(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｅ）又は（ｆ）の糖ポリペプチドからなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とする、溶存酸素の影響を受けないグルコース測定用バイオセンサ：
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチド、
（ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有する、Ｎ末端がＳＴＬＮＹである糖ポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ｅ）又は（ｆ）の糖ポリペプチドからなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含有する、溶存酸素の影響を受けないグルコース測定試薬組成物：
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチド、
（ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有する、Ｎ末端がＳＴＬＮＹである糖ポリペプチド。
【請求項３】
以下の（ｅ）又は（ｆ）の糖ポリペプチドからなり、酸素を電子受容体としないフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とする、溶存酸素の影響を受けないグルコースの測定方法：
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチド、
（ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつグルコース脱水素酵素活性を有する、Ｎ末端がＳＴＬＮＹである糖ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコース脱水素酵素及びその製造方法、並びにグルコース脱水素酵素を用いたグルコースの測定方法、グルコース測定試薬組成物及びグルコース測定用バイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中のグルコース濃度の迅速かつ正確な測定は、糖尿病を診断するうえで重要である。グルコースの測定法としては、化学法と酵素法があるが、酵素法が特異性、安全性の点で優れている。当該酵素法の中でも、検体の微量化、測定時間の短縮、装置の小型化の点から、電気化学的バイオセンサが有利である。
【０００３】
そのようなバイオセンサに使用可能な酵素として、グルコース酸化酵素が知られている。しかし、グルコース酸化酵素は、血中の溶存酸素により測定誤差が生じるという問題があるため、いくつかのグルコース脱水素酵素が開発されてきた。グルコース脱水素酵素のうち、フラビン結合型グルコース脱水素酵素は、補酵素の添加を必要としないこと、溶存酸素の影響を受けないこと及び基質特異性に優れることから、グルコースバイオセンサ用の酵素として注目されている（特許文献１〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開２００４／０５８９５８号パンフレット
【特許文献２】国際公開２００６／１０１２３９号パンフレット
【特許文献３】国際公開２００８／００１９０３号パンフレット
【特許文献４】国際公開２０１０／１４０４３１号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Mol. Plant Pathol. 5(1),p17-27,2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、グルコースバイオセンサ用の酵素として有用なグルコース脱水素酵素、これを用いたグルコースバイオセンサ及び当該グルコース脱水素酵素遺伝子を特定、単離し、効率的に組み換え酵素を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、糸状菌由来のグルコース脱水素酵素に着目し、ボトリオティニア・フケリアナ由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を単離し、さらにその組み換えベクターを大腸菌、糸状菌、酵母等の微生物に導入して組み換えグルコース脱水素酵素を製造し、その酵素活性、アミノ酸配列、グルコースセンサへの利用性等について検討した。その結果、ボトリオティニア・フケリアナ由来の配列番号５１で示されるアミノ酸配列を有する酵素は、グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）であるとされていたが（非特許文献１）、本発明により得られた組み換え酵素はグルコース酸化酵素ではなくフラビン結合型グルコース脱水素酵素であり、かつそのアミノ酸配列は従来推定されていたものとは異なり、配列番号５で示されるものであることを見出した。従って、本発明により得られたフラビン結合型グルコース脱水素酵素は、溶存酸素の影響を受けないことからグルコースバイオセンサ用の酵素として有用であることを見出した。さらには、種々の組み換え酵素のうち、形質転換真核細胞により得られた糖ポリペプチドは、形質転換大腸菌により得られた糖鎖を有さないポリペプチドに比べて、バイオセンサ用酵素として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１２〕を提供するものである。
〔１〕以下の（ｅ）又は（ｆ）の糖ポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするグルコース測定用バイオセンサ：
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチド、
（ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有する糖ポリペプチド。
〔２〕以下の（ｅ）又は（ｆ）の糖ポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含有するグルコース測定試薬組成物：
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチド、
（ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有する糖ポリペプチド。
〔３〕以下の（ｅ）又は（ｆ）の糖ポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用することを特徴とするグルコースの測定方法：
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチド、
（ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有する糖ポリペプチド。
〔４〕以下の（ｅ）又は（ｆ）の糖ポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素：
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチド、
（ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有する糖ポリペプチド。
〔５〕ボトリオティニア・フケリアナ由来の組み換えグルコース脱水素酵素遺伝子を用いた形質転換真核細胞で発現させたものである〔４〕記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素。
〔６〕以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号４又は配列番号６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド：
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
〔８〕〔６〕又は〔７〕に記載のポリヌクレオチドの上流に、シグナル配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
〔９〕シグナル配列が真核細胞由来タンパクのシグナル配列である、〔８〕記載のポリヌクレオチド。
〔10〕〔６〕〜〔９〕の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを含む組み換えベクター。
〔11〕〔１０〕記載の組み換えベクターを用いることによって作成された形質転換真核細胞。
〔12〕〔１１〕記載の形質転換真核細胞を培養し、得られた培養物からグルコース脱水素酵素を採取することを特徴とするグルコース脱水素酵素の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の糖ポリペプチドは、フラビン結合型グルコース脱水素酵素であり、溶存酸素の影響を受けずにグルコースを正確に測定できるグルコースバイオセンサに有用である。また、本発明のポリヌクレオチドを利用することにより、グルコースに対する基質認識性に優れ、しかもマルトースに対する作用性が低いという優れた特性を有するグルコース脱水素酵素を均質かつ大量に生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明グルコース脱水素酵素によるグルコース量測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明において、「グルコース脱水素酵素」とは、電子受容体存在下で、グルコースの１位の水酸基を脱水素（酸化）する反応を触媒し、グルコースへの作用性に対してマルトースへの作用性が５％以下である可溶性の蛋白質を意味し、該酵素は以下の性質を特徴とする。
１）フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする、
２）酸素を電子受容体としない、
３）基質濃度３３３ｍＭにおいて、グルコースへの作用性を１００％とした場合にマルトースへの作用性が５％以下、及び
４）酵素タンパクのポリペプチドの分子量が６０〜７０ｋＤａである。
酵素タンパクのポリペプチドの分子量とは、真核細胞で発現させた糖鎖修飾された組み換え酵素を糖鎖切断処理し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供した際の分子量である。尚、真核細胞で発現した組み換え酵素は、宿主、培養条件等の影響で糖鎖付加量は変化するため、８０〜２００ｋＤａ程度の分子量になり得る。
また、本発明において、「糖ポリペプチド」とは、糖鎖が付加したポリペプチドをいう。
【００１２】
本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号４又は配列番号６で示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
（ｂ）塩基配列（ａ）からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【００１３】
更に、本発明のポリヌクレオチドは、以下の（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
（ｃ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｄ）アミノ酸配列（ｃ）のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【００１４】
