(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポジティブに形質転換された細胞を選択する方法であって：
（ａ）内因性細胞生存タンパク質の活性を欠く真核細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞生存タンパク質または少なくともその機能的部分をコードする核酸構築物で該真核細胞を安定に形質転換する工程；および
（ｃ）細胞の生存度が該細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような条件下で、該核酸構築物で安定に形質転換した該真核細胞を培養し、それによって、ポジティブに形質転換された細胞を選択する工程
を包含し、該細胞生存タンパク質がガラクトキナーゼ１であり、該真核細胞が哺乳動物細胞であり、該核酸構築物がさらに目的のタンパク質をコードしており、かつ該細胞生存タンパク質をコードする核酸と該目的のタンパク質をコードする核酸とがバイ−シストロン性配置にある方法。
【請求項２】
細胞の生存度が細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような培養条件下で、該細胞生存タンパク質および目的のタンパク質を安定に発現するように遺伝的に改変された細胞を含む細胞毒性のない真核細胞培養物であって、該細胞生存タンパク質がガラクトキナーゼ１であり、該真核細胞が、該細胞生存タンパク質をコードする核酸と該目的のタンパク質をコードする核酸とをバイ−シストロン性配置で含む核酸構築物により安定に形質転換された哺乳動物細胞である細胞培養物。
【請求項３】
前記目的のタンパク質が、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、細胞外タンパク質、細胞接着タンパク質および細胞シグナル伝達タンパク質からなる群より選択される請求項２記載の細胞培養物。
【請求項４】
前記増殖因子が、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロンγおよび血小板由来増殖因子からなる群より選択される請求項３記載の細胞培養物。
【請求項５】
前記ホルモンが、プロラクチン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、レプチン、成長ホルモン、インスリンおよびＣＧ−βからなる群より選択される請求項３記載の細胞培養物。
【請求項６】
前記サイトカインが、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０およびＩＬ−１９からなる群より選択される請求項３記載の細胞培養物。
【請求項７】
前記細胞外タンパク質が、フィブリノーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビメンチン、微小管結合タンパク質１ｂ、神経突起伸長因子（ＮＯＦ）、細菌セルロース（ＢＣ）およびラミニンからなる群より選択される請求項３記載の細胞培養物。
【請求項８】
前記細胞接着タンパク質が、インテグリン、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）１、Ｎ−ＣＡＭ、カドヘリン、テネイシン、ギセリンおよび神経損傷誘導タンパク質２（ニンジュリン２）を含む細胞接着タンパク質からなる群より選択される請求項３記載の細胞培養物。
【請求項９】
前記細胞シグナル伝達タンパク質が、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、核因子κＢ、Ｒａｆキナーゼインヒビタータンパク質（ＲＫＩＰ）、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ホスホイノシチド−３−キナーゼγ、チロシンキナーゼ受容体、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質、カベオリン−３および１４−３−３タンパク質からなる群より選択される請求項３記載の細胞培養物。
【請求項１０】
前記培養条件がＤ−ガラクトースを含む請求項２記載の細胞培養物。
【請求項１１】
前記Ｄ−ガラクトースの濃度が０．０１〜１０ｍＭの範囲から選択される請求項１０記載の細胞培養物。
【請求項１２】
前記Ｄ−ガラクトースの濃度が０．２５ｍＭである請求項１０記載の細胞培養物。
【請求項１３】
目的のタンパク質を製造する方法であって、
（ａ）請求項２記載の真核生物細胞培養物を提供する工程；
（ｂ）細胞の生存度が該細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような条件下で、該核酸構築物で安定に形質転換された該真核細胞を培養し、それによって、ポジティブに形質転換された真核細胞を選択する工程；および
（ｃ）該ポジティブに形質転換された真核細胞またはその培養培地から、目的のタンパク質を精製する工程
を包含し、該細胞生存タンパク質がガラクトキナーゼ１であり、該真核細胞が哺乳動物細胞であり、かつ該細胞生存タンパク質をコードする核酸と該目的のタンパク質をコードする核酸とがバイ−シストロン性配置にある方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞毒性薬物の非存在下における永続的な選択を使用して、哺乳動物細胞中でタンパク質を製造する方法に関し、より詳細には、本発明は、治療的適用に適した高純度なタンパク質の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
大量の純粋なタンパク質は、治療特性ならびに基礎科学的特性のために必要とされる。たとえば、ホルモンおよび増殖因子（たとえば、インスリン、成長ホルモン）は、世界的規模で常用されている。他方、大量の純粋なタンパク質は、タンパク質結晶学および三次元構造の決定のために必要とされる。分子生物学の分野における進歩は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物および哺乳動物の細胞のような宿主細胞において目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを過剰発現させることによって、大量のタンパク質の製造を可能にする。
【０００３】
原核生物宿主細胞は、安価な供給源を使用して、堅調な製造収量を提供する。しかし、原核生物発現系における真核生物タンパク質、とりわけヒトタンパク質の発現は、翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化、カルボキシル化もしくは水酸化）および／または発現されたタンパク質の正確なフォールディングの欠如によって制限され、不溶性の封入体内における組換えタンパク質の蓄積をもたらす。
【０００４】
酵母発現系は、これらが強力な分泌経路を含み、かつある程度制限された翻訳後修飾を実行可能であるので、原核生物系を超えた特定の利点を提供する。しかし、酵母系における発現は、典型的には、ジスルフィド結合したタンパク質の不適切なフォールディングをもたらす。
【０００５】
哺乳動物発現系は、正確なタンパク質フォールディングおよび適切な翻訳後修飾を提供する。しかし、哺乳動物細胞における発現は、しばしば低いタンパク質収量を生じる。タンパク質の収量を増加させるために、目的遺伝子（ＧＯＩ）の安定なトランスフェクションが、細胞毒性薬物［たとえば、葉酸アンタゴニストであるメソトレキサート（ＭＴＸ）］、および細胞毒性薬物の効果を回避する遺伝子［たとえば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）］を含む発現カセットの存在下で実施される。しかし、トランスフェクションおよび発現のあいだに使用される大量の細胞毒性薬物に起因して、これらの条件下で製造されたタンパク質は、しばしば、痕跡の薬物が夾雑しており、それゆえに、治療的使用のためには不適切である。
【０００６】
従って、上記の制限を欠いている、薬学的適用のためのタンパク質の製造方法を開発する必要性が存在する。
【０００７】
葉酸および還元型葉酸は、ヒト還元型葉酸塩キャリア（ｈＲＦＣ）遺伝子を介して哺乳動物細胞に入る必須ビタミンである。同様に、ＤＨＲＦの強力なインヒビターであるメソトレキサート（ＭＴＸ）のような葉酸アンタゴニストもまた、ＲＦＣタンパク質を介して哺乳動物細胞に入る。ＭＴＸへの細胞の曝露は、葉酸の欠乏および最終的な細胞死を生じる。しかし、以前の研究は、ＭＴＸへの曝露が、安定なＭＴＸ輸送欠損表現型を生じるＲＦＣ不活性化をもたらす可能性があることを実証した。加えて、ｈＲＦＣコード領域における不活性変異、ならびにＲＦＣプロモーターのサイレンシング（主として、発現および／またはいくつかの転写因子の機能の喪失に起因する）および／またはｈＲＦＣプロモーターのメチル化はＲＦＣ輸送活性を無効にし、抗葉酸剤耐性を生じる（Jansenら、１９９８；Droriら、２０００ａ；Rothemら、２００２；Rothemら、２００３；Rothemら、２００４ａ，ｂ；Wormら、２００１）。加えて、他の研究は、葉酸を含まない増殖培地からのロイコボリン（還元型葉酸）の段階的な欠乏が、結果としてＭＴＸ輸送活性の１００倍の過剰産生を伴う、ｈＲＦＣ遺伝子の顕著な遺伝子増幅をもたらすことを示している（Jansenら、１９９８；Droriら、２０００ａ）。
【０００８】
Ｄ−ガラクトースは、ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ１）、ＵＤＰ−グルコース−α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、およびホスホグルコムターゼを含む三段階酵素反応でグルコース−６−リン酸に転換される、必須のヘキソースである。最近の研究は、完全な機能を有するＧａｌＫ１酵素の欠如が、ガラクトース血症を引き起こすことを実証した（NovelliおよびReichardt，２０００；TimsonおよびReece，２００３）。加えて、ガラクトキナーゼ欠損ハムスター細胞は、単独のヘキソース供給源としてＤ−ガラクトースを含む培地中で増殖することに失敗し、増殖のためにはＤ−グルコースを含む培地を必要とすることが見出された（Schumperliら、１９８２）。
【０００９】
本発明にしたがって、選択マーカーとして細胞生存タンパク質を使用する永続的な選択が、哺乳動物細胞中で目的のタンパク質を過剰発現させるために使用することができること、およびこのような方法を使用して製造されるタンパク質が薬学的適用のために高度に適切であることが見出された。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の１つの局面によれば、ポジティブに形質転換された細胞を選択するための方法が提供され、該方法は：（ａ）内因性細胞生存タンパク質の活性を欠く真核細胞を提供する工程；（ｂ）該細胞生存タンパク質または少なくともその機能的部分をコードする核酸構築物で該真核細胞を形質転換する工程；および（ｃ）細胞の生存度が該細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような条件下で、該核酸構築物で形質転換した該真核細胞を培養し、それによって、ポジティブに形質転換された細胞を選択する工程を包含する。
【００１１】
本発明の別の局面によれば、細胞の生存度が細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような培養条件下で、該細胞生存タンパク質および目的のタンパク質を発現するように遺伝的に改変されている細胞を含む細胞毒性のない真核細胞培養物が提供される。
【００１２】
本発明のなお別の局面によれば、目的のタンパク質を製造する方法が提供され、該方法は、（ａ）目的のタンパク質および細胞生存タンパク質または少なくともその機能的部分をコードする核酸構築物で、内因性細胞生存タンパク質の活性を欠く真核細胞を形質転換する工程；（ｂ）細胞の生存度が該細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような条件下で、該核酸構築物で形質転換された該真核細胞を培養し、それによって、ポジティブに形質転換された真核細胞を選択する工程；および（ｃ）該ポジティブに形質転換された真核細胞またはその培養培地から、目的のタンパク質を精製する工程を包含する。
【００１３】
好ましい実施態様に記載されるさらなる特徴によれば、前記核酸はさらに目的のタンパク質をコードしている。
【００１４】
好ましい実施態様に記載されるさらなる特徴によれば、前記生存タンパク質は、ガラクトキナーゼ１、還元型葉酸塩キャリア、チミジンキナーゼ、アデノシンキナーゼ、トリプトファンシンターゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼおよびグルタミンシンセターゼからなる群より選択される。
【００１５】
好ましい実施態様に記載されるさらなる特徴によれば、前記真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる群より選択される。
【００１６】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記目的のタンパク質は、増殖因子、ホルモン、サイトカイン、細胞外タンパク質、細胞接着タンパク質および細胞シグナル伝達タンパク質からなる群より選択される。
【００１７】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記増殖因子は、上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子−Ｉ、インスリン様増殖因子−ＩＩ、インターフェロンγおよび血小板由来増殖因子からなる群より選択される。
【００１８】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記ホルモンは、プロラクチン、副甲状腺ホルモン、ガストリン、レプチン、成長ホルモン、インスリンおよびＣＧ−βからなる群より選択される。
【００１９】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記サイトカインは、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−２０およびＩＬ−１９からなる群より選択される。
【００２０】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記細胞外タンパク質は、フィブリノーゲン、コラーゲン、フィブロネクチン、ビメンチン、微小管結合タンパク質１ｂ、神経突起伸長因子（ＮＯＦ）、細菌セルロース（ＢＣ）およびラミニンからなる群より選択される。
【００２１】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記細胞接着タンパク質は、インテグリン、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）１、Ｎ−ＣＡＭ、カドヘリン、テネイシン、ギセリンおよび神経損傷誘導タンパク質２（ニンジュリン２）を含む細胞接着タンパク質からなる群より選択される。
【００２２】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記細胞シグナル伝達タンパク質は、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、核因子κＢ、Ｒａｆキナーゼインヒビタータンパク質（ＲＫＩＰ）、Ｒａｆ−１、ＭＥＫ、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ホスホイノシチド−３−キナーゼγ、チロシンキナーゼ受容体、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質、カベオリン−３および１４−３−３タンパク質からなる群より選択される。
【００２３】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記核酸構築物は、配列番号３に示される核酸配列を含む。
【００２４】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記核酸構築物は、配列番号４に示される核酸配列を含む。
【００２５】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記細胞生存タンパク質はガラクトキナーゼ１であるのに対して、前記培養する工程はＤ−ガラクトースの存在下で達成される。
【００２６】
好ましい実施態様に記載されるさらなる特徴によれば、前記細胞生存タンパク質は還元型葉酸塩キャリアであるのに対して、前記培養する工程は還元型葉酸の存在下で達成される。
【００２７】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記還元型葉酸はロイコボリンである。
【００２８】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記Ｄ−ガラクトースの濃度は０．０１〜１０ｍＭの範囲から選択される。
【００２９】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記Ｄ−ガラクトースの濃度は０．２５ｍＭである。
【００３０】
好ましい実施態様に記載されるなおさらなる特徴によれば、前記ロイコボリンの濃度は０．０１〜５ｎＭの範囲から選択される。
【００３１】
好ましい実施態様に記載されるさらなる特徴によれば、前記ロイコボリンの濃度は０．２５ｎＭである。
【００３２】
本発明は、細胞毒性のない培養条件において永続的な選択を使用して、目的のタンパク質を製造する方法を提供することによって、現在公知の構成を首尾よく短縮化する。
【００３３】
