(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子のみを含み、且つ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与されたイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項２】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、それぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項３】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１又は請求項２記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項４】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１又は請求項２記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項５】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びスクロース加水分解酵素をコードする遺伝子がプラスミドによって導入され、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、宿主大腸菌内のゲノム遺伝子により得られたものである請求項１又は請求項２記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項６】
前記ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びチオラーゼをコードする遺伝子の発現のためのプロモーターが、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーターの少なくとも一方である請求項５記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項７】
前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、すべてクロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである請求項１又は請求項２記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
【請求項８】
請求項１〜請求項７のいずれか１項記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソプロピルアルコール生産細菌及びイソプロピルアルコール生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロピレンは、ポリプロピレンなどの合成樹脂や石油化学製品の重要な基礎原料であり、自動車用バンパーや食品容器、フィルム、医療機器などに幅広く使われている。
植物由来原料から製造されたイソプロピルアルコールは、脱水工程を経てプロピレンに変換できることから、カーボンニュートラルなプロピレンの原料として有望である。京都議定書によって２００８年から２０１２年の間に先進国全体で二酸化炭素排出量を１９９０年比で５％削減することが義務付けられている現在、カーボンニュートラルなプロピレンはその汎用性から地球環境上極めて重要である。【０００３】
植物由来原料を資化してイソプロピルアルコールを生産する細菌は既に知られている。例えば国際公開２００９／００８３７７号には、グルコースを原料としてイソプロピルアルコールを高生産するように改変された細菌が開示されており、イソプロピルアルコールの工業生産用生体触媒として優れていると記載されている。
大腸菌ではスクロースを資化できないことが知られているが、植物由来材料の中でも安価なスクロースを利用することができれば工業的に有利である。【０００４】
従来の知見によれば微生物がスクロースを資化するメカニズムは、スクロースＰＴＳ（Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase System）とスクロース非ＰＴＳの２つに大別される（例えば、特開２００１−３４６５７８号公報）。スクロース非ＰＴＳはｃｓｃＢ（スクロースの取り込みを行う）、ｃｓｃＡ（微生物内部でスクロースの分解を行う）、ｃｓｃＫ（フルクトースのリン酸化を行う）及びｃｓｃＲ（ｃｓｃＢ，Ａ，Ｋの発現を制御する）の４つの因子から構成されていることが知られている。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｈｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．１８９１−１８９６（２００５）には、これら４つの因子の遺伝子をＤ−乳酸生産大腸菌にプラスミドを用いて導入し、スクロースからＤ−乳酸を生産したことが記載されている。
また、スクロースＰＴＳはｓｃｒＡ（スクロースの取り込みを行う）、ｓｃｒＹ（スクロースのリン酸化を行う）、ｓｃｒＢ（微生物内部でスクロースの分解を行う）、ｓｃｒＲ（ｓｃｒＡ，Ｙ，Ｂの発現を制御する）及びｓｃｒＫ（フルクトースのリン酸化を行う）の５つの因子から構成されていることが知られている。【０００５】
一般に、菌が保有しない機能を微生物に導入する際には、その機能を発現する遺伝子の導入が検討される。スクロース資化能の場合、上記の各因子のＤＮＡは９００〜１５００ｂｐのサイズがあり、またイソプロピルアルコールを高生産させるために必要な４種の酵素（チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ）の遺伝子発現のために必要なＤＮＡサイズは、約４８００ｂｐである。即ち、スクロースを資化する能力とＩＰＡを生産する能力の両方を大腸菌に付与しようとすると、およそ９３００ｂｐのサイズのＤＮＡの導入が必要となる。【０００６】
しかしながら、これらを同時に大腸菌に導入することは、遺伝子導入に用いられるプラスミドＤＮＡサイズの上限を超えることから非常に困難である。プラスミドベクターを２種類用い、各々のプラスミドＤＮＡサイズを１００００ｂｐ以下に抑えたとしても、通常、２種類のプラスミドを大腸菌に導入した場合、増殖を繰り返すうちにどちらか一方又は両方のプラスミドが脱落することが多い。これを避けるためには選択マーカーに対応した高価な抗生物質に大腸菌を常に暴露させておく必要があり、工業生産には向かない。
よって、スクロースを資化する能力とイソプロピルアルコールを高生産する能力を同時に大腸菌に付与することは困難であった。【０００７】
一方、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．１８−４２２（１９９９）は、大腸菌にスクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）のみを導入することでスクロースを原料として大腸菌が増殖できるようになったことを開示している。しかしながら、該論文では同時に、ｃｓｃＡ遺伝子を遺伝子組み換え技術によって大量発現させたときｃｓｃＡのほとんど全てが細胞内に存在することも示しており、ｃｓｃＡ（インベルターゼ）は細胞外ではなく細胞内において機能し、ｃｓｃＡが細胞外でスクロースを分解していると予想することはできない。【０００８】
スクロースを資化できない大腸菌を用いてスクロースから物質生産をさせた例としては、スクロースを原料としたトリプトファンの生産を挙げることができる（例えば、特開２００１−３４６５７８号公報）。しかしながら、この例では、スクロースからアミノ酸を生産する能力を大腸菌に与えるためには、少なくともｃｓｃＡとｃｓｃＢとｃｓｃＫの遺伝子群を導入することが必要であると示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、スクロースを資化できない大腸菌にスクロースを資化する能力とイソプロピルアルコールを高生産する能力を同時に与えることは、導入すべきＤＮＡのサイズが大きすぎるため非常に困難であった。
本発明は、安価で工業的に利用価値の高いスクロースからイソプロピルアルコールを効率よく生産するために有用なイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下のイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法を提供する。【００１１】
〔１〕  スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちスクロース加水分解酵素遺伝子のみを含み、且つ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与されたイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔２〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、それぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔１〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔３〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性が、クロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア属細菌由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔１〕又は〔２〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔４〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものであり、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、エシェリヒア・コリ由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔１〕又は〔２〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔５〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びスクロース加水分解酵素をコードする遺伝子がプラスミドによって導入され、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、宿主大腸菌内のゲノム遺伝子により得られたものである〔１〕又は〔２〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔６〕  