(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質（１）〜（３）：
（１）小麦フスマ若しくは米糠のアスペルギルス属糸状菌の黒麹菌による発酵物であって１４−デヒドロエルゴステロールを含有する該発酵物のエタノール抽出、続いてヘキサン−メタノール分画によるヘキサン画分より得られること、
（２）１４−デヒドロエルゴステロールを有効成分として含有すること、及び
（３）免疫抑制作用を有すること、
を特徴とする、麹菌発酵物の処理物。
【請求項２】
制御性Ｔ細胞の誘導又は炎症性Ｔ細胞増殖の抑制を可能にするように抗原提示細胞を修飾することにより免疫抑制作用を示す、請求項１に記載の麹菌発酵物の処理物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物を含む、抗原提示細胞修飾用組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物を含む飲料又は食品。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物を含む免疫抑制剤。
【請求項６】
小麦フスマ若しくは米糠をアスペルギルス属糸状菌の黒麹菌により発酵させて１４−デヒドロエルゴステロールを含有する発酵生成物を得るステップ、発酵生成物をエタノール抽出するステップ、及びエタノール抽出物をヘキサン−メタノールで分画するステップを含む、請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物の調製方法。
【請求項７】
被験体から採取した抗原提示細胞又は抗原提示細胞に分化しうる未分化細胞に、請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物を接触させるステップを含む、制御性Ｔ細胞の誘導又は炎症性Ｔ細胞増殖の抑制を可能にするように抗原提示細胞を修飾する方法。
【請求項８】
被験体から採取した抗原提示細胞又は抗原提示細胞に分化しうる未分化細胞に、請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物を接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物を含有する、免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項１０】
１４−デヒドロエルゴステロールを有効成分として含有する免疫抑制剤。
【請求項１１】
被験体から採取した抗原提示細胞又は抗原提示細胞に分化しうる未分化細胞に、１４−デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性Ｔ細胞の誘導又は炎症性Ｔ細胞増殖の抑制を可能にするように抗原提示細胞を修飾する方法。
【請求項１２】
被験体から採取した抗原提示細胞又は抗原提示細胞に分化しうる未分化細胞に、１４−デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法。
【請求項１３】
１４−デヒドロエルゴステロールを有効成分として含有する、免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物を含有する組成物。
【請求項１５】
被験体から採取した細胞に、請求項１又は２に記載の麹菌発酵物の処理物を接触させるステップを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。
【請求項１６】
被験体から採取したナイーブＴ細胞に、１４−デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。
【請求項１７】
１４−デヒドロエルゴステロールを有効成分として含有する、制御性Ｔ細胞誘導剤。
【請求項１８】
１４−デヒドロエルゴステロールを有効成分として含有する、炎症性Ｔ細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、穀類植物由来材料の麹発酵物又はその処理物、及び該発酵物又はその処理物を含む免疫調節剤に関する。本発明はまた、抗原提示細胞及び制御性Ｔ細胞の製造方法、並びにそのような方法での穀類植物由来材料発酵物若しくはその処理物又は１４−デヒドロエルゴステロールの使用に関する。さらに、本発明は、免疫疾患の予防又は治療のための穀類植物由来材料発酵物若しくはその処理物又は１４−デヒドロエルゴステロールの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ；Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ）はＢ細胞及びマクロファージと共に抗原提示細胞の群を構成する細胞であり、その抗原提示能は種々の抗原提示細胞の中で最も高いことが知られている。ＤＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ／ＮＫＴ細胞などによる獲得免疫を中心とした末梢免疫系を刺激・感作することから、免疫系の司令塔として機能していると考えられている。ＤＣの中心的な役割のひとつは、生体外からの異物、生体内抗原タンパク質などを取り込んで、これらを分解し、抗原として提示することによって、獲得免疫系を誘導することである。別の機能として、炎症刺激に反応してそれ自身が各種炎症性サイトカインを産生する。【０００３】
現在、世界中で各種の免疫疾患（アレルギー、自己免疫疾患、腸炎など）が爆発的に増加している。このような現象の原因として、腸内細菌のバランスの変化に着目した衛生仮説などが提案されているが、確立された理論はない。しかしながら、そのような免疫疾患では、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７などの炎症性サイトカイン産生の増加が共通の特徴として認められており、これらのサイトカインの産生及びその刺激を受けて増殖する炎症性免疫細胞を抑制することが、それらの免疫疾患の予防及び治療に有効であると予測されている。実際に、これらのサイトカインを標的とする抗体が、ヒトにおいて著明な効果を示すという報告が次々となされている。【０００４】
ＬＰＳ（リポ多糖）に代表される炎症誘発性の刺激物質は、ＤＣ上のＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）によって認識され、これによりＤＣが活性化及び／又は成熟し、各種炎症性サイトカイン及びケモカインの放出を通して炎症反応を誘発することが知られている。多くの免疫疾患では、ＤＣ、マクロファージなどの自然免疫系の異常な活性化が起こっていることが報告されている。したがって、このような自然免疫系の活性化を抑制する方法、又は自然免疫系の活性化を抑制することが可能な物質は、上記のような免疫疾患の予防及び治療に非常に有効である。【０００５】
低減された炎症性活性を示すＤＣを誘導する薬物として、現在までに、ＩＬ−１０／ＴＧＦ−β、ラパマイシン、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ：Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）などが知られている。しかしながら、これらの薬物は他の多くの生物学的作用も有するため、免疫疾患の予防及び治療のために人体に投与することは現実的ではない。したがって、免疫疾患の予防及び治療のためのこれらの薬剤の使用方法としては、採取した血液からｉｎ  ｖｉｔｒｏで低減された炎症性活性を有するＤＣを誘導し、これを人体に戻すというｅｘ  ｖｉｖｏの方法が考えられる。【０００６】
組織又は臓器移植の際に問題となる拒絶反応を抑制するために、ＦＫ５０６をはじめとする免疫抑制剤が用いられている。しかしながら、既存の薬物の非特異的な免疫抑制による副作用が問題視されている。移植時の拒絶反応を抑制するために、免疫抑制剤以外に、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が有用であることが示されている。Ｔｒｅｇは、ＤＣからのサイトカインの分泌を介して誘導されることが知られている。したがって、ＴｒｅｇをもたらすことができるＤＣを誘導する方法、及びナイーブＴ細胞からＴｒｅｇを直接的に誘導する方法が開発されれば、そのような方法は、移植時の拒絶反応の抑制に対して有用であると予測される。【０００７】
最近の研究で、ＣＤ４＋Ｔ細胞に直接的に作用してＴｒｅｇを誘導し得る物質として、レチノイン酸、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３などが再発見された。このような物質は、低減された炎症性活性を示すＤＣを誘導する物質と同様に、抗炎症作用、移植拒絶反応抑制などの点で有用であると考えられる。【０００８】
特許文献１には、ダイズ、コムギ、イネあるいはこれらの副産物を含有する原料を、糸状菌、又はこれらから得られる酵素により発酵させた発酵分解物から得られる免疫強化物質が記載されている。特許文献１では、ダイズ由来材料及びコムギをアスペルギルス・オリゼー又はアスペルギルス・ソーヤを用いて発酵させることにより得られた発酵物からエタノールに不溶の画分を分離し、該画分からさらに高分子量画分を取り出すことにより得られた物質が、マクロファージのグルコース消費を増強することが示されている。【０００９】
特許文献２には、ダイズ由来材料を乳酸菌発酵することにより得られるマクロファージ活性化剤が記載されている。【００１０】
特許文献３には、ダイズ、コムギ、柑橘類、果実あるいはこれらの加工品を含有する原料を、糸状菌、納豆菌又はこれらから得られる酵素により発酵させた発酵分解物から得られるヒアルロニダーゼ阻害、抗アレルギー活性及び免疫賦活物質が記載されている。特許文献３では、ダイズ由来材料及びコムギをアスペルギルス・オリゼーを用いて発酵させ、発酵物からエタノールに不溶な画分を分離し、該画分からさらに高分子量画分を取り出すことにより得られた物質が、ヒアルロニダーゼ阻害活性、及びパイエル板細胞からのＩｇＡ産生を指標として測定される免疫賦活活性を有することが記載されている。【００１１】
特許文献４には、小麦粉等の植物成分を、グラム陰性菌であるパントエア・アグロメランスを用いて発酵させることにより得られる免疫賦活物質が記載されている。【００１２】
特許文献５には、バガス等の蒸煮爆砕処理物と小麦フスマの混合物をアスペルギルス・ソーヤを用いて発酵させて得られた発酵物が、キシロビオースとキシロトリオースに富んだキシロオリゴ糖及び抗酸化活性物質を含むことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開２００５−１７９３１５号公報
【特許文献２】特開２００３−７３２９３号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／０３０９３８号パンフレット
【特許文献４】特開２００７−２０２５６２号公報
【特許文献５】国際公開第２００６／１２３４７４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記のように、低減された炎症性活性を有するＤＣを誘導する方法、ＴｒｅｇをもたらすことができるＤＣを誘導することにより、Ｔｒｅｇを誘導する方法、及びナイーブＴ細胞から直接的にＴｒｅｇを誘導する方法、炎症性Ｔ細胞の増殖を抑制する方法、並びにそれらの方法に有用な物質が所望されている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、穀類植物由来材料、特に小麦フスマに麹菌を作用させて発酵した材料又はその処理物（以下、「穀類植物由来材料発酵物」、「穀類植物由来材料発酵物処理物」、又は「穀類植物由来材料発酵物又はその処理物」とも称する。）が上記の課題を解決することができることを見出し、本発明を完成させた。【００１６】
具体的には、本発明は以下の特徴を有する。【００１７】
〔１〕穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させることにより得られる、穀類植物由来材料発酵物又はその処理物。【００１８】
〔２〕前記穀類植物由来材料が、穀類植物種子の外皮を含む、上記〔１〕に記載の発酵物又はその処理物。【００１９】
〔３〕前記穀類植物がイネ科植物より選択される１種以上である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の発酵物又はその処理物。【００２０】
〔４〕前記穀類植物がコムギである、上記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物。【００２１】
〔５〕前記麹菌がアスペルギルス属糸状菌である、上記〔１〕〜〔４〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物。【００２２】
〔６〕前記麹菌が黒麹菌である、上記〔１〕〜〔５〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物。【００２３】
〔７〕発酵後にさらにエタノール抽出によるエタノール溶解画分の分離に供してある、上記〔１〕〜〔６〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物。【００２４】
〔８〕エタノール抽出に続いてヘキサン分画によるヘキサン溶解画分の分離に供してある、上記〔７〕に記載の発酵物又はその処理物。【００２５】
〔９〕１４−デヒドロエルゴステロールを含有する、上記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物。【００２６】
〔１０〕抗原提示細胞を修飾する作用を有する、上記〔１〕〜〔９〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物。【００２７】
