(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミューゲ香料素材を選択する方法であって、
以下の（i）〜（iii）：
（i）OR10A6、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりミューゲの匂いに対する応答性を有するポリペプチド、及び
OR2W1、又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりミューゲの匂いに対する応答性を有するポリペプチド
からなる群より選択される嗅覚受容体の両方に試験物質を添加し、該試験物質に対する該嗅覚受容体の応答を測定する工程；
（ii）該試験物質を添加しない該嗅覚受容体の応答を測定する工程；及び
（iii）該（ii）の工程で測定した応答に対して、該（i）の工程で測定した応答が２倍以上増加していた場合、該試験物質をミューゲ香料素材の候補物質として選択する工程、
により、ミューゲ香料素材の候補物質を選択すること、ならびに
該選択された候補物質の匂いを官能評価すること
を特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ミューゲの匂いに対する応答性を有するポリペプチドが、2-メチル-4-フェニル-2-ブタノール、2-メチル-4-フェニルブタン-2-オール、p-イソブチル-α-メチルヒドロシンナミックアルデヒド、及び2-メチル-3-（p-イソプロピルフェニル）-プロピオンアルデヒドから選択される化合物に応答性を有するポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記嗅覚受容体が、天然に嗅覚受容体を発現する細胞上又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記嗅覚受容体の応答を測定する工程が、レポーターアッセイによって行われる、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミューゲに応答する嗅覚受容体、及び当該受容体を利用してミューゲ香料素材を評価及び／又は選択する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
香粧品の香りはフローラル、フルーティに大別され、フローラルは、（１）ミューゲ（スズラン）、（２）ローズ、（３）ジャスミンの３大フローラルに分けられる。この中で、ミューゲの香りは、特に清潔感を表現する香りとして知られている。しかし、天然のミューゲからは精油分が産業的にほとんど得ることができず、そのため、現在、ミューゲの香りを作る際には、Suzaral、Cyclamene aldehyde等の合成香料が使用されている。より自然なミューゲの香りをもたらす天然香料や合成香料の開発が望まれる。
【０００３】
しかしながら、Suzaral、Cyclamene aldehyde等の現在使用されているミューゲ香料素材の多くは、その構造にアルデヒド基を含む。そのため、それらの素材を含む香粧品は、皮膚に使用する際の感作性が懸念されている。従って、アルデヒド基を持たない新規ミューゲ香料の開発が望まれている。
【０００４】
従来、新規香料の開発は、新規に合成した香料素材について、ヒトが官能試験によってその匂いを評価することによって行われてきた。しかし官能試験には、匂いを評価できる専門家の育成が必要なことや、スループット性が低いなどの問題がある。
【０００５】
ヒト等の哺乳動物においては、匂いは、鼻腔上部の嗅上皮に存在する嗅神経細胞上の嗅覚受容体に匂い分子が結合し、それに対する受容体の応答が中枢神経系へと伝達されることにより認識されている。近年、嗅覚受容体を培養細胞で機能的に発現させ、受容体の活動を個別に観察する手法が開発された（非特許文献１）。また、特定の嗅覚受容体を発現する培養細胞を用いて当該嗅覚受容体のリガンドを探索する方法も知られている（特許文献１及び２）。
【０００６】
前述のミューゲ香料素材の開発に、上記の嗅覚受容体を発現する培養細胞を用いたリガンド探索方法を利用できると期待される。この方法を実行するためには、求める香料に応答する受容体を発現する培養細胞を予め準備しておく必要がある。しかし、ミューゲ香料を受容する嗅覚受容体はこれまで知られていなかった。
【０００７】
ミューゲの香りに応答する嗅覚受容体を特定することができれば、天然のミューゲ香気成分の同定や、新たなミューゲ香料素材の開発のために有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６／００２１６１号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００８／００８２２４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Katada et al, Biochem Biophys Res Commun 2003, 305:964-969
