(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒径がＲ１〜Ｒ２μｍ（Ｒ１＜Ｒ２、Ｒ２は１０００以下）である粒子を分離するための、ポリマー、ガラス、あるいは金属材料によって構成された連続的２次元粒子分離装置であって、
（１）外部からの溶液の連続的な導入を可能とする、少なくとも１つの導入口Ｉと、
（２）溶液の連続的な回収を可能とする、少なくとも１つの回収口Ｏと、を有する流路構造Ｃを有しており、
前記流路構造Ｃは、
（３）前記流路構造Ｃにおけるある地点Ｐにおける流路断面Ｓ１において、前記流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置が、前記流路断面Ｓ１におけるある一点Ｘ１を中心とした直径３×Ｒ２の円の内部を通過するような、地点Ｐを少なくとも一箇所有し、
（４）また、前記地点Ｐと、前記地点Ｐより下流の地点Ｑとの間に、大きさによって粒子を分離するための構造Ｅを有することによって、前記地点Ｑにおける流路断面Ｓ２において前記流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置の差が、流路断面Ｓ１における粒子の中心位置の差と比較して、流路断面Ｓ２におけるある方向Ａに、大きさによって増幅され、
（５）また、前記地点Ｐと前記地点Ｑの間に、粒子の磁性、電荷、比重のうち、少なくとも１つの要因に応じて粒子を分離するための流路部分Ｆを有することによって、前記地点Ｑにおける流路断面Ｓ２において前記流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置の差が、前記流路断面Ｓ１における粒子の中心位置の差と比較して、流路断面Ｓ２における方向Ａとは異なる方向Ｂに、粒子の磁性、電荷、比重のうち、少なくとも１つの要因に応じて増幅され、
（６）また、点Ｑより下流における分岐点ＢＸにおいて、独立した回収口Ｏ１〜Ｏｎ（ｎ≧２）に接続されるｎ個の出口分岐流路ＯＣ１〜ＯＣｎに分岐している連続的２次元粒子分離装置。
【請求項２】
前記点Ｘ１は、前記流路断面Ｓ１における流路壁面に存在する請求項１に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項３】
前記流路断面Ｓ１の形状は矩形であり、前記点Ｘ１は、矩形の頂点の一つである請求項１に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項４】
前記流路構造Ｃは、前記地点Ｐより上流における地点Ｍにおいて分岐し、地点Ｐと地点Ｍの間における地点Ｎにおいて再合流する分岐流路ＣＢを、少なくとも１つ有している請求項１乃至３のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項５】
粒径がＲ１〜Ｒ２μｍ（Ｒ１＜Ｒ２、Ｒ２は１０００以下）である粒子を分離するための、ポリマー、ガラス、あるいは金属材料によって構成された連続的２次元粒子分離装置であって、
（１）外部からの溶液の連続的な導入を可能とする、少なくとも１つの導入口Ｉと、
（２）溶液の連続的な回収を可能とする、少なくとも１つの回収口Ｏと、を有する流路構造Ｃを有しており、
前記流路構造Ｃは、
（３）前記流路構造Ｃにおけるある地点Ｐにおける流路断面Ｓ１において、前記流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置が、前記流路断面Ｓ１におけるある一点Ｘ１を中心とした直径３×Ｒ２の円の内部を通過するような、地点Ｐを少なくとも一箇所有し、
（４）また、前記地点Ｐと、前記地点Ｐより下流の地点Ｑとの間に、大きさによって粒子を分離するための構造Ｅを有することによって、前記地点Ｑにおける流路断面Ｓ２において前記流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置の差が、流路断面Ｓ１における粒子の中心位置の差と比較して、流路断面Ｓ２におけるある方向Ａに、大きさによって増幅され、
（５）また、前記地点Ｐと前記地点Ｑの間に、粒子の磁性、電荷、比重のうち、少なくとも１つの要因に応じて粒子を分離するための流路部分Ｆを有することによって、前記地点Ｑにおける流路断面Ｓ２において前記流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置の差が、前記流路断面Ｓ１における粒子の中心位置の差と比較して、流路断面Ｓ２における方向Ａとは異なる方向Ｂに、粒子の磁性、電荷、比重のうち、少なくとも１つの要因に応じて増幅され、
（６）また、それぞれ独立した導入口Ｉ１とＩ２に接続されている粒子導入流路ＣＩ１と溶液導入流路ＣＩ２が、地点Ｐより上流における合流点Ｇにおいて合流している連続的２次元粒子分離装置。
【請求項６】
前記合流点Ｇの直前における、粒子導入流路ＣＩ１の幅、深さ及び直径等のうちのいずれかの値が、合流点Ｇにおける、溶液導入流路ＣＩ２の幅、深さ及び直径等の値のいずれかの値に対して、２分の１以下である請求項５に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項７】
前記流路構造Ｃは、前記地点Ｐより上流において、前記流路構造Ｃの断面積が徐々にあるいは段階的に縮小する部分Ｈを有している請求項１乃至６のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項８】
前記構造Ｅは、前記流路構造Ｃの断面積が徐々にあるいは段階的に増加する構造Ｅ１である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項９】
前記構造Ｅは、粒子が導入される分岐流路ＣＤ１と、導入されない分岐流路ＣＤ２からなる分岐構造Ｅ２である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１０】
前記構造Ｅは、流路構造Ｃの断面積が徐々にあるいは段階的に増加する構造Ｅ１と、粒子が導入される分岐流路ＣＤ１と導入されない分岐流路ＣＤ２からなる分岐構造Ｅ２を組み合わせた構造Ｅ３である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１１】
前記構造Ｅは、流路構造Ｃ内に２次元的に規則的に配置された障害物構造を有する構造Ｅ４である請求項１乃至７のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１２】
前記流路構造Ｃ近傍に永久磁石を配置することで、前記流路部分Ｆにおいて磁場を作用させることを可能とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１３】
前記流路構造Ｃの周囲にコイル状電極を配置し、電流を発生させることで、前記流路部分Ｆにおいて磁場を作用させることを可能とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１４】
前記流路構造Ｃの上下あるいは左右に電極を配置し、電圧を印加することで、前記流路部分Ｆにおいて電場を作用させることを可能とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１５】
前記流路部分Ｆにおいて、粒子に対し重力あるいは遠心力を作用させることを可能とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１６】
前記流路断面Ｓ２の形状は矩形であり、方向Ａと方向Ｂは矩形の縦あるいは横方向であり、それらは直交する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１７】
