(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中のGnaq遺伝子における活性化変異を有するか否かを検出する工程であって、該変異を有することが、生物学的試料中のメラニン形成細胞性新生物細胞の存在の指標となる、工程
を含む、患者由来の生物学的試料中のメラニン形成細胞性新生物細胞を検出する方法。
【請求項２】
配列変異が、GnaqのGln209をコードするコドンにある、請求項1記載の方法。
【請求項３】
変異がQ209L置換またはQ209P置換である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
検出する工程が、生物学的試料由来の核酸試料中の変異を有するか否かを検出する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
検出する工程が、Gnaq遺伝子に選択的にハイブリダイズするプローブと核酸試料とを接触させる工程、およびハイブリダイズしたプローブの存在を検出し、それにより、配列変異を検出する工程を含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
接触させる工程がインサイチューハイブリダイゼーションにおいて実施される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
検出する工程が増幅反応を含む、請求項4記載の方法。
【請求項８】
検出する工程が、Gnaq遺伝子の変異領域の配列を決定する工程を含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
検出する工程が、前記遺伝子によりコードされるタンパク質における変異を検出する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
生物学的試料が眼試料または皮膚試料である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
生物学的試料がリンパ節、肺、肝臓、副腎、軟部組織、または骨に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
生物学的試料が黒色腫を有する患者に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
黒色腫がブドウ膜から発生したものである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
黒色腫が青色母斑から発生したものである、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
黒色腫が、慢性的に日光による損傷を受けた皮膚から発生したものである、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
患者由来の生物学的試料中のGnaq遺伝子における配列変異を有する細胞の数の変化を検出する工程であって、Gnaq変異を有する細胞の数の変化が、治療に対する患者の応答の指標となる、工程
を含む、治療に対する患者対象における黒色腫の進行をモニタリングする方法。
【請求項１７】
生物学的試料が眼または皮膚に由来する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
生物学的試料が血液、リンパ節、肝臓、副腎、または骨に由来する、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
Gnaqの活性化変異を有する黒色腫細胞を有する患者への投与用の、Gnaqにおける活性化変異を有する黒色腫細胞の増殖を阻害するための、Gnaqアンタゴニストを含む薬学的組成物であって、該GnaqアンタゴニストがsiRNAである、薬学的組成物。
【請求項２０】
黒色腫細胞がブドウ膜黒色腫に由来する、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
黒色腫細胞が青色母斑から発生したものである、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
黒色腫細胞が、慢性的に日光による損傷を受けた皮膚に由来する、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
変異が、GnaqのGln209をコードするコドンにある、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
患者に存在する黒色腫に由来する生物学的試料中のGnaq遺伝子における活性化変異を有するか否かを検出する工程であって、該変異を有することが、Gnaq阻害剤による処置のための候補である黒色腫細胞の存在の指標となる、工程
を含む、Gnaq阻害剤による処置のための候補である黒色腫細胞を検出する方法。
【請求項２５】
変異が、GnaqのGln209をコードするコドンにある、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
黒色腫がブドウ膜黒色腫、悪性青色母斑、または慢性的に日光による損傷を受けた皮膚における黒色腫である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
検出工程が、遺伝子によりコードされるタンパク質における変異を検出する工程を含む、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
母斑由来の生物学的試料中のGnaq遺伝子における活性化変異を有するか否かを検出する工程であって、該変異を有することが、母斑の黒色腫への進行のリスクの増加の指標となる、工程
を含む、母斑の黒色腫への進行のリスクを決定する方法。
【請求項２９】
配列変異が、GnaqのGln209をコードするコドンである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
母斑が青色母斑である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
母斑が太田母斑である、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
検出する工程が、遺伝子によりコードされるタンパク質における変異を検出する工程を含む、請求項28記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2007年2月8日出願の米国特許仮出願第60/900,479号の恩典を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦によって後援された研究または開発の下で作成された発明に対する権利に関する言及
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたグラント番号P01 CA 025874-25-A1の下で政府の支援を受けて作成された。政府は、本発明においてある程度の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
黒色腫形成の現在のモデルは、中心的な黒色腫遺伝子における変異の蓄積により、メラニン形成細胞が正常状態から悪性状態へと進行するというものである。Meier, F., et al. (1998) Frontiers in Bioscience 3：D1005-1010を参照のこと。黒色腫は、自発的に発生する場合もあるし、または既存の母斑もしくは黒子の内部に発生する場合もある。母斑は、公知の黒色腫遺伝子における変異を保有しており、従って、黒色腫発症のリスクファクターである。例えば、Pollock, P.M., et al., (2003) Nat. Genet. 33(1): 19-20；Kumar, R. et al., (2004) J. Invest. Dermatol. 122(2):342-348；Chin, L., (2003) Nat. Rev. Cancer 3(8):559-570を参照のこと。
【０００４】
ヒトの黒色腫およびメラニン形成細胞性母斑の大多数が、BRAF遺伝子、NRAS遺伝子、C-KIT遺伝子、またはHRAS遺伝子における活性化変異を有することが示されている。さらに、最近の研究は、黒色腫が、MAPキナーゼ経路活性化の頻度の著しい差異を有する遺伝学的に別個の群に分類されることを証明した。Curtin, J.A., et al., (2005) N Engl J Med. 353(20):2135-47を参照のこと。一つのカテゴリー、ブドウ膜黒色腫は、眼の脈絡叢内のメラニン形成細胞から発生し、特徴的な細胞遺伝学的改変により皮膚黒色腫とは生物学的に区別される。Horsman et al. (1993) Cancer 71(3):811を参照のこと。他方のカテゴリーは、先天性または後天性であり得、不連続の青みがかった黒子(青色母斑)から、結膜および眼窩周囲の皮膚(太田母斑)、肩部(伊藤母斑)、ならびに腰部(蒙古斑)に影響を与える大きな青色〜灰色の斑にまでわたる多様な方式で現れる、真皮内メラニン形成細胞増殖である。Zembowicz, et al. (2004) Histopathology 45(5):433を参照のこと。これらの真皮内メラニン形成細胞増殖は、BRAF変異もNRAS変異も含有しておらず、従って、その他の母斑および黒色腫と比較して独特の病因を有しない。Ariyanayagam-Baksh SM, et al., (2003) Am J Dermatopathol. 25(1): p. 21-7を参照のこと。ブドウ膜黒色腫は、MAPキナーゼ活性化を示すが(Zuidervaat et al. (2005) British J. Cancer 92(11):2032を参照のこと)、典型的には、BRAF、NRAS、またはKITにおける変異を有していない。ブドウ膜黒色腫は、毎年100万人当たり4.3〜6例という率で米国において診断されているが、ブドウ膜黒色腫を有する1250人の白人における以前の研究では、眼または眼皮膚のメラノサートシス(melanocytosis)を有する患者はわずか17人(1.4％)しか見出されなかった。Gonder J.R., et al., (1982) Ophthalmology, 89(8): 953-60を参照のこと。真皮内メラニン形成細胞性新生物とブドウ膜黒色腫との間の可能性のある関係は、太田母斑がブドウ膜黒色腫のリスクファクターであるという事実により、そして二つの状態の組織形態学的特色のいくつかのオーバーラップにより示唆されており、二つは一緒に発生することが報告されている。Lopez, M. T., et al., (1998) Am J Dermatopathol. 20: 109-110；Singh, A.D., et al. (1998) Opthamol. 105(1): 195を参照のこと。
【０００５】
最近、マウスにおける大規模な変異誘発スクリーンによって、いくつかの暗色皮膚(Dsk)変異体が同定された。Van Raamsdonk CD, et al., (2004) Nat Genet. 36: 961-968を参照のこと。これらの変異体のいくつかは、青色母斑に類似している真皮内メラニン形成細胞のまばらな細胞増殖を有するメラニン形成細胞表現型を有していた。変異は、Gタンパク質α-サブユニットにおける変異の結果であることが示された。
【０００６】
Gタンパク質は、アルファ(α)、ベータ(β)、およびガンマ(γ)サブユニットから構成される哺乳動物に見出されるヘテロ三量体タンパク質の大きなファミリーである。Wettschureck, N. A. O. S., (2005) Physiol. Rev. 85(4): 1159-1204を参照のこと。G-αqは、GTPの結合および加水分解を通してホスホリパーゼCβの刺激を媒介する多様なG-αサブユニットのうちの一つである。Markby, D.W., et al., (1993) Science 262(1541): 1895-1901を参照のこと。G-αqの活性化は真皮内メラニン形成細胞の生存を促進するとの仮説が立てられている。Van Raamsdonk, C. D., et al., (2004)を参照のこと。これは、G-αqの機能亢進が、細胞分裂速度を増加させることなく、真皮内に遊走する未熟メラニン形成細胞であるメラニン形成芽細胞の数を増加させるというマウスにおける観察と一致している。Van Raamsdonk, C. D., et al., (2004)を参照のこと。
【０００７】
マウスにおけるGαqの生殖細胞ハイパーモルフィック(hypermorphic)変異は、上皮色素沈着を改変することなく、皮膚色素沈着過剰を引き起こす。例えば、GnaqDsk1変異およびGnaqDsk10変異は、GTPase活性にとって不可欠なアミノ酸には起こらず、エンドセリンB受容体と共役した機能性のGタンパク質に依存し続けるため、構成性ではなく機能亢進性であると見なされる。Van Raamsdonk, C.D., et al. , (2004)を参照のこと。注目すべきことに、GnaqDsk1マウスおよびGnaqDsk10マウスは腫瘍を発症しない。Van Raamsdonk, CD., et al (2004)を参照のこと。しかしながら、重大なアミノ酸の置換を通したGTPase活性の阻止は、構成性の活性化をもたらし得る。Markby, D.W., et al. (1993)を参照のこと。例えば、Gαs(Gnas)におけるQ227の変異は、ヒト下垂体腫瘍における構成性の活性を引き起こす。Landis, C.A., et al. (1989) Nature 340(6236):692-696を参照のこと。
【０００８】
メラニン形成細胞内のGタンパク質共役型受容体Grm-1を異所的に発現するトランスジェニックマウスは、真皮色素沈着過剰および大きなメラニン形成細胞性腫瘍の両方を有する。Pollock, P.M., et al. (2003) Nat. Genet. 34(1): 108-112を参照のこと。さらに、構成的に活性なGnaqにより形質転換されたNIH3T3細胞の胸腺欠損ヌードマウスへの注射は、注射の1週間以内に腫瘍を誘導する。Kaqlinec G. et al. (1992) Mol. Cell Biol. 12(10):4687-4693を参照のこと。
【０００９】
Gnaqにおける一つの変異が、黒色腫試料中に存在することが報告されている。この変異は、Sanger Institute Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer(COSMIC)ウェブサイト、http：//www.sanger.ac.uk/cosmicに記載されている。Bamford et al (2004) Br J Cancer, 91:355-358を参照のこと。COSMIC sample id no：753546(sample name CP66-MEL)に記載された変異(Mutation ID No.182000)は、保存的なアミノ酸置換(V359I)をもたらすミスセンス置換変異(1075G to A)である。CP66-MELにおけるGnaqのV359I保存的ミスセンス変異が、Gnaq活性に対して何らかの効果を有するとの教示は存在しない。
【００１０】
本発明は、Gnaqにおける変異、例えば、Gnaqを構成的に活性化する変異に起因する活性化されたGaサブユニットが、メラニン形成細胞性新生物、例えば、太田母斑のような青色母斑；青色母斑から発生する稀な型の黒色腫である悪性青色母斑(Granter, S.R., et al., (2001)Am. J. Surg. Pathol. 25(3):316-323を参照のこと)；ブドウ膜黒色腫およびある種の皮膚黒色腫、例えば、悪性黒子黒色腫または慢性的な日光による曝露により損傷を受けた皮膚からの黒色腫(CSD黒色腫)に存在することの発見に一部基づく。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、生物学的試料中の黒色腫または母斑細胞を検出する方法を提供する。方法は、患者由来の黒色腫細胞または母斑細胞を含むと推測される生物学的試料においてGnaq遺伝子における活性化配列変異を検出することを含む。例えば、本発明は、Gnaq遺伝子もしくは遺伝子によりコードされた産物における変異の存在を検出することにより；またはGnaqの過剰発現を検出することにより、黒色腫、例えば、ブドウ膜母斑、悪性青色母斑、またはCSD黒色腫(悪性黒子黒色腫を含む)を検出する方法を提供する。方法は、診断および予後の指標のため、そして様々な処置治療、例えば、G-αアンタゴニスト、またはプロテインキナーゼC阻害剤のような下流シグナル伝達成分を標的とする治療に、応答性であるかまたは応答性である可能性が高い黒色腫患者を同定するため、使用され得る。本発明は、Gnaq遺伝子における変異から発生する黒色腫、例えば、ブドウ膜黒色腫、悪性青色母斑、またはCSD黒色腫を有する患者にGnaq阻害剤を投与することを含む、黒色腫を処置する方法も提供する。
【００１２】
従って、本発明は、生物学的試料中に存在する黒色腫細胞または母斑細胞におけるGnaqの配列変異を検出し、その際、Gnaqの活性化変異の存在を、メラニン形成細胞性新生物の存在の指標とすることを含む、患者、例えば、黒色腫を有するかまたは有すると推測される患者に由来する黒色腫細胞を含む生物学的試料、例えば、皮膚試料または眼試料においてメラニン形成細胞性新生物を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、メラニン形成細胞性新生物は、ブドウ膜黒色腫、慢性的な日光による曝露から誘導された損傷を有する皮膚において発生する黒色腫、例えば、悪性黒子黒色腫、または母斑で発生する黒色腫、例えば、悪性青色母斑である。その他の態様において、メラニン形成細胞性新生物は、末端部黒子黒色腫、粘膜黒色腫、結節性黒色腫、表在拡大型黒色腫、線維硬化性黒色腫、または先天性母斑で発生する黒色腫、または転移であり得る。その他の態様において、Gnaq変異は、青色母斑、太田母斑、非定型青色母斑、非定型細胞増殖型青色母斑、ニューロクリスティック(neurocristic)過誤腫を伴う青色母斑、または特定の診断のない青色母斑のような母斑の指標となる。その他の態様において、母斑は、先天性母斑または深部浸透(deep penetrating)母斑であり得る。いくつかの態様において、検出工程は、核酸、例えば、mRNAまたはゲノムDNAにおけるGnaq変異の存在または欠如を検出することを含む。典型的な態様において、そのような検出工程は、PCRもしくはRT-PCRのような増幅反応、インサイチューハイブリダイゼーション、または電気泳動による核酸分離(例えば、ノーザンブロッティングもしくはサザンブロッティング)を含む。その他の態様において、検出工程は、Gnaqタンパク質における変異を検出すること、例えば、Gnaqの活性および/または発現のレベルを測定することを含む。典型的な態様において、そのような検出工程は、抗体の使用(免疫細胞化学)および/または電気泳動によるタンパク質分離(例えば、ウエスタンブロット)を含む。いくつかの態様において、Gnaq変異はGln209 to Leu(CAA to CTAまたはCAA to TTA)であり、その他の態様において、Gnaq変異はGln209 to Pro(CAA to CCA)である。いくつかの態様において、Gnaq変異はGln209 to Arg(CAA to CGA)である。さらにその他の態様において、Gnaq変異はGln209 to Tyr(CAA to TAT)である。
