(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中に懸濁された粒子を特徴付けるためのインピーダンス細胞採寸カートリッジであって、
前記液体進入のための、ハウンジングの外側表面に穴を有するハウンジングを備え、
前記ハウジングは、前記粒子のインピーダンス測定のために混合チャンバと収集チャンバとの間の前記粒子の通過のためのオリフィスを含むポリマー膜によって分離された混合チャンバ及び収集チャンバを有し、
前記カートリッジは、前記ハウジング内で移動可能に位置するサンプリング部材を備え、
前記サンプリング部材は、少量で精密な容量の液体を毛細管引力により受容し、保持するための空洞を有し、
前記サンプリング部材の第１の位置において、前記空洞は、記空洞内への液体サンプルの毛細管引力による進入のために穴と連通し、前記サンプリング部材の第２の位置において、前記空洞は、前記混合チャンバ内への前記液体サンプルの放出のために前記混合チャンバと連通し、
オリフィス径が３０μｍから７５μｍまでの範囲であって、同時にただ１つの前記粒子が前記オリフィスを通過される大きさに設計され、これにより、前記インピーダンス測定により前記粒子の数及び粒子サイズが検出可能にされ、
前記オリフィスの内部表面の表面粗さが０μｍ〜５μｍの範囲であり、これにより前記オリフィスの中心部に実質的に均質な電界が提供され、
前記オリフィスは、前記オリフィスのエッジ付近を通って進入する粒子が歪んだパルスを生じさせないように、前記ポリマー膜の一方の側に角を丸められたエッジを有し、該丸められたエッジの曲率半径が前記オリフィス径の１／４に実質的に等しく、これによりオリフィス進入口での電界の乱れが最小になり、更に前記オリフィスの中心部に実質的に均質な電界が提供されることを特徴とするインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
【請求項２】
前記オリフィス径は、５０μｍであることを特徴とする請求項１に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
【請求項３】
前記オリフィスの長軸に沿った前記オリフィス径の偏差が±１％〜±１０％の範囲にわたり、これにより前記オリフィスの中心部に実質的に均質な電界が提供され得ることを特徴とする請求項１または２に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
【請求項４】
前記オリフィスの最も大きい断面直径は、５０μｍであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
【請求項５】
前記オリフィスの長さは、１μｍから１０００μｍまでの範囲にわたり、例えば約５０μｍに等しいことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
【請求項６】
前記オリフィスの長さは、５０μｍに等しいことを特徴とする請求項５に記載のインピーダンス細胞採寸カートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
液体中に懸濁された粒子を特徴付けるための使い捨てカートリッジ
本発明は、液体中に懸濁された粒子がインピーダンス測定を利用する粒子の検出および特徴付けのためにオリフィスまたはアパーチャを通過する粒子特徴付け装置に関する。詳細には、本発明は、ミリメートル以下のオリフィスの精密機械加工のための基材（base material）としてのポリマー膜の利用に関する。ポリマー膜にオリフィスを形成することは、材料費および製造費が低いため、血液学分析用の単回使用カートリッジの構築を容易にする。
【背景技術】
【０００２】
自動化血液分析器（血液学分析器）は、流体フロー中を進行中の個々の血球のそれぞれを特徴付ける電気的または光学的な方法に基づく。このような機器使用はむしろ複雑高度化され、測定を行なうためには熟練した人員が必要となる。インピーダンス細胞採寸（impedance cell sizing）による粒子のカウントおよび採寸（コールター採寸またはコールターカウント（V. Kachel, "Electrical Resistance Pulse Sizing: Coulter Sizing", Flow Cytometry and Sorting, Second Edition, pp. 45-80, 1990 Wiley-Lissを参照）としても公知である）は、ほとんどの血液学分析器および粒子カウント装置で使用されている広く受け容れられた方法である。