(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
グルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されており、さらに１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
塩基性アミノ酸がリジンである、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
グルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列が配列番号１で表されるアミノ酸配列である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から６４番目のグルタミン酸が塩基性アミノ酸に置換されており、さらに１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
塩基性アミノ酸がリジンである、請求項６または７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項１０】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡの塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域が塩基性アミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
塩基性アミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、請求項１０に記載のＤＮＡ。
【請求項１２】
コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である、請求項１０または１１に記載のＤＮＡ。
【請求項１３】
配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列が塩基性アミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１４】
グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、請求項１３に記載のＤＮＡ。
【請求項１５】
配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域が塩基性アミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡであって、該ＤＮＡを野生型のコリネ型細菌に導入して得られる形質転換体のＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１６】
塩基性アミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、請求項１５に記載のＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１７記載の組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物。
【請求項１９】
染色体ＤＮＡ上に請求項９〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡを含有する微生物。
【請求項２０】
コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡのアミノ酸配列において、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産する能力を有し、かつリゾチーム感受性を示すことを特徴とする、請求項１８または１９に記載の微生物。
【請求項２１】
ＬｔｓＡのアミノ酸配列が配列番号１０で表されるアミノ酸配列である、請求項２０に記載の微生物。
【請求項２２】
ポリペプチドが配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から８０番目のアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項２１に記載の微生物。
【請求項２３】
微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である、請求項１８〜２２のいずれか1項に記載の微生物。
【請求項２４】
コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２５】
請求項１８〜２４のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−グルタミンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミンを採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−グルタミンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発酵法によるＬ−グルタミンの製造方法としてはアザセリン耐性を付与したコリネ型細菌を用いる方法（特許文献１参照）、６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン耐性を付与したコリネ型細菌を用いる方法（特許文献２参照）などが知られている。またグルタミンシンテターゼ活性を増強してＬ−グルタミンを製造する方法としては、アデニリル化による制御を行なうグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性が低下したコリネ型細菌(非特許文献１、特許文献３参照)、アデニリル化を受けるグルタミンシンテターゼの４０５番目のアミノ酸が置換したコリネ型細菌およびＰIIタンパク質の活性が低下したコリネ型細菌(非特許文献２、特許文献３参照)を用いる方法が知られている。【０００３】
コリネ型細菌にはグルタミンシンテターゼをコードするglnAの他にグルタミンシンテターゼと相同性を示すグルタミンシンテターゼ２をコードするglnA2がゲノム上に存在することが明らかになっている。コリネ型細菌のglnA2にコードされるポリペプチドはバシラス・サチリスのアデニリル化による制御を受けないグルタミンシンテターゼに高い相同性を示すが、コリネ型細菌はアデニリル化による制御をうけるグルタミンシンテターゼをコードするglnAを欠失させるとグルタミン要求性を示すことが報告されている(非特許文献１参照)。コリネ型細菌においてはglnA2のコードするポリペプチドはグルタミンシンテターゼ活性を持たず、これまでにglnA2の改変によりＬ−グルタミンを生産した例はない。【０００４】
またコリネバクテリウム・グルタミカムにおいてltsAにコードされるリゾチーム感受性に関わるポリペプチドの活性低下によりグルタミン酸を生産することが報告されている（非特許文献３、非特許文献４、特許文献４参照）。
【特許文献１】特開昭55-148094号
【特許文献２】特開平3-232497号
【特許文献３】特開2002-300887号
【特許文献４】国際公開第00/14241号パンフレット
【非特許文献１】FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001)
【非特許文献２】FEMS Microbiology Letters, 173, 303 (1999)
【非特許文献３】BMC Biotechnol., 1, 9 (2001)
【非特許文献４】Journal of Bacteriology, 182, 2696 (2000)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、改変されたグルタミンシンテターゼ２、改変されたグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該ＤＮＡを染色体上に有する微生物、および該形質転換体または該微生物を用いるＬ−グルタミンの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有し、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするポリペプチド。
（２）グルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されており、さらに１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する、上記（１）に記載のポリペプチド。
（３）塩基性アミノ酸がリジンである、上記（１）または２）に記載のポリペプチド。
（４）コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である、上記（１）〜（３）のいずれか１つに記載のポリペプチド。
（５）グルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列が配列番号１で表されるアミノ酸配列である、上記（１）に記載のポリペプチド。
（６）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸が塩基性アミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、上記（５）に記載のポリペプチド。
（７）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から６４番目のグルタミン酸が塩基性アミノ酸に置換されており、さらに１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する、上記（５）に記載のポリペプチド。
（８）塩基性アミノ酸がリジンである、上記（６）または（７）に記載のポリペプチド。
（９）上記（１）〜（８）のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（１０）コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡの塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域が塩基性アミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、上記（９）に記載のＤＮＡ。
（１１）塩基性アミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、上記（１０）に記載のＤＮＡ。
（１２）コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である、上記（１０）または（１１）に記載のＤＮＡ。
（１３）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列が塩基性アミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、上記（９）に記載のＤＮＡ。
（１４）グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、上記（１３）に記載のＤＮＡ。
（１５）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域が塩基性アミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡであって、該ＤＮＡを野生型のコリネ型細菌に導入して得られる形質転換体のＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするＤＮＡ。
（１６）塩基性アミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、上記（１５）に記載のＤＮＡ。
（１７）上記（９）〜（１６）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ。
（１８）上記（１７）記載の組換え体ＤＮＡで形質転換された微生物。
（１９）染色体ＤＮＡ上に上記（９）〜（１６）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含有する微生物。
（２０）コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡのアミノ酸配列において、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産する能力を有し、かつリゾチーム感受性を示すことを特徴とする、上記（１８）または（１９）に記載の微生物。
（２１）ＬｔｓＡのアミノ酸配列が配列番号１０で表されるアミノ酸配列である、上記（２０）に記載の微生物。
（２２）ポリペプチドが配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から８０番目のアミノ酸がアスパラギン酸であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記（２１）に記載の微生物。
（２３）微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である、上記（１８）〜（２２）のいずれか１つに記載の微生物。
（２４）コリネバクテリウム属に属する微生物がコリネバクテリウム・グルタミカムである、上記（２３）に記載の微生物。
（２５）上記（１８）〜（２４）のいずれか１つに記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−グルタミンを生成蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミンを採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミンの製造法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、改変されたグルタミンシンテターゼ２および改変されたグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡが得られ、該ＤＮＡを有する微生物によりＬ−グルタミンを生産することができる。また、該微生物のＬｔｓＡをコードする遺伝子に変異を導入することにより、さらに効率のよいＬ−グルタミンの製造が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本願発明について詳細に説明する。
