(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
β-ヒドロキシイソバレリルシコニン，β-ヒドロキシイソバレリルシコニンの薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含む，ペリオスチンの阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の剤を含む，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤。
【請求項３】
請求項１に記載の剤を含む，ペリオスチンの関与する炎症の抗炎症剤。
【請求項４】
請求項１に記載の剤を含む，ケロイド又は肥厚性瘢痕の治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，シコニン誘導体を有するペリオスチンの発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば，特開２０１０−１４３８８７号公報には，シコニンがアトピー性皮膚炎の治療に有効であることが開示されている。
【０００３】
特開２００８−１３４８７号公報には，シコニンを有する皮膚外用剤が開示されている。
【０００４】
特開２００２−２１２０６５号公報には，ナフトキノン骨格を備えたシコニン又はその誘導体を有効成分とするチロシンキナーゼ阻害剤が開示されている。具体的なシコニン誘導体として，β-ヒドロキシイソバレリルシコニンが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−１４３８８７号公報
【特許文献２】特開２００８−１３４８７号公報
【特許文献３】特開２００２−２１２０６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで，本発明は，ペリオスチンの活性を阻害するペリオスチンの阻害剤を提供することを目的とする。
【０００７】
また，本発明は，ペリオスチンの関与する炎症の抗炎症剤を提供することを目的とする。
【０００８】
また，本発明は，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤を提供することを目的とする。
【０００９】
また，本発明は，ケロイド又は肥厚性瘢痕の治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は，シコニンやアルカニン等がペリオスチンの活性を阻害する能力があるという知見に基づくものである。本発明は，シコニンの誘導体のうち特にβ−ヒドロキシイソバレリルシコニン，その誘導体，それらの塩，及びそれらの溶媒和物が，ペリオスチンの活性を阻害する能力が高いという知見に基づくものである。このシコニン誘導体は，シコニンそのものに比べてもペリオスチンの活性阻害能がきわめて高い。
【００１１】
本発明の第１の側面は，ペリオスチンの阻害剤に関する。このペリオスチンの阻害剤は，有効成分として，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される溶媒和物を含む。
【００１２】
「β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体」の例は，下記式（Ｉ）で示される化合物である。
【化１】
0005438239.tif 000002
【００１３】
上記式（Ｉ）中，Ｒ１は，式（ＩＩ）で示される基を示す。
【００１４】
【化２】
0005438239.tif 000003
【００１５】
Ｒ２〜Ｒ７及びＲ１１〜Ｒ１３は，同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子，Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はＣ１−Ｃ４アルコシキ基を示す。
【００１６】
これらのうち，好ましい例は，Ｒ２〜Ｒ７及びＲ１１〜Ｒ１３は，同一でも異なってもよく，
水素原子，ハロゲン原子，メチル基又はメトキシ基を示す。
【００１７】
有効成分として最も好ましいものは，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン，β-ヒドロキシイソバレリルシコニンの薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの薬学的に許容される溶媒和物である。
【００１８】
有効成分であるβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体等が，紫根の抽出エキスであってもよい。また，これらは，紫根の水抽出エキスであってもよい。
