(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）フローセル；
ｂ）前記フローセルに光を当てるための光源；
ｃ）前記フローセルを通過する血球の複数の光学特性を検出するための複数の検出器；及び
ｄ）データ分析ワークステーション；
を含む、血液分析器であって、
前記データ分析ワークステーションが、
ｉ．前記フローセルを通過する被検血球を計数し；
ｉｉ．前記被検血球についてのデータを分析して前記被検血球の特性を表す値を得、
前記値を複数の参照サンプルの分析から得た基準と比較し、
前記値が前記基準を満たしている場合、溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして血液サンプルにフラグを付けることにより、
溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして、前記血液サンプルにフラグを付けるようプログラムされている、前記血液分析器。
【請求項２】
前記検出器が、軸方向光損失（ＡＬＬ）、中角散乱光（ＩＡＳ）及び偏光解消側方散乱光（ＤＳＳ）を検出する、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項３】
前記データ分析ワークステーションが、血液分析器により分析した、少なくとも５０個の前の参照サンプルから得たデータを含んだメモリーを含む、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項４】
前記データ分析ワークステーションが、血液サンプルを前記分析器で分析中に、前記データを連続的に更新するようプログラムされている、請求項３に記載の血液分析器。
【請求項５】
前記値が、前記被検血球についてのデータを前記少なくとも５０個の参照サンプルから得た前記データと比較することにより得られる、請求項３に記載の血液分析器。
【請求項６】
前記基準が、少なくとも５０個の固定参照サンプルからのデータから得た静的基準である、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項７】
前記値が、前記基準を満たしている場合、溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして、前記血液の溶解サンプルにフラグを付けるレポートを提出する、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項８】
前記値が、一定期間にわたる、前記溶解サンプル中の前記細胞の数の減少率を示し、
前記減少率が、前記溶解血液の参照サンプル中の細胞の数の平均減少率よりも有意に大きい場合、前記血液の溶解サンプルにフラグを付ける、
請求項１に記載の血液分析器。
【請求項９】
前記値が、一定期間にわたる、前記溶解サンプル中の前記細胞の総数の減少率を示し、
前記減少率が、前記溶解血液の参照サンプル中の細胞の総数の平均減少率よりも有意に大きい場合、前記血液の溶解サンプルにフラグを付ける、
請求項８に記載の血液分析器。
【請求項１０】
前記値が、一定期間にわたる、前記溶解サンプル中のリンパ球として分類される細胞の数の減少率を示し、
前記減少率が、前記溶解血液の参照サンプル中のリンパ球として分類される細胞の数の平均減少率よりも有意に大きい場合、前記血液の溶解サンプルにフラグを付ける、
請求項８に記載の血液分析器。
【請求項１１】
前記値が、一定期間にわたる、リンパ球として分類される細胞の数の減少の上昇または低下率を示し、
減少率上昇が、前記血液の溶解サンプルが脆弱白血球を含有していることを示し、
減少率低下が、前記血液の溶解サンプルが溶解耐性赤血球を含有していることを示す、
請求項８に記載の血液分析器。
【請求項１２】
前記データが、リンパ球として分類される細胞についての軸方向光損失（ＡＬＬ）及び中角散乱光（ＩＡＳ）値を含み、
前記値が、細胞についての平均ＡＬＬ及びＩＡＳ値に基づいており、
前記基準が、前記参照細胞についてのＡＬＬ及びＩＡＳ値の平均のメジアンに基づいている、
請求項１に記載の血液分析器。
【請求項１３】
前記値が、前記溶解サンプル中の前記細胞についての平均ＡＬＬ及びＩＡＳ値と、前記血液分析器により予め分析した、少なくとも５０個の参照サンプルについての平均ＡＬＬ及びＩＡＳ値のメジアンとの距離である、請求項１２に記載の血液分析器。
【請求項１４】
前記データが、リンパ球として分類される細胞についてのＡＬＬ及びＩＡＳ値を含み、
前記値が、ａ）予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞の数を、ｂ）前記予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界に隣接するＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞の数で割った比であり、
前記基準が、前記参照サンプルについての前記予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界に隣接するＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞の数に対する、予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞の数に基づいている、
請求項１に記載の血液分析器。
【請求項１５】
前記データが、リンパ球として分類される細胞についての偏光解消側方散乱光（ＤＳＳ）値を含み、
前記値が、ＤＳＳ値の分布及び／または歪の程度を示し、
前記基準が、前記参照サンプルについてのＤＳＳ値の分布及び／または歪の程度に基づいている、
請求項１に記載の血液分析器。
【請求項１６】
前記データが、リンパ球として分類される細胞についての偏光解消側方散乱光（ＤＳＳ）値を含み、
前記値が、ＤＳＳ値の分布におけるゼロ−ビンデータポイントの数を示し、
前記基準が、前記参照サンプルについてのＤＳＳ値の分布におけるゼロ−ビンデータポイントの数に基づいている、
請求項１に記載の血液分析器。
【請求項１７】
前記方法が、
細胞の対応する複数の異なる特性についての複数の値を計算し、
前記値を複数の参照サンプルの分析から得た対応する複数の異なる基準と比較して複数のスコアを得、
前記スコアの合計が閾値を超えている場合、溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして、前記血液サンプルにフラグを付ける、
ことを含む、請求項１に記載の血液分析器。
【請求項１８】
前記フラグ付けが、スコアを重みづけして前記合計を得ることを含む、請求項１７に記載の血液分析器。
【請求項１９】
溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして、血液のサンプルにフラグを付ける方法であって、
ａ）全血液サンプル中の赤血球を溶解して血液の溶解サンプルを作成し、
ｂ）血液の溶解サンプルを血液分析器を用いて分析して前記溶解サンプル中の細胞についてのデータを得、
ｃ）前記データを分析して細胞の特性を表す値を得、
ｄ）前記値を複数の溶解血液の参照サンプルの分析から得た基準と比較し、
ｅ）前記値が前記基準を満たしている場合、溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして、前記血液の溶解サンプルにフラグを付けることを含む、
溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして、血液のサンプルにフラグを付ける方法。
【請求項２０】
血液分析器で使用するための物理的コンピュータ読取可能媒体であって、
前記血液分析器により分析した被検血球についてのデータを分析して被検血球の特性を表す値を得、
前記値を複数の参照血球を含む参照サンプルの分析から得た基準と比較し、
前記値が前記基準を満たしている場合、溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして、血液サンプルにフラグを付けることにより、
溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとして、前記血液サンプルにフラグを付けるようプログラムすることを含む、
血液分析器で使用するための物理的コンピュータ読取可能媒体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
フローサイトメトリーは、流体流中に懸濁しているミクロ粒子をカウントし、検査し、選別するための技術である。フローサイトメトリーにより、光学／電子検出装置中を流れる単細胞の物理的及び／または生化学的特性を同時にマルチパラメトリック分析することができる。血液分析器中に使用すると、フローサイトメトリーにより計測容量の血液または他の生物学的流体サンプル中の細胞を正確にカウントし、これらの細胞を光散乱及び／または蛍光検出の使用に基づいて同定することができる。
【０００２】
本発明は、一部は血液分析器及び血液サンプルに溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けるための方法に関する。
【発明の概要】
【０００３】
血液分析器を提供する。ある実施形態では、血液分析器は、ａ）フローセル、ｂ）フローセルに光を当てるための光源、ｃ）フローセルを通過する血球の複数の光学特性を検出するための複数の検出器、及びｄ）ｉ．フローセルを通過する被検血球を計数し、ｉｉ．血液サンプルに溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けるようにプログラムされているデータ分析ワークステーションを含む。フラッギング（フラグ付け）は、被検血球についてのデータを分析して被検血球の特性を表す値を得、前記値を複数の血球を含む参照サンプルの分析から得た基準と比較し、前記値が前記基準を満たしている場合、血液サンプルに溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けることにより実施され得る。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】典型的な血液分析器の光学サブアセンブリの略図である。
【図２】サンプルにフラグを付ける際の総数勾配の使用を示すグラフである。
【図３】一組の正常参照サンプルについての総数勾配及びその下にフラッギングスコアが集積している閾値を示すプロットである。
【図４】一組の正常参照サンプルについてのリンパ球勾配及びその下にフラッギングスコアが集積している閾値を示すプロットである。
【図５】一組の正常参照サンプルについてのリンパ球ピーク距離の分布及びその上にフラッギングスコアが集積している閾値を示すグラフである。