前記のポリヌクレオチド（ｂ）又はポリペプチド（ｄ）としては、塩基配列（ａ）又はアミノ酸配列（ｃ）と少なくとも８０％以上の相同性を有する塩基配列又はアミノ酸配列を有するものが挙げられる。ここで、少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列又はアミノ酸配列とは、夫々比較対象となる基準配列の全長にわたり、少なくとも８０％の同一性を示し、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する各配列をいう。このような配列の同一性パーセンテージは、基準配列を照会配列として比較するアルゴリズムをもった公開又は市販されているソフトウエアを用いて計算することができる。例として、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発社製）などを用いることができ、これらはデフォルトパラメーターで使用することができる。
【００１５】
本発明において、ポリヌクレオチド間のハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Denhardt’s）溶液、０．１％  ＳＤＳ、１０％  デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄することを例示することができる。
【００１６】
尚、本発明において、「ポリヌクレオチド」とは、プリン又はピリミジンが糖にβ-Ｎ-グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）、ＣＴＰ（シチジン三リン酸）、ＵＴＰ（ウリジン三リン酸）；又はｄＡＴＰ（デオキシアデノシン三リン酸）、ｄＧＴＰ（デオキシグアノシン三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシチジン三リン酸）、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸））が１００個以上結合した分子を言い、具体的にはグルコース脱水素酵素をコードする染色体ＤＮＡ、染色体ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ及び、それらを鋳型としてＰＣＲ増幅したポリヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド」とはヌクレオチドが２-９９個連結した分子を言う。また「ポリペプチド」とは、アミド結合（ペプチド結合）又は非天然の残基連結によって互いに結合した３０個以上のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。「糖ポリペプチド」とは、前記ポリペプチドに糖鎖が付加した分子を意味する。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチド（遺伝子）の最も具体的な態様は、配列番号４又は配列番号６の塩基配列を含むポリヌクレオチドである。配列番号６に代表される染色体ＤＮＡであるポリヌクレオチドは、例えばボトリオティニア・フケリアナ株から染色体ＤＮＡライブラリーを調製し、特許文献２に記載のアスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）由来グルコース脱水素酵素のアミノ酸配列又はその他のグルコース脱水素酵素のアミノ酸配列に基づいて作成した複数のオリゴヌクレオチドプローブを用いて当業者に公知の方法によって上記染色体ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって取得することができる。
【００１８】
プローブの標識は、当業者に公知の任意の方法、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）法又は非ＲＩ法によって行うことができるが、非ＲＩ法を用いることが好ましい。非ＲＩ法としては、蛍光標識法、ビオチン標識法、化学発光法等が挙げられるが、蛍光標識法を用いることが好ましい。蛍光物質としては、オリゴヌクレオチドの塩基部分と結合できるものを適宜に選択して用いることができるが、シアニン色素（例えば、Ｃｙ  ＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ-アセトキシ-Ｎ２-アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）などを使用することができる。
【００１９】
或いは、配列番号４に代表されるｃＤＮＡであるポリヌクレオチドは、例えば、本明細書の実施例に具体的に記載されているように、染色体ＤＮＡからイントロンを含む目的のポリヌクレオチドを取得した後、ＰＣＲによってイントロンを削除して得ることができる他、例えば、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記で作成したオリゴヌクレオチドプライマー（プローブ）のセットを用いた当業者に公知の各種ＰＣＲ法によって得ることができ、又は、ボトリオティニア・フケリアナ株から抽出した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ法によっても得ることができる。尚、ＰＣＲにおけるプライマー使用の最終濃度が約０．１から約１μＭになるよう留意することも必要である。プライマー設計においては、市販のソフトウエア、例えばＯｌｉｇｏＴＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（米国）製）、ＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウエア開発社製）等を用いることもできる。
【００２０】
尚、このようなオリゴヌクレオチドプローブやオリゴヌクレオチドプライマーセットは、例えば本発明のポリヌクレオチドであるｃＤＮＡを適当な制限酵素で切断して作成することもできる。
【００２１】
更に、本発明のポリヌクレオチドは、〔６〕又は〔７〕に記載のポリヌクレオチドの上流に、シグナル配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。シグナル配列をコードする塩基配列は、グルコース脱水素酵素活性を有する糖ポリペプチドを効率良く分泌できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば良く、例えば真核細胞由来タンパクのシグナル配列をコードする塩基配列が好ましく、ボトリオティニア属又はアスペルギルス属由来タンパクのシグナル配列をコードする塩基配列がより好ましい。更に、該ポリヌクレオチドにより形質転換する宿主と同属由来タンパクのシグナル配列をコードする塩基配列や、グルコース脱水素酵素のシグナル配列をコードする塩基配列が例示できる。塩基配列によりコードされるシグナル配列は、例えば特許文献２に記載のアスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素配列と分泌タンパクのアミノ酸配列とを比較することや、シグナル配列予測サイト（Signal p：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）を用いて分泌タンパクのアミノ酸配列から推定でき、更に１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたシグナル配列でも良い。具体例としては配列番号８、配列番号１０、配列番号１２及び配列番号１４に記載の配列が例示でき、これらの配列又はこれらの配列を数アミノ酸欠失させた配列を適宜組み合わせた配列でも良い。
【００２２】
シグナル配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの具体例としては、配列番号１、配列番号３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６及び配列番号４８に記載のポリヌクレオチドが例示できるが、グルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードする部位は、イントロンを含んでいても良い。
【００２３】
又、（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、例えば、前記のボトリオティニア・フケリアナ由来のグルコース脱水素酵素ｃＤＮＡを、公知のミューテーション導入法や変異導入ＰＣＲ法等によって改変して作成することができる。更に、ＮＢＲＣ７１８５株以外のボトリオティニア・フケリアナ株の染色体ＤＮＡやそのｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１のヌクレオチド配列情報に基づいて作成したオリゴヌクレオチドを用いるプローブハイブリダイゼーション法によって取得することができる。ハイブリダイゼーションに際して、ストリンジェント条件を様々に変化させることによって、上記ポリヌクレオチドを取得することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程における塩濃度、有機溶媒（ホルムアルデヒド等）の濃度、温度条件等によって規定され、例えば、米国特許No.6,100,037号明細書等に開示されているような、当業者らに周知の様々な条件を採用することができる。
【００２４】
更に、文献（例えばCarruthers(1982)Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 47:411-418; Adams(1983)J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov(1997)Nucleic Acid Res. 25:3440-3444; Frenkel(1995)Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers(1994)Biochemistry 33:7886-7896; Narang(1979)Meth. Enzymol. 68:90; Brown(1979)Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage(1981)Tetra. Lett. 22:1859; 米国特許第4,458,066号）に記載されているような周知の化学合成技術により、in vitroにおいて本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。
【００２５】
本発明の組み換えベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり、インサートとしてのポリヌクレオチドの種類や、その使用目的等に応じて適宜のものを使用する。例えば、ｃＤＮＡ又はそのＯＲＦ領域をインサートとしてグルコース脱水素酵素を生産する場合には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用の発現ベクターや、酵母、カビなどの糸状菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞のそれぞれに適した発現ベクターを使用することもできる。
【００２６】
本発明の形質転換細胞としては、例えば、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞を使用することができる。これらの形質転換細胞は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法によって組み換えベクターを細胞に導入することによって調製することができる。組み換えベクター及び形質転換細胞の具体例として、下記実施例に示した組み換えベクターと、このベクターによる形質転換カビ、形質転換酵母が挙げられる。
