(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）ブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを有するオリゴヌクレオチドプライマー（前記ブロッキング基は、前記オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の終末に又はその付近に連結され、前記ブロッキング基は、プライマーの伸長を妨げ、及び／又はプライマーがＤＮＡ合成用テンプレートとして役割を果たすことを阻害する。）、
（ｉｉ）標的配列を有してもよく又は有さなくてもよい試料核酸、
（ｉｉｉ）反応で採用された高い温度で活性を得て、より低い温度で低下した活性を有する、熱安定的なＲＮアーゼＨ２酵素である切断酵素並びに
（ｉｖ）ポリメラーゼ
を含む反応混合物を提供する工程；
ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；及び
ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
を含む、標的ＤＮＡ配列を増幅する方法。
【請求項２】
前記ＲＮアーゼＨ２酵素が化学的修飾によって又は遮断抗体によって可逆的に不活化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブロッキング基がプライマーの３’−末端ヌクレオチドに付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ブロッキング基が３’−末端残基の５’に付着されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ブロッキング基が１つ又はそれ以上の塩基脱落残基を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
塩基脱落残基がＣ３スペーサーである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ブロッキング基が増幅反応の検出を可能にする標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
標識が蛍光色素、消光物質、ビオチン又はハプテンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記切断ドメインが、塩基脱落残基をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
切断ドメインが単一のＲＮＡ残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
切断ドメインがＲＮＡ残基を欠如する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
切断ドメインが１つ又はそれ以上の２’修飾されたヌクレオシドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２’修飾されたヌクレオシドが単一の２’−フルオロヌクレオシドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオシド残基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
切断反応が、以下の二価の陽イオン：マンガン、コバルト、ニッケル又は亜鉛の１つ又はそれ以上の存在下で実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
反応混合物中にマグネシウムも存在する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
切断ドメイン内の又は切断ドメインに隣接する配列がヌクレアーゼ切断に対して耐性を有する１つ又はそれ以上のヌクレオシド間連結を含有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヌクラーゼ耐性連結が、塩基脱落残基である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヌクラーゼ耐性連結が切断ドメインの３’側に存在する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＣＲを支持するために、第一のプライマーとは逆の方向性の第二のプライマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
第二のプライマーが修飾されていないＤＮＡプライマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第二のプライマーがブロッキング基の５’に位置する切断ドメインを含み、前記ブロッキング基がオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端の終末に又はその付近に連結されており、前記ブロッキング基がプライマーの伸長を妨げる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
バリアント対立遺伝子間を識別するために、ＰＣＲアッセイが使用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
バリアント対立遺伝子の検出を増強するために、第二の変異部位が切断ドメイン内に又は切断ドメインに隣接して取り込まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
試料中の標的核酸配列の量を定量するために、ＰＣＲアッセイが使用される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
２００８年４月３０日に出願された米国仮出願６１／０４９，２０４号（その全体が、参照により組み込まれる。）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、生物学アッセイを開始し、補助し、モニターし、又は実行するために核酸鎖を切断する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などのプライマーを基礎とする増幅反応の特異性は、ＤＮＡテンプレートとのプライマーのハイブリッド形成の特異性に大きく依存する。典型的な増幅反応において使用される高温下では、プライマーは、理想的には、意図される標的配列のみにハイブリッド形成し、プライマー伸長産物を形成して、標的配列の相補物を産生する。しかしながら、プライマーハイブリッド形成の特異性を確保するために必要とされる温度より非常に低い室温では、増幅反応混合物が通例組み立てられる。より低温条件下では、プライマーは、部分的に相補的な他の核酸配列へ又は他のプライマーへ非特異的に結合し、標的配列とともに増幅され得る望ましくない伸長産物の合成を開始し得る。非特異的なプライマー伸長産物の増幅は、所望の標的配列の増幅と競合し得、所望の配列の増幅の効率を著しく減少させ得る。ある種のアッセイにおいて、非特異的増幅は偽陽性結果も生じさせ得る。
【０００４】
ＰＣＲ中の非特異的増幅産物の頻繁に観察される１つの種類は、「プライマー二量体」として知られる増幅反応のテンプレート非依存的人工産物である。プライマー二量体は、その長さが通例２つのプライマーの長さの合計に近い二本鎖断片であり、１つのプライマーが別のプライマー上で伸長されるときに増幅される。得られた二重鎖は、その長さが短いために、効率的に増幅される所望されないテンプレートを形成する。
【０００５】
非特異的な増幅は、反応の開始前に、プライマー伸長産物（例えば、プライマー二量体）の形成を低減することによって低減させることができる。「ホットスタート」プロトコールと称される１つの方法では、必要なハイブリッド形成の特異性を与えるのに十分に温度が上昇されるまで、１つ又はそれ以上の不可欠な試薬が反応混合物から除去される。このようにして、反応混合物は、より低い温度でのプライマー伸長を支持することができない。最初の高温温置工程後に反応管が開けられ、除去されていた試薬が添加される手動のホットスタート法は、労力が必要であり、反応混合物のきょう雑のリスクを増加させる。
【０００６】
あるいは、米国特許第５，４１１，８７６号及び「Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）：１７１７−１７２３」に記載されているように、反応成分を分離し又は取り囲むために、蝋などの熱感受性材料を使用することができる。これらの方法では、高温の反応前温置が熱感受性材料を融解することによって、試薬を混合させる。
【０００７】
ＰＣＲの開始前に、プライマー伸長産物の形成を低減させる別の方法は、ＤＮＡポリメラーゼの熱可逆性不活化に依拠する。米国特許第５，７７３，２５８号及び米国特許第５，６７７，１５２号（何れも、参照により、本明細書に組み込まれる。）は、修飾基の共有的付着によって可逆的に不活化されるＤＮＡポリメラーゼを記載している。高温での不活化されたＤＮＡポリメラーゼの温置は、修飾子−酵素結合を切断させることによって、酵素の活性な形態を放出する。ＤＮＡポリメラーゼ特異的抗体によるＤＮＡポリメラーゼの非共有的可逆的阻害が、米国特許第５，３３８，６７１号（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【０００８】
本発明の１つの目的は、例えば、増幅反応（特に、増幅された産物の多数のコピーが産生されるＰＣＲ）における重大な関心事である持ち越し交差きょう雑の問題に対処するために使用することができる。従来技術では、数多くの方式で、この問題を解決するための試みが為されてきた。例えば、直接的なＵＶ照射は、きょう雑ＤＮＡを効率的に除去することができるが（Ｒｙｓ  ＆  Ｐｅｒｓｉｎｇ，  １９９３，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（９）：２３５６−６０  ａｎｄ  Ｓａｒｋａｒ  ＆  Ｓｏｍｍｅｒ，  １９９０  Ｎａｔｕｒｅ．３４３（６２５３）：２７）、ポリメラーゼ、プライマー及びテンプレートＤＮＡの添加前に、ＰＣＲ試薬の照射が行われなければならない。さらに、反応中に存在するモノヌクレオチドの多数がＵＶ光の多くを吸収するので、このアプローチは非効率的であり得る。別の「ＵＮＧ法」は、天然に存在する原型のＤＮＡとは異なるように、産物の組成を変化させるために、ｄＵＴＰを増幅された断片中に取り込む（Ｌｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，  Ｇｅｎｅ，  ９３（１）：１２５−１２８）。酵素ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）が、ＰＣＲ混合物の他の成分と一緒に添加される。ＵＮＧ酵素は、増幅前に、きょう雑しているアンプリコンのＤＮＡ鎖からウラシル塩基を切断し、試料ＤＮＡに影響を与えずに、このような産物の全てが新たなＤＮＡ合成用のテンプレートとして作用できないようにする。次いで、ＵＮＧ酵素が熱不活化され、次いで、ＰＣＲが実施される。ｄＵＴＰ及びＵＮＧ酵素が必要であることが、ＰＣＲを実施するコストを著しく増大させる。
【０００９】
本発明の別の目的は、熱安定的ＲＮアーゼＨと結合された反応系列を通じて、ホットスタート反応が達成されるＰＣＲアッセイを提供することである。
【００１０】
リボヌクレアーゼ酵素
リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）は、より小さな成分へのＲＮＡの加水分解を触媒する酵素である。この酵素は、体内（体液中）、皮膚の表面上に及び処理されていない実験室のガラス機器などの多くの物体の表面上に存在する。二本鎖ＲＮアーゼは、ほぼ全ての細胞内環境中に存在し、ＲＮＡ含有二本鎖構築物を切断する。一本鎖ＲＮアーゼは、細胞外環境に遍在しており、従って、幅広い条件下で機能するために極めて安定である。
【００１１】
ＲＮアーゼＨは、これまで調べられた全ての生物中に存在するリボヌクレアーゼの保存されたファミリーである。ＲＮアーゼＨ１及びＲＮアーゼＨ２というＲＮアーゼの２つの主要なクラスが存在する。レトロウイルスのＲＮアーゼＨ酵素は、原核生物のＲＮアーゼＨ１と似ている。これらの酵素の全ては、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡ成分を切断できるという特徴を共有している。ヒト及びマウスＲＮアーゼＨ１遺伝子は、アミノ酸レベルで７８％同一である（Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ５３，  ３００−３０７）。原核生物では、遺伝子は、ｒｎｈａ（ＲＮアーゼＨ１）及びｒｎｈｂ（ＲＮアーゼＨ２）と名づけられている。原核生物のＲＮアーゼの第三のファミリーｒｎｈｃ（ＲＮアーゼＨ３）が提案されている（Ｏｈｔａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３８，  ６０５−６１８）。
【００１２】
進化的には、「古」生物（古細菌種）は、幾つかの事例で、近代的なＲＮアーゼＨ２酵素と最も近縁の単一のＲＮアーゼＨ酵素（原核生物性）のみを有するようである（Ｏｈｔａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ，８８，１２−１９）。例外が存在し、古細菌ハロバクテリウム（ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、ＲＮアーゼＨ１のオルソログを有する（Ｏｈｔａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ，  （２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３８１，  ７９５−８０２）。ＲＮアーゼＨ１遺伝子は、サームス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）中にも同定されている（Ｉｔａｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９，  ４４４３−４４４９）。ＲＮアーゼＨ２酵素は、全ての生物中に存在するようである。ＲＮアーゼＨ酵素の全てのクラスがＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡ成分を加水分解するが、基質及び補因子要求性は異なる。例えば、ＩＩ型酵素は補因子としてＭｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋（及び時には、Ｎｉ＋＋）を使用するのに対して、Ｉ型酵素はＭｇ＋＋を必要とし、Ｍｎ＋＋イオンによって阻害され得る。反応産物は酵素の両クラスに関して同じであり、切断された産物は３’−ＯＨ及び５’−ホスファートを有する（図１参照）。ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖を切断するＲＮアーゼＩＩＩクラス酵素（例えば、Ｄｉｃｅｒ、Ａｇｏ２、Ｄｒｏｓｈａ）は、類似の産物をもたらし、ＲＮアーゼＨと類似するヌクレアーゼドメインを含有する。多くの他のリボヌクレアーゼ、特に、一本鎖リボヌクレアーゼは、環状２’，３’−ホスファート及び５’−ＯＨ産物をもたらす（図２参照）。
【００１３】
Ｉ型ＲＮアーゼＨ
イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮアーゼＨ１は、広く性質決定されてきた。アンチセンスオリゴヌクレオチドの設計に影響を及ぼすので、基質の要求性の決定に焦点を絞って、この酵素に対して多数の研究が行われてきた。これには、イー・コリＲＮアーゼＨ１（Ｃｒｏｏｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３１２（Ｐｔ  ２），５９９−６０８；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２，２７５１３−２７５１６；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，３９０−３９８；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２，１８１９１−１８１９９；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，８３−９１；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１，７３−８２；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８，１４９０６−１４９１２；Ｌｉｍａ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８，４９８６０−４９８６７参照）及びヒトＲＮアーゼＨ１（Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，８，５３−６１；Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４，２８２７０−２８２７８；Ｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６，２３５４７−２３５５３参照）の両方に対する研究が含まれた。組織培養において、ヒトＲＮアーゼＨ１の過剰発現はアンチセンスオリゴ（ＡＳＯ）の効力を増加させるのに対して、ｓｉＲＮＡ又はＡＳＯの何れかを用いたＲＮアーゼＨ１のノックダウンはアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を減少させる。
【００１４】
Ｉ型ＲＮアーゼＨは、完全な活性のために、基質中に複数のＲＮＡ塩基を必要とする。（ＤＮＡオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成された）１又は２個のＲＮＡ塩基のみを有するＤＮＡ／ＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、非活性である。３つの連続するＲＮＡ塩基を有するイー・コリのＲＮアーゼＨ１基質を用いると、弱い活性を示す。４つのＲＮＡ塩基の連なりを用いると、完全な活性が観察された（Ｈｏｇｒｅｆｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６５，  ５５６１−５５６６）。ＲＮアーゼＨ１は、１９９１年に、サームス・サーモフィラスからクローニングされ、イー・コリ酵素と５６％のアミノ酸同一性を有するに過ぎないが、類似の触媒特性を有している（Ｉｔａｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９，  ４４４３−４４４９）。この酵素は、６５℃で安定であるが、８０℃まで過熱されると、急速に活性を失う。
【００１５】
１９９８年には、ヒトＲＮアーゼＨ１遺伝子（Ｉ型ＲＮアーゼＨ）がクローニングされた（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ５３，  ３００−３０７及びＡｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，  ８，  ５３−６１）。この酵素は、切断が起こるために、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ中に５塩基のＲＮＡの連なりを必要とする。中性ｐＨの１ｍＭＭｇ＋＋緩衝液中で最大の活性が観察され、Ｍｎ＋＋イオンは阻害的であった（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７４，  ２８２７０−２８２７８）。ＲＮＡを２’−修飾されたヌクレオシド（２’−ＯＭｅ、２’−Ｆなど）で置換すると、切断は観察されなかった。
【００１６】
３つのアミノ酸（Ａｓｐ−１０、Ｇｌｕ−４８及びＡｓｐ−７０）がイー・コリＲＮアーゼＨ１の触媒性部位を構成し、これらのアミノ酸は、タンパク質の高度に保存されたカルボキシ末端ドメイン中に存在する（Ｋａｔａｙａｎａｇｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４７，  ３０６−３０９）。このドメインは、部位指定突然変異誘発及び結晶構造の決定の両者によって評価された。同じアミノ酸は、二価イオン補因子の配位に関与している。
【００１７】
興味深いことに、基質二重鎖の２’−修飾は、ヘリックスの幾何学を変化させ、ＲＮアーゼＨ１の活性に悪影響を与え得る。ＲＮＡセグメントに隣接する２’−Ｏ−（２−メトキシ）エチル（ＭＯＥ）修飾は、おそらくは糖の立体構造及びヘリックスの幾何学の変化のために、切断速度を低下させる。鍵型核酸（ＬＮＡ）塩基は、より大きな程度で、ヘリックスの幾何学を擾乱し、より大きな程度で酵素活性に影響を与えた（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ７１，  ８３−９１及びＭｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ７１，  ７３−８２）。基質二重鎖中に存在するときに、Ｄａｍｈａ（ＭｃＧｉｌｌ大学）は２’−Ｆ修飾されたヌクレオシド（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ｂ−Ｄ−リボース）の効果を研究し、この基がＲＮアーゼＨ１によって切断され得ないことを見出している（Ｙａｚｂｅｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３０，  ３０１５−３０２５）。式Ａ及びＢは、ＲＮアーゼＨ１切断に関して提案された２つの異なる機序を図解しており、これらの何れもが２’ＯＨ基の関与を必要とする。
【００１８】
【化１】
0005539325.tif 000002
【００１９】
Ｄａｍｈａの研究は、反応機序が２’−ＯＨ基を伴う酵素の既知の活性部位と合致している。酵素の活性部位は、二重鎖の静電的結合におそらく寄与するリジン残基のクラスター内に存在する。結合表面と負に帯電したホスファート骨格の間の相互作用は、ＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖の小溝に沿って起こると考えられている（Ｎａｋａｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ，  （１９９１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ＵＳＡ，  ８８，  １１５３５−１１５３９）。従って、小溝に影響を与える構造の変化は、基質と活性部位間の相互作用に影響を与えるはずである。例えば、小溝の幅はＢ型ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖中で７．５オングストローム、純粋なＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖中で１１オングストロームであり、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のハイブリッドＡ型二重鎖中では８．５オングストロームである（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  ＪＭｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２３３，  ５０９−５２３）。２’−修飾は小溝内に突出しており、これは、ＲＮＡアーゼＨ１による切断に対する修飾された基質の活性を低減又は除去する上でのこれらの基の挙動の幾つかを説明し得る。化学構造の変化に関して、最も「保存的な」ＲＮＡ類縁体である２’−Ｆヌクレオシドでさえ、活性に悪影響を与える。
【００２０】
ＩＩ型ＲＮアーゼＨ
ヒトＩＩ型ＲＮアーゼＨは、１９９１年にＥｄｅｒ及びＷａｌｄｅｒによって、最初に精製及び性質決定された（Ｅｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６６，  ６４７２−６４７９）。この酵素は、特徴的な二価の金属イオン依存性を有していたので、最初、ヒトＲＮアーゼＨ１と称され、その後、クラスＩＲＮＡアーゼＨとして知られた。現在の命名法では、ＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素である。Ｍｇ＋＋中では活性であり、Ｍｎ＋＋イオンによって阻害されるＩ型酵素とは異なり、ＩＩ型酵素は幅広い様々な二価の陽イオンとともに活性を有する。１０ｍＭＭｇ＋＋、５ｍＭＣｏ＋＋又は０．５ｍＭＭｎ＋＋とともに、ヒトＩＩ型ＲＮアーゼＨの最適な活性が観察される。
【００２１】
重要なことに、ＩＩ型ＲＮアーゼＨの基質特異性（以降、ＲＮアーゼＨ２と称される。）はＲＮアーゼＨ１と異なる。特に、この酵素は、（二重鎖形態の）ＤＮＡ配列内に埋没された単一のリボヌクレオチドを切断することができる（Ｅｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  ７５，  １２３−１２６）。興味深いことに、切断は、ＲＮＡ残基の５’側で起こる（図３参照）。原核生物のＲＮアーゼＨ２酵素の要約に関しては、Ｋａｎａｙａによる最近の概説を参照されたい（Ｋａｎａｙａ  （２００１）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ３４１，  ３７７−３９４）。
【００２２】
イー・コリのＲＮアーゼＨ２遺伝子がクローニングされ（Ｉｔａｙａ，  Ｍ．  （１９９０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ８７，  ８５８７−８５９１）、性質決定されている（Ｏｈｔａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｔｏｋｙｏ），  １２７，  ８９５−８９９）。ヒト酵素と同様に、イー・コリ酵素はＭｎ＋＋イオンとともに機能し、実際に、マグネシウムよりマンガンを用いたときに活性がより高い。
【００２３】
ＲＮアーゼＨ２遺伝子はクローニングされ、この酵素は様々な真核生物及び原核生物源から性質決定されている。ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（ＫＯＤ１）ＲＮアーゼＨ２はクローニングされ、詳しく研究されている（Ｈａｒｕｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １８０，  ６２０７−６２１４；  Ｍｕｋａｉｙａｍａ，  ｅｔ  ａｌ，  （２００４）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４３，  １３８５９−１３８６６）。関連する生物ピロコッカス・フューリウス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｕｓ）から得られるＲＮアーゼＨ２もクローニングされているが、完全には性質決定されていない（Ｓａｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ３０９，  ２４７−２５２）。
【００２４】
メタノコッカス・ジャナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）から得られたＲＮアーゼＨ２が、Ｌａｉによってクローニングされ、性質決定されている（Ｌａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ８，  ８９７−９０４；  Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，  （２００３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４２，  ７８５−７９１）。酵素への金属イオンの結合を定量的に測定するために、等温滴定熱量測定を使用した。彼らは、Ｍｎ＋＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋及びＢａ＋＋の結合を検査し、全ての事例で、１：１モル濃度の結合比を観察し、酵素の活性部位中に単一の二価金属イオン補因子のみが存在することを示唆する。Ｍｎ＋＋に対する会合定数は、Ｍｇ＋＋より１０倍高かった。ピーク酵素活性は、０．８ｍＭＭｎＣｌ２で見られた。
【００２５】
きょう雑一本鎖リボヌクレアーゼによる並びにＭｇ２＋及び他の二価陽イオンによって促進される水触媒性加水分解によるオリゴヌクレオチドのバックグラウンド切断によって、サイクリングプローブ反応（Ｗａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４０３，７１１号）などのＲＮアーゼＨによるＲＮＡ含有プローブの切断を基礎とする核酸ハイブリッド形成アッセイは以前には制約されてきた。一本鎖リボヌクレアーゼの効果は、一本鎖リボヌクレアーゼを遮断するが、ＲＮアーゼＨの活性を妨害しないＲＮａｓｉｎなどの阻害剤によって、ある程度まで軽減され得る。
【００２６】
一本鎖リボヌクレアーゼはＲＮＡ残基の３’を切断し、リボースの２’及び３’位に環状ホスファート基を残す（図２参照）。水によって触媒される自発的な加水分解によって、同じ産物が産生される。何れの事例でも、環状ホスファートは加水分解することができ、酵素触媒された反応において３’−一リン酸エステル又は自発的な加水分解を通じて３’−及び２’−一リン酸エステルの混合物をさらに形成する。ＲＮアーゼＨによって形成された切断産物（図１）とプローブの非特異的切断によって形成された切断産物（図２）との差は、２つの経路を区別するための基礎を与える。単一のＲＮＡ残基のみを有する基質を用いて、ＲＮアーゼＨ２及び一本鎖リボヌクレアーゼによる切断を比較すると、この差はさらに顕著になる。この場合には、ＲＮアーゼＨ２及び一本鎖リボヌクレアーゼは、ホスファート骨格に沿った異なる位置を攻撃する（図３参照）。
【００２７】
ＲＮアーゼは、サイクリングプローブアッセイにおいて、ＰＣＲアッセイにおいて（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７６３，１８１号；Ｓａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  米国特許第７，１３５，２９１号；及びＢｅＨｌｋｅ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｅｒ，米国特許公開第２００８００６８６４３号）及び多項目式増幅反応（Ｂｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，１１２，４０６号）において、切断酵素として使用されてきた。これらのアッセイによって与えられる改善に関わらず、多大な制約が残っている。ＰＣＲアッセイは、コストを大幅に上昇させるホットスタートＤＮＡポリメラーゼを使用する。さらに、別のＤＮＡポリメラーゼが必要とされるごとに、酵素の新たなホットスタート様式を開発しなければならない。さらに、これらの様々なアッセイの有用性は、ＲＮＡ残基の３’の水及び二価の金属イオンによって触媒される加水分解、一本鎖リボヌクレアーゼによる加水分解並びにＲＮＡ残基の５’−ホスファート以外の位置でのＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素によって触媒される非典型的な切断反応などの反応において使用されるオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの望ましくない切断によって制約される。本発明は、これらの制約を克服し、生物学的アッセイにおいてＲＮアーゼＨを使用するためにさらなる利点及び新たなアッセイフォーマットを提供する。
【００２８】
本発明は、核酸増幅、検出、連結、配列決定及び合成に関連して、ＲＮアーゼＨ切断を使用する新規生物学的アッセイを提供する。さらに、本発明は、ＲＮアーゼＨによる切断を使用するための新規アッセイフォーマット及びこのようなアッセイのための新規オリゴヌクレオチド基質を提供する。本発明の化合物、キット及び方法は、プライマー二量体などの非特異的な増幅不純物を実質的に含まない、高度に特異的なプライマーを基礎とする増幅反応を達成する便利で経済的な手段を提供する。本発明の方法及びキットは、可逆的に不活化されたＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼ酵素の必要を回避する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２９】
【特許文献１】米国特許第５，４１１，８７６号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７７３，２５８号明細書
【特許文献３】米国特許第５，６７７，１５２号明細書
【特許文献４】米国特許第５，３３８，６７１号明細書
【特許文献５】米国特許第５，７６３，１８１号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００８／００６８６４３号明細書
【特許文献７】米国特許第７，１１２，４０６号明細書
【非特許文献】
【００３０】
【非特許文献１】Ｃｈｏｕ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０（７）、１９９２年、ｐｐ．１７１７−１７２３
【非特許文献２】Ｒｙｓ  ＆  Ｐｅｒｓｉｎｇ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１（９）、１９９３年、ｐｐ．２３５６−６０
【非特許文献３】Ｓａｒｋａｒ  ＆  Ｓｏｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ．３４３（６２５３）、１９９０年、２７
【非特許文献４】Ｌｏｎｇｏ他、Ｇｅｎｅ，  ９３（１）、１９９０年、ｐｐ．１２５−１２８
【非特許文献５】Ｃｅｒｒｉｔｅｌｌｉ，他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，５３，１９９８年、ｐｐ．３００−３０７
【非特許文献６】Ｏｈｔａｎｉ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３８、１９９９年、ｐｐ．６０５−６１８
【非特許文献７】Ｏｈｔａｎｉ，他、Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ，８８，ｐｐ．１２−１９
【非特許文献８】Ｏｈｔａｎｉ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，  ３８１、２００４年、ｐｐ．７９５−８０２
【非特許文献９】Ｉｔａｙａ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９、１９９１年、ｐｐ．４４４３−４４４９
【非特許文献１０】Ｃｒｏｏｋｅ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，３１２（Ｐｔ２）、１９９５年、ｐｐ．５９９−６０８
【非特許文献１１】Ｌｉｍａ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２、１９９７年、ｐｐ．２７５１３−２７５１６
【非特許文献１２】Ｌｉｍａ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６，１９９７年、ｐｐ．３９０−３９８
【非特許文献１３】Ｌｉｍａ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７２、１９９７年、ｐｐ．１８１９１−１８１９９
【非特許文献１４】Ｌｉｍａ，他、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１、２００７年、ｐｐ．８３−９１
【非特許文献１５】Ｌｉｍａ，他、Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７１、２００７年、ｐｐ．７３−８２
【非特許文献１６】Ｌｉｍａ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８、２００３年、ｐｐ．１４９０６−１４９１２
【非特許文献１７】Ｌｉｍａ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７８、２００３年、ｐｐ．４９８６０−４９８６７
【非特許文献１８】Ｗｕ，他、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，８、１９９８年、ｐｐ．５３−６１
【非特許文献１９】Ｗｕ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７４、１９９９年、ｐｐ．２８２７０−２８２７８
【非特許文献２０】Ｗｕ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７６、２００１年、ｐｐ．２３５４７−２３５５３
【非特許文献２１】Ｈｏｇｒｅｆｅ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６５、１９９０年、ｐｐ．５５６１−５５６６
【非特許文献２２】Ｉｔａｙａ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９、１９９１年、ｐｐ．４４４３−４４４９
【非特許文献２３】Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  ５３，ｐｐ．３００−３０７
【非特許文献２４】Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ，  ８、ｐｐ．５３−６１
【非特許文献２５】Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７４、ｐｐ．２８２７０−２８２７８
【非特許文献２６】Ｋａｔａｙａｎａｇｉ，他、Ｎａｔｕｒｅ，  ３４７、１９９０年、ｐｐ．３０６−３０９
【非特許文献２７】Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ７１、ｐｐ．８３−９１
【非特許文献２８】Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ７１、ｐｐ．７３−８２
【非特許文献２９】Ｙａｚｂｅｃｋ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  ３０、２００２年、ｐｐ．３０１５−３０２５
【非特許文献３０】Ｎａｋａｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｄ  ＵＳＡ，  ８８、１９９１年、ｐｐ．１１５３５−１１５３９
【非特許文献３１】Ｆｅｄｏｒｏｆｆ他、ＪＭｏｌ  Ｂｉｏｌ，  ２３３、１９９３年、ｐｐ．５０９−５２３
【非特許文献３２】Ｅｄｅｒ，他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２６６、１９９１年、ｐｐ．６４７２−６４７９
【非特許文献３３】Ｅｄｅｒ，他、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  ７５、１９９３年、ｐｐ．１２３−１２６
【非特許文献３４】Ｋａｎａｙａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，  ３４１，２００１年、ｐｐ．３７７−３９４
【非特許文献３５】Ｉｔａｙａ，  Ｍ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ８７、１９９０年、ｐｐ．８５８７−８５９１
【非特許文献３６】Ｏｈｔａｎｉ，他、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｔｏｋｙｏ），１２７、２０００年、ｐｐ．８９５−８９９
【非特許文献３７】Ｈａｒｕｋｉ，他、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １８０、１９９８年、ｐｐ．６２０７−６２１４
【非特許文献３８】Ｍｕｋａｉｙａｍａ，  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４３、２００４年、ｐｐ．１３８５９−１３８６６
【非特許文献３９】Ｓａｔｏ，他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，３０９，２００３年、ｐｐ．２４７−２５２
【非特許文献４０】Ｌａｉ，他、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，８、２０００年、ｐｐ．８９７−９０４
【非特許文献４１】Ｌａｉ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４２、２００３年、ｐｐ．７８５−７９１
【発明の概要】
【００３１】
本発明の１つの目的は、ＰＣＲ、ＯＬＡ（オリゴヌクレオチド連結アッセイ）、ＬＣＲ（連結連鎖反応）、多項目式増幅及びＤＮＡ配列決定などの（但し、これらに限定されない。）核酸増幅及び検出アッセイにおいてホットスタートプロトコールを可能にすることであり、ホットスタート成分は熱安定的なＲＮアーゼＨ又は反応において使用される高温で活性を有する他のニック生成酵素である。このようなアッセイは、相補的核酸配列にハイブリッド形成し、切断されて機能的な５’又は３’末端を生成するまで、反応に参加することができない本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドを使用する。標準的な非修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドが使用される対応するアッセイと比べて、特異性が大幅に強化される。さらに、可逆的に不活化されたＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼが不要となる。
【００３２】
プライマー伸長を伴うアッセイ（例えば、ＰＣＲ、多項目式増幅及びＤＮＡ配列決定）の場合には、オリゴヌクレオチド阻害活性の修飾は、好ましくは、３’末端に又は３’末端付近に位置する。オリゴヌクレオチドがプライマーとして使用される幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチド阻害活性は、オリゴヌクレオチドの３’末端付近に位置する（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端から最大約１０の塩基）。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド阻害活性は、３’末端付近に位置し得る（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端から約１から６の塩基）。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド阻害活性は、３’末端付近に位置し得る（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端から約１から５の塩基）。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド阻害活性は、３’末端付近に位置し得る（例えば、本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端から約１から３の塩基）。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド阻害活性が位置し得る３’末端からの正確な位置（すなわち、塩基の数）は、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーが標的配列（すなわち、それに対してハイブリッド形成が所望される配列）上のプライマー自体の短縮された相補物にハイブリッド形成する能力に影響を与える因子に依存する。このような因子には、Ｔｍ、緩衝液組成及び反応において使用される徐冷温度が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
連結アッセイ（例えば、ＯＬＡ及びＬＣＲ）に関しては、修飾阻害活性はオリゴヌクレオチドの３’又は５’末端の何れかに位置し得又はこれらの付近に位置し得る。他の実施形態において、連結アッセイに関して、修飾阻害活性は、使用されるのであれば、プローブ切断によって除去される領域中の切断可能なＲＮＡ塩基の３’に存在するドメイン内に好ましく配置される。他の実施形態において、連結アッセイに関して、ミスマッチ識別を改善するのに有用である特異性を改善するために、本発明のオリゴヌクレオチドプローブ中のＲＮＡ塩基の近くにＣ３スペーサーを配置し得る。他の実施形態において、読み取りが連結現象の産物を増幅するためのＰＣＲアッセイに依存するＯＬＡアッセイでは、ＲＮアーゼＨ切断によって除去される本発明のオリゴヌクレオチドのドメイン中に、何れかのブロッキング基を配置し得る。このような実施形態において、読み取りが連結現象の産物を増幅するためのＰＣＲアッセイに依存するＯＬＡアッセイでは、切断に対する特異性を変化させるために、ＲＮアーゼＨ切断可能なドメイン中のブロッキング基の正確な位置は調整され得、切断可能なＲＮＡ塩基に対するブロッキング基の正確な配置は、最適な切断速度を達成するために必要とされる酵素の量を変化させ得る。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、プライマー伸長と連結を妨害するためのオリゴヌクレオチドの新規修飾を提供することである。
【００３５】
本発明のさらなる目的は、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ合成用のテンプレートとしての役割を果たすことを妨げ、これにより、ＰＣＲを妨害するオリゴヌクレオチドの修飾を提供することである。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、ＲＮアーゼＨによって切断されるＲＮＡを欠如する修飾されたオリゴヌクレオチド配列を提供することである。１つのこのような実施形態において、オリゴヌクレオチドは単一の２’−フルオロ残基を含有し、切断はＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素によって媒介される。より好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは、２つの隣接する２’−フルオロ残基を含有する。
【００３７】
本発明のさらなる目的は、ＲＮＡ残基に対して３’の、水及び二価の金属イオンによって触媒される加水分解、一本鎖リボヌクレアーゼによる加水分解及びＲＮＡ残基の５’−ホスファート以外の位置での、ＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素によって触媒される非典型的な切断反応などの（但し、これらに限定されない。）所望されない切断反応を阻害するように修飾された、上記アッセイにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドを提供することである（図３参照）。１つのこのような実施形態において、ＲＮＡ残基の２’水酸基は、フッ素又はアルコキシ置換基（例えば、Ｏ−メチル）などの別の官能基で置換される。別のこのような実施形態において、ＲＮＡ残基に対して３’のホスファート基が、ホスホロチオアート又はジチオアート連結で置換される。さらに別の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡアーゼＨ２による異常な切断を抑制するために、ＲＮＡ残基の３’ホスファート基からさらに下流で又はＲＮＡ残基の５’側で、ヌクレアーゼ耐性連結によって修飾される。このような実施形態において有用なヌクレアーゼ耐性連結には、ホスホロチオアート、ジチオアート、メチルホスホナート及びＣ３スペーサーなどの塩基脱落残基が含まれる。本発明のＰＣＲアッセイにおいて使用されるオリゴヌクレオチドプライマー中へのこのようなヌクレアーゼ耐性連結の取り込みは、特に有益であることが見出された（実施例２５、２７及び２８参照）。
【００３８】
本発明のさらなる目的は、バリアント対立遺伝子の強化された識別を与えるために、切断部位に隣接する位置で修飾された上記アッセイにおいて使用するためのオリゴヌクレオチドを提供することである。このような修飾には、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基及び二次的ミスマッチ置換が含まれるが、これらに限定されない（実施例２３参照）。
【００３９】
さらなる目的は、オリゴヌクレオチドの切断を蛍光の変化によって測定することができる本発明において使用するためのオリゴヌクレオチド及びアッセイフォーマットを提供することである。１つのこのような実施形態では、ＲＮＡアーゼＨによって切断可能なプライマーは、蛍光色素及び消光物質で標識され、アッセイは蛍光の増加によってモニターされる（実施例１９から２１参照）。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、酵素が熱安定的であり、低温において低下した活性を有する、ＲＮＡアーゼＨ組成物及び該組成物を使用するためのプロトコールを提供することである。
【００４１】
さらなる実施形態において、ＩＩ型ＲＮアーゼＨは、プローブ中のＲＮＡ残基が２’−フルオロ残基で置換されているサイクリングプローブ反応において使用される。より好ましい実施形態において、２つの隣接する２’−フルオロ残基を有するプローブが使用される。
【００４２】
プライマー伸長アッセイ、連結アッセイ及びサイクリングプローブ反応に関する本発明の態様の多くは、それぞれ、表１、２及び３に要約されている。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態において、ＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素は、ＤＮＡ配列決定のための新規方法において使用される。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態において、ＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素は、ＤＮＡ合成のための新規方法において使用される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】複数のＲＮＡ塩基を含有する基質に対して、ＲＮアーゼＨ酵素を用いて生じる切断パターンを図示する。
【図２】最終産物がリボースの２’及び３’位置に環状ホスファート基をもたらす、一本鎖リボヌクレアーゼ酵素を用いて又は水によって触媒される加水分解を通じて生じる切断パターンを図示する。
【図３】単一のＲＮＡ塩基を含有する基質に上の、ＲＮアーゼＨ２及び一本鎖リボヌクレアーゼに対する切断部位を図示する。
【図４Ａ】誘導されたタンパク質が５つの古細菌ＲＮアーゼＨ２合成遺伝子から産生されたことを示すＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲルの写真である。図４Ａは、ピロコッカス・フュリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及びピロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）に対する誘導されたタンパク質を示している。