（１）本発明のポリペプチド
本発明のポリペプチドは、
（i）コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするポリペプチド、
（ii）グルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、上記（i）に記載のポリペプチド、
（iii）グルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されており、さらに１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する、上記（i）に記載のポリペプチド、
（iv）グルタミン酸以外のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、上記（ii）または（iii）に記載のポリペプチド、
（v）グルタミン酸以外のアミノ酸がリジンである、上記（ii）または（iii）に記載のポリペプチド、
（vi）コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である、上記（i）〜（v）のいずれか１つに記載のポリペプチド、
（vii）グルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列が配列番号１で表されるアミノ酸配列である、上記（i）に記載のポリペプチド、
（viii）配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有する、上記（vii）に記載のポリペプチド、
（ix）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から６４番目のグルタミン酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されており、さらに１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有する、上記（vii）に記載のポリペプチド、
（x）グルタミン酸以外のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、上記（viii）または（ix）に記載のポリペプチド、および
（xi）グルタミン酸以外のアミノ酸がリジンである、上記（viii）または（ix）に記載のポリペプチド、
などをあげることができる。【０００９】
本発明でいうコリネ型細菌に属する微生物とは、Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8, 599 (1974)に定義される、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、またはミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物等をいう。
具体的には、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium herculis、Corynebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、Corynebacterium thermoaminogenes、Corynebacterium efficiens、Corynebacterium diphtheriae、Brevibacterium saccharolyticum、Brevibacterium immariophilum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium thiogenitalis、Microbacterium ammoniaphilum等をあげることができる。【００１０】
より具体的には、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806、Corynebacterium callunaeATCC15991、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13060、Corynebacterium glutamicum ATCC13826（旧属種Brevibacterium flavum、あるいはCorynebacterium lactofermentum）、Corynebacterium glutamicum ATCC14020（旧属種Brevibacterium divaricatum）、Corynebacterium glutamicum ATCC13869（旧属種Brevibacterium lactofermentum）、Corynebacterium herculis ATCC13868、Corynebacterium lilium ATCC15990、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenesATCC9244、Corynebacterium efficiens YS-314、Corynebacterium diphtheriaeNCTC13129、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium roseum ATCC13825、Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240、Microbacterium ammoniaphilumATCC15354等をあげることができる。【００１１】
上記コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２としては、上記コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２であれば、いずれのグルタミンシンテターゼ２でもよく、例えばEP 1108790に記載されており、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株由来グルタミンシンテターゼ２、GenBankアクセッションナンバーNP_738737に記載されているアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム・エフィッシエンスYS-314株由来グルタミンシンテターゼ２、GenBankアクセッションナンバーNP_940011に記載されているアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム・ジフテリアNCTC13129株由来グルタミンシンテターゼ２等をあげることができる。【００１２】
上記（i）の本発明のポリペプチドにおいて、欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、後述の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００１３】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
上記（i）の本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性を有していることが好ましく、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有していることが望ましい。【００１４】
アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST〔Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)〕やFASTA〔Methods Enzymol., 183, 63 (1990)〕を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている〔J. Mol. Biol., 215, 403(1990)〕。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.）。【００１５】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させる際、宿主として用いる野生型のコリネ型細菌とは、自然集団中で、その微生物が属する種において、最も高頻度に見られる型の微生物のことをいい、例えば、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Corynebacterium acetoglutamicumATCC15806、Corynebacterium callunae ATCC15991、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13060、Corynebacterium glutamicum ATCC13826（旧属種Brevibacterium flavum、あるいはCorynebacterium lactofermentum）、Corynebacterium glutamicum ATCC14020（旧属種Brevibacterium divaricatum）、Corynebacterium glutamicum ATCC13869（旧属種Brevibacterium lactofermentum）、Corynebacterium herculis ATCC13868、Corynebacterium lilium ATCC15990、Corynebacterium melassecola ATCC17965、Corynebacterium thermoaminogenes ATCC9244、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium roseum ATCC13825、Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354等をあげることができる。【００１６】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させる方法としては、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを野生型のコリネ型細菌に導入し、該ＤＮＡと野生型のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の野生型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換し、該ポリペプチドを発現させる方法や、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用いて野生型のコリネ型細菌を形質転換し、該ポリペプチドを発現させる方法等をあげることができる。【００１７】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いとは、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを野生型のコリネ型細菌に導入し、該ＤＮＡと野生型のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の野生型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換し、該ポリペプチドを発現させた形質転換体や、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用いて野生型のコリネ型細菌を形質転換し、該ポリペプチドを発現させた形質転換体のＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを測定することにより確認することができる。【００１８】
具体的には、該ポリペプチドをコードするＤＮＡをコリネバクテリウム・グルタミカムの野生株であるCorynebacterium glutamicumATCC13032に導入し、該ＤＮＡとCorynebacterium glutamicum ATCC13032の染色体ＤＮＡ上の野生型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換し、該ポリペプチドを発現させた形質転換体、または該ポリペプチドをコードするＤＮＡと、pCS299P（国際公開第00/63388号パンフレット）等のベクターからなる組換え体ＤＮＡを用いてCorynebacterium glutamicum ATCC13032を形質転換した形質転換体を造成する。該形質転換体およびCorynebacterium glutamicumATCC13032をＢＹＧ寒天培地〔グルコース10g、肉エキス7g、ペプトン10g、塩化ナトリウム3g、酵母エキス（ディフコ社製）5g、バクトアガー（ディフコ社製）18gを水1Lに含みpH7.2に調整した培地〕を用い30℃で24時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地〔グルコース50g、ブイヨン20g、硫酸アンモニウム5g、尿素5g、リン酸二水素カリウム2g、硫酸マグネシウム７水和物0.5g、硫酸鉄７水和物1mg、硫酸銅５水和物0.4mg、硫酸亜鉛７水和物0.9mg、塩化マンガン４水和物0.07mg、４ホウ酸２ナトリウム１０水和物0.01mg、７モリブデン酸６アンモニウム４水和物0.04mg、チアミン塩酸塩0.5mg、ビオチン0.1mgを水1Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地〕6mlを含む試験管に植菌し、30℃で12時間〜16時間培養する。得られた種培養液を、それぞれ本培養培地〔グルコース50g、尿素2g、硫酸アンモニウム20g、リン酸二水素カリウム0.5g、リン酸水素二カリウム0.5g、硫酸マグネシウム７水和物0.5g、硫酸鉄７水和物2mg、硫酸マンガン５水和物2.5mg、チアミン塩酸塩0.5mg、ビオチン0.1mgまたは0.001mgを水1Lに含みpH7.0に調整後、炭酸カルシウムを20g加えた培地〕30mlを含むバッフルつき300ml三角フラスコに10%植菌し、30℃、220rpm条件下で、糖を完全に消費しきらないように１６〜１８時間培養する。得られた培養物から遠心分離により菌体を除去し、上清中のＬ−グルタミンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量する。形質転換体を培養して得られる上清中のＬ−グルタミンの蓄積量が、Corynebacterium glutamicum ATCC13032を培養して得られる上清中のＬ−グルタミンの蓄積量より多いことを測定することにより確認することができる。【００１９】
