(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減するための医薬の製造のための、
（ａ）下記の式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩と、
【化１】
0005539363.tif 000014
（ｂ）ペグ化インターフェロンαと、
（ｃ）リバビリンと
の組合せの使用。
【請求項２】
前記医薬が、
（ａ）下記の式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む第１の医薬組成物と、
【化２】
0005539363.tif 000015
（ｂ）ペグ化インターフェロンαを含む第２の医薬組成物と、
（ｃ）リバビリンを含む第３の医薬組成物と
を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
成分（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、前記医薬中に治療有効量で存在する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＨＣＶ感染が、遺伝子型１型である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記医薬が、未治療患者において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減するためである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項６】
前記医薬が、リバビリンおよびインターフェロンαを使用した併用療法に対して非反応性である患者において、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減するためである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬が、患者においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減するためであり、それによって患者におけるＨＣＶ−ＲＮＡレベルが、治療の結果として検出可能レベル未満に低下する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬を少なくとも４週間投与する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項９】
化合物（１）または薬学的に許容されるその塩の投与量が、１日当たり少なくとも４０ｍｇである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１０】
リバビリンの投与量が、４００ｍｇ／日、６００ｍｇ／日、８００ｍｇ／日、１０００ｍｇ／日、または１２００ｍｇ／日から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１１】
ペグ化インターフェロンαを週１回投与する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１２】
前記ペグ化インターフェロンαが、約９０〜約２００μｇ／週の投与量で投与するペグ化インターフェロンα−２ａ、または約０．５μｇ／ｋｇ／週〜約２μｇ／ｋｇ／週の投与量で投与するペグ化インターフェロンα−２ｂである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１３】
前記治療が、リバビリンおよびインターフェロンを使用した併用療法に対して非反応性である患者における遺伝子型１型のＨＣＶ感染のためであり、化合物（１）または薬学的に許容されるその塩が、１日当たり約４８ｍｇから１日当たり約２４０ｍｇの量で投与され、前記ペグ化インターフェロンαが、ペグ化インターフェロンα−２ａまたはペグ化インターフェロンα−２ｂである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１４】
化合物（１）または薬学的に許容されるその塩を１日１回投与し、リバビリンを１日２回投与し、ペグ化インターフェロンαを週１回投与する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１５】
Ｒ１５５、Ｄ１６８、またはＡ１５６の１つもしくは複数においてＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼアミノ酸置換をコードしているＨＣＶ変異体の出現が限定されるか、または出現しない、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１６】
下記の式（１）の化合物または薬学的に許容されるその塩の、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減するための医薬を調製するための、ペグ化インターフェロンα及びリバビリンと組み合わせた使用。
【化３】
0005539363.tif 000016
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００８年９月１７日に出願された先願の米国特許仮出願第６１／０９７，７５３号、２００８年１０月２８日に出願された先願の米国特許仮出願第６１／１０９，０３３号、および２００９年４月２３日に出願された先願の米国特許仮出願第６１／１７１，９３５号の利益を主張するものである。
本発明は、本明細書において記載されたような化合物（１）、インターフェロンαおよびリバビリンを含む治療上の組合せに関する。本発明はまた、患者においてＨＣＶ感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減するためのこのような治療上の組合せを使用する方法に関する。本発明はまた、本発明の治療上の組合せを含むキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、米国のみにおいて毎年概ね１５０，０００件の新規報告がなされた症例を伴う世界的なヒトの健康問題である。ＨＣＶは、非Ａ、非Ｂの輸血後および移植後肝炎の大部分の症例において同定される原因物質であり、急性散発性肝炎の共通原因である、一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＨＣＶに感染した５０％超の患者が慢性感染となり、それらの２０％は２０年以内に肝硬変を発症すると推定される。
いくつかのタイプのインターフェロン、特に、α−インターフェロンは、慢性ＨＣＶの治療のために承認されている。例えば、インターフェロン−α−２ａ（ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）−Ａ）、インターフェロン−α−２ｂ（ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）−Ａ）、コンセンサスインターフェロン（ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標））、ならびにこれらおよび他のインターフェロンのペグ化形態（ペグ化インターフェロンα−２ａ（ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標））およびペグ化インターフェロンα−２ｂ（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標））など）。しかし、大部分の患者はインターフェロン−α治療に反応せず、反応者の中でも、治療の停止後６カ月以内での再発率は高い（Ｌｉａｎｇら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０：６９、１９９３）。
【０００３】
多くのＲＮＡおよびＤＮＡウイルスに対して広範囲の活性を有するグアノシン類似体であるリバビリンは、インターフェロンαと組み合わせて使用したときに、臨床試験において慢性ＨＣＶ感染に対して有効であることが示されてきており（例えば、Ｐｏｙｎａｒｄら、Ｌａｎｃｅｔ、３５２：１４２６〜１４３２、１９９８；Ｒｅｉｃｈａｒｄら、Ｌａｎｃｅｔ、３５１：８３〜８７、１９９８を参照されたい）、この併用療法は、ＨＣＶの治療のために承認されてきた。ＲＥＢＥＴＲＯＮ（登録商標）（インターフェロンα−２ｂおよびリバビリン、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）；ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）ＲＢＶ（登録商標）（ペグ化インターフェロンα−２ａおよびリバビリン併用療法、Ｒｏｃｈｅ）；またＭａｎｎｓら、Ｌａｎｃｅｔ、３５８：９５８〜９６５（２００１）およびＦｒｉｅｄら、２００２、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４７：９７５〜９８２を参照されたい。しかし、この併用療法をもってしても、ウイルス学的反応割合はまだ、５０％またはそれ未満である。
【０００４】
さらに、このような治療と典型的に関連するかなりの副作用がある。リバビリンは、催奇形活性、精子発生の妨害、溶血、疲労、頭痛、不眠、悪心および／または食欲不振症を含めた不都合がある。インターフェロンαは、リバビリンを伴ってまたは伴わずに、多くの副作用と関連する。治療の間、インフルエンザ様症状、うつ、発疹および異常な血球数について、患者を注意深くモニターしなくてはならない。インターフェロンα−２ｂおよびリバビリンで治療を受けている患者は、重症の肝臓機能不全という合併症を有するべきではなく、このような対象には、注意深くモニターする研究におけるＣ型肝炎の治療のみが考慮される。