〔１１〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物を含む、抗原提示細胞修飾用組成物。【００２８】
〔１２〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物を含む飲料又は食品。【００２９】
〔１３〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物を含む免疫調節剤。【００３０】
〔１４〕穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させるステップ、発酵生成物をエタノール抽出するステップ、及びエタノール抽出物をヘキサン分画するステップを含む、穀類植物由来材料発酵物処理物の調製方法。【００３１】
〔１５〕前記穀類植物由来材料が、穀類植物種子の外皮を含む、上記〔１４〕に記載の方法。【００３２】
〔１６〕前記穀類植物がイネ科植物より選択される１種以上である、上記〔１４〕又は〔１５〕に記載の方法。【００３３】
〔１７〕前記穀類植物がコムギである、上記〔１４〕〜〔１６〕のいずれか１つに記載の方法。【００３４】
〔１８〕前記麹菌がアスペルギルス属糸状菌である、上記〔１４〕〜〔１７〕のいずれか１つに記載の方法。【００３５】
〔１９〕前記麹菌が黒麹菌である、上記〔１４〕〜〔１８〕のいずれか１つに記載の方法。【００３６】
〔２０〕被験体から採取した細胞に、上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法。【００３７】
〔２１〕被験体から採取した細胞に、上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法。【００３８】
〔２２〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物を含有する、免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。【００３９】
〔２３〕１４−デヒドロエルゴステロールを含有する免疫調節剤。【００４０】
〔２４〕被験体から採取した細胞に、１４−デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法。【００４１】
〔２５〕被験体から採取した細胞に、１４−デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法。【００４２】
〔２６〕１４−デヒドロエルゴステロールを含有する、免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物。【００４３】
〔２７〕１４−デヒドロエルゴステロールを含有し、抗原提示細胞を修飾する作用を有する、麹菌発酵物又はその処理物。【００４４】
〔２８〕上記〔２７〕に記載の麹菌発酵物又はその処理物を含有する組成物。【００４５】
〔２９〕被験体から採取した細胞に、上記〔１〕〜〔１０〕のいずれか１つに記載の発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。【００４６】
〔３０〕被験体から採取した細胞に、１４−デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法。【００４７】
〔３１〕１４−デヒドロエルゴステロールを含有する、制御性Ｔ細胞誘導剤。【００４８】
〔３２〕１４−デヒドロエルゴステロールを含有する、炎症性Ｔ細胞増殖抑制剤。【００４９】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００９−２８８０６３号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００５０】
本発明によれば、免疫寛容を増強させることにより、移植片拒絶及び移植片対宿主病を含む免疫疾患の予防及び治療効果を有する新規な材料及び物質が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】各種穀類植物由来材料の麹発酵物又はその処理物がＤＣ分化に及ぼす影響（ＣＤ８６発現強度）を表すグラフである。
【図２】各種穀類植物由来材料の麹発酵物又はその処理物がＤＣ分化に及ぼす影響（ＩＬ−１２ｐ７０産生）を表す図である。
【図３】各種穀類植物由来材料の麹発酵物又はその処理物がＤＣ分化に及ぼす影響（ＩＬ−１０産生）を表す図である。
【図４】各種免疫抑制物質のＤＣ分化における効果をＦｌｔ−３Ｌに基づき比較した図である。
【図５】各種免疫抑制物質のＤＣ分化における効果をＧＭ−ＣＳＦに基づき比較した図である。
【図６】小麦フスマの麹発酵物抽出物で処理したＤＣによって刺激されるＴ細胞増殖能の変化を表す図である。
【図７】小麦フスマの麹発酵物抽出物で処理したＤＣによって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞のサイトカイン産生の変化を表す図である。
【図８】小麦フスマの麹発酵物抽出物で処理したＤＣによって誘導されるＴｒｅｇの割合（抗原非特異的反応）を表す図である。
【図９】小麦フスマの麹発酵物抽出物で処理したＤＣによって誘導されるＴｒｅｇの割合（抗原特異的反応）を表す図である。
【図１０】制御性ＤＣ誘導効率における、小麦フスマの発酵に使用した麹菌種の比較（細胞表面マーカー）を表す図である。
【図１１】制御性ＤＣ誘導効率における、小麦フスマの発酵に使用した麹菌種の比較（ＩＬ−１０産生能）を表す図である。
【図１２】図１２Ａは、小麦フスマの麹発酵物の発酵条件がＤＣ成熟／分化に及ぼす影響（ＭＨＣＩＩ）を表すグラフである。図１２Ｂは、小麦フスマの麹発酵物の発酵条件がＤＣ成熟／分化に及ぼす影響（ＣＤ８６）を表すグラフである。図１２Ｃは、小麦フスマの麹発酵物の発酵条件がＤＣ成熟／分化に及ぼす影響（ＩＬ−１０）を表すグラフである。
【図１３−１】図１３Ａは、１４−デヒドロエルゴステロール（１４−ＤＨＥ）及び各種対照物質がＤＣ成熟／分化に及ぼす影響（ＣＤ４０）を表すグラフである。図１３Ｂは、１４−ＤＨＥ及び各種対照物質がＤＣ成熟／分化に及ぼす影響（ＣＤ８０）を表すグラフである。図１３Ｃは、１４−ＤＨＥ及び各種対照物質がＤＣ成熟／分化に及ぼす影響（ＣＤ８６）を表すグラフである。
【図１３−２】図１３Ｄは、１４−ＤＨＥ及び各種対照物質がＤＣ成熟／分化に及ぼす影響（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ）を表すグラフである。図１３Ｅは、１４−ＤＨＥ及び各種対照物質がＤＣ成熟／分化に及ぼす影響（ＩＣＯＳ−Ｌ）を表すグラフである。
【図１４】図１４Ａは、１４−ＤＨＥ又は各種対照物質で処理したＤＣからのサイトカイン産生（ＩＬ−１０）を表すグラフである。図１４Ｂは、１４−ＤＨＥ又は各種対照物質で処理したＤＣからのサイトカイン産生（ＩＬ−１２ｐ４０）を表すグラフである。
【図１５】１４−ＤＨＥで処理したＤＣによって誘導されるＴｒｅｇの割合（抗原非特異的反応（ＭＬＲ）及び抗原特異的反応）を表す図である。
【図１６】１４−ＤＨＥで処理したＤＣによって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞からのサイトカイン産生プロフィールを表す図である。Ａ：ＭＬＲの結果；Ｂ：抗原特異的Ｔ細胞反応の結果。培養上清中の各サイトカイン量をＥＬＩＳＡ法により測定した。
【図１７】１４−ＤＨＥで処理したＤＣのＣＤ８＋制御性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ）分化誘導能を表す図である。ＣＤ３＋ＣＤ８α＋のトータルＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ２５及びＦｏｘＰ３発現について示す。ＴＧＦ−β存在下で、１４−ＤＨＥ処理ＤＣ及び未処理対照ＤＣによるＣＤ８＋Ｔｒｅｇの誘導を表している。
【図１８】１４−ＤＨＥのナイーブＴ細胞に対するＴｒｅｇ誘導効果を表す図である。ＣＤ３＋ＣＤ４＋のトータルＣＤ４＋細胞のＣＤ２５及びＦｏｘＰ３発現について示す。１４−ＤＨＥ処理は、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ又は１０００ｎＭの濃度で行い、ＴＧＦ−β存在下でのＣＤ４＋Ｔ細胞からのＣＤ４＋Ｔｒｅｇの誘導を表している。
【図１９】１４−ＤＨＥのＤＣ活性化抑制効果の作用タイミング及び効果持続時間を表す図である。Ａ：作用タイミングに関する結果；Ｂ：効果持続時間に関する結果。
【図２０−１】多発性硬化症に対する１４−ＤＨＥの効果を表す図である。Ａ：疾患スコアに対する効果；Ｂ：ＭＯＧ抗原再刺激による炎症性サイトカイン（上段パネル：ＴＮＦ−α；下段パネル：ＩＦＮ−γ）産生量に対する効果を示す図である。ＬＮは所属リンパ節、ＳＰＮは脾臓細胞を示す。
【図２０−２】多発性硬化症に対する１４−ＤＨＥの効果を表す図である。Ｃ：ＭＯＧ抗原再刺激時のＣＤ４＋Ｔ細胞中の各サイトカイン産生陽性細胞の比率を示す図である。Ｄ：ＭＯＧ抗原再刺激時の増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を示す図である。
【図２０−３】多発性硬化症に対する１４−ＤＨＥの効果を表す図である。Ｅ：所属リンパ節及び脊髄中のｍＤＣ（ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０−）活性化マーカーの陽性率を示す図である（上段パネル：リンパ節；下段パネル：脊髄）。
【図２１】ヒトＤＣの成熟化因子細胞表面発現に対する１４−ＤＨＥの作用を表す図である。Ａ：ＨＬＡ−ＤＲ発現；Ｂ：ＣＤ８０発現；Ｃ：ＣＤ８６発現について示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させることにより得られる穀類植物由来材料発酵物又はその処理物に関する。本発明はまた、抗原提示細胞及び制御性Ｔ細胞の製造方法、並びにそのような方法での穀類植物由来材料発酵物若しくはその処理物又は１４−デヒドロエルゴステロールの使用に関する。さらに、本発明は、免疫疾患の予防又は治療のための穀類植物由来材料発酵物若しくはその処理物又は１４−デヒドロエルゴステロールの使用にも関する。
【００５３】
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、原料となる穀類植物由来材料に麹菌を添加して、発酵させることにより得ることができる。穀類植物由来材料発酵物又はその処理物との用語は、麹菌を用いて発酵させた穀類植物由来材料、及びその一部分（溶媒抽出画分など）の両者を包含する。また、穀類植物由来材料発酵物との用語は、穀類植物由来材料を発酵させた材料及びその処理物の両者を意味して用いられることもある。
【００５４】
本発明における好ましい穀類植物としては、植物分類表においてイネ科に分類されるすべての植物が挙げられる。具体的には、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、アワ、ヒエ、トウモロコシ等が例示されるが、これらに限定されるものではない。このうち、イネ、オオムギ、コムギ及びライムギが好ましく、コムギが特に好ましい。
【００５５】
本発明における穀類植物由来材料とは、穀類植物の種子に由来する材料であり、典型的には、穀類植物の種子全体、又はその一部分である。
【００５６】
本発明における穀類植物由来材料は、好ましくは種子の外皮を含む。種子の外皮を含む穀類植物由来材料としては、例えば、穀類種子全粒粉、穀類植物のフスマ、米糠などが挙げられる。特に好ましい本発明の穀類植物由来材料は、穀類植物のフスマ、最も好ましくは小麦フスマである。
【００５７】
穀類植物のフスマは、穀類植物種子の粉砕又は搗精により得られる種子の外側の部分を回収することで得ることができる。
【００５８】
本発明に用いることができる麹菌は、本発明の穀類植物由来材料を発酵させることができれば特に限定されないが、好ましくは、黒麹（アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー）、黄麹（アスペルギルス・オリゼー）、紅麹（モナスカス・アンカ）、醤油用麹菌（アスペルギルス・ソーヤ）、白麹（アスペルギルス・カワチ）、テンペ菌（リゾプス・オリゴスポラス）などである。好ましくは、麹菌はアスペルギルス属糸状菌であり、最も好ましくは黒麹菌である。本発明における黒麹菌は、狭義の黒麹菌であるアスペルギルス・アワモリ及びアスペルギルス・ニガー、狭義には白麹菌と称されるアスペルギルス・カワチ、並びにこれらの菌種から誘導された亜種を含む。これらの麹菌の種麹は、秋田今野社、樋口もやし社、日本醸造工業などから入手することができる。
【００５９】
本発明の発酵は、原料に麹菌を接種して培養する当業者に公知の方法を用いて行うことができる。そのような方法としては、例えば、蓋麹法、箱麹法、床麹法、機械麹法などを挙げることができる。
【００６０】
麹の添加量は、水を加えて処理（例えば、オートクレーブ、蒸煮など）された穀類植物由来材料に対して、好ましくは０．００５〜５重量％、より好ましくは０．０１〜１重量％、さらに好ましくは０．０５〜０．５重量％、最も好ましくは０．１重量％の種麹である。
【００６１】
発酵温度は、使用する麹によっても若干異なるが、一般的には２０℃〜５０℃、好ましくは２２℃〜４５℃、より好ましくは３０℃〜４０℃である。発酵時間は、例えば、２４時間〜１４日間、好ましくは４８時間〜１０日間、より好ましくは７２時間〜７日間である。発酵中に、一定時間ごと（例えば２４時間ごと）に手入れ（塊になった麹をほぐす作業）を行うのが好ましい。
【００６２】
発酵方法の詳細については、例えば、発酵ハンドブック（（財）バイオインダストリー協会  発酵と代謝研究会編、２００１年）などに記載されている。
【００６３】
発酵時の湿度は、当業者であれば、麹菌の種類に応じて適切に調節することができる。例えば、発酵中、相対湿度を８０％以上に維持する。又は、発酵初期には相対湿度を高く（例えば９０％以上）保ち、発酵後期（例えば、麹菌接種後２４時間以降）は相対湿度を若干下げて（例えば７５％以上）、発酵を行う。