上記(ii) 〜(vi)の本発明のポリペプチドについては、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸とは、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２が有するアミノ酸配列と配列番号1で表されるアミノ酸配列との相同性を上記したBLASTおよびFASTAなどの相同性解析プログラムおよびパラメーターを用いて計算し、２つのアミノ酸配列を整列させたとき該コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２が有するアミノ酸配列上で、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸をいう。【００２０】
グルタミン酸以外のアミノ酸としては、グルタミン酸以外のアミノ酸であればいずれのアミノ酸であってもよいが、好ましくはアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンから選ばれるアミノ酸であり、より好ましくは塩基性アミノ酸、さらに好ましくはリジン、ヒスチジン、およびアルギニンから選ばれるアミノ酸であり、最も好ましくはリジンをあげることができる。【００２１】
グルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。【００２２】
上記（iii）〜（vi）の本発明のポリペプチドは、上記（i）または（ii）の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに対して、後述する部位特異的変異導入法を用いて塩基を欠失、置換または付加することにより取得することができるＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドである。導入する部位特異的変異は、上記（i）または（ii）の本発明のポリペプチドに対して、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸以外のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されるのであれば、どのような変異でもよい。【００２３】
欠失、置換または付加されるアミノ酸は、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸以外のアミノ酸であれば特に限定されない。
また、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸以外任意の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない点、および置換可能なアミノ酸については、上記と同様である。【００２４】
上記（iii）〜（vi）のポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性を有していることが好ましく、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有していることが望ましい。
上記（vii）の本発明のポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするポリペプチドである。【００２５】
欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
また、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない点、および置換可能なアミノ酸については、上記と同様である。【００２６】
上記（vii）の本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性を有していることが好ましく、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有していることが望ましい。
上記（viii）〜（xi）の本発明のポリペプチドは、配列番号1で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸をコードするコドンを、後述する部位特異的変異導入法を用いてグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに置換したＤＮＡを用いて取得することができる。グルタミン酸以外のアミノ酸としては、上記のアミノ酸をあげることができる。【００２７】
上記（ix）〜（xi）のポリペプチドは、上記（vii）または（viii）の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに対して、後述する部位特異的変異導入法を用いて塩基を欠失、置換または付加することにより取得することができるＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドである。導入する部位特異的変異は、上記（vii）または（viii）の本発明のポリペプチドに対して、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸以外のアミノ酸配列において、1以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されるのであれば、どのような変異でもよい。【００２８】
欠失、置換または付加されるアミノ酸は、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸以外のアミノ酸であれば特に限定されない。
また、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸以外任意の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換または付加があることを意味し、欠失、置換または付加が同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない点、および置換可能なアミノ酸については、上記と同様である。【００２９】
上記（ix）〜（xi）のポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性を有していることが好ましく、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有していることが望ましい。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、
（i）上記本発明のポリペプチドのいずれか１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ii）コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡの塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、上記（i）に記載のＤＮＡ、
（iii）グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコドンである、上記（ii）に記載のＤＮＡ、
（iv）グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、上記（ii）に記載のＤＮＡ、
（v）コリネ型細菌に属する微生物がコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属またはマイコバクテリウム属に属する微生物である、上記（ii）〜（iv）のいずれか１つに記載のＤＮＡ、
（vi）配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有する、上記（i）に記載のＤＮＡ、
（vii）グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコドンである、上記（vi）に記載のＤＮＡ、
（viii）グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、上記（vi）に記載のＤＮＡ、
（ix）配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡであって、該ＤＮＡを野生型のコリネ型細菌に導入して得られる形質転換体のＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするＤＮＡ、
（x）グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンが塩基性アミノ酸をコードするコドンである、上記（ix）に記載のＤＮＡ、
（xi）グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンがリジンをコードするコドンである、上記（ix）に記載のＤＮＡ、および
（xii）上記（i）〜（xi）のいずれか１つに記載のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ、
などをあげることができる。【００３０】
上記（i）の本発明のＤＮＡは、上記（１）の本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡであり、例えば、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであり、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするポリペプチドをコードするＤＮＡをあげることができる。【００３１】
上記（ii）〜（v）の本発明のＤＮＡにおいて、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとしては、上記（１）に記載されているコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡをあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとしては、上記（１）に記載されているコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡであれば、いずれのＤＮＡでもよいが、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとしては、例えばEP 1108790に記載されている配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ、GenBankアクセッションナンバーBA000035に記載されているコリネバクテリウム・エフィッシエンスYS-314株由来の染色体ＤＮＡにおいて2258903〜2260453番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ、GenBankアクセッションナンバーBX248358に記載されているコリネバクテリウム・ジフテリアNCTC13129株由来の染色体ＤＮＡにおいて320981〜322321番目の塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。【００３２】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡの塩基配列において、配列番号２で表される塩基配列の第１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域とは、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡが有する塩基配列と配列番号２で表される塩基配列との相同性を、上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等の相同性解析プログラムおよびパラメーターを用いて計算し、２つの塩基配列を整列させたとき該コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡが有する塩基配列上で配列番号２記載の塩基配列の第１９０〜１９２番目に対応する領域をいう。【００３３】
配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域において、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンとしては、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよく、好ましくはアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンから選ばれるアミノ酸であり、より好ましくは塩基性アミノ酸、さらに好ましくはリジン、ヒスチジン、およびアルギニンから選ばれるアミノ酸であり、特に好ましくはリジンをコードするコドンあげることができる。【００３４】