【図６】リンパ球ボックス数比を調べるためのボックスの典型的なポジショニングを示すグラフである。
【図７】一組の正常参照サンプルについてのボックス数比の分布及びその上にフラッギングスコアが集積している閾値を示すグラフである。
【図８】複数の組の慢性リンパ球性白血病サンプル、正常サンプル及び溶解耐性赤血球サンプルについての偏光解消側方散乱光検出チャネル中のリンパ球の分布を示す一組の３ヒストグラムである。
【図９】幾つかのサンプルについての偏光解消側方散乱の変動係数及び歪をプロットしたグラフである。
【図１０】一組の正常参照サンプルについての偏光解消側方散乱光に基づくメトリックの値及びその上にフラッギングスコアが集積している閾値を示すグラフである。
【図１１】一組の正常参照サンプルについてのスケール化偏光解消側方散乱光ゼロ−ビン値及びフラッギングスコアを計算し、フラグを立てる際に使用される２つの閾値を示すグラフである。
【図１２】一組の正常参照サンプルについてのフラッギングスコア及びフラグを立てる際に使用される閾値を示すグラフである。
【図１３Ａ】サンプルがｒＲＢＣかまたはｆＷＢＣを含有するのかを調べるために、最良のあてはめ線の二次係数の符号をどのように使用し得るかを示すグラフである。
【図１３Ｂ】サンプルがｒＲＢＣかまたはｆＷＢＣを含有するのかを調べるために、最良のあてはめ線の二次係数の符号をどのように使用し得るかを示すグラフである。
【図１３Ｃ】サンプルがｒＲＢＣかまたはｆＷＢＣを含有するのかを調べるために、最良のあてはめ線の二次係数の符号をどのように使用し得るかを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は記載されている具体的バリエーションに限定されず、勿論変更し得ることを理解されるべきである。本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく記載されている本発明に対して各種変化を加えることができ、均等物が置換され得る。加えて、本発明の目的、趣旨または範囲に対して特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセス行動またはプロセスステップを改変させるように多くの修飾を加え得る。前記した修飾のすべてが本明細書中に記載されている特許請求の範囲内であると意図される。
【０００６】
本明細書中に記載されている方法のステップは、論理的に可能な記載されている事象の順序または事象の記載されている順序で実施され得る。更に、値の範囲が与えられている場合、その範囲の上限及び下限の間に介在するすべての値並びに記載されている範囲中の他の挙げられているまたは介在する値が本発明の範囲内に包含されると理解される。また、記載されている本発明のバリエーションの任意の要件が本明細書に記載されている１つ以上の要件と独立してまたは組み合わせて記載され、特許請求され得ると考えられる。
【０００７】
文献は本出願の出願日前の開示のためにのみ提示される。本発明が先発明の理由でこれらの文献に先行する資格がないことを容認すると解釈されるものはない。
【０００８】
単数項目への言及は存在する同一項目が複数ある可能性を含む。より具体的には、本明細書中及び添付の特許請求の範囲で使用されている単数形“ａ”、“ａｎ”、“ｓａｉｄ”及び“ｔｈｅ”は明白に別段の指示がない限り複数の言及を含む。例えば、値を「基準」と比較する場合、その値を１つ以上の基準、すなわち１つの基準または複数の基準と比較し得る。更に、特許請求の範囲が任意の要件を排除するように起案し得ることに注目されたい。よって、この記述は、特許請求の範囲の要件の詳説に関連して「唯一」、「単に」等のような排除する用語の使用、または「否定的」限定の使用に対する先行詞として役立つと意図される。
【０００９】
本明細書中、以下の略号が使用されている：ＲＢＣ（赤血球）、ｒＲＢＣ（溶解耐性赤血球）、ＷＢＣ（白血球）、ｆＷＢＣ（脆弱白血球）、ＤＳＳ（偏光解消側方散乱光）、ＣＬＬ（慢性リンパ球性白血病）、ＡＬＬ（軸方向光損失）、ＩＡＳ（中角散乱光）、ＰＳＳ（偏光側方散乱光）及びＤＳＳ（偏光解消側方散乱光）、ＮＥＵ（好中球）、ＬＹＭ（リンパ球）、ＭＯＮ（単球）、ＭＣＶ（平均細胞容積）、ＲＤＷ（赤血球分布幅）、ＰＬＴ（血小板）、ＣＢＣ（総血球数）、ＨＧＢ（ヘモグロビン）及びＦＣＳ（フローサイトメトリー標準）。
【００１０】
本明細書中、我々は、分析器により捕捉され、自動内部アルゴリズムにより（例えば、ＲＢＣ、リンパ球等として）分類される検出事象の集団のデジタル表示を表すべく用語「ＦＣＳファイル」を使用する。ＦＣＳファイル中の事象は、事象が検出時間により逐次並べられるリスト中に配置されているＦＣＳファイルフォーマットの１つのアスペクトを反映する「リストモード」とも称され得る。
【００１１】
血液分析器
上述したように、ａ）被検血球を計数し、ｂ）血液サンプルに溶解耐性赤血球（ｒＲＢＣ）または脆弱白血球（ｆＷＢＣ）を含有するとしてフラグを付けることができる血液分析器を提供する。被検サンプルについてのデータを分析して被検サンプル中の血球の特性を表す値を得；前記値を血球を含む複数の参照サンプルの分析から得た基準と比較し；前記値が前記基準を満たしている場合、血液サンプルに溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けることによりサンプルにｒＲＢＣまたはｆＷＢＣを含有するとしてフラグを付け得る。
【００１２】
以下に記載する方法は通常血液分析器を含めた適当なフローサイトメーターで使用され得、前記した血液分析器の例は当業界で公知であり、例えば米国特許５，３７８，６３３、５，６３１，１６５、６，５２４，８５８、５，２６６，２６９、５，０１７，４９７及び６，５４９，８７６、並びに米国特許出願公開ＵＳ２００８０１５３１７０、ＵＳ２００８０１５８５６１及びＵＳ２００８０２６８４９４に記載されている。これらの文献の開示内容は参照により本明細書に組み入れるとする。血液分析器は、特に総白血球の濃度及び白血球亜群の濃度を測定するために全血のサンプルを分析する。前記白血球亜群には、好中球、リンパ球、単球、好酸球及び好塩基球が含まれるが、これらに限定されない。典型的な血液分析器の光学サブアセンブリを図１に概略的に図示する。当業者は、部品の選択、数及び設計（例えば、使用するレーザーのタイプ、光学部品の数及び仕様等）は分析器間で大きく異なり、よって図１の血液分析器は例として提示されており、この開示に限定するように使用されるべきでないことを認識している。例えば、ある例では、血液分析器が蛍光を検出してもしなくてもよい。
【００１３】
ここで図１を参照すると、典型的な血液分析器１０は、光源１２、ビームを曲げるためのフロントミラー１４及びバックミラー１６、第１円柱レンズ２０及び第２円柱レンズ２２を含むビームエクスパンダーモジュール１８、焦点レンズ２４、ファインビームアジャスタ２６、フローセル２８、前方散乱光レンズ３０、半球レンズ付き検出器３２、第１光電子増倍管３４、第２光電子増倍管３６及び第３光電子増倍管３８を含む。半球レンズ付き検出器３２は、前方伝搬ビームの消光を調べるための内部検出器３２ａ（これから得られるデータは「軸方向光損失」または「ＡＬＬ」と称される）及び前方から３°〜１０°の円環で散乱する光（別名、「中角散乱光」または「ＩＡＳ」と称される）のための外部検出器３２ｂを有する。光源１２は、垂直偏波４８８ｎｍ空冷アルゴンイオンレーザーまたは垂直偏波青色（４８８ｎｍ）固体レーザーであり得る。レーザー、フローセル、レンズ、焦点レンズ、ファインビーム調節メカニズム及びレーザー焦点レンズに関する追加の詳説は、参照により本明細書に組み入れる米国特許Ｎｏ．５，６３１，１６５、特に４１欄の３２行目〜４３欄の１１行目に見つけることができる。
【００１４】
図１に示す血液分析器の前方光路システムは、球面平凸レンズ３０及び前記レンズの背面焦点面に位置する２素子フォトダイオード検出器３２を含む。この構成では、外フォトダイオード検出器３２ｂ内の各同心環はフローセル２８を移動する細胞からの光の特定の集光角に写像する。検出器３２は、軸方向光損失（ＡＬＬ）及び中角前方散乱（ＩＡＳ）を検出することができる半球レンズ付き検出器であり得る。米国特許Ｎｏ．５，６３１，１６５はこの検出器に対する各種代替物を４３欄の１２〜５２行目に記載している。
【００１５】
第１光電子増倍管３４（ＰＭＴ１）は偏光解消側方散乱光（ＤＳＳ）または緑色蛍光（ＦＬ１）を測定する。第２光電子増倍管３６（ＰＭＴ２）は偏光側方散乱光（ＰＳＳ）または黄色〜橙色蛍光（ＦＬ２）を測定し、第３光電子増倍管３８（ＰＭＴ３）は赤色蛍光（ＦＬ３）を測定する。ＦＬ１、すなわち緑色蛍光は約５１５〜５４５ｎｍで検出される。ＦＬ２、すなわち黄色〜橙色蛍光は約５６５〜５９５ｎｍで検出される。ＦＬ３、すなわち赤色蛍光は約６１５〜６４５ｎｍで検出される。側方散乱光及び蛍光発光は、効率的に検出できるように所要波長で効率的に透過し、反射させる二色ビームスプリッター４０及び４２により光電子増倍管に向けられる。米国特許Ｎｏ．５，６３１，１６５は光電子増倍管に関する各種の追加詳説を４３欄の５３行目〜４４欄の４行目に記載している。
【００１６】
蛍光を測定するとき、イマージョン集光システムを用いることにより光電子増倍管３４、３６及び３８での感度が高められる。イマージョン集光システムは、広い角度にわたって集光できるようにコンデンサーアセンブリ４４の第１レンズを屈折率照合層によりフローセル２８に光学的に接続させるものである。米国特許Ｎｏ．５，６３１，１６５はこの光学システムの各種の追加詳説を４４欄の５〜３１行目に記載している。
【００１７】
コンデンサ４４は、高解像度顕微鏡中に使用される回折限界結像のために十分な収差補正を有する光学レンズシステムである。米国特許Ｎｏ．５，６３１，１６５はこの光学システムの各種追加の詳説を４４欄の３２〜６０行目に記載している。
【００１８】
図１に示す他の部品、すなわちスリット４６、フィールドレンズ４８及び第２スリット５０の機能は米国特許Ｎｏ．５，６３１，１６５の４４欄の６３行目〜４５欄の１５行目に記載されている。光電子増倍管３４、３６及び３８は、側方散乱光（その軸が入射レーザービームに対してほぼ垂直である円錐で散乱する光）または蛍光（入射レーザービームの波長とは異なる波長で細胞から発せられる光）のいずれかを検出する。光電子増倍管３４の前面に配置されたスライダーアセンブリにより、光電子増倍管３４は偏光子５２を光経路中を移動させたときに偏光解消側方散乱光（ＤＳＳ）を検出する及びフィルター５４を光経路中を移動させたときに緑色蛍光（ＦＬ１）を検出するという２つに利用できる。光電子増倍管３６の前面に配置された類似のスライダーアセンブリ（図示せず）により、偏光側方散乱光（ＰＳＳ）及び黄色〜橙色蛍光（ＦＬ２）を検出するという２つに利用できる。光電子増倍管３８は赤色蛍光（ＦＬ３）のみを検出するようにフィルター５６を備えて構成されている。
【００１９】
