(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
i) タンパク質を100〜380 mg/ml抽出物の含量で含むことを特徴とする単離されたサケ卵の水溶性画分、およびリボ核酸、
およびii)該サケ卵とは異なる供給源に由来する脂質成分を含む、
皮膚への局所投与用の組成物。
【請求項２】
クリーム、ゲル、エマルジョン、軟膏、スプレー、粉末、またはローションとして提供される、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
タンパク質を100〜380 mg/mlの含量で含むことを特徴とする単離されたサケ卵の水溶性画分、およびリボ核酸を、局所投与に適したクリーム、ゲル、スプレー、エマルジョン、固体、樹脂もしくはマトリックス、軟膏、粉末、またはローション中に含む、皮膚への局所投与用の組成物。
【請求項４】
前記サケ卵以外の供給源に由来する脂質またはタンパク質の画分をさらに含む、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
脂質画分が、スクアレン、脂肪族ロウ、ステロールエステル、ジオールエステル、トリグリセリド、もしくはステロール、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
グルタミン、抗感染剤、抗炎症剤、抗酸化剤、および/またはニコチンアミドをさらに含む、請求項３〜５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項７】
抗酸化剤が、ビタミンA、C、D、もしくはE、またはこれらの組み合わせである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
ゲルが、ヒアルロン酸およびキトサンからなる群より選択される化合物を含む、請求項３〜７のいずれか一項記載の組成物。
【請求項９】
スプレーがエアロゾルである、請求項３〜８のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１０】
スプレーが皮膚上で乾燥する、請求項３〜９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１１】
スプレー組成物がゲル形成成分を含む、請求項３〜１０のいずれか一項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、皮膚、毛髪、皮下脂肪、軟骨、筋肉、骨格構造を含むが、これらに限定されない、美容上の外観に直接または間接的に寄与する、人の目に見える部分を改善するための方法、ならびに細胞および組織、好ましくは皮膚の健康および損傷を改善する、より好ましくは、老化した皮膚を若々しい外観に回復させるための方法に関する。いくつかの態様では、本発明は、i)分化可能細胞、ii)細胞もしくは卵の抽出物、またはiii)抽出物に含まれる精製核酸配列もしくは合成核酸配列、ポリペプチド、または天然物を含む成分の分化および抽出を誘導可能な、これらの成分を含む組成物に関する。いくつかの態様では、細胞は、分化可能細胞、好ましくは幹細胞である。いくつかの態様では、組成物は、外表面層の除去後における、皮膚および/または創傷への組成物の塗布を含む方法に使用される。いくつかの態様では、本発明は、細胞の脱分化の方法、および/または再分化後における脱分化の方法に関する。いくつかの態様では、本発明は、皮膚疾患の管理、予防、および処置に関する。
【０００２】
本発明は、細胞および組織の劣化、損傷、および機能不全を予防するための、ならびに細胞および組織の外観、活力、および健康を促進させる、改善させる、および上回らせる目的における、細胞機能を促進させる、改善させる、および上回らせるための、分化可能細胞、卵の細胞抽出物、または分化可能細胞の細胞抽出物を含む組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
皮膚は、外界からの攻撃に対抗する最初の防護壁であり、ならびに物理的および化学的な防御の両方を司る。ビタミンDは、太陽熱の放射の作用によって表皮で産生される。このビタミンは、カルシウムが腸から吸収されて骨に固定され、人体の発生および成長を可能とするために必要である。しかしながら、日光を過剰に浴びすぎると、皮膚の損傷、および潜在的には癌に至る。さらに皮膚の細胞は、物理的手段によって損なわれる、すなわち傷害を負うか、または加齢に伴って損なわれる可能性がある。したがって、皮膚の健康状態を管理および改善し、ならびに皮膚の状態および疾患を予防および処置し、ならびに正常な皮膚の外観を維持し、ならびに老化した皮膚を若々しい外観に回復させるための組成物および方法を同定する必要がある。
【０００４】
創傷が治癒すると、瘢痕がその場所を占める。脂肪、結合組織、および上皮などの単純な組織は再生するが、2つの胚葉に由来する複合組織である皮膚は、主に繊維性組織の形成によって治癒する。損傷が角質層の乳頭層を切断または破壊すると瘢痕が形成される。場合によっては、瘢痕は目立たず；また場合によっては、醜い跡となる場合がある。異常な瘢痕を有する患者にとって、今日における最も一般的な懸念は、醜い跡である。しかしながら、痛み、痒み、および運動障害などの、異常な瘢痕と関連する他の症状が現われる患者もいる。こうした他の症状は、瘢痕の外科的修復の適応となる場合がある。したがって、瘢痕の管理、予防、および処置のための組成物および方法を同定する必要がある。
【０００５】
組織もしくは器官の損傷、手術、または放射線照射後には、組織もしくは器官の瘢痕化および不完全な再生が生じる。これは疼痛および不快感を引き起こし、ならびに損傷した組織または器官の機能を損なう。一般に成人では、器官および組織は完全に治癒および再成長しないが、例えば両生類では、失われた四肢を含む組織の再成長が可能である。したがって、内臓および組織における瘢痕化を管理および処置して組織の可塑性を高め、ならびに損傷した組織および器官の再成長を促すための組成物および方法を同定する必要がある。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、皮膚、毛髪、皮下脂肪、軟骨、筋肉、骨格構造を含むが、これらに限定されない、美容上の外観に直接または間接的に寄与する、人の外から見える部分の改善、ならびに細胞および組織、好ましくは皮膚の健康および損傷の改善、ならびに、より好ましくは、老化した皮膚の若々しい外観への修復に関する。いくつかの態様では、本発明は、抽出物に含まれる精製核酸配列もしくは合成核酸配列、ポリペプチド、または天然物を含むが、これらに限定されない、脱分化を誘導可能な、細胞の組成物、細胞もしくは卵の抽出物、および抽出物の成分に関する。いくつかの態様では、細胞は、分化可能細胞、好ましくは幹細胞である。いくつかの態様では、組成物は、外表面層の除去後における、皮膚および/または創傷への組成物の塗布を含む方法に使用される。いくつかの態様では、本発明は、細胞の脱分化の方法、および/または再分化後における脱分化の方法に関する。いくつかの態様では、本発明は、皮膚疾患の管理、予防、および処置に関する。いくつかの態様では、本発明は、失われたか、または損傷した組織、器官、および四肢の修復または新規形成に関する。
【０００７】
いくつかの態様では、本発明は、i)分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、卵の細胞抽出物を含む細胞成分、または分化可能細胞の抽出物もしくは卵の細胞抽出物の成分、またはこれらの組み合わせ、およびii)脂質を含む組成物に関する。別の態様では、組成物はさらに、抽出物に含まれる精製核酸配列または合成核酸配列、タンパク質、エピジェネティックな阻害剤、または天然物、またはこれらの組み合わせを含む。別の態様では、分化可能細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、または成体幹細胞である。本発明は、任意の特定の細胞の抽出物または画分の使用に限定されない。実際には、細胞質の抽出物および画分、核の抽出物および画分、水溶性の抽出物および画分、ならびに細胞抽出物から、アフィニティクロマトグラフィー、勾配遠心分離、HPLC、サイズ排除クロマトグラフィーなどで調製された抽出物および画分を含むが、これらに限定されない、さまざまな細胞の抽出物および画分の使用が想定される。
【０００８】
いくつかの態様では、本発明は、細胞および組織の劣化、損傷、ならびに機能不全の予防に有用な、ならびに細胞および組織の外観、活力、および健康を促進、改善、上回らせることを目的として細胞機能を促進、改善、上回らせるために有用な方法および組成物を提供する。
【０００９】
いくつかの態様では、本発明は、i)分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分、ならびにii)脂質成分を含む、皮膚治癒用の組成物を提供する。別の態様では、合成タンパク質は、融合-トロージャン(Trojan)タンパク質である。別の態様では、組成物はさらに、天然の胎脂、胎脂抽出物、合成成分から作製された胎脂、および胎脂抽出物の成分を含む。別の態様では、脂質成分は、スクアレン、脂肪族ロウ、ステロールエステル、ジオールエステル、トリグリセリド、および遊離ステロールを含む。別の態様では、脂質成分は、魚類、エビ、ウニ、またはカエルの卵、および/または魚卵(fish roe)に由来する。別の態様では、脂質成分は、コレステロール、脂肪酸、およびセラミドを含む。いくつかの態様では、脂質成分は、細胞成分とは異なる供給源に由来する。別の態様では、組成物は、ケラチンまたはフィラグリンを含む。別の態様では、組成物はさらに、グルタミン、抗感染剤、抗酸化剤、および/またはニコチンアミドを含む。別の態様では、抗酸化剤は、ビタミンE、ビタミンA、もしくはビタミンC、またはこれらの組み合わせである。
【００１０】
いくつかの態様では、本発明は、2種類の組成物(第1の組成物は瘢痕組織を溶解し、かつコラーゲン溶解剤を含み、第2の組成物は創傷治癒を改善し、かつ分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分、脂質、タンパク質、および水を含む)を含む、瘢痕の外観を改善するためのキットを提供する。別の態様では、分化可能細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、または成体幹細胞である。別の態様では、第1の組成物はさらに、防腐剤、抗菌剤、抗炎症剤、免疫調節剤、プロテアーゼ、または鎮痛剤、またはこれらの組み合わせを含む。別の態様では、第2の組成物はさらに、天然の胎脂、胎脂抽出物、合成物質から作製された胎脂、および胎脂抽出物の成分を含む。別の態様では、脂質成分は、スクアレン、脂肪族ロウ、ステロールエステル、ジオールエステル、トリグリセリド、遊離ステロール、またはこれらの組み合わせを含む。別の態様では、脂質および/またはタンパク質は、魚類、エビ、ウニ、またはカエルの卵、および/または魚卵に由来する。別の態様では、脂質画分は、コレステロール、脂肪酸、もしくはセラミド、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、脂質成分は、細胞成分とは異なる供給源に由来する。別の態様では、組成物はさらに、グルタミン、抗感染剤、抗酸化剤、および/またはニコチンアミドを含む。
【００１１】
いくつかの態様では、本発明は、以下の段階を含む、皮膚の外観を改善する方法を提供する：i)皮膚組織を化学物質、レーザー、または物理的な力によって除去する段階、ならびにii)分化可能細胞、分化可能細胞もしくは卵の細胞抽出物、分化可能細胞の抽出物の成分、脂質、タンパク質、および/または水を含む、創傷治癒を改善する組成物を塗布する段階。別の態様では、皮膚の外観を改善する段階は、瘢痕の外観を改善する段階、またはシワのある皮膚の外観を改善する段階を含む。別の態様では、分化可能細胞は、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、または成体幹細胞である。別の態様では、組成物はさらに、天然の胎脂、胎脂抽出物、合成物質から作製された胎脂、および胎脂抽出物の成分を含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、分化可能細胞、卵または分化可能細胞の細胞抽出物、細胞抽出物の成分の局所投与法を提供する：分化可能細胞、卵もしくは分化可能細胞の細胞抽出物、細胞抽出物の成分を含む細胞成分を含む組成物、および皮膚を有する対象を提供する段階、ならびに抽出物を対象の皮膚に塗布する段階。別の態様では、卵もしくは分化可能細胞の抽出物、または細胞抽出物の成分は、皮膚の細胞に対する栄養として有効である。別の態様では、組成物は水ベースのゲルである。別の態様では、水ベースのゲルは、ヒアルロン酸およびキトサンからなる群より選択される化合物を含む。別の態様では、組成物は、創傷包帯上の成分である。別の態様では、組成物は、スプレー組成物中の成分である。別の態様では、スプレー組成物はエアロゾルである。別の態様では、スプレー組成物は皮膚上で乾燥する。別の態様では、スプレー組成物はゲル形成成分を含む。いくつかの態様では、組成物はさらに上記の脂質成分を含む。
【００１３】
いくつかの態様では、本発明は、分化可能細胞、卵または分化可能細胞の細胞抽出物、および細胞抽出物の成分を含む組成物を含む創傷治癒用の包帯を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、以下の段階を含む、分化可能細胞、細胞抽出物、細胞抽出物の成分の局所投与法を提供する：i)a)分化可能細胞、分化可能細胞または卵の細胞抽出物、細胞抽出物の成分を含む組成物、b)皮膚に創傷を有する対象、およびc)創傷包帯を提供する段階；ii)分化可能細胞、細胞抽出物、細胞抽出物の成分を創傷に塗布する段階；ならびにiii)創傷を創傷包帯で覆う段階。別の態様では、創傷包帯は非閉鎖性である。別の態様では、創傷包帯はプラスターである。別の態様では、創傷包帯は、i)防水層；ii)分化可能細胞、細胞抽出物、および細胞抽出物の成分を含む栄養ゲル層を含む。別の態様では、防水層は、皮膚に接着する樹脂製の膜である。別の態様では、栄養ゲル層は、抗菌剤およびコラーゲン調節剤を含む。別の態様では、栄養ゲル層は創傷治癒の速度を改善する。
【００１５】
いくつかの態様では、本発明は、以下の段階を含む、分化可能細胞、卵もしくは分化可能細胞の細胞抽出物、または細胞抽出物の成分の局所投与法を提供する：i)a)1)皮膚の創傷、および2)特殊化した細胞を含む組織を有する対象、b)創傷包帯を提供する段階；ii)特殊化した細胞を組織から回収する段階；iii)特殊化した細胞を、培養された特殊化した分化可能細胞、細胞抽出物、または細胞抽出物の成分を含む組成物が形成される条件で培養する段階；iv)組成物を創傷に塗布する段階；ならびにv)創傷を創傷包帯で覆う段階。別の態様では、特殊化した細胞は、バルジの毛包幹細胞、胚性幹細胞、または胚性生殖幹細胞からなる群より選択される。別の態様では、組成物は、特殊化した細胞の液状懸濁物である。他の態様では、組成物はプラスターである。別の態様では、組成物は、創傷への組成物の塗布に先立って、栄養ゲル層を有する膜上に配置される。別の態様では、膜は、皮膚に塗布時に閉鎖性の創傷包帯として機能する樹脂である。別の態様では、創傷包帯は市販のバンドエイドである。別の態様では、組成物の塗布に先だって皮膚を焼く段階を行い、皮膚を凍結する段階を行い、および/または皮膚を研磨する段階を行う。別の態様では、組成物の塗布に先立って、リン脂質、ミリスチン酸パルミチル、DMSO、ポリマーもしくはキトサンの懸濁物もしくはマトリックス、リポソーム、および/またはトロージャンペプチド、シャリオット(chariot)ペプチド(nature biotech 2000)、小弾性小胞(small elastic vesicle)(Van den Bergh et al., 1999)、微粒子、ナノ粒子、調製済み(preloaded)球状ビーズ、単層および/または多層小胞、レチノール分子フィルム、ポリアクリロニトリル、ベータ-グルカン(Redmond, Int Journ Cosmetic Science 2005)、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル、ジメチルイソソルベート、ジメチルホルムアミド、サリチル酸メチル、長鎖オレイン酸を含む、損なわれていない皮膚を透過する輸送用溶媒が、組成物もしくは皮膚に使用される。
【００１６】
いくつかの態様では、本発明は、胚性幹細胞、前駆細胞、体細胞、または霊長類、齧歯類、魚類、エビ、ウニ、および/またはカエルの卵を含むが、これらに限定されない動物の卵の有効量の精製細胞質画分を含む、線維芽細胞やケラチノサイトなどの細胞を刺激するための組成物を提供する。別の態様では、組成物はさらに、脂肪、タンパク質、および/または天然物を含む。別の態様では、組成物はさらに薬草成分を含む。別の態様では、薬草成分はアロエベラである。別の態様では、組成物はさらに種子抽出物を含む。別の態様では、種子抽出物は、コムギ、トウモロコシ、イネ、またはアボカドから得られる。別の態様では、組成物はさらに植物油を含む。別の態様では、組成物はさらに真菌由来物質を含む。別の態様では、真菌物質はnepal fungusである。別の態様では、組成物はさらに、魚類、エビ、ウニ、もしくはカエルの卵の抽出物、またはこれらの卵抽出物の成分を含む。別の態様では、卵抽出物の成分は、糖鎖形成の破壊剤および阻害剤である。別の態様では、卵抽出物の成分は、糖鎖形成の破壊剤であり、および阻害剤はアミノグアニジン、カルノシン、およびフェクスピリドキサミン(fex pyridoxamine)である。
【００１７】
別の態様では、本発明は、創傷を有する対象、および分化可能細胞、分化可能細胞もしくは卵の細胞抽出物、卵抽出物、細胞抽出物の成分、または卵抽出物を含む組成物を提供する段階、ならびに創傷が治癒する条件で組成物を創傷に塗布する段階を含む、創傷治癒の方法を提供する。別の態様では、組成物はさらにコラーゲン溶解剤を含む。別の態様では、コラーゲン溶解剤は酸である。別の態様では、組成物はさらにフルーツ酸を含む。別の態様では、組成物はクリームである。別の態様では、創傷は開放創であり、組成物を塗布する段階は局所的である。好ましい態様では、方法はさらに、組成物を含む支持マトリックスを提供する段階を含む。別の態様では、支持マトリックスは、繊維製または樹脂製の創傷包帯である。
【００１８】
いくつかの態様では、本発明は、創傷を有する対象、および分化可能細胞、分化可能細胞もしくは卵の細胞抽出物、または細胞抽出物もしくは卵抽出物の成分を含む組成物を提供する段階、ならびに組成物を創傷に、このような皮膚が再生する条件で塗布する段階を含む、皮膚の再生法を提供する。別の態様では、組成物はクリームである。別の態様では、創傷は開放創であり、組成物を塗布する段階は局所的である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、起伏のある皮膚を有する対象、および分化可能細胞、分化可能細胞もしくは卵の細胞抽出物、卵抽出物、または細胞抽出物の成分を含む組成物を提供する段階、ならびに組成物を、起伏のある皮膚に、このような皮膚が若返る条件で塗布する段階を含む、皮膚を若返らせる方法に関する。いくつかの態様では、細胞抽出物の成分は核酸配列であるか、または細胞抽出物の成分はペプチドもしくはこれらの組み合わせである。いくつかの態様では、起伏のある皮膚は、瘢痕またはシワの結果である。別の態様では、組成物はクリーム中に存在する。別の態様では、クリームはさらに浸透剤を含む。別の態様では、浸透剤は、毒性を有する薬剤、DMSOもしくはキトサン、キトサンポリマー、またはトリプシンである。別の態様では、浸透剤はリポソームまたはアルギン酸ビーズである。別の態様では、リポソームまたはアルギン酸ビーズは、細胞抽出物もしくは成長因子、またはこれらの組み合わせのペプチドまたは核酸の配列を含む。別の態様では、リポソームは、エレクトロポレーションによって得られた細胞抽出物または卵抽出物の核酸配列を含む。別の態様では、組成物は、細胞抽出物のペプチドを含む融合トロージャンペプチドを含む。別の態様では、組成物を塗布する段階は局所的である。別の態様では、方法はさらに、組成物を塗布する段階は、起伏のある皮膚に、起伏のある皮膚の細胞の表層が除去される条件で、化学物質を塗布した後に、レーザーを照射した後に、または物理的な力を加えた後に実施される。別の態様では、組成物はさらに、防腐剤、抗菌剤、抗炎症剤、免疫調節剤、プロテアーゼ、もしくは鎮痛剤、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２０】
いくつかの態様では、本発明は、以下を含む組成物に関する：脂質；植物種子成分の組成物；抗酸化剤；細胞抽出物に含まれる精製タンパク質もしくは合成タンパク質、または精製天然物もしくは合成天然物；安定化成分；対象の脂肪組織に由来する自家脂肪。
【００２１】
別の態様では、本発明は、皮膚または皮膚代替物を移植する段階、および以下を含む組成物を塗布する段階を含む、皮膚移植を改善する方法を提供する：分化可能細胞、分化可能細胞もしくは卵の細胞抽出物、卵抽出物；細胞抽出物もしくは卵抽出物の成分；細胞抽出物、卵抽出物に含まれる精製核酸配列もしくは合成核酸配列、精製タンパク質もしくは合成タンパク質、または精製天然物もしくは合成天然物；またはこれらの組み合わせ。
【００２２】
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に開示された組成物を使用して予防的または非予防的に投与することで、瘢痕化、異常な瘢痕、異常な創傷治癒、拡大性瘢痕(widened scar)、肥大性瘢痕(hypertrophied scar)、ケロイド、ケロイド性瘢痕、創傷治癒に伴う合併症、傷跡(cicatrix)、瘢痕の肥大(scar hypertrophy)を管理、処置、および/または予防する方法を提供する。別の態様では、本発明は、第1期治癒、創傷閉鎖、第2期治癒、上皮化、再上皮化、三次創傷閉鎖、遅延一次閉鎖、組織除去(debridement)、縫合、炎症期、増殖期、成熟期、止血、炎症、コラーゲン、凝固、トロンボキサンA2、プロスタグランジン2a、プロスタグランジン2-アルファ、血管収縮因子、出血、血管拡張、ヒスタミン、血小板、ケモカイン、表皮成長因子、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ヒスタミン、血小板由来成長因子、セロトニン、フォンビルブラント因子、血餅形成、血小板脱顆粒、補体カスケード、好中球、白血球、マクロファージ、単球、コラゲナーゼ、インターロイキン、腫瘍壊死因子、線維芽細胞、トランスフォーミング成長因子、ケラチノサイト、血管形成、肉芽組織形成、コラーゲン沈着、およびインスリン様成長因子の方法を提供する。
【００２３】
いくつかの態様では、本発明は、分化可能細胞、好ましくは胚性幹細胞または前駆細胞を含む組成物を提供する。別の態様では、組成物は、分化可能細胞、好ましくは胚性幹細胞または前駆細胞の抽出物を含む。別の態様では、組成物は、分化可能細胞、好ましくは胚性幹細胞または前駆細胞に由来する抽出物の成分を含む。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明は、分化可能細胞、好ましくは胚性幹細胞もしくは前駆細胞、分化可能細胞、好ましくは胚性幹細胞もしくは前駆細胞の抽出物、分化可能細胞に由来する抽出物の成分、および/または天然の胎脂、および/または部分合成もしくは全合成された胎脂抽出物の胎脂抽出物および/または胎脂成分を含む組成物を提供する。
【００２５】
いくつかの態様では、本発明は、以下の段階を含む、卵の細胞抽出物または分化可能細胞の細胞抽出物の局所投与法を提供する：卵の細胞抽出物または分化可能細胞の細胞抽出物を含む組成物、および皮膚を有する対象を提供する段階、ならびに抽出物を皮膚に塗布する段階。好ましくは、抽出物中の栄養シグナルが達し、またこれは皮膚細胞に対する栄養として有効である。好ましくは、組成物は、ヒアルロン酸および/またはキトサンを含む、水ベースのゲルである。別の好ましい態様では、抽出物は、液体バンドエイド、または皮膚上で乾燥する流体として作用するスプレーである。別の態様では、液体は、コラーゲンやキトサンなどのゲル形成成分を含む。別の好ましい態様では、組成物は、支持体またはクリーム上の被膜の成分である。
【００２６】
本発明は、皮膚の処置のための、シワの除去のための、皮膚の若返りのための、創傷治癒のための、皮膚の外観の改善のための、皮膚の損傷を防ぐための、皮膚の劣化を予防するための、または皮膚に栄養を提供するための前述の組成物の使用、および本明細書に記載された任意の他の使用も提供する。
【００２７】
本発明はさらに、以下の段階を含む、皮膚への局所適用用の組成物の調製法を提供する：分化可能細胞を提供するか、または分化可能細胞または卵の抽出物もしくは画分を調製する段階；および該分化可能細胞または該抽出物を、皮膚への局所投与用の薬剤によって製剤化して、局所投与に適したクリーム、ゲル、スプレー、エマルジョン、固体、樹脂もしくはマトリックス、軟膏、粉末、またはローションを提供する段階。別の態様では、本発明は、前述の方法で作製された組成物を提供する。
[請求項101]
i)分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分、ならびにii)該細胞もしくは該卵とは異なる供給源に由来する脂質成分を含む組成物。
[請求項102]
精製核酸配列もしくは合成核酸配列、ポリペプチド、炭水化物、脂質、シグナル伝達物質、または天然物、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項101記載の組成物。
[請求項103]
分化可能細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、および成体幹細胞からなる群より選択される、請求項101または102記載の組成物。
[請求項104]
エピジェネティックな阻害剤をさらに含む、請求項101〜103のいずれか一項記載の組成物。
[請求項105]
クリーム、ゲル、エマルジョン、軟膏、スプレー、粉末、またはローションとして提供される、請求項101〜104のいずれか一項記載の組成物。
[請求項106]
分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分を、局所投与に適した、クリーム、ゲル、スプレー、エマルジョン、固体、樹脂もしくはマトリックス、軟膏、粉末、またはローションとして含む組成物。
[請求項107]
精製核酸配列もしくは合成核酸配列、ポリペプチド、または天然物、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項106記載の組成物。
[請求項108]
エピジェネティックな阻害剤をさらに含む、請求項106または107記載の組成物。
[請求項109]
分化可能細胞以外の供給源に由来する脂質またはタンパク質の画分をさらに含む、請求項106〜108のいずれか一項記載の組成物。
[請求項110]
脂質画分が、スクアレン、脂肪族ロウ、ステロールエステル、ジオールエステル、トリグリセリド、もしくはステロール、またはこれらの組み合わせを含む、請求項109記載の組成物。
[請求項111]
脂質または該タンパク質の画分が、魚類、エビ、ウニ、カエルの卵もしくは魚卵(fish roe)またはこれらの両方に由来する、請求項109記載の組成物。
[請求項112]
ケラチンまたはフィラグリン(filaggrin)をさらに含む、請求項106〜111のいずれか一項記載の組成物。
[請求項113]
グルタミン、抗感染剤、抗炎症剤、抗酸化剤、および/またはニコチンアミドをさらに含む、請求項106〜112のいずれか一項記載の組成物。
[請求項114]
抗酸化剤が、ビタミンA、C、D、もしくはE、またはこれらの組み合わせである、請求項113記載の組成物。
[請求項115]
ゲルが、ヒアルロン酸およびキトサンからなる群より選択される化合物を含む、請求項106〜114のいずれか一項記載の組成物。
[請求項116]
スプレーがエアロゾルである、請求項106〜115のいずれか一項記載の組成物。
[請求項117]
スプレーが皮膚上で乾燥する、請求項106〜116のいずれか一項記載の組成物。
[請求項118]
スプレー組成物がゲル形成成分を含む、請求項106〜117のいずれか一項記載の組成物。
[請求項119]
請求項101〜118のいずれか一項記載の組成物を対象の皮膚に塗布する段階
を含む、対象の皮膚を処置する方法。
[請求項120]
皮膚組織を、塗布段階に先立って、化学物質、レーザー、または物理的な力によって除去する段階をさらに含む、請求項119記載の方法。
[請求項121]
皮膚の外観が改善される条件下で組成物が塗布され、
皮膚の外観を改善する段階が、瘢痕の外観を改善する段階、シワまたは日焼けによる損傷(sun damage)のある皮膚の外観を改善する段階、および皮膚疾患によって損傷した皮膚の外観を改善する段階からなる群より選択される、請求項119または120記載の方法。
[請求項122]
対象が、起伏のある皮膚または損傷した皮膚を有し、組成物が、該起伏のある皮膚または該損傷した皮膚に、このような皮膚が若返る条件下で塗布される、請求項119〜121のいずれか一項記載の方法。
[請求項123]
以下の段階を含む、分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分を含む組成物の局所投与法:
a)分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分を含む組成物と、皮膚を有する対象とを提供する段階;ならびに
b)該組成物を該皮膚に塗布する段階。
[請求項124]
分化可能細胞の細胞抽出物および卵の細胞抽出物、またはこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞抽出物が、皮膚の細胞に対する栄養として有効である、請求項123記載の方法。
[請求項125]
組成物が、皮膚の創傷に塗布される、請求項123または124記載の方法。
[請求項126]
以下の段階を含む、分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分を含む組成物の局所投与法:
i)a)分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分を含む組成物、
b)皮膚に創傷を有する対象、ならびに
c)創傷包帯
を提供する段階;
ii)該分化可能細胞、該細胞抽出物、該卵抽出物、該細胞抽出物の成分、該卵抽出物の成分を該創傷に塗布する段階;ならびに
iii)該創傷を該創傷包帯で覆う段階。
[請求項127]
創傷包帯が以下を含む、請求項125記載の方法:
i)防水層;
ii)分化可能細胞、分化可能細胞の細胞抽出物、および卵の細胞抽出物、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される細胞成分を含む栄養ゲル層。
[請求項128]
胚性幹細胞、前駆細胞、生殖細胞、魚類、エビ、ウニの卵および/またはカエルの卵の細胞画分を有効量含む、細胞の成長を促す組成物。
[請求項129]
皮膚の処置のため、シワの除去のため、皮膚の若返りのため、創傷治癒のため、皮膚の外観の改善のため、皮膚の損傷を予防するため、皮膚の劣化を予防するため、または皮膚に栄養を提供するための、請求項101〜118のいずれか一項記載の組成物の使用。
[請求項130]
以下の段階を含む、皮膚への局所塗布用の組成物の調製法:
分化可能細胞を提供する段階、または分化可能細胞もしくは卵の抽出物もしくは画分を調製する段階;および
局所投与に適したクリーム、ゲル、スプレー、エマルジョン、固体、樹脂もしくはマトリックス、軟膏、粉末、またはローションを提供するために、該分化可能細胞または該抽出物を、皮膚への局所投与用の薬剤で製剤化する段階。
[請求項131]
請求項130記載の方法によって作製される組成物。
【００２８】
定義
「抗感染剤」とは、ベンジルペニシリン、ペニシリン、ペニシリンG、6-フェニルアセチルペニシリン、ペニシリンV、ミクロノマイシン、クラブラン酸、オキサシリン、デカリニウム、クロキサシリン、スルベニシリン、アンピシリン、シレラール(cilleral)、およびプリンシペン(principen)、ならびにこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００２９】
「抗炎症剤」とは、炎症を緩和する物質を意味する。多くの鎮痛剤は、炎症を緩和することで痛みを和らげる。多くのステロイド(特にグルココルチコイド)は、コルチゾール受容体に結合することで炎症を低減させる。非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)は、シクロオキシゲナーゼ(COX)酵素を打ち消すことで疼痛を和らげる。COX酵素はプロスタグランジンを自発的に合成して炎症を引き起こす。ヒソップおよびヤナギ樹皮(willow bark)(後者はアスピリンの活性成分であるサリチル酸を含む)、ならびにカバノキ、カンゾウ、自然薯(wild yam)、および薬用ニンジンを含むが、これらに限定されない多くの薬用植物は、抗炎症性作用を有する。
【００３０】
「抗酸化剤」とは、酸素による別の物質の破壊を防いだり遅らせたりする、任意のさまざまな物質を意味する。合成および天然の抗酸化剤が、ガソリンおよびゴムの劣化を遅らせるために使用されており、典型的にはビタミンC(アスコルビン酸)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、およびブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)などの抗酸化剤が、腐敗または退色を防ぐために食品に添加されている。ベータ-カロテン(ビタミンA前駆体の1つ)、ビタミンC、ビタミンE、およびセレンなどの栄養素は、抗酸化剤として作用することがわかっている。これらは、他の分子と速やかに反応して酸化と呼ばれる過程で連鎖反応を開始する1つもしくは複数の不対電子を有する分子であるフリーラジカルを除去することで作用する。フリーラジカルは代謝の正常な産物であり；身体は、バランスを取るために、自身の抗酸化剤(例えば酵素スーパーオキシドジスムターゼ)を産生する。しかしながら、ストレス、老化、および汚染大気やタバコの煙などの環境中の供給源は、体内のフリーラジカル数を増やしてバランスを崩す場合がある。反応性の高いフリーラジカルは、健康なDNAを損なう場合があり、ならびに老化に伴う変化(高齢者における失明の主要因である加齢性黄斑変性症など)と、ならびに癌、心臓病、および脳卒中に至る疾患過程と関連づけられている。
