(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇ−カルテット構造を形成するＧ−カルテット形成領域（Ｄ）とターゲットに結合するアプタマー領域（Ａ）とを有する下記（Ｉ）の核酸分子を含み、
ターゲット非存在下、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が阻害され、
ターゲット存在下、前記アプタマー領域（Ａ）への前記ターゲットの接触により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）においてＧ−カルテット構造が形成され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）がＮ−メチルメソポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とするターゲット分析用蛍光センサ。
（Ｉ）前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、ブロッキング領域（Ｂ）、および前記アプタマー領域（Ａ）をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域（Ｂ）が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における部分領域（Ｄｐ）に対して相補的であり、
前記アプタマー領域（Ａ）における前記ブロッキング領域（Ｂ）側の末端領域（Ａｂ）が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における前記部分領域（Ｄｐ）の隣接領域（Ｄｆ）に相補的であり、且つ、前記アプタマー領域（Ａ）における前記ブロッキング領域（Ｂ）側とは反対側の末端領域（Ａｆ）に相補的である一本鎖核酸分子。
【請求項２】
前記（Ｉ）の一本鎖核酸分子において、
前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、および前記アプタマー領域（Ａ）を、５’側からこの順序で有している、請求項１記載の蛍光センサ。
【請求項３】
前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記アプタマー領域（Ａ）との間に、リンカー配列を有する、請求項１または２記載の蛍光センサ。
【請求項４】
さらに、基材を有し、
前記基材に、前記核酸分子が配置されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の蛍光センサ。
【請求項５】
前記核酸分子が、リンカー領域を介して前記基材に連結されている、請求項４記載の蛍光センサ。
【請求項６】
前記基材に、さらに、試薬を含む試薬部が配置されており、
前記試薬が、Ｎ−メチルメソポルフィリンを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の蛍光センサ。
【請求項７】
センサと試薬とを含み、
前記センサが、請求項１から６のいずれか一項に記載のターゲット分析用蛍光センサであり、
前記試薬が、Ｎ−メチルメソポルフィリンを含むことを特徴とするターゲット分析用キット。
【請求項８】
前記センサが、前記核酸分子が基材に配置されたセンサであり、
前記基材に、さらに、前記試薬を含む試薬部が配置されている、請求項７記載のターゲット分析用キット。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか一項に記載のターゲット分析用蛍光センサに試料を接触させる接触工程、および、
ポルフィリン存在下、前記センサにおける前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とＮ−メチルメソポルフィリンとの複合体による蛍光を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする、ターゲットの分析方法。
【請求項１０】
前記検出工程における蛍光の検出が、蛍光強度の測定である、請求項９記載の分析方法。
【請求項１１】
前記試料が、原乳、加工乳および粉ミルクからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項９または１０記載の分析方法。
【請求項１２】
前記ターゲットが、メラミンである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲット分析用蛍光センサ、ターゲット分析用キット、およびこれを用いたターゲット分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床医療、食品、環境等の様々な分野において、ターゲットの検出が必要とされている。前記ターゲットの検出は、一般的に、前記ターゲットとの相互作用を利用する方法として、前記ターゲットに特異的に結合する抗体を用いた手法が汎用されている。そして、近年、前記抗体に代えて、新たに、前記ターゲットに特異的な核酸分子（いわゆるアプタマー）を使用する方法が開発されている。
【０００３】
前記アプタマーを使用する方法としては、例えば、アプタマーとＤＮＡｚｙｍｅとを連結したセンサが報告されている。ＤＮＡｚｙｍｅとは、Ｇ−カルテット構造をとることで、ペルオキシダーゼ等と同様の酸化還元反応の触媒活性を生起するＤＮＡ分子である。このセンサによれば、まず、前記アプタマーにターゲットを結合させ、前記ターゲットが結合したセンサにおける前記ＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性を測定することで、間接的に、ターゲットを検出できる（非特許文献１）。
【０００４】
また、Ｇ−カルテット構造を形成したＤＮＡｚｙｍｅは、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発することが報告されている（非特許文献２および非特許文献３）。そこで、新たに、アプタマーとＤＮＡｚｙｍｅとを連結したセンサにおいて、ＤＮＡｚｙｍｅの酸化還元反応の触媒活性ではなく、前記複合体形成による蛍光を測定することで、ターゲットを検出する方法も報告されている。しかしながら、実用面において、より適した新たな構造の蛍光センサの提供が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tellerら、  Anal．Chem．，  2009年、vol.81、p.9114−9119
【非特許文献２】Jiangtao  Renら、Anal.  Bioanal.  Chem.  2011年、399、p.2763-2770
【非特許文献３】Seung  Soo  Ohら、PNAS、2010年、vol.107、32、p.14053-14058
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、新たなターゲット分析用蛍光センサ、ターゲット分析用キット、およびこれを用いたターゲットの分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のターゲット分析用蛍光センサは、Ｇ−カルテット構造を形成するＧ−カルテット形成領域（Ｄ）とターゲットに結合する結合領域（Ａ）とを有する下記（Ｉ）、（II）、（III）、（IV）および（Ｖ）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸分子を含み、
ターゲット非存在下、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が阻害され、
ターゲット存在下、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）においてＧ−カルテット構造が形成され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
（Ｉ）前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、ブロッキング領域（Ｂ）、および前記結合領域（Ａ）をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域（Ｂ）が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における部分領域（Ｄｐ）に対して相補的であり、
前記結合領域（Ａ）における前記ブロッキング領域（Ｂ）側の末端領域（Ａｂ）が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における前記部分領域（Ｄｐ）の隣接領域（Ｄｆ）に相補的であり、且つ、前記結合領域（Ａ）における前記ブロッキング領域（Ｂ）側とは反対側の末端領域（Ａｆ）に相補的である一本鎖核酸分子。
（II）前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、ブロッキング領域（Ｂ）、前記結合領域（Ａ）、および安定化領域（Ｓ）をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域（Ｂ）が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）に対して相補的であり、
前記ブロッキング領域（Ｂ）の前結合領域（Ａ）側の末端領域（Ｂａ）が、前記安定化領域（Ｓ）に対して相補的である一本鎖核酸分子。
（III）前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、ステム形成領域（ＳＤ）、前記結合領域（Ａ）およびステム形成領域（ＳＡ）を有し、
前記ステム形成領域（ＳＤ）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）に対して相補的な配列を有し、
前記ステム形成領域（ＳＡ）は、前記結合領域（Ａ）に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子。
（IV）前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）および前記結合領域（Ａ）を有し、
前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）が、第１領域（Ｄ１）と第２領域（Ｄ２）とを含み、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とによりＧ−カルテットを形成する領域であり、
前記結合領域（Ａ）の一方の末端側に前記第１領域（Ｄ１）を有し、前記結合領域（Ａ）の他方の末端側に前記第２領域（Ｄ２）を有する一本鎖核酸分子。
（Ｖ）第１鎖（ｓｓ１）と第２鎖（ｓｓ２）とから構成される二本鎖核酸分子であり、
前記第１鎖（ｓｓ１）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記結合領域（Ａ）とを有し、
前記第２鎖（ｓｓ２）は、ステム形成領域（ＳＤ）およびステム形成領域（ＳＡ）を有し、前記ステム形成領域（ＳＤ）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、前記結合領域（Ａ）に対して相補的な配列を有する二本鎖核酸分子。
【０００８】
本発明のターゲット分析用キットは、センサと試薬とを含み、前記センサが、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサであり、前記試薬が、ポルフィリンを含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明のターゲット分析方法は、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサに試料を接触させる接触工程、および、
ポルフィリン存在下、前記センサにおける前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体による蛍光を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のターゲット分析用蛍光センサによれば、簡便且つ効率的に、蛍光の発生により間接的にターゲットを分析できる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明のセンサにおける核酸分子の一例を示す模式図である。
【図２】図２は、本発明のセンサにおける核酸分子の一例を示す模式図である。
【図３】図３は、本発明のセンサにおける核酸分子の一例を示す模式図である。
【図４】図４は、本発明のセンサにおける核酸分子の一例を示す模式図である。
【図５】図５は、本発明のセンサにおける核酸分子の一例を示す模式図である。
【図６】図６は、本発明のセンサにおけるＧ−カルテット構造の一例を示す模式図である。
【図７】図７は、本発明のセンサにおける核酸分子の一例を示す模式図である。
【図８】図８は、本発明の実施例２において、蛍光強度を示すグラフであり、（Ａ）は、メラミンセンサ添加の結果、（Ｂ）は、メラミンセンサ未添加の結果である。
【図９】図９は、本発明の実施例３において、蛍光強度を示すグラフであり、（Ａ）は、メラミンセンサ添加の結果、（Ｂ）は、メラミンセンサ未添加の結果である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例３において、メラミンセンサ添加とメラミンセンサ未添加の蛍光強度の差を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．ターゲット分析用蛍光センサ
本発明のターゲット分析用センサは、前述のように、Ｇ−カルテット構造を形成するＧ−カルテット形成領域（Ｄ）とターゲットに結合する結合領域（Ａ）とを有する前記（Ｉ）、（II）、（III）、（IV）および（Ｖ）からなる群から選択された少なくとも一つの核酸分子を含み、
ターゲット非存在下、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成が阻害され、
ターゲット存在下、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）においてＧ−カルテット構造が形成され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
【００１３】
以下、本発明のターゲット分析用センサをセンサ、領域を核酸領域ともいう。本発明における前記一本鎖核酸分子は、例えば、一本鎖核酸素子ということもできる。また、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）について、Ｇ−カルテット構造の形成が阻害されることを、スイッチ−ＯＦＦ（またはｔｕｒｎ−ＯＦＦ）、Ｇ−カルテット構造が形成されることを、スイッチ−ＯＮ（またはｔｕｒｎ−ＯＮ）ともいう。
【００１４】