容易に分かるように、上記分析器の多数のバリエーションが可能である。例えば、２つの円柱レンズをアナモルフィックプリズム対で置換してもよく、半球レンズ付き検出器を別の検出器及びホールドミラーで置換してもよく、光の他の波長を使用してもよい。
【００２０】
蛍光を検出しない血液分析器の例は、米国特許５，３７８，６３３、特に２４欄の４７行目〜２５欄の３６行目並びに図６及び７に記載されている。この記載は参照により本明細書に組み入れる。
【００２１】
測定プロセスでは、まず細胞がシース流体で包囲されている層流サンプル流で実質的に1列縦隊でレーザー照射容積を通過するように溶解剤で希釈した細胞流をフローセル２８を通過させる。照射容積はレーザービームとサンプル流の交点により設定され、１つの実施形態ではレーザー伝搬方向に沿って８０μｍ、サンプル流の流れ方向に沿って２０μｍ、サンプルの流れ及びレーザービーム伝搬の両方に対する横断方向で約５〜１０μｍの概算寸法を有している。
【００２２】
サンプル中の赤血球を溶解し、よって血液の溶解サンプルを作成するために全血サンプルを赤血球溶解剤で処理する。次いで、血液分析器により溶解サンプル中の細胞の光散乱特性を調べて、データを提出する。データを分析して、サンプル中の白血球を計数し、白血球亜群（すなわち、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球及び単球）を計数し、分類し、更にサンプルに溶解耐性赤血球または脆弱白血球を有するとしてフラグを付け得る。
【００２３】
使用に際し、赤血球が溶解している血液の懸濁液をサンプルノズルから低速で噴射させる。サンプルノズルでは懸濁液は速く動く層流シース流と接触する。流体力学的絞り込みとして公知のプロセスでは、サンプル流は細い中心コアに絞り込められる。この構成により、通常１つの白血球のみが所与の時間にレーザービームの検出領域にあることが保証される。
【００２４】
焦光レーザービームに入る溶解生存白血球はすべての方向に光を散乱させる。光の波長は細胞サイズに比して小さいので、この散乱現象はＭｉｅ理論により大まかに記載されている。散乱光の一部はフォトダイオードにより集められる。１つの実施形態では、２つのシリコンフォトダイオードがレーザービームの軸に対して約１〜３度及び約３〜１０度の半角で散乱した光を測定する。これらのフォトダイオードはそれぞれ「０度」及び「１０度」検出器と称され得る。直接レーザー光はオブスキュレーションバーによりブロックされる。前記した低角度での光散乱は、細胞構造または複雑さからの若干の寄与を有する細胞サイズ及び平均屈折率により支配される複雑な機能である。
【００２５】
レーザービームの軸に対して９０度で散乱する光は光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いて集められ得る。高角度では比較的少ない光しか散乱せず、通常非常に低強度の蛍光発光を検出するためにも使用されるので、フォトダイオードではなく光電子増倍管を９０度チャネルで使用する。衝突偏光光が主に細胞膜及び核（存在する場合）からの光学散乱を受ける場合、該光は通常偏光の元の垂直面を維持する。しかしながら、細胞質中に存在し得るある亜細胞成分（例えば、顆粒または異方性構造）と相互作用すると、散乱光は変化した偏光角度を有し得る。この現象を利用するために、ＰＭＴの１つはその前面に水平偏光子を有し得る。この偏光子は垂直偏波光が光電子増倍管に衝突するのを防ぐ。従って、「９０度偏光解消された」ＰＭＴにより検出される光は細胞下部構造、通常白血球、特に好酸球との相互作用により偏光解消された光である。第２光電子増倍管（「９０度偏光された」ＰＭＴ）は、４５度で曲がり、励起（レーザー）波長で垂直偏波光を殆ど反射させ且つ水平偏波光を殆ど透過させるように設計されているビームスプリッターから反射された散乱光を受け得る。この第２光電子増倍管により検出される光の大部分は垂直偏波側方散乱光であり、核のコンホメーションに相関する情報を有している。ここに簡単に要約されている散乱光検出スキームは、多角度偏光散乱分離法（ＭＡＰＳＳ）と称されており、米国特許５，０１７，４９７に十分詳細に記載されている独占設計である。この記載は参照により本明細書に組み入れる。
【００２６】
光センサーから得たデータは４次元散布図を構築するために使用され得る。これは、３次元「立体」表示を空間で回転させることができる計器のコンピュータグラフィック能力を用いて見ることができ、４次元は４次元で異なるパルスマグニチュードを表すピクセルに対して異なる色を選択することにより明らかになる。文書考証の目的で、４次元散布図を２次元散布プロットまたは射影の６つのユーザーが選択可能な対及び多数のユーザーが選択可能な一次元ヒストグラム射影により検討し得る。
【００２７】
赤血球を溶解するが白血球を溶解しない赤血球溶解剤は公知であり、オキシアルコール（白血球を溶解から保護するため）、（ｐＨ緩衝能を与え且つ赤血球溶解剤の導電率を高めるように働き、８．５またはその近くのｐＨを有する）有機緩衝液及び（赤血球の溶解に寄与する）界面活性剤の水溶液を含み得る。赤血球溶解剤の組合せは溶解プロセスの有効性を高めるために低浸透モル濃度を有していなければならない。使用されるオキシアルコールは２−フェノキシエタノールであり得る。有機緩衝液はトリス／ＨＣｌ、ホウ酸、グリシルグリシン及びビシン（商標）からなる群から選択され得る。界面活性剤はトリトンＸ−１００（商標）、トリトンＸ−１１４（商標）及びポリオキシエチレンまたは糖由来界面活性剤からなる群から選択され得る。ある実施形態では、赤血球溶解剤は２０ｍＭ〜８０ｍＭの濃度の２−フェノキシエタノール、トリス（商標）／ＨＣ１緩衝液及びトリトンＸ−１００（商標）を含有している。
【００２８】
特定実施形態では、赤血球溶解剤はトリトンＸ−１００（商標）、２−フェノキシエタノール及びトリス（商標）／ＨＣ１緩衝液の水溶液を含んでいる。全血を過剰（例えば、３０〜５０倍）のこの赤血球溶解剤と混合する。浸透圧衝撃、界面活性剤の作用及び約８．５のｐＨの組合せのために、赤血球の溶解は非常に急速に起こる。最適化製剤中に、２−フェノキシエタノールは約４１ｍＭの濃度で存在しているが、有用な濃度範囲は２０〜８０ｍＭの範囲である。トリス（商標）緩衝液のｐＨはその性能に有意な影響を与えることなくｐＨ８．１に低下させ得る。緩衝液のｐＨを９．０以上に上昇させると、赤血球溶解剤はより多くの赤血球を溶解するようになり、より迅速な溶解が生ずる。微量（最高約５％ｖｏｌ／ｖｏｌ）のトリトンＸ−１００（商標）または類似の界面活性剤を存在させると、典型的には溶解しがたいと見なされている標本中の赤血球を完全に溶解させるのを助けるが、溶解も促進させる。
【００２９】
トリス（商標）／ＨＣ１を他の有機緩衝液で置換させてもよい。８．５またはそれに近いｐＨを有する有機緩衝液の中には、赤血球溶解剤中に使用され得るホウ酸、グリシルグリシン及びビシン（商標）（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍから入手可能）がある。トリトンＸ−１１４（商標）は赤血球溶解剤の界面活性剤成分として使用され得る。他の親水性界面活性剤はポリオキシエチレンまたは糖ヘッド基を有するものから選択され得る。
【００３０】
方法
サンプルに溶解耐性赤血球（ｒＲＢＣ）または脆弱白血球（ｆＷＢＣ）を含有するとしてフラグを付けるために参照サンプルから集めたデータを用いる方法の幾つかの実施形態を以下に記載する。ある実施形態では、この方法は、ａ）全血サンプル中の赤血球を溶解して血液の溶解サンプルを作成し；ｂ）血液の溶解サンプルを血液分析器を用いて分析して溶解サンプル中の細胞についてのデータを得；ｃ）データを分析して細胞の特性を表す値を得；ｄ）前記値を溶解血液の複数の参照サンプルの分析から得た基準と比較し；ｅ）前記値が前記基準を満たしている場合、血液の溶解サンプルに溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けることを含む。上記に加えて、値が基準を満たしている場合、血液分析器は血液の溶解サンプルに溶解耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けることを示すレポートを提出し得る。方法は血液分析器により自動的に実行され得る。
【００３１】
上述したように、また以下により詳細に記載するように、値が基準を満たしている場合、血液サンプルにフラグを付け得る。以下に記載する方法の幾つかは値が基準を満たしているかを調べるために１つの数（値）を別の数（基準）と比較しなければならないことがあるので、値と基準の関係に依存してａ）値が基準と同じである、ｂ）値が基準より大きい、またはｃ）値が基準より小さい場合、基準を満たし得る。
【００３２】
この開示のある部分は「被検」血球を言及している。ここで、「被検」血球は血液分析器により分析される血液サンプルの細胞である。
【００３３】
ある実施形態では、また以下により詳細に記載するように、被検サンプルについてのデータを分析して被検サンプルの特性を表す値を得、その値を複数の参照サンプルから得た基準と比較する。本質的に、被検サンプルの細胞の特性を表す値を評価して、その値が参照サンプルに比して統計上外れ値であるかを調べ、基準はその値がサンプルがｒＲＢＣもｆＷＢＣも含有していない点で「正常」であったと予想されるよりも有意に異なるかどうかを決定する閾値である。
【００３４】
特定実施形態では、値はサンプルの特性（例えば、最良のあてはめ線の勾配、グラフ上の２つのポイントからの距離、ボックス比、分布の幅、歪度等）を表す数±以前に同一機械に流した多数の前のサンプルの数に基づいて数について予想される変動の尺度に基づいている。これらの実施形態では、使用する値は上記した数±前のサンプルの変動に基づく値からの少なくとも１（例えば、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３〜最高４、５または６以上）の標準偏差であり得る。また、値を比較する基準は、参照サンプルの同一特性（例えば、最良のあてはめ線の勾配、グラフ上の２つのポイントからの距離、ボックス比、分布の幅、歪度等）を表す数±参照サンプル中のその数の変動の尺度に基づき得る。これらの実施形態では、使用される基準は、参照サンプル中の同一特性を表す数±その数からの少なくとも１（例えば、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３〜最高４、５または６以上）の標準偏差であり得る。
【００３５】
