(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iの構造を有する化合物、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物。
【化１】
0005568176.tif 000017
【請求項２】
前記薬学的に許容可能な塩が金属塩、有機アミン又はアンモニウム塩から選ばれる請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
前記金属塩がナトリウム塩、即ち式I’化合物である請求項2に記載の化合物。
【化２】
0005568176.tif 000018
【請求項４】
(1)20-ヒドロキシ-β-エクジステロンを原料として有機溶媒の存在条件下でフェニルボロン酸と反応させて式II化合物を得るステップと、
【化３】
0005568176.tif 000019
(2)式II化合物を酸性条件下で式III化合物と反応させて式IV化合物を得るステップと、
【化４】
0005568176.tif 000020
(式IIIとIV化合物中で、R1とR2はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル基又はフェニル基であり、RXとRYはそれぞれ独立してC1〜C4アルキル基、フェニル基であり、又はRXO-、RYO-及びそれらが連接した炭素と共にカルボニル基を形成する。)
(3)式IV化合物を式V化合物と反応させて式VI化合物を得るステップと、
【化５】
0005568176.tif 000021
(式V中、R3、R4及びR5はそれぞれ独立してC1〜C4アルキル基から選ばれ、Xはハロゲンであり、式VI中、R1、R2、R3、R4及びR5の定義は式IV、式Vと同様である。)
(4)式VI化合物を塩基と過酸化物の存在下で脱保護して式VII化合物を得るステップと、
【化６】
0005568176.tif 000022
(式VII中、R1、R2、R3、R4及びR5の定義は式IV、式Vと同様である。)
(5)式VII化合物をPOCl3と反応させて式VIII化合物を得るステップと、
【化７】
0005568176.tif 000023
(式VIII中、R1、R2、R3、R4及びR5の定義は式IV、式Vと同様である。)
(6)式VIII化合物を酸性条件下で脱保護して式I化合物を得るステップと、を含む請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物の製造方法。
【化８】
0005568176.tif 000024
【請求項５】
ステップ(6)で式I化合物を得た後、通常の造塩方法により式I化合物の塩を得る請求項4に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(2)の式III化合物におけるR1、R2、RX及びRYが同時にメチル基である請求項4に記載の方法。
【請求項７】
ステップ(3)の式V化合物におけるR3、R4及びR5が同時にメチル基又はエチル基であり、Xが塩素である請求項4に記載の方法。
【請求項８】
ステップ(1)において、前記有機溶媒がジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン又はジメチルスルホキシドから選ばれ、前記反応温度が0〜50℃であり、
ステップ(2)において、前記酸性条件がp-トルエンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸ピリジニウム又は二塩化スズから選ばれる酸性触媒の存在の条件を意味し、
ステップ(3)において、反応が有機塩基と活性化剤の存在下で行われ、前記有機塩基がイミダゾール、N-メチルモルホリン、ピリジン又はトリエチルアミンから選ばれ、前記活性化剤が 4-ジメチルアミノピリジン又はジメチルホルムアミドから選ばれ、
ステップ(4)において、前記塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム又は炭酸ナトリウムであり、前記過酸化物が過酸化水素であり、
ステップ(5)において、反応が有機塩基の存在下で行われ、前記有機塩基がピリジン、トリエチルアミン又はイミダゾールから選ばれる請求項4に記載の方法。
【請求項９】
請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物の血糖降下薬製造用としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然薬物化学、具体的に新規エクジステロン合成誘導体及びその製造方法と用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
