(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オニノヤガラ多糖の硫酸化誘導体の、抗腫瘍薬の製造における使用であって、
前記オニノヤガラ多糖は、オニノヤガラから抽出され、且つ下記構造式で表され：
【化１】
0005513510.tif 000003
（式中、ｘとｙは整数であり、かつｘ＋ｙ＝１６の関係を満たし、ｎは整数である）、
前記オニノヤガラ多糖は、そのピークトップ分子量が２．８×１０５であり、０．５ｍｇ／ｍＬの水溶液における比旋光度が＋９５°であり、
前記硫酸化誘導体は、主にオニノヤガラ多糖の６位におけるヒドロキシ基が硫酸化されている誘導体であり、そのピークトップ分子量が６．５×１０４であり、０．５ｍｇ／ｍＬの水溶液における比旋光度が＋１５０．０°である、前記使用。
【請求項２】
オニノヤガラ多糖の硫酸化誘導体を含有する、抗腫瘍薬であって、
前記オニノヤガラ多糖は、オニノヤガラから抽出され、且つ下記構造式で表され：
【化２】
0005513510.tif 000004
（式中、ｘとｙは整数であり、かつｘ＋ｙ＝１６の関係を満たし、ｎは整数である）、
前記オニノヤガラ多糖は、そのピークトップ分子量が２．８×１０５であり、０．５ｍｇ／ｍＬの水溶液における比旋光度が＋９５°であり、
前記硫酸化誘導体は、主にオニノヤガラ多糖の６位におけるヒドロキシ基が硫酸化されている誘導体であり、そのピークトップ分子量が６．５×１０４であり、０．５ｍｇ／ｍＬの水溶液における比旋光度が＋１５０．０°である、前記抗腫瘍薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オニノヤガラから抽出されたオニノヤガラ多糖硫酸化誘導体、その製造方法及び抗腫瘍薬を製造するための用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉｄ１は、ｂＨＬＨ型転写因子ファミリー中のＤＮＡ結合阻害タンパク質の一種であり、核内に局在し、血管生成に必要な促進因子の一種である。Ｉｄ１は、多数の腫瘍における発現レベルが高いが、正常組織における発現レベルが比較的に低くなり、優れた腫瘍標的である。これにより、Ｉｄ１を用いて、低毒性、効率性、及び強い特異性を有する抑制剤を開発することは、抗腫瘍薬を開発するための注目点となっている。現在まで、特異的に内皮細胞を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドＩｄ１−ＰＣＡＯと、転移性乳癌細胞におけるＩｄ１の発現を阻害できる低分子カンナビジオール  （Ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ）と、が報告された。しかし、アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬物とするには、まだ様々な技術的な問題が存在しており、且つカンナビジオールがカンナビノイド類似体であるので、それらのいずれも良い候補薬ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
オニノヤガラ（Ｇａｓｔｒｏｄｉａ  ｅｌａｔａ  ＢＬ．）は有名な伝統漢方薬であり、今まで、そのうちの多糖と多糖類似体に関する正式的な報告がまだ公開されていない。本発明者は、オニノヤガラからオニノヤガラ多糖を分離して、さらにその得られたオニノヤガラ多糖から、硫酸化で誘導することによってオニノヤガラ多糖硫酸化誘導体（ＷＳＳ２５）が得られた。ＷＳＳ２５は、その用量を２５μｇ／ｍｌとする場合、Ｉｄ１  ｍＲＮＡレベルとタンパク質レベルの発現を略完全に抑制できるため、血管生成を抑制でき、さらに腫瘍の成長を抑制できる。しかも、内皮細胞に対して殆ど細胞毒性を有しないため、低毒性かつ効率性を有するＩｄ１抑制剤である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
したがって、本発明の一つの目的は、オニノヤガラから抽出されたオニノヤガラ多糖硫酸化誘導体を提供することである。そのオニノヤガラ多糖の構造式は、以下のようである：