前記ＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子及びチオラーゼをコードする遺伝子の発現のためのプロモーターが、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼプロモーターの少なくとも一方である〔５〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔７〕  前記アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、すべてクロストリジウム属細菌由来の各酵素をコードする遺伝子の導入により得られたものである〔１〕又は〔２〕記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌。
〔８〕  〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のイソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】エシェリヒア・コリＢ株を、グルコース及びフルクトースを糖源として１０時間培養したときの培養上清中の糖の減少量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群に属するスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含むと共にイソプロピルアルコール生産系が付与又は強化されたイソプロピルアルコール生産大腸菌である。
本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いて、スクロースを含む植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産することを含むイソプロピルアルコール生産方法である。
【００１４】
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロースを資化するためにスクロース非ＰＴＳ遺伝子群を構成するスクロース加水分解酵素遺伝子を少なくとも含むと共にイソプロピルアルコール生産系を備えているため、スクロースを資化できない大腸菌において、スクロースを資化する能力とイソプロピルアルコールを生産する能力が同時に発揮され、スクロースからイソプロピルアルコールを効率よく生産することができる。スクロース資化能を持たない大腸菌においてスクロース非ＰＴＳ遺伝子群を導入し、スクロースを炭素源としてイソプロピルアルコールを生産させた例はこれまで全く報告されていない。
【００１５】
本発明は、非ＰＴＳ遺伝子群を構成する遺伝子群に属する少なくともスクロース加水分解酵素遺伝子をイソプロピルアルコール生産大腸菌に導入することによって、イソプロピルアルコールを高生産する大腸菌でも、スクロースが高効率に資化されることを見出したものである。この結果、スクロースを資化する能力を付与するために導入するＤＮＡサイズを大幅に減縮することができ、１つのプラスミドベクターにスクロース資化能力を付与するＤＮＡとイソプロピルアルコール生産能力を付与するＤＮＡを同時に連結させることが可能となった。これによって、スクロースを資化できない大腸菌に、スクロースを資化する能力とイソプロピルアルコールを生産する能力を同時に付与することができ、サトウキビや甜菜に由来し、安価で大量供給可能なスクロースから、効率よくイソプロピルアルコールを得ることができる。
【００１６】
特に、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌は、スクロースの分解産物であるグルコースとフルクトースをほぼ同時に資化して、イソプロピルアルコールを生産することができるのでより効率的である。
一般に、大腸菌では通常グルコースの取り込みがフルクトースよりも優先され、グルコースの存在下ではフルクトースは充分に代謝されないことが知られている。このため、グルコースによる代謝抑制（カタボライトリプレッション）の影響を受けずに、効率よくイソプロピルアルコールの生産を行うことができたことは、驚くべきことである。
なお、本発明において「宿主」とは、ひとつ以上の遺伝子の菌体外からの導入を受けた結果、本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌となる当該大腸菌を意味する。
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
以下、本発明について説明する。
【００１７】
本発明におけるスクロース非ＰＴＳ遺伝子群とは、微生物のスクロース資化経路のうち非ＰＴＳ系に関与する４つの遺伝子群のことをいう。詳しくは、リプレッサー蛋白質（ｃｓｃＲ）、スクロース加水分解酵素（ｃｓｃＡ）、フルクトキナーゼ（ｃｓｃＫ）、スクロース透過酵素（ｃｓｃＢ）で構成される遺伝子群である。本発明では、このうちｃｓｃＡを少なくとも含む１種以上であればよく、例えば、ｃｓｃＡのみ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＫの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＢの組み合わせ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲの組み合わせ、ｃｓｃＡ、ｃｓｃＲ及びｃｓｃＫの組み合わせ、ｃｓｃＡ、ｃｓｃＲ及びｃｓｃＢの組み合わせ等が挙げられる。なかでも、イソプロピルアルコールを更に効率よく生産するという観点から、ｃｓｃＡをコードする遺伝子のみを有し、その他の遺伝子を含まないことが好ましい。
【００１８】
本発明におけるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）とは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号３．２．１．２６に分類され、スクロースからＤ−グルコースとＤ−フルクトースを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
この酵素は、Ｋ１２株及びＢ株等の大腸菌には本来保有されていない酵素であり、プロトン共輸送体、インベルターゼ、フルクトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含む非ＰＴＳ代謝経路の酵素の１つである（Canadian Journal of Microbiology, (1991) vol.45, pp418-422参照）。本発明においてこのＣｓｃＡを付与することにより、特にｃｓｃＡのみを付与することにより、菌体外におけるスクロースを細胞膜上でグルコース及びフルクトースに分解して細胞外へ放出し、グルコースＰＴＳ及びフルクトースＰＴＳを介して細胞質内にリン酸化して取り込む。この結果、フルクトースを細菌におけるフルクトース代謝系へ供給して、解糖系を利用した資化を可能にすることができる。
【００１９】
本発明の宿主細菌に導入されるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるスクロース加水分解酵素（インベルターゼ、ＣｓｃＡ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。またｃｓｃＡには、ｃｓｃＡを菌体のペリプラズムへ移行させるためのシグナル配列が付加されていることが好ましい。
【００２０】
本発明の宿主細菌に導入されるリプレッサー蛋白質（ＣｓｃＲ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるリプレッサータンパク質（ＣｓｃＲ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２１】
本発明の宿主細菌に導入されるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られるフルクトキナーゼ（ＣｓｃＫ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２２】
本発明の宿主細菌に導入される、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）の遺伝子としては、この酵素を保有する生物から得られる、スクロース透過酵素（ＣｓｃＢ）をコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ、又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、アーウィニア属菌（Erwinia）、ポルテウス属菌（Proteus）、ビブリオ属菌（Vibrio）、アグロバクテリウム属菌（Agrobacterium）、リヒゾビウム属菌（Rhizobium）、スタフィロコッカス属菌（Staphylococcus），ビフィドバクテリウム属菌（Bifidobacterium）、エシェリヒア属菌（Escherichia）に由来するものを挙げることができ、例えばエシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、エシェリヒア・コリＯ１５７株由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００２３】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌とは、遺伝子組み換えにより導入又は改変されたイソプロピルアルコール生産能力を保有する大腸菌をいう。これにより、上記のＣｓｃＡ活性と組み合わせて、本来はスクロース資化能を有しない大腸菌であっても、スクロースからイソプロピルアルコールを効果的に生産することができる。
