(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端側から順に下記（１）〜（５）に示すアミノ酸配列を有するプローブ：
（１）キャップタンパク質のアミノ酸配列
（２）Ｎ端側にユビキチンリガーゼ認識配列を連結した、修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列、
（３）ユビキチン化されうるリンカー配列
（４）修飾認識配列、および
（５）発色性タンパク質のアミノ酸配列。
【請求項２】
Ｃ末端側に、さらに（６）局在性配列を有することを特徴とする、請求項１に記載するプローブ。
【請求項３】
請求項１または２に記載するプローブをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載するプローブまたは請求項３に記載するポリヌクレオチドを含む、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するための試薬または試薬キット。
【請求項５】
請求項３に記載するポリヌクレオチドを導入して調製される、請求項１または２記載のプローブを発現してなる非ヒト動物またはその子孫。
【請求項６】
請求項１または２に記載するプローブを発現する細胞を用いて、当該プローブに起因する発色を測定することを特徴とする、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量する方法。
【請求項７】
上記プローブを発現する細胞が、請求項３に記載するポリヌクレオチドを細胞内に導入することによって調製されるものである、請求項６に記載する方法。
【請求項８】
被験物質の存在下で、請求項１または２に記載するプローブに起因する発色を測定する工程を有する、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
【請求項９】
被験物質を、請求項１若しくは２に記載するプローブを発現しえる細胞または請求項５記載の非ヒト動物またはその子孫に導入し、当該プローブに起因する発色を測定する工程を有する、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の翻訳後修飾を検出しまた定量するためのプローブに関するものである。より詳細には、本発明は、タンパク質の生体内での翻訳後修飾の有無、並びに翻訳後修飾の程度を測定しまた定量するのに有効なプローブに関する。また本発明は、かかるプローブを用いて、タンパク質の生体内での翻訳後修飾の有無やその程度を測定しまた定量する方法に関する。さらに本発明は、かかるプローブを用いて、タンパク質の生体内での翻訳後修飾に正又は負の影響を与える物質を探索する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生きた細胞中や体内における生体分子の挙動を目で視覚的に見えるようにする技術開発分野のことを「分子イメージング」という。この分子イメージングにおいては、特定の生体イオンや生体分子を捕まえて光を発生する、いわゆるプローブと呼ばれる分子が極めて重要な役割を果たしている。例えば、カルシウムを可視化計測できるFura-2は、1985年に米国のRoger Y. Tsien博士により開発された合成有機蛍光プローブである（非特許文献１）。Fura-2は、カルシウム濃度振動やカルシウム波などに代表されるように、それまでは未知であった生きた細胞内におけるカルシウムの動態を可視化して、我々の生命に対する理解を一変させた。それと同時に、数十万個ないしは数百万個の細胞をすりつぶして生体イオンや脂質、タンパク質などの構成成分を抽出し、それを電気泳動あるいはラジオアイソトープを用いた方法等で分析する、いわゆる従来の破壊分析法だけでは「生命」は理解できない、ということを我々に実感させるに至った。
【０００３】
また、近年では、細胞の生理機能や疾患を理解するうえで重要な細胞内の分子過程を、可視化計測するための蛍光プローブが遺伝子工学的手法により開発されている。例えば、様々なタンパク質リン酸化酵素（キナーゼ）により生起するタンパク質リン酸化（非特許文献２−５、特許文献１）、種々のセカンドメッセンジャー（非特許文献６−１０、特許文献２）、または細胞内のＲＮＡ（非特許文献１１）などの動態を、可視化計測するための蛍光プローブが開発され、生細胞中での分子イメージングの強力なツールになることが報告されている。
【０００４】
このように、生細胞内で生起する分子過程のイメージング（分子イメージング）に関する研究成果が急速に蓄積する一方で、マウスを中心とした動物個体での分子イメージングのニーズが基礎生命科学・医学研究のみならず、薬物候補物質の評価等、創薬研究においても急増している。しかしながら、生体組織による励起光の透過不良や自家蛍光等の問題が原因で、上述の蛍光プローブを生体の分子イメージングにそのまま用いることができないのが現状である。
【０００５】
そこで、ルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質を用いた生体イメージングが近年注目され始めている。たとえば、非特許文献１２では、ホタル由来のルシフェラーゼを発現させた各種ガン細胞をマウスに移植し、そのマウスからのルシフェラーゼに起因する生物発光を指標とすることで、移植したガン細胞の転移または増殖が可視化観察できることが報告されている。また、非特許文献１３では、病原菌のマウス体内での感染が上記生物発光を指標とすることで可視化観察できることが報告されている。
【０００６】
このように、ガン細胞の転移や病原菌の感染において、分子イメージングを用いて細胞レベルで可視化することは応用段階にあるものの、生体内でのタンパク質の翻訳後修飾（リン酸化、糖鎖付加、アセチル化、ヒドロキシル化、アミド化、プレニル化等）など、生体内で生起する特定の「分子」過程について分子イメージングにより観察することを可能とする測定法は未だ開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献２】M. Sato, T. Ozawa, K. Inukai, T. Asano and Y. Umezawa, “Fluorescent Indicators for Imaging Protein Phosphorylation in Single Living Cells” Nature Biotechnol., 20, 287-294 (2002).
【非特許文献３】K. Sasaki, M. Sato and Y. Umezawa, “Fluorescent Indicators for Akt/Protein Kinase B and Dynamics of Akt Activity Visualized in Living Cells” J. Biol. Chem., 278, 30945-30951 (2003).
【非特許文献４】M. Sato, Y. Kawai and Y. Umezawa, “Genetically Encoded Fluorescent Indicators to Visualize Protein Phosphorylation by Extracellular Signal-Regulated Kinase (ERK) in Single Living Cells” Anal. Chem., 79, 2570-2575 (2007).
【非特許文献５】T. Hitosugi, K. Sasaki, M. Sato, Y. Suzuki and Y. Umezawa, “EGF Directs Sex-Specific Steroid Signaling through Src Activation” J. Biol. Chem., 282, 10694-10706 (2007)
【非特許文献６】M. Sato, Y. Ueda, T. Takagi and Y. Umezawa, “Production of PtdInsP3 at Endomembranes is Triggered by Receptor Endocytosis” Nature Cell Biol., 5, 1016-1022 (2003).
【非特許文献７】M. Sato, Y. Ueda and Y. Umezawa, “Imaging Diacylglycerol Dynamics at Organelle Membranes” Nature Methods, 3, 797-799 (2006).
【非特許文献８】M. Sato, N. Hida, M. and Y. Umezawa, “Imaging the Nanomolar Range of Nitric Oxide with an Amplifier-Coupled Fluorescent Indicator in Living Cells” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 14515-14520 (2005).
【非特許文献９】M. Sato, N. Hida, T. Ozawa and Y. Umezawa, “Fluorescent Indicators for Cyclic GMP Based on Cyclic GMP-Dependent Protein Kinase Iα and Green Fluorescent Proteins” Anal. Chem., 72, 5918-5924 (2000).
【非特許文献１０】M. Sato, Y. Ueda, M. Shibuya and Y. Umezawa, “Locating Inositol 1,4,5-trisphosphate in the Nucleus and Neuronal Dendrites with Genetically Encoded Fluorescent Indicators” Anal. Chem., 77, 4751-4758 (2005).
【非特許文献１１】T. Ozawa, Y. Natori, M. Sato and Y. Umezawa, “Imaging Dynamics of Endogenous Mitochondrial RNA in Single Living Cell” Nature Methods, 4, 413-419 (2007).
【非特許文献１２】Jenkins DE, Oei Y, Hornig YS, Yu SF, Dusich J, Purchio T, Contag PR. “Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis.” Clin Exp Metastasis. 2003; 20(8):733-44.
【非特許文献１３】Francis KP, Joh D, Bellinger-Kawahara C, Hawkinson MJ, Purchio TF, Contag PR.“Monitoring bioluminescent Staphylococcus aureus infections in living mice using a novel luxABCDE construct.”Infect Immun. 2000 Jun; 68(6):3594-600.
