(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
侵害受容感覚求心性細胞におけるエキソサイトーシス融合の阻害または低減のための非細胞傷害性タンパク質結合体であって、
（ｉ）オピオイドペプチドターゲティング部分（ＴＭ）であって、該ＴＭが、該侵害受容感覚求心性細胞上に存在するレセプターのアゴニストであり、そして該レセプターが、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性細胞内のエンドソームに取り込まれ、該ＴＭが、ＯＲＬ１レセプターのペプチドアゴニスト；エンドモルフィン；エンケファリン；β−エンドルフィン；ノシセプチン；およびダイノルフィン；からなる群より選択される、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼであって、該侵害受容感覚求心性細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得、該非細胞傷害性プロテアーゼが、クロストリジウム神経毒素Ｌ鎖プロテアーゼまたはＩｇＡプロテアーゼから選択される、プロテアーゼ；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、ボツリヌスＨＮドメインであるか、または該トランスロケーションドメインが、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素のドメインII、炭疽菌毒素、インフルエンザウイルスヘマグルチニンに由来する融合性および／または両親媒性のペプチド、セムリキ森林ウイルス融合性タンパク質、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質Ｇ、ＳＥＲウイルスＦタンパク質および泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質からなる群より選択されるトランスロケーションドメインであり、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼをトランスロケートする、トランスロケーションドメイン、
を含み、
該ＴＭと該トランスロケーションドメインとが、２０〜２９アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するスペーサーによって離れており、
該非細胞傷害性タンパク質結合体が、該非細胞傷害性プロテアーゼ、該オピオイドペプチドＴＭ、該トランスロケーションドメインの順、または、該非細胞傷害性プロテアーゼ、該トランスロケーションドメイン、該オピオイドペプチドＴＭの順で配置されている、
非細胞傷害性タンパク質結合体。
【請求項２】
前記ＴＭと前記トランスロケーションドメインとが、２０〜２７アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するスペーサーによって離れている、請求項１に記載の非細胞傷害性タンパク質結合体。
【請求項３】
前記エンドモルフィンのＴＭが、エンドモルフィン１またはエンドモルフィン２である、請求項１または２に記載の非細胞傷害性タンパク質結合体。
【請求項４】
前記エンケファリンのＴＭが、ｍｅｔ−エンケファリンまたはｌｅｕ−エンケファリンである、請求項１または２に記載の非細胞傷害性タンパク質結合体。
【請求項５】
前記レセプターが、ＯＲＬ１レセプターである、請求項１から４のいずれかの項に記載の非細胞傷害性タンパク質結合体。
【請求項６】
前記ＴＭが、配列番号２、４、６、８、１０、１２または１４から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の非細胞傷害性タンパク質結合体。
【請求項７】
前記侵害受容感覚求心性細胞が、一次侵害受容感覚求心性細胞である、請求項１から６のいずれかの項に記載の非細胞傷害性タンパク質結合体。
【請求項８】
前記ＴＭ、前記トランスロケーションドメイン、および前記プロテアーゼが、共有結合される、請求項１から７のいずれかの項に記載の非細胞傷害性タンパク質結合体。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかの項に記載の結合体および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかの項に記載の結合体をコードする、ＤＮＡ構築物。
【請求項１１】
宿主細胞において請求項１０に記載のＤＮＡ構築物を発現させる工程を含む、請求項１から８のいずれかの項に記載の結合体の調製方法。
【請求項１２】
請求項１から８のいずれかの項に記載の結合体または請求項９に記載の組成物を含む、疼痛の治療用組成物。
【請求項１３】
疼痛の治療用の医薬品の製造のための、請求項１から８のいずれかの項に記載の結合体または請求項９に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非細胞傷害性タンパク質結合体、および疼痛の治療のための該結合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、毒素は、標的細胞に対して有する効果のタイプに従って２つの群に分けられ得る。より詳細には、第一の毒素群は、それらの天然の標的細胞を殺傷し、このため、細胞傷害性毒素分子として知られる。この毒素群は、とりわけ、植物毒素（例えば、リシンおよびアブリン）および細菌毒素（例えば、ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素Ａ）によって例示される。細胞傷害性毒素は、代表的には、タンパク質合成の細胞プロセスを阻害することにより、それらの標的細胞を殺傷する。
【０００３】
対照的に、第二の毒素群は、非細胞傷害性毒素として知られ、（これらの名称が証明するとおり）それらの天然の標的細胞を殺傷しない。非細胞傷害性毒素は、それらの細胞傷害性のものほどには商業上の関心をひきつけず、そしてタンパク質合成以外の細胞プロセスを阻害することにより、標的細胞に対してそれらの効果を発揮する。細胞傷害性の対応物と同様に、非細胞傷害性毒素は、植物および細菌のような種々の供給源から生成される。細菌の非細胞傷害性毒素を、ここでより詳細に説明する。
【０００４】
クロストリジウム神経毒素は、代表的には１５０ｋＤａの程度の分子量を有するタンパク質である。それらは、種々の細菌種、特に、クロストリジウム属の細菌、最も重要にはC. tetaniおよびC. botulinumの数株、C. butyricum、およびC. argentinenseによって生成される。現在、クロストリジウム神経毒素の８つの異なるクラスが存在し（すなわち、破傷風菌毒素およびボツリヌス菌神経毒素（その血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ））、そしてそれらは全て、類似の構造および作用様式を共有する。
【０００５】
クロストリジウム神経毒素は、非細胞傷害性毒素分子の主要な群を代表し、そして単一ポリペプチドとして宿主細菌によって合成され、この単一ポリペプチドは、タンパク質分解切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって互いに接続された２つのポリペプチド鎖を形成する。これらの２つの鎖は、重鎖（Ｈ鎖）（これは、約１００ｋＤａの分子量を有する）および軽鎖（Ｌ鎖）（これは、約５０ｋＤａの分子量を有する）と称される。
【０００６】
Ｌ鎖は、プロテアーゼ機能（亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性）を有し、そしてエキソサイトーシスプロセスに関与する小胞および／または原形質膜会合タンパク質に対する高い基質特異性を示す。異なるクロストリジウム種または血清型に由来するＬ鎖は、３つの基質タンパク質（すなわち、シナプトブレビン、シンタキシン、またはＳＮＡＰ−２５）の１つにおいて、異なるが特定のペプチド結合を加水分解し得る。これらの基質は、神経分泌機構の重要な構成部分である。
【０００７】
非細胞傷害性毒素は、Neisseria属、最も重要にはN. gonorrhoeaeの種に由来するような、他の細菌によっても生産される。例えば、Neisseria sp.は、非細胞傷害性毒素であるＩｇＡプロテアーゼを生成する（ＷＯ９９／５８５７１を参照のこと）。
【０００８】
毒素分子が、その毒素の天然の標的細胞ではない細胞にリターゲティングされ得ることが当該分野において十分に書き記されている。そのようにリターゲティングされたとき、改変毒素は、所望の標的細胞に結合し得、そしてそれに続くサイトゾルへのトランスロケーション後、標的細胞にその効果を発揮し得る。該リターゲティングは、毒素の天然のターゲティング部分（ＴＭ）を異なるＴＭと置き換えることによって達成される。これに関して、ＴＭは、それが所望の標的細胞に結合し、そして標的細胞内のエンドソームへの改変毒素の引き続く通過を可能にするように選択される。改変毒素はまた、非細胞傷害性プロテアーゼの細胞サイトゾルへの侵入を可能にするトランスロケーションドメインを含む。このトランスロケーションドメインは、毒素の天然のトランスロケーションドメインであり得るか、またはトランスロケーション活性を有する微生物タンパク質から得られる別のトランスロケーションドメインであり得る。
【０００９】
例えば、非細胞傷害性毒素分子に関して、クロストリジウム神経毒素が、クロストリジウム神経毒素の天然のＴＭではないターゲティング部分（ＴＭ）の組込みによってリターゲティングされ得ることは十分に書き記されている。記載された化学結合体化および組換え方法は、従来技術とみなされ、そしてHermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press、およびWong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Pressに言及されている。
【００１０】
例えば、ＷＯ９４／２１３００は、改変クロストリジウム神経毒素分子を記載しており、この分子は、標的細胞の細胞表面に存在する膜貫通タンパク質（ＩＭＰ）密度を調節し得る。したがって、この改変神経毒素分子は、標的細胞の細胞活性（例えば、グルコース取り込み）を制御し得る。ＷＯ９６／３３２７３およびＷＯ９９／１７８０６は、末梢感覚求心性神経をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子を記載している。したがって、この改変神経毒素分子は、鎮痛効果を示し得る。ＷＯ００／１０５９８は、粘液過分泌細胞（または該粘液過分泌細胞を制御する神経細胞）をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子の調製を記載している。この改変神経毒素は、該細胞からの過分泌を阻害し得る。ＷＯ０１／２１２１３は、広範な異なるタイプの非神経標的細胞をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子を記載している。したがって、この改変分子は、標的細胞からの分泌を抑制し得る。リターゲティングされる毒素分子の技術分野におけるさらなる刊行物としては、以下が挙げられる：ＷＯ００／６２８１４；ＷＯ００／０４９２６；ＵＳ５，７７３，５８６；ＷＯ９３／１５７６６；ＷＯ００／６１１９２；およびＷＯ９９／５８５７１。
【００１１】
したがって、上記刊行物から、標的細胞に存在する対応するレセプターを有するＴＭを選択することによって非細胞傷害性プロテアーゼを所望の標的細胞にリターゲティングするという基本概念が、十分に記載されていることが理解される。
【００１２】
しかし、目的の標的細胞に存在する異なるレセプターは、異なるＴＭに対して異なる結合親和性を示す。これは、異なるＴＭに対して異なる結合親和性を有する広範なレセプタータイプを有している痛みを感じる細胞には、特に問題であり得る。したがって、特定のＴＭ（これは痛みを感じる細胞上のレセプターに結合する）を含むリターゲンティングされた結合体は、痛みを感じる標的細胞に対して低い結合親和性を示し得、これは望ましくない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、１つ以上の上記問題に取り組む改変非細胞傷害性結合体を開発する必要がある。疼痛の治療への使用のための改善された結合体の開発が特に関心がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、結合体のターゲティング部分（ＴＭ）として、目的の痛みを感じる標的細胞に存在するレセプターの「アゴニスト」を使用することによって、１つ以上の上記問題に取り組む努力をする。好適な実施態様では、痛みを感じる標的細胞は、侵害受容感覚求心性神経、より好ましくは一次侵害受容感覚求心性神経である。特に好適な実施態様では、ＴＭはオピオイド様レセプター−１（ＯＲＬ１）レセプターのアゴニストである。
【００１５】
したがって、第１の局面では、本発明は、侵害受容感覚求心性細胞におけるエキソサイトーシス融合の阻害または低減のための非細胞傷害性結合体を提供し、この結合体は、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、該ＴＭが、該侵害受容感覚求心性細胞上に存在するレセプターのアゴニストであり、そして該レセプターが、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性細胞内のエンドソームに取り込まれる、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントであって、該侵害受容感覚求心性細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートする、トランスロケーションドメイン、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｒｅｃＬＨＮ／Ｂ融合タンパク質の発現および精製を示す。
【図２】ＬＨＮ／Ｃ融合タンパク質の発現および精製を示す。
【図３】Ｎ［１−１７］−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質の発現および精製を示す。
【図４】ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製を示す。
【図５】ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製を示す。
【図６】ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の精製を示す。
【図７】ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製を示す。
【図８】ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質およびノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の結合効力の比較を示す。
【図９】ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ触媒活性を示す。
【図１０】ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製を示す。
【図１１】ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質およびＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の結合効力の比較を示す。
【図１２】可変スペーサー長産物を有する発現／精製したＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質ファミリーを示す。
【図１３】ＣＰＮ−ＡによるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断を示す。
【図１４】ＣＰＮ−ＡへのＤＲＧの曝露後の長時間にわたるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断を示す。
【図１５】ＣＰＮｖ−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断を示す。
【図１６】ＣＰＮｖ−ＡへのＤＲＧの曝露後の長時間にわたるＳＮＡＰ−２５の切断を示す。
【図１７】［３Ｈ］−ノシセプチン結合のＣＰＮｖ−Ａ融合物媒介置換を示す。
【図１８】発現／精製したＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａ産物を示す。
【図１９】ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断を示す。
【図２０】発現／精製したＣＰＮｖ−Ｃ産物を示す。
【図２１】ＣＰＮｖ−Ｃによるシンタキシンの切断を示す。
【図２２】急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮ−Ａの効力を示す。
【図２３】ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発末梢糖尿病性神経障害（神経因性疼痛）モデルにおけるＣＰＮ−Ａの効力を示す。
【図２４】急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮｖ−Ａの効力を示す。
【図２５】発現／精製したＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ産物を示す。
【図２６】発現／精製したＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ産物を示す。
【図２７】発現／精製したＣＰＯＰ−Ａ産物を示す。
【図２８】発現／精製したＣＰＯＰｖ−Ａ産物を示す。
【図２９】ＤＲＧ細胞モデルにおけるインビトロＳＮＡＰ−２５切断を示す。
【図３０】発現／精製したＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ（除去可能ｈｉｓタグ）を示す。
【図３１】リガンド競合アッセイによって評価した場合の、可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力を示す。
【図３２】インビトロＳＮＡＰ−２５切断によって評価した場合の、可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
「アゴニスト」は、通常生物学的プロセス、特にエキソサイトーシス（例えば、細胞分泌の増加、または膜タンパク質発現のアップレギュレーション）を刺激し、この「アゴニスト」の使用は、リターゲティングされた毒素の技術分野において刺激的な開発である。さらに、アゴニストが治療用組成物に用いられて、そのアゴニストが通常刺激する生物学的プロセスの低減または阻害を達成し得ることは、特に驚くべきことである。
【００１８】
本発明のアゴニスト含有結合体は、毒素結合体の別のサブセットを示す。より詳細には、本発明の結合体は、ＴＭを含み、このＴＭは、目的の痛みを感じる標的細胞上に対応するレセプターを有するという単純な根拠よりもむしろ特定のアゴニスト特性に基づいて選択されている。
【００１９】
従来、アゴニストは、細胞内で活性を上昇または低下させ得る任意の分子、すなわち、細胞活性の変化を単に引き起こす任意の分子であると考えられている。例えば、アゴニストの従来の意味は、細胞上のレセプターと結合しそして反応または活性を開始し得る化学物質、あるいは、応答が細胞活性の上昇または低下のいずれにせよ、レセプターを活性化することにより活性な応答を誘導する薬物を含む。
【００２０】
しかし、本発明の目的のために、アゴニストは、痛みを感じる標的細胞においてエキソサイトーシス融合のプロセスを刺激し得る分子として、より詳細に定義される。このプロセスは、該標的細胞におけるエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得るプロテアーゼ（またはそのフラグメント）による阻害を受けやすい。
【００２１】
したがって、本発明の特定のアゴニストの定義は、従来はアゴニストと考えられていた多くの分子を排除する。例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）は、ＴｒｋＡレセプターへの結合を介する神経分化を促進する能力に関するアゴニストである。しかし、ＮＧＦは、エキソサイトーシス融合の主なインデューサーではないので、上記基準によって評価した場合はアゴニストではない。さらに、ＮＧＦが刺激するプロセス（すなわち、細胞分化）は、非細胞傷害性毒素分子のプロテアーゼ活性による阻害を受けにくい。
【００２２】
使用に際して、本発明のアゴニスト含有結合体は、痛みを感じる標的細胞上のアゴニストレセプターを不活性化せず、むしろ結合体のプロテアーゼ活性が、アゴニストにより媒介される応答を打ち消すように働く。
【００２３】
さらに、一旦痛みを感じる標的細胞のサイトゾルに送達されると、本発明の結合体のプロテアーゼ構成部分は、同じ標的細胞において同じ効果（すなわち、エキソサイトーシス融合の増加）を引き起こし得るすべてのその後のアゴニストの作用を阻害またはブロックする。これは、好都合であり、そして本発明の結合体が、多数のアゴニストが痛覚を生じる原因であり得る状況に適用を有することを意味する。したがって、本発明の結合体を設計する場合、送達のために選択されるＴＭは、必ずしも痛覚を生じることに関連する主要なアゴニストである必要はない。
【００２４】
本発明によるアゴニストにより媒介される送達は、これまでの非細胞傷害性プロテアーゼ含有治療剤よりも以下の顕著な利点を提供する：アゴニストの使用は、結合体に選択的結合および／または内在化特性を与え得る。次に、これは、痛みを感じる標的細胞へのプロテアーゼ構成部分のより効率的な送達を生じ得る。
【００２５】
さらに、アゴニストのＴＭとしての使用は、副作用に関して自己限定的である。より詳細には、痛みを感じる標的細胞へのアゴニストの結合は、エキソサイトーシス融合を増加し、これは、痛覚を増悪させ得る。しかし、アゴニスト結合により刺激されるエキソサイトーシスプロセスは、続いて、結合体のプロテアーゼ構成部分により低減または阻害される。
【００２６】
本発明の好適な実施態様では、ＴＭは、ＯＲＬ１レセプターのアゴニストである。ＯＲＬ１レセプターは、身体において痛みを感じる細胞上に存在する。
【００２７】
ＯＲＬ１レセプターは、Ｇタンパク質と結合したクラスのレセプターのメンバーであり、そして７回膜貫通ドメイン構造を有する。ＯＲＬ１レセプターの特性は、MogilおよびPasternak (2001), Pharmacological Reviews, 53巻, 3号, 381-415頁に詳細に記載される。
【００２８】
本明細書を通して、「ＯＲＬ１レセプター」とは、ＯＲＬ１レセプターファミリーのすべてのメンバーを含む。ＯＲＬ１レセプターファミリーのメンバーは、代表的には、７回膜貫通ドメイン構造を有し、そしてＧｉおよびＧ０ファミリーのＧタンパク質に結合される。ＯＲＬ１レセプターのリガンドのＧタンパク質刺激活性の測定方法を、実施例１７に示す。ＯＲＬ１活性化後の細胞ｃＡＭＰレベルの低下の測定方法を、実施例１６に示す。ＯＲＬ１レセプターファミリーのメンバーのさらなる特徴は、それらが代表的にはノシセプチン（ＯＲＬ１の天然のリガンド）を結合し得ることである。例として、ＯＲＬ１レセプターのすべての選択的スプライス改変体は、ＯＲＬ１レセプターファミリーのメンバーである。
【００２９】
本発明の結合体は、一般に、対応する「フリー」なＴＭと比較した場合、侵害受容感覚求心性標的細胞に対して（１００倍までの範囲で）低下した結合親和性を示している。しかし、この観察にもかかわらず、本発明の結合体は、驚くべきことに、良好な効力を示している。これは、２つの主要な特徴に帰するものであり得る。第一に、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、触媒性である。したがって、少数のこのような分子の治療効果が迅速に増幅される。第二に、侵害受容感覚求心性神経上に存在するレセプターは、治療剤の侵入のための出入口としてのみ作用する必要があり、必ずしもリガンド−レセプター媒介薬理学的応答を達成するために必要とされるレベルまで刺激される必要はない。したがって、本発明の結合体は、他のタイプの鎮痛分子（例えば、ＮＳＡＩＤＳ、モルヒネ、およびガバペンチン）について用いられるよりもずっと低い投薬量で投与され得る。後者の分子は、代表的には、高マイクログラムからミリグラム（数百ミリグラムまででさえある）量で投与される。これに対して、本発明の結合体は、ずっとより低い投薬量（代表的には少なくとも１０倍低く、そしてより代表的には１００倍低い）で投与され得る。
【００３０】
本発明の特に好ましい実施態様では、結合体のＴＭは、ＯＲＬ１レセプターに対する天然のリガンドであるノシセプチンである。ノシセプチンは、ＯＲＬ１レセプターを高い親和性でターゲティングする。
【００３１】
他の好ましいＴＭの例は、以下を含む：
【００３２】
【数１】
0005536017.tif 000002
【００３３】
［１］MogilおよびPasternak, 2001, Pharmacol. Rev., 53, 381-415
［２］Maileら, 2003, Neurosci. Lett., 350, 190-192
［３］Rizziら, 2002, J. Pharmacol. Exp. Therap., 300, 57-63
［４］Okadaら, 2000, Biochem. Biophys. Res. Commun., 278, 493-498
［５］Zaveri, 2003, Life Sci., 73, 663-678.