【００１３】
典型的には、検出工程は、Gnaqにおける配列変異の存在または欠如を検出することを含む。これは、しばしば、例えば、生物学的試料由来の核酸試料を分析することにより達成される。核酸はDNA試料またはRNA試料であり得る。DNA試料は、RNAの逆転写から入手されてもよいし、またはゲノムDNAであってもよい。しばしば、変異を検出するための検出工程は増幅反応を含む。変異の存在または欠如は、例えば、増幅された核酸の配列分析により；または対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブを利用する方法により同定され得る。
【００１４】
いくつかの態様において、生物学的試料は、黒色腫、例えば、ブドウ膜黒色腫、日光による損傷を受けた皮膚における黒色腫、悪性青色母斑、または転移を有しているかまたは有していると推測される患者に由来する。その他の態様において、生物学的試料は、母斑、例えば、普通の青色母斑、太田母斑、伊藤母斑、蒙古斑、非定型青色母斑、非定型細胞増殖型青色母斑、ニューロクリスティック過誤腫を伴う青色母斑、特定の診断のない青色母斑、先天性母斑、または深部浸透母斑を有しているかまたは有していると推測される患者に由来する。
【００１５】
本発明は、Gnaqにおける変異から発生する黒色腫の処置のための治療に供された患者における黒色腫の進行をモニタリングする方法も提供する。方法は、患者由来の生物学的試料においてGnaqにおける変異を有する細胞の数の変化を検出し、その際、変異を有する細胞の数の変化を、患者の治療に対する応答の指標とすることを含む。
【００１６】
いくつかの態様において、患者におけるGnaq遺伝子における変異から発生した黒色腫の進行のモニタリングは、生物学的試料からの核酸における変異を検出することにより実施される。その他の態様において、Gnaqにおける変異から発生する黒色腫の進行は、生物学的試料中に存在するGnaqタンパク質を評価することにより検出される。いくつかの態様において、生物学的試料は眼または皮膚に由来する。その他の態様において、生物学的試料は、血液、リンパ節、肝臓、副腎、または骨に由来する。
【００１７】
典型的には、本発明に係る黒色腫進行のモニタリングにおいて、処置剤への曝露の前に患者から採取された生物学的試料の中のGnaq変異を有している細胞の数と比較して低下した、薬剤による処置の後に患者から採取された生物学的試料の中のGnaq変異を有する細胞の数の存在は、処置剤に対する陽性の治療的応答の指標となる。
【００１８】
本発明の検出法の全てにおいて、生物学的試料は、原発性または転移性の黒色腫細胞を含有していると推測される体内の任意の起源に由来し得る。従って、生物学的試料は、皮膚、例えば、末端部皮膚；慢性的な日光による曝露からの損傷を有する皮膚、眼、例えば、ブドウ膜、結膜、または粘膜に由来し得る。その他の態様において、試料は、血液、血清、リンパ節からの組織、または内臓器官からの組織に由来し得る。いくつかの態様において、例えば、黒色腫の進行のモニタリングにおいて、試料は血液のような容易に入手可能な組織に由来する。
【００１９】
もう一つの局面において、本発明は、黒色腫患者が、Gaサブユニットの活性を、直接、またはGaにより活性化されるタンパク質を阻害することにより、阻害する治療を受容するための候補であるか否かを決定する方法を提供する。方法は、黒色腫細胞がGnaqにおける活性化変異を有するか否かを決定することを含む。この決定は、本明細書に記載された検出法に従って実施される。従って、検出工程は、mRNA、DNA、またはタンパク質における変異を検出することを含み得る。いくつかの態様において、検出工程は、黒色腫または母斑に由来する核酸試料におけるGnaq変異の存在を検出することを含み得、その他の態様において、検出工程は、メラニン形成細胞性新生物由来のタンパク質試料から行われる。核酸試料は、メラニン形成細胞性新生物試料に由来するRNAまたはDNA、例えば、ゲノムDNAまたはRNAから作成されたcDNAであり得る。しばしば、検出工程は、PCRまたはRT-PCRのような増幅反応を含む。
【００２０】
いくつかの態様において、黒色腫は、ブドウ膜黒色腫、悪性青色母斑、CSD黒色腫、例えば、悪性黒子、末端部黒色腫、粘膜黒色腫、黒色腫、または表在拡大型黒色腫である。
【００２１】
もう一つの局面において、本発明は、Gnaqアンタゴニストを投与することを含む、Gnaqにおける体細胞変異から発生する母斑細胞または黒色腫細胞の成長および/または増殖を阻害する方法を提供する。Gnaqアンタゴニストは、例えば、エデルホシン(edelfosine)、プロテインキナーゼC阻害剤、スタウロスポリンアナログCPG41251のような低分子；抗体；ペプチド；または核酸であり得る。典型的には、母斑細胞または黒色腫細胞は、例えば、ブドウ膜黒色腫、CSD黒色腫、例えば、悪性黒子黒色腫、末端部黒子黒色腫、粘膜黒色腫、結節性黒色腫、表在拡大型黒色腫、線維硬化性黒色腫、転移性黒色腫、または母斑において発生する黒色腫、例えば、太田母斑、伊藤母斑、蒙古斑、非定型青色母斑、非定型細胞増殖型青色母斑、ニューロクリスティック過誤腫を伴う青色母斑、特定の診断のない青色母斑、再発性細胞増殖型青色母斑のような青色母斑から発生する黒色腫(悪性青色母斑)に由来する。黒色腫細胞は、先天性母斑または深部浸透母斑からも発生し得る。
【００２２】
本発明は、母斑由来の生物学的試料においてGnaq遺伝子における配列変異の存在または欠如を検出し、その際、変異の存在を、母斑の黒色腫への進行のリスクの増加の指標とすることを含む、母斑の黒色腫への進行のリスクを決定する方法も提供する。いくつかの態様において、配列変異はGnaqのGln209をコードするコドンである。いくつかの態様において、母斑は、太田母斑、非定型青色母斑、非定型細胞増殖型青色母斑、青色母斑ニューロクリスティック過誤腫、または特定の診断のない青色母斑のような青色母斑である。いくつかの態様において、変異は、遺伝子によりコードされるタンパク質を評価することにより検出される。
[本発明1001]
生物学的試料中のGnaq遺伝子における活性化変異の存在または欠如を検出する工程であって、該変異の存在が、生物学的試料中のメラニン形成細胞性新生物細胞の存在の指標となる、工程
を含む、患者由来の生物学的試料中のメラニン形成細胞性新生物細胞を検出する方法。
[本発明1002]
配列変異が、GnaqのGln209をコードするコドンにある、本発明1001の方法。
[本発明1003]
変異がQ209L置換またはQ209P置換である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
検出する工程が、生物学的試料由来の核酸試料中の変異の存在または欠如を検出する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
検出する工程が、Gnaq遺伝子に選択的にハイブリダイズするプローブと核酸試料とを接触させる工程、およびハイブリダイズしたプローブの存在を検出し、それにより、配列変異を検出する工程を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
接触させる工程がインサイチューハイブリダイゼーションにおいて実施される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
検出する工程が増幅反応を含む、本発明1004の方法。
[本発明1008]
Gnaq遺伝子の変異領域の配列を決定する工程をさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
検出する工程が、前記遺伝子によりコードされるタンパク質における変異を検出する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
生物学的試料が眼試料または皮膚試料である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
生物学的試料がリンパ節、肺、肝臓、副腎、軟部組織、または骨に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1012]
生物学的試料が黒色腫を有する患者に由来する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
黒色腫がブドウ膜から発生したものである、本発明1012の方法。
[本発明1014]
黒色腫が青色母斑から発生したものである、本発明1012の方法。
[本発明1015]
黒色腫が、慢性的に日光による損傷を受けた皮膚から発生したものである、本発明1012の方法。
[本発明1016]
患者由来の生物学的試料中のGnaq遺伝子における配列変異を有する細胞の数の変化を検出する工程であって、Gnaq変異を有する細胞の数の変化が、治療に対する患者の応答の指標となる、工程
を含む、治療に対する患者対象における黒色腫の進行をモニタリングする方法。
[本発明1017]
生物学的試料が眼または皮膚に由来する、本発明1016の方法。
[本発明1018]
生物学的試料が血液、リンパ節、肝臓、副腎、または骨に由来する、本発明1016の方法。
[本発明1019]
黒色腫を有する患者にGnaqアンタゴニストを投与する工程を含む、GNAQにおける活性化変異を有する黒色腫細胞の増殖を阻害する方法。
[本発明1020]
Gnaqアンタゴニストが低分子である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
GnaqアンタゴニストがプロテインキナーゼC阻害剤である、本発明1019の方法。
[本発明1022]
GnaqアンタゴニストがホスホリパーゼCβの阻害剤である、本発明1019の方法。
[本発明1023]
Gnaqアンタゴニストが抗体である、本発明1019の方法。
[本発明1024]
GnaqアンタゴニストがsiRNAである、本発明1019の方法。
[本発明1025]
黒色腫細胞がブドウ膜黒色腫に由来する、本発明1019の方法。
[本発明1026]
黒色腫細胞が青色母斑から発生したものである、本発明1019の方法。
[本発明1027]
黒色腫細胞が、慢性的に日光による損傷を受けた皮膚に由来する、本発明1019の方法。
[本発明1028]
変異が、GnaqのGln209をコードするコドンにある、本発明1019の方法。
[本発明1029]
患者に存在する黒色腫に由来する生物学的試料中のGnaq遺伝子の配列変異の存在または欠如を検出する工程であって、該変異の存在が、Gnaq阻害剤による処置のための候補である黒色腫患者の指標となる、工程
を含む、Gnaq阻害剤による処置のための候補である黒色腫患者を同定する方法。
[本発明1030]
変異が、GnaqのGln209をコードするコドンにある、本発明1029の方法。
[本発明1031]
黒色腫がブドウ膜黒色腫、悪性青色母斑、または慢性的に日光による損傷を受けた皮膚における黒色腫である、本発明1029の方法。
[本発明1032]
検出工程が、遺伝子によりコードされるタンパク質における変異を検出する工程を含む、本発明1029の方法。
[本発明1033]
母斑由来の生物学的試料中のGnaq遺伝子における配列変異の存在または欠如を検出する工程であって、変異の存在が、母斑の黒色腫への進行のリスクの増加の指標となる、工程
を含む、母斑の黒色腫への進行のリスクを決定する方法。
[本発明1034]
配列変異が、GnaqのGln209をコードするコドンである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
母斑が青色母斑である、本発明1033の方法。
[本発明1036]
母斑が太田母斑である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
検出する工程が、遺伝子によりコードされるタンパク質における変異を検出する工程を含む、本発明1033の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図1a〜1cは、hTERT/CDK4R24C/p53DDにより不死化されたメラニン形成細胞に対する変異体GNAQおよび野生型GNAQの発現の効果を示す例示的なデータを提供する。a、GNAQQ209Lは、NRASQ61Rと比較可能な効率で、TPA非依存的な様式で、hTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞の足場非依存性の成長を誘導する。b、aに示された実験のコロニーの数およびサイズ(mm)の定量分析。c、形態学的に異常な核を有する細胞の百分率。
【図２】図2a〜2bは、GNAQQ209Lがヒトメラニン形成細胞におけるMAPキナーゼ活性化を誘導することを示す例示的なデータを提供する。a、hTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞は、GNAQQ209Lによる安定的なトランスフェクションの後、GNAQWTまたはベクターのみと比較して増加したレベルのpERKおよびサイクリンD1を発現する；1細胞当たりの平均ピクセル蛍光強度の累積分布(p値：GNAQQ209L対ベクター対照)。b、GNAQWTまたはベクター対照によりトランスフェクトされた細胞と比較して、Flagタグ化GNAQQ209Lを発現する293細胞においては、pERKレベルが増加するが、pAKTレベルはそうでないことを示すウエスタンブロット。シクロフィリンBは、負荷対照として示される。
【図３】図3a〜3cは、siRNAがブドウ膜黒色腫細胞系Mel202におけるGNAQのノックダウンを媒介したことを示す。aは、siRNAに応答して減少したホスホ-ERKのレベルを示す。bは、GNAQ siRNAに応答して起こった細胞数の減少を示し、そしてcは、GNAQ siRNAに応答して起こった対照細胞と比較されたMel202細胞のアポトーシスの増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
序論
本発明は、予後的使用のための癌細胞の検出のための、そして黒色腫および母斑の処置のための方法、試薬、およびキットを提供する。本発明は、多くの黒色腫および母斑が、Gnaqにおける活性化体細胞変異、即ち、変異体G-αサブユニットのGTP加水分解活性の損失または減少をもたらす変異に起因するという発見に一部基づく。Gnaq変異を有する例示的なメラニン形成細胞性新生物には、ブドウ膜黒色腫、CSD黒色腫(悪性黒子黒色腫を含む)、悪性青色母斑、普通の青色母斑、太田母斑、非定型青色母斑、非定型細胞増殖型青色母斑、青色母斑ニューロクリスティック過誤腫、および特定の診断のない青色母斑が含まれる。
【００２５】
G-αは、脊椎動物における二つのサブグループ、GnaqおよびGna11を含む広範に発現されているGα-qファミリー、ならびにより制限された発現を示すGna14およびGna15ファミリーを形成するヘテロ三量体GTP結合タンパク質のうちの一つのαサブユニットである。Gα-qファミリーは、ビスホスホイノシチド(bisphosphoinositide)(PIP2)のイノシチド(inositide)三リン酸(IP3)およびジアシルグリセロール(DAG)への加水分解をもたらすホスホリパーゼCβの刺激を媒介する。IP3は、下流のカルシウム依存性シグナル伝達に通じる、小胞体(ER)における細胞内貯蔵庫からのカルシウムの放出を刺激することができる。それと平行して、DAGは、プロテインキナーゼC(PKC)を活性化することができ、次いで、両方の経路は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)カスケードに流れ込むことができる。Corbit, K.C., et al., (2000) Mol. Cell Biol. 20:5392-5403; Sato, M. et al., (2006) Ann. Rev. Pharm. Toxicol. 46: 151-187を参照のこと。
【００２６】
本発明者らは、Gnaqにおける活性化変異、例えば、GnaqのQ209のヘテロ接合性の体細胞置換変異が、普通の青色母斑、太田母斑、非定型青色母斑、非定型細胞増殖型青色母斑、ニューロクリスティック過誤腫を伴う青色母斑、および特定の診断のない青色母斑のような母斑を含む、いくつかの型のメラニン形成細胞性新生物に存在することを発見した。興味深いことに、その他の黒色腫遺伝子が青色母斑において変異していることは以前に報告されておらず、そのことは、青色母斑が、その他の母斑と比較して独特の病因を有することを示唆している。Ariyanayagam-Baksh, S. M., et al., (2003) Am. J. Dermatopathol. 25(1):21-27を参照のこと。Gnaqにおける活性化変異、例えば、Q209のヘテロ接合性の体細胞置換変異は、ブドウ膜黒色腫、悪性青色母斑、CSD黒色腫、および悪性黒子黒色腫(皮膚黒色腫の約4〜15％を占め、より高齢の個体において日光に曝された部位に形成される傾向がある皮膚黒色腫)を含む多様な黒色腫にも存在する(Chin L., (2003) Nat. Rev. Cancer. 3(8):559-570を参照のこと)。
【００２７】
いくつかの態様において、Gnaq活性化変異は、Gnaqの核酸配列およびポリペプチド配列の過剰発現に通じる変異である。従って、Gnaqの核酸配列および/またはポリペプチド配列のレベルを検出する方法は、母斑、例えば、太田母斑のような青色母斑、およびGnaqが過剰発現されている本明細書に記載されるような黒色腫細胞を検出するためにも使用され得る。
【００２８】
本発明の一つの局面において、Gnaqを活性化するGnaqにおける体細胞変異の検出による母斑細胞および/または黒色腫細胞を検出する能力は、多数の適用に有用である。例えば、それは、患者における黒色腫またはある型の黒色腫を診断するために、単独で、または他の診断法と組み合わせて使用され得る。それは、Gタンパク質もしくはホスホリパーゼCβまたはその他の下流のGnaqにより調節される経路の成分を標的とする治療薬のような治療薬に対して感受性の特定の黒色腫を同定するためにも使用され得る。
【００２９】
Gnaqにおける体細胞活性化変異の検出は、黒色腫処置の効力をモニタリングするためにも使用され得る。例えば、抗癌処置後の、Gnaq活性、例えば、Ga活性、またはGa活性に依存性のホスホリパーゼCβのような活性のレベル、またはGnaqにおける配列変異を有するメラニン形成細胞の数が、処置前のレベルと比較され得る。処置後のGnaq活性、例えば、ホスホリパーゼCβ活性のレベルの減少、または変異型Gnaqを有する黒色腫細胞の数の低下は、有効な処置を示す。
【００３０】
Gnaq活性のレベルおよび/またはGnaqにおける体細胞変異を有する細胞の数の変化を、特定の抗黒色腫治療の効力または観察された予後的成果と統計的に相関させ、それにより、統計に基づく予後または最も有効な処置の選択が、特定のレベル活性またはGnaq変異の診断的存在を考慮してなされ得るような、データベースの開発を可能にすることもできる。
【００３１】
Gnaqにおける活性化変異を有する細胞の検出は、例えば、経時的に癌の進行をモニタリングするため、患者における黒色腫細胞の数または位置をモニタリングするために有用であり得る。
【００３２】
