(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｉ：
【化１】
0005391373.tif 000008
（式中、ＲはＨ、アルキル、アルキルカルボニル、（ＨＯ）2ＰＯ−、アルキル−ＯＰＯ（ＯＨ）−、（アルキル−Ｏ）2ＰＯ−、シクロアルキル、シクロアルキルカルボニル、アリール、アリールカルボニル、ヘテロシクリル及びヘテロシクリルカルボニルである）で表される新規化合物、或いは、その立体異性体又は互変異性体又は薬学的に許容される塩。
【請求項２】
前記式Ｉの化合物において、ＲがＨである請求項１に記載の新規化合物ＰＭ１８１１０４、或いは、その立体異性体又は互変異性体又は薬学的に許容される塩。
【請求項３】
コクリア属に属する微生物（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）の発酵培養液から分離され、
（ａ）分子量１５１４、
（ｂ）分子式Ｃ69Ｈ66Ｎ18Ｏ13Ｓ5、
（ｃ）図１に示されるＵＶスペクトル、
（ｄ）図２に示されるＩＲスペクトル、
（ｅ）図３に示される1Ｈ ＮＭＲスペクトル、
（ｆ）図４に示される13Ｃ ＮＭＲスペクトル、
で特徴付けられる、抗菌活性を有する請求項２に記載の新規化合物ＰＭ１８１１０４、或いは、その立体異性体又は互変異性体。
【請求項４】
（ａ）炭素及び窒素源を含有する栄養培地中、好気的湛水条件下でコクリア属の微生物（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）或いはその変異体又は変異形の一つを培養して、化合物ＰＭ１８１１０４を生成させる工程と、
（ｂ）前記培養液から化合物ＰＭ１８１１０４を分離する工程と、
（ｃ）前記化合物ＰＭ１８１１０４を精製する工程と
を含む、請求項２又は３に記載の化合物ＰＭ１８１１０４の製造方法。
【請求項５】
化合物ＰＭ１８１１０４をその薬学的に許容される塩に変換する工程をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
化合物ＰＭ１８１１０４と、ＲＣＯＯＨの式で表される酸（式中、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルである。）とを反応させて、Ｒがアルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルである請求項１に記載の式Ｉの新規化合物を得る工程
をさらに含む請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＲがＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ、ＣＨ3（ＣＨ2）15ＣＨ2ＣＯ、又は
【化２】
0005391373.tif 000009
である請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
有効量の請求項１に記載の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤又は添加剤又は助剤とを含む医薬組成物。
【請求項９】
錠剤、コーティング錠、カプセル剤、顆粒剤、散剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、乳剤、懸濁剤又は注射液の形態である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
細菌感染の治療に適用される請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記細菌感染がブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌又はバチルス菌属に属する細菌により引き起こされる請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記細菌がブドウ球菌又は腸球菌属に属する請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ブドウ球菌属に属する細菌がメチシリン耐性である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ブドウ球菌属に属する細菌がバンコマイシン耐性である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記腸球菌属に属する細菌がバンコマイシン耐性である請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
細菌感染治療用薬剤の製造のための請求項１に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コクリア属に属する微生物（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）の発酵により得られる、抗菌性を有する新規化合物ＰＭ１８１１０４に関する。本発明はまた、ＰＭ１８１１０４の全ての立体異性体及び全ての互変異性体、並びにその薬学的に許容される塩及び誘導体を含む。本発明はさらに、新規抗菌化合物の製造方法、コクリア属に属する微生物（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）の製造、有効成分として前記新規化合物を含有する医薬組成物、並びに細菌感染により引き起こされる疾病の治療及び予防用薬剤における前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベータラクタム系抗生物質、マクロライド、キノロン及びバンコマイシンなどの多くの抗菌剤に対する耐性菌の出現は、世界中で重大な健康問題となっている（「微生物学の傾向（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、２、１９９４年、ｐ．４２２〜４２５）。医療における最も著しい問題は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ：ＭＲＳＡ）感染症の罹患率の増加である。現在、多剤耐性ＭＲＳＡ感染症の唯一の有効な治療薬はバンコマイシンである。しかしながら、いくつかのＭＲＳＡ分離株において、バンコマイシン耐性の出現の報告が多数ある（「抗菌剤及び化学療法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、１９９８年、４２、ｐ．２１８８〜２１９２）。最近出現した臨床的に重要な多剤耐性菌の他の群は腸球菌であり、それらのうちのいくつかもバンコマイシン耐性を示す。バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）感染症の出現は、医師にジレンマをもたらしている。オキサゾリジノン系化合物であるリネゾリドとストレプトグラミン系薬との組み合わせは、ＭＲＳＡ感染症を治療するのに選択される新薬である。しかしながら、これらオキサゾリジノン（「臨床感染症（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、２００３年、３６、付録１、Ｓ１１〜Ｓ２３、「薬物療法の記録（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ）」、２００３年、３７、ｐ．７６９〜７４）とストレプトグラミンとの組み合わせ（「現在の薬剤標的感染性疾患（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、２００１年、１、ｐ．２１５〜２５）及び様々な糖ペプチド（「臨床感染症（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）」、２００３年、３６、付録１、Ｓ１１〜Ｓ２３）に対する耐性は代替標的又は作用様式を有する薬剤の広範な開発を必要とする。重要な市中感染型の病原体である肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のペニシリンや他の抗菌性物質に対する耐性の増大もまた世界的な健康問題になっている。結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の多剤耐性菌株は、いくつかの国々で表面化している。耐性のある院内及び市中感染型病原体の出現及び蔓延は、世界的な公衆衛生に対する大きな脅威になっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