エクジステロンは1種の天然産物の総称であり、初めて昆虫体内で発現され、脱皮ホルモン活性を有する物質であり、細胞成長促進作用をもつ。60年代以降、エクジステロンは植物界でも存在して動物界より植物界における分布がより高く且つ広く、ソースが豊かであり、例えば、牛膝、桑の葉、キシュウロウロ等にはいずれもこの物質が含まれることが発見された。昆虫体内におけるエクジステロンの含有量が極めて微量であるために、植物エクジステロンは現在の商業用エクジステロンの主なソースになる。研究によれば、エクジステロンはリボ核酸・タンパク質の合成を促進、糖代謝に寄与、脂質代謝を促進、免疫を調整、中枢神経系に寄与、老化を防止、血行を促進して鬱血を解消する等、多種の薬理学的作用を有することが明らかになる。
【０００３】
楊崇仁等は中国特許出願CN 1280010A(公開日2001年1月17日)において糖尿病治療用経口薬物を開示し、それに薬物活性成分であるβ-エクジソンと2-β-エクジソンアセテートが含まれ、両方の重量比としてβ-エクジソンが50〜95％、2-β-エクジソンアセテートが5〜50％である。
【０００４】
陳秋等は中国特許出願CN 1557324A(公開日2004年12月29日)においてエクジステロンのインスリン抵抗性治療薬製造用としての応用を開示する。
【０００５】
陳秋等は「エクジステロンのHepG2細胞グルコース消費への影響」（『中国薬理学通報』、2005年11期）において、エクジステロンは1×10-6〜10-4mol.L-1の濃度範囲内でHepG2細胞によるグルコース消費量を44%〜77%増加させることができること、エクジステロンの血糖低下効果が培養液におけるグルコースの濃度の上昇につれて低下していくこと、インスリンがエクジステロンの血糖低下作用に対して顕著な影響がないことを開示する。エクジステロンはβTC3細胞のインスリン分泌を刺激する作用がないことから分かるように、エクジステロンは肝細胞によりインスリンに依存ぜずに血糖低下作用を発揮できるが、インスリンの分泌を刺激することができない。
【０００６】
陳秋等は「エクジステロンのインスリン抵抗性HepG2細胞のインスリン受容体発現への影響」（『山東医薬』、2008年 04期）おいて、1×10-5mol/LのエクジステロンがIR HepG2細胞のInsRタンパク発現を顕著に増加させることができることを開示し、エクジステロンのインスリン増感作用がインスリンシグナル伝達分子InsRタンパクの発現増強に関わる可能性が高いことが明らかになる。
【０００７】
陳秋等は「エクジステロンのインスリン抵抗性HepG2細胞のインスリンシグナル伝達のタンパク発現への影響」、（『江蘇医薬』、2009年3期）において、1×10-5Mエクジステロンがインスリン抵抗性HepG2細胞PI3K、GLUT-4タンパクの発現を増加(P<0.05)させることができることを開示し、エクジステロンのインスリン増感作用がインスリンシグナル伝達分子PI3K、GLUT-4タンパクの発現増強に関わる可能性が高いことが明らかになる。
【０００８】
宋敏等は「エクジステロンのインスリン抵抗HepG2細胞へのプロテオーム研究」、（『中国薬理学通報』、2009年12期）において、エクジステロンによるインスリン抵抗性モデル細胞のグルコース消費量への影響を開示し、エクジステロンのインスリン増感作用ターゲットは多種のインスリン抵抗性に関するタンパク質とキナーゼに関わることが明らかになる。
【０００９】
また、ecdybase.orgであるウェブサイトで分離して得た下記エクジステロンのリン酸誘導体が開示される。
【００１０】
1. 26-ヒドロキシエクジステロン-2-リン酸エステル(THOMPSON, J.A.等、(1987) Arch. Insect Biochem. Physiol. 4, 183-190)；
2. 26-ヒドロキシエクジステロン-26-リン酸エステル(THOMPSON, M.J.等、(1985) Arch. Insect Biochem. Physiol. 2, 227-236)；
3. 20-ヒドロキシエクジステロン-22-リン酸エステル(TSOUPRAS, G.等、(1982) Steroids 40, 551-560)；
4. 20-ヒドロキシエクジステロン-3-アセテート2-リン酸エステル(ISAAC, R.E.等、(1984) Biochem. J. 231, 459-464)；
5. 20-ヒドロキシエクジステロン-3(2)-リン酸エステル(TSOUPRAS, G.等、(1983) C. R. Acad. Sci. Paris, Ser. III, 296, 77-80)；
6. 20-ヒドロキシエクジステロン-3(2)-アセテート-22-リン酸エステル(TSOUPRAS, G.等、(1983) C. R. Acad. Sci. Paris, Ser. III, 296, 77-80)；
7. エクジステロン-3-リン酸エステル(TSOUPRAS, G.等、(1982) (Thesis, Strasbourg, France))；