Gnaqにおける活性化変異の存在は、変異体Gnaqを標的とする治療剤に対して応答性である可能性の高い黒色腫を示すこともできる。従って、本発明は、Gaアンタゴニスト、例えば、抗体、ペプチド、L-トレオ-ジヒドロスフィンゴシン(PKC特異的阻害剤)またはその他の低分子阻害剤のような低分子阻害剤、およびGnaq、ホスホリパーゼCβ、またはGnaqにより調節される下流経路の核酸阻害剤を投与することにより、Gnaqにおける活性化変異を有するメラニン形成細胞性新生物、例えば、ブドウ膜黒色腫、悪性黒子黒色腫、悪性青色母斑、または慢性的な日光による損傷を受けた皮膚における黒色腫を処置する方法も提供する。そのようなメラニン形成細胞性新生物は、本明細書に記載された方法を使用して、活性化変異の存在について分析することにより同定され得る。
【００３３】
母斑におけるGnaqにおける活性化変異の存在は、しばしば、黒色腫への進行のリスクを有する母斑、例えば、普通型の青色母斑および太田母斑を示す。従って、患者由来の母斑が、本明細書に記載された方法を使用して、活性化変異の存在について評価され得る。
【００３４】
定義
「Gnaq」という用語は、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)のαサブユニットをさす。その用語は、Gnaqの核酸およびポリペプチドの多形バリアント、対立遺伝子、変異体、および断片を包含する。そのような配列は当技術分野において周知である。例示的なヒトGnaq配列は、NCBIヌクレオチドデータベースにおいて参照配列NM_002072(ヌクレオチド配列)および登録番号NP_002063.2(ポリペプチド配列)の下で入手可能である。配列NM_002072は、例示的なヌクレオチド配列としてSEQ ID NO:1として提供される。例示的なポリペプチド配列はSEQ ID NO:2に示される。
【００３５】
本願に関連して使用されるような「Gnaq依存性黒色腫」とは、変異を有していないメラニン形成細胞と比較して、Gnaqを活性化し、変異体G-αサブユニットのGTP加水分解活性の損失または減少に通じる、Gnaqにおける欠陥(「変異」とも呼ばれる)を有している、即ち、「活性化」変異を有している黒色腫細胞を含むメラニン形成細胞性新生物をさす。Gnaqにおける欠陥は、タンパク質の構成性の活性をもたらす変異、例えば、置換変異を含み得る。「Gnaq依存性黒色腫細胞」は、そのような変異の一つまたは複数を有する可能性があり、例えば、細胞は、Q209を含む体細胞置換変異を有する可能性がある。本発明の「Gnaq依存性黒色腫」は、例えば、日光に曝された皮膚部位、母斑(例えば、青色母斑)、または眼(例えば、ブドウ膜)から発生し得る。「Gnaq依存性黒色腫」は、Gnaq以外の遺伝子における変異も有する可能性がある。
【００３６】
本出願の文脈において、「末端性黒色腫」は、手のひらまたは足底または爪の下の無毛部皮膚に発生する黒色腫を指す。末端性黒色腫のサブセットは、「末端性黒子性黒色腫」である。
【００３７】
「粘膜黒色腫」は、粘膜に発生する腫瘍を指す；本明細書に用いられる場合の「眼黒色腫」は眼から発生する黒色腫である。「眼黒色腫」は、ブドウ膜および結膜の黒色腫を含む。「結膜黒色腫」は、結膜に発生する黒色腫を指し、一方、「ブドウ膜黒色腫」は、眼の色素領域の黒色腫を指す。
【００３８】
本明細書に用いられる場合の「CSD黒色腫」は、慢性日光誘発性損傷を有する皮膚から発生する黒色腫を指す；本明細書に用いられる場合の「NCSD黒色腫」は、慢性日光誘発性損傷をもたない皮膚から発生する黒色腫を指す。本出願における「CSD」群と「NCSD」群との区別は、黒色腫を囲む真皮における著しい日光弾性線維症の有無の顕微鏡による決定に基づく。2、3例を除くすべての症例において、慢性日光誘発性損傷(CSD)に関連した黒色腫は、顔、ならびに前腕、手背部、脛、およびふくらはぎなどの四肢遠位部に発生する。これらの黒色腫は、典型的には、50歳より老齢の個体に発生し、顕微鏡的には、メラニン細胞が巣(nest)ではなく孤立した単位として配置されている表皮内構成要素を有する。さらに、これらの黒色腫は、乳頭間隆起の消失のある萎縮性表皮を有する傾向にある。CSD黒色腫のサブセットは、悪性の黒子性黒色腫である。一方、慢性日光誘発性損傷(NCSD)に関連していない黒色腫は、躯幹ならびに大腿部および上腕のような近位端に発生する。NCSD黒色腫は、典型的には、メラニン細胞が孤立した単位ではなく巣として配置されている表皮内構成要素を示し、多量の上方散乱(パジェット様拡散(pagetoid spread))を示す。NCSD黒色腫の多くは、表在性広範黒色腫である。
【００３９】
慢性日光誘発性損傷は、CSD 2より大きいCSDスコアをもつと定義される。スコアは、以下の系(Landi et al., Science 2006)を用いて100〜200x倍率での黒色腫を囲む正常皮膚のヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色切片上の日光弾性線維症の程度を決定することにより得られ、その例は図1に提供されている：
CSD 0：弾性線維の非存在；CSD 0+：200x倍率においてのみ識別できる極めて少ない弾性線維；
CSD 1：膠原線維束の間に、ブッシェル(bushel)としてではなく、個々の単位として存在する散乱した弾性線維；「-」または「+」分類辞は、弾性線維がほとんど散乱していないか、または密に散乱しているかを示すために用いられた。
CSD 2：個々の単位ではなくブッシェルとして主に分布している密に散乱した弾性線維；「-」分類辞は、ブッシェルが存在しているが、弾性線維は個々の単位が優勢であるように分布していることを示すために用いた；「+」分類辞は、ブッシェルのより大きな凝集体が形成されるが、不定形の沈着物を形成する代わりに個々のブッシェルの輪郭を保つ場合に用いた；
CSD 3：線維質感を喪失した、青灰色物質の不定形沈着物；「-」不定性沈着物の限局的な形成のみ；「+」広汎性の好塩基性物質の非常に大きな塊。
図1における全画像は、10x対物レンズでの全体像を示す右下を除いて40x対物レンズで撮られた。
【００４０】
本明細書に用いられる場合、ある部位、例えば、末端皮膚、粘膜、ブドウ膜、結膜、または慢性日光誘発性損傷を有する皮膚「から黒色腫が発生したことを決定すること」という用語は、黒色腫の起源の部位を同定することを指す。そのような決定は、患者の目視検査により、または黒色腫の病理評価により行われうる。
【００４１】
動物における「腫瘍」または「癌」という用語は、無制限増殖、不死性、転移能、急速な成長および増殖速度、ならびにある特定の特徴的な形態学的特性を含む、非定型の成長または形態のような特徴を有する細胞の存在を指す。多くの場合、癌細胞は、腫瘍の形をとるが、そのような細胞は動物内に単独で存在しうる。「腫瘍」は、良性および悪性新生物の両方を含む。「新生物性」という用語は、良性および悪性の両方の非定型成長を指す。
【００４２】
「メラニン形成細胞性新生物」という用語は、本明細書において使用されるように、周辺組織に比べて色素沈着過剰の区域をさす。メラニン形成細胞性新生物には、母斑および原発性黒色腫の両方が含まれ、体内の任意の場所に転移した黒色腫も含まれる。典型的には、メラニン形成細胞性新生物は、皮膚、粘膜、および眼に起こる。非限定的な例示的なメラニン形成細胞性新生物には、黒色腫、例えば、末端部黒子黒色腫、CSD黒色腫、NCSD黒色腫、悪性黒子黒色腫、粘膜黒色腫、結節性黒色腫、表在拡大型黒色腫、線維硬化性黒色腫、ブドウ膜黒色腫、結膜黒色腫、再発性細胞増殖型青色母斑、先天性母斑において発生する黒色腫、悪性青色母斑、および転移が含まれ得る。メラニン形成細胞性新生物には、本明細書において使用されるように、母斑も含まれる。例えば、メラニン形成細胞性新生物である非限定的な例には、本明細書において使用されるように、先天性母斑、結節を伴う先天性母斑、線維硬化反応を伴う先天性母斑、非定型性を伴う巨大先天性母斑、結節を伴う巨大先天性母斑、特定の診断のない先天性母斑、青色母斑、非定型青色母斑、非定型細胞増殖型青色母斑、ニューロクリスティック過誤腫を伴う青色母斑、特定の診断のない青色母斑、および特定の診断のない深部浸透母斑が含まれ得る。
【００４３】
「青色母斑」という用語は、本明細書において使用されるように、典型的に青みがかった色を有する、真皮内の、即ち、皮膚の真皮層内の、増加した色素沈着を示すメラニン形成細胞増殖をさす。先天性または後天性であり得る青色母斑は、不連続の青みがかった黒子(青色母斑)から、結膜および眼窩周囲の皮膚(太田母斑)、肩部(伊藤母斑)、ならびに腰部(蒙古斑)に影響を与える大きな青色〜灰色の斑にまでわたる多様な方式で現れ得る。
【００４４】
本明細書に用いられる場合の「生体試料」は、黒色腫を有するのではないかと疑われる、または有する患者から得られる試料を指す。いくつかの態様において、試料は、針生検、細針生検、外科生検などのような任意の型の生検を指す組織生検でありうる。試料は、典型的には、新生物または疑わしい新生物を含む皮膚組織試料を含むが、生体試料はまた、別の部位、例えば、黒色腫が転移する可能性がある部位由来、または血液由来でありうる。場合によっては、生体試料はまた、新生物または疑わしい新生物に隣接した領域由来でありうる。
【００４５】
「生体試料を供給すること」とは、本発明に記載された方法に用いる生体試料を得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、患者から細胞の試料を取り出すことにより行われるが、以前に単離された細胞(例えば、別な人により、別な時間に、および/または別の目的として、単離された)を用いることによって、または本発明の方法をインビボで実施することによっても、達成されうる。処置または転帰履歴を有するアーカイブ組織(archival tissue)もまた用いられうる。
【００４６】
2つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の関連における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、下記のデフォルトパラメーターでのBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて決定される場合、または手動のアラインメントおよび視覚的洞察により、同じであるか、またはアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの同じである特定のパーセンテージを有する(すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域に対して比較され、最大一致のために整列された場合、特定の領域に対して約60%同一性、好ましくは70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはそれ以上の同一性)、2つもしくはそれ以上の配列または部分配列を指す(例えば、NCBIウェブサイトwww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/など参照)。そのような配列は、その後、「実質的に同一」であると言われる。この定義はまた、試験配列の相補性に関係する、またはそれに適用されてもよい。この定義はまた、欠失および/または付加を有する配列、加えて置換を有する配列、加えて天然の、例えば、多型または対立遺伝子変種、および人工の変種を含む。下記のように、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどを考慮しうる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25個のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域に対して、またはより好ましくは、長さが50〜100個のアミノ酸もしくはヌクレオチドである領域に対して、存在する。例えば、本発明において使用される核酸プローブは、SEQ ID NO:1の隣接領域に対して少なくとも85%、典型的には90%、または95%の配列同一性を有してもよい。
【００４７】
配列比較について、典型的には、1つの配列が参照配列としての役目を果たし、それに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列がコンピューターへ入力され、必要に応じて、部分配列座標が指定され、そして、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムパラメーターが用いられうる、または代替パラメーターが指定されうる。配列比較アルゴリズムは、その後、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００４８】
本明細書に用いられる場合の「比較ウィンドウ」は、2つの配列が最適に整列した後、配列が同じ数の連続した位置の参照配列と比較されうる、典型的には、20個から600個まで、通常には約50個〜約200個、より通常には約100個〜約150個からなる群より選択される連続した位置の数のうちの1つのセグメントを指す。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性方法についての検索により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行により(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または手動のアラインメントおよび視覚的洞察により、行われうる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)参照)。
【００４９】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適しているアルゴリズムの好ましい例には、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムが挙げられ、それらはAltschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。本発明の目的のために、BLASTおよびBLAST 2.0が、本発明の核酸およびタンパク質についてのパーセント配列同一性を決定するためにデフォルトパラメーターで用いられる。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、米国国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)を通して公的に利用可能である。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、11のワード長(W)、10の期待値(E)、100のカットオフ、M=5、N=4、および両方の鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸(タンパク質)配列について、BLASTPプログラムは、3のワード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコア行列をデフォルトとして用いる(Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照)。本発明の目的のために、BLAST 2.0アルゴリズムがデフォルトパラメーターおよびフィルターオフで用いられる。
【００５０】
2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であるという現れは、下記のように、第一核酸がコードするポリペプチドが、第二核酸がコードするポリペプチドに対して産生された抗体と、免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、典型的には、例えば、2つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第二ポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるというもう一つの現れは、下記のように、2つの分子またはそれらの相補体がストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるというさらにもう一つの現れは、同じプライマーが配列を増幅するために用いられうることである。
【００５１】
「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で見出されるように通常はそれに伴う構成要素を、実質的にまたは本質的に含まない物質を指す。純度および均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を用いて決定される。調製物に存在する支配的な種であるタンパク質または核酸は実質的に精製されている。特に、単離された核酸は、天然でその遺伝子に隣接し、かつその遺伝子がコードするタンパク質以外のタンパク質をコードするいくつかのオープンリーディングフレームから分離されている。いくつかの態様における「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを表す。好ましくは、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、および最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを意味する。他の態様における「精製する」または「精製」は、精製されるべき組成物から少なくとも1つの夾雑物を除去することを意味する。この意味において、精製は、精製された化合物が均質、例えば、100%純粋、である必要はない。
【００５２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指すのに本明細書では互換的に用いられる。その用語は、天然のアミノ酸重合体、修飾残基を含むもの、および非天然のアミノ酸重合体だけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸重合体にも適用される。
【００５３】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成のアミノ酸、加えて、天然のアミノ酸と類似して機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号がコードするもの、加えて、後で修飾されるそれらのアミノ酸、例えば、水素、カルボキシル基、アミノ基、R基に結合するα炭素、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリン、である。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム、を指す。そのような類似体は、改変R基(例えば、ノルロイシン)または改変ペプチドバックボーンを有しうるが、天然アミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然アミノ酸と類似して機能する化学化合物を指す。
【００５４】
アミノ酸は、それらの一般的に知られた三文字表記によって、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されている一文字表記によって、本明細書に示されうる。同様に、ヌクレオチドはそれらの一般的に認められている一文字表記により示されうる。
