(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前糖尿病性の高血糖、脂質異常症及び／又は高トリグリセリド血症を治療するための医薬組成物であって、有効量の、アロエシン又はアロエシノールとそれと組み合わされたアロエゲルとを含む組成物。
【請求項２】
前記アロエシン又はアロエシノールが、天然源から単離される又は合成法によって得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記天然源が、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckea)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)の属からなる群から選ばれる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記天然源が、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckea frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)、及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)からなる群から選ばれる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記天然源が、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分からなる群から選ばれる植物部分である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
適切な医薬製剤での経口、局所、坐剤、静脈内、皮内、腹部内（intragaster）、筋肉内、腹腔内、及び静脈内投与からなる群から選ばれる投与経路で投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
１．４％（重量）以上の前記アロエシン又はアロエシノールを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前糖尿病対象において、健康的な血糖値を促進又は維持するための、血糖代謝を支えるための、及び／又は高い血糖値を低下させるための医薬組成物であって、有効量の、アロエシン又はアロエシノールとそれと組み合わされたアロエゲルとを含む組成物。
【請求項１０】
１．４％（重量）以上の前記アロエシン又はアロエシノールを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アロエシン又はアロエシノールが、天然源から単離される又は合成法によって得られる、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記天然源が、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckea)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)の属からなる群から選ばれる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記天然源が、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckea frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)、及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)からなる群から選ばれる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記天然源が、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分からなる群から選ばれる植物部分である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
適切な医薬製剤での経口、局所、坐剤、静脈内、皮内、腹部内（intragaster）、筋肉内、腹腔内、及び静脈内投与からなる群から選ばれる投与経路で投与される、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前糖尿病対象において、高い血糖値を低下させるための、空腹時血糖値を低下させるための、及び／又は耐糖能を改良するための医薬組成物であって、有効量の、アロエシン又はアロエシノールとそれと組み合わされたアロエゲルとを含む組成物。
【請求項１８】
１．４％（重量）以上の前記アロエシン又はアロエシノールを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記アロエシン又はアロエシノールが、天然源から単離される又は合成法によって得られる、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記天然源が、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckea)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)の属からなる群から選ばれる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記天然源が、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckea frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)、及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)からなる群から選ばれる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記天然源が、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分からなる群から選ばれる植物部分である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
適切な医薬製剤での経口、局所、坐剤、静脈内、皮内、腹部内（intragaster）、筋肉内、腹腔内、及び静脈内投与からなる群から選ばれる投与経路で投与される、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前糖尿病対象において、健康的なインスリン濃度を制御するための、インスリン抵抗性のリスクを低下させるための、及び／又はインスリン感受性を改良するための医薬組成物であって、有効量の、アロエシン又はアロエシノールとそれと組み合わされたアロエゲルとを含む組成物。
【請求項２６】
１．４％（重量）以上の前記アロエシン又はアロエシノールを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記アロエシン又はアロエシノールが、天然源から単離される又は合成法によって得られる、請求項２５又は２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記天然源が、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckea)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)の属からなる群から選ばれる、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記天然源が、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckea frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)、及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)からなる群から選ばれる、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記天然源が、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分からなる群から選ばれる植物部分である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
適切な医薬製剤での経口、局所、坐剤、静脈内、皮内、腹部内（intragaster）、筋肉内、腹腔内、及び静脈内投与からなる群から選ばれる投与経路で投与される、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記アロエゲルがAloe barbadensis（Aloe vera）から単離されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記アロエシン又はアロエシノールがアロエ・フェロックス(Aloe ferox)から単離又は豊富化されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
前糖尿病性の高血糖、脂質異常症及び／又は高トリグリセリド血症を治療するための医薬組成物であって、１．４％（重量）以上のアロエシン又はアロエシノールと、それと組み合わされたアロエ葉ゲル又はアロエ葉ゲル粉末とを含み、当該アロエ葉ゲル又はアロエ葉ゲル粉末がAloe barbadensis（Aloe vera）から単離されたものであり、当該アロエシン又はアロエシノールがアロエ・フェロックス(Aloe ferox)から単離又は豊富化されたものである、組成物。
【請求項３６】
前記アロエゲルがAloe barbadensis（Aloe vera）から単離されたものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アロエシン又はアロエシノールがアロエ・フェロックス(Aloe ferox)から単離又は豊富化されたものである、請求項９に記載の組成物。
【請求項３８】
前糖尿病対象において、健康的な血糖値を促進又は維持するための、血糖代謝を支えるための、及び／又は高い血糖値を低下させるための医薬組成物であって、１．４％（重量）以上のアロエシン又はアロエシノールと、それと組み合わされたアロエ葉ゲル又はアロエ葉ゲル粉末とを含み、当該アロエ葉ゲル又はアロエ葉ゲル粉末がAloe barbadensis（Aloe vera）から単離されたものであり、当該アロエシン又はアロエシノールがアロエ・フェロックス(Aloe ferox)から単離又は豊富化されたものである、組成物。
【請求項３９】
前記アロエゲルがAloe barbadensis（Aloe vera）から単離されたものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項４０】
前記アロエシン又はアロエシノールがアロエ・フェロックス(Aloe ferox)から単離又は豊富化されたものである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項４１】
前記アロエゲルがAloe barbadensis（Aloe vera）から単離されたものである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項４２】
前記アロエシン又はアロエシノールがアロエ・フェロックス(Aloe ferox)から単離又は豊富化されたものである、請求項２５に記載の組成物。
【請求項４３】
前糖尿病対象において、高い血糖値を低下させるための、空腹時血糖値を低下させるための、及び／又は耐糖能を改良するための医薬組成物であって、１．４％（重量）以上のアロエシン又はアロエシノールと、それと組み合わされたアロエ葉ゲル又はアロエ葉ゲル粉末とを含み、当該アロエ葉ゲル又はアロエ葉ゲル粉末がAloe barbadensis（Aloe vera）から単離されたものであり、当該アロエシン又はアロエシノールがアロエ・フェロックス(Aloe ferox)から単離又は豊富化されたものである、組成物。
【請求項４４】
前糖尿病対象において、健康的なインスリン濃度を制御するための、インスリン抵抗性のリスクを低下させるための、及び／又はインスリン感受性を改良するための医薬組成物であって、１．４％（重量）以上のアロエシン又はアロエシノールと、それと組み合わされたアロエ葉ゲル又はアロエ葉ゲル粉末とを含み、当該アロエ葉ゲル又はアロエ葉ゲル粉末がAloe barbadensis（Aloe vera）から単離されたものであり、当該アロエシン又はアロエシノールがアロエ・フェロックス(Aloe ferox)から単離又は豊富化されたものである、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、脂肪細胞によるアディポネクチン産生の増強、並びに脂肪酸生合成、脂肪酸のミトコンドリアβ酸化、ステロイド生合成、糖新生、脂肪輸送、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα肝シグナル伝達及び異物代謝に関与する遺伝子の調節に有効なクロモン及び新規クロモン組成物の単離及び同定に関する。インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖、メタボリックシンドローム、脂質異常症、及び高トリグリセリド血症の予防及び治療のための方法も含まれる。
【背景技術】
【０００２】
肥満、糖尿病、及びメタボリックシンドロームは急速に世界的に蔓延するようになった。世界保健機関（ＷＨＯ）の発表によると、２００５年にはほぼ４億人の成人が肥満であり、２０１５年までに７億人を超える成人が肥満になると予測されている。肥満は、心臓血管疾患及び糖尿病を含むいくつかの慢性疾患の主要危険因子である。
【０００３】
メタボリックシンドロームは、１９８８年、Ｒｅａｖｅｎによって、肥満、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血圧、及び脂質異常症（高トリグリセリド血症及び低ＨＤＬコレステロール値）を含む相互関連したありふれた臨床的障害群として最初に提唱された（Ｒｅａｖｅｎ（１９８８）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：１５９５−１６０７）。全米コレステロール教育プログラム(National Cholesterol Education Program)の成人治療委員会III(Adult Treatment Panel III)（ＡＴＰ III）は、２００１年にメタボリックシンドロームの診断基準を確立した（ＪＡＭＡ（２００１）２８５：２４８６−２４９７９７）。メタボリックシンドローム保有者を識別するために、ＡＴＰ IIIによって、腹部肥満、空腹時血糖値の異常、高トリグリセリド（ＴＧ）、低ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）濃度、及び高血圧を含む五つの基準が選ばれた。個人にいずれか三つの要素が存在するとメタボリックシンドロームと診断される。メタボリックシンドロームは世界中に広く蔓延し、その個別の要素のいずれよりも高いアテローム硬化性心臓血管疾患リスクを伴う。
【０００４】
第３回全国健康栄養調査(Third National Health and Nutrition Examination Survey)（１９８８〜１９９４）の２０歳以上の男女８８１４人のデータを分析したところ、メタボリックシンドロームの未調整及び年齢調整有病率はそれぞれ２１．８％及び２３．７％であることが明らかになった。２０００年の国勢調査データを用いると、約４７００万人の米国在住者がメタボリックシンドロームに罹患している可能性がある（Ｆｏｒｄら（２００２）ＪＡＭＡ  １６：３５９）。肥満の青少年ではメタボリックシンドロームの有病率が非常に高く、肥満の重症度に伴って増加し、重度肥満の青少年では５０パーセントに達している（Ｗｅｉｓｓら（２００４）“青少年における肥満とメタボリックシンドローム(Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents)”Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：２３６２−２３７４）。これらの青少年には心臓血管の有害転帰リスクの上昇を示すバイオマーカーが既に存在する。メタボリックシンドロームとその個別要素は肥満の集団に見られるだけでなく、標準体重及び軽度肥満の個人にも見られる。
【０００５】
有力な証拠により、代謝異常の問題の根源はインスリン抵抗性であることが示唆されている（Ｒｅａｖｅｎ  ＧＭ．（１９８８）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：１５９５−１６０７）。メタボリックシンドロームの有病率は、人種又は民族及び肥満度を調整すると、インスリン抵抗性の増加と共に有意に増加する（傾向に関してＰ＜０．００１）（Ｗｅｉｓｓら（２００４）“Obesity and the metabolic syndrome in children and adolescents”  Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５０：２３６２−２３７４）。インスリン抵抗性は、正常の循環インスリン濃度に対する応答性が低下した状態で（Ｓａｌｔｉｅｌ  ＡＲ（２０００）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：１６３−１６４）、２型糖尿病の主病因である。インスリン抵抗性は、肥満、ライフスタイル因子及び遺伝的因子に関連する（Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｔ（２０００）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：４５９−４６５；Ｓｔｅｒｎ  Ｍ（２０００）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：３２３−３２７）。インスリン受容体及びインスリンシグナル伝達経路の遺伝的欠陥が、２型糖尿病のインスリン抵抗性の病因に関与していることが動物研究から明らかに示されている。例えば、インスリン受容体ノックアウトマウスの筋肉、肝臓及び脂肪組織では、インスリン作用の不足が明らかであった。これらのマウスは高インスリン血症及び重度の糖尿病も示した。インスリンシグナル変換カスケードにおける主要シグナル伝達酵素であるＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性を増大させたマウスは、インスリン感受性の増大と、骨格筋及び脂肪細胞におけるグルコース輸送の増大のために低血糖とを示した（Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｔ（２０００）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０６：４５９−４６５）。同様に、ＰＩ３Ｋの下流のキナーゼであるＡｋｔ２欠乏マウスは、インスリン抵抗性の減退と筋肉グルコース輸送の増大を示した（Ｃｈｏら、２００１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１７２８）。
【０００６】
ヒトにおいては、最近の研究はインスリン抵抗性及び糖尿病の遺伝的基礎及び生理に関するものが多い。ＰＰＡＲガンマ２特異的Ｂエキソンにおける部分的“機能喪失”型Ｐｒｏ１２Ａｌａ変異を有する患者は、低ＢＭＩ、高いインスリン感受性及び改良された脂質プロフィールの組合せを有している（Ｄｅｅｂら、（１９９８）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０：２８４−２８７；Ａｌｈｕｌｅｒら、（２０００）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６：７６−８０）。Ｐｒｏ１２Ａｌａ多型性の生理学的結末は、遺伝的及び環境的交絡因子に大きく依存する。Ｐｒｏ１１５Ｇｌｎ機能獲得型変異を有する患者は、極度の肥満及びインスリン感受性であり（Ｒｉｓｔｏｗら（１９９８）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３９：９５３−９５９）、これは脂肪細胞分化の刺激におけるＰＰＡＲγの作用と一致している。他方、Ｐｒｏ４９５Ｌｅｕ、Ｖａｌ３１８Ｍｅｔ、Ｐｈｅ３８８Ｌｅｕ及びＡｒｇ４２５Ｃｙｓのような優性ネガティブ変異は、部分リポジストロフィー、重度のインスリン抵抗性、糖尿病、及び高血圧に関連している（Ｓａｖａｇｅら（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：９１０−９１７；Ａｇａｗａｌ及びＧａｒｇ（２００２）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８７：４０８−４１１）。
【０００７】
ヒトの遺伝的疾患である若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）は、２５歳以前での糖尿病の臨床的発症、常染色体優性遺伝、及び膵β細胞機能の原発性欠陥を特徴とする。六つのＭＯＤＹ遺伝子が同定されている。ＭＯＤＹ１、肝細胞核因子−４α（ＨＮＦ−４α）；ＭＯＤＹ２、グルコキナーゼ；ＭＯＤＹ３、ＨＮＦ−１α；ＭＯＤＹ４、インスリンプロモーター因子−１（ＩＰＦ−１）；ＭＯＤＹ５、ＨＮＦ−１β；及びＭＯＤＹ６、ベータ細胞Ｅボックストランスアクチベーター又はＮｅｕｒｏＤ１である（Ｆａｊａｎｓら（２００１）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４５：９７１）。ＭＯＤＹ遺伝子は、膵β細胞における異常な遺伝子発現及びグルコース代謝に関与しており、β細胞の機能不全を招く。
【０００８】
II型糖尿病は複合かつ異種性の多因子疾患である。稀な単一遺伝子型のＭＯＤＹは、糖尿病の病態生理に関して情報を提供してくれるが、多様なヒト糖尿病の病因をそれで捉えることはできない。ヒト全ゲノムスキャンは、多数のゲノミクス研究グループが遺伝的多型を用いて様々な感受性(susceptible)民族集団の中で糖尿病及びインスリン抵抗性の遺伝子座を探るために利用している（ＭｃＩｎｔｙｒｅ及びＷａｌｋｅｒ（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ５７：３０３）。１５番染色体上のカルパイン−１０遺伝子は、テキサスでメキシコ系アメリカ人の民族グループの２５２の同胞対の全ゲノムスキャンを用いて同定された最初の遺伝子で、後に他の民族グループの研究を用いて確認された。臨床研究から、カルパイン−１０は、筋組織に対するインスリンの作用及び膵β細胞からのインスリン分泌に影響を及ぼす因子の一つであることが示唆されている。カルパイン−１０欠損マウスでの研究によれば、カルパイン−１０は、インスリン分泌膵β細胞において脂肪酸誘導アポトーシスを媒介していることが示唆されている（Ｈｏｒｉｋａｗａら（２０００）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２６：１６３；Ｗｅｅｄｏｎら（２００３）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ７３：１２０８）。ヒトの糖尿病遺伝子に関する追求はこれからも続くが、１６番染色体上のＦＴＯは最近の発見である。ＦＴＯは、機能は未解明であるが、ＢＭＩと関連し、合計３９，０００人の様々な糖尿病調査対象集団で確認されている（Ｋａｉｓｅｒ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１８５）。さらに、候補遺伝子の関連研究によって、ＫＣＮＪ１１（β細胞のＡＴＰ感受性カリウムチャンネルの内向き整流サブユニット）及びＨＮＦ−４α遺伝子もＮＩＤＤＭ遺伝子であることが見出された（Ｔａｙｌｏｒ（２００７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５６：２８４４）。
【０００９】
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）はおそらくインスリン抵抗性の病態生理において最も重要な因子である。筋グリコーゲン合成、グルコース取込み、及びグルコース−６−リン酸濃度を追跡するのに、13Ｃ、31Ｐ、及び1Ｈアイソトープを用いる非侵襲的磁気共鳴分光法が、エール大学のＳｈｕｌｍａｎのグループによって臨床研究に使用されている。高インスリン血症正常血糖クランプ下の健常ヒト対象において、脂質注入を用いて高い血中ＦＦＡ濃度を維持すると、インスリン抵抗性が次第に発現し、インスリン刺激性筋グルコース取込みの５０％減退及び筋グリコーゲン合成の５０％減退及び脂質注入４〜６時間後のグルコース酸化という状態に至り、インスリン刺激性ＩＲＳ−１関連ＰＩ３Ｋ活性の＞９０％低下も伴う（Ｒｏｄｅｎら（１９９６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７：２８５９；Ｄｒｅｓｎｅｒら（１９９９）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３：２５３）。
【００１０】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、核内受容体スーパーファミリーのサブクラスである。ＰＰＡＲは、レチノイドＸ受容体とのヘテロ二量体として特異的ＤＮＡ応答要素に結合するリガンド依存性転写因子である。このリガンド結合は、クロマチン脱凝縮コアクチベーター複合体の優先的動員をもたらし、コリプレッサー複合体を退けること(dismissal)を支持する（Ｇｌａｓｓ（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：５５６−５６０  ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１２９７１３）。さらに、ＰＰＡＲは、他の転写因子との競合を通じて、遺伝子発現に間接的に、通常は否定的に、影響を及ぼしうる（Ｇｅｒｖｏｉｓら（２００１）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３３４７１−３３４７７）。ＰＰＡＲファミリーには、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（又はＰＰＡＲβ）及びＰＰＡＲγの三つのメンバーが存在する。広範な実験的証拠により、これら三つの核内受容体は脂質及び炭水化物代謝の調節及び調整に関連付けられている。この三つのタンパク質と、糖尿病、肥満、脂質異常症及び炎症を含む様々な疾患との関連性はよく確立されている。三つのＰＰＡＲは異なる組織に異なった形で発現されている（Ｓｅｍｐｌｅら（２００６）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：５５６−５６０  ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１２８００３）。ＰＰＡＲαは、肝臓、腎臓及び心臓に最も高発現している。ＰＰＡＲγは脂肪組織及びマクロファージに優先的に発現している。ＰＰＡＲδの発現は広範囲に広がっているが、脂肪組織、皮膚及び脳に最も高発現している。この三つの核内受容体は様々な細胞プロセスに関与している。ＰＰＡＲα又はＰＰＡＲδの活性化は脂肪酸のβ酸化の増大をもたらす。ＰＰＡＲαはリポタンパク質合成及びアミノ酸の異化作用に関係している。ＰＰＡＲγは脂肪細胞分化に重要である。該タンパク質は異なる生理的機能を有している。ＰＰＡＲαは空腹に対する組織の代謝応答を調整するが、ＰＰＡＲγの発現は食後に増加し、その活性化は脂肪組織における脂肪酸の取込みを媒介する遺伝子のアップレギュレーションをもたらす。ＰＰＡＲγは脂肪細胞分化を指揮する鍵となる転写因子である。ＰＰＡＲδの生理的機能は完全に解明されていない。しかしながら、最近の証拠から、それが筋線維型のレギュレーターであろうこと、そして該タンパク質の活性化は肥満への抵抗性及び改良された代謝プロフィールをもたらすことが示されている（Ｗａｎｇら（２００４）．ＰｌｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：ｅ２９４）。