【図４Ｂ】誘導されたタンパク質が５つの古細菌ＲＮアーゼＨ２合成遺伝子から産生されたことを示すＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲルの写真である。図４Ｂは、メタノカルドコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、スルフォロバス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、ピロコッカス・カダダレンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｄａｒｅｎｓｉｓ）に対する誘導されたタンパク質を示している。
【図５】組換えＨｉｓｔａｇＲＮアーゼＨ２タンパク質のニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いた精製後に純粋な単一のバンドを示すＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色されたタンパク質ゲルを示している。
【図６】図５から得られたタンパク質ゲルを用いる、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いて行われたウェスタンブロットを示している。
【図７】ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、ピロコッカス・フュリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及びピロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）から得られる組換えＲＮアーゼＨ２酵素による、キメラ１１ＤＮＡ−８ＲＮＡ−１１ＤＮＡ鎖及び相補的ＤＮＡ鎖を含有する二重鎖の消化を示すゲルの写真である。
【図８Ａ】ピロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、ピロコッカス・フュリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及びメタノカルドコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（図８Ａ）及びピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（図８Ｂ）から得られる組換えＲＮアーゼＨ２酵素による、キメラ１４ＤＮＡ−１ＲＮＡ−１５ＤＮＡ鎖及び相補的ＤＮＡ鎖を含有する二重鎖の消化を示すゲルの写真である。
【図８Ｂ】ピロコッカス・アビッシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ）、ピロコッカス・フュリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）及びメタノカルドコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）（図８Ａ）及びピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）（図８Ｂ）から得られる組換えＲＮアーゼＨ２酵素による、キメラ１４ＤＮＡ−１ＲＮＡ−１５ＤＮＡ鎖及び相補的ＤＮＡ鎖を含有する二重鎖の消化を示すゲルの写真である。
【図９】ピロコッカス・アビッシイのＲＮアーゼＨ２酵素の活性に対する、９５℃での様々な時間の温置の効果を示す。
【図１０】様々な温置温度での、ピロコッカス・アビッシイのＲＮアーゼＨ２による、単一のリボヌクレオチド含有基質の切断の相対的量を示すゲルの写真である。
【図１１】図１０から得られたゲル中で切断された基質の実際の量を示すグラフである。
【図１２】異なる二価の陽イオンの存在下での、様々な単一の２’修飾された基質のピロコッカス・アビッシイのＲＮアーゼＨ２による切断を示すゲルの写真である。
【図１３】単一の２’−フルオロ又は二重２’−フルオロ（ジフルオロ）修飾された基質のピロコッカス・アビッシイのＲＮアーゼＨ２による切断を示すゲルの写真である。存在する二価の陽イオンは、Ｍｎ＋＋であった。
【図１４】１６の可能なジフルオロ修飾された全ての基質の、ピロコッカス・アビッシイのＲＮアーゼＨ２による相対的な切断を定量するグラフである。
【図１５】３’ＤＮＡ塩基の異なる数（すなわち、ＲＮＡ残基の３’側のＤＮＡ塩基の数）を有するｒＮ基質の、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２による相対的切断を定量するグラフである。
【図１６】５’ＤＮＡ塩基の異なる数（すなわち、ＲＮＡ残基の５’側のＤＮＡ塩基の数）を有するｒＮ基質の、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２による相対的切断を定量するグラフである。
【図１７】３’ＤＮＡ塩基の異なる数（すなわち、ｆＵｆＣ残基の３’側のＤＮＡ塩基の数）を有するジフルオロ基質のピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２による相対的切断を定量するグラフである。
【図１８】ブロックされたＰＣＲプライマーのＲＮアーゼＨ２活性化の反応模式図である。
【図１９】単一のブロックされたｒＵ含有プライマーを用いて行われた終点ＰＣＲ反応の産物を示すゲルの写真である。２Ｄ、３Ｄなどの接尾辞は、ｒＵ残基とプライマーの３’末端間のＤＮＡ塩基の数を表す。プライマーは、ジデオキシＣ残基でブロックキングされている。
【図２０Ａ】ＲＮアーゼＨ２あり（２０Ａ）及びＲＮアーゼＨ２（２０Ｂ）なしで、修飾されていないｒＮプライマー及びブロックされたｒＮプライマーの両方を用いた、ヒトＨＲＡＳ遺伝子内の３４０塩基対アンプリコンに対するＰＣＲ増幅プロットである。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図２０Ｂ】ＲＮアーゼＨ２あり（２０Ａ）及びＲＮアーゼＨ２（２０Ｂ）なしで、修飾されていないｒＮプライマー及びブロックされたｒＮプライマーの両方を用いた、ヒトＨＲＡＳ遺伝子内の３４０塩基対アンプリコンに対するＰＣＲ増幅プロットである。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図２１Ａ】ＲＮアーゼＨ２あり（２１Ａ）及びＲＮアーゼＨ２（２１Ｂ）なしで、修飾されていないｒＮプライマー及びブロックされたｒＮプライマーの両方を用いた、ヒトＥＴＳ２遺伝子内の１８４塩基対アンプリコンに対するＰＣＲ増幅プロットである。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図２１Ｂ】ＲＮアーゼＨ２あり（２１Ａ）及びＲＮアーゼＨ２（２１Ｂ）なしで、修飾されていないｒＮプライマー及びブロックされたｒＮプライマーの両方を用いた、ヒトＥＴＳ２遺伝子内の１８４塩基対アンプリコンに対するＰＣＲ増幅プロットである。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図２２Ａ】ＲＮアーゼＨ２あり（２２Ａ）及びＲＮアーゼＨ２（２２Ｂ）なしで、修飾されていないプライマー及び３’−ｆＮ修飾されたプライマーの両方を用いた、合成１０３塩基対アンプリコンに対するＰＣＲ増幅プロットである。
【図２２Ｂ】ＲＮアーゼＨ２あり（２２Ａ）及びＲＮアーゼＨ２（２２Ｂ）なしで、修飾されていないプライマー及び３’−ｆＮ修飾されたプライマーの両方を用いた、合成１０３塩基対アンプリコンに対するＰＣＲ増幅プロットである。
【図２３】単一のホスホロチオアートヌクレオシド間修飾を含有するｒＮプライマーのＨＰＬＣの軌跡を示す。上部パネルは、元の合成産物を示し、２つの異性体の分割を示している。中央パネルは精製されたＲｐ異性体であり、及び下部パネルは精製されたＳｐ異性体である。
【図２４】単一のＲＮＡ塩基及び異なるホスホロチオアート立体異性体を有する基質を用いたＲＮアーゼＨ２対ＲＮアーゼＡ酵素的切断間の関係を示す。
【図２５】ＨＣＶアンプリコンに対して標準的なプライマー及び／ブロックされた／切断可能なプライマーを用いて行われたＰＣＲ反応から得られた産物を分離するために使用されたポリアクリルアミドゲルの写真を示し、標準的なプライマーの使用は所望されない小さなプライマー−二量体種の形成をもたらすのに対して、ブロックされたプライマーの使用は所望の産物の特異的な増幅をもたらすことを示している。核酸は、蛍光染色を用いて画像化され、明確にするために画像は反転させた。
【図２６】様々な濃度で異なる界面活性剤を含有する（％容量対容量として表されている。）緩衝液中の放射線標識されたｒＣ含有基質のピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２による相対的切断を定量するグラフである。
【図２７】蛍光消光された（Ｆ／Ｑ）ブロックされたＰＣＲプライマーのＲＮアーゼＨ２活性化の反応模式図である。
【図２８】１０３塩基の合成アンプリコンに対するブロックされ、蛍光消光された切断可能なプライマーと比較した、蛍光消光された二重標識プローブ（ＤＬＰ）とともにブロックされていないプライマーを使用することから得られる蛍光シグナルを示す増幅プロットである。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図２９】１０３塩基の合成アンプリコンに対する、Ｑ／Ｆ配置のブロックされ、蛍光消光された切断可能なプライマーと比較した、Ｆ／Ｑ配置のブロックされ、蛍光消光された切断可能なプライマーの使用から得られる蛍光シグナルを示す増幅プロットである。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図３０Ａ】ＳＭＡＤ７遺伝子内の単一の塩基が異なるＤＮＡテンプレートを識別するために、Ｆ／Ｑ構成の、ブロッキングされ、蛍光消光された切断可能なプライマーを使用することから得られる蛍光シグナルを示す増幅プロットである。パネル（Ａ）は、ＦＡＭ標識された「Ｃ」対立遺伝子プローブが使用されたＦＡＭチャンネルから得られた結果を示している。パネル（Ｂ）は、ＨＥＸ標識された「Ｔ」対立遺伝子プローブが使用されるＨＥＸチャンネルから得られた結果を示している。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図３０Ｂ】ＳＭＡＤ７遺伝子内の単一の塩基が異なるＤＮＡテンプレートを識別するために、Ｆ／Ｑ構成の、ブロッキングされ、蛍光消光された切断可能なプライマーを使用することから得られる蛍光シグナルを示す増幅プロットである。パネル（Ａ）は、ＦＡＭ標識された「Ｃ」対立遺伝子プローブが使用されたＦＡＭチャンネルから得られた結果を示している。パネル（Ｂ）は、ＨＥＸ標識された「Ｔ」対立遺伝子プローブが使用されるＨＥＸチャンネルから得られた結果を示している。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図３１】プライマープローブアッセイにおいて使用される蛍光消光された（ＦＱＴ）プライマーのＲＮアーゼＨ２切断の模式的な反応である。プライマードメインは、標的核酸に対して相補的であり、ＤＮＡ合成のプライマーとしての役割を果たす。レポータードメインは、標的に対して非相補的であり、レポーター色素と消光物質基の間に位置したＲＮＡ塩基を含有する。レポータードメインは、ＰＣＲの間に（このドメインは、この時点で、テンプレートとしての役割を果たす。）、二本鎖形態へ転化されるまで、一本鎖のままである。二本鎖形態への転化は、レポータードメインをＲＮアーゼＨ２に対する基質へ転化させ、ＲＮＡアーゼＨ２による切断はレポーターを消光物質から分離させ、検出可能な現象である。
【図３２Ａ】ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを用いて、ヒトＤｒｏｓｈａ遺伝子に対して特異的なプライマーを用いて行われるｑＰＣＲ反応の増幅プロットを示す。Ａ）修飾されていないプライマー、及び蛍光消光された二重標識プローブ（ＤＬＰ）、５’−ヌクレアーゼアッセイフォーマットを用いて行われた反応。反応は、表記のように、テンプレート（ＨｅＬａｃＤＮＡ）あり又はなしで行われた。Ｂ）プライマー−プローブアッセイフォーマットにおいて、蛍光消光されたＦＱＴフォワードプライマー及び修飾されていないリバースプライマーを用いて行われた反応。反応は、表記されているようにＲＮアーゼＨ２の添加あり又はなしで行われた。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図３２Ｂ】ＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡを用いて、ヒトＤｒｏｓｈａ遺伝子に対して特異的なプライマーを用いて行われるｑＰＣＲ反応の増幅プロットを示す。Ａ）修飾されていないプライマー、及び蛍光消光された二重標識プローブ（ＤＬＰ）、５’−ヌクレアーゼアッセイフォーマットを用いて行われた反応。反応は、表記のように、テンプレート（ＨｅＬａｃＤＮＡ）あり又はなしで行われた。Ｂ）プライマー−プローブアッセイフォーマットにおいて、蛍光消光されたＦＱＴフォワードプライマー及び修飾されていないリバースプライマーを用いて行われた反応。反応は、表記されているようにＲＮアーゼＨ２の添加あり又はなしで行われた。サイクル数はＸ軸上に示されており、相対蛍光強度はＹ軸上に示されている。
【図３３】完全な合致であり、又は単一のＲＮＡ塩基に対して＋２の位置（リボヌクレオチドに対して３’の２つの塩基）にミスマッチを含有する切断可能なブロックされたプライマーの配列を示している。プライマーがある対立遺伝子とハイブリッドを形成するときに、この戦略が単一のミスマッチの存在をどのようにしてもたらし、第二の対立遺伝子とハイブリッドを形成するときに二重ミスマッチの存在をもたらすかを示すために、ＳＮＰ部位ｒｓ４９３９８２７におけるＳＭＡＤ７標的配列が、プライマーの下に並置されている。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、及びＳｐＣ３はスペーサーＣ３修飾である。
【図３４】直鎖プライマー伸長反応においてＤＮＡ合成を開始するための異なるオリゴヌクレオチド組成物の相対的機能的活性を示すグラフである。
【図３５】ＲＮアーゼＨ２切断可能な連結プローブを用いた連結によるＤＮＡ配列決定のサイクルを実施するためのスキームを示している。
【図３６】ハイブリッド形成、連結及び特異的な典型的合成配列の組みのＲＮＡを含有する切断可能な連結プローブのＲＮアーゼによるその後の切断に対するスキームを示している。
【図３７】９マーのプローブがアクセプター核酸（ＡＮＡ）に効率的に連結されていること、及び連結産物がＲＮアーゼＨ２によって効率的に切断され、１塩基延長されたＡＮＡ種を残すことを示す、合成テンプレートに対して切断可能な連結プローブを用いて行われる連結反応から得られる産物を分離するために使用されたポリアクリルアミドゲルの写真を示している。核酸は、蛍光染色を用いて画像化され、明確にするために画像は反転させた。
【図３８】３つ又は４つの５−ニトロインドール残基の何れかを含有するＲＮＡ含有切断可能な連結プローブのハイブリッド形成及び連結に対するスキームを示している。
【図３９】３つの５−ニトロインドール（３×５ＮＩ）塩基を含有する８マーのプローブはアクセプター核酸（ＡＮＡ）へ効率的に連結されるのに対して、４つの５−ニトロインドール（４×５ＮＩ）塩基を含有する８マーのプローブは連結されないことを示す、合成テンプレートに対して切断可能な連結プローブを用いて行われる連結反応から得られる産物を分離するために使用されたポリアクリルアミドゲルの写真を示している。核酸は、蛍光染色を用いて画像化され、明確にするために画像は反転させた。
【図４０】５’末端の単一の固定されたＤＮＡ塩基、４つのランダム塩基及び３つの普遍的塩基５−ニトロインドールを含有する８マーのプローブが、単一の固定されたＤＮＡ塩基によって誘導されるように、標的へ特異的に連結し得ることを示す、合成テンプレートに対して切断可能な連結プローブを用いて行われる反応から得られる連結産物を分離するために使用されたポリアクリルアミドゲルの写真を示している。
【図４１Ａ】伝統的なオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）に対するスキームを示している。パネルＡは、２つの対立遺伝子標的系を調べるために必要とされる３つのオリゴヌクレオチドを示している。パネルＢは、連結産物の作製に関与する工程を示している。
【図４１Ｂ】伝統的なオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）に対するスキームを示している。パネルＡは、２つの対立遺伝子標的系を調べるために必要とされる３つのオリゴヌクレオチドを示している。パネルＢは、連結産物の作製に関与する工程を示している。
【図４２Ａ】本発明のＲＮアーゼＨ２切断可能なオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）に対するスキームを示す。パネルＡは、２つの対立遺伝子標的系を調べるために必要とされる４つのオリゴヌクレオチドを示している。パネルＢは、ＲＮアーゼＨ２法を使用する連結産物の作製に関与する工程を示している。パネルＣは、この方法がどのようにして塩基多型の正体を２回検査するかを示している。
【図４２Ｂ】本発明のＲＮアーゼＨ２切断可能なオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）に対するスキームを示す。パネルＡは、２つの対立遺伝子標的系を調べるために必要とされる４つのオリゴヌクレオチドを示している。パネルＢは、ＲＮアーゼＨ２法を使用する連結産物の作製に関与する工程を示している。パネルＣは、この方法がどのようにして塩基多型の正体を２回検査するかを示している。
【図４２Ｃ】本発明のＲＮアーゼＨ２切断可能なオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）に対するスキームを示す。パネルＡは、２つの対立遺伝子標的系を調べるために必要とされる４つのオリゴヌクレオチドを示している。パネルＢは、ＲＮアーゼＨ２法を使用する連結産物の作製に関与する工程を示している。パネルＣは、この方法がどのようにして塩基多型の正体を２回検査するかを示している。
【図４３】連結産物を検出するために蛍光マイクロビーズ及びＬｕｍｉｎｅｘＬ１００系を使用する、ＲＮアーゼＨ２切断可能なプローブＯＬＡの各工程の間に、本実施例において使用された配列の並置を示す。
【図４４】図４３に示されているＲＮアーゼＨ２対立遺伝子識別ＯＬＡから生成された反応産物の正体を評価するためのＬｕｍｉｎｅｘＬ１００系によって検出される生じた蛍光シグナルを示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、切断ドメイン及び３’又は５’ブロッキング基を有する新規核酸化合物を提供する。これらの化合物は、核酸増幅、検出、連結、配列決定及び合成のための既存の方法に対する改善を提供する。これらの新規核酸化合物の使用を含む新しい活性フォーマットも提供される。
【００４７】
定義
本発明の理解を補助するために、幾つかの用語が以下に定義されている。
【００４８】
本明細書において使用される「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む。）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む。）及びプリン又はピリミジン塩基のＮグリコシドであるポリヌクレオチドのあらゆる他の種類を表す。「核酸」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語間で、長さの差は意図されず、これらの用語は互換的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを表す。従って、これらの用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。本発明での使用に関して、オリゴヌクレオチドは、塩基、糖又はホスファート骨格が修飾されているヌクレオチド類縁体及び非プリン又は非ピリミジンヌクレオチド類縁体も含み得る。
【００４９】
オリゴヌクレオチドは、「Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９；」のホスホトリエステル法、「Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１」のホスホジエステル法、「Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６２」のジエチルホスホルアミダイト法及び米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法（それぞれ、参照により、本明細書に組み込まれる。）などの方法による直接的化学的方法などのあらゆる適切な方法によって調製され得る。オリゴヌクレオチドの連結体及び修飾されたヌクレオチドの合成法の概説が、「Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，  １９９０，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：１６５−１８７」（参照により、本明細書に組み込まれる。）に記載されている。
【００５０】
本明細書において使用される「プライマー」という用語は、適切な条件下で、ＤＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを表す。このような条件には、適切な緩衝液中及び適切な温度で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸及び伸長のための因子（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）の存在下において、核酸鎖と相補的なプライアマー伸長産物の合成が誘導される条件が含まれる。プライマー伸長は、ヌクレオチド三リン酸の１つ又はそれ以上の不存在下で実施することも可能であり、その場合には、限定された長さの伸長産物が産生される。本明細書において使用される「プライマー」という用語は、隣接する位置でハイブリッド形成する第二のオリゴヌクレオチドへの連結によって、１つのオリゴヌクレオチドが「伸長される」連結媒介性反応において使用されるオリゴヌクレオチドを包含するものとする。従って、本明細書において使用される「プライマー伸長」という用語は、ＤＮＡ合成の開始点としてプライマーを使用する個別のヌクレオシド三リン酸の重合及び伸長された産物を形成するための２つのオリゴヌクレオチドの連結の両方を表す。
【００５１】
プライマーは、好ましくは、一本鎖ＤＮＡである。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、典型的には、６から５０ヌクレオチドの範囲、好ましくは１５から３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、テンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より冷たい温度を一般に必要とする。プライマーは、テンプレート核酸の正確な配列を反映する必要はないが、テンプレートとハイブリッド形成するのに十分に相補的でなければならない。所定の標的配列を増幅するための適切なプライマーの設計が本分野において周知であり、本明細書に引用されている文献に記載されている。
【００５２】
プライマーは、プライマーの検出又は固定化を可能にするさらなる特徴を取り込むことができるが、ＤＮＡ合成の開始点として作用する特性というプライマーの基本的な特性を変化させない。例えば、プライマーは、標的核酸とハイブリッド形成しないが、増幅された産物のクローニング又は検出を促進するさらなる核酸配列を５’末端に含有してもよい。ハイブリッド形成するのにテンプレートに十分に相補的であるプライマーの領域は、本明細書において、ハイブリッド形成領域と称される。
【００５３】
本明細書において使用される「標的」、「標的配列」、「標的領域」及び「標的核酸」という用語は同義であり、増幅、配列決定又は検出されるべき核酸の領域又は配列を表す。
【００５４】
本明細書において使用される「ハイブリッド形成」という用語は、相補的な塩基対合のために、２つの一本鎖核酸による二重鎖構造の形成を表す。ハイブリッド形成は、完全に相補的な核酸鎖の間に又はミスマッチの僅かな領域を含有する「実質的に相補的な」核酸鎖の間に起こり得る。完全に相補的な核酸鎖のハイブリッド形成下での条件が極めて好ましく、「厳格なハイブリッド形成条件」又は「配列特異的なハイブリッド形成条件」と称される。実質的に相補的な配列の安定な二重鎖は、より低い厳格なハイブリッド形成条件下で達成され得るが、許容されるミスマッチの程度は、ハイブリッド形成条件の適切な調整によって調節することができる。核酸技術の当業者は、本分野によって提供される指針に従って（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｗｅｔｍｕｒ，  １９９１，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６（３／４）：２２７−２５９；  ａｎｄ  Ｏｗｃｚａｒｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４７：５３３６−５３５３（参照により、本明細書に組み込まれる。））、例えば、オリゴヌクレオチドの長さと塩基対の組成、イオン強度及びミスマッチされた塩基対の発生など、多数の変数を経験的に考慮して、二重鎖の安定性を測定することができる。
【００５５】
「増幅反応」という用語は、テンプレート核酸配列の増加したコピーをもたらす又はテンプレート核酸配列の転写をもたらすあらゆる化学反応（酵素反応を含む。）を表す。増幅反応には、逆転写、リアルタイムＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ，  １９９０））などのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒａｎｙ他、米国特許第５，４９４，８１０号参照）が含まれる。典型的な「増幅反応条件」又は「増幅条件」は、典型的には、２つ又は３つの何れかの工程サイクルを含む。２工程サイクルは、高温変性工程に続いて、ハイブリッド形成／伸長（又は連結）工程を有する。３段階のサイクルは、変性工程の後にハイブリッド形成工程、その後に別個の伸長又は連結工程を含む。
【００５６】
本明細書において使用される「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を表す。一般に、この酵素は、核酸テンプレート配列へ徐冷されたプライマーの３’末端において、合成を開始する。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチドの重合を触媒する。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、ピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｇｅｎｅ，  １０８：１）、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ  （Ｌｅｃｏｍｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｕｂｌｅｄａｙ，  １９８３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：７５０５）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５６：３１１２）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ  １９９１，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：７６６１）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｅｎｅｓｈ  ａｎｄ  ＭｃＧｏｗａｎ，  １９７７，  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７５：３２）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（Ｔｈｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼとも称される。Ｃａｒｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １９：４１９３）、サーモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｉａｚ  ａｎｄ  Ｓａｂｉｎｏ，  １９９８  Ｂｒａｚ  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ，  ３１：１２３９）、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｈｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７６，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｏｒｉｏｌ，  １２７：１５５０）、ピロコッカス・コダカラエンシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６３：４５０４）、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（特許出願ＷＯ０１３２８８７）及びピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）ＧＢ−Ｄ（ＰＧＢ−Ｄ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｃｏｓａ−Ｇｉｎｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １６：８２０）が含まれる。上記酵素の何れのポリメラーゼ活性も、本分野で周知の手段によって測定することができる。
【００５７】
本明細書において使用される場合、十分に厳格な条件下での増幅反応において使用されたときに、プライマーが標的核酸に主としてハイブリッド形成すれば、プライマーは、標的配列に対して「特異的」である。典型的には、プライマー−標的二重鎖の安定性がプライマーと試料中に見出される何れかの他の配列間で形成される二重鎖の安定性より大きければ、プライマーは標的配列に対して特異的である。当業者は、塩条件並びにプライマーの塩基組成及びミスマッチ位置などの様々な要因がプライマーの特異性に影響を及ぼし、プライマー特異性の定型的な実験的確認が多くの事例で必要とされることを認識する。プライマーが標的配列のみと安定な二重鎖を形成できるハイブリッド形成条件を選択することができる。従って、適切に厳格な増幅条件下での標的特異的プライマーの使用は、標的プライマー結語部位を含有する標的配列の選択的増幅を可能にする。
【００５８】
本明細書において使用される「非特異的増幅」という用語は、標的配列以外の配列にハイブリッド形成し、次いで、プライマー伸長のための基質としての役割を果たすプライマーから生じる、標的配列以外の核酸配列の増幅を表す。非標的配列へのプライマーのハイブリッド形成は「非特異的ハイブリッド形成」と称され、特に、低温、低下した厳格度、前増幅条件の間に、又は一塩基多型（ＳＮＰ）の場合、真の標的に極めて密接に関連する配列を有する試料中にバリアント対立遺伝子が存在する条件で起こる傾向がある。
【００５９】
本明細書において使用される「プライマー二量体」という用語は、別のプライマーがテンプレートとしての役割を果たすプライマー伸長から生じると考えられるテンプレート非依存的な非特異的増幅産物を表す。プライマー二量体は、しばしば、２つのプライマー（すなわち、二量体）のコンカタマーであるようであるが、３以上のプライマーのコンカタマーも生じ得る。本明細書において使用される「プライマー二量体」という用語は、テンプレート非依存的な非特異的増幅産物を包括的に包含する。
【００６０】
本明細書において使用される「反応混合物」という用語は、ある反応を実施するために必要な試薬を含有する溶液を表す。増幅反応を実施するために必要な試薬を含有する溶液を表す「増幅反応混合物」は、適切な緩衝液中に、オリゴヌクレオチドプライマー及びＤＮＡポリメラーゼ又はリガーゼを典型的に含有する。「ＰＣＲ反応混合物」は、オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（最も典型的には、熱安定的なＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＰＴ及び二価の金属陽イオンを適切な緩衝液中に典型的に含有する。反応を可能にするために必要な全ての試薬を含有していれば、反応混合物は完全と称され、必要な試薬の一部のみを含有していれば、不完全と称される。反応成分は、利便性、保存の安定性又は成分濃度の用途依存的な調整を可能にする理由で、それがぞれが全成分の一部を含有する別個の溶液として一般に保存されること、及び完全な反応混合物を作製するための反応の前に、反応成分が組み合わされることが、当業者によって理解される。さらに、反応成分は商業化のために別個に梱包されること、及び有用な市販のキットは、本発明のブロックされたプライマーを含む反応成分の何れかの一部を含有し得ることが、当業者によって理解される。
【００６１】
本発明において、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼの何れかは所期の目的のためにそのオリゴヌクレオチドと相互作用することができないので、本明細書において使用される「活性化されていない」又は「不活化された」という用語は、プライマー伸長反応又は連結反応に参加することができないプライマー又は他のオリゴヌクレオチドを表す。幾つかの実施形態において、プライマー伸長を抑制するために、プライマーは３’末端で又は３’末端付近でブロッされるので、オリゴヌクレオチドがプライマーであるときには、活性化されていない状態が生じる。特定の基がプライマーの３’末端に又は３’末端付近に結合されているときには、ＤＮＡポリメラーゼはプライマーに結合することができず、伸長が起こり得ない。しかしながら、活性化されていないプライマーは、実質的に相補的なヌクレオチド配列にハイブリッド形成することができる。
【００６２】
本明細書において、本明細書で使用される「活性化された」という用語は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼとの反応に参加することができるプライマー又は他のオリゴヌクレオチドを表す。プライマー又は他のオリゴヌクレオチドは、実質的に相補的な核酸配列にハイブリッド形成した後に、活性化された状態になり、切断されて、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼと相互作用することができるように、機能的な３’又は５’末端を生成する。例えば、オリゴヌクレオチドがプライマーであり、プライマーがテンプレートにハイブリッド形成されるときには、例えば、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーの３’末端に結合し、プライマー伸長を促進することができるように、切断酵素によって、３’−ブロッキング基はプライマーから除去され得る。
【００６３】
本明細書において使用される「切断ドメイン」又は「切断するドメイン」という用語は同義であり、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断する切断化合物（例えば、切断酵素）によって認識される、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の間に位置する領域を表す。本発明において、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドが相補的な核酸配列にハイブリッド形成されたときにのみ切断され、一本鎖であるときには切断されないように、切断ドメインが設計される。切断ドメイン又は切断ドメインに隣接する配列には、ａ）ポリメラーゼ若しくはリガーゼによるプライマー若しくは他のオリゴヌクレオチドの伸長又は連結を抑制若しくは阻害し、ｂ）バリアント対立遺伝子を検出するために識別を強化し、又はｃ）所望されない切断反応を抑制する部分が含まれ得る。１つ又はそれ以上のこのような部分を、切断ドメイン又は切断ドメインに隣接する配列に含めることができる。
【００６４】
本明細書において使用される「ＲＮアーゼＨ切断ドメイン」という用語は、１つ又はそれ以上のリボ核酸残基又はＲＮアーゼＨに対する基質を与える代替的類縁体を含有する切断ドメインの一種である。ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、プライマー又はオリゴヌクレオチド内の何れの場所にも位置することが可能であり、好ましくは、分子の３’末端若しくは５’末端にその付近に位置する。
【００６５】
「ＲＮアーゼＨ１切断ドメイン」は、一般に、少なくとも３つの残基を含有する。「ＲＮアーゼＨ２切断ドメイン」は、１つのＲＮＡ残基、連続的に連結されたＲＮＡ残基の配列又はＤＮＡ残基若しくは他の化学基によって分離されたＲＮＡ残基を含有し得る。一実施形態において、ＲＮアーゼＨ２切断ドメインは２’−フルオロヌクレオシド残基である。より好ましい実施形態において、ＲＮアーゼＨ２切断可能ドメインは、２つの隣接する２’−フルオロ残基である。
【００６６】
本明細書において使用される「切断化合物」又は「切断剤」という用語は、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド内の切断ドメインを認識し、切断ドメインの存在に基づいてオリゴヌクレオチドを選択的に切断することができるあらゆる化合物を表す。本発明において使用される切断化合物は、実質的に相補的な核酸配列にハイブリッド形成されたときにのみ、切断ドメインを含むプライマー又は他のオリゴヌクレオチドを選択的に切断するが、一本鎖であるときには、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断しない。切断化合物は、切断ドメイン内の又は切断ドメインに隣接したプライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断する。本明細書において使用される「隣接した」という用語は、切断化合物が、切断ドメインの５’末端又は３’末端の何れかにおいて、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断することを意味する。本発明において好ましい切断反応は、５’−ホスファート基及び３’−ＯＨ基を生成する。
【００６７】
好ましい実施形態において、切断化合物は「切断酵素」である。切断酵素は、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドが実質的に相補的な核酸配列にハイブリッド形成したときに、切断ドメインを認識することができるが、相補的な核酸配列を切断しない（すなわち、二重鎖内に一本鎖切断を与える。）タンパク質又はリボザイムである。切断酵素は、一本鎖である場合にも、切断ドメインを含むプライマー又は他のオリゴヌクレオチドを切断しない。切断酵素の例は、ＲＮアーゼＨ酵素及び他のニック生成酵素である。
【００６８】
本明細書において使用される「ニック生成」という用語は、完全に又は部分的に二本鎖の核酸の二本鎖部分の一本鎖のみを切断することを表す。核酸にニックが生成される位置は、「ニック生成部位」（ＮＳ）と称される。「ニック生成剤」（ＮＡ）とは、部分的に又は完全に二本鎖の核酸にニックを生成する薬剤である。ニック生成剤は、酵素又はあらゆる他の化学的化合物又は組成物であり得る。ある種の実施形態において、ニック生成剤は、完全に又は部分的に二本鎖の核酸の特定のヌクレオチド配列を認識し、認識配列の位置に関して特異的な位置（すなわち、ＮＳ）において、完全に又は部分的に二本鎖の核酸の一つの鎖のみを切断し得る。このようなニック生成剤（「配列特異的なニック生成剤と称される。）には、ニック生成エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢ）が含まれるが、これに限定されない。
【００６９】
従って、本明細書において使用される「ニック生成エンドヌクレアーゼ」（ＮＥ）は、完全に又は部分的に二本鎖の核酸分子のヌクレオチド配列を認識し、認識配列に関して特異的な位置において、核酸分子の一つの鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼを表す。このような事例では、認識部位から切断点までの配列全体が「切断ドメイン」を構成する。
【００７０】
本明細書において使用される「ブロッキング基」という用語は、増幅反応が起こらないように、プライマー又は他のオリゴヌクレオチドに結合されている化学的部分を表す。例えば、プライマー伸長及び／又はＤＮＡ連結が起こらない。ブロッキング基がプライマー又は他のオリゴヌクレオチドから除去されると、オリゴヌクレオチドは、そのために設計されたアッセイ（ＰＣＲ、連結、配列決定など）に参加することができる。従って、「ブロッキング基」は、ポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼによる認識を阻害するあらゆる化学的部分であり得る。ブロッキング基は、切断ドメイン中に取り込まれ得るが、一般に、切断ドメインの５’又は３’側に位置する。ブロッキング基は、２以上の化学的部分から構成され得る。本発明において、「ブロッキング基」は、その標的配列へのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成後に典型的に除去される。
【００７１】
「蛍光生成プローブ」という用語は、ａ）付着された蛍光色素及び消光物質を有し、小溝結合物質を場合によって有するするオリゴヌクレオチド又はｂ）ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ色素などのＤＮＡ結合試薬の何れかを表す。
【００７２】
「蛍光標識」又は「蛍光色素」という用語は、約３５０と９００ｎｍの間に最大の蛍光発光を有する化合物を表す。
【００７３】
５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも称され；スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ）、
９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセインとも称される。
【００７４】
５−ヘキサクロロ−フルオレセイン；
（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’、６’−ジピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；
６−ヘキサクロロ−フルオレセイン；
（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’、６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；
５−テトラクロロ−フルオレセイン；
（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’、６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；
６−テトラクロロ−フルオレセイン；
（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’、６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；キサンチリウム、９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ  （５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；Ｃｙ５（ヨードジカルボシアニン−５）；Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）及びＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）；Ｑｕａｓａｒ（Ｒ）−６７０色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｃａｌ  Ｆｌｕｏｒ（Ｒ）  Ｏｒａｎｇｅ色素（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｒｏｘ色素；Ｍａｘ色素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）並びにこれらの適切な誘導体などの（但し、これらに限定されない。）多様な蛍光色素を使用することができる。
【００７５】
本明細書において使用される「消光物質」という用語は、ドナーに付着され又はドナーに近接したときに、蛍光性ドナーからの発光を低減させることができる分子又は化合物の一部を表す。消光は、蛍光共鳴エネルギー転移、光誘導性電子転移、系間クロシングの常磁性的増強、Ｄｅｘｔｅｒ交換カップリング及びダークコンプレックス（ｄａｒｋ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成などの励起子カップリングなどの幾つかの機序のうちの何れかによって起こり得る。蛍光色素によって発せられた蛍光が、消光物質の不存在下での蛍光と比べて、少なくとも１０％、例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％又はそれ以上低下するときに、蛍光は「消光」される。多数の市販の消光物質が本分野で公知であり、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  ＨｏｌｅＴＭＱｕｅｎｃｈｅｒｓ（ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２及びＢＨＱ−３）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（Ｒ）  ＦＱ及びＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（Ｒ）ＲＱが含まれるが、これらに限定されない。これらは、いわゆる暗消光物質である。これらは、固有の蛍光を有しておらず、固有の蛍光を発するＴＡＭＲＡなどの他の消光物質に見られるバックグラウンドの問題が実質的になくなる。
【００７６】
本明細書において使用される「連結」という用語は、ポリヌクレオチド末端の２つのの共有結合を表す。様々な実施形態において、連結は、第二のポリヌクレオチド（ドナー）の５’末端へ第一のポリヌクレオチド（アクセプター）の３’末端を共有結合させることを含む。連結は、ポリヌクレオチド末端間で形成されているホスホジエステル結合をもたらす。様々な実施形態において、連結は、ポリヌクレオチド末端の共有結合をもたらすあらゆる酵素、化学物質又はプロセスによって媒介され得る。ある実施形態において、連結はリガーゼ酵素によって媒介される。
【００７７】
本明細書において使用される「リガーゼ」は、第二のポリヌクレオチドの５’ホスファート基へあるポリヌクレオチドの３’水酸基を共有結合させることができる酵素を表す。リガーゼの例には、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼなどが含まれる。
【００７８】
連結反応は、「リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（「リガーゼ増幅反応」（ＬＡＲとも称されるなどの）ＤＮＡ増幅法において使用され得る（Ｂａｒａｎｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８８：１８９  （１９９１）；及びＷｕ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０  （１９８９）参照（参照により、本明細書に組み込まれる。））。ＬＣＲでは、４つのオリゴヌクレオチド（標的ＤＮＡの一方の鎖へユニークにハイブリッド形成する２つの隣接するオリゴヌクレオチドと反対の鎖にハイブリッド形成する、隣接するオリゴヌクレオチドの相補的な組み）が混合され、混合物にＤＮＡリガーゼが添加される。標的配列の存在下において、ＤＮＡリガーゼは、ハイブリッド形成された分子の各組みを共有結合する。重要なことに、ＬＣＲでは、２つのオリゴヌクレオチドがギャップなしに配列と塩基対合する場合にのみ、２つのオリゴヌクレオチドは一緒に連結される。変性、ハイブリッド形成及び連結の反復されたサイクルは、ＤＮＡの短いセグメントを増幅する。隣接するオリゴヌクレオチド間の連結部でのミスマッチは、連結を阻害する。他のオリゴヌクレオチド連結アッセイにおけるように、この性質によって、ＳＮＰなどのバリアント対立遺伝子間を区別するために、ＬＣＲを使用することが可能となる。また、ＬＣＲは、単一塩基の変化の増強された検出を達成するために、ＰＣＲと組み合わせて使用されてきた（Ｓｅｇｅｖ、国際特許公開ＷＯ９００１０６（１９９０）参照）。
【００７９】
本発明の新規オリゴヌクレオチド及び化合物
【００８０】
一実施形態において、本発明の新規オリゴヌクレオチドは、例えば、２、３の応用を挙げると、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定及び多項目式増幅におけるようなＤＮＡ複製のためのプライマーである。この実施形態において、プライマーは、ＤＮＡ複製（すなわち、プライマーの伸長）が遮断される非活性な構成及びＤＮＡ複製が進行する活性化された構成を有する。プライマーの非活性な構成は、プライマーが一本鎖である場合、又はプライマーが目的のＤＮＡ配列にハイブリッド形成され、プライマー伸長が、プライマーの３’末端に又はその付近に連結された化学的部分によってブロックされたままである場合に存在する。プライマーの活性化された構成は、プライマーが目的の核酸配列にハイブリッド形成し、その後、ブロッキング基を除去するために、ＲＮアーゼＨ又は他の切断剤による作用を受けて、酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）がプライマーの伸長を触媒できるようになったときに存在する。
【００８１】
伸長を抑制するために、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）の３’末端に又はその付近に配置することができる多数のブロッキング基が、本分野において公知である。プライマー又は他のオリゴヌクレオチドは、例えば、３’デオキシリボヌクレオチド残基（例えば、コルジセピン）、２’，３’−ジデオキシリボヌクレオチド残基、非ヌクレオチド連結又はアルカン−ジオール修飾の追加によって、ＤＮＡ合成の開始を抑制又は阻害するために、３’末端ヌクレオチドにおいて修飾され得る（米国特許第５，５５４，５１６号）。プライマーの伸長を阻害又はブロックするために使用することができるアルカンジオール修飾も、Ｗｉｌｋ他（１９９０，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８  （８）：２０６５）及びＡｒｎｏｌｄ他（米国特許第６，０３１，０９１号）によって記載されている。適切なブロッキング基のさらなる例には、末端ＲＮＡ塩基の３’水酸基の置換（例えば、３’−ホスファート、３’−トリホスファート又はアルコールとの３’−ホスファートジエステル（３−ヒドロキシプロピルなど）、２’、３’−環状ホスファート、２’水酸基の置換（例えば、ホスファート又はトリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）又はｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）などの立体的に嵩が大きい基）が含まれる。オリゴヌクレオチドの３’末端において置換されたＴＩＰＳ及びＴＢＤＭＳなどの２’−アルキルシリル基は、Ｌａｉｋｈｔｅｒ他、米国特許出願第１１／６８６，９８４号（参照により、本明細書に組み込まれる。）によって記載されている。嵩が大きな置換基も、プライマー伸長をブロックするために、オリゴヌクレオチドの３’末端残基の塩基上に取り込ませることができる。