【００１９】
本発明のペリオスチンの阻害剤の好ましい用途は，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤である。
【００２０】
本発明のペリオスチンの阻害剤の好ましい用途は，ペリオスチンの関与する炎症の抗炎症剤である。
【００２１】
本発明のペリオスチンの阻害剤の好ましい用途は，ケロイド又は肥厚性瘢痕の治療剤又は予防剤である。
【００２２】
本発明の第２の側面は，紫根の抽出物を有効成分として含む，ペリオスチンの阻害剤に関する。この側面のペリオスチンの阻害剤も実質的には第１の側面のペリオスチンの阻害剤と同様の用途を有する。前記紫根の抽出物は，紫根の水抽出物であることがこのましい。また，この側面のペリオスチンの阻害剤の特に好ましい用途は，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤である。
【発明の効果】
【００２３】
本発明は，ペリオスチンの活性を阻害するペリオスチンの阻害剤を提供できる。
【００２４】
本発明は，ペリオスチンの関与する炎症の抗炎症剤を提供できる。
【００２５】
本発明は，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤を提供できる。
【００２６】
本発明は，ケロイド又は肥厚性瘢痕の治療剤又は予防剤を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明の第１の側面は，ペリオスチンの阻害剤に関する。本発明の阻害剤は有効成分として，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される溶媒和物をいずれか１つ含んでいても良いし，２種以上を含んでも良い。β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体における「その誘導体」は，β-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体を意味する。また，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される溶媒和物に結晶多型が存在する場合，本発明の阻害剤は，それらを適宜含んでも良い。これらのβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン等は，ペリオスチンの阻害剤の有効成分である。そのため，ペリオスチンの阻害剤は，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン等を有効量含む。
【００２８】
本発明の別の態様は，シコニン，シコニンの誘導体，アルカニン，アルカニンの誘導体，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される溶媒和物を含むペリオスチンの阻害剤である。すなわち，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン等は以下のとおり，優れたペリオスチンの阻害剤であるといえる。一方，シコニンやアルカニンについてもβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンよりは低いものの一応のペリオスチンの阻害活性を有する。
【００２９】
「β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体」の例は，下記式（Ｉ）で示される化合物である。
【化３】
0005438239.tif 000004
【００３０】
上記式（Ｉ）中，Ｒ１は，式（ＩＩ）で示される基を示す。
【００３１】
【化４】
0005438239.tif 000005
【００３２】
Ｒ２〜Ｒ７及びＲ１１〜Ｒ１３は，同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子，Ｃ１−Ｃ４アルキル基又はＣ１−Ｃ４アルコシキ基を示す。
【００３３】
ハロゲン原子の例は，フッ素原子，塩素原子，臭素原子，又はヨウ素原子である。これらの中で，好ましいハロゲン原子は，フッ素原子，塩素原子又は臭素原子である。
【００３４】
Ｃ１−Ｃ４アルキル基とは，炭素数が１〜４個のアルキル基を意味する。Ｃ１−Ｃ４アルキル基の例は，メチル基，エチル基，ノルマルプロピル基，イソプロピル基，ノルマルブチル基，セカンダリーブチル基，イソブチル基，及びターシャリーブチル基である。これらの中で，好ましいＣ１−Ｃ４アルキル基は，メチル基又はエチル基である。
【００３５】
