(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペクチンとドキソルビシンとを結合させて調製される受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグであって、Ｍｗが５０００から４５０００の小型分子ペクチンをドキソルビシンと反応させてＭｗが１０００００から１００００００のペクチン−ドキソルビシン複合体を取得し、該複合体を懸濁して懸濁液を準備し、該懸濁液を超高圧ナノホモジナイザーで処理し、粒径が１００ｎｍから２００ｎｍで、融点が２２０℃から２４５℃の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを取得して調製されるものであり、
前記ペクチンと前記ドキソルビシンはアミド結合により結合しており、前記ペクチンはペクチン分子のカルボキシル基とヒドロキシル基を縮合することで形成されるエステル結合によって結合されていることを特徴とする受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ。
【請求項２】
前記受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの粒径は１３０ｎｍから１８０ｎｍである、請求項１記載の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ。
【請求項３】
前記受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの水溶度は４２ｍｇ／Ｌである、請求項１又は２記載の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ。
【請求項４】
前記ペクチン-ドキソルビシン複合体は、ｐＨ５からｐＨ７、４０℃から６０℃で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ・ＨＣｌ）の存在下で前記小型分子ペクチンをドキソルビシンと反応させることで取得される、請求項１記載の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ。
【請求項５】
前記小型分子ペクチンのＭｗは１００００から３００００である、請求項４記載の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ。
【請求項６】
前記ペクチン−ドキソルビシン複合体は水中に投入され、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びグリセロールが加えられ、均質に混合されて懸濁液が作製され、前記懸濁液は超高圧ナノホモジナイザーで処理されて取得される、請求項１から５のいずれかに記載の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ。
【請求項７】
請求項６記載の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを調製する方法であって、
前記懸濁液を超高圧ナノホモジナイザーにて、まず１２０ｍｐａで処理し、続いて１８０ｍｐａで処理し、さらに１９０ｍｐａで処理する３回の処理を特徴とする方法。
【請求項８】
前記ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の量は前記ペクチン−ドキソルビシン複合体の１倍から６倍であり、前記グリセロールの量は前記ペクチン−ドキソルビシン複合体の０．１％から０．８％である、請求項７記載の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを調製する方法。
【請求項９】
受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを調製する方法であって、
（ａ）Ｍｗが５０００から４５０００の小型分子ペクチンを水中に溶解させ、塩酸ドキソルビシンを加え、均質に混合した後に１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ・ＨＣｌ）と３時間から８時間反応させ、透析して乾燥させ、Ｍｗが１０００００から１００００００のペクチン−ドキソルビシン複合体を取得するステップと、
（ｂ）前記ペクチン−ドキソルビシン複合体を水中に投入し、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）及びグリセロールを加え、均質に混合して懸濁液を作製し、前記懸濁液を超高圧ナノホモジナイザーで処理し、粒径が１００ｎｍから２００ｎｍである受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを取得するステップと、