【００３１】
「防腐剤」とは、身体の外表面上に存在する細菌、真菌、原虫、およびウイルスを含む、さまざまな微生物を死滅させるか、またはその成長および繁殖を防ぐ物質である。防腐剤の目的は、病原菌による敗血症、感染、または腐敗の可能性を小さくすることである。抗菌剤は、同じ目的を有するが、細菌にのみ作用する。抗生物質は類似の機能を果たし、体内における細菌の成長または繁殖を防ぐ。防腐剤は、アルコール、ヨウ素、過酸化水素、およびホウ酸を含むが、これらに限定されない。防腐剤が、微生物を破壊する能力、および生体組織における作用は極めて多様である。例えば、塩化水銀は強力な防腐剤であるが、敏感な組織を刺激する。これとは対照的に、硝酸銀は病原菌をほとんど死滅させないが、目や喉といった敏感な組織に使用できる。異なる防腐剤が作用に要する時間にも大きな差がある。極めて迅速に作用する防腐剤の1種であるヨウ素は、細菌を30秒以内に死滅させる。他の防腐剤は、より緩やかで、より残存性の作用を有する。多様性は極めて大きいので、特定の基準に対する、防腐剤の作用を測定するための系が考案されている。フェノールと比較時の防腐剤の(同じ条件、かつ同じ微生物に対する)静菌作用は、そのフェノール係数として知られる。
【００３２】
「キトサン」は、ベータ-1,4-結合グルコサミンポリマーであり、キチンとは異なり、存在しても少数のN-アセチル残基しか含まない。キトサンは、エビ、イセエビ、およびカニなどの甲殻類の外骨格に存在する多糖であるキチンから得られる。これらの殻を轢くことで粉末状にすることができる。この粉末が後に脱アセチル化されることで、キトサンによる脂質の吸収が可能となる。
【００３３】
「コラーゲン」とは、一般にGly-X-Y(式中、Glyはグリシン、Xはプロリン、およびYはプロリンまたはヒドロキシプロリンを意味する)のパターンに従う配列を有する、コラーゲンポリペプチドのアルファ鎖を含む任意のさまざまな物質を意味する。コラーゲンタンパク質は、かなりの量のグリシンおよびプロリンも含む。ヒドロキシプロリンおよびヒドロキシリシンは、リボソームによって直接挿入されない。これらは、ビタミンCが必要とされる翻訳後修飾の酵素過程における、プロリンおよびリシンに由来する。これは、ビタミンCの不足が、歯の喪失、およびコラーゲンの不足、または欠損型のコラーゲンによる結合組織の強度の低下に起因する、あざの生じやすさ(easy bruising)に至る疾患である壊血病を引き起こし得る要因と関連する。線維芽細胞と呼ばれる細胞は、コラーゲンを含む体内の結合組織におけるさまざまな繊維を形成する。哺乳類の大半の結合組織のマトリックスを構成する白色コラーゲン(white collagen)は、タンパク質コラーゲンのよりあわされた繊維からなる。コラーゲン繊維は、コラーゲンのサブユニットであるトロポコラーゲンの球状の単位からなる。トロポコラーゲンサブユニットは、生理学的条件下で自然に自律的に、多数の水素結合および共有結合によって安定化された、ずれた構造(staggered array)に配列する。トロポコラーゲンのサブユニットは、個々の鎖がさらに右巻きのらせんである左巻きの3本鎖である。したがって、トロポコラーゲンはコイルドコイルであると見なされる場合がある。
【００３４】
コラーゲンは皮膚の弾性に関与し、分解すると、老化に伴うシワの元となるが、これは身体の他の多くの部位で、以下のようなタイプの多様な形状で生じる：I型コラーゲン-これは、組織が修復によって治癒時に生じる最終産物である瘢痕組織中に存在する人体で最も量の多いコラーゲンである；II型コラーゲン-耳介軟骨；III型コラーゲン-これは肉芽組織のコラーゲンであり、より強固なI型コラーゲンの合成前に、若い線維芽細胞によって速やかに産生される；IV型コラーゲン-基底層；V型コラーゲン-I型に付随する大半の間質性組織；VI型コラーゲン-I型に付随する大半の間質性組織；VII型コラーゲン-上皮；VIII型コラーゲン-一部の内皮細胞；IX型コラーゲン-II型に付随する軟骨；X型コラーゲン-肥大性軟骨および石灰化軟骨；XI型コラーゲン-軟骨；XII型コラーゲン-I型およびIII型と相互作用する。
【００３５】
特定の態様と関連して、「コラーゲン調節物質」とは、コラーゲンの単位または任意のタイプのコラーゲンの形成もしくは破壊を促進可能な、さまざまな物質を意味する。
【００３６】
「ゲル」とは、コロイド溶液から形成される半固形の材料である。重量的にはゲルは、ほぼ液体であるが、固体のような挙動を示す。一例はゼラチンである。
【００３７】
「ケラチン」とは、さまざまな生組織の構造単位として作用する、任意のさまざまな繊維性タンパク質分子である。ケラチンは、毛髪、羊毛、爪、角、蹄、および羽毛の軸の主要タンパク質成分である。これらのタンパク質は一般に、大量の硫黄含有アミノ酸、特にシステインを含む。らせん状のケラチン分子は、相互に2回ねじれて、中間径フィラメントと呼ばれる拡張した鎖を形成する。ケラチンの個別のポリペプチド鎖上の2つのシステイン中の硫黄原子間でジスルフィド橋が形成されることで、これらの鎖が架橋され、かなり強固な凝集体が生じる。
【００３８】
「フィラグリン(filaggrin)」とは、ジスルフィド結合の形成を介して、最終分化中の哺乳類の表皮のケラチンの中間フィラメントと相互作用する、任意のさまざまなフィラメント結合タンパク質である。
【００３９】
「免疫調節物質」とは、免疫系に影響を及ぼす、任意のさまざまな物質を意味する。例には、サイトカイン、インターロイキン-2、免疫賦活物質、および免疫抑制物質が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
「天然物」という表現は、分子の配置が、アミノ酸、タンパク質、ポリペプチド、および核酸の配列、ならびに飽和脂肪酸を除く、生物における酵素による変換に由来する、任意のさまざまな有機化合物部分を意味する。例には、脂質(すなわち飽和脂肪酸ではない脂質)、炭水化物/糖類、および多糖類、ステロイド類およびこの誘導体、テルペン類およびこの誘導体、ビタミン、カロテノイド、およびタキソールなどの生薬などが含まれるが、これらに限定されない。「合成天然物」は、その天然の供給源からは得られない天然物である。
【００４１】
本明細書で用いる「遺伝子」という表現は、ポリペプチドすなわちタンパク質前駆体の産生に必要な制御配列およびコード配列を含むDNA配列を意味する。ポリペプチドは、完全長のコード配列によって、または所望のタンパク質活性が保持される限りにおいて、コード配列の任意の部分によってコードされる場合がある。
【００４２】
本明細書で用いる「ヌクレオシド」という表現は、ペントースに共有結合的に連結された、プリン[グアニン(G)もしくはアデニン(A)]塩基またはピリミジン[チミン(T)、ウリジン(U)、もしくはシチジン(C)]塩基からなる化合物を意味し、「ヌクレオチド」は、そのペントースのヒドロキシル基の1か所がリン酸化されたヌクレオシドを意味する。
【００４３】
本明細書で用いる「核酸配列」とは、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、およびこれらの断片もしくは一部を意味し、ならびに1本鎖もしくは2本鎖の場合があり、およびセンス鎖もしくはアンチセンス鎖である、ゲノム起源もしくは合成起源のDNAまたはRNAを意味する。
【００４４】
本明細書で用いる「アミノ酸配列」とは、ペプチドまたはタンパク質の配列を意味する。
【００４５】
本明細書で用いる「ペプチド核酸」とは、ヌクレオシドがホスホジエステル結合ではなくペプチド結合によって連結されたオリゴマー分子を意味する。抗遺伝子剤(anti-gene agent)とも呼ばれる、このような小さな分子は、核酸の相補的(テンプレート)鎖に結合することで転写物の伸長を停止させる(Nielsen et al. (1993) Anticancer Drug Des., 8:53-63)。
【００４６】
アミノ酸配列に関する「バリアント」とは、1つもしくは複数のアミノ酸(通常は関連するアミノ酸)が相互に異なるアミノ酸配列を意味するように使用される。異型は、置換されるアミノ酸が類似の構造特性または化学的特性を有する「保存的な」変化(例えばロイシンとイソロイシンの置換)を有する場合がある。まれにはバリアントは、「非保存的な」変化、例えばグリシンとトリプトファンの置換を有する場合がある。類似の小さな変化は、アミノ酸の欠失または挿入(すなわち付加)、またはこの両方を含む場合もある。どのアミノ酸残基が、またいくつのアミノ酸残基が、生物学的活性または免疫学的活性を失うことなく、置換、挿入、欠失され得るのかという判断に関する手引きは、当技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えばDNAStarソフトウェアに搭載されている場合がある。
【００４７】
アミノ酸配列またはタンパク質に関して、本明細書で用いる「一部分(portion)」という表現(「アミノ酸配列の一部分」のように使用)は、当該タンパク質の断片を意味する。断片は、4アミノ酸残基からアミノ酸配列全体の内1アミノ酸を差し引いた範囲のサイズを取り得る。
【００４８】
本明細書で用いる「精製(された)」という表現は、天然の環境から除去されたか、単離されたか、もしくは分離された、核酸、リボ核酸、脂肪酸、またはアミノ酸の配列を含むが、これらに限定されない分子を意味する。したがって、「単離された核酸配列」は、精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、天然の状態では結合している他の成分を、少なくとも60%含まない、好ましくは少なくとも75%含まない、およびより好ましくは少なくとも90%含まない。
【００４９】
「癌」とは、未分化細胞の増殖を特徴とする悪性新生物を有する、任意のさまざまな細胞性疾患を意味する。病的な細胞は実際には周辺組織に浸潤し、および新たな身体部位に転移しなければならないことは意図されない。癌は、身体の任意の組織を含む場合があり、および個々の身体部分で多種多様な形状を有する場合がある。大半の癌は、癌が最初に発生する細胞または器官の種類によって命名されている。
【００５０】
「細胞」とは、いずれも半透性の膜によって囲まれた1つもしくは複数の核、細胞質、およびさまざまな細胞小器官からなる、自律的に機能可能な、生命体の最小の構造単位を意味する。細胞は、任意の発生段階における、生きている動物または死んだ動物の身体、ならびに精子および卵(栄養および保護性の外被とともに卵細胞もしくは胚からなる動物の生殖体)を含む生殖細胞から得られるか、またはこれらに由来する全ての体細胞を含む。細胞の一般的なカテゴリーである、原核生物および真核生物の両方が含まれる。本発明における使用が想定される細胞は、全ての界のあらゆる生物体(植物、動物、原生生物、菌類、古細菌、および真正細菌)に由来する、あらゆる種類の細胞を含む。幹細胞は、連続的な分裂によって、多種多様なレベルの特殊化した細胞の産生が可能な細胞である。例えば造血幹細胞は、赤血球と白血球の両方を産生する。ヒトは、受胎から死まで幹細胞を含むが、成体では、その分化能力は減じる。
【００５１】
細胞に関して本明細書で用いる「分化」という表現は、発生能が進行的に制限される、細胞が構造的および機能的に特殊化され、機能の特殊化の進行が胚の発生中に生じ、ならびに特殊化した細胞、組織、および器官の形成に至る過程を意味する。
【００５２】
細胞に関する「脱分化」という表現は、細胞が構造的および機能的に弱く特殊化され、細胞の発生能が高まる、分化とは逆の過程を意味する。
【００５３】
「分化可能である」とは、細胞が所望の細胞タイプに分化する能力を意味する。本明細書で用いる「分化する」という表現は、特殊化(分化)、または、より未分化なタイプの細胞への復帰(脱分化)を意味する。
【００５４】
本発明で「細胞抽出物」および「卵抽出物」に関連して使用される「抽出物」とは、化学的もしくは機械的な作用によって、または圧力、蒸留、蒸発などによって得られる、上記で定義された任意のタイプの細胞の調製物を意味する。抽出物は、細胞の全体、または活性成分の濃縮調製物を含む、任意の1つの成分もしくは成分の組み合わせを含む場合がある。抽出物のこのような成分は、ペプチドおよびタンパク質、炭水化物、またはこれらの組み合わせを含む、RNA、DNA、脂質、全てのアミノ酸の基礎構造を含むが、これらに限定されない。本発明で想定される抽出物は、魚類の卵、ウニの卵、カエルの卵、成体幹細胞、植物の種子、および植物の幹細胞の抽出物を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
「成長培地」とは、微生物または細胞を培養して成長させる際に使用される組成物である。さまざまな種類の細胞を成長させる、さまざまな種類の培地が存在する。成長培地の最大の差は、培地中における細胞の成長に使用される培地(細胞培養は植物または動物に由来する特定の細胞タイプを使用する)と、微生物(通常は細菌または酵母)の成長に使用される培地にある。このような差は生物体全体に由来し、培養液中で成長された細胞が、インビボには通常存在するホルモンや成長因子などの特定の要件の供給なしには、しばしば成長不能であるという事実のために生じる。動物細胞の場合は、これらの要件は、培地への血清の添加によって提供されることがしばしばある。このような培地は、pH指示薬を含めるために、赤色またはピンクを呈している場合が多い。胚性幹細胞用の成長培地は好ましくは、最小必須培地、すなわちイーグル培地：アミノ酸、塩類(硝酸第二鉄九水和物、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム)、ビタミン類(アスコルビン酸、葉酸、ニコチンアミド、リボフラビン、B-12)、またはダルベッコ培地：鉄、グルコース；非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、β-メルカプトエタノール、L-グルタミン、ウシ胎仔血清、および白血病抑制因子(LIF)を追加的に含む。微生物の場合は単細胞生物であることが多いため、このような制限はない。他の1つの大きな差は、培養中の動物細胞は、細胞が接着する平面上で成長することが多いということ、および培地が、細胞を覆う液体状で提供されることである。大腸菌(実験室で最も一般的に使用される微生物)などの細菌は、固体培地上または液体培地中で成長させることが可能であり、液体栄養培地は一般に栄養ブロスと呼ばれる。微生物に好ましい成長培地は、栄養ブロスまたはルリア-ベルターニ(Luria-Bertani)培地(L-B培地)である。液体培養で成長する細菌は、コロイド状懸濁液を生じることが多い。寒天(ゲルを形成する物質)が液体培地に添加されると、ペトリ皿中に注いで培養液を固化させることが可能となり(寒天プレートと呼ばれる)、微生物の培養が可能な固体培地となる。
【００５６】
ある態様では、「皮膚に接着する」とは、接着剤、ペースト、または粘液などの任意のさまざまな接着物質によるようにくっつくか、もしくは固定されることを意味する。
【００５７】
「脂質」とは、水には不溶であるが非極性有機溶媒には可溶の脂肪、油、ロウ、ステロール、およびトリグリセリドを含み、触れるとべたつく任意の一群の有機化合物を意味する。主要な一群の脂肪は、脂肪酸、グリセロール由来の脂質(脂肪および油およびリン脂質を含む)、スフィンゴシン由来の脂質(セラミド、セレブロシド、ガングリオシド、およびスフィンゴミエリンを含む)、ステロイドおよびこの誘導体、テルペンおよびこの誘導体、一部の芳香族化合物、ならびに長鎖アルコールおよびロウを含む。生きている生物体では、脂肪は、細胞膜の基礎として、および燃料貯蔵部位として働いている。脂肪は、タンパク質または炭水化物と結合した状態で存在することが多く、結果として生じる物質は、リポタンパク質およびリポ多糖として知られる。脂溶性ビタミンは脂質に分類可能である。リポソームは、脂肪を水または水溶液と混合することで形成される球状の小胞である。リポソームは、その全体性が、胃内および小腸内のリパーゼによって壊されるまで保持されるため、数種類の薬剤(例えばインスリンや一部の抗癌剤)の経口投与に使用されている。
【００５８】
ある態様では、物質を含むゲルである「栄養ゲル層」が、典型的には成長培地に含まれる。
【００５９】
ある態様では、対象の「特殊化した細胞」は、細胞が、このような細胞の分化や、対象の組織に対する曝露が、免疫系が、分化した細胞に対する抗体を産生しない条件で生じる、特徴的な免疫同定可能なマーカーを有することを意味する。例えば、A型抗原またはB型抗原の一方もしくは両方を有する赤血球が、対応する抗体に曝露されると、これらは凝集、すなわち塊を形成する。ヒトは通常、自らが欠く赤血球抗原に対する抗体を有する。したがって、対象の特殊化した赤血球は、適切な血液型の赤血球となり得る。移植拒絶の原因は、T細胞による外来MHC抗原の認識、およびこのようなT細胞が活性化されてエフェクターである細胞傷害性T細胞またはヘルパーT細胞になることである。T細胞の活性化は、MHCが適合するMHCクラスI(特にHLA-B)およびクラスIIのHLA-DRの対立遺伝子を発現する有核細胞の血管新生化移植片が、適合する他のMHC抗原より移植の成功に重要な役割を果たす場合に生じ；ならびにMHCの適合の方が、マイナーな組織適合性抗原の適合より重要な役割を果たす。したがって、対象の特殊化したMHC提示細胞は、適合するMHC対立遺伝子を提示する細胞である場合がある。
【００６０】
疾患または条件と関連して使用される、「管理する」という表現は、有益な作用を、予防薬または治療薬が投与される対象に提供するが、疾患の治癒には至らないことを意味する。ある態様では、対象には、疾患の進行または悪化を予防するために疾患を管理するために、1種類もしくは複数の予防薬または治療薬が投与される。
【００６１】
本明細書で用いる、「予防する(prevent)」および「予防(preventing)」という表現は、再発、拡散、または発症の予防を含む。本発明が、完全な予防に制限されることは意図されない。いくつかの態様では、発症は遅れるか、または疾患の重症度は低下する。
【００６２】
本明細書で用いる、「処置する(treat)」および「処置(treating)」という表現は、対象(例えば患者)が治癒し、および疾患が根絶される場合に限定されない。むしろ本発明は、単に症状を軽減するか、および/または疾患の進行を遅らせる処置も想定する。
【００６３】
ある態様では、「防水層」は、水を実質的に通さない材料もしくは繊維か、または水の実質的な浸透を防ぐことが意図される密封剤の層を意味する。
【００６４】
本明細書で用いる「輸送用溶媒(transport vehicle)」という表現は、損なわれていない皮膚もしくは皮膚細胞または他の体細胞への浸透を促すことが可能な物質を含む。「輸送溶媒」という表現は、「浸透剤」という表現と同意語として使用される。このような輸送溶媒は、以下を含むが、これらに限定されない：リン脂質、ミリスチン酸パルミチル、DMSO、ポリマーもしくはキトサンの懸濁物またはマトリックス、リポソーム、トロージャンペプチド、シャリオットペプチド、小弾性小胞、微粒子(コラーゲン、グリコサミノグリカン、硫酸コンドロイチン、キトサン、または多糖などの天然由来材料から作製された、機能が付与された媒体)、ナノ粒子(脂溶性物質を有し、および皮膚内へのカプセル化材料の生物学的利用能を高める)、調製済み球状ビーズおよびスポンジ、単層および/または多層小胞(クリーム基材中の抽出物の内容物を安定化し、皮膚内への輸送を促す)、レチノール分子フィルム流体(角質層を介して活性物質の輸送を促す薄い均一の単層フィルム)、ポリアクルロニトリル(活性成分の放出を、生成物の有効性を運ぶ感覚マーカーとしての香料と同期させる制御放出系を含むポリマー)、ベータ-グルカン(皮膚への浸透を促すオート麦繊維、Redmond, Int. Journ. Cosmetic science 2005)、プロピレングリコール(薬剤の担体として、鉱油ベースのクリーム/ローションなどで最も適切に作用する)、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル、ジメチルイソソルビド、ジメチルホルムアミド、サリチル酸メチル(これらはいずれも皮膚を介した吸収を高める)、長鎖オレイン酸(プロピレングリコールベースの製剤中の組成物の浸透に不可欠な角質層内の二重層を破壊する)、pH、水和および皮膚への局所代謝を調節可能な物質。これらの因子を修飾する薬剤は、活性のある疎水性の薬剤を含む溶媒、活性成分の脱イオン化、皮膚の水和(担体溶液/クリーム/溶媒の水分)の亢進、乳酸(pHを変化させる)を含む。
【００６５】
本明細書で用いる「NANOG」という表現は、ホメオボックス遺伝子を意味する。NANOGは、幹細胞が多種多様な細胞の作製を可能としながら制限無く複製することに必要であると考えられている。この遺伝子は、実験室における胚性幹細胞の成長を促し、幹細胞を不死化に導く、潜在的なマスター遺伝子である。
【００６６】
本明細書で用いる「OCT4」という表現は、成体幹細胞を含む体細胞では活性でないが、胚性幹細胞および生殖細胞で発現される遺伝子を意味する。OCT4は、胚性幹細胞の多能性の維持に不可欠である。
【００６７】
本明細書で用いる「SOX2」という表現は、性別決定領域Y(SRY)ボックス2タンパク質のコード遺伝子を意味する。このイントロンを含まない遺伝子は、胚の発生の調節および細胞運命の決定に関与する、SRY関連HMGボックス(SOX)ファミリーの転写因子の成員をコードする。
【００６８】
本明細書で用いる「GAPDH」という表現は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼをコードするハウスキーピング遺伝子を意味する。この遺伝子は、細胞の維持に必要な基本的な機能に関与する。ハウスキーピング遺伝子は、構成的に発現される。
【００６９】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞および組織、好ましくは皮膚の健康および損傷の改善、およびより好ましくは、老化した皮膚もしくは損傷した皮膚の、若々しく健康な外観への修復に関する。いくつかの態様では、本発明は、細胞、細胞または卵の抽出物、および該抽出物に含まれる精製核酸配列もしくは合成核酸配列、ポリペプチド、または天然物を含むが、これらに限定されない、分化を誘導可能な抽出物成分の組成物に関する。いくつかの態様では、細胞は、分化可能細胞、好ましくは幹細胞または卵である。いくつかの好ましい態様では、抽出物は水性抽出物である。いくつかの態様では、抽出物は鳥類供給源以外に由来する。いくつかの態様では、組成物は、外表面層の除去後における皮膚および/または創傷への組成物の塗布を含む方法で使用される。いくつかの態様では、本発明は、細胞の脱分化、および/または再分化後における脱分化の方法に関する。いくつかの態様では、本発明は、皮膚疾患の管理、予防、および処置に関する。
【００７０】
所望の表面への組成物の塗布は、薬剤曝露前に組成物が皮膚または他の表面に塗布されるように、予防的な場合がある。組成物の塗布は、治癒的な場合、例えば、曝露された皮膚表面の天然もしくは薬剤による治癒中に、損傷した皮膚表面をさらに保護するため、または保護表面を提供するためである場合がある。組成物の塗布は例えば、皮膚表面が薬剤に曝露されないように、保護的な場合がある。
【００７１】
本発明は、身体表面への局所適用用の分化可能細胞の抽出物または成分の使用に関する。したがって本発明は、美容および治療目的の使用に関する方法および組成物を提供する。本発明は、任意の特定のタイプの分化可能細胞の抽出物または成分の使用に限定されない。実際には、哺乳類の胚性幹細胞、哺乳類の成体幹細胞、臍帯血細胞、魚類、エビ、またはウニの卵および胚、ならびに両生類の卵および胚を含むが、これらに限定されない任意の生物体に由来する、さまざまなタイプの細胞および分化可能細胞の使用が想定される。
【００７２】
いくつかの態様では、本発明は、原始状態に脱分化中の既存の上皮/表皮細胞に関する(細胞は幹細胞能力を有し、ならびに皮膚の全ての層(表皮、真皮、および皮下)の再生に妥当で必要な細胞を改善可能である)。多くの分化した細胞が、典型的には、それらの運命をたどるが、脱分化が生じる場合がある。有尾両生類および硬骨魚は、喪失した解剖学的部位を、創傷領域中の上皮細胞の遊走、脱分化、増殖、および再分化の過程によって置換可能である。分化細胞の核の機能的な再プログラミングは、多能性の胚性幹細胞(ESC)の誘導によって、および未受精卵への核移植後のクローン動物の生児出生によっても説明される。
【００７３】
本明細書で用いられる可塑性という表現は、1つの組織に由来する細胞が、別の組織の分化した細胞タイプの生成を可能なことを意味する。ツメガエル(Xenopus)の卵は、哺乳類の体細胞の核を再プログラムして、POUファミリーの成員であるホメオドメイン転写因子遺伝子Oct4を、DNAの脱メチル化を必要とする過程によって発現可能である。DNAの脱メチル化も、マウス胸腺細胞と胚性生殖細胞(EGC)の融合後に生じるが、興味深いことに、EG細胞のみが刷込み遺伝子を脱メチル化可能である。神経前駆細胞または骨髄由来細胞とESCの融合によって、多能性のマーカーを発現するハイブリッドを生じる。類似の結果は、ヒト線維芽細胞をESCと融合させることで得られている。胚性癌細胞(ESC)とTリンパ腫細胞の融合も、多能性細胞の転写物をリンパ腫ゲノムから発現するコロニーの形成を促進する。多能性のEG細胞、ES細胞、またはEC細胞の成分は、体細胞ゲノムで再プログラミングを誘発可能である。
【００７４】
体細胞の核の機能は、核および細胞質の抽出物を使用することで改変可能である。なぜなら抽出物は、必要な調節成分を提供するからである。イモリの四肢を再生する抽出物は、分化した筋管細胞における、細胞周期への再進入および筋原性マーカーの発現抑制を促進する。奇形癌腫は、未分化の幹細胞、ならびに内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む場合のある、分化した誘導体を含む特定のタイプの生殖細胞腫瘍である。未分化の癌細胞を培養することで、ECCの系列を作製することができる。ECCは、異所に移植されると悪性奇形癌腫を形成するが；一部のECC系列は、胚盤胞中に導入されると、発生中の胚の組織にも寄与する。
【００７５】
未分化のヒト奇形癌腫であるNCCIT細胞は、縦隔混合型生殖細胞腫瘍から確立することができる。NCCITは、精上皮腫(胚細胞腫瘍の前駆体)と胎生期癌の中間段階にある。NCCITは、全3種の胚葉に分化可能な、発生的に多能性を有する細胞系列であり、未分化の体細胞の抽出物である胚体外細胞系列の誘導体は、体細胞の細胞系列の脱分化を誘発可能である。これについては、Taranger et al.、「Induction of Dedifferentiation, Genome-wide Transcriptional Programming, and Epigenetic Reprogramming by Extracts of Carcinoma and Embryonic Stem Cells」 Mol Biol Cell.(2005)を参照されたい。
【００７６】
幹細胞は、損傷組織で確立可能である。これについては、Menard et al.、「Transplantation of cardiac-committed mouse embryonic stem cells to infarcted sheep myocardium: a preclinical study」 Lancet, 366(9490): 1005-12 (2005)；Goldman 「Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system」 Nat Biotechnol. 23(7):862-71 (2005)；Leri et al.、「Repair of the damaged heart」 Kidney Int. 68(5):1962 (2005)；Levy et al.、「Embryonic and adult stem cells as a source for cell therapy in Parkinson's disease」 J Mol Neurosci. 24(3):353-86 (2004)；Jack et al.、「Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction」 J Urol. 174(5):2041-5 (2005)；Kitmaura et al.、「Establishment of renal stem/progenitor-like cell line from S3 segment of proximal tubules in adult rat kidney」 Kidney Int. 68(5): 1966 (2005)を参照されたい。
【００７７】
いくつかの態様では、本発明は、免疫系を刺激して治療に役立てることが可能な抽出物に関する。例えば抽出物は、fibrogenおよび熱ショックタンパク質を含む場合がある。これらの内因性の細胞成分は、典型的にはストレスを受けた細胞または損傷を受けた細胞で発せられる警報信号である。これらは抗原提示細胞(APC)のToll様受容体(TLR)に結合して、免疫系を損傷領域に対する警戒態勢にする。これについては、Matzinger 「The Danger Model: A Renewed Sense of Self」 Science 296:301-305 (2002)を参照されたい。
【００７８】
いくつかの態様では、本発明は、毛包中に、また毛包周囲に存在する幹細胞などの、皮膚中の既存の幹細胞を刺激して、複製および/または上皮細胞もしくはニューロンに分化させる方法に関する。神経前駆細胞のマーカーであるネスチン(nestin)は、毛包バルジの細胞で発現され、幹細胞として振る舞い、1本1本の毛の成長サイクル中に多くの毛包を形成するように分化する。毛包は動的であり、生涯にわたって成長(成長期)、退行(退行期)、および休止(休止期)を循環する。毛包バルジ領域に位置する幹細胞は、個々の発育期中に濾胞構造を生じる。バルジ毛包幹細胞は、正常な毛包周期中に完全な濾胞および毛髪における全ての上皮細胞タイプを生じ得る。バルジ毛包幹細胞は、毛包マトリックス細胞、皮脂腺基底細胞、および表皮に分化する。創傷に反応して、一部の幹細胞はバルジを出て遊走し、増殖して、漏斗(infundibulum)および表皮を再増殖する。皮膚由来前駆細胞(SKP)と呼ばれる、皮膚の真皮に由来する多能性成体幹細胞は増殖および分化して、ニューロン、グリア、平滑筋細胞、および脂肪細胞を生じ得る。多能性神経冠幹細胞は、成体哺乳類の毛包の真皮乳頭中に存在する。これについては、Amoh et al.、「Multipotent nestin-positive, keratin-negative hair-follicle bulge stem cell can form neurons」、Proc Natl Acad Sci U S A. 12; 102(15):5530-4 (2005)を参照されたい。
【００７９】
骨髄は、3種類の幹細胞集団-造血幹細胞、間質細胞、および内皮前駆細胞を含む。造血幹細胞(HSC)である骨髄幹細胞は、体内の全てのタイプの血液細胞の形成に関与する。骨髄由来細胞は時に、表面マーカーのパネルを使用すると、造血幹細胞または骨髄間質細胞の集団中に選別される。HSCは、使用条件に応じて高度に精製可能か、または部分的に精製可能である。骨髄細胞の集団を分離する別の方法は、成長基質に接着する細胞(間質性細胞)か、または接着しない細胞(造血細胞)を得る分画による。骨髄の間充織幹細胞も、これらの組織を生じ、および骨髄間質性細胞と同じ細胞集団を含む。血管を裏打ちする細胞の1種である内皮細胞に分化する前駆細胞を循環血液から単離することができる。周皮細胞は、骨髄間質性細胞と関連する。
【００８０】
表面マーカーの組み合わせは、骨髄および血液に由来するHSCの同定、単離、および精製に使用される。未分化のHSCおよび造血前駆細胞は、c-kit、CD34、およびH-2Kを発現する。これらの細胞は通常、系統マーカーLinを欠くか、またはこれを極めて低レベルで発現する(Lin-/low)。BM間質性細胞は、HSCとは区別される複数の特徴を有する。2つの細胞タイプがインビトロで分離されている。骨髄がバラバラにされると、骨髄中の細胞の混合物が低密度でプレーティングされ、間質性細胞は培養ディッシュの表面に吸着し、HSCは接着しない。特定のインビトロ条件では、BM間質性細胞は、コロニー形性単位-F(CFU-F)と呼ばれる1個の細胞に由来するコロニーを形成する。これらのコロニーは後に、脂肪細胞または間質性細胞の幹細胞様の性質を示すクローンアッセイ法である骨髄支持細胞(ストローマ細胞)(myelosupportive stroma)として分化する可能性がある。インビトロで分裂しない(か、ある程度は増殖する)HSCとは異なり、BM間質性細胞はインビトロで35回の細胞集団の倍加(population doubling)が可能である。内皮幹細胞は、CD34+(HSCのマーカー)であり、転写因子GATA-2を発現する。これについては、Kocher, et al.、「Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function」 Nat. Med. 7, 430-436 (2001)を参照されたい。
【００８１】