前記分岐点ＢＸにおいて、ｈ×ｉ＝ｊ（ｈ、ｉ≧２）個の分岐流路が２次元的に配置されている、請求項１に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１８】
前記流路構造Ｃは、前記点Ｑより下流において、前記流路構造Ｃにおけるある側面ＳＫに分岐点群ＢＸ１〜ＢＸｍ（ｍ≧２）を有しており、また前記流路構造Ｃは、それぞれの分岐点ＢＸ１〜ＢＸｍにおいて、あるいはそれぞれの分岐点ＢＸ１〜ＢＸｍよりさらに下流における分岐点ＢＹ１〜ＢＹｍにおいて、ｋ個（ｋ≧１）の出口分岐流路ＯＣ１１〜ＯＣｍｋに分岐している請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項１９】
前記粒子は、動植物細胞、ウイルス、バクテリア等の生体粒子である請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項２０】
前記粒子は、動植物細胞、ウイルス、バクテリア等の生体粒子に対し、磁気微粒子を結合させた粒子複合体である請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項２１】
前記流路構造Ｃは、アクリル樹脂、ポリジメチルシロキサン、ポリカーボネート等の平板状の樹脂基板上に形成された溝構造が、別の基板と物理的あるいは化学的に張り合わせられることによって形成されている、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の連続的２次元粒子分離装置に対し、粒子を含む溶液を連続的に導入することで粒子を分離する、粒子分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、連続的２次元粒子分離装置及び粒子分離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、複雑な細胞集団の中から特定の細胞を分離・選抜する技術は、生化学等の研究分野や医療の現場において重要なプロセスである。
【０００３】
また、環境中の微粒子や合成微粒子などを、それらの性質の違いに基づいて正確に分離するプロセスは、工業生産や環境モニタリングなどの幅広い分野において重要である。
【０００４】
たとえば細胞を正確に分離・選抜するための従来技術として、フローサイトメトリーと呼ばれる手法が広く利用されている（例えば下記非特許文献１参照）。フローサイトメトリーとは、溶液中に懸濁した細胞を連続的にフローセルに導入し、蛍光マーカー等で標識した個々の細胞を光学的に分析する手法である。細胞を分析した後、微小な液滴中に閉じ込め、その液滴をソーティングすることで、特定の細胞を分離・回収することも可能であり、そのような分取機能を有する装置は、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ）と呼ばれている。フローサイトメトリーに用いられる装置はフローサイトメーターとばれ、一般的にフローセル、送液装置、光源、検出器、シグナル増幅システム、アナログデジタル変換システムから構成される。
【０００５】
フローサイトメトリーの利点として、高速（数千個／秒）かつ高精度な細胞分離が可能であり、複数の種類の蛍光物質や抗体を用いることで、複数の要因に基づいた細胞の分離・選抜が可能となる、という点があげられる。
【０００６】
また、細胞を正確に分離・選抜するための従来技術として、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ：Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）と呼ばれる細胞分離手法も利用されている（例えば下記非特許文献２参照）。ＭＡＣＳは、細胞表面に存在する特定の抗原分子に対する抗体を用いて、磁気粒子による標識を行い、磁場を利用することで標識された細胞のみを分離する手法である。磁場を印加できるカラム装置に対し細胞懸濁液を導入すると、磁気粒子で標識された細胞のみがカラム内にトラップされるため、磁場の印加を止め、溶液を導入することで、磁気標識された細胞のみを個別に回収することができる。
【０００７】
磁気細胞分離の利点としては、簡易な操作で特定の表面抗原を有する細胞を分離できる点、処理量も多く、装置も比較的安価である点などがあげられる。
【０００８】
一方近年、微細加工技術を用いて作製された、幅が数ミクロン〜数百ミクロンの微小な流路構造（マイクロ流路）を用いることで、微粒子や細胞を正確に分離する研究が多数報告されている。一般的に、マイクロ流路内では安定な層流が形成され、その流れのプロファイルをマイクロメートルオーダーで任意に制御できるため、そのような特徴を利用することで細胞を正確に分離できる。
【０００９】
例えば、下記非特許文献３乃至５に、大きさによって正確かつ連続的に細胞・微粒子を分離する手法や、磁場や電場を印加することで磁気や電荷の強弱によって細胞・微粒子を分離する手法等が報告されている。
【００１０】
これらの手法の利点としては、前記ＦＡＣＳで必要となる光学系・情報処理系などの複雑な機器・装置を必要とせず、連続的な細胞分離を容易に可能とする点、一つの要因を利用した分離ではあるものの複数のフラクションへの分離が可能である、つまり、たとえば大きさで分離する場合、大きいものと小さいものという２段階だけではなく、大きさによる３グループ以上の集団へと分離することができる点、さらに、流路の並列化などを行うことで、大量・高速な細胞の分離が可能である点などがあげられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「フローサイトメトリー：手技と実際」、蟹書房，１９８８，５
【非特許文献２】「サイトメトリー（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）」１１，２３１-２３８  ，１９９０
【非特許文献３】「アナリティカルケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）７６，５４６５-５４７１，２００４．
【非特許文献４】「ラボ・オン・ア・チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）」５，１２３３-１２３９，２００５．
【非特許文献５】「ラボ・オン・ア・チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）」６，９７４-９８０，２００６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、上記フローサイトメトリーは、フローセル内を流れている細胞に対し、レーザーを照射し、蛍光の検出・解析、およびソーティングを行うため、精密かつ非常に高価な装置が必要となる。そのため、通常、ソーティング機能を有するＦＡＣＳ装置は数千万円と非常に価格が高くなり、実用性が高いとは言い難い。また、光軸の調整など、操作に熟練の技術を要するものがほとんどである、といった問題点がある。
【００１３】
また、上記磁気細胞分離では、「磁性粒子の付着の有無」という単一の要因によって細胞分離を行う為、一度の操作では二つの画分への分離のみが可能であり、正確な分離が不可能である、という欠点がある。
【００１４】
また、上記非特許文献３乃至５のマイクロ流路を用いる技術では、大きさや磁気の強弱による分離など、単一の要因による分離であるため、同時に複数の要因によって細胞や微粒子を分離することは不可能であるという点があげられる。