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第3888974号公報（WO2002/077623）
【特許文献２】特許第3878922号公報（特開2004-325253号公報）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の従来技術における実情に鑑みてなされたものであり、生細胞または動物や植物等の生体内におけるタンパク質の翻訳後の修飾、特にリン酸化を非破壊的に検出または定量するために有用なツールとして、タンパク質の翻訳後修飾検出・定量用プローブを提供することを目的とする。
【００１０】
また本発明は、かかるプローブを用いて、生細胞または動物や植物等の生体内におけるタンパク質の翻訳後の修飾、特にリン酸化を非破壊的に検出または定量する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は、タンパク質の生体内での翻訳後修飾、特にリン酸化に影響を与える物質を取得するために有用なスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねていたところ、後述するアミノ酸配列を有するプローブが、上記目的を達成するためのタンパク質の翻訳後修飾検出・定量用プローブとして有用であること、特に生細胞または動物や植物の生体内におけるタンパク質のリン酸化を検出または定量するためのプローブとして有用であることを見出した。また、当該プローブを導入して調製される細胞や非ヒト動物（トランスジェニック動物）は、タンパク質の翻訳後修飾を検出し、定量するうえで有用であるだけでなく、当該翻訳後修飾に正または負の影響を与える物質をスクリーニングするための材料としても有用であることを確認した。
【００１２】
本発明は、かかる知見に基づいて完成したものであり、下記の実施態様を有するものである：
（Ｉ）タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するためのプローブ
（I-1）Ｎ末端側から順に下記（１）〜（５）に示すアミノ酸配列を有するプローブ：
（１）キャップタンパク質のアミノ酸配列
（２）Ｎ端側にユビキチンリガーゼ認識配列を連結した、修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列、
（３）ユビキチン化されうるリンカー配列
（４）修飾認識配列、および
（５）発色性タンパク質のアミノ酸配列。
【００１３】
（I-2）Ｃ末端側に、さらに（６）局在性配列を有することを特徴とする、（I-1）に記載するプローブ。
【００１４】
（II）プローブをコードするポリヌクレオチド
（I-1）または（I-2）に記載するプローブをコードするポリヌクレオチド。
【００１５】
（III）翻訳後修飾を検出または定量するための試薬または試薬キット
（I-1）または（I-2）に記載するプローブまたは（II）に記載するポリヌクレオチドを含む、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するための試薬または試薬キット。
【００１６】
（IV）非ヒト動物またはその子孫
（II）に記載するポリヌクレオチドを導入して調製される、(I-1)または（I-2）に記載するプローブを発現する非ヒト動物またはその子孫。  
【００１７】
（V）翻訳後修飾を検出または定量する方法
（V-1）（I-1）または（I-2）に記載するプローブを発現する細胞を用いて、当該プローブに起因する発色を測定することを特徴とする、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量する方法。
（V-2）上記プローブを発現する細胞が、（II）に記載するポリヌクレオチドを細胞内に導入することによって調製されるものである、（V-1）に記載する方法。
【００１８】
(VI) スクリーニング方法
（VI-１）被験物質の存在下で、（I-1）または（I-2）に記載するプローブに起因する発色を測定する工程を有する、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
（VI-2）被験物質を、（I-1）または（I-2）に記載するプローブを発現しえる細胞、または（IV）記載の非ヒト動物またはその子孫に導入し、当該プローブに起因する発色を測定する工程を有する、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の翻訳後修飾検出・定量用プローブによれば、前述するように、生細胞または動物や植物等の生体内におけるタンパク質の翻訳後の修飾、特にリン酸化を非破壊的に検出または定量することができる。また、当該プローブをコードするヌクレオチドを用いて当該プローブを発現するように作製したトランスジェニック動物によれば、生体内、特に対象とする生体組織や器官におけるタンパク質の修飾、特にリン酸化を経時的に検出しモニタリングすることができる。
【００２０】
また本発明の翻訳後修飾検出・定量用プローブによれば、生細胞または動物や植物等の生体内におけるタンパク質の翻訳後の修飾、特にリン酸化を制御する物質をハイスループットスクリーニングし、取得することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明のプローブを用いたタンパク質の翻訳後修飾による可視化の原理を示す模式図である。
【図２】実施例１で設計・作製した、インスリン受容体(IR)によるリン酸化を検出または定量するためのプローブ（IR-Lucus、UbG76V-IR-Lucus、IR-Lucus-Ala）の構造を示す模式図である。
【図３ａ】実施例３で行ったプローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーションの結果を示す。：「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」を、プロテアソーム阻害剤（MG-132）で処理（＋）または未処理（−）した後、抗V5抗体でウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
【図３ｂ】実施例３で行ったプローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーションの結果を示す。：MG-132で処理（＋）または未処理（−）の「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」の可溶化液について、まず抗V5抗体で免疫沈降を行い、次いで抗ユビキチン（Ub）抗体でウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
【図３ｃ】実施例３で行ったプローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーションの結果を示す。：プローブ（IR-Lucus）およびプローブ（UbG76VIR-Lucus）をそれぞれ抗V5抗体でウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
【図３ｄ】実施例３で行ったプローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーションの結果を示す。：「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」を、インスリン刺激の前後で可溶化し、抗リン酸化チロシン抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
【図３ｅ】実施例３で行ったプローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーションの結果を示す。：「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」と「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」を、それぞれプロテアソーム阻害剤（MG-132）で処理（＋）した後、インスリン刺激の前（-）と後（＋）で可溶化し、抗V5抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った結果を示す。
【図３ｆ】実施例３で行ったプローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーションの結果を示す。：「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」と「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」を、それぞれインスリンで刺激し、次いでルシフェリンを加えてルシフェラーゼに起因する発光強度を測定した結果を示す。
【図３ｇ】実施例３で行ったプローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーションの結果を示す。：上記においてインスリンの濃度を0〜200nMと変えて測定した結果を示す。
【図３ｈ】実施例３で行ったプローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーションの結果を示す。：「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」と「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」を、タンパク質合成阻害剤（cycloheximide）で処理した上で、インスリンによる刺激を行い、次いでルシフェリンを加えてルシフェラーゼに起因する発光強度を測定した結果を示す。
【図４】（ａ）実施例５において、ルシフェリンを当該マウスの腹腔内に注射して、超高感度カメラを設置した暗箱でプローブからのルシフェラーゼの生物発光を可視化計測した結果を示す。（ｂ）（ａ）で測定したそれぞれの生物発光シグナル（蛍光シグナル）を可視化計測して定量解析した結果を示す。
【図５ａ】実施例６で設計・作成した、セリン・スレオニンキナーゼ(Akt)によるリン酸化を検出または定量するためのプローブ（Akt-Lucus）の構造を示す模式図を示す。
【図５ｂ】プローブ（Akt-Lucus）をCHO細胞で発現させた際の細胞膜における発現状況を示す図である。
【図５ｃ】プローブ（Akt-Lucus）をCHO細胞で発現させた際のミトコンドリア外膜における発現状況を示す図である。
【図５ｄ】プローブ（Akt-Lucus）をCHO細胞で発現させた際の細胞内膜（小胞体膜・ゴルジ体膜）における発現状況を示す図である。
【図５ｅ】プローブ（Akt-Lucus）をCHO細胞で発現させた際の核における発現状況を示す図である。
【図５ｆ】プローブ（Akt-Lucus）をCHO細胞で発現させた際の細胞質における発現状況を示す図である。
【図５ｇ】プローブ（Akt-Lucus）を発現する細胞を、上皮成長因子（EGF）で刺激してプローブの基質配列（Akt）を活性化させて各細胞の生物発光（ルシフェラーゼ）を測定した結果を示す。
【図６】実施例９で樹立した、CHO-IR細胞にIR-Lucusを安定に発現する細胞（IR-IRLucus安定発現細胞株）を用いて、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質を探索するハイスループットスクリーニングに対するプローブ（IR-Lucus）の有効性を確認した結果を示す。ａ： 384 well Cell-Culture Microplateに播種した「IR-IRLucus安定発現細胞株」を、0〜2,000nMのインスリンで刺激し、次いでルシフェリンを加えてルシフェラーゼに起因する発光強度を測定し、S/B（Signal/Background）比に換算した結果を示す。ｂ：上記において、「IR-IRLucus安定発現細胞株」を1,536 well Cell-Culture Microplateに播種し測定を行った結果を示す。
