(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユーザによって入力される予め設定された電流と同程度の定電流を生み出すエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に対して供給するように構成された電気穿孔装置であって、
前記所望の組織中に前記定電流を生み出すエネルギーのパルスを供給できるとともに、フィードバック機構を有する電気穿孔要素と、
空間的配置を成す複数の皮膚電極を有する電極配列を含む皮膚電極アセンブリであって、当該皮膚電極アセンブリは、前記電気穿孔要素からの前記エネルギーのパルスを受けて、該パルスを前記皮膚電極を介して前記所望の組織へ供給し、前記皮膚電極はニードル電極である、皮膚電極アセンブリと、を備え、
前記複数の皮膚電極のうちの少なくとも１つは、前記エネルギーのパルスの供給中に中性であり、前記所望の組織のインピーダンスを測定するとともに、前記インピーダンスを前記電気穿孔要素に対して通信し、
前記フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けることができるとともに、前記定電流が前記所望の組織中で前記エネルギーのパルスの継続期間にわたって一定に維持されるように、前記電気穿孔要素によって供給される前記エネルギーのパルスを調整することにより、前記定電流を維持することができる、電気穿孔装置。
【請求項２】
前記ニードル電極が、筋肉組織を実質的に貫通することなく皮内組織または皮下組織と接触できる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記皮膚電極アセンブリが、
起動スイッチと、
前記皮膚電極アセンブリの起動を報告するための状態インジケータと、
を更に備える、請求項１又は２に記載の装置。
【請求項４】
前記電極配列が少なくとも３つの皮膚電極を備える、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記３つの皮膚電極が二等辺三角形の空間的配置を有する、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記複数の皮膚電極が、プログラムシーケンス下において皮膚電極の制御によりエネルギーのパルスを分散パターンで供給することができ、プログラムシーケンスがユーザによって前記電気穿孔要素へ入力される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項７】
プログラムシーケンスが順次に供給される複数のパルスを備え、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性皮膚電極を伴う少なくとも２つの活性皮膚電極によって供給され、複数のパルスに続くパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性皮膚電極を伴う少なくとも２つの活性皮膚電極のうちの異なる電極によって供給される、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記フィードバック機構がアナログ閉ループ回路によって実行される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記中性皮膚電極が、前記所望の組織のインピーダンスを測定して該インピーダンスを前記フィードバック機構に対して通信し、前記フィードバック機構は、前記インピーダンスに応答して、前記エネルギーのパルスを調整し、予め設定された電流と同程度の値の定電流を維持する、請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
ユーザから入力を受けるとともに、該入力にしたがってエネルギーのパルスを供給するために前記電気穿孔要素を制御するコントローラを更に備える、請求項１〜９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記コントローラがシングルチップマイクロコントローラである、請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記電気穿孔要素と通信するとともに、前記皮膚電極アセンブリと電気的に通信する電流波形生成器を更に備え、ユーザが、プログラムシーケンスを前記電流波形生成器へ通信する前記電気穿孔要素に対してプログラムシーケンスを入力し、前記電流波形生成器が、与えられたプログラムシーケンスにしたがって電流パルス列波形を生成する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記電流波形生成器がパワートランジスタアナログ回路である、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記皮膚電極と所望の組織との間の電気的接続の確立を検査できるインピーダンステスタを更に備える、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記電気穿孔要素と通信する波形ロガーを更に備え、該波形ロガーが、エネルギーのパルスの供給中に電気穿孔電圧および電流波形を連続的に記録できる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１６】
ユーザおよび前記電気穿孔要素と直接に通信する入力装置を更に備え、該入力装置が、入力コマンドを受けて該入力コマンドを前記電気穿孔要素へ通信することができ、該入力装置がテンキーまたはタッチスクリーンである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記電気穿孔要素と通信する状態報告要素を更に備える、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記電気穿孔要素と通信する通信ポート、前記電気穿孔要素と通信するメモリ要素、前記電気穿孔要素と通信する電源、又はこれらの組み合わせを更に備える、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
前記電極配列が、使い捨て可能であるとともに、前記皮膚電極アセンブリに対して取り外し可能に接続され、該使い捨て可能である電極配列が皮膚電極ディスクである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
前記電気穿孔要素が、
コントローラと、
前記コントローラと電子通信する波形生成器と、
前記コントローラと電子通信する波形ロガーと、
前記波形生成器へ電気的に接続されるバッテリと、
を備え、
前記コントローラは、ユーザから入力を受けて、該入力にしたがって前記所望の組織に対して前記エネルギーのパルスを供給するように前記波形生成器に指示するとともに、供給された前記エネルギーのパルスにしたがって前記波形ロガーへデータを通信し、
前記バッテリが前記波形生成器に対して電荷を送り、前記バッテリは、リチウムイオン電池、ニッケル水素電池、鉛酸蓄電池、または、ニッケルカドミウム電池である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２００６年１０月１７日に出願された米国仮出願第６０／８５２１４９号および２００７年１０月１０日に出願された米国仮出願第６０／９７８，９８２号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、特に、哺乳動物の選択された組織、好ましくは皮膚の細胞中への生体分子の導入を容易にするための電気穿孔装置および電気穿孔装置の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
哺乳動物の皮膚または皮膚組織は、特定の領域に分割される細胞の層によって特徴付けられる（図１参照）。最外表面領域が表皮（１．１）であり、この表皮は、５つの副層、すなわち、角質層（１．１．１）と、有棘層（１．１．２）と、透明層（１．１．３）と、顆粒層（１．１．４）と、基底層（１．１．５）とに分けることができる。真皮（１．２）は、表皮の真下に位置されており、血管が非常に良好に新生する領域である。また、この層内には毛根および汗腺も位置される。真皮の真下には皮下層が位置される。
【０００４】
皮膚は、物理的障壁として作用することによってだけでなく、免疫機構におけるその役割によっても保護するように進化してきた。病原体に対する宿主の防御の最前線として、皮膚は、免疫モニタのために良好に備えられている。例えば、多くの他の組織と比較して、皮膚の表皮は、非常に強力な未熟樹状細胞（「ＤＣ」）である多数のランゲルハンス細胞を含んでいる。したがって、皮膚の表皮を標的とする抗原は、強い免疫反応を効率的に引き起こすことができなければならない。しかしながら、表皮（１．１）の角質層（１．１．１）（図１参照）によってもたらされる障壁は、表皮中への抗原の効果的な侵入を妨げる傾向がある。樹状細胞は、皮膚における主要な抗原提示細胞である。皮膚中の多数のＤＣは、皮内（「ＩＤ」）免疫を魅力的な経路にする。
【０００５】
Ｉｎ ｖｉｖｏプラスミド導入技術は、特にそれが皮内（「ＩＤ」）または皮下（「ＳＱ」）組織あるいは細胞に対するプラスミドの導入に関連するときには、従来から範囲が限られてきた。これは、裸のＤＮＡ（プラスミド）導入に起因する生体内発現レベルが低く、それらの一部だけがウイルス遺伝子導入によって達成されるからである。ＩＤまたはＳＱのために適合される用量で供給され得るプラスミドの１回分投与量は、筋内注入（「ＩＭ」）で使用され得る１回分投与量と比べると少ない。多数の研究者は、ＤＮＡベクトルのようなウイルスを動物および人間に注入することに対する安全懸念および毒性懸念について概説してきた（非特許文献１）。その結果、プラスミドＤＮＡの直接的な導入が望ましい供給技術になってきたが、細胞中への効率的な供給およびタンパク質発現レベルが難関となってきた。骨格筋細胞は、ＤＮＡワクチンおよび他の用途のための直接的なプラスミド導入の主要な標的を与えてきた（非特許文献２）。
【０００６】
プラスミド生体内供給における近年の進歩は電気穿孔（「ＥＰ」）の進歩であった。ＥＰは、イオンから薬剤、色素、トレーサ、抗体、および、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡおよびＤＮＡに至る多種多様の分子の供給のために使用される（非特許文献３）。このプロセスは、対象組織を、一時的で且つ可逆的な細孔を細胞膜中に生じさせる短い電界パルスに対して晒す。膜不安定化の期間中に、プラスミドなどの分子が細胞内アクセスを得る場合がある。以前の報告により、ＥＰプロセスの向上が、導入の効果を高め且つ定電流装置を使用することによって目標レベルの抗原を生体内に生成するのに必要なプラスミドの量を低下させることが分かった（非特許文献４）。ＥＰを使用するプラスミド供給の向上により、注入された組織を、血流中へのタンパク質の高い生成および分泌および／または抗原付与のためのバイオリアクタとして使用することができる。発現レベルは、アデノウイルス介在性遺伝子供給の発現レベルと比べて、プラスミド注入だけの場合よりも２〜３オーダーの大きさだけ増大され、一部のケースでは、生理学的な範囲に達する場合がある。
【０００７】
電気穿孔は、遺伝子導入およびＤＮＡワクチン接種の分野の用途に関し、基本的な研究に役立つツールとなってきた。電気穿孔は、プラスミドの注入後に腫瘍細胞を移入するため、または、抗癌剤ブレオマイシンを人間の皮膚腫瘍または皮下腫瘍に対して供給するために好適に使用されてきた。電気穿孔は、様々なホルモン、サイトカイン、酵素、または、抗原をコードする治療遺伝子を送達するためにマウス、ラット、イヌ、および、ブタに対して使用されてきた。標的とされてきた多数の組織および器官としては、肝臓、眼、精巣、心筋、平滑筋、様々な場所の腫瘍、および、骨格筋が挙げられる。
【０００８】
大型哺乳動物およびヒトにおける皮膚ＥＰの課題のうちの１つは、皮膚厚の個々の変動、および、異なる解剖学的部位間の皮膚厚の変動である。例えば、人間の三角筋レベルでの皮膚厚は約２ミリメートル（「ｍｍ」）であるが、一方、肩甲上レベルは約２．６ｍｍであり、腰ではそれが約１．７〜１．９ｍｍであり、大腿ではそれが約１．６〜１．７ｍｍである。皮膚は敏感であり、したがって、電極は、不快感を最小にするためにゲージおよび形態も適合されなければならない。治療目的で特定の度合いの不快感を時として患者が治療中に受け入れることができるが、比較的痛みがない方法だけを予防ワクチン接種のために使用できることが提案されてきた。電極配列形態および特徴、並びに、装置パルスパターンは、この課題に適合されなければならない。電極の先端を約２ｍｍ越えるポイントから、電極先端から電極の１／３のポイントまで、電気穿孔中に最大の均一な電界が生成されることは知られている。
【０００９】
特許文献１は、身体または植物の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を容易にするためのモジュール電極システムおよびそれらの使用ついて記載している。モジュール電極システムは、複数のニードル電極と、皮下注射針と、プログラム可能定電流パルスコントローラから複数のニードル電極への導電リンクを形成する電気コネクタと、電源とを備える。オペレータは、支持構造体に装着される複数のニードル電極を把持することができるとともに、これらのニードル電極を身体または植物の選択された組織中へ確実に挿入することができる。その後、皮下注射器によって生体分子が選択された組織へと供給される。プログラム可能定電流パルスコントローラが作動され、定電流電気パルスが複数のニードル電極に対して印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞中への生体分子の導入を容易にする。特許文献１の全体の内容は、参照により本明細書の記載に組み込まれる。
【００１０】
特許文献２は、身体または植物の選択された組織の細胞中への生体分子の導入を効果的に容易にするために使用可能な電気穿孔装置について記載している。電気穿孔装置は、その動作がソフトウェアまたはファームウェアによって定められる動電装置（「ＥＫＤ」装置）を備える。ＥＫＤ装置は、パルスパラメータの入力およびユーザ制御に基づいて、一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを配列中の電極間に生成するとともに、電流波形データの記憶および取得を可能にする。また、電気穿孔装置は、ニードル電極の配列と、注入ニードルのための中央注入チャネルと、取り外し可能なガイドディスクとを有する交換可能な電極ディスクも備える。特許文献２の全体の内容は、参照により本明細書の記載に組み込まれる。
【００１１】
特許文献１および特許文献２に記載された電極配列および方法は、筋肉などの組織だけでなく他の組織や器官への深部透過に適合化されている。電極配列の構成により、（選択された生体分子を供給するための）注射針も対象器官へと完全に挿入され、また、電極によって予め輪郭付けられた領域で、注入物が対象組織に対して垂直に投与される。特許文献１および特許文献２に記載された電極は、２０ｍｍの長さおよび２１ゲージであることが好ましい。
【００１２】
広義に、電気穿孔は、生体膜中に微小通路（孔）を生じさせるための膜貫通電界パルスの使用である。これらの孔は一般に「電気穿孔」と呼ばれている。それらの存在により、生体分子、イオン、および、水は、膜の一方側から他方側へと通過できる。したがって、電気穿孔は、薬剤、ＤＮＡ、または、他の分子を多細胞組織中へ導入するために使用されてきており、特定の病気の治療に有効であることが判明するであろう。しかしながら、生体におけるＥＰの使用は、生成された熱に起因する細胞死および電気穿孔を再び密閉することができないことを含む幾つかの問題を有する。薬剤または生体分子の有利な効果は、過度な細胞加熱および細胞死が起こることから、ＥＰ方法では極めて制限される。
【００１３】
電気穿孔のプロセスを更に良く理解するためには、幾つかの簡単な方程式を見ることが重要である。組織中に埋め込まれた電極の両端間に電位差（電圧）が印加されると、その電位差は、印加電圧（「Ｖ」）を電極間の距離（「ｄ」）で割って得られる電界（「Ｅ」）を生成する。
Ｅ＝Ｖ／ｄ
【００１４】
電界強度Ｅは、被検者の細胞中へ薬剤または生体分子を送達するための電気穿孔プロトコルを編成するときには非常に重要な値である。電界強度は、電圧が与えられると電極間の距離が減少されるにつれて電界強度が増大するという点で、電極間の距離に反比例する。しかしながら、絶縁電極を用いて組織中に電界を形成できる（すなわち、電界を形成するためにイオンの流れは不要である）ことに留意されたい。理論への束縛を望むものではないが、イオンの流れが電極を開放し且つ電気穿孔中に被検者の細胞中への分子の移動を可能にすると考えられている。電位差を有する２つのポイント間での導体または媒体中の電荷の流れは、電流と呼ばれる。電極間の電流は、組織中のイオンまたは荷電粒子によって達成され、これは組織間および患者間で変動し得る。また、組織中の導電イオンの流れは、電気パルスの開始から電気パルスの終了まで、電極間で変動し得る。
【００１５】
組織の導電イオンの含有率が低い場合には、抵抗が増大され、熱が生成されて、細胞が殺される。オームの法則は、電流（「Ｉ」）、電圧（「Ｖ」）、および、抵抗（「Ｒ」）の関係を表わしている。
Ｒ＝Ｖ／Ｉ
【００１６】
２つの電極間の組織の抵抗は、組織中に存在する荷電粒子に応じて変化する。したがって、組織の抵抗は、電気パルスの開始から電気パルスの終了まで変化する。
【００１７】
加熱は、電極間インピーダンス（すなわち、抵抗とリアクタンスとの組み合わせであり、オームで測定される）の積であり、電流、電圧、および、パルス継続時間の積に比例する。また、加熱は、電流の平方およびパルス継続時間（「ｔ」、時間）として表わすこともできる。例えば、電気穿孔中、支持組織中に生成される加熱または電力（「Ｗ」、ワット）は、以下の方程式によって表わすことができる。
Ｗ＝Ｉ２Ｒｔ
【００１８】
広義には、金属電極または誘電電極が組織と接触した状態で配置され、また、所定の電圧の短いパルスが電極に課され、膜孔を一時的に開放するように細胞が促される。電気穿孔に関して現在説明されるプロトコルは、電極間の距離に比例する電圧の短いパルスに依存し且つ電流または組織抵抗に関係ない結果的な電界強度Ｅに関して規定される。したがって、異なるパルス電圧電気穿孔プロトコルを用いて様々な成功をもたらす抵抗または加熱を電気穿孔組織に関して決定することができない。確かに、効果的な電気穿孔を容易にする電気穿孔プロトコルと細胞を死なせる電気穿孔プロトコルとの間の電圧パルスの上限振幅の違いは非常に小さい。また、短い電圧パルスの上限振幅によって引き起こされる細胞の加熱と細胞の死との間で明確な相関関係が観察された。したがって、電極間の細胞の過熱は、任意の所与の電気穿孔電圧パルシングプロトコルの無効果性の主な原因としての役割を果たす。更に、電極間の電流は、電極両端間の電圧ではなく、任意の所与のパルシングプロトコルの有効性の主な決定因子としての役目を果たす。
【００１９】
被検者の細胞へ電気が供給されると、以下の式にしたがって、電流（「Ｉ」）および時間（「ｔ」）である電荷（「Ｑ」）に関して所定用量の電気を正確に表わすことができる。
Ｑ＝Ｉｔ
【００２０】
電流が一定でない場合、ＱはＩの時間積分を表わす。この点で、荷電粒子は、それらがイオンまたは分子である場合、同様の方法で反応する。例えば、電荷の標準単位（クーロン）を規定するために銀イオンが電極上に堆積されると、先に規定された電荷だけが重要である。電流を生成するためには、特定の最小電圧が存在しなければならないが、堆積されるイオンの量を所定の電圧から決定することができない。それに対応して、電気穿孔器において細胞へ供給される荷電粒子の量を、電極に課される電圧から得ることができない。
【００２１】
電気穿孔の有効性は、パルス強度に関して閾値が存在し、この閾値を下回ると電気穿孔が起こらず、また、上限が存在し、この上限を上回ると細胞が破壊されるという事実によって制限される。実験的証拠は、上限と下限との間の差が非常に小さく、そのため、必要以上の実験をすることなく有効なパルシングプロトコルを設計することが非常に難しいことを示している。これは、大抵、皮膚−層の厚さおよび数が異なる表皮および真皮の細胞、脂肪、筋膜、毛細血管から小血管までの寸法が異なる血管などの不均質な細胞組成を本質的に有する組織を対象とするときに、技術の使用を困難にする。個体間および各個体の皮膚表面上の場所間で変動し得る瞬間の状態を即座に解析することができ且つ出力を特定の状態に適合させることができる真のソフトウェア駆動装置だけがこれらの要件を満たす。また、電極は、皮膚形態に適合されなければならないとともに、組織損傷および出血を防止しなければならない。