【００６４】
本明細書中、穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、穀類植物由来材料を発酵させたもの、又はそこから溶媒抽出などにより得られた画分を包含する。発酵材料の抽出物は、当業者に公知の抽出方法により得ることができ、抽出方法としては、例えば、有機溶媒抽出、超臨界流体抽出法、加温加圧抽出法などが挙げられる。上記で例示した抽出方法は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。
【００６５】
溶媒抽出は当業者に公知の一般的な手法を用いて行うことができる。溶媒抽出に用いる有機溶媒として、限定するものではないが、エタノール、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、フェノールなどを用いることができる。好ましい有機溶媒は、エタノール、メタノール、酢酸エチル、及びヘキサンである。これらの有機溶媒は２種類以上を混合して用いてもよく、また２種類以上の有機溶媒を用いた２段階以上の溶媒抽出工程を行なってもよい。
【００６６】
具体的には、溶媒抽出は、例えば、凍結乾燥により乾燥させた発酵材料を粉砕し、これに有機溶媒を添加し、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃にて撹拌しながら超音波処理を施して行うことができる。添加する溶媒の量は、発酵材料の重量の１〜５０倍、好ましくは２〜４０倍、より好ましくは１０〜３０倍である。抽出時間は、１０分間〜２時間、好ましくは１５分間〜１時間、より好ましくは２０〜５０分間である。その後、濾過や遠心分離などにより濾液を回収し、残渣に含まれる不溶性画分を取り除き、例えば減圧蒸発により濾液から有機溶媒画分（すなわち、抽出画分）を濃縮し、流体又は乾燥形態で抽出物を得ることができる。また、有機溶媒抽出後の不溶性画分について有機溶媒による抽出を繰り返すことにより、第１回目の有機溶媒抽出後の残渣から有機溶媒画分をさらに取得することもできる。
【００６７】
また、溶媒抽出に続いてさらに別の溶媒を用いた分画を行ってもよい。例えば、溶媒抽出により得られた有機溶媒画分に、溶媒抽出に用いたものと同じか又は異なる第２の有機溶媒を添加し、これに、第２の有機溶媒とは混和しない第３の有機溶媒を添加して抽出し、第３の有機溶媒に溶解性の画分を得ることができる。
【００６８】
有機溶媒画分に存在する物質をさらに精製してもよく、この場合、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。例えば、液−液分配、有機溶媒沈澱、各種カラムクロマトグラフィー（例えばＨＰＬＣ、シリカゲルクロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化などを使用することができる。
【００６９】
好ましくは、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、発酵後に、エタノール抽出によりエタノール溶解画分を分離することにより得られたエタノール画分である。より好ましくは、本発明の穀類植物由来材料発酵物は、エタノール抽出の後、さらにヘキサン分画によりヘキサン溶解画分を分離して得られたヘキサン画分である。
【００７０】
上記のようにして得られる本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、以下の実施例に示すとおり、ＤＣにより仲介される免疫反応を抑制する作用を有する。したがって、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、免疫系の過剰な活性化により引き起こされると考えられる免疫疾患の予防及び治療に有用である。
【００７１】
ＤＣは免疫応答において中心的な役割を果たすため、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を用いて、ＤＣにより仲介される免疫応答を病因とする種々の疾患を抑制する新規な治療方法の実現が期待される。本発明を用いる治療方法の対象となる疾患は、細胞又は臓器・組織移植に伴う移植片拒絶及び移植片対宿主病、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎、自己免疫性心筋炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、全身性強皮症、潰瘍性大腸炎、クローン病、シェーグレン症候群、自己免疫性肝疾患（例えば、原発性胆汁性肝硬変）、乾癬、突発性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群（例えば、糸球体腎炎）、悪性貧血、橋本病、尋常性白斑、ベーチェット病、自己免疫性胃炎、天疱瘡、ギラン・バレー症候群、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症をはじめとする自己免疫疾患、並びに接触過敏症、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息をはじめとするアレルギー性疾患である。
【００７２】
本発明の穀類植物由来材料発酵物は、経口摂取することで、免疫疾患に由来する炎症を改善することができる。また、日常的に摂取することにより免疫疾患に罹ることを予防することができる。この目的のために、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を、１日あたり２ｇ以上、好ましくは１０ｇ以上摂取することが望ましい。本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、穀類植物由来材料を、食用に使用される麹菌により発酵処理して得られる成分であるので、日常の食生活に取り入れることができる。また、投与ないしは摂取の時期は、食前、食間及び食後のいずれの時期でもよい。
【００７３】
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、特定の組成物、例えば飲食品又は医薬品に配合して提供することができる。
【００７４】
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を飲食品に配合して提供する場合、あらゆる食品形態に加工することが可能である。本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を配合することができる飲食品としては、天然物及びその加工品を含む飲食物等を挙げることができる。またその配合量は、例えば飲食品１００ｇに対し、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を１０ｇ以上配合することができる。
【００７５】
飲食品の例としては、限定するものではないが、錠剤形、粉末状、顆粒状、カプセル状、ゼリー状等の機能性食品、パン類、菓子類、クッキー、ビスケット等の穀類加工品、牛乳、ヨーグルト、アイスクリーム等の乳製品類、炭酸飲料、清涼飲料、果汁入り飲料、薬系ドリンク等の飲料、惣菜や加工食品等が挙げられる。
【００７６】
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を医薬品に配合して提供する場合には、免疫疾患の治療、改善又は予防用の免疫調節剤として製剤化することができる。製剤の投与経路は特に限定されないが、例えば、経口投与、経腸投与等を挙げることができる。経口投与又は経腸投与の場合、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物をそのまま投与してもよく、又は製薬上許容される担体又は賦形剤と共に、液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの形態で投与してもよい。
【００７７】
製薬上許容される担体又は賦形剤としては、限定するものではないが、乳糖、ショ糖、ブドウ糖などの糖類、デンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム等の無機物、結晶セルロース、蒸留水、精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油等の一般的に使用されている担体又は賦形剤を例示することができる。また、本発明の免疫調節剤には、担体又は賦形剤の他に、結合剤、滑沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤などの添加剤を使用することができる。他の医薬品と混合又は併用することも可能である。なお、上記の製剤は殺菌処理を行なってもよい。
【００７８】
本発明の免疫調節性飲食品又は免疫調節剤を適用する対象は特に限定されず、健常者、免疫疾患の患者、免疫疾患の治療中の患者、免疫疾患の予防を検討している健常者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の動物に適用してもよい。
【００７９】
本発明の免疫調節性飲食品又は免疫調節剤は、抗原提示細胞を修飾することによって、修飾された抗原提示細胞による制御性Ｔ細胞の誘導を可能にし、また、直接的に制御性Ｔ細胞を誘導することができる。さらに、本発明の免疫調節性飲食品又は免疫調節剤は、炎症性Ｔ細胞の増殖を抑制することができる。したがって、これにより過剰な免疫反応を抑制することが可能となる。
【００８０】
本発明の免疫調節性飲食品又は免疫調節剤の投与量は、被験者の年齢、体重、性別、肥満の程度など、様々な要因に応じて変化するが、典型的には、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を１日あたり、２ｇ以上、好ましくは１０ｇ以上投与する量とし、投与間隔は特に制限されない。
【００８１】
本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、効率的に免疫疾患を改善することができ、かつ、穀類植物から食用に使用される麹菌により発酵処理して得られた成分であるので、安全性が高く、飲食品又は医薬における使用に有用である。さらに、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、小麦フスマといった、比較的安価な原料から製造することが可能であるため、コスト面においても優れている。
【００８２】
本発明は、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を含有する、免疫疾患を予防又は治療するための医薬組成物にも関する。該医薬組成物は、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物の他に、上記のような製薬上許容される賦形剤などの追加の成分を含むことができる。
【００８３】
本発明はまた、穀類植物由来材料を麹菌を用いて発酵させるステップ、発酵生成物をエタノール抽出するステップ、及びエタノール抽出物をヘキサン分画するステップを含む、本発明の穀類植物由来材料発酵物処理物の調製方法にも関する。発酵方法、溶媒抽出方法は上記のように行うことができる。
【００８４】
さらに、本発明は、被験体から採取した細胞に、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法にも関する。
【００８５】
本発明において、「抗原提示細胞」とは、樹状細胞（ＤＣ）、単球、マクロファージ、Ｂ細胞などの、細胞表面にＭＨＣクラスＩＩを発現する細胞、及びそのような細胞に分化することが可能な未分化細胞を意味する。好ましくは、抗原提示細胞は、樹状細胞である。
【００８６】
以下の実施例において示すように、本発明の方法により修飾されたＤＣは、低減した活性化細胞表面マーカー及び炎症性サイトカインの産生を示し、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導する能力を有する。したがって、本発明の方法により修飾されたＤＣは、免疫系の過剰な活性化により引き起こされると考えられる免疫疾患の予防及び治療に有用である。本発明の方法を用いて修飾された抗原提示細胞は、特に、被験体から取り出した細胞を本発明の方法を用いて処理して制御性ＤＣを得て、これを該被験体に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ治療において非常に有用である。
【００８７】
本発明において「抗原提示細胞を修飾する」とは、抗原提示細胞での遺伝子発現（細胞表面マーカー、サイトカイン等）を変化させ、Ｔ細胞等の他の細胞種に与えるその影響を変化させることを意味する。この場合、遺伝子発現とは、細胞の染色体ＤＮＡからのｍＲＮＡの転写、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳のみならず、発現タンパク質の翻訳後修飾による成熟、タンパク質の細胞内局在の変化、細胞からのタンパク質分泌の変化なども意味するものと理解される。好ましくは、本発明の方法により修飾された抗原提示細胞は、制御性Ｔ細胞を誘導する能力を有する。
【００８８】
本発明はまた、被験体から採取した細胞に、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性樹状細胞の製造方法にも関する。
【００８９】
本発明において「制御性樹状細胞」とは、自身の作用及び制御性Ｔ細胞の誘導を介して免疫系の過剰な活性化・暴走を抑制する能力を有する樹状細胞を意味する。制御性樹状細胞の定義は文献により異なり、一義的には決定されていないが、例えば、樹状細胞活性化マーカーであるＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩＩなどの発現が低下している、抑制性樹状細胞マーカーであるＩＣＯＳＬ、ＰＤ−Ｌ１などの発現が見られる、抑制性サイトカインであるＩＬ−１０、ＴＧＦ−βなどを産生する、炎症性サイトカインであるＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２などの産生が低下している、炎症誘発物質の作用に対抗して炎症性シグナルＮＦ−κＢカスケードの過剰な活性化を抑制する能力を有する、などの特徴を有する。
