(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
油中水型エマルジョンを含むワクチン組成物であって、
ここで該エマルジョンは、油成分および水性成分を含み；そして
ここで該水性成分は、少なくとも１種の抗原、ならびにアクリルポリマーおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）を含むアジュバントを含む、
ワクチン組成物。
【請求項２】
前記アクリルポリマーは、ポリアリルスクロースで架橋されたアクリル酸のポリマーである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記アクリルポリマーは、アルキル−ポリアクリル酸（「アルキル−ＰＡＡ」）アジュバントである、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記アルキル−ＰＡＡアジュバントは、デシル−ＰＡＡ、オクチル−ＰＡＡ、ブチル−ＰＡＡおよびメチル−ＰＡＡからなる群より選択される、請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記アルキル−ＰＡＡアジュバントは、オクチル−ＰＡＡである、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１種の抗原は、感染性因子である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記感染性因子は、生の感染性因子である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記感染性因子は、死滅感染性因子もしくは不活性化感染性因子である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
前記感染性因子は、ウイルス、細菌、真菌、もしくは寄生体である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の抗原は、ペプチド、ポリペプチド、もしくは核酸である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
前記感染性因子はウイルスである、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
前記感染性因子は、トリ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、もしくはウマ動物に感染することができる因子である、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
前記感染性因子は、トリ動物に感染することができる因子である、請求項１２に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項１１に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
前記油成分は、ミネラルオイルを含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、１種以上の乳化剤をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１７】
前記水性成分はレシチンをさらに含む、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項１８】
ヒトを除く動物にワクチン接種するための方法であって、該方法は、該動物に、請求項１に記載のワクチン組成物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項１９】
前記動物は、トリ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、もしくはウマ動物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ワクチン組成物を作製するための方法であって、該方法は、油成分と、水性成分とを乳化する工程を包含し、
ここで該水性成分は、少なくとも１種の抗原、ならびにアクリルポリマーおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）を含むアジュバントを含む、
方法。
【請求項２１】
前記アクリルポリマーは、ポリアリルスクロースで架橋されたアクリル酸のポリマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ワクチン組成物を作製するための方法であって、該方法は、
（ａ）抗原の水溶液と、アクリルポリマーおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）を含むアジュバントとを合わせて、抗原／アジュバント混合物を形成する工程；
（ｂ）（ａ）の抗原／アジュバント混合物と、油成分および乳化剤とを合わせて、抗原／アジュバント／油成分混合物を形成する工程；ならびに
（ｃ）（ｂ）の抗原／アジュバント／油成分混合物を
乳化して、油中水型エマルジョンを形成し、それによって、ワクチン組成物を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記アクリルポリマーは、ポリアリルスクロースで架橋されたアクリル酸のポリマーである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記油成分はミネラルオイルを含む、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、油中水型ワクチン処方物、上記処方物を作製するためのプロセスおよび動物のワクチン接種のためのこのような処方物の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
多くの感染性疾患制御プログラムの基礎は、生の微生物もしくは不活性化微生物またはそれらの生成物のいずれかでのワクチン接種による、特異的免疫の誘導である。有効なワクチン接種手順は、ある抗原についての動物における免疫記憶の状態の発生を可能にし、上記抗原とのその後に接触した際に、上記動物における急激かつ強い免疫学的応答がもたらされる。しかし、いくつかの抗原は、ごくわずかに免疫原性である。このような抗原は、その後のチャレンジの際に上記動物に有効な防御を提供するに十分な免疫応答を誘導することができない可能性があるか、または免疫原性を増大させて、有効な防御を提供するさらなる因子との投与を要し得る。
【０００３】
抗原の免疫原性は、アジュバントといわれる物質（アジュバントは、免疫系に直接作用するかまたは上記抗原の薬物動態的特徴を改変するかのいずれかによって、上記抗原に対する応答を増大し、それによって、抗原と、上記免疫系との間のその相互作用時間を増大させる）と混合した状態で抗原を投与することによって、増大させられ得る。
【０００４】
水および油から作製されたエマルジョン（例えば、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョン）は、ワクチン中のアジュバントとして使用され得る。油中水型エマルジョンは、動物ワクチン中（例えば、家禽用ワクチン中）のアジュバントとして一般に使用される。一般に、油中水型エマルジョンを作製するために、水相の抗原は、１種以上の乳化剤の存在下で、ミネラルオイルキャリアにゆっくりと添加され、油滴からなるミセルを生じ、上記油滴内に、上記水性抗原がある。上記油成分は、注射部位への免疫細胞の移動を誘導し、上記抗原から防御し、上記免疫細胞が上記抗原を処理する時間を延長させるようにも作用すると考えられている。この最終的な結果は、上記抗原自体を単に注射することと比較すると、上記免疫応答の増強である。
【０００５】
アクリルポリマーからなるアジュバントは、ときおり、ワクチン処方物中の油ベースのエマルジョンの代替として使用される。例示的なアクリルポリマーは、カルボポルとしても公知であるポリアリルスクロースで架橋されたアクリル酸の水溶性ポリマーである。米国特許第５，０２６，５４６号は、例えば、ワクチンアジュバントとしてのジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）の使用および水中のＤＤＡの溶解度を改善するためのカルボポルの添加に言及している。