【００２４】
なお、本発明における「遺伝子組み換えにより」との文言は、生来の遺伝子の塩基配列に対する別のＤＮＡの挿入、あるいは遺伝子のある部分の置換、欠失又はこれらの組み合わせによって塩基配列上の変更が生じているものであれば全て包含し、例えば、突然変異が生じた結果得られたものであってもよい。
【００２５】
本発明においてスクロース資化とは、スクロースを、そのまま、低分子化または高分子化して、好ましくは低分子化して、生体内に取り入れる能力、あるいは代謝的に別物質に変換する能力をいう。また、本発明において、資化とはスクロースをより低分子化する分解を含む。詳しくは、スクロースをＤ−グルコースとＤ−フルクトースに分解することを含む。
【００２６】
本発明におけるイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌にイソプロピルアルコールを生産させるものであればいずれの系であってもよい。
本発明において付与又は強化されるイソプロピルアルコール生産系とは、遺伝子組み換えにより導入又は改変されたイソプロピルアルコール生産能力を発揮させるための構造をいう。このようなイソプロピルアルコール生産系は、対象となる大腸菌における本来のイソプロピルアルコール生産量を増加させるものであればいずれのものであってもよい。好ましくは、イソプロピルアルコール生産活性に関与する酵素活性の不活性化、低減化若しくは増強又はこれらの組み合わせを挙げることができる。これにより、上記のＣｓｃＡ活性と組み合わせて、本来はスクロース資化能を有しない大腸菌であっても、スクロースからイソプロピルアルコールを効果的に生産することができる。
【００２７】
好ましくは、イソプロピルアルコールの生産に関与する増強された酵素活性の付与を挙げることができる。更に好ましくは、チオラーゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセト酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの酵素活性の増強を挙げることができる。即ち、本発明におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌は、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性の４種類の酵素活性が付与されていることが好ましい。
【００２８】
本発明における活性の「付与」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものを含む。
【００２９】
本発明におけるアセト酢酸デカルボキシラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号４．１．１．４に分類され、アセト酢酸からアセトンを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、バチルス・ポリミクサ（Bacillus polymyxa）等のバチルス属細菌由来のものが挙げられる。
【００３０】
本発明の宿主細菌に導入されるアセト酢酸デカルボキシラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるアセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はバチルス属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・アセトブチリカム、バチルス・ポリミクサ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３１】
本発明におけるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号１．１．１．８０に分類され、アセトンからイソプロピルアルコールを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌由来のものが挙げられる。
【００３２】
本発明の宿主細菌に導入されるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム属細菌に由来するものを挙げることができ、例えばクロストリジウム・ベイジェリンキ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３３】
本発明におけるＣｏＡトランスフェラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．８．３．８に分類され、アセトアセチルＣｏＡからアセト酢酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス（Roseburia intestinalis）等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ（Faecalibacterium prausnitzii）等ファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス（Coprococcus）属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli：大腸菌）等エシェリヒア属細菌由来のものが挙げられる。
【００３４】
本発明の宿主細菌に導入されるＣｏＡトランスフェラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム等のクロストリジウム属細菌、ローセブリア・インテスチナリス等のローセブリア属細菌、ファカリバクテリウム・プラウセンツ等のファカリバクテリウム属細菌、コプロコッカス属細菌、トリパノソーマ・ブルセイ等のトリパノソーマ、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３５】
本発明におけるチオラーゼとは、国際生化学連合（Ｉ．Ｕ．Ｂ．）酵素委員会報告に準拠した酵素番号２．３．１．９に分類され、アセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
そのようなものとしては、例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種（Halobacterium sp.）細菌、ズーグロア・ラミゲラ（Zoogloearamigera）等のズーグロア属細菌、リゾビウム種（Rhizobiumsp.）細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス（Caulobacter crescentus）等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス（Streptomyces collinus）等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス（Enterococcus faecalis）等のエンテロコッカス属細菌由来のものが挙げられる。
【００３６】
本発明の宿主細菌に導入されるチオラーゼの遺伝子としては、上述した各由来生物から得られるチオラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又はその公知の塩基配列に基づいて合成された合成ＤＮＡ配列を利用することができる。好適なものとしては、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジェリンキ等のクロストリジウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ハロバクテリウム種の細菌、ズーグロア・ラミゲラ等のズーグロア属細菌、リゾビウム種の細菌、ブラディリゾビウム・ジャポニカム等のブラディリゾビウム属細菌、カンジダ・トロピカリス等のカンジダ属細菌、カウロバクター・クレセンタス等のカウロバクター属細菌、ストレプトマイセス・コリナス等のストレプトマイセス属細菌、エンテロコッカス・ファカリス等のエンテロコッカス属細菌由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡが例示される。より好適なものとしては、クロストリジウム属細菌又はエシェリヒア属細菌に由来するものを挙げることができ、特に好ましくは、クロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡである。
【００３７】
このうち、上記４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム属細菌、バチルス属細菌及びエシェリヒア属細菌からなる群より選択された少なくとも１種由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、なかでも、アセト酢酸デカルボキシラーゼ及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼがクロストリジウム属細菌由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア属細菌由来である場合と、これら４種類の酵素がいずれもクロストリジム属細菌由来である場合が更に好ましい。
【００３８】
