(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合タンパク質であって、以下：
ａ．以下を含む軽鎖可変ドメイン：
ｉ．配列番号１４を含む軽鎖ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号４５または配列番号５０を含む軽鎖ＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号７４を含む軽鎖ＣＤＲ３；並びに
ｂ．以下を含む重鎖可変ドメイン：
ｉ．配列番号１０２を含む重鎖ＣＤＲ１；
ｉｉ．配列番号１２８を含む重鎖ＣＤＲ２；及び
ｉｉｉ．配列番号１６９を含む重鎖ＣＤＲ３；
を含んでなり、そしてここで当該抗原結合タンパク質はヒトグルカゴン受容体に特異的に結合し、ヒトグルカゴン受容体に結合するときにヒトグルカゴン受容体のグルカゴン刺激を阻害する、前記抗原結合タンパク質。
【請求項２】
以下：
（ａ）配列番号２１７、２１９、若しくは２２９と少なくとも９０％同一のアミノ配列からなる群より選択される軽鎖可変ドメイン；
（ｂ）配列番号２６３、２６５、若しくは２７５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列からなる群より選択される重鎖可変ドメイン；又は
（ｃ）軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの組合せであって、当該軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、以下：配列番号２１７と少なくとも９０％同一の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２６３と少なくとも９０％同一の配列を有する重鎖可変ドメイン；配列番号２１９と少なくとも９０％同一の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２６５と少なくとも９０％同一の配列を有する重鎖可変ドメイン；配列番号２２９と少なくとも９０％同一の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２７５と少なくとも９０％同一の配列を有する重鎖可変ドメイン；からなる組合せの群より選択される；
を含んでなり、そしてここで当該抗原結合タンパク質はヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する、請求項１に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項３】
軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインは、以下：配列番号２１７の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２６３の配列を有する重鎖可変ドメイン；配列番号２１９の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２６５の配列を有する重鎖可変ドメイン；並びに、配列番号２２９の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２７５の配列を有する重鎖可変ドメイン；からなる組合せの群より選択され、そしてここで当該抗原結合タンパク質はヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する、請求項２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４】
さらに、以下：
ａ．配列番号３０５の軽鎖定常配列；
ｂ．配列番号３０７の軽鎖定常配列；
ｃ．配列番号３０９の重鎖定常配列；
ｄ．配列番号３０５の軽鎖定常配列及び配列番号３０９の重鎖定常配列；又は
ｅ．配列番号３０７の軽鎖定常配列及び配列番号３０９の重鎖定常配列；
を含んでなる、請求項３に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
抗原結合タンパク質が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ｆａ')ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、及びＩｇＭ抗体、及びＩｇＧ１抗体、及びＩｇＧ２抗体、及びＩｇＧ３抗体、及びＩｇＧ４抗体、及び少なくとも一つのヒンジ領域内変異を有するＩｇＧ４抗体、からなる群より選択される、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
抗原結合タンパク質がヒト抗体である、請求項５に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
ヒト抗体が、以下：
ａ．配列番号３１２を有する軽鎖及び配列番号３１１を有する重鎖；又は
ｂ．配列番号３１０を有する軽鎖及び配列番号３１１を有する重鎖；
を含んでなる、請求項６に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項８】
ヒトグルカゴン受容体に結合するときに：
ａ．参照抗体と実質的に同じＫｄでヒトグルカゴン受容体に結合するか；
ｂ．前記参照抗体と実質的に同じＩＣ５０でヒトグルカゴン受容体のグルカゴン刺激を阻害するか；又は、
ｃ．ヒトグルカゴン受容体上で、前記参照抗体と結合に関して競合し；
ここで、前記参照抗体が、以下：配列番号２１７の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２６３の配列を有する重鎖可変ドメイン；配列番号２１９の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２６５の配列を有する重鎖可変ドメイン；並びに、配列番号２２９の配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号２７５の配列を有する重鎖可変ドメイン；からなる群より選択される軽鎖及び重鎖可変ドメインの組合せを含んでなる、請求項１または２に記載の抗原結合タンパク質。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１又は２の抗原結合タンパク質の軽鎖可変ドメイン、及び重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる核酸。
【請求項１１】
軽鎖配列をコードするポリヌクレオチドが配列番号２１６、２１８及び２２８から選択され；そして、重鎖配列をコードするポリヌクレオチドが配列番号２６２、２６４及び２７４から選択される；請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の核酸を含んでなる組換え発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１４】
請求項６又は７の抗体を産生可能なハイブリドーマ。
【請求項１５】
ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質の産生方法であって、請求項１３に記載の宿主細胞を、抗原結合タンパク質をそれに発現させる条件下でインキュベートすることを含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物であって、以下の治療を必要とする患者において、
（ｉ）血糖を低下させる；
（ｉｉ）耐糖能を改善する；または
（ｉｉｉ）２型糖尿病または関連する障害を予防または治療する；
ために使用される、前記医薬組成物。
【請求項１７】
関連する障害が、高血糖、空腹時血糖異常、耐糖能障害、脂質代謝異常およびメタボリック症候群である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項９に記載の医薬組成物を含んでなる、２型糖尿病の治療用キット。
【請求項１９】
血糖をの低減が有益である障害を治療するための、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
障害が、２型糖尿病、高血糖、空腹時血糖異常、耐糖能障害、脂質代謝異常およびメタボリック症候群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、2006年9月20日に出願された米国仮出願第60/846,202、および2007年8月30日に出願された米国仮出願第60/968,977の利益を請求する。該出願全体の開示は、信頼されるものであり、かつ、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
技術分野
本発明の分野は、グルカゴン受容体抗体に関する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
グルカゴンは、プロホルモン転換酵素２の細胞特異的発現によって膵アルファ細胞においてその前駆体からプロセシングされた、２９アミノ酸のホルモンである（Furutaら、J. Biol. Chem. 276:27197-27202 (2001年)）。空腹時に、グルカゴン分泌は、糖値の低下に応答して増加する。グルカゴン分泌の増加は、肝グリコーゲン分解および糖新生を促進することによってグルコース産生を刺激する。このように、グルカゴンは、動物における糖の正常値維持において、インスリンの効果との均衡を保っている。
【０００４】
グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＣＧＲ）のセレクチンサブファミリー（ファミリーＢ）に属する。グルカゴン受容体は、主として肝臓、そして腎臓に発現して、糖新生におけるその役割を表しており、肝臓においては、肝グルコース産生量を制御する。肝臓におけるグルカゴン受容体の活性化は、アデニルシクラーゼの活性およびホスホイノシトールの代謝回転を刺激し、続いて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、フルクトース-１,６-ビスホスファターゼ（ＦＢＰａｓｅ-１）およびグルコース-６-ホスファターゼ（Ｇ-６-Ｐａｓｅ）を含む糖新生酵素の発現増加をもたらす。加えて、グルカゴンのシグナル伝達は、グリコーゲンホスホリラーゼを活性化し、かつ、グリコーゲンシンターゼを阻害する。
【０００５】
試験により、より高い基礎グルカゴン値、および食後のグルカゴン分泌抑制の欠如が、ヒトにおいて糖尿病状態に寄与することが、示されている（Mullerら、N Eng J Med 283:109-115 (1970年)）。グルカゴンの産生もしくは機能を標的とすることが、血糖を調節および低下させる一つの方法である可能性がある。２型糖尿病に対して有効な治療を提供する需要が、継続して存在する。本発明は、２型糖尿病および関連する疾患の治療に対する新規の組成物および方法を提供することによって、この需要に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Furutaら、J. Biol. Chem. 276:27197-27202 (2001年)
【非特許文献２】Mullerら、N Eng J Med 283:109-115 (1970年)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一側面において、本発明は、ａ．以下からなる群より選択される配列を含んでなる軽鎖ＣＤＲ３：ｉ．Ｌ１〜Ｌ２３の軽鎖ＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、１００）からなる群より選択されるＣＤＲ３配列と合計３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｉｉ．Ｌ  Ｑ  Ｘ２１  Ｎ  Ｓ  Ｘ２２  Ｐ  Ｌ  Ｔ（配列番号２０８）；ｉｉｉ．Ｑ  Ａ  Ｗ  Ｄ  Ｓ  Ｘ２３  Ｔ  Ｖ  Ｘ２４（配列番号２０９）；ならびに、ｂ．以下からなる群より選択される配列を含んでなる重鎖ＣＤＲ３配列：ｉ．Ｈ１〜Ｈ２３の重鎖ＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９）からなる群より選択されるＣＤＲ３配列と合計４を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；ｉｉ．Ｅ  Ｘ２５  Ｘ２６  Ｘ２７  Ｙ  Ｄ  Ｉ  Ｌ  Ｔ  Ｇ  Ｙ  Ｘ２８  Ｘ２９  Ｙ  Ｙ  Ｇ  Ｘ３０  Ｄ  Ｖ（配列番号２１０）；ｉｉｉ．Ｘ３１  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｆ  Ｄ  Ｙ（配列番号２１１）；あるいは、ｃ．（ａ）の軽鎖ＣＤＲ配列および（ｂ）の重鎖ＣＤＲ配列；（ここで、Ｘ２１はヒスチジン残基またはグルタミン残基であり、Ｘ２２はアスパラギン残基、アスパラギン酸残基またはチロシン残基であり、Ｘ２３はアスパラギン残基またはセリン残基であり、Ｘ２４はイソロイシン残基またはバリン残基であり、Ｘ２５はリジン残基、グルタミン酸残基またはプロリン残基であり、Ｘ２６はアスパラギン酸残基、スレオニン残基、グルタミン残基またはプロリン残基であり、Ｘ２７はヒスチジン残基またはチロシン残基であり、Ｘ２８はアスパラギン残基、ヒスチジン残基、アスパラギン酸残基またはフェニルアラニン残基であり、Ｘ２９はチロシン残基、ヒスチジン残基またはアスパラギン残基であり、Ｘ３０はロイシン残基またはメチオニン残基であり、Ｘ３１はロイシン残基またはメチオニン残基である）のいずれかを含んでなる単離された抗原結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質を、提供する。
【０００８】
別の側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．以下からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列：ｉ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１；ｉｉ．Ｒ  Ｓ  Ｘ１  Ｑ  Ｓ  Ｌ  Ｌ  Ｄ  Ｘ２  Ｘ３  Ｄ  Ｇ  Ｔ  Ｙ  Ｔ  Ｌ  Ｄ（配列番号２００）；ｉｉｉ．Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｘ４  Ｉ  Ｒ  Ｎ  Ｄ  Ｘ５  Ｇ（配列番号２０１）；およびｉｖ．Ｓ  Ｇ  Ｄ  Ｋ  Ｌ  Ｇ  Ｄ  Ｋ  Ｙ  Ｘ６  Ｃ（配列番号２０２）（ここで、Ｘ１はセリン残基またはスレオニン残基であり、Ｘ２はアルギニン残基またはセリン残基であり、Ｘ３はアスパラギン酸残基またはアラニン残基であり、Ｘ４はグリシン残基またはアスパラギン酸残基であり、Ｘ５はロイシン残基またはフェニルアラニン残基であり、Ｘ６はバリン残基またはアラニン残基である）；ｂ．以下からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列：ｉ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ２配列（配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｉｉ．Ａ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｘ９  Ｓ（配列番号２０４）；およびｉｉｉ．Ｑ  Ｘ１０  Ｘ１１  Ｋ  Ｒ  Ｐ  Ｓ（配列番号２０５）（ここで、Ｘ９はグルタミン残基またはグルタミン酸残基であり、Ｘ１０はセリン残基またはスレオニン残基であり、Ｘ１１はスレオニン残基またはセリン残基である）；ｃ．以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列：ｉ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１；ｉｉ．Ｘ７  Ｙ  Ｘ８  Ｍ  Ｈ（配列番号２０３）（式中、Ｘ７はセリン残基またはスレオニン残基であり、Ｘ８はグリシン残基またはアスパラギン酸残基である）；ならびに、ｄ．以下からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２：ｉ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖配列；ｉｉ．Ｘ１２  Ｉ  Ｗ  Ｘ１３  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｘ１４  Ｋ  Ｙ  Ｙ  Ｘ１５  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ（配列番号２０６）；およびｉｉｉ．Ｘ１６  Ｉ  Ｓ  Ｘ１７  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｘ１８  Ｋ  Ｙ  Ｘ１９  Ｘ２０  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ（配列番号２０７）（ここで、Ｘ１２はセリン残基、フェニルアラニン残基、バリン残基またはグルタミン酸残基であり、Ｘ１３はチロシン残基またはアスパラギン残基であり、Ｘ１４はアスパラギン残基またはグルタミン酸残基であり、Ｘ１５はバリン残基またはアラニン残基であり、Ｘ１６はバリン残基またはフェニルアラニン残基であり、Ｘ１７はヒスチジン残基、アスパラギン酸残基またはチロシン残基であり、Ｘ１８はアスパラギン酸残基、アスパラギン残基またはヒスチジン残基であり、Ｘ１９はチロシン残基またはセリン残基であり、Ｘ２０はアラニン残基またはグリシン残基である）；からなる群より選択される一つのアミノ酸配列をさらに含んでなる。
【０００９】
さらなる側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ２配列（配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０）と１を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ならびに、ｄ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２）と１を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；ならびに、ｆ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；からなる群より選択される一つのアミノ酸配列を含んでなる。
【００１０】
さらなる側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）と１を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１〜Ｌ２３の軽鎖ＣＤＲ２配列（配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０）；ｃ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００）と１を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１〜Ｈ２３の重鎖ＣＤＲ１配列（配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２）；ｅ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）と１を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；ならびに、ｆ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；からなる群より選択される一つのアミノ酸配列を含んでなる。
【００１１】
さらなる側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１〜Ｌ２３の軽鎖ＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）；ｂ．Ｌ１〜Ｌ２３の軽鎖ＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００）；ｃ．Ｈ１〜Ｈ２３の重鎖ＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）；ならびに、ｄ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）と１を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；からなる群より選択される一つのアミノ酸配列を含んでなる。
【００１２】
よりさらなる側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｈ１〜Ｈ２３の重鎖ＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）；からなる群より選択される一つのアミノ酸配列を含んでなる。
【００１３】
別の側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ２配列（配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；ならびに、ｆ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）と４を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；からなる群より選択される二つのアミノ酸配列を含んでなる。
【００１４】
別の側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ２配列（配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；ならびに、ｆ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）と４を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；からなる群より選択される三つのアミノ酸配列を含んでなる。
【００１５】
別の側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ２配列（配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；ならびに、ｆ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）と４を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；からなる群より選択される四つのアミノ酸配列を含んでなる。別の側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ２配列（配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；ならびに、ｆ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）と４を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；からなる群より選択される五つのアミノ酸配列を含んでなる。
【００１６】
別の側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ１配列；ｂ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ２配列（配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ２配列；ｃ．Ｌ１〜Ｌ２３のＣＤＲ３配列（配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる軽鎖ＣＤＲ３配列；ｄ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ１配列（配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２）と２を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ１配列；ｅ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ２配列（配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３）と３を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ２配列；ならびに、ｆ．Ｈ１〜Ｈ２３のＣＤＲ３配列（配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９）と４を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なる重鎖ＣＤＲ３配列；を含んでなる。
【００１７】
別の側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．以下を含んでなる軽鎖可変ドメイン：ｉ．配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８および４１から選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｉｉ．配列番号４３、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８および７０から選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ならびにｉｉｉ．配列番号７２、７４、７６、７８、８０、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７および１００から選択される軽鎖ＣＤＲ３配列；ｂ．以下を含んでなる重鎖可変ドメイン：ｉ．配列番号１０２、１０４、１０６、１０８、１１１、１１３、１１５、１１７、１１８、１２０および１２２から選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｉｉ．配列番号１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１および１６３から選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ならびにｉｉｉ．配列番号１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７および１９９から選択される重鎖ＣＤＲ３配列；あるいは、ｃ．（ａ）の軽鎖可変ドメインおよび（ｂ）の重鎖可変ドメイン；のいずれかを含んでなる。
【００１８】
