(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）に記載の工程を含む、疲労関連遺伝子の発現強度を指標として用いて人の生理的疲労状態を評価する方法であって、
前記疲労関連遺伝子が、配列番号１〜５１で表される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子である、評価方法：
（１）被験者の前記疲労関連遺伝子の発現強度を測定し、非疲労状態における対応する疲労関連遺伝子の発現強度と比較する工程、及び
（２）対象遺伝子が配列番号１〜４８で表される遺伝子から選択される少なくとも１つである場合、非疲労状態の遺伝子発現強度よりも評価時の遺伝子発現強度が増大している場合に、被験者が生理的疲労状態であると決定する工程、または
対象遺伝子が配列番号４９〜５１で表される遺伝子から選択される少なくとも１つである場合、非疲労状態の遺伝子発現強度よりも評価時の遺伝子発現強度が減少している場合に、被験者が生理的疲労状態であると決定する工程。
【請求項２】
前記疲労関連遺伝子が、配列番号１〜４８で表される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載された生理的疲労状態の評価方法。
【請求項３】
前記疲労関連遺伝子が、配列番号１〜３６で表される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子であることを特徴とする請求項２に記載された生理的疲労状態の評価方法。
【請求項４】
下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）に記載の工程を含む、疲労関連遺伝子の発現強度を指標として用いて人の生理的疲労状態を評価する方法であって、
前記疲労関連遺伝子が、配列番号１〜５１で表される遺伝子のいずれかの遺伝子である、評価方法：
（Ｉ）被験者の複数の前記疲労関連遺伝子の発現強度を測定し、非疲労状態における対応する疲労関連遺伝子の発現強度と比較する工程、
（ＩＩ）複数の前記疲労関連遺伝子の各々の発現強度に、前記疲労関連遺伝子の生理的疲労との相関性に応じて重み付けして得られた値を求め、該値を加算する工程、および
（ＩＩＩ）対象遺伝子が配列番号１〜４８で表される遺伝子のいずれかである場合、非疲労状態の遺伝子発現強度の加算値よりも評価時の遺伝子発現強度の加算値が増大している場合に、被験者が生理的疲労状態であると決定する工程、または
対象遺伝子が配列番号４９〜５１で表される遺伝子のいずれかである場合、非疲労状態の遺伝子発現強度の加算値よりも評価時の発現強度の加算値が減少している場合に、被験者
が生理的疲労状態であると決定する工程。
【請求項５】
下記（ｉ）及び（ｉｉ）に記載の工程を含む、疲労関連遺伝子の発現強度を指標として用いて人の生理的疲労状態に影響する食品又は薬剤を評価する方法であって、
前記疲労関連遺伝子が、配列番号１〜５１で表される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子である、評価方法：
（ｉ）前記食品又は前記薬剤の摂取前後において被験者の前記疲労関連遺伝子の発現強度を測定し、前記食品又は前記薬剤の摂取前後の発現強度を比較する工程、及び
（ｉｉ）対象遺伝子が配列番号１〜４８で表される遺伝子から選択される少なくとも１つである場合、前記食品又は前記薬剤の摂取前の発現強度と比較して摂取後の発現強度が減少している場合に、前記食品又は前記薬剤が生理的疲労改善に有効であると決定する工程、または
対象遺伝子が配列番号４９〜５１で表される遺伝子から選択される少なくとも１つである場合、前記食品又は前記薬剤の摂取前の発現強度と比較して摂取後の発現強度が増大している場合に、前記食品又は前記薬剤が生理的疲労改善に有効であると決定する工程。
【請求項６】
下記（ａ）及び（ｂ）に記載の工程を含む、疲労関連遺伝子から生成されるタンパク質量を指標として使用して人の生理的疲労状態を評価する方法であって、
前記疲労関連遺伝子が、配列番号１〜５１で表される遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子である、評価方法：
（ａ）被験者の前記疲労関連遺伝子から発現されるタンパク質量を測定し、非疲労状態の対応する疲労関連遺伝子から発現されるタンパク質量と比較する工程、及び
（ｂ）対象遺伝子が配列番号１〜４８で表される遺伝子から選択される少なくとも１つである場合、非疲労状態の状態のタンパク質量よりも評価時のタンパク質量が増大していれば、被験者が生理的疲労状態であると決定する工程、または
対象遺伝子が配列番号４９〜５１で表される遺伝子から選択される少なくとも１つである場合、非疲労状態のタンパク質量よりも評価時のタンパク質量が減少していれば、被験者が生理的疲労状態であると決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理的疲労の程度に関連して発現の程度が変化する遺伝子を用いて生理的疲労を評価する方法およびそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常の日常生活の中で、労働はごく普通の行為であり、その継続の結果もたらされる疲労は、我々の生活において不可避である。そして、過度の疲労の負荷および蓄積は、我々の肉体の不可逆的な変化をもたらし、通常の回復過程では改善されない状態、結果的に疾病状態を引き起こす可能性がある。この意味で、疲労の状態を理解し、それをある範囲内に管理することは、疲労に伴う疾病の発症を未然に防止する意味で必須の要件となる。