使用する方法に応じて、基準は静的または連続的に更新される基準であり得る。静的基準は、サンプルを分析器に流す毎に連続的に更新されないが、以前別の機械に流した複数のサンプル（例えば、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、５００、１，０００、１０，０００または１００，０００個のサンプル）から得たデータに基づいている基準である。連続的に更新される基準は、正常サンプル（すなわち、正規性についての予め決めた基準を満たしているサンプル）を分析器に流す毎に更新され、基準は同一血液分析器により分析した少なくとも５、１０、５０、１００、２００、５００、１，０００または１０，０００個の前のサンプルから得た連続的に更新される基準である。静的基準は分析器に「配線接続」されると記載され得、機械の寿命の間一定のままであるのに対して、動的に更新される基準は新しいサンプルを流しながら頻繁に更新される。ある実施形態では、静的基準が変化したり、分析器ソフトウェアまたはデータステーションソフトウェアの変化が静的基準を修正する場合、静的基準を周期的に（例えば、必要に応じて１年毎または数年毎に）更新してもよい。
【００３６】
特定実施形態では、被検サンプルについてのデータをまず連続的に更新したサンプルからのデータ（すなわち、血液分析器により分析した少なくとも５、１０、５０、１００、２００、５００、１，０００または１０，０００個の前のサンプルからのデータ）の範囲内で分析して、被検サンプルが同一機械で分析した前のサンプルの特性とどのように類似しているかを示す値を得る。その値が決定したら、被検サンプルがｒＲＢＣまたはｆＷＢＣを含有しているかを調べるために静的基準と比較し得る。よって、ある実施形態では、値は被検血球についてのデータを以前同一機械に流した複数の参照サンプルから得たデータと比較することにより得ることができる。ある例では、この実施形態は特にサンプルの光学パラメーターを評価するときの機械間のばらつきをコントロールすることができる。他の実施形態では、被検血球についての値は被検サンプルについてのデータのみ（すなわち、動的に更新したサンプルからのデータを使用することなく）を分析することにより得ることができる。その値が決定したら、基準、すなわち動的に更新した基準または静的基準のいずれかと比較して、被検サンプルがｒＲＢＣまたはｆＷＢＣを含有するかを調べることができる。
【００３７】
ある例では、血液分析器のデータ分析ワークステーションは、機械により分析した複数の前の参照サンプルから得たデータ及び基準を含むメモリーを格納し得る。データ分析ワークステーションは、血液サンプルを分析器で分析しながらデータを連続的に更新するようにプログラムされ得る。血液分析器は、更に上記したまたは下記する分析に従って細胞サンプルについて得たデータを調節するように（すなわち、特定の細胞型の数を調節するように）プログラムされ得る。例えば、ｒＲＢＣが同定されたら、白血球またはリンパ球として同定された細胞の数は減少し得る。
【００３８】
細胞特性及びその細胞特性を表す値を得るための方法の例を以下に記載する。
【００３９】
細胞数減少
１つの実施形態では、細胞の特性は一定期間にわたる細胞数減少の率である。よって、ある実施形態では、血液分析器は、一定期間（典型的には、数秒間、例えば少なくとも２秒間、少なくとも５秒間、少なくとも１０秒間、少なくとも２０秒間またはそれ以上）にわたって単位時間あたり（例えば、少なくとも１０ｍｓ、少なくとも５０ｍｓ、少なくとも１００ｍｓ、または少なくとも２００ｍｓまたはそれ以上の間隔で）の細胞の数をカウントすることにより一定期間にわたる溶解血液の被検サンプル中のカウントした細胞の数の減少率を測定する。カウントされた細胞の数の減少率が溶解血液の参照サンプル中のカウントされた細胞の数の減少率に比して有意に大きい場合、血液の溶解サンプルにフラグを付けてもよい。
【００４０】
ある実施形態では、サンプルから得た履歴データを標準統計方法を用いて分析して、細胞についての最良のあてはめ線の勾配及び最良のあてはめ線に対するデータの変動性の尺度（例えば、データの標準偏差、すなわち「シグマ」）を与える。これらの実施形態では、基準と比較される値は、被検細胞についての最良のあてはめ線の勾配＋細胞についての最良のあてはめ線の勾配の少なくとも１標準偏差（例えば、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３〜最高４、５、６またはそれ以上の標準偏差）であり得る。
【００４１】
この実施形態では、被検細胞から得た値と比較される基準は参照サンプルについての最良のあてはめ線の勾配に基づき得、ある例では参照サンプルについての最良のあてはめ線の平均勾配を使用する。特定実施形態では、複数の参照サンプルから得た履歴データを分析して、参照サンプルについての対応する複数の最良のあてはめ線を与え得る。この実施形態において使用される基準は、参照細胞についての最良のあてはめ線の平均勾配及び最良のあてはめ線の勾配の可変性の尺度（例えば、最良のあてはめ線の勾配の標準偏差）に基づき得る。これらの実施形態では、値と比較される基準は、参照細胞についての最良のあてはめ線の平均勾配−参照細胞についての最良のあてはめ線の平均勾配の少なくとも１標準偏差（例えば、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３〜最高４、５、６またはそれ以上の標準偏差）であり得る。
【００４２】
図２に図示されている１つの典型的実施形態では、被検サンプルデータについての値はサンプルの最良のあてはめ線の勾配＋３標準偏差であり、基準は参照サンプルについての最良のあてはめ線の平均勾配−３標準偏差である。値が基準を満たしている場合、サンプルにフラグを付け得る。
【００４３】
特定実施形態では、値が基準を満たしている場合、値と基準の間の数値距離を示す「スコア」が与えられ得る。図２に示す実施形態では、スコアは基準を満たし（すなわち、基準よりも負である）、従ってサンプルにフラグを付け得る。値が基準よりもかなり異なるほど、スコアはより高い。
【００４４】
これらの実施形態では、基準は連続的に更新されるかまたは静的であり得る。しかしながら、細胞数減少の率は機械間で有意に変動してはならないので、多くの実施形態で使用される基準は静的基準であり得る。例えば、図３のグラフに示した基準は複数の異なる機械で実施した２，０００個以上のサンプルについての履歴データを用いて計算した。
【００４５】
血液分析器は、一定期間にわたって溶解血液の被検サンプル中のカウントした細胞の総数またはリンパ球として分類される細胞の数の減少率を調べる。値が一定期間にわたって溶解サンプル中のカウントした細胞の総数の減少率を示す場合、被検サンプルについての減少率が溶解血液の参照サンプル中のカウントした細胞の総数の減少率よりも有意に大きい場合、血液の溶解サンプルにフラグを付け得る。同様に、値が一定期間にわたって溶解サンプル中のカウントしたリンパ球として分類される細胞の数の減少率を示す場合、減少率が溶解血液の参照サンプル中のカウントしたリンパ球として分類される細胞の数の減少率よりも有意に大きい場合、血液の溶解サンプルにフラグを付け得る。ある例では、方法は総細胞の減少率を示すスコア及びリンパ球として分類される細胞の減少率を示すスコアを与え得る。
【００４６】
特定実施形態では、履歴データを更に分析して、カウントした細胞（サンプル中の総細胞またはリンパ球として分類される細胞）の数の減少率が増えるまたは減るかを調べる。減少率が増えるのは血液の溶解サンプルが脆弱白血球を含有していることを示唆し、減少率が減るのは血液の溶解サンプルが耐性赤血球を含有していることを示唆している。これらの実施形態では、データに対して非線形二次多項式分析を実施し、最良のあてはめ線の二次係数の符号はカウントした細胞の数の減少率が増えるかまたは減るかを示す。正の二次係数はサンプルがｒＲＢＣを含有していることを示唆し、負の二次係数はサンプルがｆＷＢＣを含有していることを示唆する。よって、ある実施形態では、サンプルにｒＲＢＣまたはｆＷＢＣを含有するとしてフラグを付けることに加えて、分析器はサンプルが含有している細胞がいずれかをも示す。ある例では、ｒＲＢＣを含有しているサンプルはｆＷＢＣを含有しているサンプルよりもより一般的であるので、二次多項式分析を実施しなくてもサンプルに多分ｆＷＢＣよりもｒＲＢＣを含有するとしてフラグを付け得る。これらの例では、干渉物質を同定するための追跡アッセイが推奨され得る。
【００４７】
リンパ球幾何学的距離
別の実施形態では、データはリンパ球として分類される被検サンプルの細胞についての軸方向光損失（ＡＬＬ）及び中角散乱光（ＩＡＳ）値を含み、その値は被検細胞についての平均ＡＬＬ及び平均ＩＡＳ値に基づいており、基準は参照細胞についてのＡＬＬ及びＩＡＳ値の平均のメジアンに基づいている。
【００４８】
この実施形態では、分析器は、分析器に流した複数の前のサンプルについての平均ＡＬＬ及び平均ＩＡＳ値を独立して計算し、記憶し得る（例えば、血液分析器により分析した少なくとも５、１０、５０、１００、２００、５００、１，０００または１０，０００個の前の正常サンプルからのデータ）。被検サンプルを分析したら、リンパ球として分類される細胞についての平均ＡＬＬ及び平均ＩＡＳ値を計算し、ａ）被検サンプル中でリンパ球として分類される細胞についての平均ＡＬＬ及びＩＡＳ値とｂ）複数の前のサンプルについての平均ＡＬＬ及びＩＡＳ値のメジアン間の幾何学的距離（すなわち、二次元ＡＬＬ−ＩＡＳ空間間のユークリッド距離）を測定する。計算した距離がそれ自体十分に大きい場合、サンプルが「外れ値」であり得ることを示し得る（よって、被検サンプルがｒＲＢＣを含有していることを示唆する）が、計算した距離を各参照サンプル中のリンパ球として分類される細胞についての幾何学的距離（サンプルについての平均ＡＬＬ及び平均ＩＡＳ値と参照細胞についての平均ＡＬＬ及びＩＡＳのメジアン間の距離）＋平均からの少なくとも１標準偏差（例えば、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３〜最高４、５、６またはそれ以上の標準偏差）に基づく静的基準と比較し得る。
【００４９】
図５に示す例では、静的基準は平均幾何学的距離（１．１）＋約３．６標準偏差（０．８）を表す４．０に設定し、被検サンプルについての幾何学的距離が４．０を超える場合、サンプルにｒＲＢＣを含有するとしてフラグを付け得る。ここでも、この実施形態では、値が基準を満たしている場合、値と基準間の数的距離を示す「スコア」が与えられ得る。図５に示す実施形態では、値が基準（すなわち、少なくとも４．０）を満たしている場合、サンプルにフラグを付け得る。値と基準の差が大きいほどスコアはより高い。
【００５０】
リンパ球ボックス数比
更なる実施形態では、データはリンパ球として分類される被検サンプルの細胞についての軸方向光損失（ＡＬＬ）及び中角散乱光（ＩＡＳ）値を含む。この実施形態では、値は、ａ）予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞の数をｂ）被検サンプルについての予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界に隣接するＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞の数で割った比の逆である。この実施形態では、基準は、予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞の数を参照サンプルについての予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界に隣接するＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞の数の比の逆に基づいている。
