(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つの結合体を含む、内部および外部を有するナノ担体であって、
ここで各結合体が：
ポリエチレングリコール（PEG）ポリマー；
コール酸、アロコール酸、フィトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、およびケノデオキシコール酸からなる群よりそれぞれ独立に選択される、少なくとも2つの両親媒性化合物；ならびに
ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸、およびヒドロキシルアミノカルボン酸からなる群よりそれぞれ独立に選択される複数のモノマー単位を含む、PEGに共有結合されているオリゴマーであって、両親媒性化合物の少なくとも2つが共有結合されているオリゴマーを含み；
ここで各結合体が水性溶媒中で自己集合して、各両親媒性化合物の疎水性面が互いに向き合う配向をとることによりナノ担体の内部に疎水性ポケットが形成されるようにナノ担体を形成し、ここで各結合体のPEGがナノ担体の外部で自己集合する、
前記ナノ担体。
【請求項２】
ナノ担体の疎水性ポケットに捕捉されるような疎水性薬物またはイメージング剤をさらに含む、請求項1記載のナノ担体。
【請求項３】
ジアミノカルボン酸がそれぞれ独立に2,3-ジアミノプロパン酸、2,4-ジアミノブタン酸、2,5-ジアミノペンタン酸（オルニチン）、2,6-ジアミノヘキサン酸（リジン）、(2-アミノエチル)-システイン、3-アミノ-2-アミノメチルプロパン酸、3-アミノ-2-アミノメチル-2-メチルプロパン酸、4-アミノ-2-(2-アミノエチル)酪酸および5-アミノ-2-(3-アミノプロピル)ペンタン酸からなる群より選択される、請求項1記載のナノ担体。
【請求項４】
ジヒドロキシカルボン酸がそれぞれ独立にグリセリン酸、2,4-ジヒドロキシ酪酸、2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸、2,2-ビス(ヒドロキシメチル)酪酸、セリンおよびトレオニンからなる群より選択される、請求項1記載のナノ担体。
【請求項５】
ヒドロキシルアミノカルボン酸がそれぞれ独立にセリンおよびホモセリンからなる群より選択される、請求項1記載のナノ担体。
【請求項６】
モノマー単位の少なくとも1つが、光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されている、請求項1記載のナノ担体。
【請求項７】
疎水性薬物がパクリタキセル、SN38、カンプトテシン、エトポシドおよびドキソルビシンからなる群より選択される、請求項2記載のナノ担体。
【請求項８】
結合体が式Iを有する、請求項1記載のナノ担体：
0005539993.tif 000024
式中
Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されており；
各Xはモノマー単位であり；
X'は光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されているモノマー単位であり；
各Yはスペーサーモノマー単位であり；
各R1はH、光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレート、薬物ならびに光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されている1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーからなる群より独立に選択され；
各R2はコール酸と2つのコール酸基で置換されているモノマー単位とからなる群より独立に選択され、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよく；かつ
下付き文字mは2〜20である。
【請求項９】
結合体が式Iaを有する、請求項1記載のナノ担体：
0005539993.tif 000025
式中
Aは3kDaのPEGポリマーであり；
X'のモノマー単位はリジンであり；
各Xはリジンであり；
各Yは
0005539993.tif 000026
であり；かつ
各R2は2つのコール酸基に連結されているリジンである。
【請求項１０】
結合体が式IIを有する、請求項1記載のナノ担体：
0005539993.tif 000027
式中
Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されており；
各Xはモノマー単位であり；
X'は光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されているモノマー単位であり；
各Yはスペーサーモノマー単位であり；
各R1はH、光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレート、薬物ならびに光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されている1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーからなる群より独立に選択され；
各R2はコール酸および2つのコール酸基で置換されているモノマー単位からなる群より独立に選択され、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよく；
下付き文字mおよびm'はそれぞれ独立に2〜20であり；かつ
下付き文字pは0〜10である。
【請求項１１】
結合体が式IIaを有する、請求項10記載のナノ担体。
0005539993.tif 000028
【請求項１２】
各R2がコール酸である、請求項11記載のナノ担体。
【請求項１３】
結合体が式IIIを有する、請求項1記載のナノ担体：
0005539993.tif 000029
式中
Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されており；
各Xはモノマー単位であり；
X'は光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されているモノマー単位であり；かつ
各R2はコール酸であり、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよい。
【請求項１４】
結合体が式IIIaを有する、請求項13記載のナノ担体：
0005539993.tif 000030
式中
Aは5kDaのPEGポリマーであり；
X'のモノマー単位はリジンであり；
各Xはリジンであり；かつ
各R2はコール酸である。
【請求項１５】
薬物を含む、疾患の治療に使用するための請求項1〜14のいずれか一項記載のナノ担体。
【請求項１６】
イメージング剤を含む、被験者の撮像に使用するための請求項1〜14のいずれか一項記載のナノ担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2008年9月23日提出の米国特許仮出願第61/099,272号に対する優先権を主張し、その内容は全体があらゆる目的のために本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府助成研究開発における発明への権利に関する声明
本発明は、米国立がん研究所および米国立保健研究所による助成番号第R01CA115483号の下での政府助成により行った。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
パクリタキセル（タキソール(登録商標)）は多くの癌の型、例えば、卵巣癌、乳癌、小細胞肺癌、および非小細胞肺癌に対する標準的で有効な化学療法剤である。パクリタキセルは水に難溶性であるため、この薬物の製剤には、アレルギー反応などの著しい副作用を引き起こすクレモホールELが必要である。パクリタキセル（PTX）の投与を受けている患者には、ヒスタミン遮断薬およびステロイドによる前投薬が必要である。
【０００４】
アブラキサン(登録商標)は、これらの副作用が少ないパクリタキセルの新しい製剤で、FDAが認可した最初のナノ治療薬の1つである。これはパクリタキセルを負荷したヒト血清アルブミンナノ粒子（約130nm）で構成される。しかし、比較的サイズが大きいため、アブラキサンは腫瘍塊の深部にまで浸透することはできないようである。加えて、これらの比較的大きいナノ粒子は肝臓および細網内皮系（RES）に捕捉される傾向がある。ドキシル(登録商標)すなわちリポソーム化ドキソルビシンはもう一つのナノ治療薬で、アブラキサンと同様の寸法を有するが、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされている。遊離親薬物のドキソルビシンと比べて、ドキシルは心毒性が低い。アブラキサンと同様、ドキシルが腫瘍塊の深部にまで浸透しうるかどうかは疑わしい。
【０００５】
これら2つのナノ治療薬は臨床毒性について改善された特性を示すが、その抗腫瘍効果は元の薬物製剤と比べてわずかに良いにすぎない。両親媒性ブロックコポリマーはナノスケールでミセルを形成することができ、薬物送達系の開発において適用されてきた。両親媒性ブロックコポリマーはナノスケール（＜100nm）の向水性ミセルを形成することができ、薬物送達系の開発において適用されてきた。しかし、これらのミセルのほとんどは非生分解性で、RES中に捕捉される傾向がある。さらに、これらのミセルは多くの場合、水性環境下でゆるいコアを形成する直鎖疎水性ポリマーからなり、不安定で、薬物負荷能力が低くなる。インビボでの抗癌薬送達のために有効なナノ担体としての、より小さい（20〜80nm）ステルス生体適合性ミセルの開発が必要とされている。
【０００６】
発明者らは最近、PTXまたは他の疎水性薬物のためにいくつかの新規ナノ担体を開発した。PEGおよびオリゴコール酸を含む、これらの新規ナノ担体は、水性条件下で自己集合し、疎水性内部にPTXを担持しうるコア-シェル（コラン-PEG）構造を形成することができる。これらの両親媒性薬物負荷ナノ粒子は、それら自体で臨床毒性の特性が改善された治療薬であると予想される。より重要なことに、癌細胞表面を標的とするリガンドおよび/または腫瘍血管のリガンドで修飾すると、これらのナノ担体は毒性治療薬を腫瘍部位に送達することができるであろう。ナノ担体の最終サイズ（10から100nm）は、様々な異なるコラン-PEG製剤またはその組み合わせを用いることによって調節可能である。ナノ担体ならびにそれらの成分であるPEGおよびコール酸は、すべて非毒性であり、完全に生体適合性である。
【０００７】
PEGは、不活性かつ生体適合性であるため、様々な生物医学的適用において広く用いられてきた。FDAによって認可されたいくつかのPEG修飾タンパク質薬物、例えば、PEG化アスパラギンがある。PEG化は薬動力学的性質を改善するだけでなく、タンパク質薬物の免疫原性も低下させる。低分子またはペプチド薬物をPEG化すると、それらの循環時間が長くなり、代謝が遅れることが明らかにされている。ナノ粒子の表面に接ぎ木されたPEGは、これらの粒子の正常組織および細網内皮系（RES）へのインビボでの漏出を低減する。インビボ撮像試験において、PEG修飾は、量子ドットおよび磁気ナノ粒子などの無機ナノ粒子の凝集および毒性を低減することが明らかにされている。胆汁酸は、脂肪を消化する際の乳化剤として哺乳動物の肝臓で生合成される天然の界面活性剤である。胆汁酸の主な成分であるコール酸は、面による両親媒性構造、すなわち、骨格の1つの表面に4つの親水性基と、他の表面に疎水性のメチル基とを有する、硬いステロイド骨格を有する。コール酸塩は水中で葉巻型のミセルを形成し、その合成オリゴマーは水中で疎水性ポケットを有する単分子ミセルを形成し、このポケットは疎水性分子を熱力学的に隔離することができる。しかし、薬物送達におけるオリゴコール酸の適用は、溶解性が低く、薬物負荷能力が低いために限定される。本発明者らは以前、1つのコール酸コア上に4つのPEG鎖を接ぎ木した星形コール酸-PEG化合物を調製した。この化合物は水性溶液中で球状ミセルを形成することができ、薬物送達における担体として用いることができる。しかし、この化合物の臨界ミセル濃度（cmc）は、1つのコラン単位に比べて、主となる親水性のPEG成分のために比較的高く、水性条件下で調製して得たミセルは比較的大きい（直径＞200nm）。
【０００８】
驚くことに、本発明は、PEG上でコランから調製したコア-シェル構造を有する、はるかに小さく、はるかに安定なナノ担体を提供することにより、この必要性、および他の必要性を満たすものである。
【発明の概要】
【０００９】
一つの態様において、本発明は、内部および外部を有するナノ担体であって、少なくとも1つの結合体を含み、ここで各結合体はポリエチレングリコール（PEG）ポリマーを含むナノ担体を提供する。各結合体は、親水性面および疎水性面の両方を有する、少なくとも2つの両親媒性化合物も含む。加えて、各結合体は、PEGに共有結合されているオリゴマーであって、両親媒性化合物の少なくとも2つが共有結合されているオリゴマーを含む。ナノ担体は、各結合体が水性溶媒中で自己集合して、各両親媒性化合物の疎水性面が互いに向き合う配向をとることによりナノ担体の内部に疎水性ポケットが形成されるようにナノ担体を形成するようなもので、各結合体のPEGはナノ担体の外部で自己集合する。
【００１０】
第二の態様において、本発明は、疾患の治療法であって、そのような治療を必要としている被験者に本発明のナノ担体の治療上有効な量を投与することによる方法を提供する。
【００１１】
第三の態様において、本発明は、撮像法であって、撮像する被験者に本発明のナノ担体の有効量を投与する段階を含み、ここでナノ担体はイメージング剤をさらに含む方法を提供する。
[本発明1001]
少なくとも1つの結合体を含む、内部および外部を有するナノ担体であって、
ここで各結合体が：
ポリエチレングリコール（PEG）ポリマー；
親水性面および疎水性面の両方を有する、少なくとも2つの両親媒性化合物；ならびに
PEGに共有結合されているオリゴマーであって、両親媒性化合物の少なくとも2つが共有結合されているオリゴマーを含み；
ここで各結合体が水性溶媒中で自己集合して、各両親媒性化合物の疎水性面が互いに向き合う配向をとることによりナノ担体の内部に疎水性ポケットが形成されるようにナノ担体を形成し、ここで各結合体のPEGがナノ担体の外部で自己集合する、
前記ナノ担体。
[本発明1002]
ナノ担体の疎水性ポケットに捕捉されるような疎水性薬物またはイメージング剤をさらに含む、本発明1001のナノ担体。
[本発明1003]