8. エクジステロン-2-リン酸エステル(ISAAC, R.E.等、(1984) Biochem. J. 217, 239-243)；
9. エクジステロン-2,3-ジアセテート-22-リン酸エステル(TSOUPRAS, G.等、(1982) (Thesis, Strasbourg, France))；
10. エクジステロン-2-アセテート-3-リン酸エステル(ISAAC, R.E.等、(1984) Biochem. J. 217, 239-243)；
11. エクジステロン-3(2)-アセテート-22-リン酸エステル(ISAAC, R.E.等、(1984) Biochem. J. 231, 459-464)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明者はエクジステロン誘導体に関する大量の研究から、エクジステロン類化合物の中の20-ヒドロキシ-β-エクジステロンを出発原料として思わずに構造が安定で水溶性が良好で且つ血糖降下活性に優れた新規化合物を製造した。
【００１２】
本発明はエクジステロン誘導体を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明はまた前記エクジステロン誘導体の製造方法を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明はまた前記エクジステロン誘導体を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
【００１５】
本発明はまた前記エクジステロン誘導体の血糖降下薬製造用としての用途を提供することを目的とする。
【００１６】
具体的に、本発明の提供する技術案において、本発明は、下記式Iの構造を有する化合物、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物を提供する。
【化１】
0005568176.tif 000002
【００１７】
本発明の提供する技術案において、前記薬学的に許容可能な塩は金属塩、有機アミン又はアンモニウム塩から選ばれ、前記金属塩はアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩から選ばれ、前記アルカリ金属塩はリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩又はセシウム塩等から選ばれ、前記アルカリ土類金属はカルシウム塩、マグネシウム塩又はアルミニウム塩等から選ばれ、前記有機アミン又はアンモニウム塩はC1-C4アルキル基の第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン又は第四級アンモニウム塩から選ばれる。
【００１８】
本発明の好ましい技術案において、本発明は式I化合物のナトリウム塩を提供し、その構造が下記式I’である。
【化２】
0005568176.tif 000003
【００１９】
本発明の提供する技術案において、前記溶媒和化合物は有機溶媒和化合物又は水和物から選ばれ、前記有機溶媒和化合物は例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール又はブタノール等のC1〜C4のアルカノール、又はジメチルホルムアミド、又はジメチルスルホキシド等から選ばれる。
【００２０】
一方、本発明は前記式I化合物、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物の製造方法を提供し、
(1) 20-ヒドロキシ-β-エクジステロンを原料として有機溶媒の存在条件下でフェニルボロン酸と反応させて式II化合物を得るステップと、
【化３】
0005568176.tif 000004
(2)式II化合物を酸性条件下で式IIIと反応させて式IV化合物を得るステップと、
【化４】
0005568176.tif 000005
（ここで、式IIIとIV化合物におけるR1とR2はそれぞれ独立して水素、C1〜C4アルキル基又はフェニル基であり、式III化合物におけるRXとRYはそれぞれ独立してC1〜C4アルキル基、フェニル基であるか、又はRXO-、RYO-及びそれらが連接した炭素と共にカルボニル基を形成し、好ましくは、式III化合物におけるR1、R2、RX及びRYは同時にメチル基である。）
(3)式IV化合物を式V化合物と反応させて式VI化合物を得るステップと、
【化５】
0005568176.tif 000006
（ここで、式VにおけるR3、R4及びR5はそれぞれ独立してC1〜C4アルキル基から選ばれ、好ましくは、R3、R4及びR5は同時にメチル基又はエチル基であり、Xはハロゲンであり、好ましくは、Xは塩素であり、式VIにおけるR1、R2、R3、R4及びR5の定義は式IV、式Vと同様である。）
