(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンである第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む翻訳系であって；
前記第１のＯ−ＲＳが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有すると共に、３２位にＬｅｕを、１０７位にＳｅｒを、１５８位にＰｒｏを、１５９位にＬｅｕを、１６０位にＡｓｎを、１６２位にＧｌｕを有し、且つ、
前記第１のＯ−ＲＳが、前記第１の非天然アミノ酸と、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＯ−ｔＲＮＡと、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＯ−ＲＳとを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸でアミノアシル化する、翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳがMethanococcus jannaschiiアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型Methanococcus jannaschiiチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるものである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、その核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、そのセレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項７に記載の翻訳系。
【請求項８】
前記翻訳系が宿主細胞を含み、その宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項９】
前記宿主細胞が真正細菌細胞である請求項８に記載の翻訳系。
【請求項１０】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞ある請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１１】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項８に記載の翻訳系。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載の翻訳系。
【請求項１３】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む請求項８に記載の翻訳系。
【請求項１４】
特定位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を宿主細胞で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンである第１の非天然アミノ酸と；
（ii）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（iii）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（iv）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸と、
を含む宿主細胞を提供する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階とを含み、
ここで、前記第１のＯ−ＲＳが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有すると共に、３２位にＬｅｕを、１０７位にＳｅｒを、１５８位にＰｒｏを、１５９位にＬｅｕを、１６０位にＡｓｎを、１６２位にＧｌｕを有し、且つ、
前記第１のＯ−ＲＳが、前記第１の非天然アミノ酸と、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するＯ−ｔＲＮＡと、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するＯ−ＲＳとを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸でアミノアシル化する、方法。
【請求項１５】
段階（ａ）が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｏ−ＲＳがMethanococcus jannaschiiアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｏ−ＲＳが野生型Methanococcus jannaschiiチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
段階（ａ）が、部位特異的突然変異誘発後により野生型のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポッケトを突然変異させる段階と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階とを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記選択段階が、部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記Ｏ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
段階（ａ）が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
段階（ａ）がアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ａ）が配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
段階（ａ）がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記蛋白質が第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸を更に含み、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含む翻訳系を提供し、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
段階（ａ）が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、段階（ｃ）が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が真正細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記真正細菌宿主細胞が大腸菌宿主細胞である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を有する請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
段階（ａ）が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有すると共に、３２位にＬｅｕを、１０７位にＳｅｒを、１５８位にＰｒｏを、１５９位にＬｅｕを、１６０位にＡｓｎを、１６２位にＧｌｕを有するポリペプチドであって、
ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンである第１の非天然アミノ酸と、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）とを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で、コグネートＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸でアミノアシル化するＯ−ＲＳとして機能する、ポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を有する請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項３１に記載のポリペプチド、及び／又は、請求項３２又は３３に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３５】
前記組成物が当該ポリペプチド及び／又は当該ポリヌクレオチドを含む細胞である請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項３２又は３３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３７】
発現ベクターである請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
請求項３６又は３７に記載のベクターを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は米国仮特許出願第６０／６２２，７３８号（出願日２００４年１０月２７日）の優先権と特典を主張し、その開示内容全体を参考資料として全目的で本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明はエネルギー省助成番号ＥＲ４５６０１及び国立衛生研究所助成番号ＧＭ６２１５９として米国政府助成下に創出された。米国政府は本発明に所定の権利をもつことができる。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は翻訳生化学の分野に関する。本発明は非天然アミノ酸を蛋白質に組込む直交ｔＲＮＡ、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びその対を作製及び使用するための組成物と方法に関する。本発明は更に前記対を使用して細胞で蛋白質を生産する方法と前記方法により生産された蛋白質にも関する。
【背景技術】
【０００４】
蛋白質構造及び機能の研究は従来、天然アミノ酸の反応基を使用して入手可能な性質と反応化学に依存している。残念ながら、細菌からヒトに至る全公知生物は同一の２０種の標準アミノ酸をコードする（稀な例外としてセレノシステイン（例えばＡ．Ｂｏｃｋら，（１９９１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５：５１５−２０参照）とピロリジン（例えばＧ．Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら，（２００２），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：１４５９−６２参照）も挙げられる）。Ｒ基のこの限られた選択は蛋白質構造及び機能の研究を制限しており、研究は天然アミノ酸の化学的性質により制限され、例えば、天然アミノ酸は蛋白質の他の全アミノ酸を除外する高度に標的化された蛋白質修飾を実施する能力を制限する。更に、天然アミノ酸はその機能的活性（例えば蛍光、金属キレート化、酸化還元電位、フォトケージング等）を制限される。
【０００５】
蛋白質の選択的修飾に当分野で現在使用されている大半の修飾反応は蛋白質アミノ酸側鎖の天然求核性残基を標的とする求核性反応パートナーと求電子性反応パートナーの間の共有結合形成、例えばα−ハロケトンとヒスチジン又はシステイン側鎖の反応を伴う。これらの場合の選択性は蛋白質の求核性残基の数とアクセシビリティにより決定される。残念ながら、天然蛋白質は反応部位の配置が不良であったり（例えば接近しにくい）、反応ターゲットを複数含む（例えばリジン、ヒスチジン及びシステイン残基）ことが多いため、修飾反応の選択性が低く、求核／求電子試薬による高度に標的化された蛋白質修飾は困難になる。更に、修飾部位は一般にリジン、ヒスチジン及びシステインの天然求核性側鎖に限定される。他の部位の修飾は困難又は不可能になる。
【０００６】
蛋白質構造及び機能を改変及び研究する目的で天然アミノ酸には認められない新規性質（例えば生物学的性質）をもつ非天然アミノ酸を蛋白質に組込むための新規ストラテジーが当分野で必要とされている。蛋白質を高度に選択的に修飾し、更に生理的条件下で蛋白質を修飾する蛋白質修飾反応のための新規ストラテジーの開発が当分野で大いに必要とされている。高度に特異的な蛋白質修飾（例えば、天然アミノ酸が交差反応又は副反応を全く生じないような修飾）を行うための新規方法が当分野で必要とされている。高度に特異的な蛋白質修飾の新規化学は蛋白質構造及び機能の研究に幅広く利用できる。
【０００７】
これらの制限を解決するための１つのストラテジーは遺伝コードを拡張し、顕著な物理的、化学的又は生物学的性質をもつアミノ酸を生物レパートリーに付加する方法である。このアプローチは宿主細胞（例えば真正細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母又は哺乳動物細胞）のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生合成機構を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に付加するために直交ｔＲＮＡと対応する新規直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用することにより実現可能であることが分かっている。このアプローチは各種文献（例えばＷａｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｃｈｉｎら，（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０）に記載されている。国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）も参照。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００２／０８５９２３
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００５／０１９４１５
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００５／００７８７０
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００５／００７６２４
【非特許文献１】Ｗａｎｇら，（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００
【非特許文献２】Ｃｈｉｎら，（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７
【非特許文献３】Ｃｈｉｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７
【非特許文献４】Ｃｈｉｎら，（２００２），ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４
【非特許文献５】Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非天然アミノ酸を規定位置に組込むことができ、非天然アミノ酸がこの非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質に新規生物学的性質を付与するように、非天然アミノ酸を蛋白質に組込む直交翻訳成分の開発が当分野で必要とされている。蛋白質の他の部位と交差反応又は副反応することなしに特異的修飾のターゲットとして非天然アミノ酸を利用できるような新規化学的性質をもつ非天然アミノ酸を組込む直交翻訳成分を開発することも必要である。治療用途と生物医学研究に使用できるような有意量の非天然アミノ酸含有蛋白質を生産することが可能な蛋白質発現システムも特に必要である。本発明は以下の開示から明らかなように、上記及び他の必要を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン）に応答して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば宿主細胞中）で組込むための組成物と方法を提供する。これらの組成物は宿主細胞翻訳機構と相互作用しない直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の対を含む。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡは内在宿主細胞アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより（天然又は非天然）アミノ酸を負荷されない（又は有意レベルまで負荷されない）。同様に、本発明により提供されるＯ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに（天然又は非天然）アミノ酸を有意レベルまで又は場合により検出可能なレベルまで負荷しない。これらの新規組成物は翻訳により組込まれた非天然アミノ酸をもつ大量の蛋白質の生産を可能にする。組込まれる非天然アミノ酸の化学的性質に応じて、これらの蛋白質は例えば治療薬や生物医学研究等の幅広い用途に利用される。
【００１０】
所定側面では、本発明は翻訳系を提供する。これらの系は第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、非天然アミノ酸を含み、第１のＯ−ＲＳは第１のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。第１の非天然アミノ酸はｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンから選択することができる。
【００１１】
翻訳系は各種起源に由来する成分を使用することができる。１態様では、第１のＯ−ＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ）から誘導される。他の態様では、Ｏ−ＲＳは大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ）から誘導される。系で使用されるＯ−ＲＳは配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７、５９−６３、及びこれらの配列の保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１又は２を含むか又は前記配列によりコードされる。
【００１２】
所定側面では、翻訳系は更に該当蛋白質をコードする核酸を含み、核酸はＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む。
【００１３】
所定側面では、翻訳系は第２の非天然アミノ酸を使用する第２の直交対（即ち、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡ）を含み、従って、系はポリペプチドの異なる選択部位に少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を組込むことが可能になる。このデュアル系では、第２のＯ−ＲＳは第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する。
【００１４】
所定態様では、翻訳系は宿主細胞に存在する（宿主細胞を含む）。Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡがその宿主細胞環境でその直交性を維持する限り、使用される宿主細胞は特に限定されない。宿主細胞は大腸菌等の真正細菌細胞、又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等の酵母細胞とすることができる。宿主細胞はＯ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系の成分をコードする１種以上のポリヌクレオチドを含むことができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１、５６又は５８のヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
本発明は選択位置に１種以上の非天然アミノ酸をもつ蛋白質の生産方法も提供する。これらの方法は上記翻訳系を利用する。一般に、これらの方法は（ｉ）ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンから選択される第１の非天然アミノ酸と；（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、前記Ｏ−ＲＳは前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を提供する段階から開始する。方法は次に、セレクターコドンに応答して蛋白質の翻訳中に蛋白質の選択位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を生産する。
【００１６】
この方法は各種試薬及び段階を使用して広く応用することができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する。所定態様では、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供し、例えば、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供することができる。他の態様では、大腸菌アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供し、例えば野生型大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供することができる。所定態様では、提供段階は配列番号１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７、５９−６３、及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む。
【００１７】
これらの方法の所定態様では、翻訳系を提供する段階は部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階を含む。選択段階は部位特異的突然変異誘発後に得られたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子のプールからＯ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含むことができる。所定態様では、提供段階はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡや、配列番号１又は２に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらの方法では、提供段階は更に翻訳系により利用されるアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供することができる。
【００１８】
これらの方法は２種以上の非天然アミノ酸を蛋白質に組込むように改変することもできる。これらの方法では、第２の直交翻訳系を第１の翻訳系と併用し、第２の系は異なるアミノ酸及びセレクターコドン特異性をもつ。例えば、提供段階は第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含むことができ、第２のＯ−ＲＳは第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する。
【００１９】
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産方法は宿主細胞で実施することもできる。これらの場合には、非天然アミノ酸と、Ｏ−ＲＳと、Ｏ−ｔＲＮＡと、核酸を含む宿主細胞を提供し、宿主細胞を培養することにより非天然アミノ酸を組込む。所定態様では、提供段階は真正細菌宿主細胞（例えば大腸菌）又は酵母宿主細胞を提供する段階を含む。所定態様では、提供段階はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む。例えば、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１、５６又は５８のヌクレオチド配列を含むことができる。所定態様では、翻訳系を提供する段階は細胞抽出液を提供することにより実施される。
【００２０】
所定側面では、本発明は３−ニトロ−Ｌ−チロシン又はｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンを組込むための翻訳系を提供する。これらの系は第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、非天然アミノ酸を含み、第１のＯ−ＲＳは同一非天然アミノ酸と、Ｏ−ｔＲＮＡと、配列番号７−１０から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で第１のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
【００２１】
翻訳系は各種起源に由来する成分を使用することができる。所定態様では、第１のＯ−ＲＳはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（例えば野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ）から誘導される。系で使用されるＯ−ＲＳは配列番号７−１０、及びこれらの配列の保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むことができる。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１を含むか又は前記配列によりコードされる。
【００２２】
所定側面では、翻訳系は更に該当蛋白質をコードする核酸を含み、核酸はＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンをもつ。
【００２３】
所定側面では、翻訳系は第２の非天然アミノ酸を使用する第２の直交対（即ち、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡ）を含み、従って、系はポリペプチドの異なる選択部位に少なくとも２種の異なる非天然アミノ酸を組込むことが可能になる。このデュアル系では、第２のＯ−ＲＳは第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する。
【００２４】
所定態様では、翻訳系は宿主細胞に存在する（宿主細胞を含む）。Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡがその宿主細胞環境でその直交性を維持する限り、使用される宿主細胞は特に限定されない。宿主細胞は大腸菌等の真正細菌細胞とすることができる。宿主細胞はＯ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系の成分をコードする１種以上のポリヌクレオチドを含むことができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。
【００２５】
本発明は選択位置に１種以上の非天然アミノ酸をもつ蛋白質の生産方法も提供する。これらの方法は上記翻訳系を利用する。一般に、これらの方法は（ｉ）３−ニトロ−Ｌ−チロシン又はｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンである第１の非天然アミノ酸と；（ｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；（ｉｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）（但し、Ｏ−ＲＳは前記非天然アミノ酸と、前記Ｏ−ｔＲＮＡと、配列番号７−１０から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記Ｏ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸を含む翻訳系を含む宿主細胞を提供する段階から開始する。次に宿主細胞を増殖させ、セレクターコドンに応答して蛋白質の翻訳中に核酸中のセレクターコドンの位置に対応する蛋白質の選択位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、選択位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を生産する。
【００２６】
これらの方法は各種試薬及び段階を使用して広く応用することができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する。所定態様では、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供し、例えば、野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供することができる。所定態様では、提供段階は配列番号７−１０、及びその保存変異体から選択されるアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む。
【００２７】
これらの方法の所定態様では、翻訳系を提供する段階は部位特異的突然変異誘発により野生型アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポケットを突然変異させる段階と、Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階を含む。選択段階は部位特異的突然変異誘発後に得られたアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子のプールからＯ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む。所定態様では、提供段階はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡや、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。これらの方法では、提供段階は更に翻訳系により利用されるアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供することができる。
【００２８】
これらの方法は２種以上の非天然アミノ酸を蛋白質に組込むように改変することもできる。これらの方法では、第２の直交翻訳系を第１の翻訳系と併用し、第２の系は異なるアミノ酸及びセレクターコドン特異性をもつ。例えば、提供段階は第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含み、第２のＯ−ＲＳは第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡは第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する。
【００２９】
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の生産方法は宿主細胞で実施される。これらの態様では、宿主細胞は非天然アミノ酸と、Ｏ−ＲＳと、Ｏ−ｔＲＮＡと、核酸を含み、宿主細胞を培養することにより非天然アミノ酸を組込む。所定態様では、提供段階は真正細菌宿主細胞（例えば大腸菌）を提供する段階を含む。所定態様では、提供段階はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む。例えば、Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドは配列番号１１のヌクレオチド配列を含むことができる。所定態様では、翻訳系を提供する段階は細胞抽出液を提供することにより実施される。
【００３０】
本発明は更に核酸及び蛋白質を含有する各種組成物を提供する。組成物が特定核酸又は蛋白質を含有する以外に、組成物の種類は特に限定されない。本発明の組成物は任意種類の任意数の付加成分を含むことができる。
【００３１】
例えば、本発明はＯ−ＲＳポリペプチドを含有する組成物を提供し、ポリペプチドは配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７、５９−６３、又はその保存変異体を含み、保存変異体ポリペプチドはＯ−ｔＲＮＡと、非天然アミノ酸と、配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７及び５９−６３から選択されるアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率でコグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明はこれらの上記ポリペプチドの任意のものをコードするポリヌクレオチドも提供する。所定態様では、これらのポリヌクレオチドは配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１、５６及び５８を含むことができる。所定態様では、ポリペプチドは細胞中に存在する。
【００３２】
本発明は配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１、５６又は５８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド組成物も提供する。所定態様では、本発明は前記ポリヌクレオチドを含むベクター（例えば発現ベクター）を提供する。所定態様では、本発明は上記ベクターを含む細胞を提供する。
（定義）
【００３３】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの記載を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「細胞」と言う場合には２個以上の細胞の組合せを含み、「ポリヌクレオチド」と言う場合には実際問題としてそのポリヌクレオチドの多数のコピーを含む。
【００３４】
本欄及び以下に特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００３５】
直交：本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞の内在成分と共働するか、あるいは細胞の内在成分と共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、内在ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働する能力に比較して直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は低効率（例えば２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満の効率）でしか共働できず、あるいは、内在ｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働する能力に比較して直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞内に機能的に正常な相補的内在分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。別の例では、直交ＲＳが該当細胞の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又はゼロである。第１の直交分子と共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応するｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばチロシル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に比較して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞において共働する導入相補成分を含む。
【００３６】
直交チロシルｔＲＮＡ：本明細書で使用する直交チロシルｔＲＮＡ（チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交性のｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するロイシル又はチロシルｔＲＮＡと同一であるか又は実質的に類似しているか、（２）自然又は人工突然変異誘発により天然に存在するロイシル又はチロシルｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）又は（２）の野生型又は突然変異体ロイシル又はチロシルｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型又は突然変異体ロイシル又はチロシルｔＲＮＡと相同であるか；（５）表５にロイシル又はチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡと相同であるか、あるいは（６）表５にロイシル又はチロシルｔＲＮＡシンテターゼの基質として指定する任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。ロイシル又はチロシルｔＲＮＡはアミノ酸を負荷した状態でも負荷しない状態でも存在することができる。更に当然のことながら、「チロシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」又は「ロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼにより夫々チロシン又はロイシン以外のアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）を負荷（アミノアシル化）される。実際に、当然のことながら、本発明のロイシル又はチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して成長中のポリペプチドに天然又は人工のいずれかに拘わらずほぼ任意アミノ酸を挿入するために有利に使用される。
【００３７】
直交チロシルアミノ酸シンテターゼ：本明細書で使用する直交チロシルアミノ酸シンテターゼ（チロシル−Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。チロシル−Ｏ−ＲＳがチロシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するチロシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは表５にＯ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、Ｏ−ＲＳは表５のチロシル−Ｏ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は表５のＯ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
【００３８】
同様に、直交ロイシルアミノ酸シンテターゼ（ロイシル−Ｏ−ＲＳ）とは該当翻訳系においてロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡをアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。ロイシル−Ｏ−ＲＳがロイシル−Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然、非天然又は人工のいずれかを問わずに任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するロイシルアミノ酸シンテターゼと同一又は相同であるか、あるいは表５にＯ−ＲＳとして指定するシンテターゼと同一又は相同である。例えば、Ｏ−ＲＳは表５のロイシル−Ｏ−ＲＳの保存変異体とすることができ、及び／又は表５のＯ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上配列が一致することができる。
【００３９】
コグネイト：「コグネイト」なる用語は共働する成分、例えば直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを意味する。これらの成分は「相補的」であると言うこともできる。
【００４０】
優先的にアミノアシル化する：本明細書で直交翻訳系に関して使用する場合に、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、従って、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００４１】