【００１１】
インスリン抵抗性には多数の経路が関与しうる。脂肪組織におけるＰＰＡＲγの活性化は、脂肪酸捕捉に関与する遺伝子の転写をアップレギュレートする（Ｓｅｍｐｌｅら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：５５６−５６０  ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１２８００３）。ＰＰＡＲγは内皮リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）及び脂肪酸輸送タンパク質（ＦＡＴＰ及びＣＤ３６）を活性化する。これらはそれぞれ、リポタンパク質トリグリセリドの加水分解及びＦＦＡの脂肪細胞への取込みを促進する。該プロセスは、循環中の脂質や筋肉及び肝臓のようなインスリン感受性組織への脂質の直接アクセスを減少させることによってインスリン感受性を増強する（Ｓｅｍｐｌｅら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：５５６−５６０  ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ１２８００３）。ＰＰＡＲγはよく特徴付けされている。ＰＰＡＲγの本質的役割は、ホモ接合型ＰＰＡＲγ欠損マウスの胎生致死で実証された（Ｔｓｕｃｈｉｄａら（２００５）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．９７：１６４−１７０）。野生型マウスでは、肥満及びインスリン抵抗性は高脂肪食によって誘導できる。しかしながら、高脂肪食誘導肥満又はインスリン抵抗性はヘテロ接合型ＰＰＡＲγ欠損マウスでは防止される（Ｔｓｕｃｈｉｄａら（２００５）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．９７：１６４−１７０）。例えば、ヘテロ接合型ＰＰＡＲγ（＋／−）マウスに高脂肪食を与えると、該マウスは野生型マウスよりインスリン抵抗性が低く、脂肪細胞も小さかった。該マウスは、血漿中の脂肪酸濃度が低く、レプチン濃度は増大していた（Ｋｕｂｏｔａら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４：５９７−６０９；Ｔｓｕｃｈｉｄａら（２００５）Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．９７：１６４−１７０）。しかしながら、ヘテロ接合型ＰＰＡＲγ欠損の保護効果は、マウスをＰＰＡＲγアゴニストで処置することによって減少した。チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）クラスのインスリン増感薬（Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９５）．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２９５３−１２９５６）は、逆説的ではあるが、ＰＰＡＲγ（＋／−）マウスのインスリン感受性を低下させる。これらの結果から、ＰＰＡＲγは高脂肪食誘導肥満及びインスリン抵抗性を媒介すること、及びＰＰＡＲγの阻害によって動物又はヒトはインスリン抵抗性の内因性及び外因性の原因に影響されにくくなることが示唆される。他方、高脂肪食を与えられた野生型マウスでＰＰＡＲγをＴＺＤによって超生理学的に活性化してもインスリン感受性は改良されたが、同時に脂肪細胞分化も誘導した。実験的証拠は、ＰＰＡＲγ活性のダウンレギュレーションもアップレギュレーションもインスリン感受性を改良することを示している。
【００１２】
ＰＰＡＲαは内因性脂肪酸及びそれらの誘導体の分子センサーであり、肝臓及び骨格筋におけるグルコース恒常性及び脂質代謝に重要な役割を果たしている。フィブラートのようなＰＰＡＲαアゴニストは脂質低下に有効であることが示されている（Ｌｅｆｅｂｖｒｅら（２００６）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：５７１−５８０．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２７９８９）。齧歯類において、ＰＰＡＲαアゴニストのＷｙ１４６４３は、ＫＫＡｙマウスのインスリン感受性を改良し、ＰＰＡＲγアゴニストのロシグリタゾンの抗糖尿病効果を増強した（Ｔｓｕｃｈｉｄａら（２００５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：３３５８−３３７０）。脂肪細胞の肥大はＷｙ１４６４３によって防止された（Ｔｓｕｃｈｉｄａら（２００５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：３３５８−３３７０）。
【００１３】
ＰＰＡＲδは、脂肪、骨格筋、及び心臓などの様々な組織における代謝レギュレーターとして最近浮上してきた（Ｂａｒｉｓｈら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：５９０−５９７）。ＰＰＡＲδは脂肪酸異化作用及びエネルギー脱共役を増強するので、トリグリセリド貯蔵の低下と耐久性の改良をもたらす。マウスの骨格筋におけるＰＰＡＲδの活性化形の標的発現は、改良された代謝プロフィールと共に肥満に対する抵抗性を付与する（Ｗａｎｇら（２００４）．ＰｌｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１５３２−１５３９）。
【００１４】
体内におけるＰＰＡＲ活性の調節は、食事及びその他の環境影響に応答して正常のインスリン感受性を維持するのに重要である。マウスの遺伝学的研究は、核内受容体と環境因子の複雑な相互作用を理解するための絶好の機会を提供してくれる。ＰＰＡＲ活性は異なるモジュレーターによって調節されうる。ＰＰＡＲは異なるリガンドと相互作用するので、異なるセットの標的遺伝子の活性化をもたらす。その結果、ＰＰＡＲに対するモジュレーターの異なる親和性及び作用のために、異なる転写活性及び薬理学的特性が生ずる。ＰＰＡＲのモジュレーターは、完全アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト及びコアゴニストを含むくつかのグループに分けられる（Ｋｎｏｕｆｆ及びＡｕｗｅｒｘ（２００４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２５：８９９−９１８）。
【００１５】
多数のＰＰＡＲ完全アゴニストが開発されている。ロシグリタゾン及びピオグリタゾンは、２型糖尿病の治療に臨床使用されている二つのＴＺＤである（Ｌｅｈｍａｎｎら（１９９５）Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７０：１２９５３−１２９５６）。これらのＰＰＡＲγアゴニストはインスリン抵抗性を低減し、血漿中グルコース濃度を低下させるが、該完全アゴニストは、脂肪量の増加及び浮腫による体重増加、体液貯留、血液希釈、及び心不全を含む重篤な副作用を患者の最大１５％に引き起こす（Ｍｕｄａｌｉａｒら（２００３）．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｐｒａｃｔ．９：４０６−４１６）。一部のＴＺＤは顕著な肝毒性も伴う。メタボリックシンドロームの多数の側面を予防又は治療する薬物療法は選択肢及び成功率が限られているが、新規分子薬の目標が積極的に追求されている。
【００１６】
その他のインスリン増感経路は、脂肪細胞から産生されるＴＮＦα、ＩＬ−６、ＣＲＰ、ＰＡＩ−１、アンギオテンシノーゲン、レジスチン、レプチン及びアディポネクチンなどのアディポカインの修飾プロフィールが関与する（Ｌａｕら（２００４）．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８８：Ｈ２０３１−Ｈ２０４１）。これらのアディポカインはインスリン抵抗性及び血管恒常性に著しい影響を及ぼす。これらのタンパク質のうち、アディポネクチンは脂肪細胞からの最も良く特徴付けされたホルモンの一つで、インスリン増感を媒介する。ＴＺＤは、肥満マウス及びインスリン抵抗性肥満ヒトにおいてアディポネクチン遺伝子発現を刺激し、循環アディポネクチン濃度を増大する（Ｍａｅｄａら（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０：２０９４−２０９９）。アディポネクチンはインスリン感受性を増大することによって耐糖能を改良するので、２型真性糖尿病患者におけるＴＺＤの血糖低下作用は、少なくとも一部はＴＺＤのアディポネクチン分泌に対する作用によって説明できる。
【００１７】
追加の経路はヒトにおけるインスリン増感に関与する。例えば、レプチンも齧歯類におけるインスリン感受性を改良することが示されている。脂肪萎縮マウスにおいて、生理学的用量のアディポネクチンとレプチンの組合せ投与は、インスリン感受性の完全回復をもたらしたが、アディポネクチン又はレプチンのいずれかの個別処置では部分的なインスリン増感しか観察されなかった（Ｙａｍａｕｃｈｉら（２００１）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：９４１−９４６）。レプチンは脂質合成酵素の発現を低下させ、結果として肝臓、褐色脂肪組織及び骨格筋におけるＰＰＡＲα経路を活性化する。これによってＵＣＰ−２及びベータ酸化に関与する酵素の発現の増加がもたらされる。ヒトでは、血漿中のアディポネクチン濃度は、減量によってインスリン感受性の改良した個人では変化しなかった（Ａｂｂａｓｉら（２００４）Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５３：２８０−２８３）。別の研究では、運動トレーニングによるインスリン感受性の改良は、ヒトではアディポネクチン濃度の変化の結果ではないことが示された（Ｍａｒｃｅｌｌら（２００５），Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ５４：５３３−４１）。これらのデータから、追加の経路はインスリン増感のための存在すること、及び減量後とＴＺＤ化合物による処置後ではインスリン感受性の改良に異なる機序が関与していることが示唆される。
【００１８】
クロモンは、ベンゾピラン−４−オンを主骨格として有する特定のタイプの芳香族化合物で、下記の一般構造：
【００１９】
【化１】
0005503973.tif 000002
【００２０】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ3、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ3、−ＳＣＨ3、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ2、−ＮＲＨ、−ＮＲ2、−ＮＲ3+Ｘ-、エステルであって、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルからなる群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、前記ヘキソース又はペントースは炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、前記ヘキソース又はペントースは、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体からなる群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、これらに限定されないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートなどを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］によって示される。これまでに天然源から単離された１８３種類のクロモンしかない（Ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ／ＣＲＣ，第５版：２００１年６月）。
【００２１】
クロモンは、モノアミンオキシダーゼ阻害活性（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０：３３０−３３６）、チロシナーゼ阻害活性（Ｏｉａｏら（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．５０：３０９−３１１）、抗血小板作用（Ｌｅｏｎｃｉｎｉら（１９９１）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．２３：１３９−１４８）、経口病原体に対する増殖阻害活性（Ｃａｉ（１９９６）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５９：９８７−９９０）、プロスタグランジンＨシンターゼ阻害活性（Ｊｕｒｅｎｋａら（１９８９）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９３：２５３−２５５）を示すと報告されている。クロモンはまた、ラットでII型コラーゲン誘導関節炎に対する治療効果（Ｉｎａｂａら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４８：１３１−１３９）及び脂質低下活性（Ｗｉｔｉａｋら（１９７５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８：９３５−９４２；Ｔｅｔｋｏら（１９９５）Ｂｉｏｏｒｇ  Ｋｈｉｍ．２１：８０９−８１５）も有している。また、クロモンは選択的シグマ受容体リガンドとしても機能できると報告されている（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：１５２６−１５３５）。動物研究に基づくと、クロモンは容易に吸収及び代謝され（Ｃｒｅｗら（１９７６）Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ６：８９−１００）、アロエシンのｃ−グルコシル結合はヒト腸内細菌によって切断できる（Ｃｈｅら（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３９：７０４−７０８）。
【００２２】
アロエは、多数の生物活性物質を含有する複雑な植物である（Ｄａｇｎｅら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４：１０５５−１０７８；Ｃｏｈｅｎら、Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ／Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，初版  ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９２））。３００種を超えるアロエが知られており、その大部分はアフリカ原産である。研究によれば、生物活性物質はアロエの葉の別の部分に存在することが示されている。すなわち、葉の中心部に位置する透明なゲル状フィレ、葉皮(leaf rind)又は葉の皮質(cortex of the leaf)部分、及びアロエラテックスと呼ばれ、葉皮と内部のゲル状フィレとの間に位置する維管束の内鞘細胞中に含有される黄色液中である（Ｄａｇｎｅら（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４：１０５５−１０７８）。葉の中心部に存在する透明ゲル状フィレは、水溶性多糖類、有機酸、アミノ酸及び無機塩を含有する。アロエ・ベラゲルはアロエ植物のこの部分から製造される。葉皮又は葉の皮質、及び維管束の内鞘細胞中に含有される黄色液は、芳香族化合物、例えばアントラキノン、クロモン、有機酸、酵素、ビタミン、塩及びその他の各種化合物を含有する。アロエ全葉(whole leaf)ゲルは、アントラキノン、クロモン、多糖類及びその他の化合物を含む全水溶性成分の内容物を含むアロエ植物を丸ごと粉砕することによって製造される。アントラキノンの色及び光毒性、ＧＩ刺激性、細胞毒性及びその他の副作用のため、アロエ全葉ゲルはアントラキノン及びクロモンを含むすべての芳香族化合物を除去するように処理される（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（２００７），２６（ｓｕｐｐｌ．２）：１−５０）。
【００２３】
歴史的にアロエ産物は、火傷、傷及びその他の創傷の治療のために皮膚用に使用されてきた。こうした使用に触発されて、臨床活性、特に抗炎症活性を有するアロエ植物由来化合物の同定に関する数多くの研究が行われてきた（Ｇｒｉｎｄｌａｙ及びＲｅｙｎｏｌｄｓ（１９８６）Ｊ．ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １６：１１７−１５１；Ｈａｒｔら（１９８８）Ｊ．ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２３：６１−７１参照）。これらの研究の結果、抗腫瘍活性、抗胃潰瘍、抗糖尿病、抗チロシナーゼ活性及び抗酸化活性を含む多様な生物活性を有するアロエ化合物の多数の報告がある（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ（２００７），２６（ｓｕｐｐｌ．２）：１−５０）。
【００２４】
様々なアロエ種から単離されたクロモンは多様な生物活性を有すると報告されている。アロエシンはチロシナーゼ活性を阻害し（Ｊｏｎｅｓら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２年２月１０日受理）、サイクリンＥ依存性キナーゼ活性をアップレギュレートする（Ｌｅｅら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．４１：２８５−２９２）と報告されている。アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)から単離されたｃ−グリコシルクロモンは、抗炎症活性（Ｈｕｔｔｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５９：５４１−５４３）及びラット脳ホモジネートモデルに基づくとアルファ−トコフェロールに類似した抗酸化活性（Ｌｅｅら  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８：２６１−２６５）を示す。
【００２５】
アロエ・バルバデンシスの葉及びその苦味成分は、正常及びアロキサン糖尿病マウスの血糖値に対する作用を示し（Ａｊａｂｎｏｏｒ（１９９０）Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８：２１５−２２０）、各種アロエ種の乾燥樹液は臨床研究で抗糖尿病活性を示す（Ｇｈａｎｎａｍ，（１９８６）Ｈｏｒｍ  Ｒｅｓ．２４：２８８−２９４）。アロエゲル又は抽出物の抗糖尿病作用は、低用量ストレプトゾトシン誘導糖尿病動物モデルで示されている（Ｂｅｐｐｕ（２００６））Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０３（３）：４６８−７７；Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ（２００６）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３３（３）：２３２−７）。そのような抗糖尿病作用は、フェノール及びその他の分子量１０ＫＤａ未満の化合物による、膵島Ｂ細胞への低用量ストレプトゾトシン誘導選択毒性の保護と報告されている（Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ（２００６）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３３（３）：２３２−７）。無機ミネラルなどのその他の成分（Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ（２００５）Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ．Ｒｅｓ．１０８（１−３）：１８５−１９５）及びアロエ・ベラゲル由来の抗酸化物質も抗糖尿病作用との関連で報告されている（Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｐ．５７（１）：９０−９６）。
【００２６】
最近、アロエ・ベラゲル由来の五つの植物ステロールが抗糖尿病成分と確認された（Ｔａｎａｋａ（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９（７）：１４１８−１４２２）。２００７年、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)の葉のゲルの化学成分が完全分析されて、有力な抗酸化特性が報告され、症状緩和及び／又は糖尿病予防における使用の可能性が推測された（Ｌｏｏｔｓ（２００７）Ｊ  Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５５（１７）：６８９１−６８９６）。
【００２７】
米国特許第６，７８０，４４０号に、糖尿病及び体重管理のための薬草組成物（アロエを含む）が開示されている。しかしながら、主有効成分及び作用機序は確認されていない。米国特許第５，８８，９８４号には、アロエ由来の複合炭水化物が糖尿病治療のための組成物の一つとして特許請求されている。米国特許第４，５９８，０６９号にもアロエの多糖類が低血糖の治療用として特許請求されている。米国特許第５，６２７，２０４号には、糖尿病の予防及び治療に使用するための、アルドースレダクターゼの阻害薬として作用する、異なる置換パターンを有する合成クロモン誘導体が開示されている。米国特許第６，１３３，３０５号には、糖尿病を含むプロテインキナーゼ関連障害を治療するための、クロモン骨格を有する合成化合物が特許請求されている。
【００２８】
Ｙａｇｉらは、アロエから単離された化合物群、特にアロエシン及びその誘導体の一つ、２”−Ｏ−フェルロイルアロエシンを開示している。これらはチロシナーゼの有効阻害薬である。（Ｙａｇｉら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｄｉｃａ  ５１５−５１７）。アロエシンはＣ−グルコシル化５−メチルクロモンである（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ（１９７２）Ｃｈｒｏｍｏｎｅｓ  ｉｎ  Ａｌｏｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ−Ａｌｏｅｓｉｎ  ＰＭ  １９（４）：３２２−３２５）。インビトロではアロエシンはチロシナーゼ活性の強力な阻害薬である（Ｙａｇｉら（１９８７）Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ５１５−５１７）。米国特許第６，１２３，９５９号、発明の名称“Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅ−Ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｋｉｎ（皮膚の脱色素沈着用有効成分を含む水性組成物）”には、リン脂質のリポソーム、及びメラニン合成酵素の少なくとも一つの競合阻害薬（メラニン合成酵素の少なくとも一つの非競合阻害薬と組み合わせた）を含む水性組成物が記載されている。米国特許第６，８８４，７８３号には、活性酸素種（ＲＯＳ）損傷及びその他の酸化的ストレスに伴う疾患及び状態の予防及び治療のための強力な抗酸化物質としてのアロエシン及びアロエシノールを含む７−ヒドロキシクロモン類が開示されている。
【００２９】
現在までのところ、アロエシンはもとよりその他のクロモンを精製するための公知方法はクロマトグラフィーの使用を伴う。（例えば、Ｒａｕｗａｌｄ及びＢｅｉｌ（１９９３）Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ６３９：３５９−３６２；Ｒａｕｗａｌｄ及びＢｅｉｌ（１９９３）Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ４８ｃ：１−４；Ｃｏｎｎｅｒら（１９９０）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：９４１；Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ（１９７２）Ｃｈｒｏｍｏｎｅｓ  ｉｎ  Ａｌｏｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ−Ａｌｏｅｓｉｎ  ＰＭ  １９（４）：３２２−３２５；Ｍｅｂｅ（１９８７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：２６４６；Ｈａｙｎｅｓら（１９７０）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）２５８１；ＭｃＣａｒｔｈｙ及びＨａｙｎｅｓ（１９６７）Ｔｈｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｏｅｓｉｎ  ｉｎ  Ｓｏｍｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｌｏｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ；Ｈｅｆｔ  ３  ３４２参照）。これらの手順は化学分析のために開発されたもので、アロエシンの分取規模の製造には実用的でない。米国特許第６，４５１，３５７号、発明の名称“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｏｅｓｉｎ（アロエシンの精製法）”には、結晶化を用いるアロエシンの精製法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３０】
【特許文献１】米国特許第６，７８０，４４０号
【特許文献２】米国特許第５，８８，９８４号
【特許文献３】米国特許第４，５９８，０６９号
【特許文献４】米国特許第５，６２７，２０４号
【特許文献５】米国特許第６，１３３，３０５号
【特許文献６】米国特許第６，１２３，９５９号
【特許文献７】米国特許第６，８８４，７８３号
【特許文献８】米国特許第６，４５１，３５７号
【非特許文献】
【００３１】
【非特許文献１】Ｒｅａｖｅｎ（１９８８）  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：１５９５−１６０７
【非特許文献２】ＪＡＭＡ（２００１）２８５：２４８６−２４９７９７
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【非特許文献１８】Ｋａｉｓｅｒ（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６：１８５
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【非特許文献２１】Ｄｒｅｓｎｅｒら（１９９９）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３：２５３
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【非特許文献２９】Ｌｅｆｅｂｖｒｅら（２００６）．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：５７１−５８０．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２７９８９