【０００５】
ＨＣＶ感染を治療するための特定のインターフェロンを含有する併用療法はまた、下記の米国特許出願公開第２００５／０１１２０９３号、同第２００５／０１２９６５９号、および同第２００８／０１３８３１６号に開示されている。
【０００６】
下記の化合物（１）は、
【化１】
0005539363.tif 000002
ＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼの選択的および強力な阻害剤として公知であり、ＨＣＶ感染の治療に有用である。化合物（１）は、米国特許第６，３２３，１８０号、同第７，５１４，５５７号および同第７，５８５，８４５号に開示されている、ＨＣＶ阻害剤の非環状ペプチドシリーズの範囲内に入る。化合物（１）は、米国特許第７，５８５，８４５号において化合物＃１０５５として、および米国特許第７，５１４，５５７号において化合物＃１００８として特に開示されている。化合物（１）、およびその医薬製剤は、それらの全てが参照によりその全体が本明細書に組み込まれている上記の文献に見出される一般手順によって調製することができる。化合物（１）の好ましい形態には、結晶形態、特に本明細書において例の項に記載されているように調製することができる結晶性ナトリウム塩形態が含まれる。
【０００７】
化合物（１）はまた、上記の構造と等しいその化学構造の下記の代替表示によって知られていることがあり、
【化２】
0005539363.tif 000003
式中、Ｂは、
【化３】
0005539363.tif 000004
であり、
Ｌ0は、ＭｅＯ−であり、Ｌ1は、Ｂｒであり、Ｒ2は、
【化４】
0005539363.tif 000005
である。
【０００８】
化合物（１）はウイルス量の低下およびＨＣＶ感染の治療において一般に有効であることが見出されたが、結果として生じるウイルスのリバウンドを伴うある程度のウイルス抵抗性が見出されてきた。例えば、本発明者らは、未治療患者に１４日間単独療法として１日１回投与した化合物（１）によって、強力で非常に急速な抗ウイルス作用、それに続く５〜６日後のある程度の抵抗性形成を観察した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、代替療法の分野においてＨＣＶ感染を治療および予防することが継続的に求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、患者に、本明細書に定義されているような化合物（１）、または薬学的に許容されるその塩を、本明細書に定義されているようなインターフェロンαおよびリバビリンと共に含む治療上の組合せを投与するステップを含む、患者においてＨＣＶ感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減する方法を提供する。組合せの３種の活性物質は、投与計画の一部として同時または別々に投与することができる。
【００１１】
本発明は、化合物（１）または薬学的に許容されるその塩を含む第１の医薬組成物、インターフェロンαを含む第２の医薬組成物、およびリバビリンを含む第３の医薬組成物を含むキットをさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】単独療法として１４日間の化合物（１）のナトリウム塩、それに続いてさらに１４日の化合物（１）のナトリウム塩、ペグ化インターフェロンα−２ａおよびリバビリンによる併用療法で治療された、慢性ＨＣＶ遺伝子型１型感染を有する未治療患者についての４つの患者投与群におけるＨＣＶウイルス量の平均変化を示す。
【図２】併用療法として２８日間の化合物（１）のナトリウム塩、ペグ化インターフェロンα−２ａおよびリバビリンで治療された、慢性ＨＣＶ遺伝子型１型感染を有する治療経験のある患者についての３つの患者投与群におけるＨＣＶウイルス量の平均変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
「化合物（１）」は、上記定義の通りである。
「インターフェロン」は、ウイルス複製および細胞増殖を阻害し、免疫応答を調整する、高度に相同な種特異的タンパク質のファミリーのメンバーを意味する。ヒトインターフェロンは、それらの細胞の起源および抗原性に基づいて３つのクラスに分類される。α−インターフェロン（白血球）、β−インターフェロン（線維芽細胞）およびγ−インターフェロン（Ｂ細胞）。各群の組換え形態が開発されてきており、市販されている。各群におけるサブタイプは、抗原性／構造の特徴に基づいている。別個のアミノ酸配列を有する少なくとも２４種のインターフェロンα（サブタイプＡからＨに分類される）が、これらのペプチドをコードするＤＮＡを単離し、配列決定することによって同定されてきた。「α−インターフェロン」、「アルファ−インターフェロン」および「インターフェロンα」という用語は、この群のメンバーを記載するために本出願において互換的に使用される。コンセンサスインターフェロンを含めた天然および組換えα−インターフェロンの両方を、本発明の実施において使用し得る。
本発明のための適切なインターフェロン−αには、これらに限定されないが、組換えインターフェロンα−２ｂ（ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）−ＡインターフェロンおよびＶＩＲＡＦＥＲＯＮ（登録商標）など）；組換えインターフェロンα−２ａ（ＲＯＦＥＲＯＮ（登録商標）インターフェロンなど）；組換えインターフェロンα−２ｃ（ＢＥＲＯＦＯＲ（登録商標）α２インターフェロンなど）；インターフェロンα−ｎ１、天然αインターフェロンの精製したブレンド（ＳＵＭＩＦＥＲＯＮ（登録商標）もしくはＷＥＬＬＦＥＲＯＮ（登録商標）インターフェロンα−ｎ１（ＩＮＳ）など）；またはコンセンサスαインターフェロン（米国特許第４，８９７，４７１号および同第４，６９５，６２３号に記載されているものなど）；またはインターフェロンα−ｎ３、天然αインターフェロンの混合物（ＡＬＦＥＲＯＮ（登録商標）など）が含まれる。インターフェロンα−２ａまたはα２ｂの使用が好ましい。インターフェロンα２ｂの製造は、米国特許第４，５３０，９０１号に記載されている。
【００１４】
「インターフェロンα」という用語は、インターフェロンα、好ましくはインターフェロンα−２ａおよび−２ｂのポリエチレングリコールで修飾した複合体を意味するそれらの「ペグ化」類似体を含むことをさらに意図する。好ましいポリエチレングリコール−インターフェロンα−２ｂ複合体は、ＰＥＧ12000−インターフェロンα２ｂである。「ＰＥＧ12000−ＩＦＮα」という用語は、本明細書において使用する場合、国際出願第ＷＯ９５／１３０９０号の方法によって調製されるものなどの、インターフェロンα−２ａまたは−２ｂアミノ基と、１２０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールとの間にウレタン連結を含有する複合体を意味する。
【００１５】
好ましいＰＥＧ12000−インターフェロンα−２ｂは、ＰＥＧポリマーをＩＦＮα−２ｂ分子中のリシン残基のεアミノ基に結合することによって調製される。単一のＰＥＧ12000分子は、ＩＦＮα−２ｂ分子上の遊離アミノ基にウレタン連結を介して複合体化している。この複合体は、結合したＰＥＧ12000の分子量によって特徴付けられる。ＰＥＧ12000−ＩＦＮα−２ｂ複合体は、注射のための凍結乾燥した粉末として製剤される。ＩＦＮαのＰＥＧとの複合体化の目的は、その血漿内半減期を有意に延ばし、それによってＩＦＮαの延長した活性を実現することによって、タンパク質の送達を改善することである。
【００１６】
本発明において使用し得る特に好ましいインターフェロンαの複合体は、ペグ化α−インターフェロン、例えば、ペグ化インターフェロンα−２ａ、ペグ化インターフェロンα−２ｂ、ペグ化コンセンサスインターフェロンまたはペグ化精製インターフェロンα製品である。ペグ化インターフェロンα−２ａは、例えば、欧州特許第ＥＰ０５９３８６８号に記載されており、例えば、商品名ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）で市販されている。ペグ化インターフェロンα−２ｂは、例えば、米国特許第５，９０８，６２１号およびＷＯ９８／４８８４０に記載されており、例えば、商品名ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）Ａ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）で市販されている。ペグ化コンセンサスインターフェロンは、ＷＯ９６／１１９５３に記載されている。好ましいペグ化αインターフェロンは、ペグ化インターフェロンα−２ａおよびペグ化インターフェロンα−２ｂである。また好ましいのは、ペグ化コンセンサスインターフェロンである。
【００１７】
「インターフェロンα」という用語には、インターフェロンαを水溶性ポリマーにカップリングすることによって調製することができる他のインターフェロンα複合体がさらに含まれる。このようなポリマーの非限定的一覧には、他のポリアルキレンオキシドホモポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオールなど）、そのコポリマーおよびそのブロックコポリマーが含まれる。ポリアルキレンオキシドをベースとするポリマーに代わるものとして、非抗原性材料（デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物をベースとするポリマーなど）を効果的に使用することができる。このようなインターフェロンα−ポリマー複合体は、米国特許第４，７６６，１０６号、米国特許第４，９１７，８８８号、欧州特許出願第０２３６９８７号、欧州特許出願第０５１０３５６号、同第０５９３８６８号および同第０８０９９９６号（ペグ化インターフェロンα−２ａ）ならびに国際公開第ＷＯ９５／１３０９０号に記載されている。