【００２７】
グルコース脱水素酵素を真核細胞で発現させて生産させる場合には、前記ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組み換えベクターを作成し、真核細胞内に導入すれば、グルコース脱水素酵素を真核細胞で生産することができる。プラスミドのような状態で細胞内に維持することもできるし、染色体中に組みこませて維持することもできる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐＹＥ８２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合蛋白質としてグルコース脱水素酵素ポリペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ−７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カビ、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、グルコース脱水素酵素を発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。真核細胞で発現させて生産させる場合の挿入遺伝子はイントロンを含んでいても含んでいなくても良く、例えば配列番号１、配列番号３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６又は配列番号４８に記載のシグナル配列を含む遺伝子配列が好ましいが、ベクター側に分泌シグナル配列がある場合は、配列番号４又は配列番号６に記載の遺伝子配列を挿入すれば良く、菌体内に組み換えタンパクを生産させたい場合は、配列番号４又は配列番号６に記載の遺伝子配列に開始コドンＡＴＧを付加したポリヌクレオチドを挿入すれば良いが、菌体外に分泌生産することが好ましい。真核細胞では、本発明の組み換えグルコース脱水素酵素の発現効率が高く、好ましくは培養液１ｍＬあたり少なくとも２０Ｕ、より好ましくは培養液１ｍＬあたり少なくとも５０Ｕ、更に好ましくは培養液１ｍＬあたり少なくとも８０Ｕ、特に好ましくは培養液１ｍＬあたり少なくとも１００Ｕ、最も好ましくは培養液１ｍＬあたり少なくとも１２０Ｕである。更に真核細胞では、原核細胞での組み換え製造時に問題となる封入体を作ることが無く、組み換え酵素を安定して高発現させることができる。加えて、培養物から得られる粗酵素の比活性が高く、夾雑蛋白質が少ないため、精製工程が簡便で精製コストが抑えられ、高収率で精製酵素が得られる。
【００２８】
グルコース脱水素酵素を真核細胞で発現させた後、培養物（菌体、もしくは菌体外に分泌された酵素を含む培養液、培地組成物等）から目的蛋白質を単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、熱処理、ｐＨ処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（タグ配列を利用した方法及びグルコース脱水素酵素に特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用いる方法も含む）、などが挙げられる。
【００２９】
また、グルコース脱水素酵素は、本発明のポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ又はその翻訳領域）を用いた組み換えＤＮＡ技術によって取得できる。例えば前記ポリヌクレオチドを有するベクターからｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を行うことによりｉｎ  ｖｉｔｒｏでグルコース脱水素酵素を作成することができる。またポリヌクレオチドを公知の方法により適当な発現ベクターに組み換えれば、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞で、ポリヌクレオチドがコードしているグルコース脱水素酵素を大量に発現させる事ができる。また宿主に対応して、同一アミノ酸配列であるが、コドンユーセージを最適化したポリヌクレオチドを導入しても良い。
【００３０】
グルコース脱水素酵素をｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現させて生産させる場合には、前記のポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターを有するベクターに挿入して組み換えベクターを作成し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に添加すれば、グルコース脱水素酵素をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼが結合できるプロモーターとしては、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６などが例示できる。これらのプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７１８、ｐＴ７／３１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩなどが例示できる。
【００３１】
本発明のグルコース脱水素酵素は、以下の（ｅ）又は（ｆ）の糖ポリペプチドからなるグルコース脱水素酵素である。
（ｅ）配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチド、
（ｆ）アミノ酸配列（ｅ）のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有する糖ポリペプチド。
【００３２】
本発明のグルコース脱水素酵素の最も具体的な態様は、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなる糖ポリペプチドである。グルコース脱水素酵素活性があれば、配列番号５に記載のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなる糖ポリペプチドでも良く、１〜数個とは、好ましくは多くとも１００個、より好ましくは多くとも８０個、更に好ましくは多くとも６０個、特に好ましくは多くとも４０個である。
例として、配列番号２、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７又は配列番号４９に記載のアミノ酸配列からなる糖ポリペプチドを有するグルコース脱水素酵素が例示できる。
また、本発明のグルコース脱水素酵素には、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、より好ましくは８５％以上の相同性、さらに好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつグルコース脱水素酵素活性を有する糖ポリペプチドが含まれる。
【００３３】
本発明のグルコース脱水素酵素は、電子受容体存在下でグルコースを脱水素する反応を触媒する酵素であるから、この反応による変化が利用できる用途であれば、特に制限されない。例えば、生体物質を含む試料中のグルコースの測定及び測定用試薬、消去用試薬へ使用するなどの医療分野、臨床分野への使用が可能であり、フラビン結合型グルコース脱水素酵素を使用した物質生産においても使用可能である。
【００３４】
本発明のグルコース脱水素酵素は、グルコース測定試薬組成物に用いることができる。本発明の測定試薬組成物は、本発明の糖ポリペプチドからなるグルコース脱水素酵素に、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）若しくは卵白アルブミン、該酵素と作用性のない糖類若しくは糖アルコール類、カルボキシル基含有化合物、アルカリ土類金属化合物、アンモニウム塩、硫酸塩又はタンパク質等から成る群より選ばれる熱安定化剤、又は緩衝剤等の当業者に公知の他の任意成分を適宜含有させ、該酵素や試薬成分の熱安定性や保存安定性を高めることができる。更に、被験試料中に存在する、測定に影響を与える夾雑物質の影響を抑える公知の物質を該測定試薬組成物に含ませることができる。加えて、該組成物が溶解した際に該酵素が作用し易いｐＨとなるように、該組成物に緩衝剤を含有させることができる。
【００３５】
本発明のグルコース脱水素酵素は、試料液中のグルコース濃度を測定するグルコースセンサとしてのバイオセンサに用いることができる。本発明のバイオセンサは、酵素として本発明の糖ポリペプチドからなるグルコース脱水素酵素を反応層に使用したセンサであればよい。例えば、該バイオセンサは、絶縁性基板上にスクリーン印刷や蒸着などの方法を利用して電極系を形成し、更に酸化還元酵素と電子受容体とを含む測定試薬を備えることによって作製される。このバイオセンサの測定試薬に基質を含む試料液を接触させると、測定試薬が溶解して酵素と基質が反応し、これにともなって電子受容体が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体を電気化学的に酸化させ、このとき、このバイオセンサは得られる酸化電流値から試料液中の基質濃度を測定することが可能である。この他に、発色強度又はｐＨ変化などを検知する方式のバイオセンサも構築可能である。これらのバイオセンサにより、測定対象物質を基質とする酵素を選択することによって、様々な物質の測定が可能である。
【００３６】
バイオセンサの電子受容体としては、電子の授受能に優れた物質を用いることができる。電子の授受能に優れた物質とは、一般的に「電子伝達体」、「メディエータ」あるいは「酸化還元媒介剤」と呼ばれる化学物質やタンパク質性の電子メディエータであり、これらに該当する化学物質として、例えば、特表２００２−５２６７５９に挙げられた電子伝達体や酸化還元媒介剤などを利用してもよい。
【００３７】
更に本発明のグルコース脱水素酵素は、バイオ電池に用いることができる。本発明のバイオ電池は、酸化反応を行うアノード極及び還元反応を行うカソード極から構成され、必要に応じてアノードとカソードを隔離する電解質層を含んで構成される。上記の電子メディエータ及び本発明の酵素を含む酵素電極をアノード電極に使用し、基質を酸化することによって生じた電子を電極に取り出すと共に、プロトンを発生させる。一方、カソード側には、一般的にカソード電極に使用される酵素を使用すれば良く、例えばラッカーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ又はビリルビンオキシダーゼを使用し、アノード側で発生させたプロトンを酸素と反応させることによって水を生成させる。電極としては、カーボン、金、白金等、一般的にバイオ電池に使用される電極を用いることができる。
【００３８】
［酵素活性測定法］
以下の手順に従って各溶液を混合し、吸光度を測定し、ＧＬＤ活性を調べた。