［６］Dooleyら, 1997, J Pharmacol Exp Ther. 283(2), 735-41。
【００３４】
ＴＭは、好ましくは最大で５０アミノ酸残基、より好ましくは最大で４０アミノ酸残基、特に好ましくは最大で３０アミノ酸残基、そして最も好ましくは最大で２０アミノ酸残基を含む。例えば、ノシセプチンは、１７アミノ酸残基ペプチドである。
【００３５】
上記の同定された「改変体」ＴＭは、（天然のノシセプチンと比較した場合）侵害受容感覚求心性神経に対して特に良好な結合親和性を示す。一般的に言えば、ＴＭ含有結合体は、ＴＭ自体と比べて約１００倍の結合能の低減を示す。上記の「改変体」ＴＭ自体は、天然のノシセプチンと比べて侵害受容感覚求心性神経に対して約３〜１０倍の結合能の上昇を示す。したがって、「改変体」ＴＭ含有融合物は、「フリー」のノシセプチンと比べて侵害受容感覚求心性神経に対して約１０倍の結合能の低減を示すことが予測され得る。しかし、本発明者らは、該「改変体」ＴＭを含む結合体が、「フリー」のノシセプチンの結合能を（最も驚くべきことには）厳密に反映する結合能を示すことを示した。図１７を参照のこと。
【００３６】
本発明では、用語「ＯＲＬ１レセプターのアゴニスト」（例えば、ノシセプチン、または上記の数表に列挙したペプチドのいずれか１つ）は、該アゴニストと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、および最も好ましくは少なくとも９５％の相同性を有する分子を包含する。アゴニストホモログは、ＯＲＬ１レセプターでノシセプチンのアゴニスト特性を保持し、これは、実施例１０に提供される方法を用いて検証され得る。
【００３７】
本発明はまた、上記のＴＭのいずれか１つのフラグメント、改変体、および誘導体を含む。これらのフラグメント、改変体、および誘導体は、該ＴＭに帰する特性を実質的に保持する。
【００３８】
ＴＭのアゴニスト特性は、実施例１に記載の方法を用いて確認され得る。これらの方法は、既存の実験に基づき（Inoueら (1998) Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 10949-10953を参照のこと）、これは、ＯＲＬ１レセプターの天然のアゴニストであるノシセプチンが、侵害受容一次求心性神経細胞からのサブスタンスＰの放出の誘導を引き起こすことを確認する。これは、以下の事実によって支持される：
・ノシセプチンにより誘導される応答は、特異的ＮＫ１レセプター（サブスタンスＰレセプター）アンタゴニストによって廃止される；および
・カプサイシンでの細胞の前処理（これは、小さな直径の一次求心性神経細胞からサブスタンスＰを枯渇させる）は、ノシセプチンで誘導される応答を減弱させる。
【００３９】
同様に、Inoueらは、ボツリヌス神経毒素Ａ型の足底内注射が、ノシセプチンにより誘導される応答を廃止することを確認している。ＢｏＮＴが一次求心性神経細胞からのサブスタンスＰの放出を阻害することが公知であるので（Welchら, (2000), Toxicon, 38, 245-258）、これは、ノシセプチン−ＯＲＬ１相互作用とその後のサブスタンスＰの放出との間の関連を確認する。
【００４０】
したがって、ＴＭが侵害受容感覚求心性神経細胞からのサブスタンスＰの放出の誘導を引き起こす場合、ＴＭは、ＯＲＬ１レセプターでアゴニスト活性を有するということができる（実施例１を参照のこと）。
【００４１】
他の実施態様では、オピオイドが、本発明のＴＭの好適な群を示す。エンケファリン（ｍｅｔおよびｌｅｕ）、エンドモルフィン１および２、β−エンドルフィン、ならびにダイノルフィンが、このペプチドファミリー内に含まれる。オピオイドペプチドは、侵害受容器、および疼痛応答に関与する他の細胞に対する活性を改変するために臨床で頻繁に使用される。世界保健機構の３段階徐痛ラダーに例示されるように、オピオイドは、３段階のすべてにおいて慢性の癌および非癌の疼痛の薬理学的治療へのエントリーポイントを有し、これは、疼痛治療への重要性を強調する。オピオイドとは、侵害受容感覚求心性神経への結合能を保持する、そのフラグメント、改変体、および誘導体を含む。本発明のプロテアーゼは、真核細胞においてエキソサイトーシス融合器官の１以上のタンパク質を切断し得るすべての天然に存在する非細胞傷害性プロテアーゼを含む。
【００４２】
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、細菌プロテアーゼである。
【００４３】
より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム属またはナイセリア属から選択される（例えば、クロストリジウムＬ鎖、またはナイセリアＩｇＡプロテアーゼ（好ましくは、N. gonorrhoeae由来））。
【００４４】
本発明はまた、改変非細胞傷害性プロテアーゼを含み、この改変プロテアーゼは、上記プロテアーゼ活性をなお示す限り、天然に存在しないアミノ酸配列および／または合成アミノ酸残基を含む。
【００４５】
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、セリンまたはメタロプロテアーゼ活性（例えば、エンドペプチダーゼ活性）を示す。プロテアーゼは、好ましくは、ＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ、またはシンタキシン）に特異的である。
【００４６】
特に、神経毒素のプロテアーゼドメイン（例えば、細菌神経毒素のプロテアーゼドメイン）について述べられる。したがって、本発明は、天然に存在する神経毒素ドメインの使用、ならびに該天然に存在する神経毒素の組換え調製型を包含する。
【００４７】
例示の神経毒素は、クロストリジウム属によって生成される。そして用語「クロストリジウム神経毒素」は、C. tetaniによって生成される神経毒素（ＴｅＮＴ）およびC. botulinumによって生成される神経毒素（ＢｏＮＴ）血清型Ａ〜Ｇ、ならびにC. baratiiおよびC. butyricumにより生成される密に関連したＢｏＮＴ様神経毒素を含む。上記の略語は、本明細書中を通じて使用する。例えば、ＢｏＮＴ／Ａとの名称は、神経毒素の供給源がＢｏＮＴ（血清型Ａ）であることを示す。他のＢｏＮＴ血清型に対しても、対応する名称が適用される。
【００４８】
用語「Ｌ鎖フラグメント」は、神経毒素のＬ鎖の一構成部分を意味し、このフラグメントは、メタロプロテアーゼ活性を示し、そして細胞エキソサイトーシスに関与する小胞および／または原形質膜に会合したタンパク質をタンパク質分解により切断し得る。
【００４９】
トランスロケーションドメインは、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように、痛みを感じる標的細胞へのプロテアーゼ（またはそのフラグメント）のトランスロケーションを可能にする分子である。どの分子（例えば、タンパク質またはペプチド）が保有するのであっても、本発明の必要なトランスロケーション機能は、多数の従来アッセイの任意の１つによって確認され得る。
【００５０】
例えば、Shone C.（1987）は、試験分子がチャレンジされるリポソームを用いるインビトロアッセイを記載している。必要なトランスロケーション機能の存在は、Ｋ＋および／または標識ＮＡＤのリポソームからの放出によって確認され、これは容易にモニタリングされ得る（Shone C. (1987) Eur. J. Biochem., 167(1)巻, 175-180頁を参照のこと）。
【００５１】
さらなる例は、Blaustein R.（1987）によって提供される。これは、平面リン脂質二層膜を用いる単純なインビトロアッセイを記載している。この膜に試験分子をチャレンジし、そして必要なトランスロケーション機能は、該膜を横断する伝導の増大によって確認される（Blaustein (1987) FEBS Letts., 226巻, 1号, 115-120頁を参照のこと）。
【００５２】
膜融合の評価、およびしたがって、本発明での使用に適したトランスロケーションドメインの同定を可能にするさらなる方法は、Methods in Enzymology 220巻および221巻, Membrane Fusion Techniques, A部およびB部, Academic Press 1993によって提供される。
【００５３】
トランスロケーションドメインは、好ましくは、低ｐＨ条件下で脂質膜中にイオン透過孔を形成し得る。好ましくは、エンドソーム膜内の孔形成が可能なタンパク質分子の部分のみを使用することが見出されている。
【００５４】
トランスロケーションドメインは、微生物タンパク質供給源（特に、細菌またはウイルスタンパク質供給源）から得られ得る。したがって、１つの実施態様では、トランスロケーションドメインは、細菌毒素またはウイルスタンパク質のような酵素のトランスロケーションドメインである。
【００５５】
細菌毒素分子のある種のドメインがこのような孔を形成し得ることは、十分に記載されている。ウイルス発現膜融合タンパク質のある種のトランスロケーションドメインがこのような孔を形成し得ることも公知である。このようなドメインは、本発明において用いられ得る。
【００５６】
トランスロケーションドメインは、クロストリジウム属起源であり得、すなわち、ＨＮドメイン（またはその機能的構成部分）であり得る。ＨＮは、Ｈ鎖のアミノ末端側半分にほぼ等価なクロストリジウム神経毒素のＨ鎖の一部またはフラグメント、または完全なＨ鎖中のそのフラグメントに対応するドメインを意味する。適切なクロストリジウムトランスロケーションドメインの例は、以下を含む：
ボツリヌス菌Ａ型神経毒素−アミノ酸残基（449〜871）
ボツリヌス菌Ｂ型神経毒素−アミノ酸残基（441〜858）
ボツリヌス菌Ｃ型神経毒素−アミノ酸残基（442〜866）
ボツリヌス菌Ｄ型神経毒素−アミノ酸残基（446〜862）
ボツリヌス菌Ｅ型神経毒素−アミノ酸残基（423〜845）
ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素−アミノ酸残基（440〜864）
ボツリヌス菌Ｇ型神経毒素−アミノ酸残基（442〜863）
破傷風菌神経毒素−アミノ酸残基（458〜879）。
【００５７】
ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）および破傷風菌（C. tetani）における毒素生成の遺伝的基礎に関するさらなる詳細については、Hendersonら (1997) The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic pressに参照される。
【００５８】
用語「ＨＮ」は、天然に存在する神経毒素ＨＮ部、および天然に存在しないアミノ酸配列および／または合成アミノ酸残基を有する改変ＨＮ部（ただし、改変ＨＮ部が上記トランスロケーション機能をなお示す限り）を含む。
【００５９】
あるいは、トランスロケーションドメインは、非クロストリジウム属起源であり得る（以下の数表を参照のこと）。非クロストリジウムトランスロケーションドメイン起源の例は、以下を含むが、これらに限定されない：ジフテリア毒素のトランスロケーションドメイン［O'Keefeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206；Silvermanら, J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532；およびLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, 25-51頁］、シュードモナス外毒素Ａ型のトランスロケーションドメイン［Priorら, Biochemistry (1992) 31, 3555-3559］、炭疽菌毒素のトランスロケーションドメイン［Blankeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996）93, 8437-8442］、トランスロケーション機能の種々の融合性または疎水性ペプチド［Plankら, J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924；およびWagnerら, (1992) PNAS, 89, 7934-7938頁］、および両親媒性ペプチド［Murataら, (1992) Biochem., 31, 1986-1992頁］。トランスロケーションドメインは、天然に存在するタンパク質に存在するトランスロケーションドメインを反映し得るか、またはその変化がトランスロケーションドメインのトランスロケーション能を破壊しない限り、アミノ酸変化を含み得る。
【００６０】
本発明での使用に適したウイルストランスロケーションドメインの具体的な例には、ウイルス発現膜融合タンパク質のある種のトランスロケーションドメインが含まれる。例えば、Wagnerら（1992）およびMurataら（1992）は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＮ末端領域に由来する多数の融合性および両親媒性のペプチドのトランスロケーション（すなわち、膜融合および小胞形成）機能を記載している。所望のトランスロケーション活性を有することが公知の他のウイルス発現膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の融合性ペプチドのトランスロケーションドメイン、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質Ｇのトランスロケーションドメイン、ＳＥＲウイルスＦタンパク質のトランスロケーションドメインおよび泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質のトランスロケーションドメインである。ウイルスがコードする「スパイクタンパク質」は、本発明においては特別な適用を有し、例えば、ＳＦＶのＥ１タンパク質およびＶＳＶのＧタンパク質である。
【００６１】
トランスロケーションドメイン（以下に列挙）の使用は、それらの配列改変体の使用を含む。改変体は、１つ以上の保存的な核酸置換および／または核酸欠失もしくは挿入を含み得る。ただし、この改変体は、必要なトランスロケーション機能を保有する。改変体はまた、この改変体が必要なトランスロケーション機能を保有する限り、１つ以上のアミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失もしくは挿入を含み得る。
【００６２】
【数２】
0005536017.tif 000003
【００６３】
一旦可能性のあるレセプターアゴニスト（例えば、ＯＲＬ１アゴニスト）が同定されると、１以上の以下の任意の工程が行われ得る：
（Ａ）推定アゴニスト分子またはアゴニストが、非細胞傷害性プロテアーゼ（またはそのフラグメント）および必要に応じてトランスロケーションドメインに結合して、本発明の結合体を形成し得ることを確認する工程；および／または
（Ｂ）該推定アゴニスト分子またはアゴニストが、レセプターがレセプター媒介エンドサイトーシスを受けやすい、痛みを感じる標的細胞上のレセプターに結合することを確認する工程；および／または
（Ｃ）該推定アゴニスト分子またはアゴニストが、痛みを感じる標的細胞のサイトゾルへの非細胞傷害性プロテアーゼ（またはそのフラグメント）を送達し得ることを確認する工程。
【００６４】
上記工程（Ａ）〜（Ｃ）は、当業者に容易に利用可能な通常の試験によって確認され得る。
【００６５】
例えば、工程（Ａ）は、従来の結合試薬および／またはリンカー分子を用いる単純な化学結合実験により行われ得、次いで天然のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、予想分子量を有する本発明の結合体が形成されることを確認する。結合体構成部分は、代表的には、共有結合によって（必要に応じてリンカー分子を介して）一緒に連結される。
【００６６】
例えば、工程（Ｂ）は、リガンドの結合の評価のためのある範囲の方法のいずれか１つによって行われ得る。標準テキスト、例えば、このようなアプローチを詳細に記載する「Receptor-Ligand Interactions. A Practical Approach. E. C. Hulme編, IRL Press, 1992」が利用可能である。簡単に言えば、アゴニストまたは推定アゴニスト分子は、（例えば、125-ヨウ素で）標識され、そして過剰の非標識アゴニストの存在下でインビトロにて細胞調製物に適用される。非標識材料の目的は、あらゆる非特異的結合部位を飽和させることである。アゴニストを、細胞調製物とともに十分な時間インキュベートして平衡を達成し、そして細胞に結合した標識の量を、例えば、シンチレーションまたはガンマ計数によって細胞に結合した放射活性を測定することにより評価する。
【００６７】
さらなる例として、アゴニスト（または推定アゴニスト）の金標識化、次いで電子顕微鏡を用いて標識されたアゴニストの細胞輸送の進行をモニターすることが含まれる［Rabinowitz S. (1992); J. Cell. Biol. 116(1): 95-112頁に記載の基本的方法；およびvan Deurs (1986); J. Cell. Biol. 102: 37-47頁に記載の基本的方法を参照のこと］。
【００６８】
例えば、工程（Ｃ）は、工程（Ａ）で調製した結合体を適切な標的細胞と接触させ、そしてこの基質の切断を評価することによって行われ得る。これは、ＳＮＡＲＥタンパク質の抽出、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離した試料のウェスタンブロッティングによって行われる。基質の切断は、プロテアーゼの標的細胞への送達を示す。この点で、切断は、基質の消失および／または切断産物の出現によってモニターされ得る。切断された基質産物に選択的に結合する特に有用な抗体が、ＷＯ９５／３３８５０に記載されている。
【００６９】
本発明の結合体の調製を、ここで説明する。
【００７０】
神経毒素分子のＨＣ部がＨＮとして公知のＨ鎖の他の部分から除去され得、そのため、ＨＮフラグメントが神経毒素のＬ鎖に結合したジスルフィドを保持してＬＨＮとして公知のフラグメントを提供することが当該分野で公知である。したがって、本発明の１つの実施態様では、神経毒素のＬＨＮフラグメントは、１以上のスペーサー領域を含み得る連結を用いて、ＴＭに共有結合される。
【００７１】
本発明の他の実施態様では、神経毒素のＨＣドメインは、例えば、化学的改変によって、変異、ブロック、または改変されて、神経筋接合部で神経毒素をレセプターに結合する能力を低減または好ましくは無能力にされる。次いで、この改変された神経毒素は、１以上のスペーサー領域を含み得る連結を用いて、ＴＭに共有結合される。
【００７２】
本発明の他の実施態様では、神経毒素のＨ鎖は、ＨＣドメインが、例えば、化学的改変によって、変異、ブロック、または改変されて、その本来の結合能を低減または好ましくは無能力にされており、この神経毒素のＨ鎖は、異なる神経毒素のＬ鎖、またはエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る他のプロテアーゼ（例えば、N. gonorrhoeaeのＩｇＡプロテアーゼ）と組み合わされる。次いで、このハイブリッドの改変された神経毒素は、１以上のスペーサー領域を含み得る連結を用いて、ＴＭに共有結合される。
【００７３】
本発明の他の実施態様では、神経毒素のＨＮドメインは、異なる神経毒素のＬ鎖、またはエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る他のプロテアーゼ（例えば、N. gonorrhoeaeのＩｇＡプロテアーゼ）と組み合わされる。次いで、このハイブリッドは、１以上のスペーサー領域を含み得る連結を用いて、ＴＭに共有結合される。
【００７４】
本発明の他の実施態様では、プロテアーゼ（例えば、神経毒素のＬ鎖構成部分）は、１以上のスペーサー領域を含み得る連結を用いて、関連の標的細胞の細胞質中へのプロテアーゼの内在化もまた生じ得るＴＭに共有結合される。
【００７５】
本発明の他の実施態様では、プロテアーゼ（例えば、神経毒素のＬ鎖構成部分）は、１以上のスペーサー領域を含み得る連結を用いて、サイトゾル中へのプロテアーゼフラグメントの輸送を行うためのトランスロケーションドメインに共有結合される。
【００７６】
使用に際して、本発明による結合体のドメインは、互いに結合される。１つの実施態様では、２以上のドメインは、直接（例えば、共有結合によって）またはリンカー分子を介してのいずれかで一緒に結合され得る。
【００７７】
種々の異なるリンカー／スペーサー分子は、本発明の融合タンパク質のいずれかに用いられ得る。このようなスペーサー分子の例としては、図３１および３２に示される分子が挙げられる。ここでは、特に、ＧＳ１５、ＧＳ２０、ＧＳ２５、およびＨｘ２７について述べられる。図３１および３２を参照のこと。
【００７８】
予想外に、本発明者らは、スペーサーの大きさが、（使用に際して）ＴＭ（好ましくは、そのＣ末端）とトランスロケーションドメイン（好ましくは、そのＮ末端）とが互いに４０〜１０５オングストローム、好ましくは５０〜１００オングストローム、そしてより好ましくは５０〜９０オングストローム離れているように選択される場合、非細胞傷害性プロテアーゼ−ＴＭ結合体（例えば、ＣＰＮｖ／Ａ）が、侵害受容感覚求心性神経に対する結合活性の改善を示し得ることを見出した。別の実施態様では、好ましいスペーサーは、１１〜２９アミノ酸残基、好ましくは１５〜２７アミノ酸残基、そしてより好ましくは２０〜２７アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。適切なスペーサーは、Crasto, C.J.およびFeng, J.A. (2000) 5月; 13(5);309-312頁（http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html.もまた参照のこと）に従って、通常通りに同定および入手され得る。
【００７９】
本発明における使用に適切な結合技術は、十分に文献に記載され、そして当業者には通常である。
【００８０】
２つのタンパク質分子（ＡおよびＢ）を一緒に結合することに関する方法は単純であり、そして架橋剤（化学的カップリング剤としても公知）の使用により達成される。例えば、分子ＡおよびＢを、別々に架橋剤と接触させ、分子ＡおよびＢのそれぞれの特異的な表面基を化学的に改変し、それによって誘導体化分子Ａ’およびＢ’を形成する。分子Ａ’の改変表面基は、分子Ｂ’の改変表面基と共有結合し得る。したがって、２つのタンパク質分子Ａ’およびＢ’を一緒に混合することによって、カップリング反応が完了する。
【００８１】
化学的結合を、以下の実施態様を参照して説明する：ここで、Ｐ＝非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分、Ｔ＝トランスロケーション構成部分、およびＴＭ＝ターゲティング部分である。
【００８２】
１つの実施態様では、単鎖Ｐ−Ｔを調製し、次いで、これはＴＭに結合される。他の実施態様では、単鎖ＴＭ−Ｔ（またはＴ−ＴＭ）を調製し、次いで、これはＰに結合される。さらなる実施態様では、単鎖Ｐ−ＴＭ（またはＴＭ−Ｐ）を調製し、次いで、これはＴに結合される。他の特に好ましい結合体は、（ＰとＴＭとの間の任意のプロテアーゼ切断部位とともに）構造Ｐ−ＴＭ−Ｔを有する。
【００８３】
ＴおよびＰ構成部分が単鎖ポリペプチドとして調製される場合、プロテアーゼ切断部位は、代表的には、該構成部分間に含まれる。いかなるプロテアーゼ切断部位も、この点で用いられ得る。
【００８４】
代わりの実施態様では、３つの構成部分が、同時にまたは連続して一緒に結合され得る。したがって、結合は、１段階または２段階プロセスであり得、そして１以上の異なるカップリング剤が含まれ得る。
【００８５】
化学的カップリング剤および架橋剤は、長年市販されている。
【００８６】
本発明の実施例５には、２つのタンパク質分子（ノシセプチン、およびボツリヌス神経毒素のＬＨＮ）を化学的に結合するための１つのこのようなカップリング剤（すなわち、ＳＰＤＰ）の使用が詳細に記載されている。２つの分子を、別々にＳＰＤＰと接触させ、次いで一緒に混合して共有結合させる。
【００８７】
実施例６に記載の結合体は、他のカップリング剤であるＰＤＰＨ／ＥＤＡＣまたはトラウト試薬が、ＳＰＤＰの代替のカップリング剤として用いられ得ることを確認する。
【００８８】
ＳＰＤＰおよびトラウト試薬は、タンパク質結合化学の技術分野では一般的かつ十分に記載されたカップリング剤であり、そして単に、本発明の結合体のターゲティング部分構成部分およびクロストリジウム神経毒素構成部分を一緒に共有結合するために用いられ得る周知のクラスの化合物の２つの例として、本明細書で示されている。他の適切な薬剤としては、ＳＭＰＢ、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート）、およびＬＣ−ＳＰＤＰが挙げられる。
【００８９】
より詳細には、周知のカップリング剤の市販のメンバーは、本発明の結合体を生成する目的に使用され得る。このような薬剤の詳細は、以下の刊行物に見られ得る：
Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press；
Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press；
Thorpeら (1987), Cancer Res, 1987, 47, 5924-31。この文献は、ＳＭＢＴ（S-4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチルベンジルチオ硫酸ナトリウム）およびＳＭＰＴ（4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α(2-ピリジルジチオ)トルエン）の使用を記載する；および
Peetersら (1989), J Immunol Methods. 1989, 120, 133-43。この文献は、４つのカップリング試薬：ＭＨＳ（スクシンイミジル6-(N-マレイミド)-n-ヘキサノエート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート）、ＭＢＳ（スクシンイミジルm-マレイミドベンゾエート）、およびＳＰＤＰの使用を記載する。
【００９０】
本発明による結合体はまた、実施例９〜１２に詳述するように、組換えにより調製され得る。
【００９１】
１つの実施態様では、組換え結合体の調製は、１つの遺伝子構築物中での選択したＴＭ、選択した非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分、およびトランスロケーション構成部分のコード配列の（任意の順での）配置を含む。これらのコード配列は、フレームを合わせて配置され得、そのためそれに続く転写および翻訳が、両方のコード配列を通して連続的であり融合タンパク質を生じる。すべての構築物は、Ｎ末端メチオニンをコードする５’ＡＴＧコドンおよびＣ末端翻訳停止コドンを有する。
【００９２】
したがって、組換え調製方法により、単鎖ポリペプチドが生成される。このポリペプチドを活性化するために、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分との間に、プロテアーゼ切断部位が存在する。この部位の切断は、二本鎖ポリペプチドを生成し、この二本鎖ポリペプチドでは、プロテアーゼドメインおよびトランスロケーションドメインが共有結合、好ましくはジスルフィド結合によって一緒に連結される。この点で、いかなるプロテアーゼ切断部位も用いられ得る。
【００９３】
本発明の単ポリペプチド局面において、ＴＭは、好ましくは、融合タンパク質に対してＮ末端側またはＣ末端側のいずれかに位置する。言い換えれば、ＴＭが単ポリペプチド融合タンパク質のＰ構成部分とＴ構成部分との間に位置しないことが好ましい。特に好ましい実施態様では、ＴＭは、融合タンパク質に対してＮ末端側に位置する。
