(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好中球または単球系列への分化決定に関与する転写因子（ＰＵ．１）の遺伝子発現の低下またはメタロチオネイン（ＭＴ）の遺伝子発現の上昇を検出するか、または前記ＰＵ．１の遺伝子発現の上昇または前記ＭＴの遺伝子発現の低下を検出することを特徴とするＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【請求項２】
ＰＵ．１の遺伝子発現の低下またはＭＴの遺伝子発現の上昇を、造血器腫瘍細胞のＭＴ遺伝子発現制御領域のＤＮＡのメチル化の解除に基づいて検出して、前記造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤耐性であることを検出する請求項１に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【請求項３】
ＰＵ．１の遺伝子発現の上昇またはＭＴの遺伝子発現の低下を、造血器腫瘍細胞のＭＴ遺伝子発現制御領域のＤＮＡのメチル化に基づいて検出して、前記造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤高感受性であることを検出する請求項１に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【請求項４】
ＤＮＡメチル化阻害剤として、５−アザシチジン及び／または５−アザ−２’−デオキシシチジンを用いる請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【請求項５】
ＤＮＡメチル化阻害剤として５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）を用い、PU.1/GAPDHが0.01未満またはMT-1A/GAPDHもしくはMT-1G/GAPDHが0.002より大きいことに基づいて造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤耐性であることを検出する請求項２に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【請求項６】
ＤＮＡメチル化阻害剤として５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）を用い、PU.1/GAPDHが0.1より大きいこと、またはMT-1A/GAPDHもしくはMT-1G/GAPDHが0.002未満であることに基づいて造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤高感受性であることを検出する請求項３に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【請求項７】
ＤＮＡメチル化阻害剤として５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）を用い、ＤＮＡのメチル化率が２０％未満であることに基づいて造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤耐性であることを検出する請求項２に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【請求項８】
ＤＮＡメチル化阻害剤として５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）を用い、ＤＮＡのメチル化率が５０％より大きいことに基づいて造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤高感受性であることを検出する請求項３に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血器腫瘍に対する分子標的薬剤であるＤＮＡメチル化阻害剤の薬剤効果検出方法に関する。さらに詳しく言えば、本発明は、好中球及び単球系列への分化決定に関与する転写因子（ＰＵ．１）もしくはその標的遺伝子であるメタロチオネイン（ＭＴ）の発現、またはＭＴ遺伝子発現制御領域のメチル化に基づいてＤＮＡメチル化阻害剤に対する薬剤感受性を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血器腫瘍は、通常の抗癌剤のみの治療では、その成績は頭打ちで、抗癌剤以外の腫瘍特異的な分子標的薬剤の開発が待たれている。造血器腫瘍は細胞内異常ＤＮＡメチル化などがその病態の一端を担うと考えられ、ＤＮＡメチル化阻害剤は、今後の幅広い応用が期待されている薬剤である。【０００３】
しかし、その効果は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）に対して単独で用いるのは不十分であった（特許文献１：特表2004-529104（米国特許第6,613,753号明細書）、特許文献２：特表2006-508119（欧州特許第1,575,582号明細書）参照）。そこで、このようなＤＮＡメチル化阻害剤の薬剤感受性予測マーカーの開発が待たれていた。【０００４】