Ｃ１−Ｃ４アルコキシ基とは，炭素数が１〜４個のアルコキシ基を意味する。Ｃ１−Ｃ４アルコキシ基の例は，メトキシ基，エトキシ基，ノルマルプロピルオキシ基，イソプロピルオキシ基，ノルマルブトキシ基，セカンダリーブトキシ基，イソブトキシ基，及びターシャリーブトキシ基である。これらの中で，好ましいＣ１−Ｃ４アルコキシ基は，メトキシ基又はエトキシ基である。
【００３６】
好ましい例は，Ｒ２〜Ｒ７及びＲ１１〜Ｒ１３は，同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子，メチル基又はメトキシ基を示す。
【００３７】
有効成分として最も好ましいものは，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン，β-ヒドロキシイソバレリルシコニンの薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの薬学的に許容される溶媒和物である。
【００３８】
有効成分として最も好ましいものは，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン，β-ヒドロキシイソバレリルシコニンの薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの薬学的に許容される溶媒和物である。
【００３９】
有効成分であるβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体等が，紫根の抽出エキスであってもよい。また，これらは，紫根の水抽出エキスであってもよい。
【００４０】
「シコニンの誘導体」の例は，（β，β−ジメチルアクリル）シコニン，（２−メチルブチリル）シコニン，イソブチルシコニン，デオキシシコニン，β−ヒドロキシイソバレリルシコニン，アセチルシコニン，α−メチル−ｎ−ブチルシコニン及びテラクリルシコニンである。
【００４１】
アルカニンは，シコニンの光学異性体である。したがって，アルカニンの誘導体の例は，シコニンの誘導体の光学異性体である。
【００４２】
その薬学的に許容される塩は，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体の薬学的に許容される塩を意味する。薬学的に許容される塩の例は，塩酸，臭化水素酸，ヨウ化水素酸，硫酸，硝酸，リン酸等の無機酸，ギ酸，酢酸，プロピオン酸，シュウ酸，マロン酸，コハク酸，フマル酸，マレイン酸，乳酸，リンゴ酸，酒石酸，クエン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，アスパラギン酸，グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩等が挙げられる。また，置換基の種類によっては，塩基との塩を形成する場合もあり，例えば，ナトリウム，カリウム，マグネシウム，カルシウム，アルミニウム，リチウム等の金属を含む無機塩基，或いはメチルアミン，エチルアミン，エタノールアミン，リジン，オルニチン等の有機塩基との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。
【００４３】
その薬学的に許容される溶媒和物は，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体の薬学的に許容される溶媒和物を意味する。溶媒和物の例は水和物である。
【００４４】
β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体やシコニン，アルカニン，及びそれらの誘導体は，化学合成によって，または天然物から抽出して精製することによって，調製することができる。例えば，特許２８３７７１５号公報，特許２５７１２７９号公報には，シニコンの製造方法が開示されている。シコニン，アルカニン，及びそれらの誘導体は市販品を用いてもよい（例えば，和光純薬，シコニン標準品 191-13331）。
【００４５】
β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体，シコニン，アルカニン，及びそれらの誘導体を，天然物から抽出する場合には，例えば，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体，シコニン，アルカニン，及びそれらの誘導体を含有する植物の全体又は一部分（例えば，全草，葉，根，根茎，茎，根皮，花，若しくは果実）をそのまま用いて，又は簡単に加工処理（例えば，乾燥，切断，湯通し，蒸気加熱，若しくは粉末化）したもの（例えば，生薬）を用いて抽出すればよい。抽出条件は一般的に植物抽出に用いられる条件ならば特に制限はない。シコニン，アルカニン，及びそれらの誘導体の抽出の材料として，ムラサキ（Lithospermum erythrorhizon Siebold et Zuccarini），又はアルネビア・エウクロマ（Arnebia euchroma (Royle) Johnst.），オノスマ・アルゲンタツム（Onosma argentatum），アルカネット（Anchusa