前記Ｇ−カルテット（Ｇ−ｔｅｔｒａｄともいう）は、一般に、Ｇ（グアニン）が四量体となった面の構造として知られている。本発明において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、複数の塩基Ｇを有し、その領域内で、複数の塩基ＧによるＧ−カルテット構造を形成する領域である。本発明において、前記Ｇ−カルテット構造は、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型のいずれでもよく、好ましくは、パラレル型である。本発明のセンサにおいて、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）において形成されるＧ−カルテット構造の個数は、特に制限されず、例えば、１面でも、２面以上の複数でもよいが、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、Ｇ−カルテットが複数面重なった、グアニン四重鎖（またはＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘという）構造を形成することが好ましい。本発明において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の配列は、前記Ｇ−カルテット構造を形成する配列であればよく、より好ましくは、グアニン四重鎖構造を形成する配列である。
【００１５】
ポルフィリン存在下でＧ−カルテット構造を形成した領域は、ポルフィリンとの複合体形成により、蛍光を発する。他方、本発明のセンサは、ターゲットの非存在下では、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）が、Ｇ−カルテット構造の形成を阻害されており、ターゲット存在下で、前記結合領域（Ａ）にターゲットが接触することで、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成阻害が解除され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）がＧ−カルテット構造を形成する。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）がＧ−カルテット構造を形成できないため、ポルフィリンとの複合体形成による蛍光は発することなく、ターゲット存在下で、はじめて前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）がＧ−カルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体形成による蛍光が生じる。このため、例えば、試料におけるターゲットの存在の有無またはターゲット量を、Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体形成による蛍光によって、分析できる。
【００１６】
前記Ｇ−カルテット構造を形成する核酸分子としては、例えば、酵素の触媒機能を生じる核酸分子（触媒核酸分子）が知られている。前記触媒機能は、特に制限されず、例えば、酸化還元反応の触媒機能である。前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間に電子の授受を生じる反応である。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性（以下、「ペルオキシダーゼ様活性」という）等があげられる。前記ペルオキシダーゼ活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）活性があげられる。前記触媒核酸分子は、一般に、ＤＮＡ配列の場合、ＤＮＡエンザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅと呼ばれ、ＲＮＡ配列の場合、ＲＮＡエンザイムまたはＲＮＡｚｙｍｅと呼ばれる。本発明において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、このような前記触媒核酸分子を使用できる。なお、本発明において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、Ｇ−カルテット構造を形成できればよく、前記触媒機能の有無は制限されない。
【００１７】
前記ＤＮＡｚｙｍｅとしては、例えば、下記論文（１）〜（４）等の核酸分子が例示できる。
（１）Travascioら，  Chem.  Biol.,  1998年,  vol.5，  p.505-517
（２）Chengら,  Biochimistry,  2009年,  vol.48,  p.7817-7823
（３）Tellerら，  Anal.  Chem.,  2009年,  vol.81,  p.9114-9119
（４）Taoら,  Anal.  Chem.,  2009年,  vol.81,  p.2144-2149
【００１８】
前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、一本鎖型でもよいし、二本鎖型でもよい。前記一本鎖型は、例えば、一本鎖のＧ−カルテット形成領域（Ｄ）内で、Ｇ−カルテット構造を形成でき、前記二本鎖型は、例えば、第１領域（Ｄ１）と第２領域（Ｄ２）とからなり、前記第１領域（Ｄ1）と前記第２領域（Ｄ２）との間で、Ｇ−カルテット構造を形成できる。後者の二本鎖型は、例えば、前記第１領域と、前記第２領域とが、間接的に連結された構造があげられ、具体的には、後述する核酸分子（IV）において説明する。
【００１９】
前記一本鎖型のＧ−カルテット形成領域（Ｄ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１１塩基長、好ましくは１３塩基長、より好ましくは１５塩基長であり、上限は、例えば、６０塩基長、好ましくは３６塩基長、より好ましくは１８塩基長である。
【００２０】
前記二本鎖型のＧ−カルテット形成領域（Ｄ）において、前記第１領域（Ｄ１）および前記第２領域（Ｄ２）の長さは、特に制限されず、両者は同じであっても異なってもよい。前記第１領域（Ｄ１）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、７塩基長、好ましくは８塩基長、より好ましくは１０塩基長であり、上限は、例えば、３０塩基長、好ましくは２０塩基長、より好ましくは１０塩基長、その範囲は、例えば、７〜３０塩基長、好ましくは７〜２０塩基長、より好ましくは７〜１０塩基長である。前記第２領域（Ｄ２）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、７塩基長、好ましくは８塩基長、より好ましくは１０塩基長であり、上限は、例えば、３０塩基長、好ましくは２０塩基長、より好ましくは１０塩基長、その範囲は、例えば、７〜３０塩基長、好ましくは７〜２０塩基長、より好ましくは７〜１０塩基長である。
【００２１】
本発明のセンサにおいて、ターゲットは、特に制限されず、任意のターゲットが選択できる。そして、前記任意のターゲットに応じて、前記ターゲットに結合する結合核酸分子を、前記結合領域（Ａ）として使用すればよい。
【００２２】
前記ターゲットは、特に制限されず、例えば、低分子化合物、微生物、ウイルス、食物アレルゲン、農薬、カビ毒、抗体等が例示できる。前記低分子化合物は、例えば、メラミン、抗生物質、農薬、環境ホルモン等があげられる。前記微生物は、例えば、サルモネラ菌、リステリア菌、大腸菌、カビ等があげられ、前記ウイルスは、例えば、ノロウイルス等があげられる。
【００２３】
前記結合領域（Ａ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１２塩基長、好ましくは１５塩基長、より好ましくは１８塩基長であり、上限は、例えば、１４０塩基長、好ましくは８０塩基長、より好ましくは６０塩基長であり、その範囲は、例えば、１２〜１４０塩基長であり、好ましくは１５〜８０塩基長であり、より好ましくは１８〜６０塩基長である。
【００２４】
本発明において、ある配列に対して他の配列が相補的であるとは、例えば、両者間でアニーリングが生じ得る配列であることを意味する。前記アニーリングを、ステム形成ともいう。本発明において、相補的とは、例えば、２種類の配列をアラインメントした際の相補性が、例えば、９０％以上であること、好ましくは９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上であり、より好ましくは９９％以上であり、特に好ましくは１００％、すなわち完全相補である。また、核酸分子内において、ある配列に対して他の配列が相補的であるとは、一方の５’側から３’側に向かう配列と、他方の３’側から５’側に向かう配列とを対比させた際に、互いの塩基が相補的であることを意味する。
【００２５】
本発明のセンサにおける前記核酸分子について、前記（Ｉ）、（II）、（III）、（IV）および（Ｖ）のそれぞれを、以下に説明する。なお、特に示さない限り、各核酸分子の記載を、それぞれ援用できる。
【００２６】
（１）核酸分子（Ｉ）
前記核酸分子（Ｉ）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、ブロッキング領域（Ｂ）、および前記結合領域（Ａ）をこの順序で有し、
前記ブロッキング領域（Ｂ）が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における部分領域（Ｄｐ）に対して相補的であり、
前記結合領域（Ａ）における前記ブロッキング領域（Ｂ）側の末端領域（Ａｂ）が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における前記部分領域（Ｄｐ）の隣接領域（Ｄｆ）に相補的であり、且つ、前記結合領域（Ａ）における前記ブロッキング領域（Ｂ）側とは反対側の末端領域（Ａｆ）に相補的な一本鎖核酸分子である。
【００２７】
前記核酸分子（Ｉ）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、前記一本鎖型である。
【００２８】
前記核酸分子（Ｉ）は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が、ＯＮ−ＯＦＦに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。一般的に、核酸配列は、形成し得る構造の間で熱力学的に揺らいでおり、相対的に安定性の高いものの存在比率が高くなると考えられている。そして、アプタマー等の結合核酸分子は、一般的に、ターゲット存在下では、ターゲットとの接触によって、より安定な立体構造に変化して、前記ターゲットに結合することが知られている。また、ＤＮＡｚｙｍｅ等の核酸分子も、一般的に、Ｇ−カルテット構造のような安定な立体構造によって、触媒活性を生起することが知られている。
【００２９】
前記核酸分子（Ｉ）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）が、前記ブロッキング領域（Ｂ）と相補的であり、且つ、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における隣接領域（Ｄｆ）が、前記結合領域（Ａ）の前記末端領域（Ａｂ）と相補的であるため、これらの相補関係において、ステム形成が可能である。このため、ターゲットの非存在下では、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）と前記ブロッキング領域（Ｂ）とのステム形成および前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の隣接領域（Ｄｆ）と前記結合領域（Ａ）の前記末端領域（Ａｂ）とのステム形成が生じる。前者のステム形成により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体形成が阻害され（スイッチ−ＯＦＦ）、後者のステム形成により、前記結合領域（Ａ）において、前記より安定な立体構造の形成がブロックされ、ターゲットと結合していない状態のブロッキング型構造が維持される。この状態の前記分子の構造を、ブロッキング型または不活性型ともいう。一方、ターゲットの存在下では、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触により、前記結合領域（Ａ）がより安定な立体構造に変化する。これに伴い、前記結合領域（Ａ）におけるステム形成が解除され、分子内アニーリングによって前記より安定な立体構造に変化した前記結合領域（Ａ）に、前記ターゲットが結合する。そして、前記結合領域（Ａ）におけるステム形成の解除に伴う前記結合領域（Ａ）の前記立体構造化により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のステム形成も解除され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）が分子内アニーリングによってより安定な立体構造に変化し、結果的に、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の領域内でＧ−カルテット構造が形成され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する（スイッチＯＮ）。この状態の構造を、活性型ともいう。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
【００３０】
前記核酸分子（Ｉ）は、さらに、安定化領域（Ｓ）を有してもよく、この場合、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、前記結合領域（Ａ）、および前記安定化領域（Ｓ）が、この順序で連結されていることが好ましい。以下、前記核酸分子（Ｉ）として、前記安定化領域（Ｓ）を有する一本鎖核酸分子の形態を示す場合、前記安定化領域（Ｓ）は、任意であり、含まない形態でもよい。
【００３１】
前記安定化領域（Ｓ）は、例えば、前記結合領域（Ａ）がターゲットと結合する際の構造を安定化するための配列である。前記安定化領域（Ｓ）は、例えば、前記ブロッキング領域（Ｂ）に相補的またはその一部に相補的であり、具体的には、前記ブロッキング領域（Ｂ）における前記結合領域（Ａ）側の末端領域（Ｂａ）に相補的であることが好ましい。この場合、例えば、ターゲット存在下、分子内アニーリングによる前記結合領域（Ａ）の立体構造が形成された際、前記結合領域（Ａ）に連結する前記安定化領域（Ｓ）と、前記結合領域（Ａ）に連結する前記ブロッキング領域（Ｂ）の末端領域（Ｂａ）との間でも、ステムが形成される。前記結合領域（Ａ）に連結する領域において、このようなステムが形成されることによって、ターゲットと結合する前記結合領域（Ａ）の立体構造が、より安定化される。
【００３２】