(4)式VI化合物を塩基と過酸化物の存在下で脱保護して式VII化合物を得るステップと、
【化６】
0005568176.tif 000007
（式VII中、R1、R2、R3、R4及びR5の定義は式IV、式Vと同様である。）
(5)式VII化合物をPOCl3と反応させて式VIII化合物を得るステップと、
【化７】
0005568176.tif 000008
（式VIII中、R1、R2、R3、R4及びR5の定義は式IV、式Vと同様である。）
(6)式VIII化合物を酸性条件下で脱保護して式I化合物を得るステップと、を含む。
【化８】
0005568176.tif 000009
【００２１】
本発明の提供する前記製造方法において、任意選択的に、ステップ(6)で式I化合物を得た後、本分野で通常の造塩方法により、式I化合物の塩を得る。
【００２２】
本発明の提供する前記製造方法において、任意選択的に、ステップ(6)はVIII化合物を酸性条件下で脱保護した後、塩を製造する常法により式I化合物の塩を得る。例えば、式VIII化合物を酸性条件下で脱保護してかつNaHCO3を加えて反応させ、式I化合物のナトリウム塩を得る。
【化９】
0005568176.tif 000010
【００２３】
本発明の提供する前記製造方法において、前記ステップ(1)の前記有機溶媒はジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、又はジメチルスルホキシド等から選ばれ、前記反応温度が0〜50℃、より好ましくは、室温で反応させる。
【００２４】
本発明の提供する前記製造方法において、前記ステップ(2)における前記酸性条件はp-トルエンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸ピリジニウム、又は二塩化スズ等から選ばれる酸性触媒の存在の条件を意味する。
【００２５】
本発明の提供する前記製造方法において、前記ステップ(3)における反応は有機塩基と活性化剤の存在下で行われ、前記有機塩基はイミダゾール、N-メチルモルホリン、ピリジン、又はトリエチルアミン等から選ばれ、前記活性化剤はDMAP(4-ジメチルアミノピリジン)、又はジメチルホルムアミド等から選ばれる。
【００２６】
本発明の提供する前記製造方法において、前記ステップ(4)において前記塩基は水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等であり、前記過酸化物は過酸化水素である。
【００２７】
本発明の提供する前記製造方法において、前記ステップ(5)の反応は有機塩基の存在下で行われ、前記有機塩基はピリジン、トリエチルアミン、イミダゾール等から選ばれる。
【００２８】
本発明の提供する前記製造方法において、前記ステップ(6)の酸性条件は塩酸、酢酸、フッ化水素酸、硫酸、p-トルエンスルホン酸等を意味する。
【００２９】
第三方面で、本発明は式I化合物、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物を含む医薬組成物を提供し、前記医薬組成物に式I化合物、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物が有効量で含まれ、前記有効量は例えば約0.01mg〜1000mgである。本発明の提供する医薬組成物はさらに薬学的に許容可能な賦形剤を含む。それ以外、本発明の提供する医薬組成物は経口、外用又は注射を便利にする製剤に製造することができ、例えば、錠剤、固体顆粒剤、カプセル、注射液又は凍結乾燥粉末注射剤が挙げられる。
【００３０】
第四方面で、本発明は前記式I化合物、その薬学的に許容可能な塩又は溶媒和化合物の血糖降下薬製造用としての用途を提供する。パピュレイション、年齢、性別、投与方式及び病状により、1日投与量が約0.01mg〜1000mgである。
【００３１】
本発明の提供する式I化合物による体外HepG2細胞のグルコース消費量の実験から、該化合物は顕著な血糖降下活性を有し、2×10-7〜2×10-9Mの濃度範囲でHepG2細胞のグルコース消費量を500%以上増加させることができることが明らかになる。濃度2×10-7〜2×10-8Mの20-ヒドロキシ-β-エクジステロンによるHepG2細胞のグルコース消費量の増加が15%未満であり、且つ濃度を2×10-9Mまで希釈すると、20-ヒドロキシ-β-エクジステロンはHepG2細胞に対して血糖低下効果がない。そのため、母体化合物である20-ヒドロキシ-β-エクジステロンの血糖降下活性との比較から、式I化合物の血糖降下活性は20-ヒドロキシ-β-エクジステロンよりも著しく優れることが明らかになる。溶解実験から、式I化合物又はそのナトリウム塩はそれぞれ20-ヒドロキシ-β-エクジステロンの水中における溶解度の10倍と50倍であることがわかる。その他、生体内薬理学試験から、本発明の式I化合物及びそのナトリウム塩が血糖低下作用をもつことが分かる。