他に定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含む本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は例示のみであり、限定であることを意図しない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、細胞毒性薬物の非存在下における永続的な選択を使用して、哺乳動物細胞中でタンパク質を製造する方法に関する。具体的には、本発明は、薬学的な適用のために適切である、大量の純度の高いヒトタンパク質を製造するために使用することができる。
【００３５】
本発明にしたがってタンパク質を製造する方法の原理および操作は、図面および付随する説明を参照してより良好に理解され得る。
【００３６】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その応用において、以下の記載において説明されるか、または実施例によって例示される詳細に限定されないことが理解されるべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、または種々の方法において実施されるかもしくは実行されることが可能である。また、本明細書で利用される語法および用語は説明の目的のためであり、限定として見なされるべきではないこともまた、理解されるべきである。
【００３７】
ヒト増殖因子およびホルモンは、遺伝的疾患または感染性疾患の治療において広範に使用されている。しかし、血液のようなヒト身体の供給源からのヒトタンパク質の精製は、複雑であり、労力がかかり、かつ高価である。加えて、ヒトまたは動物の細胞から精製したタンパク質は、ＨＩＶまたは肝炎ウイルスのような種々の病原体が夾雑する可能性があり、それゆえに、薬学的適用における使用のために適切ではない。
【００３８】
このような制限を克服するために、組換え発現系が開発された。哺乳動物発現系からの組換えヒトタンパク質の発現は、正確なタンパク質フォールディングおよび適切な翻訳後修飾を可能にする。しかし、一般的な哺乳動物発現系を使用するヒトタンパク質の発現は、しばしば、低いタンパク質収量ならびにトランスフェクトした細胞についてポジティブに選択するために使用される細胞毒性薬物［たとえば、メソトレキサート（ＭＴＸ）］の痕跡を生じる。
【００３９】
本発明にしたがって、選択マーカーとして細胞生存タンパク質を使用する永続的選択を、細胞毒性薬物の非存在下で、哺乳動物細胞中で目的のタンパク質を過剰発現するために使用することができること、およびこのような方法を使用して製造されるタンパク質が薬学的適用のために高度に適切であることが見出された。
【００４０】
以下の実施例の節の実施例１〜３において示されるように、ＲＦＣ遺伝子およびレポーター遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰ）を含むバイ−シストロン性発現ベクターを用いる、還元型葉酸塩キャリア（ＲＦＣ）−欠損細胞の同時トランスフェクション、続いて、ロイコボリン（還元型葉酸）の濃度の段階的減少は、ＲＦＣ遺伝子の過剰発現、およびいかなる細胞毒性薬物も含まない培地中でのレポーター遺伝子の有意な発現を生じた。さらに、以下の実施例の節の実施例１、２、および４に示されるように、ＧａｌＫ１遺伝子およびレポーター遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰ）を含むバイ−シストロン性発現ベクターを用いる、ＧａｌＫ１−欠損細胞の同時トランスフェクション、続いて、単独のヘキソース源として、５ｍＭ  Ｄ−ガラクトースを含む増殖培地中での選択は、いかなる細胞毒性薬物も非存在下でのＧａｌＫ１タンパク質およびＥＧＦＰタンパク質の過剰発現を生じた。
【００４１】
このように、本発明の１つの局面にしたがって、ポジティブに形質転換された細胞を選択する方法が提供される。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ポジティブに形質転換された細胞」という語句は、遺伝子形質転換についてポジティブである細胞、すなわち、外因性ＤＮＡ分子（すなわち、ポリヌクレオチド）が、細胞のゲノムに組み込まれているか、または染色体外複製単位として細胞核中に存在するかのいずれかである細胞をいう。細胞を形質転換する方法は当該分野において公知であり、本明細書中以下でさらに説明される。
【００４３】
この方法は、（ｉ）内因性細胞生存タンパク質の活性を欠く真核細胞を提供する工程；（ｉｉ）上記細胞生存タンパク質または少なくともその機能的部分をコードする核酸構築物で上記真核細胞を形質転換する工程；および（ｉｉｉ）細胞の生存度が上記細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような条件下で、上記核酸構築物で形質転換した該真核細胞を培養し、それによって、ポジティブに形質転換された細胞を選択する工程によってもたらされる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「細胞生存タンパク質」という語句は、細胞増殖のために必須である、すなわち、その非存在下では細胞が増殖することが不可能である任意のタンパク質をいう。細胞増殖は、細胞成分（たとえば、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、炭水化物、および脂質）および／または細胞区画（たとえば、膜、オルガネラ）の生合成のために必須である、アミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物、ビタミンなどのような栄養素の同化、取り込み、組み込み、および生合成に依存する。従って、本明細書にしたがう細胞生存タンパク質は、本明細書中上記に記載されるような細胞増殖のために必須である任意のタンパク質である。好ましくは、本発明の細胞生存タンパク質は、還元型葉酸塩キャリアタンパク質（ＲＦＣ）、ガラクトキナーゼ１タンパク質（ＧａｌＫ１）、チミジンキナーゼタンパク質、アデノシンキナーゼタンパク質、トリプトファンシンターゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、およびグルタミンシンセターゼである。
【００４５】
「機能的部分」という語句は、本明細書で使用される場合、基質への結合のような、タンパク質の機能的特性を示す細胞生存タンパク質の部分（すなわち、ポリペプチド）をいう。好ましくは、本発明の還元型葉酸塩キャリアの機能的部分は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＢ３５０５８）に示されるような、アミノ酸２３〜４３４（葉酸キャリアの領域）を含むポリペプチド配列、より好ましくは、本発明の還元型葉酸塩キャリアの機能的部分は、配列番号１に示されるような、アミノ酸１〜５９１を含むポリペプチド配列である。本発明の好ましい実施形態にしたがって、本発明のガラクトキナーゼ１タンパク質の機能的部分は、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１４５））に示されるような、アミノ酸１〜３９２を含むポリペプチド配列である。
【００４６】
本発明にしたがう真核細胞は、２つの膜からなる核膜によって取り囲まれる、高度に発達しかつ複雑な核を有する任意の細胞であり得る。本発明にしたがう真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、本発明の真核細胞は、チャイニーズハムスター細胞（ＣＨＯ細胞）、チャイニーズハムスター肺細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞、Ｃａｃｏ−２細胞、２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、Ｌ１２１０のような哺乳動物細胞である。
【００４７】
本発明の方法にしたがって、本発明の真核細胞は、本発明の細胞生存タンパク質を欠いている。このような細胞の例には、ＲＦＣトランスポーター活性を欠くＣＨＯ  ＡＡ８細胞（AssarafおよびSchimke，１９８７）、ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ）酵素が欠損しているチャイニーズハムスター肺細胞（ＡＴＣＣ；ＣＲＬ−１６５７）、チミジンキナーゼ欠損マウス細胞［Kaufman ERおよびDavidson RL, 1975, Somatic Cell Genet. 1(2): 153-63］、アデノシンキナーゼ欠損ベビーハムスター腎臓細胞［Mittal RAら、2000; Biofactors. 11(4): 247-56］、トリプトファンシンターゼ欠損およびヒスチジノールデヒドロゲナーゼ欠損ＣＨＯ細胞（Hartman SCおよびMulligan RC, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047-8051）が含まれる。
【００４８】
細胞生存タンパク質が欠損している細胞を入手する方法は当該分野で公知である。たとえば、ＲＦＣ輸送活性を欠く細胞は、高濃度の葉酸アンタゴニスト［たとえば、メソトレキサート（ＭＴＸ）］に細胞を供すること、および本質的に以下の実施例の節の実施例２に記載されるように、ＲＦＣ輸送活性を欠く生存している細胞を単離することによって入手することができる。簡潔に述べると、ＣＨＯ  ＡＡ８細胞（５×１０5／１０ｃｍ  ペトリディッシュ、２０ｍｌ培地の存在下）を、１０％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭ  グルタミン、および抗生物質を補充した２．３μＭ葉酸を含むαＭＥＭ増殖培地中で、単層として増殖させる。ＭＴＸ選択のために、細胞は、それぞれ、５０％致死用量（ＬＤ50）の〜５倍および１０倍に対応する、７５ｎＭおよび１５０ｎＭ  ＭＴＸ（Ｓｉｇｍａ）に曝露する。代替的には、段階的選択を、〜５ヶ月の期間にわたって、培地中で、１０ｎＭから、４０ｎＭ、１２０ｎＭ、および１５０ｎＭまでＭＴＸ濃度を徐々に増加させることによって実行することができる。
【００４９】
ガラクトキナーゼ１タンパク質を欠いている細胞は、本質的に、Zaret KSおよびStevens KA, Mol Cell Biol. 1990;10(9): 4582-9に記載されているように、毒性ガラクトースアナログ、２−デオキシ−Ｄ−ガラクトース（２−ＤＯＧ）に細胞を曝露することによって入手することができる。
【００５０】
本発明の方法にしたがって、本発明の細胞（細胞生存タンパク質の活性を欠いている）は、本発明の細胞生存タンパク質（たとえば、還元型葉酸塩キャリア、ガラクトキナーゼ１、チミジンキナーゼ、および／またはアデノシンキナーゼ）をコードする核酸構築物で形質転換される。
【００５１】
還元型葉酸塩キャリアは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＢ３５０５８）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ５３２８７）、およびラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ６１７８８）からクローニングされており；ガラクトキナーゼ１は、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１４５）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５８６０１）、およびラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿２１３５２８）からクローニングされており；チミジンキナーゼは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＮ７３８４７）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＤ３５０９１）、ならびに種々の細菌およびウイルスからクローニングされており；アデノシンキナーゼは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＰ３５４３４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ０９６５９）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ８１７１２）、および多くの他の生物からクローニングされている。このように、還元型葉酸塩キャリア、ガラクトキナーゼ１、チミジンキナーゼおよび／またはアデノシンキナーゼについてのコード配列情報は、http://www4.ncbi.nlm.nih.gov/を通して利用可能であるＧｅｎＢａｎｋデータベースを含むいくつかのデータベースから入手可能である。
【００５２】
哺乳動物細胞中で外因性細胞生存タンパク質（たとえば、還元型葉酸塩キャリア、ガラクトキナーゼ１）を発現するために、細胞生存タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列［たとえば、ヒト還元型葉酸塩キャリアについてはＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ７８９９６（配列番号４）；ヒトガラクトキナーゼ１についてはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００１５４（配列番号３）］が、哺乳動物細胞発現のために適切な核酸構築物に連結される。このような核酸構築物は、構成的または誘導性の様式で、細胞中のポリヌクレオチド配列の転写を指向するためのプロモーター配列を含む。
【００５３】
本発明の核酸構築物はまた、所望の活性（たとえば、還元型葉酸またはガラクトキナーゼ活性の輸送）を示す、細胞生存タンパク質ホモログをコードする核酸配列を利用することができることが認められる。このような核酸配列は、ギャップ重みが５０に等しく、長さ重みが３に等しく、平均マッチが１０に等しく、平均ミスマッチが−９に等しいSmithおよびWatermanのアルゴニズムを利用する、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージ（Wisconsin sequence analysis package）のＢｅｓｔＦｉｔソフトウェアを使用して決定されるように、配列番号３または４に対して、たとえば、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
【００５４】
好ましくは、本発明の核酸構築物は、目的のタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「目的のタンパク質」という語句は、本発明の真核細胞中で当業者が製造する任意のポリペプチドをいう。好ましくは、本発明の目的のタンパク質は、薬学的および／または基礎化学的な目的のために使用することができる。本発明の好ましい実施形態にしたがって、本発明の目的のタンパク質は、種々の障害の治療のために使用される増殖因子、サイトカインおよび／またはホルモン、ならびに組織再生適用のために使用されてもよい細胞外マトリックスタンパク質、細胞接着タンパク質、および／または細胞シグナル伝達タンパク質であり得る。
【００５６】
増殖因子の非限定的な例には、上皮増殖因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１９５４）、トランスフォーミング増殖因子β（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６５１）、酸性線維芽細胞増殖因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００７９１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１９９７）、エリスロポエチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００７９０）、トロンボポエチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００４５１）、肝細胞増殖因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００５９２）、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６０９）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６０３）、インターフェロンγ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６１０）、および血小板由来増殖因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７９４８４）が含まれる。
【００５７】
ホルモンの非限定的な例には、プロラクチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨｌ５８５０）、副甲状腺ホルモン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＫ３４９５０）、ガストリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ５２５２０）、レプチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＥＡＬ２４３１５）、成長ホルモン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ９８６１８）、インスリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＮ３９４５１）、およびＣＧ−β（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ０１２３３）が含まれる。
