(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る手順と、
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離する手順と、
分離されたスペクトル小集団を、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順と、
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の予め取得された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順と、
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する手順と、を含む蛍光強度補正方法。
【請求項２】
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を列ベクトルとして配列し、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を列ベクトルとして配列した漏れ込み行列の逆行列を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する請求項１記載の蛍光強度補正方法。
【請求項３】
スペクトル集団を、独立成分分析又は主成分分析により、複数のスペクトル小集団に分離する請求項２記載の蛍光強度補正方法。
【請求項４】
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る手順と、
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離する手順と、
分離されたスペクトル小集団を、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順と、
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の予め取得された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順と、
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する手順と、を含む蛍光強度算出方法。
【請求項５】
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る測定手段と、
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離し、
分離されたスペクトル小集団を、保持された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定し、
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の保持された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定し、
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については保持された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する算出手段と、を備える蛍光強度算出装置。
【請求項６】
微小粒子の蛍光標識に用いた蛍光色素に関する情報の入力を受け付ける入力手段と、
予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布を保持する記憶手段と、を備える請求項５記載の蛍光強度算出装置。
【請求項７】
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つの集団として得たスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離するステップと、
分離されたスペクトル小集団を、保持された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定するステップと、
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の保持された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定するステップと、
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については保持された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出するステップと、を実行する蛍光強度補正プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光強度補正方法あるいは蛍光強度算出方法と蛍光強度算出装置並びに蛍光強度補正プログラムに関する。より詳しくは、微小粒子に多重標識された複数の蛍光色素のそれぞれから発生する蛍光の強度を正確に算出するための蛍光強度補正方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞等の微小粒子を蛍光色素を用いて標識し、これにレーザ光を照射して励起された蛍光色素から発生する蛍光の強度やパターンを計測することによって、微小粒子の特性を測定する装置（例えば、フローサイトメータ）が用いられている。近年では、細胞等の特性をより詳細に分析するため、微小粒子を複数の蛍光色素を用いて標識し、各蛍光色素から発生する光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器（ＰＭＴなど）により計測するマルチカラー測定が行われるようになっている。マルチカラー測定では、用いる蛍光色素の蛍光波長に応じて光検出器側の光学フィルタを選択して蛍光の検出を行っている。