【００３２】
また、実施例において、最終的には、20,22-モノリン酸エステルエクジステロンではなく、式I化合物が得られることで、式I化合物が安定性構造を有する5員環リン酸ラクトンを形成することがさらに証明される。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、実施例により本発明の実施形態をさらに説明する。本発明の指導下で当業者による従来の技術に基づく変更も本発明の請求範囲内に入られる。
【００３４】
式I化合物又はそのナトリウム塩の合成過程は以下のとおりである。
【化１０】
0005568176.tif 000011
【００３５】
実施例1
式1化合物の製造
まず、化合物1(即ちIV化合物、ここでR1とR2はそれぞれメチル基)を製造する。
【００３６】
20-ヒドロキシ-β-エクジステロン(1.54 g、 3.21 mmol)とフェニルボロン酸(412 mg、 3.38 mmol)を20 mLのDMFに溶解し、室温で8h撹拌した後、40mLの飽和食塩水を加えて150mLの酢酸エチルで反応液を希釈する。有機層を飽和食塩水で(50mL×3)清浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、濃縮して白色固体が得られる。粗製品をさらに精製せずに直接に次の反応に与える。
【００３７】
前記粗製品とp-トルエンスルホン酸(55 mg、 0.32 mmol)を40 mLのアセトンと2,2-ジメトキシプロパン(即ち式III、ここでR1、R2、RX及びRYはそれぞれメチル基)の等体積混合溶媒に溶解する。室温で12h撹拌した後、10 mLの NaHCO3を加えて反応を停止し、かつ濃縮により有機溶媒を除去する。残り物を150 mL EtOAc(酢酸エチル)で希釈し、かつ飽和食塩水で (50mL×3) 清浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、濃縮する。残り物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(50% EtOAc/石油エーテル)により分離し、白色泡沫状物質として化合物1(1.774 g、2ステップ収率91%)が得られる。
【００３８】
次に、化合物2(即ち式VI化合物、ここでR1とR2はそれぞれメチル基であり、R3、R4及びR5はそれぞれ独立してエチル基である)を製造する。
【００３９】
前記得られた化合物1(即ち式IV化合物、ここでR1とR2はそれぞれメチル基である)(1.95 g、3.21 mmol)、イミダゾール(656 mg、9.63 mmol)及びDMAP (4-ジメチルアミノピリジン、40 mg、 0.33 mmol)を40 mLのCH2Cl2に溶解し、室温で該溶液にTESCl(即ち式V化合物、ここでR3、R4及びR5はそれぞれ独立してエチル基であり、Xは塩素である)(1.13mL、6.43mmol)を滴下する。室温で4h撹拌した後、反応液をEtOAc (150 mL)で希釈し、飽和食塩水で(50 mL×3)清浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、濃縮する。残り物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(17% EtOAc/石油エーテル)により分離し、白色泡沫状物質として化合物2 (2.11g、収率91%)を得る。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ7.79 (d,J=7.2Hz,2H)、7.46 (t,J=7.2Hz,1H)、7.36 (t,J=7.2Hz,2H)、5.82 (s,1H)、4.26-4.21 (m,2H)、4.13-4.09 (m,1H)、2.84 (t,J=2.84,1H)、2.38-2.34 (m,2H)、2.11-2.04 (m,3H)、2.04-1.81 (m,7H)、1.78-1.57 (m,4H)、1.54-1.45 (m,1H)、1.50 (s,3H)、1.34 (s,3H)、1.33 (s,3H)、1.27-1.22 (m,1H)、1.26 (s,3H)、1.25 (s,3H)、1.00 (s,3H)、0.96 (t,J=8.0Hz,9H)、0.95 (s,3H)、0.59 (q,J=8.0Hz,6H); 13CNMR (50MHz,CDCl3) δ202.6, 162.9, 134.8, 131.3, 127.9, 127.7, 121.5, 108.3, 86.2, 85.4, 85.0, 73.0, 72.1, 71.6, 51.9, 50.8, 47.3, 42.1, 37.8, 37.6, 34.5, 31.6, 30.9, 30.4, 29.7, 28.5, 26.7, 26.4, 23.6, 22.5, 21.2, 20.5, 17.0, 14.2, 7.1, 6.8; HRMS (M+Na+) calcd for C42H65BNaO7Si 743.4490, found 743.4452；IR (KBr) 3461, 2959, 1660, 1356, 1242, 1056 cm-1。