【化１】
0005513510.tif 000002
その中、ｘとｙは整数であり、かつｘ＋ｙ＝１６の関係を満たし、
ｎは整数であり、かつそのピークトップ分子量が２．８×１０５であり、０．５ｍｇ／ｍＬの水溶液における比旋光度が＋９５°であり、
該オニノヤガラ多糖硫酸化誘導体は、主にオニノヤガラ多糖の６位におけるヒドロキシ基の硫酸化誘導体であり、そのピークトップ分子量が６．５×１０４であり、０．５ｍｇ／ｍＬの水溶液における比旋光度が＋１５０．０°である。
【０００５】
本発明のもう一つの目的は、オニノヤガラ多糖硫酸化誘導体の製造方法を提供することであり、その方法について、具体的に、
１）水抽出粗多糖（ＷＧＥ）の製造ステップ：乾燥のオニノヤガラ飲片をエタノールで脱脂させ、乾燥してから、熱水で２〜５回繰り返して抽出し、抽出液を合併し、その得られた抽出液を濃縮してトリクロロ酢酸で脱タンパク質させ、遠心分離して得られた上澄み液を、中和・透析・濃縮して、濃縮液が得られ、濃縮液の体積の２〜５倍のエタノールを加え、遠心分離して沈殿が得られて、その沈殿を真空乾燥して、水抽出粗多糖ＷＧＳが得られるステップと、
２）オニノヤガラ多糖（ＷＧＥＳＣ１Ａ）の製造ステップ：前記ステップ１）で得られた水抽出粗多糖ＷＧＥに、適量の水を加えて溶解させ且つ遠心分離して上澄み液が得られ、ジエチルアミノエチルセルロース「ＤＥＡＥ−セルロース（Ｃｌ−１型）」をキャリアとして当該上澄み液に対してカラムクロマトグラフィーを行い、それぞれ水、０．１〜０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ溶液を用いてグラジェント溶離を行い、その中、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌの溶離液を濃縮・透析・冷凍乾燥して、白色綿状固体のオニノヤガラ多糖ＷＧＥＳＣ１Ａが得られるステップと、
３）オニノヤガラ多糖硫酸化誘導体（ＷＳＳ２５）の製造ステップ：分子篩で処理したピリジンを氷浴で冷却させてから、ピリジンにクロロスルホン酸を一滴ずつ滴加してエステル化剤を調製し、分子篩で処理したホルムアミドにオニノヤガラ多糖を溶解させ、該溶液を氷浴で冷却させ、その後、該溶液中に前記調製されたエステル化剤を一滴ずつ滴加し、反応が終了してから、反応液のｐＨを７．８まで調節し、濃縮を行い、得られた濃縮液を飽和ＮａＨＣＯ３溶液に対して透析を行ってから、水に対して透析を行うようにして、透析袋内液を冷凍乾燥してオニノヤガラ多糖硫酸化誘導体ＷＳＳ２５が得られるステップと、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＷＧＥＳＣ１Ａの１３Ｃ  ＮＭＲのスペクトルである。
【図２】ＷＳＳ２５の１３Ｃ  ＮＭＲのスペクトルである。
【図３】Ｉｄ１−ｌｕｃ／ＨＥＫ２９３細胞におけるルシフェラーゼの発現に対するＷＳＳ２５の影響を示す図である。
【図４】異なる濃度でＨＭＥＣ−１のマトリジェンにおける管腔形成に対するＷＳＳ２５の抑制作用を示す図である。
【図５】異なる濃度及び異なる処理時間でＨＭＥＣ−１細胞成長に対するＷＳＳ２５の影響を示す図である。
【図６】肝臓癌細胞Ｂｅｌ７４０２のマウスにおける移植腫の成長に対するＷＳＳ２５の抑制作用を示す図である。
【図７】肝臓癌細胞ＳＭＭＣ７７２１のマウスにおける移植腫の成長に対するＷＳＳ２５の抑制作用を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
具体的に、ステップ１）において、乾燥なオニノヤガラ飲片を取り、９５ｗｔ％のエタノールで一週間脱脂させ、脱脂してから室温で自然に乾燥して、乾燥後、抽出液をフェノール−硫酸で検査する場合に明らかな反応がなくなるまで、１００℃の水でオニノヤガラ飲片を繰り返して浸漬させ、各回の抽出液を合併して加熱・濃縮を行い、その得られた濃縮液を冷却させてから、１５％（Ｗ／Ｖ）のトリクロロ酢酸で脱タンパク質を行い、遠心分離して、得られた上澄み液を１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐＨ７．０程度に中和させ、流動水に対して７２時間透析し、内液を小体積に濃縮し、攪拌するとともに３倍体積の９５ｗｔ％のエタノールを加えて、一晩放置し、上澄み液を除き、遠心分離して得られた沈殿にそれぞれ２倍体積の無水エタノールとアセトンで洗浄して脱水させ、遠心分離して、得られた沈殿を４０℃で真空乾燥して、水抽出粗多糖ＷＧＥが得られる。