を含んでいることを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記小型分子ペクチンは、ペクチンを水中に溶解させ、前記ペクチンをｐＨ１３のＮａＯＨ溶液と反応させ、濃塩酸でそのｐＨを中和させ、分子量をカットオフすることで取得される、請求項９記載の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ及びその調製方法に関しており、抗癌剤の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の解説
正常組織の微小血管内皮は極小ギャップ及び無欠構造を有しているため、大型分子及び脂質粒子が血管壁を通過することは困難である。正常組織の毛管に比して固形腫瘍は、脈管が多い組織、不規則な形状及び構造、毛管の拡張及び微小血管壁の欠損、内皮細胞の無規律配列、劣った構造一体性、内皮細胞間の広くなったジャンクションギャップ並びにリンパ回復不調を特徴とし、大型分子物質及び脂質粒子に選択的に増強された透過性及び保持性を持たせる。この現象は固形腫瘍の増強された透過性及び保持性と称される（以降“ＥＰＲ効果”）。走査電子顕微鏡は、人間の結腸腺癌における微小血管内皮細胞のジャンクションギャップは４００ｎｍまで至るが、正常組織の微小血管内皮細胞のジャンクションギャップは１００ｎｍ未満であることを示す。固形腫瘍組織の病理学的構造の特徴は、大型分子抗癌剤を受動的に標的化するか固形腫瘍を選択させ、全身的投薬後に腫瘍組織に対して集中的に分布させる。この現象は受動型固形腫瘍標的特性としても知られている。しかし、小型分子抗癌薬は正常組織及び腫瘍組織の血管壁を自由に通過でき、正常組織及び腫瘍組織内の両方に一定割合で薬物を分布する。このことは抗癌効果の選択性の欠乏並びに強毒性及び副作用の重要な理由の１つである。従って、小型分子の抗癌薬には受動的な標的効果はない。グレイシュＫ他は、相対分子量が４００００以上の大型分子物質は腎臓濾過並びに腎クリアランスを克服し、通常よりも長い血漿半減期を有しており、大型分子物質の全身循環時間の延長はＥＰＲ効果の実現に有効に作用し、投薬頻度も減少させることを報告している。
【０００３】
ペクチンは一般的に天然の大型分子多糖重合体であり、植物細胞壁内に広く分布しており、α-（１→４）-Ｄ-ピラニルガラクツロンユニットで成る酸性大型分子多糖体である（ヒュンジョ・キム他「International Journal of Pharmaceutics」１９９８年１６１：１４９−１５９）。ペクチンは単核食細胞系を増殖し、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞及び補体系を活性化し、サイトカイン分泌を促進し、赤血球等の免疫力を増強することで宿主の免疫機能を改善し、固形癌細胞膜の成長特性を変化させ、固形癌細胞内の信号伝達経路及び抗遊離基効果に影響を及ぼし、分化作用及びアポトーシスを誘起し、固形癌細胞の核酸及びタンパク質の合成を抑え、固形癌細胞の超微細構造に影響を及ぼし、癌遺伝子及び抗突然変異に影響を及ぼし、固形癌の血管形成を阻止することで直接的な抗癌効果を発揮することができる（「Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine」１９９９年、５：６４）。本発明者は２００５年以来、キャリアとしてのペクチンを使用した大型分子抗癌プロドラッグの研究に携わっており、３件の中国特許願（出願番号２００６１００２０５９６．７、２００７１０２０１７２４．２及び２００８１０３０６４６３．５）を出願した。この小型分子ペクチンを利用した抗癌薬は正常組織及び腫瘍組織の血管壁を自由に通過し、容易に排出される。しかしながらこの抗癌薬は正常組織及び腫瘍組織内に満遍なく薬剤を分布させ、抗癌効果選択性に劣っており、人体内には短時間しか滞在せず、よって必要な投薬頻度は高くなる。キャリアとして大型分子ペクチンを使用して調製された抗癌プロドラッグはＥＰＲに基づく受動型腫瘍標的特性を発揮し、優れた腫瘍組織内薬剤蓄積効果を有しており、その薬剤分布状態は複数回の投薬により影響を受けない。ペクチンは体内で容易には劣化せず、腎臓を通じてのみ排出されるため、体内に蓄積される過剰な大型分子ペクチンは肺、腎臓及び他の組織並びに器官において堆積される傾向が高く、それらの機能に影響を及ぼすものであり、特定の結果は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】中国特許願  出願番号２００６１００２０５９６．７
【特許文献２】中国特許願  出願番号２００７１０２０１７２４．２