なかでも本発明にかかる４種類の酵素はそれぞれ、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・ベイジュリンキ又はエシェリヒア・コリのいずれか由来のものであることが酵素活性の観点から好ましく、アセト酢酸デカルボキシラーゼがクロストリジウム・アセトブチリカム由来の酵素であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ及びチオラーゼが、それぞれクロストリジウム・アセトブチリカム又はエシェリヒア・コリ由来の酵素であり、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが、クロストリジウム・ベイジェリンキ由来の酵素であることがより好ましく、上記４種類の酵素は、酵素活性の観点から、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性がクロストリジウム・アセトブチリカム由来であり、前記イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性がクロストリジウム・ベイジェリンキ由来であり、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来であることが特に好ましい。
【００３９】
また、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性がエシェリヒア・コリ由来である場合には、前記アセト酢酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びスクロース加水分解酵素をコードする遺伝子がプラスミドによって導入され、前記ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、宿主大腸菌内のゲノム遺伝子により得られたものであることが、イソプロピルアルコール生産能の観点から好ましい。
【００４０】
本発明においてイソプロピルアルコールの生産に関与する酵素活性が増強され、イソプロピルアルコールを生産する大腸菌の例として、ＷＯ２００９／００８３７７号に記載のｐＩＰＡ/Ｂ株又はｐＩａａａ/Ｂ株を例示できる。
【００４１】
本発明における遺伝子のプロモーターとは、上記いずれかの遺伝子の発現を制御可能なものであればよいが、恒常的に微生物内で機能する強力なプロモーターで、かつグルコース存在下でも発現の抑制を受けにくいプロモーターで、具体的にはグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーターやセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼのプロモーターが例示できる。
本発明におけるプロモーターとはシグマ因子を有するＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する部位を意味する。例えばエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーターはＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、塩基番号３９７−４４０に記されている。
【００４２】
大腸菌由来のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ及びａｔｏＡ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）は、ａｔｏＤ、ａｔｏＡ、ａｔｏＢの順番で大腸菌ゲノム上でオペロンを形成しているため（Journal of Baceteriology Vol.169 pp 42-52 Lauren Sallus Jenkinsら）、ａｔｏＤのプロモーターを改変することによって、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子とチオラーゼ遺伝子の発現を同時に制御することが可能である。
このことから、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性が、宿主大腸菌のゲノム遺伝子より得られたものである場合、充分なイソプロピルアルコール生産能力を獲得する観点から、両酵素遺伝子の発現を担うプロモーターを他のプロモーターと置換する等によって両酵素遺伝子の発現を強化することが好ましい。ＣｏＡトランスフェラーゼ活性及びチオラーゼ活性を強化するために用いられるプロモーターとしては、前述のエシェリヒア・コリ由来のＧＡＰＤＨプロモーター等を挙げることができる。
【００４３】
本発明におけるこれらの酵素の活性は、菌体外から菌体内へ導入されたもの又は、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものとすることができる。
【００４４】
酵素活性の導入は、例えばそれら４種類の酵素をコードする遺伝子を遺伝子組換え技術を用いて宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することにより行うことができる。このとき、導入される酵素遺伝子は、宿主細胞に対して同種又は異種のいずれであってもよい。菌体外から菌体内へ遺伝子を導入する際に必要なゲノムＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設計、合成等の方法は、当業者によく知られている通常の方法で行うことができる。これらの方法は、Sambrook, J., et.al., ”Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)などに記載されている。
【００４５】
本発明における能力の「付与」又は「強化」とは、酵素をコードする遺伝子を宿主細菌の菌体外から菌体内に導入することの他に、宿主細菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化すること又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させたものを含む。
【００４６】
本発明において酵素の活性を付与した大腸菌とは、菌体外から菌体内へ何らかの方法によって該酵素活性が与えられた大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、上述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内に導入する等の方法を用いて作出することができる。
【００４７】
本発明において酵素の活性を強化した大腸菌とは、何らかの方法によって該酵素活性が強化された大腸菌を指す。これらの大腸菌は、例えば該酵素及び蛋白質をコードする遺伝子を、前述したものと同様の遺伝子組換え技術を用いて菌体外から菌体内にプラスミドを用いて導入する又は、宿主大腸菌がゲノム上に保有する酵素遺伝子のプロモーター活性を強化又は他のプロモーターと置換することによって酵素遺伝子を強発現させる、等の方法を用いて作出することができる。
【００４８】
本発明において大腸菌とは、本来、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有するか否かに関わらず、何らかの手段を用いることにより植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産する能力を有し得る大腸菌を意味する。
【００４９】
ここで上記の各遺伝子の導入対象となる大腸菌としては、イソプロピルアルコール生産能を有しないものであってもよく、上記の各遺伝子の導入及び変更が可能であればいずれの大腸菌であってもよい。
より好ましくは、イソプロピルアルコール生産能が予め付与された大腸菌であることができ、これにより、より効率よくイソプロピルアルコールを生産させることができる。特に、本発明よれば、本来はスクロース資化能を備えていない大腸菌にスクロース資化能を付与し、スクロースから効率よくイソプロピルアルコールを生産することができる。このような、スクロース資化能を本来は備えていない大腸菌としては、Ｋ１２株、Ｂ株、Ｃ株及びその由来株等を挙げることができる。
【００５０】
このようなイソプロピルアルコール生産大腸菌としては、例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットに記載されているアセト酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性を付与され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるイソプロピルアルコール生成細菌などを挙げることができる。
【００５１】
本発明のイソプロピルアルコール生産方法は、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌を用いてスクロースを含む植物由来原料からイソプロピルアルコールを生産させることを含むものであり、即ち、上記イソプロピルアルコール生産大腸菌とスクロースを含む植物由来原料とを接触させて培養する工程と、接触により得られたイソプロピルアルコールを回収する回収工程とを含むものである。
【００５２】
上記イソプロピルアルコール生産方法に用いられる植物由来原料は、植物から得られる炭素源であり、スクロースを含む植物由来原料であれば特に制限されない。本発明においては、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物を指し、更に植物体、植物器官、またはそれらの分解産物から得られる炭素源のうち、微生物が培養において炭素源として利用し得るものも、植物由来原料に包含される。
【００５３】
このような植物由来原料に包含される炭素源には、スクロースの他に、一般的なものとしてデンプン、グルコース、フルクトース、キシロース、アラビノース等の糖類、またはこれら成分を多く含む草木質分解産物、セルロース加水分解物など又はこれらの組み合わせを挙げることができ、更には植物油由来のグリセリン又は脂肪酸も、本発明における炭素源に含んでもよい。
【００５４】
本発明における植物由来原料の例示としては、穀物等の農作物、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿等、又はこれらの組み合わせを好ましく挙げることができ、その原料としての使用形態は、未加工品、絞り汁、粉砕物等、特に限定されない。また、上記の炭素源のみの形態であってもよい。