【００９０】
本発明の抗原提示細胞修飾方法及び制御性樹状細胞製造方法において、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物と接触させる「細胞」としては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球などの抗原提示細胞及び抗原提示細胞に分化し得る未分化細胞（例えば、樹状細胞に分化し得る幹細胞、前駆細胞等、特に、骨髄由来幹細胞、末梢血単核球等）が挙げられる。好ましい細胞は、骨髄由来細胞をＦｌｔ−３Ｌなどのサイトカインで刺激することにより分化誘導した細胞である。
【００９１】
本発明はさらに、被験体から採取した細胞に、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を接触させるステップを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法に関する。
【００９２】
本発明において「制御性Ｔ細胞」（Ｔｒｅｇ）とは、免疫反応を抑制し、恒常性と自己寛容性を維持する特定のＴ細胞サブポピュレーションを意味する。制御性Ｔ細胞の定義は文献により異なり、一義的には決定されていないが、例えば、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＦｏｘＰ３を構成的に発現している、などの特徴を有する。
【００９３】
本発明の制御性Ｔ細胞製造方法において、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物と接触させる「細胞」としては、例えば、ナイーブＴ細胞が挙げられる。ナイーブＴ細胞は、例えば、脾臓から単離した細胞を、さらにＣＤ４及びＣＤ６２Ｌの発現により選別することによって得ることができる。
【００９４】
本発明の抗原提示細胞修飾方法、制御性樹状細胞製造方法及び制御性Ｔ細胞製造方法において、単離された細胞と接触させる本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、１〜５００μｇ／ｍＬの濃度で、好ましくは５〜２５０μｇ／ｍＬの濃度で、より好ましくは１０〜１５０μｇ／ｍＬの濃度で、特に好ましくは２５〜１００μｇ／ｍＬの濃度で、適切な培養用培地又はインキュベーション溶液中に添加し、細胞と接触させる。接触時間は、１時間〜２８日間、好ましくは１２時間〜１４日間、より好ましくは１〜１２日、最も好ましくは３〜１０日間である。
【００９５】
また、本発明は、抗原提示細胞を修飾する作用を有する、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物、及び該穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を含有する抗原提示細胞修飾用組成物にも関する。さらに、本発明は、制御性Ｔ細胞を誘導する作用を有する、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物、及び該穀類植物由来材料発酵物又はその処理物を含有する制御性Ｔ細胞誘導用組成物に関する。さらにまた、本発明は、自己免疫疾患又はアレルギー等に関連して抗原によって誘導される炎症性Ｔ細胞の増殖を抑制する炎症性Ｔ細胞増殖阻害用組成物にも関する。当該組成物は、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物の他に、上記のような製薬上許容される賦形剤、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される試薬に通常用いられる添加剤（バッファー、等張化剤等）を含むことができる。
【００９６】
以下の実施例に示すとおり、本発明者らは、小麦フスマ麹発酵物から、以下の構造式により示される化合物であるエルゴスタ−５，７，１４，２２−テトラエン−３β−オール（Ergosta-5,7,14,22-tetraen-3β-ol；本明細書中の他の箇所では、「１４−デヒドロエルゴステロール」又は「１４−ＤＨＥ」と記す。）を単離し、さらに、精製された１４−デヒドロエルゴステロールが、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物と同様にＤＣにより仲介される免疫反応を抑制する作用を有することを初めて見出した。また、この知見から、１４−デヒドロエルゴステロールが、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物の免疫調節作用を担う有効成分であることが推測される。
【化１】
0005539981.tif 000002
【００９７】
したがって、本発明の穀類植物由来材料発酵物又はその処理物は、好ましくは、１４−デヒドロエルゴステロールを含有する。
【００９８】
１４−デヒドロエルゴステロール（１４−ＤＨＥ）は、１９５１年にアスペルギルス・ニガーにおいて見出され（Ｂａｒｔｏｎ，ＤＨＲ．，ａｎｄ  Ｂｒｕｕｎ，Ｔ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２７２８−２７３３（１９５１））、２００９年にキウイフルーツ果皮の一成分として再発見されたが（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．ら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５７：４１４８−４１５５（２００９）の化合物８）、その生理的活性についてはこれまで報告されていない。
【００９９】
すなわち、本発明者らによる１４−デヒドロエルゴステロールの生理的活性の実証により、免疫疾患等の免疫系の過剰な活性化に関連する状態を予防又は治療するのに有効な新規な物質が提供されたこととなる。
【０１００】
したがって、本発明は、１４−デヒドロエルゴステロールを含有する免疫調節剤又は免疫調節性飲食品、及び１４−デヒドロエルゴステロールを含有する免疫疾患の予防又は治療のための医薬組成物にも関する。
【０１０１】
１４−デヒドロエルゴステロールの投与量は、被験者の年齢、体重、性別、肥満の程度など、様々な要因に応じて変化するが、典型的には、１４−デヒドロエルゴステロールを１日あたり、１ｍｇ以上、好ましくは５ｍｇ以上投与する量とし、投与間隔は特に制限されない。
【０１０２】
また、本発明は、被験体から採取した細胞に、１４−デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、抗原提示細胞を修飾する方法及び制御性樹状細胞の製造方法に関する。
【０１０３】
本発明の抗原提示細胞修飾方法及び制御性樹状細胞製造方法において、１４−デヒドロエルゴステロールと接触させる「細胞」としては、例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球などの抗原提示細胞及び抗原提示細胞に分化し得る未分化細胞（例えば、樹状細胞に分化し得る幹細胞、前駆細胞等、特に、骨髄由来幹細胞、末梢血単核球等）が挙げられる。好ましい細胞は、骨髄由来細胞をＦｌｔ−３Ｌなどのサイトカインで刺激することにより分化誘導した細胞である。
【０１０４】
本発明の抗原提示細胞修飾方法及び制御性樹状細胞製造方法において、単離された細胞と接触させる１４−デヒドロエルゴステロールは、０．１〜１００μＭの濃度で、好ましくは０．２〜５０μＭの濃度で、より好ましくは０．５〜２５μＭの濃度で、特に好ましくは１〜１０μＭの濃度で、適切な培養用培地又はインキュベーション溶液中に添加し、細胞と接触させる。接触時間は、１時間〜２８日間、好ましくは１２時間〜１４日間、より好ましくは１〜１２日、最も好ましくは３〜１０日間である。
【０１０５】
さらに、本発明は、被験体から採取した細胞に、１４−デヒドロエルゴステロールを接触させるステップを含む、制御性Ｔ細胞の製造方法に関する。
【０１０６】
本発明の制御性Ｔ細胞製造方法において、１４−デヒドロエルゴステロールと接触させる「細胞」としては、例えば、ナイーブＴ細胞が挙げられる。ナイーブＴ細胞は、例えば、脾臓から単離した細胞を、さらにＣＤ４及びＣＤ６２Ｌの発現により選別することによって得ることができる。
【０１０７】
本発明の制御性Ｔ細胞製造方法において、単離されたナイーブＴ細胞と接触させる１４−デヒドロエルゴステロールは、０．０１〜１０μＭの濃度で、好ましくは０．０２〜５μＭの濃度で、より好ましくは０．０５〜２．５μＭの濃度で、特に好ましくは０．０５〜１μＭの濃度で、適切な培養用培地又はインキュベーション溶液中に添加し、細胞と接触させる。接触時間は、１時間〜２８日間、好ましくは１２時間〜１４日間、より好ましくは１〜１２日、最も好ましくは３〜１０日間である。
【０１０８】
本発明の有効成分である１４−デヒドロエルゴステロールは、上記の通りアスペルギルス・ニガーにおいて見出されたので、穀類植物由来材料の発酵物に限らず、広範な麹菌の発酵物に含有される可能性がある。したがって、本発明は、１４−デヒドロエルゴステロールを含有し、抗原提示細胞を修飾する作用を有する、麹菌発酵物又はその処理物、及び該麹菌発酵物又はその処理物を含有する組成物に関する。また、本発明は、１４−デヒドロエルゴステロールを含有し、制御性Ｔ細胞を修飾する作用を有する、麹菌発酵物又はその処理物、及び該麹菌発酵物又はその処理物を含有する組成物にも関する。当該組成物は、本発明の麹菌発酵物又はその処理物の他に、上記のような製薬上許容される賦形剤、又は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される試薬に通常用いられる添加剤（バッファー、等張化剤等）を含むことができる。
【０１０９】
本明細書中に示す通り、１４−デヒドロエルゴステロールは、ＤＣを修飾することによって制御性Ｔ細胞を誘導する作用、及びナイーブＴ細胞に直接的に働きかけて制御性Ｔ細胞を誘導する作用を有する。したがって、本発明は、１４−デヒドロエルゴステロールを含有する制御性Ｔ細胞誘導剤にも関する。
【０１１０】
また、本明細書中に示す通り、１４−デヒドロエルゴステロールは、抗原刺激による炎症性Ｔ細胞の増殖を抑制する作用を有する。したがって、本発明は、１４−デヒドロエルゴステロールを含有する炎症性Ｔ細胞増殖抑制剤にも関する。
【０１１１】
本発明の制御性Ｔ細胞誘導剤及び炎症性Ｔ細胞増殖抑制剤は、有効成分としての１４−デヒドロエルゴステロールの他に、上記のような製薬上許容される賦形剤等を含むことができる。
【０１１２】
本発明の麹菌発酵物又はその処理物、及びそれを含有する組成物は、抗原提示細胞を修飾する作用を有するため、例えば、ＤＣにより仲介される免疫反応を抑制することが可能であり、免疫疾患の予防又は治療において有用である。
【０１１３】
また、本発明の麹菌発酵物又はその処理物、及びそれを含有する組成物は、ナイーブＴ細胞から制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を誘導することが可能であり、免疫疾患の予防又は治療において有用である。
【０１１４】
さらにまた、本発明の麹菌発酵物又はその処理物、及びそれを含有する組成物は、様々な抗原感作によって体内で増殖が刺激される炎症性Ｔ細胞の増殖を抑制することが可能であり、免疫疾患の予防又は治療において有用である。
【実施例】
【０１１５】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。【０１１６】
［実施例１］
各種穀類植物由来材料の麹発酵物及びその処理物の調製
イネ、オオムギの麹発酵物は、以下のようにして調製した。定法に基づいて調製した蒸米又は蒸大麦に対して、各種の市販種麹（黄麹菌：秋田今野社、強力もと立用（アスペルギルス・オリゼー）；黒麹菌：秋田今野社、黒麹マイルド（アスペルギルス・アワモリ）；紅麹菌：秋田今野社（モナスカス・アンカ））を０．１重量％の割合で接種した。相対湿度８０％以上に保持し、黄麹及び黒麹発酵試料は３５℃、７２時間、紅麹発酵試料は３０℃、７日間、適宜、手入れ（塊となった麹をほぐす作業）を施しながら、製麹を行った。【０１１７】
小麦フスマ、米糠の麹発酵物は、以下のようにして調製した。小麦フスマ（日清製粉社製）又は米糠４５０ｇに対して、５５０ｍＬの脱塩水を添加し、よく混合した後、オートクレーブを用いて１２１℃、５０分間滅菌した。滅菌後の原料に、各種の市販種麹（黒麹菌：秋田今野社、黒麹マイルド（アスペルギルス・アワモリ）；テンペ菌：秋田今野社（リゾプス・オリゴスポラス））を０．１重量％の割合で接種した。相対湿度を８５％以上に保持し、３５℃にて培養を行った。培養開始後２４時間後、及び４８時間後に手入れを行い、７２時間で培養終了とした。【０１１８】
麹発酵物試料は、凍結乾燥した後、家庭用粉砕装置にて粉砕した。得られた凍結試料２ｇに対して、９９．５％エタノールを４０ｍＬ添加し、４０℃、３０分間、撹拌しながら超音波処理を施して、エタノール抽出を行った。この上清を濾紙にて濾過し、残渣にさらに９９．５％エタノールを４０ｍＬ添加し、同様に抽出を行い、上清を同様に濾紙にて濾過し、濾液を合一した。得られた抽出液をエバポレーターにて濃縮し、さらに凍結乾燥機で乾燥後、重量を測定した。その後、８０％メタノールを１０ｍＬ添加し、よく溶解した後、１０ｍＬのヘキサンを用いた抽出を３回行い、上清を合一した。得られたヘキサン画分、および残った８０％メタノール画分をエバポレーターにて濃縮し、さらに凍結乾燥機で乾燥後、重量を測定した。ヘキサン画分乾固物は１００％エタノールに、８０％メタノール画分乾固物は５０％エタノール水溶液に溶解したものを原液として各種評価に用いた。【０１１９】
各試料を表１に示す。
【表１】
0005539981.tif 000003