【図７】ａ： 384 well Cell-Culture Microplateに播種した「IR-IRLucus安定発現細胞株」を、購入先が異なる3種類のインスリンで刺激し、次いでルシフェリンを加えてルシフェラーゼに起因する発光強度を測定し、S/B（Signal/Background）比に換算した結果を示す。ｂ：上記において、測定した発光強度からZ’ factorを算出した結果を示す。
【図８】ａ： 384 well Cell-Culture Microplateに播種した「IR-IRLucus安定発現細胞株」を、プロテアソーム阻害剤（MG-132）で処理した後、インスリン未刺激の状態でルシフェリンを加えてルシフェラーゼに起因する発光強度を測定した結果を示す。ｂ：  384 well Cell-Culture Microplateに播種した「IR-IRLucus安定発現細胞株」を、インスリン受容体（IR）キナーゼ阻害剤（AG 1024）で処理することで、インスリン刺激依存的な生物発光シグナルが減弱する割合を阻害率（% of inhibition）で算出した結果を示す。
【図９】「IR-IRLucus安定発現細胞株」を20枚の384 well Cell-Culture Microplateに播種し、インスリン刺激依存的な生物発光シグナルのEC50（50% effective concentration）値を各プレートについて算出した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（Ｉ）タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するためのプローブ
本発明のタンパク質の翻訳後修飾を検出または定量するためのプローブ（本明細書では、単に「プローブ」または「翻訳後修飾検出・定量用プローブ」ともいう）は、少なくとも「(1)キャップタンパク質のアミノ酸配列」（以下、単に「(1)キャップ配列」ともいう）、「(2)Ｎ端側にユビキチンリガーゼ認識配列を連結した、修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列」（以下、単に「(2)配列」ともいう。またこの配列のうち、「ユビキチンリガーゼ認識配列」を「UbL認識配列」と、また「修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列」を「基質配列」ともいう）、「(3)ユビキチン化されうるリンカー配列」（以下、単に「(3)リンカー配列」ともいう）、「(4)修飾認識配列」、および「(5)発色性タンパク質のアミノ酸配列」（以下、単に「(5)発色配列」ともいう）の５つのドメインを有するものである。
【００２３】
当該プローブは、生体または細胞内におけるタンパク質の翻訳後修飾を可視化し、当該修飾を検出・定量するために有効に使用することができる。
【００２４】
タンパク質の翻訳後修飾（本明細書では、単に「修飾」ともいう）とは、タンパク質の生合成において翻訳されたタンパク質が化学修飾を受けることをいう。翻訳後修飾は大きく、官能基付加、タンパク質またはペプチドの付加（ISG化、SUMO化、ユビキチン化）、アミノ酸の化学的性質の変換（シトリル化または脱アミン、脱アミド）、および構造変換（ジスルフィド化、プロテアーゼ分解）に分類することができる。本発明で対象とする翻訳後修飾は、好ましくはアミノ酸残基に対するペプチド付加または官能基付加である。かかる修飾として具体的には、リン酸化（セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸など）、グルコシル化（セリン、スレオニン、アスパラギン酸など）、アシル化（リシン）、アセチル化（リシン）、ヒドロキシル化（リシン、プロリン）、プレニル化（システイン）、パルミトイル化（システイン）、アルキル化（リシン、アルギニン）、ポリグルタミル化（グルタミン酸）、カルボキシル化（グルタミン酸）、ポリグリシル化（グルタミン酸）、シトルリン化（アルギニン）、スクシンイミド形成（アスパラギン酸）等を挙げることができる。好ましくは、リシン以外のアミノ酸残基に対するペプチド付加または官能基付加であり、特に好ましくはリン酸化を挙げることができる。
【００２５】
図１に、本発明のプローブの構成と修飾による可視化の原理を示す概略模式図を示す。図１中、上のルート（ルート１）は、プローブの「基質配列」が修飾を受けない場合のプローブの生体内または細胞内における挙動を示し、下のルート（ルート２）は、プローブの「基質配列」が修飾を受けた場合のプローブの生体内または細胞内における挙動を示す。
【００２６】
まず、本発明のプローブは、生体内または細胞内の脱ユビキチン化酵素の作用により、まず「(1)キャップ配列」が切断されて脱離するが、プローブの「基質配列」が翻訳後修飾を受けない場合（ルート１）は、上記「(1)キャップ配列」が脱離することでプローブのＮ末端側に露出した「UbL認識配列」をユビキチンリガーゼが認識する。その結果、プローブの「(3)リンカー配列」のユビキチン化部位に順次ユビキチンが結合しユビキチン化される。次いで、ポリユビキチン化されたプローブは、プロテアソームに認識され、[(5)発色配列」ともども分解されてしまう（プロテアソーム分解）ため、プローブが発色することはない。一方、プローブの「基質配列」が翻訳後修飾を受けた場合（ルート２）は、「基質配列」に「(3)リンカー配列」を介して隣接する「(4)修飾認識配列」がこれを認識し、修飾された基質配列に特異的に結合する。そうすると、当該「基質配列」のＮ端側に位置する「UbL認識配列」は、「(4)修飾認識配列」に隣接する「(5)発色配列」の立体障害を受けてユビキチンリガーゼに認識されないため、プローブはユビキチン化されず、ポリユビキチンを目印とするプロテアソーム分解を受けない。その結果、当該プローブは、その「(5)発色配列」に基づいて発色する（プローブの修飾が可視化される）。
【００２７】
これから分かるように、プローブ（正確にはプローブの「基質配列」）が修飾されたかどうかは、プローブの発色が検出できるか否かで判断することができる。すなわち、プローブの発色が検出できる場合はプローブが修飾されていると判断され、逆に、プローブの発色が検出できない場合は、プローブが修飾されていないと判断される。また、プローブの発色量は、プローブの存在量、すなわち修飾されたプローブの量と正相関するので、プローブの発色量からタンパク質の修飾の程度を定量することも可能である。
【００２８】
図２および図５ａに、本発明のプローブの一態様（実施例１、実施例６）の構成を示す概略模式図を示す。以下、図１、図２および図５ａを利用して、本発明のプローブにおける各構成部位を具体的に説明する。但し、本発明のプローブは、これらの図に示す具体的な態様に何ら制限されるものではない。
【００２９】
本発明のプローブにおいて、「(3) ユビキチンリガーゼ認識配列（UbL認識配列）」とは、標的とするタンパク質のリシン残基のアミノ基 にユビキチンのC末端をアミド結合させるために、基質として認識されるアミノ酸もしくはアミノ酸配列を意味する。具体的には、例えばアルギニンまたはアルギニンを含む２以上の複数残基、例えば２〜１０残基からなるアミノ酸配列をいう。
【００３０】
本発明のプローブにおいて、「修飾されうるポリペプチド」とは、ある設定条件において修飾されるかどうかの被験対象となる任意のポリペプチドをいう。このアミノ酸配列（基質配列）を変更することにより、様々なタンパク質の翻訳後修飾をそれぞれ特異的に検出し、また定量することができるプローブを設計することができる。当該基質配列は、翻訳後修飾を受ける部位を有するものであればよく、その限りにおいてその配列や構造は特に制限されない。なお、「修飾」とは、前述するようにタンパク質の翻訳後修飾を意味する。
【００３１】
好ましくはリシン以外のアミノ酸残基に対するペプチド付加または官能基付加による修飾であり、特に好ましくはリン酸化である。この場合、ポリペプチド上のリン酸化される部位は、基本的にＯＨ基を有している部位であればよく、具体的にはチロシン、セリン、スレオニンまたはアスパラギン酸などの天然アミノ酸部位、および化学修飾によりＯＨ基を導入した部位などを例示することができる。
【００３２】
本発明のプローブにおいて、「(3)リンカー配列」とは、柔軟な部位を有するアミノ酸配列をさす。プローブの「基質配列」が修飾を受けた場合に、それが「(3)リンカー配列」を介して隣接する「(4)修飾認識配列」と結合を形成することができる程度の柔軟性および長さを有するものであれば、その配列および長さの限定はない。また、当該リンカー配列は、「ユビキチン化されうる」部位を備えていることが好ましい、当該「ユビキチン化されうる部位」とは、本発明のプローブを、ユビキチンリガーゼの基質として反応させた場合に、ユビキチンが付加されるアミノ酸または当該アミノ酸を含む配列をさす。好ましくは１個ないし２以上の複数個のリシン残基を含むアミノ酸配列を挙げることができる。ユビキチンは、ユビキチンリガーゼによって基質に含まれる反応性リシン残基のε-アミノ基へ転移されるからである。
【００３３】
「ユビキチン化されうるリンカー配列」の一例として、「SGGTKTGGSCVKRKTGGSS」（下線部はユビキチンが結合するリシン残基、配列番号１：87〜105）や「GKRKAALAONGGGG」（下線部はユビキチンが結合するリシン残基、配列番号２：90〜103）が挙げられる。またリンカー部位は、リン酸化される部位（例えば、チロシン、セリン、またはスレオニン残基）を有さないように設計することが好ましい。
【００３４】
本発明のプローブにおいて「(4)修飾認識配列」とは、プローブ上の基質配列が修飾された場合に、当該基質配列の修飾基に特異的に結合することができるアミノ酸配列をいう。タンパク質の修飾基とその認識配列との組み合わせは、この分野において数多く知られており、例えば以下の組合せを挙げることができる。
【００３５】
（ａ）リン酸化されたチロシンを含むアミノ酸配列：Src homology 2（SH2）domain（配列番号１：106〜213）
（ｂ）リン酸化されたスレオニンを含むアミノ酸配列：forkhead-associated 2 domain（配列番号２：103〜288）
斯くして本発明の「プローブ」は、かかる「発色性タンパク質」の発色特性に基づいて、吸光分光法、発光分光法、または蛍光分光法などで検出することができ、その結果、マーカーもしくはインジケーターとして機能する。
【００３６】
さらに、本発明のプローブは、「(5)発色配列」のＣ端側に、種々の局在性配列（SLS:subcellular localization sequence）を有するものであってもよい。このような局在性配列は、特定細胞や細胞内の特定領域、あるいは特定の組織を認識し、本発明のプローブを局在化させることができるものである。すなわち、局在化させたい特定細胞や特定領域に応じて、局在化配列を適宜選択すれば、本発明のプローブを形質膜や内膜に対してのみならず、核の内膜、あるいはミトコンドリアの外膜等の他の細胞小器官膜に対しても局在化ならびに固定化することができる。かかる局在性配列としては、例えば、核外輸送シグナル配列やプレクストリン相同性（ＰＨ）ドメイン等の細胞膜結合配列を挙げることができる。より具体的には、細胞膜に結合する局在性配列としては、K-RasやN-Ras等の脂質化配列（Resh, M.D., Cell. Signal.,(1996) 8, 403-412）や膜貫通配列が例示される。また、小胞体膜やゴルジ体膜に結合する局在性配列としては、N-RasのC181S変異体やN-RasのC181変異体-eNOS、ミトコンドリア膜に結合する局在性配列としてはTom20、カベオラに結合する局在性配列としてはcaveolin、ラフトに結合する局在性配列としてはCbpが例示される。また局在性配列として、部位特異的に発現しているタンパク質に対する抗体を使用することもできる。