好中球及び単球系列への分化決定に関与する転写因子（ＰＵ．１）発現の部分的な低下が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を引き起こす（非特許文献１：2004,Nat.Gen.p624-30）。本発明者は、ＡＭＬ発症機序の解明のため、ＰＵ．１をsiＲＮＡ（small interfering RNA）により発現低下させ、ＰＵ．１発現低下細胞（Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞）を用いて解析を行った。その結果、細胞増殖、薬剤耐性に関与しているメタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子の発現が上昇していることを見出し、ＡＭＬ４２症例において、ＰＵ．１とＭＴとの間に負の相関（Ｒ＝−０．４３，ｐ＝０．００５８）が認められることを報告している（２００６年第６８回日本血液学会（登録番号：ＰＳ−２−３０）において発表）。【０００５】
【特許文献１】特表2004-529104（米国特許第6,613,753号明細書）
【特許文献２】特表2006-508119（欧州特許第1,575,582号明細書）
【非特許文献１】2004,Nat.Gen.p624-30
【非特許文献２】２００６年第６８回日本血液学会（登録番号：ＰＳ-２-３０）講演予稿集（２００６年８月３０日発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＤＮＡメチル化阻害剤の薬剤感受性予測マーカーとなる新規で有用な薬剤効果検出方法の提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、今回、メタロチオネイン（ＭＴ）の遺伝子発現制御機構について解析した。最初に、好中球または単球系列への分化決定に関与する転写因子（ＰＵ．１）を恒常的に過剰発現した細胞株であるＫ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞株を樹立し解析を行った。その結果、ＭＴの発現が、ＰＵ．１の発現上昇に伴い逆に低下することが判明し、ＭＴ遺伝子がＰＵ．１の真の標的遺伝子であることが証明された。【０００８】
クロマチン免疫沈降法により、Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞では、ＭＴプロモーター領域のヒストンＨ３のアセチル化の亢進が明らかになった。同領域はＣｐＧ配列に富む構造を有していることから、転写開始点上流４２７ｂｐまでの領域のＣｐＧメチル化について、バイサルファイト（bisulfite）ＤＮＡシークエンス法により解析を行った。その結果、メチル化は、コントロール細胞株では約４０％程度であるのに対して、Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞では１２〜１６％程度まで減少し、それに反してＫ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞では約６０％程度まで上昇し、メチル化がその制御に重要であることが判明した。【０００９】
さらに、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｄｎｍｔ）の動員が阻害されていると考えられるＫ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞は、Ｄｎｍｔ阻害剤（ＤＮＡメチル化阻害剤）である５−アザシチジンや５−アザ−２’−デオキシシチジンに対して耐性であることが判明した。以上より、ＰＵ．１の発現低下がエピジェネティックな制御異常を引き起こしていることが明らかとなり、骨髄異形成症候群やＡＭＬ、それ以外の造血器疾患を含む造血器腫瘍細胞へのＤＮＡメチル化阻害剤の適応には、ＰＵ．１やＭＴ発現、及び同プロモーター領域メチル化率の検討が治療効果の予測、検出に有用であることが見出された。【００１０】
すなわち、本発明は、以下に示されるＤＮＡメチル化阻害剤の薬剤効果検出方法を提供するものである。
１．好中球または単球系列への分化決定に関与する転写因子（ＰＵ．１）の遺伝子発現の低下またはメタロチオネイン（ＭＴ）の遺伝子発現の上昇を検出するか、または前記ＰＵ．１の遺伝子発現の上昇または前記ＭＴの遺伝子発現の低下を検出することを特徴とするＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
２．ＰＵ．１の遺伝子発現の低下またはＭＴの遺伝子発現の上昇を、造血器腫瘍細胞のＭＴ遺伝子発現制御領域のＤＮＡのメチル化の解除に基づいて検出して、前記造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤耐性であることを検出する前項１に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