【００２２】
電気穿孔装置へと向けられた文献は、電極装置および電気穿孔の生体内方法の両方の有用性について説明している。それに対応して、特定の電極または電気穿孔のための方法を特許請求する多くの米国特許が存在する。例えば、特許文献３は、化粧品用途における物質の電気的に支援される局所供給のための方法および装置について記載している。特許文献４は、患者の生体血液細胞中へ生体分子を注入するための電気穿孔装置を通じた流れを教示する。特許文献５および特許文献６は、薬剤および遺伝子の電気穿孔媒介供給のための方法および装置について記載している。より具体的には、これらの特許は、電気穿孔と化学療法薬との組み合わせを用いて腫瘍を治療して生体内で腫瘍の退縮を引き起こすための電気穿孔治療（「ＥＰＴ」）のための方法および装置について記載している。特許文献７は、組織の電気穿孔治療のためにニードル電極の配列をプログラムする方法について記載している。特許文献８は、結合電極テンプレートを有する電気穿孔装置について記載している。特許文献９は、トランス表面分子供給の装置および方法のための電極アセンブリについて記載している。特許文献１０は、薬剤および遺伝子を組織中へ電気穿孔するための低侵襲な装置および方法について記載している。特許文献１１は、ユーザ指定のパルシングおよび温度プロファイルスキームにしたがって電界を形成して印加することよってプロセス中に温度を制御するための電気穿孔装置について記載している。特許文献１２は、電界電気穿孔装置を利用する治療剤の導入のための方法について記載している。特許文献１３は、ユーザ指定のパルシングスキームにしたがって電界を形成して印加するための電気穿孔方法および装置について記載している。特許文献１４は、生体内電気穿孔治療のためのニードル配列形態を選択的に適用する方法について記載しており、また、特許文献１５は、電極間の距離を検出して前記電極間の距離に比例する距離信号を生成する検出素子と、前記電極間の距離に比例して高振幅電気信号のパルスを電極に対して印加するための前記距離信号に応答する手段とを用いて患者の身体の一部に対して電気穿孔を適用するための電極装置について記載している。特許文献１６は電気穿孔装置および注入装置を開示している。これらの引用特許の全ては、参照により本明細書の記載に組み込まれる。本明細書中で与えられる新規な皮膚電極と組み合わせて使用され且つ本明細書中に記載される実験で使用される装置は、特許文献１７および特許文献２（参照により本明細書の記載に組み込まれる）の特許請求の範囲に記載されている。
【００２３】
生体内でのプラスミド発現の向上の進展および分泌タンパク質の生理的レベルの達成は、最近、電気穿孔を使用して報告された（非特許文献５）。研究により、成長ホルモン放出ホルモン（「ＧＨＲＨ」）を発現するプラスミドの注射後の電気穿孔が、大型哺乳動物にスケールアップ可能であり、大型哺乳動物を治療する分泌タンパク質を安定して生成するためのアプローチを示すことが分かっている（非特許文献６および非特許文献７）。依然として、特にワクチン接種目的および遺伝子治療のための効率的な皮膚電気穿孔において、並びに、侵襲性および痛みの減少を伴う電気穿孔において、電気穿孔技術の更なる向上が必要とされる。
【００２４】
以前の研究者は、概念的には電極間で所定の電圧を利用する定電圧システムに基づくプラスミドＤＮＡ導入のための電気穿孔装置を利用してきた。組織中に埋め込まれる電極間のインピーダンスがケース毎にあるいは組織毎に変わることができるため、所定の電圧が所定の電流を生み出さない。所定の電圧パルスは、完全な方形波機能の損失に加えて、パルスの継続期間中に筋肉組織を通じて流れる電流の不規則な増大を引き起こす。それに対して、定電流源は、実際には、筋肉組織を通じた方形波機能定電流を維持する。しかしながら、既存の市販の電気穿孔装置は、細胞が晒される電流の正確な大きさの測定を可能にするように設計されているファームウェアを有していない。従来の電気穿孔装置を用いて生成される不規則な電流は、容易に細胞を殺すことができる量の熱を組織中に生成する場合がある。例えば、２５オーム（「Ω」）の典型的な負荷インピーダンスにおける５アンペア（「Ａ」または「Ａmp」）の平均電流を伴う典型的な電子の５０ミリ秒（ｍｓ）のパルスは、理論的に、組織の温度を７．５℃上昇させる可能性があり、これは細胞を殺すのに十分である。感電によって引き起こされる組織損傷の物理的過程はLee等によって検討されている（非特許文献８）。したがって、細胞に対して供給される電気量を効果的に制御することにより細胞の破壊を制限しつつ熟練した電気穿孔を達成する手段を設けることによって定電圧電気穿孔に関連する技術的問題を避ける必要がある。
【００２５】
多くの電極に存在する困難は、トランスフェクトされる材料が堆積されるポイントである配列の中心にパルスエネルギが集中されるという事実から生じる。結果として、エネルギ供給の空間的な分布は、非常に不均一な特徴を成す。それ故、電極アセンブリにより包囲される容量の細胞の1部のみが電気穿孔される。したがって、一部の用途においては、細胞膜の管路に衝突するイオン流動を正確に制御することにより電極間空間内の細胞に対して供給される電気の量を効果的に制御する手段を設ける必要性もある。また、大型動物用途および人間のための商業的に存在する電極は、一般に、それらが一般に非常に長く不適切なゲージおよび不適切な斜め方向を成しているため、樹状細胞のＩＤまたはＳＱターゲティングを行なうことができない。したがって、皮膚電気穿孔器のための特定の用途においては、皮膚組織中への、例えば動物におけるＩＤ空間またはＳＱ空間へのプラスミドなどの生体分子の生体内供給を容易にする必要がある。
【００２６】
更に、市販の電気穿孔装置およびニードル配列は、一般に、組織の抵抗、厚さ、および、局部状態の個々の変動間および変動内の制御を行なうことができない。これらの器具を用いると、個々の組織抵抗または厚さに関係なく、電極を通じて所定の電圧が供給される。したがって、パルス前およびパルス中の個々の変動を考慮した適合された電気穿孔を可能にする電気穿孔装置および皮膚電極の必要性もある。
【００２７】
また、電流を供給するために皮膚・筋肉侵襲的な交換可能なニードル配列を電極として使用する電気穿孔装置は、ニードル配列交換が行なわれるときに滅菌状態のメンテナンスを必要とする。これは、医療行為および規制順守の両方の観点から必要である。同時に、治療および予防の両方の目的の集団ワクチン接種での使用および低い製造コストを可能にするために、使い捨て可能な皮膚電極が必要とされる。したがって、ニードル皮膚配列の容易な交換を可能にする皮膚電極ディスクを提供する必要もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】Draghia-Akliらによる米国特許第７，２４５，９６３号
【特許文献２】Smithらによって提出された米国特許出願公開公報第２００５／００５２６３０号
【特許文献３】Zhangの米国特許第６，３０２，８７４号
【特許文献４】Hofmannらの米国特許第５，６７６，６４６号
【特許文献５】Hofmannらの米国特許第６，２４１，７０１号
【特許文献６】Hofmannらの米国特許第６，２３３，４８２号
【特許文献７】Hofmannらの米国特許第６，２１６，０３４号
【特許文献８】Hofmannらの米国特許第６，２０８，８９３号
【特許文献９】Hofmannらの米国特許第６，１９２，２７０号
【特許文献１０】Hofmannらの米国特許第６，１８１，９６４号
【特許文献１１】Nandaらの米国特許第６，１５０，１４８号
【特許文献１２】Hofmannらの米国特許第６，１２０，４９３号
【特許文献１３】Hofmannらの米国特許第６，０９６，０２０号
【特許文献１４】Hofmannらの米国特許第６，０６８，６５０号
【特許文献１５】Hofmannらの米国特許第５，７０２，３５９号
【特許文献１６】Mathiesenらによる米国特許出願公開公報第２００５／００７０８４１号
【特許文献１７】米国特許出願公開公報第２００４／０１６７４５８号
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Fredericksonら、Mol. Ther. 8:8-10 (2003)
【非特許文献２】Prud’hommeら、Curr. Gene Ther. 6:243-273 (2006)
【非特許文献３】Gehl, Acta Physiol Scand. 177:437-447 (2003)
【非特許文献４】Draghia-Akli and Smith, Page245 in Gene Therapy-Therapeutic Mechanism and Strategies, N. S. Templeton and D. D. Lasic, eds. Marcel Dekker, Inc., New York. (2003)
【非特許文献５】Draghia-Akliら、Technology in Cancer Research & Treatment 1:365-371(2002)
【非特許文献６】Draghia-Akliら、動物サイエンス８１の機関紙：2301-2310(2003)
【非特許文献７】Draghia-Akliら、FASEB J 17：526-528(2003)
【非特許文献８】Lee et al., Annu. Rev. Biomed. Eng 2；477-509.：477-509(2000)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明の１つの態様では、定電流を哺乳動物の組織に対して供給することにより該組織で電気穿孔を行なう電気穿孔装置が提供される。前記組織は皮膚組織であることが好ましい。幾つかの実施形態において、電気穿孔装置は、ユーザによって入力される予め設定された電流と同程度の定電流を生み出すエネルギーのパルスを哺乳類の所望の組織に対して供給するように構成される。電気穿孔装置は、電気穿孔要素と皮膚電極アセンブリとを備える。電気穿孔要素は、所望の組織中に定電流を生み出すエネルギーのパルスを供給できるとともに、フィードバック機構を含んでいる。皮膚電極アセンブリは、空間的配置を成す複数の皮膚電極を有する電極配列を含んでいる。この場合、皮膚電極アセンブリは、電気穿孔要素からのエネルギーのパルスを受けて、該パルスを皮膚電極を介して所望の組織へ供給する。複数の皮膚電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの供給中に中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定するとともに、該インピーダンスを電気穿孔要素に対して通信する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受けることができるとともに、定電流を維持するために電気穿孔要素によって供給されるエネルギーのパルスを調整することができる。
【００３２】
本発明の１つの態様では、ユーザによって入力される予め設定された電流と同程度の定電流を哺乳動物の所望の組織で生み出すためにエネルギーのパルスを該所望の組織に対して供給するように構成された電気穿孔ハンドルアセンブリが提供される。ハンドルアセンブリは、空間的配置を成す複数の皮膚電極を有し、皮膚電極のうちの少なくとも１つがエネルギーのパルスの供給中に中性であり且つ所望の組織のインピーダンスを測定する、皮膚電極配列と、皮膚電極配列と通信し、皮膚電極を通じたエネルギーのパルスの供給を制御するコントローラと、フィードバック機能を実行するための手段であって、フィードバック機構が、測定されたインピーダンスを中性皮膚電極から受け且つ定電流を維持するために供給されるエネルギーのパルスを必要に応じて調整するソフトウェアまたはハードウェアによって実行される手段と、を備える。
【００３３】
本発明の１つの態様では、哺乳類の組織の細胞に対して生体分子を供給するために本発明の電気穿孔装置を使用する方法が提供される。幾つかの実施形態において、前記方法は、所望の皮膚組織に対してエネルギーのパルスを供給して、ユーザによって入力される予め設定された電流と同程度の定電流を生み出すために、本明細書中に記載される皮膚電気穿孔装置を使用することを含む。この方法は、筋肉組織を実質的に貫通することなく、複数のニードル皮膚電極を皮膚組織中へ挿入することと、複数のニードル皮膚電極に対してエネルギーのパルスを印加して、予め設定された電流に等しい電流を皮膚組織中に供給することと、複数のニードル皮膚電極のうちの中性電極を用いて皮膚組織のインピーダンスを測定するとともに、電気穿孔装置のフィードバック機構を使用して、測定されたインピーダンスに応じて、印加されるエネルギーのパルスを調整することにより、皮膚組織に対して供給される電流を一定に維持することとを含む。
【００３４】
本発明の幾つかの実施形態では、複数のニードル皮膚電極を有し且つ電流波形生成器と電気的に通信する皮膚電極アセンブリを設ける工程と、哺乳類の筋肉組織を実質的に貫通することなく哺乳動物の皮膚組織と複数のニードル皮膚電極とを接触させる工程と、接触された皮膚組織を実質的に一定の電流に暴露するのに有効な条件下で且つある時間にわたって、電流波形生成器からのエネルギーの電気パルスを複数のニードル皮膚電極に対して印加する工程とを備える方法が提供される。
【００３５】
本発明の多くの目的および利点は、添付図面を参照することによって当業者により更によく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】皮膚の構造図を示している。最外表面領域が表皮（１．１）であり、この表皮は、５つの副層、すなわち、角質層（１．１．１）と、有棘層（１．１．２）と、透明層（１．１．３）と、顆粒層（１．１．４）と、基底層（１．１．５）とに分けることができる。真皮（１．２）は、表皮の直下に位置されており、血管が非常に良好に新生する領域である。また、この層内には毛根および汗腺も位置する。真皮の直下には皮下層が位置する。
【図２Ａ】本明細書中に記載されるＥＰ装置の好ましい実施形態のシステム図を示している。
【図２Ｂ】本明細書中に記載されるＥＰ装置の一部であってもよいコントローラの一例を示している。
【図２Ｃ】２５ｋｇのブタの皮膚のＩＤ層およびＳＱ層中へのプラスミド製剤注入後に電気パルスを供給するためにパルス生成器としての皮膚ＥＰ装置および前記皮膚電極配列を使用したパルスシーケンスの終了時にダウンロードされる実際のパルスシーケンス記録の一例を示している。（「２．１」）は、赤外線ポートを介してパーソナルコンピュータまたは携帯型装置へダウンロードされたファイル名を示し、（「２．２」）は、ＥＰプロセスが開始できる前の必須条件として数値パッドにより皮膚ＥＰ装置へ直接に入力される被験体数を示し、（「２．３」）は、パルスシーケンスにおけるパルス数、パルス前およびパルス間の待ち時間（秒「ｓ」）、パルス幅（ミリ秒「ｍｓ」）、パルス電流振幅（アンペア「Ａ」）を含むオペレータにより選択される電気パルスの特性を示し、（「２．４」）は、皮膚電極１、２、３のそれぞれに関して各パルス中の各電極の電荷を示しており、各電極は、以下の位置、すなわち、プラス「ｐｏｓ」、マイナス「ｎｅｇ」、または、オフ「ｏｆｆ」のうちのいずれかが可能であり、「ｏｆｆ」電極は、各パルスの前、最中および後において装置へのバック情報（「フィードバック」）を送信し、（「２．５」）は、パルスシーケンスの各パルス中の注入領域での実際のアンペア数（「Ａ」）、電圧（「Ｖ」）、および、皮膚組織抵抗Ｚ（「オーム」）を示している。０．１〜０．２ｍｓ毎にフィードバックが起こるため（このケースでは、パルスの長さが５２ｓであった）、例示目的のため、フィードバックファイルの僅かな割合だけが含められた。
【図３】皮膚ＥＰ装置による皮膚電極供給を使用した電気パルス供給の際にダウンロードされたデータのグラフィック表示の一例を示している。グラフは、パルス１（「３．１」）における皮膚ＥＰ装置により測定される電圧（「３．１．１」）並びに電流（「３．１．２」）、および、パルス２（「３．２」）における皮膚ＥＰ装置により測定される電圧（「３．２．１」）および電流（「３．２．２」）の両方を示している。パルス１（「３．３」）およびパルス２（「３．４」）に関して組織抵抗（電気パルス中に測定される）も表示されている。
【図４】皮膚ＥＰ装置において、大きい皮膚電極配列を用いた皮膚に対する電気パルスの供給を行った際にダウンロードされたデータのグラフィック表示の一例を示している。グラフは、パルス１（「４．１」）における皮膚ＥＰ装置により測定される電圧（「４．１．１」）および電流（「４．１．２」）の両方、パルス２（「４．２」）における皮膚ＥＰ装置により測定される電圧（「４．２．１」）および電流（「４．２．２」）、および、パルス３（「４．３」）における皮膚ＥＰ装置により測定される電圧（「４．３．１」）および電流（「４．３．２」）を示している。パルス１（「４．４」）、パルス２（「４．５」）、および、パルス３（「４．６」）に関して組織抵抗（電気パルス中に測定される）も表示されている。
【図５】詳細な特性を含む皮膚電極配列の概略表示を示している。すなわち、（「５．１」）単一のニードル電極の挿入端の長さおよび角度を示す側面図；（「５．２」）逆トラカールポイントにおける角度および度数を示す正面図；（「５．３」）ニードル電極仕様を示す注記。
【図６】皮膚電極ハンドルの視覚表示（「６．１」）および概略図（「６．２」）を示している。（「６．１．１」）インピーダンスチェックを起動させ、その後、電気穿孔シーケンスを起動させるために使用されるトリガ；（「６．１．２」）「ＬＥＤ」は、皮膚ＥＰ装置が処置できる状態又はエラー時にそれぞれ緑または赤を表示する；（「６．１．３」）皮膚電極配列が所定の位置にロックされる；（「６．１．４」）皮膚電気穿孔ハンドルと皮膚ＥＰ装置ユニットとの間の個々のワイヤおよび信号を収容するコード；（「６．１．５」）その詳細が図８の電気配線図に描かれる個々のワイヤ；（「６．２．１」）トリガ概略図；（「６．２．２」）ＬＥＤ概略図；（「６．２．３」）電気穿孔パルスシーケンスの完了後における皮膚電極ハンドルからの抜き出しを容易にするために使用される皮膚電極配列上の隆起部を示す概略図；（「６．２．４」）皮膚電極配列のニードル電極の概略図；（「６．２．５」）ハンドル上の所定位置にロックされた皮膚電極配列の概略側面図；（「６．２．６」）（ハンドル上の）ロッキングアームおよび戻り止めの概略図；（「６．２．７」）回路接続のための接続部を受けて形成するために使用される皮膚電極ハンドル内のソケットを示す概略図；（「６．２．８」）その詳細が図８に示される個々のワイヤを収容するコードを示す概略図である。
【図７】ハンドル上に装着された皮膚電極配列を示している。すなわち、（「７．１」）皮膚電極配列中の個々のニードル電極と皮膚電極ハンドルとの間の電気的な接続部を受けて形成するための個々のソケットの概略側面図。
【図８】配列・ハンドルアセンブリのための電気配線図を示している。
【図９】処置対象間でのハンドルの滅菌ローディングを可能にするマルチ皮膚電極配列二つ折り型パッケージ容器の概略図を示している。（「９．１」）蓋、（「９．２」）配列を収容するように特別に設計された個々のウェルを含むベース、（「９．３」）ウェルの側面図。
【図１０】骨格筋（ＬＡ）に対するプラスミド供給のために一般に使用される電極および条件と比較した、皮膚電極配列および皮膚固有ＥＰ条件（ＭＡ）を使用する皮膚ＥＰ装置を用いて、異なる量のプラスミドｐＳＰ５−１２−ＧＦＰが注射され且つ電気穿孔された動物内のＧＦＰの平均発現レベルを示している。
【図１１】距離Ｌ＝ｋｘｎである３電極ニードル配列を示している。この場合、ｎは電極の数を表わし、ｋは比例定数を表わしている。
【図１２】個々のＳＥＡＰ発現プラスミドを使用した電気穿孔時から１１日にわたるＳＥＡＰ発現レベル（ｐｇ／ｍＬ／ｋｇ）のグラフを示している。
【図１３】様々なサンプルにおける１１日目のＳＥＡＰ発現レベルのグラフを関連するＥＬＩＳＡ結果（平均抗体希釈状態）と共に示している。
【図１４】個々のＩＧＦ−Ｉ発現プラスミドを使用した電気穿孔時ときから１１日にわたるＩＧＦ−Ｉ発現レベル（ｍｇ／ｍＬ）のグラフを示している。