【００５５】
培養工程におけるイソプロピルアルコール生産大腸菌と植物由来原料との接触は、一般に、植物由来原料を含む培地でイソプロピルアルコール生産大腸菌を培養することにより行われる。
【００５６】
植物由来原料とイソプロピルアルコール生産大腸菌との接触密度は、イソプロピルアルコール生産大腸菌の活性によって異なるが、一般に、培地中の植物由来原料の濃度として、グルコース換算で初発の糖濃度を混合物の全質量に対して２０質量％以下とすることができ、大腸菌の耐糖性の観点から好ましくは、初発の糖濃度を１５質量％以下とすることができる。この他の各成分は、微生物の培地に通常添加される量で添加されればよく、特に制限されない。
【００５７】
また培地中のイソプロピルアルコール生産大腸菌の含有量としては、大腸菌の種類及び活性によって異なるが一般に、培養開始時に投入する前培養の菌液の量を培養液に対して０．１質量％〜３０質量％、培養条件制御の観点から好ましくは１質量％〜１０質量％とすることができる。
【００５８】
イソプロピルアルコール生産大腸菌の培養に用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、及びイソプロピルアルコールを生産するために微生物が要求する有機微量元素、核酸、ビタミン類等が含まれた培地であれば特に制限はない。
【００５９】
炭素源としては、スクロースの他、グルコース、フルクトース、糖蜜などの糖類、フマル酸、クエン酸、コハク酸などの有機酸、メタノール、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、その他が適宜使用される。窒素源としては、有機アンモニウム塩、無機アンモニウム塩、アンモニアガス、アンモニア水等の無機体窒素源、及び蛋白質加水分解物等の有機体窒素源、その他が適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カリウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、その他が必要に応じて適宜使用される。
【００６０】
有機微量成分としては、ビタミン、アミノ酸等及びこれらを含有する酵母エキス、ペプトン、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他が適宜使用される。
また、通常微生物の培地に添加される他の添加成分、例えば抗生物質等を、通常用いられる量で含むものであってもよい。なお、反応時の発泡を抑制するために消泡剤を適量添加することが好ましい。これらの成分の培地中の含有量は、通常、大腸菌の培養に適用される範囲であれば、特に制限はない。
なお、本発明に使用される培地としては、工業的生産に供する点を考慮すれば液体培地が好ましい。
【００６１】
本方法では、イソプロピルアルコールは、分離・回収率の観点から、培地と植物由来原料との混合液に溶解した態様、又は捕捉液に溶解した態様として回収されることが好ましい。捕捉液としては、トルエン若しくはジメチルホルムアミドなどの有機溶媒又は水などが挙げられる。捕捉液としては、中でも、イソプロピルアルコール生産時に副生される揮発性夾雑物とイソプロピルアルコールとを分離しやすい水が好ましい。そのような回収方法としては、例えば国際公開２００９／００８３７７号パンフレットに記載された方法などが挙げられる。
【００６２】
捕捉液又は混合物に溶解した態様として回収可能なイソプロピルアルコールの生産方法に適用可能な装置としては、例えば、国際公開２００９／００８３７７号パンフレットの図１に示される生産装置を挙げることができる。
この生産装置では、イソプロピルアルコール生産細菌と植物由来原料とを含む培地が収容された培養槽に、装置外部から気体を注入するための注入管が連結され、培地に対してエアレーションが可能となっている。
また、培養槽には、連結管を介して、捕捉液としてのトラップ液が収容されたトラップ槽が連結されている。このとき、トラップ槽へ移動した気体又は液体がトラップ液と接触してバブリングが生じる。
これにより、培養槽で通気培養により生成したイソプロピルアルコールは、エアレーションによって蒸散して培地から容易に分離される共に、トラップ槽においてトラップ液に補足される。この結果、イソプロピルアルコールを、より精製された形態で連続的に且つ簡便に生産することができる。
【実施例】
【００６３】
以下に、本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。なお、記載中の「％」は特に断らない限り、質量基準である。【００６４】
［実施例１］
＜エシェリヒア・コリ由来チオラーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリＯ１５７由来インベルターゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリのチオラーゼおよびエシェリヒア・コリのＣｏＡトランスフェラーゼのアミノ酸配列と遺伝子の塩基配列は既に報告されている。すなわち、チオラーゼをコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２４１３１〜２３２５３１５に記載されている。またＣｏＡトランスフェラーゼをコードする遺伝子は上記エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２７８１に記載されている。【００６５】
これらの遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。【００６６】
ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａｇｃｔａｃａｔａｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１）、及びｃｇｃｇｃｇｃａｔｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＮｄｅＩ、ＳｐｈＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターにあたるＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｊ０１７４９）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｐｈＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されていることを確認し、本プラスミドをｐＢＲｇａｐＰと命名した。【００６７】
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ａａｔａｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａｇｇｔｔｔｔｇｃａａｔｇｃｔａｇｇ（配列番号３）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａｔｔａａｇｔｃ（配列番号４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に構築したｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼが正しく挿入されていることを確認し、本プラスミドをｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈと命名した。
エシェリヒア・コリ由来のチオラーゼ遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてａｔｇｇａｔｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａａｔｔｇｔｇｔｃａｔｃｇｔｃａｇ（配列番号５）、及びｇｃａｇａａｇｃｔｔｇｔｃｔａｇａｔｔａａｔｔｃａａｃｃｇｔｔｃａａｔｃａｃｃａｔｃ（配列番号６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約１.２ｋｂｐのチオラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しチオラーゼ遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、本プラスミドをｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢと命名した。【００６８】
エシェリヒア・コリ由来のＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニット遺伝子を取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｇｃｔｃｔａｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号７）、及びｔａｇｃａａｇｃｔｔｃｔａｃｔｃｇａｇｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢを制限酵素ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニット遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、本プラスミドをｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤと命名した。【００６９】
