(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者が肺癌を有するか又は肺癌を発症するリスクを有するかを検出するための方法であって、前記被験者からの試験試料中のｍｉＲ−１５５及びｌｅｔ−７ａ−２からなるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、
前記試験試料中の前記ｍｉＲ−１５５遺伝子産物のレベルの、コントロール試料中の対応するｍｉＲ−１５５遺伝子産物のレベルに対する増加、並びに
前記試験試料中の前記ｌｅｔ−７ａ−２遺伝子産物のレベルの、コントロール試料中の対応するｌｅｔ−７ａ−２遺伝子産物のレベルに対する減少、
が、前記被験者が肺癌を有すること又は肺癌を発症するリスクを有することの指標となる、前記方法。
【請求項２】
前記方法が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−２２４ａ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ及びｌｅｔ−７ｆ−１からなる群より選択される少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０５及びｍｉＲ−２１６からなる群より選択される少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２６＊及びｍｉＲ−２２４からなる群より選択される少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記肺癌が肺腺癌であり、そして、前記方法が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２０４−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−２２４からなる群より選択される少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記肺癌が肺扁平上皮癌であり、そして、前記方法が、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ及びｍｉＲ−１９７からなる群より選択される少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記試験試料中の前記の少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物のレベルが前記コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも少ない請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記試験試料中の前記の少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物のレベルが前記コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも多い請求項２記載の方法。
【請求項９】
肺癌を有する被験者の予後を判定する方法であって、前記被験者からの試験試料中のｍｉＲ−１５５及びｌｅｔ−７ａ−２からなるｍｉＲ遺伝子産物のレベルを測定することを含み、ここで：
前記ｍｉＲ遺伝子産物が肺癌の予後不良と関連しており；
前記肺試験試料内のｍｉＲ−１５５遺伝子産物の量の、コントロール試料内の対応する
ｍｉＲ−１５５遺伝子産物の量に対する増加、並びに
前記試験試料中の前記ｌｅｔ−７ａ−２遺伝子産物のレベルの、コントロール試料中の対応するｌｅｔ−７ａ−２遺伝子産物のレベルに対する減少、
が予後不良の指標となる、前記方法。
【請求項１０】
前記方法が、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４５、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−２１からなる群より選択される少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物を測定することを含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記肺癌が肺腺癌である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
被験者が肺癌を有するか又は肺癌を発症するリスクを有するかを検出するための、請求項１記載の方法であって：
（１）前記被験者から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；
（２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて前記試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；及び
（３）前記試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルをコントロール試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較する、
ことを含み、ここで少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルの変化が前記被験者が肺癌を有すること又は肺癌を発症するリスクを有することの指標となる、前記方法。
【請求項１３】
前記コントロール試料から生成したシグナルと比較して少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルがダウンレギュレートされている、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記コントロール試料から生成したシグナルと比較して少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルがアップレギュレートされている、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記マイクロアレイが、ｍｉＲ−１５５及びｌｅｔ−７ａ−２に対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチド、並びに、所望により、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−２２４ａ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−１及びその組み合わせからなる群より選択される１又は複数種の追加のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチド、を含む請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
被験者が被験者中に予後不良の肺癌を有するか又は予後不良の肺癌を発症するリスクを有するかを検出するための、請求項９に記載の方法であって：
（１）前記被験者から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し；
（２）前記標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせて前記試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供し；及び
（３）前記試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルをコントロール試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較する；
ことを含み、ここでｍｉＲ−１５５の前記ハイブリダイゼーションプロファイルの増加、及び、ｌｅｔ−７ａ−２の前記ハイブリダイゼーションプロファイルの減少、が前記被験者が予後不良の肺癌を有すること又は予後不良の肺癌を発症するリスクを有することの指標となる、前記方法。
【請求項１７】
ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−１４５、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−２１からなる群より選択される少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物のハイブリダイゼーションプロファイルの変化が、前記被験者が予後不良の肺癌を有すること又は予後不良の肺癌を発症するリスクを有することの指標となる、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記肺癌が肺腺癌である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロアレイが、ｍｉＲ−１５５及びｌｅｔ−７ａ−２に対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチド、並びに、所望により、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−２２４ａ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−１及びその組み合わせからなる群より選択されるｍｉＲＮＡに対する少なくとも１種の追加のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
抗肺癌剤を同定するin vitroの方法であって、試験薬剤を細胞に供給し、ｍｉＲ−１５５及びｌｅｔ−７ａ−２のレベルを測定することを含み、ここでコントロール細胞と比較した前記細胞内で観察されるｍｉＲ−１５５のレベルの減少、及びｌｅｔ−７ａ−２の量の増加が、前記試験薬剤が抗肺癌剤であることの指標となる、前記方法。
【請求項２１】
肺癌細胞中の減少した発現量と関連する少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物を測定する、ここにおいて、前記少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２２４ａ、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｌｅｔ−７ｆ−１及びその組み合わせからなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物を測定する、ここにおいて、前記少なくとも１種の追加のｍｉＲ遺伝子産物が、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５０及びその組み合わせからなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明者
Ｃａｒｌｏ  Ｍ．  Ｃｒｏｃｅ，  Ｎｏｚｏｍｕ  Ｙａｎａｉｈａｒａ及びＣｕｒｔｉｓ  Ｃ．  Ｈａｒｒｉｓ
【０００２】
政府補助
本発明は全体又は部分においてＣＣＲ／ＮＣＩ／ＮＩＨからの助成金ＣＡ７６２５９及び所内助成金により、並びに契約番号ＮＯ１−ＣＯ−１２４００のもと、ＮＣＩ／ＮＩＨからの政府助成金により補助された。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肺癌は世界的に他のどのような形態の癌よりも多くの死をもたらす（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｇ．Ｅ．，Ｔｈｏｒａｘ  ５７：９９４−９９９（２００２））。米国においては、肺癌は男女両方において癌死亡の主要な原因である。２００２年、肺癌による死亡率は１３４，９００名の死亡という推定であった。肺癌はまた欧州の全ての国においても癌死亡の主要な原因であり、肺癌関連死の数は発展途上国においても同様に急速に増加している。
【０００４】
全肺癌患者の５年生存率は診断の時点での病期に関わらず約１３％しかない。これは該疾病がまだ限局性である間に発見された患者における４６％の５年生存率と対照的である。しかし、１６％の肺癌しか該疾病が転移する前に発見されない。早期発見は該疾病が進行期に達するまで臨床症状が見られないことが多いため難しい。現在では、診断は胸部Ｘ線の使用、痰に含まれる細胞の種類の分析及び気道（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｐａｓｓａｇｅ）の光ファイバー検査（ｆｉｂｅｒｏｐｔｉｃ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ）により補助される。治療計画は癌の種類及び病期によって決定され、手術、放射線治療及び／又は化学療法が含まれる。この癌や他の癌のための治療法に関するかなりの研究にも関わらず、肺癌は診断することも効果的に治療することも難しいままである。従って、このような癌の発見及び治療のための改良された方法に対する大きな需要が存在する。
【０００５】
Ｃａｒｂｏｎｅ，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２３：３２１９−３２２６  （２００５）；  Ｇｒａｎｖｉｌｌｅ及びＤｅｎｎｉｓ，  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３２：１６９−１７６  （２００５））。例えば、ｐ５３及びＲＢ／ｐ１６両者経路の異常が肺癌においては一般的である。他のいくつかの遺伝子、例えばＫ−ｒａｓ、ＰＴＥＮ、ＦＨＩＴ及びＭＹＯ１８Ｂは、より低頻度ではあるが肺癌において遺伝的に変化している（Ｍｉｎｎａほか，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １：４９−５２  （２００２）；Ｓｅｋｉｄｏほか，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ５４：７３−８７  （２００３）；Ｙｏｋｏｔａ及びＫｏｈｎｏ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ９５：  １９７−２０４  （２００４））。公知の遺伝子及びタンパク質に注目することによって有用な情報が得られてきれたが、これまでに知られていなかった肺癌のマーカーも肺癌の生物学に対する見識を与え得る。
【０００６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）標的にハイブリダイズすることにより；及び該ＲＮＡ標的の翻訳抑制を誘発すること又は（より低頻度で）分解を誘発することのいずれかにより；遺伝子発現を調節する、短い非コードＲＮＡのクラスである。ｍｉＲＮＡの発見及び研究により、細胞分化、細胞増殖及び細胞死等の、生物の発生及び様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を演じるｍｉＲＮＡ媒介型の遺伝子調節機構が明らかになった（Ｃｈｅｎｇ，  Ａ．Ｍ．，ほか，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３３：  １２９０−１２９７  （２００５））。最近の研究においては、特定のｍｉＲＮＡの異常な発現が神経障害（Ｉｓｈｉｚｕｋａ，  Ａ．ほか，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６：２４９７−２５０８  （２００２））及び癌等のヒトの疾病に関与している可能性があることが示唆されている。特に、ｍｉＲ−１６−１及び／又はｍｉＲ−１５ａの異所性発現（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）がヒト慢性リンパ球性白血病において見い出されている（Ｃａｌｉｎ，  Ｇ．Ａ．ほか，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９：１５５２４−１５５２９  （２００２））。
【０００７】
全ての公知のヒトマイクロＲＮＡを含んだマイクロアレイの開発及び使用により、試料中の全てのｍｉＲＮＡの発現の一斉分析が可能になった（Ｌｉｕ，  Ｃ．Ｇ．ほか，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：９７４０−９７４４  （２００４））。これらのマイクロＲＮＡマイクロアレイはｍｉＲ−１６−１がヒトＣＬＬ細胞において脱制御されていることを確認するために用いられただけでなく、ヒトＣＬＬの明確な臨床病理学的特徴と関連したｍｉＲＮＡ発現シグナチャーを生成するためにも用いられた（Ｃａｌｉｎ，  Ｇ．Ａ．ほか，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：１１７５−１１７６０  （２００４））。
【０００８】
肺癌細胞において異なる発現様式を示すマイクロＲＮＡの同定は肺癌の診断、予後診断及び治療に役立つ。さらに、これらのｍｉＲＮＡの推定標的の同定はその病原的役割を解明するのに役立つ。本発明は肺癌の診断、予後診断及び治療のための新奇な方法及び組成物を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は一部、肺癌細胞における変化した発現量と関連する特定のｍｉＲＮＡの同定に基づく。
【００１０】
従って、本発明は患者が肺癌を有するか又は肺癌を発症するリスクを有するか診断するための方法を含む。本発明の方法によると、前記患者からの試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量が、コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量と比較される。コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量に対する試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物の量の変化（例えば増加、減少）は、肺癌を有するか又は肺癌を発症するリスクを有する患者の指標である。ある態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ及びｌｅｔ−７ｆ−１からなる群より選択される。特定の態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２６＊及びｍｉＲ−２２４からなる群より選択される。他の態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０５及びｍｉＲ−２１６からなる群より選択される。さらに他の態様においては、前記肺癌は肺腺癌であり、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２０４−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−１４５及びｍｉＲ−２２４からなる群より選択される。
【００１１】
前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量は当業者に周知の様々な手法を用いて測定され得る（例えば定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出）。特定の態様においては、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量は、患者から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、この標的オリゴデオキシヌクレオチドを１又は複数種のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチド（例えばｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ）にハイブリダイズさせ、該試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そして該試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルをコントロール試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより測定される。該試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルの、コントロール試料に対する変化は、肺癌を有するか又は肺癌を発症するリスクを有する患者の指標である。特定の態様においては、前記マイクロアレイは全ての公知のヒトｍｉＲＮＡの実質的な部分に対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。さらなる態様においては、該マイクロアレイは、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ及びｌｅｔ−７ｆ−１からなる群より選択される１又は複数種のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００１２】
本発明は患者からの試験試料内の肺癌の予後不良と関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定することを含む、肺癌患者の予後の判定の方法も提供する。これらの方法によると、予後不良と関連するｍｉＲ遺伝子産物の試験試料中の量の、コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量と比較した際の変化は、予後不良の指標である。ある態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−９３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１４５、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−２１からなる群より選択される。特定の態様においては、前記肺癌は肺腺癌であり、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５５及びｌｅｔ−７ａ−２からなる群より選択される。
【００１３】