オリゴマーが、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸およびヒドロキシルアミノカルボン酸からなる群よりそれぞれ独立に選択される複数のモノマー単位を含む、本発明1001のナノ担体。
[本発明1004]
ジアミノカルボン酸がアミノ酸である、本発明1003のナノ担体。
[本発明1005]
ジアミノカルボン酸がそれぞれ独立に2,3-ジアミノプロパン酸、2,4-ジアミノブタン酸、2,5-ジアミノペンタン酸（オルニチン）、2,6-ジアミノヘキサン酸（リジン）、(2-アミノエチル)-システイン、3-アミノ-2-アミノメチルプロパン酸、3-アミノ-2-アミノメチル-2-メチルプロパン酸、4-アミノ-2-(2-アミノエチル)酪酸および5-アミノ-2-(3-アミノプロピル)ペンタン酸からなる群より選択される、本発明1003のナノ担体。
[本発明1006]
ジヒドロキシカルボン酸がそれぞれ独立にグリセリン酸、2,4-ジヒドロキシ酪酸、2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸、2,2-ビス(ヒドロキシメチル)酪酸、セリンおよびトレオニンからなる群より選択される、本発明1003のナノ担体。
[本発明1007]
ヒドロキシルアミノカルボン酸がそれぞれ独立にセリンおよびホモセリンからなる群より選択される、本発明1003のナノ担体。
[本発明1008]
モノマー単位の少なくとも1つが、光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されている、本発明1003のナノ担体。
[本発明1009]
疎水性薬物がパクリタキセル、SN38、カンプトテシン、エトポシドおよびドキソルビシンからなる群より選択される、本発明1002のナノ担体。
[本発明1010]
両親媒性化合物がそれぞれ独立にコール酸、アロコール酸、フィトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、およびケノデオキシコール酸からなる群より選択される、本発明1001のナノ担体。
[本発明1011]
結合体が式Iを有する、本発明1001のナノ担体：
0005539993.tif 000002
式中
Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されており；
各Xはモノマー単位であり；
X'は光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されているモノマー単位であり；
各Yはスペーサーモノマー単位であり；
各R1はH、光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレート、薬物ならびに光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されている1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーからなる群より独立に選択され；
各R2はコール酸と2つのコール酸基で置換されているモノマー単位とからなる群より独立に選択され、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよく；かつ
下付き文字mは2〜20である。
[本発明1012]
結合体が式Iaを有する、本発明1011のナノ担体：
0005539993.tif 000003
式中
Aは3kDaのPEGポリマーであり；
X'のモノマー単位はリジンであり；
各Xはリジンであり；
各Yは
0005539993.tif 000004
であり；かつ
各R2は2つのコール酸基に連結されているリジンである。
[本発明1013]
結合体が式IIを有する、本発明1001のナノ担体：
0005539993.tif 000005
式中
Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されており；
各Xはモノマー単位であり；
X'は光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されているモノマー単位であり；
各Yはスペーサーモノマー単位であり；
各R1はH、光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレート、薬物ならびに光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されている1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーからなる群より独立に選択され；
各R2はコール酸および2つのコール酸基で置換されているモノマー単位からなる群より独立に選択され、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよく；
下付き文字mおよびm'はそれぞれ独立に2〜20であり；かつ
下付き文字pは0〜10である。
[本発明1014]
結合体が式IIaを有する、本発明1013のナノ担体。
0005539993.tif 000006
[本発明1015]
各R2がコール酸である、本発明1014のナノ担体。
[本発明1016]
各R2が2つのコール酸基に連結されているモノマー単位である、本発明1014のナノ担体。
[本発明1017]
結合体が式IIbを有する、本発明1013のナノ担体：
0005539993.tif 000007
式中
Aは3kDaのPEGポリマーであり；
X'のモノマー単位はリジンであり；
各Xはリジンであり；
各Yは
0005539993.tif 000008
であり；
各R2はコール酸であり；かつ
下付き文字mおよびm'はそれぞれ4である。
[本発明1018]
結合体が式IIcを有する、本発明1013のナノ担体：
0005539993.tif 000009
式中、下付き文字pは1〜10である。
[本発明1019]
結合体が式IIIを有する、本発明1001のナノ担体：
0005539993.tif 000010
式中
Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されており；
各Xはモノマー単位であり；
X'は光学プローブ、放射性核種、常磁性物質、金属キレートおよび薬物からなる群より選択されるメンバーに任意に連結されているモノマー単位であり；かつ
各R2はコール酸であり、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよい。
[本発明1020]
結合体が式IIIaを有する、本発明1019のナノ担体：
0005539993.tif 000011
式中
Aは5kDaのPEGポリマーであり；
X'のモノマー単位はリジンであり；
各Xはリジンであり；かつ
各R2はコール酸である。
[本発明1021]
そのような治療を必要としている被験者に、本発明1002のナノ担体の治療上有効な量を投与する段階を含む、疾患の治療法であって、該ナノ担体が薬物をさらに含む、前記方法。
[本発明1022]
薬物がナノ担体の内部に捕捉された疎水性薬物である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
ナノ担体がイメージング剤をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
ナノ担体が放射性核種をさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
撮像する被験者に本発明1002のナノ担体の有効量を投与する段階を含む、撮像法であって、該ナノ担体がイメージング剤をさらに含む、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、（A）CA3（化合物1）およびCA3-PEG9（ポリマー2）の合成スキーム、（B）粒径分析により水中でポリマー2から形成されたナノ粒子の平均直径が4.3nmであること、および（C）ポリマー2の分子量分析のGPC曲線を示す図である。
【図２】図2は、CA4の化学構造および粒径を示す図である。
【図３】図3は、PEG3000-CA4の（A）化学構造、（B）粒径、および（C）分子量を示す図である。
【図４】図4は、PEG3000-CA8の（A）化学構造および（B）粒径を示す図である。
【図５】図5は、PEG分子量が5、3.35および2KDaのポリマー6〜15の化学構造を示す図である。
【図６】図6は、PEG3000-CA4-PEG8の（A）化学構造、（B）粒径、および（C）分子量を示す図である。
【図７】図7は、いくつかの方法を用い、異なるPTX濃度で、PEG3000-CA8に負荷したPTXの量を示す図である。ポリマー（PEG3000-CA8）の濃度は蒸発法では20mg/mL、透析法および溶解法では10mg/mLにそれぞれ維持した。
【図８】図8は、異なるPTX濃度で異なるポリマーに負荷したPTXの量（A）および異なる添加PTX濃度での薬物負荷ナノ粒子の粒径を示す図である。ポリマーの濃度は20mg/mLで一定に維持した。
【図９】図9は、異なるエトポシド（VP-16）濃度で異なるポリマーに負荷したエトポシドの量（A）および異なる添加エトポシド濃度での薬物負荷ナノ粒子の粒径を示す図である。ポリマーの濃度は20mg/mLで一定に維持した。
【図１０】図10は、PBS中でのPEG5000-CA8により形成したミセルからのPTXの放出を経時的に、ミセル中に残留する薬物の量のパーセンテージで示す図である。放出されたPTXのパーセンテージは透析カートリッジに残るPTXの濃度によって計算した。
【図１１】図11は、PTX負荷ナノ粒子の経時的安定性を示す図である：PTX-ミセル7（PEG5000-CA8）対アブラキサン。
【図１２】図12は、PTXを負荷したミセル7（PEG5000-CA8）の粒径を、ミセル中のPTX濃度上昇に対して示す図である。ミセルは10体積％ウシ胎仔血清（FBS）中である。
【図１３】図13は、異なる濃度のウシ胎仔血清（FBS）中のPTX-ミセル5（PEG3000-CA8）（PTX負荷：0.54mg/ml）の粒径を示す図である。
【図１４】図14Aは、ルシフェラーゼ細胞を形質移入したSKOV-3に対する様々なポリマーの細胞毒性を示す図である。図14Bは、HFF1ヒト線維芽細胞に対する無負荷PEG5000-CA8 NP（ポリマー7）およびクレモホール：エタノール媒体の細胞毒性を示す図である。C1およびC2はそれぞれ、インビボ投与後のPEG5000-CA8（ポリマー7）およびクレモホール：エタノールの推定血中濃度で、平均的なヒトの血液量を6Lと仮定している。PTX負荷PEG5000-CA8 NPの抗癌効果をES-2細胞で行った。
【図１５】図15Aおよび15Bは、ES-2（15A）およびSKOV-3細胞（15B）に対するPTX負荷ポリマーの細胞毒性を示す図である。
【図１６】図16は、ヒトSKOV3-luc卵巣癌異種移植片を有するヌードマウスにおける、異なるパクリタキセル製剤の抗腫瘍効果を示す図である。PBS（対照）、タキソール、アブラキサンまたはPEG5000-CA8-PTX製剤を、腫瘍体積が約50mm3に達した第0、4、8、12、16日にi.v.投与した。
【図１７】図17は、様々なパクリタキセル治療法または食塩水（対照）による治療後の、マウスの体重変化を示す図である。
【図１８】図18は、様々なパクリタキセル治療法または食塩水（対照）による治療後の、SKOV3-luc卵巣癌異種移植片を有するヌードマウスの赤血球数（左）および白血球数（右）を示す図である。
【図１９】図19は、色素注入の48時間後の皮下Molt-4腫瘍を有するマウスのインビボNIR蛍光撮像を示す図である。PTXを負荷した、および負荷していないNP(PEG3000-CA8)-Cy5.5およびLLP2A-NP-Cy5.5を、マウス1匹あたり4nmolの用量で尾静脈から投与した。
【図２０】図20は、NP(PEG3000-CA8、ポリマー5)-Cy5.5の4nM注入後48時間の腫瘍および器官のエクスビボ画像を示す図である。
【図２１】図21は、直鎖ポリマーの構造および機能化を示す図である。
【図２２】図22は、2分枝ポリマーの構造および機能化を示す図である。
【図２３】図23は、3分枝ポリマーの構造および機能化を示す図である。
【図２４】図24は、テロデンドリマーの構造および機能化を示す図である。
【図２５】図25は、構築ブロックの間に切断可能な連結を含む、生分解性ナノ粒子の設計を示す図である。
【図２６】図26は、コール酸基の数に対する直鎖構造のナノ担体の粒径を示す図である。
【図２７】図27は、コール酸基の数に対する分枝系1構造のナノ担体の粒径を示す図である。
【図２８】図28は、コール酸基の数に対する分枝系2構造のナノ担体の粒径を示す図である。
【図２９】図29は、コール酸基の数に対する分枝系3構造のナノ担体の粒径を示す図である。
【図３０】図30は、ヘプタデカン酸基の数に対する分枝系4構造のナノ担体の粒径を示す図である。
【図３１】図31は、PEG接ぎ木の前後のナノ担体の粒径を示す図である。
【図３２】図32は、本発明のテロデンドリマー調製のための合成スキームを示す図である。
【図３３】図33は、CDCl3（A）およびD2O（B）中で行ったPEG5000-CA8（ポリマー7）の1H NMRスペクトルを示す図である。
【図３４】図34は、それぞれ較正標準（幅18nm）としてのタバコモザイクウイルス（TMV）非存在下（34A）および存在下（34B）での、PTX（4.4mg/mL）を負荷したPEG5000-CA8（ポリマー7）のCryoTEM画像を示す図である。
【図３５】図35Aは、DLS粒径測定器で測定した3つのミセル、154nm DiD-PTX-PEG3000-CA4、64nm DiD-PTX-PEG5000-CA8、および17nm DiD-PTX-PEG2000-CA4を示す図である。図35Bは、3つのミセル製剤それぞれとインキュベートし、共焦点蛍光顕微鏡下で撮像した、264.7マクロファージ細胞を示す図である。細胞の核をDAPIで染色し、赤色DiDシグナルは、154nmのミセルはより小さいミセル（17nmおよび64nm）に比べて、マクロファージによって優先的に取り込まれることを示していた。図35Cは、尾静脈注射の24時間後に、SKOV-3卵巣癌異種移植片を有するマウスにおけるミセル（3つの異なる粒径）のエクスビボ生体分布を示す図である。図35Dは、DiD-PTX-PEG5000CA8をi.v.注射した後の腫瘍を有するマウスのインビボNIR蛍光撮像を経時的に示す図であり；S.Q.埋込異種移植片におけるミセルの受動蓄積（矢印）が注射の2時間から24時間後に観察された。