【００３７】
本発明のプローブは、上記の構成を有し、本発明所望の機能を発揮するものであればよく、その限りにおいてその製造方法は、特に限定されない。全てを化学合成により構築してもよいが、好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の一般的な遺伝子工学的手法により各アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを調製しそれぞれを連結し、次いで定法の遺伝子組み換え技術により発現産生させる方法を挙げることができる。  
【００３８】
（II）プローブをコードするポリヌクレオチド
本発明は、また、前述する翻訳後修飾検出・定量用プローブをコードするポリヌクレオチドを提供する。当該ポリヌクレオチドは、前述する本発明のプローブのアミノ酸配列から定法に従って帰納的に求めることができる。このため、本発明のポリヌクレオチドはその全配列を化学合成により構築してもよいし、またポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等の一般的な遺伝子工学的手法により各アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを調製し、それぞれを連結して作成することもできる。
【００３９】
本発明のプローブをコードするポリヌクレオチドは、通常、当該ポリヌクレオチドが細胞内で発現するのに必要な機能性ＤＮＡ配列に、作動可能に結合された状態で用いられる。ここで、機能性ＤＮＡ配列としては、本発明のプローブをコードするポリヌクレオチドが、細胞、特に動物細胞または植物細胞において発現するために必要な制御領域や調節エレメントなどを意味し、例えばポリアデニル化シグナル、上流配列ドメイン、プロモーター、エンハンサー、またはターミネーター等を例示することができる。プロモーターとしてはあらゆる動植物発現用プロモーターが使用できるが、例えば、具体的にはＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス腫瘍後期プロモーター（Ad MLP）、単純ヘルペスプロモーター、ＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、ラウス肉腫(RSV)プロモーター）、ニワトリβアクチ由来ＣＡＧプロモーター、ヒトEF-1αプロモーター、ヒトUbCプロモーター、またはＡＮＦプロモーターなどを挙げることができる、  
また、ここで「作動可能に結合する」とは、プローブをコードするポリヌクレオチドが、上記各種の機能性ＤＮＡ配列との結合位置及び方向に係わらず、細胞内で発現し得る状態で存在することを意味する。
【００４０】
これらのポリヌクレオチドは、被験者、好ましくはヒトを含む哺乳動物や植物またはそれらの細胞への投与に適した形態を備えていることが好ましい。かかるものとして動物細胞内で発現しえるベクター、例えば遺伝子治療に用いられる発現ベクターを例示することができる。かかる発現ベクターは、他のベヒクル（例えば、リポソームのような脂質ベースの分子、凝集タンパク質、またはトランスポーター分子）などと複合体を形成した状態で使用することもできる。また当該発現ベクターには、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが含まれる。ウイルスベクターの場合、プローブをコードするポリヌクレオチドは、前述する機能性ＤＮＡ配列を作動可能に結合した状態で、ウイルス粒子内に封入された状態で使用される。かかるウイルスベクターとしても当業界で公知のものを任意に使用することができ、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、及びポリオーマウイルス等を挙げることができる。
【００４１】
（III）トランスジェニック非ヒト動物
本発明は、また、前述する翻訳後修飾検出・定量用プローブを発現するように構築された非ヒト動物またはその子孫動物（トランスジェニック非ヒト動物）を提供する。
【００４２】
なお、ここで非ヒト動物としては、ラット、マウス、ハムスター、モルモット、ウシ、ウマ、サル、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物を挙げることができる。
【００４３】
トランスジェニック非ヒト動物の一態様として、本発明は、全細胞または特定の細胞若しくは器官において本発明のプローブを強制発現させてなる非ヒト動物を挙げることができる。当該非ヒト動物は、細胞中に、プロモーター等の機能的ＤＮＡの制御下で本発明のプローブをコードする遺伝子を発現可能な状態で有し、これにより所望細胞中で当該プローブが発現産生してなるトランスジェニック非ヒト動物である。当該トランスジェニック非ヒト動物は、タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化の組織学的研究やそのメカニズムの解明に有効に使用することができる。また該トランスジェニック非ヒト動物は、スクリーニング動物として、タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化を誘導若しくは促進する物質、または抑制する物質を探索するために有用であり、斯くして修飾、特にタンパク質のリン酸化が関わる疾患の予防・治療剤の開発に有効に利用することができる。
【００４４】
かかるトランスジェニック非ヒト動物を産生するための方法は、一般的に、米国特許第４８７３１９１号公報、Brister et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, p.4438-4442 (1985)、特開２００３-５５２６６号公報、並びに「Manipulating the maouse Embryo; A Laboratory Manual」第２版（編集、Hogan, Beddington, Costantimi 及びLong, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994）に記載されており、本発明もこれに準じて行うことができる。なお、これらの文献の内容は、本明細書で援用されることにより本発明の内容に組み込まれる。典型的な方法として、本発明のプローブをコードするオリグヌクレオチド（発現ベクター）を、マイクロインジェクションによりその動物の受精卵に移入する方法を例示することができる。マイクロインジェクションされた受精卵は、雌性宿主に移植され、導入遺伝子の発現を指標として子孫の中から所望のトランスジェニック非ヒト動物が選抜取得できる。
【００４５】
（IV）プローブまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含む試薬・試薬キット
前述する本発明のプローブまたはそれをコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化の組織学的研究やそのメカニズムを解明するための試薬として有効に使用することができる。特に本発明のプローブは、生きた細胞内や体内におけるタンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化を、目で視覚的に見えるように設計されていることから、マーカー試薬または分子イメージング試薬として有効に使用することができる。なお、ここでいう本発明のプローブをコードするポリヌクレオチドは、前述するように、当該ポリヌクレオチドが細胞内で発現するのに必要な機能性ＤＮＡ配列に、作動可能に結合された状態のものであってもよい。
【００４６】
また本発明は、かかるプローブまたはそれをコードするポリヌクレオチドに加えて、発色基質、発色用バッファー、トランスフェクション用試薬などを別個の包装形態で有する試薬キットを提供する。ここで発色基質とは、本発明プローブの発色性タンパク質の基質になるものであり、例えば発色性タンパク質としてルシフェラーゼを使用する場合は、発色基質としてルシフェリンを挙げることができる。
【００４７】
（V）タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量する方法
本発明は、前述する本発明のプローブまたはそれをコードするオリゴヌクレオチド（前述する試薬）を用いて、タンパク質の翻訳後修飾を検出または定量する方法を提供する。
【００４８】
当該方法は、本発明のプローブを動物細胞または植物細胞内に導入し、当該のプローブの発色量を測定することによって実施することができる。
【００４９】
本発明のプローブを細胞内に導入する方法としては、一般的な遺伝子工学的手法が使用できる。具体的には、本発明のプローブをコードするオリゴヌクレオチドを有する発現ベクターを電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法により細胞に導入する方法を例示することができる。このようにプローブを細胞内に導入し、プローブを修飾化物質、好ましくはリン酸化物質と共存させることにより、細胞を破壊することなく、タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化を検出および定量することが可能となる。
【００５０】
なお、上記細胞は、培養細胞であってもいいし、また動物や植物の体内細胞であってもよい。後者の場合、前述するように、本発明のプローブをコードするオリゴヌクレオチドを有する発現ベクターを、マイクロインジェクションによりその動物の受精卵に移入して、当該動物またはその子孫動物の全細胞に本発明のプローブを発現させたものを使用することもできる。
【００５１】
本発明方法によるタンパク質の翻訳後修飾の検出は、本発明のプローブの発色性タンパク質に起因する発色を、その発色特性に基づいて、吸光分光法、発光分光法、または蛍光分光法などを用いて検出することができる。（Ｉ）の欄で説明するように、本発明のプローブに基づいて発色が検出される場合は、タンパク質の翻訳後修飾（リン酸化）が生じていることを意味し、逆に本発明のプローブに基づく発色が検出されない場合は、タンパク質の翻訳後修飾（リン酸化）が生じていないことを意味する。また、プローブの発色量は、プローブの存在量、すなわち修飾されたプローブの量と正相関するので、プローブの発色量からタンパク質の修飾の程度を定量することが可能である。
【００５２】
（VI）タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質のスクリーニング方法
本発明は、また、前述する本発明のプローブまたはそれをコードするオリゴヌクレオチド（前述する試薬）を用いて、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法を提供する。ここで対象とする翻訳後修飾への「影響」には、タンパク質の翻訳後修飾に正の影響（修飾誘導、修飾促進）を与える場合と、負の影響（修飾抑制、脱修飾）を与える場合の両方が含まれる。
【００５３】
当該スクリーニングは、プローブを被験物質との共存下におき、プローブに起因する発色量を測定することによって実施することができる。かかるスクリーニング方法の具体的な手法は、探索する目的物質の種類によって大きく３つに分類することができる。例えば、(a)修飾を誘導する物質を探索する場合のスクリーニング方法は、本発明のプローブを被験物質と共存させることによって実施できる。また、(b)修飾を促進または抑制(阻害)する物質を探索する場合のスクリーニング方法は、本発明のプローブの修飾を被験物質の存在下で行うことで実施できる。さらに、(c)脱修飾を誘導する物質を探索するためのスクリーニング方法は、本発明のプローブを修飾した後に、当該修飾されたプローブに被験物質を共存させることで実施することができる。
【００５４】