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【非特許文献３１】Ｂａｒｉｓｈら（２００６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６：５９０−５９７
【非特許文献３２】Ｗａｎｇら（２００４）．ＰｌｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１５３２−１５３９
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【非特許文献５６】Ｈａｒｔら（１９８８）Ｊ．ｏｆ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２３：６１−７１
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【非特許文献５９】Ｈｕｔｔｅｒら（１９９６）Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５９：５４１−５４３
【非特許文献６０】Ｌｅｅら  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２８：２６１−２６５
【非特許文献６１】Ａｊａｂｎｏｏｒ（１９９０）Ｊ．Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２８：２１５−２２０
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【非特許文献６３】Ｂｅｐｐｕ（２００６））Ｊ  Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０３（３）：４６８−７７
【非特許文献６４】Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ（２００６）Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３３（３）：２３２−７
【非特許文献６５】Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ（２００５）Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｃｅ  Ｅｌｅｍ．Ｒｅｓ．１０８（１−３）：１８５−１９５
【非特許文献６６】Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｐ．５７（１）：９０−９６
【非特許文献６７】Ｔａｎａｋａ（２００６）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９（７）：１４１８−１４２２
【非特許文献６８】Ｌｏｏｔｓ（２００７）Ｊ  Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５５（１７）：６８９１−６８９６
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【非特許文献７０】Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ（１９７２）Ｃｈｒｏｍｏｎｅｓ  ｉｎ  Ａｌｏｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ−Ａｌｏｅｓｉｎ  ＰＭ  １９（４）：３２２−３２５
【非特許文献７１】Ｒａｕｗａｌｄ及びＢｅｉｌ（１９９３）Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ６３９：３５９−３６２
【非特許文献７２】Ｒａｕｗａｌｄ及びＢｅｉｌ（１９９３）Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ４８ｃ：１−４
【非特許文献７３】Ｃｏｎｎｅｒら（１９９０）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：９４１
【非特許文献７４】Ｍｅｂｅ（１９８７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：２６４６
【非特許文献７５】Ｈａｙｎｅｓら（１９７０）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（Ｃ）２５８１
【非特許文献７６】ＭｃＣａｒｔｈｙ及びＨａｙｎｅｓ（１９６７）Ｔｈｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｏｅｓｉｎ  ｉｎ  Ｓｏｍｅ  Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｌｏｅ  Ｓｐｅｃｉｅｓ；Ｈｅｆｔ  ３  ３４２
【発明の概要】
【００３２】
本発明は、脂肪細胞によるアディポネクチン産生のアップレギュレーション並びにグルコース及び脂肪酸の代謝経路及びシグナル伝達経路に関連する事実上数百の遺伝子の正常化を示す植物源由来のクロモン及び新規クロモン組成物の同定及び単離を記載する。該クロモン組成物は、脂肪細胞によるアディポネクチン産生の増強及び脂肪酸生合成、脂肪酸のミトコンドリアβ酸化、ステロイド生合成、糖新生、脂肪輸送、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα肝シグナル伝達及び異物代謝に関与する遺伝子の調節に有効である。該クロモン組成物は、哺乳動物におけるインスリン感受性の増大、耐糖能の改良、トリグリセリド濃度の低下及びグルコース濃度の均衡化に使用できる。本発明には、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖、メタボリックシンドローム、脂質異常症、及び高トリグリセリド血症（これらに限定されない）を含む様々な疾患及び状態の予防及び治療のための方法も含まれる。
【００３３】
本発明は、哺乳動物におけるメタボリックシンドローム及びインスリン抵抗性によって媒介される疾患及び状態の予防及び治療法を含む。該方法は、それを必要とする対象に一つ又は複数のクロモンを含む有効量の医薬組成物又は栄養薬組成物を投与することを含む。クロモン又はクロモンの混合物は、これに限定されないが、合成、天然、又はそのいずれかの組合せを含む単一源又は複数源から単離できる。
【００３４】
一態様において、本発明は、脂肪細胞からのアディポネクチン産生を増大させる方法であって、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物を投与することを含む方法を記載し、前記クロモン又はクロモンの混合物。別の態様において、本発明は、高脂肪食で誘導された、脂肪酸生合成、脂肪酸のミトコンドリアβ酸化、ステロイド生合成、糖新生、脂肪輸送、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα肝シグナル伝達及び異物代謝の遺伝子発現の変化を正常化する方法を記載し、前記方法は、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物を含む組成物を投与することを含む。さらに別の態様において、本発明は、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖、メタボリックシンドローム、脂質異常症、及び高トリグリセリド血症の予防及び治療法を含み、前記方法は、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物を含む組成物を投与することを含む。
【００３５】
下記に従って使用できるクロモンは、下記の一般構造：
【００３６】
【化２】
0005503973.tif 000003
【００３７】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ3、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ3、−ＳＣＨ3、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ2、−ＮＲＨ、−ＮＲ2、−ＮＲ3+Ｘ-、エステルであって、これらに限定されないが、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルを含む群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、前記ヘキソース又はペントースは炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、前記ヘキソース又はペントースは、これらに限定されないが、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体を含む群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、これらに限定されないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］によって示される化合物及び製薬学的に許容しうる担体を含む。
【００３８】
一態様において、クロモンは、下記の一般構造：
【００３９】
【化３】
0005503973.tif 000004
【００４０】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は上記定義の通り］を有するグループ化合物から選ばれるベンゾピラン−４−オン（７−ヒドロキシクロモン）である。
本発明の別の態様において、クロモンはアロエシン及び／又はアロエシノールから選ばれる。それらの構造を以下に図示する。
【００４１】
【化４】
0005503973.tif 000005
【００４２】
本発明のクロモンは合成法によって得ることも、多数の植物科の属から単離することもできる。属名を挙げると、これらに限定されないが、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckia)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)などである。好適な態様において、植物は、これらに限定されないが、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckia frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)を含む群から選ばれる。一態様において、クロモンは、アロエ・フェロックス、アロエ・ベラ、又はアロエ・バルバデンシスの全葉から単離される。
【００４３】
クロモンは該植物の様々な部分に見出される。例えば、これらに限定されないが、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽（young shoots）、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分などである。
【００４４】
本発明は、クロモンを含有する植物からのクロモンの単離及び精製について記載する。本発明の方法は、ａ）クロモン、特にアロエシン又はアロエシノールから選ばれたクロモンを含有する植物の粉砕バイオマスを抽出し；ｂ）前記抽出物を中和及び濃縮し；そしてｃ）前記中和及び濃縮抽出物をクロマトグラフィー法、例えばこれらに限定されないが、ポリアミド、ＬＨ−２０、ＸＡＤ樹脂、ＣＧ−１６１樹脂、シリカゲル又は逆相クロマトグラフィーを用いて精製することを含む。本発明の一態様において、抽出物は、再結晶、沈殿、溶媒分配及び／又はクロマトグラフィー分離からなる群から選ばれる方法を用いて精製される。本発明は、望ましい生理活性を有するクロモンを単離及び精製するための商業的に実現可能な方法を提供する。
【００４５】
医薬製剤として投与するための製品の製造は、当業者に周知の様々な方法によって実施できる。クロモンは、天然に存在する形態の薬草粉末として；異なる濃度の溶媒抽出物及び／又は超臨界流体抽出物として；再結晶、カラム分離、溶媒分配、沈殿及びその他の手段による豊富化及び精製化合物として；合成法によって製造された実質的に純化されたクロモンを含有する純粋物及び／又は混合物として製剤化できる。
【００４６】
発明者らは、承認された動物モデルを用いて、クロモン又はその混合物、例えばアロエシン及び／又はアロエシノール又は各種植物源、例えばアロエ・フェロックスの葉の滲出物から単離されたクロモンの混合物を含む抽出物を、アロエ・ベラのゲル又はアロエ・ベラの全葉ゲル粉末及び抽出物と一緒に投与すると、食物摂取及び体重に影響を及ぼすことなく、インスリン抵抗性を低減し、同時にインスリン濃度を低下させ、空腹時血糖値を低く維持し、そしてトリグリセリド値を著しく低下させることを示した。一つ又は複数のクロモン及び／又はこれらの化合物を含有する植物、例えばアロエ・ベラ及びアロエ・フェロックス及びその他の植物種から単離されたクロモン標準化抽出物の、インスリン抵抗性の改善及び空腹時血糖値の低下における新規使用はこれまでに報告されていない。開示されたクロモンは、ヒトを含むがヒトだけに限定されない哺乳動物の代謝障害、例えばこれらに限定されないが、インスリン抵抗性、耐糖能異常、メタボリックシンドローム、脂質異常症、及び高トリグリセリド血症の予防及び治療のための予防及びインスリン増感薬として使用できる。
【００４７】
本発明の組成物は、当業者に公知のいずれかの方法によって投与できる。投与様式は、これらに限定されないが、経腸（経口）投与、非経口（静脈内、皮下、及び筋肉内）投与及び局所塗布などである。本発明による治療法は、それを必要とする対象に、これらに限定されないが、合成、天然、又はそのいずれかの組合せを含む単一源又は複数源のいずれかから単離された、治療上有効な量の個別クロモン及び／又はクロモン混合物を内的又は局所投与することを含む。個別クロモン及び／又はクロモン混合物の純度は、該化合物を得るのに使用された方法によって、０．０１％〜１００％の範囲である。経口、注射、局所、エアゾール、坐剤、皮内投与におけるクロモン組成物の濃度は、適切な製剤において総量の０．００１〜９９．９９重量％であろう。クロモンは、経口、局所、エアゾール、坐剤、皮内、筋肉内、及び静脈内投与からなる群から選ばれるいずれの投与経路によっても使用でき、日用量は哺乳動物、特にヒトの体重あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１Ａ】図１Ａは、以前に公表されたプロトコルを用いた場合の培地中に分泌されるアディポネクチン量に対するインドメタシンの作用をグラフに描いたものである。図１Ａは、３Ｔ３−Ｌ１細胞を７日間分化誘導し、インドメタシンで２４時間処理したものである。アディポネクチン量の最高平均倍増率は１μＭのインドメタシンによる１．６倍であった。
【図１Ｂ】図１Ｂは、改良されたプロトコルを用いた場合の培地中に分泌されるアディポネクチン量に対するインドメタシンの作用をグラフに描いたものである。図１Ｂは、３Ｔ３−Ｌ１細胞を２日間分化誘導し、インドメタシンで２日間処理したものである。アディポネクチン量の最高平均倍増率は１００μＭのインドメタシンによる５２倍で、最低倍増率は１０μＭで７倍であった。
【図２】図２は、分化３Ｔ３−Ｌ１細胞の培地中に分泌されるアディポネクチン量に対するアロエ・フェロックスの植物抽出物（Ｐ００１７−ＯＥ）の作用をグラフで示したものである。手短に言うと、３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化誘導後、０．５、０．１６６及び０．０５５ｍｇ／ｍｌの濃度の粗有機抽出物Ｐ００１７−ＯＥで４８時間処理した。元の粗抽出物は、用量反応関係を試験するために１：３、次いで１：９に希釈された。
【図３】図３は、Ｐ００１７−ＯＥのＨＴＰ−ＵＶプロフィールとフラクションの統合を描いたものである。全９６のフラクションを８つのサブフラクションに統合した。Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３は、アディポネクチンアッセイで８つのサブフラクション中、最も活性であった。
【図４】図４は、Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３のＣ１８カラム分画を示す。Ｐ００１７−ＡＣ１及びＰ００１７−ＡＣ２はアディポネクチンアッセイで活性を示し、それぞれアロエシン及びアロエシノールと同定された。
【図５】図５は、ＵＶスペクトルの解明及びＨＰＬＣリテンションタイムの真正標準との比較によるアロエシン（ＵＰ３９４）の同定を描いたものである。
【図６】図６は、ＵＶスペクトルの解明及びＨＰＬＣリテンションタイムの真正標準との比較によるアロエシノール（ＵＰ３９６）の同定を描いたものである。
【図７】図７は、分化３Ｔ３−Ｌ１細胞の培地中に分泌されるアディポネクチン量に対するＵＰ３９４（アロエシン）及びＵＰ３９６（アロエシノール）の作用をグラフで示したものである。手短に言うと、３Ｔ３−Ｌ１細胞を分化誘導後、３０μＭの濃度のＵＰ３９４（アロエシン）及びＵＰ３９６（アロエシノール）で４８時間処理した。培地中のアディポネクチン濃度は、アディポネクチン用ＥＬＩＳＡキットで測定した。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて処置後１８日目に２ｇ／ｋｇの用量で実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。手短に言うと、動物を３時間絶食させた後、グルコースを投与した。マウスを、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）（■）、ＵＰ３９４（１００ｍｇ／ｋｇ）（▲）、ＵＰ３９６（１００ｍｇ／ｋｇ）（ｘ）及びビヒクル（◆）で腹腔内処置した。血糖値は、０、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。動物には１２週間高脂肪食を与えた。処置は第８週目に開始した。データは平均±ＳＤ、ｎ＝６である。ＧＷ１９２９及びＵＰ３９６では、ビヒクルと比較すると顕著なグルコース利用が６０、９０及び１２０分時点で観察された。Ｐ＜０．０５（*）。ＧＷ１９２９、ＵＰ３９４及びＵＰ３９６のＰ値は、ビヒクルと比較した場合、それぞれＴ０で０．００、０．８７及び０．４３；Ｔ３０で０．０７、０．１６及び０．２３であった。ＵＰ３９４のＰ値は、ビヒクルと比較した場合、Ｔ６０で０．１５；Ｔ９０で０．１０及びＴ１２０で０．１７であった。
【図８Ｂ】図８Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて積極的処置２４日目に０．５単位／ｋｇの用量で実施された腹腔内インスリン耐性試験の結果を示す。手短に言うと、動物を３時間絶食させた後、インスリンを注射した。マウスを、ＧＷ１９２９（■）、ＵＰ３９４（▲）、ＵＰ３９６（ｘ）及びビヒクル（◆）で２４日間処置した。血糖値は、０、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。動物には１２週間高脂肪食を与えた。処置は第８週目に開始した。データは平均±ＳＤ、ｎ＝６である。ＧＷ１９２９のみならずＵＰ３９４及びＵＰ３９６の場合も、ビヒクルと比較すると顕著なグルコースクリアランスがＴ３０、Ｔ６０及びＴ９０の時点で観察された。Ｐ＜０．０５（*）。ＧＷ１９２９、ＵＰ３９４及びＵＰ３９６のＰ値は、ビヒクルと比較した場合、それぞれＴ０で０．００、０．１４及び０．６７；Ｔ１２０で０．０８、０．００及び０．０４であった。
【図９】図９は、高脂肪食誘導糖尿病モデルを用いて、インスリン濃度に対するＵＰ３９４及びＵＰ３９６の作用をグラフで示したものである。動物は、高脂肪食で８週間代謝異常を誘導した後、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ３９４（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ３９６（１００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで２週間腹腔内処置した。血液は尾静脈から採取し、遠沈して血漿を得た。血漿中インスリン濃度はインスリン用ＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ−イリノイ州シカゴ）で測定した。
【図１０】図１０は、ＧＷ１９２９（■）、Ｎ９３１（▲）及びビヒクル（◆）で１０週間処置された雄のｄｂ／ｄｂマウスの毎週の空腹時血糖値をグラフで示したものである。動物には絶食時以外、Ｔ２０１８齧歯類用食餌を随意に与えた。動物を一晩絶食させた後に測定を行った。示されている値は平均±ＳＤ、ｎ＝８である。空腹時血糖値は、ＧＷ１９２９及びＮ９３１の場合、ビヒクルと比べると、第６、７、９及び１０週で著しく低かった。Ｐ＜０．０５（*）。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて１０週間の処置後に３ｇ／ｋｇの用量で実施された経口グルコース耐性試験の結果を示す。動物を一晩絶食させた後、グルコースを負荷した。マウスをＧＷ１９２９（■）、Ｎ９３１（▲）及びビヒクル（◆）で１０週間処置した。血糖値は、０、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。動物には絶食時以外、Ｔ２０１８齧歯類用食餌を随意に与えた。データは平均±ＳＤ、ｎ＝８である。ＧＷ１９２９及びＮ９３１のいずれも、ビヒクルと比べた場合、顕著なグルコース利用が０及び１２０分時点で観察された。Ｐ＜０．０５（*）。ＧＷ１９２９及びＮ９３１のＰ値は、ビヒクルと比較した場合、それぞれＴ３０で０．１５及び０．０５；Ｔ６０で０．３３及び０．０２；Ｔ９０で０．００２及び０．０８３であった。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ｄｂ／ｄｂマウスにおいて６週間の処置後に０．５単位／ｋｇの用量で実施された腹腔内インスリン耐性試験の結果を示す。動物を一晩絶食させた後、インスリンを注射した。マウスをＧＷ１９２９（■）、Ｎ９３１（▲）及びビヒクル（◆）で１０週間処置した。血糖値は、０、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。動物には絶食時以外、Ｔ２０１８齧歯類用食餌を随意に与えた。データは平均±ＳＤ、ｎ＝８である。ＧＷ１９２９及びＮ９３１のいずれも、ビヒクルと比べた場合、顕著なグルコースクリアランスが０、３０及び６０分時点で観察された。Ｐ＜０．０５（*）。ＧＷ１９２９及びＮ９３１のＰ値は、ビヒクルと比較した場合、それぞれＴ９０で０．００及び０．１４、及びＴ１２０で０．００及び０．０９であった。
【図１２】図１２は、ＧＷ１９２９、Ｎ９３１及びビヒクルで１０週間処置された雄のｄｂ／ｄｂマウスの毎週の空腹時トリグリセリド値をグラフで示したものである。動物には絶食時以外、Ｔ２０１８齧歯類用食餌を随意に与えた。動物を一晩絶食させた後に測定を行った。示されている値は、ビヒクルに対する％トリグリセリド値である。ｎ＝８。１０週間の処置後、ビヒクルと比較した場合、ＧＷ１９２９及びＮ９３１で処置された動物にトリグリセリド値の顕著な低下が見られた。Ｐ＜０．０５（*）。
【図１３Ａ】図１３Ａは、処置開始後３週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１３Ａは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ４００ｍｇ／ｋｇのＱｍａｔｒｉｘ（登録商標）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、処置開始後３週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１３Ｂは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＧＷ１９２９（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。３週間の経口処置後、ＧＷ１９２９で処置された動物では、統計的に有意なグルコースクリアランスが腹腔内グルコース負荷後３０、６０及び９０分時点で見出された。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、処置開始後３週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１３Ｃは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（１００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。ＵＰ７８０の効果は早くも３週間の処置で検出された。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、処置開始後３週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１３Ｄは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（２００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。ＵＰ７８０の効果は早くも３週間の処置で検出された。３週間の経口処置後、２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物では、統計的に有意なグルコースクリアランスが腹腔内グルコース負荷後３０、６０及び９０分時点で見出された。
【図１３Ｅ】図１３Ｅは、処置開始後３週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１３Ｅは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（４００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。ＵＰ７８０の効果は早くも３週間の処置で検出された。同様に、４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物も３０分時点で有意なグルコース利用を示した。Ｐ≦０．０５（*）。
【図１３Ｆ】図１３Ｆは、処置開始後３週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１３Ｆは、ビヒクル（◆）ｖｓ  通常の齧歯類用餌を与えられた動物の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。