別の側面において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．以下からなる群より選択される軽鎖可変ドメイン配列：ｉ．Ｌ１〜Ｌ２３から選択される軽鎖可変ドメイン配列（配列番号２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５および２５７）と少なくとも８０％同一の配列を有するアミノ酸；ｉｉ．Ｌ１〜Ｌ２３の軽鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４および２５６）と少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；ｉｉｉ．Ｌ１〜Ｌ２３の軽鎖可変ドメイン配列からなるポリヌクレオチドである配列番号２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４および２５６の相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；ｂ．以下からなる群より選択される重鎖可変ドメイン配列：ｉ．配列番号２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１および３０３のＨ１〜Ｈ２３の重鎖可変ドメイン配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸の配列；ｉｉ．Ｈ１〜Ｈ２３の重鎖可変ドメイン配列をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００および３０２）と少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；ｉｉｉ．Ｈ１〜Ｈ２３の重鎖可変ドメイン配列からなるポリヌクレオチド（配列番号２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００および３０２）の相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸の配列；あるいは、ｃ．（ａ）の軽鎖可変ドメインおよび（ｂ）の重鎖可変ドメイン；のいずれかを含んでなる。
【００１９】
一実施態様において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、ａ．配列番号２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５および２５７のＬ１〜Ｌ２３からなる群より選択される軽鎖可変ドメイン配列；ｂ．配列番号２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１および３０３のＨ１〜Ｈ２３からなる群より選択される重鎖可変ドメイン配列；あるいは、ｃ．（ａ）の軽鎖可変ドメインおよび（ｂ）の重鎖可変ドメイン；のいずれかを含んでなる。
【００２０】
別の実施態様において、単離された結合タンパク質であって、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１４Ｈ１４、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ１６Ｈ１６、Ｌ１７Ｈ１７、Ｌ１８Ｈ１８、Ｌ１９Ｈ１９、Ｌ２０Ｈ２０、Ｌ２１Ｈ２１、Ｌ２２Ｈ２２およびＬ２３Ｈ２３からなる組み合わせの群より選択される、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの組み合わせを含んでなる。一実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号３０５の軽鎖定常配列；配列番号３０７の軽鎖定常配列；配列番号３０９の重鎖定常配列；配列番号３０５の軽鎖定常配列および配列番号３０９の重鎖定常配列；あるいは、配列番号３０７の軽鎖定常配列および配列番号３０９の重鎖定常配列；をさらに含んでなる。
【００２１】
一側面において、単離された抗原結合タンパク質は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、抗原結合抗体フラグメント、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ｆａ')ｘフラグメント、ドメイン抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体およびＩｇＭ抗体およびＩｇＧ１抗体およびＩｇＧ２抗体およびＩｇＧ３抗体およびＩｇＧ４抗体、およびＨ鎖間ジスルフィド結合を形成する傾向を弱める少なくとも一つのヒンジ領域内変異を有するＩｇＧ４抗体からなる群より選択される。一実施態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。
【００２２】
別の側面において、単離された抗体結合タンパク質は、ヒトグルカゴン受容体に結合するときに：ａ．参照抗体と実質的に同じＫｄでヒトグルカゴン受容体に結合するか；ｂ．前記参照抗体と実質的に同じＩＣ５０でヒトグルカゴン受容体のグルカゴン刺激を阻害するか；または、ｃ．前記参照抗体と結合に関して競合し、ここで、前記参照抗体は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ２１Ｈ２１およびＬ２２Ｈ２２からなる群より選択される軽鎖および重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを含んでなる。
【００２３】
別の側面において提供されるのは、ヒトグルカゴン受容体に結合するときに：ａ．参照抗体と実質的に同じＫｄでヒトグルカゴン受容体に結合するか；ｂ．前記参照抗体と実質的に同じＩＣ５０でヒトグルカゴン受容体のグルカゴン刺激を阻害するか；または、ｃ．前記参照抗体と結合に関して競合する、単離されたヒト抗体であり、ここで、前記参照抗体は、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−７、Ａ−８、Ａ−９、Ａ−１１、Ａ−１２、Ａ−１３、Ａ−１５、Ａ−２１およびＡ−２２からなる群より選択される軽鎖および重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを含んでなる。
【００２４】
別の側面において提供されるのは、ヒトグルカゴン受容体に結合するときに：ａ．ヒトグルカゴン受容体のＳｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１９に特異的に結合するか；ｂ．９０ｎＭ以下のＩＣ５０値でグルカゴンのシグナル伝達を低減させるか；ｃ．動物モデルにおいて血糖を低下させるか；ｄ．ａおよびｂの両方；または、ｅ．ａ、ｂおよびｃの両方；である、単離されたヒト抗体である。一実施態様において、動物モデルは、ｏｂ／ｏｂ動物モデルである。
【００２５】
別の側面において提供されるのは、抗原結合タンパク質を医薬的に許容可能なキャリアーとの混合物中に含んでなる医薬組成物である。別の実施態様において、医薬組成物は、単離されたヒト抗体を医薬的に許容可能なキャリアーとの混合物中に含んでなる。
【００２６】
別の側面において提供されるのは、本発明の抗原結合タンパク質の軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、またはその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子である。一実施態様において、ポリヌクレオチドは、軽鎖可変ドメインポリヌクレオチド配列Ｌ１〜Ｌ２３（配列番号２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４および２５６）、重鎖可変ドメインポリヌクレオチド配列Ｈ１〜Ｈ２３（配列番号２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２）、またはその両方を含んでなる。
【００２７】
さらに提供されるのは、本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターである。一実施態様において、ベクターは発現ベクターである。さらに提供されるのは、ベクターを含んでなる宿主細胞である。さらに提供されるのは、本発明の抗原結合タンパク質を産生可能なハイブリドーマである。さらに提供されるのは、本発明の抗原結合タンパク質の作製方法であって、本発明の抗原結合タンパク質を細胞に発現させる条件下で宿主細胞を培養することを含んでなる方法である。
【００２８】
さらに提供されるのは、それを必要とする対象において血糖を低下させる方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することを含んでなる方法である。さらに提供されるのは、それを必要とする対象において耐糖能を改善する方法であって、治療有効投与量の医薬組成物を対象に投与することを含んでなる方法である。さらに提供されるのは、治療有効量の医薬組成物を対象に投与することによって、それを必要とする対象において２型糖尿病もしくは関連する障害を予防または治療する方法である。一実施態様において、対象はヒト対象である。別の実施態様において、関連する障害は、高血糖、空腹時血糖異常、耐糖能障害、脂質代謝異常およびメタボリック症候群から選択される。さらに提供されるのは、血糖を低下させ、２型糖尿病および関連する障害（高血糖、空腹時血糖異常、耐糖能障害、脂質代謝異常およびメタボリック症候群を含む）を予防または治療するのに有用な薬剤の製造における、本発明の医薬組成物の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、バッファーと比較して抗体Ａ−３または抗体Ａ−４を１または３ｍｇ／ｋｇの用量にて単回注射後の、１４週齢の雄性ｏｂ／ｏｂマウスの血糖値を示す（ｎ＝１０動物／群）。血糖は、０時点、ならびに注射後２４、４８、９６、１２０、１４４、１９２および２４０時間に測定した。
【図２】図２は、バッファーと比較して抗体Ａ−３または抗体Ａ−９を１または３ｍｇ／ｋｇの用量にて単回注射後の、１４週齢の雄性ｏｂ／ｏｂマウスの血糖値を示す（ｎ＝１０動物／群）。血糖は、０時点、ならびに注射後２４、７２、１２０、１９２および２４０時間に測定した。
【図３】図３は、ビヒクルまたは抗体９（Ａ９）の単回皮下注射前（ＧＴＴ１およびＧＴＴ２）および後（ＧＴＴ３、４および５）の曲線下糖値（ＡＵＣ）を示す、経口耐糖能試験（ＧＴＴ）の結果を示す。
【図４】図４は、標識抗体Ａ−３と結合に関して競合可能な非標識抗体（克服性抗体）を示す。
【図５】図５は、標識抗体Ａ−３と結合に関して部分的に競合可能な非標識抗体（部分的克服性抗体）を示す。
【図６】図６は、標識抗体Ａ−３と結合に関して競合可能でない非標識抗体（非克服性抗体）を示す。
【図７】図７は、四つの抗ＧＣＧＲ抗体について、ここに示したヒトＧＣＧＲおよびヒトＧＬＰ−１受容体から構築されたキメラ受容体との結合試験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、ヒトグルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）に特異的に結合する抗体などの抗原結合タンパク質に関する。これらには、グルカゴンとヒトＧＣＧＲとの結合を阻害または遮断し、そして受容体を介したグルカゴンのシグナル伝達を低減させる、抗原結合タンパク質が含まれる。一実施態様において提供されるのは、動物モデルにおいて血糖を低下させることが可能なアンタゴニスト抗体を含む、ヒト抗体である。抗原結合タンパク質は、糖尿病および関連する疾患の治療に有用である。
【００３１】
本発明は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質に関する、組成物、キットおよび方法をさらに提供する。さらに提供されるのは、抗グルカゴン受容体抗体、抗体フラグメントまたは抗体誘導体の全部もしくは一部をコードする核酸などの、グルカゴン受容体に結合するポリペプチドの全部もしくは一部分をコードするポリヌクレオチドの配列を含んでなる、核酸分子、その誘導体およびフラグメントである。本発明は、このような核酸を含んでなるベクターおよびプラスミド、ならびに、このような核酸ならびに／またはベクターおよびプラスミドを含んでなる細胞または細胞株を、さらに提供する。提供される方法には、例えば、抗ＧＣＧＲ抗体などのヒトＧＣＧＲに結合する抗原結合タンパク質を作製、同定および単離する方法、抗原結合タンパク質がＧＣＧＲに結合するかどうかを決定する方法、ヒトＧＣＧＲに結合する抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物などの組成物を作製する方法、ならびに、ＧＣＧＲと結合する抗原結合タンパク質を対象に投与するための方法であって、例えば、ＧＣＧＲが介在する状態を治療するための方法、およびグルカゴンのシグナル伝達に伴う生物活性をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節するための方法が、含まれる。
【００３２】
定義
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、標準的な１もしくは３文字略号を用いて示す。特段に示さない限り、ポリペプチド配列は、左にそのアミノ末端、および右にそのカルボキシ末端を有し、そして、一本鎖核酸配列、および二本鎖核酸配列の上部の鎖は左にその５'末端、および右にその３'末端を有する。ポリペプチドの特定の区域は、アミノ酸８０〜１１９などのアミノ酸残基番号によって、またはＳｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１９などのその部位での実際の残基によって、指定可能である。特定のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を、参照配列とどのように異なるのかを説明することにより記載することもまた可能である。特定の軽鎖および重鎖可変ドメインのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、Ｌ１（「軽鎖可変ドメイン１」）、Ｈ１（「重鎖可変ドメイン１」）と指定される。軽鎖および重鎖を含んでなる抗原結合タンパク質または抗体は、軽鎖の名称と重鎖の名称とを組み合わせることによって示される。例えば、「Ｌ４Ｈ７」は、Ｌ４の軽鎖可変ドメインおよびＨ７の重鎖可変ドメインを含んでなる抗体である。
【００３３】
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって特段に必要とされない限り、単数形の語は複数形を含み、そして、複数形の語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝子およびタンパク質および核酸の化学およびハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法、ならびにそれらの技術は、当該技術分野において周知かつ一般的に用いられるものである。本発明の方法および技術は、一般には、当該技術分野において周知の慣用の方法にしたがって、かつ特段に示さない限り本明細書全体にわたって引用され、そして論じられる種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されるとおりに、遂行される。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州 (1989) ；および、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992年)；および、 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual コールドスプリングハーバー・ラボラトリー・プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州 (1990年)を参照されたい。該文献は、参照によって本明細書に援用される。酵素反応および精製技術は、当該技術分野において一般的に行われるとおりに、または本明細書に記載されるとおりに、製造業者の仕様書にしたがって行われる。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関連して用いられる用語、ならびにそれらの実験室手順および技術は、当該技術分野において周知であり、かつ一般的に用いられるものである。標準的な技術を、化学合成、化学分析、医薬品の製造、処方物化および送達、ならびに患者の治療に用いることが可能である。
【００３４】
以下の語は、特段に示されない限り、以下の意味を有することが理解されよう：「単離された分子」（分子とは、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体である）の語は、その由来または起源によって、（１）その天然状態では付随している、自然界では随伴している構成成分を伴わないか、（２）同種由来の他分子を実質的に含まないか、（３）異なる種に由来する細胞によって発現されるか、あるいは（４）自然界に生じない、分子である。このように、化学合成されるか、または自然界において由来する細胞とは異なる細胞系において発現される分子は、自然界で随伴しているその構成成分から「単離され」ていることになる。また、分子を、当該技術分野において周知の精製技術を用いて単離することによって、自然界では随伴している構成成分を実質的に含まないようにしてもよい。分子の純度または均一性を、当該技術分野において周知の多数の手段によってアッセイしてもよい。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびポリペプチドを可視化するためのゲル染色を用いて、当該技術分野において周知の技術を用いてアッセイしてもよい。特定の目的に対しては、ＨＰＬＣ、または精製技術分野において周知の他手段を用いて、高分解能を供してもよい。
【００３５】
「グルカゴン阻害剤」および「グルカゴンアンタゴニスト」の語は、同義的に用いられる。それぞれは、グルカゴンのシグナル伝達を検出可能な程度に阻害する分子である。阻害剤によって引き起こされる阻害は、それがアッセイを用いて検出可能である限り、完全である必要がない。例えば、以下の実施例４に記載した細胞系アッセイは、グルカゴンのシグナル伝達の阻害を測定するのに有用なアッセイを示す。
【００３６】
「ペプチド」「ポリペプチド」および「タンパク質」の語は、それぞれ、ペプチド結合によって互いに連結している２またはそれより多くのアミノ酸残基を含んでなる分子を指す。これらの語は、例えば、天然および人工のタンパク質、タンパク質フラグメント、およびタンパク質配列のポリペプチドアナログ（ムテイン、バリアントおよび融合タンパク質など）、ならびに、翻訳後に、あるいは共有結合的もしくは非共有結合的に修飾されたタンパク質を、包含する。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体であっても、または多量体であってもよい。
【００３７】
「ポリペプチドフラグメント」の語は、本明細書では、対応する完全長タンパク質と比較してアミノ末端および／またはカルボキシ末端に欠失があるポリペプチドを指す。フラグメントは、例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、５０、７０、８０、９０、１００、１５０または２００アミノ酸長であることが可能である。フラグメントはまた、例えば、最長で１,０００、７５０、５００、２５０、２００、１７５、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１４、１３、１２、１１または１０アミノ酸長であることが可能である。フラグメントは、その一方または両方の末端に、１またはそれより多くのさらなるアミノ酸、例えば、自然界に存在する別のタンパク質（例えば、Ｆｃまたはロイシンジッパードメイン）に由来するアミノ酸の配列または人工アミノ酸配列（例えば、人工リンカー配列）を、さらに含んでなることが可能である。
【００３８】
本発明のポリペプチドには、例えば、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減させ、（２）酸化に対する感受性を低減させ、（３）タンパク質複合物の形成に向けて結合親和性を変え、（４）結合親和性を変え、そして（４）他の物理化学的もしくは機能的特性を与えるかまたは修飾する、任意の方法および任意の理由によって修飾されているポリペプチドが含まれる。アナログには、ポリペプチドのムテインが含まれる。例えば、１または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を、自然界に存在する配列（例えば、分子内接触を形成するドメインの外にあるポリペプチドの一部分）において行ってもよい。「保存的アミノ酸置換」は、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないものである（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるヘリックスを壊すか、あるいは親配列を特徴付けるかもしくはその機能性に必要な他のタイプの二次構造を破壊する傾向にあってはならない）。当該技術分野により認められているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編集、W. H. Freeman and Company, ニューヨーク州 (1984年)); Introduction to Protein Structure (C. BrandenおよびJ. Tooze編集、ガーランド・パブリッシング、ニューヨーク、ニューヨーク州 (1991年))；ならびに、Thorntonら、Nature 354:105 (1991年) に記載されている。該文献は、それぞれ、参照によって本明細書に援用される。
【００３９】
本発明はまた、ＧＣＧＲ抗原結合タンパク質の非ペプチドアナログも提供する。非ペプチドアナログは、鋳型となるペプチドと相似する特性を伴う薬物を提供するために、一般的に用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（peptide mimeticまたはpeptidemimetic）」と称される。Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986年); VeberおよびFreidinger TINS 392ページ (1985年)；ならびに、Evansら、J. Med. Chem. 30:1229 (1987年)。該文献は、参照によって本明細書に援用される。治療に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体を、同等の治療もしくは予防効果を得るために用いてもよい。一般に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（すなわち、所望の生化学的特性または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、ただし、当該技術分野において周知の方法によって以下からなる群より選択される結合により置換されていてもよい、１またはそれより多くのペプチド結合を有する：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２-ＣＨ２−−、−−ＣＨ=ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および-ＣＨ２ＳＯ−−。コンセンサス配列の１またはそれより多くのアミノ酸の、同じタイプのＤ-アミノ酸への系統的な置換（例えば、Ｌ-リジンの代わりにＤ-リジン)を、より安定なペプチドを作出するために用いてもよい。加えて、コンセンサス配列、または実質的に同一であるコンセンサス配列の変形形態を含んでなる、限定されたペプチドを、例えば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィド架橋を形成可能な内部システイン残基を付加することによって、当該技術分野において周知の方法により（RizoおよびGierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992年)、参照によって本明細書に援用される）作出してもよい。
【００４０】
ポリペプチドの「バリアント」（例えば、抗体）は、１またはそれより多くのアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列と比較してアミノ酸配列に挿入、欠失および／または置換されている、アミノ酸配列を含んでなる。本発明のバリアントには、融合タンパク質が含まれる。
【００４１】
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、例としてポリエチレングリコール、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）などの別の化学部分との複合体化、リン酸化およびグリコシル化によって化学修飾されている、ポリペプチド（例えば、抗体）である。特段に示されない限り、「抗体」の語には、二つの完全長重鎖および二つの完全長軽鎖を含んでなる抗体に加えて、その誘導体、バリアント、フラグメントおよびムテインが含まれ、その例を以下に記載する。
【００４２】
「抗原結合タンパク質」は、抗原に結合する部分、および所望により、抗原結合部分が抗原結合タンパク質と抗原との結合を促進するコンフォメーションを取ることを可能にさせるスキャフォールドもしくはフレームワーク部分を含んでなる、タンパク質である。抗原結合タンパク質の例には、抗体、抗体フラグメント（例えば、抗体の抗原結合部分）、抗体誘導体および抗体アナログが含まれる。抗原結合タンパク質は、例えば、代替のタンパク質スキャフォールド、またはＣＤＲもしくはＣＤＲ誘導体が移植された人工スキャフォールドを含んでなることが可能である。このようなスキャフォールドには、これに限定されないが、例えば抗原結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入された変異を含んでなる、抗体由来スキャフォールド、ならびに、例えば生体適合性ポリマーを含んでなる、完全合成スキャフォールドが含まれる。例えば、Korndorferら、2003年、Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics、第53巻、第1号:121-129；Roqueら、2004年、Biotechnol. Prog. 20:639-654を参照されたい。加えて、フィブロネクチン構成成分をスキャフォールドとして利用する抗体模倣体に基づいたスキャフォールドと同様に、抗体模倣体（「ＰＡＭ」）を用いることが可能である。
【００４３】
抗原結合タンパク質は、例えば、自然界に存在する免疫グロブリンの構造を有することが可能である。「免疫グロブリン」は、四量体分子である。自然界に存在する免疫グロブリンでは、各四量体は、二つの同一ポリペプチド鎖対から構成され、各対は、一つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および一つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、抗原認識に主として関与する、約１００〜１１０またはそれより多くのアミノ酸の可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主として関与する定常領域を定義する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、そして、抗体のアイソタイプは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして定義される。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域が約１２またはそれより多くのアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結し、重鎖にはまた、約１０のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれる。概して、Fundamental Immunology、第７章（Paul, W.編集、第２版、レーベン・プレス、ニューヨーク州(1989))を参照されたい（あらゆる目的上、その全体が参照によって援用される）。各軽／重鎖対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが二つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。
【００４４】