officinalis LINNE）を例示することができる。好ましくはシコン（紫根：Lithospermi
radix；Lithospermum root；ムラサキの根）を用いることができる。
【００４６】
シコニンは，Syk（チロシンキナーゼ）のリン酸化活性および自己リン酸化活性を阻害することにより，抗炎症作用を発揮するものと考えられている。シコニンはSykのリン酸化活性を抑制し，IgE刺激によるヒト好塩基球からのヒスタミン放出を抑制することが示唆されている（Takano-Ohmuro H, Yoshida LS, Yuda Y, Morioka K, Kitani S. Inflamm
Res. 2008 Oct；57:1-5）。
【００４７】
β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体，又はシコニン，シコニンの誘導体，アルカニン，アルカニンの誘導体，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される溶媒和物は，紫根の抽出エキスであってもよい。紫根は，硬紫根及び軟紫根のいずれであってもよい。紫根の抽出エキスの例は，紫根の水抽出エキスである。水抽出エキスとは，紫根を水溶媒を用いて抽出して得られるエキスである。
【００４８】
本発明の阻害剤は，公知の薬学的に許容される担体を含んでも良い。
【００４９】
本発明の別の側面は，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体，又はシコニン，シコニンの誘導体，アルカニン，アルカニンの誘導体，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される溶媒和物を含む，ペリオスチンの関与する炎症の抗炎症剤に関する。特にこの側面は，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤に関する。
【００５０】
アトピー性皮膚炎には，ペリオスチンが発現機序であるものがある。この事実は，実験により証明されている（Masuoka.M.et.al.,J Clin Invest.122,2590-2600,2012）。本発明の実施例により，シコニン等によりペリオスチンを抑制できることが示された。このため，分析によりペリオスチンが健常人に比べて高く発現しているアトピー性皮膚炎患者に対して，本発明の阻害剤が有効に機能し，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤として利用されうる。
【００５１】
本発明の別の側面は，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体又はシコニン，シコニンの誘導体，アルカニン，アルカニンの誘導体，その薬学的に許容される塩，又はその薬学的に許容される溶媒和物を含む，ケロイド又は肥厚性瘢痕の治療剤又は予防剤に関する。
【００５２】
本発明の第２の側面は，紫根の抽出物を有効成分として含む，ペリオスチンの阻害剤に関する。この側面のペリオスチンの阻害剤も実質的には第１の側面のペリオスチンの阻害剤と同様の用途を有する。紫根の抽出物は，紫根の水抽出物であることが好ましい。また，この側面のペリオスチンの阻害剤の特に好ましい用途は，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤である。
【００５３】
実施例において実証されたとおり，ケロイド由来の線維芽細胞においてペリオスチンが健常人に比べて高く発現する場合がある。このため，ペリオスチンを阻害することが，ケロイド又は肥厚性瘢痕の治療及び予防に有効であると考えられる。たとえば，外科手術後，施術跡に本発明のケロイド又は肥厚性瘢痕の治療剤又は予防剤を塗布することで，既に生じているケロイド又は肥厚性瘢痕の原因となる線維芽細胞を抑制できるほか，線維芽細胞がさらに発現することを防ぎ，これによりケロイド又は肥厚性瘢痕を予防できると考えられる。
【００５４】
本発明の剤は，投与経路や投与方法に応じて，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体やシコニン，アルカニン，及びそれらの誘導体を薬学的に許容される塩と適宜製剤化して，本発明の治療剤および／または予防剤とすることができる。剤型としては，注射剤（溶液，懸濁液，乳濁液，用時溶解用固形剤等），錠剤，カプセル剤，液剤，顆粒剤，散剤，リポ化剤，吸入散剤や，軟膏剤，硬膏剤，貼付剤，液剤，ローション剤，クリーム剤，エアゾール剤，スプレー剤（噴霧剤），パスタ剤，ゲル剤，外用散剤，点眼剤等の外用剤が例示される。本発明の治療剤および／または予防剤は，好ましくは皮膚に適用される皮膚外用剤である。