【０００３】
一方、現在利用されている蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ（フィコエリスリン）など）は、蛍光スペクトルに互いに重複する波長帯域が存在する。従って、これらの蛍光色素を組み合わせてマルチカラー測定を行う場合、各蛍光色素から発生する蛍光を光学フィルタにより波長帯域別に分離しても、各光検出器には目的以外の蛍光色素からの蛍光が漏れ込むことがある。蛍光の漏れ込みが生じると、各光検出器で計測される蛍光強度と目的とする蛍光色素からの真の蛍光強度にずれが生じ、測定誤差の原因となる
【０００４】
この測定誤差を補正するため、光検出器で計測された蛍光強度から漏れ込み分の蛍光強度を差し引く蛍光補正（コンペンセーション）が行われている。蛍光補正は、光検出器で計測された蛍光強度が、目的とする蛍光色素からの真の蛍光強度となるように、パルスに電気的あるいは数学的な補正を加えるものである。
【０００５】
数学的に蛍光補正を行う方法として、各光検出器で計測された蛍光強度をベクトルとして表し、このベクトルに予め設定した漏れ込み行列の逆行列を作用させることで、目的とする蛍光色素からの真の蛍光強度を算出する方法が用いられている（図９・１０，特許文献１参照）。この漏れ込み行列は、各蛍光色素を個別に単標識した微小粒子の蛍光波長分布を解析することによって作成されるものであり、各蛍光色素の蛍光波長分布が列ベクトルとして配列されたものである。漏れ込み行列の逆行列は「補正行列」とも称される。図９・１０には、５種類（ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＥＣＤ，ＰＣ５，ＰＣ７）の蛍光色素と５つの光検出器を用いて５カラー測定を行う場合を例に示した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００３−８３８９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
補正行列を用いた蛍光補正方法では、各蛍光色素の蛍光波長分布が既知である必要がある。そのため、従来は、サンプル解析の都度に単標識した微小粒子を解析することによって各蛍光色素の蛍光波長分布を取得するか、あるいは装置に予め基準となる蛍光波長分布を保持させておくことが行われている。
【０００８】
しかし、装置に予め保持させた基準となる蛍光波長分布を利用する場合には、サンプルの解析毎に生じる測定誤差の影響を排除できず、正確な蛍光強度の測定を行うためには、マニュアル操作での補正が必要となる場合が多い。また、単標識した微小粒子を解析することによって取得した蛍光波長分布を利用する場合には、多色になる程、サンプル測定前の準備に時間と手間を要する。
【０００９】
近年では、細胞等の特性をより詳細に分析するため使用可能な蛍光色素数を増やしたいというユーザのニーズが高まっている。そこで、本発明は、サンプル解析の都度に単標識した微小粒子を解析することなく、各蛍光色素の蛍光波長分布を利用した蛍光補正を行うことができ、各蛍光色素からの蛍光強度を簡便かつ正確に算出できる蛍光補正方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題解決のため、本発明は、以下の手順を含む蛍光強度補正方法あるいは蛍光強度算出方法を提供する。
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る手順。
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離する手順。
分離されたスペクトル小集団を、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順。なお、この手順では、スペクトル集団を、独立成分分析又は主成分分析などにより、複数のスペクトル小集団に分離することができる。
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の予め取得された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順。
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する手順。
この蛍光強度補正方法等では、蛍光色素を多重標識した微小粒子の測定により取得されたスペクトル集団から各蛍光色素の蛍光波長分布を抽出して蛍光強度の算出に利用できる。そして、蛍光波長分布を抽出できなかった蛍光色素がある場合には、その蛍光色素についてのみ、予め取得された蛍光波長分布を用いて蛍光強度を算出するようにできる。
具体的には、例えば、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を列ベクトルとして配列し、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については予め取得された蛍光波長分布を列ベクトルとして配列した漏れ込み行列の逆行列を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出できる。
【００１１】
また、本発明は、以下の手段を含む蛍光強度測定装置を提供する。
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る測定手段。