自然界に存在する免疫グロブリン鎖は、比較的保存性のフレームワーク領域（ＦＲ）が相補性決定領域またはＣＤＲとも称される三つの超可変領域によって連結されているという、同じ一般構造を呈する。軽鎖および重鎖の双方は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含んでなる。各ドメインへのアミノ酸の配置は、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健社会福祉省、PHS, NIH, NIH公開番号91-3242、1991年）の定義にしたがう。
【００４５】
「抗体」は、特段に定めない限り、無傷の免疫グロブリン、または特異的結合に関して無傷抗体と競合するその抗原結合部分を指す。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術、または無傷抗体の酵素的もしくは化学的切断によって、作り出してもよい。抗原結合部分には、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメント、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、および、ポリペプチドとの特異的な抗原結合を付与するのに十分である、免疫グロブリンの少なくとも一部分を含有するポリペプチドが含まれる。
【００４６】
Ｆａｂフラグメントは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインを有する一価のフラグメントであり；Ｆ(ａｂ')２フラグメントは、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結された二つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメントであり；Ｆｄフラグメントは、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを有し；Ｆｖフラグメントは、抗体の１本のアームのＶＬおよびＶＨドメインを有し；そして、ｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、またはＶＨもしくはＶＬドメインの抗原結合フラグメントを有する（米国特許第6,846,634、第6,696,245、米国出願公報第05/0202512、第04/0202995、第04/0038291、第04/0009507、第03/0039958、Wardら、Nature 341:544-546, 1989年）。
【００４７】
一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、ＶＬおよびＶＨ領域がリンカー（例えば、アミノ酸残基の合成配列）を介して連結して、連続したタンパク質鎖を形成した抗体であり、ここで、リンカーは、タンパク質鎖を折り重ね、そして一価の抗原結合部位を形成させるのに十分な長さである（例えば、Birdら、1988年, Science 242:423-26、およびHustonら、1988年, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83を参照されたい）。ダイアボディは、各ポリペプチド鎖がリンカーによって連結されているＶＨおよびＶＬドメインを含んでなる、二本のポリペプチド鎖を含んでなる二価抗体であって、ここで、当該リンカーは、同じ鎖上の二つのドメイン間で対合させるには短すぎるため、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補的なドメインと対合することを可能にする（例えば、Holligerら、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48、およびPoljakら、1994年、Structure 2:1121-23を参照されたい）。ダイアボディの二本のポリペプチド鎖が同一であるならば、その対合により生じるダイアボディは、二つの同一抗原結合部位を有するであろう。二つの異なる抗原結合部位を有するダイアボディを作製するためには、異なる配列を有するポリペプチド鎖を用いることが可能である。同様に、トリアボディおよびテトラボディは、それぞれ３本および４本のポリペプチド鎖を含んでなり、かつ、それぞれ３および４の抗原結合部位を形成する抗体であり、該結合部位は、同一であるかまたは異なることが可能である。
【００４８】
所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、米国保健社会福祉省、PHS, NIH, NIH公開番号91-3242、1991年）によって記載されたシステムを用いて同定可能である。１またはそれより多くのＣＤＲを、共有結合的あるいは非共有結合的に分子内に組み入れて、それを抗原結合タンパク質にしてもよい。抗原結合タンパク質は、ＣＤＲをより大きなポリペプチド鎖の一部として組み入れてもよく、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖と共有結合的に連結させてもよく、あるいは、ＣＤＲを非共有結合的に組み入れてもよい。ＣＤＲは、抗原結合タンパク質が目的とする特定の抗原に特異的に結合することを可能にする。
【００４９】
抗原結合タンパク質は、１またはそれより多くの結合部位を有してもよい。１より多くの結合部位があるならば、結合部位は、互いに同一であっても、あるいは異なっていてもよい。例えば、自然界に存在するヒト免疫グロブリンは、典型的には、二つの同一結合部位を有するが、「二重特異性」または「二機能性」抗体は、二つの異なる結合部位を有する。
【００５０】
「ヒト抗体」の語には、ヒト免疫グロブリン配列に由来する１またはそれより多くの可変および定常領域を有する、すべての抗体が含まれる。一実施態様において、すべての可変および定常ドメインは、ヒト免疫グロブリン配列（完全ヒト抗体）に由来する。これらの抗体は、様々な方法で調製されてもよく、ヒト重鎖および／または軽鎖をコードする遺伝子に由来する抗体を発現するよう遺伝子修飾されているマウスを、目的とする抗原で免疫することによる方法を含む、該方法の例を、以下に記載する。
【００５１】
ヒト化抗体は、それがヒト対象に投与されるときに、非ヒト種抗体と比較して免疫応答を誘導しにくく、かつ／または重篤な免疫応答をあまり誘導しないように、非ヒト種由来の抗体の配列と１またはそれより多くのアミノ酸置換、欠失および／または付加により異なる配列を有する。一実施態様では、非ヒト種抗体の重鎖および／または軽鎖のフレームワークおよび定常ドメイン内の特定のアミノ酸を変異させて、ヒト化抗体を作り出す。別の実施態様では、ヒト抗体由来の定常ドメインを、非ヒト種の可変ドメインと融合させる。別の実施態様では、非ヒト抗体の１またはそれより多くのＣＤＲ配列内の１またはそれより多くのアミノ酸残基を、それがヒト対象に投与されるときに非ヒト抗体で生じ得る免疫原性を低減するように変更し、ここで、変更されるアミノ酸残基は、抗体とその抗原との免疫特異的結合に重要でないか、あるいは、行われるアミノ酸配列への変更は、ヒト化抗体と抗原との結合を非ヒト抗体と抗原との結合よりも有意に悪化させないような保存的変更である。ヒト化抗体の作製方法の例を、米国特許第6,054,297、第5,886,152および第5,877,293に見いだしてもよい。
【００５２】
「キメラ抗体」の語は、ある抗体に由来する１またはそれより多くの領域と、１またはそれより多くの他の抗体に由来する１またはそれより多くの領域とを含有する抗体を指す。一実施態様では、ＣＤＲの１またはそれより多くが、ヒト抗ＧＣＧＲ抗体に由来する。別の実施態様では、すべてのＣＤＲが、ヒト抗ＧＣＧＲ抗体に由来する。別の実施態様では、１より多くのヒト抗ＧＣＧＲ抗体に由来するＣＤＲが、キメラ抗体内で混合され調和されている。例えば、キメラ抗体は、第一のヒト抗ＧＣＧＲ抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ１、第二のヒト抗ＧＣＧＲ抗体の軽鎖に由来するＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに第三の抗ＧＣＧＲ抗体の重鎖に由来するＣＤＲを含んでなってもよい。さらに、フレームワーク領域は、同抗ＧＣＧＲ抗体のうちの一つ、ヒト抗体などの１またはそれより多くの別の抗体、またはヒト化抗体に由来してもよい。キメラ抗体の一例として、重鎖および／または軽鎖の部分は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体と、同一であるか、相同であるか、またはそれに由来するが、鎖の残りの部分は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体（単数もしくは複数）と、同一であるか、相同であるか、またはそれに由来する。所望の生物活性（すなわち、ヒトグルカン受容体と特異的に結合する能）を呈するこのような抗体のフラグメントもまた、含まれる。
【００５３】
「中和抗体」または「阻害抗体」は、例えば、以下の実施例４に記載した細胞系アッセイにより測定されたように、グルカゴンとヒトグルカゴン受容体との結合を阻害し、かつ／または、グルカゴンのシグナル伝達を阻害もしくは低減させる抗体を指す。阻害は、完全である必要がなく、かつ、一実施態様において、結合またはシグナル伝達を少なくとも２０％低減してもよい。さらなる実施態様において、結合またはシグナル伝達の低減は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％および９９．９％である。
【００５４】
抗体のフラグメントまたはアナログは、本明細書の教示にしたがい、かつ当該技術分野において周知の技術を用いて、当業者により容易に調製可能である。フラグメントまたはアナログの好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能ドメインの境界付近に生じる。構造および機能ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列のデータを公共もしくは私有の配列データベースと比較することによって、同定可能である。公知の構造および／または機能の他のタンパク質内に生じている配列モチーフまたは予測されるタンパク質コンフォメーションドメインを同定するために、コンピューターによる比較方法を用いることが可能である。公知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定するための方法は、公知である。例えば、Bowieら、1991年、Science 253:164を参照されたい。
【００５５】
「ＣＤＲ移植抗体」は、特定の種もしくはアイソタイプの抗体に由来する１またはそれより多くのＣＤＲと、同じかもしくは異なる種またはアイソタイプの別の抗体のフレームワークとを含んでなる抗体である。
【００５６】
「多特異性抗体」は、１またはそれより多くの抗原上にある１より多くのエピトープを認識する抗体である。このタイプの抗体のサブクラスは、同じかもしくは異なる抗原上にある二つの異なるエピトープを認識する「二重特異性抗体」である。
【００５７】
抗体を含む抗原結合タンパク質は、１０−７Ｍ以下（１００ｎＭ以下）の解離定数（以下に定義される、Ｋｄ、または対応するＫｂ）値によって決定されるような高結合親和性で抗原に結合するならば、ヒトグルカゴン受容体などの抗原に「特異的に結合する」。ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、同じかまたは異なる親和性にて、他種由来のグルカゴン受容体にも同様に結合可能であってもよい。
【００５８】
「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」または「抗原結合部位」は、抗原と相互作用し、かつ抗原に対する抗原結合タンパク質の特異性および親和性に寄与するアミノ酸残基（または他の部分）を含有する、抗原結合タンパク質の一部分である。その抗原と特異的に結合する抗体に関して、これは、そのＣＤＲドメインうちの少なくとも一つの少なくとも一部を含むであろう。
【００５９】
「エピトープ」は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が結合する分子の一部分である。エピトープは、分子の連続していない一部分（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列では連続的でないが、しかし、ポリペプチドの三次および四次構造の構成においては、抗原結合タンパク質と結合するのに互いに十分な程度に近接している、アミノ酸残基）を含んでなることが可能である。
【００６０】
二つのポリヌクレオチドまたは二つのポリペプチド配列の「パーセント同一性」は、ＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．３（アクセルリス、サンディエゴ、カリフォルニア州）の一部）を用いて、その初期設定パラメータを用いて配列を比較することにより、決定される。
【００６１】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」の語は、全体にわたって同義的に用いられ、そして、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて作出されたＤＮＡもしくはＲＮＡのアナログ（例えば、ペプチド核酸および自然界に存在しないヌクレオチドアナログ）、およびそれらのハイブリッドを含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖であることが可能である。一実施態様において、本発明の核酸分子は、本発明の抗体、あるいはそのフラグメント、誘導体、ムテインまたはバリアントをコードする連続的なオープンリーディングフレームを含んでなる。
【００６２】
二つの一本鎖ポリヌクレオチドは、ギャップの導入を伴わず、かつ、いずれの配列の５'もしくは３'末端にも不対ヌクレオチドを伴わずに、一方のポリヌクレオチド中の全ヌクレオチドが、もう一方のポリヌクレオチド中のその相補的なヌクレオチドと向かい合うよう、その配列を逆平行の配向で並べることが可能であるならば、互いに「相補体」である。ポリヌクレオチドは、二つのポリヌクレオチドが中程度にストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることが可能であるならば、別のポリヌクレオチドと「相補的」である。このように、ポリヌクレオチドは、その相補体でなくても、別のポリヌクレオチドに相補的であることが可能である。
【００６３】
「ベクター」は、それに連結させた別の核酸を細胞内に導入するために用いることが可能な核酸である。あるベクターのタイプは、「プラスミド」であり、これは、その中に追加の核酸セグメントを連結可能な、直線状もしくは環状の二本鎖ＤＮＡ分子を指す。別のベクターのタイプは、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）であって、該ベクターでは、ウイルスゲノム内に追加のＤＮＡセグメントを導入可能である。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自己複製が可能である（例えば、細菌複製起点を含んでなる細菌ベクターおよび哺乳動物エピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物非エピソームベクター）は、宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノム内に組み込まれことによって、宿主ゲノムとともに複製される。「発現ベクター」は、選択されたポリヌクレオチドの発現を導くことが可能なベクターのタイプである。
【００６４】
制御配列がヌクレオチド配列の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を及ぼす場合、ヌクレオチド配列は、制御配列と「機能可能なように連結され」ている。「制御配列」とは、それと機能可能なように連結されている核酸の発現（例えば、発現のレベル、タイミングまたは位置）に影響を及ぼす核酸である。例えば、制御配列は、制御される核酸に対して、直接的に、あるいは、１またはそれより多くの他分子（例えば、制御配列および／または核酸に結合するポリペプチド）の作用を介して、その効果を発揮することが可能である。制御配列の例には、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれる。制御配列のさらなる例については、例えば、Goeddel, 1990年、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア州；および、Baronら、1995年、Nucleic Acids Res. 23:3605-06に記載されている。
【００６５】
「宿主細胞」は、核酸（例えば、本発明の核酸）を発現させるために用いることが可能な細胞である。宿主細胞は、例えば大腸菌（E.coli）などの原核生物であることが可能であり、あるいは、例えば単細胞真核生物（例えば、酵母またはその他の真菌）、植物細胞（例えば、タバコまたはトマト植物細胞）、動物細胞（例えば、ヒト細胞、サル細胞、ハムスター細胞、ラット細胞、マウス細胞または昆虫細胞）またはハイブリドーマなどの、真核生物であることが可能である。典型的には、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸によって形質転換もしくはトランスフェクトされることが可能であって、次いで、宿主細胞内でそれを発現することが可能な、培養細胞である。「組換え宿主細胞」の語句は、発現させる核酸によって形質転換もしくはトランスフェクトされている宿主細胞を示すために用いることが可能である。宿主細胞はまた、核酸を含んでなるが、ただし、核酸と機能可能なように連結されるように制御配列が宿主細胞内に導入されなければ、それを所望のレベルで発現しない細胞であることも可能である。宿主細胞の語が、特定の対象細胞のみならず、このような細胞の子孫もしくは潜在的な子孫をも指すことが、理解されよう。一定の修飾が、例えば変異または環境的影響によって、後続の世代に生じる可能性があるため、実際には、このような子孫は、親細胞と同一でない可能性があるが、それでも、本明細書で用いられる語の範囲内に含まれる。
【００６６】
グルカゴン受容体
グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）は、ヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）を介して１またはそれより多くの細胞内シグナル経路に連関している、７回膜貫通型受容体ファミリーに属する（(Jelinekら、Science 259:1614-1616 (1993年)；Segreら、Trends Endocrinol. Metab 4:309-314 (1993年)）。本明細書では、「グルカゴン受容体」および「ＧＣＧＲ」は同義的に用いられる。この群に属する他のものには、セレクチン、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ−１）、血管活性腸管ペプチド（ＶＩＰ）および成長ホルモン放出因子の受容体が含まれる。これらの受容体は、比較的大きな細胞外Ｎ末端ドメインならびに一連の膜貫通、細胞内および細胞外ドメインを含む、高度に相同性の構造的特徴を有する。
【００６７】
一実施態様において、本発明の抗原結合剤は、細胞表面に発現している膜結合型グルカゴン受容体に結合し、そしてグルカゴン受容体を介したグルカゴンのシグナル伝達を阻害もしくは遮断するように、選択されてもよい。一実施態様において、本発明の抗原結合剤は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する。さらなる実施態様において、ヒトグルカゴン受容体に結合する抗原結合タンパク質はまた、他種のグルカゴン受容体にも結合してよい。以下の実施例では、ヒト膜結合型グルカゴン受容体に結合し、そして、さらなる実施態様においては他種のグルカゴン受容体に結合する完全ヒト抗体を作出する一方法を、提供する。
【００６８】
複数の種でのグルカゴン受容体のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列が、公知である。表１は、ヒト、マウスおよびラットでの配列を示す。カニクイザルのグルカゴン受容体配列は、本明細書にて同定され、そして以下に示される。
【００６９】
【表１−１】
0005513888.tif 000002
【００７０】
【表１−２】
0005513888.tif 000003
【００７１】
【表１−３】
0005513888.tif 000004
【００７２】
【表１−４】
0005513888.tif 000005
【００７３】
【表１−５】
0005513888.tif 000006
【００７４】
抗原結合タンパク質
一側面において、本発明は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメント、抗体誘導体、抗体ムテインおよび抗体バリアント）を提供する。一実施態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。
【００７５】
本発明にしたがった抗原結合タンパク質には、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合し、そしてグルカゴン受容体を介したグルカゴンのシグナル伝達を阻害する抗原結合タンパク質が含まれる。一実施態様において、抗原結合タンパク質のＩＣ５０値は、９０ｎＭ以下である。別の側面において、抗原結合タンパク質は、グルカゴン受容体と特異的に結合し、シグナル伝達を阻害し、そして、動物モデルにおいて血糖を低下させるか、または動物モデルにおいて糖クリアランス（耐糖能）を改善するなどの、生物学的治療効果を呈する。一実施態様において、抗原結合タンパク質は、グルカゴン受容体と特異的に結合し、そしてグルカゴン受容体を介したシグナル伝達を阻害する、ヒト抗体である。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合し、グルカゴン受容体を介したシグナル伝達を阻害し、そして動物モデルにおいて血糖を低下させるかまたは糖クリアランス（耐糖能）を改善することが可能な、ヒト抗体である。
【００７６】
一実施態様において、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、以下の表２におけるＡ１〜Ａ２３のＣＤＲ配列と、それぞれ独立して５、４、３、２、１もしくは０の単一アミノ酸の付加、置換および／または欠失により異なる配列を含んでなる。本明細書では、以下の表２に示したＣＤＲ配列と、例えば合計して４を超えないアミノ酸付加、置換および／または欠失により異なるＣＤＲ配列とは、表２に示した配列と比較して４、３、２、１もしくは０の単一アミノ酸の付加、置換および／または欠失を伴う配列を指す。
【００７７】
別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、以下に示す１またはそれより多くのＣＤＲコンセンサス配列を含んでなる。コンセンサス配列は、以下の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ならびに重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３について供される。
【００７８】
抗原結合タンパク質（抗体）Ａ１〜Ａ２３の軽鎖ＣＤＲ、および典型的な抗原結合タンパク質（抗体）Ａ１〜Ａ２３の重鎖ＣＤＲを、以下の表２に示す。ＣＤＲのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列もまた示す。
【００７９】
【表２−１】
0005513888.tif 000007
【００８０】
【表２−２】
0005513888.tif 000008
【００８１】
【表２−３】
0005513888.tif 000009
【００８２】
【表２−４】
0005513888.tif 000010
【００８３】
【表２−５】
0005513888.tif 000011
【００８４】
【表２−６】
0005513888.tif 000012
【００８５】
【表２−７】
0005513888.tif 000013
【００８６】
【表２−８】
0005513888.tif 000014
【００８７】
【表２−９】
0005513888.tif 000015
【００８８】
【表２−１０】
0005513888.tif 000016
【００８９】
【表２−１１】
0005513888.tif 000017
【００９０】
【表２−１２】
0005513888.tif 000018
【００９１】
別の側面において、本発明は、Ｌ１〜Ｌ２３からなる群より選択される軽鎖可変領域、またはＨ１〜Ｈ２３からなる群より選択される重鎖可変領域、ならびに、そのフラグメント、誘導体、ムテインおよびバリアントを含んでなる、抗原結合タンパク質を提供する。このような抗原結合タンパク質は、命名法「ＬｘＨｙ」を用いて示すことが可能であり、「ｘ」は軽鎖可変領域の番号に対応し、そして「ｙ」は重鎖可変領域の番号に対応する。例えば、Ｌ２Ｈ１は、以下の表３に示した、Ｌ２のアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域、およびＨ１のアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域を伴う、抗原結合タンパク質を指す。これらの可変ドメイン配列のそれぞれのＣＤＲおよびフレームワーク領域もまた、以下の表３において特定される。本発明の抗原結合タンパク質には、例えば、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１４Ｈ１４、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ１６Ｈ１６、Ｈ１７Ｈ１７、Ｌ１８Ｈ１８、Ｌ１９Ｈ１９、Ｌ２０Ｈ２０、Ｌ２１Ｈ２１、Ｌ２２Ｈ２２およびＬ２３Ｈ２３からなる組み合わせの群から選択される軽鎖および重鎖可変ドメインの組み合わせを持つ抗体が、含まれる。一実施態様において、抗体は、ヒト抗体である。
【００９２】
以下の表３は、典型的なＧＣＧＲ抗体の可変軽鎖および可変重鎖ドメインのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）配列もまた提供する。
【００９３】
【表３−１】
0005513888.tif 000019
【００９４】
【表３−２】
0005513888.tif 000020
【００９５】
【表３−３】
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【００９６】
【表３−４】
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【００９７】
【表３−５】
0005513888.tif 000023
【００９８】
【表３−６】
0005513888.tif 000024
【００９９】
【表３−７】
0005513888.tif 000025
【０１００】
【表３−８】
0005513888.tif 000026
【０１０１】
【表３−９】
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【０１０２】
【表３−１０】
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【０１０３】
【表３−１１】
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【０１０４】
【表３−１２】
0005513888.tif 000030
【０１０５】