【００５５】
本発明の剤の製剤化には公知の方法を用いることができる。製剤化にあたり，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体やシコニン，その誘導体，および／またはアルカニン（シコニン光学異性体）または薬学的に許容される塩に悪影響を与えず，かつ本発明の効果に影響を与えない限りにおいて，他の医薬活性成分（ステロイド剤，抗ヒスタミン剤，免疫抑制剤，抗菌剤，抗生物質，非ステロイド系抗炎症剤等の薬剤）や，医薬として許容される通常の安定剤，乳化剤，溶解剤，増粘剤，界面活性剤，浸透圧調整剤，ｐＨ調節剤等の補助剤を適宜配合することができる。
【００５６】
例えば，本発明の剤を，外用剤としてアレルギー性皮膚炎，特にアトピー性皮膚炎の治療に用いる場合は，通常はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体等を適当な基剤に混合，溶解，分散等して外用剤を形成し，当該外用剤を塗布，貼付，噴霧等により損傷のある皮膚や粘膜に経皮的に投与する。当該外用剤の剤型は特に限定されないが，上記のように軟膏剤，硬膏剤，貼付剤，液剤，ローション剤，クリーム剤，ゲル剤，エアゾール剤，スプレー剤（噴霧剤），パスタ剤，外用散剤，点眼剤等が挙げられる。
【００５７】
外用剤の基剤としては外用剤に通常使用される基剤を用いることができるが，パラベン，ラノリンなどの刺激性のある表示指定成分を含まないものを使用すれば，刺激に対して敏感な患者にも本発明のアレルギー性疾患の治療剤および／または予防剤を適用でき，好ましい。
【００５８】
通常使用される基剤としては，ポリエチレングリコール，カルボキシビニルポリマー，ミツロウ，白色ワセリン，プラスチベース，高級脂肪酸または高級アルコール，親水軟膏，バニシングクリーム，親水ワセリン，オイセリン，ネオセリン，吸水軟膏，親水プラスチベース，流動パラフィン，アイソパー，シリコン油，脂肪酸エステル，植物油，スクワラン，多価アルコール脂肪酸エステル，多塩基エステル，アルキルグリセリルエーテル，大豆レシチン，ステアリン酸等が挙げられる。
【００５９】
外用剤の場合，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体等は，本発明のアレルギー性疾患の治療剤および／または予防剤において約0.001〜100μM，好ましくは約0.1〜10μMの濃度となるように基剤に配合される。
また，本発明の投与回数は，１日１回でもよく，１日２〜４回，またはそれ以上の回数に分けて投与することもでき，そのような投与を必要に応じて毎日，あるいは適当な日数をおいて必要な期間投与することができる。
【００６０】
本発明の適用対象動物としては，ヒトを含む哺乳動物（ヒト等の霊長類，犬，猫等の愛玩動物，牛，豚，馬等の家畜等），鶏等の鳥類が挙げられ，これらの動物の上記のような症状の予防，治療あるいは軽減に使用することができる。
【００６１】
また本発明は，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニンの誘導体等を含有するアレルギー性疾患の治療剤および／または予防剤を含む化粧品にも及ぶ。本発明において化粧品とは，例えば，ファンデーション，化粧水，化粧用クリーム，乳液，化粧用ジェル，パック剤，歯磨き，整髪料，石鹸，洗剤，シャンプー，リンスなどの化粧料を含む。また，化粧料は液体，固体，ゲル状などの種々の形態で容器に入って製品として提供されるが，本発明においては，かかる製品も化粧品に含まれる。例えば，本発明のアレルギー性疾患の治療剤および／または予防剤を化粧品学的に許容される物質と混合した組成物を，ティッシュペーパー等の紙シートに含ませてシート状化粧品を作製することができる。
【００６２】
本発明は，対象（例えば患者）に対し，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される溶媒和物を投与する工程を含む，前記対象におけるペリオスチンを阻害する方法をも提供する。この方法の例は，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療，ペリオスチンの関与する炎症の抗炎症治療，ケロイド又は肥厚性瘢痕の治療又は予防である。また，この方法は，シコニン等を用いる方法であってもよい。
【実施例１】
【００６３】
［参考例１］
紫根（シコン）抽出液（エキス）の調製法
