(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異タンパク質をコードする遺伝子、プロモーター、表面発現のためのポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子及び前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子と連結されるヒトパピローマウィルスの腫瘍誘発関連抗原タンパク質をコードする遺伝子を含有するＨＰＶワクチン製造用表面発現ベクター。
【請求項２】
前記ヒトパピローマウィルスの腫瘍誘発関連抗原タンパク質がＨＰＶのＥ７またはＥ７（Ｒｂ）である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記プロモーターが、乳酸菌由来のアルドラーゼプロモーターである、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子がｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡからなる群より選択される、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のベクターで形質転換された組換え微生物。
【請求項６】
前記微生物が、乳酸菌である、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
請求項５または請求項６に記載の形質転換された組換え微生物を有効成分として含有する子宮頸癌治療用ワクチン。
【請求項８】
請求項５に記載の組換え微生物を培養してＨＰＶ抗原を表面発現させる工程及び前記ＨＰＶ抗原が表面発現された組換え微生物を回収する工程を含むＨＰＶ抗原が表面発現された微生物の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法で製造されたＨＰＶ抗原が表面発現された微生物を有効性分として含有する子宮頸癌治療用ワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチンが、経口用である、請求項７または請求項９に記載の子宮頸癌治療用ワクチン。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異タンパク質をコードする遺伝子、乳酸菌由来アルドラーゼプロモーター、表面発現のためのポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡからなる群より選択されるポリガンマグルタミン酸遺伝子及び前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子と連結されるヒトパピローマウィルスの腫瘍誘発関連抗原タンパク質Ｅ７をコードする遺伝子を含有するＨＰＶワクチン製造用表面発現ベクター。
【請求項１２】
配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異タンパク質をコードする遺伝子、乳酸菌由来アルドラーゼプロモーター、表面発現のためのポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡからなる群より選択されるポリガンマグルタミン酸遺伝子及び前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子と連結されるヒトパピローマウィルスの腫瘍誘発関連抗原タンパク質Ｅ７（Ｒｂ）をコードする遺伝子を含有するＨＰＶワクチン製造用表面発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のベクターで形質転換された組換え乳酸菌。
【請求項１４】
請求項１２に記載のベクターで形質転換された組換え乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異遺伝子、プロモーター、ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子及び前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子と連結するヒトパピローマウィルス（human papilloma virus）の腫瘍誘発関連抗原タンパク質をコードする遺伝子を含有するＨＰＶ治療ワクチン製造用表面発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌から有用な外来タンパク質を多量発現させようとする試みにおいて外来タンパク質の生産量は、遺伝子複製数、即ち、プラスミド数と転写を調節するのに用いられているプロモーターの強さに依存することが知られている。通常多く用いられている高発現プロモーターの他に細菌個体当たりプラスミドベクターの数を変化させて、ターゲットタンパク質発現量を増加させられることが報告された（Tomio, M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 28:170, 1988）。また、ｍｉｎｉ−ＦプラスミドでＲｅｐＥの変異が細菌個体内でプラスミド数を変化させられることが報告された（Yasuo, K. et al., J. Biol. Chem., 267:11520, 1992）。
【０００３】
ヒトパピローマウィルス（Human papilloma virus，ＨＰＶ）は世界的に成人の５０％以上が感染していると推定され、パピローマウィルス中、特にＨＰＶ１６、１８、３１及び４５の四つのタイプは、８０％以上の子宮頸癌（cervical cancer）の原因として確認された（Lowy, D. R. et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 91:2436, 1994）。
【０００４】
世界的に子宮頸癌は、乳癌の次に女性に発生頻度が高い癌であって、世界保健機構によると、毎年世界で５０万人以上の子宮頸癌患者が発生しており、毎年３００，０００人以上が子宮頸癌によって死亡すると推定されている。特に、開発途上国及び低開発国では女性死亡の主原因になっている（Pisani, P. et al., Int. J. Cancer, 55:891, 1993）。ＩＡＲＣ統計によると、特に慢性感染者が先進国に比べて、極めて多い開発途上国のＨＰＶ感染を撲滅するため、長期的に最も効果的な方法はＨＰＶ予防ワクチンを投与すると報告された。
【０００５】
子宮頸癌に関わるワクチン開発の方法としては、大きく予防ワクチン（prophylactic）と治療ワクチン（therapeutic）の二つに焦点が絞られている。予防ワクチンは、ＨＰＶ  Ｌ１／Ｌ２抗原タンパク質によって、強い中和抗体（neutralizing antibody）が生成されるようにすることによって、宿主がＨＰＶに感染することを防ぎ、また既に感染したとしてもそれ以上疾病が進まないようにするのに目的がある。一方、治療ワクチンは、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７を対象にするが、特異的な細胞性免疫を誘導させて、既に形成された病斑や悪性腫瘍を退化させることを目的としている。
【０００６】
ＨＰＶのＥ６／Ｅ７タンパク質はＨＰＶに感染した細胞等の癌化に関わる癌特異抗原であるため、子宮頸癌の免疫治療のターゲットとしてＥ６／Ｅ７タンパク質を利用した治療ワクチン研究が続けられてきた。実際、微生物システムで合成されたＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７タンパク質を腫瘍細胞を注入したラットに投与した場合、腫瘍形成が阻害されたり遅延されるとの報告がある（Gao, L. et al., J. Gen. Viol., 75:157, 1994, Meneguzzi, G. et al., Virology, 81:62, 1991）。しかし、他の場合と同じように、生ウイルスワクチンを利用する場合、過度なウイルス複製による問題を誘発しうるため、実際には研究目的のみに使用され、商業化までには長時間及び相当な臨床実験が求められる短所がある。