【図１５】ブタの皮膚でのＩＤ／ＳＱプラスミド投与およびその後の電気穿孔（ＥＰ）の後における緑色蛍光タンパク質発現を表わす蛍光画像を示している。プラスミドは、ＩＭ＋ＥＰ（Ａ）のために使用される通例の大きなＥＰ配列または皮膚ＥＰ（Ｂ）を用いて異なる投与量および体積で送達された。
【図１６】ｐＳＥＡＰ投与後の４〜１１日目においてブタ血清で検出される分泌型胎性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のレベルを示すグラフを表わしている。動物は、濃縮製剤（１０ｍｇ／ｍＬ）または通常の製剤（２ｍｇ／ｍＬ）において同投与量のプラスミド（１ｍｇ）を摂取させた（ｎ＝５／グループ）。データはグループ平均反応±ＳＥＭとして示されている。
【図１７】非ヒト霊長類研究計画を示している。図１７Ａは、０週目および４週目において低投与量（抗原毎に０．２ｍｇ）のＨＩＶ−１イムノゲンおよびプラスミドにコードされたアカゲザルＩＬ−１２を用いてアカゲザルを２回免疫し、その後、８週目および１２週目において更に高い投与量（抗原毎に１．０ｍｇ）で２回免疫したことを示している。免疫アッセイのため、血液サンプルをほぼ２週間毎に採取した。各免疫の２週間後に、ＥＬＩＳｐｏｔを行い、また、ＥＬＩＳＡを０、４、８、１２、１８週目に行なった。図１７Ｂは、皮膚電極配列およびハンドルの図を示している。皮膚ＥＰは、長さが３〜５ｍｍでステンレススチール製の２６ゲージ電極を３つ有する使い捨て配列から成る。配列は、装置のハンドルアプリケータに対して取り付けられる。ＥＰ処置は、ハンドルアプリケータ上のトリガボタンを押すことによって始めることができる。
【図１８】プラスミドにコードされたＩＬ−１２のＩＤ／ＳＱ共注射およびその後のＥＰを伴う、ＨＩＶ−１イムノゲンに対する高い細胞性免疫反応を示すグラフを表わしている。ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔは、各免疫の２週間後に行った。ｅｎｖに対する反応が白色のバーとして描かれており、また、ｇａｇが黒色のバーとして描かれている。この場合、データは、積層グループ平均反応±ＳＥＭとして示されている。
【図１９】ＩＤ／ＳＱ  ＥＰを用いたＨＩＶ−１イムノゲンに対する高いメモリ応答を示すグラフを表わしている。最後の免疫の１０週間後に、ＩＤ／ＳＱグループおよびＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループにおけるｇａｇおよびｅｎｖに対する抗原特異的メモリ応答を測定するためにＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。データは、グループ平均反応±ＳＥＭとして示されている。
【図２０】ＨＩＶ−１ｇａｇ、ｅｎｖ、および、プラスミドｒｈＩＬ−１２のＩＤ／ＳＱ免疫後のＴＨ２ではなく、ＴＨ１媒介性の細胞反応の誘導を示すグラフを表している。Ｇａｇまたはｅｎｖ特異的なＴＨ２反応の誘導を評価するためにＩＬ−４ＥＬＩＳｐｏｔを１０週目に行った。ｅｎｖに対する反応が白色のバーとして描かれており、また、ｇａｇが黒色のバーとして描かれ、データは、積層グループ平均反応±ＳＥＭとして示されている。
【図２１】ｐ２４抗体（図２１Ａ）およびｇｐ１６０抗体（図２１Ｂ）の誘導を示すグラフを表わしている。血清は、０．４、８、１２、１８週目に採取した。ＩＤ／ＳＱ免疫グループおよびＩＤ／ＳＱ＋ＥＰ免疫グループにおいて、ｇａｇ抗体力価およびｅｎｖ抗体力価を、ｐ２４およびｇｐ１６０ＥＬＩＳＡによってそれぞれ測定した。データは、グループ平均反応±ＳＥＭとして示されている。
【図２２】マウスの異なる筋肉で測定したＳＥＡＰ発現を示す棒グラフを示している。マウスには、前脛骨筋（ＴＡ）または腓腹筋（Ｇ）中に、１０μｇのＣ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドを注射し、４ｓまたは８０ｓの遅延後にＥＰを行った。また、マウスには、ＥＰを伴うことなく（ＥＰ無し）１０μｇのｐｆＣ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドも注射した。血清ＳＥＡＰレベルは、ＥＰを伴うことなくプラスミドを受けたコントロールマウスと比べて、ＴＡ筋およびＧ筋注射したマウスの方が高かった（＊Ｐ＜１．３Ｅ−２１）。プラスミドバックボーンを有しない発現カセット（ＮＢ）を注射した後に電気穿孔したマウスは、ＥＰを伴わないＮＢグループよりも高いＳＥＡＰレベルを有していた。しかしながら、ＮＢグループでは、同じ筋肉にＣ５−１２−ＳＥＡＰを投与したマウスよりも有意に低かった（ＴＡ４ｓと比べたＮＢ４ｓ＊＊Ｐ＜０．００８；ＴＡ８０ｓと比べたＮＢ８０ｓ＊＊＊Ｐ＜０．００４）。ＴＡ筋中に注射したマウスは、Ｇ筋中に注射した動物よりも高い発現を生じ、また、ＴＡ筋における注射とＥＰとの間の遅延を８０ｓから４ｓへと短くしても発現に影響は無かった。
【図２３】それぞれ２５μＬまたは５μＬの総量にて２ｍｇ／ｍＬまたは１０ｍｇ／ｍＬの濃度で５０μｇのＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドを筋内（ＩＭ）または皮内（ＩＤ）に注射した後にマウス内で定量化した平均ＧＦＰ発現量を示す棒グラフを表わしている。ＧＦＰ発現は、２ｍｇ／ｍＬ濃度で投与した動物と比べて、１０ｍｇ／ｍＬ濃度で投与したグループの方が最も高かった（ＩＤおよびＩＭ、＊Ｐ＝０．０１）が、ＩＤ注射およびＩＭ注射部位は、互いに比べると、同程度の全体的スコアをもたらした。
【図２４】様々な電流設定下においてマウスの異なる筋肉で測定した、遍在性ＣＭＶプロモータによって駆動されたＳＥＡＰ発現を示す棒グラフを表わしている。プラスミド製剤、すなわち、生理食塩水、生理食塩水＋ＬＧＳ、水、または、水＋ＬＧＳを検査した。ＴＡ筋中の０．１Ａでの生理食塩水＋ＬＧＳ製剤が最も高い発現をもたらした。水中に配合されたプラスミドを摂取させ、０．２Ａでの電気穿孔を行った動物は、同じ筋肉において０．１Ａで行った動物よりも有意に低いＳＥＡＰレベルをもたらした。（ＴＡに関しては＊Ｐ＜０．０５、および、Ｇに関しては＊＊Ｐ＜０．００１）。水＋ＬＧＳがプラスミド製剤として使用された場合、血清ＳＥＡＰレベルの差異は、ＴＡ筋においては有意性を示さないが、Ｇ筋においては有意性を示した（＊＊＊Ｐ＜０．０４）。
【図２５】処置後１４日目に測定した抗ＳＥＡＰ抗体における力価を示しており、この力価は、プラスミドが（Ａ）生理食塩水＋ＬＧＳ中で配合されたときにはＧ筋中で且つプラスミドが（Ｂ）水＋ＬＧＳ中で配合されたときにはＴＡ筋中で０．１Ａの電流を用いて処置したマウスにおいて最も高かった。
【図２６】リレー接点マトリクスの１つの実施形態の概略図を示している。
【図２７Ａ】電気穿孔機能フローのフローチャートの第１の部分を示している。
【図２７Ｂ】電気穿孔機能フローのフローチャートの第２の部分を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下の簡略化されたあるいは短縮された定義は、本発明の好ましい実施形態の理解を助けるために与えられている。本明細書中で与えられる簡略化された定義は、決して網羅的ではなく、また、当分野で理解される定義あるいは辞書の意味に矛盾するものでもない。簡略化された定義は、本明細書中では、当分野において知られる定義を補いあるいはより明確に定めるために与えられる。
【００３８】
用語「定電流」は、本明細書中では、組織または前記組織を画定する細胞により、この組織に供給される電気パルスの継続期間にわたって受けられるあるいは経験される、電流を規定するために使用される。電気パルスは、本明細書に記載される電気穿孔装置から供給される。この電流は、前記組織においては、電気パルスの継続期間にわたって一定のアンペア数で維持される。これは、本明細書に提示される電気穿孔装置は好ましくは瞬時的フィードバックであるフィードバック要素を有しているからである。フィードバック要素は、パルスの継続期間の全体にわたって組織（または細胞）の抵抗を測定することができ、このフィードバック要素によって、電気穿孔装置は、その電気エネルギー出力を変える（例えば、電圧を増大させる）ことができ、そのため、同組織中の電流は、電気パルスの全体にわたって且つ各パルス間で一定に維持される。幾つかの実施形態において、フィードバック要素はコントローラを備えている。
【００３９】
用語「フィードバック」または「電流フィードバック」は、互換性をもって使用され、電極間における組織の電流を測定し且つそれに応じて電流を一定レベルに維持するためにＥＰ装置により供給されるエネルギー出力を変えることを含む、提示される皮膚ＥＰ装置の能動的な応答を意味している。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処置の開始前にユーザによって予め設定される。好ましくは、フィードバックは、皮膚ＥＰ装置の電気穿孔要素、例えばコントローラよって実行される。この場合、装置の電気回路は、電極間にある組織の電流を連続的にモニタして、そのモニタされた電流（または、組織中の電流）を予め設定された電流と比較するとともに、エネルギー出力調整を連続的に行なって、モニタされた電流を予め設定されたレベルに維持することができる。幾つかの実施形態において、フィードバックループは、それがアナログ閉ループフィードバックであるため瞬間的である。
【００４０】
本明細書中で使用される用語「生体分子」とは、核酸配列、タンパク質、脂質、マイクロバブル（例えば、薬物担持小胞）、および、製薬のことである。
【００４１】
本明細書中で互換性をもって使用される用語「電気穿孔」、「電気透過化」または「動電エンハンスメント（electro-kinetic enhancement）」（「ＥＰ」）とは、生体膜に微小経路（孔）を生じさせるための膜貫通電界パルスの使用のことであり、それらの微小経路の存在により、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬剤、イオン、および、水などの生体分子は、細胞膜の一方側から他方側へと通過できる。
【００４２】
用語「分散電流」は、本明細書中では、本明細書中に記載される電気穿孔装置の様々なニードル電極配列から供給される電流のパターンを規定するために使用される。この場合、該パターンは、電気穿孔されている組織の任意の領域に作用する電気穿孔関連の熱応力の発生を最小限に抑える、好ましくは排除する。
【００４３】
本明細書中で使用される用語「皮膚領域」（または、「皮膚組織」）とは、皮膚組織、真皮、真皮下層、および、皮内（「ＩＤ」）、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮下（「ＳＱ」）の層または空間のことである。皮膚領域は筋肉組織を含まない。
【００４４】
本明細書中で使用される用語「実質的に貫通することなく」とは、対象の物体（例えば、ニードル）による貫通が約１ｍｍ〜２ｍｍ以下であり、好ましくは約５ｍｍ以下であることを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用される用語「フィードバック機構」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（または、ファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスを意味し、このプロセスは、所望の組織のインピーダンスを受けて、設定値、好ましくは電流と比較し（エネルギーのパルスの供給前、供給中、および／または、供給後）、供給されるエネルギーのパルスを調整して設定値を達成する。用語「インピーダンス」は、本明細書中では、フィードバック機構について論じる際に使用され、オームの法則にしたがって電流値へと変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較が可能である。好ましい実施形態では、「フィードバック機構」がアナログ閉ループ回路によって実行される。
【００４６】
この発明の１つの態様は、本発明の電気穿孔装置、および、エネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に対して供給して該組織において定電流を維持できる電気穿孔装置の能力に関するものである。この場合、組織は、皮内組織または皮下組織であることが好ましい。電気穿孔装置は皮膚電気穿孔装置（「皮膚ＥＰ装置」）であることが好ましい。皮膚ＥＰ装置は、ＥＰ中に筋肉組織を実質的に貫通することなく皮膚組織を貫通できることが好ましい。装置は、皮膚組織、例えば皮内組織および皮下組織を貫通できる皮膚ニードル電極を介してエネルギーのパルスを供給するとともに、エネルギーのパルスを供給して、エネルギーのパルスの継続期間および電気穿孔プロセス全体にわたって組織中で一定の電流を維持する。処置組織中で一定の電流を維持する本明細書に記載の皮膚ＥＰ装置の応答性は、組織の加熱を防止して組織損傷及び痛みを減少させるとともに提示される皮膚電気穿孔技術の成功の全体に寄与する皮膚ＥＰ装置のフィードバック機構によって達成される。フィードバック機構は、本明細書中に記載される特定のソフトウェアまたはハードウェア（または、ファームウェア）の機能であり、ハードウェアの機能であることが好ましい。フィードバック機構がソフトウェアの一部である実施形態において、そのようなソフトウェアは、皮膚ＥＰ装置の動作を制御し且つ中性皮膚電極からインピーダンスを受けてこのインピーダンスを予め設定された電流と比較するとともに所望の組織へ供給されるエネルギーのパルスを調整することにより組織において一定の電流を維持する処理を行なうコントローラとデジタル通信する。
【００４７】
本発明の１つの実施形態では、ユーザにより入力される予め設定された電流と同様の定電流を生み出すエネルギーのパルスを哺乳動物の所望の組織に対して供給するように構成される電気穿孔装置が提供される。電気穿孔装置は、電気穿孔要素と皮膚電極アセンブリとを備える。電気穿孔要素は、コントローラ、電流波形生成器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力要素、状態報告要素、通信ポート、メモリ要素、電源、パワースイッチを含む皮膚ＥＰ装置の様々な要素のうちの１つ以上を含んで組み入れることができる。幾つかの実施形態において、電気穿孔要素は、皮膚ＥＰ装置の１つの要素として機能することができ、また、他の要素は、電気穿孔要素と通信する別個の要素（または、部品）である。幾つかの実施形態において、電気穿孔要素は、皮膚ＥＰ装置の複数の要素として機能することができる電気穿孔要素とは別個の皮膚ＥＰ装置の更なる他の要素と通信できる。本発明は、１つの電気機械装置または機械装置の一部として存在する皮膚ＥＰ装置の要素によって限定されない。これは、該要素が、１つの装置としてあるいは互いに通信する別個の要素として機能できるからである。電気穿孔要素は、所望の組織において一定の電流を生み出すエネルギーのパルスを供給することができ、また、フィードバック機構を含む。皮膚電極アセンブリは、空間的な配置を成す複数の皮膚電極を有する電極配列を含む。この場合、皮膚電極アセンブリは、電気穿孔要素からエネルギーのパルスを受けるとともに、このパルスを皮膚電極を介して所望の組織へ供給する。複数の皮膚電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの供給中に中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定するとともに、該インピーダンスを電気穿孔要素に対して通信する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受信できるとともに、定電流を維持するために電気穿孔要素によって供給されるエネルギーのパルスを調整することができる。ある実施形態では、所望の組織は皮膚組織であり、好ましくは、皮下組織又は皮内組織である。
【００４８】
図２Ａは、本明細書中に提示されるＥＰ装置の１つの好ましい実施形態のシステム図を示している。ＥＰ装置の主要な機能要素は、図示されているが、全ての実施形態において必ずしも全ての機能要素が必要とは限らないため単なる例示的なものである。各要素は、各要素のハードウェア機能に関して記載される。ハードウェアによって可能にされる事象のシーケンスは、本明細書中に記載されるように、ソフトウェアによって制御され得る。この例では、装置の中心要素がコントローラである。コントローラの１つの例を図２Ｂに示される概略図において見ることができる。このコントローラは、幾つかの実施形態ではＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｍｓｐ４３０Ｆ１４９またはＭｏｔｏｒｏｌａ  ６８ＨＣ９０８ＡＺ６０Ａであるマイクロコントローラである。他の代替コントローラは、電気工学の当業者に知られており、先の例示と直ちに置き換えることができる。
【００４９】
幾つかの実施形態において、皮膚電極は、ニードル電極、導電ロッド、または、導電膜領域であり、好ましくはニードル電極である。ニードル電極は、筋肉組織を実質的に貫通することなく皮内組織または皮下組織と接触できることが好ましい。幾つかの実施形態において、皮膚電極は、プラスチック材料から成ることができるベース上に装着することができ、これにより、本明細書中に記載される皮膚ＥＰ装置と関連して使用され得る皮膚電極の配列（または、皮膚配列あるいは皮膚ニードル配列）を有する置き換え可能なあるいは互換性を有する皮膚電極ディスクが形成される。幾つかの実施形態において、皮膚電極は、長さが約１ｍｍ〜２０ｍｍ；１ｍｍ〜１２ｍｍ；２ｍｍ〜１０ｍｍ；２ｍｍ〜７ｍｍ；または約５ｍｍであってもよい。幾つかの実施形態において、皮膚電極は、２２〜２８ゲージ；２３〜２７ゲージ；２４〜２７ゲージ；または、約２６ゲージであってもよい。好ましくは、皮膚電極は、長さが約５ｍｍで２６ゲージである。幾つかの実施形態において、皮膚電極は、患者の皮膚と実際に接触する皮膚ＥＰ装置の唯一の部分である（二次汚染を防止するため）。ワクチン製剤を選択された領域へ供給することができ、該領域を皮膚配列によって取り囲むことができ、また、皮膚電極を皮膚内へ挿入することができる。皮膚配列は、皮膚内へ挿入される皮膚電極の周囲に均一な圧力を生み出すことが好ましく、これにより、ＥＰプロセス中に対象領域で均一な電界を生成するのに役立つ。
【００５０】
幾つかの実施形態において、皮膚電極アセンブリは、起動スイッチと、皮膚電極アセンブリの起動を報告するための状態インジケータとを更に備える。幾つかの実施形態では、電極配列が少なくとも３つの皮膚電極を備え、また、好ましくは、３つの皮膚電極が三角形の空間的配置を有する。三角形は二等辺三角形であることが好ましい。幾つかの実施形態において、電極配列は、５ｍｍの長さの辺と３ｍｍの長さの底辺とを有する二等辺三角形として空間的に配置される３つの皮膚電極を備える。幾つかの実施形態において、電極配列は、使い捨てでき、皮膚電極アセンブリに対して取り外し可能に接続される。好ましくは、使い捨て可能な電極配列は皮膚電極ディスクであり、より好ましくは、皮膚電極ディスクが滅菌可能なものである。
【００５１】
幾つかの実施形態において、複数の皮膚電極は、エネルギーのパルスを分散パターンで供給できる。幾つかの実施形態において、複数の皮膚電極は、プログラムシーケンス下で皮膚電極の制御を通じてエネルギーのパルスを分散パターンで供給することができ、プログラムシーケンスはユーザによって電気穿孔要素へ入力される。幾つかの実施形態では、プログラムシーケンスが順次に供給される複数のパルスを備える。この場合、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性皮膚電極を伴う少なくとも２つの活性皮膚電極によって供給され、また、複数のパルスに続くパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性皮膚電極を伴う少なくとも２つの活性皮膚電極のうちの異なる電極によって供給される。
【００５２】
幾つかの実施形態では、フィードバック機構がハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行される。好ましくは、フィードバック機構はアナログ閉ループ回路によって実行される。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ毎に、２０μｓ毎に、１０μｓ毎に、又は１μｓ毎に起こるが、リアルタイムフィードバックまたは瞬時的（すなわち、応答時間の測定に利用可能な技術による測定において実質的に瞬時的）であることが好ましい。幾つかの実施形態において、中性電極は、所望の組織のインピーダンスを測定して該インピーダンスをフィードバック機構に対して通信し、フィードバック機構は、インピーダンスに応答して、エネルギーのパルスを調整し、予め設定された電流と同様の値の定電流を維持する。幾つかの実施形態において、フィードバック機構は、エネルギーのパルスの供給中に定電流を連続的に且つ瞬間的に維持する。