本発明は、動物、植物、原生生物、菌類を含む真核生物、ならびに古細菌および真正細菌の両方の界を含む原核生物の、任意の界の種の任意の多細胞生物に由来する幹細胞を含む任意のタイプの細胞の使用を想定している。多細胞生物は、生物体を構成する組織および細胞を分裂して補充可能な、全能性、多能性(mulitpotent/pluripotent)、および単能性の幹細胞を含む。幹細胞は、哺乳類動物でよく調べられており、全ての動物、例えば昆虫に存在する。ショウジョウバエの成虫は、ヒトの場合と同様の、腸における細胞の調節を制御するものと同じ幹細胞を有する。脊椎動物および無脊椎動物の消化器には、それらの発生、細胞構成、および遺伝子制御に関して広範な類似性が見られる。ショウジョウバエの中腸が典型的であり：腸細胞は腸上皮の単層の大半を構成するが、ホルモンを産生する腸内分泌細胞は分散する。ヒト(およびマウス)の腸管細胞には幹細胞が継続的に補充され、その調節異常は、いくつかの一般的な消化器疾患および癌の基礎となる場合がある。これとは対照的に、幹細胞はハエの腸では報告されておらず、ショウジョウバエの腸管細胞は比較的安定であると考えられている。系統標識(lineage labelling)によって、ショウジョウバエ成虫の後方の中腸細胞が、腸幹細胞(ISC)の明瞭な集団によって継続的に補充されていることが報告されている(Benjamin Ohlstein and Allan Spradling, The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells, Nature, online december 7 2005)。
【００８２】
動物の幹細胞に加えて、植物も幹細胞を含む。植物のシュートおよび根の分裂組織における幹細胞は、植物の一生を通じて継続して維持されており、および植物体を構成する体細胞の娘細胞を産生する。植物の幹細胞は、インビボおよびインビトロで、体細胞に由来する場合もある(Plants stem cells: divergent pathways and common themes in shoots and roots. Byrne ME, Kidner CA, Martienssen RA. Curr Opin Genet Dev. 2003 Oct; 13(5): 551-7)。動物の細胞および生物体は運動し、組織および循環性の細胞集団の再生および維持するための細胞分裂を行い、同時反復的に成長し、胚発生中に蓄積された保存された生殖細胞系列を含み、遺伝子異常に対する低い耐性を有し、複雑かつ不完全な胚を産生し、ならびに本質的に無性生殖を示さず、細胞壁をもたない。植物は、生理学的な調節によって反応し、その細胞分裂は、老化に至るまでずっと器官の新規形成に寄与し、植物の成長は連続的であり、反復的であり、および可塑的であり、植物は、予備の生殖細胞系列を有さず、遺伝子異常に対する耐性が高く、その胚は単純にして完全であり、ならびに植物細胞は全能性を有する。植物の幹細胞および種子(植物の配偶子)は、本発明における使用に想定される。動物における全能細胞がまれなのとは対照的に、真菌によって形成されるほぼ全ての細胞は「幹細胞」として機能可能である。担子菌類の真菌の多細胞の子実体は、生物体の摂食期(feeding phase)を形成する同じ種類の糸状の菌糸、すなわち菌糸からなり、視認可能な細胞の分化はほとんど存在しない(Money NP. Mushroom stem cells. Bioessays. 2002 Oct; 24(10):949-52)。
【００８３】
以下のセクションに分けて説明する：A．哺乳類の胚性幹細胞の抽出物；B．成体幹細胞の抽出物；C．臍帯血細胞の抽出物；D．非哺乳類の細胞、卵、および胚の抽出物；E．抽出物の調製法；F．エピジェネティックな阻害剤；G．局所輸送法；H．他の輸送法；I．抽出物の追加成分；J．組成物のプロファイル；K．局所適用；L．治療的使用；M．細胞全体の使用；N．エクスビボ療法およびインビボ療法。
【００８４】
A．哺乳類の胚性幹細胞の抽出物
いくつかの態様では、本発明は、胚性幹細胞、または胚性幹細胞から調製された抽出物を含む組成物を提供する。いくつかの好ましい態様では、細胞または抽出物は、以下に詳述するように、局所適用用に製剤化される。本発明は、任意の特定の種類の胚性幹細胞の使用に限定されない。実際には、無脊椎動物および脊椎動物を含むが、これらに限定されない、動物界のあらゆる種を含む、脊索動物門の種を含む、全ての霊長類、齧歯類、肉食動物、ウサギ目、および偶蹄目の動物を含むが、これらに限定されない哺乳類網のあらゆる種、および重要な点としてあらゆる目を含む、いくつかの動物種に由来する胚性幹細胞の使用が想定される。サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、およびヒツジを含む、これらの動物目の種から多能性細胞を得る方法については文献に記載されている。例えば、米国特許第5,453,357号；第5,523,226号；第5,589,376号；第5,340,740号；および第5,166,065号(いずれも特異的に参照により本明細書に組み入れられる)；ならびにEvans, et al., Theriogenology 33(1): 125-128, 1990；Evans, et al., Theriogenology 33(1): 125-128, 1990；Notarianni, et al., J. Reprod. Fertil. 41(Suppl.):51-56, 1990；Giles, et al., Mol. Reprod. Dev. 36:130-138, 1993；Graves, et al., Mol. Reprod. Dev. 36:424-433, 1993；Sukoyan, et al., Mol. Reprod. Dev. 33:418-431, 1992；Sukoyan, et al., Mol. Reprod. Dev. 36:148-158, 1993；Iannaccone, et al., Dev. Biol. 163:288-292, 1994；Evans & Kaufman, Nature 292:154-156, 1981；Martin, Proc Natl Acad Sci USA 78:7634-7638, 1981；Doetschmanet al. Dev Biol 127:224-227, 1988)；Gileset al. Mol Reprod Dev 36:130-138, 1993；Graves & Moreadith, Mol Reprod Dev 36:424-433, 1993 and Bradley, et al., Nature 309:255-256, 1984を参照されたい。
【００８５】
霊長類の胚性幹細胞は好ましくは、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,843,780号および第6,200,806号に記載された方法で得られる。霊長類(ヒトを含む)の幹細胞は、WiCell(Madison, WI)などの業者から入手することもできる。胚性幹細胞の単離に好ましい培地は「ES培地」である。ES培地は、80%のダルベッコ改変イーグル培地(DMEM；ピルビン酸なし、高グルコース製剤、Gibco BRL)と20%ウシ胎仔血清(FBS; Hyclone)、0.1 mM β-メルカプトエタノール(Sigma)、1%非必須アミノ酸ストック(Gibco BRL)からなる。好ましくは、ウシ胎仔血清のバッチは、試験目的で開発された細胞系列である低継代マウスES細胞系列(ESjt3)のクローンプレーティング効率を検討することで比較される。FBSのバッチは、バッチが、その胚性細胞の成長を支持する能力について大きく変化することがわかっているために比較の必要があるが、FBSのバッチが胚性細胞を支持する能力を調べる任意の他の方法が代替法として用いられる場合がある。
【００８６】
霊長類のES細胞は、ES細胞培地の存在下で、マウスの胚性線維芽細胞のコンフルエント層上で単離される。胚性線維芽細胞は好ましくは、非近交系CF1マウス(SASCO)の12日齢の胎仔から得られるが、他の系統をこれに代えて使用することもできる。組織培養用のディッシュは、好ましくは0.1%ゼラチン(I型；Sigma)で処理される。アカゲザルの胚の回収については、1か月あたり1頭のアカゲザルについて平均0.4〜0.6個の生胚の回収率が報告されている(Seshagiri et al. Am J Primatol 29:81-91, 1993)。マーモセットモンキーからの胚の回収についても詳細に報告されている(Thomson et al. 「Non-surgical uterine stage preimplantation embryo collection from the common marmoset」、J Med Primatol, 23:333-336 (1994))。この場合、透明帯は、プロナーゼ(Sigma)の短時間曝露によって胚盤胞から除去される。免疫手術の場合は、胚盤胞が、DMEMによる1:50の希釈率のウサギ抗マモセット脾臓細胞抗血清(マモセットの胚盤胞の場合)に、またはDMEMによる1:50の希釈率のウサギ抗アカゲザル抗血清(アカゲザル胚盤胞の場合)に30分間曝露され、DMEMで5分間、3回洗浄され、1:5の希釈率のモルモット補体(Gibco)に3分間曝露される。
【００８７】
DMEMによる、さらに2回の洗浄後に、溶解した栄養外胚葉細胞が、損なわれていない内部細胞塊(ICM)から慎重なピペット操作によって除去され、ICMが、マウスの不活性化(3000 radのガンマ線照射)胚性線維芽細胞上にプレーティングされる。7〜21日後に、ICM由来の細胞塊が、内胚葉の成長から、立体顕微鏡下で直接観察しながらマイクロピペットによって除去され、1%トリ血清が添加された0.05%トリプシン-EDTA(Gibco)に3〜5分間に曝露され、および慎重なピペット操作によって、フレームポリッシュマイクロピペットを通して穏やかに解離される。
【００８８】
解離した細胞が、新鮮なES培地中の胚フィーダー層上に再プレーティングされ、コロニーの形成が観察される。ES様の形態を示すコロニーが個別に選択され、上記の手順で再び分けられる。ES様の形態は、高い核：細胞質の比、および顕著な核小体を有する稠密なコロニーと定義される。結果として得られたES細胞は次に、常用の手段で、短時間のトリプシン処理または1〜2週間毎のダルベッコリン酸緩衝食塩水(カルシウムまたはマグネシウムを含まず、2 mM EDTAを含む)に対する曝露によって、培養物が濃厚になるまで分けられる。初期の継代細胞も凍結されて液体窒素中で保存される。
【００８９】
いくつかの態様では、抽出物は、哺乳類の胚性幹細胞から調製される。いくつかの態様では、細胞はリン酸緩衝食塩水(PBS)で、および細胞溶解用緩衝液(100 mM HEPES、pH 8.2、50 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mMジチオスレイトール、およびプロテアーゼ阻害剤)で洗浄され、400 gで沈降され、1容量の冷細胞溶解用緩衝液に再懸濁され、ならびに氷上で30〜45分間インキュベートして膨潤させる。細胞を氷上で200 μlのアリコートを対象に、直径3 mmのプローブ(B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)を接続したLabsonic-Mパルス超音波発生装置を使用して、全ての細胞および核が溶解するまで超音波処理を行う。溶解物を15,000 g、15分間、4℃の条件で沈降させて粗材料のペレットを得る。上清のアリコートを採取し、液体窒素で凍結することで、-80℃で最長9か月間にわたって保存することができる。必要であれば、浸透圧を約300 mOsm(すなわち等張性)への調節に使用する前に、抽出物をH2Oで希釈することができる。
【００９０】
いくつかの態様では、哺乳類の幹細胞の抽出物を含むが、これらに限定されない動物の幹細胞の抽出物が使用されるが、他の態様では、抽出物は単独か、または以下に詳述する他の成分とともに製剤化される。
【００９１】
B．成体幹細胞の抽出物
いくつかの態様では、本発明は、成体幹細胞または成体幹細胞から調製された抽出物を含む組成物を提供する。いくつかの好ましい態様では、細胞または抽出物は、以下に詳述する局所適用用に製剤化される。成体幹細胞は、分化した(特殊化した)組織中に存在する未分化の(特殊化していない)細胞であり；これは自然に再生可能であり、および特殊化して、起源を有する組織の特殊化した細胞タイプを産生する。このような前駆細胞は、組織中に分散した細胞集団としての動物、植物、原生生物、および真菌の界の、あらゆる多細胞生物の成体の分化した組織内に存在する。成体に由来する前駆細胞は、分化能力を元に3つのカテゴリーに分けられる。前駆細胞のこの3つのカテゴリーは、胚盤葉上層様の幹細胞、生殖層系統の幹細胞、および前駆細胞である。前駆細胞は、骨格筋、真皮、脂肪、心筋、肉芽組織、骨膜、軟骨膜、脳、髄膜、髄鞘、靱帯、腱、血管、骨髄、気管、肺、食道、胃、肝臓、腸、脾臓、膵臓、腎臓、膀胱、および睾丸を含むが、これらに限定されない、さまざまな組織から単離されている。前駆細胞は、体内の結合組織区画から、機械的な破壊および/または酵素による消化によって放出させることが可能であり、ならびに新生期、思春期、および老齢期のマウス、ラット、およびヒト、ならびに成体のウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、およびブタほかの動物から単離されている。
【００９２】
前駆細胞の第1のカテゴリーである胚盤葉上層幹細胞(ELSC)は、全3種類の胚の胚葉系統に由来する細胞を形成する幹細胞からなる。成体ラット由来の幹細胞および成人由来の幹細胞は、身体の結合組織区画から、機械的な破壊および/または酵素による消化によって放出可能である。ラット成体またはヒト成体のいずれかに由来する幹細胞はたいていの場合、緩やかに凍結され、7.5%の超純粋ジメチルスルホキシドを使用して、-80℃±5℃で保存することができる。両種に由来する幹細胞を、凍結状態から大気温度へ迅速に解凍することで、98%を超える回収率が得られる。未分化状態のこれらの細胞は、胚性幹細胞に特徴的なOct-3/4遺伝子を発現する。ELSCは、進行用薬剤、増殖用薬剤、系統誘導用薬剤、および/または組換えヒト白血病阻害因子(LIF)、組換えマウス白血病阻害因子(ESGRO)、または組換えヒト抗分化因子(ADF)などの阻害因子を欠く無血清環境では自発的に分化しない。胚性幹細胞は、このような条件で自発的に分化する。対照的に両種のELSCは、特異的な増殖用および/または誘導用の薬剤、および/または環境の作用を受けない限りは休止状態のままである。
【００９３】
ELSCは増殖して、インビトロで、血小板由来成長因子などの増殖用薬剤の存在下で細胞の多重コンフルエント層を形成し、および系統誘導用の薬剤に反応する。ELSCは、内胚葉系統に属する細胞を形成することで肝細胞成長因子に反応する。細胞系列は、一般的および特異的な誘導用薬剤に曝露されると、外胚葉起源、中胚葉起源、および内胚葉起源の多くの個別の細胞タイプに対する表現型マーカーを発現する。
【００９４】
前駆細胞の第2のカテゴリーは、3種類の異なる幹細胞からなる。個々の細胞は、特定の胚葉系列の細胞(外胚葉系幹細胞、中胚葉系幹細胞、および内胚葉系幹細胞)を形成する。一般的および特異的な誘導剤に曝露されると、胚葉系列の外胚葉系幹細胞は例えば、神経前駆細胞、ニューロン、神経節、オリゴデンドロサイト、星状細胞、シナプス小胞、放射状グリア細胞、およびケラチノサイトに分化可能である。
【００９５】
成体組織中に存在する前駆細胞の第3のカテゴリーは、多数の多分化能、三分化能、二分可能、および単分化能の前駆細胞を含む。固形組織では、これらの細胞は、それぞれの個々の分化した細胞タイプの近傍に存在する。前駆細胞は典型的には、段階特異的な胚抗原-4、段階特異的な胚抗原-1,もしくは段階特異的な胚抗原-3、または癌胎児性抗原細胞接着分子-1などの多能性のELSCの表現型発現マーカーを示さない。同様に、前駆細胞は典型的には、外胚葉系統の細胞に対するネスチンや、内胚葉系統の細胞に対するフェトプロテインなどの、胚葉系列幹細胞の表現型発現マーカーを示さない。
【００９６】
前駆細胞は、多数の細胞タイプを形成する能力を有する、多分化能を有する場合がある。下垂体前葉に存在し、下垂体前葉前駆細胞と呼ばれる外胚葉起源の前駆細胞は多能性前駆細胞の一例である。この細胞は、性腺刺激ホルモン分泌細胞、成長ホルモン分泌細胞、甲状腺刺激ホルモン分泌細胞、副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞、およびプロラクチン産生細胞(mammotroph)を形成する。特定の細胞系統の前駆細胞は、分化(CD)マーカーの細胞表面クラスターの固有のプロファイル、および表現型分化発現マーカーの固有のプロファイルを有する。前駆細胞は典型的には、LIFやADFなどの分化剤の非存在下では、無血清の合成培地では自発的に分化しない。したがって、このような条件で自発的に分化する胚性幹細胞とは異なり、前駆細胞は、増殖性物質(血小板由来増殖因子など)、および/または進行性物質(インスリン、インスリン様成長因子-I、もしくはインスリン様成長因子-IIなど)の作用を受けない限りは、休止状態のまま留まる。
【００９７】
前駆細胞は、その挙動を、移植後に休止状態から増殖状態に活性化し、および新たな衛星細胞と実質的な量の新たに分化した細胞の両方を生じるように、変動する需要にしたがって調節することができる。例えば、筋肉の筋節は、それぞれが数百個の有糸分裂後の筋細胞の核(myonuclei)を含む拡張した合胞体細胞である筋原繊維である。衛星細胞は、筋原繊維の基底層の下部に存在し、筋肉再生中に筋前駆細胞として機能する。筋肉の損傷に反応して、衛星細胞は活性化され、増殖し、および分化し、この間に融合して、損傷した筋原繊維が修復されて置換される。衛星細胞が、その筋原繊維から酵素が関与しない物理的な滴定法で除去されると、酵素による消化によっては達成されない、移植後に実質的な量の新しい筋肉を生成する能力が維持される。酵素による従来の脱凝集法は筋原能を損なう。Collins and Partridge 「Self-Renewal of the Adult Skeletal Muscle Satellite Cell」 Cell Cycle 4:10, 1338-1341 (2005)。
【００９８】
したがって本発明は、上記の幹細胞のような非胚性幹細胞の使用も想定している。いくつかの態様では、間充織幹細胞(MSC)は、骨髄、骨膜、表皮、および中胚葉性起源の他の組織から誘導することができる(例えば、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,591,625号および第5,486,359号を参照)。MSCは、さまざまなインビボまたはインビトロの環境的影響に依存して、特定のタイプの結合組織(すなわち、特殊化に関与する因子(specialized element)を支持する身体の組織；特に脂肪組織、乳輪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、骨髄間質組織、筋肉組織、および繊維性結合組織)に分化する、形成性の多能性の芽細胞である。これらの細胞は、通常は極めて低い頻度で骨髄中に存在するが、培養物中の、すなわちインビトロで骨髄由来の間充織幹細胞を単離、精製、および大規模に複製する多様な方法が報告されている(それぞれが参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,197,985号および第5,226,914号、ならびにPCT Publication No. WO 92/22584も参照)。
【００９９】
造血幹細胞の単離に関しても、さまざまな方法が報告されている(例えば、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,061,620号；第5,750,397号；第5,716,827号を参照)。本発明の方法が、造血幹細胞からリンパ系細胞、骨髄系細胞、および赤血球系細胞の産生に使用可能なことが想定される。B細胞およびT細胞を含むリンパ系列は、抗体の産生、細胞性免疫系の調節、血液中の異物の検出、宿主にとって異物である細胞の検出などを可能とする。単球、顆粒球、巨核球、ならびに他の細胞を含む骨髄系列は、血流中の異物の存在をモニタリングし、新生細胞を保護し、血流中の異物を除去し、血小板を産生したりする。赤血球系列は、酸素の運搬体として作用する赤血球を提供する。
【０１００】
したがって本発明は、発生中の胎児から一般に単離される神経幹細胞の使用も想定している。神経幹細胞の単離、培養、および使用は、いずれも参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,654,183号；第5,672,499号；第5,750,376号；第5,849,553号；ならびに第5,968,829号に記載されている。本発明の方法は、神経幹細胞を使用して、ニューロン、グリア、メラノサイト、軟骨、および頭頚部の結合組織、さまざまな分泌腺の間質、ならびに心臓の流出路の細胞を産生可能なことが想定される。
【０１０１】
いくつかの態様では、抽出物は、哺乳類の胚性幹細胞から調製される。いくつかの態様では、細胞は、リン酸緩衝食塩水(PBS)で、および細胞溶解用緩衝液(100 mM HEPES、pH 8.2、50 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mMジチオスレイトール、およびプロテアーゼ阻害剤)で洗浄され、400 gで沈降され、1容量の冷細胞溶解用緩衝液に再懸濁され、ならびに氷上で30〜45分間インキュベートされて膨潤される。細胞は、200 μlのアリコートについて氷上で、直径3 mmのプローブ(B. Braun Biotech、Melsungen、Germany)が接続されたLabsonic-Mパルス超音波発生装置を使用して、全ての細胞および核が溶解するまで超音波処理される。溶解物は、15,000 g、15分間、4℃の条件で沈降され、粗材料のペレットが得られる。上清のアリコートが採取され、液体窒素で凍結され、および-80℃で最長9か月間、保存することができる。必要であれば、抽出物を、浸透圧を約300 mOsm(すなわち等張性)に調節するために使用する前にH2Oで希釈することができる。
【０１０２】
いくつかの態様では、成体幹細胞の抽出物が使用されるが、他の態様では、抽出物は単独で使用するか、または以下に詳述する他の成分を添加する、いずれかの手法で製剤化される。
【０１０３】
C．臍帯血細胞の抽出物
いくつかの態様では、本発明は、臍帯血細胞、または臍帯血細胞から調製された抽出物を含む組成物を提供する。いくつかの好ましい態様では、細胞または抽出物は、以下に詳述する局所適用用に製剤化される。臍帯血の移植は、血液疾患患者の処置に良好に実施されており；ドナーには、HLAが患者と完全に適合する新生子の同胞が使用されている。移植用の造血幹細胞の供給源としての臍帯血の利点は明らかである。第1に、臍帯血中の造血幹細胞の増殖能は、成体由来の骨髄または血液中の細胞の増殖能を凌ぐ。これらは速やかに増殖するので、1単位の臍帯血中の幹細胞で造血系全体を再構成することができる。第2に、臍帯血の使用は、造血幹細胞の同種間移植の成功に対する主要な障害である移植片対宿主病のリスクを低減する。移植片対宿主病は、レシピエントにおけるHLA抗原に対する移植片中のT細胞の反応に起因し；臍帯血中のリンパ球の未熟さは、この反応を低下させる。欧州における合同研究では、HLAが同一の同胞の臍帯血のレシピエントでは、急性または慢性の移植片対宿主病のリスクが、HLAが同一の同胞の骨髄のレシピエントより低いことが明らかにされている。非血縁ドナーに由来するHLAが適合しない臍帯血の移植を受けた急性白血病児の移植片対宿主病のリスクは、非血縁ドナーに由来するHLAが適合しない骨髄のレシピエントに見られるリスクより低い(Hematopoietic stem-cell transplants using umbilical-cord blood, New England Journal of Medicine, 2001, 344(24):1860-1861, editorial)。
【０１０４】
HLAが適合する同胞または子どもの臍帯血細胞は、抽出物の作製に、または本発明で想定される使用の実施に使用可能であると考えられる。
【０１０５】
D．非哺乳類の細胞、卵、および胚の抽出物
いくつかの態様では、本発明の組成物は、上綱顎口上綱(Superclass Gnathostomata；有顎脊椎動物)、正真口類(Euteleostomi；骨を有する脊椎動物)、条鰭亜綱(Class Actinopterygii；条鰭類)、肉鰭亜綱(Class Sarcopterygii；肉鰭綱および陸生脊椎動物)、四足類(Tetrapoda；四足類)、有羊膜類(Amniota；有羊膜類)、単弓類(Synapsida；爬虫綱単弓亜綱)、哺乳類網(Class Mammalia；哺乳類)、初期獣弓目(Early Therapsida；early therapsids)、爬虫網(Class Reptilia；爬虫類)、無弓亜綱(Anapsida；カメ(tortoiseおよびturtle))、カメ目(Order Testudines；カメ(tortoiseおよびturtle))、双弓類(Diapsida；鳥類、ワニ、トカゲ、ヘビ、および近縁種)、主竜類(Archosauria；鳥類およびワニ)、ワニ目(Order Crocodilia；カイマン、ワニ、および近縁種)、鱗竜亜綱(Lepidosauria；ミミズトカゲ、トカゲ、ヘビ、およびムカシトカゲ)、喙頭目(Order Rhynchocephalia；ムカシトカゲ)、有鱗目(Order Squamata；ミミズトカゲ、トカゲ、およびヘビ)、両生網(Class Amphibia；両生類)、肺魚亜綱(Subclass Dipnoi；ハイギョ)、総鰭綱(Actinistia)、シーラカンス目(Order Coelacanthiformes；シーラカンス)、軟骨魚綱(Class Chondrichthyes；エイ、サメ、および近縁種)、板皮綱(Placodermi；甲冑魚類および板皮綱)、頭甲綱(Class Cephalaspidomorphi)、より好ましくは魚類、エビ、ウニ、または両生類の卵もしくは胚を含むが、これらに限定されない脊椎動物の細胞、卵、および胚の抽出物を使用する。いくつかの態様では、魚類、エビ、ウニ、または両生類の未受精ではあるものの活性化された卵が使用される。本発明は、任意の特定のタイプの卵の使用に限定されない。実際、ツメガエル、エビ、ウニ、サケ、マス、またはゼブラフィッシュの卵を含むが、これらに限定されない、さまざまな卵の使用が想定される。いくつかの態様では、卵は成熟した雌から採取され、水と接触すると自発的に活性化する。別の態様では、卵は、リンゲル生理食塩水で洗浄される。いくつかの態様では、卵は鳥類種に由来しない。
【０１０６】
E．抽出物および画分の調製
本発明の抽出物は、セクションA〜Dに記載された任意の供給源から調製される。いくつかの態様では、抽出物は細胞抽出物である。本発明の細胞抽出物は、幹細胞や卵などが破壊された細胞の組成物である。細胞は、機械的な剪断もしくは混合、超音波処理、または浸透圧溶解を含むが、これらに限定されない、さまざまな方法で破壊することができる。いくつかの態様では、細胞抽出物は好ましくは、さらに処理されて、細胞膜成分などの、天然の状態では細胞と結合する脂質を実質的に含まない組成物を得る。脂質を実質的に含まないという表現は、天然の状態では、細胞抽出物の作製に使用される細胞と結合する脂質を、約1%未満、好ましくは約0.5%未満、およびより好ましくは約0.1%未満の濃度でしか含まないことを意味する。いくつかの態様では、抽出物は、約1%未満、および好ましくは0.1%未満のコレステロールまたはオボアルブミンを含む。したがって、いくつかの態様では、細胞抽出物は、炭水化物、タンパク質、グリコシル化タンパク質または他の修飾タンパク質、ペプチド、アミノ酸、RNA(mRNA、sRNA、miRNA、rRNA)、DNA、水など、およびこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、細胞抽出物は、天然の状態では細胞と結合する少量の脂肪、ならびに染色体、核酸、および核タンパク質などの核成分を含む場合がある。いくつかの態様では、細胞抽出物は好ましくは、核、細胞膜、および天然の状態では細胞と結合する、水に不溶性の他の材料の除去によって調製された細胞質抽出物である。いくつかの態様では、これらの成分は、破壊された細胞の遠心分離または分画によって除去される。いくつかの態様では、細胞抽出物は好ましくは、タンパク質、mRNA、および炭水化物などの水溶性の細胞成分を含む水性抽出物である。
【０１０７】
抽出物は、さまざまな方法で調製することができる。例えば、いくつかの態様では、卵は「乾燥」した状態で、ガラス製の15 mlの遠心チューブ中に配置され、および15,000 gで15分間の沈降によって破砕される。この操作によって、脂質の最上層画分(回収され、アリコートが採取されて凍結)；中間の細胞画分(回収され、アリコートが採取されて凍結)；およびペレット画分(廃棄)の3つの層が得られる。いくつかの態様では、細胞の画分または抽出物は主に、細胞質の内容物を含む。細胞画分は、抽出物として使用される。いくつかの態様では、細胞画分は、脂質画分と混合して使用することができる。細胞質画分はさらに、50,000 g、100,000 g、または200,000 gで沈降させて、主に水溶性の抽出物の画分である、さらなる細胞抽出物を得るように清澄化することができる。必要であれば、使用される画分に無関係に、抽出物を、細胞溶解用緩衝液(上述)で約300 mOsmに希釈することができる。したがって、いくつかの好ましい態様では、卵または胚から抽出された水溶性の抽出物が使用される。
【０１０８】
他の態様では、卵は0.5容量の細胞溶解用緩衝液に懸濁され、全ての卵が溶解するまで氷上で超音波処理される。粒子状の材料は、15,000 g、15分間、4℃の条件で沈降される。上清は抽出物を含む。上述したように、必要であれば浸透圧は、300 mOsmに調節することができる。抽出物は、上記の手順で清澄化することもできる。
【０１０９】
さらに他の態様では、卵は、方法2の手順で細胞溶解用緩衝液に懸濁される。卵は、ガラス製の乳鉢および乳棒(Kontes、A型またはB型)を使用するダウンスによるホモジナイズ(Dounce homogenization)で溶解される。溶解物は沈降されて、上述の手順で処理される。
【０１１０】
いくつかの態様では、胚性幹細胞などの幹細胞の抽出物は同様の手順で調製される。このような態様では、幹細胞は最初に破壊された後に、上記の手順で遠心分離されて、不溶性の細胞残屑が除去される。幹細胞は一般に、極めて少量の脂質材料を含むため、最初の遠心分離によって、ペレット画分と、主に細胞質成分を含む細胞画分の2つの主要画分が得られる。いくつかの態様では、プレート上の細胞、またはフラスコもしくは発酵槽から回収された細胞のいずれかは氷冷PBSで洗浄される。プレート上の細胞の使用時は、細胞がかき取られて、エッペンドルフチューブなどの氷冷遠心チューブに移される。いくつかの態様では、細胞は次に沈降されて上清が除去される。次に細胞が破壊される。いくつかの態様では、低張溶液を細胞に、細胞ペレットに対して約1.5:1〜3.0:1の容量で添加する。適切な低張溶液は、10 mM HEPES pH 7.9、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl 3.33、0.5 mM DTT、および0.2 mM PMSFを含む。いくつかの態様では、次にTriton Xの10%溶液がペレットに添加され(約1/20容量)、およびペレットがボルテックスミキサーで再懸濁される。いくつかの態様では、次に細胞は例えばダウンス・ホモジナイザーでホモジナイズされるか、または超音波処理が行われて、さらに細胞が破壊される。いくつかの態様では、次に細胞残渣を、例えば6,000 RPM、4℃、30秒間の条件で遠心分離してペレットが得られる。次に上清が細胞抽出物として回収される。
【０１１１】
いくつかの態様では、上述の細胞抽出物、および最も好ましくは中間画分が、さらに分画される。FICOL勾配、勾配遠心分離、タンパク質沈殿法、凍結乾燥、サイズ排除クロマトグラフィーやアフィニティクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィー、ゲル分離、高圧液体クロマトグラフィー、ChIP、および免疫沈降法を含むが、これらに限定されない、さまざまな方法を使用することができる。これらの分画段階で、凍結乾燥画分、アフィニティクロマトグラフィー画分、沈降画分などの、対応する画分が得られることが認識されている。
【０１１２】
いくつかの態様では、画分は次に、以下に詳述するように、局所投与用の組成物の調製に適した成分と混合されるか、または再溶解される。
【０１１３】
F．エピジェネティックな阻害剤
いくつかの態様では、本発明の組成物は、エピジェネティックな阻害剤をさらに含む。好ましい態様では、1種類もしくは複数のエピジェネティックな阻害剤は、セクションA〜Eに記載される1種類もしくは複数の細胞抽出物と混合される。本発明は、任意の特定のエピジェネティックな阻害剤の使用に制限されない。実際に、合成されたエピジェネティックな阻害剤、および天然の供給源から単離されたか、または由来するエピジェネティックな阻害剤を含むが、これらに限定されない、多様なエピジェネティックな阻害剤の使用が想定される。エピジェネティックな阻害剤の例は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、および数種類のビタミンを含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
いくつかの態様では、エピジェネティックな阻害剤は、動物性脂肪またはミルク(例えば牛乳やチーズ)に由来するバターなどの天然の食品から作製された酪酸塩または酪酸を含む天然の抽出物、植物油(例えば、ヘラクレウム・ギガンテウム(Heracleum giganteum)(カウ・パースニップ)、およびパスティナカ・サティバ(Pastinaca sativa)(パースニップ))、または昆布茶(発酵によって、酪酸塩を含む酪酸を含む)を含む。抽出物の調製は、偏性嫌気性細菌(例えば酪酸菌(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・クライベリ(Clostridium kluyveri)、クロストリジウム・パストリアヌム(Clostridium pasteurianum)、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ブチルビブリオ・フィブリソルベンス(Butyrivibrio fibrisolvens)、ユーバクテリウム・リモスム(Eubacterium limosum))による発酵を含む場合がある。動物性脂肪または植物油の製品の抽出物を、加水分解によるグリセリドからの酪酸の解放を含む、化学的または物理的な過程で調製することができる。抽出物は、枯草菌(Bacillus subtilis)と、生成した酸を中和するための炭酸カルシウムを添加する、天然食品中の糖またはデンプンの発酵によって調製することもできると考えられる。