細菌、特にＭＲＳＡやＶＲＥなどの多剤耐性菌に感染した患者を治療する薬剤として使用できる新規化合物を見い出す差し迫った必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、コクリア属に属する微生物（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）の発酵培養液から分離される抗菌性を有する新規精製化合物（ここでは、ＰＭ１８１１０４として呼ばれる）に関する。
【０００５】
本発明は、また、（ここに記載されるように）式Ｉにより表わされるＰＭ１８１１０４の全ての立体異性体及び全ての互変異性体、並びにその薬学的に許容される塩及びエステル及びエーテル誘導体に関する。
【０００６】
化合物ＰＭ１８１１０４、並びにその異性体、薬学的に許容される塩及びエステル及びエーテル誘導体は、細菌、特にＭＲＳＡやＶＲＥなどの多剤耐性菌により引き起こされる疾病の治療及び予防に有用である。
【０００７】
本発明は、さらに、細菌、特にＭＲＳＡやＶＲＥのような多剤耐性菌により引き起こされる病状の治療のための有効成分として、新規化合物ＰＭ１８１１０４、その異性体、薬学的に許容される塩、エステル又はエーテル誘導体を含有する医薬組成物に関する。
【０００８】
本発明は、さらに、コクリア属に属する微生物（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）から、化合物ＰＭ１８１１０４及び／又はその異性体を製造する方法に関する。
【０００９】
本発明は、また、コクリア属に属する微生物（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）を製造する方法に関する。ここで、前記方法は培養によって化合物ＰＭ１８１１０４及びその異性体を製造する。
【００１０】
本発明は、また、化合物ＰＭ１８１１０４のエステル及びエーテル誘導体の製造方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、新規抗菌化合物ＰＭ１８１１０４を提供し、また、ＰＭ１８１１０４の全ての立体異性体及び全ての互変異性体、並びにその薬学的に許容される塩及びエステルそしてエーテルなどの誘導体を含む。
【００１２】
従って、本発明は次式Ｉの新規抗菌化合物に関する。
【００１３】
【化１】
0005391373.tif 000002
【００１４】
式中、ＲはＨ（ＰＭ１８１１０４）、アルキル、アルキルカルボニル、（ＨＯ）２ＰＯ−、アルキル−ＯＰＯ（ＯＨ）−、（アルキル−Ｏ）２ＰＯ−、シクロアルキル、シクロアルキルカルボニル、アリール、アリールカルボニル、ヘテロシクリル及びヘテロシクリルカルボニルである。
【００１５】
本明細書では、「アルキル」なる語は、単独及び置換基の一部のいずれで使用されていようと、直鎖又は分岐鎖アルキル基を含む飽和脂肪族基のラジカルを表す。さらに、特に明記しない限り「アルキル」なる語は、非置換アルキル基、並びに１つ以上の異なる置換基により置換されているアルキル基を含む。好ましい実施形態では、直鎖又は分岐鎖アルキルは、その骨格に２０個以下の炭素原子を有する（例えば、直鎖の場合Ｃ１〜Ｃ２０、分岐鎖の場合Ｃ３〜Ｃ２０）。１〜２０個の炭素原子を含むアルキル残基の例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘプタデシル及びエイコシル、これら全ての残基のｎ−異性体；イソプロピル、イソブチル、１−メチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル、２，２−ジメチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、イソヘキシル、２，３，４−トリメチルヘキシル、イソデシル、ｓｅｃ−ブチル又はｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。置換アルキルとは、１つ以上の水素原子、例えば、１、２、３、４又は５個の水素原子が置換基、例えば、ハロゲン、ヒドロキシル、スルホニル、アルコキシル、シクロアルキル、シアノ、アジド、アミノ、アシルオキシ、ヘテロシクロ、アラルキル、アリール或いはＮＢＤ［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］又はＢＯＤＩＰＹ［４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン基などの蛍光基と置換されたアルキル残基を意味する。
【００１６】
本明細書では、「シクロアルキル」なる語は、環構造中に３〜１０個の炭素原子、より好ましくは３、４、５、６又は７個の炭素原子を有する飽和単環又は二環系を意味する。３、４、５、６又は７個の環炭素原子を含むシクロアルキル残基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル又はシクロヘプチルが挙げられる。さらに、特に明記しない限り「シクロアルキル」なる語は、非置換シクロアルキル、並びにハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシル、アルキル、シクロアルキル、シアノ、アミノ、アミノアルキル、アシルオキシ、ヘテロシクロ、アラルキル及び／又はアリール基から選ばれる１つ以上の同一又は異なる基により置換されたシクロアルキルを含む。
【００１７】
本明細書では、「アリール」なる語は、共役π電子系を有する炭素環が少なくとも１つ存在する、１０個までの環炭素原子を有する単環式又は多環式炭化水素基を意味する。Ｃ６−Ｃ１０アリール残基の好適な例としてはフェニル、ナフチル又はビフェニルが挙げられ、特にフェニル及びナフチルが挙げられる。アリール残基、例えばフェニル又はナフチルは、一般にハロゲン、アルキル、ヒドロキシル、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、シアノよりなる群から選ばれる１個以上５個までの同一又は異なる置換基により任意に置換されていてもよい。
【００１８】
「ヘテロシクリル」なる語は５、６、７、８、９又は１０個の環原子を含む飽和、部分不飽和、若しくは芳香族単環式又は多環式複素環系を意味し、その１、２又は３個の環原子は、窒素、酸素及び硫黄から選ばれる同一又は異なるヘテロ原子である。そのようなヘテロシクリル基の好適な例としては、ピリジニル、ピペラジニル、ピペリジニル、イミダゾリル、ピロリジニル及びモルホリニルが挙げられる。多環式複素環系では、ヘテロシクリルは、２個以上の炭素が２つの隣接する環に共有される縮合環、又は環が隣接していない原子によって結合された架橋環を含んでもよい。多環式複素環系では、ヘテロシクリルは、好ましくは２つの縮合環（二環式）を含み、その少なくとも１つは５又は６員複素環である。二環式複素環基の例としては、ベンゾオキサゾリル、キノリル、イソキノリル、カルバゾリル、インドリル、イソインドリル、フェノキサジニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサジアゾリル及びベンゾフラザニルが挙げられる。ヘテロシクリル残基は、一般に、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシル、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、シアノよりなる群から選ばれる１つ以上の同一又は異なる置換基により任意に置換されていてもよい。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、式ＩにおけるＲ基は、Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ、ＣＨ３（ＣＨ２）１５ＣＨ２ＣＯ又は
【化２】
0005391373.tif 000003
を表してもよい。
【００２０】
より好ましい実施形態によれば、上記式Ｉ（式中ＲはＨ）で表される新規化合物ＰＭ１８１１０４は、コクリア属に属する微生物（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）の発酵培養液から分離され、さらに精製される。
【００２１】
新規化合物ＰＭ１８１１０４は、分子式Ｃ６９Ｈ６６Ｎ１８Ｏ１３Ｓ５（分子量１５１４）を有し、本明細書中以下に検討されるように、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量スペクトル（ＭＳ）、紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光データなどの、その物理化学及び分光特性のいずれか１つ以上で特性解析され得る。