【図１４Ａ】図１４Ａは、処置開始後９週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１４Ａは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＧＷ１９２９（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。陽性対照のＧＷ１９２９は、分析した各時点で０．０５未満のＰ値を有している。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、処置開始後９週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１４Ｂは、ビヒクル（◆）ｖｓ  Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）（４００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。ビヒクル対照と比較すると、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）で処置された動物は、９週間の毎日経口処置の後、ＩＰグルコース投与後３０、６０、９０及び１２０分の時点でグルコース利用において統計的に有意な差を示した。Ｐ≦０．０５（*）。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、処置開始後９週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１４Ｃは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（１００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。１００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物は、Ｔ３０時点でのみ有意な差を示した。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、処置開始後９週目に実施された腹腔内グルコース耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１４Ｄは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（２００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、処置開始後９週目に実施された腹腔内グルコース負荷耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１４Ｅは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（４００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。ビヒクル対照と比較すると、４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物は、９週間の毎日経口処置の後、ＩＰグルコース投与後３０、６０、９０及び１２０分の時点でグルコース利用において統計的に有意な差を示した。Ｐ≦０．０５（*）。
【図１５Ａ】図１５Ａは、処置開始後３週目に実施された腹腔内インスリン耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、０．５単位／ｋｇの用量のインスリンを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１５Ａは、ビヒクル（◆）ｖｓ  Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）（４００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、処置開始後３週目に実施された腹腔内インスリン耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、０．５単位／ｋｇの用量のインスリンを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１５Ｂは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（１００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。ＵＰ７８０のインスリン増感効果は、１０週間の毎日経口処置後のインスリン耐性試験で確認された。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、処置開始後３週目に実施された腹腔内インスリン耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、０．５単位／ｋｇの用量のインスリンを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後、０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１５Ｃは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（２００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。ＵＰ７８０のインスリン増感効果は、１０週間の毎日経口処置後のインスリン耐性試験で確認された。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、処置開始後３週目に実施された腹腔内インスリン耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、０．５単位／ｋｇの用量のインスリンを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１５Ｄは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＵＰ７８０（４００ｍｇ／ｋｇ）（■）の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。ＵＰ７８０のインスリン増感効果は、１０週間の毎日経口処置後のインスリン耐性試験で確認された。４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物には、考慮された全時点で統計的に有意なインスリン増感が観察された。Ｐ≦０．０５（*）。残りの処置群では、ＧＷ１９２９のインスリン注射１時間後以外、ほかに有意差は観察されなかった。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、処置開始後３週目に実施された腹腔内インスリン耐性試験の結果を示す。試験日、動物を３時間絶食させた後、０．５単位／ｋｇの用量のインスリンを腹腔内投与した。血糖値はグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図１５Ｅは、ビヒクル（◆）ｖｓ  ＧＷ１９２９の比較を示すグラフである。Ｐ＜０．０５（*）。
【図１６】図１６は、２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されたＵＰ７８０の一貫したグルコース低下効果をグラフで示したものである。空腹時血糖値は、ベースライン及び処置開始後２、５、及び７週間の時点で、尾静脈から得た１５〜２０μｌの血液を用いて測定した。動物は、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）（４００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル対照で処置された。処置後早くも２週間で統計的に有意な空腹時血糖値の低下が見られた。Ｐ＜０．０５（*）（Y）。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０及びＧＷ１９２９で処置された動物は、非処置ビヒクルと比較した場合、二つの週（第５及び７週）で統計的に有意な低い空腹時血糖値を示した。Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）及び４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置されたマウスも、第５週に同様の低レベルの空腹時血糖値を示した。他方、１００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０処置群は、試験したすべての週で非処置ビヒクルと比較して比較的高レベルの空腹時血糖値を維持していた。Ｐ≦０．０５（*）。
【図１７】図１７は、処置開始後２、５、及び７週間の時点で測定した、空腹時血糖値のビヒクル対照に対する低下率をグラフで示したものである。動物は、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）（４００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル対照で処置された。２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０処置群の場合、早くも第２週に一貫して低レベルの空腹時血糖値が見られた。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。空腹時血糖値の低下率（２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物）が測定され、ビヒクルと比較した場合、第２、５、及び７週でそれぞれ１８％、２０％及び１７％であることがわかった。
【図１８】図１８は、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの空腹時トリグリセリド値に及ぼすＧＷ１９２９、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルの作用をグラフで示したものである。空腹時トリグリセリド値のビヒクル対照に対する低下率を処置開始後２、５、及び７週間の時点で測定した。動物は、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）（４００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル対照で処置された。２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０処置群の場合、早くも第２週に一貫して低レベルの空腹時トリグリセリド値が見られた。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。７週間の毎日の処置後、ビヒクルに対する空腹時トリグリセリド値の低下率は、４００ｍｇ／ｋｇのＱｍａｔｒｉｘ（登録商標）、２００、４００及び１００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０、及びＧＷ１９２９についてそれぞれ２％、２２．１％、２２％、２１．７％、及び２２．７％であった。
【図１９】図１９は、コレステロール値に及ぼすＧＷ１９２９、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルの作用をグラフで示したものである。空腹時総コレステロール値は、ベースライン及び処置開始後２、５、及び７週間の時点で、尾静脈から得た１５〜２０μｌの血液を用いて測定した。動物は、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）（４００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル対照で処置された。ビヒクル対照と比較して全処置群で総コレステロール値に変化は観察されなかった。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。ビヒクル対照と比較した場合、全処置群でコレステロール値に有意な変化は認められなかった。Ｐ≦０．０５。
【図２０】図２０は、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの体重に及ぼすＧＷ１９２９、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルの影響を示す。３又は４匹の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、飼料及び水のための区画を有するマウスケージで飼育された。体重測定は、誘導期間及び処置週間中、週１回行った。動物は、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）（４００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル対照で処置された。ＧＷ１９２９、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで処置されたいずれのマウスにも群間で統計的に有意な体重増加の差は観察されなかった。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。図２０に描かれているように、ビヒクル及び通常の齧歯類用食餌を含む各処置群の動物は、研究期間中を通じて体重増加を続けた。Ｉ群（Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）４００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０）及びII群（ＧＷ１９２９、ビヒクル、１００、４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０）間で認められた体重増加の差はＰ≦０．０５で統計的に有意なものではない。
【図２１】図２１は、雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの飼料消費量に及ぼすＧＷ１９２９、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルの影響を示す。３又は４匹の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、飼料及び水のための区画を有するマウスケージで飼育された。飼料摂取測定は、誘導期間及び処置週間中、週１回行った。処置週間中の飼料消費量データは示してある。動物は、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）（４００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ７８０（１００、２００、及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクル対照で処置された。群間で統計的に有意な飼料摂取量の差はなかった。データは平均±ＳＤ、ｎ＝７である。体重データに一致して、同様のパターンの飼料消費が全群で記録された。
【図２２Ａ】図２２Ａは、雄の平均体重を測定する急性毒性研究の結果を描いたものである。対照及び処置群間の体重増加率は、研究期間中一貫していた。マウスは、２ｇ／ｋｇのＵＰ７８０及びビヒクル対照で１４日間処置された。ＵＰ７８０処置動物及びビヒクル対照についての剖検日とベースラインとの間の体重増加の差の統計的解析によれば、雄も雌も体重増加に有意差はないことが示された。同様に、ＵＰ７８０処置動物及びビヒクル対照動物の雌雄とも、比較した各データポイントで平均体重増加に統計的有意性はなかった。データは平均±ＳＤ、ｎ＝５である。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、雌の平均体重を測定する急性毒性研究の結果を描いたものである。対照及び処置群間の体重増加率は、研究期間中一貫していた。マウスは、２ｇ／ｋｇのＵＰ７８０及びビヒクル対照で１４日間処置された。ＵＰ７８０処置動物及びビヒクル対照についての剖検日とベースラインとの間の体重増加の差の統計的解析によれば、雄も雌も体重増加に有意差はないことが示された。同様に、ＵＰ７８０処置動物及びビヒクル対照動物の雌雄とも、比較した各データポイントで平均体重増加に統計的有意性はなかった。データは平均±ＳＤ、ｎ＝５である。
【図２３】図２３は、ＬＶ  ｖｓ  ＬＣの遺伝子発現の一般的アップレギュレーション（２３Ａ）及びＬＵＰ  ｖｓ  ＬＣの遺伝子発現のダウンレギュレーション（２３Ｂ）を視覚的観点からグラフで示したものである。グラフはソフトウェアＳｉｇｍａＰｌｏｔによって作成した。ＡＮＯＶＡを正規化マイクロアレイデータに対して用い、処置群間（ＬＶ  ｖｓ  ＬＣ及びＬＵＰ  ｖｓ  ＬＣ）の異なって発現された遺伝子を検出する。各比較について、著しく異なって発現された遺伝子をＡＮＯＶＡモデル及び多重比較補正の結果から得る。Ｈｏｌｍ’ｓ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による比較のための統計的に有意なプローブセットの数をグラフにまとめた。ＬＶ  ｖｓ  ＬＣ（２３Ａ）及びＬＵＰ  ｖｓ  ＬＣ（２３Ｂ）。
【図２４Ａ】図２４Ａ及びＢは、ＡＣＣ２の転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。図２４Ａはマイクロアレイデータからの定量化である。同じＲＮＡ標本をマイクロアレイにもＱＰＣＲにも使用した。ＰＭ＋ＭＭ及びＰＭのみの強度値をマイクロアレイデータ分析に独立して使用したので（実施例２０参照）、比較のため、及び入手可能な場合、動物間の変動の比較のためにどちらもプロットした。
【図２４Ｂ】図２４Ａ及びＢは、ＡＣＣ２の転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。図２４ＢはＱＰＣＲによる定量化で、ＧＡＰＤＨの発現量に従って正規化発現量としてプロットされている。三つの痩せた対照のＲＮＡサンプルをＱＰＣＲのためのＬＣとしてプールした。高脂肪食（ＬＶ）及び高脂肪食＋ＵＰ７８０（ＬＵＰ）処置のＲＮＡサンプルをＱＰＣＲ用として個別に用いた。同じＲＮＡ標本をマイクロアレイにもＱＰＣＲにも使用した。ＰＭ＋ＭＭ及びＰＭのみの強度値をマイクロアレイデータ分析に独立して使用したので（実施例２０参照）、比較のため、及び入手可能な場合、動物間の変動の比較のためにどちらもプロットした。
【図２５Ａ】図２５Ａ及びＢは、図２４Ａ及びＢに記載したのと同じフォーマットでＦＡＳＮの転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。
【図２５Ｂ】図２５Ａ及びＢは、図２４Ａ及びＢに記載したのと同じ形式でＦＡＳＮの転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。
【図２６Ａ】図２６Ａ及びＢは、図２４Ａ及びＢに記載したのと同じ形式でＰＥＰＣＫ１の転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。
【図２６Ｂ】図２６Ａ及びＢは、図２４Ａ及びＢに記載したのと同じ形式でＰＥＰＣＫ１の転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。
【図２７Ａ】図２７Ａ及びＢは、図２４Ａ及びＢに記載したのと同じ形式でＦＡＢＰ５の転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。
【図２７Ｂ】図２７Ａ及びＢは、図２４Ａ及びＢに記載したのと同じ形式でＦＡＢＰ５の転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。
【図２８Ａ】図２８Ａ及びＢは、図２４Ａ及びＢに記載したのと同じ形式でＡＭＰＫα２の転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。
【図２８Ｂ】図２８Ａ及びＢは、図２４Ａ及びＢに記載したのと同じ形式でＡＭＰＫα２の転写量に関するマイクロアレイ分析のＱＰＣＲ検証を描いている。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明は、脂肪細胞によるアディポネクチン産生のアップレギュレーション並びにグルコース及び脂肪酸の代謝経路及びシグナル伝達経路に関連する事実上数百の遺伝子の正常化を示す植物源由来のクロモン及び新規クロモン組成物の同定及び単離を記載する。該クロモン組成物は、脂肪細胞によるアディポネクチン産生の増強及び脂肪酸生合成、脂肪酸のミトコンドリアβ酸化、ステロイド生合成、糖新生、脂肪輸送、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα肝シグナル伝達及び異物代謝に関与する遺伝子の調節に有効である。該クロモン組成物は、哺乳動物におけるインスリン感受性の増大、耐糖能の改良、トリグリセリド濃度の低下及びグルコース濃度の均衡化に使用できる。本発明には、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖、メタボリックシンドローム、脂質異常症、及び高トリグリセリド血症（これらに限定されない）を含む様々な疾患及び状態の予防及び治療のための方法も含まれる。
【００５０】
また、本発明には、一つ又は複数のクロモンの混合物とアロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末のいずれかとを含む新規組成物も含まれる。これらの新規組成物は、グルコース濃度の低下及びインスリン感受性の増強に極めて有効である。該組成物は、アロエゲル粉末又は全葉アロエゲル粉末を、実質的に純粋な一つ又は複数のクロモンの混合物と混合することによって製造される。ここで、前記一つ又は複数のクロモンの混合物は、本質的にアントラキノン類を含まない（典型的にはアロインＡ及びＢ）。“実質的に純粋な”とは、クロモンの混合物が少なくとも７０％（重量％）純粋、好ましくは少なくとも８０％純粋、最も好ましくは９０％以上純粋であることを意味する。“本質的にアントラキノン類を含まない”とは、クロモンの混合物中のアントラキノン類の総量が１００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは５０ｐｐｍ以下であることを意味する。アロエゲル粉末又は全葉ゲル粉末（ここではまとめて“アロエゲル”と呼ぶ）は、これらの組成物を製造するためのいずれかの公知標準法によって製造できる。一態様において、アロエゲルはアロエ・バルバデンシス又はアロエ・ベラのいずれかから製造される。これらの組成物中のアロエゲルの全クロモンに対する比率は０．１〜９９．９％の範囲であろう。一部の態様において、組成物は９０％〜９９％（重量％）のアロエゲルと１〜１０％（重量％）の全クロモンを含む。その他の態様において、組成物は９５％〜９９％（重量％）のアロエゲルと１〜５％（重量％）の全クロモンを含む。さらに他の態様において、組成物は９８％〜９９％（重量％）のアロエゲルと１〜２％（重量％）の全クロモンを含む。クロモンは以下に詳細に記載のようにして単離される。一部の態様において、一つ又は複数のクロモンは、アロエシン、アロエシノール、アロエレシンＡ、アロエレシンＣ、アロエレシンＤ、アロエレシンＥ、アロエレシンＦ、及びアロエシン誘導体からなる群から選ばれる。本発明のクロモンは、天然クロモンの構造を化学的に変更することによって半合成しても、小さい芳香族出発物質から完全合成してもよい。
【００５１】
本明細書中では本発明の側面に様々な用語を用いて言及している。本発明の要素に関する記載を明確化する一助として、以下の定義を提供する。
特に明記しない限り、本明細書中で使用されているすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野の専門家によって通常理解されている意味を有する。
【００５２】
本明細書中では、一つの（“ａ”又は“ａｎ”）物とは、一つ又は複数のその物のことを意味する。例えば一つのクロモンとは一つ又は複数のクロモンのことである。従って、一つ（“ａ”又は“ａｎ”）、“一つ又は複数”及び“少なくとも一つ”という用語は本明細書中では互換的に使用される。
【００５３】
“クロモン”は、ベンゾピラン−４−オンを主骨格として有する特定クラスの天然産物で、下記の一般構造：
【００５４】
【化５】
0005503973.tif 000006
【００５５】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ3、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ3、−ＳＣＨ3、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ2、−ＮＲＨ、−ＮＲ2、−ＮＲ3+Ｘ-、エステルであって、これらに限定されないが、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルを含む群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、前記ヘキソース又はペントースは炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、前記ヘキソース又はペントースは、これらに限定されないが、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体を含む群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、これらに限定されないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］、及び製薬学的に許容し得る担体によって示される。
【００５６】
一態様において、クロモン（一つ又は複数）は、下記の一般構造：
【００５７】
【化６】
0005503973.tif 000007
【００５８】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は上記定義の通り］を有するグループ化合物から選ばれるベンゾピラン−４−オン（７−ヒドロキシクロモン）である。本発明の別の態様において、クロモンはアロエシン又はアロエシノールから選ばれる。
【００５９】
本発明のクロモンは合成法によって得ることも、多数の植物科の属から単離することもできる。属名を挙げると、これらに限定されないが、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckia)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)などである。好適な態様において、植物は、これらに限定されないが、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckia frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)を含む群から選ばれる。一態様において、クロモンは、アロエ・フェロックス、アロエ・ベラ、又はアロエ・バルバデンシスの全葉から単離される。
【００６０】
クロモンは該植物の様々な部分に見出される。例えば、これらに限定されないが、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分などである。
【００６１】
“アロエ”という用語は、南アフリカのユリ科の植物の一つの属のことで、アロエ・ベラ／アロエ・バルバデンシス（アロエ・バルバデンシスはアロエ・ベラ種のラテン名であることに注意）又はアロエ・フェロックスはその中の種である。アロエクロモンは、アロエのいくつかの異なる種の葉皮に主として存在する。
【００６２】
“アロエ抽出物”という用語は、アロエ植物の様々な種の全葉の乾燥ジュースと定義される。本発明の実施例で使用される“アロエ抽出物”は、様々なアロエ種の全葉の“全葉加工”によって製造された、新鮮及び濃縮アロエゲル、全葉ゲル、葉の滲出物及び抽出物を含むが、これらに限定されない。一実施例において、アロエ・バルバデンシス植物から得られた全葉は、粉砕され、ろ過され、セルラーゼ（任意）及び活性炭で処理され、そして凍結乾燥された。凍結乾燥粉末は、使用前にクロマトグラフィー溶媒で再構成された。別の実施例では、アロエ・フェロックスの葉の滲出物は水中に懸濁された後、使用前に適当なクロマトグラフィー溶媒と接触させた。
【００６３】
本明細書において“治療的”とは治療及び／又は予防を含む。使用される場合、治療的とはヒトに対してだけでなくその他の哺乳動物に対しても言う。
“製薬学的に又は治療上有効な用量又は量”とは、所望の生物学的結果を誘導するのに十分な用量レベルのことである。その結果とは、徴候、症状又は疾患の原因の緩和、又は所望される生体系の何らかその他の変化であろう。正確な用量は、各種の要因、例えばこれらに限定されないが、患者の年齢及び大きさ、疾患及び実行される処置に応じて変動することになろう。
【００６４】
“宿主”又は“患者”又は“対象”は、治療が望まれる生存哺乳動物、ヒト又は動物である。“宿主”、“患者”又は“対象”は、一般的に本発明の方法に従って実施される療法の受け手のことである。本明細書中に記載の発明は、ヒトに対する適用だけでなく獣医学のためにも使用できるので、“宿主”という用語を限定的に解釈すべきでないことに注意する。獣医学的用途の場合、用量範囲は動物の体重を考慮して以下に記載のように決定できる。
【００６５】
本明細書において“製薬学的に許容しうる担体”とは、有効成分の生物活性の効果を妨害せず、それを投与される宿主に対して非毒性のあらゆる担体のことである。“製薬学的に許容しうる担体”の例は、これらに限定されないが、いずれかの標準製薬学的担体、例えば食塩溶液、すなわち、リンガー溶液、緩衝生理食塩溶液、水、デキストロース溶液、血清アルブミン、並びに錠剤化及びカプセル化製剤用のその他の賦形剤及び保存剤などである。
