(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｓ）、及び
（ｂ）ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたパントテネートキナーゼをコードするパントテネートキナーゼ遺伝子（ｃｏａＡ）が過発現された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)菌株であって、
前記ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたパントテネートキナーゼが、野生型パントテネートキナーゼの１０６番目のアミノ酸であるアルギニンの代わりにアラニンで置換されたことを特徴とする、エシェリキア属菌株。
【請求項２】
前記遺伝子の過発現はプロモーターの置換、または遺伝子コピー数の増加によることを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属菌株。
【請求項３】
前記プロモーターの置換はｐＴｒｃ、ｐＰｒｏ、ｐＲおよびｐＬプロモーターよりなる群から選ばれたプロモーターの置換によることを特徴とする、請求項２に記載のエシェリキア属菌株。
【請求項４】
前記プロモーターは配列番号９のｐＰｒｏプロモーター全体を含むように置換されたことを特徴とする、請求項３に記載のエシェリキア属菌株。
【請求項５】
前記アミノ酸配列は配列番号８であることを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属菌株。
【請求項６】
前記菌株はリシン、トレオニン、イソロイシンまたはメチオニンを生産することが可能な菌株に由来することを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属菌株。
【請求項７】
前記菌株は、（ａ）ホモセリンアセチルトランスフェラーゼ、（ｂ）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ、または（ｃ）前記（ａ）および（ｂ）の両方ともが過発現された菌株に由来することを特徴とする、請求項６に記載のエシェリキア属菌株。
【請求項８】
前記菌株は寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐの菌株に由来することを特徴とする、請求項７に記載のエシェリキア属菌株。
【請求項９】
前記菌株は大腸菌ＣＡ０５−０５６６（寄託番号ＫＣＣＭ１１０２４Ｐ）であることを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属菌株。
【請求項１０】
前記菌株は大腸菌(Escherichia coli.)であることを特徴とする、請求項１に記載のエシェリキア属菌株。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−アセチル−ホモセリンを高収率で生産することが可能な菌株に関する。また、本発明は、前記菌株を用いてＯ−アセチル−ホモセリンを高収率で生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メチオニン(methionine)は、動物飼料、食品および医薬品に適用するために、化学的または生物学的に合成できる。
化学合成において、メチオニンは、主に、５−（β−メチルメルカプトエチル）ヒダントインを加水分解させる反応によって生産される。ところが、このような化学合成によって生産されたメチオニンは、Ｌ型とＤ型の混合形態で生産され、それぞれを分離する難しい追加的工程があるという欠点がある。そこで、本発明者は、かかる問題点を解決するために、生物学的方法を用いてＬ−メチオニンを選択的に生産することが可能な技術を開発して特許を出願したことがある（国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号）。この方法は、簡便に「２段階工法」と命名し、発酵によるＬ−メチオニン前駆体生産工程、および酵素による前記Ｌ−メチオニン前駆体のＬ−メチオニンへの転換工程を含む。前記Ｌ−メチオニン前駆体は、好ましくはＯ−アセチルホモセリン(O-acetylhomoserine)およびＯ−スクシニルホモセリン(O-succinylhomoserine)を含む。このような２段階工法を開発することにより、既存の問題となった、硫化物特有の基質毒性問題、メチオニンとＳＡＭｅによるメチオニン合成におけるフィードバック調節問題、およびシスタチオニンガンマシンターゼ(cystathionine gamma synthase)、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)およびＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)特有の中間産物分解活性問題を全て解決することができた。また、Ｌ−メチオニンのみを選択的に生産することができるため、ＤＬ−メチオニンを同時に生産する既存の化学合成工程に比べて優れた工程であり、さらに同一の反応によって副産物として有機酸、例えば、コハク酸および酢酸を同時に生産することが可能な非常に優れた工程である。
【０００３】
Ｏ−アセチルホモセリンは、メチオニン生産の前駆体として使用される物質であって、メチオニン生合成経路上にある中間体である（国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号）。Ｏ−アセチルホモセリンは、下記反応式のようにホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ(O-acetyl transferase)によってＬ−ホモセリンおよびアセチル−ＣｏＡを基質として合成される。
Ｌ−ホモセリン＋アセチル−ＣｏＡ → Ｏ−アセチル−ホモセリン
本発明者の米国公開特許第２００９−２５３１８６号では、ｔｈｒＡの強化によってＬ−ホモセリンの生合成を増加させ、ｍｅｔＸの強化によってＯ−アセチル−ホモセリンの生合成を増加させる菌株、および前記菌株を用いて高収率でＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を開示した。これに関連し、本発明者は、Ｏ−アセチルホモセリンの生合成に用いられる二つの基質の一つであるアセチル−ＣｏＡを増加させることにより、よりさらに高い収率でＯ−アセチルホモセリンを生産することができることを確認した。
【０００４】