【図３６】図36は、テロデンドリマーおよび出発原料である直鎖PEGのMALDI-TOF MS分析を示す図であり、それぞれCAの樹枝状四量体（1961ダルトン）およびCAの八量体（4031ダルトン）の分子量が近いことを考慮すると、テロデンドリマーの明確な構造を示している。
【図３７】図37は、金表面でのHS-PEG5000-CA8ミセル（37A）およびPTX薬物負荷HS-PEG5000-CA8ミセル（37C）のタッピングモードAFMトポグラフを示す図である。3D情報を評価するために、対応するカーソル特性をそれぞれ（37B）および（37D）に示す。
【図３８】図38は、PEG5000-CA8ナノ粒子の腹腔内分布を示す図である。図38Aは、DiD-PTX-NPのi.p.注射後異なる時点での、腹腔内にSKOV-3腫瘍を有するマウスのインビボNIRF撮像を示す図である。図38Bは、腫瘍上のDiD-PTX-NPの局在を示す図である。マウスを注射の72時間後に屠殺し、腹腔を露出して、Kodak撮像ステーションでスキャンした。
【図３９】図39は、SKOV3-luc卵巣癌の皮下マウスモデルにおける異なるPTX製剤の静脈内治療後の、相対腫瘍体積（39A）およびマウスの体重変化（39B）によるインビボ抗癌効果を示す図である。腫瘍を有するマウスにPBS（対照）、タキソール(登録商標)、アブラキサン(登録商標)およびPTX-PEG5000-CA8 NPを、腫瘍体積が約100〜200mm3に達した第0、4、8日および第38、42、46日（X軸上の矢印）に点滴で投与した。データは1群あたりマウス6匹の平均±SEMである。
【図４０】図40は、腹腔に播種した卵巣癌のマウスモデルにおける、異なるPTX製剤の腹腔内治療後の抗腫瘍効果および非侵襲性生物発光撮像を示す図である。図40Aは、治療後の異なる時点でのルシフェラーゼ発現SKOV3-luc癌細胞により放出される生物発光を示す図である。腹腔内SKOV3-luc腫瘍を有するマウスに、タキソール(登録商標)、アブラキサン(登録商標)およびPTX-PEG5000-CA8 NPの合計5回の腹腔内注射を、第0、4、8、12および16日に投与した。対照群にはPBSだけを投与した。各マウスの全腹腔領域からのシグナルを定量し、発光のない領域で同じサイズのROIを測定することにより、バックグラウンドを差し引いた。図40Bは、異なる治療群のマウスの生存を示す図である。白丸は麻酔中の死に続く打ち切りデータ点である（すなわち、腫瘍関連でない）。
【図４１Ａ】図41Aは、分枝ポリマー系1（P-1）のメンバーの合成（41A）を示す図である。
【図４１Ｂ】図41Bは、分枝ポリマー系1（P-1）のメンバーの合成の生成物（41B）を示す図である。
【図４２】図42は、無負荷ポリマー23ミセル（A1）、無負荷ポリマー25ミセル（低倍率）（A2）、および無負荷ポリマー25ミセル（高倍率）（A3）のTEM画像を示す図である。
【図４３】図43は、ミセルのパクリタキセル負荷能力を、分枝ポリマー系1（P-1）、分枝ポリマー系2（P-2）、分枝ポリマー系3（P-3）および分枝ポリマー系4（P-4）におけるコア形成単位の数の増加に対して示す図（43A）；ポリマー23に負荷されたパクリタキセルの量およびパクリタキセルを負荷したポリマー23の対応する平均直径を、薬物濃度の増加に対して示す図（43B）；ならびにポリマー23ミセルの負荷効率を、溶液中の薬物濃度の増加に対して示す図（43C）である。最終ミセル溶液の量は1mLに維持し、ポリマーの最終濃度はすべての薬物負荷試験で20mg/mLであった。
【図４４】図44は、37℃のPBS中でのP-1-4（ポリマー23）ミセルからのPTX放出特性を、ミセル中に残留するPTXのパーセンテージを経時的に測定して示す図である。初期パクリタキセル濃度は1.2mg/mLであった。様々な時点で透析カートリッジに残るパクリタキセル濃度をHPLCで測定した。報告値は三つ組試料の平均±SDである。
【図４５】図45は、37℃のPBS中のイヌ血漿50体積％および45mg/mLのBSA溶液中、アブラキサン(登録商標)（パクリタキセル負荷：5.0mg/ml）および7.3mg/mLのパクリタキセルを負荷したP-1-4（ポリマー23）ミセルの経時的平均直径を、動的光散乱により測定して示す図である。すべての測定は3回繰り返した。報告値は2回の重複試料の平均直径±SDである。
【図４６】図46は、異なる濃度の無負荷（「ブランク」）P-1-3（ポリマー22）ミセル、無負荷P-1-4（ポリマー23）ミセル（46A）、ならびにタキソール(登録商標)、アブラキサン(登録商標)、PTX負荷P-1-3（ポリマー22）ミセルおよびPTX負荷P-1-4ミセル（46B）で処理したSKOV-3細胞の、72時間のインキュベーション後の生存度を示すMTT検定を示す図である。細胞生存度は、処理試料における細胞数を非処理対照のもので割った比として計算した。報告値は三つ組試料の平均±SDである。
【図４７】図47は、インビボおよびエクスビボNIR光学画像を示す図である。図47Aは、PTXおよびDiD（疎水性色素）の両方を負荷したミセル24のi.v.注射後異なる時点でKodak撮像システムにより得た、SKOV-3腫瘍を有するマウスのインビボNIR光学画像を示す図である。図47Bは、摘出器官のインビボNIR画像を示す図であり、腫瘍は注射の24時間後に得た。エクスビボ画像からの腫瘍および器官の定量的蛍光強度。
【図４８Ａ】図48Aは、分枝ポリマー系2（P-2）のメンバーの合成（48A）を示す図である。
【図４８Ｂ】図48Bは、分枝ポリマー系2（P-2）のメンバーの合成の生成物（48B）を示す図である。
【図４９Ａ】図49Aは、分枝ポリマー系3（P-3）のメンバーの合成（49A）を示す図である。
【図４９Ｂ】図49Aおよび49Bは、分枝ポリマー系3（P-3）のメンバーの合成の生成物（49B）を示す図である。
【図５０Ａ】図50Aは、分枝ポリマー系4（P-4）のメンバーの合成（50A）を示す図である。
【図５０Ｂ】図50Bは、分枝ポリマー系4（P-4）のメンバーの合成の生成物（50B）を示す図である。
【図５１】図51は、HS-PEG5000-CA8の構造を示す図である。
【図５２Ａ】図52Aは、直鎖ポリマー系のメンバーの合成（52A）を示す図である。
【図５２Ｂ】図52Bは、直鎖ポリマー系のメンバーの合成の生成物（52B）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
I.  総論
本発明は、ナノ担体が水に難溶性の薬物を送達することを可能にする、疎水性内部および親水性外部を有するナノ担体を提供する。ナノ担体は結合体のミセル内への凝集によって形成される。本発明の結合体は、直鎖、分枝およびテロデンドリマーを含む様々な構造をとることができる。ナノ担体の疎水性コアは、疎水性面および親水性面を有するコール酸によって提供される。典型的には、ナノ担体中に薬物を捕捉するために、いくつかのコール酸基を用いる。ナノ担体の親水性は、ナノ担体を封入し、結合体の凝集によりミセルを形成する、ポリエチレングリコールポリマー鎖によって提供される。コール酸およびPEGは、様々な酸反復単位を含みうるオリゴマーによって連結される。典型的には、オリゴマーはジアミノカルボン酸であるリジンを含む。本発明のナノ担体は、光学プローブ、放射性核種、および金属キレート、ならびに疎水性薬物で機能化することもできる。
【００１４】
II.  定義
本明細書において用いられる「両親媒性化合物」なる用語は、疎水性部分および親水性部分の両方を有する化合物を意味する。例えば、本発明の両親媒性化合物は、化合物の1つの親水性面および化合物の1つの疎水性面を有しうる。本発明において有用な両親媒性化合物には、コール酸、およびアロコール酸、フィトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸などのコール酸類縁体が含まれるが、それらに限定されるわけではない（Current Science 2004, 87(12), 1666、その全体が本明細書に組み入れられる）。
【００１５】
本明細書において用いられる「モノマー単位」なる用語は、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸およびヒドロキシルアミノカルボン酸を意味する。本発明のジアミノカルボン酸基の例には、2,3-ジアミノプロパン酸、2,4-ジアミノブタン酸、2,5-ジアミノペンタン酸（オルニチン)、2,6-ジアミノヘキサン酸（リジン）、(2-アミノエチル)-システイン、3-アミノ-2-アミノメチルプロパン酸、3-アミノ-2-アミノメチル-2-メチルプロパン酸、4-アミノ-2-(2-アミノエチル)酪酸および5-アミノ-2-(3-アミノプロピル)ペンタン酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明のジヒドロキシカルボン酸基の例には、グリセリン酸、2,4-ジヒドロキシ酪酸、グリセリン酸、2,4-ジヒドロキシ酪酸、2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸および2,2-ビス(ヒドロキシメチル)酪酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヒドロキシルアミノカルボン酸の例には、セリンおよびホモセリンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。当業者であれば、他のモノマー単位が本発明において有用であることを理解するであろう。
【００１６】
本明細書において用いられる「スペーサーモノマー単位」なる用語は、モノマー単位を互いに連結する化学基を意味する。スペーサーモノマー単位の例には、1〜3つのオキシ-エチレン基を有するエチレングリコールオリゴマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。当業者であれば、他のスペーサーモノマー単位が本発明において有用であることを理解するであろう。
【００１７】
本明細書において用いられる「疎水性薬物」なる用語は、水を寄せ付けない任意の薬物を意味する。本発明において有用な薬物には、パクリタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、SN-38、シクロスポリンA、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アンホテリシン、イクサベピロン、パツピロン（エポテロンクラス）、ラパマイシンおよび白金薬が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明の疎水性薬物は、前述の薬物のプロドラッグ型も含む。当業者であれば、他の薬物が本発明において有用であることを理解するであろう。
【００１８】
本明細書において用いられる「結合リガンド」なる用語は、正常細胞、癌細胞および内皮細胞の細胞表面受容体、ならびに細胞外マトリックスおよび骨マトリックスにおける非細胞成分や、感染因子（特に、ウイルス、真菌、細菌および寄生生物）の表面受容体などの標的高分子に結合可能な化学または生体物質を意味する。本発明において有用な結合リガンドには、LLP2A（α4β1インテグリンリガンドに結合）、LXY1およびLXY3（α3β1インテグリンリガンドに結合）、RGDペプチド（α5β1およびαvβ3インテグリンリガンドに結合）、およびビホスホネート（向骨性分子）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。当業者であれば、他の結合リガンドが本発明において有用であることを理解するであろう。
【００１９】
本明細書において用いられる「イメージング剤」なる用語は、体の器官、組織または系を撮像することを可能にする化学物質を意味する。例示的イメージング剤には、常磁性物質、光学プローブ、および放射性核種が含まれる。
【００２０】
本明細書において用いられる「常磁性物質」なる用語は、外部から適用される場で磁性であるイメージング剤を意味する。常磁性物質の例には、ナノ粒子を含む鉄粒子が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００２１】
本明細書において用いられる「光学プローブ」なる用語は、1つの発光波長での励起および第二の異なる発光波長での検出により検出しうる蛍光化合物を意味する。本発明において有用な光学プローブには、Cy5.5、Alexa 680、Cy5、DiD（1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドジカルボシアニン過塩素酸塩）およびDiR（1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。他の光学プローブには量子ドットが含まれる。
【００２２】
本明細書において用いられる「放射性核種」なる用語は、放射性崩壊を起こす化学元素を意味する。本発明において有用な放射性核種には、3H、11C、13N、18F、19F、60Co、64Cu、67Cu、68Ga、82Rb、90Sr、90Y、99Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、129I、131I、137Cs、177Lu、186Re、188Re、211At、Rn、Ra、Th、U、Puおよび241Amが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００２３】
本明細書において用いられる「金属キレート」なる用語は、金属イオンをキレート化する化合物または物質を意味する。例えば、本発明において有用な金属キレートには、1,4,8,11-テトラアザシクロドデカン-1,4,8,11-テトラ酢酸（TETA）、4,11-ビス(カルボキシメチル)-1,4,8,11-テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカン（CB-TE2A）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）および1,4,7,10-テトラ-アザシクロデカンテトラ酢酸（DOTA）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００２４】
本明細書において用いられる「治療する」、「治療すること」および「治療」なる用語は、緩解；軽快；症状の減弱、または症状、傷害、病態もしくは状態を患者にとってより耐容できるものにすること；症状または状態の頻度または持続期間を低減すること；あるいは、いくつかの場合には、症状または状態の発症を予防することなどの任意の客観的または主観的パラメーターを含む、傷害、病態、状態、または症状（例えば、疼痛）の治療または改善における成功の任意のしるしを意味する。症状の治療または改善は、例えば、身体検査の結果を含む、任意の客観的または主観的パラメーターに基づくものでありうる。