【００６６】
本願全体を通して様々な引用がなされていることに注意する。各引用は、参照によってその全体を本明細書に具体的に援用される。
本発明は、哺乳動物におけるメタボリックシンドローム及びインスリン抵抗性によって媒介される疾患及び状態の予防及び治療法を含む。該方法は、それを必要とする対象に一つ又は複数のクロモンを含む有効量の医薬組成物又は栄養薬組成物を投与することを含む。クロモン又はクロモンの混合物は、これに限定されないが、合成、天然、又はそのいずれかの組合せを含む単一源又は複数源から単離できる。
【００６７】
一態様において、本発明は、脂肪細胞からのアディポネクチン産生を増大させる方法であって、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物を投与することを含む方法を記載し、前記クロモン又はクロモンの混合物。別の態様において、本発明は、高脂肪食で誘導された、脂肪酸生合成、脂肪酸のミトコンドリアβ酸化、ステロイド生合成、糖新生、脂肪輸送、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα肝シグナル伝達及び異物代謝の遺伝子発現の変化を正常化する方法を記載し、前記方法は、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物を含む組成物を投与することを含む。さらに別の態様において、本発明は、インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖、メタボリックシンドローム、脂質異常症、及び高トリグリセリド血症の予防及び治療法を含み、前記方法は、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物を含む組成物を投与することを含む。
【００６８】
下記に従って使用できるクロモンは、下記の一般構造：
【００６９】
【化７】
0005503973.tif 000008
【００７０】
［式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ3、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ3、−ＳＣＨ3、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ2、−ＮＲＨ、−ＮＲ2、−ＮＲ3+Ｘ-、エステルであって、これらに限定されないが、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルを含む群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、前記ヘキソース又はペントースは炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、前記ヘキソース又はペントースは、これらに限定されないが、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体を含む群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、これらに限定されないが、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］によって示される化合物及び製薬学的に許容しうる担体を含む。
【００７１】
一態様において、クロモンは、下記の一般構造：
【００７２】
【化８】
0005503973.tif 000009
【００７３】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、及びＲ3は上記定義の通り］を有するグループ化合物から選ばれるベンゾピラン−４−オン（７−ヒドロキシクロモン）である。本発明の別の態様において、クロモンはアロエシン及び／又はアロエシノールから選ばれる。それらの構造を以下に図示する。
【００７４】
【化９】
0005503973.tif 000010
【００７５】
本発明のクロモンは合成法によって得ることも、多数の植物科の属から単離することもできる。属名を挙げると、これらに限定されないが、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckia)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)などである。好適な態様において、植物は、これらに限定されないが、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckia frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)を含む群から選ばれる。一態様において、クロモンは、アロエ・フェロックス、アロエ・ベラ、又はアロエ・バルバデンシスの全葉から単離される。
【００７６】
クロモンは該植物の様々な部分に見出される。例えば、これらに限定されないが、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分などである。
【００７７】
本発明のクロモン化合物及び組成物、並びにそれらの生化学的及び生物学的活性は、以下に記載のように２０５９の植物抽出物のランダムスクリーニングから確認された。一次スクリーニングは、植物抽出物又は化合物の、培養脂肪細胞からのアディポネクチン産生増強能力に基づいて設計された。脂肪細胞はマウス線維芽細胞（３Ｔ３  Ｌ１）から分化させた。主要アディポカインマーカータンパク質、すなわち脂肪細胞培地中のアディポネクチン濃度を測定すれば、哺乳動物、特にヒトのインスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖、メタボリックシンドローム、脂質異常症、及び高トリグリセリド血症（これらに限定されない）を含む代謝異常の予防及び治療に使用するためのＰＰＡＲ汎レギュレーターとして作用する、又はその他のグルコース及び脂肪酸の主要代謝経路を調節する天然化合物の同定が可能になると考えられた。
【００７８】
植物抽出物のライブラリーを作成するために、実施例１に記載のように、乾燥植物材料を粉砕して微粉末にし、ＡＳＥ  ３００  自動抽出器を用いてメタノール：ジクロロメタン（１：１）で抽出した。抽出物は回転蒸発及びスピード−バキュームによって乾燥させた。各植物抽出物（約７５ｍｇ）を１．５ｍｌのＤＭＳＯ（１．５ｍｌ）中に溶解し、５０ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を製造した。
【００７９】
３Ｔ３−Ｌ１細胞は、ＰＰＡＲγアクチベーターに応答してアディポネクチンを産生及び培地中に分泌することが示されている。しかしながら、文献ではＰＰＡＲγアクチベーターの処理に応答したアディポネクチン分泌は２倍の増加しか達成されていない。この実験を繰り返した場合、達成されたアッセイの最良のシグナル対バックグラウンド比は、公表されている実験条件下で０．１〜３００μＭの濃度のインドメタシンを用いて１．６であった（図１Ａ）。我々は、実施例２及び３に示されているように誘導及び培養条件を変えることによってシグナル対ノイズ比を劇的に改良した。３Ｔ３−Ｌ１細胞を２日間分化誘導させた後、インドメタシンで２日間処理した。アディポネクチンの最高平均倍増率は１００μＭのインドメタシンで５２倍であった（図１Ｂ）。このアッセイ系を用いて２０５９の有機抽出物をスクリーニングした。
【００８０】
初期スクリーニングで、１０μＭの参照化合物インドメタシンによって与えられるのと同等のアディポネクチン誘導をカットオフ閾値として用いて１３９の正のヒットが得られた。その後の検証アッセイと二次スクリーニングの結果、アロエ・フェロックスの葉の滲出物からの一つの活性抽出物（Ｐ００１７と表示）は、培地中のアディポネクチン濃度の一貫した上向き調節を示した（図２）。
【００８１】
この活性植物抽出物（Ｐ００１７−ＯＥ）をその後、活性誘導(activity-guided)ＨＴＰ分画及び化合物精製に付した。実施例５に示されているように、Ｐ００１７の有機抽出物を順相フラッシュカラムを用いて分画した。類似のＵＶ吸収及びリテンションタイムを有するフラクションを統合してサブフラクションとし、低真空及び遠心下で乾燥させ、Ｐ００１７−ＯＥ−ＨＴＰＦ１〜８と名付けた（図３）。ＤＭＳＯを用いて各サブフラクションを溶解し（５０μｇ／μｌ）、一部分（２μｌ）をアディポネクチンアッセイに使用した。Ｐ００１７−ＯＥ−ＨＴＰＦ３がバイオアッセイの８つのサブフラクションの中で最大の活性を示した。活性フラクション及び化合物の反復大規模抽出及び単離を実施例７及び図４に示す。生物活性フラクションはＰ００１７−ＡＣ１及びＰ００１７−ＡＣ２と確認された。
【００８２】
活性サブフラクションのデレプリケーション（de-replication）をＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡを用いて実施した。最も強いアディポネクチン増強活性に対応して独特の化合物ピークが確認された。Ｐ００１７−ＯＥ−ＨＴＰＦ３及びＰ００１７−ＡＣ１／２において最活性化合物アロエシノール（ｍｗ＝３９６）及びアロエシン（ｍｗ＝３９４）が実施例８に記載のようにクロモンタイプの化合物と同定され、それぞれアロエシンについてはＵＰ３９４（図５）及びアロエシノールについてはＵＰ３９６（図６）とコードされた。具体的には、アロエシン及びアロエシノールは脂肪細胞からのアディポネクチン分泌を増強する活性クロモン化合物として単離及び同定された。精製ＵＰ３９４及びＵＰ３９６は実施例１０に記載のように試験され、両クロモン化合物とも、図７に示されているようにインビトロアッセイで脂肪細胞からのアディポネクチン産生の増大に活性であった。
【００８３】
実施例９には、アントラキノン不純物（具体的にはアロインＡ及びＢ）を除去するために、粗アロエ滲出物からクロモンを分取カラムクロマトグラフィー分離及び再結晶によって精製する方法が記載されている。アントラキノン類は下痢及び遺伝毒性を誘導するなどの著しい有害副作用を起こすという点で望ましくなく、故に粗クロモン抽出物の直接使用を阻んでいる。この方法による精製後に単離されたクロモンの純度は７０％、好ましくは８０％、最も好ましくは９０％以上（重量％）もの高さであり、これはＨＰＬＣによる定量で“本質的にアントラキノン類を含まない”。本質的にアントラキノン類を含まないとは、精製組成物中のアントラキノン類の総量が１００ｐｐｍ未満、好ましくは５０ｐｐｍ未満（のアロインＡ及びＢ）であることを意味する。アロエ・フェロックスの粗滲出物中、アロエシン（ＵＰ３９４）の量は約２５重量％で、アントラキノン類の量は約２２％である（Ｚａｈｎ，（２００７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．（１０）：１００２−１０２４）。従って、アロエ・フェロックスはクロモン組成物の単離のための優れた、そして好適な植物源である。実施例９に記載のように、アロエ・フェロックスの葉の滲出物から単離された単離及び精製アロエシン（ＵＰ３９４）（Ｌｏｔ＃Ａ−２７０５＆Ｌｏｔ＃Ｉ１５０６ＡＷ）は、それぞれ９３％及び１００．６％の純度を有し、総アントラキノンは５０ｐｐｍ未満であった。実施例１１及び１８に記載のように、アントラキノン除去（総アントラキノン類＜５０ｐｐｍ）アロエシン（ＵＰ３９４）を用いて、クロモン豊富化組成物Ｎ９３１及びＵＰ７８０が製造された。
【００８４】
しかしながら、アロエ・バルバデンシス（これは好適なアロエゲル源である）のような他のアロエ種におけるクロモンの量はずっと低く（０．３２ｍｇ／ｇ；０．０３２％、総クロモン０．１０％）、アントラキノン類（アロインＡ＆Ｂ）はほぼ４倍高い（１．１４ｍｇ／ｇ又は０．１１４％）と報告されている（Ｐａｒｋ（１９９８）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．（９）：１８６−１９１）。その上、クロモンはアロエ植物の皮又は葉の外層にしか貯蔵されていない。アロエ・ベラ／アロエ・バルバデンシスのようなアロエ植物からアロエゲル製品を得る標準プロセスでは、アロエの葉皮は通常除去され、透明ゲルだけがろ過及び濃縮される。アロエ全葉ゲル粉末の製造では、アロエ植物の全葉を粉砕しゲルを回収及びろ過するのであるが、その場合でも活性炭及びその他の加工ステップを用いる脱色プロセスで、アントラキノン類のみならず本質的にすべてのクロモンも除去される。従って、標準的なアロエゲル製品には有意量のクロモン又はアントラキノン類は見出されないことがＨＰＬＣでも確認されている（Ｄｅｌｌ’Ａｇｌｉ（２００７）Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅ．５５（９）：３３６３−３３６７；Ｚｏｎｔａ（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  ７１８（１）：９９−１０６）。
【００８５】
発明者らは、標準化植物抽出物中のクロモンを豊富化することによって、インスリン感受性の増強、耐糖能の改良及びトリグリセリド値の低下における改良された、より一貫性のある活性を有する組成物が提供されると考えた。この仮説を検証するために、実施例１１に示されているように、アロエ・フェロックスの葉滲出物から単離されたクロモンアロエシン（ＵＰ３９４）とアロエ・ベラから製造された全葉ゲル粉末とを組み合わせることによって独自のクロモン組成物を製造した。これら２種のアロエ由来の標準化クロモン組成物は１．４％以上のクロモン、すなわちアントラキノン類で汚染されていない（＜５０ｐｐｍのアロインＡ＆Ｂ）アロエシン（ＵＰ３９４）を含有していた。アロエシン（ＵＰ３９４）は、アロエ・フェロックスの葉滲出物から抽出され、分取クロマトグラフィーカラムによって単離された後、さらに再結晶によって精製された。これについては米国特許第６，４５１，３５７号、発明の名称“アロエシンの精製法(Method of Purification of Aloesin)”に記載されており、前記特許は引用によってその全文を本明細書に援用する。この独自の標準化クロモン組成物をＮ９３１とコードし、異なるインスリン抵抗性モデル、ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおける血糖値、インスリン抵抗性及び脂肪代謝に及ぼすその効果について試験した。
【００８６】
アディポネクチンは、メタボリックシンドロームの根本的原因と考えられているインスリン抵抗性を改良する報告されているので、クロモンＵＰ３９４及びＵＰ３９６によるインスリン抵抗性の低減は、様々な代謝異常に改良をもたらすはずと考えられた。この理論を検証するために、実施例１２に示されているように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高脂肪食を８週間与えることによって、低下したインスリン感受性、耐糖能及び代謝異常を誘導した。（Ｓｕｒｗｉｔら（１９８８）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：１１６３−１１６７；Ｌａａｋｓｏら（２００４）．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２７：２２５３−２２５９；Ｋａｈｎら（２００４）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：３２７４−３２８５；Ｓｃｈｅｕｒｉｎｋら（１９９８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  Ｅｎｄｏ．１３９：４６１−４６７）。次に該マウスをクロモンのＵＰ３９４、ＵＰ３９６及び参照化合物ＧＷ１９２９（Ｎ−（２−ベンゾイルフェニル）−Ｏ−［２−（メチル−２−ピリジニルアミノ）エチル］−Ｌ−チロシン）で４週間処置（注射又は経口）した。
【００８７】
開示されたクロモンの、高脂肪食マウスにおけるインスリン抵抗性に及ぼす治療効果を二つの試験を用いて示した。すなわちグルコース耐性試験（実施例１３）とインスリン耐性試験（実施例１４）である。腹腔内グルコース耐性試験を、開示されたクロモンのアロエシン（ＵＰ３９４）及びアロエシノール（ＵＰ３９６）による処置１８日目に実施した。動物を３時間絶食させた後、グルコースを投与した（２ｇ／ｋｇ）。血糖値をグルコース投与後０、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。実施例１３及び図８Ａに示されているように、ＵＰ３９６で処置された動物は、ビヒクル処置動物に比べて循環からのグルコースクリアランスに顕著な改良を示した。ＵＰ３９４で処置された動物も、ビヒクル処置動物に比べて改良の明白な傾向を示した（図８Ａ）。
【００８８】
腹腔内インスリン耐性試験は、実施例１４に示されているように、処置２４日目に実施した。動物を３時間絶食させた後、インスリンを注射した。血糖値をインスリン（０．５単位／ｋｇ）投与後０、３０、６０、９０、及び１２０分時点で測定した。図８Ｂ及び実施例１４に示されているように、ＵＰ３９４及びＵＰ３９６で処置された動物では、ビヒクル処置動物に比べて著しいグルコースクリアランスが観察された。ｐ＜０．０５（図８Ｂ）。
【００８９】
開示されたクロモンのインスリン増感活性は、該化合物の処置動物における血漿中インスリン濃度低下能力によっても示された。マウスの血漿中インスリン濃度はＥＬＩＳＡキットを用いて測定された（図９）。選択的ＰＰＡＲγアゴニストである参照化合物ＧＷ１９２９は、予想通りインスリン濃度を著しく低下させた。同様に、ＵＰ３９４及びＵＰ３９６も、ビヒクル処置マウスに比べてインスリン濃度を著しく低下させ（図９）、開示されたクロモン化合物は高脂肪食で誘導された代謝異常マウスにおけるインスリン感受性を増大させたことが示された。
【００９０】
糖尿病自然突然変異のホモ接合マウス（Ｌｅｐｒdb）は、およそ３〜４週齢で一目で肥満とわかるようになる。血漿中インスリンの上昇は１０〜１４日、血糖の上昇は４〜８週で始まる。ホモ接合突然変異マウスは多食、多飲、及び多尿である。疾患の経過は遺伝的背景によって著しく影響される。ｄｂ／ｄｂマウスにはいくつかの特徴が観察される。例えば、制御されない血糖の上昇、膵島のインスリン産生ベータ細胞の重度の枯渇、及び１０月齢までの死亡である。実施例１５に示されているように、雄のｄｂ／ｄｂマウス（各群８匹）をＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｎ９３１（３７５ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで１０週間処置し（注射又は経口）、マウスの空腹時血糖値を毎週測定した。その結果、Ｎ９３１はｄｂ／ｄｂマウスの血糖値低下に非常に有効であった。図１０に示されているように、ビヒクル処置マウスの血糖値は１０週間の処置中、時間経過と共に増加した。参照化合物のＧＷ１９２９は、予想通りグルコースをベースライン濃度に維持できた。ＧＷ１９２９と同様、Ｎ９３１も処置の第５週から血糖値を実質的に低下させた。空腹時血糖値は、Ｎ９３１処置群では、ビヒクル処置群と比べた場合、第６、７、９及び１０週で著しく低かった。Ｐ＜０．０５。１０週間の処置後、Ｎ９３１で処置された動物の血糖値はビヒクルで処置された動物の血糖値の５４％であった。
【００９１】
インスリン抵抗性に対するＮ９３１の効果は、実施例１６に記載のように、経口グルコース耐性試験で示された。ｄｂ／ｄｂマウス（各群８匹）をＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｎ９３１（３７５ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで１０週間処置した。動物を一晩絶食させた後、グルコースを負荷した。血糖値は、グルコース投与後０、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。ＧＷ１９２９又はＮ９３１での処置群には、ビヒクル群と比べた場合、循環からの顕著なグルコースクリアランスが０及び１２０分時点で観察された。Ｐ＜０．０５（図１１Ａ）。この結果は、Ｎ９３１が耐糖能を増大させ、従ってｄｂ／ｄｂマウスのインスリン感受性を改良する能力を有することを示している。
【００９２】
インスリン抵抗性に対するＮ９３１の効果は腹腔内インスリン耐性試験でも示された。ｄｂ／ｄｂマウス（各群８匹）をＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｎ９３１（３７５ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで６週間処置した。血糖値は、インスリン注射後０、３０、６０、９０、及び１２０分時点で測定した。ここでもＧＷ１９２９及びＮ９３１で処置されたマウスではインスリン感受性の改良が明白であった。ＧＷ１９２９及びＮ９３１とも、ビヒクルと比べた場合、顕著なグルコースクリアランスが０、３０及び６０分時点で観察された。Ｐ＜０．０５（図１１Ｂ）。
【００９３】
さらに、Ｎ９３１は、１０週間の処置後、ビヒクル群と比べてトリグリセリド値も著しく低下させた（Ｐ＜０．０５）。ＧＷ１９２９、Ｎ９３１及びビヒクルで処置された雄のｄｂ／ｄｂマウスの空腹時トリグリセリド値を実施例１７に示したように毎週測定した。動物には空腹時以外、Ｔ２０１８齧歯類用食餌を随意に与えた。１０週間の処置後、トリグリセリドの３４％の低下がＮ９３１で処置された動物に観察され（Ｐ＜０．０５）、参照化合物群では４３％の低下が観察された（Ｐ＜０．０５）（図１２）。
【００９４】
クロモン豊富化組成物の優れた思いがけない治療効果を実証するために、第二の独自組成物を、アロエ・フェロックスの葉滲出物から単離されたクロモンアロエシン（ＵＰ３９４）とアロエ・ベラから製造された葉ゲル粉末（Ｑｍａｔｒｉｘ、コード名ＱＭ４００）とを組み合わせることによって製造した。これら２種のアロエから製造されたこの標準化クロモン組成物は２％以上のクロモン、すなわちアロエシン（ＵＰ３９４）とＨＰＬＣによる定量で５０ｐｐｍを超えない総アントラキノン類を含有していた。クロモンアロエシン（ＵＰ３９４）は、アロエ・フェロックスの葉滲出物から抽出され、分取クロマトグラフィーカラムによって単離された後、さらに再結晶によって精製された。これについては実施例９に記載され、さらに米国特許第６，４５１，３５７号、発明の名称“アロエシンの精製法(Method of Purification of Aloesin)”にも記載されている。前記特許は引用によってその全文を本明細書に援用する。この新規な標準化クロモン組成物はＵＰ７８０とコードされ、高脂肪食を与えられたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスでの用量範囲設定試験で経口投与された。この試験でＵＰ７８０のインスリン増感活性を、医薬品のＧＷ１９２９及びオリジナルのアロエ・ベラゲル粉末（Ｑｍａｔｒｉｘ、ＱＭ４００）（実施例９でのＨＰＬＣによる定量によれば有意量のクロモンを含有していない）とも比較した。
【００９５】
実施例１９で３週間の毎日経口処置後、２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０（図１３Ｄ）及びＧＷ１９２９（図１３Ｂ）で処置された動物の場合、統計的に有意のグルコースクリアランスが腹腔内グルコース負荷後３０、６０及び９０分の時点で見られた。同様に、４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物は、３０分の時点で顕著なグルコース利用を示した。Ｐ≦０．０５（*）（図１３Ｅ）。同様に、９週間の経口処置後、４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物は、ビヒクル対照と比較した場合、ＩＰグルコース投与後３０、６０、９０及び１２０分時点でグルコース利用に統計的に有意な差を示した。Ｐ≦０．０５（*）（図１４Ｅ）。１００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０処置動物は、Ｔ３０で有意な差を示した（図１４Ｃ）。陽性対照のＧＷ１９２９は、分析された各時点で０．０５未満のＰ値を有している。一方、有意量のクロモンを含有しないオリジナルのアロエ・ベラゲル粉末（Ｑｍａｔｒｉｘ  ＱＭ４００）は、３週間の経口消費後も何の効果も示さなかった（図１３Ａ）。この実験は、クロモンを含まない組成物に比べて、クロモン豊富化組成物の思いがけない、優れたインスリン増感効果を明らかに示していた。
【００９６】
さらに、ＵＰ７８０のインスリン増感効果は、１０週間の毎日経口処置後のインスリン耐性試験でも確認された（図１５Ａ〜１５Ｅ）。耐糖能データと一致して、４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物に、考慮された全時点で統計的に有意なインスリン増感が観察された。Ｐ≦０．０５（*）（図１５Ｄ）。これに比べ、クロモンを含まないアロエ・ベラゲル粉末（Ｑｍａｔｒｉｘ  ＱＭ４００）は、１０週間の経口消費後、中程度の改良と単一時点のみの有意性しか示さなかった。
【００９７】
アロエシンを含む豊富化アロエ・ベラゲル粉末も一貫して低レベルの空腹時血糖値を維持した。空腹時血糖値は、処置の２、５、及び７週間時点で別々にモニターした。図１６に示されているように、２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０及びＧＷ１９２９で処置された動物は、非処置ビヒクルと比較した場合、二つの週（第５及び７週）に統計的に有意な低い空腹時血糖値を示した。Ｑｍａｔｒｉｘ（登録商標）及び４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置されたマウスも、第５週に同様の低レベルの空腹時血糖値を示した。他方、１００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０処置群は、モニターしたすべての週で非処置ビヒクルに対して比較的高レベルの空腹時血糖値を維持した。Ｐ≦０．０５（*）。類似のデータ分析によれば、２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０で処置された動物における空腹時血糖値の低下率は、ビヒクルと比較した場合に、第２、５、及び７週でそれぞれ１８％、２０％及び１７％であることがわかった（図１７）。
【００９８】
実施例１９のこの用量範囲設定試験において、続いて起こる低レベルの空腹時トリグリセリド値は、ＵＰ７８０及びＧＷ１９２９で処置された動物で観察された。７週間の毎日経口処置後、ビヒクルに対する空腹時トリグリセリド値の低下率は、２００、４００及び１００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０とＧＷ１９２９についてそれぞれ２２．１％、２２％、２１．７％、及び２２．７％であった（図１８）。しかしながら、有意量のクロモンを含有しないアロエ・ベラゲル粉末（Ｑｍａｔｒｉｘ  ＱＭ４００）は、２週間の処置後２％のトリグリセリド値の改良しか示さず、さらにこの効果は次の二つの測定時には消失した。クロモン豊富化植物抽出物によるトリグリセリド値低下における思いがけない優れた効果がこの実験によって明らかに示された。
【００９９】
図１９に示されているように、ビヒクルと比較した場合、すべての処置群についてコレステロール値に有意の変化は見られなかった。Ｐ≦０．０５。さらに、観察したすべての時間について、ＧＷ１９２９、Ｑｍａｔｒｉｘ、ＵＰ７８０（１００、２００及び４００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで処置されたすべてのマウスの群間で有意の体重増加又は飼料消費量の差はなかった。ビヒクル及び通常の齧歯類用食餌を含む各処置群の動物は、試験期間中を通じて体重増加を続けたが、処置群間で認められた体重増加の差はＰ≦０．０５で統計的に有意なものではなかった（図２０）。体重データに一致して、同様のパターンの飼料消費が全群で記録された（図２１）。
【０１００】