一般に、大腸菌において、アセチル−ＣｏＡはピルビン酸塩から生合成される。しかし、過度な糖が存在する場合、アセチル−ＣｏＡは培地中に蓄積された酢酸によって生成できる。酢酸からアセチル−ＣｏＡが合成される場合、２つの互いに異なる生合成経路によって合成できる。酢酸からアセチル−ＣｏＡを生合成する一つの経路は、アセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）によってアセチルアデニレート（acetyladenylate、ＡｃＡＭＰ）を中間体としてアセチル−ＣｏＡを生合成する経路であり、もう一つの経路は、アセテートキナーゼ（acetate kinase、ＡＣＫ）およびホスホトランスアセチラーゼ（phosphotransacetylase、ＰＴＡ）によってアセチルホスフェート(acetylphosphate)を介してアセチル−ＣｏＡを生合成する経路である(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, May 1995, p. 2878-2886)。特に、アセチル−ＣｏＡシンターゼによる生合成経路の場合、アセチル−ＣｏＡシンターゼ酵素自体がアセテートに対する高い親和度を持っているため、細胞内または外部に存在する低濃度の酢酸をアセチル−ＣｏＡに生合成する特徴を持つ。これに対し、ＡＣＫ−ＰＴＡ経路によるアセチル−ＣｏＡ生合成の場合、酵素のアセテートに対する低い親和度を有する特性上、混合酸発酵(mixed acid fermentation)によって生成された高濃度のアセテートによってのみその活性を持つ特徴を示す(J. Gen. Microbiol. 102:327-336.)。
【０００５】
前記アセチル−ＣｏＡを生合成する２つの経路のうち、前記アセチル−ＣｏＡシンターゼの場合、プロモーターのアップストリームに位置したＣＲＰ−結合部位が存在し、このような理由により、転写段階で分解代謝物阻害(Catabolite repression)によって指数的成長期まで発現が阻害され、以後、静止期では発現が増加する様相を示す(Mol Microbiol. 2004 Jan;51(1):241-54.)。
したがって、発酵中盤に培地中に蓄積されるアセテートは、ＡＣＫ−ＰＴＡ経路を用いてアセチル−ＣｏＡを合成することができる。しかし、ＡＣＫ−ＰＴＡ経路の場合、両方向性を有するため、アセテートの濃度が低くないときにアセチル−ＣｏＡがアセテートに転換できる。すなわち、ＡＣＫ−ＴＰＡ経路の間にアセチル−ＣｏＡが消耗され、Ｏ−アセチルホモセリンの合成に否定的影響を与える。
【０００６】
アセチル−ＣｏＡの生合成において、アセテート以外に別の基質として使用されるＣｏＡ(Coenzyme A)は、代表的な細胞内のアシル基伝達体である。ＣｏＡは、ビタミンパントテネートから一連の生合成過程によって生合成される。パントテネートからＣｏＡを生合成する酵素は次のとおりである。その第１段階として、パントテネートキナーゼ（Pantothenate Kinase、ｃｏａＡ）によってパントテネート（ビタミンＢ５）を４’−ホスホパントテネート(4’-phosphopantothenate)に合成し、第２段階として、Ｐ−ＰａｎＣｙｓシンターゼ／Ｐ−ＰａｎＣｙｓデカルボキシラーゼ（P-PanCys synthase/P-PanCys decarboxylase、ｃｏａＢＣ）によって４’−ホスホパントテネートにシステインを結合して４’−ホスホパントデノイル−Ｌ−システイン(4’-phosphopantothenoyl-L-cysteine)を合成し、これを脱炭酸化して４’−ホスホパンテテイン(4’-phosphopantetheine)を合成し、第３段階として、Ｐ−ＰａｎＳＨアデニリルトランスフェラーゼ（P-PanSH adenylyltransferase、ｃｏａＤ）によって３−デホスホ−ＣｏＡを合成し、最後の段階として、デホスホ−ＣｏＡキナーゼ（dephospho-CoA(deP-CoA) kinase、ｃｏａＥ）によってＡＴＰを用いてリン酸化することにより、ＣｏＡを生合成する。
【０００７】
一般に、ＣｏＡは、細胞内で多様な代謝反応はもちろん、多くの合成反応の基質として使用される。このような理由により、細胞内のＣｏＡ濃度は一定量以上存在しないように調節される。ＣｏＡ ｐｏｏｌの濃度を調節する段階は、ＣｏＡ生合成経路上で第１の生合成段階である、パントテネートから４’−ホスホパントテネートを合成する段階に関与し、速度調節酵素としてのパントテネートキナーゼがＣｏＡ濃度によるフィードバック阻害(feedback inhibition)を受け、その活性阻害を受けて細胞内のＣｏＡ濃度を調節する(J Biol Chem. 1994 Oct 28; 269(43):27051-8)。ところが、常に細胞内で一定の水準に維持されるＣｏＡの濃度はアセチル−ＣｏＡによるＯ−アセチルホモセリンを高収率で生産するのに問題として作用することができる。文献によれば、細胞内に存在するＣｏＡ ｐｏｏｌの濃度によってフィードバック阻害を受けるパントテネートキナーゼの１０６番目のアミノ酸をＲ(arginine)からＡ(alanine)へ置換する場合(JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 185, June 2003, p. 3410-3415)、ＣｏＡによるフィードバック阻害が解除できるものと確認されたことがある。野生型タンパク質の場合、４０ｍＭのＣｏＡ存在の際に残存活性が約２０％である。これに対し、Ｒ１０６Ａ変異タンパク質の場合、同一濃度のＣｏＡ存在の際にも全く活性の阻害が起こらなかった。また、変異タンパク質を発現した菌株において、ＣｏＡの細胞内濃度が野生型に比べて増加する現象を示すことを確認した。
【０００８】
本発明者は、Ｏ−アセチルホモセリンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、図１に示すように、（ａ）ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたパントテネートキナーゼ遺伝子を導入および増進させる場合、および（ｂ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子を導入および増進させる場合、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能力が向上することを見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号
【特許文献２】国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号
【特許文献３】米国公開特許第２００９−２５３１８６号
【非特許文献１】JOURNAL OF BACTERIOLOGY, May 1995, p. 2878-2886
【非特許文献２】J. Gen. Microbiol. 102:327-336.