３．ＰＵ．１の遺伝子発現の上昇またはＭＴの遺伝子発現の低下を、造血器腫瘍細胞のＭＴ遺伝子発現制御領域のＤＮＡのメチル化に基づいて検出して、前記造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤高感受性であることを検出する前項１に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
４．ＤＮＡメチル化阻害剤として、５−アザシチジン及び／または５−アザ−２’−デオキシシチジンを用いる前項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
５．ＤＮＡメチル化阻害剤として５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）を用い、PU.1/GAPDHが0.01未満またはMT-1A/GAPDHもしくはMT-1G/GAPDHが0.002より大きいことに基づいて造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤耐性であることを検出する前項２に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法
６．ＤＮＡメチル化阻害剤として５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）を用い、PU.1/GAPDHが0.1より大きいこと、またはMT-1A/GAPDHもしくはMT-1G/GAPDHが0.002未満であることに基づいて造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤高感受性であることを検出する前項３に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
７．ＤＮＡメチル化阻害剤として５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）を用い、ＤＮＡのメチル化率が２０％未満であることに基づいて造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤耐性であることを検出する前項２に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
８．ＤＮＡメチル化阻害剤として５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）を用い、ＤＮＡのメチル化率が５０％より大きいことに基づいて造血器腫瘍細胞がＤＮＡメチル化阻害剤高感受性であることを検出する前項３に記載のＤＮＡメチル化阻害剤の造血器腫瘍細胞に対する効果検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、ＤＮＡメチル化阻害剤の薬剤効果予測マーカーとなる薬剤効果検出方法を提供したものである。
本発明によれば、好中球及び単球系列への分化決定に関与する転写因子（ＰＵ．１）の遺伝子発現、その標的遺伝子であるメタロチオネイン（ＭＴ）の遺伝子発現、及び／またはＭＴ遺伝子発現制御領域のメチル化率に基づいて、薬剤の感受性を検出した上で、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、その他の造血器疾患を含む造血器腫瘍細胞に対してＤＮＡメチル化阻害剤を適用できるため治療成績が向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＰＵ．１遺伝子発現低下細胞株（Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞）の樹立を示す。
【図２】Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞においてＭＴ−１ファミリーの遺伝子発現が上昇することを示す。
【図３】ＰＵ．１遺伝子過剰発現細胞株（Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞）の樹立を示す。
【図４】Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞におけるＭＴ−１ファミリーの遺伝子発現が低下することを示す。
【図５】ＭＴ−１Ｇに関する結果を示し、ＰＵ．１遺伝子発現低下細胞でＭＴ１遺伝子発現制御領域のメチル化が解除されることを示す。
【図６】ＭＴ−１Ｇに関する結果を示し、ＰＵ．１遺伝子過剰発現細胞でＭＴ１遺伝子発現制御領域がメチル化されることを示す。
【図７】ＰＵ．１遺伝子発現低下細胞（ＰＵ２−１０,ＰＵ３−１０）とコントロール細胞（ｖｅｃ５，ｖｅｃ６）の5-azadcに対する感受性（薬剤投与後の死細胞率）の比較を示す。
【図８】ＰＵ．１遺伝子過剰発現細胞（Ａ２,Ｈ８）とコントロール細胞（ｖｅｃ１，ｖｅｃ２）の5-azadcに対する感受性（薬剤投与後の死細胞率）の比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