【０００７】
一方、バクテリアベクターを利用したワクチン開発研究も盛んに行われていがる、弱毒化されたサルモネラ菌（attenuated Salmonella typhimurium）で合成されたＨＰＶ  １６  ＶＬＰが、マウスの粘膜や全身で抗原特異的な抗体の生成を誘導するとの報告もある（Denis, N. et al., Infection and immunity, 65:3328, 1997）。合成ペプチドを利用したワクチンは、免疫反応を誘導するのに必要なエピトープのみを合成して接種（vaccination）させるものであり、既にＨＰＶ  １６  Ｅ６／Ｅ７に対する細胞性免疫反応（Cytotoxic T Lymphocyte；ＣＴＬ）を起こすエピトープが分かるようになっている（Ressing, M. E. et al., J. Immunol., 154:5934, 1995）。
【０００８】
このような試み以外に、植物からウイルスの抗原を生産するため、トマト及びジャガイモ等の野菜類を利用して、その形質転換体野菜類自体を経口用ワクチン（oral vaccine）または食用ワクチン（edible vaccine）として使おうとする研究も進行している。代表的な例としては、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原粒子（Hepatitis B surface antigen particle）（Thavala, Y. F. and Artzen, C. J., Pro. Natl. Acad. Sci. USA., 92:3358, 1995）とパピローマウイルスのギャプシドＬ１とＬ２タンパク質（韓国特許登録第０３６６６０８号）が挙げられる。しかし、植物を利用したシステムの場合、発現するＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の量が少なく、精製の問題があって、前記同様商業的な制約が従う問題がある。
【０００９】
従って、ＨＰＶの感染者が主に低開発国に集中している点を勘案すると、パピローマウィルス由来の口腔または生殖器官の皮膚粘膜の腫瘍に対する予防と治療のため、より経済的かつ安定的にＨＰＶ抗原を製造する方法の開発が強く求められている。
【００１０】
本発明者等は、ＨＰＶ抗原タンパク質を形質転換された組換え微生物の表面に効果的に発現させるベクターと、微生物の表面にＨＰＶ抗原タンパク質を発現させる方法を開発した（韓国特許登録第０６０９８６６号）。
【００１１】
そこで、本発明者等は、ＨＰＶ抗原タンパク質が形質転換された組換え乳酸菌表面でより安定的かつ構成的に高発現されるベクターを開発しようと鋭意努力した結果、ｒｅｐＥ変異遺伝子を含有するベクターで形質転換された組換え微生物においてより安定的にターゲットタンパク質の発現が向上することを確認して、本発明の完成に至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の主な目的は、ｒｅｐＥ変異遺伝子を利用してＨＰＶ抗原タンパク質が形質転換された組換え乳酸菌の表面で安定的かつ構成的に高発現させられるベクターを提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記発現ベクターで形質転換された組換え乳酸菌及び前記乳酸菌を利用してＨＰＶ抗原タンパク質の製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、前記形質転換組換え乳酸菌を利用して、子宮頸癌治療用に形質転換された組換え乳酸菌ワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するため、本発明は配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異遺伝子、プロモーター、ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子及び前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子と連結するヒトパピローマウィルスの腫瘍誘発関連抗原タンパク質をコードする遺伝子を含有する表面発現ベクターを提供する。
【００１６】
本発明は、また前記ＨＰＶ抗原タンパク質を表面発現するベクターで形質転換された組換え微生物を提供する。
【００１７】
本発明は、またＨＰＶ抗原タンパク質が表面に発現した形質転換組換え微生物を有効性分とする子宮頸癌治療用ワクチンを提供する。
【００１８】
本発明は、また前記ベクターで形質転換された組換え微生物を培養してＨＰＶ抗原を表面発現させる工程及び前記ＨＰＶ抗原が表面発現された組換え微生物を回収する工程を含むＨＰＶ抗原が表面発現された微生物の製造方法を提供する。
【００１９】
本発明は、前記方法で製造された抗原が表面発現された微生物を有効性分として含有する子宮頸癌治療用ワクチンを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ｒｅｐＥ変異遺伝子が導入されたｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ａｍｙｌａｓｅベクターのマップを示す。
【図２】Ｅ７遺伝子を表面発現する２種の発現ベクターのマップを示す。
【図３】ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７で形質転換された組換え乳酸菌においてＥ７の表面発現をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す。
【図４】Ｅ７を表面発現する形質転換された組換え乳酸菌の免疫効能実験のため、マウスに形質転換された組換え乳酸菌を投与する日程を示す。
【図５】Ｅ７を表面発現する形質転換された組換え乳酸菌の経口投与時ＩｇＧとＩｇＡの変化を示す。
【図６】Ｅ７を表面発現する形質転換された組換え乳酸菌の経口投与時のＥ７特異的ＩＦＮ−ｇａｍｍａ分泌を確認した結果を示す。
【図７】Ｅ７を表面発現する形質転換された組換え乳酸菌の経口投与時腫瘍移植による腫瘍サイズの増加の有無を確認した経過を示す。
【図８】Ｅ７（Ｒｂ）遺伝子を表面発現する発現ベクターのマップを示す。
【図９】ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７（Ｒｂ）で形質転換された組換え乳酸菌においてＥ７（Ｒｂ）が表面発現されたことを確認した結果を示す。
【図１０】Ｅ７特異的ＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１１】Ｅ７（Ｒｂ）を表面発現する形質転換された組換え乳酸菌の経口投与時Ｅ７（Ｒｂ）特異的ＩＦＮ−ｇａｍｍａ分泌を確認した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は一つの観点において、配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異遺伝子、プロモーター、ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子及び前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子と連結するヒトパピローマウィルスの腫瘍誘発関連抗原タンパク質をコードする遺伝子を含有する表面発現ベクターに関する。
【００２２】
本発明では形質転換された微生物内でベクターが安定的に維持される配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異遺伝子、ラクトバチルスカゼイ（Lactobacillus casei）のアルドラーゼ（aldolase）遺伝子から由来したアルドラーゼプロモーター（Pald）を共に導入した結果としてターゲットタンパク質の発現が向上することを確認した。本発明のシャトルベクターが安定的に維持され、ターゲットタンパク質が発現することを確認するため、目的遺伝子としてアミラーゼ（amylase）遺伝子を挿入してアミラーゼの発現を確認した。
【００２３】