【００９４】
１つの実施態様では、クロストリジウム神経毒素のＬ鎖またはエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る他のプロテアーゼ（例えば、ＩｇＡプロテアーゼ）またはそのフラグメント／改変体は、ＴＭとの融合タンパク質として組換え発現され得る。このＴＭはまた、分泌の原因となる関連の標的細胞の細胞質へのＬ鎖構成部分の内在化をもたらし得る。あるいは、融合タンパク質は、トランスロケーションドメインをさらに含み得る。発現した融合タンパク質は、１以上のスペーサー領域を含み得る。
【００９５】
一例として、以下の情報は、本発明の薬剤を組換えにより生成するために必要とされる：
（Ｉ）選択したＴＭに関するＤＮＡ配列データ；
（II）プロテアーゼ構成部分に関するＤＮＡ配列データ；
（III）トランスロケーションドメインに関するＤＮＡ配列データ；および
（IV）（Ｉ）、（II）および（III）を含む構築物の構築および発現を可能にするためのプロトコル。
【００９６】
上記の基本情報（Ｉ）〜（IV）のすべては容易に利用可能であるか、または従来の方法によって容易に決定可能である。例えば、ＷＯ９８／０７８６４およびＷＯ９９／１７８０６の両方とも、本出願での使用に適切な組換え技術を例示する。
【００９７】
さらに、本発明の構築物の構築および発現の方法は、以下の参照文献などからの情報を用い得る：
Lorberboum-Galski, H., FitzGerald, D., Chaudhary, V., Adhya, S., Pastan, I. (1988), Cytotoxic activity of an interleukin 2-Pseudomonas exotoxin chimeric protein produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85(6):1922-6；
Murphy, J.R. (1988), Diphtheria-related peptide hormone gene fusions: a molecular genetic approach to chimeric toxin development. Cancer Treat. Res.; 37:123-40；
Williams, D.P., Parker, K., Bacha, P., Bishai, W., Borowski, M., Genbauffe, F., Strom, T.B., Murphy, J.R. (1987), Diphtheria toxin receptor binding domain substitution with interleukin-2: genetic construction and properties of a diphtheria toxin-related interleukin-2 fusion protein. Protein Eng;1(6):493-8；
Arora, N., Williamson, L.C., Leppla, S.H., Halpern, J.L. (1994), Cytotoxic effects of a chimeric protein consisting of tetanus toxin light chain and anthrax toxin lethal factor in non-neuronal cells J. Biol. Chem., 269(42):26165-71；
Brinkmann, U., Reiter, Y., Jung, S.H., Lee, B., Pastan, I. (1993), A recombinant immunotoxin containing a disulphide-stabilized Fv fragment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(16):7538-42；および
O'Hare, M., Brown, A.N., Hussain, K., Gebhardt, A., Watson, G., Roberts, L.M., Vitetta, E.S., Thorpe, P.E., Lord, J.M. (1990), Cytotoxicity of a recombinant ricin-A-chain fusion protein containing a proteolytically-cleavable spacer sequence. FEBS Lett 10月29日;273(1-2):200-4。
【００９８】
Ｌ鎖およびＬＨＮ鎖に関する適切なクロストリジウム神経毒素配列情報は、例えば、Kurazono, H. (1992) J. Biol. Chem., 267巻, 21号, 14721-14729頁；およびPopoff, M.R.およびMarvaud, J.-C. (1999) The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, 第2版（Alouf, J.E.およびFreer, J.H.編）, Academic Press, 174-201頁から得られ得る。
【００９９】
上記刊行物のすべては、参照文献として本明細書中に援用される。
【０１００】
同様に、適切なＴＭ配列データは、当該技術分野で広く入手可能である、あるいは、任意の必要な配列データは、当業者に周知の技術によって得られ得る。
【０１０１】
例えば、ＴＭ構成部分をコードするＤＮＡは、正確なコード領域についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし（例えば、公知の配列情報に基づく特定のオリゴヌクレオチドを用いてライブラリーをプローブすることにより）、ＴＭのＤＮＡを単離し、このＤＮＡを確認の目的で配列決定し、次いで選択した宿主中での発現に適切な発現ベクター中に単離したＤＮＡを配置することによって、供給源生物からクローニングされ得る。
【０１０２】
ライブラリーからの配列の単離の代替として、利用可能な配列情報を用いて、ＰＣＲにおける使用のための特異的プライマーを調製し得、それにより、次いでコード配列を供給源材料から直接増幅し、そしてプライマーの適切な使用により、発現ベクター中に直接クローニングし得る。
【０１０３】
コード配列の単離のための他の代替方法は、既存配列情報を使用し、そしてＤＮＡ合成技術を用いて、可能であれば変化を組み込んで、コピーを合成することである。例えば、ＤＮＡ配列データは、既存タンパク質および／またはＲＮＡ配列情報から生成され得る。ＤＮＡ合成技術を用いてこのようにすること（および上記の代替）により、コード配列のコドン偏位を選択した発現宿主に最適であるように改変できる。これは、融合タンパク質の優れた発現レベルを生じ得る。
【０１０４】
発現宿主に対するコドン偏位の最適化は、構築物のＴＭ構成部分およびクロストリジウム構成部分をコードするＤＮＡ配列に適用され得る。コドン偏位の最適化は、自由に利用可能なＤＮＡ／タンパク質データベースソフトウエア（例えば、Genetics Computer Group, Inc.から入手可能なプログラム）にタンパク質配列を適用することによって可能である。
【０１０５】
本発明の結合体を調製すると、種々のドメインが特定された機能を保持することを確認することが通常のことになる。
【０１０６】
結合後のプロテアーゼ機能は、例えば、以下の通常の試験のいずれか１つを用いることにより試験され得る：
【０１０７】
ＳＮＡＰ−２５（またはシナプトブレビン、またはシンタキシン）は、試験されるべき結合体がチャレンジされ、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥペプチド分離技術によって分析され得る。ＳＮＡＰ−２５（または神経分泌機構の他の構成部分）の切断された産物に対応する分子量を有するペプチドの（例えば、銀染色による）その後の検出により、機能的Ｌ鎖の存在を確認する。
【０１０８】
さらなる代替として、結合体は、抗体特異的結合によりＳＮＡＰ−２５（またはシナプトブレビン、またはシンタキシン）切断産物についてアッセイすることによって試験され得る（ＷＯ９５／３３８５０を参照のこと）。より詳細には、特異的抗体がＳＮＡＰ−２５の切断を検出するために用いられる。抗体は、切断されたＳＮＡＰ−２５を認識するが、非切断ＳＮＡＰ−２５を認識しないので、抗体による切断された産物の同定は、Ｌ鎖タンパク質分解機能の存在を確認する。例示として、このような方法は、ＷＯ９６／３３２７３の実施例２および３に記載される。
【０１０９】
結合後のトランスロケーション構成部分の機能は、例えば、以下の通常の試験のいずれか１つを用いて試験され得る：
【０１１０】
適切な方法は、例えば、Shoneら (1987) Eur. J. Biochem. 167, 175-180頁；およびBlausteinら (1987) FEBS 226 (1), 115-120頁に記載される。
【０１１１】
Shoneらの方法は、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）および放射標識ＮＡＤを搭載する人工リポソームを用いる。Ｋ＋およびＮＡＤのリポソームからの放出は、チャンネル形成活性についての陽性の結果と相関し、したがってトランスロケーション活性と相関する。この点で、リポソームからのＫ＋の放出は、電極を用いて測定され得、そしてＮＡＤ放出は、上清中の放射活性を測定することによって算定される（176頁の１欄の33行〜２欄の17行を参照のこと）。
【０１１２】
Blausteinらの方法は、平面リン脂質二層膜を用い、これは、チャンネル形成活性について試験するために使用される。より詳細には、膜のいずれかの側における塩溶液を、異なるｐＨ（シス側でｐＨ４．７〜５．５およびトランス側でｐＨ７．４）に緩衝化する。試験されるべき「結合体」を、膜のシス側に添加し、そして電気計測を、膜を横切る電流の流れをモニターするために電圧固定条件下で行う（2.2章、116〜118頁を参照のこと）。活性なトランスロケーション機能の存在は、一定速度のチャンネルターンオン（すなわち、チャンネル形成についての陽性の結果）により確認される（3章、118頁を参照のこと）。
【０１１３】
結合後のターゲティング部分（ＴＭ）機能は、ＴＭに固有のアゴニスト機能についてアッセイすることにより試験され得る。適切な方法としては、実施例１に記載の方法が挙げられる。
【０１１４】
本発明の結合体が侵害受容求心性細胞からのサブスタンスＰ放出を阻害する能力は、実施例１５に記載の方法を用いて評価され得る。
【０１１５】
実施例１５において、本発明の第１の局面によるノシセプチン−ＬＨＮ／Ａ結合体は、一次侵害受容感覚求心性神経細胞からのサブスタンスＰの放出を阻害する能力について評価される。表１からわかるように、結合体と侵害受容求心性神経細胞の培養物とのインキュベーションにより、サブスタンスＰの放出が顕著に阻害される（細胞とＬＨＮ／Ａ単独とのインキュベーションと比較した場合）。したがって、実験は、結合体がこれらの細胞からのサブスタンスＰ放出を阻害していることを確認する。
【０１１６】
本発明の使用に際して、痛みを感じる標的細胞が選択され、この細胞では、エキソサイトーシス融合のプロセスを低減または阻害することが所望され、エキソサイトーシスプロセスは、痛覚に関連する徴候の原因である。例えば、問題の標的細胞は、望ましくない表現型（例えば、望ましくない分泌、または望ましくない濃度の膜レセプター、トランスポーター、もしくは膜チャンネルの発現）を示し、これは、疼痛に関連する徴候の原因である。あるいは、エキソサイトーシス融合のプロセスが痛覚の原因である標的細胞が選択され得る。
【０１１７】
本発明の好適な実施態様では、標的細胞は、侵害受容感覚求心性細胞、好ましくは一次侵害受容求心性細胞である（例えば、Ａδ−線維のようなＡ−線維またはＣ−線維）。したがって、本発明の結合体は、侵害受容感覚求心性神経細胞の離散した集団からの神経伝達物質または神経調節物質（例えば、グルタミン酸、サブスタンスＰ、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、および／または神経ペプチドＹ）の放出を阻害し得る。使用に際して、結合体は、末梢から中枢の疼痛線維への感覚求心性シグナル（例えば、神経伝達物質または神経調節物質）の伝達を低減または抑制し、したがって疼痛、特に慢性疼痛の治療のための治療分子としての適用を有する。
【０１１８】
ＴＭが侵害受容感覚求心性神経に結合することを確認することは通常のことである。例えば、侵害受容感覚求心性神経の代表的な組織または細胞（例えば、ＤＲＧ）が、過剰の非標識リガンドの存在下で標識（例えば、トリチウム化）リガンドに曝露される簡単な放射能置換実験が、用いられ得る。このような実験において、非特異的結合および特異的結合の相対的割合を求め、それにより、リガンドが侵害受容感覚求心性標的細胞に結合することの確認が可能になり得る。必要に応じて、アッセイは、１つ以上の結合アンタゴニストを含み得、そしてこのアッセイは、リガンド結合の喪失を観察する工程をさらに含み得る。このタイプの実験の例は、Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, 概要, 303〜311頁, Receptor biochemistry, A Practical Approach, E.C. Hulme編, Oxford University Pressに見出され得る。
【０１１９】
第２の局面によれば、本発明は、侵害受容感覚求心性細胞におけるエキソサイトーシス融合の阻害または低減のための非細胞傷害性結合体を提供し、この結合体は、
（ｉ）ターゲティング部分（ＴＭ）であって、該ＴＭが、該侵害受容感覚求心性細胞上に存在するレセプターのアゴニストであり、そして該レセプターが、エンドサイトーシスを受けて該侵害受容感覚求心性細胞内のエンドソームに取り込まれる、ＴＭ；
（ii）非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列であって、該侵害受容感覚求心性細胞において発現可能であり、そして発現した場合に、該侵害受容感覚求心性細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得るプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント提供する、ＤＮＡ配列；および
（iii）トランスロケーションドメインであって、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該侵害受容感覚求心性細胞へと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをコードする該ＤＮＡ配列をトランスロケートする、トランスロケーションドメイン、
を含む。
【０１２０】
好適な実施態様では、レセプターは、ＯＲＬ１レセプターである。
【０１２１】
目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、Cottonら（Cotton, M., Wagner, E.およびBirnstiel, L. (1993) Receptor-mediated transport of DNA into eukaryotic cells. Methods in Enzymol. 217, 619-645）によって確認されるように、タンパク質−ＤＮＡ結合体のレセプター媒介エンドサイトーシスにより真核細胞にトランスフェクトされ得る。ポリカチオン性リガンドを用いて適切なサイズにＤＮＡを凝縮するためのいくつかの方法が存在する。これらとしては、ポリリジン、種々のカチオン性ペプチドおよびカチオン性リポソームが挙げられる。これらのうち、ポリリジンを、本研究で使用した。レセプター媒介トランスフェクション研究における成功した報告で使用されているからである（Cottonら, 1993）。
【０１２２】
非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分をコードするＤＮＡ配列は、薬剤の一部として（例えば、コード領域の上流のプロテアーゼＤＮＡ配列の一部として）存在する作動可能に連結したプロモーターの制御下で発現され得る。あるいは、標的細胞におけるプロテアーゼ構成部分の発現は、標的細胞に存在するプロモーターに依存し得る。
【０１２３】
プロテアーゼ構成部分をコードするＤＮＡ配列は、標的細胞のＤＮＡ配列に組み込まれ得る。１以上の組み込み部位が、結合体の一部として（例えば、プロテアーゼＤＮＡ配列の一部として）提供され得る。
【０１２４】
本発明のこの第２の局面のＴＭ、トランスロケーションドメイン、およびプロテアーゼ構成部分は、本発明の第１の局面について定義されたものと同様である。実施例１３および１４は、本発明の第２の局面による結合体の調製を記載する。
【０１２５】
第３の局面によれば、本発明は、本発明の第１および／または第２の局面による結合体を含む薬学的組成物を提供する。
【０１２６】
薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、および／または適切な希釈剤および／または賦形剤をさらに含み得るが、組成物の的確な形態は、投与様式に合わせられ得る。投与は、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトに対してである。
【０１２７】
組成物の構成成分は、例えば、吸入用にエアロゾルまたは噴霧液の形態で、あるいは非経口投与、関節内投与、または頭蓋内投与用に滅菌溶液の形態で用いられ得る。
【０１２８】
組成物はまた、ポンプシステムの使用を含む、静脈内注射により投与され得る。脊髄注射（例えば、硬膜外注射もしくは髄腔内注射）または留置ポンプもまた使用され得る。
【０１２９】
本発明の構成部分の投与のための投薬量範囲は、所望の治療効果を生じる投薬量範囲である。必要投薬量範囲は、構成部分の正確な性質、投与経路、処方の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度、もしくは重篤度、禁忌（ある場合）、および主治医の判断に依存することが理解される。
【０１３０】
適切な一日投薬量（各構成部分について）は、０．０００１〜１ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．００２〜０．５ｍｇ／ｋｇ、および特に好ましくは０．００４〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。単位投薬量は、１μｇ未満から３０ｍｇまでの間で変動し得るが、代表的には一投与あたり０．０１〜１ｍｇの範囲内であり、これは、毎日、または好ましくは頻度を下げて（例えば、毎週または半年毎に）投与され得る。
【０１３１】
特に好ましい投薬レジメは、１×の用量として２．５ｎｇの融合タンパク質（例えば、ＣＰＮｖ／Ａ）に基づく。これに関して、好ましい投薬量は、１×〜１００×（すなわち、２．５〜２５０ｎｇ）の範囲内である。この投薬量範囲は、他のタイプの鎮痛分子（例えば、ＮＳＡＩＤＳ、モルヒネ、およびガバペンチン）で用いられるよりも有意に低い（すなわち、少なくとも１０倍、代表的には１００倍低い）。さらに、上記差異は、モル基準で同じ比較がなされる場合に有意に拡大される。これは、本発明の融合タンパク質が、従来の「小さな」分子治療剤よりも相当に大きなＭｗを有するからである。
【０１３２】
しかしながら、必要投薬量に広範な変動があることは、構成部分の正確な性質および種々の投与経路の異なる効率に依存して予想されることである。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い投薬量が必要であることが予想される。
【０１３３】
これらの投薬量レベルの変動は、当該分野で周知であるように、最適化のために標準的な経験的作業を用いて調整され得る。
【０１３４】
注射に適した組成物は、溶液、懸濁液、もしくは乳濁液、または使用前に適切なビヒクル中に溶解もしくは懸濁される乾燥粉末の形態であり得る。
【０１３５】
液状単位投薬剤形は、代表的には、発熱性物質除去滅菌ビヒクルを利用して調製される。
【０１３６】
活性成分は、使用するビヒクルおよび濃度に依存して、そのビヒクル中に溶解または懸濁され得る。
【０１３７】
溶液は、非経口投与の全ての剤形に使用され得、特に静脈内注射に使用される。溶液を調製する際、構成成分はビヒクル中に溶解され得、溶液は、必要に応じて塩化ナトリウムの添加により等張にされる。そして無菌技術を用いて滅菌フィルターを通して濾過することにより滅菌され、次いで適切な滅菌バイアルまたはアンプル中に充填し、密封され得る。あるいは、溶液安定性が十分である場合、その密封容器中の溶液は、オートクレーブによって滅菌され得る。
【０１３８】
好都合には、添加剤（例えば、緩衝化剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤もしくは殺菌剤、懸濁化剤もしくは乳化剤、および／または局所麻酔剤）がビヒクル中に溶解され得る。
【０１３９】
使用前に適切なビヒクル中に溶解または懸濁される乾燥粉末は、滅菌区域で無菌技術を用いて、予め滅菌しておいた薬物および他の成分を滅菌容器中に充填することにより調製され得る。
【０１４０】
あるいは、組成物の構成成分は、水性ビヒクル中に溶解され得、この溶液は、濾過により滅菌され、そして滅菌区域で無菌技術を用いて適切な容器中に分配される。製品は、次いで凍結乾燥され、そして容器は、無菌下で密封される。
【０１４１】
筋肉内注射、皮下注射、または皮内注射に適切な非経口投与用懸濁液は、滅菌構成成分を溶解する代わりに滅菌ビヒクル中に懸濁しそして滅菌が濾過によって達成できないことを除いて、実質的に同様にして調製される。構成成分は、滅菌状態で単離され得るか、あるいは単離後に（例えば、ガンマ照射によって）滅菌され得る。
【０１４２】
好都合には、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン）が、構成成分の均一な分布を促進するために、組成物中に含まれる。
【０１４３】
気道を介する投与に適した組成物としては、エアロゾル、噴霧液、または吸入用微細粉末が挙げられる。後者の場合、粒径は、５０ミクロン未満、特に１０ミクロン未満が好ましい。このような組成物は、従来の様式で作製され、そして従来の投与デバイスと併用して用いられ得る。
【０１４４】
本発明に記載の組成物は、エキソサイトーシス（例えば、分泌、または細胞の原形質膜へのレセプター、トランスポーター、および膜チャンネルのようなタンパク質の送達）に関連する症状の治療のために、直接または薬学的に受容可能な塩としてのいずれかで、インビボで使用され得る。
【０１４５】
第４の局面によれば、本発明は、本発明の第１または第２の局面による結合体をコードするＤＮＡ構築物を提供する。
【０１４６】
宿主細胞において構築物を発現することによって、本発明の結合体が調製され得る。
【０１４７】
第５の局面によれば、本発明は、本発明の第１〜第４の局面による結合体、組成物、または構築物、あるいはそれらの任意の組み合わせの、患者への投与による疼痛の治療方法を提供する。
【０１４８】
好適な実施態様では、本発明は、慢性疼痛の治療方法を提供する。
【０１４９】
第６の局面によれば、本発明は、疼痛、好ましくは慢性疼痛の治療のための医薬品の製造のための、本発明の第１〜第４の局面による結合体、組成物、または構築物の使用を提供する。
【０１５０】
定義の節
エキソサイトーシス融合は、細胞内分子が、痛みを感じる標的細胞のサイトゾルからその原形質（すなわち、細胞）膜へ輸送されるプロセスである。その後、細胞内分子は、原形質膜の外表面上に提示されるようになり得るか、または細胞外環境中に分泌され得る。
【０１５１】
健常個体では、エキソサイトーシス融合の速度は注意深く調節され、そして痛みを感じる細胞のサイトゾルと原形質膜との間での分子の輸送を制御する。例えば、エキソサイトーシス回路の調節は、細胞の表面に存在するレセプター、トランスポーター、または膜チャンネルの密度を制御し、および／または細胞のサイトゾルからの細胞内構成成分（例えば、神経伝達物質）の分泌速度を制御する。
【０１５２】
しかし、非健常個体では、エキソサイトーシス融合の調節は改変され得る。例えば、エキソサイトーシス融合は、影響を受けた痛みを感じる細胞を過剰分泌の状態に入らせ得る。あるいは、エキソサイトーシス融合により、痛みを感じる細胞の表面に存在するレセプター、トランスポーター、または膜チャンネルを増加された濃度で提示し得、これは、細胞を望ましくない外部刺激に曝露し得る。したがって、エキソサイトーシス融合のプロセスは、疼痛の進行および／または重篤度に寄与し得、したがって、治療的介入のための標的を提供する。
【０１５３】
そうでなければ、細胞のエキソサイトーシス融合の正常速度が、易感染性患者における疼痛の進行および重篤度に寄与し得ることもまた理解されるべきである。したがって、本発明によりエキソサイトーシス融合をターゲティングすることによって、このような患者における治療もまた提供し得る。
【０１５４】
ターゲティング部分（ＴＭ）は、結合体と痛みを感じる標的細胞の表面との間に物理的会合を引き起こすように、レセプター（例えば、ＯＲＬ１レセプター）と機能的に相互作用する結合体と会合する任意の化学的構造を意味する。用語「ＴＭ」は、標的細胞上のレセプターに結合し得る任意の分子（すなわち、天然に存在する分子、またはそれらの化学的／物理的に改変された改変体）を含み、レセプターは、内在化（例えば、エンドソーム形成）（これは、レセプター媒介エンドサイトーシスとも呼ばれる）を行い得る。ＴＭは、エンドソーム膜トランスロケーションドメインを保有し得、この場合、本発明の薬剤に、ＴＭ構成部分とトランスロケーションドメイン構成部分とが別々に存在する必要はない。
【０１５５】
用語「フラグメント」とは、目的のＴＭの少なくとも３５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも１５、および最も好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基を有するペプチドを意味する。１つの実施態様では、フラグメントの最初のアミノ酸残基は、フラグメントが由来するＴＭのＮ末端アミノ酸残基である。
【０１５６】
「改変体」の例は、１以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸）または置換した結合を含むＴＭのペプチドまたはペプチドフラグメントである。
【０１５７】
「誘導体」は、目的のＴＭ、およびさらなるペプチド配列を含む。さらなるペプチド配列は、好ましくは、ＴＭの塩基折り畳みおよびこのような立体配座構造を妨害すべきでない。２以上のペプチド（またはフラグメント、または改変体）は、一緒に結合されて誘導体を形成し得る。あるいは、ペプチド（またはフラグメント、または改変体）は、関連のない分子（例えば、第２の非関連ペプチド）に結合され得る。誘導体は、化学的に合成され得るが、代表的には組換え核酸方法によって調製される。脂質、および／または多糖、および／またはポリケチド構成部分のような追加の構成部分が含まれ得る。
【０１５８】
用語「非細胞傷害性」は、問題のプロテアーゼ分子が、それがリターゲティングされた痛みを感じる標的細胞を殺傷しないことを意味する。
【０１５９】