【００８２】
プライマー伸長を阻害するためのブロッキング基は、３’末端残基から上流（すなわち、５’）に位置することもできる。ポリメラーゼによる結合を妨害する立体的に嵩が大きな置換基は、３’末端から上流の残基の塩基、糖又はホスファート基上に取り込ませることができる。このような置換基には、ｔ−ブチル、トリイソプロピルのような嵩が大きなアルキル基並びに蛍光色素及び消光物質などの多芳香族化合物が含まれ、３’末端から１残基ないし約１０残基に配置し得る。あるいは、プライマーの伸長をブロックするために、Ｃ３スペーサーなどの塩基脱落残基をこれらの位置に取り込ませ得る。１つのこのような実施形態において、２つの隣接するＣ３スペーサーが使用される（実施例２７及び２８参照）。
【００８３】
ＰＣＲの場合には、３’末端残基の上流のブロッキング部分は、１）プライマー伸長を阻害するため、及び２）リバースプライマーからの合成によって、伸長産物が複製されるときに、プライマーがＤＮＡ合成用テンプレートとして役割を果たすのをブロックするという２つの機能を果たし得る。プライマー伸長が起こり得る場合でさえ、後者は、ＰＣＲをブロックするのに十分である。３’末端残基の上流に配置されたＣ３スペーサーは、このようにして機能することができる（実施例２６及び２７参照）。
【００８４】
ブロッキング基として使用される修飾は、標的核酸配列に対して非相補的である反応開始配列の３’領域内にも位置し得る。
【００８５】
オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長を阻害するために使用されるブロッキング基の上流に位置する切断ドメインをさらに含む。ＲＮアーゼＨ切断ドメインが好ましい。単一のＲＮＡ残基又は１つ若しくはそれ以上の別のヌクレオシドとのＲＮＡ塩基の置換を含むＲＮアーゼＨ２切断ドメインが最も好ましい。
【００８６】
一実施形態において、ＲＮアーゼＨ２は、単一の２’−フルオロ残基を含有する二重鎖を切断するために使用することができる。切断は、２’−フルオロ残基の５’側で起こる。好ましい実施形態において、２つの隣接する２’−フルオロ残基を含むＲＮアーゼＨ２切断ドメインが使用される（実施例６参照）。２つの連続する２’−フルオロ修飾が存在すると、活性は増強される。この実施形態において、切断は、２’−フルオロ残基の間で優先的に起こる。修飾されていないＲＮＡ残基を含有するオリゴヌクレオチドとは異なり、２’−フルオロ基を有するオリゴヌクレオチドは、一本鎖リボヌクレアーゼによって切断されず、水によって触媒される切断に対して耐性があり、高温で完全に安定である。２’−フルオロ修飾されたＲＮＡ残基が２’ＬＮＡ修飾されたＲＮＡ残基とともに使用される場合にも、増強された切断が見出される。２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的配列間でのミスマッチに関してより大きな識別を与える上で、ＲＮＡ含有オリゴヌクレオチドと比べて、ある種の適用ではさらに有利であることが見出された。
【００８７】
ＲＮアーゼＨ酵素によって切断が媒介される本発明において使用することができるＲＮＡ残基の代替物には、２’−Ｏ−アルキルＲＮＡヌクレオシド、好ましくは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオシド、２’−フルオロヌクレオシド、鍵型核酸（ＬＮＡ）、２’−ＥＮＡ残基（エチレン核酸）、２’−アルキルヌクレオシド、２’−アミノヌクレオシド及び２’−チオヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。ＲＮアーゼＨ切断ドメインは、単独で又はＲＮＡ塩基と組み合わせて、これらの修飾された残基の１つ又はそれ以上を含み得る。より大きな性能を与えるために、ＤＮＡ塩基及びＣ３スペーサーなどの塩基脱落残基も含ませ得る。
【００８８】
切断剤がＲＮアーゼＨ１酵素である場合、少なくとも３つのＲＮＡ残基の連続する配列が好ましい。４つのＲＮＡ残基の連続する配列が、一般に、最大の活性をもたらす。切断剤がＲＮアーゼＨ２酵素である場合、単一のＲＮＡ残基又は２つの隣接する２’−フルオロ残基が好ましい。
【００８９】
ＲＮアーゼＨ切断ドメイン内に修飾された残基を取り込む１つの目的は、水によって触媒される加水分解又は一本鎖リボヌクラーゼによる切断に起因するプライマー又はプローブのバックグラウンド切断を抑制することである。ＲＮＡ残基の隣接するホスファート基を攻撃することができない置換基で２’−水酸基を置換することによって、この目標を達成することができる。このアプローチの例には、２’−フルオロ及び２’−Ｏ−メチルヌクレオシドなどの、上に列記されている２’−置換されたヌクレオシドの使用が含まれる。これは、切断がＲＮアーゼＨ２によって媒介され、切断ドメイン内に単一のＲＮＡ残基が存在するときに特に有利である。図３に示されているように、この場合には、一本鎖リボヌクレアーゼ又は水によって触媒される加水分解による切断は、ＲＮアーゼＨ２による切断とは異なる位置で起こる。
【００９０】
一本鎖リボヌクレアーゼ及び水によって触媒される加水分解によるＲＮＡ残基での切断を抑制するために使用することができる修飾の他の例には、隣接する残基（ＲＮＡ残基に対して３’）の５’酸素原子をアミノ基、チオール基又はメチレン基（ホスホナート連結）で置換することが含まれる。あるいは、リボヌクレオチド残基のバックグラウンド切断を阻害するために、隣接する残基の５’炭素上の水素原子の一方又は両方を、メチル基などのより嵩が大きな置換基で置換することが可能である。別のこのような実施形態において、ＲＮＡ残基の３’側のホスファート基は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート又はボロナート連結で置換することができる。ホスホロチオアートの場合には、Ｓ立体異性体が好ましい。これらの様々な修飾の組み合わせも使用し得る。
【００９１】
一本鎖リボヌクレアーゼ又は水によって触媒される加水分解によるＲＮＡ残基でのバックグラウンド切断は、ＤＮＡ合成用のプライマーとしての役割を果たすことができないブロックされた３’末端をもたらす（図３参照）ことに注目すべきである。これは、このような切断が起こる場合でさえ、偽陽性結果の出現を低減する。
【００９２】
切断がブロッキング基の５’側で起こり、遊離の３’−ＯＨを生成する限り、切断ドメインは、ブロッキング基を含み得る。しかしながら、一般的には、切断ドメインとブロッキング基は、１から約１５塩基隔てられている。切断が起こった後、ブロッキング基を含有する切断部位から３’のプライマーの一部は、テンプレートから解離し、ポリメラーゼ酵素による作用を受けることができる機能的な３’−水酸基が露出される。切断部位とブロッキング基の間の最適な距離は、切断剤及びブロッキング基の性質に依存する。オリゴヌクレオチドの切断が単一のＲＮＡ残基においてＲＮアーゼＮ２によって媒介される場合には、切断部位とブロッキング基の間の３から約８塩基の距離が好ましい。ブロッキング基が、立体的に小さい場合、例えば、以下の構造
【００９３】
【化２】
0005539325.tif 000003
のように、３’末端ヌクレオチドのホスホジエステルである場合には、３’末端から５塩基の切断部位が一般に最適である。ブロッキング基がより大きく、切断部位をそれより遠く配置することが有利である。
【００９４】
好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドを切断するために、好熱性ＲＮアーゼＨ２酵素が使用される。さらに好ましい実施形態において、高温より室温でより活性が低い好熱性ＲＮアーゼＨ２酵素が使用される。これは、反応のホットスタート型がＰＣＲ及びホットスタート（すなわち、可逆的に不活化された）ＤＮＡポリメラーゼを実際に必要とすることなく、本発明のブロックされたプライマーを使用する他のプライマー伸長アッセイ中で達成されることを可能にする。ずっと高価な酵素のホットスタート様式に代えて、Ｔａｑポリメラーゼなどのより安価な標準的ＤＮＡポリメラーゼポリメラーゼを使用することができる。さらに、様々な用途に関して、別のＤＮＡポリメラーゼが好ましい場合があり得る。アッセイのホットスタート成分としてＲＮアーゼＨを使用するによって、それぞれの異なるポリメラーゼの新しい可逆的に不活化された類縁体を開発する必要が回避される。
【００９５】
酵素のホットスタート特性は、ピロコッカス・アビッシイのＲＮアーゼＨ２の場合のように、タンパク質に内在し得る（実施例４参照）。あるいは、酵素は、例えば、無水シトラコン酸（ｃｉｔｒｏｃｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）などのマレイン酸無水物類縁体を用いて、化学的修飾によって可逆的に不活化され得る。これらの混合物は、タンパク質のアミノ基と反応し、高温において放出されて、活性を回復する。さらに別の実施形態において、酵素をブロックする抗ＲＮアーゼＨ抗体を使用し得、酵素は高温で変性される。
【００９６】
さらに別の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列特異的なニック生成剤、例えば、ニック生成酵素によって認識及び切断される切断ドメインを有する。ニック生成剤は、修飾された核酸又は修飾された核酸の群において、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）を切断するように設計することもできる。この実施形態において、オリゴヌクレオチドは、標的核酸とのハイブリッド形成に際して、ニック生成剤によって認識されるように設計され、オリゴヌクレオチド／標的二重鎖のニック生成は、ブロッキング基を除去し、オリゴヌクレオチドの伸長を可能にするために使用することができる。ニック生成部位（ＮＳ）は、好ましくは、オリゴヌクレオチドの３’末端に又はその付近に位置し、具体的には、オリゴヌクレオチドの３’末端から１ないし約１５の塩基である。
【００９７】
典型的なニック生成剤には、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩなどの特異的な配列を認識する一本鎖ニック生成制限エンドヌクレアーゼ又は（ＡＰエンドヌクレアーゼと組み合わせた）ＭｕｔＨ、ＭｕｔＹなどの修復酵素又はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＡＰリアーゼ及びＡＰエンドヌクレアーゼと組み合わせて）及びバクテリオファージｆ１のｇｅｎｅＩＩタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
本発明のブロックされたプライマーは、プライマー伸長の前に、標的へのハイブリッド形成に続いて切断を要求することによって、非特異的な反応を最小限に抑える。プライマーが関連配列へ誤ってハイブリッド形成すれば、特に、切断部位に又はその付近に横たわるミスマッチが存在する場合に、プライマーの切断は阻害される。これは、このような位置での誤った反応開始の頻度を低下させることにより、反応の特異性を増加させる。本発明において使用されるピロコッカス・アビッシイＩＩ型ＲＮアーゼＨ及び他のＲＮアーゼＨ酵素を用いると、切断部位にミスマッチが存在する場合でさえ、幾らかの切断が起こることに注目すべきである。正しい標的へハイブリッド形成したプライマー間での及びミスマッチが存在する場合の切断効率の差を最大化するために、反応条件、特にＲＮアーゼＨの濃度及び各サイクルでハイブリッド形成及び伸長を行う時間は、最適化することができる。これによって、ＳＮＰなどのバリアント対立遺伝子間を識別するために、本発明の方法を極めて効果的に使用することが可能となる（実施例１２から１４、２２から２５参照）。
【００９９】
上述されているように、切断されたプライマーの３’末端に形成された２’，３’−環状ホスファート（又は２’若しくは３’−ホスファート）がプライマーの伸長をブロックするので、ＲＮＡ残基がオリゴヌクレオチド中に取り込まれると、プライマーのバックグラウンド切断は偽陽性の反応開始をもたらさない。ＤＮＡポリメラーゼに対する基質を形成するためには、自由に接近可能な３’ＯＨ基が必要とされる。プライマー−二量体の形成（ＰＣＲ中で起こる一般的な副反応）も、本発明の３’ブロックされたプライマーを用いて阻害することができる。これは、ＰＣＲにおける多重化（例えば、ＤＮＡ検出／増幅アッセイの場合に、複数の標的配列を検出すること）のより大きな程度を可能にする。
【０１００】
いかなる理論にも拘泥するものではないが、ミスマッチが存在する場合には、おそらくはＲＮアーゼＨ２によって触媒されて遊離の３’−ＯＨを生成し、プライマー伸長に至る、非典型的な切断がＲＮＡ残基の３’に低い頻度で発生し得ることが観察された。これは、反応の特異性の減少をもたらし得る。この効果を軽減するために、ＲＮＡ残基の３’に、プライマー中にヌクレアーゼ耐性残基を取り込ませることができる（実施例２２、２５及び２８参照）。このような基には、１つ又はそれ以上のホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート及びＣ３スペーサーなどの塩基脱落残基が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０１】
本発明の方法におけるバリアント対立遺伝子の識別及び検出を強化するために、ＲＮＡ残基の５’及び３’に対する他の置換も使用することができる。このような置換には、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ及び二次的ミスマッチが含まれるが、これらに限定されない（実施例２３参照）。
【０１０２】
プライマーの伸長を妨げるブロッキング基の性質は重要ではない。ブロッキング基は、３’末端の残基に又は３’末端の残基の上流に配置することができる。標識基は、ブロッキング基の中に取り込ませることが可能であり、又は切断が起こった後にテンプレートから解離するオリゴヌクレオチドプライマーの３’−セグメント上の他の位置に付着させることが可能である。このような標識基には、蛍光色素、消光物質、ビオチン、ジゴキシゲニンなどのハプテン、酵素及び抗体などのタンパク質、質量分析法による検出のために切断断片の質量を変化させる質量タグ並びに１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、３２Ｐ及び３３Ｐなどの放射性標識が含まれるが、これらに限定されない。これらの標識基は、切断部位の５’においてプライマーに付着させることも可能であり、この場合には、標識基は伸長産物内に取り込まれる。
【０１０３】
一実施形態において、オリゴヌクレオチドの３’末端における又は３’末端付近のブロッキング基は蛍光性部分であり得る。この場合には、プライマー伸長反応の進行をモニターするために、蛍光性分子の放出を使用することができる。オリゴヌクレオチドが切断部位の５’側に伸長物質部分も含有する場合に、これは促進される。反応の間のオリゴヌクレオチドの切断は、蛍光色素を消光物質から分離させ、蛍光の増加をもたらす。消光物質自体が蛍光色素である場合には（Ｔａｍｒａなど）、その蛍光の減少も観察され得る。
【０１０４】
更なる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、切断ドメインの５’側の蛍光分子で標識され、分子の３’末端に又は３’末端付近に位置するブロッキング基は、２、３例を挙げると、ＩｏｗａＢｌａｃｋ（Ｒ）、ＢｌａｃｋＨｏｌｅＴＭ又はＴａｍｒａなどの消光物質である。同じく、オリゴヌクレチド（例えば、プライマー）からの消光物質の切断は、オリゴヌクレオチド伸長反応の進行をモニターするために使用することができる蛍光の増加をもたらす。さらに、この場合には、プライマー伸長産物は蛍光標識される。
【０１０５】
さらなる実施形態において、本発明のブロックされたプライマーは核酸配列決定のために使用される。ＤＮＡ増幅反応の場合と同様、本発明のオリゴヌクレオチドを使用すると、ＤＮＡ配列決定のためのプライマー伸長の特異性も増加する。１つの配列決定実施形態において、蛍光標識され及び鎖終結物質として使用される２’，３’ジデオキシヌクレオチド三リン酸及び反応において産生された入れ子状の断片は、電気泳動、好ましくは、キャピラリー電気泳動によって分離される。
【０１０６】
さらに別の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは蛍光基で標識され、３’ジデオキシヌクレオチド三リン酸鎖終結物質は標識されない。この実施形態において、ブロッキング基は消光物質であり得、プライマー自体は蛍光性でないので、この場合には、バックグラウンド蛍光は低下する。伸長産物のみが蛍光性である。
【０１０７】
本発明の別の態様には、Ｍｎ２＋、Ｎｉ２＋又はＣｏ２＋（Ｍｇ２＋あり又はＭｇ２＋なし）などの別の二価の陽イオンをアッセイ緩衝液中に取り込ませることを含む。本発明のある種の実施形態において、このような別の二価の陽イオンが存在する場合には、特定のアッセイの有効性は、ＲＮアーゼＨ２による強化された切断のために増加する。一実施形態において、２つの隣接する２’−フルオロヌクレオシド残基がＲＮアーゼＨ２切断可能ドメインを構成する場合には、２から４ｍＭＭｇＣｌ２を加えた０．３から１ｍＭＭｎＣｌ２がアッセイにおいて最適な性能を与えた（実施例３）。
【０１０８】
本発明の方法
本明細書に記載されているプライマー、プローブ及び他の新規オリゴヌクレオチドは、多数の生物学的アッセイにおいて使用することができる。以下のリストは網羅的ではないが、本発明の方法の大半は、（１）プライマー伸長アッセイ（ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定及び多項目式増幅を含む。）、（２）オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、（３）サイクリングプローブ反応、（４）連結による配列決定、（５）ＲＮアーゼＨ酵素を用いて、末端標識された断片の作製による配列決定及び（６）連結による合成という６つの一般的なカテゴリーに属する。
【０１０９】
本明細書に記載されているプライマー、プローブ及び他の新規オリゴヌクレオチドは、多数の伸長アッセイにおいて使用することができる。
【０１１０】
プライマー伸長アッセイ
本発明の一実施形態において、目的の標的ＤＮＡ配列を増幅する方法が提供される。この方法は、
（ａ）切断ドメインと及びプライマーの伸長を妨げる、プライマーの３’末端に又は３’末端の付近に連結されたブロッキング基とを有するプライマー、目的の標的ＤＮＡ配列を有する試料核酸、切断酵素及びポリメラーゼを含む反応混合物を提供すること；
（ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的ＤＮＡ配列に前記プライマーをハイブリッド形成させる工程；
（ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；並びに
（ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
を含む。
【０１１１】
ＰＣＲ全般
ＰＣＲにおいて使用される場合、切断ドメインを含有する３’−ブロックされたプライマーは、まず、標的配列にハイブリッド形成する。この実施形態において、相補的ＤＮＡ配列へのハイブリッド形成後に、３’ブロッキング基の切断後が起こるまで、プライマーは伸長できない。例えば、ＲＮアーゼＨ切断ドメインがプライマー中に存在する場合、ＲＮアーゼＨ酵素はプライマーと標的によって形成された二本鎖基質を認識し、切断ドメイン内で又は切断ドメインに隣接してプライマーを切断する。次いで、プライマーは伸長することができ、次いで、標的の増幅が起こり得る。プライマーは、伸長前に、ＲＮアーゼＨによって認識及び切断される必要があるので、非特異的な増幅が低下する。
【０１１２】
旧来のＰＣＲにおいて、プライマー二量体を低下させ、非特異的な増幅を減少させるために、しばしば、「ホットスタート」ポリメラーゼが使用される。ＲＮアーゼＨによる切断を必要とする本発明のブロックされたプライマーは同じ利点を付与し得る。低温で殆ど又は全く活性を持たない温熱性ＲＮアーゼＨ酵素が好ましい。プライマーの活性化は、標的配列へのハイブリッド形成及び高温での切断後にのみ起こる。可逆的に不活化されたホットスタートＤＮＡポリメラーゼの使用と比較したこのアプローチの利点は、上述されている。もちろん、所望であれば、ホットスタートＲＮアーゼＨ酵素及びホットスタートＤＮＡポリメラーゼとともに使用することができる。
【０１１３】
１）ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の場合のように、低温では殆ど又は全く内在的活性を持たない熱安定的ＲＨアーゼＨ酵素、２）化学的修飾によって可逆的に不活化された熱安定的ＲＮアーゼＨ及び３）ブロッキング抗体によって可逆的に不活化された熱安定的ＲＮアーゼＨという、ホットスタートＲＮアーゼＨ酵素の３つの種類が、本明細書に記載されている（表１、２及び３参照）。さらに、無作為突然変異導入などの本分野で周知の手段を通じて、本発明のアッセイにおいて望ましいＲＮアーゼＨの形質をさらに改善することができるＲＮアーゼＨの変異体様式を合成することができる。あるいは、本発明のために望ましい特徴を共有する他の酵素の変異体株を使用することができる。
【０１１４】
一実施形態において、プライマー内の切断ドメインは、ＲＮアーゼＨによって切断可能である。さらなる実施形態において、ＲＮアーゼＨ切断ドメインは単一のＲＮＡ残基からなり、プライマーの切断はＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素によって、好ましくは好熱性ＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素、より好ましくは、高温より室温においてより活性が低い好熱性ＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素によって媒介される。さらなる実施形態において、ＲＮアーゼＨ２切断ドメインは、２つの隣接する２’−フルオロヌクレオシド残基からなる。切断ドメインが２つの隣接する２’−フルオロヌクレオシド残基からなる本発明のさらに好ましい実施形態において、Ｍｇ２＋の他にＭｎ２＋、Ｎｉ２＋又はＣｏ２＋などの（但し、これらに限定されない。）、別の二価の陽イオンを含有する緩衝液中でＰＣＲが実施される。さらなる実施形態において、切断ドメインを含む本発明の３’ブロックされた新規プライマーは、好熱性のニック生成酵素が使用され、及び切断ドメインがニック生成部位であるホットスタートＰＣＲの変形において使用することができる。
【０１１５】
あるいは、ホットスタート特性を欠く切断酵素は、高温度で酵素を添加すること、蝋の中に必要な試薬若しくは酵素を閉じ込めることなどの伝統的なホットスタート法とともに、又は可逆的に不活化されたホットスタートＤＮＡポリメラーゼとともに、本発明において使用することができる。
【０１１６】
増幅反応において使用される場合、本発明の増加した特異性によって、リアルタイムＰＣＲ用法は、標準的なＤＮＡプライマーを用いた旧来のリアルタイムＰＣＲと比べて、より特異的な結果を達成することが可能になる。例えば、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎアッセイなどの二本鎖ＤＮＡ結合色素アッセイは、色素がＰＣＲによって産生された何れかの二本鎖産物（例えば、プライマー二量体）に結合するとシグナルが生成され、これにより、偽陽性結果を生じ得る点で欠点を有する。しかし、本発明のプライマーが使用される場合、非特異的な増幅及びプライマー・二量体形成は低下し、二本鎖ＤＮＡ結合色素のシグナルの強度は、所望される標的のみの増幅を反映する（実施例１７参照）。
【０１１７】
アッセイの試薬濃度及び反応条件は、その有用性を最大化するために変動させ得る。本発明のブロックされたプライマーを用いたＰＣＲの相対的効率性は、ブロッキング除去酵素の濃度及び（ブロッキング除去が進行する）徐冷／伸長反応温度での滞留時間に関する。酵素の少量及び短い滞留時間では、切断は不完全であり得、ブロックされたプライマーを用いる反応は、ブロッキングされていないプライマーを用いる反応より低い効率性を有する。酵素濃度又は滞留時間が増加するにつれて、ブロックされたプライマーを用いた反応の効率は増加し、ブロッキングされていないプライマーと同一になる。さらに多くの酵素又はより長い滞留時間の使用は、アッセイの特異性を減少させ、切断部位での又は周囲の配列内のミスマッチを識別するシステムの能力を弱め得る（実施例４参照）。ミスマッチ配列にハイブリッド形成されると、プライマーの切断の効率の増加が存在するので、これが生じる。各サイクルで既に１００％なので、真の標的部位での切断はさらに増加させることはできない。従って、より高い特異性を必要とするＳＮＰアッセイのために、又はより低い特異性を必要とするｍＲＮＡの発現レベルの定量のために、アッセイを調整することができる。
【０１１８】
別の実施形態において、１つのブロックされたプライマーと１つのブロッキングされていないプライマーを有するプライマー対を使用することができる。別の実施形態において、より低い配列特異性を有し、様々な配列を切断することができる酵素を選択することができる。さらに別の実施形態において、バリアント対立遺伝子を識別する能力を増加させるために、切断部位に隣接するさらなるミスマッチを添加することができる。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドなどの修飾された塩基は、特異性を増加させるために、切断部位の何れかの側でプライマー中に導入することもできる（実施例２３参照）。
【０１１９】
本明細書に記載されている様々なアッセイの方法は、２、３例を挙げると、蛍光検出、質量タグによる検出、酵素的検出を用いて、及びビオチン、ハプテン、放射線核種及び抗体などの様々な他の基を用いて、プローブ又はプライマーを標識することを介してモニターすることができる。一実施形態において、本発明の修飾されたプライマーを使用するＰＣＲの進行は、例えば、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎを用いる色素挿入アッセイを用いて、リアルタイムにモニターされる。さらなる実施形態において、本発明の修飾されたプライマーを使用するＰＣＲの進行は、分子ビーコンなどの蛍光色素及び消光物質で標識されたプローブを用いて、又はプローブの切断が起こる５’ヌクレアーゼアッセイにおけるようにモニターされる。あるいは、ＲＮアーゼＨ２によって切断可能な二重標識されたプローブを使用し得る。後者の場合には、ハイブリッド形成されたプライマー及びプローブの両方の切断が、同じ酵素によって媒介され得る。プローブ内のＲＮアーゼＨ切断ドメインは、ＲＮＡ残基のみを含み得る。一般に、本発明のブロックされたプライマーの切断ドメインにおいて有用な残基の組み合わせの全てを、プローブ内の切断ドメインとして使用することができる。特に、ＲＮアーゼＨ２が切断酵素として使用される場合には、単一のＲＮＡ残基又は２つの隣接する２’−Ｆ残基が、プローブ内の切断ドメインとして好ましい。このような修飾されたオリゴヌクレオチドプローブは、リアルタイムＰＣＲにおいて得に有用であり、標準的なＤＮＡプライマーとともに又は本発明のブロックされたプライマーとともに使用することができる。このようなリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、ＲＮアーゼＨ２の好熱性様式、特に、低温でより低い活性を有する好熱性ＲＮアーゼＨ２酵素が好ましい。本明細書において記載されている実施例において、多数の好熱性ＲＮアーゼＨ２酵素が単離され、サーモサイクル条件下で安定であり、ＰＣＲにおいて有用であることが示されている。本発明のブロックされたプライマーとともに使用されると、特異的なホットスタートＤＮＡポリメラーゼが不要となり得る。これは、アッセイのコストの著しい減少をもたらす。
【０１２０】
別の実施形態において、本発明のブロックされたプライマーは、米国特許公開２００９／００６８６４３号に記載されているＰＣＲ用のプライマー−プローブアッセイフォーマットにおいて使用することができる。この事例において、プライマーは、標的核酸に対して相補的であってもよく、又は相補的でなくてもよいオリゴヌクレオチドの５’末端上に標識ドメインも含有する。プライマーの伸長によって生成された産物は、ＰＣＲの次のサイクルにおいて、リバースプライマーによる合成のためのテンプレートとしての役割を果たす。これは、標識ドメインを二本鎖構造へ転化させる。１つのこのような実施形態において、標識ドメインに蛍光色素及び消光物質が付着され、反応は、一本鎖状態と比較した、二本鎖形態中の蛍光色素と消光物質間の距離の増加から生じる蛍光の増加によってモニターされる。さらに別のこのような実施形態において、標識ドメインは蛍光色素と消光物質間に位置する切断ドメインを含有する。切断は、切断ドメインが二本鎖である場合にのみ起こる。同じく、反応は、蛍光の増加によってモニターされる。この例では、切断剤は、両鎖、プライマー及びその相補物を切断する切断剤（制限酵素など）であり得る。あるいは、切断剤は、プライマーのみを切断するニック生成剤、好ましくは、ＲＮアーゼＨ酵素、さらに好ましくは、熱安定的なＲＮアーゼＨ２酵素であり得る。このアッセイフォーマットでは、プライマー内に２つの切断ドメイン（１つは、そこで切断が起こって、プライマーを活性化し、伸長を可能にするブロッキング基の５’及び２つ目は標識ドメイン内にある。）が存在する。両部位での切断は、同じ切断剤によって媒介され得る。標識ドメインは、２、３の例を挙げると、ビオチン、ハプテン及び酵素などの（但し、これらに限定されない。）他の標識基も含有し得る。あるいは、標識ドメイン内の切断によって放出される５’断片は、質量分析法による検出用の質量タグとしての役割を果たし得る。
【０１２１】
さらに別の実施形態において、本発明のブロックされたプライマーは、米国特許公開２００９／００６８６４３号に記載されているＰＣＲ用のテンプレート−プローブアッセイフォーマットにおいて使用することができる。
【０１２２】
本発明の別の実施形態において、ＤＮＡ及びＲＮＡなどの（但し、これらに限定されない。）重亜硫酸ナトリウム処理された核酸のＰＣＲ分析によって５−メチルシトシン残基を検出するために、ＲＮアーゼＨ２切断可能なブロックされたオリゴヌクレオチドが使用される。以前の研究は、亜硫酸塩での核酸テンプレートの処理は、塩基の５’炭素上でメチル化されないシトシンを迅速に脱アミノ化させることを確立した。この脱アミノ反応は、メチル化されていないシトシンをウラシルへ転化させ、核酸配列中に機能的なＣ−＞Ｔ遷移変異をもたらす。５−メチルシトシンはこの脱アミノ化に対して極めて耐性であり、チミンへ転化させるのではなく、シトシンとして５−メチルシトシンヌクレオチドを保存させることも知られている。重亜硫酸塩転化技術後に、５’シトシンのメチル化の修飾を検出するために、多数の方法が使用されてきた。例には、標準的なミスマッチ特異的な定量的及び非定量的ＰＣＲ法並びに生成された重亜硫酸ナトリウム反応産物のサブクローニング及び配列決定が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本発明において、テンプレートは、当業者に周知である方法によって処理された重硫酸塩である。最初のテンプレートがＲＮＡであれば、相補的なｃＤＮＡ鎖は、何れかの周知の逆転写法によって生成される。標的テンプレートのシトシン（この時点で、ウラシルに転化されている。）若しくは５−メチルシトシンとマッチし、又はこれらに対して識別するブロックされた切断可能なオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨ２酵素及び亜硫酸塩処理されたテンプレートを含有するＰＣＲ反応に添加される。ミスマッチされた（転化されたシトシン＜ウラシル又は転化されていない５−メチルシトシン＞５−メチルシトシン）塩基を含有するテンプレートの増幅は、ＲＮアーゼＨ２切断反応のミスマッチ識別のために、マッチされた塩基テンプレートと比べて非常に低下される。シトシンのウラシルへの不完全な重亜硫酸塩転化（重亜硫酸ナトリウム転化技術に一貫して伴う懸念）は、重亜硫酸塩によって転化されたテンプレート中の既知の非−５’メチル化シトシンを標的とするブロックされた切断可能なオリゴヌクレオチドを設計することによって検出することができる。これらのプライマーを用いた転化されていないシトシンのＰＣＲ増幅は、標準的なブロッキングされていないプライマーと比べて、より大きな識別を示すはずである。本発明は、メチル化された及びメチル化されていないシトシンの識別を著しく増加すると予想される。
【０１２４】
対立遺伝子特異的ＰＣＲ
本発明のブロックされたプライマーは、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）において使用することもできる。一般に、遺伝子のバリアント対立遺伝子、特に、ＳＮＰなどの単一の塩基の変異を検出するためにＡＳ−ＰＣＲが使用される（例えば、米国特許第５，４９６，６９９号参照）。ゲノム中のＳＮＰの位置及び変異された発癌遺伝子の配列は本分野において公知であり、ＰＣＲプライマーはこれらの領域と重複するように設計することができる。
【０１２５】
単一の塩基ミスマッチの検出は、ある疾病を診断し、特定の遺伝子配列又は変異と相関させる上で重要なツールである。ＡＳ−ＰＣＲは１０年以上にわたって、生物分野において公知であり（Ｂｏｔｔｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２１８，  ｐｐ．３８８−４０２）、特定のミスマッチと完全に相補的な配列間でより正確に識別するためのツールがなお必要とされている。本発明は、この必要性に対処する。
【０１２６】
ＡＳ−ＰＣＲでは、バリアント遺伝子座と重複するプライマーが使用される。一般に、プライマーは、３’末端のヌクレオチドが変異部位上に位置するように設計される。あるいは、変異部位は、時には、３’末端から１又は２塩基上に位置する。３’末端に又はその付近にミスマッチが存在する場合、プライマーの伸長が阻害され、従って、ＰＣＲが阻害される。プライマーと正確なマッチが存在する場合対１つ又はそれ以上のミスマッチが存在する対立遺伝子バリアントの増幅効率の差は、幾つかの事例において、終点ＰＣＲによって測定することが可能であり、その場合には、最終増幅産物は、例えば、ゲル電気泳動によって分析される。より一般的には、増幅の効率を測定するために、リアルタイムＰＣＲが使用される。ＤＮＡ色素結合アッセイ又は二重標識されたプローブアッセイなど、リアルタイムでアンプリコンを検出する蛍光を基礎とする方法が、最もしばしば使用される。蛍光が最初にバックグラウンドレベル（Ｃｐ又はクロシングポイント）を上回って検出可能なＰＣＲサイクルは、増幅効率の指標を提供する。プライマーと標的ＤＮＡ間にミスマッチが存在する場合には、増幅効率が低下し、Ｃｐは遅延する。一般に、４から５サイクルのＣｐの増加がＳＮＰの識別に十分である。
【０１２７】
本発明の１つのＡＳ−ＰＣＲの実施形態において、プライマーは単一のＲＮＡ残基を含有し、ミスマッチは、プライマーのＲＮＡ残基上に直接並置することができる。完全な合致とミスマッチ間のクロシングポイント（Ｃｐ）値の差（切断の差に相関する。）は明白である（実施例１３参照）。幾つかの事例において、ＲＮＡ残基の一塩基５’又は３’側にミスマッチを並置することは、Ｃｐ値の差を増大させる。ミスマッチがＲＮＡ残基の５’側に位置する場合には、その後のＲＮアーゼＨ２切断は、切断されたプライマーの３’末端の最後の塩基としてミスマッチを残す。驚くべきことに、ＲＮＡ残基の上に直接ミスマッチを有することは、ＲＮＡ残基の５’側にミスマッチが位置するより、多くの場合に、より効果的である。
【０１２８】
別の実施形態において、プライマーは複数のＲＮＡ残基又は２つの隣接する２’−フルオロ残基を含有し、ミスマッチの検出は、１つのＲＮＡ残基を含有するプライマーと同じ原理に従う。ミスマッチは、好ましくは、予想される切断点の近くに又はその上に位置する。
【０１２９】
別の実施形態において、アッセイの感度を増加させるために第二のミスマッチが使用される。さらなる実施形態において、ＳＮＰ部位の上に直接、ミスマッチの３’側に、第二のミスマッチが配置される。さらなる実施形態において、ＳＮＰ部位の直接上にミスマッチから１又は２塩基に、第二のミスマッチが配置される（実施例２３参照）。
【０１３０】
さらに別の実施形態において、修飾された残基は、変異部位上に位置する塩基の５’又は３’側でプライマー中に取り込まれる。本発明の１つのこのような実施形態において、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドは、プライマー内のＲＮＡ塩基に対してすぐ５’に配置される（実施例２２参照）。
【０１３１】
アッセイの感度は、変異部位上の塩基の３’側でのプライマー中へのヌクレアーゼ耐性類縁体の取り込みを通じて増加させることもできる。このようなヌクレアーゼ耐性類縁体には、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート及びＣ３スペーサーなどの塩基脱落残基が含まれるが、これらに限定されない。本発明の１つのこのような実施形態において、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結は、プライマーの３’末端側の変異部位上のＲＮＡ塩基からの各位置に取り込まれる。さらに別のこのような実施形態において、ホスホロチオアート連結又はホスホロジチオアートは、ＲＮＡ残基の３’側の塩基からプライマーの３’末端までの全ての位置に取り込まれる。さらに別のこのような実施形態において、単一のホスホロチオアート又はホスホロジチオアートが、プライマー内のＲＮＡ塩基からすぐ下流の残基の３’側に導入される。一実施形態において、ホスホロチオアート結合は、ＳＮＰ部位の直接上のＲＮＡ単量体に対して３’の各単量対間に並びにＲＮＡ単量体とＲＮＡ塩基に対して３’の塩基間に配置される（実施例２５参照）。
【０１３２】
アッセイの感度は、１つ又は複数の３’ブロッキング基の配置を最適化することによっても向上させることができる。一実施形態において、ブロッキング基はオリゴヌクレオチドの３’末端に対して内側に配置される。さらなる実施形態において、２以上のブロッキング基が３’末端に対して内側に配置される。さらなる実施形態において、ＲＮＡ単量体はＳＮＰ部位の直接上に存在し、ＤＮＡ単量体はＲＮＡ単量体の３’側に存在し、２つのＣ３が続き、最後に、３’末端の塩基が続く（実施例２８参照）。
【０１３３】
対立遺伝子特異的ＰＣＲの一実施形態において、プライマーは、２以上のミスマッチを検出するように設計され得る。例えば、フォワードプライマーは、第一のミスマッチを検出することができ、リバースプライマーは第二のミスマッチを検出することができる。この実施形態において、アッセイは、２つのミスマッチが分析されている同じ遺伝子又は染色体上に生じるかどうかを示すために使用することができる。このアッセイは、目的の細菌が病原性であり且つ抗生物質耐性であるかどうかを測定するなどの用途において有用である。
【０１３４】
逆転写酵素ＰＣＴ（ＲＴ−ＰＣＲ）
さらに別の実施形態において、本発明の方法は、結合された逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）において使用することができる。１つのこのような実施形態において、逆転写及びＰＣＲは２つの異なる工程において実施される。まず、オリゴｄＴプライマー又は配列特異的プライマーを用いて、試料ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーが合成される。ｃＤＮＡ合成を開始するために、無作為なヘキサマーなどを使用することもできる。次いで、本発明のブロックされたプライマー及び方法を使用するＰＣＲのための基質として、生じたｃＤＮＡを使用する。
【０１３５】
あるいは、逆転写及びＰＣＲは、単一の閉管反応において実施することができる。１つのこのような実施形態において、３つのプライマー（１つは逆転写酵素用及び２つはＰＣＲ用）が使用される。逆転写用のプライマーは、ＰＣＲアンプリコンの位置に対して３’でｍＲＮＡに結合する。不可欠ではないが、逆転写プライマーは、ＲＮＡ残基又はｍＲＮＡにハイブリッド形成したときに、ＲＮアーゼＨに対する基質を形成しない２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基などの修飾された類縁体を含み得る。好ましくは、低温で減少した活性を有するＲＮアーゼＨ２酵素が切断剤として使用される。
【０１３６】
３プライマーのＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、ＲＴプライマーがＰＣＲ反応に参加するのを阻害することが望ましい。これは、ＰＣＲプライマーより低いＴｍを有し、従って、ＰＣＲ条件下でハイブリッドを形成しないＲＴプライマーを使用することによって達成することができる。あるいは、例えば、（多項目式増幅のように、米国特許第７，１１２，４０６号参照）２つの隣接するＣ３スペーサーを取り込んだ複製不能なプライマーをＲＴプライマーとして使用することができる。ｃＤＮＡがフォワードＰＣＲプライマーの伸長によって複製されるこの場合には、ＲＴプライマーに対する結合部位を含まない。
【０１３７】
一実施形態において、リバースＰＣＲプライマーのみが、本発明の組成物及び方法を用いてブロックされる。さらに別の実施形態では、フォワード及びリバースＰＣＲプライマーの両方がブロックされる。３プライマーＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、リバースＰＣＲプライマーが逆転写のために使用されるのを防ぐために、リバースＰＣＲプライマーがブロックされる。所望であれば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基などの修飾された塩基をリバースＰＣＲプライマー中に取り込ませることができるが、何れのこのような修飾も、プライマー配列がＤＮＡ合成用のテンプレートとしての役割を果たし、複製されることが可能でなければならない。
【０１３８】
本発明の２プライマーＲＴ−ＰＣＲアッセイでは、フォワードＰＣＲのみがブロックされる。リバースＰＣＲプライマーは、ＲＴ−プライマーとしての役割も果たし、従って、ブロックされることはできない。
【０１３９】
網羅的ではないが、表１は、ブロッキング基、標識基、切断部位の実施形態、オリゴヌクレオチドの切断部位又は他の領域に対する修飾、緩衝液条件及び酵素の変動が、アッセイフォーマットの具体的な用途に応じて、アッセイフォーマットをどのようにしてさらに最適化することができるかを例示する。アッセイフォーマット及び用途の例には、ＰＣＲ；ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎなどの二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用するリアルタイムＰＣＲ、５’ヌクレアーゼアッセイ（ＴａｑｍａｎＴＭアッセイ）又は分子ビーコン；プライマー−プローブ及びテンプレート−プローブアッセイ（米国特許公開２００９／００６８６４３号参照）；多項目式の又は連結された線形増幅アッセイ；ＰＣＲを介した遺伝子構築又は断片の集合；一塩基多型及び他のバリアント対立遺伝子を検出するために使用される対立遺伝子特異的なＰＣＲ及び他の方法；核酸配列決定アッセイ；並びに鎖置換増幅が含まれる。これらの様々なアッセイにおいて、本発明のプライマーの切断は、特定の反応の特異性を強化するために使用することができる。
【０１４０】
【表１】
0005539325.tif 000004
【０１４１】
サイクリングプローブ反応
サイクリングプローブ反応は、特異的な核酸配列を検出するための別の技術である（米国特許第５，４０３，７１１号参照）。反応は、等温条件下で又は温度のサイクリングを用いて行う。ＰＣＲとは異なり、産物は線形様式で蓄積する。
【０１４２】
表２は、サイクリングプローブ反応に基づいてアッセイを改善するための、本発明の可能な要素の非網羅的な組みを例示する。本発明の新たな特徴には、１）ホットスタートＲＮアーゼＨ酵素の使用；２）ＲＮアーゼＨ酵素による新しい配列の切断（例えば、ＩＩ型ＲＮアーゼＨによる、２’−フルオロヌクレオシドを含有する基質の切断）；並びに３）特異性を増強し及び／又は非特異的な切断反応を抑制するための、ＲＮアーゼＨ切断ドメインに隣接する修飾及び二次的ミスマッチの導入が含まれる。このような修飾及び二次的ミスマッチは、切断がＩＩ型ＲＮアーゼＨによって媒介されるときに特に有用であり、切断ドメインは単一のＲＮＡ残基又は２つの隣接する２’−フルオロ残基である。
【０１４３】
【表２】
0005539325.tif 000005
【０１４４】
ＤＮＡ連結アッセイ
本発明は、ＤＮＡ連結アッセイの特異性を増加させる役割も果たし得る。標的ＤＮＡ配列上で互いに隣接して結合し、連結を妨げるために修飾される本発明のドナー及び／又はアクセプターオリゴヌクレオチドを設計することができる。連結を阻害するのに有用なアクセプターオリゴヌクレオチド上のブロッキング基は、プライマー伸長を妨げるために使用されたものと同じである。ドナーオリゴヌクレオチドのブロッキングは、例えば、ホスホジエステルとして、例えば、
【０１４５】
【化３】
0005539325.tif 000006
として、５’−ＯＨ基をキャッピングすることによって容易に達成され得る。
【０１４６】
他の５’ブロッキング基には、５’−Ｏ−メチル又は５’−Ｏ−トリチル基などの５’−Ｏ−アルキル置換基、５’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３などの５’−Ｏ−ヘテロアルキル基、５’−Ｏ−アリール基及びＴＩＰＳ又はＴＢＤＭＳなどの５’−Ｏ−シリル基が含まれる。５’デオキシ残基も、連結をブロッキングするために使用することができる。
【０１４７】
連結反応をブロックするために、立体的に嵩が大きな基をオリゴヌクレオチドの５’末端に又はその付近に配置することもできる。５’−ホスファート基はＤＮＡリガーゼに対する天然の基質であるので、５’−ＯＨをブロックするために使用することができない。標的ＤＮＡ配列へのハイブリッド形成後にのみ、ブロッキング基は、例えば、ＲＮアーゼＨ切断可能ドメインでの切断によって除去されて、連結の発生を可能にする。好ましくは、切断は、ＲＮアーゼＨＩＩ型酵素、より好ましくは、好熱性ＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素によって媒介される。より好ましくは、切断を媒介し、これにより、アクセプター及び／又はドナーオリゴヌクレオチドの活性化を媒介するために、高温より室温で活性がより低い好熱性ＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素が使用される。あるいは、ドナー及び／又はアクセプターオリゴヌクレオチドの切断を媒介するために、制限酵素などの配列特異的なニック生成酵素を使用し得る。
【０１４８】
さらなる実施形態において、まず、切断反応は、２つのオリゴヌクレオチドのうち１つのみが標的配列へハイブリッド形成するより高い温度で実施される。次いで、温度が下げられ、第二のオリゴヌクレオチドが標的にハイブリッド形成し、次いで、連結反応が起こる。
【０１４９】
ドナーオリゴヌクレオチド中に配置された切断ドメインが存在するさらなる実施形態において、このオリゴヌクレオチドは５’末端で又はその付近においてブロックされず、単に遊離の５’―ＯＨを有する。このオリゴヌクレオチドは、連結反応においてドナーとして役割を果たすことができず、ドナーとしての役割を果たすためには、５’−ホスファート基を必要とする。従って、５’末端が機能的にブロックされる。ＲＮアーゼＨによる切断は５’−ホスファート基を生成し、ドナーオリゴヌクレオチドが連結反応関与することを可能にする。
【０１５０】
本発明の重要な利点は、変異部位の二重調査を可能にし、従って、標準的な連結アッセイより大きな特異性を可能にすることである。切断工程と連結工程の両方で、バリアント対立遺伝子を識別するための機会が存在する。
【０１５１】
表３は、オリゴヌクレオチド連結アッセイを改良するための、本発明の可能な要素の非網羅的な組を例示する。
【０１５２】
【表３】
0005539325.tif 000007
【０１５３】
配列決定反応
一実施形態において、目的の標的ＤＮＡを配列決定する方法が提供される。この方法は、
（ａ）切断ドメインと及びプライマーの伸長を妨げる、プライマーの３’末端に又は３’末端の付近に連結されたブロッキング基とを有するプライマー、目的の標的ＤＮＡ配列を含む試料核酸、切断酵素、ヌクレオチド三リン酸鎖終結物質（例えば、３’ジデオキシヌクレオチド三リン酸）及びポリメラーゼを含む反応混合物を提供すること；
（ｂ）二本鎖基質を形成するために、標的核酸に前記プライマーをハイブリッド形成する工程；
（ｃ）前記プライマーから前記ブロッキング基を除去するために、前記切断ドメイン内の又は前記切断ドメインに隣接した点において、前記切断酵素を用いて、ハイブリッド形成されたプライマーを切断する工程；並びに
（ｄ）前記ポリメラーゼを用いて、前記プライマーを伸長させる工程；
を含む。
【０１５４】
一実施形態において、本発明は、「次世代」配列決定プラットフォームにおいて使用される。次世代配列決定の１つの種類は、ゲノムＤＮＡが剪断され及びアダプターオリゴヌクレオチドと連結され、又は遺伝子特異的なプライマーによって増幅され、次いで、ガラススライド上に被覆され又はＰＣＲ用のエマルジョン中に配置された相補的オリゴヌクレオチドにハイブリッド形成される「合成による配列決定」である。その後の配列決定反応は、色素標識されたヌクレオチド三リン酸を取り込み、又はＡＴＰを生成させるためのＡＴＰスルフリラーゼを用いた伸長反応、及び次いで、オキシルシフェリンと光を生成するためのルシフェラーゼとその基質ルシフェリンのＡＴＰによって触媒される反応において放出されたピロホスファートの反応から生じた化学発酵によって検出される。
【０１５５】
次世代配列決定の別の種類は、４つの塩基の各々に相当するオリゴヌクレオチドの４つの組みが使用される「連結による配列決定」である。各組において、１つの塩基が指定されており、残りはユニバーサル又は縮重塩基である約７から１１の塩基の蛍光色素標識されたオリゴヌクレオチドが使用される。例えば、イノシンなどの３つのユニバーサル塩基及び４つの縮重位置を含有する８塩基オリゴヌクレオチドが使用される場合、１つの位置に指定された塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）と及び分子の５’若しくは３’末端の何れか又は連結を妨害しない内部の位置に付着された蛍光標識とをそれぞれが有する各組中に、４４又は２５６の異なるオリゴヌクレオチドが存在する。それぞれが４つの塩基のうちの１つに対して特異的である４つの異なる標識が使用される。オリゴヌクレオチドのこれらの４つの組みの混合物を、増幅された試料ＤＮＡにハイブリッド形成させる。ＤＮＡリガーゼの存在下で、標的にハイブリッド形成されたオリゴヌクレオチドはアクセプターＤＮＡ分子に連結された状態になる。付着された標識の検出によって、オリゴヌクレオチド内の指定された塩基と相補的な位置において、試料ＤＮＡ中の対応する塩基を決定することができる。
【０１５６】