また、ターゲットタンパク質の表面発現のため、表面発現モチーフであるポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子をターゲットタンパク質と連結して発現するように位置させ、前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子は、ｐｇｓＢＣＡであることが望ましく、さらに望ましくはｐｇｓＡである（韓国登録特許第４６９８００号）。
【００２４】
本発明の一様態において、ＰｇｓＡのＣ末端にターゲットタンパク質であるＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質が融合するようｐｓｇＡとＨＰＶ１６  Ｅ７コードする遺伝子を融合させて、乳酸菌からＨＰＶ抗原タンパク質を構成的に表面発現できるベクターｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７を製造し、前記発現ベクターをラクトバチルスカゼイに挿入してＨＰＶ抗原タンパク質を発現する形質転換された組換え乳酸菌を製造した。
【００２５】
本発明において、前記「ターゲットタンパク質」または「外来タンパク質」とは、前記タンパク質を発現する形質転換された宿主細胞では正常には存在できないタンパク質を意味する。例えば、乳酸菌からウイルス由来または腫瘍由来タンパク質を人為的に発現するように操作した場合、前記タンパク質を外来タンパク質またはターゲットタンパク質という。
【００２６】
本発明はまた、他の観点において、前記ＨＰＶ抗原タンパク質を表面発現するベクターで形質転換された組換え微生物及び前記形質転換組換え微生物を有効性分とする子宮頸癌治療用ワクチンに関する。
【００２７】
本明細書において「宿主」、または「微生物」とは、プロバイオティクス（probiotics）のグラム陽性桿菌である乳酸菌に言及することができ、一般的なプロバイオティクス微生物の選別基準には（ｉ）ヒト由来の微生物であること;（ii）胆汁、酸、酵素及び酸素に安定的であること;（iii）腸内粘膜に付着する能力があること;（iv）消化器官内でコロニーを形成できる能力があること;（ｖ）抗バクテリア性物質を生産できること;及び（vi）効能や安全性が証明されること、等の条件が含まれている。前記条件を基に乳酸菌は人体内での生長が親和的、無害な菌であることは明らかである。従って、乳酸菌を宿主とする形質転換体を人体に適用させて、疾病の予防または治療のための遺伝子伝達またはタンパク質伝達等の用途に用いる場合、菌株を用いる通常のワクチン製造方法とは異なって菌株の無毒化の工程を要しない。
【００２８】
本発明において、前記乳酸菌はラクトバチルス属、ストレプトコッカス属及びビフィドバクテリウム属を含んでもよい。代表的にはラクトバチルス属はラクトバチルスアシドフィルス（L. acidophilus）、ラクトバチルスカゼイ（L. casei）、ラクトバチルスプランタラム（L. plantarum）、ラクトバチルスファーメンタム（L. ferementum）、ラクトバチルスデルブルッキー（L. delbrueckii）、ラクトバチルスジョンソニー（L. johnsonii LJI）、ラクトバチルスロイテリ（L. reuteri）及びラクトバチルスブルガリクス（L. bulgaricus）;ストレプトコッカス属は、ストレプトコッカスサーモフィルス（S. thermophilus）；ビフィドバクテリウム属は、ビフィドバクテリウムインファンティス（B. infantis）、ビフィドバクテリウムビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウムロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム シュードロンガム（B. psuedolongum）、ビフィドバクテリウムブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウムラクティスＢｂ−１２（B. lactis Bb-12）及びビフィドバクテリウムアドレスセンティス（B. adolescentis）等を宿主として用いられ、より望ましくはラクトバチルス属である。
【００２９】
本発明はまた、前記ベクターで形質転換された組換え微生物を培養してＨＰＶ抗原を表面発現させる工程及び前記ＨＰＶ抗原が表面発現された組換え微生物を回収する工程を含むＨＰＶ抗原が表面発現された微生物の製造方法に関する。
【００３０】
本発明に係る組換え微生物の培養は、広く公知の方法に従って行われ、培養温度及び時間、培地のｐＨ等の条件は、適宜調節される。前記培養物での組換え微生物菌体の回収は通常の分離技術、例えば、遠心分離、ろ過法等を用いてもよい。
【００３１】
本発明はまた、他の観点において、前記方法で製造された抗原が表面発現された微生物を有効性分として含有する子宮頸癌治療用ワクチンに関する。
【００３２】
また、本発明は、経口用である子宮頸癌治療用ワクチンに関する。
ワクチンは、疾病に対する予防目的として生きている生物を使って、免疫システムを刺激させるのに用いられる薬剤である。免疫活性化は、有機体内で抗体生成、Ｔ−リンパ球の刺激、または他の免疫細胞（例：大食細胞）を刺激して、抗原を効率的に除去するための過程を意味する。前記に関する詳しい免疫学の概観は当業界の通常の技術を有する者なら簡単に理解できる（Barrett, J.T., Textbook of Immunology, 1983）。抗原としてのターゲットタンパク質を発現する形質転換された微生物ワクチンの投与対象は、ほ乳動物であってもよく、より望ましくはヒトである。
【００３３】
前記ワクチン組成物の製法は標準的な技法を用いて実施でき、投与者に適する投与量は遺伝子生成物の抗原性によって異なり、存在するワクチンの典型的な免疫反応を誘導するのに十分な量であれば良く、通常実験過程を経て必要量を簡単に判断できる。典型的な初期のワクチン容量は、体重１ｋｇ当り抗原０.００１〜１ｍｇであり、望ましい水準の保護を提供するのに必要に応じて量を増加したり複数回投与（multiple dose）を用いる。前記量は当該技術分野に属する専門家によって決められ、製剤化方法、投与方式、投与者の年令、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によっても多様に処方される。
【００３４】
本発明のＨＰＶ抗原タンパク質Ｅ７をコードするＨＰＶワクチン製造用表面発現ベクターの最も望ましい様態は、配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異タンパク質をコードする遺伝子、乳酸菌由来アルドラーゼプロモーター、表面発現のためのポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡで構成された群から選択されるポリガンマグルタミン酸遺伝子及び前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子と連結するヒトパピローマウィルスの腫瘍誘発関連抗原タンパク質E７をコードする遺伝子を含有するＨＰＶワクチン製造用表面発現ベクターで、前記ベクターで形質転換された組換え乳酸菌を培養してＨＰＶ抗原タンパク質Ｅ７を表面発現させた後、ワクチンとしてそのまま使用可能である。
【００３５】
本発明のＨＰＶ抗原タンパク質Ｅ７（Ｒｂ）をコードするＨＰＶワクチン製造用表面発現ベクターの最も望ましい様態は、配列番号１のアミノ酸配列を持つｒｅｐＥ変異タンパク質をコードする遺伝子、乳酸菌由来アルドラーゼプロモーター、表面発現のためのポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子ｐｇｓＢ、ｐｇｓＣ及びｐｇｓＡで構成された群から選択されるポリガンマグルタミン酸遺伝子及び前記ポリガンマグルタミン酸合成酵素複合体遺伝子と連結するヒトパピローマウィルスの腫瘍誘発関連抗原タンパク質Ｅ７（Ｒｂ）をコードする遺伝子を含有するＨＰＶワクチン製造用表面発現ベクターで、前記ベクターで形質転換された組換え乳酸菌を培養してＨＰＶ抗原タンパク質Ｅ７（Ｒｂ）を表面発現させた後、ワクチンとしてそのまま使用可能である。