ステップ２）において、水抽出粗多糖ＷＧＥを取り、適量の水で溶解させ、遠心分離して不溶物を除去し、上澄み液をジエチルアミノエチルセルロース「ＤＥＡＥ−セルロース（Ｃｌ−１型）」カラムで分離する。そして、水、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌの順で溶離を行い、フェノール−硫酸法で溶離曲線を作成し、その溶離曲線に応じて溶離液をそれぞれ採取・合併して、その中、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌの溶離液を濃縮し、蒸留水に対して透析を行い、得られた透析袋内液を冷凍乾燥して、オニノヤガラ多糖ＷＧＥＳＣ１Ａが得られる。
前記ステップ３）において、４Åの分子篩で処理されたピリジンを氷浴で冷却させてから、クロロスルホン酸／ピリジンＶ／Ｖ＝２：１になるように、ピリジンにクロロスルホン酸を一滴ずつ滴加してエステル化剤を調製し、８ｍＬの４Åの分子篩で処理したホルムアミド毎に、１５８．９ｍｇのオニノヤガラ多糖を溶解させ、該溶液を氷浴で０℃に冷却させてから、溶液中に２ｍＬの新しく調製されたエステル化剤を一滴ずつ滴加してから、２５℃の水浴で４時間反応させ、反応が終了してから、反応液を５ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐＨ７．８程度に調整し、それから３０℃未満で小体積に減圧濃縮し、２Ｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液に対して得られた濃縮液を２４時間透析を行った後、２Ｌのイオン交換水に対して３回×２４時間／回で透析を行い、透析袋内液を冷凍乾燥してオニノヤガラ多糖硫酸化類似体が得られる。図２はＷＳＳ２５の１３Ｃ  ＮＭＲスベクトルであり、図２により、硫酸化が主に６位において生じることが分かった。
前記抽出過程において、オニノヤガラ飲片は上海徐匯中薬飲片有限公司から購入されたものであり、水として、蒸留水、或いはイオン交換水を使用することができ、透析に用いられる膜は、本領域に通常に使用されている透析膜である。
【０００８】
本発明のもう一つの目的は、オニノヤガラ多糖硫酸化誘導体の抗腫瘍薬の製造における用途である。体内外実験により、オニノヤガラ多糖硫酸化誘導体は、Ｉｄ１の発現を抑制することで、血管生成を抑制し、さらに腫瘍の成長を抑制し、明らかな抗腫瘍作用を有する。したがって、抗腫瘍薬として開発することが有望である。
【実施例】
【０００９】
＜実施例１：オニノヤガラからのオニノヤガラ多糖の抽出＞
１０００ｇの乾燥なオニノヤガラ飲片を取り、５Ｌの９５ｗｔ％のエタノールで一週間脱脂させ、脱脂してから室温で自然に乾燥する。９７５ｇの乾燥後のオニノヤガラ飲片を沸水で抽出し、抽出毎に、３０Ｌの水を加え、４時間実施して、フェノール−硫酸法で検査する場合に明らかな糖反応がなくなるまで実行した。各回の抽出液を合併して、小体積に濃縮し、１５％（Ｗ／Ｖ）のトリクロロ酢酸で脱タンパク質を行い、遠心分離して得られた上澄み液を１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐＨ７．０程度に中和させ、流動水に対して７２時間透析を行い、内液を小体積に濃縮し、攪拌するとともに３倍体積の９５ｗｔ％のエタノールを加えて一晩放置してから、上澄み液を除いて、遠心分離して得られた沈殿にそれぞれ無水エタノール、アセトンで洗浄して脱水させ、遠心分離して得られた沈殿を４０℃に真空乾燥して、１９５ｇの水抽出粗多糖ＷＧＥが得られた
【００１０】