上記（ii）〜（v）のＤＮＡがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことは、上記と同様な方法、すなわち該ＤＮＡを野生型のコリネ型細菌に導入し、該ＤＮＡと野生型のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の野生型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換し、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させた形質転換体、または該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用いて野生型のコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させた形質転換体を取得し、該形質転換体と宿主細胞である野生型のコリネ型細菌とを培地に培養したときの培養上清中のＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを測定することにより確認することができる。【００３５】
上記（vi）〜（viii）の本発明のＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡにおいて、後述する部位特異的変異導入法を用いることにより、配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列をグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンに置換したＤＮＡである。該コドンとしては、上記のグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンあげることができる。【００３６】
上記（vi）〜（viii）のＤＮＡがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことは、該ＤＮＡを野生型のコリネ型細菌に導入し、該ＤＮＡと野生型のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の野生型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換し、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させた形質転換体、または該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用いて野生型のコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させた形質転換体を取得し、該形質転換体と宿主細胞である野生型のコリネ型細菌とを培地に培養したときの培養上清中のＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを測定することにより確認することができる。具体的には上記の通りである。【００３７】
上記（ix）〜（xi）のＤＮＡにおいて、配列番号２で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとは、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖の一部または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０mol/lの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行
った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０mmol/l塩化ナトリウム、１５mmol/lクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、Molecular cloning, a laboratory manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＤＮＡ Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも７０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００３８】
上述のハイブリダイズ可能なＤＮＡにおいて、配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡにおいて、該コドンとしては、上記のグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンをあげることができる。
該ＤＮＡがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。【００３９】
本発明のＤＮＡとしては、例えば、配列番号２で表される塩基配列において、該塩基配列の５’末端から１９０番目のグアニンがアデニンに置換したＤＮＡ等をあげることができる。該ＤＮＡは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸がグルタミン酸からリジンに置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードずるＤＮＡである。【００４０】
上記（xii）の本発明の組換え体ＤＮＡは、上記（i）〜（xi）の本発明のＤＮＡとベクターからなる組換え体ＤＮＡである。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ等をあげることができ、（i）〜（xi）の本発明のＤＮＡと連結できるものであればいずれのベクターでも構わない。プラスミドとしては、pUC19（タカラバイオ社製）、pHSG299（タカラバイオ社製）、pBR322（タカラバイオ社製）、pCG1（特開昭57-134500号）、pCG2（特開昭58-35197号）、pCG4（特開昭57-183799号）、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）等をあげることができる。コスミドとしては、pAxCAwtit（ニッポンジーン社製）等をあげることができ、バクテリオファージとしては、M13mp18RF（ニッポンジーン社製）等をあげることができる。
（３）本発明のＤＮＡの調製
（i）コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡの取得
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡを取得する方法としては、コリネ型細菌に属する微生物から斎藤らの方法[Biochim. Biophys.Acta, 72, 619 (1963)]に従い調製することのできる染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列に基づき設計、合成することのできるプライマーＤＮＡを用いてPCR等により取得することができる。【００４１】
染色体ＤＮＡの全塩基配列が明らかとなっているコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡを取得する方法としては、上記のように染色体ＤＮＡを鋳型として、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと70％以上の相同性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計、合成することのできるプライマーＤＮＡを用いてPCR等により取得することができる。【００４２】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032株から染色体ＤＮＡを調製し、該ＤＮＡを鋳型として、配列番号２で表される塩基配列の５’末端および３’末端領域の配列を有するＤＮＡを化学合成し、該ＤＮＡをプライマーセットとして用いたPCRによりグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡを取得することができる。上記方法により取得できるＤＮＡとしては、配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ等をあげることができる。【００４３】
また、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの一部、または全部をプローブとしたハイブリダイゼーション法によって、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡを取得することができる。
さらに、コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡは、配列番号２で表される塩基配列に基づき、公知の方法で該塩基配列を有するＤＮＡを化学合成することにより取得することができる。
（ii）本発明のＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡは、上記（i）で得られるコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡを用いて、常法により取得することができる。【００４４】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)、等に記載の部位特異的変異導入法を用いて部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００４５】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産するコリネ型細菌は、上記方法により取得することができる該ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、野生型グルタミンシンテターゼ２を生産するコリネ型細菌を形質転換し、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードするＤＮＡと該野生型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡを相同組換え技術を用いて置換することにより取得できる。また、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用いて、コリネ型細菌を形質転換することにより取得することができる。【００４６】
上記方法により取得することができるＤＮＡがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多い変異型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡの取得方法としては以下の方法もあげられる。【００４７】
上記コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡに、ヒドロキシルアミンなどの化学変異剤を接触させる方法やエラー・プローンPCR法によりランダム変異を導入した変異型グルタミンシンテターゼ２遺伝子のライブラリーを造成する。該ライブラリーと、コリネ型細菌内で自立複製可能であり、かつコリネ型細菌の生育を抑制する薬剤への耐性を付与する薬剤耐性遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを連結し、組換え体ＤＮＡを造成後、該組換え体ＤＮＡを用いて野生型のコリネ型細菌を形質転換する。該形質転換体を、グルタミン要求性を示すコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032由来glnA欠損株MJ4-26株[FEMS Microbiology Letters, 154, 81 (1997)]を1 X 106 cells/cm3程度含有する最小寒天培地〔グルコース 1%、NH4Cl 0.4%、尿素 0.2%、KH2PO40.1%、K2HPO4 0.3%、MgSO40.04%、FeSO410mg/L、MnSO4 1mg/L、ニコチン酸 5mg/L、ビオチン 100μg/L、チアミン塩酸塩 5mg/L、バクトアガー（Difco） 1.6%（pH7.2）〕に1〜10 cells/cm2になるように塗布する。該最小寒天培地を３０℃で２〜３日間静置後、寒天培地に含まれるグルタミン要求株MJ4-26株の生育も確認できるハローをかきとり、組換え体ＤＮＡを有する形質転換体のみが生育可能な薬剤を含有する最小寒天培地にシングルコロニーを形成するように塗布する。該薬剤含有最小寒天培地を３０℃で１〜２日間静置後、コロニーを形成する形質転換体を選択する。さらに、該形質転換体を培地中に培養し、培養終了時の培地中のグルタミン濃度を測定する。同様に該野生型のコリネ型細菌を培養して検出されるグルタミン濃度よりも、培養終了時の培地中のグルタミン濃度が増加している形質転換体を選択する。該形質転換体が保持する組換え体ＤＮＡが有する変異型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡは、宿主に野生型のコリネ型細菌よりも高いＬ−グルタミン生産性を付与しており、このような手法で本発明のＤＮＡを取得することができる。【００４８】
コリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、上記した部位特異的変異導入法により、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸をコードするコドンをグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンとなるように塩基置換を行うことにより取得することができる。グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンとしては、グルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンであればいずれでもよく、好ましくはアラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、およびチロシンから選ばれるアミノ酸であり、より好ましくは塩基性アミノ酸、さらに好ましくはリジン、ヒスチジン、およびアルギニンから選ばれるアミノ酸であり、最も好ましくはリジンをコードするコドンあげることができる。【００４９】
上記方法により取得することができるＤＮＡがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。