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ミューゲに応答する嗅覚受容体の提供、及び当該受容体を利用してミューゲ香料素材を評価及び／又は選択する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ミューゲ香料に応答する嗅覚受容体を特定することに成功し、また当該受容体の活動を指標とすれば新規ミューゲ香料素材を評価及び／又は選択することができることを見出した。
【００１２】
すなわち、本願発明は、以下を提供する。
（１）ミューゲ香料素材の候補物質を選択する方法であって、
OR10A6、OR2W1、及びこれらとアミノ酸配列で８０％以上の同一性を有するポリペプチドからなる群より選択される嗅覚受容体のいずれか１以上に試験物質を添加する工程；
当該試験物質に対する当該受容体の応答を測定する工程；及び
測定された該応答に基づいて、当該試験物質をミューゲ香料素材の候補物質として選択する工程、
を含む、方法。
（２）ミューゲ香料素材を選択する方法であって、（１）記載の方法で選択された候補物質の匂いを評価することを特徴とする、方法。
（３）前記匂いの評価が官能評価によって行われる（２）記載の方法。
（４）前記嗅覚受容体が、天然に嗅覚受容体を発現する細胞上又は嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞上に発現された嗅覚受容体である（１）記載の方法。
（５）試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答を測定する工程をさらに含む（１）記載の方法。
（６）前記試験物質を添加しない嗅覚受容体の応答に対して、試験物質を添加された嗅覚受容体の応答が２倍以上増加していれば、当該試験物質をミューゲ香料素材の候補物質として選択する（５）記載の方法。
（７）前記受容体の応答を測定する工程が、レポーターアッセイによって行われる（１）記載の方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ミューゲ香料素材の候補物質を効率よく同定又は選択することができるので、効率のよい新規ミューゲ香料素材の開発が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（Ａ）各種香料素材に対するOR10A6の応答、（Ｂ）各種香料素材に対するOR2W1の応答。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「ミューゲ香料素材」とは、ミューゲ香料の材料となる、ミューゲ様の香気を有する化合物、組成物又は混合物をいう。
【００１６】
本発明は、ミューゲ香料素材の候補物質を選択する方法を提供する。当該方法は、ミューゲの匂いに応答する嗅覚受容体に試験物質を添加する工程；当該試験物質に対する当該受容体の応答を測定する工程；及び、測定された該応答に基づいて、当該試験物質をミューゲ香料素材の候補物質として選択する工程、を包含する。
【００１７】
上記本発明の方法の好ましい態様においては、試験物質が添加される嗅覚受容体は、ミューゲの匂いに応答する嗅覚受容体（ミューゲ受容体）から選択される嗅覚受容体のうちの少なくとも１種であり、選択される候補物質は、ミューゲ香料素材の候補物質である。
【００１８】
本発明の方法で試験物質が添加される嗅覚受容体としては、OR10A6及びOR2W1からなる群より選択される嗅覚受容体のいずれか１以上が挙げられる。OR10A6及びOR2W1は、ヒト嗅細胞で発現している嗅覚受容体であり、それぞれ、GenBankに GI:52218835、169234788として登録されている。OR10A6は、配列番号１で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。OR2W1は、配列番号３で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、本発明の方法に使用される嗅覚受容体としては、上記OR10A6及びOR2W1のアミノ酸配列に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ミューゲの匂いに対する応答性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明の方法では、当該嗅覚受容体のうちのいずれか１つを単独で使用してもよく、又は複数を組み合わせて使用してもよい。
【００１９】
上記本発明の方法において、上記嗅覚受容体は、受容体の機能を失わない限り、任意の形態で使用され得る。例えば、嗅覚受容体は、生体から単離された嗅覚受容器若しくは嗅細胞等の天然に嗅覚受容体を発現する組織や細胞、又はそれらの培養物；当該嗅覚受容体を担持した嗅細胞の膜；当該嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞又はその培養物；当該組換え細胞の膜；及び、当該嗅覚受容体を有する人工脂質二重膜、等の形態で使用され得る。これらの形態は全て、本発明で使用される嗅覚受容体の範囲に含まれる。
【００２０】