【０１２０】
［実施例２］
制御性ＤＣ誘導活性の評価
移植片拒絶反応及び移植片対宿主病を含む各種免疫疾患を緩和、予防及び治療するために用いるのに有効な活性を有する物質を得る目的で、炎症刺激に対して（Ａ）ＣＤ８６に代表される細胞表面成熟化因子の発現の低下、（Ｂ）ＤＣが産生するＩＬ−１２などの炎症性サイトカインの発現量の低下、及び（Ｃ）ＤＣが産生するＩＬ−１０などの制御性サイトカインの発現量の上昇を指標として、実施例１で調製した試料を評価した。【０１２１】
以下の方法により、各試料が、マウス骨髄細胞からのＤＣ誘導、及びＤＣ分化に与える影響の評価を行った。【０１２２】
＜実験方法＞
表１に示される、実施例１で調製した穀類植物由来材料及びそれらの麹発酵物について試験した。まず、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞を大腿骨から常法に従って回収し、赤血球除去処理を行った。次に得られた骨髄細胞を、１０％ＦＣＳ、２μＭ  β−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）に、１×１０６細胞／ｍＬになるように縣濁した。得られた細胞懸濁液に、ＤＣ誘導サイトカインとしてＦｌｔ−３Ｌ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を終濃度１００ｎｇ／ｍＬで添加した。続いて、表１に示す各試料を終濃度５０μｇ／ｍＬで添加した。ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２にて１週間、細胞を培養した後、最後の２４時間にＬＰＳ（シグマアルドリッチ社製）を終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した。対照としてＬＰＳ非添加試料も作製した。【０１２３】
培養８日目に細胞を回収し、上記（Ａ）ＣＤ８６発現量をフローサイトメーターを用いた解析により評価した。簡潔には、細胞を回収し、洗浄した後、抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、抗ＣＤ１１ｂ−ＦＩＴＣ、抗Ｂ２２０−ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ８６−ＰＥの各抗体（すべて、ベクトンディッキンソンから入手）を用いて３０分間、４℃にて染色し、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ベクトンディッキンソン社製）を用いて解析した。【０１２４】
Ｆｌｔ−３ＬによるＤＣ培養では、ミエロイドＤＣ（ｍＤＣ）とプラスマサイトイドＤＣ（ｐＤＣ）が生成される。本実施例では、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０−で定義されるｍＤＣにゲートを設定して解析を行った。【０１２５】
培養上清は、上記（Ｂ）ＩＬ−１２産生量、及び（Ｃ）ＩＬ−１０産生量を調べるＥＬＩＳＡアッセイに供した。ＥＬＩＳＡキットとして、ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｅｔ（ベクトンディッキンソン社製）を使用し、製造業者の使用説明書に従い測定を行なった。【０１２６】
＜実験結果＞
（Ａ）ＬＰＳ刺激に応答しての成熟マーカーＣＤ８６発現に対する各試料の影響
図１に、表１に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。対照（試料溶媒であるエタノールのみを添加）では、ＬＰＳ刺激により爆発的にＣＤ８６発現量（平均蛍光強度：ＭＦＩとして評価）が増大した。各試料を添加することにより、ＣＤ８６の発現量の上昇が抑制される現象が観察された。特にサンプル７、８、９、１０及び２０によって、ＣＤ８６発現量は対照の５０％以下となり、顕著な低下が認められた。【０１２７】
（Ｂ）ＬＰＳ刺激に応答しての炎症性サイトカインＩＬ−１２ｐ７０発現に対する各試料の影響
図２に、表１に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。Ｎｏ．１から１０までのすべてのヘキサン抽出画分で、顕著なＩＬ−１２ｐ７０発現抑制が見られた。【０１２８】
（Ｃ）ＬＰＳ刺激に応答しての制御性サイトカインＩＬ−１０発現に対する各試料の影響
図３に、表１に挙げられた試料についてのアッセイ結果を示す。Ｎｏ．８のみで、顕著なＩＬ−１０発現促進活性が見られた。【０１２９】
以上の結果、（Ａ）〜（Ｃ）の条件を完全に満たすものとして、Ｎｏ．８の試料、すなわち小麦フスマ黒麹発酵物のエタノール抽出ヘキサン画分が特定された。これは制御性ＤＣを誘導すると言うことができる。また、Ｎｏ．７、９、１０及び２０の試料は、ＩＬ−１０産生促進効果は見られないものの、ＤＣの活性化阻害効果（ＬＰＳ刺激に応答しての成熟マーカー（ＣＤ８６）発現低下、及び炎症性サイトカイン（ＩＬ−１２）産生低下）が見られることから、抗炎症性を有することが明らかになった。【０１３０】
［実施例３］
小麦フスマ麹発酵物と他の制御性ＤＣ誘導法との比較
実施例２で制御性ＤＣ誘導活性が認められた小麦フスマ麹発酵物抽出物について、公知の代表的な制御性ＤＣ誘導剤との比較を行った。【０１３１】
ラパマイシンは、ＤＣ誘導中に添加することによって、低下したＣＤ８６／ＭＨＣＩＩ発現及び低下したＩＬ−１２ｐ７０産生を示すＤＣを分化させることが報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７，１７８：７０１８−７０３１．）。一方、Ｓａｔｏらは、ＤＣ誘導開始とともにＩＬ−１０／ＴＧＦ−βを添加することにより、一連のＤＣ成熟マーカー発現が低下することを報告している（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２００３，１８：３６７−３７９．）。また、ＤＣに関与するかどうかは不明であるが、米糠に含まれるγ−オリザノールには抗炎症効果があり、腸炎を改善することが報告されている（Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００８，１５４：８１２−８２４．）。小麦フスマ発酵物がこれらと比して同等な効果を有するかどうかを検討した。【０１３２】
＜実験方法＞
表１に示される、実施例１で調製した小麦フスマ麹発酵物ヘキサン画分（Ｎｏ．８）を試験に用いた。ラパマイシン及びＩＬ−１０／ＴＧＦ−βの報告ではＤＣ誘導剤としてＧＭ−ＣＳＦを使用しているため、ＧＭ−ＣＳＦ及びＦｌｔ−３Ｌそれぞれの系でＤＣを誘導し、各制御性ＤＣ誘導剤について評価した。【０１３３】
（Ａ）Ｆｌｔ−３ＬによるＤＣ誘導系
実施例２の実験方法と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、１×１０６細胞／ｍＬで培地に縣濁し、Ｆｌｔ−３Ｌを１００ｎｇ／ｍＬ添加した。小麦フスマ麹発酵物抽出物及びγ−オリザノール（和光純薬社製）は５０μｇ／ｍＬ、ＩＬ−１０／ＴＧＦ−β（それぞれ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）は各２０ｎｇ／ｍＬで、培養開始後０日目（ｄａｙ０）に添加した。ラパマイシン（和光純薬社製）は１０ｎｇ／ｍＬで培養開始３日後に添加した。培養は７日間行い、最後の２４時間にＬＰＳを終濃度１ｎｇ／ｍＬで添加した。【０１３４】
評価法として、細胞表面のＤＣ活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＭＨＣＩＩ、並びに抑制性マーカーＰＤ１Ｌの発現強度を、フローサイトメーターを用いた解析により評価した。実施例１と同様ｍＤＣにゲートを設定して解析を行った。抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗Ｂ２２０−ＰｅｒＣＰ、抗ＣＤ４０−ＦＩＴＣ及び抗ＣＤ８６−ＰＥ、又は抗ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ、抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗Ｂ２２０−ＰｅｒＣＰ、抗ＭＨＣＩＩ−ＦＩＴＣ及び抗ＰＤ１Ｌ−ＰＥ（すべてベクトンディッキンソンから入手）を用いて染色し、解析した。【０１３５】
（Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦによるＤＣ培養系
実施例１の実験方法と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、２×１０５細胞／ｍＬで培地に縣濁し、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加した。試験物質の添加濃度及び添加のタイミングは上記と同様に行った。【０１３６】
評価法として、細胞表面のＤＣ活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＭＨＣＩＩ、並びに抑制性マーカーＰＤ１Ｌの発現強度を、フローサイトメーターを用いた解析により評価した。ＧＭ−ＣＳＦによるＤＣ誘導ではｍＤＣしか生成されないが、Ｆｌｔ−３Ｌの場合と同様、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋Ｂ２２０−のｍＤＣゲートを設定して解析を行った。【０１３７】
＜実験結果＞
（Ａ）Ｆｌｔ−３ＬによるＤＣ誘導系における結果
まず、ＩＬ−１０／ＴＧＦ−β添加ではＤＣが分化せず、評価が不能であった。図４に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物（図中、単に「小麦フスマ発酵物」と記載。以下同じ。）ではＬＰＳ刺激に応答してのＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＭＨＣＩＩの反応が顕著に抑制された。一方、γ−オリザノールではこれらの活性化マーカーに変動を認めず、効果がないことが示された。ラパマイシンではＣＤ４０及びＣＤ８６で若干の抑制効果が認められたが、小麦フスマ麹発酵物抽出物には大きく劣った。ＤＣ上の抑制性マーカーＰＤ１Ｌについては、どのサンプルでも大きな変動を認めなかった。【０１３８】
（Ｂ）ＧＭ−ＣＳＦによるＤＣ誘導系における結果
図５に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したＤＣは、ＬＰＳ非添加状態においてもＤＣ活性化マーカーの発現が対照に比べて強く抑制されていることに加えて、ＬＰＳ刺激に対してほぼ無反応で、炎症刺激に対して寛容状態となっていることが示された。γ−オリザノールでは、対照と同様に強い活性化マーカーの発現上昇が見られ、制御性ＤＣ誘導効果を認めなかった。ラパマイシンではＬＰＳ非添加・添加に関わらず、ＣＤ４０及びＣＤ８６の発現抑制効果が認められたが、ＭＨＣＩＩに対しては効果が見られず、限定的な制御性ＤＣの生成が確認された。ＩＬ−１０／ＴＧＦ−βでは、小麦フスマ麹発酵物抽出物と同様なＣＤ４０、ＣＤ８６、及びＭＨＣＩＩの発現抑制が観察されたが、ＤＣの分化マーカーであるＣＤ１１ｃの発現度が低下しており、ＤＣ分化そのものが阻害されていることが考えられた。【０１３９】
以上の結果から、食品由来で安全性・副作用・コストの点で大きく優位な小麦フスマ麹発酵物抽出物は、公知の制御性ＤＣ誘導剤であるラパマイシン及びＩＬ−１０／ＴＧＦ−βと同等かそれ以上の有効性で制御性ＤＣを誘導し得ることが示された。【０１４０】
［実施例４］
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したＤＣのＴ細胞増殖支持能及びサイトカイン産生能の評価
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したＤＣのＴ細胞増殖支持能を評価するために、混合リンパ球培養反応（ｍｉｘｅｄ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ＝ＭＬＲ）試験を行った。【０１４１】
＜実験方法＞
表１に示される、実施例１で調製した小麦フスマ麹発酵物（Ｎｏ．８）を試験に用いた。骨髄細胞の供給源としてＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた以外は上記実施例と同様にして、小麦フスマ麹発酵物抽出物存在下で、Ｆｌｔ−３ＬによってＤＣを誘導し、最後の２４時間はＬＰＳ処理による刺激を行った。対照として、小麦フスマ麹発酵物抽出物を添加しない細胞を作製した。【０１４２】
続いてＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０−のｍＤＣをセルソーター（ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ）を用いてソーティングした。次にＤＣ自体の培養期間中における増殖を止めるため、マイトマイシンＣ処理を行った。簡潔には、細胞を１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（ナカライテスク社製）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃にて３０分間インキュベートし、ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した。【０１４３】
次に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をセルソーターによってソーティングし、ＣＦＳＥラベルで蛍光染色した。簡潔には、抗ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７、抗ＣＤ４−ＡＰＣ、及び抗ＣＤ６２Ｌ−ＰＥを用いて細胞を染色し、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をソーティング後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥ  Ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて、製造業者の使用説明書に従って染色を行なった。【０１４４】
