(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２又は３からなる親グルコアミラーゼにおいて、Ｉ３４Ｒ、Ｑ１７２Ｆ、Ｑ２０８Ｎ、Ｓ２２１Ｒ、Ｇ２９４Ｃ、及びＶ３１４Ｈからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸の置換を含むグルコアミラーゼ変異体。
【請求項２】
前記置換がＱ１７２Ｆ、Ｑ２０８Ｎ、又はＳ２２１Ｒである、請求項１のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項３】
前記置換がＩ３４Ｒ又はＧ２９４Ｃである、請求項１のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項４】
前記変異体が親グルコアミラーゼと比較して高められた熱安定性を有する、請求項１のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項５】
前記変異体が親グルコアミラーゼと比較して高められた特異活性を有する、請求項１のグルコアミラーゼ変異体。
【請求項６】
請求項１の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項８】
請求項１のグルコアミラーゼ変異体を含む酵素組成物。
【請求項９】
前記組成物がデンプン転換工程に用いられる請求項８の酵素組成物。
【請求項１０】
前記組成物が動物飼料製剤である、請求項８の酵素組成物。
【請求項１１】
前記組成物生物がアルコール発酵工程に用いられる、請求項８の酵素組成物。
【請求項１２】
請求項６のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物で宿主細胞形質転換することを含む宿主細胞内で変異体グルコアミラーゼを生成する方法であって、宿主細胞を前記グルコアミラーゼ変異体の発現及び生成に適した条件下で、宿主細胞を培養する工程及び前記変異体を生産する工程を含む、方法。
【請求項１３】
前記培養からグルコアミラーゼを回収する工程を更に含む請求項１２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は修飾された性質（例えば、改善された熱安定性及び／又は特異活性）を有する親グルコアミラーゼの変異体に関する。特に本発明は、変異体グルコアミラーゼを含む、デンプン加水分解組成物、動物飼料用組成物、及び洗浄用組成物を含む組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
グルコアミラーゼ酵素（グルカン１，４−α−グルコヒドロラーゼ、ＥＣ３．２．１．３）はデンプン加水分解ｅｘｏ活性カルボヒドラーゼである。この酵素はデンプン又は関連オリゴ及びポリサッカライド分子の非還元末端から連続的にグルコース単位を除去することを触媒する。グルコアミラーゼは直鎖又は分岐鎖の両方のデンプン（例えば、アミロース及びアミロペクチン）のグルコシル結合を加水分解することができる。
【０００３】
グルコアミラーゼはバクテリア、糸状菌、酵母、植物の多くの株によって生成される。特に興味深く、商業的に重用なものは、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４８：５２９−５４４；Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２；Ｈａｙａｓｈｉｄａ  et  al.,（１９８９）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：９２３−９２９；米国特許Ｎｏ．５，０２４，９４１；米国特許Ｎｏ．４，７９４，１７５  及びＷＯ８８／０９７９５）；タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）（米国特許Ｎｏ．４，２４７，６３７；米国特許Ｎｏ．６，２５５，０８４  及び米国特許Ｎｏ．６，６２０，９２４）；リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）（Ａｓｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０：９５７−９６４；Ａｓｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：１２９−１３３  及び米国特許Ｎｏ．４，８６３，８６４）；フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（ＷＯ  ０５／０５２１４８及び米国特許Ｎｏ．４，６１８，５７９）及びむこーる（Ｍｕｃｏｒ）（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ-Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６２：２１０−２１７）の株から細胞外的に生成された糸状菌酵素であるグルコアミラーゼである。これらの酵素をコードする多くの遺伝子がクローン化され酵母、糸状菌及び／又はバクテリア細胞の中で発現されてきた。
【０００４】
商業的に、グルコアミラーゼは非常に重要な酵素であり、デンプンの加水分解を必要とする幅広い各種製品に用いられてきた。（例えば、デンプンからグルコース及び他の単糖の生成）。グルコアミラーゼは米国の５０％以上の甘味料マーケットにおいて、フルクトースコーン甘味料を生成するために用いられる。通常、グルコアミラーゼが用いられ、一般的には、デンプン加水分解工程においてアルファアミラーゼと共に用いてデンプンをデキストリンに加水分解し、その後、グルコースを生成する。このグルコースはその後、他の酵素（例えば、グルコースイソメラーゼ）を用いてフルクトースに転換されるか、結晶化されるか、又は多くの最終生成物（例えば、エタノール、クエン酸、酪酸、スクシニル酸、アスコルビン酸中間体、グルタミン酸、グリセロール、及び１，３プロパノール）を生産するために用いられる。デンプン及び／又はセルロース含有物質の発酵におけるグルコアミラーゼを用いて生産されたエタノールは燃料源として又はアルコールを含む消費材として用いられる。
【０００５】
グルコアミラーゼは長い間市販製品において、成功裏に用いられてきたが、変更された性質を有する（改善された特異的活性及び高められた熱安定性）新たなグルコアミラーゼについての需要が依然として存在する。
【０００６】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のグルコアミラーゼについて（熱安定性及び特異活性の改善された）異なる変異体が生成されている。米国特許Ｎｏ．６，５３７，７９２；米国特許Ｎｏ．６，３５２，８５１；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．９：４９９−５０５、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ．  ８：５７５−５８２；Ｆｉｅｒｏｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：８６９８−８７０４；及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１１９９−１２０４参照。しかしながら、依然としてこれらの文献に記載の変異体に対してより改善された、変更された性質を有するグルコアミラーゼを提することが必要とされている。
発明の概要
【０００７】
本発明の更なる側面は、配列番号２又は３の４、５、１２、２４、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、７０、７５、６、９４、１００、１０８、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２５、１３７、１４１、１４３、１４６、１４８、１６９、１７１、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２２８、２４２、２４３、２４５、２９２、２９４、１９７、３０９、３１０、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２１、３４０、３４１、３５０、３５３、３５６、３６３、３６８、３６９、３７５、３７６、３９５、３９８、４０１、４０８、４０９、４１２、４１５、４１８、４２１、４３３、４３６及び４５１から選択される位置に対応する、又はこれと等しい残基において１つ以上のアミノ酸置換を有するグルコアミラーゼである。等しい位置は配列同一性により決定され、前記親グルコアミラーゼが配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、及び９に対して８０％乃至１００％未満の配列同一性を有している。親グルコアミラーゼは配列番号１、２、又は３である。等しい位置は配列番号３に対する構造同一性により決定される。本発明の発明の更なる態様は、４、５、２４、２９、４３、４９、４９、７０、７５、７６、１００、１０８、１１９、１２４、１３７．１４６、１４８、１６９、１７１、１７２、１７５、」１７８、１８１、２０８、２１１、２４３、２９２、２９４、２９７、３１４、３１６、３１７、３４０、３４１、３５０、３５６、３６３、３６８、３６９、３７６、３９５、４０１、４１２、４３３、４３６、及び４５１から選択される位置に対応する１つ以上のアミノ酸置換を有し、配列番号２で定義さされる配列にス９０％の配列同一性を有する、グルコアミラーゼ変異体である。幾つかの側面において、この１つ以上のアミノ酸置換は、５、２４、４３、４９、７０、７５、７６、９４、１１９、１４１、１４６、１４８、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２４３、２９４、３０９、３１４、３５３、３６９、３７５、４０９に対応している。親グルコアミラーゼは、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）、  アスペルギスル種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．）、ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓｅ  ｓｐｐ．）又はシゾサッカロミセス種（ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）のいずれかでよい。幾つかの側面において、グルコアミラーゼ変異タンパク質インデックスは好ましくは、トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．）又はアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）である。
【０００８】
更なる本発明の側面において、グルコアミラーゼ変異体は以下の挙げる位置の少なくとも１つに対応する位置で置換を有する：Ｄ４Ｌ／Ｅ／Ｒ／Ｓ／Ｃ／Ａ／Ｑ／Ｗ、Ｆ５Ｃ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｉ１２Ｌ／Ｒ、Ｄ２４Ｅ／Ｌ／Ｙ／Ｔ、Ｆ２９Ｌ／Ｉ／Ｄ／Ｃ／Ｓ／Ｖ／Ｗ、Ｉ４３Ｆ／Ｒ／Ｄ／Ｙ／Ｓ、Ｄ４４Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｎ／Ｙ／Ｆ／Ｒ、Ｙ４７Ｗ、Ｙ４９Ｎ、Ｑ７０Ｒ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｇ／Ｌ／Ｆ、Ｑ７５Ｒ／Ｋ／Ａ、Ｒ７６Ｌ／Ｍ／Ｋ／Ｔ／Ｐ、Ｐ９４Ｌ、Ｄ１００Ｗ／Ｉ／Ｑ／Ｍ／Ｐ／Ａ／Ｎ、Ｎ１１９Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ、Ｎ１４６Ｓ／Ｇ／Ｃ／Ｈ／Ｅ／Ｄ／Ｔ／Ｗ／Ｌ／Ｍ、Ｑ１４８Ｖ／Ｙ／Ｈ／Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｙ１６９Ｄ／Ｆ、Ｑ１７２Ｃ／Ａ／Ｄ／Ｒ／Ｅ／Ｆ／Ｈ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ｅｌ８０Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｖ１８１Ｅ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｓ／Ｋ／Ｆ／Ａ、Ｑ２０８Ｌ／Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｎ／Ｆ／Ｈ／Ｔ、Ｓ２１１Ｃ／Ｒ／Ｅ／Ａ／Ｙ／Ｗ／Ｍ／Ｈ／Ｌ／Ｉ／Ｒ／Ｑ／Ｔ、Ｅ２４３Ｓ／Ｒ／Ｎ／Ｍ／Ｙ／Ａ／Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｅ／Ｍ／Ｉ／Ｐ／Ｖ、Ｉ２９２Ｄ／Ｈ／Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｎ／Ｖ／Ｆ／Ｌ、Ｇ２９４Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ａ、Ｋ２９７Ｆ／Ｌ／Ｐ／Ｔ／Ｍ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ａ／Ｙ／Ｈ／Ｓ／Ｒ／Ｗ、Ｒ３０９Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｌ、Ｙ３１０Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｓ／Ｗ／Ｒ／Ｑ、Ｄ３１３Ｑ、Ｖ３１４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｋ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｙ３１５Ｆ、Ｙ３１６Ｑ／Ｒ、Ｎ３１７Ｔ／Ｈ、Ｋ３４０Ｄ／Ｔ、Ｋ３４１Ｆ／Ｄ／Ｐ／Ｖ／Ｇ／Ｓ、Ｔ３５０Ｓ／Ｅ／Ａ／Ｎ、Ｑ３５６Ｈ／Ｄ／Ｅ、Ｔ３６３Ｌ／Ｒ／Ｃ／Ｈ／Ｗ、Ｓ３６８Ｗ／Ｄ／Ｆ／Ｌ、Ｓ３６９Ｆ、Ｎ３７６Ｑ／Ｔ／Ｈ／Ｓ／Ｖ、Ｙ３９５Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ａ３９８Ｓ／Ｉ／Ｔ、Ｓ４０１Ｃ／Ｖ、Ｒ４０８Ｓ、Ｎ４０９Ｗ／Ｔ／Ｋ、Ｔ４１２Ａ／ｈ／Ｋ／Ｇ、Ｒ４３３Ｈ／Ｑ、Ｉ４３６Ａ／Ｔ、及びＳ４５１Ｍ／Ｔ／Ｈ。幾つかの好適な変異体は１７２位に置換を有する。他の好適な変異体は２０８又は２１１の位置で置換を有する。他の好適な変異体はＱ１７２Ｆ、Ｑ２０８Ｎ、又はＳ２２１Ｒに対応する置換を有する。他の好適な変異体は３１４位において少なくとも１つの置換を有する。一つの側面において、本発明の変異体は２４、１８１、２０８、２４３、２９２、２９４、３５３、３７５、又は４０９において少なくとも１つの置換を有する。幾つかの好適な態様は、Ｄ２４Ｅ／Ｌ／Ｙ、Ｖ１８１Ｋ／Ｌ、Ｑ２０８Ｃ、Ｅ２４３ＹＩ２９２Ｖ、Ｇ２９４Ａ／Ｑ、Ｔ３５３Ｒ、Ｎ３７５Ｎ／Ｑ及び／又はＮ４０９Ｋ／Ｗにおける置換である。１つの側面において、変異体グルコアミラーゼは親グルコアミラーゼと比べて、熱安定性が高められている。あるいは、又は加えて、この変異体は親グルコアミラーゼと比べて、高められた特異活性を有している。
【０００９】
本発明の更なる側面は本明細書で説明する変異体をコードするポリヌクレオチドである。本発明の発明の更なる側面は、本明細書で説明するグルコアミラーゼ変異体を含む酵素組成物である。１つの側面において、この酵素組成物はデンプン転換工程、又は動物飼料製品中に用いられる。他の側面において、この酵素組成物はアルコール発酵工程に用いられる。
【００１０】
本発明の更なる側面は、変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築物で、宿主細胞を軽質転換する工程、前記宿主細胞をグルコアミラーゼへの発現及び生産に好適な条件下で培養する工程、及び変異体を生産する工程を含む、該宿主細胞中で変異体グルコアミラーゼを生産する方法である。この方法は培養物からグルコアミラーゼ変異体を回収する工程を更に含んでいても良い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、６３２アミノ酸を有するトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の親グルコアミラーゼ（配列番号１）を示す。シグナルペプチドは下線で、４５３アミノ酸残基の、ＳＶＤＤＦＩ（配列番号１６０）から開始する触媒領域（配列番号３）は太字で示す。リンカー領域はイタリック体で示し、結合領域は下線のイタリック体で示す。触媒ドメイン（配列番号３）、リンカー領域、及びデンプン結合ドメインを含む天然タンパク質は配列番号２で示す。図１Ｂは、ＴｒＧＡをコードするｃＤＮＡを示す（配列番号４）。
【図２】図２は、親ＴｒＧａのｃＤＮＡ配列（配列番号４）を含むｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡプラスミドを示す。
【図３】図３はプラスミドｐＲＥＰ３Ｙ−ＤＥＳＴ（Ａ）及びｐＲＥＰ３Ｙ（Ｃ）を示す。
【図４】図４Ａ及びＡＢは、アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）  （ＡａＧＡ）（配列番号５）；アスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（ＡｎＧＡ）（配列番号６）；アスペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｚｙａｅ）（ＡｏＧＡ）（配列番号７）；トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ＴｒＧＡ）（配列番号３）；フミコーラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）（ＨｇＧＡ）（配列番号８）；及びハイポクレアビノセア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ）（ＨｖＧＡ）（配列番号９）由来のグルコアミラーゼを含む親グルコアミラーゼの触媒ドメインのアラインメント比較である。一致するアミノ酸はアスタリスク（＊）で示した。
【図５】図５は（Ａ）プラスミドｐＴｒｅｘ−ＤＥＳＴ及び（Ｂ）トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中で変異体グルコアミラーゼを発現し生産するための発現ベクターとして用いられるプラスミドｐＴｒｅｘ３ｇ−ＴｒＧＡを示す。
【図６】図６は、実施例８で説明する、６０℃及び３２℃における、親ＴｒＧＡ（野生型）と変異体、Ｖ３１４、Ｓ２１１ＲｍＱ１７２、及びＱ２０８の間のＶｍａｘ（μＭグルコース／ｓｅｃ）比較を示す。
【図７】図７はデンプン上の組合せ変異体の活性を示す。
【図８】図８は、コーンスターチにおける１部位への活性を示す。
【図９】図９は、実施例１０で説明する、液状コーンマッシュ（ＮＥ）サンプルにおけるＴｒＧＡ及びＴｒＧＡ変異体ＬＲ８の活性プロファイルを示す。
【図１０】図１０は、実施例１０で説明する液状コーンマッシュ（ＢＳＥ）上におけるＴｒＧＡ及びＴｒＧＡ変異体ＬＲ８の活性プロファイルを示す。
【図１１】図１１は可溶性コーンスターチ基質におけるＴｒＧＡ変異体ＬＲ８を示す。
【図１２】図１２は、側面から見た、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ（黒）  （配列２）及び  アスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉｉ）  グルコアミラーゼ（グレイ）の３次元構造の比較である。
【図１３】図１３は、上から見た、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ（黒）  （配列２）及びアスペルギウスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉｉ）  グルコアミラーゼ（グレイ）の３次元構造の比較である。
【発明の詳細な説明】
【００１２】
１．    定義
特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的な用語及び科学的な用語は、本発明の属する分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味で用いられる。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  Ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９４）、及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｋｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は本明細書で用いる用語の多くの一般的な意味を当業者に提供する。更に、目的を明確にし、容易に参照できるようにするために、特定の用語を以下で定義する。
【００１３】
本明細書において、「グルコアミラーゼ（ＥＣ３．３．１．３）」の語は、デンプン、及び関連するオリゴ及びポリサッカライドの非還元末端からＤ−グルコースを放出する酵素を意味する。
【００１４】
「親」又は「親配列」の語は天然の配列又は宿主細胞中に自然発生的に生じる配列を意味する。
【００１５】
「ＴｒＧＡ」の語は、配列番号２で定義される成熟タンパク質配列を有する親トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ配列を意味する。この配列は配列番号３で示される触媒ドメインを含む。ＴｒＧＡの単離、クローン、及び発現はＷＯ２００６／０６００６２及び２００６年５月４日に出願された米国特許出願番号Ｎｏ．２００６／００９４０８０に記載されている。これらの文献を参照により本明細書に援用する。幾つかの態様において、この親配列は、タンパク質工学の開始点であるＴｒＧＡを意味する。グルコアミラーゼアミノ酸のナンバリングはＴｒＧＡの配列（配列２及び配列番号３）に基づいている。
【００１６】
「タンパク質又はポリペプチドの成熟体」の語は、の成熟形態の語は、タンパク質又はポリペプチドの最終的な機能形態を意味する。例えば、ＴｒＧＡの成熟形態は触媒ドメイン、リンカー領域、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するデンプン結合ドメインを含む。
【００１７】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体の語は、ＴｒＧＡ配列（配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に対して少なくとも８０％の配列相同性を有し、及びグルコアミラーゼの機能的特長を維持してい（有して）いる親グルコアミラーゼを意味する。
【００１８】
本明細書で用いる、「相同配列」の語は、比較のために最適に整列させたときに、ある核酸配列又はポリペプチド配列に対して、少なくとも１００％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８８％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％、又は少なくとも４５％の配列相同性を有する核酸又はポリペプチド配列の機能は、これと比較される核酸配列又はポリペプチド配列と必然的に同じになる。幾つかの形態において、相同配列は８５％乃至１００％の間の配列相同性を有し、他の態様において、９０％乃至１００％の配列相同性を有し、他の態様において、９５％乃至１００％の配列相同性を有する。幾つかの態様において、候補となる他の相同配列はＴｒＧＡ核酸配列又は成熟タンパク質配列と比較される。
【００１９】
本明細書において、「グルコアミラーゼ変異体」、「変異体」、及びＴｒＧＡ変異体の語は、親グルコアミラーゼ配列（ＴｒＧＡ又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体）には似ているが、それらのアミノ酸配列の中に、少なくとも１つの置換、欠失、又は挿入を有し、それゆえ、親グルコアミラーゼとは異なる配列をなる。
【００２０】
本明細書において、「触媒ドメイン」の語は、基質を加水分解するのに、活性部位を含むポリペプチドの構造領域を意味する。
【００２１】
「リンカー」の語は、触媒ドメインを含むアミノ酸配列を有するデンプン結合ドメインを含むアミノ酸配列を有するデンプン結合ドメインを含むアミノ酸配列に共有結合的に結合する３０乃至４０アミノ酸算さを有する短いアミノ酸配列を一般的に意味する。
【００２２】
「デンプン結合ドメイン」の語は、デンプン基質に先手区的に結合するアミノ酸配列を意味する。
【００２３】
本明細書において、「変異体配列」及び「変異体遺伝子」の語は、互換的に用いられ、宿主細胞の親配列の中で発生する少なくとも１つのコドンに代替するポリヌクレオチド配列を意味する。変異体配列の発現生成物は親タンパク質と異なるアミノ酸配列を有する。この発現生成物は修飾された機能を有する（例えば、高められた酵素活性）。
【００２４】
ポリペプチドに対して用いる、「性質」又はこれと同義語は、選択される又は検されるポリペプチドの任意の性質又は特性を意味する。これらの性質は酸化安定性、基質特異性、触媒活性、熱安定性、ｐH活性プロファイル、タンパク質分解に対する耐性、ＫＭ、ＫＣＡＴ、ＫＣＡＴ／ＫＭ比、タンパク質の折りたたみ、基質結合能、及び分泌能を含むがこれらに限定されない。変異配列の発現生成物は親タンパク質とは異なるアミノ酸配列を有する変異体タンパク質である。この発現生成物は機能的に修飾されている（例えば、高められた酵素活性）。
【００２５】
本明細書で、核酸について用いる、「性質」又はこれと同義語は、選択される又は検される核酸の任意の性質又は特性を意味する。これらの性質は、遺伝子転写に影響する性質（例えば、プロモーター長さ、又はプロモーター認識）、ＲＮＡプロセッシングに影響する性質（例えば、ＲＮＡスプライシング及びＲＮＡ安定性）、翻訳に影響する性質（例えば、調節、ｍＲＮＡのリボゾームタンパク質への結合）を含むがこれらに限定されない。
【００２６】
「熱に安定な」及び「熱安定性」の語は、デンプン基質の加水分解の間に通常用いられる条件下で、所与の温度に所与の時間曝された後に、特定の酵素活性の量を保持している本発明のグルコアミラーゼ変異体を意味する。
【００２７】
熱安定性等の性質に用いる、「高められた安定性」の語は、他のグルコアミラーゼ変異体及び／又は野生型グルコアミラーゼと比較してより高いデンプン加水分解活性を所定の時間、保持していることを意味する。
【００２８】
熱安定性等の性質に用いる、「減少した安定性」の語は、他のグルコアミラーゼ変異体及び／又は野生型グルコアミラーゼと比較してより低いデンプン加水分解活性を所定の時間、保持していることを意味する。
【００２９】
「活性」及び「生物学的に活性」の語は、特定のタンパク質に関係しるせ異物学的活性を意味する。所与の例えば、の生物学的活性は、当業者により認識される典型的な任意の生物学的活性を意味する。例えば、グルコアミラーゼの関係する酵素活性は、加水分解性であり、従って活性なグルコアミラーゼは加水分解活性を有している。
【００３０】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さの核酸の重合形態を意味し、通常、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかである。これらの語は、一本鎖、又は二本鎖、又は三本鎖のＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基を含むポリマー、又は他の自然発生的な、化学的、生物学的に修飾された非天然の又は誘導された核酸塩基を含むがこれらに限定されない。
【００３１】