【００３６】
ワクチンが抗体を生成するに当り効果を高めるためには、抗原性物質がワクチン処理された対象の抗体生成機構が実現できるように体内に放出されなければならない。従って、免疫反応のためには遺伝子産物の微生物キャリアが、体内にまず導入されなければならない。本発明の形質転換された組換え乳酸菌で提示される抗原による望ましい反応を刺激するためには、経口投与または噴霧剤状で子宮頚部に直接投与することが望ましい。
【００３７】
ワクチン組成物を投与者に経口投与するためには、親液性の形状、例えば、カプセル状で提供することが望ましい。前記カプセルはＥｕｄｒａｇａｔｅ  Ｓ、Ｅｕｄｒａｇａｔｅ  Ｌ、セルロースアセテート、セルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸用被覆で提供される。前記カプセル類は、それ自体で使ってもよく、投与する前に懸濁液のような親液性物質に再構成して使用してもよい。再構成は形質転換された組換え微生物の生存に適するｐＨの緩衝液で行うことが望ましい。胃酸から前記形質転換された組換え微生物及びワクチンを保護するため、毎回ワクチン投与以前に重炭酸ナトリウム製剤を投与することが望ましい。選択的にワクチンは非経口投与、鼻内投与または乳腺内投与用として製造される。
即ち、下記工程は一つの例示として説明され、本発明の範囲がこれに限定されない。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明を実施例を挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業界において通常の知識を持った者にとって自明である。
【００３９】
［実施例１］ｒｅｐＥ変異遺伝子を含有する表面発現ベクターの製造（Ｐｋｖ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡＬ−Ａｍｙｌａｓｅ）
本実施例では、宿主細胞で発現ベクターを安定させるため、ｒｅｐＥ変異遺伝子を含有するターゲットタンパク質の発現が向上した表面発現ベクターを作製した。
【００４０】
先ず、乳酸菌でより一層発現量を高めるため、ラクトバチルスカゼイ由来のプロモーターであるアルドラーゼプロモーターの断片を得た。前記アルドラーゼプロモーターは韓国公開特許第１０−２００８−００８６１６１号に開示されたｐＤＴ−ＰｇｓＡ−Ａｍｙｌａｓｅを鋳型として配列番号２と配列番号３のプライマーを使ってＰＣＲ法で得た。
配列番号２：５’−ｃｇｃ  ｇｃａ  ｔｇｃ  ａａｔ  ａｃｃ  ｃａｃ  ｔｔａ  ｔｔｇ  ｃｇ−３’
配列番号３：５’−ｃａｇ  ｔｔｃ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ｃａｔ  ｇｔａ  ｇａｔ  ａｔｃ  ｃｔｃ  ｃ−３’
【００４１】
その結果、アルドラーゼプロモーターを含み、５'末端にはＳｐｈＩ制限酵素部位を含んでおり、３'末端にはｐｇｓＡのＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  １７ｂｐを含んでいる４２１ｂｐのＤＮＡ切片を取得し、同じベクターを鋳型として配列番号４と配列番号５のプライマーを使ってＰＣＲを行い、先に得たアルドラーゼプロモーター切片と連結できるｐｇｓＡ遺伝子の部分を得た。
配列番号４：５’−ｇｇａ  ｇｇａ  ｔａｔ  ｃｔａ  ｃａｔ  ｇａａ  ａａａ  ａｇａ  ａｃｔ  ｇ−３’
配列番号５：５’−ｇｇｃ  ｇｃｔ  ｇｇｃ  ｇｇｔ  ｃｇｔ  ｔｔｇ  ｇ−３’
【００４２】
その結果、取得したＤＮＡ切片のＮ末端の部分は、アルドラーゼプロモーターの３'末端の１３ｂｐを含み、ｐｇｓＡが直接連結している７８２ｂｐ切片を得た。この切片のｐｇｓＡ部分内部にＰｓｔＩ制限酵素部位が含まれている。
【００４３】
取得した二つの切片を連結して両側末端のプライマーを用いてＰＣＲを行い、１１７５ｂｐのＤＮＡ切片を取得し、ＳｐｈＩとＰｓｔＩで切断して、アルドラーゼプロモーターとｐｇｓＡ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌの一部分を含んだ切片を得た。
【００４４】
ｐＢＴ：ｐｇｓＡ−Ａｍｙｌａｓｅ（ｐＡＴ−ＰｓｌｐＡ−ｐｇｓＡ−ａｍｙｌａｓｅ；韓国登録特許第０８７２０４２号の間接実施例参照）を制限酵素ＳｐｈＩ及びＰｓｔＩで切断してＳｌｐＡ７プロモーターの部分とｐｇｓＡ  Ｎ末端の部分を除去して、発現ベクターの骨格とした。
【００４５】
ＳｐｈＩとＰｓｔＩで切断したアルドラーゼプロモーターを含有しているＤＮＡ断片を同じ制限酵素で切断したｐＢＴ：ＰｓｌｐＡ−Ａｍｙｌａｓｅと連結して、ｐＡＴ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ａｍｙｌａｓｅを作製し、ｐＡＴ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ａｍｙｌａｓｅベクターにｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ方法でｒｅｐＥ遺伝子４７５番目のアミノ酸ロイシンをコードするＴＴＡコドンをＴＧＡ停止コドンで置換してＲｅｐＥタンパク質中２１個のＣ末端アミノ酸が切断されて、配列番号１のアミノ酸配列を持つようにコードしたｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ａｍｙｌａｓｅを完成した（図１）。
【００４６】
［実施例２］ＨＰＶ１６  Ｅ７表面発現ベクター（ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７）の製造
実施例１で製造された表面発現ベクター（ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ａｍｙｌａｓｅ）を使ってＰｇｓＡのＣ末端にＨＰＶ１６のＥ７タンパク質をコードする遺伝子を挿入させて、乳酸菌で表面発現できるベクターｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７を製造した。
【００４７】
先ず、実施例１で製造されたｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−ＡｍｙｌａｓｅベクターでｐｇｓＡと融合したアミラーゼ遺伝子を除去し、ＨＰＶ１６  Ｅ７をコードする遺伝子を挿入した。ＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子を含む断片を図１に示されたようにｐＨＡＴ：ｐｇｓＡ−Ｅ７（Poo et al., Int. J. Cancer, 119:1702, 2006）を鋳型で配列番号６と配列番号７をプライマーとして用いてＰＣＲを行って、取得した。
配列番号６：５’−ｇｃｇ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ｃａｔ  ｇｇａ  ｇａｔ  ａｃａ  ｃｃｔ  ａｃａ  ｔｔｇ  ｃ−３’
配列番号７：５’−  ａｃｇ  ｃａｇ  ａａｇ  ｃｇｇ  ｔｃｔ  ｇａｔ  ａａ  −３’
【００４８】
その結果、ＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子を含んでいる３８６ｂｐの切片を取得し、前記切片の５'末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでおり、前記切片の３'末端にはＸｂａＩ制限酵素部位を含んでいる。取得したＤＮＡ切片をＢａｍＨＩとＸｂａＩ処理により、切断して、３０６ｂｐ切片を得た。
【００４９】
ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−ＡｍｙｌａｓｅをＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断してアミラーゼ遺伝子の部分を除去してベクターの部分を得た。
ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断したＥ７遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を同じ制限酵素で切断したベクターと連結してｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７を完成した（図２のＡ）。
【００５０】
［実施例３］ｐＨＡＴ：ＰｇｓＡ−Ｅ７とｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７の乳酸菌形質転換体の発現確認
本実施例では実施例２で作製されたｐＨＡＴ：ＰｇｓＡ−Ｅ７とｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７でラクトバチルスカゼイを形質転換させて、前記形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを培養してＥ７タンパク質の発現を確認した。形質転換された組換えラクトバチルスカゼイでｐｇｓＡと融合したＥ７タンパク質の発現の有無を調べた。
【００５１】
ｐＨＡＴ：ＰｇｓＡ−Ｅ７とｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイをＭＲＳ培地（Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA）、３０℃で静置培養してポリガンマグルタミン酸を合成する遺伝子ｐｇｓＡのＣ末端と融合したＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質の表面発現を誘導した。
【００５２】
前記培養されたラクトバチルスカゼイの全細胞をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及びｐｇｓＡに対する特異抗体を利用したウェスタンブロッティングを行って、前記融合タンパク質の発現を確認した。
【００５３】
具体的には、発現が誘導された形質転換された組換えラクトバチルスカゼイ全細胞を同じ細胞濃度で得られたタンパク質で変性させた（denature）試料を準備して、これをＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した後、分画されたタンパク質をＰＶＤＦ（polyvinylidene-difluoride membranes，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）メンブレンに移した。タンパク質が移されたＰＶＤＦメンブレンをブロッキング緩衝溶液（５０ｍＭトリス塩酸、５％スキムミルク（skim milk）、ｐＨ８.０）で１時間振ってブロッキングさせた後、ＰｇｓＡに対するウサギ由来のポリクローナル一次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍に希釈して、１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは、緩衝溶液で洗浄してＨＲＰが標識されたウサギに対する二次抗体をブロッキング緩衝溶液に１００００倍希釈して、１時間反応させた。反応が終わったメンブレンは、緩衝溶液で洗浄し、洗浄されたメンブレンに基質（ｌｕｍｉｇｅｎ  ＰＳ−３  ａｃｒｉｄａｎ、Ｈ２０２）を添加して、約１分間発色させ、ＣＣＤカメラでＰｇｓＡに対する特異抗体と前記融合タンパク質との間の特異的な結合を確認した（図３）。
【００５４】
図３のレーンＣはＰｇｓＡのみ発現し、形質転換された組換えラクトバチルスカゼイ（ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ）であり、レーン１はｐＨＡＴ：ＰｇｓＡ−Ｅ７で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイの発現であり、レーン２はｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイのタンパク質発現を示したものである。図３に示されたようにＰｇｓＡ特異的抗体を用いて、レーン１と２で５４.４ｋＤａのＰｇｓＡ−Ｅ７融合タンパク質の発現が確認でき、ｐＨＡＴ：ＰｇｓＡ−Ｅ７によるＰｇｓＡ−Ｅ７融合タンパク質の発現と比較するとｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７による融合タンパク質がより強く発現することを確認した。
【００５５】
正常なＲｅｐＥを含んでいるｐＨＡＴ：ＰｇｓＡ−Ｅ７のＰｓｌｐＡ−ＰｇｓＡ−Ｅ７部分をＰａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７で置換した構築体の場合、前記と同じ方式で行った乳酸菌形質転換体製造方法によって、乳酸菌形質転換体を取得できなかった。
【００５６】
［実施例４］ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原を表面発現するラクトバチルスの体液性免疫反応誘導能比較
前記表面発現用ベクターでラクトバチルスカゼイを形質転換させて実施例２と同じ方法で表面発現を誘導した後、２種類の形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを用いてＰｇｓＡと融合したＨＰＶ１６  Ｅ７の体液性免疫反応誘導を比較した。また、融合タンパク質の発現量が異なる２種類の形質転換体を各々多様な量（１、１／５、１／１０）で投与して、免疫反応誘導を比較した。
【００５７】
前記ベクターでラクトバチルスカゼイを形質転換させた後、培養して回収した後、凍結乾燥して準備したパウダーを緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶かした後、６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに経口で投与した。
【００５８】
具体的には、ＨＰＶ１６  Ｅ７を発現する形質転換された組換えラクトバチルスカゼイ（ｐＨＡＴ−Ｅ７、ｐＫＶ−Ｅ７）と、発現しないラクトバチルスカゼイ（ｐＡＴ）の凍結乾燥パウダーを各々ＰＢＳに濃度毎（５×１０９/２００μＬ、１×１０９/２００μＬ、５×１０８/２００μＬ）に溶かした後、一週間に５回ずつ２週間免疫（０〜４ｄａｙｓ、７〜１１ｄａｙｓ）と１週後に一次ブースティング（２１〜２５ｄａｙｓ）、さらに１週後に二次ブースティング（３５〜３９ｄａｙｓ）を経口投与した。血清内のＨＰＶ１６  Ｅ７特異的なＩｇＧ抗体と粘膜内で分泌されるＨＰＶ１６  Ｅ７特異的なＩｇＡ抗体を測定するため、腸内（Intestinal）洗浄液と膣内（Vaginal）洗浄液を１４日、２８日、及び４２日に、各々のマウスからサンプルとして採取した（図４）。血液はヘパリンがコーティングされたマイクロキャピラリーチューブを使って、マウスの目から取得し、１ｍＭ  ＰＭＳＦが含まれたＰＢＳ洗浄液を使って、腸内と膣内を各々０.８ｍＬと２５０μＬで洗浄した後、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上澄液を分離してＥＬＩＳＡを行った。
【００５９】
ＥＬＩＳＡはＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質をウェル当たり各々５００ｎｇ／１００μＬでコーティング緩衝溶液（０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎｉｕｍ、０．０２％  ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ、ｐＨ９．６）を使って希釈した後、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに１００μＬずつ分株し、４℃で一晩中反応させた。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を３００ｕＬ／ウェルずつ添加しながら、３回洗浄した後、５％スキムミルク１００μＬを入れて３７℃で１時間ブロッキングさせ、ブロッキング緩衝溶液を除去した後、ＰＢＳＴで３回洗浄して希釈させた血清と粘膜洗浄液を各々１００μＬずつ添加した。検体を添加した後、３７℃で２時間反応させた後、洗浄溶液で３回洗浄してからセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡ抗体を１：５０００で希釈してウェルに添加後、３７℃で１時間反応させてから洗浄溶液で洗浄した後、ＴＭＢ発色溶液で発色させて、２.５Ｍ硫酸で発色を固定させた。４５０ｎｍで、ＥＬＩＳＡリーダーで測定してＨＰＶ１６  Ｅ７特異抗体の量を分析した。