【００１５】
そこで本発明は、従来の技術が有する、上記したような種々の問題点に鑑みてなされたものであり、粒子の分離において、「大きさ」および「比重、磁性、電荷、あるいは表面状態のいずれか１つ」の２つの要因を同時に利用することで、多種類の粒子の混合物であっても、その中から目的とする粒子を精度よく分離・回収することを可能とする装置を提供しようとするものである。
【００１６】
また、本発明の目的とするところは、粒子の分離および回収を行う際に、複雑な操作や高価な機器を必要としない装置を提供しようとするとともに、ディスポーザブルな装置を提供しようとするものである。
【００１７】
また、本発明の目的とするところは、粒子の分離および回収を連続的に行うことで、比較的大量の粒子・細胞であっても効率的な処理を可能とする装置を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的を達成するために、本発明の第一の観点に係る発明は、粒径がＲ１〜Ｒ２μｍ（Ｒ１＜Ｒ２、Ｒ２は１０００以下）である粒子を分離するための、ポリマー、ガラス、あるいは金属材料によって構成された連続的２次元粒子分離装置であり、その連続的２次元粒子分離装置が、（１）外部からの溶液の連続的な導入を可能とする、少なくとも１つの導入口Ｉと、（２）溶液の連続的な回収を可能とする、少なくとも１つの回収口Ｏを有する流路構造Ｃを有しており、さらにその流路構造Ｃが（３）流路構造Ｃにおけるある地点Ｐにおける流路断面Ｓ１において、流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置が、流路断面Ｓ１におけるある一点Ｘ１を中心とした直径３×Ｒ２の円の内部を通過するような、地点Ｐを少なくとも一箇所有し、（４）また、地点Ｐと、地点Ｐより下流の地点Ｑとの間に、大きさによって粒子を分離するための構造Ｅを有することによって、地点Ｑにおける流路断面Ｓ２において流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置の差が、流路断面Ｓ１における粒子の中心位置の差と比較して、流路断面Ｓ２におけるある方向Ａに、大きさによって増幅され、（５）また、地点Ｐと地点Ｑの間に、粒子の磁性、電荷、比重のうち、少なくとも１つの要因に応じて粒子を分離するための流路部分Ｆを有することによって、地点Ｑにおける流路断面Ｓ２において流路構造Ｃを流れる粒子の中心位置の差が、流路断面Ｓ１における粒子の中心位置の差と比較して、流路断面Ｓ２における方向Ａとは異なる方向Ｂに、粒子の磁性、電荷、比重のうち、少なくとも１つの要因に応じて増幅される、連続的２次元粒子分離装置を用いる、というものである。これにより、流路内の断面において、異なる方向にそれぞれ、「大きさ」と「磁性、電荷、比重のうち、少なくとも１つ」の２つに応じた粒子の分離が同時に可能となるため、２次元的な粒子の分離が可能となる。
【００１９】
また、本観点において、限定されるわけではないが、点Ｘ１は、流路断面Ｓ１における流路壁面に存在することが好ましい。これにより、粒子が分離される前に、地点Ｐにおいて流路壁面に粒子が効率的に押し付けられるため、粒子が地点Ｐを通過する位置を流路断面Ｓ１における一定の範囲に収束することで、分離の精度を向上することが可能となる。
【００２０】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路断面Ｓ１の形状は矩形であり、点Ｘ１は、矩形の頂点の一つであることが好ましい。これにより、粒子が分離される前に、地点Ｐにおいて流路壁面に粒子がより効率的に押し付けられるため、粒子が地点Ｐを通過する位置を流路断面Ｓ１における片隅に収束することで、分離の精度を向上することが可能となる。
【００２１】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃは、地点Ｐより上流における地点Ｍにおいて分岐し、地点Ｐと地点Ｍの間における地点Ｎにおいて再合流する分岐流路ＣＢを、少なくとも１つ有していることが好ましい。このようにすることで、分岐流路ＣＢ中に粒子が導入されないことを利用することで、粒子を流路断面Ｓ１における流路壁面に効率的に押し付けることが可能になる。
【００２２】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃにおいて、それぞれ独立した導入口Ｉ１とＩ２に接続されている粒子導入流路ＣＩ１と溶液導入流路ＣＩ２が、地点Ｐより上流における合流点Ｇにおいて合流している、というものである。このようにすることで、２つの導入口から、粒子懸濁液と粒子を含まない溶液を連続的に導入することで、流路内を流れる粒子を流路壁面Ｓ１に効率的に押し付けることが可能となる。
【００２３】
また、上記において合流点Ｇの直前における、粒子導入流路ＣＩ１の幅・深さ・直径等のうちのいずれかの値が、合流点Ｇにおける、溶液導入流路ＣＩ２の幅・深さ・直径等の値のいずれかの値に対して、２分の１以下であることがより好ましい。このようにすることで、粒子を、粒子を含まない溶液によって流路壁面に押し付ける際、流路断面Ｓ１における片隅に効率的に押し付けることが可能となる。
【００２４】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃは、地点Ｐより上流において、流路構造Ｃの断面積が徐々にあるいは段階的に縮小する部分Ｈを有している、というものである。このようにすることで、粒子の流れる位置がより効率的に収束されるため、流路断面Ｓ１において、粒子を、点Ｘ１を中心とした半径３×Ｒ２の円の内部を効率的に通過させることが可能である。
【００２５】
また、本観点において、限定されるわけではないが、構造Ｅは、流路構造Ｃの断面積が徐々にあるいは段階的に増加する構造Ｅ１であることが好ましい。このようにすることで、流路断面Ｓ１における粒子の流れる位置の差が、粒子の大きさに応じて増幅されるため、流路断面Ｓ２において、効率的に粒子を大きさに応じて分離することが可能となる。
【００２６】
また、本観点において、限定されるわけではないが、構造Ｅは、粒子が導入される分岐流路ＣＤ１と、導入されない分岐流路ＣＤ２からなる分岐構造Ｅ２であることが好ましい。このようにすることで、流路内を流れる溶液を２つの流路に分配することにより、流路断面Ｓ２において、粒子を大きさに応じてより効率的に分離することが可能となる。
【００２７】
また、本観点において、限定されるわけではないが、構造Ｅは、流路構造Ｃの断面積が徐々にあるいは段階的に増加する構造Ｅ１と、粒子が導入される分岐流路ＣＤ１と導入されない分岐流路ＣＤ２からなる分岐構造Ｅ２を組み合わせた構造Ｅ３であることが好ましい。このようにすることで、分岐構造Ｅ２と構造Ｅ３を組み合わせることで、流路断面Ｓ２において、粒子を大きさに応じてより効率的に分離することが可能となる。
【００２８】
また、本観点において、限定されるわけではないが、構造Ｅは、流路構造Ｃ内に２次元的に規則的に配置された障害物構造を有する構造Ｅ４であることが好ましい。このようにすることで、障害物構造を有する構造Ｅ４が存在することにより、粒子が大きさに応じて、異なる経路を流れるため、流路断面Ｓ２において、粒子を大きさに応じて分離することが可能となる。
【００２９】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃ近傍に永久磁石を配置することで、流路部分Ｆにおいて磁場を作用させることを可能とすることが好ましい。このようにすることで、流路構造Ｃにおける流路部分Ｆ内を流れる粒子に対して磁場を印加することが可能となり、流路断面Ｓ２において、粒子を磁性に応じて分離することが可能となる。