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳは「Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡの非天然アミノ酸負荷とＯ−ｔＲＮＡの天然アミノ酸負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００４２】
セレクターコドン：「セレクターコドン」なる用語は翻訳プロセスでＯ−ｔＲＮＡにより認識され、内在ｔＲＮＡにより認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。セレクターコドンとしては例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン）等のナンセンスコドン、４塩基以上のコドン、レアコドン、天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン及び／又は同等物を挙げることができる。
【００４３】
サプレッサーｔＲＮＡ：サプレッサーｔＲＮＡは例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン（例えばアンバー、オーカー又はオパールコドン）、４塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。
【００４４】
抑圧活性：本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドンや４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観測される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００４５】
本発明は抑圧活性を定量することが可能な種々の手段を提供する。該当セレクターコドン（例えばアンバーコドン）に対する特定Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの抑圧百分率とは、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及びセレクターコドンをもたない陽性対照構築物に比較して、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む該当翻訳系で発現され、そのコーディング核酸中にセレクターコドンを含む所与試験マーカー（例えばＬａｃＺ）の活性百分率を意味する。従って、例えば、セレクターコドンをもたない活性陽性対照マーカー構築物が所与翻訳系において該当マーカーアッセイに関連する単位で表した観測活性Ｘをもつ場合には、セレクターコドンを含む試験構築物の抑圧百分率は、Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳを更に含む翻訳系で発現される以外は陽性対照マーカーが発現される環境条件とほぼ同一の環境条件下で試験マーカー構築物が示すＸの百分率である。一般に、試験マーカーを発現する翻訳系は更にＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡにより認識されるアミノ酸を含む。場合により、抑圧百分率測定値は、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳにより認識される該当アミノ酸を含まない系で試験マーカーと同一のセレクターコドンを含む「バックグラウンド」又は「陰性」対照マーカー構築物に試験マーカーを比較することにより精密化することができる。この陰性対照は該当翻訳系におけるマーカーからのバックグラウンドシグナル効果を考慮するように抑圧百分率測定値を正規化するのに有用である。
【００４６】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００４７】
翻訳系：「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（蛋白質）にアミノ酸を組込む成分を意味する。翻訳系の成分としては例えばリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等を挙げることができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系に付加するか又はその一部とすることができ、例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）で使用される。
【００４８】
非天然アミノ酸：本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は２０種の標準天然アミノ酸の１種又はセレノシステインもしくはピロリジン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸、及び／又はアミノ酸類似体を意味する。例えば、図１は本発明で利用される１７種の非天然アミノ酸を示す。
【００４９】
から誘導：本明細書で使用する「から誘導」なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか、あるいは特定分子もしくは生物を使用するか又は特定分子もしくは生物からの情報を使用して作製された成分を意味する。例えば、第２のポリペプチドから誘導されるポリペプチドは第２のポリペプチドのアミノ酸配列と同一又は実質的に同様のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドの場合には、誘導種は例えば自然突然変異誘発、人工的特異的突然変異誘発又は人工的ランダム突然変異誘発により得ることができる。ポリペプチドを誘導するために使用される突然変異誘発は意図的に特異的でも意図的にランダムでもよいし、各々の混合でもよい。第１のポリペプチドから誘導される別のポリペプチドを作製するためのポリペプチドの突然変異誘発は（例えばポリメラーゼの非忠実性に起因する）ランダムなイベントとすることができ、誘導されたポリペプチドの同定は例えば本明細書に記載するような適当なスクリーニング法により実施することができる。ポリペプチドの突然変異誘発は一般にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。
【００５０】
ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、該当形質をもたない細胞からこの形質を含む細胞（例えばポジティブ選択マーカーをもつ細胞）を識別するマーカーを意味する。
【００５１】
ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー：本明細書で使用する「ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー」なる用語は、このマーカーが存在する（例えば発現、活性化等される）場合に、（例えば選択性質又は形質をもつ細胞に対して）選択性質又は形質をもたない細胞を識別することができるマーカーを意味する。
【００５２】
レポーター：本明細書で使用する「レポーター」なる用語は該当系のターゲット成分を同定及び／又は選択するために使用することができる成分を意味する。例えば、レポーターとしては蛋白質、例えば抗生物質耐性又は感受性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）等）、蛍光スクリーニングマーカー（例えば緑色蛍光蛋白質（例えばＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ等）、発光マーカー（例えばホタルルシフェラーゼ蛋白質）、アフィニティースクリーニングマーカー、又はポジティブもしくはネガティブ選択マーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ、β−ｇａｌ／ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）、ｈｉｓ３、ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｌｙｓ２等）を挙げることができる。
【００５３】
真核生物：本明細書で使用する「真核生物」なる用語は真核生物界に属する生物を意味する。真核生物はその構成が一般に多細胞であり（但し、例えば酵母のように多細胞ではないものもある）、膜結合核と他の膜結合オルガネラが存在し、遺伝物質が線状であり（即ち染色体が線状）、オペロンが存在せず、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在し、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に原核生物から区別できる。真核生物としては例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
【００５４】
原核生物：本明細書で使用する「原核生物」なる用語はモネラ界（原核生物界とも言う）に属する生物を意味する。原核生物はその構成が単細胞であり、出芽又は分裂による無性生殖であり、膜結合核又は他の膜結合オルガネラをもたず、染色体が環状であり、オペロンが存在し、イントロン、メッセージキャッピング及びポリＡ  ｍＲＮＡが存在せず、更に他の生化学的特徴（例えば特徴的リボソーム構造）により一般に真核生物から区別できる。原核生物は真正細菌及び古細菌亜界を含む。シアノバクテリア（藍藻類）とマイコプラズマをモネラ界の別々の分類にする場合もある。
【００５５】
細菌：本明細書で使用する「細菌」及び「真正細菌」なる用語は「古細菌」から区別できる原核生物を意味する。同様に、古細菌は真正細菌から区別できる原核生物を意味する。真正細菌と古細菌は多数の形態学的及び生化学的基準により区別することができる。例えば、リボソームＲＮＡ配列の相違、ＲＮＡポリメラーゼ構造、イントロンの有無、抗生物質感受性、細胞壁ペプチドグリカン及び他の細胞壁成分の有無、膜脂質構造の分岐の有無、並びにヒストン及びヒストン様蛋白質の有無を使用して生物を真正細菌又は古細菌に分類する。
【００５６】
真正細菌の例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓが挙げられる。古細菌の例としては、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ及びＴｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍが挙げられる。
【００５７】
保存変異体：翻訳成分に関して本明細書で使用する「保存変異体」なる用語は類似する基本成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と同様に機能するが、参照Ｏ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに比較して配列に変異をもつ翻訳成分（例えば保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳ）を意味する。例えば、Ｏ−ＲＳ、又はこのＯ−ＲＳの保存変異体はコグネイトＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えばＮ−アセチルガラクトサミン部分を含むアミノ酸）でアミノアシル化する。この例では、Ｏ−ＲＳと保存変異体Ｏ−ＲＳは同一アミノ酸配列をもたない。保存変異体はこの保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳに相補的である限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。
【００５８】
所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含む。所定態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳに比較して１カ所以上の保存アミノ酸置換を含むと共に、更にＯ−ＲＳ生物活性を維持し、例えば親Ｏ−ＲＳ分子の生物活性の少なくとも１０％を維持し、あるいは、少なくとも２０％、少なくとも３０％、又は少なくとも４０％を維持する保存変異体Ｏ−ＲＳが挙げられる。所定の好ましい態様では、保存変異体Ｏ−ＲＳは親Ｏ−ＲＳ分子の生物活性の少なくとも５０％を維持する。保存変異体Ｏ−ＲＳの保存アミノ酸置換はアミノ酸結合ポケットを含むＯ−ＲＳの任意ドメインに生じることができる。
【００５９】
選択又はスクリーニング物質：本明細書で使用する「選択又はスクリーニング物質」なる用語はこのような物質が存在すると、集団から所定成分を選択／スクリーニングすることができる物質を意味する。例えば、選択又はスクリーニング物質としては限定されないが、例えば栄養素、抗生物質、光波長、抗体、発現されたポリヌクレオチド等が挙げられる。選択物質は例えば濃度、強度等を変動させることができる。
【００６０】
〜に応答して：本明細書で使用する「〜に応答して」なる用語は本発明のｔＲＮＡがセレクターコドンを認識し、ｔＲＮＡと結合した非天然アミノ酸を成長中のポリペプチド鎖に組込むのを媒介するプロセスを意味する。
【００６１】
コードする：本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列鎖とは異なる第２の分子又は配列鎖の生産を誘導するためにポリマー巨大分子又は配列鎖中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。１側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
【００６２】
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を誘導するためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードするトリプレットコドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
本発明は２０種の天然アミノ酸により制限される翻訳系を使用する際の固有の問題を解決する方法を提供する。これらの解決方法は直交翻訳系を使用して新規性質をもつ非天然アミノ酸を蛋白質にプログラム下で部位特異的に生合成的に組込む。本明細書ではセレクターコドン（例えば、アンバーナンセンスコドンＴＡＧ）に応答して各種非天然アミノ酸を蛋白質に高い効率で特異的に遺伝的に組込むための新規組成物（例えば、新規アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ）と新規方法について記載する。
【００６４】
場合により、非天然アミノ酸側鎖をその後、特異的且つ位置選択的に修飾することができる。これらの非天然アミノ酸置換基のユニークな反応化学により、これらを組込んだ蛋白質を非常に高い選択性で修飾することができる。場合により、非天然アミノ酸反応基はｉｎ  ｖｉｖｏ系に対して完全に外来性であるため、反応選択性を改善できるという利点がある。所定側面では、蛋白質に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ両者の結合反応を可能にする比較的温和な反応条件を使用して修飾反応を実施することができるので、蛋白質の生物活性を維持できる。蛋白質中の非天然アミノ酸と結合する材料の種類は特に限定されず、任意所望物質とすることができ、例えば、色素、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（例えばポリエチレングリコール誘導体）、光架橋剤、細胞傷害性化合物、アフィニティーラベル、ビオチン誘導体、樹脂、ビーズ、第２（又は第３以下）の蛋白質又はポリペプチド、ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ，ＲＮＡ等）、金属キレート剤、補因子、脂肪酸、炭水化物等が挙げられる。
【００６５】
他の側面では、組込まれた非天然アミノ酸はこの非天然アミノ酸が組込まれた蛋白質に新規生物学的性質を付与する。例えば、非天然アミノ酸は蛍光アミノ酸、フォトケージド又は光活性化可能なアミノ酸、供与体又は受容体としてＦＲＥＴ対で使用可能なアミノ酸、レドックス活性アミノ酸、金属キレート化アミノ酸等とすることができる。
【００６６】
所定側面では、（限定されないが）本発明を実証するために、本明細書の開示は非天然アミノ酸部分をモデル蛋白質に組込むことができることを実証する。非天然アミノ酸の組込みをこのようなモデル蛋白質に限定するものではない。本明細書の開示から明らかなように、任意所定該当蛋白質への非天然アミノ酸の組込みは治療及び研究用の多様な蛋白質に有利である。
【００６７】
本発明者らはセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸（例えば、図１に示す非天然アミノ酸）を部位特異的に組込むために真正細菌と酵母で機能する新規直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を開発した。要約すると、本発明者らは夫々大腸菌宿主細胞又は酵母宿主細胞でサプレッサーｔＲＮＡに非天然アミノ酸を選択的に負荷するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ及び大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼの新規突然変異体を同定した。
【００６８】
これらの進化型ｔＲＮＡ−シンテターゼ対は各非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むために使用することができる。非天然アミノ酸の蛋白質組込みは非天然アミノ酸の組込みを指示するセレクターコドンを含むように該当蛋白質をコードするポリヌクレオチドを組換えることにより任意所望位置で行われるようにプログラムすることができる。
直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術
【００６９】
本発明の新規組成物及び方法の理解は直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対に関連する活性を理解することにより容易になる。直交ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ技術については例えば、国際公開ＷＯ２００２／０８５９２３、ＷＯ２００２／０８６０７５、ＷＯ２０４／０９４５９、ＷＯ２００５／０１９４１５、ＷＯ２００５／００７８７０及びＷＯ２００５／００７６２４に記載されている。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。
【００７０】
付加反応性非天然アミノ酸を遺伝コードに付加するためには、宿主翻訳機構で効率的に機能することができるが、対が翻訳系に内在性のシンテターゼ及びｔＲＮＡから独立して機能するという意味で該当翻訳系に対して「直交性」のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと適切なｔＲＮＡを含む新規直交対が必要である。直交対の所望特徴としては、内在ｔＲＮＡによりデコードされない特定コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、そのコグネイトｔＲＮＡをただ１種の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（又は負荷）するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡは更に一般に内在シンテターゼによりアミノアシル化されない。例えば大腸菌では、直交対は例えば大腸菌に存在する４０種の内在ｔＲＮＡのいずれとも交差反応しないアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌に存在する２１種の内在シンテターゼのいずれによってもアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含む。
【００７１】
本発明は真正細菌（例えば大腸菌）又は酵母の蛋白質に非天然アミノ酸を遺伝的にコードさせて組込むための直交対を提供し、直交成分は宿主細胞の翻訳機構の内在大腸菌又は酵母成分と交差反応しないが、所望非天然アミノ酸を認識し、セレクターコドン（例えば、アンバーナンセンスコドンＴＡＧ）に応答して蛋白質に組込む。本発明により提供される直交成分としては、真正細菌宿主細胞で直交対として機能するＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、突然変異体チロシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサーが挙げられる。本発明は更に、酵母宿主細胞で直交対として機能する大腸菌ロイシルＲＮＡシンテターゼから誘導される直交成分と突然変異体大腸菌ロイシルｔＲＮＡＣＵＡアンバーサプレッサーも提供する。これらの系では、突然変異体アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはサプレッサーｔＲＮＡを夫々の非天然アミノ酸でアミノアシル化するが、２０種の標準アミノ酸のいずれでもアミノアシル化しない。
【００７２】
本発明は非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために使用することができる付加直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対（例えばＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）の組成物と、前記対の同定及び作製方法を提供する。本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸（例えば図１に示す非天然アミノ酸）の例えばｉｎ  ｖｉｖｏでの組込みを媒介することができる。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンループはｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識し、そのアミノ酸（例えば図１に示す非天然アミノ酸）をポリペプチドのこの部位に組込む。一般に、本発明の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはそのＯ−ｔＲＮＡをただ１種の特定非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化（又は負荷）する。
【００７３】
非天然アミノ酸（例えば図１に示す非天然アミノ酸）を蛋白質に部位特異的に組込むことができると、蛋白質の研究を助長できると共に、新規性質をもつ蛋白質の開発が可能になる。例えば、１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質の発現は特異的標識による蛋白質の試験を容易にし、酵素の触媒機能を改変し、生体活性を改善又は基質に対する交差反応性を低減し、蛋白質を他の蛋白質、小分子又は生体分子と架橋し、蛋白質分解を低減又は排除し、（例えば、導入した反応部位のペグ化又は他の修飾により）蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を改善すること等が可能になる。
直交ｔＲＮＡ／直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ及びその対
【００７４】
１種以上の非天然アミノ酸を含む蛋白質の作製に適した翻訳系は例えば国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ−ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）；ＷＯ２００５／００７８７０（出願日２００４年７月７日）；及びＷＯ２００５／００７６２４（出願日２００４年７月７日）に記載されている。これらの各出願はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。このような翻訳系は一般に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸を含む細胞（例えば大腸菌等の非真核細胞又は酵母等の真核細胞とすることができる）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化する。本発明の直交対はＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ、フレームシフトｔＲＮＡ等）とＯ−ＲＳを含む。本発明は個々の成分も提供する。
【００７５】
一般に、直交対がセレクターコドンを認識し、セレクターコドンに応答してアミノ酸を負荷するとき、直交対はセレクターコドンを「抑圧」すると言う。即ち、翻訳系の（例えば細胞の）内在機構により認識されないセレクターコドンは通常翻訳されないので、非抑圧下で核酸から翻訳されるポリペプチドの生産を阻止することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識し、本明細書の配列表に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを該当非天然アミノ酸でアミノアシル化する。細胞は例えば該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を介して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むためにＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を使用し、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。所定の望ましい側面では、細胞は付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含むことができ、付加Ｏ−ｔＲＮＡは付加Ｏ−ＲＳにより別の非天然アミノ酸を負荷される。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの一方は４塩基コドンを認識することができ、他方は終止コドンを認識することができる。あるいは、複数の異なる終止コドン又は複数の異なる４塩基コドンが異なるセレクターコドンを特異的に認識することができる。
【００７６】
本発明の所定態様では、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む細胞（例えば大腸菌細胞又は酵母細胞）が提供され、ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。翻訳系は無細胞系でもよく、例えば各種市販「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」転写／翻訳系の任意のものを本明細書に記載するようなＯ−ｔＲＮＡ／ＯＲＳ対及び非天然アミノ酸と併用することができる。
【００７７】
１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば約５倍、１０倍、１５倍、２０倍、又は２５倍以上である。１側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率は本明細書の配列表に記載するような直交シンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも例えば約３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上である。
【００７８】
上記のように、本発明は場合により細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含み、２種以上の非天然アミノ酸を組込むことができる。例えば、細胞は更に別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対（Ｏ−ｔＲＮＡは例えばアンバーセレクターコドンを認識する）を含む細胞は更に第２の直交対を含むことができ、第２のＯ−ｔＲＮＡは別のセレクターコドン（例えばオパールコドン、４塩基コドン等）を認識する。各直交対は異なるセレクターコドンの認識を助長できるように異なる起源に由来することが望ましい。
【００７９】
Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは天然に存在するものでもよいし、例えば種々の生物の任意のものに由来するｔＲＮＡのライブラリー及び／又はＲＳのライブラリーを作製するか及び／又は種々の利用可能な突然変異ストラテジーの任意のものを使用することにより、天然に存在するｔＲＮＡ及び／又はＲＳの突然変異により誘導してもよい。例えば、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための１つのストラテジーは例えば宿主細胞以外の起源又は多重起源に由来する（宿主に対して）異種のｔＲＮＡ／シンテターゼ対を宿主細胞に導入する方法である。異種シンテターゼ候補の特性としては、例えば宿主細胞ｔＲＮＡに負荷しないことが挙げられ、異種ｔＲＮＡ候補の特性としては、例えば宿主細胞シンテターゼによりアミノアシル化されないことが挙げられる。更に、異種ｔＲＮＡは全宿主細胞シンテターゼに対して直交性である。
【００８０】
直交対を作製するための第２のストラテジーはＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳをスクリーニング及び／又は選択するための突然変異体ライブラリーを作製する方法である。これらのストラテジーを組み合わせてもよい。
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）
【００８１】
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）はＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドによりコードされる蛋白質への非天然アミノ酸の例えばｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組込みを媒介することが望ましい。所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表のＯ−ｔＲＮＡ配列に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡに比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。
【００８２】
抑圧効率は当分野で公知の多数のアッセイの任意のものにより測定することができる。例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターアッセイを使用することができ、例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡを含むプラスミドと共に修飾ｌａｃＺプラスミド（構築物はｌａｃＺ核酸配列中にセレクターコドンをもつ）を適当な生物（例えば直交成分を使用することができる生物）に由来する細胞に導入する。コグネイトシンテターゼも（ポリペプチド又は発現されるとコグネイトシンテターゼをコードするポリヌクレオチドとして）導入することができる。細胞を培地で所望密度（例えばＯＤ６００＝約０．５）まで増殖させ、例えばＢｅｔａＦｌｕｏｒ（登録商標）β−ガラクトシダーゼアッセイキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用してβ−ガラクトシダーゼアッセイを実施する。比較可能な対照（例えば所望位置にセレクターコドンではなく対応するセンスコドンをもつ修飾ｌａｃＺ構築物から観測される値）に対するサンプルの活性百分率として抑圧百分率を計算することができる。
【００８３】
本発明のＯ−ｔＲＮＡの例を本明細書の配列表に記載する。代表的Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表、実施例及び図面も参照。更に、本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。Ｏ−ＲＳ  ｍＲＮＡ又はＯ−ｔＲＮＡ分子等のＲＮＡ分子では、所与配列又はその相補配列に対してチミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）で置換されている（コーディングＤＮＡでは逆）。塩基に付加修飾を加えてもよい。
【００８４】
本発明は本明細書に記載する特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体も含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体としては、例えば本明細書の配列表に記載するような特定Ｏ−ｔＲＮＡと同様に機能し、適当な自己相補性によりｔＲＮＡ  Ｌ形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面又は実施例に記載する配列と同一配列をもたない分子が挙げられる（更に野生型ｔＲＮＡ分子以外のものであることが望ましい）。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【００８５】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含むことができ、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は更に（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）翻訳系を含むことができる。該当ポリペプチドをコードし、Ｏ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを含む核酸、又はこれらの１種以上の組み合わせも細胞に加えることができる。本明細書の「直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」のセクションも参照。
【００８６】
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法も本発明の特徴である。本方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも本発明の特徴である。本発明の所定態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体ライブラリーを作製することにより作製することができる。突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ｔＲＮＡは例えば表５の代表的Ｏ−ｔＲＮＡの部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。
【００８７】
ｔＲＮＡの所望ループ又は領域（例えばアンチコドンループ、受容体ステム、Ｄアーム又はループ、可変ループ、ＴＰＣアーム又はループ、ｔＲＮＡ分子の他の領域又はその組合せ）の特定位置（例えば非保存位置又は保存位置）、ランダム位置又は両者の組合せに付加突然変異を導入することができる。一般に、ｔＲＮＡの突然変異としてはセレクターコドンの認識を可能にするように突然変異体ｔＲＮＡライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させる方法が挙げられる。この方法は更にＯ−ｔＲＮＡに付加配列を付加する段階を含むことができる。一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは所望ＲＳに対するその親和性等を維持しながら、出発材料（例えば複数のｔＲＮＡ配列）に比較して所望生物に対する直交性が改善されている。
【００８８】
前記方法は場合によりｔＲＮＡ及び／又はアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの配列の類似性（及び／又は推定相同性）を分析し、特定生物に対して直交性であると思われるＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ及び／又はその対の潜在候補を決定する段階を含む。分析には、当分野で公知であり、本明細書に記載するコンピュータープログラム（例えばＢＬＡＳＴ及びｐｉｌｅｕｐプログラム）を使用することができる。１例では、大腸菌で使用するための潜在的直交翻訳成分を選択するためには、真正細菌生物に密接な配列類似性を示さないシンテターゼ及び／又はｔＲＮＡを選択する。
【００８９】
一般に、Ｏ−ｔＲＮＡは複数の潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのメンバーを含む第１の種の細胞の集団に例えばネガティブ選択を実施することにより得られる。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に直交性のｔＲＮＡプールが得られる。
【００９０】
所定態様において、ネガティブ選択では、ネガティブ選択マーカー（例えば抗生物質耐性を付与する酵素（例えばβ−ラクタマーゼ）、検出可能な産物を付与する酵素（例えばβ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ））、例えば毒性物質（例えばバルナーゼ））をコードするポリヌクレオチドの（例えば機能的バルナーゼを依然として産生する）非必須位置等にセレクターコドンを導入する。場合により選択物質（例えばアンピシリン等の抗生物質）の存在下で細胞集団を増殖させることによりスクリーニング／選択を実施する。１態様では、選択物質の濃度を変動させる。
【００９１】
例えば、サプレッサーｔＲＮＡの活性を測定するためには、セレクターコドン（例えばネガティブ選択マーカー（例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ））をコードするポリヌクレオチドに導入されたナンセンス（例えば終止）又はフレームシフト突然変異）のｉｎ  ｖｉｖｏ抑圧に基づく選択システムを使用する。例えば、所定位置（例えばＡ１８４）にセレクターコドンをもつポリヌクレオチド変異体（例えばｂｌａ変異体）を構築する。細胞（例えば細菌）をこれらのポリヌクレオチドで形質転換する。内在大腸菌シンテターゼにより効率的に負荷することができない直交ｔＲＮＡの場合には、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性）はプラスミドで形質転換されていない細菌と同等以下のはずである。ｔＲＮＡが非直交性の場合、又はｔＲＮＡに負荷することが可能な異種シンテターゼをシステムで同時発現させる場合には、より高レベルの抗生物質（例えばアンピシリン）耐性が観測される。プラスミドで形質転換されていない細胞と同等の抗生物質濃度のＬＢ寒天プレートで増殖することができない細胞（例えば細菌）を選択する。
【００９２】
毒性物質（例えばリボヌクレアーゼ又はバルナーゼ）の場合には、複数の潜在的ｔＲＮＡのメンバーが内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼによりアミノアシル化されるとき（即ち、宿主（例えば大腸菌）シンテターゼに非直交性であるとき）には、セレクターコドンは抑圧され、生産される毒性ポリヌクレオチド産物は細胞死を生じる。直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む細胞は生存する。
【００９３】
１態様では、所望生物に直交性のｔＲＮＡプールに次にポジティブ選択を実施し、セレクターコドンを例えばβ−ラクタマーゼ遺伝子等の薬剤耐性遺伝子によりコードされるポジティブ選択マーカーに配置する。ポジティブ選択は細胞に直交性のｔＲＮＡプールのメンバーをコードするか又は前記メンバーを含むポリヌクレオチドと、ポジティブ選択マーカーをコードするポリヌクレオチドと、コグネイトＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む細胞で実施される。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。ポリヌクレオチドを細胞で発現させ、選択物質（例えばアンピシリン）の存在下で細胞を増殖させる。次に、同時発現させたコグネイトシンテターゼによりアミノアシル化され、このセレクターコドンに応答してアミノ酸を挿入することができるｔＲＮＡを選択する。一般に、これらの細胞は非機能的ｔＲＮＡ、又は該当シンテターゼにより効率的に認識することができないｔＲＮＡを含む細胞に比較して高い抑圧効率を示す。非機能的ｔＲＮＡ又は該当シンテターゼにより効率的に認識されないｔＲＮＡを含む細胞は抗生物質に感受性である。従って、（ｉ）内在宿主（例えば大腸菌）シンテターゼの基質ではなく；（ｉｉ）該当シンテターゼによりアミノアシル化することができ；（ｉｉｉ）翻訳で機能的なｔＲＮＡが両者選択後に生存している。
【００９４】
従って、スクリーニングされる状況に応じて同一マーカーがポジティブマーカーにもネガティブマーカーにもなる。即ち、マーカーがポジティブスクリーニングされる場合にはポジティブマーカーであり、ネガティブスクリーニングされる場合にはネガティブマーカーである。
【００９５】