この方法は、電解質中の比較的非導電性の粒子により生じる電気的インピーダンスの測定可能な変化に基づく。「アパーチャ」または「オリフィス」と呼ばれる小さな開口が、それぞれが電解質に接触するための電極を有する２つの電気的に隔離されたチャンバを繋ぐ。オリフィスは電気経路に対する制限として働き、これにより検知区域が築かれ、そこを通って粒子が吸引される。検知区域では、各粒子は周囲電解質との置換を生じ、したがって電流経路の一部を遮断し、よって短い電圧パルスを生じる。オリフィスを通じての一個ごとの粒子の吸引により、粒子は、パルス特性の記録により体積および導電性に関して特徴付けることができる。粒子の特定のサブグループの濃度は、パルス特性から、そして分析されたサンプル容量を計量することにより決定され得る。
【０００３】
インピーダンス技法を利用する従来の装置は、精密機械加工されたオリフィスを有する固定膜をベースにする。そのオリフィスは膜をフラッシュおよびリンスすることにより維持されている。従来のインピーダンス細胞採寸装置では、オリフィスは、サファイア膜に微小穿孔および研磨により作成される。これらのオリフィスは優れた頑健性を示し、合間に適切に清浄にすれば数千もの分析に繰り返し使用し得る。しかし、サファイアから作製され煩雑な調製技法を必要とするので、これらの膜は交換するのにかなり高くつく。
【０００４】
WO 01/69292は、メンテナンスフリーの読み取り器と血液のサンプリングおよび取扱用の独特な使い捨てカートリッジとを有する持ち運び可能な血液学分析器を開示する。この使い捨てカートリッジは、インピーダンス細胞採寸のためのオリフィスを有する膜を含む。
【０００５】
単回使用カートリッジの提供を可能にするためには、精密機械加工されたオリフィスを有する安価な単回使用膜材料が必要である。
さらに、低い費用で、正確性および再現性を有するオリフィスを持つ膜を製造する方法が必要である。
【０００６】
代表的には、公知の方法は必要な正確性を提供しない。正確なインピーダンス測定を容易にするため、オリフィス径の正確性は、±10％以内、より好ましくは±５％以内、より好ましくは±２％以内であることが望ましい。所望のオリフィス径は、代表的には10μm〜1000μmの範囲、好ましくは30μm〜75μmの範囲である。したがって、製造したオリフィスを有する膜が有用な結果を提供するためには、製造プロセスは、μmのスケールでの精密性、例えば±２μm以内の正確性を有するオリフィスを提供することができなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、液体中に懸濁された粒子（例えば、血液サンプル中の細胞）を特徴付けるために、（例えば単回使用カートリッジを有する）インピーダンス細胞採寸装置において使用するためのオリフィスを有する膜を提供することである。好ましくは、このカートリッジは、サンプル取り扱いおよび別のユニットへのサンプル移動の必要なく１つのデバイスで分析を実施し得るように、サンプル採取、サンプル調製、および粒子特徴付けを可能にする。
単回使用カートリッジは、１つの液体サンプルの分析後、廃棄されることを意図される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に従えば、精密機械加工（例えば、ミリング、穿孔、パンチ、削磨（ablation）、蒸着、射出成形、パンチ、水流切断（water cutting）、気流切断（air cutting）、レーザ切断など）によりポリマー膜にオリフィスを作製する方法によって上記および他の目的が達成される。
【０００９】
ポリマーシートの使用は、細胞分析用の使い捨てカートリッジに対する要求を満たす理想的な方法であることが証明されている。ポリマーシートの主要な利点は、材料費の低さ、製造プロセス費用の低さ、他のポリマーとの単純で信頼性のある溶接方法、理想的な電気的絶縁特性および良好な化学的安定性である。
【００１０】
軟質ポリマー（例えば、感光性樹脂（フォトレジスト））は、本質的に軟質であるかまたは流体であり、硬化する前に支持面に塗布しなければならない。このような感光性樹脂の膜厚は、制御するのが困難であり、それが塗布されている表面全体にわたって著しく変化し得る。膜のより大きな領域にわたって厚さの制御を得るためには、膜は、必要な厚さを規定するためのロールを使用することにより製作しなければならない。
したがって、好ましくは、ポリマー膜は、その膜が自立する（self-sustained）ように、硬化ポリマーまたは硬質ポリマーから製造される。
【００１１】
フォトリソグラフィは、予熱、露光、硬化および溶解のような多くの異なるプロセス工程を有する緩慢なプロセスである。これらの工程がこの製作方法を煩雑で高価にする。