本発明の抗原結合タンパク質の特定の実施態様は、上記に示したＣＤＲおよび／またはＦＲ（フレームワーク領域）のうちの１またはそれより多くのアミノ酸配列と同一である、１またはそれより多くのアミノ酸配列を含んでなる。一実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した軽鎖ＣＤＲ１配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した軽鎖ＣＤＲ２配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した軽鎖ＣＤＲ３配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した重鎖ＣＤＲ１配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した重鎖ＣＤＲ２配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した重鎖ＣＤＲ３配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した軽鎖ＦＲ１配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した軽鎖ＦＲ２配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した軽鎖ＦＲ３配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した軽鎖ＦＲ４配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した重鎖ＦＲ１配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した重鎖ＦＲ２配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した重鎖ＦＲ３配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した重鎖ＦＲ４配列を含んでなる。
【０１０６】
別の実施態様において、抗原結合タンパク質のＣＤＲ３配列のうちの少なくとも一つは、上記の表２および３に示したＡ１〜Ａ２３のＣＤＲ３配列と、６、５、４、３、２、１もしくは０を超えない単一アミノ酸の付加、置換および／または欠失により異なる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質の軽鎖ＣＤＲ３配列は、上記に示したＡ１〜Ａ２３の軽鎖ＣＤＲ３配列と、６、５、４、３、２、１もしくは０を超えない単一アミノ酸の付加、置換および／または欠失により異なり、かつ、抗原結合タンパク質の重鎖ＣＤＲ３配列は、上記に示したＡ１〜Ａ２３の重鎖ＣＤＲ３配列と、６、５、４、３、２、１もしくは０を超えない単一アミノ酸の付加、置換および／または欠失により異なる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質はさらに、Ａ１〜Ａ２３のＣＤＲ配列と６、５、４、３、２、１もしくは０の単一のアミノ酸の付加、置換および／または欠失によりそれぞれ独立して異なる１、２、３、４または５のＣＤＲ配列を含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に記載した軽鎖可変領域のＣＤＲおよび重鎖可変領域のＣＤＲを含んでなる。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、上記に示した１、２、３、４、５および／または６のコンセンサスＣＤＲ配列を含んでなる。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１４Ｈ１４、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ１６Ｈ１６、Ｈ１７Ｈ１７、Ｌ１８Ｈ１８、Ｌ１９Ｈ１９、Ｌ２０Ｈ２０、Ｌ２１Ｈ２１、Ｌ２２Ｈ２２およびＬ２３Ｈ２３のいずれか一つのＣＤＲを含んでなる。一実施態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。
【０１０７】
一実施態様において、抗原結合タンパク質（抗体または抗体フラグメントなど）は、Ｌ１〜Ｌ２３からなる群より選択される軽鎖可変ドメインの配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０の残基においてのみ異なるアミノ酸の配列を含んでなる、軽鎖可変ドメインを含んでなり、ここで、このような配列の違いは、それぞれ独立して１アミノ酸残基の欠失、挿入または置換である。別の実施態様において、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１〜Ｌ２３からなる群より選択される軽鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一である、アミノ酸の配列を含んでなる。別の実施態様において、軽鎖可変ドメインは、以下に掲載するＬ１〜Ｌ２３ポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、アミノ酸の配列を含んでなる。別の実施態様において、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１〜Ｌ２３からなる群より選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、アミノ酸の配列を含んでなる。別の実施態様において、軽鎖可変ドメインは、Ｌ１〜Ｌ２３からなる群より選択される軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、アミノ酸の配列を含んでなる。
【０１０８】
別の実施態様において、本発明は、重鎖可変ドメインを含んでなる抗原結合タンパク質であって、重鎖可変ドメインが、Ｈ１〜Ｈ２３からなる群より選択される重鎖可変ドメインの配列と１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１または０の残基においてのみ異なるアミノ酸の配列を含んでなる、抗原結合タンパク質を提供し、ここで、このような配列の違いは、それぞれ独立して１アミノ酸残基の欠失、挿入または置換である。別の実施態様において、重鎖可変ドメインは、Ｈ１〜Ｈ２３からなる群より選択される重鎖可変ドメインの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一である、アミノ酸の配列を含んでなる。別の実施態様において、重鎖可変ドメインは、Ｈ１〜Ｈ２３からなる群より選択される重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる、アミノ酸の配列を含んでなる。別の実施態様において、重鎖可変ドメインは、Ｈ１〜Ｈ２３からなる群より選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、アミノ酸の配列を含んでなる。別の実施態様において、重鎖可変ドメインは、Ｈ１〜Ｈ２３からなる群より選択される重鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、アミノ酸配列を含んでなる。
【０１０９】
さらなる実施態様には、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１４Ｈ１４、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ１６Ｈ１６、Ｈ１７Ｈ１７、Ｌ１８Ｈ１８、Ｌ１９Ｈ１９、Ｌ２０Ｈ２０、Ｌ２１Ｈ２１、Ｌ２２Ｈ２２およびＬ２３Ｈ２３の組み合わせを含んでなる抗原結合タンパク質が含まれる。
【０１１０】
本発明の抗原結合タンパク質（例えば、抗体、抗体フラグメントおよび抗体誘導体）は、当該技術分野において公知の任意の定常領域を含んでなることが可能である。軽鎖定常領域は、例えば、カッパもしくはラムダ型軽鎖定常領域（例えば、ヒト  カッパもしくはラムダ型軽鎖定常領域）であることが可能である。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマもしくはミュー型重鎖定常領域（例えば、ヒト  アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマもしくはミュー型重鎖定常領域）であることが可能である。一実施態様において、軽鎖もしくは重鎖定常領域は、自然界に存在する定常領域のフラグメント、誘導体、バリアントまたはムテインである。
【０１１１】
目的とする抗体とは異なるサブクラスもしくはアイソタイプの抗体の誘導体化、すなわち、サブクラススイッチングの技術は、公知である。このように、ＩｇＧ抗体を、例えばＩｇＭ抗体から誘導体化してもよく、逆もまた同様である。このような技術は、所与の抗体（親抗体）の抗原結合特性を有するが、ただし、親抗体のものとは異なる抗体アイソタイプもしくはサブクラスに付随した生物学的特性もまた呈する、新たな抗体の調製を可能にする。組換えＤＮＡ技術を使用してもよい。特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡ（例えば、所望のアイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡ）を、このような手順において使用してもよい。Lanittoら、Methods Mol. Biol. 178:303-16 (2002年)もまた参照されたい。
【０１１２】
一実施態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、定常軽鎖カッパもしくはラムダドメインまたはこれらのフラグメントをさらに含んでなる。軽鎖定常領域の配列およびそれらをコードするポリヌクレオチドを、以下の表４に供する。別の実施態様において、本発明の抗原結合タンパク質は、表４に供したＩｇＧ２重鎖定常領域などの、重鎖定常ドメインまたはそのフラグメントをさらに含んでなる。
【０１１３】
一実施態様において、抗体Ａ−９およびＡ−３のＩｇＧ２型のヒト軽鎖および重鎖アミノ酸配列は、以下の配列番号３１０、配列番号３１１、配列番号３１２および配列番号３１１に示される。
【０１１４】
【表４−１】
0005513888.tif 000031
【０１１５】
【表４−２】
0005513888.tif 000032
【０１１６】
【表４−３】
0005513888.tif 000033
【０１１７】
本発明の抗原結合タンパク質（例えば、抗体）には、所望のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤ）を有する、例えば、可変ドメインの組み合わせＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１４Ｈ１４、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ１６Ｈ１６、Ｈ１７Ｈ１７、Ｌ１８Ｈ１８、Ｌ１９Ｈ１９、Ｌ２０Ｈ２０、Ｌ２１Ｈ２１、Ｌ２２Ｈ２２およびＬ２３Ｈ２３を含んでなるもの、ならびにそれらのＦａｂまたはＦ(ａｂ')２フラグメントが含まれる。さらに、ＩｇＧ４を所望する場合は、ＩｇＧ４抗体における不均一性をもたらす可能性のあるＨ鎖内ジスルフィド結合を形成する傾向を弱めるために、Bloomら、1997年、Protein Science 6:407（参照によって本明細書に援用される）に記載されるように、ヒンジ領域に点変異を導入することが望ましい場合もある。
【０１１８】
抗体および抗体フラグメント
一実施態様において、抗原結合タンパク質は抗体である。「抗体」の語は、定義の項にて十分に記載したように、無傷の抗体、またはその抗原結合フラグメントを指す。抗体は、完全な抗体分子（完全長の重鎖および／もしくは軽鎖を有するポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化またはヒト版を含む）を含んでなってもよく、あるいはその抗原結合フラグメントを含んでなってもよい。抗体フラグメントには、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆｖ、ＦｃおよびＦｄフラグメントが含まれ、かつ、これを単ドメイン抗体、一本鎖抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに組み入れることが可能である（例えば、HollingerおよびHudson、2005年、Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照されたい）。さらに含まれるのは、米国特許第6,703,199に開示されるものなどの、フィブロネクチンポリペプチド・モノボディを含む、抗体ポリペプチドである。その他の抗体のポリペプチドは、米国特許公報2005/0238646に開示されており、それらは一本鎖ポリペプチドである。一実施態様において、本発明の抗体は、上記の表２に示した、少なくとも一つのＣＤＲもしくはコンセンサスＣＤＲを含んでなる。
【０１１９】
キメラ抗体およびヒト化抗体は、定義の項に定義されており、かつ、それらを公知の技術によって調製してもよい。一実施態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変ドメイン（またはその抗原結合部位の全部もしくは一部）およびヒト抗体に由来する定常ドメインを含んでなる。あるいは、ヒト化抗体フラグメントは、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体に由来する可変ドメインフラグメント（抗原結合部位を欠損）を含んでなってもよい。操作されたモノクローナル抗体の産生手順には、Riechmannら、1988年、Nature 332:323；Liuら、1987年、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439；Larrickら、1989年、Bio/Technology 7:934；および、Winterら、1993年、TIPS 14:139に記載されるものが含まれる。一実施態様において、キメラ抗体は、ＣＤＲ移植抗体である。抗体をヒト化する技術は、例えば、米国特許第5,869,619；第5,225,539；第5,821,337；第5,859,205；第6,881,557；Padlanら、1995年、FASEB J. 9:133-39；Tamuraら、2000年、J. Immunol. 164:1432-41；Zhang, W.ら、Molecular Immunology. 42(12):1445-1451, 2005年；Hwang W.ら、Methods. 36(1):35-42, 2005年；Dall’Acqua WFら、Methods 36(1):43-60, 2005年；および、Clark, M., Immunology Today. 21(8):397-402, 2000年において論じられている。
【０１２０】
本発明の抗体はまた、完全ヒトモノクローナル抗体であってもよい。完全ヒトモノクローナル抗体は、当業者が精通しているであろう任意の多数の技術により作出されてもよい。このような方法には、これに限定されないが、ヒト末梢血細胞（例えば、Ｂリンパ球を含有）のエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）形質転換、ヒトＢ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫、挿入されたヒト免疫グロブリン遺伝子を保有する免疫されたトランスジェニックマウスから得た脾臓細胞の融合、ヒト免疫グロブリンＶ領域ファージライブラリからの単離、あるいは、当該技術分野において公知であり、かつ本明細書における開示に基づくその他の手順が含まれる。
【０１２１】
非ヒト動物においてヒトモノクローナル抗体を作出するための手順が、開発されている。例えば、１またはそれより多くの内因性免疫グロブリン遺伝子が種々の手段により不活化されているマウスが、作製されている。ヒト免疫グロブリン遺伝子が、不活化されたマウス遺伝子を置換するために、マウスに導入されている。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座のエレメントが、内因性重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的化破壊を含有する胚性幹細胞株に由来するマウスの系に導入される（例えば、Bruggemannら、Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997年)もまた参照されたい）。例えば、ヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、マウスリンパ組織においてＢ細胞特異的なＤＮＡ再構成および超変異を起こす、ミニ遺伝子コンストラクト、または酵母人工染色体上の導入遺伝子座であってもよい。
【０１２２】
動物において産生される抗体は、動物に導入されたヒト遺伝物質によりコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を組み入れている。一実施態様において、トランスジェニックマウスなどの非ヒト動物を、適切なＧＣＧＲ免疫原で免疫する。適切なＧＣＧＲ免疫原の一例は、以下の実施例に記載するものなどの、受容体を多く含む細胞膜画分である。別の例は、配列番号２の細胞外ドメインである。
【０１２３】
ヒト抗体もしくは部分的ヒト抗体を産生するためのトランスジェニックマウスの作製技術および使用の例は、米国特許第5,814,318、第5,569,825および第5,545,806；Davisら、Production of human antibodies from transgenic mice in Lo編集、Antibody Engineering: Methods and Protocols, ヒューマナ・プレス、ニュージャージー州:191-200 (2003年)；Kellermannら、2002年、Curr Opin Biotechnol. 13:593-97；Russelら、2000年、Infect Immun. 68:1820-26；Galloら、2000年、Eur J Immun. 30:534-40；Davisら、1999年、Cancer Metastasis Rev. 18:421-25；Green, 1999年、J Immunol Methods. 231:11-23；Jakobovits, 1998年、Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42；Greenら、1998年、J Exp Med. 188:483-95；Jakobovits A, 1998年、Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14；Tsudaら、1997年、Genomics. 42:413-21；Mendezら、1997, Nat Genet. 15:146-56；Jakobovits, 1994年、Curr Biol. 4:761-63；Arbonesら、1994, Immunity. 1:247-60；Greenら、1994, Nat Genet. 7:13-21；Jakobovitsら、1993年、Nature. 362:255-58；Jakobovitsら、1993年、Proc Natl Acad Sci U S A. 90:2551-55；Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar “Immunoglobulin gene rearrangement in B-cell deficient mice generated by targeted deletion of the JH locus.” International Immunology 5 (1993年): 647-656；Choiら、1993年、Nature Genetics 4: 117-23；Fishwildら、1996年、Nature Biotechnology 14: 845-51；Hardingら、1995年、Annals of the New York Academy of Sciences；Lonbergら、1994年、Nature 368: 856-59；Lonberg, 1994年、Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101；Lonbergら、1995年、Internal Review of Immunology 13: 65-93；Neuberger, 1996年、Nature Biotechnology 14: 826；Taylorら、1992年、Nucleic Acids Research 20: 6287-95；Taylorら、1994年、International Immunology 6: 579-91；Tomizukaら、1997年、Nature Genetics 16: 133-43；Tomizukaら、2000年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 97: 722-27；Tuaillonら、1993年、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 90: 3720-24；および、Tuaillonら、1994年、Journal of Immunology 152: 2912-20；Lonbergら、Nature 368:856, 1994年；Taylorら、Int. Immun. 6:579, 1994年；米国特許第5,877,397；Bruggemannら、1997年、Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58；Jakobovitsら、1995年、Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35に記載されている。加えて、ゼノマウス（登録商標）（XenoMouse）（アブジェニクス社、現在はアムジェンＩｎｃ．）を伴うプロトコールは、例えば、米国05/0118643およびWO 05/694879、WO 98/24838、WO 00/76310、ならびに米国特許7,064,244に記載されている。
【０１２４】
免疫されたトランスジェニックマウスから得たリンパ球細胞を、例えば、ハイブリドーマを作り出すために、骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリドーマを作り出す融合手順における使用のための骨髄腫細胞は、好ましくは、抗体を産生せず、高い融合効率、ならびに、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの生育を補助する一定の選択培地中でそれらを生育不可能にさせる酵素欠損を有する。このような融合における使用に適した細胞株の例には、Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7およびS194/5XX0 Bulが含まれ；ラット融合に用いられる細胞株の例には、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび4B210が含まれる。細胞融合に有用なその他の細胞株は、U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6である。
【０１２５】
リンパ球（例えば、脾臓）細胞と骨髄腫細胞とを、ポリエチレングリコールまたは非イオン性界面活性剤などの膜融合促進剤とともに数分間合わせ、次いで、ハイブリドーマ細胞の生育は補助するが、しかし融合していない骨髄腫細胞の生育は補助しない選択培地上に、低密度で蒔いてもよい。一つの選択培地は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）である。十分な時間（通常は、約１〜２週間）の後、細胞のコロニーを観察する。単一コロニーを単離し、そして、細胞によって産生される抗体を、当該技術分野において公知であって、かつ本明細書に記載される多様な免疫アッセイのいずれか一つを用いて、ヒトＧＣＧＲとの結合活性につき試験してもよい。ハイブリドーマをクローニングし（例えば、限界希釈クローニングまたは軟寒天プラーク単離による）、そして、ヒトＧＣＧＲに特異的な抗体を産生する陽性コロニーを選択し、そして培養する。ハイブリドーマ培養物から得たモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ培養物の上清から単離してもよい。
【０１２６】
本発明のヒト抗体を作出するための別の方法には、ＥＢＶ形質転換によるヒト末梢血細胞の不死化が含まれる。例えば、米国特許第4,464,456を参照されたい。ヒトＧＣＧＲに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するこのような不死化Ｂ細胞株（またはリンパ芽球様細胞株）を、例えばＥＬＩＳＡなどの、本明細書にて供する免疫検出法によって同定し、次いで、標準的なクローニング技術により単離することが可能である。抗ＧＣＧＲ抗体を産生するリンパ芽球様細胞株の安定性を、当該技術分野において公知の方法にしたがって、形質転換した細胞株をネズミ骨髄腫と融合させてマウス−ヒトハイブリッド細胞株を作り出すことにより、改善してもよい（例えば、Glaskyら、Hybridoma 8:377-89 (1989年)を参照されたい）。ヒトモノクローナル抗体を作出するためのさらに別の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫であって、該方法は、ヒト脾臓Ｂ細胞をヒトＧＣＧＲで抗原刺激し、続いて、抗原刺激されたＢ細胞をヘテロハイブリッド融合パートナーと融合させることを含む。例えば、Boernerら、1991 J. Immunol. 147:86-95を参照されたい。
【０１２７】
特定の実施態様では、抗ヒトＧＣＧＲ抗体を産生しているＢ細胞を選択し、そして、軽鎖および重鎖可変領域を、当該技術分野において公知の分子生物学的技術（WO 92/02551；米国特許5,627,052；Babcookら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996年)）および本明細書に記載される該技術によって、Ｂ細胞からクローニングする。免疫した動物から得たＢ細胞を、ＧＣＧＲに特異的に結合する抗体を産生している細胞を選択することによって、脾臓、リンパ節または末梢血試料から単離してもよい。Ｂ細胞を、ヒトから、例えば末梢血試料からも、単離してよい。例えば、プラーク形成、蛍光活性化細胞選別、特異抗体の検出に続くｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激等による、所望の特異性を持つ抗体を産生している単一Ｂ細胞を検出するための方法は、当該技術分野において周知である。特異抗体を産生するＢ細胞の選択方法には、例えば、ヒトＧＣＧＲを含有する軟寒天中でのＢ細胞の一細胞懸濁液の調製が含まれる。Ｂ細胞により産生される特異抗体と抗原との結合は、複合物の形成をもたらし、これを免疫沈降として見ることのできる可能性がある。所望の抗体を産生するＢ細胞を選択した後、特異抗体の遺伝子を、当該技術分野において公知の方法および本明細書に記載した方法によってＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離および増幅することにより、クローニングしてもよい。
【０１２８】