【００５８】
サイトカインの非限定的な例には、ＳＤＦ−１α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ４０１００）、ＩＬ−７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００８７１）、ＩＬ−１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００５６３）、ＩＬ−２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６１１９４）、およびＩＬ−１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿７１５６３９）が含まれる。
【００５９】
細胞外タンパク質の非限定的な例には、フィブリノーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００４９９）、コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００００７９）、フィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２０１７）、ビメンチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００３３７１）、微小管結合タンパク質１ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００５９００）（Theodosis DT. 2002; Front Neuroendocrinol. 23: 101-35）、神経突起伸長因子（ＮＯＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ２１７４１）（Tsukamoto Yら、2001; Histol. Histopathol. 16: 563-71）、細菌セルロース（ＢＣ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿６２５４７７）、およびラミニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００２１８）が含まれる。
【００６０】
細胞接着タンパク質の非限定的な例には、インテグリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２２０２）（Stefanidakis Mら、2003; J Biol Chem. 278: 34674-84）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１９２）（van de Stolpe Aおよびvan der Saag PT. 1996; J. Mol. Med. 74: 13-33）、Ｎ−ＣＡＭ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６０６）、カドヘリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００４３５１）、テネイシン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６１９７８）（Joshi Pら、1993; J. Cell Sci. 106: 389-400）、ギセリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００６４９１）、および神経損傷誘導タンパク質２（ニンジュリン２）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６７６０６）（Araki TおよびMilbrandt J. 2000; J. Neurosci. 20: 187-95）が含まれる。
【００６１】
細胞シグナル伝達タンパク質の非限定的な例には、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２７３６）、核因子κＢ（ＧｅｎＢａｎｋＮＰ＿００３９８９）、Ｒａｆキナーゼインヒビタータンパク質（ＲＫＩＰ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿４９７８４６）、Ｒａｆ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２８７１）、ＭＥＫ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２７４６）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２７２８）、ホスホイノシチド−３−キナーゼγ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２６４０）、チロシンキナーゼ受容体［たとえば、インスリンレセプター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００１９９）］、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質［たとえば、Ｇα（ｉ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２０６０）、Ｇα（ｓ）  ＮＰ＿０００５０７、およびＧα（ｑ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２０６３）］、カベオリン−３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００１２２５）、および１４−３−３タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００３３９７）が含まれる。
【００６２】
本発明との使用のために適切な構成的プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のような、大部分の環境条件下および大部分の細胞の型で活性であるプロモーター配列である。本発明との使用のために適切な誘導性プロモーターには、たとえば、メタロチオネイン遺伝子（ＭＴＩおよびＭＴＩＩ）のプロモーター（Majumdar Sら、(2003) J. Biol. Chem. 278: 26216-26226）およびテトラサイクリン誘導性プロモーター［Zabala Mら、Cancer Res. 2004, 64(8): 2799-804］が含まれる。
【００６３】
本発明の核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」ともいう）は、このベクターを、原核生物、真核生物、または好ましくは両方における複製および組み込みのために適切にするさらなる配列を含む（たとえば、シャトルベクター）。加えて、典型的なクローニングベクターはまた、転写および翻訳の開始配列、転写および翻訳のターミネーター、ならびにポリアデニル化シグナルを含んでもよい。
【００６４】
真核生物プロモーターは、典型的には、２つの型の認識配列、ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含む。転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼを、ＲＮＡ合成を開始するように方向付けることに関与すると考えられている。他の上流プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
【００６５】
エンハンサーエレメントは、連結した相同プロモーターまたは異種プロモーターから、１，０００倍まで転写を促進することができる。エンハンサーは、転写開始部位から下流または上流に配置された場合に活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは広い宿主範囲を有し、種々の組織において活性である。たとえば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多くの細胞型について適切である。本発明のために適切である他のエンハンサー／プロモーターの組み合わせには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウス白血病ウイルスのような種々のレトロウイルスからの長い末端（term）反復、マウスまたはラウス肉腫ウイルス、およびＨＩＶに由来するものが含まれる。参照として本明細書に援用される、Enhancers and Eukaryotic Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1983を参照のこと。
【００６６】
発現ベクターの構築において、プロモーターは、好ましくは、異種転写開始部位から、これがその天然の設定における転写開始部位からであるのとほぼ同じ距離に配置される。しかし、当該分野において公知であるように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失を伴うことなく、適合されることができる。
【００６７】
ポリアデニル化配列もまた、細胞生存タンパク質および／または目的のタンパク質の翻訳の効率を向上させるために、発現ベクターに加えることができる。２つの別個の配列エレメントが、正確かつ効率的なポリアデニル化のために必要とされる：ポリアデニル化部位から下流に位置するＧＵまたはＵリッチ配列、および１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する高度に保存された６ヌクレオチドの配列、ＡＡＵＡＡＡである。本発明のために適切である終止シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するものが含まれる。
【００６８】
すでに述べたエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローニングした核酸の発現のレベルを増加させること、または組換えＤＮＡを有する細胞の同定を容易にすることが意図される、他の特別なエレメントを含んでもよい。たとえば、多くの動物ウイルスは、許容状態の細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促進するＤＮＡ配列を含む。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノムに付随するかのいずれかである遺伝子によって提供される限り、エピソーム的に複製される。
【００６９】
ベクターは、真核生物のレプリコンを含んでもよいし、または含まなくてもよい。真核生物のレプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して、真核生物中で増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム性増幅は可能ではない。その代わりに、ＤＮＡは、操作された細胞のゲノムに組み込まれ、そこでプロモーターは、所望の核酸の発現を方向付ける。
【００７０】
本発明の発現ベクターは、たとえば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）のような、単一のｍＲＮＡからいくつかのタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列、およびプロモーター−キメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列をさらに含むことができる。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態にしたがって、本発明の核酸構築物の構築において、目的のタンパク質をコードする核酸配列は、細胞生存タンパク質をコードする核酸配列の上流または下流にライゲーションされる。好ましくは、目的のタンパク質をコードする核酸配列は、目的のタンパク質の発現が細胞生存タンパク質の発現を調節するのと同じプロモーターの下にあるように、たとえば、ＩＲＥＳ含有発現ベクターを使用して、細胞生存タンパク質の下流でライゲーションされる。
【００７２】
たとえば、以下の実施例の節の実施例２において示されるように、ｈＲＦＣ  ｃＤＮＡ（すなわち、細胞生存タンパク質）は、ｐＩＲＥＳ−２−ＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＩＲＥＳエレメントの上流、すなわち、目的のタンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする核酸配列の上流にクローニングされた。
【００７３】
哺乳動物発現ベクターの例には、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能であるｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴｌ、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能であるｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能であるｐＭｂａｃ，ｐＰｂａｃ，ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能であるｐＴＲＥＳ、およびこれらの誘導体が含まれるがこれらに限定されない。
【００７４】
レトロウイルスのような真核生物ウイルスからの調節エレメントを含む発現ベクターもまた、使用することができる。ＳＶ４０ベクターにはｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシパピローマウイルスに由来するベクターにはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン−バーウイルスに由来するベクターにはｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ+、ｐＭＴＯ１０／Ａ+、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ポリへドリンプロモーター、または真核細胞中での発現のために有効であることが示されている他のプロモーターの指示下でのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【００７５】
上記のように、ウイルスは、多くの場合において、宿主の防御メカニズムから逃れるように進化してきた非常に特定化された感染性因子である。典型的には、ウイルスは、特定の細胞型において感染し、かつ増殖する。ウイルスベクターの特異性を標的化することは、所定の細胞型を特異的に標的化するために、その天然の特異性を利用し、それによって、組換え遺伝子を感染した細胞に導入する。従って、本発明によって使用されるベクターの型は、形質転換される細胞型に依存する。形質転換される細胞型にしたがって適切なベクターを選択する能力は、十分に当業者の能力の範囲内にあり、そのこと自体として、選択の考慮の一般的説明は本明細書では提供されない。たとえば、骨髄細胞は、ヒトＩ型Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−Ｉ）を使用して標的化することができ、腎臓細胞は、Liang CYら、2004(Arch Virol. 149: 51-60)において記載されるようなバキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）に存在する異種プロモーターを使用して標的化してもよい。
【００７６】
組換えウイルスベクターは、これらが側方（lateral）感染および特異性の標的化のような利点を提供するので、本発明の細胞生存タンパク質および／または目的のタンパク質のインビボ発現のために有用である。側方感染は、たとえば、レトロウイルスの生活環において固有であり、単一の感染した細胞が、それによって隣接する細胞に出芽し、感染するプロセスである。その結果は、大きな領域が急速に感染され、その大部分は、もともとのウイルス粒子によって最初には感染されていなかった。これは、感染性因子が娘の子孫を通してのみ広がる垂直感染とは対照的である。側方に広がることが不可能であるウイルスベクターもまた、産生することができる。この特徴は、所望の目的が、局在化した数の標的化細胞のみに特定の遺伝子を導入することである場合に、有用であり得る。
【００７７】
種々の方法を、幹細胞に本発明の発現ベクターを導入するために使用することができる。このような方法は、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、Changら、Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)、Vegaら、Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)、Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)およびGilboaら [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] に一般的に記載されており、たとえば、これらには、安定なまたは一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組換えウイルスベクターを用いる感染が含まれる。加えて、ポジティブ−ネガティブ選択方法については、米国特許第５，４６４，７６４号および同第５，４８７，９９２号を参照されたい。
【００７８】