本発明の「プロテアーゼ切断部位」は、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分とＴＭ構成部分との間の位置で結合体の切断（好ましくは、制御された切断）を可能にする。１つの実施態様では、結合体は、１より多くのタンパク質分解切断部位を含み得る。しかし、２以上のこのような部位が存在する場合、それらは、別のものであり、それにより、単一のプロテアーゼの存在下で複数の切断事象が生じることが実質的に防止される。別の実施態様では、結合体は、単一のプロテアーゼ切断部位を有することが好ましい。プロテアーゼ切断配列は、従来の手段（例えば、部位特異的変異誘発）によってＤＮＡレベルで導入（および／または任意の固有切断配列が除去）され得る。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは、手動またはコンピューターソフトウエア（例えば、DNASTAR, Inc.によるMapDrawプログラム）の補助のもとに行われ得る。
【０１６０】
任意のプロテアーゼ切断部位が用いられ得るが、以下が好ましい：
エンテロキナーゼ                （ＤＤＤＤＫ↓）
第Ｘａ因子                      （ＩＥＧＲ↓／ＩＤＧＲ↓）
ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）  （ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ）
トロンビン                      （ＬＶＰＲ↓ＧＳ）
PreScission                     （ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）。
【０１６１】
用語「プロテアーゼ切断部位」には、インテイン（これは自己切断性配列である）も包含される。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変更することによって、制御可能である。
【０１６２】
本発明を、以下の実施例および図面を参照して説明するが、これらに限定することを意図しない。
【０１６３】
図面を、より詳細に説明する。
【０１６４】
図１：ｒｅｃＬＨＮ／Ｂ融合タンパク質の発現および精製
大腸菌からのｒｅｃＬＨＮ／Ｂの発現および精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。図１において、ｒｅｃＬＨＮ／Ｂは、実施例３に記載のように３カラムの方法を用いて細胞ペーストから精製する。タンパク質試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてシンプリーブルーセーフステインクマシー試薬での染色によって可視化する。浄化した抽出物内に含まれる粗可溶性ＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｂ融合タンパク質（レーン２）を、Ｑ−セファロースＦＦアニオン交換樹脂に供する。レーン３は、１５０〜２００ｍＭの塩でカラムから溶出した組換えＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｂ融合物を示す。この試料を、第Ｘａ因子プロテアーゼで処理してＭＢＰアフィニティータグを除去し（レーン４）、そして切断した混合物をより低い塩濃度に希釈して、Ｑ−セファロースＦＦアニオン交換カラムに供する。１２０〜１７０ｍＭの塩で溶出した材料は、ＬＨＮ／Ｂリッチであった（レーン５）。レーン６および８のタンパク質は、それぞれ非還元および還元条件下で、エンテロキナーゼでの処理およびベンズアミジンセファロースを用いる最終精製後に収穫したＬＨＮ／Ｂを示す。レーン１および７は、分子量マーカー［Mark 12（Invitrogen）］を示す。
【０１６５】
図２：ＬＨＮ／Ｃ融合タンパク質の発現および精製
大腸菌からのＬＨＮ／Ｃの発現および精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。図２において、ｒｅｃＬＨＮ／Ｃは、実施例４に記載の２段階方法を用いて大腸菌細胞ペーストから精製する。タンパク質試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてクマシーブルーでの染色によって可視化する。浄化した粗細胞溶解物（レーン２）を、Ｑ−セファロースＦＦアニオン交換樹脂に供する。融合タンパク質であるＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｃを、０．１ＭのＮａＣｌで溶出する（レーン３）。溶出した材料を、第Ｘａ因子プロテアーゼ（New England Biolabs）とともに２２℃にて１６時間インキュベートして、融合タグＭＢＰを切断しそしてリンカー部位でｒｅｃＬＨＮ／Ｃに切り目を入れる。目的のタンパク質を、切断した融合産物（レーン４）からＱ−セファロースＦＦを用いてさらに精製する。レーン５および７は、それぞれ非還元条件および１０ｍＭのＤＴＴでの還元条件下で精製したｒｅｃＬＨＮ／Ｃを示し、第Ｘａ因子で切り目を入れた後にＬＣドメインとＨＮドメインとの間のリンカー領域でのジスルフィド結合を示す。レーン１および６は、分子量マーカー、Mark 12（Invitrogen）を示す（ＫＤａで示す）。
【０１６６】
図３：Ｎ［１−１７］−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質の発現および精製
大腸菌からのＮ［１−１７］−ＬＨＮ／Ａの発現および精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。図３において、Ｎ［１−１７］−ＬＨＮ／Ａは、実施例９に概説する方法を用いて大腸菌ＢＬ２１細胞ペーストから精製する。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウェスタンブロッティング（パネルＢ）によって評価した。抗ノシセプチン抗血清（Abcamから入手）をウェスタンブロッティングの一次抗体として用いた。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
【０１６７】
図４：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製
実施例２６に概説する方法を用いて、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質を大腸菌ＢＬ２１細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウェスタンブロッティング（パネルＢ）によって評価した。抗ノシセプチン抗血清（Abcamから入手）をウェスタンブロッティングの一次抗体として用いた。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
【０１６８】
図５：ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製
実施例２６に概説する方法を用いて、ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質を大腸菌ＢＬ２１細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウェスタンブロッティング（パネルＢ）によって評価した。抗ノシセプチン抗血清（Abcamから入手）をウェスタンブロッティングの一次抗体として用いた。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
【０１６９】
図６：ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の精製
実施例２６に概説する方法を用いて、ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質を大腸菌ＢＬ２１細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）およびウェスタンブロッティング（パネルＢ）によって評価した。抗ノシセプチン抗血清（Abcamから入手）をウェスタンブロッティングの一次抗体として用いた。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
【０１７０】
図７：ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製
実施例２６に概説する方法を用いて、ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質を大腸菌ＢＬ２１細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
【０１７１】
図８：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質およびノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の結合効力の比較
ノシセプチン融合物がＯＲＬ１レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を１ｎＭ［３Ｈ］−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射標識リガンドの特異的結合の減少を、シンチレーション計数により評価し、そして非標識リガンド（Tocrisノシセプチン）の効率と比較してプロットした。ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物が、ＯＲＬ１レセプターとの相互作用においてノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物よりもはるかに優れていることが明らかである。
【０１７２】
図９：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ触媒活性
精製したＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロエンドペプチダーゼ活性を、本質的にChaddockら 2002, Prot. Express Purif. 25, 219-228に記載のように決定した。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレートに固定したＳＮＡＰ−２５ペプチドを、種々の濃度の融合タンパク質に３７℃にて１時間曝露した。一連の洗浄後、切断されたＳＮＡＰ−２５ペプチドの量を、特異的抗血清との反応性によって定量した。
【０１７３】
図１０：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製
実施例２６に概説する方法を用いて、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質を大腸菌ＢＬ２１細胞から精製した。簡単に言えば、細胞破壊後に得た可溶性産物を、ニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
【０１７４】
図１１：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質およびＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の結合効力の比較
ノシセプチン融合物がＯＲＬ１レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を１ｎＭ［３Ｈ］−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射標識リガンドの特異的結合の減少を、シンチレーション計数により評価し、そして非標識リガンド（Tocrisノシセプチン）の効率と比較してプロットした。ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ−ＬＨＡ）が、ＯＲＬ１レセプターとの相互作用においてＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ−ＬＨＡ）よりも優れていることが明らかである。
【０１７５】
図１２：可変スペーサー長産物を有する発現／精製したＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質ファミリー
実施例２６に概説する方法を用いて、ＧＳ１０、ＧＳ３０およびＨＸ２７からなるＬＣ／Ａ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ａ融合物の改変体を大腸菌細胞ペーストから精製する。ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１０）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ３０）−ＨＮ／Ａ、およびＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＨＸ２７）−ＨＮ／Ａの精製からの試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してクマシーブルーでの染色によって評価した。電気泳動プロフィールは、ＣＰＢＥ−Ａの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。上のパネル：Ｍ＝分子量マーカー標線；Ｓ＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；ＦＴ＝Ｎｉ２＋荷電セファロースカラムに結合しなかったタンパク質；ＦＵＳＩＯＮ＝イミダゾールの添加により溶出した融合タンパク質。下のパネル：レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物；レーン４＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（５μｌ）；レーン６＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（１０μｌ）；レーン７＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（２０μｌ）；レーン８＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン９＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン１０＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）。
【０１７６】
図１３：ＣＰＮ−ＡによるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断
簡単に言えば、背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合を、デンシトメトリー分析によって算定し、そして融合物濃度に対してプロットした（破線）。また、物質を回収して、特異的ＥＩＡキットを用いてサブスタンスＰ含量を分析した。サブスタンスＰ放出の阻害を実線で示す。５０％最大ＳＮＡＰ−２５切断に達するのに必要な融合物濃度は、６．３０±２．４８ｎＭであると概算される。
【０１７７】
図１４：ＣＰＮ−ＡへのＤＲＧの曝露後の長時間にわたるＳＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮ−Ａに２４時間曝露した。ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ／Ａ）をコントロールとして用いた。この最初の曝露後、細胞外物質を洗浄により除去し、そして細胞を３７℃にて種々の時間インキュベートした。特定の時点で、細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合を、デンシトメトリー分析によって算定し、そして点線で示した。また、物質を回収して、特異的ＥＩＡキットを用いてサブスタンスＰ含量を分析した。サブスタンスＰの放出の阻害を実線で示す。
【０１７８】
図１５：ＣＰＮｖ−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮｖ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。５０％最大ＳＮＡＰ−２５切断に達するのに必要な融合物濃度は、１．３８±０．３６ｎＭであると概算される。
【０１７９】
図１６：ＣＰＮｖ−ＡへのＤＲＧの曝露後の長時間にわたるＳＮＡＰ−２５の切断
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮｖ−Ａに２４時間曝露した。ＣＰＮ−Ａをコントロールとして用いた。この最初の曝露後、細胞外物質を洗浄により除去し、そして細胞を３７℃にて種々の時間インキュベートした。特定の時点で、細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。
【０１８０】
図１７：［３Ｈ］−ノシセプチン結合のＣＰＮｖ−Ａ融合物媒介置換
ノシセプチン融合物がＯＲＬ１レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を１ｎＭ［３Ｈ］−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射標識リガンドの特異的結合の減少を、シンチレーション計数により評価し、そして非標識リガンド（Tocrisノシセプチン）の効率と比較してプロットした。ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ−ＬＨｎＡと表示）が、ＯＲＬ１レセプターとの相互作用においてＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ−ＬＨｎＡと表示）よりも優れていることが明らかである。
【０１８１】
図１８：発現／精製したＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａ産物
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、クマシーブルーで染色した。電気泳動プロフィールは、ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物；レーン４＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物（５μｌ）；レーン５＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物（１０μｌ）；レーン６＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物（２０μｌ）；レーン７＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン８＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン９＝エンテロキナーゼでの活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）。
【０１８２】
図１９：ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＡによるＳＮＡＰ−２５の切断
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。実施例２６で調製したＣＰＮｖ−Ａを比較の目的で用いた。ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａ（Ｅｎ活性化と表示）およびＣＰＮｖ−Ａ（Ｘａ活性化と表示）によるＳＮＡＰ−２５の切断割合を示す。
【０１８３】
図２０：発現／精製したＣＰＮｖ−Ｃ産物
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、クマシーブルーで染色した。電気泳動プロフィールは、ＣＰＮｖ−Ｃの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物；レーン４＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最終の捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン５＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの第２の捕捉後の精製物；レーン６＝最終精製物；レーン７＝最終精製物＋ＤＴＴ；レーン８＝分子量マーカー標線。
【０１８４】
図２１：ＣＰＮｖ−Ｃによるシンタキシンの切断
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＮｖ−Ｃに２４時間曝露した。細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットに供し、そして抗シンタキシンでプローブしてシンタキシン切断の評価を容易にした。切断されたシンタキシンの割合をデンシトメトリー分析によって算定した。５０％最大シンタキシン切断に達するのに必要な融合物濃度は、３．１３±１．９６ｎＭであると概算される。
【０１８５】
図２２：急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮ−Ａの効力
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ／Ａ）がカプサイシン誘発機械的異痛を阻害する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注射により評価した。試験動物を、研究に参加させる前（処置前）；ＣＰＮ／Ａでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前（ＣＡＰ前）；およびＣＰＮ／Ａの注射後カプサイシン追加投与後（１５分および３０分での応答の平均；ＣＡＰ）に、１０ｇのVon Freyフィラメントによる一連の刺激（１０刺激×３試行）に応じた足逃避率（ＰＷＦ％）について評価した。カプサイシン追加投与を１０μＬの０．３％溶液の注射によって行った。試料希釈液を、０．５％ＢＳＡ／生理食塩水中で調製した。
【０１８６】
図２３：ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発末梢糖尿病性神経障害（神経因性疼痛）モデルにおけるＣＰＮ−Ａの効力
Sprague-Dawley雄ラット（２５０〜３００ｇ）をクエン酸緩衝液中６５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺで（静脈内）処置し、そして血中のグルコースおよび脂質を毎週測定して、モデルの準備ができていることを確認する。足逃避閾値（ＰＷＴ）を所定の期間にわたるVon Freyフィラメントによる一連の刺激に応じて測定する。異痛は、２日の連続した試験日（１週間空ける）におけるＰＷＴがスケールの上で６ｇを下回って測定する場合に確立されるといわれる。この時点で、ラットを生理食塩水群（陰性効力コントロール）、ガバペンチン群（陽性効力コントロール）または試験群（ＣＰＮ／Ａ）に無作為に振り分ける。試験物質（２０〜２５μｌ）を１回の注射で皮下注射し（ガバペンチンを除く）、ＰＷＴを処置後１日目およびその後２週間にわたって定期的に測定する。ガバペンチン（３ｍｌ／ｋｇ注入容量で３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）は、ＰＷＴ試験開始の２時間前に毎日注射する。
【０１８７】
図２４：急性カプサイシン誘発機械的異痛モデルにおけるＣＰＮｖ−Ａの効力
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ／Ａ）がカプサイシン誘発機械的異痛を阻害する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注射により評価した。試験動物を、研究に参加させる前（処置前）；ＣＰＮｖ／Ａでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前（ＣＡＰ前）；およびＣＰＮｖ／Ａの注射後カプサイシン追加投与後（１５分および３０分での応答の平均；ＣＡＰ）に、１０ｇのVon Freyフィラメントによる一連の刺激（１０刺激×３試行）に応じた足逃避率（ＰＷＦ％）について評価した。カプサイシン追加投与を１０μＬの０．３％溶液の注射によって行った。試料希釈液を、０．５％ＢＳＡ／生理食塩水中で調製した。これらのデータを、正規化した足逃避率差として表す。ここでは、ピーク応答（カプサイシン後）とベースライン応答（カプサイシン前）との間の差を百分率にて示す。この分析にて、ＣＰＮｖ／Ａは、ＣＰＮ／Ａよりも強力であることが理解され得る。これは、ＣＰＮｖ／Ａは、ＣＰＮ／Ａで見られるのと同様の鎮痛効果を生じるのに必要とする投薬量が、より少ないからである。
【０１８８】
図２５：発現／精製したＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ産物
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＬＥ−Ａの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋荷電セファロースの最初の捕捉後の精製物；レーン４＝Ｎｉ２＋荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン５＝Ｎｉ２＋荷電セファロースの第２の捕捉後の精製物；レーン６＝最終精製物；レーン７＝最終精製物＋ＤＴＴ。
【０１８９】
図２６：発現／精製したＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ産物
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＢＥ−Ａの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン２＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物；レーン３＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン４＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（５μｌ）；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（１０μｌ）；レーン６＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（２０μｌ）；レーン７＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン８＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン９＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）；レーン１０＝分子量マーカー標線。
【０１９０】
図２７：発現／精製したＣＰＯＰ−Ａ産物
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＯＰ−Ａの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物；レーン３＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン４＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの第２の捕捉後の精製物；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（５μｌ）；レーン６＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（１０μｌ）；レーン７＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（２０μｌ）；レーン８＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン９＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン１０＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）。