より具体的には、(a)のスクリーニングは、本発明のプローブを被験物質と共存させた場合と共存させない場合とでプローブの発色量を対比し、被験物質と共存させた場合のプローブの発色量が、共存させない場合のプローブの発色量に比して大きければ（被験物質と共存させた場合にプローブが発色する場合など）、当該被験物質は、タンパク質の翻訳後修飾を誘導する物質として判断することができる。かかる修飾誘導物質としては、例えばリン酸化を誘導するプロテインキナーゼ活性を有する物質が挙げられる。また逆に、被験物質と共存させた場合のプローブの発色量が、共存させない場合のプローブの発色量と同じで変わらなければ、当該被験物質は、タンパク質の翻訳後修飾を誘導しない物質として判断することができる。
【００５５】
また、（b）のスクリーニングは、本発明のプローブの修飾（正確には「基質配列」の修飾）を、被験物質の存在下または非存在下で行った場合に、被験物質の存在下で得られるプローブの発色量が、被験物質の非存在下で得られるプローブの発色量に比して大きければ、当該被験物質は、タンパク質の翻訳後修飾を促進する物質として判断することができる。かかる修飾促進物質としては、例えばリン酸化を促進するプロテインキナーゼ活性化物質を挙げることができる。また逆に、被験物質の存在下で得られるプローブの発色量が、被験物質の非存在下で得られるプローブの発色量に比して小さければ、当該被験物質は、タンパク質の翻訳後修飾を抑制（阻害）する物質として判断することができる。かかる修飾抑制物質としては、例えばリン酸化を抑制（阻害）するプロテインキナーゼ阻害物質を挙げることができる。
【００５６】
さらに、（c）のスクリーニングは、本発明のプローブを修飾（正確には「基質配列」を修飾）した後に、被験物質を共存させる場合と共存させない場合とでプローブの発色量を対比した場合、被験物質と共存させた場合のプローブの発色量が、被験物質と共存させない場合のプローブの発色量に比して小さくなれば、当該被験物質は、脱修飾を誘導するか促進する物質として判断することができる。かかる脱修飾物質としては、例えば脱リン酸化を誘導または促進する物質としてプロテインフォスファターゼあるいは脱リン酸化活性化物質を挙げることができる。
【００５７】
以上のスクリーニング方法において、本発明のプローブは、例えばｐＨ、塩濃度等を調整した溶液中で被験物質と共存させてもよいし、一般的な遺伝子工学的手法により、前述する本発明のプローブをコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入し、細胞内で発現させた状態で被験物質と接触させてもよい。このとき被験物質は、細胞外に存在していても、細胞に取込まれてもよく、さらには予め細胞に遺伝子工学的手法により導入されていてもよい。
【００５８】
ここで被験物質としては、制限はされないが、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物、または無機化合物などを挙げることができる。また、被験物質は、細胞中に本来存在する内在性の酵素やレセプター等であってもよい。スクリーニングは、具体的には、これらの被験物質またはこれらを含む組成物（例えば、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物等を含む）をプローブと接触させることにより行うことができる。また、スクリーニングに際して採用される被験物質とプローブとの接触条件は、特に制限されないが、生体内の環境またはこれに準じた条件を用いることができ、これを細胞内で行う場合は、細胞が死滅せず所望の遺伝子を発現できる培養条件を選択することが好ましい。
【００５９】
本発明のプローブを細胞内に導入する方法としては、一般的な遺伝子工学的手法が使用できる。具体的には、本発明のプローブをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ発現ベクターを電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法により細胞に導入する方法を例示することができる。このようにプローブをコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入し発現させ、被験物質と共存させた場合の当該プローブの発色量を測定することで、細胞を破壊することなく、タンパク質の翻訳後修飾に影響を与える物質を探索することが可能になる。このため、本発明のプローブは、タンパク質の翻訳後修飾、特にリン酸化または脱リン酸化をコントロールする物質のハイスループットスクリーニングを目的とした多細胞分析においても有益である（Science 279, 84-88(1998); Drug Discovery Today 4, 363-369(1999)）。
【００６０】
さらに、本発明のスクリーニングは、本発明のプローブを発現するためのポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物細胞を個体発生させることによって作成したトランスジェニック非ヒト動物（子孫動物を含む）を用いて行うこともできる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、体細胞中に本発明のプローブを発現可能な状態で保有しているため、細胞または組織中に被験物質を導入し共存させることで、生細胞や組織におけるタンパク質の翻訳後修飾に対する被験物質の影響を調べることができる。斯くして細胞や組織において、タンパク質の翻訳後修飾に対して正の影響（修飾誘導、修飾促進）または負の影響（修飾抑制、脱修飾）を与える物質を探索し取得することができる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実験例により説明するが、本発明は、かかる実験例に限定されるものではない。また、以下の実験例において、遺伝子操作、細胞培養等には、特に断りのない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press), Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Willey-Interscience）等に記載された方法を用いた。
【００６２】
下記の実施例では、タンパク質の翻訳後修飾のうち、代表的なリン酸化修飾を例に挙げて、本発明のプローブの構成およびその作用を説明する。タンパク質のリン酸化を検出・定量するための本発明のプローブにおいて、その「修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列」（基質配列）は、当該プローブのキナーゼ選択性を決める重要な領域になる。この基質配列を変更することにより、様々なキナーゼによるリン酸化を特異的に可視化するプローブを開発することができる。
【００６３】
実施例1    タンパク質の翻訳後修飾（リン酸化）を検出または定量するためのプローブ作成（その１）（図２参照）
（１）インスリン受容体によるリン酸化検出・定量用プローブ（IR-Lucus）の設計と作成（図２）
受容体型チロシンキナーゼであるインスリン受容体（IR）による翻訳後修飾（リン酸化）を可視化するためのプローブ（以下、これを「IR-Lucus」ともいう）を作成した。
【００６４】
作成した「IR-Lucus」の構造を示す模式図を図２に、またそのアミノ酸配列を配列番号１に示す。当該「IR-Lucus」は、下記に詳述するように、Ｎ末端から順に「（1）キャップタンパク質のアミノ酸配列」（図２中、「Ub」と表示）、「（2）Ｎ端領域にユビキチンリガーゼ認識配列を連結した、修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列」、「（3）ユビキチン化されうるリンカー配列」（図２中、(2)と(3)を併せて「Substrate with lnker」と表示）、「（4）修飾認識配列」（図２中、「SH2 domain」と表示）、および「（5）発色性タンパク質のアミノ酸配列」（図２中、「FLuc」と表示）から構成される。
【００６５】
本発明のプローブは、基本的に上記の「（1）キャップタンパク質のアミノ酸配列」（以下、「(1)キャップ配列」という）、「（2）Ｎ端領域にユビキチンリガーゼ認識配列を連結した、修飾されうるポリペプチドのアミノ酸配列」（以下、「(2) Ｎ端領域にUbL認識配列を連結した基質配列」という）、「（3）ユビキチン化されうるリンカー配列」（以下、「(3)リンカー配列」という）、「（4）修飾認識配列」、および「（5）発色性タンパク質のアミノ酸配列」（以下、「(5)発色配列」という）から構成されるが、ここでは、実施例３でのキャラクタリゼーションに供するために、「（5）発色配列」のＣ末端側に、5Vエピトープのアミノ酸配列「GKPIPNPLLGLDST」（配列番号１：779〜784）を連結した。これにより、抗5V抗体（クロンテック社）を使用することで、当該プローブの細胞内（生体内）での挙動、ならびに翻訳後修飾（リン酸化）が細胞のどこで、どの程度起こっているかを、測定することができる。
【００６６】
ここで「(1)キャップ配列」として、ユビキチンのアミノ酸配列を使用した。すなわち、図２中、「Ub」として示されている領域は、ユビキチンのアミノ酸配列に相当する領域であって、配列番号１で示すアミノ酸配列において１〜76番目の領域に相当する。
【００６７】
また「(2)Ｎ端領域にUbL認識配列を連結した基質配列」として、Ｎ端にアルギニン（R）（配列番号１：77）を連結した「GTEEYMKMD」（下線部はリン酸化されるチロシン、配列番号１：78〜86）からなるアミノ酸配列（基質配列）を使用した。アルギニンは、ユビキチンリガーゼが酵素として機能を発揮するときに基質として認識され、当該ユビキチンリガーゼに結合するアミノ酸である。そのうえ、当該アルギニンがＮ末端に位置する場合、多くの組織に広く分布するユビキチンリガーゼに普遍的に認識される。
【００６８】
「基質配列」として使用する「GTEEYMKMD」は、受容体型チロシンキナーゼであるインスリン受容体（IR）と相互作用することでリン酸化されるタンパク質（インスリン受容体基質タンパク質-1、以下、「IRS-1」という。）の、リン酸化されるアミノ酸（チロシン）を含む領域のアミノ酸配列に相当する。つまり、かかるアミノ酸配列を基質配列として有するプローブは、インスリン受容体（IR）（キナーゼ）の作用を受けることで、上記基質配列中のリン酸化部位（チロシン）がリン酸化されることになる。
【００６９】
また、上記基質配列のＣ端側に、「(3)リンカー配列」として、「SGGTKTGGSCVKRKTGGSS」（下線部はユビキチンが結合するリシン、配列番号１：87〜105）を用いた。当該リンカー配列は、ユビキチンが結合するように１以上のリシン残基を有するように設計されたアミノ酸配列である。当該アミノ酸配列のリシン残基の側鎖のアミノ基とユビキチンのＣ末端がアミド結合することで一つめのユビキチンが付加され、さらにそのユビキチン中のリシン残基の側鎖に更に次のユビキチンが付加するというように複数のユビキチンが次々と付加される（ポリユビキチン化）。
【００７０】
また上記リンカー配列のＣ端側に、「(4)修飾認識配列（リン酸化認識配列）」として、「GSSASDAEWYWGDISREEVNEKLRDTADGTFLVRDASTKMHGDYTLTLRKGGNNKLIKIFHRDGKYGFSDPLTFNSVVELINHYRNESLAQYNPKLDVKLLYPVSGGG」（配列番号１：106〜213）を用いた。当該「(4)修飾認識配列」は、Phosphoinositide 3-kinase （PI3K）のサブユニットの1つであるp85αのSrc homology 2 domain（SH2 domain）のアミノ酸配列に相当する。かかるSH2 domainは、インスリン受容体基質タンパク質-1（IRS-1）がインスリン受容体（IR）（キナーゼ）の作用でリン酸化されると、当該リン酸化部位を含むアミノ酸配列を認識して当該配列に結合するように機能する。このため、IRの作用によって前述する「基質配列」上のチロシン残基がリン酸化されると、上記「修飾認識配列」はこのリン酸化された「基質配列」を認識してこれと結合することになる。