したがって、好ましくは、膜の精密機械加工は、フォトリソグラフィ以外のプロセスを含む。
【００１２】
本発明に従うレーザ切断によるオリフィスを有するポリマー膜の機械加工は、インピーダンス粒子カウントおよび/または採寸用の精密機械加工オリフィスを有する膜の安価で迅速な製造を提供する。
高エネルギーレーザスポットは、そのスポットの集束領域で材料の蒸発または削磨を引き起こす。エキシマレーザのレーザスポットは、数マイクロメートルに集束させることができ、本発明に従う所望の正確性を提供する。
好ましくは、レーザは、その優秀なレーザ切断の正確性のためにUV-レーザである。
好ましくは、UV-レーザは、150nm〜350nmの範囲の波長を有するエキシマレーザである。
【００１３】
本発明の１つの実施形態に従えば、レーザは、従来のドリルのように使用される。すなわち、集束したレーザスポットはオリフィスの所望の位置のままで、オリフィスは、一連のレーザパルスにより作製される。
【００１４】
本発明の別の実施形態に従えば、集束したレーザビームを、所望のオリフィス周縁に沿って走査させ、これにより膜のオリフィスを切り抜く。この方法で、オリフィスのいかなる所望の周縁形状でも製造され得る。
【００１５】
本発明のなお別の実施形態に従えば、細いレーザビームを、オリフィスの作製のために取り除かれることが望ましい膜表面を横切って、例えば直線的に、例えば一行ごとに走査させる。
【００１６】
本発明の第２の観点に従えば、膜の一方の側に丸められたエッジを有するオリフィスを持つポリマー膜が提供される。これにより、オリフィス進入口での電界の乱れが最小になり、オリフィスの中心部で実質的に均質な電界が提供され得る。
この結果、オリフィスの中心部でオリフィスを通る粒子およびオリフィスのエッジ近くでオリフィスを通る粒子により発生する電気パルスは、実質的に同じパルスを生じる。丸められたエッジがなければ、エッジ近くでオリフィスを通る粒子は、歪んだパルスを発生する。
好ましくは、丸められたエッジの曲率半径は、長さ対直径比１を有するオリフィス径の１/４に相当する。この結果、均質な電界が、エッジで場が乱れることなく、なおオリフィス内に到達する。
オリフィスの丸められたエッジを設けるために、始めはより大きな領域を、次いでオリフィスの実効直径を規定する直径にまで狭めて加工処理するようにレーザをプログラムする。
さらに、０μm〜５μmの範囲の内部表面の表面粗さを有するオリフィスを持つポリマー膜が提供される。これにより、オリフィスの中心部で実質的に均質な電界が提供され得る。
なおさらに、±１％〜±10％の範囲のオリフィス長軸に沿ったオリフィス径の偏差を有するオリフィスを持つポリマー膜が提供される。これによりオリフィスの中心部で実質的に均質な電界が提供され得る。
【００１７】
本発明に従う膜は、例えば、液体中に懸濁された粒子を特徴付けるためのカートリッジに組み込まれてもよい。このカートリッジは、混合チャンバと収集チャンバとの間の粒子の通過のためのオリフィスを含む膜によって分離された混合チャンバおよび収集チャンバを有するハウジングを備える。オリフィスを通過する粒子を特徴付けるために粒子特徴付け手段が提供される。
【００１８】
サンプル採取は、液体サンプルの進入用の、ハウジングの外側表面の穴（bore）を通して行ない得る。ハウジングは、ハウジング内で移動可能に位置するサンプリング部材をさらに備える。サンプリング部材は、少量で精密な容量の液体を受容および保持するための空洞（cavity）を有する。サンプリング部材の第１の位置で、空洞は、液体サンプルの空洞への進入のために穴と連通状態にある。サンプリング部材の第２の位置で、空洞は、混合チャンバへの入口と連通状態にある。
したがって、サンプリング部材は、精密な容量の液体サンプルを受容および保持するため、ならびに混合チャンバの入口へサンプルを移動させるために動作する。
【００１９】
好ましくは、サンプリングすべき液体は、液体フローを引き起こす毛細管引力により空洞に進入する。毛細管力の利用は、サンプルを採取するためにポンプも、膜も、シリンジも他のフロー発生手段も必要としないので、フローシステムを単純化する。
したがって、穴は、毛細管引力による液体サンプルの進入のための第１の毛細管トンネルを構成し得る。毛細管トンネルは、穴とサンプリングすべき液体との間の接触の際に、液体のサンプルが毛細管引力により穴中に引き込まれるような寸法である。
