーゼ(TMB-Plus、Kem-En-Tech、Copenhagen、Denmark)を含有する基質溶液を、１００μＬ/ウェルで各ウェルに適用し、暗所室温で３０分間インキュベートし、呈色反応後に１Ｍ硫酸（５０μＬ）を各ウェルに添加して呈色反応を停止させた。４５０nmでの波長にて該ウェルの吸光度をＥＬＩＳＡプレートリーダーで読みとり、６５０nmでの光吸光度を控除する。次いで、サンプル中のＮＧＡＬの濃度を、既知濃度の較正装置の光吸光度の読み取り値から作製した標準曲線から計算した。
【００５０】
アッセイは、４ｐｇ／ｍＬの検出限界(０との違いに関する９５％信頼限界)でもって、０.０１６ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬの範囲であった。血漿サンプルを１／１０の希釈にて規定通りに測定した。
【００５１】
当業者には明らかであろうが、複合体のいずれかの成分または両方の成分に特異的な結合分子により、血液または血漿中のＡＰＣ-ＰＣＩ複合体を測定する多くの他の方法が考えられ得る、これには迅速で患者付近での分析に好適な方法やオートメーション化された任意抽出方式の中央検査室機器に好適な方法が挙げられる。例えば、免疫蛍光分析方法がStrandbergら(2001)により説明される。
【００５２】
さらに、当業者には明らかであろうが、ＡＰＣ処置のための敗血症患者を選択するこの方法は、内因性ＰＣ活性化の状態を測定するあらゆる特定の方法には依らない。これは、血漿中の内因性ＡＰＣを測定すること、免疫化学的、免疫酵素分析的またはその他の方法により測定すること、またはセルピン（ここで該セルピンはＰＣＩ、ＡＡＴまたはＡＰＣと反応できる別のセルピンである）と内因的に生成したＡＰＣにより形成したあらゆる複合体を測定すること、またはＡＰＣおよびＡＰＣに特異的に結合するあらゆる内因性分子により形成した複合体を測定することにより定量できる。この方法は、ＡＰＣとセルピンまたは他の結合分子の複合体を測定する任意の特定方法に依るものでもない。各場合において、実験的に決定した修正係数を乗じた、既知の凝固障害のない健康な個体からのサンプルにその選択した方法を適用して得た値の上限により、該カットオフ値を決定した。多くの不確定要素が様々な交絡因子により導入されても、内因性ＰＣ活性化の血液または血漿中のＰＣおよび／またはＰＣＩの全体量を測定すること、また、この値と、実験的に決定した係数を乗じた、これらタンパク質の通常の血液または血漿濃度の各平均から得たカットオフ値とを比較することにより内因性ＰＣ活性化の状態も評価できる。その後、各カットオフレベル以下のこれらのタンパク質のレベルは、ＰＣ活性化の程度を示すと仮定される。
【００５３】
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