乾燥させた紫根（植物体）を液体窒素下，フリーザーミルで粉末にして，以下の抽出を行った。
水抽出は，0.5gの乾燥粉末を50mLの遠沈管に入れ，10mLの蒸留水を加えて懸濁し，50℃のウォーターバスで1時間抽出し，冷めない内に濾過した。そのろ液を水抽出液（H）とした。
水/DMSO抽出は，先ず，蒸留水とDMSOを1：1の容量で混合した液を水/DMSO溶液とし，0.5gの乾燥粉末を50mLの遠沈管に入れ，10mLの水/DMSO溶液を加えて懸濁し，室温で12時間撹拌しながら抽出した。その後，遠心して上澄み液を抽出液（H/D）とした。
クロロホルム及びアセトン抽出は，0.5gの乾燥粉末を50mLの遠沈管に入れ，10mLのクロロホルム及びアセトンをそれぞれ加えて懸濁し，室温で12時間撹拌しながら抽出した。その後，遠心して上澄み液をそれぞれクロロホルム抽出液（C），アセトン抽出液（A）とした。
更に，クロロホルム抽出液からクロロホルムを低温，減圧条件で蒸発させ，乾固した抽出物を得た。それを10mLの蒸留水に懸濁させ，4℃で12時間抽出し，そのろ液をクロロホルム-水画分（CH）とした。
【００６４】
同意を得た3人の健常人の皮膚由組織から，それぞれ分離，培養した線維芽細胞（A，B，C）を用いて，以下の実験を行った。
予備検討1として，それぞれの線維芽細胞（15PDL以内）を0.5%FBSと抗生物質・抗菌剤を含むIMDM培地で懸濁し，96 well plateに3×103
cell/wellで播種し，翌日，培地交換して0.5%FBSと抗生物質・抗菌剤を含むIMDM培地にIL-13（Miltenyi
Biotec）を0〜0.4μg/mLで添加し，3日間CO2インキュベーターで培養した。その後，培養上清中のぺリオスチンをAVISCER BIOSCIENCE,INC社製のELISAで測定した。更に，細胞のviabilityを生細胞数測定試薬SF（nakalai tesque）で測定した。この結果から，それぞれの細胞でペリオスチンを最も産生するIL-13濃度を求めた。また，細胞のviabilityの低下が無いことを確認した。
【００６５】
予備検討2として，溶媒及び抽出液の細胞毒性を検討した。予備検討と同じ条件で，溶媒と抽出液を0〜40,000倍希釈で添加し，細胞のviabilityを測定した。無添加条件と比較して，95%以上のviabilityを示した濃度を細胞毒性が無い濃度とした結果，1,000倍希釈までの抽出液を用いることにした。
【００６６】
本試験は，予備検討と同じ条件で，無添加（blank），溶媒，抽出液，IL-13溶液及びIL-13+抽出液をサンプルとして，各細胞に添加して，3日間培養後，その培養上清中のペリオスチンを測定した。結果を表１〜３に示す。
【００６７】
【表１】
0005438239.tif 000006
【００６８】
【表２】
0005438239.tif 000007
【００６９】
【表３】
0005438239.tif 000008
【００７０】
線維芽細胞の種類（個体）により，発現しているペリオスチン量とIL-13刺激により誘導されたペリオスチン量に差があったが，どの個体でも全ての抽出液でIL-13により誘導されたペリオスチンの発現をほぼ100％抑制した。更に，個体によっては，無刺激で発現しているペリオスチン量を80%以上抑制した。
【実施例２】
【００７１】
同意を得た健常人の皮下脂肪組織から，脂肪幹細胞（ASC）を分離培養して，以下の実験を行った。
【００７２】
予備検討1として，脂肪幹細胞（15PDL以内）を0.5%FBSと抗生物質・抗菌剤を含むIMDM培地で懸濁し，96 well plateに3×103 cell/wellで播種し，翌日，培地交換して0.5%FBSと抗生物質・抗菌剤を含むIMDM培地にIL-13（Miltenyi Biotec）を0〜0.4μg/mLで添加し，3日間CO2インキュベーターで培養した。その後，培養上清中のぺリオスチンをAVISCER BIOSCIENCE,INC社製のELISAで測定した。更に，細胞のviabilityを生細胞数測定試薬SF（nakalai tesque）で測定した。
【００７３】
この結果から，それぞれの細胞でペリオスチン量を最も産生するIL-13濃度を求めた。また，細胞のviabilityの低下が無いことを確認した。
【００７４】
予備検討2として，溶媒及び抽出液の細胞毒性を検討した。予備検討と同じ条件で，溶媒と抽出液を0〜40,000倍希釈で添加し，細胞のviabilityを測定した。
無添加条件と比較して，95%以上のviabilityを示した濃度を細胞毒性が無い濃度とした結果，1,000倍希釈までの抽出液を用いることにした。
【００７５】
本試験は，予備検討と同じ条件で，無添加（blank），溶媒，抽出液，IL-13溶液及びIL-13+抽出液をサンプルとして，各細胞に添加して，3日間培養後，その培養上清中のペリオスチンを測定した。結果を表４に示す。