さらに、空洞は、毛細管引力により空洞中に液体サンプルを引き込むように適合させた第２の毛細管トンネルを構成し得る。好ましくは、第１および第２の毛細管トンネルは同じ直径を有する。また、第１の位置で、第１および第２の毛細管トンネルは、実質的に同じ長手方向の中心軸に沿って伸びるのが好ましい。
【００２０】
好ましくは、サンプリング部材は、空洞の長軸に対して実質的に垂直な回転軸の周りを回転可能である。
加えて、または択一的には、サンプリング部材は、空洞の長軸に実質的に垂直な方向に移動してもよい。
【００２１】
第１および第２の毛細管トンネル内壁の表面は、親水性であってもよく、これにより液体サンプルの毛細管引力が促進される。例えば、トンネル内壁は、例えばガラスまたはポリスチレンのようなポリマーから作製されてもよい。
あるいは、毛細管トンネル壁は、別のタイプの材料から作製されても、ポリマーまたは試薬のような親水性材料で共有結合的または非共有結合的にコーティングされてもよい。
毛細管トンネルはまた、トンネル内壁に付着または化学的に結合した１以上の試薬を含んでもよい。これらの試薬は、サンプルの毛細管引力をさらに促進する目的、および任意には液体サンプル中で化学反応をも引き起こす目的（例えば、血液サンプル中に抗凝固活性を導入する目的）に役立つ。このような試薬は、ヘパリン、EDTAの塩などを含んでもよい。
好ましくは、サンプリング部材はポリマーから作製される。
【００２２】
本発明のさらなる観点に従えば、液体中に懸濁された粒子を特徴付けるための装置が提供される。この装置は、本明細書中に開示したようなカートリッジ、およびカートリッジを取り外し可能に受容するドッキングステーション（docking station）を備え、ドッキングステーションは、カートリッジがドッキングステーションに受容されているとき、粒子特徴付け手段との機能的な接続のためのコネクタを備える。
カートリッジは、オリフィスを通る液体フローを引き起こすために収集チャンバと連通するカートリッジポートをさらに備えてもよく、ドッキングステーションは、オリフィスを通る液体フローを引き起こす圧力の印加のために、カートリッジがドッキングステーションに受容されているとき、カートリッジポートと気体接続を形成するための対応するポートをさらに備えてもよい。
【００２３】
粒子特徴付け手段は、混合チャンバ中に第１の電極を、そして収集チャンバ中に第２の電極を備えてもよい。各電極は、カートリッジがドッキングステーションに受容されているとき、ドッキングステーションの各自コネクタとの機能的な接続のために、カートリッジの外部表面でアクセス可能な各自端子部材と電気的に接続する。一般に、カートリッジとの必要なすべての電気的および流体的接続は、カートリッジをドッキングステーションにはめ込むことにより、好ましくは単に押し込むはめ込みにより確立できることが好ましい。
【００２４】
第１および第２の電極は、例えば血球のカウントおよび採寸のために、周知のコールターインピーダンス原理を利用する粒子特徴付けを容易にし得る。この方法は、世界的に受け容れられた方法になっており、大部分の血液学分析器で使用される。毎秒数千の粒子が、この原理を利用して高度な精密性および正確性で特徴付けられ得る。
【００２５】
電気的インピーダンス技法で、測定値から粒子体積を求めることが可能である。粒子は電解質に比べて非導電性であると考えることができ、オリフィスの中心部の電界（DCまたはRF）は均質であると考えることができ（このことは、代表的には、直径Ｄがオリフィスの長さｌより小さい（l/D＞１）場合に満たされる）、粒子ｄはオリフィス径に比べて小さい（d＜0.2*D）と考えることができ、同時にはただ１つの粒子が通過し、そして粒子はオリフィスの長さに沿ってオリフィスを通過することを前提として、オリフィスを横切って定電流を維持することにより、オリフィス中の電解質に置換する粒子からの記録電圧パルスは、粒子の体積に比例する高さを有する。
好ましくは、オリフィスの長さまたは深さは、１〜1000μmであり、例えば約50μmである。望ましくは、オリフィスの長さは、0.1〜100μm直径の粒子を検出するときにオリフィス内にただ１つの粒子が存在するように選択する。しかし、オリフィス中の電界の均質性を考慮すれば、直径より長いかまたは直径と等しいオリフィスの長さが必要になり得る。カウント（このうちいくらかは、２つの粒子の同時カウントであり得る）は、統計学的推定を行なうことにより数学的に較正することができる。オリフィスの縦横比（長さまたは深さ/直径）は、好ましくは0.5:1〜5:1、より好ましくは1:1〜3:1である。
好ましくは、オリフィスの最大断面寸法は、５〜200μm、例えば10〜50μmである。
【００２６】