【００３０】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃの周囲にコイル状電極を配置し、電流を発生させることで、流路部分Ｆにおいて磁場を作用させることを可能とすることが好ましい。このようにすることで、流路構造Ｃにおける流路部分Ｆ内を流れる粒子に対して電磁石による磁場を印加することが可能となり、流路断面Ｓ２において、粒子を磁性に応じて分離することが可能となる。
【００３１】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃの上下あるいは左右に電極を配置し、電圧を印加することで、流路部分Ｆにおいて電場を作用させることを可能とすることが好ましい。このようにすることで、流路構造Ｃにおける流路部分Ｆ内を流れる粒子に対して電場を印加することが可能となり、流路断面Ｓ２において、粒子を内部および表面の電荷に応じて分離することが可能となる。
【００３２】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路部分Ｆにおいて、粒子に対し重力あるいは遠心力を作用させることを可能とすることが好ましい。このようにすることで、流路構造Ｃにおける流路部分Ｆ内を流れる粒子に対し、遠心力を作用させる、あるいは重力による沈降を行うことで、流路断面Ｓ２において、粒子を比重に応じて分離することが可能となる。
【００３３】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃの断面形状は少なくとも部分的に矩形であり、方向Ａと方向Ｂは矩形の縦あるいは横方向であり、それらは直交することが好ましい。このようにすることで、２つの要因による分離の方向を直交させることで、流路断面Ｓ２においてより効率的な粒子の分離が可能となるほか、分離した粒子を効率よく、個別の回収口から回収することが可能となり分離精度が高まる、といった効果が得られる。
【００３４】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃは、点Ｑより下流における分岐点ＢＸにおいて、独立した回収口Ｏ１〜Ｏｎ（ｎ≧２）に接続されるｎ個の出口分岐流路ＯＣ１〜ＯＣｎに分岐していることが好ましい。このようにすることで、流路断面Ｓ２において複数の要因に応じて分離された粒子を、それぞれ異なる回収口から回収することが可能となる。
【００３５】
また、上記において、ｈ×ｉ＝ｊ（ｈ、ｉ≧２）個の分岐流路が２次元的に配置されている、というものであることがより好ましい。このようにすることで、流路断面Ｓ２において複数の要因に応じて分離された粒子を、それぞれ異なる回収口から２次元的に回収することが可能となる。
【００３６】
また、本観点において、限定されるわけではないが、流路構造Ｃは、点Ｑより下流において、流路構造Ｃにおけるある側面ＳＫに分岐点群ＢＸ１〜ＢＸｍ（ｍ≧２）を有しており、また流路構造Ｃは、それぞれの分岐点ＢＸ１〜ＢＸｍにおいて、あるいはそれぞれの分岐点ＢＸ１〜ＢＸｍよりさらに下流における分岐点ＢＹ１〜ＢＹｍにおいて、ｋ個（ｋ≧１）の出口分岐流路ＯＣ１１〜ＯＣｍｋに分岐していることが好ましい。このようにすることで、流路断面Ｓ２において複数の要因に応じて分離された粒子を、それぞれ異なる回収口から２次元的に回収することが可能となる。
【００３７】
また、本観点において、限定されるわけではないが、粒子とは、動植物細胞、ウイルス、バクテリア等の生体粒子であることが好ましい。このようにすることで、動植物細胞、ウイルス、バクテリア等の生体粒子を分離・回収することが可能となる。
【００３８】
また、本観点において、限定されるわけではないが、動植物細胞、ウイルス、バクテリア等の生体粒子に対し、磁気微粒子を結合させた粒子複合体であることが好ましい。このようにすることで、動植物細胞、ウイルス、バクテリア等の生体粒子を分離する際に、特定の抗体を利用した磁気標識を行うことで、特定の表面抗原を有する生体粒子を効率的に分離・回収することが可能となる。
【００３９】
また、本観点において、限定されるわけではないが、アクリル樹脂、ポリジメチルシロキサン、ポリカーボネート等の平板状の樹脂基板上に形成された溝構造が、別の基板と物理的あるいは化学的に張り合わせられることによって形成されていることが好ましい。このようにすることで、アクリル樹脂、ポリジメチルシロキサン、ポリカーボネート等の樹脂を用いて流路を作製する事で、比較的安価かつ容易に流路構造を作製することが可能となり、ディスポ―サブルな装置を提供することが可能となる。
【００４０】
また、本発明の他の一観点に係る粒子分離方法は、上記第一の観点の連続的２次元粒子分離装置に対し、粒子を含む溶液を連続的に導入することで粒子を分離する、粒子分離方法である。本観点は、このような連続的２次元粒子分離装置を利用した粒子の分離方法を用いることで、複雑な粒子集団の中から、目的の粒子のみを、連続的かつ迅速かつ正確に分離・回収することが可能となる。
【発明の効果】
【００４１】
本発明は、以上に述べられたように構成されているため、粒子懸濁液を、特定の形状を持つ微細な流路構造に連続的に導入し、同時に流路の特定部に磁場、電場、あるいは遠心力を作用させるだけで、複雑な粒子集団に含まれる粒子を、２つの要因によって分離することができ、必要に応じて目的の粒子のみを回収する事ができる、という優れた効果を発揮する。
【００４２】
また本発明は、以上に述べられたように構成されているため、複雑な操作や機器を必要としない、という優れた効果を発揮する。
【００４３】
また本発明は、以上に述べられたように構成されるため、粒子の分離および回収を連続的に行うことが可能であり、バッチ処理の分離技術と比較して、大量の細胞を処理できる可能性がある、という優れた効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】最も基本的な連続的２次元粒子分離装置の概略図例であり、図１（ａ）は平面的に構成された連続的２次元粒子分離装置および流路構造Ｃを上面から観察した様子を示した概略図であり、図１（ｂ）および図１（ｃ）は、それぞれ、図１（ａ）に示す流路構造における、地点Ｐおよび地点Ｑにおける流路断面Ｓ１および流路断面Ｓ２を模式的に示した図である。
【図２】実施形態に係る連続的２次元粒子分離装置の第２の概略図であり、図２（ａ）は連続的２次元粒子分離装置および流路構造Ｃを上面から観察した模式図を示し、図２（ｂ）〜（ｅ）はそれぞれ、図２（ａ）におけるＷ０−Ｗ１線、Ｗ２−Ｗ３線、Ｗ４−Ｗ５線、Ｗ６−Ｗ７線における、連続的２次元粒子分離装置の断面図を表している。
【図３】実施形態に係る連続的２次元粒子分離装置における、分離対象となる粒子の概略図および、図２に示す連続的２次元細胞分離装置における流路構造Ｃ内を流れる粒子の位置を示した概略図であり、図３（ａ）は粒子の大きさの大小および磁気の強弱を示した説明図であり、図３（ｂ）は粒子の位置を上面から観察した様子を示した概略図であり、図３（ｃ）〜（ｊ）は、それぞれ図３（ｂ）における、Ａ−Ａ’線、Ｂ−Ｂ’線、Ｃ−Ｃ’線、Ｄ−Ｄ’線、Ｅ−Ｅ’線、Ｆ−Ｆ’線、Ｇ−Ｇ’線、Ｈ−Ｈ’線における断面と、粒子の位置を示した概略図である。なお、図３（ｆ）および（ｈ）は、それぞれ流路断面Ｓ１およびＳ２に相当する。
【図４】実施形態に係る連続的２次元粒子分離装置における、地点Ｍ１〜Ｍｎにおいて分岐した流路が、地点Ｎ１〜Ｎｎおいて再び合流する流路構造の概略図である。