【００２５】
本明細書において用いられる「投与すること」なる用語は、被験者への経口投与、坐剤としての投与、局所接触、非経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、鼻内もしくは皮下投与、くも膜下腔内投与、リンパ内、微小液滴の吸入、または徐放性装置、例えば、ミニ浸透圧ポンプの埋込を意味する。
【００２６】
本明細書において用いられる「被験者」なる用語は、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むが、それらに限定されるわけではない、哺乳動物などの動物を意味する。特定の態様において、被験者はヒトである。
【００２７】
本明細書において用いられる「治療上有効な量または用量」または「治療上十分な量または用量」または「有効または十分な量または用量」なる用語は、投与の目的である治療効果を生じる用量を意味する。正確な用量は治療の目的に依存することになり、当業者であれば、公知の技術を用いて確認可能であろう（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Pickar, Dosage Calculations (1999)；およびRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins参照）。感作された細胞では、治療上有効な用量は非感作細胞に対する通常の治療上有効な用量よりも低いことが多くなりうる。
【００２８】
本明細書において用いられる「隔離/捕捉された」なる用語は、疎水性薬物がナノ担体の疎水性内部にあって、ナノ担体の外側の親水性環境に曝露されないことを意味する。
【００２９】
III.  ナノ担体
本発明は、ミセルを形成するナノ担体を提供し、ここでそれぞれ個々のナノ担体は疎水性内部および親水性外部を有するミセルである。ナノ担体の疎水性領域は疎水性薬物を捕捉することができる。ナノ担体は、両親媒性化合物から形成される疎水性領域およびポリエチレングリコール（PEG）ポリマーなどの親水性領域を有する結合体の凝集によって形成される。PEGは結合体の疎水性領域を封入するのに十分なサイズのものであり、したがって結合体は水中に溶解し、自己集合して、ナノ担体ミセルを形成することができ、被験者への疎水性薬物またはイメージング剤の投与を容易にする。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明は、疎水性薬物を捕捉可能なナノ担体を提供する。本発明のナノ担体は内部および外部を有し、ナノ担体は少なくとも1つの結合体を含み、ここで各結合体はポリエチレングリコール（PEG）ポリマーを含む。各結合体は、親水性面および疎水性面の両方を有する、少なくとも2つの両親媒性化合物も含む。加えて、各結合体はオリゴマーを含み、ここで両親媒性化合物の少なくとも2つはPEGに共有結合されているオリゴマーに共有結合されている。ナノ担体は、水性溶媒中で各結合体が自己集合して、各両親媒性化合物の疎水性面が互いに向き合う配向をとることによりナノ担体の内部に疎水性ポケットが形成されるようにナノ担体を形成するようなもので、各結合体のPEGはナノ担体の外部で自己集合する。
【００３１】
任意のサイズおよび構造のポリエチレングリコール（PEG）ポリマーが本発明のナノ担体において有用である。いくつかの態様において、PEGは1〜100kDaである。他の態様において、PEGは1〜10kDaである。いくつかの他の態様において、PEGは約3kDaである。さらに他の態様において、追加のPEGポリマーが両親媒性化合物に連結される。例えば、両親媒性化合物がコール酸である場合、最大3つのPEGポリマーが各コール酸に連結される。両親媒性化合物に連結されるPEGポリマーは200〜10,000Daのサイズである。さらに他の態様において、両親媒性化合物に連結されるPEGポリマーは1〜5kDaのサイズである。当業者であれば、他のPEGポリマーおよび他の親水性ポリマーが本発明において有用であることを理解するであろう。
【００３２】
本発明の結合体は、同じまたは異なる少なくとも2つの両親媒性化合物も含む。本発明の結合体において有用な両親媒性化合物は、親水性面および疎水性面の両方を有するものである。加えて、各両親媒性化合物はモノマー単位に連結され、モノマー単位はそれ自体が別のモノマー単位および/またはPEGポリマーに連結されている。いくつかの態様において、両親媒性化合物はそれぞれ独立にコール酸、アロコール酸、フィトコール酸、アビコール酸、デオキシコール酸、またはケノデオキシコール酸でありうる。当業者であれば、他の両親媒性化合物が本発明において有用であることを理解するであろう。
【００３３】
本発明の結合体は、複数のモノマー単位も含む。いくつかの態様において、複数のモノマー単位は互いに連結してオリゴマーを形成する。オリゴマーはPEGおよび両親媒性化合物に共有結合されている。オリゴマ−は、直鎖構造、分枝構造またはテロデンドリマー構造などの、いくつかの構造のいずれかをとることができる。
【００３４】
いくつかの態様において、ナノ担体は、ナノ担体の疎水性ポケットに捕捉されるような疎水性薬物またはイメージング剤を含む。疎水性薬物は、本明細書において論じるとおり、水を寄せ付けない任意の薬物でありうる。疎水性薬物およびイメージング剤は、ナノ担体の疎水性ポケットに捕捉されるか、または結合体に共有結合されうる。イメージング剤には、常磁性物質、光学プローブおよび放射性核種が含まれる。常磁性物質には、ナノ担体の疎水性ポケットに捕捉される鉄ナノ粒子などの鉄粒子が含まれる。
【００３５】
いくつかの他の態様において、本発明の結合体において有用なモノマー単位は、ジアミノカルボン酸、ジヒドロキシカルボン酸、またはヒドロキシルアミノカルボン酸でありうる。さらに他の態様において、ジアミノカルボン酸はアミノ酸である。本発明のジアミノカルボン酸基の例には、2,3-ジアミノプロパン酸、2,4-ジアミノブタン酸、2,5-ジアミノペンタン酸（オルニチン）、2,6-ジアミノヘキサン酸（リジン）、(2-アミノエチル)-システイン、3-アミノ-2-アミノメチルプロパン酸、3-アミノ-2-アミノメチル-2-メチルプロパン酸、4-アミノ-2-(2-アミノエチル)酪酸および5-アミノ-2-(3-アミノプロピル)ペンタン酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明のジヒドロキシカルボン酸基の例には、グリセリン酸、2,4-ジヒドロキシ酪酸、2,2-ビス(ヒドロキシメチル)プロピオン酸、2,2-ビス(ヒドロキシメチル)酪酸、セリンおよびトレオニンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。ヒドロキシルアミノカルボン酸の例には、セリンおよびホモセリンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３６】
もう一つの態様において、複数の型のモノマー単位を本発明の結合体において用いて、酸コポリマーを提供する。例えば、酸コポリマーはジアミノカルボン酸とヒドロキシルアミノカルボン酸またはジヒドロキシカルボン酸を交互に有しうる。
【００３７】
他の態様において、モノマー単位の少なくとも1つは光学プローブ、放射性核種、金属キレートまたは薬物に任意に連結されている。薬物は様々な親水性または疎水性薬物でありえ、本発明のナノ担体の内部に捕捉される疎水性薬物に限定されない。
【００３８】
ナノ担体に捕捉されうる、または本発明の結合体に連結されうる薬物には、細胞分裂抑制剤、細胞毒性剤（例えば、DNA相互作用剤（シスプラチンまたはドキソルビシンなど）などであるが、それらに限定されるわけではない）；タキサン（例えば、タキソテール、タキソール）；トポイソメラーゼII阻害剤（エトポシドなど）；トポイソメラーゼI阻害剤（イリノテカン（またはCPT-11）、カンプトスター（camptostar）、またはトポテカンなど）；チューブリン相互作用剤（パクリタキセル、ドセタキセルまたはエポチロンなど）；ホルモン剤（タモキシフェンなど）；チミジル酸シンターゼ阻害剤（5-フルオロウラシルなど）；代謝拮抗剤（メトトレキセートなど）；アルキル化剤（テモゾロミド（Schering-Plough Corporation, Kenilworth, N.J.製のTEMODAR(商標)）、シクロホスファミドなど）；アロマターゼの併用；ara-C、アドリアマイシン、シトキサン、およびゲムシタビンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明のナノ担体において有用な他の薬物には、ウラシルマスタード、クロルメチン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、フロクスウリジン、シタラビン、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、フルダラビンリン酸塩、オキサリプラチン、ロイコビリン、オキサリプラチン（Sanofi-Synthelabo Pharmaeuticals, France製のELOXATIN(商標)）、ペントスタチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン-C、L-アスパラギナーゼ、テニポシド17アルファ-エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン、ゴセレリン、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミゾール、ナベルベン（Navelbene）、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサフィン（Reloxafine）、ドロキサフィン（Droloxafine）、またはヘキサメチルメラミンが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
本発明において有用な他の薬物には、67Cu、90Y、123I、125I、131I、177Lu、188Re、186Reおよび211Atなどの放射性核種も含まれる。いくつかの態様において、放射性核種は薬物として、およびイメージング剤として、治療的に作用しうる。
【００４０】
本発明のナノ担体において有用な疎水性薬物には、水に難溶性の任意の薬物が含まれる。いくつかの態様において、疎水性薬物はパクリタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、イリノテカン、SN-38、カンプトテシン、シクロスポリンA、ポドフィロトキシン、カルムスチン、アンホテリシン、イクサベピロン、パツピロン（エポテロンクラス）、ラパマイシンおよび白金薬である。いくつかの他の態様において、薬物はパクリタキセル、SN-38、カンプトテシン、エトポシドまたはドキソルビシンでありうる。プロドラッグ型も本発明において有用である。
【００４１】
いくつかの態様において、結合体は式Iを有する：
0005539993.tif 000012
式中、Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されている。各Xはモノマー単位である。X'は光学プローブ、放射性核種、金属キレートまたは薬物に任意に連結されているモノマー単位である。各Yはスペーサーモノマー単位である。各R1はH、光学プローブ、放射性核種、金属キレート、疎水性薬物または光学プローブ、放射性核種、金属キレートもしくは薬物に任意に連結されている1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーである。各R2は独立にコール酸または2つのコール酸基で置換されているモノマー単位であり、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよい。下付き文字mは2〜20である。
【００４２】
他の態様において、結合体は式Iaを有する：
0005539993.tif 000013
式中、Aは3kDaのPEGポリマーである。X'のモノマー単位はリジンである。各Xはリジンである。各Yは
0005539993.tif 000014
であり；各R2は2つのコール酸基に連結されているリジンである。
【００４３】
いくつかの他の態様において、結合体は式IIを有する：
0005539993.tif 000015
式中、Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されている。各Xはモノマー単位である。X'は光学プローブ、放射性核種、金属キレートまたは薬物に任意に連結されているモノマー単位である。各Yはスペーサーモノマー単位である。各R1は独立にH、光学プローブ、放射性核種、金属キレート、薬物または光学プローブ、放射性核種、金属キレートもしくは疎水性薬物に任意に連結されている1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーである。各R2は独立にコール酸または2つのコール酸基で置換されているモノマー単位であり、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよい。下付き文字mおよびm'はそれぞれ独立に2〜20である。下付き文字pは0〜10である。
【００４４】
さらに他の態様において、結合体は式IIaを有する：
0005539993.tif 000016
さらに他の態様において、各R2はコール酸である。さらに他の態様において、各R2は2つのコール酸基にそれぞれ連結されているモノマー単位である。
【００４５】
もう一つの態様において、結合体は式IIbを有する：
0005539993.tif 000017
式中、Aは3kDaのPEGポリマーである。X'のモノマー単位はリジンである。各Xはリジンである。各Yは
0005539993.tif 000018
であり；各R2はコール酸である。下付き文字mおよびm'はそれぞれ4である。
【００４６】
いくつかの態様において、結合体は式IIcを有する：
0005539993.tif 000019
式中、下付き文字pは1〜10である。
【００４７】
他の態様において、結合体は式IIIを有する：
0005539993.tif 000020
式中、Aは1〜100kDaのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーであり、ここでAは結合リガンドLに任意に連結されている。各Xはモノマー単位である。X'は光学プローブ、放射性核種、金属キレートまたは薬物に任意に連結されているモノマー単位である。そして、各R2はコール酸であり、ここで各コール酸基は、それぞれ独立に200〜10,000Daのサイズの1〜3つのポリエチレングリコール（PEG）ポリマーで置換されていてもよい。