【００２２】
新規化合物ＰＭ１８１１０４の構造は解明されており、その完全な特性解析はＨＰＬＣ、ＭＳ、ＵＶ、ＩＲ及びＮＭＲ分光データにより行われる。前記構造は生物活性１５Ｎ及び１３Ｃで標識されたＰＭ１８１１０４の三次元（３Ｄ）ＮＭＲ研究により確認された。
【００２３】
化合物ＰＭ１８１１０４並びにそのエステル及びエーテル誘導体は、細菌、特にＭＲＳＡやＶＲＥなどの多剤耐性菌に対して活性のある新規な抗生物質である。
【００２４】
化合物ＰＭ１８１１０４の製造に使用できる微生物は、以下、培養物番号ＺＭＡ Ｂ−１と呼ばれ、インドのタミールナドゥ海岸ポークベイで採取された海水試料から分離されたコクリア属の菌株（ＺＭＡ Ｂ−１／ ＭＴＣＣ ５２６９）である。
【００２５】
本発明はさらに、培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１、その変異体（ｍｕｔａｎｔ）及び変異形（ｖａｒｉａｎｔ）から化合物ＰＭ１８１１０４を製造する方法を提供し、前記方法は、１以上の炭素源及び１つ以上の窒素源並びに任意に無機栄養塩及び／又は微量元素源を含有する栄養培地中において、好気的湛水条件下で培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１を成長させる工程、培養液から化合物ＰＭ１８１１０４を分離する工程、及び関連技術分野で一般的に使用される精製法を用いて化合物ＰＭ１８１１０４を精製する工程を含む。
【００２６】
本明細書では、「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」なる語は、野生型に対する代替表現型である、変異を保因する生物又は細胞を意味する。
【００２７】
本明細書では、「変異形（ｖａｒｉａｎｔ）」なる語は、その種における任意の標準型とは認識できる程度に異なる個々の生物を意味する。
【００２８】
ＰＭ１８１１０４の産生元である培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の予備同定は、そのコロニー形態、ウェットマウント観察及びグラム染色反応の分析により行った。分離された培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の菌株の顕微鏡的研究を、寒天を１．５％含有するゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６（海水培養液２２１６）上で行い、２５℃でのインキュベーションの１、２及び３日目において観察を行った。
【００２９】
寒天を１．５％含有するゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６（海水培養液２２１６）上の成長物は、平滑な表面、橙黄色の色素沈着、規則的な縁及び柔らかな堅さを有する直径２ｍｍのコロニーとして成長する。可溶性色素はこの培養液中では観察されない。位相差光学顕微鏡検査下では球菌は４００倍の倍率で観察される。前記球菌は十分に分離及び単離されている。これらはグラム陽性であり非運動性である。観察された形態から、この生物はミクロコッカス科の仲間として分類される。分離株の同定は、その１６Ｓ  ｒＲＮＡポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で入手可能な既存の配列と比較することにより行った。培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１は、世界知的所有機関権機関（ＷＩＰＯ）が国際寄託当局（ＩＤＡ）として承認した微生物技術研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｏｒ  ３９−Ａ，Ｃｈａｎｄｉｇａｒｈ−１６０  ０３６，Ｉｎｄｉａ）の微生物系統保存機関（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＭＴＣＣ）に寄託され、受入番号ＭＴＣＣ  ５２６９が付与された。
【００３０】
本明細書中に記載の特定の微生物に加え、当然のことながら、Ｘ線や紫外線などを含む化学的及び物理学的突然変異誘発要因の使用により製造されたものや遺伝子構造が分子生物学的手法により組み換えられた生物などの変異体もまた、化合物ＰＭ１８１１０４の製造のために培養されてよい。
【００３１】
本発明の化合物を製造できる適切な変異体及び変異形のスクリーニングは、ＨＰＬＣ及び／又は培養液中に蓄積された活性化合物の生物学的活性の測定、例えば化合物の抗菌活性を試験することにより確認することができる。
【００３２】
化合物ＰＭ１８１１０４を製造する培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の分離及び培養に使用する培地及び／又は栄養培地は、好ましくは、炭素、窒素及び無機栄養塩の源を含有する。炭素源としては、例えば、スターチ、グルコース、スクロース、デキストリン、フルクトース、糖蜜、グリセロール、ラクトース又はガラクトースのうちの１つ以上が挙げられる。好ましい炭素源は、グルコースである。窒素源としては、例えば、大豆ミール、ピーナッツミール、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、麦芽エキス、コーンスチープリカー、ゼラチン又はカサミオン酸（ｃａｓａｍｉｏｎ  ａｃｉｄｓ）のうちの１つ以上が挙げられる。好ましい窒素源は、ペプトン及び酵母エキスである。無機栄養塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化ストロンチウム、臭化カリウム、フッ化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、リン酸二ナトリウム、炭酸カルシウム、重炭酸ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、クエン酸鉄（ＩＩＩ）又はホウ酸のうちの１つ以上が挙げられる。炭酸カルシウム、塩化ナトリウム及び塩化マグネシウムが好ましい。
【００３３】
培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の維持は、２１℃〜３５℃の範囲の温度及びｐＨ約６．５〜８．５で行なってもよい。典型的には、培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１は、２７℃〜２９℃及びｐＨ約７．４〜７．８に維持される。よく成長した培養物は４℃〜８℃の冷蔵庫中で保存してもよい。
【００３４】
培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の種培養の培養は、２５℃〜３５℃の範囲の温度及びｐＨ約６．５〜８．５で２０〜５５時間２００〜２８０ｒｐｍで行なってもよい。典型的には、培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の種培養は、２９℃〜３１℃及びｐＨ約７．４〜７．８で２４〜４８時間２３０〜２５０ｒｐｍで培養される。
【００３５】
化合物ＰＭ１８１１０４の製造は、２６℃〜３６℃の範囲の温度及びｐＨ約６．５〜８．５で２４〜９６時間６０〜１４０ｒｐｍ及び１００〜２００ｌｐｍの通気での発酵により、培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１を培養することにより行なわれてもよい。典型的には、培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１は、３０℃〜３２℃及びｐＨ７．４〜７．８で４０〜７２時間９０〜１１０ｒｐｍ及び１４０〜１６０ｌｐｍの通気で培養される。
【００３６】