好ましい態様においては、嗅細胞等の天然に嗅覚受容体を発現する細胞、嗅覚受容体を発現するように遺伝的に操作された組換え細胞、又はその培養物が本発明の方法において使用される。当該組換え細胞は、嗅覚受容体をコードする遺伝子およびそれの膜発現を促進する蛋白質であるRTP1S（非特許文献２：Zhuang H and Matsunami H, J Biol Chem 282, 15284-15293 (2007)）をコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いて細胞を形質転換することで作製することができる。
上記組換え細胞の作製に使用できるRTP1Sとしては、例えば、ヒトRTP1Sが挙げられる。ヒトRTP1Sは、GenBankにGI:50234917として登録されている。ヒトRTP1Sは、配列番号５で示される遺伝子配列を有する遺伝子にコードされる、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ヒトRTP1Sの代わりに、ヒトRTP1Sのアミノ酸配列（配列番号６）に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトRTP1Sと同様に、嗅覚受容体の膜における発現を促進するポリペプチドを使用してもよい。例えば、マウスRTP1S（上述のZhuang H and Matsunami H）は、配列番号６で示されるアミノ酸配列と８９％の配列同一性を有し、且つ嗅覚受容体の膜における発現を促進する機能を有し、上記組換え細胞の作製に使用することができる蛋白質である。
【００２１】
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の配列同一性は、リップマン−パーソン法（Lipman-Pearson法；Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（Ｖｅｒ.５．１．１；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行なうことにより算出される。
【００２２】
上記本発明の方法において、嗅覚受容体に添加される試験物質は、ミューゲ香料素材として使用することを所望する物質であれば、特に制限されない。試験物質は、天然に存在する物質であっても、化学的又は生物学的方法等で人工的に合成した物質であってもよく、また化合物であっても、組成物若しくは混合物であってもよい。
【００２３】
上記本発明の方法においては、試験物質の添加に続いて、当該試験物質に対する嗅覚受容体の活動が測定される。測定は嗅覚受容体の活動を測定する方法として当該分野で知られている任意の方法、例えば、細胞内カルシウム量測定法、細胞内ｃＡＭＰ量測定法等によって行えばよい。例えば、HEK293T細胞において嗅覚受容体は、匂い分子によって活性化されると、細胞内のＧαｓと共役してアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させることが知られている（Kajiya K. et al. Journal of Neuroscience, 2001, 21:6018-6025）。従って、匂い分子添加後の細胞内ｃＡＭＰ量を指標にすることで、嗅覚受容体の活動を測定することができる。ｃＡＭＰ量を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡ、ルシフェラーゼアッセイ法等の各種レポーターアッセイ等が挙げられる。
【００２４】
次いで、測定された嗅覚受容体の活動に基づいて試験物質を評価し、受容体活動を活性化した試験物質を、ミューゲ香料素材の候補物質として選択する。試験物質の評価は、例えば、試験物質添加群と対照群（例えば、試験物質非添加群若しくは対照物質添加群）との間で受容体活動を比較することによって行われ得る。対照群と比較して、試験物質添加群における受容体活動が増加していれば、当該試験物質を、ミューゲの匂いに応答する受容体の活動を活性化することができる、ミューゲ香料素材の候補物質として選択することができる。好ましくは、試験物質添加群における受容体活動が対照群と比較して２倍以上増加していれば、当該試験物質を、ミューゲ香料素材の候補物質として選択する。あるいは、試験物質の評価は、種々の濃度の試験物質間で受容体活動を比較することによって行われ得る。受容体活動が試験物質の濃度に相関して増強する場合、当該試験物質を、ミューゲ香料素材の候補物質として選択することができる。
【００２５】
従来の香料開発過程では、官能試験等によって膨大な数の物質の匂いを１つ１つ確認して香料素材を選択していかなければならなかったため、香料開発までに多くの時間とコストが必要であった。しかし、上記本発明の方法によれば、ミューゲの匂いに応答する嗅覚受容体の活動に基づいて候補物質を予め選択することができるので、実際の匂いを調べるべき候補物質の数を大きく減少させることができる上、得られた候補物質がミューゲの香料素材として使用できるものである可能性が高い。よって、上記本発明の方法によれば、ミューゲ香料の開発の効率が大きく向上する。
【００２６】