【００６０】
その結果、図５のＡに示されたように最初２週間免疫した後のＥ７特異的血清ＩｇＧの平均ＯＤ値を測定した結果、ｐＡＴ−Ｅ７とｐＫＶ−Ｅ７投与群がｐＡＴ対照群に比べて高いＯＤ値を示した。また、投与した量に伴ってＥ７特異的抗体が増加することを確認した。一次ブースティング後のＥ７特異的血清ＩｇＧの平均ＯＤ値は、ｐＡＴ−Ｅ７とｐＫＶ−Ｅ７投与群共に最初２週間免疫に比べて増加したＯＤ値を示しブースティング効果を見せた。二次ブースティング後のＥ７特異的血清ＩｇＧの平均ＯＤ値も二つの投与群でブースティング効果を示し、特にｐＡＴ−Ｅ７に比べてＥ７融合タンパク質の表面発現量がずっと高いｐＫＶ−Ｅ７投与群の場合、１／５投与群とｐＡＴ−Ｅ７  １／１投与群が似たようなＩｇＧブースティング効果を示した。
【００６１】
さらに、粘膜免疫反応を測定するために腸内と膣内でのＥ７特異的ＩｇＡ抗体をＥＬＩＳＡで測定した結果、図５のＢと図５のＣに示されたように最初２週間免疫した後の平均ＯＤ値は、ｐＡＴ対照群に比べてｐＡＴ−Ｅ７、ｐＫＶ−Ｅ７投与群共にＥ７特異的ＩｇＡが増加することを確認し、また投与した量に伴ってE７特異的抗体が増加することを確認した。一次ブースティング後の平均ＯＤ値はより一層増加し、二次ブースティング効果は一次ブースティングに比べて、若干効果を見せた。
【００６２】
本発明によるＨＰＶ１６  Ｅ７を発現する形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを経口投与する場合、ＨＰＶ１６  Ｅ７特異的な体液性免疫（血清ＩｇＧ誘導）と粘膜免疫（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｎａｌ／Ｖａｇｉｎａｌ  ＩｇＡ誘導）を誘導できたことを示し、特にＥ７をより多く発現するｐＫＶ−Ｅ７投与群がｐＡＴ−Ｅ７投与群よりも効果的に免疫反応を誘導できたことが示唆された。
【００６３】
［実施例５］ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原を表面発現するラクトバチルスの細胞性免疫反応誘導能比較
ＨＰＶ  １６  Ｅ７抗原の表面発現量が異なる２種類の形質転換された組換えラクトバチルスカゼイ（ｐＨＡＴ−Ｅ７、ｐＫＶ−Ｅ７）を経口投与したマウスからＥ７抗原に特異的なＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介免疫反応誘導とＴ細胞免疫反応の誘導に当り差があるか確認しようと各々ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ染色とＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを行って、細胞性免疫誘導能を調べた。
【００６４】
実施例４で説明したようにＥ７を表面発現している形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを経口投与したマウスから脾臓細胞を分離した。５×１０６ｃｅｌｌの脾臓細胞を１０％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊して、２４ウェルプレートに分株した。各ウェルにＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉエピトープを含むＥ７ペプチド（ａ．ａ  ４９−５７、ＡｎｉＧｅｎ、Ｋｏｒｅａ）とＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を処理し、３７℃で１６時間培養した。培養された細胞はフィコエリスリン（ＰＥ）標識モノクローナルラット抗マウスＣＤ８抗体で、４℃で４０分間染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｋｉｔを利用して、細胞内部のＩＦＮ−γをＦＩＴＣ標識モノクローナルラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体で染色した。
【００６５】
二つの組換えラクトバチルスカゼイを経口投与した後、ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ染色を行ってＥ７特異的にＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞の数を測定した結果、図６に示されたように、Ｅ７を発現する形質転換された組換えラクトバチルスカゼイによるＥ７特異的なＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞前駆体の数が増加したことを確認することができた。特に、免疫反応を誘導した初期には表面発現量が多いｐＫＶ−Ｅ７で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイによる細胞媒介性免疫反応がより増加することが確認されたが、ブースティングに伴いｐＨＡＴ−Ｅ７乳酸菌による細胞媒介性免疫反応も似たレベルで増加した。
【００６６】
Ｅ７特異的なＴ細胞免疫反応誘導を調べるためＥ７ペプチドによる刺激に特異的にＩＦＮ−γを分泌する全Ｔ細胞数を測定するためにＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを行った。
脾臓細胞を分離する一日前に、プレートに抗マウスＩＦＮ−ｇ捕捉抗体をコーティングし、実験当日分離した脾臓細胞はウェル当たり２×１０５ｃｅｌｌに分株した。細胞が分株されたウェルにＥ７ペプチドまたはＰＨＡ−Ｍ、ｍｅｄｉａを処理して２日間培養した。２日後、プレートの内容物を除去して蒸溜水で２回、０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン化抗マウス  ＩＦＮ−gを分株し常温で２時間反応させた。反応後、内容物を除去して０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄後、ストレプトアビジンＨＲＰを分株し常温で一時間反応させた。内容物を除去して０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０が含まれたＰＢＳで４回洗浄してＰＢＳで２回洗浄した後、基質と反応させて、発色を確認しながら５〜６０分間観察し、蒸溜水で反応を停止させ、ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを用いて、各ウェルのスポット数を測定した。
【００６７】
図６に示されたようにｐＨＡＴ−Ｅ７またはｐＫＶ−Ｅ７で形質転換された組換え乳酸菌を経口投与したマウスの場合、Ｅ７ペプチドの刺激に対するＩＦＮ−γ分泌細胞数が増加することを確認でき、ｐＨＡＴ−Ｅ７で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを投与した群よりｐＫＶ−Ｅ７で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを投与した群でより多くの数のＩＦＮ−γ分泌細胞数の分布を確認することができた。
【００６８】
［実施例６］ＨＰＶ  Ｅ７抗原を表面発現するラクトバチルスで免疫したマウスの腫瘍細胞チャレンジ
ＨＰＶ  １６  Ｅ７抗原の表面発現量が異なる２種類の形質転換された組換えラクトバチルス（ｐＨＡＴ−Ｅ７、ｐＫＶ−Ｅ７）の抗癌効果と投与量に伴う抗癌効果を確認するためＥ７タンパク質を発現するTＣ−１腫瘍細胞モデルを利用して、腫瘍細胞チャレンジを行った。
【００６９】