さらにエシェリヒア・コリ由来ＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニット遺伝子を得るために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてａａｇｔｃｔｃｇａｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｇａｔｇｃｇａａａｃａａｃｇｔａｔｔｇ（配列番号９）、及びｇｇｃｃａａｇｃｔｔｃａｔａａａｔｃａｃｃｃｃｇｔｔｇｃ（配列番号１０）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｈｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することで約６００ｂｐのＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニットフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤを制限酵素ＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニット遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、本プラスミドをｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡと命名した。
【００７０】
さらにエシェリヒア・コリＯ１５７株由来のｃｓｃＡを取得するために、エシェリヒア・コリＯ１５７株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａｃｇｃａａｔｃｔｃｇａｔｔｇｃａｔｇ（配列番号１１）、及びｔｔａａｃｃｃａｇｔｔｇｃｃａｇａｇｔｇｃ（配列番号１２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで末端リン酸化することで約１４７０ｂｐのｃｓｃＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントと先に作成したｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化の後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、さらにアルカリフォスファターゼで末端を脱リン酸化したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニット遺伝子の３’末端側とｃｓｃＡの５’末端側が連結されｃｓｃＡが正しく挿入されていることが確認されたプラスミドをｐＧＡＰ−ＩＰＡｄｈ−ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡ−ｃｓｃＡと命名した。
なおエシェリヒア・コリＯ１５７のゲノムは標準物質及び計量技術研究所より入手することができる。【００７１】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃａｇｇｔａｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｇａａｇｔａａｔｔａａａｃａａａｔｔａｇｃ（配列番号１３）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｃｔｔａａｇａｔａａｔｃａｔａｔａｔａａｃｔｔｃａｇｃ（配列番号１４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈ-ａｔｏＢ−ａｔｏＤ−ａｔｏＡ−ｃｓｃＡを制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子が正しく挿入されていることを確認し、本プラスミドをｐＧＡＰ-Ｉａａａ-ｃｓｃＡと命名した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養し、得られた形質転換体をｐＧＡＰ-Ｉａａａ-ｃｓｃＡ／Ｂ株とした。【００７２】
［実施例２］
＜３Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａａａ-ｃｓｃＡ／Ｂ株によるスクロースからのイソプロピルアルコール生産＞
本実施例では、ＷＯ２００９／００８３７７号パンフレット図１に示される生産装置を用いてイソプロピルアルコールの生産を行った。培養槽には３リットル容のものを使用し、トラップ槽には１０Ｌ容のものを使用した。培養槽、トラップ槽、注入管、連結管、排出管は、すべてガラス製のものとした。トラップ槽には、トラップ液としての水（トラップ水）を、６Ｌの量で注入した。なお、培養槽には廃液管を設置して、糖や中和剤の流加により増量した培養液を適宜培養槽外に排出した。【００７３】
実施例１において得られたｐＧＡＰ-Ｉａａａ-ｃｓｃＡ／Ｂ株を前培養としてアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）２５ｍＬを入れた１００ｍＬ容三角フラスコ植菌し、一晩、培養温度３５℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液全量を、以下に示す組成の培地１４７５ｇの入った３Ｌ容の培養槽（ＡＢＬＥ社製培養装置ＢＭＪ−０１）に移し、培養を行った。
培養は大気圧下、通気量１．５Ｌ／ｍｉｎ、撹拌速度５５０ｒｐｍ、培養温度３５℃、ｐＨ７．０（ＮＨ３水溶液で調整）で行った。培養開始から８時間後までの間、４０ｗｔ／ｗｔ％のスクロース水溶液を５ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。その後は４０ｗｔ／ｗｔ％のスクロース水溶液を１５ｇ／Ｌ／時間の流速で添加した。培養開始から４８時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のイソプロピルアルコールの蓄積量をＨＰＬＣで定法に従って測定した。【００７４】
＜培地組成＞
コーンスティープリカー（日本食品化工製）：２０ｇ／Ｌ
Ｆｅ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０９ｇ／Ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：２ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：２ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４：２ｇ／Ｌ  
アデカノールＬＧ１２６（旭電化工業）０．６ｇ／Ｌ
（残部：水）【００７５】
その結果、培養開始４８時間後に５．９ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水（６Ｌ）中の合算値である。
この結果より、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちｃｓｃＡを導入することによってスクロースが分解されて、分解物であるグルコースとフルクトースが速やかに細胞内へ取り込まれ、イソプロピルアルコールへ変換されたことがわかった。【００７６】
［実施例３］
宿主大腸菌のゲノム上のＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ａｔｏＤ及びａｔｏＡ）とチオラーゼ遺伝子（ａｔｏＢ）の発現を強化し、導入するプラスミドベクターにはアセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びｃｓｃＡのみを連結してプラスミド全長のＤＮＡサイズを小さくして、スクロースからのイソプロピルアルコールの生産を試みた。【００７７】
＜エシェリヒア・コリＢ株ゲノム上ａｔｏＤプロモーターのＧＡＰＤＨプロモーターへの置換＞
エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ０００９６）、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＣｏＡトランスフェラーゼ  αサブユニットをコードする遺伝子（以下、ａｔｏＤと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちａｔｏＤはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｕ０００９６に記載のエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株ゲノム配列の２３２１４６９〜２３２２１３１に記載されている。【００７８】
上記の遺伝子を発現させるために必要なプロモーターの塩基配列として、ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２６６２の塩基配列情報において、３９７−４４０に記されているエシェリヒア・コリ由来のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下ＧＡＰＤＨと呼ぶことがある）のプロモーター配列を使用することができる。ＧＡＰＤＨプロモーターを取得するためエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇｃｔｃａａｔｔｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号１５）、及びａｃａｇａａｔｔｃｇｃｔａｔｔｔｇｔｔａｇｔｇａａｔａａａａｇｇ（配列番号１６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１００ｂｐのＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントとプラスミドｐＵＣ１９（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｘ０２５１４）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、さらにアルカリフォスファターゼ処理したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニー１０個をそれぞれアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、プラスミドを回収し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した際、ＧＡＰＤＨプロモーターが切り出されないものを選抜し、さらに、ＤＮＡ配列を確認しＧＡＰＤＨプロモーターが正しく挿入されたものをｐＵＣｇａｐＰとした。得られたｐＵＣｇａｐＰを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化した。【００７９】