本発明の一実施形態において、約７から１１塩基のドナーオリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの５’末端に指定された塩基を含有する。残りの塩基は縮重又はユニバーサル塩基であり、指定された塩基に対して特異的な標識は指定された塩基の３’側に取り込まれる。ドナーオリゴヌクレオチドがアクセプターとしても作用するのを防ぐために、プローブの３’末端は不可逆的にブロックされる。幾つかの事例では、これは、標識基によって達成され得る。オリゴヌクレオチドの５’末端から二番目の塩基（すなわち、指定された塩基の次の残基）は、４つのＲＮＡ塩基の縮重混合物である。あるいは、２’−フルオロヌクレオシドなどのＲＮアーゼＨ２によって認識されるあらゆる類縁体は、この位置で置換され得る。リボイノシン又はリボ−５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基も、この位置に取り込ませ得る。まず、プローブは標的配列にハイブリッド形成し、連結反応による標準的な配列決定と同様に、アクセプターＤＮＡ断片に連結された状態となる。指定された塩基の検出後に、ＲＮＡ残基の５’側のプローブを切断するＲＮアーゼＨ２を添加し、指定された塩基をアクセプター断片の３’末端に付着されたままにする。最終結果は、アクセプター断片が１つの塩基によって伸長され、この段階で、配列内の次の塩基の決定を可能にする位置にある。サイクルは何度も繰り返され、各事例で、ドナーオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成の位置を標的配列の３’側に１塩基移動させる。指定された塩基は連結反応の連結部に常に位置するので、連結による伝統的な配列決定と比べて特異性が増加される。
【０１５７】
ドナーオリゴヌクレオチドプローブは、５−ニトロインドール、リボ−５’−ニトロインドール、２’−Ｏ−メチル−５−ニトロインドール、イノシン、リボイノシン、２’−Ｏ−メチルリボイノシン及び３−ニトロピロールなどの（但し、これらに限定されない。）ユニバーサル塩基を場合によって含有し得る。これは、ユニバーサル塩基で置換されたプローブ上の全ての縮重位置に対して、アッセイのために必要とされる各組中の異なるオリゴヌクレオチドの数を４倍低下させる。この方法は、連結反応とＲＮアーゼＨ２切断工程の間にキャッピング工程を含むこともできる。キャッピング反応は、ＤＮＡポリメラーゼ及び鎖終結物質を導入することによって、前工程でドナーオリゴヌクレオチドプローブと連結しなかったアクセプター断片分子の全てをキャップすることによって実施することができる。
【０１５８】
上の例では、連結反応、従って、配列決定読み取りは、一度に１塩基、５’から３’方向に進行する。あるいは、ドナーオリゴヌクレオチドは、２つの塩基が各サイクルにおいて決定されるように設計することができる。この事例では、ドナーオリゴヌクレオチドの５’末端上の最初の２つの塩基が指定されている（例えば、ｐＡ−Ｃ−Ｒ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｉ−Ｉ−Ｘ（Ｒ＝４ＲＮＡ塩基全ての縮重混合物、Ｎ＝縮重ＤＮＡ塩基、Ｉ＝イノシン及びＸ＝蛍光色素）。全ての事例におけるように、アクセプターへのドナーオリゴヌクレオチドの連結を許容する５’−ホスファート（ｐ）が存在する。１６のこのようなオリゴヌクレオチドの組み（１６の可能なジヌクレオチドの各々に対して１つ）が必要される。１６の各々は、異なる蛍光色素で標識することができる。あるいは、連結反応は、それぞれがオリゴヌクレオチドの４つのこのような組みを有する４つの別個のプールを用いて実施することができる。その場合には、４つの異なる蛍光色素のみが必要とされる。
【０１５９】
５’から３’方向に配列決定するための別の実施形態において、以下の種類のドナーオリゴヌクレオチドを使用することができる。ｐＡ−Ｎ−Ｒ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｉ−Ｉ−Ｘ（ｐ、Ｎ、Ｒ、Ｉ及びＸは、前例に定義されているとおりである。）。各サイクルで１つの塩基が決定されるが、別の位置（１、３、５など）で決定される。参照データベースと比較されるのであれば、これは、配列を同定するのに十分であり得る。所望であれば、残りの塩基（位置２、４、６など）は、元のアクセプターオリゴヌクレオチドを１塩基上流又は下流にシフトさせながら、同じテンプレート上で配列決定反応を反復することによって決定することができる。関連する例では、以下の種類のドナーオリゴヌクレオチドを使用することができる。ｐ−Ａ−Ｆ−ＦＮ−Ｎ−Ｎ−Ｉ−Ｉ−Ｘ（ｐ、Ｎ、Ｉ及びＸは、上に定義されているとおりである、Ｆは４つの２’−フルオロヌクレオシド全ての縮重混合物である。）。連結に続いて、ＲＮアーゼＨ２による切断は、アクセプターの３’末端に２つの塩基を付加することを含む（すなわち、ＡＦ）。次の連結反応後に、アクセプターの３’末端の配列は．．．Ａ−Ｆ−Ｓ−Ｆ−Ｆ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｉ−Ｉ−Ｘ（Ｓは３位の指定された塩基であり、Ｘは、指定された塩基がＡでなければ、前サイクルとは異なる蛍光色素である。）である。次に、ＲＮアーゼＨ２での切断が２つの２’−フルオロ残基間で起こる。単離された２’−フルオロ残基でのＲＮアーゼＨ２による切断はずっと遅く起こり、ＲＮアーゼＨ２濃度及び反応時間を調節することによって避けることができる。
【０１６０】
配列決定が３’から５’方向に進行する上記方法の変形を実施することができる。この場合には、以下のような構造のアクセプターオリゴヌクレオチドが各サイクルにおいて添加される。Ｘ−Ｉ−Ｉ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｆ−Ｆ−Ｓ−ＯＨ（指定された塩基（Ｓ）はオリゴヌクレオチドの３’末端にある。）。オリゴヌクレオチドがドナーとして作用するのを防ぐために、５’末端はブロックされる。ＲＮアーゼＨ２による切断は、次の配列決定サイクルのために準備されるドナー断片の５’末端に配列ｐＦ−Ｓを残す。アクセプターへの連結が起こることができなかった場合に、ドナーオリゴヌクレオチドの５’−ホスファートを除去するために、ホスファターゼを用いる切断反応の前に、キャッピング工程をサイクル中に含めることができる。
【０１６１】
さらなる実施形態において、本発明は、蛍光標識されたプライマーとともに、リボ三リン酸（又は２’−フルオロヌクレオシド三リン酸などのＲＮアーゼＨ２に対する基質を与える別の類縁体）を用いて、ＤＮＡ配列決定に対する改善を提供する。本分野において公知の伝統的な配列決定法と同様に、三リン酸残基がＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれる。リボ三リン酸又はＲＮアーゼＨ２に対する基質を与える別の類縁体の濃度は、ポリメラーゼによって産生された各伸長産物内に、平均して１つのこのような塩基が無作為に取り込まれるような濃度になるように調整される。プライマーから生じた断片の入れ子状ファミリーがＲＮアーゼＨ２での切断によって生成され、次いで、標準的なＤＮＡ配列決定法としての電気泳動によって分離される。あるいは、複数のＲＮＡ残基又は２’−フルオロヌクレオシドなどの修飾されたヌクレオシドが伸長産物中に取り込まれ得、平均して、各鎖が一回だけ切断されるように、ＲＮアーゼＨ２でのその後の消化は制限される。それぞれ、異なるリボ三リン酸（Ａ、Ｃ、Ｔ又はＧ）又は他のＲＮアーゼＨ２切断可能な類縁体で塩基の１つを置換する４つの別個の反応が実行される。このアッセイは、蛍光標識された高価なジデオキシ三リン酸鎖終結物質の使用は回避される。
【０１６２】
本発明の別の実施形態において、オリゴヌクレオチド合成のための改善された方法が提供される。上記されているような類似の技術を用いて、アクセプター断片の３’末端にさらなる塩基を付加するために、ドナーオリゴヌクレオチドとして作用する組成物をアクセプター断片に連結させることができる。合成を経験している成長しているポリヌクレオチドであるのはアクセプター断片である。この事例では、ドナー断片の組成物は、好ましくは、３’末端上に約１から８塩基の突出部を有する二本鎖領域を与えるためのヘアピンを形成する一本鎖オリゴヌクレオチドである。５’末端の塩基は、成長しているアクセプター断片に付加するための望ましい塩基である。４つの塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ及びＧ）を全て含有するポリヌクレオチドを合成するために、５’塩基が変動することを除き、同一の配列を有し得る４つの異なるドナー断片が使用される。好ましくは、ドナーは３’末端においてブロックされているので、アクセプターとして反応することができない。ドナーの３’末端に又は３’末端付近に配置されたブロッキング基は、反応のモニターを可能とするための標識であり得る。ドナーの５’末端の４つの異なる塩基に対応する４つの異なる標識を使用することができる。５’末端の所望される塩基に隣接する塩基は、ＲＮＡ塩基又はＲＮアーゼＨ２に対する基質を与える２’−フルオロヌクレオシドなどの別の類縁体である。３’末端での突出部は、無作為な（縮重）塩基又はユニバーサル塩基又は両者の組み合わせであり得る。ドナー断片は、ドナーオリゴヌクレオチドの３’突出部へのアクセプターの３’末端のハイブリッド形成を通じて、アクセプター断片に結合する。次いで、２つの断片を連結するために、ＤＮＡリガーゼ酵素が使用される。次に、ＲＮアーゼＨ２切断部位の５’側で産物を切断するために、ＩＩ型ＲＮアーゼＨが使用され、ドナーの５’塩基をアクセプターの３’末端に移す。連結できなかった可能性があり得る成長しているポリヌクレオチド鎖の分子が、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒されるジデオキシヌクレオチド三リン酸（又は他の鎖終結物質）との反応によってキャップされる第三の工程を、リガーゼとＲＮアーゼＨ２切断反応の間のサイクル中に場合によって含めることができる。一実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシヌクレオチド末端転移酵素である。サイクルは反復され、アクセプター断片は５’から３’の方向で伸長を継続することができる。各工程で成長しているポリヌクレオチドの単離を促進するために、調節されたポアガラス又はポリスチレンなどの固体支持体へアクセプターを付着させることができる。
【０１６３】
上記配列方法と同様に、各サイクルでアクセプターオリゴヌクレオチドの３’末端に２つの塩基を付加するために、ドナーオリゴヌクレオチドを使用することができる。この場合には、ＲＮアーゼＨ２切断可能な残基は、ドナーの５’末端から３’に配置される。この酵素的な合成法は、より長いＤＮＡ分子を合成するために特に有利である。各塩基に対応するヘアピン試薬は、更なるサイクル又はさらなる合成において再使用するために収集することができる。この系は有機溶媒を使用しないので、廃棄物の廃棄は簡略化される。
【０１６４】
本発明のキット
本発明は、上記方法における本発明のプライマー及び他の新規オリゴヌクレオチドの使用を可能にする、核酸増幅、検出、配列決定、連結又は合成のためのキットも提供する。幾つかの実施形態において、キットは、切断化合物（例えば、ニック生成酵素又はＲＮアーゼＨ酵素）を含有する容器；ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＤＮＡリガーゼを含有する別の容器を含み、好ましくは、キットを使用するための取り扱い説明冊子が存在する。ある種の実施形態において、キットは、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼと組み合わされたニック生成酵素又はＲＮアーゼＨ酵素の両方を含有する容器を含む。場合によって、アッセイにおいて使用される修飾されたオリゴヌクレオチドは、酵素とともに含めることができる。アッセイにおいて使用される切断酵素剤、ＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＤＮＡリガーゼ及びオリゴヌクレオチドは、好ましくは、これらが長期の安定性を示す状態で、例えば、適切な保存緩衝液中に又は凍結乾燥若しくはフリーズドライされた状態で保存される。さらに、キットは、ニック生成剤若しくはＲＮアーゼＨのための緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ若しくはＤＮＡリガーゼのための緩衝液又は両方の緩衝液をさらに含み得る。あるいは、キットは、ニック生成又はＲＮアーゼＨ及びＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼの両方に適した緩衝液をさらに含み得る。緩衝液は、ＲＮａｓｉｎ及び一本鎖リボヌクレオチドの他の阻害剤を含み得る。本キットの様々な成分の記載は、本発明の様々な方法に関する前節に見出され得る。
【０１６５】
場合によって、キットは、本発明の新規プライマー及び／又は他の新規オリゴヌクレオチドの存在下で、核酸を増幅又は連結するための、本発明のキットの使い方に関する情報を提供する取り扱い説明冊子を含有し得る。ある種の実施形態において、前記情報は、アッセイにおいて使用されるＲＮアーゼＨ、ニック生成剤、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びオリゴヌクレオチドの使用及び／又は保存の仕方に関する１つ又はそれ以上の説明並びにニック生成剤又はＲＮアーゼＨ及びＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼのための緩衝液、適切な反応温度及び反応時間の説明などを含む。
【０１６６】
従って、一実施形態において、試料からの核酸の選択的増幅のためのキットが提供される。キットは、
（ａ）それぞれが３’末端及び５’末端を有する第一及び第二のオリゴヌクレオチドプライマー（各オリゴヌクレオチドは、増幅されるべき核酸の一部又はその相補物に対して相補的であり、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨ切断可能なドメインと並びにプライマー伸長を妨げるために及び／又は反対のプライマーから誘導されるＤＮＡ合成によってプライマーが複製されるのを妨げるために、オリゴヌクレオチドの３’末端に若しくは３’末端付近に連結されたブロッキング基とを含む。）；
（ｂ）ＲＮアーゼＨ酵素；並びに
（ｃ）核酸を増幅するための指示マニュアル；
を含む。
キットは、ＤＮＡポリメラーゼを場合によって含み得る。
【０１６７】
さらなる実施形態において、核酸の選択的増幅のためのキットは、ＲＮアーゼＨ切断可能ドメイン、蛍光色素及び消光物質を含む３’末端及び５’末端を有するオリゴヌクレオチドプローブを含み、前記切断可能ドメインは蛍光色素と消光物質の間に位置しており、並びにプローブは増幅されるべき核酸の一部又はその相補物に対して相補的である。
【０１６８】
さらに別の実施形態において、本発明は、標的核酸配列の存在下で、アクセプターオリゴヌクレオチドとドナーオリゴヌクレオチドを連結するためのキットに関する。キットは、
（ａ）オリゴヌクレオチドの一方又は両方がＲＮアーゼＨ切断可能ドメイン及び連結を妨げるブロッキング基を含むドナーオリゴヌクレオチド及びアクセプターオリゴヌクレオチド；
（ｂ）ＲＮアーゼＨ酵素；並びに
（ｃ）標的核酸配列の存在下で、アクセプター及びドナーオリゴヌクレオチドを連結するための指示マニュアル；
を含む。
【０１６９】
さらなる実施形態において、キットは、ＤＮＡリガーゼ酵素を場合によって含み得る。
【０１７０】
さらなる連結キットの実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドはＲＮアーゼ切断ドメインを含有するが、５’末端に又は５’末端付近にブロッキング基を欠き、代わりに遊離の５’−ＯＨを有する。
【０１７１】
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することによってさらに例示される。しかしながら、これらの実施例は、上記実施形態と同様に例示的なものであり、いかなる意味においても、本発明の可能な範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１７２】
好熱性生物からのコドン最適化されたＲＮアーゼＨ２酵素のクローニング
この実施例は、好熱性生物からのコドン最適化されたＲＮアーゼＨ２酵素のクローニングを記載する。
【０１７３】
新しく有用な活性を有する可能性がある機能的な新規ＲＮアーゼＨ２酵素を探索するために、そのゲノム配列が以前に決定されている古細菌超好熱性生物から得られる公共のヌクレオチド配列保管所から候補遺伝子を同定した。ＲＮアーゼＨ２酵素は幾つかのアミノ酸相同性を共有し、幾つかの高度に保存された残基が存在するが、同定された候補遺伝子間の実際の相同性は低く、これらが機能的なＲＮアーゼＨ酵素に相当し、又は未知の機能の遺伝子であり、又は非機能的なＲＮアーゼＨ２遺伝子であるかどうかは不明確であった。表４に示されているように、ＲＮアーゼＨ２遺伝子が性質決定されていない２つの生物及びＲＮアーゼＨ２遺伝子（ｒｎｈｂ）及び機能的なタンパク質が同定されており、機能的酵素であることが知られている陽性対照として使用するための３つの生物を含む５つの遺伝子を研究のために選択した。２つの性質決定されていない予想ｒｎｈｂ遺伝子をこの初期研究のために選択したが、多くのさらなる古細菌種が、そのｒｎｈｂ遺伝子が性質決定されていない決定されたゲノム配列を有しており、同様に研究することができる。
【０１７４】
【表４】
0005539325.tif 000008
参考文献１から６：１）Ｈａｒｕｋｉ，  Ｍ．，  Ｈａｙａｓｈｉ，  Ｋ．，  Ｋｏｃｈｉ，  Ｔ．，  Ｍｕｒｏｙａ，  Ａ．，  Ｋｏｇａ，  Ｙ．，  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  Ｍ．，  Ｉｍａｎａｋａ，  Ｔ．  ａｎｄ  Ｋａｎａｙａ，  Ｓ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｃｈａｅｏｎ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，  １８０，  ６２０７−６２１４；２）  Ｈａｒｕｋｉ，  Ｍ．，  Ｔｓｕｎａｋａ，  Ｙ．，  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋａｎａｙａ，  Ｓ．  （２００２）  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ／ＤＮＡ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｔ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ＲＮＡ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ＲＮａｓｅｓ  ＨＩＩ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  ５３１，  ２０４−２０８；  ３）Ｍｕｋａｉｙａｍａ，  Ａ．，  Ｔａｋａｎｏ，  Ｋ．，  Ｈａｒｕｋｉ，  Ｍ．，  Ｍｏｒｉｋａｗａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｋａｎａｙａ，  Ｓ．  （２００４）  Ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｏｂｕｓｔ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４３，  １３８５９−１３８６６；４）  Ｓａｔｏ，  Ａ．，  Ｋａｎａｉ，  Ａ．，  Ｉｔａｙａ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｔｏｍｉｔａ，  Ｍ．  （２００３）  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｏｋａｚａｋｉ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ  ａｎｄ  ＦＥＮ−Ｉ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｃｈａｅｏｎ，  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，  ３０９，  ２４７−２５２；５）  Ｌａｉ，  Ｂ．，  Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｃａｏ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｌａｉ，  Ｌ．  （２００３）  Ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ  ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４２，  ７８５−７９１；及び６）  Ｌａｉ，  Ｌ．，  Ｙｏｋｏｔａ，  Ｈ．，  Ｈｕｎｇ，  Ｌ．Ｗ．，  Ｋｉｍ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｋｉｍ，  Ｓ．Ｈ．  （２０００）  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｒｃｈａｅａｌ  ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ：ａ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍａｊｏｒ  ＲＮａｓｅ  Ｈ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ８，  ８９７−９０４。
【０１７５】
上に列記されているｒｎｈｂ遺伝子によってコードされるタンパク質の予想される物理的特性が、表５に示されている（Ｐａｃｅ，  Ｃ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ，  （１９９５）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，４，  ｐ．２４１１）
【０１７６】
【表５】
0005539325.tif 000009
【０１７７】
この５つの配列の組みの中の、異なる古細菌種由来のＲＮアーゼＨ２酵素（又は候補酵素）間のアミノ酸の類似性は、３４％から６５％の範囲である。アミノ酸同一性マトリックスが、下表６に示されている。
【０１７８】
【表６】
0005539325.tif 000010
【０１７９】
標準的なコドン使用表を用いて、原型の遺伝子配列のコドンをイー・コリ中での発現に関して最適化した。以下の配列を集合させ、標準的な方法を用いて合成オリゴヌクレオチドから作製された人工的遺伝子としてプラスミド中にクローニングした。ＤＮＡ配列の同一性は、両鎖に対して確認した。人工的なＤＮＡ構築物の配列が以下に示されている。小文字は、５’末端のＢａｍＨＩ部位及び３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むリンカー配列を表す。大文字はコード配列を表し、ＡＴＧ開始コドンには下線が付されている。
【０１８０】
【化４】
0005539325.tif 000011
【０１８１】
【化５】
0005539325.tif 000012
【０１８２】
【化６】
0005539325.tif 000013
【０１８３】
【化７】
0005539325.tif 000014
【０１８４】
【化８】
0005539325.tif 000015
【実施例２】
【０１８５】
組換えＲＮアーゼＨ２ペプチドの発現
以下の実施例は、組換えＲＮアーゼＨ２ペプチドの発現を示す。
【０１８６】
ユニークなＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いて、実施例１から得られた５つの合成遺伝子配列を細菌発現ベクターｐＥＴ−２７ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）中にサブクローニングした。このベクターは、発現されたペプチドのカルボキシ末端（停止コドンが続く。）に、６つのヒスチジン残基（これらは、一緒になって「Ｈｉｓタグ」を構成する。）を配置する。「Ｈｉｓタグ」によって、当業者に周知の方法であるＮｉアフィニティークロマトグラフィーを用いた組換えタンパク質の迅速で簡易な精製の使用が可能になる。あるいは、合成遺伝子は、Ｈｉｓタグなしの原型形態で発現され、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー又は同じく当業者に周知である他のこのような方法を用いて精製することができる。
【０１８７】
ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換受容性細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を各プラスミドで形質転換し、０．５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で、４．５時間２５℃で誘導した。全てのクローンに対して、製造業者の指示書に従って可溶性タンパク質を放出させ、核酸を分解させるために、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Ｒ）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で、ＩＰＴＧによって誘導された培養物５ｍＬを処理した。回収されたタンパク質をＮｉアフィニティーカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）上に通過させ、製造業者によって提供されたプロトコールに従って、１Ｍイミダゾールを含有する緩衝液を用いて溶出した。
【０１８８】
ＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、細菌可溶化液の「総」及び「可溶性」画分の両方を調べた。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色を用いてタンパク質を可視化した。ＩＰＴＧ誘導後、組換えタンパク質の大量を５つの古細菌ＲＮアーゼＨ２合成遺伝子全てから産生した。この精製方法を用いて、４つの酵素（ピロコッカス・コダカラエンシス、ピロコッカス・フリオサス、メタノカルドコッカス・ジャンナシイ及びピロコッカス・アビッシイ）に関して、タンパク質は可溶性画分中に回収された。スルフォロバス・ソルファタリカスのＲＮアーゼＨ２に関しては、この溶解操作を用いて、可溶性タンパク質は回収されなかった。誘導されたＲＮアーゼＨ２タンパク質の例が、図４Ａ及び４Ｂに示されている。
【０１８９】
以下のような性質決定のためにタンパク質の小規模な量を作製するために、組換えタンパク質を産生及び精製するための改良された方法を開発した。各クローンに対して得られる可溶性タンパク質の量を最大化するために、３７℃の誘導温度を６時間使用する。ピロコッカス・コダカラエンシス、メタノカルドコッカス・ジャンナシイ及びスルフォロバス・ソルファタリカスに関しては、溶解のために、ＣｅｌＬｙｔｉｃＴＭＢ１０×溶解試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を使用する。５００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９中での１０倍希釈を作製し、誘導された培養物から得られる沈降した細菌ペースト０．５ｇ当り１０ｍＬを使用する。ピロコッカス・フリオサス及びピロコッカス・アビッシイに関しては、誘導された培養物１００ｍＬ当りＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｒ）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）５ｍＬを細胞溶解のために使用する。さらに、細菌細胞の溶解を増強し、溶液の粘度を減少させるために、全てのクローンに対して１００ｍＬの誘導された培養物当り、５ＫＵｒＬｙｓｏｚｙｍｅＴＭ（Ｎｏｖａｇｅｎ）及び２５０ＵＤＮアーゼＩ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を使用する。細胞破砕物を除去するための遠心後、ＤＮアーゼＩ及び存在する他のあらゆる細胞性ヌクレアーゼを不活化するために、可溶化液を７５℃で１５分間加熱した。次いで、熱処理後に変性タンパク質を沈降させるために、１６，０００×ｇで２０分間、可溶化液を遠心する。遠心工程単独で、組換え熱安定的酵素の機能的な精製の大きな程度を提供する。
【０１９０】
Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（Ｒ）樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ）を含有するＮｉアフィニティーカラム上に、得られた可溶性上清を通過させ、２００ｍＭイミダゾールを含有する溶出緩衝液を用いて溶出する。次いで、長期間の保存のために、タンパク質を濃縮及び安定化させるために、７０％硫酸アンモニウムの存在下で精製されたタンパク質を沈殿させ、保存緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０％グリセロール）中に再懸濁した。残存する塩を除去するために、同じ保存緩衝液に対して、濃縮されたタンパク質を２×２時間（それぞれ、×２５０容積）透析する。最終の精製されたタンパク質は、−２０℃で保存する。ピロコッカス・アビッシイに対して、これらのプロトコールを用いて、ＩＰＴＧによって誘導された培養物２００ｍＬは、可溶性タンパク質の約２ｍｇを与える。Ｎｉカラム上を通過させた後、純粋なタンパク質約０．７ｍｇが回収される。機能的な使用のために、濃縮された酵素原液を保存緩衝液中に希釈し、研究される全ての酵素反応において１：１０で添加した。従って、全ての反応緩衝液は、０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び５％グリセロールを含有する。
【０１９１】
上に概説されているように、クローニングされたＲＮアーゼＨ２酵素の各々に対して、組換えタンパク質を作製し、精製した。ＳＤＳ１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、ピロコッカス・コダカラエンシス、ピロコッカス・フリオサス、ピロコッカス・アビッシイ及びスルフォロバス・ソルファタリカスから得られた試料を調べた。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ染色を用いてタンパク質を可視化した。結果が図５に示されている。発現及び精製法が予想通りに機能すれば、これらのタンパク質は全て、ウェスタンブロットによる抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出することができる６×ヒスチジンタグを含有するはずである。図５に示されているゲルは、ナイロン膜に転写された電気ブロットであり、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。結果が図６に示されている。全ての組換えタンパク質は、抗Ｈｉｓ抗体によって認識され、所望の組換えタンパク質種が産生及び精製されたことを示している。
【０１９２】
組換えタンパク質の大規模な調製物は、当業者に周知の細菌発酵操作を用いて、よりよく発現させることができる。熱処理の後、変性タンパク質を沈降させるための遠心によって、大幅な精製が得られ、最終的な精製は、Ｈｉｓタグの必要性又はＮｉ−アフィニティークロマトグラフィーの使用なしに、サイズ排除又は陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて達成することができる。
【実施例３】
【０１９３】
組換えペプチドに対するＲＮアーゼＨ２活性
以下の実施例は、組換えペプチドに対するＲＮアーゼＨ２活性を示す。
【０１９４】
ＲＮアーゼＨ酵素は、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のＲＮＡ残基を切断する。全てのＲＮアーゼＨは、少なくとも４つの連続するＲＮＡ残基が存在する場合に、この種の基質を切断することができる。キメラＲＮＡ／ＤＮＡ種のＲＮＡ「ウィンドウ」が４残基未満まで短縮されるにつれて、ＲＮアーゼＨ１酵素は急速に活性を失う。他方、ＲＮアーゼＨ２酵素は、単一のＲＮＡ残基のみを含有するＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖を切断することができる。全ての事例で、切断産物は、３’−ヒドロキシル及び５’−ホスファートを含有する（図１参照）。複数のＲＮＡ残基が存在する場合には、切断はＲＮＡ塩基間に起こり、ＲＮＡ−ホスファート連結を切断する。単一のＲＮＡ残基のみが存在する場合、切断はＩＩ型ＲＮアーゼＨ酵素のみで起こる。この場合には、切断は、ＤＮＡ−ホスファート連結においてＲＮＡ塩基の５’側に起こる（図３参照）。ＲＮアーゼＨ酵素は、二価の金属イオン補因子の存在を必要とする。典型的には、ＲＮアーゼＨ１酵素はＭｇ＋＋イオンの存在を必要とするのに対して、ＲＮアーゼＨ２酵素は、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、Ｃｏ＋＋及びＮｉ＋＋などの（但し、これらに限定されない。）多数の二価の陽イオンの何れかとともに機能を発揮することができる。
【０１９５】
実施例２に記載されている組換えＲＮアーゼＨ２タンパク質をＲＮアーゼ活性の両種類に関して検査し、上に列記されている特徴に関して調べた。
【０１９６】
複数のＲＮＡ塩基を有する基質の切断。長いＲＮＡドメインの切断に関して、これらの酵素の活性を検査するために、以下の合成３０塩基対基質を使用した。基質は、一方の鎖の上に１１のＤＮＡ塩基、８のＲＮＡ塩基及び１１のＤＮＡ塩基を有し、他方の鎖として完全にマッチするＤＮＡ相補物を有する「１１−８−１１」デザインである。使用したオリゴヌクレオチドが以下に示されている（大文字はＤＮＡ塩基を表し、小文字はＲＮＡ塩基を表す。）。
【０１９７】
配列番号６
【０１９８】
【化９】
0005539325.tif 000016
【０１９９】
配列番号７
【０２００】
【化１０】
0005539325.tif 000017
【０２０１】
徐冷されると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１１−８−１１」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する。
【０２０２】
配列番号８
【０２０３】
【化１１】
0005539325.tif 000018
【０２０４】
４５℃又は７０℃で２０分間、緩衝液５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２及び１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０中、８０μＬの反応容積で、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド基質とともに、組換えタンパク質産物の各々の分取試料を温置した。ゲル搭載緩衝液（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって、反応を添加し、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＧｅｌＳｔａｒＴＭ（Ｌｏｎｚａ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＥ）を用いてゲルを染色し、ＵＶ励起で可視化した。５つの組換えペプチド全てが、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖（１１−８−１１）基質中の８塩基ＲＮＡ配列を切断する能力を示した。重要なことに、組換えタンパク質は、一本鎖ＲＮＡを含有するオリゴヌクレオチド（配列番号６）を分解せず、二本鎖基質が必要とされることを示唆する。さらに、ｄｓＤＮＡ基質は切断されなかった。
【０２０５】
二価の陽イオンの不存在下で、切断は観察されなかった（例えば、Ｍｇ＋＋が反応緩衝液に存在しなければ、活性は全く観察されなかった。）。Ｍｇ＋＋滴定を行い、２から８ｍＭＭｇＣｌ２の間で、高い酵素活性が観察された。３から６ｍＭＭｇＣｌ２の間で、最適な活性が観察された。また、Ｍｎ＋＋及びＣｏ＋＋を含む他の二価の陽イオンを用いて、切断活性を検出した。ＭｎＣｌ２では、０．３ｍＭから１０ｍＭ二価の陽イオン濃度で、良好な活性が見られた。３００ｎＭから１ｍＭの範囲で、酵素活性が最適であった。ＣｏＣｌ２に関して、０．３ｍＭから２ｍＭの範囲で観察が見られ、０．５から１ｍＭの範囲で活性は最適であった。従って、単離された酵素はＲＮアーゼＨ活性及びＲＮアーゼＨ２クラスの特徴である二価の陽イオンの要求性を示す。
【０２０６】
ピロコッカス・コダカラエンシス、ピロコッカス・フリオサス及びピロコッカス・アビッシイから得られた組換えＲＮアーゼＨ２酵素による１１−８−１１基質の消化が図７に示されている。
【０２０７】
ＲＮアーゼＨ酵素による基質切断は、３’−ＯＨ及び５’−ホスファートを有する産物をもたらすと予想される。質量分析によって、新しい組換えＲＮアーゼＨ２タンパク質から得られる反応産物の正体を調べた。電子スプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）は、このサイズの核酸断片に対して、ほぼ単一のダルトン分解を有する（＋／−０．０２％の精度）。３つのピロコッカス種のＲＮアーゼＨ酵素による消化前及び後の両方に、オリゴヌクレオチド１１−８−１１基質（配列番号８）をＥＳＩ−ＭＳによって調べた。観察された質量と一致する核酸種の同定とともに、観察された主な質量が表７に報告されている。
【０２０８】
【表７】
0005539325.tif 000019
【０２０９】
同定された主要な種が示されている。ＤＮＡ塩基は大文字で示されており、ＲＮＡ塩基は小文字で示されており、ホスファート＝「Ｐ」。分子量は、最も近いダルトンに四捨五入した。他の表記が存在していない場合、核酸鎖は５’−ヒドロキシル又は３’−ヒドロキシルで終わる。
【０２１０】
全ての事例では、ＤＮＡ相補鎖は完全な状態で（非分解）観察された。ＲＮＡ含有鎖は効率的に切断され、反応産物の観察された質量が生成された主要な断片である以下の種と合致する。１）消化されていないＤＮＡ残基及び３’−水酸基を有する単一の３’−ＲＮＡ残基を含有する種（配列番号９）及び２）５’−ホスファート、単一の５’−ＲＮＡ残基及び消化されないＤＮＡ残基を有する種（配列番号１０）。観察された反応産物は、ＲＮアーゼＨ１及びＲＮアーゼＨ２酵素の両方の公知の切断特性と合致している。
【０２１１】
【化１２】
0005539325.tif 000020
【０２１２】
【化１３】
0005539325.tif 000021
【０２１３】
単一のＲＮＡ塩基を有する基質の切断。ＲＮアーゼＨ２酵素は、単一のＲＮＡ残基を含有する基質を特徴的に切断するのに対して、ＲＮアーゼＨ１酵素は切断できない。単一のＲＮＡ残基での切断に関して、これらの酵素の活性を検査するために、以下の合成３０塩基対基質を使用した。基質は、一方の鎖の上に１４のＤＮＡ塩基、１つのＲＮＡ塩基及び１５のＤＮＡ塩基を有し、他方の鎖として完全なマッチのＤＮＡ相補物を有する「１４−１−１５」デザインである。４つのＲＮＡ塩基（Ｃ、Ｇ、Ａ及びＵ）の各々を含む８成分の一本鎖オリゴヌクレオチドから、４つの異なる基質を作製した。使用したオリゴヌクレオチドが以下に示されている（大文字はＤＮＡ塩基を表し、小文字はＲＮＡ塩基を表す。）。
【０２１４】
Ｆｏｒ  ｒＣ：
配列番号１１
【０２１５】
【化１４】
0005539325.tif 000022
【０２１６】
配列番号１２
【０２１７】
【化１５】
0005539325.tif 000023
【０２１８】
徐冷されると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１４−１−１５ｒＣ」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する。
【０２１９】
配列番号１３
【０２２０】
【化１６】
0005539325.tif 000024
【０２２１】
Ｆｏｒ  ｒＧ：
配列番号１４
【０２２２】
【化１７】
0005539325.tif 000025
【０２２３】
【化１８】
0005539325.tif 000026
【０２２４】
徐冷されると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１４−１−１５ｒＧ」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する。
【０２２５】
配列番号１６
【０２２６】
【化１９】
0005539325.tif 000027
【０２２７】
Ｆｏｒ  ｒＡ：
【０２２８】
【化２０】
0005539325.tif 000028
【０２２９】
【化２１】
0005539325.tif 000029
【０２３０】
徐冷されると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１４−１−１５ｒＡ」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する。
【０２３１】
配列番号１９
【０２３２】
【化２２】
0005539325.tif 000030
【０２３３】
Ｆｏｒ  ｒＵ：
配列番号２０
【０２３４】
【化２３】
0005539325.tif 000031
【０２３５】
配列番号２１
【０２３６】
【化２４】
0005539325.tif 000032
【０２３７】
徐冷されると、これらの一本鎖（ｓｓ）オリゴヌクレオチドは、以下の「１４−１−１５ｒＵ」二本鎖（ｄｓ）基質を形成する。
【０２３８】
配列番号２２
【０２３９】
【化２５】
0005539325.tif 000033
【０２４０】
７０℃で２０分間、緩衝液５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２及び１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０中で、８０μＬの反応容積で、上記一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド基質とともに、組換えタンパク質産物の各々の分取試料を温置した。ゲル搭載緩衝液（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって、反応を停止し、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＧｅｌＳｔａｒＴＭ（Ｌｏｎｚａ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＥ）を用いてゲルを染色し、ＵＶ励起で可視化した。５つの組換えペプチド全てが、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖（１４−１−１５）中の単一のＲＮＡ配列を切断する能力を示した。４つのＲＮＡ塩基の各々が、これらの酵素で切断可能な基質として機能した。重要なことに、組換えタンパク質は、一本鎖ＲＮＡを含有するオリゴヌクレオチド（配列番号１１、１４、１７、２０）を分解せず、二本鎖基質が必要とされることを示唆する。従って、単離された酵素はＲＮアーゼＨ２活性を示す。二価の陽イオンの滴定を検査し、結果は、８−１１−８基質を用いて以前に得られた結果と同一であった。
【０２４１】
ピロコッカス・アビッシイ、ピロコッカス・フリオサス及びメタノカルドコッカス・ジャンナシイ由来の組換えＲＮアーゼＨ２酵素による４つの１４−１−１５基質（配列番号１３、１６、１９、２２）及び１１−８−１１基質（配列番号８）の消化が図８Ａに示されており、ピロコッカス・コダカラエンシス由来の酵素による消化が図８Ｂに示されている。
【０２４２】
ＲＮアーゼＨ酵素による基質切断は、３’−ＯＨ及び５’−ホスファートを有する産物をもたらすと予想される。さらに、ＲＮアーゼＨ２酵素による単一のリボヌクレオチドを含有する基質の切断は、ＲＮＡ残基に対して５’のＤＮＡ連結で特徴的に起こる。質量分析によって、新しい組換えＲＮアーゼＨ２タンパク質から得られる単一のリボヌクレオチド基質を用いて反応産物の正体を調べた。３つのピロコッカス種のＲＮアーゼＨ２酵素及びメタノカルドコッカス・ジャンナシイ酵素による消化前及び後の両方に、ＥＳＩ−ＭＳによってオリゴヌクレオチド１４−１−１５ｒＣ基質（配列番号１３）を調べた。観察された質量と一致する核酸種の同定とともに、観察された主な質量が表８に報告されている。
【０２４３】
【表８】
0005539325.tif 000034
【０２４４】
同定された主要な種が示されている。ＤＮＡ塩基は大文字で示されており、ＲＮＡ塩基は小文字であり、ホスファート＝「Ｐ」である。分子量は、最も近いダルトンに四捨五入した。他の表記が存在しない場合、核酸鎖は５’−ヒドロキシル又は３’−ヒドロキシルで終わる。
【０２４５】
全ての事例で、ＤＮＡ相補鎖は完全な状態で（非分解）観察された。ＲＮＡ含有鎖は効率的に切断され、反応産物の観察された質量が生成された主要な断片である以下の種と合致する。１）３’−水酸基を有する消化されていないＤＮＡ残基を含有する種（配列番号２３）及び２）５’−ホスファート、単一の５’−ＲＮＡ残基及び消化されないＤＮＡ残基を有する種（配列番号２４）。観察された反応産物は、ＲＮアーゼＨ２クラス酵素の公知の切断特性と合致している。
【０２４６】
配列番号２３
５’ＣＴＣＧＴＧＡＧＧＴＧＡＴＧ３’
【０２４７】
配列番号２４
５’Ｐ−ｃＡＧＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＧＣＧ
【０２４８】
まとめると、５つの古細菌種から得たＲＮアーゼＨ２酵素をコードすると予測されるクローニングされ、コドン最適化されたｒｎｈｂ遺伝子は全て、ＲＮアーゼＨ２ファミリーの要素に対して予想される酵素活性と合致する酵素活性を示す組換えタンパク質産物を産生した。１）酵素は、機能を発揮するために二価の陽イオンを必要とした（ここに記された実験は、Ｍｇ＋＋を用いて行った。）。活性は、Ｍｎ＋＋又はＣｏ＋＋イオンを用いても存在する。２）一本鎖核酸は分解されない。３）１つの鎖が１つ又はそれ以上のＲＮＡ塩基を含有する二本鎖へテロ二重鎖核酸は基質である。４）２つ又はそれ以上の連続するＲＮＡ塩基を含有する基質に関しては、切断は、ＲＮＡ連結間で、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ中に起こり、単一のＲＮＡ塩基を含有する基質に関しては、切断は、ＤＮＡ連結で、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ中のＲＮＡ塩基のすぐ５’で起こり、並びに６）反応産物は３’−ヒドロキシル及び５’−ホスファートを有する。
【実施例４】
【０２４９】
ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の反応温度の最適化及び熱的安定性
本実施例及び全てのその後の研究について、使用される酵素の量は、以下の単位の定義に基づいて標準化した。
【０２５０】
１ユニットは、４ｍＭＭｇ２＋を含有する緩衝液ｐＨ８．０中、７０℃で、１分当り単一のｒＣ残基を含有するヘテロ二重鎖基質の１ナノモルの切断をもたらす酵素の量として定義される。
【０２５１】
ユニット濃度を標準化する目的で、ＲＮアーゼＨ２酵素調製物を性質決定するために、基質配列番号１３を使用した。別段の記載がなければ、以下の標準化された緩衝液を使用した。「Ｍｇ切断緩衝液」：４ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、１０μｇ／ｍＬＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及び３００ｎＭオリゴ−ｄＴ（２０マーのポリ−ｄＴオリゴヌクレオチド）。ＢＳＡ及びオリゴ−ｄＴは、プラスチック上の非特異的な結合部位を飽和させ、実施されるアッセイの定量的性質を向上させる役割を果たす。
【０２５２】
精製された組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素を熱的安定性に関して研究した。酵素の分取試料を９５℃で様々な時間にわたって温置し、次いで、基質配列番号１３を含有する単一のｒＣを切断するために使用した。６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌγ−３２Ｐ−ＡＴＰ及び酵素Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ、ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、基質のＲＮＡ鎖を３２Ｐで放射性標識した。追跡標識を反応混合物に添加した（１：５０）。Ｍｇ切断緩衝液中に酵素の１００μユニット（μＵ）を有する１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。７０℃で２０分間、反応物を温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合として結果をプロットした。結果が図９に示されている。酵素は、９５℃で３０分間以上、完全な活性を保持した。４５分の温置後に、活性は５０％まで低下し、８５分の温置後に１０％まで低下した。
【０２５３】
これらの結果は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素は十分に熱安定的であり、９５℃での長期の温置を生き残るので、ＰＣＲ反応中で典型的に使用される条件を生き残ることを示す。
【０２５４】
次に、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素の活性の温度依存性を性質決定した。３０℃から７０℃の範囲で、４０℃にわたって活性を研究した。ｒＣ基質配列番号１３のＲＮＡ鎖を上述されているように放射性標識した。Ｍｇ切断緩衝液中に酵素の２００μマイクロユニット（μＵ）を有する１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。３０℃、４０℃、５０℃、６０℃又は７０℃で１０分間、反応を温置した。ホルムアミドゲル搭載緩衝液を含有する冷たいＥＤＴＡの添加によって、反応を停止させた。次いで、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。得られたゲルの画像が図１０に示されている。製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合として結果をプロットした（図１１参照）。酵素は、３０℃で約０．１％の活性を示すに過ぎず、約５０から６０℃まで、評価可能な活性を達成しない。
【０２５５】
従って、実用的な目的のために、酵素は室温で機能的に非活性である。従って、この酵素を使用する反応は、氷上に又は室温にさえ設定することができ、温度が上昇するまで、反応は進行しない。ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２切断がＰＣＲ反応に連結されれば、本明細書に示されている温度依存性の活性は、効果的に機能を発揮して、修飾されたＤＮＡポリメラーゼの不存在下で「ホットスタート」反応フォーマットを与える。
【実施例５】
【０２５６】
ＲＮアーゼＨ２による非標準的な塩基での切断
ＲＮアーゼＨ１及びＲＮアーゼＨ２に対する天然の生物学的基質は、１つ又はそれ以上のＲＮＡ残基を含有する二重鎖ＤＮＡ配列である。ヒドロキシル（ＲＮＡ）以外の２’位に置換を含有する修飾された塩基がこれらの酵素に対する基質であることは観察されていない。以下の実施例は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素が修飾されたＲＮＡ含有基質に対して活性を有することを示す。