【００７１】
さらに上記「(4)修飾認識配列」のＣ端側に、「(5)発色性タンパク質」として、自家蛍光の影響を受けず、生体深部の可視化が可能な生物発光タンパク質であるホタルルシフェラーゼを用いた。そのアミノ酸配列は、配列番号１において、アミノ酸番号216〜635の領域に相当する。かかる生物発光タンパク質により、生体内における当該プローブの修飾（リン酸化）を可視化することができる。
【００７２】
このプローブを用いた生体内での翻訳後修飾（リン酸化）の可視化の原理を、図１を用いて説明する。本発明のプローブの基質配列がリン酸化されない場合は、図１の上のルート（ルート１）を通り、プローブがユビキチン化され、プロテアソームに認識されて分解される結果、発色を呈しない。一方、本発明のプローブの基質配列がリン酸化される場合は、図１の下のルート（ルート２）を通り、プローブは上記のようなユビキチン化を受けないため、結果としてプローブの「(5)発色性タンパク質」に基づいて発色し、結果としてプローブのリン酸化が可視化される。
【００７３】
具体的には、本発明のプローブの基質配列がキナーゼの作用によりリン酸化されない場合（ルート１）は、生体内の脱ユビキチン化酵素の作用により、プローブ（IR-Lucus）から、まず「(1)キャップ配列」に相当するユビキチンのアミノ酸配列が切断されて脱離する。その結果、プローブのＮ末端側に露出した「UbL認識配列」に相当するアルギニン（R）をユビキチンリガーゼが認識して、それに結合することで、プローブの「(3)リンカー配列」に順次ユビキチンが結合されユビキチン化される。斯くしてポリユビキチン化されたプローブは、ポリユビキチンを目印としてプロテアソームに認識されて分解されてしまい、発色を呈しない。
【００７４】
一方、本発明のプローブの基質配列がキナーゼの作用によりリン酸化されると（ルート２）、当該リン酸化された基質配列は、これに「（3）リンカー配列」を介して連結している「(4) 修飾認識配列」によって認識され、上記リンカー配列がループ状に折れ曲がって当該基質配列と結合する。当該基質配列のＮ端側に位置する「UbL認識配列」は、「(5)発色性タンパク質」の立体配座の影響をうけ覆い隠されるためユビキチンリガーゼによって認識されず、その結果、プローブはユビキチン化を受けない。このため、当該プローブは、ユビキチンを目印とするプロテアソーム分解を受けないため、その「(5)発色性タンパク質」に基づいて発色する（プローブのリン酸化が可視化される）。
【００７５】
（２）比較用プローブ（UbG76VIR-Lucus、IR-Lucus-Ala）の設計と作成（図２）
上記プローブ（IR-Lucus）のNegative Controlとして、２種類のプローブ（UbG76VIR-Lucus、IR-Lucus-Ala）を作成した。
【００７６】
プローブ（UbG76VIR-Lucus）は、上記プローブ（IR-Lucus）において、「(1)キャップタンパク質」がユビキチンリガーゼ（DUB）によって切断され脱離しないように、配列番号１のアミノ酸配列の76番目のグリシン残基（G）をバリン残基（V）に置換した構造を有するものである。またプローブ（IR-Lucus-Ala）は、上記プローブ（IR-Lucus）において、基質配列がリン酸化修飾を受けないように、当該基質配列のチロシン残基（Y）をアラニン残基（A）に置換した構造を有するものである。
【００７７】
実施例２  IR導入細胞（CHO-IR細胞）およびプローブ導入細胞の調製
（１）IR導入細胞（CHO-IR細胞）の調製
（1-1）IR発現ベクターの構築
インスリン受容体（IR）のcDNAを、膵臓由来のcDNAライブラリーから定法のPCRに従って増幅しクローニングした。クローニングして得られたcDNAをpBLuescript SK(+)（宝酒造社製）にサブクローニングし、得られたPCRフラグメントの塩基配列を、ABI310ジェネティック・アナライザーにより確認した。斯くして、インスリン受容体（IR）をコードするcDNAを、哺乳類の発現ベクターであるpcDNA3.1/V5-HisA（Invitrogen Co.）のHind IIIおよびEcoR I部位にサブクローニングし、これをIR発現ベクターとした。
【００７８】
（1-2）IR導入細胞の調製
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を、10 %ウシ胎児血清（FCS）（ライフ・テクノロジー社製）を補充したHamのF-12培養液（CHO用培養液）中で、37℃、5 %CO2 下で培養した。得られたCHO細胞を付着細胞用表面処理済み培養皿に播種し、LipofectAMINE2000試薬（ライフ・テクノロジー社製） を用いて、37℃、5 %CO2の条件で、（1-1）で調製したIR発現ベクターを導入し、IR導入細胞（CHO-IR細胞）を調製した。
【００７９】
（２）プローブ導入細胞の調製
（2-1）プローブ発現ベクターの構築
実施例１で作成した各プローブ（IR-Lucus、UbG76VIR-Lucus、IR-Lucus-Ala）をコードするcDNAを、それぞれ哺乳類の発現ベクターであるpcDNA3.1/V5-HisA（Invitrogen Co.）のHind IIIおよびEcoR I部位にサブクローニングし、それぞれIR-Lucus発現ベクター、UbG76VIR-Lucus発現ベクター、およびIR-Lucus-Ala発現ベクターとした。
【００８０】
（2-2）プローブ導入細胞の調製
上記（１）で調製したIR導入細胞（CHO-IR細胞）を、付着細胞用表面処理済み培養皿に播種した。次いでLipofectAMINE2000試薬（ライフ・テクノロジー社製）を用いて、37℃、5％CO2の条件で、当該IR導入細胞（CHO-IR細胞）に、上記（2-1）で調製した各プローブ発現ベクター（IR-Lucus発現ベクター、UbG76VIR-Lucus発現ベクター、およびIR-Lucus-Ala発現ベクター）をそれぞれ導入し、プローブ導入細胞（IR-Lucus導入細胞、UbG76VIR-Lucus導入細胞、およびIR-Lucus-Ala導入細胞）を調製した。当該プローブ導入細胞は、インスリン受容体（IR）（キナーゼ）とプローブ（IR-Lucus、UbG76VIR-Lucus、またはIR-Lucus-Ala）が共発現するCHO細胞（IR-プローブ発現細胞）である。以下、IRとプローブ（IR-Lucus）が共発現するCHO細胞を「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」と、IRとプローブ（UbG76VIR-Lucus ）が共発現するCHO細胞を「IR-プローブ（UbG76VIR-Lucus ）発現細胞」と、またIRとプローブ（IR-Lucus-Ala）が共発現するCHO細胞を、「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」という。
【００８１】
実施例３  プローブ（IR-Lucus）のキャラクタリゼーション
（１）実施例２（２）（2-2）で調製した「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」を、プロテアソーム阻害剤（MG-132）で処理した後、この細胞を可溶化し、V5エピトープに対する抗V5抗体（クロンテック社製）とHRP標識二次抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。また比較のため、プロテアソーム阻害剤（MG-132）で処理しない「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」についても可溶化して同様に、抗V5抗体を用いてウェスタンブロッティングに供した。
【００８２】
結果を図３ａに示す。MG-132未処理物の結果（レーン：−）からわかるように、プローブ（IR-Lucus）の推定分子量は約89kDaであるが、MG-132処理物では、200kDaを越える高分子量域にもバンドが検出された（レーン：＋）。
【００８３】
そこで次に、MG-132で処理した「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」の可溶化液について、まず抗V5抗体（クロンテック社製）で免疫沈降を行い、次いで抗ユビキチン（Ub）抗体（クロンテック社製）でウェスタンブロッティングを行った。
【００８４】
結果を図３ｂに示す。この結果から、上記で200kDaを越える高分子として検出されたバンドは、プローブ（IR-Lucus）が、ポリユビキチン化されたものであると考えられた。
【００８５】
（２）プローブ（IR-Lucus）およびプローブ（UbG76VIR-Lucus）の推定分子量は約89kDaである。しかし、抗V5抗体でウェスタンブロッティングを行った結果、プローブ（IR-Lucus）はプローブ（UbG76VIR-Lucus）より小さい約80kDaの位置で検出された。これは、細胞内の脱ユビキチン化酵素（DUB）により、プローブ（IR-Lucus）は、そのＮ末端領域のユビキチンに相当するアミノ酸配列が遊離されたことを示唆している（図３ｃ参照）。
【００８６】
（３）プローブ（IR-Lucus） をCHO-IR細胞に導入して調製した「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」の培養液中に100nM インスリンを添加する前後で可溶化し、まず抗V5抗体（クロンテック社製）で免疫沈降を行い、次いで抗リン酸化チロシン抗体（クロンテック社製）でウェスタンブロッティングを行った。その結果を図３ｄに示す。図３ｄからわかるように、約80kDaのプローブ（IR-Lucus）はインスリン刺激によって、その基質配列上のチロシン残基がインスリン依存的かつ刺激時間依存的にリン酸化されていることを確認できた（図３ｄ）。
【００８７】
（４）プローブ（IR-Lucus）とプローブ（IR-Lucus-Ala）を、それぞれCHO-IR細胞に導入し調製した「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」と「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」を、それぞれプロテアソーム阻害剤（MG-132）で処理した後、インスリン刺激の前後で可溶化し、抗V5抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。結果を図３ｅに示す。図３ｅからわかるように、200kDaを越える高分子として検出されるプローブ（IR-Lucus-Ala）の量は、インスリン刺激（＋）しても減少しなかったが、200kDaを越える高分子として検出されるプローブ（IR-Lucus）の量は、インスリン刺激（＋）することで減少した。
これは、プローブ（IR-Lucus-Ala）の基質配列はインスリン刺激してもリン酸化されず、ポリユビキチン化が生じているのに対して、プローブ（IR-Lucus）の基質配列は、インスリン刺激によってリン酸化し、その結果、ポリユビキチン化が抑制されていることを意味する（図３ｅ参照）。
【００８８】
（５）次にプローブの生物発光の検討を行った。
【００８９】
プローブ（IR-Lucus）とプローブ（IR-Lucus-Ala）を、それぞれCHO-IR細胞に導入し調製した「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」と「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」を、それぞれ100nMの インスリンで刺激し、次いでプローブの「(5)発光性タンパク質」（ルシフェラーゼ）の基質であるルシフェリンを加えて、発光強度をルミノメーターで測定した。