【０００６】
油ベースのエマルジョンおよびアクリルポリマーはともに、ワクチン処方物中でアジュバントとして使用される場合、別個の利点を有する。しかし、アクリルポリマー（例えば、カルボポル）が油エマルジョンと会合して非常に反応性になると予測されているので、油中水型エマルジョンおよびアクリルポリマーを合わせることは妨げられている。例えば、米国特許第５，０２６，５４６号（上記で議論されている）は、カルボポルの使用に言及しているが、ＤＤＡおよび／もしくはカルボポルを、油中水型エマルジョンもしくは水中油型エマルジョン中で使用するという示唆を何ら提供していない。さらに、特定の種（例えば、家禽）のためのアジュバントに関しては、アクリルポリマーは、一般にそれらの認識されている高い反応性に起因して、回避されてきた。従って、ワクチン接種された動物において上記アクリルポリマーによって引き起こされる有害な反応性の欠点がない、アクリルポリマーおよび油中水型エマルジョンの合わされた利点を提供する新規なアジュバントが当該分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、油ベースのエマルジョンワクチン組成物を水相中のアクリルポリマー（例えば、カルボポル）と処方することは、アクリルポリマーを含まない油ベースのエマルジョンワクチン組成物と比較して、ワクチン組成物によって生成される免疫応答を顕著に増大させるという驚くべき発見に一部基づいている。さらに、油中水型エマルジョンの上記水相中のアクリルポリマーを処方することによって、上記動物におけるアクリルポリマーの予測される有害な反応性が回避された。
【０００８】
従って、本発明は、油中水型エマルジョンを含むワクチン組成物を提供する。本発明の油中水型エマルジョンは、油成分および水性成分を含む。上記水性成分は、少なくとも１種の抗原、ならびにアクリルポリマーおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）からなる群より選択される少なくとも１種のアジュバントを含む。本発明はまた、動物にワクチン接種するための方法を包含し、上記方法は、本発明のワクチン組成物を動物に投与する工程を包含する。
【０００９】
本発明の他の局面は、油中水型エマルジョンを含むワクチン組成物を作製するための方法を包含する。本発明の方法は、油成分を、水性成分と乳化する工程を包含し、ここで上記水性成分は、少なくとも１種の抗原、ならびにアクリルポリマーおよびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）からなる群より選択される少なくとも１種のアジュバントを含む。
【００１０】
本発明の上記の特徴および多くの他の付随する利点は、添付の図面とともに理解される場合に、以下の詳細な説明を参照することによってさらに理解されることになる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明のエマルジョンワクチン組成物を作製するための例示的方法を示すフローチャートである。
【図２】図２は、不活性化Ｈ５Ｎ３トリインフルエンザ抗原を含む油中水型エマルジョンワクチン処方物を接種したシチメンチョウ由来の血液のＨＩ（赤血球凝集阻害）を示す。
【図３】図３は、コントロールシチメンチョウ、ならびに不活性化Ｈ５Ｎ３トリインフルエンザ抗原およびアジュバントなし、カルボポル（登録商標）、カルボポル（登録商標）＋ＤＤＡ、ＣＭＣ、ＨＰＭＣ、もしくはＡｌ（ＯＨ）３（ｒｅＨｙｄｒａｇｅｌ（登録商標））を含む油中水型エマルジョンワクチンを接種したシチメンチョウ由来の血液のＨＩ力価を示す。「前採血」と示された上記ＨＩ力価レベルは、３匹の非ワクチン接種シチメンチョウ由来のものであった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、エマルジョンを含むワクチン組成物を提供する。上記エマルジョンは、油成分および水性成分を含む。上記水性成分は、少なくとも１種の抗原および少なくとも１種のアジュバントを含む。上記アジュバントは、アクリルポリマーおよび／もしくはＤＤＡを含み得る。
【００１３】
（エマルジョン）
種々のタイプの、ワクチン調製物において使用されるエマルジョンとしては、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、および水中油中水型エマルジョンが挙げられる。本発明の状況において使用するための異なるタイプのエマルジョンは、油中水型エマルジョンである。油中水型エマルジョンは、１種以上の油溶性界面活性剤、１種硫黄の水溶性界面活性剤、さらなるアジュバント、さらなる水相成分、エマルジョン安定化剤、もしくはこれらの組み合わせをさらに含み得る。油中水型エマルジョンを作製するための方法は、当該分野で公知であり、本明細書中の他の箇所で記載されている。
【００１４】
（ワクチン組成物）
本明細書で使用される場合、「ワクチン組成物」とは、レシピエントにおける防御免疫を誘発するために使用され得る組成物である。従って、被験体に抗原をワクチン接種した後に、ワクチンは、非ワクチン接種被験体に対して、同じもしくは関連する抗原に曝された被験体における疾患を予防するか、遅延させるか、または上記疾患の発症の重篤度を軽減する。ワクチンによって提供される防御免疫は、液性（抗体媒介性）免疫もしくは細胞性免疫、またはその両方であり得る。ワクチン接種は、例えば、病原体もしくは感染細胞の負担を排除もしくは低下させ得るか、または任意の他の測定可能な感染の軽減を生じ得る。ワクチン接種はまた、免疫した（ワクチン接種した）被験体における腫瘍負荷を低下させ得る。
【００１５】
用語「防御免疫」とは、本明細書で使用される場合、被験体が抗原に曝されて、上記被験体において免疫応答（活性／獲得もしくは受動／先天性、またはその両方）を生じ、不活性化および／もしくは抗原の負荷における低下ならびに免疫記憶の生成（例えば、記憶Ｔ細胞もしくは記憶Ｂ細胞）をもたらした場合に、抗原に対して獲得される免疫をいう。
【００１６】
ワクチン接種によって提供される防御免疫は部分的であってもよいし、ワクチン接種した被験体の一部にのみ提供されてもよい。従って、ワクチンは、上記免疫した集団の一部において防御免疫を誘導し得る。なぜなら、いくらかの個体は、強い免疫応答もしくは防御免疫応答を上昇させることができない可能性があるか、またはいくつらかの場合には、いかなる免疫応答をも上昇させることができない可能性があるからである。この無能力は、上記個々の遺伝的バックグラウンドから、または免疫不全状態（後天性もしくは先天的のいずれか）もしくは免疫抑制（例えば、化学療法での処置もしくは免疫抑制剤の使用に起因する（例えば、器官拒絶を予防するかもしくは自己免疫状態を抑制するために））が原因で生じ得る。にも拘わらず、上記免疫した集団の一部に防御を提供するワクチンは、有用であり、有効であると考えられている。
【００１７】
（アジュバント）
用語「アジュバント」とは、本明細書で使用される場合、抗原と共同して投与される場合に、その抗原に対する被験体の免疫応答を増強する化合物をいう。
【００１８】
上記免疫応答のアジュバント媒介性の増強は、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、それらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって評価され得る：（ｉ）上記抗原単独での免疫に応じて生成された抗体の数に対して、上記アジュバント／抗原組み合わせでの免疫に応じて生成された抗体の数の増加；（ｉｉ）上記抗原もしくは上記アジュバントを認識するＴ細胞の数の増加；（ｉｉｉ）１種以上のＩ型サイトカインのレベルの増加；ならびに（ｉｖ）生のチャレンジ後のインビボ防御。
【００１９】
免疫応答は、抗原特異的免疫反応性（例えば、抗体力価もしくはＴ細胞生成）の任意の測定可能なパラメーターが、抗原単独でチャレンジした被験体と比較して、被験体が抗原およびアジュバントでチャレンジされた場合に、少なくとも１０％増大すると、増大したと考えられている。本発明の特定の実施形態において、免疫応答は、抗原特異的眼年期反応性の任意の測定可能なパラメーターが、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも２２５％、少なくとも２５０％、少なくとも２７５％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、もしくは少なくとも１０００％増大した場合に、増強されている。