従って、本発明はまた、ミューゲ香料素材を選択する方法を提供する。当該方法は、上述の方法により選択されたミューゲ香料素材の候補物質の匂いを評価することによって行われる。候補物質の匂いの評価は、当該分野で通常使用される匂い評価手順によって行われ得る。例えば、匂いの評価は、専門家による官能評価、匂いセンサー等の手段によって行うことができる。斯くして選択されたミューゲ香料素材は、ミューゲ香料、及びミューゲの香りを有する芳香剤、化粧料等の製造のために、あるいは、新たなミューゲ香料素材の開発のための原料として使用することができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００２８】
実施例１  ヒト嗅覚受容体遺伝子のクローニング
OR10A6およびOR2W1はGenBankに登録されている配列情報を基に、human genomic DNA female (G1521：Promega)を鋳型としたPCR法によりクローニングした。ＰＣＲ法により増幅した各遺伝子をpENTRベクター（Invitrogen）にマニュアルに従って組込み、pENTRベクター上に存在するNot I、Asc Iサイトを利用して、pME18Sベクター上のFlag-Rhoタグ配列の下流に作成したNot I、Asc Iサイトへと組換えた。
【００２９】
実施例２  pME18S-hRTP1Sベクターの作製
ヒトRTP1Sはhuman RTP1遺伝子（MHS1010-9205862：Open Biosystems）を鋳型としたＰＣＲ法によりクローニングした。ＰＣＲに用いるプライマーには、センス側にEcoR I、アンチセンス側にXho Iサイトを付加した。ＰＣＲ法により増幅したhRTP1S遺伝子をpME18SベクターのEcoR I、Xho Iサイトへ組込んだ。
【００３０】
実施例３  ミューゲ受容体を用いた香料素材評価
１）嗅覚受容体発現細胞の作製
OR10A6及びOR2W1をそれぞれ発現させたＨＥＫ２９３細胞は次のように作製した。表１に示す組成の反応液を調製しクリーンベンチ内で１５分静置した後、９６ウェルプレート（ＢＤ）の各ウェルに添加した。次いで、ＨＥＫ２９３細胞（３×１０5細胞／ｃｍ2）を１００μｌずつ各ウェルに播種し、３７℃、５％ＣＯ2を保持したインキュベータ内で２４時間培養した。
【００３１】
【表１】
0005520173.tif 000002
【００３２】
２）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞に発現させた嗅覚受容体は、細胞内在性のＧαｓと共役しアデニル酸シクラーゼを活性化することで、細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる。本研究での匂い応答測定には、細胞内ｃＡＭＰ量の増加をホタルルシフェラーゼ遺伝子（fluc2P-CRE-hygro）由来の発光値としてモニターするルシフェラーゼレポータージーンアッセイを用いた。また、ＣＭＶプロモータ下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を融合させたもの（hRluc-CMV）を同時に遺伝子導入し、遺伝子導入効率や細胞数の誤差を補正する内部標準として用いた。
上記１）で作製した培養物から、培地をピペットで取り除き、ＣＤ２９３培地（Invitrogen）で調製した匂い物質を含む溶液を７５μｌ添加した。試験物質としては、文献（合成香料“化学と商品知識”印藤元一  化学工業日報社)の情報から、ＩＦＦ、高砂香料工業、Givaudan、宇部興産、Sigma-Aldrich、Firmenich、花王株式会社などより下記表２に記載の香料を入手し、３００μＭを用いた。細胞をＣＯ2インキュベータ内で３７℃で４時間培養し、ルシフェラーゼ遺伝子を細胞内で充分に発現させた。プレートを１０分間室温に放置した後、Dual-GloTM luciferase assay kit（Promega）を用いて細胞内に蓄積したルシフェラーゼ量を測定することにより、それぞれの嗅覚受容体の応答を評価した。ルシフェラーゼの活性測定には、Dual-GloTM luciferase assay system（promega）を用い、製品の操作マニュアルに従って測定を行った。試験物質刺激により誘導されたホタルルシフェラーゼ由来の発光値を、試験物質刺激を行わない細胞での発光値で割った値をfold increaseとして算出し、応答強度の指標とした。
【００３３】
【表２】
0005520173.tif 000003
【００３４】
結果を図１に示す。OR10A6（図１Ａ）、OR2W1（図１Ｂ）は、それぞれミューゲ香料であるDimethyl phenylethyl carbinol、Muguesia、Suzaral、Cyclamene aldehydeに強く応答したが、一方、非ミューゲ香料であるFruitate、Muscone、Boisambrene forte、Ambroxan、Amber core、Iso E Super、Acetylcedrene、Vanillin、Herbavert、Triplal及びIsocyclocitralには試験物質刺激を行わない場合と同等程度にしか応答しなかった。このことから、嗅覚受容体OR10A6又はOR2W1を用いてミューゲ香料素材の候補物質の選択が可能であることが示された。
【図１】
0005520173.tif 000004
【配列表】
0005520173000001.app