さらにａｔｏＤを取得するために、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてｃｇａａｔｔｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇａａａａｃａａａａｔｔｇａｔｇａｃａｔｔａｃａａｇａｃ（配列番号１７）、及びｇｃｇｇｔａｃｃｔｔａｔｔｔｇｃｔｃｔｃｃｔｇｔｇａａａｃｇ（配列番号１８）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化することで約６９０ｂｐのａｔｏＤフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントを先に制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩで消化したｐＵＣｇａｐＰと混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｔｏＤが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰａｔｏＤと命名した。
なおエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株はアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００８０】
上述した通り、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡにおけるａｔｏＤの塩基配列も報告されている。エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの５’近傍領域の遺伝子情報に基づいて作成された、ｇｃｔｃｔａｇａｔｇｃｔｇａａａｔｃｃａｃｔａｇｔｃｔｔｇｔｃ（配列番号１９）とｔａｃｔｇｃａｇｃｇｔｔｃｃａｇｃａｃｃｔｔａｔｃａａｃｃ（配列番号２０）を用いて、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。【００８１】
また、エシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のＧＡＰＤＨプロモーターの配列情報に基づいて作製されたｇｇｔｃｔａｇａｇｃａａｔｇａｔｔｇａｃａｃｇａｔｔｃｃｇ（配列番号２１）とエシェリヒア・コリＭＧ１６５５株のａｔｏＤの配列情報に基づいて作製された配列番号１８のプライマーを用いて、先に作製した発現ベクターｐＧＡＰａｔｏＤを鋳型としてＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤからなる約７９０ｂｐのＤＮＡフラグメントを得た。【００８２】
上記により得られたフラグメントをそれぞれ、制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩ、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化し、このフラグメントを温度感受性プラスミドｐＴＨ１８ｃｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０１９６１０）〔Hashimoto-Gotoh, T., Gene, 241, 185-191 (2000)〕をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して得られるフラグメントと混合し、リガーゼを用いて結合した後、ＤＨ５α株に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地で３０℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収した。このプラスミドをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、クロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに３０℃で一晩培養し、形質転換体を得た。得られた形質転換体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液体培地に接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養菌体をクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに塗布し、４２℃で培養しコロニーを得た。得られたコロニーを抗生物質を含まないＬＢ液体培地で３０℃で２時間培養し、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートに塗布して４２℃で生育するコロニーを得た。【００８３】
出現したコロニーの中から無作為に１００コロニーをピックアップしてそれぞれを、抗生物質を含まないＬＢ寒天プレートとクロラムフェニコール１０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートに生育させ、クロラムフェニコール感受性のクローンを選んだ。さらにはこれらのクローンの染色体ＤＮＡからＰＣＲによりＧＡＰＤＨプロモーターとａｔｏＤを含む約７９０ｂｐ断片を増幅させ、ａｔｏＤプロモーター領域がＧＡＰＤＨプロモーターに置換されている株を選抜し、以上を満足するクローンをエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株と命名した。
なお、エシェリシア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。【００８４】
［実施例４］
＜クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
クロストリジウム属細菌のアセト酢酸デカルボキシラーゼはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ Ｍ５５３９２に、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ１５７３０７に記載されている。
イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ＡＡＴＡＴＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＴＧＣＴＡＧＧ（配列番号３）、及びｇｃｇｇａｔｃｃｔｔａｔａａｔａｔａａｃｔａｃｔｇｃｔｔｔａａｔｔａａｇｔｃ（配列番号２２）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＳｐｈＩ、ＢａｍＨＩで消化することで約１．１ｋｂｐのイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＢＲｇａｐＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＢａｍＨＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収しＩＰＡｄｈが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈと命名した。【００８５】
アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子を取得するために、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いて、ｃａｇｇａｔｃｃｇｃｔｇｇｔｇｇａａｃａｔａｔｇｔｔａａａｇｇａｔｇａａｇｔａａｔｔａａａｃａａａｔｔａｇｃ（配列番号２３）、及びｇｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃｔｔａｃｔｔａａｇａｔａａｔｃａｔａｔａｔａａｃｔｔｃａｇｃ（配列番号２４）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで消化することで約７００ｂｐのアセト酢酸デカルボキシラーゼフラグメントを得た。得られたＤＮＡフラグメントと先に作成したプラスミドｐＧＡＰ-ＩＰＡｄｈを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで得られるフラグメントを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られたコロニーをアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地で３７℃で一晩培養し、得られた菌体からプラスミドを回収し、ａｄｃが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-Ｉａと命名した。【００８６】
このプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａを実施例３で作成したエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ/ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株を得た。
なお、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ８２４、エシェリシア・コリＢ株は細胞・微生物・遺伝子バンクであるアメリカンタイプカルチャーコレクションより入手することができる。また、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＮＲＲＬ Ｂ−５９３は細胞・微生物バンクであるＶＴＴカルチャーコレクションより入手することができる。【００８７】
［実施例５］