５ｇの水抽出粗多糖ＷＧＥを取り、適量の水で溶解させ、遠心分離して不溶物を除去し、上澄み液をジエチルアミノエチルセルロース「ＤＥＡＥ−セルロース（Ｃｌ−１型）」カラムで分離した。そして、蒸留水、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．２ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、０．４ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌの順で溶離を行い、フェノール−硫酸法で溶離曲線を作成し、その溶離曲線に応じて溶離液をそれぞれ採取・合併して、その中、０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌの溶離液を濃縮し、蒸留水に対して透析を行い、得られた透析袋内液を冷凍乾燥してＷＧＥＳＣ１Ａ（２．０ｇ）が得られた。
【００１１】
物理化学的性質の測定について、多糖の通常に採用されている方法に基づき、分子量が知られたデキストランＴ−７００、Ｔ−５８０、Ｔ−１１０、Ｔ−８０、Ｔ−４０、Ｔ−１１を標準として、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＧＰＣで測定されたＷＧＥＳＣ１Ａのピークトップ分子量は２．８×１０５であり、旋光度測定装置であるＰｅｉｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２４１  Ｍを使用して、０．５ｍｇ／ｍＬの水溶液における比旋光度が＋９５°であることが測定された。
【００１２】
糖組成分析について、２ｍｇのＷＧＥＳＣ１Ａサンプルを取り、１１０℃で封管して、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で１．８時間加水分解させ、加水分解生成物をアセチル化してから、島津ＧＣ−１４Ｂガスクロマトグロフィーで分析を行った。結果により、該多糖がグルカンであることが示された。
【００１３】
化学構造測定について、多糖の通常に採用されている方法に基づき、室温で４０ｍｇのＷＧＥＳＣ１Ａを取り、重水素交換を経てから、核磁気共鳴装置であるＢｒｕｃｋｅｒ  ＡＭ−４００で、その１３Ｃ  ＮＭＲスベクトル（図１を参照）が得られた。８ｍｇのＷＧＥＳＣ１Ａを取り、Ｎｅｅｄｓ法でメチル化分析を行った結果、ＷＧＥＳＣ１Ａにおいて、末端のグルコース、１，４結合したグルコース、１，４，６結合したグルコースのモル比は１：１６：１である。これは、α−１，４連結したグルカンであり、６位において少量のα−１  ，４連結を有するグルコオリゴ糖である。
【００１４】
＜実施例２：オニノヤガラ多糖硫酸化誘導体の製造＞
４Åの分子篩で処理されたピリジンを氷浴で冷却させてから、クロロスルホン酸／ピリジンＶ／Ｖ＝２：１になるように、ピリジンにクロロスルホン酸を一滴ずつ滴加して、エステル化剤を調製した。８ｍＬの４Åの分子篩で処理したホルムアミド毎に、１５８．９ｍｇのＷＧＥＳＣ１Ａを溶解させ、該溶液を氷浴で０℃に冷却させてから、溶液中に２ｍＬの新しく調製されたエステル化剤を一滴ずつ滴加した。その後、２５℃の水浴で４時間反応させた。反応が終了してから、反応液を５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＯＨでｐＨ７．８に調整し、そして３０℃未満で小体積に減圧濃縮した。２Ｌの飽和ＮａＨＣＯ３溶液に対して濃縮液を２４時間透析を行った後、２Ｌのイオン交換水に対して３回×２４時間／回で透析を行い、透析袋内液を冷凍乾燥してＷＧＥＳＣ１Ａの硫酸化類似体ＷＳＳ２５が得られた。図２はＷＳＳ２５の１３Ｃ  ＮＭＲスベクトルであり、図２により、硫酸化が主に６位において生じることが分かった。
【００１５】
物理化学的性質の測定について、多糖の通常に採用されている方法に基づき、分子量が知られたデキストランＴ−７００、Ｔ−５８０、Ｔ−１１０、Ｔ−８０、Ｔ−４０、Ｔ−１１を標準として、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＧＰＣで測定されたＷＳＳ２５のピークトップ分子量は６．５×１０４であり、旋光測定装置であるＰｅｉｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２４１  Ｍを使用して、０．５ｍｇ／ｍＬの水溶液における比旋光度が＋１５０°であることが測定された。