前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量はここで記されるように測定され得る（例えば定量又は半定量ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出、マイクロアレイ分析）。試験試料における少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルのコントロール試料に対する変化は、予後不良の肺癌を有するか又は発症するリスクを有する患者の指標である。特定の態様においては、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−２２４及び／又はｍｉＲ−２１のシグナルの変化は、予後不良の肺癌を有するか又は発症するリスクを有する患者の指標である。他の態様においては、肺腺癌の患者からの試料におけるｍｉＲ−１５５及び／又はｌｅｔ−７ａ−２のシグナルの変化は予後不良の指標である。ある態様においては、前記マイクロアレイはｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ及びｌｅｔ−７ｆ−１からなる群より選択される１又は複数種のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００１４】
本発明は患者の癌細胞中で少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が脱制御（例えばダウンレギュレート、アップレギュレート）されている患者の肺癌を治療する方法も含む。少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が前記肺癌細胞中でダウンレギュレートされている場合、前記方法は有効な量の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又はその単離された変異体若しくは生物活性のある断片を投与し、前記患者中の癌細胞の増殖を抑制することを含む。少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が該肺癌細胞中でアップレギュレートされている場合、前記方法はこの少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制するための少なくとも１種の化合物の有効な量を前記患者に投与し、肺癌細胞の増殖を抑制することを含む。
【００１５】
関連する態様においては、患者の肺癌を治療する前記方法はさらに、まず該患者の肺癌細胞内の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定し、このｍｉＲ遺伝子産物の量をコントロール細胞中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量と比較する工程を含む。該ｍｉＲ遺伝子産物の発現が肺癌細胞中で脱制御（例えばダウンレギュレート、アップレギュレート）されている場合、前記方法はさらに該肺癌細胞中で発現しているこの少なくとも１種のｍｉＲＮＡ遺伝子産物の量を変えることを含む。ある態様においては、前記癌細胞中に発現している前記ｍｉＲＮＡ遺伝子産物の量はコントロール細胞中に発現しているｍｉＲ遺伝子産物の量よりも少なく、該ｍｉＲ遺伝子産物の有効な量、又はその単離された変異体若しくは生物活性のある断片が前記患者に投与される。他の態様においては、該癌細胞中に発現する該ｍｉＲ遺伝子産物の量はコントロール細胞中に発現する該ｍｉＲ遺伝子産物の量よりも多く、この少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子の発現を抑制するための少なくとも１種の化合物の有効な量が該患者に投与される。
【００１６】
本発明はさらに肺癌を治療するための医薬組成物を提供する。一態様においては、該医薬組成物は少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又はその単離された変異体若しくは生物活性のある断片と、薬理学的に許容される担体とを含む。特定の態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は、適したコントロール細胞と比較して肺癌細胞内での減少した発現量を有するｍｉＲ遺伝子産物に相当する。ある態様においては、前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｌｅｔ−７ｆ−１及びその組み合わせからなる群より選択される。
【００１７】
他の態様においては、本発明の医薬組成物は少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物を含む。特定の態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物はコントロール細胞よりも肺癌細胞中において発現が多いｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である。ある態様においては、前記ｍｉＲ発現抑制化合物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５０及びその組み合わせからなる群より選択される１又は複数種のｍｉＲＮＡ遺伝子産物に対して特異的である。
【００１８】
本発明は、細胞に対し試験薬剤を供給し、該細胞内における少なくとも１種のｍｉＲＮＡ遺伝子産物の量を測定することを含む、抗肺癌剤の同定法も含む。一態様においては、前記方法は試験薬剤を細胞に供給し、肺癌細胞中の減少した発現量と関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定することを含む。適したコントロール細胞に対する前記細胞中のｍｉＲ遺伝子産物の量の増加は、前記試験薬剤が抗肺癌剤であることの指標である。特定の態様においては、肺癌細胞中の減少した発現量と関連する前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｌｅｔ−７ｆ−１及びその組み合わせからなる群より選択される。
【００１９】
他の態様においては、前記方法は細胞に対し試験薬剤を供給し、肺癌細胞中の増加した発現量と関連する少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定することを含む。適したコントロール細胞に対する、肺癌における前記細胞中の増加した発現量と関連する前記ｍｉＲ遺伝子産物の量の減少は、前記試験薬剤が抗肺癌剤であることの指標である。特定の態様においては、肺癌細胞中の増加した発現量と関連する前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５０及びその組み合わせからなる群より選択される。
【００２０】
発明の詳細な説明
【００２１】
本発明は一部、肺癌細胞において正常なコントロール細胞と比較して変化した発現量を有する特定のマイクロＲＮＡの同定、並びにこれらのマイクロＲＮＡの特定の診断上の、予後診断上の、及び治療上の特性との関連性に基づく。
【００２２】
本明細書では互換的に、「ｍｉＲ遺伝子産物」、「マイクロＲＮＡ」、「ｍｉＲ」、又は「ｍｉＲＮＡ」という語をｍｉＲ遺伝子からのプロセシングされていない又はプロセシングされたＲＮＡ転写産物を表すものとして用いる。ｍｉＲ遺伝子産物はタンパク質に翻訳されないため、「ｍｉＲ遺伝子産物」という語はタンパク質を含まない。プロセシングされていないｍｉＲ遺伝子転写産物は「ｍｉＲ前駆体」とも呼ばれ、典型的には７０−１００ヌクレオチドの長さのＲＮＡ転写産物を含む。このｍｉＲ前駆体はＲＮＡｓｅ（例えば、Ｄｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、ＲＮＡｓｅＩＩＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅＩＩＩ等））による消化でプロセシングされ、活性のある１９−２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子となり得る。この活性のある１９−２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は「プロセシングされた」ｍｉＲ遺伝子転写産物又は「成熟」ｍｉＲＮＡとも呼ばれる。
【００２３】
前記の活性のある１９−２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は天然のプロセシング経路を通じて（例えば無傷細胞又は細胞ライセートを用いて）又は合成プロセシング経路により（例えば単離されたＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、若しくはＲＮＡｓｅＩＩＩ等の単離されたプロセシング酵素を用いて）、ｍｉＲ前駆体から得ることが出来る。活性のある１９−２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は生物学的又は化学的合成により、ｍｉＲ前駆体からプロセシングされる必要なく、直接産生することも出来ると理解される。マイクロＲＮＡがここで名称により表される際、特に断りの無い限りは、その名称は前駆体及び成熟型の両者に相当する。
【００２４】
本発明は、患者からの試験試料における少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量の測定と、該試験試料中のｍｉＲ遺伝子産物の量の、コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量に対する比較とを含んだ、患者が肺癌を有するか又は肺癌を発症するリスクを有するかを診断する方法を含む。ここで、「患者」は肺癌を有する又は有する疑いのあるどのような哺乳類であってもよい。好ましい態様においては、前記患者は肺癌を有する又は有する疑いのあるヒトである。
【００２５】
前記肺癌はどのような形態の肺癌であっても、例えば組織学的に異なった肺癌（腺癌、扁平上皮癌等）であってもよい。さらに、前記肺癌は特定の予後（低生存率、急速な進行等）と関連するものであってもよい。
【００２６】
表１ａ及び表１ｂに特定の前駆体及び成熟ヒトマイクロＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【００２７】
表１ａ−ヒトマイクロＲＮＡ前駆体の配列
【表１】
0005451077.tif 000002
【表２】
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【表３】
0005451077.tif 000004
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
0005451077.tif 000011
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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＊前駆体配列内の下線の配列は成熟型の、プロセシングされたｍｉＲ転写産物に対応する（表１ｂ参照）。いくつかの前駆体配列は同一の前駆体に由来する２種類の異なる成熟ｍｉＲを表す２カ所の下線の配列を有する。全配列はヒトのものである。
【００２８】
表１ｂ−ヒト成熟マイクロＲＮＡの配列
【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【００２９】
少なくとも１種のｍｉＲＮＡ遺伝子産物の量は前記患者から得た生体試料の細胞中で測定することが出来る。例えば、肺癌を有することが疑われる患者から通常の生検法で組織試料を採取することが出来る。他の態様においては、前記患者から血液試料を採取し、標準的な方法により白血球をＤＮＡ抽出のために単離することが出来る。前記血液又は組織試料は好ましくは放射線治療、化学療法又は他の治療方法の前に前記患者から得られる。対応するコントロール組織若しくは血液試料、又はコントロール標準試料は前記患者の非病変組織から、健常なヒト個体若しくは健常個体集団から、又は患者の試料内の大部分の細胞に相当する培養細胞から得ることが出来る。前記患者の試料からの細胞内の任意のｍｉＲ遺伝子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物の量が前記コントロール試料の細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物の量と比較出来るように、前記のコントロール組織又は血液試料はその後、該患者からの試料と同時に処理される。または、標準試料を得て試験試料とは別に（例えば時間をずらして）処理し、該試験試料からの細胞内の任意のｍｉＲ遺伝子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物の量を該標準試料からの対応するｍｉＲ遺伝子産物の量と比較することが出来る。
【００３０】
一態様においては、前記試験試料中の前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量は前記コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量よりも多い（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「アップレギュレート」されている）。ここで、患者からの細胞又は組織試料中のｍｉＲ遺伝子産物の量がコントロール細胞又は組織試料中の同一の遺伝子産物の量よりも多い場合、ｍｉＲ遺伝子産物の発現は「アップレギュレート」されている。他の態様においては、前記試験試料中の前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量は前記コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量よりも少ない（すなわち、ｍｉＲ遺伝子産物の発現が「ダウンレギュレート」されている）。ここで、患者からの細胞又は組織試料中のこの遺伝子から産生されるｍｉＲ遺伝子産物の量がコントロール細胞又は組織試料中の同一の遺伝子から産生された量よりも少ない場合、ｍｉＲ遺伝子の発現は「ダウンレギュレート」されている。コントロール及び通常の試料におけるｍｉＲ遺伝子相対発現量を１又は複数種のＲＮＡ発現量スタンダードに対して測定することが出来る。前記スタンダードには、例えば、ゼロｍｉＲ遺伝子発現量、標準的な細胞株における前記ｍｉＲ遺伝子発現量、前記患者の非病変組織中の前記ｍｉＲ遺伝子発現量、又は健常ヒトコントロールの集団についてこれまでに得られているｍｉＲ遺伝子平均発現量が含まれ得る。
【００３１】
前記患者から得られた前記試料中のｍｉＲ遺伝子産物量の、コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量に対する変化（すなわち増加又は減少）は、その患者における肺癌の存在の指標である。一態様においては、該試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量は該コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量よりも多い。他の態様においては、該試験試料中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量は該コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量よりも少ない。ある態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ及びｌｅｔ−７ｆ−１からなる群より選択される。特定の態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０５及びｍｉＲ−２１６からなる群より選択される。他の態様においては、前記肺癌は肺腺癌であり、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２６＊及びｍｉＲ−２２４からなる群より選択される。
【００３２】
特定の態様においては、前記ｍｉＲ遺伝子産物はｌｅｔ７ａ−２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−７−３、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−９−１、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ−１、ｍｉＲ−３４ａ−２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２３、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１２９−１／２  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３５−１、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−ａｓ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ  １５９−１、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−１  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２２１及び／又はｍｉＲ−２２３のうちの１又は複数種ではない。
【００３３】
試料中のｍｉＲ遺伝子産物の量は生体試料中のＲＮＡ発現量を検出するのに適したどのような手法を用いて測定されてもよい。生体試料（細胞、組織等）中のＲＮＡ発現量を測定するのに適した手法（ノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等）は当業者に周知である。特定の態様においては、少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量はノーザンブロット分析によって検出される。例えば、核酸抽出バッファーの存在下でホモジナイズし、遠心分離することにより全細胞ＲＮＡを細胞から精製することが出来る。核酸を沈殿させ、ＤＮＡをＤＮａｓｅ処理及び沈殿により除去する。その後、前記ＲＮＡ分子を標準的な方法によりアガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーする。このＲＮＡを加熱によって前記フィルター上に固定する。特定のＲＮＡの検出及び定量は、問題のＲＮＡに対して相補的な、適当に標識されたＤＮＡ又はＲＮＡプローブを用いて達成される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ほか編，第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，第７章を参照されたい（この開示全体が参照により組み入れられたものとする）。
【００３４】
任意のｍｉＲＮＡ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションのための適したプローブ（例えばＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ）は表１ａ及び表１ｂに示した核酸配列から作成することが出来、目的とするｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の相補性を有するプローブと、目的とするｍｉＲ遺伝子産物に対し完全な相補性を有するプローブとを含むが、これらに限定されるものではない。標識されたＤＮＡ及びＲＮＡプローブの調製方法、及びその標的ヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションの条件はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ほか編，第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，第１０章及び第１１章に記載されており、この開示は参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【００３５】
例えば、前記核酸プローブは３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ又は３５Ｓ等の放射性核種；重金属；標識されたリガンドの特異的結合ペアメンバー（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐａｉｒ  ｍｅｍｂｅｒ）として機能し得るリガンド（例えばビオチン、アビジン又は抗体）；蛍光分子；化学発光分子；酵素などよって標識することが出来る。
【００３６】
プローブは、Ｒｉｇｂｙほか（１９７７），  Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１３：２３７−２５１のニックトランスレーション法、又はＦｉｅｎｂｅｒｇほか（１９８３），  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３２：６−１３のランダムプライム法のいずれかにより高い比活性に標識することが出来る（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。後者は一本鎖ＤＮＡから又はＲＮＡ鋳型から高比活性の３２Ｐ標識プローブを合成する際に最適な方法である。例えば、既存のヌクレオチドを高い放射性を示すヌクレオチドとニックトランスレーション法で置換することにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを優に超えた比活性を有する３２Ｐ標識核酸プローブを調製することが出来る。そして、ハイブリダイゼーションにかけたフィルターを写真フィルムに曝露することにより、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーによる検出を行うことが出来る。ハイブリダイゼーションにかけた前記フィルターを曝露した写真フィルムのデンシトメーターによるスキャニングによってｍｉＲ遺伝子転写産物の量の正確な測定が提供される。他のアプローチとしては、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州ピスカタウェイから入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ等のコンピューター化されたイメージングシステムによりｍｉＲ遺伝子転写産物の量が定量出来る。