ウイルス感染による核酸の導入は、より高いトランスフェクション効率をウイルスの感染的性質に起因して得ることができるので、リポフェクションおよびエレクトロポレーションのような他の方法を超えたいくつかの利点を提供する。
【００７９】
本発明にしたがう培養は、細胞の生存度が、細胞生存タンパク質の正常な活性に依存するような条件下でもたらされる。このような条件は、使用される細胞生存タンパク質の型に依存することが認められる。
【００８０】
たとえば、本発明によって使用される細胞が、還元型葉酸塩キャリアの活性を欠くもの（たとえば、ＣＨＯ  ＡＡ８細胞）であるならば、還元型葉酸塩キャリア（たとえば、配列番号４）をコードする核酸構築物を用いるトランスフェクション後に、細胞は、単独の葉酸源として、還元型葉酸［たとえば、５−ホルミル−テトラヒドロ葉酸塩（ロイコボリン）または５−メチル−テトラヒドロ葉酸塩］を含む培養培地中で培養される。
【００８１】
好ましくは、このような培養条件には、０．０１〜５ｎＭの濃度範囲、より好ましくは０．０２〜２ｎＭの濃度範囲、最も好ましくは０．２５〜２ｎＭの濃度範囲のロイコボリンが含まれる。
【００８２】
以下の実施例の節の実施例２において示されるように、還元型葉酸塩キャリア発現細胞の選択は、１０％透析ウシ胎仔血清を補充し、単独の葉酸源として２ｎＭロイコボリンを含む培養培地（葉酸を欠くＲＰＭＩ−１６４０培地）の存在下で実行された。培養の５週間後、細胞は、１、０．５、または０．２５ｎＭロイコボリンの存在下で永続的に選択された。
【００８３】
代替としては、本発明によって使用される細胞が、ガラクトキナーゼ１タンパク質の活性を欠くもの［たとえば、ＧａｌＫ１欠損細胞；Zaret、1990（前出）］であるならば、ガラクトキナーゼ１（たとえば、配列番号３）をコードする核酸構築物を用いるトランスフェクション後に、細胞は、単独のヘキソース源としてＤ−ガラクトースを含む培養培地中で培養される。
【００８４】
好ましくは、このような培養条件には、０．０１〜１０ｍＭの濃度範囲、より好ましくは０．０５〜８ｍＭの濃度範囲、０．１〜５ｍＭの濃度範囲、最も好ましくは０．２５〜０．５ｍＭの濃度範囲のＤ−ガラクトースが含まれる。
【００８５】
以下の実施例の節の実施例２において示されるように、Ｄ−ガラクトキナーゼ発現細胞の選択は、１０％透析ウシ胎仔血清を補充し、単独のヘキソース源として５ｍＭまたは２ｍＭ  Ｄ−ガラクトースを含む培養培地（グルコースを欠くＲＰＭＩ−１６４０培地）の存在下で実行された。培養の３日後、細胞は、１または０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトースを含む培養培地に移され、４０日間このような条件下で培養され、その後、これらは、単独のヘキソース源として、０．２５または０．１ｍＭ  Ｄ−ガラクトースの存在下で永続的に選択された。
【００８６】
本発明のポジティブに形質転換された細胞の選択プロセスを容易にするために、および非トランスフェクト細胞の増殖を妨害するために、トランスフェクションは、好ましくは、抗生物質薬物のようなネガティブな選択剤の存在下で実行される。従って、トランスフェクションの直後に、発現ベクター上の抗生物質耐性遺伝子（たとえば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を含むトランスフェクト細胞を、比較的高濃度の抗生物質（たとえば、３００〜６００μｇのＧ４１８）の存在下で培養することができるのに対して、非トランスフェクト細胞は増殖することが不可能である。しかし、一旦トランスフェクト細胞が有意なレベルの本発明の細胞生存タンパク質を発現すると、このようなネガティブ選択因子（たとえば、Ｇ４１８）は必要ではなく、好ましくは除去されることが認められる。
【００８７】
以下の実施例の節の実施例２において示されるように、Ｇ４１８は、選択の最初の数週間のあいだに３００〜６００μｇ／ｍｌの濃度で使用され、その後、Ｇ４１８は除去され、安定な形質転換体が、使用される細胞の型に依存して、還元型葉酸塩（たとえば、ロイコボリン）またはＤ−ガラクトースの存在下で、細胞毒性のない培養条件下で培養された。
【００８８】
従って、本発明の別の局面にしたがって、細胞毒性のない真核細胞培養物が提供される。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「細胞毒性のない」という語句は、細胞に対して毒性があり、細胞の機能に干渉することができる任意の薬剤を含まない状態をいう。正常な機能は、異常な細胞増殖を誘導する因子（癌性因子）、アミノグリコシドおよびタンパク質翻訳に干渉する他の抗生物質因子、遺伝子発現を阻害するＤＮＡ結合剤などによって、遮断することができる。
【００９０】
本発明の細胞培養は、本発明の選択的培養条件下で本発明の細胞生存タンパク質および目的のタンパク質を発現するために、本明細書中上記に記載したように遺伝的に改変されている細胞を含む。
【００９１】
細胞生存タンパク質および目的のタンパク質をコードする核酸配列が、本明細書の核酸構築物中で同じ転写調節下に配置される場合（たとえば、バイ−シストロン性ベクターを使用して）、同様のレベルの発現が、トランスフェクトされた細胞中の両方の核酸配列から予測されることが認められる。従って、高レベルの細胞生存タンパク質を発現する細胞は、同様のレベルの目的のタンパク質を発現するようである。
【００９２】
確かに、図１２および１３ならびに以下の実施例の節の実施例３において示されるように、フローサイトメトリー分析は、ＲＦＣ発現ベクターを用いてトランスフェクトされ、それぞれ、０．２５〜２ｎＭまたは２〜１０ｎＭロイコボリンの存在下で培養された細胞中で１００倍または１０倍のＥＧＦＰ発現の増加を示した。このように、本発明の方法は、細胞毒性のない培養条件下で、高レベルの目的のタンパク質製造するために使用することができる。
【００９３】
従って、本発明のなお別の局面にしたがって、目的のタンパク質を製造する方法が提供される。
【００９４】
本発明のこの局面にしたがう方法は、本発明の真核細胞（すなわち、内因性の細胞生存タンパク質の活性を欠く細胞）を、目的のタンパク質および細胞生存タンパク質またはそれらの機能的部分をコードする核酸構築物で形質転換する工程、本明細書中上記のような細胞を培養する工程、ならびにこの形質転換細胞から目的のタンパク質を精製する工程によってもたらされる。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「精製する」という語句は、本発明の細胞または細胞培養物から本発明の目的のタンパク質を単離することをいう。本発明の目的のタンパク質は、ポリペプチド配列単独として、タンパク質−脂質複合体の一部として（たとえば、ヒストンタンパク質中で）、糖質のような種々の修飾を伴って（たとえば、糖タンパク質）などとして、単離することができる。加えて、本発明の精製タンパク質は、任意の型で、すなわち、可溶型、凍結乾燥型、結晶型などであり得る。
【００９６】
真核細胞からタンパク質を精製する方法は当該分野において公知である。たとえば、組換え分泌タンパク質は、たとえば、Por-Hsiung, L.およびStrickland, Tの国際公開第８６／０７５９４号パンフレット; Schneider P, Methods Enzymol. 2000; 322: 325-45に記載されるようなイオン交換および逆相クロマトグラフィーを使用して、培養培地から精製することができる。組換え膜結合タンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなイオン性界面活性剤、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のような非イオン性界面活性剤およびＣＨＡＰＳならびにカオトロピック剤を有する尿素ベースの溶液、界面活性剤、および有機溶媒を使用して精製することができ（Molloy、2000; Santoniら、2000; Taylorら、2002; Ferroら、2002; Ferroら、2000）、そしてＤＮＡ結合タンパク質は、Pedersen LBら、Mol Microbiol. 1996; 20(2): 295-311に記載されるように精製することができる。
【００９７】
本発明の目的のタンパク質を産生する細胞は、細胞毒性のない培養条件下で（すなわち、抗生物質の除去後の永続的選択下で）培養されるので、このような細胞によって産生されるタンパク質は、高度に純粋であり、かつ細胞毒性夾雑物を含まない。このようなタンパク質は、高度に純粋な、細胞毒性のない目的のタンパク質が、それを必要とする個体に投与される治療的適用などの種々の適用において使用することができることが認められる。
【００９８】
本発明の目的のタンパク質は、それ自体で、またはそれが適切なキャリアもしくは賦形剤と混合されている医薬組成物中で投与することができる。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」とは、生理学的に適切であるキャリアおよび賦形剤のような他の化学的成分を伴う、本明細書に記載される１種以上の活性成分の調製物をいう。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。
【０１００】
本明細書では、「活性成分」という用語は、生物学的効果についての原因である目的のタンパク質をいう。
【０１０１】
本明細書中以下では、交換可能に使用されてもよい「生理学的に許容され得るキャリア」および「薬学的に許容され得るキャリア」という語句は、生物に対して顕著な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑止しないキャリアまたは希釈剤をいう。アジュバントはこれらの語句に含まれる。
【０１０２】
本明細書では、「賦形剤」という用語は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に加えられる不活性物質をいう。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖およびデンプン型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１０３】
薬物の製剤および投与のための技術は、参照として本明細書に援用される「Remington's Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co., Easton, PA、最新版において見出され得る。
【０１０４】
適切な投与の経路は、たとえば、経口、直腸、経粘膜、とりわけ、経鼻、腸または非経口送達を含んでもよく、この非経口送達には、筋肉内、皮下および脊髄内の注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内または眼内の注射が含まれる。
【０１０５】
あるいは、たとえば、患者の組織領域への直接的な医薬組成物の注射を介して、全身的投与であるよりはむしろ局所的に、医薬組成物を投与してもよい。
【０１０６】
本発明の医薬組成物は、当該分野において周知のプロセスによって、たとえば、従来的な混合、溶解、顆粒化、糖衣錠製造、粉末化、乳化、カプセル化、包括（entrapping）または凍結乾燥のプロセスの手段によって、製造されてもよい。
【０１０７】
従って、本発明による使用のための医薬組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性成分の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１種以上の薬学的に許容され得るキャリアを使用して、従来的な様式で製剤化されてもよい。適切な製剤は、選択される投与の経路に依存する。
【０１０８】
注射のために、医薬組成物の活性成分は、水溶液中、好ましくは、Ｈａｎｋ’ｓ溶液、Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ溶液、または生理学的な塩の緩衝液のような生理学的に適合可能な緩衝液中で製剤化されてもよい。経粘膜的投与のために、浸透される障壁に対して適切な浸透剤が、製剤中で使用されてもよい。このような浸透剤は当該分野において一般的に公知である。
【０１０９】
経口投与のために、医薬組成物は、当該分野において周知である薬学的に許容され得るキャリアと活性成分を合わせることによって容易に製剤化することができる。このようなキャリアは、患者による経口摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、リキッド、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして、医薬組成物が製剤化されることを可能にする。経口使用のための薬理学的調製物は、所望される場合、錠剤または糖衣錠コアを得るために、適切な補助剤を加えた後で、固体賦形剤を使用し、得られる混合物を任意に粉砕し、および顆粒の混合物を加工して作製することができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖のような充填剤；たとえば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなセルロース調製物；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のような薬学的に許容され得るポリマーである。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩などの崩壊剤が加えられてもよい。
【０１１０】
適切なコーティングを有する糖衣錠コアが提供される。この目的のために、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および適切な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含んでもよい濃縮糖溶液が使用されてもよい。染料または色素は、同定のため、または活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けするために、錠剤または糖衣コーティングに加えられてもよい。
【０１１１】
経口的に使用することができる医薬組成物には、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤製のソフトな密封カプセルが含まれる。押し込み型カプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤、および任意に、安定剤と混合された活性成分を含んでもよい。ソフトカプセルにおいては、活性成分は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適切な液体中に溶解または懸濁されてもよい。加えて、安定剤が加えられてもよい。経口投与のためのすべての製剤は、選択された投与の経路のために適切な投薬量であるべきである。
【０１１２】
口腔投与については、組成物は、従来的な様式で製剤化された錠剤またはトローチ剤（lozenge）の形態を取ってもよい。
【０１１３】
鼻吸入による投与については、本発明にしたがう使用のための活性成分は、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロエタン、または二酸化炭素の使用を伴う、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー提示の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合には、投薬量単位は、計量した量を送達するためのバルブを提供することによって決定されてもよい。化合物の粉末混合物およびラクトースまたはデンプンのような適切な粉末基剤を含む、ディスペンサーにおける使用のための、たとえば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤化されてもよい。
【０１１４】
本明細書に記載される医薬組成物は、たとえば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために製剤化されてもよい。注射のための製剤は、単位剤形で、たとえば、任意に保存剤を加えた、アンプルまたは複数用量容器中で、提供されてもよい。この組成物は、油性または水性の媒体中の懸濁液、溶液、またはエマルジョンであってもよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤のような製剤用剤を含んでもよい。
【０１１５】
非経口投与のための医薬組成物には、水溶性型の活性調製物の水溶液が含まれる。加えて、活性成分の懸濁液が、適切な油性または水性ベースの注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒または媒体には、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームのような合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよい。任意に、この懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする、活性成分の溶解度を増加させる適切な安定剤または薬剤を含んでもよい。
【０１１６】
代替的には、活性成分は、使用前には、適切な媒体、たとえば、滅菌の、ピロゲンを含まない水ベースの溶液との構成のための粉末型であってもよい。
【０１１７】
本発明の医薬組成物はまた、たとえば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来的な坐剤ベースを使用して、坐剤または保持浣腸剤のような直腸組成物中で製剤化されてもよい。
【０１１８】