【図５】実施形態に係る連続的２次元粒子分離装置における、粒子を大きさに応じて分離するための構造Ｅ４の、他の概略図例が示されており、図５（ａ）および（ｂ）には、流路内に斜めに規則的に配置された凹凸状の障害物構造を有する構造Ｅ４の概略図および大きさの異なる粒子の流れの様子が示されており、図５（ａ）は図５（ｂ）におけるＡ矢視図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）のＸ０−Ｘ１線における流路断面図である。また図５（ｃ）は、２次元的に配置されたピラー状の障害物構造を有する構造Ｅ４の概略図である。
【図６】実施形態に係る連続的２次元粒子分離装置における、図２に示す出口構造とは異なる形態を有する出口構造を示した概略図であり、図６（ａ）は、出口分岐流路および回収口の概略図であるとともに、図６（ｂ）〜（ｆ）におけるＦ矢視図であり、また、図６（ｂ）〜（ｆ）はそれぞれ、図６（ａ）におけるＡ―Ａ´線〜Ｅ―Ｅ´線における断面図である。なお、図６（ａ）〜（ｆ）における着色部は基板部分を表し、非着色部は流路内の空間を表している。
【図７】実施例に係る連続的２次元粒子分離装置および粒子分離方法の実施例のための装置概略図である。
【図８】実施例に係る連続的２次元粒子分離装置を用いた、ＪＭ細胞の分離結果例を示したグラフであり、図８（ａ）および図８（ｂ）は、それぞれ磁場非印加時および磁場印加時における、４ｘ４の出口分岐流路を通過したＪＭ細胞の割合を示した棒グラフである。
【図９】実施例に係る連続的２次元粒子分離装置を用いた、直径９．９ｍｍのポリスチレン蛍光微粒子の分離結果例を示したグラフであり、図９（ａ）および図９（ｂ）は、それぞれ磁場非印加時および磁場印加時における、４ｘ４の出口分岐流路を通過したポリスチレン蛍光微粒子の割合を示した棒グラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、本発明を実施するための最良の形態について、図面を用いて詳細に説明する。但し本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の零時にのみ限定されるものでは無い。
【００４６】
図１は、本実施形態において、最も基本的な連続的２次元粒子分離装置の例の概略図である。図１（ａ）は平面的に構成された連続的２次元粒子分離装置および流路構造Ｃを上面から観察した様子を示した概略図であり、図１（ｂ）および図１（ｃ）は、それぞれ、図１（ａ）に示す流路構造における、地点Ｐおよび地点Ｑにおける流路断面Ｓ１および流路断面Ｓ２を模式的に示した図である。
【００４７】
図１における流路構造Ｃは、どの地点においても断面形状が矩形であり、流路深さは均一である。断面形状は、粒子を断面において２つの要因によって分離するために、また、流路構造の作製上の容易さから、矩形であることが望ましいが、部分的に矩形以外の形状を有する断面であっても良く、また、部分的に深さが異なっていても良い。
【００４８】
図１に示した流路構造Ｃにおける導入口Ｉから連続的に導入された溶液中の粒子は、地点Ｐにおいてある一定の範囲内、つまり、図１（ｂ）に示す着色部内を通過する必要がある。粒子の大きさと流路構造の関係から、粒子の径が十分に大きい場合、あるいは流路構造の内径が十分に小さい場合は、流路構造Ｃが導入口Ｉと地点Ｐの間の範囲に特定の構造を有さなくても良いが、粒子を効率的に図１（ｂ）に示す着色部内を通過させるために、流路構造Ｃが導入口Ｉと地点Ｐの間の範囲に特定の構造を有するものである方が好ましい。
【００４９】
そして、導入口Ｉから連続的に導入され、地点Ｐを通過した溶液中の粒子は、構造Ｅによって、断面における横方向に大きさによって分離されるため、地点Ｑにおける流路断面Ｓ２において、方向Ａに、大きさによって分離される。
【００５０】
さらに、流路部分Ｆにおいて流路構造の上下方向に磁場、電場、重力場等を作用させることにより、連続的に導入された溶液中の粒子は、断面における縦方向に磁気、電場、比重の大小あるいは強弱という要因によって分離されるため、地点Ｑにおける流路断面Ｓ２において、方向Ｂに、これらの要因のうちの一つによって分離される。
【００５１】
地点Ｑの近傍あるいは下流において、粒子が流路構造Ｃの断面において通過する位置を計測することで、どのような性質を有する粒子がどの程度含まれるかを測定することが可能である。
【００５２】
なお、図１に示す流路構造Ｃにおいて、構造Ｅと流路部分Ｆは別々に存在するため、粒子が２つの要因によってそれぞれ分離される位置が異なるが、流路部分Ｆが構造Ｅを含んでいても良く、また、流路部分Ｆが構造Ｅよりも上流に存在していても良い。
【００５３】
図２は、本実施形態における連続的２次元粒子分離装置の他の概略図である。図２（ａ）は連続的２次元粒子分離装置および流路構造Ｃを上面から観察した模式図を示し、図２（ｂ）〜（ｅ）はそれぞれ、図２（ａ）におけるＷ０−Ｗ１線、Ｗ２−Ｗ３線、Ｗ４−Ｗ５線、Ｗ６−Ｗ７線における、連続的２次元粒子分離装置の断面図を表している。
【００５４】
図２における流路構造Ｃは、「大きさ」および「磁気の強弱」の２つの要因によって粒子を２次元的に分離し、さらに分離された粒子を、それぞれ個別の出口から分離し回収することを可能とするものであり、微小な流路構造が加工された平板状の基板２枚と、流路構造が加工されていない平板状の基板１枚を積層することによって形成されている。また、最上部の基板は、他の基板に比べて小さいため、図２に示す連続的２次元粒子分離装置は、２枚の基板によって構成された部分と３枚の基板によって構成された部分によって構成されている。
【００５５】
図２における流路構造Ｃにおいて、流路の深さは部分的に異なっているが、流路の深さは均一でも良く、さらに、径の同じ、あるいは異なる円管が少なくとも部分的に接続された構造であっても良い。ただし、流路構造が少なくとも部分的に平面的に構成されているものの方が、流路設計における抵抗値の設定が容易になり、また、流路構造の作製が容易になる、という点においてより好ましい。
【００５６】
なお、図１および図２に示す連続的２次元粒子分離装置を作製する場合に用いる技術としては、例えば、モールディングやエンボッシングといった鋳型を用いる作製技術は、流路構造を正確かつ容易に作製可能であるという点において好ましいが、その他にも、ウェットエッチング、ドライエッチング、レーザー加工、電子線直接描画、機械加工等の作製技術を用いることも可能である。
【００５７】
また、流路構造を作製する場合の、マイクロ流体システムの材質としては、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、アクリル等の各種ポリマー材料、ガラス、シリコン、セラミクス、ステンレスなどの各種金属、などを用いることができ、また、これらの材料のうち、任意の２種類の基板を組み合わせて用いることも可能である。ただし、流路自体を安価に作製し、ディスポーザブルな装置を提供するためには、少なくとも部分的にポリマー材料を用いることが好ましい。
【００５８】
図２（ａ）に示す流路構造Ｃにおいて、それぞれ独立した導入口Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３に接続されている粒子導入流路ＣＩ１、溶液導入流路ＣＩ２、溶液導入流路ＣＩ３が、地点Ｐより上流における合流点ＧおよびＧ’において段階的に合流しており、導入口Ｉ１から導入された粒子懸濁液（溶液Ａ）の流量と、導入口Ｉ２および導入項Ｉ３から導入された溶液Ｂの流量をそれぞれ調整する事で、流路断面Ｓ１内を流れる粒子を効率的にフォーカシングすることが可能になる。なお、このような導入口および導入流路は、３つ以上存在していても良く、また、溶液導入流路ＣＩ２およびＣＩ３が共通した導入口Ｉ２に接続されていても良い。
【００５９】