【非特許文献３】Mol Microbiol. 2004 Jan;51(1):241-54.
【非特許文献４】J Biol Chem. 1994 Oct 28; 269(43):27051-8
【非特許文献５】JOURNAL OF BACTERIOLOGY, 185, June 2003, p. 3410-3415
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、より高い収率でＯ−アセチルホモセリンを生産するために、Ｏ−アセチルホモセリンの生産を増加させることが可能なａｃｓ遺伝子の過発現およびＣｏＡによってフィードバック阻害を受けるｃｏａＡ遺伝子のフィードバック阻害解除によってアセチル−ＣｏＡの生合成経路を強化し、これにより高収率のＯ−アセチルホモセリンを生産する微生物菌株を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、 前記菌株を用いてＯ−アセチルホモセリンを高収率で生産する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のある観点によれば、（ａ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（Acetyl-CoA synthase、ａｃｓ）、（ｂ）ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたパントテネートキナーゼをコードするパントテネートキナーゼ遺伝子（Panthothenate kinase、ｃｏａＡ）、または（ｃ）前記（ａ）のアセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｓ）および前記（ｂ）のパントテネートキナーゼ遺伝子（ｃｏａＡ）の両方ともが導入および増進された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)菌株を提供する。
本発明の他の観点によれば、前記菌株を培養培地で発酵する段階を含む、当該培地内でＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を提供する。
本発明の別の観点によれば、（ａ）前記Ｏ−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属菌株を培養して発酵によってＯ−アセチルホモセリンを生産する段階と、（ｂ）生産されたＯ−アセチルホモセリンを分離する段階と、（ｃ）前記分離されたＯ−アセチルホモセリンをメチルメルカプタンと共に、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、およびＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼよりなる群から選ばれた酵素を用いて酵素反応を起し、Ｌ−メチオニンおよびアセテートを生産する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
したがって、本発明によれば、Ｏ−アセチルホモセリンを高収率で生産することが可能な菌株を使用する場合、高収率でメチオニンを化学的合成方法より環境親和的に生産することができる。また、生産されたＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリンは、Ｏ−アセチル−ホモセリンスルフヒドリラーゼによってメチオニンと酢酸との合成の前駆体として用いて高収率でＬ−メチオニンを生物転換することができる。転換された前記Ｌ−メチオニンは動物飼料または動物飼料添加剤だけでなく、ヒトの食品または食品添加剤の生産に有用である。
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、添付図面を参照する次の説明からさらに明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はＯ−アセチル−ホモセリンを高収率で生産することが可能なＯ−アセチル−ホモセリン生合成経路を示す図である。
【図２】図２はアセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｓ）発現用ベクターｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓの遺伝子の地図及び構成を示す図である。
【図３】図３はフィードバック阻害が解除されたパントテネートキナーゼをコードするｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）遺伝子発現用ベクターｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）とｐＡＣＹＣ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）の遺伝子の地図及び構成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
一つの様態として、本発明は、（ａ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｓ）、（ｂ）ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたパントテネートキナーゼをコードするパントテネートキナーゼ遺伝子（ｃｏａＡ）、または（ｃ）前記（ａ）のアセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（ａｃｓ）および前記（ｂ）のパントテネートキナーゼ遺伝子（ｃｏａＡ）の両方ともが導入および増進された、Ｏ−アセチルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)菌株を提供する。
本発明で使用される用語「Ｌ−メチオニン前駆体」とは、メチオニン生合成経路の一部分である代謝物質、またはこの代謝物質から派生した物質をいう。具体的に、本発明におけるＬ−メチオニン前駆体とはＯ−アセチルホモセリンを意味する。
【００１５】