カートリッジは、オリフィスを通る液体フローの促進のためのカートリッジフローシステム内で実質的に周囲の大気圧を保存するための周囲環境と連通する吸排気装置の入口/出口をさらに備えてもよい。
【００２７】
好ましくは、カートリッジは、単回使用後に使い捨て可能であるように設計される。使用後、新たなカートリッジを用いる新たなアッセイ手順で使用可能となる前に、装置を浄化する必要がないことが望ましい。したがって、ドッキングステーションへの進入時のカートリッジからの液体の漏れは回避されるべきである。この目的のため、吸排気装置入口/出口、第２のチャンバ入口/出口および粒子特徴付けデバイス構成要素に関するオリフィスの配置は、好ましくは、所望の粒子特徴付けに十分な容量の液体を、液体がハウジングの外を通らずに、オリフィスを通して引き込むかまたはくみ上げることが可能であるようにするような配置である。一般に、液体がカートリッジを出ることなく粒子特徴付け測定を行ないながら、所定の容量、少なくとも0.1ml〜10ml、例えば0.5mlの液体が、オリフィスを通過することが可能であるべきである。
【００２８】
カートリッジは、所定容量の液体がオリフィスを通過したその期間の始めおよび終わりを決定するために容量計量手段を備えてもよい。
好ましくは、容量計量手段は、収集チャンバと連通する入力、および出力を有する容量計量チャンバを備える。ここで、入力および出力のそれぞれで、液体の存在が検出される。
例えば、液体の存在は、空気で満たされているときから液体で満たされているときまでのチャンネル構成の光学特性変化により光学的に検出されてもよい。これは、表面からの反射率または透過率検出として構成される。ここで、入射光は、空のチャンネルから反射されそして満たされたチャンネルを透過し、したがって検出した反射光または透過光に明確なシフトを生じる。
計量チャンバの入力および出力は、計量チャンバの容量に比較してほんの少量の液体容量を収容するための狭いチャンネルによって形成されることが好ましい。その結果、チャンネル中の容量計量手段（例えば光学反射率検出）の実際の配置は、容量計量手段の測定値の正確性に実質的に影響しない。
混合チャンバまたは収集チャンバが容量計量チャンバを構成してもよい。しかし、容量計量手段（例えば光学反射率検出）の配置を容易にする独立の容量計量チャンバを提供することが好ましい。
容量計量手段は、計量チャンバ中の液体が、容量計量チャンバの各自レベルにまたはそれより上にある時を検知するように配置されてもよい。
容量計量手段は、液体のレベルが各自計量手段が液体で満たされているかまたは満たされていないようなレベルである時を検知するために使用してもよく、したがって固定容量の液体がオリフィスを通過したその期間の始めおよび終わりを決定するために働いてもよい。例えば、粒子特徴付けは、液体のレベルが計量手段のレベルを超えてちょうど上昇するときに始まり、液体のレベルが第２の計量手段を超えてちょうど上昇するときに終了してもよい。この期間の間にオリフィスを通過する液体の容量は、各自計量手段の分離によって規定される。
規定容量の液体の通過の終点が、１つのチャンバがオリフィスのレベルの下まで事実上空になることである場合、収集チャンバおよび混合チャンバのそれぞれ（または少なくとも液体が去るチャンバ）は、チャンバ高のオリフィスより上の実質的部分にわたるチャンバの横断面積より実質的に小さいオリフィスレベルでの横断面積を有することが好ましい。
【００２９】
コールター原理を使用する場合、本発明に従う装置に使用するための希釈剤は、液体を高導電性にする無機塩を含んでもよい。サンプルが電解質に適用される場合、電解質対サンプル容量は、好ましくは10より高くあるべきである。サンプル調製は、好ましくは1,000〜10,000,000粒子/mlの間、より好ましくは10,000と100,000粒子/mlとの間を生じるべきである。電解質添加後にサンプルを混合することが推奨される。粒子径は、好ましくはオリフィス径の１〜60％内、より好ましくはオリフィス径の５〜25％の間であるべきである。体積流量は、好ましくは10μl〜10ml/分、より好ましくは100μlと１ml/分の間であるべきである。測定には、約１〜５mAの定電流が好ましくは印加される。電流源は、好ましくは1,000より良好な信号対雑音比（S/N）を有するべきである。電極からの応答は、バンドパスフィルタにより電気的にフィルタリングされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明に従う使い捨てカートリッジの構成要素の側断面図である。
【図２】フロースルーセンサ概念を概略的に説明する。
【図３】使い捨てカートリッジ、ドッキングステーションおよび読み取り器を有する、本発明に従う装置を概略的に説明する。