【００２０】
上記アジュバントは、好ましくは、アクリルポリマー、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、もしくはアクリルポリマーとＤＤＡとの組み合わせである。上記アジュバントは、好ましくは、水溶性アジュバントもしくは水分散性アジュバントである。
【００２１】
アクリルポリマーは、本明細書で使用される場合、アクリル部分を含むポリマーもしくはコポリマーである。例示的なアクリルポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸、メタクリル酸、メタクリレート、アクリルアミド、アクリレート、アクリルニトリル、およびポリアクリル酸のアルキルエステルが挙げられる。アクリルコポリマーの例としては、例えば、ポリ（アクリルアミド−コ  ブチル，メタクリレート）、アクリル−メタクリル酸、アクリル−アクリルアミドおよびポリ（メタクリレート）が挙げられる。市販のアクリルポリマーの例としては、カルボポル（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、カルボセット（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、ネオクリル（Ａｖｅｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌ．）、およびユードラジット（Ｒｏｈｍ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｍａｌｄｅｎ，Ｍａｓｓ．）が挙げられる。本発明のエマルジョンにおける使用に特に有用なアクリルポリマーは、カルボポルであり、カルボポルはまた、ポリアリルスクロースで架橋されたアクリル酸の水溶性ポリマーと一般的にいわれ、当該分野で公知である。
【００２２】
本発明の油中水型エマルジョンの水相において含まれ得る特定のアクリルポリマーとしては、米国特許第６，３４０，４６４号、およびそこで引用される参考文献に記載されるように、アルキル−ポリアクリル酸（「アルキル−ＰＡＡ」）ポリマーが挙げられる。例示的なアルキル−ＰＡＡポリマーとしては、デシル−ＰＡＡ（Ｃ１０−ＰＡＡ）、オクチル−ＰＡＡ（Ｃ８−ＰＡＡ）、ブチル−ＰＡＡ（Ｃ４−ＰＡＡ）、およびメチル−ＰＡＡ（Ｃ１−ＰＡＡ）が挙げられる（例えば、米国特許第６，３４０，４６４号、表Ｉを参照のこと）。オクチル−ＰＡＡは、あるいは、「オクチル−アルキル−ＰＡＡ」もしくは「ＯＡ−ＰＡＡ」といわれ得る。
【００２３】
本発明の特定の実施形態において、上記水性成分はまた、レシチンを含む。本発明の状況において、上記レシチンは、リポソームを形成するために使用され得る任意のレシチン（例えば、レシチン脂質性物質（例えば、ホスファチジルコリン））であり得る。リン脂質、リゾリン脂質、糖脂質および中性脂質は、レシチンの代表的な組成を含む。レシチンは、完全に加水分解される場合に、脂肪酸が２分子、ならびにグリセロール、リン酸、および塩基性窒素含有化合物（これは、通常、コリンである）が各々１分子を生じる分子である。加水分解時にレシチンから得られる上記脂肪酸は、通常、オレイン酸、パルミチン酸およびステアリン酸であるが、これらに限定されない。上記リン酸は、α位もしくはβ位のいずれかでグリセロールに結合されて、それぞれ、α−グリセロリン酸もしくはβ−グリセロリン酸を形成し、αレシチンおよびβ−レシチンとして公知の対応する一連のレシチンを生成し得る。レシチンおよびアクリルポリマーを含むアジュバントの例は、例えば、米国特許第６，６７６，９５８号に記載される。
【００２４】
本発明のワクチン組成物において、上記アクリルポリマーおよび／もしくはＤＤＡは、１種以上のさらなるアジュバントとともに使用され得る。例示的なさらなるアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＭＦ５９、もしくはＳＡＦ；ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム（ミョウバン、例えば、Ｒｅｈｅｉｓ，Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ）から市販されるＡｌ（ＯＨ）３  ｒｅＨｙｄｒａｇｅｌ（登録商標））、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム）またはカルシウム塩（例えば、リン酸カルシウム））；微生物由来のアジュバント（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、百日咳毒素、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ熱不安定性毒素（ＬＴ）、変異毒素（例えば、ＬＴＫ６３もしくはＬＴＲ７２）、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、ミコバクテリア、破傷風毒素、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフ、ムラミルジペプチド、もしくはモノホスホリルリピドＡ；粒状アジュバント（例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、リポソーム、生体分解性マイクロスフェア、またはサポニン（例えば、ＱＳ−２１）；サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２もしくはＧＭ−ＣＳＦ）；合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロックコポリマーもしくは界面活性剤、ムラミルペプチドアナログ（例えば、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン［ｔｈｒ−ＭＤＰ］、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルダミニル−Ｌ−アラニン−２−［１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ］−エチルアミン）、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、炭化水素エマルジョン、あるいはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるアジュバントとしては、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）およびＨＰＭＣ（ヒドロキシプロピルメチルセルロース）が挙げられる。
【００２５】
本明細書で提供される実施例に例示されるように、油中水型エマルジョンワクチンの水相におけるアジュバント（例えば、カルボポル、アルキル−ＰＡＡ（例えば、ＯＡ−ＰＡＡ）および／もしくはＤＤＡ）の使用は、驚くべきことに、アジュバントなしの伝統的な油中水型エマルジョンワクチンと比較して、上記ワクチンの抗原性を改善した。
【００２６】
（抗原）
用語「抗原」とは、本明細書において使用される場合、被験体に導入される場合に、宿主の免疫系によって認識され、免疫応答を誘発することができかつ防御免疫を生成することができる薬剤をいう。抗原としては、病原体の表面もしくは感染細胞の表面、または腫瘍細胞の表面に天然に発現されている「表面抗原」が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の特定の実施形態において、上記抗原は、感染性因子である。上記感染性因子は、生の感染性因子であってもよいし、死滅感染性因子もしくは不活性化感染性因子であってもよい。本発明のワクチン組成物において抗原として働き得る例示的な感染性因子としては、例えば、ウイルス、細菌、真菌、寄生体もしくは他の微生物が挙げられる。上記抗原はまた、ウイルス、細菌、真菌、寄生体もしくは他の微生物に由来する成分もしくは生成物であり得る。あるいは、上記抗原は、化学合成によって生成される生成物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、糖タンパク質、糖脂質、核酸、もしくはこれらの組み合わせであり得る。当業者は、核酸抗原が動物に導入される場合に、次に免疫応答を誘発する、例えば、ペプチドもしくはタンパク質の生成を最終的にもたらすことを理解する。