前記核酸分子（Ｉ）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、および前記結合領域（Ａ）、ならびに任意の前記安定化領域（Ｓ）の順序は、特に制限されず、例えば、５’側からこの順序で連結してもよいし、３’側からこの順序で連結してもよく、好ましくは前者である。図１に、前記核酸分子（Ｉ）の一例として、５’側から前記各領域が連結している状態の一本鎖核酸分子（Ｉ）の模式図を示す。図１において、（Ａ）が、各配列の順序を示した模式図であり、（Ｂ）が、ターゲット非存在下におけるブロッキング型の模式図であり、（Ｃ）は、ターゲット存在下における活性型の模式図である。図１において、Ｄは、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の構成単位（ヌクレオチド）、Ｂは、前記ブロッキング領域（Ｂ）の構成単位、Ａは、前記結合領域（Ａ）の構成単位、Ｓは、前記安定化領域（Ｓ）の構成単位を、それぞれ示し、各構成単位間の線は、結合を示す。なお、図１は、各領域を模式的に示したものであり、各領域の構成単位の数（配列の長さ）は、何ら制限されず、また、前記安定化領域（Ｓ）は、任意である（以下、同様）。
【００３３】
図１（Ａ）に示すように、前記核酸分子（Ｉ）の一例は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、前記結合領域（Ａ）、および任意で前記安定化領域（Ｓ）を、この順序で有する。前記核酸分子（Ｉ）は、例えば、図１（Ｂ）に示すように、ターゲット非存在下では、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の一部が、前記ブロッキング領域（Ｂ）および前記結合領域（Ａ）の一部と結合して、ステムを形成し、ブロッキング型の一本鎖核酸分子となる。他方、前記核酸分子（Ｉ）は、例えば、図１（Ｃ）に示すように、ターゲットの存在下では、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触により、前記結合領域（Ａ）は、その分子内アニーリングにより立体構造を形成し、それに伴い、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）におけるステム形成も解除され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、その分子内アニーリングにより、Ｇ−カルテット構造を形成する。また、図１（Ｃ）に示すように、例えば、前記ブロッキング領域（Ｂ）と前記安定化領域（Ｓ）とが結合することによって、前記結合領域（Ａ）の立体構造が、より安定化される。
【００３４】
前記核酸分子（Ｉ）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、および前記結合領域（Ａ）、ならびに任意で前記安定化領域（Ｓ）は、例えば、それぞれの間が、スペーサー配列が介在することにより間接的に連結してもよいが、前記スペーサー配列が介在することなく直接的に連結していることが好ましい。
【００３５】
前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、前述のように、前記ブロッキング領域（Ｂ）に相補的な配列を有し、且つ、前記結合領域（Ａ）の一部にも相補的な配列を有する。また、前記ブロッキング領域（Ｂ）は、前述のように、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の一部と相補的であり、また、前記安定化領域（Ｓ）を有する場合は、前記安定化領域（Ｓ）にも相補的である。
【００３６】
前記ブロッキング領域（Ｂ）の配列および長さは、特に制限されず、例えば、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の配列および長さ等に応じて、適宜設定できる。
【００３７】
前記ブロッキング領域（Ｂ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１塩基長であり、好ましくは２塩基長であり、より好ましくは３塩基長であり、上限は、例えば、２０塩基長であり、好ましくは１５塩基長であり、より好ましくは１０塩基長であり、その範囲は、例えば、１〜２０塩基長であり、好ましくは２〜１５塩基長であり、より好ましくは３〜１０塩基長である。
【００３８】
これに対して、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の前記部分領域（Ｄｐ）の長さは、例えば、下限は、例えば、１塩基長であり、好ましくは２塩基長であり、より好ましくは３塩基長であり、上限は、例えば、２０塩基長であり、好ましくは１５塩基長であり、より好ましくは１０塩基長であり、その範囲は、例えば、１〜２０塩基長であり、好ましくは２〜１５塩基長であり、より好ましくは３〜１０塩基長である。前記ブロッキング領域（Ｂ）の長さと前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の前記部分領域（Ｄｐ）の長さは、例えば、同じであることが好ましい。
【００３９】
前記核酸分子（Ｉ）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における前記部分領域（Ｄｐ）の位置、すなわち、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における前記ブロッキング領域（Ｂ）のアニール領域は、特に制限されない。前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、および前記結合領域（Ａ）、ならびに任意で前記安定化領域（Ｓ）が、この順序で連結している場合、前記部分領域（Ｄｐ）は、例えば、以下の条件で設定できる。
【００４０】
前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における前記部分領域（Ｄｐ）の隣接領域であって、前記部分領域（Ｄｐ）のブロッキング領域（Ｂ）側末端と前記ブロッキング領域（Ｂ）における前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）側末端との間の領域（Ｄｂ）の長さは、下限が、例えば、３塩基長であり、好ましくは４塩基長であり、より好ましくは５塩基長であり、上限が、例えば、４０塩基長であり、好ましくは３０塩基長であり、より好ましくは２０塩基長であり、その範囲が、例えば、３〜４０塩基長であり、好ましくは４〜３０塩基長であり、より好ましくは５〜２０塩基長である。
【００４１】
前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における前記部分領域（Ｄｐ）の隣接領域であって、前記ブロッキング領域（Ｂ）側とは反対側の領域（Ｄｆ）の長さは、下限が、例えば、０塩基長であり、好ましくは１塩基長であり、より好ましくは２塩基長であり、上限は、例えば、４０塩基長であり、好ましくは３０塩基長であり、より好ましくは２０塩基長であり、その範囲は、例えば、０〜４０塩基長であり、好ましくは１〜３０塩基長であり、より好ましくは２〜２０塩基長である。
【００４２】
前記結合領域（Ａ）における前記ブロッキング領域（Ｂ）側の末端領域（Ａｂ）は、前述のように、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の隣接領域（Ｄｆ）に相補的である。ここで、前記結合領域（Ａ）の末端領域（Ａｂ）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の隣接領域（Ｄｆ）の全領域に対して相補的でもよいし、前記隣接領域（Ｄｆ）の部分領域に対して相補的でもよい。後者の場合、前記結合領域（Ａ）の末端領域（Ａｂ）は、前記隣接領域（Ｄｆ）における、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）側の末端領域に対して相補的であることが好ましい。
【００４３】
前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の隣接領域（Ｄｆ）に相補的な、前記結合領域（Ａ）における末端領域（Ａｂ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１塩基長であり、上限は、例えば、２０塩基長であり、好ましくは８塩基長であり、より好ましくは３塩基長であり、その範囲は、例えば、１〜２０塩基長であり、好ましくは１〜８塩基長であり、より好ましくは１〜３塩基長である。
【００４４】
前記安定化領域（Ｓ）は、前述のように、例えば、ブロッキング領域（Ｂ）に相補的またはその一部に相補的であり、具体的には、前記ブロッキング領域（Ｂ）における前記結合領域（Ａ）側の末端領域（Ｂａ）に相補的であることが好ましい。
【００４５】
前記安定化領域（Ｓ）の配列および長さは、特に制限されず、例えば、前記ブロッキング領域（Ｂ）の配列および長さ、前記結合領域（Ａ）の配列および長さ等に応じて適宜決定できる。前記安定化領域（Ｓ）の長さは、下限が、例えば、０塩基長であり、好ましくは１塩基長であり、上限が、例えば、１０塩基長であり、好ましくは５塩基長であり、より好ましくは３塩基長であり、その範囲は、例えば、０〜１０塩基長であり、好ましくは１〜５塩基長であり、より好ましくは１〜３塩基長である。これに対して、例えば、前記安定化領域（Ｓ）が前記ブロッキング領域（Ｂ）の全体と相補的な場合、前記ブロッキング領域（Ｂ）は、前記安定化領域（Ｓ）と同じ長さであり、例えば、前記安定化領域（Ｓ）が前記ブロッキング領域（Ｂ）の一部と相補的な場合、前記ブロッキング領域（Ｂ）の一部、例えば、前記末端領域（Ｂａ）は、前記安定化領域（Ｓ）と同じ長さである。
【００４６】
前記核酸分子（Ｉ）の全長の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、２５塩基長であり、好ましくは３５塩基長であり、より好ましくは４０塩基長であり、上限は、例えば、２００塩基長であり、好ましくは１２０塩基長であり、より好ましくは８０塩基長であり、その範囲は、例えば、２５〜２００塩基長であり、好ましくは３５〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜８０塩基長である。
【００４７】
前記核酸分子（Ｉ）は、例えば、一方の末端または両端に、さらにリンカー領域が付加されてもよい。前記末端に付加されたリンカー領域を、以下、付加リンカー領域ともいう。前記付加リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、１〜６０塩基長である。
【００４８】
（２）核酸分子（II）
前記核酸分子（II）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、ブロッキング領域（Ｂ）、前記結合領域（Ａ）、および安定化領域（Ｓ）をこの順序で有し、前記ブロッキング領域（Ｂ）が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）に対して相補的であり、前記ブロッキング領域（Ｂ）の前結合領域（Ａ）側の末端領域（Ｂａ）が、前記安定化領域（Ｓ）に対して相補的な一本鎖核酸分子である。
【００４９】
前記核酸分子（II）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、前記一本鎖型である。
【００５０】
前記核酸分子（II）において、前記結合領域（Ａ）は、それ単独では、ターゲットとの結合に必要な分子内アニーリングが形成されない配列であることが好ましい。そして、前記核酸分子（II）は、ターゲット存在下、前記結合領域（Ａ）に隣接する前記ブロッキング領域（Ｂ）の末端領域（Ｂａ）と前記安定化領域（Ｓ）とのアニーリングによって、前記結合領域（Ａ）と前記末端領域（Ｂａ）と前記安定化領域（Ｓ）との全体から、前記立体構造が形成されることが好ましい。
【００５１】
前記核酸分子（II）は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が、ＯＮ−ＯＦＦに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。
【００５２】
前記一本鎖核酸（II）において、前記G−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）が、前記ブロッキング領域（Ｂ）と相補的であるため、この相補関係において、ステム形成が可能である。このため、ターゲットの非存在下では、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）と前記ブロッキング領域（Ｂ）とのステム形成が生じる。このステム形成により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体形成が阻害され（スイッチＯＦＦ）る。また、前記結合領域（Ａ）は、それ単独ではターゲットとの結合に必要な分子内アニーリングが形成されない配列であるため、ターゲットと結合するための、より安定な前記立体構造の形成がブロックされ、ターゲットと結合していない状態が維持される。つまり、ターゲット非存在下において、前記核酸分子（II）は、ブロッキング型構造が維持される。の状態の前記分子の構造を、ブロッキング型または不活性型ともいう。一方、ターゲットの存在下では、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触により、前記結合領域（Ａ）がより安定な立体構造に変化する。これに伴い、前記ブロッキング領域（Ｂ）の末端領域（Ｂａ）と前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）とのステム形成が解除され、新たに、前記ブロッキング領域（Ｂ）の末端領域（Ｂａ）と前記安定化領域（Ｓ）とのアニーリングにより、ステムが形成され、このステムが、前記結合領域（Ａ）がターゲットに結合するために必要な分子内アニーリングの役目を担い、前記ステムと前記結合領域（Ａ）との全体から、前記立体構造が形成され、前記結合領域（Ａ）に前記ターゲットが結合する。そして、前記ブロッキング領域（Ｂ）と前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とのステム形成の解除により、新たに前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）が分子内アニーリングによってＧ−カルテット構造を形成し、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する（スイッチＯＮ）。この状態の構造を、活性型ともいう。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
【００５３】