【００１８】
「インターフェロンα」という用語には、インターフェロンαの融合タンパク質、例えば、インターフェロン−α−２ａ、インターフェロン−α−２ｂの融合タンパク質、コンセンサスインターフェロンまたは精製インターフェロン−α製品（これらの各々は別のタンパク質に融合している）がさらに含まれる。特定の好ましい融合タンパク質は、米国特許第６，９７２，３２２号ならびに国際公開ＷＯ２００５／００３２９６号および同第ＷＯ２００５／０７７０４２号に記載されているような、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α−２ｂ）およびアルブミンを含む。ヒトアルブミンに複合体化した好ましいインターフェロンは、アルブミン融合技術を使用して生じさせたインターフェロンαのより長く活性な形態であるＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（登録商標）である。ＡＬＢＵＦＥＲＯＮ（登録商標）は、ヒトアルブミンおよびインターフェロンαの遺伝子融合からもたらされる。また含まれるのは、コンセンサスインターフェロン（ＩＮＦＥＲＧＥＮ（登録商標）など）である。
【００１９】
「薬学的に許容される塩」という用語は、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応などがなく、正しい医学的判断の範囲内でヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに適し、合理的な便益／リスク比と釣り合い、一般に水溶性または油溶性または分散性であり、かつそれらの使用目的のために有効である式（１）の化合物の塩を意味する。
この用語には、薬学的に許容される酸付加塩および薬学的に許容される塩基付加塩が含まれる。適切な塩の一覧は、例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｉｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９７７、６６、１〜１９頁に見出される。
【００２０】
「薬学的に許容される酸付加塩」という用語は、無機酸（塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、硝酸、リン酸など）、および有機酸（酢酸、トリフルオロ酢酸、アジピン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、酪酸、ショウノウ酸、カンファースルホン酸、ケイ皮酸、クエン酸、ジグルコン酸、エタンスルホン酸、グルタミン酸、グリコール酸、グリセロリン酸、ヘミ硫酸、ヘキサン酸、ギ酸、フマル酸、２−ヒドロキシエタン−スルホン酸（イセチオン酸）、乳酸、ヒドロキシマレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メシチレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタリンスルホン酸、ニコチン酸、２−ナフタリンスルホン酸、シュウ酸、パモ酸、ペクチン酸、フェニル酢酸、３−フェニルプロピオン酸、ピバリン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、スルファニル酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ウンデカン酸など）と形成される、遊離塩基の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にまたはその他の点で望ましくないことがないその塩を意味する。
【００２１】
「薬学的に許容される塩基付加塩」という用語は、無機塩基（アンモニアまたは水酸化物、炭酸アンモニウムもしくは重炭酸アンモニウムなど）、または金属カチオン（ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウムなど）と形成される、遊離酸の生物学的有効性および特性を保持し、生物学的にまたはその他の点で望ましくないことがないその塩を意味する。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩である。薬学的に許容される有機無毒性塩基に由来する塩には、第一級、第二級、および第三級アミン、第四級アミン化合物、置換アミン（天然置換アミンを含めた）、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂（メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イソプロピルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、２−ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、テトラメチルアンモニウム化合物、テトラエチルアンモニウム化合物、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ポリアミン樹脂など）の塩が含まれる。特に好ましい有機無毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。
【００２２】
「リバビリン」は、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能な１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミドを意味し、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｎｏ．８１９９、第１１版に記載されている。その製造および製剤は、米国特許第４，２１１，７７１号に記載されている。好ましい市販されているリバビリン製品には、ＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）およびＣＯＰＥＧＵＳ（登録商標）が含まれる。この用語には、米国特許第６，０６３，７７２号、同第６，４０３，５６４号および同第６，２７７，８３０号に記載されているものなどの、その誘導体または類似体がさらに含まれる。例えば、誘導体または類似体には、修飾リバビリン（５’−アミノエステル、ＩＣＮ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのリバビリンのＬ−エナンチオマー（ＩＣＮ１７２６１）、リバビリンの２’−デオキシ誘導体およびリバビリンの３−カルボキサミジン誘導体、ビルアミジン（リバミジンとして既知である）など）が含まれる。
【００２３】
「治療上の組合せ」という用語は、本明細書において使用する場合、１種または複数の活性薬物原料、すなわち、治療上の有用性を有する化合物の組合せを意味する。典型的には、本発明の治療上の組合せ中の各々のこのような化合物は、その化合物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物中に存在する。本発明の治療上の組合せにおける化合物は、投与計画の一部として同時または別々に投与し得る。
【００２４】
本発明の実施形態
一般の実施形態によると、本発明は、患者に、本明細書に定義されているような化合物（１）、または薬学的に許容されるその塩を、インターフェロンαおよびリバビリンと共に含む治療上の組合せを投与するステップを含む、患者においてＨＣＶ感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、患者においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減するための、医薬品キットの調製のための、本明細書に定義されているような化合物（１）、または薬学的に許容されるその塩、インターフェロンα、およびリバビリンの使用を教示する。
この併用療法は全てのＨＣＶ遺伝子型に対して有効であることが予想されるが、サブ遺伝子型１ａおよび１ｂを含めたＨＣＶ遺伝子型１型感染を治療するのに特に有効であることが示されてきた。
【００２５】
本発明の併用療法で治療される患者集団は、「未治療」患者、すなわち、ＨＣＶ感染についていかなる従前の治療も受けていないそれらの患者、および「治療経験のある」患者、すなわち、ＨＣＶについて従前の治療を受けていたそれらの患者にさらに分類することができる。これらのクラスの患者のどちらも、本発明の併用療法で治療し得る。好ましくは治療される特定のクラスの患者は、従前のインターフェロンおよびリバビリン療法を受けたが、前記療法に対して非反応性であるそれらの治療経験のある患者である（本明細書において「非反応者」）。このような非反応者には、３種の別個の患者群が含まれる。（１）インターフェロンおよびリバビリンによる治療の間にＨＣＶ  ＲＮＡレベルの＜１×ｌｏｇ10最大低下を経験したもの（「無反応者」）、（２）インターフェロンおよびリバビリンによる治療の間にＨＣＶ  ＲＮＡレベルの≧１×ｌｏｇ10最大低下を経験したが、検出レベル未満のＨＣＶ  ＲＮＡレベルを達成したことがないもの（「部分的反応者」）、および（３）インターフェロンおよびリバビリン療法によって、およびその間にウイルス学的反応を達成したが、治療の間に（患者の服薬不履行によるものを除いて）、または治療の完了後にウイルス量のリバウンドを有したもの（「再発者」）。下記で詳述するように、特に驚くべき結果が、本発明の併用療法の投与計画を使用して、特定の非反応者である患者の治療によって得られた。