【００５３】
幾つかの実施形態において、皮膚電気穿孔装置は、ユーザから入力を受けるとともに、該入力にしたがってエネルギーのパルスを供給するために電気穿孔要素を制御するコントローラも含む。幾つかの実施形態において、コントローラは、ユーザからの入力を受信できるとともに、該入力にしたがってエネルギーのパルスを供給するために電気穿孔要素を制御することができる。好ましくは、コントローラはシングルチップマイクロコントローラである。
【００５４】
幾つかの実施形態において、皮膚ＥＰ装置の１つの要素は、これに接続されあるいはこれと関連付けられる様々な周辺装置を制御する役目を担うことができるコントローラである。コントローラは、（１）電流波形生成器を制御することによって電極アセンブリのための電気穿孔ファイヤリングシーケンスまたは定電流パルスパターンを生成し、（２）電気穿孔が行なわれるべきかどうかを決定するためにインピーダンス検査を行ない、（３）ユーザコマンドを検出して処理し、（４）ユーザに対して状態情報を提供し、（５）通信ポートを介して電気穿孔データを外部電子装置へ送信し、（６）電気穿孔データ（例えば、電圧曲線および電流曲線）をメモリに保存し且つメモリから検索する、などの操作を含む電気穿孔処理を管理する役目を担う。コントローラは、ユーザが所望のパルスパラメータおよびプログラムシーケンス（電極ファイヤリングシーケンスを含む）を入力して皮膚ＥＰ装置の動作を制御できるようにするソフトウェアまたはファームウェアアプリケーションを介して操作することができる。
【００５５】
幾つかの実施形態において、コントローラは、皮膚ＥＰを受けている組織およびユーザの両方からの情報を効率的に処理し且つ組織に対して定電流を供給するために電気エネルギー出力を制御するソフトウェアを含むか、又は該ソフトウェアを使用してプログラムされる。プログラムされるものとしては、予め設定された電流、（電極ファイヤリングシーケンスの）プログラムシーケンス、パルス継続期間、（パルス列中の）パルス数、予め設定された電流前後の許容エラーを含む、電気穿孔前に予め選択される多くのパルスパラメータのうちの任意の１つを挙げることができる。入力を受けて処理するとともに電気出力を決定するために該入力をファクタリングするこのプロセスは、電気パルスの継続時間内で起こり得るとともに、好ましくは１ミリ秒（ｍｓ）内、より好ましくは１００マイクロ秒（μｓ）内、更に好ましくは１０μｓ内、より更に好ましくは１μｓ内で起こり得る。幾つかの実施形態では、この処理がリアルタイムであるいは瞬時的に起こる。
【００５６】
本明細書中に記載される皮膚ＥＰ装置の動作の一例において、コントローラは、少なくとも所望の定電流を予め設定された電流に設定することによりプログラムシーケンスにしたがってエネルギーのパルスを供給することができる。１つの実施形態において、アナログ閉ループフィードバック回路は、対象組織、好ましくは皮膚の抵抗が変化するにつれて電極の両端間に印加される電圧を調整することによって所望の定電流を連続的に維持する。コントローラは、所望の出力電流をゼロに設定することによりパルス時間長が満たされたときにパルスを終了させることができる。パルスのシーケンスが終了すると、コントローラは、波形データを見直し、電気穿孔シーケンス中に所望の組織中の電流が予め設定された電流の前後のエラーの範囲から外れていた場合にユーザに警告することができる。
【００５７】
コントローラは、シングルチップマイクロコントローラであって、好ましくは、以下の特性、すなわち、豊富なＩ／Ｏ、オンボード周辺機器、低電力消費量、および、大きな記憶容量のうちの１つ以上を有するプロセッサであり得る。幾つかの実施形態において、コントローラは、テキサス・インスツルメンツプロセッサｍｓｐ４３０Ｆ１４９を備える。ソフトウェアは、電気穿孔手順の工程を制御することができ、ハードウェアと関連して工程を制御することができるとともに、好ましくはウァームウェアである。それがシングルチップマイクロコントローラ内に永久的に存在してシングルチップマイクロコントローラから実行するからである。幾つかの実施形態において、ソフトウェアは、装置ユーザの入力を受信し、パルス受信組織の抵抗または該組織中の電流に関する情報をニードル電極から受けるとともに、各電気パルスの継続期間内に受信入力に基づいて電気出力を調整することを含むアルゴリズムを実行する。
【００５８】
幾つかの実施形態において、皮膚電気穿孔装置は、電気穿孔要素と通信するとともに、皮膚電極アセンブリと電気的に通信する電流波形生成器も含んでおり、該電流波形生成器は、皮膚電極アセンブリを通じた供給のために電流パルス列波形を生成する。幾つかの実施形態において、ユーザは、プログラムシーケンスを電流波形生成器へ通信する電気穿孔要素にプログラムシーケンスを入力し、電流波形生成器は、与えられたプログラムシーケンスにしたがって電流パルス列波形を生成することができる。好ましくは、電流波形生成器はパワートランジスタアナログ回路である。電流波形生成器は、プログラムシーケンスにしたがって電極配列の電極を通過する電流パルス列波形を生成することができる。パルス列は正方形状であることが好ましく、また、パルスの数は、ソフトウェアまたはファームウェアによって制限され、好ましくは１〜１０パルスであり、より好ましくは２〜５パルスであり、より好ましくは２〜３パルスである。１つのパルスは各電極セットに対して印加される。幾つかの実施形態において、パルスは、継続時間が２０ｍｓ〜５２ｍｓであり、１Ｈｚの頻度で起こる。パルス列の振幅は、オペレータによってプログラム可能であり、０．１Ａの増分で０．１アンペア（ＡまたはＡｍｐ）〜１．５Ａの範囲で変動する。本発明における１つの実施形態において、パルス振幅は、０．４Ａ未満であり、好ましくは０．１〜０．２Ａ（図２および図３参照）である。パルス列の振幅は、個体間および同個体の対象となる異なる身体領域、好ましくは皮膚組織の両方の個々の組織抵抗の関数として適合させることができる。電流波形生成器は、コントローラの支配下で機能できる一般のパワートランジスタアナログ回路を備えることができる。
【００５９】
幾つかの実施形態において、皮膚電気穿孔装置は、皮膚電極と所望の組織との間の電気的接続の確立を検査できるインピーダンステスタも含む。インピーダンステスタは、皮膚ＥＰ装置の回路が組織に対する適切な電気的接続を確立したかどうかを決定するために使用することもできる。この検査は、挿入された皮膚電極がハンドルに対する良好な接続を確立したことを検証するとともに、皮膚電極が組織に対しても良好な接続を有することを検証する。ＥＰ処置は、インピーダンス検査によって先行され得る。インピーダンス測定値のうちのいずれかが（オーム、Ωで測定された）抵抗のプログラム可能範囲から外れている場合には、インピーダンス検査が不合格となり、電気穿孔シーケンスが開始されない。これについては、図２７Ａの電気穿孔機能フロー、特に、インピーダンスが使用不可能な場合（すなわち、電極と所望の組織との間で電気的接触がなされない場合）にファイヤリングの遅延をもたらすことができる決定ボックス２７Ａ．１０を参照されたい。
【００６０】
インピーダンス検査は、動作中に無効にされ得るソフトウェアまたはファームウェアによって制御されるオペレータプログラマブル機能である。インピーダンステスタは、コントローラの命令に従って機能する一般のオペアンプアナログ回路から成っていてもよい。
【００６１】
インピーダンステスタは、皮膚ＥＰ装置における安全機能としての役割を担うことができる。インピーダンステスタは、例えば、電極の全てが同じ組織を貫通したかどうか、また、回路を確立できるかどうかを示すことができる。空気、特に乾燥空気と接触する電極は極めて高い抵抗を有する。電気穿孔が開始して１つ以上の電極が組織を貫通しなかった場合（皮膚電極処置および皮膚ＥＰ処理を扱うときには現実に起こり得る）には、結果として得られる電極電圧が数千ボルトになる可能性があり、患者にとって致命的なあるいは損傷を与える結果となる場合があるとともに、皮膚ＥＰ装置を損傷する場合がある。このため、電極における過度な電圧を防止するために過負荷電圧保護が実施されてもよい。幾つかの実施形態では、電気穿孔装置が電圧キャップである安全機能を含んでおり、電圧キャップは、エネルギのパルスに対する調整が電圧キャップを越える電圧を生じるときに、装置がエネルギのパルスを組織へ供給するのを防止する。電力負荷（例えば、空気、皮膚、または、筋肉組織）に関係なく、１ｍｓ以下の時間にわたってＶｉｊが２００Ｖを越える場合には、過電圧保護が関与してもよい（または、安全キャップがトリガされてもよい）。Ｖｉｊは電極ｉ及びｊの間の電圧である（ｉ，ｊ＝１〜５）。過電圧保護が関与する（または、安全キャップがトリガされる）場合、Ｖｉｊは、次の電気穿孔パルスが発せられるまで、ほぼ０になる。皮膚ＥＰ装置がオフ状態にある間、任意の電極対の間の電圧が１０Ｖを越えないことが好ましい。
【００６２】
幾つかの実施形態において、皮膚電気穿孔装置は、電気穿孔要素と通信する波形ロガーも含んでいる。好ましくは、波形ロガーは、エネルギのパルスの供給中に電気穿孔電圧および電流波形を連続的に記録できる。より好ましくは、波形ロガーは、２０００サンプル／秒の速度で電気穿孔電圧および電流波形を記録できる。波形ロガーは、電気穿孔処置のパラメータをサンプリングしてモニタすることにより、ユーザが想定し得る問題を受けて処理できるようにするとともに、電気穿孔処置が失敗しあるいは所望の結果を達成しない場合にユーザが設定を調整できるようにする。典型的なサンプリング速度は２０００サンプル／秒であり、５２ミリ秒（ｍｓ）の２〜３の電流パルス当たりは約１０４サンプルである。典型的な全体のサンプリング時間は２２０８ｍｓであり、その場合、サンプリングは、最初のパルスが発せられる前約５０ｍｓで始まり、２パルスパターンの最後のパルス後約５０ｍｓで停止する。電圧波形および電流波形は、±１最下位ビット（「ＬＳＢ」）線形性を伴う１２ビットデジタル表示へと定量化されてもよい。電流波形分解能は好ましくは少なくとも１０ミリアンペア（ｍＡ）となるべきであり、また、電圧波形分解能は好ましくは少なくとも１．０Ｖとなるべきである。波形ロガーは、コントローラと共に使用するのに適したアナログ-デジタル（「Ａ／Ｄ」）変換器と一般的なオペアンプアナログ回路とから構成されていてもよい。ＤＮＡ製剤の皮膚供給に特徴的な波形ロガーの一例が図２Ｃにおいて表に示されている。（「２．５」を参照されたい）。
【００６３】
幾つかの実施形態において、皮膚電気穿孔装置は、ユーザおよび電気穿孔要素と直接的に通信する入力装置も含んでおり、該入力装置は、入力コマンドを受けて該入力コマンドを電気穿孔要素へ通信することができる。好ましくは、入力装置がテンキーまたはタッチスクリーンである。１つの例において、皮膚ＥＰ装置動作パラメータは、テンキー（Ｇｒａｙｈｉｌｌ  ８８ＡＢ２など）を介してオペレータによって入力されてもよい。好ましい実施形態では、キーパッドに入力される数字が液晶ディスプレイ（「ＬＣＤ」）に表示される。プログラムされ得る典型的なパラメータは、電気穿孔パルス電流、インピーダンス検査有効／無効、電気穿孔ファイヤリング遅延である。キーパッドに関連する機能をコントローラによって命令することもできる。前述した皮膚ＥＰ装置のうちの１つを使用する電気穿孔に有用な情報の一例としては、被検者識別番号、シーケンスのパルス数、事前待ち時間（秒、ｓ、ｓｅｃ）、パルス幅（ｍｓ）、パルス電流（アンペア）、および、皮膚電極配列のニードル電極の切り換えパターンが挙げられる（被検者識別番号および電気穿孔条件は、自動的に記録されるとともに、解析のために利用できる）。前述した皮膚ＥＰ装置のうちの１つを使用する電気穿孔において有用な情報の１つの例が図２Ｃに提示されている（被検者識別番号および電気穿孔条件が自動的に記録されて解析のために利用できることに留意されたい）。
【００６４】
幾つかの実施形態において、皮膚ＥＰ装置は、システムの状態についてオペレータに表示するあるいは知らせるための状態報告要素を更に含むことができる。幾つかの実施形態において、皮膚電気穿孔装置は、電気穿孔要素と通信する状態報告要素も含む。好ましくは、状態報告要素は、情報表示パネル、可聴通知、発光ダイオード、または、これらの組み合わせである。状態報告要素は、エネルギのパルスの生成および定電流の供給の確認を報告することができる。これらの状態報告要素は、液晶ディスプレイ（「ＬＣＤ」）（例えばＬｕｍｅｘ  ＬＣＭ−Ｓ０２００４ＤＦＳ）などの情報表示パネルを含んでいてもよい。ＬＣＤは、文字表示タイプのものであることが好ましく、それぞれが２０文字から成る４つの行を表示できることが好ましい。また、ＬＣＤには、トグルスイッチによってＯＮ／ＯＦＦ切り換えされ得るバックライトも設けられることが好ましい。状態情報は、様々なピッチで発するブザーなどの可聴通知（ＣＵＩ  ＣＥＰ−２２０２ＡＳなど）によって提示されていてもよい。各ピッチは、ソフトウェアまたはファームウェアによって制御され、異なる意味を有することが好ましい。例えば、ブザーの音量は、３つのプログラム可能な設定を有し、ブザーから１ｍの距離で約６０〜８０ｄＢの範囲で変化するものであってもよい。音圧レベル範囲は単なる参照として提示される。音レベルは、その最大レベルに設定される場合にはそれが騒々しい環境（例えば、農場、または、軍事基地）で聞き取ることができ、かつ、その最小レベルに設定される場合に静かな環境（例えば、オフィス）であまり騒々しくなければ許容範囲にあるといえる。また、ユニットがＯＮされているかあるいはＯＦＦされているかどうかを示すために、ＳＫＩＮ  ＥＰ  ＤＥＶＩＣＥには発光ダイオード（「ＬＥＤ」）（例えば、Ｌｕｍｅｘ  ＳＳＩ−ＬＸＲ１６１２ＩＤ、または、任意のパネル装着型赤色ＬＥＤ）が設けられてもよい。
【００６５】
好ましくは、状態報告要素は、電気パルスシーケンスの完了後にＬＣＤに電界生成の成功を示す視覚的確認手段を含む。１つの実施形態では、各電気穿孔プロセス（または、電気穿孔シーケンス）後に、ＬＣＤは、電気穿孔シーケンスの核パルスについて１つずつ、「１」または「０」のいずれかの３つあるいは５つの数値のリストを表示する。「０」は、パルスが正常であったことを示し、また、「１」は、パルスが異常であったことを示す。より具体的には、各パルスは、予め設定された電流の少なくとも９０％を達成し他場合に正常であるとして表示されるか、又は「０」がＬＣＤに表示される。特定のパルスが予め設定された電流の９０％未満を達成する場合には、パルスが異常であり、「１」が表示される。また、異常パルスの最低電流及び平均電流が表示される。例えば、０．５アンペアの電流に設定された５つのパルスからなる電気穿孔シーケンスにおいて、パルス３およびパルス５が０．４アンペアおよび０．３アンペアしか達成できない場合には、「００１０１」および「低：６０％平均８０％」が表示される。
【００６６】
幾つかの実施形態において、皮膚電気穿孔装置は、電気穿孔要素と通信する通信ポートも含んでいる。幾つかの実施形態において、通信ポートは、観察目的のため、電気穿孔波形データを携帯パソコン（例えば、「Ｐｏｃｋｅｔ  ＰＣ」）、携帯端末（「ＰＤＡ」）、または、パーソナルコンピュータ（「ＰＣ」）などの外部電子装置へアップロードするために使用できる。好ましくは、通信ポートは、赤外線（「ＩＲ」）ポート（トランシーバ：ＡＣＴｉＳＹＳＡＣＴ−ＩＲ２２０ＬＮ１１５，またはＺｉｌｏｇ  ＺＨＸ１２０１；Ｅｎｃｏｄｅｒ：Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  ＭＣＰ２１２０またはＴＩ  ＴＩＲ１０００など）などの光学シリアル通信ポートである。
【００６７】
幾つかの実施形態において、皮膚電気穿孔装置は、電気穿孔要素と通信するメモリ要素も含む。メモリ要素は、電気穿孔波形データおよび操作パラメータを記憶することができる。好ましくは、メモリ要素（Ａｔｍｅｌ  ＡＴ４５ＤＢ３２１ＢまたはＡＴ４５ＤＢ３２１Ｃ−ＴＵなど）は不揮発性であり、このことは、皮膚ＥＰ装置がＯＦＦの場合でもメモリ要素がそのデータを保持することを意味する。メモリを保護するため、電気穿孔パルス列のアクティブ期間中は、電気穿孔波形データだけをメモリに保存することができる。非アクティブ期間中は、波形のうちのいずれか１つが特定の閾値を越える場合にサンプリングされたデータだけをメモリに記憶することができる。例えば、これらの閾値は、２Ｖの電圧閾値および１０ｍＡの電流閾値であってもよい。電流パルス列の非アクティブ期間中にメモリに記憶されたデータは、波形が再構成されるとデータの時間インデックスが知らされるようにタイムスタンプされてもよい。パルス列の非アクティブ期間中に生じる最大４０サンプル（２０ｍｓ）のデータを終了する記憶容量が備えられてもよい。ソフトウェアは、２０ｍｓを越える累積期間において閾値のどれか１つを越えた場合には電気穿孔シーケンスの残りの部分について中断するように定めることができるため、記憶を２０ｍｓに制限してもよい。前記圧縮技術が実施される場合には、電気穿孔波形データセットは約２ｋＢのメモリを必要とする。皮膚ＥＰ装置のメモリ要素は、少なくとも８０００パルスを保存するために十分なメモリを含むことが好ましい（各パルスは個別に記憶される）。
【００６８】
幾つかの実施形態では、皮膚電気穿孔装置が電気穿孔要素と通信する電源も含んでいる。電源は、バッテリであることが好ましく、より好ましくは、リチウムイオン電池、ニッケル水素電池、鉛酸蓄電池、または、ニッケルカドミウム電池などの電池である。幾つかの実施形態において、電源は、好ましくはバッテリ（２つの６ＶＰａｎａｓｏｎｉｃ  ＬＣ−Ｒ０６４Ｒ５Ｐ  ４．５Ａｈ、２つの６ＶｇｅｎｅｓｉｓＮＰ７−６  ６Ｖ７．０Ａｈなど）であり、皮膚ＥＰ装置の回路のそれぞれに対して電力を供給する役目を担う。これらの回路は、コントローラおよびその周辺機器のための低電圧／低電力容量電源と、インピーダンステスタのための低電圧・低電力容量電源と、電流波形生成器のための高電力容量電源とを含んでいる。パワースイッチ（Ｅ−Ｓｗｉｔｃｈ  Ｒ５ＣＢＬＫＢＬＫＥＦ０または任意のＤＰＤＴ  １０Ａパネル装着型ロッカースイッチなど）は、皮膚ＥＰ装置への電力を制御するとともに、ＯＮまたはＯＦＦのいずれかとなり得る。ＯＦＦ位置では、電極アセンブリに対する全ての電気的な接続は、電源がＯＦＦになった後５秒内に電気的に中性になる。
【００６９】
本発明の１つの態様では、ユーザによって入力される予め設定された電流と同程度の定電流を哺乳動物の所望の組織で生み出すためにエネルギのパルスを該所望の組織に対して供給するように構成される電気穿孔ハンドルアセンブリ（または、「ハンドルアセンブリ」）が提供される。ハンドルアセンブリは、空間的配置を成す複数の皮膚電極を有し、皮膚電極のうちの少なくとも１つがエネルギのパルスの供給中に中性であり且つ所望の組織のインピーダンスを測定する、皮膚電極配列と、皮膚電極配列と通信し、皮膚電極を通じたエネルギのパルスの供給を制御するコントローラと、フィードバック機能を実行するための手段であって、フィードバック機構が、測定されたインピーダンスを中性皮膚電極から受信し、且つ定電流を維持するために供給されるエネルギのパルスを必要に応じて調整するソフトウェアまたはハードウェアによって実行される、手段とを備える。
【００７０】
幾つかの実施形態では、皮膚ＥＰ装置が皮膚電極ハンドルアセンブリも含む。好ましくは、ハンドルアセンブリは、３つの要素、すなわち、皮膚電極配列（好ましくは、皮膚ニードル電極配列）と、皮膚ＥＰ装置の状態を報告するための状態インジケータと、起動スイッチとを含む。配列は、１つ以上の異なる空間的配置を成す任意の数のニードル電極を含むことができ、好ましくは奇数の電極を含むことができ、また好ましくは低級の数の電極を含むことができ、好ましくは７個以下の電極を含むことができる。好ましい実施形態において、ニードル皮膚電極配列は、円形であり、５ｍｍの長い辺と３ｍｍの短い底辺とを有する二等辺形態で配置される３つのニードル皮膚電極を備える。この配置は、パルスパターンおよび電界生成にとって重要であると考えられ、その結果、皮膚ＥＰの質にとっても同様に重要であると考えられている。皮膚ＥＰ装置の状態は、電極ファイヤリングシーケンスの様々な工程を示すために様々な色で断続的に点滅するようにプログラムされ得る１つ以上のＬＥＤなどの状態インジケータの使用によってハンドルアセンブリ上に表示されることが好ましい。ハンドルアセンブリ起動スイッチを使用して、電極ファイヤリングシーケンスの様々な工程を開始することが好ましい（「６．１．１」）。