【００１６】
＜実験性実施例＞
１、Ｉｄ１発現抑制剤のスクリーニング
Ｉｄ１プロモーターを有するｐＧＬ４．１４［ｌｕｃ２／Ｈｙｇｒｏ］をヒト胚腎臓細胞ＨＥＫ２９３（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｐｙｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより提供された）に導入させた。ハイグロマイシンでスクリーニングして安定細胞株Ｉｄｕ−ｌｕｃ／ＨＥＫ２９３が得られ、該細胞株はＩｄ１発現抑制剤のスクリーニングに用いられ、１０％のウシ胎児血清（杭州四季青製）を含むＤＭＥＭ培地によって３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータで培養した。スクリーニングのとき、９０μＬのＩｄｌ−ｌｕｃ／ＨＥＫ２９３細胞を９６穴プレートに加え、穴毎に２５００個の細胞が存在するようにして、２４時間後、１０μＬの２５０μｇ／ｍＬ及び１０００μｇ／ｍＬのＷＳＳ２５を加え、濃度毎に、同条件の対照用穴を三つ設け、同体積の生理食塩水を対照とした。継続に１８時間培養してから、ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＮＯＶＯｓｔａｒ  ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ．Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）でルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）の活性を測定した結果、抑制率＝［（対照群ルシフェラーゼ相対活性−投与群ルシフェラーゼ相対活性）／対照群ルシフェラーゼ相対活性］×１００％ことである。図３に示したように、２５μｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのＷＳＳ２５の抑制率が、それぞれ３９．２５％と４６．２４％である。
【００１７】
２、ヒト微血管内皮細胞ＨＭＥＣ−１の管腔形成に対するＷＳＳ２５の影響
５０μｌ／穴となるように９６穴プレートにマトリジェン（Ｍａｔｒｉｇｅｌ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加え、３７℃で３０分放置してから、１０μＬのＷＳＳ２５と９０μＬの３×１０４個のＨＭＥＣ−１細胞を含む培地をそれぞれ加え、ＷＳＳ２５の最終濃度をそれぞれ６．２５、２５、５０μｇ／ｍｌとなるようにした。濃度毎に、同条件の対照用穴を三つ設けた。培地は、２ｍＭのグルタミン、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（上海ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ生物科技公司製）、１５％のＦＢＳ（杭州四季青製）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプレマイシンを含むＭＣＤＢ１３１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地である。３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータによって１０時間培養してから、拡大倍数を２００と設定した顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ  ５１）で撮影した。図４に示したように、２５μｇ／ｍＬの濃度のＷＳＳ２５は、マトリジェンにおけるＨＥＭＣ−１細胞の管腔の形成を大幅に抑制することができ、濃度が低い場合においても、弱い抑制作用を果たしている。