得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離し、分離されたスペクトル小集団を、保持された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定し、いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の保持された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定し、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については保持された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する算出手段。
この蛍光強度測定装置は、さらに、微小粒子の蛍光標識に用いた蛍光色素に関する情報の入力を受け付ける入力手段と、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布を保持する記憶手段と、を備える。
【００１２】
さらに、本発明は、以下のステップを実行する蛍光強度補正プログラムを提供する。
複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つの集団として得たスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離するステップ。
分離されたスペクトル小集団を、保持された各蛍光色素の蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定するステップ。
いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素の保持された蛍光波長分布と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定するステップ。
スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素については保持された蛍光波長分布を用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出するステップ。
【００１３】
本発明において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
【００１４】
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、サンプル解析の都度に単標識した微小粒子を解析することなく、各蛍光色素の蛍光波長分布を利用した蛍光補正を行うことができ、各蛍光色素からの蛍光強度を簡便かつ正確に算出できる蛍光補正方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る蛍光強度補正方法の手順を説明するフローチャートである。
【図２】ステップＳ６０の手順を詳しく説明するフローチャートである。
【図３】ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＰＥ−ＴＲ，ＰＥ−Ｃｙ５の４種の蛍光色素により多重標識した微小粒子を測定して得られるスペクトル集団のスペクトログラム（Ａ）と、このスペクトル集団から分離されるスペクトル小集団のスペクトログラム（Ｂ）〜（Ｇ）である。
【図４】ＦＩＴＣのリファレンスデータのスペクトログラムである。
【図５】ＰＥのリファレンスデータのスペクトログラムである。
【図６】ＰＥ−ＴＲのリファレンスデータのスペクトログラムである。
【図７】ＰＥ−Ｃｙ５のリファレンスデータのスペクトログラムである。
【図８】本発明に係る蛍光強度算出装置１の機能的構成を示すブロック図である。
【図９】従来の補正行列を用いた蛍光補正方法を説明する図である。
【図１０】従来の補正行列の行列要素を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．蛍光強度補正方法
（１）ステップＳ１０：蛍光色素情報の入力
（２）ステップＳ２０：ネガティブコントロールの測定
（３）ステップＳ３０：サンプルの測定
（４）ステップＳ４０：解析微小粒子集団のゲーティング
（５）ステップＳ５０：スペクトル小集団の分離
（６）ステップＳ６０：各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定
（６−１）ステップＳ１００：スペクトル小集団の選択
（６−２）ステップＳ２００：リファレンスデータの参照
（６−３）ステップＳ６００：差分スペクトルの算出
（６−４）ステップＳ７００：リファレンスデータの参照
（７）ステップＳ７０：蛍光補正演算
（８）ステップＳ８０：データ表示
２．ステップＳ５０（スペクトル小集団の分離）とステップＳ６０（各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定）の処理の具体例
（１）ステップＳ５０：スペクトル小集団の分離
（２）ステップＳ６０：各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定
３．蛍光強度算出装置・蛍光強度算出プログラム
【００１８】
１．蛍光強度補正方法
図１及び図２は、本発明に係る蛍光強度補正方法の手順を説明するフローチャートである。図２は、図１中のステップＳ６０の手順を詳しく説明するフローチャートである。本発明に係る蛍光強度補正方法は、以下の手順を含むことを特徴とする。
「ステップＳ３０」：複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に光を照射することによって励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光し、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として得る手順と、