【００７１】
幾つかの実施形態において、ハンドルアセンブリは、無線であり、電気穿孔要素（または、コントローラ）から遠隔操作できる。無線ハンドルアセンブリは、プログラムされたシーケンスおよびパルスパラメータを含む情報を電気穿孔要素（または、コントローラ）から受信することができるとともに、エネルギのパルスを所望の組織に対して供給して、同組織で定電流を維持することができる。無線ハンドルアセンブリは、その動作のための電荷を保持する内部バッテリまたはキャパシタを含むことができる。好ましくは、無線ハンドルアセンブリは、フィードバック機構、好ましくはアナログ閉ループ回路を含む。無線ハンドルアセンブリは、電気穿孔要素とドッキングできるとともに、情報を交換して、本明細書中に記載の皮膚ＥＰ装置の機能のうちの１つ以上を提供することができる。
【００７２】
幾つかの実施形態において、電極配列は、使い捨てであるとともに、皮膚電極アセンブリに対して取り外し可能に接続される。好ましくは、使い捨て電極配列は、皮膚電極ディスクであり、より好ましくは、皮膚電極ディスクは、滅菌可能である。
【００７３】
本発明の１つの実施形態において、皮膚ＥＰ装置は、ハンドルアセンブリに取り外し可能に装着できる交換可能な皮膚電極ディスクを含んでいる。好ましい実施形態において、交換可能な皮膚電極ディスクは、皮膚ＥＰ装置のハンドルアセンブリに装着される。図６．１および図６．２は電極配列の側面図を示している（「６．２．３」および「６．２．５」）。図６．１および図６．２において、電極ディスクは、選択された組織、特に皮膚を貫通するための空間的な配列で支持構造体に装着された複数のニードル皮膚電極を有する。好ましい実施形態では、空間的配列が円形皮膚配列である。皮膚電極ディスクのハンドル側のニードル配列における個々の皮膚電極は、ハンドルの相補的な電気接属具内への挿入のために末端が平滑であり面取りされている。ハンドルは、ニードル皮膚電極からパルス生成器または皮膚ＥＰ装置への電気コネクタを収容することが好ましい。
【００７４】
好ましい実施形態では、皮膚ＥＰ装置の皮膚電極アセンブリおよび交換可能な皮膚電極ディスクにおけるニードル皮膚電極が円形配列を成している。更なる好ましい実施形態では、複数のニードル皮膚電極が３つのニードル皮膚電極から成る。更に好ましい実施形態において、３つのニードル皮膚電極の中心は、５ｍｍの２つの辺と３ｍｍの短い底辺とによって内接される形状で円形配列内に収まる。
【００７５】
好ましい実施形態において、ニードル皮膚電極は、各皮膚電極配列の滅菌状態を維持しつつ処置する被検者間での皮膚電極配列の迅速な交換を可能にする特定のパッケージシステム（図９）内に滅菌状態で保管される。
【００７６】
幾つかの実施形態では、皮膚ニードル配列の各電極がプラス電極として、マイナス電極として、あるいは、中性電極として機能することを制御するプログラムシーケンスが皮膚ＥＰ装置の操作のために提供されれる。例えば、図２Ｃに示されるように、プログラムシーケンスでは、各電極がプラス状態、マイナス状態、または、ＯＦＦ状態として機能できる。図２Ｃにはシーケンス全体が描かれており、図中、電極１〜３が連続的にプラス電極になる。この場合、２つのマイナスに帯電された電極が皮膚配列の反対側の頂点にあり（「２．４」−２番目の縦列）、あるいは、１つの電極がＯＦＦであり、１つの電極がプラスであり、そして１つの電極がマイナスである（「２．４」−４番目の縦列）。
【００７７】
幾つかの実施形態において、電気穿孔要素は、コントローラと、コントローラと電子通信する波形生成器と、コントローラと電子通信する波形ロガーと、波形生成器に対して電気的に接続されるバッテリとを備える。コントローラは、ユーザから入力を受信し、該入力にしたがって所望の組織に対してエネルギのパルスを供給するように波形生成器に指示するとともに、供給されたエネルギのパルスにしたがって波形ロガーへデータを通信することができ、この場合、バッテリが波形生成器に対して電荷を送り、バッテリは、リチウムイオン電池、ニッケル水素電池、鉛酸蓄電池、または、ニッケルカドミウム電池である。装置は携帯型であることが好ましい。携帯型装置は、バッテリパックによって作動し、治療目的またはワクチン接種目的での集団予防接種に適している。
【００７８】
本発明の幾つかの実施形態では、本明細書中に記載された皮膚電気穿孔装置を使用してエネルギのパルスを所望の皮膚組織に対して供給することによりユーザによって入力される予め設定された電流と同程度の定電流を生み出す方法が提供される。該方法は、筋肉組織を実質的に貫通することなく、複数のニードル皮膚電極を皮膚組織中へ挿入し、複数のニードル皮膚電極に対してエネルギのパルスを印加して、予め設定された電流に等しい電流を皮膚組織中に供給し、複数のニードル皮膚電極のうちの中性電極を用いて皮膚組織のインピーダンスを測定するとともに、電気穿孔装置のフィードバック機構を使用して、測定されたインピーダンスに応じて、印加されるエネルギのパルスを調整することにより、皮膚組織に対して供給される電流を一定に維持することを含む。好ましい実施形態の１つの例では、皮膚ＥＰ装置を使用する方法は、図２７Ａおよび図２７Ｂに提示されるフローチャートに記載されるような電気穿孔機能シーケンスによって進行することを含む。特に、図２７Ｂの２７Ｂ．１０は、「電流パルスの生成」工程のブローアップ（blow-up）を示しているとともに、好ましくはアナログ閉ループ回路によって実行され且つリアルタイムで（あるいは、瞬時的にに）作動するフィードバック機構を表わしている。
【００７９】
幾つかの実施形態において、前記方法は、所望の皮膚組織とニードル皮膚電極との間で電気的な接触が成されるかどうかを決定するために、エネルギのパルスを印加する前にインピーダンスを測定することを更に含む。幾つかの実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つのＤＮＡワクチンを前記皮内組織または皮下組織と接触させるために使用される。
【００８０】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、所望の皮膚組織に対するエネルギのパルスの供給から電気穿孔装置によってコンパイルされるデータを記録することを含む。
【００８１】
本発明の幾つかの実施形態では、複数のニードル皮膚電極を有し且つ電流波形生成器と電気的に通信する皮膚電極アセンブリを設ける工程と、哺乳動物の筋肉組織を実質的に貫通することなく哺乳動物の皮膚組織と複数のニードル皮膚電極とを接触させる工程と、接触された皮膚組織を実質的に一定の電流に暴露するのに有効な条件下で且つある時間にわたって、電流波形生成器からのエネルギの電気パルスを複数のニードル皮膚電極に対して印加する工程とを備える方法が提供される。
【００８２】
幾つかの実施形態において、エネルギの電気パルスを印加する前記工程は、複数のニードル皮膚電極のうちの中性電極を用いて、接触された皮膚組織のインピーダンスを測定し、測定されたインピーダンスを、電流波形生成器と電気的に通信するフィードバック機構へ通信することを備え、フィードバック機構は、測定されたインピーダンスに応じて、電流波形生成器から供給されるエネルギのパルスを調整して、実質的に一定の電流を維持する。幾つかの実施形態において、フィードバック機構は、電気穿孔装置の一部であるアナログ閉ループ回路によって実行され、前記測定工程および前記通信工程は、エネルギのパルスの継続時間の全体にわたって瞬時的に行なわれる。
【００８３】
本発明の１つの態様は、所望の皮膚組織または皮膚細胞中への生体分子、例えばＤＮＡプラスミド等のｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔を可能にする皮膚ＥＰ装置に関する。幾つかの実施形態において、皮膚ＥＰ装置は、皮膚電極ニードル配列によって対象の皮膚組織に対して定電流電界を与えるとともに、選択された皮膚組織、好ましくは皮下（ＳＱ）および／または皮内（ＩＤ）組織の細胞内への生体分子の導入を容易にする。皮膚ＥＰ装置は、プログラムシーケンスにしたがって皮膚電極ニードル配列の電極を通過し且つ処置中にモニタされて記録され得る電流パルス列波形を生成する。ニードル電極は、筋肉組織を実質的に貫通することなくＳＱまたはＩＤ組織などの皮膚組織と接触することができる。皮膚ＥＰ装置は、プログラムシーケンスにしたがって皮膚配列の皮膚電極を通過し且つ処置中にモニタされて記録され得る電流パルス列波形を生成する（図２Ｃ参照）。ニードル皮膚電極は、筋肉組織を実質的に貫通することなく皮内組織または皮下組織と接触することができる。
【００８４】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開公報２００５／００５２６３０は、本発明にしたがって使用され得る特定の電気穿孔要素のシステム図を開示している。この場合、これらの電気穿孔要素は皮膚ＥＰ装置に適合できあるいは皮膚ＥＰ装置の一部として適合できる。該特許において、各要素は、そのような要素のハードウェア機能に関して記載されている。これら文献のそれぞれの内容全体は、公報全体を参照することにより本願に組み込まれる。ハードウェアによって可能になる一連の事象は、本明細書中に記載されるように、ソフトウェアまたはファームウェアまたはこれらの両方の組み合わせによって制御される。
【００８５】
幾つかの実施形態において、皮膚ＥＰ装置の電気穿孔要素は、プログラムシーケンスを簡略化でき且つ皮膚電極アセンブリの電極のファイヤリングを操作できる電極接続リレーマトリクスを備える。リレーマトリクスは各電極、好ましくはニードル電極を制御することができ、それにより、各電極は、５つの状態、すなわち、ＯＦＦ、プラス低電圧、インピーダンス測定入力、プラス高電圧、および、マイナス（調整）高電圧の状態のうちの１つを成す。１つの実施形態において、リレーマトリクスは、スイッチマトリクスを形成する１１個の２極双投（ＤＰＤＴ）リレーを含んでいる。これらのリレーのうちの１０個は、ＳＰＩ−並列ポート（SPI-to-parallel port）としてシリアル周辺インタフェース（ＳＰＩ）ポートに接続された一組のシフトレジスタを使用して駆動される。ＳＰＩスレーブ・イン・マスター・アウト（ＳＩＭＯ）は、両方の７４ＶＨＣ５９５（または、認可された同等物）シフトレジスタのＤａｔａ-Ｉｎピンに対して接続される。７４ＶＨＣ５９５は２つのクロック入力を有する。ユニバーサルシリアル同期／非同期通信インタフェースクロック（ＵＣＬＫ）信号は、データをレジスタへシフトするために使用されるレジスタのシフトレジスタクロック入力（ＳＣＫ）ピンに対して接続される。別個の汎用入力／出力（ＧＰＩＯ）ピンは、データをシフトレジスタから出力レジスタへとパラレルにクロックするために使用される記憶レジスタクロック（ＲＣＫ）クロック入力へ行く。その結果、同じシリアルデータが両方のシフトレジスタへシフトされるが、このとき、データは、変更するために、レジスタのうちの出力レジスタへとクロックされるだけである。
【００８６】
実際のリレーコイルを駆動させるため、ＳＰＩポート回路の出力は、２つのＵＬＮ２００３Ａ（または、認可された同等物）８チャンネルリレーコイルドライバを与える。このチップは基本的にオープンコレクタバイポーラ接合トランジスタ（ＢＪＴ）の配列である。また、各チャンネル出力は、その向かい側に内部キックバックダイオードを有している−これにより、外部ダイオードが不要になる。リレーコイルのプラス側は１５ボルトに結合され、一方、コイルのマイナス側はＵＬＮ２００３Ａ部品を介してグランドに引き付けられている。
【００８７】
接点マトリクス（contact matrix）には３組のリレーがある。リレーの一例を図２６において見ることができる。第１の組は実際には１ ＤＰＤＴリレーである。接点の１つの組は、プラスレールを、低電圧、インピーダンス測定電圧から２００Ｖ電源の出力へと切り換える。同じリレーにおける接点の他の組は、マイナスレールをインピーダンス測定回路とパルス電流調整経路との間で切り換える。したがって、このリレーの位置は、電流パルスを生じるためあるいはインピーダンス測定を行なうようにプラスレールおよびマイナスレールの両方を設定する。リレーの次の組は、極性リレーの５−リレー組である。これらのリレーは、各電極毎に１つずつあり、その電極における極性をプラスレールまたはマイナスレールへと切り換える。リレーの最後の組は、各接点をプラスでもマイナスでもないように分離させることができるようにする単なる接点のインラインの組である。リレー接点の寿命を向上させるため、マトリクスは、所望の方向に負荷を適切な電極に対して接続するようになっているだけである。この場合、パルスまたはインピーダンス回路は、電圧または電流を負荷へ送る。その後、電圧または電流は、任意の接点が開放される前に除去される。電流が印加されるときには実際には接点が切り換わらないため、接点の寿命を大きく延ばすことができる。
【００８８】
皮膚ＥＰ装置によって生成される電流パルスの１つの例が図３．１および図３．２に示されている。図３．１および図３．２は各電流パルスの波形を示している。波形パラメータは以下の通りである。
周期（ｔｐ）：１０００ｍｓ±２５０μｓ
立ち上がり時間（ｔｒ）：最大２０μｓ
整定時間（ｔｓ）：最大２０μｓ
パルス幅（ｔｗ）：５２ｍｓ±１００μｓ
立ち下がり時間（ｔｆ）：最大２０μｓ
公称電流（Ｉｎ）：Ｒｉ≦１００Ω、ｔｈ期間中における、Ｉｎ∈（０．１Ａ．０．２Ａ，０．３Ａ．．．．１．５Ａ）±Ｉｎの１０％
Ｒｌは、図３．３および図３．４に示される３つの電極組のうちのいずれか同士の間の負荷抵抗である。図３．１および図３．２では電流波形だけが示される。電圧波形の形状は、電流パルスが発している間（ｔｈ中）に電極によって確認されるインピーダンスによって決まる。電圧波形はｔｈにおいて定められない。これは、この期間中、インピーダンスが未知だからである。ｔｌ中における任意の電極組の両端間の電圧は０Ｖである。
【００８９】
理論への束縛を望むものではないが、電気穿孔が同じ構造を利用し且つこれらの構造に高いイオン流動を生じさせ、そして管路を開放または拡大すると考えられている。金属電極または誘電電極は組織と接触した状態で配置され、また、電極間の距離に比例する所定の電圧がこれらの電極に対して印加される。電気穿孔のために使用されるプロトコルは、式Ｅ＝Ｖ／ｄにしたがって生じる電界強度として定義される。ここで、（「Ｅ」）は電界であり、（「Ｖ」）は課された電圧であり、また、（「ｄ」）は電極間の距離である。
【００９０】
電界強度Ｅは、被検体の細胞中への薬剤または生体分子の供給のための電気穿孔プロトコルを編成するときに重要な値である。したがって、電極間の距離に比例する所定の電圧のパルスを印加することによって、様々なプロトコル用に電界強度を計算することができる。しかしながら、絶縁電極を用いて組織中に電界を生成できる（すなわち、電界を形成するためにイオンの流れは不要である）ことに留意されたい。理論への束縛を望むものではないが、ＥＰの成功のために必要なものは、電界それ自体ではなく、電流である。皮膚ＥＰ装置の電流波形生成器の起動により、定電流電気パルスを複数のニードル皮膚電極へ分配し、それにより、領域において分散されたＥＰ現象が生じ、その領域で一致したＥＰ重合点が現れない。分散ＥＰの領域で細胞の透過性が高まり、また、細胞または組織を過熱または損傷させることなく、被検者の細胞中へ生体分子が送達される。
【００９１】
本発明の１つの態様は、ＩＤまたはＳＱワクチン接種目的で動物細胞、特に皮膚の１つ以上の細胞中へと生体分子を導入するための皮膚ＥＰ装置に関する。好ましくは、皮膚ＥＰ装置は、供給される電気パルスの継続時間にわたってＳＱまたはＩＤ組織などの皮膚組織に定電流を供給して維持することによって、同組織中へ生体分子を導入する。幾つかの実施形態において、皮膚電極ハンドルアセンブリのハンドルは、非導電性であり、選択された組織、特に皮膚にニードル皮膚電極アセンブリを埋め込むための容易な手段をユーザに提供するように設計されている。ハンドル上にスナップ方式で装着される使い捨て可能なニードル皮膚電極ディスクを利用することにより、ユーザは、ニードル皮膚電極ディスクを素早く取り付けおよび取り外すことができ、それにより、処置される被検者間での迅速な（および、滅菌状態での）交換が可能になる。皮膚ＥＰ装置の電源は、例えばバイオテロの攻撃中における集団ワクチン接種の場合のように電気コンセントまたは他の電源のアクセスおよび使用が危険または不都合な現場で用いるバッテリパックを利用することができる。
【００９２】
ＳＱ組織およびＩＤ組織などの皮膚組織の細胞中へ送達するための生体分子としては、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡワクチン（ＤＮＡワクチンおよびＤＮＡプラスミドは互いに排他的ではない）、遺伝子、治療薬剤、または、他の物質が挙げられ、これらは相補的な物質であっても促進物質であってもよい。好ましくは、生体分子は、対象の皮膚組織の細胞中で発現可能なＤＮＡプラスミドであり、また、皮膚ＥＰ送達用の生体分子は複数種類の生体分子を含むことができる。幾つかの実施形態では、生体分子がＤＮＡプラスミドである。
【００９３】
本発明と共に使用されるＤＮＡプラスミドは、遺伝子治療、すなわち、負傷状態または疾病状態を予防し、改善し、あるいは、治療する目的での宿主への目的の遺伝子の導入に役立つＤＮＡプラスミドであってもよい。ＤＮＡプラスミドは、皮膚ＥＰ装置の使用により、哺乳動物の対象の遺伝子を発現することができ、これによって病気の症状を改善するため、病気の病原を減らすため、病気の根本的原因を排除するため、または、病気の発症を予防することができる。ＤＮＡプラスミド中のコーディング遺伝子は、外因性供給源から得られる異種遺伝子であってもよい。遺伝子治療は、嚢胞性線維症や筋ジストロフィーなどの遺伝子的に引き起こされる病気のために行なうことができる。また、遺伝子治療は、腫瘍の治療のために適用することができる。好ましくは、ＤＮＡプラスミドの遺伝子は、成長ホルモン放出ホルモン、または、インスリン成長因子Ｉをコードするものであり、合成または天然型であっても完全長または機能断片であってもよい。
【００９４】
幾つかの実施形態において、本発明と共に使用されるＤＮＡプラスミドは、例えば、ワクチン接種の目的で、または、肝炎、インフルエンザ、デング熱、日本脳炎、および、ＨＩＶなどの感染病に対する予防注射のため、哺乳動物の細胞に対して導入することができる。幾つかの例では、ＤＮＡプラスミドは、ウイルスタンパク質の免疫原性断片であるポリペプチドを発現できる。
【００９５】
皮膚ＥＰによって皮膚組織へ送達するための生体分子として使用され得る薬剤の例としては、ブレオマイシン、ネオカルチノスタチン、スラミン、ドキソルビシン、カルボプラチン、タキソール、マイトマイシンＣ、および、シスプラチンを含む抗腫瘍作用または細胞毒性作用を有する化学療法薬が挙げられる。他の化学療法薬は、当業者に知られており、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘを含む参考文献において見出すことができる。また、膜貫通送達を助ける物質（「送達剤」）も送達用の生体分子として予期され、そのような物質としては、Ｎ−アルキルメラアミドおよびパラクロロ水銀ベンゾエートが挙げられる。生体分子がＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡワクチンである実施形態において、このＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡワクチンと共に、先に、または、後に送達するための更なる生体分子は、別の１つ以上のＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡワクチンである。生体分子が免疫反応を引き出す標的タンパク質を発現するように設計されたＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡワクチンである実施形態において、ＤＮＡプラスミドまたはＤＮＡワクチンと共に、先に、または、後に送達するための更なる生体分子は、そのような標的タンパク質に対する免疫反応を更に促進する１種類以上のタンパク質の遺伝子である。そのような遺伝子の例は、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＦＳ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２，ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＩＬ−１５（信号シーケンスが削除され且つ随意的にＩｇＥからの信号ペプチドを含むＩＬ−１５を含む）などの他のサイトカインおよびリンフォカインをコードする遺伝子である。他の有用であろう遺伝子としては、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１□、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、突然変異型ＩＬ−１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮細胞増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、Ｃａｓｐａｓｅ、ＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、不活性型ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答性遺伝子、ＮＦκＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、および、これらの機能断片をコードする遺伝子が挙げられる。