【００４０】
次に、化合物3(即ち式VII化合物、ここで、R1とR2はそれぞれメチル基であり、R3、R4及びR5はそれぞれ独立してエチル基である)を製造する。
【００４１】
前記得られた化合物2 (2.17 g、3.01 mmol)を30 mL CH2Cl2に溶解した後、室温で1 M NaOH (20 mL)と30% H2O2 (10mL)を加える。室温で30分間撹拌した後、反応液をEtOAc (100mL)で希釈し、有機層を分ける。有機層を飽和食塩水で(50mL×3)清浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、濃縮する。残り物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (25% EtOAc/石油エーテル)により分離し、白色泡沫状物質として化合物3 (1.88 g、 収率98%)を得る。1H NMR (400MHz,CDCl3) δ5.82 (d,J=0.8 Hz,1H)、4.27-4.20 (m,2H)、3.42 (d,J=10.4 Hz)、2.81 (t,J=8.4 Hz,1H)、2.36-2.30 (m,2H)、2.11-2.03 (m,4H)、1.98-1.93 (dd,J=14.4,5.6 Hz,1H)、1.88-1.81 (m,2H)、1.78-1.66 (m,6)、1.62-1.46 (m,2H)、1.48 (s,3H)、1.37-1.32 (m,1H)、1.32 (s,3H)、0.98 (s,3H)、0.95 (t,J=8.0 Hz,9H)、0.86 (s,3H)、0.59 (q,J=8.0 Hz,6H);13C NMR (50 MHz,CDCl3) δ202.7, 163.3, 121.4, 108.3, 84.9, 76.6, 73.9, 72.2, 71.6, 50.8, 49.1, 47.6, 42.1, 37.8, 37.6, 34.5, 31.8, 31.2, 30.2, 29.7, 28.5, 26.7, 26.4, 26.1, 23.6, 20.8, 20.5, 20.4, 17.4, 7.1, 6.6; HRMS (M+Na+) calcd for C36H62NaO7Si 657.4163 found 657.4131; IR (KBr) 3450, 2960, 1659, 1378, 1239, 1056 cm-1。
【００４２】
最後に、式I化合物を製造する。
【００４３】
前記得られた化合物3(1.28 g、2.02mmol)とピリジン(3.4 mL)を30mL THF(テトラヒドロフラン)に溶解する。氷水浴による冷却下で、POCl3(0.96 mL、10.5mmol)を該反応液に滴下する。反応液を室温で8h撹拌した後、氷浴による冷却下で、注意しながらH2O(2mL)を加えて反応を停止する。反応液をEtOAc(150mL)で希釈し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、濃縮する。粗製品をさらに精製せずに直接に次の反応に与える。
【００４４】
前記粗製品を30mLTHFに溶解して1M HCl (10mL)を加える。室温で12 h撹拌した後、反応液を濃縮する。残り物をC18シリカゲルカラムクロマトグラフィー (20% MeOH/H2O)により分離し、白色粉末状物質として、式I化合物 (880mg、80%)を得る。1H NMR (400 MHz,CD3OD) δ5.81 (s,1H)、4.24 (s,1H)、3.94 (s,1H)、3.84-3.81 (m,1H)、3.16-3.12 (m,1H)、2.40-2.36 (m,2H)、2.17-2.10 (m,2H)、2.02-1.88 (m,2H)、1.84-1.62 (m,10H)、1.54-1.40 (m,2H)、1.46 (s,3H)、1.20 (s,3H)、1.19 (s,3H)、0.96 (s,3H)、0.86 (s,3H);13C NMR (50 MHz,CD3OD) δ206.3, 166.9, 122.4, 91.8, 86.7, 85.0, 70.8, 68.7, 68.5, 51.8, 51.0, 50.9, 41.5, 39.2, 37.4, 35.1, 32.8, 32.1, 31.6, 29.6, 28.9, 25.9, 25.6, 24.4, 22.3, 21.4, 17.4;31P NMR δ15.8ppm referenced to external H3PO4; HRMS (M+Na+) calcd for C27H43NaO9P 565.2542 found 565.2520; IR (KBr) 3412, 2966, 1653, 1384, 1227cm-1。