前記核酸分子（II）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、前記結合領域（Ａ）、および前記安定化領域（Ｓ）の順序は、特に制限されず、例えば、５’側からこの順序で連結してもよいし、３’側からこの順序で連結してもよく、好ましくは前者である。図２に、前記核酸分子（II）の一例として、５’側から前記各領域が連結している状態の一本鎖核酸分子（II）の模式図を示す。図２において、（Ａ）が、各領域の順序を示した模式図であり、（Ｂ）が、ターゲット非存在下におけるブロッキング型の模式図であり、（Ｃ）は、ターゲット存在下における活性型の模式図である。図２において、Ｄは、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の構成単位（ヌクレオチド）、Ｂは、前記ブロッキング領域（Ｂ）の構成単位、Ａは、前記結合領域（Ａ）の構成単位、Ｓは、前記安定化領域（Ｓ）の構成単位を、それぞれ示し、各構成単位間の線は、結合を示す。なお、図２は、各領域を模式的に示したものであり、各領域の構成単位の数（配列の長さ）は、何ら制限されない（以下、同様）。
【００５４】
図２（Ａ）に示すように、前記核酸分子（II）の一例は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、前記結合領域（Ａ）、および前記安定化領域（Ｓ）を、この順序で有する。前記核酸分子（II）は、例えば、図２（Ｂ）に示すように、ターゲット非存在下では、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の一部が、前記ブロッキング領域（Ｂ）と結合して、ステムを形成し、ブロッキング型の一本鎖核酸となる。この際、前記結合領域（Ａ）は、前記立体構造を形成していない。他方、前記核酸分子（II）は、例えば、図２（Ｃ）に示すように、ターゲットの存在下では、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触により、前記ブロッキング領域（Ｂ）と前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とのステム形成が解除され、新たに、前記ブロッキング領域（Ｂ）と前記安定化領域（Ｓ）との間でステムが形成され、前記結合領域（Ａ）と前記ブロッキング領域（Ｂ）と前記安定化領域（Ｓ）とから、立体構造が形成される。そして、例えば、前記ブロッキング領域（Ｂ）と前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とのステム形成の解除に伴い、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、その分子内アニーリングにより、Ｇ−カルテット構造を形成する。また、図２（Ｃ）に示すように、例えば、前記ブロッキング領域（Ｂ）と前記安定化領域（Ｓ）との結合によって、前記結合領域（Ａ）と前記ブロッキング領域（Ｂ）と前記安定化領域（Ｓ）とから形成された立体構造が、より安定化される。
【００５５】
前記核酸分子（II）において、特に示さない限り、前記核酸分子（Ｉ）の記載を援用できる。前記核酸分子（II）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、前記ブロッキング領域（Ｂ）、および前記安定化領域（Ｓ）は、例えば、前記核酸分子（Ｉ）と同様である。
【００５６】
前記ブロッキング領域（Ｂ）は、前述のように、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記安定化領域（Ｓ）のそれぞれに対して、相補的な配列を有している。具体的には、前記ブロッキング領域（Ｂ）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の部分領域（Ｄｐ）に相補的であり、前記ブロッキング領域（Ｂ）の前記結合領域（Ａ）側の末端領域（Ｂａ）は、前記安定化領域（Ｓ）に対しても相補的である。
【００５７】
前記ブロッキング領域（Ｂ）において、前記安定化領域（Ｓ）と相補的な末端領域（Ｂａ）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、１塩基長であり、上限は、例えば、１５塩基長であり、好ましくは１０塩基長であり、より好ましくは３塩基長であり、その範囲は、例えば、１〜１０塩基長であり、好ましくは１〜５塩基長であり、より好ましくは１〜３塩基長である。
【００５８】
前記核酸分子（II）の全長の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、２５塩基長であり、好ましくは３５塩基長であり、より好ましくは４０塩基長であり、上限は、例えば、２００塩基長であり、好ましくは１２０塩基長であり、より好ましくは８０塩基長であり、その範囲は、例えば、２５〜２００塩基長であり、好ましくは３５〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜８０塩基長である。
【００５９】
（３）核酸分子（III）
前記核酸分子（III）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）、ステム形成領域（ＳＤ）、前記結合領域（Ａ）およびステム形成領域（ＳＡ）を有し、前記ステム形成領域（ＳＤ）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、前記結合領域（Ａ）に対して相補的な配列を有する一本鎖核酸分子である。
【００６０】
前記核酸分子（III）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、前記一本鎖型である。
【００６１】
前記核酸分子（III）は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が、ＯＮ−ＯＦＦに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。前記核酸分子（III）は、ターゲット非存在下では、前記分子内で、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記ステム形成領域（ＳＤ）とがアニーリングすることで、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体形成が阻害される（スイッチ−ＯＦＦ）。また、前記分子内で、前記結合領域（Ａ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）とがアニーリングすることで、前記結合領域（Ａ）の構造も固定されている。この状態の前記分子の構造を、不活性型ともいう。他方、前記核酸分子（III）は、ターゲット存在下では、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域（Ａ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）とのアニーリングが解除され、前記結合領域（Ａ）の立体構造が、より安定な構造に変化する。これに伴い、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記ステム形成領域（ＳＤ）とのアニーリングが解除され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の領域内でＧ−カルテット構造が形成され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する（スイッチ−ＯＮ）。この状態の前記分子の構造を、活性型ともいう。このため、前記核酸分子（III）によれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
【００６２】
前記ステム形成領域（ＳＤ）は、例えば、その全部または一部が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の一部に対して相補的な配列であることが好ましい。また、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、例えば、その全部または一部が、前記結合領域（Ａ）の一部に対して相補的な配列であることが好ましい。
【００６３】
前記核酸分子（III）において、前記各領域の順序は、前記分子内で、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記ステム形成領域（ＳＤ）とがアニーリングし、前記結合領域（Ａ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）とがアニーリングする順序であればよい。具体例としては、以下の順序が例示できる。
（１）  ５’−  Ａ−ＳＤ−Ｄ−ＳＡ  −３’
（２）  ５’−  ＳＡ−Ｄ−ＳＤ−Ａ  −３’
（３）  ５’−  Ｄ−ＳＡ−Ａ−ＳＤ  −３’
（４）  ５’−  ＳＤ−Ａ−ＳＡ−Ｄ  −３’
【００６４】
前記（１）−（４）の形態は、例えば、以下のように、Ｇ−カルテット構造の形成がＯＮ−ＯＦＦされる。ターゲット非存在下、前記結合核酸分子（Ａ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）と前記ステム形成領域（ＳＤ）が、それぞれステムを形成し、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成を阻害する。そして、ターゲット存在下、前記結合核酸分子（Ａ）へのターゲットの接触により、前記それぞれのステム形成が解除され、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）において、Ｇ−カルテット構造が形成される。
【００６５】
前記（１）および（３）において、前記ステム形成領域（ＳＤ）は、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）の３’側領域と相補的であり、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、前記結合核酸分子（Ａ）の３’側領域と相補的であることが好ましい。前記（２）および（４）において、前記ステム形成領域（ＳＤ）は、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）の５’側領域と相補的であり、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、前記結合核酸分子（Ａ）の５’側領域と相補的であることが好ましい。
【００６６】
前記核酸分子（III）は、例えば、前記各領域間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが、前記介在リンカー領域を介して結合していることを意味する。前記介在リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。
【００６７】
前記核酸分子（III）は、例えば、前記介在リンカー領域として、互いに非相補的な２つの介在リンカー領域を有することが好ましい。前記２つの介在リンカー領域の位置は、特に制限されない。
【００６８】
具体例として、前記（１）−（４）が、さらに２つの介在リンカー領域を有する形態について、例えば、以下の順序が例示できる。以下の例示において、前記結合核酸分子（Ａ）に連結する介在リンカー領域を（Ｌ１）、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）に連結する介在リンカー領域を（Ｌ２）で示す。前記核酸分子（II）は、例えば、介在リンカー領域として、例えば、（Ｌ１）および（Ｌ２）の両方を有してもよいし、いずれか一方のみを有してもよい。
（１’）  ５’−  Ａ−Ｌ１−ＳＤ−Ｄ−Ｌ２−ＳＡ  −３’
（２’）  ５’−  ＳＡ−Ｌ２−Ｄ−ＳＤ−Ｌ１−Ａ  −３’
（３’）  ５’−  Ｄ−Ｌ２−ＳＡ−Ａ−Ｌ１−ＳＤ  −３’
（４’）  ５’−  ＳＤ−Ｌ１−Ａ−ＳＡ−Ｌ２−Ｄ  −３’
【００６９】
前記（１’）−（４’）の形態は、例えば、以下のように、Ｇ−カルテット構造の形成がＯＮ−ＯＦＦされる。ターゲット非存在下において、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）と前記ステム形成領域（ＳＤ）が、それぞれステムを形成し、これら２つのステムの間で、前記介在リンカー領域（Ｌ１）と前記介在リンカー領域（Ｌ２）が、内部ループを形成して、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成を阻害する。そして、ターゲット存在下、前記結合核酸分子（Ａ）へのターゲットの接触により、前記それぞれのステム形成が解除され、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）において、Ｇ−カルテット構造が形成される。
【００７０】
前記（１’）−（４’）の形態を例として、ターゲット非存在下における前記核酸分子（III）の状態を、図３および図４の模式図に示す。図３および図４において、（Ａ）と（Ｂ）とは、互いに、各領域の順序が、逆向きとなっている形態を示す。図３（Ａ）が、形態（１’）、図３（Ｂ）が、形態（２’）、図４（Ａ）が、形態（３’）、図４（Ｂ）が、形態（４’）である。
【００７１】
図３および図４において、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｌ１は、前記介在リンカー領域（Ｌ１）、ＳＤは、前記ステム形成配列（ＳＤ）、Ｄは、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）、Ｌ２は、前記介在リンカー領域（Ｌ２）、ＳＡは、前記ステム形成配列（ＳＡ）を示す。図３および図４に示すように、ターゲット非存在下では、前記核酸分子（II）の自己アニーリングによって、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。そして、ターゲット存在下では、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合することによって、前記２つのステム形成が解除され、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）がＧ−カルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発する。
【００７２】
前記核酸分子（III）において、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さは、特に制限されない。前記ステム形成配列（ＳＡ）の長さは、例えば、１〜６０塩基長であり、好ましくは１〜１０塩基長であり、より好ましくは１〜７塩基長である。前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さは、例えば、１〜３０塩基長であり、好ましくは０〜１０塩基長、１〜１０塩基長であり、より好ましくは、０〜７塩基長、１〜７塩基長である。前記ステム形成配列（ＳＡ）と前記ステム形成配列（ＳＤ）は、例えば、同じ長さでもよいし、前者が長くてもよいし、後者が長くてもよい。
【００７３】