【００２６】
他の実施形態によれば、本発明は、それを必要としている患者に本発明による治療上の組合せを投与するステップを含む、前記患者においてＨＣＶ−ＲＮＡレベルを低下させる方法を提供する。好ましくは、本発明の方法は、患者においてＨＣＶ−ＲＮＡレベルを検出可能レベル未満に低下させる。「検出可能レベル未満」および「検出レベル未満」という用語は、本明細書において互換的に使用され、検出可能レベル未満のＨＣＶ  ＲＮＡであるのと同じ意味を有する。検出可能レベルのＨＣＶ  ＲＮＡは、本発明において使用する場合、ＷＨＯ国際標準による定量的なマルチサイクルのリバーストランスクリプターゼＰＣＲ法によって測定すると、患者の血清１ｍｌ当たり少なくとも５０国際単位（ＩＵ）を意味する（Ｓａｌａｄａｎｈａ  Ｊ、Ｌｅｌｉｅ  ＮおよびＨｅａｔｈ  Ａ、Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （ＮＡＴ）  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ＨＣＶ  ＲＮＡ．  ＷＨＯ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ、７６：１４９〜１５８、１９９９）。このような方法は、当技術分野で周知である。好ましい実施形態において、本発明の方法は、患者において、血清１ｍｌ当たり２５ＩＵ未満まで、よりさらに好ましくは血清１ｍｌ当たり１０ＩＵ未満までＨＣＶ−ＲＮＡレベルを低下させる。
【００２７】
標準的なインターフェロンおよびリバビリン療法についての通常の治療期間は、ＨＣＶ遺伝子型１型感染について少なくとも４８週間、ならびにＨＣＶ遺伝子型２型および３型について少なくとも２４週間である。しかし、本発明の３剤併用療法において、化合物（１）、または薬学的に許容されるその塩を添加することによって、かなりより短い治療期間とすることが可能であることがある。本発明の３剤併用療法によって、意図される治療期間には、少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１２週間、例えば、約１２週間から約２４週間が含まれるが、４８週間まで、およびそれを超えた治療もまた可能である。したがって、さらなる実施形態には、少なくとも２４週間および少なくとも４８週間の治療が含まれる。異なるＨＣＶ遺伝子型、例えば、ＨＣＶ遺伝子型２型、３型または４型についての期間は、同様であると予想される。本発明の３剤併用療法を伴う最初の治療計画、それに続いてインターフェロンおよびリバビリンのみの２剤併用療法を継続させることがまた意図される。したがって、最初の３剤、次いで２剤併用療法についての可能性のあるシナリオには、例えば、（１）４週間の３剤併用療法、それに続く２０〜４４週間のインターフェロンおよびリバビリンのみの療法、（２）１２週間の３剤併用療法、それに続く１２〜３６週間のインターフェロンおよびリバビリンのみの療法、ならびに（３）２４週間の３剤併用療法、それに続く１２〜２４週間のインターフェロンおよびリバビリンのみの療法が含まれる。
【００２８】
治療上の組合せの第１の成分、すなわち、化合物（１）または薬学的に許容されるその塩は、組成物中に含まれる。このような組成物は、化合物（１）、または薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容されるアジュバントまたは担体とを含む。化合物（１）、または薬学的に許容されるその塩のために使用し得る典型的な医薬組成物は、米国特許第７，５８５，８４５号に記載されている通りである。
【００２９】
一般に、化合物（１）または薬学的に許容されるその塩は、少なくとも４０ｍｇ／日の投与量（単回用量または分割用量）で投与し得る。投与量および範囲についてのさらなる実施形態には、（単回用量または分割用量で）
（ａ）少なくとも４８ｍｇ／日、
（ｂ）少なくとも１００ｍｇ／日、
（ｃ）少なくとも１２０ｍｇ／日、
（ｄ）少なくとも２００ｍｇ／日、
（ｅ）少なくとも２４０ｍｇ／日、
（ｆ）少なくとも３６０ｍｇ／日、
（ｇ）少なくとも４８０ｍｇ／日、
（ｈ）約４０ｍｇ／日〜約４８０ｍｇ／日、
（ｉ）約４８ｍｇ／日〜約２４０ｍｇ／日、
（ｊ）約１００ｍｇ／日〜約３００ｍｇ／日、
（ｋ）約１２０ｍｇ／日〜約３００ｍｇ／日、
（ｌ）約１２０ｍｇ／日〜約２４０ｍｇ／日、
（ｍ）約２４０ｍｇ／日〜約４８０ｍｇ／日、
（ｎ）約４８ｍｇ／日、
（ｏ）約１２０ｍｇ／日、
（ｐ）約２４０ｍｇ／日、
（ｑ）約３６０ｍｇ／日、
（ｒ）約４８０ｍｇ／日
が含まれる。
【００３０】
化合物（１）または薬学的に許容されるその塩は、単回用量または分割１日用量で投与し得るが、１日用量の１日１回投与が好ましい。しかし、当業者は認識するであろうが、上記に記載したものよりも低いまたは高い用量が必要なことがある。任意の特定の患者についての特定の投与量および治療計画は、年齢、体重、身体全体の健康状態、性別、食事、投与時間、排せつ率、薬物の組合せ、感染の重症度および経過、感染に対する患者の傾向および治療を行う医師の判断を含めた種々の要因によって決まる。一般に、化合物は、有害または害のある副作用をもたらすことなしに、抗ウイルス的に有効な結果が一般に得られる濃度レベルで投与されることが最も望ましい。
治療上の組合せの第２の成分、すなわち、インターフェロン−αは、医薬組成物中に含まれる。典型的には、このような組成物は、インターフェロン−αおよび薬学的に許容されるアジュバントまたは担体を含む注射可能な製剤であり、いくつかの市販されているインターフェロン−α製剤を含めて当技術分野で周知である。例えば、様々な市販されているインターフェロン−α製品、および本明細書において上記で引用したインターフェロン−αに関する様々な特許および他の文献を参照されたい。
【００３１】
組合せにおいて使用し得るインターフェロン−αのタイプは、定義の項に上記で概略する通りである。好ましい一実施形態において、インターフェロンαは、ペグ化インターフェロンαである。さらなる実施形態において、インターフェロンαは、ペグ化インターフェロンα−２ａまたはペグ化インターフェロンα−２ｂである。特に好ましい実施形態において、インターフェロンαは、ＰＥＧＡＳＹＳ（登録商標）またはＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標）である。
公知の市販されているインターフェロンα製品を使用するとき、このような製品は、ＨＣＶ感染の治療のためにインターフェロンおよびリバビリン併用療法に適応される、それらのラベル表示されている投与量レベルで投与し得る。当然ながら、本発明の３剤併用療法によって、このような療法と通常関連する副作用がより少なく、現在の標準的な療法と同じまたはよりよい有効性を実現する一方で、より低い（例えば、現在の標準的なインターフェロンおよびリバビリン療法において使用されるよりも有意に低い）投与量のインターフェロンαを使用することが可能であることがある。
【００３２】
一実施形態において、インターフェロンαは、非経口的に１週当たり１〜３回、好ましくは１週当たり１回または２回投与し得る。ペグ化インターフェロンαに関して、これらは典型的には週１回投与され、１週間の総用量は、ペグ化インターフェロンα−２ｂの場合、例えば約０．５μｇ／ｋｇ／週から約２μｇ／ｋｇ／週の範囲であり、ペグ化インターフェロンα−２ａに関しては、投与量はホストの体重とは無関係であり、典型的には約９０〜２００μｇ／週、さらに好ましくは約１６０〜約２００μｇ／週である。リバビリンと組み合わせて、標準的な投与量のペグ化インターフェロンα−２ｂは、約１．５μｇ／ｋｇ／週であり、標準的な投与量のペグ化インターフェロンα−２ａは、約１８０μｇ／週である（約６００〜１２００ｍｇ／日、特に、８００〜１２００ｍｇ／日の経口リバビリンと共に）。
【００３３】
さらなる実施形態によれば、ペグ化インターフェロンα−２ｂは、
（ａ）約０．５μｇ／ｋｇ／週〜約２μｇ／ｋｇ／週、
（ｂ）約１μｇ／ｋｇ／週〜約２μｇ／ｋｇ／週、
（ｃ）約１．５μｇ／ｋｇ／週〜約２μｇ／ｋｇ／週、
（ｄ）約１．５μｇ／ｋｇ／週
の投与量で投与し得る。
さらなる実施形態によれば、ペグ化インターフェロンα−２ａは、
（ａ）約９０〜約２００μｇ／週、
（ｂ）約１６０〜約２００μｇ／週、
（ｂ）約１８０μｇ／週
の投与量で投与し得る。
【００３４】
治療上の組合せの第３の成分、すなわち、リバビリンは、医薬組成物中に含まれる。典型的には、このような組成物は、リバビリンおよび薬学的に許容されるアジュバントまたは担体を含み、いくつかの市販されているリバビリン製剤を含めて当技術分野で周知である。リバビリンを含む製剤はまた、例えば米国特許第４，２１１，７７１号に開示されている。
【００３５】
組合せにおいて使用し得るリバビリンのタイプは、定義の項において上記で概略する通りである。好ましい一実施形態において、リバビリンはＲＥＢＥＴＯＬ（登録商標）またはＣＯＰＥＧＵＳ（登録商標）であり、ＨＣＶ感染の治療のためのインターフェロンおよびリバビリン併用療法に適応される、それらのラベル表示されている投与量レベルでそれらは投与し得る。当然ながら、本発明の３剤併用療法によって、このような療法と通常関連する副作用がより少なく、現在の標準的な療法と同じまたはよりよい有効性を実現する一方で、より低い（例えば、現在の標準的なインターフェロンおよびリバビリン療法において使用されるよりも低い）投与量のリバビリンを使用することが可能であることがある。
【００３６】
様々な実施形態によれば、リバビリンは、（単回用量または分割用量で）
（ａ）４００ｍｇ／日〜約１２００ｍｇ／日、