上記方法における選択（例えばポジティブ選択、ネガティブ選択又はポジティブ選択とネガティブ選択の両者）のストリンジェンシーは場合により選択ストリンジェンシーの変動を含む。例えば、バルナーゼは極毒性蛋白質であるので、異なる数のセレクターコドンをバルナーゼ遺伝子に導入するか及び／又は誘導プロモーターを使用することによりネガティブ選択のストリンジェンシーを制御することができる。別の例では、選択又はスクリーニング物質の濃度（例えばアンピシリン濃度）を変動させる。本発明の１側面では、初期ラウンド中の所望活性は低いと思われるのでストリンジェンシーを変動させる。即ち、初期ラウンドでは低ストリンジェンシー選択基準を適用し、後期ラウンドの選択では高ストリンジェンシー基準を適用する。所定態様では、ネガティブ選択、ポジティブ選択又はネガティブ選択とポジティブ選択の両方を複数回反復することができる。複数の異なるネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はネガティブ選択マーカーとポジティブ選択マーカーの両方を使用することができる。所定態様では、ポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーを同一にすることができる。
【００９６】
本発明ではセレクターコドンに応答して非天然アミノ酸を負荷する直交翻訳成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を作製するために他の型の選択／スクリーニングを使用することもできる。例えば、ネガティブ選択マーカー、ポジティブ選択マーカー又はポジティブ選択マーカーとネガティブ選択マーカーの両方として、適切な反応体の存在下で蛍光発光するか又は発光反応を触媒するマーカーを使用することができる。別の態様では、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）又は発光によりマーカーの産物を検出する。場合により、マーカーはアフィニティースクリーニングマーカーを含む。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９０：１０４４４−８も参照。
【００９７】
組換え直交ｔＲＮＡの他の作製方法も例えば国際出願公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；及びＷＯ２００５／０１９４１５（出願日２００４年７月７日）に記載されている。Ｆｏｒｓｔｅｒら，（２００３）Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＰＮＡＳ  １００（１１）：６３５３−６３５７；及びＦｅｎｇら，（２００３），Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔＲＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｈａｎｇｅ，ＰＮＡＳ  １００（１０）：５６７６−５６８１も参照。
直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）
【００９８】
本発明のＯ−ＲＳはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳを含むポリペプチド及び／又はＯ−ＲＳ又はその一部をコードするポリヌクレオチドにより翻訳系（例えば細胞）に提供することができる。例えば、Ｏ−ＲＳの１例は本明細書の配列表と実施例に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。別の例では、Ｏ−ＲＳ、又はその一部は本明細書の配列表又は実施例に記載する配列を含むアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。例えば、代表的Ｏ−ＲＳ分子の配列については本明細書の表及び実施例参照。本明細書の「核酸及びポリペプチド配列と変異体」のセクションも参照。
【００９９】
Ｏ−ｔＲＮＡと併用する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（例えばＯ−ＲＳ）の同定方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は第１の種の細胞集団について選択（例えばポジティブ選択）を実施する段階を含み、前記細胞は１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）のメンバー（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）と；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）（例えばポジティブ）選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞を選択又はスクリーニングする。抑圧効率は当分野で公知の技術及び本明細書に記載するように測定することができる。抑圧効率の高い細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。第１の種に由来する第１組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルを第２の種に由来する第２組のｔＲＮＡの活性ＲＳによる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）アミノアシル化レベルと比較する。アミノアシル化レベルは検出可能な物質（例えば標識非天然アミノ酸）により測定することができる。第１組のｔＲＮＡに比較して第２組のｔＲＮＡをより効率的にアミノアシル化する活性ＲＳを一般に選択することにより、Ｏ−ｔＲＮＡと併用する効率的（最適化）直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが得られる。この方法により同定されたＯ−ＲＳも本発明の特徴である。
【０１００】
アミノアシル化を測定するためには多数のアッセイの任意のものを使用することができる。これらのアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイは例えばＨｏｂｅｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｌ（１９８５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１３：５５−５９に記載されている。アミノアシル化は直交翻訳成分と共にレポーターを使用し、蛋白質をコードする少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを発現する細胞でレポーターを検出することにより測定することもできる。ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」も参照。
【０１０１】
同定されたＯ−ＲＳを更に操作し、所望非天然アミノ酸のみをＯ−ｔＲＮＡに負荷し、２０種の標準アミノ酸のいずれをも負荷しないようにシンテターゼの基質特異性を改変することができる。非天然アミノ酸に対して基質特異性をもつ直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの作製方法は例えばシンテターゼの活性部位、シンテターゼの編集メカニズム部位、シンテターゼの各種ドメインを組み合わせることによる各種部位等でシンテターゼを突然変異させる段階と、選択プロセスを適用する段階を含む。ポジティブ選択後にネガティブ選択を行う併用に基づくストラテジーを使用する。ポジティブ選択では、ポジティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、細胞はポジティブ選択圧下で生存する。従って、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者の存在下で生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷する活性シンテターゼをコードする。ネガティブ選択では、ネガティブマーカーの非必須位置に導入したセレクターコドンが抑圧されると、天然アミノ酸特異性をもつシンテターゼは除去される。ネガティブ選択とポジティブ選択の生存細胞は直交サプレッサーｔＲＮＡを非天然アミノ酸のみでアミノアシル化（負荷）するシンテターゼをコードする。その後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発（例えばＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法）に付すことができる。
【０１０２】
突然変異体Ｏ−ＲＳのライブラリーは当分野で公知の種々の突然変異誘発技術を使用して作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳは部位特異的突然変異、ランダム点突然変異、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築又はその任意組み合わせにより作製することができる。例えば、突然変異体ＲＳのライブラリーは２種以上の他の例えばサイズとダイバーシティーの小さい「サブライブラリー」から作製することができる。ＲＳのキメラライブラリーも本発明に含まれる。なお、場合により各種生物（例えば真正細菌又は古細菌等の微生物）に由来するｔＲＮＡシンテターゼのライブラリー（例えば天然ダイバーシティーを含むライブラリー）（例えば米国特許第６，２３８，８８４号（Ｓｈｏｒｔら）；米国特許第５，７５６，３１６号（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら）；米国特許第５，７８３，４３１号（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら）；米国特許第５，８２４，４８５号（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら）；米国特許第５，９５８，６７２号（Ｓｈｏｒｔら）参照）を構築し、直交対についてスクリーニングする。
【０１０３】
シンテターゼにポジティブ及びネガティブ選択／スクリーニングストラテジーを実施した後、これらのシンテターゼを更に突然変異誘発することができる。例えば、Ｏ−ＲＳをコードする核酸を単離することができ；（例えばランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組換え又はその任意組み合わせにより）突然変異Ｏ−ＲＳをコードする１組のポリヌクレオチドを核酸から作製することができ；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまでこれらの個々の段階又はこれらの段階の組み合わせを繰り返すことができる。本発明の所定側面では、前記段階を複数回、例えば少なくとも２回実施する。
【０１０４】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、又はその対を作製するための本発明の方法では、付加レベルの選択／スクリーニングストリンジェンシーを使用することもできる。選択又はスクリーニングストリンジェンシーはＯ−ＲＳの作製方法の一方又は両方の段階で変動させることができる。これは例えば選択／スクリーニング物質の使用量等の変動とすることができる。付加ラウンドのポジティブ及び／又はネガティブ選択を実施することもできる。選択又はスクリーニングは更にアミノ酸浸透率の変化、翻訳効率の変化、翻訳忠実度の変化等の１種以上を含むこともできる。一般に、１種以上の変化は蛋白質を生産するために直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を使用する生物における１個以上の遺伝子の突然変異に基づく。
【０１０５】
Ｏ−ＲＳの作製と、シンテターゼの基質特異性の改変に関するその他の一般的な詳細については国際公開ＷＯ２００２／０８６０７５、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＯＲＴＨＯＧＯＮＡＬ  ｔＲＮＡ  ＡＭＩＮＯＡＣＹＬ−ｔＲＮＡ  ＳＹＮＴＨＥＴＡＳＥ  ＰＡＩＲＳ）」；及びＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」に記載されている。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。
資源及び宿主生物
【０１０６】
本発明の直交翻訳成分（Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳ）はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ成分と宿主系が直交に作用するという条件で他の任意種に由来する宿主翻訳系で使用するために任意生物（又は生物組み合わせ）に由来することができる。直交対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは同一生物に由来する必要はない。所定側面では、直交成分は真正細菌宿主系で使用するために古細菌遺伝子（即ち古細菌）に由来する。
【０１０７】
例えば、直交Ｏ−ｔＲＮＡは古細菌生物、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは生物又は生物組み合わせ、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの資源として使用することができる。
【０１０８】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来する。
【０１０９】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニングすることができ、及び／又は非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するために細胞（例えば真正細菌細胞）で使用することができる。使用される真正細菌細胞は限定されないが、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｐｈｉｌｕｓ等である。本発明の翻訳成分を含む真正細菌細胞の組成物も本発明の特徴である。
【０１１０】
別の種で使用するためにある種のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングする方法については、国際出願公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」（出願日２００４年４月１６日）も参照。
【０１１１】
所定側面では、非天然アミノ酸を組込んだポリペプチドを生産するためにＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対をｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択又はスクリーニング及び／又は細胞（例えば真核細胞）で使用することができる。使用する真核細胞は限定されず、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の適切な任意酵母細胞を使用することができる。本発明の翻訳成分を組込んだ真核細胞の組成物も本発明の特徴である。
【０１１２】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは各種利点があるので、真核宿主種として選択することができる。この種は単細胞であり、１世代の寿命が短く、遺伝的に十分に特性決定されている。例えばＤ．Ｂｕｒｋｅら，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照。更に、真核生物の翻訳機構は高度に保存されている（例えば（１９９６）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｙ．Ｋｗｏｋ，＆  Ｊ．Ｔ．Ｗｏｎｇ，（１９８０），Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｕｔｉｒｕｂｒｕｍ  ａｎｄ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｍｉｎｏａｃｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ａｓ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８：２１３−２１８；及び（２００１）Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ参照）ので、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発見された非天然アミノ酸の組込み用Ｏ−ＲＳ遺伝子（例えば、野生型大腸菌ＲＳ配列に由来するＯ−ＲＳ遺伝子）を高等真核生物（例えば哺乳動物細胞）に導入し、非天然アミノ酸を組込むためにコグネイトｔＲＮＡと併用することができる（例えばＫ．Ｓａｋａｍｏｔｏら，（２００２）Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：４６９２−４６９９；及びＣ．Ｋｏｈｒｅｒら，（２００１），Ｉｍｐｏｒｔ  ｏｆ  ａｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｏｃｈｒｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔＲＮＡｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：１４３１０−１４３１５参照）。
【０１１３】
（例えば、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を含む）直交翻訳系は非天然アミノ酸をもつ蛋白質を生産するために培養宿主細胞を利用することができるが、本発明の直交翻訳系は無傷の生存宿主細胞を必要とするものではない。例えば、直交翻訳系は細胞抽出液の存在下で無細胞系を利用することができる。実際に、蛋白質生産に無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を使用することは確立した技術である。本明細書に記載する直交翻訳系成分を使用して非天然アミノ酸をもつ蛋白質を生産するようにこれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を適応させることは十分に本発明の範囲に含まれる。
セレクターコドン
【０１１４】
本発明のセレクターコドンは蛋白質生合成機構の遺伝コドン枠を拡張する。例えば、セレクターコドンとしては例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）等の終止コドン）、非天然コドン、少なくとも４塩基のコドン、レアコドン等が挙げられる。例えば１個以上、２個以上、４個以上等の多数のセレクターコドンを所望遺伝子に導入することができる。複数の異なるセレクターコドンを使用することにより、これらの異なるセレクターコドンを使用して（例えば少なくとも１種の非天然アミノ酸を含む）複数の非天然アミノ酸の同時部位特異的組込みを可能にする複数の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用することができる。
【０１１５】
１態様では、本方法は非天然アミノ酸を細胞にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むために終止コドンであるセレクターコドンを使用する。例えば、終止コドンを認識し、Ｏ−ＲＳにより非天然アミノ酸でアミノアシル化されるＯ−ｔＲＮＡを作製する。このＯ−ｔＲＮＡは天然に存在する宿主のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。慣用部位特異的突然変異誘発法を使用して該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの該当部位に終止コドンを導入することができる。例えばＳａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら，（１９８８），５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７９１−８０２参照。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び該当ポリペプチドをコードする核酸を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで併用すると、非天然アミノ酸は終止コドンに応答して組込まれ、特定位置に非天然アミノ酸を含むポリペプチドが得られる。本発明の１態様では、セレクターコドンとして使用される終止コドンはアンバーコドンＵＡＧ及び／又はオパールコドンＵＧＡである。１例では、セレクターコドンとしてＵＡＧとＵＧＡの両者を使用する遺伝コードは存在度が最も高い終結シグナルであるオーカーナンセンスコドンＵＡＡを保存しながら２２種のアミノ酸をコードすることができる。
【０１１６】
非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（ＵＡＧコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）放出因子１（ＲＦ１）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加するか又はＲＦ１欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＡＧコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）と（終止コドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する）真核放出因子（例えばｅＲＦ）の競合に依存するので、例えばＯ−ｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、付加化合物、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤も加えてもよい。
【０１１７】
非天然アミノ酸はレアコドンでコードすることもできる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成反応でアルギニン濃度を下げると、レアアルギニンコドンＡＧＧはアラニンでアシル化された合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であることが分かっている。例えばＭａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９（１９９３）参照。この場合には、合成ｔＲＮＡは大腸菌に少量種として存在する天然ｔＲＮＡＡｒｇと競合する。更に、生物によっては全トリプレットコドンを使用しないものもある。Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓで割り当てられないコドンＡＧＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳抽出物へのアミノ酸挿入に使用されている。例えばＫｏｗａｌ  ａｎｄ  Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２５：４６８５（１９９７）参照。本発明の成分はこれらのレアコドンをｉｎ  ｖｉｖｏ使用するために作製することができる。
【０１１８】
セレクターコドンは更に拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）も含むことができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用すると同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９も参照。
【０１１９】
例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むために４塩基コドンが使用されている。例えばＭａら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：３４参照。２個の化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体をストレプトアビジンに同時にｉｎ  ｖｉｔｒｏで組込むためにＣＧＧＧとＡＧＧＵが使用されている。例えばＨｏｈｓａｋａら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１２１９４参照。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験では、ＭｏｏｒｅらはＮＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドン（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る）を抑圧する能力を試験し、４塩基ＵＡＧＡはＵＣＵＡアンチコドンをもつｔＲＮＡＬｅｕにより１３〜２６％の効率でデコードすることができるが、０又は−１フレームでは殆どデコードできないことを見出した。Ｍｏｏｒｅら，（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５参照。１態様では、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを本発明で使用し、他の望ましくない部位でのミスセンス読み飛ばしとフレームシフト抑圧を減らすことができる。４塩基コドンは各種直交系でセレクターコドンとして使用されている。例えば、ＷＯ２００５／０１９４１５；ＷＯ２００５／００７８７０；及びＷＯ２００５／００７６２４参照。その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）も参照。下記実施例ではアンバーセレクターコドンを使用しているが、４塩基Ｏ−ｔＲＮＡと各種非天然アミノ酸Ｏ−ＲＳについて従来記載されている突然変異と同様の突然変異を含むように改変したシンテターゼを使用するように下記実施例を変更することにより、４塩基以上のコドンも使用することができる。
【０１２０】
所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、内在系はこの天然塩基コドンを使用しない（又は殆ど使用しない）。例えば、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系、及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
【０１２１】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝子アルファベットを拡張する。塩基対が１個増えると、トリプレットコドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。方法と組成物に適応可能な非天然塩基対については、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２に記載されている。Ｗｕ，Ｙ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。他の関連文献は以下に挙げる。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化され、対応する三リン酸塩を形成する。更に、増加した遺伝情報は安定しており、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらによる従来の報告はカノニカルワトソンクリック対とは異なる水素結合パターンを利用しており、そのうちで最も注目される例はイソＣ：イソＧ対である。例えばＳｗｉｔｚｅｒら，（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３：３３；Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２参照。これらの塩基は一般に天然塩基とある程度まで誤対合し、酵素複製することができない。Ｋｏｏｌらは水素結合を塩基間の疎水性パッキング相互作用に置き換えることにより塩基対の形成を誘導できることを立証した。Ｋｏｏｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３６，２８２５参照。上記全要件を満足する非天然塩基対を開発する目的でＳｃｈｕｌｔｚ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇらは一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は天然塩基対よりも安定しており、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＫＦ）によりＤＮＡに効率的に組込むことができる。例えばＭｃＭｉｎｎら，（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：３２７４参照。生体機能に十分な効率と選択性でＫＦにより３ＭＮ：３ＭＮ自己対を合成することができる。例えばＯｇａｗａら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：８８０３参照。しかし、どちらの塩基も後期複製用チェーンターミネーターとして作用するものである。ＰＩＣＳ自己対を複製するために使用できる突然変異体ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。更に、７ＡＩ自己対も複製することができる。例えばＴａｅら，（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：７４３９参照。Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると安定な対を形成する新規メタロ塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら，（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１０７１４参照。拡張コドンと非天然コドンは天然コドンに本質的に直交性であるので、本発明の方法は天然コドンに直交性のｔＲＮＡを作製するためにこの性質を利用することができる。
【０１２３】
翻訳バイパス系を使用して非天然アミノ酸を所望ポリペプチドに組込むこともできる。１翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に挿入されるが、蛋白質に翻訳されない。この配列はリボソームに配列を飛び越させて挿入の下流の翻訳を再開するための合図として機能する構造を含む。
非天然アミノ酸
【０１２４】
本明細書で使用する非天然アミノ酸とはセレノシステイン及び／又はピロリジンと２０種の遺伝的にコードされる以下のα−アミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。α−アミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化１】
0005539948.tif 000002
により表される。
【０１２５】
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のα−アミノ酸以外の天然化合物でもよい。
【０１２６】
本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖が天然アミノ酸と異なるので、天然蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつ。
【０１２７】
本発明では図１に示す非天然アミノ酸が特に重要である。例えば、これらの非天然アミノ酸としては限定されないが、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。本発明ではこれらの非天然アミノ酸のＬ及びＤエナンチオマーのどちらも利用できる。
【０１２８】
図１の非天然アミノ酸に加え、例えば本発明により提供される直交対と適切な第２のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を併用して他の非天然アミノ酸を同時に該当ポリペプチドに組込むことができる。多数のこのような付加非天然アミノ酸と適切な直交対が公知である。本明細書の引用文献参照。例えば、その開示内容全体を参考資料として本明細書に組込むＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ“Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，”Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４４（１）：３４−６６（２００５）参照。
【０１２９】
他の非天然アミノ酸では、例えば、式ＩにおけるＲは場合によりアルキル、アリール、アシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、エーテル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、エノン、イミン、エステル、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、ケト含有アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、アミノ酸側鎖と結合した糖部分、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学分解性又は光分解性アミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。
【０１３０】
別の側面では、本発明は下式ＩＶ：
【化２】
0005539948.tif 000003
により表される一般構造をもつ非天然アミノ酸を提供する。
【０１３１】
この構造をもつ非天然アミノ酸は一般にＲ１が２０種の天然アミノ酸の１種で使用される置換基（例えば、チロシン又はフェニルアラニン）であり、Ｒ２が置換基である任意構造である。従って、この種のアミノ酸は天然アミノ酸誘導体とみなすことができる。
【０１３２】
図１に示す非天然アミノ酸等の新規側鎖を含む非天然アミノ酸に加え、非天然アミノ酸は場合により例えば式ＩＩ及びＩＩＩ：
【化３】
0005539948.tif 000004
の構造により表されるような修飾主鎖構造も含み、上記式中、Ｚは一般にＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み、ＸとＹは同一でも異なっていてもよく、一般にＳ又はＯであり、ＲとＲ’は場合により同一又は異なり、一般に式Ｉをもつ非天然アミノ酸について上記に記載したＲ基と同一の基及び水素から選択される。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合により式ＩＩ及びＩＩＩにより表されるようにアミノ又はカルボキシル基に置換を含む。この種の非天然アミノ酸としては限定されないが、例えば２０種の標準天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖をもつα−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが挙げられる。更に、α炭素の置換は場合によりＬ、Ｄ又はα，α−ジ置換アミノ酸（例えばＤ−グルタミン酸、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸等）を含む。他の代替構造としては環状アミノ酸（例えばプロリン類似体や、３、４、６、７、８及び９員環プロリン類似体）、β及びγアミノ酸（例えば置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸）が挙げられる。
【０１３３】
所定側面では、本発明はＬ配置の非天然アミノ酸を利用する。しかし、本発明はＬ配置非天然アミノ酸の使用に限定されない。本発明ではこれらの非天然アミノ酸のＤエナンチオマーも利用できると考えられる。
【０１３４】
チロシン類似体としてはパラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンはアルキニル基、アセチル基、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖又は分岐鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基等を含む。更に、多置換アリール環も考えられる。本発明のグルタミン類似体としては限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。フェニルアラニン類似体の例としては限定されないが、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基はアルキニル基、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、ニトロ、チオール基又はケト基等を含む。非天然アミノ酸の特定例としては限定されないが、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリンアミノ酸、７−ヒドロキシ−クマリンアミノ酸、ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられる。更に、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（ＤＨＰ）、３，４，６−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、３，４，５−トリヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニトロ−フェニルアラニン、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチルフェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、３−ニトロ−チロシン、３−チオール−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−Ｄｏｐａ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、及びイソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン等が挙げられる。各種非天然アミノ酸の構造は本明細書（例えば図１）に示す。公開国際出願ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」も参照。
非天然アミノ酸の化学的合成
【０１３５】
上記非天然アミノ酸の多くは例えばＳｉｇｍａ（米国）やＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，米国）から市販されている。市販されていないものは場合により各種刊行物に記載されている方法や当業者に公知の標準方法を使用して合成される。有機合成技術については例えばＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎ著Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２，第２版，Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；Ｍａｒｃｈ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，１９８５，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇ著Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第３版，Ｐａｒｔｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）参照。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては例えばＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）」；Ｍａｔｓｏｕｋａｓら，（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．＆  Ｋｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．＆  Ｃｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３，１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．＆  Ｆｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４，１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｒａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ａｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら，（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  α−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−α−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−α−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら，（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）も参照。