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１．００ｍＬ、１Ｍ Ｄ−グルコース溶液１．００ｍＬ、超純水０．６１ｍＬ、３ｍＭ ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下ＤＣＩＰという）０．１４ｍＬ及び３ｍＭ １−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェイト（以下１−ｍ−ＰＭＳという）０．２０ｍＬを混合し、３７℃で１０分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から５分間、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を測定し、直線部分から式１に従いＧＬＤ活性を算出した。この際、ＧＬＤ活性は、３７℃、ｐＨ６．０で１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義した。尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．８はｐＨ６．０におけるＤＣＩＰのモル吸光係数（ｍＭ-1ｃｍ-1）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ６００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量、ｄｆは希釈倍率を表す。
【００３９】
【数１】
0005592440.tif 000002
【００４０】
本酵素のタンパク濃度の測定においては、該酵素を、好ましくは終濃度０．２〜０．９ ｍｇ／ｍＬ  になるように適宜希釈して用いる。本発明におけるタンパク濃度は、日本バイオ・ラッド（株）から購入できるタンパク濃度測定キットであるＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを用い、取扱説明書に従って、牛血清アルブミン（ＢＳＡ，和光純薬工業（株）製，生化学用）を標準物質として作成した検量線から換算して求めることができる。
【００４１】
尚、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、遺伝子工学及び分子生物学的技術はSambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法又はそれらと実質的に同様な方法や改変法に基づき実施可能である。さらに、この発明における用語は基本的にはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。又、本明細書中に引用される文献に記載された内容は、本明細書の一部として本明細書の開示内容を構成するものである。
［実施例１］
（ボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素（ＢｆＧＬＤ）活性の確認）
ポテトデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）２．４％の培地１００ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、シリコ栓をし、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、ボトリオティニア・フケリアナ（Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ  ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）ＮＢＲＣ７１８５株を接種し、２５℃で２１６時間、通気撹拌の条件で菌体を培養した結果、培養上清に、培養液１ｍＬ当たり０．２１Ｕ／ｍＬのグルコース脱水素酵素活性が確認された。尚、グルコース酸化酵素（ＧＯＤ）活性は検出されなかった。
ＧＯＤ活性は、以下の方法で測定した。１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．００ｍＬ、２５ｍＭ ４−アミノアンチピリン０．１０ｍＬ、４２０ｍＭフェノール０．１０ｍＬ、ペルオキシダーゼ（１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）０．１０ｍＬ、超純水０．６５ｍＬ、Ｄ−グルコース１．００ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温後、酵素サンプル０．０５ｍＬを添加し、反応を開始した。反応開始時から酵素反応の進行に伴う５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量（ΔＡ５００）を測定し、式２に従いＧＯＤ活性を算出した。この際ＧＯＤ活性は、３７℃、ｐＨ７．０で、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義した。尚、式中の３．０は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、１０．６６は本測定条件におけるモル吸光係数（ｍＭ-1ｃｍ-1）、０．５は１モルの過酸化水素の生成量に対するキノン型色素の生成量、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、０．０５は酵素溶液の液量（ｍＬ）、ΔＡ５００ｂｌａｎｋは酵素の希釈に用いた溶液を酵素溶液の代わりに添加して反応開始した場合の５００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの増加量、ｄｆは希釈倍率を表す。
【００４３】
【数２】
0005592440.tif 000003
【００４４】
［実施例２］
（真核細胞による組み換えボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素（ＢｆＧＬＤ）の発現）
（１）菌体培養
グルコース（ナカライ社製）１％（Ｗ／Ｖ）、脱脂大豆（昭和産業社製）２％（Ｗ／Ｖ）、コーンスティープリカー（サンエイ糖化社製）０．５％（Ｗ／Ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物（ナカライ社製）０．１％（Ｗ／Ｖ）及び水からなる液体培地をｐＨ６．０に調整し、１００ｍＬを５００ｍＬ容の坂口フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、ボトリオティニア・フケリアナＮＢＲＣ７１８５株を接種し、２５℃で９０時間振とう培養した後、吸引ろ過により湿菌体を回収した。
【００４５】
（２）染色体ＤＮＡの抽出
（１）で得られた菌体のうち湿菌体０．２５ｇを液体窒素により凍結した後、粉砕し、常法により染色体ＤＮＡを抽出した。
【００４６】
（３）ＢｆＧＬＤ遺伝子の取得
（２）で取得したＤＮＡを鋳型とし、ＢｆＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。プライマーは、本発明者らによって既に解明されていた複数のＧＬＤ遺伝子配列から共通配列を解析し、その共通配列を基に縮重プライマーを設計して遺伝子断片を取得し、最終的に下記のプライマー：primer1F（配列番号１５）及びprimer2R（配列番号１６）を用いて、目的のＧＬＤ遺伝子全長（イントロンを含む）を含む約１．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。
primer1F：(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)ATGTATCGTTTACTCTCTACATTTG（配列番号１５）
（括弧内：転写増強因子）
primer2R：((GCTATCCTGTTACGCTTCTAGA))GCATGCCTAAATGTCCTCCTTGATCAAATCT（配列番号１６）
（二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳｐｈＩ））
primer3F：((CCGTCCTCCAAGTTA))GTCGAC(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)（配列番号１７）
（二重括弧内：ｐＳＥＮＳベクター配列、下線部：制限酵素部位（ＳａｌＩ）、括弧内：転写増強因子）
【００４７】
（４）ＢｆＧＬＤ遺伝子を含むベクターの調製
公知文献１（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属の異種遺伝子発現系、峰時俊貴、化学と生物、３８、１２、８３１−８３８、２０００）に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターを使用し、その下流に（３）で得られたＤＮＡ断片を鋳型として上記のプライマー：primer3F（配列番号１７）及び上記のプライマー：primer2Rを用いて増幅したＧＬＤ遺伝子を結合させることで、該遺伝子が発現可能なプラスミドベクターを調製した。この発現用プラスミドベクターを大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換し、得られた形質転換体を培養して、集菌した菌体から、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ｐｌａｓｍｉｄ−ｐｒｅｐ ＭＩＮＩ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いてプラスミドを抽出した。該プラスミド中のインサートの配列解析を行ったところ、イントロンを含むＢｆＧＬＤ遺伝子（配列番号３）が確認できた。
【００４８】
（５）形質転換体の取得
（４）で抽出したプラスミドを用いて、公知文献２（Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１（８），１３６７−１３６９，１９９７）及び３（清酒用麹菌の遺伝子操作技術、五味勝也、醸協、４９４−５０２、２０００）に記載の方法に準じて、ＢｆＧＬＤを生産する組み換えカビ（アスペルギルス・オリゼ）を作製し、得られた組み換え株をＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ固体培地で純化した。使用する宿主としては、アスペルギルス・オリゼＮＳ4株を使用した。本菌株は、公知文献２にあるように、１９９７年（平成９年）に醸造試験所で育種され、転写因子の解析、各種酵素の高生産株の育種などに利用され、分譲されているものが入手可能である。
【００４９】
（６）組み換えカビ由来ＢｆＧＬＤの確認
パインデックス２％（松谷化学工業社製）（ｗ／ｖ）、トリプトン１％（ＢＤ社製）（ｗ／ｖ）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（ｗ／ｖ）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（５）で取得した形質転換体を植菌し、３０℃で３〜４日間振とう培養した。培養終了後、遠心して上清を回収し、組み換えＢｆＧＬＤ糖鎖有りサンプル（Ｓｃ（＋）ＢｆＧＬＤ）とした。
【００５０】
前述の酵素活性測定法に従い組み換えＳｃ（＋）ＢｆＧＬＤのグルコース脱水素酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を測定したところ、培養液１ｍＬ当たり、３日目が１３３Ｕ／ｍＬ、４日目が９８Ｕ／ｍＬのグルコース脱水素酵素活性を確認できた。尚、グルコース酸化酵素活性は確認できなかった。また、本発明の組み換えＢｆＧＬＤは、基質濃度３３３ｍＭにおいて、Ｄ−グルコースに対する活性を１００％とした場合に、マルトース対する反応性が１．３％であった。
【００５１】
（６）酵素の精製
Ｄ−グルコース１％（ｗ／ｖ）、大豆粉２％（ｗ／ｖ）、コーンスティープリカー０．５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム七水和物０．１％（ｗ／ｖ）及び水からなる液体培地（ｐＨ７．０）５０ｍＬを２００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、（５）で取得した形質転換体を植菌し、２５℃で３日間振とう培養して種培養液とした。前記と同様の培地組成で消泡剤を添加した培地３．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、種培養液を５０ｍＬ植菌し、３０℃、３００ｒｐｍ、１ｖ／ｖ／ｍで７日間培養した。培養終了後、培養液をろ布でろ過し、回収したろ液を遠心して上清を回収し、更にメンブレンフィルター（１０μｍ、アドバンテック社製）でろ過して培養上清を回収し、分画分子量８，０００の限外ろ過膜（ミリポア社製）で濃縮して粗酵素液とした。粗酵素液の比活性は１，１７０Ｕ／ｍｇだった。