また、図２（ａ）に示す流路構造Ｃは、地点Ｐより上流において断面積が段階的に縮小する部分Ｈを有しているため、流路内径と粒子径の関係から、地点Ｐにおいて、粒子を流路断面Ｓ１における片隅近傍の、より狭い範囲にフォーカシングすることが可能となる。
【００６０】
さらに、合流点Ｇの直前における、粒子導入流路ＣＩ１の深さが、合流点Ｇにおける、溶液導入流路ＣＩ２の深さに対して、２分の１以下であるため、粒子を流路断面Ｓ１における片隅近傍の、より狭い範囲にフォーカシングすることが可能となる。
【００６１】
さらに、図２（ａ）に示す流路構造Ｃは、粒子を大きさによって分離するための構造Ｅとして、流路幅が拡大しさらに分岐する構造Ｅ３を有しており、一方の分岐は、ドレインに接続された、粒子が導入されない分岐流路ＣＤ２であり、もう一方の分岐は、粒子が導入される分岐流路ＣＤ１であり、流路部分Ｆ方向に延長されている。
【００６２】
また、流路部分Ｆは、２枚の基板によって形成された部分に存在しており、その上部に永久磁石を設置することにより、流路の深さ方向に磁場を印加することができ、粒子を深さ方向に磁気の強弱によって分離することが可能である。
【００６３】
また、図２（ａ）に示す流路構造Ｃは、地点Ｑにおいて流路の幅方向に大きさによって、深さ方向に磁気の強弱によって分離した粒子を、それぞれ個別に回収するために、４つの分岐点ＢＸ１〜ＢＸ４においてそれぞれ垂直方向に分岐する分岐流路を有しており、それらの流路は、さらに下流の、最上段の基板の下面に形成された流路構造部に存在する分岐点ＢＹ１〜ＢＹ４において、それぞれ４つの出口分岐流路に分岐しているため、結果として、合計１７の回収出口、つまり回収口Ｏ１１〜Ｏ４４と回収口Ｏ５に接続される１７の分岐流路を有している。なお、これらの分岐点、出口分岐流路および回収口の数は、対象となる粒子および求められる分離の精度によって、任意の値に設定することが可能である。
【００６４】
図３は、分離対象となる粒子の概略図および、図２に示す連続的２次元細胞分離装置における流路構造Ｃ内を流れる粒子の位置を示した概略図である。図３（ａ）は粒子の大きさの大小および磁気の強弱を示した説明図であり、図３（ｂ）は粒子の位置を上面から観察した様子を示した概略図であり、図３（ｃ）〜（ｊ）は、それぞれ図３（ｂ）における、Ａ−Ａ’線、Ｂ−Ｂ’線、Ｃ−Ｃ’線、Ｄ−Ｄ’線、Ｅ−Ｅ’線、Ｆ−Ｆ’線、Ｇ−Ｇ’線、Ｈ−Ｈ’線における断面と、粒子の位置を示した概略図である。なお、図３（ｆ）および（ｈ）は、それぞれ流路断面Ｓ１およびＳ２に相当する。
【００６５】
まず、導入口Ｉ１から粒子懸濁溶液を、導入口Ｉ２およびＩ３から粒子を含まない溶液を連続的に導入すると、まず、合流点Ｇ’において、粒子は導入口Ｉ３より導入された溶液Ｂによって、流路壁面近傍に押し付けられる。そして、合流点Ｇにおいて、粒子導入流路ＣＩ１の深さが溶液導入流路ＣＩ２よりも浅く、また、部分Ｈにおいて流路構造Ｃは幅・深さともに縮小するため、地点Ｐを含むピンチ部において、粒子は流路断面Ｓ１における片隅に押し付けられる。
【００６６】
なお図４に示すような、地点Ｍ１〜Ｍｎにおいて分岐した流路が、地点Ｎ１〜Ｎｎおいて再び合流する流路構造を利用することも可能であり、分岐された溶液の流れの合流によって粒子が押しつけられつつ流れることで、粒子を地点Ｐにおいてフォーカシングすること、粒子を角近傍に押しつけることが可能となる。そのための手法としては、分岐の流れの抵抗を調節し、ある一定の大きさ以上の粒子が分岐に導入されないようにするための手法である、水力学的フィルトレーション手法を利用することが可能である。この技術は、例えば、“「マイクロフルイディクス・アンド・ナノフルイディクス（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」６，５７１−５７６（２００９）“を参照して実行することができる。
【００６７】
地点Ｐにおいて流路断面Ｓ１における一定の位置範囲を通過した粒子は、構造Ｅ３が分岐を有し、また、流路幅が拡大しているために、流路の幅方向に大きさによって分離される。なお、流路が深さ方向に拡大していても良く、その場合は、粒子は大きさによって深さ方向に分離される。また、分岐を有さずに、単に流路幅が拡大されている構造Ｅ１、あるいは、流路幅が拡大されずに分岐を有するだけの構造Ｅ２でも、大きさによる分離が達成されるが、これらの組み合わせである構造Ｅ３が、分離効率の観点からもより望ましい。
【００６８】
なお、粒子を大きさによって分離する構造Ｅ３において、導入された粒子を全て分岐流路ＣＤ１へ導入することが可能であり、その原理としては、「非対称ピンチドフローフラクショネーション（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｐｉｎｃｈｅｄ  Ｆｌｏｗ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＡｓＰＦＦ））」と呼ばれる手法を用いる事ができる。より具体的には、水力学的フィルトレーション手法と同じく、流路の抵抗値を適切に設計し、また、ピンチ部（地点Ｐ）の流路幅および粒子径の関係から、ある特定のサイズの粒子を、特定の分岐にのみ導入できる、という原理である。なお、分岐流路ＣＤ２の終端において、溶液を排出する為の、流路と外部を接続している貫通孔および排出口（ドレイン）の存在が必要である。この技術は、例えば、“「ラボ・オン・ア・チップ（Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｐ）」５，７７８−７８４，２００５．”を参照して実行することができる。
【００６９】
図５は、粒子を大きさに応じて分離するための構造Ｅの、他の概略図例である。図５（ａ）および（ｂ）には、流路内に斜めに規則的に配置された凹凸状の障害物構造を有する構造Ｅ４の概略図および大きさの異なる粒子の流れの様子が示されており、図５（ａ）は流路構造図５（ｂ）におけるＡ矢視図であり、図５（ｂ）は、図５（ａ）のＸ０−Ｘ１線における流路断面図である。また図５（ｃ）には、２次元的に配置されたピラー状の障害物構造を有する構造Ｅ４の概略図が示されている。
【００７０】
図５（ａ）に示された着色部および斜線部はそれぞれ、図５（ｂ）における上段基板下面および下段基板上面に存在する障害物であり、境界部の上流と下流で流路の深さが変化する。図５（ｂ）に示すように、流路深さが深い方から順にそれぞれ２Ｈおよび２ｈ（Ｈ＞ｈ）であり、障害物の高さが高い方から順にそれぞれＨおよびｈであり、また、導入する最大の粒子の直径と最小の粒子の直径がそれぞれＤおよびｄ（Ｄ≧ｄ）である時、ｄ＜ｈ＜Ｄ＜Ｈであり、また、ｗ＞Ｄであれば、これらの粒子が大きさによって分離される。なお、流路深さあるいは幅が段階的に異なる流路を直列に接続することによって、より精度の高い大きさによる分離が達成される。
【００７１】
また、図５（ｃ）に示した構造Ｅ４は、２次元的に配置された障害物構造を有しているため、粒子の大きさに応じて粒子の流れる軌跡が変化するため、大きさによる粒子の分離を可能とするものである。このような分離構造は、決定論的横方向変位（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｓｔｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）と呼ばれる原理を利用するものである。この技術は、例えば、“「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」３０４，９８７−９９０，２００４．”を参照することが好ましい。
【００７２】