【００３７】
ＤＮＡ又はＲＮＡプローブの放射性核種標識が実際的ではない場合、ランダムプライマー法を用いてアナログ、例えばｄＴＴＰアナログである５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子に組み込むことが出来る。このビオチン化プローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素又は発色反応を引き起こす酵素に結合したアビジン、ストレプトアビジン及び抗体（例えば抗ビオチン抗体）等のビオチン結合タンパク質との反応によって検出することが出来る。
【００３８】
ノーザン及び他のＲＮＡハイブリダイゼーション手法以外に、ＲＮＡ転写産物の量の測定はｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの方法を用いて達成することが出来る。この手法はノーザンブロット法よりも少ない細胞しか必要とせず、細胞全体を顕微鏡のカバーガラス上に設置し、放射性の又は別の方法で標識された核酸（例えばｃＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む溶液で該細胞の核酸内容物を調べることを含む。この手法は特に患者からの組織生検試料を分析するのに適している。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法の実践は米国特許第５，４２７，９１６号により詳細に記載されている（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。任意のｍｉＲ遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションに適したプローブは上記のように、表１ａ及び表１ｂに示す核酸配列から作成することが出来、目的とするｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の相補性を有するプローブと、目的とするｍｉＲ遺伝子産物にに対し完全な相補性を有するプローブとを含むが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
細胞中のｍｉＲ遺伝子転写産物の相対数はｍｉＲ遺伝子転写産物の逆転写を行い、この逆転写された転写産物の増幅をポリメラーゼ連鎖反応によって行う（ＲＴ−ＰＣＲ）ことにより測定することも出来る。ｍｉＲ遺伝子転写産物の量は内部標準、例えば同一試料中に存在する「ハウスキーピング」遺伝子からのｍＲＮＡの量との比較で定量することが出来る。内部標準として使用するための適した「ハウスキーピング」遺伝子には、例えばミオシン又はグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量及び半定量ＲＴ−ＰＣＲを行う方法及びその変法は当業者に周知である。
【００４０】
一部の例においては、試料中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現量を同時に測定することが望ましい場合がある。他の例においては、癌と関連のある全ての公知のｍｉＲ遺伝子の転写産物の発現量を測定することが望ましい場合がある。何百ものｍｉＲ遺伝子又は遺伝子産物の癌特異的発現量を評価するのには多大な時間を必要とし、大量の全ＲＮＡ（例えば各ノーザンブロットに対し少なくとも２０μｇ）と放射性同位体を要するオートラジオグラフィー法とが必要である。
【００４１】
これらの制限を克服するため、ｍｉＲ遺伝子のセットに対して特異的なオリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）プローブのセットを含んだ、マイクロチップ型のオリゴライブラリー（すなわちマイクロアレイ）を構築することが出来る。ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを生成し、それらをハイブリダイズしてマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドについて調べ、ハイブリダイゼーション、又は発現プロファイルを生成することにより、このようなマイクロアレイを用いて生体試料中の複数のマイクロＲＮＡの発現量を測定出来る。そして、試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルをコントロール試料のものと比較し、どのマイクロＲＮＡが肺癌細胞において変化した発現量を有しているか決定することが出来る。ここで、「プローブオリゴヌクレオチド」又は「プローブオリゴデオキシヌクレオチド」は標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることが出来るオリゴヌクレオチドを表す。「標的オリゴヌクレオチド」又は「標的オリゴデオキシヌクレオチド」は（例えばハイブリダイゼーションによる）検出対象となる分子を表す。「ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド」又は「ｍｉＲに対して特異的なプローブオリゴヌクレオチド」とは、特定のｍｉＲ遺伝子産物に、又はその特定のｍｉＲ遺伝子産物の逆転写産物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【００４２】
特定の試料の「発現プロファイル」又は「ハイブリダイゼーションプロファイル」は基本的にその試料の状態のフィンガープリントである；２状態間では任意の特定の遺伝子が同様に発現している場合があるが、多数の遺伝子の同時評価によって細胞の状態に固有の遺伝子発現プロファイルの生成が可能になる。すなわち、正常組織を肺癌組織と区別することが出来、また肺癌組織内において異なった予後状態（例えば、良い又は悪い長期生存見通し）を判定することが出来る。異なった状態の肺癌組織の発現プロファイルを比較することにより、これらの各状態においてどの遺伝子が重要かに関する情報（遺伝子のアップレギュレーション及びダウンレギュレーションの両者を含む）が得られる。肺癌組織又は正常肺組織で異なる発現を示す配列、及び異なる予後（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｏｕｔｃｏｍｅ）をもたらす異なった発現の同定により、様々な形でこの情報の利用が可能になる。例えば、特定の治療計画を評価する（例えば、化学療法薬が特定の患者において長期予後を改善する作用を示すかどうか確認する）ことが出来る。同様に、患者の試料を公知の発現プロファイルと比較することにより診断を行うこと又は確認することが出来る。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（又は個々の遺伝子）によって、肺癌発現プロファイルを抑制したり又は悪い予後のプロファイルをより良好な予後のプロファイルに変えたりする薬剤候補のスクリーニングが可能になる。
【００４３】
従って、本発明は患者から得た試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供することと、該標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んだマイクロアレイとハイブリダイズして該試験試料のためのハイブリダイゼーションプロファイルを提供することと、該試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルをコントロール試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較し、ここで少なくとも１種のｍｉＲＮＡのシグナルの変化が肺癌を有するか又は発症するリスクを有する前記患者の指標であることとを含む、患者が肺癌を有するか又は発症するリスクを有するかを診断する方法を提供する。一態様においては、前記マイクロアレイは全ての公知のヒトｍｉＲＮＡの実質的な部分に対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様においては、前記マイクロアレイは、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ、ｌｅｔ−７ｆ−１及びその組み合わせからなる群より選択される１又は複数種のｍｉＲＮＡに対するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００４４】
前記マイクロアレイは公知のｍｉＲＮＡ配列から生成した遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから作成することが出来る。このアレイは各ｍｉＲＮＡに対し２つの異なったオリゴヌクレオチドプローブを含んでいてもよく、その一方は活性のある成熟型の配列を含み、もう一方は該ｍｉＲＮＡの前駆体に対して特異的である。このアレイはヒトのオルソログと数塩基しか相違しない１又は複数個のマウスの配列等のコントロールを含むことも出来、これをハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの条件のコントロールとすることが出来る。両種からのｔＲＮＡ及び他のＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）も前記マイクロチップ上にプリントしてよく、これが特異的ハイブリダイゼーションのための、内部の比較的安定なポジティブコントロールとなる。非特異的ハイブリダイゼーションのための１又は複数個の適当なコントロールも前記マイクロチップ上に含めてよい。この用途のためには、どのような公知のｍｉＲＮＡとも全く相同性が存在しないことを基準に配列が選択される。
【００４５】
前記マイクロアレイは公知の手法を用いて制作することが出来る。例えば、適当な長さ、例えば４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドをＣ６位で５’−アミン修飾し、市販のマイクロアレイシステム、例えばＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（登録商標）  １００  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（登録商標）活性化スライド（ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｌｉｄｅｓ）を用いてプリントする。標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーを、標識プライマーを用いて該標的ＲＮＡを逆転写することにより調製する。その後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させ、ＲＮＡ鋳型を分解する。次に、このように調製された標識された標的ｃＤＮＡを、例えば６×ＳＳＰＥ／３０％フォルムアミド、２５℃において１８時間というハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイチップとハイブリダイズさせ、０．７５×ＴＮＴ中で３７℃にて４０分間洗浄する。固定されたプローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置でハイブリダイゼーションが起こる。この標識された標的ｃＤＮＡは結合が生じたアレイ上の正確な位置の印となり、自動検出及び定量が可能となる。アウトプットには前記患者試料内の特定のｃＤＮＡ配列の相対存在量、従って対応する相補的ｍｉＲの相対存在量を示す、ハイブリダイゼーション結果のリストが含まれる。一態様によると、前記標識ｃＤＮＡオリゴマーはビオチン標識ｃＤＮＡであり、ビオチン標識プライマーから調製される。前記マイクロアレイはその後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲート等を用いたビオチン含有転写産物の直接的検出によって処理され、通常のスキャニング法を利用してスキャンされる。前記アレイ上の各スポットの画像強度は前記患者試料内の対応するｍｉＲの存在量に比例する。
【００４６】
前記アレイの使用にはｍｉＲＮＡ発現の検出に対していくつかの利点がある。第１に、数百個の遺伝子の全体的な発現を一時点における同一試料中で同定することが出来る。第２に、前記オリゴヌクレオチドプローブの周到な設計により、成熟型及び前駆体分子の両者の発現が識別可能である。第３に、ノーザンブロット分析と比べ、前記チップは少量のＲＮＡしか必要とせず、２．５μｇの全ＲＮＡを用いて再現性のある結果が得られる。ｍｉＲＮＡの数は比較的限られているため（１種あたり数百）、いくつかの種に共通の、それぞれに対して別々のオリゴヌクレオチドプローブを含んだ共通マイクロアレイを構築することが可能である。このようなツールにより、公知の各ｍｉＲの種を超えた発現の分析が様々な条件下において可能である。
【００４７】
特定のｍｉＲの定量的な発現量アッセイのための利用以外にも、ｍｉＲＮオーム（ｍｉＲＮｏｍｅ）の実質的部分、好ましくはｍｉＲＮオーム全体、に相当するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んだマイクロチップを用いて、ｍｉＲ発現パターン分析のためのｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを行うことが出来る。異なるｍｉＲシグナチャーは確立している疾病マーカーと、又は直接病状と関連している場合がある。
【００４８】
ここに記載された発現プロファイリング法によると、癌（例えば肺癌）を有する疑いのある患者の試料からの全ＲＮＡを定量的に逆転写し、該試料中の該ＲＮＡに相補的な標識された標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを得る。この標的オリゴデオキシヌクレオチドを次にｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んだマイクロアレイとハイブリダイズさせ、前記試料のハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。その結果が、該試料中のｍｉＲＮＡの発現パターンを示す該試料のハイブリダイゼーションプロファイルである。このハイブリダイゼーションプロファイルは該試料からの標的オリゴデオキシヌクレオチドの、前記マイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブに対する結合によるシグナルを含む。このプロファイルは結合の有無（シグナル対ゼロシグナル）として記録され得る。より好ましくは、記録された該プロファイルは各ハイブリダイゼーションからのシグナルの強度を含む。このプロファイルは正常な、例えば非癌性の、コントロール試料から生成された前記ハイブリダイゼーションプロファイルと比較される。前記シグナルの変化は前記患者における癌の存在又は癌を発症し易い傾向の指標である。
【００４９】
ｍｉＲ遺伝子の発現量を測定する他の手法も公知であり、ＲＮＡの転写及び分解の速度を測定するための様々な手法を含む。
【００５０】
本発明は患者からの試験試料において肺癌の特定の予後と関連した少なくとも１種のｍｉＲＮＡ遺伝子産物の量を測定することを含んだ、肺癌を有する患者の予後（例えば良好な又は見通しの明るい（ｇｏｏｄ  ｏｒ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）予後、悪い又は不良な（ｐｏｏｒ  ｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ）予後）を判定する方法も提供する。これらの方法によると、試験試料における特定の予後と関連したｍｉＲ遺伝子産物の量の、コントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量に対する変化は、特定の予後を示す肺癌を有する患者の指標である。一態様においては前記ｍｉＲ遺伝子産物は不良な（すなわち悪い）予後と関連している。不良な予後の例としては低生存率及び急激な病状悪化等があるが、これらに限定されるものではない。ある態様においては特定の予後と関連する前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−９３、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−１４５、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−２０及びｍｉＲ−２１からなる群より選択される。特定の態様においては、前記肺癌は肺腺癌であり、特定の予後と関連する前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５５及びｌｅｔ−７ａ−２からなる群より選択される。ある態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量は前記患者から得た試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供することと、該標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含んだマイクロアレイとハイブリダイズして該試験試料のためのハイブリダイゼーションプロファイルを提供することと、該試験試料ハイブリダイゼーションプロファイルをコントロール試料から生成したハイブリダイゼーションプロファイルと比較することとによって測定される。
【００５１】
どのような理論の制約を受けることもなく、細胞内の１又は複数種のｍｉＲ遺伝子産物の量の変化はこれらのｍｉＲが対象とする１又は複数種の標的の脱制御を引き起こす場合があり、これは肺癌の形成をもたらし得る。従って、前記ｍｉＲ遺伝子産物の量を変えることにより（例えば肺癌細胞内でアップレギュレートされているｍｉＲの量を減少させることにより；肺癌細胞内でダウンレギュレートされているｍｉＲの量を増加させることにより）前記肺癌を首尾良く治療することが出来る。
【００５２】
従って、本発明は少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物が患者の細胞（例えば肺癌細胞）内で脱制御されている（例えばダウンレギュレートされている；アップレギュレートされている）患者における肺癌を治療する方法を含む。一態様においては、試験試料（例えば肺癌試料）内の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量はコントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量よりも多い。他の態様においては、試験試料（例えば肺癌試料）内の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量はコントロール試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物の量よりも少ない。前記の少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が前記肺癌細胞内でダウンレギュレートされている場合、本方法は前記の少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物又はその単離された変異体若しくは生物活性のある断片の有効な量を投与し、前記患者において癌細胞の増殖を抑制することを含む。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物が患者の癌細胞内でダウンレギュレートされている場合、該患者に単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効な量を投与することで該癌細胞の増殖を抑制することが出来る。該患者に投与される前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物は該癌細胞においてダウンレギュレートされている内在性の野生型ｍｉＲ遺伝子産物（例えば表１ａ及び表１ｂに示すｍｉＲ遺伝子産物）と同一であるか、又はその変異体若しくは生物活性のある断片であり得る。ここでは、ｍｉＲ遺伝子産物の「変異体」とは、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して１００％未満の同一性を有し、この対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１又は複数種の生物活性を有するｍｉＲＮＡを表すと定義される。このような生物活性の例としては標的ＲＮＡ分子の発現の抑制（例えば標的ＲＮＡ分子の翻訳抑制、標的ＲＮＡ分子の安定性の調節、標的ＲＮＡ分子のプロセシングの抑制）及び肺癌と関連のある細胞プロセス（細胞分化、細胞増殖、細胞死）の抑制等があるが、これらに限定されるものではない。これらの変異体には、種変異体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔ）と、ｍｉＲ遺伝子内の１又は複数個の突然変異（例えば置換、欠失、挿入）の結果である変異体とが含まれる。ある態様においては、前記変異体は対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一である。
【００５３】
ここで、ｍｉＲ遺伝子産物の「生物活性のある断片」とは、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１又は複数種の生物活性を有する、ｍｉＲＮＡ遺伝子産物のＲＮＡ断片を表す。上記の通り、このような生物活性の例としては標的ＲＮＡ分子の発現の抑制及び肺癌と関連のある細胞プロセスの抑制等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ある態様においては前記の生物活性のある断片は少なくとも約５、７、１０、１２、１５、又は１７ヌクレオチド長である。特定の態様においては、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は１又は複数種のさらなる抗癌治療と組み合わせて患者に投与され得る。適した抗癌治療には化学療法、放射線治療及びその組み合わせ（例えば化学放射線療法）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