前記介在リンカー領域（Ｌ１）および（Ｌ２）の長さは、特に制限されない。前記介在リンカー領域（Ｌ１）および（Ｌ２）の長さは、それぞれ、例えば、０〜３０塩基長、好ましくは１〜３０塩基長、より好ましくは１〜１５塩基長、さらに好ましくは、１〜６塩基長である。また、前記介在リンカー領域（Ｌ１）および（Ｌ２）の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。前記介在リンカー領域（Ｌ１）および前記（Ｌ２）は、後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、１〜１０塩基長、好ましくは１または２塩基長、より好ましくは１塩基長である。
【００７４】
前記核酸分子（III）の長さは、特に制限されない。前記核酸分子（II）の長さは、例えば、４０〜１２０塩基長であり、好ましくは４５〜１００塩基長であり、より好ましくは、５０〜８０塩基長である。
【００７５】
前記一本鎖核酸分子（III）は、例えば、一方の末端または両端に、さらに前記付加リンカー領域が付加されてもよい。前記付加リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
【００７６】
前記核酸分子（III）は、例えば、一方の末端が、前記付加リンカー領域を介して、基材に連結されてもよい。
【００７７】
（４）核酸分子（IV）
前記核酸分子（IV）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）および前記結合領域（Ａ）を有し、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）が、第１領域（Ｄ１）と第２領域（Ｄ２）とを含み、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とによりＧ−カルテットを形成する領域であり、前記結合領域（Ａ）の一方の末端側に前記第１領域（Ｄ１）を有し、前記結合領域（Ａ）の他方の末端側に前記第２領域（Ｄ２）を有する一本鎖核酸分子である。
【００７８】
前記核酸分子（IV）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、前記二本鎖型（以下、「スプリット型」ともいう）である。前記スプリット型のＧ−カルテット形成分子（Ｄ）は、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とを含み、両者が一対となりＧ−カルテット構造を形成する分子である。前記核酸分子（IV）において、前記第１領域（Ｄ１）および前記第２領域（Ｄ２）は、それぞれ、前記Ｇ−カルテット構造を形成する配列であればよく、より好ましくは、グアニン四重鎖構造を形成する配列である。
【００７９】
前記核酸分子（IV）は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が、ＯＮ−ＯＦＦに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。前記核酸分子（IV）は、前述のように、一対となってＧ−カルテット構造を形成する前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とが、前記結合領域（Ａ）を介して、それぞれ離れて配置されている。このように、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とが距離を置いて配置されているため、ターゲット非存在下では、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）との間で、Ｇ−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）とポルフィリンとの複合体形成が阻害される（スイッチ−ＯＦＦ）。この状態の前記分子の構造を、不活性型ともいう。他方、前記核酸分子（IV）は、ターゲット存在下では、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域（Ａ）の立体構造が、ステムループ構造を有するより安定な構造に変化する。この前記結合領域（Ａ）の立体構造の変化に伴い、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とが接近し、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）との間で、Ｇ−カルテット構造が形成され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する（スイッチ−ＯＮ）。この状態の前記分子の構造を、活性型ともいう。このため、前記核酸分子（IV）によれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
【００８０】
前記核酸分子（IV）は、前述のように、Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）として、二本鎖型を使用し、前記結合領域（Ａ）を介して、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とを配置している。このため、例えば、アプタマーの種類ごとに条件設定を行う必要がなく、前記結合領域（Ａ）として所望のアプタマーをセットできることから、汎用性に優れる。
【００８１】
前記核酸分子（IV）において、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）は、前記結合領域（Ａ）を介して配置されていればよく、いずれが前記結合領域（Ａ）の５’側または３’側に配置されてもよい。以下、特に説明しない限り、便宜上、前記結合領域（Ａ）の５’側に前記第１領域（Ｄ１）、前記結合領域（Ａ）の３側に前記第２領域（Ｄ２）が配置されている例を示す。
【００８２】
前記核酸分子（IV）は、例えば、前記第１領域（Ｄ１）と前記結合領域（Ａ）との間が、直接的または間接的に連結してもよいし、前記第２領域（Ｄ２）と前記結合領域（Ａ）との間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが、前記介在リンカー領域を介して結合していることを意味し、具体的には、一方の領域の３’末端と前記介在リンカー領域の５’末端とが直接結合し、前記介在リンカー領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが直接結合していることを意味する。前記介在リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。
【００８３】
前記核酸分子（IV）は、前述のように、前記第１領域（Ｄ１）と前記結合領域（Ａ）との間に前記介在リンカー領域（第１リンカー領域（Ｌ１））を有し、前記第２領域（Ｄ２）と前記結合領域（Ａ）との間に前記介在リンカー領域（第２リンカー領域（Ｌ２））を有することが好ましい。前記第１リンカー領域（Ｌ１）および前記第２リンカー領域（Ｌ２）は、いずれか一方でもよく、両方を有することが好ましい。前記第１リンカー領域（Ｌ１）と前記第２リンカー領域（Ｌ２）の両方を有する場合、それぞれの長さは、同じ長さでもよいし異なってもよい。
【００８４】
前記リンカー領域の長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、１、３、５、７、９塩基長であり、その上限は、例えば、２０、１５、１０塩基長である。
【００８５】
また、前記第１リンカー領域(Ｌ１)の５’末端側からの塩基配列と前記第２リンカー領域(Ｌ２)の３’末端側からの塩基配列とは、例えば、互いに非相補的であることが好ましい。この場合、前記第１リンカー領域(Ｌ１)の５’末端側からの塩基配列と前記第２リンカー領域(Ｌ２)の３’末端側からの塩基配列は、アライメントした状態で、前記核酸分子（IV）の分子内で内部ループを形成する領域ともいえる。このように、前記第１領域（Ｄ１）および前記第２領域（Ｄ２）と前記結合領域（Ａ）との間に、非相補的な前記第１リンカー領域（Ｌ１）と前記第２リンカー領域（Ｄ２）を有することで、例えば、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）との距離を十分に保つことができる。このため、例えば、ターゲット非存在下における、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とによるＧ−カルテット構造の形成を、十分に抑制し、ターゲット非存在下での、蛍光発生に基づくバックグラウンドを十分に低下することができる。
【００８６】
前記核酸分子（IV）として、前記第１リンカー領域（Ｌ１）と前記第２リンカー領域（Ｌ２）と有する形態について、図５の模式図を用いて、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とによる蛍光発生のＯＮ−ＯＦＦを説明する。なお、本発明は、これには制限されない。図５は、前記核酸分子（IV）における蛍光発生のＯＮ−ＯＦＦを示す概略図である。図５の左に示すように、ターゲット非存在下、前記核酸分子（IV）は、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）との間でのＧ−カルテット構造の形成が抑制された不活性型となる。他方、ターゲット存在下では、前記結合領域（Ａ）にターゲットが接触することで、前記結合領域（Ａ）の立体構造が変化し、これに伴い、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とが接近して、両者の間でＧ−カルテット構造が形成された活性型となる。
【００８７】
前記核酸分子（IV）が、例えば、「Ｄ１−Ｗ−Ｄ２」で表され、リンカーとして、前記第１リンカー領域（Ｌ１）のみを有する場合、前記式におけるＷは、例えば、５’側から、第１リンカー領域（Ｌ１）と前記結合領域（Ａ）とをこの順序で有し、前記第２リンカー領域（Ｌ２）のみを有する場合、前記式におけるＷは、例えば、５’側から、前記結合領域（Ａ）と第２リンカー領域（Ｌ２）とをこの順序で有し、前記第１リンカー領域（Ｌ１）と前記第２リンカー領域（Ｌ２）の両方を有する場合、前記式におけるＷは、例えば、５’側から、前記第１リンカー領域（Ｌ１）と前記結合領域（Ａ）と前記第２リンカー領域（Ｌ２）とをこの順序で有する。この場合、Ｄ１−Ｗ−Ｄ２で表される核酸分子（IV）は、それぞれ、例えば、Ｄ１−Ｌ１−Ａ−Ｄ２、Ｄ１−Ａ−Ｌ２−Ｄ２またはＤ１−Ｌ１−Ａ−Ｌ２−Ｄ２と表すことができる。
【００８８】
前記核酸分子（IV）は、例えば、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とが、それぞれ、前記結合領域（Ａ）の位置とは反対側の末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。具体的には、例えば、前記第１領域（Ｄ１）が前記結合領域（Ａ）の５’側に配置されている場合、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とは、前記第１領域（Ｄ１）の５’末端と前記第２領域（Ｄ２）の３’末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。また、例えば、前記第１領域（Ｄ１）が前記結合領域（Ａ）の３’側に配置されている場合、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とは、前記第１領域（Ｄ１）の３’末端と前記第２領域（Ｄ２）の５’末端に、互いに相補的な配列を有することが好ましい。このように、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とが、それぞれの末端における前記相補的な配列を有することで、前記配列間で、分子内アニーリングによりステム構造の形成が可能となる。このため、例えば、ターゲット存在下、ターゲットの接触による前記結合領域（Ａ）の立体構造の変化に伴い、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とが接近した際、前記配列間でのステム構造の形成によって、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とのＧ−カルテット構造の形成がより容易になる。
【００８９】
前記核酸分子（IV）は、例えば、前述のように、Ｄ１−Ｗ−Ｄ２で表すことができ、具体的には、下記式（Ｉ）で表すことができる。
【化１】
0005503062.tif 000002
【００９０】
前記式（Ｉ）中、
５’側の配列(N)n1-GGG-(N)n2-(N)n3-が、前記第１領域（Ｄ１）の配列（ｄ１）であり、
３’側の配列-(N)m3-(N)m2-GGG-(N)m1が、前記第２領域（Ｄ２）の配列（ｄ２）であり、
Ｗが、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）との間の領域であって、前記結合領域（Ａ）を含み、
Nは、塩基を示し、n1、n2およびn3ならびにm1、m2およびm3は、それぞれ塩基Nの繰り返し個数を示す。
【００９１】
前記式（Ｉ）は、前記核酸分子（IV）において、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とを分子内アライメントした状態を示すが、これは、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）との配列の関係を示すための模式図であって、本発明において、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とが、この状態を取ることを限定するものではない。
【００９２】
前記第１領域（Ｄ１）の配列（ｄ１）および前記第２領域（Ｄ２）の配列（ｄ２）は、例えば、(N)n1と(N)m1とが、下記条件（１）を満たし、(N)n2と(N)m2とが、下記条件（２）を満たし、(N)n3と(N)m3とが、下記条件（３）を満たすことが好ましい。
【００９３】
条件（１）
(N)n1および(N)m1は、(N)n1の５’末端側からの塩基配列と(N)m1の３’末端側からの塩基配列とが、互いに相補的であり、n1およびm1は、同じ０または正の整数である。
条件（２）
(N)n2および(N)m2は、(N)n2の５’末端側からの塩基配列と(N)m2の３’末端側からの塩基配列とが、互いに非相補的であり、n2およびm2は、それぞれ、正の整数であり、同じでも異なってもよい。
条件（３）
(N)n3および(N)m3は、n3およびm3が、それぞれ、３または４であり、同じでも異なってもよく、３つの塩基Gを有し、n3またはm3が４の場合、(N)n3および(N)m3は、２番目または３番目の塩基がG以外の塩基Hである。
【００９４】