本発明で使用される用語「Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株」とは、Ｏ−アセチルホモセリンを生物体内で生産することが可能な原核または真核微生物菌株であって、本発明に係る操作によってＯ−アセチルホモセリンを菌株内に蓄積することが可能な菌株をいう。例えば、本発明で有用な前記菌株は、エシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、サルモネラ属(Salmonellar sp.)、ブレビバクテリア属(Brevibacteria sp.)、ヒポモナス属(Hypomononas sp.)、クロモバクテリウム属(Chromobacterium sp.)、ノカルジア属(Norcardia sp.)、カビ類(fungi)または酵母類(yeast)に属する微生物菌株が含まれ得る。好ましくはエシェリキア属、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属の微生物菌株と酵母である。さらに好ましくはエシェリキア属の微生物菌株であり、さらに好ましくはリシン、トレオニン、イソロイシンまたはメチオニンを生産する菌株由来であり、最も好ましくは本発明によって提供された米国特許第１２/０６２８３５号（米国公開特許第２００９−２５３１８６号）に記載されているｔｈｒＡおよびｍｅｔＸ遺伝子を導入したトレオニン生産菌株由来のＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリン生合成経路が強化された大腸菌菌株（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）である。
好適な一実施態様として、本発明は、アセチル−ＣｏＡ生合成経路を強化してＯ−アセチルホモセリン生産能が向上するように、アセチル−ＣｏＡの生合成に関与するアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を前記菌株に導入及び増進させた菌株をＯ−アセチルホモセリン生産菌株として提供する。
【００１６】
好適な一実施態様として、本発明は、アセチル−ＣｏＡ生合成経路を強化してＯ−アセチルホモセリン生産能が向上するように、ＣｏＡ生合成経路上のＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害を解除したパントテネートキナーゼ遺伝子を前記菌株に導入および増進させた菌株をＯ−アセチルホモセリン生産菌株として提供する。
好適な一実施態様として、本発明は、アセチル−ＣｏＡ生合成経路を強化してＯ−アセチルホモセリン生産能が向上するように、アセチル−ＣｏＡの生合成に関与するアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を前記菌株に導入および増進させ、同時にＣｏＡ生合成経路上のＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害を解除したパントテネートキナーゼ遺伝子を導入および増進させた菌株をＯ−アセチルホモセリン生産菌株として提供する。
本発明で使用される用語「導入および増進」は相応する遺伝子によってコードされる酵素の細胞内活性の増加を意味し、これは一般的に遺伝子の過発現によって行われ得る。目的遺伝子の過発現は、前記遺伝子のプロモーター部位および/または５’−ＵＴＲ地域の塩基配列を変形させることにより、タンパク質発現を増進させることができ、目的遺伝子を染色体上に追加導入することにより、発現を強化させることができ、目的遺伝子をベクター上に自己プロモーターまたは強化された別個のプロモーターと共に導入して菌株に形質転換させることにより、タンパク質の発現量を強化させることができる。また、目的遺伝子のＯＲＦ(open reading frame)地域に突然変異を導入することにより、目的遺伝子を過発現させることができる。過発現の測定によれば、相応するタンパク質の活性または濃度が、野生型タンパク質または初期の微生物菌株における活性または濃度を基準として、一般に最小１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％または５００％、最大１０００％または２０００％まで増加する。
【００１７】
好ましくは、前記遺伝子を導入および増進させるためには強力なプロモーターへの置換、プロモーターの変異誘発、または遺伝子コピー数の増加による方法を使用することができ、さらに好ましくは、強力なプロモーターへの置換によって前記遺伝子を導入および増進させることができる。前記強力なプロモーターは、当業界において発現を常に増加させることができると知られているプロモーターであればその制限はないが、ｐＴａｃ、ｐＴｒｃ、ｐＰｒｏ、ｐＲ、ｐＬなどのプロモーターが使用でき、最も好ましくは配列番号９のｐＰｒｏプロモーターであり、前記遺伝子は配列番号９のｐＰｒｏプロモーターを全体または一部含むことができる。
酵素のアセチル−ＣｏＡシンターゼおよびパントテネートキナーゼは多様な微生物種に由来できる。このような活性を持つタンパク質をコードする遺伝子は、本発明においてそれぞれａｃｓおよびｃｏａＡと通称できる。
より具体的に、本発明では、アセチル−ＣｏＡシンターゼ活性が強化されるように変形してＯ−アセチル−ホモセリン生産能が向上した菌株、および前記菌株を用いてＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を提供する。
本発明の具体的な実施態様として、Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株を製造する方法は次のとおりである。
Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンの生産を増加させることを可能とするために、菌株をアセチル−ＣｏＡシンターゼタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター部分を、配列番号９の構成的プロモーターＰ（ｐｒｏ）で置換して代謝物質阻害のない常時発現形態のプラスミド形態に製作して目的遺伝子の過発現を誘導した。前記アセチル−ＣｏＡシンターゼをコードする遺伝子を通称「ａｃｓ」と表記する。これは文献(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)によって公開された大腸菌のゲノム配列から得ることができる（ｇｉ：８９１１０７９０）。また、前記遺伝子配列は、米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースからも得ることができる。
前記アセチル−ＣｏＡシンターゼは、下記反応を触媒する活性を持っている。よって、このような活性を有する遺伝子の発現を強化する場合、細胞内へのアセチル−ＣｏＡの蓄積を誘導することができる。
アセテート＋ＣｏＡ  ⇔ アセチル−ＣｏＡ
【００１８】
次に、構成的発現プラスミドを含む菌株においてアセチル−ＣｏＡの合成をさらに増加させるための操作を行うことができる。ＣｏＡ生合成経路の第１の段階であり且つ速度調節酵素であるパントテネートキナーゼを、ＣｏＡによるフィードバック阻害を解除するために突然変異させる。このために、パントテネートキナーゼの遺伝子配列上に突然変異を導入する。フィードバック阻害の解除されたパントテネートキナーゼをコードする遺伝子ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）の発現を強化させる。この遺伝子は文献(Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 2006 Feb 21.)によって公開された大腸菌のゲノム配列から得ることができる（ｇｉ：８９１１００６０）。また、前記遺伝子配列は米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）および日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）などのデータベースからも得ることができる。