非天然アミノ酸の細胞取込み
【０１３６】
細胞による非天然アミノ酸取り込みは例えば蛋白質に組込むように非天然アミノ酸を設計及び選択する場合に一般に考慮される問題の１つである。例えば、α−アミノ酸は電荷密度が高いため、これらの化合物は細胞に浸透しにくいと思われる。天然アミノ酸は異なる程度のアミノ酸特異性を示すことが多い一連の蛋白質輸送システムにより細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が細胞に取り込まれる場合にはどの非天然アミノ酸が取り込まれるかを判断する迅速なスクリーニングを実施することができる。例えば国際公開ＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」（出願日２００３年１２月２２日）；及びＬｉｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ  ９６：４７８０−４７８５における毒性アッセイ参照。取込みは種々のアッセイで容易に分析されるが、細胞取込み経路に利用可能な非天然アミノ酸を設計する代替方法は、アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産する生合成経路を提供する方法である。
非天然アミノ酸の生合成
【０１３７】
細胞にはアミノ酸と他の化合物を生産するために多数の生合成経路が元々存在している。特定非天然アミノ酸の生合成法は自然界（例えば細胞中）には存在しないと思われるが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は場合により新規酵素を付加するか又は既存宿主細胞経路を改変することにより宿主細胞で作製される。付加新規酵素は場合により天然酵素又は人工的に進化させた酵素である。例えば、（ＷＯ２００２／０８５９２３、前出の実施例に記載されているような）ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成は他の生物に由来する公知酵素の組合せの付加に依存している。これらの酵素の遺伝子はこれらの遺伝子を含むプラスミドで細胞を形質転換することにより細胞に導入することができる。これらの遺伝子は細胞で発現されると、所望化合物を合成するための酵素経路を提供する。場合により付加される酵素種の例は下記実施例に記載する。その他の酵素配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに登録されている。人工的に進化させた酵素も場合により同様に細胞に付加する。このように、非天然アミノ酸を生産するように細胞機構と細胞資源を操作する。
【０１３８】
実際に、生合成経路で使用する新規酵素を生産するため又は非天然アミノを生産するように既存経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで進化させるためには種々の方法の任意のものを使用することができる。非天然アミノ酸を生産するため（又は、実際に新規基質特異性もしくは他の該当活性をもつようにシンテターゼを進化させるため）には、酵素及び他の生合成経路成分を進化させる方法として入手可能な多数の方法を本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸を生産（又は新規シンテターゼを生産）するように新規酵素及び／又は前記酵素の経路をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで開発するためには、場合によりＤＮＡシャフリングを使用する。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４），Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１参照。関連アプローチは所望特性をもつ酵素を迅速に進化させるために関連（例えば相同）遺伝子のファミリーをシャフリングする。このような「ファミリー遺伝子シャフリング」法の１例はＣｒａｍｅｒｉら（１９９８）“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”Ｎａｔｕｒｅ，３９１（６６６４）：２８８−２９１に記載されている。（生合成経路成分であるか又はシンテターゼであるかを問わずに）新規酵素は例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １７：１２０５に記載されているような「ハイブリッド酵素作製用インクリメンタルトランケーション（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ＩＴＣＨＹ）」として知られるＤＮＡ組換え法を使用して作製することもできる。このアプローチは１種以上のｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ組換え法の基質として使用することができる酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために使用することもできる。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）“Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：３５６２−６７，及びＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９），“Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ，”  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅ���ｉｓｔｒｙ，７：２１３９−４４も参照。別のアプローチは例えば非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産に関連する生合成反応を触媒する能力について選択する酵素又は他の経路変異体のライブラリーを作製するために指数的集合突然変異誘発を使用する。このアプローチでは、該当配列中の小群の残基を並行してランダムに突然変異させ、機能的蛋白質をもたらすアミノ酸を各変異位置で同定する。非天然アミノ酸（又は新規シンテターゼ）の生産用新規酵素を作製するように本発明に応用することができるこのような方法の例はＤｅｌｅｇｒａｖｅ  ＆  Ｙｏｕｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１：１５４８−１５５２に記載されている。更に別のアプローチでは、例えばＡｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｔｏ  ｅｎｃｏｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２９７−３００；又はＲｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）“Ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−８６の一般突然変異誘発法を使用することにより、酵素及び／又は経路成分操作にドープ又は縮重オリゴヌクレオチドを使用するランダム又は半ランダム突然変異誘発を使用することができる。ポリヌクレオチドリアセンブリと部位飽和突然変異誘発を使用する更に別のアプローチ（「非確率論的」突然変異誘発と呼ぶことが多い）を使用すると、酵素及び／又は経路成分を作製した後に、（例えば非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ生産のための）１種以上のシンテターゼ又は生合成経路機能を実施する能力についてスクリーニングすることができる。例えばＳｈｏｒｔ「遺伝子ワクチン及び酵素の非確率論的作製（ＮＯＮ−ＳＴＯＣＨＡＳＴＩＣ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＡＮＤ  ＥＮＺＹＭＥＳ）」ＷＯ００／４６３４４参照。
【０１３９】
このような突然変異法の代替方法は生物の全ゲノムを組換え、得られた子孫を特定経路機能について選択する方法である（「全ゲノムシャフリング」と呼ぶことが多い）。このアプローチは、例えばゲノム組換えと非天然アミノ酸（又はその中間体）の生産能に関する生物（例えば大腸菌又は他の細胞）の選択により本発明に適用することができる。例えば、非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ生産するように細胞で既存及び／又は新規経路を進化させるための経路設計には、以下の刊行物に教示されている方法を適用することができる：Ｐａｔｎａｉｋら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｃｉｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（７）：７０７−７１２；及びＺｈａｎｇら（２００２）“Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｒａｐｉｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ”Ｎａｔｕｒｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ７，４１５（６８７２）：６４４−６４６。
【０１４０】
例えば所望化合物を生産するための他の生物及び代謝経路組換え技術も利用可能であり、同様に非天然アミノ酸の生産に適用することができる。有用な経路組換えアプローチを教示している刊行物の例としては、Ｎａｋａｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（２００３）“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３  ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４（５）：４５４−９；Ｂｅｒｒｙら（２００２）“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｂｏｔｈ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｄｉｇｏ”Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：１２７−１３３；Ｂａｎｔａら（２００２）“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｆａｃｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ２，５−ｄｉｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１（２０），６２２６−３６；Ｓｅｌｉｖｏｎｏｖａら（２００１）“Ｒａｐｉｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ”Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６７：３６４５、及び他の多数の文献が挙げられる。
【０１４１】
使用する方法に関係なく、一般に本発明の組換え生合成経路を使用して生産される非天然アミノ酸は効率的な蛋白質生合成に十分な濃度（例えば天然細胞内量）で生産されるが、他の細胞内アミノ酸濃度を有意に変化させたり細胞内資源を枯渇させる程ではない。このようにｉｎ  ｖｉｖｏ生産される典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約０．０５ｍＭである。特定経路に所望される酵素を生産するように細胞を組換え、非天然アミノ酸を作製したら、場合によりｉｎ  ｖｉｖｏ選択を使用してリボソーム蛋白質合成と細胞増殖の両方に適合するように非天然アミノ酸の生産を更に最適化させる。
非天然アミノ酸を組込むための直交成分
【０１４２】
本発明はセレクターコドン（例えばアンバー終止コドン、ナンセンスコドン、４塩基以上のコドン等）に応答して成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸（例えば図１に示す非天然アミノ酸）を例えばｉｎ  ｖｉｖｏで組込むための直交成分を作製する組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）及びその対を提供する。これらの対は成長中のポリペプチド鎖に非天然アミノ酸を組込むために使用することができる。
【０１４３】
本発明の組成物は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン又はｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンで優先的にアミノアシル化する。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７及び５９−６３とその保存変異体のいずれか１種を含むアミノ酸配列を含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡよりもＯ−ｔＲＮＡを優先的に特定非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと同一非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。
【０１４４】
Ｏ−ＲＳを含む組成物は場合により更に直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含むことができ、Ｏ−ｔＲＮＡはセレクターコドンを認識する。一般に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号１）及び実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率に比較してコグネイトシンテターゼの存在下でセレクターコドンに応答して少なくとも例えば約４５％、５０％、６０％、７５％、８０％、又は９０％以上の抑圧効率を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＯ−ＲＳの不在下のＯ−ｔＲＮＡの抑圧効率の例えば５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍又はそれ以上である。所定側面では、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡの併用による抑圧効率はＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交チロシルｔＲＮＡシンテターゼ対、あるいは大腸菌に由来する直交ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ対の抑圧効率の少なくとも４５％である。
【０１４５】
Ｏ−ｔＲＮＡを含む組成物は場合により細胞（例えば大腸菌細胞等の真正細菌細胞、又は酵母細胞等の真核細胞）、及び／又は翻訳系を含むことができる。
【０１４６】
本発明は翻訳系を含む細胞（例えば真正細菌細胞又は酵母細胞）も提供し、前記翻訳系は直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；非天然アミノ酸（例えば図１に示すアミノ酸）を含む。一般に、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡよりもＯ−ｔＲＮＡを優先的に非天然アミノ酸でアミノアシル化し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを優先し、非天然アミノ酸を負荷されるＯ−ｔＲＮＡと非天然アミノ酸を負荷される内在ｔＲＮＡの比は１：１を上回り、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的又はほぼ排他的に負荷することがより好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡは第１のセレクターコドンを認識し、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは配列番号１、配列番号２に記載のポリヌクレオチド配列又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。１態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７、５９−６３及びその保存変異体の任意１種に記載のアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
本発明の細胞は場合により異なる付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を更に含むことができ、例えばこのＯ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、このＯ−ＲＳは対応するＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のアミノ酸は第１の非天然アミノ酸と異なる。場合により、本発明の細胞は該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。
【０１４８】
所定態様では、本発明の細胞は直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と、非天然アミノ酸と、該当ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む真正細菌細胞（例えば大腸菌細胞）又は酵母細胞であり、前記ポリヌクレオチドはＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンを含む。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率よりも高い効率でＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。
【０１４９】
本発明の所定態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは本明細書の配列表（例えば配列番号１又は配列番号２）もしくは実施例に記載するようなポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされる。本発明の所定態様では、Ｏ−ＲＳは本明細書の配列表に記載するようなアミノ酸配列、又はその保存変異体を含む。１態様では、Ｏ−ＲＳ又はその一部は本明細書の配列表もしくは実施例に記載するようなアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列、又はその相補的ポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１５０】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳは種々の生物（例えば真核及び／又は非真核生物）の任意のものに由来することができる。
【０１５１】
ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。本発明のポリヌクレオチドは本明細書の配列表に記載するようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む人工（例えば人為的に作製され、天然には存在しない）ポリヌクレオチドを含むか、及び／又は前記ポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードする。本発明のポリヌクレオチドは更に核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸も含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは更に天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸のポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致するポリヌクレオチドを含み（但し、本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡ又は対応するコーディング核酸以外のものである）、前記ｔＲＮＡはセレクターコドン（例えば４塩基コドン）を認識する。上記任意ポリヌクレオチド及び／又は上記任意ポリヌクレオチドの保存変異体を含むポリヌクレオチドと例えば少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチドも本発明のポリヌクレオチドに含まれる。
【０１５２】
本発明のポリヌクレオチドを含むベクターも本発明の特徴である。例えば、本発明のベクターはプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、発現ベクター及び／又は同等物を含むことができる。本発明のベクターを含む細胞も本発明の特徴である。
【０１５３】
Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の成分の作製方法も本発明の特徴である。これらの方法により作製された成分も本発明の特徴である。例えば、細胞に対して直交性である少なくとも１種のｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の作製方法は突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製する段階と；セレクターコドンを認識できるように突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーの各メンバーのアンチコドンループを突然変異させることにより、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーを提供する段階と、潜在的Ｏ−ｔＲＮＡのライブラリーのメンバーを含む第１の種の第１の細胞集団についてネガティブ選択を実施する段階を含む。ネガティブ選択は細胞に内在性のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される潜在的Ｏ−ｔＲＮＡライブラリーのメンバーを含む細胞を排除する。こうして、第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールが得られ、それにより少なくとも１種のＯ−ｔＲＮＡが得られる。本発明の方法により作製されたＯ−ｔＲＮＡも提供する。
【０１５４】
所定態様では、前記方法は更に第１の種の第２の細胞集団についてポジティブ選択を実施する段階を含み、前記細胞は第１の種の細胞に対して直交性のｔＲＮＡプールのメンバーと、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、ポジティブ選択マーカーを含む。ポジティブ選択を使用し、コグネイトアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化され、ポジティブ選択マーカーの存在下で所望応答を示すｔＲＮＡプールのメンバーを含む細胞について細胞を選択又はスクリーニングすることにより、Ｏ−ｔＲＮＡを得る。所定態様では、第２の細胞集団はネガティブ選択により排除されなかった細胞を含む。
【０１５５】
非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの同定方法も提供する。例えば、方法は第１の種の細胞集団に選択を実施する段階を含み、前記細胞は、１）複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）（例えば複数のＲＳは突然変異体ＲＳ、第１の種以外の種に由来するＲＳ、又は突然変異体ＲＳと第１の種以外の種に由来するＲＳの両方を含むことができる）のメンバーと；２）（例えば１種以上の種に由来する）直交−ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；３）ポジティブ選択マーカーをコードし、少なくとも１個のセレクターコドンを含むポリヌクレオチドを各々含む。
【０１５６】
複数のＲＳのメンバーを含まないか又はその量の少ない細胞に比較して抑圧効率の高い細胞について細胞（例えば宿主細胞）を選択又はスクリーニングする。これらの選択／スクリーニングした細胞はＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化する活性ＲＳを含む。この方法により同定された直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼも本発明の特徴である。
【０１５７】
非天然アミノ酸を選択位置にもつ蛋白質を細胞（例えば大腸菌細胞等の真正細菌細胞、又は酵母細胞）で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を提供する段階と、少なくとも１個のセレクターコドンによる核酸の翻訳中に蛋白質の特定位置に非天然アミノ酸を組込むことにより、蛋白質を生産する段階を含む。細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１５８】
本発明は例えばｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン又はｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は公知蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分）のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。場合により、組成物は医薬的に許容可能なキャリヤーを含有する。
核酸及びポリペプチド配列と変異体
【０１５９】
本明細書に記載するように、本発明は例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列と、ポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ＲＳ）と、例えば前記ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を含む組成物、系及び方法を提供する。前記配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳアミノ酸及びヌクレオチド配列）の例を本明細書に開示する（表５、例えば配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７及び５９−６３参照）。しかし、当業者に自明の通り、本発明は本明細書、例えば実施例や配列表に開示する配列に限定されない。当業者に自明の通り、本発明は本明細書に記載する機能をもつ多数の関連配列（例えば、本明細書に開示するＯ−ＲＳの保存変異体をコードするポリヌクレオチド及びポリペプチド）も提供する。
【０１６０】
Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えば図１に示す非天然アミノ酸）でアミノアシル化することが可能な直交シンテターゼ種（Ｏ−ＲＳ）の構築と分析を実施例１〜１６に記載する。これらの実施例は非天然アミノ酸ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンを組込むことが可能なＯ−ＲＳ種の構築と分析について記載する。
【０１６１】
本発明はポリペプチド（Ｏ−ＲＳ）とポリヌクレオチド（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチド、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼクローンを単離するために使用されるオリゴヌクレオチド等）を提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、１個以上のセレクターコドンをもつ本発明の該当蛋白質又はポリペプチドをコードするものが挙げられる。更に、本発明のポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１、５６及び５８に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；そのポリヌクレオチド配列に相補的であるか又は前記配列をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは更に配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７及び５９−６３を含むＯ−ＲＳアミノ酸配列をコードする任意ポリヌクレオチドを含む。同様に、核酸の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下で上記ポリヌクレオチドとハイブリダイズする人工核酸（天然ポリヌクレオチド以外のもの）も本発明のポリヌクレオチドである。１態様では、組成物は本発明のポリペプチドと賦形剤（例えば緩衝液、水、医薬的に許容可能な賦形剤等）を含有する。本発明は本発明のポリペプチドに対して特異的に免疫反応性の抗体又は抗血清も提供する。人工ポリヌクレオチドは人為的に作製され、天然には存在しないポリヌクレオチドである。
【０１６２】
本発明のポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し、天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）も含む。ポリヌクレオチドは天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する（但し１００％は一致しない）人工ポリヌクレオチドも含む。
【０１６３】
所定態様では、ベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス等）に本発明のポリヌクレオチドを組込む。１態様では、ベクターは発現ベクターである。別の態様では、発現ベクターは本発明のポリヌクレオチドの１種以上と機能的に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、本発明のポリヌクレオチドを組込んだベクターを細胞に導入する。
【０１６４】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。少なくとも１種の開示配列とハイブリダイスする核酸ポリヌクレオチド配列の変異体も本発明に含むものとする。例えば標準配列比較法により判定した場合に本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であると判断される配列も本発明に含まれる。
保存変異
【０１６５】
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸配列をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１個又は少数のアミノ酸を高度に類似する性質をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異体は本発明の特徴である。
【０１６６】
特定核酸配列の「保存変異体」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味し、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の指定ポリペプチド配列の「保存変異体」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基のアミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【０１６７】
機能的に類似するアミノ酸を示す保存置換表は当分野で周知であり、このようなアミノ酸では、あるアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば芳香族側鎖又は正荷電側鎖）をもつ別のアミノ酸残基に置換しているため、ポリペプチド分子の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似する天然アミノ酸を含む代表的グループを以下に示すが、これらのグループ内の置換は「保存置換」である。
【表１】
0005539948.tif 000005
核酸ハイブリダイゼーション
【０１６８】
本発明の核酸の保存変異体を含めて本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができ、この比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別する１好適方法である。更に、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１、５６及び５８により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は少数のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【０１６９】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも５０％の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
【０１７０】
核酸は一般に溶液中で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）に記載されており、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）と、Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【０１７１】
サザン又はノーザンブロットで１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【０１７２】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件では、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。
【０１７３】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択される。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【０１７４】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１７５】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高レベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【０１７６】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に同一である場合には実質的に同一である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
【０１７７】
所定側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は任意公知Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【０１７８】
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中にユニークサブ配列を含むポリペプチドを含む。この場合には、ユニークサブ配列は任意公知ポリペプチド配列に対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【０１７９】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチド（例えば本発明のシンテターゼを例えば突然変異により誘導した元の親配列）の任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
配列比較、一致度及び相同度
【０１８０】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度百分率」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０１８１】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、約８０％、約９０〜９５％、約９８％、約９９％又はそれ以上であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約５０残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約１００残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。
【０１８２】
蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を利用可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードする。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【０１８３】
配列比較及び相同性判定には、一般にある配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０１８４】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）参照）により実施することができる。
【０１８５】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０１８６】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施する（例えばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
【０１８７】
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチド及び本発明で使用されるポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００４年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、更に例えば非天然アミノ酸、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製に関連する他の多くの関連事項について記載している。
【０１８８】
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンを該当蛋白質又はポリペプチドに挿入するために、本発明では各種突然変異誘発法を使用する。これらの方法としては限定されないが、部位特異的、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の既知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）に基づいて突然変異誘発を誘導することができる。
【０１８９】
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質のコーディング領域を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターはエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７））、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入する。
【０１９０】
大腸菌でアンバー終止コドン（ＵＡＧ）に応答して非天然アミノ酸を蛋白質に部位特異的に組込むための非常に効率的で多目的な単一プラスミドシステムが開発された。新規システムでは、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡｔｙｒ（ＣＵＡ）とチロシルｔＲＮＡシンテターゼの対は大半の大腸菌発現ベクターと適合可能な単一プラスミドでコードされる。最適二次構造とｔＲＮＡプロセシングのためにｐｒｏＫプロモーター及びターミネーターの制御下のモノシストロンｔＲＮＡオペロンが構築された。シンテターゼのｇｌｎＳプロモーターの突然変異形を導入すると、抑圧効率と忠実度の両者が有意に増加した。抑圧効率の増加はｔＲＮＡ遺伝子の多重コピーとシンテターゼの特異的突然変異（Ｄ２８６Ｒ）によっても得られた（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ，”Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１０（６）：４２５−４３２［２００３］）。最適化システムの汎用性は蛋白質機能及び構造の研究におけるそのユニークな有用性が従来認められている数種の異なる非天然アミノ酸が非常に効率的且つ正確に組込まれることによっても実証された。