【００５５】
「保存的に改変された変種」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変種は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするそれらの核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一のもしくは関連した、例えば、天然で近接する、配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が、大部分のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUのすべてが、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定されるあらゆる位置において、コドンは、コードするポリペプチドを変化させることなく、説明された対応するコドンのうちの別なものへ変化しうる。そのような核酸変異は、「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列はまた、核酸のサイレント変異を説明する。当業者は、ある特定の状況において、核酸における各コドン(通常、メチオニンの唯一のコドンであるAUG、および通常、トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)は、機能的に同一の分子を生じるように改変されうることを認識していると思われる。従って、多くの場合、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関しては説明された配列に内在するが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。
【００５６】
アミノ酸に関して、コードされた配列において単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージのアミノ酸を変化させる、付加する、または欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質の配列への個々の置換、欠失、または付加は、その変化が結果として、アミノ酸の、化学的に類似したアミノ酸との置換を生じる「保存的に改変された変種」である。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的に改変された変種は、本発明の多型変種、種間相同体、および対立遺伝子に加えてであり、それらを排除しない。典型的な、お互いに保存的な置換：1)アラニン(A)、グリシン(G)；2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4)アルギニン(R)、リシン(K)；5)イソロイシン(I)、ロイシン(L))、メチオニン(M)、バリン(V)：6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7)セリン(S)、トレオニン(T)；および8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)参照)。
【００５７】
本明細書に用いられる「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または文法的相当語句は、共に共有結合された少なくとも2個のヌクレオチドを意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には、長さが約5、6、7、8、9、10、12、15、25、30、40、50ヌクレオチド、またはそれ以上から、最高約100ヌクレオチド長までである。核酸およびポリヌクレオチドは、より長い長さ、例えば、200個、300個、500個、1000個、2000個、3000個、5000個、7000個、10,000個などを含む任意の長さの重合体である。本発明の核酸は、一般的に、ホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、例えば、ホスホロアミデート、ホスホロチオネート、ホスホロジチオネート、またはO-メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照)；ならびにペプチド核酸バックボーンおよび結合を含む代替バックボーンを有しうる核酸類似体が含まれる。他の類似体核酸は、米国特許第5,235,033号および第5,034,506号ならびにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds.を含む、正のバックボーン(positive backbone)；非イオン性バックボーン、および非リボースバックボーンを有するものを含む。1つまたは複数の炭素環糖(carbocyclic sugar)を含む核酸もまた、核酸の一つの定義内に含まれる。リボース-リン酸バックボーンの改変は、様々な理由で、例えば、生理学的環境下において、またはバイオチップ上のプローブとして、そのような分子の安定性および半減期を増加させるために、行われうる。天然核酸および類似体の混合物が作製されうる；あるいは、異なる核酸類似体の混合物、ならびに天然核酸および類似体の混合物が作製されうる。
【００５８】
様々な参照文献は、例えば、ホスホロアミデート(Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925 (1993)およびその中の参照文献; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 (1970); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); およびPauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986)、ホスホロチオネート(Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991); および米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオネート(Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989))、O-メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press参照)、ならびにペプチド核酸バックボーンおよび結合(Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996)参照、それらのすべては参照により組み入れられている)を含むそのような核酸類似体を開示する。他の類似体核酸は、米国特許第5,235,033号および第5,034,506号ならびにChapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, 「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cookを含む、正バックボーン(Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995)；)非イオン性バックボーン(米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号、および第4,469,863号; Kiedrowshi et al., Angrew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, 「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」, Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994); Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996))、および非リボースバックボーンを有するものを含む。1つまたは複数の炭素環糖を含む核酸もまた、核酸の一つの定義内に含まれる(Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp 169-176参照)。いくつかの核酸類似体は、Rawls, C & E News June 2,1997 page 35に記載されている。これらの参照文献のすべては、参照により本明細書によって明白に組み入れられている。
【００５９】
他の類似体には、ペプチド核酸類似体であるペプチド核酸(PNA)を含む。これらのバックボーンは、天然核酸の高荷電したホスホジエステルバックボーンと対照的に、天然条件下において実質的に非イオン性である。これは結果として2つの利点を生じる。第一に、PNAバックボーンは、向上したハイブリダイゼーション動力学を示す。PNAは、ミスマッチした塩基対対完全にマッチした塩基対についての融解温度(Tm)においてより大きな変化を有する。DNAおよびRNAは、典型的には、内部ミスマッチについてのTmにおいて2〜4℃降下を示す。非イオン性PNAバックボーンに関して、降下はほぼ7〜9℃である。同様に、それらの非イオン性の性質のために、これらのバックボーンに付着した塩基のハイブリダイゼーションは塩濃度に対して比較的非感受性である。加えて、PNAは細胞酵素により分解されず、従って、より安定でありうる。
【００６０】
核酸は、特定されているように、一本鎖もしくは二本鎖でありうる、または二本鎖もしくは一本鎖配列の両方の部分を含む。当業者により認識されているように、一本鎖の描写はまた相補鎖の配列を定義する；従って、本明細書に記載された配列はまた配列の相補体も提供する。他に規定がない限り、特定の核酸配列はまた、明確に示された配列だけでなく、それらの保存的に改変された変種(例えば、縮重コドンの置換)および相補配列も暗黙的に含む。核酸は、ゲノムおよびcDNAの両方のDNA、RNA、またはハイブリッドでありえ、核酸は、デオキシリボヌクレオチド、およびリボヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の組み合わせを含みうる。「転写産物」は、典型的には、天然のRNA、例えば、プレmRNA、hnRNA、またはmRNAを指す。本明細書に用いられる場合、「ヌクレオシド」という用語は、ヌクレオチドおよびヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、ならびにアミノ修飾ヌクレオシドのような修飾ヌクレオシドを含む。加えて、「ヌクレオシド」は、非天然の類似体構造を含む。従って、例えば、それぞれが塩基を含むペプチド核酸の個々の単位は、本明細書でヌクレオシドと呼ばれる。
【００６１】
「標識」または「検出可能な部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、32P、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて一般的に用いられるような)、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよびタンパク質、または、例えば、放射性標識をペプチドへ組み入れることにより検出可能にされうる、もしくはペプチドに特異的反応性である抗体を検出するために用いられうる他の実体が挙げられる。標識は、KIT核酸、タンパク質、および抗体へ任意の位置に組み入れられうる。抗体を標識へ結合させるための当技術分野における公知の任意の方法が用いられることができ、例えば、Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diegoに記載された方法を用いる。
【００６２】
「標識された核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、リンカーもしくは化学結合を通して共有結合性にか、またはプローブに結合した標識の存在を検出することによりプローブの存在が検出されうるように、標識へのイオン結合、ファンデルワールス結合、静電気結合、もしくは水素結合を通して非共有結合性にかのいずれかで、結合しているものである。あるいは、結合パートナーのペアの一方が、他方、例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、に結合する高親和性相互作用を用いる方法は、同じ結果に達しうる。
【００６３】
本明細書に用いられる場合、「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、1つまたは複数の型の化学結合を通して、通常には相補的塩基対形成を通して、通常には水素結合形成を通して、相補配列の標的核酸へ結合する能力がある核酸として定義される。本明細書に用いられる場合、プローブは天然(すなわち、A、G、C、またはT)または修飾された塩基(7-デアザグアノシン、イノシンなど)を含みうる。加えて、プローブにおける塩基は、ハイブリダイゼーションに機能的に干渉しない限り、ホスホジエステル結合以外の結合により連結されうる。従って、例えば、プローブは、成分塩基がホスホジエステル結合よりむしろペプチド結合により連結されるペプチド核酸でありうる。プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存してプローブ配列との完全な相補性を欠く標的配列を結合しうることは当業者によって理解されていると思われる。プローブは、好ましくは、同位元素、発色団、発光団、色素原と同様に、直接的に標識される、またはストレプトアビジン複合体が後で結合しうるビオチンと同様に、間接的に標識される。プローブの有無についてアッセイすることにより、選択配列もしくは部分配列の有無を検出できる。診断または予後は、ゲノムレベルで、またはRNAもしくはタンパク質発現のレベルに基づきうる。
【００６４】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関連して用いられる場合の「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、またはベクターが、異種性核酸もしくはタンパク質の導入、または天然の核酸もしくはタンパク質の変化により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞由来であることを示す。従って、例えば、組換え細胞は、その細胞の天然(非組換え)型の内に見出されない遺伝子を発現する、または、別な具合で異常に発現するか、十分に発現しないか、もしくは全く発現しない天然遺伝子を発現する。本明細書での「組換え核酸」という用語は、通常には天然で見出されない形で、一般的には、例えば、ポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いる核酸の操作により、最初にインビトロで形成される核酸を意味する。同様に、「組換えタンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、上記のように組換え核酸の発現を通して、生成されたタンパク質である。
【００６５】
「選択的に(または特異的に)ハイブリダイズする」という句は、配列が混合物(例えば、全細胞もしくはライブラリーのDNAまたはRNA、増幅反応)中に存在する場合、特定のヌクレオチド配列に対する分子の結合が混合物中のヌクレオチド配列の存在を決定するように、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、分子が、特定のヌクレオチド配列へ結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることを指す。
【００６６】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、典型的には核酸の複雑な混合物において、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境において異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays」(1993)に見出される。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度、pHにおいて特定の配列についての熱融解点(Tm)より約5〜10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする(標的配列が過剰に存在する場合、Tmにおいて、プローブの50%が平衡状態で占有される)温度(規定されたイオン強度、pHおよび核酸濃度下で)である。ストリンジェントな条件は、塩濃度がpH7.0〜8.3において約1.0M未満ナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(または他の塩)であり、かつ温度が、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)について少なくとも約30℃、および長いプローブ(例えば、50ヌクレオチドより長い)について少なくとも約60℃であるものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加で達成されうる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、陽性シグナルはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示としてのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のとおりでありうる：65℃での0.2xSSCおよび0.1%SDSにおける洗浄と共に、50%ホルムアミド、5xSSC、および1%SDS、42℃でのインキュベーション、または5xSSC、1%SDS、65℃でのインキュベーション。PCRについて、約36℃の温度は低ストリンジェンシー増幅について典型であるが、アニーリング温度は、プライマーの長さに依存して約32℃と48℃の間で変動しうる。高ストリンジェンシーPCR増幅について、約62℃の温度が典型であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に依存して約50℃から約65℃までの範囲でありうる。高いおよび低いストリンジェンシー増幅の両方についての典型的なサイクル条件は、30秒〜2分間の90℃〜95℃の変性相、30秒〜2分間続くアニーリング相、および1〜2分間の約72℃の伸長相を含む。低いおよび高いストリンジェンシー増幅反応についてのプロトコールおよびガイドラインは、例えば、Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.に提供されている。
【００６７】
ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、まだなお実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝暗号により許容される最大コドン縮重を用いて生成される場合に起こる。そのような場合、核酸は、典型的には、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。例示的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、37℃で40%ホルムアミド、1M NaCl、1%SDSの緩衝液におけるハイブリダイゼーション、および45℃で1XSSCにおける洗浄を含む。陽性ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が類似したストリンジェンシーの条件を提供するために利用されうることを容易に認識すると思われる。ハイブリダイゼーションパラメーターを決定するためのさらなるガイドラインは、多数の参照文献、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel, et al.に提供されている。
【００６８】
Gnaqタンパク質の活性を阻害する化合物を試験するためのアッセイに関連した「機能的効果」という語句には、間接的にまたは直接的に、Gnaqのタンパク質または核酸の影響下にあるパラメーター、例えば、腫瘍形成を減少させるかまたはGTP加水分解酵素活性を改変する能力のような機能的、物理的、または化学的な効果の決定が含まれる。Gnaqの活性または機能的効果には、タンパク質間相互作用活性、例えば、抗体またはGnaqが相互作用するその他のタンパク質との、Gnaqの結合能；GTP加水分解酵素活性、GnaqのGTPおよび/またはGDPとの結合能；成長の接触阻害および密度制限；細胞増殖；細胞形質転換；色素沈着の変化；増殖因子または血清に対する依存性；腫瘍特異マーカーレベル；マトリゲルへの侵襲性；モデル系における腫瘍成長および腫瘍「取り込み(take)」の測定を含む、インビボの腫瘍の成長および転移；転移中の細胞を含む細胞におけるmRNAおよびタンパク質の発現、ならびに癌細胞のその他の特徴が含まれ得る。「機能的効果」には、インビトロ、インビボ、およびエクスビボの活性が含まれる。
【００６９】
本明細書において使用されるように、Gnaqの「阻害剤」または「アンタゴニスト」(例えば、「Gnaqアンタゴニスト」)とは、Gnaqタンパク質、ホスホリパーゼCβ、またはGnaqにより調節される下流の分子、例えば、プロテインキナーゼC(PKC)に、例えば、結合するか、それらの活性を部分的にもしくは完全に阻止するか、それらを減少させるか、それらを防止するか、それらの活性化を遅延させるか、それらを不活化するか、それらを脱感作するか、またはそれらの活性もしくは発現をダウンレギュレートする、調整性の分子または化合物をさす。阻害剤には、siRNAまたはアンチセンスRNA、遺伝学的に修飾されたGnaqタンパク質のバージョン、例えば、改変された活性を有するバージョンが含まれ、天然に存在する、および合成のGnaqアンタゴニスト、抗体、小さな化学分子等も含まれる。本発明において使用するためのGnaq阻害剤は、当技術分野において公知である。例えば、本発明において使用するのに適している非限定的な例示的な阻害剤には、PKCの阻害剤、例えば、比較的非特異的なPKC阻害剤スタウロスポリン、スタウロスポリンアナログCPG41251、ブリオスタチン-1、KAI-9803、7-ヒドロキシスタウロスポリン、L-トレオ-ジヒドロスフィンゴシン(サフィンゴール(safingol))、非選択的PKC阻害剤(PKC412)、イルモホシン(ilmofosine)(BM 41 440)、PKCμを含む古典的PKCアイソフォームのより特異的な阻害剤であるインドールカルバゾールGo6796、PKCαアンチセンス阻害剤LY900003、およびPKCβ阻害剤LY333531、LY317615(エンザスタウリン(Enzastaurin))が含まれ得る。PKCαmRNAの枯渇において使用するのに適している例示的なアンチセンス分子は、
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である。ホスホリパーゼCβの非限定的な例示的な阻害剤には、エデルホシン(edelfosine)およびフルビルシン(fluvirusin)B[2]が含まれ得る。その他の阻害剤を同定するためのアッセイは、試験阻害剤化合物を適用し、次いで、活性に対する機能的効果を決定することにより、インビトロまたはインビボで、例えば、細胞または細胞膜において実施され得る。
【００７０】
いくつかの態様において、可能性のある阻害剤により処置されるGnaqタンパク質を含む試料またはアッセイが、活性に対する効果を調査するために、阻害剤を含まない対照試料と比較される。典型的には、Gnaq変異を有しており、かつ阻害剤により処理されていない対照試料、例えば、黒色腫細胞に、100％という相対タンパク質活性値が割り当てられる。対照に比べて活性値が少なくとも20％、好ましくは50％、より好ましくは75〜100％、またはそれ以上、変化した場合、Gnaqの阻害が達成されている。いくつかの態様において、阻害剤は、GTP加水分解のような特定の活性を活性化するであろうが、正味の効果は、例えば、活性化されたGnaqを有する対照と比較した、Gnaqの活性の減少であろう。
【００７１】
「細胞成長における変化」という句は、病巣の形成、足場非依存性、半固体もしくは軟寒天成長、成長の接触阻止および密度制限における変化、成長因子もしくは血清要求性の喪失、細胞形態における変化、不死化の獲得もしくは喪失、腫瘍特異的マーカーの獲得もしくは喪失、適切な動物宿主へ注入された場合の腫瘍を形成もしくは抑制する能力、ならびに/または細胞の不死化のような、インビトロまたはインビボでの細胞成長および増殖特性における任意の変化を指す。例えば、Freshney, Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique pp. 231-241 (3rd ed. 1994)参照。
【００７２】
本明細書に用いられる場合、「抗体」は、特定の抗原と免疫学的反応性である免疫グロブリン分子への言及を含み、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方を含む。その用語はまた、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)およびヘテロ結合抗体(例えば、二重特異性抗体)のような遺伝子操作型を含む。「抗体」という用語はまた、抗原結合性能力を有する断片を含む、抗体の抗原結合型を含む(例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、およびrIgG。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, ILも参照)。例えば、Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York (1998)も参照。その用語はまた、組換え一本鎖Fv断片(scFv)を指す。抗体という用語はまた、二価または二重特異性分子、ダイアボディ(diabody)、トリアボディ(triabody)、およびテトラボディ(tetrabody)を含む。二価および二重特異性分子は、例えば、Kostelny et al., (1992) J Immunol 148:1547, Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579, Hollinger et al., 1993, 前記, Gruber et al. (1994) J Immunol:5368, Zhu et al. (1997) Protein Sci 6:781, Hu et al. (1996) Cancer Res. 56:3055, Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026、およびMcCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301に記載されている。
【００７３】
特定の抗原と免疫学的反応性である抗体は、ファージまたは類似したベクターにおける組換え抗体のライブラリーの選択のような組換え方法により(例えば、Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); およびVaughan et al., Nature Biotech. 14:309-314 (1996)参照)、または抗原、もしくは抗原をコードするDNAで動物を免疫することにより、作製されうる。
【００７４】
典型的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含む(領域は「ドメイン」としても知られている)。軽鎖および重鎖可変領域は、相補性決定領域(CDR)とも呼ばれる3つの超可変領域により中断される4つのフレームワーク領域を含む。
【００７５】
「VH」または「VH」への言及は、Fv、scFv、またはFabの重鎖を含む、抗体の免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「VL」または「VL」への言及は、Fv、scFv、dsFv、またはFabの軽鎖を含む、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【００７６】
「キメラ抗体」は、(a)定常領域またはその部分が、抗原結合部位が異なるもしくは変化したクラス、エフェクター機能、および/もしくは種の定常領域、または新しい性質をキメラ抗体に与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物など、に連結されるように、変化している、置換されている、または交換されている；または(b)可変領域またはその部分が、異なるもしくは変化した抗原特異性を有する可変領域で変化している、置換されている、または交換されている、免疫グロブリン分子である。
【００７７】
「ヒト化抗体」は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む免疫グロブリン分子である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種(ドナー抗体)のCDR由来の残基により置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基により置換されている。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも移入されたCDRまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含みうる。一般的に、ヒト化抗体は、CDR領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、かつフレームワーク(FR)領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン定常配列のそれらである、少なくとも1つの、典型的には2つの、可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれ、の少なくとも一部を含む(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992))。ヒト化は、本質的には、Winterおよび共同研究者らの方法に従って(Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988))、齧歯類CDR配列をヒト抗体の対応する配列に代わって用いることにより、行われうる。従って、そのようなヒト化抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、無傷ヒト可変ドメインより実質的に少ない部分が、非ヒト種由来の対応する配列により置換されている。
【００７８】
「完全なヒト抗体」という用語は、ヒトフレームワークおよび定常領域に加えてヒト超可変領域を含む免疫グロブリンを指す。そのような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製されうる。例えば、インビトロ方法は、バクテリオファージ(例えば、McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554; Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991);およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991))、酵母細胞(Boder and Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557)、またはリボソーム(Hanes and Pluckthun, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942)上にディスプレイされるヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を含む。同様に、ヒト抗体は、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスへの、ヒト免疫グロブリン座の導入により作製されうる。攻撃によって、遺伝子再編成、組み立て、および抗体レパートリーを含むすべての点でヒトにおいて見られるものによく似ているヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第6,150,584号；第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号に、および以下の科学刊行物に記載されている：例えば、Jakobavits, Adv Drug Deliv Rev. 31:33-42 (1998), Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。
【００７９】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、連続したアミノ酸、またはタンパク質の三次折り畳みにより並列される非連続性アミノ酸の両方から形成されうる。連続したアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露において保持されるのに対して、三次折り畳みにより形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒での処理で喪失される。エピトープは、典型的には、固有の空間的立体構造で、少なくとも3個、より通常には、少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体構造を決定するための方法には、例えば、x線結晶学および2次元核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)参照。
【００８０】
一般的な組換え法
本発明は、例えば、Gnaqの検出において使用される方法のため、またはスクリーニングアッセイのようなアッセイにおいて使用され得るGnaqポリペプチドの調製のため、組換え遺伝学の分野におけるルーチンの技術に一部頼る。本発明において有用な一般的な方法を開示している基本的な教科書には、Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999)が含まれる。例えば、阻害剤を検出するアッセイにおいて使用するため、Gnaqまたはその断片が作製される適用において、例えば、ルーチンの発現プロトコルが利用される。
【００８１】
患者由来の試料におけるGnaq配列の同定
本発明の一つの局面において、Gnaqポリヌクレオチド、例えば、mRNAもしくはゲノムDNAにおける活性化変異の存在、またはGnaqタンパク質の増加した活性、および/またはGnaqタンパク質における配列変異の存在が、母斑細胞および/または黒色腫細胞を含むと推測される生物学的試料において決定される。
【００８２】
いくつかの態様において、Gnaq核酸における活性化変異が決定される。前述のように、ヒトGnaq配列は周知である。Gnaq遺伝子は9q21にマッピングされており、mRNA転写物は2.188kbであり、359アミノ酸タンパク質をコードする。
【００８３】
「配列変異」とは、本願において使用されるように、タンパク質活性の変化をもたらすポリヌクレオチド配列の変化をさす。変異は、一ヌクレオチド置換のようなヌクレオチド置換、挿入、または欠失であり得る。本発明のメラニン形成細胞性新生物におけるGnaq変異は、典型的には、Gnaq活性の構成性の活性化に通じる活性化変異である。理論に拘束はされないが、構成性の活性は、変異体Gnaqタンパク質におけるGTP加水分解酵素活性の欠如に起因すると考えられる。
【００８４】
本発明は、メラニン形成細胞性新生物、例えば、青色母斑、太田母斑、悪性青色母斑、ブドウ膜黒色腫、およびCSD黒色腫(例えば、悪性黒子黒色腫)におけるGnaqに存在するヘテロ接合性の体細胞活性化変異の発見に一部基づく。変異は、それがGnaqの活性化に通じるようなGnaq遺伝子の任意の部分にあり得る。一般的な配列変異部位はQ209に存在する。本発明において同定され得る例示的な変異は表2に示される。これらの変異には、CAA to CTAおよびCAA to TTA(いずれもQ209L置換をもたらす)、Q209P置換をもたらすCAA to CCA、Q209R置換をもたらすCAA to CGA、ならびにQ209Y置換をもたらすCAA to TATが含まれる。当技術分野において理解されるように、特定の変異は、一般的に、核酸配列における変異に起因するアミノ酸配列の変化により言及される。
【００８５】
本発明において、Gnaq活性の改変されたレベルおよび/またはGnaqにおける配列変異が、メラニン形成細胞性新生物の診断のため(または予後の指標のため)、例えば、ブドウ膜黒色腫、末端部黒色腫、CSD黒色腫、および悪性青色母斑のような黒色腫、ならびに良性青色母斑および太田母斑のサブタイプの診断のため、検出される。従って、メラニン形成細胞性新生物を有するかまたは有すると推測される患者から入手された生物学的試料が、GnaqのmRNAまたはタンパク質の配列における変異について分析され得る。変異の存在は、RNA、DNA、またはタンパク質の試料を使用して便利に分析される。
【００８６】
Gnaqにおける配列変異の検出
一つの態様において、Ganqにおける配列変異の診断的および予後的な検出は、Gnaqにおける配列変異を有する生物学的試料中の細胞の数を決定することにより実施される。特定の遺伝子の配列を評価する方法は、当業者に周知であり、とりわけ、ハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイを含む。本発明において、Gnaqにおける配列変異は、変異体配列に選択的にハイブリダイズするプローブを使用して決定され得る。
【００８７】
いくつかの態様において、生物学的試料中のGnaq配列変異は、インサイチューハイブリダイゼーション、例えば、蛍光インサイチューハイブリダイゼーションにより決定される。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイは周知である(例えば、Angerer(1987)Meth. Enzymol 152: 649)。そのような適用において使用されるプローブは、変異を保持しているGnaq配列の領域に特異的にハイブリダイズする。好ましいプローブは、ストリンジェントな条件の下で標的核酸に特異的にハイブリダイズするよう十分に長く、例えば、約10、15、または20ヌクレオチド〜約50ヌクレオチドまたはそれ以上である。