【００７６】
脂肪幹細胞では，シコン抽出液（H，D/H及びC）はIL-13で誘導したペリオスチンを27〜46％抑制した。
【実施例３】
【００７７】
大学から提供されたケロイド由来の線維芽細胞を用いて，以下の実験を行った。
【００７８】
予備検討1として，線維芽細胞を0.5%FBSと抗生物質・抗菌剤を含むIMDM培地で懸濁し，96 well plateに3×103
cell/wellで播種し，翌日，培地交換して0.5%FBSと抗生物質・抗菌剤を含むIMDM培地にIL-13（Miltenyi
Biotec）を0〜0.4μg/mLで添加し，3日間CO2インキュベーターで培養した。その後，培養上清中のぺリオスチンをAVISCER BIOSCIENCE,INC社製のELISAで測定した。更に，細胞のviabilityを生細胞数測定試薬SF（nakalai tesque）で測定した。この結果から，それぞれの細胞でペリオスチン量を最も産生するIL-13濃度を求めた。また，細胞のviabilityの低下が無いことを確認した（データは未記載）。
【００７９】
予備検討2として，溶媒及び抽出液の細胞毒性を検討した。予備検討と同じ条件で，溶媒と抽出液を0〜40,000倍希釈で添加し，細胞のviabilityを測定した。無添加条件と比較して，95%以上のviabilityを示した濃度を細胞毒性が無い濃度とした結果，1,000倍希釈までの抽出液を用いることにした。
【００８０】
本試験は，予備検討と同じ条件で，無添加（blank），溶媒，抽出液，IL-13溶液及びIL-13+抽出液をサンプルとして，各細胞に添加して，3日間培養後，その培養上清中のペリオスチンを測定した。結果を表５に示す。
【００８１】
【表５】
0005438239.tif 000009
【００８２】
ケロイド由来線維芽細胞では，クロロホルム-水画分（CH）のみIL-13で誘導したペリオスチンを100％抑制し，更に無刺激で産生されたペリオスチンに対しても46%抑制した。
【実施例４】
【００８３】
実験は，実施例２と同様に行った。即ち，3種類の溶媒及びそれぞれの溶媒でシコンを抽出した液を培地に添加し，ASCを3日間培養後に培地上清中のペリオスチンを測定した。
その結果は表６に示した。
【００８４】
【表６】
0005438239.tif 000010
【００８５】
ASCに対して，シコン抽出液はペリオスチンの発現を促進した。しかし，実施例２の表4から，シコン抽出液にはペリオスチンの産生促進と産生抑制の相反する2つの作用が認められる。シコン抽出液のペリオスチン産生抑制は，IL-13で促進したペリオスチンに対しての効果と考えられる。
【実施例５】
【００８６】
シコニン誘導体の検証１
紫根抽出液に替えて高純度のシコニン誘導体を試薬として購入し、ペリオスチン発現抑制試験に用いた。シコニン誘導体としてはシコニン（Ｓ１）（Enzo Life Science），アルカンニン（Ｓ２）(長良サイエンス)，（β，β−ジメチルアクリル）シコニン（Ｓ３）(東京化成工業)，（２−メチルブチリル）シコニン（Ｓ４）(東京化成工業)，イソブチルシコニン（Ｓ５）(東京化成工業)，デオキシシコニン（Ｓ６）(東京化成工業)，（イソバレリル）シコニン（Ｓ７）(長良サイエンス)、β−ヒドロキシイソバレリルシコニン（Ｓ８）(長良サイエンス)，アセチルシコニン（Ｓ９）(長良サイエンス)，α−メチル−ｎ−ブチルシコニン（Ｓ１０）(長良サイエンス)及びテラクリルシコニン（Ｓ１１）(長良サイエンス)の１１種類を用いて、以下の実験を行った。
各シコニン誘導体は、アセトンで１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し原液とした（冷蔵保存）。次にＰＢＳ（−）で１００倍希釈して冷蔵保管し、実験直前にＰＢＳ（−）希釈液を上記IMDM培地で希釈した。
シコニン誘導体の濃度は、線維芽細胞Ａを用いて、予め細胞毒性を検討した結果から9,000倍から81,000倍とした。
ペリオスチン発現抑制試験として、線維芽細胞Ａを０．５％ＦＢＳと抗生物質・抗菌剤を含むIMDM培地に懸濁し、96 well plateに3×103
cell/wellで播種し、翌日90％〜100%
confluentの状態で、IL-13（0〜0.4μg/mL）とシコニン誘導体を含む上記IMDM培地に交換して、実験を開始した。培養3日後に培養上清を回収し、上清中のペリオスチン濃度をELISAキットで測定した。
更に、培養上清を回収した細胞に生細胞数測定試薬SFを含む上記IMDM培地を添加、培養して1〜2時間後に吸光度を測定することで、細胞のviabilityとした。
【００８７】
【表７−１】