血液細胞は幹細胞から発生する。幹細胞は様々な系列へと分化し、最終的に様々な形態、機能を持つ血液細胞が産生される。このような分化（枝分かれ）には、その分化系列を特異的に発現する遺伝子の発現を調節する転写因子と呼ばれる核内因子が重要な役割を果たしている。【００１４】
このような転写因子の中で、ＰＵ．１は好中球、単球系列への分化決定に重要な役割を果たす。すなわち、転写因子ＰＵ．１については、マウスを用いた解析から、その発現を低下させるのみで、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia;ＡＭＬ）を発症することが判明している。このように、成人において最も頻度の高いタイプの白血病であるＡＭＬの発症には、造血系転写因子ＰＵ．１の発現低下が中心的な役割を果たしている。【００１５】
ＡＭＬの発症原因及びメカニズムを明らかにするために、白血病細胞（Ｋ５６２細胞）でＰＵ．１の発現を抑制するsiＲＮＡ法を用いて人工的にＰＵ．１の発現のみを低下させた細胞株（Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞）を作成した。そして、コントロール細胞と比較して、網羅的に遺伝子発現を解析するマイクロアレイ法を用い、ＰＵ．１の発現低下に伴い発現が変動する遺伝子の同定を試みた。その結果、ＰＵ．１の発現低下に伴い、一群のメタロチオネイン（ＭＴ）遺伝子（ＭＴ−１Ａ、ＭＴ−１Ｇ等）の発現が増加することが判明した（図１、図２）。【００１６】
図１（ａ）及び（ｂ）は、ＰＵ．１発現低下株（Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞）の樹立実験の結果を示す。すなわち、ＰＵ．１siＲＮＡ発現ベクター（Takara, Ohtsu, Japan）とそのコントロールベクター(Takara)を白血病細胞株であるＫ５６２細胞に、文献記載の方法（Takahashi S et al., British Journal of Haematology, 2005(130), p428-436）に従って導入した。具体的には、この方法はエレクトロポレーションを用いて、前記発現ベクターとそのコントロールベクターを白血病細胞株（Ｋ５６２細胞）に導入した。導入された細胞を１μｇ／ｍＬのピューロマイシン存在下RPMI培地で培養することにより恒常的にＰＵ．１siＲＮＡを発現する細胞を選択し、限界希釈法により単離した。単離したコントロール細胞（Control Ｋ５６２）（Ｖ５，Ｖ６）と、ＰＵ．１発現低下細胞（２−１０，３−１０）（Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞）を用いて、常法に基づき調製した蛋白質をSDS-PAGEで電気泳動後、膜に転写し、ＰＵ．１抗体及び蛋白量の目安となるβ−アクチン（β-actin）にてブロットした（図１（ａ））。【００１７】
また、上記細胞から常法に基づき調製したＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成を行い、定量ＰＣＲ（条件：実施例参照）を行った。ＰＵ．１の発現量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase）の発現量で補正し、ＰＵ．１／ＧＡＰＤＨとして図１（ｂ）に示した。
ＰＵ．１の発現はコントロール株（Ｖ５，Ｖ６）と比較してＰＵ．１低下細胞（Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞）（２−１０，３−１０）で低下していることが明らかになった。【００１８】
図２は、人工的にＰＵ．１の発現のみを低下させた細胞株（Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞）においてＭＴ−１ファミリー遺伝子の発現が上昇することを示す。
Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞（ＰＵ２−１０，ＰＵ３−１０）及びそのコントロール細胞（Control Ｋ５６２）（Ｖ５，Ｖ６）より常法に基づき調製したＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成を行い、ＭＴ１Ａ，ＭＴ１Ｇの発現を検討するため後述の実施例に記載の条件で定量ＰＣＲを行った。その結果、ＭＴ１Ａ及びＭＴ１Ｇの発現量をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase）の発現量で補正し、ＭＴ１Ａ／ＧＡＰＤＨ，ＭＴ１Ｇ／ＧＡＰＤＨとして図２に示した。
Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞においてＭＴ１Ａ，ＭＴ１Ｇいずれの遺伝子発現量も増加していることが判明した。【００１９】