【００８８】
多数のその他のハイブリダイゼーションに基づくアッセイが、生物学的試料中の細胞におけるGnaqにおける配列変異を検出するために使用され得る。例えば、ドットブロット、アレイに基づくアッセイ等が、Gnaq配列変異を決定するために使用され得る。
【００８９】
いくつかの態様において、増幅に基づくアッセイが、Gnaqにおける配列変異を検出するため、またはGnaq転写物のレベルを測定するために使用される。そのようなアッセイにおいて、Gnaq核酸配列は、増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応またはPCR)における鋳型として作用する。例示的な増幅に基づくアッセイには、当業者に周知のRT-PCR法が含まれ得る(例えば、Ausubel et al., 前記を参照のこと)。定量増幅法を含む、DNAおよびRNAのPCRのための詳細なプロトコルは公知である(例えば、Innis et al. (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y.；およびAusubel and Russell & Sambrook(いずれも前記)を参照のこと)。Gnaqの公知の核酸配列(例えば、SEQ ID NO:1を参照のこと)は、当業者が、遺伝子の任意の部分を増幅するためのプライマーをルーチンに選択することを可能にするのに十分である。特定の配列の増幅のために適しているプライマーは、当技術分野において周知の原理を使用して設計され得る(例えば、Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual (1995)を参照のこと)。
【００９０】
その他の適当な増幅法には、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560、Landegren et al. (1988) Science 241 : 1077、およびBarringer et al. (1990) Gene 89: 117を参照のこと)、転写増幅(Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173)、自家持続配列複製(Guatelli et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874)、ドットPCR、およびリンカーアダプターPCR等が含まれるが、これらに限定はされない。
【００９１】
GnaqのDNA配列またはRNA配列における変異の存在は、当技術分野において公知の任意の技術を使用して決定され得る。例えば、一つの態様において、変異体核酸配列または正常核酸配列に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用した、正常核酸配列からの変異体核酸配列の識別に頼る、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションが使用され得る。この方法は、典型的には、正常対立遺伝子または変異体対立遺伝子にディファレンシャルにハイブリダイズするよう設計された、短いオリゴヌクレオチド、例えば、15〜20ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを利用する。そのようなプローブを設計するための案内は、当技術分野において入手可能である。変異体対立遺伝子の存在は、試料にハイブリダイズする対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドの量を測定することにより決定される。
【００９２】
試料中のプローブと標的核酸配列との間に形成されたハイブリッドの検出のために適しているアッセイフォーマットは、当技術分野において公知であり、固定化標的(ドットブロット)フォーマットおよび固定化プローブ(逆ドットブロットまたはラインブロット)アッセイフォーマットを含む。ドットブロットアッセイフォーマットおよび逆ドットブロットアッセイフォーマットは、米国特許第5,310,893号；第5,451,512号；第5,468,613号；および第5,604,099号に記載されている。
【００９３】
その他の態様において、正常Gnaq核酸または変異体Gnaq核酸の存在(または量)は、対立遺伝子特異的増幅またはプライマー伸長法を使用して検出され得る。これらの反応は、典型的には、プライマーの3'末端にあるミスマッチを介して、正常対立遺伝子または変異体対立遺伝子を特異的に標的とするよう設計されたプライマーの使用を含む。ミスマッチの存在は、ポリメラーゼがエラー補正活性を欠く場合にポリメラーゼがプライマーを伸長する能力を達成する。増幅された産物の量は、プローブを使用して、または反応中に存在するDNAの量を直接測定することにより、決定され得る。
【００９４】
Gnaq核酸のレベル、例えば、正常Gnaqポリヌクレオチドおよび/もしくは変異体Gnaqポリヌクレオチドのレベル、またはGnaq変異の存在の検出は、例えば、米国特許第5,210,015号；第5,487,972号；および第5,804,375号；ならびにHolland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：7276-7280に記載されたような、(「TaqMan(登録商標)」アッセイとも呼ばれる)5'ヌクレアーゼ活性のような定量アッセイを使用しても実施され得る。そのようなアッセイにおいては、増幅される領域の内部にハイブリダイズする標識された検出プローブが、増幅反応の間に添加される。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションプローブは、正常対立遺伝子または変異体対立遺伝子を識別する対立遺伝子特異的なプローブであり得る。または、方法は、対立遺伝子特異的プライマーおよび増幅された産物に結合する標識されたプローブを使用して実施され得る。その他の態様において、プローブは変異体対立遺伝子と正常対立遺伝子とを識別しない可能性がある。
【００９５】
その他の態様において、変異体Gnaq対立遺伝子の存在は、ピロシーケンシング(pyrosequenceing)のようなDNA配列決定またはその他の公知の配列決定技術を使用して便利に決定され得る。その他の検出法には、一本鎖立体構造的多形または制限断片長多形検出法および変性勾配ゲル電気泳動分析が含まれる。
【００９６】
上述のように、いくつかの態様において、Gnaq RNAのレベルが検出される。核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、Gnaq遺伝子転写物(mRNAまたはそれから作成されたcDNA)のレベルを検出し、かつ/または定量化する方法は、当業者に公知である。例えば、Gnaqの発現レベルは、例えば、対立遺伝子特異的なプライマーまたはプローブを使用したリアルタイムRT-PCRを使用したRT-PCR、ドットブロッティング、インサイチューハイブリダイゼーション、RNase保護、プロービングDNAマイクロチップアレイ等のような技術によっても分析され得る。
【００９７】
変異型配列または正常な核酸配列および/もしくはポリペプチド配列のいずれかであるGnaqの過剰発現は、例えば、上記のような当技術分野において公知の定量的な配列を使用して検出され得る。過剰発現は、対照、例えば、正常組織または正常メラニン形成細胞に比して決定される。
【００９８】
Gnaqポリペプチド配列の検出
改変されたGnaqの発現および/または活性は、Gnaqタンパク質または活性を検出することによっても検出され得る。例えば、Gnaqタンパク質活性の検出または変異を有するGnaqタンパク質の存在は、診断的な目的のため、またはスクリーニングアッセイにおいて使用され得る。いくつかの態様において、Gnaqのレベルまたは試料中の正常Gnaqポリペプチドもしくは変異体Gnaqポリペプチドの存在は、免疫学的アッセイを使用して便利に決定される。その他の態様において、Gnaq活性は生物学的試料中のGnaqの活性化変異の存在を決定するために使用され得る。以下のセクションは、Gnaqの免疫学的検出について記述する。このセクションは、例えば、治療的用途において使用され得る、抗体の製造および操作にも関する。
【００９９】
Gnaqの免疫学的検出
抗体は、Gnaqを検出するために使用され得、またはGnaqを阻害する能力について本発明の方法において査定され得る。Gnaqの検出および/または定量化は、多数のよく認識されている免疫学的結合アッセイを使用して達成され得る。適用可能な技術の一般的な概要は、Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988)およびHarlow & Lane, Using Antibodies (1999)に見出され得る。Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37(Asai, ed. 1993)；Basic and Clinical Immunology(Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991)、およびCurrent Protocols in Immunology(Coligan, et al. Eds, John C. Wiley, 1999-present)を含むその他の情報源も参照のこと。免疫学的結合アッセイは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用し得る。いくつかの態様において、変異体Gnaq分子を特異的に検出する抗体が利用され得る。
【０１００】
一般的に用いられるアッセイには、非競合的アッセイ(例えば、サンドイッチアッセイ)および競合的アッセイが挙げられる。競合的アッセイにおいて、試料に存在するGnaqの量は、試料に存在する未知のGnaqにより抗Gnaq抗体から置換された(競合して追い出された)既知の加えられた(外因性)Gnaqの量を決定することにより間接的に決定される。一般的に用いられるアッセイ形式には、試料においてタンパク質の存在を検出および定量化するために用いられる、イムノブロットが挙げられる。他のアッセイ形式には、リポソームイムノアッセイ(LIA)が挙げられ、それは、特定の分子(例えば、抗体)に結合し、封入されていた試薬またはマーカーを放出するように設計されたリポソームを用い、その試薬またはマーカーがその後、標準技術により検出される(Monroe et al., Amer. Clin. Prod. Rev. 5:34-41 (1986)参照)。
【０１０１】
イムノアッセイはまた、多くの場合、抗体および抗原により形成される複合体に特異的に結合して、標識するために標識剤を用いる。標識剤は、それ自身、抗体/抗原複合体を含む部分の1つでありうる。従って、標識剤は、標識Gnaqポリペプチドまたは標識抗Gnaq抗体でありうる。あるいは、標識剤は、抗体/抗原複合体に特異的に結合する二次抗体のような第三部分でありうる(二次抗体は、典型的には、第一抗体が由来する種の抗体に特異的である)。プロテインAまたはプロテインGのような免疫グロブリン定常領域に特異的に結合する能力がある他のタンパク質もまた、標識剤として用いられうる。標識剤は、ストレプトアビジンのようなもう一つの分子が特異的に結合できるビオチンのような、検出可能な部分で修飾されうる。様々な検出可能な部分は、当業者に周知である。
【０１０２】
アッセイに用いられる特定の標識または検出可能な群は、それがアッセイに用いられる抗体の特異的結合に有意には干渉しない限り、本発明の重要な局面ではない。検出可能な群は、検出可能な物理的または化学的性質を有する任意の物質でありうる。そのような検出可能な標識は、イムノアッセイの分野において十分開発されており、一般的に、そのような方法に有用な大部分の任意の標識が本発明に適用されうる。従って、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的手段により検出可能な任意の組成物である。本発明に有用な標識には、磁気ビーズ(例えば、DYNABEADS(商標))、蛍光化合物(例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセインなど)、放射標識、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびELISAに一般的に用いられる他のもの)、ストレプトアビジン/ビオチン、および金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)のような比色標識が挙げられる。化学発光性化合物もまた用いられうる。用いられうる様々な標識またはシグナル発生系の概説については、米国特許第4,391,904号を参照されたい。
【０１０３】
Gnaqに対する抗体は、市販されている(例えば、Genesis Biotech, Inc. Taipei County, Taiwan)。いくつかの態様において、Gnaqに対する変異は、変異体型に特異的に結合する抗体を使用して検出され得、従って、イムノアッセイも変異体Gnaqタンパク質を検出するために使用され得る。
【０１０４】
Gnaqまたはその断片、例えば、配列変異を高頻度に含有しているペプチドの部分が、Gnaqに対し特異的に反応する抗体を作製するために使用され得る。例えば、組換えGnaqまたはその抗原性断片が単離される。組換えタンパク質は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の作製のための好ましい免疫原である。または、本明細書に開示された配列に由来し、担体タンパク質にコンジュゲートされた合成ペプチドが、免疫原として使用され得る。純粋な形態または純粋でない形態の天然に存在するタンパク質も、使用され得る。次いで、生成物は、抗体を製造するために使用される。
【０１０５】
Gnaqと特異的に反応するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法は、当業者に公知である(例えば、Coligan, 前記；Harlow & Lane, 前記)を参照のこと)。そのような技術には、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製が含まれ、ウサギまたはマウスを免疫感作することによるポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製も含まれる(例えば、Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989)；Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)を参照のこと)。そのような抗体は、診断的または予後的な適用のため、例えば、Gnaqの増加した発現または活性を示す黒色腫またはその他の癌の検出において、使用され得る。
【０１０６】
典型的には、104以上の力価を有するポリクローナル抗血清が選択され、競合結合イムノアッセイを使用して、非Gnaqタンパク質または他の生物に由来する他の関連タンパク質との交差反応性について試験される。特異的なポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体は、通常、少なくとも約0.1mM、より通常では少なくとも約1μM、任意で、少なくとも約0.1μM以下、任意で、0.01μM以下のKdで結合すると考えられる。
【０１０７】
いくつかの態様において、Gnaq抗体は治療的用途のために使用され得る。例えば、いくつかの態様において、そのような抗体は、下記のようにGnaqの生物学的機能を低下させるかまたは排除するために使用され得る。即ち、メラニン形成細胞性新生物(または癌細胞を含有している細胞集団)への抗Gnaq抗体(ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナル)の添加は、新生物を低下させるかまたは排除し得る。一般に、活性、成長、サイズ等の少なくとも25％の減少が好ましく、少なくとも約50％が特に好ましく、約95〜100％の減少が特に好ましい。
【０１０８】
しばしば、治療的用途のためのGnaqタンパク質に対する抗体は、ヒト化抗体である(例えば、Xenerex Biosciences、Mederex, Inc.、Abgenix, Inc.、Protein Design Labs,Inc)。ファージディスプレイライブラリー(Hoogenboom & Winter, J. Mol. Biol. 227：381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222：581 (1991))を含む、当技術分野において公知の様々な技術を使用して、ヒト抗体が作製されてもよい。ColeらおよびBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p. 77 (1985)およびBoerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991))。同様に、ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活化されているトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックマウスに、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することにより作成され得る。抗原投与により、遺伝子の転位、組み立て、および抗体レパートリーを含むすべての点においてヒトにおいて見られるものに精密に類似しているヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号；5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号、および以下の科学的刊行物に記載されている：Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)；Lonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)。
【０１０９】
活性の検出
当業者により認識されるように、Gnaq活性は、発現レベルを評価するため、または活性の阻害剤を同定するために検出され得る。活性は、GTPおよびGDPとの結合活性、GTP加水分解酵素活性、またはホスホリパーゼCβの測定を含む、多様なインビトロおよびインビボのアッセイを使用して査定され得る。いくつかの態様において、Gnaq活性は、形質転換または色素沈着に関連したもののような付加的な終点を使用して評価され得る。そのようなアッセイは、実施例およびさらなるGnaq阻害剤の同定の方法を詳述するセクションにおいて、より詳しく記載される。典型的には、Gnaq活性は、Gnaqが相互作用するタンパク質、例えば、抗体、リガンド、またはシグナル伝達分子のようなその他のタンパク質に結合する能力を測定することにより決定される。
【０１１０】
疾患診断/予後