【０１９１】
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。シーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面のその他の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出）、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）、及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ  ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，ワールドワイドウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍで販売）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ワールドワイドウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍで販売）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及び他の多数の企業等の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）をオーダーメード又は標準注文することができる。
【０１９２】
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。例えば細胞単離及び培養（例えば後期核酸単離）に有用な他の文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
該当蛋白質及びポリペプチド
【０１９３】
特定位置に非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産する方法も本発明の特徴である。例えば、１方法は、少なくとも１個のセレクターコドンを含み、蛋白質をコードする核酸を含む細胞を適当な培地で増殖させる段階と、非天然アミノ酸を提供する段階を含み、細胞は更に、細胞で機能し、セレクターコドンを認識する直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。この方法により生産された蛋白質も本発明の特徴である。
【０１９４】
所定態様では、Ｏ−ＲＳは発現系において内在ｔＲＮＡよりもコグネイトＯ−ｔＲＮＡのアミノアシル化を優先する。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【０１９５】
本発明は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物も提供する。所定態様では、蛋白質は治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分のアミノ酸配列と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む。
【０１９６】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」、及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌細胞又は酵母細胞）に導入すると、前記対はセレクターコドンに応答してｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリン−アラニン、７−ヒドロキシ−クマリン−アラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン又はｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン等の非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質組込みを誘導する。系に付加される非天然アミノ酸は合成アミノ酸（例えばフェニルアラニン又はチロシン誘導体）とすることができ、外部から増殖培地に添加することができる。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。
【０１９７】
本発明の細胞は非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を大量の有用な量で合成することができる。所定側面では、組成物は場合により、非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、又はそれ以上、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
【０１９８】
非天然アミノ酸の組込みは例えば寸法、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位接近性、（例えば蛋白質アレーのための）部分へのターゲット、ラベル又は反応基の組込み等を変化させるように例えば蛋白質構造及び／又は機能の変化を調整するために実施することができる。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は触媒性又は物性を強化するか又は全く新規にすることができる。例えば、非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことにより、場合により毒性、生体分布、構造的性質、分光学的性質、化学及び／又は光化学的性質、触媒能、半減期（例えば血清半減期）、他の分子との（例えば共有又は非共有）反応性等の性質を改変する。少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を含有する組成物は例えば新規治療薬、診断薬、触媒酵素、産業用酵素、結合蛋白質（例えば抗体）、及び例えば蛋白質構造と機能の研究に有用である。例えばＤｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２参照。
【０１９９】
本発明の所定側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個が非天然アミノ酸で置換された蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０２００】
本明細書に記載する組成物と方法を使用して非天然アミノ酸を含むほぼ任意蛋白質（又はその部分）（及び例えば１個以上のセレクターコドンを含む対応する任意コーディング核酸）を生産することができる。数十万種の公知蛋白質を列挙するには及ばないが、例えば該当翻訳系に１個以上の適当なセレクターコドンを含むように入手可能な任意突然変異法を調整することにより、１種以上の非天然アミノ酸を組込むように公知蛋白質の任意のものを改変することができる。公知蛋白質の一般的な配列寄託機関としてはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ及びＮＣＢＩが挙げられる。他の寄託機関もインターネットを検索することにより容易に確認できる。
【０２０１】
一般に、蛋白質は入手可能な任意蛋白質（例えば治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその部分等）と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、出願日２００４年４月１６日、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；及びＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」に記載されているものが挙げられる。１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体（抗体の詳細については後述する）、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテインＧ、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ並びに他の多数の蛋白質が挙げられる。
【０２０２】
本明細書に記載する非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
【０２０３】
本発明の蛋白質（例えば１種以上の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質）の１類としてはサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物等の生体活性蛋白質が挙げられ、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【０２０４】
少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ酵素（例えば産業用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【０２０５】
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ２００２カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１種以上の非天然アミノ酸を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを改変することができる。治療関連特性の例としては血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
【０２０６】
他の各種蛋白質も本発明の組成物と方法を使用して１種以上の非天然アミノ酸を組込むように改変することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１種以上の天然アミノ酸を非天然アミノ酸で置換することができる。
【０２０７】
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も非天然アミノ酸修飾の適切なターゲットである。
【０２０８】
所定態様では、本発明の方法及び／又は組成物における該当蛋白質又はポリペプチド（又はその部分）は核酸によりコードされる。一般に、核酸は少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含む。
【０２０９】
該当蛋白質又はポリペプチドをコードする遺伝子は例えば非天然アミノ酸を組込むための１個以上のセレクターコドンを付加するように本明細書の「突然変異誘発及び他の分子生物学技術」のセクションに記載する当業者に周知の方法を使用して突然変異誘発することができる。例えば、１個以上のセレクターコドンを付加するように該当蛋白質の核酸を突然変異誘発し、１種以上の非天然アミノ酸を挿入できるようにする。本発明は例えば少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ任意蛋白質のこのような任意変異体（例えば突然変異体、変形）を含む。同様に、本発明は対応する核酸、即ち１種以上の非天然アミノ酸をコードする１個以上のセレクターコドンを含む任意核酸も含む。
【０２１０】
非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を生産するためには、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対による非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みに適した宿主細胞及び生物を使用することができる。直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び修飾すべき蛋白質をコードするベクターを発現する１種以上のベクターで宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）する。これらの成分の各々を同一ベクターに配置してもよいし、各々別々のベクターに配置してもよいし、２成分を第１のベクターに配置し、第３の成分を第２のベクターに配置してもよい。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
【０２１１】
本発明のポリペプチドは種々の新規ポリペプチド配列（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には非天然アミノ酸を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含むポリペプチド）を提供するので、ポリペプチドは例えばイムノアッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴である。本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【０２１２】
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準解説については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細は国際公開ＷＯ２００４／０９４５９３、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（ＥＸＰＡＮＤＩＮＧ  ＴＨＥ  ＥＵＫＡＲＹＯＴＩＣ  ＧＥＮＥＴＩＣ  ＣＯＤＥ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；ＷＯ２００４／０３５６０５、発明の名称「糖蛋白質合成（ＧＬＹＣＯＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」；及びＷＯ２００４／０５８９４６、発明の名称「蛋白質アレー（ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＲＲＡＹＳ）」に記載されている。
Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の使用
【０２１３】
本発明の組成物と本発明の方法により作製された組成物は場合により細胞に導入する。その後、本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対又は個々の成分を宿主系の翻訳機構で使用することができ、その結果として、非天然アミノ酸が蛋白質に組込まれる。国際公開ＷＯ２００２／０８５９２３、発明者Ｓｃｈｕｌｔｚら、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」はこのプロセスを記載しており、参考資料として本明細書に組込む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を宿主（例えば大腸菌又は酵母）に導入すると、前記対はセレクターコドン（例えばアンバーナンセンスコドン）に応答して外部から増殖培地に添加することができる非天然アミノ酸の蛋白質（例えばミオグロビン試験蛋白質又は治療用蛋白質）へのｉｎ  ｖｉｖｏ組込みを誘導する。場合により、本発明の組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入してもよいし、細胞内ｉｎ  ｖｉｖｏ系に導入してもよい。非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質は多様な用途の任意のものに使用することができる。例えば、蛋白質に組込まれた非天然部分は例えば、他の蛋白質、小分子（例えばラベルや色素）及び／又は生体分子との架橋をはじめとする多様な修飾の任意のもののターゲットとして利用することができる。これらの修飾により、非天然アミノ酸の組込みの結果、治療用蛋白質を改善することができ、更に酵素の触媒機能を改変又は改善するために使用することもできる。所定側面では、非天然アミノ酸の蛋白質組込みとその後の修飾は蛋白質構造、他の蛋白質との相互作用等の研究を助長することができる。
光調節及びフォトケージング
【０２１４】
例えば酵素、受容体、イオンチャネル等の活性を直接調節するか、又は各種シグナル伝達分子の細胞内濃度を調節することにより、光調節型アミノ酸（例えばフォトクロミック、光分解性、光異性化可能等）を使用して各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御することができる。例えばＳｈｉｇｅｒｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，２００１，９１：８５；Ｃｕｒｌｅｙら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．，１９９９，８２：３４７；Ｃｕｒｌｅｙら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．，１９９９，３：８４；“Ｃａｇｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｒｉｏｔｔ，Ｇ．，Ｅｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９８，Ｖ．２９１；Ａｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３，５５：７５５＋；及びＢｏｃｈｅｔら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  １，２００２，１２５参照。本発明の各種態様では、組成物及び方法は光調節型アミノ酸を含む。例えば、本発明は光調節型非天然アミノ酸であるｏ−ニトロベンジル−セリンとＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンの組込み用直交翻訳系を提供する（図１、並びに実施例８及び９参照）。
【０２１５】
「光調節型アミノ酸」は一般に例えば感光性アミノ酸である。光調節型アミノ酸は一般に所定方法で光（例えばＵＶ、ＩＲ等）により制御されるアミノ酸である。従って、例えば、光調節型アミノ酸が生体活性をもつペプチドに含まれる場合には、照射によりアミノ酸を改変することにより、ペプチドの生体活性を変化させることができる。光調節型アミノ酸には、「フォトケージドアミノ酸」、「感光性アミノ酸」、「フォトレービルアミノ酸」、「光異性化可能なアミノ酸」等も含まれる。ケージドアミノ酸やケージドペプチド等の「ケージド種」は大きな部分（例えば分子）の内側にトラップされ、特定照射を受けると遊離する種である。例えばＡｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ，１９９３，５５：７５５−７８４参照。アミノ酸の「ケージング」基は（例えばターゲット分子との相互作用を通常は安定化させる結合を切断するか、特定側鎖の疎水性又はイオン特性を変化させるか、あるいは立体障害等により）分子（例えばこのようなアミノ酸を含むペプチド）内の生体活性を阻害又は隠蔽することができる。「光異性化可能な」アミノ酸は露光により異性体形に転換することができる。このようなアミノ酸の各種異性体が組込まれると、蛋白質の他の側鎖との相互作用が変化する。実施例２参照。こうして光調節型アミノ酸はそれらが組込まれたペプチドの生体活性を（活性化、部分活性化、不活化、部分不活化、変形活性化等により）制御することができる。光調節型アミノ酸及び分子の詳細な定義と例についてはＡｄａｍｓ前出と本セクションの他の引用文献参照。
【０２１６】
多数の光調節型アミノ酸が当業者に公知であり、多数のものが市販されている。光調節分子をアミノ酸と結合及び／又は会合する方法も公知である。このような光調節型アミノ酸は一般に本発明の各種態様に利用可能である。当然のことながら、本明細書には考えられる多数の光調節部分（例えばフォトケージング基等）と多数の光調節型アミノ酸を挙げるが、これらの例は限定的であるとみなすべきではない。従って、本発明は本明細書に具体的に記載しない光調節部分及び光調節型アミノ酸にも利用可能である。
【０２１７】
上記のように、光調節型アミノ酸を作製するために場合により多数の方法が適用可能である。例えば、光調節型アミノ酸（例えばフォトケージドアミノ酸）はそのα−アミノ基をＢＯＣ（ブチルカルボニル）等の化合物で保護し、α−カルボキシル基をｔ−ブチルエステル等の化合物で保護することにより作製することができる。このような保護後にクロロギ酸２−ニトロベンジル、臭化α−カルボキシル２−ニトロベンジルメチルエステル、又は２−ニトロベンジルジアゾエタン等の反応形の２−ニトロベンジル等のフォトレービルケージング基とアミノ酸側鎖を反応させることができる。フォトレービルケージ基を付加した後に標準手順により保護基を除去することができる。例えばＵＳＰＮ５，９９８，５８０参照。
【０２１８】
別例として、クロロギ酸２−ニトロベンジルを使用してリジン残基をケージングし、ε−リジンアミノ基を修飾し、正電荷を除去することもできる。あるいは、α−カルボキシ２−ニトロベンジルオキシカルボニルケージング基の使用により（このようなリジンをもつ）ペプチドに負電荷を導入することによりリジンをケージングすることもできる。更に、ホスホアミノ酸又はホスホペプチドを１（２−ニトロベンジル）ジアゾエタンで処理することによりホスホセリンとホスホスレオニンをケージングすることができる。例えばＷａｌｋｅｒら，Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７２：２８８−３０１，１９８９参照。例えばセリン、スレオニン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、アスパラギン酸及びグルタミン酸等の他の多数のアミノ酸も容易に標準ケージング化学に適用可能である。例えばＷｉｌｃｏｘら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：１５８５−１５８９，１９９０参照。この場合も当然のことながら、特定光調節型（アミノ酸及び／又は光調節形に変換可能なアミノ酸）の記載は必ずしも限定的とみなすべきではない。
【０２１９】
アミノ酸残基は他の方法で光調節型（例えば感光性又はフォトレービル）にすることもできる。例えば、特定アミノ酸残基をもつペプチド主鎖が放射線照射により開裂するような所定アミノ酸残基を作製することができる。例えば、フォトレービルグリシンである２−ニトロフェニルグリシンはこのように機能することができる。例えばＤａｖｉｓら，１９７３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１６：１０４３−１０４５参照。２−ニトロフェニルグリシンを組込んだペプチドに放射線を照射すると、２−ニトロフェニルグリシンのα炭素とα−アミノ基の間のペプチド主鎖は開裂する。２−ニトロベンジル基をα炭素とα−アミノ基の間に挿入するならば、グリシン以外のアミノ酸にもこのような開裂ストラテジーを一般に適用することができる。
【０２２０】
このような基を他の分子（例えばアミノ酸）と共有結合させるために使用される多数の光調節基（例えばケージング基）と多数の反応性化合物が当分野で周知である。光調節（例えばフォトレービル、ケージング）基の例としては限定されないが、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ニトロインドリン；Ｎ−アシル−７−ニトロインドリン；フェナシル；ヒドロキシフェナシル；臭素化７−ヒドロキシクマリン−４−イルメチル（例えばＢｈｃ）；ベンゾインエステル；ジメトキシベンゾイン；メタフェノール；２−ニトロベンジル；１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチル（ＤＭＮＰＥ）；４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル（ＤＭＮＢ）；α−カルボキシ−２−ニトロベンジル（ＣＮＢ）；１−（２−ニトロフェニル）エチル（ＮＰＥ）；５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル（ＣＭＮＢ）；（５−カルボキシメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシ）カルボニル；（４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンジル）オキシ）カルボニル；デオキシベンゾイニル等が挙げられる。例えばＵＳＰＮ５，６３５，６０８（Ｈａｕｇｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｅ）（１９９７年６月３日）、発明の名称「α−カルボキシケージド化合物（α−ｃａｒｂｏｘｙ  ｃａｇｅｄ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」Ｎｅｕｒｏ  １９，４６５（１９９７）；Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５０８．３，８０１（１９９８）；Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８  Ｓｅｐ，８５（１７）：６５７１−５；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７  Ｆｅｂ  １４，２７２（７）：４１７２−８；Ｎｅｕｒｏｎ  ２０，６１９−６２４，１９９８；Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．２８：２００１：３１７−３２５；Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３９２，１９９８：９３６−９４１；Ｐａｎ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂａｙｌｅｙ，Ｈ．“Ｃａｇｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４０５：８１−８５（１９９７）；Ｐｅｔｔｉｔら（１９９７）“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｗｏ−ｐｈｏｔｏｎ  ｕｎｃａｇｉｎｇ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ”Ｎｅｕｒｏｎ  １９：４６５−４７１；Ｆｕｒｕｔａら（１９９９）“Ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ  ７−ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ｙｌｍｅｔｈｙｌｓ：ｎｏｖｅｌ  ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｕｓｅｆｕｌ  ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｗｏ  ｐｈｏｔｏｎ  ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６（４）：１１９３−１２００；Ｚｏｕら“Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ  ｃａｇｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｒｅｏｎｉｎｅ”Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４：８２２０−８２２９；Ｚｏｕら“Ｃａｇｅｄ  Ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２００１）４０：３０４９−３０５１；Ｃｏｎｒａｄ  ＩＩら“���−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎａｃｙｌ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ：Ｔｈｅ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｅｘｃｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｐｈｏｔｏｒｅｌｅａｓｅ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：９３４６−９３４７；Ｃｏｎｒａｄ  ＩＩら“Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ  １０：Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  π，π＊  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ”Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２０００）２：１５４５−１５４７；Ｇｉｖｅｎｓら“Ａ  Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｔｒｉｇｇｅｒｓ  ９：ｐ−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎａｃｙｌ  ａｓ  ａ  Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎｕｓ  Ｐｈｏｔｏｒｅｍｏｖａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅｓ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２０００）１２２：２６８７−２６９７；Ｂｉｓｈｏｐら“４０−Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ−２，２０−ｂｉｐｙｒｉｄｙｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ（Ａｂｃ）ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｗｉｔｈｉｎ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２０００）５６：４６２９−４６３８；Ｃｈｉｎｇら“Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ａｓ  Ｓｕｒｆａｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｔｅｔｈｅｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｏｔｏｌｙｔｉｃ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  Ｅｎａｂｌｉｎｇ  Ｌａｓｅｒ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ／Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｂｏｕｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６）７：５２５−８；ＢｉｏＰｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ又はＷｅｂ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ、並びにその引用文献参照。各種分子のケージング用の多数の化合物、キット等が例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。その他の情報は例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１（１９８６）及びＣｏｒｒｉｅ，Ｊ．Ｅ．Ｔ．ａｎｄ  Ｔｒｅｎｔｈａｍ，Ｄ．Ｒ．（１９９３）Ｉｎ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｗｉｔｃｈｅｓ，ｅｄ．，Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｈ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２４３−３０５に記載されている。適切な感光性ケージング基の例としては限定されないが、２−ニトロベンジル、ベンゾインエステル、Ｎ−アシル−７−ニトロインドリン、メタフェノール、及びフェナシルが挙げられる。
【０２２１】
所定態様では、光調節（例えばケージング）基は第２の結合部分と結合することができる第１の結合部分を場合により含むことができる。例えば、市販ケージドホスホロアミダイト［１−Ｎ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−（６−ビオチンアミドカプロアミドメチル）−１−（２−ニトロフェニル）−エチル］−２−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓ．ｃｏｍ製品ＰＣ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍａｄｉｔｅ）はフォトレービル基とビオチン（第１の結合部分）を含む。従って、第２の結合部分（例えばストレプトアビジン又はアビジン）をケージング基と結合することができ、その嵩とケージング効力を増すことができる。所定態様では、ケージド成分は第１の結合部分を各々含む２個以上のケージング基を含み、第２の結合部分は２個以上の第１の結合部分と同時に結合することができる。例えば、ケージド成分は少なくとも２個のビオチン化ケージング基を含むことができ、ストレプトアビジンが複数のケージド成分分子上の複数のビオチン部分と結合すると、ケージド成分は相互に結合して大きな網状構造とする。ビオチンを前記成分と結合するフォトレービル基が開裂すると、網状構造は解離する。
【０２２２】
ケージドポリペプチド（例えば抗体や転写因子等のペプチド基質及び蛋白質を含む）を作製する「従来」方法としては、例えばポリペプチドをケージング化合物と反応させる方法や、ポリペプチドの合成中にケージドアミノ酸を組込む方法がある。例えば米国特許第５，９９８，５８０号（Ｆａｙら）（１９９９年１２月７日）発明の名称「感光性ケージド巨大分子（Ｐｈｏｔｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃａｇｅｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」；Ｋｏｓｓｅｌら（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１４７０２−１４７０７；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ（１９９９）４：３３０−３３４；ＰＮＡＳ（１９９８）９５：１５６８−１５７３；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００２）１２４：８２２０−８２２９；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２００１）９１：８５−９２；及びＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（２００１）４０：３０４９−３０５１参照。（例えば蛋白質形質導入ドメイン及びセンサー等を結合するための）フォトレービルポリペプチドリンカーは例えば米国特許第５，９９８，５８０号に記載されているもの等のフォトレービルアミノ酸を含むことができる。
【０２２３】
光を照射すると、例えばこのようなアミノ酸を含むペプチドの活性に重要なアミノ酸の側鎖残基を遊離させることができる。更に、所定態様では、ケージ解除したアミノ酸はアミノ酸を含むペプチドのペプチド主鎖を開裂し、従って、例えば環状ペプチドを開環し、別の生物学的性質等をもつ線状ペプチドとすることができる。
【０２２４】
ケージドペプチドの活性化は当業者に公知の任意標準方法により光調節型アミノ酸上の感光性ケージング基の破壊により実施することができる。例えば、感光性アミノ酸は（例えばＵＶ域又は赤外域で発光する）レーザー等の適切な慣用光源に暴露することによりケージ解除又は活性化することができる。本発明で使用するもの等の光調節型アミノ酸と併用するために適用可能な適切な波長及びエネルギーのその他の多数のレーザー並びに適切な適用プロトコール（例えば照射時間等）が当業者に自明である。光調節型ケージドアミノ酸の遊離はこのようなアミノ酸を含むペプチドの制御を可能にする。このような制御は位置と時間の両面で可能である。例えば、集束レーザー照射は他の位置のアミノ酸をケージ解除せずに、ある位置のアミノ酸をケージ解除することができる。
【０２２５】
当業者に自明のとおり、光調節型アミノ酸の活性を評価するためには各種アッセイ（例えば下記実施例に記載するアッセイ）を使用することができる。光調節型アミノ酸を組込んだペプチドを細胞又は組織に導入する前後と、光調節型分子の遊離後に多様な例えば細胞機能、組織機能等をアッセイすることができる。
【０２２６】
本発明の組成物及び方法は多数の側面で利用することができる。例えば、光調節型アミノ酸の遊離又は活性化／不活化／等は標的光照射等により局在化することができるので、（例えばペプチド中の）光調節型アミノ酸は治療用組成物を身体の個別位置に送達することができる。同様に当然のことながら、本発明の方法、構造、及び組成物は光調節型天然アミノ酸（例えば光調節部分を結合／会合したアミノ酸）の組込み／使用にも適用可能である。
【０２２７】
酵素（例えばＷｅｓｔｍａｒｋら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５：３４１６−１９及びＨｏｈｓａｋａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９４，１１６：４１３−４参照）、受容体（例えばＢａｒｔｅｌｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９７１，６８：１８２０−３；Ｌｅｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９７７，２６６：３７３−４：Ｃｒｕｚら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，２０００，１２２：８７７７−８；及びＰｏｌｌｉｔｔら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ，１９９８，３７：２１０４−７参照）、又はイオンチャネル（例えばＬｉｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９６，１１８：１２２２２−３；Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００，１２２：６３６４−７０；及びＢａｎｇｈａｒｔら，Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００４，７：１３８１−６参照）の活性を直接調節するか、あるいは各種シグナル伝達分子の細胞内濃度（例えばＡｄａｍｓら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３，５５：７５５−８４参照）を調節することにより、フォトクロミック及び光分解性基を使用して各種生体プロセスを空間的及び時間的に制御することができる。一般に、このためには蛋白質又は小分子をアゾベンゼン又はニトロベンジル基等の光反応性リガンドで化学的に修飾する必要がある。光反応性アミノ酸を生体の蛋白質の規定部位に直接遺伝的に組込むことができるならば、この技術の範囲は有意に拡大すると思われる。例えばＷｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６：１４３０６−７参照。
キット
【０２２８】
キットも本発明の特徴である。例えば、少なくとも１種の非天然アミノ酸を組込んだ蛋白質を細胞で生産するためのキットが提供され、前記キットはＯ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ｔＲＮＡ、及び／又はＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチド配列、及び／又はＯ−ＲＳを収容する容器を含む。１態様では、キットは更にｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシルアラニン、７−アミノ−クマリンアラニン、７−ヒドロキシ−クマリンアラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、３−ニトロ−Ｌ−チロシン又はｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン等の非天然アミノ酸を含む。別の態様では、キットは更に蛋白質を生産するための説明書を含む。
【０２２９】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。本発明の範囲から逸脱せずに変更可能な種々の非必須パラメーターが当業者に自明である。
【実施例１】
【０２３０】
３−ニトロ−Ｌ−チロシンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用して３−ニトロ−Ｌ−チロシン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能する新規直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を単離した。