【００９０】
結果を図３ｆ及び図３ｇに示す。その結果、IR-Lucus導入細胞（IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞）（図３ｆ中、■で示す）において、経時的にルシフェラーゼの発光強度が上昇することが確認された（図３ｆ）。また「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」において、インスリン濃度依存的に発光強度が上昇することが確認された（図３ｇ中、■で示す）。一方、ネガティブコントロールとして用いた「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」については、インスリン刺激してもルシフェラーゼの発光強度の上昇は確認できなかった（図３ｆ、ｇ中、□で示す）。
【００９１】
（６）さらに、プローブのリン酸化依存的な細胞内寿命について調べた。
【００９２】
プローブ（IR-Lucus）とプローブ（IR-Lucus-Ala）を、それぞれCHO-IR細胞に導入し調製した「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」と「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」を、タンパク質合成阻害剤（cycloheximide）で処理し、更なる新生タンパク質の発現を阻害した上で、インスリンによる刺激を行い、プローブの「(5)発光性タンパク質」（ルシフェラーゼ）の基質であるルシフェリンを加えて、発光強度をルミノメーターで測定した。
【００９３】
その結果、「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」において、インスリン刺激しない（−）と生物発光は時間依存的に低下するものの、インスリン刺激（＋）により当該生物発光の時間依存的な低下が抑制された（図３ｈの左図）。このことから、プローブの細胞内寿命はリン酸化依存的に延長することが示された。一方、ネガティブコントロールとして用いた「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」では、インスリン刺激してもプローブの寿命延長は確認できなかった（図３ｈの右図）。
【００９４】
以上（１）〜（６）の検討より、本発明のプローブ（IR-Lucus）は、インスリン受容体（キナーゼ）の働きによってリン酸化すること、そして、リン酸化依存的にユビキチン−プロテアソームの分解経路から逃れて、生物発光を生起することが明らかとなった。このことは、このプローブが、キナーゼによるタンパク質修飾（リン酸化）（翻訳後修飾）の検出・定量に有用であることを示している。
【００９５】
実施例４  IR-Lucus導入細胞、あるいはIR-Lucus-Ala導入細胞のマウスへの移植
CHO-IR細胞に、プローブ（IR-Lucus）またはプローブ（IR-Lucus-Ala）を導入して調製した「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」（5×106個）または「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」（5×106 個）を、マウス右背面皮下にそれぞれ移植して一晩放置した後、1.0IU/kgの容量でインスリンを当該マウスの腹腔内に注射した。
【００９６】
実施例５  マウス生体での蛋白質リン酸化の可視化計測
マウスin vivoイメージングの直前に、ルシフェリン（150mg/kg）を当該マウスの腹腔内に注射して、超高感度カメラを設置した暗箱でプローブからのルシフェラーゼの生物発光を1分間可視化計測した。
【００９７】
結果を図４ａ及びｂに示す。図４ａに示すように、インスリン注射により「IR-プローブ（IR-Lucus）発現細胞」からの生物発光シグナルが増強することが観察された（図４ａ）。一方、ネガティブコントロールの「IR-プローブ（IR-Lucus-Ala）発現細胞」からの生物発光シグナルは、インスリン注射によっても増強しなかった（図４ａ）。図４ｂは、それぞれの生物発光シグナル（蛍光シグナル）を可視化計測して定量解析した結果を示す。これから、本発明のプローブによれば、生物発光シグナルを定量することでタンパク質の修飾化（リン酸化）を定量することができる。
【００９８】
これらの結果より、本発明のプローブが、生体内（in vivo）でのタンパク質修飾（リン酸化）の可視化計測およびその定量に利用できることが判明した。
【００９９】
実施例６  タンパク質の翻訳後修飾（リン酸化）を検出または定量するためのプローブ作成（その２）（図５参照）
（１）セリン・スレオニンキナーゼによるリン酸化検出・定量用プローブ（Akt-Lucus）の設計と作成（図５ａ）
細胞死や糖代謝を制御するセリン・スレオニンキナーゼであるAkt による翻訳後修飾（リン酸化）を可視化するためのプローブ（以下、これを「Akt-Lucus」ともいう）を作成した。
【０１００】
作成した「Akt-Lucus」の具体的構成を示す模式図を図５ａに、またそのアミノ酸配列を配列番号２に示す。当該「Akt-Lucus」は、下記に詳述するように、Ｎ末端から順に「（1）キャップ配列」（図５ａ中、「Ub」と表示）、「（2）Ｎ端領域にUbL認識配列を連結した基質配列」、「（3）リンカー配列」（図２中、(2)と(3)を併せて「Substrate with lnker」と表示）、「（4）修飾認識配列」（図２中、「FHA2 domain」と表示）、および「（5）発色配列」（図２中、「FLuc」と表示）を有している。
【０１０１】
本発明のプローブは、基本的に上記の「（1）キャップ配列」、「（2）Ｎ端領域にUbL配列を連結した基質配列」、「（3）リンカー配列」、「（4）修飾認識配列」、および「（5）発色配列」から構成されるが、ここでは、プローブを特定の細胞膜に局在化させて、当該部位でのリン酸化の挙動を可視化するために、「（5）発色配列」のＣ末端に、リンカー配列「GGSGGSGGSGG」（配列番号２：708〜718）を介して、細胞膜の局在化配列（SLS：subcellular localization sequence）（配列番号２：719〜729）を連結した。
【０１０２】
なお、上記局在化配列（SLS）として様々な細胞内器官の局在化配列を使用することで、本発明のプローブを特定の細胞内器官に局在化させることができ、その結果、当該部位でのリン酸化の挙動を可視化することができる。かかるプローブによれば、Aktによる翻訳後修飾（リン酸化）が細胞のどこで、どの程度起こっているかを、測定することができる。
【０１０３】
この目的で、配列番号２に示すプローブ（Akt-Lucus）の局在化配列（配列番号２：719〜729）に代えて、細胞内膜（小胞体膜・ゴルジ体膜）の局在化配列（QGCMGLPCVVM：配列番号３）（Cell 98, 69-80 (1999)）、ミトコンドリア外膜の局在化配列（FNRWFLTGMTVAGVVLLGSLFSRK：配列番号４）（Biochemistry 43, 10930-10943 (2004)）、核の局在化配列（DPKKKRKVDPKKKRKVDPKKKRKVEDA：配列番号５）（Anal. Chem. 77, 4751-4758 (2005)）、細胞質の局在化配列（LPPLERLTL：配列番号６）（Cell 90, 967-970 (1997)）をそれぞれ有するプローブ（Akt-Lucus）を同様に作成した。
【０１０４】
なお、当該プローブ（Akt-Lucus）において、「(1)キャップ配列」として、実施例１のプローブ（IR-Lucus）と同様に、ユビキチンのアミノ酸配列を使用した。すなわち、図５ａ中、「Ub」として示されている領域は、ユビキチンのアミノ酸配列に相当する領域であって、配列番号２で示すアミノ酸配列において１〜76番目の領域に相当する。
【０１０５】
また「(2)Ｎ端領域にUbL認識配列を連結した基質配列」として、Ｎ端にアルギニン（R）（配列番号２：77）を連結した「GRKRDRLGTLGI」（下線部はリン酸化されるスレオニン、配列番号２：78-89）で示されるアミノ酸配列を用いた。当該アミノ酸配列は、セリン・スレオニンキナーゼ（Akt）と相互作用してリン酸化されるタンパク質（基質タンパク質）の、当該リン酸化されるアミノ酸（チロシン）を含む領域のアミノ酸配列に相当する。つまり、かかるアミノ酸配列を基質配列として有するプローブによれば、セリン・スレオニンキナーゼ（Akt）の作用を受けることで、上記基質配列中のリン酸化部位（スレオニン）がリン酸化されることになる。
【０１０６】
また、上記基質配列のＣ端側に、「(3)リンカー配列」として、「GKRKAALAQNGGGG」（下線部はユビキチンが結合するリシン、配列番号２：90〜102）を用いた。当該リンカー配列は、ユビキチンが結合するように１以上のリシン残基を有するように設計されたアミノ酸配列である。当該アミノ酸配列のリシン残基の側鎖のアミノ基とユビキチンのＣ末端がアミド結合することで一つめのユビキチンが付加され、さらにそのユビキチン中のリシン残基の側鎖に更に次のユビキチンが付加するというように複数のユビキチンが次々と付加される（ポリユビキチン化）。
【０１０７】
また上記リンカー配列のＣ端側に、「(4)修飾認識配列（リン酸化認識配列）」として、「GSGNGRFLTLKPLPDSIIQESLEIQQGVNPFFIGRSEDCNCKIEDNRLSRVHCFIFKKRHAVGKSMYESPAQGLDDIWYCHTGTNVSYLNNNRMIQGTKFLLQDGDEIKIIWDKNNKFVIGFKVEINDTTGLFNEGLGMLQEQRVVLKQTAEEKDLVKKLTQEAAAREAAAREAAAREAAAR」（配列番号２：104〜285）を用いた。当該配列は、前述する基質タンパク質のリン酸化スレオニンを含むアミノ酸配列に結合するforkhead-associated 2 domain（FHA2 domain）のアミノ酸配列に相当する。このため、セリン・スレオニンキナーゼ（Akt）の作用によって前述する「基質配列」上のスレオニンがリン酸化されると、当該「基質配列」は上記「(4)修飾認識配列」と結合することになる。
【０１０８】
さらに上記「(4)修飾認識配列」のＣ端側に、「(5)発色性タンパク質」として、実施例１のプローブ（IR--Lucus）と同様に、ホタルルシフェラーゼを用いた。そのアミノ酸配列は、配列番号２において、アミノ酸番号288〜707の領域に相当する。かかる生物発光タンパク質により、生体内における当該プローブの修飾（リン酸化）を可視化することができる。
【０１０９】
実施例７  プローブ（Akt-Lucus）導入細胞の調製
（１）プローブ導入細胞の調製
（1-1）プローブ発現ベクターの構築
実施例６で作成したプローブ（Akt-Lucus）をコードするcDNAを、哺乳類の発現ベクターであるpcDNA3.1/V5-HisA（Invitrogen Co.）のHind IIIおよびEcoR I部位にサブクローニングし、Akt-Lucus発現ベクターとした。
【０１１０】
（1-2）プローブ導入細胞の調製
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞を、10 %ウシ胎児血清（FCS）を補充したHamのF-12培養液（CHO用培養液）中で、37℃、5 %CO2 下で培養した。得られたCHO細胞を付着細胞用表面処理済み培養皿に播種し、LipofectAMINE2000試薬（ライフ・テクノロジー社製） を用いて、37℃、5 %CO2の条件で、（1-1）で調製したAkt-Lucus発現ベクターを導入し、プローブ（Akt-Lucus）導入細胞（「プローブ（Akt-Lucus）発現細胞」）を調製した。
【０１１１】
実施例８  プローブ（Akt-Lucus）のキャラクタリゼーション