ゲノム研究は、定義によれば、全発現遺伝子を網羅するプローブセットを含有するＤＮＡマイクロアレイチップを頻繁に利用することによって行われる全ゲノム規模の研究である。哺乳動物系の場合、２５，０００個の遺伝子が機能性であり発現されていると考えられている。マイクロアレイチップをｍＲＮＡから作製されたｃＲＮＡ／ｃＤＮＡとハイブリダイズした後、マイクロアレイチップから検出される信号は、ｍＲＮＡの組織／細胞源の遺伝子発現のスペクトルを反映しているはずである。発現変動を有する遺伝子（典型的には数千）をゲノムデータベースによって解析し、生物学的経路におけるそれらの関与について調べる。
【０１０１】
我々は、実施例２０に記載のように、ＵＰ７８０に関するマイクロアレイ研究を実施した。使用したマイクロアレイチップは、４５，０００のプローブセットを含有するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のマウスゲノム４３０  ２．０であった。遺伝子発現変動のマイクロアレイデータをＡＮＯＶＡという積極的な統計的手法によって解析し、遺伝子発現変動の妥当性について調べた。発現変動を伴う鍵遺伝子は、実施例２１に記載のように、定量的逆転写ＰＣＲ（ＱＰＣＲ）によってさらに検証した。代謝及びシグナル伝達経路に影響を及ぼした遺伝子発現変動によって検出された処置の効果をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア及びデータベース（ＩＰＡ５）によって分析した。
【０１０２】
血糖値が高くなると、膵β細胞はインスリンを分泌する。このインスリンは肝臓及び筋肉中のグルコース輸送体をグルコースの取込み及びグリコーゲンとしてのグルコースの貯蔵のために細胞膜に移動させる。インスリンは、肝臓及び脂肪組織における脂肪酸及びトリグリセリドの合成並びに脂肪組織における脂肪の貯蔵も増大させる。インスリン抵抗性は、誤ったインスリン受容体シグナル伝達カスケードによって引き起こされ、グルコース輸送体の細胞膜への移動の減少、脂肪貯蔵の減少、並びに血糖及び遊離脂肪酸の増加をもたらす。高い血中遊離脂肪酸は、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）を不活化するので、インスリン抵抗性を誘導する因子である。
【０１０３】
ＵＰ７８０の効果研究に使用したＣ５７ＢＬ６前糖尿病マウスモデルがマイクロアレイのためのマウス組織源であった。マウスの組織は、ＲＮＡ抽出のために、痩せた対照、高脂肪食（ビヒクルとも呼ぶ）、及び高脂肪食＋２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０処置からそれぞれ三重に採取した。エネルギー取込み、代謝、インスリン抵抗性、肥満、及び糖尿病にとって重要な組織は、肝臓、筋肉、及び脂肪である。肝臓マイクロアレイの一つのデータセットを完成させた。一般に、高脂肪食（ＬＶ）は、痩せた対照（ＬＣ）と比べて遺伝子発現を増大したが、遺伝子発現量の多くは高脂肪食＋ＵＰ７８０（ＬＵＰ）によって減少した（図２３）。
【０１０４】
マイクロアレイ及びＱＰＣＲ研究から得られた最も重要な所見は、実施例２０及び２１に示されているように、ＵＰ７８０による脂肪酸生合成の減少であった。律速酵素のアセチル−ＣｏＡカルボキシキナーゼ（ＡＣＣ２）、及び脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳＮ）の転写産物は、高脂肪食と比較すると、ＵＰ７８０によってそれぞれ３倍及び３．５倍減少した（表１並びに図２４及び２５）。高脂肪食の場合、グルコースからの過剰のエネルギーは脂肪に変換される。すると必然的な結果として血漿中の遊離脂肪酸が増加し、これが筋肉におけるインスリン抵抗性を引き起こす。脂肪酸生合成の減少におけるＵＰ７８０の直接的な結果は、動物モデルで観察されたように、増強されたインスリン感受性及び耐糖能のはずである。
【０１０５】
さらに、ポリ不飽和脂肪酸合成の委託酵素であるステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（ＳＣＤ１）欠損マウスは、高脂肪食でも痩せたままである。ＵＰ７８０は、高脂肪食と比べてＳＣＤ１転写産物を４．４４倍減少させた。
【０１０６】
マイクロアレイ分析からは、ＵＰ７８０が、痩せた対照及び高脂肪食と比べて、ミトコンドリアの脂肪酸β酸化に関与している酵素の転写量も減少させたことがわかった（表１）。β酸化の減少は、高エネルギー摂取下でのミトコンドリア酸化の総量を正常化するだろうから、起こりうる結果としてはミトコンドリアの遊離酸素ラジカル生成の正常化である。
【０１０７】
高ステロイド濃度はフィードバックされてステロイド生合成を減少させることが知られている。これは高脂肪食及びＵＰ７８０処置、特に律速酵素ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼで観察された（表１）。ＵＰ７８０は高脂肪食と比べてＣＹＰ７Ａ１を増加させた。起こりうる有益な結果は胆汁酸生合成の増大である。
【０１０８】
解糖／糖新生経路における全体的な遺伝子発現の変動は、関与した大部分の酵素が双方向性であるため、全体的な変化はほとんどないことを示していた。肝臓の糖新生の律速酵素は、ピルビン酸代謝経路内のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）である（表１）。マイクロアレイ及びＱＰＣＲは、痩せた対照と比べるとＵＰ７８０によるＰＥＰＣＫ転写産物の増加傾向を示したが、高脂肪食とは同等であった（図２６）。これは、抗肥満抗糖尿病治療で回避されるべき血糖を増加させることになりかねない。しかしながら、筋肉がＵＰ７８０によってグルコースの取込み及び使用の増大を示すならば、正味の効果は上記の動物試験で示されるように全体的なバランスを保つことができる。
【０１０９】
肝臓では、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ５についての転写産物は、マイクロアレイ及びＱＰＣＲで観察されたように高脂肪食と比べてＵＰ７８０によって１．７４倍増加した。増加したＦＡＢＰ５は、脂肪酸の輸送を促進し、インスリン抵抗性の原因になる遊離血漿脂肪酸を減少させる。細胞膜ＬＤＬ受容体はＵＰ７８０によって減少したので、血液からのＬＤＬ取込みは減少し、肝臓のトリグリセリド含有量は減少することになる。さらに、細胞膜ＨＤＬ、酸化ＬＤＬ、及び脂肪酸取込みのためのＣＤ３６も、高脂肪食に比べてＵＰ７８０によって減少したので、肝臓の脂肪含有量はさらに減少することになる（表１）。
【０１１０】
高脂肪食は、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα肝シグナル伝達経路に関与する遺伝子の転写産物を増加したが、これはＵＰ７８０によって特にＰＰＡＲα、ＣＤ３６、及びｃ−Ｊｕｎに関して減少した。肝臓におけるＰＰＡＲα活性化は、ＨＤＬの上昇及びＬＤＬの低下によって血漿中の脂質プロフィールを正常化する。しかしながら、ＡｐｏＡ１及びＡｐｏＡ２（どちらもＨＤＬのためのリポタンパク質）の転写量は、高脂肪食又はＵＰ７８０のいずれによっても目に見える変化はなかった。ＵＰ７８０のＰＰＡＲαに対する作用は更なる注目に値する。
【０１１１】
ＵＰ７８０は、薬物の代謝及び解毒に関与する酵素、例えばＣＹＰ７Ｂ１、ＣＹＰ２Ｂ９、ＣＹＰ２Ｃ１８、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、及びＳＯＤ３の多くの転写産物を削減した。この作用も更なる研究に値する（表１）。
【０１１２】
ＡＭＰＫは、エネルギー平衡の細胞センサーとみなされている。健常細胞は常に高いＡＴＰ濃度を維持している。ＡＭＰＫは、細胞のＡＭＰ／ＡＴＰ比が増加したとき（エネルギーストレスの徴候）に活性化される（Ｈａｒｄｉｅ（２００４）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１７：５４７９）。ＡＭＰＫの活性化は、グルコース及び脂肪酸の合成を阻害し、グルコース及び脂肪の取込みを増大し、解糖及び脂肪酸β酸化を増大し、タンパク質合成及び細胞増殖を減少させる（Ｈａｒｄｉｅ（２００４）Ｒｅｖ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ５：１１９）。ＵＰ７８０は、高脂肪食によって引き起こされたＡＭＰＫ転写量の抑制を逆転した（図２８）。
【０１１３】
クロモン豊富化植物抽出物ＵＰ７８０の安全性プロフィールはＣＤ−１マウスで実施され、この組成物は良く耐容されると判定された。実施例２２に示されているように、ＵＰ７８０を２．０ｇ／ｋｇで１４日間毎日ＣＤ−１マウスに投与したが、試験期間を通じて発病又は死亡の徴候は見られなかった。マウスの身体状態及び健康について系統的検査を毎日実施したが、試験化合物関連の毒性又は異常を示唆する徴候は試験の間中見られなかった。この急性毒性試験中、すべてのマウスは試験の過程中体重増加を続けた（図２２Ａ及びＢ）。すべての主要血液生化学データは正常範囲内であったが、例外的に電解質に参照範囲からの軽微な逸脱がこの１４日間の毒性試験で観察された。ＵＰ７８０で処置された雌のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ナトリウム、カリウム及び平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）並びに雄の総タンパク質及び血中尿素窒素（ＢＵＮ）に、ビヒクル対照と比較した場合に統計的に有意の差があった。Ｐ≦０．０５（データ示さず）。ＭＣＨＣ、総タンパク質、及びＢＵＮについて観察された平均値はまだ正常参照範囲内であったが、ＡＳＴ、ナトリウム及びカリウムの平均値は正常範囲外であった。
【０１１４】
全マウスの死後の肉眼的検査は一般的にビヒクル対照もＵＰ７８０処置動物も正常であった（データ示さず）。ＵＰ７８０を１４日間投与されたマウスにおいて、顕微鏡検査用に指定されたどの組織にも試験物質関連の顕微鏡的変化は観察されなかった。検査した器官及び組織に観察された多少の雑多な顕微鏡的変化は、この年齢及び系統の実験マウスに自然発生する変化としてしばしば観察される類のものであった。観察された電解質の不均衡は、腎臓及び副腎の障害、嘔吐及び／又は下痢をもたらす何らかの疾病を含む多数の条件によって起こりうる。低ＡＳＴ値は臨床的に特に重要でない。臨床的観察、血液学的値及び組織病理学的結果に対応する証拠がないため、正常値からのこれらの逸脱は飼育及び実験室条件によるものであろうと考えている。さらに、精神的ストレスによる溶血及び脾臓収縮の結果としての細胞漏出などの発生が分析物のデータに偽性の増加又は減少をもたらすこともある。従って、血液学、血液化学及び組織病理学に関する臨床所見及び実験報告に基づくと、本研究のどのマウスにもこの用量では何らかの全身毒性の証拠は見られなかったと結論付けられた。ビヒクルも試験物質も、これらの偶発的所見の種類、発生又は重症度に何の影響も及ぼさなかった。
【０１１５】
本発明の化合物、並びに該化合物を含有する植物は、錠剤、カプセル、ソフトゲルに製剤化された栄養補助食品として、及び日常食及び／又は機能性食品、パワーバー、フルーツドリンク及び炭酸飲料又は通常飲料に入れて、ヒトを含む（ヒトだけに限らない）哺乳動物におけるインスリン抵抗性、耐糖能異常、高トリグリセリド値及びグルコース値不均衡によって媒介される疾患及び状態の予防及び治療に使用するために（体内に）送達することができる。
【０１１６】
医薬組成物にして投与するための化合物の製造は当業者に周知の各種方法によって実施できる。クロモンは、天然に存在する形態の薬草粉末として；異なる濃度の溶媒抽出物及び／又は超臨界流体抽出物として；再結晶、カラム分離、溶媒分配、沈殿及びその他の手段による豊富化及び精製化合物として；合成法によって製造された実質的に純化されたクロモンを含有する純粋物及び／又は混合物として製剤化できる。
【０１１７】
当該技術分野では様々な送達システムが知られており、本発明の治療用組成物を投与するのに使用できる。例えば、散剤、カプセル、錠剤、チンキ剤、舌下送達システム、フードバー及び各種溶液、例えば水、フルーツジュース、及び炭酸飲料、クリーム及びエマルジョンなどが経口投与用に使用される。該組成物は、水溶液、リポソーム被包、微粒子、及びマイクロカプセルとして送達することもできる。本発明の治療用組成物は注射によって非経口投与できるが、他の有効な投与形態、例えば関節内注射、吸入ミスト、経口及び局所用活性製剤、経皮イオン導入又は坐剤なども想定している。一つの好適な担体は生理食塩水であるが、その他の製薬学的に許容しうる担体も使用できると考えられる。一態様において、担体とクロモンは生理学的に適合性のある徐放性製剤を構成することを想定している。そのような担体における主溶媒は本来水性でも非水性でもよい。さらに、該担体は、ｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明性、色、滅菌性、安定性、溶解速度、又は製剤臭を変更又は維持するためのその他の薬理学的に許容しうる賦形剤を含有していてもよい。同様に、該担体は、リガンドの安定性、溶解、放出又は吸収速度を変更又は維持するためのさらにその他の薬理学的に許容しうる賦形剤を含有することもできる。そのような賦形剤は、単位用量形又は複数回投与形のいずれかの形態で非経口投与するための剤形を作製するのに通常及び習慣的に使用されるような物質である。
【０１１８】
治療用組成物が製剤化されたら、無菌バイアル中に溶液、懸濁液、クリーム、ゲル、エマルジョン、固体、又は脱水もしくは凍結乾燥粉末として貯蔵できる。そのような製剤は、すぐに使用できる形態又は投与直前に再構成（還元）を必要とする形態のいずれで貯蔵してもよい。組成物を含有する製剤を全身送達するための投与様式は、経口、皮下、筋肉内、静脈内、局所、鼻腔内又は膣用もしくは直腸用坐剤によるものとなろう。
【０１１９】
特別の障害又は状態の治療に有効な組成物の量は、障害又は状態の性質による。これは標準的な臨床技術によって決定できる。さらに、インビトロ又はインビボアッセイを所望により使用すれば最適の用量範囲を確認するのに役立つであろう。製剤に使用されるべき正確な用量は、投与経路、及び疾患又は状態の重症度又は進展にも依存するので、担当医及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から推定できる。例えば、本発明の組成物の有効量は、組成物を段階的用量で投与して所望の効果を観察することによって容易に決定される。
【０１２０】
本発明による治療法は、その必要ある哺乳動物（ヒトを含むが、ヒトだけに限定されない）に、治療上有効量の、単一源又は複数源由来の一つ又は複数のクロモンを内的又は局所投与することを含む。クロモン又はその混合物の純度は、化合物を得るのに使用された方法によるが、０．０１％〜１００％の範囲であろう。経口、注射、局所、エアゾール、坐剤、皮内投与におけるクロモン組成物の濃度は、適切な製剤において総量の０．００１〜９９．９９重量％であろう。クロモンは、経口、局所、エアゾール、坐剤、皮内、筋肉内、及び静脈内投与からなる群から選ばれる標準の投与経路によって使用でき、日用量は哺乳動物、特にヒトの体重あたり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇである。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例は説明の目的のためだけに提供されるものであり、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。
実施例１．乾燥植物からの有機及び水性抽出物の製造
乾燥植物材料を２ｍｍ以下の粒径に粉砕し、その一部の２０ｇをＡＳＥ  ３００  自動抽出器を用いて１００ｍｌのメタノール：ジクロロメタン（１：１）で３回抽出した。有機抽出物（ＯＥ）は回転蒸発及びスピード−バキューム乾燥を用いて溶媒を除去することによって得た。各植物抽出物を秤量し（約７５ｍｇ）、１．５ｍｌのＤＭＳＯ中に溶解して５０ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を製造した。
【０１２２】
実施例２．マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞系及び培養条件
マウス胎仔細胞系の３Ｔ３−Ｌ１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナッサス）は、前脂肪細胞から脂肪細胞状態に分化できる３Ｔ３スイスアルビノ系の亜株である。これらの前脂肪細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，バージニア州ハーンドン）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
【０１２３】
実施例３．アディポネクチンＥＬＩＳＡアッセイ
分化プロトコルを確立するために、３Ｔ３−Ｌ１細胞を９６ウェルプレートに蒔き、一晩培養して集密（コンフルエント）にした。集密細胞を集密後２日間分化誘導した。誘導は、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、１．０μＭのデキサメタゾン及び１．７μＭのインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）を培地中に補給して実施した。第７日目に脂肪細胞を対照化合物又は植物抽出物で２４時間処理した。すべての対照及び植物抽出物はＤＭＳＯ中に可溶化し、培地に総体積の１％で加えた。アディポネクチン量を測定するために細胞培地を回収し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により製造業者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）に従ってアッセイした。アッセイ感度は３１．２５〜２０００ｐｇ／ｍＬの範囲であった。陽性対照は０．０１〜３００μＭの範囲で試験した（図１）。アディポネクチン量の最大の倍増率は、インドメタシン及びトログリタゾンとも１μＭで観察され、アディポネクチン量がそれぞれ１．６及び１．７倍増加した。
【０１２４】
アッセイのシグナル対バックグラウンド比が不良のため（２未満）、前述のプロトコルは改良の必要があった。脂肪細胞は前述のように培養及び分化された。細胞は、分化培地中で４８時間、インスリンを加えて又は加えずに分化させた。次に、細胞を対照化合物又は植物抽出物で分化後４８時間だけ処理した。その他すべてのパラメーターは前述の通りであった。インドメタシン（図１）及びトログリタゾン（データ示さず）の対照をそれぞれ１０〜１００μＭ及び３〜３０μＭで試験した。アディポネクチン量の最大増加はベースラインのシグナルの５２倍で、これは１００μＭのインドメタシン処理で達成された。一方、最低の増加は１０μＭのインドメタシンでの７倍であった（図１Ｂ）。トログリタゾン処理によるアディポネクチンの最大増加は３０μＭで達成されて４９倍の増加、一方アディポネクチン量の最低の倍増率は３μＭで観察されて２４倍であった（データ示さず）。これらの化合物はどちらも、公表されているデータより実質的に高いアディポネクチン量の増加を示した。
【０１２５】
実施例４．脂肪細胞におけるアディポネクチン産生増強のための植物抽出物のスクリーニング
植物抽出物のライブラリーを実施例３に記載のアディポネクチンＥＬＩＳＡアッセイを用いてスクリーニングした。実施例１に記載のようにして単離された有機抽出物を、対照としてインドメタシン及びトログリタゾンを用いて三重にスクリーニングした。２０５９の粗抽出物から、その１４．９％（１３９抽出物）が対照レベルより高いアディポネクチン産生を誘導した。これらの陽性抽出物のうち、３７抽出物（全体の１．８％）はトログリタゾン対照の最低濃度（３μＭ）より活性であった。これらの３７の粗抽出物を系列希釈（連続希釈）を用いて再試験した。アロエ・フェロックスの葉の滲出物からの有機抽出物Ｐ００１７−ＯＥがアディポネクチン誘導の良好な用量反応曲線を示したので（図２）、これを選択して更に評価した。
【０１２６】
実施例５．アロエ・フェロックスからの活性有機抽出物のハイスループット精製（ＨＴＰ）
Ｐ００１７−ＯＥをバイオアッセイ誘導(bioassay-guided)活性化合物分画のために選んだ。Ｐ００１７−ＯＥ（４００ｍｇ）をプレパック順相フラッシュカラム（内径２ｃｍ×８．２ｃｍ、シリカゲル１０ｇ）に装填した。該カラムを、Ｈｉｔａｃｈｉハイスループット精製（ＨＴＰ）システムを用い、（Ａ）５０：５０のＥｔＯＡｃ：ヘキサン及び（Ｂ）メタノールの勾配移動相（３０分で１００％のＡから１００％のＢへ）により流速５ｍＬ／分で溶離した。分離は広帯域波長ＵＶ検出器でモニターし、フラクションは、Ｇｉｌｓｏｎフラクションコレクターを用い、９６深型ウェルプレートに１．９ｍＬ／ウェルで採集した。類似のＵＶ吸収及びリテンションタイムを有するフラクションを統合して８つのサブフラクションにし、低真空及び遠心下で乾燥させ、Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７及びＦ８と名付けた（図３）。ＤＭＳＯを用いて各サブフラクションを溶解し（５０μｇ／μｌ）、一部分（２μｌ）を取ってアディポネクチンアッセイに供した。Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３が８つのサブフラクションの中で最も活性なフラクションである。
【０１２７】
実施例６．Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−サブフラクションのＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡによるデレプリケーション
Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３はアディポネクチンアッセイで最も活性なサブフラクションであることが分かったので、ＬＣ−ＭＳ／ＰＤＡを利用して、ＨＴＰ分画から得られた各Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−サブフラクションを分析し、Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３における独自化合物のピークを見つけるために相互に比較した。Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３中、分子量３９４（アロエシン）及び３９６（アロエシノール）を有する最も可能性ある活性化合物が、分子量及び文献調査に基づいて仮定された。
【０１２８】
実施例７．アロエ・フェロックスからのアロエシン及びアロエシノールの抽出及び精製
アロエ・フェロックスの葉の滲出物（Ｐ００１７）（２００ｇ）をメタノールで抽出した（３回）。合わせたメタノール溶液を低真空下で蒸発させ、メタノール抽出物を得た。Ｐ００１７からのメタノール抽出物（５ｇ）を実施例６のＰ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３で記載した方法を用いて分画した。活性フラクション（実施例６のＰ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３フラクションに相当）（１５０ｍｇ）をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ  Ｃ18カラム（２５０×３０ｍｍ  １０μ）に装填し、Ｈｉｔａｃｈｉハイスループット精製（ＨＴＰ）システムで、（Ａ）水及び（Ｂ）メタノールの勾配移動相（４０分で９０％のＡから１００％のＢへ）により流速５ｍＬ／分で溶離し、次いで１００％メタノールで１０分間洗浄した。分離は広帯域波長ＵＶ検出器でモニターし、フラクションは、Ｇｉｌｓｏｎフラクションコレクターを用い、試験管に採集した。４回のＣ18カラム操作から１０の主要化合物ピークを手で集めた。１０のフラクションを乾燥させ、再結晶によって精製して、Ｐ００１７−ＡＣ１、Ｐ００１７−ＡＣ２、Ｐ００１７−ＡＣ３、Ｐ００１７−ＡＣ４、Ｐ００１７−ＡＣ５、Ｐ００１７−ＡＣ６、Ｐ００１７−ＡＣ７、Ｐ００１７−ＡＣ８、Ｐ００１７−ＡＣ９及びＰ００１７−ＡＣ１０と名付けた（図４）。Ｐ００１７−ＡＣ１及びＰ００１７−ＡＣ２がアディポネクチンアッセイで活性を示し、それぞれアロエシン及びアロエシノールと同定された。残りの８化合物は非活性又は低活性である。
【０１２９】
実施例８．アロエシン及びアロエシノールの詳細な同定
アロエシン（ＵＰ３９４）：収率、Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３から２．４％（純度＞９８％、ＨＰＬＣ）；ＵＶ（最大）：２４８．４、及び２９５．９ｎｍ；ＭＳ（ＥＳＩ、陰イオン検出）：ｍ／ｚ  ３９３（Ｍ−１、１００％）。サンプルにアロエシン標準を加えた(spike)ところ、ＨＰＬＣクロマトグラムで同じリテンションタイムを示した（図５）。
【０１３０】
アロエシノール（ＵＰ３９６）：収率、Ｐ００１７−ＯＥ−ＮＰ−Ｆ３から１．４％（純度＞９７％、ＨＰＬＣ）；ＵＶ（最大）：２４８．４、及び２９５．９ｎｍ；ＭＳ（ＥＳＩ、陰イオン検出）：ｍ／ｚ  ３９５（Ｍ−１、１００％）。サンプルにアロエシノール標準を加えたところ、ＨＰＬＣクロマトグラムで同じリテンションタイムを示した（図６）。
【０１３１】
実施例９．アロエ・フェロックスの抽出物からのアロエシンの製造と定量化
アロエシン（ＵＰ３９４）は、アロエ・フェロックスの全葉抽出物から抽出され、分取クロマトグラフィーカラムによって単離された後、さらに再結晶によって精製された。これについては米国特許第６，４５１，３５７号、発明の名称“アロエシンの精製法(Method of Purification of Aloesin)”に記載されており、前記特許は引用によってその全文を本明細書に援用する。手短に言うと、乾燥抽出物をアロエ・フェロックスの全葉（予め熱水中に溶解し、ろ過して不溶性粒子を除去してある）から得た。次に、該抽出物をＣＧ−１６１樹脂が充填されている逆相カラムに装填し、カラムをＤＩ水で洗浄後、アロエシン（ＵＰ３９４）を２０〜３０％メタノールでカラムから溶離した。２０〜３０％メタノール溶離液を合わせて蒸発させた。固体をアルコール／水溶媒中で純度＞９０％に達するまで再結晶させた。下記のＨＰＬＣ法によればアントラキノンによる汚染もなかった（アロインＡ及びＢの含有量１００ｐｐｍ以下）。
【０１３２】
アロエシン（ＵＰ３９４）、アロエシノール（ＵＰ３９６）、及びアロエレシンＡといったクロモンを、公表されたＨＰＬＣ法（Ｚａｈｎ（２００７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．１０：１００２−１０２４）を用いてアントラキノン汚染物質（すなわちアロインＡ＆Ｂ）に対して定量化した。この解析的分析は、Ｌ−７１００ポンプ、Ｌ−７２００自動サンプラー及びＬ７３００カラムオーブンを備えたＨｉｔａｃｈｉ  Ｌ−７０００ＨＰＬＣシステムで実施した。この方法ではＣ１８ガードカートリッジを接続したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＩＢ  ＳＩＬ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ  粒径５μ）を用いた。移動相は水／メタノールの勾配からなり、最初の５分間は６６％：３４％の比率でスタートした。比率は１５分で水２４％：メタノール７６％（体積％）に変化させ、その後この比率をさらに２分間維持した。カラムは、次のサンプル注入の前に、水６６％及びメタノール３４％で５分間平衡化された。流速は１．０ｍｌ／分であった。クロモン及びアントラキノン類はＬ−７４００ＵＶ検出器を用い、波長２９７ｎｍで検出された。クロモンとアントラキノン類はＨＰＬＣのリテンションタイムに基づいて同定され、個別のクロモン及びアントラキノンスタンダードに対するピーク面積に基づいて定量化された。
【０１３３】
アロエ・フェロックスの粗抽出物中のアロエシン（ＵＰ３９４）含有量は２４．８重量％、アントラキノン類は２２％と報告された（Ｚａｈｎ，（２００７）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．１０：１００２−１０２４）。それとは別のアロエ・バルバデンシスの葉におけるアロエシン含有量は０．３２ｍｇ／ｇ（すなわち０．０３２％）で、総クロモン０．１０３７％と報告されている。これに対し、アントラキノン含有量（アロインＡ＆Ｂ）はアロエシン含有量よりほぼ４倍高い（１．１４ｍｇ／ｇ又は０．１１４％）（Ｐａｒｋ（１９９８）Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌ．９：１８６−１９１）。