「ステップＳ５０」：得られたスペクトル集団を、複数のスペクトル小集団に分離する手順。
「ステップＳ６０（Ｓ２００）」：分離されたスペクトル小集団を、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布（リファレンスデータ）と比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順。
「ステップＳ６０（Ｓ６００・Ｓ７００）」：いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されないスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを、特定されていない蛍光色素のリファレンスデータと比較して、いずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定する手順。
「ステップＳ７０」：スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用い、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素についてはリファレンスデータを用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する手順。
【００１９】
本発明に係る蛍光強度補正方法には、例えば、図８を参照して詳しく後述する蛍光強度算出装置１が用いられる。蛍光強度算出装置１は、フローサイトメータとＣＰＵ、メモリ、ハードディスク、ユーザインタフェース等を有する。
【００２０】
（１）ステップＳ１０：蛍光色素情報の入力
まず、測定対象とする微小粒子を複数の蛍光色素を用いて多重標識する。微小粒子の蛍光色素標識は従来公知の手法によって行うことができる。例えば測定対象を細胞とする場合には、細胞表面分子に対する蛍光標識抗体と細胞とを混合し、細胞表面分子に抗体を結合させる。蛍光標識抗体は、抗体に直接蛍光色素を結合させたものであってよく、ビオチン標識した抗体にアビジンを結合した蛍光色素をアビジン・ビオチン反応によって結合させたものであってもよい。また、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であってよい。
【００２１】
蛍光色素には、従来公知の物質を２以上組み合わせて用いることができる。例えば、フィコエリスリン（ＰＥ）、ＦＩＴＣ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−テキサスレッド(PE-Texas red)、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＡＰＣ−Ｃｙ７、エチジウムブロマイド（Ethidium bromide）、プロピジウムアイオダイド（Propidium iodide）、ヘキスト（Hoechst）33258/33342、ＤＡＰＩ、アクリジンオレンジ（Acridine orange）、クロモマイシン（Chromomycin）、ミトラマイシン（Mithramycin）、オリボマイシン（Olivomycin）、パイロニン（Pyronin）Ｙ、チアゾールオレンジ（Thiazole orange）、ローダミン（Rhodamine）１０１イソチオシアネート（isothiocyanate）、ＢＣＥＣＦ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、Ｃ．ＳＮＡＲＦ−１、Ｃ．ＳＮＡＲＦ−１−ＡＭＡ、エクオリン（Aequorin）、Ｉｎｄｏ−１、Ｉｎｄｏ−１−ＡＭ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３−ＡＭ、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２−ＡＭ、オキソノール（Oxonol）、テキサスレッド(Texas red)、ローダミン（Rhodamine）１２３、１０−Ｎ−ノニ−アクリジンオレンジ（Acridine orange）、フルオレセイン（Fluorecein）、フルオレセインジアセテート（Fluorescein diacetate）、カルボキシフルオレセイン（Carboxyfluorescein）、カルビキシフルオレセインジアセテート（Caboxyfluorescein diacetate）、カルボキシジクロロフルオレセイン（Carboxydichlorofluorescein）、カルボキシジクロロフルオレセインジアセテート（Carboxydichlorofluorescein diacetate）が挙げられる。
【００２２】
図１中、ステップＳ１０では、ユーザによって、微小粒子の蛍光標識に用いた蛍光色素に関する情報（以下、「蛍光色素情報」と称する）が蛍光強度算出装置１に入力される。蛍光色素情報は、マウスやキーボード等のユーザインタフェースを用いて入力する。蛍光強度算出装置１には、各蛍光色素について基準となる蛍光波長分布（以下、「リファレンスデータ」とも称する）が保持されている。リファレンスデータには、装置に保持されているもの、あるいは予め各蛍光色素の蛍光波長分布を測定して取得されるものが用いられる。リファレンスデータの取得は、サンプル解析の都度行われるものではなく、一度リファレンスデータを取得して装置に保持させた後は、サンプル解析の都度に行う必要はないものである。本ステップにおいて入力される蛍光色素情報は、例えば蛍光色素の名称や型番等であって、保持された各蛍光色素のリファレンスデータに対応付けられた情報を意味するものとする。