【０１１５】
他の態様では、エピジェネティックな阻害剤は、赤ブドウの果汁または発酵果汁(ワイン)の抽出物を含む、フィトアレキシン、レスベラトロールを含む赤ブドウの天然抽出物を含む。抽出物は、ブドウの機械的な破壊、果肉および種子からの皮の分離、ならびに化学的もしくは機械的な方法によるフィトアレキシンの抽出か、または煮沸、分画、アフィニティクロマトグラフィー、凍結乾燥、またはゲル分離を含む、化学的もしくは物理的な方法による、生ブドウ果汁もしくは発酵ブドウ果汁からの調製のいずれかによって調製することもできるであろう。
【０１１６】
他の態様では、エピジェネティックな阻害剤は、細菌や古細菌などの、B12の合成に必要な酵素を含む生物から、または肉類(特に肝臓および貝類)、玉子、ならびに乳製品を含む、このようなB12産生細菌を含む天然物から作られるシアノコバラミン(ビタミンB-12)を含む天然抽出物を含む。抽出物は、ホモジナイゼーションなどの化学的もしくは物理的な方法と、これに続く分画、アフィニティクロマトグラフィー、凍結乾燥、またはゲル分離によって調製することができる。
【０１１７】
他の態様では、エピジェネティックな阻害剤は、ジャガイモ、バナナ、レンズマメ、トウガラシ、テンパ、レバー、シチメンチョウ、マグロ、栄養酵母(もしくはビール酵母)、ビール、またはマーマイトのいずれかから作られるビタミンBの1種類または複数の異型を含む天然抽出物を含む。抽出物は、ホモジナイゼーションなどの化学的もしくは物理的な方法と、これに続く、例えば分画、アフィニティクロマトグラフィー、凍結乾燥、またはゲル分離によって調製可能である。
【０１１８】
他の態様では、エピジェネティックな阻害剤は、レチニルエステルを含む動物供給源(例えばミルクや卵)から、またはプロビタミンAカロテノイドを含む植物(例えば、ニンジン、ホウレンソウ)のいずれかから作られる、レチノイドまたはレチノイド前駆物質を含む天然抽出物を含む。抽出物は、レチノールを生じるレチニルエステルの加水分解によって修飾することができる(動物供給源)が、プロビタミンAカロテノイドを含む植物抽出物は切断されてレチナール(レチンアルデヒド)を生じ得る(これはさらに可逆的に還元されてレチノールを生じるか、または不可逆的に酸化されてレチノイン酸を生じる)。最も詳細が明らかな活性レチノイド代謝物は、この抽出物に添加可能な11-シス-レチナールならびにレチノイン酸の全トランス異性体および9-シス-異性体である。
【０１１９】
DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤の他の例は、5-アザシチジン、5-アザ-20-デオキシシチジン、アラビノシル-5-アザシチジン、5-6-ジヒドロ-5-アザシチジン、5-フルオロ-20-デオキシシチジン、EGX30P、エピガロカテキン-3-ガラート、緑茶ポリフェノール、ヒドララジン、MG98、プロカインアミド、プロカイン、およびゼブラリン(Zebularine)を含むが、これらに限定されない。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の他の例は、アピシジン(Apicidin)、酪酸塩、フェニル酢酸塩、m-カルボキシケイ皮酸ビスヒドロキサミド(CBHA)、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド1(CHAP1)、TSA-トラポキシン(Trapoxin)ハイブリッド、デプデシン(Depudecin)エポキシド、デプシペプチドFR901228、ベンズアミジン、LAQ824、オキサムフラチン(Oxamflatin)、MGCDO103、PXD101、ピロキサミド(Pyroxamide)、スベリン酸ビスヒドロキサン酸(SBHA)、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(SAHA)、トリコスタチンA(TSA)、トラポキシン(Trapoxin)A、バルプロ酸を含むが、これらに限定されない。
【０１２０】
G．局所輸送法
いくつかの態様では、上記の抽出物(または抽出物の成分)は、局所輸送用に製剤化される。局所輸送用の一般的な製剤は、Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing、p.1288〜1300 [1990]に記載されている。したがって、いくつかの態様では、抽出物は、水ベースのゲルもしくはペースト、軟膏、クリーム(無水もしくは含水)、ローション(無水もしくは含水)、エマルジョン、スプレー、溶液、エアロゾル、スティック(固形クリーム)、液体バンドエイド、粉末、吸入スプレー、鼻内スプレー、べーサル・ドロップ(basal drop)、チーク・ドロップ(cheek drop)、舌下薬(sublingual drop)、点眼液またはスプレー、点耳薬(ear drop)またはスプレー、および経皮パッチとして製剤化される。
【０１２１】
H．他の輸送法
いくつかの態様では、上記の抽出物(または抽出物の成分)は、さまざまな方法による輸送用に製剤化される。いくつかの態様では、上記の抽出物は、皮膚、消化器路、沈着脂肪、軟骨、骨、結合組織、筋肉、または内臓への輸送用に製剤化される。いくつかの態様では、抽出物またはこの成分は、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、液体、スラリー、懸濁液、および乳濁液中に、デンプン、ショ糖または乳糖などの、適切な担体を添加または添加せずに、経口投与用に製剤化される。いくつかの態様では、経口輸送用の溶媒は、腸溶コーティングを含む。他の態様では、抽出物もしくはこの成分は、カプセル、クリーム、坐薬、または液剤として直腸内投与用に製剤化される。いくつかの態様では、抽出物またはこの成分は、シリンジによって腹腔に、または内臓もしくは組織内に注入される。いくつかの態様では、抽出物またはこの成分は、浸透圧ポンプによる輸送用に製剤化される。
【０１２２】
さらに他の態様では、抽出物またはこの成分は、マイクロインジェクションによって、好ましくは微粒子銃(すなわち遺伝子銃)経由で輸送される。粒子を介する遺伝子輸送法は当技術分野で既知であり、市販されており、および全体が参照により本明細書に組み入れられる、McCabeによる米国特許第5,584,807号に記載されたガス式遺伝子輸送装置を含むが、これらに限定されない。この方法は、対象となる核酸配列による重金属粒子表面の被覆、および被覆された粒子の、輸送用の圧縮ガスによる圧力下における標的組織への加速を含む。他の粒子衝撃法を利用することもできる。一般に、このような方法は、抽出物またはこの成分の、金、白金、またはタングステンなどの材料の小さな高密度粒子の表面への沈着を含む。次に、被覆された粒子そのもので、金属板などの硬い表面か、またはマイラーなどの壊れやすい材料製のキャリアシートのいずれかをコーティングする。被覆されたシートは次に、標的となる生物組織に向けて加速される。平面シートを使用することで、結果的に核酸試料の標的組織への導入を生じる、一様な条件で粒子を浴びる細胞の数を最大化する加速粒子の均一な拡散が可能となる。本発明は、抽出物または抽出物の成分を上記の手順で送込むための遺伝子銃の記載された使用を想定している。
【０１２３】
さらに他の態様では、胚性幹細胞、成体幹細胞、または卵の抽出物もしくは成分は、(例えば、コラーゲンやグリコサミノグリカンによって)マイクロカプセルに封入され、ナノ粒子に(例えば油のコア中にレシチンで封入される)、リポソームに、マイクロエマルジョンに、またはナノエマルジョンに、油体に、レチノール分子の流体フィルムに、単層小胞に、多層小胞に、調製済み球状ビーズまたはスポンジに、弾性小胞などに成形される。
【０１２４】
I．組成物のプロファイル
いくつかの態様では、局所投与用および/または内臓投与用の組成物は、抽出物と脂質および/または水および/または炭水化物および/または核酸および/またはタンパク質および/またはシグナル伝達物質の混合物である。いくつかの態様では、本明細書に記載された抽出物は、抽出物が作製されるか、または合成バージョンおよび/または天然バージョンの脂質および/または炭水化物および/または核酸および/またはタンパク質および/またはシグナル伝達物質に由来する、細胞全体、または細胞の脂質および/または炭水化物および/または核酸および/またはタンパク質および/またはシグナル伝達物質の組み合わせを含む。シグナル伝達プロファイルは、細胞の抽出物中に含まれる、細胞から放出される活性物質の組み合わせを含み、ならびに抽出物に添加された合成バージョンおよび/または天然バージョンのこれらのシグナル伝達物質を含む。想定されるシグナル伝達物質は、成長因子、エンドルフィン、ホルモン、アミノ酸伝達物質、免疫調節性のサイトカイン、および他の免疫関連因子を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
成長因子-β1は、酸化的ストレスの組織レベルのセンサーとして、照射組織の生物学的側面を調整し、および細胞のDNAの損傷反応に不可欠である。両生類に存在する、このシグナル伝達因子ファミリーの成員であるトランスフォーミング成長因子-β5(TGF-β5)は、四肢の再生時に形成される再生途上の芽体で発現され(King et al., 2003)、およびTGF-βの全ての哺乳類のイソ型は、傷害部位において、さまざまな細胞から局所的に放出され、哺乳類組織の修復中における線維化および瘢痕化の制御に重要な役割を果たす。特定のTGF-βのイソ型を操作することで、マウスにおける創傷の瘢痕を生じない治癒を導くことが可能となる(Ferguson and O'Kane, 2004)。TGF-β1は、免疫寛容につながる、炎症および調節性T細胞の活性の抑制に関与する強力な免疫調節性サイトカインである(Chen and Wahl, 2003)。哺乳類における創傷治癒および免疫抑制に関する研究から、両生類の四肢の断端の再生における異なる活性のTGF-βが、線維化の抑制、および芽体形成を許容する条件の確立に関与している可能性があることがわかっている。
【０１２６】
胚様体由来(EBD)細胞と呼ばれる胚性生殖細胞に由来するヒト多能性幹細胞からインビトロで放出させたトランスフォーミング成長因子-アルファ(TGF-アルファ)および脳由来神経栄養因子(BDNF)は、宿主ニューロンの死滅を防ぐことで動物の神経機能を回復させる能力を有し、および運動ニューロンの細胞体のreafferentationを促す(Kerr DA, et al., Human embryonic germ cell derivatives facilitate motor recovery of rats with diffuse motor neuron injury. J Neurosci. 2003 Jun 15; 23(12):5131-40)。
【０１２７】
FGF-10などの線維芽細胞成長因子(FGF)は、カエルの四肢の再生に重要な役割を果たすことが報告されている(Christen and Slack, 1997；Yokoyama et al., 2000)。
【０１２８】
α-メラニン細胞刺激ホルモン(α-MSH)、エンドルフィン、および複数の他のペプチドホルモンのプロ-オピオメラノコルチン(POMC)前駆体は、再生芽体(King et al., 2003)で、皮膚ならびに脳で、下垂体で、および他の器官で発現される。POMCは、主にα-MSHの活性のために、皮膚中における免疫活性の調節に極めて重要である(Luger et al., 1999)。α-MSHペプチドの傍分泌放出は、強力な免疫調節作用を免疫細胞に対して発揮する。α-MSHは、これまで調べられたあらゆる形状の炎症を阻害し(Lipton et al., 1997)、およびα-MSHの局所的な産生は、皮膚内の特定の部位における最適な免疫応答の維持を促す(Paus et al., 2003)。芽体のα-MSH細胞の発現は、四肢または組織の再成長に必要な線維化および再生の阻害に潜在的に重要な抗炎症作用を付与すると考えられている。
【０１２９】
チモシン-β4は、血管形成、ケラチノサイトの遊走、および創傷治癒を促進することも報告されている胸腺成熟因子である(Malinda et al., 1999)。チモシン-β4は強力な抗炎症活性を発揮し、胸腺に加えて、皮膚、腸、および他の器官のマクロファージおよびTリンパ球から放出される(Young et al., 1999；Girardi et al., 2003)。チモシン-β4は、カエルの偽芽体(pseudoblastema)(King et al., 2003)、および再生途上の芽体でアップレギュレートされ、ならびに失われた四肢の組織におけるチモシン-β4の活性は、上皮の遊走および再生の他の局面の刺激に加えて、炎症応答の免疫調節を含む場合がある。
【０１３０】
J．他の成分
いくつかの態様では、上記の抽出物またはこの成分に他の成分が混合される。いくつかの態様では、このような追加的な成分は、抽出物成分の取り込み、生物学的利用能、または浸透を高める。好ましい態様では、抽出物成分は、天然の成分または合成成分の混合物を含む場合がある。成分は、部分合成または全合成が可能である。いくつかの態様では、細胞もしくは抽出物、または抽出物中に同定される物質から作製された合成成分は、水、皮脂線および表皮の脂肪および細胞抽出物、タンパク質、ならびにこれらの成分を含む、好ましくは重量比で約10%の脂質画分を含む、重量比で約10%のタンパク質画分を含む、および重量比で約80%の揮発性画分を含む組成物と混合される
【０１３１】
胎脂(vernix caseosa、vernix)は、天然の皮膚保護物質である。胎脂は、皮脂、表皮脂質、および妊娠後期に羊水で完全に囲まれた発生中の胎児の皮膚を進行的に覆ってゆく落剥性の上皮細胞を含む、脂質に富む物質である。いくつかの態様では、本発明は、脂質画分が好ましくは、胎脂中の成分、レシチンおよび他のリン脂質、スクアレン、ロウ、ロウエステル、ステロールエステル、ジオールエステル、トリグリセリド、遊離ステロール、およびC12〜C26の鎖長の4クラスの脂肪酸(直鎖飽和、直鎖不飽和、分岐鎖飽和、および分岐鎖不飽和)を含む組成物に関する。好ましい態様では、胎脂の脂質成分は以下の通りである(括弧内は相対パーセンテージ)：スクアレン(9%)、脂肪族ロウ(12%)、ステロールエステル(33%)、ジエステル(7%)、トリグリセリド(26%)、遊離ステロール(9%)、他の脂質(4%)。別の態様では、脂質組成物は、創傷治癒特性を有する、卵および/または魚卵に由来する脂肪を含む(うち30%が保護脂肪(プロテオリピドマトリックス)；コレステロール(1.1%、保護の52.8%)、遊離脂肪酸(0.6%、保護の27.7%)、リン脂質(0.4%)、セラミド(0.7%、保護の20.1%))。別の好ましい態様では、タンパク質画分は、胎脂のタンパク質成分、すなわちケラチン、フィラグリン、調節タンパク質(例えばEGF)、およびグルタミンを含む。
【０１３２】
脂肪族ロウ中の脂肪酸は分岐している場合があり、および分岐鎖脂肪酸はメチル化されている場合がある。タンパク質画分は、表皮由来タンパク質、主にケラチンおよびフィラグリンからなる。タンパク質画分は、表皮成長因子(EGF)などのマイクロモル〜ミリモル濃度の範囲の微量の調節タンパク質、およびサーファクタントAやサーファクタントBなどのナノモル〜マイクロモル濃度の微量のサーファクタントタンパク質も含む。揮発性画分は主に水である。揮発性成分の蒸発の速度は、おそらく水素結合の解離に、および水を液体から気体の状態に変化させるための、脂質成分を介する細胞成分からの拡散に要するエネルギー要件が高いために、比較的緩やかである。他の好ましい態様では、組成物は、細胞抽出物、好ましくは幹細胞抽出物に含まれるmRNAを含む。
【０１３３】
いくつかの態様では、胚性幹細胞、成体幹細胞、または卵の抽出物もしくは成分には、リン脂質または他の親油性物質、ミリスチン酸パルミチル、ジメチルスルホキシド(DMSO)、キトサン、多糖などの長鎖有機ポリマー、非水性溶媒、ベータ-グルカン、pH調節成分、皮膚代謝阻害剤、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイル、または他の天然の油、ジメチルイソソルビド、ジメチルホルムアミド、サリチル酸メチル、長鎖オレイン酸、ムコ多糖、および他の薬剤が混合される。
【０１３４】
いくつかの態様では、他の薬剤は、ユビキチン、抗菌剤(アルファ-デフェンシン、LL37、ベータ-デフェンシンなど)、コレクチンファミリーのサーファクタントタンパク質(コレクチン関連タンパク質AおよびD)、ニコチンアミド、ならびにプソリアシン(psoriacin)を含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
いくつかの態様では、他の薬剤は、ビタミン、抗酸化剤、ミネラル、抽出物、ならびにアルファ-トコフェロール(ビタミンE)、メラニン、ビタミンC、プロビタミンA、プロピオン酸レチニル、レチノイン酸、ビタミンD3、ニコチンアミド(ビタミンB)、ナイアシンアミド(表面皮膚を剥落させるVit B3)、d-パンテノール(損傷の皮膚修復を促す)、ビタミンA、ヒアルロン酸、セラミド、海草(藻類)、鉱油(鉱物油)、ペトロラタム(Petrolatum)、グリセリン、イソヘキサデカン、ライム(Cirtus aurantifolia；ライム)抽出物、微結晶ロウ(cera microcristallina)、ラノリンアルコール、ゴマ(Seamum indicium)の種油、ユーカリ(Eucalyptus globules；ユーカリ)葉油、硫酸マグネシウム、ゴマ種子、アルファルファ(Medicago satvia)種子、ヒマワリ(Helianthus annuus)種子、アーモンド(Prunus dulcis；粉末アーモンド)、ナトリウム、カリウム、銅、カルシウム、マグネシウム、グルコン酸亜鉛、パラフィン、ビタミンEスクシネート、ナイアシン、ベータ-カロテン、オレイン酸デシル、ジステアリン酸アルミニウム、オクチルドデカノール、クエン酸、シアノコバラミン、ステアリン酸マグネシウム、パンテノール、リモネン、ゲラニオール、リナロール、ヒドロキシシトロネラール、シトロネロール、サリチル酸ベンジル、シトラール、メチルクロロイソチアゾリン、メチルイソチアゾリノン、変性アルコール、フレグランス(香料)、ブチレングリコール、シアバター(Byrospermum parkii)、魚類の軟骨抽出物、ポリエチレン、水素化ポリイソブテン、シクロペンタシロキサン、セチルエステル、セテアリルアルコール、マラカイト(Malachite)、ネオペンタン酸イソステアリル、ポリブテン、ショ糖、シリカ、トコトリエノール、キュウリ(Cucumis satvius)果実エキス、ツボクサ(Centella asiatica)エキス、ゴマ種子、ユーカリ葉油、アルファルファ種子、ヒマワリ種子、アーモンド、カリウム、銅、カルシウム、マグネシウム、カフェイン、ヒアルロン酸ナトリウム、リノール酸、グルタミン酸コレステリル/ベヘニル/オクチルドデシルラウロイル、セスキステアリン酸メチルグルコース、コレステロール、ジメチコン、バジル(Ocimum basilicum)、ハッカ(Mentha arvensis；野生ミント)、アクリレート/C10-30アルキルアクリレートクロスポリマー、ジステアリン酸グリセリル、セテアリールグルコシド、ステアレス(Steareth)-10、カルボマー(Carbomer)、アミノメチルプロパノール、リモネン、リナロール、サリチル酸ベンジル、EDTA二ナトリウム、BHT、デヒドロ酢酸ナトリウム、フェノキシエタノール、メチルパラベン、二酸化チタン(CI 77891)、C12-20酸PEG-8エステル、硬化植物油、ペトロラタム(Petrolatum)、ブチレングリコール、グリセリン、アセチル化ラノリン、糖タンパク質、パナクス(Panax)、チョウセンニンジン根エキス、ツクシ(Equisetum Arvense)エキス、カルボマーナトリウム、蜜蝋(cera alba)、セチルリン酸、ポリペルフルオロメチルイソプロピルエーテル、ベンジルアルコール、リナロール、ヒドロキシシトロネラール、アルファ-イソメチルイオノン、アミルシンナマル、ヘキシルシンナマル、ツリーモス(Verenia furfuracea)エキス、ゲラニオール、安息香酸ベンジル、ブチルフェノールメチルプロピオナール、オイゲノール、サリチル酸ベンジル、クロルフェネシン、フェノキシエタノール、およびメチルパラベンなどの化合物を含��が、これらに限定されない。
【０１３６】
K．局所適用
上記の局所適用用の組成物は、美容と治療の両方の目的に有用なことが想定される。治療目的の使用については、セクションJで詳述した通りである。いくつかの態様では、上記の組成物は、皮膚または身体の他の上皮もしくは表皮の表面に直接塗布されることが想定される。組成物は、処方に適切に、1日に1回、2回、または3回、塗布される場合がある。塗布される量は一般に重要ではないが、一般に約0.001 μg〜10 gの抽出物(またはこの成分)を含む組成物が、身体の任意の表面に塗布される場合がある。上述したように、組成物は、補助剤、担体、他の活性成分などの他の成分を含む場合がある。
【０１３７】
いくつかの態様では、本発明は、製品の劣化を防ぐために、好ましくはエデト酸三ナトリウムおよびエデト酸四ナトリウム(EDTA)ならびにトコフェロール(ビタミンE)を含む保存剤および抗酸化剤(ビタミン類を含む)を含む組成物に関する。別の態様では、組成物は、細菌の混入を防ぐための抗菌剤、好ましくはブチルパラベン、プロピルパラベン、エチルパラベン、およびメチルパラベン、DMDMヒダントイン、メチルイソチアゾリノン、フェノキシエタノール(バラエーテル香料の成分も)、クオタニウム(quaternium)-15を含む。別の態様では、組成物は、口紅やほお紅などの、粘性のある製品に使用される増粘剤およびロウ、好ましくはカンデリラロウ、カルナウバロウ、および微結晶ロウ、カルボマーおよびポリエチレンなどの増粘剤を含む。別の態様では、組成物は、希釈用の溶媒、好ましくはブチレングリコールおよびプロピレングリコール、シクロメチコン(揮発性シリコーン)、エタノール(アルコール)、およびグリセリンを含む。別の態様では、組成物は、崩壊して純化する乳化剤、好ましくはモノステアリン酸グリセリン(真珠光沢剤も)、ラウラミドDEA(増泡剤も)、およびポリソルベートを含む。いくつかの態様では、組成物は、着色添加剤-石炭および石油の供給源に由来する合成有機色素、好ましくはD&C Red No.7カルシウムレーキ(および水に溶解しない他の色素)、酸化鉄、雲母(虹色)、およびアミノフェノールを含む。別の態様では、組成物は、酸および塩基を安定化または調整するためのpH調整剤、好ましくは水酸化アンモニウム(皮膚剥離およびヘアウェービングおよび直毛化)、クエン酸(pH調整)、ならびにトリエタノールアミン(主に透明石鹸に使用されるpH調整剤)を含む。別の態様では、組成物は、薬剤、好ましくはケイ酸マグネシウムアルミニウム(吸収剤)、固化防止剤、シリカ(二酸化シリコン)(吸収剤)、固化防止剤、研磨剤、ラウリル硫酸ナトリウム(界面活性剤)、ステアリン酸(クレンジング剤)、乳化剤、タルク(粉末状のケイ酸マグネシウム)(吸収剤)、固化防止剤、およびステアリン酸亜鉛(肌触りを改善する粉末中に使用)、潤滑剤を含む。
【０１３８】
組成物は、記載された成分およびこれらの組み合わせを、1リットルあたり約0.5〜50グラム、好ましくは1リットルあたり約3〜10グラムの総量で含むが、より高い濃度または低い濃度も許容される。このような組成物は、エマルジョン、クリーム、軟膏(salve)などの形状をとる場合があり、活性材料には、水、アルキレングリコール、さまざまな天然および合成のオイル、ペトロラタム、保存剤、着色剤、香料、および美容技術分野における従来の同様の成分が混合される場合がある。
【０１３９】
組成物は、顔面、眼瞼、または他の身体部分に、個人に見合った量で塗布することができる。1 cm2あたり約0.01〜1 g、有利には約0.02〜0.75 g、および好ましくは約0.3〜0.5 gが有用であることがわかっているが、より多い量または少ない量を使用することができる。塗布は週に1回、またはこれより高頻度で、さらには1日に数回、実施することができる。
【０１４０】
本発明の組成物および方法に準じて、本発明の卵、胚、または幹細胞の抽出物を、薬学的に許容される担体を追加的に含む薬学的組成物の状態で塗布することができる。当業者であれば、哺乳類などの動物への抽出物組成物の適切な投与法が利用可能なこと、ならびに特定の組成物を塗布する複数の方法が使用可能であるが、特定の方法および用量では、他の場合より迅速な、およびより有効な反応が得られる場合があることを理解するであろう。薬学的に許容される担体も当業者に周知である。担体の選択は部分的には、特定の組成物によって、および組成物の特定の塗布法の両方によって決定されることになる。したがって、本発明の薬学的組成物には、さまざまな適切な製剤が存在する。
【０１４１】
いくつかの好ましい態様では、本発明の製剤は局所投与用に設計される。このような製剤の典型は、軟膏、クリーム、およびゲルである。
【０１４２】
軟膏は一般に、(1)油性基剤、すなわち不揮発性油や、白色ワセリンや鉱油などの炭化水素からなる基剤、または(2)吸収性の基剤、すなわち無水物質すなわち水を吸収可能な物質(例えば無水ラノリン)からなる基剤のいずれかを使用して調製される。習慣的に、基剤の形成に準じて、油性または吸収性にかかわらず、活性成分(例えばサケ卵抽出物や幹細胞抽出物)が、所望の濃度をもたらす量で添加される。
【０１４３】
クリームは、油/水型の乳濁物である。クリームは、不揮発性油、ロウ、ペトロラタム、鉱油などの炭化水素などを典型的に含む油相(内部相)、ならびに水、および添加塩などの任意の水溶性物質を含む水相(連続相)からなる。2つの相は、乳化剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムなどの表面活性剤；アカシアのコロイド状クレイやビーガム(veegum)などの親水性コロイドなどを使用することで安定化される。乳濁物が形成時に、活性成分(例えば、サケ卵抽出物や幹細胞抽出物)が、所望の濃度を達成する量で習慣的に添加される。
【０１４４】
ゲルは、油性基剤、水、または上記のような乳濁物-懸濁基剤から選択される基剤を含む。基剤には、基剤中でマトリックスを形成して、その粘性を高めるゲル化剤が添加される。ゲル化剤の例には、ヒドロキシプロピルセルロースやアクリル酸ポリマーなどがある。習慣的に、活性成分(IGF-II)が製剤に、ゲル化剤の添加に先立つ時点で、所望の濃度で添加される。
【０１４５】
本発明の製剤に配合される抽出物の量は重要ではなく；濃度は、所望の量の抽出物を輸送する量での創傷領域への製剤の要時塗布(ready application)を十分許容する範囲内にあればよい。
【０１４６】
塗布される製剤の習慣的な量は、製剤中の活性成分の濃度に依存する。いくつかの態様では、抽出物中のタンパク質の量が決定される。続いて、特定の量の抽出物が、タンパク質の量を元に、薬学的に許容される担体中に含められる。一般に製剤は、1 cm2の皮膚あたり約0.1〜約500 μgのタンパク質が塗布される量で創傷に塗布される。好ましくは、タンパク質の塗布量は、約1〜約300 μg/cm2、より好ましくは約5〜約200 μg/cm2の範囲である。他の態様では、特定の容量の抽出物が、薬学的に許容される担体に添加される。したがって、いくつかの態様では、本発明の組成物は、体積/体積ベース(抽出物の体積および薬学的に許容される担体の体積)で、例えば約0.001〜50%の抽出物、約0.01〜50%の抽出物、約0.1〜50%の抽出物、約0.001〜10%の抽出物、約0.01〜10%の抽出物、約0.1〜10%の抽出物、約0.001〜5%の抽出物、約0.01〜5%の抽出物、約0.1〜5%の抽出物、約0.001〜4%の抽出物、約0.01〜4%の抽出物、約0.1〜4%の抽出物、約0.001〜2%の抽出物、約0.01〜2%の抽出物、約0.1〜2%の抽出物、約0.001〜1%の抽出物、約0.01〜1%の抽出物、または約0.1〜1%の抽出物で含む。
【０１４７】
本発明は、必要に応じて、界面活性剤、油および脂肪、多価アルコール、低級アルコール、増粘剤、UV吸収剤、光散乱剤、保存剤、抗酸化剤、抗生物質、キレート剤、pH調整剤、香料添加剤、色素、および水などの、薬学領域で一般に使用される添加剤とともに製剤化することができる。
【０１４８】
界面活性剤の例は、POE-オクチルドデシルアルコールやPOE-2-デシルテトラデシルアルコールなどのポリオキシエチレン(以下、POE-分岐アルキルエーテルと略)、POE-オレイルアルコールエーテルやPOE-セチルアルコールエーテルなどのPOE-アルキルエーテル、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモンイソステアレート、およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル、POE-ソルビタンモノオレエート、POE-ソルビタンモノイソステアレート、およびPOE-ソルビタンモノラウレートなどのPOE-ソルビタンエステル、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、およびグリセリルモノミリステートなどのグリセロールの脂肪酸エステル、POE-グリセリルモノオレエート、POE-グリセリルモノステアレート、およびPOE-グリセリルモノミリステートなどのグリセロールのPOE-脂肪酸エステル、POE-ジヒドロコレステロールエステル、POE-硬化ヒマシ油、POE-硬化ヒマシ油イソステアレートなどのPOE-硬化ヒマシ油の脂肪酸エステル、POE-オクチルフェノールエーテルなどのPOE-アルキルアリールエーテル、グリセロールモノイソステアレートやグリセロールモノミリステートなどのグリセロールエステル、POE-グリセロールモノイソステアレートやPOE-グリセロールモノミリステートなどのPOE-グリセロールエーテル、ジグリセリルモノステアレート、デカグリセリルデカステアレート、デカグリセリルデカイソステアレート、およびジグリセリルジイソステアレートなどのポリグリセロールの脂肪酸エステル、ならびに他の非イオン性界面活性物質；ミリスチン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ベヘン酸、イソステアリン酸、およびオレイン酸などの高級脂肪酸のカリウム塩、ナトリウム塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、アミノ酸塩、ならびに他の塩、カルボン酸エーテルの上記のアルカリ塩、N-アシルアミノ酸、N-アシルサルコネート、高級アルキルスルホン酸、および他の陰イオン性界面活性物質の塩；アルキルアミン塩、ポリアミン、脂肪酸アミノアルコール塩、有機シリコーン樹脂、アルキル四級アンモニウム塩、および他の陽イオン性界面活性物質；ならびにレシチン、ベタイン誘導体、および他の両性界面活性物質を含む。
【０１４９】
油および脂肪の例は、ヒマシ油、オリーブオイル、カカオ脂、ツバキ油、ヤシ油、ウッドワックス(wood wax)、ホホバオイル、グレープシードオイル、およびアボカド油などの植物油および植物性脂肪；ミンクオイルや卵黄オイルなどの動物油および動物性脂肪；蜜蝋、鯨ろう、ラノリン、カルナウバロウ、およびカンデリラロウなどのロウ；液体パラフィン、スクアレン、微結晶ロウ、地蝋、パラフィンロウ、およびワセリンなどの炭化水素；ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、イソステアリン酸、およびベヘン酸などの天然または合成の脂肪酸；セタノール、ステアリルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルデカノール、およびラウリルアルコールなどの天然または高級アルコール；ならびにミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オクチルドデシル、オレイン酸オクチルドデシル、およびオレイン酸コレステロールなどのエステルを含む。
【０１５０】
多価アルコールの例は、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、1,4-ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセロール、ジグリセロール、トリグリセロール、テトラグリセロール、および他のポリグリセロール、グルコース、マルトース、マルチトース、ショ糖、フルクトース、キシリトース、ソルビトール、マルトトリオース、スレイトール、およびエリスリトールを含む。
【０１５１】
増粘剤の例は、アルギン酸ナトリウム、キサンテンガム、ケイ酸アルミニウム、マルメロ種子抽出物、ガムトラガカント、デンプン、コラーゲン、およびヒアルロン酸ナトリウムなどの天然の高分子物質；メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、可溶性デンプン、およびカチオン化セルロースなどの半合成高分子物質；ならびにカルボキシビニルポリマーおよびポリビニルアルコールなどの合成高分子物質を含む。
【０１５２】
UV吸収剤の例は、p-アミノ安息香酸、2-エトキシエチルp-メトキシシンナメート、イソプロピルp-メトキシシンナメート、ブチルメトキシベンゾイルメタン、グリセリル-モノ-2-エチルヘキサノイル-ジ-p-メトキシベンゾフェノン、ジガロイルトリオレエート、2,2'-ジヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン、エチル-4-ビスヒドロキシプロピルアミノ安息香酸、2-エチルヘキシル-2-シアノ-3,3'-ジフェニルアクリレート、エチルヘキシルp-メトキシシンナメート、2-エチルヘキシルサリチレート、グリセリルp-アミノ安息香酸、ホモメチルサリチレート、メチルo-アミノ安息香酸、2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン、アミルp-ジメチルアミノ安息香酸、2-フェニルベンゾイミダゾール-5-スルホン酸、および2-ヒドロキシ-4-メトキシベンゾフェノン-5-スルホン酸を含む。