図３に示すように、構造Ｅによって流路幅方向に粒子が分離された後、下流における流路部分Ｆにおいて、流路上部に配置された磁石によって磁場を発生することにより、より磁性の強い粒子は、流路の縦方向に移動することによって、分離される。この場合、方向Ａは矩形断面を有する流路の幅方向、方向Ｂは深さ方向であり、これらは直交している。なお、流路部分Ｆにおける滞留時間、流路構造Ｃと磁石の距離、また、磁石による磁場の強さなどを調節することで、磁場による最適な分離を達成することが望ましい。
【００７３】
図６は、図２に示す出口構造とは異なる形態を有する出口構造を示した概略図であり、図６（ａ）は、出口分岐流路および回収口の概略図であるとともに、図６（ｂ）〜（ｆ）におけるＦ矢視図であり、また、図６（ｂ）〜（ｆ）はそれぞれ、図６（ａ）におけるＡ−Ａ’線〜Ｅ−Ｅ’線における断面図である。なお、図６（ａ）〜（ｆ）における着色部は基板部分を表し、非着色部は流路内の空間を表している。
【００７４】
図６に示すような、単一の分岐点ＢＸにおいて２次元的に分岐する分岐流路群を利用することによっても、２次元的に分離された粒子を個別に回収することが可能となる。なお、図６に示した出口構造において、ｈ＝４、ｉ＝４、ｊ＝１６であるため、最大１６のフラクションへの分離が可能であるが、これは分離対象となる粒子の性質、および求められる分離の精度に応じて、任意に設定することができる。なお、ｈおよびｉが２以上であれば、出口分岐流路はいくつ存在しても良く、また、いくつかの出口分岐流路が統合されていても良い。
【００７５】
なお、図２に示すように、複数の回収口を有する連続的２次元粒子分離装置の場合、流路ネットワーク全体を抵抗回路のアナロジーとしてみなし、適切な設計を行うことで、任意の流量分配比を達成することができるため、そのような考えに基づいた設計を行うことが望ましい。
【００７６】
そして、流路内部におけるこれらの流量条件を達成するための導入量の調節方法として、導入口からシリンジポンプ等を用いて溶液を導入することが操作上簡便であり好ましいが、ペリスタポンプ等の他のポンプを用いる手法、ボンベ、圧力装置等を用いた定圧送液方法、電気浸透流や遠心力等を用いた送液方法などを用いることも可能である。
【００７７】
なお、粒子の安定的かつ効率的な分離を達成するためには、流路内で安定な層流が保たれることが好ましく、具体的には、レイノルズ数が１０００以下になる条件下で送液操作を行うことが好ましい。ただし、直径１ｍｍ以下の流路構造を用いる場合、乱流を形成することは比較的困難であり、そのような条件を達成することは容易である。
【００７８】
上記した連続的２次元粒子分離装置を用いて、分離を行う対象となる粒子としては、目的に応じて、ポリスチレン等のポリマー粒子、金属微粒子、セラミックス粒子、またはそれらの表面に物理的あるいは化学的な処理を施した粒子を用いることができる他、動植物細胞、細菌、バクテリア、ウイルスやそれらの構成要素であるオルガネラ等の生物粒子を用いることができる。なお、それらの生物粒子の場合、表面に存在する抗原分子に特異的な抗体を利用し、あらかじめ磁気微粒子を付着させることによって、磁気微粒子の付着の多少、つまり、表面抗原分子の多少を利用して、粒子を分離することが可能となる。
【００７９】
粒子懸濁液および押付液としては、目的に応じて様々な溶液を用いることができ、例えば粒子としてポリマー粒子や金属粒子を用いる場合には、各種化学物質を含む水溶液の他、有機溶液、イオン性流体等を用いることができる。さらに、粒子として細胞等の生物粒子を用いる場合には、細胞培養液や緩衝液などの細胞と等張の水溶液を用いるのが好ましい。ただし、たとえばバクテリアや植物細胞のような比較的低張あるいは高張溶液に対し耐性をもつ細胞の場合には、必ずしも等張である必要はない。また、操作の都合上、溶液の密度と粒子の密度の差が大きくない系がより好ましい。
【００８０】
粒子懸濁液、押付液の粘度に関しては、これらの粘度における差が小さい系がより好ましいが、粒子の処理を可能とするシステムであれば、粘度に差があっても構わない。
【００８１】
また、導出口から流出する、粒子を含むあるいは含まない溶液を回収するために、導出口に、回収のためのチューブ構造を接続することが可能であるが、回収口の体積を十分に大きくすることによって、ある程度多量の溶液を回収口中に保持し、一定時間の分離操作後に、分離された粒子を溶液ごと回収することも可能である。
【００８２】
以上のような流路構成および流量調整により、導入口Ｉ１より導入された粒子は、粒子の「大きさ」と「磁性」の２つの要因によって分離され、異なる回収口より回収される。
【００８３】
つまり、粒子懸濁液を導入口Ｉ１から、押付液を導入口Ｉ２から、それぞれ連続的に導入し、流路部分Ｆが存在する部分に、磁場を印加するだけで、複雑な装置を用いることなく、連続的かつ簡便に、同時に２要因による粒子の分離および回収を達成することが可能となる。
【００８４】
なお、磁場を利用せずに、流路部分Ｆの上下あるいは左右に電極を形成し、電場を印加することで、表面の電荷に応じた分離も可能となるほか、流路部分Ｆにおける滞留時間を長くし、流路下面方向に粒子に印加される重力を用いることで、比重による分離も可能となる。
【実施例】
【００８５】
以下、本発明に係る連続的２次元粒子分離装置および粒子分離方法の具体的な実施例を詳細に説明する。
【００８６】
図７には、本実施例に係る連続的２次元粒子分離装置および粒子分離方法の実施例のための装置概略図が示されている。
【００８７】
この連続的２次元粒子分離装置は、磁気粒子で標識された細胞を、まず構造Ｅによって大きさに応じて分離し、さらに、流路部分Ｆにおいて、流路部分Ｆの上部に設置された磁石によって磁場を発生し、磁気粒子によって標識された細胞を磁場印加方向、つまり流路深さ方向に分離することで、粒子を２次元的に分離することを可能とするものである。
【００８８】
この連続的２次元粒子分離装置は、溝構造を有さない平板状の基板（ガラス板）と、微細な溝構造を有する２枚の平板状のポリマー基板（ＰＤＭＳ；ポリジメチルシロキサン）を積層し貼り合わせることにより形成された、３段構造であり、図２に示す流路構造と類似の構成となっている。全体の大きさは、５０ｘ５０ｘ４ｍｍ程度である。
【００８９】
上段および中段のポリマー基板の下面には、それぞれ微小な流路構造が形成されており、上段および中段における貫通孔として導入口Ｉ１〜Ｉ３、中段下面にピンチ部（地点Ｐ）、構造Ｅ３、流路部分Ｆおよび分岐点ＢＸ１〜ＢＸ４を含む流路構造Ｃ、上段における貫通孔として回収口Ｏ１〜Ｏ４、上段下面に分岐点ＢＹ１〜ＢＹ４および出口分岐流路ＯＣ１１〜ＯＣ４４を含む流路構造Ｃが、それぞれ形成されている。また、分岐点ＢＸ１〜ＢＸ４において分岐した流路は、中段基板に形成された貫通孔によって、上段下面に形成された流路構造に接続されている。
【００９０】
上段基板、中段基板、および下段基板の厚さは、それぞれ約２．０ｍｍ、０．７ｍｍ、１．１ｍｍであった。また、上段基板において、流路部分Ｆに相当する部分に、長方形の貫通孔が形成されている。
【００９１】
上段基板下面に存在する流路の深さは３０μｍ、中段基板下面に存在する流路構造の深さは、導入流路Ｉ３が約３８０μｍ、その他の部分が約３０μｍである。これらの値に関しては、用いる対象の大きさに応じて、１μｍから１ｃｍまでの任意の値の流路構造を採用することが可能であり、また、下段の基盤の上面にも同様の加工が施されていても良い。また、流路構造Ｃにおける流路幅は、地点Ｐを含むピンチ部は約３０μｍ、導入流路Ｉ３は約３００μｍ、構造Ｅ３における幅広い分岐流路ＣＤ１およびＣＤ２は約１ｍｍである。
【００９２】