本発明における使用のために適切である医薬組成物には、活性成分が、意図される目的を達成するための有効量で含まれる組成物が含まれる。より詳細には、治療有効量は、障害（たとえば、虚血）の徴候を予防、軽減、もしくは改善するため、または治療される被験体の生存を延長するために有効な活性成分（核酸構築物）の量を意味する。
【０１１９】
治療有効量の決定は、とりわけ、本明細書で提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１２０】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療有効量または用量は、インビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。たとえば、用量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデル中で処方することができる。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１２１】
本明細書に記載される活性成分の毒性および治療的効力は、インビトロ、細胞培養、または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を製剤化する際に使用することができる。この投薬量は、用いられる投薬量および利用される投与の経路に多く依存している可能性がある。正確な処方、投与の経路、および投薬量は、患者の症状を考慮して、個々の医師によって選択されることができる（Finglら、1975, 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、第１章、１頁を参照のこと）。
【０１２２】
投薬量および間隔は、生物学的効果を達成するために十分なレベルの活性成分を提供するために個々に調整されてもよい（最小有効濃度、ＭＥＣ）。ＭＥＣは、各々の調製物について変動するが、インビボデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は、個体の特性および投与の経路に依存する。検出アッセイは、血漿濃度を決定するために使用することができる。
【０１２３】
治療される症状の重篤度および応答性に依存して、投薬は、数日間から数週間まで続く治療単位を用いて、または治療がもたらされるか、もしくは疾患状態の減少が達成されるまで、単回または複数回の投与であり得る。
【０１２４】
投与される組成物の量は、当然、治療される被験体、苦痛の重篤度、投与の様式、処方する医師の判断などに依存する。
【０１２５】
本発明の組成物は、所望される場合、活性成分を含む１つ以上の単位剤形を含んでもよいＦＤＡ認可キットのような、パックまたはディスペンサーデバイス中で提供されてもよい。このパックは、たとえば、ブリスターパックのような、金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随してもよい。このパックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって指示された形式で容器に付随する注意書によって適合されてもよく、この注意書は、政府機関による、組成物の型またはヒトへの投与もしくは獣医学的な投与の認可を反映する。このような注意書は、たとえば、処方薬または認可された製品の挿入についての米国食品医薬品局によって認可された標識であり得る。適合可能な薬学的キャリア中で製剤化された本発明の調製物を含む組成物もまた、上記にさらに詳述されるように、調製され、適切な容器中に配置され、そして示された症状の治療のために標識されてもよい。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は±１０％をいう。
【０１２７】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、限定を意図するものではない以下の実施例の試験に際して、当業者には明らかとなる。加えて、本明細書上記に描写されるような、および特許請求の範囲の節で特許請求されるような、本発明の種々の実施形態および局面の各々は、以下の実施例において実験的なサポートを見出す。
【実施例】
【０１２８】
ここで以下の実施例に対する参照がなされ、これは、上記の説明と一緒に、非限定的な様式で本発明を例証する。
【０１２９】
一般的に、本明細書で使用される命名法、および本発明において利用される実験室の手順は、分子、生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技術を含む。このような技術は、文献中に徹底的に説明されている。たとえば、以下を参照のこと:「Molecular Cloning: A laboratory Manual」Sambrookら、(1989); 「Current Protocols in Molecular Biology」I-III巻 Ausubel, R. M.編 (1994); Ausubelら、「Current Protocols in Molecular Biology」John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal、「A Practical Guide to Molecular Cloning」John Wiley & Sons, New York (1988); Watsonら、「Recombinant DNA」Scientific American Books, New York; Birrenら(編)「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」1-4巻, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 米国特許第４，６６６，８２８号; 同第４，６８３，２０２号; 同第４，８０１，５３１号; 同第５，１９２，６５９号および同第５，２７２，０５７号に記載されるような方法論; 「Cell Biology: A Laboratory Handbook」I-III巻 Cellis, J. E.編(1994); Freshneyによる「Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique」、Wiley-Liss, N. Y. (1994), 第3版; 「Current Protocols in Immunology」 I-III巻 Coligan J. E.編(1994); Stitesら(編)、「Basic and Clinical Immunology」(第8版), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); MishellおよびShiigi(編)「Selected Methods in Cellular Immunology」 W. H. Freeman and Co., New York (1980)；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、たとえば、以下を参照のこと：米国特許第３，７９１，９３２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，８５０，７５２号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，８７９，２６２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４，０７４号；同第４，０９８，８７６号；同第４，８７９，２１９号；同第５，０１１，７７１号および同第５，２８１，５２１号；「Oligonucleotide Synthesis」Gait, M. J.編(1984); 「Nucleic Acid Hybridization」Hames, B. D.およびHiggins S. J.編(1985); 「Transcription and Translation」Hames, B. D.およびHiggins S. J.編(1984); 「Animal Cell Culture」Freshney, R. I.編(1986); 「Immobilized Cells and Enzymes」IRL Press, (1986); 「A Practical Guide to Molecular Cloning」Perbal, B., (1984) および「Methods in Enzymology」1-317巻, Academic Press; 「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshakら「Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual」CSHL Press (1996)；これらのすべては、あたかも完全に本明細書に示されるように、参照として援用される。他の一般的な参考文献は、この文書の全体を通して提供される。その中での手順は、当該分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。そこに含まれるすべての情報は、参照として本明細書に援用される。
【０１３０】
実施例１
ＣＨＯ細胞における非毒性永続性選択の設計
永続的選択のために使用される遺伝子に関する一般的背景
還元型葉酸塩キャリア（ＲＦＣ）−葉酸および還元型葉酸塩は、哺乳動物細胞におけるプリン、チミジル酸および特定のアミノ酸の生合成のために必須である親水性ビタミンである（図１およびStockstad, 1990）。ＤＮＡ合成を補助するために、哺乳動物細胞は、原核生物および植物とは異なり、それら自体の葉酸ビタミンを合成することが不可能であるので、外因性供給源からの葉酸の取り込みに頼らなくてはならない（MatherlyおよびGoldman, 2003）。ロイコボリン（５−ホルミル−テトラヒドロ葉酸）および５−メチル−テトラヒドロ葉酸を含む関連する還元型葉酸塩は、プリンおよびピリミジンのデノボ生合成における１炭素ドナーの前駆体である。還元型葉酸塩およびメソトレキサート（ＭＴＸ；）のような葉酸アンタゴニスト（すなわち、抗葉酸剤；図２を参照のこと）の取り込みのための主要な細胞輸送系は、ヒト還元型葉酸塩キャリア（ｈＲＦＣ；図１、ZhaoおよびGoldman, 2003）である。図３ａ〜ｂは、葉酸およびＭＴＸの化学構造を示す。
【０１３１】
ｈＲＦＣは、１２個の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、短いＮ末端および長いＣ末端を有し、その両方が細胞質に存在する、５９１個のアミノ酸を含む内在性原形質膜タンパク質（〜６５ｋＤａの予測分子量）である（FergusonおよびFlintoff, 1999）（図４）。このタンパク質は、第１の細胞外ループ（Ｌ１）中に単一のＮ−結合グリコシル化部位を含み、このタンパク質を〜８５ｋＤａの分子量を有する広く移動するタンパク質にする、重度のグルコシル化を受ける（Matherlyら、1992；Freisheimら、1992）。ＲＦＣは、葉酸コファクターを取り込み、チアミンピロリン酸を含む（Zhaoら、2001a）種々の有機アニオンを搬出する（HendersonおよびZevely, 1981）、二方向性アニオン交換体として機能する古典的なトランスポーターである（Goldman, 1971；HendersonおよびZevely, 1981）。ＲＦＣは、原核生物と真核生物の両方において、多様な有機化合物および無機化合物を輸送する大きなキャリアのグループである、主要促進因子（major facilitator）スーパーファミリー（ＭＦＳ）のメンバーである（Paoら、1998）。哺乳動物ＲＦＣの中心的な生理学的役割は、最近、マウスＲＦＣ遺伝子座の標的化された破壊の研究において確証された。Ｚｈａｏら（Zhaoら、2001b）は、最近、マウスＲＦＣ遺伝子のホモ接合性破壊が胚形成期において致死的であること、および母方の葉酸補充が胚の致死性をレスキューすることができ、初期の新生仔の造血器官の不全を生じることを実証した。
【０１３２】
抗葉酸剤は、葉酸代謝経路において特定の酵素を阻害することによって、それらの細胞毒性活性を発揮する（図２）。たとえば、ＲＦＣを介して細胞に入るＭＴＸは、葉酸代謝における最初でかつ鍵となる酵素である、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の強力なインヒビターである（図１）。ＭＴＸへの細胞の曝露は、葉酸の欠乏ならびにプリンおよびデオキシチミジル酸を合成することの失敗を生じる。結果として、ＤＮＡ合成は阻害され、細胞はアポトーシスおよび細胞死を受ける。本発明者らによって行われた以前の研究は、ＭＴＸへの曝露が、安定なＭＴＸ輸送欠損表現型を生じるＲＦＣ不活性化をもたらし得ることを実証した。ｈＲＦＣコード領域における不活性変異は、ＲＦＣ輸送活性を無効にし、葉酸拮抗薬物耐性を生じる（Jansenら、1998；Droriら、2000a；Rothemら、2002）。加えて、ＲＦＣプロモーターのサイレンシング（主として、いくつかの転写因子の発現および／または機能の損失に起因する）は、ＲＦＣ遺伝子発現の損失を引き起こし、損なわれたＭＴＸ輸送を生じた（Rothemら、2003；Rothemら、2004a, b）。加えて、まれではあるが、ｈＲＦＣプロモーターメチル化もまた、ｈＲＦＣ遺伝子サイレンシングのメカニズムとして実証された（Wormら、2001）。
【０１３３】
ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ１）遺伝子−Ｄ−ガラクトースは、ジサッカリドであるラクトース（ミルク中に豊富である成分）の加水分解から誘導されるヘキソースである。Ｄ−ガラクトースは、三段階の酵素的転換で、グルコース−６−リン酸に転換される（図５ならびにNovelliおよびReichardt、2000）。第１段階において、ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ１；ＥＣ  ２．７．１．６）は、ＡＴＰの非存在下で、Ｄ−ガラクトースからＤ−ガラクトース−１−リン酸に転換する；第２段階において、Ｄ−ガラクトース−１−リン酸は、ＵＤＰ−グルコースの存在下で、ＵＤＰ−グルコース−α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼによる、Ｄ−グルコース−１−リン酸へのエピマー化を受ける；最終段階において、Ｄ−グルコース−１−リン酸は、ホスホグルコムターゼによって、Ｄ−グルコース−６−リン酸に転換され、次いでこれを解糖において使用することができる。最近の研究は、完全に機能的なＧａｌＫ１の欠如が、遺伝性疾患ガラクトース血症の１つの原因であり、その主要な臨床的徴候は早発性白内障であることを実証した（NovelliおよびReichardt，2000；Timson および Reece，2003）。
【０１３４】
ガラクトキナーゼ欠損ハムスター細胞（Schumperliら、1982）は、単独のヘキソース源としてＤ−ガラクトースを含む培地中で増殖することに失敗し、増殖のためにＤ−グルコースを含む培地を必要とする。
【０１３５】
ＲＦＣ遺伝子を使用する永続的選択の実験設計−ＲＦＣ永続的選択アプローチの最初の段階は、ＲＦＣ欠損ＣＨＯ細胞の樹立を必要とする。細胞は、葉酸を輸送する能力を欠くことが判明した後で、これらは、バイ−シストロン性配置においてヒトＲＦＣ遺伝子に連結されたレポーター遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰ）を有する発現ベクターでトランスフェクトする（図６におけるフローチャートを参照のこと）。トランスフェクト細胞は、ＲＦＣ発現細胞を選択するために、選択葉酸濃度下で（単独の葉酸源としての還元型ロイコボリン）Ｇ４１８中で増殖させる。トランスフェクト細胞が、十分な量の還元型葉酸を内在化すること、および葉酸欠乏条件下で生存することを可能にするために、ｈＲＦＣの発現レベルは高くあるべきである。一旦、安定なトランスフェクト細胞プールが樹立されると、ロイコボリン濃度は次第に減少し、ＧＦＰの発現は、毒性選択の非存在下で、発現の安定性を評価するためにＧ４１８の除去の際に続く。これらの条件下で、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現は、時間の経過とともに安定して維持されるはずであることが予測される。
【０１３６】
ＧａｌＫ１遺伝子を使用する永続的選択の実験設計−ガラクトキナーゼ欠損細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６５７）は、バイ−シストロン性配置においてヒトＧａｌＫ１遺伝子（Stambolianら、1995）に連結されたレポーター遺伝子（たとえば、ＥＧＦＰ）を有する発現ベクターでトランスフェクトする（図７におけるフローチャートを参照のこと）。トランスフェクト細胞は、ＧａｌＫ１発現細胞を選択するために、選択ガラクトース濃度下で（単独のヘキソース源としての５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース）Ｇ４１８中で増殖させる。一旦、安定なトランスフェクト細胞プールが樹立されると、Ｄ−ガラクトース濃度は次第に減少し、次いで、ＧＦＰの発現は、毒性選択の非存在下で、発現の安定性を評価するためにＧ４１８の除去の際に続く。これらの条件下で、ＧＦＰレポーター遺伝子の発現は、時間の経過とともに安定して維持されるはずであることが予測される。
【０１３７】
実施例２
永続的に選択されるＲＦＣ発現細胞の樹立