【特許文献３】中国特許願  出願番号２００８１０３０６４６３．５
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】ヒュンジョ・キム他「International Journal of Pharmaceutics」１９９８年１６１：１４９−１５９
【非特許文献２】「Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine」１９９９年、５：６４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の概要
本発明により解決されるべき技術的課題は、ペクチン抗癌プロドラッグのＥＰＲ効果に基づく受動型腫瘍標的特性の提供、並びに固形腫瘍組織内進入後に薬剤を放出し、キャリアを小型分子に分解し、排出を助けることである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の本発明の目的を達成するため、本発明の方法は、大型分子ペクチンを分子量（Ｍｗ）５０００から４５０００（好適には１００００から３００００）の小型分子ペクチンに切断（カット）し、Ｍｗ５０００から４５０００の小型分子ペクチンをドキソルビシンと反応させてＭｗ１０００００から１００００００（好適には２０００００から８０００００、さらに好適には４０００００から６０００００）のペクチン-ドキソルビシン複合体を調製し、そのペクチン-ドキソルビシン複合体を懸濁液とし（ペクチン-ドキソルビシン複合体を水に入れ、ＰＶＤ及びグリセロールを加え、均質に混合することで調製）、その懸濁液を超高圧ナノホモジナイザーで処理し、粒径１００ｎｍから２００ｎｍ（好適には１３０ｎｍから１８０ｎｍ）で溶融温度２２０℃から２４５℃の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを調製するものである。このペクチン-ドキソルビシン複合体において、ペクチンとドキソルビシンはアミド結合しており、ペクチンはペクチン分子のカルボキシル基及びヒドロキシル基を縮合することで形成されるエステル結合によって結合されている。固形腫瘍組織内に進入後、抗癌プロドラッグはＥＰＲに基づく受動型標的特性を発揮し、腫瘍組織内での顕著な蓄積性能を有し、長い血漿半減期を備え、長い全身循環時間を有し、小型分子内に薬剤を放出してキャリアを分解し、排出を促す。本発明の分子量とは重量平均分子量（Ｍｗ）のことである。
【０００８】
この受動型固形標的抗癌プロドラッグの水溶度は４２ｍｇ／Ｌである。
【０００９】
受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを調製する方法は、
ａ）Ｍｗ５０００から４５０００（好適には１００００から３００００）の小型分子ペクチンを水中に溶解させ、塩酸ドキソルビシンを添加し、均質に混合した後にＥＤＣ・ＨＣｌと反応させ、透析し、乾燥させてＭｗ１０００００から１００００００のペクチン-ドキソルビシン複合体を得る工程と、
ｂ）そのペクチン-ドキソルビシン複合体を水に投入し、ＰＶＰ及びグリセロールを添加し（あるいは一定量のレシチンまたはＤＭＳＯを添加し（添加量：ペクチン-ドキソルビシン複合体の２％未満））、均質に混合して懸濁液を調製し、その懸濁液を超高圧ナノホモジナイザーで処理し、粒径１００ｎｍから２００ｎｍの受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを得る工程と、
を含んでいる。
【００１０】
ペクチン-ドキソルビシン複合体は４０℃から６０℃、ｐＨ５から７のＥＤＣ・ＨＣｌの存在下で小型分子ペクチンをドキソルビシンと反応させることで得られる。
【００１１】
さらに、工程（ｂ）で、ＰＶＰ量はペクチン-ドキソルビシン複合体量の１倍から６倍であり、グリセロール量はペクチン-ドキソルビシン複合体量の０．１％から０．８％である。
【００１２】
好適には、超高圧ナノホモジナイザー内で懸濁液を、まず１２０ｍｐａで処理し、続いて１８０ｍｐａで処理し、最後に１９０ｍｐａで処理する計３回の処理が行われる。
【００１３】
小型分子ペクチンはペクチンを水中で溶解させ、ペクチンをｐＨ１３のＮａＯＨ溶液と反応させ、濃塩酸でｐＨを中性に調整し、分子量をカットオフ（減少）させることで得られる。
【００１４】
本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグをリアーゼ内で加水分解し、アミド結合を破壊し、ドキソルビシンを放出させる。加水分解及び限外濾過後にカットオフされたフィルターケーキを残留ドキソルビシンが除去されて液体の赤味が消えるまで９５％エタノールにより反復的に洗浄し、溶媒を蒸発させて乾燥状態とし、蒸留水を加えて沈殿物を溶解させ、ゲル透過クロマトグラフィによって決定される分子量を１００００から３００００とする。