本発明の抗体を得るためのさらなる方法は、ファージディスプレイによる。例えば、Winterら、1994年、Annu. Rev. Immunol. 12:433-55；Burtonら、1994年、Adv. Immunol. 57:191-280を参照されたい。ヒトまたはネズミの免疫グロブリン可変領域遺伝子コンビナトリアルライブラリを、ＴＧＦ−β結合タンパク質またはそのバリアントもしくはフラグメントに特異的に結合するＩｇフラグメント（Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖまたはその多量体）を選択するためにスクリーニングすることが可能なファージベクターにおいて、創出することが可能である。例えば、米国特許第5,223,409; Huseら、1989年、Science 246:1275-81；Sastryら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989年)；Alting-Meesら、Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990年)；Kangら、1991年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66；Hoogenboomら、1992年、J. Molec. Biol. 227:381-388；Schlebuschら、1997年、Hybridoma 16:47-52、およびそれらに引用されている参考文献を参照されたい。例えば、Ｉｇ可変領域フラグメントをコードする多数のポリヌクレオチド配列を含有するライブラリを、Ｍ１３またはそのバリアントなどの線維状バクテリオファージのゲノム内に、ファージコートタンパク質をコードする配列にインフレームで挿入してもよい。融合タンパク質は、コートタンパク質と軽鎖可変領域ドメインおよび／または重鎖可変領域ドメインとの融合であってもよい。特定の実施態様によると、免疫グロブリンＦａｂフラグメントも、ファージ粒子上に提示することが可能である（例えば、米国特許第5,698,426を参照されたい）。
【０１２９】
また、重鎖および軽鎖免疫グロブリンのｃＤＮＡ発現ライブラリを、例えば、λＩｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｌ）ベクター（ストラタジーン社、ラホヤ、カリフォルニア州）を用いて、ラムダファージにおいて調製してもよい。簡潔には、ｍＲＮＡを、Ｂ細胞集団から単離し、そして、これを用いて、重鎖および軽鎖免疫グロブリンのｃＤＮＡ発現ライブラリをλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｈ）およびλＩｍｍｕｎｏＺａｐ（商標）（Ｌ）ベクターにおいて創出する。これらのベクターを、個々にスクリーニングするか、または同時発現させて、Ｆａｂフラグメントまたは抗体を形成してもよい（Huseら、同上を参照されたい； Sastryら、同上もまた参照されたい）。続いて、陽性プラークを、大腸菌からのモノクローナル抗体フラグメントの高レベル発現を可能にする非溶解性プラスミドに変換してもよい。
【０１３０】
一実施態様では、ハイブリドーマにおいて、目的とするモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域を、ヌクレオチドプライマーを用いて増幅させる。これらのプライマーは、当業者が合成してもよいし、または、市販元から購入してもよい（例えば、とりわけＶＨａ、ＶＨｂ、ＶＨｃ、ＶＨｄ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬ領域のプライマーを含む、マウスおよびヒト可変領域のプライマーを販売する、ストラタジーン社（ラホヤ、カリフォルニア州）を参照されたい）。これらのプライマーを用いて、重鎖もしくは軽鎖可変領域を増幅させてもよく、次いで、それをＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）Ｌ（ストラタジーン社）などのベクター内に、それぞれ挿入してもよい。次いで、これらのベクターを、発現させるために、大腸菌、酵母または哺乳動物に基づく系に導入してもよい。ＶＨおよびＶＬドメインの融合を含有する大量の一本鎖タンパク質を、これらの方法を用いて調製してもよい（Birdら、Science 242:423-426, 1988年を参照されたい）。
【０１３１】
本発明に記載の抗体を産生する細胞を、上述の免疫および他の技術のいずれかを用いて得たならば、本明細書に記載の標準的な手順にしたがって、そこからＤＮＡまたはｍＲＮＡを単離および増幅することによって、特異抗体の遺伝子をクローニングしてもよい。そこから産生された抗体を配列決定してもよく、そして、同定されたＣＤＲおよび当該ＣＤＲをコードするＤＮＡを前述のように操作して、本発明に記載の他の抗体を作出してもよい。
【０１３２】
本発明の抗原結合タンパク質は、好ましくは、本明細書に記載した細胞系アッセイおよび／または本明細書に記載したｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、グルカゴンのシグナル伝達を調節し、かつ／または、本出願に記載した抗体の一つの結合を交差遮断し、かつ／または、本出願に記載した抗体の一つによってＧＣＧＲとの結合を交差遮断される。したがって、このような結合剤を、本明細書に記載したアッセイを用いて同定することが可能である。
【０１３３】
特定の実施態様において、抗体は、ＧＣＧＲを過剰発現している細胞に結合する抗体をまず同定することによって作出され、かつ／または、本明細書に記載した細胞系アッセイおよび／もしくはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて中和し、かつ／または、本出願に記載した抗体を交差遮断し、かつ／または、本出願に記載した抗体の一つによってＧＣＧＲとの結合を交差遮断される。
【０１３４】
抗体などのいくつかのタンパク質は、様々な翻訳後修飾を受けてもよいことが、当業者によって理解されよう。これらの修飾のタイプおよび程度は、タンパク質を発現させるために用いられる宿主細胞株、ならびに培養条件によって決まる場合が多い。このような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペリジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギン脱アミドにおける変形形態が含まれてもよい。頻度の高い修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端の塩基残基（リジンまたはアルギニンなど）の欠失である（Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995年に記載される）。
【０１３５】
ネズミモノクローナル抗体産生のための別の方法は、同系のマウス、例えば、モノクローナル抗体を含有する腹腔液の形成を促進するように処置されている（例えば、プリスタンで抗原刺激された）マウスの腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射することである。モノクローナル抗体は、多様な確立された技術によって、単離および精製することが可能である。このような単離技術には、プロテインＡ セファロースを用いたアフィニティ・クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィおよびイオン交換クロマトグラフィが含まれる（例えば、Coligan、2.7.1-2.7.12ページおよび2.9.1-2.9.3ページ；Bainesら、「Purification of Immunoglobulin G (IgG)」、Methods in Molecular Biology, 第10巻、79-104ページ（ヒューマナ・プレスＩｎｃ．1992年)を参照されたい）。モノクローナル抗体を、抗体の特有の特性（例えば、重鎖もしくは軽鎖のアイソタイプ、結合特異性等）に基づいて選択された適切なリガンドを用いて、アフィニティ・クロマトグラフィにより精製してもよい。固相担体上に固定された適切なリガンドの例には、プロテインＡ、プロテインＧ、抗定常領域（軽鎖もしくは重鎖）抗体、抗イデオタイプ抗体およびＴＧＦ−β結合タンパク質、あるいはそれらのフラグメントまたはバリアントが含まれる。
【０１３６】
Schierら、1996年、J. Mol. Biol. 263:551に記載のように、抗体結合部位の中心にある相補性決定領域（ＣＤＲ）の分子進化もまた、親和性が増加している抗体、例えば、ｃ−ｅｒｂＢ−２に対する親和性が増加している抗体を単離するために用いられている。したがって、このような技術は、ヒトグルカゴン受容体に対する抗体の調製において有用である。
【０１３７】
ヒトグルカゴン受容体指向性の抗原結合タンパク質を、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかでの、グルカゴン受容体の存在を検出するためのアッセイにおいて、用いることが可能である。
【０１３８】
ヒト、部分的ヒトもしくはヒト化抗体は、多くの適用、特に、ヒト対象へ抗体を投与することを伴うものに適するであろうが、特定の適用に関しては、他のタイプの抗原結合タンパク質が適するであろう。本発明の非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバまたは非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルもしくはアカゲザルなどのサル、または類人猿（例えば、チンパンジー））などの任意の抗体産生動物に由来することが可能である。本発明の非ヒト抗体を、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび細胞培養に基づく適用に、あるいは、本発明の抗体に対する免疫応答が起こらないか、有意でないか、阻止可能であるか、問題とならないか、または所望される、任意の他の適用に用いることが可能である。以下の実施例２に、マウス抗体の作出について記載する。一実施態様では、本発明の非ヒト抗体を、非ヒト対象に投与する。別の実施態様では、非ヒト抗体は、非ヒト対象において免疫応答を誘発しない。別の実施態様では、非ヒト抗体は、非ヒト対象と同じ種に由来し、例えば、本発明のマウス抗体は、マウスに投与される。例えば、その種の動物を所望の免疫原で免疫するか、またはその種の抗体を作出するための人工の系（例えば、特定の種の抗体を作出するための、細菌もしくはファージディスプレイに基づく系）を用いることによるか、あるいは、例えば、抗体の定常領域を他種に由来する定常領域に置換するか、または、抗体の１またはそれより多くのアミノ酸残基を、他種に由来する抗体の配列により類似するように置換することによって、ある種に由来する抗体を別の種に由来する抗体に変換することにより、特定の種に由来する抗体を作製することが可能である。一実施態様において、抗体は、２またはそれより多くの異なる種に由来する抗体に由来するアミノ酸配列を含んでなる、キメラ抗体である。
【０１３９】
また、抗体を、多数の慣用の技術のいずれかによって調製してもよい。例えば、それらを、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて、自然にそれらを発現する細胞から精製してもよいし（例えば、抗体を、それを産生するハイブリドーマから精製することが可能である）、あるいは、組換え発現系において産生させてもよい。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennetら（編集）、プレナム・プレス、ニューヨーク州(1980年)；および、Antibodies: A Laboratory Manual, HarlowおよびLand（編集）、コールドスプリングハーバー研究所プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州(1988年)を参照されたい。これに関しては、以下の核酸の項に論じる。
【０１４０】
抗原結合タンパク質を、多数の公知の技術のいずれかによって、調製し、そして所望の特性に関してスクリーニングしてもよい。該技術のいくつかは、目的とする抗原結合タンパク質（例えば、抗グルカゴン受容体抗体）のポリペプチド鎖（またはその一部分）をコードする核酸を単離し、そして組換えＤＮＡ技術により核酸を操作することを、伴う。核酸を、目的とする別の核酸と融合させてもよく、あるいは、例えば、１またはそれより多くのアミノ酸残基を付加、欠失もしくは置換するように（例えば、変異誘発または他の慣用の技術により）変えてもよい。
【０１４１】
上記のＣＤＲの１またはそれより多くを含有する、本発明に記載の抗体の親和性を改善することが望ましい場合、ＣＤＲの維持（Yangら、J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995年）、鎖シャフリング（Marksら、Bio/Technology, 10, 779-783, 1992年）、大腸菌変異株の使用（Lowら、J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996年）、ＤＮＡシャフリング（Pattenら、Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997年）、ファージディスプレイ（Thompsonら、J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996年）およびさらなるＰＣＲ技術（Crameriら、Nature, 391, 288-291, 1998年）を含む、多数の親和性成熟プロトコールによって得ることが可能である。親和性成熟のこれらの方法はすべて、Vaughanら（Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998年）により論じられている。
【０１４２】
抗体フラグメント
別の側面において、本発明は、本発明の抗グルカゴン受容体抗体のフラグメントを提供する。このようなフラグメントは、完全に抗体由来配列からなることが可能であるか、または、追加の配列を含んでなることが可能である。抗原結合フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')２、一本鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびドメイン抗体が含まれる。他の例は、Lundeら、2002年、Biochem. Soc. Trans. 30:500-06に提供されている。
【０１４３】
重鎖および軽鎖の可変ドメイン（Ｆｖ領域）フラグメントをアミノ酸架橋（短いペプチドリンカー）を介して連結して、一本のポリペプチド鎖を得ることによって、一本鎖抗体を形成してもよい。このような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、二つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間にペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合させることによって、調製されている。得られたポリペプチドは、それ自体で折り畳まれて、抗原結合単量体を形成可能であり、あるいは、それらは、二つの可変ドメイン間の可動性リンカーの長さに応じて、多量体（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成可能である（Korttら、1997年、Prot. Eng. 10:423；Korttら、2001年、Biomol. Eng. 18:95-108）。異なるＶＬおよびＶＨを含んでなるポリペプチドを組み合わせることによって、異なるエピトープに結合する多量体のｓｃＦｖを形成することが可能である（Kriangkumら、2001年、Biomol. Eng. 18:31-40）。一本鎖抗体の作製に向けて開発された技術には、米国特許第4,946,778；Bird, 1988年、Science 242:423；Hustonら、1988年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879；Wardら、1989年、Nature 334:544；de Graafら、2002年、Methods Mol Biol. 178:379-87に記載されるものが含まれる。本明細書に提供される抗体に由来する一本鎖抗体には、これに限定されないが、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１０Ｈ１０、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１４Ｈ１４、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ１６Ｈ１６、Ｌ１７Ｈ１７、Ｌ１８Ｈ１８、Ｌ１９Ｈ１９、Ｌ２０Ｈ２０、Ｌ２１Ｈ２１、Ｌ２２Ｈ２２およびＬ２３Ｈ２３の可変ドメイン組み合わせを含んでなるｓｃＦｖが含まれ、本明細書に包含される。
【０１４４】
抗体に由来する抗原結合フラグメントはまた、例えば慣用の方法による全抗体のペプシンもしくはパパイン消化などの、例えば、抗体のタンパク質分解性加水分解によっても、得ることが可能である。一例として、抗体フラグメントを、ペプシンを用いた抗体の酵素的切断により作り出して、Ｆ(ａｂ')２と称される５Ｓフラグメントを得ることが可能である。このフラグメントを、チオール還元剤を用いてさらに切断して、３．５Ｓ  Ｆａｂ'一価フラグメントを作り出すことが可能である。所望により、切断反応を、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基に対する封鎖基を用いて行うことが可能である。あるいは、パパインを用いた酵素的切断により、二つの一価Ｆａｂフラグメントおよび一つのＦｃフラグメントを直接的に作り出す。これらの方法は、例えば、Goldenberg, 米国特許第4,331,647；Nisonoffら、Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960年；Porter, Biochem. J. 73:119, 1959年；Edelmanら、Methods in Enzymology 1:422（アカデミック・プレス、1967年）；および、Andrews, S.M.およびTitus, J.A.、Current Protocols in Immunology（Coligan J.E.ら編集）、ジョンワイリー＆サンズ、ニューヨーク州(2003年)、2.8.1-2.8.10ページおよび2.10A.1-2.10A.5ページに記載されている。一価軽鎖−重鎖フラグメント（Ｆｄ）を形成するための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、またはその他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技術などの、抗体を切断するための他の方法も、フラグメントが無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限りにおいては、用いてもよい。
【０１４５】
抗体フラグメントの別の形態は、抗体の１またはそれより多くの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでなるペプチドである。ＣＤＲは、目的とするＣＤＲをコードするポリヌクレオチドを構築することによって得ることが可能である。このようなポリヌクレオチドを、例えば、抗体産生細胞のｍＲＮＡを鋳型として用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて可変領域を合成することにより、調製することが可能である（例えば、Larrickら、Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991年；Courtenay-Luck、「Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritterら（編集）、166ページ（ケンブリッジ大学プレス、1995年）；および、Wardら、「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」、Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birchら（編集）、137ページ(ワイリー−リスＩｎｃ．1995年)を参照されたい）。抗体フラグメントは、本明細書に記載した抗体の少なくとも一つの可変領域ドメインをさらに含んでなってもよい。このように、例えば、Ｖ領域ドメインは、単量体であってもよく、かつ、以下に記載のように少なくとも１ｘ１０−７Ｍ以下での親和性で、独立してヒトグルカゴン受容体と結合可能な、ＶＨもしくはＶＬドメインであってもよい。
【０１４６】
可変領域ドメインは、自然界に存在する可変ドメインであっても、またはその操作されたものであってもよい。操作されたものとは、組換えＤＮＡ操作技術を用いて創出された可変領域ドメインを意味する。このような操作されたものには、例えば、特異抗体のアミノ酸配列内での、もしくは当該配列への挿入、欠失または変更によって、特異抗体の可変領域から創出されたものが含まれる。特定の例には、少なくとも一つのＣＤＲ、および、所望により、第一抗体に由来する１またはそれより多くのフレームワークアミノ酸、そして、残りの部分に第二抗体に由来する可変領域ドメインを含有する、操作された可変領域ドメインが含まれる。
【０１４７】
可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸において、少なくとも一つの他の抗体ドメインもしくはそのフラグメントと共有結合的に結び付いてもよい。このように、例えば、可変領域ドメイン内に存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはそのフラグメントと連結してもよい。同様に、ＶＬドメインは、ＣＫドメインまたはそのフラグメントと連結してもよい。このように、例えば、抗体は、抗原結合ドメインが付随するＶＨおよびＶＬドメインを含有し、そのＣ末端においてＣＨ１およびＣＫドメインとそれぞれ共有結合的に連結している、Ｆａｂフラグメントであってもよい。ＣＨ１ドメインを、さらなるアミノ酸により伸長して、Ｆａｂ'フラグメントにおいて認められるようにヒンジ領域またはヒンジ領域ドメインの一部分を供するか、あるいは、抗体ＣＨ２およびＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを供してもよい。
【０１４８】
抗原結合タンパク質の誘導体およびバリアント
Ａ１〜Ａ２３の対応するアミノ酸配列をコードする、Ｌ１〜Ｌ２３およびＨ１〜Ｈ２３のヌクレオチド配列を、例えば、ランダム変異誘発または部位指向性変異誘発（例えば、オリゴヌクレオチドにより導かれる部位特異的変異誘発）によって変え、非変異ポリヌクレオチドと比較して１またはそれより多くの特定のヌクレオチド置換、欠失または挿入を含んでなる改変ポリヌクレオチドを創出することが可能である。このような改変を行うための技術の例は、Walderら、1986年、Gene 42:133；Bauerら、1985年、Gene 37:73；Craik, BioTechniques, 1985年1月、12-19；Smithら、1981年、Genetic Engineering: Principles and Methods、プレナム・プレス；および、米国特許第4,518,584および第4,737,462に記載されている。これらおよびその他の方法を、例えば、所望の特性を有する抗グルカゴン受容体抗体の誘導体を作製するために用いることが可能であり、ここで、所望の特性とは、例えば、誘導体化されていない抗体と比較した場合の、グルカゴン受容体に対する親和性、アビディティまたは特異性の増加、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性または安定性の増加、あるいはｉｎ  ｖｉｖｏ副作用の低減である。
【０１４９】
本発明の範囲内にある抗グルカゴン受容体抗体の他の誘導体には、抗グルカゴン受容体抗体ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端と融合している異種ポリペプチドを含んでなる組換え融合タンパク質の発現によるなどの、抗グルカゴン受容体抗体もしくはそのフラグメントと他のタンパク質もしくはポリペプチドとの共有結合または凝集による複合体が含まれる。例えば、複合体化されたペプチドは、例えば酵母アルファ因子リーダーなどの異種シグナル（もしくはリーダー）ポリペプチド、あるいは、エピトープタグなどのペプチドであってもよい。抗原結合タンパク質を含有する融合タンパク質は、抗原結合タンパク質の精製および同定を容易にするために付加されるペプチド（例えば、ポリＨｉｓ）を含んでなることが可能である。抗原結合タンパク質を、Hoppら、Bio/Technology 6:1204, 1988年および米国特許5,011,912に記載のＦＬＡＧペプチドと連結させることもまた可能である。ＦＬＡＧペプチドは、高抗原性で、かつ、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に可逆的に結合するエピトープを供し、発現した組換えタンパク質の迅速アッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドと融合している融合タンパク質を調製するのに有用な試薬は、市販されている（シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）。別の実施態様において、１またはそれより多くの抗原結合タンパク質を含有するオリゴマーを、グルカゴン受容体アンタゴニストとして使用してもよい。オリゴマーは、共有結合的もしくは非共有結合的に連結している二量体、三量体またはそれより高次のオリゴマーの形態であってもよい。２またはそれより多くの抗原結合タンパク質を含んでなるオリゴマーは、一例として、ホモ二量体での使用が企図される。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が含まれる。
【０１５０】
一実施態様は、抗原結合タンパク質と融合しているペプチド部分間が共有結合的もしくは非共有結合的相互作用によって連結している、複数の抗原結合タンパク質を含んでなるオリゴマーに関する。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促す特性を有するペプチドであってもよい。ロイシンジッパーおよび特定の抗体由来ポリペプチドは、以下により詳細に記載するように、それと結び付いている抗原結合タンパク質のオリゴマー化を促すことが可能なペプチドの一つである。
【０１５１】
特定の実施態様において、オリゴマーは、２〜４の抗原結合タンパク質を含んでなる。オリゴマーの抗原結合タンパク質は、例えばバリアントまたはフラグメントといった上述の形態のいずれかなどの、任意の形態であってもよい。好ましくは、オリゴマーは、グルカゴン受容体結合活性を有する抗原結合タンパク質を含んでなる。
【０１５２】
一実施態様において、オリゴマーを、免疫グロブリン由来ポリペプチドを用いて調製する。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の種々の部分と融合している特定の異種ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質の調製については、例えば、Ashkenaziら、1991年、PNAS USA 88:10535；Byrnら、1990年、Nature 344:677；および、Hollenbaughら、1992年「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」、Current Protocols in Immunology, Suppl.4, 10.19.1 - 10.19.11ページにより記載されている。本発明の一実施態様は、抗グルカゴン受容体抗体のグルカゴン受容体結合フラグメントと抗体のＦｃ領域とを融合させることによって創出された、二つの融合タンパク質を含んでなる二量体に関する。該二量体は、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクター内に挿入し、組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞内で遺伝子融合体を発現させ、そして、発現した融合タンパク質を、鎖間ジスルフィド結合をＦｃ部分間に形成して二量体を生じる抗体分子に酷似するように会合させることによって、作製することが可能である。
【０１５３】