【００２８】
被験体に投与される場合、抗原は、免疫系の抗原認識分子（例えば、免疫グロブリン（抗体）もしくはＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ））と特異的に相互作用して、免疫応答を誘発し、記憶細胞（例えば、記憶Ｂ細胞および記憶Ｔ細胞）および防御免疫の形成をもたらす。いくつかの抗原は、免疫応答を誘発するためにアジュバントもしくはキャリアとの同時投与を必要とする。
【００２９】
ワクチンは、抗原に加えて、もしくは抗原の代わりに抗原を生成する成分（例えば、ベクター）を含み得る。用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」とは、宿主を形質転換し、そして抗原のその導入された配列の発現（例えば、転写および／もしくは翻訳）を促進するように、核酸配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入され得るビヒクルを意味する。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、およびウイルス（例えば、ＲＮＡウイルス（例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルス））が挙げられる。
【００３０】
本発明の特定の実施形態において、上記抗原が感染性因子である場合、上記感染性因子は、動物に感染し得る因子であり得る。例えば、上記感染性因子は、ヒト、トリ（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、鳩など）、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、もしくはウマ動物に感染し得る。
【００３１】
抗原が防御免疫を誘発し得る疾患の病原体および／もしくは状態の非限定的例は、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、感染性気管支炎ウイルス、ライノウイルス、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス（例えば、アヒルパルボウイルス）、アデノウイルス、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、トリ白血症、伝染性ファブリキウス嚢病、レオウイルス、水痘（ｐｏｘ）、咽頭気管支炎、マレック病、破傷風、Ｂ型肝炎、マラリア、肺炎球菌肺炎、ロタウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス（ｃａｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｏｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、ＶｉｂｒｉｏおよびＧｉａｒｄｉａ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ、ならびにＣｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍである。抗原はまた、悪性腫瘍（例えば、固形腫瘍もしくは血液腫瘍（例えば、肉腫、癌腫、神経膠腫、芽細胞腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、リンパ腫、白血病、および黒色腫）に対する防御免疫を誘発し得る。
【００３２】
特定の実施形態において、上記抗原は、インフルエンザウイルス（例えば、不活性化インフルエンザウイルス）である。上記不活性化インフルエンザウイルスは、伝統的な方法もしくはいわゆる「逆遺伝学」技術によって得られ得る。本発明のワクチン組成物において使用するためのインフルエンザウイルス抗原を作製するために使用され得る例示的な逆遺伝学方法は、例えば、米国特許第６，９５１，７５４号、同第５，５７８，４７３号、同第５，８２０，８７１号、同第６，８８７，６９９号、同第６，５４４，７８５号、ならびに米国特許出願公開第２００３／００３５８１４号、同第２００６／０１３４１３８号、同第２００６／００５７１１６号、同第２００５／００３７４８７号、同第２００５／０００３３４９号、同第２００６／０１６６３２１号、および同第２００４／０１４２００３号で開示されている。前述の特許および特許出願公開の内容は、それらの全体が本明細書に参考として援用される。
【００３３】
任意の不活性化インフルエンザウイルスは、本発明の状況において使用され得、任意の不活性化インフルエンザＡ型株（例えば、トリインフルエンザ株）が挙げられる。上記インフルエンザウイルスは、伝統的な卵ベースの方法もしくは本明細書中上記で言及した逆遺伝学技術によって生成される組換えインフルエンザウイルスであり得る。上記組換えウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）サブタイプの任意の組み合わせを有し得る。本発明の状況において抗原として使用され得る例示的不活性化インフルエンザウイルスとしては、Ｈ１、Ｈ５、Ｈ７もしくはＨ９のヘマグルチニンと、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８もしくはＮ９のうちのいずれかとを組み合わせて有するウイルスが挙げられる。一般に、上記抗原のヘマグルチニンサブタイプは、循環する感染性インフルエンザ株によって示されるヘマグルチニンサブタイプに基づいて選択される。
【００３４】
上記抗原が不活性化インフルエンザウイルス（例えば、例えば、Ｈ５Ｎ３もしくはＨ５Ｎ９）である場合、上記ワクチン組成物中の抗原の量は、代表的には、赤血球凝集単位（ＨＡＵ）／用量に関して表される。例えば、本発明の特定の実施形態において、上記抗原は、不活性化インフルエンザウイルスであり、上記ワクチン組成物中に、５０〜１０００ＨＡＵ／用量の量で存在する。具体的な実施形態において、ワクチン組成物の各用量は、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５、約１６０、約１６５、約１７０、約１７５、約１８０、約１８５、約１９０、約１９５、約２００、約２０５、約２１０、約２１５、約２２０、約２２５、約２３０、約２３５、約２４０、約２４５、約２５０、約２５５、約２６０、約２６５、約２７０、約２７５、約２８０、約２８５、約２９０、約２９５、約３００、約３０５、約３１０、約３１５、約３２０、約３２５、約３３０、約３３５、約３４０、約３４５、約３５０、約３５５、約３６０、約３６５、約３７０、約３７５、約３８０、約３８５、約３９０、約３９５、約４００、約４０５、約４１０、約４１５、約４２０、約４２５、約４３０、約４３５、約４４０、約４４５、約４５０、約４５５、約４６０、約４６５、約４７０、約４７５、約４８０、約４８５、約４９０、約４９５、約５００、約５０５、約５１０、約５１５、約５２０、約２５２５、約５３０、約５３５、約５４０、約５４５、約５５０、約５５５、約５６０、約５６５、約５７０、約５７５、約５８０、約５８５、約５９０、約５９５、約６００、約６０５、約６１０、約６１５、約６２０、約６２５、約６３０、約６３５、約６４０、約６４５、約６５０、約６５５、約６６０、約６６５、約６７０、約６７５、約６８０、約６８５、約６９０、約６９５、約７００、約７０５、約７１０、約７１５、約７２０、約７２５、約７３０、約７３５、約７４０、約７４５、約７５０、約７５５、約７６０、約７６５、約７７０、約７７５、約７８０、約７８５、約７９０、約７９５、約８００、約８０５、約８１０、約８１５、約８２０、約８２５、約８３０、約８３５、約８４０、約８４５、約８５０、約８５５、約８６０、約８６５、約８７０、約８７５、約８８０、約８８５、約８９０、約８９５、約９００、約９０５、約９１０、約９１５、約９２０、約９２５、約９３０、約９３５、約９４０、約９４５、約９５０、約９５５、約９６０、約９６５、約９７０、約９７５、約９８０、約９８５、約９９０、約９９５、または約１０００ＨＡＵを含む。
【００３５】
特定の他の実施形態において、ワクチン組成物の各用量は、約１８２ＨＡＵ、２５６ＨＡＵもしくは５１２ＨＡＵを含む。
【００３６】
（油成分）