【００５２】
前記粗酵素液を、５０％飽和硫酸アンモニウム溶液（ｐＨ５．０）になるように調整し、４℃で一晩放置後、遠心分離して上清を回収した。
該上清を、５０％飽和硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で予め平衡化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（φ７．５ｃｍ×１７．７ｃｍ）に通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、限外濾過膜で濃縮後、脱塩し、１ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）と平衡化させ、同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥセルファインＡ−５００ｍ（チッソ社製）カラム（φ６．０ｃｍ×２１．９ｃｍ）に通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。回収した活性画分を、分画分子量８，０００の限外ろ過膜で濃縮後、水置換して組み換えＢｆＧＬＤ糖鎖有りサンプル（Ｓｃ（+）ＢｆＧＬＤ）の精製酵素とした。該精製酵素の比活性は２，１００Ｕ／ｍｇだった。
更に、糖鎖切断前後の組み換えＢｆＧＬＤをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供して確認を行った。詳細には、組み換えＳｃ（＋）ＢｆＧＬＤ５μＬと１％ＳＤＳ及び２％β―メルカプトエタノールを含む０．４Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５μＬを混合し、１００℃で３分間熱処理を行った。糖鎖切断処理として、熱処理後のサンプルにエンドグリコシダーゼＨ（ロシュ製）を１０μＬ（５０ｍＵ）添加し、３７℃で１８時間反応させた。糖鎖切断処理前後のサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、分子量マーカーより分子量を求めたところ、糖鎖切断前の酵素が９０〜１００ｋＤａ、糖鎖切断後の酵素が６０〜７０ｋＤａの組み換えＢｆＧＬＤを確認できた。
【００５３】
［参考例１］
（原核細胞による組み換えボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素（ＢｆＧＬＤ）の発現）
（１）ＢｆＧＬＤ遺伝子のクローニング
実施例２の（４）で抽出したプラスミドを鋳型とし、ＢｆＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ増幅した。予想シグナル配列をコードする遺伝子配列を含まないＢｆＧＬＤ（１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ）遺伝子を得るために、野生型ＢｆＧＬＤの予想Ｎ末端からＣ末端をコードする遺伝子を増幅できる下記のprimer4F_BfGLD_Sig(-)/Sac（配列番号１８）及びprimer5R_BfGLD/Hind（配列番号１９）のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。予想シグナル配列をコードする遺伝子配列を含まないポリヌクレオチドの取得は、分泌シグナル配列をコードする遺伝子配列を含む外来遺伝子を用いて大腸菌で組み換えタンパクを発現させる場合は、組み換えタンパクがペリプラズムに移行されるため生産性が悪いことから、組み換えタンパクを効率よく回収したい場合は、一般的にシグナル配列をコードする遺伝子配列を削除した配列を用いることが知られているためである。尚、ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を使用し、反応条件は［９４℃／３０秒→５０℃／１分→７２℃／２分］×３０サイクルとした。野生型ＢｆＧＬＤの予想Ｎ末端は、ＢｆＧＬＤの全長アミノ酸配列（配列番号２）と国際公開２００６／１０１２３９号パンフレットの配列番号２に記載のアスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素（ＡｔＧＬＤ）との配列同一性を調べ、野生型ＡｔＧＬＤのＮ末端である国際公開２００６／１０１２３９号パンフレットの配列番号２の２０番目以降のアミノ酸配列から、野生型ＢｆＧＬＤのＮ末端は、配列番号１記載の１７番目以降のアミノ酸配列であると予測した。
primer4F_BfGLD_Sig(-)/Sac：AAAGAGCTCGAGCACCGACTCTACCTTAAA（配列番号１８）
（下線部：制限酵素部位（ＳａｃＩ））
primer5R_BfGLD/Hind：CCCAAGCTTCTAAATGTCCTCCTTGATC（配列番号１９）
（下線部：制限酵素部位（ＨｉｎｄＩＩＩ））
ＰＣＲにより、４６ｂｐのイントロンを含み、予想シグナル配列をコードする４８ｂｐの塩基配列を含まない配列にプライマー付加配列が付加したＤＮＡ断片を取得した。
【００５４】
次いで、イントロンを削除するため、前記で得られたＤＮＡ断片を鋳型として、primer4F_BfGLD_Sig(-)/Sac（配列番号１８）及び下記のprimer6R_Bf_up(int)（配列番号２０）のプライマーセット又は下記のprimer7F_Bf_(int)down（配列番号２１）及びprimer5R_BfGLD/Hind（配列番号１９）のプライマーセットを用いて各々前記ＰＣＲ条件でＰＣＲ増幅した。
primer6R_Bf_up(int)：GGGTGTATGCCATTCCATTGATAGTACTAGTCCCT（配列番号２０）
primer7F_Bf_(int)down：GAATGGCATACACCCGAGCCGAAGAT（配列番号２１）
得られた２つの増幅配列を１つのＰＣＲ増幅チューブに入れ、primer4F_BfGLD_Sig(-)/Sac（配列番号１８）及びprimer5R_BfGLD/Hind（配列番号１９）のプライマーセットを用いて前記ＰＣＲ条件でＰＣＲ増幅し、イントロンを含まず、予想シグナル配列をコードする４８ｂｐの塩基配列を含まない１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子にプライマー付加配列が付加したＤＮＡ断片を取得した。
【００５５】
（２）ＢｆＧＬＤ遺伝子を含むベクターの調製及び形質転換体の取得
ｐＵＣ１８ベクター（タカラバイオ社製）を制限酵素ＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩで開裂し、同制限酵素処理したＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をベクターにライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換した。得られた形質転換体のうち６クローンよりプラスミドＤＮＡを調製し、ＳａｃＩとＨｉｎｄＩＩＩで処理したところ全てのクローンで目的のサイズの断片が確認できた。そのうち１クローンについてプラスミドを調製してそのインサートの配列決定を行ったところ、イントロンを含まず、予想シグナル配列をコードする４８ｂｐの塩基配列を含まない配列番号５０に記載の１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子が確認された。
【００５６】
（３）組み換え大腸菌由来ＢｆＧＬＤの確認
ＬＢ液体培地１０ｍＬを太試験管に入れ、シリコ栓をし、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを加え、（４）で作成した形質転換体を接種し、３７℃で振とう培養した。培養液のＯＤ６００が約０．４〜０．５となった時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭ添加し、更に１８時間振とう培養を行った。培養終了後、菌体を遠心により集め、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。超音波破砕装置を用いて菌体を破砕後、遠心して無細胞抽出液を調製した。前述の酵素活性測定法に従い組み換えＢｆＧＬＤ糖鎖無しサンプル（Ｓｃ（−）ＢｆＧＬＤ）のグルコース脱水素酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を測定したところ、培養液１ｍＬ当たり、０．７０３Ｕ／ｍＬのグルコース脱水素酵素活性を確認できた。尚、グルコース酸化酵素活性は確認できなかった。
【００５７】
（４）組み換えＳｃ（−）ＢｆＧＬＤの精製
（２）で作成した形質転換体を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地１０ｍＬに植菌し、３７℃で７時間振とう培養した後、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地５０ｍＬ入りの２５０ｍＬ容のマイヤーフラスコに植菌し、３７℃で１７．５時間振とう培養し、前培養液とした。５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地１．５Ｌ入りの２Ｌ容のジャーファーメンターに前培養液５０ｍＬを植菌し、３７℃で培養し、培養液のＯＤ６００が約０．４〜０．５となった時点で、ＩＰＴＧを１ｍＭ添加し、２５．５時間通気撹拌条件で培養を行った。培養終了後、遠心により集めた菌体を、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し、超音波破砕装置を用いて菌体を破砕後、遠心して無細胞抽出液を調製した。該無細胞抽出液の比活性は０．０１８２Ｕ／ｍｇだった。前記無細胞抽出液を２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００カラムに通液し、溶出液を集めた。前記溶出液を５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セルロファインＡ−５００カラムに通液して酵素を吸着させた。該カラムを同緩衝液で洗浄した後、同緩衝液から０．３Ｍ 塩化カリウムを含む同緩衝液へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて活性画分を集めた。活性画分を分画分子量１００００の限外濾過膜で濃縮し、脱塩後２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に置換し、Ｓｃ（−）ＢｆＧＬＤの精製酵素とした。
更に、組み換えＳｃ（−）ＢｆＧＬＤをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供し、分子量マーカーより分子量を求めたところ約６０ｋＤａの組み換えＳｃ（−）ＢｆＧＬＤを確認できた。
【００５８】
［実施例３］
（組み換えＢｆＧＬＤの公知配列との比較）