【０１９１】
図２８：発現／精製したＣＰＯＰｖ−Ａ産物
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＯＰｖ−Ａの推定分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最初の捕捉後の精製物；レーン４＝Ｎｉ２＋荷電セファロースでの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（５μｌ）；レーン６＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（１０μｌ）；レーン７＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物（２０μｌ）；レーン８＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（５μｌ）；レーン９＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（１０μｌ）；レーン１０＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ（２０μｌ）。
【０１９２】
図２９：ＤＲＧ細胞モデルにおけるインビトロＳＮＡＰ−２５切断
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度のＣＰＯＰｖ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。
【０１９３】
図３０：発現／精製したＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ（除去可能ｈｉｓタグ）
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、クマシーブルーで染色した。この電気泳動プロフィールは、ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴの予測分子量のジスルフィド結合した二本鎖種の精製を示している。レーン１＝分子量マーカー標線；レーン２＝大腸菌タンパク質全可溶性画分；レーン３＝Ｎｉ２＋荷電セファロースの最終捕捉前の第Ｘａ因子処理物；レーン４＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物；レーン５＝第Ｘａ因子での活性化後の精製した最終物＋ＤＴＴ。
【０１９４】
図３１：リガンド競合アッセイによって評価した場合の、可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力
可変スペーサー長のＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物がＯＲＬ１レセプターに結合する能力を、簡易競合アッセイを用いて評価した。背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、１ｎＭの［３Ｈ］−ノシセプチンの存在下で種々の濃度の試験物質に曝露した。放射標識リガンドの特異的結合の減少をシンチレーション計数によって評価し、そして非標識リガンド（Tocrisノシセプチン）の効力に比較してプロットした。上のパネルは、ＧＳ０、ＧＳ２０、ＧＳ３０およびＨｘ２７のスペーサーの置換特性を示しているが、下のパネルは、ＧＳ１０、ＧＳ１５、およびＧＳ２５のスペーサーによる融合タンパク質により生じた置換を示している。ＯＲＬ１レセプターからノシセプチンを置き換えるのに、ＧＳ０およびＧＳ３０スペーサーは無効であり、そしてＧＳ１０は有効性に乏しいと結論される。
【０１９５】
図３２：インビトロＳＮＡＰ−２５切断によって評価した場合の、可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質のインビトロ効力
背根神経節（ＤＲＧ）の初代培養物を、種々の濃度の（可変スペーサー長の）ＣＰＮ−Ａに２４時間曝露した。細胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ウェスタンブロットし、そして抗ＳＮＡＰ−２５でプローブしてＳＮＡＰ−２５切断の評価を容易にした。切断されたＳＮＡＰ−２５の割合を、デンシトメトリー分析によって算定した。ＧＳ１０スペーサーによる融合タンパク質の乏しい効果の結合特性（図２８を参照のこと）は、細胞内ＳＮＡＰ−２５の切断を生じるのに必要とされる融合物の濃度がより高いことに反映されている。ＧＳ０およびＧＳ３０スペーサーによる融合タンパク質は、全く無効であった（データは示さず）。ＧＳ１５、２０、および２５スペーサーによる融合タンパク質は、同様に有効であった。
【０１９６】
（配列番号）
配列番号１  Ｎ［１−１７］のＤＮＡ配列
配列番号２  Ｎ［１−１７］のタンパク質配列
配列番号３  Ｎ［１−１１］のＤＮＡ配列
配列番号４  Ｎ［１−１１］のタンパク質配列
配列番号５  Ｎ［［Ｙ１０］１−１１］のＤＮＡ配列
配列番号６  Ｎ［［Ｙ１０］１−１１］のタンパク質配列
配列番号７  Ｎ［［Ｙ１１］１−１１］のＤＮＡ配列
配列番号８  Ｎ［［Ｙ１１］１−１１］のタンパク質配列
配列番号９  Ｎ［［Ｙ１４］１−１７］のＤＮＡ配列
配列番号１０  Ｎ［［Ｙ１４］１−１７］のタンパク質配列
配列番号１１  Ｎ［１−１３］のＤＮＡ配列
配列番号１２  Ｎ［１−１３］のタンパク質配列
配列番号１３  Ｎｖ（Ｎ［［Ｒ１４Ｋ１５］１−１７］としても公知）のＤＮＡ配列
配列番号１４  Ｎｖ（Ｎ［［Ｒ１４Ｋ１５］１−１７］としても公知）のタンパク質配列
配列番号１５  Ｎ［１−１７］−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質のＤＮＡ配列
配列番号１６  Ｎ［１−１７］−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号１７  Ｎ［［Ｙ１１］１−１１］−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質のＤＮＡ配列
配列番号１８  Ｎ［［Ｙ１１］１−１１］−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号１９  Ｎ［１−１３］−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質のＤＮＡ配列
配列番号２０  Ｎ［１−１３］−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号２１  ＬＨＮ／Ａ−Ｎ［１−１７］融合タンパク質のＤＮＡ配列
配列番号２２  ＬＨＮ／Ａ−Ｎ［１−１７］融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号２３  ＬＨＮ／Ｃ−Ｎ［１−１１］融合タンパク質のＤＮＡ配列
配列番号２４  ＬＨＮ／Ｃ−Ｎ［１−１１］融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号２５  Ｎ［［Ｙ１４］１−１７］−ＬＨＮ／Ｃ融合タンパク質のＤＮＡ配列
配列番号２６  Ｎ［［Ｙ１４］１−１７］−ＬＨＮ／Ｃ融合タンパク質のタンパク質配列
配列番号２７  ＬＣ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号２８  ＨＮ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号２９  ＬＣ／ＢのＤＮＡ配列
配列番号３０  ＨＮ／ＢのＤＮＡ配列
配列番号３１  ＬＣ／ＣのＤＮＡ配列
配列番号３２  ＨＮ／ＣのＤＮＡ配列
配列番号３３  ＣＰＮ−ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号３４  ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号３５  Ｎ末端側提示ノシセプチン挿入片のＤＮＡ配列
配列番号３６  ＣＰＮ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号３７  ＣＰＢＥ−ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号３８  ＣＰＮｖａｒ−ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号３９  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号４０  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号４１  Ｎ−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号４２  Ｎ−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号４３  ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号４４  ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号４５  ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ｃ（Ａリンカー）融合物のＤＮＡ配列
配列番号４６  ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ｃ（Ａリンカー）融合物のタンパク質配列
配列番号４７  ＬＣ／Ａ−ＣＰＭＥ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号４８  ＬＣ／Ａ−ＣＰＭＥ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号４９  ＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号５０  ＬＣ／Ａ−ＣＰＢＥ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号５１  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号５２  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号５３  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号５４  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号５５  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１０］１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号５６  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１０］１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号５７  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１１］１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号５８  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１１］１−１１］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号５９  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１４］１−１７］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号６０  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［［Ｙ１４］１−１７］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号６１  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［１−１３］−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号６２  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ［１−１３］−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号６３  ノシセプチン−スペーサー−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号６４  ノシセプチン−スペーサー−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号６５  ＣＰＮ−Ａ  ＧＳ１０リンカーのＤＮＡ配列
配列番号６６  ＣＰＮ−Ａ  ＧＳ１５リンカーのＤＮＡ配列
配列番号６７  ＣＰＮ−Ａ  ＧＳ２５リンカーのＤＮＡ配列
配列番号６８  ＣＰＮ−Ａ  ＧＳ３０リンカーのＤＮＡ配列
配列番号６９  ＣＰＮ−Ａ  ＨＸ２７リンカーのＤＮＡ配列
配列番号７０  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号７１  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号７２  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号７３  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号７４  ＣＰＮｖａｒ−Ａエンテロキナーゼ活性化リンカーのＤＮＡ配列
配列番号７５  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号７６  ＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号７７  ＣＰＮｖａｒ−ＡリンカーのＤＮＡ配列
配列番号７８  ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ｃ融合物（ａｃｔ．Ａ）のＤＮＡ配列
配列番号７９  ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ｃ融合物（ａｃｔ．Ａ）のタンパク質配列
配列番号８０  ＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号８１  ＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号８２  ＬＣ／Ａ−ＣＰＯＰ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号８３  ＬＣ／Ａ−ＣＰＯＰ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号８４  ＬＣ／Ａ−ＣＰＯＰｖ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号８５  ＬＣ／Ａ−ＣＰＯＰｖ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号８６  ＩｇＡプロテアーゼのＤＮＡ配列
配列番号８７  ＩｇＡ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａ融合物のＤＮＡ配列
配列番号８８  ＩｇＡ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号８９  ＦＸａ−ＨＴのＤＮＡ配列
配列番号９０  ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴのＤＮＡ配列
配列番号９１  ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ融合物のタンパク質配列
配列番号９２  ＤＴトランスロケーションドメインのＤＮＡ配列
配列番号９３  ＣＰＬＥ−ＤＴ−ＡのＤＮＡ配列
配列番号９４  ＣＰＬＥ−ＤＴ−Ａ融合物のタンパク質配列
配列番号９５  ＴｅＮＴ  ＬＣのＤＮＡ配列
配列番号９６  ＣＰＮｖ−ＴＥＮＴ  ＬＣのＤＮＡ配列
配列番号９７  ＣＰＮＶ−ＴｅＮＴ  ＬＣ融合物のタンパク質配列
配列番号９８  ＣＰＮｖａｒ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号９９  ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ｃ融合物（ａｃｔ．Ｃ）のＤＮＡ配列
配列番号１００  ＬＣ／Ｃ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ｃ融合物（ａｃｔ．Ｃ）のタンパク質配列
【実施例】
【０１９７】
実施例１：神経細胞培養物からのサブスタンスＰの放出の測定によるＴＭアゴニスト活性の確認
（材料）
サブスタンスＰ  ＥＩＡを、R&D Systems, UKから入手する。
【０１９８】
（方法）
ｅＤＲＧの初代神経細胞培養物を、既述（Dugganら, 2002）のようにして樹立させる。この培養物からのサブスタンスＰ放出を、本質的には、既述（Dugganら, 2002）のようにして、ＥＩＡによって評価する。目的のＴＭを（処理前に少なくとも２週間樹立させた）神経細胞培養物に添加する；ＴＭの代わりにビヒクルを添加することにより、コントロール培養を並行して行う。サブスタンスＰの刺激された（１００ｍＭのＫＣｌ）放出および基礎の放出を、全細胞溶解物含量とともに、コントロール培養およびＴＭ処理培養物の両方について得る。サブスタンスＰ免疫反応性を、サブスタンスＰ酵素免疫アッセイキット（Cayman Chemical Company, USAまたはR&D Systems, UK）を製造者の指示書に従って用いて測定する。
【０１９９】
目的のＴＭの存在下での神経細胞により放出されたサブスタンスＰの量を、１００ｍＭのＫＣｌの存在または不在下で得られる放出と比較する。基礎放出を上回る目的のＴＭによるサブスタンスＰ放出の刺激によって、目的のＴＭが本明細書中で定義した「アゴニストリガンド」であることが確立される。所望の場合、目的のＴＭによるサブスタンスＰ放出の刺激を、天然のＯＲＬ−１レセプターリガンドであるノシセプチン（Tocris）を用いて作成した標準サブスタンスＰ放出曲線に比較し得る。
【０２００】
実施例２：触媒活性ＬＨＮ／Ａの発現および精製
（材料）
合成ＤＮＡをSigma Genosysから入手。
【０２０１】
制限酵素をNew England Biolabsから入手。
【０２０２】
（方法）
触媒活性ＬＨＮ／Ａの発現および精製を、本質的に、Suttonら, (2005), Prot. Express. Purif., 40, 31-41頁に記載のように行った。
【０２０３】
簡単に言えば、ＢｏＮＴ／Ａの軽鎖と重鎖のＮ末端から４２３アミノ酸とをコードするＤＮＡを、Sigma-Genosysにより合成して、大腸菌コドン偏位を有する合成ＬＨＮ／Ａ遺伝子を作成した。軽鎖とＨＮドメインとの間のリンカー領域を、スプライス重複伸長ＰＣＲにより第Ｘａ因子切断部位を含むように操作した。長い変異誘発プライマーおよびより短い非変異誘発プライマーからなる以下のプライマー対を用いて、２つのＰＣＲ産物を生成した：
（5'-tccaaaactaaatctctgATAGAAGGTAGAaacaaagcgctgaacgac）と（5'-CTTGATGTACTCTGTGAACGTGCTC）；および
（5'-gtcgttcagcgctttgttTCTACCTTCTATcagagatttagttttgga）と（5'-ATGGAGTTCGTTAACAAACAGTTC）。
【０２０４】
これらの２つの反応からの産物を、スプライス重複伸長ＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。さらなるＰＣＲ反応を行って、活性化ｒｅｃＬＨＮ／Ａ遺伝子の両末端にBamHIおよびSalI部位のいずれかを付加し、そしてこれらの部位を用いてInvitrogenゲートウェイエントリーベクター中に挿入した。次いで、エントリーベクターを、ＬＲクロナーゼ反応において、ゲートウェイ組換え部位適合pMAL c2xとともに用いて、pMAL c2x ｒｅｃＬＨＮ／Ａを形成した。このpMAL c2x ｒｅｃＬＨＮ／Ａを改変して、ＭＢＰのＮ末端に６’ＨＩＳタグを組み込んだ。これは、pMALのNdeI部位にＨＩＳタグをコードするアニールしたオリゴヌクレオチドを挿入することにより行った。
【０２０５】
ＬＨＮ／Ａを発現する発現ベクターを、大腸菌HMS174またはAD494(DE3)（Novagen）に形質転換した。培養物を、ＺｎＣｌ２（１μＭ）、アンピシリン（100μｇ／ｍｌ）、および０．２％（ｗ／ｖ）グルコースを添加したTerrificブロス複合培地中で増殖させた。すべての構築物の発現についてのパラメータは、８Ｌ発酵装置システムに移す前の振盪フラスコ培養において最初に決定した。開始培養物を、３７℃、２２０ｒｐｍにて１６時間増殖させ、そして１Ｌを接種に用いて、３７℃、２５０ｒｐｍにて増殖を続けた。０．６のＯＤ６００ｎｍで、温度を３０分間２５℃まで下げて、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。誘導を４時間続け、細胞を採取して−７０℃で保存した。
【０２０６】
代表的には、１６ｇの細胞ペーストを、１６０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、そして超音波処理（MSE Soniprep 150）により溶解した。得られた溶解物を遠心分離により澄明にし、２５ｍｌのアミロースカラムに供し、ＰＢＳ中１０ｍＭのマルトースで溶出させた。溶出液は約５０％純粋な融合タンパク質を含み、そして第Ｘａ因子で処理して（１ユニットの第Ｘａ因子／１００μｇ融合タンパク質；２０時間；２６℃）ＨＩＳＭＢＰを除去し、そしてＬＣ−ＨＮ接合部を切断してタンパク質を活性化した。インキュベーション後、試料を濾過し（０．４５ｍｍ）、そして水で２倍希釈して０．５×ＰＢＳ緩衝液組成物を得た。切断し、濾過しそして希釈したｒｅｃＬＨＮ／Ａを、ＱセファロースＦＦカラム（１０ｍｌ）にかけ、そして８０ｍＭのＮａＣｌでＨＩＳＭＢＰを含み、そして１２０ｍＭのＮａＣｌで約７５％純粋なｒｅｃＬＨＮ／Ａを含む段階グラジエントで溶出した。ＭＢＰへのＨｉｓタグの付加により、ＬＨＮ／ＡとＭＢＰとの共溶出というこれまでの問題を解決した。ＨＩＳＭＢＰの完全な除去を確実にするための最終の精製工程として、Ｑセファロースカラムからの１２０ｍＭのＮａＣｌ溶出物を、ニッケル荷電した５ｍｌのＨｉｓＴｒａｐカラム（Amersham）に通した。ＨｉｓＴｒａｐカラムからの流出物は、約９５％純粋なｒｅｃＬＨＮ／Ａを含んでいた（ＬＨＮ／Ａについての精製スキームの図については、Suttonら, (2005), Prot. Express. Purif., 40, 31-41頁の図を参照のこと）。
【０２０７】
実施例３：触媒活性な組換えＬＨＮ／Ｂの発現および精製
以下に記載の方法は、ＬＨＮ／Ｂポリペプチドをコードする適切なプラスミドで形質転換した大腸菌から触媒活性なＬＨＮ／Ｂプロテアーゼを精製する。適切なＬＨＮ／Ｂポリペプチドの種々の配列が、ＰＣＴ／ＧＢ９７／０２２７３、ＵＳ６４６１６１７特許、および米国特許出願１０／２４１５９６（参照文献として本明細書中に援用する）に記載されていることに留意されたい。
【０２０８】
（方法）
ＬＨＮ／Ｂのコード領域を、発現ベクターpMAL（New England Biolabs）中のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子の３’側にフレームを合わせて挿入し、pMAL-c2x-ＬＨＮ／Ｂを作出する。この構築物では、発現されるＭＢＰポリペプチドおよびＬＨＮ／Ｂポリペプチドは、第Ｘａ因子切断部位によって分離され、そしてＬＣドメインおよびＨＮドメインは、エンテロキナーゼでの切断を受けやすいペプチドによって分離されている。発現クローンをpMAL-c2X-ｓｙｎＬＨＮ／Ｂと称する。
【０２０９】
pMAL-c2x-ｓｙｎＬＨＮ／Ｂを大腸菌HMS174に形質転換し、そして８Ｌ発酵装置システム中でTerrificブロス複合培地中にて培養する。誘導前細菌増殖を、５．０のＯＤ６００ｎｍに３７℃にて維持し、この段階で、ｒｅｃＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｂの発現を、ＩＰＴＧを０．５ｍＭまで添加し、そして温度を３０℃に下げることによって誘導する。３０℃にて４時間後、細菌を遠心分離によって回収し、そして得られたペーストを−７０℃で保存する。
【０２１０】
細胞ペーストを２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１μＭのＺｎＣｌ２中に再懸濁し、そしてAPV-Gaulin lab model 1000ホモジナイザーまたはMSE Soniprep 150ソニケーターを用いて細胞破壊を行う。得られた懸濁液を、精製前に遠心分離によって清澄化する。
【０２１１】
細胞破壊後、ＭＢＰ−融合タンパク質を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１２５ｍＭのＮａＣｌ、１μＭのＺｎＣｌ２中アミロースアフィニティー樹脂上、または５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１μＭのＺｎＣｌ２（塩添加なし）中Ｑ−セファロースＦＦアニオン交換樹脂上のいずれかで捕捉する。１０ｍＭマルトースを加えた同じ緩衝液中のアミロース樹脂から、および１５０〜２００ｍＭ塩中のＱ−セファロースから、単一ピークを溶出する。ＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｂ接合部の切断は、１Ｕ／５０μｇ融合タンパク質で第Ｘａ因子（ＮＥＢ）との２２℃にての１８時間インキュベーション工程で完了する。少なくとも４ｍｇ／ｍｌの基質（ＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｂ）濃度が、効率的な切断を生じるのに望ましい。
【０２１２】
切断したタンパク質を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ７．２の緩衝液組成となるように２０ｍＭのＨｅｐｅｓで希釈し、そしてＱ−セファロースカラムに通してＬＨＮ／ＢからＭＢＰを分離する。ＬＨＮ／Ｂを、１２０〜１７０ｍＭ塩でＱ−セファロースカラムから溶出する。次いで、軽鎖とＨＮドメインとの間のリンカーに、１００μｇのＬＨＮ／Ｂ当たり１Ｕのエンテロキナーゼと２２℃にて１６時間インキュベートすることによって切り目を入れる。最後に、エンテロキナーゼを、ベンズアミジンセファロースカラムと４℃にて３０分間インキュベートすることにより樹脂に優先的に結合させて、切り目を入れたＬＨＮ／Ｂおよび他の夾雑タンパク質から分離する。精製したＬＨＮ／Ｂを必要になるまで−２０℃で保存する。ｒｅｃＬＨＮ／Ｂの精製スキームの図については図１を参照のこと。