本発明のワクチン組成物はまた、油成分を含む。上記油成分に含まれ得る油の例としては、テルペン油（例えば、スクアランおよびスクアレン）；植物性油（例えば、ダイズ油、オリーブ油、コーン油、ホホバ油、ラッカセイ油、綿実油、ひまわり油、サフラワー油、ごま油、アプリコット油、アボカド油、小麦胚芽油、キャノーラ油、亜麻仁油、およびアーモンド油）；魚油（例えば、鮫油、ヒウチ鯛油（ｏｒａｎｇｅ  ｒｏｕｇｈｙ  ｏｉｌ）、ニシン油（Ｍｅｎｈａｄｅｎ  ｏｉｌ）、および鱈肝油）；動物性油（例えば、ミンク油、ラード油、および鶏脂油（ｃｈｉｃｋｅｎ  ｆａｔ  ｏｉｌ）；ならびに合成油（例えば、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標）  ８４０（Ｓａｓｏｌ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）、およびＣａｐｔｅｘ（登録商標）  ３００（Ａｂｉｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，Ｏｈｉｏ）ならびにミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販される）、トリグリセリド油、プロピレングリコール誘導体、およびプリスタンが挙げられるが、これらに限定されない。上記油相の好ましい油は、ミネラルオイルである。これら油の組み合わせはまた、使用され得る。
【００３７】
（さらなる成分）
本発明の特定の実施形態において、上記ワクチン組成物は、１種以上のさらなる成分（例えば、界面活性剤、緩衝化剤および安定化化合物）を含み得る。
【００３８】
油溶性界面活性剤としては、Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）  ８３（Ｕｎｉｑｕｅｍａ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥから市販されるセスキオレイン酸ソルビタン）、Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）  Ａ（Ｕｎｉｑｕｅｍａ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥから市販のモノオレイン酸マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ））、Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）  ８０（Ｕｎｉｑｕｅｍａ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥから市販されている）、Ｓｐａｎ（登録商標）  ８０（モノオレイン酸ソルビタン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｌ１２１ポロキサマー  ４０１（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）  Ｌ１２１、ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）が挙げられる。１つの好ましい油溶性界面活性剤は、Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）  ８３である。
【００３９】
水溶性界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が挙げられる。１つの好ましい水溶性界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０である。
【００４０】
水相は、ｐＨ緩衝化成分（例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤が挙げられ得る。
【００４１】
エマルジョンは、１種以上の安定化化合物を含めることによって、安定化され得る。安定化剤のクラスとしては、ポリマー性安定化剤および低分子量安定化剤が挙げられる。ポリマー性安定化剤は、バルク相においてゲルを、もしくは界面で他の構造を形成し、そして上記相もしくは界面のうちの１つ以上の粘性を増大する。ポリマー性安定化剤としては、タンパク質、デンプン、ガム、セルロース性物質（ｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ）、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸およびポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。これら物質は、共有結合によって、または静電気的相互作用および疎水性相互作用によって、界面に結合する。それらは、「界面複合体」を形成し、界面複合体は、上記バルク相のいずれにも存在しない関係において界面で２つ以上の表面活性分子との会合として定義される。低分子量安定化剤の例は、コレステロールおよび二価カチオンの脂肪酸塩（例えば、ステアリン酸アルミニウム）であるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明のワクチン組成物を作製するための方法）
本発明はまた、ワクチン組成物を作製するための方法を包含する。一実施形態において、本発明の方法は、油成分を水性成分と乳化する工程を包含する。上記でより詳細に記載されるように、上記ワクチン組成物の水性成分は、少なくとも１種の抗原、ならびにアクリルポリマーおよびＤＤＡからなる群より選択される少なくとも１種のアジュバントを含む。上記油成分、抗原、アジュバントおよび本明細書の他の箇所で記載されるこれらのバリエーションのうちのいずれかは、本発明の方法において使用され得る。
【００４３】
具体的な実施形態において、ワクチン組成物を作製するための方法が提供され、ここで上記方法は、以下の工程を包含する：（ａ）抗原の水溶液と、アクリルポリマーおよびＤＤＡからなる群より選択される少なくとも１種のアジュバントとを合わせて、抗原／アジュバント混合物を形成する工程；（ｂ）（ａ）の上記抗原／アジュバント混合物と、油成分および乳化剤とを合わせて、抗原／アジュバント／油成分混合物を形成する工程；ならびに（ｃ）（ｂ）の上記抗原／アジュバント／油成分混合物を乳化して、油中水型エマルジョンを形成し、それによって、ワクチン組成物を形成する工程。
【００４４】
本発明の方法は、油成分を、水性成分と乳化して、例えば、油中水型（ＷＯ）エマルジョンを形成する工程を包含する。ワクチン組成物のための油中水型エマルジョンを調製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、米国特許第５，１０９，０２６号および同第５，７４４，１３７号を参照のこと。一般に、水相（必要に応じて、界面活性剤を含む）および油相（必要に応じて、界面活性剤を含む）は、調製および混合されて、油中水型エマルジョンを形成する。
【００４５】
例えば、カルボポルもしくはカルボポル＋ＤＤＡの油中水型エマルジョンは、以下のように調製され得る：水相は、１種以上の抗原および必要に応じて、カルボポル（登録商標）もしくはカルボポル（登録商標）＋ＤＤＡを、逐次的にもしくは同時に水溶液中で混合して、均質な混合物を形成することによって、調製される。水溶性界面活性剤は、必要に応じて、上記抗原含有水性混合物と混合され得る。さらなるアジュバントを含むさらなる水性成分は、上記水相に添加され得る。本発明のワクチン処方物を調製するための１つの例示的方法を示すフローチャートは、図１に示される。
【００４６】
ワクチン組成物の各用量の全体の容積は、例えば、０．０５ｍＬ〜２．０ｍＬであり得る。例えば、特定の実施形態において、上記ワクチン組成物の用量の容積は、約０．０５ｍＬ、約０．１０ｍＬ、約０．１５ｍＬ、約０．２０ｍＬ、約０．２５ｍＬ、約０．３０ｍＬ、約０．３５ｍＬ、約０．４０ｍＬ、約０．４５ｍＬ、約０．５０ｍＬ、約０．５５ｍＬ、約０．６０ｍＬ、約０．６５ｍＬ、約０．７０ｍＬ、約０．７５ｍＬ、約０．８０ｍＬ、約０．８５ｍＬ、約０．９０ｍＬ、約０．９５ｍＬもしくは約１．０ｍＬである。
【００４７】
本発明のワクチン組成物を調製することにおいて、油成分に対する水性成分（例えば、アジュバントと合わせた水溶液中の抗原）の種々の割合が、以下の表１に示されるように、使用され得る：
【００４８】
【表１】
0005457340.tif 000002