化合物ＰＭ１８１１０４の製造は、ここに記載した条件下、好ましくは好気的湛水条件下、例えば、振とうフラスコ中並びに実験室用発酵槽中で適切な栄養培養液中で培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１を培養することにより行なうことができる。発酵及び化合物ＰＭ１８１１０４の製造の進行は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、及び公知の微生物寒天平板拡散分析法により、ブドウ球菌及び／又は腸球菌属に対する培養液の生物活性を測定することにより求めることができる。好ましい培養物は、メチシリンに対する耐性菌株である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）３０６６、文献において報告されているβラクタム系抗生物質、及びバンコマイシンに対して耐性のあるエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ２（ＶＲＥ）である。得られる培養液中において、化合物ＰＭ１８１１０４は、培養ろ液中及び細胞集団中に存在し、溶剤抽出及びカラムクロマトグラフィーなどの公知の分離方法を用いて分離され得る。したがって、化合物ＰＭ１８１１０４は、ｐＨ約５〜９で石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、ジエチルエーテル又はブタノール等の水非混和性溶媒を用いた抽出により、或いは、「ダイヤイオンＨＰ−２０（登録商標）」（三菱化成工業、日本）、「アンバーライトＸＡＤ（登録商標）」（ロームアンドハース工業、米国）などの高分子樹脂、活性炭を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、或いは、ｐＨ５〜９でのイオン交換クロマトグラフィーにより、培養ろ液から回収され得る。活性物質は、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール又はイソプロパノールのような水混和性溶媒、或いは石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル又はブタノールのような水非混和性溶媒での抽出により、細胞集団から回収され得る。他の選択肢としては、石油エーテル、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール又はブタノールから選ばれる溶媒で全培養液を抽出することが挙げられる。典型的には、活性物質は、全培養液から酢酸エチルで抽出される。抽出物を濃縮及び凍結乾燥して活性粗材料を得る。
【００３７】
本発明の化合物ＰＭ１８１１０４は、次の手法、即ち、：順相クロマトグラフィー（固定相としてアルミナ又はシリカゲル；石油エーテル、酢酸エチル、ジクロロメタン、アセトン、クロロホルム、メタノール又はそれらの組み合わせなどの溶離剤；及びＮＥｔ３などのアミンの添加を使用）；逆相クロマトグラフィー（固定相としてジメチルオクタデシルシリルシリカゲル（ＲＰ−１８）又はジメチルオクチルシリルシリカゲル（ＲＰ−８）などの逆相シリカゲル；並びに水、緩衝液（例えば、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩（ｐＨ２〜８））、及び有機溶媒（例えば、メタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフラン又はこれら溶媒の組み合わせ）などの溶離剤を使用）；ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（メタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル又はそれらの組み合わせなどの溶媒中でセファデックスＬＨ−２０（登録商標）（ファルマシア化学工業、スウェーデン）、ＴＳＫゲル（登録商標）トーヨーパールＨＷ（トーソーハース、東ソー株式会社、日本）、或いは水中でセファデックス（登録商標）Ｇ−１０及びＧ−２５などの樹脂を使用）；或いは向流クロマトグラフィー（水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、石油エーテル、ベンゼン及びトルエンなどの溶媒２つ以上からなる２相性溶離剤系を使用）のいずれかの手法を用いた分画により、粗材料から回収され得る。これらの手法を単独又は組み合わせて繰り返し使用してもよい。典型的な方法は、逆相シリカゲルクロマトグラフィー（ＲＰ−１８）である。
【００３８】
化合物ＰＭ１８１１０４及びその異性体は、それらの薬学的に許容される塩に変換され得、それら塩はすべて本発明の範囲内にある。塩は、当業者に公知の標準的な方法により調製され得、例えば、ナトリウム及びカリウム塩のような塩は化合物ＰＭ１８１１０４及びその異性体を適切なナトリウム又はカリウム塩基、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムで処理することにより調製され得る。
【００３９】
式Ｉにより表わされる化合物ＰＭ１８１１０４のエステル及びエーテルは、文献（「先進有機化学（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、第４版、Ｊ．マーチ、ジョンワイリーアンドサンズ、１９９２年）で示された方法により調製され得る。エステルはまた、文献（「医化学ジャーナル（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、３５、１９９２年、ｐ．１４５〜１５１）に記載されている方法により調製され得る。本発明の好ましい実施形態において、Ｒがアルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルである式Ｉの化合物は、ＰＭ１８１１０４と式ＲＣＯＯＨで表される適切な酸（式中、Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール又はヘテロシクリルである。）とをジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）などのカップリング剤及び触媒量のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）などの塩基の存在下で反応させることにより調製される。
【００４０】
リン酸エステルは、文献（「生物有機化学及び医薬品化学書簡（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、第４巻、第２１号、１９９４年、ｐ．２５６７〜２５７２）で報告された方法により調製され得る。エーテルは、米国特許第７，０２２，６６７号に記載されているような方法により調製され得、該特許は参照によりに本書に援用される。
【００４１】
化合物ＰＭ１８１１０４は、広範囲の菌株に対して抗菌活性を有する。化合物ＰＭ１８１１０４、その立体異性体、薬学的に許容される塩並びにエステル及びエーテルなどの誘導体は、単独若しくは組み合わせて、医薬品として及び医薬組成物の形態でヒトを含む哺乳動物などの動物に投与することができる。従って、本発明はまた、医薬品として使用する化合物ＰＭ１８１１０４、その立体異性体、その薬学的に許容される塩、並びにそのエステル及びエーテル誘導体に関し、また、抗菌活性を有する薬剤の製造のための、化合物ＰＭ１８１１０４、その立体異性体、その薬学的に許容される塩、並びにそのエステル及びエーテル誘導体の使用に関する。
【００４２】
本発明はさらに、有効量の化合物ＰＭ１８１１０４及び／又はその立体異性体及び／又は１つ以上の薬学的に許容される塩及び／又は誘導体（特に、エステル及びエーテル）を、薬学的に許容される担体と共に含有する医薬組成物に関する。化合物ＰＭ１８１１０４又はその立体異性体、若しくはその薬学的に許容される塩又はその誘導体の医薬品中での有効成分としての有効量は、通常約０．０１ｍｇ〜１００ｍｇである。
【００４３】
本発明はまた、化合物ＰＭ１８１１０４及び／又はその立体異性体及び／又は１つ以上の薬学的に許容される塩及び／又はエステル及びエーテル誘導体を含有する、細菌感染により引き起こされる疾病の治療及び予防用の薬剤の調製方法に関する。
【００４４】
本発明の化合物は、抗菌剤として特に有用である。従って、本発明は、細菌感染により引き起こされる疾病の予防又は治療用薬剤の製造のための、化合物ＰＭ１８１１０４及び／又はその立体異性体及び／又は１つ以上の薬学的に許容される塩及び／又は誘導体の使用に関する。本発明の化合物が治療に使用される細菌感染は、ブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌及びバチルス属に属する細菌により引き起こされ得る。
【００４５】