【００１５】
ヒト化された肺癌細胞ＮＣｌ-Ｈ４４６及びＡ５４９を使用した本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ（ペクチン-ドキソルビシン複合体）注射による細胞阻害率はそれぞれ６５．２３％と６８．５２％であり、同一ドキソルビシン濃度（２ｍｇ／ｍｌ）の塩化ドキソルビシンのもの（６３．３３％と６７．６２％）と同じである。黒色腫Ｂ１６肺転移モデルマウスの効能研究では、ペクチン-ドキソルビシン複合体群の腫瘍を持つマウスの寿命は４２．３±１２．４日であり、塩化ドキソルビシン群のもの（２３．１±１０．２日）よりも著しく長くなっている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は紫外線スペクトル図である。
【図２】図２は赤外線スペクトル図であり、（ａ）はドキソルビシンであり、（ｂ）はペクチン-ドキソルビシン複合体であり、（ｃ）はペクチンであり、（ｄ）はペクチンとドキソルビシンの物理的混合物である。
【図３】図３は本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの粒径分布図である。
【図４】図４は本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグのリソソーム加水分解試験結果であり、グラフ線１は実験群、グラフ線２は盲験群、水平座標軸は時間（ｈ）及び垂直座標軸は薬剤放出率（％）を表す。
【図５】図５は肺癌を患うマウスの寿命に対する本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの薬効を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
好適実施例の詳細な説明
受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの調製方法は、大型分子ペクチンをＭｗ５０００から４５０００（好適には１００００から３００００）の小型分子ペクチンにカットオフし、続いて小型分子ペクチン-ドキソルビシンを（アミド結合により）合成し、ペクチン分子のカルボキシル基及びヒドロキシル基を縮合して大型分子を形成し、大型分子を超高圧ナノホモジナイザーで処理し、粒径１００ｎｍから２００ｎｍ、分子量１０００００から１００００００の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグを得る工程を含んでいる。
【００１８】
特定調製法：
１．小型分子ペクチンの調製：ペクチンを蒸留水中に溶解させ、ペクチンをＮａＯＨと反応させ、ｐＨを濃塩酸で中和し、カットオフによってＭｗ５０００から４５０００（好適には１００００から３００００）の小型分子ペクチンを得る。
【００１９】
１例：１３．３ｇのペクチンを計量し、１Ｌの蒸留水を加え、混合して溶解させ、５ＭのＮａＯＨでｐＨ１３に調整し、６５℃にて１０時間反応させ、反応を停止させ、その反応溶液を塩酸で中和し、カットオフ分子量３００００のミリポアにより濾過し、濾過物をカットオフ分子量１００００のミリポアで濾過し、カットオフ分子量１００００の不透過性固形物を回収し、圧力を下げ、乾燥状態にまで濃縮し、真空下で乾燥させて分子量１００００から３００００の小型分子ペクチンを得る。
【化１】
0005536210.tif 000002
【００２０】
２．ドキソルビシンの配合及び小型分子ペクチンの架橋
２．１．反応式
【化２】
0005536210.tif 000003
ここで、
【化３】
0005536210.tif 000004
【００２１】
２．２．実験手法
実験手法は次の通りである。まず分子量１００００から３００００の小型分子ペクチンを溶解させ、１-エチル-３-（３-ジメチルアミノプロピル）塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ・ＨＣｌ）の存在下で塩酸ドキソルビシン溶液とｐＨ５から７にて４０℃から６０℃で反応させ、透析して乾燥させ、４２ｍｇ／Ｌの溶解性で融点２２０℃から２４５℃である赤茶色の水不溶性の固体（ペクチン-ドキソルビシン複合体）を得る。
【００２２】
測定された薬剤含有率は１５％から３５％であり、分子量（Ｍｗ）は１０００００から１００００００、好適には２０００００から８０００００、さらに好適には４０００００から６０００００であった。
【００２３】
紫外線可視スペクトル図の逆解析（逆分析）により、ペクチンは吸光されず、ドキソルビシンは４７９．５ｎｍで最大吸光ピークを有し、ペクチンとドキソルビシンの混合は４８８．５ｎｍで最大吸光ピークを有し、ペクチン-ドキソルビシン複合体Ｐ（Ａ）ｎは４９８ｎｍで最大吸光ピークを有し、吸光赤方偏移が発生し、ドキソルビシンとペクチンとの間では化学結合が存在することが示された。