【００４８】
いくつかの他の態様において、結合体は式IIIaを有する：
0005539993.tif 000021
式中、Aは5000DaのPEGポリマーである。X'のモノマー単位はリジンである。各Xはリジンである。そして、各R2はコール酸である。
【００４９】
本発明の結合体は、当業者には公知の様々な方法によって調製することができる。
【００５０】
IV.  治療法
本発明のナノ担体は、ナノ担体の内部に疎水性薬物を捕捉すること、またはナノ担体の結合体への薬物の共有結合などにより、薬物の投与を必要とする任意の疾患を治療するために用いることができる。ナノ担体は、ナノ担体の内部にイメージング剤を捕捉すること、またはナノ担体の結合体にイメージング剤を結合することなどにより、撮像のために用いることもできる。
【００５１】
いくつかの態様において、本発明は、疾患の治療法であって、そのような治療を必要としている被験者に、本発明のナノ担体の治療上有効な量を投与する段階を含み、ここでナノ担体は薬物を含む方法を提供する。薬物はナノ担体の結合体に共有結合されていてもよく、または薬物はナノ担体の内部に捕捉された疎水性薬物であってもよい。他の態様において、ナノ担体はイメージング剤も含む。イメージング剤はナノ担体の結合体に共有結合されていてもよく、またはイメージング剤はナノ担体の内部に捕捉されてもよい。いくつかの他の態様において、疎水性薬物およびイメージング剤の両方がナノ担体の内部に捕捉される。さらに他の態様において、薬物およびイメージング剤の両方がナノ担体の1つまたは複数の結合体に共有結合されている。さらに他の態様において、ナノ担体は放射性核種も含む。
【００５２】
本発明のナノ担体を、例えば、癌腫、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、およびバーキットリンパ腫、頭頸部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道の癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢の癌、小腸の癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頸癌、膣癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵内分泌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽細胞腫、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫などであるが、それらに限定されるわけではない、癌を含む過剰増殖障害の治療のために、被験者に投与することができる（その他の癌についてはCANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE (DeVita, V. T. et al. eds 2008)を参照されたい）。
【００５３】
本発明のナノ担体によって治療しうる他の疾患には下記が含まれる：（I）全身性アナフィラキシーまたは過敏性反応、薬物アレルギー、昆虫刺創アレルギーなどの炎症またはアレルギー疾患；クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎などの炎症性腸疾患；膣炎；皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、じんま疹などの乾癬および炎症性皮膚疾患；脈管炎；脊椎関節症；強皮症；喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの呼吸器アレルギー疾患など、（2）関節炎（リウマチ性および乾癬性）、骨関節炎、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、真性糖尿病、糸球体腎炎などの自己免疫疾患など、（3）移植片拒絶（同種移植片拒絶および移植片対宿主病を含む）、ならびに（4）望まれない炎症反応が阻害されるべき他の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、筋炎、卒中および非開放性頭部損傷などの神経状態、神経変性疾患、アルツハイマー病、脳炎、髄膜炎、骨粗鬆症、痛風、肝炎、腎炎、敗血症、サルコイドーシス、結膜炎、耳炎、慢性閉塞性肺疾患、副鼻腔炎およびベーチェット症候群）。
【００５４】
加えて、本発明のナノ担体は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生生物などの病原体による感染症の治療のために有用である。他の疾患も本発明のナノ担体を用いて治療することができる。
【００５５】
A.  製剤
本発明のナノ担体を、当業者には公知の様々な異なる様式で製剤することができる。薬学的に許容される担体は部分的には、投与中の特定の組成物、ならびに組成物を投与するために用いる特定の方法によって決定される。したがって、本発明の薬学的組成物には多種多様の適当な製剤がある（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., 2003, 上記参照）。有効な製剤には、経口および鼻製剤、非経口投与用の製剤、ならびに持続放出のために製剤された組成物が含まれる。
【００５６】
経口投与に適した製剤は（a）水、食塩水またはPEG 400などの希釈剤に懸濁された本発明の化合物の有効量などの、液剤；（b）活性成分のあらかじめ決められた量を液体、固体、顆粒またはゼラチンでそれぞれ含む、カプセル剤、パック剤（sachet）、デポー剤または錠剤；（c）適当な液体中の懸濁剤；（d）適当な乳剤；および（e）パッチ剤で構成されうる。前述の液剤は滅菌溶液でありうる。薬学的剤形は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ならびに他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝化剤、湿潤剤、保存剤、着香剤、色素、崩壊剤、および薬学的に適合する担体の1つまたは複数を含みうる。ロゼンジ剤形は、香味料、例えば、スクロース中に活性成分を含むことができ、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースなどの不活性基剤中に活性成分を含む香錠や、活性成分に加えて当技術分野において公知の担体を含むアカシア乳剤、ゲル剤など。
【００５７】
薬学的製剤は好ましくは単位剤形である。そのような剤形において、製剤を適当な量の活性成分を含む単位用量に細分する。単位剤形は、バイアルまたはアンプル中に包装された錠剤、カプセル剤、および散剤などの、包装された製剤でありえ、包装は分離した量の製剤を含む。また、単位剤形はそれ自体でカプセル剤、錠剤、カシェ剤、またはロゼンジでありえ、または包装された形の適当な数のこれらのいずれかでありうる。組成物は、望まれる場合には、他の適合性治療薬を含むこともできる。好ましい薬学的製剤は、本発明の化合物を徐放性製剤で送達することができる。
【００５８】
本発明において有用な薬学的製剤は、持続放出製剤も含む。いくつかの態様において、本発明において有用な持続放出製剤は米国特許第6,699,508号に記載されており、これは米国特許第7,125,567号に従って調製することができ、これらの特許はいずれも参照により本明細書に組み入れられる。
【００５９】
薬学的製剤は典型的には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物に送達される。本発明の方法を用いて治療される非ヒト哺乳動物には、家庭内動物（すなわち、イヌ、ネコ、マウス、齧歯類、およびウサギ）および農業用動物（ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ）が含まれる。
【００６０】
本発明の方法を実施する際に、薬学的組成物を単独で、または他の治療薬もしくは診断薬との組み合わせで用いることができる。
【００６１】
B.  投与
本発明のナノ担体を、時間ごと、日ごと、週ごとまたは月ごとを含む、必要に応じた頻度で投与することができる。本発明の薬学的方法において用いる化合物は、1日に約0.0001mg/kgから約1000mg/kgの初期用量で投与する。約0.01mg/kgから約500mg/kg、または約0.1mg/kgから約200mg/kg、または約1mg/kgから約100mg/kg、または約10mg/kgから約50mg/kgの1日用量範囲を用いることができる。しかし、用量は患者の要求、治療中の状態の重症度、および用いている化合物に依存して変動してもよい。例えば、特定の患者で診断された疾患の型および病期を考慮して、用量を経験的に決定することができる。本発明の状況において、患者に投与する用量は、経時的に患者で有益な治療反応をもたらすのに十分であるべきである。用量のサイズは、特定の患者において特定の化合物の投与に伴う任意の有害副作用の有無、性質、および程度によっても決定されることになる。特定の状況に対する適当な用量の決定は、当業者の技術の範囲内である。一般に、治療は化合物の最適用量よりも低い低用量で開始する。その後、状況下での最適効果に達するまで用量を少しずつ増量する。便宜上、望まれる場合には、1日の全用量を分割し、1日の間に数回投与してもよい。用量は、治療する医師によって決定されるとおり、毎日、または隔日で投与することもできる。用量を、皮下カプセル剤、パック剤もしくはデポー剤を用いる、またはパッチ剤もしくはポンプによるなどの、長期間（数週間、数ヶ月間または数年間）にわたって定期的または持続的に投与することもできる。
【００６２】
薬学的組成物を患者に、局所、非経口、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、結腸、直腸、または腹腔内を含む、様々な様式で投与することができる。好ましくは、薬学的組成物を非経口、局所、静脈内、筋肉内、皮下、経口または吸入によるなどの鼻投与する。
【００６３】
本発明の方法を実施する際に、薬学的組成物を単独で、または他の治療薬もしくは診断薬との組み合わせで用いることができる。本発明の併用プロトコルにおいて用いる追加の薬物を別々に投与することもでき、または併用プロトコルにおいて用いる薬物の1つもしくは複数を混合物中などで一緒に投与することもできる。1つまたは複数の薬物を別々に投与する場合、各薬物の投与のタイミングおよびスケジュールは変動しうる。他の治療薬または診断薬を本発明の化合物と同時に、別々に、または異なる時に投与することができる。
【００６４】
V.  撮像法
いくつかの態様において、本発明は撮像法であって、撮像する被験者に本発明のナノ担体の有効量を投与する段階を含み、ここでナノ担体はイメージング剤を含む方法を提供する。
【００６５】
他の態様において、治療法および撮像法を、薬物およびイメージング剤の両方を有するナノ担体を用いて同時に行う。
【実施例】
【００６６】
VI.  実施例
以下の議論において、ナノ担体の化学構造を示すために以下の命名法PEG0000-CAn-PEG3nを用いる。最初のPEGの上付き数字は用いる直鎖PEGのサイズを表す。CAはコール酸を表し、「n」はナノ担体の各単位に存在するコール酸（CA）の数を表す。二つ目のPEGはコール酸（CA）に結合しているPEGを意味する。
【００６７】
実施例1：CA3-PEG9（2）の調製
コール酸の三量体（CA3または化合物1）を、図1に従い、出発原料としてコール酸NHS活性エステルおよびトリアミノエチルアミンを用いて、まず調製した。低分子三量体1は水に限られた溶解性を有することが判明した。不溶性粒子をろ過した後、サイズが1nm前後の単分子ミセル構造を形成することが観察された。酸化エチレンのアニオン重合によるPEG化の後、CA3-PEG9（ポリマー2）の分子量は7.7KDaに増加し、多分散指数（PDI）は1.04であり、分子量の非常に狭い分布が示された。水中でポリマー2により形成されたナノ粒子（ナノ担体2）のサイズは、単分散性で直径4.3nmであることが判明した。
【００６８】
実施例2：テロデンドリマーPEG-CA4（4）の調製
CA4の固相合成：
コール酸の四量体（ポリマー3）をRink樹脂上で、分枝を作るためにリジンを用い、固相合成により合成した。カップリング反応を標準のFmocペプチド合成法に従って実施し、四量体生成物を樹脂から、水およびスカベンジャーとしてのトリイソプロピルシラン存在下、TFAにより切断した。CA4は水に限られた溶解性を有するが、直径77nmのミセルに自己集合することが観察された（図2）。
【００６９】
テロデンドリマーポリマーの液相合成：
星形コール酸四量体PEG3000-CA4（ポリマー4）を直鎖ポリエチレングリコール上で、液相縮合反応により合成した（図3）。可溶性PEG化生成物の単離を、冷エーテル中の沈澱により行った。アジド基を、分子量3000DaのFmoc保護したアミノ-PEG-COOHのカルボキシル基にカップリングさせた。FmocをDMF中の20％ピペリジン溶液で処理して除去した後、(Fmoc)Lys(Boc)-OHをPEGのN末端に、カップリング試薬としてDICおよびHOBtを用いてカップリングさせた。Fmocペプチド合成による(Fmoc)lys(Fmoc)-OHの繰り返しカップリングにより、分枝構造を得た。コール酸を分枝リジンのアミノ基にコール酸NHSエステルにより導入してPEG3000-CA4を生成し、これは直径15nmの狭いサイズ分布のナノ粒子に自己集合することが観察された。PEG3000-CA4のGPC試験でも分子量の狭い分散が示され、平均分子量は4.8KDaで、9.2KDaに小さいピークが見られたが、これは両親媒性のポリマー4の凝集によると考えられる（図3C）。星形コール酸八量体（ポリマー5）を直鎖ポリエチレングリコール上で、第三世代の樹枝状オリゴリジンにより合成した。これは直径21nmのより大きいナノ粒子に自己集合することが観察された。このPEG3000-CA8ナノ担体はPTXなどの疎水性抗腫瘍薬に対する有望な負荷能力を示し、以下に詳細に論じる。
【００７０】
実施例3：テロデンドリマーPEG3000-CA4-PEG8（16）の調製
PEG3000-CA4-PEG8のアニオン重合による合成：
ポリマー4を前述のとおり直鎖ポリエチレングリコール上で合成した。コラン単位上の12のヒドロキシル基から出発して、酸化エチレンのアニオン重合により、分子をPEG鎖でさらに接ぎ木してポリマー16を作成した（図6）。より大きいポリマー16から誘導されるミセルが、より小さいポリマー4により形成されるものよりも小さかったことは興味深い（それぞれ8nmと15nm）。おそらく、各コラン単位上の追加のPEGが、多数のポリマー単位の大きく安定なミセルへの会合を制限している。予期しなかったわけではなく、薬物負荷試験からPTX負荷能力は比較的低い（0.64mg/mL）ことが判明し、このナノ担体の疎水性ポケットはかなり小さいことが示された。