上記とは逆に、人工的にＰＵ．１を過剰に発現する細胞（Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞）を作製して、ＰＵ．１遺伝子の発現を検討したところ、ＭＴ遺伝子の発現が低下することが確認され、このような遺伝子が真の標的遺伝子であることが分かった（図３，図４）。【００２０】
図３（ａ）及び（ｂ）に、ＰＵ．１過剰発現細胞株（Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞）の樹立実験の結果を示す。すなわち、ＰＵ．１発現ベクターは文献記載のものを使用し（Inomata et al., Leukemia Research 30 (2006) p659-664）、これとそのコントロールベクター、ｐｃＤＮＡ３．１(Invitrogen，ＣＡ）を白血病細胞株であるＫ５６２細胞に、文献記載の方法に従って導入した（Takahashi S et al., British Journal of Haematology, 2005(130), p428-436）。導入された細胞を４００μｇ／ｍＬのネオマイシン存在下ＲＰＭＩ培地で培養し、恒常的にＰＵ．１を発現する細胞を選択し、限界希釈法により単離した。単離したコントロール細胞（Control Ｋ５６２）（Ｖ１，Ｖ２）と、ＰＵ．１過剰発現細胞（Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞）（Ａ２，Ｈ８）を用いて、常法に基づき調製した蛋白質をSDS-PAGEで電気泳動後、膜に転写し、ＰＵ．１抗体及び蛋白量の目安となるβ-actinにてブロットした（図３（ａ））。
また、上記細胞から常法に基づき調製したＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成を行い、後述の実施例に記載の条件で定量ＰＣＲ（条件：実施例参照）を行った。その結果を、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase）の発現量で補正し、ＰＵ．１／ＧＡＰＤＨとして図３（ｂ）に示した。
ＰＵ．１の発現はコントロール株（Control Ｋ５６２）（Ｖ１，Ｖ２）と比較してＰＵ．１過剰発現細胞（Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞）（Ａ２，Ｈ８）で上昇していることが明らかになった。【００２１】
図４は、ＰＵ．１を過剰に発現する細胞（Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞）においてＭＴ−１ファミリー遺伝子の発現が低下することを示す。
Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞（Ａ２，Ｈ８）及びそのコントロール細胞（Control Ｋ５６２）（Ｖ１，Ｖ２）より常法に基づき調製したＲＮＡを用いてｃＤＮＡ合成を行い、ＭＴ１Ａ，ＭＴ１Ｇの発現を検討するため後述の実施例に記載の条件で定量ＰＣＲを行った。その結果をハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase）の発現量で補正し、ＭＴ１Ａ／ＧＡＰＤＨ，ＭＴ１Ｇ／ＧＡＰＤＨとして図４に示した。
Ｋ５６２ＰＵ．１ＯＥ細胞においてＭＴ１Ａ，ＭＴ１Ｇいずれの遺伝子発現量も低下していることが判明した。【００２２】
ＤＮＡからｍＲＮＡが合成される転写では、ＤＮＡが核内蛋白質ヒストンに密に巻き付けられているか、緩やかに巻き付けられているかで転写量が全く異なることが分かっている。このような核内のＤＮＡと蛋白質の複合体であるクロマチン構造の変化が転写制御に重要であり、その中で着目すべきは、ＤＮＡメチル化機構である。ＤＮＡのメチル化が起こると転写が抑制される。【００２３】
本発明者は、前述のＰＵ．１遺伝子発現低下によるＭＴ遺伝子の発現上昇が、このＤＮＡメチル化機構により制御されていること、すなわち、ＭＴ遺伝子発現制御領域のＤＮＡのメチル化が低下して、その遺伝子発現上昇に関与していることを発見した（図５、図６）。このような遺伝子のメチル化はＭＴ遺伝子だけでなく、ＰＵ．１遺伝子発現低下細胞の複数の遺伝子発現制御領域においても低下している。このような結果から、ＰＵ．１遺伝子発現低下による白血病においては、ＤＮＡメチル化阻害剤の薬剤効果が不十分であることが考えられる。【００２４】
図５（ａ）及び（ｂ）は、ＭＴ−１Ｇに関する結果を示し、ＰＵ．１遺伝子発現低下細胞ではＭＴ１遺伝子発現制御領域のメチル化が解除されることを示す。
ＭＴ−１Ｇ遺伝子の５’上流域を図５（ａ）の模式図に示す。矢印が文献報告されている転写開始点である（Huang et al., Int. J. Cancer: 104, p735-744 (2003)）。ＴＡＴＡボックスとＣｐＧアイランド（白丸：○）を示した。番号は今回解析を行った転写開始点上流−４２７ｂｐからのＣｐＧアイランドの数を示す。