本明細書において、「ＤＮＡ構築体」、「軽質転換しているＤＮＡ」、及び「発現ベクター」の語は互換的に用いられ、宿主細胞又は有機体に配列を導入するために用いられるＤＮＡを意味する。このＤＮＡはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＣＲで生成されるか、又は当分野で知られている任意の好適な技術を用いて生成することができる。このＤＮＡ構築体、形質転換ＤＮＡ、又は組換え発現ベクターは、プラスミド、クロモソーム、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸フラグメントに取り込まれる。通常、発現ベクター、ＤＮＡ構築体、又は軽質転換ＤＮＡの一部分である組換え発現カセットは他の配列の中に、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。好適な態様において、発現ベクターは、宿主細胞中で異種ＤＮＡフラグメントを取り込み発現する能力を有している。
【００３２】
本明細書において、「ベクター」の語は、１つ以上の細胞タイプへ核酸を導入するためにデザインされたポリヌクレオチド構築体を意味する。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミドベクター、カセット等を含む。
【００３３】
本明細書において、細胞内へ核酸配列を導入する意味で用いる、「導入された」の語は細胞へ核酸配列を導入するのに適した任意の方法を意味する。導入のためのそのような方法は、プロトプラスト融合、トランスフェクション、トランスフォーメーション、コンジュゲンチオビオース-ション、及びトランスダクションを含むがこれらに限定されない。
【００３４】
本明細書において、「軽質転換された」及び「安定な軽質転換された」の語は、そのゲノム又は少なくとも２世代にわたり維持されているエピソームプラスミドとして取り込まれた非天然（異種）ポリヌクレオチド配列を有する細胞を意味する。
【００３５】
本明細書において、「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」の語は、ベクターを含む宿主細胞の選択を容易にするために、宿主細胞中で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を意味する。通常、選択可能マーカーは、軽質転換の相ｓ例えば、に任意の外来配列を受け取っていない細胞から、この外来性ＤＮＡを区別するための、抗生物質耐性又は代謝利益を付与する遺伝子である。
【００３６】
本明細書において「プロモーター」の語は、下流遺伝子の転写に直接影響する核酸配列を意味する。他の転写及び翻訳調節核酸配列と、プロモーターは所与の遺伝子の発現に必須である。通常、転写及び翻訳調節領域は、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始及び停止配列、翻訳開始及び停止配列、及びエンマンサー、又はアクティベーター配列を含むがもれらに限定されない。
【００３７】
他の核酸配列と機能的な関係に配置された場合、この核酸は「作動可能に結結合している」と言う。例えば、分泌リーダーをコードしているＤＮＡ（即ち、シグナルペプチド）は、ポリペプチドの分泌に参加しているタンパク質として発現されたならば、ポリペプチドのために作動可能に結合しているという。通常、「作動可能に結合」の語は、結合されているＤＮＡ配列が繋がっていて、分泌リーダーの場合、連続していて、リーディングフェーズ中にあることを意味する。
【００３８】
本明細書において、「遺伝子」の語は、ポリヌクレオチドをコードし、個々のコード配列（エキソン）の間の介在配列（イントロン）だけでなく、コード領域の前及び後ろに続く領域を含むポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡフラグメント）を意味する。
【００３９】
本明細書において、「相同遺伝子」の語は異なるが通常関連性を有している一組の遺伝子を意味する。これらはお互いに対応し、お互いに同一であるか非常に似ている。この語は遺伝子複製により分離された遺伝子（パラロガス）の他に、スペーシエーションにより分離された遺伝子（即ち、新たな種の発達）（例えば、オーソログ遺伝子）種により分離された遺伝子も含む。
【００４０】
本明細書において「オーソログ」及び「オーソロガス遺伝子」の語はスペーシエーションにより共通の遺伝子の祖先から進化した遺伝子を意味する（即ち、ホモロガス遺伝子）。通常、オーソロガスは進化の過程において同じ機能を保持している。オーソロガスの同定は新たに配列決定されたゲノムにおいて遺伝子の機能を予測するのに有用である。
【００４１】
本明細書において、「パラログ」及び「パラロガス遺伝子」の語はゲノム内の複製により関係している遺伝子を意味する。オーソロガスは進化の過程で同じ機能を保持しているのに対し、パラロガスは、幾つかの機能はオリジナルのものに関連しているが、更に新たな機能を獲得している。パラロガス遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びトロンビンをコードしている遺伝子を含むがこれらに限定されない。これらは全て、セリンプロテアーゼであり同じ種を起源とする。
【００４２】
本明細書において、「ホモロジー」の語は類似又は同一な配列を意味し、同一であることが好ましい。このホモロジーは当業者において標準的な方法で測定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，２：４８２  ［１９８１］；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．、４８：４４３  ［１９７０］；  Ｐｅａｒｓｏｎ  Ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  ［１９８８］；ウィスコンシンジェネチックソフトウェアパッケージのＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）；及びＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２：３８７-３９５  ［１９８４］参照のこと）。
【００４３】
「核酸配列相同性のパーセンテージ（％）」又は「アミノ酸配列相同性のパーセンテージ（％）」の語は、候補配列中の開始配列（即ち、ＴｒＧＡ）の核酸配列又はアミノ酸配列と同一な核酸残基又はアミノ酸残基のパーセンテージを意味する。
【００４４】
ホモロガス配列は配列アラインメントの既知の方法で決定することができる。通常用いられているアライント方法はＡｌｔｓｃｈｕｌらの（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３-４１０，［１９９０］；  及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３-５７８７  ［１９９３］）ＢＬＡＳＴである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０-４８０［１９９６］参照）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムは幾つかのサーチパラメータを用いるがその大部分は規定値である。調節可能なパラメーターは以下の値のセットである：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワードスレッシュホールド（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは動的値であり、特定の配列の組成、及び所望の配列を検索するための特定のデータベースの組成に依存して、プログラム自体のより確立される。しかしながら、この値は感受性を高めるために調節される。アミノ酸配列相同性のパーセンテージの値は同一であり一致した残基の数を配列された領域内の「より長い」残基の全ての残基数で割って決定される。この「長い」配列はアラインされた領域内の実際の残基の大部分を有するものである（アラインメントスコアを最大化するためのＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されたギャップは無視する）。
【００４５】
他の方法も配列のアラインメントにおいて用いることができる。有用なアルゴリズムの一例としては、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的で対合的な配列法を用いて、関係する配列の群から、多重配列アラインメントを、作り出す。アラインメントを作るための関係性の集積を示す系統樹（ｔｒｅｅ）もプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進的アラインメント方法を簡素化したものである（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ.Ｍｏｌ.Ｅｖｏｌ.,３５:３５１-３６０[１９８７]）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐによって述べられた方法と同じである（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１-１５３[１９８９]）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３.００のデフォルトギャップウエイト、０.１０のデフォルトギャップレングス、及び、ウエイト及びギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｅｎｄ  ｇａｐｓ）を含んでいる。
【００４６】
「最適アラインメント」の語は最も高いパーセント同一スコアを与えるアラインメントを意味する。
【００４７】
本明細書で用いる、「ハイブリダイゼーション」の語は、本発明の技術分野で知られているように、塩基のペアリングを通じて、相補的なストランドと結合している核酸のストランドによるプロセスであると定義される。
【００４８】
核酸配列は、２つの配列が、中程度から高度に過酷な条件下及び洗浄条件下で、一方の配列に特異的にハイブリダイズする場合、選択的にハイブリダイズすると言う。ハイブリダイゼーション条件は複合的に結合している又はプローブに結合している核酸の融点（Ｔｍ）に基づいている。例えば、最大ストリンジェンシーは通常約Ｔｍ―５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こり、「高度なストリンジェンシー」はＴｍの約５乃至１０℃下で起こる。「中程度のストリンジェンシー」はプローブの約１０乃至２０℃下の温度で生じ、「低いストリンジェンシー」はプローブのＴｍの約２０℃乃至２５℃の温度で起こる。機能的には、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダーゼーションプローブと厳密に一致又は準厳密に一致する配列を同定するために用いられる。中程度又は低いストロンジェンシーハイブリダイゼーション条件は相同なポリヌクレオチド配列を同定又は検出するために用いられる。
【００４９】
中程度及び高いストリンジェンシー条件は当業者に良く知られている。高いストリンジェンシー条件の例としては、約４２℃、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハード溶液、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性されたキャリアーＤＮＡ中でハイブリダイズを行い、その後、室温で、２ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで２回洗浄し、更に、４２℃で、０．１ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳで２回追加的に洗浄する。中程度のストリンジェンシー条件は２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード溶液、１０％  硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌ変性され、剪断されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩ハイブリダイズを行い、その後３７℃乃至５０℃で１ｘＳＳＣでフィルターを洗浄する。当業者は、プローブ長さ等の因子を最適化するために必要とされている温度、イオン強度等をどのように調整するのかを知っている。
【００５０】
本明細書において、「組換え」の語は、異種又は相同な核酸の導入により修飾されたあるいは、そのように修飾された細胞由来である細胞又はベクターを意味する。従って、例えば、組換え細胞はその細胞の天然形態（非組換体）のなかの遺伝子とは一致しない遺伝子を発現する、あるいは、人工的な技術を介して、過剰に発現するか、発現されない、又は全く発現しない天然の遺伝子を発現する。
【００５１】
本発明の１つの態様において、へＤＮＡ配列は少なくとも１つのコドンにおける部位飽和変異誘発を用いて生成される。他の好適な態様において、部位変異誘発は２つ以上のコドンに対して行われる。更なる態様において、変異体ＤＮＡ配列は親配列に対して、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は８９％以上相同である。代替的な態様において、変異体ＤＮＡは、例えば、放射、ニトロソグアニジン等の既知の変異方法を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで生成される。所望のＤＮＡ配列をその後単離し、本明細書で提供する方法に用いる。
【００５２】
本明細書において、「異種タンパク質」の語は天然には生じないタンパク質又はポリペプチドを意味する。
【００５３】
本明細書において、「相同タンパク質」の語は細胞の中に天然又は自然発生するタンパク質又はポリペプチドを意味し、組換ＤＮＡ技術により、又は自然発生的に過剰に細胞内で過剰発現した天然タンパク質を含む。
【００５４】
もし、対応する野生型細胞において発現されているよりも高いレベルの酵素が細胞内で発現しているときに、その酵素が「過剰発現している」と言う。
【００５５】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は本明細書において互換的に用いられ、本明細書及び特許請求の範囲において、アミノ酸残基について通常用いられている１文字コード及び３文字コードを用いる。アミノ酸の３文字コードは生化学命名法についてのＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同委員会において定義されているアミノ酸についての３文字コードを使用する。遺伝子コードの退縮により１つのポリヌクレオチドは１つ以上の核酸配列によりコードされることは理解されている。
【００５６】
本発明の変異体は以下のように命名する：［オリジナルアミノ酸残基／位置／置換するアミノ酸残基］。例えば、７６位で、アルギニンがロイシンで置換された場合、Ｒ／７６／Ｌとあらわす。１つ以上のアミノ酸が所与の位置で置換された場合、この置換を１）Ｑ１７２Ｃ、Ｑ１７２Ｄ、又はＱ１７２Ｒ；２）Ｑ１７２Ｃ、Ｄ、又はＲ、あるいはｃ）Ｑ１７２Ｃ／Ｄ／Ｒと表す。置換について好適な位置が、特定のアミノ酸を提言せずに本明細書において同定される場合、任意のアミノ酸残基がその位置に存在するアミノ酸残基で置換されることが理解される。変異体グルコアミラーゼは他のグルコアミラーゼと比較して欠失を含んでおり、この形質転換ｓｉｔｕは“＊”で表される。例えば、Ｒ７６が欠失している場合、Ｒ７６＊を表される。２つ以上の保存アミノ酸の欠失は、例えば、（７６−７８）＊と表す。
【００５７】
「プロ配列」はシグナル配列及びタンパク質に分泌に必要とされる成熟タンパク質の間のアミノ酸配列である。このプロ配列が切断すると成熟活性タンパク質となる。
【００５８】
「シグナル配列」又は「シグナルヘフチド」の語は核酸及び／又はアミノ酸の任意の配列を意味する。この核酸及び／又はアミノ酸はタンパク質の成熟又は前駆体の分泌に参加する。シグナル配列の同定は機能的なものであり、タンパク質の分泌に参加するタンパク質遺伝子のＮ末端部分によりコードされるアミノ酸配列を全て含む。これらは、しばしは、タンパク質のＮ末部分又は前駆体タンパク質のＮ末部分に結合するが、常に結合するわけではない。シグナル配列は内性又は外性のものでよい。このシグナル配列は通常タンパク質（例えば、グルコアミラーゼ）に関係するものであるが、他の分泌されたタンパク質をコードしている遺伝子由来でもよい。
【００５９】
タンパク質又はペプチドの「前駆体」形態の語は、アミノ酸又はタンパク質のカルボキシ末端に作動可能に結合している配列を有するタンパク質の成熟形体を意味する。前駆体はプロ配列のアミノ末端に作動可能に結合している「シグナル配列も有している。前駆体は翻訳後活性（例えば、タンパク質又はポリペプチドの成熟形態から切断されて除去されるポリヌクレオチド）に含まれる追加的なポリヌクレオチドも有している。
【００６０】
「宿主株」又は「宿主細胞」の語は、本発明の発明のＤＮＡを含む発現ベクターに適した宿主を意味する。
【００６１】
「〜由来」及び「〜得られた」の語は意図する有機体の株により生成された又は生成可能なグルコアミラーゼだけでなく、そのような株から単離された、又はそのようなＤＮＡ配列を含む宿主有機体において生成されるＤＮＡによりコードされるグルコアミラーゼも意味する。更に、この語は合成及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされ、糸するグルコアミラーゼの性質を同定するグルコアミラーゼも意味する。
【００６２】
この定義の範囲内の「活性」は、野生型、天然、親において観察される加水分解活性の特徴を保持していることを意味する。グルコアミラーゼの機能的な誘導体は自然発生、合成、又は組み替えにより生成された、本発明のグルコアミラーゼの一般的な特徴を有する、ペプチド又はペプチドフラグメントを包含する。
【００６３】
「単離された」又は「精製された」の語は本来の環境から切り離された状態にある物質を意味する（例えば、もしその物質が自然発生したものであるならば、自然環境から切り離される。）
【００６４】
本明細書において、「組換変異誘発」の語は、開始配列の変異タンパク質遺伝子のライブラリーを精製する方法を意味する。これらのライブラリーにおいて、変異体は変異の予め同定されたセットから選択される１つ又は幾つかの変異を有している。更に。この方法は変異の予め決められたセットのメンバーではないランダム変異を導入する手段も提供する。幾つかの態様において、この方法は参照により本明細書に援用される、米国特許Ｎｏ．６，５８２，９１４に定義されている方法を含む。代替的な態様において、組合せ変異誘発方法は市販のキットも含む（例えば、クイックチェンジ（Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ）（商標）マルチサイト、ストラタジェン、サンディエゴ、カルフォルニア）。
【００６５】
本明細書において、「変異のライブラリー」の語はそれらの大部分は同じであるが、１つ以上の遺伝子の異なる相同体を含む細胞の集団を意味する。そのようなライブラリーは、例えば、改善された性質を有する遺伝子又はオペロンを同定するために用いることができる。
【００６６】
本明細書において、「乾燥固形含量（ＤＳ又はｄｓ）」の語は乾燥重量に基づくスラリー中の総固形分のパーセンテージ（％）を意味する。
【００６７】
本明細書において、「開始ヒット（ｉｎｉｔｉａｌ  ｈｉｔ）」の語は組合せコンセンサス変異誘発のスクリーニングにより同定された変異体を意味する。好適な態様において、開始ヒットは、開始遺伝子と比較して改善された特徴を有している。
【００６８】
本明細書において、「改善されたヒット（ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｈｉｔ）の語は、高められた組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーのスクリーニングにより同定された変異体を意味する。
【００６９】
本明細書において、「標的特性」の語は変更される開始遺伝子の特性を意味する。本発明を任意の特定の標的特性に限定することは意図しない。しかしながら、幾つかの態様において、この標的特性は遺伝子生産物の安定性である（例えば、変性、タンパク質分解、又は他の分解因子に対する安定性）。他の態様において、宿主細胞の生産における生産物のレベルが変更されている。すなわち、任意の開始遺伝子の任意の特性を本発明に用いること意図する。
【００７０】
用語の他の定義は本明細書全体から明らかとなる。
【００７１】
例示的な態様を詳細に説明する前に、本発明を説明される特定の態様に限定する意図はなく、本発明はこれらの態様に基づき変動することを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲に基づいて限定されるのであるから、本明細書で用いる技術的用語は、特定の態様を説明するために用いることを意図し、本発明を限定する意図で用いるものではないことを理解されたい。
【００７２】
数値範囲が提供されている場合、特に他で明確に定義しない限り、この範囲の上限値及び下限値の間にある、でそれぞれの値を下限値の１０分の１の単位で開示することを意図する。記載の範囲又はその間の範囲の間のそれぞれのより小さい範囲及びこの範囲内のほかに言及された又は介在する値も本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値はこの範囲から独立して包含又は排除されうる。より小さい範囲い含まれるそれぞれの範囲のいずれか、又はどちらでもない、又は両方に相当するそれぞれの範囲は本発明に含まれ、言及された範囲において、特に排除される。言及された範囲が１つ又上限値と下限値の含む場合、これらに含まれる現地のいずれか１つ又は両方を排除する範囲も本発明に含まれる。
【００７３】
本明細書で説明する任意の方法及び物質に似た又は等しいものを本発明の実施又は試験に用いることができるけれども、本明細書においては好適な方法及び物質を開示している。本明細書において言及する全ての文献は参照により及び／又はこれらの文献に引用され、関係する方法及び／又は物質を説明することにより、本明細書に援用される。
【００７４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、「１つの」及び「この」というような単数を示す語は、別に定義しない限り、複数も含む。従って、例えば、「１つの遺伝子」はそのような遺伝子の候補となる複数の遺伝子を含み、「この細胞」の語は１つ以上の細胞及び当業者が等しいと認識するものも含む。
【００７５】
本明細書において議論される刊行物は本発明の出願日に先立って開示されていることを提供することに用いる。これらは、そのような刊行物に記載された従前の発明があることにより本願発明が特許を受けることができるものではないということを証明するために解釈されてはいけない。
好適な態様
【００７６】
本発明の目的は、親グルコアミラーゼ、特にＴｒｉｃｈｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉグルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の熱安定性及び／又は特異活性を改善するように、性質を変更することである。例えば、改善された、変更された性質を有するグルコアミラーゼ変異体は、例えば、デンプンの転換又はアルコール発酵工程において有用である。
親グルコアミラーゼ
【００７７】
幾つかの態様において、本発明はグルコアミ変異体を提供する。このグルコアミ変異体は親グルコアミラーゼの変異体であり、この親グルコアミラーゼは配列番号１、２、３、５、６、７、８、又は９で定義されるアミノ酸配列を含む。及びこの親グルコアミラーゼは配列番号１、２、３、５、６、７、又は８で定義される及び／又は中程度、高度、又は過酷な条件下で配列番号１、２、又は３のアミノ酸配列の１つを有するグルコアミをコードするＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列の１つ以上に少なくとも８０％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する触媒ドメインを含む。
【００７８】
グルコアミラーゼの予測される構造及び既知の配列は糸状菌株の間で保存されている（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７：３９３−４００  及びＣｏｕｔｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，７：  ７４９−７６０）。幾つかの態様において、親グルコアミラーゼはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ、Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、Ｔ．ｓｔｒｉｃｔｉｐｉｌｉｓ、Ｔ．ａｓｐｅｒｅｌｌｕｍ、Ｔ．ｋｏｎｉｌａｎｇｂｒａ及びＴ．ｈａｚｉａｎｕｍ）、アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｋａｗａｃｈｉ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ  及びＡ．ｏｒｚｙａｅ）、タラロマイセス（Ｔａｒａｌｏｍｙｃｅｓ）株（例えば、Ｔ．  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＴ．ｄｕｐｏｎｔｉ）、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）株  （例えば、Ｈ．ｇｅｌａｔｉｎｏｓａ  、Ｈ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｈ．ｖｉｎｏｓａ、及びＨ．ｃｉｔｒｉｎａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株（例えば、Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ、及びＦ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、  ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）  株（例えば、  Ｎ．ｃｒａｓｓａ）及びフミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）株  （例えば、Ｈ．ｇｒｉｓｅａ、Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ及びＨ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓｅ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）株（例えば、Ｐ．ｎｏｔａｔｕｍ  又はＰ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）株（例えば、Ｓ．ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）から得られる。
【００７９】
幾つかの態様において、親グルコアミラーゼはバクテリアのグルコアミラーゼである。例えば、このポリペプチドはバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ，Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）又はストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）等のグラム引用文献で遺伝子バクテリア株から得られる。
【００８０】
幾つかの態様において、親グルコアミラーゼは配列番号２のＴｒＧＡアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも８８％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも、９３％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、及び少なくとも９９％の配列同一性を有している。