【０１３４】
脱色法及びその他の製造法を用いると、アロエシン及びアントラキノン類は、アロエ・ベラ全葉スプレー乾燥ゲル粉末（Ｌｏｔ＃ＲＭ０４０８０５−０２＆ＲＭ０４０８０５−０５）及びアロエ・ベラゲル粉末（Ｑｍａｔｒｉｘ脱水）（Ｌｏｔ＃ＲＭ１２０８０６−０１）から完全に除去される（ＨＰＬＣ分析によればどちらも５０ｐｐｍ未満であった）。アロエ・フェロックスの葉抽出物から単離及び精製されたアロエシン（ＵＰ３９４）（Ｌｏｔ＃Ａ−２７０５＆Ｌｏｔ＃Ｉ１５０６ＡＷ）は、それぞれ９３％及び１００．６％の純度を有し、総アントラキノンは５０ｐｐｍ未満であった。以下の実施例に記載のように、アントラキノン除去（総アントラキノン類（アロインＡ及びＢ）  ＜５０ｐｐｍ）アロエシン（ＵＰ３９４）を用いてクロモン豊富化組成物（Ｎ９３１及びＵＰ７８０）を製造した。
【０１３５】
実施例１０．アロエシン（ＵＰ３９４）及びアロエシノール（ＵＰ３９６）によるアディポネクチン産生の増強
二つの純粋なクロモン、ＵＰ３９４（アロエシン）及びＵＰ３９６（アロエシノール）を、実施例３に記載のように３０μＭで脂肪細胞のアディポネクチン産生の増加について試験した。アロエシン及びアロエシノールは、脂肪細胞によるアディポネクチン産生にそれぞれ２及び３．２倍の増加を示した（図７）。
【０１３６】
実施例１１．Ｎ９３１（Ｌｏｔ＃Ｄ１２０５−０１）の詳細な製造法
この独自の組成物（Ｎ９３１）は、アロエ・フェロックスの葉の滲出物から単離された純粋なクロモンアロエシン（ＵＰ３９４）と、アロエ・ベラから製造された全葉ゲル粉末とを組み合わせることによって製造された。この２種のアロエ由来の標準化クロモン組成物は、１．４％以上のクロモン、すなわちアロエシン（ＵＰ３９４）を含有していた。アロエシン（ＵＰ３９４）は、アロエ・フェロックスの全葉滲出物から抽出され、分取クロマトグラフィーカラムによって単離された後、さらに再結晶によって精製された。これについては実施例９に示された通りであり、さらに米国特許第６，４５１，３５７号、発明の名称“アロエシンの精製法(Method of Purification of Aloesin)”に記載の通りである。前記特許は引用によってその全文を本明細書に援用する。この独自の標準化クロモン組成物をＮ９３１とした。
【０１３７】
次に、０．８１１ｋｇのアロエシン（Ｌｏｔ＃Ａ−２７０５、純度９３％、水分５％）を５０ｋｇのアロエ・ベラ全葉スプレー乾燥ゲル粉末（Ａｌｏｅｃｏｒｐ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ：５０２０，Ｌｏｔ＃ＲＭ−０４０８０５−０２及びＲＭ−０４０８０５−０５）に加え、混合物をＶ−ブレンダーでブレンドした。インテンシファイアーバー(intensifier bar)を始動し、インテンシファイアーバーとシェルの両方を５分以上７分以下のブレンド時間運転した。インテンシファイアーバーだけを切り、ブレンドを５分以上１０分以下続けた。再度インテンシファイアーバーをオンにし、５分以上７分以下ブレンドした。ブレンドを停止し、ブレンドされた材料を集めて、ＵＰ７８０中のアロエシン含有量をＨＰＬＣ法により定量化した。実施例９に示されたＨＰＬＣ法による定量化でアロエシン含有量は１．５％、総アントラキノン含有量は５０ｐｐｍ未満であった。
【０１３８】
実施例１２．高脂肪食誘導前糖尿病モデル
クロモン抽出物の治療効果の可能性を評価するために高脂肪食誘導動物モデルを開発し使用した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊは、代謝異常、耐糖能障害の病態生理学及び新規治療薬の開発に関する研究に使用できる臨床的に関連する動物モデルである（Ａｈｒｅｎら（２００４）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３）：Ｓ２１５−Ｓ２１９；Ｌａａｋｓｏら（２００４）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２７：２２５３−２２５９；Ｋａｈｎら（２００４）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：３２７４−３２８５；Ｓｃｈｅｕｒｉｎｋら（１９９８）Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  Ｅｎｄｏ．１３９：４６１−４６７；Ｙｕａｎら（２００２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５１：１８５１−１８５８；Ｒｅｉｔｍａｎら（２００５）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４５：３２５８−３２６４；Ｖｌａｓｓａｒａら（２００５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：２３１４−２３１９；Ｃａｗｔｈｏｒｎｅら（２００２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １：５０９−５１６）。モデル誘導の方法論は最初にＳｕｒｗｉｔらが１９８８年に報告した（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ３７：１１６３−１１６７）。手短に言うと、耐糖能障害及び代謝異常様の症状は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高脂肪食を８週間与えるとうまく負わせることができた。雄のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メーン州バーハーバー）から６週齢で購入した。１週間の馴化期間後、動物をグループ分けし（ｎ＝５又は６）、高脂肪（４５％ｋｃａｌ）の齧歯類用ペレット（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ニューブランズウィック）及び水を随意に１２週間与えた。ただしグルコース耐性試験及びインスリン耐性試験の時は別で、このときは３時間絶食させた。動物は温度管理室（２２．２℃）にて１２時間の明暗サイクルで飼育された。血中のグルコース、コレステロール、及びトリグリセリドを前述のように１２週間毎週モニターした。体重測定も１２週間の間、週１回行った。
【０１３９】
選択されたパラメーター（グルコース、トリグリセリド及びコレステロール）を毎週モニターすることによって代謝異常の誘導が確認されたら、すなわち第８週目であったが、毎日の腹腔内処置を開始し、４週間継続した。試験の各日ごとに試験化合物及び陽性対照ＧＷ１９２９（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ミズーリ州エリスヴィル，バッチ＃２Ａ／５８７０５）を０．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス，Ｌｏｔ＃１１６Ｈ０８５７）に溶解し、それぞれ腹腔内用量１００及び５ｍｇ／ｋｇで送達した。ＧＷ１９２９はメチルセルロースに完全に溶解しなかったので、最初にＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス，バッチ＃０６４Ｋ００６７）中に溶解した。そこでビヒクルも含めた各化合物の最終濃度を５％ＤＭＳＯを含有するように調整した後、薬物投与した。ビヒクル処置動物は０．５％メチルセルロースのみを投与された。各化合物又はビヒクル投与後、検出できるほどの刺激の徴候は観察されなかった。
【０１４０】
使用された陽性対照のＧＷ１９２９、すなわちＮ−（２−ベンゾイルフェニル）−Ｏ−［２−（メチル−２−ピリジニルアミノ）エチル］−Ｌ−チロシンは、バッチ分子量５０４．５９の黄色固体粉末である（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ミズーリ州エリスヴィル，バッチ＃２Ａ／５８７０５）。該化合物は選択的な経口活性ＰＰＡＲγアゴニストである。経口投与すると、糖尿病動物モデルのグルコース、脂肪酸及びトリグリセリド値を低下させる（Ｂｒｏｗｎら（１９９９）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８：１４１５；Ｗａｙら（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５６５１−２５６５３）。動物には高脂肪食を１２週間与えた。処置は第８週目に開始され、４週間続いた。
【０１４１】
実施例１３．インスリン抵抗性に及ぼすＵＰ３９４及びＵＰ３９６の効果
腹腔内グルコース耐性試験は、実施例１２に記載のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用い、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ３９４（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ３９６（１００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルの腹腔内投与による処置の１８日目に２ｇ／ｋｇの用量で実施した。動物を３時間絶食させた後、グルコースを投与した。血糖値は、０、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。データは平均±ＳＤ、ｎ＝６である。ＧＷ１９２９及びＵＰ３９６では、ビヒクルと比較すると顕著なグルコース利用が６０、９０及び１２０分時点で観察された。Ｐ＜０．０５。ＧＷ１９２９、ＵＰ３９４及びＵＰ３９６のＰ値は、ビヒクルと比較した場合、それぞれＴ０で０．００、０．８７及び０．４３；Ｔ３０で０．０７、０．１６及び０．２３であった。ＵＰ３９４のＰ値は、ビヒクルと比較した場合、Ｔ６０で０．１５；Ｔ９０で０．１０及びＴ１２０で０．１７であった（図８Ａ）。
【０１４２】
ＵＰ３９４及びＵＰ３９６ともインスリン耐性試験でインスリン増感に対する効果を示した。腹腔内インスリン耐性試験は、実施例１３に示したように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを用い、ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ３９４（１００ｍｇ／ｋｇ）、ＵＰ３９６（１００ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルの経口投与による処置の２４日目に０．５単位／ｋｇの用量で実施した。動物を３時間絶食させた後、インスリンを注射した。血糖値は、０、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。データは平均±ＳＤ、ｎ＝６である。ＧＷ１９２９のみならずＵＰ３９４及びＵＰ３９６の場合も、ビヒクルと比較すると顕著なグルコースクリアランスがＴ３０、Ｔ６０及びＴ９０の時点で観察された。Ｐ＜０．０５。ＧＷ１９２９、ＵＰ３９４及びＵＰ３９６のＰ値は、ビヒクルと比較した場合、それぞれＴ０で０．００、０．１４及び０．６７；Ｔ１２０で０．０８、０．００及び０．０４であった（図８Ｂ）。
【０１４３】
実施例１４．高脂肪食誘導インスリン抵抗性モデルにおけるインスリン感受性に及ぼすＵＰ３９４及びＵＰ３９６の効果
経口投与のＵＰ３９４（１００ｍｇ／ｋｇ）及びＵＰ３９６（１００ｍｇ／ｋｇ）のインスリン抵抗性に及ぼす効果を、化合物ＵＰ３９４及びＵＰ３９６で処置された動物でさらに示した。これらの動物におけるインスリン濃度は著しく低下した。血漿中インスリン濃度はインスリン用ＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ−イリノイ州シカゴ）で測定した。動物は、８週間の高脂肪食後、ＧＷ１９２９、ＵＰ３９４及びＵＰ３９６、そしてビヒクルで２週間処置された（図９）。血液は尾静脈から採取し、遠沈して血漿を得た。血漿中インスリン濃度の顕著な低下は、ビヒクル群と比較した場合、ＧＷ１９２９、ＵＰ３９４及びＵＰ３９６の処置群で１４日目に観察された。Ｐ＜０．０５。
【０１４４】
実施例１５．ｄｂ／ｄｂマウスにおける空腹時血糖値に及ぼすＮ９３１の効果
ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｎ９３１（３７５ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで処置された雄のｄｂ／ｄｂマウス（各群８匹）の空腹時血糖値を毎週測定した。動物には絶食時以外、Ｔ２０１８齧歯類用食餌を随意に与えた。測定は動物を一晩絶食させた後に行われた。図１０に示されているように、ビヒクル処置マウスの血糖値は１０週間の処置中、時間経過と共に増加した。参照化合物のＧＷ１９２９は、予想通り血糖値をベースライン濃度に維持できた。ＧＷ１９２９と同様、Ｎ９３１も処置第５週から血糖値を実質的に低下させた。空腹時血糖値は、ビヒクルと比べた場合、Ｎ９３１では、第６、７、９及び１０週で著しく低かった。Ｐ＜０．０５。処置第１０週の時点で、Ｎ９３１で処置された群では血糖値の４６％の低下が観察された。
【０１４５】
実施例１６．ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるインスリン抵抗性に及ぼすＮ９３１の効果
ｄｂ／ｄｂマウスで１０週間の処置後、経口グルコース耐性試験を３ｇ／ｋｇの用量で実施した。動物には絶食時以外、Ｔ２０１８齧歯類用食餌を随意に与えた。動物を一晩絶食させた後、グルコースを負荷した。マウス（各群８匹）をＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｎ９３１（３７５ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで１０週間処置した。血糖値は、グルコース負荷後０、３０、６０、９０、及び１２０分時点で測定した。ＧＷ１９２９又はＮ９３１のいずれかで処置されたマウスには、ビヒクルと比べた場合、循環からの顕著なグルコースクリアランスが０及び１２０分時点で観察された。Ｐ＜０．０５（図１１Ａ）。この結果は、Ｎ９３１が耐糖能を増大させる能力を有し、従ってｄｂ／ｄｂマウスのインスリン感受性を改良することを示している。
【０１４６】
ｄｂ／ｄｂマウスで６週間の処置後、腹腔内インスリン耐性試験を０．５単位／ｋｇの用量で実施した。動物を一晩絶食させた後、インスリンを注射した。ｄｂ／ｄｂマウス（各群８匹）をＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｎ９３１（３７５ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで６週間処置した。血糖値は、インスリン注射後０、３０、６０、９０、及び１２０分時点で測定した。ここでもＧＷ１９２９及びＮ９３１で処置されたマウスではインスリン感受性の改良が明白であった。ＧＷ１９２９及びＮ９３１とも、ビヒクルと比べた場合、顕著なグルコースクリアランスが０、３０及び６０分時点で観察された。Ｐ＜０．０５（図１１Ｂ）。
【０１４７】
実施例１７．ｄｂ／ｄｂマウスモデルにおけるトリグリセリド値に及ぼすＮ９３１の効果
ＧＷ１９２９（５ｍｇ／ｋｇ）、Ｎ９３１（３７５ｍｇ／ｋｇ）及びビヒクルで処置された雄のｄｂ／ｄｂマウスの毎週の空腹時トリグリセリド値を１０週間取った。動物には絶食時以外、Ｔ２０１８齧歯類用食餌を随意に与えた。測定は動物を一晩絶食させた後に行った。示されている値は、ビヒクルに対する％トリグリセリド値である。ｎ＝８。１０週間の処置後、ビヒクルと比較した場合、ＧＷ１９２９及びＮ９３１で処置された動物にトリグリセリド値の顕著な低下が見られた。Ｐ＜０．０５（図１２）。
【０１４８】
実施例１８．クロモン豊富化組成物（ＵＰ７８０）の製造及び投与
この独自組成物（ＵＰ７８０）は、アロエ・フェロックスの葉の滲出物から単離された純クロモンアロエシン（ＵＰ３９４）とアロエ・ベラから製造された葉ゲル粉末とを組み合わせることによって製造された。この２種のアロエから製造された標準化クロモン組成物は２％以上のクロモン、すなわちアロエシン（ＵＰ３９４）を含有し、総アントラキノン類は５０ｐｐｍ未満であった。クロモンのアロエシン（ＵＰ３９４）は、アロエ・フェロックスの全葉滲出物から抽出され、分取クロマトグラフィーカラムによって単離された後、さらに再結晶によって精製された。これについては実施例９に示され、米国特許第６，４５１，３５７号、発明の名称“アロエシンの精製法(Method of Purification of Aloesin)”にも記載されている通りである。前記特許は引用によってその全文を本明細書に援用する。この独自の標準化クロモン組成物をＵＰ７８０とした。
【０１４９】
アロエクロモン豊富化アロエ・ベラゲル粉末、すなわちＵＰ７８０の５ｋｇバッチの製造法を以下に記載する。これは、アロエ・ベラゲル粉末中に２％以上のアロエシンを含む標準化アロエゲル組成物である。アロエ・フェロックスの全葉滲出物から精製され、純度１００．６％を有する０．１１ｇのアロエシン（Ｌｏｔ＃Ｉ１５０６ＡＷ）を、４．９０ｋｇのアロエ・ベラゲル（Ｑｍａｔｒｉｘ  脱水）粉末（Ａｌｏｅｃｏｒｐ  Ｐａｒｔ  Ｎｏ：ＡＡ８０１０ＸＱ８０  Ｌｏｔ＃ＲＭ−１２０８０６−０１）に加えた。この混合物をブレンドしてアロエクロモン標準化組成物ＵＰ７８０（Ｌｏｔ＃Ｌ１８０６ＱＭＡＷ−０１）を得た。組成物（ＵＰ７８０）中のアロエシン（ＵＰ３９４）の含有量は、ＨＰＬＣによって２．２％であることが確認され、アントラキノン汚染もなかった。
【０１５０】
８週間の高脂肪食後、選択されたパラメーターのモニターによって動物に疾患の誘導が確認されたら、毎日の経口処置を開始した。各日ごとに試験物質及び陽性対照ＧＷ１９２９（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ミズーリ州エリスヴィル，バッチ＃２Ａ／５８７０５）を０．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス，Ｌｏｔ＃１１６Ｈ０８５７）に溶解し、経口用量１００、２００及び４００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０（Ｌｏｔ＃Ｌ１８０６ＱＭＡＷ−０１）；４００ｍｇ／ｋｇのＱｍａｔｒｉｘ（登録商標）アロエ・ベラゲル粉末（ＱＭ４００、Ｌｏｔ＃Ｇ６３１９１０３−Ｌ３）並びに５ｍｇ／ｋｇのＧＷ１９２９を投与した。ＧＷ１９２９はメチルセルロースに完全に溶解しなかったので、最初にＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州セントルイス，バッチ＃０６４Ｋ００６７）中に溶解した。そこでビヒクルも含めた試験化合物の最終濃度を５％ＤＭＳＯを含有するように調整した後、薬物投与した。担体ビヒクル処置動物は０．５％メチルセルロースのみを投与された。各薬物又はビヒクル投与後、検出できるほどの刺激の徴候は観察されなかった。
【０１５１】
実施例１９．高脂肪食誘導Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対するＵＰ７８０の効果と用量範囲試験
実施例１２に記載のように、雄のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（メーン州バーハーバー）から６週齢で購入した。１週間の馴化期間後、動物を６群に分け（ｎ＝７）、高脂肪（４５％ｋｃａｌ）の齧歯類用ペレット（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．，ニュージャージー州ニューブランズウィック）及び水を随意に与えた。ただしグルコース耐性試験及びインスリン耐性試験の時は別で、このときは３時間絶食させた。動物は温度管理室（２２．２℃）にて１２時間の明暗サイクルで飼育された。
【０１５２】
３又は４匹の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、飼料及び水のための区画を有するマウスケージで飼育された。餌の摂取量は、事前に秤量した高脂肪ペレットの値と所定の日に残されたものの値との差を測定することによって毎日測定した。体重測定は試験期間中週１回行った。
【０１５３】
空腹時血糖値、総コレステロール値及びトリグリセリド値を、尾静脈から得た１５〜２０μｌの血液を用いて測定した。血糖値については評判の高い試験紙付きＩＱ（Ｗａｌｇｒｅｅｎ，Ｈｏｍｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，フロリダ州フォートローダーデール）血糖値モニタリングシステム、及びコレステロールとトリグリセリドについてはＰＴＳパネルズ試験紙付きＣａｒｄｉｏＣｈｅｋ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ，インジアナ州インジアナポリス）を用いてコレステロール及びトリグリセリドの全血値を測定した。
【０１５４】
腹腔内グルコース耐性試験は、処置開始後第０日（ベースライン）、第３及び９週に実施した。試験日には動物を３時間絶食させ、２ｍｇ／ｇの用量のグルコースを腹腔内投与した。血糖値をグルコース投与後０（グルコース注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。腹腔内インスリン耐性試験は第１０週に実施した。動物を３時間絶食させ、０．５ＩＵ／ｋｇの用量のインスリン（酵母に発現させたヒト組換え、Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス、Ｌｏｔ＃０５５Ｋ１３２１）を腹腔内投与した。血糖値をインスリン投与後０（インスリン注射前）、３０、６０、９０、及び１２０分の時点で測定した。血液は尾静脈から得た。
【０１５５】
実施例２０．ＤＮＡマイクロアレイ材料及び方法
マウスを７つの処置群に分け、各群あたり３匹の動物を組織採取用に選んだ。１０週間の処置後、マウスをＣＯ2ガスで麻酔し、安楽死の５分以内に肝臓、体壁筋、及び脂肪を採取した。組織は５ｍｍ未満の塊に切断し、組織採取中はＲＮＡＬａｔｅｒ溶液（Ａｍｂｉｏｎ）に浸けて保存し、その後長期保存のために−８０℃の冷蔵庫に移した。ＲＮＡ単離のため、マウス組織を解凍し、ＲＮＡＬａｔｅｒ保存溶液から取り出した。ＲＮＥａｓｙ全ＲＮＡ単離キットを肝臓の全ＲＮＡ抽出用に、ＲＮＥａｓｙ線維組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を筋肉の全ＲＮＡ抽出用に使用した。組織は、ガラス製Ｄｕｎｃｅホモジネーターを用い、ＲＮＥａｓｙキットに付いているグアニジンチオシアネート及びβ−メルカプトエタノール含有ＲＬＴ溶液中でホモジナイズした。抽出されたＲＮＡは２６０／２８０ｎｍの波長におけるＵＶ吸収によって定量した。ＲＮＡの品質は、変性グリオキサールアガロースゲル（１％）電気泳動を用いて２８Ｓ及び１８Ｓ ｒＲＮＡバンドの完全性と、ゲノムＤＮＡの不在について判定した。ゲノムＤＮＡがゲルから観察された場合、その特定のＲＮＡサンプルについてＲＮＥａｓｙキットを用いて第二回目の抽出を実施した。
【０１５６】
ＤＮＡマイクロアレイ研究用として、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のマウスゲノム４３０  ２．０アレイを選んだ。各アレイには、３４，０００個のマウス遺伝子の４５，０００のプローブセット及びハイブリダイゼーション用コントロール配列、ポリ−Ａ、１００のノーマライゼーション用プローブセット、及びハウスキーピング遺伝子が含まれている。ｃＲＮＡ合成、ハイブリダイゼーション／洗浄、スキャニング、及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧＣＯＳソフトウェアを用いたデータ解析の工程を実行するために、１２のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社公認サービスプロバイダのリストからＣｏＧｅｎｉｃｓ社を選んだ。ＣｏＧｅｎｉｃｓは、ＲＮＡサンプルを受け取るとすぐに、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計及びＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザーを用いて、彼ら独自の内部的ＲＮＡ品質管理を実施した。マイクロアレイ処理中、ＣｏＧｅｎｉｃｓはｃＲＮＡ及びマイクロアレイデータセットの品質管理も実施した。マウス肝臓の場合、痩せた対照（ＬＣ）、高脂肪食（ＬＶ）、及び高脂肪食＋２００ｍｇ／ｋｇのＵＰ７８０（ＬＵＰ）の処置群をマイクロアレイ実験用に選んだ。合計９アレイ。すべてのＲＮＡ、ｃＲＮＡ、及び最終マイクロアレイデータセットとも品質管理にパスした。
【０１５７】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のマウスゲノム４３０  ２．０アレイは、標準のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイデザインに従っている。すなわち、プローブセットあたり１１のプローブ対で、各プローブ対は、一つのパーフェクトマッチ（ＰＭ）と一つのミスマッチ（ＭＭ）の２５マー(25-mer)オリゴヌクレオチドを含有する。ＧＣＯＳによるデータ解析は、バックグラウンド減算をしたＰＭ及びＭＭの強度の両方を使用した。各プローブセットについて、全１１のＰＭ値及び１１のＭＭ値を一つの強度値にまとめた。次に、アレイのデータセットを、アレイ対アレイの比較のために、平均強度値及びターゲット強度値に基づいて全体的にスケーリングした。独立したマイクロアレイデータ分析もＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのソフトウェア“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ”を用いて実施した。強度サマライズ(intensity summarization)のためにＧＣＯＳで使用されたＭＡＳ５アルゴリズムのほか、ＲＭＡ及びＰＬＩＥＲのアルゴリズムも強度サマライズのためにＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅで使用された。
【０１５８】
ＭＭプローブの有用性は議論の主題となっている。そこで、我々は、バックグラウンド補正されたＰＭ値だけを用いて追加のマイクロアレイデータ分析もＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒソフトウェアで実施した。アレイは各処置群に３つずつあった。ＭＡプロットは処置群内のアレイの一貫性を診断するために使用した。不一致については、Ｒプログラミング言語によるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒマイクロアレイパッケージのｌｏｅｓｓ関数を用いて正規化した。処置群の各プローブセットについて、３３個のＰＭ値を一つの強度値に統合し、ｌｏｇ2変換した。さらに、処置群間で統計的検定ＡＮＯＶＡを各プローブセットについて３３対３３個のＰＭ値を用いて実施した。合計で３×４５，０００のＡＮＯＶＡ検定をＬＵＰ対ＬＶ、ＬＵＰ対ＬＣ、及びＬＶ対ＬＣの処置群間で実施した。遺伝子発現変動の有意性は、有意水準α＝０．０５で、ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅ（ＦＤＲ）及びＨｏｌｍ’ｓ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｃｏｒｒｅｃｉｔｏｎの方法によって検定した。
【０１５９】