「ブドウ球菌属」なる語は、顕微鏡で観察するとブドウの房のように見え、血液寒天プレート上で成長させた時に、しばしばβ溶血を伴って、大きくて丸い黄橙色のコロニーとして出現するグラム陽性菌を意味する。ブドウ球菌属に属する黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、様々な、腫れ物、麦粒腫及びフルンケル症といった表層病変などの化膿性（膿成形性）感染症；肺炎、乳腺炎、静脈炎、脳膜炎及び尿路感染などのより重篤な感染症；並びに骨髄炎や心内膜炎などの深在性感染を引き起こす。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、外科創傷の病院内で獲得する（院内）感染及び留置医療用具に関連する感染の主要な原因である。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、食物中にエンテロトキシンを放出することによる食中毒、及び血流に超抗原を放出することによる毒素性ショック症候群を引き起こす。
【００４６】
「連鎖球菌属」なる語は、球形のグラム陽性菌属であり、ファーミキューテス門の仲間を意味する。連鎖球菌は乳酸菌である。連鎖球菌属は脳膜炎、細菌性肺炎、心内膜炎、丹毒及び壊死性筋膜炎（「人喰い」菌感染）などの感染症の原因である。
【００４７】
「腸球菌属」なる語は、ファーミキューテス門の乳酸菌属を意味する。それらは、しばしばペア（双球菌）で発生するグラム陽性球菌である。腸球菌は、通性嫌気性生物である。腸球菌は、院内感染の最多原因である。腸球菌は、ゲンタマイシン及びバンコマイシンなどの抗生物質に対して耐性を発現する。
【００４８】
「バチルス属」なる語は、周毛性鞭毛により運動性を有し好気性である多数の種々のグラム陽性桿菌を意味する。これもまたファーミキューテス門の仲間である。この属の仲間は不利な環境状況に対して高い抵抗性を有する内生胞子を形成することができる。バチルス属に属するセレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）は２種類の食物経由の中毒を引き起こす。１つ目の種類は、悪心、嘔吐及び腹部仙痛の症状で特徴付けられる。２つ目の種類は、主として腹部仙痛及び下痢により現われる。バチルス属に属する故草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に起因する感染症としては、免疫不全状態の患者における菌血症、心内膜炎、肺炎及び敗血症が挙げられる。
【００４９】
本発明の化合物は、経口、経鼻、局所、皮下、筋肉内、静脈内又は他の投与経路により投与することができる。
【００５０】
ＰＭ１８１１０４或いはその立体異性体又は薬学的に許容される塩又はエステル若しくはエーテル誘導体と共に他の薬学的活性物質を含む医薬組成物は、活性化合物と、１つ以上の薬理学的に許容される、湿潤剤、界面活性剤などの溶解剤、ベヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）、等張化剤、フィラー（ｆｉｌｌｅｒｓ）、着色剤、マスキング用着香料、滑沢剤、崩壊剤、希釈剤、結合剤、可塑剤、乳化剤、軟膏基剤、皮膚軟化薬、増粘剤、ポリマー、脂質、油、助溶剤、錯形成剤又は緩衝物質のような助剤及び／又は賦形剤とを混合し、該混合物を適切な剤型、例えば、錠剤、コーティング錠、カプセル剤、顆粒剤、散剤、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤又は非経口投与に適した溶液へ変換することにより調製され得る。
【００５１】
記載できる助剤及び／又は賦形剤の例としては、クレモフォール、ポロキサマー、塩化ベンザルコニウム、ラウリル硫酸ナトリウム、デキストロース、グリセリン、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、デンプン、デキストリン、ラクトース、セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、タルク、寒天、鉱油、動物油、植物油、有機及びミネラルワックス、パラフィン、ゲル、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、ジメチルアセトアミド、エタノール、ポリグリコール、Ｔｗｅｅｎ８０、ソルトールＨＳ１５並びに水が挙げられる。
【００５２】
ベヒクル又は希釈剤なしで、適切な形態、例えばカプセル剤として活性物質を投与することも可能である。
【００５３】
慣習どおりであるが、特定の症例において適切な剤形及び投与方法並びに投薬量域は、治療される種及びそれぞれの症状又は疾病の状態に依拠し、技術分野で公知の方法を用いて最適化できる。平均すると患者一人における活性化合物の一日量は１ｋｇ当たり０．０００５ｍｇ〜１５ｍｇ、典型的には、１ｋｇ当たり０．００１ｍｇから７．５ｍｇである。
【００５４】
以下に、本発明を説明するための実施例を示すが本発明の範囲を限定するものではない。
【００５５】
実施例１
海洋源からの培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の分離
ａ）分離培地の組成
ゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６（１．５％寒天で寒天化）
動物組織のペプシン消化物５．０ｇ、酵母エキス１．０ｇ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）０．１ｇ、塩化ナトリウム１９．４５ｇ、塩化マグネシウム８．８ｇ、硫酸ナトリウム３．２４ｇ、塩化カルシウム１.８ｇ、塩化カリウム０．５５ｇ、重炭酸ナトリウム０．１６ｇ、臭化カリウム８０．０ｍｇ、塩化ストロンチウム３４．０ｍｇ、ホウ酸２２．０ｍｇ、ケイ酸ナトリウム４．０ｍｇ、フッ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｔｅ）２．４ｍｇ、硝酸アンモニウム１．６ｍｇ、リン酸二ナトリウム８．０ｍｇ、寒天末１５．０ｇ。再蒸留水１．０Ｌ、最終ｐＨ（２５℃）７．４〜７．８。
【００５６】
ｂ）手順
海綿試料、Ｓｐｉｒａｓｔｒｅｌｌａ  ｉｎｃｏｎｓｔａｎｓ  ｖａｒ．ｄｉｇｉｔａｔａ  （Ｄｅｎｄｙ）は、スキューバダイビングで３メートルの深さからインドのタミールナドゥ海岸ポークベイから採取した。海綿試料を無菌海水ですすぎ、直ちに無菌ポリエテン容器に移した。容器を−２０℃で保存し、詳細検討のため、０℃未満の温度を維持して実験室に運んだ。実験室に到着するとすぐに、海綿試料を０℃未満で保存し、その後培養物の分離の直前に室温（２５±２℃）で解凍した。海綿試料を２×２ｃｍ片に無菌的に切断し、２５ｍＬの殺菌された試験管中の無菌海水５ｍＬの中に懸濁した。試験管を３０秒間攪拌し、海水を排出し、新しい海水を加えた。同様の工程を３度繰り返した。最後に海水を排出し、海綿片を上述の分離培地［ゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６（１．５％寒天により寒天化）、ＨｉＭｅｄｉａ］を含むペトリ皿上に置いた。ペトリ皿中で成長が観察されるまで、ペトリ皿を室温（２５±２℃）で培養した。ペトリ皿上で成長したコロニーをコロニーの特徴に基づき分離し、上述の分離培地［ゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６（１．５％寒天により寒天化）、ＨｉＭｅｄｉａ）を含むペトリ皿上に線画した。純粋な培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１が得られるまで分離株を繰り返し二次培養した。このようにして、培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１を成長している微生物の中から単一の分離株として分離した。
【００５７】
実施例２
培養物番号ＺＭＡＢ−１の精製
ａ）分離培地の組成
ゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６（１．５％寒天により寒天化）
ペプトン５．０ｇ、酵母エキス１．０ｇ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）０．１ｇ、塩化ナトリウム１９．４５ｇ、塩化マグネシウム８．８ｇ、硫酸ナトリウム３．２４ｇ、塩化カルシウム１．８ｇ、塩化カリウム０．５５ｇ、重炭酸ナトリウム０．１６ｇ、臭化カリウム０．０８ｇ、塩化ストロンチウム３４．０ｍｇ、ホウ酸２２．０ｍｇ、ケイ酸ナトリウム４．０ｍｇ、フッ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｔｅ）２．４ｍｇ、硝酸アンモニウム１．６ｍｇ、リン酸二ナトリウム８．０ｍｇ、寒天１５．０ｇ、脱塩水１．０Ｌ、ｐＨ７．４〜７．８。
【００５８】
ｂ）手順