【００７１】
実施例4：直鎖ポリマー系（ポリマー17〜20）の調製
直鎖形のコール酸-PEGポリマー直鎖系1を、テロデンドリマーの調製と同じ液相縮合反応により調製した。可溶性PEG化生成物の単離を、冷エーテル中の沈澱により行った。ポリマー17を合成手順の例として：アジド基を、分子量3000ダルトンのFmoc保護したアミノ-PEG-COOHのカルボキシル基に、カップリング試薬としてDIC/HOBtを用いてカップリングさせた。アジドPEGの冷エーテルによる沈澱後、Fmoc基をDMF中の20％ピペリジン溶液で処理して除去し、(Fmoc)Lys(Fmoc)-OHの2段階カップリングをPEGのN末端に、Fmocペプチド化学により、カップリング試薬としてDICおよびHOBtを用いて逐次実施した。Boc保護基をDCM中の50％TFAで30分間処理することにより除去し、ポリマーを冷エーテルで再度沈澱させた。立体障害を排除するために、柔軟なスペーサー分子（Fmoc-Ebes）をリジンの側鎖にカップリングさせた。Fmoc基をDMF中の20％ピペリジンで処理して除去した後、(Fmoc)Lys(Boc)-OHを側鎖リジンに、カップリング試薬としてDIC/HOBtを用いてカップリングさせた。Fmoc保護基の除去後、コール酸NHS活性エステルをリジンの側鎖にカップリングさせて側鎖疎水性コランブロックを導入した。Fmoc保護N末端は蛍光色素（Cy5.5など）または放射性核種とカップリング可能である。各リジン単位上に2つのコール酸を有する一連の直鎖ポリマーを調製し（図26）、DLS粒径測定器で測定したミセルのサイズは、リジン(CA)2の反復単位が2から3、4および5に増えると、狭い多分散性で9.5nmから12.6および20nmに増加した。
【００７２】
実施例5：分枝ポリマー系1〜4の調製
分枝ポリマー系1および4
分枝したコール酸-PEGポリマー分枝系1および4を、テロデンドリマーの調製と同じ液相縮合反応により調製した。可溶性PEG化生成物の単離を、冷エーテル中の沈澱により行った。ポリマー21を分枝ポリマー系1（図27）の合成手順の例とし、合成スキームを図41に示す：DMF中、3-アジドプロピルアミン（3当量）をFmocNH-PEG-COOH（3000Da）のカルボキシル基に、カップリング試薬としてN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt、3当量）/ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、3当量）を用いて終夜カップリングさせた。続いて、ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。FmocをDMF中の20％ピペリジン溶液で除去した後、(Fmoc)Lys(Dde)-OH（3当量）をPEGのN末端に、カップリング試薬としてDICおよびHOBtを用い、Kais試験の結果が陰性になり、それによってカップリング反応の完了が示されるまでカップリングさせた。次いで、PEG化化合物を冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。PEGのN末端上のFmocをDMF中の20％ピペリジン溶液処理により除去した後、Fmocペプチド合成による(Fmoc)lys(Fmoc)-OHのカップリングによって、分枝構造を得た。2つの柔軟なスペーサー分子（Fmoc-Ebes）をリジンのアミノ基にカップリングさせた。次いで、Fmoc基をDMF中の20％ピペリジン溶液を用いて除去した後、(Fmoc)Lys(Boc)-OHをスペーサー分子にカップリングさせた。(Fmoc)Ebes-OHリンカー（6当量）および(Fmoc)Lys(Boc)-OH（6当量）をFmocペプチド合成手順を用いて繰り返しカップリングさせた後、それぞれ2、3、4および5つの[Ebes-lys(Boc)]反復単位を有する、ポリマー21、22、23および24の骨格が合成された。FmocをDMF中の20％ピペリジン溶液を用いて除去し、Boc基を50％TFA/DCMを用いて除去した後、コール酸NHSエステルを骨格の遊離アミノ基と反応させて、P-1系のポリマー21〜24を生成した。ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄し、水に溶解した。ポリマー溶液をろ過し、次いでMWCO：3.5kDaの透析チューブ内で4Lの水に対して透析し、貯留槽の水は24時間で4回完全に新しくした。最後に、ポリマーを凍結乾燥した。
【００７３】
分枝ポリマー系2
図48に示す分枝ポリマー系2（図28）の合成：
系2のポリマーを分枝ポリマー系1と同様の戦略で、Fmocペプチド化学により合成した。DMF中、3-アジドプロピルアミン（3当量）をFmocNH-PEG-COOH（3000Da）のカルボキシル基に、カップリング試薬としてN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt、3当量）/ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、3当量）を用いて終夜カップリングさせた。続いて、ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。FmocをDMF中の20％ピペリジン溶液で除去した後、(Fmoc)Lys(Dde)-OH（3当量）をPEGのN末端に、カップリング試薬としてDICおよびHOBtを用い、Kais試験の結果が陰性になり、それによってカップリング反応の完了が示されるまでカップリングさせた。次いで、PEG化化合物を冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。PEGのN末端上のFmocをDMF中の20％ピペリジン溶液処理により除去した後、Fmocペプチド合成による(Fmoc)lys(Fmoc)-OHのカップリングによって、分枝構造を得た。2つの柔軟なスペーサー分子（Fmoc-Ebes）をリジンのアミノ基にカップリングさせた。次いで、Fmoc基をDMF中の20％ピペリジン溶液を用いて除去した後、(Fmoc)Lys(Boc)-OHをスペーサー分子にカップリングさせた。(Fmoc)Ebes-OHリンカー（6当量）および(Fmoc)Lys(Boc)-OH（6当量）をFmocペプチド合成手順を用いて繰り返しカップリングさせた後、それぞれ2、3および4つの[Ebes-lys(Boc)]反復単位を有する、ポリマー25、26および27の骨格が合成された。Boc基を50％TFA/DCMを用いて除去した後、(Fmoc)lys(Fmoc)-OHをリジン側鎖のアミノ基にカップリングさせて、各反復単位のアミノ基を倍増させた。Fmoc保護基をDMF中の20％ピペリジン溶液を用いて除去した後、コール酸NHSエステルを骨格の遊離アミノ基と反応させて、分枝ポリマー系2のポリマー25〜27を生成した。ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄し、水に溶解した。ポリマー溶液をろ過し、次いでMWCO：3.5kDaの透析チューブ内で4Lの水に対して透析し；貯留槽の水は24時間で4回完全に新しくした。最後に、ポリマーを凍結乾燥した。
【００７４】
分枝ポリマー系3
図49に示す分枝ポリマー系3（図29）の合成：系3のポリマーを分枝ポリマー系1と同様の戦略で、Fmocペプチド化学により、反復単位におけるEbesリンカー分子を用いずに合成した。DMF中、3-アジドプロピルアミン（3当量）をFmocNH-PEG-COOH（5000Da）のカルボキシル基に、カップリング試薬としてN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt、3当量）/ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、3当量）を用いて終夜カップリングさせた。続いて、ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。FmocをDMF中の20％ピペリジン溶液で除去した後、(Fmoc)Lys(Dde)-OH（3当量）をPEGのN末端に、カップリング試薬としてDICおよびHOBtを用い、Kais試験の結果が陰性になり、それによってカップリング反応の完了が示されるまでカップリングさせた。次いで、PEG化化合物を冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。PEGのN末端上のFmocをDMF中の20％ピペリジン溶液処理により除去した後、Fmocペプチド合成による(Fmoc)lys(Fmoc)-OHのカップリングによって、分枝構造を得た。2つの(Fmoc)Lys(Boc)-OHをリジンのアミノ基にカップリングさせた。(Fmoc)Lys(Boc)-OH（6当量）をFmocペプチド合成手順を用いて繰り返しカップリングさせた後、それぞれ2、3、4および5つの[lys(Boc)]反復単位を有する、ポリマー28、29、30および31の骨格が合成された。Boc基を50％TFA/DCMを用いて除去した後、コール酸NHSエステルを骨格の遊離アミノ基と反応させて、分枝ポリマー系3のポリマー28〜31を生成した。ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄し、水に溶解した。ポリマー溶液をろ過し、次いでMWCO：3.5kDaの透析チューブ内で4Lの水に対して透析し、貯留槽の水は24時間で4回完全に新しくした。最後に、ポリマーを凍結乾燥した。
【００７５】
分枝ポリマー系4
分枝ポリマー系4（図30）のとおり、ポリマーの骨格は系3のポリマーと同じで、疎水性セグメントとしてコール酸の代わりにヘプタデカン酸を用いた（図50）。DMF中、3-アジドプロピルアミン（3当量）をFmocNH-PEG-COOH（5000Da）のカルボキシル基に、カップリング試薬としてN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt、3当量）/ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、3当量）を用いて終夜カップリングさせた。続いて、ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。FmocをDMF中の20％ピペリジン溶液で除去した後、(Fmoc)Lys(Dde)-OH（3当量）をPEGのN末端に、カップリング試薬としてDICおよびHOBtを用い、Kais試験の結果が陰性になり、それによってカップリング反応の完了が示されるまでカップリングさせた。次いで、PEG化化合物を冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。PEGのN末端上のFmocをDMF中の20％ピペリジン溶液処理により除去した後、Fmocペプチド合成による(Fmoc)lys(Fmoc)-OHのカップリングによって、分枝構造を得た。2つの(Fmoc)Lys(Boc)-OHをリジンのアミノ基にカップリングさせた。(Fmoc)Lys(Boc)-OH（6当量）をFmocペプチド合成手順を用いて繰り返しカップリングさせた後、それぞれ2、3、4および5つの[lys(Boc)]反復単位を有する、ポリマー35、36、37および38の骨格が合成された。Boc基を50％TFA/DCMを用いて除去した後、ヘプタデカン酸NHSエステルを骨格の遊離アミノ基と反応させて、分枝ポリマー系3のポリマー35〜38を生成した。ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄し、水に溶解した。ポリマー溶液をろ過し、次いでMWCO：3.5kDaの透析チューブ内で4Lの水に対して透析し、貯留槽の水は24時間で4回完全に新しくした。最後に、ポリマーを凍結乾燥した。
【００７６】
実施例6：薬物負荷
薬物負荷法
水溶液中での疎水性薬物としてのPTXのポリマーナノ担体への負荷を最適化した。発明者らは3つの異なる方法を評価した。
【００７７】
直接溶解法
1mgのPTX粉末を0.1mLのポリマー水溶液（10mg/ml）に加えた。混合物を室温で2時間超音波処理し、続いて1000rpmで遠沈して不溶性薬物を除去した。上清を孔径0.2μmのフィルターを通してろ過した。PTXの負荷をHPLCで定量した。薬物-ミセル溶液の一定量を取り出し、DMSOで10倍希釈した後、HPLCに注入した。PTXの濃度をPTXピーク下面積に基づいて算出した。発明者らは、PEG-CAポリマー溶液が水溶液中のPTXの溶解性を、直鎖PEGを用いた場合の約10倍に高めうることを示すことができた。この方法は有機溶媒の使用を回避する。この方法を用いて、発明者らはポリマー4の薬物負荷能力がポリマー2および6よりも高く、その値は1.1mg/mLに達しうることを観察した。
【００７８】
透析法
0.1mLのDMSO中の濃PTX溶液をPBS中のポリマー溶液（10mg/ml）に、ボルテックスで撹拌しながら滴加した。混合物を室温で2時間超音波処理して、ミセルへの薬物負荷を促進した。DMSOおよび遊離薬物を、MWCO：3000の膜を用いてのPBSに対する透析により、または遠心ろ過により除去した。
【００７９】
蒸発法
PTXおよびポリマーをまずクロロホルム、アセトン、エタノールなどの有機溶媒に溶解した。有機溶媒を丸底フラスコ中、減圧下でロータリーエバポレーターにより蒸発させて薄膜を形成し、これを減圧下で30分間さらに乾燥して、有機溶媒を除去した。PBS緩衝溶液をフラスコに加え、続いて2時間超音波処理して、ポリマー-薬物結合体を水に分散させた。最後に、ミセル溶液を0.2μmフィルターを通してろ過した。
【００８０】
DiDおよびPTXのミセルへの同時負荷
PEG5k-CA8ナノ粒子のリアルタイム生体分布を光学撮像システムでモニターするために、DiD（疎水性NIRF色素）およびPTXをナノ担体に、前述と同じ蒸発法を用いて同時負荷した。PEG5k-CA8ナノ粒子に負荷されたPTXの濃度をHPLCで測定した。PTXおよびDiD負荷後のナノ粒子の平均直径およびゼータ電位を、動的光スキャニング（DLS）で評価した。
【００８１】
表1は、前述の様々な新規ナノ担体の物理化学的性質をまとめて示す。全体として、5KDaのPEG鎖を有するポリマー7〜9は最適な治療的サイズ（20〜60nm）および薬物負荷特性を有するナノ粒子を生成しうるようである。発明者らは、卵巣癌治療標的指向試験のために、発明者らの卵巣癌を標的指向するリガンドをポリマー7のPEGリンカーのアジド基に結合する。