【０２５７】
ＲＮアーゼＨ２が切断のための部位として単一の非ＲＮＡ２’修飾された塩基を認識することができるかどうかを決定するために、修飾された塩基を含有する以下の１４−１−１５基質を検査した。修飾は塩基の２’位上に位置し、鍵型核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）及び２’−フルオロ（２’Ｆ）が含まれる。陽性対照として、単一のリボＣ含有基質を使用した。以降、ＬＮＡ塩基は、接頭辞「＋」（＋Ｎ）で表記され、２’−ＯＭｅ塩基は接頭辞「ｍ」（ｍＮ）で示され、２’Ｆ塩基は接頭辞「ｆ」（ｆＮ）で示され、２’−アミノ塩基は接頭辞「ａ」（ａＮ）で示される。
【０２５８】
リボ−Ｃ基質
配列番号１３
【０２５９】
【化２６】
0005539325.tif 000035
【０２６０】
ＬＮＡ−Ｃ基質
配列番号２５
【０２６１】
【化２７】
0005539325.tif 000036
【０２６２】
２’ＯＭｅ−Ｃ基質
配列番号２６
【０２６３】
【化２８】
0005539325.tif 000037
【０２６４】
２’Ｆ−Ｃ基質
配列番号２７
【０２６５】
【化２９】
0005539325.tif 000038
【０２６６】
組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素とともに、７０℃で２０分間、様々な緩衝液中、８０μＬの反応容積で、上記４つの基質を温置した。検査した緩衝液は、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭＣｏＣｌ２又は１０ｍＭＭｎＣｌ２の何れかとともに、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．０を含んだ。ゲル搭載緩衝液（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって、反応を添加し、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＧｅｌＳｔａｒＴＭ（Ｌｏｎｚａ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＥ）を用いてゲルを染色し、ＵＶ励起で可視化した。結果が図１２に示されている。単一のリボＣ残基を有する対照基質は１００％切断した。単一のＬＮＡ−Ｃ又は単一の２’ＯＭｅーＣ残基を含有する基質は切断されなかった。しかしながら、単一の２’−Ｆ−Ｃ残基を含有する基質は僅かな程度で切断された。この切断は、マンガンを含有する緩衝液中でのみ起こり、コバルト又はマグネシウム緩衝液中では見られなかった。
【０２６７】
２’−Ｆ−Ｃ−塩基での切断は予想外であった。以下の基質を用いて、２’−フルオロ塩基の切断をさらに調べた。
【０２６８】
リボ−Ｃ基質
配列番号１３
【０２６９】
【化３０】
0005539325.tif 000039
【０２７０】
２’Ｆ−Ｃ基質
配列番号２７
【０２７１】
【化３１】
0005539325.tif 000040
【０２７２】
２’Ｆ−Ｕ基質
配列番号２８
【０２７３】
【化３２】
0005539325.tif 000041
【０２７４】
２’Ｆ−Ｃ＋２’ＦＵ（ｆＣｆＵ）基質
配列番号２９
【０２７５】
【化３３】
0005539325.tif 000042
【０２７６】
組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素又は組換えピロコッカス・フリオサスＲＮアーゼＨ２酵素の何れかを用いて、７０℃で２０分間、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０及び１０ｍＭＭｎＣｌ２を含有する緩衝液中、８０μＬの反応容量で、上記４つの基質を温置した。ゲル搭載緩衝液（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって、反応を停止し、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＧｅｌＳｔａｒＴＭ（Ｌｏｎｚａ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＥ）を用いてゲルを染色し、ＵＶ励起で可視化した。結果が図１３に示されている。単一のリボＣ残基を有する対照基質は１００％切断した。単一の２’−Ｆ−Ｃ又は単一の２’−Ｆ−Ｕ残基を含有する基質は僅かな程度で切断された。隣接する２’−Ｆ−Ｃ及び２’−Ｆ−Ｕ残基を含有するジフルオロ基質（ｆＣｆＵ）は、ほぼ１００％切断された。さらに、ピロコッカス・アビッシイ及びピロコッカス・フリオサスＲＮアーゼＨ２酵素は何れも、同じ様式で、修飾された基質を切断した。この実施例は、ｆＣ基の予想外の切断がｆＣに限定されず、ｆＵを用いても起こることを示す。さらに重要なことに、２つの連続する２’−フルオロ修飾された塩基の組み合わせは、ＲＮアーゼＨ２に対するずっと優れた基質であった。この新しい切断特性は、ピー・アビッシイ及びピー・フリオサスの両方に対して見られた。このような非典型的な基質の切断は、全ての古細菌のＲＮアーゼＨ２酵素に共通な特性であり得る。
【０２７７】
実施例３で記載されている方法を使用して、質量分析法を用いて、ジフルオロｆＣｆＵ基質の切断産物の正体を研究した。伝統的なリボヌクレオチド基質を用いると、ＲＮアーゼＨ酵素による切断は、３’−ＯＨ及び５’−ホスファートを有する産物をもたらす。組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素による消化の前及び後の両方に、ＥＳＩ−ＭＳによってｆＣｆＵ基質（配列番号２９）を調べた。観察された質量と一致する核酸種の同定とともに、観察された主な質量が表９に報告されている。
【０２７８】
【表９】
0005539325.tif 000043
同定された主要な種が示されている。ＤＮＡ塩基は大文字で示されており、２’−Ｆ塩基はｆＣ又はｆＵとして示されており、ホスファート＝「Ｐ」。分子量は、最も近いダルトンに四捨五入した。他の表記が存在しない場合、核酸鎖は５’−ヒドロキシル又は３’−ヒドロキシルで終わる。
【０２７９】
質量分析法のデータは、ＲＮアーゼＨ２によって上で研究されたジフルオロ基質（ｆＣｆＵ二重鎖など）の消化が２つのフルオロ塩基間に切断をもたらすことを示唆する。さらに、反応産物は３’−ヒドロキシル及び５’−ホスファートを含有し、ＲＮＡ含有基質の消化からもたらされる産物と類似する。
【０２８０】
修飾された塩基の切断は、二価の陽イオンの不存在下で観察されなかった。滴定を実施し、０．２５から１０ｍＭＭｎＣｌ２と０．２５から１．５ｍＭＣｏＣｌ２間で、酵素活性を観察した。ＭｎＣｌ２とＣｏＣｌ２の両方に関して、酵素活性は、０．５ｍＭから１ｍＭの範囲で最適であった。以降、反応において、０．６ｍＭＭｎＣｌ２と０．５ｍＭＣｏＣｌ２を使用した。Ｍｇ緩衝液を用いると、修飾された基質の切断に対する低下した活性が観察された。総じて、ジフルオロ（ｆＮｆＮ）基質の切断に関して、Ｍｎ緩衝液を用いて最適な活性が観察されたのに対して、Ｍｇ緩衝液はリボヌクレオチド（ｒＮ）基質の切断に関して優れていた。
【０２８１】
単一又は二重の２’−Ｆ塩基でのＲＮアーゼＨ２酵素の切断能は予想外であった。次に、この実施例に上述されている同じ方法を用いて、さらに多様な修飾された基質を切断する能力に関して、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素を検査した。上述されているように、基質の修飾された鎖を放射線標識した。１００ｎＭ基質及びＭｎ切断緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．６ｍＭＭｎＣｌ２、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ）中の組換え酵素４８０から１０００ｍＵを用いて、反応を行った。７０℃で２０分間、反応物を温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。製造業者の画像解析ソフトウェアを用いて各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合としてプロットされた結果が表１０に示されている。
【０２８２】
【表１０】
0005539325.tif 000044
【０２８３】
上記結果から、多くの異なる２’−修飾が、これまでに理解されなかったＲＮアーゼＨ２酵素によって切断され得ることが明らかである。２’−修飾された基質のうち、ジフルオロ化合物（２つの連続する２’−フルオロ塩基を有する化合物）が最も高い活性を示した。３又は４つの連続する２’−フルオロ塩基を有する幾つかの基質など、さらなる基質を検査した。２残基以上２’−フルオロ含量を増加させると、活性の増加は見られなかった。
【０２８４】
酵素のより少量を用いて、実験の類似の系列を行った。以下の実験は、以前に使用された４８０ｍＵに代えて組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１４８μＵを用い（３０００倍少ない酵素）、緩衝液が二価の陽イオンの混合物（３ｍＭＭｇＣｌ２＋０．６ｍＭＭｎＣｌ２）を含有することを除き、同じプロトコールを用いて行った。これらの条件下で、単一のリボヌクレオチド残基を含有する基質は完全に切断されないのに、修飾された基質は完全には切断されなかった。結果が表１１に示されている。２’修飾された塩基の切断より、ＲＮＡ塩基を含有する基質の切断において、ＲＮアーゼＨ２はより活性が高い。
【０２８５】
【表１１】
0005539325.tif 000045
【０２８６】
従って、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２は、ＲＮＡ塩基を一切含有していないが、代わりに、２’修飾された塩基を含有する基質を切断するために使用することができる。研究された化合物のうち、ジフルオロ（ｆＮｆＮ）含有基質が、最高の成績を示した。修飾された基質の使用は、酵素の増加した量を一般に必要とするが、この酵素は触媒的に極めて強力であり、ジフルオロ基質の１００％切断を達成するのに十分な酵素を使用することに困難は生じない。
【０２８７】
この実施例に記載されている２’修飾された基質は、典型的なＲＮアーゼ酵素による切断に対して感受性を有さない。従って、それらは、他のＲＮＡアーゼ酵素（特に、一本鎖リボヌクレアーゼ）による切断に対して完全に耐性を示す基質を使用して、ＲＮアーゼＨ２によって切断現象が媒介される新規アッセイフォーマット中で使用することができる。
【実施例６】
【０２８８】
ジフルオロｆＮｆＮ基質の切断に対する塩基の選好性
以下の実施例は、１６の可能な２’−フルオロジヌクレオチド全てがＲＮアーゼＨ２によって切断され得ることを示す。異なる塩基選好性が観察される。
【０２８９】
表１２に示されているように、以下の１６の基質を合成し、組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素を用いて、切断の効率性に関して検査した。
【０２９０】
【表１２】
0005539325.tif 000046
0005539325.tif 000047
【０２９１】
上述されているように、各基質の修飾された鎖を放射線標識した。Ｍｎ切断緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．６ｍＭＭｎＣｌ２、１０μｇ／ｍＬＢＳＡ）中の組換え酵素２５ｍＵとともに１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。７０℃で２０分間、反応物を温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合としてプロットされた結果が図１４に示されている。より活性が低い基質に対して相対的な切断効率の正確な評価を行えるように、過剰な酵素が存在することなしに、最も活性が高い基質が９０から９５％で切断されるような酵素量を滴定した。
【０２９２】
１６のジヌクレオチドｆＮｆＮ対の全てがＲＮアーゼＨ２によって切断されたが、明瞭な基質選好性が観察された。一般に、配列ｆＮｆＵを有する基質の成績がより悪く、ジヌクレオチド対の３’位にｆＵ塩基を配置することは好ましくないことを示唆している。最も活性が低い基質はｆＵｆＵであり、これは、ｆＡｆＣ又はｆＡｆＧ基質の９０％超の切断をもたらした条件下で、１０％の切断を示した。
【０２９３】
酵素のより多量を使用すると、基質間の切断効率の相対的な差は小さく、ここで研究した全ての基質に対して、１００％の切断を容易に達成することができる。
【実施例７】
【０２９４】
ｒＮ及びｆＮｆＮ基質の切断に対する３’及び５’塩基長の最適化
以下の実施例は、プライマー又はプローブ配列の３’及び５’末端に対する切断可能ドメインの配置の最適化を示す。前実施例において、基質は全て、切断可能ドメインに隣接する５’及び３’側の両方に１４又は１５のＤＮＡ塩基を有していた。切断可能なプローブ及びプライマーの設計において使用するために、Ｔｍ（ハイブリッド形成温度）を調節するために又は反応を開始する特異性を改善するために、これらの隣接する配列を可能な限り短くすることが時に有益であり得る。従って、効率的な酵素切断を得るために必要とされる二重鎖の最小の長さを確定することが重要である。
【０２９５】
この実験では、単一のｒＣ切断可能塩基、リボヌクレオチドにの５’に隣接する２５ＤＮＡ塩基の固定されたドメイン及び３’側の塩基の変動する数を有する、表１３に示されている合成基質二重鎖を作製した。
【０２９６】
【表１３】
0005539325.tif 000048
【０２９７】
上述されているように、各基質の修飾された鎖を放射線標識した。Ｍｇ切断緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、４ｍＭＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ）中の組換え酵素１００μＵとともに１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。７０℃で２０分間、反応物を温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合としてプロットされた結果が図１５に示されている。最大の切断は、リボヌクレオチドの３’側に隣接する４から５個のＤＮＡ塩基で起こった。
【０２９８】
次の実験では、リボヌクレオチドの３’側に隣接する２５塩基対の固定されたドメイン及び５’側の２から１４個の塩基対とともに、単一のｒＵ切断可能塩基を有する、表１４に示されている合成基質二重鎖を作製した。長い核酸試料へのハイブリッド形成をシミュレートするために、最小５つの対形成されない塩基（ダングリング末端）を修飾されていない相補物上に残した。
【０２９９】
【表１４】
0005539325.tif 000049
【０３００】
前述されているように、各基質の修飾された鎖を放射線標識した。Ｍｇ及びＭｎ陽イオンをともに含有する混合された緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．６ｍＭＭｎＣｌ２、３ｍＭＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍＬＢＳＡ）中の組換え酵素１２３μＵとともに１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。７０℃で２０分間、反応物を温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合としてプロットされた結果が図１６に示されている。短い基質では、切断は殆ど見られなかった。５’側にｒＵ塩基が隣接する二重鎖の約１０から１２塩基で最大の切断が得られるまで、５’−ＤＮＡドメインの長さとともに、活性が増加した。
【０３０１】
ジフルオロ（ｆＮｆＮ）基質の切断のために必要とされる３’−ＤＮＡの最適な長さを決定するために、類似の実験を行った。表１５に示されている二重鎖を合成し、ｆＵｆＣジフルオロ基質の３’末端に必要とされるＤＮＡ塩基の長さを機能的に確定するために検査した。５’末端に、２２塩基対の固定されたドメインを配置し、３’ドメインは２から１４塩基まで変動させた。
【０３０２】
【表１５】
0005539325.tif 000050
【０３０３】
上述されているように、各基質の修飾された鎖を放射線標識した。Ｍｇ及びＭｎ陽イオンをともに含有する混合された緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．６ｍＭＭｎＣｌ２、３ｍＭＭｇＣｌ２、１０μｇ／ｍＬＢＳＡ）中の組換え酵素３７ｍＵとともに１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。７０℃で２０分間、反応物を温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合としてプロットされた結果が図１７に示されている。切断可能ドメインの３’側に２つのＤＮＡ塩基を有する基質では、切断は全く見られなかった。４つのＤＮＡ塩基を用いると、切断は見られ、８から１０個のＤＮＡ塩基がｆＵｆＣ切断ドメインの３’側に存在するときに最大の切断が得られるまで着実に増加した。興味深いことに、切断ドメインの３’側のＤＮＡ塩基の最適な長さは、単一のリボヌクレオチド基質（４から５塩基）と比べて、ジフルオロ基質（８から１０塩基）においてより長かった。
【０３０４】
要約すると、リボヌクレオチド含有基質に関して、３’側に少なくとも４から５個のＤＮＡ残基が配置されており、及び切断可能ドメインの５’側に１０から１２のＤＮＡ残基が配置されているときに、最大の切断活性が見られる。ジフルオロ基質に関しては、切断可能ドメインの３’側に少なくとも８から１０個のＤＮＡ残基が配置されているときに、最大の切断活性が見られ、前実施例から、１４から１５のＤＮＡ残基が切断可能ドメインの５’側に配置されているときに活性が高いことが明らかである。
【実施例８】
【０３０５】
ＤＮＡプライマーへの応用：プライマー伸長アッセイフォーマット及びＤＮＡ配列決定への使用可能性
上記実施例は、熱安定的なＲＮアーゼＨ２酵素が、単一の内側リボヌクレオチド又は２’−フルオロジヌクレオチドにおいて、二重鎖核酸を切断する能力を性質決定した。実施例７は、この切断反応における効果的な基質である短いオリゴヌクレオチドを設計するためのパラメータを確立する。ＤＮＡ配列決定又はＰＣＲなどのプライマー伸長アッセイにおいて機能する切断可能プライマーを作製するために、これらの特徴を組み合わせることができる。一本鎖オリゴヌクレオチドは切断反応のための基質ではなく、従って、修飾されたオリゴヌクレオチドプライマーは、標的配列にハイブリッド形成するまで、機能的に「不活性」である。その他には修飾されていないオリゴヌクレオチド中に切断可能ドメインが取り込まれると、このオリゴヌクレオチドはＰＣＲを開始するように機能し、最終ＰＣＲ産物からプライマードメインの手ごろな大きさの一部が切断され得る最終産物をもたらし、反応の無効化がもたらされる（反応開始部位を欠如し、産物は、もはや元のプライマーの組みを使用するＰＣＲに対するテンプレートではない。）。３’末端でブロックされた切断可能ドメインがオリゴヌクレオチド中に取り込まれると、切断が起こるまで、このプライマーはＰＣＲ中で活性を示さない。切断は、ブロックされたプライマーを「活性化する」。従って、切断現象の前にはＤＮＡ合成は全く起こりえないので、このフォーマットは、ＰＣＲ反応に「ホットスタート」を付与することができる。実施例４は、高温が達成されるまで、この切断現象がピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２において極めて非効率的であることを示した。さらに、切断反応とプライマー伸長は、プライマーがテンプレートにハイブリッド形成するときに形成される二重鎖の酵素的認識を必要とするので、両工程の連結はアッセイにさらなる特異性を付与する。この反応の模式図が図１８に示されている。この模式図は、単純なプライマー伸長反応とＰＣＲの両方に適用されることに注目されたい。この模式図は、単純なプライマー伸長反応及びＰＣＲの両方に当てはまる。連結反応などの酵素的アッセイの他の種類においても、活用することができる。
【０３０６】
以下の実施例は、ＤＮＡ配列決定のためのＲＮアーゼＨ２切断可能プライマーの使用を示す。今日使用されているＤＮＡ配列決定の最も一般的な方法は、ジデオキシ終結物質ヌクレオチドの存在下で行われる連続的ＤＮＡ合成反応（プライマー伸長反応）を伴う。反応は、プライマー伸長の複数サイクルが実施され、産物が線形様式で蓄積するサーマルサイクリングフォーマットで行われる。
【０３０７】
ＤＮＡ配列決定は、Ｂｉｇ  ＤｙｅＴＭＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を用いて行った。以下のプライマーを使用した。
【０３０８】
Ｍ１３（−２７）
配列番号８４
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３’
【０３０９】
Ｍ１３（−２７）−ｒＣ
配列番号８５
５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣｃＡＴＧＡ−ＳｐＣ３−３’
【０３１０】
前述のように、ＤＮＡ塩基は大文字で示され、ＲＮＡ塩基は小文字で示され、ＳｐＣ３はオリゴヌクレオチドの３’末端に配置されたスペーサーＣ３ブロッキング基である。ブロックされた切断可能プライマーは、リボヌクレオチドの５’側に１７のＤＮＡ塩基及びリボヌクレオチドの３’側に４つのＤＮＡ塩基を含有するので（１７−１−４デザイン）、実施例７で確立された最適化デザイン規則に合致する。
【０３１１】
０．７５×ＡＢＩ反応緩衝液、１６０ｎＭプライマー、０．５×ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ及び２３０ｎｇプラスミドＤＮＡテンプレートを含む２０μＬの容量で、配列決定反応物を設定した。場合によって、組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１４、１．４又は０．１４ｍＵとともに又はなしに、４ｍＭのさらなるＭｇＣｌ２を反応中に補充した。以下のサイクル配列決定プログラムを使用した。９６℃３０秒間、その後、［９６℃５秒間、５０℃１０秒間、５５℃４分間］の２５サイクル。ＤＮＡ配列決定反応を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ３１３０ｘ１  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ上で実施した。得られた配列決定の軌跡を品質及び読み取り長さに関して調べた。結果が下表１６に要約されている。
【０３１２】
【表１６】
0005539325.tif 000051
【０３１３】
修飾されていないプライマーを使用する対照反応は、８００塩基を僅かに超える使用可能な読み取り長を有する高品質のＤＮＡ配列軌跡をもたらした。これらの反応へのＲＮアーゼＨ２酵素の添加は、反応の品質を損なわなかった。製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、配列決定キットに提供されている緩衝液の陽イオン含量を開示していないので、実際の反応条件は不明確である。さらに４ｍＭＭｇＣｌ２の反応への補充は、全く効果を有していなかった。ｒＣによってブロックされた切断可能なプライマーは、ＲＮアーゼＨ２の添加なしに、ＤＮＡ配列決定を補助しなかった。ＲＮアーゼＨ２を添加すると、２０μＬの反応中に酵素１４ｍＵを用いて、高品質の配列決定反応が得られた。より少量の酵素の使用は、より低品質の反応をもたらし、又は機能的な反応を全くもたらさなかった。ブロックされたプライマーを用いて切断及びプライマー伸長反応を得るために、反応緩衝液のマグネシウム含有物を補充することが必要であった。ここで使用した酵素の量は、最適な条件下（７０℃、２０分の温置）で、ｒＮ基質の１００％切断を達成するために必要とされる量より１００倍高い。本明細書において行われたサイクル配列決定反応では、それぞれ、プライマーの徐冷は５０℃で実行され、伸長反応は、４分１０秒間、５５℃で実行された。これらのより低い温度は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２に対して最適ではない（上記実施例４参照）。より高い温度でサイクル配列決定反応を実施することは、より少ない酵素を要求するが、必要ではない。
【０３１４】
この実施例は、ＲＮアーゼＨ２のための内部切断部位を含有するブロックされたプライマーは、ジデオキシ（Ｓａｎｇｅｒ）配列決定などのプライマー伸長を基礎とする配列決定法とともに使用することができ、既存の高処理量蛍光性配列決定プロトコールの使用と適合性があることを示す。本発明のブロックされたプライマー及び方法の使用は、配列決定反応にさらなる特異性を付与することができるので、より多くのサイクルに対して及び修飾されていないプライマーでは良好に機能しない極めて複雑な核酸試料に対して配列決定を実施することが可能となる。
【実施例９】
【０３１５】
ＤＮＡプライマーへの応用：ＰＣＲ及び定量的リアルタイムＰＣＲにおけるｒＮプライマー
実施例８は、ブロックされたプライマーを切断するためにＲＮアーゼＨ２を使用できること、及びこの系をＤＮＡ合成及びプライマー伸長反応（ＤＮＡ配列決定など）に組み合わせることができることを示した。以下の実施例は、ＰＣＲでのこの方法の有用性を示す。第一の系は終点ＰＣＲフォーマットでの使用を示し、第二の系は定量的リアルタイムＰＣＲフォーマットでの使用を示す。
【０３１６】
合成的終点ＰＣＲアッセイで使用するために、表１７に示されているプライマーを作製した。Ｓｙｎ−Ｆｏｒ及びＳｙｎ−Ｒｅｖプライマーは、人工的なアンプリコン（合成オリゴヌクレオチドテンプレート）に対して特異的な修飾されていない対照プライマーである。Ｓｙｎ−Ｆｏｒプライマーは、修飾されていない対照Ｓｙｎ−Ｒｅｖプライマー又は様々な修飾されたＳｙｎ−Ｒｅｖプライマーと対合した。単一のｒＵ（切断可能）塩基の後に２から６のＤＮＡ塩基を含有する修飾されたＳｙｎ−Ｒｅｖプライマーの組み（全て、ジデオキシＣ残基（ｄｄＣ）で終わる。）を作製した。ｄｄＣ残基は、プライマーの機能を妨げるブロッキング基として機能する。ＲＮアーゼＨ２の作用によるｒＵ塩基でのプライマーの切断を用いて、ｄｄＣブロッキング基を除去する（図１８に示されているブロッキング除去工程）。合成テンプレートは、以下に示されている１０３塩基長のオリゴヌクレオチド（配列番号９３）である。プライマー結合部位には、下線が付されている。
【０３１７】
【表１７】
0005539325.tif 000052
【０３１８】
合成テンプレート
配列番号９３
【０３１９】
【化３４】
0005539325.tif 000053
【０３２０】
２００ｎＭプライマー、２ｎｇテンプレート、各ｄＮＴＰの２００μＭ（合計８００μＭ）、Ｉｍｍｏｌａｓｅ（熱安定的なＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｉｏｌｉｎｅ）の１ユニット、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ及び３ｍＭＭｇＣｌ２を用いて、２０μＬ容量でＰＣＲ反応を行った。ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１００μＵあり又はなしで、反応を実行した。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の３５サイクルが続いた。１０％非変性ポリアクリルアミドゲル上で反応産物を分離し、ＧｅｌＳｔａｒ染色を用いて可視化した。結果が図１９に示されている。修飾されていない対照プライマーは、正しいサイズの強力なバンドを産生した。３’末端がブロックされたｒＵプライマーは、ＲＮアーゼＨ２の不存在下で産物を一切産生しなかった。ＲＮアーゼＨ２の存在下で、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６プライマーを用いると、ブロックされたプライマーは正しいサイズの強力なバンドを産生した。Ｄ２又はＤ３プライマーを用いると、シグナルは見られなかった。この実施例は、本発明の方法を使用するＰＣＲ反応において、ブロックされたプライマーを使用できることを示す。さらに、本実施例は、実施例７において予め形成された二重鎖基質の切断を用いて得られた結果（４から５個の３’−ＤＮＡの存在が、ｒＮ含有プライマーの切断に関して最適であることが見出された。）と合致する。
【０３２１】
次に、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ検出を使用する定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、上記同じ合成的ＰＣＲアンプリコンアッセイ系を検査した。Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、反応を行った。反応は、１０μＬの容量に、１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、各プライマーの２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）、合成テンプレートオリゴヌクレオチド（配列９３）の２×１０６コピー及びピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の５ｍＵを含んだ。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃２０秒間＋７２℃３０秒間］の４５サイクルを実施した。全ての反応は３つ組みで実行し、反応は同じ修飾されていないＦｏｒプライマー（配列番号８６）を使用した。修飾されていないプライマーと２から６Ｄ修飾されたプライマー（配列番号８７から９２）の間で、Ｒｅｖプライマーは変動した。これらの実験におけるＣｐ値（陽性反応が最初に検出されるＰＣＲサイクル数）が、下表１８に示されている。修飾されていないＦｏｒ＋Ｒｅｖプライマーを用いて行われた対照反応及びＲＮアーゼＨ２の存在下で、Ｄ４、Ｄ５又はＤ６ブロックされたプライマーを用いて行われた、連結された切断ＣＰＲ反応に対して、Ｃｐは実質的に同一であった。ＲＮアーゼＨ２の不存在下では、ブロックされたプライマーを用いて、陽性シグナルは検出されなかった。終点アッセイにおいて見られたように、より短い３’−ＤＮＡドメインを有するプライマー（Ｄ２又はＤ３）に対して、性能は低下した。
【０３２２】
【表１８】
0005539325.tif 000054
【０３２３】
以下の実施例は、内在性ヒト遺伝子標的及びＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡをテンプレートとして使用する定量的リアルタイムＰＣＲアッセイフォーマットにおいて、ｒＮブロックされたプライマー（Ｆｏｒ及びＲｅｖの両方）を用いるＲＮアーゼＨ２切断の使用を示す。ヒトＨＲＡＳ遺伝子（ＮＭ １７６７９５）に対して特異的な表１９に示されているプライマーを設計し、合成した。この事例では、ブロッキング基としてＣ３スペーサーを使用した。
【０３２４】
【表１９】
0005539325.tif 000055
【０３２５】
これらのプライマーは、以下に示されているように、ＨＲＡＳ遺伝子内の３４０塩基対アンプリコンを規定する。プライマー結合部位には、下線が付されている。
【０３２６】
ＨＲＡＳアッセイアンプリコン
配列番号９８
【０３２７】
【化３５】
0005539325.tif 000056
【０３２８】
Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、１０μＬの容量で反応を行った。反応物は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の５ｍＵあり又はなしで、２５Ｕ／ｍＬでｉＴＡＱＤＮＡポリメラーゼを使用する１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、３ｍＭＭｇＣｌ２、各プライマー２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）、ｃＤＮＡ２ｎｇ（ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡから作製）を含んだ。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃２０秒間＋７２℃３０秒間］の５０サイクルを実施した。全ての反応は、３つ組みで行った。修飾されていないプライマーを用いると、クロシング点（Ｃｐ）はサイクル２７に生じた。ＲＮアーゼＨ２の不存在下において、ブロックされたプライマーを用いて行った反応はＰＣＲを支持せず、５０サイクルの反応の間に、蛍光シグナルは検出されなかった。ＲＮアーゼＨ２の存在下で、ブロックされたプライマーを用いて行われた反応はサイクル２７．４で検出可能なシグナルを生成し、ブロックされていない対照プライマーと実質的に同じであった。リアルタイムＰＣＲ蛍光プロットが図２０に示されている。
【０３２９】
以下の実施例は、別の内在性ヒト遺伝子標的及びＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡをテンプレートとして使用する定量的リアルタイムＰＣＲアッセイフォーマットにおいて、ｒＮブロックされたプライマーを用いるＲＮアーゼＨ２切断の使用を示す。ヒトＥＴＳ２遺伝子（ＮＭ ００５２３９）に対して特異的な表２０に示されているプライマーを設計し、合成した。
【０３３０】
【表２０】
0005539325.tif 000057
【０３３１】
これらのプライマーは、以下に示されているように、ＥＴＳ２遺伝子内の１８４塩基対のアンプリコンを規定する。プライマー結合部位には、下線が付されている。
【０３３２】
ＥＴＳ２アッセイアンプリコン
配列番号１０３
【０３３３】
【化３６】
0005539325.tif 000058
【０３３４】
Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、１０μＬの容量で反応を行った。反応物は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の５ｍＵあり又はなしで、２５Ｕ／ｍＬでｉＴＡＱＤＮＡポリメラーゼを使用する１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、３ｍＭＭｇＣｌ２、各プライマー２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）、ｃＤＮＡ２ｎｇ（ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡから作製）を含んだ。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃２０秒間＋７２℃３０秒間］の５０サイクルを実施した。全ての反応は、３つ組みで行った。ブロックされていないプライマーを用いると、Ｃｐはサイクル２５．７に生じた。ＲＮアーゼＨ２の不存在下において、ブロックされたプライマーを用いて行った反応はＰＣＲを支持せず、５０サイクルまで、蛍光シグナルは検出されなかった。ＲＮアーゼＨ２の存在下で、ブロックされたプライマーを用いて行われた反応はサイクル３１．７（修飾されていない対照プライマーから６サイクル遅延）で検出可能なシグナルを生成した。１つのブロックされたプライマー（修飾されていないＦｏｒ又はブロックされたＲｅｖ又はブロックされたＦｏｒ又は修飾されていないＲｅｖ）を用いて行われた反応は、中間のＣｐ値を示した。リアルタイムＰＣＲ蛍光プロットが図２１に示されている。
【０３３５】
本反応条件を用いて、修飾されていないプライマー対ブロックされたプライマーを用いて、ＨＲＡＳアッセイを同じように行った。しかしながら、修飾されていないプライマー対ブロックされたプライマーの間で、ＥＴＳ２アッセイは遅延を示した。迅速な熱的サイクリングが行われるＰＣＲ反応の設定では、プライマーハイブリッド形成及び切断速度論は、ブロックされたプライマーを使用する反応に関する反応全体の効率において重要な役割を果たす。ＤＮＡ合成をブロッキング除去現象に連結し、ブロッキング除去には、プライマーが活性化された状態になり、ＤＮＡ合成を開始できる前に、ハイブリッド形成、ＲＮアーゼＨ２の結合及び基質の切断が必要である。存在するＲＮアーゼＨ２の量を増加させることによって又は反応の徐冷時間を増加させることによって、各サイクルに産生される切断されたプライマーの量を増加させることができるはずである。ＤＮＡ合成は、ほぼ徐冷温度（６０℃）で及び上記実施例において使用された伸長温度（７２℃）で起こる。しかしながら、徐冷工程の間にのみＲＮアーゼＨ２に対する二本鎖基質を形成することが可能であり、７２℃（プライマーは一本鎖形態のみで存在する。）では形成できない使用されるプライマーのＴｍのために、ブロッキング除去は徐冷工程（６０℃）の継続中にのみ起こり、伸長工程（７２℃）の間には起こらない。
【０３３６】
これらの反応パラメータを変更することによって、ブロックされたＥＴＳ２プライマーが修飾されていない対照プライマーと類似の効率で機能できるかどうかを調べるために、６０℃で行われる単一の現象として徐冷／伸長を有する２工程反応にＰＣＲサイクルパラメータを変更し、徐冷／伸長工程の期間を変化させた。Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、１０μＬの容量で反応を行った。反応物は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の５ｍＵあり又はなしで、２５Ｕ／ｍＬでｉＴＡＱＤＮＡポリメラーゼを使用する１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、３ｍＭＭｇＣｌ２、各プライマー２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）、ｃＤＮＡ２ｎｇ（ＨｅＬａ細胞の全ＲＮＡから作製）を含んだ。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃２０から１２０秒間］の４５サイクルを実施した。全ての反応は、３つ組みで行った。ブロックされたプライマーと修飾されていない対照プライマーに対して得られたＣｐ値間の差（デルタＣｐ）が、下表２１に要約されている。
【０３３７】
【表２１】
0005539325.tif 000059
【０３３８】
サイクルパラメータの微少な調整及び６０℃の徐冷工程の期間の２０秒から１ないし２分への増加によって、ブロックされた切断可能なプライマーと修飾されていない対照プライマーの間で均一な性能がもたらされた。サイクルパラメータを一定に保ち、酵素を増加させながら、類似の実験を行った。予想通り、酵素のより多い量を用いて、ブロックされたプライマーの性能を向上させることができた。６０℃での３０秒の徐冷工程を使用すると、使用する酵素の量を１０ｍＵＲＮアーゼＨまで倍増させることによって、ブロックされていない対照とブロックされた切断可能なプライマーとの間に最小の差がもたらされた。
【０３３９】
上記実施例は、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、実施例７に教示されている最適化された設計の単一リボヌクレオチド残基を含有するブロックされたプライマーをＲＮアーゼＨ２とともに使用できることを示す。
【実施例１０】
【０３４０】
ＤＮＡプライマーへの応用：ＰＣＲ及び定量的リアルタイムＰＣＲにおけるｆＮｆＮプライマー
上記実施例９は、終点及び定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいてｒＮブロックされたプライマーを使用するためのＲＮアーゼＨ２媒介性切断の有用性を示した。本実施例は、定量的リアルタイムＰＣＲアッセイにおいてｆＮｆＮブロックされたプライマーを使用する有用性を示す。
【０３４１】
ＲＮアーゼＨ２によるジフルオロ基質の切断は３’−ＯＨ末端を有する種をもたらすので、単一の２’−Ｆ塩基（ｆＮ）を有するプライマーがＤＮＡ合成を開始することができると仮定すると、この産物も実施例９に記載されているのと同じ反応フォーマットを使用するＰＣＲ反応を支持することができるはずである。ジフルオロ基質の切断は、マンガン陽イオンの存在下で最も良好に進行するのに対して、ＰＣＲ反応は、マグネシウム陽イオンの存在下で一般に行われる。３ｍＭＭｇＣｌ２を含有する標準的なｑＰＣＲ緩衝液及び３ｍＭＭｇＣｌ２＋０．６ｍＭＭｇＣｌ２を含有する修飾された緩衝液を用いて、修飾されていないプライマーを使用するＰＣＲ反応を検査した。反応性能は同一であり、マンガンのこの少量の存在は反応の定量的な性質に悪影響を及ぼさなかった。
【０３４２】
実施例９に記載されている合成ＰＣＲアンプリコン系を用いて、末端３’−ｆＮプライマーがＰＣＲ中で機能する能力を調べた。表２２に示されている以下のプライマーを検査した。
【０３４３】
【表２２】
0005539325.tif 000060
【０３４４】
合成テンプレート
配列番号９３
【０３４５】
【化３７】
0005539325.tif 000061
【０３４６】
Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、１０μＬの容量で反応を行った。反応物は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．７５Ｕあり又はなしで、２５Ｕ／ｍＬでｉＴＡＱＤＮＡポリメラーゼを使用する１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、３ｍＭＭｇＣｌ２、０．６ｍＭＭｎＣｌ２、各プライマー２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）、合成オリゴヌクレオチド標的の２×１０６コピーを含んだ。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃１２０秒間＋７２℃１２０秒間］の３０サイクルを実施した。全ての反応は、３つ組みで行った。結果が図２２に示されている。ＲＮアーゼＨ２の不存在下で、３’末端に２’−Ｆ塩基を有するプライマーは、修飾されていないプライマーと比べて同一の効率で、ＰＣＲを支持した。しかしながら、ＲＮアーゼＨ２の存在下では、２’−Ｆ修飾されたプライマーは修飾されていないプライマーと比べて、３．５Ｃｐの遅れを示した。これは、ＲＮアーゼＨ２によるＤＮＡ合成の阻害から生じるのではなく、ＲＮアーゼＨ２による増幅産物からのプライマーの切断の低いレベルから生じる。ＤＮＡ合成後、新たに形成されたＤＮＡ産物中にｆＮ含有プライマーを取り込むことによって、ＲＮアーゼＨ２に対する潜在的基質が作出される（上記実施例５参照）。２’−Ｆ塩基での切断はアンプリコンのこの鎖からの反応開始部位を除去し、そこから作製される一切の産物がさらなる反応開始現象を行うことができないように、この産物を効果的に無効化する。多項目式増幅で起こるのはこの反応系列である。しかしながら、単一の２’−Ｆ残基を含有する基質の切断は相対的に非効率なので、ＰＣＲ反応効率の穏やかな減少が見られるに過ぎない。ＰＣＲに続く７２℃での伸長温置は、増幅産物からのプライマーの完全な切断をもたらし、さらなる増幅が起こる能力を完全に遮断し、これにより、産物を無効化するはずである。これは、ＰＣＲ反応の交叉きょう雑の抑制において有用なはずである。
【０３４７】
単一の２’−Ｆ残基の切断が非効率であることに鑑みれば、酵素のより少量を使用すること又は７２℃の伸長工程を削除することによって、単一の２’−フルオロ残基を含有するプライマー伸長反応産物を著しく切断せずに、ＲＮアーゼＨ２によるジフルオロブロックされたプライマーを切断することが可能となる。あるいは、末端の２’−Ｆ残基及び隣接するＤＮＡ塩基間でのホスホロチオアート修飾の選択的な配置によって、この切断現象をブロックすることが可能なはずである。
【０３４８】
ジフルオロブロックされたプライマーがｑＰＣＲを支持する能力は、上記実施例９に記載されている合成オリゴヌクレオチドアンプリコン系において、表２３に示されているプライマーを用いて示された。
【０３４９】
【表２３】
0005539325.tif 000062
【０３５０】
合成テンプレート
配列番号９３
【０３５１】
【化３８】
0005539325.tif 000063
【０３５２】
Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、１０μＬの容量で反応を行った。反応物は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．７５Ｕあり又はなしで、２５Ｕ／ｍＬでｉＴＡＱＤＮＡポリメラーゼを使用する１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、３ｍＭＭｇＣｌ２、０．６ｍＭＭｎＣｌ２、各プライマー２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）、合成オリゴヌクレオチド標的の２×１０６コピーを含んだ。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃１２０秒間＋７２℃１２０秒間］の４５サイクルを実施した。全ての反応は、３つ組みで行った。３’末端に単一の２’−フルオロ塩基を有する対照プライマー（ｆＮｆＮブロックされたプライマーの切断産物を模倣する。）を用いて行った反応は、２０のＣｐを有していた。ブロックされたｆＵｆＣプライマーを用いて行った反応も、２０のＣｐを有していた。
【０３５３】
次に、ジフルオロプライマー切断アッセイにおいて必要とされるＲＮアーゼＨ２酵素の量をより詳しく研究した。Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、１０μＬの容量で反応を行った。反応物は、２５Ｕ／ｍＬでｉＴＡＱＤＮＡポリメラーゼを使用する１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、３ｍＭＭｇＣｌ２、０．６ｍＭＭｎＣｌ２、各プライマー２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）、合成オリゴヌクレオチド標的の２×１０６コピーを含んだ。全ての反応において、同じ修飾されていないＳｙｎ−Ｆｏｒプライマーを使用した。反応当り０から６００ｍＵの組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２を添加した。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃１２０秒間＋７２℃１２０秒間］の４５サイクルを実施した。全ての反応は、３つ組みで行った。各プライマーに対するＲＮアーゼＨ２の変動する量に対応するＣｐ値が表２４に示されている。
【０３５４】
【表２４】
0005539325.tif 000064
【０３５５】
ＲＮアーゼＨ２の最適量は２００ｍＵである（Ｃｐ＝２１．３が太字及び下線で示されている。）。ＲＮアーゼＨ２の濃度が高くなるほど、ＰＣＲ反応の効率は低くなり、同じ程度で、３’フルオロＵプライマー及びブロックされたジフルオロプライマーはともに、類似の程度であった。おそらく、これは、上述されているように、ＰＣＲ産物内のｆＵの組みでの切断のレベルが低いことによるものである。
【０３５６】
一般に、ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが２つの連続する２’−フルオロヌクレオシドであるブロックされたプライマーを用いる結合されたＲＮアーゼＨ２−ＰＣＲに対して、１０μＬ当りピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の約２００ｍＵが最適な酵素濃度である。２と６サイクルの間の、標準的な修飾されていないＤＮＡプライマーと比べたＣｐの増加が通例観察される。結果はＣｐ対未知の試料を検査するために使用したものと同じプライマーを用いて生じた標的コピー数の標準曲線と常に比較されるので、この小さな差はアッセイ性能に対して影響を及ぼさない。
【０３５７】
結論として、本実施例は、ブロックされたｆＮｆＮプライマーは本発明の方法とともにＲＮアーゼＨ２切断を使用するｑＰＣＲ反応を支持できることを示し、使用するＲＮアーゼＨ２の最適な量及びサイクリング条件を確定する。
【実施例１１】
【０３５８】
ＰＣＲ反応中でｒＮブロックされたプライマーを使用する改善された特異性。
【０３５９】
理論的には、ＰＣＲはほぼ無限の増幅能を有しており、ＰＣＲ反応は反応混合物中の試薬の消費によってのみ制約を受けるはずである。実際に実施する際には、特異性の保持を助けるために、ＰＣＲ反応は通例４０から４５サイクルに限定される。ＰＣＲの増幅能は莫大であり、サイクル数が４０から４５を超えるにつれて、誤った反応開始現象が所望されない産物の増幅及び偽陽性シグナルを生じさせることが益々一般的になる。本実施例は、切断可能なブロックされたプライマーを本発明の方法とともに使用することが、どのようにして反応特異性を改善し、多数のＰＣＲサイクルの使用を可能にし、これにより、ＰＣＲの潜在的な感度を増加させるかを示す。
【０３６０】
本実施例において、本発明者らは、３つのヒト遺伝子に対して特異的なＰＣＲ反応を調べ、ヒト及びラットｃＤＮＡをテンプレートとして使用する増幅において、プライマー対の各組みの特異性を比較した。伝統的な修飾されていないオリゴヌクレオチドを本発明の新しい切断可能なブロックされたプライマーと比較した。表２５に示されている以下のプライマーを使用した。ＤＮＡ塩基は大文字で、ＲＮＡ塩基は小文字で示されており、使用された３’−ブロッキング基はＣ３スペーサー（ＳｐＣ３）であった。調べた遺伝子標的は、ヒトＥＴＳ２、ＮＭ ００５２３９（ラット相同体ＮＭ ００１１０７１０７）、ヒトＨＲＡＳ、ＮＭ １７６７９５（ラット相同体ＮＭ ００１０６１６７１）及びヒトＡＣＡＣＡ、ＮＭ １９８８３４（ラット相同体ＮＭ ０２２１９３）であった。
【０３６１】
【表２５】
0005539325.tif 000065
【０３６２】
Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、ＰＣＲ反応を行った。反応物は、１０μＬの容量に、１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、各プライマー２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）及びピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．３ｍＵを含んだ。テンプレートＤＮＡは、ヒトＨｅＬａ細胞ｃＤＮＡの２ｎｇ及びラット脊髄ｃＤＮＡの何れかであった。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃９０秒間］の６０サイクルを実施した。これらの条件下で、ヒトｃＤＮＡに対して観察されるＣｐ値は真の陽性現象に相当する。ラットｃＤＮＡを用いて何らかのシグナルが検出されれば、偽陽性現象として記録された。これらの３つの遺伝子に対して、ヒト及びラット配列は、プライマー結合部位において多様である。従って、ヒト遺伝子特異的プライマーを用いたラットｃＤＮＡ中のＰＣＲ産物の検出は誤った反応開始から生じる望ましくない偽陽性の結果である。結果が下表２６に示されている。
【０３６３】
【表２６】
0005539325.tif 000066
【０３６４】
修飾されていないプライマーを用いて、ヒトｃＤＮＡ中のヒト標的が首尾よく検出され、２３から２６のＣｐが観察された。３つのＰＣＲアッセイの全てで、サイクルを継続すると、ヒト遺伝子特異的なプライマーはラットｃＤＮＡ中の産物も検出し、３５から５６のＣｐが観察された。これらは、ＰＣＲアッセイが真の陽性シグナルの低いレベルを検出する能力を制限する望ましくない偽陽性シグナルに相当する。