【０１５３】
保存剤の例は、安息香酸塩、サリチル酸塩、ソルビン酸塩、デヒドロ酢酸塩、p-オキシ安息香酸塩、2,4,4'-トリクロロ-2'-ヒドロキシジフェニルエーテル、3,4,4'-トリクロロカルバニリド、塩化ベンザルコニウム、ヒノキチオール、レゾルシノール、およびエタノールを含む。
【０１５４】
抗酸化剤の例は、トコフェロール、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、ジブチルヒドロキシトルエン、ノルジヒドログアイアレチン酸、および没食子酸プロピルを含む。
【０１５５】
キレート剤の例は、エデト酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウムを含む。
【０１５６】
抗生物質の例は、ペニシリン、ネオマイシン、セファロチン、過マンガン酸カリウム、硫化セレン、エリスロマイシン、バシトラシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、バンコマイシン、ニトロフラントイン、アクリゾルシン、クロロドントイン(chlorodontoin)、およびフルシトシンを含む。
【０１５７】
これらの添加物の一部は、本発明の必須成分の安定性または経皮吸収性を高めることで組成物の有効性を高めるように機能する。
【０１５８】
さらに、溶液、乳濁液、粉末分散液、または他の形状にかかわらず、任意の投与剤形が許容される。適用性は広く、ローション、乳濁液、クリーム、およびゲルなどの基本的な投与剤形が含まれる。
【０１５９】
上記の薬剤に加えて、適切な溶媒、担体、および補助剤は、水、ワセリン、ペトロラタム、鉱油、植物油、動物油、有機および無機のロウ、キサンタン、ゼラチン、セルロース、コラーゲン、デンプン、カオリン、カラゲナン、アラビアゴム、合成ポリマー、アルコール、ポリオールなどのポリマーを含む。担体は、lypizome、マイクロスポンジ、微粒子、またはマイクロカプセル、水性軟膏(aqueous base ointment)、油中水型もしくは水中油型の乳濁液、ゲルなどの徐放性担体を含む場合もある。
【０１６０】
本発明に関して、動物、特にヒトに投与される投与は、妥当な時間枠で治療反応を十分にもたらすべきである。用量は、使用される特定の組成物の強度、および個人の条件によって決定される。用量のサイズおよび塗布の頻度も、特定の組成物の投与に伴う場合のある任意の有害な副作用の存在、性質、および規模によって決定される。
【０１６１】
L．治療的使用
いくつかの態様では、細胞または抽出物の組成物は、水分補給(すなわち、血管内の脱水および創傷における浮腫の処置)、防水(すなわち、創傷における循環血液量低下の補償)、感染防止(すなわち、創傷の感染からの予防)、酸化防止(すなわち、虚血性組織の炎症反応における酸素フリーラジカル産生の予防)、創傷治癒(すなわち、低酸素条件、特に熱傷を負った皮膚または嫌気性代謝における細胞における高い代謝の亢進)に有用である。いくつかの好ましい態様では、組成物は無臭であり(すなわち、揮発性の炭素または窒素を含む化合物が存在しないことの特徴)。
【０１６２】
いくつかの態様では、本発明は、複数の組成物を使用する方法に関する。好ましい態様では、コラーゲン溶解剤または酸によって瘢痕を緩めるか、および/または溶解するために、第1のクリームが使用される。第2のクリームは、本明細書に記載された抽出物またはこの成分、ならびに他の創傷治癒物質を含む。別の好ましい態様では、レーザー、化学薬品による剥離、かみそり、酸、凍結、剥離剤、および/または研磨剤が、本明細書に記載された抽出物またはこの成分、ならびに他の創傷治癒用物質を含むクリームの塗布後における瘢痕またはシワの除去に使用される。
【０１６３】
いくつかの態様では、本発明は第1の組成物、好ましくは創傷治癒を遅らせる、炎症を軽減する、および/または瘢痕形成を低下させるクリームに関する。このような組成物は、数日間にわたって塗布される。好ましい態様では、組成物は、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、好中球の遊走および/または増殖を弱めることが可能な抽出物の成分もしくは成分、マクロファージ、ホスホリパーゼ、アラキドン酸を刺激する抽出物の成分もしくは成分の1種類もしくは複数の組み合わせを含む。別の態様では、組成物に胎脂特性を提供する水、脂質、タンパク質の内容物が含まれる。別の態様では、組成物中の成分は、線維形成サイトカインの活性を低下させる。好ましくは、第1の組成物は約1〜3日間にわたって塗布される。
【０１６４】
別の態様では、本発明は第2の組成物、好ましくは、必要な細胞を刺激することで創傷を治癒するクリームに関する。好ましくはこの組成物は対象に、第1の組成物の塗布後に塗布される。好ましくは、第2の組成物は約3〜14日間にわたって塗布される。この第2の組成物は、コラゲナーゼを調節する、血餅を溶解するプラスミノゲナーゼ(plasminogenase)を活性化する、上皮化(すなわち遊走、増殖、脱分化、再分化)を刺激する、フィブロネクチンおよび線維芽細胞成長因子を活性化する、血管形成を刺激する、線維形成サイトカインの活性を低下させる、ならびにTP53などの遺伝子を調節する、細胞および細胞抽出物の成分を含む。
【０１６５】
別の態様では、本発明は第3の組成物、好ましくはクリームに関する。好ましくはこの組成物は対象に、第2の組成物の塗布後に塗布される。この第3の組成物は、コラーゲンの合成および破壊による、好ましくはコラゲナーゼおよび金属タンパク質、および好ましくはコラーゲンIによるコラーゲンのリモデリングを制御するように、ならびにフィブロネクチン、ヒアルロン酸、およびグリコサミノグリカン、および脱水による腫脹を不活性化するように機能する。第3の組成物は好ましくは、第1および第2の組成物の塗布後に、約1〜6週間にわたって塗布される。いくつかの態様では、キトサンマトリックス、生分解性ポリマーマトリックス、コラーゲンマトリックス、または液体バンドエイドなどのマトリックスが提供される。
【０１６６】
いくつかの態様では、生体適合性の液体中に分散された細胞および/または抽出物の組成物が液体状態で、生理学的に許容される支持構造に付与されて被膜が形成される。被膜は本明細書で、温度依存性の特性を有する、液体状または固体状の、表面および/または界面の覆いと定義される。被膜形性法は、噴霧、押出、吹きつけ、注入、蒸散、被覆、および塗装を含むが、これらに限定されない。分散は、支持体と接触時に融合して被膜を形成する液滴として現われる。
【０１６７】
別の態様では、形成済みの被膜が支持体に付与される。生理学的に許容される支持構造は、滅菌、好ましくはガンマ線照射や加圧滅菌などの、当業者に既知の標準的な滅菌法による滅菌に耐え得る構造である。支持構造は、特定の組成物または組成に限定されず、およびその使用に依存して、滅菌される場合もされない場合もあり、ならびにさまざまな形状を取り得る。
【０１６８】
別の態様では、被膜は、皮膚細胞の成熟を促すために使用され、およびフィルター、膜、ビーズ、粒子などの構造体に付与することができる。同様に支持構造は、特定の状態に限定されず、固体、半固体、ゲルなどの形状を取り得る。1つの態様では、支持体は界面パッド(Interfaces pad)(Winfield Laboratories, Inc., Dallas Tex.)などのナイロンモノフィラメントの干渉性表面材料(interpositional surfacing material)、Biobrane II.RTM.(Sterling Drug Inc., New York, N.Y.)、または適切な空隙率の円形ナイロンフィルター(Micron Separations Inc., Westboro, Mass.)からなる。しかしながら、他の支持材料を本発明の実施に使用することもできるであろう。
【０１６９】
別の態様では、物質曝露や外傷による損傷を処置または予防するために被膜が使用され、および留置型の多様な材料に露出した皮膚部位に直接または間接的に接触するように付与可能である。皮膚部位は、損なわれていない(例えば正常な皮膚)か、または損なわれている場合があり、損なわれているか、または角質層の少なくとも一部を欠く皮膚であると定義される(例えば、問題となっている薬剤、別の薬剤、発疹や接触性皮膚炎などの病理学的条件の存在、切り傷、外傷、もしくは擦傷などの物理的外傷の曝露によって損傷した皮膚、早産児に見られるような未発達の皮膚、表皮の全体もしくは一部の一方が露出した条件、化学的剥奪、皮膚剥離、およびレーザーリサーフェシングなどの再生手順で遭遇する部分厚の創傷などの、真皮の一部が除去された条件)。
【０１７０】
支持構造は、物理的および/または化学的な薬剤を透過可能であり、ならびに、その目的、および包帯もしくは処置を必要とする領域の規模に応じて、さまざまな形状を取り得る。被膜は、熱可塑性フィルム、ブラウンフィルム、および通気性フィルム、ならびに織物、不織布、紡糸布、および縫合布などの、さまざまな天然および合成の繊維組成物などの多様な合成物に付与することができる。本発明は、さまざまな製品に使用することができる。製品の例には、テープ、ガーゼ、接着製品(adhesive product)などの、皮膚に短期間もしくは長期間使用される創傷包帯および創傷被覆材、オストミーケア製品、失禁用おむつ(incontinent pad)、吸収性パッド(absorbent pad)、および検査用パッド(examination pad)などのホスピタルパッド(hospital pad)、使い捨ておよび布製のおむつ、ならびに生理用品(intralabial device)などの女性用衛生製品などがある。
【０１７１】
いくつかの態様では、本発明は、所望の美容上の外観を有する皮膚の機能の再生、および皮膚損傷の予防に関する。別の態様では、早期の瘢痕形成は、創傷形成時に瘢痕防止組成物を使用することで予防される。別の態様では、ストレスを受けた皮膚および老化した皮膚の若返りおよび再生を促すことで、シワの形成が予防される。別の態様では、このような製品は、皮膚の老化に伴って生じる連続的な損傷過程を遅らせるために、間欠的に使用される。
【０１７２】
皮膚は、表皮と真皮の2種類の主な層を有する。これらの下部には、皮下脂肪の層が存在する。皮膚の外表面は、それ自体が基底細胞層、棘層、顆粒細胞層、および角質層の複数の層を含む表皮である。表皮の最深部の層が基底細胞層である。この層では細胞は、連続的に分裂して、肉付きのよい新しい皮膚細胞を生じている。この細胞は皮膚の表面に向かって移動し、下方に存在する分裂中の細胞によって上方に向かって押し上げられる。真皮中の血管(基底細胞層の下方に存在)は、新しい皮膚細胞のこの活発な成長を支えるために栄養を供給する。基底細胞が上方へ移動し、その血液供給から離れると、その細胞内容物および形状は変化する。基底細胞層の上方の細胞は、形状がより不定形となり、および有棘層を形成する。この上方では、細胞が顆粒層中に移動する。真皮中の血液供給から離れるにつれ、細胞は死滅し始めてケラチンと呼ばれる物質を蓄積し始める。
【０１７３】
角質層(「角質(horny)の層」)は表皮の最上層であり、体の外から見える皮膚の層である。この層の細胞は平板であり、うろこ様の(「squamous(扁平上皮の)」)形状である。この細胞は死んでおり、多数のケラチンを含み、および強固で防水性の特性を皮膚の表面に付与する重なり合った層として配置している。死んだ皮膚細胞は、皮膚の表面から絶え間なく剥がれ落ちている。これは、基底細胞層中で分裂する細胞との間でバランスが図られており、このため定常的な再生の状態が生じている。基底細胞層中には、メラニンを産生する細胞も存在する。メラニンは、分裂中の皮膚細胞中に吸収されて、太陽光(紫外光)による損傷に対する保護を促す色素である。皮膚中のメラニンの量は、遺伝子構成および個人の太陽光曝露によって決まる。存在するメラニン色素の量が多いほど皮膚の色は濃くなる。
【０１７４】
表皮の下部には、真皮と呼ばれる層がある。真皮の最上層(表皮の直下の層)には、乳頭と呼ばれる多くの隆起がある。指先には、皮膚の表面が、この隆起パターンに従い、個人に特有の指紋を生じる。真皮は、可変量の脂肪に加えて、皮膚に強度および柔軟性を付与するコラーゲンおよびエラスチン繊維も含む。高齢者では、エラスチン繊維の断片および皮膚の弾性の大半が失われる。これは、皮下脂肪の喪失とあいまって、シワを生じる。血管は、基底層中の分裂中の細胞に栄養を供給し、廃棄物を除去する。血管はまた、身体がその表面から熱を失うことを必要とする場合に拡張し、より多くの血液を運搬することで、体温の維持も促し；身体がその表面から失われる熱の量の制限する必要がある場合には狭まり、より少量の血液を運ぶ。皮膚は一部の神経および腺も含む。
【０１７５】
全体的な皮膚の質および外観は、老化、光老化、にきび、毛穴の拡大、および瘢痕形成を含む、さまざまな疾患の影響を受ける場合がある。経時的な老化の内因性の過程は、表皮および真皮が薄くなること、ならびに弾性が失われることで生じる。この過程は、皮下組織、筋・筋膜(musculofascial)系、表面の筋腱膜系、および顔面の骨格を含む、顔面の全ての層に影響する。この結果、骨の再吸収、皮下脂肪の萎縮、筋繊維系の減弱、および皮膚表面の変化が生じる。真皮-表皮の境界は平板となり、この結果、乳頭間隆起が失われ、および表皮の外観は薄くなる。真皮も薄くなり、弾性繊維、コラーゲン産生、血管分布、および基質は低下・減少する。コラーゲンおよびエラスチンの生化学的変化は、より緩いものの、弾性および弾力の低い真皮につながる。総合すると、これらの変化は、皮膚に細かなシワを生じ、および顔面骨格を覆う組織にたるみを生じる。
【０１７６】
いくつかの態様では、本発明は、皮膚細胞を刺激して自発的に再生させることが可能な抽出物を含む組成物に関する。別の態様では、対象自身の細胞からインサイチューで作製されたテロメアが延長された細胞が対象に再導入される。
【０１７７】
多くの様式で皮膚を再生し、皮膚の質を改善し、シミを減らし、細いシワを和らげ、にきびや他の瘢痕を処置することが可能である。様式には、従来の皮膚剥離、化学薬品による剥離、レーザーリサーフェシング、およびマイクロ皮膚剥離術などがある。新たな成長を刺激するという考えに基づく、皮膚の外層の除去を試みる手法は外観を改善する。皮膚条件の初期の評価は典型的には、紫外光に対する患者の反応および色素沈着の既存の程度を示す、太陽光反応皮膚タイプのフィッツパトリックのスケールを使用して達成される。I型の患者は常に熱傷状態であり、決して日焼けしない。II型の患者は、なんとか日焼けし、通常は熱傷状態である。III型の患者は日焼けするが、時に熱傷状態となる。IV型の患者は、まれに熱傷状態であり、日焼けしやすい。V型の患者は極めて容易に日焼けし、かつ極めてまれに熱傷状態となる。VI型の患者は極めて容易に日焼けし、決して熱傷状態とはならない。
【０１７８】
化学薬品による剥離は、皮膚疾患を改善するための、皮膚の層の化学的な除去である。剥離剤の作用機構は比較的わかりやすい。フェノール(クロトン油やグリセリンなどのさまざまな添加剤を含む)やトリクロロ酢酸(TCA)などの強い薬剤は、いくつかの制御変数および非制御変数に依存して、皮膚のさまざまな深さに化学的な壊死を生じる。弱い薬剤は、pHを十分に変化させて細胞に表面ショックを生じ、および多くの変数に依存して、細胞の損傷または細胞死を引き起こす。保湿剤の使用時は、このような酸は単純に、細胞および細胞間の膨張および膨潤(plumping)を生じるように作用して、細胞およびマトリックスのサイズを一過的に拡大し、ならびに細いしわおよびrhytideを細くする。処置を継続することで、剥離およびつややかな肌(smoother complexion)が得られる。刺激の継続は、トレチノインまたはレチノイドによる処置の多くの同じ作用(すなわち、真皮の厚みの増加、皮膚への血流の増加)につながる場合がある。フェノール剥離剤(「べーカー剤(The Baker formula)」)は、3 cm3のフェノールUSP、88%(49%)；2 cm3の蒸留水(44%)；3摘のクロトン油(2.1%)；および8滴のSeptisol(4.5%)である。
【０１７９】
マイクロ皮膚剥離術は、皮膚を高圧流の結晶で薄く削る。マイクロ皮膚剥離術は、表皮条件に最も有効である。というのは、浅い深さの損傷を生じるからである。浅在性の皮膚条件は、早期の光老化、細いシワ、および浅在性の瘢痕化を含む。マイクロ皮膚剥離術は、皮膚を張った状態において、有効真空状態に置くことで達成される。典型的には、処理領域を非利き手で伸ばし、および利き手でハンドピースを導くことが、この効果を達成するために使用される方法である。頚部の処置時には、頚部を伸ばした状態にすることで、皮膚の張りが保たれるようにする。ハンドピースを処置領域上で、1回の滑らかなストロークで動かす(この動作は繰り返すことも可能)。結晶流の圧力はフットペダルで制御される。額、顎、および鼻の皮膚などの厚い皮膚は、より強く処置することができる(すなわちハンドピースの動きまたは通過回数を調節する)。下眼瞼や頬上部の薄い皮膚を処置する場合は、圧力を低くする。頚部の処置時は、全てのストロークを縦方向とする。
【０１８０】
レーザーリサーフェシング(LSR)は、単独の手順として、または結膜交叉眼瞼形成術(transconjunctival blepharoplasty; TCB)、美容整形、および内視鏡による睫毛挙上(browlift)などの手法に補助的に実施することができる。レーザーの使用によって剥離深度の正確な制御が可能となり、外科医は深度を必要に応じて変えることができるようになる。精度の改善に加えて、LSRは真皮の望ましい加熱を可能とし、これはコラーゲン繊維を強化して線維芽細胞による新生コラーゲンの分泌の促進につながる。顔面皮膚のリサーフェシングには、パルス二酸化炭素およびエルビウム：イットリウム-アルミニウム-ガーネット(Er:YAG)の2種類のレーザー波長の使用が好ましい。個々のEr:YAGパルスは50〜100マイクロメートルの組織を除去するパルス二酸化炭素と比較して、25〜30マイクロメートルの組織のみを除去する。Er:YAGは、より低い側方方向の(collateral)真皮エネルギーを生じる。というのは、熱伝導が約5マイクロメートルであり；パルス二酸化炭素は30〜50マイクロメートルだからである。Er:YAGのレーザー出力がコラーゲンおよび真皮タンパク質によって直接吸収されるのに対し、二酸化炭素レーザーは、真皮中の細胞外水を気化させる。個々のEr:YAGの照射は、同じ量の剥離を生じるが、パルス二酸化炭素は、各照射時に低い蒸散深度(vaporization depth)を生じる。
【０１８１】
本発明の組成物は創傷治癒にも有用である。創傷は皮膚の裂傷である(皮膚の外層は表皮と呼ばれる)。創傷は通常、切断または擦りむきによって引き起こされる。治癒は、一連の現象で始まる傷害に対する反応である。骨を例外として、全ての組織は、ある程度の瘢痕化を伴って治癒する。適切なケアの目的は、感染および瘢痕化の可能性を最小限に留めることである。
【０１８２】
褥瘡は、組織に損傷を生じる間断ない圧迫に起因する慢性の創傷である。褥瘡は、観察される組織損傷のレベルにしたがってI〜IVの段階に分けられる。褥瘡は、入院患者、養護ホーム患者、および脊椎損傷者に極めて一般的に見られる。褥瘡の標準的な処置は、間欠的な包帯交換、圧力の緩和、体位の変換、身体の強化、栄養補給、および感染管理を含む。仮に創傷が重度になれば、外科的な介入は、創傷壊死組織切除(debridement)および皮弁、筋弁、または遊離皮弁の再建を含む。
【０１８３】
本発明は、さまざまな皮膚疾患の処置にも有用である。起伏のある皮膚、変色、および成長は、遺伝的要因、太陽光曝露、および/または医薬品使用を含む、さまざまな因子によって引き起こされる場合がある。皮膚硬結の形成(鶏眼)は、間欠的な圧力および摩擦力による皮膚の肥厚化である。手および足の形状は、鶏眼形成に重要である。特に、中手指節関節および中足指節関節の骨隆起は、重なり合う皮膚摩擦を誘導するような経路で生じることが多い。鶏眼の形成が進むと、履き物に対する摩擦が角質増殖を永続化させる可能性が高い。拘縮および鉤爪足趾、槌趾、および槌状(mallet-shaped)趾を含む足趾変形は、病因に関わっている可能性がある。内反小趾、すなわちlateral fifthの中足骨頭上の皮膚硬結は、基礎となる外側指(lateral digital)神経の圧迫のために神経症状と関連する可能性がある。さらに、第2趾が第1趾より長いモートン趾(Morton toe)は集団の25%に見られ；これは、一般的な第2中足骨頭の皮膚硬結、すなわち難治性の足底の角化症における極めて重要な病原因子の1つである可能性がある。
【０１８４】
ほくろ(母斑)は、相互に接触するメラノサイトの細胞巣である。母斑は典型的には、幼児期に形成が始まる。母斑は太陽光曝露に反応して生じることが示唆されている。しかしながら、母斑には遺伝因子が明らかに関与している。成員が極めて多数の母斑(時には外皮上に散在する150個を上回る母斑)を有する常染色体優性条件を示す家系もある。母斑は、第2度熱傷や日焼けなどの水疱形成後に；毒性を有する表皮壊死症；ならびに表皮水疱症などの遺伝的な水疱性疾患患者で速やかに生じることが観察されている。塩基性線維芽細胞成長因子などの成長因子は、増殖ケラチノサイトによって放出され、メラノサイトの増殖を促すことが示唆されている。メラノサイト系母斑は良性の新生物であるか、またはほとんどが、表皮にコロニーを形成する色素産生細胞であるメラノサイトを含む過誤腫である。メラノサイトは神経冠に由来し、胚発生中に特定の外胚葉部位(主に皮膚およびCNS)へ移動するが、目および耳にも移動する。異所性のメラノサイトは、剖検時に消化器路および尿生殖路に同定されている。先天性のメラノサイト系母斑は、胚発生における異常であると考えられており、したがって形成異常または過誤腫と見なされる場合がある。これとは対照的に、大半の後天的なメラノサイト系母斑は、良性の新生増殖と見なされている。
【０１８５】
異型母斑/変形母斑は、臨床的および組織学的な定義が未だ定まっていない、皮膚の後天性のメラノサイト病変である。異型母斑は、一般的な後天性のメラノサイト系母斑とは、直径および色素の均一性の不在を含む複数の点で異なる。
【０１８６】
あざ(毛細血管腫)は、最も一般的な乳児の良性の眼窩腫瘍の1つである。あざは、典型的には誕生時には存在せず、乳児期に特徴的に速やかな成長を有し、高齢期になると自発的に退縮する、良性の内皮細胞の新生物である。これは、別の既知の一群の小児の血管異常である脈管奇形とは対照的である。リンパ管腫や動静脈奇形などの脈管奇形は、誕生時に存在し、成人期も持続する極めて緩やかな成長を特徴とする。
【０１８７】
萎縮線状(皮膚線条)は、連続的かつ進行的な伸長を受ける皮膚に影響し；身体のさまざまな部分のサイズの拡大のために、大きなストレスが結合組織に加わる。これは腹部および妊娠女性の胸部に、ボディービルダーの肩に、急成長中の青少年に、ならびに過体重者に見られる。皮膚の膨張は見かけ上、後にコラーゲンおよびエラスチンが損なわれる過剰なマスト細胞の脱顆粒に至る。経口コルチコステロイドもしくは局所コルチコステロイドの長期使用、またはクッシング症候群(副腎皮質活性の上昇)は脈理の発生に至る。
【０１８８】
にきびの発生は、毛包脂腺の分布によって決まる。青年期は、adnexal elementの内分泌の成熟を引き起こし、結果的に、ductile系内における細胞生産物の蓄積につながる。細胞生産物に加えて、微生物、最も一般的には、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)や表在性ブドウ球菌(Staphylococcus epidermidis)が共存する。
【０１８９】
酒さは、顔面紅潮の症状、ならびに紅斑、末梢血管拡張、肌あれ、およびにきびに似た、炎症性の膿疱性丘疹の発生を含む一連の臨床症状を特徴とする一般的な条件である。酒さは、少なくとも3か月間は持続する、顔面の中央部の持続的な紅斑であると定義される。支持基準は、紅潮、丘疹、膿疱、および凸面上における末梢血管拡張を含む。二次的な特徴は、灼熱感および刺痛、浮腫、プラーク、乾燥肌、眼の症状、ならびにphymatousの変化である。口囲皮膚炎(POD)は、慢性の丘疹膿疱性の顔面皮膚病である。同疾患は主に若年女性に見られる。病変の臨床的および組織学的な特性は、酒さに似ている。
【０１９０】
いぼは、ヒトパピローマウイルス(HPV)に起因する、皮膚および粘膜の良性の増殖である。現在、100種類以上のHPVが同定されている。ある型のHPVは特定の解剖学的部位で生じる傾向があるが；任意のHPV型のいぼは任意の部位で生じる場合がある。HPV感染の主な臨床症状は、尋常性疣贅、陰部疣贅、扁平疣贅、および深在性の掌蹠いぼ(ミルメシア(myrmecia))を含む。HPV感染のそれほど一般的ではない症状は、限局性上皮過形成(ヘック病)、疣贅状表皮発育異常症、および足底の嚢胞を含む。いぼは、直接または間接的な接触によってうつり、事前準備因子は、正常な上皮障壁の破壊を含む。治療は困難であり、失敗率および再発率は高い。
【０１９１】
陰部疣贅は、上皮内の欠損(例えば皮膚の解離)を介した表皮内へのウイルスの播種によって獲得されるヒトパピローマウイルス(HPV)感染の結果である。反対側の病変へのウイルスの自己接種(autoinoculation)は一般的である。HPV感染の拡散は通常、皮膚関連ウイルスにより、血液感染にはよらない。
【０１９２】
ボーエン様丘疹症(BP)は、性的に活発な男女の陰部に生じる。BPは、ヒトパピローマウイルス(HPV)によって誘導される丘疹として発生し、明瞭な組織病理像(ボーエン様異形成(bowenoid dysplasia))を示す。
【０１９３】
乾癬は、皮膚の非常に速いターンオーバーを特徴とし、および銀鱗状の覆い(silvery scale covering)を有する、慢性で左右対称の紅斑性プラーク様病変のように現われる。古典的な病変は、肘、膝、背中、および頭皮を含む伸側面上に位置する。一様な全身性の病変が生じる場合もある。
【０１９４】
フォン・レックリングハウゼン病では、多数の神経索腫瘍が身体上に現われる。数多くの色素性皮膚病変が生じる。従来型のカフェオレスポットが優勢になる。加えて、色素性虹彩過誤腫(すなわちLisch結節)が一般的である。骨の病変ならびに頭蓋内およびGIの病変および症状が認められる場合がある。
【０１９５】
糖尿病性リポイド類壊死症は、糖尿病患者に典型的に見られる、斑状で、凹状の、萎縮性の黄色い病変である。これは糖尿病と強く関連し、実際に、全身的な疾患の発症の臨床的前駆症状(clinical prodrome)である場合がある。同病変は、下肢以外の部位にまれに見られ、糖尿病ではない場合にはほとんど見られない。同病変は、赤い斑状の領域から、時に潰瘍化する可能性のある萎縮を有する領域へ進行する傾向がある。
【０１９６】
脂漏性皮膚炎は、頭皮、顔面、および体幹の皮脂に富む領域のパターンを示す丘疹落屑性疾患である。皮脂に加えて、この皮膚炎は、マラセジア属(Malassezia)、免疫異常、および補体の活性化と関連する。
【０１９７】
脂漏性角化症(脂漏性いぼ、老人性いぼ、および基底細胞乳頭腫としても知られる)は、進行性で中年期に見られる一般的な良性腫瘍である。同疾患は典型的には、明るい色から暗い茶色まで多様な色の隆起した丘疹状病変である。脂漏性角化症は、滑らかか、または視認可能な穴を有するいぼ状の場合がある。一般的な部位は、顔面、体幹、および四肢を含む。同病変は、有茎性または無茎性の場合もある。黒色丘疹性皮膚症として知られるバリアントは、黒色の皮膚を有する人の額および頬の領域に生じる。
【０１９８】
先端線維性軟ゆう(スキンタグ、線維上皮性ポリープ、軟性線維腫、および繊維上皮性の乳頭腫(fibroepithelial papilloma)としても知られる)は時に、妊娠、糖尿病、および腸ポリポーシス症候群と関連する。これらは、腋窩、鼠径部、および乳房下部領域の間擦部位に、ならびに襟のライン(collar line)に沿った下部頸髄に位置する傾向がある。これらは、柔らかい肉厚の丘疹(soft fleshy papule)であり、通常は、必ずしも必須ではないが有茎性である。
【０１９９】
光線角化症は、最も一般的な太陽光に関連した成長である。光線角化症は主に、顔面、耳、額、および手の背面の、太陽光を浴びる部位に見られる。しかしながら、同疾患は、背中、胸部、および脚などの、長期的または反復的に太陽光に曝露される任意の領域に生じる場合がある。これらは通常、多数の明瞭な平板な、または隆起した、いぼを伴う角化性病変として現われる。病変は典型的には、うろこ(角質増殖)で覆われた紅斑性の基部を有する。これは通常、直径が3〜10 mmであり、より広範囲に、より隆起した病変に徐々に拡大してゆく。時間の経過に伴い、光線角化症は、浸潤性の皮角または皮膚癌となる可能性がある。組織学的には、表皮の変化は、表皮肥厚(acanthosis)、錯角化、および異常角化を特徴とする。細胞異型が存在し、ならびにケラチノサイトは、サイズおよび形状がさまざまである。有糸分裂像は共通している。
【０２００】
ボーエン病は、上皮内癌および扁平類表皮(intraepidermoid)の異常増殖としても知られる。病変は主に、太陽光に曝露されなかった(すなわち保護された)皮膚を含む。古典的には、ボーエン病は陰部を含む。痒みが一般的な愁訴である。外因部の痒みとともに、大陰唇は小陰唇よりも多く関与する傾向がある。病変はうろこ状であり、外皮を有し、紅斑を有する。
【０２０１】
偽上皮腫性増殖症は、下方に真皮中に成長する扁平上皮の舌を特徴とする回復過程に起因する病変である。
【０２０２】
ヤーダッソン(Jadassohn)の脂腺母斑は、皮脂腺およびアポクリン腺、欠損型の毛包、表皮肥厚、および乳頭腫症の因子を発現する過誤腫性病変である。これは、通常は頭皮および顔面に存在する先天性の病変である。この病変は、時間の経過に伴って拡大する傾向がある。
【０２０３】
エリマトーデス(lupus erythematosus; LE)は、ポリクローナルのB細胞の活性化と関連する、非均質な結合組織疾患である。
【０２０４】
皮脂腺腫は、病変の中心部に近づくにつれて末梢性の生殖細胞および多様な皮脂腺の分化を伴う結節状および分葉状の病変である。同病変は、皮脂腺過形成のパターンとして組織化されない。同病変は、結節性硬化症候群の患者の顔面上に現われる過誤腫性の病変とは異なる。
【０２０５】
反転性毛包角化症は、脂漏性角化症の炎症性のバリアントと考えられている。同疾患は一般に、高齢患者の顔面および太陽光曝露部位に見られる。典型的には、この病変は、上眼瞼上に位置する。解剖学的には、これは、毛嚢脂腺小胞の上皮内における上下が逆の、または内部寄生菌による過程である。同病変は単独で、また丘疹または結節として存在する傾向がある。
【０２０６】
毛包上皮腫は、一般的ではない良性病変である。同病変は一般にピンク色〜肌色である。同病変は多発性であることが多く、潰瘍性ではない。このような病変は、毛包の反復発生(recapitulation)である傾向がある。当初、これは思春期に現われる。この病変の典型的な領域は顔面および頭皮であり、ならびに他に頻度は低いが、体幹および頚部である。
【０２０７】
外毛根鞘腫は、球状のグリコーゲンに富む明細胞のパターンを示す良性腫瘍である。時には、中心部におけるケラチン化が肉眼で同定される。
【０２０８】
皮脂腺軟属腫(Molluscum sebaceum)は、自己回復する皮膚腫瘍である。この病変は、中央にケラチンのクレーターを有する古典的にドーム形の隆起である。
【０２０９】
基底細胞癌は、身体の太陽光に曝される部分における、潜行性で、無痛性で、非治癒性の潰瘍または結節として現われる上皮の悪性腫瘍である。頭部の最も一般的な部位は鼻、特に鼻の先端および鼻翼である。リスクは、皮膚のタイプおよび太陽光(特にUV-B光)の曝露の程度と関連する。この腫瘍は色白の人に多く見られる。
【０２１０】
大半の扁平細胞癌は、身体の太陽光曝露領域に現われる。扁平上皮癌(SCC)は、表皮中のケラチノサイトの悪性形質転換および増殖から生じる。SCCは、光線角化症、白斑症、放射線による角化症もしくは皮膚炎、瘢痕、慢性潰瘍、または慢性副鼻腔炎から生じる場合がある。光線角化症患者は、表皮の3分の1〜半分の領域に非定型の扁平上皮細胞を有する。ボーエン病または上皮SCCの患者は、表皮全体に非定型のケラチノサイトを有する。侵襲性のSCCは表皮を含み、真皮に浸潤する。腫瘍は最初に、炎症の中央領域、硬結を拡大および分化する皮膚パッチ、プラーク、ならびに結節として現われ、後には壊死および血液の漏れを生じる。SCCは直接、リンパ性および血行性の拡大によって転移する。
【０２１１】
黒色腫は、メラノサイトの悪性形質転換の結果として生じる腫瘍である。この細胞は神経冠に由来する。黒色腫は通常、皮膚上に生じるが、消化器管や脳などの、神経冠細胞が移動する他の部位に生じる場合がある。
【０２１２】
本発明の組成物は、前述のあらゆる皮膚条件および皮膚疾患の処置に有用なことが想定される。
【０２１３】
本発明の組成物は、熱傷の処置にも有用である。日焼けは、皮膚が紫外光(UVR)を過度に浴びた後に生じる急性の皮膚炎症性反応である。太陽光曝露には、皮膚によるビタミンDの合成を刺激して、放射による温感覚を提供するという有益な効果がある。しかし残念なことに、皮膚が紫外線領域(波長<400 nm)の過度の放射を受けると、有害な作用が生じる場合がある。最も一般的な作用は、急性の日焼けすなわち日光紅斑である。目、特に角膜(眼球前方の透明な窓の組織)は、太陽からの、および溶接のアーク、写真家のフラッドランプ、太陽灯、またはさらにはハロゲン卓上スタンドなどの、紫外光の他の供給源からの紫外光曝露によって容易に損なわれる場合がある。
【０２１４】
重度の熱傷は、液体および電解質の喪失に至る恐れのある皮膚の障壁の崩壊、ならびに全身感染に至る皮膚感染につながる。熱傷は、組織に対する損傷の程度によってランク付けされている。第1度熱傷は、皮膚の最上層(表皮)の損傷を含み、第2度熱傷は、表皮および皮膚の基底層(真皮)を含む。第1度および第2度の熱傷は、部分(partial-thickness)熱傷と呼ばれる場合もある。第3度熱傷は、表皮、真皮、および皮下を冒し、皮膚表面のすぐ下部に見える固まった血管を伴う、皮膚の黒化や、半透明の白色化を引き起こす。これらは、全層熱傷とも呼ばれる。
【０２１５】