【００５１】
図６の概略的散乱光プロットに図示されているように、予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球として分類される細胞はスポットを含む左下ボックス中に示されている。ボックス内のリンパ球として分類される細胞（「真の」リンパ球）の数を１つ以上の隣接ボックス中の細胞、すなわち「真でない」リンパ球の数と比較する。図６に示すように、１つ以上の細胞数比を規定するために、真でないリンパ球は真のリンパ球ボックスの左の隣接ボックス、真のリンパ球ボックスの下の隣接ボックス及び／または真のリンパ球ボックスの右の隣接ボックスにより規定される。上述したように、隣接ボックスはすべて規定されたＩＡＳ及びＡＬＬの上限及び下限を有し、これらの限界は「真の」リンパ球ボックスと辺、辺の一部または角を共有している。
【００５２】
真のリンパ球ボックスについての予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界は、（例えば血液分析器により分析した少なくとも５、１０、５０、１００、２００、５００、１，０００または１０，０００個の前の正常サンプルからのデータを用いて）分析器に流した複数の前のサンプル中のリンパ球として分類される細胞についての平均ＡＬＬ及び平均ＩＡＳ値のメジアン±平均からの少なくとも１標準偏差（例えば、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３〜最高４、５、６またはそれ以上の準偏差）により規定される。図６に示すように、前のサンプル中のリンパ球として分類される細胞についての平均ＩＡＳ値のメジアンはほぼ１９であり、標準偏差がほぼ３であるので、リンパ球として分類される細胞についてのＩＡＳ下限及び上限はそれぞれほぼ１６及び２２である。同様に、前のサンプル中のリンパ球についての平均ＡＬＬ値のメジアンはほぼ２５であり、標準偏差がほぼ４であるので、リンパ球についてのＩＡＳ下限及び上限はそれぞれほぼ２１及び２９である。真のリンパ球ボックスのサイズは変化し得、ボックスの位置は前のサンプルに応じて移動し得るので、隣接ボックスのサイズ及び位置もリンパ球ボックスと共通する角または縁を維持するように変化する。これは図６中に点線の縁を有する第２リンパ球ボックス及びその対応する隣接ボックスにより概略的に示されている。
【００５３】
特定実施形態では、リンパ球ボックス数比を表す単一比を規定するために、隣接ＡＬＬ及びＩＡＳ限界により規定されるリンパ球の総数（すなわち、１つ以上の隣接する真でないリンパ球ボックス中の細胞の総数）を予め決定したＡＬＬ及びＩＡＳ限界中のリンパ球の数（すなわち、真のリンパ球ボックス中の細胞の数）で割る。
【００５４】
この比はそれ自体他の前のサンプルに比して十分に大きい場合、サンプルが外れ値であり得ることを示し得る（よって、被検サンプルはｒＲＢＣを含有することを示す）が、その比は各参照サンプル中のリンパ球として分類される細胞についての平均リンパ球ボックス数比＋平均からの少なくとも１標準偏差（例えば、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３〜最高４、５、６またはそれ以上の標準偏差）に基づく静的基準と比較し得る。
【００５５】
ここでも、この実施形態では、値（上で検討した比である）と基準（参照サンプルの集団の比の平均及び標準偏差に基づき得る）の数的距離を示すスコアが与えられ得る。図７に示す実施形態では、値が基準（すなわち、少なくとも０．８である）を満たしている場合、サンプルにフラグを付け得る。値が基準に比して高いほど、スコアはより高い。
【００５６】
リンパ球ＤＳＳ
別の実施形態では、データはリンパ球として分類される細胞についての偏光解消側方散乱光（ＤＳＳ）値を含み、基準と比較されるその値は被検サンプルについてのＤＳＳ値の分布及び／または歪の程度を示し、基準は参照サンプルについてのＤＳＳ値の分布及び／または歪の程度に基づいている。この実施形態では、リンパ球として分類される細胞についてのＤＳＳ値を大箱に入れ、ビンを分析してＤＳＳ値の分布幅を調べる。図８に示すように、ｒＲＢＣは正常細胞より幅広い分布を有し、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞はより狭い分布を有する。同様に（別の統計方法を用いて）、ＤＳＳビンを分析してＤＳＳ値の歪を調べることができ、図８に示すように正常及びＣＬＬサンプルからのリンパ球はｒＲＢＣを含有するサンプルに比して比較的正規な分布を有している。
【００５７】
図９に図示した１つの実施形態では、基準と比較するために使用される値はＤＳＳ分布及びＤＳＳ歪が２つの軸を形成している散布図にサンプルをプロットしたＤＳＳ分布及びＤＳＳ歪に基づいており、値はこの散布図上の所定線（「線」）からの符号付き幾何学的距離である（すなわち、サンプルが線の上にある場合は正であり、線の下にある場合は負である）。主として正常サンプルを含むサンプル組（“Ｎｏｒｍ”，“Ｎｏｒｍ１２１”）、主として負の（すなわち、ｒＲＢＣ非含有）サンプルを含む組（“Ｎｅｇ”，“ＪＮｅｇ”）、及び主として異常（すなわち、ｒＲＢＣ含有）サンプルを含む他の組（“Ｐｏｓ”，“ＪＰｏｓ”）を含めた各種タイプのサンプルをこのグラフにプロットする。他の実施形態では、サンプルにフラグを付けるためにＤＳＳ分布及びＤＳＳ歪を独立して使用し得る。
【００５８】
この値はそれ自体他の前のサンプルに比して十分に大きい場合サンプが外れ値であることを示し得る（よって、被検サンプルがｒＲＢＣを含有していることを示す）が、値を各参照サンプル中のリンパ球として分類される細胞についての平均ＤＳＳ分布及び／または平均ＤＳＳ歪＋平均からの少なくとも１標準偏差（例えば、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３〜最高４、５、６またはそれ以上の標準偏差）に基づく静的基準と比較することができる。図１０に示す実施形態では、ＤＳＳ由来値の平均及び標準偏差はそれぞれ−６．６及び２．２であり、０の基準を与える。
【００５９】
ここでも、この実施形態では、値が基準を満たしている場合、値と基準の数値差を示す「スコア」が与えられ得る。図１０に示す実施形態では、値が基準（すなわち、少なくとも０）を満たしている場合、サンプルにフラグを付け得る。値が基準に比して高い場合、より高いスコアが得られる。
【００６０】
別の実施形態では、データはリンパ球として分類される細胞についての偏光解消側方散乱光（ＤＳＳ）値を含み、その値はＤＳＳ値の分布中のゼロ−ビン事象（「ゼロ−ビン事象」は第１デジタル化ビン中の分類される事象であり、すなわちデジタル化のために利用可能な範囲のビン「ゼロ」）の数を示し、基準は参照サンプルについてのＤＳＳ値の分布中のゼロ−ビン事象の数に基づいている。ここでも、値が基準を満たしている場合、値と基準の数値差を示す「スコア」が与えられ得る。
【００６１】
合計スコア、重みづけ及びクロスチェック
上述したように、各方法は被検サンプルと参照サンプルの差を表す数値スコアを与え得る。ある実施形態では、これらのスコアを合計し、合計したスコアが閾値を超える場合血液サンプルにフラグを付け得る。合計する前に、個々のスコアに重みを加えてもよい。特定実施形態では、値が基準を満たしていない場合、「０」のスコアを付け得、よってスコアの合計に寄与しない。
【００６２】
ある実施形態では、ｒＲＢＣの直接検出に加えて、方法はインピーダンスＲＢＣアッセイ（ＲＢＣｉ）及び網状赤血球（ＲＥＴＣ）アッセイを用いてＷＢＣ数の精度をも推定し得る。
【００６３】
１つの実施形態では、インピーダンスＲＢＣヒストグラムはデジタル化範囲の最上デジタル化ビン（例えば、最新の１ビン、最新の５ビン等）中に殆どのＷＢＣを含有し、このクロスチェックによりヒストグラムから得られ得るＷＢＣ／ＲＢＣ比が（ＷＢＣアッセイからの）ＷＢＣ濃度及び（ＲＢＣｉアッセイからの）ＲＢＣ濃度から得られるＷＢＣ／ＲＢＣ比よりも有意に低くないことが確認される。ＲＢＣｉヒストグラムからのＷＢＣ／ＲＢＣ比がＷＢＣ及びＲＢＣｉアッセイからのＷＢＣ／ＲＢＣ比よりも有意に低い場合、ｒＲＢＣフラグを揚げる。
【００６４】
他の実施形態では、サンプル中の細胞をＦＬ１対ＩＡＳの散乱パターンに基づくＲＥＴＣアッセイにおいてＷＢＣ、ＲＢＣ及びＰＬＴに分離する。クロスチェックは、上記したＷＢＣ及びＲＢＣｉアッセイからのＷＢＣ／ＲＢＣ比と比較されるこのアッセイにおけるＷＢＣ対ＲＢＣの比を用いる。ＲＥＴＣアッセイからの比がＷＢＣ及びＲＢＣｉアッセイからの比よりも有意に低い場合、ｒＲＢＣフラグを揚げる。
【００６５】
プログラミング
１つの実施形態では、上記した方法を実施するための指示を含む物理メモリ（すなわち、「プログラミング」）を提供する。幾つかの実施形態では、メモリは、上記したように、血液分析器により分析した被検血球についてのデータを分析して被検血球の特性を表す値を得；前記値を複数の参照血球を含む参照サンプルの分析から得た基準と比較し；前記値が前記基準を満たしている場合、血液サンプルに耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けることにより血液サンプルに耐性赤血球または脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けるようにプログラミングすることを含む物理コンピューター−読取り可能媒体を含み得る。
【００６６】
プログラミングは物理記憶または伝送媒体中に備えられ得る。その後、指示を受けるコンピューターは当該方法から得たアルゴリズム及び／またはプロセスデータを実行し得る。コンピューター−読取り可能な記憶媒体の例にはフロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、ＲＯＭまたは集積回路、光磁気ディスクまたはコンピューター−読取り可能なカード（例えば、ＰＣＭＣＩＡカード等）が含まれ、前記デバイスはコンピューターの内部または外部にあってもよい。情報を含むファイルはコンピューター−読取り可能媒体に記憶され得、「記憶」はローカルまたはリモートネットワークでコンピューターによりその後アクセス可能であり、検索可能であるように情報を記録することを意味する。
【００６７】
上記した方法はサンプルを流す毎に自動的に実行され得る。
【００６８】
用途