前記の少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物が前記癌細胞内でアップレギュレートされている場合、本方法はこの少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を抑制する化合物の有効な量を前記患者に投与し、肺癌細胞の増殖を抑制することを含む。このような化合物をここではｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物と呼ぶ。適したｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物としては、本明細書に記載されたもの（例えば二本鎖ＲＮＡ、アンチセンス核酸及び酵素ＲＮＡ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ＲＮＡ）分子）等があるが、これらに限定されるものではない。特定の態様においては、ｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は１又は複数種のさらなる抗癌治療と組み合わせて患者に投与され得る。適した抗癌治療には化学療法、放射線治療及びその組み合わせ（例えば化学放射線療法）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
ある態様においては、肺癌において脱制御されている前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１９２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１２５ａ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２６ａ−１−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１９９ｂ−ｐｒｅｃ、ｌｅｔ−７ａ−２−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ−ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ａ、及びｌｅｔ−７ｆ−１からなる群より選択される。特定の態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２０５及びｍｉＲ−２１６からなる群より選択される。他の態様においては、前記肺癌は肺腺癌であって、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１２６＊及びｍｉＲ−２２４からなる群より選択される。
【００５６】
特定の態様においては、前記のｍｉＲ遺伝子産物はｌｅｔ７ａ−２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−７−３、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−９−１、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ−１、ｍｉＲ−３４ａ−２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２３、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１２９−１／２  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３５−１、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−ａｓ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ  １５９−１、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−１  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２２１及び／又はｍｉＲ−２２３のうちの１又は複数種ではない。
【００５７】
「治療する」「治療すること」及び「治療」という語はここで、疾病又は状態、例えば肺癌、と関連する症状を改善することを表し、該病徴の発症を予防または遅延させること及び／又は該疾病又は状態の症状の重症度又は頻度を減少させることを含む。「患者」及び「個体」という語はここで霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウス、又は他のウシ類、ヒツジ類、ウマ類、イヌ類、ネコ類、齧歯類、若しくはネズミ類の種を含むがこれらに限定されない哺乳類等の動物を含むと定義される。好ましい態様においては前記動物はヒトである。
【００５８】
ここで、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の「有効な量」とは、肺癌を患う患者の癌細胞の増殖を抑制するのに十分な量を表す。当業者は任意の患者に投与されるべきｍｉＲ遺伝子産物の有効な量を該患者のサイズ及び重量；疾病の浸透（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の度合い；該患者の年齢、健康及び性別；投与経路；及び該投与が局所投与か全身投与か；等の要素を考慮することによって容易に決定することが出来る。
【００５９】
例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効な量は治療対象となる腫瘤のおおよその重量に基づき得る。腫瘤のおおよその重量は該腫瘤のおおよその容積を算出することにより決定し得、ここで１立方センチメートルの容積は大まかには１グラムに匹敵する。この腫瘤の重量に基づく前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効な量は腫瘤のグラム当たり約１０−５００マイクログラムの範囲であり得る。ある態様においては、前記腫瘤は腫瘤のグラム当たり少なくとも約１０マイクログラム、腫瘤のグラム当たり少なくとも約６０マイクログラム、又は腫瘤のグラム当たり少なくとも約１００マイクログラムであり得る。
【００６０】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効な量は治療の対象となる患者のおおよその又は推定された体重に基づきうる。好ましくは、このような有効な量はここに記載されるように非経口的に又は経腸的に投与される。例えば、患者に投与される前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効な量は約５−３０００マイクログラム／体重のｋｇの範囲、約７００−１０００マイクログラム／体重のｋｇの範囲、又は約１０００マイクログラム／体重のｋｇよりも多いものであり得る。
【００６１】
当業者は任意の患者への単離されたｍｉＲ遺伝子産物の投与のための適当な投与計画も容易に決定し得る。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は前記患者に単回で（例えば一回の注射又はデポジション（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）として）投与され得る。又は、ｍｉＲ遺伝子産物は約３ないし約２８日、より特別には約７ないし約１０日の期間、患者に毎日１又は２回投与され得る。特定の投与計画においては、ｍｉＲ遺伝子産物は７日間、毎日１回投与される。投与計画が複数回の投与を含む場合、前記患者に投与される前記ｍｉＲ遺伝子産物の有効な量は、投与計画全体にわたって投与される遺伝子産物の総量を含み得ると理解される。
【００６２】
ここで「単離した」ｍｉＲ遺伝子産物とは、合成された、又は人の介在により天然の状態から改変された若しくは取り出されたものを表す。例えば合成ｍｉＲ遺伝子産物、又は天然の状態で同時に存在している物質から部分的に若しくは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は「単離された」ものと考えられる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、実質的に精製された形態で存在することが出来、又はｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞内に存在することが出来る。このように、意図的に細胞内に送達された又は細胞内で発現させられたｍｉＲ遺伝子産物は「単離された」ｍｉＲ遺伝子産物と考えられる。細胞内部でｍｉＲ前駆体分子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物も「単離された」分子であると考えられる。本発明によると、ここに記載された単離されたｍｉＲ遺伝子産物は患者（例えばヒト）の肺癌を治療するための薬剤の製造に使用することが出来る。
【００６３】
単離されたｍｉＲ遺伝子産物は多数の標準的な手法を用いて得ることが出来る。例えば、前記ｍｉＲ遺伝子産物は公知の方法を用いて化学的に合成したり又は組換えによって作成することが出来る。一態様においては、ｍｉＲ遺伝子産物は適当に保護されたリボヌクレオシドホスホアミダイト及び通常のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて化学的に合成される。合成ＲＮＡ分子又は合成試薬の供給業者としては、Ｐｒｏｌｉｇｏ（ハンブルク,ドイツ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（コロラド州ラフィエット，米国）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部，イリノイ州ロックフォード，米国）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング，米国），ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（マサチューセッツ州アシュランド，米国）及びＣｒｕａｃｈｅｍ（グラスゴー，英国）等が挙げられる。
【００６４】
あるいは、前記ｍｉＲ遺伝子産物は任意の適したプロモーターを用いて組換え環状又は直鎖ＤＮＡプラスミドから発現され得る。プラスミドからＲＮＡを発現するための適したプロモーターとしては、Ｕ６若しくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、又はサイトメガロウイルスプロモーター等がある。他の適したプロモーターの選択は公知である。本発明の組換えプラスミドは癌細胞内における前記ｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能な又は調節可能なプロモーターも含む。
【００６５】
組換えプラスミドから発現される前記のｍｉＲ遺伝子産物は標準的な手法により培養細胞発現系から単離され得る。組換えプラスミドから発現される該ｍｉＲ遺伝子産物を前記癌細胞へ送達することや、該細胞内で直接発現させることも出来る。癌細胞への該ｍｉＲ遺伝子産物送達のための組換えプラスミドの使用はより詳細に以下で議論される。
【００６６】
前記ｍｉＲ遺伝子産物は別々の組換えプラスミドから発現させることが出来るか、又は同一の組換えプラスミドから発現させることが出来る。一態様においては、前記ｍｉＲ遺伝子産物は単一のプラスミドからのＲＮＡ前駆体分子として発現され、該前駆体分子は癌細胞内に現存するプロセシング系を含むがそれに限定されない適したプロセシング系によって機能的なｍｉＲ遺伝子産物へとプロセシングされる。他の適したプロセシング系としては、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞溶解物系（例えばＴｕｓｃｈｌほかに対する米国特許出願公開第２００２／００８６３５６号に記載の通り；この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）及びＥ．  ｃｏｌｉ  ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ系（例えばＹａｎｇほかに対する米国特許出願公開第２００４／００１４１１３号に記載の通り；この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）が含まれる。
【００６７】
ｍｉＲ遺伝子産物の発現に適したプラスミドの選択、該遺伝子産物発現のための核酸配列の該プラスミドへの挿入方法、及び該組換えプラスミドの対象細胞への送達方法は公知である。例えば、Ｚｅｎｇほか（２００２）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３；Ｔｕｓｃｈｌ（２００２）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０：４４６−４４８；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐほか（２００２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉほか（２００２）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：４９７−５００；Ｐａｄｄｉｓｏｎほか（２００２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６：９４８−９５８；Ｌｅｅほか（２００２）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：５００−５０５；及びＰａｕｌほか（２００２）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：５０５−５０８（これらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）を参照されたい。
【００６８】
一態様においては、前記ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドはＣＭＶ中間初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）プロモーターの調節下にｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。ここで、プロモーターの「調節下」とは、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする前記核酸配列が該プロモーターの３’側に位置し、該プロモーターがｍｉＲ遺伝子産物をコードする該配列の転写を開始することが出来るということを意味する。
【００６９】
前記ｍｉＲ遺伝子産物は組換えウイルスベクターから発現させることも出来る。該ｍｉＲ遺伝子産物は２つの別々の組換えウイルスベクターから又は同一のウイルスベクターから発現させることが出来ると考えられる。この組換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは標準的な方法により培養細胞発現系から単離することも、又は癌細胞において直接発現させることも出来る。癌細胞への前記ｍｉＲＮＡ遺伝子産物送達のための組換えウイルスベクターの使用はより詳細に以下で議論される。
【００７０】
本発明の組換えウイルスベクターは前記ｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列と該ＲＮＡ配列を発現させるための任意の適したプロモーターとを有する。適したプロモーターとしては、Ｕ６若しくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、又はサイトメガロウイルスプロモーター等があるが、これらに限定されるものではない。他の適したプロモーターの選択は公知である。本発明の組換えウイルスベクターは癌細胞内における前記ｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能な又は調節可能なプロモーターも含む。
【００７１】
ｍｉＲ遺伝子産物のコード配列を受け入れることの出来るどのようなウイルスベクターも使用することが出来る；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えばレンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクター。該ウイルスベクターの親和性は他のウイルスからのエンベロープタンパク質又は他の表面抗原で該ベクターをシュードタイピング（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）することにより、又は異なるウイルスキャプシドタンパク質を置換することにより適切なものに改変することが出来る。
【００７２】
例えば、本発明のレンチウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面タンパク質でシュードタイピングすることが出来る。本発明のＡＡＶベクターは、該ベクターを異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するように操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることが出来る。例えば、血清型２型ゲノム上で血清型２型キャプシドを発現するＡＡＶベクターはＡＡＶ２／２と呼ばれる。このＡＡＶ２／２ベクター中の血清型２型キャプシド遺伝子を血清型５型キャプシド遺伝子に置換してＡＡＶ２／５ベクターを作成することが出来る。異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築する手法は公知である；例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｅ．ほか（２００２），  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：７９１−８０１を参照されたい（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。
【００７３】
本発明における使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ＲＮＡを発現する核酸配列を該ベクターに挿入する方法、該ウイルスベクターを対象となる細胞に送達する方法、及び発現したＲＮＡ産物の回収は公知の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ  （１９９５），  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．  ２：３０１−３１０；  Ｅｇｌｉｔｉｓ  （１９８８），  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４；  Ｍｉｌｌｅｒ  （１９９０），  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐ．  １：５−１４；  及びＡｎｄｅｒｓｏｎ  （１９９８），  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２５−３０を参照されたい（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。
【００７４】
特に適したウイルスベクターはＡＶ及びＡＡＶから得られたものである。前記ｍｉＲ遺伝子産物を発現するのに適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターの構築方法、及び該ベクターを標的細胞へと送達する方法についてはＸｉａほか（２００２），Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２０：１００６−１０１０に記載されている（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。前記ｍｉＲ遺伝子産物を発現するのに適したＡＡＶベクター、組換えＡＡＶベクターの構築方法、及び該ベクターを標的細胞へと送達する方法についてはＳａｍｕｌｓｋｉほか（１９８７），Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒほか（１９９６），Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．,  ７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉほか（１９８９），Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ  ９４／１３７８８号；及び国際特許出願第ＷＯ  ９３／２４６４１号に記載されている（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。一態様においては、前記ｍｉＲ遺伝子産物は前記ＣＭＶ中間初期プロモーターを含む単一の組換えＡＡＶベクターから発現される。
【００７５】
ある態様においては、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの調節下の、ポリＴ終結配列と操作可能に連結されたｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を有する。ここで、「ポリＴ終結配列と操作可能に連結された」とは、センス又はアンチセンス鎖をコードする該核酸配列がポリＴ終結シグナルと５’方向でじかに隣接していることを意味する。前記ベクターからの前記ｍｉＲ配列の転写の際、このポリＴ終結シグナルは転写を終結させる役割を果たす。
【００７６】