（ｂ）約８００ｍｇ／日〜約１２００ｍｇ／日、
（ｃ）約１０００ｍｇ／日〜約１２００ｍｇ／日、
（ｄ）約１０００ｍｇ／日、
（ｅ）約１２００ｍｇ／日、
（ｆ）約３００ｍｇ／日〜約８００ｍｇ／日、
（ｇ）約３００ｍｇ／日〜約７００ｍｇ／日、
（ｈ）５００ｍｇ／日〜約７００ｍｇ／日、
（ｉ）４００ｍｇ／日〜約６００ｍｇ／日、
（ｊ）約４００ｍｇ／日、
（ｋ）約６００ｍｇ／日、
（ｌ）約８００ｍｇ／日
の投与量で投与し得る。
【００３７】
一実施形態によれば、リバビリン組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、または１日６回の投与に適した製剤中にリバビリンを含む。例えば、治療上の組合せが約１０００ｍｇ／日の投与量のリバビリンを含み、かつ１日５回の投与が所望である場合、治療上の組合せは、例えば約２００ｍｇのリバビリンを含有する製剤、例えば錠剤中にリバビリンを含む。
本発明の化合物（１）または薬学的に許容されるその塩およびインターフェロンαおよびリバビリンの３剤併用療法に関して、本発明は、本明細書において上記の様々な好ましい実施形態および部分実施形態の全ての組合せを意図し、それらが含まれる。
例えば、一実施形態において、本発明は、患者に、
（ａ）１日当たり約４８ｍｇから１日当たり約４８０ｍｇの投与量の化合物（１）または薬学的に許容されるその塩と、
（ｂ）約１６０〜約２００μｇ／週の投与量のペグ化インターフェロンα−２ａ、または約０．５μｇ／ｋｇ／週〜約２μｇ／ｋｇ／週の投与量のペグ化インターフェロンα−２ｂと、
（ｃ）約４００ｍｇ／日〜約１２００ｍｇ／日の投与量のリバビリンと
を含む治療上の組合せを投与するステップを含む、患者においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減する方法を意図する。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、患者に、
（ａ）１日当たり約４８ｍｇから１日当たり約４８０ｍｇの投与量の化合物（１）または薬学的に許容されるその塩と、
（ｂ）約１８０μｇ／週の投与量のペグ化インターフェロンα−２ａと、
（ｃ）約１０００ｍｇ／日〜約１２００ｍｇ／日の投与量のリバビリンと
を含む治療上の組合せを投与するステップを含む、患者においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減する方法を意図する。
別の実施形態において、本発明は、患者に、
（ａ）１日当たり約４８ｍｇから１日当たり約４８０ｍｇの投与量の化合物（１）または薬学的に許容されるその塩と、
（ｂ）約１．５μｇ／ｋｇ／週の投与量のペグ化インターフェロンα−２ｂと、
（ｃ）約８００ｍｇ／日の投与量のリバビリンと
を含む治療上の組合せを投与するステップを含む、患者においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療し、または１つもしくは複数のその症状を軽減する方法を意図する。
さらなる実施形態には、上記の実施形態のいずれかが含まれ、
（ａ）ＨＣＶ感染は、遺伝子型１型であり、患者は、未治療患者であり、または
（ｂ）ＨＣＶ感染は、遺伝子型１型であり、患者は、インターフェロンおよびリバビリンの併用療法に対して非反応性である、治療経験のある患者である。
さらなる実施形態には、上記の実施形態のいずれかが含まれ、化合物（１）または薬学的に許容されるその塩は１日１回投与され、インターフェロンαは週１回投与され、リバビリンは１日２回投与される。
【００３９】
別の実施形態によれば、本発明の治療上の投与計画は、患者に、少なくとも約４週間、さらに好ましくは少なくとも約１２週間または少なくとも約２４週間、
（ｉ）１日１回、治療有効量の化合物（１）または薬学的に許容されるその塩と、
（ｉｉ）週１回、治療有効量のインターフェロンαと、
（ｉｉｉ）１日２回、治療有効量のリバビリンと
を投与することを含む。
別の実施形態によれば、本発明は、患者においてＨＣＶ感染を治療するのに使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の治療上の組合せのいずれかを含み得る。キットは、治療上の組合せを利用するための説明書をさらに含む。キットは、患者のクラスもしくはタイプ、または他の臨床的関連要因（年齢、体重、併発した疾患／状態、ＨＣＶ感染の重症度およびステージ、従前の治療に対する反応性または非反応性、副作用についての傾向など）のニーズに合わせ得る。
別の実施形態によれば、本発明は、
（ａ）化合物（１）または薬学的に許容されるその塩を含む第１の医薬組成物と、
（ｂ）インターフェロンαを含む第２の医薬組成物と、
（ｃ）リバビリンを含む第３の医薬組成物と、
（ｄ）上記の組成物を利用するための説明書と
を含むキットを提供する。
【００４０】
さらに、驚くべき結果は、本発明によって意図される併用療法による治療の間に、ＨＣＶウイルス抵抗性の抑制において見出された。単独療法としての化合物（１）（ナトリウム塩）の投与は、ウイルス量の低下が観察された未治療患者の全ての投与群からの患者の大部分において、治療の間最初の１４日において急速なウイルス量のリバウンドをもたらした。対照的に、ペグ化インターフェロンα２ａおよびリバビリン（ＰｅｇＩＦＮ／ＲＢＶ）と組み合わせて、４８ｍｇ（ｎ＝６）、１２０ｍｇ（ｎ＝７）、または２４０ｍｇ（ｎ＝６）の１日１回（ｑｄ）用量の化合物（１）（ナトリウム塩）を２８日間投与された１９人の治療経験のある患者の中で、２８日の治療の間にウイルスのリバウンドは、４８ｍｇ投与群において２／６の患者、および１２０ｍｇ投与群において１／７の患者にのみ観察された。特に、化合物（１）（ナトリウム塩）の２４０ｍｇ（ｑｄ）による治療をペグＩＦＮ／ＲＢＶと組み合わせて投与された治療経験のある投与群において、最初の２８日の間にリバウンドは見出されなかった。
したがって、さらなる実施形態において、本発明の併用療法の間にウイルス抵抗性の出現は限定されるか、または出現しない。より特定の実施形態において、本発明の併用療法の間にＲ１５５および／もしくはＤ１６８および／もしくはＡ１５６の１つもしくは複数においてＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼアミノ酸置換をコードするＨＣＶ変異体の出現は限定されるか、または出現しない。
さらなる実施形態には、上記の実施形態のいずれかが含まれ、
（ａ）ＨＣＶ感染は、遺伝子型１ａであり、患者は、未治療患者であり、または
（ｂ）ＨＣＶ感染は、遺伝子型１ａであり、患者は、インターフェロンおよびリバビリンの併用療法に対して非反応性である、治療経験のある患者であり、
本発明の併用療法の間にＮＳ３プロテアーゼアミノ酸Ｒ１５５において置換をコードする変異体の出現は限定されるか、または出現しない。
さらなる実施形態には、上記の実施形態のいずれかが含まれ
（ａ）ＨＣＶ感染は遺伝子型１ｂであり、患者は、未治療患者であり、または
（ｂ）ＨＣＶ感染は遺伝子型１ｂであり、患者は、インターフェロンおよびリバビリンの併用療法に対して非反応性である、治療経験のある患者であり、
本発明の併用療法の間にＮＳ３プロテアーゼアミノ酸Ｄ１６８において置換をコードする変異体の出現は限定されるか、または出現しない。
【実施例】
【００４１】
Ｉ．化合物（１）を調製する方法
アモルファス化合物（１）を調製する方法は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許６，３２３，１８０号、同第７，５１４，５５７号および同第７，５８５，８４５号に見出すことができる。下記の例１〜５は、本発明に使用し得る化合物（１）のさらなる形態を調製するための方法を提供する。
【００４２】
例１−化合物（１）のタイプＡの結晶形態の調製
アモルファス化合物（１）（バッチ７、１３．８０ｇ）を、１０００ｍｌの三つ口フラスコに加えた。無水エタノール（２４８．９ｇ）を、フラスコに加えた。撹拌している間、フラスコの内容物を、摂氏６０度／時間で摂氏約７４度まで加熱した（固体は摂氏７４度で溶解しない）。次いで、水（２５７．４ｇ）を４時間に亘りこのように得られたスラリーに直線的に加えた、その間撹拌し、温度を摂氏７４度に維持した。水の添加が完了した後、温度を周囲温度に摂氏８度／時間で直線的に低下させ、次いで周囲温度で６時間保持し、その間撹拌した。このように得られた固体を濾過によって集め、１／１（ｗ／ｗ）のＥｔＯＨ／水（５０ｍｌ）で洗浄した。湿った固体をケークによってＮ2を吸引することによって漏斗上で３０分間乾燥させた（この試料のＸＲＰＤ分析は、パターンがＥｔＯＨ溶媒和物と同様であることを示す）。次いで、固体を摂氏６５〜７０度にて真空（ＨｇでＰ＝２５）および窒素流下で１．５時間乾燥させた。このように得られた固体（１２．６ｇ、９５．５％の補正収率）は、ＸＲＰＤによってタイプＡの化合物（１）であると確認した。
【００４３】
例２−化合物（１）のナトリウム塩の調製−方法１
２．１ｇのアモルファス化合物（１）のナトリウム塩および８．９０ｇのアセトンをバイアルに加え、周囲温度で３時間撹拌した。スラリーは濾過した母液であり、このように得られた固体を２０分間窒素流下で２０分間乾燥させた。固体として１．５１ｇの化合物（１）の結晶性ナトリウム塩を集めた。
【００４４】
例３−化合物（１）のナトリウム塩の調製−方法２
１５．６ｇの化合物（１）のタイプＡ、１７５ｍｌのアセトンおよび３．６ｍｌの水を２５０ｍｌの反応器に加え、摂氏５３度に加熱し、固体を溶解した。９００ｕｌのＮａＯＨ（１０．０Ｎ）を反応器に加え、溶液をタイプＡで種晶添加した。種晶添加した溶液を摂氏５３度で１０分間撹拌した。第２の９００ｕｌ部分のＮａＯＨ（１０．０Ｎ）を加え、系を摂氏５３度で３０分間撹拌し、その間にスラリーが発生した。スラリーを、１時間当たり摂氏１５度の冷却速度で摂氏１９度に冷却し、摂氏１９度で一晩保持した。最終的なこのように得られたスラリーを濾過し、湿った固体を１５ｍｌのアセトンで洗浄した。固体を摂氏５２度にて真空下で窒素流により１時間乾燥させ、次いで固体を実験室の空気に１時間曝した。１２．１ｇの化合物（１）の結晶性ナトリウム塩の固体を集めた。