ＭＴ−１Ｇ遺伝子プロモーターのＤＮＡメチル化塩基配列解析の結果を図５（ｂ）に示した。図に示した細胞からゲノムＤＮＡを調製し、バイサルファイト処理を行った後、後述の実施例に示すプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、PGEMT easy vector（Promega, Madison, WI）にクローニングし、シークエンス解析を行った。黒丸（●）がメチル化されたＣｐＧアイランドで、白丸（○）が非メチル化ＣｐＧアイランドである。
ＰＵ．１発現低下細胞（２−１０：メチル化率１５．７９％，３−１０：メチル化率２９．４７％）では、コントロール細胞（ｖｅｃ５：メチル化率２８．６８％，ｖｅｃ６：メチル化率４０．５３％）と比較してメチル化率が低下していることが明らかになった。  【００２５】
図６（ａ）及び（ｂ）は、ＭＴ−１Ｇに関する結果を示し、ＰＵ．１遺伝子過剰発現細胞ではＭＴ１遺伝子発現制御領域がメチル化されることを示す。
ＭＴ−１Ｇ遺伝子の５’上流域を上記図５（ａ）と同様に図６（ａ）の模式図に示す。
ＭＴ−１Ｇ遺伝子プロモーターのＤＮＡメチル化塩基配列解析の結果を図６（Ｂ）に示した。図に示した細胞からゲノムＤＮＡを調製し、バイサルファイト処理を行った後、後述の実施例に示すプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、PGEMT easy vector (Promega, Madison, WI)にクローニングし、シークエンス解析を行った。黒丸（●）がメチル化されたＣｐＧアイランドで、白丸（○）が非メチル化ＣｐＧアイランドである。
ＰＵ．１遺伝子過剰発現細胞（Ｈ８：メチル化率５９．４７％）では、コントロール細胞（ｖｅｃ１：メチル化率３６．０５％）と比較してメチル化率が上昇していることが明らかになった。【００２６】
そこで、ＰＵ．１の遺伝子発現を低下させた細胞（Ｋ５６２ＰＵ．１ＫＤ細胞）と、過剰発現させた細胞（Ｋ５６２ＰＵ. １ＯＥ細胞）を用いて、ＤＮＡメチル化阻害剤で、実際に臨床的に用いられている薬剤である５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-aza-2’-deoxycitidine(5-azadcまたはＡＺＡと略記することがある））をこれらの細胞に投与した。その結果、ＤＮＡメチル化活性の阻害されたＰＵ．１遺伝子発現低下細胞は、5-azadcに対して耐性で感受性が低く（図７）、逆にＰＵ．１遺伝子過剰発現細胞は感受性が高いことが判明した（図８）。【００２７】
２種類のＰＵ．１遺伝子発現低下細胞（ＰＵ２−１０，ＰＵ３−１０）とコントロール細胞（ｖｅｃ５，ｖｅｃ６）について、5-azadc（ＡＺＡ）に対する感受性（％effect：薬剤投与後の死細胞率）を比較した。すなわち、９６ウェルプレートに、前記細胞をそれぞれ２０００個／ウェルでまき、5-azadc（ＡＺＡ）を0.2、1、3.9、15.6、62.5、250及び1000ｎＭの濃度でウェル中に添加後、９６時間後に細胞生存率アッセイを用いて行った。このアッセイでは、１００μＬの細胞培養液が入っているウェル中に、１０μＬのWST-8試薬（Dojindo, Japan）を添加し、３７℃で２時間、５％ＣＯ2インキュベーターで培養後、４９０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定することにより細胞生存率を測定し、その結果を死細胞率（％effect）として図７に示した。
ＰＵ．１遺伝子発現低下細胞（ＰＵ２−１０，ＰＵ３−１０）はコントロール細胞（ｖｅｃ５，ｖｅｃ６）と比較し、約２０％程度死細胞率が低いことが明らかになり、同細胞は薬剤耐性を持つことが判明した。【００２８】
２種類のＰＵ．１遺伝子過剰発現細胞（Ａ２，Ｈ８）とコントロール細胞（ｖｅｃ１，ｖｅｃ２）について、5-azadc（ＡＺＡ）に対する感受性（％effect：薬剤投与後の死細胞率）を比較した。実験は上記図７の場合と同様に行った。その結果を図８に示した。ＰＵ．１遺伝子過剰発現細胞はコントロール細胞と比較し、約２０％程度死細胞率が高いことが明らかになり、同細胞は薬剤に対して高感受性であることが判明した。【００２９】
がんでは、がん抑制遺伝子発現制御領域の異常メチル化が高頻度に認められたことから、その発症機構としてメチル化の異常が関与しているのではないかと考えられてきた。抗癌剤と比較して副作用の少ないＤＮＡメチル化阻害剤は、前白血病状態と考えられている骨髄異形成症候群でその効果が認められつつある。また、骨髄異形成症候群以外の造血器悪性疾患に対しても用いられ始めている。【００３０】
幹細胞の段階で発現しており、造血に重要な転写因子であるＡＭＬ１遺伝子は、一部のＡＭＬ（急性骨髄性白血病）において、８番と２１番目の染色体が部分的に置き換わる、相互転座と呼ばれる異常により、ＡＭＬ１−ＥＴＯと呼ばれる異常な融合産物となる。この異常融合転写因子が、造血細胞の分化に関わる遺伝子の発現を異常に制御することにより病態に関与すると考えられている。ＡＭＬ１−ＥＴＯを含むいくつかのＡＭＬ特異的融合転写因子はＤＮＡメチル化活性が高いと言われていることから、ＡＭＬに対してもメチル化阻害剤の投与の検討が行われている。しかし、その効果はまだ明らかではない。【００３１】