配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該ポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを特徴とするポリペプチドをコードするＤＮＡの取得方法としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを用い、上記した部位特異的変異導入法、化学変異剤を接触させる方法やエラー・プローンPCRによりランダム変異を導入する方法をあげることができ、上記した方法によりグルタミン生産量を比較することにより本発明のＤＮＡであることを確認できる。【００５０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸がグルタミン酸以外のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、上記した部位特異的変異導入法により、配列番号1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸をコードするコドンをグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンとなるように塩基置換を行うことにより取得することができる。該コドンとしては、上記のグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンをあげることができる。【００５１】
上記方法により取得することができるＤＮＡがコードするポリペプチドを野生型のコリネ型細菌を宿主細胞に用いて発現させたときのＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことは、上記した方法により確認することができる。
配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸以外の１以上のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する際には、該アミノ酸をコードするコドン以外のコドンをそのコドン単位で、すなわち３塩基分を欠失させることが好ましい。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸以外の１以上のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する際には、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のアミノ酸をコードするコドンに含まれる塩基以外の塩基において、該塩基を含むコドンがコードするアミノ酸が別のアミノ酸に変わるように塩基を置換することが好ましい。さらに、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する際には、アミノ酸をコードする各コドンの間、または前後にアミノ酸をコードするコドン、すなわち３塩基分を付加することが好ましい。【００５２】
本発明のＤＮＡは、ストリンジェントな条件下で、配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖の一部または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより取得することもできる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０mol/lの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０mmol/l塩化ナトリウム、１５mmol/lクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを取得することができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ストリンジェントな条件は、プローブＤＮＡの鎖長の長さやＧＣ含量に応じて調整が可能であり、モレキュラー・クローニング第３版等に記載の方法により設定することができる。【００５３】
上述のコロニー・ハイブリダイゼーション法等により取得したＤＮＡが、配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の塩基配列に相応する領域がグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンである塩基配列を有するＤＮＡであることを確認し、さらに該ＤＮＡを野生型のコリネ型細菌に導入し、該ＤＮＡと野生型のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上の野生型グルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡとを相同組換え技術により置換し、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させた形質転換体、または該ＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを用いて野生型のコリネ型細菌を形質転換し、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を有するポリペプチドを発現させた形質転換体を取得し、上記した方法を用いて該形質転換体と宿主細胞である野生型のコリネ型細菌とを培地に培養したときの培養上清中のＬ−グルタミンの生産量が該野生型のコリネ型細菌より多いことを確認することにより、本発明のＤＮＡを取得することができる。【００５４】
本発明のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡは、本発明のＤＮＡとベクターとを連結することにより取得することができる。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ等をあげることができ、本発明のＤＮＡと連結できるものであればいずれのベクターでも構わない。本発明のＤＮＡとベクターとを連結させる方法としては、T4 DNA ligase（タカラバイオ社製）等を用いて酵素的に本発明のＤＮＡとベクターとを連結させる方法等をあげることができる。
（４）本発明のポリペプチドの製造
上記（１）の本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載されている方法に従い、例えば以下の方法により、上記（２）の本発明のＤＮＡを宿主細胞内で発現させて製造することができる。【００５５】
すなわち、上記で取得されたＤＮＡを元にして、必要に応じて該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に連結した組換え体ＤＮＡを作成する。該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適した宿主細胞に導入することにより、形質転換体を作製することができる。
また該ＤＮＡ断片の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製することにより、本発明のポリペプチドを効率よく製造することができる。【００５６】
宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発現できる細菌、または酵母であればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００５７】
発現ベクターとしては、例えば、pBTrp2、pBTac1、pBTac2（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600号）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、pTrs30〔Escherichia coli JM109/pTrS30 （FERM BP-5407）より調製〕、pTrs32〔Escherichia coli JM109/pTrS32（FERM BP-5408）より調製〕、pGHA2〔Escherichia coli IGHA2（FERM B-400）より調製、特開昭60-221091号〕、pGKA2〔Escherichia coliIGKA2（FERM BP-6798）より調製、特開昭60-221091号〕、pTerm2（米国特許4686191号、米国特許4939094号、米国特許5160735号）、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)〕、pGEX（Pharmacia社製）、pETシステム（Novagen社製）等をあげることができる。【００５８】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換え体ＤＮＡベクターにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００５９】
宿主細胞としては、エシェリヒア属（Escherichia）、セラチア属（Serratia）、バチルス属（Bacillus）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、シュードモナス（Pseudomonas）属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coliKY3276、Escherichia coliW1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coliW3110、Escherichia coli NY49、Escherichia coli GI698、Escherichia coli TB1、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticumATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentumATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilumATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。【００６０】
特に宿主細胞が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、またはミクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物であるときは、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacterium callunae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium lactofermentum、Corynebacterium herculis、Corynebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、Corynebacterium thermoaminogenes、Brevibacterium saccharolyticum、Brevibacterium immariophilum、Brevibacterium roseum、Brevibacterium thiogenitalis、Microbacterium ammoniaphilum等を使用することが好ましい。【００６１】
より具体的には、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806、Corynebacterium callunae ATCC 15991、Corynebacterium glutamicum ATCC 13032、Corynebacterium glutamicum ATCC 13060、Corynebacterium glutamicum ATCC 13826（旧属種Brevibacterium flavum）、Corynebacterium glutamicumATCC 14020（旧属種Brevibacterium divaricatum）、Corynebacterium glutamicumATCC 13869（旧属種Brevibacterium lactofermentum）、Corynebacterium herculis ATCC 13868、Corynebacterium lilium ATCC 15990、Corynebacterium melassecola ATCC 17965、Corynebacterium thermoaminogenesATCC 9244、ATCC 9245、ATCC 9246およびATCC 9277、Brevibacterium saccharolyticumATCC 14066、Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、Brevibacterium roseum ATCC 13825、Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240、Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354を使用することが好ましい。【００６２】
宿主細胞が、上記のCorynebacterium属、Brevibacterium属、またはMicrobacterium属に属する微生物であるときは、本発明のＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡを作製するために用いられるベクターとして、pCG1（特開昭57-134500号）、pCG2（特開昭58-35197号）、pCG4（特開昭57-183799号）、pCG11（特開昭57-134500号）、pCG116、pCE54、pCB101（いずれも特開昭58-105999号）、pCE51、pCE52、pCE53［いずれもMolecular and General Genetics, 196, 175 (1984)］、pCS299P（国際公開第00/63388号パンフレット）等を用いることが好ましい。【００６３】