「Ｆｃポリペプチド」の語には、本明細書では、抗体のＦｃ領域に由来するポリペプチドの天然およびムテイン形態が含まれる。二量体化を促すヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断型もまた含まれる。Ｆｃ部分を含んでなる融合タンパク質（およびそれから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡもしくはプロテインＧカラムでのアフィニティ・クロマトグラフィにより容易に精製できるという利点を供する。
【０１５４】
ＰＣＴ出願WO 93/10151（参照によって本明細書に援用される）に記載されたある適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然のＣ末端へと伸長している一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許5,457,035およびBaumら、1994年、EMBO J. 13:3992-4001に記載されているＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、WO 93/10151に示されている天然Ｆｃ配列のものと、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変更され、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変更され、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変更されていることを除けば、同一である。該ムテインは、Ｆｃ受容体に対する親和性の低減を呈する。他の実施態様において、抗体重鎖および／もしくは軽鎖の可変部分を、抗グルカゴン受容体抗体の重鎖および／もしくは軽鎖の可変部分に置き換えてもよい。
【０１５５】
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を伴うか、または伴わない、複数の抗原結合タンパク質を含んでなる融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーには、米国特許4,751,180および4,935,233に記載されているものがある。
【０１５６】
オリゴマー抗原結合タンパク質を調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、それらが内部に認められるタンパク質のオリゴマー化を促すペプチドである。ロイシンジッパーは、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において最初に同定され（Landschulzら、1988, Science 240:1759）、そしてそれ以降、多様な異なるタンパク質内に発見されている。公知のロイシンジッパーには、二量体化および三量体化させる、自然界に存在するペプチドおよびその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質を作り出すための適切なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願WO 94/10308に記載されており、そして、肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）由来ロイシンジッパーについては、Hoppeら、1994年、FEBS Letters 344:191に記載されており、該文献は、参照によって本明細書に援用される。融合している異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする修飾されたロイシンジッパーの使用については、Fanslowら、1994年、Semin. Immunol. 6:267-78に記載されている。あるアプローチにおいては、ロイシンジッパーペプチドと融合している抗グルカゴン受容体抗体フラグメントまたは誘導体を含んでなる組換え融合タンパク質を、適切な宿主細胞において発現させ、そして、形成する可溶性オリゴマーの抗グルカゴン受容体抗体フラグメントまたは誘導体を、培養上清から回収する。
【０１５７】
別の実施態様において、抗体誘導体は、本明細書に開示したＣＤＲの少なくとも一つを含んでなることが可能である。例えば、１またはそれより多くのＣＤＲを、公知の抗体フレームワーク領域（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２等）内に組み入れるか、または適切なビヒクルと複合体化させて、その半減期を増強してもよい。適切なビヒクルには、これに限定されないが、Ｆｃ、アルブミン、トランスフェリン等が含まれる。これらおよびその他の適切なビヒクルは、当該技術分野において公知である。このような複合体化されたＣＤＲペプチドは、単量体、二量体、四量体またはその他の形態であってもよい。一実施態様では、１またはそれより多くの水溶性ポリマーが、結合剤の１またはそれより多くの特定の位置、例えばアミノ末端に結合している。例として、抗体誘導体は、これに限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む、１またはそれより多くの水溶性ポリマーの連結を含んでなる。例えば、米国特許第4,640,835、第4,496,689、第4,301,144、第4,670,417、第4,791,192および第4,179,337を参照されたい。特定の実施態様において、誘導体は、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物系ポリマー類、ポリ-(Ｎ-ビニルピロリドン)-ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール・ホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド・コポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールの１またはそれより多く、ならびにこのようなポリマーの混合物を含んでなる。特定の実施態様において、１またはそれより多くの水溶性ポリマーは、１またはそれより多くの側鎖とランダムに結び付いている。特定の実施態様において、ＰＥＧは、抗体などの結合剤の治療能力を改善するように作用することが可能である。特定のこのような方法は、例えば、米国特許第6,133,426に論じられ、該文献は、任意の目的で、参照によって本明細書に援用される。
【０１５８】
本発明の抗体は、抗体が結合特異性を保持するならば、少なくとも一つのアミノ酸置換を有してもよいことが理解されよう。したがって、抗体構造に対する修飾は、本発明の範囲に包含される。これらには、抗体のヒトグルカゴン受容体結合能力を破壊しないアミノ酸置換が含まれてもよく、該置換は、保存的であっても、または非保存的であってもよい。保存的アミノ酸置換は、自然界に存在しないアミノ酸残基を包含してもよく、該アミノ酸残基は、生体系での合成よりもむしろ化学ペプチド合成によって、典型的には組み入れられる。これらには、ペプチド模倣体、およびアミノ酸部分の他の逆転もしくは反転形態が含まれる。保存的アミノ酸置換はまた、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷にほとんどもしくは全く影響がないような、規範的な残基への天然アミノ酸残基の置換を伴ってもよい。非保存的置換は、ある分類に属するアミノ酸またはアミノ酸模倣体のメンバーの、異なる物理学的特性（例えば、サイズ、極性、疎水性、電荷）を伴う別の分類に属するメンバーへの交換を伴ってもよい。このような置換される残基は、非ヒト抗体と相同であるヒト抗体の領域内、または、分子の非相同領域内に挿入されてもよい。
【０１５９】
さらに、当業者は、所望の各アミノ酸残基に単アミノ酸置換を含有する試験バリアントを作出してもよい。次いで、該バリアントを、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることが可能である。このようなバリアントは、適切なバリアントに関する情報を集めるために用いることが可能である。例えば、特定のアミノ酸残基への変更により、活性が破壊されるか、望ましくないことに低減するか、または不適当となることが発見された場合、このような変更を伴うバリアントは避けてもよい。言い換えれば、このようなルーチンの実験から集められた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換を単独で、または他の変異と組み合わせて避けるべきであるアミノ酸を、容易に決定することが可能である。
【０１６０】
当業者は、周知の技術を用いて、本明細書に記載のポリペプチドの適切なバリアントを決定することが可能であろう。特定の実施態様において、当業者は、活性に重要であると考えられていない領域を標的とすることによって、活性を破壊せずに変更し得る分子の適切な区域を同定してもよい。特定の実施態様において、類似するポリペプチドの間で保存されている分子の残基および部分を同定することが可能である。特定の実施態様において、生物活性または構造に重要な可能性のある区域であっても、生物活性を破壊しなければ、あるいはポリペプチド構造に悪影響を及ぼさなければ、保存的アミノ酸置換を受けてもよい。加えて、当業者は、活性または構造に重要である類似するポリペプチド中の残基を同定する構造−機能試験を、再検討することが可能である。このような比較を考慮して、類似するタンパク質において活性または構造に重要であるアミノ酸残基に対応する、タンパク質中のアミノ酸残基の重要性を、予測することが可能である。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基を、化学的に類似するアミノ酸へ置換することを選んでもよい。
【０１６１】
当業者はまた、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似するポリペプチドにおけるその構造に関連して解析することも可能である。このような情報を考慮して、当業者は、抗体のアミノ酸残基のアラインメントを、その三次元構造に関して予測してもよい。特定の実施態様において、当業者は、タンパク質表面にあることが予測されるアミノ酸残基への抜本的な変更を行わないことを、このような残基が他分子との重要な相互作用に関与する可能性があることから、選択してもよい。多数の科学出版物が、二次構造の予測に供されている。Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996年)；Chouら、Biochemistry, 13(2):222-245 (1974年)；Chouら、Biochemistry, 113(2):211-222 (1974年)；Chouら、Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978年)；Chouら、Ann. Rev. Biochem., 47:251-276；および、Chouら、Biophys. J., 26:367-384 (1979年)を参照されたい。さらに、コンピュータープログラムが、二次構造の予測を支援するために、現在利用可能である。二次構造を予測するある方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、配列同一性が３０％を超えるか、または類似性が４０％を超える二つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似する構造トポロジーを有する場合が多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長によって、ポリペプチドもしくはタンパク質の構造内での潜在的な折り畳み数を含む、増強された二次構造の予測性が供されている。Holmら、Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999年)を参照されたい。所与のポリペプチドもしくはタンパク質における折り畳み数は限られており、そして、臨界数の構造が決定されているならば、構造予測は劇的により正確となるであろうと、示唆されている（Brennerら、Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997年)）。
【０１６２】
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング」（(Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997年)；Sipplら、Structure, 4(1):15-19 (1996年)）、「プロファイル解析」（Bowieら、Science, 253:164-170 (1991年)；Gribskovら、Meth. Enzym., 183:146-159 (1990年)；Gribskovら、Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987年)）、および「進化的連鎖」（Holm, 同上、(1999年)、およびBrenner, 同上、(1997年)を参照されたい）が含まれる。特定の実施態様において、抗体のバリアントには、グリコシル化部位の数および／またはタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変わっている、グリコシル化バリアントが含まれる。特定の実施態様において、バリアントは、天然タンパク質よりも多いかもしくは少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含んでなる。あるいは、この配列を排除する置換は、既存のＮ結合型炭水化物鎖を除去するであろう。さらに提供されるのは、１またはそれより多くのＮ結合型グリコシル化部位（典型的には、自然界に存在するもの）が排除され、そして１またはそれより多くの新たなＮ結合型部位が創出される、Ｎ結合型炭水化物鎖の再配列である。さらなる好ましい抗体バリアントには、親アミノ酸配列と比較して、１またはそれより多くのシステイン残基が欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）を置換している、システインバリアントが含まれる。システインバリアントは、不溶性封入体の単離後のような、生物学的に活性なコンフォメーションにリフォールディングされなければならない場合に、有用な場合がある。システインバリアントは、一般に、天然のタンパク質よりもシステイン残基が少なく、かつ、典型的には、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にするために偶数を有する。
【０１６３】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的のいずれも）は、このような置換が所望されるときに、当業者によって決定されることが可能である。特定の実施態様において、アミノ酸置換を、ヒトグルカゴン受容体に対する抗体の重要な残基を同定するために、あるいは本明細書に記載したヒトグルカゴン受容体に対する抗体の親和性を増加もしくは減少させるために、用いることが可能である。
【０１６４】
特定の実施態様によると、好ましいアミノ酸置換とは、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減させ、（２）酸化に対する感受性を低減させ、（３）タンパク質複合物を形成するために結合親和性を変え、（４）結合親和性を変え、かつ／あるいは、（５）このようなポリペプチドに他の生理化学的もしくは機能的特性を付与するかまたは修飾するものである。特定の実施態様によると、１または複数のアミノ酸置換（特定の実施態様では、保存的アミノ酸置換）を、自然界に存在する配列内にて（特定の実施態様では、分子間接触を形成するドメイン外にあるポリペプチドの一部分にて）行ってもよい。特定の実施態様において、保存的アミノ酸置換は、典型的には、親配列の構造的特徴を実質的には変更してはならない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じているヘリックスを壊すか、または、親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当該技術分野において承認されているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton編集、W. H. Freeman and Company, ニューヨーク州(1984年))；Introduction to Protein Structure (C. BrandenおよびJ. Tooze編集、ガーランド・パブリッシング、ニューヨーク、ニューヨーク州(1991年))；および、Thorntonら、Nature 354:105 (1991年)に記載されており、該文献のそれぞれは、参照によって本明細書に援用される。
【０１６５】
特定の実施態様において、本発明の抗体は、ポリマー、脂質またはその他の部分と化学的に結合していてもよい。
抗原結合剤は、本明細書に記載したＣＤＲの少なくとも一つを、生体適合性のフレームワーク構造に組み入れて、含んでなってもよい。一例において、生体適合性のフレームワーク構造は、局在する表面領域において抗原に結合する１またはそれより多くのアミノ酸の配列（例えば、ＣＤＲ、可変領域等）を提示可能な、配座的に安定な構造担体またはフレームワークまたはスキャフォールドを形成するのに十分であるポリペプチドまたはその一部分を含んでなる。このような構造は、自然界に存在するポリペプチドまたはポリペプチド「フォールド」（構造モチーフ）であることが可能であり、あるいは、自然界に存在するポリペプチドもしくはフォールドと比較して、アミノ酸の付加、欠失または置換などの、１またはそれより多くの修飾を有することが可能である。これらのスキャフォールドは、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌またはウイルスなどの、任意の種の（または１より多くの種の）ポリペプチドに由来することが可能である。
【０１６６】
典型的には、生体適合性のフレームワーク構造は、免疫グロブリンドメイン以外のタンパク質スキャフォールドもしくは骨格に基づく。例えば、フィブロネクチン、アンキリン、リポカリン、ネオカルチノスタチン（neocarzinostain）、シトクロムｂ、ＣＰ１ジンクフィンガー、ＰＳＴ１、コイルドコイル、ＬＡＣＩ−Ｄ１、Ｚドメインおよびテンダミスタットドメインに基づくものを、用いてもよい（例えば、NygrenおよびUhlen、1997年、Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469を参照されたい）。
【０１６７】
加えて、適切な結合剤には、本明細書に具体的に開示した重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の１またはそれより多くなどの、これらの抗体の一部分が含まれることを、当業者は認識するであろう。重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の領域の少なくとも一つは、抗体が非置換ＣＤＲの結合特異性を保持するならば、少なくとも一つのアミノ酸置換を有してもよい。抗体の非ＣＤＲ部分は、結合剤が本明細書に開示した抗体とヒトＧＣＧＲとの結合を交差遮断し、かつ／または、受容体を介したグルカゴンのシグナル伝達活性を阻害する、非タンパク質分子であってもよい。抗体の非ＣＤＲ部分は、抗体が、競合的結合アッセイにおいて、抗体Ａ１〜Ａ２３の少なくとも一つが呈するものに類似する、ヒトＧＣＧＲペプチドとの結合パターンを呈し、かつ／または、グルカゴンの活性を中和する、非タンパク質分子であってもよい。抗体の非ＣＤＲ部分は、抗体が組換え結合タンパク質または合成ペプチドであり、そして、組換え結合タンパク質が、本明細書に開示した抗体とヒトＧＣＧＲとの結合を交差遮断し、かつ／または、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおいてグルカゴン活性を中和する、アミノ酸から構成されてもよい。抗体の非ＣＤＲ部分は、抗体が組換え抗体であり、そして、組換え抗体が、競合的結合アッセイにおいて、抗体Ａ１〜Ａ２３の少なくとも一つが呈するものに類似する、ヒトＧＣＧＲペプチドとの結合パターンを呈し、かつ／または、グルカゴンのシグナル伝達を中和する、アミノ酸から構成されてもよい。
【０１６８】
核酸
一側面において、本発明は、単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、例えば、抗原結合タンパク質（例えば、本発明の抗体の一方もしくは両方の鎖、またはそのフラグメント、誘導体、ムテインもしくはバリアント）の全部もしくは一部をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、解析、変異もしくは増幅させるためのハイブリダイゼーション・プローブ、ＰＣＲプライマーまたはシークエンシング・プライマーとしての使用に十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンス核酸、ならびに、前述のものの相補的配列を含んでなる。核酸は、任意の長さであることが可能である。それらは、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１,０００、１,５００、３,０００、５,０００またはそれより多くのヌクレオチド長であることが可能であり、かつ／あるいは、１またはそれより多くのさらなる配列（例えば、制御配列）を含んでなることが可能であり、かつ／あるいは、より大きな核酸（例えば、ベクター）の一部であることが可能である。核酸は、一本鎖または二本鎖であることが可能であり、そして、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、ならびにその人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）を含んでなることが可能である。
【０１６９】
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖もしくは軽鎖、可変ドメインのみ、または完全長）をコードする核酸を、ＧＣＧＲ抗原で免疫されているマウスのＢ細胞から単離してもよい。該核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの慣用の手順により単離してもよい。
【０１７０】
重鎖および軽鎖可変領域の可変領域をコードする核酸配列を、上記に示す。当業者は、遺伝コードの縮重によって、本明細書に開示したポリペプチド配列のそれぞれが、多数の他の核酸配列によりコードされることを、理解するであろう。本発明は、本発明の各抗原結合タンパク質をコードする、各縮重ヌクレオチド配列を提供する。
【０１７１】
本発明は、特定のハイブリダイゼーション条件下で他の核酸（例えば、Ａ１〜Ａ１４のいずれかのヌクレオチド配列を含んでなる核酸）とハイブリダイズする核酸を、さらに提供する。核酸をハイブリダイズするための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Current Protocols in Molecular Biology, ジョンワイリー＆サンズ、ニューヨーク州(1989年), 6.3.1-6.3.6を参照されたい。本明細書に定義したように、例えば、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含有する前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６Ｘ  ＳＳＣのハイブリダイゼーション・バッファーおよび５５℃のハイブリダイゼーション温度（または、４２℃のハイブリダイゼーション温度で、約５０％ホルムアミドを含有するものなどの、他の同様なハイブリダイゼーション溶液）、ならびに０．５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での６０℃の洗浄条件を、用いる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６Ｘ  ＳＳＣ中で４５℃にてハイブリダイズさせ、続いて、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．２％  ＳＤＳ中で６８℃にて、１回またはそれより多く洗浄する。さらに、当業者は、少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％互いに同一であるヌクレオチド配列を含んでなる核酸が、典型的には、互いにハイブリダイズしたままとなるよう、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件を操作して、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加もしくは減少させることが可能である。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的なパラメータ、および適切な条件を考案するためのガイダンスは、例えば、Sambrook, FritschおよびManiatis (1989年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, コールドスプリングハーバー研究所プレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、第9および11章；および、Current Protocols in Molecular Biology, 1995年、Ausubelら編集、ジョンワイリー＆サンズＩｎｃ． 2.10および6.3-6.4項)に記載されており、そして、例えばＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者により容易に決定されることが可能である。変更を、変異によって核酸に導入することにより、それがコードするポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）のアミノ酸配列内での変更をもたらすことが可能である。変異は、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて導入可能である。一実施態様では、１またはそれより多くの特定のアミノ酸残基を、例えば、部位指向性変異誘発プロトコールを用いて、変更する。別の実施態様では、１またはそれより多くのランダムに選択された残基を、例えば、ランダム変異誘発プロトコールを用いて、変更する。どのように作製されるにせよ、変異ポリペプチドを、所望の特性に関して発現させ、そしてスクリーニングすることが可能である。
【０１７２】
変異を、核酸に、それがコードするポリペプチドの生物活性を有意に変えずに導入することが可能である。例えば、本質的でないアミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらす、ヌクレオチド置換を行うことが可能である。一実施態様では、Ｌ−１〜Ｌ−２３およびＨ−１〜Ｈ−２３、またはその所望のフラグメント、バリアントもしくは誘導体に関して本明細書に供されるヌクレオチド配列を、それが、Ｌ−１〜Ｌ−２３およびＨ−１〜Ｈ−２３に関して本明細書に示すアミノ酸残基の１もしくはそれより多くの欠失または置換を含んでなるアミノ酸配列をコードするように変異させ、２またはそれより多くの配列が異なっている残基にする。別の実施態様では、変異誘発により、Ｌ−１〜Ｌ−２３およびＨ−１〜Ｈ−２３に関して本明細書に示す１またはそれより多くのアミノ酸残基に隣接してアミノ酸を挿入し、２またはそれより多くの配列が異なっている残基にする。あるいは、１またはそれより多くの変異を、コードするポリペプチドの生物活性（例えば、ＧＣＧＲとの結合）を選択的に変える核酸に導入することが可能である。例えば、変異は、量的および質的に生物活性を変えることが可能である。量的な変更の例には、活性を増加、低減もしくは排除することが含まれる。質的な変更の例には、抗原結合タンパク質の抗原特異性を変えることが含まれる。