上記した血液分析器は、脆弱白血球（ｆＷＢＣ）または溶解耐性赤血球（ｒＲＢＣ）を含有しているサンプルを同定し、フラグを付けるために使用され得る。
【００６９】
（脆弱白血球）
ある例では、血液サンプル中の白血球は溶解に対して特に脆弱であり、赤血球溶解剤により完全にまたは部分的に溶解され得る。上述したように、上記した方法は血液サンプルに脆弱白血球を含有するとしてフラグを付けるために使用され得る。
【００７０】
少数でまれであるが非常に深刻な臨床障害では、ある循環している白血球亜群は非常に溶解感受性のメンバーを含有していることがある。慢性リンパ球性白血病のある例及び伝染性単核球増加症の場合のような「脆弱なリンパ球」はこの状況に対するパラダイムである。そのような臨床状態では、前世紀の形態学者らが血液塗沫標本の顕微鏡分析で「グンプレヒトの核影」を同定した（Ｈ．Ｂｅｇｅｍａｎｎ，Ｊ．Ｒａｓｔｅｔｔｅｒ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，第４版，１９８９，ｐ．２２７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇを参照されたい）。今日の技術者らは、「スミア細胞」（Ｊ．Ｃｒｏｓｓ，Ｃ．Ａ．Ｓｔｒａｎｇｅ，“Ｅｒｒｏｎｅｏｕｓ  Ｏｒｔｈｏ  ＥＬＴ  ８００／ＷＳ  ＷＢＣ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ”，Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９８７，９，３７１−３７５）または「破損細胞」（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｃｏｕｎｔ  （Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ）  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ，ＮＣＣＬＳ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｈ２０−Ａ  １９９２，Ｖｉｌｌａｎｏｖａ，Ｐａ）を認識している。冒された白血球細胞集団は、塗沫標本作成プロセスのストレスを細胞に与える前に血液の液滴に高濃度のコロイド（例えば、アルブミン）を添加しないと血液塗沫標本中に保存され得ないほど脆弱な細胞を含有し得る（例えば、ＮＣＣＬＳ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｈ２０−Ａ；及びＤｅｎｓｍｏｒｅ，Ｃ．Ｍ．，“Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｆｉｌｍｓ”，Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，１２：６４０−４１，１９８１を参照されたい）。
【００７１】
血液を十分に希釈し、フローサイトメトリック自動血球カウンターで激しく処理すると、非常に脆弱な白血球も保存しがたい。このことは、希釈剤が多数の干渉赤血球を溶解するよりもむしろ保存するように意図されている適当に緩衝されている（タンパク質非含有）生理食塩液であるときでも当てはまる。よって、脆弱白血球がサンプル中に存在するときには、正確な循環白血球濃度（または、総白血球数）及び白血球亜群についての正確な数的数を知ることが実際不可能なことが時にある。（例えば、Ｊ．Ｃｒｏｓｓ，Ｃ．Ａ．Ｓｔｒａｎｇｅ，“Ｅｒｒｏｎｅｏｕｓ  Ｏｒｔｈｏ  ＥＬＴ  ８００／ＷＳ  ＷＢＣ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ”，Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９８７，９，３７１−７６；Ｊ．Ｂ．Ｄｉｘｏｎら，“Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｏｇ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  Ｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｉｅｓ  Ａｒｉｓｉｎｇ  Ｆｒｏｍ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ４Ｃ  ａｎｄ  Ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ”，Ｒｅｓ．Ｖｅｔ．Ｓｃｉ．，３１（２），１９８１，２４９−２５２；及びＪ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄら，“Ａｎ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｒｔｈｏ  ＥＬＴ−８”，Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９８２，４，１８７−９９を参照されたい）
【００７２】
（耐性赤血球）
ある例では、血液サンプル中の赤血球は溶解に対して特に耐性であり、赤血球溶解剤により十分に溶解されない。上述したように、上記した方法は血液サンプルに溶解耐性赤血球を含有するとしてフラグを付けるために使用され得る。
【００７３】
溶解生存赤血球をもたらす公知の状態の１つの群では、赤血球それ自体は典型的なヒトサンプルに適用し得る技術により溶解するのが困難なようである。これらの状態の例には、鎌状赤血球症、肝疾患、サラセミア、並びに他の非典型異常型生理学的哺乳動物赤血球集団が含まれる。正常及び健常な新生児及び幼児の赤血球も高度の溶解耐性を示す。状態または疾患の別の群では、溶解に対抗する干渉物質の存在により、典型的なヒトサンプルに対して有効な赤血球溶解状態で赤血球は溶解しにくくなる。例えば、異常に高濃度の血液タンパク質は幾つかの赤血球溶解剤を中和し、赤血球溶解の物理的アプローチの幾つかと膨張的に拮抗する傾向にある（例えば、Ａ．Ｂｒｅｍｍｅｌｇａａｒｄ，Ｊ．Ｎｙｇａｒｄ，“Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｃｒｙｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｗｈｉｔｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ”，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，５１（５）１９９１，４８９−４９２を参照されたい）。非経口栄養溶液、ある血液脂質障害及び治療薬も単独で、或いは他の物質または異常な赤血球と一緒に赤血球保護状態を生じるように作用し得る。
【００７４】
溶解耐性赤血球の問題で赤血球が全くまたは部分的にしか溶解しないと、総白血球カウント手順は冒されたサンプルに対して無効になり得る。溶解生存赤血球は白血球可視化を妨害する。１μｌ毎のヒト血液に対して５百万個の赤血球の１％が溶解しないと、５０００個の非溶解赤血球は代表的な１μｌのヒト血液中に存在する５０００個の有核白血球を覆い隠したままである。
【実施例】
【００７５】
ＣＥＬＬ−ＤＹ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）血液分析器を用いて白血球（ＷＢＣ）濃度及び差を測定するための本方法は赤血球（ＲＢＣ）の溶解を必要とする。溶解剤のサポニンはＷＢＣパートＡ試薬の成分である。正常な標本に対して、この試薬はＲＢＣを溶解する際に有効であり、よってＷＢＣ濃度及び差は正確である。しかしながら、幾つかの人口統計学（新生児／小児）及び病理学（鎌状赤血球貧血、肝疾患）により、ＲＢＣを溶解剤に対して耐性とする変化が生じ得る。これが起こると、見かけＷＢＣ濃度、リンパ球濃度及びリンパ球パーセンテージが誤って評価される恐れがある。この状態が検出されたなら、患者レポートのＷＢＣ濃度及び差の結果を無効にし、「耐性ＲＢＣ」（ｒＲＢＣ）フラグを立てる。ｒＲＢＣを検出するためのアルゴリズムを以下に記載する。
【００７６】
１．ｒＲＢＣフラッギングアルゴリズム
ｒＲＢＣフラッギングアルゴリズムは、フラグを立てなければならないかを決定するために１つ以上の基準を使用する。基準は、
１）ＷＢＣアッセイの固定された最初の期間（例えば、最初の９秒間）にわたる総細胞数の低下；
２）ＷＢＣアッセイ間でのリンパ球（“ｌｙｍｐｈ”）数率の低下。開始時からタイムマーク１１２６までのＦＣＳファイルからのリンパ球事象を使用する（この実施形態では、ＦＣＳファイルリストモードタイムマークは８ミリ秒（ｍｓ）離れている；８ｍｓ＊１１２６間隔〜９秒）；
以下の基準のすべてに対して、リストモードデータのすべての組を使用する。
３）ＣＢＣまたはＣＢＣ＋ＲＥＴＣ検査選別において最新の５１の正常患者ランのランニングメジアンと比較した（ＩＡＳ、ＡＬＬ）空間中の計器リンパ球集団の位置（検査選別はアッセイの特定組合せを実行するように分析器を構成する；ＣＢＣ検査選別は、例えば中でも標準溶解濃度で流すＲＢＣｉアッセイ及びＷＢＣアッセイを含み、ＣＢＣ＋ＲＥＴＣ検査選別は更にＲＥＴＣアッセイを含む）；
４）散布図の予想される領域内のリンパ球の隣接する領域中のリンパ球の比；
５）ＤＳＳにおけるリンパ球の分布。正常及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）サンプルはより少ない歪のより狭い分布を有する；
６）ＤＳＳにおけるゼロビンのカウントの数。ｒＲＢＣサンプルはこのビンにおいて正常サンプルよりもより多くのカウントを有する；
である。
【００７７】
有核ＲＢＣ（ＮＲＢＣ）アルゴリズムを実施する前にｒＲＢＣフラッギングアルゴリズムを実行する。ＮＲＢＣアルゴリズムは時々リンパ球対ＮＲＢＣ及びその反対の事象の分類を変化し得る。ＮＲＢＣアルゴリズムにより影響される事象のすべてはＦＬ３において正である。ｒＲＢＣアルゴリズムは殆どＦＬ３において不明瞭なｒＲＢＣ粒子と関係しており、従ってＮＲＢＣアルゴリズムにより考慮され得ない。ｒＲＢＣアルゴリズムの目的は、ｒＲＢＣ粒子が存在している強い証拠がある場合、無効フラグを出すことである。
【００７８】
ｒＲＢＣの存在についての直接尺度に加えて、サンプルについての検査選別の一部が手元にある場合は、アルゴリズムはＲＢＣｉアッセイ及びＲＥＴＣアッセイから推定ＷＢＣ数を調べることにより最終ＷＢＣ数をチェックする。
【００７９】
２．較正のためのデータ
アルゴリズムを開発し、検査するために使用するすべてのデータを日本にある１４台の分析器及びオランダにある３台の分析器に集めた。
【００８０】
２台の分析器からのデータを使用して、すべてのｒＲＢＣフラッギング基準に対する正常値を決定した。１０３１個の正常サンプルについてのデータをオランダの１台の分析器を用いて集め、２０６３個のサンプルについてのデータを日本の別の分析器を用いて集めた。正常サンプルに対する基準は、