【００８１】
他の態様において、親グルコアミラーゼは配列番号３のＴｒＧＡアミノ酸配列の触媒ドメインに対して、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、及び少なくとも９８％の配列同一性を有している。
【００８２】
他の態様において、この親グルコアミラーゼは配列番号５又は配列番号６で定義されるアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の触媒ドメインに対して、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９３％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９６％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、少なくとも９８％の配列同一性、及び少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８３】
他の態様において、親グルコアミラーゼは配列番号８のフミコーラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）親グルコアミラーゼの触媒ドメインに対して少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９７％の配列同一性、及び少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８４】
更なる態様において、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）株から得られる。幾つかの好適なトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体は米国特許公開公報Ｎｏ．２００６／００９４０８０に記載されており、この文献の配列番号１７乃至２２及び４３乃至４７で定義される配列を参照されたい。
【００８５】
幾つかの好適な態様において、親グルコアミラーゼは配列番号２のアミノ酸配列を含むＴｒＧＡ又はこのＴｒＧＡ配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体である。
グルコアミラーゼ構造相同体
【００８６】
分子生物学のセントラルドグマは特定の酵素に対する遺伝子をコードしているＤＮＡの配列がタンパク質のアミノ酸配列を決定し、この配列が反対に酵素の３次元の折りたたみを決定している。この折りたたみが異なる残基を結合させ、触媒中心及び基質結合表面を形成し、その結果、酵素の高い特異性及び活性が生じる。
【００８７】
グルコアミラーゼは３つのもの異なる構造ドメインから成り、１つの触媒ドメインは約４５０残基であり、全てのグルコアミラーゼにおいて構造的に保存されている。通常触媒ドメインの後に、約１００残基のデンプン結合ドメインに結合する約３０乃至８０残基のリンカー領域がくる。これらの３つの領域が無傷で含まれているトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼは１．８音グルコアミラーゼとロームであると本明細書において測定された（表１５及び実施例１１参照）。座標を利用して（表１５参照）、すでに決定されているアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）株×１００の触媒ドメイン（Ａｌｅｓｈｉｎ，Ａ．Ｅ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｃ，Ｆｉｒｓｏｖ，Ｌ．Ｍ．，及びＨｏｎｚａｔｋｏ，Ｒ．Ｂ．１９９４  Ｒｅｆｉｎｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  Ｘｌ００．  Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２３８：  ５７５-５９１）にこの構造を整列させた。このアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）の結晶構造は触媒ドメインが含まれているのみであった。図１２及び１３に示すように、触媒ドメインの構造は非常にオーバーラップしており、構造的な重ね合わせに基づくと等しい残基である可能性があった。発明者らは、図１２及び１３に示す基本的な構造は全てのグルコアミラーゼが共通に持っていると信じる。
【００８８】
図１２は、側面から見た配列番号１のトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ（黒）（図１のアミノ酸配列参照）及びアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（グレイ）の３次元構造の比較である。この側面からみると、触媒ドメインとリンカー領域とデンプン結合ドメインの間の関係がわかる。
【００８９】
図１３は、上から見た、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ（黒）及びアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）（グレイ）の３次元構造の比較である。２つのグルコアミラーゼがここで示しているように、本出願時における全ての既知のグルコアミラーゼはこのような構造相同性を有している。全てのグルコアミラーゼについて構造の保存は活性の保存及び作用メカニズムの保存と関係がある。この高い相同性は、変更されて機能を生じるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼの部位特異変異体における変更が、他のグルコアミラーゼにおいても同様の構造及び機能も有することになる。それゆえ、所望の利益を生じる変異体の示唆は他のグルコアミラーゼにも適用できる。
【００９０】
従って、本明細書において議論されているアミノ酸の位置番号は図１で示す天然のトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼに対して番号付けされたものを意味する。本発明は、しかしながら、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼのこの変異体に限定することを意図するものではなく、トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（配列番号２）で定義される残基に等しいアミノ酸残基の位置でアミノ酸残基を含むグルコアミラーゼに適用することができる。本発明の好適な態様において、親グルコアミラーゼはタラロマイセス（Ｔａｌｅｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＡであり及び置換は本明細書で開示するＴａｌｅｒｏｍｙｃｅｓグルコアミラーゼにおけるアミノ酸残基の位置で行われる。他の態様において、親グルコアミラーゼは表１で示されているものである。更なる態様において、親グルコアミラーゼはＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ等のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍグルコアミラーゼである。
【００９１】
行動的な同一性は、アミノ酸残基が等しいかどうかで決定される。構造的な同一性は２つの構造（３次元構造及びアミノ酸構造）を整列させたときのお互いの位相的な等しさである。トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ（同じ又は似た結合、反応、又は相互化学作用する機能的な能力を有する）における残基の特定の残基及び位置に、相同（即ち、１次的な３次的構造のおける位置に対応している）であるか異なるかのいずれかであった場合、グルコアミラーゼの（アミノ酸）残基位置は、トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの残基に等しいと言う。
【００９２】
１次構造の同一性を確立するために、グルコアミラーゼのアミノ酸配列をトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）１次配列、及び特に配列が知られている個々のグルコアミラーゼにおいて不変であると知られている残基のセットと直接比較することができる。例えば、図４Ａ及び図Ｂはグルコアミラーゼ間で保存されている残基を示している。保存されている残基を整列させた後、アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失を行う（即ち、任意の欠失及び挿入により保存残基がなくならないようにする）。トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの１次配列における特定のアミノ酸に等しい残基が同定される。保存残基のアラインメントは好ましくは、そのような残基の１００％が保存されることが好ましい。しかしながら、保存残基の７５％より大きな又は５０％程度のアラインメントも等しい残基を同定することに適している。
【００９３】
例えば、図４において、６つの有機体からのグルコアミラーゼを整列させて、アミノ酸配列の相同性の最大量を提供する。これらの配列の比較は、アルタリスクで染まされるように、それぞれの配列において、多くの保存残基が含まれていることを示している。これらの保存残基は従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ由来グルコアミラーゼにおける、対応するトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの等しいアミノ酸残基を同定するのに用いる。
【００９４】
構造的な同一性は２つの構造の間の等しい残基の同定を含む。「等しい残基」はＸ線結晶画法（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）により同定されている３次元構造を有する酵素について、３次元構造（構造同一性）のレベルで相同性を決定することにより同定される。等しい残基はトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特定のアミノ酸残基の主鎖の２つ以上の原子配置（Ｎ上のＮ、ＣＡ上のＣＡ、Ｃ上のＣ、及びＯ上のＯ）が整列させた後に、０．１３ｎｍ以内、及び好ましくは０．１ｎｍ以内にあることであると定義される。アラインメントはトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼに意図するグルコアミラーゼの非水素タンパク質原子の原子配置の最大オーバーラップが得られるように、ベストモデルが配置され、位置合わせされた後に達成される。このベストモデルは、最も高い回折度における実験的な回折データについても最も低いＲ値を与えている結晶画法（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ）モデルである。
【式１】
【００９５】
0005568307.tif 000002
【００９６】
トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特定の残基に機能的に類似している等しい残基はタンパク質の構造、基質結合、又は触媒作用を、変更するか、修飾するか、又は貢献するかのいずれかにより、機能するように配置されられた酵素のアミノ酸であると定義され、トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの特定の残基にあると考えられている。更に、それらは、相同位置を占めている塩基が等しいとされる基準を満たさないけれども。所与の残基の主鎖原子がこの残基の主鎖原子の少なくとも２つの原子座標がトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍ以内に配置されているという点において、相同な位置にある、酵素の残基（三次元構造がｘ線結晶画法により得られている）である。トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼの三次元構造の配置は表１５で定義され、３次元構造のレベルで等しい残基を決定するための前述の概要を用いることができる。
【００９７】
置換のために同定された残基の幾つかは保存残基であるが、そうでないものもある。保存されない残基の場合、１つ以上のアミノ酸の置換は天然には天然において発見されるものに対応しないアミノ酸配列を有する変異体を生成する置換に限定される。保存残基の場合、そのような置換は自然発生配列とはならない。
変異体
【００９８】
本発明の変異体は親グルコアミラーゼからの配列において、異なる変異タンパク質遺伝子を生成する親グルコアミラーゼのアミノ酸配列において、少なくとも１つの置換、欠失、又は挿入を、含む。幾つかの態様において本発明の変異体は配列番号２のＴｒＧＡ活性のグルコアミラーゼ活性の、少なくとも２０％、少なくとも４０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも１００％の活性を有する。
【００９９】
幾つかの態様において、本発明の変異体は、親ＴｒＧＡ（配列番号２）の少なくとも１つのアミノ酸位置のおいて、あるいは、このＴｒＧＡ配列に少なくとも９０％の、少なくとも９３％の、少なくとも９５％の、少なくとも９７％の、少なくとも９９％の配列相同性を有するがこれには限定されない、他の親グルコアミラーゼの配列の等しい位置において、置換、欠失、又は挿入を含む。
【０１００】
他の態様において、本発明の変異体は親ＴｒＧＡのフラグメントの少なくとも１つのアミノ酸位置において、置換、欠失、又は挿入を含む。このフラグメントはＴｒＧＡ配列の触媒ドメイン（配列番号３）を含む。あるいは、本発明の変異体は、ＴｒＧａ配列に少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、及び少なくとも９９％の配列相同性を有するがこれらに限定されないＴｒＧＡ配列のフラグメントの触媒ドメインを含むフラグメント中の等しい位置において、置換、欠失、又は挿入を含む。幾つかの態様において、このフラグメントは少なくとも４００、４２５、４５０、及び／又は５００アミノ酸残基を含む。幾つかの態様において、親グルコアミラーゼが触媒ドメインだけでなく、リンカー領域、及びデンプン結合ドメインを含む場合、このフラグメントはリンカー領域の一部分を含んでいても良い。特に好適な態様において、この変異体は置換、欠失、及び挿入を、ＴｒＧＡ配列のフラグメントのアミノ酸配列（配列番号２又は３）中に含む。
【０１０１】
アミノ酸置換についての、構造的な同一性は相同なグルコアミラーゼ又は親グルコアミラーゼにおいて等しいアミノ酸位置で置換が起こることを意味する。この等しい位置の語は、ＴｒＧＡ参照グルコアミラーゼのアミノ酸配列及び三次元配列と、意図する親グルコアミラーゼの３次元構造の整列だけでなく、意図する親グルコアミラーゼのアミノ酸配列のアラインメントに基づき、２つの配列に共通な位置を意味する。例えば、図４を参照すると、ＴｒＧＡ（配列番号３）における２４位はＤ２４である、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（配列番号６）の等しい残基はＤ２５であり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａ（配列番号７）の等しい残基はＤ２６である。３次元配列の例示的なアラインメントについては、図１２及び１３を参照のこと。
【０１０２】
幾つかの態様において、グルコアミラーゼへは親配列のアミノ酸配列中に少なくとも１つの置換を含む。更なる態様において、この変異体は１つ以上の置換を有していてもよい（例えば、２、３又は４つの置換）。
【０１０３】
幾つかの態様において、グルコアミラーゼ変異体は図４（例えば、図４のアスタリスクで示されている位置に対応する位置のアミノ酸）に示す非保存アミノ酸の領域に態様する位置において少なくとも１つのアミノ酸位置において、置換、欠失、又は挿入を有していることが好ましい。
【０１０４】
１つの態様においてこの変異体は成熟タンパク質配列（配列番号２又は３）における任意の位置であるが、グルコアミラーゼ変異体は配列番号２又は３で定義されるアミノ酸配列の、４、５、１２、２４、２９、４３、４４、４５、４６、４７、４９、５１、７０、７５、７６、９４、１００、１０８、１１４、１１６、１１９、１２２、１２４、１２５、１３７、１４３、１４６、１４８、１６９、１７１、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２２８、２４２、２４３、２４５、２９２、２９４、２９７、３０９、３１０、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３２１、３４０、３４１、３５０、３５３、３５６、３６３、３６８、３６９、３７５、３７６、３９５、３９８、４０１、４０８、４０９、４１２、４１５、４１８、４２１、４３３、４３６及び４５１の位置及び／又は親グルコアミラーゼの等しい位置において１つ以上の置換を含む。幾つかの態様において、親グルコアミラーゼは配列番号２又は配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも８９％、及び少なくとも９９％の配列同一性を有している。他の態様において、この親グルコアミラーゼはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａグルコアミラーゼ相同体である。
【０１０５】
幾つかの態様において、グルコアミラーゼ変異体は配列番号２又は配列番号３で定義されるアミノ酸配列において、Ｄ４、Ｆ５、Ｉ１２、Ｄ２４、Ｆ２９、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｙ４７、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｙ７０、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｐ９４、Ｄｌ００、Ｋ１０８、Ｋｌ１４、Ｆｌ１６、Ｎｌ１９、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｇ１３７、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｙ１６９、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｗ１７８、Ｅ１８０、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｗ２２８、Ｎ２４２、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｒ３０９、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｙ３１５、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｗ３２１、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｒ４０８、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｈ４１８、Ｗ４２１、Ｒ４３３、１４３６、及び／又は  Ｓ４５１、及び／又は親グルコアミラーゼに置ける等しい位置（例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体）において、１つ以上の置換を含む。
【０１０６】
幾つかの態様において、親グルコアミラーゼの変異体は配列番号２又は３で定義されるアミノ酸配列の、４、５、２４、２９、４４、４９、７０、７５、７６、１００、１０８、１１９、１２４、１３７、１４６、１４８、１６９、１７１、１７２、１７５、１７８、１８１、２０８、２１１、２４３、２９２、２９４、２９７、３１４、３１６、３１７、３４０、３４１、３５０、３５６、３６３、３６８、３６９、３７６、３９５、４０１、４０９、４１２、４３３、４３６、及び／又は４５１の位置、及び／又は親グルコアミラーゼに置ける等しい位置（例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体）において、１つ以上の置換を含む。
【０１０７】
更なる態様において、この親グルコアミラーゼの変異体は配列番号２又は３で定義されるアミノ酸配列の、Ｄ４Ｌ／Ｅ ／Ｒ／Ｓ／Ｃ／Ａ／Ｑ／Ｗ、Ｆ５Ｃ／Ｍ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｉ１２Ｌ／Ｒ、Ｄ２４Ｅ／Ｌ／Ｙ／Ｔ、Ｆ２９Ｌ／Ｉ／Ｄ／Ｃ／Ｓ／Ｖ／Ｗ、Ｉ４３Ｆ／Ｒ／Ｄ／Ｙ／Ｓ、Ｄ４４Ｅ／Ｈ／Ｋ／Ｓ／Ｎ／Ｙ／Ｆ／Ｒ、Ｙ４７Ｗ、Ｙ４９Ｎ、Ｑ７０Ｒ／Ｋ／Ｍ／Ｐ／Ｇ／Ｌ／Ｆ、Ｑ７５Ｒ／Ｋ／Ａ、Ｒ７６Ｌ／Ｍ／Ｋ／Ｔ／Ｐ、Ｐ９４Ｌ、Ｄ１００Ｗ／Ｉ／Ｑ／Ｍ／Ｐ／Ａ／Ｎ、Ｎｌ１９Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｄ／Ｅ、Ｎ１４６Ｓ／Ｇ／Ｃ／Ｈ／Ｅ／Ｄ／Ｔ／Ｗ／Ｌ／Ｆ／Ｍ、Ｑ１４８Ｖ／Ｙ／Ｈ／Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｍ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、Ｙ１６９Ｄ／Ｆ、Ｑ１７２Ｃ／Ａ／Ｄ／Ｒ／Ｅ ／Ｆ／Ｈ／Ｖ／Ｌ／Ｍ／Ｎ／Ｓ／Ｔ／Ｖ、Ｆ１７５Ｈ／Ａ／Ｇ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｃ／Ｗ／Ｙ、Ｗｌ７８Ａ／Ｃ／Ｄ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｅｌ８０Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｒ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｙ、Ｖ１８１Ｅ／Ｃ／Ｄ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｓ／Ｌ／Ｋ／Ｆ／Ａ、Ｑ２０８Ｌ／Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｎ／Ｆ／Ｈ／Ｔ、Ｓ２１１Ｃ／Ｒ／Ｅ／Ａ／Ｙ／Ｗ／Ｍ／Ｈ／Ｌ／Ｉ／Ｒ／Ｑ／Ｔ、Ｅ２４３Ｓ／Ｒ／Ｎ／Ｍ／Ｙ／Ａ／Ｌ、Ｒ２４５Ａ／Ｅ／Ｍ／Ｉ／Ｐ／Ｖ、Ｉ２９２Ｄ／Ｈ／Ｐ／Ｒ／Ｔ／Ｎ／Ｖ／Ｆ／L、Ｇ２９４Ｄ／Ｅ／Ｔ／Ｑ／Ｉ／Ａ、Ｋ２９７Ｆ／Ｌ／Ｐ／Ｔ／Ｍ／Ｄ／Ｎ／Ｑ／Ａ／Ｙ／Ｈ／Ｓ／Ｒ／Ｗ、Ｒ３０９Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｎ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ／Ｌ、Ｙ３１０Ｅ／Ｇ／Ｌ／Ｐ／Ｓ／Ｗ／Ｒ／Ｑ、Ｄ３１３Ｑ、Ｖ３１４Ａ／Ｒ／Ｎ／Ｄ／Ｃ／Ｅ／Ｑ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／ＵＫ／Ｍ／Ｆ／Ｐ／Ｓ／Ｔ／Ｗ／Ｙ、Ｙ３１５Ｆ、Ｙ３１６Ｑ／Ｒ、Ｎ３１７Ｔ／Ｈ、Ｋ３４０Ｄ／Ｔ、Ｋ３４１Ｆ／Ｄ／Ｐ／Ｖ／Ｇ／Ｓ、Ｔ３５０Ｓ／Ｅ／Ａ／Ｎ、Ｑ３５６Ｈ／Ｄ／Ｅ、Ｔ３６３Ｌ／Ｒ／Ｃ／Ｈ／Ｗ、Ｓ３６８Ｗ／Ｄ／Ｆ／Ｌ、Ｓ３６９Ｆ、Ｎ３７６Ｑ／Ｔ／Ｈ／Ｓ／Ｖ、Ｙ３９５Ｑ／Ｒ／Ｓ、Ａ３９８Ｓ／Ｉ／Ｔ、Ｓ４０１Ｃ／Ｖ、Ｒ４０８Ｓ、Ｎ４０９Ｗ／Ｔ／Ｋ、Ｔ４１２Ａ／Ｈ／Ｋ／Ｇ、Ｒ４３３Ｈ／Ｑ、Ｉ４３６Ａ／Ｔ、Ｓ４５１Ｍ／Ｔ／Ｈ／の少なくとも１つの置換、及び／又は親グルコアミラーゼ相同体における等しい位置における置換を含む。
【０１０８】
幾つかの工程な態様において、このグルコアミラーゼ変異体は配列番号２で定義される５、２４、４３、４９、７０、７５、７６、９４、１１９、１４６、１４８、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２４５、２９４、３５３、３１５、３７５、４０９、３０９、３１４、３６９、４１２及び／又は親グルコアミラーゼ相同体における等しい位置において少なくとも１つの置換を含む。
【０１０９】
幾つかの特に好適な態様において、このグルコアミラーゼ変異体は配列番号２又は３で定義される位置に対応するＦ５Ｗ、Ｄ２４Ｅ、Ｉ４３Ｒ、Ｉ４３Ｙ、Ｉ４３Ｓ、Ｉ４３Ｆ、Ｙ４７Ｗ、Ｙ４９Ｎ、Ｑ７０Ｋ、Ｑ７５Ｒ、Ｒ７６Ｌ、Ｐ９４Ｌ、Ｎ１１９Ｐ／Ｔ／Ｙ／Ｄ、Ｎ１４６Ｓ／Ｄ／Ｔ／Ｅ／Ｗ／Ｌ、Ｑ１４８Ｖ、Ｎ１７１Ｄ、Ｑ１７２Ｃ／Ｄ／Ｒ／Ｅ／Ｆ／Ｖ／Ｌ／Ｔ、Ｆ１７５Ｒ／Ｗ／Ｙ、Ｗ１７８Ｋ／Ｎ／Ｙ、Ｅ１８０Ｈ／Ｎ／Ｖ／Ｒ、Ｖ１８１Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ／Ｈ、Ｑ２０８Ａ／Ｔ／Ｎ、Ｓ２１１Ｈ／Ｍ／Ｌ／Ｒ、Ｒ２４５Ｅ、Ｒ２４５Ｍ、Ｒ３０９Ｗ、Ｖ３１４Ｆ／Ｇ／Ｈ／Ｋ／Ｐ／Ｒ／Ｙ、Ｙ３１５Ｆ、Ｓ３６９Ｆ、Ｔ４１２Ｋの位置から選択される少なくとも１つの置換、及び／又は親グルコアミラーゼ相同体の等しい位置における置換を含む。
【０１１０】
更なる好適な態様において、グルコアミラーゼへは配列番号２又は３の５、４３、７５、７６、９４、１０８、１１９、１２４、１４６、１４８、１７１、１７２、１７５、１７８、１８０、１８１、２０８、２１１、２９７、３１４、３１６，又は４１２に対応する位置から線炊くされるアミノ酸残基の少なくとも１つの置換、及び／又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等しい位置における置換を含む。幾つかの好適な態様において、この置換は配列番号２又は３の１４８、１７２、１７５、１７８、１８０、２０８、２１１、３１４、４１２又は２９７の位置番号に対応する位置における置換、及び／又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等しい位置における置換である。
【０１１１】
幾つかの特に好適な態様において、この置換は配列番号２又は相同な親グルコアミラーゼ（例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体）の１０８、１２４、１７１、１７２、２０８、２１１、３１４又は３１６の位置番号に対応する位置における置換である。
【０１１２】
幾つかの態様において、このグルコアミラーゼ変異体は複数の置換を含む。この複数の置換の幾つかは配列番号２又は３の２４、４３、４４、１０８、１２４、１７１、１７５、１８１、２０８、２４３、２９２、２９４、２９７、３１０、３１４及び３６３に等しい及びこれらの位置を含む１つ以上の置換を含む。幾つかの好適な複数の置換は配列番号２又は３の１０８、１２４、１７１、２０８、２１１及び３１４に等しい及び対応する１つ以上の位置の含む。幾つかの態様において、このグルコアミラーゼ変異体は、Ｙ４７Ｗ及びＹ３１５Ｆ又はＹ４７Ｆ及びＹ３１５Ｗ等の複数の置換を含む。
【０１１３】
複数の置換の幾つかの例は、配列番号２又は３の
Ｄ２４／Ｉ４３／Ｄ４４／Ｆ１７５／Ｖ１８１／Ｖ３１４／Ｔ３６３；
Ｄ２４／Ｑ２０８／Ｉ２９２／Ｇ２９４／Ｋ２９７／Ｙ３１０；
Ｖ１８１／Ｅ２４３／Ｉ２９２／ｋ２９７／Ｎ３１７／Ｙ３９５；
Ｄ２４／Ｖ１８１／Ｑ２０８／Ｇ２９４／Ｔ３６３／Ｎ３７６／Ｎ４０９；
Ｄ２４／Ｖ１８１／Ｉ２９２／Ｇ２９４／Ｅ２４３／Ｎ４０９；
及びＩ４３Ｒ／Ｅ２４３／Ｉ２９２／Ｇ２９４／Ｋ２９７の位置、及び親グルコアミラーゼの等しい位置、及び特にトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等しい位置における置換を含む。
【０１１４】
幾つかの好適な複数の置換は、配列番号２又は３の
Ｄ２４Ｅ，Ｌ／Ｉ４３Ｆ，Ｒ／Ｄ４４Ｈ，Ｎ／Ｆ１７５Ｈ／Ｖ１８１Ｋ，Ｌ／Ｖ３１４Ｄ，Ｈ，Ｋ／Ｔ３６３Ｒ；
Ｄ２４Ｌ，Ｗ，Ｙ／Ｑ２０８Ｆ／Ｉ２９２Ｆ，Ｎ，Ｖ／Ｇ２９４Ａ，Ｉ，Ｑ／Ｋ２９７Ａ／Ｙ３１０Ｆ，Ｑ，Ｒ；
Ｖ１８１Ｆ，Ｋ，Ｌ／Ｅ２４３Ａ，Ｎ，Ｍ，Ｒ，Ｙ／Ｉ２９２Ｆ，Ｌ，Ｎ，Ｖ／Ｋ２９７Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ／Ｎ３１７Ｈ／Ｙ３９５Ｑ，Ｒ