本発明の治療方法の他の態様においては、ｍｉＲの発現を抑制する少なくとも１種の化合物の有効な量を前記患者に投与することが出来る。ここで、「ｍｉＲの発現を抑制する」とは、処置後の前駆体及び／又は活性のある成熟型ｍｉＲ遺伝子産物の産生が処置前に産生される量よりも少ないことを意味する。当業者は、例えば本明細書で議論されているｍｉＲ転写産物量を測定するための手法を用いて、ｍｉＲ発現が癌細胞において抑制されているかどうかを容易に決定することが出来る。抑制は遺伝子発現のレベルで（すなわち前記ｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写の抑制により）、又はプロセシングのレベルで（例えば、ｍｉＲ前駆体の成熟した活性のあるｍｉＲへのプロセシングの抑制により）、起こり得る。
【００７７】
ここで、ｍｉＲの発現を抑制する化合物の「有効な量」とは、癌（例えば肺癌）を患う患者の癌細胞の増殖を抑制するのに十分な量である。当業者は任意の患者に投与されるべきｍｉＲ発現抑制化合物の有効な量を該患者のサイズ及び重量；疾病の浸透の度合い；該患者の年齢、健康及び性別；投与経路；及び該投与が局所投与か全身投与か；等の要素を考慮することによって容易に決定することが出来る。
【００７８】
例えば、前記発現抑制化合物の有効な量は本明細書に記載されるように治療対象となる腫瘤のおおよその重量に基づき得る。ｍｉＲの発現を抑制する化合物の有効な量は本明細書に記載されるように治療の対象となる患者のおおよその又は推定された体重にも基づきうる。
【００７９】
本明細書に記載されるように当業者はｍｉＲの発現を抑制する化合物の任意の患者への投与のための適当な投与計画も容易に決定し得る。ｍｉＲ遺伝子の発現を抑制するための適した化合物としては二本鎖ＲＮＡ（短鎖若しくは低分子干渉ＲＮＡ又は「ｓｉＲＮＡ」）、アンチセンス核酸、及びリボザイム等の酵素ＲＮＡ分子等がある。これらの化合物はそれぞれ任意のｍｉＲ遺伝子産物を標的とし、該標的ｍｉＲ遺伝子産物の発現を（例えば翻訳を抑制することにより、切断及び／又は分解を誘導することにより）妨げることが出来る。
【００８０】
例えば、前記ｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相同性を有する単離された二本鎖ＲＮＡ（「ｄｓＲＮＡ」）分子を用いて該ｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することにより、任意のｍｉＲ遺伝子の発現を抑制することが出来る。特定の態様においては前記ｄｓＲＮＡ分子は「短鎖若しくは低分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」である。
【００８１】
本方法において有用なｓｉＲＮＡとしては、約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチド長、好ましくは約１９ヌクレオチドから約２５ヌクレオチド長の短い二本鎖ＲＮＡ等がある。該ｓｉＲＮＡは、共に標準的なワトソン−クリック塩基対相互作用（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）でアニールした（以降、「塩基対形成した」）センスＲＮＡ鎖と相補的アンチセンスＲＮＡ鎖とを含む。該センス鎖は前記標的ｍｉＲ遺伝子産物内部に含まれる核酸配列と実質的に同一の核酸配列を含む。
【００８２】
ここで、前記標的ｍＲＮＡ内部に含まれる標的配列と「実質的に同一」のｓｉＲＮＡ内の核酸配列は、該標的配列と同一であるか、又は該標的配列と１若しくは２ヌクレオチドが相違する核酸配列である。前記ｓｉＲＮＡの前記センス及びアンチセンス鎖は２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含み得るか、又は２つの相補的部位が塩基対形成し、一本鎖の「ヘアピン」領域によって共有結合した単一の分子を含み得る。
【００８３】
前記ｓｉＲＮＡは１又は複数ヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更によって天然に存在するＲＮＡとは相違する改変ＲＮＡであってもよい。このような改変としては、非ヌクレオチド物質の該ｓｉＲＮＡの末端部への若しくは該ｓｉＲＮＡの１又は複数個の内部ヌクレオチドへの付加；又は該ｓｉＲＮＡをヌクレアーゼによる消化に対して抵抗性にする修飾；又は該ｓｉＲＮＡ内の１若しくは複数ヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドとの置換；などがあり得る。
【００８４】
前記ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖は３’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）も有し得る。ここで「３’オーバーハング」とは、二本鎖を形成するＲＮＡ鎖の３’末端から伸びる、少なくとも１個の対になっていないヌクレオチドを表す。従って、ある態様においては、前記ｓｉＲＮＡは１ないし約６ヌクレオチド（これはリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む）長、１ないし約５ヌクレオチド長、１ないし約４ヌクレオチド長、又は約２ないし約４ヌクレオチド長の、少なくとも１つの３’オーバーハングを有する。特定の態様においては、この３’オーバーハングは前記ｓｉＲＮＡの両鎖に存在し、２ヌクレオチド長である。例えば、該ｓｉＲＮＡの各鎖はジチミジル酸（「ＴＴ」）又はジウリジル酸（「ｕｕ」）の３’オーバーハングを有し得る。
【００８５】
前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物について前述したのと同様に、前記ｓｉＲＮＡは化学的に若しくは生物学的に調製するか、又は組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることが出来る。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を調製又は試験するための典型的な方法はＧｅｗｉｒｔｚに対する米国特許出願公開第２００２／０１７３４７８号及びＲｅｉｃｈほかに対する米国特許出願公開第２００４／００１８１７６号に記載されており、この両者の開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【００８６】
任意のｍｉＲ遺伝子の発現はアンチセンス核酸によって抑制することも出来る。ここで、「アンチセンス核酸」とは、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡ又はＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用によって標的ＲＮＡに結合し、該標的ＲＮＡの活性を変える核酸分子を指す。本方法における使用に適したアンチセンス核酸は一般的にｍｉＲ遺伝子産物内の連続した核酸配列に対し相補的な核酸配列を含んでいる一本鎖核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。該アンチセンス核酸はｍｉＲ遺伝子産物内の連続的な核酸配列に対し５０−１００％相補的な、７５−１００％相補的な、又は９５−１００％相補的な核酸配列を含み得る。特定のヒトｍｉＲ遺伝子産物の核酸配列を表１ａ及び表１ｂに示す。どのような理論の制約を受けることもなく、前記アンチセンス核酸はＲＮａｓｅ  Ｈ又はｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸二本鎖を消化する他の細胞性ヌクレアーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ）を活性化すると信じられている。
【００８７】
アンチセンス核酸は、標的特異性、ヌクレアーゼ抵抗性、送達又は該分子の有効性と関連する他の特性を増強するための、核酸骨格に対する又は糖及び塩基部分（若しくはその同等物）に対する修飾も含み得る。このような修飾としてはコレステロール部分、アクリジン等の二本鎖インターカレーター（ｄｕｐｌｅｘ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、又は１若しくは複数種のヌクレアーゼ抵抗基等がある。
【００８８】
前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物について前述したのと同様に、アンチセンス核酸は化学的に若しくは生物学的に調製するか、又は組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることが出来る。調製又は試験するための典型的な方法は公知であり；例えばＳｔｅｉｎ及びＣｈｅｎｇ（１９９３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１００４及びＷｏｏｌｆほかに対する米国特許第５，８４９，９０２号を参照されたい（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。
【００８９】
任意のｍｉＲ遺伝子の発現を酵素的核酸（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）によって抑制することも出来る。ここで「酵素的核酸」とは、ｍｉＲ遺伝子産物の連続した核酸の配列に対して相補性を有する基質結合領域を含み、該ｍｉＲ遺伝子産物を特異的に切断することが出来る核酸を表す。前記酵素的核酸の基質結合領域はｍｉＲ遺伝子産物内の連続した核酸配列に対して例えば５０−１００％相補的、７５−１００％相補的、又は９５−１００％相補的であり得る。前記酵素的核酸は塩基、糖、及び／又はリン酸基における修飾も有し得る。本方法において用いられる典型的な酵素的核酸はリボザイムである。
【００９０】
前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物について前述したのと同様に、前記酵素的核酸は化学的に若しくは生物学的に調製するか、又は組換えプラスミド若しくはウイルスベクターから発現させることが出来る。ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ分子を調製及び試験するための典型的な方法はＷｅｒｎｅｒ及びＵｈｌｅｎｂｅｃｋ（１９９５），Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３：２０９２−９６；Ｈａｍｍａｎｎほか（１９９９），Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．  ９：２５−３１；及びＣｅｃｈほかに対する米国特許第４，９８７，０７１号に記載されており、これらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする。
【００９１】
少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物、又はｍｉＲの発現を抑制する少なくとも１種の化合物の投与は、癌（例えば肺癌）を有する患者の癌細胞の増殖を抑制するはずである。ここで、「癌細胞の増殖を抑制する」こととは、該細胞を殺すこと、又は該細胞の増殖を永続的に若しくは一時的に停止若しくは減速させることを意味する。癌細胞の増殖の抑制は、前記ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物の投与後、前記患者中のこのような細胞の数が一定を維持しているか又は減少する場合に推定されうる。癌細胞増殖の抑制は、このような細胞の絶対数は増加したが腫瘍の成長速度が減少した場合にも推定される。
【００９２】
患者の体内の癌細胞数は直接的な測定、又は原発性の若しくは転移性の腫瘤のサイズからの推定によって決定されうる。例えば、患者における癌細胞の数は免疫組織学的方法、フローサイトメトリー、又は癌細胞の特徴的な表面マーカーを検出するように設計された他の手法によって測定することが出来る。
【００９３】
腫瘤のサイズは直接的な目視観察、又はＸ腺、磁気共鳴映像法、超音波、及びシンチグラフィー等の画像診断法によって確認することが出来る。該腫瘤のサイズの確認に用いられる画像診断法は公知の造影剤を用いて又は用いずに行うことが出来る。腫瘤のサイズは、組織塊の触診、又はキャリパー等の測定器具を用いた該組織塊の測定等の物理的手段により確認することも出来る。
【００９４】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は患者の癌細胞にこれらの化合物を送達するのに適したどのような方法によっても患者に投与することが出来る。例えば、該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ発現抑制化合物は、該患者の細胞にこれらの化合物又はこれらの化合物をコードする配列を含んだ核酸をトランスフェクトするのに適した方法によって投与することが出来る。一態様においては、該細胞は少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含んだプラスミド又はウイルスベクターでトランスフェクトされる。
【００９５】
真核細胞のトランスフェクション法は公知であり、例えば細胞の核又は前核への核酸の直接注入；エレクトロポレーション；リポソームトランスファー（ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）又は脂溶性物質を介したトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）；受容体の媒介による核酸送達、バイオバリスティック（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）又は粒子加速；リン酸カルシウム沈殿、及びウイルスベクターの媒介によるトランスフェクション等がある。
【００９６】
例えば、細胞は、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルフェート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）又はＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ等の同等物などを用いてトランスフェクトすることが出来る。本発明の実践においては用いる核酸の量は重大な意味を持たない；１０５個の細胞当たり０．１−１００マイクログラムの核酸を用いて満足のいく結果が達成され得る。例えば、１０５個の細胞当たりで３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中の約０．５マイクログラムのプラスミドベクターという割合を用いてもよい。
【００９７】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物はどのような適した経腸的又は非経口的投与経路によっても患者に投与することが出来る。本方法のための適した経腸投与経路としては、例えば経口、直腸、又は鼻腔内投与等がある。適した非経口的投与経路としては、例えば血管内投与（静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入及び血管系へのカテーテル注入（ｃａｔｈｅｔｅｒ  ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）等）；組織周囲又は組織内注入（腫瘍周囲及び腫瘍内注入、網膜内注入、又は網膜下注入等）；（浸透圧ポンプによる等の）皮下注入を含む皮下注射又はデポジション（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）；例えばカテーテル又は他の留置装置（網膜ペレット（ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｅｌｌｅｔ）又は座薬又は多孔性の、非多孔性の、若しくはゼラチン状の物質を含んだ埋没物（ｉｍｐｌａｎｔ）等）による、対象組織への直接適用；及び吸入等がある。特に適した投与経路は注射、注入、及び前記腫瘍への直接注射である。
【００９８】
本方法においては、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子産物発現抑制化合物を、送達試薬と組み合わせたむき出しのＲＮＡとして、又は該ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子産物発現抑制化合物を発現する配列を含んだ核酸（組換えプラスミド又はウイルスベクター等）として、前記患者に投与することが出来る。適した送達試薬としては、例えばＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ  脂溶性試薬；ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ；リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）；セルフェクチン（ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）；ポリカチオン類（ポリリジン等）及びリポソーム等がある。
【００９９】
ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物を発現する配列を含む組換えプラスミド又はウイルスベクター、及びこのようなプラスミド及びベクターを癌細胞へ送達する手法は本明細書で議論され、及び／又は周知である。
【０１００】
特定の態様においては、ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はこれらをコードする配列を含んだ核酸）を患者に送達するためにリポソームが用いられる。リポソームは該遺伝子産物又は核酸の血中半減期を伸ばすことも出来る。本発明における使用のための適したリポソームは中性の又は負に帯電したリン脂質及びコレステロール等のステロールを一般的に含む標準的なベシクル形成（ｖｅｓｉｃｌｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ）脂質類から生成し得る。脂質類の選択は一般的に所望のリポソームサイズ及び該リポソームの血流中における半減期等の要素を考慮して導かれる。リポソームの調製のための様々な方法が公知であり、例えばＳｚｏｋａほか（１９８０），Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；及び米国特許第４，２３５，８７１号，第４，５０１，７２８号，第４，８３７，０２８号及び第５，０１９，３６９号に記載されている（これらの開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。
【０１０１】
本方法における使用のためのリポソームは、該リポソームに対し癌細胞を標的とさせるリガンド分子を含んでいても良い。癌細胞において優勢である受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体等が好ましい。
【０１０２】
本方法における使用のためのリポソームは単核マクロファージ系（「ＭＭＳ」）及び細網内皮系（「ＲＥＳ」）による排除を避けるために修飾されていても良い。このような修飾リポソームは表面上の、又はリポソーム構造内に組み込まれたオプソニン化抑制部分を有する。特に好ましい態様においては、本発明のリポソームはオプソニン化抑制部分及びリガンドの両者を有していてもよい。
【０１０３】
本発明のリポソームの調製において使用するためのオプソニン化抑制部分は、典型的には該リポソーム膜に結合した大型の親水性ポリマーである。ここで、オプソニン化抑制部分は、それが例えば該膜自体への脂溶性アンカーのインターカレーションにより、又は膜脂質の活性基への直接の結合により化学的又は物理的にこの膜に付着している場合、リポソーム膜に「結合」している。これらのオプソニン化抑制親水性ポリマーは、例えば米国特許第４，９２０，０１６号（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）に記載のように、前記ＭＭＳ及びＲＥＳによる前記リポソームの取り込みを著しく減少させる保護表面層を形成する。
【０１０４】
リポソームを修飾するのに適したオプソニン化抑制部分は好ましくは約５００ないし約４０，０００ダルトンの、より好ましくは約２，０００ないし約２０，０００ダルトンの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。このようなポリマーとしては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）又はその誘導体；例えば、メトキシＰＥＧ又はＰＰＧ、及びＰＥＧ又はＰＰＧステアレート；ポリアクリルアミド又はポリＮ―ビニルピロリドン等の合成ポリマー類；直鎖、分岐又はデンドリマーのポリアミドアミン類；ポリアクリル酸類；ポリアルコール類、例えばカルボキシル基又はアミノ基が化学的に連結したポリビニルアルコール及びポリキシリトール、並びにガングリオシドＧＭ１等のガングリオシド類等が挙げられる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、若しくはメトキシＰＰＧのコポリマー類又はその誘導体も適している。それに加え、前記オプソニン化抑制ポリマーはＰＥＧと、ポリアミノ酸、ポリ多糖、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、又はポリヌクレオチドのいずれかとのブロックコポリマーであってもよい。前記オプソニン化抑制ポリマー類はアミノ酸を、若しくはガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラギーナン等のカルボン酸を含む天然多糖類；アミノ化した多糖類若しくはオリゴ糖類（直鎖又は分岐）；又はカルボキシル化された多糖類若しくはオリゴ糖類（炭酸の誘導体と反応し、カルボキシル基の連結を生じたもの等）であってもよい。好ましくは、前記オプソニン化抑制部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、又はその誘導体である。ＰＥＧ又はＰＥＧ誘導体で修飾されたリポソームは「ペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）リポソーム」と呼ばれる場合がある。
【０１０５】