培養物は直径１５ｍｍのペトリ皿中のゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６（１．５％寒天により寒天化）上で得られた。ペトリ皿上の増殖物を傾斜ゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６（１．５％寒天により寒天化）上に線画した。この斜面培地を２５℃で２日間培養した。斜面培地の上部からの単一コロニーの１つを新しい斜面培地に移した。この斜面培地を２５℃で２日間培養した。次に、斜面培地を、抗感染性の一次スクリーニングのため、振とうフラスコ発酵に使用した。
【００５９】
実施例３
産生株（培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１）の維持
ａ）培地（ゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６）の組成
ペプトン５．０ｇ、酵母エキス１．０ｇ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）０．１ｇ、塩化ナトリウム１９．４５ｇ、塩化マグネシウム８．８ｇ、硫酸ナトリウム３．２４ｇ、塩化カルシウム１．８ｇ、塩化カリウム０．５５ｇ、重炭酸ナトリウム０．１６ｇ、臭化カリウム０．０８ｇ、塩化ストロンチウム３４．０ｍｇ、ホウ酸２２．０ｍｇ、ケイ酸ナトリウム４．０ｍｇ、フッ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｔｅ）２．４ｍｇ、硝酸アンモニウム１．６ｍｇ、リン酸二ナトリウム８．０ｍｇ、寒天１５．０ｇ、脱塩水１．０Ｌ、ｐＨ７．４〜７．８。
【００６０】
ｂ）加熱により材料を完全に溶解した後に、得られた溶液を試験管に分配し、１２１℃で３０分間殺菌した。試験管を冷却し斜位にて凝固させた。寒天斜面培地に、ワイヤループにより培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の増殖物で線画し、良好な成長が観察されるまで２７〜２９℃で培養した。よく成長した培養物を４〜８℃の冷蔵庫内に保存した。
【００６１】
実施例４
振とうフラスコ中の培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の発酵
ａ）シード培地（ゾーベルマリンブロス（Ｚｏｂｅｌｌ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｂｒｏｔｈ）２２１６）の組成
ペプトン５．０ｇ、酵母エキス１．０ｇ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）０．１ｇ、塩化ナトリウム１９．４５ｇ、塩化マグネシウム８．８ｇ、硫酸ナトリウム３．２４ｇ、塩化カルシウム１．８ｇ、塩化カリウム０．５５ｇ、重炭酸ナトリウム０．１６ｇ、臭化カリウム０．０８ｇ、塩化ストロンチウム３４．０ｍｇ、ホウ酸２２．０ｍｇ、ケイ酸ナトリウム４．０ｍｇ、フッ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｔｅ）２．４ｍｇ、硝酸アンモニウム１．６ｍｇ、リン酸二ナトリウム８．０ｍｇ、脱塩水１．０Ｌ、ｐＨ７．４〜７．８。
【００６２】
ｂ）上記培地を５００ｍｌの三角フラスコに４０ｍｌの分量で分配し、１２１℃で３０分間加圧滅菌した。フラスコを室温に冷却し、各フラスコにおいて１白金耳量のよく成長した産生株（培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１）を斜面培地に播種し、２４〜４８時間、２３０〜２５０ｒｐｍ、３０℃（±１℃）で回転式振とう培養機で振とうして種培養を得た。
【００６３】
ｃ）生産培地の組成
ペプトン５．０ｇ、酵母エキス１．０ｇ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）０．１ｇ、塩化ナトリウム１９．４５ｇ、塩化マグネシウム８．８ｇ、硫酸ナトリウム３．２４ｇ、塩化カルシウム１．８ｇ、塩化カリウム０．５５ｇ、重炭酸ナトリウム０．１６ｇ、臭化カリウム０．０８ｇ、塩化ストロンチウム３４．０ｍｇ、ホウ酸２２．０ｍｇ、ケイ酸ナトリウム４．０ｍｇ、フッ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｔｅ）２．４ｍｇ、硝酸アンモニウム１．６ｍｇ、リン酸二ナトリウム８．０ｍｇ、脱塩水１．０Ｌ、ｐＨ７．４〜７．８。
【００６４】
ｄ）容量５００ｍｌの三角フラスコ中で４０ｍｌの生産培地を１２１℃で３０分間加圧滅菌し、２９〜３０℃に冷却して、実施例４ｂに記載の種培養を２ｍｌ播種した。
【００６５】
ｅ）発酵パラメーター
温度：２９〜３０℃、撹拌：２３０〜２５０ｒｐｍ、集菌時間：４８〜７２時間
【００６６】
発酵培養液中の化合物ＰＭ１８１１０４の産生は、寒天拡散法を用いてエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ２（ＶＲＥ）及び／又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）３０６６ＭＲＳＡ株に対する生物活性を試験することにより判定した。培養液の集菌ｐＨは７．０〜８．０であった。培養液を採取し、全培養液を、発酵培養液中の化合物ＰＭ１８１１０４の存在を示す生物活性試験に使用した。
【００６７】
実施例５
発酵用振とうフラスコでの種培養の調製
ａ）培地の組成
ペプトン５．０ｇ、酵母エキス１．０ｇ、クエン酸鉄（ＩＩＩ）０．１ｇ、塩化ナトリウム１９．４５ｇ、塩化マグネシウム８．８ｇ、硫酸ナトリウム３．２４ｇ、塩化カルシウム１．８ｇ、塩化カリウム０．５５ｇ、重炭酸ナトリウム０．１６ｇ、臭化カリウム０．０８ｇ、塩化ストロンチウム３４．０ｍｇ、ホウ酸２２．０ｍｇ、ケイ酸ナトリウム４．０ｍｇ、フッ素酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒａｔｅ）２．４ｍｇ、硝酸アンモニウム１．６ｍｇ、リン酸二ナトリウム８．０ｍｇ、脱塩水１．０Ｌ、ｐＨ７．４〜７．８。
【００６８】
ｂ）上記培地を１Ｌの三角フラスコに２００ｍｌの分量で分配し、１２１℃で３０分間加圧滅菌した。フラスコを室温に冷却し、各フラスコにおいて１白金耳量のよく成長した産生株（培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１）を斜面培地に播種し、２４〜４８時間、２３０〜２５０ｒｐｍ、２９〜３１℃（±１℃）で回転式振とう培養機で振とうし、種培養を得た。
【００６９】
実施例６
発酵槽での培養物番号ＺＭＡ  Ｂ−１の培養
ａ）生産培地の組成
グルコース５０．０ｇ、酵母エキス１１．０ｇ、ペプトン４．０ｇ、牛肉エキス４．０ｇ、炭酸カルシウム５ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、脱塩水１Ｌ、ｐＨ７．６（殺菌前）。
【００７０】
ｂ）３００Ｌの発酵槽中の２５０Ｌの生産培地を、消泡剤としての８０ｍｌのデスモフェンと一緒に、１２１℃で３０分間その場所で殺菌し、２９〜３１℃に冷却して、実施例５ｂに記載の種培養を６Ｌ播種した。
【００７１】
ｃ）発酵パラメーター
温度：３０〜３２℃、撹拌：１００ｒｐｍ、通気：１５０ｌｐｍ、集菌時間：４４〜６６時間
【００７２】
発酵培養液中の化合物ＰＭ１８１１０４の産生は、寒天拡散法を用いて、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）３０６６（ＭＲＳＡ株）及び／又はエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ２（ＶＲＥ）に対する生物活性を試験することにより判定した。培養液の集菌ｐＨは７．０〜８．０であった。培養液を採取し、全培養液を化合物ＰＭ１８１１０４の分離及び精製に使用した。
【００７３】
実施例７
化合物ＰＭ１８１１０４の分離及び精製
実施例６の全培養液（２４０Ｌ）を採取し、酢酸エチル（２４０Ｌ）を用いてガラス容器中で撹拌することにより抽出した。有機層をディスクスタックセパレータ（アルファラバル株式会社、型番ＬＡＰＸ４０４）を用いて分離し、濃縮して粗抽出物（２９６ｇ）を得た。得られた粗材料を石油エーテル（３×１Ｌ）を用いて３０分間撹拌及び超音波処理し、ろ過して不溶残渣（３８ｇ）を得、これを以下方法を用いて真空液体クロマトグラフィーにより分画した。
【００７４】