Ｄ２４Ｅ，Ｌ，Ｙ／Ｖ１８１Ｆ，Ｋ，Ｌ／Ｑ２０８Ｃ，Ｆ／Ｇ２９４Ａ，Ｉ，Ｑ／Ｔ３６３Ｒ／Ｎ３７６Ｑ／Ｎ４０９Ｋ，Ｗ；
Ｄ２４Ｅ，Ｌ，Ｙ／Ｖ１８１Ｆ，Ｋ，Ｌ／Ｉ２９２Ｆ，Ｌ，Ｎ，Ｖ／Ｇ２９４Ａ，Ｉ，Ｑ／Ｅ２４３Ａ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｙ／Ｎ４０９Ｋ，Ｗ；及び
Ｉ４３Ｒ／Ｅ２４３Ａ，Ｍ，Ｎ，Ｒ，Ｙ／Ｉ２９２Ｆ，Ｌ，Ｎ，Ｖ／Ｇ２９４Ａ／Ｋ２９７Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｍ，Ｎ，Ｑ，Ｓ，Ｒ，Ｗ，Ｙの位置、及び親グルコアミラーゼの等しい位置、及び特にトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体における等しい位置における置換を含む。
【０１１５】
多くの親グルコアミラーゼをＴｒＧＡのアミノ酸配列に整列させた。図４は以下の親グルコアミラーゼの触媒ドメインを含んでいるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ（ＡａＧＡ）（配列番号５）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡ）（配列番号６）；  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｚｙａｅ（ＡｏＧＡ）（配列番号７）、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ（ＨｇＧＡ）（配列番号８）及びＨｙｐｏｃｒｅａ  ｖｉｎｏｓａ（ＨｖＧＡ）（配列番号９）。触媒ドメインの同一性％を以下の表１に示す。幾つかの態様において、例えば、この変異体グルコアミラーゼはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓグルコアミラーゼで親グルコアミラーゼ由来であり、及びこの変異体は配列番号２又は３で定義された位置と等しい位置において少なくとも１つの置換、特に、Ｄ４、Ｆ５、１１２、Ｄ２４、Ｆ２９、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｙ４７、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｙ７０、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｐ９４、Ｄｌ００、Ｋ１０８、Ｋｌ１４、Ｆｌ１６、Ｎｌ１９、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｇ１３７、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｙ１６９、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｗ１７８、Ｅ１８０、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｗ２２８、Ｎ２４２、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｒ３０９、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｙ３１５、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｗ３２１、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｒ４０８、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｈ４１８、Ｗ４２１、Ｒ４３３、１４３６，及び／又はＳ４５１に対応する位置において置換を含む。
【０１１６】
トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼにおけるＮ結合した糖の末端H（水素）は（温度から判断した場合）安定効果を有している。従って、Ｎ１７１Ｄの置換を有する変異体は野生型と比較した場合、増加された案手負い性を有している。幾つかの態様において、トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（配列番号２）におけるＮ１７１Ｄを含む、Ｎ結合した糖を有する部位における１つ以上の置換を有する変異体が提供される。
【表１】
0005568307.tif 000003
【０１１７】
本発明は、親グルコアミラーゼ、特にＴｒＧＡと比較した時に、少なくとも１つの変更された性質（例えば、改善された性質）を有するグルコアミラーゼ変異体を提供する。幾つかの好適な態様において、変更される少なくとも１つの性質（例えば、改善された性質）は、酸安定性、熱安定性、及び特異活性からなる群より選択される。好ましくは、この変更された性質は、高められた酸安定性、高められた熱安定性、及び／又は高められた特異活性である。好ましくは、高められた熱安定性は高い温度における安定性である。１つの態様において、高められたｐＨ安定性は高いｐＨである。更なる態様において、高められたｐＨ安定性は低いｐＨにおける安定性である。
【０１１８】
本発明のグルコアミラーゼ変異体は親グルコアミラーゼと比較して、低い基質濃度において、デンプン加水分解の速度がより高いことを特徴とする。この変異体は同じ条件で試験をした場合、親グルコアミラーゼよりも、Ｖｍａｘが高い、又はＫｍが低い。例えば、へグルコアミラーゼは２５℃乃至７０℃（例えば、２５℃乃至３５℃、３０℃乃至３５℃、４０℃乃至５０℃、５０℃乃至５５℃、及び５５℃乃至６２℃において）の温度範囲においてより高いＶｍａｘを示す。ミカエリス・メンテン係数である、Ｋｍ及びＶｍａｘは既知の方法を用いて容易に決定することができる。
熱安定性（熱安定性変異体）
【０１１９】
１つの側面において、本発明は親又は野生型グルコアミラーゼと比較して、変更された温度において、変更された熱安定性を有する変異体グルコアミラーゼを提供する。変更された温度は高められた又は低められた温度を含む。幾つかの態様において、グルコアミラーゼ変異体は、例えば、変更された温度に、少なくとも６０分、１２０分、１８０分、２４０分、３００分等の所与の期間曝した後に、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の酵素活性を有しているような、改善された熱安定性を有している。幾つかの態様において、この変異体は、好ましくは４．０乃至６．０のｐＨの範囲内で、４０℃乃至８０℃の範囲、５０℃乃至７５℃の範囲、及び６０℃乃至７０℃の範囲から選択される温度範囲において、親グルコアミラーゼと比較した場合、高められた熱安定性を有する。幾つかの態様において、この熱安定性は実施例において説明される。
【０１２０】
幾つかの態様において、熱安定性に関して特に意図する変異体は、配列番号２又は３で定義されるアミノ酸配列のＤ４、Ｆ５、Ｉ１２、Ｄ２４、Ｆ２９、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｙ４７、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｙ７０、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｐ９４、Ｄｌ００、Ｋ１０８、Ｋｌ１４、Ｆｌ１６、Ｎｌ１９、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｇ１３７、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｙ１６９、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｗ１７８、Ｅ１８０、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｗ２２８、Ｎ２４２、Ｅ２４３、Ｒ２４５、１２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｒ３０９、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｙ３１５、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｗ３２１、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｒ４０８、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｅ４１８、Ｗ４２１、Ｒ４３３、１４３６，及び／又はＳ４５１の位置、及び／又は親グルコアミラーゼのこれらの等しい位置において、１つ以上の欠失、置換、又は挿入を含む。幾つかの好適な態様において、この親グルコアミラーゼはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体であり、更に好適な態様において、この親グルコアミラーゼは配列番号２又は３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、及び少なくとも９８％同一である。
キメラグルコアミラーゼ
【０１２１】
本発明のグルコアミラーゼ変異体は、例えば、１つのグルコアミラーゼ由来のデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）、及び別のグルコアミラーゼ由来の触媒ドメイン及びリンカーを含む、キメラ又はハイブリッドグルコアミラーゼも含む。例えば、ハイブリッドグルコアミラーゼはＡｎＧＡのＳＢＤとＴｒＧＡのＳＢＤを交換して、ＡｎＧＡのＳＢＤとＴｒＧＡの触媒ドメイン及びリンカーを含むハイブリッドを生成することにより作られる。代替的に、ＡｎＧＡ由来ＳＢＤ及びリンカーをＴｒＧＡのＳＢＤ及びリンカーと交換してもよい。
特定活性
【０１２２】
他の側面において、本発明は親又は野生型グルコアミラーゼと比較して変更された特異活性を有する変異体グルコアミラーゼに関する。
【０１２３】
幾つかの態様において、改善された特異活性を有することについて特に意図する変異体は、１つ以上の欠失、置換、又は挿入を含み、特に配列番号２又は３で定義されるアミノ酸配列においてＤ４、Ｆ５、Ｉ１２、Ｄ２４、Ｆ２９、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｙ４７、Ｙ４９、Ｗ５１、Ｙ７０、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｐ９４、Ｄｌ００、Ｋ１０８、Ｋｌ１４、Ｆｌ１６、Ｎｌ１９、Ｒ１２２、Ｑ１２４、Ｒ１２５、Ｇ１３７、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｙ１６９、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｗ１７８、Ｅ１８０、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｗ２２８、Ｎ２４２、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｒ３０９、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｙ３１５、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｗ３２１、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｓ３６９、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｒ４０８、Ｎ４０９、Ｔ４１２、Ｈ４１８、Ｗ４２１、Ｒ４３３、１４３６、及び／又はＳ４５１の位置での、及び／又は親グルコアミラーゼにおけるこれらと等しい位置における置換を含む。幾つかの態様において、改善された特異活性を有する本発明の変異体は、配列番号２又は３で定義されるアミノ酸配列の、Ｄ４、Ｄ２４、Ｉ４３、Ｄ４４、Ｙ７０、Ｑ７５、Ｒ７６、Ｄｌ００、Ｋ１０８、Ｎｌ１９、Ｑ１２４、Ｎ１４６、Ｑ１４８、Ｎ１７１、Ｑ１７２、Ｆ１７５、Ｖ１８１、Ｑ２０８、Ｓ２１１、Ｅ２４３、Ｒ２４５、Ｉ２９２、Ｇ２９４、Ｋ２９７、Ｖ３１４、Ｙ３１６、Ｎ３１７、Ｋ３４０、Ｋ３４１、Ｔ３５０、Ｑ３５６、Ｔ３６３、Ｓ３６８、Ｎ３７６、Ｙ３９５、Ａ３９８、Ｓ４０１、Ｎ４０９、Ｔ４１２、１４３６、及び／又はＳ４５１及び／又は親グルコアミラーゼにおけるこれらと等しい位置における置換を含む。幾つかの好適な態様において、この親グルコアミラーゼは配列番号２又は３の配列と少なくとも９０％、又は少なくとも９５％同一な配列を含む。
ポリヌクレオチド
【０１２４】
本発明は本発明の変異体グルコアミラーゼをコードしている単離されたポリヌクレオチドにも関する。変異体グルコアミラーゼをコードしているポリヌクレオチドは当分野において確立された方法で調製することができる。このポリヌクレオチドは自動ＤＮＡ合成機等による、合成により調製される。このＤＮＡ配列は混合ゲノム（又はｃＤＮＡ）及びフラグメントを互いに結合することにより調製された合成物でもよい。このポリヌクレオチドは特定のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応方法（ＰＣＲ）により調製することもできる。通常、文献はＭｉｎｓｈｕｌｌ  Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．、（２００４）、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２（４）：４１６−４２７）である。Ｇｅｎｅａｒｔ  ＡＧ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙの様な合成ＤＮＡの業者は今や数が多い。
【０１２５】
本発明は、（ｉ）配列番号４に少なくとも７０％等しい、又は（ｉｉ）中乃至高度に過酷な条件下で配列番号４で定義される核酸配列由来のプローブにハイブリダイズすることができる、又は（ｉｉｉ）配列番号４で定義される配列に少なくとも９０％同一な核酸配列に相補的な、核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドも提供する。本発明に有用なプローブは配列番号４の少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、又はこれ以上連続した核酸を含む。
【０１２６】
本発明は更には２又は３のアミノ酸配列に少なくとも８０％の同一なアミノ酸を含む変異体グルコアミラーゼをコードする探知されたポリヌクレオチドを提供する。幾つかの態様において、この変異体グルコアミラーゼは配列番号２又は３に少なくとも８０％のアミノ酸配列の同一性を有している。幾つかの態様において、この変異体グルコアミラーゼは配列番号２に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列の同一性を有している。幾つかの態様において、この変異体グルコアミラーゼは配列番号２に対して少なくとも９３％のアミノ酸配列の同一性を有している。幾つかの態様において、この変異体グルコアミラーゼは配列番号２に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列の同一性を有している。幾つかの態様において、この変異体グルコアミラーゼは配列番号２に対して少なくとも９７％のアミノ酸配列の同一性を有している。幾つかの態様において、この変異体グルコアミラーゼは配列番号２に対して少なくとも９８％のアミノ酸配列の同一性を有している。幾つかの態様において、この変異体グルコアミラーゼは配列番号２に対して少なくとも９９％のアミノ酸配列の同一性を有している。本発明は前述のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクターも提供する。
【０１２７】
本発明は本明細書で提供される変異体グルコアミラーゼをコードしているＤＮＡのフラグメント（即ち、一部分）も提供する。これらのフラグメントは糸状菌細胞（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，及びＨｕｍｉｃｏｌａ）又はグルコアミラーゼ活性を有しているそれらの断片から本明細書で説明する成熟グルコアミラーゼ酵素をコードしているポリヌクレオチドを単離又は同定するために用いることができる部分的な長さのＤＮＡフラグメントを得るために用いることができる。幾つかの態様において、このＤＮＡフラグメントは少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００又はそれ以上の連続するヌクレオチドを含む。幾つかの対応において、配列番号４で提供されるこのＤＮＡの部分は、グルコアミラーゼをコードする糸状菌等の他株から、親グルコアミラーゼ、特にトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体を得るために用いることができる。
ＤＮＡ構築体及びベクター
【０１２８】
本発明の１つの態様において、本発明に包含される変異体グルコアミラーゼをコードしており、及びプロモーターに作動可能に結合している前述のポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築体を構築して宿主細胞内へ輸送する。
【０１２９】
このＤＮＡ構築体はベクターを用いて宿主細胞内へ導入する。このベクターは宿主細胞内に導入されたときに、好ましくは宿主細胞のゲノムに取り込まれ、複製されうる任意のベクターでよい。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。幾つかの好適な対応において、このベクターはグルコアミラーゼコード配列に作動可能に結合している調節配列を含む発現ベクターである。
【０１３０】
好適な発現ベクター及び／又は融合ベクターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、（１９８９）上記、及びＡｕｓｕｂｅｌ  （１９８７）上記、及びｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  ｉｎ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ  （Ｅｄｓ．）  ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．３９６−４２８及び米国特許Ｎｏ．５，８７４，２７６に記載されている。ベクターのリストについては、Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ  （ＦＧＳＣ、<www.fgsc.net>）を参照のこと。特に有用なベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＰｒｏｍｅｇａよる入手可能なベクターを含む。
【０１３１】
糸状菌宿主細胞に用いる特定のベクターは、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣｌ００、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１、ｐＤＯＮＲ（商標）２２１、ｐＥＮＴＲ（商標）、ｐＧＥＭ（商標）３Ｚ  及びｐＧＥＭ（商標）４Ｚ等を含む。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓに用いる一般的な発現ベクターはｇｌａＡプロモーターを有するｐＲＡＸを含み、Ｈｙｐｏｃｒｅａ／Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａについては、ｃｂｈ１プロモーターを含むｐＴｒｅｘ３ｇを含む。
【０１３２】
バクテリア細胞に有用な好適なプラスミドサンプルは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて複製できるｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１９、及びＢａｃｉｌｌｕｓにおいて複製できるｐＥ１９４を含む。
【０１３３】
幾つかの好適な態様において、プロモーターはバクテリア細胞又は糸状菌宿主細胞中で転写活性を示し、この宿主細胞に相同又は異種のいずれかの例えば、をコードしている遺伝子由来である。このプロモーターは変異していて良く、切断された、及び／又はハイブリッドプロモーターでも良い。前述のプロモーターは当業者に知られている。
【０１３４】
菌類、特にトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｌｕｓ等の糸状菌細胞に適したプロモーターの例は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉプロモーターである、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｌｇ１、ｅｌｇ２、ｅｌｇ５、ｘｌｎ１、及びｘｌｎ２を含む。他の有用なプロモーターの例としては、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ及びＡ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子（ｇｌａＡ）（例えば、Ｓｅｅ、Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ、（１９８４）ＭｏＩＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２３０６-２３１５及びＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ、（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１５８１−１５８５参照）、Ａ．ｏｒｙｚａｅＴＡＫＡアミラーゼプロモーター、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＴＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼ）プロモーター、アスペルギルスニデュランス（Ａｓｐｒｅｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ遺伝子由来のプロモーター、及びリゾムコアミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ遺伝子を含む。
【０１３５】
バクテリア細胞に有用なプロモーターの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロン；バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）；バチルススブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、ベータラクタマーゼ遺伝子、及びｔａｃプロモーターから得られたものを含む。
【０１３６】
１つの態様において、このプロモーターは天然の宿主細胞のものである。例えば、トリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）が宿主の場合、このプロモーターは天然のトリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）プロモーターである。他の態様において、このプロモーターは菌類宿主細胞に対して異種のものである。幾つかの態様において、このプロモーターはＴｒＧＡプロモーターのような、親グルコアミラーゼプロモーターである。
【０１３７】
幾つかの態様において、このＤＮＡ構築体はコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向かわせるポリペプチドのアミノ末端に作動可能に結合しているアミノ酸配列であるシグナル配列をコードする核酸を含む。この核酸配列のコード配列の５’末端は、天然では、シグナルペプチドコード配列を含み、このコード配列は、グルコアミラーゼのコード配列のセグメントに、翻訳領域フレームにおいて結合している。このグルコアミラーゼコード領域は分泌されるグルコアミラーゼをコードしている。この核酸配列のコード配列の５’末端はコード配列の外側にあるシグナルペプチドを含む。いくつかの態様において、このＤＮＡ構築体は変異体グルコアミラーゼを得るための親グルコアミラーゼに本来関係質得るシグナル配列を含む。幾つかの態様において、このシグナル配列は、配列番号１で定義される配列であるか、又はこの配列に少なくとも９０％、少なくとも９４％、及び少なくとも９８％の同一性を有している配列である。効果的なシグナル配列は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（トリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）グルコアミラーゼ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（フミコーラインソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ又はフミコーラグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ及びアスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ）、及びリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）由来の他の糸状菌酵素のグルコアミラーゼから得られたシグナル配列を含む。
【０１３８】
追加的な態様において、宿主細胞に導入されるシグナル配列及びプロモーターを含むＤＮＡ構築体又はベクターは幾つかの源由来でよい。いくつかの好適な態様において、Ｈｙｐｏｃｒｅａ株由来のシグナル配列のようなトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）グルコアミラーゼ相同体の天然グルコアミラーゼシグナル配列が用いられる。
【０１３９】
いくつかの態様において、この発現ベクターもターミネション配列も含む。宿主細胞の中で機能する任意のターミネーター配列を本発明に用いることができる。１つの態様において、このターミネーター配列及びプロモーター配列は幾つかの源由来でよい。他の態様において、このターミネーター配列は宿主細胞に相同なものでよい。有用なターミネーター配列はトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ｃｂｈ１；アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルスアワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）上記、及びＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）上記）、アスペルギルスニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルスオリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、又はアスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ｔｒｐＣ（Ｐｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）  ｇｅｎｅ  ５６：１１７−１２４）の遺伝子から得られたターミネーター配列を含む。
【０１４０】