【０００３】
即ち、現代社会において、“疲労”、特に過度の“疲労”（過労）は、公衆衛生および労務管理の上でも大きな問題となっている。“疲労”を計測・評価し、適正範囲にコントロールすることは健康増進および疾病予防の観点からも重要な課題である。“疲労”は、われわれにとって身近なものである一方、現象としての“疲労”は、実に広範囲な現象を内包している。このことが、「“疲労”とは何か」、「何を測ることが“疲労”を計測することになるのか」の問いに対する回答の困難さの理由になっていると考えられる。
【０００４】
“疲労”の定義として、「過度の肉体的、精神的な活動により生じた、独特の病的不快感と休養を求める欲求を伴う、身体あるいは精神機能の減弱状態」と表されている例がある（下記非特許文献１参照）。この場合、「身体あるいは精神機能の減弱状態」とは「身体および精神作業の質的あるいは量的な低下」と、「過度の肉体的、精神的な活動」は「ストレス（負荷）」と、言い換え可能とされている。そして、刺激（負荷）と反応（疲労）とは、明瞭に区別すべき対象であるとされている。さらに、疲労計測の困難さの要因として、刺激として与える側の疲労負荷の定量化は容易であるが、受ける側の疲労反応の定量化は容易ではないため、と報告されている。
【０００５】
“疲労”の分類には、全身疲労および局所疲労（一部の筋肉疲労など）、精神的疲労および肉体的疲労、急性疲労および慢性疲労、などがある。その中で、典型的な“疲労”過程における分類法として、「生理的疲労」および「病的疲労」という分類がある。生理的疲労とは、治療の必要なく回復する疲労、例えば「一晩寝れば回復するような」疲労状態を表し、一方、病的疲労とは、回復に治療を必要とする疲労、すなわち「すぐにでも病院に行ったほうがいい」疲労状態を表している。「慢性疲労」は生理的疲労に分類され、「慢性疲労症候群」は病的疲労に分類される。これら、生理的疲労状態、および、病的疲労状態の分類は、通常の疲労の進行過程を考察・評価してゆく上で、基本的、かつ重要な観点である。
【０００６】
疲労の程度を表す「疲労指標」は、主観的指標と客観的指標とに分類される。主観的指標とは、疲労自覚症状を反映する指標であり、質問紙などによる心理的指標である。客観的指標は、「生理的指標」と「行動的指標」に分類される。生理的指標には、呼吸、脈拍、発汗等が含まれるが、広い意味での生理的指標として、エネルギー代謝率、２点識別方法、フリッカー（ちらつき）値検査法、などがある。
【０００７】
フリッカー値検査法によって測定されるフリッカー値は、光を点滅させた際に、光のちらつき感じる最も高い周波数を表す値である。フリッカー値検査法は、Simon & Enzer (1941)らにより疲労検査法として提唱されて以来、人間工学および労働衛生の分野で広く利用され、大脳皮質の活動水準を示すものとして利用されてきている。人の精神的疲労を測
定するために、専用の測定装置を代替する手段として携帯電話を使用する方法や、瞳孔の変化を観測する方法が知られている（下記特許文献１、２参照）。
【０００８】
主観的指標の一つとして、“自覚症状しらべ”が知られている。これは、現厚生労働省管轄の労働衛生研究所が約２０年前に発表した、疲労過程で発生する身体の自覚症状２５項目に着目し、１項目ごと５段階評価で、その状況を評価し、全項目の積算点を疲労の指標とするものである。たとえば、「目がしょぼつく」、「肩がこる」、「足がだるい」、などの項目を、「非常によくあてはなる：５点」から「まったくあてはまらない：１点」までの５段階評価で、評価する主観的評価法である。
【０００９】
また、別の主観的指標として、Visual Analog Scale (VAS)が知られている。これは、
日本疲労学会が提唱する疲労評価方法である。紙に印刷した１０ｃｍの線の、左端を「疲れを全く感じない最良の感覚」、右端を「何もできないほど疲れきった最悪の間隔」と規定し、自身の感覚がその両端の間でどのぐらいの場所に位置するかを、主観的にバツ印を記入する形で決定してもらう、主観的評価法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００８−２２０６３９号公報
【特許文献２】特開２００８−３０１８４１号公報
【特許文献３】特開２００７−２２８８７８号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】梶木修身，野崎聡，“疲労のバイオマーカー開発と抗疲労食薬の開発”，現代科学，pp35-37，.444(2008)，(東京化学同人)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
人の生理的疲労を適切に評価することは容易ではない。例えば、従来の自覚症状しらべやＶＡＳによる評価方法は、主観的な方法であり、信頼度の点で問題がある。
【００１３】