重度の熱傷患者の処置は、創傷の早めの洗浄および壊死組織切除、電解質を含む静脈内(IV)流体、全身性抗生物質、局所抗生物質、栄養補給、および疼痛をコントロールする医薬品を含む。一般に、患者の供与部位から採取した皮膚による皮膚移植が創傷領域の閉鎖に必要な場合がある。大規模な熱傷では、自家移植用の皮膚は、創傷を完全に閉鎖するために十分な量を入手できない場合がある。この場合、拡大された自家移植片で創傷が覆われ、創傷を完全に閉鎖するために、死体同種移植片が後に使用される。皮膚移植のドナー部位は、他の開放創傷と同じレベルのケアを必要とする、外科的に作られた創傷である。
【０２１６】
本発明の組成物は、さまざまなタイプの内傷の処置にも有用である。内部組織の創傷は、癌組織の除去や、口唇裂および/または口蓋裂の補正によって生じた疾患などの、手術の結果の疾患である可能性がある。創傷は、口腔、鼻、および消化管の膜上で形成される場合がある。
【０２１７】
口唇裂または口蓋裂は、解剖学的な奇形の結果として、顔面の形状に明瞭に影響し、ならびに小児の食べる能力、話す能力、聞く能力、および呼吸する能力に影響する機能的重要性を有する。特に、両側唇裂の状態で誕生した乳児の場合、外科医は最初に、突き出た前上顎骨、ならびに適切な軸唇の長さ、および再建中に唇に対する鉛直高さの達成の困難に直面する。両側唇裂の手術は多くの点で進んでいるが、この先天性奇形に関連する鼻の奇形の補正は、依然として形成外科手術における最大の課題の1つである。両側唇裂と関連する鼻の奇形の外科的修復は、鼻のさらなる成長および発達に伴って奇形が明瞭となる恐れがあることから困難である。
【０２１８】
顎骨からの癌の除去は、周囲の組織を冒す骨にギャップを生じることがしばしばある。仮骨延長術は、骨が、漸進的で制御された移動を受ける手術で切断された骨性部分間に生じる、正常治癒過程の一部としての新規の骨形成によって延長される手法である。
【０２１９】
口蓋帆咽頭(VP)不全は、正常な括約筋の閉鎖が生じると干渉する上咽頭のレベルにおける、軟口蓋および/または咽頭壁の任意の構造的および/または神経筋の疾患を含む。VP不全は、解剖学的な、筋肉と神経の、行動または疾患の組み合わせに起因する場合がある。
【０２２０】
多形紅斑(EM)は、粘膜の病変を伴う場合もあれば伴わない場合もある、全身に分布する皮膚の隆起を特徴とする、重症度が多様な急性の皮膚粘膜の過敏反応である。より一般的な軽度の疾患である軽症型(EM minor)は、複数の粘膜の表面が関与する皮膚病変からなる。全身に分布する紅斑性の拡大性の筋肉または丘疹は、明るい赤色の境界および点状出血の見られる中央部、小胞、または紫斑を伴う、古典的な虹彩または標的病変に変化する。軽症型のEM、またはスティーブンス・ジョンソン症候群は、より重症であり、皮膚の関与がさまざまな2か所以上の粘膜が関与する。同疾患は内臓を含む場合があり、典型的には全身症状と関連する。皮膚の所見は軽症型EMと似ている場合があるが、より多様で重傷度は高いことが少なくない。出血および壊死を伴うことのある炎症性の小水疱水疱性病変が典型的である。
【０２２１】
鼻炎は鼻粘膜の炎症と定義され、以下の任意の組み合わせからなる複合症状を特徴とする：くしゃみ、鼻づまり、鼻の痒み、および鼻漏。目、耳、洞、および喉が関与する場合もある。アレルギー性鼻炎は、鼻炎の最も一般的な要因である。
【０２２２】
クローン病は、口から肛門に至るGI管の任意の部分に影響を及ぼす場合のある、腸の特発性の、慢性の、貫壁性の炎症性過程である。この条件は、炎症誘発性メディエーターと抗炎症性メディエーター間の不均衡の結果であると考えられている。大半の症例は、小腸、特に回腸終端部を含む。クローン病の特徴的な臨床像は、腸管の瘻管形成(intestinal fistulization)、閉塞、またはこの両方の合併症を伴う場合のある、腹痛および下痢を伴う。初期病変は、陰窩周辺の限局的な炎症性浸潤として始まり、浅い粘膜潰瘍がこれに続く。後に炎症性細胞は深層に浸潤し、この過程で、非乾酪化肉芽腫への組織化が始まる。肉芽腫は、腸壁の全層に、ならびに腸管膜および所属リンパ節中に拡大する。肉芽腫の形成はクローン病に特徴的であるが、その不在は診断を除外しない。初期異常は、関与する粘膜の充血および浮腫である。後に、明瞭な表在性潰瘍が形成し、これが炎症性粘膜の全体にわたって横および縦に位置する深在性の匐行性潰瘍となり、粘膜を丸石様の外観にする。この病変は、分節状であることが多く、健康な領域によって隔てられる。機能性の粘膜の吸収性の表面の喪失の結果、吸収不良が生じる。この現象は、タンパク質-カロリー栄養障害、脱水、および多様な栄養不足につながる場合がある。回腸終端部の関与は、胆汁酸の吸収不良を生じる場合があり、これは脂肪便、脂溶性ビタミン不足、および胆石形成につながる。カルシウムの捕捉による脂肪吸収不良は、シュウ酸塩(通常はカルシウムと結合)の排出の亢進を生じる場合があり、腎石形成につながる。
【０２２３】
胃炎は、有害刺激物質に起因するびらん性胃炎、胆汁および膵液の曝露による逆流性胃炎、出血性胃炎、感染性胃炎、および胃粘膜の萎縮を含む、胃粘膜における炎症性変化が関与する、極めて多数の疾患を含む。消化性潰瘍(PUD)は、酸およびペプシンの分泌に曝露された消化管(胃または十二指腸)の一部における明瞭な粘膜損傷を意味する。びらん性胃炎は通常、重篤な疾患と、またはさまざまな薬剤と関連する。ストレス、エタノール、胆汁、および非ステロイド性抗炎症剤(NSAID)は、胃粘膜の防護壁を破壊して、正常な胃分泌物による攻撃を受けやすくする。短いらせん形の微好気性グラム陰性桿菌ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の感染は、PUDの主要原因であり、およびNSAIDによって誘導されない実質的に全ての潰瘍と関連する。
【０２２４】
経口ヘルペスは、単純ヘルペスウイルスに起因する感染症である。このウイルスは、痛みを伴うびらんを、唇、歯肉、舌、口蓋、および頬の内側に生じる。発熱や筋肉痛などの症状を引き起こす場合もある。
【０２２５】
本発明の組成物はさらに、治癒過程のさまざまな相の促進に有用である。治癒過程には、さまざまな相がある。炎症期は、損傷そのものによって開始される。炎症期は、止血および炎症を特徴とする。出血し、血管が直ちに狭くなり、血餅が生じ、およびさまざまな化学物質が創傷中に放出されて治癒過程が始まる。特殊化した細胞は、残渣の創傷を数日間かけて除去する。創傷形成中に露出したコラーゲンは、(内因性および外因性の両経路で)凝固カスケードを活性化して炎症期を開始する。組織の損傷が生じた後に、創傷の形成によって損傷した細胞膜は、強力な血管収縮物質であるトロンボキサンA2およびプロスタグランジン2-アルファを放出する。この初期反応によって、出血を抑えやすくなる。短時間後に、毛細血管の拡張が局所ヒスタミンの放出によって生じ、炎症細胞が創傷床に移動可能となる。
【０２２６】
第1の反応細胞である血小板は、表皮成長因子(EGF)、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ヒスタミン、血小板由来増殖因子(PDGF)、セロトニン、およびフォンビルブランド因子を含む複数のケモカインを放出する。これらの因子は、血餅形成を介して創傷の安定化を促す。これらのメディエーターは、出血を制御するように、および損傷の規模を制限するように作用する。血小板の脱顆粒は、補体カスケード、特に好中球に対する強力な化学誘引物質であるC5aも活性化する。炎症期は持続し、より多くの免疫反応細胞が創傷に移動する。創傷に移動する第2の反応細胞である好中球は、残渣の除去、補体による細菌のオプソニン化、および酸化的バースト機構(すなわちスーパーオキシドおよび過酸化水素の生成)による細菌の破壊に関与する。好中球は細菌を死滅させ、創傷から異物の残骸を除く。創傷中に存在する次の細胞は、白血球およびマクロファージ(単球)である。編曲家とでも言うべきマクロファージは、創傷治癒に不可欠である。数多くの酵素およびサイトカインがマクロファージによって分泌される。これらは、創傷を除去するコラゲナーゼ；線維芽細胞(コラーゲンを産生する)を刺激して血管形成を促すインターロイキンおよび腫瘍壊死因子(TNF)；ならびにケラチノサイトを刺激するトランスフォーミング成長因子(TGF)を含む。この段階は、組織再生の過程、すなわち増殖期への移行の指標となる。
【０２２７】
増殖期では、細胞のマトリックスすなわち格子が形成される。このマトリックス上に、新たな皮膚細胞および血管が形成される。これは、治癒創傷にピンク色または赤紫色の外観を付与する新しい細い血管(毛細血管として知られる)である。このような新しい血管は、再建途上の細胞に酸素および栄養を供給して、新しい細胞の成長を支え、およびタンパク質(主にコラーゲン)の産生を支える。コラーゲンは、新たな組織の構築時の枠組みとして作用する。コラーゲンは、最終的な瘢痕中の主要な物質である。
【０２２８】
上皮化、血管形成、肉芽組織形成、およびコラーゲン沈着は、創傷治癒の同化部分(anabolic portion)の増殖期に関与する。上皮化は、創傷修復の初期に生じる。基底膜が損なわれていなければ、上皮細胞は正常なパターンで上方に移動する。これは、第1度の皮膚熱傷と等価である。上皮の前駆細胞は、創傷の下部で完全な状態を維持し、表皮の正常な層は2〜3日中に回復する。仮に第2度または第3度の熱傷のように基底膜が破壊されると、創傷は、末梢の正常細胞から、および損なわれていなければ皮膚付属器(例えば毛包、汗腺)から上皮化する。
【０２２９】
TNF-アルファが刺激する血管形成は、内皮細胞の移動および毛細血管の形成の指標である。新しい毛細血管は栄養を創傷に運び、および肉芽組織床の維持を促す。創傷床への毛細血管の移動は、適切な創傷治癒に極めて重要である。肉芽期および組織の蓄積には、毛細血管によって供給される栄養が必要であり、供給がなされないと、慢性的に治癒されない創傷となる。血管形成を修飾する機構については研究が進行中であり、治癒過程を改善する大きな可能性が秘められている。
【０２３０】
肉芽組織の形成中に、線維芽細胞は分化し、基質を産生し、後にはコラーゲンを産生する。基質は創傷床中に蓄積し；次にコラーゲンが、創傷が修復の最終相に進むにつれて蓄積する。創傷修復の増殖期には、多種多様なサイトカインが関与する。制御の段階および正確な機構は詳しくは解明されていない。このようなサイトカインには、PDGF、インスリン様成長因子(IGF)、およびEGFなどがある。
【０２３１】
リモデリング段階中に、フレームワーク(コラーゲン)は、より組織化されて組織を強固にする。血管密度は低くなり、および創傷は、そのピンク色を失い始める。6か月の間に、同領域は強度を増し、最終的には非損傷皮膚の70%の強度に達する。成熟期には、創傷は収縮を受け、最終的に少量の見かけ上の瘢痕組織を生じる。過程の全体は動的な連続体であり、各相は重複し、リモデリングを継続する。創傷は、1年後の時点でに最大強度に達し、張力強度は正常皮膚の30%となる。コラーゲンの沈着は長期にわたって継続するが、コラーゲン沈着の正味の増加は21日後にプラトーに達する。
【０２３２】
上皮化は、新しい皮膚細胞すなわち上皮細胞が定着する過程である。皮膚は、外部環境と身体の間に防護壁を形成する。その主な目的は、過度の水の喪失および細菌の進入を防ぐことである。この層の再構築は、損傷から数時間以内に開始し、24〜48時間以内に、清浄な縫合された(stitched)創傷として完了する。開放創は7〜10日を要する場合がある。なぜなら炎症性過程が長期にわたり、これが瘢痕化に寄与するからである。瘢痕化は、損傷が皮膚の深層を超えて(真皮中に)拡大すると生じる。
【０２３３】
創縫合の3つのカテゴリーは、一次、二次、および三次である。一次治癒は、その発生から数時間以内における創傷の閉鎖を含む。二次治癒は、正式な創縫合を含まず；創傷は収縮および再上皮化によって自然に閉鎖する。遅延一次縫合(delayed primary closure)とも呼ばれる三次創縫合は、長期間に及ぶ創傷の初期壊死組織除去、およびこれに続く、縫合または別の機構による正式な閉鎖を含む。
【０２３４】
本発明の組成物はさらに、瘢痕の処置に単独で、または既知の瘢痕処置と組み合わせることで有用である。開放創は、創傷感染を含むいくつかの合併症、ならびにケロイド、拡大性瘢痕、および肥大性瘢痕を含む、外観を損なう瘢痕を生じる場合がある。ケロイドと肥大性瘢痕はいずれも、皮膚表面上で過度に治癒する創傷である。ケロイドと肥大性瘢痕の差は、ケロイドが創傷が当初のサイズおよび形状を超えて拡大を続けるのに対し、肥大性瘢痕は当初の創傷の制限内において拡大する点にある。いずれも赤色を呈して隆起状の場合があるが、ケロイドは成長の発現を続け、肥大性瘢痕は時間の経過とともに消失する傾向がある。いずれも外科的切除後に再発する場合があるが；ケロイド性瘢痕の再発の方が一般的である。拡大性瘢痕は通常は、治癒過程中に、創傷縁に垂直方向の張力に反応して分離する創傷である。肥大性瘢痕はケロイドより一般的である。肥大性瘢痕は、任意の年齢で、または任意の部位で生じる場合があり、自然に消失する傾向がある。一般に肥大性瘢痕は処置に強く反応する。ケロイドが黒人に多く見られるのに対し、肥大性瘢痕は、ケロイド形成の傾向があることが証明されている任意の人種で生じる場合がある。ケロイドは10〜30歳の人で多く見られ、肥大性瘢痕はどの年齢層でも見られる。
【０２３５】
どの因子がケロイドまたは肥大性瘢痕の形成を開始させるのかについては不明な点が多い。複数の遺伝的および環境的な要因が、ケロイドおよび肥大性瘢痕の病因に関連づけられている。ケロイドと肥大性瘢痕の形成においては、コラーゲン合成の上昇か、またはコラーゲン分解の低下による、コラーゲンの過剰な沈着が見られる。異常な瘢痕形成に関して提案されている要因には、異物反応および細菌感染がある。多くの異常な瘢痕が、入れ墨、熱傷、注射、咬傷、ワクチン接種、外傷、外科手術、または感染症と関連づけられている。皮膚の張りは、肥大性瘢痕の形成と関連づけられることが多い。異常な瘢痕治癒は一般に、前胸部、肩、および上背部などの皮膚の張りの高い領域を含む。異常な瘢痕形成の病因に関連づけられている他の因子は、創傷感染、または長期の炎症反応である無酸素症、およびシワの走行に一致するライン(relaxed skin tension line)とは異なる創傷の方向を含む。ケロイドの形成には、特定の人種および特定の家系で見られる傾向によって示されている遺伝的な基礎がある。ケロイドは、思春期または妊娠中に加速的な成長を示す傾向があり、および閉経に伴って寛解する傾向があるので、ホルモン(アンドロゲンとエストロゲンの両方)がケロイド形成に関連づけられている。ケロイドの形成と関連づけられている他のホルモンは、甲状腺ホルモンの変化、およびメラニン細胞刺激ホルモンを含む。免疫学的な変化が、異常な瘢痕と関連づけられている。特に、免疫グロブリンおよび補体の不正なレベル、トランスフォーミング成長因子-ベータの増加、およびマスト細胞が異常な瘢痕中にみられる。加えて、腫瘍壊死因子およびインターロイキン1のレベルの低下が、このような異常な瘢痕でみられる。拡大性瘢痕は、治癒過程における創傷縁に垂直方向の過剰な張力から生じる。瘢痕の拡大は通常、損傷直後の6か月以内に見られる。
【０２３６】
異常な瘢痕形成には多数の因子が関与しているが、研究では、ケロイドおよび肥大性瘢痕が、コラーゲン産生の増大およびコラーゲン分解の低下によって生じることが明らかにされている。コラーゲン関連構造であるプロリルヒドロキシラーゼのレベルは、ケロイドのある皮膚では正常皮膚と比較して高い。プロリルヒドロキシラーゼは、コラーゲン合成中におけるプロリンの水酸化に必要なことから、コラーゲンの過剰産生がケロイドでは生じていることが示唆されている。
【０２３７】
コラーゲンの産生は、ケロイド生検試料では、およびケロイドに由来する培養線維芽細胞では上昇する。ケロイドに由来する培養線維芽細胞によるコラーゲン産生の上昇は、そのインビトロにおける寿命が尽きるまで持続し；これは、病変を培養に移した後は正常には戻らない。ケロイドの真皮を正常真皮と比較しても、DNA量または細胞性に有意差は認められない。これは個々の線維芽細胞が、正常量のコラーゲンを産生する線維芽細胞の数に見られる上昇より多くのコラーゲンを産生していることを示唆する。ケロイド形成では、線維芽細胞による過剰なコラーゲン産生は、創傷環境に起因する可能性が高い。
【０２３８】
拡大性瘢痕の形成は、治癒中の皮膚の損傷に対して垂直方向の張力による創傷縁の分離の結果であると考えられている。皮膚は通常、張った状態であり；損傷した皮膚にはギャップが生じ、球形というより楕円形となる。創傷が、張力のラインの反対側に閉じられると、拡大性瘢痕の形成の機会は大きくなる。
【０２３９】
臨床検査時にケロイドおよび肥大性瘢痕は、皮膚レベルより上に隆起している。肥大性瘢痕は自己制限的であり；肥大は創傷の境界内にある。当初、肥大性瘢痕は隆起し、赤色を呈し、痒みを生じ、さらには痛みを生じる場合があるが；時間の経過に伴って色は薄くなり、平板となる。肥大性瘢痕は、2週間〜2か月間に悪化するようである。ケロイド性瘢痕は、当初の創傷を超える拡散によって肥大性瘢痕と区別できる。ケロイド性瘢痕は、閉経まで数か月間〜数年間にわたって赤色を呈し、痒みを生じ、および痛みを伴ったままである傾向がある。患者は通常、ケロイド形成の個人歴または家族歴を有する。肥大性瘢痕およびケロイド性瘢痕とは異なり、拡大性瘢痕は平板であり、時にくぼんだ状態である。創傷の適切な成熟に伴い、これらの創傷は、周囲の非損傷皮膚の色に薄れてゆく。拡大性瘢痕は通常は赤くなく、痒みもない。
【０２４０】
シワの走行に一致するラインは、皮膚が弛緩する際に生じる溝に沿っている。シワとは異なり、これは、皮膚の目に見える特徴ではない。これは、皮膚の圧迫によって生じる溝に由来するに過ぎない。このような溝は好ましくは、ラインに垂直な方向に加わる圧迫によって生じる。皮膚が、シワの走行に一致するラインに対して斜めに圧迫されると、S字状のパターンが生じる。皮膚がラインに平行方向に圧迫される場合は、生じる溝の数は少なく、溝の高さは低い。シワの走行に一致するラインの反対側に切開が閉じられると、拡大性瘢痕または肥大性瘢痕の形成リスクが高まる恐れがある。
【０２４１】
瘢痕がケロイドの場合は、瘢痕が悪化するリスクがあるために、瘢痕修正手術に対する潜在的に相対的な禁忌が存在する。場合によっては、ケロイドが再び生じると、当初より大きくなる。拡大性瘢痕は、理学的検査で得られる知見を元に、肥大性瘢痕およびケロイド性瘢痕と容易に区別できる。拡大性瘢痕は平板であり、時にはくぼんだ状態の場合もある。肥大性瘢痕およびケロイドは、光学顕微鏡下では識別できない。しかしながら、電子顕微鏡下で観察すると、また免疫化学的に評価すると、いくつかの差が見られる。ケロイドが、表皮のヒアルロン酸含量の増加を伴う厚いコラーゲン繊維を含む一方で、肥大性瘢痕は、細いコラーゲン繊維を伴う結節構造を示し、アルファ平滑筋アクチンのレベルは高い。ケロイドと肥大性瘢痕の両方におけるコラーゲンは、分散した結節中に組織化され、高頻度で病変の乳頭状真皮中の釘脚(rete peg)を閉鎖する。正常真皮中のコラーゲンが、かなり大きな間質腔に隔てられた分散状の小束に配置されると、ケロイド中ならびに肥大性瘢痕中のコラーゲン結節は無血管性かつ一方向性のように見え、ならびに高度にストレスの加わった配置で配列する。
【０２４２】
異常な瘢痕は、さまざまな非外科的なオプションで処置される。圧力は、創傷内における組織代謝を低下させてコラーゲン分解を上昇させると考えられている。圧力を加えるさまざまな方法は、四肢への弾性包帯(ACEラップ)、血栓塞栓症用のストッキング、またはIsotoner型の手袋の使用を含む。または、オーダーメイドの(custom-fitted)圧迫衣を使用して、頚部および体幹を含む、より困難な部位に圧力を加えることが可能である。これらの器具は、使用が心地よくないので、患者のコンプライアンスは多様である。しかし残念ながら、最善の結果を得るためには、このような器具は、創傷の成熟中、6〜12か月間にわたって使用しなければならない。
【０２４３】
シリコーンゲルを、異常な瘢痕の処置に使用することができる。シリコーンゲルは、特に肥大性瘢痕の形成に経時的に使用時に、瘢痕容積を有意に縮小することが明らかにされている。瘢痕に対するシリコーンゲルの作用は、創傷の水和によるものと考えられている。シリコーンゲルは、創傷に1日に少なくとも12時間塗布される。患者は、夜間にシリコーンを創傷に使用することが適している。シリコーンゲルは小さな領域に、1日に12時間、通常夜間に使用可能なために、好評を博しつつある。しかしながら、皮膚荒れ、発疹、および創傷への接着に困難が伴うことから、使用が中止される場合がある。
【０２４４】
ステロイド注射は、問題となる瘢痕の処置における一般的な非外科的なオプションとなっている。病巣内注射に使用されるステロイドはトリアムシノロン(Kenalog)である。トリアムシノロン注射は、肥大性瘢痕の平坦化、退色、および症状緩和を誘導する標準的な治療法となりつつある。このような注射は、問題となる瘢痕が同定された直後に実施することができる。注射の用量は、瘢痕のサイズに依存して10〜120 mgの範囲を変動し得る。
【０２４５】
幅が狭い〜広い肥大性瘢痕にはトリアムシノロン注射を、および極めて広範囲に及ぶ肥大性瘢痕にはシリコーンを使用することが可能である。患者のなかには、特に、接着が弱い身体部位への毎日の6〜9か月間に及ぶシリコーンの使用および着用を避けるために、トリアムシノロン注射を好む者がいる。トリアムシノロン注射の有害作用は、低色素沈着および皮下萎縮を含む。他の非外科的オプションは、コルチコステロイドの病巣内注射、ビタミンE療法、酸化亜鉛療法、抗悪性腫瘍剤、および免疫療法を含む。
【０２４６】
異常な瘢痕の処置において、手術によらない処置が成功しない場合は、手術による介入が検討される場合がある。シワの走行に一致するラインに沿った創傷の閉鎖は重要である。病変の切除後に、どちらかといえば無意識に行われることの多い標準的な処置は、創傷の縁の配列に基づく、または創傷の圧迫による、創傷を最も弱い張力の方向の評価を含む。
【０２４７】
瘢痕の修正に用いられる第1選択の処置は、紡錘形切除(fusiform excision)である。一般に紡錘形切除は、瘢痕を長くする必要がない。canine auricleを回避するために、創傷は長さと幅が4:1の比となるようにする。紡錘形切除は、シワの走行に一致するラインに沿った、長さの短い創傷に好ましい。ミラード(Millard)法は紡錘形切除に似ているが、これは、瘢痕および基礎となる脂肪とのつながりの保存を含む。皮膚には、瘢痕の周囲に、皮下レベルに至る紡錘形に切り込みが入れられる。次に瘢痕は脱上皮化し、および皮膚の縁が、脱上皮化した瘢痕に近づけられる。ミラード法は、幅が広く、凹んだ瘢痕に好ましく用いられている。
【０２４８】
シワの走行に一致するラインに沿っていない瘢痕は、Z形成術で修飾することができる。Z形成術では、等しい長さの四肢(limb)が作られる。Zの角度が、瘢痕の張力分布および伸長の長さを決定する(例えば、30°では25%、45°では50%、60°では75%、75°では100%、90°では120%)。瘢痕修正を目的としたW形成術は、直線状の瘢痕を目立ちにくいパターンに崩す結果が得られる点でZ形成術と似ている。紡錘形切除と同様に、W形成術は皮膚の除去を含むため；創傷縁の周囲にかなりの張りが存在する場合には、この方法は回避される。W形成術による瘢痕修正は、シワの走行に一致するラインに沿った瘢痕；bowstring拘縮を有する瘢痕；短くて凹んだ瘢痕；および顔面の瘢痕に好まれている。
【０２４９】
組織伸展術および分割切除術は、過剰な創傷張力の存在が推定される場合に、より大規模な瘢痕修正と見なすことができる。2回以上の分割切除が推定されれば、組織伸展術が好ましい。さらに、瘢痕の処置に関して報告されている他の手順には、皮膚削皮術、冷凍手術、およびレーザー療法などがある。拡大性瘢痕は、肥大性瘢痕とは異なる方法で処置することができる。拡大性瘢痕は平板であるか、または凹んでいる場合もある。したがって、病巣内へのステロイドの投与は好ましくなく；このような薬剤は、窪みを悪化させる恐れがある。拡大性瘢痕は好ましくは、脱上皮化瘢痕を対象としたミラード2弁法(Millard 2-flap technique)で処置される。この手法によって、近似的な創傷縁の下部に軟組織が満たされる。また仮に拡大性瘢痕が再発したら、シワの走行に一致するラインに沿った創傷張力の方向を変えることによって、別の再発のリスクを最小限に留めることができる。拡大性瘢痕の処置に関して報告されている他の補助的手法は、脂肪移植片または他の組織代替物の注射を含む。シワの走行に一致するラインの近傍に向けられると、肥大性瘢痕は紡錘形に切除可能となる。仮に、望ましくない創傷方向の結果として創傷に対する過剰な張力のために肥大性瘢痕が生じたら、再発のリスクを最小限に留めるために、Z形成術が創傷の方向を、張力を多方向に分散させるように変えるために有用な場合がある。
【０２５０】
術後の4〜6か月間は、再発リスクを抑えるために、圧迫帯およびシリコーンゲルが好ましい。患者は、創傷の強度が当初の創傷張力強度の約80%に達するまで、激しい活動を少なくとも6週間は控えることが推奨される。患者は、再発を検出するために、および再発を早期に回避するために、術後6か月間にわたってモニタリングされる。術後の患者には、肥大性瘢痕および拡大性瘢痕の再発リスクがある。他のリスクは、感染、血腫、血清腫、および痛みを伴うか、または見栄えのよくない瘢痕化を含む。再発のリスクは、肥大性瘢痕と拡大性瘢痕の両方において無視できず、また手術を繰り返すことで大きくなる。創傷治癒には、外科医および患者が改善を観察して予測するために約1年間を要する。瘢痕が成熟する様子が見られたら、瘢痕の修正が考慮され得る。
【０２５１】
本発明のいくつかの態様では、細胞抽出物を含む組成物が、皮膚、毛髪、爪、歯、皮下脂肪、軟骨、筋肉、および骨格構造を含むが、これらに限定されない、目に見え、かつ美容上の外観に寄与する、人体の任意の領域を改善するために使用される。文献に記載された、遺伝子銃やマイクロインジェクションによる輸送法が、抽出物または抽出物成分を人の表面皮膚の下部の構造へ導入する際に想定される。
【０２５２】
本発明は、細胞および組織を、分化可能細胞、細胞もしくは卵の抽出物、またはシグナル伝達分子、ペプチド、炭水化物、脂肪、もしくは核酸を含む該抽出物の成分で処理することによる、外観、活力、および健康の促進、改善、および強化を目的とした、細胞および組織の劣化、損傷、および機能不全の予防に、ならびに細胞機能の促進、改善、および強化に関する。
【０２５３】
本発明は、目に見える表面、皮膚のpH、厚み、構造、および皮膚層の弾性の解析および測定、マイクロチップ、RT-PCR、質量分析、高圧液体クロマトグラフィー、ELISAアッセイ法、RNA解析による血液試料もしくは組織試料の解析、DNA配列決定によるDNA損傷の蓄積または欠損遺伝子の解析、X線イメージング、超音波イメージング、コンピュータ断層撮影(CT)、磁気共鳴イメージング(MRI)、陽電子発光断層撮影(PET)による内臓および組織の健康状態の評価を含むが、これらに限定されない複数の手段による、損傷の治癒、再生、または修復を必要とする人の評価を想定している。
【０２５４】
皮下脂肪は、人の美容上の外観に寄与し、ならびに加齢中に、喫煙により、およびHIVや糖尿病を含む、さまざまな疾患により、ならびに熱傷を負った人において再配置される。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)-リポジストロフィー症候群は、脂肪再分布、およびインスリン耐性を含む代謝異常と関連する。高い筋細胞内脂肪(IMCL)の濃度は、インスリン耐性に寄与し、代謝および身体組成の変数に関連すると考えられている。HIV感染者では、腓腹の皮下脂肪領域および末端の脂肪が減じている。四肢の脂肪は、HIV感染患者ではIMCLと強く関連し、回帰モデルにおいて、内臓の腹部脂肪、腹部皮下脂肪、および抗レトロウイルス薬を制御している。混合型のリポジストロフィーパターンが見られるHIV感染女性における高IMCLは、四肢の脂肪の減少と極めて強く関連する(Torriani M et al., J Appl Physiol. 2006 Feb; 100(2):609-14. Epub 2005 Oct 13)。皮下貯蔵脂肪の飽和は、多くの患者におけるインスリン耐性の病態生理における主要イベントであり、ならびに、この影響力の大きいイベントが、高血圧、高トリグリセリド血症、およびHDLレベルの低下(すなわちメタボリック症候群)の発生につながる可能性があることが推定される。現在、このような人々の皮下脂肪を再分布させる有効な手段はなく、現行の処置法は、以下を含む：(1)貯蔵脂肪のサイズに応じてインスリン耐性に関して見られる反応が異なる減量；(2)皮下脂肪組織を拡大するチアゾリジンジオンなどのペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマアゴニスト；(3)レジスタンストレーニングによる筋肥大などの、さまざまな手法によるトリグリセリドの代替的保存部位の拡大もインスリン耐性を改善する可能性がある；(4)脂肪分解を促進するベータ3アドレナリン受容体アゴニストなどの薬剤は遊離脂肪酸を血流中に放出することでインスリン耐性を高める可能性がある。遊離脂肪酸のベータ酸化の阻害剤(例えばカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ阻害剤)は、脂肪を保存することでインスリン耐性を引き起こす可能性がある；(5)皮下脂肪組織のサイズの減少による脂肪吸引は、インスリン耐性を悪化させることで2型糖尿病のリスクを高める恐れがある(Cherian MA, Santoro TJ, Med Hypotheses. 2005 Dec 14; [Epub ahead of print])。
【０２５５】
加齢および疾患中に生じるホルモン変化による皮下脂肪および皮膚条件の変化も、本発明の使用が想定される領域である。卵巣および他のステロイドの作用は、皮膚および毛髪の代謝、身体組成の変化、ならびに生涯を通じた皮下脂肪分布の変化に重要である。いわゆる美容内分泌学では、皮膚および毛髪、ならびに他の性器以外、すなわち肥満やセルライトなどのさまざまな問題につながる卵巣ステロイドの不足または過剰が評価される。性ステロイドは、適切に製剤化された場合に、局所適用によって皮膚に輸送される小分子であり、全身反応を避けながら局所作用を達成する目的で、本発明の抽出物に添加されることが想定される。経口的または局所的に投与されるエストロゲンは、特に閉経期後に皮膚の老化を抑える可能性がある。エストロゲンは単独では、若々しい皮膚の再構築に十分ではないが、皮膚の老化過程を遅らせる可能性がある。これまで女性の脱毛の処置に成功したのは、非ホルモン性化合物ミノキシジルの使用だけであり、本発明で想定される組成物は、脱毛の異なる処置法となる可能性がある。実際、想定される組成物は、毛包(hair sack follicle)を刺激して、毛髪ならびに爪の再成長の速度を速めたり質を高めたりする可能性がある。エストロゲンは、多毛(女性における体毛の成長が通常わずかか、または体毛が存在しない部位における太くて暗い色の毛の過度の成長)、にきび、および身体組成の変化にも寄与する(Gruber CJ, et al., Current concepts in aesthetic endocrinology. Gynecol Endocrinol. 2002 Dec; 16(6):431-41)。加えて本発明の組成物は、ホルモン、食習慣、癌、慢性疾患、またはストレスに起因する可能性のある男性の脱毛およびはげにおける使用が想定される。
【０２５６】
本発明は、局所投与または皮下投与による、所望の部位における毛髪の成長の低下または促進すなわち再生のいずれかのための、毛包細胞の刺激または調節による毛髪の成長の調節に使用可能なことが想定される。
【０２５７】
本発明は、セルライトの処置にも有用である。セルライトは、起伏のあるえくぼ、または「オレンジの皮(orange peel)」様の皮膚を引き起こす貯留脂肪の浅在性のポケットを表現するのに用いられる一般名称である。セルライトは思春期後の女性の90%に見られ、男性ではまれである。セルライトが見られる一般的ではあるが排他的ではない部位は、大腿、臀部、および腹部である。一般に流布する説とは対照的に、セルライトは肥満とは無関係である。というのはセルライトは、過体重、正常体重、および痩身の女性で見られるからである。セルライトには、電動ローラーおよび調整サクション(regulated suction)を備えた機械装置が役立つ。この非外科的かつ非侵襲的な装置は、深在性の組織の移動を可能とし、セルライトの減少およびloss of inchesにつながる、対称的な皮膚のひだを生じる。本発明は、皮下脂肪の蓄積の分布を調節するための、およびセルライトの影響を受けた部位の美容上の外観を改善するための、抽出物の局所的または皮下への使用を想定している。
【０２５８】
本発明は、筋肉、脂肪、軟骨、骨、結合組織、脾臓、肝臓、膵臓、肺、および神経組織を含むが、これらに限定されないあらゆる内臓および組織を含む、皮膚の下部に存在する損傷した組織、器官、および細胞の修復もしくは若返り、または新規形成に有用な可能性があることが想定される。内臓組織または器官の損傷は、例えば事故、疾患、医薬品、癌、放射線、および外科手術によって引き起こされる可能性がある。
【０２５９】
身体が高線量の放射線に曝露されると、多臓器不全(MOF)に至る可能性のある複合的な生物学的反応が開始される。MOFは、細胞標的におけるエネルギーの蓄積によって開始し、細胞損傷に対する組織の反応によって拡大して増幅される。創傷治癒の生物学的側面は、外科的外傷によるMOFの基礎であり、炎症は敗血症におけるMOFの基礎であり、および照射組織の生物学的側面は放射能によるMOFを開始する。放射線障害に対する組織反応は、細胞外シグナルの伝達によって開始されて同調されることが示唆されている。トランスフォーミング成長因子-β1は、酸化的ストレスに対する組織レベルのセンサーとして照射組織の生物学的側面を調整し、細胞のDNA損傷応答に不可欠なことが明らかにされている(Barcellos-Hoff MH. How tissues respond to damage at the cellular level: orchestration by transforming growth factor-β (TGF-β) British Journal of Radiology (2005) Supplement_27, 123-127)。