いくつかの態様において、発現ベクターは選択マーカーを含む。好適な選択マーカーの例は、抗生物質耐性（例えば、ハイグロマイシン及びフレオマイシン）を付与する。栄養を選択するマーカーも本発明に用いることができ、これらはａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、及びｐｙｒＧ（オロチジン−５’フォスフェートカルボキシラーゼ）であると当業者に知られているマーカーを含む。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の軽質転換のためのベクターシステムに有用なマーカーは当業者に知られている（例えば、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、ｃｈａｐｔｅｒ  ６  ｉｎ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｄｓ．  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ（１９９２）；  Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ、Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｃｈａｐｍａｎ  Ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ；Ｂｅｒｇｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｅａｕ（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９：３５９−３６５；及びｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  ＭｏＩ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：７１-７５参照）。好適な態様において、選択マーカーはａｍｄＳ遺伝子であり、これはアセトアミダーゼ酵素をコードし、窒素源登録商標のアセトアミド上で軽質転換させた細胞を育成させることができる。選択マーカーとしてアスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子の使用はＫｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ、（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９  及びＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）ｇｅｎｅ６１：１５５−１６４に記載されている。
【０１４１】
変異体グルコアミラーゼ、プロモーター、ターミネーター、及び他の配列をコードしている核酸配列を含むＤＮＡ構築体を結合し、それらを好適なベクターに挿入するために用いる方法は当業者に知られている。結合は適した制限部位において結合することにより行うことができる。そのような部位が存在しない場合は、合成オリグヌクレオチドリンカーが従来の技術に従って用いられる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  （１９８９）上記、及び  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ、ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９１）  ｐｐ．７０―７６．）参照）。更に、ベクターは従来技術を用いて構築することができる（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
宿主細胞
【０１４２】
本発明は本発明の変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、本発明のグルコアミラーゼを生産するために用いる宿主細胞にも関する。幾つかの好適な態様において、この宿主細胞はバクテリア、菌類、植物、及び酵母細胞から選択される。宿主細胞の語は、本発明のグルコアミラーゼを生産する細胞、この細胞の子孫、及びこの細胞から生成されたプロトプラストを含む。
【０１４３】
幾つかの態様において、この宿主細胞は糸状菌細胞、好ましくは糸状菌宿主細胞である。「糸状菌」の語はユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門の全ての糸状菌を意味する（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ、Ｃ．Ｊ．（１９６２）、ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＯＲＹ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。これらの糸状菌は、キチン、セルロース、及び他の複合ポリサッカライドからなる細胞壁を有する栄養菌糸体により特徴付けられる。本発明の糸状菌は形態学的、生理的、及び遺伝的に酵母とは区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の伸長によるものであり、ほとんどの糸状菌の炭素異化は絶対好気性である。本発明において、糸状菌親細胞はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、（例えば、トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、依然はトリコデルマロンギブラキアタム（Ｔ．  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）として分類されていたハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）の無性形態、トリコデルマヴィリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマコニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマハルジアウム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）（Ｓｈｅｉｒ-Ｎｅｉｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０：４６−５３；ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５  Ａｎｄ  ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１）；ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、フミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐ．）（例えば、フミコーラインソレンス（Ｈ．ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコーララングイノサ（Ｈ．ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）及びフミコーラグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ））；クリソスポリウム種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）（例えば、クリソスポルクノエンス（Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ））、グリオクラジウム種（Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．）、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（例えば、アスペルギルスオリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスソジアエ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、アスペルギルスジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルスニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、及びアスペルギルスアワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ））（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９：７３８−７４３及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２）Ｇｅｎｅｔ  ４１：８９−９８）、フサリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）（例えば、フサリウムロセウム（Ｆ．ｒｏｓｅｕｍ）、フサリウムグラミナス（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フサリウムクレアリス（Ｆ．ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フサリウムオキシスポリウム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｉｍ）及びフサリウムベネナタム（Ｆ．ｖｅｎｅｎａｔｕｍ））、ニューロスポラ種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）、（ニューロスポレクラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ハイポクレア種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐ．）、ムコール種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）（ムコールミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ））、リゾプス（Ｒｈｉｚｏ���ｕｓ  ｓｐ）．及びエメリセラ種（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｓｐ．）（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ、（１９８５）Ｓｃｉ．２２８：２１−２６参照）の細胞であるがこれらに限定されない。「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）」又は「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株」、又は「トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種の語は、従来又は近年トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）に分類された任意の糸状菌を意味する。
【０１４４】
幾つかの態様において、宿主細胞はグラム陽性バクテリア細胞である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、（例えば、ストレプトマイセスリビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトマイセスコエリコロラ（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）及びストレプトマイセスグリセウス（Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓ））及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を含む。本明細書において、「Ｂａｃｉｌｌｕｓ属」の語は、バチルススブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスリケニフォルミスス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチスルブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアルカロフィリス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスクラウシ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルスハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルスメガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルスコアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルスダーキュランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルスラウタス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、及びバチルスツリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）を含むがこれらに限定されない、当業者にバシルスであると認識されている全てのバシルスを含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓは分類学上の再編成を受け続けていることは理解されるべきである。従って、この属は、現在は、ゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）と命名されている、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）を含むがこれらに限定されない、この属に分類されていた種を含む。
【０１４５】
いくつかの態様において、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種等のグラム陰性バクテリア株である。他の態様において、この宿主細胞はサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、シゾサッカロミセス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ピチア種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、又はカンジダ種（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ）等の酵母細胞である。
【０１４６】
他の態様において、この宿主細胞は、例えば、バクテリア又は糸状菌細胞中の欠失にとり、天然の遺伝子が不活性化させられている遺伝子操作されて宿主細胞である。１つ以上の失活した遺伝子を有する糸状菌宿主細胞をえるには、既知の方法を用いることができる（例えば、米国特許Ｎｏ．５，２４６，８５３、米国特許Ｎｏ．５，４７５，１０１及びＷＯ９２／０６２０９に記載の方法）。遺伝子の失活は、完全又は部分的な欠失、挿入による失活、又はその目的とする遺伝子を機能させないようにする他の任意の手段（遺伝子が機能的なタンパク質を発現させないようにする）により達成することができる。いくつかの態様において、宿主細胞がトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞、特にトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞である場合、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２遺伝子失活させ、このましくは欠失させられる。特に好適な４個一組の欠失タンパク質を有するトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞は米国特許Ｎｏ．５，８４７，２７６及びＷＯ０５／００１０３６に記載されている。他の態様において、この宿主細胞はプロテアーゼ欠失又はプロテアーゼマイナス株である。
宿主細胞の軽質転換
【０１４７】
宿主細胞へのＤＮＡ構築体又はベクターの導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核酸注入、形質導入、リポフェクチョン仲介及びＤＥＡＥ−デキストリン仲介形質感染を含む形質感染、カルシウムリン酸ＤＮＡ沈殿によるインキュベーション、ＤＮＡコートのマイクロプロジェクタイルを用いた高速遺伝子銃及びプロトプラスト融合を含む。一般的な形質転換技術はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）上記、9章及びＳａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）上記、に記載されている。糸状菌の形質転換のより詳しい方法はＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６に開示されている。
【０１４８】
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の形質転換方法はＡｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ  Ｃ  Ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｐｉｚｉｚｅｎ（１９６１）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：７４１−７４６及びＷＯ  ０２／１４４９０を含む数多くの文献に記載されている。
【０１４９】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のための形質転換方法はＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４；  Ｂｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）ｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｄｓ．Ｋｅｌｌｙ  Ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ）；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）Ｓｃｉ．９：９９１−１００１；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ、（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３-５６  及びＥＰ  ２３８  ０２３に記載されている。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）における異種タンパク質の発現は、米国特許Ｎｏ．６，０２２，７２５；米国特許Ｎｏ．６，２６８，３２８；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７-２３３；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）ＢＩＯ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：５９６−６０３；ＥＰ  ２４４，２３４；ＥＰ  ２１５，５９４；Ａｎｄ  Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ.、“ＴＨＥ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ”、ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ、Ｅｄｓ．Ｌｅｏｎｇ  Ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．、ＮＹ  （１９９２）  ｐｐ．１２９−１４８）に記載されている。Ｆｕｓａｒｉｕｍ株の形質転換については、ＷＯ９６／００７８７及びＢａｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２０２-２８２１２を参照のこと。
【０１５０】
１つの特定の態様において、形質転換のためのトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐ．）の調製は糸状菌菌糸からプロトプラストを調製することを含む（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３-５６；Ｐｅｎｔｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１：１５５-１６４参照）。アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を媒体とした糸状菌の形質転換方法が知られている（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８３９-８４２参照）。糸状菌宿主に用いる形質転換方法については、米国特許Ｎｏ．６，０２２，７２５及び米国特許Ｎｏ．６，２６８，３２８も参照のこと。
【０１５１】
好ましくは、遺伝的に安定な形質転換方法がベクターシステムを用いて構築され、それゆえ、変異体グルコアミラーゼをコードしている核酸が安定に宿主細胞染色体に取り込まれることが好ましい。形質転換体はその後、既知の方法で生成される。
【０１５２】
更なる幾つかの態様において、宿主細胞植物細胞である。そのような細胞は単子葉植物（例えば、コーン、コムギ、及びソルガム）、又は双子葉植物（例えば、ダイズ）からの細胞である。植物の形質転換に有用なＤＮＡ構築体を作る方法及び植物の形質転換方法は知られている。これらの方法のいくつかは、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒体遺伝子輸送、微量注入照射  （ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍａｒｄｍｅｎｔ）、プロトプラストのＰＥＧ媒体形質転換；エレクトロポレーション等を含む。参考文献は、米国特許Ｎｏ．６，８０３，４９９、米国特許Ｎｏ．６，７７７，５８９；  Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：８３３-８３９；Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＭｏＬ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１６９−１７７である。
タンパク質の生産
【０１５３】
本発明は更に、本発明の変異体グルコアミラーゼをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する宿主細胞を形質転換させることを含む変異体グルコアミラーゼを生産する方法に関する。この方法は任意で、変異体グルコアミラーゼの生産に適した条件下で宿主細胞を培養する工程、及び任意でこのグルコアミラーゼを回収する工程を含む。
【０１５４】
本発明の発現及び生産方法において、宿主細胞は、生理的な塩類及び栄養含む好適な培地を含む、実験室規模又は工業的規模の、小スケール又は大スケール（連続、バッチ、及びフェドバッチを含む）振とうフラスコ培養条件下で培養される（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ、Ｊ．ｅｔ  al、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ、ｅｄｓ．Ａｕｂｅｒｔ、Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．、  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ．７１-８６、１９８８及びＩｌｍｅｎ、Ｍ．ｅｔ  ａl、（１９９７）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８-１３０６参照）。一般的な市販の調製培地（例えば、酵母モルト抽出物（ＹＭ）ブロス、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、及びサブローデキストロース（ＳＤ）ブロス）も本発明に用いることができる。バクテリア及び糸状菌細胞に好適な培養条件は当業者にしられており、特定の文献及び／又はアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）及び糸状菌遺伝子ストックセンター（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）等の菌類の供給源において開示されている。グルコアミラーゼコード配列が誘発プロモーターの制御下にある場合、誘発因子（例えば、糖、金属塩、又は抗生物質）をグルコアミラーゼ発現を誘発するのに効果的な濃度で添加される。
【０１５５】
幾つかの態様において、本発明は、変異体の生産に好適な条件下で本発明のグルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを含む植物又は植物細胞を培養することを含む変異体グルコアミラーゼを生産する方法に関する。該方法は任意でこのグルコアミラーゼを回収する工程を含む。
【０１５６】
幾つかの態様において、本発明の変異体グルコアミラーゼをコードするポリヌクレオチドで形質転換させた細胞系統による変異体グルコアミラーゼの発現を評価するために、タンパク質のレベル、ＲＮＡレベルでのアッセイ及び／又はグルコアミラーゼ活性及び／又は生成のための機能的なバイオアッセイが行われる。いくつかのアッセイは、ノザンブロット、ドットブロッティング（ＤＮＡ又はＲＮＡアッセイ）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転者ポリメラーゼ連鎖反応方法）、又は適したラベルプローブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダーゼーション（核酸コード配列に基づく）、及び従来のサザンブロッティング及びオートラジオグラフィーを含む。
【０１５７】
更に、変異タンパク質遺伝子グルコアミラーゼの生産及び／又は発現は、サンプルで直接、例えば、培地中のグルコース等の還元糖の減少を測定することにより、及びグルコアミ活性、発現、及び／又は生産をアッセイすることにより、直接測定できる。特に、グルコアアミラーゼ活性は３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）方法でアッセイされる（例えば、Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９４）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：４９−５４参照）。更なる態様において、タンパク質発現、は細胞、組織断片の免疫学的染色又は組織培養培地のイムノアッセイ（例えば、ブロット又はＥＬＩＳＡによる）により評価する。このような方法の詳細は当業者の知識の範囲内であり、このような方法に用いる多くの試薬は市場において入手可能である。
【０１５８】
本発明のグルコアミラーゼは、遠心、ろ過、抽出、沈殿等を含む当業者に知られている方法を用いて培地から回収される。
相同体
【０１５９】
変異体グルコアミラーゼはデンプンの加水分解、糖化工程、洗浄用及び潜在組成物（例えば、洗濯用洗剤、食器用洗剤、及び硬表面洗浄組成物）、アルコール発酵組成物、及び動物飼料組成物中に用いられる。更に、変異体グルコアミラーゼはパン及びケーキ等のベーキング製品、醸造、ヘルスケア、再生可能資源転換工程、バイオパルプ処理工程、及びバイオマス転換製品に用いられる。
【０１６０】