【００２４】
赤外線スペクトルでの走査により、ペクチンと較べてＰ（Ａ）ｎは１６２０／ｃｍにてアミドバンドＩとアミドバンドＩＩのハイブリッド吸光ピークを有し、エステル結合ピーク１７５０／ｃｍと較べてピーク面積比は著しく増加し、ペクチンがエステル結合によって架橋したことを示し、１１００／ｃｍと１０１７／ｃｍでドキソルビシンの顕著なアントラサイクリンの特徴的吸光ピークが現れ、第一アミドの吸光ピークは１４１１．２３で現れ、ペクチンとドキソルビシンがアミド結合していることが示された。
【００２５】
赤茶色の固形物は粉砕処理され、一定量のＰＶＰが加えられ、超高圧ナノホモジナイザー（河北廊坊通用机器制造有限公司製造Ｔ−２００Ｄ型）で処理され、分子量１０００００から１００００００で粒径１００ｎｍから２００ｎｍの受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグが得られた。
【００２６】
３．不溶性の大型分子ペクチン-ドキソルビシン複合体は粉砕処理され、一定量のＰＶＰが加えられ、超高圧ナノホモジナイザーで処理され、分子量１０００００から１００００００で粒径１００ｎｍから２００ｎｍの受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグが得られた。
【実施例】
【００２７】
以下の実施例は本発明のさらなる説明のためであり、本発明の限定は意図されていない。
【００２８】
［実施例１］
実施例１：本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌薬Ｐ（Ａ）ｎの調製
１．小型分子ペクチンの調製
この調製は、１３．３ｇのペクチンを計量し、１Ｌの蒸留水を加え、混合して溶解させ、ｐＨを５ＭのＮａＯＨで１３に調整し、６５℃で１０時間反応させ、反応を停止させ、さらに、反応溶液を濃塩酸で中和し、カットオフ分子量３００００のミリポアで濾過し、濾過物をカットオフ分子量１００００のミリポアで濾過し、カットオフ分子量１００００の不透過性固形物を回収し、減圧濃縮して乾燥状態とし、真空下で乾燥させて分子量１００００から３００００の小型分子を得るものである。
【００２９】
２．ドキソルビシンの配合及び小型分子ペクチンの架橋
配合及び架橋の工程は、分子量１００００から３００００の小型分子ペクチン-ドキソルビシンを計量して反応フラスコに投入し、１００ｍｌの水を加え、混合して溶解させ、０．５ｇの塩酸ドキソルビシンを計量し、超音波溶解のために５０ｍｌの蒸留水を加え、その塩酸ドキソルビシン溶液を反応フラスコに投入し、さらに５０ｍｌの蒸留水で反応フラスコに付着したドキソルビシンを洗浄し、続けて１ｇのＥＤＣ・ＨＣｌを計量して反応フラスコに加え、５０℃に温度を上昇させて６．５時間反応させ、反応後にカットオフ分子量（Ｍｗ）３５００の透析バッグを投入して１日透析し、蒸留水を３時間毎に交換し、続いて溶媒を蒸発させて乾燥状態とし、真空下で１２時間乾燥させて赤茶色の固形物、すなわち４２ｍｇ／Ｌの溶解性と、融点２２０℃から２４５℃である１．１ｇの水不溶性大型分子ペクチン-ドキソルビシン複合体を得るものである。
【００３０】
吸光分光機による薬剤含有率の確認
標準曲線の設定：標準塩酸ドキソルビシン溶液を１０．００、２０．００、３０．００、４０．００及び５０．００μｇ／ｍＬの濃度で正確に調製し、４７９．５ｎｍ（紫外線可視吸光分光機を使用したスペクトル走査により決定）での吸光を確認。
【００３１】
サンプルの薬剤含有率の確認：一定量のＰ（Ａ）ｎを正確に計量し、そのＰ（Ａ）ｎを二次水に溶解させて測定対象の溶液を調製し、吸光を確認し、薬剤含有率が２１．４％であることを確認。
【００３２】
構造的特徴化
エステル結合及びアミド結合に対するＰ（Ａ）ｎ内のカルボン酸塩の影響を回避させるべく、Ｐ（Ａ）ｎはプロドラッグサンプルを調製するために脱塩処理された。ドキソルビシン、ペクチン、本発明サンプル及びドキソルビシンとペクチンの混合物は二次水に溶解された。紫外線スペクトル及び赤外線スペクトルは図１と図２でそれぞれ示すように現れた。
【００３３】
図１では、ドキソルビシンは４７９．５ｎｍで最大吸光ピークを有し、ペクチンとドキソルビシンの混合物は４８８．５ｎｍで最大吸光ピークを有し、Ｐ（Ａ）ｎは４９８ｎｍで最大吸光ピークを有し、ペクチンは吸光されないことが示されている。吸光赤方偏移はＰ（Ａ）ｎに４９８ｎｍにて生じた。これはドキソルビシンとペクチンとの間の化学結合が存在することを示す。
【００３４】