また、構造Ｅ３において、ピンチ部においてフォーカシングされた粒子は、分岐流路ＣＤ１へと導入され、粒子が導入されない分岐流路ＣＤ２（ドレイン流路）へは、地点Ｐを通過する流量のうち、約７０％が導入されるように設計されている。ドレイン流路の長さは約８０ｍｍである。
【００９３】
流路部分Ｆは、図７に示すようにターンしている。このような折り返し構造によって、粒子の滞留時間を増加させ、磁場印加の時間を長くすることができ、より効率的な磁場の印加が可能となる。なお、流路部分Ｆの長さは約１１０ｍｍであり、幅は１ｍｍであるが、これらの値は、印加する磁場の強さや、分離対象となる粒子の性質等によって、最適化することが望ましい。
【００９４】
導入口Ｉ１は粒子懸濁液の導入口であり、導入口Ｉ２およびＩ３は、粒子を含まない溶液の導入口であり、回収口Ｏ１、Ｏ２、Ｏ３、Ｏ４は粒子および／あるいは溶液の排出口である。導入口からそれぞれの溶液を連続的に供給するために、各導入口における貫通孔に対して、外径２ｍｍ、内径１ｍｍのシリコーンチューブが接続されている。
【００９５】
以上の構成を有する連続的２次元粒子分離装置に対し、フォーカシングの効率を確認するため、直径１ｍｍの蛍光微粒子懸濁液を導入口Ｉ１から、粒子を含まない溶液を導入口Ｉ２，Ｉ３から、それぞれ連続的に導入し、地点Ｐにおける蛍光粒子の存在位置を、共焦点レーザー顕微鏡を用いて観察したところ、流量比が約１：３０：１の場合には、蛍光粒子が流路断面Ｓ１における片隅近傍、より具体的には、片隅を近傍とする半径１０μｍの１／４円の領域内にのみ存在することが確認され、効果的なフォーカシングが達成されていることが確認された。なお、流路断面Ｓ１において蛍光粒子が流れる位置範囲は、各導入口からの流量を調整することで、調整可能である。つまり、粒子を含まない溶液の流量が相対的に増加すると、フォーカシング効率が上がり、蛍光粒子の通過範囲が狭まる、という様子が観察された。なお、この結果から、上記の流量条件であれば、導入口Ｉ１から導入された直径約１０μｍ以上の粒子あるいは細胞は、ほぼ完全に流路断面Ｓ１における片隅を通過しつつ流れる、ということが想定された。
【００９６】
以上の流路構成を有する連続的２次元粒子分離装置を用いた、細胞および粒子の２次元的分離と回収操作について説明する。
【００９７】
まず、導入口Ｉ１から導入する細胞懸濁溶液における溶液としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用い、導入口Ｉ２およびＩ３から導入する粒子を含まない溶液としてＰＢＳを用いた。
【００９８】
また細胞としては、モデルとして、ヒト白血球細胞株（Ｔ細胞株）であるＪＭ細胞（直径９―２０μｍ、平均直径１３．２μｍ）を、ＣＤ３抗体付き磁気粒子（直径５０ｎｍ）で磁気標識したものを用いた。同時に対照として、磁気標識されない粒子として、ポリスチレン標準蛍光微粒子（直径９．９μｍ）を用いた。これらの細胞および粒子を、ＰＢＳに懸濁した後に、４０μｍのフィルターを通して、大きな細胞塊や粉塵等の除去を行った。以下、これらの細胞、粒子を、それぞれ「ＪＭ細胞」、「蛍光粒子」と記述する。
【００９９】
流路部分Ｆにおいて粒子に磁場を印加するための磁石として、直方体のネオジム磁石（表面磁束密度３８０ｍＴ）を用いており、具体的には、中段基板の流路部分Ｆ上かつ、上段基板に形成された長方形の貫通孔部分に、当該ネオジム磁石を設置することで、流路に対して垂直に磁場を印加した。なお、細胞および粒子の分離挙動の検証における、磁場非印加時とは、磁石を取り外し、磁場を印加しなかった状態を示すものである。
【０１００】
調製した細胞懸濁液および粒子を含まない溶液を、導入口Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３から、シリンジポンプを用いてそれぞれ連続的に導入した。なお、導入口Ｉ１，Ｉ２，Ｉ３からの導入流量はそれぞれ、５０μＬ／ｈ、５０μＬ／ｈ、３０００μＬ／ｈであった。この流量条件では、流路部分Ｆにおける平均滞留時間は、約４３秒である。
【０１０１】
上記の流量条件で、各溶液を導入したところ、ピンチ部（地点Ｐ）において、導入したＪＭ細胞および蛍光粒子は流路片隅に押し付けられ、ブロード部において、流路壁面から異なる距離を流れていた粒子の粒子間距離が増幅され、粒子が大きさごとに分離される様子が観察された。
【０１０２】
図８および図９にはそれぞれ、磁場印加時および磁場非印加時の、ＪＭ細胞および蛍光粒子の分離結果が示されており、それぞれのグラフにおいて、ｘ軸およびｙ軸は４ｘ４の出口分岐流路番号、ｚ軸はそれぞれの出口分岐流路を通過した細胞あるいは粒子の割合を示したものである。
【０１０３】
磁場の印加による分離位置の違いを観察したところ、磁場非印加時には、ＪＭ細胞は約６２％が出口分岐流路ＯＣ３１〜ＯＣ３４を通過したが、磁場印加時には、約６０％が出口分岐流路ＯＣ２１〜ＯＣ２４を通過したため、磁場による分離位置の違いを観察することができ、磁気およびサイズによる細胞の分離が達成されていることが確認された。
【０１０４】
一方、蛍光粒子は、磁場印加の有無にかかわらず、ＯＣ３３から主に回収されたため、この結果によっても、磁性を有する粒子によって標識された細胞が２次元的に分離されていることが示された。
【０１０５】
なお、以上の実施例においては、細胞・粒子としてＪＭ細胞とポリスチレン標準蛍光微粒子を用いたが、他の細胞・粒子等を目的とした分離・回収を行う事も可能である。例えば、血球細胞の分画、分化の程度の異なる幹細胞集団の純化、環境中の特定バクテリアの単離など、多岐に及ぶ医学・生物学的応用が可能である他、合成微粒子や磁気ナノ粒子の精製などの応用も可能である。
【０１０６】
また以上の実施例においては、流路部分Ｆに磁場を印加することで、粒子の磁性による分離を行ったが、流路部分Ｆにおいて、電場の印加あるいは、遠心力および重力を作用させる事によって、大きさという要因と同時に、粒子の電荷状態や、粒子の比重という要因の２つの要因による細胞・粒子の分離・回収を行うことも可能である。
【０１０７】
また以上の実施例においては、ＢＹ１〜ＢＹ４において分岐した出口分岐流路は、それぞれ共有の回収口Ｏ１〜Ｏ４に接続されていたため、２次元的に分離された細胞および粒子を個別に回収することは不可能であった。細胞・粒子集団の性質を解析する目的であれば、回収口を共有していても構わないが、それぞれ個別に回収する必要がある場合は、図２に示すように、出口分岐流路はそれぞれ個別の回収口に接続されていることが望ましい。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、以上に説明したように構成されているため、たとえば、生細胞と死細胞の選別、抗原特異性Ｔ細胞の選抜、ｉＰＳ細胞・ＥＳ細胞・造血幹細胞等の肝細胞の高度選抜、癌細胞等の特殊な細胞や、循環血液中の腫瘍細胞等の希少細胞を、簡便かつ効率的に分離・回収する有効な手段となりうるため、それらのプロセスを必要とする医療の現場や生化学の研究分野において、効果的でかつ比較的安価な装置を提供することができ、産業上の利用可能性も大きいものと考えられる。
【０１０９】
また、本発明は、以上に説明したように構成されているため、例えば、細胞核、ミトコンドリア、葉緑体やリソソーム等の細胞小器官の分画を行う上でも有効な手段となりうる。
【０１１０】
さらに、本発明は、以上に説明したように構成されているため、例えばフローサイトメトリーに用いる、複雑な操作を必要とする機器や高価な機器を必要としない、粒子の分離・回収手段として、幅広い利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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