前記条件（１）は、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とをアライメントした場合の５’末端の(N)n1と３’末端の(N)m1との条件である。前記条件（１）において、前記(N)n1の５’末端側からの塩基配列と前記(N)m1の３’末端側からの塩基配列とは、互いに相補的であり、同じ長さである。(N)n1と(N)m1とは、同じ長さの相補的な配列であるため、アライメントした状態で、ステムを形成するステム領域ともいえる。
【００９５】
n1およびm1は、同じ０または正の整数であればよく、例えば、それぞれ、０、１〜１０であり、好ましくは、１、２または３である。
【００９６】
前記条件（２）は、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とをアライメントした場合の(N)n2と(N)m2との条件である。前記条件（２）において、前記(N)n2の塩基配列と前記(N)m2の塩基配列とは、互いに非相補的であり、n2およびm2は、同じ長さでも異なる長さでもよい。 (N)n2と(N)m2とは、非相補的な配列であるため、アライメントした状態で、内部ループを形成する領域ともいえる。
【００９７】
n2およびm2は、正の整数であり、例えば、それぞれ、１〜１０であり、好ましくは、１または２である。n2とm2とは、同じでも異なってもよく、例えば、n2＝m2、n2＞m2、n2＜m2のいずれでもよく、好ましくはn2＞m2、n2＜m2である。
【００９８】
前記条件（３）は、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）とをアライメントした場合の (N)n3と(N)m3との条件である。前記条件（３）において、前記(N)n3の塩基配列と前記(N)m3の塩基配列とは、それぞれ、３つの塩基Gを有する３塩基長または４塩基長の配列であり、同じでも異なってもよい。n3またはm3が４の場合、(N)n3および(N)m3は、２番目または３番目の塩基がG以外の塩基Hである。３つのGを有する(N)n3および(N)m3は、（N)n1と(N)n2との間のGGGおよび(N)m1と(N)m2との間のGGGとともに、Ｇ−カルテット構造を形成するＧ領域である。
【００９９】
n3およびm3は、例えば、n3＝m3、n3＞m3、n3＜m3のいずれでもよく、好ましくはn3＞m3、n3＜m3である。
【０１００】
G以外の塩基である前記塩基Hは、例えば、A、C、TまたはUがあげられ、好ましくは、A、CまたはTである。
【０１０１】
前記条件（３）は、具体例として、下記条件（３−１）、（３−２）または（３−３）があげられる。
条件（３−１）
(N)n3および(N)m3のうち、一方の５’側からの配列がGHGGであり、他方の５’側からの配列がGGGである。
条件（３−２）
(N)n3および(N)m3のうち、一方の５’側からの配列がGGHGであり、他方の５’側からの配列がGGGである。
条件（３−３）
(N)n3および(N)m3の両方の配列がGGGである。
【０１０２】
前記第１領域（Ｄ１）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、７塩基長、好ましくは８塩基長、より好ましくは１０塩基長であり、上限は、例えば、３０塩基長、好ましくは２０塩基長、より好ましくは１０塩基長、その範囲は、例えば、７〜３０塩基長、好ましくは７〜２０塩基長、より好ましくは７〜１０塩基長である。前記第２領域（Ｄ２）の長さは、特に制限されず、下限は、例えば、７塩基長、好ましくは８塩基長、より好ましくは１０塩基長であり、上限は、例えば、３０塩基長、好ましくは２０塩基長、より好ましくは１０塩基長、その範囲は、例えば、７〜３０塩基長、好ましくは７〜２０塩基長、より好ましくは７〜１０塩基長である。前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）の長さは、それぞれ同じであっても異なってもよい。
【０１０３】
前記核酸分子（IV）において、前記第１領域（Ｄ１）の配列（ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）の配列（ｄ２）との組み合わせを、以下に例示するが、本発明は、これらには制限されない。下記１〜４９の組み合わせにおいて、Ｗは、前記核酸分子（IV）における前記配列（ｄ１）および前記配列（ｄ２）との間の領域を意味し、５’末端側および３’末端側の小文字領域は、それぞれ(N)n1および(N)m1を示し、５’側および３’側の下線部領域は、それぞれ(N)n2および(N)m2を示し、５’側および３’側の下線部領域とＷとの間の領域が、それぞれ(N)n3および(N)m3を示す。
【０１０４】
【表１】
0005503062.tif 000003
【０１０５】
表１の組み合わせ１−２４は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、０−３塩基長に変化させ、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、ACの２塩基長とAの１塩基長、Ｇ領域となる(N)n3および(N)m3を、GGGの３塩基長とGTGGの４塩基長に設定した配列であり、Ｗは、制限されない。
【０１０６】
【表２】
0005503062.tif 000004
【０１０７】
表２の組み合わせ２５−４８は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、Aの１塩基長とTの１塩基長、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、１または２塩基長に変化させ、Ｇ領域となる(N)n3および(N)m3を、GAGG、GGAG、GCGGおよびGTGGの４種類の４塩基長とGGGの３塩基長に設定した配列であり、Ｗは、制限されない。表２の組み合わせ４９は、ステム領域となる(N)n1および(N)m1を、CAの２塩基長とTGの２塩基長、内部ループ領域となる(N)n2および(N)m2を、TおよびAの１塩基長、Ｇ領域となる(N)n3および(N)m3を、GAGGの４塩基長とGGGの３塩基長に設定した配列であり、Ｗは、制限されない。
【０１０８】
ターゲット存在下、前記核酸分子（IV）における前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）との間で形成されるＧ−カルテット構造について、一例として、組み合わせ２４（配列番号２４）を図６に示す。図６は、組み合わせ２４（配列番号２４）の一本鎖核酸分子における、前記第１領域（Ｄ１）と前記第２領域（Ｄ２）との間で形成されるＧ−カルテット構造の概略である。図６に示すように、前記第１領域（Ｄ１）におけるＧと前記第２領域（Ｄ２）におけるＧとの間で、Ｇ−カルテットが３面重なったグアニン四重鎖が形成される。なお、本発明は、この例示に限定されない。
【０１０９】
前記核酸分子（IV）の長さは、特に制限されない。前記核酸分子（IV）の長さは、下限が、例えば、２５塩基長、好ましくは３０塩基長、より好ましくは３５塩基長であり、上限が、例えば、２００塩基長、好ましくは１００塩基長、より好ましくは８０塩基長、その範囲が、例えば、２５〜２００塩基長、好ましくは３０〜１００塩基長、より好ましくは３５〜８０塩基長である。
【０１１０】
前記核酸分子（IV）は、例えば、一方の末端または両端に、さらに前記付加リンカー領域が付加されてもよい。前記付加リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
【０１１１】
前記核酸分子（IV）は、例えば、一方の末端が、前記付加リンカー領域を介して、基材に連結されてもよい。
【０１１２】
（５）核酸分子（Ｖ）
前記核酸分子（Ｖ）は、第１鎖（ｓｓ１）と第２鎖（ｓｓ２）とから構成される二本鎖核酸分子であり、前記第１鎖（ｓｓ１）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記結合領域（Ａ）とをこの順序で有し、前記第２鎖（ｓｓ２）は、ステム形成領域（ＳＤ）およびステム形成領域（ＳＡ）をこの順序で有し、前記ステム形成領域（ＳＤ）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）に対して相補的な配列を有し、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、前記結合領域（Ａ）に対して相補的な配列を有する二本鎖核酸分子である。
【０１１３】
前記核酸分子（Ｖ）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、前記一本鎖型である。
【０１１４】
前記核酸分子（Ｖ）は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が、ＯＮ−ＯＦＦに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。前記核酸分子（Ｖ）は、ターゲット非存在下では、前記分子内で、前記第１鎖（ｓｓ１）の前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記第２鎖（ｓｓ２）の前記ステム形成領域（ＳＤ）とがアニーリングすることで、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体形成が阻害される（スイッチ−ＯＦＦ）。また、前記分子内で、前記第１鎖（ｓｓ１）の前記結合領域（Ａ）と前記第２鎖（ｓｓ２）の前記ステム形成領域（ＳＡ）とがアニーリングすることで、前記結合領域（Ａ）の構造も固定されている。この状態の前記分子の構造を、不活性型ともいう。他方、前記核酸分子（Ｖ）は、ターゲット存在下では、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域（Ａ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）とのアニーリングが解除され、前記結合領域（Ａ）の立体構造が、より安定な構造に変化する。これに伴い、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記ステム形成領域（ＳＤ）とのアニーリングが解除され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の領域内でＧ−カルテット構造が形成され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する（スイッチ−ＯＮ）。この状態の前記分子の構造を、活性型ともいう。このため、前記核酸分子（Ｖ）によれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
【０１１５】
前記ステム形成領域（ＳＤ）は、例えば、その全部または一部が、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の一部に対して相補的な配列であることが好ましい。また、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、例えば、その全部または一部が、前記結合領域（Ａ）の一部に対して相補的な配列であることが好ましい。
【０１１６】
前記核酸分子（Ｖ）において、前記各領域の順序は、前記分子内で、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記ステム形成領域（ＳＤ）とがアニーリングし、前記結合領域（Ａ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）とがアニーリングする順序であればよい。具体例としては、以下の順序が例示できる。
（１）  ｓｓ１    ５’−  Ａ−Ｄ  −３’
ｓｓ２    ３’−  ＳＡ−ＳＤ  −５’
（２）  ｓｓ１    ５’−  Ｄ−Ａ  −３’
ｓｓ２    ３’−  ＳＤ−ＳＡ  −５’
【０１１７】
前記（１）において、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、前記結合核酸分子（Ａ）の３’側領域と相補的であり、前記ステム形成領域（ＳＤ）は、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）の５’側領域と相補的であることが好ましい。前記（２）において、前記ステム形成領域（ＳＤ）は、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）の３’側領域と相補的であり、前記ステム形成領域（ＳＡ）は、前記結合核酸分子（Ａ）の５’側領域と相補的であることが好ましい。
【０１１８】
前記核酸分子（Ｖ）は、例えば、前記各領域間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが、前記介在リンカー領域を介して結合していることを意味する。前記介在リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。
【０１１９】
前記核酸分子（Ｖ）は、例えば、前記第１鎖（ｓｓ１）における前記結合核酸分子（Ａ）と前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）との間、および、前記第２鎖（ｓｓ２）における前記ステム形成領域（ＳＤ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）との間に、前記介在リンカー領域を有することが好ましい。前記第１鎖（ｓｓ１）における介在リンカー領域（Ｌ１）と、前記第２鎖（ｓｓ２）における介在リンカー領域（Ｌ２）とは、互いに非相補的な配列であることが好ましい。
【０１２０】
具体例として、前記（１）および（２）が、前記第１鎖（ｓｓ１）および前記第２鎖（ｓｓ２）に前記介在リンカー領域を有する形態について、例えば、以下の順序が例示できる。以下の例示において、前記結合核酸分子（Ａ）と前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）とを連結する介在リンカー領域を（Ｌ１）、前記ステム形成領域（ＳＤ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）とを連結する介在リンカー領域を（Ｌ２）で示す。前記核酸分子（Ｖ）は、例えば、介在リンカー領域として、例えば、（Ｌ１）および（Ｌ２）の両方を有してもよいし、いずれか一方のみを有してもよい。
（１’）  ｓｓ１    ５’−  Ａ−Ｌ１−Ｄ  −３’
ｓｓ２    ３’−  ＳＡ−Ｌ２−ＳＤ  −５’
（２’）  ｓｓ１    ５’−  Ｄ−Ｌ１−Ａ  −３’
ｓｓ２    ３’−  ＳＤ−Ｌ２−ＳＡ  −５’
【０１２１】
前記（１’）および（２’）の形態は、例えば、以下のように、Ｇ−カルテット構造の形成がＯＮ−ＯＦＦされる。ターゲット非存在下において、例えば、前記結合核酸分子（Ａ）と前記ステム形成領域（ＳＡ）、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）と前記ステム形成領域（ＳＤ）が、それぞれステムを形成し、これら２つのステムの間で、前記介在リンカー領域（Ｌ１）と前記介在リンカー領域（Ｌ２）が、内部ループを形成して、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成を阻害する。そして、ターゲット存在下、前記結合核酸分子（Ａ）へのターゲットの接触により、前記それぞれのステム形成が解除され、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）において、Ｇ−カルテット構造が形成される。