【００２３】
（２）ステップＳ２０：ネガティブコントロールの測定
図１中、ステップＳ２０では、ユーザによって、蛍光色素による標識を行っていない微小粒子（ネガティブコントロール）の測定が行われる。微小粒子の測定は、従来公知のマルチカラー測定フローサイトメータを用いた方法と同様にして行うことができる。本ステップでは、微小粒子の自家蛍光の蛍光スペクトル（バックグランド値）が取得され、これと同時にサンプルの蛍光色素標識の特異性が確認される。
【００２４】
（３）ステップＳ３０：サンプルの測定
図１中、ステップＳ３０では、ユーザによって、蛍光色素を標識した微小粒子（サンプル）の測定が行われる。本ステップでは、複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に対して光を照射することによって、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光する。そして、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として取得する。
【００２５】
（４）ステップＳ４０：解析微小粒子集団のゲーティング
図１中、ステップＳ４０は、必要に応じてユーザによって行われる手順であり、サンプルの中から解析を行う微小粒子集団を抽出（ゲーティング）する。本ステップは、例えば、血液細胞サンプルの中からリンパ球のみを解析する場合や、サンプル中の生細胞のみを解析する場合に行われる。サンプルが解析を行う微小粒子集団のみからなる場合には、本ステップは不要である。本ステップを行うことで、各光検出器の検出値から解析微小粒子集団に対応する蛍光スペクトル集団を適切に抽出できる。
【００２６】
ゲーティングは、従来公知のフローサイトメータにおける方法と同様にして行うことができる。具体的には、ディスプレイやマウス、キーボード等のユーザインタフェースを用いて、前方散乱光（Foward Scatter: FSC）をX軸に、側方散乱光（Side Scatter: SSC）をY軸にとった二次元相関図上で解析を行う微小粒子集団を指定する。なお、本ステップは、プログラムによって自動で行われる手順であってもよい。
【００２７】
（５）ステップＳ５０：スペクトル小集団の分離
図１中、ステップＳ５０では、ユーザあるいはプログラムによって、ステップＳ３０で取得されたスペクトル集団から、主要な成分集団（以下、「スペクトル小集団」と称する）を複数分離する。スペクトル小集団の分離は、ユーザによって行われる場合には、ディスプレイやマウス、キーボード等のユーザインタフェースを用いて、スペクトル集団のスペクトログラム上で成分集団を指定することにより行う。また、プログラムによってスペクトル小集団を分離する場合には、独立成分分析や主成分分析などの通常用いられる成分分析アルゴリズムが適用される。
【００２８】
ステップＳ３０で取得されたスペクトル集団は、そのデータ値（蛍光強度）からステップＳ２０で取得したバックグランド値を減算した後、スペクトル小集団の分離に供する。
【００２９】
（６）ステップＳ６０：各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定
図１中、ステップＳ６０では、プログラムによって、ステップＳ５０で分離されたスペクトル小集団と、予め取得された各蛍光色素の蛍光波長分布（リファレンスデータ）と、を用いて、各蛍光色素の蛍光スペクトルを特定する。図２を参照して、本ステップの詳しい手順を説明する。
【００３０】
（６−１）ステップＳ１００：スペクトル小集団の選択
本ステップでは、まず、ステップＳ５０で分離された複数のスペクトル小集団の１つを選択する。選択するスペクトル小集団は、ステップＳ５０で分離された複数のスペクトル小集団の中から、他のスペクトル小集団と最も明確に分離されたものとすることが好ましい。
【００３１】
（６−２）ステップＳ２００：リファレンスデータの参照
本ステップでは、ステップＳ１００で選択されたスペクトル小集団とリファレンスデータとを比較して、このスペクトル小集団に蛍光波長分布パターンが一致するリファレンスデータを検索する。
【００３２】
一致するリファレンスデータが存在した場合には、当該リファレンスデータに対応付けされた蛍光色素情報に基づいて、選択されたスペクトル小集団を該当蛍光色素の蛍光スペクトルとして確定し、保持する。また、一致するリファレンスデータが存在しない場合には、選択されたスペクトル小集団を不一致の集団として保持する（ステップＳ３００）。
【００３３】
続く、ステップＳ４００では、ステップＳ５０で分離された複数のスペクトル小集団の全ての処理が完了しているかを確認する。処理が完了していないスペクトル小集団が存在する場合には、そのスペクトル小集団についてステップＳ１００に戻って処理が続行され、全てのスペクトル小集団の処理が完了するまで繰り返される。
【００３４】
（６−３）ステップＳ６００：差分スペクトルの算出
ステップＳ５００では、ステップＳ１０で蛍光色素情報が入力された蛍光色素の全てについて、そのリファレンスデータと蛍光波長分布パターンが一致するスペクトル小集団が確定したかを確認する。すなわち、微小粒子の蛍光標識に用いた蛍光色素の全てについて、その蛍光スペクトルとみなされるスペクトル小集団が確定しているか否かが確認される（ステップＳ５００参照）。
【００３５】