油中水型エマルジョンを調製するための一方法は、上記水相を上記油相に添加することである。次いで、この混合物は、１５〜２０秒間手動で振盪され、高剪断プローブ（Ｂｒｉｎｋｍａｎホモジナイザー，Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎ．Ｙ．）  Ｐｏｌｙｔｒｏｎ  １０／３５を使用して２０秒間乳化するか、ボルテックスするか、または当業者が精通している技術を使用して同様に混合される。
【００４９】
界面活性剤組成物含有油中水型エマルジョンワクチンの工業的調製について、上記油および界面活性剤含有水相は、Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎホモジナイザーで混合され得る。
【００５０】
当業者は、上記抗原を含む水相、上記油相、および上記界面活性剤の相対量が、粘性の特定の望ましい特性を有するエマルジョンを達成するために調節され得ることを認識し得る。
【００５１】
（動物をワクチン接種するための方法）
本発明はまた、動物をワクチン接種するための方法を包含する。本発明の方法は、動物に、本明細書中の他の箇所で記載されるワクチン組成物のうちのいずれかを投与する工程を包含する。
【００５２】
本発明のワクチン組成物は、任意の動物（例えば、ヒト、トリ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタもしくはウマ動物が挙げられる）に投与され得る。例示的なトリ動物としては、例えば、トリ動物（飼い慣らされていようと、野生であろうと）、および特に、食肉もしくは卵の生成のために商業的に飼育されているものが挙げられる。これらに限定されないが、例示的なトリとしては、ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、アヒル、キジなどが挙げられる。
【００５３】
ワクチン処方物は、限定されないが、経皮送達によって、または経粘膜投与（経口経路、口内経路、鼻内経路、眼科的経路、膣経路、直腸経路、大脳内経路、皮内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、静脈内経路、皮下経路が挙げられるが、これらに限定されない）によって、切皮法（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、二股の鍼（ｂｉｆｕｒｃａｔｅｄ  ｎｅｅｄｌｅ）を使用して、皮膚の最上層を引っ掻くこと）を介して、吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）（肺の）もしくは吸入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）（口もしくは鼻のいずれかを介して）によって、またはエキソビボでの抗原提示細胞（例えば、樹状細胞（ＤＣ）への投与、続いて、上記細胞の被験体への投与によって、または任意の他の標準的な免疫経路によって投与され得る。
【００５４】
好ましくは、本発明のワクチン組成物は、非経口的に、すなわち、静脈内（ｉ．ｖ．）投与、皮下（ｓ．ｃ．）投与、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）（ｓ．ｄ．）投与、もしくは皮内（ｉ．ｄ．）投与によって、例えば、ボーラス注射、連続注入、もしくは遺伝子銃を介して（例えば、被験体にベクターワクチン（例えば、裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ）を投与するために）直接注射によって、送達され得る。注射用の処方物は、単位投与形態において（例えば、アンプルもしくは保存料を添加した複数用量の容器において）示され得る。
【００５５】
吸入による投与について、本発明に従う治療剤は、適切なプロペラント（例えば、ジクロロジフルオロ−メタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切なガス）を使用して、加圧パックもしくはネブライザからのエアロゾルスプレー提示の形態で便利に投与され得る。加圧エアロゾルの場合、上記投与単位は、計量した量を送達するためのバルブを提供することによって、決定され得る。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒ）もしくは吸入器（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）における使用のための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが、処方され得、上記化合物および適切な粉末基剤（例えば、ラクトースもしくはデンプン）の粉末ミックスを含む。
【００５６】
本発明の組成物はまた、直腸用組成物（例えば、坐剤もしくは保持浣腸剤）において処方され得る。
【００５７】
本発明の方法によれば、本明細書に記載されるワクチン組成物は、被験体に治療上有効な用量で、好ましくは、最小限の毒性で投与される。
【００５８】
用語、用量もしくは量に対して適用される用語「治療上有効な」とは、化合物、薬学的組成物もしくはワクチンが必要な動物に投与した際に、望ましい活性を生じるに十分な上記化合物もしくは薬学的組成物もしくはワクチンの量をいう。アジュバント含有組成物もしくは組成物および抗原含有組成物もしくはワクチンに関して本明細書で使用される場合、用語「治療上有効な量／用量」は、用語「免疫原性的に有効な量／用量」と交換可能に使用され、動物に投与された際に、有効な免疫応答を生じるに十分な化合物（例えば、抗原および／もしくはアジュバント）または薬学的組成物またはワクチンの量／用量をいう。
【００５９】
語句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に生理学的に許容可能でありかつ代表的には、不適切な反応を生じない、このような組成物の分子実体および他の成分をいう。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されているか、または動物、およびより具体的にはヒトにおいて使用するために、米国局方もしくは他の一般に認識されている局方に列挙されていることを意味する。
【００６０】
治療上有効な用量は、当該分野で周知の方法を使用して、用量−応答曲線から決定され得る。用量−応答曲線の例は、限定されることなく、以下の実施例４に記載される。
【００６１】
ワクチン組成物中のアジュバント、抗原および他の成分の用量は、連続してもしくは周期的に投与される抗原の用量が、試験動物および被験体の個々の状態における結果を考慮して、特定の量を超えないような量であるべきである。
【００６２】
特定の投与レジメンは、投与手順、患者もしくは被験体動物の条件（例えば、年齢、体重、性別、感受性、食事、投与期間、組み合わせて使用される薬物、疾患の重篤度）に依存して変動する。特定の条件下での適切な容量および投与時間は、各患者の状況に従って、および標準的な臨床技術に従って、担当医によって決定され得る。
【００６３】
アジュバント含有免疫原性組成物の毒性および治療的効力は、実験動物における標準的薬学的手順によって、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を決定することによって、決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す治療剤が使用され得る（例えば、癌もしくは生命を脅かす感染の重篤な形態を処置する場合に）一方で、他の組織および器官への潜在的な損傷を最少にし、それによって、副作用を軽減するために、このような免疫原性組成物を特定の部位（例えば、免疫応答を媒介するリンパ組織、腫瘍もしくは感染性因子の複製を支援している器官）を標的とする送達系を設計する配慮がなされるべきである。
【００６４】
（ワクチン組成物を作製するための成分を含むキット）
特定の実施形態において、本発明は、免疫原性処方物の１種以上の成分を充填した１つ以上の容器を含む薬学的パックもしくはキットを提供する。好ましい実施形態において、薬学的組成物もしくはワクチン組成物の調製のためのキットは、少なくとも１種の抗原、アジュバント（例えば、カルボポル（登録商標）もしくはカルボポル（登録商標）＋ＤＤＡ）、油相、および水相を含み、上記キットは、異なる容器に上記成分を含み、そして必要に応じて、上記成分を混合するために、および／もしくは上記組成物の投与のために説明書を含む。上記キットの各容器はまた、必要に応じて、１種以上の生理学的に受容可能なキャリアおよび／もしくは賦形剤および／もしくは補助物質を含み得る。製造、製薬製品もしくは生物製品の使用もしくは販売を規制する政府当局によって規定された形態の注意書きは、このような容器と関連づけられ得、この注意書きは、製造、ヒト投与のための使用もしくは販売の当局による承認を示す。