前記フィードバック阻害の解除されたパントテネートキナーゼは、下記反応式に示すように、パントテネートを４’−ホスホパントテネートに合成する活性を持っており、細胞内に蓄積されたＣｏＡの濃度による活性阻害を受けない特性を持っている。よって、このようなフィードバック阻害を受けない活性を持つ遺伝子の発現を強化する場合、細胞内にＣｏＡ ｐｏｏｌの増加を誘導することができる。
パントテネート＋ＡＴＰ ⇔ ４’−ホスホパントネート＋ＡＤＰ
前記方法によって製作されたＯ−アセチルホモセリン生産菌株は、細胞内に多量のＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを蓄積し、ｍｅｔＸによりコードされる酵素によってホモセリンとアセチル−ＣｏＡを基質としてＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリンを高収率で生産することが可能な菌株を製作することができる。
前述した方法によって製作したＯ−アセチルホモセリン生産菌株ＣＪＭ−ＸにｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−Ａｃｓ、ｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）、およびｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓとｐＡＣＹＣ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）を形質転換した菌株をそれぞれ「大腸菌ＣＡ０５−０５６５」、「大腸菌ＣＡ０５−０５６４」および「大腸菌ＣＡ０５−０５６６」と命名し、ＫＣＣＭ（Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済１洞ユリムビル３６１−２２１）に２００９年８月１１日付でそれぞれ寄託番号ＫＣＣＭ１１０２３Ｐ、ＫＣＣＭ１１０２２ＰおよびＫＣＣＭ１１０２４Ｐで寄託した。
【００１９】
好適な一実施態様として、本発明は、アセチル−ＣｏＡの生合成に関与する遺伝子ａｃｓのプロモーターを構成的プロモーターＰｒｏに置換して過発現させたＯ−アセチルホモセリン生産菌株を提供する。より具体的に、ｐＰｒｏプロモーターは配列番号９の全体または一部が使用できる。
好適な一実施態様として、本発明は、ＣｏＡ生合成経路上の主要段階を担当するパントテネートキナーゼのＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたＯ−アセチルホモセリン生産能が向上した菌株を提供する。また、高収率でＯ−アセチルホモセリンを生産する方法を提供する。好ましくは、前記パントテネートキナーゼのアミノ酸配列において１０６番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されることにより、ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除され、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を向上させることができる。さらに好ましくは、前記パントテネートキナーゼのアミノ酸配列において１０６番目のアルギニンがアラニンに置換されることにより、ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除され、Ｏ−アセチルホモセリン生産能を向上させることができる。最も好ましくは、前記ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害の解除されたパントテネートキナーゼのアミノ酸配列が配列番号８のパントテネートキナーゼを用いることにより、Ｏ−アセチルホモセリンの生産能を向上させることができる。
【００２０】
また、好適な一実施態様として、前記２つの方法を併行して使用し、アセチル−ＣｏＡシンターゼ活性及びパントテネートキナーゼ活性を強化してＯ−アセチルホモセリン生産能を向上させる方法を用いて製作されたＯ−アセチルホモセリン生産大腸菌を提供する。
好ましくは、Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株の製造に有用な前記大腸菌はリシン、トレオニン、イソロイシンまたはメチオニン生産菌株のいずれか一つを用いることができる。さらに好ましくは、前記大腸菌は（ａ）ホモセリンアセチルトランスフェラーゼの活性、（ｂ）アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼの活性、または（ｃ）前記（ａ）および（ｂ）の両方ともが導入された菌株を用いて製造することができる。最も好ましくは大腸菌ＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）由来の菌株を用いて製造することができる。
本発明の具体的な実施例では、ａｃｓ遺伝子をクローニングして、配列番号９の構成的プロモーターｐＰｒｏの発現調節を受けるａｃｓ発現用ベクターｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓを製作し（図２）、ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されるようにアミノ酸配列の１０６番目のアルギニンがアラニンに置換された配列番号８の変異ｃｏａＡ遺伝子（Ｒ１０６Ａ）をクローニングして、 配列番号９の構成的プロモーターｐＰｒｏの発現調節を受ける変異ｃｏａＡ遺伝子発現用ベクターｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）およびｐＡＣＹＣ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）を製作した（図３）。