【０２３１】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーチロシルｔＲＮＡＣＵＡ（配列番号１）と併用した。これらの新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーチロシルｔＲＮＡＣＵＡに３−ニトロ−Ｌ−チロシンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答して３−ニトロ−Ｌ−チロシンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。これらのｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はＴＡＧのみに応答して送達される。
【０２３２】
従来記載されているプロトコール（例えば、Ａｌｆｏｎｔａら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２５（４８）：１４６６２−１４６６３（２００３）；及び国際公開ＷＯ２００５／０３８００２、公開日２００５年４月２８日参照）を使用して新規シンテターゼを単離した。
【０２３３】
野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ分子のアミノ酸配列とポリヌクレオチド配列を表５に夫々配列番号３及び４で示す。突然変異誘発はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する相同チロシルｔＲＮＡシンテターゼの結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０２３４】
突然変異誘発後、突然変異体ライブラリーのシンテターゼプールを５ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡに３−ニトロ−Ｌ−チロシンを負荷することが可能な７個のシンテターゼクローン（クローンＡ〜Ｇ）が得られた。これらの選択シンテターゼクローンをシーケンシングし、そのアミノ酸配列を以下のように決定した。
【表２】
0005539948.tif 000006
【０２３５】
クローンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＧはいずれも同一突然変異体配列に収束した。クローンＤ及びＦは異なる配列を示した。これらの突然変異体シンテターゼのアミノ酸配列を表５、配列番号７〜９に示す。
【実施例２】
【０２３６】
ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（ＮＯ２−Ｐｈｅ）を大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は新規直交翻訳系を使用してｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン（図１参照；ＮＯ２−Ｐｈｅとも言う）を大腸菌の蛋白質に遺伝的プログラム下で部位特異的に組込む方法について記載する。
【０２３７】
非天然アミノ酸ＮＯ２−Ｐｈｅは蛋白質−受容体構造を研究するための光親和性標識プローブ（Ｄｏｎｇ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００５，６９，１８９２）や、プロテアーゼ活性（Ｗａｎｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９４，２０１：８３５）及び蛋白質構造（Ｓｉｓｉｄｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０：１５２０；２００２，７２４：１４５８６）を調査するための蛍光クエンチャーとして使用されている。このアミノ酸は３塩基（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９，２４４：１８２）、４塩基（Ｍ．Ｓｉｓｉｄｏ）及び５塩基（Ｍ．Ｓｉｓｉｄｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１，２９，３６４６）コドンを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成法により蛋白質に部位特異的に組込まれている。しかし、このアプローチでは一般に少量の蛋白質しか生産されない。更に、この方法は化学量論的量のアシル化ｔＲＮＡが必要であることと、アミノアシルｔＲＮＡを再生できないことにより制限されている。これらの欠点に鑑み、本発明者らは以下に記載するように、この非天然アミノ酸を蛋白質に直接組込むための新規ｉｎ  ｖｉｖｏ直交翻訳系を開発した。
【０２３８】
大腸菌でＮＯ２−Ｐｈｅを遺伝的にコードさせるために、シンテターゼが突然変異体チロシンアンバーサプレッサーｔＲＮＡ（ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ）に非天然アミノ酸ＮＯ２−Ｐｈｅを特異的に負荷するように直交Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）の特異性を改変した。突然変異体シンテターゼは突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳライブラリーのスクリーニングから誘導した。ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒにｐ−ブロモフェニルアラニンを選択的に負荷する突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳの結晶構造の分析に鑑み、この突然変異体ライブラリーの突然変異誘発位置を選択した。
【０２３９】
夫々１ｍＭ  ＮＯ２−Ｐｈｅの存在下又は不在下でｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒと突然変異体ＭｊＴｙｒＲＳライブラリーを使用して数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択後に、高濃度クロラムフェニコール（９０μｇ／ｍＬ）下の生存がＮＯ２−Ｐｈｅの存在に依存するクローンが出現した。更に、ＮＯ２−ＰｈｅにＴ７／ＧＦＰｕｖレポーターを付加し、レポーター遺伝子内の部位にアンバーセレクターコドンを配置した場合には、選択クローンのみで緑色蛍光が観察された。この結果は進化型シンテターゼが他の全天然アミノ酸よりもＮＯ２−Ｐｈｅに高い特異性をもつことを示唆している。クローンのシーケンシングの結果、この進化型シンテターゼには以下の突然変異：
Ｔｙｒ３２→Ｌｅｕ
Ｇｌｕ１０７→Ｓｅｒ
Ａｓｐ１５８→Ｐｒｏ
Ｉｌｅ１５９→Ｌｅｕ
Ｈｉｓ１６０→Ａｓｎ
Ｌｅｕ１６２→Ｇｌｕ
が判明した。このクローンのヌクレオチド配列を表５、配列番号１１に示し、対応するアミノ酸配列を表５、配列番号１０に示す。
【０２４０】
進化型シンテターゼ（ｍｕｔＮＯ２−ＰｈｅＲＳ）とｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒがＮＯ２−Ｐｈｅを蛋白質に選択的に組込む能力を試験するために、Ｃ末端ヘキサマーＨｉｓタグを付けたＺドメイン蛋白質の遺伝子の許容部位（Ｌｙｓ７）をアンバー終止コドンに置換した。ｍｕｔＮＯ２−ＰｈｅＲＳ、ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ及びＺドメイン遺伝子で形質転換した細胞をＧＭＭＬ最少培地中１ｍＭ  ＮＯ２−Ｐｈｅの存在下で増殖させた。Ｎｉ２＋アフィニティーカラムを使用して突然変異体蛋白質を精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２参照）とＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（図３）により分析した。ＮＯ２−Ｐｈｅを組込んだＺドメイン蛋白質ではＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析からの実測質量（ｍ／ｅ＝７９５８）は予想質量（ｍ／ｅ＝７９５８）に一致する。ＮＯ２−Ｐｈｅ（図１参照）の不在下ではＺドメインは得られず、非天然アミノ酸の組込みの忠実度が非常に高いことを示した。
【０２４１】
次に、組込まれたＮＯ２−Ｐｈｅを蛍光クエンチャーとして使用できるかどうかを試験した。ＮＯ２−Ｐｈｅの報告されているフルオロフォア対応部分（例えばチロシン、トリプトファン、１−ピレニルアラニン、及びβ−アントラニロイル−ｌ−α，β−ジアミノプロピオン酸）からトリプトファン／ＮＯ２−Ｐｈｅ対を選択し、平行コイルドコイルホモダイマーを形成するモデルＧＣＮ４ロイシンジッパーに組込んだ。トリプトファンをコードしないＧＣＮ４遺伝子のＤＮＡ結合領域（６７６−８４０ｂｐ）を酵母ゲノムから蛋白質発現ベクターｐＥＴ−２６ｂにクローニングした。次に、部位特異的突然変異誘発を利用してこの蛋白質の特定部位のアミノ酸をトリプトファン又は（ＴＡＧセレクターコドンによりコードされる）ＮＯ２−Ｐｈｅ非天然アミノ酸で置換した。ＧＣＮ４発現ベクターと、ｍｕｔＮＯ２−ＰｈｅＲＳとｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒの両者を含むプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に同時形質転換した後、ＧＭＭＬ最少培地中１ｍＭ  ＮＯ２−Ｐｈｅの存在下で増殖させた。蓄積したＧＣＮ４ｐ１突然変異体蛋白質をＮｉ２＋アフィニティーカラムにより精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により確認した。
【０２４２】
精製した突然変異体蛋白質の定常状態蛍光スペクトルを測定した。図４Ａは２２Ｔｒｐ突然変異体蛋白質単独の蛍光スペクトルと、２２Ｔｒｐ及び２２ＮＯ２−Ｐｈｅ突然変異体の混合物の蛍光スペクトルを示し、図４Ｂは５５Ｔｒｐ突然変異体蛋白質の蛍光スペクトルと、５５Ｔｒｐ及び２２ＮＯ２−Ｐｈｅ突然変異体の混合物の蛍光スペクトルを示す。２２Ｔｒｐ／２２ＮＯ２−Ｐｈｅ突然変異体対では顕著な蛍光消光が観察されたが、５５Ｔｒｐ／２２ＮＯ２−Ｐｈｅ突然変異体対では有意蛍光消光は得られなかった。この結果はＴｒｐ／ＮＯ２−Ｐｈｅ対間のフルオロフォア／クエンチャー相互作用が距離依存的であることを明白に示している。従って、このシステムは蛋白質フォールディングと蛋白質−蛋白質及び蛋白質−リガンド相互作用の研究に容易に適用することができる。
【実施例３】
【０２４３】
レドックス活性アミノ酸３−アミノ−Ｌ−チロシンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用して３−アミノ−Ｌ−チロシン（図１参照；ＮＨ２−ＹＲＳとも言う）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０２４４】
この非天然アミノ側鎖は対応するセミキノン及びキノンに酸化し易いので、蛋白質で電子移動プロセスを探査及び操作するために使用することができる。酸化キノン形はヘテロ・ディールズ・アルダー反応によりアクリルアミドと効率的に結合することができる。この性質により別の用途が得られ、即ちこの非天然アミノ酸は蛋白質の化学修飾基として機能する。
【０２４５】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡ（配列番号１）と併用した。この新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡに３−アミノ−Ｌ−チロシンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答して３−アミノ−Ｌ−チロシンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。これらのｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はＴＡＧのみに応答して送達される。
【０２４６】
従来記載されているプロトコールを使用して新規シンテターゼを単離した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製した。突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０２４７】
突然変異誘発後、突然変異体ライブラリーのシンテターゼプールを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡに３−アミノ−Ｌ−チロシンを負荷することが可能な１個のシンテターゼクローンが得られた。この選択シンテターゼクローンは表５、配列番号１２に示すアミノ酸配列と、表５、配列番号１３に示すポリヌクレオチド配列をもつ。
【実施例４】
【０２４８】
ホスホチロシンミミックアミノ酸ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン（図１参照；ｐＣＭＦとも言う）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０２４９】
この非天然アミノ側鎖はチロシンリン酸化の安定的ミミックとして使用することができる。チロシンリン酸化は細胞増殖、代謝調節、転写調節、及び増殖等の多様な細胞プロセスで細胞内シグナル伝達の調節に重要な役割を果たす。チロシンリン酸化はｉｎ  ｖｉｖｏで可逆的プロセスである。内在チロシンホスファターゼによるチロシンの脱リン酸化傾向はチロシンリン酸化の効果の研究を妨げるため、この研究の解釈の妨げとなっている。アミノ酸ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニンはホスホチロシンミミックであり、細胞浸透性であり、更に、チロシンホスファターゼの基質として作用しない。この非天然アミノ酸を蛋白質に組込むと、構成的に活性な蛋白質突然変異体を作製するために使用することができる。この非天然アミノ酸はｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニンを含むペプチドライブラリーから蛋白質チロシンホスファターゼに対する阻害剤を選択するためにファージディスプレイで使用することもできる。
【０２５０】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡと併用した。これらの新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡにｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答してｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。これらのｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はＴＡＧのみに応答して送達される。
【０２５１】
直交ｔＲＮＡにｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニンを特異的に負荷することが可能な直交シンテターゼの探索を実施した。この探索は従来記載されているプロトコールを使用した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製し、突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０２５２】
突然変異誘発後、突然変異体シンテターゼライブラリーを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡにｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニンを負荷することが可能な５個のシンテターゼクローンが得られた。これらのシンテターゼクローンをシーケンシングし、アミノ酸配列を決定した（表５参照）。これらのＯ−ＲＳクローンのアミノ酸配列は配列番号１４、１６、１８、２０及び２２に示す。これらの同一Ｏ−ＲＳクローンのヌクレオチド配列は配列番号１５、１７、１９、２１及び２３に示す。
【実施例５】
【０２５３】
疎水性非天然アミノ酸ビフェニルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してビフェニルアラニン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０２５４】
ビフェニルアラニン非天然アミノ酸は大きな芳香族側鎖をもつ。疎水性相互作用は蛋白質フォールディングと蛋白質−蛋白質相互作用を誘導する主要な力の１つである（他の主要な力は静電相互作用、水素結合、及びファン・デル・ワールス力である）。疎水性相互作用は細胞膜を通る蛋白質輸送、蛋白質凝集、及び酵素触媒等の多数の生体イベントに関与している。ビフェニルアラニンの疎水性は２０種の標準アミノ酸のどれよりも高い。ビフェニルアラニンの蛋白質組込みは蛋白質における分子内及び分子間疎水性パッキング相互作用の研究と調節に有用なツールである。
【０２５５】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡと併用した。これらの新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡにビフェニルアラニンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答してビフェニルアラニンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。これらのｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はＴＡＧのみに応答して送達される。
【０２５６】
直交ｔＲＮＡにビフェニルアラニンを特異的に負荷することが可能な直交シンテターゼの探索を実施した。この探索は従来記載されているプロトコールを使用した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製し、突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０２５７】
突然変異誘発後、突然変異体シンテターゼライブラリーを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡにビフェニルアラニンを負荷することが可能な７個のシンテターゼクローンが得られた。これらのシンテターゼクローンをシーケンシングした（表５参照）。これらのＯ−ＲＳクローンのアミノ酸配列は配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４及び３６に示す。これらの同一Ｏ−ＲＳクローンの対応するヌクレオチド配列は配列番号２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７に示す。
【実施例６】
【０２５８】
金属キレート化非天然アミノ酸ビピリジルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してビピリジルアラニン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０２５９】
ビピリジルアラニン非天然アミノ酸は金属イオンをキレート化する能力をもつ。このアミノ酸側鎖のＮ、Ｎ−二座部分はＣｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋及びＲｕ２＋等の遷移金属イオンの強力なキレート剤である。この金属キレート化アミノ酸は（１）レドックス活性又は求電子性金属イオンを蛋白質に導入するため、（２）Ｒｕ（ｂｐｙ）３等の蛍光金属イオン錯体を形成するため、又は（３）ビピリジルアラニンを含む蛋白質の金属イオン依存性二量化を媒介するために使用することができる。
【０２６０】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡと併用した。新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡにビピリジルアラニンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答してビピリジルアラニンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。これらのｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はＴＡＧのみに応答して送達される。
【０２６１】
直交ｔＲＮＡにビピリジルアラニンを特異的に負荷することが可能な直交シンテターゼの探索を実施した。この探索は従来記載されているプロトコールを使用した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製し、突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０２６２】
突然変異誘発後、突然変異体シンテターゼライブラリーを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡにビピリジルアラニンを負荷することが可能な２個のシンテターゼクローンが得られた。これらのシンテターゼクローンをシーケンシングした（表５参照）。これらのＯ−ＲＳクローンのアミノ酸配列は配列番号３８及び４０に示す。これらの同一Ｏ−ＲＳクローンの対応するヌクレオチド配列は配列番号３９及び４１に示す。
【実施例７】
【０２６３】
蛍光非天然アミノ酸１，５−ダンシルアラニンを酵母宿主細胞の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は酵母宿主細胞翻訳機構を使用して１，５−ダンシルアラニン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。大腸菌に由来し、酵母宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０２６４】
蛍光はその操作の感度と安全性の高さにより、バイオテクノロジーで最重要検出シグナルの１つになっている。更に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法や蛍光偏光法等の方法は生体分子結合イベント、移動又はコンホメーション変化のリアルタイム分析を可能にする。蛋白質をｉｎ  ｖｉｖｏ試験するための現行蛍光法は大きな蛍光蛋白質との融合構築物に依存することが多い。あるいは、小さい有機ラベルを使用して構造変化を最小限にすることができるが、位置選択性が不良であり、細胞傷害性であるか又は色素結合蛋白質モチーフを導入する必要があり、蛋白質表面に限定される傾向がある。これに対して、蛍光アミノ酸は細胞傷害性の可能性のある基を必ずしも含まず、その導入により蛋白質構造の変化が非常に少なく、ｉｎ  ｖｉｖｏで蛋白質の任意位置の特異的標識が可能である。
【０２６５】
本発明は蛍光アミノ酸１，５−ダンシル修飾アラニン（図５Ａ参照）を酵母の成長中のポリペプチド鎖に組込む直交翻訳系成分を提供する。この非天然アミノ酸はそのＩＵＰＡＣ名２−アミノ−３−（５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニルアミノ）プロピオン酸で指称する場合もある。ダンシルクロモフォアは励起波長と発光波長の最大値の差が非常に大きく（＞２００ｎｍ）、発光強度の環境極性依存性が高い等の有利なスペクトル特性をもつ。このため、蛋白質コンホメーション変化や、局所蛋白質環境、従って極性が変化する結合イベントの研究に好適である。ジクロロメタン中でトリエチルアミンを使用してＮ−Ｂｏｃ−アミノアラニンをダンシルクロリドと結合した後にジクロロメタン中でＴＦＡにより酸脱保護する２段階法でこの非天然アミノ酸の合成を実施した。
【０２６６】
従来記載されているプロトコール（例えば、Ｗｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２６：１４３０６−１４３０７（２００４）；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３４００２、出願日２００５年９月２１日、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら参照）を使用して１，５−ダンシルアラニンを組込むための新規シンテターゼを単離した。酵母宿主細胞系でランダム突然変異させた大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼライブラリーから初期負荷活性を示した突然変異体大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼクローン（クローンＢ８）を単離した。表５と配列番号４２及び４３参照。突然変異体大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼライブラリーの部位はＭ４０、Ｌ４１、Ｙ４９９、Ｙ５２７及びＨ５３７とした。ライブラリーの全クローンに認められた（ライブラリー作製に起因する）付加突然変異はＨ６７Ｒ、Ｎ１９６Ｔ、Ｒ２６２Ａ及びＳ４９７Ｃであった。
【０２６７】
しかし、Ｂ８突然変異体大腸菌シンテターゼは３３位に許容アンバーヒドンをもつ発現されたモデル蛋白質ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ−３３ＴＡＧ−Ｈｉｓ６）のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによると、ロイシンに類似の分子量をもつ１種以上の天然アミノ酸に対してバックグラウンド活性を示した。ダンシルアラニン−ＡＭＰアミドとの理論的ドッキング試験とＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔ．ｔｈ．）に由来する相同ロイシルｔＲＮＡシンテターゼの結晶構造によると、πスタッキングがナフチル部分に作用することなく、主に疎水性の相互作用によりリガンドと結合する拡大結合ポケットが形成されることが示唆された（図５Ｂ参照）。
【０２６８】
大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼにはプルーフリーディング活性が存在し、選択した突然変異体では１，５−ダンシルアラニンに対する活性化及び負荷活性が既に生じていたので、活性化又は負荷された天然アミノ酸を編集部位のリモデリングにより選択的に除去することを目的とするストラテジーを考案した。観察されたバックグラウンドはＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳにより示唆されるようにロイシンの組込みに起因すると考えられた。Ｔ．ｔｈ．に由来する相同ロイシルｔＲＮＡシンテターゼの結晶構造と突然変異試験によると、活性化又は負荷されたロイシンはγ−メチル側鎖に対する非極性アミノ酸の単なる立体障害により加水分解部位と結合できないと考えられる（Ｌｉｎｃｅｃｕｍら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．，４：９５１−９６３［２００３］）。
【０２６９】
ロイシンに対する加水分解活性を増加するために、大腸菌シンテターゼ編集ドメインの残基Ｔ２５２及びＶ３３８をＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発によりアラニンに交換して結合ポケットを拡大した（図６Ａ参照）。Ｖ３３８Ａシンテターゼ（表５、配列番号４６及び４７参照）はモデル蛋白質ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）を使用する発現試験で有意差を示さなかったが、Ｔ２５２Ａシンテターゼ（表５、配列番号４４及び４５参照）は顕著なバックグラウンド低下を示した（図６Ｂ参照）。この突然変異体の高い選択性はｈＳＯＤ−３３ＴＡＧ−Ｈｉｓ６のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳにより更に確認された。
【０２７０】
従って、本発明は酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞翻訳機構を使用して１，５−ダンシルアラニンを蛋白質に生合成的に組込むことが可能な大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼに由来する新規突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼを提供する。
【実施例８】
【０２７１】
フォトケージド非天然アミノ酸ｏ−ニトロベンジルセリンを酵母宿主細胞の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は酵母宿主細胞翻訳機構を使用してｏ−ニトロベンジルセリン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。大腸菌に由来し、酵母宿主細胞系で機能するこの非天然アラニンを組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０２７２】
生体における特定遺伝子の機能の調査は主にその不活性化又は活性化と得られる効果の試験に依存している。古典的な遺伝子ノックアウト試験はＤＮＡレベルで遺伝子を標的化しているため、コードされる全蛋白質変異体の生産が不活性化され、得られる効果をリアルタイムで調べることができない。近年、有機小分子の使用により遺伝子不活性化の特異性は劇的に増加した。このようなツールを使用すると、単一蛋白質変異体（又はこの変異体の単一ドメイン）を標的化することができ、分子の付加後にリアルタイムで効果を調べることができる。
【０２７３】
一過的な活性化可能なノックアウトとして蛋白質にフォトケージドアミノ酸を導入すると、このような試験の確度を更に増加することができる。化学的ノックアウトストラテジーを使用すると、その標的蛋白質への化合物の拡散時間は律速的となり、全細胞調査することしかできない。これに対して、特定アミノ酸のフォトアンケージングは迅速な時間スケールで実施することができ、高度集束レーザー光パルスを使用して細胞の特定区画を調査することができる。
【０２７４】
ケージドシステイン誘導体ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣとも言う）を特異的に認識する突然変異体大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼが酵母宿主細胞で突然変異体大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼライブラリーから既に作製されている（Ｗｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２６：１４３０６−１４３０７（２００４）；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３４００２，出願日２００５年９月２１日，発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら参照）。このアプローチの適用可能性を拡大するために、ｏ−ニトロベンジルセリン（ｏＮＢＳ）を特異的に組込むｔＲＮＡシンテターゼの開発を検討した。このフォトケージドアミノ酸が蛋白質に遺伝的に組込まれると、シグナル伝達経路の最重要化学マーカーの１つであるセリン残基に関する任意機能（限定されないが、例えばキナーゼによるセリンリン酸化）を光調節するために使用することができると考えられる。ｏＮＢＳアミノ酸は塩基としてＮａＨを使用してＤＭＦ中でｏ−ニトロベンジルブロミドをＢｏｃ−Ｎ−Ｓｅｒ−Ｏ−ｔＢｕと結合した後にスカベンジャーとしてトリエチルシランの存在下に塩化メチレン中ＴＦＡで酸脱保護することにより総収率５２％で合成することができる。
【０２７５】
ｏＮＢＣ組込み用に開発した突然変異体大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（クローン３Ｈ１１；表５、配列番号４８及び４９参照）は既に多少のｏＮＢＳ組込み活性を示したが、ｏＮＢＣアミノ酸に比較して効率は約２分の１であった。より効率的なｏＮＢＳ翻訳系を開発するために、同様に遺伝子当たり１、２又は５カ所の突然変異を導入するように３種の異なる突然変異原性を使用して、選択クローン３Ｈ１１シンテターゼをエラープローンＰＣＲにより多様化させ、総ダイバーシティ１×１０７個のクローンを得た。ランダム突然変異に使用したロイシルｔＲＮＡシンテターゼ酵素の位置はＭ４０、Ｌ４１、Ｙ４９９、Ｙ５２７及びＨ５３７とした。本実施例で使用したプロトコールは従来技術（例えば、Ｗｕら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２６：１４３０６−１４３０７（２００４）；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０３４００２、出願日２００５年９月２１日、発明者Ｄｅｉｔｅｒｓら）に記載されている一般方法に従った。
【０２７６】
新規突然変異体シンテターゼライブラリーのスクリーニングの結果、ｏＮＢＳ組込み効率が２倍に増加したシンテターゼ（クローンＧ２−６）が得られた。Ｇ２−６クローンのシーケンシングの結果、初期３Ｈ１１シンテターゼ出発材料に比較して酵素全体で５カ所の付加突然変異（位置Ｓ３１Ｇ、Ｔ２４７Ａ、Ｔ２４８Ｓ、Ｍ６１７Ｉ及びＶ６７３Ａ）が確認された。ライブラリーの全クローンに認められた（ライブラリー作製中に生じた）付加突然変異Ｈ６７Ｒ、Ｎ１９６Ｔ、Ｒ２６２Ａ及びＳ４９７Ｃも観察された。このシンテターゼ単離体の完全アミノ酸配列及びヌクレオチド配列を表５、配列番号５０及び５１に示す。この改良型突然変異体シンテターゼを図７Ａに模式的に示し、Ｇ２−６シンテターゼ突然変異体におけるｏＮＢＳ組込み活性の改善を図７Ｂに実験により示す。ｏＮＢＳの選択的組込みは発現試験のモデルシステムとして同様にｈＳＯＤを使用するＭＡＬＤＩ  ＭＳにより更に確認された。
【０２７７】
従って、本発明は酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞翻訳機構を使用してｏＮＢＳを蛋白質に生合成的に組込むことが可能な大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼに由来する新規突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼを提供する。
【実施例９】
【０２７８】
フォトケージド非天然アミノ酸Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は古細菌シンテターゼ種と大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０２７９】
「ケージド蛋白質」は光、通常は不活性形態から活性化形態への光分解変換により生物活性を制御することができる修飾蛋白質である。照射のタイミング、位置及び振幅を容易に制御することができ、蛋白質機能の詳細な研究が可能になるのでこれは特に有用である（詳細については、Ｓｈｉｇｅｒｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．２００１，９７：８５；Ｃｕｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ．１９９９，８２：３４１；Ｃｕｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．１９９９，３：８４；“Ｃａｇｅｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；Ｍａｒｒｉｏｔｔ，Ｇ．，Ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８；Ｖ．２９１；及びＡｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｔｓｉｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９３，５５：７５５参照）。
【０２８０】
最も一般的なケージング基は２−ニトロベンジル基であり（Ｂｏｃｈｅｔ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，Ｐｅｒｋｉｎ  １  ２００２，１２５；Ｇｉｖｅｎｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９９８，２９１，１；及びＰｉｌｌａｉ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９８０，１参照）、ポリペプチド又は蛋白質のヒドロキシ、カルボキシ、チオ、又はアミノ基に配置し、非光損傷性紫外光を照射すると、容易に開裂する。従来、ケージング基の配置を位置制御せずに単離蛋白質の化学修飾によりケージド蛋白質が作製されているが、そのため、複数のケージング基を組込むことが多い（例えば、Ｓｅｌｆ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１９９６，２，８１７）。ナンセンスコドン抑圧技術を使用してケージドアミノ酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組込みを利用している例もある（Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１，２８１，Ｃ１９５；Ｐｏｌｌｉｔｔ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９８，３７，２１０５；Ｃｏｏｋら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．１９９５，３４，１６２９参照）。アミノアシル化ｔＲＮＡを化学的に合成しなければならないので、少量の蛋白質しか得られず、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験は制限されている。
【０２８１】
直交翻訳系技術の使用によりこれらの技術の固有の問題が解決された。細胞系を使用し、大腸菌の翻訳機構に新規成分を付加することにより非天然アミノ酸を高い翻訳忠実度で蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏで部位特異的に組込むことができる（詳細については、例えば、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００４，４４，３４；Ｃｒｏｐｐ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｔｒｅｎｄ．Ｇｅｎ．２００４，２０，６２５；及びＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２，１参照）。
【０２８２】
本実施例は大腸菌の遺伝コードにフォトケージドチロシン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン（図１参照）を付加する方法について記載する。チロシンは蛋白質チロシンキナーゼ及びホスファターゼ基質における重要なアミノ酸であり、数個の酵素活性部位の必須残基であり、蛋白質−蛋白質界面に位置することが多い。
【０２８３】
（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｎｅｕｒｏｎ  １９９８，２０，６１９に記載されているようにＬ−チロシンから合成した）Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンに３６５ｎｍで照射すると、図８に模式的に示すように、ベンジルＣＯ結合の開裂と脱ケージドアミノ酸の迅速な形成が誘導される（ｔ１／２＝４分，関連情報参照）。
【０２８４】
図９に示す実験結果に例証するように、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンのフォトケージングを実験により観察することができる。同図に示すように、ハンドヘルドＵＶランプ（３６５ｎｍ、距離１０ｍｍ）を使用して０．２ｍＭ水溶液（６ウェルプレートのウェル１個）の照射によりＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンのフォトケージングを試験した。特定時点でアリコートを分取し、ＬＣ／ＭＳにより分析した。Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン（四角）と脱ケージド種（円）の濃度を図に示す。約４分後に５０％脱ケージングが達成された。
【０２８５】
Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンを受容するが、２０種の標準アミノ酸は基質として受容しない直交シンテターゼを作製するための出発点としてＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＭｊＹＲＳ）を使用した。ＭｊＹＲＳは内在大腸菌ｔＲＮＡをチロシンでアミノアシル化しないが、突然変異体チロシンアンバーサプレッサー（ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ）をアミノアシル化する。Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンを選択的に認識するようにＭｊＹＲＳの特異性を改変するために、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＹＲＳ／ｔＲＮＡＴｙｒ−チロシン複合体（Ｚｈａｎｇら，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．２００５，１４，１３４０；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３，１０，４２５）の結晶構造に基づいてチロシン結合ポケットの６個の残基（Ｔｙｒ３２、Ｌｅｕ６５、Ｐｈｅ１０８、Ｇｌｎ１０９、Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２）をランダムに突然変異させることにより、ＹＲＳ突然変異体約１０９個からなるライブラリーを作製した。これらの６個の残基はチロシンのフェニル環のパラ位とのその近接性に基づいて選択し、そのうち、Ｔｙｒ３２とＡｓｐ１５８はチロシンのヒドロキシル基と水素結合を形成する。これらの残基の突然変異はＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンと他の非天然アミノ酸を特異的に認識するようにシンテターゼの基質結合ポケットを拡大すると予想される。
【０２８６】
ポジティブ選択とネガティブ選択に夫々クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）及びバルナーゼレポーターシステムを使用して突然変異体ＭｊＹＲＳライブラリーから活性シンテターゼ変異体をスクリーニングした。交互に５ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択後に、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンの存在下と不在下で９６個のクローンの表現型をスクリーニングした。ＣＡＴ遺伝子のＡｓｐ１１２ＴＡＧコドンの抑圧に基づくｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して３個のシンテターゼを更に特性決定した。３個のＭｊＹＲＳ／ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ対を発現する大腸菌はクロラムフェニコール上で生存し、ＩＣ５０値はＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン（１ｍＭ）の存在下と不在下で夫々１１０ｍｇ／Ｌと１０ｍｇ／Ｌ未満であった。クロラムフェニコール耐性の大きな差は選択したシンテターゼ／ｔＲＮＡ対がアンバーコドンに応答して２０種の全天然アミノ酸よりもＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンの挿入に実質的なｉｎ  ｖｉｖｏ特異性をもつこと示唆している。
【０２８７】
これらの３個のＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン−ｔＲＮＡシンテターゼをコードする核酸をシーケンシングし、それらのアミノ酸配列を推定した。３個のＯＮＢＹシンテターゼクローンの完全アミノ酸配列を表５、配列番号５２〜５４に示す。このシーケンシングの結果を表３に示す。
【表３】
0005539948.tif 000007
【０２８８】
突然変異Ｔｙｒ３２→Ｇｌｙ３２／Ａｌａ３２及びＡｓｐ１５８→Ｇｌｕ１５８、Ａｌａ１５８、又はＳｅｒ１５８の結果、Ｔｙｒ３２、Ａｓｐ１５８と天然基質チロシンの間の水素結合が失われ、その結合が低下すると考えられる。
【０２８９】
３個のＯＮＢ−ＭｊＹＲＳの忠実度と効率を測定するために、Ｃ末端にヘキサヒスチジンタグを付けた突然変異体マッコウクジラミオグロビン遺伝子の４位のアンバーコドンに応答してＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンを組込んだ。組換え蛋白質を発現させるために、シンテターゼ／ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ対とＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン（１ｍＭ）の共存下で（アラビノースプロモーターとｒｒｎＢターミネーターの制御下の突然変異体マッコウクジラミオグロビン遺伝子と；ｌｐｐプロモーターとｒｒｎＣターミネーターの制御下のチロシルｔＲＮＡＣＵＡと；テトラサイクリン耐性マーカーをコードする）プラスミドｐＢＡＤ／ＪＹＡＭＢ−４ＴＡＧを（突然変異体シンテターゼとカナマイシン耐性遺伝子をコードする）ｐＢＫベクターと共にＤＨ１０Ｂ大腸菌に同時形質転換した。テトラサイクリン（２５ｍｇ／Ｌ）とカナマイシン（３０ｍｇ／Ｌ）を補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（５ｍＬ）で細胞を増幅させ、リン酸緩衝液で洗浄し、適当な抗生物質、フォトケージドチロシン（１ｍＭ）、及びアラビノース（０．００２％）を加えた液体グリセロール最少培地（ＧＭＭＬ；０．３ｍＭロイシンを補充したグリセロール最少培地）５００ｍＬに接種するために使用した。細胞を飽和まで増殖させた後、遠心により回収した。
【０２９０】
Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより収量約２〜３ｍｇ／Ｌで精製突然変異体ミオグロビン蛋白質が得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色により＞９０％均質であると判定された。収量は同一アンバーコドンを抑圧する野生型ＭｊＹＲＳ／ｍｕｔＲＮＡＣＵＡ対を使用するミオグロビン発現と同等である。非天然アミノ酸の不在下又は１ｍＭチロシンの存在下ではミオグロビンを検出することができず、全３個のシンテターゼはＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンに対して非常に高い選択性をもつことが判明した（図１０参照）。
【０２９１】
部位特異的フォトケージド蛋白質の存在を更に確認するために、（高い質量分析特性により）Ｇｌｙ７４にアンバーコドンをもつ別のミオグロビン突然変異体をｐＯＮＢ−ＭｊＹＲＳ−１、ｔＲＮＡＣＵＡ、及びＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン（１ｍＭ）の存在下で発現させた。Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン（１ｍＭ）の存在下でシンテターゼｐＯＮＢ−１を使用し、４ＴＡＧ突然変異体と同一条件下でミオグロビン突然変異体７４ＴＡＧを発現させ、ニッケルアフィニティーカラムにより精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色により蛋白質バンドを可視化し、ポリアクリルアミドゲルから切り出した。ゲル切片を１．５ｍｍ立方体にスライスし、ほぼ従来の記載通りにトリプシン加水分解した（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら（１９９６）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６８：８５０−８５８）。Ｎａｎｏｓｐｒａｙ  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズ）を取付たＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  Ｄｅｃａイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）で液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によりトリプシンペプチドを分析した。非天然アミノ酸（Ｊで示す）を含むペプチドＨＧＶＴＶＬＴＡＬＧＪＩＬＫ（配列番号６５）の単一及び二重荷電イオンに対応する前駆体イオンをイオントラップ質量分析計で分離分画した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は７４位にチロシンを示す（トリプシンペプチドＨＧＶＴＶＬＴＡＬＧＹＩＬＫ（配列番号６４））。フラグメントイオン質量は帰属させることができ、チロシン（３）が７４位に部位特異的に組込まれたことが確認された（図１１Ａ及び１１Ｂ参照）。Ｔｙｒ７４の検出はＭＳ分析中にＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンの不安定なベンジルエーテルが分解したためである可能性が高い。
【０２９２】
ケージドアミノ酸Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンの上記組込みを確認するために、重水素化誘導体を合成し、同一条件下で同一ミオグロビン突然変異体の発現に使用した。次に蛋白質をトリプシン処理し、質量分析により分析した。フラグメントイオン質量の帰属の結果、ミオグロビンの７４位にｄ２−チロシンの組込みが判明し、非天然アミノ酸２の組込みが明白に実証された（図１２Ａ及び１２Ｂ参照）。ＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析はこの位置に天然アミノ酸の組込みを示さず、進化型シンテターゼの高い忠実度が更に証明された。
【０２９３】
更に、ｌａｃＺをレポーター遺伝子として使用することにより、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンをもつ蛋白質のｉｎ  ｖｉｖｏ光化学的活性化を実証することができる。大腸菌β−ガラクトシダーゼは５０３位に必須チロシンを示す（Ｊｕｅｒｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，４０，１４７８１；Ｐｅｎｎｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９，７７，２２９）。ケージドＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンを組込むために、対応するコドンをアンバー終止コドンＴＡＧに突然変異させた。β−ガラクトシダーゼをチロシン脱ケージングの前後にモニターする。ｉｎ  ｖｉｖｏ照射後にβ−ガラクトシダーゼ活性は回復する。
【実施例１０】
【０２９４】
非天然アミノ酸ｐ−シアノフェニルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してｐ−シアノフェニルアラニン（図１参照；４−シアノフェニルアラニンとも言う）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０２９５】
シアノ基は疎水性又は親水性環境で移動させると、そのＣＮ伸縮振動（ｖ２）が１０のオーダーの波数で周波数シフトするので、優れた局所環境ＩＲプローブである（Ｇｅｔａｈｕｎら，“Ｕｓｉｎｇ  Ｎｉｔｒｉｌｅ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｌｏｃａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”ＪＡＣＳ  １２５，４０５−４１１［２００３］）。従って、パラ（４位）及びメタ（３位）シアノフェニルアラニンは蛋白質−蛋白質結合、蛋白質コンホメーション、及び疎水性崩壊を含む各種蛋白質特性の研究に有用である。
【０２９６】
パラ形とメタ形のシアノフェニルアラニンはペプチド鎖中にあるときには極性環境と疎水性環境の両者に存在することができ、コンホメーションに及ぼすそれらの効果はごく僅かである。従って、どちらも蛋白質又はペプチドにおいてこれらが置換する野生型残基と同一環境に存在すると思われる。更に、これらの化合物のＣＮ伸縮振動は狭く、他の蛋白質吸収とオーバーラップせず、蛋白質の他の振動から分離されていることが多く、溶媒極性の変化に対して極めて感受性である。これらの理由から、どちらもペプチドコンホメーション研究の優れたツールである。
小ペプチドにおける局所環境ＩＲプローブとしての芳香族ニトリル
【０２９７】
Ｇｅｔａｈｕｎら（Ｇｅｔａｈｕｎら，“Ｕｓｉｎｇ  Ｎｉｔｒｉｌｅ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｌｏｃａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”ＪＡＣＳ  １２５，４０５−４１１［２００３］）はパラ−シアノフェニルアラニンのシアノ伸縮振動が水中ではＴＨＦ中よりも１０波数大きいことを示した（図１３参照）。パラ−シアノフェニルアラニンをその脂質結合部分に組込むように１４残基両親媒性ペプチドマストパランｘ（ＭＰｘ）を突然変異させると、ＭＰｘをＰＯＰＣ脂質二重層に結合した場合にシアノ伸縮は２２２９．６ｃｍ−１で生じる。水中では、ＭＰｘ  ＰｈｅＣＮ突然変異体のＣＮ伸縮振動は２２３５．７ｃｍ−１で生じる。つまり、水和ペプチド中のシアノ伸縮は水中の遊離パラ−シアノフェニルアラニンシアノ伸縮と同等であるが、埋設型ペプチド中のＰｈｅＣＮシアノ伸縮はＴＨＦ中の遊離ＰｈｅＣＮシアノ伸縮と同等である（Ｔｕｃｋｅｒら，“Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｓｉｄｅ  Ｃｈａｉｎｓ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”ＪＡＣＳ  １２６  ５０７８−５０７９［２００４］）。
【０２９８】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡと併用した。この新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡにｐ−シアノフェニルアラニンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答してｐ−シアノフェニルアラニンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。これらのｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はＴＡＧのみに応答して送達される。
【０２９９】
直交ｔＲＮＡにｐ−シアノフェニルアラニンを特異的に負荷することが可能な直交シンテターゼの探索を実施した。この探索は従来記載されているプロトコールを使用した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製し、突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０３００】
突然変異誘発後、突然変異体シンテターゼライブラリーを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡにｐ−シアノフェニルアラニンを負荷することが可能な１個のシンテターゼクローンが得られた。このシンテターゼクローンをシーケンシングし、アミノ酸配列を決定した（表５、配列番号５５及び５６参照）。このシンテターゼ突然変異体は野生型シンテターゼ配列に対して以下の置換：Ｔｙｒ３２Ｌｅｕ、Ｌｅｕ６５Ｖａｌ、Ｐｈｅ１０８Ｔｒｐ、Ｇｌｎ１０９Ｍｅｔ、Ａｓｐ１５８Ｇｌｙ及びＩｌｅ１５９Ａｌａを示す。
【実施例１１】
【０３０１】
非天然アミノ酸ｍ−シアノフェニルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してｍ−シアノフェニルアラニン（図１参照；３−シアノフェニルアラニンとも言う）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０３０２】
シアノ基は疎水性又は親水性環境で移動させると、そのＣＮ伸縮振動（ｖ２）が１０のオーダーの波数で周波数シフトするので、優れた局所環境ＩＲプローブである（Ｇｅｔａｈｕｎら，“Ｕｓｉｎｇ  Ｎｉｔｒｉｌｅ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｉｎｆｒａｒｅｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｌｏｃａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”ＪＡＣＳ  １２５，４０５−４１１［２００３］）。従って、パラ（４位）及びメタ（３位）シアノフェニルアラニンは蛋白質−蛋白質結合、蛋白質コンホメーション、及び疎水性崩壊を含む各種蛋白質特性の研究に有用である。
【０３０３】
パラ形とメタ形のシアノフェニルアラニンはペプチド鎖中にあるときには極性環境と疎水性環境の両者に存在することができ、コンホメーションに及ぼすそれらの効果はごく僅かである。従って、どちらも蛋白質又はペプチドにおいてこれらが置換する野生型残基と同一環境に存在すると思われる。更に、これらの化合物のＣＮ伸縮振動は狭く、他の蛋白質吸収とオーバーラップせず、蛋白質の他の振動から分離されていることが多く、溶媒極性の変化に対して極めて感受性である。これらの理由から、どちらもペプチドコンホメーション研究の優れたツールである。
蛋白質における芳香族ニトリル
【０３０４】
確立されている特異的進化プロトコールに従い、アンバーＴＡＧコドンに応答して高い忠実度でメタ−シアノフェニルアラニンを部位特異的に組込む新規Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ−チロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）対を開発した。この直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡにｍ−シアノフェニルアラニンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答してｍ−シアノフェニルアラニンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。これらのｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はアンバーナンセンスコドンＴＡＧのみに応答して送達される。
【０３０５】
直交ｔＲＮＡにｍ−シアノフェニルアラニンを特異的に負荷することが可能な直交シンテターゼの作製は従来記載されているプロトコールを使用した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製し、突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０３０６】
突然変異誘発後、突然変異体シンテターゼライブラリーを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡにｍ−シアノフェニルアラニンを負荷することが可能な１個のシンテターゼクローンが得られた。このシンテターゼクローンをシーケンシングし、アミノ酸配列を決定した（表５、配列番号５７及び５８参照）。このシンテターゼ突然変異体は野生型シンテターゼ配列に対して以下の置換：Ｔｙｒ３２Ｈｉｓ、Ｈｉｓ７０Ｓｅｒ、Ａｓｐ１５８Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１５９Ｓｅｒ及びＬｅｕ１６２Ｐｒｏを示す。
【０３０７】
夫々の直交ｔＲＮＡ／シンテターゼ対を使用してｍ−シアノフェニルアラニンとｐ−シアノフェニルアラニンの存在下と不在下の両者でｃ末端Ｈｉｓ６タグ付きＺドメイン蛋白質のＴｙｒ７→ＴＡＧ突然変異体を抑圧しようと試みた。どちらの場合も、非天然アミノ酸の存在下では全長蛋白質が産生されたが、各非天然アミノ酸の不在下ではＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでクーマシーブルー染色により生成物は検出できなかった。
【０３０８】
更に、メタ及びパラ−シアノフェニルアラニンの両者を７位に組込んだこの蛋白質のＩＲスペクトルを得た。野生型ｚドメインＩＲスペクトルのバックグラウンドを差し引いた後に、図１４Ａ及び１４Ｂに示すスペクトルが得られた。図１４Ａはパラ−シアノフェニルアラニンが図１３に示す極大値の中間に単一吸光度をもつことを示し、残基番号７は蛋白質の表面に位置するが、直接分解しないことを示唆している。図１４Ｂは２２３６ｃｍ−１と２２２８ｃｍ−１にピークをもつ２つのガウス分布の和としてメタ−シアノフェニルアラニンのスペクトルを示す。曲線のＲ２値は非常に良好な曲線フィットである０．９９よりも大きく、従って、図１４Ｂのデータはｍ−シアノフェニルアラニンが２個のコンホメーションをもつことを示唆している。２２２８ｃｍ−１のピークから明らかなように、一方のコンホメーションはシアノ基を蛋白質の疎水性領域に配置する。２２３６ｃｍ−１のピークは他方のコンホメーションがシアノ基を水和環境に配置することを示唆している。
【実施例１２】
【０３０９】
非天然アミノ酸ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０３１０】
生体物理学的プローブ、細胞傷害剤、架橋剤、及び他の物質による蛋白質の部位特異的修飾は蛋白質構造及び機能の分析と、診断薬、治療薬、及び高スループットスクリーニングの開発に広く使用されている。蛋白質を選択的に修飾する１つのアプローチはＮ末端セリン又はスレオニンを酸化して対応するアルデヒドとした後にヒドラジン、アルコキシアミン、又はヒドラジン誘導体と結合する方法である。残念ながら、この方法は蛋白質のＮ末端位置を修飾するためにしか使用することができないので限定されている。２−アミノ−１−ヒドロキシエチルのアミノアルコール必須官能基を標的蛋白質の側鎖に配置する本発明のアプローチはＮ末端に限定された選択的蛋白質修飾の問題を解決すると共に、更に蛋白質中のアミノアルコール基の位置を制御できるという利点もある。
【０３１１】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡと併用した。この新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡにｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答してｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。このｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はアンバーナンセンスコドンＴＡＧのみに応答して組込まれる。
【０３１２】
直交ｔＲＮＡにｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニンを特異的に負荷することが可能な直交シンテターゼの探索を実施した。この探索は従来記載されているプロトコールを使用した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製し、突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０３１３】
突然変異誘発後、突然変異体シンテターゼライブラリーを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡにｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニンを負荷することが可能な１個のシンテターゼクローンが得られた。このシンテターゼクローンをシーケンシングし、アミノ酸配列を決定した（表５、配列番号５９参照）。このシンテターゼ突然変異体は野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉシンテターゼ配列に対して以下の置換を示す。
【表４】
0005539948.tif 000008
【実施例１３】
【０３１４】
非天然アミノ酸ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０３１５】
半合成蛋白質の作製に有用な１つの方法は全く保護されていない２個のペプチドフラグメントを室温で温和な生理的条件下にアミド結合により結合することができる天然化学ライゲーションである（Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２００５，３４，９１−１１８；Ｄａｗｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，２６６，７７６−７７９）。一方又は両方の反応パートナーを組換え手段により作製した発現蛋白質ライゲーションと呼ぶこの方法の変法は１００残基を上回る蛋白質の合成に有用である（Ｍｕｉｒ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００３，７２，２４９−２８９；Ｄａｖｉｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４，２７１，６６３−６７７）。実際に、どちらの技術もＣ末端α−チオエステルの存在が必要であるため、これらの方法はペプチドフラグメントのＣ末端の修飾に限定されている。細菌で発現されたペプチド／蛋白質の任意残基に反応性チオエステル基を配置できるならば、これらの技術の範囲は著しく拡大し、例えば、環状又は分岐構造の合成や、生体物理学的プローブ、ポリエチレングリコール又は各種タグによる側鎖の選択的修飾が可能になると思われる。チオエステル含有側鎖をもつ蛋白質の作製方法は、チオエステル含有側鎖がｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び場合によりｉｎ  ｖｉｖｏでの後期化学ライゲーション反応に関与し得る用途に利用される（Ｃａｍａｒｅｒｏ  ａｎｄ  Ｍｕｉｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，５５９７−５５９８；Ｃａｍａｒｅｒｏら，Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００１，９，２４７９−２４８４；Ｓｃｏｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９９，９６，１３６３８−１３６４３；Ｅｖａｎｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５，９０９１−９０９４；Ｙｅｏら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３，２８７０−２８７１）。
ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンの合成
【０３１６】
市販のα−ブロモ−ｐ−トルイル酸（１ａ）とＮ−（ジフェニルメチレン）グリシンｔｅｒｔ−ブチルエステル（１ｃ）から出発して４段階（図１５参照）でｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（構造１；４−（エチルチオカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニンとも言う）を合成した。これらの段階を以下に要約する。
【０３１７】
４−（ブロモメチル）ベンゾチオ酸Ｓ−エチル（構造１ｂ）の合成：１ａ（２．１５ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍｌ）溶液に塩化チオニル（２ｍｌ，２８ｍｍｏｌ）とＤＭＦ（５０μｌ）を順次加え、反応混合物を５時間室温で撹拌した。白色固体が出現するまで有機溶媒を減圧除去した後、白色固体をＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶かし、溶液を０℃まで冷却した。エタンチオール（０．７８ｍｌ，１０．０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２ｍｌ，１４ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液を３０分間かけて滴下した。反応混合物を更に４時間撹拌し、溶媒を除去した。水（１００ｍｌ）とエーテル（２００ｍｌ）を加えた。有機相をＨ２Ｏ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥し、減圧除去した。粗生成物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中８％酢酸エチル）により精製すると、１ｂ（２．１８ｇ，７８％）が無色油状物として得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．５０（ｓ，２Ｈ），３．０７（ｑ，Ｊ＝７．６，１５．２Ｈｚ，２Ｈ），１．３５（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，３Ｈ）。精密質量ｍ／ｚ  Ｃ１０Ｈ１１ＢｒＯＳの計算値２５８．０／２６０．０，実測値（ＬＣ／ＭＳ）２５９．１／２６０．１。
【０３１８】
２−（ジフェニルメチレンアミノ）−３−（４−（エチルチオカルボニル）フェニル）プロパン酸ｔｅｒｔ−ブチル（構造１ｄ）の合成：１ｂ（０．４５５ｇ，１．７６ｍｍｏｌ）、１ｃ（０．４７ｇ，１．６０ｍｍｏｌ）、１８−クラウン−６（０．４２ｇ，１．５９ｍｍｏｌ）及び無水Ｋ２ＣＯ３（０．３４４ｇ，２．５０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ３ＣＮ（１０ｍｌ）溶液を２４時間室温で撹拌した。有機溶媒を減圧除去した。水（１００ｍｌ）とＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍｌ）を加えた。有機相をＨ２Ｏ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＮａＳＯ４で乾燥し、減圧除去した。粗生成物を精製せずに次段階で直接使用した。精密質量ｍ／ｚ  Ｃ２９Ｈ３１ＮＯ３Ｓの計算値４７３．２，実測値（ＬＣ／ＭＳ）４７４．３。
【０３１９】
（４−（エチルチオカルボニル））フェニルアラニン（１）の合成：前段階からの１ｄ（０．９４ｇ，２．０ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸（８ｍｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（２ｍｌ）溶液を１時間室温で撹拌した。有機溶媒を完全に減圧除去した後、濃ＨＣｌ溶液（０．８ｍｌ）とＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を加え、得られた溶液を１時間室温で撹拌した後、全溶媒を除去し、無水アセトン（１０ｍｌ）を加えた。溶液を濾過し、回収した固体に無水ＭｅＯＨ（２ｍｌ）を加えて研和した。濾過後、メタノール濾液を減圧すると、１が白色固体として得られた（＞０．５５ｇ，９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．８５（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），４．２１（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），３．０６（ｑ，Ｊ＝１４．８，１７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．００（ｓ，２Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。精密質量ｍ／ｚ  Ｃ１２Ｈ１５ＮＯ３Ｓの計算値２５３．１，実測値（ＬＣ／ＭＳ）２５４．２。
ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン組込みの遺伝的プログラミング
【０３２０】
ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンを大腸菌で遺伝的にコードさせるためには、このアミノ酸に特異的な直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を作製することが必要であった。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡＬ−チロシン複合体（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３，１０，４２５−４３２）の結晶構造に基づき、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳのチロシン結合部位の６個の残基（Ｔｙｒ３２，Ｌｅｕ６５，Ｐｈｅ１０８，Ｇｌｎ１０９，Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２）をランダムに突然変異させた。夫々ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下と不在下でＴｙｒＲＳ突然変異体１０９個のライブラリーに（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼのアンバーコドンの抑圧に基づく）ポジティブ選択３ラウンドと（バルナーゼ遺伝子の３個のアンバーコドンの抑圧に基づく）ネガティブ選択２ラウンドを交互に実施すると、クロラムフェニコール中の生存がｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンに依存する多数のクローンが出現した。これらの突然変異体のうちの１個はｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下で１２０μｇ  ｍＬ−１クロラムフェニコールと、その不在下で１０μｇ  ｍＬ−１クロラムフェニコール中で細胞増殖に対応することが判明した。
【０３２１】
このクローンのシーケンシングの結果、以下の突然変異が判明した：Ｔｙｒ３２Ａｌａ、Ｌｅｕ６５Ｐｈｅ、Ｐｈｅ１０８Ｔｒｐ、Ｇｌｎ１０９Ｓｅｒ、Ａｓｐ１５８Ｓｅｒ及びＬｅｕ１６２Ｈｉｓ（表５、配列番号６０参照）。Ｔｙｒ３２→Ａｌａ３２の突然変異は結合チロシンのフェノールヒドロキシル基とＴｙｒ３２の間の水素結合を除去すると思われる。
【表５】
0005539948.tif 000009
【０３２２】
観察される表現型がｍｕｔＲＮＡＣＵＡ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対によるｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンの部位特異的組込みに起因することを確認するために、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグに融合したＺドメイン蛋白質（Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９８７，１，１０７−１１３）をコードする遺伝子の７番目のコドン（Ｔｙｒ）をアンバーコドンで置換した。１ｍＭ  ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンの存在下又は不在下で蛋白質を発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、突然変異体Ｚドメイン蛋白質の発現はｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンの存在に完全に依存することが判明した。突然変異体蛋白質は野生型Ｚドメイン蛋白質（１％グリセロール、０．３ｍＭロイシン及び１ｍＭ  ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンと適当な抗生物質を添加した最少培地中〜８ｍｇ／Ｌ）に対して約１０〜３０％の収率で発現された。
【０３２３】
ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンの部位特異的組込みはマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）により更に確証された。無傷のＴｙｒ→ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン蛋白質（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８００２Ｄａ，図１６参照）で８００６Ｄａの平均質量実験値が観察されたことに加え、最初のメチオニン部分をもたないアセチル化形態の突然変異体蛋白質（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７９１３Ｄａに対してＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝７９１３Ｄａ）に対応する弱いピークと、最初のメチオニン部分をもたない突然変異体蛋白質（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８７１Ｄａに対してＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝７８７１Ｄａ）に対応する主ピークも検出された（図１６）。７位にチオエステル部分ではなく遊離カルボン酸基を含むＺドメイン蛋白質に対応する７８２８Ｄａの別の主ピークも存在していた（プロトン化形態の質量計算値７８２７Ｄａ）。酸とチオエステルを含有する突然変異体蛋白質の両者が質量検出条件下で同等のイオン化効率をもつと仮定すると、それらの対応する質量ピーク面積の積分は約４０％のチオエステル含有突然変異体蛋白質が加水分解されることを示唆している。突然変異体シンテターゼがその加水分解形態の非天然アミノ酸ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンをｉｎ  ｖｉｖｏで組込まず、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンがｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両者で安定しているらしいという事実は、チオエステルから酸への加水分解がチオエステル特異的突然変異体シンテターゼによるＺドメイン蛋白質へのその組込み後に生じることを示唆している。
【０３２４】
突然変異体蛋白質のチオエステル側鎖を選択的に修飾できるか否かを調べるために、１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）と２Ｍ塩化グアニジニウムを加えたリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、２０〜６０μｇ／ｍｌ粗チオエステル含有突然変異体蛋白質と１０ｍＭシステインエチルエステルを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学ライゲーションを実施した。得られた修飾蛋白質を次に精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。システイン１分子で修飾したチオエステル含有蛋白質に対応する７９５６Ｄａと７９９８Ｄａの平均質量実験値が得られた（夫々最初のメチオニン部分をもたない蛋白質と最初のメチオニン部分をもたないアセチル化形態の蛋白質のＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７９５８Ｄａ及び８０００Ｄａ）（図１７）。標識効率はそれらの質量ピーク面積の積分により８５％を上回ると定量的に推定することができる。
【０３２５】
図１６に示すように、Ｚドメイン蛋白質は主に最初のメチオニン残基なしに発現される。この形態では、未修飾チオエステル含有突然変異体蛋白質は分子量７８７２であり、アセチル化形態の酸含有蛋白質（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８６９Ｄａ）とオーバーラップしていると思われる。従って、標識効率を計算する際には、７８６７Ｄａのピーク面積を未修飾チオエステル含有蛋白質の上限値としたため、８５％を上回る標識効率推定値が得られた。
【０３２６】
７８２５Ｄａと７８６７Ｄａ（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８２７Ｄａ及び７８６９Ｄａ）のピークはシステインエチルエステルに対して非反応性の７位カルボン酸基を含むＺドメイン蛋白質の存在を示す。予想通り、ＷＴ  Ｚドメイン蛋白質に標識物は検出されず、標識反応はシステイン分子とチオエステル基の間のみで生じ、ＷＴ蛋白質の既存官能基間には生じないことが判明した。他方、チオエステル含有突然変異体蛋白質ではチオエステル基と５個のリジン残基のε−アミノ基に関する分子内側鎖環化も自己二量化も観察されなかった。従って、これらのデータはチオエステル基が確実で選択的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質修飾に優れた選択性と反応性をもつことを実証するものである。
システインエチルエステルとチオエステルを含有するＺドメイン蛋白質の化学ライゲーション
【０３２７】