ここで、全ての蛍光色素についてスペクトル小集団が確定している場合には、処理を終了する。一方、スペクトル小集団が確定していない蛍光色素が存在する場合には、ステップＳ６００で以下の処理を行う。すなわち、まず、ステップＳ３００においていずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されず、不一致集団として保持されたスペクトル小集団と、一以上の特定されたスペクトル小集団と、の差分スペクトルを算出する（ステップＳ６００）。不一致集団として保持されたスペクトル小集団の一つからは、特定されたスペクトル小集団の１あるいは２以上を組み合わせて差分をとることによって、複数の差分スペクトルが算出される。
【００３６】
ステップＳ４００までの手順で、いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されず、不一致集団として保持されたスペクトル小集団には、複数の蛍光色素のスペクトル情報が畳み込み演算されている可能性が高い。本ステップでは、不一致のスペクトル小集団のデータ値から、すでにいずれかの蛍光色素の蛍光スペクトルとして特定されたスペクトル小集団のデータ値を減算することにより、畳み込み演算の影響を解消する。
【００３７】
（６−４）ステップＳ７００：リファレンスデータの参照
ステップＳ７００では、ステップＳ６００で算出された差分スペクトルとリファレンスデータとを比較して、この差分スペクトルに蛍光波長分布パターンが一致するリファレンスデータを検索する。
【００３８】
一致するリファレンスデータが存在した場合には、当該リファレンスデータに対応付けされた蛍光色素情報に基づいて、算出された差分スペクトルを該当蛍光色素の蛍光スペクトルとして確定し、保持する。また、一致するリファレンスデータが存在しない場合には、算出された差分スペクトルを不一致の集団として保持する（ステップＳ８００）。
【００３９】
続く、ステップＳ９００では、ステップＳ１０で蛍光色素情報が入力された蛍光色素の全てについて、そのリファレンスデータと蛍光波長分布パターンが一致するスペクトル小集団あるいは差分スペクトルが確定したかを確認する。すなわち、微小粒子の蛍光標識に用いた蛍光色素の全てについて、その蛍光スペクトルとみなされるスペクトル小集団あるいは差分スペクトルが確定しているか否かが確認される。
【００４０】
ここで、全ての蛍光色素についてスペクトル小集団あるいは差分スペクトルが確定している場合には、処理を終了する。
【００４１】
ステップＳ９００において、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが確定していない蛍光色素が存在する場合には、さらに、ステップＳ３００において不一致集団として保持されたスペクトル小集団の全ての処理が完了しているかを確認する（ステップＳ１０００）。処理が完了していないスペクトル小集団が存在する場合には、そのスペクトル小集団についてステップＳ６００に戻って処理が続行され、全てのスペクトル小集団の処理が完了するまで繰り返される。
【００４２】
ステップＳ１０００において、スペクトル小集団の全てを処理したことが確認された場合、処理を終了する。この段階で、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが確定していない蛍光色素が存在する場合もあり得る。スペクトル小集団あるいは差分スペクトルを確定できなかった蛍光色素は、微小粒子に特異的に標識されなかった可能性が高い。
【００４３】
（７）ステップＳ７０：蛍光補正演算
図１中、ステップＳ７０では、プログラムによって、ステップＳ６０において特定された各蛍光色素の蛍光スペクトルを用いて、各蛍光色素から発生した蛍光の強度を算出する。
【００４４】
この際、ステップＳ６０においてスペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を用いて、蛍光強度を算出する。また、ステップＳ６０においてスペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されなかった蛍光色素についてはリファレンスデータを用いて、蛍光強度を算出する。
【００４５】
具体的には、例えば、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定された蛍光色素については該スペクトル小集団あるいは該差分スペクトルの蛍光波長分布を列ベクトルとして配列し、スペクトル小集団あるいは差分スペクトルが特定されない蛍光色素についてはリファレンスデータを列ベクトルとして配列した漏れ込み行列の逆行列を用いて、各蛍光検出器からの検出値を補正する。なお、蛍光強度の算出は、漏れ込み行列の逆行列を用いた方法に限定されない。
【００４６】
（８）ステップＳ８０：データ表示
図１中、ステップＳ８０は、プログラムによって、蛍光強度の算出結果をディスプレイ等のユーザインタフェースに表示する。本ステップは、従来公知のフローサイトメータにおける方法と同様にして行うことができる。具体的には、各微小粒子について異なる２種類の蛍光色素の蛍光強度をそれぞれＸ軸又はＹ軸にプロットした２次元相関図による表示が採用できる。
【００４７】
従来、補正行列を用いた蛍光補正方法では、サンプル解析の都度に単標識した微小粒子を解析することによって各蛍光色素の蛍光波長分布を取得するか、あるいは装置に予めリファレンスデータを保持させておくことが行われている。しかし、従来のリファレンスデータを利用する方法では、サンプルの解析毎に生じる測定誤差の影響を排除できなかった。また、単標識した微小粒子を解析することによって取得した蛍光波長分布を利用する場合には、多色になる程、サンプル測定前の準備に時間と手間を要していた。
【００４８】
本発明に係る蛍光強度補正方法では、蛍光色素を多重標識したサンプルの測定により取得されたスペクトル集団から各蛍光色素の蛍光波長分布を抽出して補正行列を作成できる。そして、蛍光波長分布を抽出できなかった蛍光色素のみについて、リファレンスデータを用いて補正行列要素を構成するようにしている。従って、この蛍光強度補正方法によれば、サンプル解析の都度に単標識した微小粒子を解析することなく、サンプルの解析毎に生じる測定誤差の影響を最小限として、各蛍光色素からの蛍光強度を簡便かつ正確に算出できる。