【０１７３】
別の側面において、本発明は、本発明の核酸配列を検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーション・プローブとしての使用に適している核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列のほんの一部分を含んでなることが可能であって、例えば、プローブまたはプライマーとして用いることが可能なフラグメント、あるいは、本発明のポリペプチドの活性部分（例えば、ＧＣＧＲ結合部分）をコードするフラグメントである。
【０１７４】
本発明の核酸の配列に基づくプローブを、核酸または類似核酸、例えば、本発明のポリペプチドをコードする転写物を検出するために、用いることが可能である。プローブは、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素または酵素補助因子などの、標識基を含んでなることが可能である。このようなプローブを、ポリペプチドを発現する細胞を同定するために用いることが可能である。
【０１７５】
別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその一部分をコードする核酸を含んでなるベクターを提供する。ベクターの例には、これに限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター（例えば、組換え発現ベクター）が含まれる。
【０１７６】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内での核酸の発現に適した形態で、本発明の核酸を含んでなることが可能である。組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され、発現させる核酸配列に機能可能なように連結されている、１またはそれより多くの制御配列を含む。制御配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を導くもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ラウス肉腫ウイルスプロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）、特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を導くもの（例えば、組織特異的な制御配列、Vossら、1986年、Trends Biochem. Sci. 11:287；Maniatisら、1987年、Science 236:1237を参照されたい。該文献の全体は、参照によって本明細書に援用される）、ならびに、特定の処理または条件に応答してヌクレオチド配列の誘導的発現を導くもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニンプロモーター、ならびに、原核生物および真核生物系の両方におけるｔｅｔ応答性および／またはストレプトマイシン応答性プロモーター）が含まれる（同上を参照されたい）。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等などの要因に応じて決まり得ることが、当業者によって理解されるであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞内に導入することによって、本明細書に記載の核酸によりコードされるタンパク質またはペプチド（融合タンパク質もしくはペプチドを含む）を産生することが可能である。
【０１７７】
別の側面において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であることが可能である。原核宿主細胞には、例えば大腸菌または桿菌などの、グラム陰性もしくはグラム陽性生物が含まれる。より高次の真核細胞には、昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳動物由来の確立された細胞株が含まれる。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または、血清非含有培地で生育するベジーＣＨＯおよび関連する細胞株などのその誘導体（Rasmussenら、1998年、Cytotechnology 28:31を参照されたい）、あるいは、ＤＨＦＲが欠損しているＣＨＯ系ＤＸＢ−１１（Urlaubら、1980年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20を参照されたい）が含まれる。ＣＨＯ細胞株には、さらに、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ＃  ＣＣＬ−６１）、 ＥＭ９（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１８６１）およびＵＶ２０（ＡＴＣＣ＃  ＣＲＬ−１８６２）が含まれる。宿主細胞には、さらに、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Gluzmanら、1981年、Cell 23:175を参照されたい）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、ＡＭ−１／Ｄ細胞（米国特許第6,210,924に記載）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株（McMahanら、1991年、EMBO J. 10:2821を参照されたい）、２９３、２９３ＥＢＮＡもしくはＭＳＲ２９３などのヒト胚性腎細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、その他の形質転換された霊長類細胞株、正常二倍体細胞、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ初代組織培養由来の細胞系、初代外植体、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主での使用に適したクローニングベクターおよび発現ベクターについては、Pouwelsら（Cloning Vectors: A Laboratory Manual, エルゼビア社、ニューヨーク州、1985年)に記載されている。
【０１７８】
ベクターＤＮＡを、慣用の形質転換もしくはトランスフェクション技術によって、原核もしくは真核細胞内に導入することが可能である。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関しては、用いる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、ほんのわずかの細胞が外来ＤＮＡをそのゲノム内に組み込む可能性のあることが、知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、一般には、選択マーカーをコードする遺伝子（例えば、抗生物質への耐性に対する）を、目的とする遺伝子とともに宿主細胞内に導入する。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの、薬物に耐性を付与するものが含まれる。導入した核酸を安定にトランスフェクトされている細胞を、いくつかの方法の中でも特に薬物選択（例えば、選択マーカー遺伝子を組み入れた細胞は生存するが、他の細胞は死滅する）によって、同定することが可能である。
【０１７９】
形質転換された細胞を、ポリペプチドの発現を促す条件下で培養し、そして、該ポリペプチドを慣用のタンパク質精製手順によって回収することが可能である。一つのこのような精製手順を、以下の実施例に記載する。本明細書における使用を企図されるポリペプチドには、実質的に内因性物質の混入を伴わない、実質的に均一な組換え哺乳動物抗グルカゴン受容体抗体ポリペプチドが含まれる。
【０１８０】
抗原結合タンパク質の活性
一側面において、本発明は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合する、抗原結合タンパク質、具体的にはヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体を提供する。このような抗体には、例えば、実施例４に記載した細胞系機能アッセイによって測定されるように、グルカゴンのシグナル伝達を低減もしくは中和可能な、拮抗もしくは中和抗体が含まれる。一実施態様において、本発明のヒト抗体などの抗原結合タンパク質のＩＣ５０値は９０ｎＭ以下であり、別の実施態様においてはＩＣ５０値は８０ｎＭ以下であり、別の実施態様においては７０ｎＭ以下、別の実施態様においては６０ｎＭ以下、別の実施態様においては５０ｎＭ以下、別の実施態様においては４０ｎＭ以下、別の実施態様においては３０ｎＭ以下、別の実施態様においては２５ｎＭ以下である。別の実施態様において、本発明のヒト抗体などの抗原結合タンパク質は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合可能であり、そして、参照抗体と実質的に類似するＩＣ５０値を有する。別の実施態様において、抗原結合タンパク質は、以下の実施例に記載したアッセイ（または類似のアッセイ）によって測定されるように、参照抗体と実質的に類似するＫｂ（もしくはＫｄ）を有する。本明細書では、「実質的に類似する」の語は、参照抗体のＩＣ５０またはＫｂ（もしくはＫｄ）値と同等であるか、あるいは約１００％、９９％、９８％、９７％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％または５０％同一であることを、意味する。参照抗体には、例えば、重鎖および軽鎖の組み合わせＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ２１Ｈ２１およびＬ２２Ｈ２２を有する抗体が含まれる。一実施態様において、参照抗体には、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−７、Ａ−８、Ａ−９、Ａ−１１、Ａ−１２、Ａ−１３、Ａ−１５、Ａ−２１およびＡ−２２が含まれる。別の実施態様において、本発明のヒト抗体などの抗原結合タンパク質は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合可能であって、かつ、動物モデルにおいて血糖を低下させることが可能である。一実施態様において血糖は非処理動物と比較して２％低下し、別の実施態様において血糖は非処理動物と比較して５％低下し、別の実施態様において血糖は非処理動物と比較して１０％低下し、別の実施態様においては１５％、別の実施態様においては２０％、別の実施態様においては２５％以上、非処理動物と比較して血糖が低下する。血糖の低減量は、投与量によって調節される。治療有効投与量は、動物もしくはヒト患者に対して血糖を正常範囲内に低減させるために必要とされる投与量である。典型的な動物モデルは、以下の実施例６に記載のように、ｏｂ／ｏｂマウスである。別の実施態様において、本発明のヒト抗体は、ヒトグルカゴン受容体に特異的に結合可能であって、かつ、動物モデルにおいて糖クリアランスを改善することが可能である。典型的な動物モデルは、以下の実施例７に記載のように、カニクイザルである。糖クリアランスの改善は、経口グルコースの負荷を動物もしくはヒト患者に行った後、血糖を低減させるのにかかる時間量を指し、かつ、耐糖能の尺度である。これは、以下の実施例に記載のように、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）などの標準的な試験によって測定される。本発明の抗原結合タンパク質は、動物モデルにおいて耐糖能を改善することが可能である。加えて、該抗原結合タンパク質は、これに限定されないが、空腹時耐糖能、脂質代謝異常およびメタボリック症候群を含む、２型糖尿病および高血糖に付随する他のｉｎ  ｖｉｖｏ指標を改善することが可能である。
【０１８１】
ヒトグルカゴン受容体との結合
一実施態様において、本発明は、Ｌ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ２１Ｈ２１およびＬ２２Ｈ２２からなる群より選択される、軽鎖および重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを含んでなる参照抗体と、結合に関して交差競合する抗原結合タンパク質を提供する。別の実施態様において、本発明は、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−７、Ａ−８、Ａ−９、Ａ−１１、Ａ−１２、Ａ−１３、Ａ−１５、Ａ−２１およびＡ−２２である参照抗体と、結合に関して交差競合するヒト抗体を、提供する。別の側面において、本発明は、ヒトグルカゴン受容体のＳｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１９領域に結合するヒト抗体を提供する。別の実施態様において、本発明は、ヒトグルカゴン受容体のＳｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１９領域に結合する参照抗体と、結合に関して交差競合するヒト抗体を、提供する。別の実施態様において、本発明は、グルカゴン受容体のＳｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１９領域に結合するヒト抗体であって、かつ、ＩＣ５０値が、例えば実施例４に記載したアッセイにおいて測定されたように、９０ｎＭ以下、別の実施態様では８０ｎＭ以下、別の実施態様では７０ｎＭ以下、別の実施態様では６０ｎＭ以下、別の実施態様では５０ｎＭ以下、別の実施態様では４０ｎＭ以下、別の実施態様では３０ｎＭ以下、別の実施態様では２５ｎＭ以下であるヒト抗体を、提供する。別の実施態様において、本発明は、Ａ−３である参照抗体と、ヒトグルカゴン受容体への結合に関して交差競合するヒト抗体を、提供する。
【０１８２】
さらなる実施態様において、ヒトグルカゴン受容体に結合するときに、参照抗体と実質的に同じＫｄにてヒトグルカゴン受容体に結合し；前記参照抗体と実質的に同じＩＣ５０にてヒトグルカゴン受容体のグルカゴン刺激を阻害し；かつ／または、ヒトグルカゴン受容体上で結合に関して前記参照抗体と交差競合する、抗原結合タンパク質が提供され、ここで、前記参照抗体はＬ１Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ４Ｈ４、Ｌ５Ｈ５、Ｌ６Ｈ６、Ｌ７Ｈ７、Ｌ８Ｈ８、Ｌ９Ｈ９、Ｌ１１Ｈ１１、Ｌ１２Ｈ１２、Ｌ１３Ｈ１３、Ｌ１５Ｈ１５、Ｌ２１Ｈ２１およびＬ２２Ｈ２２からなる群より選択される、軽鎖および重鎖可変ドメイン配列の組み合わせを含んでなる。
【０１８３】
さらなる実施態様において、単離されたヒト抗体は、ヒトグルカゴン受容体に結合するときに、参照抗体と実質的に同じＫｄにてヒトグルカゴン受容体に結合し；前記参照抗体と実質的に同じＩＣ５０にてヒトグルカゴン受容体のグルカゴン刺激を阻害し；かつ／または、ヒトグルカゴン受容体上で結合に関して前記参照抗体と交差競合し、ここで、前記参照抗体は、Ａ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ａ−４、Ａ−５、Ａ−６、Ａ−７、Ａ−８、Ａ−９、Ａ−１１、Ａ−１２、Ａ−１３、Ａ−１５、Ａ−２１およびＡ−２２からなる群より選択される。
【０１８４】
さらなる実施態様において、ヒトグルカゴン受容体に結合するときに、ａ．ヒトグルカゴン受容体のアミノ酸Ｓｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１９部分に特異的に結合するか；ｂ．９０ｎＭ以下のＩＣ５０値でグルカゴンのシグナル伝達を低減するか；ｃ．動物モデルにおいて血糖を低下させるか；または、（ａ）および（ｂ）、もしくは（ａ）、（ｂ）および（ｃ）である、単離された抗体が提供される。
【０１８５】
抗体との交差競合能を、以下のように測定する。以下の実施例８に、Ａ−３を参照抗体として用いた、典型的な競合的結合アッセイについて記載する。試験された抗体は、結合に関してＡ−３と競合可能であった克服性抗体、結合に関して部分的にのみ競合可能であった部分的克服性抗体、および、結合に関してＡ−３と競合しなかった非克服性抗体であった。結果は、図４〜６に示す。
【０１８６】
加えて、以下の実施例９に記載のように、ヒト抗体Ａ−３および他のヒト抗体が結合する部位を、ヒトＧＣＧＲとヒトＧＬＰ−１受容体とのキメラ受容体を構築することにより、決定した。以下に記載し、かつ図７に示すようにキメラ受容体を用いて、抗体Ａ−３に関しては、ヒトグルカゴン受容体のアミノ酸Ｓｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１７の領域が、結合に必要かつ十分であることが、決定された。加えて、ヒトＧＣＧＲは、三対のシステインを含有する。抗体Ａ−３に関して、第二および第三のシステイン対が結合に必要であったが、しかし、第一の対は必要でなかった。このことは、三対のシステインが無傷である場合にのみ結合する抗体Ａ−１８、Ａ−２１およびＡ−１０とは、対照的であった。
【０１８７】
適応症
糖尿病（特に、２型糖尿病）およびその合併症は、世界中の人々にとってますます大きな問題となっている。一般には、この疾患は、膵β細胞からのインスリン産生障害に起因する。最も一般的な疾患形態である２型糖尿病では、遺伝要因と環境要因とが組み合わさって、β細胞の障害がもたらされると考えられており、結果として、多くの個体において、インスリンの分泌および活性の障害、ならびにインスリン抵抗性が生じる。肥満は、成人において、そして子供においてさえも、２型糖尿病の増加に寄与すると考えられている一状態である。脂質代謝異常、または異常なＨＤＬ（高密度リポタンパク質）およびＬＤＬ（低密度リポタンパク質）が２型糖尿病に関連することもまた、公知である。
【０１８８】
２型糖尿病は、筋肉および他器官が正常のインスリン循環濃度に応答できないことを、特徴とする。これに続いて、高インスリン血症として公知の状態である、膵ベータ細胞からのインスリン分泌増加が起こる。最終的には、ベータ細胞は、もはや代償することができず、耐糖能障害、空腹時血糖値障害、慢性高血糖および組織損傷をもたらす。加えて、２型糖尿病前症は、脂質代謝異常、または異常なＨＤＬ（高密度リポタンパク質）およびＬＤＬ（低密度リポタンパク質）に関連することが公知である。脂質代謝異常と高血糖の双方は、メタボリック症候群を患う患者に存在する。
【０１８９】
本発明は、抗原結合タンパク質、具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてグルカゴン受容体と結合し、かつ動物モデルにおいて血糖値を低減することが可能なヒト抗体を、提供する。抗原結合タンパク質は、耐糖能を改善することも可能である。一実施態様において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有効である完全ヒト抗体を提供する。ｏｂ／ｏｂマウスにおける単回抗体注射の効果は、例えば、注射後の数日間、血糖を低下させ、高血糖、２型糖尿病および関連する障害に対して、有効で長期間持続する治療を提供する。単回抗体注射はまた、以下に記載のカニクイザルに行った耐糖能試験（ＧＴＴ）において、血液からの糖クリアランスも改善（耐糖能を改善）した。抗原結合タンパク質、および具体的には本発明のヒト抗体は、血中もしくは血清中グルコースを低下させ、耐糖能障害を改善し、空腹時血糖値を改善し、そして脂質代謝異常を改善するのに有用である。このように、抗原結合タンパク質、特に発明のヒト抗体は、高血糖、２型糖尿病、メタボリック症候群、および脂質代謝異常を含む他の関連する状態の治療に有用である。加えて、Richardsonら、Nature Clin Pract Oncol 2: 48-53 (2005年)；Giovannucciら、Gastroenterology 132: 2208-2225 (2007年)；Kroneら、Integrative Cancer Ther 4(1): 25-31 (2005年)；Changら、Diabetologia 46(5): 595-607 (2003)；Jeeら、Yonsei Med J 46(4):  449-55 (2005年)において論じられるように、血糖を低下させることが、結腸直腸癌などの特定の癌の予防および治療において、状況次第では有用なことが示されている。
【０１９０】
治療の方法
別の側面において、対象を治療する方法であって、治療投与量の本発明の抗原結合タンパク質を投与することを含んでなる方法が、提供される。一実施態様において、抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。本明細書では、「対象」の語は、ヒトを含む哺乳動物を指し、そして、「患者」の語と同義的に用いられる。ヒト抗体を、対象における過剰レベルのグルカゴンおよび／もしくは血糖を特徴とする障害または状態を治療、調節または予防し、そして、耐糖能を改善するために、用いることが可能である。これらの障害には、高血糖、メタボリック症候群および２型糖尿病が含まれる。「治療」の語は、少なくとも一つの症状、もしくは疾患の他の側面の軽減または予防、あるいは疾患重症度の低減等を、包含する。抗原結合タンパク質、特に本発明によるヒト抗体は、役に立ち得る治療剤であるためには、完全な治癒をもたらすか、または疾患の症状もしくは兆候を根絶する必要はない。適切な分野において認識されているように、治療剤として使用される薬物は、所与の疾患状態の重症度を低減してもよいが、ただし、有用な治療剤と見なされるために、疾患の全兆候を消滅させる必要はない。同様に、予防的投与治療は、役に立ち得る予防剤であるためには、状態の発現の阻止において完全に有効である必要はない。疾患のインパクトを低減させるか（例えば、その症状の数もしくは重症度を低減させるか、または別の治療の有効性を増加させるか、または別の有益な効果を作り出すことによる）、あるいは、対象において疾患が生じるかもしくは悪化する可能性を低減させるだけで、十分である。本発明の一実施態様は、ヒト抗体などの抗原結合タンパク質を、特定の障害の重症度を反映する指標のベースラインを超える、持続した改善を誘導するのに十分な量および期間、患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【０１９１】
適切な分野において理解されるように、本発明の抗原結合タンパク質を含んでなる医薬組成物は、適応症に対して適切なように、対象に投与される。一実施態様において、医薬組成物は、本発明のヒト抗体を含んでなる。医薬組成物は、これに限定されないが、非経口、局所または吸入を含む任意の適切な技術によって、投与されてもよい。注射される場合、医薬組成物は、例えば、動脈内、静脈内、筋肉内、病巣内、腹腔内または皮下経路、ボーラス注射、あるいは持続注入によって、投与されることが可能である。経皮送達および移植物からの持続放出のような、例えば疾患もしくは傷害部位における限局投与が、考えられる。吸入による送達には、例えば、経鼻もしくは経口吸入、噴霧器の使用、エアロゾル形態での抗原結合タンパク質の吸入等が含まれる。他の代替方法には、丸薬、シロップまたはロゼンジを含む経口用調製物が含まれる。
【０１９２】
有利には、本発明の抗原結合タンパク質は、生理学的に許容可能なキャリアー、賦形剤または希釈剤などの１またはそれより多くのさらなる構成成分を含んでなる組成物の形態にて、投与される。所望により、該組成物は、例えば以下に記載のように、１またはそれより多くの生理学的に活性な剤をさらに含んでなる。種々の特定の実施態様において、該組成物は、１またはそれより多くの本発明の抗原結合タンパク質（例えば、ヒト抗体）に加えて、１、２、３、４、５または６の生理学的に活性な剤を含んでなる。
【０１９３】
一実施態様において、医薬組成物は、本発明のヒト抗体を、抗体に適した適切なｐＨのバッファー、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド（１０アミノ酸未満のものなど）、タンパク質、アミノ酸、デキストリンなどの炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、グルタチオン、安定剤および賦形剤からなる群より選択される、１またはそれより多くの物質とともに含んでなる。適切な工業規格にしたがって、保存剤もまた加えてよい。組成物は、適切な賦形剤溶液を希釈剤として用いて、凍結乾燥物として処方物化されてもよい。適切な構成成分は、使用される投与量および濃度において、レシピエントに対し非毒性である。医薬処方物において使用されてもよい構成成分のさらなる例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第16版(1980年) および第20版(2000年), マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルバニア州に示されている。
【０１９４】
１またはそれより多くの本発明の抗原結合タンパク質、および本明細書に論じた状態のいずれかの治療における使用のための表示または他の取扱説明書を含む、医学専門家による使用のためのキットが、提供されている。一実施態様において、該キットは、１またはそれより多くのヒト抗体の無菌調製物を含み、これは、上記に開示の組成物の形態であってもよく、そして、１またはそれより多くのバイアルに入っていてもよい。
【０１９５】
投与量および投与頻度は、投与経路、使用される特定の抗体、治療される疾患の性質および重症度、状態が急性であるかまたは慢性であるか、ならびに対象の大きさおよび一般状態などの要因に応じて、異なってもよい。適切な投与量は、例えば、用量漸増試験を伴うことのある臨床試験などの、適切な技術分野において公知の手順によって、決定可能である。
【０１９６】
本発明の抗原結合タンパク質、特にヒト抗体は、例えば通常の間隔である期間にわたって、例えば１回または１回より多く、投与されてもよい。特定の実施態様において、ヒト抗体は、少なくとも１ヶ月に１回またはそれより多くの回、ある期間にわたって、例えば１、２もしくは３ヶ月間または無制限に、投与されてもよい。慢性状態を治療するには、長期治療が、一般には最も効果的である。しかしながら、急性状態を治療するには、例えば１〜６週間などのより短期の投与で、十分な可能性がある。一般に、ヒト抗体は、患者が、選択された指標（単数もしくは複数）に対して医学的に関連する程度のベースラインを超える改善を現すまで、投与される。
【０１９７】
本明細書に提供した治療レジメンの一例は、血糖値が関与する状態を治療するための、ヒト抗体などの抗原結合タンパク質の週１回の適切な投与量での皮下注射を含んでなる。このような状態の例は、本明細書において供され、かつ、例えば、高血糖、２型糖尿病、空腹時耐糖能障害、耐糖能障害および脂質代謝異常を含む。抗原結合タンパク質の週毎もしくは月毎の投与は、所望の結果を達成するまで（例えば、対象の症状が鎮静するまで）継続されるであろう。治療は必要に応じて再開されてもよいし、あるいは、維持用量が投与されてもよい。
【０１９８】
対象の血糖値を、その値の変化をあるとすれば検出するために、ヒト抗体などの抗原結合タンパク質による治療の前、間および／または後にモニターしてもよい。いくつかの障害に関しては、血糖上昇の発生率が、病期などの要因に応じて異なる可能性がある。公知の技術を、糖値を測定するために使用してもよい。患者の血中におけるグルカゴン値もまた、例えばＥＬＩＳＡなどの公知の技術を用いて測定してよい。
【０１９９】
本発明の方法および組成物の特定の実施態様は、例えば、ヒト抗体などの抗原結合タンパク質および１またはそれより多くのグルカゴンアンタゴニスト、２またはそれより多くの本発明の抗原結合タンパク質、あるいは、本発明の抗原結合タンパク質および１またはそれより多くの他のグルカゴンアンタゴニストの使用を伴う。さらなる実施態様において、抗原結合タンパク質は、単独で、または患者が患っている状態の治療に有用な他剤と併用して、投与される。このような剤の例には、タンパク質性と非タンパク質性の両方の薬剤が含まれる。複数の治療剤を投与する場合、投与量を、適切な技術分野において認識されているように、適宜に調整してもよい。「同時投与」および併用療法は、同時の投与に限定されるばかりでなく、少なくとも一つの他の治療剤を患者に投与することを伴う治療コース中に、抗原結合タンパク質を少なくとも一回投与する治療レジメンも含む。