【００４５】
例４−化合物（１）のナトリウム塩の調製−方法３
２５．４Ｋｇのアモルファス化合物（１）、２２８ＬのＴＨＦおよび１１．１Ｋｇの１０重量％ＮａＯＨ（水溶液）を、反応器に加えた。成分を摂氏２５度で混合し、全ての固体を溶解した。このように得られた溶液を濾過し、反応器およびフィルターを２３ＬのＴＨＦで洗浄した。１８０Ｌの溶媒は、摂氏６５度で常圧蒸留を使用して除去した。１９５ＬのＭＩＢＫを加え、１６６Ｌの溶媒を、摂氏約４４度で減圧蒸留によって除去した。１６１ＬのＭＩＢＫおよび０．４１Ｋｇの水を反応器に戻し、内容物を摂氏７０度に加熱した。２５５ｇの化合物（１）のナトリウム塩の種晶を摂氏７０度で加え、１．４２Ｌの水を１．５時間に亘り加えた。水を添加した後、スラリーを摂氏７０度で４５分間保持し、次いで摂氏４５度に１時間に亘り冷却した。このように得られたスラリーを濾過し、約０．８重量％の水を含有する６４ＬのＭＩＢＫで洗浄した。湿ったケークを摂氏５５度で乾燥させ、約２５Ｋｇの化合物（１）の結晶性ナトリウム塩を得た。
【００４６】
例５−化合物（１）のナトリウム塩の調製−方法４
２．００ｇのアモルファス化合物（１）、９．９６ｇのＴＨＦおよび０．１１ｇの水を反応器に加え、周囲温度で撹拌し、固体を溶解した。エタノール中の２１重量％ＮａＯＥＴ（０．８２０ｍｌ）を滴下で添加し、その間溶液を撹拌し、溶液Ａを得た。１５．９ｇのｎ−ＢｕＡｃおよび１６０ｕｌの水を第２の反応器に加え、摂氏６５度に加熱した（溶液Ｂ）。２．５６ｇの溶液Ａを溶液Ｂに摂氏６５度で加え、このように得られた混合物を４０ｍｇの化合物（１）のナトリウム塩の種晶で種晶添加した。種晶添加した混合物を摂氏６５度で４５分間熟成させた。４つの別々の間隔で２．５６ｇの溶液Ｂを溶液Ａに加え、４５分間熟成させた。最後の添加および熟成後に、スラリーを１時間に亘り摂氏５０度に冷却し、濾過した。湿ったケークを０．５重量％の水を含有するｎ−ＢｕＡｃ（６ｍｌ）で洗浄した。最終的な固体を、窒素パージを使用して摂氏５０度にて真空下で乾燥させた。化合物（１）の結晶性ナトリウム塩固体を集めた。
【００４７】
ＩＩ．臨床結果
下記の臨床試験について、投与した製剤は、化合物（１）のナトリウム塩の経口溶液剤であった。化合物（１）のナトリウム塩は、共に供給される溶剤を使用して経口溶液剤を調製するために粉末として医療機関（複数可）に提供した。その溶剤をまた、プラセボとして使用した。
【００４８】
例６−未治療患者による臨床試験
単独療法として、およびペグインターフェロンα２ａ（Ｐ）およびリバビリン（Ｒ）と組み合わせて投与される、慢性Ｃ型肝炎遺伝子型１型感染を有する未治療患者における、新規なＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤である化合物（１）のナトリウム塩の安全性および抗ウイルス活性
背景：化合物（１）のナトリウム塩は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤である（３〜６ｎＭのＥＣ５０）。複数の用量漸増研究によって、慢性ＨＣＶ遺伝子型１型感染を有する未治療患者（ｐｔ）における安全性および抗ウイルス活性を、１４日間単独療法、それに続くさらに１４日間のＰ＋Ｒとの３剤併用療法として評価した。
方法：０〜３のＭｅｔａｖｉｒ線維症スコアを有し、かつ任意のインターフェロンまたはＲによる従前の治療を受けていない３４人の患者（フランス、ドイツ、スペイン、ＵＳＡ）を、１日１回（ｑｄ）の化合物（１）のナトリウム塩（２０ｍｇ（ｎ＝８）、４８ｍｇ（ｎ＝９）、１２０ｍｇ（ｎ＝９）、または２４０ｍｇ（ｎ＝８））の４つの投与群に無作為割り付けした（２人がプラセボ：６人または７人が活性物質）。化合物（１）のナトリウム塩を、単独療法として１４日間投与した。１０日目のウイルス量（ＶＬ）が＜１ｌｏｇ１０で減少したＰｔは、１４日目以降は化合物（１）のナトリウム塩を中断した。１０日目のＶＬが≧１ｌｏｇ１０で減少したＰｔは、１５日目に化合物（１）のナトリウム塩を続け、３剤併用療法のためにＰ（１８０μｇ／週）＋Ｒ（体重に基づく）を２８日目まで加えた。主要エンドポイントは、１４日目までいかなる時点においても≧２ｌｏｇ１０のＶＬの低下であった。血漿ＨＣＶ−ＲＮＡレベルを、Ｒｏｃｈｅ  ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（ＬＬＯＱ２５ＩＵ／ｍＬ）で測定した。２８日目以降、研究者の判断で、患者は標準的な治療、すなわち、Ｐ＋Ｒを続けて受けることができた。
結果：３３人のｐｔは白人、１人はアジア人、２７人は男性、平均年齢＝４８．９±１１．１歳、平均体重７９．１±１７．５ｋｇ、およびベースラインＶＬ中央値（範囲）は６．８（４．７〜７．７）ｌｏｇ１０であった。投与群の間に有意な人口統計上の差異はなかった。化合物（１）のナトリウム塩は耐容性良好であった。単独療法の間に有害事象（ＡＥ）によって治療を中断したｐｔはなかった。観察されたＡＥは、Ｐ＋Ｒに典型的なものであった。１件の重症のＡＥ（無力症）が、Ｐ＋Ｒを開始した６日後に、２０ｍｇ用量のコホートにおいて発生した。ＶＬの急速な減少が、全てのｐｔにおいて観察され、最大減少は典型的には化合物（１）のナトリウム塩を開始した２〜４日後であった。２０ｍｇのコホートにおける１人のｐｔを例外として、化合物（１）のナトリウム塩を投与された全てのｐｔは、単独療法期間の間に＞２ｌｏｇ１０のＶＬの減少を達成した。２０ｍｇ、４８ｍｇ、１２０ｍｇ、および２４０ｍｇの群についての１４日の単独療法の間のＶＬにおける最大低下中央値（範囲）は、各々３．０（１．５〜３．９）、３．６（３．１〜３．８）、３．７（３．３〜４．１）、および４．２（３．６〜４．８）ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌであった。プラセボにおいて、ＶＬの有意な変化は観察されなかった。全ての投与群からの患者の大部分において、治療の間のＶＬのリバウンドが単独療法の最初の１４日に見られた。
【００４９】
結論：１４日間の単独療法としての化合物（１）のナトリウム塩、それに続くさらに１４日間のＰ＋Ｒとの組合せは耐容性良であり、未治療患者において強力で急速な抗ウイルス応答を誘発した。
【００５０】
図１は、この研究の４つの患者投与群、すなわち、１４日日間、単独療法として化合物（１）のナトリウム塩、続いてさらに１４日間、化合物（１）のナトリウム塩、ペグ化インターフェロンα−２ａおよびリバビリンによる併用療法で治療を受けた、慢性ＨＣＶ遺伝子型１型感染を有する未治療患者におけるＨＣＶウイルス量の平均変化を示す。図において、ウイルス量の変化は、ＩＵ／ｍｌ  ｌｏｇ１０単位で示し、４つの患者投与群は、下記のように名前を付ける。
「２０ｎａｉｖ  ａｖ」＝２０ｍｇ投与群についての平均ウイルス量変化
「４８ｎａｉｖ  ａｖ」＝４８ｍｇ投与群についての平均ウイルス量変化
「１２０ｎａｉｖ  ａｖ」＝１２０ｍｇ投与群についての平均ウイルス量変化
「２４０ｎａｉｖ  ａｖ」＝２４０ｍｇ投与群についての平均ウイルス量変化
【００５１】
未治療患者の治療の間の変異体の出現
ベースラインおよび治療の間のリバウンドにおけるＮＳ３／４Ａプロテアーゼの集団配列決定（population sequencing）によって、化合物（１）のナトリウム塩にインビトロの抵抗性を与える変異体の選択が明らかになった。様々な投与群において治療期間を通じて、サブタイプ参照（サブ遺伝子型１ａ：ＡＦ００９６０６、またはサブ遺伝子型１ｂ：ＡＪ２３８７９９）に関連して、ＮＳ３プロテアーゼドメイン内の重要な残基において著しい変化が見出された。詳細については下記の表１〜４を参照されたい。全ての表において、Ｇｔは、ＨＣＶサブ遺伝子型を表し、１日目は、ベースライン配列を表し、示されたアミノ酸置換は、重要な残基において天然ＮＳ３多形である。薬物抵抗性をコードすることがあり、または関連することがあるさらなる変化は、治療の間に異なる日において確認される。
【００５２】
表１
２０ｍｇ投与群の未治療患者からの、集団をベースとするアミノ酸配列（population-based amino acid sequences）における重要な残基における主な変異体（サブタイプ参照に関連して）
0005539363.tif 000006
なし：選択した位置における置換が観察されなかった
ＢＬＤ：ＰＣＲ増幅についての検出限界未満
ＮＤ：未決定
*Ｖ／Ｉ１７０Ｔベースライン多形をコードする。
【００５３】
表２
４８ｍｇ投与群の未治療患者からの、集団をベースとするアミノ酸配列における重要な残基における主な変異体（サブタイプ参照に関連して）。
0005539363.tif 000007
なし：選択した位置における置換が観察されなかった
ＢＬＤ：配列決定について検出限界未満
ＮＤ：未決定
【００５４】
表３
１２０ｍｇ投与群の未治療患者からの、集団をベースとするアミノ酸配列における重要な残基における主な変異体（サブタイプ参照に関連して）
0005539363.tif 000008
なし：選択した位置における置換が観察されなかった
ＢＬＤ：配列決定について検出限界未満
ＮＤ：未決定
【００５５】
表４
２４０ｍｇ投与群の未治療患者からの、集団をベースとするアミノ酸配列における重要な残基における主な変異体（サブタイプ参照に関連して）
0005539363.tif 000009
なし：選択した位置における置換が観察されなかった
ＢＬＤ：ＰＣＲ増幅および配列決定について検出限界未満
ＮＤ：未決定