不溶残渣（３５．５ｇ）を、メタノール及びアセトニトリルの混合物（３：１、４００ｍｌ）に溶解し、リクロプレップＲＰ−１８［２５〜４０μ，４０ｇ）に前吸着し、リクロプレップＲＰ−１８（２５〜４０μ，１１０ｇ）吸着材が充填されたフリットろ過漏斗（Ｇ−４グレード、１０ｃｍ×１０．５ｃｍ）に導入した。家庭用真空掃除器（１００〜１２０ｍｍ）を用いた溶出は、まず水（４Ｌ）、次に水：メタノール（１：１、５Ｌ）、メタノール（３Ｌ）、メタノール：アセトニトリル（２．５Ｌ）、及びアセトニトリルで行った。精製のモニタリングは、エンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ２及び／又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）３０６６対するバイオアッセイ及び／又は分析的ＨＰＬＣにより行なった。化合物ＰＭ１８１１０４はメタノール、メタノール：アセトニトリル、及びアセトニトリル画分中で検出された。同様の画分を貯留し、濃縮して半純粋物質（１．８２６ｇ）を得た。
【００７５】
最終精製は下記条件で分取ＨＰＬＣを繰り返して行なった。
【００７６】
カラム：ＥｕｒｏｓｐｈｅｒＲＰ−１８（１０μ、３２×２５０ｍｍ）
溶離剤：アセトニトリル：水（５６：４４）
流量：５０ｍｌ／分
検出（ＵＶ）：２２０ｎｍ
保持時間：１２〜１４分
【００７７】
画分の純度は、エンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ２及び／又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）３０６６対するバイオアッセイ及び／又は分析的ＨＰＬＣにより調べた。溶媒を除去するために化合物ＰＭ１８１１０４を含有する溶出液を減圧下で貯留及び濃縮し、６００ｍｇの純粋化合物を得た。
【００７８】
化合物ＰＭ１８１１０４の物理化学及び分光特性
外観：白色非晶質固体
融点：＞３００℃（分解）
溶解度：メタノール、ＤＭＳＯ
ＨＰＬＣ：Ｒｔ５．６１分
カラム：クロマシルＣ１８（５μ、１５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．）（カラム温度４０℃）
移動相：アセトニトリル：水（１：１）
注入量：１０μｌ（移動相中で０．１ｍｇ／ｍｌの濃度）
流量：１ｍｌ／分
検出：２２０ｎｍ
ＨＲ-ＥＳＩ（＋）ＭＳ  ｍ／ｚ：１５１５．３７３３（Ｍ＋Ｈ）
分子式：Ｃ６９Ｈ６６Ｎ１８Ｏ１３Ｓ５
分子量：１５１４
ＵＶ（ＭｅＯＨ）：２０５．２、２２０．６及び３０６．２ｎｍ（図１参照）
ＩＲ（ＫＢｒ）：３３６８、２９８１、１６５４、１５１６、１４２９、１３１４、１１９９、１２６９、１０７４、１０３４、８０５、５８０ｃｍ−１（図２参照）
１ＨＮＭＲ：表１及び図３参照
１３ＣＮＭＲ：表２及び図４参照
【００７９】
【表１】
0005391373.tif 000004
【００８０】
【表２】
0005391373.tif 000005
【００８１】
化合物ＰＭ１８１１０４の生物学的評価
インビトロアッセイ
実施例８
インビトロでの効力は、米国臨床研究所規格委員会（２０００）のガイドライン［抗菌剤化学療法ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ）、５０、２００２年、ｐ．１２５〜１２８（クロスリファレンス８：好気的に増殖する細菌に対する希釈抗菌物質感受性試験法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  Ｇｒｏｗ  Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ）、第５版：承認規格（Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）Ｍ７−Ａ５、ＮＣＣＬＳ、ウェイン、ＰＡ、ＵＳＡ））によるマクロブロス希釈法を用いた菌株に対する化合物ＰＭ１８１１０４の最小阻止濃度（ＭＩＣ）測定により確定した。特に明記しない限り、ミュラーヒントン培養液をアッセイの培養液として使用した。リネゾリド（グレンマーク製薬製、バッチ番号Ｋ２００５０２８）を全インビトロ実験におけるの公知の標準物として使用した。保存溶液の調製のため、化合物ＰＭ１８１１０４をクロロホルム（全必要容量の５％）に溶解し、メタノール（全必要容量の９５％）を用いて希釈した。
【００８２】
結果
得られた結果を下記表３に示す。この結果は、化合物ＰＭ１８１１０４が細菌感染の治療に有用性を有することを示す。
【００８３】
【表３】
0005391373.tif 000006
【００８４】
表３中で使用される略語は次のとおりである。
Ｓ：ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
Ｅ：腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）
Ｂ：バチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
【００８５】
インビボアッセイ
インビボでの効力は、雄又は雌いずれかのＢａｌｂ／Ｃマウスを用いた３つの動物モデルにおける、抗生物質活性についての化合物ＰＭ１８１１０４の感染防御量（ＰＤ）測定により確定した。使用したモデルは汎用有効性試験モデル及び臓器／組織特異的有効性試験モデルであった。使用した汎用有効性試験モデルは、全身感染モデル（敗血症）及び局所感染モデル（好中球減少性大腿部モデル）であった。使用した有効性試験用臓器／組織特異的感染モデルは、腎臓、肺感染症及び皮膚膿瘍モデルであった。
【００８６】
実施例９
全身感染モデル
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）Ｅ７１０（ＭＲＳＡ）を一晩成長させ生理食塩液（０．８５％塩化ナトリウム）に懸濁した培養物を、〜１０８から１０９ｃｆｕで前記動物に腹腔内感染させた。実施例１４に記載のように、クレモホール−エタノール製剤でＰＭ１８１１０４溶液を調製した。該溶液を感染直後に５ｍｇ、２．５ｍｇ及び１．２５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与した。各実験群は１０匹の動物で構成された。敗血症モデルに対するＰＭ１８１１０４のＰＤ１００は、標準抗生物質であるリネゾリド（グレンマーク製薬製、バッチ番号Ｋ２００５０２８）のＰＤ１００が２５ｍｇ／ｋｇを示すのに対して、５ｍｇ／ｋｇであると測定された。
【００８７】
実施例１０
好中球減少性大腿部モデル
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｅ−７１０感染の９６時間及び２４時間前にマウスをシクロホスファミド（それぞれ１５０ｍｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）で好中球減少症にした。前記動物に、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｅ７１０を一晩成長させ生理食塩水（０．８５％塩化ナトリウム）に懸濁した培養物を、〜１０７ｃｆｕで大腿部に筋肉内感染させた。各実験群は６匹の動物で構成された。実施例１４に記載のように、クレモホール−エタノール製剤でＰＭ１８１１０４溶液を調製した。溶液を感染２時間後に５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与した。前記動物を様々な時点で屠殺し、大腿組織を採取して生菌数を測定した。６時間後時点において、５ｍｇ／ｋｇの投与量のＰＭ１８１１０４では、ほぼ１ｌｏｇの減少が観察され、これは２５ｍｇ／ｋｇの投与量の標準抗生物質、すなわち、リネゾリド（グレンマーク製薬製、バッチ番号Ｋ２００５０２８）と同等であった。
【００８８】
実施例１１
腎臓感染モデル
０．２ｍｌの２％λカラギーナンを感染の７日前にＢａｌｂ／Ｃマウスに静脈内投与した。一晩成長させたエンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）ＡＴＣＣ４７０７７の対数期培養物を約１０９ｃｆｕ／ｍｌに調整し、０．２ｍｌの容量でマウスに静脈内注射した。実施例１４に記載のように、クレモホール−エタノール製剤で調製したＰＭ１８１１０４溶液を、感染の４時間、２４時間及び４８時間後にマウスに静脈内投与した。感染の７２時間後に動物を屠殺し、腎臓を採取して細菌負荷を測定した。５ｍｇ／ｋｇの投与量のＰＭ１８１１０４では、ほぼ１ｌｏｇの細菌数の減少が観察され、これは標準抗生物質、すなわち、５ｍｇ／ｋｇの投与量のリネゾリド（グレンマーク製薬製、バッチ番号Ｋ２００５０２８）及び１５０ｍｇ／ｋｇの投与量の塩酸バンコマイシン（ＨｉＭｅｄｉａ製、カタログ番号ＲＭ２１７−５００ｍｇ、ロット番号０６−０３５０）と同等であった。
【００８９】
実施例１２
肺感染モデル