【００１８】
３、内皮細胞に対するＷＳＳ２５の細胞毒性
２ｍＭのグルタミンと、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（上海ＰｒｉｍｅＧｅｎｅ生物科技公司製）と、１５％のＦＢＳ（杭州四季青製）と、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと、１００μｇ／ｍｌのストレプレマイシンとを含むＭＣＤＢ１３１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）培地によって培養された成長状態良好のヒト微血管内皮細胞ＨＭＥＣ−１細胞９０μｌを、穴毎に５０００個の細胞を有するように９６穴プレートに加えた。３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータによって２４時間培養した後、最終濃度１０、５０、１００、１０００μｇ／ｍｌとなるように、それぞれ１０μＬ  のＷＳＳ２５を加える。濃度毎に、同条件の対照用穴を三つ設け、そして３７℃で５％のＣＯ２のインキュベータによる培養を継続し、２４時間後、４８時間後、７２時間後のそれぞれに、２０μＬの５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ製）を加え、３７℃で４時間反応させてから、１００μＬのライゼート（１０％ＳＤＳ−５％イソブタノール−０．１Ｍ  ＨＣｌ）を加えて、３７℃で１２〜１６時間溶解させ、５７０度で吸光度（Ａ５７０）を測定し、抑制率を計算した結果、抑制率＝［（対照Ａ５７０−投与群Ａ５７０）／対照Ａ５７０］×１００％ことである。上記結果により、図５に示したように、１ｍｇ／ｍＬのＷＳＳ２５の場合に、僅かな細胞毒性作用しか示されていなく、１００μｇ／ｍＬの場合に、細胞に対する影響は殆どなかった。
【００１９】
４、マウスにおける移植腫の成長に対するＷＳＳ２５の抑制作用
４．１受検試薬の準備
本発明で作成された検査試薬のＷＳＳ２５は、硫酸化のグルカンであり、水に溶けやすいものである。実験過程において、生理食塩水を溶媒として相応の濃度に調製し、溶液を０．２２μｍの微孔性濾過膜で濾過してから投与した。
【００２０】
４．２マウスにおける移植腫成長に対するＷＳＳ２５の抑制作用の実験
４．２．１肝臓癌細胞Ｂｅｌ７４０２のマウスにおける移植腫の成長に対するＷＳＳ２５の抑制作用の実験
５−６週齢のＳｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．により購入されたオスのＢＡＬＢ／ｃＡマウスの右前足の皮下に、４００μＬの４×１０６個の肝臓癌細胞Ｂｅｌ７４０２（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｔｐｙｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより提供された）を含む細胞懸濁液を注射し、ノギスで測定した腫瘍体積が、約１００ｍｍ３程度まで成長してから、ランダムに陰性対照群と１００ｍｇ／ｋｇのＷＳＳ２５投与群に組み分け、群毎のマウス数を５匹とし、投与を開始した。投与群に対して、投与前に新しく１０ｍｇ／ｍＬの生理食塩水で調製されたＷＳＳ２５を、マウス毎に０．１ｍＬ／１０ｇずつ投与した。対照群に対して、マウス毎に相応の体積の生理食塩水を投与した。投与は、尾静脈から（投与前に生理食塩水で新しく調製したもの）、二日間１回に行い、１０回連続して投与した。毎回投与する前に、マウスの体重を測定した。投与後、三日間１回にノギスで腫瘍体積を測定した。腫瘍体積Ｖ＝０．５２×ａ×ｂ２であり、その中、ａが移植腫における最長距離であり、ｂが移植腫における最短距離である。２１日目に、マウスを死亡させ、ノギスで測定した対照群の平均腫瘍体積は８２２．９７ｍｍ３であり、投与群の平均腫瘍体積は２７２．１９５ｍｍ３であった。抑制率＝［（対照群腫瘍体積−投与群腫瘍体積）／対照群腫瘍体積］×１００％に基づき、抑制率を計算した結果、図６に示したように、抑制率は６６．９％である。