【０２６０】
M．細胞全体の使用
本発明のいくつかの態様では、損なわれていない幹細胞(胚性および成体)、または臍帯血幹細胞を含む組成物が美容もしくは治療の目的で使用される。いくつかの態様では、液状の細胞の懸濁物が皮膚に導入される。いくつかの態様では、液状の細胞の懸濁物が開放創中に導入された後に、呼吸可能な(非密封性の)創傷包帯で覆われる。いくつかの態様では、密封性の創傷包帯が使用される。いくつかの態様では、例えば、皮膚に接着する防水性の樹脂製の膜、細胞に栄養を供給することで創傷治癒を速める栄養ゲル(抗菌剤、コラーゲン調節物質、および他の物質を含む)の層；ならびに創傷に直接接触するように栄養層中に埋め込まれたか、栄養層上に配置された皮膚幹細胞の層などの1つもしくは複数の層が使用される。いくつかの態様では、細胞は実験室で当人自身の皮膚、脂肪組織、または幹細胞から培養される。いくつかの好ましい態様では、細胞は次に回収され、懸濁物中に移されて、流体として使用されるか、または密封性の創傷包帯/プラスター/バンドエイドとして皮膚に塗布される栄養ゲル層とともに樹脂膜上に配置される。
【０２６１】
N．エクスビボ療法およびインビボ療法
いくつかの態様では、抽出物は、患者に由来する細胞のエクスビボ療法に使用される。簡単に説明すると、細胞が患者から回収され、増殖され、透過処理され、抽出物とともにインキュベートされ、閉鎖された後に患者の処置に使用される。この過程において、テロメア(染色体上の中央のDNAを保護する染色体の末端で、細胞分裂の進行に伴って短くなるので、処理細胞を再生し、および寿命を長くする)の延長を含むが、これらに限定されない、いくつかの細胞特性は変化するか、または高められる。好ましい方法は実施例3に記載されている。
【０２６２】
いくつかの態様では、抽出物はインビボで、患者の内臓および/または組織もしくは細胞に使用される。簡単に説明すると、抽出物またはこの成分を腹腔に注入することで、したがって腸、肝臓、脾臓、膵臓、胃、および膀胱を含むが、これらに限定されない腹部器官の表面を浸すことで、これらの器官および組織における創傷の治癒を促すか、または器官および/または組織を構成する細胞の再生を促す。
【０２６３】
細胞もしくは抽出物、またはこれらの成分を、組織および器官の新規の細胞形成を誘導するために、および/または組織/器官を構成する細胞を若返らせるために、筋肉、脳、脂肪、結合組織、軟骨、膵臓、肝臓、脾臓、心臓、および肺を含むが、これらに限定されない内臓および/または組織中に導入することも想定される。新規の細胞形成は、ヒトを含む生物において自然に進行する。最も強力な専門抗原提示細胞である樹状細胞による局所リンパ組織の新規形成(Ludewig B et al., 1998 J Exp Med)。
【０２６４】
生命は成長することが自明である。植物では、成長は、従属栄養と独立栄養の2つのタイプを取り得る。独立栄養成長は、栄養に無機材料を用いる。従属栄養成長は、栄養に有機材料に依存する。発芽中に、実生は通常、従属栄養的に成長するが、植物が光合成をするようになると、土壌および大気中のミネラル、ならびに日光をエネルギーとして用いて独立栄養的に成長可能となる。したがって、寿命の大半の期間を植物は独立栄養的に送る。しかしながら、宿主から無機材料を得て、従属栄養的に成長する寄生植物が存在する。植物では、成長は連続的、反復的、および可塑的であり、ならびに細胞分裂は、老化に至る全ての段階において、器官の新規形成に寄与する。動物では、細胞分裂は、組織および循環性細胞集団の再生および維持に関与し、ならびに成長は同時に反復性であり、細胞分裂を経るに従って短くなってゆくテロメアの長さに依存する。
【０２６５】
本発明は、あらゆる器官および組織における細胞の成長、機能、および新規形成を栄養供給、促進および調節するために、抽出物に含まれるか、または抽出物に添加される有機材料と無機材料の両方の使用を想定している。植物の種子は、従属栄養的な成長のための材料を含み、およびヒトの細胞の成長を促すために抽出物中における使用が想定される。
【０２６６】
一部の動物は身体の一部を、喪失または傷害後に再生する能力を有する。失われた器官または他の構造を、単に瘢痕組織で空隙を埋めるのではなく、実際に再成長させることは、傷害反応および創傷治癒から、胚発生中に見られるのに似た、新たな組織の成長、パターン形成、および分化への過程を含む。全てとは言わないまでも大半の成体器官における幹細胞の存在、および組織の修復に関与する能力に関する新たな証拠から、再生生物学の領域は、かなり広い範囲の医学的重要性があると目されている(Stocum, 1995, 2004)。さまざまな器官系における再生能力の系統発生学的分布に注目すると、この能力は、動物の進化の過程で次第に失われてきたようである(Thouveny and Tassava, 1998；Sanchez Alvarado, 2000)。両生類における失われた四肢の再生は、極めて詳細に調べられたモデル系の1つであり、および脊椎動物の器官再生の多くの特徴を理解する際の有用なパラダイムである。「付加(epimorphic)」形成の例として、この系は、四肢断端(limb stump)の損傷組織における細胞の脱分化、および失われた四肢の構造を再構築するためのパターン形成および成長を受ける遠位の芽体(distal blastema)を形成するための、このような細胞の増殖を含む。なぜ系統学的に進んだ脊椎動物の四肢が再生能力を失ったのかという疑問は、無尾目両生類の四肢を対象とした研究によって説明されている。再生は、無尾類(カエルおよびヒキガエル)の四肢発生の初期段階において優れているが、幼生が変態に近づくにつれて次第に低下する(Dent, 1962)。無尾類の成体の四肢には、完全な再生能力はない。
【０２６７】
しかしながら、有尾両生類(イモリおよびサンショウウオ)は一般に、四肢、ならびに時には尾、顎、および目の一部などの他の器官を生涯にわたって再生する。このような再生現象は、爬虫類、鳥類、および哺乳類の成体では極めてまれであることから、再生能の喪失は、より進んだ四足類に向かう進化的変遷の適応的な部分である可能性があることが示唆される。複数の研究者が、無尾類の四肢の分化中の筋肉および他の組織の細胞が、増殖状態へ復帰し、四肢の再成長に寄与する能力を失っていると示唆している。この見解と一致して、再生および形態形成は、組織の解離および細胞の脱分化が、追加的な外傷によって断端(stump)組織で高められた時に、カエル成体の四肢では促進されることが報告されている(Polezhaev, 1972)。再生能を有する四肢における分化状態の可塑性、および多核性の筋肉繊維が脱分化して細胞周期に復帰する能力は現在、四肢再生の領域で活発に研究が行われている(Brockes et al., 2001；Brockes and Kumar, 2002)。
【０２６８】
再生には、胚性四肢の発生時のような、四肢断端の遠位部における上皮-間葉の相互作用が必要であり、および幼生から成体への移行中における無尾類の四肢切断後における創縫合の性質を変化させることも研究されている。哺乳類の四肢断端の閉鎖は、皮膚全層の収縮を含み、およびカエル成体では、当初、切断面を覆っている頂部創傷(apical wound)の表皮の下部の結合組織の速やかな形成を含む(Carlson, 1974)。TassavaおよびOlsen (1982)は、高等脊椎動物が機能性の創傷上皮を形成できないことで、再生能力の喪失を説明できると示唆している。再生を促すことを目的とした、哺乳類またはカエル成体の失われた四肢中における遠位の瘢痕形成への干渉は、ほとんど成功していない(Stocum, 1996の総説を参照)が、頂部上皮(apical epithelium)と、基礎となる中胚葉系細胞間の互恵的な相互作用に適した条件を確立することの重要性は、四肢が再生する場合には明らかである。胚の四肢では、頂部外胚葉(apical ectoderm)と、隣接する中胚葉系細胞の線維芽細胞成長因子(FGF)およびその受容体の間でシグナルがやりとりされる。Galis et al. (2003)は、高等脊椎動物の四肢が機能性の組織の相互作用を再構築できない理由は、四肢の再生が、四肢が体節などの一過的な構造との相互作用に依存しない半自律的なモジュールとして発生する場合にのみ可能であるためであると示唆している。
【０２６９】
爬虫類、鳥類、および哺乳類の四肢の発生は初期胚で始まり、さまざまな一過的な近傍構造とのシグナル伝達の相互作用が関与する一方で、両生類では、四肢の発生は発生のより後期に生じ、一過的な構造との相互作用とはカップリングしていない。免疫系の因子および細胞が再生能力に影響している可能性もある(Harty et al., 2003)。より一般的で原始的な先天性免疫機構を付加し、および生物体による、侵入微生物に対する高度に特異化した防御機構の獲得を可能とする適応免疫の出現が、外傷組織における活性が、四肢再生の開始に必要とされる細胞の脱分化またはシグナル伝達に反する免疫細胞およびサイトカインを、このような免疫の存在下における傷害に対する反応に、再生ではなく組織の修復および線維症が主要な役割を果たすように生じていた可能性がある(Mescher and Neff, 2005)。
【０２７０】
再生能力の制限につながった、進化の過程における適応免疫の起源は、免疫系統発生学に関する現時点における知識と矛盾しない(Flajnik et al., 2003)。良好に発達した再生能力を通常有する無脊椎動物には、適応免疫は全くない。無脊椎動物は代わりに、極めて有効な先天性免疫系を構成する一連の防御に頼っている。獲得免疫すなわち適応免疫の基礎となる機構は、有顎脊椎動物で最初に現われ、さまざまな目の魚類および両生類で、より効率的になってゆき、恒温動物で高度に発達した(Flajnik et al., 2003)。
【０２７１】
本発明は、細胞の脱分化および組織の解離を高めることによって細胞、組織、および器官の新規再生を可能とすることで、可塑性を高めること、ならびに細胞および組織の成長能力を変化させることを想定している。抽出物中の活性物質による免疫反応の変化も想定される。
【０２７２】
実施例
実施例1
細胞および細胞抽出物
NCCIT細胞、ジャーカット(クローンE6-1)細胞、および293T細胞(American Type Culture Collection, Bethesda, MD)は、10%ウシ胎児血清(FCS)、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、および非必須アミノ酸を含むRPMI 1640(Sigma, St. Louis, MO)(完全RPMI)で培養する。NIH3T3 Swiss-Albino線維芽細胞(American Type Culture Collection)は、10% FCS、L-グルタミン、および0.1 mM β-メルカプトエタノールを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM；Sigma)で培養する。マウスのESCは、株sv129胚盤胞の内部細胞塊から単離され、ゼラチンコーティングプレート上に1,000単位/ml(10 ng/ml)の組換え型白血病阻害因子(LIF；Sigma)が添加されたESC培地(DMEM、15% FCS、0.1 mM β-メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)中のマウス線維芽細胞のγ線照射済みのフィーダー層上にプレーティングする。抽出物を調製するための回収に先立ち、ESCを継代し、10 ng/mlのLIFを含むRPMI中で、無フィーダー条件で培養する。
【０２７３】
NCCITの抽出物を調製するために、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)および細胞溶解用緩衝液(100 mM HEPES、pH 8.2、50 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mMジチオスレイトール、およびプロテアーゼ阻害剤)で洗浄し、400 gで沈降させ、1容量の冷細胞溶解用緩衝液に再懸濁し、氷上で30〜45分間インキュベートする。細胞を氷上で200 μlのアリコートを対象に、直径3 mmのプローブ(B. Braun Biotech, Melsungen, Germany)を接続したLabsonic-Mパルス超音波発生装置を使用して、顕微鏡による判断によって全ての細胞および核が溶解するまで超音波処理を行う。溶解物を15,000 g、15分間、4℃の条件で沈降させて粗材料のペレットを得る。上清のアリコートを得て、液体窒素で凍結して保存する。95,583±10,966個のNCCIT細胞の溶解物を使用して抽出物を得る。ESC抽出物(25〜30 mg/mlタンパク質)をLIFになじませたESC培養液から同様に調製する。293T、ジャーカット、およびNIH3T3の抽出物についても上記の手順で調製する。必要であれば、抽出物をH2Oで希釈後に、約300 mOsmへの浸透圧の調節に使用する。
【０２７４】
実施例2
バルジ毛包幹細胞
感覚毛の濾胞(vibrissa follicle)を単離するために、対象の感覚毛パッド(vibrissa pad)を含む上唇を切断し、その内表面を露出させた。ヒトでは、感覚毛に代えて、頭皮の毛髪または他の有毛部分の毛を使用することができる。感覚毛または毛包は、双眼顕微鏡下で切開する。感覚毛は、細いピンセットで頚部を穏やかに引いてパッドから抜く。抜かれた感覚毛は、B-27(GIBCO/BRL)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(GIBCO/BRL)を含むDMEM-F12(GIBCO/BRL)で洗浄した。全ての外科的手順は無菌環境下で実施した。感覚毛の濾胞バルジ領域は、ネスチン発現細胞を含む。細胞を、蛍光顕微鏡下で蛍光抗ネスチン抗体に曝露して単離した。単離された細胞を、1%メチルセルロース(Sigma-Aldrich)を含むB-27、およびおよび20 ng/mlの塩基性FGF(bFGF)(Chemicon)を含む1 mlのDMEM-F12に懸濁した。細胞を24ウェルの組織培養ディッシュ(Corning)で、37℃、5% CO2/95%大気の条件の組織培養用インキュベーター内で培養した。4週間後に、バルジ領域の細胞がコロニーを形成する。
【０２７５】
実施例3
エクスビボ療法
エクスビボにおける再プログラム対象の細胞を冷PBSで、ならびにCa2+-およびMg2+を含まない冷ハンクス平衡塩溶液(HBSS; Invitrogen, Gaithersburg, MD)で洗浄する。細胞を100,000個の細胞/100 μl HBSS、またはこの倍数のアリコートに再懸濁し、1.5 mlチューブ中に移し、120 g、5分間、4℃の条件で、スイングアウトローターで遠心分離する。沈降した細胞を97.7 mlの冷HBSSに懸濁し、チューブを37℃の水浴に移して2分間維持し、2.3 mlのSLO(Sigma；冷HBSSで1:10に希釈した100 mg/mlのストック)を、SLOの濃度が最終的に230 ng/mlとなるように添加する。試料を37℃の水浴中で50分間、ときおり攪拌しながら水平方向でインキュベート後に氷上に移す。試料を200 mlの冷HBSSで希釈し、細胞を120 g、5分間、4℃の条件で沈降させる。透過化を、細胞の再閉鎖および再プレーティングの24時間後に、別の試料中の70,000 Mrのテキサスレッド-結合デキストラン(Molecular Probes, Eugene, OR; 50 μg/ml)の取り込みをモニタリングすることで評価する。このような条件における透過化効率は約80%である。
【０２７６】
透過化後に、エクスビボにおける再プログラム対象の細胞を、ATP再生系(1 mM ATP、10 mMクレアチンリン酸、25 mg/mlクレアチンキナーゼ；Sigma)、100 μM GTP(Sigma)、および1 mMの各ヌクレオチド三リン酸(NTP; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を含む100 mlの抽出物中に1,000個の細胞/μl(またはこの倍数)となるように再懸濁する。細胞を含むチューブを、37℃の水浴で1時間、ときおり攪拌しながら水平方向にインキュベートする。形質膜を再び閉じるために、抽出物を、2 mMのCaCl2および抗生物質を含む完全RPMIで希釈し、ならびに細胞を48ウェルプレートに、100,000個/ウェルとなるように添加する。2時間後、浮遊する細胞を除去し、プレート上の細胞を完全RPMIで培養する。再プログラムされた細胞を患者に移植することができる。
【０２７７】
実施例4
細胞抽出物とともに使用するクリーム基剤
水-78%
タンパク質-10%
例えば、ケラチン、フィラグリン、および/または微量の成長因子(μM〜mM量のEGF、IGF、IGFII、インスリン、サブスタンスP、デフェンシン、NGF)
脂質-10%
スクアレン(9%)、脂肪族ロウ(12%)、ステロールエステル(33%)、ジオールエステル(7%)、トリグリセリド(26%)、遊離ステロール(9%)、他の脂質(4%)。
細胞抽出物もしくは卵の抽出物、または抽出物の成分-2%
【０２７８】
クリーム基剤は、脂質および/またはタンパク質および/または細胞抽出物を含む水の任意の組み合わせから作製する。
【０２７９】
実施例5
魚の卵抽出物の調製
生殖期(晩秋)の雌から回収された、新鮮で未受精のサケ(Salmo salar)の卵を氷上で維持し、抽出物を好ましくは直ちに作製する。卵を凍結防止剤(例えば、1.5 Mの1,2-プロパンジオールおよび0.2 Mのショ糖)で、卵膜を破壊することなく凍結乾燥することが可能である。凍結は段階的に(-1℃/分)、-80℃まで行うべきである。卵を解凍し、抽出物の調製手順の間、氷上で維持することができる。
【０２８０】
卵を、プロテアーゼ阻害剤(10 μg/ml)が添加されたHBSSまたは海水で2回洗浄する。洗浄液を除去し、卵を溶解し、事前に凍結しておいたダウンス・ガラス-ガラスホモジナイザーでホモジナイズする。溶解物を、卵殻の混入を避けながら、Beckman Ultra Clearポリアロマー遠心チューブ(5 ml)に移し、15分間、15,000gで4℃の条件で、Beckman超遠心機でSW55T1ローターを使用して遠心分離する。こうして、脂質を含む最上層画分、細胞質を含む中間層画分、ならびに卵殻および核デブリを含む下層画分の3つの画分が得られる。細胞質を含む中間層画分が、回収される抽出物である。この抽出物は、ミトコンドリア、リソソーム、およびペルオキシソームを含む細胞質ゾルのオルガネラの大半を含むことが推定され、清澄かつ粘張であるはずであり、またオレンジ色を呈する。プロテアーゼ阻害剤(10 μg/mlストック)を添加し、抽出物を-80℃で維持する。
【０２８１】
細胞質抽出物をさらに分画することが可能である。100,000 g、4℃、60分間の条件による遠心分離で、2〜3つの画分が得られ、最上層/中間層の細胞質画分には、小胞体、SV、およびミクロソームを含む細胞質ゾルが含まれる。抽出物のpHをリトマス試験紙で測定し、タンパク質濃度をブラッドフォード(Bradford)アッセイ法で測定し、浸透圧を浸透圧計で測定する。
【０２８２】
中胞胞胚のゼブラフィッシュ胚を回収し、液体を除去して-20℃に凍結する。抽出物を調製するために、胚を氷上で解凍し、溶解し、少量のHBSS中または海水(好ましくはv/vで液体が50%未満)中のいずれかで、ダウンス・ガラス-ガラスホモジナイザーでホモジナイズする。溶解物を、滅菌済みの麻布で濾過し、5,000g、4℃、20分間の条件で、Beckman X-22R遠心分離機を使用してSX4250ローターで遠心分離する。細胞質抽出物(上清)を回収し、プロテアーゼ阻害剤(10 μg/ml)を添加する。抽出物をミリポアフィルターで濾過することができる(0.22 μm MilliQ滅菌済みのフィルター)。抽出物を-80℃で維持する。抽出物のpHをリトマス試験紙で測定し、タンパク質濃度をブラッドフォードアッセイ法で測定し、浸透圧を浸透圧計で測定する。
【０２８３】
この一般的な手順は、ウニ、エビ、魚卵(fish egg/roe)、またはカエルの卵からの抽出物の調製に有用である。簡単に説明すると、卵を抱えた雌の魚(または妊娠したカエル)から、放卵プログラム(放卵の6〜8時間前、通常は明け方(午前2〜4時)にhCGホルモン(1 ml/kg)の注入)で放出直後に卵を回収する。卵を、-20℃で凍結乾燥するか、もしくは凍結するか、または新鮮な状態で使用する。魚卵を、異なる種の魚から回収する。ウニの場合は、0.5 MのKClを口腔周囲に注入して卵の放出を誘発する。抽出物を卵から、破砕(細胞破砕機もしくはダウンスホモジナイザー)、またはさまざまな速度による遠心分離で、全内容物を含む細胞質、卵殻(透明帯)を含むか、もしくは含まない細胞質、核/細胞質ゾルを含むか、もしくは含まない細胞質、オルガネラを含むか、もしくは含まない細胞質、脂肪を含むか、もしくは含まない細胞質を分離して調製する。さらに分画を行って、mRNA、タンパク質、低分子量ペプチド、炭水化物、および脂肪の1種類もしくは複数を単離することができる。魚卵中の脂肪酸の主要成分は、オレイン酸、リノール酸、およびオメガ-3脂肪酸である。
【０２８４】
サケ卵抽出物に上記のプロトコルを適用したところ、サケ卵抽出物は、6.4〜6.8のpH、および約350 mOsmの浸透圧で、100〜380 mg/mlの驚くほど高いタンパク質濃度を有していた。抽出物は透明かつ粘張で、0.45 μm MilliQフィルターでは濾過されなかった。抽出物中のタンパク質は、高タンパク質含量および低pHのために、低緩衝能の水または含水溶液を添加すると容易に沈殿する。抽出物は、アルカリ(1〜3 μlの1 M NaOH/ml抽出物)を添加することでpH 7.0に中和することができる(水および含水溶液による希釈も可能)。ゼブラフィッシュの抽出物は、6.4〜6.8のpH、および80〜150 mOsmの浸透圧で、23〜26 mg/mlのタンパク質濃度を有していた。抽出物は透明かつ非粘張であり、濾過可能で、および水で任意の希釈率に容易に希釈された。
【０２８５】
実施例6
抽出物の毒性の検討
低pHで、特定の物質を含む抽出物は、細胞に毒性作用を及ぼす場合がある。個々のバッチの毒性は、再プログラムされる個々の細胞タイプを対象に検討すべきである。細胞を回収して、HBSSで2回洗浄する。約100,000個の細胞のペレットを得て、100 μlの抽出物に再懸濁し、37℃の水浴で1時間インキュベートする。抽出物の希釈率を検討し、さまざまなタンパク質濃度、pH、および浸透圧の抽出物中における細胞の生存率を評価することができる。好ましくは、タンパク質濃度は25 mg/ml以上であるべきであり、pHは7.2付近であるべきであり、および浸透圧は280 mOsmに近い値であるべきである。細胞および抽出物を、正常培地(選択される細胞のタイプに合わせたもの)を含むウェルで24時間インキュベートし、細胞の形態を顕微鏡で調べる。細胞を回収し、染色し、生細胞をカウントする。培養後に50%を超える細胞が生きていなければ、抽出物には毒性があると見なされる。
【０２８６】
上記のプロトコルを適用することで、293T細胞は、サケ卵の抽出物とのインキュベーション後の少なくとも3週間にわたって生存しており、またゼブラフィッシュ胚のタンパク質濃度は、140〜350の浸透圧、6.9〜7.7のpHで、24〜380 mg/mlであった。140 mOsm以下の浸透圧では細胞は死滅した。
【０２８７】
サケ卵の抽出物またはゼブラフィッシュ胚の抽出物によって再プログラムされた細胞の形態は、約3日後に変化した。293T細胞は球形となり、および細胞集団の一部は、割球様の球に成長を開始する。これらの変化は一貫しており、および21日(実験終了)まで観察可能であるが、条件によっては、変化は、2週間後に正常な293Tの形態に逆転するように見える。正常培地(10% FCSおよび0.2%抽出物を含むRPMI-1640)に添加された抽出物による正常293T細胞の培養では、正常培地で培養された再プログラムされた細胞に見られるのと同様の形態変化が観察可能である。加えて、特にサケ卵抽出物とともに培養された細胞は、正常細胞と比較して成長速度が速い。細胞を飢餓状態におくと(0.5% FCSを含むRPMI-1640)、非抽出物処理細胞に関しては成長速度は有意に低下し、細胞の形態はわずかに変化する。抽出物(飢餓培地中に0.2%の抽出物を含む)とともに成長させた飢餓状態の細胞の場合は、変化はより顕著である。この場合、細胞集団の大半は割球様の球に成長し、およびこの球は培養容器から剥がれて培地中に浮遊し、この状態で成長を続ける。興味深いことに、成長速度の減速は、飢餓培地に添加された抽出物とともに培養された細胞では逆転する。
【０２８８】
実施例7
抽出物の遺伝子発現アッセイ法
再プログラム細胞における抽出物による研究対象遺伝子の発現を検証するために、抽出物から単離されたRNAを対象にRT-PCRを実施することができる。RNAは抽出物から選択法で、例えばQiagen RNeasy Plus Kit (Qiagen)を使用して単離することができる。RNAを分光光度計で定量し、-80℃で保存する。1 μgのRNAをcDNAの合成に使用する。cDNAの合成は例えば、iScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)の使用と、これに続く、選択プライマーによるPCRによって実施することができる。検討対象の各プライマーセットには正の対照を含める。PCR産物を臭化エチジウムを含む1%アガロースゲルに流し、バンドをUVランプで可視化する。
【０２８９】
上記プロトコルの適用により、アガロースゲル上に見える、対象ヒト遺伝子に特異的なプライマーによって得られた抽出物のPCR産物を、今回の検討対象の遺伝子(例えば、OCT4、NANOG、SOX2、UFT1、GAPDH、REX1(別名ZFP42)、LMN-A、LMN-B1,OXT2、ACI33、APL、およびSTELLA)を発現することが既知である正の対照のヒト細胞系列から得られたバンドと比較した。正の対照であるNCCIT細胞は、検討対象の各遺伝子の推定サイズに1本のバンドを示し、サケ卵抽出物にもゼブラフィッシュ胚抽出物にも由来しないPCR産物は、ゲル上に複数のバンドを生じる。これらの結果は、抽出物が、使用プライマーによって検出されるヒト遺伝子の異型を発現しないことを意味する。
【０２９０】
実施例8
魚卵または胚の抽出物による細胞の再プログラミング
細胞タイプの選択(例えば、ヒト293T細胞や脂肪組織幹細胞(ASC tested))を回収し、氷上で維持し、および氷冷HBSSで2回洗浄する。100,000〜500,000個の細胞を遠心分離して(300 g、4℃で10分間)ペレットを得る。細胞を、再プログラミング前に37℃の水浴で50分間インキュベートすることでストレプトリシン-O(SLO)で透過化することができるが、これは魚卵または胚の抽出物の再プログラミング作用には必要ない。SLOとのインキュベーション後に、細胞を氷冷HBSSで洗浄し、遠心分離し、ペレットから過剰な液体を除去する。細胞を100,000個あたり100 μlの抽出物に再懸濁し、37℃の水浴で1時間インキュベートする。約100,000個の細胞を、選択される完全培地を含むウェルに添加する。仮にSLOによる透過化を実施したら、細胞を、再プログラミング後に、2 mM CaCl2が添加された培地で2時間培養して細胞膜を閉じる。培地は、再プログラミングの2〜12時間後に交換すべきである。SLOによる透過化の規模を評価するために、50 μg/mlのAlexia red結合デキストラン(10,000 Mrまたは70,000 Mrのデキストラン)を含む0 ng/mlまたは100 ng/mlのSLO中で50分間インキュベートされた細胞を対象に、落射蛍光顕微鏡を使用して、細胞の透過化および再閉鎖を検証する。
【０２９１】
細胞をウェル中で、増殖によって、大きな容器への分割が可能となるまで培養する。細胞のタイプに適切に細胞を分けるが、コンフルエントにならないようにする。遺伝子解析用のペレットは、毎週回収して、各継代時に形態を位相差顕微鏡で評価すべきである。細胞は可能な限り長く培養することができるが、再プログラミング作用の持続性を評価するためには、40日が最短であると示唆されている。
【０２９２】
加えて細胞を、魚類の卵または胚の抽出物で強化された培地でインキュベートすることで再プログラムすることができる。0.4%の抽出物を正常完全培地(10% FCS)または飢餓培地(0.5% FCS)に添加することで、細胞は再プログラムされる。選択された細胞を、50%のコンフルエンシーになるまで成長させ、正常培地を、0.4%の抽出物を含む完全培地または飢餓培地と交換する。細胞を、抽出物を含む培地で適切に分ける。抽出物を含む新鮮な培地を、週に2回未満に分けるのであれば、少なくとも週に2回、細胞に添加すべきである。遺伝子解析用のペレットは毎週回収して、各継代時に形態を位相差顕微鏡で評価すべきである。細胞は可能な限り長く培養することができるが、再プログラミング作用の持続性を評価するためには、40日が最短であると示唆されている。
【０２９３】
上述のプロトコルに従って、魚の卵抽出物もしくはゼブラフィッシュの胚抽出物で再プログラムされた細胞、または抽出物が添加された培地で成長された細胞を回収してRNAを単離した。再プログラムされた293T細胞または正常293T細胞を、抽出物(0.2%)を含むか、もしくは含まない完全培地(10% FCSを含むRPMI-1640)か、または抽出物を含むか、もしくは含まない飢餓培地(0.5% FCSを含むRPMI-1640)のいずれかでインキュベートした。リアルタイムRT-PCRを行って、分化マーカー遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションを調べた。7日後に、OCT4遺伝子の顕著なアップレギュレーションが、抽出物で処理した細胞に見られ、およびこの変化は、17日後まで見られる。遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子GAPDHを遺伝子発現の標準として計算した。結果を表1および表2に示す。値は、正常培地で成長させた非処理細胞に対する処理細胞における遺伝子発現の上昇を示す。再プログラミング17日後に17日間処理した細胞に関する値を示す。
【０２９４】
（表１）
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【０２９５】
（表２）
0005641734.tif 000003
【０２９６】
結果から、非処理細胞と比較して、抽出物で処理された全ての細胞において、OCT-4遺伝子がアップレギュレートされることがわかる(18〜100倍)。NANOG遺伝子の発現の変化は中程度であり、アップレギュレーションは、全くなしから5倍までである。SOX2遺伝子の発現に関しては、アップレギュレーションは基礎値の2〜8倍を変動した。
【０２９７】
抽出物なしに培養した飢餓細胞では、OCT4、NANOG、およびSOX2の全ての遺伝子がダウンレギュレートされる(正常培地で成長させた正常293T細胞の0.2〜0.6倍)。飢餓培地に0.2%抽出物を添加することで遺伝子発現プロファイルが救済され、OCT4遺伝子の発現は、正常293T細胞における発現の5〜13倍にアップレギュレートされる(これは非処理の飢餓状態の293T細胞の約100倍のアップレギュレーション)。同じことは、飢餓によるダウンレギュレートする作用が救済されないNANOG遺伝子の発現には見られない。SOX2遺伝子の発現に関しては、OCT4の場合と似た救済が観察されるが顕著ではない(最大4倍のアップレギュレーション)。これらの実験では、サケ卵の抽出物は、脱分化関連遺伝子の最大の救済およびアップレギュレーションを付与するようである。
【０２９８】
この再プログラミング実験を3回繰り返したところ、サケ卵の抽出物が脱分化関連遺伝子をアップレギュレートすることを確認する結果が得られ、293T細胞の「幹細胞性」が高まることがわかった。
【０２９９】
再プログラミングを、以下の3つの異なる方法で行った：
1．方法に記載された手順で再プログラミングを実施後に、正常細胞を培養；
2．記載通りに再プログラミング後に、0.4%のサケ卵抽出物が添加された培地(再プログラミング用と同じもの)で培養；ならびに
3．再プログラムされなかった正常細胞を、0.4%のサケ卵抽出物が添加された培地(再プログラミング用と同じもの)で培養。
【０３００】
3つの全ての方法で、細胞の形態および遺伝子発現に変化が認められるが、レベルは異なり、生じる時間も異なる。遺伝子発現の変化は、形態変化が観察されるのと同じ時点で見られ、再プログラミングの5日後から、再プログラミングの28日後の範囲にある。これは、使用される方法に依存するようであり：再プログラミング(方法1および方法2)は、非再プログラミングより、および添加培地(方法2)における培養より速やかな変化を生じる可能性がある。
【０３０１】
以下に示すように、形態の変化および遺伝子発現の変化が見られる再プログラムされた細胞を、さらにOCT4およびNANOGに対する抗体で標識し、共焦点顕微鏡下で蛍光二次抗体によって可視化して、これらの遺伝子の発現の上昇を検証した。
【０３０２】
例示的な結果を、以下の表3および表4に示す。数字は、正常293T細胞と比較時の、脱分化関連遺伝子であるOCT4、NANOG、およびSOX2の発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの倍率を示す。下の数字はダウンレギュレーションを意味し、上の数字はアップレギュレーションを意味する。表中、大規模なアップレギュレーション効果を、青い字で示す。アップレギュレーションは、ASCが脂肪組織幹細胞を示す日に見られ、遺伝子発現には、わずかな変化のみが検出可能である。これは、異なる抽出物を対象に実施された実験と一致する(未公表の観察、Taranger et al., 2006)。
【０３０３】
（表３）
0005641734.tif 000004
【０３０４】
（表４）
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【０３０５】