【図４】実施例１で得られた結果のプロットである。
【図５】実施例２で得られた結果のプロットである。
【図６】実施例３で得られた結果のプロットである。
【図７】実施例４で得られた結果のプロットである。
【図８】実施例５で得られた結果のプロットである。
【図９】本発明の実施形態に従うオリフィスを有する膜の製造を概略的に説明する。
【図１０】本発明の別の実施形態に従うオリフィスを有する膜の製造を概略的に説明する。
【図１１】本発明に従って製造された膜オリフィスの断面を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、添付の図面を参照してさらに開示および説明される。
図１は、本発明に従う使い捨てカートリッジの構成要素の側断面図である。
図２は、フロースルーセンサ概念を概略的に説明する。
図３は、使い捨てカートリッジ、ドッキングステーションおよび読み取り器を有する、本発明に従う装置を概略的に説明する。
図４は、実施例１で得られた結果のプロットである。
図５は、実施例２で得られた結果のプロットである。
図６は、実施例３で得られた結果のプロットである。
図７は、実施例４で得られた結果のプロットである。
図８は、実施例５で得られた結果のプロットである。
図９は、本発明の実施形態に従うオリフィスを有する膜の製造を概略的に説明する。
図10は、本発明の別の実施形態に従うオリフィスを有する膜の製造を概略的に説明する。
図11は、本発明に従って製造された膜オリフィスの断面を示す。
【００３２】
図１は、液体希釈剤11を含む液体貯蔵チャンバ１、血液サンプル８をサンプリングするためにハウジング85中に位置しそして血液サンプル８を受容および保持するための空洞10を有するサンプリング部材２を備える、血液分析のためのハウジング85を有する使い捨てカートリッジを示す。部材２は、第１の位置で、空洞10が毛細管力により空洞10への血液サンプル８の進入のために穴90と連通状態にあり、第２の位置で、空洞10が、液体希釈剤11により希釈された血液サンプル８の混合チャンバ３への放出のために液体貯蔵チャンバ１および混合チャンバ３と連通状態にあるように、ハウジング85との関係で移動可能に位置する。混合チャンバ３は、混合チャンバ３と収集チャンバ５との間の血液サンプル８の通過のためにオリフィス59を有する本発明に従う膜により、収集チャンバ５と分離されている。オリフィス59を含む膜は、フロースルーセンサ４の部分を構成する。
【００３３】
容量計量機構は、収集チャンバに接続されており、光学的または電気的手段による液体の出入を記録するための比較的小さい内部容量の２つの接続チャンネル12、13を有する、測定の間に測定すべき容量サイズを有する容量計量チャンバ６を備える。容量計量チャンバからは、圧力を印加することができる接続ポート67にチャンネル７が引き出されている。
【００３４】
図２は、インピーダンス測定による粒子のカウントおよび採寸を概略的に説明する。図２は、オリフィス59を含む膜91の一部分の断面を示す。２つのチャンバ、混合チャンバ３および収集チャンバ５は、オリフィス59を通って連通する。チャンバ３、５はそれらの間に電界を発生させるための電極61、62を備える。膜91は電気絶縁体であり、したがってオリフィス59は電界を制限し、これにより検知区域60が確立され、ここを通って粒子58が吸引される。検知区域60で、各粒子58は周囲の電解質との置換を生じ、したがって電極61、62間の電流経路の部分を遮断し、これにより短い電圧パルス57を発生させる。オリフィス59を通じての（好ましくは一個ごとの）粒子の吸引により、粒子58は、各自の電圧パルス57の特性の記録により容量および導電性に関して特徴付けることができる。
【００３５】
図３は、使い捨てカートリッジ、ドッキングステーション、および読み取り器を有する装置を概略的に説明する。フロースルーセンサの各側のチャンバは、外部端子61、62から使い捨てユニットの基底壁63を通って伸び、各自のチャンバの内側に面するように構成された電極34、35を有する。カートリッジは、検査を実行するために、持ち運び可能な装置のドッキングステーション66に配置される。ドッキングステーション66は、基部70および周囲側壁71を有するカップ状ハウジングを有する。基部70には、カートリッジがドッキングステーション中に押し込みはめ込みのように受容されると、カートリッジの端子61、62と自動的に接触するための各自のバネ付電気コネクタ64、65がある。カートリッジの導管67と整列された基底壁70を通過する導管68もまた存在する。導管67は、壁70の上面への開口部で、カートリッジの基底壁63の下面との気密性接続を形成するために、例えばＯリングのようなシール69およびを有する。真空ポンプ72が、ライン73によって導管68の下端に接続する。この装置の変形では、真空ポンプ72は、導管68へ陽圧の気圧を印加するために逆にすることができる。74に概略的に示されているのは、コールターカウンタのさらなる従来の構成要素（装置の動作に必要なすべての電子回路および表示装置を含む）である。