【００９６】
当業者であれば分かるように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、皮膚ＥＰ装置の多くの変更および改良を成すことができる。皮膚ＥＰ装置は、図１１において見ることができる異なるパターンで配置される３−電極配列などの任意の数の電極を含むことができる。距離Ｌは、ポイントＢでのエネルギ強度がポイントＡでのエネルギ強度の１／３となるように選択される。３パルス後（１から２へ、２から３へ、および、３から１へ）には、ポイントＢは、ポイントＡに等しい累積用量を受信している。配列中の電極の数が増加すると、それに比例して、均一なエネルギ分布をもたらすために必要な距離Ｌが長くなるので、Ｌ＝ｋ×ｎとなる（ここで、ｎは電極の数であり、ｋは比例定数である）。したがって、より多くの電極を選択することにより、より大きな体積の組織を取り囲むことができる。選択される皮膚電極の最適な数は、トランスフェクトすべきマテリアルの体積、および、注入と電気穿孔との間隔に依存するであろう。
【実施例】
【００９７】
以下実施例において本発明を更に説明する。言うまでもなく、これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として与えられていることを理解されたい。先の議論およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の必須の特徴を確認することができるとともに、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用および状態に適合させるために本発明の様々な変更および改良を成すことができる。したがって、図示され且つ本明細書中に記載される発明に追加される様々な改良は、前述した説明から当業者に明らかである。そのような改良も添付の各請求項の範囲内に入るものである。
【００９８】
好ましくは、本明細書中で説明される皮膚ＥＰ装置と共に使用するためのＤＮＡ製剤は、高いＤＮＡ濃度、好ましくは、皮膚への供給に最適な僅かな体積中に、好ましくは僅かな注入量中、理想的には２５〜２００マイクロリットル（μＬ）中に数グラム量のＤＮＡを含む濃度を有している。幾つかの実施形態では、ＤＮＡ製剤が１ｍｇ／ｍｌ（ｍｇＤＮＡ／製剤の体積）以上などの高いＤＮＡ濃度を有している。より好ましくは、ＤＮＡ製剤は、２００μＬの製剤中にグラム量のＤＮＡ、より好ましくは１００μＬの製剤中にグラム量のＤＮＡを与えるＤＮＡ濃度を有している。
【００９９】
本発明の皮膚ＥＰ装置と共に使用するためのＤＮＡプラスミドは、既知の装置と技術との組み合わせを使用して調製または製造することができるが、好ましくは、２００７年５月２３日に出願された本発明者らの同時係属中の米国仮出願第ＵＳ６０／９３９，７９２号に記載される最適化されたプラスミド製造技術を使用して製造される。幾つかの例において、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で配合することができる。また、製造技術は、２００７年７月３日に発行された共有特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に知られる様々な装置およびプロトコルも含みあるいは組み込む。本明細書中に記載される皮膚ＥＰ装置および送達技術と共に使用される高濃度のプラスミドは、適度に低い量でのＩＤ／ＳＣ空間中へのプラスミドの投与を可能にするとともに、発現効果および免疫効果を高めるのに役立つ。本発明者らの出願および特許である米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号はそれぞれ、その全体が本願により組み込まれる。
【０１００】
実施例１．皮膚電気穿孔のための動電装置（「皮膚ＥＰ装置」）の動作
最初に、皮膚ＥＰ装置の電源がＯＮされる。ファームウェアは、ユーザから入力が受けられるまでアイドル状態のままである。電気穿孔シーケンスを開始するため、パスワードが入力され、それにより、ＬＣＤ上で導入プロンプトが得られる。この時点で、ハンドルアセンブリ起動スイッチが押される。その後、ユーザは、番号、好ましくは被検者識別番号を入力し、この番号は、以後のダウンロードのために記憶される全てのパルスのデータと共に記録される。該番号は、テンキーを使用して入力されることが好ましい。その後、生体分子製剤が、ＩＤ注入またはＳＱ注入として、適度に少ない注入量で、理想的には２５〜２００皮膚リットルで投与され、また、皮膚電極配列が皮膚中に挿入され、注入領域を完全に取り囲むが、これは容易に視認される。その後、ユーザは、ブザーからの「ビーッ」の音により、起動スイッチを押して電気穿孔シーケンスを続けるように促される。起動スイッチが押された後、ファームウェアは、インピーダンステスタが使用可能か否かを定める。インピーダンステスタが使用可能である場合には、ソフトウェアが一連のインピーダンス測定を直ちに行なう。ファームウェアは、低いＤＣ電圧を用いて電極間のインピーダンスを検査する。
【０１０１】
電極が対象組織中へ挿入された後、インピーダンスチェック中に、プロセッサは、組織の導電率を電極レベルでチェックする。これは、電極が患者の対象組織と電気接触しているのを確認するために行なわれる。これらの測定は、正確な読み取りを達成できる十分な時間をもって数秒足らずで、多くの場合、２秒未満で行なわれる。インピーダンス検査中、ハンドルアセンブリ上の赤色ＬＥＤが点灯される。インピーダンス測定値のいずれかが不合格であると、長いエラー「ビーッ」音が鳴り、ハンドルＬＥＤが赤色のままになるとともに、ＬＣＤがエラーを表示し、ファームウェアがアイドル状態に戻る。
【０１０２】
全ての測定値が合格すると、短い「ビーッ」音が発せられる。ハンドルアセンブリ上の緑色ＬＥＤが点灯され、また、ディスプレイは、起動スイッチを押して続行するようにユーザに促す。ファームウェアは、ハンドル起動スイッチが再び押されるのを待ってからシーケンスを続ける。この時点でキーパッド上の任意のキーが押されると、長い「ビーッ」というエラー音が鳴り、ユニットがアイドル状態へ戻る。
【０１０３】
ファームウェアは、選択されたパルシングプログラムによって禁止されるファイヤリングシーケンスを実施する。各電気パルスまたはエネルギーのパルスの供給中に、ＥＰ装置は、対象組織、例えば皮膚で測定された抵抗に基づいてその出力を連続的に調整して、所望の電流を維持する。要するに、プロセッサは、所望の出力電流レベルをユーザによって入力される予め設定された電流値のレベルに設定することによって、パルスシーケンスを開始する。ハードウェアフィードバックループ（すなわち、アナログ閉ループ回路）は、対象組織抵抗の変化に伴って電極の両端間に印加される電圧を調整することによって、所望の出力電流を連続的に維持する。エネルギーのパルスの供給中、プロセッサがパルス波形を記録する。プロセッサは、パルス時間長がそのような時間に所望の出力電流をゼロに設定することによって満たされたとき、パルスを終わらせる。パルスのシーケンスが終わると、プロセッサは、波形データを見直して、電気穿孔シーケンス中に電流が設定パラメータの範囲内になかった場合にはオペレータに警告し、それにより、電気穿孔シーケンスまたは処理が不完全であったか否かについてユーザに知らせる。
【０１０４】
ＥＰシーケンスが良好に完了すると、皮膚ＥＰ装置がアイドル状態に戻る。電気パルスシーケンスの完了後に、電界生成の成功の更なる視覚的確認がＬＣＤ上でなされる。各シーケンス後、ＬＣＤは、電気穿孔シーケンスの各パルスごとに１つずつ、「１」または「０」のいずれかによって、３つあるいは５つの数値のリストを示す。「０」は、パルスが正常であったことを示し、また、「１」は、パルスが異常であったことを示す。より具体的には、各パルスは、正常であるとして表わされるように、すなわち、「０」がＬＣＤで表示されるように、予め設定された電流の少なくとも９０％を達成しなければならない。特定のパルスが予め設定された電流の９０％未満しか達成しない場合には、パルスが異常であり、「１」が表示される。更に、異常パルスの最低電流および平均電流が表示される。例えば、０．５アンペアの電流で設定された５パルス電気穿孔シーケンスの場合、パルス３およびパルス５が、それぞれ０．４アンペアおよび０．３アンペアしか達成しない場合、「００１０１」が表示されるとともに、「低：６０％平均８０％」が表示される。この制御機構は、治療用途または予防用途のためのワクチンを送達するときには不可欠である。ワクチン送達が不十分な場合には、治療または予防のために必要とされる抗体反応または細胞反応が得られない確率が高く、被検者が病気を発症する危険がある（Rothら、2005）。
【０１０５】
実施例２．データ取得および記憶
皮膚ＥＰ装置ソフトウェアまたはファームウェアは、リアルタイムのデータ取得および不揮発性メモリ内への記憶を可能にする。図２Ｃは、電気穿孔プロセス中に採取され得るデータの第１の部分を示している。ファイルヘッダの第１のセクションはファイル名（「２．１」）および動物名（「２．２」）を含む。縦欄のデータ（「２．３」）は、シーケンスのパルス、パルシング前の待ち時間、パルス幅、および、３つの各電極のパルス電流を記述している。図２．４は、任意のパルスシーケンス中の各電極の配置を特定するデータの第２の部分を示している。図２．５は、同じ電気穿孔における未加工データの第３の部分のフォーマット化バージョンを示している。ファイルは、皮膚ＥＰ装置からＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ＣＳＶファイルとしてダウンロードされる。データは、テンプレートＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  Ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔファイルへとコピー＆ペーストされる。スプレッドシート中の縦列は、電気穿孔パルス中に測定された電圧（Ｖ）および電流（アンペア）並びに組織抵抗（オーム）の計算値を表わしている。小さい方の電極をブタの皮膚で使用した後にダウンロードされたデータは、大きい方の電極を使用した後と比べて約２倍の皮膚抵抗（７００Ω〜２２００Ω）を生じた。
【０１０６】
実施例３．プラスミド設計、送達方法、および、ブタにおける実験的研究
プラスミドコンストラクト．本明細書中に記載される実験で使用されるｐＥＧＦＰ−Ｎ１（カリフォルニア州のマウンテンビューにあるＣｌｏｎｔｅｃｈ）は、哺乳動物細胞内でより強い蛍光とより高い発現が得られるように最適化された野生型ＧＦＰのレッドシフト（red-shifted）変異体をコードする（最大励起波長＝４８８ｎｍ；最大放出波長＝５０７ｎｍ）。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１は、Ｐｈｅ−６４→ＬｅｕおよびＳｅｒ−６５→Ｔｈｒの二重アミノ酸置換を含むＧＦＰｍｕｔ１変異体をコードする。ＥＧＦＰ遺伝子のコード配列は、ヒトコドン使用選択に対応する１９０を超えるサイレント塩基変異を含む。ＥＧＦＰのフランキング配列は、真核細胞における翻訳効率を更に高めるためにＫｏｚａｋコンセンサス翻訳開始部位へと変換し。ＥＧＦＰ遺伝子の下流側のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ＥＧＦＰｍＲＮＡの３’末端の適切な処理が調節される。また、ベクターバックボーンは、ＳＶ４０  Ｔ−抗原を発現する哺乳動物細胞における複製のためのＳＶ４０複製開始点も含む。ＳＶ４０初期プロモータと、Ｔｎ５のネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子由来のポリアデニル化シグナルとから成るネオマイシン耐性カセット（ｎｅｏｒ）により、Ｇ４１８を用いた安定にトランスフェクトされた真核細胞のセレクションが可能になる。このカセットの上流側の細菌由来プロモータは、大腸菌においてカナマイシン耐性を発現する。また、ｐＥＧＦＰ-Ｎ１バックボーンは、大腸菌としての増殖用ｐＵＣ１９複製開始点と、一本鎖ＤＮＡ生成のためのｆ１複製開始点とを提供する。（２００９・６・９）
【０１０７】
電気穿孔条件．
全ての実験で方形波パルスを使用した。電気穿孔条件は各実験毎に個別に提示される。全てのケースにおいて、０．１〜０．４アンペアの定電流を２０または５２ミリ秒／パルスにわたる２個または３個のパルスとして使用した。この場合、パルス間は１秒である。（生体分子を骨格筋へ送達するために先に使用した）制御皮膚ＥＰ装置電気穿孔装置は、非導電材料上に装着される５つの等間隔に配置された２１−ゲージ純ステンレススチール製ニードル電極の円形配列（１ｃｍ直径）を含んでいた。皮膚電気穿孔皮膚電極は、非導電材料上に装着される二等辺三角形構成（２つの長辺の長さは５ｍｍであり、短辺の長さは３ｍｍである）の３つの２６−ゲージ純ステンレススチール製ニードル電極から成る。
【０１０８】
ブタにおけるプラスミドＤＮＡの筋肉注射．
ＧＦＰ実験では、体重が１５〜４０ｋｇの生後３〜６週目の性別混合の若いハイブリッドブタが使用された。動物は、食料および水を自由に摂取可能な状態で個々の檻に収容された。エンドトキシンフリーのプラスミドの調製物を滅菌水で希釈し、ＨＰＬＣ精製した低分子量ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（平均ＭＷ１０，９００）と１％重量／重量で配合した。実験の０日目には、動物を手作業で拘束し、前述したようにＧＦＰプラスミド溶液をＩＤおよび／またはＳＱで直接注射した。正方形の左上隅の中心から２ｃｍの場所に入れ墨が付けられ、正方形の中心部に注入部位が位置された。これにより、各注入部位を容易に特定して切り取ることができる。適切な注射部位を見つける際に全ての主要な表面血管を避けた。
【０１０９】
皮膚採取．
ブタを放血させ、注射部位を特定した。各注射部位で２．５平方ｃｍの皮膚、皮下組織、および、少量の下層筋肉を直ちに切り取った。切り取られた領域は、３６５ｎｍ波長のＵＶ光を使用して暗室内で観察した。
【０１１０】
発現領域の写真解析．
十分な蛍光発光を示したサンプルをデジタルカメラで撮影した。蛍光を発しないあるいは非常に僅かな蛍光量のサンプルは撮影しなかった。蛍光は、処理情報を与えられていない３人の観察者によって０〜５のスケールでスコア付けされた。蛍光を発していないサンプルに対して０が割り当てられ、非常に僅かな蛍光が観察されたが撮影しなかったサンプルに対しては１が割り当てられ、３〜５は、撮影した蛍光について決定した。サンプルは組織学試験のために保存した。
【０１１１】
実施例４．比較研究
全ての検査状態からのデータを表にした。図１０は、平均スコアが２以上であった状態のみを示しているが、最大可能スコアは５である（スコア付け説明に関しては、段落[００９９]を参照されたい）。データが示すように、皮膚特異的な皮膚配列（１番目の横列、図１０）を使用して最良の全体的結果が得られた。次のグループ（２番目の横列、図１０）は同じ数値スコアを有するが、皮膚配列（「ＭＡ」）に関しては、５０μＬ中に配合された５０μｇのプラスミドだけが使用され、一方、大きな配列（「ＬＡ」）に関しては、倍の量、すなわち、１００μＬ中に配合された１００μｇのプラスミドが使用されたことに留意すべきである。更に、皮膚電極配列について最適化した状態を使用すると、時間がかなり減少した。すなわち、ＭＡを使用すると、観察される注射とＥＰとの間の処置時間は４秒であり（４番目の縦列を参照、図１０）、ＬＡを使用すると８０秒である。プラスミド投与量、配合量、タイムラグ、電流振幅、および、パルス長に関する多くの他の条件を評価し、これを図１０に示す。一般に、より少ない体積で適切なプラスミド投与量を含む場合（より濃縮された溶液）により良好な結果が得られることが分かった。
【０１１２】
実施例５．ブタにおける皮内送達と筋内送達との比較
ブタに皮内（ＩＤ）送達又は筋内（ＩＭ）送達した濃縮用量のＣＭＶ−ＧＨＲＨおよびＣＭＶ−ＳＥＡＰプラスミドの送達量および発現量を比較した。結果は、分泌性タンパク質（ＳＥＡＰ、ＧＨＲＨ）並びにブタのＳＥＡＰ免疫原性の両方を用いた場合、どの送達方法がブタにおいて最も高い発現量をもたらすのかを初めて明らかするものである。
【０１１３】
動物は、個別に収容して、７日間かけて順応させた。研究の０日目に、動物は、体重を量り、採血し、その後麻酔した。ブタ（ｎ＝４／グループ）には、１ｍｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰおよびＣＭＶ−ＧＨＲＨ＋０．１％ポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩を様々な濃度および電流強度で注射した（表１）。４秒後、様々な電流（０．１〜０．５アンペア）を用いてＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）電気穿孔装置（ペンシルベニア州のブルーベル１９４２２にあるＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ）（５個のニードル、５２ミリ秒パルス、パルス間が１秒、全体で３つのパルス）によって動物を電気穿孔した。ブタを麻酔から回復させ、ブタが２４時間にわたってモニタして十分な回復を確認した。処置後２〜３時間以内に完全に回復しなかった動物を全て記録した。ブタは、２、４、７、９、１１日目に体重を量って採血した。実験期間にわたって食料および水は自由に摂取できた。ＳＥＡＰ、ＳＥＡＰ抗体ＥＬＩＳＡ、ＧＨＲＨ、および、ＩＧＦ−Ｉ用に血液を採取した。
【表１】
0005439183.tif 000002
【０１１４】
図１２に示されるように、製造メーカ使用説明書に従って化学発光キットＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（マサチューセッツ州のベッドフォードにあるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して血清サンプル中のＳＥＡＰ発現量を測定した。分析のための検出の下限は３ｐｇ／ｍＬである。ＩＭ注射して０．５アンペアで電気穿孔した動物では、濃縮プラスミドと比べて、希釈プラスミドを投与しグループの方がＳＥＡＰレベルが高かった（４３％高い、＊Ｐ＝０．０２４）。非常に低いレベルの検出可能なＳＥＡＰタンパク質が、ＩＤ注射した動物の血清中に認められた。
【０１１５】
この研究で使用されるＳＥＡＰは、ヒトタンパク質であり、したがって、ブタ体内で免疫反応を引き起こさせる。ＥＬＩＳＡを使用した抗体反応の測定を行い、その結果は図１３に示されるグラフで見ることができる。１１日目の血清サンプルにおける抗体反応を、１１日目の血清ＳＥＡＰ結果と共にグラフ化した。その中で、濃縮プラスミドサンプルが最も高い平均抗体力価をもたらした。
【０１１６】