幾つかの態様において、培養培地においてえられた、又は培養培地から回収された本発明の変異体グルコアミラーゼを含む酵素組成物は、アルファアミラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、イソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、シクロデキストリングルコトランスフェラーゼ、リパーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、オキシダーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、キシラナーゼ、顆粒デンプン加水分解酵素、及び他のグルコアミラーゼの任意の１つ又は任意の組合せの酵素と組み合わせて用いられる。１つの態様においてこのプロテアーゼは酸性糸状菌プロテアーゼ（ＡＦＰ）である。更なる態様において、この酸性糸状菌プロテアーゼはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）である（例えば、ＮＳＰ−２４、２００６年７月１３日に提出された米国特許出願Ｎｏ．２０００６／０１５３４２の配列１０を参照のこと。該文献を参照により本明細書に援用する）。更なる態様において、フィターゼはＢｕｔｔｉａｕｘｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．（例えば、ＢＰ−１７、ＷＯ２００６／０４３１７８）参照のこと。
【０１６１】
幾つかの好適な組成物において、本発明の変異体グルコアミラーゼは糸状菌アルファアミラーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）又はバクテリアアルファアミラーゼ（例えば、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）等のバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．））及びそれらの変異体及びハイブリッドと組み合わせて用いられる。１つの態様において、このアルファアミラーゼは酸安定性アルファアミラーゼである。１つの態様において、このアルファアミラーゼは顆粒デンプン加水分解酵素（ＧＳＨＥ）である。１つの態様において、このアルファアミラーゼはアスペルギルスカワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ）アルファアミラーゼ（ＡＫＡＡ）（米国特許Ｎｏ．７，０３７，７０４参照）である。本発明の組成物中に用いる市販のアルファアミラーゼは既知のものでよく、ＧＺＹＭＥ  Ｇ９９７、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＸＴＲＡ、ＳＴＡＲＧＥＮ  （Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ、Ｉｎｃ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ  １２０−Ｌ及びＳＵＰＲＡ  （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｂｉｏｔｅｃｈ．）及びＶＩＲＩＤＩＵＭ  （Ｄｉｖｅｒｓａ）を含む。
【０１６２】
他の好適な態様において、本発明の変異体グルコアミラーゼは他のグルコアミラーゼと組み合わせて用いられる。幾つかの態様において、本発明のグルコアミラーゼはアスペルギルスオリザエ（Ａ.  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルスニガー（Ａ.  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスカワチ（Ａ.  ｋａｗａｃｈｉ）、及びアスペルギルスアワモリ（Ａ.  ａｗａｍｏｒｉ）等のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はそれらの変異体由来のグルコアミラーゼ；フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の株又はそれらの変異体、好ましくはフミコーラグリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）由来のグルコアミラーゼ（そのようなグルコアミラーゼはＷＯ０５／０５２１４８に記載の配列番号に対して９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％の配列相同性有する）；タラロマイセス（Ｔａｒａｌｏｍｙｃｅｓ又はそれらの変異体の株由来のグルコアミラーゼ（特にタラロマイセスエメソニ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））；アセリア（Ａｔｈｅｌｉａ）及び特にアセリアロルフシ（Ａ．ｒｏｌｆｓｉｉ）由来のグルコアミラーゼ；ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、特にペニシリウムクリヨロゲウム（Ｐ．ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）由来のグルコアミラーゼの１つ以上と組み合わせて用いられる。
使用
【０１６３】
特に、変異体グルコアミラーゼはデンプンの転換工程、及び特にフルクトースシロップのためのデキストロース生産工程、特にデンプン含有基質の発酵から糖及びアルコール及び他の最終生成物（例えば、有機酸、アスコルビン酸、及びアミノ酸）を生産する工程に用いられる（Ｇ．Ｍ．Ａ  ｖａｎ  Ｂｅｙｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｄｓ．（１９８５）ＳＴＡＲＣＨ  ＣＯＮＶＥＲＳＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．ＮＹ）。本発明の変異体グルコアミラーゼ組成物を用いて生成されたデキストリンは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のグルコース生産となる。本発明のグルコアミラーゼを用いてデンプン基質の発酵から得られたアルコールは燃料アルコール又はポータブルアルコールの生産を含む。幾つかの態様において、アルコールの生産は、変異体グルコアミラーゼが親グルコアミラーゼと同じ条件下で用いたときにアルコール生産の割合が大きい。幾つかの態様において、アルコールの生産は、親グルコアミラーゼと比較して、約０．５％乃至２．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％。２．１％、２．２％、２．３％、及び２．４％ほど高い。
【０１６４】
１つの好適な態様において、本発明の発明の変異体グルコアミラーゼはアルコール生産に用いられる各種植物ベースの基質からデンプンを加水分解することに用いることができる。幾つかの好適な態様において、この植物ベース基質はコーン、コムギ、オオムギ、ライムギ、マイロ、コメ、トウキビ、ジャガイモ、及びこれらの組合せを含む。幾つかの態様において、この植物ベース基質は繊維、顆粒、タンパク質、及びデンプン（胚乳）等に分画された植物物質、例えば、コーン等の穀物顆粒である（米国特許Ｎｏ．６，２５４，９１４及び米国特許Ｎｏ．６，８９９，９１０）。アルコール発酵の方法はＴＨＥ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＴＥＸＴＢＯＯＫ、Ａ  ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＢＥＶＥＲＡＧＥ、ＦＵＥＬ  ＡＮＤ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＡＬＣＯＨＯＬ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ、３ｒｄ  Ｅｄ．、Ｅｄｓ  Ｋ．Ａ．  Ｊａｃｑｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＵＫに記載されている。特に好適な態様において、このアルコールはエタノールである。特に、アルコール発酵工程は湿式製粉工程又は乾燥製粉工程により特徴付けられる。幾つかの態様において、この変異体グルコアミラーゼは湿式製粉発酵工程に用いられ、他の態様において、この変異体グルコアミラーゼは乾燥製粉工程に用いられる。
【０１６５】
乾燥顆粒製粉は多くの基本的な工程を含む。それらは、通常、粉砕、焼成、液化、糖化、発酵、及び液体と固体の分離、をしてアルコールと他の副生成物に分離する。植物物質、特にコーン、コムギ、又はライムギ等の穀物顆粒全体を粉砕する。幾つのケースにおいて、穀物顆粒を最初に成分ごとに分類する。地下植物は粗い又は細かい粒子をえるために製粉される。地下植物物質はスラリートランク内で液体と混合される。（例えば、水及び／又は薄い物置台（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）このスラリーを液化酵素を含む水蒸気調理器中で高温に曝し（例えば、９０℃乃至１０５℃又はより高温）、顆粒状のデンプンを可溶化及び加水分解してデキストリンにする。この混合物を冷却して、更に本発明のグルコアミラーゼのような糖化酵素を用いて、グルコースを生成する。グルコースを含むマッシュをその後エタノール生成微生物等の発酵微生物、特に酵素の存在下で（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）、約２４時間乃至１２０時間、発酵させる。マッシュ中の固形物を液相から分離して。エタノール等のアルコール及び醸造穀物等の有用な副生成物が得られる。
【０１６６】
幾つかの態様において、糖化工程及び発行工程は一緒に行われ、及び／又はこの工程は糖化発酵同時工程、又は同時糖化、酵母プロパゲーション、及び発酵同時工程と言われる。
【０１６７】
他の態様において、変異体グルコアミラーゼはデンプン加水分解の工程に用いられる。この工程の温度は３０℃乃至７５℃の間の温度、及び４０℃乃至６５℃の間の温度であり、ｐＨは３．０乃至６．５の間である。幾つかの態様における発酵工程は、穀物顆粒の粉砕又は穀物の分画、及びこの粉砕された穀物顆粒を液体と混合して、スラリーを形成する好ましくは工程、その後、単一の反応管の中で本発明の変異体グルコアミラーゼ、任意でアルファアミラーゼ、他のグルコアミラーゼ、フィターゼ、プロテアーゼ、オウルラナーゼ、イソメラーゼ、又は顆粒デンプン加水分解活性を有する他の酵素、及び酵母を含むがこれらに限定されない他の酵素と混合して、エタノール及び他の副生成物を生成する（米国特許Ｎｏ．４，５１４，４９６、ＷＯ０４／０８１１９３、及びＷＯ０４／０８０９２３）。
【０１６８】
幾つかの態様において、本発明は本発明の変異体グルコアミラーゼを用いた酵素糖化工程を含むデンプン溶液を糖化する方法に関する。
【０１６９】
本発明は、本発明の変異体グルコアミラーゼの少なくとも１つを含む動物飼料も提供する。デンプンを含む飼料の生産にグルコアミラーゼ酵素を用いる方法は２００２年１２月１３日に提出されたＷＯ０３／０４９５５０に記載されている（この文献を参照により本明細書に援用する）。グルコアミラーゼは、動物の体内では利用されにくいデンプンを分解することができる。
【０１７０】
本発明の他の目的及び／又は利点は本明細書により明らかである。
試験方法
【０１７１】
以下の開示及び実施例のセクションにおいて、以下の略語を用いる：ＧＡ（グルコアミラーゼ）、ＧＡＵ（グルコアミラーゼ単位）、ｗｔ％（重量パーセント）、℃（摂氏）、ｒｐｍ（１分間当たりの回転数）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ｄｌＨ２Ｏ（脱イオン水、ミリＱろ過）、ａａ又はＡＡ（アミノ酸）、ｂｐ（ベースペア）、ｋｂ（キロベースペア）、ｋＤ（キロダルトン）、ｇ又はｇｍ（グラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μＬ（マイクロリットル）、μＭ（マイクロモル）、Ｕ（単位）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（ｓ）又はｓ（ｓ）（秒）、ｍｉｎ（ｓ）又はｍ（ｓ）（分）、ｈｒ（ｓ）又はｈ（ｓ）（時間）、ＤＯ（溶存酸素）、ＡＢＳ（吸光度）、Ｎ（ノーマル）、ＤＰ１（モノサッカライド）、ＤＰ２（ジサッカライド）、ＤＰ＞３（オリゴサッカライド、重合度が３以上の糖）、ｐｐｍ（１００万分の１）。
【０１７２】
変異体を提供するために用いる方法を以下で説明する。しかしながら、異なる方法も親分子の変異体を提供するために用いることができ、本発明の発明を実施例の方法に限定することは意図しない。
９６ウェルマイクロタイタープレートのｐＮＧグルコアミラーゼ活性
【０１７３】
試薬溶液を以下に示す：ＮａＡｃ緩衝液：２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５；基質：ＮａＡｃ緩衝液中５０ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄグルコピラノシド（シグマＮ−１３７７）（０．３ｇ／２０ｍｌ）及び停止溶液：８００ｍＭグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）。３０μＬろ過上清を新しい平底ＭＴＰの９６ウェルに入れる。各ウェルに５０μＬのＮａＡｃ緩衝液及び１２０μＬの基質を添加して５０℃で３０分間インキュベートする。（サーモラボシステム（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍ）ｉＥＭＳインキュベータ／シェーカーＨＴ）。反応を１００μＬの停止溶液を入れて終らせる。４０５ｎｍの吸光度をＭＴＰリーダーで測定する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｅｃ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３８４  ｐｌｕｓ）。０．００１１μＭ／ｃｍのモル休校係数をもちいて活性を測定する。
安定性アッセイ
【０１７４】
粗上清（１００μｌ）を１００μＬの５０ｍＭＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．５に添加した。このサンプルを２つのＭＴＰに分けた。１つのＭＴＰ（初期プレート）を４℃で２時間インキュベーションし、他のＭＴＰ（加熱プレート）を６０℃で１時間（サーモラボシステム（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂ  ｓｙｓｔｅｍ）ｉＥＭＳインキュベータ／シェーカーＨＴ）インキュベーションした。残りのプレートを氷上で１５分間冷却した。以下で説明するエタノールアプリケーションアッセイを用いて両方のプレートについて活性を測定した。この方法は熱安定性アッセイに用いたサンプルの量を２５μＬにして、３０ｍＭＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．０を３５μＬの量で用いた点について変更を加えている。
【０１７５】
熱安定性は残り活性のパーセンテージ（％）で示され、以下のように計算される：
（ＡＢＳ（３４０）加熱−ブランク）／（ＡＢＳ（３４０）初期−ブランク）×１００。
【０１７６】
育成期間の後の培養培地における残りのグルコースに粗上清を試験した。もし、グルコースが残っていれば、残りの活性として、両初期活性の測定吸光度から吸光度を差し引くことができる。
９６ウェルマイクロタイタープレートにおける例えば、生成のブラッドフォードアッセイ
【０１７７】
試薬溶液はＢｒａｄｆｏｒｄＱｕｉｃｋｓｔａｒｔ  ｗｏｒｋ溶液（バイオラド、カタログＮｏ．５００−０２０５）。１００μＬｎｏ１０ｋＤフィルターろ過した上清を平底ＭＴＰの９６ウェルに入れた。各ウェルに２００μＬの試薬を添加し、室温で５分間インキュベーションした。５９５ｎｍの吸光度をＭＴＰリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｅｃ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３８４  ｐｌｕｓ）で測定した。タンパク質の濃度はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準曲線（０乃至５０μｇ／ｍｌ）を用いて計算した。
ヘキソキナーゼ活性アッセイ
【０１７８】
ヘキソキナーゼカクテル（混合物）：使用の１０乃至１５分前に、９０ｍｌの水をＢｏａｔＩＬコンテナグルコースＨＫＲ１（ＩＬテストグルコース（ＨＫ）キット、インスツルメントラボラトリー＃１８２５０７−４０）に添加し、ゆるやかに混合した。８５μＬのヘキソキナーゼカクテルを１００μＬｎｏｄＨ２Ｏに添加した。１５μＬのサンプルをこの混合物に添加し、暗室で５分間、室温でインキュベーションした。ＭＴＰリーダーで３４０ｎｍの吸光度を測定した。グルコース濃度はグルコースの標準曲線（０−１ｍｇ／ｍｌ）を用いて計算した。
エタノールアプリケーションのアッセイ条件
【０１７９】
８％ストック溶液：８ｇの可溶性コーンデンプン（シグマ＃Ｓ４１８０）を室温で４０ｍｌのｄＨ２Ｏに懸濁した。２５０ｍｌのフラスコ内で、５０ｍｌの沸騰ｄＨ２Ｏをこのスラリーに添加して５分間加熱した。デンプン溶液を２５℃に冷却し、ｄＨ２Ｏｄｅ１００ｍｌになるよに容量を調節した。
【０１８０】
停止溶液：８００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．０
【０１８１】
４％（ｍ／ｖ）可溶性デンプン希釈標準溶液：１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０でストック溶液を１：１希釈する。
【０１８２】
５０μＬの３０ｍＭＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．０を新しい９６ウェル平底プレートに入れた。各ウェルに１２０μＬの４％可溶性コーンデンプン及び１０μＬの１０ｋＤろ過上清を添加し、９００ｒｐｍで３２℃２時間インキュベーションした。（サーモラボシステム  いＥＭＳ  インキュベータ／シェーカーＨＴ）。９０μＬの４℃に冷却した溶液を添加して反応を止めた。サンプルを氷上で冷却した。１５℃で５分間７１６ｘｇでデンプンを遠沈させ、１５μＬの上清を、グルコース含量の測定と同様にヘキソキナーゼ活性のアッセイに用いた。
甘味料アプリケーションのアッセイ条件
【０１８３】
８％ストック溶液：８ｇの可溶性コーンデンプン（シグマ＃Ｓ４１８０）を室温で４０ｍｌのｄＨ２Ｏに懸濁した。２５０ｍｌのフラスコ内で、５０ｍｌの沸騰ｄＨ２Ｏをこのスラリーに添加して５分間加熱した。デンプン溶液を２５℃に冷却し、ｄＨ２Ｏｄｅ１００ｍｌになるよに容量を調節した。
【０１８４】
停止溶液：８００ｍＭのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０．０
【０１８５】
４％（ｍ／ｖ）可溶性デンプン希釈標準溶液：１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０でストック溶液を１：１希釈する。
【０１８６】
５０μＬｎｏ８０ｍＭＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４．５を新しい９６ウェル平底プレートに入れた。各ウェルに１２０μＬの４％可溶性コーンスターチ及び５μＬの１０ｋＤろ過上清を添加し、６０℃で１時間インキュベーションした。４℃に冷却した停止溶液を９０μＬ入れて反応を停止させた。このサンプルを氷上に３０分間静置させた。デンプンを１５℃で５分間７１６ｒｐｍで遠沈させ（シグマ  ６Ｋ１５  遠心分離機）、１５μＬの上清を、グルコース含量の測定と同様にヘキソキナーゼ活性のアッセイに用いた。
【実施例】
【０１８７】
以下の実施例を特定の好適な態様の実施及び説明の目的で提供する。本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
【０１８８】
ＴｒＧＡシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）、プロピレン配列、及び成熟タンパク質からなり、触媒ドメイン、リンカー領域、及びデンプン結合ドメインＴｒＧＡ発現カセットをｐＤＯＮＲ（商標）、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）エントリーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）内にクローンした。このＴｒＧＡ発現カセットは、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）ＬＲ組換反応により、ＧａｔｅｗａｙのコンパチブルデスティネーションベクターｐＲＥＰ３Ｙ−ＤＥＳＴ（図３）内へクローンされた。
【０１８９】
ｐＲｅｐ３Ｙ−ＴｒＧＡ発現ベクター（図３）はシゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）において、ＴｒＧＡタンパク質（配列番号２）を発現することができる。
【０１９０】
６５のＴｒＧＡ部位飽和変異（ＳＳＭ）ライブラリーを表２に記載のものをテンプレート及びプライマーとしてｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡエントリーベクター（図２）を用いて構築した。この試験に用いた変異誘発プライマーは全てＮＮＳ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ及びＳ＝Ｃ又はＧ）コドンをＴｒＧＡ配列（配列番号２）を変異させ及び核酸のランダム取り込みを開始させる位置に含んでいる。各ＳＭＭライブラリーの構築は、Ｇａｔａｗａｙフォワード‘ｐＤＯＮＲ２０１−ＦＷ）及び特定のリバース変異誘発プライマー（表３）、及びＧａｔａｗａｙリバースプライマー（ｐＤＯＮＲ２０１−ＲＶ）、及び特定のフォワード変異誘発プライマー（表２）（変異誘発プライマーの対して等しい位置）をもちいた２つのＰＣＲ増幅により開始された。フュージョンハイフェデリティー（Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ  ＯＹ、Ｅｓｐｏｏ、Ｆｉｎｌａｎｄ）をフィンザイム（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ）のプロトコルに従ってＰＣＲ増幅に用いた（０．２μＬプライマー、２５サイクル）。簡単に説明すると、両方の特定のＰＣＲ混合物、両方の同じコドンを標的とする、１μＬのＤＮＡ（配列番号１）フラグメントをＧａｔｅｗａｙＦＷ及びＧａｔｅｗａｙＲＶ（インビトロジェン）及び混合物を一緒の４８μＬのＰＣＲ反応溶液に添加した。融合ＰＣＲ増幅（２２サイクル）により直線発現カセットＤＮＡフラグメントとランダムに変異された特定のＴｒＧＡコドンを生じ、この両末端にゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）組換部位が存在している。このＤＮＡフラグメントの精製（ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｈｃｈ（商標）ＰＣＲクリーンアップ、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア）及びｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェン）を用いたＢＰ組換反応（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア）は環状多重結合ＤＮＡ（エントリーベクター）を精製し、のちにこのベクターはＥ．ｃｏｌｉ最大効率ＨＤ５α（インベトロジェン）に形質転換され、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを懸濁した２ｘＴＹ培地（バクトトリプトン（ディフコ）１６ｇ／Ｌ、バクトイースト抽出物１０ｇ／Ｌ、ＮａＣＬ５ｇ／Ｌ）上で平板培養した。
【表２−１】
0005568307.tif 000004
【表２−２】
0005568307.tif 000005
【表３−１】
0005568307.tif 000006
【表３−２】
0005568307.tif 000007
【０１９１】
各ライブラリーについて、３７℃で一晩インキュベーションした後、コロニーをＰＳＳ中にコロニーを再懸濁することにより収集した。集められたＥ．ｃｏｌｉ形質転換体から、全部のプラスミドを標準的な方法を用いて（キアゲン）単離した。簡単に説明すると、１μＬのプラスミド溶液を１μＬのｐＲｅｐ３Ｙデスティネーションベクター（図１Ａ）に添加して、インビトロジェンにより提供されたＬＲクロナーゼ（商標）ＩＩ酵素混合物に添加した。上で説明したように環状多重結合ＤＮＡを生成し、Ｅ．ｃｏｌｉＭａｘＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙＤＨ５αに形質転換させた。
【０１９２】
３７℃でインキュベーションした後、各ライブラリーのシングルクローンを１００μＬのアンピシリンを含む２ｘＴＹアガープレートから採取し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２００μＬの２ｘＴＹ培地を含むＭＴＰ中で、３７℃、２４時間育成させた。培地を配列解析に用いた（ＢａｓｅＣｌｅａｒ  Ｂ．Ｖ．，リンデン、オランダ）。
【０１９３】
ランダムに変異されたＴｒＧＡ配列のコロンを参照することにより、ライブラリーの数は１乃至６５に変動した。選択の後、各ライブラリーは最大１９ＴｒＧＡ変異体を含んでいた、これらの変異体は独立して、説明書（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｏｒａｎｇｅ  ＣＡ、ＵＳＡ）に従って、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅに移された。
【０１９４】
Ｓ．ｐｏｍｂｅ形質転換させたものを選択培地上で平板培養し（ＥＭＭアガー、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、Ｌｒｉｖｉｎｅ、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．５１１０−２３２）、２８℃で４日間インキュベーションした。ＥＭＭアガー上のコロニーの線画により形質転換プレートから形質転換体を精製した。
実施例２
育成条件及びサンプル前処理の説明
【０１９５】
Ｓ．ｐｏｍｂｅ形質転換体を選択培地（２ｘＥＭＭ−Ｃ）（６４．４ｇ／ＬのＥＭＭブロス（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４１１０−０３２）、０．６２ｇ／Ｌのコンプリートサプリメント混合物（ＣＳＭ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＴＲＰ、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４５３０−１２２）を含む９６ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に接種して、２８℃で一晩インキュベーションした。一晩インキュベーションしたマイクロタイタープレートから、１００ｍｌの振とうフラスコ内の２０ｍｌの２ｘＥＭＭ−Ｃ液体培地に２００μＬ育成したＳ．ポンベ培地を接種して、マルチトロン振とうインキュベータ（Ｉｎｆｏｒｓ  ＡＧ、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で２８０ｒｐｍ、２６℃で４日間インキュベーションした。この育成培地から、２ｍｌのＳ．ｐｏｍｂｅ培地を取り出し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離（シグマ）した。この上清を１０ｋＤのＶｉａｓｐｉｎ５００ＨＴフィルターセットアップ（ＶｉｖａＳｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内に移し、１０００ｇで２５分間遠心分離した。この残基（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を０．０１５％Ｔｗｅｅｎ−８０で懸濁した５０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．５でもとの容量になるように希釈した。この溶液を異なるアッセイに用いた。