組換え体ＤＮＡベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（例えば、特開昭57-186492および特開昭57-18649）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)、電気穿孔法［例えば、J. Bacteriology, 175, 4096 (1993)］に記載の方法等をあげることができる。【００６４】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEp13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1 プロモーター、CUP 1プロモーター等をあげることができる。【００６５】
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、クリュイベロミセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シワニオミセス（Schwanniomyces）属、ピヒア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属等に属する微生物、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、トリコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulans）、シワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces alluvius）、キャンディダ・ユーティリス（Candida utilis）等をあげることができる。【００６６】
組換え体ＤＮＡベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。【００６７】
酵母により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
遺伝子の発現方法としては、そのまま発現させる以外に、モレキュラー・クローニング第３版に記載されている方法等に準じて、融合タンパク質として発現させることができる。【００６８】
本発明のポリペプチドは、上記方法で得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成、蓄積させ、該培養物より本発明のポリペプチドを採取することで得ることができる。
該形質転換体の培養は、通常の培養法によって実施することができる。
培地としては、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００６９】
炭素源としては、例えばグルコース、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。【００７０】
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。【００７１】
培養は、振とう培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２０℃〜４２℃が好適であるが、特に２５℃〜４０℃が好ましい。培地中のpHは、５〜９に維持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。培養期間は通常１２時間〜６日間である。また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７２】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００７３】
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、採用する方法に応じて、宿主細胞を選択し、発現させるポリペプチドの構造を変えることができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989)、Genes Develop., 4, 1288（1990)〕、または特開平5-336963号、国際公開94/23021号パンフレット等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【００７４】
また、特開平2-227075号に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
本発明の形質転換体により製造されたポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）−セファロース、DIAION HPA-75（三菱化学社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００７５】
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。【００７６】
本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００７７】
このようにして取得されるポリペプチドとして、上記（１）のポリペプチドがあげることができ、より具体的には配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸残基がリジン残基に置換したポリペプチドをあげることができる。
（５）本発明の微生物
本発明の微生物としては、本発明のポリペプチドを生産する微生物をあげることができ、本発明のポリペプチドを生産できる微生物であればいずれの微生物でもよいが、好ましくはコリネ型細菌に属する微生物、より好ましくはコリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、またはミクロバクテリウム属に属する微生物、さらに好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムなどをあげることができる。【００７８】
本発明の微生物は、本発明のＤＮＡを用いて、常法に準じて宿主細胞を形質転換することにより取得することができ、例えば、上記（４）で得られる形質転換体をあげることができる。
また、本発明の微生物としては、染色体ＤＮＡ上に本発明のＤＮＡを有する微生物をあげることができる。該微生物は、通常の変異処理法、組換えＤＮＡ技術による遺伝子置換法、細胞融合法、あるいは形質導入法等を用いて、宿主に使用される微生物の染色体ＤＮＡ上のグルタミンシンテターゼ２に部位特異的変異を導入して得ることができる。部位特異的変異の導入は、モレキュラー・クローニング第３版、カレントプロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)、等に記載の方法に従って行うことができる。【００７９】
また、相同組換え法を用いて、染色体ＤＮＡ上のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡを上記（３）の方法で得られる本発明のＤＮＡで置換することによっても、染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物を作製することができる。
具体的には、上記（３）の方法で得られる本発明のＤＮＡを、宿主細胞中では自律複製できず、かつ抗生物質に対する耐性マーカー遺伝子および枯草菌のレバンシュクラーゼ遺伝子sacB[Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)]を有するプラスミドに組み込み、上記（４）記載の方法に従い微生物に導入する。【００８０】
該組換え体プラスミドは宿主細胞中で自律複製できないので、該組換え体プラスミド上に存在する抗生物質の耐性で選択することにより、該組換え体プラスミドがCampbellタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれた形質転換株を取得することができる。
つぎに、本発明のＤＮＡと共に染色体上に組み込まれる枯草菌レバンシュークラーゼがシュークロースを自殺基質に転換することを利用した選択［J. Bacteriol., 174, 5462 (1992)］を行うことによって、宿主染色体ＤＮＡ上のグルタミンシンテターゼ２が本発明のＤＮＡに置換された株を取得することができる。【００８１】
以上の方法で、染色体上の遺伝子置換を行うことができるが、上記の方法に限らず、染色体上の遺伝子を置換できる方法であれば他の遺伝子置換法も用いることもできる。
染色体上に本発明のＤＮＡを有する微生物を作製する方法としては、他にも細胞融合法、形質導入法をあげることができる。例えば、相田 浩ら 編、アミノ酸発酵、１９８６年、学会出版センターに記載の方法をあげることができる。
また、本発明の微生物としては、本発明のＤＮＡを有し、かつ
（i）コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産する能力を有し、かつリゾチーム感受性を示すことを特徴とする微生物、
（ii）ポリペプチドが配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記（i）に記載の微生物、
（iii）グリシン以外のアミノ酸がアスパラギン酸である、上記（ii）に記載の微生物、
（iv）ＬｔｓＡのアミノ酸配列が配列番号１０で表されるアミノ酸配列である、上記（i）に記載の微生物、
（v）ポリペプチドが配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、Ｎ末端から８０番目のアミノ酸がグリシン以外のアミノ酸であるアミノ酸配列を有することを特徴とする、上記（iv）に記載の微生物、および
（vi）グリシン以外のアミノ酸がアスパラギン酸である、上記（v）に記載の微生物、
などをあげることができる。【００８２】
コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡとしては、配列番号１１で表される塩基配列を有するＤＮＡの相補鎖、または該ＤＮＡの一部からなるＤＮＡの相補鎖をプローブとして用い、上記ハイブリダイゼーションにより、または、配列番号１１で表される塩基配列から設計できるプライマーＤＮＡを用い、上記コリネ型細菌の染色体ＤＮＡを鋳型としたPCRにより取得することができるＬｔｓＡをコードするＤＮＡを用いて、常法により取得することができる。【００８３】
上記コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡとしては、上記コリネバクテリウム属に属する微生物由来のＬｔｓＡであれば、いずれのＬｔｓＡでもよく、例えばEP 1108790に記載されている配列番号１０記載のアミノ酸配列を有するＬｔｓＡをあげることができる。
コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、上記のコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを造成する方法と同様な方法で造成することができる。欠失、置換または付加されたアミノ酸の数、位置、種類に関しては上記のコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドの場合と同様である。【００８４】
コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産するコリネ型細菌は、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、野生型ＬｔｓＡを生産し、かつ本発明のＤＮＡを有するコリネ型細菌を形質転換し、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードするＤＮＡと該野生型ＬｔｓＡをコードするＤＮＡを相同組換え技術を用いて置換することにより取得することができる。該コリネ型微生物がリゾチーム感受性を示し、かつ該コリネ型微生物のグルタミン生産量がＬｔｓＡ変異を導入する前のコリネ型細菌の生産量よりも多いことを測定することによって、該コリネ型細菌が本発明の微生物であることを確認することができる。【００８５】
コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産するコリネ型細菌がリゾチーム感受性を示すとは、該コリネ型細菌を、ＬｔｓＡを置換する前の野生型ＬｔｓＡを生産するコリネ型細菌が生育できる最大濃度のリゾチームを含有する培地で培養したとき、その生育速度が野生型ＬｔｓＡを生産するコリネ型細菌を該培地で培養したときの生育速度より遅いことを意味する。【００８６】
上記(ii) または（iii)の本発明の微生物については、コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡにおいて、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸とは、コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡが有するアミノ酸配列と配列番号１０で表されるアミノ酸配列との相同性を上記したBLASTおよびFASTAなどの相同性解析プログラムおよびパラメーターを用いて計算し、両配列を整列させたとき該コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡが有するアミノ酸配列上で、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸をいう。【００８７】
グリシン以外のアミノ酸としては、グリシン以外のアミノ酸であればいずれのアミノ酸であってもよいが、好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸から選ばれるアミノ酸であり、より好ましくはアスパラギン酸をあげることができる。【００８８】
上記(ii) または（iii)の本発明の微生物については、コリネ型細菌に属する微生物由来のＬｔｓＡにおいて、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のアミノ酸に相応する位置のアミノ酸をコードするコドンを、上記した部位特異的変異導入法を用いてグリシン以外のアミノ酸をコードするコドンに置換したＤＮＡを造成し、該ＤＮＡを用いて、野生型ＬｔｓＡを生産し、かつ本発明のＤＮＡを有するコリネ型細菌を形質転換し、上記方法により取得することができるＤＮＡと該野生型ＬｔｓＡをコードするＤＮＡとを相同組換え技術を用いて置換することにより取得できる。該コリネ型微生物がリゾチーム感受性を示し、かつ該コリネ型微生物のグルタミン生産量がＬｔｓＡ変異を導入する前のコリネ型細菌の生産量よりも多いことを測定することによって、該コリネ型細菌が本発明の微生物であることを確認することができる。【００８９】