【００５６】
例７−治療経験のある患者による臨床試験
慢性Ｃ型肝炎遺伝子型１型感染を有するＰ＋Ｒ治療経験のある患者における、２８日間のペグインターフェロンα２ａ（Ｐ）およびリバビリン（Ｒ）による併用療法における、新規なＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤である化合物（１）のナトリウム塩の安全性および抗ウイルス活性
背景：化合物（１）のナトリウム塩は、ＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤である（３〜６ｎＭのＥＣ５０）。複数の用量漸増研究によって、慢性Ｃ型肝炎遺伝子型１型感染を有するＰ＋Ｒ治療経験のある患者（ｐｔ）における安全性および抗ウイルス活性を、２８日日間のＰ＋Ｒとの併用療法として評価した。
【００５７】
方法：Ｐ＋Ｒ併用療法によってウイルス学的反応がないことを従前に経験した、０〜３のＭｅｔａｖｉｒ線維症スコアを有する１９人のｐｔ（フランス、ドイツ、スペイン、ＵＳＡ）を割り付け、２８日間Ｐ（１８０μｇ／ｗｋ）＋Ｒ（体重に基づく）と組み合わせた、４８ｍｇ（ｎ＝６）、１２０ｍｇ（ｎ＝７）、または２４０ｍｇ（ｎ＝６）の１日１回（ｑｄ）用量の化合物（１）のナトリウム塩を投与した。全ての患者を、治験薬の安全性および耐容性についてモニターした。主要エンドポイントは、２８日目までいかなる時点においても、ＨＣＶウイルス量（ＶＬ）のベースラインからの≧２ｌｏｇ１０低下であった。血漿ＨＣＶ−ＲＮＡレベルは、Ｒｏｃｈｅ  ＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイを使用して測定した（ＬＬＯＱ２５ＩＵ／ｍＬ）。この研究において治療経験のある患者には、Ｐ＋Ｒ無反応者および部分的反応者が含まれた。２８日目以降、研究者の判断で、患者は標準的な治療、すなわち、Ｐ＋Ｒを続けて受けることができた。
【００５８】
結果：１９人のｐｔは白人、１１人は男性、平均年齢は４８±９歳、平均体重は８１±１５ｋｇ、およびベースラインＶＬ中央値（範囲）は６．９（５．９〜７．４）ｌｏｇ１０であった。投与群の間に有意な人口統計上の差異はなかった。化合物（１）のナトリウム塩は耐容性良好であり、この研究においてｐｔの間に重大または重度の有害事象（ＡＥ）は観察されなかった。ＡＥは、Ｐ＋Ｒに典型的なものであった。１人の対象は、ＡＥ（不安）によって治療を停止した。ＶＬの急速な用量関連減少が、全てのｐｔにおいて観察された。化合物（１）のナトリウム塩＋Ｐ＋Ｒで治療された全てのｐｔは、３剤併用療法で＞２ｌｏｇ１０のＶＬの減少を達成した。４８ｍｇ、１２０ｍｇ、および２４０ｍｇ用量のコホートについて２８日の併用療法の間のＶＬの最大減少中央値（範囲）は、各々４．８（３．４〜５．９）、５．２（３．９〜６．０）、および５．３（４．８〜６．１）ｌｏｇ１０ＩＵ／ｍｌであった。治療の間のウイルスのリバウンドは、化合物（１）のナトリウム塩＋Ｐ＋Ｒ投与の最初の２８日の間に観察された（４８ｍｇ投与群において２／６ｐｔ、１２０ｍｇ投与群において１／７ｐｔ）。これらの患者において、ベースラインおよび治療の間のウイルスのリバウンドにおけるＮＳ３／４Ａプロテアーゼの集団配列決定によって、化合物（１）のナトリウム塩にインビトロの抵抗性を与えることが示されたＮＳ３プロテアーゼドメインにおける変異体の選択が明らかになった。１２０ｍｇ投与群における１人の患者は、ウイルスのリバウンドを示さなかったが、２８日目までに約５００コピーＩＵ／ｍｌのＶＬで横ばい状態となり、Ｒ１５５Ｋ突然変異体をコードした。このウイルス量試料は、本発明者らの表現型抵抗性アッセイにおいて検出下限未満であった。
【００５９】
２８日のＢＩ２０１３３５治療の間に、２４０ｍｇ（ｑｄ）用量のコホートにおいてリバウンドは見出されなかった。５／６ｐｔは、２８日目に＜２５ＩＵ／ｍＬのＶＬを有した。６人目のｐｔは、２８日目においてＶＬのベースラインから４．７ｌｏｇ１０で減少し、ＶＬは次の来診（４２日目）において＜２５ＩＵ／ｍｌであった。
【００６０】
結論：２８日間のＰ＋Ｒとの併用療法における１日１回投与の化合物（１）のナトリウム塩は、耐容性良好であり、治療経験のある患者において強力で急速な抗ウイルス応答を誘発した。
【００６１】
図２は、この研究についての３つの患者投与群、すなわち、併用療法として化合物（１）のナトリウム塩、ペグ化インターフェロンα−２ａおよびリバビリンで２８日間治療を受けた慢性ＨＣＶ遺伝子型１型感染を有する治療経験のある患者におけるＨＣＶウイルス量の平均変化を示す。図において、ウイルス量の変化は、ＩＵ／ｍｌ  ｌｏｇ１０単位で示し、４つの患者投与群は、下記のように名前を付ける。
「４８ＮＲ  ａｖ」＝４８ｍｇ投与群について平均ウイルス量変化
「１２０ＮＲ  ａｖ」＝１２０ｍｇ投与群について平均ウイルス量変化
「２４０ＮＲ  ａｖ」＝２４０ｍｇ投与群について平均ウイルス量変化
この研究における患者のウイルス学的反応に関する特定のパラメータ（ウイルス量の低下）を、下記の表に示す（「Ｄ」＝日、「ＱＤ」＝１日１回、「Ｎ」＝患者の数、「定量化の限界未満」は、血清１ｍｌ当たり２５ＩＵ未満を意味する）。
【００６２】
１２２０．２治験経験のある患者におけるウイルス学的反応
0005539363.tif 000010
【００６３】
治療経験のある患者の治療の間の変異体の出現
様々な投与群において治療期間を通じて、サブタイプ参照（サブ遺伝子型１ａ：ＡＦ００９６０６、またはサブ遺伝子型１ｂ：ＡＪ２３８７９９）に関連して、ＮＳ３プロテアーゼドメイン内の重要な残基において著しい変化がある。詳細については下記の表１〜４を参照されたい。全ての表において、Ｇｔは、ＨＣＶサブ遺伝子型を表し、１日目は、ベースライン配列を表し、示されたアミノ酸置換は、重要な残基において天然ＮＳ３多形である。薬物抵抗性をコードすることがあり、または関連することがあるさらなる変化は、治療の間に異なる日において確認される。
【００６４】
表５
治療経験のある４８ｍｇ投与群からの、集団をベースとするアミノ酸配列における重要な残基における主な変異体（サブタイプ参照に関連して）。
0005539363.tif 000011
なし：選択した位置における置換が観察されなかった
ＢＬＤ：ＰＣＲ増幅および配列決定について検出限界未満
【００６５】
表６
治療経験のある１２０ｍｇ投与群からの、集団をベースとするアミノ酸配列における重要な残基における主な変異体（サブタイプ参照に関連して）。
0005539363.tif 000012
なし：選択した位置における置換が観察されなかった
ＢＬＤ：ＰＣＲ増幅および配列決定について検出限界未満
*ＶＬは、これらの時点において＜１０００ＩＵ／ｍｌで横ばい状態になる。
【００６６】
表７
治療経験のある２４０ｍｇ投与群からの、集団をベースとするアミノ酸配列における重要な残基における主な変異体（サブタイプ参照に関連して）
0005539363.tif 000013
なし：選択した位置における置換が観察されなかった
ＢＬＤ：ＰＣＲ増幅および配列決定について検出限界未満
【００６７】
全体的評価
これらの結果は、単独療法として１４日間１日１回投与の化合物（１）のナトリウム塩で治療された未治療患者において強力で非常に急速な抗ウイルス作用を示し、これに続いて５〜６日の単独療法の後に抗ウイルス抵抗性形成およびウイルス量の増加が起こる。しかし、１４日目の本発明の３剤併用療法の開始によって（化合物（１）のナトリウム塩、ならびにペグ化インターフェロンα２ａおよびリバビリン）、ウイルス量は連続的に減少したが、これは未治療患者において本発明の３剤併用療法の抗ウイルス有効性を示す。図１を参照されたい。
【００６８】
化合物（１）のナトリウム塩を、治療経験のある患者（インターフェロンおよびリバビリンの無反応者および部分的反応者）に、ペグ化インターフェロンα２ａおよびリバビリンと組み合わせて２８日間１日１回の投与したとき、その結果は、抵抗性形成が低下するが同じ強力で非常に急速な抗ウイルス応答を示す。図２を参照されたい。このような治療経験のある非反応者である患者において、これらの患者はペグ化インターフェロンおよびリバビリン療法に対して非反応性であることにより選択されたため、同様のウイルス抵抗性が５日目以降に起こるであろうと予期されるであろう。しかし、連続的なウイルス抑制が起こった。
【００６９】
本質的に、本発明の３剤併用療法は、慢性Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子型１型感染を有する未治療および治療経験のある患者のウイルス量を効果的に低下することができ、少なくとも何人かの患者においては、それを検出可能レベル未満（ＷＨＯ国際標準による定量的なマルチサイクルのリバーストランスクリプターゼＰＣＲ法によって測定すると、患者の血清１ｍｌ当たり５０国際単位未満と定義される）に保持することが示された。好ましい実施形態において、本発明の３剤併用療法は、ＨＣＶ遺伝子型１型感染患者におけるウイルス量を、血清１ｍｌ当たり１０国際単位未満に効果的に低下することができる。
【００７０】
明確に驚くべき結果には、以下が含まれる。
（１）ウイルス抵抗性を経験した未治療患者における化合物（１）のナトリウム塩単独の同じ用量の作用と比較して（図１を参照されたい、最初の１４日）、標準的な用量のペグ化インターフェロンα２ａおよびリバビリンと組み合わせた化合物（１）のナトリウム塩で治療された治療経験のある患者において早期の抵抗性形成（例えば、Ｒ１５５および／またはＤ１６８においてＮＳ３アミノ酸置換をコードする変異体）がない（図２）。治療経験のある患者において、これらの患者は従前のペグ化インターフェロンおよびリバビリン併用療法に対して非反応性であることにより選択されたため、ペグ化インターフェロンα２ａおよびリバビリンを添加しても、５日目以降同様のウイルス抵抗性が起こるであろうと予期されるであろう。