【０２１３】
実施例４：触媒活性な組換えＬＨＮ／Ｃの発現および精製
ＬＨＮ／Ｃのコード領域を、発現ベクターpMAL（New England Biolabs）中のマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子の３’側にフレームを合わせて挿入し、pMAL-c2x-ＬＨＮ／Ｃを作製する。この構築物では、発現されるＭＢＰポリペプチドおよびＬＨＮ／Ｃポリペプチドは、第Ｘａ因子切断部位によって分離されている。
【０２１４】
pMAL-c2x-ＬＨＮ／ＣをE. coli AD494（DE3, IRL）に形質転換し、そして８Ｌ発酵装置システム中でTerrificブロス複合培地中にて培養する。誘導前細菌増殖を、８．０のＯＤ６００ｎｍに３０℃にて維持し、この段階で、recMBP-c2x-ＬＨＮ／Ｃの発現を、ＩＰＴＧを０．５ｍＭまで添加し、そして培養温度を２５℃に下げることによって誘導する。２５℃にて４時間後、細菌を遠心分離によって回収し、そして得られたペーストを−７０℃で保存する。
【０２１５】
細胞ペーストを５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．２）、１μＭのＺｎＣｌ２中に１：６（ｗ／ｖ）で再懸濁し、そしてAPV-Gaulin lab model 1000ホモジナイザーまたはMSE Soniprep 150ソニケーターを用いて細胞破壊を行う。得られた懸濁液を、精製前に遠心分離によって清澄化する。
【０２１６】
細胞破壊および清澄化後、ＭＢＰ−融合タンパク質を、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）、１μＭのＺｎＣｌ２中、Ｑ−セファロースファストフローアニオン交換樹脂で分離し、そして１００ｍＭのＮａＣｌを添加した同じ緩衝液で溶出する。第Ｘａ因子との単回インキュベーション工程にて、ＭＢＰ−ＬＨＮ／Ｃ接合部およびＨＮ−ＬＣリンカーでの二点切断を実施する。この反応は、１００μｇ融合タンパク質当たり１Ｕの第Ｘａ因子（NEB）との２２℃にて１６時間のインキュベーション工程により完了する。切断したタンパク質を、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２の緩衝液組成となるように２０ｍＭのＨｅｐｅｓで希釈し、そして第二のＱ−セファロースカラムに通してＬＨＮ／ＣからＭＢＰを分離する。活性化した（ジスルフィド結合が切断したリンカー）ＬＨＮ／Ｃを、１２０〜１７０ｍＭ塩の塩濃度グラジエント（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、１μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ７．２）によってＱ−セファロースカラムから溶出する。ＬＨＮ／Ｃの精製の図については図２を参照のこと。
【０２１７】
実施例５：ノシセプチンとＬＨＮ／Ａとの化学結合体の生成
（材料）
Ｃ末端伸長したノシセプチンペプチドをSigma Genosysから入手。
【０２１８】
結合用化学物質をPierceから入手。
【０２１９】
（方法）
Ｃ末端Ｃｙｓを介してノシセプチンペプチドを結合するために、まず、最後のＣ末端アミノ酸としてＣｙｓを含むように、ペプチドを（市販で入手可能な、標準的手順により）合成した。
【０２２０】
次いで、このペプチドを、以下に記載のようなスルフヒドリルに基づくカップリング反応における第２成分として用いた（これまでの刊行物のＷＯ９９／１７８０６およびＷＯ９６／３３２７３、ならびにDugganら, (2002), J. Biol. Chem. 277, 24846-34852およびChaddockら, (2000), Infect Immun., 68, 2587-2593も参照のこと）。
【０２２１】
（スルフヒドリルに基づくカップリング反応）
簡単に言えば、約２つの反応脱離基を、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応によって、ＬＨＮ／Ａに導入した（リン酸緩衝化生理食塩水中５ｍｇ／ｍｌ）。
【０２２２】
誘導体化した材料を、サイズ排除クロマトグラフィーにより過剰のＳＰＤＰから単離した。再構成したシステインタグ付けしたノシセプチンリガンドを、誘導体化したＬＨＮ／Ａと４：１のモル比で混合し、そして穏やかに攪拌しながら室温にて１時間インキュベートして、還元可能なジスルフィド共有結合による化学結合体を生成した。非結合体化ペプチドを除去するための結合体混合物の最初の分画を、サイズ排除クロマトグラフィー（結合のスケールに依存してSuperose-12またはSuperdex G-200）により行った。
【０２２３】
実施例６：ノシセプチンとＬＨＮ／Ｂとの化学結合体の生成
（材料）
Ｃ末端伸長したノシセプチンペプチドをSigma Genosysから入手。
【０２２４】
結合用化学物質をPierceから入手。
【０２２５】
（方法）
凍結乾燥したノシセプチンを、水の添加によって溶解し、そしてＭＥＳ緩衝液（０．１ＭのＭＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）中に透析した。この溶液（約０．３ｍｇ／ｍｌの濃度）に、最終濃度１ｍｇ／ｍｌまでＰＤＰＨ（ＤＭＦ中１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した。混合した後、固体のＥＤＡＣを添加して、約０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。反応を、室温にて少なくとも３０分間行った。次いで、過剰のＰＤＰＨを、ＭＥＳ緩衝液で予め平衡化したＰＤ−１０カラム（Pharmacia）上で脱塩することによって除去した。
【０２２６】
用いたノシセプチンの重量の半分に等価の量のＬＨＮ／Ｂを約１ｍｇ／ｍｌの濃度でトリエタノールアミン緩衝液（０．０２Ｍトリエタノールアミン／ＨＣｌ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．８）に溶解し、これを、２ｍＭの最終濃度のTraut試薬（１Ｍトリエタノールアミン／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の１００ｍＭストック溶液）と反応させた。１時間後、ＬＨＮ／Ｂを、ＰＤ−１０カラム（Pharmacia）を用いてＰＢＳＥ（１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝化生理食塩水）中で脱塩した。カラム溶出物からのタンパク質ピークを、Microcon 50（Amicon）を用いて約２ｍｇ／ｍｌの濃度まで濃縮した。
【０２２７】
誘導体化したノシセプチンを、最終濃縮工程に供して、開始容量の１０％未満までの容量に減少させ、次いで誘導体化したＬＨＮ／Ｂと室温にて終夜混合した。反応産物を、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析した。
【０２２８】
上記反応から得られた結合体を、Bio-Gel P-100（BioRad）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより部分精製した。溶出プロフィールを、２８０ｎｍでの光学密度の測定および画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって追跡した。これにより、遊離のノシセプチンおよび反応副生成物から結合体を分離できた。
【０２２９】
実施例７：ノシセプチン１−１１とＬＨＮ／Ｂとの化学結合体の生成
（材料）
Ｃ末端伸長したノシセプチン１−１１ペプチドをSigma Genosysから入手。
【０２３０】
結合用化学物質をPierceから入手。
【０２３１】
（方法）
Ｃ末端Ｃｙｓを介してノシセプチン１−１１ペプチドを結合するために、まず、最後のＣ末端アミノ酸としてＣｙｓを含むように、ペプチドを（市販で入手可能な、標準的手順により）合成した。
【０２３２】
次いで、このペプチドを、実施例５に記載のようなスルフヒドリルに基づくカップリング反応における第２成分として用いた。
【０２３３】
実施例８：ノシセプチンＮ［［Ｙ１４］１−１７］とＬＨＮ／Ｃとの化学結合体の生成
（材料）
Ｃ末端伸長したノシセプチンＮ［［Ｙ１４］１−１７］ペプチドをSigma Genosysから入手。
【０２３４】
結合用化学物質をPierceから入手。
【０２３５】
（方法）
Ｃ末端Ｃｙｓを介してペプチドを結合するために、まず、最後のＣ末端アミノ酸としてＣｙｓを含むように、ペプチドを（市販で入手可能な、標準的手順により）合成した。
【０２３６】
次いで、このペプチドを、実施例５に記載のようなスルフヒドリルに基づくカップリング反応における第２成分として用いた。
【０２３７】
実施例９：ノシセプチン−ＬＨＮ／Ａの単ポリペプチド融合物の組換え生成（配列番号１５および配列番号１６）
ノシセプチン−ＬＨＮ／ＡのＤＮＡ配列を、ＬＣ／Ａ、ＨＮ／Ａ、およびノシセプチンのアミノ酸配列の逆翻訳により設計した。ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−活性化ループ−ＨＮ／Ａ配列を含む完全なＯＲＦを、標準的なＤＮＡ配列操作ソフトウエア（EditSeq）内で組み立てた。ＬＣ／ＡのシステインとＨＮ／Ａのシステインとの間の活性化ループ（CVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLC）を改変して、第Ｘａ因子プロテアーゼ認識部位を組み込んだ。
【０２３８】
必要とされる発現ベクターへのクローニングを容易にするために適切な制限部位（例えば、BamHI/SalI）を、配列のそれぞれ５’末端および３’末端に組み込み、正しい読み取り枠を維持した。ＤＮＡ配列を、逆翻訳中に組み込んだ制限酵素切断配列について（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて）スクリーニングした。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにした。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日）を参照することによって評価した。
【０２３９】
次いで、ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−活性化ループ−ＨＮ／Ａオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するこの最適化したＤＮＡ配列を商業的に合成し、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
【０２４０】
ノシセプチン−ＬＨＮ／Ａ融合物をコードするＤＮＡを、pCR 4から単離し、そしてpMALベクターバックボーン中に移してタンパク質発現を容易にした。得られたpMAL NO-ＬＨＮ／Ａベクターを、コンピテント大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、そして正しい形質転換体を選択した。pMAL NO-ＬＨＮ／Ａの単一コロニーを、ＺｎＣｌ２（１ｍＭ）、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、０．２％（ｗ／ｖ）グルコースを追加したTerrificブロス複合培地中で増殖した。挿入片の発現を、ＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）の添加によって誘導し、そして培養物を１６℃にて１６時間維持した。この発現期間の後、細菌を遠心分離によって単離し、そして細胞ペレットを、使用するまで−２０℃にて保存した。
【０２４１】
１０ｇの大腸菌ＢＬ２１細胞ペーストを、２５ｍｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌを含むファルコン管中で解凍した。融解した細胞ペーストを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌで８０ｍｌにし、そして氷上で２２ミクロンのパワーで３０秒間オン、３０秒間オフを１０サイクルで超音波処理し、試料を冷却したままにした。溶解した細胞を１８，０００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離した。この上清を、０．１Ｍ  ＮｉＳＯ４荷電キレートカラム（２０〜３０ｍｌカラムが十分である）に供し、そして５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。
【０２４２】
１０ｍＭおよび４０ｍＭのイミダゾールの段階グラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出した融合タンパク質を５Ｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌに対して４℃にて終夜透析し、そして透析した融合タンパク質のＯＤを測定した。１００μｇ融合タンパク質当たり１単位の第Ｘａ因子を添加し、そして２５℃にて終夜静置インキュベートした。切断混合物を０．１Ｍ  ＮｉＳＯ４荷電キレートカラム（２０〜３０ｍｌカラムが十分である）に供し、そして５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌで平衡化した。
【０２４３】
１０ｍＭおよび４０ｍＭのイミダゾールの段階グラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出した。溶出した融合タンパク質を５Ｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌに対して４℃にて終夜透析し、そしてこの融合物を約２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、試料を小分けし、そして−２０℃にて保存した。
【０２４４】
図３は、Ｎ［１−１７］−ＬＨＮ／Ａの発現および精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０２４５】
実施例１０：（ノシセプチン１−１１）−ＬＨＮ／Ｂの単ポリペプチド融合物の組換え生成
（ノシセプチン１−１１）−ＬＨＮ／ＢのＤＮＡ配列を、ＬＣ／Ｂ、ＨＮ／Ｂ、およびノシセプチン１−１１のアミノ酸配列の逆翻訳により設計した。（ノシセプチン１−１１）−ＬＣ／Ｂ−活性化ループ−ＨＮ／Ｂ配列を含む完全なＯＲＦを、標準的なＤＮＡ配列操作ソフトウエア（EditSeq）内で組み立てた。ＬＣ／ＢのシステインとＨＮ／Ｂのシステインとの間の活性化ループを改変して、第Ｘａ因子プロテアーゼ認識部位を組み込んだ。
【０２４６】
次いで、組換え融合タンパク質を、本質的に実施例９に記載のようにして生成した。
【０２４７】
実施例１１：（ノシセプチンＮ［［Ｙ１４］１−１７］）−ＬＨＮ／Ｃの単ポリペプチド融合物の組換え生成（配列番号２５および配列番号２６）
ノシセプチンＮ［［Ｙ１４］１−１７］のＤＮＡ配列を、ＬＣ／Ｃ、ＨＮ／Ｃ、およびノシセプチンＮ［［Ｙ１４］１−１７］のアミノ酸配列の逆翻訳により設計した。（ノシセプチンＮ［［Ｙ１４］１−１７］）−ＬＣ／Ｃ−活性化ループ−ＨＮ／Ｃ配列を含む完全なＯＲＦを、標準的なＤＮＡ配列操作ソフトウエア（EditSeq）内で組み立てた。ＬＣ／ＣのシステインとＨＮ／Ｃのシステインとの間の活性化ループを改変して、第Ｘａ因子プロテアーゼ認識部位を組み込んだ。
【０２４８】
次いで、組換え融合タンパク質を、本質的に実施例９に記載のようにして生成した。
【０２４９】
実施例１２：ＬＨＮ／Ｃ−（ノシセプチン１−１１）の単ポリペプチド融合物の組換え生成（配列番号２３および配列番号２４）
ＬＨＮ／Ｃ−（ノシセプチン１−１１）のＤＮＡ配列を、ＬＣ／Ｃ、ＨＮ／Ｃ、およびノシセプチン１−１１のアミノ酸配列の逆翻訳により設計した。ＬＣ／Ｃ−活性化ループ−ＨＮ／Ｃ−フレキシブルスペーサー−（ノシセプチン１−１１）を含む完全なＯＲＦ（配列番号２３）を、標準的なＤＮＡ配列操作ソフトウエア（EditSeq）内で組み立てた。
【０２５０】
次いで、組換え融合タンパク質（配列番号２４）を、本質的に実施例９に記載のようにして生成した。
【０２５１】
実施例１３：ＬＣ／ＣをコードするＤＮＡの細胞への送達のための結合体の生成
ノシセプチン−ＨＮ−［ＬＣ／Ｃ］結合体の構築を以下に説明する。ここで、［ＬＣ／Ｃ］は、ボツリヌス神経毒素Ｃ型の軽鎖をコードするポリリジン凝縮ＤＮＡを示す。
【０２５２】
（材料）
ＳＰＤＰは、Pierce Chemical Co.から入手する。
【０２５３】
他の試薬は、Sigma Ltd.から入手する。
【０２５４】
（方法）
ＣＭＶ（前初期）プロモーターの制御下にＬＣ／Ｃをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて、ＤＮＡの凝縮を、１ポリリジンに対して２ＤＮＡの比になるようにＳＰＤＰ誘導体化ポリリジンを用いて行った。次いで、凝縮したＤＮＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ）をＨＮ−ノシセプチン（１００μｇ／ｍｌ）と２５℃にて１６時間混合することによって結合体を調製した。ＳＰＤＰ誘導体化ポリリジンとＨＮドメイン上に存在する遊離のＳＨ基とを結合させて、ＤＮＡとタンパク質との共有結合を容易にする。
【０２５５】
実施例１４：ＬＣ／ＢをコードするＤＮＡの細胞への送達のための結合体の生成
（ノシセプチン１−１１）−ＨＮ−［ＬＣ／Ｂ］結合体の構築を以下に説明する。ここで、［ＬＣ／Ｂ］は、ボツリヌス神経毒素Ｂ型の軽鎖をコードするポリリジン凝縮ＤＮＡを示す。
【０２５６】
（材料）
ＳＰＤＰは、Pierce Chemical Co.から入手する。
【０２５７】
他の試薬は、Sigma Ltd.から入手する。
【０２５８】
（方法）
ＣＭＶ（前初期）プロモーターの制御下にＬＣ／Ｂをコードする遺伝子を含むプラスミドを用いて、ＤＮＡの凝縮を、１ポリリジンに対して２ＤＮＡの比になるようにＳＰＤＰ誘導体化ポリリジンを用いて行った。次いで、凝縮したＤＮＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ）をＨＮ−（ノシセプチン１−１１）（１００μｇ／ｍｌ）と２５℃にて１６時間混合することによって結合体を調製した。ＳＰＤＰ誘導体化ポリリジンとＨＮドメイン上に存在する遊離のＳＨ基とを結合させて、ＤＮＡとタンパク質との共有結合を容易にする。
【０２５９】
実施例１５：サブスタンスＰ放出神経細胞におけるノシセプチン−ＬＨＮ／Ａの活性の評価
Dugganら,（2002, J. Biol. Chem., 277, 34846-34852）に記載の方法を用いて、ブスタンスＰ放出神経細胞におけるノシセプチン−ＬＨＮ／Ａの活性を評価した。
【０２６０】
ノシセプチン−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質を、２週齢の背根神経節の神経細胞培養物に塗布し、そして３７℃にて１６時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除去し、そして細胞がサブスタンスＰ（ＳＰ）の刺激による放出を受ける能力を評価した。
【０２６１】
ノシセプチン−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質とインキュベートした神経細胞からのＳＰの放出を、（ｉ）ＬＨＮ／Ａのみで処理した細胞および（ii）培地のみで処理した細胞と比較してアッセイした。これにより、ｅＤＲＧからのサブスタンスＰの阻害％を算定できた。ノシセプチン−ＬＨＮ／Ａ融合タンパク質がＳＰ放出を阻害する能力（培地のみで処理した細胞に対して）を表１に記載した。データは、３つの測定の平均を示す。
【０２６２】
【表１】
0005536017.tif 000004
【０２６３】
実施例１６：フォルスコリン刺激ｃＡＭＰ生産の測定によるＯＲＬ１レセプター活性化の確認
所与のＴＭがＯＲＬ１レセプターを介して作用することの確認は、以下の試験によって提供される。ここでは、ＴＭがフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ生産を阻害する能力を評価する。
【０２６４】
（材料）
［３Ｈ］アデニンおよび［１４Ｃ］ｃＡＭＰはGE Healthcareから入手する。
【０２６５】
（方法）
この試験は、本質的には、Meunierら［Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL1 receptor. Nature 377: 532-535, 1995］によって既述のようにして、２４ウェルプラスチックプレート上に播種した無傷のトランスフェクトＣＨＯ細胞において行う。
【０２６６】
細胞に、０．４ｍｌの培養培地中の［３Ｈ］アデニン（１．０μＣｉ）を添加する。細胞を３７℃にて２時間保持して細胞内ＡＴＰプールにアデニンを取り込ませる。２時間後、細胞を、以下を含有するインキュベーション緩衝液で１回洗浄する：１３０ｍＭのＮａＣｌ、４．８ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、１０ｍＭのグルコース、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）。そしてこれを、目的のＴＭを含むまたは含まない、フォルスコリン（１０μＭ）およびイソブチルメチルキサンチン（５０μＭ）を含有する緩衝液と置き換える。１０分後、培地を吸引して０．５ｍｌの０．２Ｍ  ＨＣｌと置き換える。約１０００ｃｐｍの［１４Ｃ］ｃＡＭＰを各ウェルに添加し、そしてこれを内部標準として使用する。次いで、ウェルの内容物を０．６５ｇ乾燥アルミナ粉末のカラムに移す。カラムを４ｍｌの５ｍＭ  ＨＣｌ、０．５ｍｌの０．１Ｍ酢酸アンモニウム、次いでさらに２ｍｌの酢酸アンモニウムで溶出する。最終溶出物をシンチレーションバイアルに集めて１４Ｃおよびトリチウムについて計数する。集めた量を［１４Ｃ］ｃＡＭＰの回収率に対して補正する。ＯＲＬ１レセプターでアゴニストであるＴＭは、フォルスコリンに応じて生成されるｃＡＭＰのレベルの減少を引き起こす。
【０２６７】
実施例１７：ＧＴＰγＳ結合機能アッセイを用いるＯＲＬ１レセプター活性化の確認
所与のＴＭがＯＲＬ１レセプターを介して作用することの確認は、以下の試験、ＧＴＰγＳ結合機能アッセイによっても提供される。
【０２６８】
（材料）
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳはGE Healthcareから入手する。
【０２６９】
小麦胚凝集素コーティング（ＳＰＡ）ビーズはGE Healthcareから入手する。
【０２７０】
（方法）
このアッセイは、本質的には、TraynorおよびNahorski［Modulation by μ-opioid agonists of guanosine-5-O-(3-[35S]thio)triphosphate binding to membranes from human neuroblastoma SH-SY5Y cells. Mol. Pharmacol. 47: 848-854, 1995］に記載されるようにして行う。
【０２７１】
細胞を、組織培養皿からかき取って２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸に入れ、次いで５００×ｇで１０分間遠心分離する。細胞をこの緩衝液に再懸濁して、Polytron Homogenizerでホモジナイズする。
【０２７２】
ホモジネートを２７，０００×ｇで１５分間遠心分離し、そしてペレットを緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含有する）に再懸濁する。懸濁液を２０，０００×ｇで再度遠心分離し、もう一度緩衝液Ａに懸濁する。結合アッセイのために、膜（８〜１５μｇタンパク質）を、目的のＴＭを含むおよび含まない［３５Ｓ］ＧＴＰ  Ｓ（５０ｐＭ）、ＧＤＰ（１０μＭ）と総容量１．０ｍｌで２５℃にて６０分間インキュベートする。試料をガラスファイバーフィルターで濾過し、そして結合アッセイについて記載したように計数する。
【０２７３】
実施例１８：ＬＣ／ＡおよびＨＮ／Ａバックボーンクローンの調製
以下の手順によって、マルチドメイン融合物発現用の構成部分バックボーンとして使用するためのＬＣフラグメントおよびＨＮフラグメントを作製する。本実施例は、血清型Ａベースのクローン（配列番号２７および配列番号２８）の調製に基づいているが、手順および方法は他の血清型にも同等に適用可能である［血清型Ｂ（配列番号２９および配列番号３０）ならびに血清型Ｃ（配列番号３１および配列番号３２）については配列表に図示］。
【０２７４】
（クローニングベクターおよび発現ベクターの調製）
pCR 4（Invitrogen）は、構築物の確認を容易にするために、ベクター内の制限配列の欠損および隣接する配列決定プライマー部位によって選択した、選り抜きの標準的なクローニングベクターである。この発現ベクターは、pMAL（NEB）発現ベクターに基づいており、これは、構築物の挿入のために正しい方向でマルチプルクローニング部位内に所望の制限配列を有する（BamHI−SalI−PstI−HindIII）。非動員性プラスミドを作製するために、発現ベクターのフラグメントが除去されており、そして精製の選択肢を増大させるために、種々の異なる融合タグが挿入されている。
【０２７５】
（プロテアーゼ（例えば、ＬＣ／Ａ）挿入片の調製）
ＬＣ／Ａ（配列番号２７）を、二通りの方法の一方によって作製する：
ＤＮＡ配列を、［種々の逆翻訳ソフトウエアツール（例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)）の１つを用いて、GenBank（アクセッション番号P10845）またはSwissprot（アクセッション位置BXA1_CLOBO）のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる］ＬＣ／Ａアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。BamHI／SalI認識配列を、配列の５’末端および３’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み取り枠を維持する。ＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて）スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日）を参照することによって評価する。次いで、ＬＣ／Ａオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するこの最適化したＤＮＡ配列を商業的に合成し（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
【０２７６】