【００８２】
（表１）様々な新規ナノ担体の物理化学的性質
0005539993.tif 000022
a MALDI-TOF MS分析、マトリックス化合物としてα-シアノ-ヒドロキシル-ケイ皮酸により得た。b 1H NMR法により得た。MALDI-TOF MSによる出発物質のPEGの分子量を考慮して、分子量を1H NMRスペクトルにおけるコール酸のメチル基のプロトンシグナルの、PEGのプロトンシグナルに対する比に基づいて算出した。c CMCをプローブとしてピレン（2×10-6M）を用いての蛍光分光法により測定した。d 動的光散乱粒径測定器（Nanotrac(登録商標)）により測定した。e 20mg/mlのテロデンドリマー存在下でのPTX負荷を、0.45μmフィルターを通過させた後にHPLCで測定した。N/Dは検出不可能を意味する。f PTXを蒸発法により10mg/mlのポリマーでナノ担体に負荷した。g PTXの負荷を、0.45μmフィルターを通過させた後に分析した。h CF＝ギ酸コレステロール；LA＝リトコール酸；HA＝ヘプタデカン酸。
【００８３】
（表２）構築ブロックとしてコール酸を用いた直鎖および分枝ポリマーの物理化学的性質
0005539993.tif 000023
a 動的光散乱粒径測定器（Nanotrac(登録商標)）により測定し、ポリマーの濃度はPBS中20mg/mLに維持した；b 動的光散乱粒径測定器（Nanotrac(登録商標)）により測定し、PTXを蒸発法により20mg/mlのポリマーでナノ担体に負荷し、PTX負荷をその後の括弧内に示した；c 対応するポリマーから調製したナノ担体のPTX負荷能力、PTXを蒸発法により20mg/mlのポリマーでナノ担体に負荷した。d コール酸基をヘプタデカン酸基で置き換えている。
【００８４】
実施例7：薬物放出
ナノ担体からのPTXのインビトロ放出をPBS溶液に対する透析法を用いて試験した。この実験において、PBS中10mg/mLのポリマー5（PEG3000-CA8）4.6mLにPTX（3.2mg/ml）を負荷し、MWCO：3,500の3〜12mL透析カートリッジ（Pierce Chemical Inc.）に注入し、4LのPBSに対して透析した。様々な時点で透析カートリッジに残ったPTXの濃度をHPLCで測定した。累積薬物放出曲線を図10に示す。24時間後、約50％のPTXがミセルから放出された。
【００８５】
実施例8：ナノ担体の安定性
PEG5000-CA8（ポリマー7）から誘導したアブラキサンおよびPTX負荷ナノ担体の粒径を、4℃で保存中の異なる時点でNanotrac DLS粒径測定器を用いてモニターした。アブラキサンはより大きいサイズ（130nm）を有することが判明し、5日間の保存後に目に見える白色沈澱のより大きい凝集物（約3μm）を形成した（図11）。これに対し、PTX-ナノ担体7の粒径は変化しないままで、同じ期間を通じて目に見える沈澱はなかった。
【００８６】
実施例9：PTX負荷ナノ担体のサイズ
PTX負荷ミセルのサイズをウシ胎仔血清（FBS）存在下で試験した。図12により、10％FBS中のナノ担体7に負荷したPTXの濃度を上昇させると、ナノ担体の粒径は約20nmで一定状態に達することが判明した。図13は、ポリマー5のPTX負荷ナノ担体は様々な濃度のFBS中、90nmで安定に推移し、FBS内部の6.5nmの粒子と共存することを示している。前述の試験は、薬物負荷ミセルが血清中で安定であることを示すもので、これは臨床適用のために重要である。
【００８７】
実施例10：ナノ担体の細胞毒性
PEG-CAポリマー単独の細胞毒性を、96穴プレート内のSKOV-3（卵巣癌細胞株）でMTT検定を用いて評価した（図14）。ポリマー4、7および16は、最大1mg/mLのポリマー濃度で観察可能な細胞毒性はないことが判明した。ポリマー5は、1mg/mL濃度でのみ軽度の細胞毒性を示し、100μg/mL未満では非毒性であることが明らかとなった。（B）無負荷PEG5000-CA8 NPおよびクレモホール：エタノール媒体のHFF1ヒト線維芽細胞に対する細胞毒性。C1およびC2はそれぞれ、平均的なヒトの血液量を6Lと仮定しての、PEG5000-CA8およびクレモホール：エタノールのインビボ投与後の血中濃度推定値である。
【００８８】
PTX負荷ナノ担体およびパクリタキセルの2つの臨床製剤（タキソール(登録商標)およびアブラキサン(登録商標)）の、2つの異なる卵巣癌細胞株に対する細胞毒性を評価した。薬物と72時間インキュベートした後、細胞を洗浄し、MTT検定を実施した。5つのパクリタキセル製剤のIC50は同等であることが判明した。ES-2細胞株では、PTX-PEG3000-CA8は他の製剤よりも強力であるようであった（図15）。
【００８９】
実施例11：異種移植マウスモデルIにおけるPEG5000-CA8-PTXのインビボ有効性試験
ルシフェラーゼ遺伝子を形質移入したヒトSKOV-3卵巣癌細胞を有するヌードマウスを、パクリタキセルの様々な製剤で4日ごとに5回の投与で治療した。腫瘍反応の結果を図16に示す。様々なパクリタキセル製剤を、異種移植片が比較的小さい（50mm3）時点で投与した。これら5つの各治療法で、初回治療投与の28日後まで腫瘍増殖は検出されなかった。これに対し、PBS単独で治療した対照マウスは、初回治療投与の約16日後に急速な腫瘍増殖を示した。
【００９０】
これら5つの治療群および1つの食塩水対照群で急性毒性は観察されなかった。これらのマウスの体重を試験の全過程を通して測定した。結果を図17に示す。タキソールで治療した群では、治療第一週の間にマウスの有意な体重減少が見られ、実験の全期間で、体重は5つの治療群に比べて最も低いままであった。これに対し、食塩水対照群、アブラキサン群、および3つのPEG5000-CA8-PTX群でマウスの体重はほぼ同等であり、3つの新規パクリタキセルナノ治療製剤は少なくともアブラキサンと同等に有効かつ耐容可能であることを示している。
【００９１】
パクリタキソール治療の初回投与から28日後のRBCおよびWBC数に対する5つの治療法の効果も試験した。結果を図18に示す。5つの治療群および1つの対照群で、RBC数の変化において有意差は見られなかった。これに対し、タキソール群では有意な骨髄抑制が観察された（WBC数の70％低下）。アブラキサン群ではWBC数は30％低下した。これに対し、3つのPEG5K-CA8-PTX群ではWBC数は10〜20％低下したにすぎなかった。このデータは、3つの新規パクリタキセルナノ治療製剤がタキソールおよびアブラキサンよりも骨髄抑制性が低いことを示している。
【００９２】
実施例12：異種移植マウスモデルIにおけるナノ担体の生体分布
図19において、皮下Molt-4腫瘍を有するマウスの48時間におけるインビボ近赤外（NIR）蛍光撮像を、4つの異なるナノ粒子-色素結合体（PTX負荷および無負荷のNP(PEG3000-CA8)-Cy5.5およびLLP2A-NP-Cy5.5）をマウス1匹につき4nmolの用量で尾静脈から注射した後に記録した。腫瘍への蛍光取り込みが4匹のマウスすべてで観察された。器官および摘出腫瘍のエクスビボ撮像も実施した（図20）。NP-色素結合体は、Molt-4およびK562腫瘍の両方において高い取り込みを示すことが判明した。肝取り込みが顕著であった。しかし、腎臓を含む他の器官による取り込みは非常に低かった。NP-Cy5.5およびNP-Cy5.5-PTXを投与したマウスにおいて、Molt-4腫瘍は肝臓よりも有意に高い取り込みを示した。しかし、LLP2Aリガンドの有無は腫瘍または肝臓によるナノ粒子の取り込みに影響はないようである。
【００９３】
実施例13：異種移植マウスモデルIIにおけるナノ担体の生体分布へのサイズの影響
ナノ粒子のインビボ生体分布への粒径の影響を試験するために、同じ濃度のDiD（疎水性近赤外（NIR）シアニン色素、1mg/ml）を、PEG2000-CA4、PEG5000-CA8およびPEG3000-CA4の20mg/mLミセル溶液にPTX（それぞれ4mg/ml、4mg/mlおよび3mg/ml）と共に同時負荷して、それぞれ17nm、64nmおよび154nmの異なるサイズの3つの蛍光標識ミセル製剤を形成した（図35a）。これら3つのサイズのDiD負荷ミセルをそれぞれRaw 264.7マクロファージ細胞と2時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで3回洗浄し、70％エタノールで固定し、共焦点蛍光顕微鏡で観察した。図35bに示すとおり、大きいミセル（154nm）は2つの小さいミセルに比べて、マクロファージに優先的に取り込まれ、これはフローサイトメトリー分析のデータと一致している（データは示していない）。NIR蛍光撮像を用いて、SKOV-3卵巣癌異種移植片（皮下および腹腔内埋込）を有するヌードマウスにおける、サイズが異なる3つのミセルのインビボ生体分布を評価した。マウスに尾静脈からPBS中の前述の3つのPTX-DiD負荷ミセル製剤を同量注射した。摘出した器官および腫瘍のエクスビボ撮像を注射の24時間後に実施した。図35cは、大きいナノ粒子（154nm）は肝臓および肺で最も高い蛍光強度を示し、これはおそらくはこれらの器官内のマクロファージによる非特異的取り込みによると考えられたが、腫瘍による蛍光取り込みは低かったことを示している。これに対し、小さいミセル（17および64nm）の腫瘍取り込みは通常の器官の取り込みよりもはるかに高かった。DiD-PTX-PEG5000CA8で治療した腫瘍を有するマウスのインビボNIR画像を経時的に記録した（図35d）。EPR効果による腫瘍部位でのDiD負荷ミセルの蓄積は注射の2時間後に始まり、24時間を通じて増加し続けた。これに対し、遊離色素で治療した腫瘍を有するマウスでは、腫瘍標的指向は見られなかった（画像は示していない）。
【００９４】
実施例14：NMRおよびCryoTEM試験
NMR試験
図33Aに示すとおり、テロデンドリマーPEG5000-CA8のプロトンNMRスペクトルを、PEGおよびコール酸の両方にとって良好な溶媒である重水素化クロロホルム中で収集した。親水性PEG鎖（3.3〜3.6ppm）および両親媒性コール酸（0.6〜2.2ppm）上のシグナルを検出することができ、PEG鎖の比およびコール酸の数を3.65ppmのPEGの積分したピークの比およびコール酸上のメチル基（0.67ppm）の1つの強度に基づいて算出した。NMR試験に基づき、式はPEG5000-CA7.3と計算され、これは理論式PEG5000-CA8に非常に近い。しかし、NMR試験を水中で行うと、樹枝状のコール酸のシグナル（0.6〜2.2ppm）は検出されず（図33B）；PEGのプロトン（3.2〜3.8ppm）だけが検出された。これは、コール酸の疎水性セグメントが水中では凝集して、コール酸部分の動きを制限し、緩和時間（D2）を著しく延長して、NMRスペクトルのシグナルが弱くなったことを示している。このNMRデータは、水中のテロデンドリマーのミセルを支持するものである。
【００９５】
CryoTEM試験
CryoTEMは、水性条件下で水和されたミセルの実際の形態およびサイズの観察を可能にする。PTX負荷後、ミセルのサイズはDLS測定により50〜60nmに増大する。同時に、ミセルコアの密度も高まる。図34は、4.4mg/mLのPTXを負荷したPEG5000-CA8のcryoTEM画像を示す。顕微鏡写真を、標準として18nmの幅を有するタバコモザイクウイルス（TMV）非存在下（A）および存在下（B）で得た。30〜60nmのサイズの球状ミセルが観察され、これはDLS測定から得た結果（60nm）と一致している。
【００９６】
実施例15：MALDI-ToF MSおよびAFM画像によるミセルの特徴づけ
MALDI ToF MS
テロデンドリマーの物理的性質およびナノ粒子のインビボでの受動的腫瘍標的指向効果の試験において、PEG鎖長が異なる（2〜10kDa）モノ官能基化MeO-PEG-NH2を用い、樹枝状ブロックにおける様々な数のCA（4、8および16）を結合して、一連のテロデンドリマーを調製し（表1）、MALDI-TOF質量分析によって、コール酸の数の増加に伴い、テロデンドリマーの分子量が比例的に増加することが判明した（図36）。MALDI-ToF MS法から得た分子量は理論値と非常に近く（表1）、これはテロデンドリマーの明確な構造を強く示すもので、標準のブロックコポリマーアプローチでは達成が非常に難しい快挙である。
【００９７】
AFM画像
チオール官能基化HS-PEG5000-CA8（構造を図51に示す）から調製したミセル（DLSにより16±4nm）およびPTX負荷ミセル（6.4mg PTX/mL、DLSにより23±8nm）をAFMスキャニングのための金表面に固定した。タッピングモードAFMトポグラフを水溶液中で得た。無負荷および薬物負荷ミセルはいずれも、平均サイズがそれぞれ、DLS測定によって得られた粒径と近い、15nmおよび26nmの個々に固定されたナノ粒子として現れた（図37）。
【００９８】
実施例16：異種移植マウスモデルIIIにおけるナノ担体の生体分布へのサイズの影響
腹腔内SKOV3-luc卵巣腫瘍を有するマウスにおけるi.p.注射後のPEG5000-CA8（ポリマー7）ナノ粒子生体分布を調査した。マウスに遊離DiDまたはDiD負荷PEG5000-CA8ナノ担体をi.p.注射した。遊離DiDで治療したマウスでは、注射後、蛍光は体中に速やかに拡散し、72時間の時点でバックグラウンドの自己蛍光と識別できないレベルに低下した。これに対し、DiD標識PEG5000-CA8ナノ担体を注射したマウスでは、主に腹腔領域に局在する強い蛍光が見られ、72時間の時点で大部分がまだ残っていた（図38A）。72時間の時点で、腹腔を露出し、Kodak撮像ステーションでスキャンし、腹腔腫瘍結節の表面上にDiD標識PEG5000-CA8ナノ担体の局在が示された（図38B）。結果は、PEG5000-CA8薬物担体は腹腔内のパクリタキセルの滞留時間を有意に延長し、腹腔から全身循環への薬物吸収の速度および程度を低下させることを示している。
【００９９】
実施例17：異種移植マウスモデルIIにおけるPEG5000-CA8-PTXのインビボ有効性試験