シグナル配列部分を含むＢｆＧＬＤのアミノ酸配列は配列番号２に記載の通りだったが、該配列を用いてＢＬＡＳＴ検索したところ、驚いたことにボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース酸化酵素のアミノ酸配列と一致していた。しかし、本発明で得られたＢｆＧＬＤは、実施例２の（６）に記載の通りグルコース脱水素酵素活性を有しており、グルコース酸化酵素活性は全くみられなかった。ボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース酸化酵素のアミノ酸配列は公知文献４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００４）５（１），１７−２７）に記載されており、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（＝Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）のセルフクローニングを行っていることが記載されている。更に該文献中に記載の公知文献５（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９８）５３，１２３―１３２）に、野生型のＢｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（＝Ｂｏｔｒｙｏｔｉｎｉａ ｆｕｃｋｅｌｉａｎａ）由来グルコース酸化酵素の特性が記載されているが、該酵素はサブユニット分子量が３５ｋＤａで、ゲルろ過分子量が約１６０ｋＤａの４量体酵素であることが記載されている。これに対して本発明の組み換えＢｆＧＬＤは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動における分子量が、真核細胞で組み換えた場合、糖鎖切断前の酵素が９０〜１００ｋＤａ、糖鎖切断後の酵素が６０〜７０ｋＤａのグルコース脱水素酵素である。例えば、公知文献６（蛋白質核酸酵素（２００４）４９（５），６２５-６３３，Ｒｅｖｉｅｗ）には、キサンチン脱水素酵素が、プロテアーゼによる部分分解でキサンチン酸化酵素へ変換されることが記載されている。つまり、立体構造が取られた後に、プロテアーゼにより分解されており、キサンチン脱水素酵素とキサンチン酸化酵素は同じ遺伝子に由来している。これらのことから、本発明のボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素とボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース酸化酵素は、遺伝子配列から推測されるアミノ酸配列は同じ配列であっても、ボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース脱水素酵素はサブユニット分子量が糖鎖切断前の酵素で９０〜１００ｋＤａ、糖鎖切断後の酵素で６０〜７０ｋＤａであり、かつグルコース脱水素酵素活性を有しており、一方、論文記載のボトリオティニア・フケリアナ由来グルコース酸化酵素はサブユニット分子量が３５ｋＤａで、かつグルコース酸化酵素活性を有しており、構造、機能とも全く異なる酵素であり、両者の違いは、立体構造を取った後にプロテアーゼによる分解等何らかの修飾を受けるか否かによると推察される。特に、アスペルギルス属で組み換えた酵素においては、プロテアーゼ修飾による活性の変換は見られなかったため、アスペルギルス属で組み換え製造することは、組み換えＢｆＧＬＤを効率的に製造できる有意義な方法と思われる。
【００５９】
［実施例４］
（電極によるグルコースの測定）
組み換えＢｆＧＬＤ糖鎖有りサンプル（Ｓｃ（＋）ＢｆＧＬＤ）を使用し、電極によるＤ−グルコースの測定を行った。酵素０．１６Ｕを搭載したグラッシーカーボン（ＧＣ）電極を用いて、グルコース濃度に対する応答電流値を測定した。電解セル中に、５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０又はｐＨ７．０）１．８ｍＬ及び１Ｍ ヘキサシアノ鉄（ＩＩＩ）酸カリウム（フェリシアン化カリウム）水溶液０．２ｍＬを添加した。ＧＣ電極をポテンショスタットＢＡＳ１００Ｂ／Ｗ（ＢＡＳ製）に接続し、３７℃で溶液を撹拌し、銀塩化銀参照電極に対して＋５００ｍＶを印加した。これらの系に終濃度が１０ｍＭになるように１Ｍ Ｄ−グルコース溶液を５μｌ添加し、定常状態の電流値を測定した。更に各終濃度になるように１Ｍ Ｄ−グルコース溶液を添加し電流値を測定するという作業を、繰り返し、最終的に各グルコース濃度（５、１０、２０、３０、４０ｍＭ）の電流値を測定した。これをプロットしたところ、検量線が作成できた（図１）。尚、５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を用いて組み換えＢｆＧＬＤ糖鎖無しサンプル（Ｓｃ（−）ＢｆＧＬＤ）についても同様に電流値を測定した結果、Ｓｃ（＋）ＢｆＧＬＤの方が、Ｓｃ（−）ＢｆＧＬＤより約２倍のセンサ感度を示した。
【００６０】
［実施例５］
（Ｎ末端解析）
組み換えＢｆＧＬＤ糖鎖有りサンプル（Ｓｃ（＋）ＢｆＧＬＤ）のＮ末端を解析したところ、ＳＴＬＮＹであることが明らかになった。つまり、ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡＳＴＤの１９アミノ酸がシグナル配列であり、該酵素は、翻訳後のペプチドからシグナルペプチダーゼによる修飾で、該１９アミノ酸が削除された形で存在していることが分かった。
【００６１】
［実施例６］
（シグナル配列変異）
組み換えカビによる組み換えＢｆＧＬＤ製造において、分泌シグナルの変異を行った。
下記に記載したプライマーを合成し、実施例２の（４）で取得したプラスミドベクターを鋳型として、シグナル配列を置換したＢｆＧＬＤ遺伝子をＰＣＲ法により増幅した。
primer8_Bf-Atsignal1-7AA-F：((CCCTGTCCCTGGCAGTGGCGGCACCTTTG))TTTGCTGTAGCCTCTTTGGCTGCAG（配列番号２２）
primer9_Bf-Atsignal2-F：((ATGTTGGGAAAGCTCTCCTTCCTCAGTGCCCTGTCCCTGGCAGTGGCGGCACCTTTG))（配列番号２３）
primer10_Bf-eno-Atsignal-F：(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)((ATGTTGGGAAAGCTCTCCTTCCTCA))（配列番号２４）
primer11_Bf-infusion-F：CTCCAAGTTAGTCGAC(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)（配列番号２５）
primer12_Bf-infusion-R：CGCTTCTAGAGCATGCCTAAATGTCCTCCTTGATCAAATC（配列番号２６）
primer13_Bf-Aosig-short1-7AA-F：((AGTGCCCTGTCGCTGGCCACGGCA))TTTGCTGTAGCCTCTTTGGCTGCA（配列番号２７）
primer14_Bf-Aosig-short2-F：((ATGCTCTTCTCACTGGCATTCCTGAGTGCCCTGTCGCTGGCCACGGCA))（配列番号２８）
primer15_Bf-Aosignal1-7AA-F：((TCGCTGGCCACGGCATCACCGGCTGGACGGGCC))TTTGCTGTAGCCTCTTTGGCTGCAGCTAGCACC（配列番号２９）
primer16_Bf-Aosignal2-F：((ATGCTCTTCTCACTGGCATTCCTGAGTGCCCTGTCGCTGGCCACGGCATCACCGGCTGGACGGGCC))（配列番号３０）
primer17_Bf-eno-Aosignal-F：(TGACCAATTCCGCAGCTCGTCAAA)((ATGCTCTTCTCACTGGCATTCCTGA))（配列番号３１）
primer18_Bf-Atsignal1-16AA-F:((CCCTGTCCCTGGCAGTGGCGGCACCTTTG))AGCACCGACTCTACCTTAAACTATG（配列番号３２）
primer19_Bf-Aosig1-short1-16AA-F：((AGTGCCCTGTCGCTGGCCACGGCA))AGCACCGACTCTACCTTAAACTATG（配列番号３３）
primer20_Bf-Atsignal1-19AA-F：((CCCTGTCCCTGGCAGTGGCGGCACCTTTG))TCTACCTTAAACTATGATTATATCATCG（配列番号３４）
primer21_Bf-Aosig1-short1-19AA-F：((AGTGCCCTGTCGCTGGCCACGGCA))TCTACCTTAAACTATGATTATATCATCG（配列番号３５）
（FはForward、RはReverse、下線部：制限酵素切断部位、二重括弧内：各シグナル配列、括弧内：enoA 5'-UTR、その他：ORF）
尚、上記プライマーは、国際公開２００６／１０１２３９号パンフレットの配列番号２に記載のアスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素（ＡｔＧＬＤ）のシグナル配列情報（該公報記載の配列番号２の１から１９番目のアミノ酸配列：配列番号１０）及びシグナル配列予測サイト（Signal p：http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）を用いて推定したアスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素（ＡｏＧＬＤ）のシグナル配列を元にデザインした。尚、ＡｏＧＬＤのシグナル配列は、２種類（短め：配列番号１２及び長め：配列番号１４）の配列を予想した。
【００６２】
１．ＢｆＧＬＤのシグナル配列のうち７アミノ酸を削除して別シグナルを付加するためのクローニング
１−（１）ＡｔＧＬＤのシグナル配列１９アミノ酸を付加するためのクローニング
ＢｆＧＬＤのシグナル配列のうちメチオニンから７番目までのアミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴ）を削除してＡｔＧＬＤのシグナル配列１９アミノ酸を付加するために、イントロンを含む全長ＢｆＧＬＤ遺伝子のシグナル配列部分をコードする塩基配列のうち２１番目までの塩基を、配列番号９に記載の、アスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素のシグナル配列をコードする塩基配列５７ｂｐに置換するために、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは４段階で行った。まず、１段階目として、実施例２の（４）で抽出したプラスミドを鋳型として、primer8_Bf-Atsignal1-7AA-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。次に、２段階目として、1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer9_Bf-Atsignal2-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。続いて、３段階目として、２段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer10_Bf-eno-Atsignal-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。最後に、４段階目として、３段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer11_Bf-infusion-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＢｆＧＬＤの全長アミノ酸配列（配列番号２）のシグナル配列部分の７アミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴ）をＡｔＧＬＤのシグナル配列（配列番号１０）に置換した配列をコードしている、イントロンを含むポリヌクレオチドである。該配列のイントロンを含まない配列をＡｔｓｉｇ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子として配列番号３６に示し、該配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号３７に示した。