別の方法は、５’および３’のＰＣＲプライマーにそれぞれ組み込んだBamHIおよびSalI制限酵素配列を用いる既存ＤＮＡ配列からのＰＣＲ増幅を使用することである。相補的オリゴヌクレオチドプライマーは、製造業者（例えば、MWGまたはSigma-Genosys）によって、各対が、クロストリジウム標的ＤＮＡの範囲（ストレッチ）に隣接する（互いに「向かって」３’末端の向きに）向かい合った鎖に対して、これらの２つのＤＮＡ鎖の各々に１つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズする能力を有するように、化学合成される。ＰＣＲ産物を生成するために、クロストリジウムＤＮＡ配列に特異的な短いオリゴヌクレオチドプライマーの対を、クロストリジウムＤＮＡ鋳型および他の反応成分と混合し、そして反応チューブのインキュベーション温度を自動変更し得る機器（「ＰＣＲ機器」）中に配置し、約９４℃（変性用）、５５℃（オリゴヌクレオチドアニーリング用）、および７２℃（合成用）のサイクルにかける。ＰＣＲ産物の増幅に必要な他の試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、TaqまたはPfuポリメラーゼ）、ＤＮＡの４つのヌクレオチドdNTP構築ブロックの等モル量（５０〜２００μＭ）の各々、およびＭｇ２＋濃度（０．５〜５ｍＭ）に最適化した酵素に適切な緩衝液が含まれる。
【０２７７】
増幅産物を、Taq PCR産物に対してTOPO TAクローニングまたはPfu PCR産物に対してZero Blunt TOPOクローニング（両キットともInvitrogenより市販されている）のいずれかを用いて、pCR 4にクローニングする。得られたクローンを配列決定により確認する。次いで、クローニング系と適合可能でない任意の付加制限配列を、部位特異的変異誘発を用いて［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］取り除く。
【０２７８】
（トランスロケーション（例えばＨＮ）挿入片の調製）
ＨＮ／Ａ（配列番号２８）を、二通りの方法の一方によって作製する：
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウエアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)］の１つを用いて、［GenBank（アクセッション番号P10845）またはSwissprot（アクセッション位置BXA1_CLOBO）のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる］ＨＮ／Ａアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。Ｎ末端にPstI制限配列を、そしてＣ末端にXbaI−停止コドン−HindIIIを付加し、正しい読み取り枠を維持するようにする。ＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて）スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列を商業的に合成し（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
【０２７９】
別の方法は、５’および３’のＰＣＲプライマーにそれぞれ組み込んだPstIおよびXbaI−停止コドン−HindIII制限酵素配列を用いる既存ＤＮＡ配列からのＰＣＲ増幅を使用することである。ＰＣＲ増幅は、上記のように行う。このＰＣＲ産物をpCR 4ベクターに挿入し、そして配列決定によって確認する。次いで、クローニング系と適合可能でない任意の付加制限配列を、部位特異的変異誘発を用いて［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］取り除く。
【０２８０】
実施例１９：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製（ノシセプチンがＨＮ鎖のＮ末端側にある）
（リンカー−ノシセプチン−スペーサー挿入片の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、鋳型としてリンカーについての既存配列情報を用いて、第一の原則から設計し得る。例えば、血清型Ａリンカー（この場合、ＬＣとＨＮとの間のジスルフィド架橋のシステイン間に存在するドメイン間ポリペプチド領域として定義される）は、２３アミノ酸長であり、そして配列ＶＲＧＩＩＴＳＫＴＫＳＬＤＫＧＹＮＫＡＬＮＤＬを有する。この配列内で、天然でのタンパク質分解活性化により、配列ＡＬＮＤＬのＮ末端を有するＨＮドメインが生じることが理解される。この配列情報は、GenBank（アクセッション番号P10845）またはSwissprot（アクセッション位置BXA1_CLOBO）のような利用可能なデータベースソースから自由に入手可能である。このリンカーに、第Ｘａ因子部位、ノシセプチンおよびスペーサーを組み込み、そして種々の逆翻訳ソフトウエアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0（Entelechon）］の１つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。次いで、制限部位をこのＤＮＡ配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号３３）として配置させ得る。スペーサー、ノシセプチン、および制限配列について正しい読み枠を維持すること、そしてＤＡＭメチル化を生じ得る塩基ＴＣがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このＤＮＡ配列を、制限配列の組み込みについてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から任意の付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列を商業的に合成し（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
【０２８１】
（ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物の調製）
ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮ構築物（配列番号３９）を作製するために、リンカー（配列番号３３）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、BamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号２７）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをPstIおよびXbaI制限酵素で切断し、そしてPstIおよびXbaIで切断したＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２８）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号３９）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号４０に示される配列の融合タンパク質が発現される。
【０２８２】
実施例２０：ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製（ノシセプチンがＬＣ鎖のＮ末端側にある）
ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａバックボーンを、活性化のために第Ｘａ因子部位を付加し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−リンカー−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号３４）として配置させた、合成血清型Ａリンカーを用いて、実施例１９に記載のように構築する。ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａバックボーンおよび合成したＮ末端側提示ノシセプチン挿入片（配列番号３５）を、BamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、ゲル精製し、そして一緒に連結してノシセプチン−スペーサー−ＬＣ−リンカー−ＨＮを作製する。次いで、ＯＲＦ（配列番号４１）を制限酵素AvaIおよびXbaIを用いて切断し、これは、発現ベクターに移入され、配列番号４２に示される配列の融合タンパク質が発現される。
【０２８３】
実施例２１：ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ｃ（配列番号３１）およびＨＮ／Ｃ（配列番号３２）を作製し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号３６）として配置させた血清型Ｃリンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号４３）を含んでおり、これは、配列番号４４に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２８４】
実施例２２：血清型Ａ活性化配列を有するＬＣ／Ｃ−ノシセプチン−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ｃ（配列番号３１）およびＨＮ／Ｃ（配列番号３２）を作製し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号３３）として配置させた血清型Ａリンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号４５）を含んでおり、これは、配列番号４６に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２８５】
実施例２３：ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製
ｍｅｔエンケファリンリガンドのサイズが小さい（５アミノ酸）ため、ＬＣ／Ａ−ｍｅｔエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合物を、鋳型としてＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号３９）を用いる部位特異的変異誘発［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］によって作製する。ＹＧＧＦＭ  ｍｅｔエンケファリンペプチドをコードし、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号３９）のリンカー領域に相補的な配列が隣接するオリゴヌクレオチドを設計する。ＳＤＭ産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ｍｅｔエンケファリン−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号４７）を含んでおり、これは、配列番号４８に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２８６】
実施例２４：ＬＣ／Ａ−βエンドルフィン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ａ（配列番号２７）およびＨＮ／Ａ（配列番号２８）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−βエンドルフィン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号３７）として配置させた血清型Ａのβエンドルフィンリンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−βエンドルフィン−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号４９）を含んでおり、これは、配列番号５０に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２８７】
実施例２５：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ａ（配列番号２７）およびＨＮ／Ａ（配列番号２８）を作製し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号３８）として配置させた血清型Ａのノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号５１）を含んでおり、これは、配列番号５２に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２８８】
実施例２６：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の精製方法
２５ｍｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌおよび約１０ｇの大腸菌ＢＬ２１細胞ペーストを含むファルコン管を解凍する。この融解した細胞ペーストを５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌで８０ｍｌにし、そして氷上にて、２２ミクロンのパワーで３０秒間オン、３０秒間オフを１０サイクルで超音波処理し、試料を冷却したままにする。溶解した細胞を１８，０００ｒｐｍで４℃にて３０分間遠心分離する。この上清を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌで平衡化した０．１Ｍ  ＮｉＳＯ４荷電キレートカラム（２０〜３０ｍｌカラムが十分である）に供する。１０ｍＭおよび４０ｍＭのイミダゾールの段階グラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を５Ｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌに対して４℃にて終夜透析し、そして透析した融合タンパク質のＯＤを測定する。１００μｇ融合タンパク質当たり１単位の第Ｘａ因子を添加し、そして２５℃にて終夜静置インキュベートする。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化しておいた０．１Ｍ  ＮｉＳＯ４荷電キレートカラム（２０〜３０ｍｌカラムが十分である）に供する。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌでベースラインまでカラムを洗浄する。１０ｍＭおよび４０ｍＭのイミダゾールの段階グラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を１００ｍＭイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を５Ｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、２００ｍＭのＮａＣｌに対して４℃にて終夜透析し、そしてこの融合物を約２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、試料を小分けし、そして−２０℃にて凍結する。ＯＤ、ＢＣＡ、純度分析、およびＳＮＡＰ−２５評価を用いて精製タンパク質を試験する。
【０２８９】
実施例２７：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製（ノシセプチンがＨＮ鎖のＮ末端側にある）
リンカー−ノシセプチン−スペーサー挿入片を、実施例１９に記載のように調製する。
【０２９０】
（ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物の調製）
ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮ構築物（配列番号３９）を作製するために、リンカー（配列番号３３）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号２７）の挿入および連結用のレシピエントとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてpMALベクター（NEB）のようなBamHI、SalI、PstI、およびHindIIIに対する独自のマルチプルクローニング部位を含むベクターを同様に切断して、これにＬＣ／Ａ−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、ＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２８）をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてこれを同様に切断したpMAL−ＬＣ／Ａ−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号３９）を含んでおり、これは、配列番号４０に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２９１】
実施例２８：ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製（ノシセプチンがＬＣ鎖のＮ末端側にある）
ノシセプチン−スペーサー−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／Ａ構築物を作製するために、活性化のために第Ｘａ因子部位を付加し、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−リンカー−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号３４）として配置させた血清型Ａリンカーを、実施例２７に記載のように合成する。このリンカーをコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号２７）の挿入および連結用のレシピエントとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そして合成したＮ末端提示ノシセプチン挿入片（配列番号３５）を含む同様に切断したベクターにＬＣ／Ａ−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、この構築物をAvaIおよびHindIIIで切断し、そしてpMALプラスミド（NEB）のような発現ベクターに挿入する。次いで、ＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２８）を、PstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そして同様に切断したpMAL−ノシセプチン−ＬＣ／Ａ−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ノシセプチン−スペーサー−ＬＣ／Ａ−ＨＮ／ＡのＯＲＦ（配列番号６３）を含んでおり、これは、配列番号６４に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２９２】
実施例２９：可変スペーサー長を有するＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質ファミリーの調製および精製
実施例１９で用いたのと同じストラテジーを用いて、ノシセプチンおよび可変スペーサー内容物をコードする種々のＤＮＡリンカーを調製した。種々の逆翻訳ソフトウエアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0（Entelechon）］の１つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。次いで、制限部位をＤＮＡ配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ノシセプチン−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号６５〜配列番号６９）として配置させ得る。スペーサー、ノシセプチン、および制限配列について正しい読み枠を維持すること、そしてＤＡＭメチル化を生じる塩基ＴＣがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このＤＮＡ配列を、制限配列の組み込みについてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から任意の付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列を商業的に合成し（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供する。
【０２９３】
作製したスペーサーは、以下を含んでいた：
【０２９４】
【表２】
0005536017.tif 000005
【０２９５】
例示として、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ融合構築物（配列番号７０）を作製するために、リンカー（配列番号６６）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、同様にBamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号２７）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてpMALベクター（NEB）のようなBamHI、SalI、PstI、およびHindIIIに対する独自のマルチプルクローニング部位を含むベクターを同様に切断して、これにＬＣ／Ａ−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、ＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２８）をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてこれを同様に切断したpMAL−ＬＣ／Ａ−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／ＡのＯＲＦ（配列番号７０）を含んでおり、これは、配列番号７１に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２９６】
さらなる例として、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ融合構築物（配列番号７２）を作製するために、リンカー（配列番号６７）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、BamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＡのＤＮＡ（配列番号２７）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてpMALベクター（NEB）のようなBamHI、SalI、PstI、およびHindIIIに対する独自のマルチプルクローニング部位を含むベクターを同様に切断して、これにＬＣ／Ａ−リンカーフラグメントを挿入する。次いで、ＨＮ／ＡのＤＮＡ（配列番号２８）をPstIおよびHindIII制限酵素で切断し、そしてこれを同様に切断したpMAL−ＬＣ／Ａ−リンカー構築物に挿入する。最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／ＡのＯＲＦ（配列番号７２）を含んでおり、これは、配列番号７３に示される配列のタンパク質として発現する。
【０２９７】
ＧＳ１０、ＧＳ３０およびＨＸ２７からなるＬＣ／Ａ−ＣＰＮ−ＨＮ／Ａ融合物の改変体も同様に作製する。実施例２６に記載の精製方法を用いて、融合タンパク質を大腸菌細胞ペーストから精製する。図１２は、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１０）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ１５）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ２５）−ＨＮ／Ａ、ＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＧＳ３０）−ＨＮ／ＡおよびＬＣ／Ａ−ＣＰＮ（ＨＸ２７）−ＨＮ／Ａの場合に得られた精製産物を示している。
【０２９８】
実施例３０：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物のインビトロ効力の評価
実施例２および９に従って調製した融合タンパク質をｅＤＲＧ神経細胞モデルにおいて評価した。
【０２９９】
サブスタンスＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断に関するアッセイは、既に報告されている（Dugganら, 2002, J. Biol. Chem., 277, 34846-34852）。簡単に言えば、背根神経節ニューロンを１５日齢胎児Sprague-Dawleyラットから摘出し、そして解離した細胞を、Matrigelでコーティングされた２４ウェルプレート上に、１×１０６細胞／ウェルの密度で播種した。播種の１日後、細胞を１０μＭシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシドで４８時間処理する。細胞を、５％熱不活性化ウシ胎児血清、５ｍＭのＬ−グルタミン、０．６％のＤ−グルコース、２％のＢ２７補充物、および１００ｎｇ／ｍｌの２．５Ｓマウス神経成長因子を加えたダルベッコ最小必須培地中に維持する。試験物質を添加する前に、培養物を９５％空気／５％ＣＯ２中に３７℃にて２週間維持する。
【０３００】
ｅＤＲＧからのサブスタンスＰの放出を酵素結合免疫吸着アッセイによって評価する。簡単に言えば、ｅＤＲＧ細胞を低カリウム平衡塩類溶液（ＢＳＳ：５ｍＭのＫＣｌ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのグルコース、０．４４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２ｍＭのＣａＣｌ２）で２回洗浄する。基本試料を、各ウェルを１ｍｌの低カリウムＢＳＳと５分間インキュベートすることにより得る。この緩衝液の除去後、１ｍｌの高カリウム緩衝液（上記ＢＳＳに対してＮａＣｌで等張平衡化した１００ｍＭのＫＣｌを含むように改変した）と５分間インキュベートすることにより、細胞を放出に対して刺激する。サブスタンスＰのアッセイ前に、全ての試料を氷上のチューブに移す。２５０μｌの２Ｍ酢酸／０．１％トリフルオロ酢酸を添加して細胞を溶解し、遠心分離にてエバポレートし、そして５００μｌのアッセイ緩衝液に再懸濁することにより、全細胞溶解物を調製する。希釈した試料を、サブスタンスＰ含量について評価する。サブスタンスＰ免疫反応性を、サブスタンスＰ酵素免疫アッセイキット（Cayman Chemical CompanyまたはR&D Systems）を製造者の指示書に従って用いて測定する。サブスタンスＰは、並行して実行した標準サブスタンスＰ曲線に対してｐｇ／ｍｌで表す。
【０３０１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を、標準プロトコル（Novex）を用いて実施した。ＳＮＡＰ−２５タンパク質を１２％Tris／グリシンポリアクリルアミドゲル（Novex）上で分離し、引き続いてニトロセルロース膜に転写した。この膜を、切断したＳＮＡＰ−２５および完全なＳＮＡＰ−２５を認識するモノクローナル抗体（ＳＭＩ−８１）でプローブした。ペルオキシダーゼ結合二次抗体および化学発光検出系を用いて特異的結合を可視化した。ＳＮＡＰ−２５の切断を、走査デンシトメトリー（Molecular Dynamics Personal SI, ImageQuantデータ解析ソフトウエア）によって定量した。ＳＮＡＰ−２５の切断パーセントを、以下の式に従って算定した：（切断されたＳＮＡＰ−２５／（切断されたＳＮＡＰ−２５＋完全なＳＮＡＰ−２５））×１００。