また、フリッカー値による評価方法は、客観的な評価方法ではあるが、測定には所定の時間を要し、その間測定対象者を拘束しなければならない問題がある。短時間の効率的な測定でなければ、測定対象者にとって測定自体が疲労の原因になり得る。また、フリッカー値検査法は、疲労によって人に生じる生体機能の低下を評価するものであり、生理状態を直接測定するものではない。
【００１４】
病的疲労である慢性疲労症候群の診断に関しては、上記特許文献３に開示された、所定の遺伝子の発現を解析する方法などが知られているが、慢性疲労症候群に至る前の段階における生理的疲労の評価には適用できない。
【００１５】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、測定対象者にとって負担にならず、より簡便に、且つ、生理状態を直接測定することができる客観的な生理的疲労の評価方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明に係る第１の生理的疲労状態の評価方法は、疲労関連遺伝子の発現強度を指標として用いて人の生理的疲労状態を評価する方法であって、
前記疲労関連遺伝子が、図４〜９に示された核酸データベースのアクセス番号GenbankAccessionによって特定される遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子であり、
前記疲労関連遺伝子の発現強度を測定し、該発現強度を提示することを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る第２の生理的疲労状態の評価方法は、上記の第１の生理的疲労状態の評価方法において、
前記疲労関連遺伝子が、図１０、図１１及び図１２に示された核酸データベースのアクセス番号GenbankAccessionによって特定される遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子であることを特徴としている。
【００１８】
本発明に係る第３の生理的疲労状態の評価方法は、上記の第２の生理的疲労状態の評価方法において、
前記疲労関連遺伝子が、図１０及び図１１に示された核酸データベースのアクセス番号GenbankAccessionによって特定される遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子であることを特徴としている。
【００１９】
本発明に係る第４の生理的疲労状態の評価方法は、上記の第１〜第３の生理的疲労状態の評価方法の何れかにおいて、
複数の前記疲労関連遺伝子の発現強度を測定する場合に、
複数の前記疲労関連遺伝子の各々の発現強度を、前記疲労関連遺伝子の生理的疲労との相関性に応じて重み付けして得られた値を求め、該値を提示することを特徴としている。
【００２０】
本発明に係る食品又は薬剤の評価方法は、疲労関連遺伝子の発現強度を指標として用いて人の生理的疲労状態に影響する食品又は薬剤を評価する方法であって、
前記疲労関連遺伝子が、図４〜９に示された核酸データベースのアクセス番号GenbankAccessionによって特定される遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子であり、
記食品又は前記薬剤の摂取前後において前記疲労関連遺伝子の発現強度を測定し、該発現強度を提示することを特徴としている。
【００２１】
本発明に係る第１の評価装置は、疲労関連遺伝子の発現強度を指標として用いて人の生理的疲労状態を評価するために使用される装置であって、
図４〜９に示された核酸データベースのアクセス番号GenbankAccessionによって特定される遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子を構成するＤＮＡの相補的ＤＮＡが結合されていることを特徴としている。
【００２２】
本発明に係る第２の評価装置は、上記の第１の評価装置において、
前記評価装置が、マイクロアレイ、チップ、メンブレンフィルター、またはビーズであることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係る第５の生理的疲労状態の評価方法は、疲労関連遺伝子によって生成されるタンパク質の量を指標として使用して人の生理的疲労状態を評価する方法であって、
前記疲労関連遺伝子が、図４〜９に示された核酸データベースのアクセス番号GenbankAccessionによって特定される遺伝子のうちの少なくとも１つの遺伝子であり、
前記疲労関連遺伝子によって生成されるタンパク質の量を測定し、該量を提示することを特徴としている。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、疲労関連遺伝子の発現強度を測定するので、生理的疲労を直接測定することができる。また、少量の血液を採取するだけでよいので、長い時間被験者を拘束する必要がない。また、定期的に測定することが容易であり、定期的に測定したデータを記録しておけば、慢性疲労症候群などの病的疲労に移行しないように、生理的疲労状態をコ
ントロールすることが容易になる。
【００２５】