【００６３】
１−（２）Ｓ．ＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列１６アミノ酸を付加するためのクローニング
ＢｆＧＬＤのシグナル配列のうちメチオニンから７番目までのアミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴ）を削除してＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列１６アミノ酸を付加するために、イントロンを含む全長ＢｆＧＬＤ遺伝子のシグナル配列部分をコードする塩基配列のうち２１番目までの塩基を、配列番号１１に記載の、アスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素の予想短めシグナル配列をコードする塩基配列４８ｂｐに置換するために、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは４段階で行った。まず、１段階目として、実施例２の（４）で抽出したプラスミドを鋳型として、primer13_Bf-Aosig-short1-7AA-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。次に、２段階目として、1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer14_Bf-Aosig-short2-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。続いて、３段階目として、２段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer17_Bf-eno-Aosignal-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。最後に、４段階目として、３段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer11_Bf-infusion-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＢｆＧＬＤの全長アミノ酸配列（配列番号２）のシグナル配列部分の７アミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴ）をＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列（配列番号１２）に置換した配列をコードしている、イントロンを含むポリヌクレオチドである。該配列のイントロンを含まない配列をＡｏｓｉｇＳ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子として配列番号３８に示し、該配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号３９に示した。
【００６４】
１−（２）Ｌ．ＡｏＧＬＤの予想長めシグナル配列２２アミノ酸を付加するためのクローニング
ＢｆＧＬＤのシグナル配列のうちメチオニンから７番目までのアミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴ）を削除してＡｏＧＬＤの予想長めシグナル配列２２アミノ酸を付加するために、イントロンを含む全長ＢｆＧＬＤ遺伝子のシグナル配列部分をコードする塩基配列のうち２１番目までの塩基を、配列番号１３に記載の、アスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素の予想長めシグナル配列をコードする塩基配列６６ｂｐに置換するために、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは４段階で行った。まず、１段階目として、実施例２の（４）で抽出したプラスミドを鋳型として、primer15_Bf-Aosignal1-7AA-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。次に、２段階目として、1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer16_Bf-Aosignal2-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。続いて、３段階目として、２段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer17_Bf-eno-Aosignal-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。最後に、４段階目として、３段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer11_Bf-infusion-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＢｆＧＬＤの全長アミノ酸配列（配列番号２）のシグナル配列部分の７アミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴ）をＡｏＧＬＤの予想長めシグナル配列（配列番号１４）に置換した配列をコードしている、イントロンを含むポリヌクレオチドである。該配列のイントロンを含まない配列をＡｏｓｉｇＬ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子として配列番号４０に示し、該配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号４１に示した。
【００６５】
２．ＢｆＧＬＤのシグナル配列のうち１６アミノ酸を削除して別シグナルを付加するためのクローニング
２−（１）ＡｔＧＬＤのシグナル配列１９アミノ酸を付加するためのクローニング
ＢｆＧＬＤのシグナル配列のうちメチオニンから１６番目までのアミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡ）を削除してＡｔＧＬＤのシグナル配列１９アミノ酸を付加するために、イントロンを含む全長ＢｆＧＬＤ遺伝子のシグナル配列部分をコードする塩基配列のうち４８番目までの塩基を、配列番号９に記載の、アスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素のシグナル配列をコードする塩基配列５７ｂｐに置換するために、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは４段階で行った。まず、１段階目として、実施例２の（４）で抽出したプラスミドを鋳型として、primer18_Bf-Atsignal1-16AA-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。次に、２段階目として、1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer9_Bf-Atsignal2-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。続いて、３段階目として、２段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer10_Bf-eno-Atsignal-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。最後に、４段階目として、３段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer11_Bf-infusion-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＢｆＧＬＤの全長アミノ酸配列（配列番号２）のシグナル配列部分の１６アミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡ）をＡｔＧＬＤのシグナル配列（配列番号１０）に置換した配列をコードしている、イントロンを含むポリヌクレオチドである。該配列のイントロンを含まない配列をＡｔｓｉｇ-１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子として配列番号４２に示し、該配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号４３に示した。
【００６６】
２−（２）Ｓ．ＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列１６アミノ酸を付加するためのクローニング
ＢｆＧＬＤのシグナル配列のうちメチオニンから１６番目までのアミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡ）を削除してＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列１６アミノ酸を付加するために、イントロンを含む全長ＢｆＧＬＤ遺伝子のシグナル配列部分をコードする塩基配列のうち４８番目までの塩基を、配列番号１１に記載の、アスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素の予想短めシグナル配列をコードする塩基配列４８ｂｐに置換するために、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは４段階で行った。まず、１段階目として、実施例２の（４）で抽出したプラスミドを鋳型として、primer19_Bf-Aosig-short1-16AA-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。次に、２段階目として、1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer14_Bf-Aosig-short2-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。続いて、３段階目として、２段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer17_Bf-eno-Aosignal-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。最後に、４段階目として、３段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer11_Bf-infusion-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＢｆＧＬＤの全長アミノ酸配列（配列番号２）のシグナル配列部分の１６アミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡ）をＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列（配列番号１２）に置換した配列をコードしている、イントロンを含むポリヌクレオチドである。該配列のイントロンを含まない配列をＡｏｓｉｇＳ-１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子として配列番号４４に示し、該配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号４５に示した。