【００６５】
ワクチン組成物は、望ましい場合、活性成分（すなわち、抗原および／もしくはアジュバント）を含む１つ以上の単位投与形態を含み得るパックもしくはディスペンサーデバイス中に提示され得る。上記パックは、例えば、金属ホイルもしくはプラスチックホイル（例えば、ブリスターパック）を含み得る。上記パックもしくはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。適合性の薬学的キャリア中に処方された組成物がまた、調製され得、適切な容器中に入れられ得、そして示される病原体および／もしくは状態に対してワクチン接種するために表示され得る。
【００６６】
（分子生物学の定義）
本発明によれば、当該分野の技術班以内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は周知であり、参考文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ［Ｂ．Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．  （１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；およびＦ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【００６７】
「核酸分子」（もしくは代わりに「核酸」）とは、一本鎖形態、もしくは二本鎖形態のいずれかのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン：「ＲＮＡ分子」）もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、もしくはデオキシシチジン）：「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステルポリマー形態、またはその任意のホスホエステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）をいう。オリゴヌクレオチド（１００ヌクレオチドより少ない構成要素単位を有する）もしくはポリヌクレオチドは、定義された用語内に含まれ、ならびに二本鎖のＤＮＡ−ＤＮＡヘリックス、ＤＮＡ−ＲＮＡヘリックス、およびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスを含む。この用語は、例えば、特に、直線状（例えば、制限フラグメント）もしくは環状のＤＮＡ分子、プラスミド、および染色体において見いだされる二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖のＤＮＡ分子の構造を議論するにあたって、配列は、５’方向から３’方向で、ＤＮＡの転写されない鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）とともに、配列のみを与えるという通常の慣習に従って、本明細書で記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を行ったＤＮＡ分子である。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸ベースのポリマーであって、核酸によってコードされ得るかもしくは合成によって調製され得るものをいう。ポリペプチドは、タンパク質、タンパク質フラグメント、キメラタンパク質などであり得る。一般に、用語「タンパク質」とは、細胞チュで内因的に発現されるポリペプチドをいう。一般に、特定のタンパク質もしくは酵素をコードするＤＮＡ配列は、対応するｍＲＮＡ配列へと「転写」される。上記ｍＲＮＡ配列は、続いて、タンパク質を形成するアミノ酸の配列へと「翻訳」される。「アミノ酸配列」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖である。用語「ペプチド」とは、通常、１００個未満のアミノ酸構成要素単位を有するアミノ酸ベースのポリマーについて使用されるのに対して、用語「ポリペプチド」とは、少なくとも１００個のこのような単位を有するポリマーを指定する。しかし、本明細書において、「ポリペプチド」は、総称的な用語である。
【００６９】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物の例示であって、限定ではない。種々の条件およびパラメーターの他の適切な改変および適合は、通常、本開示に鑑みれば、当業者にとって明らかな分子生物学および化学の範囲内で遭遇することになり、本発明の趣旨および範囲内である。
【実施例】
【００７０】
（実施例１：コントロール油中水型エマルジョンワクチン処方物の調製）
不活性化逆遺伝学Ｈ５Ｎ３トリインフルエンザ（Ｌｉｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１４：５８０−５９０（２００３））を、滅菌生理食塩水に添加した。上記混合物を攪拌して、均質な混合物を形成した。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０（７．２ｍＬ）を上記混合物に添加して、続いて、混合して、均質な水性混合物を形成した。
【００７１】
上記水性混合物が全容積の４０％であり、上記油混合物が全容積の６０％であるように、上記水性混合物をミネラルオイル／Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）  ８３Ｖ混合物（７２０ｍＬ）にゆっくりと添加して、油中水型エマルジョンを形成した。
【００７２】
（実施例２：水相中にアジュバントを含む油中水型エマルジョンワクチンの調製）
水相にアジュバントを含む油中水型エマルジョンを、本質的に実施例１に記載されるように調製した。不活性化Ｈ５Ｎ３トリインフルエンザおよび表２の５種のアジュバントのうちの１種を、滅菌生理食塩水に添加して、全容積１９７ｍＬにした。上記混合物を攪拌して、均質な混合物を形成した。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０（３．０ｍＬ）を上記混合物に添加して、続いて、混合して、均質な水性混合物を形成した。
【００７３】
上記水性混合物が全容積の４０％であり、上記油混合物が全容積の６０％であるように、上記水性混合物をミネラルオイル／Ａｒｌａｃｅｌ（登録商標）  ８３Ｖ混合物（３００ｍＬ）にゆっくりと添加して、油中水型エマルジョンを形成した。従って、５種のエマルジョンワクチンを、５種の異なるアジュバントを使用して調製した。
【００７４】
【表２】
0005457340.tif 000003
（実施例３：シチメンチョウの接種についての投与量決定）
シチメンチョウを、１２８ＨＡＵ、２５６ＨＡＵ、もしくは５１２ＨＡＵ（赤血球阻害単位）／０．５ｍＬのアジュバントなしのワクチン（実施例１に記載されるとおり）を接種した。上記接種したシチメンチョウに由来する血液のＨＩ（赤血球凝集阻害）力価を、接種の３週間後、６週間後、および９週間後に測定した。上記サンプルを、赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ（動物インフルエンザの診断およびサーベイランスに関する世界保健機関マニュアル、ＷＨＯ／ＣＤＳ／ＣＳＲ／ＮＣＳ／２００２．５）で試験した。結果を図２に示す。各投与量は、合理的に良好な血清学的応答を最初に与えるが、上記ＨＩ力価は、その後すぐに劇的に低下した。
【００７５】
（実施例４：水相中にアジュバントを含む油中水型エマルジョンワクチンのシチメンチョウへの接種）
シチメンチョウに、水相中にアジュバントを含むワクチン（実施例２に記載されるとおり）を接種した。１０羽の１週齡のシチメンチョウに、０．５ｍＬの上記ワクチン（２５６ＨＡＵ／用量）をワクチン接種した。コントロールとして、１０羽のシチメンチョウに、実施例１に記載される処方物を接種し、１０羽のシチメンチョウには、接種しなかった。接種したシチメンチョウを、最初のワクチン接種の３週間後に、０．５ｍＬのワクチン（２５６ＨＡＵ／用量）の第２のワクチンブースターを与えた。上記シチメンチョウ由来の血清サンプルを、４週齡、７週齡、および１０週齡で採取し、実施例４に使用される同じ赤血球凝集阻害アッセイを使用して試験した。表３は、上記に記載されるような実験プロトコルの表の記載を提供する。