上記（iv）の配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて、上記のコリネ型細菌に属する微生物由来のグルタミンシンテターゼ２のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを造成する方法と同様な方法で造成することができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸の数、位置、種類に関しては上記の通りである。【００９０】
配列番号１０で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ該アミノ酸配列を有するポリペプチドを菌体内で生産される唯一のＬｔｓＡとして生産するコリネ型細菌は、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて、野生型ＬｔｓＡを生産し、かつ本発明のＤＮＡを有するコリネ型細菌を形質転換し、上記方法により取得することができるポリペプチドをコードするＤＮＡと該野生型ＬｔｓＡをコードするＤＮＡを相同組換え技術を用いて置換することにより取得できる。該コリネ型微生物がリゾチーム感受性を示し、かつ該コリネ型微生物のグルタミン生産量がＬｔｓＡ変異を導入する前のコリネ型細菌の生産量よりも多いことを測定することによって、該コリネ型細菌が本発明の微生物であることを確認することができる。【００９１】
上記（v）または（vi）の本発明の微生物は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて、配列番号1で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のグリシン残基をコードするコドンを、上記した部位特異的変異導入法を用いてグリシン残基以外のアミノ酸をコードするコドンに置換したＤＮＡを用いて取得することができる。該アミノ酸としては、上記のグリシン以外のアミノ酸をあげることができる。【００９２】
上記(v）または（vi）の本発明の微生物は、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のグリシン残基をコードするコドンを、上記した部位特異的変異導入法を用いてグリシン以外のアミノ酸をコードするコドンに置換したＤＮＡを造成し、該変異ＤＮＡを用いて、野生型ＬｔｓＡを生産し、かつ本発明のＤＮＡを有するコリネ型細菌を形質転換し、上記方法により取得することができるＤＮＡと該野生型ＬｔｓＡをコードするＤＮＡを相同組換え技術を用いて置換することにより取得できる。該コリネ型微生物がリゾチーム感受性を示し、かつ該コリネ型微生物のグルタミン生産量がＬｔｓＡ変異を導入する前のコリネ型細菌の生産量よりも多いことを測定することによって、該コリネ型細菌が本発明の微生物であることを確認することができる。【００９３】
なお、上記（i）〜（vi）の本発明の微生物は、コリネ型細菌に上記のようにＬｔｓＡの変異を導入した後、本発明のポリペプチドの生産能を付与することによっても、本発明の微生物を造成することができる。
（６）Ｌ−グルタミンの製造
上記（４）で得られる形質転換体、または上記（５）で得られる本発明の微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−グルタミンを生成、蓄積させ、該培養物中よりＬ−グルタミンを採取することにより、Ｌ−グルタミンを得ることができる。【００９４】
該微生物の培養は、Ｌ−グルタミンを生成する能力を有する微生物の通常の培養法によって行うことができる。
培地としては、炭素源、窒素源、無機塩類などを適量含有する培地であれば合成培地または天然培地いずれも使用できる。
炭素源としては、本発明の微生物が資化できるものであればよく、例えばグルコース、糖蜜、果糖、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノールなどのアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。【００９５】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、その他窒素含有化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としてはリン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム等を用いることができる。【００９６】
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。
培養は、振とう培養、深部通気撹拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は一般に２０〜４２℃が好適であり、さらに好ましくは３０℃〜４０℃である。培地のｐＨは５〜９の範囲で、中性付近に維持することが好ましい。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。【００９７】
培養期間は通常１２時間〜６日間であり、培養液中にＬ−グルタミンが生成蓄積する。
培養終了後、菌体などの沈殿物を除去して得られた培養液より、活性炭処理、イオン交換樹脂処理などの公知の方法を併用することによりＬ−グルタミンを回収することができる。
以下に本願発明の実施例を示すが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９８】
遺伝子置換用プラスミドpCglnA2の作製
配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸がリジンに置換(Glu64Lys)されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、ＰＣＲを用いる部位特異的変異法[モレキュラー・クローニング第３版]を用いて次のようにして取得した。【００９９】
まず、コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型株ATCC13032の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]に従って調製した。
次いで、該染色体ＤＮＡを鋳型として、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、添付のバッファーおよび後述のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲに用いたプライマーは、EP 1108790に記載されているコリネバクテリウム・グルタミカム由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき、配列番号２で表されるグルタミンシンテターゼ２をコードする領域中で、配列番号１で表されるグルタミンシンテターゼ２の有するアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸をコードする領域（配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の領域、gaa）を含む２１塩基からなる領域（配列番号２で表される塩基配列の５’末端から１８０〜２００番目の塩基配列、および配列番号３で表される塩基配列の５’末端から６８０〜７００番目の塩基配列）において、配列番号５で表される該グルタミン酸をコードする領域を、リジンをコードするコドン(aaa)に置換した塩基配列からなるＤＮＡ断片、およびその相補配列である配列番号６で表される２１塩基の塩基配列を有するＤＮＡ断片を常法に従い合成した。【０１００】
また、配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１６７〜１８６番目の塩基配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したＤＮＡ断片を合成し、その塩基配列を配列番号４に示した。
配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１１８５〜１２０４番目の塩基配列の相補配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したＤＮＡ断片を合成し、その塩基配列を配列番号７に示した。【０１０１】
配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとし、また配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。【０１０２】
各々のＰＣＲにより得られた、約0.5kbの増幅産物（配列番号３で表される塩基配列の５’末端から第１６７〜７００番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片、および第６８０番目から１２０４番目に対応するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸をコードするコドン(gaa)がリジンをコードするコドン(aaa)に置換された約1.0kbのＤＮＡ断片を取得した。得られた約1.0kbのＤＮＡ断片をBamHI処理し、アガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した。【０１０３】
該ＤＮＡ断片をプラスミドpESB30に挿入した。pESB30は、カナマイシン耐性遺伝子を有するベクターpHSG299 [Gene, 61, 63 (1987)]のPstI切断部位に、Bacillus subtilis由来のレバンシュクラーゼ遺伝子sacBを含む2.6kbのPstIＤＮＡ断片[Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)]を連結したプラスミドである。具体的にはpESB30をBamHI（タカラバイオ社製）で切断後、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）処理を行ない、アガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いてpESB30のBamHI処理断片を抽出、精製した。このpESB30断片と、上記で得られたBamHI処理した約1.0kbのＤＮＡ断片を混合し、ライゲーションキットver１（タカラバイオ社製）を用い、リガーゼ反応を行った。得られた反応産物を用い、常法[モレキュラー・クローニング第３版]に従ってEscherichia coli DH5α（東洋紡社製）を形質転換した。【０１０４】
該菌株を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）10g、酵母エキス（ディフコ社製）5g、塩化ナトリウム 10g、バクトアガー（ディフコ社製）16gを水1Lに含み、pH7.0に調整された培地］上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を20μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリＳＤＳ法（モレキュラー・クローニング第３版）によりプラスミドを調製した。【０１０５】
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pESB30に上記で得られた約1.0kbのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpCglnA2と命名した。
【実施例２】
【０１０６】
遺伝子発現用プラスミドpGlnA2の造成
配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸がリジンに置換(Glu64Lys)されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、実施例１と同様の方法で取得した。
コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型株ATCC13032の染色体ＤＮＡにおいて、グルタミンシンターゼ２をコードする塩基配列の５’末端側の上流に位置する塩基配列（配列番号３で表される塩基配列の５’末端から１〜２０番目の塩基配列）にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したＤＮＡ断片、および３’末端側に位置する塩基配列（配列番号３で表される塩基配列の５’末端から第１８２５〜１８４４番目の塩基配列）の相補配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したＤＮＡ断片を合成し、その塩基配列をそれぞれ配列番号８、配列番号９に示した。【０１０７】
配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号６で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとし、また配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、ATCC13032株の染色体ＤＮＡを鋳型として、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。【０１０８】
各々のＰＣＲにより得られた、約0.7kbの増幅産物（配列番号３で表される塩基配列の５’末端から第１〜７００番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片）、約1.1kbの増幅産物（配列番号３で表される塩基配列の５’末端から第６８０〜１８４４番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した。【０１０９】