静脈内注射後のPTX-PEG5000-CA8 NPの抗腫瘍効果を皮下SKOV3-luc腫瘍を有するマウスで評価した。PBS、タキソール(登録商標)（13.4mg/kg）、アブラキサン(登録商標)（30mg PTX/kg）およびPTX-PEG5000-CA8 NP（13.4および30mg PTX/kg）を第0、4、8日に投与した（第一クール）。腫瘍増殖はすべてのPTX製剤治療マウスで阻害され、30mg PTX/kgのPTX-PEG5000-CA8 NPが最も有効であった。しかし、これらの治療群すべてでその後腫瘍の進行が認められた。第二の治療周期を第38日に開始した。全体として、マウスはタキソール(登録商標)、アブラキサン(登録商標)およびPTX-PEG5000-CA8 NPの静脈内投与後に腫瘍増殖速度の低下を示した（図39A）。しかし、PTX-PEG5000-CA8はタキソール(登録商標)と比べて優れた抗腫瘍活性を示した。第73日までに、出発腫瘍サイズに対する相対腫瘍体積（RTV）中央値はタキソールでは14.9であったが、13.4mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8 NP、アブラキサンおよび30mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8 NPのRTVはそれぞれ10.7、7.9および5であった（すべてでP＜0.05）。さらに、30mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8 NP群では1例の完全寛解が見られたが、他の群のいずれでも完全寛解例はなかった。
【０１００】
動物の行動、体重変化、血球数、ならびに肝および腎機能に対する影響を分析することにより、毒性を評価した。タキソール(登録商標)治療を受けたマウスは注射後10分間に全般的活動性の低下を高頻度で示すが、PTX-PEG5000-CA8 NPのいずれかの用量の投与後に活動性の顕著な変化は観察されないことが注目された。タキソール(登録商標)群で観察されたこの行動の違いは、パクリタキセルの媒体としてのクレモホールELおよびエタノールの使用に関連づけることができる。タキソール(登録商標)群は両方の治療周期中に有意な体重減少を示した（P＜0.05）が、PTX-PEG5000-CA8 NP群では体重は減少しなかった（図39B）。最後の注射後3日目に、血球数および血清化学測定のために血液試料を採取した。すべての群で白血球（WBC）、赤血球（RBC）、および血小板数は正常範囲内で、血液毒性の可能性は排除された。すべての群で血清化学（ALT、AST、全ビリルビン、BUNおよびクレアチニン）も正常範囲内で、肝および腎毒性もないことが示された。肝臓の組織検査により、肝毒性がないことがさらに確認された。
【０１０１】
実施例18：異種移植マウスモデルIIIにおけるPEG5000-CA8-PTXのインビボ有効性試験
腹腔転移卵巣癌の同所性マウスモデルにおいてi.p.治療後のPTX-PEG5000-CA8 NPの治療効果を評価し、タキソール(登録商標)およびアブラキサン(登録商標)と比較した。i.p.転移SKOV3-luc卵巣腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにタキソール(登録商標)（20mg/kg）、アブラキサン(登録商標)（45mg PTX/kg）およびPTX-PEG5000-CA8（20および45mg PTX/kg）を第0、4、8、12および16日に合計5回投与した。生物発光撮像を治療後毎週実施し、腫瘍の生物発光を擬似カラー強度を測定することにより定量した（図40A）。対照群と比べて、すべての治療群のマウスは光強度の上昇速度が有意に遅かった（P＜0.05）。治療群の中で、PTX-PEG5000-CA8群の光強度は等価のPTX用量のタキソール(登録商標)およびアブラキサン(登録商標)の光強度よりも低かった。特に、20mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8 NP群の1匹のマウスおよび45mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8 NP群の2匹のマウスは治療に対して完全寛解を経験し、その後再発した。反対に、タキソール(登録商標)で治療したマウスで完全寛解を示すものはなかった。すべてのマウスを追跡して生存の長さも調べた。PBS対照群の未治療マウスの生存時間中央値は39日（29〜45日の範囲）であったが、3つのPTX製剤治療すべてで生存時間中央値は有意に延長された（P＜0.001）。しかし、PTX-PEG5000-CA8 NP治療は等価のPTX用量のタキソール(登録商標)およびアブラキサン(登録商標)よりも生存における大きい利点を示した。タキソール(登録商標)群の生存時間中央値は65日（37〜81日の範囲）で、20mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8 NP群では74日（49〜92日の範囲）であった。アブラキサン(登録商標)群の生存中央値は81日（55〜90日の範囲）で、45mg PTX/kg PTX-PEG5000-CA8 NP群では85日（66〜105+日の範囲）であった（図40B）。
【０１０２】
実施例19：分枝ポリマー系P-1の調製
直鎖PEG化二股コール酸オリゴマーを段階的ペプチド化学により合成した。例えば、発明者らはP-１系ポリマーを合成するために、直鎖ポリエチレングリコールから液相反応により開始した（図41）。DMF中、3-アジドプロピルアミン（3当量）をFmocNH-PEG-COOH（3000Da）のカルボキシル基に、カップリング試薬としてN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt、3当量）/ジイソプロピルカルボジイミド（DIC、3当量）を用いて終夜カップリングさせた。続いて、ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。FmocをDMF中の20％ピペリジン溶液で除去した後、(Fmoc)Lys(Dde)-OH（3当量）をPEGのN末端に、カップリング試薬としてDICおよびHOBtを用い、Kais試験の結果が陰性になり、それによってカップリング反応の完了が示されるまでカップリングさせた。次いで、PEG化化合物を冷エーテルで沈澱させ、洗浄した。次いで、(Fmoc)lys(Fmoc)-OH（3当量）、(Fmoc)Ebes-OH（6当量）、(Fmoc)Lys(Boc)-OH（6当量）を前述のPEG化生成物に同じFmocペプチド合成手順により段階的にカップリングさせた。ポリマー21、ポリマー22、ポリマー23およびポリマー24の骨格を、(Fmoc)Ebes-OHおよび(Fmoc)Lys(Boc)-OHのカップリングをそれぞれ2、3、4および5回繰り返して構築した。BocおよびFmoc基の除去後、コール酸NHSエステルを骨格の遊離アミノ基と反応させて、P-1系の4つのポリマーを生成した。ポリマーを冷エーテルで沈澱させ、洗浄し、水に溶解した。ポリマー溶液をろ過し、次いでMWCO：3.5KDaの透析チューブ内で4Lの水に対して透析し；貯留槽の水は24時間で4回完全に新しくした。最後に、ポリマーを凍結乾燥した。P-2、P-3およびP-4系を同様の戦略で、Fmoc-lys(Fmoc)-OHおよびFmoc-lys(Boc)-OHの異なる組み合わせ、ならびにカップリングおよびFmoc脱保護の異なる繰り返しを用いて合成した。
【０１０３】
実施例20：ポリマーP-1およびP-2系のTEM画像
ミセルの形態を、風乾したミセルをリンタングステン酸（0.1重量％）で染色した後に透過電子顕微鏡（TEM）で観察した。図42（A1）に示すとおり、小さいポリマー23（約10nm）および大きいポリマー25（約150nm）ミセルの両方が円形およびサイズの均一性を保持していた。より高い倍率では、ポリマー25の明らかなコアシェル構造が明白であった（図42 A3）。動的光散乱（DLS）測定により、ポリマー23およびポリマー25ミセルの平均直径はそれぞれ11および157nmであることが示され、これはTEMデータ観察されたものと一致していた。
【０１０４】
実施例21：P-1、P-2およびP-3系ポリマーにおけるPTX負荷とそれらのサイズ
様々な水に難溶性の抗腫瘍薬をこれらのミセルに、溶媒蒸発法により効率的に封入することができる。パクリタキセル（PTX）は様々な悪性腫瘍を治療するために用いられる広域抗腫瘍薬である。PTXは水溶性が非常に低い（1μg/mL）ため、PTXの市販製剤（タキソール(登録商標)）は、重篤な副作用を引き起こしうる脱水アルコ−ルとクレモホールELとの混合物中で製剤される。アブラキサン(登録商標)は水溶液中の130nmのパクリタキセルのアルブミン結合粒子製剤である。本明細書では、PTXが、本発明者らのミセルに、水溶液中で、容易に負荷され得ることを証明する（図43A）。CMC値が4.5〜7.8μMの範囲のミセルは、CMC値がより低いまたは高いミセルよりも良好なPTX負荷能力（≧4.5mg/mL）を有する傾向にあることが観察された。ポリマー23ミセル（CMC：5.8μM）は12.0mg/mLで最も高いパクリタキセル負荷能力を有し（図43B）、これはミセルの全質量の37.5重量％に等しかった。これは、PTXのポリマー23ミセル製剤がこの薬物の水溶性を12,000倍に高めうることを示していた。したがって、薬物負荷能力に関して、ポリマー23ミセルは2つの臨床PTX製剤、タキソール(登録商標)（6.0mg/mL）およびアブラキサン(登録商標)（5.0mg/mL）、ならびに25％未満のPTX負荷能力を有すると報告された他の通常のミセル製剤よりもはるかに優れていた。さらに、負荷効率は、PTXを最大10mg/mLまで加えるとほぼ100％で、最終粒径は25〜30nmの範囲のままであった（図43B、43C）。
【０１０５】
実施例22：ポリマー23により形成されたミセルからのPTX放出
PTX負荷ミセルのPTX放出特性を37℃のPBS中で調べた。PTX負荷ポリマー23ミセルは、薬物放出試験において24時間以内に明白な「爆発的放出」を示すものはなく（＜30％）、PTX放出は最長7日まで続いた（図44）。試験終了時に、負荷PTXの80％がミセルから放出されていた。
【０１０６】
実施例23：ポリマー23により形成されたPTX負荷ミセルの安定性
これらのミセル製剤の長期安定性を4℃での保存中に評価した。薬物負荷ミセルを4℃で8ヶ月間保存し、サイズおよび薬物含量の両方で非常に安定であることが観察された。これに対し、アブラキサン(登録商標)は保存2日後により大きい凝集物を形成し、沈澱した。さらに、動物モデルにおいてミセルまたは薬物負荷ミセルについて薬動力学的モデリングおよび有効性データの基本的評価を行い、血清または血清アルブミン存在下でのミセルまたは薬物負荷ミセルの安定性を試験した。同様に、PTX負荷7.3mg/mLのポリマー23ミセルは、生理的に妥当な濃度のウシ血清アルブミン（BSA）（45mg/mL）存在下、50体積％イヌ血清中、37℃で96時間のインキュベーション期間を通し、30nm前後の均質なサイズを保持した（図45）。これに対し、アブラキサン(登録商標)ではそのような条件下で顕著なサイズ変動が観察された。これらのインビトロ安定性試験により、これらのPTX負荷ミセルは生理的条件下で長い循環時間を有しうることが示唆された。薬物負荷ポリマーミセルは一般に、薬物負荷が増大するにつれてより不安定になることが報告されている。これに対し、ポリマー23により形成されたミセルは、保存中または生理的条件下で、薬物負荷レベルが非常に高くても、非常に安定なままである。
【０１０７】
実施例24：P-1系ポリマーにより形成されたPTX負荷ミセルの細胞毒性
臨床において有用であるために、ナノ担体自体は非毒性であるべきである。新規ポリマーの4つの構築ブロックはすべて生体適合性分子である。ナノ担体自体は、MTT検定によりSKOV-3卵巣癌細胞に対して最大1mg/mLまで観察可能な細胞毒性を示さなかった（図46A）。PTX負荷ナノ担体はパクリタキセルの2つの臨床製剤（タキソール(登録商標)およびアブラキサン(登録商標)）と同等のインビトロ抗腫瘍効果を有し、SKOV-3卵巣癌細胞に対するIC50値は1.21から4.37ng/mLの範囲である（図46B）。
【０１０８】
実施例25：卵巣癌異種移植マウスモデルにおけるミセルの生体分布
インビボトラッキングのために、疎水性蛍光プローブをミセルに物理的に取り込ませることができる。これにより、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインド-ジカルボシアニン過塩素酸塩（DiD）、疎水性近赤外（NIR）蛍光色素をPTXと共にポリマー23ミセルに負荷した。最終ミセルの粒径は、DLSで測定して30±10nmであった。NIR光学撮像試験を実施して、ヒトSKOV-3卵巣癌異種移植片を有するマウスでナノ担体の生体分布および腫瘍標的指向能力を評価した。100μLのDiDおよびPTX同時負荷ミセル溶液をマウスに尾静脈から注射し、次いでマウスをKodak撮像システム（IS2000MM）により異なる時点でスキャンした。注射後3時間の時点で腫瘍およびバックグラウンドの間の蛍光シグナルの対比が観察され、24時間の時点でより顕著になった（図47A）。エクスビボ撮像により、ナノ担体は正常器官以外の腫瘍に優先的に蓄積することが確認された（図47B）。これは多分、ミセルのインビボ循環時間の延長ならびにサイズによる血管透過性および滞留性亢進（EPR）効果によると考えられる。
【０１０９】
実施例26：チオール化テロデンドリマーHS-PEG5000-CA8の調製
チオール化テロデンドリマーHS-PEG5000-CA8を直鎖ポリエチレングリコール上で液相縮合反応により合成した（図51）。可溶性PEG化生成物の単離を、冷エーテル中の沈澱により行った。S-トリチル保護2-チオールエチルアミンを分子量5000DaのFmoc保護アミノ-PEG-COOHのカルボキシル基にカップリングさせた。FmocをDMF中の20％ピペリジン溶液処理で除去した後、(Fmoc)Lys(Fmoc)-OHをPEGのN末端に、カップリング試薬としてDICおよびHOBtを用いてカップリングさせた。第三世代の樹枝状ポリリジンをFmocペプチド合成による(Fmoc)lys(Fmoc)-OHの繰り返しカップリングで調製した。コール酸を分枝リジンのアミノ基にコール酸NHSエステルにより導入した。トリチル基をDCM中50％のTFAで除去して、HS-PEG5000-CA8を生成し、これをミセルのAFM画像のための金表面に固定することができる。
【０１１０】
前述の発明を、理解を明確にするために例示および実施例によっていくらか詳細に記載してきたが、当業者であれば、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および改変を行いうることを理解するであろう。加えて、本明細書において提供する引用文献はそれぞれ、引用文献がそれぞれ個別に参照により組み入れられた場合と同程度に、その全体が参照により組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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