すなわち、単純にＤＮＡメチル化阻害剤が全てのＡＭＬ細胞に著効という訳ではないと考えられる。実際本発明者の今回の発見でも、ＡＭＬを模した状態であるＰＵ．１転写因子の発現低下により、細胞内メチル化が低下し、薬剤耐性であることが判明した。
逆に、ＰＵ．１転写因子発現上昇により、細胞内メチル化が上昇し、薬剤感受性が高まることが判った。すなわち、本発明によれば、骨髄異形成症候群やＡＭＬ等の造血器疾患において、ＰＵ．１の発現、ならびにその標的遺伝子であるＭＴの発現の検討が、より効果的な、ＡＭＬに対するＤＮＡメチル化阻害剤効果の予測、検出に用いられることが判った。【００３２】
すなわち、（１）転写因子ＰＵ．１発現量、（２）ＭＴ（ＭＴ−１Ａ、ＭＴ−１Ｇ等）発現量、及び（３）ＭＴ（ＭＴ−１Ａ、ＭＴ−１Ｇ等）遺伝子発現制御領域のメチル化を検討することが、5-azadc等のＤＮＡメチル化阻害剤効果を予測、検出する臨床的に有用なマーカーとなることが判った。【００３３】
実施例の結果から、PU.1／GAPDHのレベルが0.01未満（図１）またはＭＴ−１Ａ  またはＧ／ＧＡＰＤＨのレベルが0.002より大きい（図２）場合、5-azadcに対して感受性が低く、PU.1／GAPDHのレベルが0.1より大きく（図３）またはＭＴ−１ＡまたはＧ／ＧＡＰＤＨのレベルが0.002未満（図４）の場合、5-azadcに対して感受性が高いことが判った。また、メチル化率が２０％未満だと5-azadcに対して耐性であることが判り（図５）、５０％より大きいと感受性が高いことが判った（図６）。【００３４】
5-azadcはＤＮＡメチル化阻害剤として注目されている薬剤であるが、ＡＭＬに対してこれのみで充分な治療効果が期待できる薬剤ではなかった。しかし、本発明により、薬剤投与前に、ＰＵ．１あるいはその標的遺伝子であることが明らかとなったＭＴの遺伝子発現、遺伝子発現制御領域のＤＮＡメチル化などを検討することにより、薬剤効果を予測、検出できることが判った。このような情報をもとに治療を行えば、抗癌剤のみに頼らずに、有効でかつ特異的なＡＭＬ等の造血器腫瘍の治療が行え、その治療成績が向上する。【００３５】
本発明によれば、ＰＵ．１遺伝子低発現造血器腫瘍細胞に対しては5-azadc等のＤＮＡメチル化阻害剤が耐性であり、ＰＵ．１遺伝子高発現造血器腫瘍細胞では5-azadc等のＤＮＡメチル化阻害剤が高感受性であるという知見に基づいて、非常に特異性の高い薬剤効果予測マーカーが提供される。また、ＭＴ−１Ａ、ＭＴ−１Ｇ等のＭＴ遺伝子のメチル化率がＰＵ．１遺伝子の発現と相関することから、これら遺伝子群のメチル化率の検出も、5-azadc等のＤＮＡメチル化阻害剤に対する薬剤効果予測マーカーとして有用である。【００３６】
本発明によれば、５−アザ−２’−デオキシシチジン（5-azadc）のほか、５−アザシチジン、またはこれと5-azadcとの混合物を含むＤＮＡメチル化阻害剤の薬剤効果を効果的に予測、検出することができる。
【実施例】
【００３７】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３８】
実施例
［転写因子ＰＵ．１及び標的遺伝子ＭＴ−１発現量の検討］
同意が得られた、芽球比率が高い、骨髄血あるいは末梢血由来の患者検体からFicoll Hypaque(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)を用いた密度勾配遠心法により、常法に基づき単核球を分離した。分離した単核球から、Isogen(ニッポンジーン社)を用いてtotal ＲＮＡを常法に基づき調製した。得られたＲＮＡを用いて、スーパースクリプトファーストストランドシステム（Invitrogen社、Carlsbad、CA）により常法に従ってｃＤＮＡを合成した。【００３９】
定量ＰＣＲに用いたプライマーは下記の通りである。
MT-1G forward;5’-CTTCTCGCTTGGGAACTCTA-3’（配列番号１）、
reverse;5’-AGGGGTCAAGATTGTAGCAAA-3’（配列番号２）、
MT-1A forward;5’-CTCGAAATGGACCCCAACT-3’（配列番号３）、
reverse;5’-ATATCTTCGAGCAGGGCTGTC-3’（配列番号４）、
PU.1  forward;5’-GTGCCCTATGACAACGGATCT-3’（配列番号５）、
reverse;5’-GAAGCTCTCGAACTCGCTGT-3’（配列番号６）。【００４０】
これらプライマーを用い、Quantitect SYBR green PCR reagent(Qiagen社、Miami、FL)を説明書に従って、Opticon mini real-time PCR instrument(Bio-Rad, Hercules, CA)を使用し、定量ＰＣＲを行うことにより、発現量を検出した。また、全ての遺伝子産物の発現量は下記に示すハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現量で補正して算出した。