【０３０２】
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ−Ａと称する）へのｅＤＲＧニューロンの曝露後、サブスタンスＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断の両方が観察されている（図１３）。融合物への２４時間の曝露後、６．３±２．５ｎＭの融合物濃度で、最大の５０％のＳＮＡＰ−２５切断が生じている。
【０３０３】
融合物の効果は、ＣＰＮ−ＡへのｅＤＲＧの１６時間曝露後の所定の時点でも評価している。図１４は、ＣＰＮ−Ａ融合タンパク質の長期にわたる作用期間を示しており、曝露後２８日でもなお、測定可能な活性が観察されている。
【０３０４】
実施例３１：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物のインビトロ効力の評価
実施例８および９に従って調製した融合タンパク質を、実施例３０に記載の方法を用いて、ｅＤＲＧ神経細胞モデルにおいて評価した。
【０３０５】
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ−Ａと称する）へのｅＤＲＧニューロンの曝露後、サブスタンスＰ放出の阻害およびＳＮＡＰ−２５の切断の両方が観察されている。融合物への２４時間の曝露後、１．４±０．４ｎＭの融合物濃度で、最大の５０％のＳＮＡＰ−２５切断が生じている（図１５）。
【０３０６】
融合物の効果は、ＣＰＮ−ＡへのｅＤＲＧの１６時間曝露後の所定の時点でも評価している。図１６は、ＣＰＮ−Ａ融合タンパク質の長期にわたる作用期間を示しており、曝露後２４日でもなお、測定可能な活性が観察されている。
【０３０７】
ＣＰＮｖ−Ａ融合タンパク質の結合能もまた、ＣＰＮ−Ａ融合物に比較して評価している。図１７は、ＯＲＬ−１レセプターでの結合効力を決定するための競合実験の結果を示している。ＣＰＮｖ−Ａが［３Ｈ］−ノシセプチンを置き換えることが示され、それにより、レセプターへの接近が、中心提示様式におけるリガンドを用いて可能であることが確認される。
【０３０８】
実施例３２：エンテロキナーゼでの処理により活性化されるＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製
実施例１および２で使用した方法に従って、ＬＣ／Ａ（配列番号２７）およびＨＮ／Ａ（配列番号２８）を作製し、BamHI−SalI−リンカー−エンテロキナーゼプロテアーゼ部位−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号７４）として配置させた血清型Ａのノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ配列（配列番号７５）を含んでおり、これは、配列番号７６に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａと称する。図１８は、活性化のために１００μｇの融合タンパク質当たり０．０００６４μｇでエンテロキナーゼを用いたこと以外は実施例２６で使用した方法に従った、大腸菌からのＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａの精製を示している。
【０３０９】
実施例３３：エンテロキナーゼでの処理により活性化されたＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物のインビトロ効力の評価
実施例３２で調製したＣＰＮｖ（Ｅｋ）−Ａを精製形態で得て、ｅＤＲＧ細胞モデルに適用してＳＮＡＰ−２５の切断を評価する（実施例３０からの方法を用いる）。図１９は、ＣＰＮｖ（Ｅｋ）−ＡへのｅＤＲＧの２４時間曝露後のＳＮＡＰ−２５の切断を示している。切断の効率は、実施例３１に記載したように、第Ｘａ因子切断物で得られるのと同様であることが観察されている。
【０３１０】
実施例３４：血清型Ａに由来する第Ｘａ因子活性化リンカーを有するＬＣ／Ｃ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製
実施例２１で使用した方法に従って、ＬＣ／Ｃ（配列番号３１）およびＨＮ／Ｃ（配列番号３２）を作製し、BamHI−SalI−リンカー−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号７７）として配置させた血清型Ａのノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ配列（配列番号７８）を含んでおり、これは、配列番号７９に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ａ）と称する。図２０は、実施例２６で使用した方法に従った、大腸菌からのＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ａ）の精製を示している。
【０３１１】
実施例３５：ＬＣ／Ｃ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質のインビトロ効力の評価
実施例２６で使用した方法に従って、実施例３４で調製したＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ａ）を精製形態で得て、ｅＤＲＧ細胞モデルに適用してＳＮＡＰ−２５の切断を評価する（実施例３０からの方法を用いる）。融合物への２４時間曝露後、３．１±２．０ｎＭの融合物濃度で、最大の５０％のシンタキシン切断が生じている。図２１は、ＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ａ）へのｅＤＲＧの２４時間曝露後のシンタキシンの切断を示している。
【０３１２】
実施例３６：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物のインビボ効力の評価
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ／Ａ）が急性カプサイシン誘発機械的異痛を阻害する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注射により評価する。試験動物を、研究に参加させる前、ＣＰＮ／Ａでの皮下処置後カプサイシン投与前、およびＣＰＮ／Ａの注射後カプサイシン追加投与後（１５分および３０分での応答の平均）に、１０ｇのVon Freyフィラメントによる一連の刺激（１０刺激×３試行）に応じた足逃避率（ＰＷＦ％）について評価する。カプサイシン追加投与を１０μＬの０．３％溶液の注射によって行う。試料希釈液を、０．５％ＢＳＡ／生理食塩水中で調製する。図２２は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物の種々の濃度での動物の前処置により得られる機械的異痛の逆転を示している。
【０３１３】
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮ／Ａ）がラットにおいてストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘発機械的（触覚）異痛を阻害する能力を評価する。ラットにおけるＳＴＺ誘発機械的異痛をストレプトゾトシンの注射（腹腔内または静脈内）によって生じさせる。これにより、膵臓β細胞が破壊され、インスリン生産の喪失が生じ、代謝ストレスを併発する（高血糖および高脂血症）。このように、ＳＴＺは、Ｉ型糖尿病を誘発する。さらに、ＳＴＺ処置により神経障害の進行性の発症が生じ、これは、痛覚過敏および異痛を伴う慢性疼痛のモデルとなり、これは、ヒト糖尿病患者で観察される徴候（末梢糖尿病性神経障害）を反映し得る。
【０３１４】
Sprague-Dawley雄ラット（２５０〜３００ｇ）をクエン酸緩衝液中６５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺで（静脈内）処置し、そして毎週、血中のグルコースおよび脂質を測定して、モデルの準備性を定める。足逃避閾値（ＰＷＴ）を所定の期間にわたるVon Freyフィラメントによる一連の刺激に応じて測定する。異痛は、２日の連続した試験日（１週間空ける）におけるＰＷＴがスケールの上で６ｇを下回って測定する場合に確立されるといわれる。この時点で、ラットを生理食塩水群（陰性効力コントロール）、ガバペンチン群（陽性効力コントロール）または試験群（ＣＰＮ／Ａ）のいずれかに無作為に振り分ける。試験物質（２０〜２５μｌ）を１回の注射で皮下注射し（ガバペンチンを除く）、ＰＷＴを処置後１日目およびその後２週間にわたって定期的に測定する。ガバペンチン（３ｍｌ／ｋｇ注入容量で３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）は、ＰＷＴ試験開始の２時間前に毎日注射する。図２３は、７５０ｎｇのＣＰＮ／Ａでの動物の前処置により得られる異痛の逆転を示している。データは、ＣＰＮ／Ａの単回注射後２週間にわたって得た。
【０３１５】
実施例３７：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物のインビボ効力の評価
ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（ＣＰＮｖ／Ａ）がカプサイシン誘発機械的異痛を阻害する能力を、ラット後肢足蹠への皮下足底内注射により評価する。試験動物を、研究に参加させる前（処置前）；ＣＰＮｖ／Ａでの皮下足底内処置後カプサイシン投与前（ＣＡＰ前）；およびＣＰＮｖ／Ａの注射後カプサイシン追加投与後（１５分および３０分での応答の平均；ＣＡＰ）に、１０ｇのVon Freyフィラメントによる一連の刺激（１０刺激×３試行）に応じた足逃避率（ＰＷＦ％）について評価する。カプサイシン追加投与を１０μＬの０．３％溶液の注射によって行う。試料希釈液を、０．５％ＢＳＡ／生理食塩水中で調製する。
【０３１６】
図２４は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物の種々の濃度での動物の前処置により得られる異痛の逆転を、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物の添加で得られた逆転と比較して示している。これらのデータは、正規化した足逃避率差として表す。ここでは、ピーク応答（カプサイシン後）とベースライン応答（カプサイシン前）との間の差を百分率にて示す。この分析にて、ＣＰＮｖ／Ａは、ＣＰＮ／Ａよりも強力であることが理解され得る。これは、ＣＰＮｖ／Ａは、ＣＰＮ／Ａで見られるのと同様の鎮痛効果を生じるのに必要とする投薬量が、より少ないからである。
【０３１７】
実施例３８：ＬＣ／Ａ−ｌｅｕエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製
ｌｅｕエンケファリンリガンドのサイズが小さい（５アミノ酸）ため、ＬＣ／Ａ−ｌｅｕエンケファリン−ＨＮ／Ａ融合物を、鋳型としてＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号３９）を用いる部位特異的変異誘発［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］によって作製する。ＹＧＧＦＬ  ｌｅｕエンケファリンペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを設計し、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号３９）のリンカー領域に相補的な配列を隣接させる。ＳＤＭ産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ｌｅｕエンケファリン−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号８０）を含んでおり、これは、配列番号８１に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をＣＰＬＥ−Ａと称する。図２５は、実施例２６で使用した方法に従った、大腸菌からのＣＰＬＥ−Ａの精製を示している。
【０３１８】
実施例３９：ＬＣ／Ａ−βエンドルフィン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の発現および精製
実施例２６で使用した方法に従って、そして実施例２４で作製したＬＣ／Ａ−βエンドルフィン−ＨＮ／Ａ融合タンパク質（ＣＰＢＥ−Ａと称する）を用いて、ＣＰＢＥ−Ａを大腸菌から精製する。図２６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した精製したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析にて示している。
【０３１９】
実施例４０：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン変異体−ＨＮ／Ａ融合物の調製
ノシセプチン配列を１位でＰｈｅからＴｙｒに変異させるのに必要な単一アミノ酸改変のために、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン変異体−ＨＮ／Ａ融合物を、鋳型としてＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号３９）を用いる部位特異的変異誘発［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］によって作製する。ノシセプチン配列の１位でチロシンをコードするオリゴヌクレオチドを設計し、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のＬＣ／Ａ−ノシセプチン−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号３９）のリンカー領域に相補的な配列を隣接させる。ＳＤＭ産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン変異体−スペーサー−ＨＮ／Ａ融合物のＯＲＦ（配列番号８２）を含んでおり、これは、配列番号８３に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をＣＰＯＰ−Ａと称する。図２７は、実施例２６で使用した方法に従った、大腸菌からのＣＰＯＰ−Ａの精製を示している。
【０３２０】
実施例４１：ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体変異体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製および評価
ノシセプチン配列を１位でＰｈｅからＴｙｒに変異させるのに必要な単一アミノ酸改変のために、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体変異体−ＨＮ／Ａ融合物を、鋳型としてＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号５１）を用いる部位特異的変異誘発［例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて］によって作製する。ノシセプチン配列の１位でチロシンをコードするオリゴヌクレオチドを設計し、標準的な大腸菌コドン利用を維持して付加的な制限部位が組み込まれないようにし、ノシセプチン部分のいずれかの側のＬＣ／Ａ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合物（配列番号５１）のリンカー領域に相補的な配列を隣接させる。ＳＤＭ産物を配列決定により確認し、そして最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ノシセプチン変異体−スペーサー−ＨＮ／Ａ融合物のＯＲＦ（配列番号８４）を含んでおり、これは、配列番号８５に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をＣＰＯＰｖ−Ａと称する。図２８は、実施例２６で使用した方法に従った、大腸菌からのＣＰＯＰｖ−Ａの精製を示している。
【０３２１】
実施例３０に記載の方法を用いて、ＣＰＯＰｖ−ＡをｅＤＲＧ細胞モデルでＳＮＡＰ−２５を切断する能力について評価する。図２９は、ＣＰＯＰｖ−ＡがｅＤＲＧモデルでＳＮＡＰ−２５を切断できることを示しており、約５．９ｎＭの融合物に細胞を２４時間曝露した後、最大の５０％のＳＮＡＰ−２５切断を生じている。
【０３２２】
実施例４２：ＩｇＡプロテアーゼ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ａ融合タンパク質の調製
ＩｇＡプロテアーゼアミノ酸配列を、自由に利用可能なデータベース供給源（例えば、GenBank（アクセッション番号P09790））から入手した。N. GonorrhoeaeＩｇＡプロテアーゼ遺伝子の構造に関する情報は、文献で入手可能である（Pohlnerら, Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease, Nature, 1987, 325(6103), 458-62）。Backtranslation tool v2.0（Entelechon）を用いて、大腸菌発現のために改変したＩｇＡプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を決定した。BamHI認識配列をＩｇＡのＤＮＡの５’末端に組み込み、システインアミノ酸をコードするコドンおよびSalI認識配列を３’末端に組み込んだ。ＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、MapDraw（DNASTAR Inc.）を用いてスクリーニングした。クローニングに必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）によって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表を参照することによって評価した。次いで、ＩｇＡオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むこの最適化したＤＮＡ配列（配列番号８６）を商業的に合成する。
【０３２３】
ＩｇＡ（配列番号８６）を、BamHIおよびSalI制限酵素を用いてＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号５１）に挿入して、ＩｇＡプロテアーゼＤＮＡとＬＣとを置換する。最終構築物は、ＩｇＡ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ（配列番号８７）を含んでおり、これは、配列番号８８に示される配列のタンパク質として発現する。
【０３２４】
実施例４３：除去可能なヒスチジン精製タグを有するノシセプチン標的エンドペプチダーゼ融合タンパク質の調製および評価
第Ｘａ因子の除去可能なｈｉｓタグ（ｈｉｓ６）をコードするＤＮＡを調製したが、エンテロキナーゼのような別のプロテアーゼ部位およびもっと長いヒスチジンタグのような別の精製タグもまた可能であることが明らかである。種々の逆翻訳ソフトウエアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0（Entelechon）］の１つを用いて、第Ｘａ因子の除去可能なｈｉｓタグ領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。次いで、制限部位をこのＤＮＡ配列に組み込み、そしてNheI−リンカー−SpeI−PstI−ＨＮ／Ａ−XbaI−ＬＥＩＥＧＲＳＧＨＨＨＨＨＨ停止コドン−HindIII（配列番号８９）として配置させ得る。このＤＮＡ配列を、組み込まれた制限配列についてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から任意の付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列を商業的に合成し（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供する。ＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴ（配列番号９０、除去可能なｈｉｓタグ構築物）を作製するために、除去可能なｈｉｓタグをコードしているpCR 4ベクターをNheIおよびHindIIIで切断する。次いで、NheI−HindIIIフラグメントを、同様にNheIおよびHindIIIによって切断しておいたＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａベクター（配列番号５１）に挿入する。最終構築物は、ＬＣ／Ａ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮ−ＦＸａ−Ｈｉｓタグ−HindIIIのＯＲＦ配列（配列番号９０）を含んでおり、これは、配列番号９１に示される配列のタンパク質として発現する。図３０は、実施例２６で使用した方法に従った、大腸菌からのＣＰＮｖ−Ａ−ＦＸａ−ＨＴの精製を示している。
【０３２５】
実施例４４：ジフテリア毒素由来トランスロケーションドメインを含むｌｅｕエンケファリン標的エンドペプチダーゼ融合タンパク質の調製
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウエアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0（Entelechon）］の１つを用いるジフテリア毒素のトランスロケーションドメインのアミノ酸配列（GenBank（アクセッション番号1XDTT）のような自由に利用可能なデータベースソースから入手）の逆翻訳によって設計する。次いで、制限部位をこのＤＮＡ配列に組み込み、そしてNheI−リンカー−SpeI−PstI−ジフテリアトランスロケーションドメイン−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号９２）として配置させ得る。PstI／XbaI認識配列を、配列のトランスロケーションドメインの５’末端および３’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み枠を維持する。このＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて）スクリーニングする。クローニング系に必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日）を参照することによって評価する。次いで、ジフテリアトランスロケーションドメインを含むこの最適化したＤＮＡ配列を、NheI−リンカー−SpeI−PstI−ジフテリアトランスロケーションドメイン−XbaI−停止コドン−HindIIIとして商業的に合成し（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター（Invitrogen）中に提供する。ジフテリアトランスロケーションドメインをコードしているpCR 4ベクターをNheIおよびXbaIで切断する。次いで、NheI−XbaIフラグメントを、同様にNheIおよびXbaIによって切断しておいたＬＣ／Ａ−ＣＰＬＥ−ＨＮ／Ａベクター（配列番号８０）に挿入する。最終構築物は、ＬＣ／Ａ−ｌｅｕエンケファリン−スペーサー−ジフテリアトランスロケーションドメインのＯＲＦ配列（配列番号９３）を含んでおり、これは、配列番号９４に示される配列のタンパク質として発現する。
【０３２６】
実施例４５：破傷風菌毒素由来ＬＣドメインを含むノシセプチン改変体標的エンドペプチダーゼ融合タンパク質の調製
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウエアツール［例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0（Entelechon）］の１つを用いて、破傷風菌毒素ＬＣアミノ酸配列（GenBank（アクセッション番号X04436）のような自由に利用可能なデータベースソースから入手）の逆翻訳によって設計する。BamHI／SalI認識配列を、配列の５’末端および３’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み枠を維持する（配列番号９５）。このＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込まれた制限酵素切断配列について、（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウエアを用いて）スクリーニングする。クローニング系に必要とされる配列と共通であることが見出されている任意の切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウエアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年9月13日）を参照することによって評価する。次いで、破傷風菌毒素ＬＣのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むこの最適化したＤＮＡ配列を、商業的に合成し（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター（Invitrogen）中に提供する。ＴｅＮＴ  ＬＣをコードしているpCR 4ベクターをBamHIおよびSalIで切断する。次いで、BamHI−SalIフラグメントを、同様にBamHIおよびSalIによって切断しておいたＬＣ／Ａ−ＣＰＮｖ−ＨＮ／Ａベクター（配列番号５１）に挿入する。最終構築物は、ＴｅＮＴ  ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ配列（配列番号９６）を含んでおり、これは、配列番号９７に示される配列のタンパク質として発現する。
【０３２７】
実施例４６：第Ｘａ因子切断を受けやすい天然型血清型Ｃリンカーを有するＬＣ／Ｃ−ノシセプチン改変体−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製
実施例２１で使用した方法に従って、ＬＣ／Ｃ（配列番号３１）およびＨＮ／Ｃ（配列番号３２）を作製し、そしてBamHI−SalI−リンカー−ノシセプチン改変体−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号９８）として配置させた血清型Ｃノシセプチン改変体リンカーに挿入する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ノシセプチン改変体−スペーサー−ＨＮのＯＲＦ配列（配列番号９９）を含んでおり、これは、配列番号１００に示される配列のタンパク質として発現する。この融合タンパク質をＣＰＮｖ−Ｃ（ａｃｔ．Ｃ）と称する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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