【００２１】
４．２．２肝臓癌細胞ＳＭＭＣ７７２１のマウスにおける移植腫の成長に対するＷＳＳ２５の抑制作用
１２匹の体重２３±１ｇのオスのＢａｌｂ／ｃ品種マウスは、Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｌａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．により提供された。１×１０７個のヒト肝臓癌ＳＭＭＣ−７７２１腫瘍細胞（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｔｐｙｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより提供された）をマウスの脇の下に注射し、マウス体内に遺伝して３世代目以降のマウスから腫瘍ブロックを取り、１．５ｍｍ３の大きさの腫瘍ブロックにカットし、実験マウスの脇の下に接種し、腫瘍が約１００ｍｍ３程度に成長したことがノギスによって測定された後、ランダムに動物を組み分け、投与を開始した。１２匹のＳＭＭＣ−７７２１腫瘍細胞が接種されたマウスを、ランダムに２群と分け、１）陰性対照群×６匹と、２）１００ｍｇ／ｋｇのＷＳＳ２５投与群×６匹と分けた。陰性対照群に対して、二日間１回に０．１ｍｌ／１０ｇの生理食塩水を尾静脈から注射し、１００ｍｇ／ｋｇのＷＳＳ２５投与群（投与前に、新しく生理食塩水中に調製した）に対して、二日間１回に０．１ｍｌ／１０ｇの１０ｍｇ／ｍＬのＷＳＳ２５を尾静脈から注射し、三日間１回に重量を測定し、ノギルで腫瘍体積を測定した。１０回投与してから、投与を停止した。陰性対照群と１００ｍｇ／ｋｇのＷＳＳ２５投与群のマウスの体重に関して、実験治療前後で明らかな変化がなかった。各群に関して、動物の死亡例がなかった。２３日目に、マウスを死亡させ、体重を測定し、ノギルで腫瘍ブロックの体積を測定し、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）、相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）を計算した。腫瘍体積Ｖ＝ａ×ｂ２／２であり、その中、ａが移植腫における最長距離であり、ｂが移植腫における最短距離である。ＲＴＶ  ＝  Ｖｔ／Ｖ０に基づき、相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を計算した。その中、Ｖｔが所定時間の腫瘍体積であり、Ｖ０が投与開始時に測定された腫瘍体積である。相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）を抗腫瘍活性評価の指標として、Ｔ／Ｃ（％）＝投与群平均相対腫瘍体積／対照群平均相対腫瘍体積×１００％のようになる。Ｔ／Ｃ（％）≦６０％の場合、統計学測定で明らかな差異が検出されたこととして、明らかなｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍作用を有すると見なす。日数が対応する陰性対照群と比較すると、１００ｍｇ／ｋｇのＷＳＳ２５投与群のマウスにおける移植腫の体積は、投与した３日目から小さくなった。図７に示したように、陰性対照群の相対腫瘍体積（ＲＴＶ）が３．０であり、１００ｍｇ／ｋｇのＷＳＳ２５群のＲＴＶ値が１．６８であり、相対腫瘍増殖率（Ｔ／Ｃ）が５６％であった。
【００２２】
以上の実験によれば、本発明で製造されたオニノヤガラ多糖硫酸化誘導体ＷＳＳ２５は、明らかな抗腫瘍作用を有し、かつ内皮細胞に対して殆ど毒性がないので、抗腫瘍薬として開発することが有望である。
【図１】
0005513510.tif 000005
【図２】
0005513510.tif 000006
【図３】
0005513510.tif 000007
【図４】
0005513510.tif 000008
【図５】
0005513510.tif 000009
【図６】
0005513510.tif 000010
【図７】
0005513510.tif 000011