【００６７】
３．ＢｆＧＬＤの全シグナル配列１９アミノ酸を削除して別シグナルを付加するためのクローニング
３−（１）ＡｔＧＬＤのシグナル配列１９アミノ酸を付加するためのクローニング
ＢｆＧＬＤの全シグナル配列、つまりメチオニンから１９番目までのアミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡＳＴＤ）を削除してＡｔＧＬＤのシグナル配列１９アミノ酸を付加するために、イントロンを含む全長ＢｆＧＬＤ遺伝子のシグナル配列部分をコードする塩基配列のうち５７番目までの塩基を、配列番号９に記載の、アスペルギルス・テレウス由来グルコース脱水素酵素のシグナル配列をコードする塩基配列５７ｂｐに置換するために、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは４段階で行った。まず、１段階目として、実施例２の（４）で抽出したプラスミドを鋳型として、primer20_Bf-Atsignal1-19AA-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。次に、２段階目として、1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer9_Bf-Atsignal2-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。続いて、３段階目として、２段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer10_Bf-eno-Atsignal-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。最後に、４段階目として、３段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer11_Bf-infusion-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＢｆＧＬＤの全長アミノ酸配列（配列番号２）の全シグナル配列１９アミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡＳＴＤ）をＡｔＧＬＤのシグナル配列（配列番号１０）に置換した配列をコードしている、イントロンを含むポリヌクレオチドである。該配列のイントロンを含まない配列をＡｔｓｉｇ-１９ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子として配列番号４６に示し、該配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号４７に示した。
【００６８】
３−（２）Ｓ．ＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列１６アミノ酸を付加するためのクローニング
ＢｆＧＬＤの全シグナル配列、つまりメチオニンから１９番目までのアミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡＳＴＤ）を削除してＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列１６アミノ酸を付加するために、イントロンを含む全長ＢｆＧＬＤ遺伝子のシグナル配列部分をコードする塩基配列のうち５７番目までの塩基を、配列番号１１に記載の、アスペルギルス・オリゼ由来グルコース脱水素酵素の予想短めシグナル配列をコードする塩基配列４８ｂｐに置換するために、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは４段階で行った。まず、１段階目として、実施例２の（４）で抽出したプラスミドを鋳型として、primer21_Bf-Aosig-short1-19AA-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。次に、２段階目として、1段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer14_Bf-Aosig-short2-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。続いて、３段階目として、２段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer17_Bf-eno-Aosignal-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。最後に、４段階目として、３段階目のＰＣＲ産物を鋳型として、primer11_Bf-infusion-Fとprimer12_Bf-infusion-Rとを用いたＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物は、ＢｆＧＬＤの全長アミノ酸配列（配列番号２）の全シグナル配列１９アミノ酸（ＭＹＲＬＬＳＴＦＡＶＡＳＬＡＡＡＳＴＤ）をＡｏＧＬＤの予想短めシグナル配列（配列番号１２）に置換した配列をコードしている、イントロンを含むポリヌクレオチドである。該配列のイントロンを含まない配列をＡｏｓｉｇＳ-１９ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子として配列番号４８に示し、該配列にコードされるアミノ酸配列を配列番号４９に示した。
【００６９】
２．ベクターの調整
得られた各ＰＣＲ産物を、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲクローニングキット（タカラバイオ社製）を用いて、公知文献１に記載してあるアスペルギルス・オリゼ由来のアミラーゼ系の改良プロモーターの下流に結合させる事で、各々イントロンを含むＡｔｓｉｇ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＳ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＬ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、Ａｔｓｉｇ-１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＳ-１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、Ａｔｓｉｇ-１９ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子及びＡｏｓｉｇＳ-１９ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子が発現可能なベクターを各々調製した。
【００７０】
これらの発現用ベクターを各々大腸菌ＪＭ１０９株に導入して形質転換し、得られた形質転換体を各々培養して、集菌した菌体から、Ｉｌｌｕｓｔｒａ ｐｌａｓｍｉｄ-ｐｒｅｐ ＭＩＮＩ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、各プラスミドを抽出し、インサートの配列解析を各々行ったところ、各プラスミドで各々イントロンを含むＡｔｓｉｇ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＳ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＬ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、Ａｔｓｉｇ-１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＳ-１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、Ａｔｓｉｇ-１９ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子及びＡｏｓｉｇＳ-１９ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子が確認できた。
【００７１】
３．形質転換体の取得
実施例２の（５）と同様の方法で、各々イントロンを含むＡｔｓｉｇ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＳ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＬ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、Ａｔｓｉｇ-１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、ＡｏｓｉｇＳ-１６ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子、Ａｔｓｉｇ-１９ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子及びＡｏｓｉｇＳ-１９ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子を導入した組み換えカビを各々作製し、Ｃｚａｐｅｋ-Ｄｏｘ固体培地で各形質転換体を純化した。パインデックス２％（松谷化学工業社製）（W／V）、トリプトン１％（BD社製）（W／V）、リン酸二水素カリウム０．５％（ナカライテスク社製）（W／V）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５％（W／V）（ナカライテスク社製）及び水からなる液体培地１０ｍＬを太試験管（２２ｍｍ×２００ｍｍ）に入れ、１２１℃、２０分間オートクレーブした。冷却したこの液体培地に、取得した各形質転換体を１遺伝子につき数本ずつ植菌し、３０℃で４日間振とう培養した。３日目及び４日目にサンプリングした培養上清を遠心（３，０００×g、２０分）し、沈殿を取り除いたものを各酵素サンプルとした。
【００７２】
前述の酵素活性測定法に従い各酵素サンプルのグルコース脱水素酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を測定した結果、同一遺伝子につき活性の高かった２サンプルの平均値が下記の表１のとおりとなった。
【００７３】
【表１】
0005592440.tif 000004
【００７４】
本酵素サンプルのうち、Ａｔｓｉｇ-７ＡＡ（−）ＢｆＧＬＤ遺伝子に由来する酵素サンプルについて、Ｎ末端を解析したところ、ＳＴＬＮＹであることが明らかになった。つまり、野生型のオリジナルシグナル配列の一部を削除して、他シグナル配列を付加しても、酵素のＮ末端は野生型と同じＳＴＬＮＹとなっていることが分かった。
【００７５】
以上の結果より、ＢｆＧＬＤを組み換え製造する場合、ＢｆＧＬＤのシグナル配列をコードする遺伝子の一部又は全部を、他のシグナル配列をコードする遺伝子と置換しても野生型と同じＢｆＧＬＤを製造できることが明らかになった。
【図１】
0005592440.tif 000005
【配列表】
0005592440000001.app