図２では、ペクチンと較べてペクチン-ドキソルビシンは１６２０／ｃｍにてアミドバンドＩとアミドバンドＩＩのハイブリッド吸光ピークを有しており、１７５０／ｃｍのエステル結合ピークと較べてピーク面積比は著しく増加し、ペクチンがエステル結合によって架橋されていることが示され、１１００／ｃｍ及び１０１７／ｃｍにてドキソルビシンの顕著なアントラサイクリンの特徴的な吸光ピークが現れ、第一アミドの吸光ピークは１４１１．２３で現れ、ペクチンとドキソルビシンがアミド結合により結合していることが示されている。
【００３５】
３．受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの調製
０．４６８ｇの大型分子不溶性ペクチン-ドキソルビシン複合体（薬剤含有率２１．４％）に１ｇのＰＶＰ、３ｍｌのグリセロール及び５０ｍｌの水が加えられ、粉砕処理され、懸濁液が調製され、超高圧ナノホモジナイザー（河北廊坊通用机器制造有限公司製造Ｔ−２００Ｄ型）で処理された。懸濁液はまず１２０ｍｐａにて処理され、２回目は１８０ｍｐａで処理され、３回目は１９０ｍｐａで処理され、計３回の超高圧ナノホモジナイザー処理された。超高圧ナノホモジナイザーで処理後の粒径分布は図３に示されている。
【００３６】
懸濁液は超高圧ナノホモジナイザーで処理され、分子量１０００００から１００００００で、粒径１００ｎｍから２００ｎｍの受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグが得られた。
【００３７】
［実施例２］
実施例２：本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌薬Ｐ（Ａ）ｎの調製
１．小型分子ペクチンの調製
この調製は、次のステップを含む。１３．３ｇのペクチンを計量し、１Ｌの蒸留水を加え、混合して溶解させ、ｐＨを５ＭのＮａＯＨで１３に調整し、６５℃で１０時間反応させ、反応を停止し、反応溶液を濃塩酸で中和し、１００００のカットオフ分子量のミリポアで濾過し、濾過物をカットオフ分子量７０００の透析バッグで透析し、透析物を回収し、減圧し、濃縮して乾燥状態とし、真空下で乾燥させて、７０００から１００００の分子量の小型分子ペクチンが得られる。
【００３８】
２．ドキソルビシンの配合及び小型分子ペクチンの架橋
配合及び架橋は、次のステップを含む。１ｇの分子量７０００から１００００の小型分子ペクチン−ドキソルビシンを計量して反応フラスコに投入し、１００ｍｌの水を加え、混合して溶解させ、０．５ｇの塩酸ドキソルビシンを計量し、５０ｍｌの蒸留水を加えて超音波溶解させ、その塩酸ドキソルビシン溶液を反応フラスコに投入し、さらに５０ｍｌの蒸留水で反応フラスコに付着したドキソルビシンを洗浄し、１ｇのＥＤＣ・ＨＣｌを計量して反応フラスコに投入し、５０℃に温度を上昇させ、６．５時間反応させ、反応後に透析のために１日、カットオフ分子量（Ｍｗ）３５００の透析バッグを配合し、３時間毎に蒸留水を交換し、続いて溶媒を蒸発させて乾燥状態とし、１２時間真空下で乾燥させて赤茶色の固形を得るものである。すなわち、２４．２％の薬剤含有率である１．２ｇの大型分子不溶性ペクチン-ドキソルビシン複合体が得られる。
【００３９】
０．４６８ｇの大型分子不溶性ペクチン-ドキソルビシン複合体に、溶媒として、１ｇのＰＶＰ、３ｍｌのグリセロール、及び５０ｍｌの２％レシチン溶液が加えられて、砕かれて懸濁液が調製され、超高圧ナノホモジナイザー（河北廊坊通用机器制造有限公司製造Ｔ−２００Ｄ型）により処理された。その懸濁液は、超高圧ナノホモジナイザーで、３回処理され、１回目は１２０ｍｐａであり、２回目は１８０ｍｐａであり、３回目は１９０ｍｐａであった。
【００４０】
分子量１０００００から１００００００で粒径１００ｎｍから２００ｎｍの受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグが得られた。
【００４１】
［実施例３］
実施例３：本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌薬Ｐ（Ａ）ｎの調製
１．小型分子ペクチンの調製
この調製は、次のステップを含む。１３．３ｇのペクチンを計量し、１Ｌの蒸留水を加え、混合して溶解させ、ｐＨを５ＭのＮａＯＨで１３に調整し、６５℃で１０時間反応させ、反応を停止し、反応溶液を濃塩酸で中和し、５００００のカットオフ分子量のミリポアで濾過し、濾過物をカットオフ分子量２００００の透析バッグで４８時間透析し、３時間毎に蒸留水を交換し、減圧し、濃縮して乾燥状態とし、真空下で乾燥され、２００００から５００００の分子量の小型分子ペクチンが得られる。
【００４２】
２．ドキソルビシンの配合及び小型分子ペクチンの架橋