ＭＴＸ−輸送欠損細胞の単離−ＲＦＣトランスポーター活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＡＡ８細胞変異体の単離は、以前に記載されている（AssarafおよびSchimke, 1987）。野生型ＣＨＯ  ＡＡ８細胞は、もともとはLarry H. Thompson博士:Lawrence Livemore National Laboratory, CAの研究室からであり、Cyntia Hoy博士から恵与された。簡潔に述べると、ＣＨＯ  ＡＡ８細胞（５×１０5細胞／１０ｃｍペトリディッシュ、２０ｍｌ培地の存在下）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、および抗生物質を補充した増殖培地（αＭＥＭ、２．３μＭ葉酸含有）中で単層として増殖させた。細胞を、それぞれ、５０％致死用量（ＬＤ５０）の〜５倍および１０倍に対応する、７５ｎＭまたは１５０ｎＭ  ＭＴＸ（シグマ）に曝露した。ＭＴＸ選択を、１０％透析ウシ胎仔血清（ｄＦＳＣ、ギブコ）を補充した増殖培地中で実行した。
【０１３８】
ＲＦＣ欠損ＣＨＯ−Ｓ細胞（インビトロジェン、化学的に規定された培地、ＣＤ−ＣＨＯ（インビトロジェン）中の懸濁液中で増殖）を、徐々に増加する濃度のＭＴＸの段階的選択によって単離した。細胞を、１０ｎＭ  ＭＴＸの初期濃度に供し、ＣＨＯ−Ｓ  ＲＦＣ欠損細胞は、〜５ヶ月の期間にわたって、培地中で、１０ｎＭから、４０ｎＭ、１２０ｎＭ、および１５０ｎＭまでＭＴＸ濃度を徐々に増加させることによって、１５０ｎＭ  ＭＴＸ中で単離した。
【０１３９】
ｈＲＦＣ−ＥＧＦＰベクターの構築−ｈＲＦＣ  ｃＤＮＡは、以前にｐｃＤＮＡ３．１（ｐｈＲＦＣｌ）にクローニングされ、配列決定され、そして輸送活性の能力が確認された（Droriら、2000b）。ｈＲＦＣ  ｃＤＮＡ  （配列番号５）は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターから、ＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限酵素を使用して、ｐｈＲＦＣｌ哺乳動物発現ベクターから切除され、ｐＩＲＥＳ−２−ＥＧＦＰベクター（クローンテック）中で、ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位において、ＩＲＥＳエレメントの上流に方向性を伴ってクローニングした。
【０１４０】
ｈＲＰＣのＣ末端においてヒトインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）を含むｈＲＦＣ−ＨＡ構築物は、以前に記載されたように（LiuおよびMatherly, 2002；FergusonおよびFlintoff, 1999）構築した。ｈＲＰＣのＣ末端における小さなＨＡエピトープタグは、ＲＦＣの葉酸／ＭＴＸ輸送活性に干渉せず、市販のモノクローナル抗体を使用して、過剰発現されたｈＲＦＣ−ＨＡ遺伝子の検出を可能にする。注目すべきことに、このような抗体は、おそらく、ある程度のまれな逆転および再発現を受ける可能性がある内因性不活性化ｈＲＦＣ遺伝子を検出しない。ｈＲＦＣ−ＨＡ構築物は、ｐＩＲＥＳ−２−ＥＧＦＰベクター（クローンテック）に、ＢｇｌＩＩ−ＳａｌＩ部位においてＩＲＥＳエレメントの上流に、方向性を伴ってクローニングした。
【０１４１】
ｈＧＡＬＫ１−ＥＧＦＰベクターの構築−ヒトＧＡＬＫ１遺伝子は、School of Biological Sciences, University of Manchester, UKのRichard J. Reece博士より恵与された細菌発現ベクター（ｐＥＴ２１ｄ、ノバジェン（Novagen））から、ＰＣＲによってクローニングした（TimsonおよびReece, EJB, 2003）；Reece博士は、ＩＭＡＧＥコンソーシアムからこのＧａｌＫ１  ｃＤＮＡを入手した（クローンＩＤ：３５０１７８８）。
【０１４２】
ヒトＧａｌＫ１遺伝子の全体のコード領域を増幅するために、ＲＴ−ＰＣＲは以下のＰＣＲプライマーを使用して実施した：フォワード；５’−ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＣＴＴ  ＴＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  Ｃ−３’（配列番号１）およびリバース；５’−ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  Ｃ−３’（配列番号２）。下線を付したヘキサヌクレオチド配列は、それぞれ、ＸｈｏＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位をコードする。このＧａｌＫ１  ＰＣＲ産物（配列番号６）は、アガロース電気泳動によって分離し、ゲル抽出キット（キアゲン（Qiagen））を使用して精製し、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰベクター（クローンテック）に、方向性を伴ってクローニングした。ｈＧａｌＫ１−ＥＧＦＰベクターは、コンピテントＴｏｐ１細菌（Department of Biology, Technion, Haifa 32000, IsraelのDan Cassel教授より恵与された）を形質転換するために使用した。ＧａｌＫ１特異的ＰＣＲ、ならびにＧａｌＫ１インサートのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ切除の両方によって証明されたように、拾い上げた〜４０個のクローンのうちで、９５％がＧａｌＫ１インサートを含んでいた。ポジティブ形質転換体の配列決定は、ＧａｌＫ１遺伝子の存在を確認した。
【０１４３】
安定な形質転換体の樹立
ｈＲＦＣ−ＥＧＦＰ−対数増殖期の単層Ｃ５Ｒ０．１５細胞（２×１０7細胞）は、標準的なトリプシン処理プロトコールによって脱着させたのに対して、懸濁液中で増殖させたＣＨＯ−Ｓ細胞は、遠心分離によって収集した。次いで、細胞を、ｈＲＦＣ遺伝子またはｈＲＦＣ−ＨＡ遺伝子をコードする、ＥＧＦＰベースの１０μｇのバイ−シストロン性発現ベクターを使用して、エレクトロポレーション（１０００マイクロファラド、２３４Ｖ、Rothemら、2003）によってトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、１０％透析ＦＣＳで補充し、単独の葉酸源として２ｎＭロイコボリンを含む、葉酸を含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に移し、３７℃で４８時間増殖させた。次いで、細胞を、葉酸を欠き、１０％透析ウシ胎仔血清を補充し、４５０μｇ／ｍｌまたは６００μｇ／ｍｌのいずれかのＧ−４１８（カルビオケム−ノババイオケム、サンディエゴ、ＣＡ）および単独の葉酸源としての２ｎＭ  ロイコボリンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地に移した。６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８＋２ｎＭ  ＬＣＶの存在下で５週間後、細胞をよりストリンジェントな選択に供し、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８の定常濃度の存在下で、１、０．５、および０．２５ｎＭロイコボリンに並行して移した。細胞を、これらの選択条件下で少なくとも１ヶ月間増殖させ、その時点で、細胞を、Ｇ−４１８の非存在下または存在下でさらに増殖させた。
【０１４４】
ｈＧＡＬＫｌ−ＥＧＦＰ−対数増殖期のＧａｌＫ１欠損単層細胞（２×１０7細胞）を、標準的なトリプシン処理プロトコールによって脱着させた。次いで、細胞を、ＧａｌＫ１遺伝子をコードする、ＥＧＦＰベースの１０μｇのバイ−シストロン性発現ベクターを使用して、エレクトロポレーション（１０００マイクロファラド、２３４Ｖ）（Rothemら、2003）によってトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、１０％透析ウシ胎仔血清で補充し、５ｍＭまたは２ｍＭのいずれかのＤ−ガラクトースを含む、グルコースを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に移し、３７℃で２４時間増殖させた。次いで、細胞を、グルコースを欠き、１０％透析ウシ胎仔血清を補充した、３００、４５０または６００μｇ／ｍｌのいずれかのＧ−４１８を含み、５ｍＭまたは２ｍＭのいずれかのＤ−ガラクトースを有するＲＰＭＩ−１６４０培地（６つの独立したプール）に移した。３日後、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８＋５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース中で増殖している培養物を分割し、よりストリンジェントなＤ−ガラクトースおよび／またはＧ−４１８選択に、以下のように移した：１ｍＭ  Ｄ−ガラクトース＋６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８；  ０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース＋３００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８；  ０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ａｌｏｎｇ）＋７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８。ストリンジェントな条件で４０日後、０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース＋７５０μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８で増殖している培養物を、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８の存在下または非存在下で、０．２５ｍＭまたは０．１ｍＭ  Ｄ−ガラクトースを含む培地中にさらに配置した。これらの培養物は、分析の前に、少なくとも５週間増殖させた。
【０１４５】
細胞増殖アッセイ−宿主細胞およびそれらのトランスフェクト誘導体の倍加時間を決定するために、２×１０5細胞を、適切な増殖培地（５ｍｌ増殖培地／ディッシュ）：宿主細胞については、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％  ＦＣＳ、およびトランスフェクト体については、各々それぞれの選択培地中にある、１０％透析ＦＣＳを補充した、葉酸を欠くＲＰＭＩ  １６４０中で、３０ｍｍペトリディッシュに播種した。細胞を、増殖培地中で、３７℃で４日間インキュベートし、そのあいだ、生存細胞の数を、トリパンブルー排除を使用して毎日測定した。倍加時間は増殖曲線から計算した（細胞数対インキュベーション時間）。
【０１４６】
抗葉酸剤による細胞増殖阻害−抗葉酸剤細胞増殖阻害のために、細胞（１０4／ウェル）を、種々の濃度のＭＴＸまたは親油性抗葉酸剤、トリメトキサート（trimeterxate）（David Fry博士、Warner-Lambert, Parke-Davis, Detroit, Michigen）を含むそれぞれの増殖培地中で（ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳ中でＡＡ８および誘導体、ならびにＣＤ−ＣＨＯ中でＣＨＯ−Ｓ）、２４ウェルプレートに播種し、３７℃で３日間インキュベートした。その後、細胞をトリプシン処理によって脱着させ、生存細胞の数をトリパンブルー排除を使用して決定した。５０％阻害濃度（ＩＣ50）は、細胞増殖が、未処理コントロールと比較して５０％阻害される薬物濃度として定義する。
【０１４７】
Ｆ−ＭＴＸ染色ならびに親水性および親油性抗葉酸剤との競合−細胞を６０ｍｍペトリディッシュに播種し、２μＭフルオレセイン−ＭＴＸ（Ｆ−ＭＴＸ）を含む増殖培地中で、３７℃で８時間インキュベートした。次いで、細胞をＦＢＳで洗浄し、ＭＴＸおよびその親油性アナログＴＭＱとの競合に供した。３時間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理によって脱着させ、１％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳ中に懸濁し、そして細胞あたりの残りのグリーン蛍光を、４８８ｎｍの励起および５２５ｎｍの発光にて、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ベクトン−デッキンソン）を使用して測定した。非染色細胞の自己蛍光は定期的に記録した。
【０１４８】
［3Ｈ］−ＭＴＸ輸送−抗葉酸剤耐性クローンが抗葉酸剤を取り込む能力を決定するために、［3Ｈ］−ＭＴＸの流入速度を測定し、コントロールＣＨＯ  ＡＡ８細胞と比較した。増殖の対数期中期の細胞（２×１０7）を、ＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水溶液（ＨＢＳＳ、Rothemら、2002）からなる輸送緩衝液中で３回洗浄し、２μＭ  ［3Ｈ］−ＭＴＸを含むＨＢＳＳ（１ｍｌ懸濁液）の存在下で、３７℃で３分間インキュベートした。輸送コントロールは、５００倍過剰（１ｍＭ）の未標識ＭＴＸを含んだ。［3Ｈ］−ＭＴＸの輸送は、１０ｍｌの氷冷ＨＢＳＳの添加によって停止した。次いで、細胞懸濁液は、５００×ｇの遠心分離速度を使用して、４℃で５分間遠心分離し、その後、細胞ペレットを、１０ｍｌの氷冷輸送緩衝液で２回洗浄した。最終細胞ペレットは水に懸濁し、シンチレーション計数のために処理した。
【０１４９】
ＭＴＸ輸送欠損ＣＨＯ  ＡＡ８細胞の単離−ＲＦＣ輸送活性を欠いているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＡＡ８細胞変異体は、５０％致死用量（ＬＤ50）の（それぞれ）〜５倍および１０倍に対応する、７５ｎＭまたは１５０ｎＭ  ＭＴＸ濃度に、野生型ＡＡ８細胞を曝露することによって単離した（図１１ａ〜ｂ）。ＭＴＸ選択は、１０％透析ウシ胎仔血清（ｄＦＣＳ、ギブコ）を補充した増殖培地中で実行した。ＭＴＸへの曝露の１８日後、７個の独立したクローンを、滅菌クローニングリングを使用して拾い上げた（コロニーサイズ〜８０−３００細胞）。最初に拾い上げた７個の独立したＣＨＯ  ＡＡ８コロニー（７５および１５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性細胞に由来する）のうち、両方とも１５０ｎＭ  ＭＴＸの存在下での選択に由来する２個のクローン（Ｃ４  Ｒ０．１５およびＣ５  Ｒ０．１５）のみが、ＭＴＸ選択培地中での安定な増殖を示した。残りの５個のクローンは、選択培地中で不安定な増殖を示し、および／または倍数体表現型を示し、それゆえに廃棄されたかのいずれかであった。
【０１５０】
ＲＦＣ欠損ＣＨＯ−Ｓ細胞の単離−化学的に規定された培地中の懸濁液中で増殖しているＣＨＯ−Ｓ細胞を、〜５ヶ月の期間にわたって、１５０ｎＭ  ＭＴＸまで（１０、４０、１２０、および１５０ｎＭ）ＭＴＸ濃度を徐々に増加させる段階的選択によって単離した。１５０ｎＭ  ＭＴＸに対して耐性であった細胞を、ＣＨＯ−ＳＲ０．１５と名付けた。
【０１５１】
ＭＴＸ耐性細胞株のＲＦＣ輸送活性−ＭＴＸ耐性細胞株（ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ  ＡＡ８）は、それらのＭＴＸ輸送活性が損なわれていることを確証するために、Ｆ−ＭＴＸ染色のフローサイトメトリーアッセイ、続いて親水性抗葉酸剤（ＭＴＸ）および親油性抗葉酸剤（ＴＭＱ）との競合を利用した。図８に示すように、ＣＨＯ−Ｓ  Ｒ０．１５細胞は、ＣＨＯ−Ｓ細胞のそれよりも〜２倍高かった明るいＦ−ＭＴＸ染色を示し、このことは、ＣＨＯ−Ｓ  Ｒ０．１５細胞におけるＤＨＦＲ発現の増加を示唆した。しかし、予測されるように、１００  ｎＭ  ＭＴＸの存在下での細胞のインキュベーション後に、ＣＨＯ−Ｓ細胞は、それらのＦ−ＭＴＸ染色を完全に消失した（図８）。対照的に、１００ｎＭ  ＭＴＸとのＣＨＯ−Ｓ  Ｒ０．１５細胞のインキュベーションは、細胞のＦ−ＭＴＸ染色のいかなる消失も生じなかった。さらに、１０００ｎＭ  ＭＴＸは、ＣＨＯ−Ｓ  Ｒ０．１５細胞におけるＦ−ＭＴＸの完全な置き換えのために必要であった。他方、拡散によって細胞に入る脂質溶解性抗葉酸剤ＴＭＱの１０ｎＭのみとのいずれかの細胞型のインキュベーションは、Ｆ−ＭＴＸ蛍光の完全な消失を生じた（図８）。同様に、３０ｎＭ  ＭＴＸとのＣＨＯ  ＡＡ８細胞のインキュベーションは、Ｆ−ＭＴＸ蛍光の完全な消失を生じた（図９ａ）。他方、３μＭのＭＴＸが、ＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ４Ｒ０．１５細胞およびＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ５Ｒ０．１５細胞からのＦ−ＭＴＸ蛍光を完全に置き換えるために必要であった（それぞれ、図９ｂおよびｃ）。
【０１５２】
［3Ｈ］−ＭＴＸ輸送アッセイ−本発明のＭＴＸ−耐性細胞株が、ＭＴＸ輸送において確かに欠損していることの直接的な証拠を提供するために、［3Ｈ］−ＭＴＸ輸送アッセイを利用した。ＭＴＸ取り込みの初期速度は、３分間の取り込みにわたって、２μＭ  ［3Ｈ］−ＭＴＸを使用して決定した。それぞれ、４０および１２０ｎＭ  ＭＴＸの存在下で、ＭＴＸ段階的選択の初期段階において単離されたＣＨＯ−Ｓ細胞株は、コントロールＣＨＯ−Ｓ輸送活性の９２．５％および９６．４％を喪失した（図１１ａ）。同様に、ＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ４  Ｒ０．１５およびＣ５  Ｒ０．１５細胞株は、コントロールＡＡ８細胞と比較して、ＭＴＸ取り込みの９０〜９１％の喪失を示した（図１１ｂ）。それゆえに、これらのＭＴＸ耐性細胞株におけるＭＴＸの非常に乏しい輸送は、ＲＦＣ輸送活性がこれらの細胞中で大部分喪失されていることの直接的な証拠を提供する。
【０１５３】
［3Ｈ］−ＭＴＸ輸送アッセイとフルオレセイン−ＭＴＸ染色アッセイの両方を使用して、ＲＦＣ欠損性であることが確証された細胞は、ｈＲＦＣのトランスフェクションのための宿主として使用した。