また、本願発明を適用することによって、食品や薬剤の疲労改善の効果を客観的に評価することが可能になる。近年、疲労状態の積極的な解消、および、能動的な疲労状態に対する耐性の付与を目的とした、抗疲労薬品および抗疲労食品の開発が進められている。一方、その状況に対し、これら薬品および食品の具体的な作用の把握、さらに、その作用機序（メカニズム）の把握が求められている。これら、薬品および食品の作用の強度は性格上、マイルドであり、なかなか明瞭な作用の把握および作用機序の把握が困難であることが知られている。本発明に係る疲労関連遺伝子群は、疲労の進行とともに、具体的にその発現が変化するものであり、連続的な疲労の進行および回復においてもその変化が検出可能である。また、網羅した遺伝子群の組み合わせから、それら、薬品および食品の作用機序の把握も可能であると考えられる。
【００２６】
また、疲労遺伝子の発現によるタンパク質を測定するキットなどを使用すれば、個人でも生理的疲労状態を評価することができる。例えば、スポーツ選手が自己の生理的疲労状態を簡便に評価することができるようになる。
【００２７】
また、現在、がん、うつ病、など様々な疾患の診断を目的とした遺伝子の探索およびDNAマイクロアレイの開発が進んでいる。一方、さまざまな疾患は、ある状況で急に発症す
るのではなく、環境的および身体的は状況の積み重ねにより段階的に、状況が移行してゆくものと考えられる。とくに、うつ病などは、過度の疲労状態の連続の結果、引き起こされうるものと考えられ、過度の労働による発症の危険性も意識され、現在職場では、疲労状況の把握およびうつ病発症抑制が広く意識されている。本発明によれば、疲労関連遺伝子の発現により疲労状態を把握することができるので、疲労の過度の進行による、うつ病および生活習慣病（高血圧、脳血管疾患、心筋梗塞）などの発症を抑制することが可能になる。また、実際の病院などでの臨床において、抗がん剤治療、インターフェロン療法など、さらには、各種外科手術など、効果はあるのだが、患者に過度の負担を強いる療法がある。その場合、患者にどの程度の負担を強いているのか、患者がどの程度疲労を感じているのかを評価する指標はない。この場合、本発明を適用して、疲労状況を評価すれば、療法の負担の程度、および、回復にともなう疲労感の低減などを具体的な数値として評価しうるものとなる。本発明は、疲労と疾病の間でプラスの方向とマイナスの方向の両方の場合において状況把握に利用可能である。
【００２８】
また、日常的な労働状況に加え、過酷な労働状況であるところの勤務医、看護師、また、極端な緊張と疲労を伴う、ＰＫＯ活動、さらには、南極観測隊または宇宙飛行など、極限環境における労働とその影響の把握および解消においても、本発明は、有用な疲労計測管理方法をもたらす基盤となるものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】モデルシフト勤務実験全体の概要を示す図である。
【図２】６人の被験者に関して、フリッカー値を測定した結果を示すグラフである。
【図３】モデルシフト勤務実験における、特定の１人の被験者に関するフリッカー値、アミラーゼ活性、主観的疲労指標である自覚症状しらべ、およびVAS、の変化を示すグラフである。
【図４】主観的疲労指標と正（フリッカー値とは負）の相関性をもって変化する１３９遺伝子の一部を示す図である。
【図５】主観的疲労指標と正（フリッカー値とは負）の相関性をもって変化する１３９遺伝子の一部を示す図である。
【図６】主観的疲労指標と正（フリッカー値とは負）の相関性をもって変化する１３９遺伝子の一部を示す図である。
【図７】主観的疲労指標と正（フリッカー値とは負）の相関性をもって変化する１３９遺伝子の一部を示す図である。
【図８】主観的疲労指標と正（フリッカー値とは負）の相関性をもって変化する１３９遺伝子の一部を示す図である。
【図９】主観的疲労指標と負（フリッカー値とは正）の相関をもって変化する６遺伝子を示す図である。
【図１０】主観的疲労指標と正相関する超中心遺伝子を示す図である。
【図１１】主観的疲労指標と正相関する般中心遺伝子を示す図である。
【図１２】主観的疲労指標と正相関する中核中間遺伝子を示す図である。
【図１３】主観的疲労指標と正相関する般中間遺伝子を示す図である。
【図１４】主観的疲労指標と正相関する周辺遺伝子を示す図である。
【図１５】主観的疲労指標と正相関する超中心遺伝子の発現強度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係る実施の形態を、添付した図面に基づいて説明する。本発明では、特定の「疲労関連遺伝子」を指標として疲労関連遺伝子の発現強度を測定し、その値を用いて人の生理的疲労を評価する。従って、まず、疲労の評価方法および疲労関連遺伝子の特定に関して説明する。
【００３１】
フリッカーテストで生理的疲労を評価できることを実験によって検証するために、６人の被験者を対象として、一日の典型的な頭脳労働を模した夜勤シフト勤務としてモデルシフト勤務負荷課題（以下、夜間勤務負荷実験ともいう）を行なった。実験全体の概要を図１に示す。
【００３２】