【０１２２】
前記（１’）および（２’）の形態を例として、ターゲット非存在下における前記核酸分子（Ｖ）の状態を、図７の模式図に示す。図７において、（Ａ）と（Ｂ）とは、互いに、各領域の順序が、逆向きとなっている形態を示す。図７（Ａ）が、形態（１’）、図７（Ｂ）が、形態（２’）である。
【０１２３】
図７において、Ａは、前記結合核酸分子（Ａ）、Ｌ１は、前記介在リンカー領域（Ｌ１）、ＳＤは、前記ステム形成配列（ＳＤ）、Ｄは、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）、Ｌ２は、前記介在リンカー領域（Ｌ２）、ＳＡは、前記ステム形成配列（ＳＡ）を示す。図７に示すように、ターゲット非存在下では、前記核酸分子（IV）における前記第１鎖（ｓｓ１）と前記第２鎖（ｓｓ２）とのアニーリングによって、二カ所にステムが形成され、前記ステムの間に内部ループが形成される。そして、ターゲット存在下では、前記結合核酸分子（Ａ）にターゲットが結合することによって、前記２つのステム形成が解除され、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）がＧ−カルテット構造を形成し、ポルフィリンとの複合体を形成することで、蛍光を発する。
【０１２４】
前記核酸分子（Ｖ）において、前記ステム形成配列（ＳＡ）および前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さは、特に制限されない。前記ステム形成配列（ＳＡ）の長さは、例えば、１〜６０塩基長であり、好ましくは１〜１０塩基長であり、より好ましくは１〜７塩基長である。前記ステム形成配列（ＳＤ）の長さは、例えば、１〜３０塩基長であり、好ましくは０〜１０塩基長、１〜１０塩基長であり、より好ましくは、０〜７塩基長、１〜７塩基長である。前記ステム形成配列（ＳＡ）と前記ステム形成配列（ＳＤ）は、例えば、同じ長さでもよいし、前者が長くてもよいし、後者が長くてもよい。
【０１２５】
前記介在リンカー領域（Ｌ１）および（Ｌ２）の長さは、特に制限されない。前記介在リンカー領域（Ｌ１）および（Ｌ２）の長さは、それぞれ、例えば、０〜３０塩基長、好ましくは１〜３０塩基長、より好ましくは１〜１５塩基長、さらに好ましくは、１〜６塩基長である。また、前記介在リンカー領域（Ｌ１）および（Ｌ２）の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。前記介在リンカー領域（Ｌ１）および前記（Ｌ２）は、後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、１〜１０塩基長、好ましくは１または２塩基長、より好ましくは１塩基長である。
【０１２６】
前記核酸分子（Ｖ）において、前記第１鎖（ｓｓ１）および前記第２鎖（ｓｓ２）の長さは、特に制限されない。前記第１鎖（ｓｓ１）の長さは、例えば、４０〜２００塩基長であり、好ましくは４２〜１００塩基長であり、より好ましくは、４５〜６０塩基長である。前記第２鎖（ｓｓ２）の長さは、例えば、４〜１２０塩基長であり、好ましくは５〜２５塩基長であり、より好ましくは、１０〜１５塩基長である。
【０１２７】
前記一本鎖核酸分子（Ｖ）は、例えば、前記第１鎖（ｓｓ１）および前記第２鎖（ｓｓ２）の前記一方の末端または両端に、さらに前記付加リンカー領域が付加されてもよい。前記付加リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
【０１２８】
前記核酸分子（Ｖ）は、例えば、前記第１鎖（ｓｓ１）または前記第２鎖（ｓｓ２）の一方の末端が、前記付加リンカー領域を介して、基材に連結されてもよい。
【０１２９】
（６）核酸分子（VI）
本発明において、前記核酸分子は、例えば、下記核酸分子（VI）でもよい。前記核酸分子（VI）は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）および前記結合領域（Ａ）をこの順序で有し、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記結合領域（Ａ）とが、互いに相補的な配列を有する一本鎖核酸分子である。
【０１３０】
前記核酸分子（VI）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、前記一本鎖型である。
【０１３１】
前記核酸分子（VI）は、例えば、以下のようなメカニズムに基づいて、ターゲットの存否により、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が、ＯＮ−ＯＦＦに制御される。なお、本発明は、このメカニズムには制限されない。前記核酸分子（Ｉ）は、ターゲット非存在下では、前記分子内で、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記結合領域（Ａ）とがアニーリングすることで、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）のＧ−カルテット構造の形成が阻害され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体形成が阻害される（スイッチ−ＯＦＦ）。この状態の前記分子の構造を、不活性型ともいう。他方、前記核酸分子（Ｉ）は、ターゲット存在下では、前記結合領域（Ａ）への前記ターゲットの接触によって、前記結合領域（Ａ）の立体構造が、より安定な構造に変化する。これに伴い、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記結合領域（Ａ）との領域内アニーリングが解除され、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の領域内でＧ−カルテット構造が形成され、結果として、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体が形成され、蛍光を発する（スイッチ−ＯＮ）。この状態の構造を、活性型ともいう。このため、本発明のセンサによれば、ターゲット非存在下では、前記複合体形成による蛍光が発生せず、ターゲット存在下でのみ、前記複合体形成による蛍光が発生するため、定性または定量等のターゲット分析が可能となる。
【０１３２】
前記核酸分子（VI）において、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記結合領域（Ａ）とは、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）の５’側からの配列と、前記結合領域（Ａ）の３’側からの配列とが、互いに相補的な配列を有することが好ましい。前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における相補配列および前記結合領域（Ａ）における相補配列は、それぞれステム形成領域（Ｓ）ということもでき、また、前者の前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における相補配列は、前記結合領域（Ａ）に対するステム形成領域（ＳＡ）、後者の前記結合領域（Ａ）における相補配列は、前記結合領域（Ａ）における相補配列は、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）に対するステム形成領域（ＳＤ）ということもできる。前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）は、例えば、その一部が、前記相補配列、すなわち前記ステム形成領域（ＳＡ）であり、前記結合領域（Ａ）は、例えば、その一部が、前記相補配列、すなわち前記ステム形成領域（ＳＤ）であることが好ましい。前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）における前記相補配列の位置、前記結合領域（Ａ）における前記相補配列の位置は、それぞれ、特に制限されない。
【０１３３】
前記核酸分子（VI）において、前記Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）と前記結合核酸分子（Ａ）との間における各相補配列の長さは、特に制限されない。前記各相補配列の長さは、例えば、１〜３０塩基長、好ましくは１〜１０塩基長、より好ましくは１〜７塩基長である。
【０１３４】
前記核酸分子（VI）は、例えば、前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）と前記結合領域（Ａ）との間が、直接的または間接的に連結してもよい。前記直接的な連結は、例えば、一方の領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが直接結合していることを意味し、前記間接的な連結は、例えば、一方の領域の３’末端と他方の領域の５’末端とが、リンカー領域を介して結合していることを意味する。
【０１３５】
前記領域間を連結するリンカー領域を、以下、介在リンカー領域ともいう。前記介在リンカー領域は、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、好ましくは前者である。前記介在リンカー領域の長さは、特に制限されず、例えば、０〜２０、１〜１０塩基長、１〜６塩基長である。
【０１３６】
前記核酸分子（VI）は、例えば、一方の末端が、前記付加リンカー領域を介して、基材に連結されてもよい。
【０１３７】
前記核酸分子（VI）の長さは、特に制限されない。前記核酸分子（VI）の長さは、例えば、４０〜１２０塩基長であり、好ましくは４５〜１００塩基長であり、より好ましくは、５０〜８０塩基長である。
【０１３８】
本発明のセンサは、例えば、前記核酸分子を有する分子でもよいし、前記核酸からなる分子でもよい。
【０１３９】
本発明のセンサは、ヌクレオチド残基を含む分子であり、例えば、ヌクレオチド残基のみからなる分子でもよいし、ヌクレオチド残基を含む分子でもよい。前記ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。具体的に、前記センサは、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＤＮＡでもよいし、リボヌクレオチドおよび／またはその誘導体を含むＲＮＡでもよいし、前者と後者とを含むキメラ（ＤＮＡ／ＲＮＡ）でもよい。前記センサは、好ましくは、ＤＮＡである。
【０１４０】
前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基（非人工塩基）および非天然塩基（人工塩基）のいずれを含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、２’−フルオロピリミジン、２’−Ｏ−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−Ｏ−メチルウラシル、２−チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記候補分子は、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等の非ヌクレオチドを含んでもよい。
【０１４１】
前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリンおよび金属元素と錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、Ｎ−メチルメソポルフィリン（ＮＭＭ）、ＴＭＰｙＰ（５，１０，１５，２０−テトラキス（Ｎ−メチルピリジニウム−４−イル）−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィリン、テトラキス（ｐ−トルエンスルホネート））等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、鉄ポルフィリン、亜鉛ポルフィリン等があげられ、具体例として、Ｚｎ−ＤＩＧＰ（テトラキス−（ジイソプロピル−グアニジノ）亜鉛フタロシアニン）、ＺｎＰＰ９（Ｚｉｎｃ（Ｈ）プロトポルフィリンＤ）等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、ＮＭＭが好ましい。
【０１４２】
本発明のセンサは、例えば、前記核酸分子が遊離状態であってもよいし、前記核酸分子が固定化した状態であってもよい。後者のセンサは、例えば、前記核酸分子を前記基材に固定化し、デバイスとして使用できる。前記基材は、例えば、プレート、シート、フィルム、スワブ等の基板；ウェルプレート、チューブ等の容器；ビーズ、粒子、フィルター等があげられる。前記核酸分子は、例えば、５’末端および３’末端のいずれを固定化してもよい。
【０１４３】
前記固定化方法は、特に制限されず、例えば、化学的結合による連結が例示できる。具体例としては、例えば、前記基材および前記核酸分子のいずれか一方に、ストレプトアビジンまたはアビジンを結合させ、他方に、ビオチンを結合させ、前者と後者との結合を利用して固定化する方法があげられる。
【０１４４】
前記固定化方法は、例えば、この他に、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許５，４２４，１８６号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法は、例えば、前記基材上で前記核酸分子を合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法があげられ、具体例として、米国特許５，８０７，５２２号明細書、特表平１０−５０３８４１号公報等を参照できる。
【０１４５】
前記核酸分子は、例えば、前記基材に、直接的に固定化してもよいし、間接的に固定化してもよい。前者の場合、例えば、前記核酸分子の末端において、前記核酸分子を前記基材に固定化することが好ましい。後者の場合、例えば、前記核酸分子を、固定化用のリンカーを介して、前記基材に固定化してもよい。前記リンカーは、例えば、核酸配列でもよいし、非核酸配列でもよく、前述の付加リンカー領域等があげられる。前記基材に前記核酸分子が固定化されている場合、前記核酸分子の配置部は、前記センサにおける被検出部ということもできる。
【０１４６】
本発明のセンサは、例えば、複数の被検出部を備えてもよい。この場合、前記センサは、例えば、前記基材の表面をマトリックスに分画し、各分画領域に、前述のような被検出部を備えることが好ましい。本発明のセンサにおいて、１つの被検出部に配置するセンサの数は、特に制限されない。
【０１４７】