【００７６】
【表３】
0005457340.tif 000004
コントロールおよび実験的ワクチン接種の結果を、表４および図３に示す。上記結果は、上記カルボポル（登録商標）もしくはカルボポル（登録商標）＋ＤＤＡアジュバントを含むワクチンの有効性を実証する。
【００７７】
【表４】
0005457340.tif 000005
（実施例５：カルボポルおよびＤＤＡを含む油中水型ワクチン組成物を使用して得られるシチメンチョウにおける増強された免疫応答）
本実施例において、カルボポルもしくはカルボポル＋ＤＤＡありもしくはなしの油中水型エマルジョン中にトリインフルエンザ抗原を含むワクチン組成物を使用して、シチメンチョウにワクチン接種し、上記インフルエンザ抗原に対する免疫応答を評価した。
【００７８】
本実施例において使用されるワクチン組成物を、図１に概説される一般的方法を本質的に使用して調製した。簡潔には、トリインフルエンザＨ５Ｎ９不活性化ウイルスを含む水溶液を、０．２％  カルボポルもしくは０．２％  カルボポル＋０．５ｇ／ｍＬ  ＤＤＡありまたはなしで、乳化剤と合わせた。上記得られた混合物を、ミネラルオイルにゆっくりと添加し、次いで、乳化／均質化に供して、「標準的エマルジョン」（カルボポルおよびＤＤＡを欠いている）もしくは「カルボポルエマルジョン」もしくは「カルボポル＋ＤＤＡエマルジョン」のいずれかを生成した。最終的なエマルジョン中の不活性化Ｈ５Ｎ９の量は、０．５ｍＬ用量あたり５１２ＨＡＵ（不活性化前ウイルスストックに対して試験することによって測定した場合）であった。
【００７９】
４群のシチメンチョウを、実施例において使用し、各群は、２０羽の１週齢の市販の白色シチメンチョウからなった。実験設計を、以下の表５にまとめる：
【００８０】
【表５】
0005457340.tif 000006
群１、群２および群３におけるトリに、１週間後に対応するワクチン組成物を投与し、続いて、４週齢でブースターワクチン接種を行った。血液サンプルを最初のワクチン接種時、およびブースターワクチン接種時およびその後３週間の間隔を空けて（すなわち、７週齡、１０週齡、１３週齡、１６週齡および１９週齡で）回収した。上記サンプルを、赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ（動物インフルエンザの診断およびサーベイランスに関する世界保健機関マニュアル、ＷＨＯ／ＣＤＳ／ＣＳＲ／ＮＣＳ／２００２．５）で試験した。上記ＨＩアッセイを、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）不活性化Ｈ５Ｎ９抗原ストックを使用して行った。
【００８１】
上記ＨＩアッセイの結果（幾何平均力価（ＧＭＴ）に関して表した）を、以下の表６に示す：
【００８２】
【表６】
0005457340.tif 000007
Ｈ５Ｎ９抗原＋カルボポルエマルジョン（群２）もしくはＨ５Ｎ９抗原＋カルボポル＋ＤＤＡエマルジョン（群３）をワクチン接種したシチメンチョウは、Ｈ５Ｎ９抗原のみの標準的エマルジョンをワクチン接種したトリ（群１）と比較して、より高いＨＩ  ＧＭＴを示した。さらに、カルボポルを含むエマルジョンを投与したシチメンチョウにおける血清学的応答のより高いレベルは、ブースターワクチン接種の１５週間後（１９週齢のシチメンチョウ）に対する研究の期間にわたって持続した。
【００８３】
本実施例において、血清学的応答の一般的増強は、カルボポルもしくはカルボポル＋ＤＤＡを水相中に含む油中水型ワクチンエマルジョンを投与したシチメンチョウにおけるトリインフルエンザに対して観察された。この増強は、逆遺伝学起源の低病原性Ｈ５Ｎ３単離株（実施例４）を利用して観察された結果と同様に、従来の低病原性Ｈ５Ｎ９単離株で生じた。従って、上記増強された免疫応答は、上記アジュバントに帰する可能性があり、そして種々の抗原に対して明らかに適用可能である。
【００８４】
（実施例６：カルボポルを含む油中水型ワクチン組成物を使用して得られた、アヒルにおける増強された免疫応答）
本実施例において、水相中にカルボポルありまたはなしで、トリインフルエンザ抗原を油中水型エマルジョン中に含むワクチン組成物を使用して、異なる４品種のアヒルにワクチン接種し、上記インフルエンザ抗原に対する免疫応答を評価した。
【００８５】
本実施例において使用されるワクチン組成物を、図１に概説される一般的方法を本質的に使用して、調製した。簡潔には、逆遺伝学トリインフルエンザＨ５Ｎ３不活性化ウイルス（「ｒｇ−Ｈ５Ｎ３」、実施例１を参照のこと）を含む水溶液を、０．２％  カルボポルありまたはなしで、乳化剤と合わせた。上記得られた混合物を、ミネラルオイルにゆっくりと添加し、次いで、乳化／均質化に供して、「標準的エマルジョン」（カルボポルを欠いている）もしくは「カルボポルエマルジョン」（０．２％  カルボポルを水相中に含む）のいずれかを生成した。最終的なエマルジョン中のｒｇ−Ｈ５Ｎ３の量は、０．５ｍＬ用量あたり２５６ＨＡＵであった。
【００８６】
本実施例において、異なる４品種のアヒル：Ｐｅｋｉｎ、Ｍａｌｌａｒｄ、Ｋｈａｋｉ  ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＧｏｌｄｅｎ  Ｈｙｂｒｉｄ  ３００を使用した。各品種のアヒルを、以下の表７に示されるように、３つの異なる処置群にさらに分けた：
【００８７】
【表７】
0005457340.tif 000008
処置群１および２におけるアヒルに、日齢のうちに（１〜６日齢の間）０．２ｍＬ全容積のその対応するエマルジョンワクチン組成物を首の後ろの皮下にワクチン接種した（「最初のワクチン接種」）。３週齢のときに、上記アヒルに、０．５ｍＬの同じワクチンを首の後ろの皮下にブーストした。
【００８８】
血液サンプルを、最初のワクチン接種時およびその後３週間の間隔を空けて（すなわち、最初のワクチン接種の３週間後に（「３  ＷＰＶ１」））、ならびに上記ブースターワクチン接種の３週間後、６週間後、９週間後および１２週間後（「３  ＷＰＶ２」、「６  ＷＰＶ２」、「９  ＷＰＶ２」、および「１２  ＷＰＶ２」）に、回収した。上記サンプルを、赤血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイ（動物インフルエンザの診断およびサーベイランスに関する世界保健機関マニュアル、ＷＨＯ／ＣＤＳ／ＣＳＲ／ＮＣＳ／２００２．５）で試験した。上記ＨＩアッセイを、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）活性化Ｈ５Ｎ３抗原ストックを使用して行った。
【００８９】
日齢のうち（ワクチン接種前）での各品種の代表的アヒルから回収した血清は、トリインフルエンザに対するＨＩ検出可能抗体を含んでいなかった（データは示さず）。上記ＨＩアッセイの残りの時点での結果（幾何平均力価（ＧＭＴ）に関して表した）を、以下の表８に示す：
【００９０】
【表８】
0005457340.tif 000009
上記に示した結果は、カルボポルを水相中に処方した油中水型ワクチン組成物が、カルボポルを水相中に含まないで処方された油中水型ワクチン組成物と比較して、試験したアヒルの大部分の品種で、有意により大きな免疫応答を生じたことを示す。これらの結果は、アクリルポリマー（例えば、カルボポル）を水相中に含む油中水型ワクチン組成物が、従来の油中水型ワクチン組成物と比較して、優れた免疫応答を提供することをさらに確認する。
【００９１】
前述の発明は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によって幾分詳細に記載されてきたが、本発明は、特定の開示された実施形態に限定されないが、特許請求の範囲によって定義されるように、発明の趣旨および範囲内にある全ての変更および改変を網羅することが意図される。
【００９２】
本明細書において言及される全ての刊行物および特許は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許は、各個々の刊行物および特許出願が、具体的にかつ個々に参考として援用されることが示されるのと同程度まで、本明細書に参考として援用される。
【図１】
0005457340.tif 000010
【図２】
0005457340.tif 000011
【図３】
0005457340.tif 000012