0005438239.tif 000011
【００８８】
【表７−２】
0005438239.tif 000012
【００８９】
その結果、シコニン、アルカンニン，及びβ−ヒドロキシイソバレリルシコニンは，IL-13存在下及び非存在下、即ち、IL-13でペリオスチンの発現を誘導した条件と自発的に発現しているペリオスチンの両方の発現を抑制した。特に、IL-13で誘導したペリオスチンの発現を強く抑制を示した（表7）。
しかし、シコニンとアルカンニンは発現抑制と共に細胞毒性も強いことから、医薬品などへの利用にはβ−ヒドロキシイソバレリルシコニンが適していると判断した。
【実施例６】
【００９０】
各シコニン誘導体のPBS（-）希釈液を冷蔵庫で保存すると沈殿が生じることが判明したことから、実施例５を踏まえて、発現抑制の効果があったシコニン、アルカンニン，及びβ−ヒドロキシイソバレリルシコニンの3種類の誘導体について再現性の確認試験を実施した。その際、誘導体は試験開始直前に原液からPBS及び培地で希釈して調製した。
実験条件は実施例５と同様に実施した。
その結果を表８に示したが、IL-13存在下及び非存在下ともにペリオスチン抑制効果が確認できた。しかし、抑制効果は増大したが、細胞毒性も強くなりviabilityは低下した。
【００９１】
【表８−１】
0005438239.tif 000013
【００９２】
【表８−２】
0005438239.tif 000014
【００９３】
11種類のシコニン誘導は水には溶解せず、有機溶媒で溶解できたことは、紫根の有機溶媒抽出液に含まれるペリオスチンの発現を抑制する有効成分は、主にシコニン、アルカンニン，及びβ−ヒドロキシイソバレリルシコニンの3種類と考えられる。特に、細胞毒性の強さから、β−ヒドロキシイソバレリルシコニンが最も有効な成分である。
【実施例７】
【００９４】
実施例６までのペリオスチン発現抑制試験は、ヒト線維芽細胞にサンプルと同時にヒトIL-13も添加し、3日後のペリオスチン発現を測定していた。今回は、先にIL-13（0.3〜0.4μg/mL）を添加し、3日間培養してから、サンプルを含む培地に交換して更に3日間培養した。
このようにペリオスチンを十分に発現させた状態で、3種類のシコニン誘導体が発現を抑制するか実験した結果、3種類の誘導体は、濃度依存的にペリオスチンの発現を抑制した。しかし、S1（シコニン）とS2（アルカンニン）は抑制が強いと細胞毒性も強い相関関係があり、細胞毒性によりペリオスチンの発現が低下したと考えられる。
唯一、S8(β−ヒドロキシイソバレリルシコニン)は、細胞毒性を示さない濃度でペリオスチン発現を抑制した。
以上の結果より、β−ヒドロキシイソバレリルシコニンは、IL-13と同時でも単独でもペリオスチンの発現を抑制することから、抑制のメカニズムとして、IL-13とその受容体の結合を阻害するだけでなく、IL-13の刺激からペリオスチンを発現させるまでのシグナル伝達系を阻害する可能性を示唆している。
【００９５】
【表９】
0005438239.tif 000015
【実施例８】
【００９６】
β−ヒドロキシイソバレリルシコニンの原液をPBS(-)で10,000倍に希釈し、0.7％ヒアルロン酸ナトリウムを含む試験薬を調製し、軽度のアトピー症状のある3人と症状のない2人に使用してもらった。
使用法は、風呂上がりに試験薬、1mLを症状のある首と腕に1日1回、3日連続で使用してもらい4日目に自己評価してもらった。
その結果は、表１０に示したように赤みが薄くなり、皮膚のツッパリ感やザラザラ感が消えて、改善が実感できたが、就寝中の痒みは若干未だ残っていた。
【００９７】
【表１０】
0005438239.tif 000016
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明は，医薬品産業及び化粧品産業の分野で利用されうる。
【要約】
【課題】  ペリオスチンの活性を阻害するペリオスチンの阻害剤，ペリオスチンの関与する炎症の抗炎症剤，ペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤，ケロイド又は肥厚性瘢痕の治療剤又は予防剤を提供する。
【解決手段】  β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体，β-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される塩，又はβ-ヒドロキシイソバレリルシコニン又はその誘導体の薬学的に許容される溶媒和物を有効成分として含む，ペリオスチンの阻害剤，およびこの阻害剤を含むペリオスチン高発現アトピー性皮膚炎の治療剤，ペリオスチンの関与する炎症の抗炎症剤，及びケロイド又は肥厚性瘢痕の治療剤又は予防剤。
【選択図】  なし