Gnaqの核酸配列およびポリペプチド配列は、患者におけるメラニン形成細胞性新生物の診断または予後のために使用され得る。例えば、上記のように、患者由来のメラニン形成細胞性新生物試料中のGnaqの配列、レベル、または活性が決定され得、その際、改変、例えば、Gnaqの発現もしくは活性のレベルの増加またはGnaqにおける配列変異は、メラニン形成細胞性新生物の存在または可能性を示す。
【０１１１】
本発明の方法は、癌を有する患者における最適の処置過程を決定するために使用され得る。例えば、Gnaqにおける配列変異の存在は、Gnaq、ホスホリパーゼCβ、またはGnaqにより調節される下流経路を標的とする治療薬のようなある種の治療薬が、患者にとって有益であろうことを示し得る。さらに、Gnaqにおける欠陥または配列変異の存在と、一つのまたはもう一つの抗黒色腫剤の相対効力との間の相関は、容易に確立され得る。そのような分析は、例えば、後向きに実施され得る。即ち、一つまたは複数の型の抗癌治療、例えば、Gタンパク質またはホスホリパーゼCβまたはGnaqにより調節されるその他の下流の経路を標的とする治療をその後に受ける患者から事前に採取された試料においてGnaqの欠陥または配列変異について分析し、欠陥の存在を処置の既知の効力と相関させることにより実施され得る。
【０１１２】
しばしば、そのような方法は、付加的な診断法、例えば、他の黒色腫の指標、例えば、細胞形態学等の検出と共に使用されるであろう。その他の態様において、例えば、腫瘍由来の、黒色腫細胞を含有していることが既知の組織試料が、癌についての情報、例えば、GnaqまたはGnaqにより調節される下流経路を標的とする治療薬のようなある種の処置の効力を決定するために、Gnaq欠陥について分析されるであろう。
【０１１３】
いくつかの態様において、Gnaqの欠陥または配列変異の存在についての黒色腫細胞の分析は、黒色腫を有する患者の予後を決定するため、または疾患の進行を決定するため、使用され得る。「診断的存在」とは、GnaqのmRNAもしくはタンパク質のレベルおよび/もしくは活性の増加、ならびに/または機能を改変するGnaqにおける配列変異の存在であり得る。
【０１１４】
黒色腫細胞を含有していると推測される任意の生物学的試料が、進行を決定するために評価され得る。例えば、内臓器官からの組織、血液、リンパ節等が、Gnaq配列変異の存在およびまたはGnaq活性の増加したレベルについて分析され得る。
【０１１５】
Gnaqの阻害剤またはモジュレーターのスクリーニング
もう一つの局面において、本発明は、阻害剤またはGnaqアンタゴニストを投与することを含む、Gnaqを過剰発現し、かつ/またはGnaqにおける変異を有する黒色腫を処置する方法を含む。阻害剤およびGnaqアンタゴニストは公知である。例えば、本発明による使用に適している非限定的な例示的な阻害剤には、PKCならびにPKCμおよびPKCεを含む様々なPKCアイソフォームの特異的阻害剤および非特異的阻害剤が含まれ得る。本発明による使用に適している例示的な非限定的な阻害剤には、スタウロスポリン、スタウロスポリンアナログCPG41251、ブリオスタチン-1、KAI-9803、7-ヒドロキシスタウロスポリン、L-トレオ-ジヒドロスフィンゴシン(サフィンゴール)、非選択的PKC阻害剤(PKC412)、イルモホシン(BM 41 440)、PCKμを含むPKCの古典的アイソフォームをより特異的に阻害するインドールカルバゾールであるGo6976、PKCαアンチセンス阻害剤LY900003、およびPKCβ阻害剤LY333531、LY317615(エンザスタウリン)が含まれる。ホスホリパーゼCβの非限定的な例示的な阻害剤には、エデルホシンおよびフルビルシンB[2]が含まれ得、これらも本発明における使用に適している。
【０１１６】
その他の阻害剤には、抗体、ペプチド、核酸等のような阻害剤が含まれる。本明細書において使用されるように、Gnaq阻害剤とは、Gnaq核酸発現および/もしくはGnaqタンパク質活性、またはGnaqにより調節される下流経路をモジュレートする分子であり得る。例えば、PKCαmRNAの枯渇において使用するのに適している非限定的な例示的なアンチセンス分子は、
0005513129.tif 000003
である。
【０１１７】
化合物のモジュレーターについてスクリーニングする方法は、例えば、Gnaqが過剰発現されているかまたは変異している黒色腫細胞を利用することができる。そのようなモジュレーターは、候補Gnaq GTP加水分解酵素モジュレーターであり得る。
【０１１８】
さらなるGnaq阻害剤は、Gnaq活性、例えば、GTP結合活性またはGTP加水分解酵素活性についてアッセイすることにより同定され得る。そのようなアッセイは、公知のGnaq配列またはその断片、例えば、Gnaqのグアニン結合ドメインまたはそのバリアントを利用する。そのようなアッセイにおいて使用され得る例示的なヒトGnaqポリペプチド配列は、SEQ ID NO:2に提供される。
【０１１９】
活性アッセイは、治療剤として用いられうる阻害剤、例えば、Gnaqに対する抗体およびGnaq活性のアンタゴニスト、を同定するために用いられる。Gnaq活性の阻害剤は、組換えかまたは天然のいずれかの、Gnaqポリペプチドを用いて試験される。そのタンパク質は、組換えかまたは天然のいずれかで、単離されうる、細胞において発現しうる、組織または動物において発現しうる。例えば、形質転換細胞が用いられうる。調節は、本明細書に記載されたインビトロまたはインビボのアッセイの1つを用いて試験される。活性はまた、ホスホリパーゼCβまたはGTPのような別のタンパク質に結合するGnaq断片を用いて、溶解または固体状態反応でインビトロで調べることができる。
【０１２０】
もう一つの態様において、mRNAおよび/またはタンパク質の発現レベルは、試験化合物のGnaqの発現レベルへの効果を評価するために決定されうる。Gnaqを発現する宿主細胞を、任意の相互作用をもたらすのに十分な時間、試験化合物と接触させ、その後、mRNAまたはタンパク質のレベルを決定する。そのような相互作用をもたらしうる時間の量は、例えば、時間経過をたどり、時間の関数として発現のレベルを決定することによって、実験的に決定されうる。発現の量は、適切な当業者に公知の任意の方法を用いることにより決定されうる。
【０１２１】
発現の量は、その後、試験化合物の非存在下での発現の量と比較される。実質的に同一の細胞は、組換え細胞が調製されたが、異種性DNAの導入により改変されなかった同じ細胞由来でありうる。発現の量における差は、試験化合物がある様式でGnaqのレベルを変化させていることを示す。
【０１２２】
Gnaq阻害剤を同定するための一部のアッセイにおいて、可能性のある阻害剤で処理される試料は、調節の程度を決定するために対照試料と比較される。変異されずまた候補阻害剤で処理されていない対照試料は、100の相対活性値を割り当てられる。Gnaqの阻害は、対照に対する活性値が約80%、任意で50%、任意で25〜0%である場合、達成される。
【０１２３】
Gnaqの阻害剤として試験される化合物は、任意の小さな化学化合物、または生物学的実体、例えば、タンパク質、糖、核酸、もしくは脂質のような高分子でありうる。あるいは、モジュレーターは、Gnaqの遺伝子改変バージョンでありうる。典型的には、試験化合物は、化学的小分子、およびペプチドまたは抗体である。
【０１２４】
いくつかの態様において、作用物質は、1,500ダルトン未満、および場合によっては、1,000、800、600、500、または400ダルトン未満の分子量を有する。より小さな分子をもつ作用物質は、より大きい分子量をもつ作用物質より、経口吸収を含む良い薬物動態学的特性に適合する生理化学的性質を有する可能性がより高いため、比較的小さなサイズの作用物質が望ましい。例えば、透過性および溶解性に基づいて薬物として成功する可能性がより低い作用物質は、以下のとおり、Lipinski et al.により記載された：5個より多いH-結合ドナー(OHおよびNHの合計として表される)を有する；500を超える分子量をもつ；5を超えるLogP(または4.15を超えるMLogP)を有する；および/または10個より多いH-結合アクセプター(NおよびOの合計として表される)を有する。例えば、Lipinski et al. Adv Drug Delivery Res 23:3-25 (1997)参照。生物学的輸送体の基質である化合物クラスは、典型的には、その規則の例外である。
【０１２５】
本質的に任意の化学化合物が、本発明のアッセイにおいて可能性のあるモジュレーターまたはリガンドとして用いられうる。ほとんどの場合、化合物は、水溶液または有機溶液(特に、DMSOに基づく)に溶解されうる。アッセイは、アッセイ段階を自動化することにより大きな化学ライブラリーをスクリーニングするように設計され、典型的には並行して実行される(例えば、ロボットによるアッセイにおいてマイクロタイタープレート上のマイクロタイター形式で)。Sigma(St. Louis, MO)、Aldrich(St. Louis, MO)、Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)、Fluka Chemika-Biochemica Analytika(Bucks Switzerland)などを含む、化学化合物の多くの供給業者があることは認識されていると思われる。
【０１２６】
発現アッセイ
特定のスクリーニング方法は、Gnaq発現を調節する化合物についてスクリーニングする段階を含む。そのような方法は、一般的に、試験化合物をGnaqを発現する1つまたは複数の細胞と接触させる細胞に基づくアッセイを行う段階、およびその後、発現(転写産物かまたは翻訳産物のいずれか)における減少を検出する段階を含む。
【０１２７】
発現はいくつかの異なる方法で検出することができる。本明細書に記載されているように、細胞におけるタンパク質の発現レベルは、細胞において発現したmRNAを、Gnaq転写産物(またはそれ由来の相補核酸)と特異的にハイブリダイズするプローブで探索することにより決定されうる。あるいは、タンパク質は、細胞可溶化物がそのタンパク質へ特異的に結合する抗体で探索される免疫学的方法を用いて検出することができる。
【０１２８】
細胞に基づく他のアッセイは、そのタンパク質を発現しない細胞で行われるレポーターアッセイである。多くの場合、これらのアッセイは、検出可能な産物をコードするレポーター遺伝子に機能的に連結されているプロモーターを含む異種性核酸構築物で行われる。
【０１２９】
黒色腫処置ならびに薬学的組成物およびワクチン組成物の投与
Gnaqの阻害剤は、Gnaqにおける配列変異を有するメラニン形成細胞性新生物の処置のため患者に投与され得る。以下に詳細に記載されるように、阻害剤は、任意で、薬学的に許容される担体を用いて、任意の適当な様式で投与される。いくつかの態様において、PKCまたはホスホリパーゼCβの阻害剤が投与される。阻害剤の投与のためのプロトコルは公知であり、薬理学分野において公知の原理に基づき、黒色腫患者のためにさらに最適化され得る(Remington's Pharmaceutical Sciences. 17th ed., 1989)。
【０１３０】
阻害剤は、メラニン形成細胞性新生物を予防する、処置する、または制御するために治療的有効量で患者へ投与されうる。この化合物は、患者において効果的な防御または治療応答を誘発するのに十分な量で患者へ投与される。効果的な治療応答は、疾患の症状もしくは合併症を少なくとも部分的に停止するまたは遅らせる応答である。これを達成するのに適切な量は、「治療的有効量」と定義される。その用量は、用いられる特定のGnaq阻害剤の効力、および被験体の状態、加えて体重または処置される領域の表面積により決定される。用量のサイズはまた、特定の被験体における特定の化合物の投与に伴う任意の有害効果の存在、性質、および程度により決定される。
【０１３１】
そのような化合物の毒性または治療効力は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、LD50(集団の50%に致死的な用量)およびED50(集団の50%において治療効果のある用量)を測定することにより、決定されうる。毒性効果と治療効果の間の用量比は治療指数であり、比、LD50/ED50として表されうる。治療指数の大きい化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物も用いられうるが、正常細胞への潜在的な損傷を最小限にし、それにより副作用を低減するように罹患組織の部位へそのような化合物を標的化する送達系を設計するという配慮がなされるべきである。
【０１３２】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに用いる用量範囲を策定するために用いられうる。そのような化合物の用量は、好ましくは、有るか無しかの毒性でED50を含む循環濃度の範囲内にある。用量は、用いられる剤形および投与経路に依存してこの範囲内で変動しうる。本発明の方法に用いられる任意の化合物について、治療的有効量は、最初に、細胞培養アッセイから推定されうる。細胞培養において測定されたようなIC50(症状の最大半減抑制を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて用量が策定されうる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられうる。血漿におけるレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、決定されうる。一般的に、モジュレーターの用量当量は、典型的な被験体について約1ng/kgから10mg/kgまでである。
【０１３３】
本発明に用いる薬学的組成物は、1つもしくは複数の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて標準技術により製剤化されうる。化合物ならびにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物は、吸入を介して、局所に、経鼻で、経口で、非経口で(例えば、静脈内に、腹腔内に、膀胱内に、または髄腔内に)、または直腸にを含む任意の適切な経路による投与のために製剤化されうる。
【０１３４】
経口投与について、薬学的組成物は、例えば、結合剤、例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース；増量剤、例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、もしくはリン酸水素カルシウム；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、もしくはシリカ；崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプンもしくはデンプングリコール酸ナトリウム；または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含む、薬学的に許容される賦形剤と共に通常の手段により調製される錠剤またはカプセルの形をとりうる。錠剤は、当技術分野において周知の方法によりコーティングされうる。経口投与のための液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、もしくは懸濁液の形をとりうる、またはそれらは、使用前の水もしくは他の適した媒体との構成のための乾燥製品として提供されうる。そのような液体調製物は、薬学的に許容される添加剤、例えば、沈殿防止剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂；乳化剤、例えば、レシチンまたはアラビアゴム；非水性媒体、例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコール、または分留化植物油；および保存剤、例えば、p-ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸、と共に通常の手段により調製されうる。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香味剤、着色剤、および/または甘味剤を含みうる。必要なら、経口投与のための調製物は、活性化合物の徐放性を与えるように適切に製剤化されうる。
【０１３５】
吸入による投与について、化合物は、好都合なことに、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガス、を用いて、加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー供与の形で送達されうる。加圧エアゾールの場合、用量単位は、定量を送達するためのバルブを提供することにより決定されうる。ゼラチンなどの、吸入器または注入器に用いるカプセルおよびカートリッジは、ラクトースまたはデンプンなどの、化合物および適した粉末基剤の粉末混合物を含んで製剤化されうる。
【０１３６】
化合物は、注入、例えば、ボーラス注入または持続注入による非経口投与のために製剤化されうる。注入のための製剤化は、加えられた保存剤と共に、単位用量形で、例えば、アンプル中または複数回用量容器中で、提供されうる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳濁液などの形をとることができ、製剤化剤、例えば、懸濁剤、安定剤、および/または分散剤を含みうる。あるいは、活性成分は、使用前の適切な媒体、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水、との構成のための粉末形でありうる。
【０１３７】
化合物はまた、直腸作用性組成物、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含む坐剤または保持浣腸剤に製剤化されうる。
【０１３８】
さらに、化合物はデポ製剤として製剤化されうる。そのような長時間作用性製剤は、埋め込みにより(例えば、皮下にまたは筋肉内に)、または筋肉内注射により投与されうる。従って、例えば、化合物は、適切な高分子もしくは疎水性材料(例えば、許容できる油中の乳濁液のような)で、もしくはイオン交換樹脂で、または難溶性塩のような難溶性誘導体として、製剤化されうる。
【０１３９】
組成物は、必要に応じて、活性成分を含む1つまたは複数の単位用量形を含みうるパックまたはディスペンサー装置で提供されうる。パックは、例えば、金属またはプラスチックホイルからなる、例えば、ブリスターパックでありうる。パックまたはディスペンサー装置は、投与についての使用説明書を添付しうる。
【０１４０】
診断的および/または予後的用途に用いるキット
本発明はまた、診断的または治療的用途のためのキットを提供する。診断/予後的用途について、そのようなキットは以下のいずれかまたは全部を含みうる：アッセイ試薬、緩衝液、Gnaqプローブ、プライマー、抗体など。
【０１４１】
加えて、キットは、本発明の方法の実施についての説明書(すなわち、プロトコール)を含む教材を含みうる。教材は、典型的には、文書によるまたは印刷された資料を含むが、それらに限定されない。そのような使用説明書を保存し、それらをエンドユーザーへ通信することができる任意の媒体が本発明により企図される。そのような媒体には、限定されるわけではないが、電子記憶媒体(例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えば、CD ROM)などが挙げられる。そのような媒体は、そのような教材を提供するインターネットサイトへのアドレスを含みうる。