突然変異体ｔＲＮＡシンテターゼをコードするプラスミドと、７位アンバーコドンとＣＯＯＨ末端Ｈｉｓ−６タグをもつＺドメイン遺伝子をコードする発現ベクターｐＬＥＩＺを導入した大腸菌ＤＨ１０Ｂ細胞（６０ｍｌ）を３７℃で増殖させ、１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることによりＯＤ６００＝０．５で４時間誘導し、ペレット化した。ペレット化した細胞に緩衝液（６Ｍ塩化グアニジニウム、１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ＝８．０）１ｍｌを加えた。溶液を１時間室温で振盪し、３分間音波処理し、遠心して細胞破片を除去した。透明上清にリン酸緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、２００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１Ｍシステインエチルエステル、ｐＨ＝８．０）２ｍｌと、ジチオスレイトール溶液（２Ｍ）１５０μｌと、２−メルカプトエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳＮＡ）６０ｍｇを加えた。溶液混合物を１２時間室温で振盪した。修飾蛋白質を含有する溶液を交換し、緩衝液（８Ｍ尿素、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｚｍａ，ｐＨ８．０）５００μｌに濃縮した。修飾蛋白質を製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）に従ってＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、蒸留水で透析し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。
結論
【０３２８】
結論として、本発明ではＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される新規直交シンテターゼを提供した。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡと併用すると、これらの試薬はポリペプチド鎖への非天然アミノ酸ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンのｉｎ  ｖｉｖｏ組込みを可能にする。本実施例は規定部位に側鎖チオエステル基を含む蛋白質の細菌による生産のための生合成プロトコールを例証する。従って、アミノ酸の蛋白質組込み後にｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンアミノ酸残基上の反応基に多様なリガンドを高度に選択的で効率的に化学ライゲーションすることが可能になる。
【実施例１４】
【０３２９】
ジケトン非天然アミノ酸ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してジケトン非天然アミノ酸ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０３３０】
単純なモノケトン又はβ−ジケトン官能基がブチルアミンとイミンを形成する能力と、こうして形成されたイミンの各種ｐＨのリン酸緩衝液中における安定性に関する比較試験によると、ｐＨ６．５〜１０．５でβ−ジケトン部分から形成されるエノールイミンが生成し易いことと、ｐＨ３．９までの酸加水分解に対してその安定性が高いことが明らかである。他方、同一条件下でｐＨ１０．５までモノケトン基は主に遊離形態のままであり、イミン形成は検出できない。従って、β−ジケトン部分をその側鎖にもつ非天然アミノ酸を合成し、この非天然アミノ酸を組込むことが可能な直交ｔＲＮＡ−シンテターゼ対の同定を行った。本発明はこのジケトン含有アミノ酸を高い翻訳効率及び忠実度で蛋白質に特異的にｉｎ  ｖｉｖｏで組込む有効な進化型突然変異体シンテターゼを提供する。以下に詳述するように、Ｚドメイン蛋白質に遺伝的にコードさせたこのジケトン基に次にビオチンヒドロキシルアミン誘導体が選択的に結合し、ジケトン部分は各種外部性質を標的蛋白質に導入するために標準生化学成分に対して直交性の反応性をもつ強力な化学基として機能し得ることを示唆された。
【０３３１】
大腸菌又は酵母の翻訳機構に新規成分を付加することにより、直交翻訳成分を使用して非カノニカルアミノ酸を高い翻訳忠実度及び効率で蛋白質に部位特異的にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで組込むことができることは従来実証されている。このアプローチはケトン含有アミノ酸を蛋白質に遺伝的に組込むために使用されており、その後、ヒドラゾン及びオキシム結合の形成により各種生物学的及び／又は物理的性質をもつ非ペプチド分子（例えば、ポリエチレングリコール、ビオチン、糖ミメティクス等）と結合することができる。これらのヒドラゾン及びオキシム結合は生理的条件下で安定であるが、２０種の標準アミノ酸に存在しない２個の官能基の共存を必要とするという欠点がある。リジンのε−アミノ基又はα−アミノ基と安定な付加物を直接形成するチオエステル又はβ−ジケトン等の反応性官能基があったならば、分子間又は分子内蛋白質架橋を形成することができよう。このために、本実施例では大腸菌におけるジケトン含有アミノ酸２の遺伝的コーディングを報告する。図２１参照。
【０３３２】
アリールジケトン２と脂肪族アミンの結合物は６員分子内水素結合により安定化された対応するエナミンに互変異性化することが可能なイミン付加物３（図２１参照）を形成できるのではないかと考えた。その結果、生理的ｐＨで安定な付加物が得られると思われる。この根拠を実験により検証するために、まず６．５〜１０．５の各種ｐＨの１００ｍＭリン酸緩衝液中でブチルアミンとアリールモノケトン１ａ及びアリールジケトン２の間の一連のイミン形成を含む単純なモデルシステムの相対反応性を測定した。液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）を使用して各種付加物（１ｂ及び３ａ−３ｄ）をアッセイした。表４参照。同表は各種ｐＨのＰＢＳ緩衝液（１００ｍＭ  Ｋ（ＰＯ４）ｉ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ）中でブチルアミン（１０ｍＭ）とアリールモノケトン１（１ｍＭ）又は２（１ｍＭ）のイミン形成の結果を示す。反応は室温で１週間実施した。
【表６】
0005539948.tif 000010
この分析の結果、１０．５までのｐＨでは１ａほぼ遊離形態のままであり、１ｂの形成は検出できなかった。他方、ｐＨ７．４で２の５０％が３に変換されており、この百分率はｐＨ１０．５では７５％という高い値まで増加する。
【０３３３】
即ち、ケト形態２ｂとエノール−イミン形態３ｂは水性媒体中で他の対応する互変異性体よりも多いという従来の知見（Ｉｇｌｅｓｉａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００４，８，１−２４；Ｐａｔｔｅｕｘら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００３，５，３０６１−３０６３；Ａｌｙ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２００３，５０，１７３９−１７４７；Ｌｏｐｅｚら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  １９９８，９，３７４１−３７４４；Ｍａｚｚｏｎｅら，Ｓ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２１，２７７−２８４；及びＫｉｍ  ａｎｄ  Ｒｙｕ，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９２，１３，１８４−１８７）と総合すると、水素結合により誘導された安定化は１ａと比較した場合に３（主に３ｂ）の生成を有意に助長することが確認される。
【０３３４】
安定化された分子内Ｈ結合が単純イミン１ｂよりも３の加水分解安定性を増加することを更に確証するために、１．９〜９．４のｐＨで１ｂと３の両者にＬＣ／ＭＳ分析も実施した。図１に実証するように、３（主に３ｂ）は７．４以上の生理的ｐＨでほぼ無傷のままである。ｐＨを３．９まで下げると、室温で４日後に僅かに〜４０％の３から２への変換が生じる。より酸性度の高い処理を３に実施すると、アミノ基は完全に除去された（図１８）。予想されたことではあるが、全く対照的に、１ｂはｐＨ１０．５でも一晩撹拌後に容易に加水分解される（データは示さず）。
非天然アミノ酸合成
【０３３５】
これらの知見に力を得て、β−ジケトン部分をその側鎖に含む非天然アミノ酸ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンを修飾するための化学を確立したいと思った。本発明の合成ストラテジー（図１９参照）はまず主鎖アミノ基と酸基をＢｏｃ化学とエステル化により夫々保護することにより入手し易いｐ−アセチル−（±）−Ｌ−フェニルアラニンから出発する。第２のカルボニル基の付加は混合溶媒（２：３［ｖ／ｖ］酢酸メチル：ＴＨＦ）中、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドを使用する反応条件下で実施した。Ｂｏｃ基をＴＦＡで除去した後にアルカリ加水分解すると、所望ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンが総収率４０％で得られた。
直交翻訳成分の同定
【０３３６】
確立プロトコールを使用してｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンを蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための新規直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を作製した。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳ−ｔＲＮＡ（Ｔｙｒ）Ｌ−チロシン複合体（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００３，１０，４２５−４３２）の結晶構造に基づき、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＴｙｒＲＳのチロシン結合部位の周囲の６個の残基（Ｔｙｒ３２，Ｌｅｕ６５，Ｐｈｅ１０８，Ｇｌｎ１０９，Ａｓｐ１５８及びＬｅｕ１６２）をランダムに突然変異させた。作製した突然変異体約１０９個からなるライブラリーに本発明者らの公開プロトコールに従ってポジティブ選択３ラウンドとネガティブ選択２ラウンドを順次実施した後に、クロラムフェニコール中の生存がｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの存在に依存する多数のクローンが出現した。ＣＡＴ遺伝子のＡｓｐ１１２ＴＡＧコドンの抑圧に基づくｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用することにより２個のＴｙｒＲＳ突然変異体を同定した。これらの２個の突然変異体はｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの存在下で１２０μｇ  ｍＬ−１クロラムフェニコールと、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの不在下で１０μｇ  ｍＬ−１クロラムフェニコール中で細胞増殖が可能である。この結果は、２個の進化型シンテターゼがいずれも天然アミノ酸よりもｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンに対して高い活性をもつことを示唆している。これらの突然変異体のＤＮＡをシーケンシングした処、同一配列に収束することが判明した（表５、配列番号６１参照）。
【０３３７】
結合チロシンのフェノールヒドロキシ基とＴｙｒ３２及びＡｓｐ１５８の間の水素結合はいずれもＧｌｙへの突然変異により破壊される。Ｌｅｕ６５をＶａｌ６５に変換すると、恐らくβ−ジケトンの延長主鎖を受容するためにより大きなスペースが得られる。従って、Ｐｈｅ１０８Ｔｈｒ及びＬｅｕ１６２Ｓｅｒの突然変異とＧｌｎ１０９の保存はβ−ジケトン部分のカルボニル酸素とのＨ結合にそれらが関与していることを示すものであると思われる。これらのシンテターゼクローンの配列を以下に要約する。
【表７】
0005539948.tif 000011
【０３３８】
観察される表現型がｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対によるｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの部位特異的組込みに起因することを確認するために、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグに融合したＺドメイン蛋白質（Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１９８７，１，１０７−１１３）をコードする遺伝子の７位のチロシンのコドンの代わりにアンバーコドンを導入した。１ｍＭ  ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの存在下又は不在下で蛋白質を発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーにより精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、非天然アミノ酸に依存的な蛋白質発現が判明した（図２０）。ゲルに負荷された突然変異体蛋白質の容量はジケトン含有非天然アミノ酸をチロシン残基で置換した野生型（ＷＴ）蛋白質の３倍であり、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの組込み効率はチロシンに比較して約３０％であることが判明した。
【０３３９】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）によりｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの明白な組込みが更に確証された。無傷の蛋白質で７９９１Ｄａ（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７９９７Ｄａ）の平均質量実験値が観察されたことに加え、最初のメチオニン部分をもたない蛋白質（ＭＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＝７８６７Ｄａ，ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝７８６６Ｄａ）に対応する主ピークも検出された。シグナル対ノイズ比は＞４００であり、進化型ｍｕｔＲＮＡＣＵＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳ対を使用すると、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの組込みの忠実度は９９％よりも良好であることが示唆された。
【０３４０】
発現されたジケトン含有蛋白質をビオチンヒドロキシルアミン誘導体（ＭＷ＝３３１．３９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入）でｉｎ  ｖｉｔｒｏ標識することにより、蛋白質を外部性質で部位特異的に修飾するための化学基としてジケトン部分を使用する可能性を試験した。精製突然変異体及びＷＴ  Ｚドメイン蛋白質をｐＨ４．０のリン酸緩衝液中、２ｍＭビオチンヒドロキシルアミンで２５℃にて１２時間処理した。水で透析して過剰のビオチンヒドロキシルアミンを除去した後に、蛋白質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。８３１５Ｄａ（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８３１０Ｄａ，無傷の突然変異体蛋白質をビオチンで標識したもの）、８１８２Ｄａ（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８１７９Ｄａ，最初のメチオニン残基をもたない突然変異体蛋白質をビオチンて標識したもの）、及び８２２５Ｄａ（ＭＴｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ＝８２２１Ｄａ，最初のメチオニン残基をもたないそのアセチル化形態の突然変異体蛋白質をビオチンで標識したもの）の平均質量実験値が得られ、ビオチンヒドロキシルアミンは突然変異体Ｚドメイン蛋白質と１：１のモル比で反応したことが確認された。予想通り、ＷＴ  Ｚドメイン蛋白質に標識物は検出されず、標識反応はヒドロキシルアミンとジケトン基の間のみで生じ、ＷＴ蛋白質の既存官能基間には生じないことが判明した。質量スペクトルに未標識ジケトン含有突然変異体蛋白質は観察されなかったことと総合すると、これらのデータはジケトン基が選択的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質修飾に優れた選択性と高い反応性をもつことを実証するものである。
【０３４１】
本実施例は進化型高特異性直交翻訳系を使用するβ−ジケトン基のｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質組込みがその天然対応部分と適合可能な高い忠実度と効率で部位特異的に行われることを実証するものである。３は広いｐＨ範囲で安定性が高く且つ生成し易いため、特にｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンを有利な疎水性環境に配置する場合には、β−ジケトン部分とリジン残基のアミノ基の間のシッフ塩基の形成により蛋白質−蛋白質相互作用の調節が行われる可能性が非常に高い。
【実施例１５】
【０３４２】
非天然アミノ酸ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンを大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用してｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。この非天然アミノ酸を蛋白質に組込むと、翻訳後修飾のターゲットとして利用でき、更に、非天然アミノ酸上の化学反応性部分が細胞内酵素の加水分解活性に対して耐性であるので有利である。
【０３４３】
Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡと併用した。この新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡにｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答してｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。このｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はアンバーナンセンスコドンＴＡＧのみに応答して組込まれる。
【０３４４】
直交ｔＲＮＡにｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンを特異的に負荷することが可能な直交シンテターゼの探索を実施した。この探索は従来記載されているプロトコールを使用した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製し、突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。
【０３４５】
突然変異誘発後、突然変異体シンテターゼライブラリーを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡにｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンを負荷することが可能な１個のシンテターゼクローンが得られた。このシンテターゼクローンをシーケンシングし、アミノ酸配列を決定した（表５、配列番号６２参照）。このシンテターゼ突然変異体は野生型Ｍ．ｊａｎａｓｃｈｉｉシンテターゼ配列に対して以下の置換を示す。
【表８】
0005539948.tif 000012
【実施例１６】
【０３４６】
クマリンを含む蛍光非天然アミノ酸を大腸菌の蛋白質にｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交翻訳成分
本実施例は大腸菌宿主細胞翻訳機構を使用して７−アミノ−クマリンアラニンと７−ヒドロキシ−クマリンアラニン（図１参照）を蛋白質に生合成的に組込むための組成物と方法について記載する。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来し、大腸菌宿主細胞系で機能するこの非天然アミノ酸を組込むための新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対を単離した。
【０３４７】
蛍光は分子生物学で最も高感度で有用な技術の１つである。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発見により細胞生物学は劇的に進歩し、直接可視化により生きた細胞における蛋白質発現、局在、ダイナミクス及び相互作用の試験が可能になった（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．（２００１）２：４４４−４５６）。しかし、蛋白質相互作用及びダイナミクスはＧＦＰの寸法により原子レベルの分解能でピンポイントすることができない。更に、ＧＦＰは適切なシグナルを得るために多数の転写産物が必要であり、そのフォールディングとフルオロフォア成熟にラグタイムを要した。
【０３４８】
完全蛍光蛋白質部分に対し、蛍光アミノ酸の組込みはＧＦＰ蛍光システムの問題の一部を解消すると考えられる。蛍光アミノ酸の部位特異的組込みは宿主蛋白質に最小限の撹乱しか導入しないので、著しく高精度で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定することが可能になる（Ｔｒｕｏｎｇ  ａｎｄ  Ｉｋｕｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ．２００１，１１：５７３−５７８）。更に、蛍光アミノ酸を使用すると、各アミノ酸位置の局所環境を探索し、蛋白質中の蛍光アミノ酸の位置を変えることにより他の細胞成分との相互作用を媒介する残基をピンポイントできる。通常、蛋白質１分子は２個以上のトリプトファン残基を含み、蛍光プローブによる蛋白質の特異的化学標識は極めて困難であるため、これは特に単分子システム（Ｌｉｐｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３，３０１：１２３３−１２３５）における蛋白質フォールディングのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験（Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  Ｅｄ．２；Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）にも非常に有用であると思われる。
【０３４９】
図１に示すクマリンアラニンは化学的に合成されている。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから新規直交シンテターゼを誘導し、従来記載されているＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡと併用してこれらのクマリンアミノ酸を組込んだ。この新規直交対は標準（即ち天然）アミノ酸に対して親和性がないか又は非常に低い。誘導した直交ｔＲＮＡシンテターゼはアンバーサプレッサーｔＲＮＡＣＵＡに７−アミノ−クマリンアラニンと７−ヒドロキシ−クマリンアラニンを選択的に負荷する。アミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡ（即ち「負荷されたｔＲＮＡ」）は転写産物中で遭遇したＴＡＧアンバー終止コドン（セレクターコドン）に応答して７−アミノ−クマリンアラニンと７−ヒドロキシ−クマリンアラニンを組込むために内在大腸菌翻訳機構により基質として使用される。このｔＲＮＡ／シンテターゼ対の直交性により、ｔＲＮＡもシンテターゼも内在大腸菌ｔＲＮＡ又はシンテターゼと交差反応せず、非天然アミノ酸はＴＡＧのみに応答して組込まれる。
【０３５０】
直交ｔＲＮＡに７−アミノ−クマリンアラニン又は７−ヒドロキシ−クマリンアラニンを特異的に負荷することが可能な直交シンテターゼの探索を実施した。この探索は従来記載されているプロトコールを使用した。野生型Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼの突然変異誘発によりＭ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ突然変異体のライブラリーを作製し、突然変異誘発は他のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子の結晶構造に基づいて６個の予想活性部位残基をランダムに突然変異させることにより実施した。ライブラリーは約１０９種のダシバーシティをもつ。
【０３５１】
突然変異誘発後、突然変異体シンテターゼライブラリーを複数ラウンドのポジティブ選択とネガティブ選択に付した。この選択の結果、Ｏ−ｔＲＮＡに７−アミノ−クマリンアラニン又は７−ヒドロキシ−クマリンアラニンを負荷することが可能な１個のシンテターゼクローンが得られた。このシンテターゼクローンをシーケンシングし、アミノ酸配列を決定した（表５、配列番号６３参照）。このシンテターゼ突然変異体は野生型Ｍ．ｊａｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼ配列に対して以下の置換：Ｙ３２Ｒ、Ｌ６５Ａ、Ｈ７０Ｍ、Ｄ１５８Ｎ及びＬ１６２Ｔを示す。
【０３５２】
単離シンテターゼ種を含む直交翻訳系でセレクターコドンに応答してクマリンアラニンアミノ酸が蛋白質に選択的に組込まれることを実証する付加データも取得されている。このデータとしては、（ａ）発現試験においてＴＡＧセレクターコドンを４位にもつミオグロビン遺伝子は非天然アミノ酸の存在下でしか発現されず；（ｂ）非天然アミノ酸の存在下で合成された突然変異体ミオグロビンはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析で蛍光バンドとして出現し；（ｃ）単離突然変異体シンテターゼは結晶化され、非天然アミノ酸の存在下の突然変異体シンテターゼの共結晶構造は蛍光発光することが挙げられる。
【実施例１７】
【０３５３】
非天然アミノ酸を組込むためのＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡ種
本発明では各種Ｏ−ｔＲＮＡ種を使用することができ、本発明は任意特定Ｏ−ｔＲＮＡの使用に限定されない。例えば、本発明では配列番号１又は配列番号２のヌクレオチド配列を含むＯ−ｔＲＮＡ種を利用する。本明細書の教示に従い、本発明で使用する付加Ｏ−ｔＲＮＡ種を作製することができる。
【０３５４】
同様に、非天然アミノ酸（例えば、ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニン、１，５−ダンシル−アラニン、７−アミノ−クマリンアラニン、７−ヒドロキシ−クマリンアラニン、ｏ−ニトロベンジル−セリン、Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン、ｐ−カルボキシメチル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ｍ−シアノ−Ｌ−フェニルアラニン、ビフェニルアラニン、３−アミノ−Ｌ−チロシン、ビピリジルアラニン、ｐ−（２−アミノ−１−ヒドロキシエチル）−Ｌ−フェニルアラニン；ｐ−イソプロピルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン；３−ニトロ−Ｌ−チロシン及びｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンから選択される非天然アミノ酸）を組込むためのプロトコールで使用するＯ−ＲＳ種も記載する（表５参照）。本発明のＯ−ＲＳポリペプチドとしては、表５、配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７及び５９−６３に記載するアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
【０３５５】
Ｏ−ＲＳ又はその部分をコードするポリヌクレオチドの例も記載する。例えば、本発明のＯ−ＲＳ分子をコードするポリヌクレオチドとしては、配列番号１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、５１、５６、５８が挙げられる。しかし、本発明のポリヌクレオチドは表５に記載するポリヌクレオチドに限定するものではない。実際に、本発明のＯ−ＲＳアミノ酸配列（例えば、配列番号７−１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５０、５２−５５、５７及び５９−６３）をコードする任意ポリヌクレオチドも本発明の特徴である。
【０３５６】
当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に示唆され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
【０３５７】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記全技術及び装置は種々に組合せて使用することができる。本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【実施例１８】
【０３５８】
ヌクレオチド及びアミノ酸配列
本実施例は夫々各種ポリヌクレオチド及びポリペプチドのヌクレオチド配列とアミノ酸配列を記載する。下表５に記載する配列は例示に過ぎず、本発明を表５に記載する配列に限定するものではない。
【表９−１】
0005539948.tif 000013
【表９−２】
0005539948.tif 000014
【表９−３】
0005539948.tif 000015
【表９−４】
0005539948.tif 000016
【表９−５】
0005539948.tif 000017
【表９−６】
0005539948.tif 000018
【表９−７】
0005539948.tif 000019
【表９−８】
0005539948.tif 000020
【表９−９】
0005539948.tif 000021
【表９−１０】
0005539948.tif 000022
【表９−１１】
0005539948.tif 000023
【表９−１２】
0005539948.tif 000024
【表９−１３】
0005539948.tif 000025
【表９−１４】
0005539948.tif 000026
【表９−１５】
0005539948.tif 000027
【表９−１６】
0005539948.tif 000028
【表９−１７】
0005539948.tif 000029
【表９−１８】
0005539948.tif 000030
【表９−１９】
0005539948.tif 000031
【図面の簡単な説明】
【０３５９】
【図１−１】図１Ａは各種非天然アミノ酸の化学構造を示す。
【図１−２】図１Ａは各種非天然アミノ酸の化学構造を示す。
【図１−３】図１Ａは各種非天然アミノ酸の化学構造を示す。
【図２】ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンの存在下（レーン２）又は不在下（レーン３）で蓄積したＺドメイン蛋白質の染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。レーン１は分子量マーカーを含む。
【図３】ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンを組込んだＺドメイン蛋白質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。予想質量：７９５８，７８２６（最初のメチオニンを除く）；実測値：７９５８，７８２８。
【図４】図４Ａは２２Ｔｒｐ  ＧＣＮ４ｐ１突然変異体（実線）と、２２Ｔｒｐ及び２２ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンＧＣＮ４ｐ１突然変異体の混合物（破線）の蛍光スペクトルを示す。図４Ｂは５５Ｔｒｐ  ＧＣＮ４ｐ１突然変異体（実線）と、５５Ｔｒｐ及び２２ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンＧＣＮ４ｐ１突然変異体の混合物（破線）の蛍光スペクトルを示す。
【図５】図５Ａは１，５−ダンシルアラニンの化学構造を示す。図５Ｂは１，５−ダンシルアラニン−ＡＭＰ−アミドを結合したＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓロイシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＬＲＳ）活性部位のモデルを示す。ランダム突然変異領域を構成する突然変異体ＬＲＳクローンＢ８の活性部位残基を棒線として示す。ナンバリングは大腸菌ＬＲＳに対応する。
【図６】図６Ａ及び６Ｂは突然変異体Ｂ８ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ編集部位の再設計ストラテジーを示す。図６Ａは荷電ｔＲＮＡ  ３’末端を模倣する２’−（Ｌ−ノルバリル）−アミノ−２’−デオキシアデノシンとの複合体におけるＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓロイシルｔＲＮＡシンテターゼの編集部位の結晶構造を示す。図６ＢはロイシルｔＲＮＡシンテターゼクローンＢ８と２種の突然変異体Ｖ３３８Ａ及びＴ２５２Ａを使用して３３位にダンシルアラニンをもつＮｉ−ＮＴＡ精製ｈＳＯＤに実施したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。上段ゲルはクーマシー染色の写真である。下段ゲルは励起波長３０２ｎｍ及び発光検出波長５２０ｎｍの蛍光画像である。Ｌ＝分子量ラダー；ＵＡＡ＝非天然アミノ酸。
【図７】図７Ａ及び７ＢはエラープローンＰＣＲと選択により作製した大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼクローンＧ２−６の高いアンバー抑圧効率を示す。図７ＡはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓロイシルｔＲＮＡシンテターゼの結晶構造を示す（Ｃｕｓａｃｋら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９（１０）：２３５１−２３６１［２０００］）。Ｇ２−６クローンクローンに存在する合成ドメイン、編集ドメイン、相同大腸菌シンテターゼでランダム突然変異させたアミノ酸、及びエラープローンＰＣＲにより置換したアミノ酸を全て示す。図７Ｂはｏ−ニトロベンジルシステインを組込むように設計した大腸菌ロイシルｔＲＮＡ突然変異体シンテターゼクローン３Ｈ１１と、ｏ−ニトロベンジルセリンによる効率的抑圧のために進化させた突然変異体大腸菌ロイシルｔＲＮＡシンテターゼクローンＧ２−６を使用して３３位にｏ−ニトロベンジルセリンをもつ発現したｈＳＯＤに実施したクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ｌ＝分子量ラダー；ＵＡＡ＝非天然アミノ酸（ｏＮＢＳ）。
【図８】３６５ｎｍ照射によるケージドチロシン分子Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンのフォトデケージング（光活性化）の結果として、ベンジルＣＯ−結合の開裂と、脱ケージドアミノ酸の迅速な形成が生じる反応を模式的に示す。
【図９】実験により観察されたケージドチロシン分子Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンのフォトデケージング（光活性化）を示す濃度曲線アッセイを示す。Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンのフォトデケージングはハンドヘルドＵＶランプ（３６５ｎｍ、距離１０ｍｍ）を使用して０．２ｍＭアミノ酸水溶液の照射により実施した。特定時点でアリコートを分取し、ＬＣ／ＭＳにより分析した。Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシン（四角）と対応する脱ケージド種（円）の濃度を示す。
【図１０】３種の異なる突然変異体シンテターゼを使用してＯ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンの存在下又は不在下で発現させたミオグロビン７４ＴＡＧのＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは７４位にチロシンを示す７４ＴＡＧ突然変異体ミオグロビン蛋白質（トリプシンペプチドＨＧＶＴＶＬＴＡＬＧＹＩＬＫ（配列番号６４））のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示す。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは重水素化Ｏ−（２−ニトロベンジル）−Ｌ−チロシンを使用する以外は図１１Ａ及び１１Ｂに示したと同様のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を示し、Ｊは重水素化アミノ酸を表す（トリプシンペプチドＨＧＶＴＶＬＴＡＬＧＪＩＬＫ（配列番号６５））。
【図１３】ＴＨＦと水中で取得したパラ−シアノフェニルアラニンＩＲスペクトルの重ねグラフである。
【図１４】図１４Ａはガウス曲線（破線）にフィットさせたパラ−シアノフェニルアラニン（実線）のバックグラウンドを差し引いたスペクトルを示す。図１４Ｂは２つのガウス曲線（破線）にフィットさせたメタ−シアノフェニルアラニン（実線）のバックグラウンドを差し引いたスペクトルを示す。
【図１５】ｐ−エチルチオカルボニル−Ｌ−フェニルアラニンの合成を示す模式図である。
【図１６】７位に非天然アミノ酸を含む突然変異体Ｚドメイン蛋白質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析結果を示す。実験により得られた全質量データはチオエステル基又はカルボン酸基を含む無傷の蛋白質の質量計算値と非常によく一致している。
【図１７】化学ライゲーションによる蛋白質標識の模式図である。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｄは３４０ｎｍでモニターしたＬＣ／ＭＳ溶出プロフィル（最初のピーク：３；２番目のピーク：２）を示す。図１８ＡはＭｅＯＨ中で３と２の１：１混合物を使用したプロフィルを示す。図１８ＢはＰＢＳ（ｐＨ＝７．４，反応時間：１週間）中で３を使用したプロフィルを示す。図１８ＣはＰＢＳ（ｐＨ＝３．９，反応時間：４日間）中で３を使用したプロフィルを示す。図１８Ｄは希Ｈ２ＳＯ４溶液（ｐＨ＝１．９，反応時間：１２時間）中で３を使用したプロフィルを示す。全反応は室温で一定撹拌下に実施した。
【図１９】ジケトン含有非天然アミノ酸ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの合成を示す模式図である。
【図２０】ｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンの存在下又は不在下で発現させたＺドメイン蛋白質のＧｅｌｃｏｄｅ  Ｂｌｕｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分析はｐ−（３−オキソブタノイル）−Ｌ−フェニルアラニンを含む突然変異体Ｚドメイン蛋白質のフルオレセインヒドラジドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ標識を示す。ｗｔ＝野生型。
【図２１】ジケトン含有部分の各種付加物の合成を示すスキームである。
【図１−１】
0005539948.tif 000032
【図１−２】
0005539948.tif 000033
【図１−３】
0005539948.tif 000034
【図２】
0005539948.tif 000035
【図３】
0005539948.tif 000036
【図４】
0005539948.tif 000037
【図５】
0005539948.tif 000038
【図６】
0005539948.tif 000039
【図７】
0005539948.tif 000040
【図８】
0005539948.tif 000041
【図９】
0005539948.tif 000042
【図１０】
0005539948.tif 000043
【図１１】
0005539948.tif 000044
【図１２】
0005539948.tif 000045
【図１３】
0005539948.tif 000046
【図１４】
0005539948.tif 000047
【図１５】
0005539948.tif 000048
【図１６】
0005539948.tif 000049
【図１７】
0005539948.tif 000050
【図１８】
0005539948.tif 000051
【図１９】
0005539948.tif 000052
【図２０】
0005539948.tif 000053
【図２１】
0005539948.tif 000054
【配列表】
0005539948000001.app