（２）ペグ化インターフェロンおよびリバビリンと組み合わせた１２０ｍｇ  ＱＤ（１日１回）のみの用量は、ペグ化インターフェロンおよびリバビリン療法に対して従前に非反応性であった治療経験のある患者の５０％超において、定量化レベル未満（血清１ｍｌ当たり２５ＩＵ未満として定義される）までのウイルスの減少を誘発した（表を参照されたい）。
【００７１】
例８−ＨＣＶ  ＮＳ３変異体を同定する方法
ウイルスＲＮＡ抽出およびＰＣＲ増幅
ウイルスＲＮＡをＨＣＶ感染した対象の血漿から単離し、完全なＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域を含有する２．４ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ＩＩＩワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにＮＳ２における位置３２７６およびＮＳ４Ｂにおける５６５０をスパンする２つの遺伝子特異的プライマーを使用して最初に合成した。最初のＰＣＲ産物の精製後、２．３ｋｂｐまたは０．７ｋｂｐの２つの異なる２回目のセミネステッドＰＣＲ産物（各々、全ＮＳ３／ＮＳ４ＡまたはＮＳ３プロテアーゼドメインのみをスパンする）を、次いでＫＯＤ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して生じさせた。ＲＴ−ＰＣＲ増幅法の検出限界によって、分析は１０００ＩＵ／ｍｌを超えるＶＬを有する患者試料に限定された。
【００７２】
配列分析
次いで、ＢＩＧ  ＤＹＥ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１３０ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、２．３ｋｂｐのＤＮＡ産物を、全ＮＳ３−ＮＳ４Ａの２０５５ｎｔ領域の直接の集団をベースとする配列決定のために使用した。配列は１０個のプライマーから得て、ＮＳ３−ＮＳ４Ａ領域について少なくとも９０％の二本鎖カバレッジ（double strand coverage）を達成した。このように得られたヌクレオチド配列は、ＳＥＱＳＣＡＰＥ（登録商標）ｖ２．５（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。
【００７３】
０．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを使用して、ＮＳ３の最初の１８１ａａを包含する５４３ｎｔのＮＳ３プロテアーゼ領域の、クローンをベースとする（ＺＥＲＯＢＬＵＮＴ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）クローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）配列を生じさせた。各試料について、９６のクローンを取り上げ、ユニバーサルプライマーを使用してＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＢＩＧ  ＤＹＥ（商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  ＰＣＲ配列決定によって配列決定した。各クローンについて２回のシングルパス配列を行い、ＭＵＴＡＴＩＯＮ  ＳＵＲＶＥＹＯＲ（商標）ｖ３．０（Ｓｏｆｔｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＬＬＣ）で分析して、５４３ｎｔ領域の９０〜１００％の二本鎖カバレッジをもたらした。各患者試料について、質の低い配列を有する、または欠失、挿入もしくは終止コドンを含有するクローンは、さらなる分析のために含めなかった。そのため分析したクローンの数は７４〜８９で変動した（中央値および平均は８０クローン）。
【００７４】
このように得られた配列を、ＴＲＵＥＧＥＮＥ（商標）ＨＣＶ５’ＮＣジェノタイピングアッセイによるトライアルスクリーニング相の間に事前に決定したそれらの各々のサブタイプによる参照配列と比較した。ＡＦ００９６０６はサブタイプ１ａへの参照としての役割を果たし、ＡＪ２３８７９９はサブタイプ１ｂへの参照としての役割を果たした。ＮＳ３プロテアーゼドメイン中の１５の位置における、アミノ酸置換をもたらす変異に特に注意を集中させた。これらの位置は、このクラスの化合物に抵抗性を潜在的に与えるものとして全て事前に報告されていた。これらの位置は、３６、４１、５４、７１、８０、８６、８９、１０９、１１１、１５５、１５６、１６８、１７０、１７６および１７８である（参考文献：［１］Ｔｏｎｇ  Ｘ、Ｂｏｇｅｎ  Ｓ、Ｃｈａｓｅ  Ｒ、Ｇｉｒｉｊａｖａｌｌａｂｈａｎ  Ｖ、Ｇｕｏ  Ｚ、Ｎｊｏｒｏｇｅ  ＦＧ、Ｐｒｏｎｇａｙ  Ａ、Ｓａｋｓｅｎａ  Ａ、Ｓｋｅｌｔｏｎ  Ａ、Ｘｉａ  Ｅ、Ｒａｌｓｔｏｎ  Ｒ、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＣＶ  ｋｅｔｏａｍｉｄｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．、２００８、３月、７７（３）：１７７〜１８５、［２］Ｌａｇａｃｅ  Ｌ、Ｍａｒｑｕｉｓ  Ｍ、Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  Ｃ、Ｄｏ  Ｆ、Ｇｉｎｇｒａｓ  Ｒ、Ｌａｍａｒｒｅ  Ｄ、Ｌａｍａｒｒｅ  Ｌ、Ｍａｕｒｉｃｅ  Ｒ、Ｐａｕｓｅ  Ａ、Ｐｅｌｌｅｒｉｎ  Ｃ、Ｓｐｉｃｋｌｅｒ  Ｃ、Ｔｈｉｅａｕｌｔ  Ｄ、およびＫｕｋｏｌｊ  Ｇ、ＢＩＬＮ  ２０６１  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ：ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＣＶ  ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａ  ＮＳ３  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  Ｉｎ  Ｆｒａｍｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ．、ＲＦ  ＳｃｈｉｎａｚｉおよびＥＲ  Ｓｃｈｉｆｆ（編）、Ｐ２６３〜２７８、ＩＨＬ  ｐｒｅｓｓ、２００６、［３］Ｋｏｅｖ  Ｇ、Ｋａｔｉ  Ｗ、Ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｒｕｇｓ、１７（３）、３０３〜３１９、２００８（Ｐ０８−０３８９５）
【００７５】
薬物感受性アッセイ
ルシフェラーゼレポーター遺伝子および適合Ｃｏｎ−１ＮＳ３／ＮＳ５Ｂ領域（adapted Con-1 NS3 /NS5B region）を含むバイシストロニックなＨＣＶレプリコンシャトルベクター（ｐＩＴ２）を改変し、ＮＳ３コドン１１および２２５において２つの独特の制限部位（Ｍｌｕ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉ）を生じさせ、それによってＨＣＶ感染患者の血漿試料から単離した適合性のＮＳ３単位複製配列の挿入が可能となった。精製した患者血漿のＲＮＡ（集団およびクローンをベースとする配列決定のためのフラグメントを生じさせるためにまた使用した）から合成した１回目のＰＣＲ産物を使用して、シャトルベクターへの挿入のための独特のＭｌｕＩおよびＳｐｅＩ制限部位を各々含有するプライマー対を有する０．６５ｋｂｐのフラグメントを増幅した。単位複製配列をｐＩＴ２シャトルベクター中に連結させ、再構成プラスミドＤＮＡを使用して、ＨＣＶサブゲノムレプリコンＲＮＡ転写を生じさせた（Ｔ７ＲＩＢＯＭＡＸ（商標）キット、Ｐｒｏｍｅｇａ）。インビトロで転写されたＲＮＡを、Ｈｕｈ−７．５細胞中で電気穿孔法によって一時的にトランスフェクトし、次いでそれを９６ウェルプレート中に２４時間接種し、一連の濃度の化合物（１）のナトリウム塩（またはＩＦＮ−α）で７２時間の期間処理した。培養プレートの各ウェル中の定量化した発光（ＣＰＳ）がＨＣＶ  ＲＮＡ複製の量を反映するため、インキュベーションの終わりに、ＢＲＩＧＨＴ−ＧＬＯ（商標）基質でルシフェラーゼ活性を測定した。阻害剤を含有する各ウェルにおける阻害レベル（％阻害）を下記の式で計算した。％阻害＝１００−［１００×ＣＰＳ（阻害剤）／ＣＰＳ（対照）］。ＨＣＶ  ＲＮＡ複製の５０％阻害を生じさせる濃度（ＥＣ50）を、ＳＡＳの非線形回帰ルーチンＮＬＩＮ手順によって決定した。突然変異体ＮＳ３のＥＣ50をベースラインＥＣ50と比較し、倍率変化値を得るために使用した。
【００７６】
治療中のウイルスリバウンド試料における主な遺伝子型１ａの抵抗性変異はＲ１５５Ｋ置換をコードし、他の少数変異体は、この位置におけるクローン配列分析によって検出した。Ｒ１５５Ｋ変異体は、１．８〜６．５μＭのＥＣ50値の範囲で、ＢＩ２０１３３５への感受性の低下をもたらした。遺伝子型１ｂウイルスは、バリンを主な置換としてＤ１６８における変化を主にコードし、他の少数変異体は感受性のクローン配列決定によって検出した。Ｄ１６８変異体についてのＥＣ50値は、３．６〜１５μＭの範囲であった。このプロファイルは、遺伝子型１ｂ（リシンへの変更をコードするのに２つのヌクレオチド置換を必要とする）に対して、遺伝子型１ａ（単一のヌクレオチド転移が、コドンをリシンに変更する）中のＲ１５５コドンにおける抵抗性に対する異なる変異障害に部分的に起因し得る。
【図１】
0005539363.tif 000017
【図２】
0005539363.tif 000018