GAPDH forward;5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’（配列番号７）、
reverse;5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’（配列番号８）。【００４１】
ＰＣＲ条件は下記の通りである。
PU.1：step1,95℃ 15分;
step2,95℃ 15秒;
step3,60℃ 1分；
steps2-3を35回繰り返す。
MT-1A,G及びGAPDH：
step1,95℃ 15分;
step2,95℃ 30秒;
step3,55℃ 30秒；
step4,72℃ 30秒；
steps2-4を35回繰り返す。
発現量検出に必要なコピー数の計算は報告されている方法（Takahashi S et al., Leukemia Research, 2005 (29), p893-899）に従って行った。なお、この方法は、具体的には、上記のプライマーで増幅したＤＮＡを、PGEMT easy vector(Promega, Madison, WI)にクローニングすることで、その遺伝子特異的なプラスミドＤＮＡを作成し、次に、その作成したプラスミドＤＮＡ質量に基づいたコピー数を計算して、プラスミドの希釈系列を作成し、測定するｃＤＮＡと同時に定量ＰＣＲを行い、その希釈系列による検量線から発現量検出に必要なコピー数を算出するものである。【００４２】
作成した培養細胞における結果から、上記方法で算出したＰＵ．１／ＧＡＰＤＨのレベルが0.01未満（図１）またはＭＴ−１ＡまたはＧ／ＧＡＰＤＨのレベルが0.002より大きい（図２）場合、5-azadcに対して耐性で感受性が低く、ＰＵ．１／ＧＡＰＤＨのレベルが0.1より大きく（図３）またはＭＴ−１ＡまたはＧ／ＧＡＰＤＨのレベルが0.002未満（図４）の場合、5-azadcに対して感受性が高いことが判った。【００４３】
［ＭＴ−１遺伝子発現制御領域のメチル化の検討］
同意が得られた、芽球比率が高い、骨髄血あるいは末梢血由来の患者検体からFicoll Hypaque(GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden)を用いた密度勾配遠心法により、常法に基づき単核球を分離した。前記分離した単核球からゲノムＤＮＡをQiagen社 Blood & Cell Culture DNA mini kit (QIAGEN)を用いて調製した。そのＤＮＡについてEZ DNA Methylation-Gold kit (Zymo Research社、Orange、CA)で常法に基づきバイサルファイト処理を行なうと、メチル化シトシンは変換されず非メチル化シトシンのみがウラシルに変換される。得られたＤＮＡを下記のプライマーにより増幅し、PGEMT easy vector (Promega, Madison, WI)にクローニングした。
MT-1G forward;5’-TTTGGTAGATTTAGAAAGTGGAGTATAAGA-3’（配列番号９）、
reverse;5’-CTCAAACCCAAAAACACTCTCTATAATATC-3’（配列番号10）、
MT-1A forward;5’-GGGATAGGAGTAGGAGGTTGTGGTTGTATT-3’（配列番号11）、
reverse;5’-ACACCTCTACTCCTAAAAACATCTATCCTATA-3’（配列番号12）。【００４４】
ベクターにクローニング後、常法に基づいてBig Dye Sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、ABI Prism DNA sequencer 3130(Applied Biosystems) によりシークエンス解析をし、シトシンからチミンへの変換を検討することで、メチル化率を算定した。シークエンス反応として、ウラシルはチミンとして表現され、バイサルファイト処理後で生じるシトシンとチミン（ウラシル）の配列上の表現はメチル化の有無により異なる。【００４５】
図５及び図６の結果から、メチル化率が２０％未満だと5-azadcに対して耐性で感受性が低く（図５）、５０％より多いと感受性が高いことが判った（図６）。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、その他の造血器疾患を含む造血器腫瘍細胞に対する分子標的薬剤であるメチル化阻害剤を有効に適用するための薬剤効果検出方法を提供したものである。
本発明によれば、好中球及び単球系列への分化決定に関与する転写因子（ＰＵ．１）の遺伝子発現、その標的遺伝子であるメタロチオネイン（ＭＴ）の遺伝子発現、及び／またはＭＴ遺伝子発現制御領域のメチル化率に基づいて、薬剤（メチル化阻害剤）の感受性を検出した上で、造血器腫瘍に対する有効かつ特異的な治療を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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