ＧＨＲＨ軸の下流側ホルモン、インスリン様成長因子ＩすなわちＩＧＦ−Ｉを使用してＧＨＲＨ発現量を測定した。その結果は図１４に示されるグラフに見ることができる。ＩＧＦ−Ｉは、血清中で比較的安定なタンパク質であり、ＩＧＦ−Ｉ  ＲＩＡキットを用いて容易に測定できる。注射後１１日目のの血清ＩＧＦ−Ｉレベルは、濃縮プラスミドをＩＭ投与（Ｃ−ＩＭ−０．５Ａ）したグループと比べて、非濃縮プラスミドをＩＭ投与（Ｄ−ＩＭ−０．５Ａ）したグループの方が高かった。
【０１１７】
結果は、発現及び分泌されるタンパク質の発現並びにこれらのタンパク質に対する免疫原性に関して注射の体積および経路が非常に重要な役割を果たすことを示している。発現対免疫原性に関する限り、濃縮ＤＮＡと非濃縮ＤＮＡとの間には有意差が認められた。
【０１１８】
ＩＧＦ−Ｉ発現は、ＩＭ注射して０．５アンペア電流強度で電気穿孔した動物においてより高かった。より低い電流強度では低い発現レベルが生じ、動物が小数であったため、その差異は非統計的なものであった。
【０１１９】
実施例６．ブタにおける皮膚ＥＰ研究
材料および方法
動物
予備実験では、体重が２５〜４０ｋｇの生後３〜６週目の性別混合の若いハイブリッドブタを使用した（ｎ＝５／グループ）。動物は、米国実験動物介護認定協会の基準にしたがって、テキサス州のシュガーランドにあるＳｔｉｌｌｍｅａｄｏｗ社に収容した。動物は、食料および水に自由に摂取可能な檻の中にグループで収容した。動物は、実験開始前に５日間かけて順応させた。
【０１２０】
プラスミド
実験１、２のそれぞれでは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１またはｐＳＥＡＰ−２  Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（カリフォルニア州のパロ・アルトにあるＣｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用した。実験１（Ｅｘｐ．１）で使用したｐＥＧＦＰ−Ｎ１は、哺乳動物細胞内でより強い蛍光とより高い発現が得られるように最適化された野生型ＧＦＰのレッドシフト（red-shifted）変異体をコードする（最大励起波長＝４８８ｎｍ；最大放出波長＝５０７ｎｍ）。遍在性サイトメガロウイルスプロモータ（ＣＭＶ）がｐＳＥＡＰ−２  Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ中の分泌型胎性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を駆動させた。このプラスミドをブタ実験２（Ｅｘｐ．２）で使用した。プラスミドは市販のキット（米国、カリフォルニア州のチャッツワースにあるＱｉａｇｅｎ社）を使用して得た。エンドトキシンレベルは、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）によって測定したところ、０．０１ＥＵ／μｇ未満であった。プラスミド調製物は、滅菌水で希釈して、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＭＷ＝１０．５ｋＤａ平均）（ミズーリ州のセントルイスにあるＳｉｇｍａ）と１％重量／重量で配合し、ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（テキサス州のウッドランド）にて更にＨＰＬＣ精製した。
【０１２１】
皮内／皮下（ＩＤ／ＳＱ）プラスミド投与および電気穿孔（ＥＰ）
実験１の０日目に、動物は、体重を量り、イソフルレン（５％で誘起、２〜３％で維持）を用いて麻酔した。各横腹の２つの３”×３”部位の体毛を剃り、該部位を注意深く洗浄した。後の識別のために、入れ墨インクを使用して、１インチブロックのマークを付けた。各プラスミド注射物はブロックの中心に送達された。動物には、様々なＥＰ条件（以下を参照）、注射体積および投与量、すなわち、プラスミド投与量、注入体積（５０μｇ／５０μＬ、５０μｇ／１００μＬ、１００μｇ／１００μＬ、および、２００μｇ／１００μＬ）でＩＤ／ＳＱ注射し、電流振幅およびパルス長を変え、また、処置領域の生検について、処置グループの識別情報を与えられていない個別の観察者によるスコア付けを行った。切り取られた皮膚領域の写真を撮影し、また、注射後５日目に蛍光を測定した。最も発現量の高いサンプルとの比較において、分布領域および蛍光強度に基づいて数値スコアを計算した（０＝蛍光無し、分布無し；５＝最も明るい蛍光、最も大きい分布）。全ての実験で方形波パルスを使用し、適応定電流（下層の組織によって受けられる定電流）を供給可能な皮膚ＥＰ装置、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）装置（ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、テキサス州のウッドランド）を使用して投与した。全てのケースにおいて、２個または３個のパルスを用いて、２０ミリ秒／パルスまたは５２ミリ秒／パルスにわたって、適応定電流パラメータが０．１〜０．４アンペアであった。この場合、パルス間は１秒であった。
【０１２２】
実験１では、２つのタイプの配列を使用した。すなわち、筋内（ＩＭ）ＥＰのために先に使用した非導電材料上に装着される５つの等間隔に配置された２１−ゲージ純ステンレススチール製ニードル電極の円形配列（１ｃｍ直径）である電極配列及び非導電材料上に装着され且つ二等辺三角形構成（２つの長辺の長さは５ｍｍであり、短辺の長さは３ｍｍである）で配置された長さが３ｍｍの３つの２６−ゲージ純ステンレススチール製ニードル電極から成るＩＤ／ＳＣ皮膚ニードル電極（図１７Ｂも参照）を使用した。
【０１２３】
実験２において、動物には、２ｍｇ／ｍＬ（ＩＭ注入と同様の５００μＬ）の標準的なプラスミド調製物又は１０ｍｇ／ｍＬ（１００μＬ）の濃縮されたプラスミド調製物として、１ｍｇのｐＳＥＡＰをＩＤ／ＳＱ注射および皮膚ＥＰを行った。また、プラスミド投与後１１日目までＳＥＡＰ発現を測定した。
【０１２４】
血液採取およびＳＥＡＰ分析
実験２の０、４、７、１１日目には、８：３０ＡＭに動物の体重を量り、頸静脈穿刺によってＭＩＣＲＯＴＡＩＮＥＲ血清セパレータチューブ内へと血液を採取した。血液を室温で１０〜１５分間かけて凝固させた。その後、血液を３０００ｘｇで１０分間遠心し、血清を−８０℃で更なる分析まで保存した。
【０１２５】
血清サンプルを解凍させ、そのうち５０μＬについて、製造メーカ使用説明書に従ってＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（マサチューセッツ州のベッドフォードにあるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＳＥＡＰ活性を分析した。分析のための検出の下限は３ｐｇ／ｍＬである。ＳＥＡＰ活性に関する分析前に、より高濃度の血清サンプルをマウス血清で１：１０に希釈した。全てのサンプルは、ＬＵＭＩｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ照度計（ドイツ、オッフェンブルクにあるＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。
【０１２６】
結果
実験１
最も高いＧＦＰスコアは、皮膚ニードル電極配列およびＩＭ電極の両方を使用した場合に得られた。しかしながら、ＩＭ電極を用いて最適な結果を得るにはは、皮膚ニードル電極配列での５０μＬ中に配合される５０μｇのプラスミドの場合と比べ、同じ濃度で２倍のプラスミド投与量、すなわち、１００μＬ中に配合される１００μｇのプラスミドを必要とした（図１５）。また、本発明者らが皮膚ＥＰにとって最適な条件であると決定した０．２アンペア、２つのパルス、５２ｍｓ／パルス、パルス間１秒を使用すると、処理時間が顕著に減少した。すなわち、皮膚ＥＰ装置を使用すると、処置時間がたったの４〜５秒であり、ＩＭ配列を使用すると８０秒である。一般に、適切なプラスミド１回分量をもって用量（より濃縮された溶液）を更に少なくすると、良好な結果をもたらすことが分かった。
【０１２７】
実験２
ブタは、皮膚ＥＰとの関連でＩＤ／ＳＱプラスミド送達にとって最適となるように先の実験で決定された条件、すなわち、０．２アンペア、２パルス、５２ｍｓ／パルス、パルス間１秒を使用して処置した。動物には、少用量の製剤、または、ＩＭ＋ＥＰ注入に通常用いられる用量で、同じプラスミド量、すなわち、１ｍｇのｐＳＥＡＰを投与した。濃縮プラスミド調製物を使用して注射体積をより少量に抑えた場合により高いＳＥＡＰ値が得られた（図１６）（Ｐ＜０．０５）。これらの条件は、非ヒト霊長類の実験で更に確認された。
【０１２８】
実施例７．霊長類実験
アカゲザルは、ＩＤ／ＳＱ注射およびその後の皮膚ＥＰにより、低投与量のＤＮＡ（０．２ｍｇ／抗原）を用いて２回免疫し、その後、高投与量のＤＮＡ（１．０ｍｇ／抗原）を用いて３回免疫した。２回の低投与量免疫により、ＩＤ／ＳＱのみのグループ並びにＩＤ／ＳＱ注射及びその後の皮膚ＥＰ（ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰ）のグループの両方は、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔの測定において弱い細胞性免疫反応しか示さなかった。しかしながら、ＤＮＡ投与量を増大させた３回の免疫によって、ＩＤ／ＳＱグループにおいて１，０００ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣにまで反応が上昇した。ＩＤ＋ＥＰグループは、ＩＤ／ＳＱグループよりも５０％多くのＩＦＮγ生成細胞を有していた。ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループにおける免疫原性の高まりは、ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループのメモリＴ細胞反応においても見られ、ＩＤ／ＳＱグループよりも２倍多い抗原特異的ＩＦＮγ生成細胞を有していた。ＩＤ／ＳＱ免疫のみでは、ｇａｇまたはｅｎｖ抗体力価の有意な生成をもたらさなかった（＜５０終点力価）。しかしながら、ＥＰを用いたプラスミド送達は、８８００のピークｇａｇ終点力価および１６００のｅｎｖ終点力価をもたらした。最後に、プラスミドにコードされたｒｈＩＬ−１２の同時免疫は、ＩＬ−４ＥＩＳｐｏｔ分析による測定で、決定されるＴＨ１極性免疫反応を生じさせた。
【０１２９】
材料および方法
動物
動物は、実験前に隔離した状態で少なくとも３０日かけて順応させた。
【０１３０】
プラスミド
この実験では、ｐＧａｇ４Ｙ、ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂ、および、ＷＬＶ１０４プラスミドを使用した。ｐＧａｇ４Ｙは、ＨＩＶのｇａｇタンパク質をコードする発現カセットを含む。ｐＧａｇ４Ｙ遺伝子は、更なる実験のため、発現ベクターｐＶａｘ（米国カリフォルニア州のカールズバッドにあるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとサブクローニングした。ｐＥＹ２Ｅ１−Ｂは、ＨＩＶクレードＢのエンベロープをコードする発現カセットを含む。ＷＬＶ１０４Ｍは、ｒｈＩＬ−１２遺伝子をコードするプラスミドである。プラスミドは、市販のキット（米国カリフォルニア州のチャッツワースにあるＱｉａｇｅｎ社）を使用して得た。エンドトキシンレベルは、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）によって測定すると、０．０１ＥＵ／μｇ未満であった。プラスミド調製物は、滅菌水で希釈し、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＭＷ＝１０．５ｋＤａ平均）（ミズーリ州のセントルイスにあるＳｉｇｍａ）と１％重量／重量で配合し、ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（テキサス州のウッドランド）で更にＨＰＬＣ精製した。
【０１３１】
免疫
ＨＩＶ  ＤＮＡワクチンは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）適応定電流ＥＰ装置（前述した実施例３の場合と同様）および皮膚ニードル電極配列を使用したＥＰを用いて（ｎ＝３／グループ）およびＥＰを用いることなく（ｎ＝３／グループ）、非ヒト霊長類にＩＤ／ＳＱ送達した。免疫を４週間置いて行い、また、抗体反応およびＴ細胞反応を測定するために、動物は２週間毎に採血した。最初の２回の免疫では、０．２ｍｇの２種類のＨＩＶ抗原（ｇａｇおよびｅｎｖ）をそれぞれ送達し、また、アジュバントとしてのＩＬ−１２発現プラスミドは、２００μＬの量で、動物毎に２つのＩＤ／ＳＱ注射部位へと分けて投与した。その後の２回の免疫は、１ｍｇの各のＨＩＶワクチンおよび更に高いプラスミド濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）のＩＬ−１２プラスミド（全体で３ｍｇ）を使用して行い、それにより、先の２回の免疫と同じ体積でより多くのプラスミド投与量を達成した。電気穿孔条件は、０．２アンペア定電流、２パルス、パルス間が１秒の５２ｍｓのパルス長であった。
【０１３２】
血液採取
動物は、実験期間中に２週間毎に採血した。ＥＤＴＡチューブ内に１０ｍＬの血液を採取した。ＰＢＭＣは、標準的なＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離器を用いて分離し、その後、完全培養媒地（１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および、５５μＭ／Ｌのβ−メルカプトエタノールを添加した２ｍＭ／ＬのＬ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。ＲＢＣは、ＡＣＫ溶解バッファ（ニュージャージー州のイーストラザフォードにあるＣａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で溶解した。
【０１３３】
酵素結合免疫吸着剤分析（ＥＬＩＳＡ）
１００ｎｇ／ウェルの組み換えＨＩＶ−１  IIIＢ  ｐ２４またはｇｐ１２０（マサチューセッツ州のウォバーンにあるＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて９６ウェルプレートを一晩かけてコーティングし、ＨＩＶのｇａｇ反応およびｅｎｖ反応をそれぞれ測定した。１００ｎｇ／ウェルのウシ血清アルブミンでコーティングしたプレートは、ネガティブコントロールとして用いた。プレートは、３７℃において１時間にわたり３％ＢＳＡ−ＰＢＳＴでブロックした。その後、プレートは、３７℃で１時間にわたって４倍連続血清希釈を用いてインキュベートした。その後、ヤギ由来抗サルＩｇＧホースラディシュ・ペルオキシダーゼ結合抗体を、プレートに１：１０，０００の希釈率で添加し（オハイオ州のオーロラにあるＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、３７℃で１時間にわたってインキュベートした。テトラメチルベンジジン（ミネソタ州のミネアポリスにあるＲ＆Ｄシステム）を用いてプレートをデベロップし、２ＮのＨ２ＳＯ４を用いて反応を止めた。その後、光学濃度（ＯＤ）を測定した。
【０１３４】
ＩｇＧ終点力価は、ＢＳＡウェルの平均ＯＤ値の２倍を超えるＯＤ値をもたらす血清希釈率の逆数として規定された。
【０１３５】
酵素結合免疫スポット分析（ＥＬＩＳｐｏｔ）
ＥＬＩＳｐｏｔは、ＩＦＮγまたはＩＬ−４捕獲・検出抗体（スウェーデンのＭａｂＴｅｃｈ）を用いて行なった。抗原特異的応答は、ペプチドを含有するウェルからネガティブコントロールウェル中のスポットの数を差し引くことによって測定した。その結果は、３重複ウェルについて得られた平均値（スポット／１００万の脾細胞）として表示される。
【０１３６】
統計的解析
データは、Ｐｒｉｓｍ  Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを使用して解析し、平均±ＳＥＭとして表わす。
【０１３７】
非ヒト霊長類の実験計画
アカゲザルは、最適化されたＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖコンストラクトおよびプラスミドにコードされるｒｈＩＬ−１２を用いて、図１７Ａに示す設計に従って免疫した。非ヒト霊長類においても、ブタ実験で使用した装置（図１７Ｂ）を用いた。ＩＤ／ＳＱ注射によって３体の動物を免疫し、ＩＤ／ＳＱ注射とその後の皮膚電気穿孔（ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰ）を用いて３体の動物を免疫した。動物は、０、４、８、１２、１６週目に５回免疫した。２週間毎に血液を採取し、各免疫後２週目にＥＬＩＳｐｏｔ分析を行なった。一方、ＥＬＩＳＡ分析は、各免疫後４週目に行なった。
【０１３８】
ＥＬＩＳｐｏｔ解析
各免疫後の細胞性免疫応答の誘起は、ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔによって測定した（図１８）。０．２ｍｇ／抗原の１回の低用量免疫後、ＩＤ／ＳＱグループおよびＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループの両方が非常に弱い反応を示した（それぞれ、７２±１１ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣおよび８５±３４ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。第２の低用量免疫では、ＩＤ／ＳＱグループ内のＩＦＮγ生成細胞の数が倍増し（１７３±７７ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）、ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループの反応が３倍に増加した（２８７±３４ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。２回の低用量免疫後に非常に弱い細胞性応答が観察されたため、本発明者らは、次の３回の免疫ではより多くのＤＮＡ投与量（１ｍｇ／抗原）を使用した。免疫応答は、ＩＤ／ＳＱグループでは、３回目の免疫によっても有意に増大しなかった（１７６±７２ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。しかしながら、ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループは、より多くの用量によってブーストされ、それにより、抗原特異的ＩＦＮγ生成細胞の量が倍増した（３８３±１６２ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。１ｍｇ投与量のＤＮＡを用いて動物に４回目の免疫を行った。ＩＤ／ＳＱグループでは、前回の免疫と比べてＩＦＮγ応答の３倍の増加が観察された（３７６±２１０ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。第３の免疫と同様、皮膚ＥＰを用いた高投与量でのＤＮＡの送達では、ＩＦＮγ応答が倍増した（１４６６±７６２ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。これらの高いレベルの抗原特異的応答は、最後の免疫を通じて維持された（１４５３±８７３ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。最後の免疫により、ＩＤ／ＳＱグループではＩＦＮγ生成細胞の量が更に倍増した（９２７±１９１ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。
【０１３９】
メモリＴ細胞応答
ロバストなメモリＴ細胞応答の誘導は、ワクチンの成功の重要な局面である。ＩＤ／ＳＱ  ＤＮＡ免疫によって誘起されるメモリＴ細胞群を評価するために、最後のＤＮＡワクチン接種後１０週目にＥＬＩＳｐｏｔ解析を行なった（図１９）。ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループは、ＩＤ／ＳＱグループの２倍の強度のメモリＩＦＮγ応答を示した（それぞれ、９９８±２９０および４４９±１０８ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）。