【００３６】
図４
実施例１−ポリマービーズの採寸
電解質に懸濁された５μm粒子と10μm粒子との混合物を、図３に示した装置のオリフィスを通して吸引した。検出した粒子数および検出した各粒子のサイズを記録した。検出した粒子サイズの二峰性分布が図に明らかに見られる。
【００３７】
図５
実施例２−赤血球細胞のカウント
血球の測定を行ない、結果を図５に示す。赤血球細胞は、図５から理解できるように、通常、直径が１〜７μm付近であり、全血中に最大頻度で存在する。分布は、期待されたように、ガウス曲線である。血球カウントは臨床診断に用いることができる。血液学のとって基本パラメータと考えられる（"Fundamentals of Clinical Haematology", Stevens, W.B. Saunders Company, ISBN 0-7216-4177-6を参照）インピーダンス測定により赤血球、白血球および血小板をカウントすることはかなり簡単である
【００３８】
図６
実施例３−すべての血球を保存するように選択した試薬組成物を含む希釈剤を使用する白血球細胞カウント
材料
本発明に記載するような機能を含むカートリッジおよび装置
塩化ナトリウム 7.9g/L、塩化カリウム 0.4g/L、リン酸水素二ナトリウム 1.9g/L、リン酸二水素ナトリウム 0.2g/L、２ナトリウム−EDTA 0.4g/Lおよびフッ化ナトリウム 0.3g/Lを含む、Isoton, Beckman Coulter（製品番号24655）
Vacutainer（K3E, Becton & Dickinson, 製品番号367652）
Bayer, ADVIA-120装置
【００３９】
実行
手順の完全な流れは以下のとおりである：
− Vacutainerチューブに静脈血サンプルを収集
− 沈降プロセスを進行させるために３時間サンプルを放置
− バフィコート区分の大部分が含まれる血漿相を抽出
− 白血球の含有量についての比較値を得るためにBayer Advia 120装置を使用して分析を実施
− 検査リグ（test rig）のチャンバに希釈剤として5.00mlの等張溶液を添加
− チャンバに10.0μlのサンプルを添加
− チャンバで液体を混合
− コンピュータで検査シーケンスを開始（くみ上げを開始しサンプリングを準備）
− 液体が第１のレベルの電極に達したときにサンプリングを開始
− 液体が第２のレベルの電極に達したときにサンプリングを停止
− サンプリングした値をファイルに保存
− データを分析し、赤血球細胞と重複する白血球の減算を含む計算法を使用して結果を計算するために「pulse-viewer」を使ってファイルを開く。
【００４０】
結果
Bayer Advia-120： 11.96×109 白血球/L
検査リグ： 11.92×109 白血球/L
正確性の差: (11.96−1.92)/11.96＝0.33％
【００４１】
図７
実施例４−赤血球細胞を主に溶血するように選択した試薬組成物を含む希釈剤を使用する白血球細胞分離
材料
本発明に記載したような機能を含むカートリッジおよび装置
塩酸プロカイン 0.10g/L、1,3-ジメチロール尿素 0.90g/L、Ｎ−(１−アセトアミド)イミノ２酢酸 1.28g/L、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド 7.51g/Lおよび塩化ナトリウム 0.03g/Lを含む希釈剤
Vacutainer（K3EDTA, Becton & Dickinson, 製品番号367652）
【００４２】
実行
手順の完全な流れは以下のとおりである：
− Vacutainerチューブに静脈血サンプルを収集
− 沈降プロセスを進行させるために３時間サンプルを放置
− バフィコート区分の大部分が含まれる血漿相を抽出
− 検査リグのチャンバに上記のような2.000mlの希釈剤を添加
− チャンバに4.0μlのサンプルを添加
− チャンバで液体を混合
− コンピュータで検査シーケンスを開始（くみ上げを開始しサンプリングを準備）
− 液体が第１のレベルの電極に達したときにサンプリングを開始
− 液体が第２のレベルの電極に達したときにサンプリングを停止