前記オプソニン化抑制部分は多数の周知の手法のうちいずれによって前記リポソーム膜に結合されてもよい。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルはホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーに結合し、次いで膜に結合することが出来る。同様に、デキストランポリマーはＮａ（ＣＮ）ＢＨ３及び溶剤混合液（例えば３０：１２の割合のテトラヒドロフラン及び水、６０℃）を用いた還元的アミノ化によってステアリルアミン脂溶性アンカーと誘導体化することが出来る。
【０１０６】
オプソニン化抑制部分で修飾されたリポソームは未修飾のリポソームよりもずっと長く循環中に残る。そのため、このようなリポソームは「ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）」リポソームと呼ばれることがある。ステルスリポソームは多孔性又は「漏出性の（ｌｅａｋｙ）」微少血管系によって送り込まれ、組織内に蓄積することが知られている。従って、このような微少血管系異常を特徴とする組織、例えば固形腫瘍（肺癌等）は、これらのリポソームを効率良く蓄積する；Ｇａｂｉｚｏｎほか（１９８８），Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，１８：６９４９−５３を参照のこと。それに加え、前記ＲＥＳによる取り込みの減少は、肝臓及び膵臓内における前記リポソームの著しい蓄積を妨げることにより、ステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン化抑制部分で修飾されたリポソームは前記ｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はこれらをコードする配列を含んだ核酸）を腫瘍細胞へ送達するのに特に適している。
【０１０７】
前記ｍｉＲ遺伝子産物又はｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は、公知の手法により、患者にそれらが投与される前に「薬剤」と呼ばれる場合のある医薬組成物として製剤されてもよい。従って、本発明は肺がんを治療するための医薬組成物も含む。一態様においては、前記医薬組成物は少なくとも１種の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、又はその単離された変異体若しくは生物活性のある断片と、薬理学的に許容される担体とを含む。特定の態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物は肺癌細胞において適したコントロール細胞と比べて発現量が減少しているｍｉＲ遺伝子産物に相当する。ある態様においては、前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１及びその組み合わせからなる群より選択される。一態様においては、前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１ではない。さらなる態様においては、前記のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１０又はｍｉＲ−２１２ではない。他の態様においては、前記のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５又はｍｉＲ−９ではない。さらに他の態様においては、前記のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２１２又はｍｉＲ−９ではない。
【０１０８】
他の態様においては、本発明の前記医薬組成物は少なくとも１種のｍｉＲ発現抑制化合物を含む。特定の態様においては、前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物は肺癌細胞においてコントロール細胞よりも発現が多いｍｉＲ遺伝子に対して特異的である。ある態様においては、前記ｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５０及びその組み合わせからなる群より選択される１又は複数種のｍｉＲ遺伝子産物に対して特異的である。一態様においては、前記の単離されたｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１５ａ又はｍｉＲ−１６−１に対して特異的ではない。さらなる態様においては、前記のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１０又はｍｉＲ−２１２に対して特異的ではない。他の態様においては、前記のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５又はｍｉＲ−９に対して特異的ではない。さらに他の態様においては、前記のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−２１２又はｍｉＲ−９に対して特異的ではない。本発明の医薬組成物は少なくとも無菌であり、発熱物質を含まないことを特徴とする。ここで、「医薬組成物」とは、ヒト及び獣医学用途のための製剤を含む。本発明の医薬組成物を調製する方法は公知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ペンシルバニア州イーストン（１９８５）に記載されている（この開示全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする）。
【０１０９】
本医薬組成物は、薬理学的に許容される担体と混合された少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又は該ｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含んだ少なくとも１種の核酸）（例えば０．１ないし９０重量％）又はその生理学的に許容される塩を含む。ある態様においては、本発明の前記医薬組成物はさらに１又は複数種の抗癌剤（例えば化学療法剤）を含む。本発明の前記医薬製剤は、リポソームによって封入された少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含んだ少なくとも１種の核酸）、及び薬理学的に許容される担体も含む。一態様においては、前記医薬組成物はｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１４３及び／又はｍｉＲ−１４５ではないｍｉＲ遺伝子又は遺伝子産物を含む。
【０１１０】
特に適した薬理学的に許容される担体は水、緩衝水、生理食塩水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸等である。
【０１１１】
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、ヌクレアーゼ類による分解に対して耐性を示す少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含んだ少なくとも１種の核酸）を含む。当業者は、例えば前記ｍｉＲ遺伝子産物に２’位が修飾された１又は複数個のリボヌクレオチドを組み込むことによってヌクレアーゼ耐性を有する核酸を容易に合成することが出来る。適した２’位修飾リボヌクレオチドとしては、フルオロ、アミノ、アルキル、アルコキシ及びＯ−アリルで２’位が修飾されたもの等が挙げられる。
【０１１２】
本発明の医薬組成物は通常の医薬賦形剤及び／又は添加物も含み得る。適した医薬賦形剤としては、安定化剤、酸化防止剤、オスモル濃度調整剤、緩衝液、及びｐＨ調整剤等がある。適した添加物としては、例えば、生理的に生体適合性の緩衝液（塩酸トロメタミン等）；キレート剤（例えばＤＴＰＡ、又はＤＴＰＡ−ビスアミド等）若しくはカルシウムキレート複合体（例えばカルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミド等）の添加；又は任意に、カルシウム若しくはナトリウム塩類（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム若しくは乳酸カルシウム）の添加等が挙げられる。本発明の医薬組成物は液体の形態で使用するために包装するか、又は凍結乾燥してもよい。
【０１１３】
本発明の固形医薬組成物には通常の非毒性の固形の薬理学的に許容される担体を用いることが出来る；例えば医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム等。
【０１１４】
例えば、経口投与のための固形医薬組成物は上記に列挙した担体及び賦形剤のいずれか、並びに１０−９５％、好ましくは２５−７５％の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はこれらをコードする配列を含んだ少なくとも１種の核酸）を含んでいてもよい。エアロゾル（吸入の）投与のための医薬組成物は、リポソーム内に上記のように封入された０．０１−２０重量％、好ましくは１−１０重量％の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含んだ少なくとも１種の核酸）と、噴霧剤とを含んでいてもよい。担体も所望により含んでいてもよい；鼻腔内投与のためのレシチン等。
【０１１５】
本発明の医薬組成物はさらに１又は複数種の抗癌剤を含んでいてもよい。特定の態様においては、前記組成物は少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物（又はｍｉＲ遺伝子産物若しくはｍｉＲ遺伝子発現抑制化合物をコードする配列を含んだ少なくとも１種の核酸）と、少なくとも１種の化学療法剤とを含む。本発明の方法に適した化学療法剤としてはＤＮＡ−アルキル化剤、抗腫瘍性抗生物質、代謝拮抗剤、チューブリン安定化剤、チューブリン脱安定化（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）剤、ホルモン拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、サイクリン阻害剤、カスパーゼ阻害剤、メタロプロテイナーゼ阻害剤、アンチセンス核酸、三重らせんＤＮＡ、核酸アプタマー、並びに分子修飾されたウイルス、細菌及び外来病原体等があるが、これらに限定されるものではない。本発明の組成物のための適した薬剤としてはシチジンアラビノシド、メトトレキサート、ビンクリスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、デキサメタゾン、アルグラビン（ａｒｇｌａｂｉｎ）、シクロホスファミド、サルコリシン、メチルニトロソウレア、フルオロウラシル、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ビンブラスチン、カンプトセシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、過酸化水素、オキサリプラチン、イリノテカン、トポテカン、ロイコボリン、カルムスチン、ストレプトゾシン、ＣＰＴ−１１、タキソール、タモキシフェン、ダカルバジン、リツキシマブ、ダウノルビシン、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、イマチニブ、フルダラビン、ドセタキセル及びＦＯＬＦＯＸ４等があるが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
本発明は、試験薬剤を細胞に供給し、該細胞中の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定することを含んだ、抗肺癌剤を同定する方法も含む。一態様においては、本方法は試験薬剤を細胞に与え、肺癌細胞における減少した発現量と関連した少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定することを含む。該細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物の量の、適したコントロール（例えばコントロール細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物の量）に対する増加は、この試験薬剤が抗肺癌剤であることの指標である。特定の態様においては、肺癌細胞における減少した発現量と関連した前記の少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２２４、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−２１８−２、ｍｉＲ−９５、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１９８、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−２１９−１、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−２６ａ−１、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｌｅｔ−７ａ−２、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−２２０、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１０１−１、ｍｉＲ−１２４ａ−３、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｌｅｔ−７ｆ−１及びその組み合わせからなる群より選択される。一態様においては前記ｍｉＲ遺伝子産物はｌｅｔ７ａ−２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−７−３、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−９−１、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ−１、ｍｉＲ−３４ａ−２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２３、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１２９−１／２  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３５−１、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−ａｓ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ  １５９−１、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−１  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２２１及び／又はｍｉＲ−２２３のうちの１又は複数種ではない。
【０１１７】
他の態様においては、本発明は、試験薬剤を細胞に供給し、肺癌細胞における増加した発現量と関連した少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の量を測定することを含む。該細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物の量の、適したコントロール（例えばコントロール細胞中の該ｍｉＲ遺伝子産物の量）に対する減少は、この試験薬剤が抗肺癌剤であることの指標である。特定の態様においては、肺癌細胞における増加した発現量と関連した少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物はｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−１５０及びその組み合わせからなる群より選択される。一態様においては前記ｍｉＲ遺伝子産物はｌｅｔ７ａ−２、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−７−２、ｍｉＲ−７−３、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−９−１、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４−１、ｍｉＲ−２４−２、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２９ｂ−２、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ａ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−３４ａ−１、ｍｉＲ−３４ａ−２、ｍｉＲ−９２−２、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−９９ａ、ｍｉＲ−９９ｂ  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２３、ｍｉＲ−１２４ａ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−１、ｍｉＲ−１２５ｂ−２、ｍｉＲ−１２６＊、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１２８ｂ、ｍｉＲ−１２９、ｍｉＲ−１２９−１／２  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３５−１、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−ａｓ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１４８、ｍｉＲ−１４９、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ  １５９−１、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−１８１ｂ−１、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６−１、ｍｉＲ−１９６−１  ｐｒｅｃ、ｍｉＲ−１９６−２、ｍｉＲ−１９９ａ−１、ｍｉＲ−１９９ａ−２、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１１、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２２１及び／又はｍｉＲ−２２３のうちの１又は複数種ではない。
【０１１８】
適した薬剤には、薬物（ｄｒｕｇ）（小分子、ペプチド等）及び生体高分子（タンパク質、核酸等）が含まれるが、これらに限定されるものではない。前記薬剤は組換えにより若しくは合成により製造することが出来、又は天然源から単離（すなわち精製）することが出来る。このような薬剤を細胞に供給（例えばトランスフェクション）するための様々な方法が周知であり、このような方法のいくつかは前述の部分において記載されている。少なくとも１種のｍｉＲ遺伝子産物の発現を検出するための方法（例えばノーザンブロッティング、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、発現プロファイリング）も周知である。これらの方法のいくつかは本明細書にも記載されている。
【０１１９】
以下、本発明を下記の限定されない実施例により例証する。
【実施例１】
【０１２０】
原発性肺癌における変化したｍｉＲＮＡ発現量
材料及び方法
試料
原発性肺癌及び対応する非癌性肺組織の１０４組を本研究に用いた。５年間まで経過観察を行うことが出来たさらなる３２の症例を独立の検証用データセットとして用いた。これらの組織は外科標本として１９９０年から１９９９年までの間にボルティモア大都市圏の患者からインフォームドコンセントを得て倫理調査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）の同意の上で得た。肺癌組織は６５名の肺腺癌患者及び３９名の肺扁平上皮癌患者から得た。このセットには６５才の年齢中央値（３８−８４才の範囲）を有する６５名の男性及び３９名の女性が含まれた。６５例の腫瘍がＩ期、１７例がＩＩ期、及び２２例がＩＩＩ又はＩＶ期の腫瘍と分類された。大部分の試料について臨床的及び生物学的情報を入手可能であった。組織からの全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製品の使用説明書記載の方法により精製した。
【０１２１】
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を先の記載に従って行った（Ｌｉｕ，  Ｃ．Ｇ．ほか，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：９７４０−９７４４  （２００４））。簡単に述べると、５μｇの全ＲＮＡを３５２種のプローブを三重に含むｍｉＲＮＡマイクロアレイチップとハイブリダイズした。具体的には、これらのチップは接触技術によってスポットされ、ポリマー・マトリクスに共有結合した１６１種類のヒトｍｉＲＮＡ、８４種類のマウスｍｉＲＮＡ、別の３種からのｍｉＲＮＡ、及びｔＲＮＡから生成された遺伝子特異的な４０量体オリゴヌクレオチドプローブを含む。前記マイクロアレイを６Ｘ  ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ／６０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ／８ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）／３０％ホルムアミド中で２５℃において１８時間ハイブリダイズし、０．７５Ｘ  ＴＮＴ（Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ／ＮａＣｌ／Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で３７℃において４０分間洗浄し、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７複合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）によるビオチン含有転写産物の直接検出法を用いて処理した。処理したスライドは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ＸＬ５Ｋ  Ｓｃａｎｎｅｒを用い、レーザーを６３５ｎｍにセットし、Ｐｏｗｅｒ  ８０及びＰＭＴ  ７０のセッティングで、１０μｍのスキャン解像度によりスキャンした。各ｍｉＲＮＡに対する３つの反復スポットの平均値を正規化し、ＢＲＢ−ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ  バージョン３．２．３において分析した。バックグラウンド以下のハイブリダイゼーション強度の負の値を除外した後、チップ当たり中央値正規化法（ｐｅｒ  ｃｈｉｐ  ｏｎ  ｍｅｄｉａｎ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）及びリファレンスとして中央値アレイ（ｍｅｄｉａｎ  ａｒｒａｙ）への正規化を用いて正規化を行った。最終的に、５０％超の前記試料中に存在する一致する対数値の１４７種のｍｉＲＮＡを選択した。群間で異なって発現していた遺伝子をｔ及びＦ検定を用いて同定し、遺伝子はそのｐ値が０．００１未満であった場合に統計的に有意であると考えた。群間で発現プロファイルが異なったかというグローバルテスト（ｇｌｏｂａｌ  ｔｅｓｔ）も、どのアレイがどの群に対応するかのラベルの順序を変えて行った。各並べ替えにおいて前記ｐ値を再計算し、０．００１水準で有意な遺伝子の数に注目した。少なくとも実際のデータと同数の有意な遺伝子を示した並べ替えの割合が前記グローバルテストの有意水準であった。