＜クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、エシェリヒア・コリＯ１５７由来インベルターゼ遺伝子発現ベクターおよび該発現ベクター形質転換体の構築＞
エシェリヒア・コリＯ１５７株のゲノムＤＮＡの全塩基配列は公知であり（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＥ００５１７４）、エシェリヒア・コリＯ１５７株のインベルターゼをコードする遺伝子（以下、ｃｓｃＡと略することがある）の塩基配列も報告されている。すなわちｃｓｃＡはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＥ００５１７４に記載のエシェリヒア・コリＯ１５７株ゲノム配列の３２７４３８３〜３２７５８１６に記載されている。【００８８】
ｃｓｃＡを取得するために、エシェリヒア・コリＯ１５７株のゲノムＤＮＡをテンプレートに用いてＡＴＧＧＴＡＣＣＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＧＣＡＡＴＣＴＣＧＡＴＴＧＣＡＴＧ（配列番号２５）、及びＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＣＣＣＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＧＴＧＣ（配列番号２６）によりＰＣＲ法で増幅し、得られたＤＮＡフラグメントを制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化することで約１４７０ｂｐのｃｓｃＡフラグメントを得た。このＤＮＡフラグメントと先に実施例４で作成したｐＧＡＰ−Ｉａ（クロストリジウム属細菌由来アセト酢酸デカルボキシラーゼ遺伝子、クロストリジウム属細菌由来イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現ベクター）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで消化したものとを混合し、リガーゼを用いて結合した後、エシェリヒア・コリＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績株式会社 ＤＮＡ−９０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートに生育する形質転換体を得た。得られた菌体からプラスミドを回収し、ｃｓｃＡが正しく挿入されていることを確認し、このプラスミドをｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡと命名した。【００８９】
このプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡを実施例３で作成したエシェリヒア・コリＢ株ａｔｏＤ欠失ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株のコンピテントセルに形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養することにより、エシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株を得た。
なおエシェリヒア・コリＯ１５７のゲノムは標準物質及び計量技術研究所より入手することができる。【００９０】
［実施例６］
＜３Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株によるスクロースからのイソプロピルアルコール生産＞
実施例５で得られたエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株を用いて、実施例２と同様にイソプロピルアルコール生産検討を行った。
また、培養槽中のスクロース、グルコース、フルクトースの蓄積量を測定し、結果を表１に示した。【００９１】
その結果、培養開始４８後時間に３１．４ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。【００９２】
【表１】
0005568562.tif 000002
【００９３】
この結果より、アセト酢酸デカルボキシラーゼ活性及びイソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性をクロストリジウム属細菌由来の遺伝子とし、これらとスクロース非ＰＴＳ遺伝子群のうちのｃｓｃＡのみを導入することによって、スクロースが分解されて、分解物であるグルコースとフルクトースが速やかに細胞内へ取り込まれ、イソプロピルアルコールへ変換されたことがわかった。また、本結果では、スクロースの分解によりグルコースとフルクトースは等モル生成されているはずであるが、フルクトースが培地中に蓄積することはなく、グルコースによる代謝抑制（カタボライトリプレッション）の影響を受けずに、効率よくイソプロピルアルコールの生産が行われていることが確認できた。【００９４】
［実施例７］
＜１Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株による糖蜜からのイソプロピルアルコール生産＞
実施例６と同様にイソプロピルアルコール生産検討を行った。ただし４０ｗｔ／ｗｔ％のスクロース水溶液に代えて、８０ｗｔ／ｗｔ％の糖蜜（大日本明治精糖製）を用いて行った。培養開始４８後時間に２９．４ｇ／Ｌのイソプロピルアルコールの蓄積が確認された。なお、測定値は、培養後の培養液とトラップ水中の合算値である。【００９５】
［比較例１］
＜３Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株によるイソプロピルアルコール生産＞
実施例２と同様な条件で、実施例４で作成したｐＧＡＰ-Ｉａ／ＧＡＰｐａｔｏＤゲノム挿入株についてイソプロピルアルコール培養検討を行った。その結果、４８時間後においても、イソプロピルアルコールの生産は確認されず、添加したスクロースは、ほぼ同量、培養上清に残されていた。
このことは、イソプロピルアルコール生産能が付与されていてもＣｓｃＡが導入されていないと、イソプロピルアルコールが生産できないことを示している。【００９６】
［比較例２］
＜３Ｌ培養槽を使用したエシェリヒア・コリｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／Ｂ株によるイソプロピルアルコール生産＞
実施例５で作成したプラスミドｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡをエシェリヒア・コリＢ株（ＡＴＣＣ１１３０３）に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレートで３７℃で一晩培養し、得られた形質転換体をｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／Ｂ株とした。作成したｐＧＡＰ-Ｉａ-ｃｓｃＡ／Ｂ株について実施例２と同様な条件で、イソプロピルアルコール培養検討を行った。４８時間においてイソプロピルアルコールの生産は確認されなかった。
このことは、イソプロピルアルコール生産能が付与されていなければ、ＣｓｃＡのみをエシェリヒア・コリＢ株に導入してもイソプロピルアルコールが生産できないことを示している。【００９７】
［比較例３］
＜大腸菌Ｂ株におけるグルコースによる代謝抑制（カタボライトリプレッション）の確認＞
本発明のイソプロピルアルコール生産大腸菌の宿主であるＢ株は、本来的にグルコースによる代謝抑制（カタボライトリプレッション）の影響を受ける大腸菌であることを確認した。
大腸菌Ｂ株（ＡＴＣＣ１１３０３）を前培養としてＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，  Ｍｉｌｌｅｒ培養液（Ｄｉｆｃｏ２４４６２０）５ｍＬを入れた１４ｍＬ容量のプラスチックチューブ（ＦＡＬＣＯＮ社製  ２０５７）に植菌し、一晩、培養温度３７℃、１２０ｒｐｍで攪拌培養を行った。前培養液０．３ｍＬを、表２に示す１〜４の組成の培地３０ｍＬが入った１００ｍＬ容のバッフル付フラスコに移し、培養を行った。培養は、撹拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度３７℃で行った。【００９８】
培養開始から０、２、４、６、８、１０時間後に菌体培養液をサンプリングし、遠心操作によって菌体を除いた後、得られた培養上清中のグルコースとフルクトースの含有量をＦ−キット  グルコース／フルクトース（Ｊ．Ｋ．インターナショナル  製品番号１３９１０６）で測定した。結果を図１に示す。図１において黒丸はグルコースの減少量を、白丸はフルクトースの減少量をそれぞれ示す。更に、培養０時間目から各培養時間でグルコース又はフルクトースがどのくらい減少したか算出した。各培地における１０時間後のグルコース減少量を表２に示す。【００９９】
【表２】
0005568562.tif 000003
【０１００】
表２に示されるように、１０時間後のフルクトースグルコース減少量を比較したところ、糖源としてフルクトースのみを含む培地Ｎｏ．４は３．４ｇ／Ｌとなっているのに対して、糖源がグルコースとフルクトースの双方を含む培地Ｎｏ．２では、フルクトースの取り込みが抑制されることが示された。このことにより、Ｂ株では、糖源がフルクトース単独の場合には、グルコースと同様にフルクトースは取り込まれるが、グルコースとフルクトースが共存した場合にはフルクトースの取り込みが抑制されることが確認された。【０１０１】
このように本発明によれば、安価で工業的に利用価値の高いスクロースからイソプロピルアルコールを効率よく生産するために有用なイソプロピルアルコール生産大腸菌及びイソプロピルアルコール生産方法を提供することができる。【０１０２】
２００９年９月１６日に出願された日本国特許出願第２００９−２１４６９４号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
0005568562.tif 000004
【配列表】
0005568562000001.app