実施例６で調製したプローブ（Akt-Lucus）を用いて、Akt によるタンパク質リン酸化が細胞内のどこで、どの程度起こっているのかを検討した。
【０１１２】
実施例７に示す方法で、プローブ（Akt-Lucus）を培養細胞（CHO細胞）で発現させた結果、細胞膜（図５ｂ参照）、ミトコンドリア外膜（図５ｃ参照）、細胞内膜（小胞体膜・ゴルジ体膜）（図５ｄ参照）、核（図５ｅ参照）、細胞質（図５ｆ参照）に、予想通りに局在化していることが明らかとなった。
【０１１３】
そこで、プローブ（Akt-Lucus）をそれぞれ発現する細胞を、上皮成長因子（EGF）で刺激することで、その細胞内に発現しているプローブの基質配列（Akt）を活性化させ、それぞれの細胞の生物発光（ルシフェラーゼ）を測定した。その結果、細胞内膜（小胞体膜・ゴルジ体膜）（pm）にプローブ（Akt-Lucus）を局在化させた細胞、および細胞膜（em）にプローブ（Akt-Lucus）を局在化させた細胞（em）において、特に強い生物発光シグナル（ルシフェラーゼ）が計測された（図５ｇ参照）。一方、ミトコンドリア外膜（mit）、細胞質（cyto）、および核内（nuc）にプローブ（Akt-Lucus）を局在化させた細胞においては、生物発光シグナルは微弱であった（図５ｇ参照）。
【０１１４】
これらの結果は、Akt はEGFの刺激によって、特に細胞内膜（小胞体膜・ゴルジ体膜）と細胞膜で強く活性化することを示している。また、これらの結果は、本発明のプローブが様々なキナーゼの可視化計測に応用できることを示すと共に、SLSのような、細胞内の様々な細胞内器官への局在化配列を連結したプローブを用いることにより、細胞内での空間情報をも取得できることを示している。
【０１１５】
実施例９  CHO-IR細胞にキナーゼ検出・定量用プローブを安定に発現する細胞の樹立
IR導入細胞を、10 %ウシ胎児血清（FCS）（HyClone）を補充したHamのF-12培養液(GIBCO）中（CHO用培養液）、37℃ 、5 % CO2 下で培養した。得られたCHO細胞を付着細胞用表面処理済み培養皿に播種し、LipofectAMINE2000試薬（ライフテクノロジー社製） により37℃、5 %CO2 下でIR-Lucus発現ベクターを遺伝子導入した。その後、遺伝子導入した細胞を0.2mg/ml G418および0.2mg/ml Hygromycin B（Invitrogen）で処置し、G418（ナカライテスク）およびHygromycin Bへの耐性に対してIR-Lucusを安定的に発現する細胞を選択するために培養を続け、安定発現細胞株（IR-IRLucus安定発現細胞株）を選択した。
【０１１６】
実施例１０  ハイスループットスクリーニングに対する本プローブの有効性の確認
本プローブが、タンパク質の翻訳後修飾に影響を及ぼす物質を探索するハイスループットスクリーニングにおいて、有効に利用できることが実証するために、384 well Cell-Culture Microplate(コーニング社)および1,536 well Cell-Culture Microplate（greiner bio-one社）による検討を行った。
【０１１７】
IR-IRLucus安定発現細胞株を（0、250、500、1,000、2,000、4,000、6,000あるいは8,000）cells/wellとなるように、Multidrop Combi（マイクロプレート用試薬ディスペンサー）を用いて、384 well Cell-Culture Microplateには25μl/wellで、1,536 well Cell-Culture Microplateには5μl/wellで細胞を播種した。各プレートを37℃ 、5 % CO2 下で一晩、培養した後、384 well Cell-Culture Microplateにおいては20μl/well、1,536 well Cell-Culture Microplateにおいては4μl/wellの0.01% BSA（bovine serum albumin）を含むF-12培養液にて細胞洗浄を行った。0.01% BSA（bovine serum albumin）を含むF-12培養液にて、37℃ 、5 % CO2 下で2時間、培養した後、384 well Cell-Culture Microplateには5μl/wellで、1,536 well Cell-Culture Microplateには1μl/wellでインスリン溶液（終濃度2,000、500、125、31.25、7.8125、1.953125、0.4882812あるいは0 nM）を添加した。37℃ 、5 % CO2 下で培養後（10、30、60、180、360あるいは1,440分後）、mini-Gene LD-01（マイクロプレート用試薬ディスペンサー）を用いて、384 well Cell-Culture Microplateには25μl/wellで、1,536 well Cell-Culture Microplateには5μl/wellで発光基質溶液としてピッカジーンLT2.0（東洋ビーネット社）を添加した。発光強度は、ViewLux（CCDカメラ搭載マイクロプレートイメージャー）を用いて測定した。
【０１１８】
検討した条件の中で、インスリン濃度依存的な発光強度の変化を示す代表的なグラフを示す。384 well Cell-Culture Microplateを用いた場合の最大S/B（signal/background）値（発光強度変化）は約60で、データのバラツキを示す%CV（coefficient of variation）値は約15%であった（図６ａ参照）。一方、1,536 well plateを用いた場合の最大S/B値は約30、%CV値は約20%を示した（図６ｂ参照）。
【０１１９】
さらに、購入先が異なる3種類のインスリン（Invitrogen、Roche Applied Science、ペプチド研究所）を用いて、384 well Cell-Culture Microplateにおける発光強度の変化を確認した。その結果、いずれのインスリンにおいても、発光強度の変化はほぼ同じであった（図７ａ参照）。また、ハイスループットスクリーニングのクオリティーを評価する指標となる統計的パラメーターであるZ’ factor（Zhang JH, Chung TD, Oldenburg KR. J Biomol Screen. 1999;4(2):67-73.）は、精度良いスクリーニングに必要とされる0.5以上を示すことが確認できた（図７ｂ参照）。
【０１２０】
一方、インスリン非存在下において、MG-132（Calbiochem）が発光強度に与える影響を384 well Cell-Culture Microplateを用いて検討した。その結果、MG-132濃度依存的に発光強度が上昇したことから（図８ａ参照）、本プローブはユビキチン−プロテアソームの分解経路によって厳密に制御されていることが示された。
【０１２１】
次に、インスリン存在下（125 nM）において、AG 1024（インスリン受容体（IR）キナーゼ阻害剤、Calbiochem）が発光強度に与える影響を384 well Cell-Culture Microplateを用いて検討した。その結果、AG 1024濃度依存的に発光強度が抑制され、50μM AG 1024存在下で発光強度の上昇は完全に阻害された（図８ｂ参照）。そのIC50 （50% inhibitory concentration）値（50%阻害濃度）は、0.12μMであり、AG 1024のIC50値として報告がある0.1μM（Parrizas M, Gazit A, Levitzki A, Wertheimer E, LeRoith D.Endocrinology. 1997 Apr;138(4):1427-33.）と同等であった。このことは本プローブが、キナーゼによる翻訳後修飾に影響を及ぼす物質を探索するツールとして有用であることを示している。
【０１２２】
さらに、20枚の384 well Cell-Culture Microplateを用いてハイスループットスクリーニングへの適応性について検討を行った。その結果、インスリン刺激による発光強度のEC50（50% effective concentration）値（50%効果濃度）は、全プレートを通して安定していた（図９）。また、Z’値の平均は0.58を示したことから、本プローブを用いることで精度良いハイスループットスクリーニングが可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
細胞内キナーゼによるタンパク質のリン酸化は、細胞内のシグナリングにおいて最も重要なステップのひとつであり、細胞の生存、増殖、分化等の過程に深く関わっている。このため、タンパク質のリン酸化や脱リン酸化は、多くの疾患において原因あるいは症状の一環として観察される。すなわち、特定タンパク質のリン酸化を可視的に検出あるいは定量することにより、様々な疾患の早期診断が可能となる。また、タンパク質のリン酸化や脱リン酸化を増強または阻害する物質を探索し取得することにより、これらの疾患に関与する物質や、新規治療薬を開発することが可能になる。本プローブはリン酸化依存的にユビキチン/プロテアソームの分解から免れ発光シグナルを生じることから、これまで生体内に限らず細胞内における検出・定量も非常に煩雑であったタンパク質リン酸化の可視化計測を、容易に行うことが可能となった。
【０１２４】
また本プローブは、基質配列とリン酸化認識ドメインの組み合わせを変更することで、様々なキナーゼの活性を定量することが可能であることから、細胞を用いた創薬スクリーニング（Cell-based HTS）およびin vivoイメージングによる薬効評価において非常に強力な創薬ツールになると考えられる。かかるスクリーニングは、前述するように、本発明のプローブを発現する細胞をマイクロプレートに培養し、そこにスクリーニングする対象の被験物質を添加するにより実施することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号１は、タンパク質の翻訳後修飾（リン酸化）を検出または定量するためのプローブ（IR-Lucus）のアミノ酸配列；配列番号２は、タンパク質の翻訳後修飾（リン酸化）を検出または定量するためのプローブ（Akt-Lucus）のアミノ酸配列；配列番号３は細胞内膜（小胞体膜・ゴルジ体膜）の局在化配列のアミノ酸配列；配列番号４はミトコンドリア外膜の局在化配列のアミノ酸配列；配列番号５は核の局在化配列のアミノ酸配列；配列番号６は細胞質の局在化配列のアミノ酸配列を、それぞれ示す。
【図１】
0005513844.tif 000002
【図２】
0005513844.tif 000003
【図３ａ】
0005513844.tif 000004
【図３ｂ】
0005513844.tif 000005
【図３ｃ】
0005513844.tif 000006
【図３ｄ】
0005513844.tif 000007
【図３ｅ】
0005513844.tif 000008
【図３ｆ】
0005513844.tif 000009
【図３ｇ】
0005513844.tif 000010
【図３ｈ】
0005513844.tif 000011
【図４】
0005513844.tif 000012
【図５ａ】
0005513844.tif 000013
【図５ｂ】
0005513844.tif 000014
【図５ｃ】
0005513844.tif 000015
【図５ｄ】
0005513844.tif 000016
【図５ｅ】
0005513844.tif 000017
【図５ｆ】
0005513844.tif 000018
【図５ｇ】
0005513844.tif 000019
【図６】
0005513844.tif 000020
【図７】
0005513844.tif 000021
【図８】
0005513844.tif 000022
【図９】
0005513844.tif 000023
【配列表】
0005513844000001.app