先ず、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを各集団毎に５匹ずつ準備してＥ７を表面発現している形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを経口投与した。経口投与は、週５回行い、最初１週間投与後、１週間の休止期間を設け、さらに１週間と最初のブースティング後、再び１週間の休止期間を設けた後１週間と二回目のブースティングを行った。最初１週間の経口投与後、２×１０４ｃｅｌｌのＴＣ−１腫瘍細胞を左の上腿内側に皮下注射（ｓ．ｃ．）で癌を誘導した。形成された癌の大きさはキャリパーを利用して、週に３回測定した。
【００７０】
図７に示されたように、ｐＨＡＴ−Ｅ７またはｐＫＶ−Ｅ７で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを経口投与した集団で対照群のラクトバチルスカゼイを経口投与した集団に比べて、腫瘍細胞の大きさが５０％程度で小さく形成されることを確認することができた。また、ｐＫＶ−Ｅ７で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイの量を１／５に減らして投与した集団の場合も対照群集団に比べて、腫瘍細胞の大きさが小さかった。
【００７１】
［実施例７］ＨＰＶ  ｔｙｐｅ１６  Ｅ７関連部位アミノ酸の変異導入タンパク質表面発現免疫乳酸菌（ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７（Ｒｂ））の製造
パピローマウィルスが細胞に感染する場合発現したＥ７タンパク質とｐＲｂ（Retinoblastoma Growth Suppressor Protein）タンパク質が結合して、癌を誘発する可能性があるため、Ｅ７遺伝子のｐＲｂタンパク質と結合する部分の塩基配列に変異を誘発した。このように変異が誘発されたＥ７（Ｒｂ）遺伝子を大腸菌と乳酸菌で安定的に発現するｐＫＶシャトルベクターを用いてＰｇｓＡ末端に融合させて、乳酸菌で表面発現できるベクターｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７（Ｒｂ）を製造した。
【００７２】
ＨＰＶ  ｔｙｐｅ１６  Ｅ７内のＲｂ結合領域を調べた結果、ｐＲｂ結合領域（ＤＬｘＣｘＥ）は、ＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子の２１番目アミノ酸から２６番目アミノ酸と知られている（Smahel M. et al., Virology, 281:231, 2001）。その中で２１番目（Ｄ）、２４番目（Ｃ）、２６番目（Ｅ）のアミノ酸を共にグリシンで置換させるため、プライマーを使ったｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ方法によってＥ７タンパク質のｐＲｂタンパク質との結合の可能性を無くした。実施例２で取得したｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７ベクターを鋳型として配列番号８と９、配列番号１０と１１を使って、各々ＰＣＲを行った。
配列番号８：５’−ｔｃｔ  ｇｇａ  ｔｃｃ  ａｔｇ  ｃａｔ  ｇｇａ  ｇａｔ  ａｃａ  ｃｃｔ  ａｃ−３’
配列番号９：５’−ｔｔｇ  ｃｃｃ  ａｔａ  ａｃｃ  ｇｔａ  ｇａｇ  ａｃｃ  ａｇｔ  ｔｇｔ  ｃ−３’
配列番号１０：５’−ａｃｔ  ｇｇｔ  ｃｔｃ  ｔａｃ  ｇｇｔ  ｔａｔ  ｇｇｇ  ｃａａ  ｔｔａ  ａａｔ  ｇ−３’
配列番号１１：５’−ｃａｔ  ｔｃｔ  ａｇａ  ｔｃａ  ｔｔａ  ｔｇｇ  ｔｔｔ  ｃｔｇ  ａｇａ  ａｃａ  ｇ−３’
【００７３】
その結果、配列番号８及び９のプライマーによってＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子を含んでいる８７ｂｐの切片を取得し、ＤＮＡ切片の５'末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位を含んでおり、配列番号１０及び１１のプライマーによって取得した変異された２４９ｂｐ  ＤＮＡ切片の３'末端にはＸｂａＩ制限酵素部位を含んでいた。二つの取得したＤＮＡ切片をミックスして、９５℃−３０秒、４２℃−３０秒、７２℃−３０秒の条件で１０回ＰＣＲを行った後、配列番号８及び１１のプライマーを添加してＰＣＲ（９５℃−３０秒、５３℃−３０秒、７２℃−３０秒）を行った。取得した３１２ｂｐ  ＤＮＡ切片の５'末端にはＢａｍＨＩ制限酵素部位が、３'末端にはＸｂａＩ制限酵素部位が含まれていた。この切片をＢａｍＨＩとＸｂａＩ処理し、切断して、３０６ｂｐの変異されたＥ７（Ｒｂ）遺伝子切片を取得した。ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−ＡｍｙｌａｓｅをＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断してアミラーゼ遺伝子の部分を除去してベクターの部分を取得した。ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断された変異Ｅ７（Ｒｂ）遺伝子を含有しているＤＮＡ断片を同じ制限酵素で切断したベクターと連結して、ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７（Ｒｂ）を完成した（図８）。
構築された前記構築体をラクトバチルスカゼイにエレクトロポレーション法を利用して、形質転換し、構築体が形質転換された乳酸菌形質転換体を取得した。
【００７４】
［実施例８］ｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７（Ｒｂ）乳酸菌形質転換体の発現確認
取得した乳酸菌表面発現用ベクターｐＫＶ−Ｐａｌｄ−ＰｇｓＡ−Ｅ７（Ｒｂ）で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイからＰｇｓＡと融合したＥ７私のＲｂ結合部位変異タンパク質の発現の有無を確認した。
【００７５】
形質転換された組換えラクトバチルスカゼイをＭＲＳ培地（Lactobacillus MRS, Becton Dickinson and Company Sparks, USA）、３０℃で静置培養を行い、菌体を回収して、実施例３のような方法でウェスタンブロッティングを行って、発現されたことを確認した。ＰｇｓＡ特異抗体とＨＰＶ１６  Ｅ７特異抗体（E7 monoclonal Ab, Invitrogen, USA）を用いてウェスタンブロッティングを行った結果、図９に示されたように約５４．７ｋＤａのＰｇｓＡと融合した変異E７タンパク質の発現を確認した。
【００７６】
［実施例９］変異されたＨＰＶ１６  Ｅ７（Ｒｂ）抗原を表面発現するラクトバチルスの体液性免疫反応誘導
ＰｇｓＡと融合した変異Ｅ７タンパク質の発現が確認された形質転換された組換えラクトバチルスカゼイをマウスに経口投与し、体液性免疫反応が誘導されるか確認した。前記ベクターをラクトバチルスカゼイに形質転換させた後、培養して回収した後、凍結乾燥して準備したパウダーを緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に溶かした後、６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに経口投与した。
【００７７】
具体的には、ＨＰＶ１６  Ｅ７（Ｒｂ）を発現する形質転換された組換えラクトバチルスカゼイ（Ｅ７−Ｒｂ）と、発現しないラクトバチルスカゼイ（Ｌ５２５）の凍結乾燥パウダーを各々ＰＢＳに２〜５×１０９ｃｅｌｌ/２００μＬで溶かした後、週に５回ずつ２週間免疫（０〜４ｄａｙｓ、７〜１１ｄａｙｓ）して１週後に一次ブースティング（２１〜２５ｄａｙｓ）、さらに１週間後に二次ブースティング（３５〜３９ｄａｙｓ）を経口投与した。血清内のＨＰＶ１６  Ｅ７特異的なＩｇＧ抗体と、粘膜内で分泌されるＨＰＶ１６  Ｅ７特異的なＩｇＡ抗体を測定するため、腸内洗浄液と膣内洗浄液を図３に示されたように１４日、２８日、そして４２日に各々マウスからサンプルを採取した。実施例４同様に血液はヘパリンがコーティングされたマイクロキャピラリーチューブを用いて、マウスの目から得られ、１ｍＭ  ＰＭＳＦが含まれたＰＢＳ洗浄液を用いて、腸内と膣内を各々０．８  ｍＬと２５０μＬで洗浄した後、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄液を分離して、実施例４と同じ方法でＥＬＩＳＡを行った。