【０１２２】
溶液ハイブリダイゼーション検出分析及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
成熟ｍｉＲＮＡの発現量をｍｉｒＶａｎａ（登録商標）  ｍｉＲＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社、テキサス州）を用いて溶液ハイブリダイゼーション検出により測定した。簡単に述べると、１μｇの全ＲＮＡをこれらのｍｉＲＮＡに対応する放射標識プローブとインキュベートした。消化によって標的ｍｉＲＮＡに結合しなかったいずれのプローブも除いた後、前記の放射標識された産物を変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分画した。プローブはＴ４  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）  Ｐｒｏｂｅ  ＆  Ｍａｒｋｅｒ  Ｋｉｔ  （Ａｍｂｉｏｎ社、テキサス）を用い、製品の使用説明書記載の方法に従って５’末端標識により調製した。定量リアルタイムＰＣＲを記載（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎほか，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２：ｅ４３  （２００４））に従ってＡｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍのＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍにおいて行い、全反応を３回繰り返して行った。簡単に述べると、遺伝子特異的プライマー及びＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔを用いてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、式：２―ｄＣＴ（ここで、ｄＣＴ＝（ＣＴｍｉＲＮＡ―ＣＴＵ６））を用いて開始メチオニンのｔＲＮＡに対する各ｍｉＲＮＡの相対量を決定する。
【０１２３】
生存分析
発現が前記患者の生存と有意に関連している遺伝子を同定した。各遺伝子の統計的有意水準をＢＲＢ−ＡｒａｙＴｏｏｌｓ  バージョン３．２．３における一変量コックス比例ハザード回帰モデルに基づき算出した。これらのｐ値を次に、生存期間及び打ち切りインジケータ（ｃｅｎｓｏｒｉｎｇ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）の順序を任意にアレイ間で変えた多変量並べ替え検定において用いた。遺伝子はそのｐ値が０．０５未満であった場合に統計的に有意であると考えた。
【０１２４】
生存曲線をカプラン・マイヤー法（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ノースカロライナ州カリー）によって推定し、得られた曲線をログランク検定により比較した。共変量（ｃｏ−ｖａｒｉａｂｌｅｓ）のジョイントエフェクト（ｊｏｉｎｔ  ｅｆｆｅｃｔ）をコックス比例ハザード回帰モデルを用いて試験した。統計分析はＳｔａｔＭａｔｅ（ＡＴＭＳ社、東京、日本）を用いて行った。
【０１２５】
結果
１０４組の原発性肺癌及び対応する非癌性肺組織におけるｍｉＲＮＡの発現を分析し、肺癌におけるｍｉＲＮＡの関与を観察した。いくつかの具体的な群のペアに関するｍｉＲＮＡ発現量の比較を表２に列挙する。５つの表現型的及び組織学的分類において異なった発現を示すｍｉＲＮＡ（表２）が同定された。
【０１２６】
肺癌組織及び対応する非癌性肺組織におけるｍｉＲＮＡ発現量の比較において、４３種のｍｉＲＮＡが群間で発現量の統計的有意差を示したと同定された（表３）。発明者らのマイクロアレイ分析ツールを用いたクラス比較（ｃｌａｓｓ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）分析において前記多変量並べ替え検定を多重比較のコントロールのために行った。この検定は過誤発見（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）数が目標水準（ｔａｒｇｅｔ  ｌｅｖｅｌ）を超過しないことを保証する、又は過誤発見を示す遺伝子リストの割合が目標水準を超過しないことを保証する具体的信頼水準を提供する。このように、０．００１未満の水準で偶然統計的に有意な少なくとも４３種の異なる発現量を示すｍｉＲＮＡを得る確率は、前記クラス間に実際の差異が無かった場合、前記多変量並べ替え検定によって０と見積もられた。さらに、１０４例の肺癌の９１％が複合共変量予測子（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｃｏｖａｒｉａｔｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）に基づくリーブワンアウト交差検定クラス予測（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ  ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｃｌａｓｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）法を用いて正確に分類された。２０００回の無作為並べ替えによると、実際のデータの交差検定誤り率（ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｅｄ  ｅｒｒｏｒ  ｒａｔｅ）以下の交差検定誤り率を示す無作為並べ替えの割合として定義される前記ｐ値は０．０００５未満であった。
【０１２７】
これらのｍｉＲＮＡのうちいくつかはＦＲＡと関連していた（表３）。特に、３種のｍｉＲＮＡは染色体不安定部内に位置している（ＦＲＡ１７Ｂにおけるｈｓａ−ｍｉｒ−２１、ＦＲＡ９Ｄにおけるｈｓａ−ｍｉｒ−２７ｂ、及びＦＲＡ９Ｅにおけるｈｓａ−ｍｉｒ−３２）。さらに、これらの同定されたｍｉＲＮＡの多くがいくつかの悪性腫瘍において頻繁に欠失又は増幅している領域に位置している（表３）。例えば、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１及びｈｓａ−ｍｉｒ−２０５は肺癌において増幅している領域に位置している一方、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６＊及びｈｓａ−ｍｉｒ−１２６は肺癌において欠失している領域である９ｑ３４．３に位置している。前駆体ｌｅｔ−７ａ−２及びｌｅｔ−７ｆ−１の減少した発現も０．０５のｐ値カットオフで腺癌及び扁平上皮癌において見いだされた。同様に、肺腺癌と非癌性組織との、及び扁平上皮癌と非癌性組織との比較分析によって、それぞれ１７種及び１６種のｍｉＲＮＡにおいて統計的に差異のある発現量が見いだされた（表４）。６種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉｒ−２１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１０、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６＊、及びｈｓａ−ｍｉｒ−２２４）は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の両者の組織学的な型において共有されていた。
【０１２８】
表２  臨床病理学的分類の比較分析
【表３４】
0005451077.tif 000035
ａ遺伝子数、０．００１で有意な遺伝子の数。
ｂＦＤＲ、偶然に有意となる遺伝子の確率である過誤発見率。
ｃ正確に分類された％（ｐ値）。複合共変量予測子に基づくリーブワンアウト交差検定クラス予測法。前記ｐ値は実際のデータの交差検定誤り率以下の交差検定誤り率を示す無作為並べ替えの割合である。
ｄＡｄｅｎｏ、腺癌
ｅＳＣＣ、扁平上皮癌。
表３  肺癌組織と非癌性肺組織との間で異なる発現量を示した４３種のｍｉＲＮＡ。
【表３５】
0005451077.tif 000036
ａ情報は先の報告（Ｃａｌｉｎ，  Ｇ．  Ａ．ほか，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：  ２９９９−３００４  （２００４））から得た。
ｂ情報は先の報告（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ａ．ほか，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １４：  １９０２−１９１０  （２００４））から得た。
ｃＡｍｐ、増幅；ｄＤｅｌ、欠失；ｅＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌；ｆＨＣＣ、肝細胞癌；ｇｍｌｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ様非コードＲＮＡ；ｈＮＤ、定義されず；ｉＭＦＨｓ、悪性線維性組織球腫。
【０１２９】
選択された前駆体ｍｉＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、前記マイクロアレイ分析からの結果を確認した。まず、１６組の肺腺癌及び１６組の肺扁平上皮癌からのｃＤＮＡをｈｓａ−ｍｉｒ−２１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６＊、ｈｓａ−ｍｉｒ−２０５及びＵ６（コントロールとして）に対する遺伝子特異的プライマーを用いて調製した。次に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、前記のさまざまな試料におけるこれらのｍｉＲＮＡの発現量を測定した。ｈｓａ−ｍｉｒ−２１及びｈｓａ−ｍｉｒ−２０５前駆体ｍｉＲＮＡの発現における少なくとも２倍のアップレギュレーション（非癌性組織におけるこれらのｍｉＲＮＡの発現量と比較した場合）が、それぞれ３２例のうちの６６％及び５６％において見いだされた（図１）。これらの差異は対応のあるｔ検定においてｐ＜０．００１で統計的に有意であった。一方、統計的に有意ではなかったものの試験した３２例の肺癌のうち３１％が前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６＊の発現量において５０％超の減少を示した（図１）。これらの発見は、特定の前駆体ｍｉＲＮＡが肺癌において頻繁にアップレギュレートされているか又は減少していることを示しており、マイクロアレイ分析を用いて決定したそれらの成熟ｍｉＲＮＡの発現様式と一致している。
【０１３０】
表４  腺癌組織／肺扁平上皮癌組織と非癌性肺組織との間で異なった発現を示すｍｉＲＮＡ
【表３６】
0005451077.tif 000037
【０１３１】
さらに、前記の３種の前駆体ｍｉＲＮＡ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６＊、及びｈｓａ−ｍｉｒ−２０５に対する前記マイクロアレイデータが、溶液ハイブリダイゼーション検出法により、それらの成熟ｍｉＲＮＡにおいて確認された。具体的には、十分量のＲＮＡが入手可能であった７組の原発性肺癌組織及び対応する非癌性肺組織を分析した。ｈｓａ−ｍｉｒ−２１及びｈｓａ−ｍｉｒ−２０５の成熟型は前記の対応する非癌性肺組織と比較して明らかに肺癌組織内においてアップレギュレートされていた（図２）が、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６＊は試験したほとんどの肺癌組織においてダウンレギュレートされていた。従って、前記ＲＴ−ＰＣＲの結果のように、これらの分析によってこの３種のｍｉＲＮＡに対する前記マイクロアレイ発現データが確認された。
【実施例２】
【０１３２】
ヒト肺癌細胞株における異なったｍｉＲＮＡ発現シグナチャー
材料及び方法
試料
５種の小細胞肺癌（ＳＣＬＣｓ）細胞株及び８種の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣｓ）細胞株からなる１３種の肺癌細胞株を本研究に用いた。前記の５種ＳＣＬＣ細胞株はＤＭＳ  ９２、ＮＣＩ−Ｈ８２、ＮＣＩ−Ｈ１４６、ＮＣＩ−Ｈ４４６及びＮＣＩ−Ｈ４１７（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）であった。前記の８種のＮＳＣＬＣ細胞株はＮＣＩ−Ｈ１５７、Ｃａｌｕ−１、Ｃａｌｕ−６、ＮＣＩ−Ｈ２９２、ＮＣＩ−Ｈ５９６、Ａ−４２７、Ａ５４９及びＡ２１８２（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、バージニア州マナッサス）であった。組織及び培養細胞からの全ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）により、製品の使用説明書記載の方法に従って精製した。
【０１３３】
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を先の記載に従って行った（Ｌｉｕ，  Ｃ．Ｇ．ほか，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：９７４０−９７４４  （２００４）、実施例１も参照のこと）。
【０１３４】
統計分析
統計分析を前述の部分において記載されたように行った（例えば実施例１を参照のこと）。
【０１３５】
結果
５種の小細胞肺癌（ＳＣＬＣｓ）細胞株及び８種の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣｓ）細胞株のｍｉＲＮＡ発現プロファイルをマイクロアレイ分析により生成した。ＮＳＣＬＣｓ及びＳＣＬＣｓのｍｉＲＮＡ発現プロファイルの比較により、３種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉｒ−２４−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２９ａ、及びｈｓａ−ｍｉｒ−２９ｃ）の発現量において統計的有意差（ｐ＜０．００１、ｔ検定による）が見いだされた。さらに、階層的クラスタ分析を１８種の最も異なる発現を示した各試料型のｍｉＲＮＡに適用した際に異なったクラスターが見いだされ、全ＮＳＣＬＣ細胞株がＳＣＬＣ細胞株のものとは異なるクラスターに分類された（図３Ａ、図３Ｂ）。これらの結果は、先の研究（例えばＬｉｕ，  Ｃ．Ｇ．ほか，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：９７４０−９７４４  （２００４）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ，  Ａ．ほか，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８：１３７９０−１３７９５  （２００１）；  Ｇａｒｂｅｒ，  Ｍ．Ｅ．ほか，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８：  １３７８４−１３７８９  （２００１）を参照のこと）において見いだされているように、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルが、異なった起源及び／又は種類の細胞で異なりうることを示している。
【実施例３】
【０１３６】
肺癌の臨床病理学的特徴と関連したｍｉＲＮＡの同定
材料及び方法
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を先の記載に従って行った（Ｌｉｕ，  Ｃ．Ｇ．ほか，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：９７４０−９７４４  （２００４）、実施例１も参照のこと）。
【０１３７】
統計分析
統計分析を前述の部分において記載されたように行った（例えば実施例１を参照のこと）。
【０１３８】
結果
前記マイクロアレイデータが臨床的挙動の異なる肺癌のサブセットに対して特異的な分子シグナチャーを見いだしたかに関して分析を行った。この分析のために、５種類の臨床的及び病理学的情報の関連性を試験した（表２）。組織学的分類においては、ＮＳＣＬＣの２種類の最も一般的な組織学的型である腺癌及び扁平上皮癌において異なった発現を示す６種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉｒ−２０５、ｈｓａ−ｍｉｒ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２０３、ｈｓａ−ｍｉｒ−２０２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０２及びｈｓａ−ｍｉｒ−２０４−ｐｒｅｃ）が同定された。ｈｓａ−ｍｉｒ−９９ｂ及びｈｓａ−ｍｉｒ−１０２の発現量は、腺癌において、より高かった。年齢、性別又は人種によって区別した群では異なった発現を示すｍｉＲＮＡは同定されなかった。
【実施例４】
【０１３９】
ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現量と肺腺癌を有する患者の予後との相関
材料及び方法
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を先の記載に従って行った（Ｌｉｕ，  Ｃ．Ｇ．ほか，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：９７４０−９７４４  （２００４）、実施例１も参照のこと）。
【０１４０】
統計分析
統計分析を前述の部分において記載されたように行った（例えば実施例１を参照のこと）。
【０１４１】
遺伝子オントロジー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ）分析
ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの予測される標的（ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ）をＬｅｗｉｓほか（Ｌｅｗｉｓ，  Ｂ．Ｐ．ほか，  Ｃｅｌｌ  １２０：  １５−２０  （２００５））及びＰｉｃＴａｒ（Ｋｒｅｋ，  Ａ．ほか，  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  ３７：  ４９５−５００  （２００５））の方法により決定し、特定の遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的グルーピング内のオーバーリプリゼンテーション（ｏｖｅｒ−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）について分析した。ＧＯターム（ＧＯ  ｔｅｒｍ）リストをＷｈｏｌｅ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｓｃｏｐｅ（ＷＰＳ）アプリケーションを用いた分析にかけ、０．００５未満のフィッシャーの正確確率スコア（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｅｘａｃｔ  ｓｃｏｒｅ）を示したこれらのタームをリストアップした。
【０１４２】
結果
ｍｉＲＮＡ発現量の、患者の生存率との相関を評価した。ＢＲＢ−ＡｒａｙＴｏｏｌｓにおけるグローバル並べ替え検定（ｇｌｏｂａｌ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）を用いた一変量コックス比例ハザード回帰モデルにおいて、８種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５、ｈｓａ−ｍｉｒ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４５、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ及びｈｓａ−ｍｉｒ−２１）が腺癌患者の生存率と相関していた。ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５、ｈｓａ−ｍｉｒ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１０６ａ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３、又はｈｓａ−ｍｉｒ−２１のいずれかの高発現及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｂ又はｈｓａ−ｍｉｒ−１４５のいずれかの低発現が有意に悪い予後を示すことが見いだされた。また、４１名のＩ期腺癌患者の生存分析において３種のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５、ｈｓａ−ｍｉｒ−１７−３ｐ、及びｈｓａ−ｍｉｒ−２０）が患者予後と関連していることが明らかになった。これらの結果は、病期に関わりなく、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルと患者の生存率との間に重大な関連性があることを示している。