開始から３時間ごとに、各被験者に対して、フリッカーテストおよび主観的指標調査（質問紙による自覚的疲労度の調査：自覚症状しらべ、ＶＡＳ）を行い、６時間ごとに採血を行い血液中の遺伝子の発現状態を測定した。各被験者には、１８時間の連続疲労負荷の後、仮眠してもらい、その後にも、フリッカーテスト、主観的指標調査、および採血・遺伝子発現の測定を行った。夜間勤務負荷実験は平日午後（１４：３０）から開始し、所要時間はおよそ２４時間であった。実験開始（１４：３０）から翌朝（８：３０）までの間でフリッカーテストおよび主観的指標調査を７回および採血を４回行った。その後の仮眠後、フリッカーテスト、主観的指標調査および採血を１回行った。従って、フリッカーテストおよび主観的指標調査を合計８回行い、採血を合計５回行った。疲労計測およびサンプル採取以外の時間は、各自のペースで労働としての勤務、例えばデータ整理や論文または学会要旨作成などを行ってもらった。なお、本実験において採血は、１回あたり１０ｍｌで合計５回、医師の管理下のもとに行った。
【００３３】
フリッカー値の計測（フリッカーテスト）には、従来のフリッカー値標準計測装置を使用し、測定されたフリッカー値が、疲労負荷によってどのように変化するかについて検討を行った。
【００３４】
図２は、６人の被験者（Ａ〜Ｆ）に関して、フリッカー値を測定した結果を示すグラフである。横軸は測定回数を示す。これから、計測したフリッカー値は、疲労負荷に伴いほぼ同様に漸進的に減少し、また、休息による疲労回復によって元の値に戻ることが確認された。即ち、計測したフリッカー値の変化が疲労の状況（程度）を反映し得るものであることが明らかになった。
【００３５】
図３は、特定の１人の被験者に関するデータであり、フリッカー値（左上のグラフ）、アミラーゼ活性（右上のグラフ）、自覚症状しらべ（左下のグラフ）、およびＶＡＳ（右
下のグラフ）の連続疲労負荷過程における変化を示す。ここで、アミラーゼ活性は、二プロ株式会社製のアミラーゼモニターを使用して、被験者の唾液の中のアミラーゼ活性を測定した値である。ニプロ社製の唾液アミラーゼモニター用チップの先端を口に含み唾液採取部を舌の下に入れ1分間、唾液に暴露させる。その間、唾液中のアミラーゼが、チップ
の試験紙に含まれるα-2-クロロ-4-ニトロフェニル-ガラクトピラノシルマルトサイド(Gal-G2-CNP)を加水分解し、2-クロロ-4-ニトロフェノール（CNP）を生成させる。その後、
取り出したチップを、唾液アミラーゼモニターにセットする。生成したCNPによる試験紙
の反射光強度を唾液アミラーゼモニター本体で測定し、アミラーゼ活性値に換算する。
【００３６】
唾液中のアミラーゼの量、そしてアミラーゼ活性は、自律神経の支配を受けているといわれ、疲労の蓄積とともに、アミラーゼ活性が減少するといわれている。
【００３７】
これらの結果から、実験開始の最初の計測時である１４：３０から翌日の８：３０に向かって、連続疲労負荷にともない、フリッカー値は漸進的に減少したが（図２）、一方主観的疲労指標である自覚症状しらべ（図３）およびＶＡＳ（図３）の値は、漸進的に増加していった。すなわち、疲労蓄積を示す指標としては、漸進的増加を示したと考えられた。その後、仮眠をとった後に、再度、フリッカー値を計測すると、その値は、ほぼ開始点レベルまで増大し、一方、自覚症状調べおよびＶＡＳの値は、ほぼ開始レベルまで減少していることが確認された。すなわち、疲労蓄積を示す指標が、疲労回復を示したと考えられる。
【００３８】
上記の夜間勤務負荷実験の結果を使用して、以下に説明するように、「疲労指標の変化と追従する形で遺伝子の発現が増加・減少する遺伝子」を疲労関連遺伝子の基本概念として、これに該当する遺伝子を特定した。
【００３９】
上記の実験によって得られた、フリッカー値、自覚症状しらべのトータルスコアー、ＶＡＳのスコアーのそれぞれと、遺伝子の発現強度との相関を調べた。具体的には、相関を、重回帰係数Ｒとｐ値とで評価した。その結果、採血の第１回目（実験開始の１４：３０）と第４回目（１８時間後の翌朝８：３０）との間で発現が（ａ）有意に増大し、（ｂ）発現量の増加率が２倍以上であり、（ｃ）第４回目の発現量が、それ以前の第１、第２、第３回目および第５回目よりも大きい、という条件、すなわち、疲労負荷とともに第１から第４回目にかけて発現量が増加し、仮眠と共に第４から第５回目にかけて発現量が減少する遺伝子が、１２８遺伝子存在することが明らかになった。主観的疲労指標と正（フリッカー値とは負）の相関性をもって変化する１２８遺伝子を表す表を図４〜図８に示す。
【００４０】
これらの表において、GenbankAccessionの列は、核酸データベースのアクセス番号（(GenBank) Accession Number）であり、これによって遺伝子が特定される。また、ProbeNameは、後述する遺伝子の発現強度の測定で使用したＤＮＡマイクロアレイキット（G4112F
、Whole Human Genome Origo ＤＮＡマイクロアレイキット、Agilent Technologies社製
）で使用されているプローブを特定する情報である。また、ControlTypeは、対象遺伝子
のコントロールとなるプローブの情報である。後述するAgilent Technologies社の場合、ControlTypeは、４つあり、（１）通常のデータ解析の対象としてのプローブ（Plobe）の場合は、falseと記載される。一方、（２）ポジティブコントロール(Positive)の場合に
は、posまたはpositive、（３）ネガティブコントロール(Negative)の場合には、negまたはnegative、（４）プローブでない(Not Probe)場合には、notprobe、と表される。FALSEと記載されている行のデータは、通常の基本条件と比較条件の対応関係を示しており、Normalizationもうまくいったことを示している。