【０２００】
別の側面において、本発明は、２型糖尿病、高血糖、メタボリック症候群、脂質代謝異常および関連する障害の治療のための薬剤であって、２型糖尿病および関連する障害の治療のために、本発明の抗原結合タンパク質（例えば、ヒト抗体）の医薬的に許容可能な賦形剤中の混合物を含んでなる、前記薬剤の調製方法を、提供する。薬剤の製造方法は、上記に記載している。
【０２０１】
併用療法
別の側面において、本発明は、本明細書に記載した完全ヒト治療用抗体などの本発明の治療用抗原結合タンパク質を用いて、１またはそれより多くの他の治療と併せて、糖尿病に関して対象を治療する方法を、提供する。一実施態様において、このような併用療法は、相乗効果を達成する。抗原結合タンパク質を、現在利用可能な以下の２型糖尿病治療の１またはそれより多くと併用してもよい。これらには、ビグアナイド(メタフォルミン）およびスルホニル尿素（グリブリド、グリビジドなど）が含まれる。グルコース恒常性の維持に向けたさらなる治療には、ＰＰＡＲガンマアンタゴニスト（ピオグリタゾン、ロシグリタゾン）；およびアルファグルコシダーゼ阻害剤（アカルボース、ボグリボース)が含まれる。さらなる治療には、エクセナチド（登録商標）（グルカゴン様ペプチド）およびシムリン（登録商標）（プラムリンチド）などの注射治療が含まれる。
【０２０２】
本発明に関して記載してきたが、以下の実施例を、限定でなく例示の目的で提供する。
【実施例】
【０２０３】
（実施例１：抗原の調製）
完全長の４７７アミノ酸グルカゴン受容体（配列番号２）をコードするヒトＧＣＧＲ  ｃＤＮＡを、ｐＤＣ３１２発現ベクター内にサブクローニングし、そしてＡＭ１Ｄ細胞内にトランスフェクトした。選択および単細胞クローニング後に、一つのクローン（クローン１００４）を、受容体の細胞表面での発現に基づいてさらに特徴付けるために選択した。飽和結合解析によって測定された受容体発現レベル（Ｂｍａｘ）は、１１．４ｐｍｏｌｅグルカゴン受容体／ｍｇ膜タンパク質であった。
【０２０４】
加えて、Ｎ末端ＧＣＧＲ（配列番号２のアミノ酸１〜１４２）をコードするｃＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ１  ＦｃのｃＤＮＡとインフレームで融合させ、そしてｐＤｓＲａ２１ベクター（米国2005/0118643に記載）内にサブクローニングした。安定な細胞プールを、ＡＭ１Ｄ細胞へのトランスフェクション後に選択した。ＧＣＧＲ  Ｎ末端Ｆｃを、組換えプロテインＡ高流速カラム（ＧＥヘルスケア社）に続き、ソース３０Ｑ陰イオン交換カラム（ＧＥヘルスケア社）によって、濃縮条件培地から精製した。
【０２０５】
（実施例２：マウス抗ヒトハイブリドーマの作出）
上述のクローン１００４から得た粗細胞膜画分を、Ｃ５７ＢＬ／６もしくはＤＢＦ１マウス（ジャクソン・ラボラトリーズ、バーハーバー、メイン州）の慣用の免疫およびＲＩＭＭＳ免疫（複数部位注射による急速免疫）双方のための抗原として用いた。数巡の免疫後に、リンパ球をリンパ節（ＲＩＭＭＳ免疫）または脾臓（慣用の免疫）から放出させ、そして、マウス骨髄腫細胞Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ）と電気融合によって融合させた。融合細胞を、９６ウェルプレートに、１０％ＦＢＳ、５％オリジーン・クローニングファクター（バイオベリス（商標））、１ｘペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン(ギブコ社）および１ｘＯＰＩ(オキサロ酢酸、ピルビン酸およびインスリン、シグマ社）を添加されたＢＤ培地１００μｌ中に２ｘ１０４細胞／ウェルの密度で蒔いた。２４時間培養した後に、１００μｌの２ｘＨＡＴ（０．１ｍＭヒポキサンチン、０．１６ｍＭチミジン、４ｍＭアミノプテリン、シグマ社）を各ウェルに加えた。培地を、融合後７日および１０日にそれぞれ変え、そして、条件培地を二回目の培地交換後２日に回収し、そして、以下に記載の第一スクリーニングのために送った。
【０２０６】
ハイブリドーマ上清を、１００４細胞、および並列して親ＡＭ１Ｄ細胞を用いた、細胞系ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）またはＦＭＡＴ（蛍光微量アッセイテクノロジー）にかけた。ＧＣＧＲ特異抗体を含有するハイブリドーマクローンを、１００４に特異的結合するが、しかしＡＭ１Ｄには特異的結合しないことに基づいて、選択した。
【０２０７】
モノクローナル抗体を、以下に記載の増殖させたハイブリドーマ培養物から部分的に精製し、そして、以下に記載のように、結合（ＥＬＩＳＡもしくはＦＭＡＴ）アッセイおよび機能細胞系アッセイを用いて、グルカゴンにより誘導されるｃＡＭＰ産生の中和についてアッセイした。陽性クローンを増殖させ、単細胞クローニングし、そして多数のアッセイによりさらに確認した。
【０２０８】
（実施例３：完全ヒト抗体の作出）
粗細胞膜調製物由来である、ヒトＧＣＧＲを高発現する細胞株１００４を、例えば米国05/0118643およびWO 05/694879、WO 98/24838、WO 00/76310および米国特許7,064,244（該文献はすべて、参照によって本明細書に援用される）に記載されているプロトコールにしたがって、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ゼノマウス（登録商標）（アブジェニクス社、現在はアムジェンＩｎｃ．）を免疫するための抗原として用いた。合計２回のキャンペーンを行った。最初の免疫後に、それに続く数巡の追加免疫を、適切な抗体価に到達するまで施行した。適切な力価を呈した動物を同定し、そして、リンパ球を流入領域リンパ節から得て、そして必要ならば、各コホートからプールした。場合によっては、リンパ球を、適切な培地（例えば、ＤＭＥＭ、インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）とともに粉砕して、組織から細胞を放出させることによって、リンパ系組織から解離させた。Ｂ細胞を選択し、そして、例えば、上記の参考文献に記載のように、非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（アメリカン・カルチャー・タイプ・コレクション ＣＲＬ１５８０、Kerneyら、J. Immunol. 123, 1548-1550 (1979年)）などの、適切な融合パートナーと融合させた。その他の適切な融合パートナーには、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ）細胞が含まれる。融合細胞をペレット状にし、そして選択培地（典型的には、アザセリンおよびヒポキサンチン（hypozanthine）および他の添加物質を含有するＤＭＥＭ）中に再懸濁し、２０〜３０分間インキュベートし、そして次いで、選択培地中に再懸濁し、そしてプレーティングする前に培養した。次いで、細胞を、クロナリティを最大限にするようにウェルに分配し、そして、標準的な技術を用いて培養した。培養後に、ハイブリドーマ上清を、ＦＭＡＴを用いて、豊富に含まれるグルカゴン受容体細胞クローン１００４および親細胞株ＡＭ１Ｄに対してスクリーニングした。続いて、ＧＣＧＲ特異的結合剤を、ＦＩＴＣ標識（フルオレセイン・イソチオシアネートと複合体化）抗ヒトＩｇＧ抗体を用いたＦＡＣＳ解析によって確認した。受容体特異的モノクローナル抗体を含有するハイブリドーマクローンを、米国2005/0118643および上記に引用した他の参考文献に記載されているプロトコールにしたがって、増殖させた。上清を、以下に記載のように、グルカゴンにより誘導されるｃＡＭＰ産生の阻害について試験した。拮抗性抗体を含有するハイブリドーマクローンを、単細胞クローニングし、そしてさらなる試験に向けて増殖させた。次いで、抗体を以下に記載のように精製し、そして次いで、これらの単クローンから得た精製抗体を、中和活性について再び試験した。
【０２０９】
抗体を、Ｍａｂセレクト（ＧＥヘルスケア社）樹脂を用いて、ハイブリドーマの条件培地から精製した。ＰＢＳ中で平衡化した１００μｌのＭａｂセレクト樹脂の１：２スラリーを、７〜１０ｍｌの条件培地（ＣＭ）に加えた。チューブを、４〜８℃にて一晩、回転器に載せた。チューブを、１０００Ｘｇにて５分間遠心分離し、そして、非結合画分をデカントした。樹脂を５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、そして上記のように遠心およびデカントした。次いで、樹脂をＳＰＩＮ−Ｘ、０．４５μｍ、２ｍｌチューブに移した。樹脂を、０．５ｍｌのＰＢＳでさらに二回洗浄し、そして遠心分離した。モノクローナル抗体を、０．２ｍｌの０．１Ｍ酢酸を用いて、時折混合しながら室温で１０分間インキュベートすることにより、溶出させた。チューブを遠心分離し、そして、３０μｌの１Ｍトリスバッファー  Ｐｈ８．０を溶出液に加えた。精製された抗体を、４〜８℃に保管した。
【０２１０】
（実施例４：抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ性状解析）
抗体／受容体結合アッセイ：全細胞に基づくＥＬＩＳＡ
ＧＣＧＲを過剰発現しているＣＨＯ細胞（クローン１００４）および親細胞（ＡＭＩＤ）を、９０％までのコンフルエンスでマイクロプレート上に蒔いた。細胞をＢＳＡによりブロッキングし、そして、ハイブリドーマの上清とともに４℃にて９０分間インキュベートした。徹底的に洗浄した後、細胞を、検出抗体であるヤギ抗ネズミＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（ピアス社）とともにインキュベートし、そして三回洗浄した。５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ＫＰＬ社）を加え、そして、室温にて５〜１０分間インキュベートした。反応を、５０μｌの０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えることで停止させ、そして、プレートを、スペクトラ・マックス（モレキュラー・デバイシズ社）において４５０ｎｍで読み取った。ＧＣＧＲ膜で免疫したマウスの血清を陽性対照として用い、そして、培地のみをバックグラウンド対照として用いた。
【０２１１】
抗体／受容体結合アッセイ：ＦＭＡＴ
ＧＣＧＲを過剰発現しているＣＨＯ細胞（クローン１００４）を、９６ウェル透明底黒色壁マイクロプレート（アプライド・バイオシステムズ社）に、サブコンフルエントな密度（５０〜６０％）で蒔き、そして、室温にて６０分間、ハイブリドーマ上清とともにインキュベートした。細胞像および細胞に結合している蛍光の量を、８２００細胞検出システム（アプライド・バイオシステムズ社）を用いて、ＦＭＡＴ青色標識二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ、アプライド・バイオシステムズ社）とともにインキュベートした後に、記録した。
【０２１２】
細胞に基づく機能アッセイ
抗グルカゴン受容体抗体を、細胞系機能アッセイにおいて、その中和活性について、安定な機能細胞株を用いて試験した。ヒト、マウス、ラット、カニクイザルまたはラット由来のＧＣＧＲ  ｃＤＮＡ（配列番号２、４、６、８をそれぞれコードするｃＤＮＡ）を含有する発現コンストラクト（ｐｃＤＮＡ３．１、インビトロジェン社）を、安定な細胞株を確立しているＣＨＯ  Ｋ１細胞に、それぞれトランスフェクトした。上記の種に由来するＧＣＧＲを発現している最終的な機能細胞株を、トランスフェクトされたプールから単細胞クローニングし、そして、グルカゴンにより刺激されるｃＡＭＰ産生について試験した。各個々の株のＥＣ５０に基づいて最終的なアッセイ用細胞株を選択し、そして、将来的な使用のために預託した。
【０２１３】
以下のプロトコールを、競合的結合アッセイにおいて、アンタゴニスト存在下での用量反応曲線のシフトに基づくＳｃｈｉｌｄ解析によって計算される、抗体結合のＫｂまたは解離定数を決定するために、用いた。Ｓｃｈｉｌｄ解析の使用については、Lazaenoら、Br. J. Pharmacol. 109(4):1110-9 (1993年)に記載されており、該文献は、参照によって本明細書に援用される。本アッセイは、小分子に向けた使用を、本明細書の抗体を用いた使用へと適応させている。ハイブリドーマ上清および精製抗体の双方を、以下のプロコールを用いて試験した。
【０２１４】
シスバイオ社のＨＴＲＦ（均一時間分解蛍光）−ｃＡＭＰダイナミックキットを、機能アッセイに用いた。結合アッセイにおいてヒトＧＣＧＲへの特異的結合が示されたクローンから得たハイブリドーマ上清を、まず、機能アッセイを用いてスクリーニングした。次いで、抗体を、ハイブリドーマ条件培地から精製し、そして、ＫｂおよびＩＣ５０値について再試験した。グルカゴン刺激によるｃＡＭＰ産生を阻害可能な、グルカゴンアンタゴニストである抗体は、本過程を用いて同定可能である。
【０２１５】
上述の選択された安定な機能的細胞株を、９６半ウェルプレート内に蒔いた。ＧＣＧＲ抗体を、ウェル内に加え、そして３７℃にて２０分間インキュベートし、続いて、グルカゴン（カルビオケム社）を加え、そして３７℃にてさらに１５分間インキュベートした。溶解バッファー中のｃＡＭＰ複合体を加え、そして次いで、抗ｃＡＭＰ−クリプテート（クリプテートと複合体化しているｃＡＭＰに対する抗体）をウェル内に加えた後、プレートを、ルビースター（ＢＭＧラボテック社の蛍光マイクロプレートリーダー）で読み取る前に、室温にて１時間インキュベートした。
【０２１６】
精製抗体を、機能的ヒトＧＣＧＲ細胞株を用いて、最初に、２μＭの濃度で試験した。細胞を５０ｐＭグルカゴンで刺激し、そして、強い阻害活性を示した抗体を、ベースラインを超える最大応答の半分を阻害するのに必要な抗体濃度として定義されるＩＣ５０を決定するために、選択した。該抗体を、１μＭの濃度から試験し、そして、順次の２倍段階希釈を続いて行った。用量反応曲線をプロットし、そして、ＩＣ５０を、グラフパッド・プリズム・ソフトウエアを用いて決定した。ヒトＧＣＧＲに対するＩＣ５０が低い抗体を選択し、そして、異種間の受容体活性について、適切な細胞株を用いてさらに試験した。
【０２１７】
【表５】
0005513888.tif 000034
【０２１８】
異なる種間のヒト抗ＧＣＧＲ抗体の相対力価を決定するために、Ｓｃｈｉｌｄ解析を、選択されたヒト抗体のそれぞれについて行った。簡潔には、異なる濃度の抗体を、１００ｎＭ〜１０ｆＭのグルカゴンの段階希釈の存在下で試験した。異なる抗体濃度でのグルカゴンの用量反応曲線を、グラフパッド・プリズム・ソフトウエアを用いてプロットした。グルカゴンの用量反応曲線の２倍右方向へのシフトを生じるのに必要な抗体濃度の負の対数であるｐＡ２を、抗体について計算した。Ｓｃｈｉｌｄ勾配が１に等しいとき、ｐＡ２は、抗体結合の解離定数であるｐＫｂに等しい。次いで、Ｋｂを、ｐＫｂの逆対数によって得て、そして、種間で個々の抗体の相対力価を比較するために直接用いることが可能である。
【０２１９】
さらなる抗体を、ヒトＧＣＧＲに対する活性について試験した。
【０２２０】
【表６】
0005513888.tif 000035
【０２２１】
【表７】
0005513888.tif 000036
【０２２２】
（実施例５：抗体の組換え発現および精製）
抗体を発現する安定な細胞株の開発
ＰＣＲプライマーを、アブジェニクス社により提供された各抗体のＤＮＡ配列に基づいて、完全な軽鎖オープンリーディングフレーム、ならびに重鎖のシグナルペプチドおよび可変領域オープンリーディングフレームを捕らえるように、設計した。完全な軽鎖、ならびに重鎖のシグナルペプチドおよび可変領域に加えて、ヒトＩｇＧ２定常領域を、発現ベクターｐＤＣ３２３およびｐＤＣ３２４に、それぞれライゲーションした。
【０２２３】
ＰＣＲプライマーセットの例として、５'Ａ−９軽鎖プライマーは、ＳａｌＩ制限酵素部位、インフレームの終止コドン、コザック配列を含有し、かつアミノ酸ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬ（配列番号３１４）をコードする、４３３７-１２（５’-ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＣＣＣ ＧＣＴ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ-３’）（配列番号３１３）であり、そして、３'プライマーは、ＮｏｔＩ制限酵素部位、終止コドンを含有し、かつアミノ酸ＦＮＲＧＥＣ（配列番号３１６）をコードする、３２５０−８０（５'-ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＡ ＣＡＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＡＡ-３'）（配列番号３１５）であった。５'Ａ−９重鎖プライマーは、ＳａｌＩ制限酵素部位、インフレームの終止コドン、コザック配列を含有し、かつアミノ酸ＭＥＦＧＬＳＷＶＦ（配列番号３１８）をコードする、３４４４-３４（５'-ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＴＡＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＴＴＣ-３'）（配列番号３１７）であり、Ａ−９重鎖可変領域／ＩｇＧ２（＋）鎖接合プライマー  ４３４１-２９（５'-ＧＡＣ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＡＡ ＧＧＧ ＣＣＣ ＡＴＣ ＧＧＴ ＣＴＴ-３'）（配列番号３１９）、およびその相補的（−）鎖プライマー  ４３４１-３０（５'-ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＧＧ ＣＣＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＧ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＧＴＣ-３’）（配列番号３２０）であって、アミノ酸ＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦ（配列番号３２１）をコードし、そして、ＮｏｔＩ制限酵素部位、終止コドンを含有し、かつアミノ酸ＳＬＳＰＧＫ（配列番号３２３）をコードする、３'プライマー  ３２５０-７９（５'-ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＡＣ ＡＧＧ ＧＡ-３’）（配列番号３２２）であった。
【０２２４】
抗ＧＣＧＲ発現プラスミドのトランスフェクションに用いられるＣＨＯ宿主細胞は、無血清培地への適応によってＤＸＢ−１１細胞（Urlaubら、PNAS US 77:4126-4220,(1980年)）から得られたＣＨＯ細胞株である（Rasmussenら、Cytotechnology 28:31-42, 1998年）。
【０２２５】
抗ＧＣＧＲ細胞株を、発現プラスミドｐＤＣ３２３−抗ＧＣＧＲκおよびｐＤＣ３２４−［抗ＧＣＧＲ−ＩｇＧ２］を、標準的な電気穿孔手順を用いて宿主細胞にトランスフェクトすることによって、創出した。宿主細胞株に発現プラスミドをトランスフェクトした後、プラスミドの選択および細胞の回収を可能にするため、細胞を、４％透析ウシ胎仔血清（ｄｓもしくはｄｆＦＢＳ）含有選択培地中（ＧＨＴを含まない）で、２〜３週間生育させた。次いで、血清を培地から除去し、そして、細胞を−ＧＨＴ選択培地中で、＞８５％生存率に達するまで生育させた。次いで、このトランスフェクトされた細胞プールを、１５０ｎＭ  ＭＴＸを含有する培地中で培養した。
【０２２６】
細胞株クローニング
細胞バンクを、以下の手順にしたがって、選択されたクローンから作製した。クローニング工程は、クローン集団および細胞バンクが作出されたことを確実にし、商業的製造における再現性能を可能にする。増幅された抗体発現細胞プールを、９６ウェルプレートにおいて限界希釈下で蒔き、そして、小規模な試験において、候補のクローンを、生育および産生性能に関して評価した。
【０２２７】
（実施例６：ｏｂ／ｏｂマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ活性）
１２週齢の雄性ｏｂ／ｏｂマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ、バーハーバー、メーン州）に、バッファーまたは抗体３もしくは４を１または３ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＰ注射した（ｎ＝８〜１０／群）。血糖を、０時点、ならびに抗体の単回注射後２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１９２および２４０時間に測定した。図１に示すように、３ｍｇ／ｋｇの抗体用量の抗体３によって、血糖は、８日間低下した。
【０２２８】
同様に、１２週齢の雄性ｏｂ／ｏｂマウス（ジャクソン・ラボラトリーズ、バーハーバー、メーン州）に、バッファーまたは抗体３もしくは９を１または３ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＰ注射した（ｎ＝８〜１０／群）。血糖を、０時点、ならびに抗体の単回注射後２４、７２、１２０、１９２および２４０時間に測定した。図２に示すように、３ｍｇ／ｋｇの抗体用量の抗体３および９によって、血糖は、８日間低下した。
【０２２９】
（実施例７：正常な雄カニクイザルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ有効性）
雲南霊長類センター（雲南、中国）において、抗体Ａ−９の単回皮下（ＳＣ）投与の有効性を、雄カニクイザルで評価した。耐糖能試験（ＧＴＴ）を、サルにおいて、グルコースの経口投与による負荷後の血液からの糖クリアランスについて試験することにより、行った。ＧＴＴデータを、図３にみられるように、負荷後０、３０および９０分における血糖量を測定することによる糖クリアランスを表すＡＵＣ（曲線下面積）として、示す。図３に示すように、投与前ＧＴＴ１を、抗体投与前２４日に開始して順次施行し、投与前ＧＴＴ２を、単回投与前１７日に開始して順次施行した。抗体を、合計３もしくは３０ｍｇ／ｋｇの抗体Ａ−９または対照の単回皮下（ＳＣ）注射として、３０例の雄性カニクイザルに投与した。ＧＴＴ３を、注射後３日にサルに施行し、ＧＴＴ４を注射後８日に施行し、そして、ＧＴＴ５を注射後１７日に施行した。その結果、図３に示すように、抗体９の３または３０ｍｇ／ｋｇいずれかの単回ＳＣ注射は、耐糖能試験中の糖クリアランスを改善した。
【０２３０】
（実施例８：競合的結合アッセイ）
本発明の抗体のいくつかを、どの抗体が標識参照抗ＧＣＧＲ抗体との結合に関して交差競合するかを決定するために、競合的結合アッセイを用いて群分けした。Ａ−３抗体を、トレーサーとしてアレクサ蛍光色素（モレキュラー・プローブス／インビトロジェン社、カールスバッド、カリフォルニア州）を用いて標識し、製造業者の取扱説明書にしたがって調製した。ＣＨＯ細胞上に発現しているヒトＧＣＧＲ受容体との結合に関して、各抗体を、１ｎＭ濃度に固定された標識Ａ−３抗体とのその競合能について、用量範囲にわたりアッセイした（上述のように）。蛍光強度を、実施例４に記載のようにＦＭＡＴによって測定し、そして、アレクサＡ−３と受容体との結合を阻害する程度を計算した。これらの解析に基づいて、三群の抗体に分類することが可能である。それらは、アレクサ−Ａ−３と競合する場合における克服性、部分的克服性または非克服性抗体である。克服性抗体は、Ａ−３と結合について競合可能であるが、非克服性抗体は、交差競合できず、そしてヒトＧＣＧＲ上に異なる結合部位を有するようである。部分的克服性抗体は、Ａ−３とある程度、結合部位が重複している。これらを、図４〜６に示す。試験され、そしてアレクサＡ−３と結合について競合可能であることが見いだされた抗体（克服性）は、Ａ−１１、Ａ−２、Ａ−７、Ａ−１２、Ａ−１７、Ａ−６、Ａ−８、Ａ−１５およびＡ−５である。試験され、そしてアレクサＡ−３と結合について部分的にのみ競合可能であることが見いだされた抗体（部分的克服性）は、Ａ−１６、Ａ−１４、Ａ−２０およびＡ−２３である。試験され、そしてアレクサＡ−３と結合について競合できないことが見いだされた抗体（非克服性）は、Ａ−１９およびＡ−１０である。克服性抗体の全部もしくはほとんどは、細胞系アッセイにおける阻害活性（ＩＣ５０）を示すが、部分的克服性および非克服性抗体は、このアッセイを用いて活性を示さなかったことが、注目される。
【０２３１】
（実施例９：キメラ受容体の構築）
ヒトＧＣＧＲは、ヒトＧＬＰ−１受容体に最も相同であり、そして、その双方は、受容体のＮ末端区域に三つのシステイン対を有する、ファミリーＢ  ＧＰＣＲに属する。試験されるヒト抗体が結合するであろうヒトＧＣＧＲ上の領域もしくは部位を決定し、そして、ジスルフィド結合を互いに形成する三つのシステイン対によって維持されるコンフォメーションの重要性を決定するために、ヒトＧＣＧＲとヒトＧＬＰ−１Ｒ（ＧＬＰ−１Ｒ、アクセッション番号ＮＰ ００２０５３）との複数のキメラ受容体コンストラクトを作出し、そして細胞内で発現させた。これらを、図７に示す。ヒトＧＣＧＲ由来のキメラの配列を、図７に示す。例えば、図の最上部に示したキメラ４では、アミノ酸１〜１４２がヒトＧＣＧＲ由来で、そして残りの部分がＧＬＰ−１受容体由来である。キメラ４は、三つの無傷のシステイン対を含有する。システイン対における点変異（Ｃｙｓ１−３、Ｃｙｓ２−５またはＣｙｓ４−６）を、その後の三つのキメラであるキメラ−４  １ＣＡ、３ＣＡ；４  ２ＣＡ、５ＣＡ、および４  ４ＣＡ、６ＣＡのそれぞれが、システイン対の一つを破壊されているように、キメラ４に導入した。キメラ−７は、ヒトＧＣＧＲ由来のアミノ酸１〜７９を有し；キメラ−８は、ヒトＧＣＧＲ由来のアミノ酸８０〜４７７を有し；キメラ−１０は、ヒトＧＣＧＲ由来のアミノ酸８０〜１４２を有し；キメラ−１５は、ヒトＧＣＧＲ由来のアミノ酸８０〜１１９を有し；キメラ−１９は、ヒトＧＣＧＲ由来のアミノ酸１〜１１９および１４３〜４７７を有する。細胞表面の受容体発現を、蛍光タンパク質のインフレームＣ末端融合によりモニターした。抗体と特定のキメラ受容体との結合を、アレクサ標識参照抗体Ａ−３を用いて、ＦＭＡＴにより直接測定した。図７に示すように、ここで試験したすべての抗体は、結合するために、ヒトＧＣＧＲのＮ末端（アミノ酸１〜１４２）を必要とする。抗体Ａ−１８、Ａ−２１およびＡ−１０は、すべての三つのシステイン対が無傷のキメラ−４のみとの結合を呈した点において、同様に挙動した。これは、これらの抗体に対するコンフォメーショナルエピトープを示している。抗体Ａ−３に関しては、ヒトＧＣＧＲのアミノ酸配列８０〜１１９が、抗体の結合に必要かつ十分である。加えて、ヒトＧＣＧＲのアミノ酸１２０〜１４２は、Ａ−３の結合に必要とされないことが示された。さらに、抗体Ａ−３に関しては、コンフォメーションは、第一のシステイン対によってではなく、第二および第三のシステイン対（Ｃｙｓ２−５、Ｃｙｓ４−６）によって維持される。したがって、抗体Ａ−３、およびＡ−３と交差反応するすべての抗体がヒトＧＣＧＲと結合する受容体の区域は、ヒトＧＣＧＲのアミノ酸Ｓｅｒ８０〜Ｓｅｒ１１９の内にある。
【０２３２】
本明細書に引用される各参考文献の全体は、それが教示するすべてのものに関して、およびすべての目的に関して、参照によって援用される。
本発明は、本明細書に記載した特定の実施態様によって範囲を限定されず、本発明の個々の側面の単なる例示として意図され、かつ、機能的に同等の方法および構成成分は発明である。実際に、本明細書に示し、かつ記載したものに加えて、本発明の種々の修飾は、前述の記載および付随する図面から、当業者に明白となるであろう。このような修飾は、添付した特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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