【０１５４】
全体的に見て、これらの結果は、有意により多い量のＭＴＸが、ＲＦＣ欠損細胞（すなわち、ＣＨＯ−Ｓ  Ｒ１５０細胞、ＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ４Ｒ０．１５細胞およびＣ５Ｒ０．１５細胞）中で、細胞内Ｆ−ＭＴＸ（これは細胞内ＤＨＦＲとの高い親和性の複合体で存在する）を置き換えるために必要であることを実証する。それゆえに、これらの結果は、ＣＨＯ−Ｓ  Ｒ１５０細胞、ＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ４Ｒ０．１５細胞およびＣ５Ｒ０．１５細胞が、ＭＴＸの取り込みにおいて欠損していることを示唆する。
【０１５５】
ＭＴＸ耐性細胞株のＴＭＱ過敏性−ＲＦＣ輸送活性が損なわれている細胞は、典型的には、これらの細胞内葉酸プールにおいて著しい縮小を有するので、脂質溶解性抗葉酸剤、トリメトレキサート（ＴＭＱ）およびピリトレキシム（ＰＴＸ）に対する過敏性の表現型を示す（Rothemら、2002）。抗葉酸剤に対するＲＦＣ欠損細胞の感受性をさらに特徴付けするために、ＣＨＯ−Ｓ  Ｒ０．１５細胞、Ｃ４Ｒ０．１５細胞およびＣ５Ｒ０．１５細胞を、ＴＭＱ細胞毒性実験に供した。図１０に示すように、ＣＨＯ−Ｓ細胞において、細胞増殖の５０％阻害（すなわち、ＩＣ50）が、およそ４０ｎＭのＴＭＱの存在下で達成されたのに対して、ＣＨＯ−Ｓ  Ｃ４Ｒ０．１５細胞においては、ＩＣ50は１０ｎＭのＴＭＱであった（図１０）。これらの結果は、ＲＦＣ輸送活性の喪失が、細胞内葉酸プールの減少と関連することを示す。
【０１５６】
さらに、ＭＴＸ耐性ＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ４Ｒ０．１５細胞およびＣ５Ｒ０．１５細胞は、それらのＣＨＯ  ＡＡ８対応物（それぞれ、ＩＣ50値〜８ｎＭおよび６ｎＭ、データ示さず）と比較した場合に、ＰＴＸおよびＴＭＱに対して、それぞれ、＞３倍および＞５倍の過敏性であった。
【０１５７】
これらの結果は、ＲＦＣ輸送活性の喪失、それによって、細胞内葉酸プールの著しい減少および結果として親油性抗葉酸剤に対する著しい過敏性を生じることに対するさらなる証拠を提供する。
【０１５８】
実施例３
永続的に選択されるＲＦＣ発現細胞は、細胞毒性薬物（Ｇ４１８）の非存在下で高発現レベルを維持する
培養細胞からの膜タンパク質の抽出−対数増殖期の細胞をトリプシン処理によって脱着し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして遠心分離によって収集した。次いで、細胞（１×１０6〜３×１０6）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ならびに、１０μｇ／ｍｌ  フェニルメチルスルホニルフルオリド、６０μｇ／ｍｌ  アプロトニン、５μｇ／ｍｌ  ロイペプチン、１０μｇ／ｍｌ  ペプスタチン、１ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ  ８）、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８）を含むプロテアーゼインヒビターのｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）ｍｉｎｉ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ロッシュ）を含む溶解緩衝液中でインキュベートした（AssarafおよびBorgnia、1994）。氷上での１時間のインキュベーション後、タンパク質抽出物を遠心分離し、上清のアリコートを、分析まで−８０℃で保存した。タンパク質含量は、ＢｒａｄｆｏｒｄにしたがうＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを使用して決定した。
【０１５９】
ウェスタンブロット分析−ＲＦＣ−ＨＡ発現を、抗ＨＡ抗体を使用するウェスタンブロット分析によって研究した。簡潔に述べると、ミクロソームタンパク質を、ＳＤＳを含む１０％ポリアクリルアミノゲル上の電気泳動によって分離し、ニトロセルロースナイロンメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ）に電気的に転写した。このブロットを、１％スキムミルクを含むＴＢＳ緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／Ｃｌ  ｐＨ  ８．０）中で、室温にて１時間ブロックし、その後、これらを、ＨＡエピトープに対して特異的である、１：１０００希釈のＨ１２モノクローナル抗体（コバンス社（Covance Inc.）、プリンストン、ＮＪ）とともにインキュベートした。次いで、ブロットを、同じ緩衝液中で、室温にて１０分間すすぎ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合体化ヤギ抗マウス二次抗体（ＩｇＧ；１：４０，０００希釈、ジャクソン  イムノリサーチ  ラブ（Jackson Immunoresearch Labs）、ウエストグローブ、ＰＡ）とともに、室温で１時間、さらにインキュベートした。ＴＢＳ中での、室温における３回の１０分間の洗浄後、増強化学発光検出（enhanced chemiluminescence detection）を、製造業者（バイオロジカル  インダストリーズ（Biological Industries）、Ｂｅｔｈ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）の指示書にしたがって実施した。タンパク質含量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（バイオラッド）を使用して決定した。
【０１６０】
免疫蛍光染色−細胞（１０4）を、滅菌ガラスカバースリップ上で、２４ウェルプレート（１ｍｌ培地／ウェル）に播種し、３７℃で３日間インキュベートした。免疫染色のために、増殖培地を除去し、単層細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを使用して１０分間固定した。固定後、カバースリップをＰＢＳで洗浄し、２回蒸留水中の８０％メタノールの溶液中で２０分間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄し、１％スキムミルクを含むＰＢＳ中で室温にて１時間ブロックし、そして抗ＨＡモノクローナル抗体Ｈ１２（コバンス社、プリンストン、ＮＪ；１：１００希釈）とともに反応させた。抗ＨＡインキュベーション後、カバースリップを、ＰＢＳの存在下で洗浄し、ＦＩＴＣ−結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（シグマ；１：１００）とともにさらにインキュベートした。二次抗体とのインキュベーション後、カバースリップをＰＢＳで２回洗浄し、細胞核を、０．５μｇ／ｍｌの最終濃度で、ＤＡＰＩ（シグマ；カタログ番号Ｄ−９５６４）を用いて、室温で６０分間染色した。ＰＢＳを用いる４回の洗浄後（各々２ｍｌを用いる）、カバースリップを、フルオロマウント−ＧＴＭ（サザンバイオテック、バーミンガム、アラバマ、カタログ番号０１００−０１）を使用してスライドガラスに装着した。次いで、スライドを、ＢｉｏＲａｄ  ＭＲＣ  １０２４共焦点顕微鏡を使用して調べた。
【０１６１】
ＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析−２５ｍｍ組織培養フラスコ中で培養した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理によって脱着し、そして１０6細胞／ｍｌでＰＢＳ＋１％  ＦＣＳ中に懸濁した。次いで、細胞を、細胞あたりのグリーン蛍光について、４８８ｎｍの励起および５２５ｎｍの発光にて、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ベクトンデッキンソン）を使用して分析した。非染色細胞の自己蛍光は定期的に記録した。
【０１６２】
細胞増殖アッセイおよび抗葉酸剤による阻害−本明細書中上記の実施例２に記載されるのと同様である。
【０１６３】
レポーター遺伝子発現に対するロイコボリンの効果−ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現に対する減少するロイコボリン濃度の効果。減少濃度のロイコボリン（０．２５〜２ｎＭ）の存在下でのＧ−４１８（６００μｇ／ｍｌ）において増殖したＣ５  Ｒ０．１５  ＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体のフローサイトメトリー分析は、非トランスフェクトコントロール細胞と比較して、ＥＧＦＰ蛍光の１００倍の増加を示した（図１２）。同様に、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８および２ｎＭまたは１０ｎＭロイコボリンの存在下で増殖したｈＲＦＣ  ＣＨＯ−Ｓ  Ｒ０．１５は、選択マーカーとしてのＲＦＣまたはＲＦＣ−ＨＡ、および第２のシストロンとしてのＥＧＦＰをコードするバイ−シストロン性ベクターを用いるトランスフェクション後に、ＥＧＦＰ蛍光の〜１０倍増加を示した（図１３）。これらの結果は、ロイコボリン選択の有効性を示し、上流の遺伝子、ＲＦＣまたはＲＦＣ−ＨＡが、これらの形質転換細胞において高いレベルで発現されることを示唆する。
【０１６４】
ウェスタンブロットによるｈＲＦＣ発現の確認−ＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト細胞におけるＲＦＣ−ＨＡの発現は、ＨＡエピトープに対するモノクローナル抗体を使用するウェスタンブロット分析によってさらに確認した。図１４に示すように、２ｎＭロイコボリンおよび６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８を含む選択培地中で増殖しているＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ５  Ｒ０．１５トランスフェクト細胞は、ｈＲＦＣ−ＨＡタンパク質を強力に発現した。
【０１６５】
増殖阻害に対するｈＲＦＣ発現の効果−トランスフェクトｈＲＦＣ−ＨＡ細胞が機能的葉酸トランスポーターを示すことを確認するために、ＭＴＸ増殖阻害アッセイを実行した。機能的ｈＲＦＣレセプターを過剰発現するＲＦＣ欠損細胞は、それらの親の宿主と比較して、ＭＴＸに対して過敏性であることが予測される。これらの実験において、親のＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ５細胞は、〜３μＭのＭＴＸ  ＩＣ50値を有することが見出されたのに対して、ｈＲＰＣおよびｈＲＦＣ−ＨＡ  ＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ５Ｒ０．１５トランスフェクト体は、２７〜２９ｎＭのＭＴＸ  ＩＣ50値を示し、親の細胞と比較して２オーダー低い規模であった（図１５）。それゆえに、ｈＲＦＣおよびｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト細胞は、親のＣ５Ｒ０．１５細胞と比較して、１００倍機能的なｈＲＰＣおよびｈＲＰＣ−ＨＡトランスポーターを発現した。
【０１６６】
ＲＦＣの免疫蛍光検出−ｈＲＦＣ−ＨＡが原形質膜に正確に標的化されたことを確認するために、トランスフェクト細胞を、抗ＨＡ抗体を使用する免疫蛍光染色、その後の共焦点顕微鏡分析に供した。図１６ａ〜ｇに示すように、ｈＲＦＣ−ＨＡ過剰発現に対応するグリーン蛍光は、ＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ５Ｒ０．１５トランスフェクト体の原形質膜に制限されたのに対して、非トランスフェクト細胞においては染色は観察されなかった（図１６ｆを図１６ｃと比較のこと）。ＤＡＰＩ色素を用いる対比染色は、核の境界を正確に位置付けした（図１６ｂおよびｄ）。
【０１６７】
ＲＦＣトランスフェクト細胞株の増殖−ＲＦＣ欠損宿主細胞およびそれらのトランスフェクト体の増殖特性を試験した。２．３μＭ葉酸を含む増殖培地中で増殖しているＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ５  Ｒ０．１５細胞は、〜２４時間の倍化時間を示した（図１７）。倍加時間はまた、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８の存在下で、またはＧ−４１８除去の３週間後に、１〜２ｎＭロイコボリンを含む、葉酸を含まない培地中で増殖したｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体についてもまた決定した。これらの種々の選択増殖条件下で、倍加時間は、ＣＨＯ  ＡＡ８  Ｃ５  Ｒ０．１５宿主細胞株の倍加時間と同様に、〜２８時間であった。比較において、親のＡＡ８細胞株は、〜１５時間の倍化時間を示した（図１７）。ＲＦＣ欠損細胞のより長い倍加時間は、細胞内葉酸プールにおける著しい縮小に起因する、十分に確立された現象である（Rothemら、2002）。
【０１６８】
これらの結果は、ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体が、厳しい選択増殖条件の存在下においてさえ、比較的長い倍加時間を保持することを示す。
【０１６９】
ＲＦＣを用いる永続的選択条件下での発現の安定性−過剰発現したレポーター遺伝子の安定性を研究するために、ＥＧＦＰのフローサイトメトリー分析は、Ｇ−４１８の存在下または非存在下で、連続的な１〜２ｎＭロイコボリンの存在下で増殖している種々のトランスフェクト体を使用して実施した。図１８ａ〜ｂに示すように、ＥＧＦＰ発現は、Ｇ−４１８の非存在下で、２ヶ月間、ナノモル濃度のロイコボリン濃度において安定に維持された。加えて、Ｇ−４１８の非存在下で、１ｎＭのみのロイコボリンを含む培地中での永続的な選択条件下で２ヶ月間増殖しているｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体は、Ｇ−４１８を含まない培地中で３週間のみ増殖しているトランスフェクト体よりも、高いＥＧＦＰ蛍光を有するように見えた。これらの結果は、永続的選択条件下で、ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体において、高いレベルのＥＧＦＰ発現が保持されることを明確に確立する。
【０１７０】
実施例４
永続的に選択されたＧＡＬ４発現細胞は、低いＤ−ガラクトース濃度の存在下で高い発現レベルを維持する
材料および実験方法−本明細書中上記の実施例２および３と同様である。
【０１７１】
ガラクトキナーゼ欠損ハムスター細胞のトランスフェクション−ガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ）を欠損しているチャイニーズハムスター肺細胞は、ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１６５７）から購入した。これらの細胞は、Ｄ−グルコース含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中で正常な増殖を示したのに対して、これらは、単独のヘキソース源として１０ｍＭまでの高さの濃度のＤ−ガラクトースを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（バイオロジカル  インダストリーズ、Ｂｅｔｈ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）中で増殖することに失敗した（データ示さず）。
【０１７２】
ガラクトース欠乏下での発現の安定性−永続的選択条件下での、ＧａｌＫ１遺伝子を有するレポーター遺伝子の発現の安定性、およびＤ−ガラクトースの段階的な欠乏の効果を評価するために、ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現のレベルを、Ｇ−４１８の存在下または非存在下で決定した。１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８および単独のヘキソース源としての０．２５〜０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトース中で３週間増殖させたＧａｌＫ１トランスフェクト体のフローサイトメトリー分析は、非トランスフェクトＧａｌＫ欠損細胞と比較して、〜５倍および１００倍のＥＧＦＰ過剰発現を示した、２つの均等に分布した亜集団を明らかにした（図１９）。単独のヘキソース源として０．２５〜０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトースを含む培地中での２ヶ月間の増殖後、ＧａｌＫ１トランスフェクト体は、Ｄ−ガラクトース含有培地中のＧ−４１８（１ｍｇ／ｍｌ）の存在に関わりなく、１００倍のＥＧＦＰを安定に発現する優勢な集団でより均質となった（図１９ｂ）。これらの結果は、これらのＧａｌＫ１トランスフェクト体におけるＥＧＦＰ発現の初期の駆動力が、Ｄ−ガラクトースの段階的な欠乏であることを示唆する。それゆえに、本研究におけるレポーター遺伝子（ＥＧＦＰ）は、毒性選択の非存在下で、ＧａｌＫ１遺伝子を用いる永続的な選択条件下で、少なくとも２ヶ月間、安定して発現されることが示された。高レベルのＧａｌＫ１は、ミリモル濃度以下濃度のＤ−ガラクトースで細胞増殖を可能にするために発現されなければならないので、上流のＧａｌＫ１遺伝子は、ＥＧＦＰのレベルと比較し得るか、またはより高いレベルで過剰発現される可能性が高い。