【００４１】
なお、核酸データベースのアクセス番号とは、次の３機関が共同で構築する『DDBJ/EMBL/GenBank国際塩基配列データベース』(The International Nucleotide Sequence Databa
ses:INSD)におけるデータ登録番号である。
【００４２】
日本のDNAデータバンクDDBJ(DNA Data Bank of Japan)：国立遺伝学研究所の下部組織
が管理する。データベース名は「DDBJ」
欧州の欧州生命情報学研究所EBI(European Bioinformatics Institute)：欧州分子生物学研究所EMBL(European Molecular Biology Laboratory)の下部組織が管理する。データ
ベース名は「EMBL Nucleotide Sequence Database」
米国の国立バイオテクノロジー情報センターNCBI (National Center for Biotechnology Information)：国立医学図書館NLM (National Library of Medicine)の下部組織が管理する。データベース名は「GenBank」
各遺伝子の具体的な塩基配列は、上記のデータベースで公開されているので、記載を省略する。
【００４３】
また、第１回目と第４回目との間で発現が（ｃ）有意に減少し、（ｄ）発現量の増加率が１／２倍以下であり、（ｅ）第４回目の発現量が、それ以前の第１、第２、第３回目および第５回目よりも小さい、という条件、すなわち、疲労負荷とともに第１から４回目にかけて発現量が減少し、仮眠と共に第４から第５回目にかけて発現量が増加する遺伝子が、６遺伝子存在することが明らかになった。主観的疲労指標と負（フリッカー値とは正）の相関をもって変化する６遺伝子を表す表を図９に示す。
【００４４】
以上のことから、主観的疲労指標と正（フリッカー値とは負）の相関性をもって変化する上記の１２８遺伝子、及び、主観的疲労指標と負（フリッカー値とは正）の相関をもって変化する上記の６遺伝子のうちのいずれかの遺伝子を使用すれば、生理的疲労を評価することができる。
【００４５】
さらに、図４〜図９に示した主観的疲労指標と正又は負（フリッカー値とは負又は正）の相関性をもって変化する１３４遺伝子（１２８遺伝子＋６遺伝子）を、その疲労との相関性の高さによって次のように分類する。まず、以下の第一選別基準および第二選別基準を設定する。
【００４６】
［第一選別基準］
（１）第１回目採血（疲労負荷の開始時点）と第４回目採血（疲労負荷の終了時点：フリッカー値測定の第７回目に対応）との間で発現強度が有意に増加・減少している遺伝子
（２）第１回目採血（疲労負荷の開始時点）と第４回目採血（疲労負荷の終了時点）との間で発現強度が２倍または１／２に増加または減少している遺伝子
（３）第４回目採血（疲労負荷の終了時点）での遺伝子の発現強度が最大値または最小値であり、その他の採血サンプルにおいてはその時点よりも減少または増加している遺伝子（発現強度の変化のグラフが、第４回目採血の発現強度を頂点にした山形および逆山形（谷形）になっている遺伝子）
図４〜図９に示した１３４遺伝子（１２８遺伝子＋６遺伝子）は全て、上記の（１）〜（３）の全ての条件を満たす。
【００４７】
［第二選別基準］
遺伝子の相対発現強度の変化が、フリッカー値、自覚症状しらべスコアー、ＶＡＳスコアーの各変化と比較して、回帰分析のｐ値で分類を行う基準（中心定義）を定める。基本的選別条件として、フリッカー値、自覚症状しらべスコアー、及びＶＡＳスコアーのうちの少なくとも１つについてｐ値が０．０５以下であり、２つについてｐ値が０．１以下であることとする。
【００４８】
具体的には下記の基準に従って、「中心遺伝子」、「中間遺伝子」、「周辺遺伝子」に
分類し、「中心遺伝子」をさらに「超中心遺伝子」、「般中心遺伝子」に分類し、「中間遺伝子」をさらに「超中核遺伝子」、「般中核遺伝子」に分類する。即ち、遺伝子の相対発現強度の変化と、フリッカー値、自覚症状しらべスコアー、およびＶＡＳスコアーの変化とを、回帰分析で比較したときのｐ値によって分類する。
（１）中心遺伝子：フリッカー値、自覚症状しらべスコアー、およびＶＡＳスコアーの少なくとも１つについてｐ値が０．０５以下であり、他の２つについてｐ値が０．１以下である遺伝子
（１−１）超中心遺伝子：フリッカー値、自覚症状しらべスコアー、およびＶＡＳスコアーの３つともｐ値が０．０５以下である遺伝子
（１−２）般中心遺伝子：中心遺伝子の条件の遺伝子から超中心遺伝子を除いた遺伝子（２）中間遺伝子：フリッカー値、自覚症状しらべスコアー、およびＶＡＳスコアーの少なくとも１つについてｐ値が０．１以下である遺伝子であり、中心遺伝子を除いた遺伝子
（２−１）中核中間遺伝子：フリッカー値、自覚症状しらべスコアー、およびＶＡＳスコアーの１つについてｐ値が０．０５以下である遺伝子（他の１つ又は２つについてｐ値が０．１以上の遺伝子）であり、中心遺伝子を除いた遺伝子
（２−２）般中間遺伝子：少なくとも１つについてｐ値が０．１以下である遺伝子であり、中心遺伝子および中核中間遺伝子を除いた遺伝子
（３）周辺遺伝子：第一選考基準で選定した中で、中心遺伝子と中間遺伝子とを除いた遺伝子
その結果、図４〜図９に示した１３４遺伝子（１２８遺伝子＋６遺伝子）は次のように分類された。