本発明のセンサは、例えば、さらに、試薬を含む試薬部が配置されてもよい。前記試薬は、例えば、前記ポルフィリンを含む。前記試薬部は、例えば、前記基材に配置でき、前記基材における前記試薬部の配置部位は、例えば、前記核酸分子の配置部位と同じでもよいし、異なってもよい。後者の場合、例えば、試料の添加によって、前記試薬部の前記試薬が、前記センサに接触できればよい。
【０１４８】
本発明のセンサの使用方法は、特に制限されず、以下のように、本発明のターゲットの分析方法に使用できる。
【０１４９】
２．ターゲット分析方法
本発明のターゲット分析方法は、前述のように、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサに試料を接触させる接触工程、および、ポルフィリン存在下、前記センサにおける前記Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）とポルフィリンとの複合体による蛍光を検出することによって、前記試料中のターゲットを検出する検出工程を含むことを特徴とする。
【０１５０】
前記試料は、特に制限されない。前記試料は、例えば、ターゲットを含む試料、およびターゲットを含有するか否かが不明な試料のいずれでもよい。前記試料は、例えば、液体試料が好ましい。被検体が、例えば、液体の場合、前記被検体をそのまま試料として使用してもよいし、溶媒に混合した希釈液を試料として使用してもよい。被検体が、例えば、固体、粉末等の場合は、溶媒に混合した混合液、または、溶媒に懸濁した懸濁液等を、試料として使用してもよい。前記溶媒は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等があげられる。前記被検体は、例えば、生体、土壌、海水、川水、下水、飲食品、浄水、空気中等から採取した検体があげられる。
【０１５１】
また、前記試料の具体例として、例えば、原乳、加工乳および粉ミルクがあげられる。前記試料中の非タンパク質または非脂質をターゲットとする場合、本発明のセンサによれば、例えば、前記試料からタンパク質および脂質を除去する前処理を行うことなく、前記試料中のターゲットを分析することができる。
【０１５２】
本発明のセンサとして、遊離状態の前記核酸分子を使用する場合、例えば、前記容器内で、前記センサと前記試料とを接触させることが好ましい。また、本発明のセンサとして、前記基材に固定化した前記核酸分子を使用する場合、例えば、前記基材上の前記センサに、前記試料を接触させることができる。
【０１５３】
前記検出工程は、例えば、ポルフィリン存在下、前記センサからの蛍光の検出を行う工程である。前記蛍光の検出は、例えば、目視でもよいし、蛍光強度の検出でもよい。
【０１５４】
蛍光強度の検出において、励起波長は、例えば、３５０〜５５０ｎｍ、好ましくは３５０〜４５０ｎｍ、より好ましくは３９９ｎｍであり、発光波長は、例えば、５５０〜７００ｎｍ、好ましくは５５０〜６５０ｎｍ、より好ましくは６０５ｎｍである。
【０１５５】
本発明の分析方法において、前記ポルフィリンは、例えば、前記接触工程で、前記センサと共存させてもよいし、次の検出工程で、前記センサと共存させてもよい。前者の場合、例えば、前記センサに前記試料を接触させる前に、前記センサにポルフィリンを供給してもよいし、前記試料の接触と同時に、前記センサにポルフィリンを供給してもよい。この場合、ポルフィリンは、例えば、前述のように、前記センサの試薬部に予め配置してもよい。他方、後者の場合、前記センサに前記試料を接触させた後、前記センサにポルフィリンを供給してもよい。
【０１５６】
ポルフィリンを前記センサに供給する場合、前記ポルフィリンの形態は、特に制限されず、例えば、液体に混合した試薬液として、前記センサに供給することが好ましい。前記ポルフィリンを混合する液体は、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液が好ましい。前記試薬液における前記ポルフィリンの濃度は、特に制限されず、例えば、５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１００〜３００ｍｍｏｌ／Ｌである。また、前記試薬液のｐＨは、例えば、６〜９であり、好ましくは６．８〜９である。
【０１５７】
前記接触工程の時間は、特に制限されず、例えば、１〜３０分である。前記接触工程および前記検出工程において、前記センサと前記試料とポルフィリンとが接触してから、蛍光を検出するまでの処理時間は、例えば、１〜３０分である。前記接触工程および前記検出工程の温度条件は、特に制限されず、例えば、１５〜３７℃である。
【０１５８】
本発明の分析方法において、前記接触工程と前記検出工程との間に、さらに、洗浄工程を有してもよい。前記洗浄工程は、例えば、前記センサと前記試料とを接触させた後、前記センサを洗浄液で洗浄する工程である。前記洗浄工程によって、例えば、前記試料中に含まれる夾雑物を除去でき、さらに精度に優れる分析が可能となる。前記洗浄液は、特に制限されず、例えば、水、緩衝液等の水性溶媒があげられる。前記センサは、例えば、前記洗浄工程が容易に行えることから、前述のような基材に前記核酸分子が固定化されていることが好ましい。
【０１５９】
本発明は、前述のように、Ｇ−カルテット形成領域（Ｄ）がＧ−カルテット構造を形成して、ポルフィリンとの複合体を形成することによって発生する蛍光を検出するため、前記センサ自体の発光の検出ともいえる。このため、本発明は、例えば、従来のセンサのように、ＤＮＡｚｙｍｅ等の触媒分子の触媒活性を測定するための、触媒反応用基質等は不要である。前記触媒反応用基質とは、例えば、触媒反応によって、発色、蛍光等を生じる、もしくは、それらが消失する基質等である。
【０１６０】
３．分析用キット
本発明の分析用キットは、前述のように、センサと試薬とを含み、前記センサが、前記本発明のターゲット分析用蛍光センサであり、前記試薬が、ポルフィリンを含むことを特徴とする。本発明の分析用キットは、前記センサとポルフィリンとを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。
【０１６１】
本発明の分析用キットは、前記センサおよびポルフィリンの他に、例えば、前記緩衝液および前記基材等の構成成分を含んでもよい。
【０１６２】
本発明の分析用キットにおいて、例えば、前記センサと前記試薬とは、例えば、それぞれ別個に収容されてもよい。また、本発明の分析用キットが、前述のように、さらに他の構成要件を含む場合、これらの構成要件は、例えば、前記センサと別個に収容されてもよい。前記センサは、例えば、前記核酸分子が前記基材に固定化されてもよいし、前記核酸分子が固定化されていなくてもよい。前記分析用キットは、例えば、さらに、使用説明書を含んでもよい。
【０１６３】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１６４】
（実施例１）
結合核酸分子（Ａ）としてメラミンアプタマー、Ｇ−カルテット形成分子（Ｄ）として一本鎖型ＤＮＡｚｙｍｅとを用いて、メラミン分析用蛍光センサを作製した。
【０１６５】
前記核酸分子（Ｉ）に該当するメラミン分析用蛍光センサを作製した。前記蛍光センサの配列を以下に示す。下記配列において、５’側の下線部が、ＤＮＡｚｙｍｅであり、３’側の下線部が、メラミンアプタマーである。そして、四角で囲んだ領域が、互いに相補的な配列であり、メラミン非存在下で、これらがステムを形成することで、前記蛍光センサはブロック型となる。
【０１６６】
【表３】
0005503062.tif 000005
【０１６７】
（実施例２）
前記実施例１のメラミン分析用蛍光センサを用いて、牛乳中のメラミンの検出を行った。
【０１６８】
緩衝液Ａ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌおよび
０．０５％（ｗ／ｖ）  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
緩衝液Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、
２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、
０．０５％（ｗ／ｖ）  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および
５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ
【０１６９】
前記蛍光センサを前記緩衝液Ｂに懸濁したセンサ試薬、ＮＭＭを前記緩衝液Ｂに懸濁したＮＭＭ試薬を、それぞれ調製した。市販牛乳（生乳１００％、商品名明治おいしい牛乳、株式会社明治）を１００％サンプルとし、前記市販牛乳を前記実施例１の前記緩衝液Ａで希釈したものを希釈サンプルとして使用した。
【０１７０】
まず、１．５ｍＬのチューブに前記センサ試薬を入れ、９５℃で５分間処理した後、室温で１５分間インキュベートした。つぎに、前記チューブに、前記ＮＭＭ試薬と前記サンプル２５μＬとを添加して、室温で３０分間インキュベートした。前記反応液５０μＬにおいて、前記センサの最終濃度は、４００ｎｍｏｌ／Ｌとし、ＮＭＭの最終濃度は、２００ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記牛乳の最終濃度は、０（牛乳未添加）、１０、２０、３０、４０および５０％とした。そして、この反応液を、プレート（商品名Greiner  384  Flat  Bottom  Black  Polystyrol、Greiner社製）のウェルに分注し、蛍光強度を測定した。蛍光強度の測定は、測定装置（商品名TECAN  infinite  Ｍ1000  PRO、TECAN社）を使用し、励起波長は３９９ｎｍとし、発光波長は５５０〜６９０ｎｍとした。
【０１７１】
これらの結果を図８に示す。図８は、発光波長域における蛍光強度を示すグラフであり、（Ａ）が、センサ添加反応液の蛍光強度の結果であり、（Ｂ）が、センサ未添加反応液の蛍光強度の結果である。各グラフにおいて、縦軸は、蛍光強度、横軸は、発光波長を示す。図８（Ａ）に示すように、センサ添加反応液では、図８（Ｂ）のセンサ未添加反応液よりも、６０５ｎｍにおいて大きなピークが確認できた。この結果から、発光波長６０５ｎｍが最も高いＳ／Ｎ比を示すこと、牛乳において、前記センサとＮＭＭとの複合体による蛍光を検出できることが確認できた。
【０１７２】
（実施例３）
前記実施例１のメラミン分析用蛍光センサを用いて、牛乳中のメラミンの検出を行った。
【０１７３】
市販牛乳（生乳１００％、商品名明治おいしい牛乳、株式会社明治）を、メラミン未添加１００％サンプルとし、前記市販牛乳を前記実施例１の前記緩衝液Ａで希釈したものを、メラミン未添加希釈サンプルとして使用した。さらに、前記メラミン未添加１００％サンプルおよび前記メラミン未添加希釈サンプルに、メラミンを添加して、メラミン添加サンプルを調製した。サンプルとして、前記メラミン未添加サンプルと前記メラミン添加サンプルを使用し、測定条件を、励起波長３９９ｎｍ、発光波長６０５ｎｍとした以外は、前記実施例２と同様にして、センサ添加反応液とセンサ未添加反応液とについて、蛍光強度を測定した。なお、前記反応液において、前記牛乳の最終濃度は、０、１０、２０、３０、４０および５０％とし、添加メラミンの最終濃度は、０、１、２、３、５ｍｍｏｌ／Ｌとした。
【０１７４】
これらの結果を図９に示す。図９は、蛍光強度を示すグラフであり、（Ａ）が、センサ添加反応液の蛍光強度の結果であり、（Ｂ）が、センサ未添加反応液の蛍光強度の結果である。各グラフにおいて、縦軸は、蛍光強度を示す。各グラフにおいて、横軸は、サンプルの種類を示し、左から、前記反応液における牛乳の最終濃度０、１０、２０、３０、４０、５０％のサンプルセットであり、各セットの５本のバーは、左から前記反応液におけるメラミンの最終濃度が０、１、２、３、５ｍｍｏｌ／Ｌである。図９（Ｂ）に示すように、センサ未添加反応液は、牛乳濃度を統一した各サンプルセットにおいて、メラミン濃度にかかわらず、蛍光強度は一定であった。これに対して、図９（Ａ）に示すように、センサ添加反応液は、各サンプルセットにおいて、メラミン濃度の増加に伴って、蛍光強度が増加した。これらの結果から、実施例の蛍光センサによれば、サンプル中のメラミンを濃度依存的に検出できることがわかった。
【０１７５】
また、図９（Ａ）において、各サンプルセットのメラミン０ｍｍｏｌ／Ｌのサンプルは、図９（Ｂ）におけるセンサ未添加反応液の蛍光強度と同程度であった。このことから、センサ使用時バックグラウンドは低く、例えば、センサ未添加反応液の蛍光強度を、センサ添加反応液の蛍光強度から引くことで、標準化することもできることがわかった。
【０１７６】
そこで、図９（Ａ）のセンサ添加反応液の蛍光強度から、図９（Ｂ）のセンサ未添加反応液の蛍光強度を差し引いた結果を、図１０に示す。
【０１７７】
図１０は、蛍光強度を示すグラフであり、センサ添加反応液の蛍光強度からセンサ未添加反応液の蛍光強度を差し引いた値であり、横軸は、前記反応液における牛乳の最終濃度であり、各プロットは、前記反応液におけるメラミンの最終濃度を示す。図１０に示すように、牛乳終濃度が１０−５０％の反応液のいずれにおいても、メラミンの存在によって、蛍光強度が顕著に増加した。この結果から、サンプルの牛乳濃度にかかわらず、メラミンを検出できることがわかった。
【０１７８】
一般的に、市場では、５００ｐｐｍ（４ｍｍｏｌ／Ｌ）以上のメラミンを検出できることが求められている。図１１において、添加メラミン濃度が４ｍｍｏｌ／Ｌである牛乳１００％をサンプルとして使用した反応液（メラミン終濃度２ｍｍｏｌ／Ｌ、牛乳終濃度５０％）について、十分な蛍光強度が得られていることから、市場で求められている精度を十分に実現していることがわかった。
【０１７９】
以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明のターゲット分析用蛍光センサによれば、簡便且つ効率的に、蛍光の発生により間接的にターゲットを分析できる。このため、本発明は、例えば、臨床医療、食品、環境等の様々な分野における研究および検査に、極めて有用な技術といえる。
【要約】
【課題】  新たなターゲット分析用蛍光センサ、ターゲット分析用キット、およびこれを用いたターゲットの分析方法を提供する。
【解決手段】  本発明のターゲット分析用蛍光センサは、Ｇ−カルテット構造を形成するＧ−カルテット形成核酸領域（Ｄ）とターゲットに結合する結合核酸領域（Ａ）とを有する核酸分子を含み、ターゲット非存在下、前記Ｇ−カルテット形成核酸領域（Ｄ）のＧ−カルテット形成が阻害され、ターゲット存在下、前記結合核酸領域（Ａ）への前記ターゲットの接触により、前記Ｇ−カルテット形成核酸領域（Ｄ）においてＧ−カルテット構造が形成され、前記Ｇ−カルテット形成核酸領域（Ｄ）がポルフィリンと複合体を形成することにより、前記複合体が蛍光を生じることを特徴とする。
【選択図】図１【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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