【００７８】
その結果、図１０のＡに示されたように最初２週間免疫した後のＥ７特異的血清ＩｇＧの平均ＯＤ値を測定したところ、Ｅ７−Ｒｂ投与群がＬ５２５（−ｃｏｎｔｒｏｌ）投与群に比べて高いＯＤ値を示した。一次ブースティング後のE７特異的血清ＩｇＧの平均ＯＤ値は、Ｅ７−Ｒｂ投与群で最初２週間免疫に比べて増加したＯＤ値を示しており、ブースティング効果が示された。二次ブースティング後のＥ７特異的血清ＩｇＧの平均ＯＤ値を見てもブースティング効果が示された。しかし、Ｌ５２５投与群では特別なブースティング効果が見られなかった。また、粘膜で誘導される体液性免疫反応を測定するために腸内と膣内でのＥ７特異的ＩｇＡ抗体をＥＬＩＳＡで測定した結果、図１０のＢと図１０のＣに示されたように最初２週間免疫した後の平均ＯＤ値は、Ｌ５２５（ｃｏｎｔｒｏｌ）投与群に比べてＥ７−Ｒｂ投与群が、Ｅ７特異的ＩｇＡが増加することを確認し、一次ブースティング後の平均ＯＤ値は、より一層増加し、二次ブースティング効果は一次ブースティングに比べて増加した効果が見られた。
【００７９】
以上の結果から確認されたように、Ｅ７−Ｒｂ形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを経口投与した場合、ＨＰＶ１６  Ｅ７特異的な全身性液性免疫反応（systemic humoral immune response）（血清ＩｇＧ誘導）と粘膜液性免疫反応（mucosal humoral immune response）（Ｉｎｔｅｒｓｔｉｎａｌ／Ｖａｇｉｎａｌ  ＩｇＡ誘導）を共に誘導できることが示された。
【００８０】
［実施例１０］変異されたＨＰＶ１６  Ｅ７（Ｒｂ）抗原を表面発現するラクトバチルスの細胞性免疫反応誘導
変異されたＨＰＶ  １６  Ｅ７（Ｒｂ）抗原を表面発現する形質転換された組換えラクトバチルス（Ｅ７−Ｒｂ）が、Ｅ７（Ｒｂ）抗原に特異的なＴ細胞媒介免疫反応誘導を誘導する能力有しているかを調べるために、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを行い、細胞性免疫誘導能を調べた。
【００８１】
実施例７で作製したＥ７（Ｒｂ）を表面発現している形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを経口投与したマウスで脾臓細胞を分離した。５×１０６ｃｅｌｌの脾臓細胞を１０％ＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊して、２４ウェルプレートに分株した。各ウェルにＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉエピトープを含むＥ７ペプチド（ａ．ａ  ４９−５７、ＡｎｉＧｅｎ、Ｋｏｒｅａ）とＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）処理して、３７℃で１６時間培養した。培養された細胞は、フィコエリスリン（ＰＥ）標識モノクローナルラット抗マウスＣＤ８抗体で、４℃で４０分間染色し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  ｋｉｔを利用して、細胞内部のＩＦＮ−γをＦＩＴＣ標識モノクローナルラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体で染色した。
【００８２】
二種類の組換えラクトバチルスカゼイを経口投与した後、ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ染色を行って、Ｅ７（Ｒｂ）特異的にＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋  Ｔ細胞の数を測定した結果、図１１に示されたように、Ｅ７（Ｒｂ）を発現する形質転換された組換えラクトバチルスカゼイによるＥ７（Ｒｂ）特異的なＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞前駆体の数が増加したことを確認することができた。特に、免疫反応を誘導した初期には表面発現量が多いｐＫＶ−Ｅ７（Ｒｂ）乳酸菌による細胞媒介性免疫反応がより増加することが確認されたが、ブースティングに伴ってｐＨＡＴ−Ｅ７（Ｒｂ）乳酸菌による細胞媒介性免疫反応も似たレベルに増加した。
【００８３】
Ｅ７（Ｒｂ）特異的なＴ細胞免疫反応誘導を調べるため、Ｅ７ペプチドによる刺激に特異的にＩＦＮ−γを分泌する全Ｔ細胞の数を測定するため、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴを行った。
【００８４】
脾臓細胞を分離する一日前にプレートに抗マウスＩＦＮ−ｇ捕捉抗体をコーティングし、実験当日に分離した脾臓細胞は、ウェル当たり２×１０５ｃｅｌｌに分株した。細胞が分株されたウェルにＥ７ペプチドまたはＰＨＡ−Ｍ、ｍｅｄｉａ処理して２日間培養した。２日後、プレートの内容物を除去して蒸溜水で２回、０.０５％ｔｗｅｅｎ−２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄し、ビオチン化抗マウスＩＦＮ−ｇを分株し常温で２時間反応させた。反応後、内容物を除去して０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０が含まれたＰＢＳで３回洗浄後、ストレプトアビジンＨＲＰを分株し常温で一時間反応させた。内容物を除去して０．０５％ｔｗｅｅｎ−２０が含まれたＰＢＳで４回洗浄してＰＢＳで２回洗浄した後、基質と反応させて、発色を確認しながら、５〜６０分間観察し、蒸溜水で反応を停止させ、ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを用いて、各ウェルのスポット数を測定した。
【００８５】
図１１に示されたようにｐＨＡＴ−Ｅ７（Ｒｂ）またはｐＫＶ−Ｅ７（Ｒｂ）で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを経口投与したマウスの場合、Ｅ７ペプチドの刺激に対するＩＦＮ−γ分泌細胞数が増加することが確認でき、ｐＨＡＴ−Ｅ７（Ｒｂ）で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを投与した群よりｐＫＶ−Ｅ７（Ｒｂ）で形質転換された組換えラクトバチルスカゼイを投与した群の方がより多くの数のＩＦＮ−γ分泌細胞数の分布を確認することができた。
【００８６】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明に係るヒトパピローマウィルス抗原タンパク質の表面発現用ベクターで形質転換された組換え乳酸菌及びこれを主要成分として含んだ組成物は、子宮頸癌治療用ワクチンとして活用でき、構成的にＨＰＶ抗原を高発現する形質転換された組換え菌株を経済的に大量増殖させて、経口ワクチンとしてまたは膣部位に直接適用することができるため、非常に経済的な効果がある。
【図１】
0005536803.tif 000002
【図２】
0005536803.tif 000003
【図４】
0005536803.tif 000004
【図５】
0005536803.tif 000005
【図６】
0005536803.tif 000006
【図７】
0005536803.tif 000007
【図８】
0005536803.tif 000008
【図１０】
0005536803.tif 000009
【図１１】
0005536803.tif 000010
【図３】
0005536803.tif 000011
【図９】
0005536803.tif 000012
【配列表】
0005536803000001.app