マイクロアレイデータセットは、典型的には発現変動を有する数千の範囲の遺伝子があり、生物学的意義を理解するために経路解析ソフトウェアからの助けが必要である。ＰＭ値からサマライズされた３つずつのＬＣ、ＬＶ、及びＬＵＰアレイのマウス肝臓データセットを、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＩＰＡ５）及び関連するゲノムデータベースを用いて分析した。三つのカットオフ基準、ＡＮＯＶＡ  ｐ≦０．０００１、ｌｏｇ２強度≧２．５、及びｌｏｇ２比率≧０．９を適用した。ＩＰＡ５によって、４０の既知経路(canonical pathway)及び７０の機能が得られた。それぞれ三つのデータセットの少なくとも一つは閾値のｐ値０．０５を通過した。（既知経路は、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＳＴＫＥ及びＫＥＧＧのような馴染み深いシグナル伝達経路及び代謝経路データベースから取ってある。機能はＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）データベースに基づく。）よく確立された既知経路、特に栄養素代謝に対してＵＰ７８０の明白な影響を示した上位の代謝経路は詳細に分析された。ＩＰＡ５から得られた経路分析データは表１に示してある。
【０１６０】
実施例２１．ＵＰ７８０によって調節された遺伝子発現のＱＰＣＲ分析
マウス組織から抽出された全ＲＮＡは通常、マイクロアレイ実験に必要とされるものより過剰であった。そこで、マイクロアレイに使用された同じ全ＲＮＡサンプルを、ＱＰＣＲによるマイクロアレイ結果の検証（通常数ヶ月後に実施される）のために取っておいた。全ＲＮＡは日常的に−８０℃の冷蔵庫で保管され、長期保管後も劣化は全く観察されなかった。全ＲＮＡからのｃＤＮＡ合成の逆転写反応のために、我々は改変逆転写酵素、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  IIIを、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  III用の試薬として供給されている緩衝液、ヌクレオチド、オリゴ（ｄＴ）7プライマー、及びＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡｓｅＩと共に使用した。各反応について、５μｇの全ＲＮＡを５０μｌの反応体積中で使用した。ファーストストランドｃＤＮＡを水で２．５倍の体積に希釈し、５０μｌのＱＰＣＲ反応あたり２μｌのｃＤＮＡを使用した。各遺伝子のためのＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＡｓｓａｙのＡＢＩプライマーとプローブセットは、使用前にＤＮＡ配列分析によって確認した。すべてのプローブはＦＡＭ色素標識ＭＧＢプローブであった。ＡＢＩの２Ｘ  ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘをＱＰＣＲ反応に使用した。サーマルサイクリング及び検出は、ＡＢＩ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒによって実施し、装置制御及びＱＰＣＲデータ取得はＡＢＩ  ＳＤＳソフトウェアによって行った。ΔΔＤｔの相対定量法を使用し、各ＱＰＣＲの９６ウェルプレートは対照ｃＤＮＡ（ＬＣ）及びハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのコントロールプライマーとプローブのセットを含有していた。
【０１６１】
実施例２２．ＵＰ７８０の安全性評価
目的を持って繁殖されたＣＤ−１マウスは、ＵＳＤＡ（米国農務省）認可の実験動物供給業者Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入した。動物は、到着後１週間順応させ、８週齢で研究に使用した。動物は温度管理室（２２．２℃）にて１２時間の明暗サイクルで飼育され、飼料及び水は随意に与えられた。
【０１６２】
ベースラインの体重測定は処置の初日、投与前に実施し、その後剖検日まで週２回行った。処置群の全マウス（ｎ＝１０、雄５匹及び雌５匹）に連続１４日間、ＵＰ７８０（Ｌｏｔ＃Ｌ１８０６ＱＭＡＷ−０１）を２００μｌの水（ビヒクルとして）中２．０ｇ／ｋｇの用量でシリンジ及び先端にボールの付いた１８ゲージの給餌針を用いて経口投与した。対照群（ｎ＝１０、雄５匹及び雌５匹）には２００μｌの水のみを投与した。
【０１６３】
系統的な臨床的観察を試験前及び試験期間中毎日実施した。動物の毛色、被毛、眼、粘膜、歩行、呼吸、姿勢の変化、及びその他の異常徴候を含む毒性の徴候をモニターした。臨床的観察は、振戦、痙攣、下痢、嗜眠、病的状態、線維束性収縮、落下（droppings）、流涎、分泌物及び脱水などの何らかの薬物毒性についても行った。アッセイ最終日、全動物を２Ｌ／分の酸素流速で２％イソフルランにより麻酔し、採血して、包括的哺乳動物プロファイリングのためにＡｎｔｅｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ（オレゴン州ポートランド）に送った。全血のサンプル（ラベンダー色の蓋のマイクロ容器(microtainer)）は血液学的評価に、血漿は臨床化学（緑色の蓋のマイクロ容器、セパレーターゲル入り）評価に使用した。全動物の血を抜いて肉眼的病理検査をした。腹腔を開いたら、臓器を肉眼検査し、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、肝臓、直腸、脳（複数のセクション）、脳下垂体、筋肉付き末梢神経（坐骨神経）、脊髄（３レベル）、眼、副腎、甲状腺／副甲状腺、膵臓、肺及び気管、喉頭、大動脈（胸部）、心臓、リンパ節（頚部＆腸間膜）、脾臓、胸腺、腎臓、膀胱、精巣、副睾丸、精嚢、前立腺、頚管、卵巣、子宮、胆嚢、関節付き大腿、皮膚、唾液腺及び舌のサンプル組織を採取し、１０％緩衝中性ホルマリンで固定し、組織病理用プレパラート及び顕微鏡的評価のためにＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ（ペンシルバニア州ニューブリテン）に送った。
【０１６４】
臨床化学、血液学、体重及び飼料消費に関するすべての非離散的データは平均及び標準偏差とともに表にまとめた。結果の解釈は、病理学的所見、異常な身体的徴候及びデータの統計的評価に基づいてなされた。
【０１６５】
【表１】
0005503973.tif 000011
以下に、出願時の特許請求の範囲を記載する。
［請求項１］  脂肪細胞からのアディポネクチン産生を増大させる方法であって、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物｛前記クロモン又はクロモンの混合物は、下記構造：
【化１】
0005503973.tif 000012
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、エステルであって、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルからなる群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体からなる群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］を有する化合物の群から選ばれる｝、及び
製薬学的に許容しうる担体を投与することを含む方法。
［請求項２］  前記クロモン又は前記クロモンの混合物が、下記一般構造：
【化２】
0005503973.tif 000013
［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上記定義の通り］を有する化合物の群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
［請求項３］  前記クロモンがアロエシン又はアロエシノールから選ばれる、請求項１に記載の方法。
［請求項４］  前記クロモンが、植物の部分から単離される又は合成法によって得られる、請求項１に記載の方法。
［請求項５］  前記植物が、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckia)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)の属からなる群から選ばれる、請求項４に記載の方法。
［請求項６］  前記植物が、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckia frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)、及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)からなる群から選ばれる、請求項４に記載の方法。
［請求項７］  前記植物の部分が、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽（young shoots）、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分からなる群から選ばれる、請求項４に記載の方法。
［請求項８］  クロモン組成物が０．０１％〜１００％のクロモンを含む、請求項１に記載の方法。
［請求項９］  組成物が０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
［請求項１０］  投与経路が、適切な医薬製剤での経口、局所、坐剤、静脈内、皮内、腹部内（intragaster）、筋肉内、腹腔内、及び静脈内投与からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
［請求項１１］  高脂肪食が誘導する、脂肪酸生合成、脂肪酸のミトコンドリアβ酸化、ステロイド生合成、糖新生、脂肪輸送、ＰＰＡＲα／ＲＸＲα肝シグナル伝達及び異物代謝の遺伝子発現の変化を正常化するための方法であって、前記方法は、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物を含む組成物を投与することを含む方法。
［請求項１２］  前記クロモン又はクロモンの混合物が、下記構造：
【化３】
0005503973.tif 000014
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、エステルであって、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルからなる群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体からなる群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］を有する化合物の群から選ばれ、及び製薬学的に許容しうる担体、請求項１１に記載の方法。
［請求項１３］  前記クロモン又は前記クロモンの混合物が、下記一般構造：
【化４】
0005503973.tif 000015
［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上記定義の通り］を有する化合物の群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
［請求項１４］  前記クロモンがアロエシン又はアロエシノールから選ばれる、請求項１１に記載の方法。
［請求項１５］  前記クロモンが、植物の部分から単離される又は合成法によって得られる、請求項１１に記載の方法。
［請求項１６］  前記植物が、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckia)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)の属からなる群から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
［請求項１７］  前記植物が、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckia frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)、及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)からなる群から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
［請求項１８］  前記植物の部分が、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分からなる群から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
［請求項１９］  クロモン組成物が０．０１％〜１００％のクロモンを含む、請求項１１に記載の方法。
［請求項２０］  組成物が０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項１１に記載の方法。
［請求項２１］  投与経路が、適切な医薬製剤での経口、局所、坐剤、静脈内、皮内、腹部内（intragaster）、筋肉内、腹腔内、及び静脈内投与からなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
［請求項２２］  インスリン抵抗性、耐糖能異常、高血糖、メタボリックシンドローム、脂質異常症、及び高トリグリセリド血症の予防及び治療法であって、前記方法は、それを必要とする対象に有効量のクロモン又はクロモンの混合物を含む組成物を投与することを含む方法。
［請求項２３］  前記クロモン又はクロモンの混合物が、下記構造：
【化５】
0005503973.tif 000016
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、エステルであって、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルからなる群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体からなる群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］を有する化合物の群から選ばれ、及び製薬学的に許容しうる担体、請求項２２に記載の方法。
［請求項２４］  前記クロモン又は前記クロモンの混合物が、下記一般構造：
【化６】
0005503973.tif 000017
［式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は上記定義の通り］を有する化合物の群から選ばれる、請求項２２に記載の方法。
［請求項２５］  前記クロモンがアロエシン又はアロエシノールから選ばれる、請求項２２に記載の方法。
［請求項２６］  前記クロモンが、植物の部分から単離される又は合成法によって得られる、請求項２２に記載の方法。
［請求項２７］  前記植物が、アカシア(Acacia)、アディナ(Adina)、アロエ(Aloe)、アルテルナリア(Alternaria)、アムーラ(Amoora)、アンチデスマ(Antidesma)、アルテミシア(Artemisia)、バエッキア(Baeckia)、カッシア(Cassia)、クルセア(Clusea)、シニジウム(Cnidium)、コンボルブルス(Convolvulus)、エピメジウム(Epimedium)、エリオセマ(Eriosema)、エリオステモン(Eriostemon)、ユーゲニア(Eugenia)、ガルシニア(Garcinia)、ハイペリカム(Hypericum)、リンデンベルジア(Lindenbergia)、パンクラチウム(Pancratium)、ペニシリウム(Penicillium)、ポリゴナム(Polygonum)、プタエロキシロン(Ptaeroxylon)、レウム(Rheum)、ソフォラ(Sophora)、ステファニティス(Stephanitis)、シジジウム(Syzygium)、タラロミセス(Talaromyces)及びゾナリア(Zonaria)の属からなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
［請求項２８］  前記植物が、アカシア・カテチュー(Acacia catechu)、アカシア・コンシンナ(Acacia concinna)、アロエ・アルボレセンス(Aloe arborescens)、アロエ・バルバデンシス(Aloe barbadensis)、アロエ・クレムノフィラ(Aloe cremnophila)、アロエ・フェロックス(Aloe ferox)、アロエ・サポナリア(Aloe saponaria)、アロエ・ベラ(Aloe vera)、アロエ・ベラ変種シネンシス(Aloe vera var. chinensis)、アンチデスマ・メンブラナセウム(Antidesma membranaceum)、アルテミシア・キャピラリエス(Artemisia capillaries)、バエッキア・フルテセンス(Baeckia frutescens)、エピメジウム・サジッタタム(Epimedium sagittatum)、ガルシニア・ダルシス(Garcinia dulcis)、ハイペリカム・ジャポニカム(Hypericum japonicum)、ポリゴナム・カスピダタム(Polygonum cuspidatum)、ソフォラ・トメントサ(Sophora tomentosa)、及びステファニティス・ロドデンドリ(Stephanitis rhododendri)からなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
［請求項２９］  前記植物の部分が、茎、茎皮、幹、幹皮、小枝、塊茎、根、根皮、若芽、種、根茎、花及びその他の生殖器官、葉、及びその他の気生部分からなる群から選ばれる、請求項２６に記載の方法。
［請求項３０］  クロモン組成物が０．０１％〜１００％のクロモンを含む、請求項２２に記載の方法。
［請求項３１］  組成物が０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項２２に記載の方法。
［請求項３２］  投与経路が、適切な医薬製剤での経口、局所、坐剤、静脈内、皮内、腹部内（intragaster）、筋肉内、腹腔内、及び静脈内投与からなる群から選ばれる、請求項２２に記載の方法。
［請求項３３］  組成物であって、
ａ．９０〜９９％（重量％）のアロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末；及び
ｂ．１〜１０％（重量％）の一つ又は複数のクロモンの混合物
を混合することによって形成され、前記クロモンの混合物は実質的に純粋であり、前記クロモンの混合物は本質的にアントラキノン類を含まない組成物。
［請求項３４］  前記アロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末がアロエ・バルバデンシス又はアロエ・ベラから単離され、前記クロモンの混合物がアロエ・フェロックスから単離される、請求項３３に記載の組成物。
［請求項３５］  前記クロモン又は前記クロモンの混合物が、下記一般構造：
【化７】
0005503973.tif 000018
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、エステルであって、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルからなる群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体からなる群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］を有する化合物の群から選ばれ、及び製薬学的に許容しうる担体、請求項３３に記載の組成物。
［請求項３６］  前記クロモンがアロエシン又はアロエシノールから選ばれる、請求項３５に記載の組成物。
［請求項３７］  組成物であって、
ａ．９５〜９９％（重量％）のアロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末；及び
ｂ．１〜５％（重量％）の一つ又は複数のクロモンの混合物
を混合することによって形成され、前記クロモンの混合物は実質的に純粋であり、前記クロモンの混合物は本質的にアントラキノン類を含まない組成物。
［請求項３８］  前記アロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末がアロエ・バルバデンシス又はアロエ・ベラから単離され、前記クロモンの混合物がアロエ・フェロックスから単離される、請求項３７に記載の組成物。
［請求項３９］  前記クロモン又は前記クロモンの混合物が、下記一般構造：
【化８】
0005503973.tif 000019
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、エステルであって、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルからなる群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体からなる群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］を有する化合物の群から選ばれ、及び製薬学的に許容しうる担体、請求項３７に記載の組成物。
［請求項４０］  前記クロモンがアロエシン又はアロエシノールから選ばれる、請求項３９に記載の組成物。
［請求項４１］  組成物であって、
ａ．９８〜９９％（重量％）のアロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末；及び
ｂ．１〜２％（重量％）の一つ又は複数のクロモンの混合物
を混合することによって形成され、前記クロモンの混合物は実質的に純粋であり、前記クロモンの混合物は本質的にアントラキノン類を含まない組成物。
［請求項４２］  前記アロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末がアロエ・バルバデンシス又はアロエ・ベラから単離され、前記クロモンの混合物がアロエ・フェロックスから単離される、請求項４１に記載の組成物。
［請求項４３］  前記クロモン又は前記クロモンの混合物が、下記一般構造：
【化９】
0005503973.tif 000020
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＨ３、−ＳＨ、アルキル、アルケニル、オキソアルキル、オキソアルケニル、ヒドロキシルアルキル、ヒドロキシルアルケニル、−ＯＣＨ３、−ＳＣＨ３、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＮＨ２、−ＮＲＨ、−ＮＲ２、−ＮＲ３＋Ｘ−、エステルであって、ガレート、アセテート、シンナモイル及びヒドロキシル−シンナモイルエステル、トリヒドロキシベンゾイルエステル及びカフェオイルエステルからなる群から選ばれるエステル；及びヘキソース又はペントースであって、炭素、窒素、硫黄又は酸素によってクロモンに連結され、アルドペントース類、メチルアルドペントース、アルドヘキソース類、ケトヘキソース及びそれらの化学誘導体からなる群から選ばれるヘキソース又はペントースからなり、二量体、三量体及びその他の重合クロモンが含まれる群から、独立して選ばれ；
前記アルキル及び／又はアルケニル基は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖及び／又は分枝鎖で、異なる位置にある、二重結合、及び−ＯＨ、＝Ｏ及び−ＯＲからなる群から選ばれる置換基を有し及び／又は有さず；
Ｘは、ヒドロキシル、クロリド、ヨージド、スルフェート、ホスフェート、アセテート、フルオリド、カーボネートを含む製薬学的に許容しうる対イオンの群から選ばれ；そして
Ｒは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基である］を有する化合物の群から選ばれ、及び製薬学的に許容しうる担体、請求項４１に記載の組成物。
［請求項４４］  前記クロモンがアロエシン又はアロエシノールから選ばれる、請求項４３に記載の組成物。
［請求項４５］  アロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末と、１〜１０％（重量％）の一つ又は複数のクロモンとを含む組成物であって、前記組成物は本質的にアントラキノン類を含まず、前記アロエゲルはアロエ・バルバデンシス又はアロエ・ベラから選ばれる植物から単離され、そして前記一つ又は複数のクロモンはアロエ・フェロックスから単離される組成物。
［請求項４６］  アロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末と、一つ又は複数のクロモンの混合物とを含む組成物の製造法であって、前記製造法は、
ａ．一つ又は複数のクロモンの混合物を含む組成物を準備し、ここで、前記一つ又は複数のクロモンの組成物は実質的に純粋であり、本質的にアントラキノン類を含まず；そして
ｂ．ステップａ）の前記組成物とアロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末とを、１〜１０％（重量％）の前記クロモンの混合物及び９０〜９９％（重量％）のアロエゲル粉末又はアロエ全葉ゲル粉末の比率で組み合わせる
ことを含む方法。
【図１Ａ】
0005503973.tif 000021
【図１Ｂ】
0005503973.tif 000022
【図２】
0005503973.tif 000023
【図３】
0005503973.tif 000024
【図４】
0005503973.tif 000025
【図５】
0005503973.tif 000026
【図６】
0005503973.tif 000027
【図７】
0005503973.tif 000028
【図８Ａ】
0005503973.tif 000029
【図８Ｂ】
0005503973.tif 000030
【図９】
0005503973.tif 000031
【図１０】
0005503973.tif 000032
【図１１Ａ】
0005503973.tif 000033
【図１１Ｂ】
0005503973.tif 000034
【図１２】
0005503973.tif 000035
【図１３Ａ】
0005503973.tif 000036
【図１３Ｂ】
0005503973.tif 000037
【図１３Ｃ】
0005503973.tif 000038
【図１３Ｄ】
0005503973.tif 000039
【図１３Ｅ】
0005503973.tif 000040
【図１３Ｆ】
0005503973.tif 000041
【図１４Ａ】
0005503973.tif 000042
【図１４Ｂ】
0005503973.tif 000043
【図１４Ｃ】
0005503973.tif 000044
【図１４Ｄ】
0005503973.tif 000045
【図１４Ｅ】
0005503973.tif 000046
【図１５Ａ】
0005503973.tif 000047
【図１５Ｂ】
0005503973.tif 000048
【図１５Ｃ】
0005503973.tif 000049
【図１５Ｄ】
0005503973.tif 000050
【図１５Ｅ】
0005503973.tif 000051
【図１６】
0005503973.tif 000052
【図１７】
0005503973.tif 000053
【図１８】
0005503973.tif 000054
【図１９】
0005503973.tif 000055
【図２０】
0005503973.tif 000056
【図２１】
0005503973.tif 000057
【図２２Ａ】
0005503973.tif 000058
【図２２Ｂ】
0005503973.tif 000059
【図２３】
0005503973.tif 000060
【図２４Ａ】
0005503973.tif 000061
【図２４Ｂ】
0005503973.tif 000062
【図２５Ａ】
0005503973.tif 000063
【図２５Ｂ】
0005503973.tif 000064
【図２６Ａ】
0005503973.tif 000065
【図２６Ｂ】
0005503973.tif 000066
【図２７Ａ】
0005503973.tif 000067
【図２７Ｂ】
0005503973.tif 000068
【図２８Ａ】
0005503973.tif 000069
【図２８Ｂ】
0005503973.tif 000070