配合及び架橋は、次のステップを含む。１ｇの分子量２００００から５００００の小型分子ペクチンを計量して反応フラスコに投入し、１００ｍｌの水を加え、混合して溶解させ、０．５ｇの塩酸ドキソルビシンを計量し、５０ｍｌの蒸留水を加えて超音波溶解させ、その塩酸ドキソルビシン溶液を反応フラスコに投入し、さらに５０ｍｌの蒸留水で反応フラスコに付着したドキソルビシンを洗浄し、１ｇのＥＤＣ・ＨＣｌを計量して反応フラスコに投入し、５０℃に温度を上昇させ、６．５時間反応させ、反応後に透析のために１日、カットオフ分子量（Ｍｗ）３５００の透析バッグを配合し、３時間毎に蒸留水を交換し、続いて溶媒を蒸発させて乾燥状態とし、１２時間真空下で乾燥させて赤茶色の固形を得るものである。すなわち、２５．２％の薬剤含有率である１．２ｇの大型分子不溶性ペクチン-ドキソルビシン抱合体が得られる。
【００４３】
０．４６８ｇの大型分子不溶性ペクチン-ドキソルビシン抱合体に１ｇのＰＶＰ及び５０ｍｌの水とＤＭＳＯの混合物（水：ＤＳＭＯ＝０．７５：０．２５）が加えられて懸濁液が調製され、その懸濁液は超高圧ナノホモジナイザー（河北廊坊通用机器制造有限公司製造Ｔ−２００Ｄ型）により処理された。その懸濁液は、超高圧ナノホモジナイザーで３回処理され、１回目は１２０ｍｐａであり、２回目は１８０ｍｐａであり、３回目は１９０ｍｐａであった。
【００４４】
分子量１０００００から１００００００で粒径１００ｎｍから２００ｎｍの受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグが得られた。
【００４５】
［試験例１］
試験例１：本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグのリソソーム加水分解試験
リソソーム源：文献「細胞生物学の実験方法及び技術」に従って純化リソソームが抽出された。
【００４６】
実験群：２５ｍＬの円錐形フラスコに１０ｍＬのリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）（ｐＨ＝５）、１０ｍｇの実施例２に従って調製された１ｍｇ／ｍＬ受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ及び０．４ｍＬのリソソームのスクロース（０．２５モル／Ｌ）懸濁液が加えられ、振動機の暗所内で培養のために３７℃のサーモスタットに入れられた。
【００４７】
リソソームは対照群には加えられなかったが、他の条件は同じであった。
【００４８】
０．５ｍＬのサンプルが断熱状態で０．２５時間、０．５時間、１時間、２．５時間、及び１８時間後にそれぞれ採取され、続いて０．５ｍＬの超純水、０．２ｍＬの１モル／ＬであるＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．８）バッファー溶液及び２．５ｍＬのＣＨＣｌ３-ＭｅＯＨ（３：１）がサンプル採取後に連続して加えられ、均質に混合され、３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離されてドキソルビシンが有機相で分布された。
【００４９】
ドキソルビシンの内容物は高性能液体クロマトグラフィにより決定された。クロマトグラフカラム：フェノメネックス・ルナＣ１８（２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）
移動相：メタノール：アセトニトリル：リン酸バッファー塩＝７：４：６
検出波長：４８０ｎｍ
流量０．８ｍＬ／分
【００５０】
実験結果は図４で示す。実験群の最大放出量は３５％であり、６時間後の放出量は３０％であり、６時間から３０時間内に３０％で基本的に安定し、対照群の最大放出量は７％であり、放出プロセス全体の当初放出量及び最終放出量は少なく、本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグがリアーゼに加水分解し、アミド結合が崩壊してドキソルビシンが放出されたことを示す。
【００５１】
アルカリ法及び超濾過法による脂質還元後の小型分子ペクチンの分子量確認
超濾過後に残るフィルターケーキが回収され、９５％エタノールにより液体の赤色が消えるまで繰り返し洗浄され、溶媒は蒸発されて乾燥状態にされ、蒸留水が加えられて沈殿物が溶解され、分子量がゲル透過クロマトグラフィにより確認された。
【００５２】
クロマトグラフ条件：アグリエント１１００シリーズのＨＰＬＣ、１３６２Ａ視差検出器及びＧ１３１０Ａ装置ポンプ
クロマトグラフカラム：ウルトラヒドロゲル（登録商標）リニアカラム（７．８ｘ３００ｍｍ、水）
カラム温度：４０℃
フローセル温度：３５℃
移動相：０．００５ＭのＫＮＯ３
流量：０．５ｍＬ／分
サンプル濃度：５ｍｇ／ｍＬ（０．０５％のアジ化ナトリウムを溶解に使用）
サンプルサイズ：２０μＬ
【００５３】
標準曲線の調製：標準物質デキストラン（Ｍｗ＝５０００、２５０００、５００００、８００００、２７００００）に作用させるためにグルカンが使用された。