【００４９】
２．ステップＳ５０（スペクトル小集団の分離）とステップＳ６０（各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定）の処理の具体例
図３〜７を参照して、本発明に係る蛍光強度補正方法のステップＳ５０，Ｓ６０の具体的な処理内容について説明する。３２チャンネルのマルチカラー測定フローサイトメータを用いて、ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＰＥ−ＴＲ，ＰＥ−Ｃｙ５の４種の蛍光色素により多重標識した微小粒子を測定（ステップＳ３０参照）して得たスペクトル集団（Ａ）と、このスペクトル集団から分離されるスペクトル小集団のスペクトログラム（Ｂ）〜（Ｇ）を図３に例示する。また、ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＰＥ−ＴＲ，ＰＥ−Ｃｙ５について単標識微小粒子の解析によって予め取得した蛍光波長分布（リファレンスデータ）のスペクトログラムをそれぞれ図４〜７に例示する。リファレンスデータは、励起レーザ（640 nm）からの漏れ込みを防ぐために設けられたノッチフィルタの特性を含んだデータとなっているため、色素自身のスペクトル情報と完全に一致せずに、機器特有のものとなる。
【００５０】
微小粒子は、ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＰＥ−ＴＲ，ＰＥ−Ｃｙ５の４種の蛍光色素に対して異なる染色性を示す複数のポピュレーションからなっており、これを測定して得られるスペクトル集団（Ａ）は、各ポピュレーションのデータが混在したものとなっている。
【００５１】
（１）ステップＳ５０：スペクトル小集団の分離
スペクトル集団（Ａ）からのスペクトル小集団の分離は、ポピュレーションごとの染色性の特徴に基づいて分離することが可能である。例えば、まず、チャネル２５の検出値の大小（あるいは有無）によって分離できる。チャネル２５の検出値によって分離すると、スペクトル集団（Ａ）は、スペクトル小集団（Ｂ）と（Ｃ）に分離される。次に、スペクトル小集団（Ｃ）を、チャネル１６の検出値の大小によって分離すると、スペクトル小集団（Ｄ）と（Ｅ）に分離できる。さらに、スペクトル小集団（Ｅ）を、チャネル１６の検出値の大小によって分離すると、スペクトル小集団（Ｆ）と（Ｇ）に分離できる。
【００５２】
上記の処理によって、スペクトル集団（Ａ）から、スペクトル小集団（Ｂ），（Ｄ），（Ｆ），（Ｇ）の４つのスペクトル小集団が分離された。
【００５３】
（２）ステップＳ６０：各蛍光色素の蛍光スペクトルの特定
ステップＳ１００で、スペクトル小集団（Ｂ）を選択する。ステップＳ２００で、リファレンスデータを参照すると、スペクトル小集団（Ｂ）は、ＦＩＴＣの蛍光波長分布パターンに一致する（図４参照）。従って、ステップＳ３００で、スペクトル小集団（Ｂ）をＦＩＴＣの蛍光スペクトルとして確定、保持する。ステップＳ４００で、スペクトル小集団（Ｄ），（Ｆ），（Ｇ）が処理されていないため、ステップＳ１００に戻る。
【００５４】
ステップＳ１００で、スペクトル小集団（Ｄ）を選択する。ステップＳ２００で、リファレンスデータを参照すると、蛍光波長分布パターンが一致するデータがない。従って、ステップＳ３００で、スペクトル小集団（Ｄ）を不一致集団として保存する。ステップＳ４００で、スペクトル小集団（Ｆ），（Ｇ）が処理されていないため、ステップＳ１００に戻る。
【００５５】
ステップＳ１００で、スペクトル小集団（Ｆ）を選択する。ステップＳ２００で、リファレンスデータを参照すると、蛍光波長分布パターンが一致するデータがない。従って、ステップＳ３００で、スペクトル小集団（Ｆ）を不一致集団として保存する。ステップＳ４００で、スペクトル小集団（Ｇ）が処理されていないため、ステップＳ１００に戻る。
【００５６】
ステップＳ１００で、スペクトル小集団（Ｇ）を選択する。ステップＳ２００で、リファレンスデータを参照すると、蛍光波長分布パターンが一致するデータがない。従って、ステップＳ３００で、スペクトル小集団（Ｇ）を不一致集団として保存する。ステップＳ４００で、全てのスペクトル小集団が処理されているため、ステップＳ５００に進む。
【００５７】
ステップＳ５００では、これまでにＦＩＴＣのスペクトル小集団（Ｂ）が確定したのみであるため、ステップＳ６００に進む。
【００５８】
ステップＳ６００では、ステップＳ３００において、いずれの蛍光色素の蛍光スペクトルとしても特定されず、不一致集団として保存されたスペクトル小集団（Ｄ），（Ｆ），（Ｇ）と、ＦＩＴＣの蛍光スペクトルとして特定されたスペクトル小集団（Ｂ）と、の差分スペクトルを算出する。
【００５９】
ここでは、まず、スペクトル小集団（Ｄ）とスペクトル小集団（Ｂ）との差分スペクトル（Ｈ）をとる。この差分スペクトル（Ｈ）は、リファレンスデータを参照すると、ＰＥの蛍光波長分布パターンに一致する（図５参照）。従って、ステップＳ８００で、差分スペクトル（Ｈ）をＰＥの蛍光スペクトルとして確定、保持する。ステップＳ９００で、ＰＥ−ＴＲとＰＥ−Ｃｙ５の差分スペクトルが確定していないため、ステップＳ１０００に進む。さらに、ステップＳ１０００で、スペクトル小集団（Ｆ），（Ｇ）が処理されていないため、ステップＳ６００に戻る。
【００６０】