【０３６５】
修飾されたプライマーを用いて、ヒトｃＤＮＡ中の望ましい産物が首尾よく検出され、Ｃｐは全て、修飾されていないプライマーに対して得られた値の１以内であった。しかしながら、修飾されたプライマーとともにラットｃＤＮＡを用いると、６０サイクルでさえ、偽陽性シグナルが見られなかった。ＲＮアーゼＨ２ブロックされた切断可能なプライマーの使用は改善された特異性をもたらし、偽反応開始現象の検出なしに、より長く、より感度の高いＰＣＲ反応（本事例では、最大６０サイクル）を使用することを可能にする。これにより、野性型配列のさらに大過剰の存在下にあるバリアント対立遺伝子を検出する能力がずっと大きくなる。
【実施例１２】
【０３６６】
定常状態条件下でのｒＣ基質に対するミスマッチの識別
実施例１１は、本発明の方法が、バックグラウンドの誤った反応開始現象に直面するｑＰＣＲ反応の特異性を改善できることを示した。本実施例は、一塩基の差（ＳＮＰ）に関するＲＮアーゼＨ２切断反応の特異性を示す。単一のｒＣ塩基を含有する二重鎖基質中の塩基ミスマッチを区別するピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素の能力を、定常状態条件下で検査した。以下の基質は３２Ｐ末端標識され、上記実施例４に記載されているように、「Ｍｇ切断緩衝液」中で温置した。反応は、２０μＬの容量中に、酵素の１００μＵとともに１００ｎＭ基質を含み、７０℃で２０分間温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭＳｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合として結果をプロットした。
【０３６７】
完全なマッチ（ｒＣ：Ｇ、配列番号１３並びにｒＣ塩基での（３つの二重鎖、配列番号１１８から１２０）、ｒＣに対して＋１の位置での（３つの二重鎖、配列番号１２１から１２３）及びｒＣに対してー１の位置での（３つの二重鎖、配列番号１２４から１２６）での各可能な塩基ミスマッチを含む１０の二重鎖を調べた。完全なマッチ＝１００％に対して結果を標準化し、下表２７に示されている。
【０３６８】
【表２７】
0005539325.tif 000067
【０３６９】
ピロコッカスＲＮアーゼＨ２は、これらの条件下で、単一塩基のミスマッチを識別することができた。識別の正確な程度は、ミスマッチ中で何れの塩基が対合されているかに応じて変動した。興味深いことに、−１でのミスマッチ（ｒＣ塩基に対して５’の１つの塩基）は相対的に優れたミスマッチの識別を示したのに対して、＋１でのミスマッチ（ｒＣ塩基に対して３’の１つの塩基）は一般に効果がより低かった。選択性は相対的に大きくないように見受けられるが、ＰＣＲの反復されたサイクルとともに、選択性は大幅に増幅される。
【実施例１３】
【０３７０】
熱的サイクリングの間のｒＮ基質に対するミスマッチ識別
ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素は、定常条件下で、ｒＣ基質に対する塩基のミスマッチを区別できることを実施例１２に記載した。本実施例では、この酵素が、熱的サイクリングの条件下で、全てのｒＮ含有基質に対する塩基のミスマッチを区別する能力を調べた。これらの条件において、切断可能な基質は、温度上昇が二重鎖を破壊する前に短期間、酵素によるプロセッシングのために利用できるに過ぎない。ミスマッチの識別は、蛍光定量的リアルタイムＰＣＲアッセイの設定において評価した。本発明者らは、定常状態条件下で観察された場合より、これらの速度論的に限定された条件下において、塩基ミスマッチ識別が大幅に改善されることを見出した。
【０３７１】
本実施例では、以下の核酸を使用した。最も近い全ての隣接対とミスマッチを網羅するように、オリゴヌクレオチドを合成した。
【０３７２】
修飾されていないＦｏｒプライマー：
配列番号８６
【０３７３】
【化３９】
0005539325.tif 000068
【０３７４】
ブロックされたｒＮ基質ｒｅｖプライマー（３’末端にＣ３スペーサーブロッキング基）が以下に示されている。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字である。変動領域は、太字及び下線によって示されている。単一のＲＮＡ残基を含有する合計２８のブロックされたプライマーを合成した。
【０３７５】
ｒＡシリーズ：
配列番号１２７
【０３７６】
【化４０】
0005539325.tif 000069
【０３７７】
配列番号１２８
【０３７８】
【化４１】
0005539325.tif 000070
【０３７９】
配列番号１２９
【０３８０】
【化４２】
0005539325.tif 000071
【０３８１】
配列番号１３０
【０３８２】
【化４３】
0005539325.tif 000072
【０３８３】
配列番号１３１
【０３８４】
【化４４】
0005539325.tif 000073
【０３８５】
配列番号１３２
【０３８６】
【化４５】
0005539325.tif 000074
【０３８７】
配列番号１３３
【０３８８】
【化４６】
0005539325.tif 000075
【０３８９】
ｒＵシリーズ：
配列番号１３４
【０３９０】
【化４７】
0005539325.tif 000076
【０３９１】
配列番号１３５
【０３９２】
【化４８】
0005539325.tif 000077
【０３９３】
配列番号１３６
【０３９４】
【化４９】
0005539325.tif 000078
【０３９５】
配列番号１３７
【０３９６】
【化５０】
0005539325.tif 000079
【０３９７】
配列番号１３８
【０３９８】
【化５１】
0005539325.tif 000080
【０３９９】
配列番号１３９
【０４００】
【化５２】
0005539325.tif 000081
【０４０１】
配列番号１４０
【０４０２】
【化５３】
0005539325.tif 000082
【０４０３】
ｒＣシリーズ：
配列番号１４１
【０４０４】
【化５４】
0005539325.tif 000083
【０４０５】
配列番号１４２
【０４０６】
【化５５】
0005539325.tif 000084
【０４０７】
配列番号１４３
【０４０８】
【化５６】
0005539325.tif 000085
【０４０９】
配列番号１４４
【０４１０】
【化５７】
0005539325.tif 000086
【０４１１】
配列番号１４５
【０４１２】
【化５８】
0005539325.tif 000087
【０４１３】
配列番号１４６
【０４１４】
【化５９】
0005539325.tif 000088
【０４１５】
配列番号１４７
【０４１６】
【化６０】
0005539325.tif 000089
【０４１７】
ｒＧシリーズ：
配列番号１４８
【０４１８】
【化６１】
0005539325.tif 000090
【０４１９】
配列番号１４９
【０４２０】
【化６２】
0005539325.tif 000091
【０４２１】
配列番号１５０
【０４２２】
【化６３】
0005539325.tif 000092
【０４２３】
配列番号１５１
【０４２４】
【化６４】
0005539325.tif 000093
【０４２５】
配列番号１５２
【０４２６】
【化６５】
0005539325.tif 000094
【０４２７】
配列番号１５３
【０４２８】
【化６６】
0005539325.tif 000095
【０４２９】
配列番号１５４
【０４３０】
【化６７】
0005539325.tif 000096
【０４３１】
ブロックされていない対照Ｒｅｖプライマー（ＲＮアーゼＨ２による切断後のブロックされたプライマーの反応産物を模倣する。）は、以下のとおりであった。
【０４３２】
配列番号８７
５’ＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴＧ３’
【０４３３】
以下の完全にマッチした及びミスマッチした合成テンプレートを使用した。変動する塩基の位置は、下線付きの太字フォントで示されている。リボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの５’の１つの塩基若しくは３’の１つの塩基での可能な各塩基変動に対して、ユニークなテンプレートを作製した。合計、２８のテンプレートを合成し、検査した。
【０４３４】
ｒＡテンプレート：
配列番号１５５
【０４３５】
【化６８】
0005539325.tif 000097
【０４３６】
配列番号１５６
【０４３７】
【化６９】
0005539325.tif 000098
【０４３８】
配列番号１５７
【０４３９】
【化７０】
0005539325.tif 000099
【０４４０】
配列番号１５８
【０４４１】
【化７１】
0005539325.tif 000100
【０４４２】
配列番号１５９
【０４４３】
【化７２】
0005539325.tif 000101
【０４４４】
配列番号１６０
【０４４５】
【化７３】
0005539325.tif 000102
【０４４６】
配列番号１６１
【０４４７】
【化７４】
0005539325.tif 000103
【０４４８】
ｒＵテンプレート：
配列番号１６２
【０４４９】
【化７５】
0005539325.tif 000104
【０４５０】
配列番号１６３
【０４５１】
【化７６】
0005539325.tif 000105
【０４５２】
配列番号１６４
【０４５３】
【化７７】
0005539325.tif 000106
【０４５４】
配列番号１６５
【０４５５】
【化７８】
0005539325.tif 000107
【０４５６】
配列番号１６６
【０４５７】
【化７９】
0005539325.tif 000108
【０４５８】
配列番号１６７
【０４５９】
【化８０】
0005539325.tif 000109
【０４６０】
配列番号１６８
【０４６１】
【化８１】
0005539325.tif 000110
【０４６２】
ｒＧテンプレート：
配列番号１６９
【０４６３】
【化８２】
0005539325.tif 000111
【０４６４】
配列番号１７０
【０４６５】
【化８３】
0005539325.tif 000112
【０４６６】
配列番号１７１
【０４６７】
【化８４】
0005539325.tif 000113
【０４６８】
配列番号１７２
【０４６９】
【化８５】
0005539325.tif 000114
【０４７０】
配列番号１７３
【０４７１】
【化８６】
0005539325.tif 000115
【０４７２】
配列番号１７４
【０４７３】
【化８７】
0005539325.tif 000116
【０４７４】
配列番号１７５
【０４７５】
【化８８】
0005539325.tif 000117
【０４７６】
ｒＣテンプレート：
配列番号１７６
【０４７７】
【化８９】
0005539325.tif 000118
【０４７８】
配列番号１７７
【０４７９】
【化９０】
0005539325.tif 000119
【０４８０】
配列番号１７８
【０４８１】
【化９１】
0005539325.tif 000120
【０４８２】
配列番号１７９
【０４８３】
【化９２】
0005539325.tif 000121
【０４８４】
配列番号１８０
【０４８５】
【化９３】
0005539325.tif 000122
配列番号１８１
【０４８６】
【化９４】
0005539325.tif 000123
【０４８７】
配列番号１８２
【０４８８】
【化９５】
0005539325.tif 000124
【０４８９】
一緒に、これらの核酸は、表記されているＰＣＲアッセイの設定を構成する。
【０４９０】
【化９６】
0005539325.tif 000125
【０４９１】
末端のＣ３スペーサー基（「ｘ」によって示される。）は、プライマーとしての役割を果たすために、ｒＵ含有オリゴヌクレオチドをブロックする。テンプレートにハイブリッド形成されると、二重鎖はＲＮアーゼＨ２に対する基質となり、切断はｒＵ残基のすぐ５’で起こり、（←）で示されているように、機能的なプライマーをもたらす。
修飾されていないプライマー配列番号８６並びにｒＮ含有プライマー配列番号１２７から１５４のとテンプレート配列番号１５５から１８２の対を成す組み合わせを用いて、定量的リアルタイムＰＣＲ反応を行った。Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、反応を行った。反応物は、１０μＬの容量に、１×ＢＩＯ−ＲＡＤｉＱＴＭＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）、各プライマー２００ｎＭ（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）及びピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．３ｍＵを含んだ。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で５分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃２０秒間＋７２℃３０秒間］の４５サイクルを実施した。これらの条件下において、Ｆｏｒ＋Ｒｅｖ（修飾されていない）プライマーを用いて行われた対照反応及び完全なマッチのＦｏｒ（修飾されていない）＋ｒＮＲｅｖ（ブロックされた）プライマーを用いて行われた対照の連結されたＲＮアーゼＨ２切断ＰＣＲ反応に関して、Ｃｐ値は同一であった。従って、使用した反応条件は、リアルタイム熱的サイクリングの速度論的制約の中で完全にマッチする種を切断するのに十分な温置時間及びＲＮアーゼＨ２濃度を有し、この点からの何らかの逸脱は、ブロックされたプライマーと様々なテンプレートの間に存在する塩基のミスマッチにより付与された反応効率の変化を表す。
【０４９２】
プライマーとテンプレートの対を成す組み合わせは上述のように実行され、結果は、デルタＣｐ（対照とミスマッチ反応間で観察されたサイクル閾値の差である。）を示す以下に要約されている。各ＣｐはＰＣＲ中のサイクル（これらの条件下での指数関数的反応である。）を表すので、１０のデルタＣｐは２１０の本当の差、すなわち感度の１０２４倍の変化を表す。対立遺伝子特異的ＰＣＲアッセイにおいてＳＮＰを識別するために、４から５サイクルのデルタＣｐが一般に十分である。
【０４９３】
ｒＮ塩基上の中心位置の塩基を変動させて行われた検査の結果が、下表２８に示されている。
【０４９４】
【化９７】
0005539325.tif 000126
【０４９５】
【表２８】
0005539325.tif 000127
【０４９６】
熱的サイクリング条件下でのｒＮ基質のＲＮアーゼＨ２切断において、相対的な効率の極めて大きな差が見られ、約４０倍の差（デルタＣｐ５．３）から３０，０００倍超の差（デルタＣｐ１４．９）の範囲にわたった。アッセイの何れもが、５サイクル未満のデルタＣｐを示さなかった。従って、ＲＮアーゼＨ２ｒＮ切断反応は、定常状態条件より、速度論的アッセイ（ｑＰＣＲ）の設定においてより大きな特異性を示し、標準的なＤＮＡプライマーを用いた対立遺伝子特異的ＰＣＲよりずっと大きな選択性を示す。本発明の詳細な説明に記載されている及び以下の実施例に示されているプライマーの設計によって、さらなる特異性が付与され得る。
【０４９７】
ｒＮ塩基に対して−１の位置の塩基を変動させて行われた検査の結果が、下表２９に示されている。
【０４９８】
【化９８】
0005539325.tif 000128
【０４９９】
【表２９】
0005539325.tif 000129
【０５００】
ｒＮ塩基に対して＋１の位置の塩基を変動させて行われた検査の結果が、下表３０に示されている。
【０５０１】
【化９９】
0005539325.tif 000130
【０５０２】
【表３０】
0005539325.tif 000131
【０５０３】
ｒＡ、ｒＣ及びｒＧプローブなどの、ｒＮ塩基に対して−１及び＋１の位置に対して上に列記されている全ての配列バリアントに対して、対を成す組み合わせを同様に検査した。結果が下表３１から３６に示されている。
【０５０４】
【表３１】
0005539325.tif 000132
【０５０５】
【表３２】
0005539325.tif 000133
【０５０６】
【表３３】
0005539325.tif 000134
【０５０７】
【表３４】
0005539325.tif 000135
【０５０８】
【表３５】
0005539325.tif 000136
【０５０９】
【表３６】
0005539325.tif 000137
【０５１０】
単一の塩基ミスマッチの設定における、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２によるｒＮ基質の切断の反応効率の相対的変化は、対を成す塩基の種類、切断部位に対するミスマッチの相対的位置及び隣接塩基によって変動する。ミスマッチ遺伝子座とマッチした遺伝子座の間の予想される差（デルタＣｐ）を最大化する最適なミスマッチ検出アッセイを設計するために、本実施例において確定されたミスマッチチャートを使用することが可能であり、新しいアッセイデザインの最適化を自動化するために、アルゴリズム中に組み込むことができる。
【実施例１４】
【０５１１】
定常状態条件下でのｆＵｆＵ基質に対するミスマッチの識別
ｆＵｆＵジヌクレオチド対を含有する二重鎖基質中の塩基ミスマッチを区別するピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素の能力を、定常状態条件下で検査した。以下の基質は３２Ｐ末端標識され、上記実施例５及び６に記載されているように、「Ｍｎ切断緩衝液」中で温置した。反応は、２０μＬの容量中に、酵素の１Ｕとともに１００ｎＭ基質を含み、７０℃で２０分間温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合として結果をプロットした。
【０５１２】
完全なマッチ（配列番号６０）、２’−フルオロジヌクレオチド対内のミスマッチ（配列番号１８３から１８９）及び２’−フルオロジヌクレオチド対に隣接するミスマッチ（配列番号１９０から１９５）を含む表３７に示されている１４の二重鎖を研究した。結果は、完全なマッチ＝１００％に対して標準化した。
【０５１３】
【表３７】
0005539325.tif 000138
0005539325.tif 000139
【０５１４】
ピロコッカスＲＮアーゼＨ２は、これらの条件下で、単一塩基のミスマッチを極めて効率的に識別することができた。識別の正確な程度は、ミスマッチ中で何れの塩基が対合されているかに応じて変動した。興味深いことに、（ｆＵｆＵドメインに対して）−１及び＋１の両位置でのミスマッチが有効であった。ｆＵｆＵ基質を用いた切断に対する特異性は、ｒＣ基質（上記実施例１２）より、定常アッセイ条件下で著しく高かった。
【０５１５】
上記研究は、１６の可能なジヌクレオチド対の切断に対して最も効率性が低いジフルオロ基質であることが実施例６において既に示されたｆＵｆＵジヌクレオチド対を使用した。これは、ミスマッチの結果に影響を及ぼし得る。ｆＵｆＣジフルオロ基質鎖に置き換えて、同じ相補鎖を用いて同様の実験を行った。ｆＵｆＵ基質と比べてｆＵｆＣに対して見られた増加した切断活性のために、ＲＮアーゼＨ２は２０ｍＵに減らした。結果が下表３８に示されている。
【０５１６】
【表３８】
0005539325.tif 000140
0005539325.tif 000141
【０５１７】
再び、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２は、単一の塩基ミスマッチを極めて効率的に識別することができた。識別の正確な程度は、ミスマッチ中で何れの塩基が対合されているかに応じて変動した。前述のように、（ｆＵｆＣドメインに対して）−１及び＋１の両位置でのミスマッチが有効であった。ｆＵｆＣ基質を用いた切断に対する特異性は、ｒＣ基質（上記実施例１２）より、定常アッセイ条件下で著しく高く、ｆＵｆＵ基質より僅かに大きな特異性も示した。熱的サイクリング中の速度論的アッセイ条件下で、ジフルオロ基質を使用するミスマッチアッセイはさらに大きな選択性を示し得る。
【実施例１５】
【０５１８】
基質中へのホスホロチオアートヌクレオチド間修飾の選択的配置
幾つかの異なる基質に対して、ホスホロチオアートヌクレオシド間連結の取り込みの効果を検査した。ホスホロチオアート（ＰＳ）結合は、通例、相対的にヌクレアーゼ耐性であると考えられ、血清などのヌクレアーゼ含有溶液中でオリゴヌクレオチドの安定性を増加させるために一般に使用されている。ＰＳ結合はＲｐ及びＳｐという２つの立体異性体を形成し、これらは、異なるヌクレアーゼに対して安定化の異なるレベルを通常示す。
【０５１９】
２つの修飾された塩基間のＰＳ結合を用いて、ジフルオロ基質を調べた。両ジアステレオマーの混合物を本研究のために使用した。
【０５２０】
修飾されていないｆＵｆＣ基質：
配列番号５８
【０５２１】
【化１００】
0005539325.tif 000142
【０５２２】
ＰＳ修飾されたｆＵ＊ｆＣ基質（「＊」＝ＰＳ結合）：
配列番号２０９
【０５２３】
【化１０１】
0005539325.tif 000143
（注意−配列中のギャップは、並置を目的とするためのものである。）
【０５２４】
１２０μＬ容量中で基質１６０ｐｍｏｌｅ（１．３μＭ）及び組換えピロコッカスＲＮアーゼＨ２酵素の４ユニットを用いて、「Ｍｎ切断緩衝液」中において、７０℃で１時間、上記基質を温置した。ゲル搭載緩衝液（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって、反応を停止し、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＧｅｌＳｔａｒＴＭ（Ｌｏｎｚａ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＥ）を用いてゲルを染色し、ＵＶ励起で可視化した。修飾されていない基質は、これらの条件下で１００％切断されたが、ＰＳ修飾された基質は実質的に切断されなかった。ホスホロチオアート修飾は、ジフルオロ基質の切断を効率的にブロックすることができる。
【０５２５】
次に、単一のｒＣ残基を含有する基質を調べ、ＲＮＡ塩基の何れかの側（表記されているとおり、５’又は３’側）へのＰＳ修飾の配置を検査した。両ジアステレオマーの混合物を本研究のために使用した。
【０５２６】
修飾されていないｒＣ基質：
配列番号１３
【０５２７】
【化１０２】
0005539325.tif 000144
【０５２８】
ＰＳ修飾された５’＊ｒＣ基質：
配列番号２１０
【０５２９】
【化１０３】
0005539325.tif 000145
【０５３０】
ＰＳ修飾された３’ｒＣ＊基質：
配列番号２１１
【０５３１】
【化１０４】
0005539325.tif 000146
【０５３２】
１２０μＬ容量中で基質１６０ｐｍｏｌｅ（１．３μＭ）及び組換えピロコッカスＲＮアーゼＨ２酵素の４ユニットを用いて、「Ｍｇ切断緩衝液」中において、７０℃で１時間、上記基質を温置した。ゲル搭載緩衝液（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって、反応を停止し、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＧｅｌＳｔａｒＴＭ（Ｌｏｎｚａ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，  ＭＥ）を用いてゲルを染色し、ＵＶ励起で可視化した。修飾されていない基質は、これらの条件下で１００％切断された。５’−＊ｒＣ及び３’−ｒＣ＊ＰＳ修飾された基質は何れも、これらの条件下で、約５０％切断された。これらの結果は、一方の立体異性体（Ｒｐ又はＳｐ）が他方の異性体より切断に対して耐性があることと最もよく合致する。
【０５３３】
３’−ｒＣ＊基質をさらに詳しく研究した。ＲＮアーゼＨ２はこの基質をリボヌクレオチドの５’側で切断するのに対して、他のＲＮアーゼ（ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼ１など）はリボヌクレオチドの３’側でこの切断を切断するので、ＲＮアーゼＨ２基質として利用可能なままにしながら、他のヌクレアーゼによる望ましくない分解から基質を保護する方法としてＰＳ修飾を使用することが可能であり得る。ＲＮアーＡ及び他の一本鎖リボヌクレアーゼによるＲＮＡ基質の切断は、Ｒｐ異性体よりＳｐホスホロチオアート異性体によって、より大きな程度で阻害されることが周知である。ＲＮアーゼＨ２切断に対するＳｐ対Ｒｐ異性体の相対的効果は知られていなかった。従って、２つの立体異性体が精製され、３’−ｒＣ＊基質の安定性に対するＳｐ及びＲｐ異性体の相対的な寄与を調べた。
【０５３４】
ＨＰＬＣ技術によって、ホスホロチオアート異性体を分離できること、及び単一のＰＳ結合のみがオリゴヌクレオチド中に存在すれば、この分離が容易に行われることは周知である。従って、３’−ｒＣ＊基質（配列番号２１１）の２つのＰＳ異性体を精製するために、ＨＰＬＣを使用した。オリゴヌクレオチドを含有する一本鎖３’−ｒＣ＊の７ｎｍｏｌｅの質量を使用した。性質決定は、キャピラリー電気泳動によって９５％のモル濃度純度で、ＥＳＩ−ＭＳによって、検査材料が９４６４ダルトン（計算値９４６５）の分子量を有することが示された。２．５ミクロンの粒子サイズを有する４．６ｍＭ×５０ｍｍＸｂｒｉｄｇｅＴＭＣ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）中に、この材料を注入した。最初の移動相（緩衝液Ａ）は５％アセトニトリルを加えた１００ｍＭＴＥＡＡｐＨ７．０であり、これを３５℃で純粋なアセトニトリル（緩衝液Ｂ）と混合した。使用したＨＰＬＣ法は、試料中の２つのピークを明確に分割し、純度を示すために、これを集め、再度走行させた。混合された異性体試料及び精製された試料のＨＰＬＣの軌跡が図２３に示されている。「Ａ」及び「Ｂ」の両ピークは、ＥＳＩ−ＭＳによって、９４６４ダルトンの同じ質量を有していた。元の試料から、ピーク「Ａ」の１．３ｎｍｏｌｅ及びピーク「Ｂ」の３．６ｎｍｏｌｅが回収された。
【０５３５】
質量又はＨＰＬＣデータに基づいて、何れのピークがＲｐであり、何れのピークがＳｐ異性体であるかを同定することは不可能であった。異性体の種類を精製画分に割り振るために、ＲＮアーゼＡによる分解に対する相対的な耐性を使用した。Ｓｐ異性体は、Ｒｐ異性体より相対的に大きなＲＮアーゼＡ分解に対する耐性を付与することが知られている。一本鎖形態で、精製された産物を調べた。６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌγ−３２Ｐ−ＡＴＰ及び酵素Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ、ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、基質を３２Ｐで放射性標識した。追跡標識を反応混合物に添加した（１：５０）。Ｍｇ切断緩衝液中にＲＮアーゼＡの１ｐｇ（７２ａｔｔｏｍｏｌｅ）を加えた２０μＬ容積中の１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。７０℃で２０分間、反応物を温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合として結果をプロットした。ピーク「Ａ」は、ピーク「Ｂ」よりＲＮアーゼＡによってより完全に分解された。従って、ピーク「Ａ」をＲｐ異性体として割り振り、ピーク「Ｂ」をＳｐ異性体として割り振った。
【０５３６】
ＲＮアーゼＨ２切断に対する各立体異性体の相対的感受性を調べた。６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌγ−３２Ｐ−ＡＴＰ及び酵素Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｏｐｔｉｋｉｎａｓｅ、ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて、基質のＲＮＡ含有鎖を３２Ｐで放射性標識した。追跡標識を反応混合物に添加した（１：５０）。Ｍｇ切断緩衝液中に組換えピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１００μＵとともに、２０μＬ容積中の１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。一本鎖形態と二重鎖形態の両方の基質を使用した。７０℃で２０分間、反応物を温置した。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を定量し、切断された総基質の割合として結果をプロットした。予想通り、一本鎖基質はＲＮアーゼＨ２酵素によって切断されなかった。使用された条件下で、修飾されていない対照ｒＣ二重鎖（配列番号１３）が１００％切断された。Ｓｐ異性体３’−ｒＣ＊二重鎖基質（ピーク「Ｂ」）は約３０％切断されたのに対して、Ｒｐ異性体（ピーク「Ａ」）は、これらの条件下で、１０％未満切断された。従って、ラセミ的に純粋なホスホロチオアート修飾された基質の切断に対するこの位置での（リボヌクレオチドの３’）相対的感受性は、ＲＮアーゼＨ２とＲＮアーゼＡに対して正確に反対である。Ｓｐ異性体は、ＲＮアーゼＨ２によってより容易に切断されるのに対して、Ｒｐ異性体は、ＲＮアーゼＡによってより容易に切断される。従って、ＲＮアーゼＨ２による切断に対する機能的な基質のまま、一本鎖ヌクレアーゼ（ＲＮアーゼＡなど）による望ましくない分解からこの結合を保護するために、リボヌクレオチドの３’側にラセミ的に純粋なＳｐ異性体ホスホロチオアート修飾を有する単一のリボヌクレオチド含有基質を使用することができた。酵素切断とホスホロチオアート立体異性体間の関係が、図２４に要約されている。
【実施例１６】
【０５３７】
ｑＰＣＲアッセイにおける二重標識されたｒＮ含有プローブの有用性
以下の実施例は、ｒＵを含有する二重標識されたプローブを用いるリアルタイムＰＣＲアッセイを例示する。前に、本発明者らは、実施例９において、ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ検出フォーマットを使用するｑＰＣＲにおいてｒＮブロックされたプライマーを使用できることを示した。本発明の方法を用いたブロックされたオリゴヌクレオチドの切断は、二重標識プローブアッセイフォーマットにも適用することができる。等温サイクリングプローブアッセイフォーマットにおける、４ＲＮＡ塩基切断ドメインを含有する二重標識プローブを切断するためのＲＮアーゼＨ１の使用が、Ｈａｒｖｅｙ他（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３３３：２４６−２５５，  ２００４）によって記載されている。ＲＮアーゼＨ２を使用する終点ＰＣＲフォーマットにおいて多型を検出するために、単一のリボヌクレオチド残基を含有する分子ビーコンが使用される、ＲＮアーゼＨを用いた別の二重標識プローブアッセイが記載されている（Ｈｏｕ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １７：４３３−４４３，  ２００７）。本実施例において、本発明者らは、プローブのＲＮアーゼＨ２切断に依拠するｑＰＣＲアッセイフォーマットにおける、二重標識プローブを含有する単一リボヌクレオチドの使用を示す。
【０５３８】
二重標識された蛍光消光プローブを用いるｑＰＣＲアッセイにおいて、表３９に示されている以下のオリゴヌクレオチドをプローブ及びプライマーとして使用した。標的は、合成オリゴヌクレオチドテンプレートであった。
【０５３９】
【表３９】
0005539325.tif 000147
【０５４０】
合成テンプレート（プライマー及びプローブ結合部位には、下線が付されている。）。
【０５４１】
配列番号９３
【０５４２】
【化１０５】
0005539325.tif 000148
【０５４３】
修飾されていないプライマー配列番号８６及び８７並びにプローブ配列番号２１２及び２１３を用いて、定量的なリアルタイムＰＣＲ反応を行った。Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、反応を行った。反応物は、１０μＬの容積中に、各プライマー（ｆｏｒ＋ｒｅｖ）の２００ｎＭ及び２００ｎＭプローブ、合成テンプレートの２×１０６コピー並びにピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の５ｍＵを含んだ。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で１０分の最初の温置を含み、次いで、［９５℃１０秒間＋６０℃３０秒間＋７２℃１秒間］の４５サイクルを実施した。使用した緩衝液は、使用したポリメラーゼとともに変動した。
【０５４４】
５’−エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定的なＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲが行われる場合、ポリメラーゼはプローブを分解する。これらの条件下で、ＤＮＡプローブはｒＮ修飾されたプローブと同じように機能するはずである。この反応は、陽性対照を構成する。５’−エキソヌクラーゼ活性を欠如するＤＮＡポリメラーゼが使用されれば、何れのプローブも分解されないはずである。この反応は、陰性対照を構成する。しかしながら、ＲＮアーゼＨ２とともにエキソ陰性ポリメラーゼを用いるＰＣＲ反応は、ｒＮ含有プローブを分解するが、ＤＮＡプローブを分解しないはずであり、本発明の機能を示す。本研究のために、以下の２つの熱安定的なポリメラーゼを使用した。Ｉｍｍｏｌａｓｅ（完全な状態の５’ヌクレアーゼ活性、Ｂｉｏｌｉｎｅ）及びＶｅｎｔＥｘｏ−（５’−エキソヌクレアーゼ陰性変異体、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。使用した緩衝液は、ＤＮＡポリメラーゼに対して製造業者が推奨する緩衝液であり、ＲＮアーゼＨ２活性に対して最適化されなかった。Ｉｍｍｏｌａｓｅに関しては、緩衝液は、１６ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、６７ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．３及び３ｍＭＭｇＣｌ２を含んだ。ＶｅｎｔＥｘｏ−に関しては、緩衝液は、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．８、１０ｍＭＫＣｌ及び３ｍＭＭｇＳＯ４を含んだ。
【０５４５】
記載されているとおり、ｑＰＣＲ反応を実行し、結果は下表４０に示されている。
【０５４６】
【表４０】
0005539325.tif 000149
【０５４７】
エキソヌクレアーゼ陽性ポリメラーゼを用いると、両プローブは類似の機能的性能を示し、類似のＣｐ値を与えた（何れも、ＲＮアーゼＨ２あり又はなし）。しかしながら、エキソヌクレアーゼ欠損変異体ポリメラーゼを用いると、ＤＮＡプローブは検出可能な蛍光シグナルを一切生成しなかった。ｒＵプローブは、ＲＮアーゼＨ２の不存在下で、蛍光シグナルを生成できなかったが、ＲＮアーゼＨ２の存在下では、切断され、予想されたＣｐ値でシグナルをもたらした。ジフルオロ含有プローブを用いて、類似の結果を得ることができる。ＲＮアーゼＨ２切断ドメインが変異部位上に配置されれば、バリアント対立遺伝子を区別するために、このようなプローブを使用することができる。
【０５４８】
増幅を基礎とするアッセイ系の特異性をさらに増加させるために、ＲＮアーゼＨ切断可能なプローブは、本発明のブロックされたプライマーの使用と組み合わせることもできる。
【実施例１７】
【０５４９】
プライマー・二量体形成を抑制するためのｒＮ含有ブロックされたプライマーの有用性
プライマー・二量体又は他の小さな標的非依存性アンプリコンの形成は、終点及びリアルタイムＰＣＲの両方において重要な問題であり得る。これらの産物は、プライマーが適切に設計されていると思われる場合でさえ生じ得る。さらに、特異的な領域にハイブリッド形成するプライマーを選択するための配列の制約のために、最適でないデザインを有するプライマーを使用することが時には必要である。例えば、株間で可変的な領域中でプライマーが選択される場合には、ある種のウイルスためのＰＣＲアッセイはサブタイプ又は血清型特異的であり得る。逆に、ウイルスゲノムの高度に保存された領域中にプライマーが配置される場合には、全てのウイルス株を広く増幅するように、ＰＣＲ反応を設計することができる。従って、プライマーを選択するために利用可能な配列空間は極めて限定され得、プライマー二量体を形成する可能性を有する「不良な」プライマーを使用しなければならない場合があり得る。「ホットスタート」ＰＣＲ法の使用は、これらの問題の幾つかを除去し得るが、全てを除去するわけではない。
【０５５０】
以下の実施例は、幅広いウイルスの血清型の検出を可能にする保存されたドメイン中の部位を使用するＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）用のＰＣＲを基礎とする核酸検出アッセイの開発の間に、プライマー・二量体が重大な問題であることが見出された、米国特許第０６００１６１１に引用されている１つのこのような事例から得られる。本発明者らは、本実施例において、切断可能なブロックされたプライマーの使用が、特に、「ホットスタート」ＤＮＡポリメラーゼの不存在下で、望ましくないプライマー・二量体の形成を抑制し得ることを示す。
【０５５１】
表４１に示されているように、ＰＣＲアッセイにおけるプライマーとして、以下のオリゴヌクレオチドを使用した。標的は、プラスミドから単離されたクローニングされた合成アンプリコンであった。
【０５５２】
【表４１】
0005539325.tif 000150
【０５５３】
クローニングされた合成標的（プライマー結合部位には、下線が付されている）。
【０５５４】
配列番号２１８
【０５５５】
【化１０６】
0005539325.tif 000151
【０５５６】
Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットウォームを使用する３８４ウェルフォーマットで、ＰＣＲ反応を行った。反応は、１０μＬの容量に、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．３ｍＵあり又はなしに、ＤｙＮＡｍｏＤＮＡポリメラーゼを有する１×Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）  ＤｙＮＡｍｏ反応混合物、各プライマーの２００ｎＭ（Ｆｏｒ＋Ｆｅｖ）を含んだ。テンプレートＤＮＡは、直鎖化されたＨＣＶプラスミドアンプリコンの２０００コピー又は標的なし対照であった。熱的サイクルのパラメータには、９５℃で２分の最初の浸漬を含み、次いで、［９５℃１５秒間＋６０℃３０秒間］の５０サイクルを実施した。８％ポリアクリルアミド非変性ゲル上で試料を分離し、ＧｅｌＳｔａｒ染色を用いて可視化した。結果が図２５に示されている。ブロックされていない標準的なプライマーは５５塩基対から９０塩基対の範囲のサイズを有する複数の産物を産生し、所望される完全長の産物は見られなかった。ＲＮアーゼＨ２の不存在下で、ブロックされたプライマーの使用は増幅された産物を一切もたらさなかった。ＲＮアーゼＨ２を用いると、ブロックされたプライマーは予想されたサイズの単一の強力なアンプリコンを産生し、所望されない小さな片は見られなかった。
【０５５７】
ＤｙＮＡｍｏは非ホットスタートＤＮＡポリメラーゼである。低温で低下した活性を有するホットスタートＲＮＡアーゼＨ２とともに本発明のＲＮアーゼＨ２ブロックされたプライマーの使用は、反応から所望されないプライマー・二量体を除去し、所望のアンプリコンの形成をもたらしたのに対して、標準的なブロックされないプライマーは所望のアンプリコンの形成をもたらすことができず、小さな所望されない種のみを産生した。
【実施例１８】
【０５５８】
ＲＮアーゼＨ２アッセイ緩衝液中での変性剤の使用
変性剤の存在は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２酵素による切断にとって有益であることが見出された。反応条件を最適化するために、異なる濃度で異なる変性剤を検査した。
【０５５９】
７０℃で２０分間、緩衝液５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２及び１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０中で、８０μＬの反応容積で、上記一本鎖及び二本鎖オリゴヌクレオチド基質とともに、組換えＲＮアーゼＨ２酵素の各々の分取試料を温置した。ゲル搭載緩衝液（ホルムアミド／ＥＤＴＡ）の添加によって、反応を停止し、変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。基質配列番号１３のＲＮＡ鎖を３２Ｐで放射線標識した。変動する濃度で異なる変性剤とともに、Ｍｇ切断緩衝液中の酵素１００μユニット（μＵ）とともに１００ｎＭ基質を用いて、反応を行った。検査した変性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＣＴＡＢ及びＮ−ラウロイルサルコシルを含んだ。ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２を用いた結果が、図２６に示されている。ＣＴＡＢ変性剤濃度をさらに緻密に滴定するために、さらなる実験を行った。最高の酵素活性を得るための変性剤の最適なレベルは、（ｖｏｌ：ｖｏｌ）：Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００  ０．０１％、Ｔｗｅｅｎ−２０  ０．０１％、ＣＴＡＢ０．００１３％であった。変性剤Ｔｗｅｅｎ−８０及びＮ−ラウロイルサルコシルは、検査した他の変性剤と同じように良好に機能を発揮しなかった。従って、本発明の好熱性ＲＮアーゼＨ２酵素を安定化させるために、非イオン性（Ｔｒｉｔｏｎ、Ｔｗｅｅｎ）及びイオン性（ＣＴＡＢ）変性剤の両方を使用することができる。
【実施例１９】
【０５６０】
蛍光消光された（Ｆ／Ｑ）切断可能プライマーのｑＰＣＲにおける使用
上記実施例９において、切断可能なブロックされたプライマーがＰＣＲにおいて機能し、さらに、ＳＹＢＲグリーン検出を用いるリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）において使用できることを示した。本実施例において、本発明者らは、ＰＣＲ反応の間に、プライマー自体が検出可能なシグナルを生成する蛍光−消光切断プライマーの使用を示す。
【０５６１】
図１８は、ブロックされた切断可能プライマーを使用するＰＣＲを実施するためのスキームを示す。図２７は、蛍光−消光された切断可能プライマーを使用するＰＣＲを実施するためのスキームを示す。この事例では、対中の１つのプライマーが蛍光色素で検出可能に標識される。蛍光消光物質はプライマーの３’末端に又は３’末端付近に位置し、プローブが完全な状態のときに、反応開始及びＤＮＡ合成を効果的に抑制する。単一のリボヌクレオチド塩基が色素と消光物質の間に位置している。ＲＮアーゼＨ２によるリボヌクレオチドでの切断はレポーターと消光物質を分離し、消光を除去し、検出可能なシグナルをもたらす。同時に、切断がプライマープライマーを活性化し、ＰＣＲが進行する。
【０５６２】
合成テンプレートを用いてこの反応を示すために、表４２に示されている以下の合成オリゴヌクレオチドを使用した。対照として、修飾されていないプライマー及び標準的な蛍光−消光プライマーを用いて５’−ヌクレアーゼＴａｑｍａｎ（Ｒ）アッセイを行った。ＲＮＡ塩基の３’に４、５又は６つのＤＮＡ塩基を有する合成蛍光−消光切断可能プライマーの３つのバリアントを比較した。Ｃ３スペーター又はｄｄＣ末端基を有するオリゴヌクレオチド基質を用いると、ＲＮＡ塩基の３’の４つのＤＮＡ塩基が最適であることが以前に確立された。３’末端に又は３’末端付近に嵩が大きな疎水性消光物質基が存在することが、このドメイン中に必要とされるＤＮＡ残基の最適な数を変化させ得ることが可能であった。
【０５６３】
【表４２】
0005539325.tif 000152
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＦＡＭは、６−カルボキシフルオレセインである。ＩＢＦＱは、暗消光物質であるＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱである。
【０５６４】
合成テンプレート
配列番号９３
【０５６５】
【化１０７】
0005539325.tif 000153
【０５６６】
ＰＣＲ反応は、１０μＬ容量で、２００ｎＭプライマー、各ｄＮＴＰの２００μＭ（合計８００μＭ）、ｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の１ユニット、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ及び３ｍＭＭｇＣｌ２を用いて行った。反応は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の変動する量あり又はなしで、合成テンプレート／標的オリゴヌクレオチド（配列番号９３）の２×１０６コピーを用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で行った。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の４５サイクルが続いた。内部に配置されたＤＬＰ（配列番号２１９）とともに、Ｆｏｒ及びＲｅｖプライマー（配列番号８６及び８７）を使用した。あるいは、ＦＱプライマー（個別に）（配列番号２２０から２２２）とともに、Ｆｏｒプライマー（配列番号８６）を使用した。
【０５６７】
Ｆ／Ｑ切断可能プライマーの使用は、５’−ヌクレアーゼアッセイフォーマットで、伝統的な二重標識プローブ（ＤＬＰ）（配列番号２１９）を用いて得られたものと同様の検出可能な蛍光シグナルを、ＰＣＲの間にリアルタイムでもたらした。ＲＮＡ残基の３’に４つのＤＮＡ残基を有するプライマー配列番号２２０は、修飾されていないプライマーと比べて遅延した増幅を示した。ＲＮＡ残基の３’に５つ及び６つのＤＮＡ残基を有するプライマー配列番号２２１及び２２２はより効率的であり、同様に良好に機能した。従って、３’−ブロッキング基がより小さいときに最適な３から４つのＤＮＡ塩基デザインではなく、このアッセイフォーマットでは、ＲＮＡ塩基に対して３’に５つのＤＮＡ塩基を有するオリゴヌクレオチドデザインを使用することが好ましい。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎアッセイフォーマットを使用する前実施例では、ＲＮアーゼＨ２の１．３ｍＵは修飾されていないプライマーと同一の反応開始効率をもたらした。本Ｆ／Ｑアッセイフォーマットでは、ＲＮアーゼＨ２の１．３ｍＵの使用は遅延した増幅をもたらしたのに対して、修飾されていないプライマーと比べて、ＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵの使用は同じ結果をもたらした。従って、Ｆ／Ｑアッセイフォーマットに対してＲＮアーゼＨ２の量を増加させることが好ましい。シグナルの増幅及び検出の両方が、ＲＮアーゼＨ２依存性であった。
【０５６８】
５’−ヌクレアーゼアッセイＤＬＰ（配列番号２１９）及びＦ／Ｑ切断可能５Ｄプライマー（配列番号２２１）を用いて実施されたｑＰＣＲ反応に対する増幅プロットの例が、図２８に示されている。蛍光が最初に検出されるＣｐ値が同じ（２０．０）である両方法間で、増幅効率が類似していることが明瞭である。興味深いことに、デルタＲｆ（検出された蛍光シグナルの規模）は、ＤＬＰを用いると、ＦＱプライマーより僅かに高いレベルでピークに達した。最大蛍光シグナル放出の差に関する１つの可能な説明は、ＦＱプライマー上の蛍光色素が反応の終了時に部分的に消光されたままであるということである。５’−ヌクレアーゼアッセイでは、プローブが分解され、一本鎖の短い核酸断片に付着された反応混合物中にレポーター色素が放出される。ＦＱプライマーアッセイフォーマットにおいて、蛍光レポーター色素はＰＣＲアンプリコンに付着されたままであり、二本鎖フォーマットである。ＤＮＡはフルオレセインの発光を消光することができるので、この構成は最終シグナルを低下させ得る。
【０５６９】
従って、本発明者らは、プライマー上の色素／消光物質の構成を変化させることが、同じプライマーのＦ／Ｑ対Ｑ／Ｆ様式を比較して、蛍光シグナルを変化させるかどうかを検査した。上で使用された合成アンプリコンアッセイにおいて、好ましい５−ＤＮＡプローブは３’末端に存在する「Ｇ」残基を有する。Ｇ残基はＦＡＭを消光する傾向があるのに対して、他の塩基はＦＡＭ蛍光に対して殆ど効果を有さない。従って、この塩基を塩化させるために、アンプリコンを修飾した。表４３の配列を合成し、蛍光リアルタイムＰＣＲアッセイフォーマットで検査した。
【０５７０】
【表４３】
0005539325.tif 000154
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＦＡＭは、６−カルボキシフルオレセインである。ＩＢＦＱは、暗消光物質であるＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱである。
【０５７１】
合成テンプレート
配列番号２２５
【０５７２】
【化１０８】
0005539325.tif 000155
【０５７３】
ＰＣＲ反応は、１０μＬ容量で、２００ｎＭプライマー、各ｄＮＴＰの２００μＭ（合計８００μＭ）、ｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の１ユニット、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ及び３ｍＭＭｇＣｌ２を用いて行った。反応は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵとともに、合成テンプレート／標的オリゴヌクレオチド（配列番号２２５）の２×１０６コピーを用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で行った。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の４５サイクルが続いた。ＦＱプライマー（配列番号２２３）又はＱＦプライマー（配列番号２２４）の何れかとともに、Ｆｏｒプライマー（配列番号８６）を使用した。
【０５７４】
Ｆ／Ｑ及びＱ／Ｆ切断可能プライマーの使用は同じＣｐをもたらし、両プライマーは、反応において、同じ効率で機能することを示す。予想通り、Ｑ／ＦプライマーはＦ／Ｑプライマーと比べて増加したデルタＲｆを示した。プライマーの両様式は、アッセイにおいて同じく良好に機能する。
【実施例２０】
【０５７５】
蛍光消光された（Ｆ／Ｑ）切断可能プライマーの多重ｑＰＣＲにおける使用
実験を合理化し、情報処理量を増加させるために、今日、多重アッセイが一般に使用される。目的の実験用遺伝子に対して特異的なｑＰＣＲアッセイを標準化用の内部参照対照遺伝子に対して特異的な第二のｑＰＣＲアッセイと組み合わせることが特に一般的である。ｑＰＣＲのためのＳＹＢＲＧｒｅｅｎ検出の１つの弱点は、多重反応が不可能なことである。色素標識された蛍光−消光プローブ又はプライマーの使用は、このような多重反応の実行を可能にする。同じ反応管中への２、３又は４つの異なる蛍光色素の組み合わせを可能にするリアルタイムＰＣＲサイクリング及び検出装置が今日では利用可能である。本実施例は、蛍光消光された（Ｆ／Ｑ）切断可能プライマーの多重ｑＰＣＲにおける有用性を示す。
【０５７６】