【０１４３】
これらのｍｉＲＮＡのうちの５種（ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５、ｈｓａ−ｍｉｒ−１７−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４５、及びｈｓａ−ｍｉｒ−２１）が肺癌組織と対応する非癌性肺組織との間で異なった発現を示していたことから、これらのｍｉＲＮＡをさらなる生存分析に用いた。これら５種のｍｉＲＮＡそれぞれについて、肺癌における発現量の、対応する非癌性肺組織における発現量に対する比を算出し、前記患者をその発現量比に従って分類した。これらのグルーピングを各ｍｉＲＮＡについて用い、カプラン・マイヤー生存分析を行った。カプラン・マイヤー生存率推定においては、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の高発現又はｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の低発現のいずれかを示す肺腺癌患者は、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の低発現又はｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の高発現を示す患者よりも悪い生存の見通しを有することが示された（図４及び図５）。これら２群の予後の差異はｈｓａ−ｍｉｒ−１５５において高度に有意であった（ｐ＝０．００６；ログランク検定）が、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２においてはそれほど有意ではなかった（ｐ＝０．０３３；ログランク検定）。臨床病理学的要因に関する生存分析においては、病期は有意に生存率と相関していたが（ｐ＝０．０１；ログランク検定）、年齢、人種、性別、及び喫煙歴は悪い予後の原因ではなかったことが示された（表５Ａ及び５Ｂ）。多重比較の補正のため、過誤発見率を０．０５に制限してＳｔｏｒｅｙほか（Ｓｔｏｒｅｙ，  Ｊ．Ｄ．及びＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ，  Ｒ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １００：  ９４４０−９４４５  （２００３））の方法を用いた。この率を用いてもまだｈｓａ−ｍｉｒ−１５５と病期とは統計的に有意であった。次に、これら全ての臨床病理学的及び分子的要因を用いて多変量コックス比例ハザード回帰分析を行った。病期（ｐ＝０．０１３；リスク比３．２７；９５％  ＣＩ、１．３１−８．３７；表５Ａ）に加え、ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の高発現は他の臨床病理学的要因とは独立に好ましくない予後因子であることが決定された（ｐ＝０．０２７；リスク比３．０３；９５％  ＣＩ、１．１３−８．１４）。
【０１４４】
表５Ａ  分子的及び臨床病理学的特徴並びにマイクロアレイ分析によって分析されたｍｉＲＮＡ発現量との関連における、肺腺癌を有する患者の術後生存率。
【表３７】
0005451077.tif 000038
ａ９５％  ＣＩ、９５％信頼区間。
ｂ多変量解析、コックス比例ハザード回帰モデル。
ｃｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２  低／高は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０８９）。
【０１４５】
表５Ｂ  臨床病理学的特徴及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって解析された前駆体ｍｉＲＮＡ発現量との関連における、肺腺癌を有する患者の術後生存率。
【表３８】
0005451077.tif 000039
ａ９５％  ＣＩ、９５％信頼区間。
ｂ多変量解析、コックス比例ハザード回帰モデル。
【０１４６】
変化したｈｓａ−ｍｉｒ−１５５及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２発現量の生物学的影響を調べるため、生命情報科学的分析を行い、遺伝子オントロジー（ＧＯ）タームに従ってこれらのｍｉＲＮＡの予測された標的を分類した（表６）。より一般的な機能のＧＯタームとの相関に加え、転写と関連した標的の有意なエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）がｈｓａ−ｍｉｒ−１５５に見られた。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａはプロテインキナーゼ及び細胞内シグナル伝達系と関連した遺伝子標的のオーバーリプリゼンテーションを示し、この発見は報告されているｌｅｔ−７とＲＡＳとの間の機能的相互作用（Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｓ．Ｍ．ほか，Ｃｅｌｌ  １２０：６３５−６４７  （２００５））と矛盾しない。
【０１４７】
表６  ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ａの予測された転写産物標的の遺伝子オントロジー分析（生物学的過程）
【表３９】
0005451077.tif 000040
【０１４８】
ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５及びｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２に対してリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、前記前駆体ｍｉＲＮＡの発現も腺癌患者の予後に対する影響を有するか決定した。まず、ＲＮＡが入手可能であったもとのセットからの３２組の腺癌をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析にかけた。肺癌における発現量の、対応する非癌性肺組織における発現量に対する比を算出し、前記患者をこの発現量比に応じて分類した。カプラン・マイヤー生存分析（図６、図７）において、前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の高発現（ｐ＝０．０４７；ログランク検定）又は前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の低発現（ｐ＝０．０３７；ログランク検定）のいずれの患者においても有意に低い生存率が示された（表５Ｂ）。さらにここで記載されている予後分類を確認するために、３２個の腺癌のさらなる独立したセットをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて分析した。カプラン・マイヤー生存曲線（図８、図９）は、前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の発現量における明確な相関（ｐ＝０．０３３；ログランク検定）と、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現量における有意傾向（ａｐｐｒｏａｃｈｉｎｇ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）（ｐ＝０．０８４；ログランク検定）とをこのコホートにおいても示した（表５Ｂ）。また、前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の高度発現は、多変量コックス比例ハザード回帰分析により、悪い予後の独立した予測材料であることが見いだされた（表５Ｂ）。前記のもとのセット（３２例）及び前記の追加セット（３２例）において何らかのグルーピングバイアス（ｇｒｏｕｐｉｎｇ  ｂｉａｓ）が存在したかを確認するため、一変量及び多変量生存分析を全６４例において行った。先の結果と一致して、これらの分析は前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５発現量の有意性を示した（表５Ｂ；図１０）。注目すべきことに、前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の低発現も腺癌患者の予後に対する同様の影響を有しており（表５Ｂ；図１１）、先の報告（Ｔａｋａｍｉｚａｗａ，  Ｊ．ほか，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４，  ３７５３−３７５６  （２００４））と一致していた。
【０１４９】
実施例５
ＮＳＣＬＣ細胞株におけるｍｉＲＮＡ発現のエピジェネティックな調節の欠如
材料及び方法
マイクロアレイ分析
マイクロアレイ分析を先の記載に従って行った（Ｌｉｕ，  Ｃ．Ｇ．ほか，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０１：９７４０−９７４４  （２００４）、実施例１も参照のこと）。
【０１５０】
統計分析
統計分析を前述の部分において記載されたように行った（例えば実施例１を参照のこと）。
【０１５１】
５−アザ−ｄＣ及び／又はＴＳＡ処理
Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ１５７肺癌細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより入手可能）を１．０μＭ  ５−アザ−ｄＣ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を含んだ培地で４８時間インキュベートし、１．０μＭ  ＴＳＡ（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）の存在下でさらに２４時間インキュベートした。全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で単離し、マイクロアレイ分析を上記の通り行った。各処理は３回繰り返して行った。
【０１５２】
結果
ｍｉＲＮＡマイクロアレイを用い、２種の肺癌細胞株（Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ１５７）において、ＤＮＡメチル化阻害剤である５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）及び／又は強力なヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）による処理の際の様々なｍｉＲＮＡの発現量を分析した。転写をしていないことが知られる遺伝子（ＭＹＯ１８Ｂ）の増加した発現量が５−アザ−ｄＣ又はＴＳＡによる処理後に確認された（図１２）が、前記マイクロアレイからのｍｉＲＮＡはどれも、どちらの化合物で処理した後にも発現量に統計的に有意な変化が見られず、少なくともこれらの２種の細胞株において過剰メチル化及びヒストン脱アセチル化はｍｉＲＮＡ発現量の減少の原因ではないことが示唆された。
【０１５３】
本明細書に引用され、明確に参照により組み入れられていない全ての出版物の関連する教示は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする。本発明は特にその好ましい態様に対する参照により示され記載されたが、添付の請求の範囲によって含まれる発明の範囲から逸脱することなく形態及び詳細における様々な変更をそこに加えることが出来ると当業者によって理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
本特許又は出願ファイルは、カラーで生成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許又は特許出願公開のコピーは、要請及び必要な料金の支払いに応じて、特許庁より提供される。
【図１】図１にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析で測定されたヒトｍｉＲ−２１前駆体（ｈｓａ−ｍｉｒ−２１；上部パネル）、ヒトｍｉＲ−１２６＊前駆体（ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６＊；中央パネル）及びヒトｍｉＲ−２０５前駆体（ｈｓａ−ｍｉｒ−２０５；下部パネル）の肺癌（Ｃａ）及び非癌性（Ｎ）組織における相対発現量を表すグラフを示す。癌試料は腺癌又は扁平上皮癌（ＳＣＣ）のいずれかであった。肺癌組織と非癌性肺組織との間における発現量の統計的有意性を確かめるために対応のあるｔ検定を行った。
【図２】図２に肺癌試料（すなわち腺癌（Ａｄｅｎｏ）及び扁平上皮癌（ＳＣＣ））における溶液ハイブリダイゼーションで検出されたｍｉＲ−２１（ｈｓａ−ｍｉｒ−２１）、ｍｉＲ−１２６＊（ｈｓａ−ｍｉｒ−１２６＊）及びｍｉＲ−２０５（ｈｓａ−ｍｉｒ−２０５）の成熟ｍｉＲＮＡの発現を示す。Ｃａは肺癌組織を表し、Ｎは非癌性肺組織を表す。５ＳｒＲＮＡをローディングコントロール（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ）とした。
【図３】図３Ａに小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を代表する１３の肺癌細胞株のマイクロＲＮＡ発現プロファイルに基づく階層的クラスタ分析を表すデンドログラムを示す。  図３Ｂに図３Ａに列挙されたものに対応する１３の肺癌細胞株のｍｉＲＮＡ発現クラスター図（上部）を示す。図の右側に列挙した種々のｍｉＲＮＡの発現量を色分けして示す。青色は中央値よりも少ない発現量を表し、黒色は中央値におよそ等しい発現量を表し、橙色は中央値よりも多い発現量を表す。灰色は欠落したデータポイント（ｄａｔａ  ｐｏｉｎｔ）を表す。
【図４】図４は腺癌患者のカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存曲線である。ハイブリダイゼーション強度がバックグラウンドと異なる腺癌患者（実施例４参照）をｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の発現量によって分類し、生存データをログランク検定により比較した。平均発現量比は、平均発現量比＝腫瘍での発現量の平均／非癌性組織での発現量の平均と定義される。前記ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５高発現量群（すなわち、平均発現量比（１．４２）以上の発現量比を示す群；ｎ＝２７）を対応する非癌性肺組織と比較した。ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５低発現量群（すなわち、平均発現量比（１．４２）未満の発現量比を示す群；ｎ＝２８）を対応する非癌性肺組織と比較した。これらの比は肺癌試料における非癌性コントロールに対するハイブリダイゼーションシグナルの強度を表す。
【図５】図５は腺癌患者のカプラン・マイヤー生存曲線である。ハイブリダイゼーション強度がバックグラウンドと異なる腺癌患者（実施例４参照）をｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現量によって分類し、生存データをログランク検定により比較した。平均発現量比は、平均発現量比＝腫瘍での発現量の平均／非癌性組織での発現量の平均と定義される。前記ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２高発現量群（すなわち、平均発現量比（０．９５）以上の発現量比を示す群；ｎ＝３４）を対応する非癌性肺組織と比較した。ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２低発現量群（すなわち、平均発現量比（０．９５）未満の発現量比を示す群；ｎ＝１８）を対応する非癌性肺組織と比較した。
【図６】図６は腺癌患者のカプラン・マイヤー生存曲線である。もとのコホートからの３２名の腺癌患者を前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の発現量によって分類し、生存データをログランク検定により比較した。平均発現量比は、平均発現量比＝腫瘍での発現量の平均／非癌性組織での発現量の平均と定義される。前記前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５高発現量群（すなわち、平均発現量比（１．１９）以上の発現量比を示す群；ｎ＝１３）を対応する非癌性肺組織と比較した。前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５低発現量群（すなわち、平均発現量比（１．１９）未満の発現量比を示す群；ｎ＝１９）を対応する非癌性肺組織と比較した。
【図７】図７は腺癌患者のカプラン・マイヤー生存曲線である。もとのコホートからの３２名の腺癌患者を前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現量によって分類し、生存データをログランク検定により比較した。平均発現量比は、平均発現量比＝腫瘍での発現量の平均／非癌性組織での発現量の平均と定義される。前記前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２高発現量群（すなわち、平均発現量比（０．９２）以上の発現量比を示す群；ｎ＝１８）を対応する非癌性肺組織と比較した。前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２低発現量群（すなわち、平均発現量比（０．９２）未満の発現量比を示す群；ｎ＝１４）を対応する非癌性肺組織と比較した。
【図８】図８は腺癌患者のカプラン・マイヤー生存曲線である。独立したさらなるコホートからの３２名の腺癌患者を前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現量によって分類し、生存データをログランク検定により比較した。前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５高発現量群（ｎ＝１４）；前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５低発現量群（ｎ＝１８）。
【図９】図９は腺癌患者のカプラン・マイヤー生存曲線である。独立したさらなるコホートからの３２名の腺癌患者を前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現量によって分類し、生存データをログランク検定により比較した。前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２高発現量群（ｎ＝１５）；前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２低発現量群（ｎ＝１７）。
【図１０】図１０は腺癌患者のカプラン・マイヤー生存曲線である。２つの独立したコホートの組み合わせからの６４名の腺癌患者を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって推定した前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５の発現量によって分類した。生存データをログランク検定により比較した。平均発現量比は、平均発現量比＝腫瘍での発現量の平均／非癌性組織での発現量の平均と定義される。前記前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５高発現量群（すなわち、平均発現量比（１．１９）以上の発現量比を示す群；ｎ＝２７）を対応する非癌性肺組織と比較した。前駆体ｈｓａ−ｍｉｒ−１５５低発現量群（すなわち、平均発現量比（１．１９）未満の発現量比を示す群；ｎ＝３７）を対応する非癌性肺組織と比較した。
【図１１】図１１は腺癌患者のカプラン・マイヤー生存曲線である。２つの独立したコホートの組み合わせからの６４名の腺癌患者を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって推定した前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２の発現量によって分類した。生存データをログランク検定により比較した。平均発現量比は、平均発現量比＝腫瘍での発現量の平均／非癌性組織での発現量の平均と定義される。前記前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２高発現量群（すなわち、平均発現量比（０．９２）以上の発現量比を示す群；ｎ＝３３）を対応する非癌性肺組織と比較した。前駆体ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２低発現量群（すなわち、平均発現量比（０．９２）未満の発現量比を示す群；ｎ＝３１）を対応する非癌性肺組織と比較した。
【図１２】図１２にＲＴ−ＰＣＲ分析によって測定した２つの肺癌細胞株（Ｈ１５７、Ａ５４９）における５−アザ−ｄＣ及び／又はＴＳＡ処理後のＭＹＯ１８Ｂ  ｍＲＮＡの発現量を示す。レーン１、非処理；レーン２、１．０μＭ  ５−アザ−ｄＣによる７２時間処理；レーン３、１．０μＭ  ＴＳＡによる２４時間処理；レーン４、１．０μＭ  ５−アザ−ｄＣによる７２時間処理後、１．０μＭ  ＴＳＡによる２４時間処理。ＧＡＰＤＨの発現量をローディングコントロールとした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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