実施例３
ＴｒＧＡの４変異体の組合せライブラリーの構築
【０１９６】
（Ａ）Ｑ１２７Ｆ；Ｓ２１１Ｒ、及びＶ３１４Ｈの部位の変異を組み合わせたＴｒＧＡ変異体の構築を行った
変異の組合せは以下のようである
ａ）  Ｑ１７２Ｆ；  Ｑ２０８Ｎ  
ｂ）  Ｑ１７２Ｆ；  Ｓ２１１Ｒ  
ｃ）  Ｑ１７２Ｆ；  Ｖ３１４Ｈ  
ｄ）  Ｑ２０８Ｎ；  Ｓ２１１Ｒ  
ｅ）  Ｑ２０８Ｎ  Ｖ３１４Ｈ  
ｆ）  Ｓ２１１Ｒ；  Ｖ３１４Ｈ  
ｇ）  Ｑ１７２Ｆ；  Ｑ２０８Ｎ；  Ｓ２１１Ｒ  
ｈ）  Ｑ１７２Ｆ；  Ｑ２０８Ｎ；  Ｖ３１４Ｈ  
ｉ）  Ｑ１７２Ｆ；  Ｓ２１１Ｒ；  Ｖ３１４Ｈ
ｊ）  Ｑ２０８Ｎ；  Ｓ２１１Ｒ；  Ｖ３１４Ｈ  
ｋ）  Ｑ１７２Ｆ；  Ｑ２０８Ｎ；  Ｓ２１１Ｒ；  Ｖ３１４Ｈ
【０１９７】
クイックチェンジ（商標）マルチ部位検出変異誘発（ＱＣＭＳ）キット（ストラタジェン）をこのライブラリーを構築するために用いた。このライブラリーの生成に用いた５’リン酸プライマーを表４に示す。プライマーの全長の取り込み及びプライマー誘発エラーの有意な減少の点から、最適な結果がＨＰＬＣ、ＰＡＧＥ、又は任意の生成されたプライマーにより得られた。（インビトロジェン）
【表４】
0005568307.tif 000008
【０１９８】
テンプレートプラスミドｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡ（図２）をストラタジェンのＱＣＭＡキットを用いた組合せライブラリーの構築に用いた。このライブラリーを反応に用いたプライマーの濃度を変更した以外は前述と同様に構築した。具体的には、４μＬのｐＤＯＮＲ−ＴｒＧＡ（２５乃至５０ｎｇ）を１１又はＬの滅菌脱イオン水、１．５又はＬのｄＮＴＰ；２．５又はＬの１０ｘＱＣＭＳ緩衝液；１μＬの酵素ブレンド、及び各反応における１００ｎｇのプライマーとなるように１μＬの各変異プライマー混合物に添加した。ＰＣＲ条件は、０．２ｍｌの薄壁ＰＣＲチューブを用いてＭｊリサーチサーモサイクラーで、９５℃を１分、続いて、９５℃１分ｎ、５５℃２分、及び６５℃を６分を３０サイクル繰り返えした。反応生成物を３７℃オーバーナイトでインキュベーションすることによりＱＣＭＳキットから１μＬのＤｐｎｌで消化した。ＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いてサンプルを精製し、Ｄｐｎｌ（ストラタジェン）をもちいて、３７℃、１時間で第二の消化を行った。
【０１９９】
この反応混合物をＥ．ｃｏｌｉ  Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ＤＨ５α（インビトロジェン）へ形質転換し、選択アガー（５０μｇ／ｍｌの濃度でカナマイシンを含む２ｘＴＹ）上で平板培養した。３７℃で一晩インキュベーションした後、９６シングルクローンを配列解析（ＢａｓｅＣｌｅａｒ  Ｂ．Ｖ．，Ｌｉｎｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のために採取した。この組合せへをクローンし、ＷＯ０６／０６００６２に記載のようにトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞内で発現させた。
【０２００】
（Ｂ）更に６つの組合せライブラリー（表５）をＧｅｎｅａｒｔ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成的に作成し、熱安定性、エタノール、及び甘味量アプリケーションアッセイに用いた。
【表５】
0005568307.tif 000009
実施例４
改善された熱安定性を有する変異体
【０２０１】
説明する条件下の親ＴｒＧＡ分子は１５乃至４４％（日差変動）の間の残余活性を有していた。パフォーマンスインデックスを同じバッチのＴｒＧＡ熱安定性に基づいて計算した。パフォーマンス指数はＰＩ＝（変異体残余活性）／（ＴｒＧＡ残余活性）である。１より大きいパフォーマンスインデックスは安定性が改善されたことを示す。１．０より大きい熱安定性パフォーマンスインデックスを有する変異体を以下の表６に示す。
【表６−１】
0005568307.tif 000010
【表６−２】
0005568307.tif 000011
【表６−３】
0005568307.tif 000012
実施例５
エタノールスクリーニングアッセイからの高性能変異体
【０２０２】
前述のアッセイ方法を用いたエタノールアッセイで変異体を試験した。表７は親ＴｒＧＡＰＩと比較したときに１．０より大きいパフォーマンスインデックス（ＰＩ）を有する変異体についてのスクリーニングの結果を示す。このＰＩは特異活性の測定値である（活性／ｍｇ酵素）。特異活性のＰＩは、変異体の特異活性を野生型の特異活性で割った値である。特異活性のＰＩは１．０であり１．０より大きいＰＩは親ＴｒＧＡよりも高い特異活性を示す。この特異化成は通常のブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイで得られた結果でエタノールスクリーニングアッセイの結果を割って決定される。
【表７−１】
0005568307.tif 000013
【表７−２】
0005568307.tif 000014
【表７−３】
0005568307.tif 000015
実施例６
甘味料スクリーニングアッセイからの高性能変異体
【０２０３】
前述の甘味料スクリーニングアッセイで変異体を試験した。表８はこのスクリーニングの結果を示す。親ＴｒＧＡのＰＩと比較して、パフォーマンスフォマンス指数（ＰＩ）が１．００より大きい変異体を示している。このＰＩは特異活性の測定値（特異活性／ｍｇ酵素）である。この特異活性のＰＩは「変異体の特異活性／野生型特異活性」の式で計算される。この特異活性のＰＩは１．０であり、１．０より大きいＰＩを有する変異体は親ＴｒＧＡよりも特異活性が高いことを示す。
【表８−１】
0005568307.tif 000016
【表８−２】
0005568307.tif 000017
【表８−３】
0005568307.tif 000018
ベクターの構築及びトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞への形質転換
Ａ．変異体ＧＡをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築
【０２０４】
ＤＮＡ配列番号４を含むＴｒＧＡ発現カセットをＧａｔｅｗａｙ（商標）エントリーベクター（インビトロジェン、カールスバッド、カリファオルニア）である、ｐＤＯＮＲ（商標）２０１内へクローンした。このＴｒＧＡ発現カセットをＧａｔｅｗａｙ（商標）ＬＲ組み換え反応により、ＷＯ０６／０６００６２に記載されている、Ｇａｔｅｗａｙコンパチブルディスティネーションベクター、ｐＴｒｅｘ３ｇ−ＤＥＳＴ（図５）へクローンした。このＴｒｅｘ３ｇ−ＴｒＧＡ発現ベクター（図５）は、トリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞でＴｒＧＡタンパク質（配列番号２）を発現させることができる。ベクターは少なくとも（１）Ｖ３１４Ｈ；（２）Ｓ２１１Ｒ；（３）Ｑ２０８Ｎ、及び（４）Ｑ１２７Ｆの変異をコードしている修飾ＴｒＧＡｃＤＮＡを含むように構築した。
Ｂ．形質転換
【０２０５】
変異体ＧＡを含み、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅｌｉｕｍ  Ｓｙｓｔｅｍ（バイオラドＣａｔ．Ｎｏ．１６５−０２２５７）による発現構築体はＲＬ−Ｐ７（ＩＡ５２）由来Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ宿主株で形質転換された。このプロトコルは以下のようであり、参考文献はＷＯ０５／００１０３６である。
【０２０６】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉの株からの胞子の懸濁液（約５Ｘ１０８）を調製した。１００μＬ乃至２００μＬの胞子懸濁液を最小培地（ＭＭ）アセトアミド培地のプレートの中心に塗布した。ＭＭアセトアミド培地の成分は、０．６ｇ／Ｌアセトアミド、１．６８ｇ／ＬのＣｓＣｌ、２０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／ＬＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇ／ＬＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／Ｌ１０００Ｘ微量元素溶液、２０ｇ／Ｌアガロース、及びｐＨ５．５であった。１ｍｌ／Ｌ４００Ｘ微量元素溶液は、１７５ｇ／Ｌクエン酸、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／ＬＨ３ＢＯ３であった。懸濁液をＭＭアセトアミド培地の表面で乾燥させた。
【０２０７】
形質転換は製造元に仕様に従って行った。簡単に説明すると、６０ｍｇのＭ１０タングステン粒子を微少遠心管の中に入れた、１ｍＬのエタノールを添加して、１５分間静置した。粒子を１５，０００ｒｐｍで１５秒間遠心分離した。エタノールを除去し、滅菌ｄＨ２Ｏで粒子を３回洗浄し、次いで１ｍＬの５０％（ｖ／ｖ）滅菌グリセロールを添加した。２５μｌのタングステン粒子の懸濁液を遠心管に入れた。連続的に撹拌している間に、０．５乃至５μｌ（１００−２００ｎｇ／μｌ）のプラスミドＤＮＡ、２５μｌの２．５ＭＣａＣｌ２、及び１０μｌの０．１Ｍのスペルミジンを添加した。この粒子を３秒間遠心した。この懸濁液を除去し、粒子を２００μｌの７０％（ｖ／ｖ）のエタノールで洗浄し、３秒間遠心した。上清を除去し、２４μｌの１００％エタノールを添加して、ピペッティングにより混合した。このチューブを超音波バスに入れ、８μｌの粒子のアリコートを除去して、デシケーター中に置いてあるマクロキャリアーディスクの中心に置いた。このタングステン／ＤＮＡ懸濁液が乾燥したら、このマクロキャリアーディスクをＭＭアセトアミド培地プレートと一緒にボンバードメントチャンバー内に置き、ボンバードメントプロセスを製造元の仕様に従い行った。タングステン／ＤＮＡ粒子と一緒に平板培養されている胞子のボンバードメントの後、このプレートを２８℃でインキュベートした。４日後に、形質転換されたコロニーをＭＭアセトアミド培地の新しいプレートに採取した（Ｐｅｎｔｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６１：１５５−１６４）。
Ｃ．形質転換された細胞中で発言されたＴｒＧＡ変異体からＧＡ活性のデモンストレーション
【０２０８】
ＭＭアセトアミドプレート上で５日間育成させた後、安定な形態を示している形質転換体を３０ｍｌのＰｒｏｆｌｏ培地を含む２５０ｍｌの振とうフラスコに接種した。Ｐｒｏｆｌｏ培地は、３０ｇ／Ｌのα−ラクトース、６．５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）ＳＯ４、２ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／Ｌの４００×微量元素塩溶液（１７５ｇ／Ｌのクエン酸、２００ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／ＬのＺｎＳＯ４ｔｅｎｎ  ７Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ＬのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．８ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、２ｍｌ／Ｌの１０％Ｔｗｅｅｎ８０、２２．５ｇ／ＬＰｒｏＦｌｏコットンシードの粉（Ｔｒａｄｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ、メンフィス、テネシー州）、０．７２ｇ／ＬのＣａＣＯ３を含む。２８℃、１４０ｒｐｍで２日間育成した後、１０％のプロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地を３０ｍｌのラクトース欠失培地を含む２５０ｍｌの振とうフラスコに移した。このラクトース欠失培地の成分は、５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／Ｌの１，４−ピペラジンビス（プロパンスルホン酸）緩衝液、９ｇ／Ｌのカサミノ酸、４．５ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．０ｇ／ＬＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５ｍｌ／ＬのＭａｚｕ  ＤＦ６０−Ｐ消泡剤（Ｍａｚｕｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、イリノイ州）、１００Ｘ微量元素溶液、ｐＨ５．５であり、４０ｍｌ／Ｌの４０％（ｗ／ｖ）ラクトース溶液を滅菌後にこの培地に添加した。このラクトース欠失培地を含む振とうフラスコを２８℃、１４０ｒｐｍで４乃至５日間インキュベートした。
【０２０９】
この培養上清のサンプルを還元アガーを含む適量の２Ｘサンプルローディング緩衝液と混合した。菌糸体を遠心分離により除去し、上清中の総タンパク質を解析した（ＢＣＡ  タンパク質アッセイキット、ピアスＣａｔ．Ｎｏ．２３２２５）。
【０２１０】
ＧＡ活性はｐＮＰＧを基質（シグマ、Ｎ−１３７７）としたｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシダーゼ（ｐＮＰＧ）アッセイを用いて測定した。このアッセイにおいて、ｐ−ニトロフェニル−アルファ−Ｄ−グルコピラノシダーゼ（ｐＮＰＧ）をグルコースに加水分解するグルコアミラーゼの能力を測定する。アルカリｐＨにおいて、グルコアミラーゼ活性に比例してニトロフェノールが黄色を呈し、これを４０５ｎｍで測定して、ＧＡＵとして測定される標準的な酵素を比較する（Ｅｌｄｅｒ、Ｍ．  Ｔ．  Ａｎｄ  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  Ｒ．  Ｓ．、Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  めてょｄ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ｖｏｌ．  ７８（２）、１９９５）１ＧＡＵはｐＨ４．２及び６０℃において可用性デンプン基質から１時間にグルコースとして計算される還元糖１ｇを生成する酵素の量として定義される。
【０２１１】
ＭＥＳ  ＳＤＳランニング緩衝液（インビトロジェン、カースルバッド、カリフォルニア、米国）を用いたＮｕＰＡＧＥ（商標）Ｎｏｖｅｘ１０％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＧｅｌ上のＰＡＧＥ電気泳動によりタンパク質プロファイルを決定した。
実施例８
可用性基質上の選択された変異体の小スケールアプリケーション
【０２１２】
ａ）Ｖ３１４Ｈ、ｂ）Ｓ２１  ＩＲ、ｃ）Ｑ１７２Ｆ及びｄ）Ｑ２０８Ｎの１つの変異を発現しているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ宿主株をグルコース（Ｃｅｒｅｌｏｓｅ  ＤＥ９９）、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、微量元素、及びＭａｚｕ消泡（ＤＦ６０００Ｋ）を栄養培地を含むで育成し、ｐＨ３．５、３４℃の１４Ｌの発酵槽で育成し、ｐＨ及び温度をそれぞれ、４．０、２０℃に動かした。細胞物質をろ過により除去し、培養上清を収集し、タンパク質量として９０％以上のグルコアミラーゼ濃度となるように濃縮した。
【０２１３】
各種動的性質をｐＨ４．３、３２℃及び６０℃における可用性ポテト基質上でのグルコース生産について決定し、野生型ＴｒＧＡと比較した。４つの変異体は高められた触媒反応速度（ｋｃａｔ（ｓｅｃ−１）を示し、野生型ＴｒＧＡと比較して高められたＶｍａｘ（μＭグルコース／ｓｅｃ）を示した。図６は各試験について２回繰り返したＶｍａｘの結果を示す。
実施例９
変異体のＥｔＯＨ生産に置けるパフォーマンスを決定する方法
【０２１４】
スクリーニングのバリデーションを、新規な小スケールエタノールアプリケーション試験を用いて親ＴｒＧＡと比較したときにより高いパフォーマンスインデックスを有すると定義される変異体に適用した（図７及び８）。部位評価及び組合せ（表９）ライブラリーからの２４の変異体を選択し、大スケールでの試験のためにＴｏｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｓｅｉへ形質転換させた。この変異体を示差走査熱量計（以下で説明するＤＳＣ解析）を用いて、熱変性を、新規な二次的小少スケールエタノールアプリケーションアッセイを用い手パフォーマンスについて試験を行った。この方法は、１）変異体をアニオン交換カラムに注入してタンパク質濃度を正確に決定する及び２）野生型分子に対するエタノール精製のパフォーマンスを計算するために、３つの異なるＴｒＧＡ濃度（０．３−０．１５−０．０７５ｇ／２８ｇ  ｄｓ）で変異体の滴定を行う工程からなる。
【表９】
0005568307.tif 000019
タンパク質生成及び検出
【０２１５】
粗酵素調製物をＡＫＴＡ  エクスプローラ１００ＦＰＬＣシステム（アマシャム  バイオサイエンス、ピスカタウェイ、ニュジャージ）を用いて精製した。β−シクロデキストリン（シグマ−アルドリッチ、Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ  オランダ）をエポキシ活性請求項ふぁロースビーズ（ＧＥヘルスケア、Ｄｉｅｇｅｎ  ベルギー、１７−０４８０−０１）に結合させた。このカラムを酵素調製物からグルコアミラーゼを捕らえるために用いた。２５ｍＭとリス緩衝液ｐＨ７．５又は１０ｍＭα−シクロデキストリン（シグマ、２８７０５）を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．３を用いて酵素をビーズから遊離させた。生成したサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。変異体のタンパク質濃度を正確に決定するために、ＦＰＬＣベースタンパク質決定方法を用いた。第一に精製されたＴｒＧＡ分子のタンパク質濃度を標準的なブラッドフォード法（バイラド、ｃａｔ＃５００−０２０５）を用いて決定した。第二に、精製サンプルをＲｅｓｏｕｒｃｅＱ＿１ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）に注入し、酵素を５００ｍＭＮａＣｌを含む２５ｍＭとリスｐＨ緩衝液で溶出した。ピークエリアを決定し、タンパク質濃度を既知の濃度の標準ＴｒＧＡのピークエリアと比較することにより計算した。
小スケールＥｔＯＨアプリケーション
【０２１６】
表１０は異なる組換え変異体によるエタノール及び糖（ＤＰ１、ＤＰ２、及びＤＰ＞３）の生成をまとめたものである。液状コーンマッシュのサンプルを用意し、薄い台を用いて２５％ＤＳで希釈剤した。このスラリーのｐＨを４Ｎ硫酸を用いて４．３に調整した。マッシュの１００ｍｇのアリコートを３２℃の浴槽内に静置し、平衡化させた。１００μｌの４００ｐｐｍの尿酸を添加し、１ｍｌの精製した変異体ＴｒＧＡ酵素サンプル（１５０μｇ／ｍｌ）又は生成したＴｒＧＡ（３００、１５０、７５μｇ／ｍｌ）を各コーンマッシュサンプルに添加した。最後に、ＤＩ水溶液４５ｍｌ中で３０分間加水分解させた１５ｇのＲｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｒｅｄ  Ｙｅａｓｔ（Ｌｅｓａｆｆｒｅ  ｙｅａｓｔ  Ｃｏｒｐ．ミルウォーキー、ウィンスコンシン州）を３３３μｌ、各サンプルに添加した。サンプルを５、２１、２８、４８、及び２５時間後に採取し、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム９（バイオラド）を用いたＨＰＬＣにより解析した。
エタノール及び炭化水素決定
【０２１７】
２ｍｌのエッペンドルフ遠心管を発酵ビールで満たし、氷上で１０分間冷却した。このサンプルを１４，０００ｘｇで３分間遠心分離し、５００μｌの上清を５０μｌのキル（ｋｉｌｌ）溶液（１．１Ｎ硫酸）を含む試験管に移し、５分間静置した。５．０ｍｌの水をこの試験管に添加し、０．２２μｍのろ過プレート（マルチスクリーン、ミリポア、アムステルダム、オランダ）でろ過し、ＨＰＬＣにかけた。カラム温度は６０℃で、移動相は０．０１Ｎ硫酸で、流速は０．６ｍｌ／分であった。検出器はＲＩで、注入量は２０μＬであった。このカラムは電荷及び分子量に基づいて、ＤＰ１（モノサッカライド）、ＤＰ２（ジサッカライド）、ＤＰ３（トリサッカライド）、ＤＰ＞３（重合度が２より大きいオリゴサッカライド）、スクシニル酸、酪酸、グリセロール、メタノール、エタノール分子の分離を行う。
ＤＳＣ解析
【０２１８】
精製酵素サンプル（０．２乃至０．４ｍｇ／ｍｌ）の融点を示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて決定した。
【表１０】
0005568307.tif 000020
【０２１９】
表１１は０．１５ｍｇ投与の変異体の最終メタノール生産及びパフォーマンスを示す。このパフォーマンスは変異体の値により、０．３ｍｇ及び０．１５ｍｇ変異体の値を補間しることにより計算した。
【表１１】
0005568307.tif 000021
【０２２０】
ＥＴ７−２以外の全ての組合せ変異体は野生型ＴｒＧＡよりも性能が高いことが示された。ＬＲ８は、最も高い１．５６倍の改善された性能を示した。表１２において黒塗り下カラムの変異体はＴｒＧＡよりも高い性能を示し、高い熱変性温度も示していた（ｄＴｍ）。
【表１２】
0005568307.tif 000022
【０２２１】
この結果は、クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）がタンパク質濃度を正確に決定するのに有用なツールであることを示している。この結果は、３つのＴｒＧＡ濃度での変異体の滴定が小スケールでの変異体のパフォーマンスを決定するのに有用な方法であることも示している。７つの変異体は野生型ＴｒＧＡよりも高い性能を示し（表１２参照）、この変異体は高い熱変性温度を有しており、ＴｒＧＡのような低いＴｍを示さなかった。
実施例１０
選択されたセットの組合せ変異体及び一部位変異体の特異活性の決定及びＬＲ８の基質特異性
【０２２２】
組合せ変異体及び組合せ変異体の構築に用いたいくつかの一部位変異体の特異活性を解析した（表１３）。ＬＲ８（小スケールアプリケーションアッセイでのＰＩ１．５６）を更に、基質特異性に関する試験に用いた。このことはＧＡ変異体のグルコース生産を決定するための及びＬＲ変異体の基質特異性を決定するためのＭＴＰアッセイをセッティグアップ（ｓｅｔｔｉｎｇ  ｕｐ）することにより行った。このＭＴＰアッセイは変異体間及びＥＴ７−１以外の、野生型（ｗｔ）トリコデルマレーシグルコアミラーゼよりも高い生産速度を示した全ての変異体を区別する。更に、幾つかの変異体（ＬＲ８／ＴＥ８／Ｑ１７２Ｆ）はＴｒＧＡよりも２０乃至３０％性能が高かった。ＬＲ８は可溶性コーンスターチ及び別の２つの液状コーンマッシュにおいて、野生型よりも高い性能を示した。
【０２２３】
以下の実験に用いた基質は、以下のようにして調製された可溶性コーンスターチストック溶液である。８ｇの可溶性コーンスターチ（シグマ、＃Ｓ４１８０）を１００ｍｌのミリＱ水に溶解し、マイクロウェーブで１分間加熱した。この分散溶液を５分間沸騰させ、冷却後、容量を１００ｍｌに調整した。をこのストック溶液を１００ｍＭのＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４で１：１希釈することにより、４％の可溶性コーンスターチを調製した。１つの実験において、液化コーン基質（ＮＥ）を水分解析を用いてｄｓ％を測定することにより調製した。その後、基質を５０ｍＭＮａＡｃで７．５ｘに希釈して、４％ｄｓの基質を得た。この基質を２，０００ｘｇで５分間遠心して、上清を０．２２μｍのフィルターを用いてろ過した。他の実験において、液状コーン基質（ＢＳＥ）を、遠心分離の前に１０ｘに希釈する意外は同じ方法で調製した。
【０２２４】
酵素を１５０μｇ酵素／ｍｌ（３μｇ／１８０μｌ反応混合物）のストック溶液を用いて希釈した。溶液を更に、５０ｍＭのＮａＡｃｐＨ４．０で以下のように希釈した。３００ｎｇ（１０ｘ）、２００ｎｇ、１５０ｎｇ、１００ｎｇ、７５ｎｇ、５０ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇ／１８０μｌ反応溶液）。
【０２２５】
このアッセイを以下のように行った。４０μｌの５０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．０、１２０μｌの４％可溶性コーンスターチ、及び２０μｌの酵素を各ウェルに添加する。サンプルを３２℃、９００ｒｐｍで２時間インキュベートする。９０μｌの８００ｍＭのグリシンＭａＯＨ緩衝液、ｐＨ１０を添加してインキュベートを停止し、氷上に５分間置く。このプレートを１５℃、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。新しいプレートに、８５μｌのミリＱミ水及び１００又はｌヘキソキナーゼクックテイル（ＩＩテストグルコース（ＨＫ）キット、インスツルメンタルラボラトリー＃１８２５０７−４０）及び２０μｌの上清を添加した。グルコースキャリブレーション直線（０−１ｍｇ／ｍｌ）のために、２０μｌのグルコースストックを代わりに添加した。プレートを暗室で１０分間インキュベートし、スペクトラマックス（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ）を用いて３４０ｎｍの吸光度を測定した。
【表１３】
0005568307.tif 000023
【０２２６】
ＧＡ変異体によるグルコース生産速度を決定するためのアッセイの結果を図７及び８に示す。これらの図において、ＴｒＧＡに対する相対的なパフォーマンスを添加酵素の量に対して計算した。結論は、１５０ｎｇの酵素におけるこのグラフの直線の領域から出た。図７及び８、並びに表１３の結果はＬＲ８、ＥＴ８、ＥＴ７−２、Ｓ２１１Ｒ、Ｑ１７２Ｆ、及びＰ９４Ｎが直線の範囲を超えて野生型よりも優れていたことを示した。
【０２２７】
ＬＲ８の基質特異性
ＬＲ８及びＴｒＧＡ野生型のパフォーマンスはスクリーニング及びアプリケーションにおいて用いた基質（実施例１０で調製した可溶性コーンスターチ、及び２つのコーンマッシュ基質）上で試験した。ＨＰＬＣで解析するときに、この基質は異なる重合度（ＤＰ）パターンを示した（図９乃至１１参照）。ＮＥ及びＢＳＥにおいて、ＤＰ１がＤｐ４よりも多く、可溶性コーンスターチは少なくとも４乃至それ以上のグルコース分子からなる。全ての基質において、ＬＲ８は野生型よりも優れた性能を示した（図９、１０、及び１１参照）。
ＴｒＧＡの結晶構造
【０２２８】
トリコデルマレーシ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）グルコアミラーゼ（ＴｒＧＡ）の完全な３次元構造を１．９Åで決定した。表１５はトリコデルマレーシグルコアミラーゼ結晶構造の配置を示す。ＴｒＧＡは完全な形で、野生型宿主において通常起こりうる全ての翻訳後修飾された５９９残基が結晶化されている。この結晶構造を以下のように生成し解析した。
【０２２９】
タンパク質発現及び精製−ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＧＡをコードする遺伝子を、２００６年に５月４日に公開された、Ｄｕｎｎ−Ｃｏｌｅｍａｎらによる、米国特許出願Ｎｏ．ＵＳ２００６／００９４０８０Ａ１に記載の方法に従ってクローンし、発現させた。