５’−ヌクレアーゼアッセイとともに二重標識プローブ又はＦ／Ｑ切断可能プライマーの何れかを使用して多重ｑＰＣＲを実施するために、表４４に示されている以下のオリゴヌクレオチド試薬を合成した。１つのアッセイはヒトＭＹＣ遺伝子（ＮＭ ００２４７６）に対して特異的であり、第二のアッセイは、一般的に使用される内部標準化対照遺伝子であるスプライシング因子であるヒトＳＦＲＳ９遺伝子（ＮＭ ００３７６９）に対して特異的であった。
【０５７７】
【表４４】
0005539325.tif 000156
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＦＡＭは、６−カルボキシフルオレセインである。ＩＢＦＱは、暗消光物質であるＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱである。ＭＡＸは、赤いレポーター色素である。ＳｐＣ３は、Ｃ３スペーサーである。
【０５７８】
ＰＣＲ反応は、１０μＬ容量で、２００ｎＭプライマー（及び適宜プローブ）、各ｄＮＴＰの２００μＭ（合計８００μＭ）、ｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の１ユニット、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ及び３ｍＭＭｇＣｌ２を用いて行った。全ＨｅＬａ細胞ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡの２ｎｇをとともに、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１０ｍＵを用いて反応を実施した。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の４５サイクルが続いた。
【０５７９】
５’−ヌクレアーゼアッセイのための多重反応は、ＭＹＣＦｏｒ及びＲｅｖプライマー＋ＭＹＣプローブ（配列番号２２６から２２８）及びＳＦＲＳ９Ｆｏｒ及びＲｅｖプライマー＋ＳＦＲＳ９プライマー（配列番号２３１から２３３）を含んだ。ＦＱ切断可能プライマーアッセイのための多重反応は、ＭＹＣ−Ｆｏｒ−ＦＱ及びＭＹＣ−Ｒｅｖ−Ｂブロックされたプライマー（配列番号２２９及び２３０）並びにＳＦＲＳ９−Ｆｏｒ−ＦＱ及びＳＦＲＳ９−Ｒｅｖ−Ｂブロックされたプライマー（配列番号２３４及び２３５）を含んだ。全てのアッセイは、比較のために、一重フォーマットでも実施した。ＦＡＭプライマー及びプローブはフルオレセイン色素チャンネル中で検出されたのに対して、ＭＡＸプライマー及びプローブはＨＥＸ色素チャンネル中で検出された。多重化されたＤＬＰ５’−ヌクレアーゼアッセイ及び多重化されたＦＱ−切断可能プライマーアッセイは何れも良好に機能し、極めて類似のデータ（下表４５に要約されている。）をもたらした。
【０５８０】
【表４５】
0005539325.tif 000157
【０５８１】
ＲＮアーゼＨ濃度を滴定し、多重フォーマットでの反応効率を維持するために、酵素のより高いレベルが必要とされた。例えば、一重ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ検出フォーマットでのブロックされたプライマーは、酵素１．３ｍＵを必要とした。一重フォーマットでのブロックされたＦＱプライマーは、酵素２．６ｍＵを必要とした。多重フォーマットでのブロックされたＦＱプライマーは、酵素１０ｍＵを必要とした。従って、異なるアッセイフォーマットにおいて、切断可能プライマーが使用される場合には、使用されるＲＮアーゼＨ２酵素の量を滴定することが重要である。
【０５８２】
多重プローブの使用が一般的に行われる別の用法は、対立遺伝子識別ＳＮＰである。直腸結腸癌の発症に関連していることが知られている部位ｒｓ４９３９８２７において、ＳＭＡＤ７遺伝子に対してＳＮＰ対を区別するために、以下のアッセイを設計した。この遺伝子中の「Ｃ」及び「Ｔ」対立遺伝子を識別するためのさらなる最適化なしに、上記実施例において教示されている標準的なデザインの特徴を用いて、この部位において、ＦＱブロックされたプライマーを設計し、合成した。配列が下表４６に示されている。
【０５８３】
【表４６】
0005539325.tif 000158
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＦＡＭは、６−カルボキシフルオレセインである。ＩＢＦＱは、暗消光物質であるＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱである。ＭＡＸは、赤いレポーター色素である。
【０５８４】
上記プライマーは、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ ００５９０４）の以下の８５塩基対領域を標的とする。プライマー結合部位には下線が付されており、ＳＮＰ位置は太字の斜字体として強調表示されている。
【０５８５】
ｒｓ４９３９８２７  （ＳＭＡＤ７）Ｃ対立遺伝子（配列番号２３９）
【０５８６】
【化１０９】
0005539325.tif 000159
【０５８７】
ｒｓ４９３９８２７  （ＳＭＡＤ７）Ｔ対立遺伝子（配列番号２４０）
【０５８８】
【化１１０】
0005539325.tif 000160
【０５８９】
ＰＣＲ反応は、１０μＬ容量で、２００ｎＭＦＱ−Ｆｏｒ及び修飾されていないＲｅｖプライマー、各ｄＮＴＰの２００μＭ（合計８００μＭ）、ｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の１ユニット、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ及び３ｍＭＭｇＣｌ２を用いて行った。標的ＤＮＡの２ｎｇとともに、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵを用いて反応を実施した。標的ＤＮＡは、２つのＳＭＡＤ７対立遺伝子に関してホモ接合である細胞から作製されたゲノムＤＮＡであった（Ｃｏｒｅｉｌｌ１８５６２及び１８５３７）。「Ｃ」及び「Ｔ」対立遺伝子（配列番号２３９及び２４０）を個別に（ホモ接合体）及び一緒に（ヘテロ接合体）検査した。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の４５サイクルが続いた。データの獲得は、ＦＡＭ及びＨＥＸチャンネルを検出する多重モードに設定した。
【０５９０】
結果が図３０に示されている。ＦＡＭ標識された「Ｃ」プローブは「Ｃ」標的ＤＮＡの存在を検出したが、「Ｔ」標的ＤＮＡの存在は検出せず、ＨＥＸ「Ｔ」プローブは「Ｔ」標的ＤＮＡの存在を検出したが、「Ｃ」標的ＤＮＡの存在は検出しなかったことが明白である。従って、ＳＮＰ識別のために、多重フォーマットでＦＱ切断可能プライマーを使用することができる。
【実施例２１】
【０５９１】
プライマー−プローブアッセイにおける蛍光消光された切断可能プライマーの使用
本発明者らは、異なるが、連結された２つの要素（５’末端方向に位置されたレポータードメイン及び核酸分子の３’末端に位置されたプライマードメイン）を含む蛍光消光されたプライマーを用いて、核酸試料を検出する方法を以前に記載した（米国特許出願公開ＵＳ２００９／００６８６４３）。プライマードメインは、ＰＣＲにおいて使用される条件下で、標的核酸に対して相補的であり、標的核酸に結合する。プライマードメインは、ＰＣＲなどにおいて、テンプレートとして相補的な標的を使用して、ＤＮＡ合成を開始することができる。レポータードメインは、標的に対して相補的であり得る配列を含み、標的核酸と無関係であり得、標的にハイブリッド形成しない。さらに、レポータードメインは、蛍光レポーター色素及び消光物質などの検出可能要素を含む。レポータードメインが一本鎖のランダムコイル立体構造であるときに、レポーター色素からの蛍光シグナルが消光物質によって効果的に抑制されるように、レポーター色素及び消光物質は、適切なヌクレオチドの数によって隔てられる。ＰＣＲの間、プライマードメインはＤＮＡ合成を開始し、これにより、ＦＱＴ合成オリゴヌクレオチドは産物核酸中に取り込まれ、ＰＣＲの次のサイクルにおいて、それ自体がテンプレートとして使用され得る。ＰＣＲの次のサイクルの間のプライマー伸長の際に、レポータードメインを含むＦＱＴプローブ全体が二本鎖形態へ転化される。堅固な二本鎖の二重鎖の形成が、蛍光色素と消光物質間の距離を物理的に増加させ、蛍光発光の抑制を減少させる（従って、蛍光強度を増加させる）。従って、ＰＣＲの間の、ＦＱＴプライマーの二本鎖形態への転化は、検出可能な現象である。レポーター色素及び消光物質が物理的に隔てられた状態になり、同じ核酸分子上でもはや共有結合されないように、レポーター色素と消光物質の間の部位でのレポータードメインの切断によって、蛍光シグナルのさらなる増加が達成され得る。ＦＱＴプライマーがその元の一本鎖状態にあれば、切断が起こりえないように、この切断現象は、二本鎖核酸配列の形成に依存する。レポーターと消光物質を分離するための適切な方法には、例えば、ｄｓＤＮＡ中の特異的な配列において切断するための制限エンドヌクレアーゼを使用することが含まれる。あるいは、ＲＮアーゼＨ２切断ドメインは、蛍光色素と消光物質の間に配置することができる。蛍光色素と消光物質の間に単一のリボヌクレオチド残基を配置することによって、ＦＱＴプライマーが、ＰＣＲの間のＲＮアーゼＨ２に対する適切な基質となる。この反応に対する模式図が図３１に示されている。本実施例は、プライマー−プローブリアルタイムＰＣＲアッセイにおける、蛍光消光されたプライマーの切断を媒介するための熱安定的なＲＮアーゼＨ２の使用を示す。
【０５９２】
５’−ヌクレアーゼアッセイでの使用に適した内部に配置された二重標識プローブを有する修飾されていないＦｏｒ及びＲｅｖプライマーを含む、ヒトＤｒｏｓｈａ遺伝子に対してｑＰＣＲアッセイを設計した。Ｆｏｒプライマーは、修飾されていないＦｏｒプライマーと同じプライマードメインを使用し、中心に配置されたｒＵ塩基（切断部位）を含む１１の塩基によって隔てられたレポーター色素（フルオレセイン−ｄＴ）及び暗消光物質（ＩＢＦＱ）を含むレポータードメインを５’末端上にレポータードメインを追加して、ＦＱＴフォワードプライマーとしても合成された。配列が下表４７に示されている。
【０５９３】
【表４７】
0005539325.tif 000161
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。Ｆｌ−ｄＴｉｎは、内部フルオレセイン−ｄＴ修飾された塩基である。ＩＢＦＱは、暗消光物質であるＩｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱである。Ｄｒｏｓｈａ標的に対して相補的であるＦＱＴプローブの部分には、下線が付されている（すなわち、プライマードメイン）。
【０５９４】
上記プライマーは、ヒトＤｒｏｓｈａ遺伝子（ＲＮＡＳＥＮ，ＮＭ ０１３２３５）の以下の１４１塩基対領域を標的とする。プライマー結合部位には下線が付されており、５’−ヌクレアーゼアッセイに対する内部のプローブ結合部位は太字のフォントで記載されている。
【０５９５】
Ｄｒｏｓｈａアンプリコン（配列番号２４５）
【０５９６】
【化１１１】
0005539325.tif 000162
【０５９７】
５’−ヌクレアーゼｑＰＣＲ反応は、１０μＬ容量で、２００ｎＭプローブを有する２００ｎＭの修飾されていないＦｏｒ及びＲｅｖプライマー、各ｄＮＴＰの２００μＭ（合計８００μＭ）、ｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の１ユニット、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ及び３ｍＭＭｇＣｌ２を用いて行った。ＦＱＴｑＰＣＲ反応は、１０μＬ容量で、２００ｎＭＦＱＴＦｏｒプライマー及び２００ｎＭの修飾されていないＲｅｖプライマー、各ｄＮＴＰの２００μＭ（合計８００μＭ）、ｉＴａｑ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の１ユニット（ホットスタート熱安定的ＤＮＡポリメラーゼ、ＢＩＯ−ＲＡＤ）、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ及び３ｍＭＭｇＣｌ２を用いて行った。反応は、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵあり又はなしで行った。反応は、ＨｅＬａ全細胞ＲＮＡから作製されたｃＤＮＡ１０ｎｇあり又はなしで行った。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の４５サイクルが続いた。
【０５９８】
５’−ヌクレアーゼｑＰＣＲ反応に対する結果が、図３２Ａに示されている。陽性シグナルがサイクル２６で見られた。ＦＱＴプライマーｑＰＣＲ反応に対する結果が、図３２Ｂに示されている。陽性シグナルはサイクル２７で見られ、５’−ヌクレアーゼアッセイの結果とほぼ同じであった。この事例では、シグナルはＲＮアーゼＨ２切断に依存した。従って、異なる蛍光消光レポータードメインを有するＦＱＴプライマーからシグナルを生成させるために、ＲＮアーゼＨ２による内部ＲＮＡ残基での切断を使用することができる。
【実施例２２】
【０５９９】
ミスマッチの識別を改善するための、切断可能なブロックされたプライマーにおける修飾された塩基の使用
本発明者らは、実施例１３におけるＳＹＢＲＧｒｅｅｎアッセイフォーマット及び実施例２０における蛍光−消光（ＦＱ）アッセイフォーマット中で単一の塩基ミスマッチを区別するために、ブロックされた切断可能プライマーをｑＰＣＲで使用できることを示した。正確な塩基のミスマッチ及び配列の文脈に応じて、ミスマッチ標的に対する検出可能なシグナルが、完全にマッチする標的の検出から５ないし１５サイクル後に起こった。主に野性型細胞のバックグラウンド中での希な変異体対立遺伝子の検出など、ミスマッチ識別のより大きなレベルが所望される状況が存在し得る。本発明者らは、本実施例において、切断可能プライマー内の２’ＯＭｅＲＮＡ修飾された残基の選択的な配置がミスマッチ識別を向上させ得ることを示す。
【０６００】
上記実施例５は、使用される修飾の種類及び切断部位に対する配置に応じて、修飾された塩基がＲＮアーゼＨ２によるヘテロ二重鎖基質の切断と適合的であり得ることを示した。ここで、本発明者らは、単一の修飾されていないリボヌクレオチド塩基を有するブロックされたプライマー中での２’ＯＭｅ修飾の使用をさらに詳しく示す。表４８で以下に示されている以下のプライマーを合成し、合成オリゴヌクレオチドテンプレートとともに、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎフォーマットでのｑＰＣＲ反応において使用した。さらなる修飾なしに（配列番号１３４）又はｒＵの５’側の２’ＯＭｅ塩基（配列番号２４７）とともに又はｒＵの３’側の２’ＯＭｅ塩基（配列番号２４８）ともに、単一のｒＵ残基を有するブロックされた切断可能プライマーを合成した。２’ＯＭｅ残基がリボヌクレオチドの５’に位置していれば、ＲＮアーゼＨ２による切断から生じる最終プライマー中に残存する。従って、この反応産物（配列番号２４６）を模倣するために、３’末端に３’−２’ＯＭｅＵ残基を有する合成テンプレートに対して特異的なＳｙｎ−Ｒｅｖ−ｍＵプライマーを作製した。
【０６０１】
【表４８】
0005539325.tif 000163
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。２’ＯＭｅＲＮＡ塩基は、（ｍＮ）と記されている。
【０６０２】
以下の合成オリゴヌクレオチドをテンプレートとして使用した。プライマー結合部位には、下線が付されている。
【０６０３】
合成テンプレート、配列番号１６２
【０６０４】
【化１１２】
0005539325.tif 000164
【０６０５】
Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックス中に、上に示されている異なるＲｅｖプライマーの各々の２００ｎＭと対を成す２００ｎＭの修飾されていないＦｏｒプライマーを使用して、１０μＬ容量で、ＰＣＲ反応を行った。反応は、標的なしで又は合成オリゴヌクレオチドテンプレートの２×１０６コピーありで、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上において、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．３から２００ｍＵあり又はなしで行った。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃２０秒間及び７２℃３０秒間］の４５サイクルが続いた。結果が表４９に要約されている。
【０６０６】
【表４９】
0005539325.tif 000165
【０６０７】
３’末端の２’ＯＭｅ塩基を有するブロックされていないプライマー（配列番号２４６）は、修飾されていないプライマー（配列番号８７）と比べて２サイクルの遅延を示し、末端の２’ＯＭｅ塩基が反応開始効率を僅かに減少させるが、それにもかかわらず、ＰＣＲプライマーとして機能的であることを示唆した。単一のｒＵ塩基を含有するブロックされたプライマー（配列番号１３４）は、予想通り（実施例１３参照）、ＲＮアーゼＨ２の低濃度とともに、良好に機能し、動作した（データは示さず）。２’ＯＭｅＲＮＡ含有プライマーに関しては、ＲＮアーゼＨ２のより高い濃度が必要とされた。リボヌクレオチドの５’に２’ＯＭｅ残基を有するプライマー（配列番号２４７）は、５０ｍＵＲＮアーゼＨ２で良好な活性を示し、１００ｍＵ又はそれ以上のＲＮアーゼＨ２を使用したときに、ブロックされていない２’ＯＭｅ対照プライマー（配列番号２４６）と同じように機能した。リボヌクレオチドの３’に２’ＯＭｅ残基を有するプライマー（配列番号２４８）は、検査したＲＮアーゼＨ２の全てのレベルで機能しなかった。次に、ミスマッチ識別ｑＰＣＲアッセイにおいて、リボヌクレオチドの５’に２’ＯＭｅ残基を有するプライマー（配列番号２４７）を検査した。
【０６０８】
標準的な構成のブロックされたＲＮアーゼＨ２切断可能プライマー（配列番号１３４）を、この配列の５’−２’ＯＭｅ様式（配列番号２４７）と比較した。これらの２つの「Ｒｅｖ」プライマーは、（実施例１３において、ミスマッチ識別能を確定する際に場合によって使用された）３つの異なる合成オリゴヌクレオチドテンプレートと一緒に、修飾されていない「Ｆｏｒ」プライマー（配列番号８６）とともに使用した。これらのテンプレートは、完全なマッチの対照（テンプレート配列番号１６２）、Ｔ／Ｕミスマッチ（テンプレート配列番号１５５）又はＧ／Ｕミスマッチ（テンプレート配列番号１７６）を与える。３つのテンプレートオリゴヌクレオチドが、マッチ対ミスマッチの領域を図解するために以下に並置されている切断可能なブロックされたプライマー（配列番号１３４）とともに、以下に示されている。
【０６０９】
合成テンプレート、配列番号１６２（Ａ：Ｕマッチ）
【０６１０】
【化１１３】
0005539325.tif 000166
【０６１１】
合成テンプレート、配列番号１５５（Ｔ：Ｕマッチ）
【０６１２】
【化１１４】
0005539325.tif 000167
【０６１３】
合成テンプレート、配列番号１７６（Ｇ：Ｕマッチ）
【０６１４】
【化１１５】
0005539325.tif 000168
【０６１５】
ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックス中で、切断可能なブロックされたＲｅｖプライマー（配列番号１３４）又は５’ｍＵを含有する切断可能なブロックされたＲｅｖプライマー（配列番号２４７）の２００ｎＭとともに、２００ｎＭの修飾されていないＦｏｒプライマーを用いて、１０μＬの容量で行った。反応は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．３ｍＵ（プライマー配列番号１３４）又は１００ｍＵ（プライマー配列番号２４７）を用いて行った。反応は、異なる合成オリゴヌクレオチドテンプレート（配列番号１５５、１６２又は１７６）の２×１０６コピーを用いて、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で行った。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃２０秒間及び７２℃３０秒間］の４５サイクルが続いた。結果は表５０に要約されており、デルタＣｐ（デルタＣｐ＝Ｃｐミスマッチ−Ｃｐマッチ）として示されている。
【０６１６】
【表５０】
0005539325.tif 000169
【０６１７】
検査された何れの事例においても、切断可能なリボヌクレオチドのすぐ５’側に２’ＯＭｅ残基を添加することによって、ミスマッチ識別が大幅に改善された。Ｔ／Ｕミスマッチは５．３から１２．７のデルタＣｐまで改善し、Ｇ／Ｕミスマッチは１０．９から１４．４のデルタＣｐまで改善した。この新しいプライマーのデザインは、（１０μＬアッセイにおいて）１．３ｍＵと比較した１００ｍＵＲＮアーゼＨ２化合物の使用を必要としたが、酵素は安価であり、反応特異性の強化は大幅なものであった。本発明者らは、切断可能なプライマー内の選択された位置において化学的に修飾された残基を使用することが、アッセイのミスマッチ識別能を大幅に改善できると結論する。
【実施例２３】
【０６１８】
ミスマッチ識別を改善するための、切断可能なブロックされたプライマーにおける二重ミスマッチデザインの使用
野性型（ＷＴ）配列に対して相補的な幾つかの核酸プローブは、２つの配列（ＷＴ及び変異体）が容易に識別されない十分に類似した親和性で、完全なマッチのＷＴ標的と単一塩基のミスマッチを有する変異体標的の両方に結合する。プローブと標的配列の間に導入された単一のミスマッチは野性型標的（プローブと１つのミスマッチを有する。）への結合を著しく崩壊させ得ないが、変異体標的（プローブとの２つのミスマッチを有する。）への結合を崩壊させる。この戦略は、ハイブリッド形成を基礎とするアッセイ及び核酸結合タンパク質との相互作用に依存するアッセイの選択性を改善させるために使用されてきた。本実施例は、本発明の切断可能なブロックされたプライマーの使用による塩基識別を改善するための二重ミスマッチ戦略の使用を示す。
【０６１９】
本研究のために、ＦＱフォーマットに代えて、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ検出フォーマットを使用したことを除き、実施例２０に記載されているＳＭＡＤ７ｑＰＣＲＳＮＰ識別アッセイをモデル系として使用した。切断可能なリボヌクレオチドに位置する塩基ミスマッチを有するブロックされた切断可能プライマーを合成した。本プローブデザインを用いると、切断部位（ＲＮＡ塩基）の５’に配置されたあらゆるミスマッチがプライマー伸長産物中に保持されるので、ＰＣＲの間に複製される。ＰＣＲの間に二重ミスマッチの存在を維持するためには、切除され、娘産物中には保持されないドメイン中の切断可能なＲＮＡ残基の３’に、新たなミスマッチが配置しなければならない。意図的に付加された第二のミスマッチは、完全にマッチする標的とのプライマーの機能を崩壊させないことが望ましい。「＋１位」（すなわち、ＲＮＡ塩基のすぐ３’）に存在するミスマッチは、切断及び機能的なプライマー効率に著しい影響を有し得ることが実施例１３において示された。従って、この構成が単一のミスマッチとして崩壊的でないが、二重のミスマッチとしては崩壊的であることを予想しながら、ＲＮＡ塩基の３’の「＋２位」に二重ミスマッチを配置した。
【０６２０】
ＳＭＡＤ７遺伝子（ＳＮＰ遺伝子座ｒｓ４９３９８２７）中の「Ｃ」及び「Ｔ」対立遺伝子を識別するために、標準的なデザインの特徴を用いて、この部位で、ブロックされた切断可能プライマーを設計し、合成した。全てのアッセイにおいて、同じ修飾されていないＲｅｖプライマー（配列番号２３６）を用いた。完全なマッチの「Ｃ」対立遺伝子プライマーは配列番号２５０であり、完全なマッチの「Ｔ」対立遺伝子プライマーは配列番号２５４である。次に、リボヌクレオチドに対して＋２の位置に（ＲＮＡ残基に対して３’側に２塩基）に変異を有する一連のプライマーを作製した。塩基ミスマッチの種類は、この位置にミスマッチを有していればアッセイ中に導入する相対的な擾乱を変化させると予想された。従って、完全なマッチ（野性型）及び３つの可能な塩基ミスマッチの全てを合成し、研究した（配列番号２１５から２５３及び２５５から２５７）。配列が下表５１に示されている。
【０６２１】
【表５１】
0005539325.tif 000170
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＳｐＣ３は、３’ブロッキング基として使用されたスペーサーＣ３である。二重ミスマッチを作製するために導入された変異は、太字の下線で記されている。
【０６２２】
上記プライマーは、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ００ ５９０４）の以下の８５塩基対領域を標的とする。プライマー結合部位には下線が付されており、ＳＮＰ位置は太字の斜字体として強調表示されている。ＳＮＰ識別を改善するための「二重変異体」アプローチのスキームの図解を助けるために、図３３中において、プライマーは標的と並置されている。
【０６２３】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｃ対立遺伝子（配列番号２３９）
【０６２４】
【化１１６】
0005539325.tif 000171
【０６２５】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｔ対立遺伝子（配列番号２４０）
【０６２６】
【化１１７】
0005539325.tif 000172
【０６２７】
ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックスにおいて、修飾されていないＲｅｖプライマー（配列番号２３６）及び切断可能なブロックされた一連のＦｏｒプライマー（配列番号２５０から２５７）の２００ｎＭを用いて、１０μＬの容積で行った。標的ｃＤＮＡの２ｎｇを用いて、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵを用いて反応を実施した。標的ＤＮＡは、２つのＳＭＡＤ７対立遺伝子に関してホモ接合である細胞から作製されたゲノムＤＮＡであった（Ｃｏｒｅｉｌｌ  １８５６２  ａｎｄ  １８５３７）。「Ｃ」及び「Ｔ」対立遺伝子（配列番号２３９及び２４０）を個別に検査した。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の８０サイクルが続いた。結果が下表５２に示されている。
【０６２８】
【表５２】
0005539325.tif 000173
【０６２９】
「Ｃ」対立遺伝子に関しては、標準デザインの完全にマッチしたプローブ（配列番号２５０は、修飾されていない対照プライマーと類似の増幅効率を示し、ミスマッチ識別は「Ｔ」標的に対して１０．７サイクル（デルタＣｐ＝１０．７）であった。ミスマッチプライマーは、「Ｃ」対立遺伝子標的で、検出効率の僅かな減少（最大２．４サイクルのシフトが観察された。）を示したが、ＳＮＰ部位でのミスマッチ識別は著しく増加し、ｒＣＡＡプライマー（配列番号２５１）に対して、１８．８サイクルのデルタＣｐが見られた。
【０６３０】
「Ｔ」対立遺伝子に関しては、標準デザインの完全なマッチのプローブ（配列番号２５４）は、修飾されていない対照プライマーと類似の増幅効率を示し、ミスマッチ識別は「Ｃ」標的に対して１３．４サイクル（デルタＣｐ＝１３．４）であった。しかしながら、「Ｃ」対立遺伝子とは異なり、「Ｔ」対立遺伝子に対するミスマッチプライマーは、「Ｔ」対立遺伝子標的での検出効率の大きな減少を示した。最大２０サイクルのシフトが観察された。それにも関わらず、相対的なＳＮＰ識別は改善され、ｒＵＡＣプライマー（配列番号２５６）に対して２４．２サイクルのデルタＣｐが見られた。ＳＭＡＤ７遺伝子のこの領域に関して、「Ｔ」対立遺伝子は切断可能なＲＮＡ塩基の部位に「ＡＴリッチな」連なりを作出し、この配列は低い熱的安定性を有する。＋２位でのミスマッチの存在は、より高い安定性の「Ｃ」対立遺伝子より「Ｔ」対立遺伝子に対してずっと大きく、この領域中の構造を不安定化させるはずであり、これは、「Ｔ」標的に対する「Ｔ」対立遺伝子プローブに対して観察されたＣｐの増加を説明する。しかしながら、Ｃｐ値のこのシフトはアッセイの有用性を制限しない。ブロックされた切断可能なプライマーの固有の増加した特異性に鑑みれば（実施例１１参照）、６０から８０又はそれ以上のサイクルまで反応を定型的に伸長させることに伴う問題は存在しないはずである。ある種の設定では、二重ミスマッチフォーマットの増加した識別能は、より低い総反応効率を受容するのに十分な値である。ＳＭＡＤ７「Ｔ」対立遺伝子のような「ＡＴリッチ」領域では、＋３位に二重ミスマッチを配置し、切断可能なリボヌクレオチドからその崩壊効果をさらに取り除くことも有用であり得る。
【実施例２４】
【０６３１】
切断可能なブロックされたプライマーを用いたＳＮＰ部位でのＰＣＲ増幅によって作製された反応産物の特定
ＰＣＲ又は何れかのプライマー伸長用途において使用する場合、塩基ミスマッチ（ＳＮＰ部位）がブロックされた切断可能プライマー中のリボヌクレオチド残基に直接配置されていれば、ＲＮＡ塩基に対して５’に起こる切断現象がテンプレート核酸中に存在する塩基バリアントを再生するプライマー伸長産物をもたらす。ＲＮＡ塩基に対して３’で起こる切断現象は、産物をプライマー中に存在するＲＮＡ残基へ変化させるプライマー伸長産物をもたらし、その後のＰＣＲサイクルで複製される誤りを作出する。従って、リボヌクレオチドの３’側での切断は望ましくない現象である。ＰＣＲの莫大な増幅能に鑑みれば、３’切断の少量でさえ、配列の誤りを含有する産物の相当な量の蓄積をもたらし得る。例えば、０．１％の割合での切断は、ＲＮＡ残基の部位に「誤った」塩基を有する分子を１０００分子のうち１つもたらし、次いで、これは、その後のＰＣＲサイクルで「完全なマッチ」として検出可能である。これは、ｑＰＣＲ反応での１０サイクルシフト（デルタＣｐ＝１０）に等しい。実施例１３に教示されているデザインパラメータを用いると、ＳＮＰ識別に対するサイクルシフトは５から１５まで変動した。従って、望ましくない予想外の３’切断の少量が、ＳＮＰ検査の間に実施例１３で見られた遅延した偽陽性シグナルを容易に説明し得る。
【０６３２】
対立遺伝子特異的なＳＮＰ識別反応中の偽陽性シグナルは２つの源から生じ得る。まず、ミスマッチに関わらず、ＲＮＡ塩基の５’側の「正常な」ＲＮアーゼＨ２切断部位で進行する非効率な切断（図３）。この反応は、最初の標的と同じプライマー伸長産物をもたらす。第二に、対立遺伝子特異的なＳＮＰ識別反応中での偽陽性シグナルは、ＲＮＡ塩基の３’側の何れかの場所の「異常な」位置での非効率的な切断からも生じ得る。この反応は、プライマーと同じプライマー伸長産物を生成し、これは、その後、この同じプライマーを用いて高い効率で増幅する。第一のシナリオが正しければ対立遺伝子「Ｂ」標的とともに対立遺伝子「Ａ」プライマーを用いて行われた反応から得られる産物は殆ど対立遺伝子「Ｂ」産物を産生するはずであり、これは、対立遺伝子「Ａ」プライマーによって非効率的に増幅し続ける。第二のシナリオが正しければ対立遺伝子「Ｂ」標的とともに対立遺伝子「Ａ」プライマーを用いて行われた反応から得られる産物は殆ど対立遺伝子「Ａ」産物を産生するはずであり、これは、対立遺伝子「Ａ」プライマーによって効率的に増幅する。
【０６３３】
これらの可能性を区別するために、ＳＭＡＤ７「Ｔ」対立遺伝子標的ＤＮＡとともに又はＳＭＡＤ７「Ｃ」対立遺伝子標的ＤＮＡとともにＳＭＡＤ７「Ｔ」対立遺伝子プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅の第一巡が行われる再増幅実験を行った。反応産物を１０８倍希釈し、増幅の第一巡の間に反応産物中に存在するＳＮＰ塩基の種類が変化したかどうかを決定するために、「Ｔ」対「Ｃ」対立遺伝子プライマーを用いて再増幅を行った。下表５３に示されている以下のプライマー及び標的ＤＮＡを使用して、ＳＭＡＤ７ｒｓ４９３９８２７対立遺伝子系を用いた。
【０６３４】
【表５３】
0005539325.tif 000174
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＳｐＣ３は、３’ブロッキング基として使用されたスペーサーＣ３である。
【０６３５】
上記プライマーは、ＳＭＡＤ７遺伝子（ＮＭ ００５９０４）の以下の８５塩基対領域を標的とする。ＳＭＡＤ７系において純粋な標的として使用するために合成オリゴヌクレオチドを合成し、以下に示されている。プライマー結合部位には下線が付されており、ＳＮＰ位置は太字の斜字体として強調表示されている。
【０６３６】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）Ｃ対立遺伝子（配列番号２３９）
【０６３７】
【化１１８】
0005539325.tif 000175
【０６３８】
ｒｓ４９３９８２７（ＳＭＡＤ７）対立遺伝子（配列番号２４０）
【０６３９】
【化１１９】
0005539325.tif 000176
【０６４０】
ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックスにおいて、修飾されていないＲｅｖプライマー（配列番号２３６）及び「Ｔ」対立遺伝子切断可能なブロックされたＦｏｒプライマー（配列番号２５４）の２００ｎＭを用いて、１０μＬの容積で行った。反応は、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵとともに、合成オリゴヌクレオチド標的ＳＭＡＤ７「Ｃ」対立遺伝子（配列番号２３９）又はＳＭＡＤ「Ｔ」対立遺伝子（配列番号２４９）の６．５×１０５コピーとともに、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で行った。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の８０サイクルが続いた。このＳＮＰ部位で行われたｑＰＣＲ増幅の結果は、下表５４に示されている。
【０６４１】
【表５４】
0005539325.tif 000177
【０６４２】
「Ｔ」対立遺伝子プライマーは、マッチ「Ｔ」対立遺伝子標的ＤＮＡ及びミスマッチ「Ｃ」対立遺伝子標的ＤＮＡを用いて行われた反応の間で１３．６のデルタＣｐを示す以前の結果と同様に機能した。
【０６４３】
標的ＤＮＡとして上記ＰＣＲ増幅から得られた反応産物の１０８希釈を用いて、この実験を反復した。ミスマッチ部位での切断がリボヌクレオチドの５’の予想された位置で起こったら、反応産物は「正しい」まま保たれているはずであり、「Ｔ」対立遺伝子産物は入力「Ｔ」対立遺伝子テンプレートから作製され、「Ｃ」対立遺伝子産物は入力「Ｃ」対立遺伝子テンプレートから作製される。しかしながら、何らかの相当な切断がリボヌクレオチドの３’に起これば、反応産物は、ＳＮＰ部位においてプライマーの配列へ転化されるはずである。この場合には、「Ｔ」対立遺伝子産物が「Ｃ」対立遺伝子標的から作製される。
【０６４４】
ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックスにおいて、修飾されていないＲｅｖプライマー（配列番号２３６）及び「Ｔ」対立遺伝子切断可能なブロックされたＦｏｒプライマー（配列番号２５４）又は「Ｃ」対立遺伝子切断可能なブロックされたＦｏｒプライマー（配列番号２５０）の２００ｎＭを用いて、１０μＬの容積で行った。反応は、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵありで行った。入力標的ＤＮＡは、上表５４に示されている反応産物の１０８希釈であった。反応は９５℃で５分間の浸漬から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の４５サイクルが続いた。このＳＮＰ部位で行われたｑＰＣＲ増幅の結果が、下表５５に示されている。
【０６４５】
【表５５】
0005539325.tif 000178
【０６４６】
「Ｔ」対立遺伝子標的と「Ｃ」対立遺伝子標的の両方とともに「Ｔ」対立遺伝子プライマーを用いて以前に作製された反応産物（表５４）は、現在、「Ｔ」対立遺伝子プライマーを用いたほぼ同一の増幅効率を示すのに対して、２つの異なる出発標的ＤＮＡ間に、１３．６のデルタＣｐが以前に観察された。これは、類似の配列を有する産物核酸と最も合致する（すなわち、現在、両者は、主に「Ｔ」対立遺伝子である。）。この仮説と合致して、これらの試料の両方は、現在、「Ｃ」対立遺伝子プライマーを用いて、類似の遅延したＣｐを示す。従って、「Ｃ」対立遺伝子標的を用いて「Ｔ」対立遺伝子プライマー増幅から得られた産物の多くは「Ｔ」対立遺伝子に転化されたようであり、リボヌクレオチド塩基の３’に起こるプライマー切断現象とともに産物が生じることと合致する。「Ｔ」対立遺伝子プライマー（表５４）を用いて元の増幅から得られた反応産物をサブクローニングし、ＤＮＡ配列を決定した。同定された全てのクローンは、出発テンプレートが「Ｔ」対立遺伝子又は「Ｃ」対立遺伝子であるかどうかを問わず、存在する「Ｔ」対立遺伝子を有し、この結論にさらなる裏付けを追加する。
【実施例２５】
【０６４７】
ミスマッチの識別を改善するための、切断可能なブロックされたプライマーにおける修飾されたホスホロチオアート修飾されたヌクレオチド間連結の使用
実施例２４から得られた結果は、ミスマッチされたプライマー／標的の組み合わせを用いて行われたＰＣＲが、標的の代わりに、プライマーとマッチする配列とともに産物を産生できることを示唆する。産物のこの種類をもたらす最も可能性が高いシナリオは、リボヌクレオチド残基の３’位でのミスマッチされたプライマーの切断とともに開始する。プライマーのこのドメイン中での望ましくない切断を妨げる化学的修飾の使用は、特にＳＮＰ識別における切断可能なブロックされたプライマーの性能を向上させ得る。表記されているように、リボヌクレオチドの３’の位置に配置されたヌクレアーゼ耐性ホスホロチオアート（ＰＳ）修飾されたヌクレオチド間連結を用いて、下表５６に示されているように、以下のプライマーが合成された。ＲＮＡ塩基に直接、ＰＳ結合を３’連結に配置することが切断効率を減少させ得ることが実施例１５で確立された。従って、この修飾研究は、この部位に対してさらに３’のＤＮＡ連結に対して焦点を当てた。実施例１３において以前に使用された合成アンプリコン系が使用された。
【０６４８】
【表５６】
0005539325.tif 000179
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。「＊」は、ホスホロチオアート（ＰＳ）修飾されたヌクレオチド間連結を示す。
【０６４９】
標準的な構成のブロックされたＲＮアーゼＨ２切断可能プライマー（配列番号１３４）を、この配列のＰＳ修飾された様式（配列番号２５７から６０）と比較した。「Ｒｅｖ」プライマーのこの組みは、（実施例１３において、ミスマッチ識別能を確定する際に最初に使用された）２つの異なる合成オリゴヌクレオチドテンプレートと一緒に、修飾されていない「Ｆｏｒ」プライマー（配列番号８６）とともに使用した。これらのテンプレートは、完全なマッチの対照（テンプレート配列番号１６２）及びＴ／Ｕミスマッチ（テンプレート配列番号１５５）を与える。２つのテンプレート及びオリゴヌクレオチドが、マッチ対ミスマッチの領域を図解するために以下に並置されている切断可能なブロックされたプライマー（配列番号１３４）とともに、以下に示されている。
【０６５０】
合成テンプレート、配列番号１６２（Ａ：Ｕマッチ）
【０６５１】
【化１２０】
0005539325.tif 000180
【０６５２】
合成テンプレート、配列番号１５５（Ｔ：Ｕミスマッチ）
【０６５３】
【化１２１】
0005539325.tif 000181
【０６５４】
ＰＣＲ反応は、Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックスちゅうの、修飾されていないＦｏｒプライマー（配列番号８６）及び上に示されている異なる切断可能なブロックされたＲｅｖプライマー（配列番号１３４、２５７から２６０）の２００ｎＭを用いて、１０μＬの容積で行った。反応は、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．３ｍＵを用いて行った。入力標的ＤＮＡは、上に示されている合成標的配列の２×１０６コピーであった（配列番号１５５及び１６２）。反応は９５℃で５分間の温置から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の４５サイクルが続いた。このＳＮＰ部位で行われたｑＰＣＲ増幅の結果は、下表５７に示されている。
【０６５５】
【表５７】
0005539325.tif 000182
【０６５６】
３’「＋１」位置へのＰＳ修飾された連結の配置によって（ｒＵＣ＊ＣＣＣ）、このアッセイでのＳＮＰ識別のほぼ５サイクルの改善がもたらされ（配列番号２６０対１３４）、リボヌクレオチドの３’のドメイン中のヌクレアーゼ安定性を増加させることがアッセイ性能を著しく改善させることができることを示している。リボヌクレオチドからさらに３’の連結の修飾は、最小限の影響を有していた。この領域中の連結の全ての修飾も有益であることが示された（ｒＵＣ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｃ、配列番号２６０）、相対的なＳＮＰ識別を３サイクル改善させたが、３’＋１連結で単一の修飾のみを使用するより、予想外に低い有益性を示した。これは、同じくＰＳ修飾から生じる低下した結合親和性Ｔｍと関連している可能性があり得る。
【０６５７】
従って、切断可能なリボヌクレオチドの３’の連結にヌクレアーゼ耐性修飾を付加することは、ＲＮアーゼＨ２によって媒介される切断可能なブロックされたプライマーＰＣＲアッセイに対してＳＮＰ識別を増加させることができる。典型的には、ＰＳ連結での２つの立体異性体（Ｒｐ又はＳｐ異性体）の１つだけが有益性を付与する。従って、実施例１５に示されているように、ここで、キラル的に純粋なＰＳ化合物を単離することによって、改善された活性が実現され得る。２、３例を挙げると、非キラルホスホロジチオアート連結、メチルホスホナート連結、ホスホルアミダート連結、ボラノホスファート連結及びＣ３スペーサーなどの塩基脱落残基などの、他のヌクレアーゼ耐性修飾がこの分野において適切であり得る。
【実施例２６】
【０６５８】
ｑＰＱＲアッセイにおける、ブロックされていない３’−ヒドロキシルを有する切断可能プライマーの使用
上記実施例において、ＲＮアーゼＨ２切断の前に、プライマー伸長が起こらないようにするために、プライマーの３’末端にブロッキング基を配置させた。ある種のプライマーの設計及び用途に関しては、３’−ブロッキング基を使用する必要がなく又は望ましい場合さえあり得る。本発明者らは、プライマーの機能を保持しながら、テンプレート機能をブロックする様式で化学的に修飾されたプライマーを使用する、多項目式増幅と名付けられた核酸増幅の方法を以前に記載した。内部Ｃ３スペーサー及び内部２’ＯＭｅＲＮＡ塩基を含む様々な基をこの目的のために使用することができる。入れ子状のプライマーを用いると、高い特異性が達成され、増幅能は使用される入れ子状のプライマーの数に依存し、ＰＣＲで見られる指数関数的な増幅に代えて、多項目式増幅に従って増幅が起こる（米国特許第７，１１２，４０６号及び係属中の米国特許公開２００５／０２５５４８６号及び２００８／００３８７２４号参照）。多項目式増幅プライマーの要素を本発明のＲＮアーゼＨ２切断可能ドメインと組み合わせことによって、ブロックされていない３’−ヒドロキシルを有し、プライマー伸長を支持することができるが、ＰＣＲを支持することができない新規のプライマーデザインがもたらされる。切断されると、テンプレートブロッキング基が除去され、ＰＣＲにおいて使用するためのプライマー機能が復活する。本実施例は、３’−ヒドロキシルを有する、テンプレートブロックされた切断可能なプライマーのｑＰＣＲにおける使用を示す。
【０６５９】
下表５８に示されているように、前実施例において使用された人工的な合成アンプリコンとともに使用するために、以下のプライマーを合成した。
【０６６０】
【表５８】
0005539325.tif 000183
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。
ＳｐＣ３は、プライマーの内部又は３’末端の何れかに配置されたスペーサーＣ３基である。
【０６６１】
合成アンプリコンオリゴヌクレオチドテンプレート（配列番号１６２）が、上に並置されて示されている修飾されていない及び様々な修飾された切断可能Ｆｏｒプライマー及び下に並置されている修飾されていないＲｅｖプライマーとともに以下に示されている。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、及び「ｘ」はスペーサーＣ３基を示す。
【０６６２】
【化１２２】
0005539325.tif 000184
【０６６３】
Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックス中で、各Ｆｏｒプライマー（配列番号８６、２６１から６５）及び修飾されていないＲｅｖプライマー（配列番号８７）の２００ｎＭを用いて、１０μＬの容量でＰＣＲ反応を行った。反応は、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の１．３ｍＵあり又はなしで行った。入力標的ＤＮＡは、上に示されている合成標的（配列番号１６２）の２×１０６コピーであった。反応は９５℃で５分間の温置から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の６０サイクルが続いた。ｑＰＣＲの増幅の結果が下表５９に示されている。
【０６６４】
【表５９】
0005539325.tif 000185
【０６６５】
ブロックされていないプライマーは、このアッセイ系において、およそサイクル１７で検出可能なシグナルを与えた。３’−ブロックされたＦｏｒプライマーとともにブロックされていないＲｅｖプライマーを用いると、ＲＮアーゼＨ２なしで実施された６０サイクルのＰＣＲ以内にシグナルは検出されなかったが、ＲＮアーゼＨ２を加えると、約１７の類似のサイクル検出時間が見られた。遊離の３’−ヒドロキシル基を有する内部にブロックされたＦｏｒプライマーは、３’−修飾されたプライマーと同じような挙動を示した。ブロックされていない３’−ヒドロキシルに関わらず、おそらくは、内部Ｃ３スペーサーによって課されるテンプレート機能の喪失のために、ＰＣＲでの機能のためにＲＮアーゼＨ２によるプライマー切断が必要とされた。３’末端付近に配置されたＣ３スペーサーも、ある程度まで、プライマーの伸長を阻害し得る。ＲＮアーゼＨ２の不存在下では、シグナルは検出されなかった。ＲＮアーゼＨ２を用いると、切断及び増幅が正常に進行した。
【０６６６】
本実施例は、切断可能プライマーＰＣＲアッセイにおいて機能するために、３’末端残基において切断可能プライマーが修飾される必要がないこと、及びテンプレート機能を破壊させる内部修飾を有するプライマーも良好に機能し得ることを示す。プライマー設計のためのこの知見の重要性に鑑み、これらの結果を一般化できることを確かめるために、ヒトゲノムＤＮＡを使用する内在性ヒト遺伝子標的を用いて、類似の実験を行った。
【０６６７】
下表６０に示されているように、「Ｃ」対立遺伝子のみを使用して、前実施例において使用されるヒトＳＭＡＤ７遺伝子を基礎として、以下のプライマーを合成した。
【０６６８】
【表６０】
0005539325.tif 000186
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＳｐＣ３は、プライマーの内部（テンプレートブロック）又は３’末端（プライマーブロック）の何れかに配置されたスペーサーＣ３基である。
【０６６９】
上に並置されて示されている修飾されていない及び様々な修飾された切断可能Ｆｏｒプライマーとともに、ＳＭＡＤ７アンプリコン配列（配列番号２３９）が以下に示されている。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、及び「ｘ」はスペーサーＣ３基を示す。
【０６７０】
【化１２３】
0005539325.tif 000187
【０６７１】
Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックス中で、各Ｆｏｒプライマー（配列番号２４９から５０、２６６から６９）及び修飾されていないＲｅｖプライマー（配列番号２３６）の２００ｎＭを用いて、１０μＬの容量でＰＣＲ反応を行った。反応は、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵあり又はなしで行った。入力標的ＤＮＡは、ヒト細胞株から得られたゲノムＤＮＡ２ｎｇ（Ｃｏｒｅｉｌｌ１８５６２、ＳＭＡＤ７「Ｃ」対立遺伝子）であった。反応は９５℃で５分間の温置から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の６０サイクルが続いた。ｑＰＣＲの増幅の結果が下表６１に示されている。
【０６７２】
【表６１】
0005539325.tif 000188
【０６７３】
ブロックされていないプライマーは、ヒトゲノムＤＮＡを使用するこのアッセイ系において約サイクル２６で、検出可能なシグナルを与えた。３’−ブロックされたＦｏｒプライマーとともにブロックされていないＲｅｖプライマーを用いると、ＲＮアーゼＨ２なしで実施された６０サイクルのＰＣＲ以内にシグナルは検出されなかったが、ＲＮアーゼＨ２を加えると、約２６の類似のサイクル検出時間が見られた。遊離の３’−ヒドロキシル基を有する内部にブロックされたＦｏｒプライマーの全てが、３’−修飾されたプライマーと同じような挙動を示した。ＲＮアーゼＨ２の不存在下では、シグナルは検出されなかった。ＲＮアーゼＨ２を用いると、切断及び増幅が正常に進行し、約２６サイクルで検出が起こった。
【０６７４】
本実施例は、切断可能プライマーｑＰＣＲアッセイにおいて機能するために、切断可能プライマーが３’末端での修飾を必要としないことをさらに示す。テンプレート機能を破壊させる内部修飾を有するプライマーは、前記アッセイでプライマーとして機能するために、プライマー切断現象をなお必要とする。ＲＮアーゼＨ２を用いて、単一のＲＮＡ塩基のような内部切断可能残基で切断が行われると、増幅効率は修飾されていないプライマーを用いて見られる増幅効率と同じである。ヒトゲノムＤＮＡのような複雑な核酸試料中でＰＣＲを実行するために、テンプレートブロックされた切断可能プライマーのこの新しい様式を使用することができる。
【実施例２７】
【０６７５】
内部テンプレートブロッキング基及び３’−ヒドロキシルを有する切断可能プライマーはＤＮＡ合成を開始させることができる
実施例２６に開示されている切断可能なテンプレートブロックされたプライマーは、オリゴヌクレオチドが線形プライマー伸長反応でプライマーとして機能するのを可能にするはずであるブロックされていない３’−水酸基を有するが、内部テンプレートブロック基は、プライマーの多くを複製できないように、ＰＣＲ中での機能を妨げる。その結果、プライマー結合部位は娘産物中には存在しない。ＲＮアーゼＨ２によるプライマーの切断は、テンプレートブロッキング基を含有するドメインを除去し、正常なプライマー機能を回復させる。本実施例は、これらの組成物がＤＮＡ合成を開始する機能を発揮できることを示す。
【０６７６】
前実施例で使用された人工的な合成アンプリコン系を用いる線形プライマー伸長反応を実施するために、下表６２に示されている以下のプライマーを使用した。
【０６７７】
【表６２】
0005539325.tif 000189
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＳｐＣ３は、プライマーの内部又は３’末端の何れかに配置されたスペーサーＣ３基である。
【０６７８】