【０１４２】
実施例
実施例1 - Gnaq配列変異の存在についての黒色腫試料および母斑試料の調査
Gnaqがヒトメラニン形成細胞性新生物において役割を果たしているか否かを決定するため、Gnaqコーディング領域を、広範囲の良性および悪性のメラニン形成細胞性腫瘍において配列決定した。対照として、選択された生検材料に由来する正常周辺組織においても、Gnaqコーディング領域を配列決定した。
【０１４３】
生物学的試料
黒色腫試料および母斑試料に由来するDNAは、以前の研究(Curtin, J.A., et at., (2005) N Engl J Med, 353(20):2135-47を参照のこと)から入手されたか、またはUCSFおよびStanfordの施設内審査委員会の承認の下でサンフランシスコおよびドイツにおける収集からのアーカイブのパラフィン包埋生検材料から入手された。表皮にのみ位置している病変部は、分析のために十分なDΝAを提供しなかったため、これらの試料のすべてが、真皮から単離された病変組織をある程度含有していた。
【０１４４】
配列決定
DNAは、以前に記載されたようにして、パラフィン塊から抽出された。Bastian, et al., (1998) Cancer Res. 58(10): 2170-2175を参照のこと。試料DNAは、PCRを使用して増幅され、PCR精製カラムを使用して精製され、次いで両方向で行われた配列決定反応のための鋳型として使用された。両方の配列決定方向で変異を有すると同定された試料が、少なくとも2回複製され、制限断片長多形(RFLP)アッセイにより確証された。配列決定のための反応条件は、0.25mM各dNTP、0.4×BSA(New England Biolabs)、1U Hotstar Taq(Qiagen)、1×Hotstar Taq緩衝液(Qiagen)、および0.5 uM各プライマー
0005513129.tif 000004
(GNAQエキソン5用)であった。GNAQ用およびGNA11用のその他のプライマー配列は、請求により入手可能である。PCRは、95度(30秒)、58度(1分)、および72度(1分)の35サイクルからなっていた。PCR反応物は、カラムを使用して精製され、次いで、両方向で行われたBig Dye(ABI)を使用した配列決定反応のための鋳型として使用された。両方の配列決定方向において変異を有すると同定された試料が、少なくとも2回複製された。変異1〜3(表2)がRFLPアッセイにより確証された。変異1および2は、Eco0109I制限部位を作出し、変異3は、(両方の改変された塩基対が同一の対立遺伝子にある場合)AflII制限部位を生じる。従って、配列決定分析により変異3を示す試料をAfIIIで切断し、タンデムの塩基対改変が単一の対立遺伝子内にあることを証明することが可能であった。
【０１４５】
混合細胞集団におけるQ209変異を検出するための高感度アッセイ
ペプチド核酸(PNA)
0005513129.tif 000005
を、50％DMFに再懸濁させ、25ulの反応において2ngの鋳型DNAに対して4uMの最終濃度で使用した。反応条件は、0.25mM dNTP、6×BSA、2U Hotstar Taq、1×Hotstar Taq緩衝液、および0.5uM各プライマー
0005513129.tif 000006
であった。PCRは、95度(1分)、73度(1分)、57度(45秒)、および72度(1分)の40サイクルからなっていた。試料が変異体対立遺伝子を含有していることを確認するため、野生型配列は切断しないAflIIおよびEco0109Iで試料を消化した。
【０１４６】
結果
GnaqにおけるQ209のヘテロ接合性の体細胞置換変異が、異なる組織病理学的成長パターンを表す青色母斑の83％に見出された(表1、表2)。青色母斑におけるGnaqにおける体細胞構成性活性変異の高い蔓延は、生殖細胞ハイパーモルフィックGnaq対立遺伝子が、マウスにおける真皮内色素沈着過剰に通じるという以前の観察(Van Raamsdonk et al. (2004))と共に、これがこれらの型の病変を形成するための主要な経路であることを示唆している。稀であるが、青色母斑は「悪性青色母斑」と呼ばれる悪性黒色腫を発生させることがある。Gnaq-Q209変異は、分析された二つの「悪性青色母斑」試料のうちの一つに見出された(表1、表2)。
【０１４７】
ブドウ膜黒色腫生検材料も、ロイシンまたはプロリンのいずれかへの体細胞性の(周辺正常組織には存在しない)ヘテロ接合性の変異を有する48の試料のうちの22(46％)においてGnaq-Q209における変異を示し(表1、表2)、このことから、Gnaqがブドウ膜黒色腫形成において中心的な役割を果たしていることが示された。
【０１４８】
黒色腫試料および母斑試料において検出された五つのGnaq変異の各々は、表2に示されるように、グルタミン209のロイシン(66％)、プロリン(30％)、アルギニン(2％)、またはチロシン(2％)への非同義の置換を予測する。これらの変異の各々は、RFLPアッセイを使用して確認された(データ非呈示)。
【０１４９】
(表１)黒色腫生検試料および母斑生検試料におけるGnaq変異の頻度
0005513129.tif 000007
【０１５０】
(表２)黒色腫試料および母斑試料におけるコドン209における三つのGnaq変異
0005513129.tif 000008
【０１５１】
実施例2. Q209L変異を有するGNAQはメラニン形成細胞を形質転換する
ヒトメラニン形成細胞に対するGNAQQ209Lの効果を査定するため、本発明者らは、正常ヒトメラニン形成細胞および遺伝学的に修飾されたヒトメラニン形成細胞をトランスフェクトするためのエピトープタグ化レンチウイルス発現構築物を確立した。後者は、延長された寿命を有するが、なお、成長のために付加的な因子(cAMP、TPA)を必要とする(hTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞)。Garraway, L. A. et al., Nature 436(7047): 117 (2005)を参照のこと。初代ヒトメラニン形成細胞へのGNAQQ209Lの安定的トランスフェクションは、足場非依存性の成長を誘導するのには不十分であった(データ非呈示)。対照的に、hTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞へのGNAQQ209Lのトランスフェクションは、NRASQ61Rによるトランスフェクションと比較可能か、またはそれよりわずかに高い効率で、足場非依存性の成長をもたらした(図1a〜b)。さらに、GNAQQ209Lは、メラニン形成細胞における高度に形質転換された形態学を誘導した(図1c)。
【０１５２】
プラスミド
GNAQQ209LのGNAQコーディング領域全体を有するプラスミドを、UMR cDNA Resource Centerから入手した。野生型対応物は、コドン209の部位特異的変異誘発により製造された。両方の構築物のコーディング領域を、N末端フラッグタグによりエピトープタグ化し、レンチウイルス発現ベクターFG12にクローニングした。すべての構築物を確認のために配列決定した。
【０１５３】
細胞培養
hTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞は、Dr. David Fisher(Dana Farber Cancer Institute)からの寄贈であった。それは、p53およびp16/CDK4/網膜芽細胞腫タンパク質経路がテロメラーゼ(hTERT)発現と共に不活性化されているヒトメラニン形成細胞である。hTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞は、7％FBS、50ng/mlTPA、0.1mM IBMX、10μM Na3VO4、1mM dbcAMPが補足されたグルタミン含有Ham's F12において培養された。初代正常メラニン形成細胞は、Dr. Meenhard Herlyn(Wistar Institute)からの寄贈であって、20％FBS、2％キレート化FBS、5μg/ml L-グルタミン、15μg/mlコレラ毒素、0.5ng/ml bFGF、100nM ET3、および1.68mM SCFが補足されたMCDB153において培養された。細胞系Mel202および293Tは、10％ウシ胎仔血清が補足されたRPMIにおいて培養された。
【０１５４】
レンチウイルス感染
ウイルス上清を、10μgプラスミドおよび適切なレンチウイルスパッケージングプラスミドでトランスフェクトされた293T細胞を使用して製造した。培地をトランスフェクションの16時間後に交換し、40〜56時間後にウイルスを採集した。ヒト初代メラニン形成細胞およびヒト不死化メラニン形成細胞に感染させ、感染効率をGFP発現細胞の割合により推定した。
【０１５５】
一過性感染
293T細胞を、RPMI/10％FCSを用いて1ウェル当たり1×106細胞で6穴プレートに播種した。Lipofectamine 2000(Invitrogen)、および単独の、またはそれぞれGNAQQ209LまたはGNAQWTのいずれかの完全コーディング領域を含有している2μgのプラスミドpcDNA(商標)6.2/V5-DEST(登録商標)Gateway ベクター(Invitrogen)を使用して、トランスフェクションを実施した。細胞をトランスフェクションの48時間後に溶解させ、タンパク質含有量についてアッセイした。
【０１５６】
細胞増殖アッセイ
相対細胞数を、96穴プレートを使用して、製造業者のプロトコルに従い、CyQUANT(登録商標)Cell(Invitrogen)Proliferation Assay Kitにより定量化した。7.5×103個のMel202細胞を未処理のままにするか、または非ターゲティングsiRNA、GNAQ siRNA、および20μM MEK阻害剤U0126(Promega)のいずれかによりトランスフェクトし、72h後に蛍光強度を読み取った。偽トランスフェクションを受けた細胞およびDMSO処理を受けた細胞を、対照として使用した。
【０１５７】
実施例3 GNAQQ209Lはヒトメラニン形成細胞およびブドウ膜黒色腫細胞におけるMAPキナーゼ経路活性化に寄与する
GNAQの下流シグナル伝達経路には、ホスホリパーゼCβによるジアシルグリセロール(DAG)の放出を介したプロテインキナーゼCファミリーメンバーの活性化が含まれる。それと一致して、GNAQQ209Lにより形質転換されたメラニン形成細胞は、合成DAGアナログTPAの非存在下で、軟寒天において成長した(図1a〜b)。GNAQ活性化経由のPKC活性化は、その他の細胞型においてMAPキナーゼ経路を活性化することができる(Hubbard, K. B. and Hepler, J. R., Cell Signal 18 (2): 135 (2006)；Goldsmith, Z. G. and Dhanasekaran, D. N., Oncogene 26 (22):3122 (2007)を参照のこと)。ブドウ膜黒色腫はMAPキナーゼ活性化を示すが(Zuidervaart, W. et al., Br J Cancer 92 (11):2032 (2005)を参照のこと)、本発明者らの研究におけるブドウ膜黒色腫は、いずれも、他の研究と一致して、BRAFまたはNRASにおける変異を示さなかった(例えば、Saldanha, G. et al., Int J Cancer 111 (5), 705 (2004)；Cruz, F., 3rd et al., Cancer Res 63 (18):5761 (2003)を参照のこと)。従って、本発明者らは、GNAQQ209Lがヒトメラニン形成細胞およびヒトブドウ膜黒色腫細胞におけるMAPキナーゼ経路活性化に寄与するか否かを試験した。図2aおよびbに示されるように、hTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞へのGNAQQ209Lトランスフェクションは、野生型GNAQ(GNAQWT)または空ベクター(ベクター)でトランスフェクトされた対照細胞と比較して増加したホスホ-ERKおよびサイクリンD1の発現のレベルを引き起こした。類似した結果は、初代ヒトメラニン形成細胞および293T細胞へのGNAQQ209Lトランスフェクションでも入手された。
【０１５８】
ブドウ膜黒色腫細胞を、GNAQを標的とするsiRNAによる処理にも供した。結果は、GNAQQ209L変異を保持しているブドウ膜黒色腫細胞系Mel202におけるGNAQのsiRNAにより媒介されるノックダウンが、ホスホ-ERKレベルの減少をもたらすことを示す(図3a)。さらに、Mel202細胞におけるGNAQノックダウンは、対照細胞と比較して、細胞数の実質的減少(図3b)およびアポトーシスの著しい増加(図3c)の両方を引き起こす。GNAQ変異体黒色腫細胞におけるホスホ-PKCμの高いレベルも、二つの異なるGNAQ siRNAのプールによる処理により劇的に低下したが、ホスホ-PKCα/βIIのレベルは影響を受けなかった。従って、データは、ブドウ膜黒色腫において役割を果たしているPKCμの関与を示している。トランスジェニックマウスモデルからのデータは、PKCεの関与も示している(10)。
【０１５９】
免疫蛍光
初代ヒトメラニン形成細胞およびhTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞を、6穴プレートにおいてカバーガラス上で培養し、GNAQQ209LもしくはGNAQWTのいずれかを含有しているレンチウイルスベクターまたは対照としての空ベクターを感染させた。感染の5日後に、細胞を室温で10分間PBS中の4％ホルムアルデヒドで固定し、室温で10分間PBS中の0.2％トリトンX100で透過性化し、ブロッキング工程として室温で10分間3％ウシ血清アルブミンと共にインキュベートした。pERK(E-4、Santa Cruz Biotechnology)、サイクリンD1(M-20、Santa Cruz Biotechnology)、およびGNAQ(C-19、Santa Cruz biotechnology)に対する抗体を、Alexa Fluor 594および532(Molecular Probes)で標識された二次抗体を使用して検出した。グレイスケールM4+CLカメラおよびIsisソフトウェア(Metasystems, Germany)が装備されたAxio Image M1顕微鏡(Zeiss, Germany)で固定露光で画像を撮影した。個々の細胞の蛍光強度を、ImageJソフトウェアを使用して定量化し、平均ピクセル強度を、Microsoft ExcelおよびData Deskを使用して、統計分析のために使用した。
【０１６０】
軟寒天アッセイ
GNAQQ209L、GNAQWT、NRASQ61R、またはベクター対照を安定的に発現するヒト初代メラニン形成細胞(10×104)およびhTERT/CDK4R24C/p53DDメラニン形成細胞を、0.35％寒天を含有している完全培地に懸濁させ、6穴プレートにおける0.5％寒天の下層に播種した。28日後に、細胞を0.005％クリスタルバイオレットで染色し、コロニーからの画像を600dpiでフラットベッドスキャナを使用して取得した。コロニーの数およびサイズを、ImageJソフトウェアを使用して定量化した。
【０１６１】
細胞周期分析
siRNAでトランスフェクトされたMel202細胞を、トリプシン処理し、冷PBSにより洗浄し、70％エタノールで固定した。固定された細胞を、RNase染色緩衝液中のヨウ化プロピジウムで染色した(BD Pharmingen)。最低20.000の事象を用いて、FACSCalibur(BD Biosciences)により細胞周期測定を実施し、プロファイルをFlowJoおよびModFitを使用して分析した。
【０１６２】
siRNAトランスフェクション
RPMI/10％FCS中のMel202を、1ウェル当たり1.5×105または5×103細胞で、それぞれ6穴または96穴プレートに播種した。異なる2つのプールを比較した；各々、4つのsiRNA二重鎖から構成されている(Dharmacon)。
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対照siRNAは抗シクロフィリンBおよび非ターゲティングsiRNAを含んでいた(いずれもDharmacon)。すべてのトランスフェクションを、100nMの最終濃度でリポフェクタミンRNAiMax(1μl/pmol siRNA)を使用して実施した。siRNA複合体をOptimemにおいて形成させた。トランスフェクションの72〜96時間後、細胞を分析のために溶解させた。
【０１６３】
ウエスタンブロット分析
細胞を、氷冷PBSで2回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤カクテル、およびEDTA(Pierce Biotechnologies)が補足された溶解緩衝液(50mMトリス-HCl pH7.8、1％NP-40、10％グリセロール、150mM NaCl、1％デオキシコール酸ナトリウム、1％硫酸ドデシルナトリウム)に溶解させた。溶解物のタンパク質含有量を、BCA Protein Assay Reagent(Pierce Biotechnologies)により決定した。5〜20μgのタンパク質を、SDS-PAGEにより分離し、免疫検出のためにImmobilon-P膜(Millipore)上に転写した。使用された一次抗体は以下の通りであった：pERK(E-4、Santa Cruz Biotechnology)、サイクリンD1(M-20、Santa Cruz Biotechnology)、およびGNAQ(C-19、Santa Cruz biotechnology)、Phospho-Akt(736E11、Cell signaling)、Cyclophilin B(Abcam)、抗FLAG M2(Sigma)、抗ERK1/2pAb(Promega)、およびβ-アクチン(Sigma)。西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されたヤギ抗マウスまたは抗ウサギ(Upstate)を、二次抗体として使用した。
【０１６４】
統計分析
免疫蛍光データおよびCyQUANT測定は、スチューデントt検定を使用して分析された。フィッシャーの正確確率検定が、非定型細胞の割合を比較するために使用された。
【０１６５】
本明細書に引用されたすべての刊行物、特許、アクセッション番号、および特許出願は、あたかも個々の刊行物または特許出願が各々参照により組み入れられると特別に個々に示されたかのごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６６】
上記の発明は、明瞭な理解を目的として例示および実施例によってある程度詳細に記載されたが、本発明の教示を考慮すれば、ある種の変更および改変が、添付の特許請求の範囲の本旨または範囲を逸脱することなくなされ得ることは、当業者に容易に明白となるであろう。
【０１６７】
例示的なGNAQ配列：
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【０１６８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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