【００４５】
実施例2
式I化合物ナトリウム塩(即ち式I’化合物)の製造：
実施例1で得られた化合物3(5.00 g、7.88 mmol)とピリジン(12.7mL)を50 mL THFに溶解する。氷水浴による冷却下で、オキシ塩化リンを5.7 mLゆっくりに滴下し、滴下終了後、室温で4h反応し、反応液を-30℃まで冷却し、飽和炭酸水素ナトリウムをゆっくり滴下してpHを7に調節する。反応液をEtOAc(150mL)で希釈し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過、濃縮する。粗製品をさらに精製せずに直接に次の反応に与える。
【００４６】
前記粗製品を50mL(メタノール：5%塩酸=1：9)溶液に溶解し、室温で24h反応し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてpHを7に調節し、30分間撹拌し、ろ過して45℃でろ液を減圧濃縮し、蒸発乾固した後、エタノールを50mL加えて固体を十分に溶解した後、ろ過して45℃でろ液を減圧濃縮し、乾固まで濃縮した後、カラムクロマトグラフィー(溶離剤：ジクロロメタン：メタノール=3：1)を行い、最後に白色粉末状物質として、式I化合物のナトリウム塩(2.5 g、56 %)を得る。1HNMR (400 MHz,CD3OD) δ5.80 (s,1H)、4.13 (dd,J=9.2,2.8,1H)、3.95 (s,1H)、3.84-3.81 (m,1H)、3.17-3.13 (m,1H)、2.40-2.33 (m,2H)、2.20-2.11 (m,2H)、1.99-1.58 (m,12H)、1.51-1.40 (m,2H)、1.42 (s,3H)、1.20 (s,3H)、1.18 (s,3H)、0.96 (s,3H)、0.86 (s,3H);13C NMR (50 MHz,CD3OD) δ206.3, 167.3, 122.2, 88.8, 85.1, 84.6, 70.9, 68.6, 68.4, 51.7, 50.9, 50.8, 42.0, 39.2, 37.3, 35.0, 32.8, 32.1, 31.7, 29.7, 28.8, 25.9, 25.8, 24.5, 22.4, 21.5, 17.5;31P NMRδ14.3ppm referenced to external H3PO4; HRMS (M+H+) calcd for C27H43NaO9P 565.2542 found 565.2540; IR (KBr) 3406, 2966, 1651, 1382, 1206cm-1。
【００４７】
実施例3
式I化合物を5mg含む医薬組成物錠剤の製造。
【００４８】
前記医薬組成物錠剤は以下の組成を有する。
【００４９】
0005568176.tif 000012
【００５０】
前記医薬組成物錠剤は前記含有量の各成分を使用して、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを適量の水で溶解した後、次の使用に準備するステップと、活性成分(式I化合物)、ラクトーズ、微結晶性セルロース、低置換度のヒドロキシプロピルセルロースを均一に混合し、ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液を適量加えて、撹拌して軟質材を製造するステップと、軟質材を20メッシュのふるいにかけて顆粒を製造し、湿式顆粒を得るステップと、湿式顆粒を40〜50℃で乾燥して乾燥顆粒を得るステップと、乾燥顆粒を20メッシュにかけて整粒するステップと、ステアリン酸マグネシウムを加えて均一に混合するステップと、顆粒含有量を測定し、錠重を計算して製錠するステップとにより製造してなるものである。
【００５１】
実施例4
式I化合物を100mg含む医薬組成物錠剤の製造。
【００５２】
前記医薬組成物錠剤は以下の組成を有する。
【００５３】
0005568176.tif 000013
【００５４】
前記医薬組成物錠剤は前記含有量の各成分を使用して、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを適量の水で溶解した後、次の使用に準備するステップと、活性成分(式I化合物)、ラクトーズ、微結晶性セルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロースを均一に混合し、ヒドロキシプロピルメチルセルロース溶液を適量加え、撹拌して軟質材を製造するステップと、軟質材を20メッシュのふるいにかけて製粒し、湿式顆粒を得るステップと、湿式顆粒を40〜50℃で乾燥し、乾燥顆粒を得るステップと、乾燥顆粒を20メッシュのふるいにかけて整粒するステップと、ステアリン酸マグネシウムを加えて均一に混合するステップと、顆粒の含有量を測定し、錠重を計算して製錠するステップとにより製造してなるものである。