上記Ｓｙｎ−Ｆｏｒプライマー（配列番号２７０）と相補的である新たに合成された１０３マーのオリゴヌクレオチドテンプレートを作製し、上に並置されている修飾されていない及び様々な修飾された切断可能なＦｏｒプライマーとともに以下に示されている。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、及び「ｘ」はスペーサーＣ３基を示す。
【０６７９】
【化１２４】
0005539325.tif 000190
【０６８０】
上に記載されているように、上に示されている６つのＦｏｒプライマーを３２Ｐで放射線標識された。プライマー伸長反応は、１×ｉＴａｑ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．４、５０ｍＭＫＣｌ）中の、０．８ＵｉＴａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、８００μＭｄＮＴＰ、３ｍＭＭｇＣｌ２、並びに２ｎＭプライマー及びテンプレート（２０μＬ反応中に、各オリゴヌクレオチドの４０ｆｍｏｌｅ）を用いて、２０μＬ容量で行った。反応は９５℃で５分間の温置から始まり、ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＰＴＣ−１００サーマルサイクラー上で、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の３５サイクルが続いた。ホルムアミドゲル搭載緩衝液を含有する冷たいＥＤＴＡの添加によって、反応を停止させた。変性７Ｍ尿素、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて、反応産物を分離し、Ｐａｃｋａｒｄ  ＣｙｃｌｏｎｅＴＭ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（リン画像化装置）を用いて可視化した。各バンドの相対的強度を上記のように定量し、プライマー伸長産物に相当するバンド中に存在する全放射性物質の割合として結果をプロットした。結果が図３４に示されている。
【０６８１】
これらの反応条件下で、対照のブロックされていないプライマー（配列番号８６）の６１％が、より高い分子量のプライマー伸長産物へ転化された。予想通り、３’末端がブロックされた切断可能プライマー（配列番号２６１）は、プライマー伸長産物を一切示さなかった。同様に、内部Ｃ３基及び３’−ヒドロキシルを有するＤ１及びＤ２切断可能プライマー（配列番号２６２から３）も、プライマー伸長を支持しなかった。僅かに長い末端のＤＮＡドメインを有する切断可能プライマー（Ｄ４及びＤ５配列、配列番号２６４から５）はプライマー伸長を支持し、Ｄ４は伸長産物へのプライマーの４７％の転化及びＤ５は６０％の転化を示し、修飾されていない対照プライマーと同一の反応効率である。従って、内部Ｃ３スペーサーが３’末端の極めて近くに配置されると、反応開始機能とテンプレートの機能の両方が破壊される。３’末端から４残基超離れて配置されると、テンプレート機能のみがブロックされる。
【実施例２８】
【０６８２】
ミスマッチ識別を向上させるための、内部テンプレートブロッキング基及び３’−ヒドロキシルを有する切断可能プライマーの使用
実施例２４は、ＲＮアーゼＨ２によるＲＮＡ塩基の３’側でのＲＮＡ含有プライマーの切断が、ｑＰＣＲＳＮＰ識別アッセイにおいて偽陽性シグナルを後に生じさせることに寄与し得る望ましくない現象である。実施例２５は、ヌクレアーゼ耐性をこのドメインに付与する修飾がＳＮＰ識別を改善できることを示した。実施例２６及び２７に記載されている新規組成物は、ＲＮアーゼＨ２切断によって除去されるドメイン中のプライマーのテンプレート機能を崩壊させる切断可能なリボヌクレオチドの３’側に内部Ｃ３基を配置する。本実施例は、ＲＮＡ塩基の近くにＣ３スペーサー基を配置することが、修飾されていない３’−ヒドロキシルを有するプローブを「ブロックされない」状態に保つフォーマットを用いるＳＮＰ識別での切断可能プライマーの性能を向上させる。
【０６８３】
下表６３に示されているように、前実施例と同様に、ヒトＳＭＡＤ７遺伝子に対して、以下のプライマーを合成した。「Ｃ」対立遺伝子に対して特異的なプライマーを作製し、「Ｃ」対立遺伝子と「Ｔ」対立遺伝子ゲノムＤＮＡ標的の両方に対して検査した。
【０６８４】
【表６３】
0005539325.tif 000191
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示されている。ＳｐＣ３は、プライマーの内部又は３’末端の何れかに配置されたスペーサーＣ３基である。
【０６８５】
その上に並置されて示されている修飾されていない及び２つの修飾された切断可能Ｆｏｒプライマーとともに、ＳＭＡＤ７アンプリコン配列（配列番号２３９、「Ｃ」標的）が以下に示されている。ＤＮＡ塩基は大文字であり、ＲＮＡ塩基は小文字であり、及び「ｘ」はスペーサーＣ３基を示す。ｒｓ４９３９８２７Ｃ／ＴＳＮＰの部位は、太字下線で示されている。
【０６８６】
【化１２５】
0005539325.tif 000192
【０６８７】
同じプライマーがミスマッチＳＭＡＤ７アンプリコン配列とともに並置されている（配列番号２４０、「Ｔ」標的）。
【０６８８】
【化１２６】
0005539325.tif 000193
【０６８９】
Ｂｉｏ−ＲａｄＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックス中で、各Ｆｏｒプライマー（配列番号２４９から５０、２６６から６９）及び修飾されていないＲｅｖプライマー（配列番号２３６）の２００ｎＭを用いて、１０μＬの容量でＰＣＲ反応を行った。反応は、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒ）４８０プラットフォーム上で、ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の２．６ｍＵあり又はなしで行った。入力標的ＤＮＡは、ＳＭＡＤ７「Ｃ」及び「Ｔ」対立遺伝子に関してホモ接合であるヒト細胞株から得たゲノムＤＮＡの２ｎｇであった（Ｃｏｒｅｉｌｌ１８５６２及び１８５３７）。反応は９５℃で５分間の温置から始まり、［９５℃１０秒間、６０℃３０秒間及び７２℃１秒間］の７５サイクルが続いた。ｑＰＣＲの増幅の結果が下表６４に示されている。
【０６９０】
【表６４】
0005539325.tif 000194
【０６９１】
修飾されていないプライマーは、非識別的でありように設計されており、両対立遺伝子を類似の効率で増幅し、約２６から２７サイクルで検出可能なシグナルを生成した。両切断可能プライマーは機能に関してＲＮアーゼＨ２に依存的であり、切断酵素の不存在下では、何れの対立遺伝子に対しても検出可能なシグナルを一切生成しなかった。ＲＮアーゼＨ２の少量（２．６から１０ｍＵ）を使用すると、３’−ブロックされた切断可能プライマー（配列番号２５０）は、マッチ「Ｃ」対立遺伝子に対して、約２７サイクルで検出可能なシグナルを生成し、ミスマッチ「Ｔ」対立遺伝子に対しては、３８から４０サイクルの遅延したＣｐを示した（１０から１３のデルタＣｐ）。ＲＮアーゼＨ２のより大量を使用すると、特異性が失われ、両対立遺伝子は類似の効率で増幅した。リボヌクレオチドの３’に２つのＣ３スペーサーを有する切断可能プライマー（配列番号２７１）は、効率的な切断／反応開始のためにＲＮアーゼＨ２のより高いレベルを必要とし、酵素の２．６及び１０ｍＵを用いると、完全なマッチの「Ｃ」対立遺伝子に対してさえ遅延したＣｐ値を示した。ＲＮＡ切断可能部位に近いこの種の修飾が酵素のより高い量を必要とすることは驚くべきことではない。実施例２２は、リボヌクレオチドに隣接して２’ＯＭｅ修飾を配置することが、完全な活性を達成するために、ＲＮアーゼＨ２の１００ｍＵを必要とすることを示した。酵素のより多量を使用すると、効率的な切断をもたらし、ＲＮアーゼＨ２の５０又は２００ｍＵを用いて、約２７サイクルで陽性シグナルが検出された。重要なことに、このプライマーデザインを用いると、ＳＮＰ識別は顕著に改善され、２．６から５０ｍＵの濃度範囲のＲＮアーゼＨ２を用いると、「Ｔ」対立遺伝子に対するデルタＣｐは約２５サイクルであった。酵素の２００ｍＵを使用すると、ミスマッチ識別が減少したが、ＳＮＰ識別は、なお、ほぼ１４サイクルデルタＣｐであった。最適な酵素濃度は５０ｍＵであり、この点で、反応開始効率は修飾されていないプライマーと類似であり、ＳＮＰ識別は２５．７サイクルデルタＣｐを示した。
【０６９２】
従って、リボヌクレオチドの付近に２つの内部Ｃ３スペーサー基及びブロックされていない３’−ヒドロキシルを有する本切断可能プライマー設計、「ＲＤｘｘＤ」は、元のプライマー設計「ＲＤＤＤＤ−ｘ」（Ｒ＝ＲＮＡ塩基、Ｄ＝ＤＮＡ塩基及びｘ＝Ｃ３スペーサー）に比べて大幅に改善されたミスマッチ識別を示した。「ＲＤＤｘｘＤ」又は「ＲＤｘｘＤＤ」などの関連する設計は、同様に改善された機能を示し得、設計の小さな最適化が、目的とするＳＮＰの正確な配列の文脈に応じて有益であり得る。テンプレート機能を崩壊させるが、３’−ヒドロキシルを修飾されていないままにするＣ３スペーサーのような化学修飾基を使用することは、ＲＮアーゼＨ２によるリボヌクレオチドでの切断の特異性を増強させ、ＳＮＰ識別を改善する。
【実施例２９】
【０６９３】
ＤＮＡ配列決定法におけるＲＮアーゼＨ２切断可能連結プローブの使用
前実施例は、切断可能なオリゴヌクレオチドがＤＮＡ合成反応を開始させるプライマーとしての用途のための、ＲＮＡアーゼＨ２切断可能オリゴヌクレオチド組成物の使用を記載した。上記実施例に開示されている用途には、幾つかの異なる検出フォーマットでの終点及びリアルタイムＰＣＲの両方が含まれる。実施例８は、ＤＮＡポリメラーゼ及びジデオキシヌクレオチド終結物質とともにサンガー配列決定法を使用するＤＮＡ決定配列用途における、切断可能プライマーの使用を示した。この事例では、ＲＮアーゼＨ２によって切断可能なオリゴヌクレオチドは、プライマーとしても機能した。ＲＮアーゼＨ２切断可能なオリゴヌクレオチドは、連結フォーマットアッセイにおいても使用され得る。１つのこのような用途は、切断可能な連結プローブを用いるＤＮＡ配列決定である。本実施例は、ＤＮＡ配列決定での使用に適したフォーマットでの、ＲＮアーゼＨ２切断可能な連結プローブの使用を示している。
【０６９４】
未知の核酸配列中で塩基の種類を連続して調べるための（すなわち、ＤＮＡ配列決定）連結プローブの使用は、記載されている（米国特許第５，７５０，３４１号及び米国特許第６，３０６，５９７号及び米国特許公開２００８／０００３５７１参照）。連結による５’から３’方向への配列決定のための基本的なスキームは、未知の核酸配列にハイブリッド形成された核酸アクセプター分子から始まる。既知の固定されたＤＮＡ塩基を５’末端に有し、未知の配列の標的核酸へのプローブの安定な核酸ハイブリッド形成を可能にするランダム塩基又はユニバーサル塩基がその後に続くこの配列に、一連の塩基検査プローブがハイブリッド形成される。ハイブリッド形成及びその後の連結反応は、連結プローブと標的間の完全な又はほぼ完全なマッチに依存する。連結の部位では、完全なマッチが必要とされる。連結は、連結部位に存在する特異的な塩基の同定を可能にする検出可能な現象をもたらす。ＲＮアーゼＨ２切断可能部位が連結プローブ内に含有されている。連結後、ＲＮアーゼＨ２によってプローブを切断し、プローブの多くを放出するが、新たに同定された塩基はアクセプター核酸配列に連結されたままにされ、この時点で、連結及び切断のサイクルの結果、アクセプター核酸配列は１残基延長されている。この一連の酵素的及び化学的現象は、連結、塩基の同定及び切断の複数サイクルを通じて繰り返され、これにより、未知の核酸配列が決定される。
【０６９５】
上に引用されている特許文献は、連結によって配列決定するための方法を教示するが、連結／検出の複数サイクルを許容する連結プローブの切断及び放出を達成するためにその中に示唆されている方法は、実行が非効率であり、困難である。本発明の方法を使用するＲＮアーゼＨ２切断可能オリゴヌクレオチドは、既存の方法に対して改善を与え、より安価で、使いやすいＤＮＪ配列決定用の切断可能な連結プローブの構築を可能にする。ＲＮアーゼＨ２切断可能な連結プローブと使用するＤＮＡ配列決定のための１つのスキームが図３５に示されている。
【０６９６】
この方法におけるＲＮアーゼＨ２切断可能な連結プローブは、５’末端に固定された既知の１つのＤＮＡ塩基（又は複数の塩基）を含有する。固定された既知の塩基は、最も５’側の単一の塩基であり得、又は５’末端方向に２若しくは３若しくはそれ以上の塩基を含み得る。本実施例は、プローブの５’末端に単一のＤＮＡ塩基のみが固定される系を使用する。合成オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡリガーゼを用いた酵素的連結を可能にするために、５’−ホスファートを有する。プローブの活性化されたアデニル化形態も使用することができる。既述のように、５’末端の最初の塩基は固定されている（既知）。従って、ＤＮＡ配列決定を実行するために、４つの独立したプローブ（「Ａ」プローブ、「Ｃ」プローブ、「Ｔ」プローブ及び「Ｇ」プローブ）が必要される。明らかに、固定された塩基の数が１より多ければ、さらに多くのプローブが必要とされる（例えば、最初の２つの塩基が固定された既知の配列として使用される場合には、１６の連結プローブ（それぞれの可能なジヌクレオチドに対して１つ）が必要とされる。固定された既知のＤＮＡ残基の後の第一の塩基（この場合には、５’末端から二番目の塩基）は、ＲＮアーゼＨ２によって切断可能な残基である。本実施例では、ＲＮＡ塩基が使用されるが、２’ーＦ残基又は他の切断可能な修飾された塩基（前実施例記載されているような）も使用することができる。このプローブ中の残りの塩基は、ランダムな塩基（４つのＤＮＡ塩基の雑多な混合物）及び／又はユニバーサル塩基（イノシン、５−ニトロインドール又は当業者に周知である他のこのような基など）である。プローブの全長は通常約８から９塩基であるが、使用される具体的なリガーゼ酵素に応じて、より長い又はより短いプローブ長が可能である。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用する場合、効率的なハイブリッド形成及び酵素的連結を達成するために８の長さが十分である。より長いプローブを使用することもできる。
【０６９７】
プローブ集団の複雑さは、４Ｎ（Ｎ＝使用されるランダムな塩基の数）に従って増加する。例えば、プローブ「ｐＴｎＮＮＮＮＮＮ」は５’末端に固定された「Ｔ」塩基、単一の「ｎ」ＲＮＡ塩基及び６つの「Ｎ」ＤＮＡ塩基、合計７つのランダムな残基（ｐ＝ホスファート、ｎ＝ＲＮＡ、Ｎ＝ＤＮＡ）を有する。これは、集団中に４７分子の複雑さ（１６，３８４）を与える。プローブの複雑さは、ランダムなＮ塩基をユニバーサル塩基の基に置換することによって減少させることができる。これは、３’末端方向で特に効果的である。例えば、３つのイノシン残基を使用することは、上記プローブを「ｐＴｎＮＮＮＩＩＩ（前記のとおり、Ｉ＝イノシン）に転化させる。このプローブは、４４分子の複雑性（２５６）を有する。１６，３８４の複雑性を有するプローブに比べて、２５６の複雑性を有するプローブを用いて１００％の連結を達成するためには、連結プローブの著しく低い質量の入力を必要とする。１つ又はそれ以上のユニバーサル塩基の使用が、一般に好ましい。最後に、連結プローブは、連結後に分割され得る検出可能なシグナルを与えるために、３’末端に又は３’末端付近に色素分子を有する。連結プローブそのものは、アクセプター核酸としての役割を果たすことができないように、３’修飾基は３’末端で連結をブロックする役割も果たす。
【０６９８】
ＤＮＡ配列決定でのこの設計のＲＮアーゼＨ２切断可能な連結プローブの使用は、図３５に模式的に示されている。ユニバーサルなプライマー又はアクセプター核酸は、未知の核酸にハイブリッド形成される。アクセプター分子のハイブリッド形成を可能にするために、未知の配列の末端にユニバーサルなアダプター配列を付着させることが必要とされ得、この戦略は、全ての反応に対して同じアクセプター核酸を使用することを可能にする。アクセプター核酸は、連結に利用可能な３’水酸基を有さなければならない。連結プローブの混合物は、モル濃度過剰で反応中に導入され（上に記載されている８マーのイノシン含有プローブデザインに対して２５６倍超過剰）、酵素的連結を実施するためにＴ４ＤＮＡリガーゼが使用される。遊離のプローブは洗浄によって除去され、保持された蛍光シグナルが測定される。保持された色素の色が、何れのプローブ（Ａ対Ｇ対Ｃ対Ｔ）が連結反応の間に付着されたかを特定する。次いで、プローブを切断するためにＲＮアーゼＨ２が使用され、「Ｎ」塩基及びユニバーサルな塩基を除去するが、既知の塩基はアクセプター核酸に付着されたままにする。このようにして、テンプレート内の対応する塩基の種類が決定され、アクセプター核酸は１塩基伸長され、接近可能な３’−ヒドロキシルが再び連結のために利用可能となり、プロセスのサイクリングが可能となる。
【０６９９】
本発明の方法を使用するＲＮＡ含有蛍光性連結プローブの連結及びその後の切断を示すための代表的な合成系として、下表６５に示されている以下のオリゴヌクレオチドを作製した。ここでは、連結プローブは固定された９塩基配列（「Ｎ」塩基又はユニバーサル塩基修飾なし）を有する。「ＣＬＰ」という表記は、「切断可能な連結プローブ」を示す。表記「ＡＮＡ」は、連結反応のために３’−ヒドロキシルアクセプター部位を提供する「アクセプター核酸」を示す。「Ｔａｒｇ−Ａ」は標的核酸であり、相補的な「Ｔ」連結プローブを伴う連結反応を誘導する（「ＣＬＰ−Ｔ−Ｃｙ３」）。「Ｔａｒｇ−Ｔ」は標的核酸であり、相補的な「Ａ」連結プローブを伴う連結反応を誘導する（「ＣＬＰ−Ａ−ＦＡＭ」）。
【０７００】
【表６５】
0005539325.tif 000195
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示され、「ｐ」は５’−ホスファートである。ＴＲは、蛍光性色素テキサスレッドである。Ｃｙ５は、蛍光性色素シアニン−５である。Ｃｙ３は、蛍光性色素シアニン−３である。ＦＡＭは、蛍光性色素６−カルボキシフルオレセインである。Ｔａｒｇ−ＡとＴａｒｇ−Ｔ間での塩基変動の位置には下線が付されており、対応する連結プローブの５’塩基に対して相補的である。
【０７０１】
図３６は、上に示されている合成オリゴヌクレオチド配列を用いて、連結−切断反応サイクルに対して予想された結果を示す。「Ｔａｒｇ−Ａ」（配列番号２７７）は「ＣＬＰ−Ｔ−Ｃｙ３」プローブ（配列番号２７５）のハイブリッド形成及び連結を誘導するのに対して、「Ｔａｒｇ−Ｔ」（配列番号２７８）は「ＣＬＰ−Ａ−ＦＡＭ」プローブ（配列番号２７４）のハイブリッド形成及び連結を誘導する。反応が高い特異性を有すると仮定すると、残りの２つの連結プローブは、この実験では、マッチする標的を有しておらず、従って、連結反応には参加しないはずである。連結後、「ＡＮＡ」＋「ＣＬＰ」産物の新たに形成された融合はＲＮアーゼＨ２に対する基質になる。ＲＮアーゼＨ２による切断は連結プローブの３’末端の放出をもたらし（ＲＮＡ塩基及び蛍光性レポーター色素を含む。）をもたらし、「ＡＮＡ」分子を１塩基だけ長くする。
【０７０２】
「Ｔ」標的核酸（配列番号２７８）又は「Ａ」標的核酸（配列番号２７７）及び「ＡＮＡ」アクセプター核酸（配列番号２７６）を１．７５μＭで混合し、４つの連結プローブの全て（配列番号２７２から７５）を、３．５μＭ（それぞれ）の濃度になるように、８０μＬの容量のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール１ｍＭＡＴＰ）に添加し、７０℃まで３分間加熱し、２５℃までゆっくり冷却した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼの１４０ユニットあり又はなしで、３７℃で５分間、連結反応を温置した。６５℃で１０分間加熱することによって、反応を停止させた。次いで、ＲＮアーゼＨ２緩衝液［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０（最終濃度１０ｍＭ）、ＮａＣｌ（最終濃度５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（最終濃度４ｍＭ）］を添加して、反応容積を２００μＬになるように調整し、ＲＮアーゼＨ２の２０ユニットを各チューブに添加した。６０℃で３０分間、反応混合物を温置した後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム上で脱塩し、試料を凍結乾燥した。試料を水７０μＬ中で再水和させ、２０％アクリルアミド、７Ｍ尿素、変性ゲル上で分取試料１０μＬを分析した後、ＧｅｌＳｔａｒ染色（＃５０５３５  ＧｅｌＳｔａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ，  Ｌｏｎｚａ）を用いて可視化した。必要に応じて質量分析法又は他の方法などの将来の検査のために、反応の残りを−２０℃で保存した。
【０７０３】
ゲルの画像が図３７に示されている。レーン１及び５は、サイズマーカー（レーンＭ）と比較した移動を可視化するために、酵素の不存在下での成分オリゴヌクレオチドを示す。レーン２及び３は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、４つの切断連結プローブ（配列番号２７２から７５）とともにＴａｒｇ−Ａ（配列番号２７７）が温置された２つ組みの反応である。ＣＬＰ−Ｔ−Ｃｙ３（配列番号２７５）との連結を表すアクセプター核酸（ＡＮＡ、配列番号２７６）の上方へのサイズシフトが明瞭に見られ、連結産物として同定される。正しいＣＬＰ−Ｔ−Ｃｙ３プローブとの特異的な連結が起こり、他の３プローブ（ミスマッチされた塩基）との連結は起こらず、これは、色素の色の視覚的検査によって確認され（これは、図３７に示されている白黒の画像では認められない。）、質量分析法によってさらに確認された。同様に、レーン７及び８は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で、４つの切断連結プローブ（配列番号２７２から７５）とともにＴａｒｇ−Ｔ（配列番号２７８）が温置された２つ組みの反応である。ＣＬＰ−Ａ−ＦＡＭ（配列番号２７４）との連結を表すアクセプター核酸（ＡＮＡ、配列番号２７６）の上方へのサイズシフトが明瞭に見られ、連結産物として同定される。正しいＣＬＰ−Ｔ−ＦＡＮプローブとの特異的な連結が起こり、他の３つのプローブ（ミスマッチされた塩基）との連結は起こらず、これは、色素の色の視覚的検査によって再度確認され、質量分析法によって確認された。最後に、レーン４及び８は、ＲＮアーゼＨ２で処理されたときに、これらの連結産物のサイズが低下することを示しており、切断が起こったことを示唆する。生じたバンドは、元のＡＮＡバンドと比較して僅かに低下した移動度を示し、この新しい種が最初の材料より長いことを示唆することが注目される。質量分析法は、レーン４及び８の反応産物の実際の質量が最初のＡＮＡ核酸の予想される１塩基伸長と合致すること、正しい塩基が挿入されたこと、及び新しい「ＡＮＡ＋１」種が３’−ヒドロキシルを有することを確認した。この時点で、新たなＡＮＡ＋１種が連結／切断の第二のサイクルのために調製される。
【０７０４】
従って、本実施例は、短いＲＮＡ含有短プローブが相補的標的核酸の存在下で、アクセプター核酸へ特異的に連結され得ることを示した。連結は、連結プローブの５’末端塩基にマッチするテンプレート塩基の種類に対して感受性であり、正しい相補的なプローブの特異的連結を異なるプローブ配列の雑多な混合物内から検出することができる。最後に、ＲＮアーゼＨ２は、ＲＮＡ塩基の５’側で連結プローブを切断し、プローブの多くを放出させることができ、１塩基だけ長さが伸長したアクセプター核酸分子をもたらし得る。伸長されたアクセプター核酸は３’−ヒドロキシルを含有し、連結／切断の反復サイクルにおいて使用することができる。
【実施例３０】
【０７０５】
ＲＮアーゼＨ２によって切断可能な連結プローブにおけるユニバーサル塩基の使用
上記実施例２９では、切断可能な連結プローブにおいて、５’−ニトロインドール又はイノシンなどのユニバーサルな塩基を使用できることが提案された。本実施例は、プローブ配列が固定されている（ランダムなＮ−塩基を含有しない）モデル系における、ユニバーサル塩基５−ニトロインドールの使用を示す。実施例２９における合成プローブ／テンプレート系を基礎として、下表６６に示されているオリゴヌクレオチドを合成した。切断連結プローブは、５’−ホスファート、（「Ｔ」標的への連結を誘導するための）５’末端の「Ａ」塩基、単一のリボヌクレオチド及び２又は３の追加の固定されたＤＮＡ塩基を有する８マートしてデザインされた。３’末端方向に、３つ又は４つの５−ニトロインドール塩基を配置した。ＦＡＭ蛍光色素を３’末端に付着させた。実施例２９と同じアクセプター核酸（ＡＮＡ）及びＴ−標的核酸を使用した。本実施例のためのオリゴヌクレオチド成分の並置を示す反応スキームが図３８に示されている。
【０７０６】
【表６６】
0005539325.tif 000196
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示され、「ｐ」は５’−ホスファートである。「Ｘ」は、ユニバーサル塩基５−ニトロインドールである。ＦＡＭは、蛍光性色素６−カルボキシフルオレセインである。連結プローブの５’末端との塩基ハイブリッド形成の位置には、標的上に下線が付されている。
【０７０７】
「Ｔ」標的核酸（配列番号２７８）及び「ＡＮＡ」アクセプター核酸（配列番号２７６）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ）中の３Ｘ又は４Ｘ５’−ニトロインドール含有ＣＬＰ（切断可能な連結プローブ、配列番号２７９から８０）と２μＭで混合した。反応を７０℃で５分間加熱し、２５℃までゆっくり冷却した。７．５から１２０ユニットの範囲で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、２５又は３７℃で５分間、連結反応を温置した。５０ｍＭの最終濃度になるようにＥＤＴＡを添加することによって、反応を停止させた。最終反応容量は５０μＬであった。９０％ホルムアミド、１×ＴＢＥ搭載緩衝液の等容量を各試料に添加し、次いで、７０℃で３分間熱変性させ、氷上で冷却した。変性７Ｍ尿素、２０％ポリアクリルアミドゲル上で、試料を分離した。ＧｅｌＳｔａｒＴＭ染色を用いてゲルを染色し、ＵＶ励起で可視化した。ゲルの画像が図３９に示されている。
【０７０８】
３つの５−ニトロインドールユニバーサル塩基を有する８マーの切断可能な連結プローブ（配列番号２７９）は良好に機能し、より高い酵素量（６０から１２０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ）を用いると、ほぼ１００％連結効率を示した。これに対して、４つの５−ニトロインドールユニバーサル塩基を有する８マーの切断可能な連結プローブ（配列番号２８０）は、酵素の何れの量を用いても、アクセプター核酸に連結しなかった。２５℃及び３７℃でも、同じ結果が見られ、反応性のこの差が２つのプローブのＴｍの差に関連しないことを示唆する。異なる反応性はＴ４ＤＮＡリガーゼ酵素の基質選好性に関連する可能性がより高い。本実施例は、８マーの連結プローブの３’末端に３つの５−ニトロインドール塩基を配置することができ、優れた機能を保持できることを示す。９マーの連結プローブを用いて、この同じ実験を繰り返した。この場合には、「６つのＤＮＡ＋３つの５−ニトロインドール塩基」を有するプローブ及び「５つのＤＮＡ＋４つの５−ニトロインドール塩基」を有するプローブは何れも、Ｔ４ＤＮＡリガーゼに対する基質であるが、「４つの塩基＋５つの５−ニトロインドール塩基」を有するプローブは基質でなく（示されず）、良好に機能するために、連結プローブの５’末端方向にＴ４ＤＮＡリガーゼが５つの固定されたＤＮＡ塩基を必要とするという考え方及びこの要件を満たした後に、５’−ニトロインドール塩基を導入することができるという考え方と合致する。正確な最適なプローブのデザインは、異なるリガーゼ酵素とともに変動し得る。
【０７０９】
連結プローブのより低い複雑性プールの合成を可能にするので、これらの知見は重要である。
【実施例３１】
【０７１０】
ＲＮアーゼＨ２によって切断可能な連結プローブにおけるランダム塩基及びユニバーサル塩基の使用
実施例２９及び３０は、プローブ配列の一部又は全部が標的と完全にマッチするＲＮアーゼＨ２によって切断可能な連結プローブの使用を示した。未知の配列の核酸を配列決定する際に、プローブハイブリッド形成が遭遇される何れの配列に対しても起こり得るように、主としてランダム塩基を含有するプローブを使用することが必要である。本実施例は、ランダム塩基（Ｎマー）ドメイン、ユニバーサル塩基（５−ニトロインドール）ドメイン及び５’塩基に単一の固定されたＤＮＡ塩基のみを有する８マーの切断可能な連結プローブの使用を示す。表６７に示されている以下のオリゴヌクレオチドを使用した。
【０７１１】
【表６７】
0005539325.tif 000197
ＤＮＡ塩基は大文字で示されている。ＲＮＡ塩基は小文字で示され、「ｐ」は５’−ホスファートである。「Ｎ」は、ＤＮＡ塩基Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴのランダムな混合を表す。「ｎ」は、ＲＮＡ塩基Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵのランダムな混合を表す。「Ｘ」は、ユニバーサル塩基５−ニトロインドールである。ＦＡＭは、蛍光性色素６−カルボキシフルオレセインである。Ｃｙ５は、蛍光性色素シアニン−５である。Ｃｙ３は、蛍光性色素シアニン−３である。連結プローブの５’末端との塩基ハイブリッド形成の位置には、標的上に下線が付されている。
【０７１２】
「Ｔ」標的核酸（配列番号２７８）及び「ＡＮＡ」アクセプター核酸（配列番号２７６）を、それぞれ０．４μＭの最終濃度で一緒に混合し、５０μＬの最終反応容量で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中に、５０μＭの最終濃度で（標的及びアクセプターの１２５倍過剰）個別に、３つの切断可能な連結プローブ（配列番号２８１から８３）を添加した。反応を７０℃まで５分間加熱し、２５℃までゆっくり冷却した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを添加し（４００℃）、連結反応を３７℃で３０分間温置した。６５℃で１０分間加熱することによって反応を停止させた後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム上で脱塩し、その後、試料を凍結乾燥し、９０％ホルムアミド、１×ＴＢＥ搭載緩衝液の１０μＬと混合された水１０μＬ中に再水和させた。７０℃で３分間、試料を熱変性させ、氷上で冷却した。２０％アクリルアミド７Ｍ尿素変性ゲル上で反応産物を分離させた後、ＵＶ透光とともにＧｅｌＳｔａｒ染色を使用して可視化した（５０５３５  ＧｅｌＳｔａｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ，  Ｌｏｎｚａ）。結果が図４０に示されている。
【０７１３】
標的核酸は、連結点に相補的な部位に「Ｔ」塩基を含有した。このテンプレートは、「Ａ−ＦＡＮ」連結プローブ（配列番号２８１）の連結を正しく誘導したが、ミスマッチ「Ｔ−Ｃｙ３」（配列番号２８２）又は「Ｇ−Ｃｙ５」（配列番号２８３）連結プローブの誘導は正しく誘導しなかった。連結の特異性は、その他はランダム「Ｎ」塩基又はユニバーサル５−ニトロインドール塩基を含む連結プローブの５’末端の単一の固定されたＤＮＡ塩基によって誘導された。標的及びアクセプター核酸に対して１２５倍モル濃度過剰で、連結プローブを連結反応に添加した。連結プローブは４塩基の「Ｎ」ドメインを含有するので、核酸混合物の複雑性は４４（２５６）であった。従って、反応は、入力アクセプター核酸の約５０％のみと連結するのに十分な完全にマッチしたプローブを理論的には含有した。図４０中の相対蛍光画像から、より長い連結産物種にアクセプターの約半分が存在し、半分が未反応であったことが明瞭であり、反応が予想通り進行したことを示唆する。ミスマッチされた配列が何らかの相当な効率でアクセプターに連結すれば、連結プローブの１２５倍過剰はアクセプター核酸分子の５０％超と反応した可能性が最も大きいが、これは観察されなかった。従って、このデザインの切断可能な連結プローブを使用する連結反応は、効率的且つ特異的であった。
【実施例３２】
【０７１４】
オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）におけるＲＮアーゼＨ２によって切断可能なプローブの使用
ＤＮＡ配列決定での切断可能な連結プローブの使用は、アッセイのこの一般的なクラスに対して可能なフォーマット／用途の１つに過ぎない。配列決定用途は、標的核酸が未知の配列という点で特有である。より典型的には、オリゴヌクレオチド連結アッセイは、目的の試料核酸内に既知の核酸配列が存在するか又は存在しないかを決定するために使用される。例えば、ＯＬＡは、ヒトＤＮＡのバックグラウンドにおいて病原性生物に対して特異的な核酸配列の存在を検出するために使用することができる。別の例は、特異的な標的核酸遺伝子座における既知の所定の多型の存在又は不存在を決定することである（例えば、対立遺伝子識別アッセイ又はＳＮＰアッセイ）。これらの用途の全てにおいて、１つの連結プローブは、最も３’側の又は５’側の塩基がＳＮＰ部位と並置するように配置され、第二の完全にマッチする核酸は、プローブ配列がＳＮＰ塩基に対してマッチすれば、連結現象が起こり得るように隣接して配置されている。プローブ配列がＳＮＰ塩基に対してミスマッチであれば、連結は阻害される。連結現象は、検出可能な種の形成をもたらす。
【０７１５】
本発明の新規ＲＮアーゼＨ２切断可能な連結オリゴヌクレオチドプローブの有用性を示すために、対立遺伝子識別（ＳＮＰ）アッセイが本実施例に示されている。本実施例において示されている配列デザインは、アクセプター連結プローブの３’末端方向にＳＮＰ部位を配置する。
【０７１６】
伝統的なＯＬＡは、２つの対立遺伝子を識別するために３つの合成オリゴヌクレオチドを使用する（図４１Ａ）。ＳＮＰ部位が「Ｃ」対立遺伝子及び「Ａ」対立遺伝子を含む場合には、２つのアクセプターオリゴヌクレオチド（１つは「Ｇ」塩基（Ｃ対立遺伝子に対するマッチ）を有し及び１つは「Ｔ」塩基（Ａ対立遺伝子に対するマッチ）を有する。）が必要とされる。アクセプターオリゴヌクレオチドは、遊離の３’水酸基を有する。標的にハイブリッド形成して、連結プローブの３’末端にその５’末端を隣接して配置する第三のオリゴヌクレオチド（ドナー核酸）が使用される。アクセプター核酸は５’−ホスファートを有し、一般に、連結反応に参加できないように、ドナーオリゴヌクレオチドの３’末端がブロックされている。このようにして、標的上でのアクセプター及びドナープローブの完全なマッチのハイブリッド形成は、アクセプターの３’−ヒドロキシルをドナーの５’−ホスファートの間での連結を可能にする「ヘッド・トゥー・テール」様式で２つのオリゴヌクレオチドを配置させる（図４１Ｂ）。これに対して、ＳＮＰ部位のミスマッチはこの構造を破壊し、連結を阻害する。伝統的なＯＬＡでは、ハイブリッド形成／連結の時点で１回、ＳＮＰ塩基の正体が調べられ、特異性は、完全にマッチする種に対して連結を行うが、ミスマッチされない種に対しては連結しないＤＮＡリガーゼの能力に完全に依存している。典型的には、３つのオリゴヌクレオチド（２つの連結プローブ及びアクセプター）は、同じ条件下で、標的核酸と一緒に機能できるように、類似のＴｍを有する。
【０７１７】
本発明の新しいＲＮアーゼＨ２ＯＬＡは、２つの対立遺伝子を識別するために４つの合成核酸を使用する（図４２Ａ）。ＳＮＰ部位が「Ｃ」対立遺伝子及び「Ａ」対立遺伝子を含む場合には、２つの切断可能なアクセプター連結プローブ（１つは「Ｇ」塩基（Ｃ対立遺伝子に対するマッチ）を有し及び１つは「Ｔ」塩基（Ａ対立遺伝子に対するマッチ）を有する。）がこの実施形態で必要とされる。切断可能なアクセプター連結プローブは、標的ＳＮＰ部位の塩基と相補的な又は相補的でない（マッチ対ミスマッチ）ように並置された分子の３’末端方向に配置された単一のＲＮＡ塩基を有する。ＲＮＡ塩基の３’に、さらなるＤＮＡ塩基（好ましくは、全て標的に対して相補的である４つのＤＮＡ塩基）が配置されており、連結を妨げるために、ブロッキング基が３’末端に配置されている。切断可能な連結プローブの一般的なデザインと機能は、ｑＰＣＲフォーマットＳＮＰ識別アッセイにおいて、実施例１３で示された切断可能プライマーと類似する。切断可能な連結プローブは、ＲＮアーゼＨ２切断部位におけるＳＮＰ識別を改善するために、上記実施例に概説されているように、化学的に修飾された様々な塩基及び塩基脱落残基を用いてデザインすることもできる（実施例２２、２３、２５及び２８）。好ましくは、切断可能な連結プローブは、酵素に対する最適な温度範囲で、切断可能なプローブの標的とのハイブリッド形成することを可能にするために、（ＲＮアーゼＨ２切断緩衝液中で）６０から７０℃の範囲のＴｍを有するように設計されている。
【０７１８】
伝統的なＯＬＡフォーマットと異なり、ＲＮアーゼＨ２ＯＬＡフォーマット中のドナーオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰ検査プローブでもある。従って、２つのドナープローブ（１つは「Ｇ」塩基（Ｃ対立遺伝子に対するマッチ）を有し及び１つは「Ｔ」塩基（Ａ対立遺伝子に対するマッチ）を有する。）が必要とされる。何れのドナープローブも、連結を可能にするために５’末端にホスファートを有しており、場合によって、３’末端でブロックされている（図４２Ａ）。２つのドナー連結プローブは、反応温度の調節によって、標的核酸との切断可能な連結プローブ及びドナー連結プローブのハイブリッド形成が異なって制御され得るように、ＲＮアーゼＨ２によって切断可能な連結プローブより低いＴｍを有し得る。このアッセイフォーマットにおけるこれらのドナープローブは、ＲＮアーゼＨ２と相互作用しない。
【０７１９】
ＲＮアーゼＨ２ＯＬＡを実施するために、４つのＯＬＡプローブ全てを、ＲＮアーゼＨ２活性と適合的な緩衝液中において、標的核酸の存在下で混合する（上記実施例参照）。好ましくは、これは、約６０から７０℃で行われる。ＲＮアーゼＨ２によって切断可能なアクセプターオリゴヌクレオチドは標的核酸に対して相補的であり、これらの条件下で、標的核酸にハイブリッド形成する。アクセプタープローブのＲＮＡ塩基及び標的ＳＮＰ部位の塩基がマッチすれば、ＲＮアーゼＨ２切断が起こり得る（図４２Ｂ）。ドナー連結プローブ（非切断可能プローブ）が切断可能なプローブより低いＴｍを有することが好ましい。次いで、非切断可能なドナープローブが標的とハイブリッド形成しない、非切断可能なドナープローブのＴｍより十分に高い温度で、反応の第一段階（アクセプターオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成及びＲＮアーゼＨ２による切断）を実施することができる。ＲＮアーゼＨ２によるアクセプタープローブの切断はＲＮＡ塩基を除去し、ＳＮＰ部位を露出させて、ＳＮＰ部位が非切断可能な連結プローブ（ドナーオリゴヌクレオチド）とハイブリッド形成のために利用可能となる。
【０７２０】
ＰＬＡのＲＮアーゼＨ２切断相が完了したら、標的への非切断可能な連結プローブのハイブリッド形成を可能にするために反応温度を低下させる。ドナープローブの５’末端の塩基がＳＮＰ部位の部位と対合すれば、ＤＮＡリガーゼの存在下において、非切断可能プローブの５’末端は隣接する切断されたプローブの３’末端に連結する（図４２Ｂ）。従って、ＲＮアーゼＨ２ＯＬＡアッセイは、ＳＮＰ部位の塩基の種類を２回（アクセプターオリゴヌクレオチドプローブのＲＮアーゼＨ２媒介性切断の間に１回及び連結反応で再度）調べる（図４２Ｃ）。２つの異なる酵素現象によってＳＮＰ塩基の種類を二重に調査することによって、伝統的なＯＬＡを用いて達成できるより大きな特異性を与える。
【実施例３３】
【０７２１】
ＯＬＡにおけるＲＮアーゼＨ２切断可能なプローブを用いたＳＮＰ識別
ＯＬＡ産物の検出を可能にする様々な方法が存在する。本実施例では、実施例３２に概説されているようにＲＨアーゼＨ２ＯＬＡ対立遺伝子識別アッセイを実施するために、ビーズ捕捉アッセイフォーマットにおいて蛍光検出が行われる。ＬｕｍｉｎｅｘＬ１００検出系（Ｌｕｍｉｎｅｘ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）で検出するＬｕｍｉｎｅｘｘＭＡＰ蛍光性マイクロビーズ系とともに使用するのに適合的な配列を設計した。
【０７２２】
カルボジイミドカップリング化学を用いてカルボキシラートｘＭＡＰ蛍光ビーズへの連結を可能にするために、５’−アミノ修飾子を用いて、「ＯＬＡ−Ｃ−アンチタグ」及び「ＯＬＡ−Ｔ−アンチタグ」配列（配列番号２８４から５）を作製した。連結反応中でドナーオリゴヌクレオチドとしての役割を果たす「ＯＬＡ−Ｔ−タグ」及び「ＯＬＡ−Ｃ−タグ」配列（配列番号２８８から９）は、５’末端の方向に、標的配列に相補的である１２塩基配列を有しており、ＳＮＰ部位（Ｃ／Ｔ）塩基を５’末端に配置する。これらの１２塩基ドメインに対するＴｍは、（１０ｍＭＭｇ＋＋を含有する緩衝液中で）５０から５３℃であると推定される。両配列は、連結を可能にするために５’−ホスファートを有する。これらの配列の３’末端は、「アンチタグ」配列に相補的な「タグ」配列であり、ハイブリッド形成によるアンチタグを有するビーズへの捕捉を可能にする。「ＯＬＡ−Ｃ」及び「ＯＬＡ−Ｔ」プローブ（配列番号２８６から７）はアクセプター断片としての役割を果たし、標的に対して相補的であり、単一のリボヌクレオチド塩基（ｒＣ又はｒＵ）をＳＮＰ部位に配置する。切断可能な連結プローブに対するＴｍは、（１０ｍＭＭｇ＋＋を含有する緩衝液中で）約７５であると推定される。オリゴヌクレオチドプローブは何れも、５’末端にビオチンを有しており、これにより、ＬｕｍｉｎｅｘＬ１００系による検出のために、レポーター色素ストレプトアビジン−フィコエリトリンの結合が可能になる。本実施例では、「Ｃ」対立遺伝子（標的中のＧ塩基、配列番号２９０）及び「Ｔ」対立遺伝子（表的中のＡ塩基、配列番号２９１）に対応する合成９８マーオリゴヌクレオチド標的を使用した。配列番号２８４から２９１に対応する配列が、下表６８に示されている。このアッセイ中の様々な工程の間における異なるプローブ、標的、タグ及びアンチタグ配列の並置及び相互作用が図４３に示されている。
【０７２３】
【表６８】
0005539325.tif 000198
ＤＮＡ塩基は大文字である。ＲＮＡ塩基は小文字である。ビオチンは、ビオチン−ＴＥＧ基である。Ｘは、Ｃ３スペーサーを表す。ＯＬＡＣ／Ｔタグオリゴヌクレオチドに関しては、「タグ」であり、「アンチタグ」配列を結合する配列の部分には下線が付されている。調査されている標的配列のＳＮＰの部位には、下線が付され、太字で記載されている。
【０７２４】
ｘＭＡＰ小球体へのアンチタグオリゴのカップリング。暗所にて９０分間、室温で、０．１ＭＭＥＳ、ｐＨ４．５緩衝液（Ｍ−８２５０Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｔｃｈ）中の３ｍｇ／ｍＬＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（０３４４９−１Ｇ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｔｃｈ）を用いて、１．２５×１０７のｘＭＡＰＭｕｌｔｉ−Ａｎａｌｙｔｅ  ＣＯＯＨ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（Ｌ１００−Ｃ１２７−０１及びＬ１００−Ｃ１３８−０１，Ｌｕｍｉｎｅｘ，  Ａｕｓｔｉｎ，  ＴＸ）に、５’アミノ基を含有するアンチタグオリゴヌクレオチドを連結させた（修飾された製造業者のプロトコール）。カップリング後に、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で小球体を１回、次いで、０．１％ＳＤＳで１回洗浄した。ＴＥｐＨ７．５の２００μＬ中に、小球体を再懸濁した。小球体の濃度は、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  ＴＭＳ，  Ｆｒｅｙｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＩＬ）下で、血球計算器を用いて計数することによって測定した。５’ビオチン修飾を含有する相補的なオリゴヌクレオチドの２５から２５０ｆｍｏｌｅをハイブリッド形成させ、２μｇ／ｍＬのストレプトアビジンＲ−フィコエリトリン連結物（Ｓ８６６  １  ｍｇ／ｍＬ，  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いてハイブリッドを検出することによって、カップリングの成功を測定した。平均蛍光強度は、濃度依存的な様式で増加しなければならなかった。２つのアンチタグ配列間に、交叉ハイブリッド形成は観察されなかった。
【０７２５】
ＯＬＡアッセイ。２５０ｎＭの最終濃度で、ｒｓ４９３９８２７ＯＬＡＣ及びｒｓ４９３９８２７ＯＬＡＴオリゴ（配列番号２８６から７）、及び２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．６）２５ｍＭＫＡｃ、１０ｍＭＭｇＡｃ、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＮＡＤ及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００緩衝液（ＴａｑＤＮＡリガーゼ緩衝液、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｔｈｃ、ＭＡ）中に１２５ｎＭのＣ、Ｔ又はＣ／Ｔミックステンプレートオリゴヌクレオチド（配列番号２９０から９１）を含有するＲＮアーゼＨ２消化混合物（１０μＬ）を調製した。ピロコッカス・アビッシイＲＮアーゼＨ２の５ｍＵあり又はなしで、６５℃で３０分間、試料を温置した。各ＲＮアーゼＨ２消化反応のために、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ７．６）、２５ｍＭＫＡｃ、１０ｍＭＭｇＡｃ、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＮＡＤ及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の最終緩衝液組成を維持しながら、ＴａｑＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，  ＭＡ）の４０Ｕあり又はなしで、ｒｓ４９３９８２７ＯＬＡ１２Ｃタグ２．５ｐｍｏｌｅ及び２．５ｐｍｏｌｅのｒｓ４９３９８２７ＯＬＡ１２Ｔタグオリゴヌクレオチド（配列番号２８８から９）（各オリゴに対して、１００ｎＭの最終濃度）を添加することによって、２５μＬまで容量を増加させた。連結反応物は４５℃で３０分間温置した。
【０７２６】
蛍光ビーズ上での連結産物の捕捉及びシグナルの検出。各種類の１００ビーズ／μＬの密度で、各連結混合物１０μＬをＨ２Ｏの１５μＬ及びｘＭＡＰビーズ混合物（ビーズの組み１２７及び１２８）の２５μと組み合わせた。試料を７０℃まで９０秒間加熱し、続いて、５０℃で３０分間加熱した。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎろ過プレート（ＭＡＢＶＮ１２５０，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）に試料を移し、５０℃の０．２ＭＮａＣｌ、０．１ＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．０８％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００緩衝液１００μＬで２回洗浄した。ストレプトアビジン−Ｒフィコエリトリン（Ｓ８６６１ｍｇ／ｍＬ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の２μｇ／ｍＬ溶液の７５μＬとともに、微小球体を５０℃で１５分間温置した。ＬｕｍｉｎｅｘＬ１００検出系（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）上で、平均蛍光を測定した。
【０７２７】
結果が図４４に示されている。「Ｃ」対立遺伝子アンチタグ配列を有する蛍光ビーズは、「Ｃ」対立遺伝子標的又は「Ｃ／Ｔ」混合物の存在下で、反応が実行されたときのみ、陽性蛍光シグナルを示した。「Ｔ」対立遺伝子アンチタグ配列を有する蛍光ビーズは、「Ｔ」対立遺伝子標的又は「Ｃ／Ｔ」混合物の存在下で、反応が実行されたときのみ、陽性蛍光シグナルを示した。シグナルはＲＮアーゼＨ２の使用に依存し、標的ＤＮＡの不存在下では観察されなかった。従って、本発明のＲＮアーゼＨ２切断可能オリゴヌクレオチド連結アッセイは、高度に特異的な様式で、標的ＤＮＡ中に存在するＣ／ＴＳＮＰの存在を識別するのに有効であることが示された。
【０７２８】
さらなる確認
公報、特許出願及び特許を含む本明細書に引用されている全ての参考文献は、あたかも、各参考文献が参照により、個別的及び具体的に組み込まれると記されており、その全体が本明細書に記載されているのと同じ程度まで、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０７２９】
本発明の記載における（特に、以下の特許請求の範囲において）「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語及び類似の表記の使用は、本明細書に別段の記載がなければ又は文脈上明白に矛盾しなければ、単数と複数の両方を包含するものと解釈すべきである。「含む」、「有する」、「包含する」及び「含有する」という用語は、別段の記載がなければ、オープンエンドの用語として（すなわち、「含むが、これらに限定されない」を意味する。）と解釈しなければならない。本明細書における値の範囲の表記は、本明細書に別段の記載がなければ、その範囲に属するそれぞれの個別の値を個別的に表記する省略法としての役割を意図したものに過ぎず、本明細書に個別に表記されている如く、それぞれの個別の値が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書に別段の記載がなければ又は文脈上明瞭に矛盾がなければ、あらゆる適切な順序で実施することが可能である。本明細書に提供されているあらゆる全ての例又は例示的用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をより明解にすることを意図するものに過ぎず、別段の記載がなければ、本発明の範囲に対して限定を加えるものではない。本明細書中の何れの用語も、特許請求の範囲に記載されていない何れかの要素を本発明の実施にとって不可欠であることを示すものと解釈すべきでない。
【０７３０】
本発明を実施するために本発明者らに知られた最善の様式など、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。前記記載を読めば、好ましい実施形態の変形は当業者にとって自明となり得る。本発明者らは、当業者がこのような変形を適宜使用することを想定し、本発明者らは、本発明が本明細書中に具体的に記載されているものとは異なって実施されることを予定する。従って、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に表記されている主題のあらゆる改変及び均等物を含む。さらに、本明細書に別段の記載がなければ又は文脈上明確に矛盾しなければ、その全ての可能な変形における上記要素のあらゆる組み合わせが本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３】
0005539325.tif 000251
【図４４】
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【配列表】
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