本明細書に記載された研究は、魚の卵抽出物の調製、このような抽出物の特性解析および毒性試験の適切なプロトコル、抽出物による細胞の再プログラミングためのプロトコル、ならびに抽出物によって細胞に誘導される変化の結果を示す。この結果は、顕微鏡画像で認められる形態変化、ならびにリアルタイムPCRデータとして提示される処理細胞における遺伝子発現の変化を含む。293T細胞の再プログラミングは、17回の独立した回で実施されており、形態の変化が17例の再プログラミング中12例で認められた。遺伝子発現の変化は、調べた12例中8例で認められた(再プログラミングに関する遺伝子発現解析は現在も継続中)。形態の変化は、遺伝子発現の変化と相関している。すなわち形態の変化は、細胞内における遺伝子発現の変化と同時に生じ、これは、再プログラムされた細胞中における脱分化関連遺伝子の免疫蛍光標識によって検証される。脂肪組織幹細胞の再プログラミングは6回実施され、形態変化は、これらのうち1例でのみ観察された。これらの再プログラムされた細胞では、遺伝子発現の変化はわずかしか検出されない。
【０３０６】
実施例9
抽出物で処理された細胞の形態学的変化
サケ卵の抽出物、またはゼブラフィッシュ胚の抽出物によって再プログラムされた細胞の形態は、約3日後に変化する。293T細胞は球形に近くなり、および細胞集団の一部は、割球様の球に成長を開始する。このような変化は持続的であり、および21日目(実験終了)まで観察可能であるが、条件によっては、変化は2週間後に正常293Tの形態に逆転するようである。正常293T細胞を、正常培地(10%FCSおよび0.2%抽出物を含むRPMI-1640)に添加された抽出物とともに培養すると、正常培地で培養されて再プログラムされた細胞に見られるのと類似の形態変化が観察される。加えて、特にサケ卵抽出物とともに培養された細胞は、正常細胞と比較して速い成長速度を有する。飢餓状態の細胞(0.5%のFCSを含むRPMI-1640)では、非抽出物処理細胞より成長速度は有意に低下し(示していない)、細胞形態はわずかにしか変化しない。抽出物(飢餓培地中に0.2%の抽出物)とともに成長させた飢餓細胞では変化は顕著である。この場合、細胞集団の大半は割球様の球に成長し、およびこの球は、培養容器から剥がれ、培養液中を浮遊した状態で成長を続ける。
【０３０７】
興味深いことに、成長速度の減速は、飢餓培地に添加された抽出物とともに培養された細胞では逆転する。良好な再プログラミングは一般に、細胞容器内に肉眼で視認可能な大きな塊(直径>2 mm)の状態で成長する。
【０３０８】
実施例10
抽出物とともにインキュベートされた細胞の成長パターンの変化
500,000個の293T細胞を中型の円形培養ディッシュに添加し、正常培地で、または抽出物が添加された培地で、または飢餓培地でインキュベートした。24時間後、41時間後、および68時間後に細胞を回収し、カウントし、ならびに成長速度を計算した。結果を表5および表6に示す。
【０３０９】
（表５）
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【０３１０】
（表６）
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【０３１１】
成長速度の変化が認められ、飢餓状態の細胞は、正常培地における細胞より、研究の全期間を通して、はるかに緩やかに成長する。この作用は、培養開始から48時間後にサケ卵を培地に添加することで救済される。ゼブラフィッシュ胚抽出物およびサケ卵抽出物を含む正常培地で成長させた細胞は、最初の24時間中に、あらゆる細胞のなかで最も速く成長する。これについては図1〜3を参照されたい。
【０３１２】
実施例11
サケ卵抽出物による創傷治癒の促進
試験の目的：
マウスの皮膚に見られる創傷治癒に対する、添加されたサケ卵抽出物の効果を調べる。
【０３１３】
方法：
概要：
2タイプの創傷をマウスの背の皮膚に誘導した。直径1 cmの切除創(excision wound)を各マウス(n=12で計3回)の背中の左側に誘導し、および長さ2 cmの切開創(incision wound)を背中の右側に、脊椎に平行方向に誘導した。マウスの半数(無作為に選択)を、創傷誘導後に30 μlのサケ卵抽出物で3日ごとに12日間にわたって処置した。対照群には処置を行わなかった。全マウス(処置群および対照群)の創傷に1日目に、3回の試行のうち1回について液体バンドエイドを噴霧したが、これは全3回の実験(バンドエイドの噴霧を行った場合と行わない場合)において観察された対照マウスと処置マウス間に見られる差に影響しなかった。
【０３１４】
各実験においてマウスを3つのケージに分け、各ケージに対照2個体と処置2個体を入れた。創傷治癒過程のモニタリングを12日間にわたって、創傷面積、完全な治癒(再上皮化および瘡蓋の喪失)が生じるまでの日数、ならびに結果として生じる瘢痕のサイズを含む尺度によって行った。1日目および12日目に生検を行ってさらに解析し、創傷の写真をその都度撮影して治癒の進行を記録した。
【０３１５】
材料：
マウス：A/JまたはNMRIのアルビノの雄。
創傷誘導前における皮膚の滅菌用のエタノール。
小型の手術用具(surgical scissor)および超小型の手術用具(micro scissor)、メスおよびピンセット。
上述の手順で調製されたサケ卵抽出物(バッチLE4)。
イソフルランガス：FORENE Isofluran Vnr 506949、ロット22397VA、exp 2009-10(Abbott, Solna, Sweden)
気化器：Datex-Ohmeda Isotec 5
生検試料用の液体窒素。
生検試料用の4% PFA(溶媒PBS)。
治癒期間中における創傷および皮膚の写真を撮影用のデジタルカメラ。
動物の創傷サイズのマーキング用の直径1 cmの円形の型。
【０３１６】
試験デザイン：
動物
体重が25 g〜35 gの健康な近交系の雄のNMRIまたはA/Jマウス(別の研究)を、Institute of National Public Health(ノルウェー・オスロ)の動物部門から入手した。このマウスを実験開始前の1週間にわたって馴化させ、ポリプロピレン製ケージ内で、通常の餌および水を自由に与えながら飼育し、耳に標識を施し(各ケージに1〜4匹)、1週間後に実験を開始した。動物の体重を実験の前後に定期的に測定した。マウスを麻酔した後に実験的創傷を加えた。外科的介入は無菌条件で、イソフルランガス(酸素とイソフルランを気化器中で混合)を使用して実施した。感染症の徴候がないか個体を詳しく観察し；感染症の徴候が見られた個体は別にして試験から除外した。本明細書に記載された手順で、抽出物に関する急性毒性試験を実施した。本試験はノルウェーの倫理委員会によって承認された。
【０３１７】
創傷治癒活性
切除創および切開創の創傷モデルを使用して、サケ卵抽出物の創傷治癒活性の評価を行った。各個体の背中の右側に切除創を加え、背中の左側に切開創を加えた。創傷は1日目に加え、試験は12日目に終了した。
【０３１８】
切除創および切開創
個々のマウスに1か所の切除創(Morton JJP, Malone MH. Evaluation of vulnerary activity by an open wound procedure in rats. Arch Int Pharmacodyn. 1972; 196:117-126)および1か所の切開創を加えた(Ehrlich HP, Hunt TK. Effect of cortisone and vitamin A on wound healing. Ann Surg. 1968; 167:324-328)。創傷を加える前に、マウスをイソフルランガス(マスクを使用、系については後述)で麻酔した。背中の毛を電気バリカンで剃り、作られる切除創の領域を、背中の左側に防水性の油性ペンで印をつけた。全厚(約1 mm)の幅1 cm(円の面積=0.785 cm2)の切除創を印に沿って、歯付きピンセット、メス、および先端のとがった器具(pointed scissors)を使用して作製し、創傷全体を開いた状態にした。脊椎の右側には、長さ2 cmの縦方向の傍脊椎切開を、頚部の皮膚および皮膚組織を通して行った。実験群については、水溶液状のサケ卵抽出物(30 μl)で処理し、3日ごとに創傷に局所的に塗布した。対照群の創傷には処理は行わなかった。
【０３１９】
検討されたパラメータは、創縫合、創傷サイズ、瘢痕サイズ、上皮化に要する時間、および組織像(皮膚の形態学的なパラメータ)である。切除創モデルの創傷領域の測定は、最初の創傷から1日目、5日目、9日目、および12日目に、透明紙および油性ペンを用いて行った。各マウスの創傷の写真をデジタルカメラで毎日撮影した(詳細は以下)。上皮化に要する期間は、創傷に瘡蓋が見られなくなるまでに要する日数として計算した。
【０３２０】
生検
1日目に、切除創の作製時に切断された皮膚を正常皮膚生検として維持することで、後の生検解析における各個体のそれ自身の対照とした。生検の半分を4% PFAで固定し、残る半分を液体窒素で瞬間凍結した。切除創および切開創の創傷モデルでは、創傷上に生じた肉芽組織を、術後12日目に頸椎脱臼またはCO2ガスで動物を殺した後に切除した。切除創および切開創を、最初の創傷誘導の印に沿って外科的に除去した。生検の半数を4% PFAで固定し、残る半数については、後の解析用に液体窒素で瞬間凍結した。
【０３２１】
生検の組織病理学的解析
切除創および切開創の創傷モデルで、全個体から12日目に得られた治癒組織の半数をパラホルムアルデヒド(リン酸ナトリウム緩衝液中に4%)で室温で2時間かけて固定し、4℃で保存し、遠心分離し、クリオスタットで皮膚表面に対して逆平行に切片を作製した。切片をH&Eで染色し、肉芽組織の厚みを含む瘢痕のパラメータを顕微鏡下で測定した。
【０３２２】
H&E染色の標準的な手順を行った。簡単に説明すると、マウス皮膚生検の10 μmのクリオスタット切片(SuperFrost Plusスライド上)を(無水〜96%および70%エタノールから)再水和後にヘマトキシリン(Sigma 51275 HEMATOXYLIN SOLUTION ACC. TO MAYER)で着色し(7分間)、流水で洗浄し(5分間)、エオシン(Sigma HT110116 EOSIN Y SOLUTION ALCOHOLIC)で着色し(1分間)、水で軽くすすぎ、(70%〜96%〜無水エタノールと、これに続くキシロール(2x5分)から)脱水した。切片をキシロールからEukitt(Sigma 03989-100ML EUKITT(登録商標) QUICK-HARDENING MOUNTING ME-DI)で直接マウントした。
【０３２３】
代表的な処理個体および対照個体に由来する、1日目(創傷誘導時)および12日目(治癒後)に得られたマウス皮膚生検のH&E染色済みの切片を光学顕微鏡で調べ、デジタル写真を4x、10x、20x、および40xの対物レンズで撮影し、皮膚厚および瘢痕パラメータをデジタル画像から測定した。
【０３２４】
マウス皮膚生検のクリオスタット切片の免疫標識
代表的な抽出物処理個体および非処理対照個体の、1日目および12日目に採取された切除創生検の切片を、文献(Boulland et al., Expression of the vesicular glutamate transporters during development indicates the widespread corelease of multiple neurotransmitters. J Comp Neurol. 2004 Dec 13; 480(3):264-80)に記載された手順で、NANOG(ウサギポリクローナル、Abcam)およびカルビンジン(マウス、Abcam)、またはOCT3/4(ウサギポリクローナル、Santa Cruz)およびカルレチニン(ヤギ、Chemicon)のいずれかに対する抗体によって二重免疫染色して、治癒創傷中の幹細胞における発現の上昇(NANOGおよびOCT3/4の存在によって示される)について観察を行った。
【０３２５】
結果
サケ卵抽出物で処理された創傷の治癒率を非処理対照と比較した。
【０３２６】
処理皮膚および非処理皮膚における創傷の外観
結果から、抽出物処理個体(画像は示さず)では、より速く創傷が治癒することがわかる(9日目および12日目に有意差)。また創傷サイズは、抽出物処理個体では、より速やかに縮小し、5日目および9日目に有意差が認められた。図4を参照されたい。
【０３２７】
組織学的検査のための皮膚生検のヘマトキシリン-エオシン染色(パラフィン包埋切片またはクリオスタット切片)
1日目に除去されて切除創を作るために皮膚から得られた生検、および12日目に6匹から採取された同じ部位の同等の生検をクリオスタットで切片化し、H&Eで染色し、顕微鏡画像を撮影して解析した。形態学的には、1日目の正常皮膚生検の切片は、対照個体と処理個体群で似ており、皮膚パラメータの尺度は同等であった。12日目に、瘢痕組織、特にコラーゲンの組織化は、対照動物では、抽出物処理動物と比較して、より乱れた状態であった。
【０３２８】
（表７）
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【０３２９】
測定値(1切片あたりの3回の独立した測定の平均)は以下のように得られた：表皮厚は、基底ケラチノサイト(stratum germinatum)〜角質層から測定した。真皮厚は、基底ケラチノサイトの下部〜皮下組織(真皮下の脂肪組織組織)から測定した。全皮膚厚は、表皮と真皮の厚みを足し合わせることで測定した。12日目における瘢痕の直径を、瘢痕組織のいずれかの側の創傷治癒の突端(tongue)(wound healing tongue)間について測定し、1日目の切除創の直径(1 cm)と比較した。毛嚢(hair sack)間の距離は、隣接する毛髪の毛乳頭の中心間について測定した(12日目における瘢痕の近位)。
【０３３０】
測定値から、瘢痕の厚み、直径、表皮厚、および真皮厚のばらつきが、処理個体では、非処理対照個体と比較して小さいことがわかる。抽出物処理個体では、より厚い正常に近い(同じ個体の1日目に測定時の表皮厚に近い)表皮厚が見られ、および瘢痕に近位の、新たに形成された毛嚢間の距離は、より均一に分布していた(1日目における正常皮膚の毛嚢の分布に近い)が、対照個体における治癒皮膚の毛嚢は、より乱れており、正常皮膚と比較して、短い距離の毛嚢で分布していた。
【０３３１】
要約すると、以上の結果から、抽出物処理個体が、非処理対照個体と比較して41%薄い瘢痕(瘢痕中央部における全皮膚厚)を有しており、ならびに治癒した皮膚において新たに形成された上皮が、処理個体では、非処理対照個体と比較して148%薄く、および新しい真皮は7%薄いことがわかる。加えて、新しい毛嚢間の距離は、非処理対照個体と比較して、処理個体における術前の距離に16%近い。
【０３３２】
マウス皮膚生検のクリオスタット切片の免疫標識
代表的な抽出物処理個体および非処理対照個体の1日目および12日目に得られた切除創生検の切片を、文献(Boulland et al.)に記載された手順で、NANOG(ウサギポリクローナル、Abcam)およびカルビンジン(マウス、Abcam)、またはOCT3/4(ウサギポリクローナル、Santa Cruz)およびカルレチニン(ヤギ、Chemicon)のいずれかに対する抗体によって二重免疫標識して、治癒創傷における幹細胞の発現の上昇(NANOGおよびOCT3/4の存在によって示される)を観察した。
【０３３３】
OCT3/4は、主に核内に見出される、胚性幹細胞および他の幹細胞のマーカーである。OCT4(緑色)の染色は、表皮(増殖中のケラチノサイト)の基底層で検出された(新たな知見)。培養中の毛包間のケラチノサイトは、OCT-4で既にトランスフェクトされており、Sox-2、Nanog、Uft1、およびRex-1の発現の上昇を生じた。
【０３３４】
NANOGの発現はしばしば、幹細胞におけるOCT4の発現を伴う。NANOGの標識は12日目に、毛嚢の基部(毛髪の幹細胞)で、ならびに遊走中の細胞で創傷治癒突端に沿って検出された(新たな知見)。
【０３３５】
カルレチニンは、ヒト毛包の伴細胞層に存在することが報告されているカルシウム結合タンパク質である。カルレチニンの染色は予想と違わず、毛幹に沿って見られた。
【０３３６】
カルビンジンは、表皮ケラチノサイトの核および細胞質中に存在する(細胞質より核で多い)。創傷に伴い、核内のカルビンジンのレベルは、創傷後の約10日間にわたって低下する。カルビンジンの標識は、ケラチノサイト(表皮および毛幹の周囲の層)に見られた。
【０３３７】
処理創傷と非処理対照間の差を見出すためには、共焦点顕微鏡によるZ-stackおよびフーリエ変換を使用した、さらなる解析が必要である。
【０３３８】
実施例12
ヒト皮膚線維芽細胞およびHEK細胞の再プログラミング
hsF細胞(ヒト皮膚線維芽細胞)の継代培養
hsF用の完全培地
500 mlのDMEM F-12(+Glutamax)
50 ml(10%)のFCS(ウシ胎仔血清-加熱不活性化済み)
5 ml(1%)のPenStrep
hsF用の飢餓培地
500 mlのDMEM F-12(+Glutamax)
5 ml(1%)のPenStrep
【０３３９】
細胞を大型フラスコ(162 cm2)で培養する(約1 mlの細胞をコンフルエンス時に大型フラスコか、または再プログラミング用のウェル中のカバースリップ上に移す)(使用するhsF細胞はACCTから入手)。
【０３４０】
hsF細胞の継代培養：
1．細胞層を10〜15 mlのPBSで2回洗浄して、微量の血清を全て除去する。
2．2 mlのトリプシン-EDTA溶液を、細胞層が分散するまで(5〜7分間)添加する。
3．4 mlの培地を添加し、細胞を穏やかなピペット操作で吸引する。
4．継代培養比は1:2〜1:4とし；2〜3 mlの細胞懸濁物をフラスコに添加し、新鮮な培地を加えて計25 mlとする。細胞1:2〜1:4で2〜3日毎に(例えば1:4で週に2回)、継代培養する。
【０３４１】
細胞-ペレットの凍結：
1．新鮮な凍結用培地を作製する：
a．20% FCSおよび10% DMSOを含む正常培地
2．上記のプロトコル(継代培養)を3まで行い；その後、
3．細胞を50 mlのNuncチューブに移し、300 g(1500 rpm)で10分間、4℃で遠心分離する。
4．細胞を1 mlの凍結用培地に100万個となるように再懸濁し、1 mlのアリコートをNunc cryoチューブに移す。
5．Mr. Frostyボックス中で細胞をイソプロパノールで、-80℃に一晩かけて(-1℃/分)凍結させる。
6．窒素タンクへ移す。
【０３４２】
RNA単離用のペレットの作製：
継代培養プロトコルを3まで行い；その後、
1．細胞を50 mlのNuncチューブに移し、300 g(1500 rpm)で10分間、4℃で遠心分離する。
2．細胞を百万個あたり1 mlの氷冷PBSで洗浄し、遠心分離する(300 g、10分間、4℃)。
3．ペレットを同量のPBSに再懸濁し、RNAペレット用に1 mlをエッペンドルフチューブに移す。
4．300x g、10分、4℃の条件で遠心分離する。
5．PBSを吸引する。
6．ペレットを氷上に静置し、液体N2で瞬間凍結する。
7．-80℃の冷凍庫に移す。
【０３４３】
SLOを含むカバースリップ上におけるhsFの再プログラミング
目的：
細胞を無核抽出物で再プログラムし、遺伝子発現、形態、および成長の因子を変化させること、ならびに分化の状態の変化を調べること。
【０３４４】
材料：
カバースリップ上で24ウェルプレートで成長させたhsF細胞(1ウェルあたり約100,000個の細胞を約5日前に飢餓培地中に添加し、1ウェルあたり約50,000個の細胞を約3日前に正常培地に添加)；抽出物(サケ卵抽出物)；対照用培地によるインキュベーション；1xPBS；4℃のCa2+を含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)；フラスコからhsF細胞を剥がすためのTE；HBSSで1:100に希釈した100 μg/mlのSLOストック；ATP(水を溶媒とする200 mMのストック)；GTP(水を溶媒とする10 mMのストック)；ホスホクレアチン(水を溶媒とする2 Mのストック)；クレアチンキナーゼ(水を溶媒とする5 mg/mlストック)；蒸気滅菌済みのMQ水；37℃の水浴；CaCl2(2 mM)濃縮培地：100 mMのCaCl2ストックを1.67 gのCaCl2を15 mlの蒸留水と混合して調製して濾過滅菌したもの。2 mMの濃度のCaCl2を、例えば50 μlの100 mM CaCl2と2450 μlの再プログラミング用培地を混合することで作製する。
【０３４５】
手順：
細胞を氷冷1xPBS(1 ml)で2回洗浄する。細胞を冷HBSS(1 ml)で2回洗浄する。試料を37℃のインキュベーターで2〜3分間あらかじめ加温し、HBSSを除去する。110 μlのHBSSおよび90 μlのSLOを(最終SLO濃度が450 ng/mlとなるように)添加して混合する。200 μlのHBSSを、SLOなしに対照ウェルに添加する。インキュベーター内で30分間インキュベートする(プレートを10分毎に傾ける)。SLOを除去する(SLOがウェル中に残るように一方を平行に保つ)。再プログラミング用の抽出物を調製する：1回の再プログラミング反応物は、250 μlの抽出物(〜50〜100 Kの細胞)を含む。ATP生成系を調製して氷上で維持し：ATP、GTP、クレアチンキナーゼ、ホスホクレアチンを1:1:1:1の比で混合し、氷上で維持する。1回の反応あたり12.5 μlのATP生成系を抽出物に添加する。250 μlのサケ卵抽出物を(ATP生成系とともに)添加する。抽出物がカバースリップ上で細胞を覆っていることを確認する。プレートを傾けて混合する。インキュベーター内で60分間インキュベートする(プレートを10分毎に傾ける)。抽出物(200 μl)を吸引し、高Ca培地(約1500 μl)を各ウェルに添加する。2時間インキュベートする。細胞がカバースリップ上に接着しているか否かを顕微鏡でチェックする。接着していたら、Ca含有培地を除去して完全培地(約500 μl)を添加する。37℃、5% CO2の条件でインキュベートする。細胞を培養開始から24時間以内に評価する。位相差顕微鏡による観察を行う。コンフルエンスに至ったら細胞を分ける。再プログラミングの1日後にカバースリップを新しいウェルに動かし、数枚のカバースリップをトリプシン処理して小さなボトルに移した。細胞は剥がれなかったので、カバースリップ全体をボトルに移した。
【０３４６】
結果-hsFの再プログラミング
RPE(飢餓培地)およびRPF(正常培地)による再プログラミング実験
遺伝子発現の変化：
（表８）qPCRによる評価による、GAPDHに対して、発生段階で調節されるOCT4遺伝子およびNANOG遺伝子のアップレギュレーションの倍率
0005641734.tif 000009
【０３４７】
細胞の形態変化
再プログラミング後に、細胞培養を位相差顕微鏡で評価して正常細胞と比較した。
【０３４８】
再プログラミングの1日後には、生存細胞集団は正常hSF細胞と似ていたが、細胞の部分集団は、変化した形態を示した。これらの細胞は、正常細胞より長い/伸びた状態に見え、および一部(特に飢餓培地に由来するもの)は、細胞質中で円形の小胞/体を示した。飢餓培地に由来する細胞は、正常培地に由来する細胞より多くが生存した。
【０３４９】
再プログラミング後の12日目から22日目(実験は22日目に終了)までに、カバースリップに接着した状態の細胞は、薄い「側枝」/「突起」を有する、大きく、かつより明瞭な核を有する異常な形態を示し、正常細胞とは異なる形状を有する細胞であった。細胞の部分集団(主に飢餓状態の細胞)は、細胞質内で円形の小胞/体の状態を保っていた。各実験における全ての細胞の完全なプログラミングは予測されないので(Taranger et al., 2005)、形態変化を示す細胞の部分集団は、おそらく、qPCRで検出される遺伝子発現の変化に関与する、再プログラムされた細胞である。
【０３５０】
免疫蛍光
細胞を、再プログラミング後の7日目にカバースリップ上に固定した。免疫蛍光標識は基本的に、組織切片に関して報告された手順(Boulland et al., 2004)で実施した。簡単に説明すると、カバースリップ上で成長させた細胞を、4% PFA(室温で30分間)で固定し、PBSで洗浄し、1 Mエタノールアミンでブロックし、3xPBSで洗浄し、ブロック溶液(室温で1時間)でプレインキュベートし、インキュベーション用溶液を溶媒とするOCT 3/4(Santa Cruz)(1:200)に対する一次抗体とインキュベートし(室温で3時間)、3xPBSで洗浄し、蛍光結合二次抗体Alexa 488(1:2000)(Molecular Probes)とインキュベートし(室温で1時間)、最後に3xPBSで洗浄した。核を染色するために、DAPI(1:1000)を添加後に洗浄を行った。カバースリップをProLong Gold Antifade試薬(Molecular Probes)でマウントし、画像を蛍光顕微鏡(Olympus)または共焦点顕微鏡(Zeiss)で得た。
【０３５１】
OCT4の染色が大半の細胞の細胞質で認められ、極めて弱い染色を示す正常対照と比較して、より強い標識が、再プログラムされた細胞で見られた。正常細胞の核にヘキスト(Hoechst)染色が認められ、さらにこれは、再プログラムされた細胞の細胞質においてOCT4染色と重複していた。細胞の感染を、細胞質のヘキスト染色がマイコプラズマに起因せず、再プログラミングの真の発現によることを確認することで評価した。
【０３５２】
HEKa細胞(ヒト表皮ケラチノサイト-成体)の継代培養
Cascade Biologicsのケラチノサイト培養システム
EXTENDED-LIFESPANシステム
Basal Medium EpiLife(登録商標)培地
成長用サプリメント  HKGS(S-001-5)
継代培養試薬  トリプシン/EDTA(R-001-100)
継代培養試薬  トリプシン中和液(R-002-100)
抗生物質(再プログラミング後)  ゲンタマイシン/アンホテリシンB(R-015-10)
HEKa(C-005-5C)の推定寿命  35〜45回の集団の倍加
HEKa用の完全培地
500 mlのEpiLife培地
5 mlのHKGS(ヒトケラチノサイト成長サプリメント)
再プログラミング後：1 mlのゲンタマイシン/アンホテリシン(GA)
細胞を75 cm2の培養フラスコで培養(コンフルエンス時に約10 mlの細胞)。
【０３５３】
HEKa細胞の継代培養
1．細胞を3 mlのトリプシン/EDTAで速やかに洗浄する。
2．1 mlの新鮮なトリプシン/EDTAを添加し、細胞が分散するまで(8〜10分間)インキュベートする。
3．3 mlのトリプシン/中和液を添加し、細胞を滅菌済みの15 mlチューブに移す。さらに3 mlの追加のトリプシン/中和液で繰り返す。
4．180x gで7分間、遠心分離する。
5．細胞ペレットを再懸濁し、新しい培養容器に1 cm2あたり2.5x103個の細胞となるように添加する。
6．48時間後に、細胞の培地を交換する。
7．培地を、培養物が約50%のコンフルエンシーになるまで1日おきに交換する。
8．培地を、培養物が約80%のコンフルエンシーになるまで1日おきに交換する。
【０３５４】
細胞-ペレットの凍結：
7．新鮮な凍結用培地を作製する：
a．10% FCSおよび10% DMSOを添加した正常培地
8．上記プロトコル(継代培養)を4まで行う。
9．細胞をPBSで洗浄する(180x g、7分間)。
10．細胞ペレットを、1 mlの凍結用培地あたり百万個となるように再懸濁し、1 mlをcryoチューブに移す。
11．Mr. Frostyボックス中で細胞をイソプロパノールで、-80℃に一晩かけて(-1℃/分)凍結する。
12．窒素タンクへ移す。
【０３５５】
RNA単離用のペレットの作製：
継代培養プロトコルを4まで行い；その後、
8．細胞を1 mlのPBSに百万個となるように再懸濁し、RNAペレット用に1 mlをエッペンドルフチューブに移す。
9．300x g、10分、4℃の条件で遠心分離する。
10．PBSを吸引し、ペレットを氷上で維持し、液体N2で瞬間凍結する。
11．-80℃の冷凍庫に移す。
【０３５６】
HEKa細胞の再プログラミング(SLO不使用)
目的：
細胞を無核抽出物で再プログラムし、遺伝子発現、形態、および成長の因子を変化させて分化状態の変化を調べる。
【０３５７】
実験用のHEKa細胞を、正常培地(HGKSまたは1% GA[再プログラミング後]を添加したEpiLife)で成長させた。「擬似」再プログラミングを、対照(細胞は抽出物不添加の正常培地で再プログラミング手順を受ける)として実施し、および正常HEKa細胞を陰性対照として平行して培養した。
【０３５８】
1つの擬似再プログラミング、および対照としての1フラスコの正常293Tも含む同じ実験で、293Tは再プログラムされた。293Tは、正常培地(1% PSを含むRPMI)で成長させる。
【０３５９】
材料：
1フラスコのHEK細胞；1フラスコの293T；抽出物(サケ卵抽出物)；対照用培地におけるインキュベーション；RPMI培地(293T)；EpiLife培地(HEK)；1xPBS；4℃のCa2+を含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)；HEK細胞をフラスコから剥がすためのTE；TN(トリプシン中和)溶液；ATP(水を溶媒とする200 mMのストック)；GTP(水を溶媒とする10 mMのストック)；ホスホクレアチン(水を溶媒とする2 Mのストック)；クレアチンキナーゼ(水を溶媒とする5 mg/mlのストック)；NTP(25 mMのストック)；蒸気滅菌済みのmq水；75 cm2のフラスコ；15 ml、1.5 mlのチューブ。4℃に冷却遠心分離し；1.5 mlのチューブ用および15 mlチューブ用のスイングアウトバケツローター；37℃の水浴。
【０３６０】
手順：
1．HEK細胞を回収する(1 mlのTEで洗浄し、吸引し、3 mlのTEと5〜10分間インキュベートする)。細胞を15 mlチューブに移し、200x g、10分間、4℃の条件で遠心分離する(293T細胞を回収する(PBSで洗浄し、10 mlのRPMI培地を添加し、細胞を剥がし、50 mlチューブに移す)。
a．30 mlの氷冷PBSで1回、および10 mlの氷冷HBSSで1回洗浄する。
b．1 mlのHBSSあたり500,000個となるように細胞を再懸濁する。
2．500,000個の細胞を個々の再プログラミング用チューブに添加する。
a．1200 rpm、5分間、4℃の条件で、SWローターで遠心分離する。
b．HBSSを除去する。
3．再プログラミング用の抽出物を調製する。
a．ATP生成系を調製して氷上で維持する：ATP、GTP、クレアチンキナーゼ、ホスホクレアチンを1:1:1:1の比で混合して氷上で維持する。1回の反応あたり+0.5 mMのNTPを添加する。
b．1回の反応あたり30 μlのATP生成系を添加する。
4．抽出物(ATP生成系を含む)を、チューブ1本あたり500 μl〜500,000個の細胞となるように添加する。
a．チューブをパラフィルムで覆い、37℃の水浴で60分間インキュベートする。インキュベーション中に細胞を2回、軽く叩く。
5．培地を含む1個のフラスコあたり1本の再プログラミング用チューブを添加する。
6．37℃で5% CO2の条件でインキュベートする。
【０３６１】
培養の開始から24時間以内に細胞を評価する。位相差顕微鏡で観察する。コンフルエントになったら細胞を分ける。
【０３６２】
結果：
HEKaの再プログラミング
再プログラミング実験RPH。
【０３６３】
遺伝子発現の変化：
（表９）qPCRによって評価された、GAPDHに対する、発生段階で調節されたOCT4遺伝子およびNANOG遺伝子のアップレギュレーションの倍率
0005641734.tif 000010
【０３６４】
細胞の形態変化：
再プログラミング後に、細胞培養物を位相差顕微鏡で評価し、正常細胞と比較した。
【０３６５】
対照となる擬似細胞と比較して、抽出物とインキュベートした細胞で再プログラミング手順を経て生存した細胞はほとんどなかった。再プログラムされた細胞の一部は、細胞質内で円形の小胞/体を示し、核は、より大きくて不明瞭であった。細胞の一部は形質膜から突出し、正常細胞とは異なる、さまざまな全体的な形状を有する有足細胞に似た、小さな「スパイク」を有する非定型の形態を示した。
【０３６６】
免疫蛍光
再プログラミングを開始してから9日目に細胞をカバースリップ上に固定した。免疫蛍光標識を、hSF細胞について記載された手順で実施した。
【０３６７】
HEK細胞を、OCT4に関して免疫標識し(hSF細胞の場合と同じ手順および抗体)、核をヘキスト染色によって蛍光顕微鏡で同定した。正常HEK細胞は核内で極めて弱いOCT4染色を示したが、サケ卵抽出物で再プログラムされたHEK細胞の部分集団の核は、OCT4によって明らかにより強く染色され、同じ再プログラミングに由来する細胞におけるOCT4のアップレギュレーションを示すqPCRの結果と一致した。ヘキスト染色は、大半の細胞の核でOCT4染色と重複しており、およびOCT4染色は、再プログラムされた細胞の核で特に強かった。負の対照(一次抗体を含まないもの)ではOCT4染色は見られなかったが、核はヘキストで通常通りに染色された。細胞の観察には、同じ設定の顕微鏡およびデジタル画像キャプチャーを使用した。
【図面の簡単な説明】
【０３６８】
【図１】経時的な世代を示すグラフ。
【図２】時間に対する分/世代を示すグラフ。
【図３】成長曲線のグラフ。
【図４】マウス皮膚の創傷および瘢痕の測定値および創傷治癒率を示すグラフ。これらのデータから、創傷治癒の抽出物が、マウスの皮膚における2つのタイプの創傷の治癒に影響することがわかる(左のパネルは切除創、右のパネルは切開創)。1日目、5日目、9日目、および12日目に透明なフィルム上にトレースされたルーラーおよび創傷/瘢痕面積によって得られた測定値。切除の面積、および切開創の長さ(上のパネル)から、創傷面積が1日目から12日目にかけて段階的に縮小することがわかる。治癒が早期に開始されるほど、抽出物処理動物における創傷の縮小は、より速やかであり、切除創については、5日目および9日目に有意となる。形成された瘢痕は、再上皮化の日から測定された(中央のパネル)。より小さなサイズの創傷に対する傾向が、切除創と切開創の双方について見られる。瘢痕が創傷となる日数が進むにつれて、完全な治癒に要する日数が現われる。創傷が完全に治癒した動物のパーセント(下のパネル)から、切開創が処置動物で、より速やかに治癒することがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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