最後に、マイトマイシン処理の終了したＢＡＬＢ／ｃ由来ＤＣと、Ｃ５７ＢＬ／６由来ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞とを、ＤＣ：ＣＤ４＋Ｔ＝１：１０（細胞数）となるように混合し、７日間培養した。培養終了後、ＣＦＳＥの強度減少によってＣＤ４＋Ｔ細胞の分裂・増殖の程度を評価した。また、分化したＣＤ４＋Ｔ細胞からの炎症性サイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ−１７産生を細胞内サイトカイン染色によって判定した。簡潔には、抗ＣＤ３−ＡＰＣ及び抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（いずれもベクトンディッキンソン社製）を用いた細胞表面マーカーの染色後、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ベクトンディッキンソン社製）を用いて細胞膜透過処理を行い、抗ＴＮＦα−ＦＩＴＣ及び抗ＩＬ−１７−ＰＥ（いずれもベクトンディッキンソン社製）を用いてサイトカイン染色を行なった。【０１４５】
＜実験結果＞
（Ａ）図６に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物を用いて処理したＤＣは、対照と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞の分裂・増殖支持能を著明に低下させることが示され、急激なＴ細胞増加を防ぐ抗炎症効果を有することが示された。【０１４６】
（Ｂ）図７に示すように、小麦フスマ麹発酵物抽出物を用いて処理したＤＣと共培養したＴ細胞の炎症性サイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ−１７陽性細胞率は、対照ＤＣの場合と比較して、半分に低下していた。このことによっても、小麦フスマ麹発酵物抽出物の抗炎症作用が示された。【０１４７】
［実施例５］
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したＤＣの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導能の評価
小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したＤＣの、ナイーブＴ細胞からＴｒｅｇへの変換を誘導する能力を評価するために、アッセイを行った。【０１４８】
＜実験方法＞
（Ａ）抗原非特異的なＴｒｅｇ誘導能の検討
上記実施例と同様にして、小麦フスマ麹発酵物処理物存在下でＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄細胞からＦｌｔ−３Ｌを用いてＤＣを誘導し、ＬＰＳで２４時間処理した。得られた細胞から、実施例３と同様にしてｍＤＣをソーティングし、マイトマイシンＣ処理によってＤＣの細胞増殖を止めた。【０１４９】
次に、Ｃ５７ＢＬ／６からナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をソーティングし、ＤＣ：ＣＤ４＋Ｔ＝１：１０（細胞数）で混合し、共培養した。この際、培地に０．５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）を添加した。【０１５０】
７日後に細胞を回収し、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＦｏｘＰ３＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の割合をフローサイトメーターで求めた（抗ＣＤ２５−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７及び抗ＣＤ４−ＰｅｒＣＰを用いた細胞表面マーカー染色後、Ｆｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて製造業者の使用説明書に従って細胞膜透過処理を行い、抗Ｆｏｘｐ３−ＰＥ（ｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）で細胞内Ｆｏｘｐ３を染色した）。対照として、小麦フスマ麹発酵物抽出物非存在下（無添加）で作製したｍＤＣ、さらにＳａｔｏらの方法に従い、ＧＭ−ＣＳＦにＩＬ−１０／ＴＧＦ−βを添加して誘導されるＤＣｒｅｇを用いた。【０１５１】
（Ｂ）抗原特異的なＴｒｅｇ誘導能の検討
（Ａ）と同様に各種ＤＣを調製した。次にＯＶＡ特異的ＴＣＲを有するＤＯ１１．１０マウス（チャールズリバーから入手）のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をソーティングし、ＤＣ：ＣＤ４＋Ｔ＝１：１０（細胞数）で混合し、共培養した。この際、培地に０．５ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦ−β１及び０．１μＭ  ＯＶＡ３２３−３３９ペプチドを添加し、５日間培養した。続いて、Ｔｒｅｇの生成効率を、（Ａ）と同様に求めた。【０１５２】
＜実験結果＞
（Ａ）抗原非特異的なＴｒｅｇ誘導能
図８に示すように、Ｔｒｅｇの生成は、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したＤＣとの共培養により、対照と比較して３倍以上に増加した。一方、ＤＣｒｅｇでは、対照と比較して２倍以上の増加が見られた。【０１５３】
（Ｂ）抗原特異的なＴｒｅｇ誘導能
図９に示すように、Ｔｒｅｇの生成は、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したＤＣとの共培養により、対照と比較して３倍以上に増加した。一方、ＤＣｒｅｇでは、対照と比較して２倍以上の増加が見られた。【０１５４】
以上の結果から、小麦フスマ麹発酵物抽出物で処理したＤＣは、Ｔｒｅｇを効率的に誘導する能力を有することが示された。その効果は、公知の方法で作製したＤＣｒｅｇと比較しても、より高いことが示された。このことは、小麦フスマ麹発酵物が、制御性ＤＣ誘導、それによるＴｒｅｇ増加を介して、各種免疫疾患を予防及び治療することができることを示唆している。【０１５５】
［実施例６］
使用麹菌種の比較
小麦フスマ発酵に使用する麹菌種の違いによって、制御性ＤＣ誘導効率に差が生じるかについて、様々な麹菌種を比較することによって検討した。【０１５６】
＜サンプル調製＞
市販種麹として、黒麹菌（秋田今野社：黒麹マイルド（アスペルギルス・アワモリ）；秋田今野社：焼酎用白麹（アスペルギルス・カワチ）；樋口もやし社：ヒグチ黒麹（アスペルギルス・アワモリ））、醤油用麹菌（秋田今野社：醤油１号（アスペルギルス・ソーヤ））、黄麹菌（秋田今野社：強力もと立用（アスペルギルス・オリゼー））、及びテンペ菌（秋田今野社：リゾプス・オリゴスポラス）を用いた以外は、実施例１に記載の小麦フスマ黒麹発酵物及びその処理物の調製法と同様にして、発酵物及び抽出物を調製した。また、発酵なしの試料としては、同じ方法で滅菌し、種麹を接種していないものを用いた。【０１５７】
＜実験方法＞
上記実施例と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞にＦｌｔ−３Ｌを添加してＤＣへと分化誘導し、同時に各種麹菌種を用いて発酵させた小麦フスマ麹発酵物抽出物を５０μｇ／ｍＬ添加して、７日間培養した。最後の２４時間にＬＰＳで細胞を刺激し、続いて細胞活性化マーカーＣＤ８６及びＭＨＣＩＩ、並びに培養上清中のＩＬ−１０濃度を測定した。【０１５８】
＜実験結果＞
図１０に示すように、ＣＤ８６抑制活性についてはどの菌株を用いた場合でも大差はなかった。また、未発酵物でも若干劣るが抑制活性が見られた。ＭＨＣＩＩ抑制活性については、黒麹が他と比べて若干活性が高かった。【０１５９】
図１１にＩＬ−１０濃度を示す。どの菌株を用いた場合でも安定したＩＬ−１０産生が見られ、菌株の違いによる差はなかった。未発酵物でも半分程度のＩＬ−１０促進活性が見られた。【０１６０】
以上の結果から、菌株として総合的に黒麹菌が好ましいこと、及び、原料である小麦フスマそのものにも制御性ＤＣ誘導活性が見られるが、発酵によって活性を高めることができることが示された。【０１６１】
［実施例７］
発酵条件と活性との関連
小麦フスマを黒麹で発酵させる際の温度、培養日数、及び水分条件が、発酵物の効果に影響を与えるかについて検討を行った。【０１６２】
＜サンプル調製＞
市販種麹として樋口もやし社のヒグチ黒麹を用いて、実施例１に記載の小麦フスマ黒麹調製法と同様にして、発酵物及び抽出物を調製した。その際、培養温度を３０、３５又は３７℃、培養日数を２、３又は４日とし、水分量は基本条件の５５％の他に４５％としたものを設けた。【０１６３】
＜実験方法＞
上記実施例と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞にＦｌｔ−３Ｌを添加して、ＤＣへと分化誘導し、同時に各培養条件によって発酵させた小麦フスマ麹発酵物抽出物を５０μｇ／ｍＬ添加し、７日間培養した。最後の２４時間にＬＰＳで細胞を刺激し、細胞活性化マーカーＣＤ８６及びＭＨＣＩＩ、並びに培養上清中のＩＬ−１０濃度を測定した。【０１６４】
＜実験結果＞
図１２に示すように、３０℃・２日間培養では若干ＩＬ−１０産生誘導が低下していたが、その他の条件では特に大きな効果の差異は見出されなかった。【０１６５】
以上の結果から、特に３０℃で３日以上発酵させることによって、安定した活性を有する物質が産生されることが示唆された。【０１６６】
［実施例８］
有効成分の単離
小麦フスマ麹発酵物から、上記実施例での免疫制御作用を発揮するための有効成分と考えられる化合物を単離した。【０１６７】
＜実験方法＞
黒麹菌（秋田今野社：黒麹マイルド（アスペルギルス・アワモリ））を用いて、培養温度３０℃、培養日数３日、水分量５５％として、実施例１と同様の方法により小麦フスマ麹発酵物を調製した。得られた発酵物をさらにエタノール抽出及びヘキサン抽出に供し、ヘキサン抽出物を調製した。発酵物の凍結乾燥物１００ｇから、抽出物３ｇが得られた。【０１６８】
得られた抽出物を２００ｍｇ／ｍＬとなるようにヘキサンに溶解し、ヘキサンでコンディショニングしたＭｅｇａ  Ｂｏｎｄ  Ｅｌｕｔｅ  ＳＩ（２０ｇ）（Ｖａｒｉａｎ社製）に、１本あたり３ｍＬアプライした。続いて６０ｍＬのヘキサンでカラムを洗浄し、６０ｍＬの酢酸エチルで溶出して、カラム吸着物を回収した。得られた溶出液をエバポレーターで乾固した。３ｇのヘキサン抽出物から、２．８ｇのＳＩカラム吸着物が得られた。【０１６９】
得られたＳＩカラム吸着物を、２００ｍｇ／ｍＬとなるようにヘキサン／エタノール（８０／２０；ｖ／ｖ）に溶解し、ＵＫ−Ｓｌｉｃａ（１０×２５０ｍｍ）（インタクト社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ヘキサン／イソプロパノール＝９８／２）にかけた。保持時間１８〜１９分の画分を分取し、濃縮乾固した。これをさらにヘキサン／エタノール（２０／８０；ｖ／ｖ）に溶解し、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−５（１０×２５０ｍｍ）（野村化学社製）を用いた高速液体クロマトグラフィー（アセトニトリル／イソプロパノール＝９９／１）にかけ、保持時間３２．５〜３３．５分の画分を分取した。この画分に含まれる化合物を定法に従いさらに分析すると、以下の構造式及び物理化学的特性を有する１４−デヒドロエルゴステロール（14-dehydroergosterol）が検出された。
【化２】
0005539981.tif 000004
【０１７０】
（１）分子量：３９４．３２２７５（高分解能ＡＰＣＩ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ法による観測値：ｍ／ｚ  ３９５．３３０５７（Ｍ＋Ｈ）＋）
（２）分子式：Ｃ２８Ｈ４２Ｏ（精密分子量：３９４．３２３５６５）
（３）溶剤に対する溶解性：水に不溶、エタノールに難溶、クロロホルムに易溶
（４）紫外部吸収スペクトル（ＭｅＣＮ）：３９１ｎｍ
（５）1H-NMR(CD3OD)ppm： 6.15 (1H, m), 5.75 (1H, m), 5.65 (1H, dd, J = 2.2, 5.9 Hz), 5.27 (1H, dd, J = 7.0, 15.1 Hz), 5.21 (1H, dd, J = 7.9, 15.1 Hz), 3.64 (1H, m), 2.51 (1H, ddd, J = 2.2, 5.1, 10.6 Hz), 2.30 (1H, m), 2.20 (1H, m), 2.20 (1H, dd, J = 3.2, 7.8 Hz), 2.06 (1H, m), 2.05 (1H, m), 1.94 (1H, m), 1.90 (1H, m), 1.87 (2H, m), 1.87 (1H, ddd, J = 3.2, 7.0, 7.3 Hz), 1.71 (1H, m), 1.59 (1H, m), 1.57 (1H, m), 1.45 (1H, m), 1.45 (1H, ddd, J = 3.2, 6.3, 6.5 Hz), 1.30 (1H, m), 1.05 (3H, d, J = 6.8 Hz ), 0.93 (3H, d, J = 7.3 Hz), 0.92 (3H, s,), 0.89 (3H, s), 0.85 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.83 (3H, d, J = 6.3 Hz). 