【００５５】
実施例5
式I化合物を50mg含む医薬組成物のカプセル剤の製造。
【００５６】
前記医薬組成物のカプセル剤は以下の組成を有する。
【００５７】
0005568176.tif 000014
【００５８】
前記医薬組成物のカプセル剤は前記含有量の各成分を使用して、活性成分(式I化合物)、ラクトーズ、マイクロパウダーシリカゲル、ステアリン酸マグネシウムを均一に混合するステップと、粉末含有量を測定し、仕込み量を計算してサイズが適切な硬質カプセルに充填するステップにより製造されるものである。
【００５９】
試験例1: 式I化合物の体外HepG2細胞グルコース消費量の実験：
実施例1で得られた式I化合物に対して体外HepG2細胞グルコース消費量の検定実験を行い、実験過程は以下のとおりである。
【００６０】
生長状態がよいHepG2細胞を選択し、消化液としてトリプシンとEDTA(エチレンジアミンテトラアセテート)を使用して消化させ、消化を停止した後、ウシ胎児血清( Fetal bovine serum,FBS )を10%含むDMEM ( Dulbecco's Modified Eagle Medium )である培養液で単一細胞懸濁液を調製し、1ウェルに細胞1*104個のように96ウェル培養板に接種し、細胞融合度が約50%に達した後、血清のない高グルコースDMEM培養液に変更し、12h飢餓培養する。細胞上清液を吸い上げて除去し、薬剤を含む又は薬剤を含まない新鮮な高グルコースDMEM培養液を加え、細胞を空白対照群、20-ヒドロキシ-β-エクジステロン群、式I化合物群に分けてそれぞれ24時間培養した後、グルコースオキシダーゼ法により培養液におけるグルコースの変化を測定する。測定結果は表1に示す。
【表１】
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【００６１】
表1で示された実験結果から、式I化合物は著しい血糖降下活性を持ち、2×10-7〜2×10-9Mの濃度範囲内でHepG2細胞のグルコース消費量を500%以上増加させることができることがわかる。濃度2×10-7〜2×10-8Mの20-ヒドロキシ-β-エクジステロンによるHepG2細胞のグルコース消費量の増加が15%未満であり、且つ濃度を2×10-9Mまで希釈すると、20-ヒドロキシ-β-エクジステロンはHepG2細胞に対して血糖低下効果がない。そのため、母体化合物である20-ヒドロキシ-β-エクジステロンの血糖降下活性に比べ、式I化合物の血糖降下活性は20-ヒドロキシ-β-エクジステロンより著しく優れる。
【００６２】
試験例2: 式I化合物及びそのナトリウム塩の溶解度実験：
式I化合物(実施例1の方法により製造してなる)は白色又は類白色の結晶性粉末であり、融点が164〜177℃、分子式がC27H43 O9P、分子量が542.6であり、1gの本製品を完全に溶解するのに12mLの水が必要であり、その溶解性が約20-ヒドロキシ-β-エクジステロンの10倍に相当する。
【００６３】
式I化合物のナトリウム塩(実施例2の方法により製造してなる)は白色又は類白色の結晶性粉末であり、融点が173〜185℃、分子式がC27H42O9NaP、分子量が564.6であり、1gの本製品を完全に溶解するのに2.5mLの水が必要であり、その溶解性が約20-ヒドロキシ-β-エクジステロンの50倍に相当する。
【００６４】
試験例3：式1化合物及びそのナトリウム塩の薬理学実験：
実施例1と実施例2で得られた式I化合物及びそのナトリウム塩に対して薬理学実験を行い、実験過程は以下のとおりである
体重が21±1.8gの雄性マウス(昆明種マウス：SPF級、雄性、四川省中医薬科学院実験動物センターにより提供)40匹をランダムに4群に分け、それぞれ対照群、式I化合物5mg/kg群、式I化合物ナトリウム塩5mg/kg群及びグリベンクラミド(天津太平洋製薬有限公司製)25mg/kg群になる。対照群に蒸留水を投与し、残りの各群に相応した薬物を投与する。1日ごとに0.2ml/10gの投与体積により2回直接胃内投与し、連続的に19回投与する。第5目投与後及び第19目投与後、徹底的に2時間断食させた後、全血血糖測定装置を用いてマウスの血糖値を測定してかつそれぞれ記録する。以下の結果が得られる。
【表２】
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【００６５】
対照群に比べ、*P＜0.05である。
【００６６】
表2から、式I化合物及びそのナトリウム塩が正常マウスに対して血糖低下作用を果たすことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は構造が安定で水溶性が良好で且つ血糖降下活性に優れた新規化合物を製造する。