感染の４日前及び２日前に２００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドを腹腔内投与することにより、Ｂａｌｂ／Ｃマウスを好中球減少症にした。感染当日にマウスを麻酔し、ほぼ１０６〜１０７ｃｆｕ／ｍｌの細菌密度を有する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｅ−７１０対数期培養物懸濁液で感染させた。感染の２４時間後及び３６時間後に、第１と第２それぞれの投与量の薬物を静脈内投与した。感染の４８時間後に動物を人道的に安楽死させ、その肺を無菌的に採取して生菌数を測定した。このモデルでは、実施例１４に記載のように、クレモホール−エタノール製剤で調製したＰＭ１８１１０４を５ｍｇ／ｋｇの投与量で試験した。２つの標準抗生物質、すなわちリネゾリド（８０ｍｇ／ｋｇ、感染の２４時間後に単回投与）及びバンコマイシン（１１０ｍｇ／ｋｇ、感染の２４時間後及び４８時間後に２回投与）を陽性対照として使用した。ＰＭ１８１１０４はリネゾリド（グレンマーク製薬製、バッチ番号：Ｋ２００５０２８）標準物と同等の静菌作用を示した。塩酸バンコマイシン（ＨｉＭｅｄｉａ製、カタログ番号ＲＭ２１７−５００ｍｇ、ロット番号０６−０３５０）標準物は殺菌性を示した。ＰＭ１８１１０４で処置された動物の肺の細菌数は、未処置の対照動物の肺の細菌数と比較して、ほぼ２ｌｏｇの差があった。
【００９０】
実施例１３
皮膚膿瘍モデル
一晩成長させたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｅ７１０（ＭＲＳＡ）の培養物約１０８ｃｆｕを、Ｂａｌｂ／Ｃマウスに皮下感染させた。この細菌は、２％サイトデックスビーズと生理食塩水（０．８５％塩化ナトリウム）の１：１混合物に懸濁していた。実施例１４に記載のように、クレモホール−エタノール製剤でＰＭ１８１１０４溶液を調製した。この溶液を２．５ｍｇ、５ｍｇ及び１０ｍｇ／ｋｇの投与量で感染の２時間後に静脈内投与した。各実験群は６匹の動物で構成された。膿瘍形成後、動物を屠殺し、膿瘍を採取して生菌数を測定した。５ｍｇ／ｋｇの投与量のＰＭ１８１１０４では、ほぼ１ｌｏｇの細菌数の減少が観察され、これは５０ｍｇ／ｋｇの投与量の標準抗生物質、すなわち、リネゾリド（グレンマーク製薬製、バッチ番号Ｋ２００５０２８）と同等であった。
【００９１】
化合物ＰＭ１８１１０４の製剤化
実施例１４
注射製剤を次の一般的な方法により調製した。
エタノール及びクレモホールＥＬを１：１の割合（重量で）で混合した。これにＰＭ１８１１０４を加えて撹拌した。この混合物を２５℃で超音波処理した。この混合物（これを１０％の構成要素と考える）を水（９０％）を加えて希釈し、撹拌して注射製剤を得た。
【００９２】
化合物ＰＭ１８１１０４の誘導体
実施例１５
ＰＭ１８１１０４の酪酸エステル誘導体
ジクロロメタン（２ｍｌ）に溶解したＰＭ１８１１０４（０．１３ｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）の溶液に、酪酸（０．００８μｌ、０．０８５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．０１８ｇ、０．０８５ｍｍｏｌ）及び触媒量のＤＭＡＰ（０．００２ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を窒素雰囲気下で１８時間撹拌した。反応混合物に冷水を添加し、有機層を分離した。水層をジクロロメタン（３×５０ｍｌ）で抽出し、有機抽出物を貯留し、水洗（２×３０ｍｌ）した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー［シリカゲル（６０〜１２０メッシュ）、クロロホルム中４％メタノール）を用いて粗生成物を精製し、表題化合物を白色固形物として得た。収率：０．１１ｇ（８１％）、ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：１５８５（Ｍ＋Ｈ）、
ＰＭ１８１１０４の酪酸エステル誘導体は、エンテロコッカスフェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ−２（ＶＲＥ）菌株に対して、２．５μｇ／ｍｌのＭＩＣ値を示した。
【００９３】
実施例１６
ＰＭ１８１１０４のステアリン酸エステル誘導体
ジクロロメタン（２ｍｌ）に溶解したＰＭ１８１１０４（０．１２ｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）の溶液に、ステアリン酸（０．０２２μｌ、０．０７９ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．０１６ｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）及び触媒量のＤＭＡＰ（０．００２ｇ、０．０１６ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を窒素雰囲気下で６時間撹拌した。反応混合物に冷水を添加し、有機層を分離した。水層をジクロロメタン（３×５０ｍｌ）で抽出し、有機抽出物を貯留し、水洗（２×３０ｍｌ）した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮した。カラムクロマトグラフィー［シリカゲル（６０−１２０メッシュ）、クロロホルム中４％メタノール］を用いて粗生成物を精製し、表題化合物を白色固形物として得た。収率：０．１ｇ（７１％）、ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：１７８１（Ｍ＋Ｈ）。
【００９４】
ＰＭ１８１１０４のステアリン酸エステル誘導体は、エンテロコッカスフェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）Ｒ−２（ＶＲＥ）菌株に対して１.２５μｇ／ｍｌのＭＩＣ値を示した。
【００９５】
実施例１７
ＰＭ１８１１０４のニコチン酸エステル誘導体
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解したＰＭ１８１１０４（０．０２ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の溶液に、ニコチン酸（０．００８ｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（０．０１４ｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）及び触媒量のＤＭＡＰ（０．０００８ｇ、０．００６５ｍｍｏｌ）を添加し、この反応混合物を窒素雰囲気下で１８時間撹拌した。溶媒を除去し、残渣に１０ｍｌのジクロロメタンを添加した。不溶解尿素をろ過し、ろ液を水洗（２×１０ｍｌ）した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮乾固した。カラムクロマトグラフィー［Ｃ−１８逆相カラム（Ｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ、２０ｎｍ）、水中５５％アセトニトリル］により粗生成物を精製し、表題化合物を白色固形物として得た。収率：０．０１１ｇ（５６％）、ＭＳ  ｍ／ｚ（ＥＳＩ）：１６２１（Ｍ＋Ｈ）。
【００９６】
ＰＭ１８１１０４のニコチン酸エステル誘導体を菌株に対して試験した。得られた結果を下記表４に示す。この結果は、化合物ＰＭ１８１１０４のニコチン酸エステル誘導体が細菌感染の治療に有用であることを示す。
【００９７】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
図１は、ＰＭ１８１１０４の紫外線吸収（ＵＶ）スペクトルを示す。
図２は、ＰＭ１８１１０４の赤外線吸収（ＩＲ）スペクトルを示す。
図３は、ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＰＭ１８１１０４の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ）を示す。
図４は、ＤＭＳＯ−ｄ６におけるＰＭ１８１１０４の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（１２５ＭＨｚ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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