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号８で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号９で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、グルタミンシンターゼ２の５’末端側の上流に存在するプロモーター配列と、配列番号２において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸をコードするコドン(gaa)がリジンをコードするコドン(aaa)に置換された塩基配列を含む約1.9kbのＤＮＡ断片を取得した。この約1.9kbのＤＮＡ断片をBamHI（タカラバイオ社製）で処理し、アガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いて抽出、精製した。pCS299P（国際公開第00/63388号パンフレット）をBamHI（タカラバイオ社製）で切断後、アルカリフォスファターゼ（タカラバイオ社製）処理を行ない、アガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kit(BIO 101社製)を用いてpCS299P断片を抽出、精製した。【０１１０】
このpCS299P断片に上記で得られたBamHI処理した約1.9kbのＤＮＡ断片を実施例１と同様の方法でクローン化した。
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pCS299Pに上記で得られた約1.9kbのＤＮＡ断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpGlnA2と命名した。
【実施例３】
【０１１１】
遺伝子置換用プラスミドpCltsAの作製
配列番号１０で表されるリゾチーム感受性に関わるポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から第８０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換(Gly80Asp)されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、実施例１と同様の方法で取得した。同変異の導入によりリゾチーム感受性が付与されることが報告されている[BMC Biotechnol. 9, 1 (2001)]。【０１１２】
コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型株ATCC13032の染色体ＤＮＡにおけるＬｔｓＡをコードするＤＮＡの周辺領域を示す、配列番号１２で表される塩基配列の５’末端から１〜２０番目の塩基配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したＤＮＡ断片、および配列番号１２で表される塩基配列の５’末端から９８１〜１０００番目の塩基配列の相補配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したＤＮＡ断片を合成し、その塩基配列をそれぞれ配列番号１３、配列番号１６に示した。配列番号１１で表されるＬｔｓＡをコードする領域中で、配列番号１０で現されるＬｔｓＡの有するアミノ酸配列のＮ末端から第８０番目のグリシンをコードするコドン（配列番号１１で表される塩基配列の５’末端から２３８〜２４０番目の塩基配列、ggt）を含む２１塩基からなる領域（配列番号１１で表される塩基配列の５’末端から２２９〜２４９番目の塩基配列、および配列番号１２で表される塩基配列の５’末端から４９１〜５１１番目の塩基配列）において、該グリシンをコードするコドンをアスパラギン酸をコードするコドン(gat)に置換した、配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ断片、および該塩基配列の相補配列である配列番号１４で表される２１塩基の塩基配列を有するＤＮＡ断片を常法に従い合成した。【０１１３】
配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号１４で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとし、また配列番号１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、ATCC13032株の染色体ＤＮＡを鋳型として、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と添付のバッファーを用いて２種類のＰＣＲを各々行った。【０１１４】
各々のＰＣＲにより得られた、約0.5kbの増幅産物（配列番号１２で表される塩基配列の５’末端から１〜５１１番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片、および配列番号１２で表される塩基配列の５’末端から４９１〜１０００番目の塩基配列に対応するＤＮＡ断片）をアガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行った。このＰＣＲにより、配列番号１０で表されるＬｔｓＡが有するアミノ酸配列のＮ末端から第８０番目のグリシンをコードする領域(ggt)がアスパラギン酸をコードするコドン(gat)に置換された約1.0kbのＤＮＡ断片を取得した。この約1.0kbのＤＮＡ断片をBamHI（タカラバイオ社製）で処理し実施例１と同様の方法でpESB30にクローン化し、このプラスミドをpCltsAと命名した。
【実施例４】
【０１１５】
本発明のＤＮＡを有するＬ−グルタミン生産菌の造成
上記実施例１で作製したプラスミドpCglnA2を用い、遺伝子置換法によってコリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032の染色体ＤＮＡにおいてグルタミンシンテターゼ２をコードする遺伝子に配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸をリジンに置換する変異（Glu64Lys）を導入した。【０１１６】
遺伝子置換法によるATCC13032の染色体ＤＮＡにおいてグルタミンシンテターゼ２をコードする遺伝子への変異の導入は、次に示すような2回の組換え操作によって行った。まず、上記で作製したプラスミドpCglnA2がコリネ型細菌内では自律複製できないことを利用して、以下の方法で、このプラスミドが相同組換えでコリネバクテリウム グルタミクムATCC13032の染色体ＤＮＡ中に組み込まれた株を選択した。【０１１７】
具体的には、該プラスミドを用い、レストらの方法[Appl. Microbiol. Biotech., 52, 541 (1999)]に従って電気穿孔法にてATCC13032株を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの1株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）により調べた結果、プラスミドがCampbellタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型および変異型のグルタミンシンテターゼ２遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で2回目の相同組換えが起こりやすくなっている。【０１１８】
該形質転換株（1回組換え体）をＳＵＣ寒天培地〔ショ糖100g、肉エキス7g、ペプトン10g、塩化ナトリウム3g、酵母エキス（ディフコ社製）5g、バクトアガー（ディフコ社製）18gを水1Lに含みpH7.2に調整した培地〕上に塗布し、30℃で1日間培養して、生育するコロニーを選択した。sacB遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するので、この培地では生育できない[J. Bacteriol., 174, 5462 (1991)]。これに対し、染色体上に近接して存在する野生型と変異型のグルタミンシンテターゼ２遺伝子間での２回目の相同組み換えによりsacB遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この２回目の相同組み換えの際には、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、sacBとともに欠失する。このとき野生型がsacBとともに欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったことになる。【０１１９】
このようにして得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]により調製し、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号７で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。これらのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体の染色体ＤＮＡ上のグルタミンシンテターゼ２遺伝子が野生型であるか変異型であるかを判定した。その結果、染色体ＤＮＡにおいてグルタミンシンテターゼ２をコードする遺伝子に、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸をリジンに置換する変異（Glu64Lys）を有する２回組換え体であるGS2株を取得した。【０１２０】
GS2株にさらに、上記と同様の方法でpCltsAを用いて染色体ＤＮＡ上のＬｔｓＡ遺伝子に、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のグリシンをアスパラギン酸に置換する変異（Gly80Asp）を導入し、GLA2株を取得した。宿主にGS2株を用い、置換用のプラスミドにpCltsAを用いる以外は上記と同じ操作を行い、得られた２回組換え体の染色体ＤＮＡを、斎藤らの方法[Biochim. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]により調製し、該染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片と配列番号１６で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と添付のバッファーを用いてＰＣＲを行った。これらのＰＣＲ産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体の染色体ＤＮＡ上のＬｔｓＡ遺伝子が野生型であるか変異型であるかを判定した。その結果、染色体ＤＮＡにおいてＬｔｓＡをコードする遺伝子に、配列番号１０で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のグリシンをアスパラギン酸に置換する変異（Gly80Asp）を有する２回組換え体であるGLA2株を取得した。【０１２１】
また、実施例２で作成したpGlnA2またはコントロールとしてpCS299PをATCC13032株に電気穿孔法にて形質転換し、ATCC13032/pGlnA2株およびATCC13032/pCS299P株を取得した。
【実施例５】
【０１２２】
グルタミンシンターゼ２変異株によるＬ−グルタミン生産試験
取得したGS2株、GLA2株、ATCC13032/pGlnA2株、ATCC13032/pCS299P株および親株であるATCC13032株を、ＢＹＧ寒天培地〔グルコース10g、肉エキス7g、ペプトン10g、塩化ナトリウム3g、酵母エキス（ディフコ社製）5g、バクトアガー（ディフコ社製）18gを水1Lに含みpH7.2に調整した培地〕を用い30℃で24時間培養し、各菌株をそれぞれ種培地〔グルコース50g、ブイヨン20g、硫酸アンモニウム5g、尿素5g、リン酸二水素カリウム2g、硫酸マグネシウム７水和物0.5g、硫酸鉄７水和物1mg、硫酸銅５水和物0.4mg、硫酸亜鉛７水和物0.9mg、塩化マンガン４水和物0.07mg、４ホウ酸２ナトリウム１０水和物0.01mg、７モリブデン酸６アンモニウム４水和物0.04mg、チアミン塩酸塩0.5mg、ビオチン0.1mgを水1Lに含みpH7.2に調整後、炭酸カルシウムを10g加えた培地〕6mlを含む試験管に植菌し、30℃で12時間〜16時間培養した。【０１２３】
得られた種培養液を、それぞれ本培養培地〔グルコース50g、尿素2g、硫酸アンモニウム20g、リン酸二水素カリウム0.5g、リン酸水素二カリウム0.5g、硫酸マグネシウム７水和物0.5g、硫酸鉄７水和物2mg、硫酸マンガン５水和物2.5mg、チアミン塩酸塩0.5mg、ビオチン0.1mgまたは0.001mgを水1Lに含みpH7.0に調整後、炭酸カルシウムを20g加えた培地〕30mlを含むバッフルつき300ml三角フラスコに10%植菌し、30℃、220rpm条件下で、糖を完全に消費しきらないように１６〜１８時間培養した。【０１２４】
培養終了後、遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中のＬ−グルタミンおよびＬ−グルタミン酸の蓄積量をそれぞれ高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。また、培養終了時のそれぞれの菌体量を培養液の６６０ｎｍでの吸光度（ＯＤ６６０）として測定した。結果を第１表に示す。【０１２５】
【表１】
0005592059.tif 000002
【０１２６】
第１表から明らかなように、本発明のＤＮＡを有するGS2株、ATCC13032/pGlnA2株のＬ−グルタミンの生産効率は、親株に比べ有意に向上していた。また、さらにＬｔｓＡ遺伝子に変異を導入することでビオチンを制限することなく、グルタミン生産効率が向上した。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明によれば、新規なＬ−グルタミンの製造法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２８】
配列番号４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
0005592059000001.app