【０２３０】
全ての結晶化試験に用いたＴｒＧＡタンパク質物質は、まず、アニオン交換クロマトグラフィーを用いて１工程で精製した。この方法は、１８０ｍｇ／ｍｌ総タンパク質を含むＴｒＧＡを発現している濃縮培養上清を２５ｍＭトリスＨＣｌｐＨ８．０緩衝液中に１：１０希釈した。ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０Ｑ  セファロースＦＦカラム（ＨＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）をアニオン交換精製に用いた。ＨｉＰｒｅｐカラムを４倍のカラム容量（ＣＶ）の開始緩衝液（２５ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ８．０）で平衡化し、１０ｍｌの希釈タンパク質サンプルを注入した。８ＶＣのランニング緩衝液（２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で０乃至１４０ｍＭＮａＣｌの勾配を用いて結合タンパク質を溶出させた。結合したＴｒＧＡは約１０ｍＭＮａＣｌの塩濃度でＨｉＰｒｅｐ  Ｑセファロースカラムから溶出する。精製ＴｒＧＡタンパク質を含む分画を収集し、１０ｋＤの分子量をカットオフ（ＭＷＣＯ）する２５ｍｌのＶｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮チューブを用いて５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。精製され濃縮されたＴｒＧＡ物質は５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．３で平衡化されたＤＧ−１０脱塩カラム（バイオラド）を用いてバッファー交換された。タンパク質濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した。この精製及び濃縮されたＴｒＧＡタンパク質を−２０℃で貯蔵した。
【０２３１】
１つの追加的なアニオン交換精製及びサイズ排除精製の、２つの更なる精製工程を用いてＴｒＧＡタンパク質物質の結晶可能性を高めた。これらの２つの追加的な精製工程は以下のように行った。第一のアニオン交換精製工程において、１０ｍｌのＭｏｎｏＱカラム（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。初めに精製し凍結したＴｒＧＡ物質（５０ｍｇタンパク質）の１ｍｌのサンプルを溶解させ、新しい緩衝液６ｍｌで希釈することにより、緩衝液を２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に交換した。次いで、このサンプルを６ｍｌの５ｋＤ  ＭＷＣＯを用いて０．５ｍｌに濃縮した。このＴｒＧａサンプルを、滅菌水中での最後の濃縮工程の後、このタンパク質サンプルの伝導性がアニオン交換の開始緩衝液の伝導性即ち、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、に等しくなるまで、希釈した。ＭｏｎｏＱカラムを４カラム容量（ＣＶ）の開始緩衝液で平衡化し、その後、希釈したタンパク質サンプルをカラムに注入した。結合タンパク質は２つの異なる勾配を用いてＭｏｎｏＱカラムから溶出させた。初めに、４ＣＶ直線ｐＨ勾配を用いた。開始緩衝液のｐＨは８．０乃至６．０に減らした。第二の勾配において、８ＣＶ開始緩衝液を塩濃度がランニング緩衝液（２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ６．０）中１乃至３５０ｍＭＮａＣｌになるように塩濃度の勾配をかけた。結合したＴｒＧＡは第二塩濃度の勾配が約１５０ｍＭのときにカラムから溶出した。ＴｒＧＡを含む分画を収集し、６ｍｌの５ｋＤ  ＭＷＣＯビバスピン（Ｖｉｖａｓｐｉｎ）遠心管を用いて２ｍｌに濃縮した。この濃縮ＴｒＧＡサンプルを、４ＣＶの２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０及び５０ｍＭＮａＣｌ（この溶液はランニング緩衝液としても用いる）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６／６０サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ）に適用させた。サイズ排除後の主要な溶出ピークからの分画を収集し、６ｍｌの５ｋＤ  ＭＷＣＯＶｉｖａｓｐｉｎ遠心管を用いて約７．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度になるまで濃縮した。
【０２３２】
タンパク質結晶化−初期ＴｒＧＡ結晶化条件を見るために用いたこのタンパク質サンプルは一旦アニオン交換で精製しその後−２０℃で貯蔵したＴｒＧＡ物質のサンプルである。このＴｒＧＡタンパク質サンプルを初期結晶化試験の前に溶解し、５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．３で約１２ｍｇ／ｍｌに希釈した。斜方晶系ｘ線データセットを分子置換（ＭＲ）によるＴｒＧＡ構造の解析に、高解像度斜方晶系データセットを最終斜方晶系空間グループＴｒＧＡ構造モデルに用いた。２０℃における、ハンギングドロップス（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐｓ）（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  １９８２）を用いた、蒸気拡散方法を用いて、２５％ＰＥＧ３３５０、０．２０Ｍ酢酸アンモニウムからなる溶液中で斜方晶系ＴｒＧＡ結晶の成長が観察された、結晶化ドロップを等量のタンパク質溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）及び貯蔵溶液と混合して最終容量が１０μｌになるように調製した。このＴｒＧＡ結晶は、ａ＝５２．２Å、ｂ＝９９．２Å、ｃ＝１２１．２Åのセルサイズを有するＰ２１２１２１の斜方晶系空間グループに属し、非対称単位な１分子であり、２．３のＶｍ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  １９６８）を有することがわかった。
【０２３３】
Ｘ線データ収集−２つの斜方晶系ＴｒＧＡデータセットを室温で、密閉されたキャピラリーチューブ内にある単一の結晶から収集した。分子置換法（ＭＲ）による構造解析に用いた初期のｌｏｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ斜方晶系ＴｒＧＡｘ線データセットをホームＸ線ソース、Ｒｉａｋｕ  ＲＵ２００回転陽極検出器からもＣｕ  Ｋａ放射を用いた収束ミラーを備えたＭＳＣ／Ｒｉｇａｋｕ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｇｒｏｕｐ．，ウッドランド、テキサス）Ｒａｘｉｓ  ＩＶ＋＋イメージプレート検出器上で収集した。このデータセットをＭＳＣ／Ｒｉｇａｋｕにより提供されているｄ＊ｔｒｅｋソフトウェアを用いて、処理し、測定し、及び平均化した。Ｃを中心とする単斜晶データセットを１００Ｋで、２５％ＰＥＧ３３５０、１５％グリセロール、５０ｍＭＣａＣｌ２、及び０．１Ｍビストリス、ｐＨ５．５からなる凍結保護剤で平衡化され、レーヨン繊維ループ中にマウントされ、シンクロトロンに移す前に液化窒素中に急冷された単一の凍結ＴｒＧＡ結晶から、収集した。高解析度斜方晶系（１．９Å）データセット及びＣ中心単斜晶データセット（１．８Å）をシンクロトロンソース、Ｌｕｎｄ、ＳｗｅｄｅｎにおけるＭＡＸ  ＬＡＢで９１１：５ビームラインで収集した。シンクロトロンソースで収集された両方のデータセットをＭＯＳＦＬＭで処理し、ＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４、１９９４）に含まれるＳＣＡＬＡプログラムで測定した。ほかに定義しない限り、以下のデータ処理はＣＣＰ４プログラムパッケージ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４、１９９４）を用いて行った。各データセットからの映像の５％のセットを取り除き、Ｒ−ｆｒｅｅ（Ｂｒｕｎｇｅｒ  １９９２）モニタリングに用いた。
【０２３４】
構造解析−ＴｒＧＡ構造を初めに、初期低解析度（ｌｏ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）斜方晶系データセット及びサーチモデルとしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ．ａｗａｍｏｒｉＧＡ（ＡｓＧＡ）変異体Ｘ１００（ｐｄｂエントリーｌＧＬＭ）（Ａｌｅｓｈｉｎら、１９９２））の配置を用いてＣＣＣＰ４プログラムパッケージに含まれる、自動置換プログラムＭＯＬＲＥＰ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４、１９９４）を用いたＭＲにより解析した。このＡ．ａｗａｍｏｒｉＧＡサーチモデルは、ＭＲ実験を行う前に、全てのＮ−及びＯ−グリコシル化としてタンパク質に付加するグリコシル部分及び全ての溶媒部分を除去してある。初期低解析度（ｌｏ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）ＴｒＧＡデータセットからの３６．８及び２．８Å解析度の間の全ての映像をＭＲソリューションに用いた。このＭＲプログラムはバックグラウンド以上の１１．１бの最大を用いて単一回転関数解を見つけ、次の最も高い最大はバックグラウンドより高い３．８бである。この翻訳関数解４８．７％のＲ因子を与え、１７．４のコントラスト因子を有していた。ＭＲソリューションは、プログラムＲｅｆｍａｃ５．０（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、１９９７）を用いた抑制最小二乗リファインメントの１０サイクルの間に整理された。このことは結晶映像のＲ因子を３１．１％に低め、Ｒ−ｆｒｅｅの値を４２．２％から４１．１％に低めた。
【０２３５】
モデルフィッティング及びリファインメント−リファインされたＭＲソリューションモデルを低解析度（ｌｏ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）ＴｒＧＡデータセットからの初期密度マップの計算に用いた。ＴｒＧＡの１９及び２６の残基の間のジスルフィド結合の電子密度（ジスルフィド結合はＡ．ａｗａｍｏｒｉ変異体ｘ１００構造モデルには存在しない）はこの電子密度マップ中で容易に同定できる。このことは、この電子密度マップがそのアミノ酸配列からＴｒＧＡの構造モデルを構築するのに用いた十分な量であることを示している。低解析度（ｌｏ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）データセットに基づく、この初期ＴｒＧＡ構造モデルはＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ  ２００４）を用いたモデル構築の代替サイクルＲｅｆｍａｃ５．０を用いた最大見込みリファインメントを用いてリファインされた。
【０２３６】
初期ＴｒＧＡ構造モデルの解像はプログラムＲｅｆｍａｃ５．０を用いた抑制リファインメントの１０サイクルに対する高解像度データセットに対する初期ＴｒＧＡ構造モデルのリファインニングにより、高解像度データセット（１．９Å）の解像に適用された。構造モデルの中の大部分の水分子をリファインニングプログラム中の水ピックアップ手段を用いて自動的に位置あわせし、その後、目視検査で、手動的に選択又は排除する。全ての構造プログラムはＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ｃｏｗｔａｎ２００４）又はＯ（Ｊｏｎｅｓら、１９９１）のいずれかにより作られ、フィギアはＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  ２００２）により作成されている。
【０２３７】
これらの結果から、ＴｒＧＡ触媒コアセグメントはＡｓＧＡについて、Ａｌｅｓｈｉｎら、１９９２によるものと同じ内部へリックスのＮ末端へ入るＣ末端の外部へリックスを有するアルファへリックスのダブルバレルからなる、（α／α）６−バレルトポロジーを示していることがわかる。１９及び２６残基の間のジスルフィド結合及びＡａＧａに対する挿入（２５７乃至２６０残基）のような電子密度における重要な違いを確立することが可能である。８０乃至１００を含むセグメントも大幅なモデル再構築を受けた。１つの主要なグリコシル化部位はＡｓｎ１７１で同定された。これは４つまでのグリコサイド部分を付加する。段いつのグリコシル化部位はＡａＧａにおいて同定された。更に、２２及び２３、４４及び４５、及び１２２及び１２３の間の３つのシスペプチドを含む触媒コアＴｒＧＡ及びＡａＧＡの間で保存されている。これら全体は、ＴｒＧＡ及びＡａＧＡの触媒コアの配置を比較したときに、全体に、４５３個のＣａ原子の４０９間に０．５３５Åのｒｍｓ変異があった。
実施例１２
ＴｒＧＡ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉＧＡの間の相同性
【０２３８】
実施例１２で、ＴｒＧＡの同定された結晶構造をＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉのすでに同定されている結晶構造と重ね合わせた。このＡａＧＡ結晶構造はタンパク質データベース（ＰＤＢ）から得られ、結晶化されたＡａＧＡの形態は触媒ドメインのみを含む形態である。インタクトな状態３つの領域を有するトリコデルマレーシグルコアミラーゼの構造は本明細書において１．８Åの解像度で決定された（表１４及び実施例１２）。配列を用いて（表１４）、予め構造が決定されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ変異体ｘ１００（Ａｌｅｓｈｉｎ、Ａ．Ｅ．、Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｃ、Ｆｉｒｓｏｖ、Ｌ．Ｍ．、ａｎｄ  Ｈｏｎｚａｔｋｏ、Ｒ．Ｂ．１９９４  Ｒｅｆｉｎｅｄ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．Ｘｌ００．Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２３８：５７５-５９１  aｎｄ  Ｔｈｅ  ＰＤＢ）の触媒ドメインにこの構造を整列させた。図１２及び１３に示すように、触媒ドメインの構造は非常に類似しており、この構造の重ね合わせの結果に基づいて、等しい残基であると同定できるほどのものであった。
【０２３９】
これらの解析に基づいて、ＴｒＧＡにおいて変異された部位は安定性及び／又は特異活性が固められたと同定された。これらの部位は、活性部位における１０８、１２４、１７５、及び３１６を含んでいる。また、特定の２部位変異体、Ｙ４７Ｗ／Ｙ３１５Ｆ及びＹ４７Ｆ／Ｙ３１５Ｗも特定された。他の部位は、１４３、Ｄ４４、Ｐ４５、Ｄ４６、Ｒ１２２、Ｒ１２５、Ｖ１８１、Ｅ２４２、Ｙ３１０、Ｄ３１３、Ｖ３１４、Ｎ３１７、Ｒ４０８，及びＮ４０９であると同定された。構造の類似性が高いことから、トリコデルマレーシＧＡにおいて発見された部位の変異体はアスペルギルスアワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）及び他の類似するグルコアミラーゼと類似の配列を有することが予測された。
【０２４０】
本発明の範囲及び精神に逸脱しない範囲内で行われる本発明の方法及びシステムの各種変更及び変法は当業者に明らかである。本発明は特定の好適な態様を用いて説明してきたが、特許請求の範囲の発明をこれらに限定することを意図するものではない。すなわち、本発明を実施するための各種変更は当業者に明らかであり、これらの変更も本発明の範囲内である。
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【表１４−７】
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【表１４−８】
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【表１４−９】
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【表１４−１０】
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【表１４−１１】
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【表１４−１２】
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【表１４−１３】
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【表１４−１４】
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【表１４−１５】
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【表１４−１６】
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【表１４−１７】
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【表１４−１８】
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【表１４−１９】
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【表１４−２０】
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【表１４−２１】
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【表１４−２２】
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【表１４−２３】
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【表１４−２４】
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【表１４−２５】
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【表１４−２６】
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【表１４−２７】
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【表１４−２８】
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【表１４−２９】
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【表１４−３０】
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【表１４−３１】
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【表１４−３２】
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【表１４−３３】
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【表１４−３４】
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【表１４−３５】
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【表１４−３６】
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【表１４−３７】
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【表１４−３８】
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【表１４−３９】
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【表１４−４０】
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【表１４−４１】
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【表１４−４２】
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【表１４−４３】
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【表１４−４４】
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【表１４−４５】
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【表１４−４６】
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【表１４−４７】
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【表１４−４８】
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【表１４−４９】
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【表１４−５０】
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【表１４−５１】
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【表１４−５２】
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【表１４−５３】
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【表１４−５４】
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【表１４−５５】
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【表１４−５６】
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【表１４−５７】
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【表１４−５８】
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【表１４−５９】
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【表１４−６０】
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【表１４−６１】
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【表１４−６２】
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【表１４−６３】
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【表１４−６４】
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【表１４−６５】
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【表１４−６６】
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【表１４−６７】
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【表１４−６８】
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【表１４−６９】
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【表１４−７０】
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【表１４−７１】
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【表１４−７２】
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【表１４−７３】
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【表１４−７４】
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【表１４−７５】
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【表１４−７６】
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【表１４−７７】
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【表１４−７８】
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【表１４−７９】
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【表１４−８０】
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【表１４−８１】
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【表１４−８２】
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【表１４−８３】
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【表１４−８４】
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【表１４−８５】
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【表１４−８６】
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【表１４−８７】
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【表１４−８８】
0005568307.tif 000111
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0005568307.tif 000113
【図２】
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【図３Ａ】
0005568307.tif 000115
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
0005568307.tif 000117
【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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