ステップＳ６００で、スペクトル小集団（Ｆ）と、ＦＩＴＣの蛍光スペクトルとして特定されたスペクトル小集団（Ｂ）及び／又はＰＥの蛍光スペクトルとして特定された差分スペクトル（Ｈ）との差分スペクトルを算出する。スペクトル小集団（Ｆ）からスペクトル小集団（Ｂ）を引いた差分スペクトル（Ｉ）は、リファレンスデータを参照すると、ＰＥ−ＴＲの蛍光波長分布パターンに一致する（図６参照）。従って、ステップＳ８００で、差分スペクトル（Ｉ）をＰＥ−ＴＲの蛍光スペクトルとして確定、保持する。ステップＳ９００で、ＰＥ−Ｃｙ５の差分スペクトルが確定していないため、ステップＳ１０００に進む。さらに、ステップＳ１０００で、スペクトル小集団（Ｇ）が処理されていないため、ステップＳ６００に戻る。
【００６１】
ステップＳ６００で、スペクトル小集団（Ｇ）から、ＦＩＴＣの蛍光スペクトルとして特定されたスペクトル小集団（Ｂ）とＰＥの蛍光スペクトルとして特定された差分スペクトル（Ｈ）とＰＥ−ＴＲの蛍光スペクトルとして確定された差分スペクトル（Ｉ）とから選択される１又は２以上を引いて差分スペクトルを算出する。スペクトル小集団（Ｇ）からスペクトル小集団（Ｂ）を引いた差分スペクトル（Ｊ）は、リファレンスデータを参照すると、ＰＥ−Ｃｙ５の蛍光波長分布パターンに一致する（図７参照）。従って、ステップＳ８００で、差分スペクトル（Ｊ）をＰＥ−Ｃｙ５の蛍光スペクトルとして確定、保持する。ステップＳ９００で、全ての蛍光色素の差分スペクトルが確定したので、ステップＳ６０を終了し、ステップＳ７０へ進む。
【００６２】
上記の処理によって、ＦＩＴＣの蛍光スペクトルとしてスペクトル小集団（Ｂ）が、ＰＥの蛍光スペクトルとして差分スペクトル（Ｈ）が、ＰＥ−ＴＲの蛍光スペクトルとして差分スペクトル（Ｉ）が、ＰＥ−Ｃｙ５の蛍光スペクトルとして差分スペクトル（Ｊ）が特定された。
【００６３】
続く、蛍光補正演算（ステップＳ７０）では、ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＰＥ−ＴＲ，ＰＥ−Ｃｙ５の各蛍光色素について、それぞれスペクトル小集団（Ｂ）、差分スペクトル（Ｈ），（Ｉ），（Ｊ）の蛍光波長分布を用いて、蛍光強度を算出する。具体的には、ＦＩＴＣ，ＰＥ，ＰＥ−ＴＲ，ＰＥ−Ｃｙ５の各蛍光色素について、それぞれスペクトル小集団（Ｂ）、差分スペクトル（Ｈ），（Ｉ），（Ｊ）の蛍光波長分布を列ベクトルとして配列した漏れ込み行列の逆行列を用いて、各蛍光検出器からの検出値を補正する。
【００６４】
３．蛍光強度算出装置・蛍光強度算出プログラム
本発明に係る蛍光強度算出装置と蛍光強度算出プログラムは、上述の蛍光強度補正方法の各手順を実行するための手段を備え、各手順を実行するステップを備える。図８に、本発明に係る蛍光強度算出装置１の機能的構成をブロック図により示す。蛍光強度算出装置１は、フローサイトメータ１０とＣＰＵ２０、メモリ３０、ハードディスク４０、ユーザインタフェースを有する。
【００６５】
ユーザインタフェースには、ユーザによる蛍光色素情報の入力（ステップＳ１０参照）を受け付けるマウス５１やキーボード５２等の入力手段が含まれる。記憶手段であるハードディスク４０には、蛍光強度算出プログラムと、各蛍光色素のリファレンスデータ４２が格納、保持されている。
【００６６】
フローサイトメータ１０は、蛍光色素を標識した微小粒子（サンプル）の測定を行う（ステップＳ３０参照）。フローサイトメータ１０は、複数の蛍光色素により多重標識された微小粒子に対して光を照射することによって、励起された蛍光色素から発生する蛍光を受光波長帯域の異なる複数の光検出器で受光する。そして、各光検出器から検出値を収集して、各蛍光色素の蛍光スペクトルを一つのスペクトル集団として取得する。また、フローサイトメータ７０は、微小粒子から発生する散乱光も検出する。
【００６７】
取得されたスペクトル集団に関する情報は、オペレーティングシステム（ＯＳ）４３の制御の下でユーザーインタフェース（ディスプレイ６１）に表示される。ディスプレイ６１に表示されたスペクトル集団のスペクトログラムは、ユーザがマウス５１やキーボード５２を用いてスペクトル集団の成分集団を指定するために利用され得る（ステップＳ５０参照）。また、ディスプレイ４１には、微小粒子の散乱光情報を含む二次元相関図も表示され、ユーザが解析を行う微小粒子集団を指定するために利用される（ステップＳ４０参照）。
【００６８】
さらに、スペクトル集団に関する情報は、オペレーティングシステム（ＯＳ）４１の制御の下で起動される蛍光強度算出プログラムによって処理され、上記のステップＳ５０以降の各手順に対応するステップが実行される。
【００６９】
蛍光強度算出プログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されたものとできる。記録媒体としては、コンピュータ読み取り可能な記録媒体であれば特に制限はないが、具体的には、例えば、フレキシブルディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の円盤形記録媒体が用いられる。また、磁気テープ等のテープ型記録媒体を用いてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明に係る蛍光強度補正方法等によれば、複数の蛍光色素により標識された微小粒子を複数の光検出器によってマルチカラー測定する場合に、サンプル解析の都度に単標識した微小粒子を解析することなく、各蛍光色素の蛍光波長分布を利用した蛍光補正を行うことができ、各蛍光色素からの蛍光強度を簡便かつ正確に算出できる。従って、本発明に係る蛍光強度補正方法等は、細胞等の微小粒子の特性をより詳細に解析するため寄与し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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