【００４９】
超中心遺伝子として、正相関する遺伝子群中の１９遺伝子、負相関する遺伝子群中の１遺伝子を特定できた。正相関する１９遺伝子を図１０に示す。１９遺伝子中の８遺伝子（図１０の上から８行）について、発現強度のグラフを図１５に示す。負相関する１遺伝子は、図９に示したNo.4列のA_32_P199217である。図１０において、実数検定とは、実際の蛍光の強度そのもので、２条件間の値に対しｔ検定を行ったもの、倍数検定とはバックグラウンドの蛍光強度の値を差し引きしノーマライズした値に対してｔ検定を行ったものである。
【００５０】
図１０において、No.、ProbeNameは、図４〜９と同じである。６ｈ、１２ｈ、１８ｈ、２４ｈは実験開始からの経過時間を表し、第２〜５回目採血時に対応する。発現強度は、第１回目の測定値を１とした相対値である。これらのことは、以下の図１１〜１４に関しても同様である。
【００５１】
般中心遺伝子として、正相関する遺伝子群中の１７遺伝子を特定できた（負相関する遺伝子群にはなし）。それらの遺伝子を図１１に示す。
【００５２】
中核中間遺伝子として、正相関する遺伝子群中の１２遺伝子、負相関する遺伝子群中の２遺伝子を特定できた。正相関する遺伝子群中の１２遺伝子を図１２に示す。負相関する２遺伝子は、図９に示したNo.2のA_23_P171034とNo.6のA_24_P360499である。
【００５３】
般中間遺伝子として、正相関する遺伝子群中の３６遺伝子を特定できた（負相関する遺伝子群にはなし）。それらの遺伝子を図１３に示す。
【００５４】
周辺遺伝子として、正相関する遺伝子群中の４４遺伝子を特定できた（負相関する遺伝子群にはなし）。それらの遺伝子を図１４に示す。
【００５５】
さらに、生理的疲労の評価に使用する遺伝子を選択するための選択肢として、上記の第一基準に関して３つの条件、即ち（１−i）発現強度の差が２倍の遺伝子、（１−ii）発
現強度の差が１．５倍の遺伝子、（１−iii）全遺伝子  を設定し、上記の第二基準に関
して４つの条件、即ち（２−i）中心遺伝子、（２−ii）中心遺伝子および中核中間遺伝
子、（２−iii）中心遺伝子および中間遺伝子、（２−iv）中心遺伝子、中間遺伝子およ
び周辺遺伝子  を設定する。
【００５６】
上記の条件（１−i）及び条件（２−ii）を満たす遺伝子は、図１０（超中心遺伝子  
１９遺伝子）、図１１（般中心遺伝子  １７遺伝子）及び図１２（中核中間遺伝子  １２遺伝子）に示した遺伝子（合計４８遺伝子）である。従って、これら４８遺伝子の何れかを使用して、生理的疲労を評価することが望ましい。
【００５７】
また、上記の条件（１−i）及び条件（２−i）を満たす遺伝子は、図１０（超中心遺伝子  １９遺伝子）及び図１１（般中心遺伝子  １７遺伝子）に示した遺伝子（合計３６遺伝子）である。従って、これら３６遺伝子の何れかを使用して、生理的疲労を評価することが、より望ましい。
【００５８】
以上で、生理的疲労の評価に使用することができる疲労関連遺伝子を特定したので、次に、疲労関連遺伝子を使用して、生理的疲労を評価する方法について説明する。
【００５９】
まず、評価対象者から採血（以下、試料とも記す）を行う。この採血は、生理的疲労の評価を目的としたものに限定されず、別の目的で採血された血液を使用することができる。例えば、定期健康診断において採血された血液の一部を使用してもよい。
【００６０】
採血された血液について、上記した疲労関連遺伝子の発現強度を測定する。遺伝子の発現強度を測定する方法は、ノーザンブロットやＲＴＰＣＲを複数行う等、遺伝子の発現量が測定できる方法であればどのような方法を使用してもよい。例えば、ＤＮＡが固定されたマイクロアレイを用いる方法が好適である。マイクロアレイを使用する場合、試料から発現しているＤＮＡまたはＲＮＡを取りだし、必要によりＰＣＲなどを用いて増幅し、アレイに添加（適用）する。そして、温度を適当に調整して、試料中のＤＮＡとアレイ上のｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）をハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたＤＮＡの検出は蛍光色素などのマーカーを用いて検出する。マーカーを用いず、表面プラズモン共鳴や、偏光解消或いはエバネッセント光などを用いた検出法を用いることもできる。
【００６１】
なお、マイクロアレイ以外にも、ＤＮＡ固相化されたチップ、メンブレンフィルター、ビーズなどを使用することができる。また、発現解析方法としては、ノーザンブロットやＲＴＰＣＲ以外にも、リアルタイムＰＣＲ、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法などを使用することができる。
【００６２】
発現強度の測定方法に関して、一例として、上記の夜間勤務負荷実験で行った発現強度の測定を具体的に説明すれば次の通りである。
まず、ＲＮＡサンプルを調製する。分析用ＲＮＡサンプルの調製は、PreAnalytiX社のPAXgene, Blood RNA Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いた。注射器により採血した、２．５ｍｌの血液を、PAXgene, Blood RNA KitのパクスジーンＲＡＮ採血管に注入した。注入後、垂直撹拌を５回行い、採血管の試薬と血液を十分に混ぜ合わせた。採血後、最低２時間室温（１５〜２５℃）でインキュベートを行った。この過程で、血液細胞の溶解、および、ＲＮＡの安定化を行った。その後、庫内温度が−８０℃に維持された冷蔵庫にて保存した。