本発明者の米国特許第１２/０６２８３５号（即ち、米国公開特許第２００９−２５３１８６号）に開示されたｔｈｒＡおよびｍｅｔＸの強化菌株ＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）からｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬプラスミドを除去して製作されたＣＪＭ−Ｘ菌株に、ｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓ、ｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）、並びにｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓおよびｐＡＣＹＣ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）を形質転換することにより、それぞれ（ａ）アセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（Acetyl-CoA synthase、ａｃｓ）、（ｂ）ＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたパントテネートキナーゼ遺伝子（Panthothenate kinase、ｃｏａＡ）、および（ｃ）前記（ａ）および（ｂ）の両方ともが導入および増進される特徴を有する、Ｏ−アセチルホモセリン生産能が向上した菌株を製造した（実施例１〜３）。これら菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能をフラスコ培養によって比較した結果、対照群であるＣＪＭ−Ｘに比べて、前記（ａ）のアセチル−ＣｏＡシンターゼ遺伝子（Acetyl-CoA synthase、ａｃｓ）を有するｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓが形質転換された菌株はＯ−アセチルホモセリン生産量が２．８ｇ／Ｌ、収率が４．７％向上したことを確認した。また、前記（ｂ）のＣｏＡ蓄積によるフィードバック阻害が解除されたパントテネートキナーゼ遺伝子（ｃｏａＡ）を有するｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）の形質転換された菌株は、対照群に比べてＯ−アセチルホモセリン生産量が２．１ｇ／Ｌ、収率が３．５％向上することを確認した。また、ｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓおよびｐＡＣＹＣ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）が形質転換された前記（ａ）および（ｂ）の両方ともが導入および増進される特徴を有する菌株は、対照群に比べて生産量が６．８ｇ／Ｌ、収率が１１．４％向上することを確認した（実施例２、表２）。また、本発明の方法で製造された菌株のＯ−アセチルホモセリン生産能が向上することを確認した。
【００２１】
別の様態として、本発明は、前記方法によって製造されたＯ−アセチル−ホモセリン生産能が向上した大腸菌を培養培地で発酵し、培地にＯ−アセチル−ホモセリンを蓄積させることにより、Ｏ−アセチル−ホモセリンを生産する方法に関する。
別の様態として、本発明は、（ａ）前記方法によって製造されたＯ−アセチルホモセリン生産能が向上したエシェリキア属由来の菌株を培養し、発酵によってＯ−アセチルホモセリンを生産する段階、（ｂ）生産されたＯ−アセチルホモセリンを分離する段階、および（ｃ）前記分離されたＯ−アセチルホモセリンおよびメチルメルカプタンを基質として、シスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼおよびＯ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼの活性を有する酵素よりなる群から選ばれた転換酵素を用いて酵素反応を起し、Ｌ−メチオニンおよびアセテートを生産する方法に関する。
前記方法は、本発明者が２００７年に出願した特許（国際特許公開公報第２００８／０１３４３２号に基づき、メチオニン転換酵素としてのシスタチオニンガンマシンターゼ、Ｏ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼの活性を用いてＬ−メチオニンを生産する方法であって、本発明で提供する菌株を用いる場合、さらに高い収率でＬ−メチオニンを生産することができる。
【００２２】
前記で製造されたＯ−アセチル−Ｌ−ホモセリン生産菌株の培養過程は、当業界に知られている適切な培地と培養条件に応じて行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例には回分式、連続式および流加式培養が含まれるが、これに限定されない。このような各種培養方法は、例えば文献『“Biochemical Engineering” by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176』に開示されている。
培養に使用される培地は、特定の菌株の要求条件を満足させなければならない。多様な微生物の培地は、例えば文献『“Manual of Methods for General Bacteriology” by the American Society for Bacteriology, Washington D. C., USA, 1981』に開示されている。一般的に前記培地は多様な炭素源、窒素源、および微量元素成分を含む。炭素源は、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、澱粉およびセルロースなどの炭水化物；大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ヤシ油などの脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸などの脂肪酸；グリセロールおよびエタノールなどのアルコールと酢酸などの有機酸を含む。これらの炭素源は単独でまたは組み合わせて使用できる。窒素源としては、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、コーンスティープリカー（(corn steep liquor)ＣＳＬ）およびベスン粉(bean flour)などの有機窒素源、および尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどの無機窒素源を含む。これらの窒素源は、単独で或いは組み合わせて使用できる。前記培地にはリン酸源としてさらにリン酸二水素カリウム(potassium dihydrogen phosphate)、リン酸水素カリウム(dipotassium hydrogen phosphate)および相応するナトリウム含有塩(sodium-containing salts)を含むことができる。また、培地は硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄などの金属を含むことができる。また、アミノ酸、ビタミン、および適した前駆体などが添加できる。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式で添加できる。