（６）13C-NMR(CD3OD)ppm： 149.2 (s), 143.0 (s), 135.4 (s), 132.2 (s), 132.0 (s), 120.5 (s), 120.4 (s), 117.4 (s), 70.4 (s), 58.1 (s), 46.3 (s), 45.4 (s), 42.8 (s), 41.0 (s), 39.0 (s), 38.9 (s), 37.8 (s), 37.0 (s), 36.0 (s), 33.1 (s), 32.0 (s), 21.1 (s), 19.9 (s), 19.7 (s), 19.6 (s), 17.6 (s), 16.8 (s), 14.5 (s). 【０１７１】
［実施例９］
１４−デヒドロエルゴステロールの制御性ＤＣ誘導活性
上記のように小麦フスマ麹発酵物から単離・精製され、構造決定された１４−デヒドロエルゴステロール（１４−ＤＨＥ）について制御性ＤＣ誘導活性を評価した。対照として、エルゴステロール関連物質であるエルゴステロール（和光純薬社製）、９（１１）−デヒドロエルゴステロール（９（１１）−ＤＨＥ）（シグマアルドリッチ社製）を用いた。また、過去にＤＣ活性化阻害について報告がある共役リノール酸（ＣＬＡ）として、ＣＬＡ（９Ｚ，１１Ｅ）及びＣＬＡ（１０Ｅ，１２Ｚ）（いずれもＣａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）、並びにリノール酸（和光純薬社製）についても測定を行なった（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７５（８）：４９９０−８，Ｏｃｔ  １５，２００５）。陰性対照として、化合物を投与しない試料（ｎｏｎｅ）、及びＬＰＳのみを投与した試料（ｃｔｒｌ）について測定を行なった。【０１７２】
＜実験方法＞
実施例２と同様にして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、Ｆｌｔ−３Ｌを用いて樹状細胞を誘導した。培養開始と同時に被験物質を１μＭ、５μＭ又は１０μＭで添加した。７日後に、ＬＰＳ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｏｓａ由来）（シグマアルドリッチ社製）を５ｎｇ／ｍＬで添加し、２４時間後に細胞を回収した。続いて、以下の細胞マーカーについて細胞を染色し、フローサイトメトリー解析に供した。抗体はすべてベクトンディッキンソン社製のものを用いた。ｍＤＣのゲートとしてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋を設定し、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ及びＩＣＯＳ−Ｌの発現レベルを測定した。また、培養上清中のＩＬ−１２ｐ４０及びＩＬ−１０をＥＬＩＳＡによって測定した。【０１７３】
＜結果＞
図１３に示すように、ＭＨＣクラスＩＩ分子であるＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ、並びに共刺激分子であるＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現レベルは、１４−ＤＨＥにより大きく低下した。対照物質のうちでは、９（１１）−ＤＨＥについて、最大濃度（１０μＭ）での添加によってこれらの分子の発現レベルの若干の低下が観察された。このことから、本発明の穀類植物由来材料から見出された１４−ＤＨＥは、ＬＰＳをはじめとする炎症刺激に対する不応答性を誘導する活性が極めて高いことが示され、デヒドロエルゴステロールのうちでも、二重結合の位置が活性において重要な役割を果たすことが示唆された。【０１７４】
ＤＣの免疫抑制作用の指標となるマーカーＩＣＯＳ−Ｌの発現レベルは、１４−ＤＨＥによってほとんど変化しなかった。結果として、ＤＣ上の免疫活性化マーカーと免疫抑制マーカーの比率は、１４−ＤＨＥの添加により飛躍的に抑制側に傾いた。【０１７５】
図１４に示すように、炎症性サイトカインであるＩＬ−１２ｐ４０の発現は、１４−ＤＨＥの添加により劇的に低下した。この場合も、対照物質のうち９（１１）−ＤＨＥで若干の低下が見られたが、１４−ＤＨＥによる低下と比較して効果は大きく劣っていた。さらに、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０の発現は、１４−ＤＨＥの添加により若干上昇した。このことは、１４−ＤＨＥが全体として炎症を抑制し、抗炎症作用を高めることを示唆している。【０１７６】
図１３及び１４の結果から分かるように、ＤＣ活性化阻害の報告がある共役リノール酸等は、用いた濃度では一連のＤＣの細胞表面マーカー及びサイトカインの発現には影響を及ぼさなかった。先行文献でこれらの物質の効果が示されたのは５０μＭで用いた場合であり、１４−ＤＨＥはこれらの物質と比較して低濃度で突出した効果を示すことが明らかとなった。【０１７７】
［実施例１０］
１４−ＤＨＥで処理したＤＣの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）誘導能の評価
＜実験方法＞
実施例５と同様にして、１４−ＤＨＥで処理したｍＤＣのＴｒｅｇ誘導活性を測定した。対照として、１４−ＤＨＥで処理していないＤＣを用いた同様の測定も行なった。【０１７８】
＜結果＞
（Ａ）抗原非特異的Ｔｒｅｇ誘導能（混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ））
図１５Ａに示すように、Ｔｒｅｇの生成は、１４−ＤＨＥで処理したＤＣとの共培養により、対照と比較して２倍程度増加した。【０１７９】
（Ｂ）抗原特異的Ｔｒｅｇ誘導能
図１５Ｂに示すように、Ｔｒｅｇの生成は、１４−ＤＨＥで処理したＤＣとの共培養により、対照と比較して２倍程度増加した。【０１８０】
以上の結果から、１４−ＤＨＥは、ＤＣの性質を変化させることにより、Ｔｒｅｇ生成能を高めることができることが示された。【０１８１】
［実施例１１］
１４−ＤＨＥ処理ＤＣにより誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞により産生されるサイトカインプロフィール
＜実験方法＞
（１）ＭＬＲ
上述の実施例と同様にしてＣ５７ＢＬ／６マウス大腿骨から骨髄細胞を調製し、Ｆｌｔ−３Ｌを用いて樹状細胞を誘導した。培養開始と同時に１４−ＤＨＥを３μＭで添加した。７日後に、サルモネラ・タイフォサ（Salmonella typhosa）由来ＬＰＳ（シグマアルドリッチ）を５ｎｇ／ｍＬで添加し、２４時間後に細胞を回収した。その後、ｍＤＣのゲートとしてＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１１ｂ＋を設定し、回収した細胞をソーティングした。次に、ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓より、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞アイソレーションキットＩＩ（マウス）（ミルテニーバイオテク）によりＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞を分離し、ｍＤＣ：ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を１：５として混合培養した。対照として、１４−ＤＨＥ非存在下で作製したｍＤＣを用いた。培養４日後の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法にてＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７を測定した。ＥＬＩＳＡキットとして、Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ−α  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡセット（ＢＤライフサイエンス）、Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−６  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１０  ＥＬＩＳＡセット（ＢＤライフサイエンス）、及びＭｏｕｓｅ  ＩＬ−１７  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をそれぞれ用いた。【０１８２】
（２）抗原特異的Ｔ細胞反応
ｍＤＣはＭＬＲの実験と同じ方法で調製した。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドでＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲがＯＶＡ３２３−３３９エピトープに特異的なＯＴ−ＩＩマウス（チャールズリバー）から調製した。ｍＤＣ：ＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を１：５として、０．１μＭのＯＶＡ３２３−３３９ペプチド存在下で混合培養した。培養４日目の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法にて、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７を測定した。【０１８３】
＜結果＞
（１）ＭＬＲ
図１６Ａに示すように、対照ｍＤＣの場合と比較して、１４−ＤＨＥ処理ｍＤＣを用いて増殖させたＣＤ４＋Ｔ細胞では、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６及びＩＬ−１７について有意な産生の低下が認められた。抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０については、統計学的な有意差は認められなかった。【０１８４】
（２）抗原特異的Ｔ細胞反応
図１６Ｂに示すように、対照ｍＤＣの場合と比較して、１４−ＤＨＥ処理ｍＤＣを用いて増殖させたＣＤ４＋Ｔ細胞では、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６について有意な産生の低下が認められた。ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７については統計学的な有意差は認められなかった。抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０については、有意な産生の増加が見られた。【０１８５】
（３）まとめ
以上の結果から、１４−ＤＨＥで処理したｍＤＣと共に増殖させたＣＤ４＋Ｔ細胞では、炎症性サイトカインの産生が低下することが示された。このことは、１４−ＤＨＥが炎症反応を抑制する作用を有することを示唆しており、この物質は抗炎症剤として有用であると考えられる。【０１８６】
［実施例１２］
１４−ＤＨＥ処理ＤＣのＣＤ８＋制御性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔｒｅｇ）分化誘導能の評価
一般には、Ｔｒｅｇという用語は、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞を指すことが多い。しかし、近年、ＣＤ４＋Ｔ細胞のみならず、ＣＤ８＋Ｔ細胞の中にもＦｏｓＰ３＋の制御性Ｔ細胞集団が存在しており（Ｃｏｓｍｉ，Ｌ．ら，Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０２（１２）：４１０７−１４）、それが強い抗炎症作用を示すこと（Ｓｉｎｇｈ，ＲＰ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１００７，１７８（１２）：７６４９−５７；Ｃｈａｐｕｔ，Ｎ．ら，Ｇｕｔ，２００９，５８（４）：５２０−９）が報告された。１４−ＤＨＥ処理ＤＣがＣＤ４＋制御性Ｔ細胞を増加させることは実施例１０の結果より明らかである。本実施例では、１４−ＤＨＥ処理ＤＣのＣＤ８＋制御性Ｔ細胞誘導作用について検討した。【０１８７】
＜実験方法＞
実施例１１と同様に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞より１４−ＤＨＥ及びＦｌｔ−３Ｌ存在下で誘導したＤＣから、ｍＤＣをソーティングした。次にＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓からＣＤ８α＋Ｔ細胞アイソレーションキット（マウス）（ミルテニーバイオテク）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を分離した。ｍＤＣ：ＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を１：１０として細胞を混合した後、０．５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βを含む培地にて５日間培養した。５日後に細胞を回収し、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合をフローサイトメーターを用いて求めた。フローサイトメトリーに先立って、ＣＤ８α−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ２５−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ３ｅ−ＰｅｒＣＰを用いて細胞染色を行なった後、ＦｏｘＰ３染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞膜透過処理を行ない、続いてＦｏｘＰ３−ＰＥ染色を行なった。【０１８８】
＜結果＞
図１７に示すように、１４−ＤＨＥ処理ｍＤＣは、対照ｍＤＣと比較して３倍以上のＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞を誘導した。【０１８９】
以上の結果から、１４−ＤＨＥは、従来提唱されているＣＤ４＋Ｔｒｅｇのみならず、ＣＤ８＋Ｔｒｅｇについても誘導効果を有することが示された。【０１９０】
［実施例１３］
１４−ＤＨＥのＣＤ４＋ナイーブＴ細胞に対する制御性Ｔ細胞誘導効果
実施例１０及び１２から、１４−ＤＨＥはＤＣの形質を変化させることにより間接的に制御性Ｔ細胞誘導作用を発揮することが示された。本実施例では、１４−ＤＨＥがＴ細胞に直接的に作用して制御性Ｔ細胞を誘導できるか否かを明らかにするために、１４−ＤＨＥをナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に直接作用させ、ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の誘導を調べた。【０１９１】
＜実験方法＞
ＢＡＬＢ／ｃマウス脾臓由来の細胞から、ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞アイソレーションキットＩＩ（マウス）（ミルテニーバイオテク）を用いて、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を５×１０５細胞／ｍＬの密度で４８穴プレート（１ウェルあたり２．５×１０５細胞）に播種し、１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体及び０．２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８抗体を添加した。このとき、２種類の培地（ＴＧＦ−βを添加したもの及び未添加のもの）を用いた。１４−ＤＨＥを０、５０、１００、５００及び１０００ｎＭで添加した。５日後に細胞を回収し、ＣＤ４＋Ｔ細胞中のＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞の割合を、フローサイトメーターを用いて求めた。フローサイトメトリーに先立って、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ２５−ＦＩＴＣ及びＣＤ３ｅ―ＰｅｒＣＰを用いて細胞表面染色を行なった後、ＦｏｘＰ３染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞膜透過処理を行ない、続いてＦｏｘＰ３−ＰＥ染色を行なった。【０１９２】