【０１７３】
ｈＧａｌＫ１トランスフェクト細胞株の増殖−ガラクトキナーゼ欠損宿主細胞ならびにそれらの種々のＧａｌＫ１トランスフェクト体の倍加時間を決定した（図２０）。親のハムスターのガラクトキナーゼ欠損細胞は、およそ〜２４時間の倍化時間を示した。０．２５ｍＭ  Ｄ−ガラクトースおよび１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８、またはＤ−ガラクトース単独の両方を含む培地中で増殖しているＧａｌＫ１トランスフェクト体は、２４〜２８時間の倍化時間を有することが見出された。しかし、ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体を用いる場合と同様に、種々のＧａｌＫ１トランスフェクト体におけるラグタイムにおける顕著な増加が存在した。これらの結果は、種々のＧａｌＫ１トランスフェクト体が、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８まで高く、および０．２５ｍＭ  Ｄ−ガラクトースまで低い、厳しい選択増殖条件の存在下においてさえ、比較的良好な倍加時間を保持することを実証する。
【０１７４】
バイオリアクター中での目的遺伝子の発現のために、永続的な、非毒性選択剤として、選択可能遺伝子を利用することの実行可能性を試験するために、２つの新規な選択可能遺伝子を利用した：還元型葉酸塩キャリア（ＲＦＣ）およびガラクトキナーゼ（ＧａｌＫ）遺伝子である。レポーター遺伝子（ＥＧＦＰ）とともにＲＦＣ遺伝子またはＧａｌＫ１遺伝子を含む発現ベクターを構築し、ＲＦＣ−またはＧａｌＫ−欠損細胞を、それぞれの発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトした。
【０１７５】
この実行可能性研究は、試験した２つの遺伝子（還元型葉酸塩キャリアおよびガラクトキナーゼ）が永続的選択の目的のために使用することができること、およびそれらのそれぞれの選択培地中での細胞の増殖（葉酸の非存在下で、または単独のヘキソース源としてガラクトースの存在下で）が、毒性選択の非存在下で、少なくとも２ヶ月のあいだ、レポーター遺伝子（ＥＧＦＰ）の安定な発現を維持することを可能にすることを確認した。
【０１７６】
個別の実施形態において、明確化のために記載されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態の組み合わせにおいて提供されてもよいことが認められる。逆に、単一の実施形態の状況において、簡潔さのために記載されている本発明の種々の特徴はまた、別々に、または任意の適切な小結合において提供されてもよい。
【０１７７】
本発明は、その特定の実施形態とともに説明されてきたが、多くの代替物、修飾、およびバリエーションが当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明の技術思想および添付の特許請求の範囲の広い範囲に含まれる、すべてのこのような代替物、修飾、およびバリエーションを包含することが意図される。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各々の個々の刊行物、特許、および特許出願が、具体的かつ個々に参照として本明細書に援用されることが示されるのと同程度に、それらの全体が参照として本明細書に援用される。加えて、本願におけるいかなる参考文献の引用または同定も、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であることの認可として解釈されるべきではない。
【０１７８】
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【０１７９】
本発明は、例示のみの目的のために、添付の図面を参照して本明細書で説明される。ここでの詳細な図面への具体的な参照を用いて、示される詳細が例示のためであり、かつ本発明の好ましい実施形態の例示的な議論の目的のみのためであることが強調され、そして最も有用であり、かつ最も容易に理解された本明細書の原理的および概念的な局面の説明であると考えられているものを提供するために提示される。この点に関して、本発明の基礎的な理解のために必要とされるよりも詳細には、本発明の構造的な詳細を示すための試みはなされておらず、本発明のいくつかの形態がどのように実用上具体化され得るかを当業者に対して明らかにする図面を用いて、説明がなされる。以下は図面の説明である。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】還元型葉酸塩の代謝を示す概略図である。ＰＲＰＰ：５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸；ＧＡＲ−ＴＦａｓｅ：グリシンアミドリボヌクレオチドトランスフォーミラーゼ；ＡＩＣＡＲ−ＴＦａｓｅ：５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオチドトランスフォーミラーゼ；ＭＲＰ−１：多剤耐性タンパク質１；ＴＳ：チミジル酸シンターゼ；ＩＭＰ：イノシン一リン酸；ＴＳ−チミジル酸シンターゼ；ＤＨＦＲ：ジヒドロ葉酸還元酵素；ＲＦＣ：還元型葉酸塩キャリア。
【図２】葉酸代謝の代謝拮抗阻害を示す概略図である。ＲＦＣを介して細胞に入る葉酸代謝阻害剤は、緑色で印を付けている；細胞膜を介して拡散によって細胞に入る葉酸代謝阻害剤は、茶色で印を付けている；阻害されるタンパク質には赤色で印を付けている。ＭＴＸ−メソトレキサート；ＭＴＡ：複数を標的とする抗葉酸剤；ＥＤＸ：エダトレキサート；ＡＭＴ：アミノペトリン；ＴＭＱ：トリメトレキサート；ＤＤＡＴＨＦ：５，１０−ジデアザ−５，６，７，８−テトラヒドロ葉酸。
【図３】葉酸（ａ）およびＭＴＸ（ｂ）の化学式を示す概略図である。
【図４】ｈＲＦＣについてのトポロジーモデルを示す概略図である。ｈＲＦＣについてのこのトポロジーモデルは、１２個の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）、内側に配向しているＮ末端およびＣ末端、ならびにＡｓｎ５８で外側に配向しているＮグリコシル化部位を示す。ｈＲＦＣ一次配列における１１個のシステイン残基の位置もまた示す。Ｃ末端の５６個のアミノ酸は、４個のシステイン残基を含む（CaoおよびMatherly, 2003から採用）。
【図５】グルコース−６−リン酸へのグルコースの代謝的変換を示す概略図である。
【図６】ＲＦＣ遺伝子を用いる永続的選択ストラテジーを示す概略図である。（１）ＲＦＣ−細胞の単離のためのＭＴＸを用いる処理；（２）バイ−シストロン性配置でｈＲＦＣ遺伝子に連結されたＥＧＦＰ（レポーター遺伝子）を有する発現ベクターを用いるトランスフェクション；（３）還元型葉酸塩（ロイコボリン）およびＧ４１８の選択濃度での増殖；（４）Ｇ４１８の非存在下でのロイコボリンの選択濃度での高発現レベルの維持−非毒性永続的選択；本研究においてはＧＦＰを目的遺伝子として使用した。
【図７】Ｇａｌｋ１遺伝子を用いる永続的選択ストラテジーを示す概略図である。（１）バイ−シストロン性配置でヒトＧａｌＫ１遺伝子に連結されたＥＧＦＧ（レポーター遺伝子）を有する発現ベクターを用いるトランスフェクション；（２）グルコースの非存在下かつ選択ガラクトース濃度およびＧ４１８の選択濃度での増殖；（３）Ｇ４１８の非存在下での選択ガラクトース濃度での高発現レベルの維持；非毒性永続的選択；本研究においてはＧＦＰを目的遺伝子として使用した。
【図８】ＲＦＣ機能を喪失したＣＨＯ−Ｓ細胞における、Ｆ−ＭＩＸ蛍光の抗葉酸剤による置き換えを示すＦＡＣＳ分析である。ＣＨＯ−ＳおよびＲＦＣ欠損ＣＨＯ−Ｓ細胞（１５０ｎＭ  ＭＴＸへの曝露によって樹立したＣＨＯ−ＳＲ０．１５）を、Ｆ−ＭＴＸ（蛍光性ＭＴＸアナログ）で染色し、その後、細胞を種々の濃度のＭＴＸまたはＴＭＱ（トリメトレキサート、その実体についてはＲＦＣ非依存性である脂溶性抗葉酸剤）とともにインキュベートした。Ｆ−ＭＴＸの置き換えは、機能的に活性なＲＦＣを示す。ＣＨＯ−ＳＲ０．１５の１００ｎＭ  ＭＴＸ濃度を用いる競合後のＦ−ＭＩＸ蛍光の保持は、ＭＴＸ輸送の欠損、すなわち、ＲＦＣ機能の喪失を示唆する。
【図９】ＲＦＣ機能を喪失したＣＨＯ  ＡＡ８細胞における、Ｆ−ＭＩＸ蛍光の抗葉酸剤による置き換えを示すＦＡＣＳ分析である。野生型ＣＨＯ  ＡＡ８細胞およびＲＦＣ欠損クローンＣ４およびＣ５を、Ｆ−ＭＴＸ（蛍光性ＭＴＸアナログ）で染色し、その後、細胞を種々の濃度のＭＴＸまたはＴＭＱ（その実体についてはＲＦＣ非依存性である脂溶性抗葉酸剤）に供した。Ｆ−ＭＴＸの置き換えは、機能的に活性なＲＦＣを示す。高濃度ＭＴＸを用いる競合後のＦ−ＭＩＸ蛍光の保持は、ＭＴＸ輸送の欠損、すなわち、ＲＦＣ機能の喪失を示す。
【図１０】親の細胞またはＣＨＯ−ＳＲ０．１５細胞のＴＭＱ過敏性を図示する棒グラフである。細胞は、増殖培地および種々の濃度のＴＭＱの存在下で３日間インキュベートし、細胞の生存およびＴＭＱの５０％阻害濃度を決定した。親のＣＨＯ細胞と比較した場合のＣＨＯ−ＳＲ０．１５細胞の８倍の過敏性に注目のこと。
【図１１】抗葉酸剤耐性亜系統におけるＭＴＸ輸送の喪失を示す棒グラフである。［3Ｈ］ＭＴＸ輸送速度は、親の細胞および抗葉酸剤耐性細胞において決定した。細胞は、２μＭ  ＭＴＸとともに３分間インキュベートし、その後、放射性標識されたＭＴＸの取り込みのレベルをシンチレーション計数によって決定した。ＣＨＯ−Ｓ−Ｒ０．０４およびＣＨＯ−Ｓ−Ｒ０．１２は、それぞれ、４０ｎＭおよび１２０ｎＭまでのＭＴＸに対する細胞の段階的曝露によって得られたＣＨＯ−Ｓ  ＲＦＣ欠損細胞である。Ｃ４およびＣ５は、１５０ｎＭ  ＭＴＸを用いる処理によって得られたＣＨＯ  ＡＡ８クローンである。ＣＨＯ  Ｓ  ＭＴＸＲ細胞ならびにＣＨＯ  Ｃ４細胞およびＣ５細胞における［3Ｈ］ＭＴＸの乏しい輸送は、ＲＦＣ機能の喪失を示すことに注目のこと。
【図１２】ＲＦＣ−ＨＡでトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｃ５細胞におけるＥＧＦＰ発現を示すＦＡＣＳ分析である。非トランスフェクトＣＨＯ  Ｃ５細胞およびそれらのＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体のフローサイトメトリー分析は、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および０．２５〜２μＭ  ロイコボリン（ＬＣＶ）を含む培地中で６週間、二重に選択した。トランスフェクトされた細胞は、すべてのロイコボリン濃度において、均質にＥＧＦＰを発現するように見えた。
【図１３】ＲＦＣおよびＲＦＣ−ＨＡでトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｓ細胞におけるＥＧＦＰ発現を示すＦＡＣＳ分析である。非トランスフェクトＣＨＯ−ＳＲ０．１５細胞ならびにそれらのＲＦＣまたはＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体のＥＧＦＰ蛍光の代表的なフローサイトメトリー分析は、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および２〜１０ｎＭ  ロイコボリンを含む培地中で２週間、二重に選択した。ＣＨＯ−ＳＲ０．１５トランスフェクト集団は均質であり、非トランスフェクト細胞と比較して５〜１０倍のＥＧＦＰ蛍光の増加を示した。
【図１４】トランスフェクトされたＣＨＯ  Ｃ５細胞におけるＲＦＣ−ＨＡの発現を示すウェスタンブロット分析である。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００可溶性タンパク質を、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ−４１８および２ｎＭロイコボリンを含む増殖培地中で４週間増殖したＣＨＯ  Ｃ５（−）細胞およびそれらのＲＦＣ−ＨＡ形質転換体（＋）から最初に抽出した。次いで、タンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ナイロンメンブレンに転写し、そしてＨＡタグに対するモノクローナル抗体とともに反応させた。メンブレンを、標準増強化学発光（standard enhanced chemiluminescence）  （ＥＣＬ）手順を使用して発色させた。ＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト細胞におけるＨＡタグの特異的発現に注目のこと。
【図１５】ＲＦＣトランスフェクション細胞におけるＭＴＸ増殖阻害を示すグラフである。Ｃ５Ｒ０．１５細胞（ＲＦＣ欠損）およびそれらのＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体に対するＭＴＸの細胞毒性を示す。細胞は、種々の濃度のＭＴＸで３日間インキュベートし、その後、細胞の生存をトリパンブルー排除を使用して測定し、そして５０％阻害濃度を決定した（矢印によって示す）。ＲＦＣとＲＦＣ−ＨＡの両方のトランスフェクト体においてＭＴＸ感度が１００倍増加することに注目のこと。
【図１６】は、ＲＦＣの免疫蛍光染色を示す蛍光画像である。Ｃ５の親の細胞またはＣ５  ＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト細胞は１ｎＭロイコボリンの存在下で培養し、６００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を免疫蛍光染色に供した。細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、溶解緩衝液で処理し、そしてヘマグルチニン（ＨＡ）タグに対するＭＡｂで染色し、続いてフルオレセイン結合体化二次抗体で染色した。Ｄａｐｉ核酸染色は細胞核を示す。ａ〜ｃ−トランスフェクトしていないＣ５細胞（ＲＦＣ−、ネガティブコントロール）；ｄ〜ｇ−ＲＦＣ−ＨＡ  Ｃ５細胞。グリーン蛍光染色は、トランスフェクトしていないＣ５細胞（ｃ）と比較して、ＲＦＣ−ＨＡ  Ｃ５トランスフェクト細胞（ｆおよびｇ）において、ＨＡ免疫染色後に観察されたことに注目のこと。ｇは、ｆの染色された細胞の拡大を示す。
【図１７】は、選択増殖条件下でのｈＲＦＣトランスフェクト細胞の増殖を示すグラフである。２×１０５細胞を３０ｍｍペトリディッシュ中で播種した（５ｍｌ培地／ディッシュ）。培地の交換なしで、全体で４日間、細胞濃度を毎日測定した。ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体は、０．６ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で、またはＧ４１８が３週間の間除去された後で、透析ＦＢＳ、１または２ｎＭロイコボリン（ＬＣＶ）を含む選択培地中で増殖させた。選択培地中では増殖することができなかった、親のＲＦＣ−ＡＡ８細胞およびＣ５細胞は、２．３μＭ葉酸を含み、かつ１０％  ＦＢＳを補充した非選択培地（ＲＰＭＩ）中で増殖させた。ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体の倍加時間は〜２８時間であった。
【図１８】ＲＦＣを用いる永続的選択条件下でのＥＧＦＰ発現の安定性を示すＦＡＣＳ分析である。ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクトＣ５細胞における増強したグリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のフローサイトメトリー分析を示す。ｈＲＦＣ−ＨＡトランスフェクト体は、６００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で、またはＧ４１８の除去後に、透析ＦＢＳ、１または２ｎＭロイコボリン（ＬＣＶ）を含む選択培地中で増殖させた。選択培地中では増殖することができなかった、親のＲＦＣ−Ｃ５細胞（ネガティブコントロール）は、２．３μＭ葉酸を含み、かつ１０％  ＦＢＳを補充した非選択培地中で増殖させた。
【図１９】Ｇａｌｋ１を用いる永続的な選択条件下でのＥＧＦＰ発現の安定性を示すＦＡＣＳ分析である。ｈＧａｌ−Ｋ１−ＥＧＦＰバイ−シストロン性ベクターでトランスフェクトし、Ｇ−４１８の非存在下または存在下、ミリモル濃度以下のガラクトース濃度での選択下で、３週間（ａ）または２ヶ月間（ｂ）増殖させた、ガラクトキナーゼ欠損チャイニーズハムスター細胞におけるＥＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析を示す。ガラクトキナーゼ欠損細胞は、非選択培地中で増殖させた。
【図２０】選択増殖条件下でＧａｌＫ１トランスフェクト細胞の増殖を示すグラフである。２×１０5細胞を３０ｍｍペトリディッシュ中で播種した（５ｍｌ培地／ディッシュ）。培地の交換なしで、全体で４日間、細胞濃度を毎日測定した。ＧａｌＫ１トランスフェクト体は、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８の存在下で、またはＧ４１８が３週間の間除去された後で、選択培地（１０％透析ＦＢＳ、０．２５〜０．５ｍＭ  Ｄ−ガラクトースで補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で増殖させた。親のガラクトキナーゼ欠損チャイニーズハムスター細胞は、非選択培地（５ｍＭ  Ｄ−グルコースを含み、かつ１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０）中で増殖させた。選択培地中でのＧａｌＫ１トランスフェクト体の倍加時間は〜２８時間であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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