【００５４】
測定された分子量は１００００から３００００であった。
【００５５】
同一条件下にて商業的に入手できるオレンジの高エステルペクチン分子量の確認：計測された絶対分子量は３００００から６０００００であった。
【００５６】
［試験例２］
試験例２：ＭＴＴ法による腫瘍細胞ラインの成長活性に対する受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの阻害活性の観察
【００５７】
１．試験薬
塩酸ドキソルビシンは浙江海正薬業股▲分▼有限公司から購入され、生理塩水内に溶解させることで２ｍｇ／ｍｌのドキソルビシンを含むように調製された。
【００５８】
試験で使用された受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグは試験例１（２ｍｇ／ｍｌドキソルビシンと等量）で調製された。
【００５９】
２．方法：ＲＰＭＩの１６４０培養液で培養された対数増殖相で成長する細胞溶液（濃度５００００細胞／ｍｌ）が９６ウェルプレートに注入され、注入後に２４時間、対応する薬剤処置が行われた。２４時間の薬剤処置後に、０．０２ｍｌで５ｍｇ／ｍｌの３-（４，５-ジメチルチアゾリル-２）-２，５-臭化ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）が４時間、処置のために加えられ、続いて培養液が取り除かれ、０．１５ｍｌのジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）が加えられ、吸光値がマイクロプレートリーダにより５７０ｎｍであると確認された。
【００６０】
阻害率（％）＝（１−吸光値／ブランク対照群の吸光値）ｘ１００％、並びに各群の異なる薬剤の細胞阻害率は表１で示されている。
【表１】
0005536210.tif 000005
【００６１】
［試験例３］
試験例３：肺転移腫瘍に対する受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの実験研究
【００６２】
１．主要材料
塩酸ドキソルビシンは浙江海正薬業股▲分▼有限公司から購入された。
【００６３】
ペクチン-ドキソルビシン複合体は本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグ及び試験例２のサンプル（２ｍｇ／ｍｌのドキソルビシンと等量）であった。
【００６４】
細胞及び動物：生後６週間から７週間で体重２０±３ｇの精選された雌の近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスが四川大学華西医学実験室動物中心から購入され、実験中は飲食自由にされ、毎日１２時間照明が当てられ、マウス檻（５匹づつ）は中央換気システムにより換気された。マウス黒腫細胞ラインＢ１６は上海細胞生物研究所から購入され、実験場で飼育された。
【００６５】
２．方法
細胞培養：細胞はＲＰＭＩの１６４０が１００ｍＬ／Ｌウシ胎児血清の培養液及びペニシリン-ストレプトマイシン溶液（１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン）内で日常的に培養され、培養のために３７℃の５０ｍＬ／ＬのＣＯ２培養器に入れられ、対数増殖相の細胞が３または４安定継代培養後に回収され、２．５ｇ／Ｌのトリプシンにより消化され、血清を含まない培養液の懸濁により回収され、細胞密度はその後の利用のために無血清１６４０媒液によって調整された。
【００６６】
マウス肺転移腫瘍モデルの確立：Ｃ５７ＢＬ／６マウスは無作為に複数群に振り分けられ、マウスの尻尾の皮膚が７５０ｍＬ／Ｌ（物質濃度）のエタノールで消毒され、Ｂ１６黒腫細胞溶液が０．１ｍＬの注入量でマウスに尻尾静脈注射された。
【００６７】
腫瘍細胞がマウスに接種された後に４日から５日薬剤が投与された。それぞれのマウスは毎週２回、１回当たり１匹４０から５０μｌの薬剤が投与された。腫瘍を有するマウスの生存日数が観察された。
【００６８】
肺癌を有するマウスの生存日数に対する本発明の受動型固形腫瘍標的抗癌プロドラッグの薬効は図５で示されている。図５から黒腫Ｂ１６肺転移モデルマウスの薬効の研究で、ペクチン-ドキソルビシン複合体群の腫瘍を有するマウスの生存日数は４２．３±１２．４日であり、これは塩酸ドキソルビシン群のマウスの生存日数（２３．１±１０．２日）よりも大幅に長い。
【図１】
0005536210.tif 000006
【図２】
0005536210.tif 000007
【図３】
0005536210.tif 000008
【図４】
0005536210.tif 000009
【図５】
0005536210.tif 000010