【０１４０】
ＴＨ２Ｔ細胞応答
皮膚免疫のための遺伝子銃を使用した実験により、ＴＨ２バイアスＴ細胞応答の誘導が実証された。しかしながら、ＩＬ−１２タンパク質も送達した場合には、このバイアスをＴＨ１応答側に反転できることが分かった。ＩＤ  ＤＮＡ免疫におけるｒｈＩＲ−１２の同時送達を行い、その同時送達がＴＨ１バイアス応答を誘導するかどうかを決定した（図２０）。抗原特異的ＴＨ２応答の誘導は、最後の免疫後１０週間目にＩＬ−４  ＥＬＩＳｐｏｔ分析によって測定した。ＩＤ／ＳＱのみのグループの全ての動物がＩＬ−４応答陰性（＞５０ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）を示し、ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループの１体の動物だけがＩＬ−４応答陽性（１３６ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ）を示した。このことは、ＴＨ１応答が優勢であることを示唆している。
【０１４１】
体液性応答
ＤＮＡ免疫の脆弱性は、それが非ヒト霊長類研究およびヒト臨床研究で抗体応答を引き起こすことができないことにある。組み換えｐ２４抗原およびｇｐ１６０抗原に対するＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖ特異的抗体力価の両方を誘起する各グループの能力は、ＥＬＩＳＡ分析によって測定した（図２１）。両方の抗原において、ＩＤ／ＳＱグループは有意な抗体力価を示さなかった（＜５０終点力価）。ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループは、第２の低用量免疫後に低レベルの抗体を生成した（終点力価：１００±５０）。しかしながら、抗体のより大きな誘起は、高用量のＤＮＡ（２２２０±１０００）を用いた第３の免疫において送達されるＤＮＡの投与量が増大された後に認められた。抗体力価は第４の免疫を通じて増大した（８８００±４０００）。また、ｅｎｖ抗体応答は、低い力価を示すＩＤ／ＳＱグループ（＜５０終点力価）及び１６００±８００の最大終点力価に達するＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループについても、ｇａｇ抗原に関して本発明者らが観察した結果を反映していた。
【０１４２】
ＩＭ対ＩＤ／ＳＱ電気穿孔
アカゲザルは、ＩＭ免疫により、１．０ｍｇ／ｍＬで（前述したものと）同じＨＩＶｇａｇ、ｅｎｖ、および、ｒｈＩＬ−１２コンストラクトを用いて３回免疫した。細胞性免疫応答の誘起を比較したところ、ＩＭルートおよびＩＤ／ＳＱルートはいずれも、最初の２回の免疫後に同様のレベルのＩＦＮγ生成細胞を有していた。一方、ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰによる免疫は、ＩＭ＋ＥＰと比べて、１回の高用量免疫後に高いレベルのＨＩＶｇａｇ抗体力価をもたらした。２回の免疫後、ＩＤ／ＳＱ＋ＥＰグループは、ＩＭ＋ＥＰグループの２倍のＨＩＶｇａｇ終点力価を示した。
【０１４３】
これらの実験において、本発明者らは、ＩＤ／ＳＱ区画室内への送達のために皮膚ニードル電極を使用するとともに、その結果として得られる免疫応答とＩＭ＋ＥＰ後に得られる免疫応答とを比較した（表１参照）。
【表２】
0005439183.tif 000003
【０１４４】
実施例８．皮膚ＥＰを使用するマウスにおけるＤＮＡワクチン接種
Ａ.プラスミドコンストラクト
遍在性サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）プロモータまたは筋肉特異的な合成プロモータ（ＳＰｃ５−１２）は、マウス実験１、３（Ｅｘｐ．１およびＥｘｐ．３）で使用したｐＳＥＡＰ−２  Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒにおけるヒト分泌型胎性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を促進する。哺乳動物細胞でより強い蛍光とより高い発現量が得られるように最適化された野生型緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−プラスミド、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１を発現するレッドシフト変異体（最大励起波長＝４８８ｎｍ；最大放出波長＝５０７ｎｍ）を、レポータ遺伝子実験（実験２）で使用した。プラスミドは市販のキット（カリフォルニア州のチャッツワースにあるＱｉａｇｅｎ社）を使用して得た。エンドトキシンレベルは、Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍａｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）によって測定したところ、０．０１ＥＵ／μｇ未満であった。コンセンサスＨＡおよびＮＡ構造は、近年においてヒトに致命的であることが分かった１６  Ｈ５ウイルスおよび４０種類を越えるヒトＮ１ウイルスの一次ウイルス配列を解析することによって作製した。これらの配列は、ロスアラモス国立研究所のインフルエンザ配列データベースからダウンロードした。コンセンサス配列を作製した後、コントラストは、Ｋｏｚａｋ配列の付加、コドン最適化、ＲＮＡ最適化を含めて、哺乳動物での発現用に最適化した。これらのコンストラクトは、その後、ｐＶａｘベクター（カリフォルニア州のカールズバッドにあるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとサブクローニングした。他に表示がない限り、プラスミド調製物は、滅菌水中で希釈されて、ポリ−Ｌ−グルタミン酸塩（ＬＧＳ）と１％重量／重量で配合され（ＭＷ＝１０．５ｋＤａ平均）（ミズーリ州のセントルイスにあるＳｉｇｍａ）、ＶＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（テキサス州のウッドランド）で更にＨＰＬＣ精製した。
【０１４５】
Ｂ．マウスにおけるレポータ遺伝子実験
この研究は、いずれの電気穿孔パラメータ（最低有効電流）、タイムラグ（注射と電気穿孔の開始との間の時間）、配合、および、対象筋肉が、発現レベルおよび抗体レベルに影響を与えるのかを決定するために、ＳＥＡＰまたはＥＧＦＰ発現プラスミドの送達および発現を試験した。動物は、様々な電流でのＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）皮膚ＥＰ装置（３×２６ゲージ電極の使用を含む）の使用と、ＩＭまたはＩＤ注射との様々なタイムラグの条件で電気穿孔した。
【０１４６】
第１の実験（Ｅｘｐ．１）において、Ｃ５７／Ｂ１６マウス（ｎ＝１０／グループ）のグループには、筋肉特異的合成プロモータ（ｐＳＰｃ５−１２−ＳＥＡＰ）の制御下においてＳＥＡＰを発現するプラスミド１０μｇを、４秒または８０秒のタイムラグおよび０．１Ａの定電流で、前脛骨筋（ＴＡ）または腓腹筋（Ｇ）内へと注射した。コントロールグループは、ＥＰを伴わずに（ＥＰ無し）ＴＡ内にプラスミドを摂取させた。別の動物グループは、プラスミドバックボーン有しないが（ＮＢ）同一のプロモータ、トランス遺伝子、および、３’ポリアデニル化シグナルを有する発現カセットを等モル濃度で、ＥＰを伴っておよびＥＰを伴わずにＴＡ筋肉およびＧ筋肉中に摂取させた。
【０１４７】
第２の実験（Ｅｘｐ．２）において、グループは、マウス（ｎ＝４）であり、ＩＭまたはＩＤのいずれかによって１０ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬの最終プラスミド濃度で、それぞれ５μＬまたは２５μＬの体積にて、５０μｇのｐＣＭＶ−ＥＧＦＰを注射した。切り取った皮膚および筋肉領域の写真を撮影し、注射後５日目に蛍光を測定した。処置し領域は、処置グループの識別情報を与えられていない個別の観察者によってスコア付けした。最も発現量の高いサンプル（０＝蛍光無し、分布無し；５＝最も明るい蛍光、最も大きい分布）と野比較において、分布領域および蛍光強度に基づいて数値スコアを計算した。
【０１４８】
第３のマウス実験（Ｅｘｐ．３）では、１６グループ×５匹のマウス／グループ、全部で８０匹のマウスを使用した（表２）。マウス（ｎ＝５／グループ）には、様々な配合（生理食塩水、生理食塩水＋１％ＬＧＳ、水、水＋１％ＬＧＳ）および電流強度で５０μｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（１０ｍｇ／ｍＬ）を注射した。動物は、ＴＡ筋肉またはＧ筋肉中へのＩＭ注射のため、４秒のタイムラグで様々な電流（０．１Ａ〜０．２Ａ）を用いて電気穿孔した。
【表３】
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【０１４９】
全てのケースにおいて、動物は、３日間かけて順応させ、体重を量り、耳にタグを付けた。実験期間中、食料および水は自由に摂取可能な状態にした。実験０日目において、動物は、体重を量り、採血し、齧歯動物用の配合麻酔剤−キシラジン（３７．５ｍｇ／ｍＬ；０．０５ｍＬ／３０グラム体重）、ケタミン（１．９ｍｇ／ｍＬ；０．０１６ｍＬ／１０グラム体重）、アセプロマジン（０．３７ｍｇ／ｍＬ；０．０２５ｍＬ／１５グラム体重）を使用して麻酔し、設計に従ってプラスミドを投与し、電気穿孔した。実験１、３において、血液をレトロオービタルブリードを使用して採取し、凝固させた。採取し全ての血液は、血清および血漿を分離するために遠心分離し、その後、先に行なった態様にわずかな修正を加えたＳＥＡＰ分析および抗ＳＥＡＰ  ＥＬＩＳＡのために氷上のチューブへと分注した。１４日後、全ての動物は、麻酔の外科的状態で採取した。
【０１５０】
Ｃ．解析
血液採取
０、４、７、１１日目に、マウスの体重を量り、レトロオービタルブリードによってマイクロチューブに採血した。血液は、室温で１０〜１５分間かけて凝固させ、その後、１０分間にわたって３０００ｘｇで遠心分離し、更なる分析まで血清を−８０℃で保存した。
【０１５１】
ＳＥＡＰアッセイ
血清サンプルを解凍し、そのうち５０μＬについて、製造メーカ使用説明書に従ってＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（マサチューセッツ州のベッドフォードにあるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、先と同様にＳＥＡＰ活性のアッセイをおこなった。アッセイの検出下限は３ｐｇ／ｍＬである。ＳＥＡＰ活性のアッセイ前に、より高濃度の血清サンプルをコントロール種特異的な血清で１：１０に希釈した。全てのサンプルは、ＬＵＭＩｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙ照度計（ドイツ、オッフェンブルクにあるＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して測定した。
【０１５２】
ＳＥＡＰ間接ＥＬＩＳＡ
ヒトＳＥＡＰタンパク質に対する免疫原性を、以下の変更された手順によってマウスで測定した。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｂ（ニューヨーク州のロチェスター）プレートを、４℃で一晩かけて、ＰＢＳ中の精製ヒト胎性アルカリホスファターゼ（１００ナノグラム／ウェルのヒト胎性アルカリホスファターゼを含む１００μＬ（Ｓｉｇｍａ））でコーティングした。プレートは、３回デカント洗浄した。プレートは、ＰＢＳ中に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）溶液（ブロッキング溶液）を使用してブロッキングし、室温で２時間インキュベートした。血清サンプルを１：１００で希釈した後、別個の希釈プレートにおいてＰＢＳの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０における１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で１：４の連続希釈を行った。ブロッキング溶液はプレートからデカントした。１００μｌの希釈検査血清を各ウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。血清希釈液をデカントして３回洗浄した。二次抗体（ホースラディシュ・ペルオキシダーゼと結合したウサギ由来抗マウス抗体）をＰＢＳ中に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１％ＢＳＡ溶液で１：１０００に希釈し、室温で１時間インキュベートした。プレートをデカント洗浄した。１ウェル当たり１００μｌのｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）基質を０．１Ｍクエン酸バッファ中に添加し（０．６７ｍｇ／ｍＬ）、８分間インキュベートした。また、１００μｌの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を停止させた。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４  プレートリーダー（カリフォルニア州のサニーベールにあるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１５３】
Ｄ．マウスの結果
ＳＥＡＰ発現は対象マウスに依存する
発現は、ＳＥＡＰ発現プラスミド注射が、Ｇ筋肉よりもＴＡ（図２２）へ投与される場合に増大した。両方の筋肉への投与において、注射と皮膚ＥＰ装置によるＥＰとの間のタイムラグは８０秒および４秒であった。ＳＰｃ５−１２−ＳＥＡＰプラスミドをＴＡ筋肉へ注射した場合、血清ＳＥＡＰレベルは、ＥＰ無しでプラスミドを摂取させたコントロール動物の場合よりも２８５倍高かった（Ｐ＜１．３  Ｅ−２１）。ＴＡ筋肉においては、８０秒のタイムラグと４秒のタイムラグとの間で違いが観察されなかった（３５７±６対３５７±６．２ｐｇ／ｍＬ／ｇ）。同じ条件下でのＧ筋肉中への注射では、コントロール動物よりも９０〜１８２倍高いＳＥＡＰレベルが得られら（Ｇ８０ｓ対ＥＰ無しコントロール、Ｐ＜０．００３；Ｇ４ｓ対ＥＰ無しコントロール、Ｐ＜７．７Ｅ−０６）。発現カセットだけを含むプラスミド断片が等モル配合でＴＡおよびＧ（バックボーンは無い（ＮＢ）が、同じプロモータ、トランス遺伝子、および、３’ポリアデニル化シグナルを含む）に注射した場合、発現レベルは、ＩＭ＋ＥＰを受けなかった対照よりも２１０〜２５０倍高かった（８０ｓ対ＥＰ無し、Ｐ＜１．８Ｅ−０８；４ｓ対ＥＰ無し、Ｐ＜３．８Ｅ−０５）。ＴＡ８０ｓにおけるＳＥＡＰ発現はＮＢ８０ｓグループよりも２４％高かった（Ｐ＜０．００８）。一方、ＴＡ４ｓはＮＢ４ｓグループよりも３７％高かった（Ｐ＜０．００４）。ＥＰなしでＣ５−１２−ＳＥＡＰとＮＢを投与した両グループは、無視し得るＳＥＡＰ発現量を示した。
【０１５４】
ＧＦＰ発現
ＧＦＰ発現は、注射部位を注意深く剥離した後に視覚化し、処置グループが分からない観察者によってスコア付けされた。ＧＦＰスコアは、ＩＤ（４．６３±０．２４対３．２５±０．１４、Ｐ＝０．０１）およびＩＭ（４．７５±０．１４対３±０．５４、Ｐ＝０．０１）の両方に濃縮プラスミドを投与注入した動物のグループの方が、非濃縮プラスミドを投与したグループに対して高かった（図２３）。これらの研究では、濃縮製剤（最大１０ｍｇ／ｍＬ）が更に高い全発現と関連付けられた。この実験からの結果に基づいて、実験３では、プラスミドが１０ｍｇ／ｍＬの濃度で使用された。
【０１５５】
ＳＥＡＰ発現は配合および電流強度に依存する
ＳＥＡＰレベルの違いは、ＳＥＡＰトランス遺伝子が遍在性プロモータの制御下にあるときに評価した（実験１で使用される筋肉特異的プロモータに対して）。先の実験と同様に、発現は、プラスミド注射−ＥＰ操作をＧ筋肉（Ｐ＝０．０５）に行った場合よりもＴＡ（図２４）で行った場合に増大した。この特定の実験において、生理食塩水＋ＬＧＳ製剤は、生理食塩水製剤と比べて高い血清ＳＥＡＰレベルをもたらしたが（それぞれ、４１．１±７．９ｐｇ／ｍＬ／ｇ対３１．０±５．９ｐｇ／ｍＬ／ｇ）、これは、グループ内での変動がおおきかったため統計的有意性を示すものではなかった。一般に、０．１Ａ電流設定で電気穿孔された動物は、０．２Ａ定電流で送達される同一のＬＧＳプラスミド製剤を摂取させた動物よりも僅かに高いＳＥＡＰ発現量を示した。それにもかかわらず、水中に配合された０．２Ａプラスミド製剤を摂取させた動物は、同じ筋肉において０．１Ａで摂取させた動物よりも有意に低いＳＥＡＰレベルを示した（ＴＡに対してＰ＜０．０５、および、Ｇに対してＰ＜０．００１）。ＬＧＳを水製剤に添加した場合には、ＴＡ筋肉に対する差異は有意なものではなかったが、Ｇ筋肉に対しては有意性を保持していた（Ｐ＜０．０４）。
【０１５６】
抗ＳＥＡＰ抗体の発現誘導
生理食塩水＋ＬＧＳを含むＳＥＡＰプラスミドの製剤は高いタンパク質発現量をもたらしたが、抗ＳＥＡＰ抗体の力価は、水＋ＬＧＳに配合されたＳＥＡＰプラスミドを注射した動物と比較すると低かった（図２５）。しかし、これは、グループ内での変動がおおきかったため統計的有意性を示すものではなかった。
【０１５７】
実施例９．霊長類における皮内送達と筋内送達との比較
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１５８】
これらの実験では、アカゲザルを免疫した。動物は、実験開始前に２ヶ月かけて順応させた。研究は以下のように進めた。０週目は最初の免疫（プラスミド１回分量を投与）およびベースライン採血を行なった；２週目は採血を行なった；３週目は２回目の免疫を行なった（プラスミド１回分量を投与）；５週目は採血を行なった；６週目は３回目の免疫（プラスミド１回分量を投与）および採血を行なった；８週目は採血を行なった。
【０１５９】
全てのプラスミドは、先の実施例に記載されるように、＋１％ＬＧＳ注射物用に水中に１０ｍｇ／ｍＬで配合させ、各実験グループ（前記表中のグループＡ−Ｈ）ごとに１つの溶液として混合した。ＩＭ  ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）  ＩＤ  ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）およびＩＭ  Ｓｙｒｉｎｇｅに指定される各グループ用の正確な注射量を計算した。ＩＤ投与において、必要な注射量が１部位当たり１００μＬを超えた場合には、製剤を複数個所（全部で何ｍｇのワクチンが投与されたかに応じて２、３または６箇所）に分けて注射した。ＩＭ注射した動物には、１箇所にで全製剤を投与した。
【０１６０】
前記実施例で説明したブタ実験および非ヒト実験で使用しＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）適応定電流装置は、本非ヒト霊長類実験においても使用した。電気穿孔条件は以下の通りであった。すなわち、ＩＭ注入および電気穿孔グループに関して、条件は、０．５アンペア、５２ｍｓ／パルス、３パルス、プラスミド注射と電気穿孔との間の遅延４ｓであった。ＩＤ注入および電気穿孔グループに関して、条件は、０．２アンペア、５２ｍｓ／パルス、３パルス、プラスミド注射と電気穿孔との間の遅延４ｓであった。
【０１６１】
血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ
１部の血清を３部の酵素で希釈することによりサル血清をレセプター破壊酵素（ＲＤＥ）で処理し、３７℃のウォーターバスで一晩インキュベートした。酵素を５６℃で３０分間のインキュベートによって不活性化させ、その後、６部のＰＢＳを添加して１／１０の最終希釈を行った。ＨＩ分析は、４ＨＡユニットのウィルスおよび１％ウマ赤血球を使用して、Ｖ字ボトム９６ウェルマイクロタイタープレートで行なった。ここに示されるデータは、２回目の免疫後の結果である（３回目の免疫前に採取された血液）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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