− サンプリングした値をファイルに保存
− データを分析し、結果を作成するために「pulse-viewer」を使ってファイルを開く。
【００４３】
結果
図６のヒストグラムで理解できるように、白血球に対応する粒子集団は、赤血球細胞の非存在下で容易に同定される。
【００４４】
図８
実施例５−体性細胞のカウント
乳質は、農家、日々の生産者および消費者にとって重要である。農家は、特定の質の乳汁を配達しなければならない。質は、いわゆる体性細胞カウント（SCC）により制御される。乳質の検査において、乳汁中の体性細胞は感染（臨床乳腺炎）を決定するためにカウントされる。日々の再販には、農家は、400,000細胞/mlの限度を満たさなければならない。飼料の変化、ストレスまたは乳腺炎は、より高いSCCレベルを導き、したがって乳質を低下させ、結果的には単位容量あたりの価格を低下させる。安価な細胞カウンタは、農家や日々の生産者がSCCレベルをモニターするのを助けるであろう。
【００４５】
図９に概略的に示すように、インピーダンス細胞採寸のためのオリフィス59は、ポリマー91のレーザ微小機械加工によって製造することができ、カートリッジ用のオリフィス59を製造しそして組み立てる簡便な方法が導かれる。一連の50μmの小オリフィスは、UVレーザ100で製造されてきた。オリフィス59は、50μmのポリマーシートに10ms未満で作成される。オリフィス59の均一性は非常に高く、オリフィス進入口の平滑性は特有である。
好ましくは、レーザ100はUVレーザであり、例えば、その優秀なレーザ切断の正確性のために、150nm〜350nmの範囲の波長を有するエキシマレーザである。
本発明に従うレーザ切断によるオリフィス59を有するポリマー膜91の製造は、インピーダンス粒子カウントおよび/採寸のための、精密機械加工したオリフィス59を有する膜91の安価で迅速な製造を提供する。
高エネルギーレーザスポット104は、スポット104の集束領域で材料の蒸発または削磨を引き起こす。エキシマレーザ100のレーザスポット104は、数マイクロメートルに集束されてもよく、これにより本発明に従う所望の正確性を提供する。
図９に示される実施形態では、レーザ100は従来のドリルのように使用される。すなわち、集束させたレーザスポット104は、オリフィスの所望の位置のままで、オリフィス59は、一連のレーザパルスにより作製される。
【００４６】
図10に示される実施形態では、集束したレーザビーム102を、オリフィス59の所望の周縁に沿って走査させ、これにより膜91のオリフィス59を切り抜く。この方法で、オリフィス59のいかなる所望の周縁形状でも製造され得る。
【００４７】
本発明のなお別の実施形態に従えば、細いレーザビーム102を、オリフィス59の作製のために取り除かれることが望ましい膜91の表面を横切って、例えば直線的に、例えば一行ごとに走査させる。
【００４８】
図11は、本発明に従って製造された膜オリフィス59の断面を示す。示したポリマー膜91は、膜91の一方の側に丸められたエッジ56を有するオリフィス59を有して提供される。これにより、オリフィス59の進入口での電界の乱れが最小になり、オリフィス59の中心部で実質的に均質の電界が提供され得る。
【００４９】
この結果、オリフィス59の中心部でオリフィス59を通る粒子およびオリフィス59のエッジ近くでオリフィス59を通る粒子により発生する電気パルスは、実質的に同じパルスを生じる。丸められたエッジ56がなければ、エッジ近くでオリフィス59を通る粒子は、歪んだパルスを発生する。
好ましくは、丸められたエッジ56の曲率半径は、オリフィス59の直径の1/4に相当する。
【符号の説明】
【００５０】
１  液体貯蔵チャンバ
３  混合チャンバ
４  フロースルーセンサ
５  収集チャンバ
６  容量計量チャンバ
７  チャンネル
８  血液サンプル
１０  空洞
１１  液体希釈剤
１２  接続チャンネル
１３  接続チャンネル
３４  電極
３５  電極
５８  粒子
５９  オリフィス
６０  検知区域
６１  電極、外部端子
６２  電極、外部端子
６３  基底壁
６４  バネ付電気コネクタ
６５  バネ付電気コネクタ
６６  ドッキングステーション
６７  接続ポート
６８  導管
６９  シール
７０  基部、基底壁
７１  周囲側壁
７２  真空ポンプ
７３  ライン
８５  ハウジング
９０  穴
９１  膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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