【００２３】
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を適切な方式で添加することにより、培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することにより、培養中の気泡生成を抑制することができる。また、培養液の好気性条件を保つために、培養液内に酸素または酸素含有ガス（例えば、空気）が注入できる。培養物の温度は一般に２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。培養はＬ−メチオニン前駆体の生産が所望の水準に到達するまで続けることが可能であり、好ましい培養時間は１０〜１６０時間である。
【００２４】
以下、実施例によって本発明をより詳しく説明する。ところが、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２５】
実施例１：Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株の製造
<１−１>ａｃｓ遺伝子のクローニング
ａｃｓ遺伝子のクローニングは、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ２７３２５）を鋳型としたＰＣＲによって、アセチル−ＣｏＡシンターゼであるａｃｓ遺伝子を確保した。米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に基づいてａｃｓ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ｇｉ：８９１１０７９０）を確保した。その配列は配列番号７に示した。前記配列に基づいてａｃｓ遺伝子のＡＴＧ部分とＴＡＡを含有するＯＲＦ部分を増幅し、制限酵素ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を含んでいるプライマー（配列番号１および２）を合成した。大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号１および２のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素はＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼを使用した。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５０℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を１サイクルとして３０サイクル繰返し行った。その結果、ａｓｃ遺伝子と制限酵素ＥｃｏＲＶとＨｉｎｄＩＩＩを含有した約２．０ｋｂの増幅された遺伝子を獲得した。
前記ＰＣＲによって獲得したａｃｓ遺伝子の末端に含まれた制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩを処理し、制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩが処理されたｐＰｒｏ−ＧＦＰベクターに接合によってクローニングし、最終的に構成的プロモーターＰｒｏによって発現調節されるａｃｓ遺伝子のクローニングされたｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓ組み換えベクターを製作した。図２はａｃｓ発現用ベクターｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓを示す図である。
【００２６】
<１−２>フィードバック抵抗性ｃｏａＡ遺伝子のクローニング
フィードバック阻害が解除されたｃｏａＡ遺伝子のクローニングは、大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ２７３２５）を鋳型としたＰＣＲによって、パントテネートキナーゼであるｃｏａＡ遺伝子を確保した。米国国立保健院の遺伝子銀行（ＮＩＨ ＧｅｎＢａｎｋ）に基づいてｃｏａＡ遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩ登録番号ｇｉ：８９１１００６０）を確保し、これに基づいてｃｏａＡ遺伝子のＡＴＧ部分からフィードバック阻害の解除が可能な３１６番目〜３１８番目の遺伝子配列をＣＧＴからＧＣＣに変更し、制限酵素ＥｃｏＲＶが含まれたプライマー（配列番号３および４）を合成した。また、フィードバック阻害の解除が可能な３１６番目〜３１８番目の遺伝子配列をＣＧＴからＧＣＣに変更し、ＴＡＡ部分までを含み、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを含むように増幅可能なプライマー（配列番号５および６）を合成した。
【００２７】
大腸菌Ｗ３１１０の染色体ＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号３および４と配列番号５および６のプライマーを用いてＰＣＲを行った。重合酵素は、ＰｆｕＵｌｔｒａＴＭ高信頼ＤＮＡポリメラーゼを使用した。ＰＣＲは、変性９６℃、３０秒；アニーリング５０℃、３０秒；および重合反応７２℃、２分を１サイクルとして３０サイクル繰返し行った。その結果、ｃｏａＡ遺伝子のＡＴＧ部分から３１６番目〜３１８番目の遺伝子配列がＣＧＴからＧＣＣに変更された部分を含むように突然変異を導入した約３４４ｂｐの増幅された遺伝子断片と、突然変異を導入して３１６番目〜３１８番目の遺伝子配列がＣＧＴからＧＣＣに変更された部分を含み、ＴＡＡ部分を含む約６４２ｂｐの増幅された遺伝子を獲得した。
前記で獲得した、増幅された２つの遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、変性９６℃、６０秒；アニーリング５０℃、６０秒；および重合反応７２℃、２分を１サイクルとして１０サイクル繰返し行った後、配列番号３および６のプライマーを添加し、しかる後に、２０サイクル繰返し行った。その結果、ｃｏａＡ遺伝子の３１６番目〜３１８番目の遺伝子配列がＣＧＴからＧＣＣに変更された９６３ｂｐの増幅されたｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）遺伝子を獲得した。
【００２８】
前記ＰＣＲによって獲得したｃｏａＡ遺伝子の末端に含まれた制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩを処理し、制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩが処理されたｐＰｒｏ−ＧＦＰベクターに接合によってクローニングし、最終的に構成的プロモーターＰｒｏ（配列番号９）によって発現調節を受け、１０６番目のアミノ酸のコドンがＣＧＴからＧＣＣに突然変異されたｃｏａＡ遺伝子がクローニングされたｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）組み換えベクターを製作した。前記変異ｃｏａＡのアミノ酸配列は配列番号８に示した。