・標本タイプ＝患者、
・無効にされたデータなし、
・次の範囲内の数値結果：
３．９＜    ＷＢＣ    ＜１０．０  ｋ／μＬ
３８．０＜  ％ＮＥＵ  ＜８０．０
１５．０＜  ％ＬＹＭ  ＜４０．０
０．０＜  ％ＭＯＮ  ＜１３．０
４．２＜  ＲＢＣ    ＜５．７  Μ／μΙ、
８０．０＜  ＭＣＶ    ＜９７．０  ｆＬ
１１．０＜  ＲＤＷ    ＜１５．０  ％ＣＶ
１４０．０＜  ＰＬＴ    ＜３９０．０  ｋ／μＬ
１３．２＜  ＨＧＢ    ＜１６．９  ｇ／ｄＬ
であった。
【００８１】
３．アルゴリズム基準
３．１  総数率勾配
検査サイクルのＷＢＣ部分の間、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ（登録商標）システムはハードウェアカウンター中の全事象（トリプルトリガー設定に基づいて資格を与えるシグナル）の数を記録する。１００ミリ秒（ｍｓ）間隔で、蓄積された全事象数を捕捉して、ＷＢＣハードウェア事象数データとして公知のデータシリーズを形成する。これを本明細書では「総数データ」（その亜群（例えば、リンパ球）とは対照的に、その全体をＷＢＣの総数と指す）と称する。検査サイクルのＷＢＣ部分の長さは検査選別に従って異なるが、いずれの場合でも少なくとも９秒の長さである。
【００８２】
総数率勾配基準は総数データの最小の９秒に基づいている。これらのデータにおいて、低下率、すなわち瞬時総数（逐次総数データ値間のデルタ）を増分的１００ｍｓｅｃ間隔に対してプロットしたときの有意に負の勾配を求める。９秒分の瞬時総数データの直線あてはめの勾配は０より有意に低くなければならない。スコアを得る前に実際の閾値（「有意」として解釈される）はアルゴリズム開発データ組中の正常サンプルの分布から生ずる。正常サンプルは０．０２±０．０３（平均±標準偏差）のＷＢＣ総数データ勾配を有している。アルゴリズムは、その下に総数率勾配基準寄与スコアが集積されている閾値として参照細胞の正常平均−０．０７以下の３シグマ値を使用する。これを図２に例示する。
【００８３】
測定したサンプル毎に、アルゴリズムは勾配値の不確実性の尺度である勾配及びその標準偏差、すなわちシグマを得るために直線フィット法を使用する。アルゴリズムは、閾値と比較するための総数率の勾配に対して使用した値として勾配＋そのシグマの３倍を使用する。アルゴリズムはハードウェア数の総数により勾配を正規化する。この基準のスコアは最終勾配と閾値の差に比例しており、最終勾配が閾値よりも負の場合は閾値であり、最終勾配が閾値よりも負でない場合は０である。
【００８４】
図３のプロットは、訓練組中の正常サンプルについてのすべての総数勾配及びその下にｒＲＢＣスコアが集積されている閾値を示す。閾値の下にｒＲＢＣスコアが集積しているサンプルは少数である。
【００８５】
３．２  リンパ球数率勾配
総勾配は、いずれも勾配をリンパ球中の赤血球（ＲＢＣ）干渉の検出に対して感受性としない好中球及び生存ＲＢＣを含めたカウントされるすべての事象を含む。総勾配は、既にＲＢＣとして分類されている（従って、リンパ球数またはＷＢＣ数のいずれでも干渉されない）ｒＲＢＣ事象のために負であり得る。一方、総勾配は、ｒＲＢＣはリンパ球数を変化させるが、例えば高率の好中球または別の細胞集団のために０に近づき得る。従って、アルゴリズムは数率勾配がリンパ球として分類される事象についてのものに関心がある。アルゴリズムはこれらの事象を採用し、リンパ球のみについての数率ヒストグラムを作成するためにＦＣＳデータ中の時間変数を使用する。この実施形態では、ＦＣＳファイルにおける各タイムスタンプは８ｍｓである。全９秒に相当する０〜１１２５タイムスタンプの範囲を使用する。リストモードリンパ球データの９秒を３０ビンに入れ、ビン毎のリンパ球数を測定する。次いで、線をすべてのビン（フィットの偽歪みを避けるためにゼロカウントを含むビンを除く）にあてはめる。
【００８６】
正常サンプルは０．０４±０．１５のリンパ球勾配を有する。アルゴリズムは閾値として正常平均−０．４１の下３シグマ値を使用する。サンプル毎の勾配を推定し、サンプルあてはめ線からの３つの標準分布を推定サンプル勾配に加える。最後に、サンプルリンパ球勾配をリンパ球の総数により正規化する。これを図４に示す。
【００８７】
３．３  リンパ球位置
２つのリンパ球位置チェックは、リンパ球と併合し、リンパ球と一緒にカウントされるｒＲＢＣの集団を検出することを目的とする。多くの場合、ｒＲＢＣで汚染されると、リンパ球集団の位置が移動する。第１位置チェックは全リンパ球集団のＡＬＬ及びＩＡＳ中の平均位置を分析する。
【００８８】
３．３．１  リンパ球平均値履歴
リンパ球の位置（すなわち、サンプル毎のすべてのリンパ球事象の平均のＡＬＬ及びＩＡＳビン数）を殆ど最近の５１個の正常サンプルについて追跡する。５１個の組に入るすべてのサンプルは次の基準：
・標本タイプ＝患者
・検査選別＝ＣＢＣまたはＣＢＣ＋ＲＥＴＣ
・リンパ球フラグなし
・以下の範囲内の数値結果：
３．９＜      ＷＢＣ  ＜１０．０  ｋ／μＬ
３８．０  ＜％ＮＥＵ  ＜８０．０
１５．０＜  ％ＬＹＭ  ＜４０．０
０．０＜    ％ＭＯＮ  ＜１３．０
のすべてを満たしていなければならない。
【００８９】
ヘモグラム結果の残りは、ＷＢＣ結果のみがリンパ球位置履歴を使用し、更新した時点でのアルゴリズムに対して利用可能なためにここでは使用しないことに留意されたい。
【００９０】
ＣＢＣ及びＣＢＣ＋ＲＥＴＣ検査選別でのサンプルランの場合、このサンプルと比較するために各履歴（ＡＬＬ及びＩＡＳ）のメジアンを計算し、使用する。ＣＢＣ＋ＲＥＴＣ＋Ｒ及びＣＢＣ＋Ｒ検査選別でのサンプルランの場合（ＷＢＣアッセイをより高い溶解濃度で流した以外、ＣＢＣ＋ＲＥＴＣ＋Ｒ検査選別はＣＢＣ＋ＲＥＴＣ検査選別と同様である；ＷＢＣアッセイをＣＢＣ＋ＲＥＴＣ＋Ｒ検査選別よりもなお高い溶解濃度で流した以外、ＣＢＣ＋Ｒ検査選別はＣＢＣ検査選別と同様である）、アルゴリズムは記憶ＡＬＬメジアンから（２５６ビンスケールで）９ビン、記憶ＩＡＳメジアンから（同じく２５６ビンスケールで）１４ビンを差し引く。差は、正常溶解レベル検査選別（ＣＢＣ、ＣＢＣ＋ＲＥＴＣ）とより高い溶解レベル検査選別（ＣＢＣ＋ＲＥＴＣ＋Ｒ、ＣＢＣ＋Ｒ）の間の平均リンパ球ＡＬＬ及びＩＡＳ位置の差のためである。アルゴリズムは、他の検査選別を余り使用しないので、ＣＢＣ及びＣＢＣ＋ＲＥＴＣ検査選別における位置を追跡するだけである。
【００９１】
リンパ球平均位置履歴ファイルは５１対のＡＬＬ及びＩＡＳ平均値から構成されている。ＩＡＳ平均履歴及びＡＬＬ平均履歴の両方のメジアン値も履歴ファイル中に記憶させる。メジアンはＩＡＳ及びＡＬＬにおいて独立して計算する。よって、ＩＡＳにおけるメジアン値は、履歴ファイルが段階的に更新されるにつれてＡＬＬのメジアンとは異なって影響され得る。
【００９２】
リンパ球平均履歴コンフィギュレーションファイルがソフトウェアインストールまたはスタートアップ時（または、あるサービス事象後）に存在していないときには、リンパ球位置履歴コンフィギュレーションファイルをデータステーションソフトウェアからの既存のコンフィギュレーションファイルサポートを用いて作成する。ＡＬＬ及びＩＡＳ平均値についてのデフォルトは、それぞれＡＬＬ及びＩＡＳのこのデフォルト位置に設定する。デフォルトビン値はリンパ球ＡＬＬ＝１００及びリンパ球ＩＡＳ＝７５（いずれも、２５６ビンスケールで）である。
【００９３】
ａ）Ｏｐｔｉｃａｌ  ＷＢＣについてのＡＬＬまたはＩＡＳ  Ｐｒｅ−Ａｍｐ  ＧａｉｎまたはＡｍｐｌｉｆｉｅｒ  Ｇａｉｎセットポイントを変化させ、活性化した後にサンプルを流す；
ｂ）ＩＡＳまたはＡＬＬについてのデフォルト位置値を変化させた後にサンプルを流す；
のいずれかを実施する場合、ＡＬＬまたはＩＡＳ平均値の対をこのデフォルト位置値（ＡＬＬ及びＩＡＳに対する値）にリセットする。
【００９４】
リンパ球平均位置値はＷＢＣ検査ラン毎に計算する。標本タイプが患者（すなわち、バックグラウンド及び他の特殊な検査ランを除く）であり、検査選別がリンパ球報告可能なデータについての欠点を待たないＣＢＣまたはＣＢＣ＋ＲＥＴＣである場合、このリンパ球平均値をリンパ球平均履歴コンフィギュレーションファイルに記憶する。５１対が満たされたら、フォーマット先入れ先出しに従って最も古い対を除く。
【００９５】
履歴ファイルからのリンパ球平均値のメジアンをＦＣＳファイルのヘッダに記憶する。
【００９６】
３．３．２  リンパ球幾何学的距離
アルゴリズムは、所与のサンプルの（ＩＡＳ，ＡＬＬ）空間中のリンパ球の位置を最新の５１個の正常サンプルのメジアンと比較する。第１検査は、履歴ファイルからの（ＩＡＳ，ＡＬＬ）空間中のメジアン位置とこのサンプルのリンパ球の位置（すなわち、このサンプル中のすべてのリンパ球事象のＩＡＳ及びＡＬＬにおける平均位置）の間のユークリッド距離の値である。図５は、訓練組からの正常サンプルについてのこの距離の分布である。閾値は４．０であり、これは集団平均（１．１）＋３シグマ値（０．８）の近似値である。メモリ使用を制限するために、すべての距離計算を６４ビンスケールで実施する。これは、データの分布で目に見えるかなり低い解像度につながる。
【００９７】
実行するための他のオプションは、多次元空間中のリンパ球の位置を表す際にＡＬＬ及びＩＡＳ以外の追加の検出チャネル（例えば、ＰＳＳ、ＤＳＳまたは蛍光チャネル）を使用することを含む。この場合、メジアン参照リンパ球位置と被検サンプルリンパ球位置間の幾何学的距離もユークリッド距離として計算されるが、前記位置を表す際に使用される検出チャネルの数くらい多くの次元にわたり計算される。
【００９８】
３．４  リンパ球ボックス数比
リンパ球位置情報に基づく第２検査は、リンパ球が通常あると予想されるボックス中のカウントを予想されるリンパ球位置の周りの一連のボックス中の数と比較する。図５には、当該ボックス及び位置が図示されている。調節可能なボックス角すべてをソリッドドットでマークする。他のボックス境界は調節可能な角に従ってのみ調節する。赤色のマークは、最新の５１個の正常で追跡したリンパ球平均履歴のメジアン位置である。リンパ球メジアン位置が動くときすべての他のボックスがどのように動くかを示すために、我々は緑色のドットでマークした第２リンパ球メジアン位置を示す。「真の」（予想される）リンパ球ボックスの４つの角をメジアン位置から計算し、ＩＡＳでは３．０（同じく、６４ビンスケールで）、ＡＬＬでは４．２（同じく、６４ビンスケールで）を加えるまたは減ずることによりメモリ使用を限定するために６４ビンスケールで値に変換する。これらの数は、アルゴリズム開発サンプル組からのＩＡＳ及びＡＬＬにおける正常の分布の３シグマ値である。これは黒色で示される予想リンパ球ボックスの位置を決定する。
【００９９】