【００６３】
次に、ＲＮＡの抽出、逆転写、ラベリング、およびＤＮＡマイクロアレイによる分子診断を、以下の通り行った。
・採血管のＲＮＡの抽出は、PAXgene, Blood RNA Kitを用いて行った。
・トータルで５μｇのＲＮＡの抽出を行った。
・抽出したＲＮＡを用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写を行った。（T7シークエンスに結合したdTプライマーを用いた。）
・ｃＤＮＡをCyanine-3(Cy3)でラベルした（RNeasy Mini kit: (Qiagen, Hilden, Germany)）。コントロール条件、および、比較条件は、それぞれ別々に調製しCy3でラベルし、
２群のCy3-DNAを調製した。それぞれのｃＤＮＡは、別々にハイブリダイゼイションさせ
た。
・Cy3-DNAをDNA microarry（Whole Human Genome Origo Multiplex Microarry slides: (#G4112F, Agilent Technologies, Santa Clara, CA,USA）)にアプライした。６５℃、１
７時間でハイブリダイゼイションを行った。
・洗浄の後、DNA microarryのスキャナー（DNA Microarray Scanner, Model G2565BA, (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)）により、各遺伝子に対応した各スポットのCy3の蛍光を測定した。
・Cy3の強度を、バックグラウンドの蛍光強度の差分から計算し、数量化した（Feature extraction (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)）。
・相対的発現強度は、それぞれのサンプルでのCy3の蛍光強度の比較で評価した。
【００６４】
得られた疲労関連遺伝子の発現強度を、予め疲労していない状態で同様に採血及び測定された発現強度と比較して、生理的疲労を評価する。図４〜８に示した１２８遺伝子の何れかを指標とする場合、相対発現強度が有意に増大していれば、生理的疲労状態にあると判断する。また、図９に示した６遺伝子の何れかを指標として使用する場合、相対発現強度が有意に減少していれば、生理的疲労状態にあると判断する。なお、上記したように、図１０（超中心遺伝子）、図１１（般中心遺伝子）及び図１２（中核中間遺伝子）に示した４８遺伝子の何れかを、指標として使用することが望ましい。さらに、図１０（超中心遺伝子）及び図１１（般中心遺伝子）に示した３６遺伝子を、指標として使用することがより望ましい。
【００６５】
このとき、指標として、１つの遺伝子を使用して生理的疲労を判断してもよいが、複数の遺伝子を使用すればより精度よく生理的疲労を判断することができる。また、複数の遺伝子を使用する場合、発現強度を同等に扱うのではなく、それぞれの遺伝子の生理的疲労との相関性を考慮して生理的疲労を判断してもよい。例えば、上記した１３４種類の遺伝子（正相関の遺伝子１２８種類および負相関の遺伝子６種類）の群全体、または、その一部からなる遺伝子群を対象として、各遺伝子の発現強度に、相関性に応じたウエイトをかけて、加算した値を、生理的疲労の評価に用いることができる。上記した３６種類の中心遺伝子、３６種類の中心遺伝子及び１２種類の中核中間遺伝子、などの遺伝子群やその一部からなる遺伝子群に関しても同様である。これによって、さらに評価精度を高くすることができる。
【００６６】
また、特定の人に関して、定期的に、本発明の方法で疲労関連遺伝子の発現強度を測定してデータベースに記録しておけば、その人の疲労状態を把握することができ、病的疲労状態まで進行する前に適正範囲へのコントロールが可能となる。
【００６７】
また、本発明を使用して、食品や薬剤の生理的疲労への影響を評価することができる。例えば、特定の食品や薬剤を摂取する前後や、継続的に摂取する過程において、本発明を適用することで、その食品や薬剤が疲労改善に有効であるか否かを評価することができる。従って、本発明は、疲労改善に有効な食品や薬剤を開発するときの評価に使用することができる。
【００６８】
上記では、遺伝子の発現強度を測定する方法を説明したが、これに限定されず、タンパ
ク質を測定してもよい。即ち、疲労関連遺伝子によって直接的または間接的に生成されるタンパク質の、採血された血液中の量を測定してもよい。
【００６９】
また、医師などの医療従事者以外の者が採血することが法的に許される量は極少量（μｌ）であるが、本発明は極少量の血液で十分であるので、スポーツ選手などが個人で使用できる簡易型の疲労試験器（マイクロアレイ、チップ、キットなどを含む）として提供することも可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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