＜結果＞
図１８に示すように、ＴＧＦ−β非存在下では１４−ＤＨＥ添加によるＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞比率の変化は認められなかった。ＴＧＦ−β存在下では、５０ｎＭの最低濃度で、未添加の場合と比較して５倍以上のＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞比率の増加が認められた。【０１９３】
以上の結果から、１４−ＤＨＥはＤＣに作用してその形質を変化させるだけでなく、Ｔ細胞に対して直接的に作用して、Ｔｒｅｇを誘導し得ることが明らかになった。その有効濃度は、ＤＣの場合（１μＭ）と比較して２０倍以上低い。このことは、Ｔ細胞の１４−ＤＨＥへの感受性が、ＤＣよりも高いことを示し、また、ヒトに投与する場合、用量を大きく低減させることができることを示唆している。【０１９４】
［実施例１４］
１４−ＤＨＥのＤＣ活性化抑制効果の作用タイミング及び効果持続時間
１４−ＤＨＥが制御性ＤＣ誘導活性を有することを示した実施例９の実験では、１４−ＤＨＥはＤＣ分化開始と同時に添加し、ＬＰＳ誘導の最終ステップまで存在していたため、１４−ＤＨＥがＤＣ分化のどのステージに作用するのか、その効果はどの位の時間、持続するのか不明であった。そこで、本実施例では、以下の点について検討する：（１）ＤＣ分化誘導開始時から１４−ＤＨＥを添加する場合、効果を得るのに必要な作用時間はどの程度であるか、（２）ＤＣ分化開始後に１４−ＤＨＥを添加しても、効果は得られるのか、及び（３）効果の持続時間の長さはどの程度か。【０１９５】
＜実験方法＞
上記の実施例と同様に、Ｃ５７ＢＬ／６マウス骨髄細胞を調製し、Ｆｌｔ−３を用いてＤＣを誘導した。１４−ＤＨＥの添加濃度は全ての場合で３μＭであり、培養系における薬剤の存在時間は培地交換によって制御した。５ｎｇ／ｍＬのＬＰＳで炎症を誘導し、フローサイトメーターを用いてＣＤ８６の発現量を測定することにより制御性ＤＣの形質を判定した。この際、１４−ＤＨＥを添加せずＬＰＳ処理した細胞を対照として用いた。１４−ＤＨＥ処理細胞についてのＣＤ８６の蛍光強度中央値（Ｍｅｄｉａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）を、未処理細胞のＭＦＩで除した値が、１以上：効果なし（スコア：−）；０．７〜０．９９：弱い効果あり（スコア：＋）；０．４〜０．６９：中程度の効果あり（スコア：＋＋）；０．４以下：強い効果あり（スコア：＋＋＋）と判定した。【０１９６】
＜結果＞
結果を図１９に示す。図１９Ａ１〜８から、ＤＣ分化開始時から１４−ＤＨＥを添加した場合、強い効果を得るには分化開始から７日間添加することが必要であることが示された。５又は６日間の添加でも効果は見られるが、大きく低下した。【０１９７】
図１９Ａ９〜１１から、ＤＣ分化終了時であるＤａｙ７から１４−ＤＨＥを添加した場合でも、Ｄａｙ０から添加した場合と同程度の強い効果が得られることが明らかになった。また、ＬＰＳ添加時に１４−ＤＨＥが存在しない場合、効果の低下が見られた。このことは、１４−ＤＨＥの作用が炎症誘導時に生じている可能性を示唆する。【０１９８】
図１９Ｂでは、１４−ＤＨＥの効果の持続時間について検討した。１４−ＤＨＥをＤａｙ０から添加した場合、及びＤａｙ７から添加した場合、いずれにおいても７２時間以内に効果が大きく低下することが示された。【０１９９】
以上の結果から、（１）１４−ＤＨＥの作用時間は好ましくは７日間以上であること、（２）１４−ＤＨＥは分化後のＤＣに対して炎症性反応を抑制すること、及び、炎症刺激時に存在することが重要であること、並びに（３）効果の持続時間は７２時間であることが示された。【０２００】
これらのことから、１４−ＤＨＥをヒトに投与する場合、１４−ＤＨＥは、既に体内に存在しているＤＣに作用して炎症刺激を減弱させる抗炎症剤として機能することが示唆された。【０２０１】
［実施例１５］
多発性硬化症モデルに対する１４−ＤＨＥの効果
上記の実施例から、１４−ＤＨＥがｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗炎症作用を有することが証明された。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症作用について検証するため、自己免疫疾患モデルとしてしばしば用いられるマウス多発性硬化症モデル（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｃ；ＥＡＥ）に１４−ＤＨＥを投与した。【０２０２】
＜実験方法＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウス、雌性８週齢を１群５匹として以下の２群に分けた：
（１）ビヒクル群
（２）１４−ＤＨＥ  １０μｇ／匹
Ｄａｙ０に、抗原であるミエリン稀突起膠細胞糖タンパク質３５−５５ペプチド（ＭＯＧ３５−５５、オペロン）を完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ）と混合し、２００μｇ／匹で皮内投与した。その後、Ｄａｙ１及びＤａｙ３に百日咳毒素（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ、和光純薬工業）を２００ｎｇ／匹で腹腔内投与して、多発性硬化症の発症を誘発した。Ｄａｙ７〜１８に、１４−ＤＨＥを１０μｇ／匹で１日１回、腹腔内投与した。ビヒクル群には、１４−ＤＨＥの溶媒である１０％エタノール（和光純薬工業）／１０％クレモホール（和光純薬工業）／８０％ＰＢＳ（Ｔａｋａｒａ）を投与した。【０２０３】
実験期間中、Ｄａｙ０からＤａｙ２０まで、疾患スコアを以下の基準で判定した：
スコア０：正常
スコア１：尻尾が自由に動かない
スコア２：正常に歩行ができない
スコア３：片側後肢の麻痺
スコア４：両後肢の麻痺
スコア５：前後肢の麻痺
スコア６：死亡
体内で炎症が起こっていると考えられるＤａｙ１１に、生化学データ取得のためにマウスを解剖した。【０２０４】
（１）脾臓細胞を調製し、２μＭ  ＭＯＧ再刺激あり／なしで７日間培養した。培養上清を回収し、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−α産生量をＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。【０２０５】
（２）脾臓細胞及び所属リンパ節（腋化、鼠頸部）細胞を調製し、２μＭ  ＭＯＧ再刺激ありで３日間培養した。１μＬ／ｍＬのＧｏｌｇｉ  ｐｌｕｇ（ベクトンディッキンソン）を添加し、さらに４．５時間インキュベートした。細胞を回収し、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７で細胞表面染色を行なった。次に、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍキット（ベクトンディッキンソン）を用いて細胞膜透過処理を行ない、ＴＮＦ−α−ＦＩＴＣ、ＩＬ−１７−ＰＥ、ＩＬ−１０−ＡＰＣ、ＩＦＮ−γ−ＰＥ−Ｃｙ７抗体で細胞内サイトカイン染色を行なって、ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン陽性率をＦＡＣＳを用いて測定した。【０２０６】
（３）所属リンパ節細胞及び脾臓細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ＣＦＳＥ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて染色した。染色した細胞を１×１０６細胞／ｍＬで播種し、２μＭ  ＭＯＧ刺激ありで３日間培養した。細胞を回収後、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４−ＡＰＣで染色し、ＦＡＣＳ解析に供した。細胞増殖は、全体のうちのＣＦＳＥ蛍光強度が低下した細胞の割合として評価した。【０２０７】
（４）所属リンパ節細胞及び脾臓細胞中のｍＤＣの活性化を評価するために、細胞をＦＩＴＣ−Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＰＥ−ＣＤ８６、ＰｅｒＣＰ−Ｂ２２０、ＡＰＣ−ＣＤ８０、ＡＰＣ−Ｃｙ７−ＣＤ１１ｂ、ＰＥ−Ｃｙ７−ＣＤ１１ｃで染色した。ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋Ｂ２２０−細胞をｍＤＣとして細胞をゲートし、活性化マーカーとしてＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ（ＭＨＣクラスＩＩ）、ＣＤ８６及びＣＤ８０を測定した。【０２０８】
＜結果＞
結果を図２０に示す。図２０Ａにおいて、１４−ＤＨＥ投与群では、累積疾患スコア、最大スコア、発症率のいずれにおいても低下が示され、発症の遅延も観察された。【０２０９】
図２０Ｂは、Ｄａｙ１１時点での所属リンパ節細胞及び脾臓細胞からの炎症性サイトカインの産生量を示す。１４−ＤＨＥ投与群では、所属リンパ節細胞でＭＯＧ抗原再刺激の有無にかかわらず炎症性サイトカインＴＮＦ−αの産生が有意に低下し、ＭＯＧ抗原で再刺激された脾臓細胞からのＴＮＦ−αの産生も低下した。ＩＦＮ−γについては、所属リンパ節細胞でＭＯＧ抗原再刺激なしの場合に有意な低下が見られ、ＭＯＧ抗原再刺激ありの場合に両者の細胞で低下傾向が見られた。【０２１０】
図２０Ｃは、所属リンパ節細胞及び脾臓細胞中のＣＤ４＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す。ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γについて、リンパ節細胞及び脾臓細胞の両者で１４−ＤＨＥ投与群での産生の有意な低下が見られた。また、ＩＬ−１７について、脾臓細胞で１４−ＤＨＥ投与により産生の有意な低下が観察された。【０２１１】
図２０Ｄは、所属リンパ節細胞及び脾臓細胞でのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖率を示す。脾臓細胞ではＭＯＧ抗原再刺激の有無にかかわらず１４−ＤＨＥ投与群で有意な低下が見られ、リンパ節細胞でも低下傾向が観察された。このことから、１４−ＤＨＥ投与によって炎症性Ｔ細胞の増殖が抑制されていることが示された。【０２１２】
図２０Ｅは、Ｄａｙ１１での解剖の時点での、リンパ節及び脊髄における抗原提示細胞であるｍＤＣの活性化を示す。リンパ節においては、ＤＣ活性化の指標であるＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ（ＭＨＣクラスＩＩ）及びＣＤ８６の低下傾向が見られ、ＣＤ８０については有意な低下が観察された。脊髄では、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅの有意な低下が見られた。このことから、１４−ＤＨＥによる炎症性Ｔ細胞増殖抑制は、抗原提示細胞の不活性化を介したものであると推測することができる。【０２１３】
以上の結果から、１４−ＤＨＥは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、多発性硬化症をはじめとする自己免疫疾患に対する抑制効果を有することが示された。【０２１４】
［実施例１６］
１４−ＤＨＥのヒト制御性ＤＣ誘導活性
上記の実施例により、１４−ＤＨＥは、マウスＤＣに対して、細胞表面での成熟化因子の発現低下をもたらし得ることが明らかとなった。本実施例では、ヒトＤＣに対する１４−ＤＨＥの作用を評価した。【０２１５】
＜実験方法＞
ヒト末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥヘルスケア）を用いた密度勾配遠心により単核球を調製した。これを抗ヒトＣＤ１４  ＭＡＣＳビーズ（ミルテニーバイオテク）でポジティブセレクションすることにより、ＣＤ１４陽性細胞を取得した。ＣＤ１４陽性細胞を、組み換え型ヒトＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ、Ｌｅｕｋｉｎｅ、Ｂｅｒｌｅｘ）及び組み換えヒトＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノール（和光純薬工業）、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（シグマアルドリッチ）中で培養した。培養中は、２日に一度、培地交換を行なった。培養７日目に、１μＭ、３μＭ又は１０μＭの１４−ＤＨＥを添加した。対照には、関連物質である１０μＭのエルゴステロールを添加した。また、陰性対照には、１４−ＤＨＥの溶媒である１％エタノールを添加した。培養８日目に細胞を回収し、細胞数をカウントし、上記培地に３×１０５細胞／ｍＬの密度で懸濁した。細胞懸濁液に、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ及び１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γ（いずれもシグマアルドリッチ）、又はサイトカインカクテル（１μｇ／ｍＬ  ＰＧＥ２（シグマアルドリッチ）、１０ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−α、２μｇ／ｍＬ  ＩＬ−６及び１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１β（いずれもＢＤバイオサイエンス））を添加して２４時間培養した。培養後、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８０について細胞を染色した。抗体は全てＢＤバイオサイエンス社製のものを用いた。ＦＳＣ及びＳＳＣによりＤＣのゲートを設定し、これらの細胞表面マーカーの発現レベルを解析した。【０２１６】
＜結果＞
図２１に示すように、ヒトＤＣ上のＭＨＣクラスＩＩ分子であるＨＬＡ−ＤＲ並びに共刺激分子であるＣＤ８０及びＣＤ８６の細胞表面発現レベルは、１４−ＤＨＥ処理により低下した。対照であるエルゴステロールは、これらの分子の細胞表面発現レベルに影響を及ぼさなかった。【０２１７】
以上の結果から、１４−ＤＨＥは、ヒト細胞においても、ＤＣ上の成熟化因子の細胞表面発現を抑制する作用を有していることが明らかになった。【０２１８】
１４−ＤＨＥを用いたこれらの実験の結果は、上記実施例において証明された穀類植物由来材料発酵物処理物の免疫調節作用が、１４−ＤＨＥによりもたらされたものであることを強く支持しており、また１４−ＤＨＥは新規な免疫調節剤として利用できるものであることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０２１９】
本発明によれば、炎症反応の予防及び改善に用いることができる新規な食品由来材料が提供される。したがって、本発明は、健康科学分野、医療分野及び食品分野において有用性を有する。【０２２０】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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