ボックススコア比は、黒色ボックス（「真の」リンパ球）の数で割った青色ボックス中のリンパ球（「真でない」リンパ球）の数である。これを図６に図示する。
【０１００】
基準閾値を確立するために使用される２台の分析器はボックス数比の顕著に異なる分布を示す。４２８４１ＡＺ分析器は常に４２１２１ＡＺ分析器よりも高い非リンパ球対リンパ球比を有している。これは、多分訓練組における２台の分析器間の光学アラインメントの差による。４２８４１ＡＺ分析器はより広く散らばった集団を有し、よって非リンパ球ボックス中のカウントがより多くなる。他の分析器をチェックし、４２８４１ＡＺ分析器が多くの分析器よりもより高い平均ボックス数比を有することが判明した。従って、閾値は、同様の性能を有する分析器での過剰フラッギングを避けるためにその性能に基づいていた。４２８４１ＡＺ分析器のボックス数比の分布の平均及びＳＤはそれぞれ０．３９及び０．１１である。アルゴリズム閾値値を平均＋３シグマ値の近似値である０．８に設定した。これを図７に図示する。
【０１０１】
３．５  ＤＳＳ
リンパ球事象の線形ＤＳＳヒストグラムを使用した。このヒストグラムをそのメジアン、ロバストＳＤ（ｒＳＤ）＝メジアン（｜ｘ−メジアン（ｘ）｜）、並びに１０及び９０百分位数について分析する。ゼロビンにおける正規化数（すなわち、分布中の事象の総数によりスケール化した利用可能な範囲の第１デジタル化ビン中に分類される事象の数）も使用する。図８には、公知のＣＬＬ、正常及びｒＲＢＣサンプルのＤＳＳヒストグラムを示す。
【０１０２】
ヒストグラムは、
・ｒＲＢＣサンプルが非常に幅広い分布を有する；
・ｒＲＢＣサンプルはより大きな歪を有する；及び
・ｒＲＢＣサンプルはゼロビン中の数のより高い正規化数を有する；
を示す。
【０１０３】
３．５．１  ＤＳＳ分布幅及び歪
分布幅は、ｒＣＶ＝（１００＊ｒＳＤ／メジアン）として規定されるロバストＣＶ尺度（ｒＣＶ）によりパラメーター化される。歪度尺度は歪＝（２＊メジアン−１０百分位数−９０百分位数）である。これらの２つの数を用いて、アルゴリズムはＤＳＳセクションについての第１スコアを計算する。（歪、ｒＣＶ）空間中の線からの幾何学的距離である。この距離についての数値はｄ＝（０．４＊歪＋ｒＣＶ−２５）である。図９のグラフには、線が正常、正及び負のサンプル組と一緒に示されている。
【０１０４】
図１０中、正常サンプル組についてのｄの値を示す。この正常サンプル組についての平均及びＳＤはそれぞれ−６．６及び２．２であり、これからゼロの閾値が導かれる。
【０１０５】
３．５．２  ＤＳＳゼロ−ビン尺度
第２ＤＳＳ尺度はＤＳＳゼロビン中の事象数に基づく尺度である。ゼロ−ビン尺度は「スケール化したゼロ−ビン」＝［ゼロ−ビン数＊メジアン＊メジアン／（総リンパ球数）］である。メジアンによるスケーリングは、ＤＳＳにおける単にゲイン変化または平均ドリフトに起因し得るゼロビン中の変化を補正する試みである。他のスケーリングオプションが可能であり、更にゲイン変化のみによるゼロ−ビン値の予測される変化をより正確にモデル化するためにＤＳＳ分布の標準偏差を明らかにすることを含む。
【０１０６】
４２１２１ＡＺ分析器でのゼロ−ビン尺度に対するメジアン及びＳＤはそれぞれ０及び３．３であり、約１０の閾値が生ずる。この閾値でゼロ−ビン尺度が他の５つの尺度に比して誤った正の結果を引き出す可能性がより高いと観察されたために、２０の第２閾値を設定した。１０以下のスケール化ゼロ−ビン値が生ずるサンプルの場合、基準はｒＲＢＣフラグに対する総スコアに寄与しない。１０と２０の間では、基準は総スコアに寄与するが、達成する基準の総数に寄与しない。２０を超えると、基準はスコア及び達成する総基準数に寄与する。
【０１０７】
図１１には、正常サンプル組についてのスケール化ゼロ−ビン値を示す。４２１２１ＡＺ分析器は４２８４１分析器よりも多くのより小さい正常を有し、正常と呼ばれるサンプルさえも幾つかのｒＲＢＣを含んでいる。ゼロビン尺度において７０のスコアを有するサンプルは別の基準からのより多くのスコアの集積を起こし、実際立てるべきｒＲＢＣフラグを実際にトリガーする。
【０１０８】
４．合計スコア
上に詳記した６つの基準のすべてからのスコアにそれぞれの重みを掛けた後、最終スコアのために合計する。重みは、１００個の正及び１００個の負のサンプルを同定した後、正確な分類の数を最大とするために重みを最適化することにより決定した。
【０１０９】
【表１】
0005457560.tif 000002
重みの最終検査は、大きなデータ組に対してアルゴリズムを実施し、結果を別のｒＲＢＣフラッギングアルゴリズムと比較することにより実施する。このことは広範囲に実施されており、結果は新しいアルゴリズムが他のアルゴリズムよりもより良好に働くことを強制的に示す。
【０１１０】
５．トリガーメカニズム
このアルゴリズムは、少なくとも２つの基準がそれぞれの閾値より高いことを必要とする。次いで、アルゴリズムは、上記したように合計スコアを計算し、重みづけしたスコアが８５以上に達したらフラグを立てる。３つ以上の基準がそれぞれの閾値を超えたなら、総スコアに関係なくフラグも立てる。
【０１１１】
６．すべての正常サンプルについてのスコア
図１２のグラフは、すべての正常サンプルについてのｒＲＢＣスコアを示す。５個のサンプルを除いてスコアはすべて０である。５個のサンプルのうちの１個がｒＲＢＣフラグをトリガーするために十分なスコアを蓄積した。
【０１１２】
７．ＲＢＣｉクロスチェック
インピーダンスＲＢＣ（リストモード）ヒストグラムはその最新ビン中に殆どのＷＢＣを含んでいる。クロスチェックにより、インピーダンスヒストグラムから得られ得るＷＢＣ／ＲＢＣ比がＷＢＣアッセイからのＷＢＣ濃度及びインピーダンス数からのＲＢＣ濃度を用いて得たＷＢＣ／ＲＢＣ比よりも余り低くないことが確かめられる。最新のビン中のＲＢＣの数は、ＲＢＣのＭＣＶが増加するにつれて増加する。従って、ＭＣＶが１００ｆＬ未満の場合は、アルゴリズムはクロスチェックとしてＲＢＣヒストグラムのみを用いる。ＭＣＶがより低いサンプルの場合、最新のビンに対するＲＢＣの寄与は（ＭＣＶ−８３）＊０．７正規化数として推定される。ＭＣＶが８３未満の場合は、寄与はない。アルゴリズムにより、ＲＢＣヒストグラムにおいてＷＢＣの数を推定し、その数を報告されているＷＢＣ数と比較する。ＲＢＣヒストグラムからの数がＷＢＣアッセイ数よりもかなり低い場合、ｒＲＢＣフラグを揚げる。ＭＣＶが増加するにつれて、揚げるべきフラグに対するバーも増える。ＲＢＣｉクロスチェックは決してｒＲＢＣフラグを消去しない。
【０１１３】
実施するための他のオプションは、ＭＣＶに加えてクロスチェックにおけるパラメーターとして測定した赤血球（サイズ）分布幅ＲＤＷを用いることを含む。大きいＲＤＷが最新のビンをＲＢＣ事象と集団化させ得るので、クロスチェックは、最新のビン中に存在するＲＢＣの可能性を調べるために測定したＭＣＶ値と一緒に使用されるＲＤＷ閾値を含み、可能性が十分に低い場合クロスチェックをトリガーするだけである。別のオプションでは、ＷＢＣの数を推定するためにＲＢＣｉヒストグラムからの複数の最上ビンを使用する。
【０１１４】
８．ＲＥＴＣクロスチェック
ＲＥＴＣアルゴリズムは、ＦＬ１対ＩＡＳにおける散布図に基づいてＷＢＣ、ＲＢＣ及びＰＬＴを分離する。クロスチェックはＲＥＴＣアッセイにおけるＷＢＣ事象対ＲＢＣ事象の比を使用し、この比をＣＢＣアッセイからのＷＢＣ濃度対ＲＢＣ濃度の比と比較する。ＲＥＴＣアッセイからの比がＣＢＣアッセイからの数よりも有意に低い場合、ＣＢＣアッセイにおいてｒＲＢＣフラグを揚げる。
【０１１５】
ＲＥＴＣアルゴリズムは（ＲＢＣｉアッセイからの）ＲＢＣリストモード数及び（ＷＢＣアッセイからの）ＷＢＣリストモード数を使用する。ＲＥＴＣアルゴリズムにおけるｒＲＢＣクロスチェックは、ＷＢＣリストモード事象の数ｎを取り、そのシグマをｓｑｒｔ（ｗ）として計算した後、ＷＢＣリストモード事象の数に対して３シグマを加えることによりＷＢＣリストモード数に対する上限を計算する。この増加したＷＢＣリストモード事象数を使用して、ＷＢＣ／ＲＢＣ比を計算する。真のＷＢＣ／ＲＢＣ比に対する上限として意図される。この比をＷＲ ＲＥＴＣと呼ぶ。ＣＢＣ  ＷＢＣ／ＲＢＣ比（未検出のｒＲＢＣが存在する場合、ＷＢＣのオーバーカウントを受けやすい）をＷＲ ＣＢＣと呼ぶ。
【０１１６】
アルゴリズムは分比Ｄ＝１００＊（ＷＲ ＣＢＣ−ＷＲ ＲＥＴＣ）／（ＷＲ ＣＢＣ＋ＷＲ ＲＥＴＣ）を計算する。Ｄが５０より大きい場合、ｒＲＢＣフラグを立てる。Ｄに対する限界のこの選択は、ｒＲＢＣフラグを立てる前にＣＢＣ  ＷＢＣ／ＲＢＣ比がＲＥＴＣ  ＷＢＣ／ＲＢＣ比の上限より少なくとも３倍高くなければならないことを意味する。
【０１１７】
９．二次係数
図１３Ａ〜１３Ｃは、最良のあてはめ線の二次係数の符号を使用してサンプルがｒＲＢＣまたはｆＷＢＣを含有しているかをどのように調べるかを図示している。図１３Ａは、ＲＢＣが溶解する前、その間及びその後、更にＷＢＣが溶解する前、その間及びその後の細胞の総数の減少を図示するグラフを示す。赤血球溶解剤を添加した後、ＲＢＣは縦赤線で示す期間で溶解する。ＷＢＣが溶解していない期間（右手縦赤線と左手縦赤線の間の期間）後、ＷＢＣは（縦青線間の期間で）溶解し始める。図１３Ｂは、ＲＢＣが溶解している期間の細胞の総数の減少を図示している。この期間では、最良のあてはめ線は正の二次係数（すなわち、細胞数の減少率が減っていく）を有している。図１３Ｃは、ＷＢＣが溶解している期間の細胞の総数の減少を図示している。この期間では、最良のあてはめ線は負の二次係数（すなわち、細胞数の減少率が増えていく）を有している。
【０１１８】
本明細書中に引用されているすべての刊行物及び特許は、各々の個々の刊行物または特許が具体的に個別に参照により組み入れると述べられていたように参照により本明細書に組み入れる。刊行物の引用は出願日前の開示のためであり、本発明が先発明の理由でこれらの刊行物に先行する資格がないことを容認すると解釈されるべきでない。
【０１１９】
本発明をその具体的実施形態を参照して記載してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく各種の変化を加えることができ、均等物を置換することができることを当業者により理解されるべきである。加えて、本発明の目的、趣旨及び範囲に対して具体的状況、材料、組成物、プロセス、１つまたは複数のプロセスステップを改変させるように多くの修飾を加えることができる。前記した修飾のすべてが添付されている特許請求の範囲内に入ると意図される。
【図１】
0005457560.tif 000003
【図２】
0005457560.tif 000004
【図３】
0005457560.tif 000005
【図４】
0005457560.tif 000006
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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