前記で製作されたｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）組み換えベクターをｐＡＣＹＣ１７７ベクターにクローニングするために、ｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）組み換えベクターに制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを処理することにより、１．４５ｋｂのＰｒｏプロモーターを含むｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）切片を得た。こうして得られたＰｒｏプロモーターを含むｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）切片を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを処理したｐＡＣＹＣ１７７ベクターと接合することにより、ｐＡＣＹＣ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）ベクターを製作した。図３はｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）発現用ベクターｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）およびｐＡＣＹＣ−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）を示す図である。
【００２９】
<１−３>Ｏ−アセチルホモセリン生産菌株の製作
ＡｃｓとｃｏａＡの発現が強化されたＯ−アセチルホモセリン生産菌株の製作のために、米国公開特許第２００９−２５３１８６号に開示されたＣＪＭ−Ｘ／ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬ（寄託番号ＫＣＣＭ１０９２１Ｐ）菌株からｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬプラスミドを除去し、ｐｔｈｒＡ（Ｍ）−ＣＬの除去された菌株ＣＪＭ−Ｘを製作した。こうして製作されたＣＪＭ−Ｘ菌株に、実施例<１−１>および<１−２>で製造されたｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓおよびｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）プラスミドを取り込んでそれぞれ形質転換（ＫＣＣＭ１１０２３ＰおよびＫＣＣＭ１１０２２Ｐ）し、ＬＢ−Ｓｐ（酵母抽出１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２５μｇ／Ｌ）培地で培養した後、ストレプトマイシン耐性を有するコロニー１０株ずつを選抜した。さらに、前記で製作したｐＣＬ−Ｐ（ｐｒｏ）−ａｃｓを含むＣＪＭ−Ｘ菌株に、実施例<１−２>で製作したｐＡＣＹＣ−ＣｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）を取り込んで形質転換（ＫＣＣＭ１１０２４Ｐ）し、ＬＢ−Ｓｐ−Ａｐ（酵母抽出１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２５μｇ／Ｌ、アンピシリン５０μｇ／Ｌ）培地で培養した後、ストレプトマイシンとアンピシリンに対して耐性を示すコロニー１０株を選抜した。選抜されたコロニーのＯ−アセチルホモセリン生産性を互いに比較した。
【００３０】
実施例２：Ｏ−アセチルホモセリン生産のための発酵
実施例１で製作された菌株のメチオニン前駆体としてのＯ−アセチルホモセリンの生産能力を確保するために、三角フラスコ培養を行った。
表１に示したＯ−アセチル−ホモセリン力価培地を用いて三角フラスコでＯ−アセチルホモセリンの生産性を比較した。
【００３１】
【表１】
0005536496.tif 000002
【００３２】
３２℃の培養器でＬＢ固体培地内に一晩培養した単一コロニーを２５ｍＬのＯ−アセチルホモセリン力価培地に１白金耳ずつ接種して、２５０ｒｐｍで攪拌しながら３２℃で４２〜６４時間培養した。培養物からＯ−アセチルホモセリンをＨＰＬＣによって定量的に分析した。分析結果を表２に示した。
下記表２に示した結果のように、ａｃｓ遺伝子のプロモーターを構成的発現プロモーターＰ（ｐｒｏ）に置換したａｃｓ遺伝子を過発現する場合、対照群菌株としてのＣＪＭ−Ｘ菌株に比べてＯ−アセチルホモセリンの生産量が２．８ｇ／Ｌ、収率は４．７％向上することを確認することができた。また、フィードバック阻害の解除されたｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）遺伝子を過発現させる場合、対照群菌株であるＣＪＭ−Ｘ菌株に比べてＯ−アセチルホモセリンの生産量が２．１ｇ／Ｌ、収率は３．５％向上することを確認することができた。ａｃｓとｃｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）を同時に過発現した場合、対照群菌株としてのＣＪＭ−Ｘ菌株に比べてＯ−アセチルホモセリンの生産量が６．８ｇ／Ｌ、収率は１１．４％が向上することを確認した。
このようなフラスコ培養の結果からみて、ａｃｓ遺伝子の発現強化、フィードバック阻害の解除されたｃｏａＡ遺伝子の発現強化、またはａｃｓおよびフィードバック阻害の解除されたｃｏａＡ遺伝子の発現強化がＯ−アセチルホモセリンの生産性および収率の向上に効果的であることを確認することができた。
【００３３】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００３４】
上述したように、本発明は、培地内で発酵するときに培地で高収率でＯ−アセチルホモセリンを生産するエシェリキア属菌株を提供する。また、前記Ｏ−アセチルホモセリンとメチルカプタンを基質として用いて、メチオニン転換酵素の存在下に転換反応を行うことにより、高収率でＬ−メチオニンと酢酸を同時に生産することができる。
以上、本発明の好適な実施例について説明の目的で開示したが、当業者であれば、添付した請求の範囲に開示された本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変形、追加または置換を加え得ることを理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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