(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
【請求項２】
以下の(ａ)、（ｃ）、または（ｄ）である、請求項１に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
【請求項３】
コードするタンパク質が膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼファミリーに属するものである、請求項１または２記載の核酸。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１又は６で示される塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４又は９で示される塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号５又は１０で示される塩基配列を含む核酸
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、請求項５に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
【請求項７】
膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼファミリーに属するものである、請求項５または６記載のタンパク質。
【請求項８】
配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、前記脂肪酸組成物の製造方法であって、ここで当該脂肪酸組成物中の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率が、非形質転換体である宿主を培養して得られる脂肪酸組成物のアラキドン酸比率よりも高い、製造方法。
【請求項１２】
請求項９記載の組換えベクターを用いて、当該ベクターが導入された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、当該ベクターを導入していない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高くする方法。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
【請求項１４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なリゾリン脂質アシル基転移酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度不飽和脂肪酸の生合成
脂肪酸は、リン脂質やトリアシルグリセロール等の脂質を構成する重要な成分である。不飽和結合を２箇所以上含有する脂肪酸は高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と総称され、アラキドン酸やジホモ−γ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が知られており、様々な生理活性が報告されている（非特許文献１）。【０００３】
この高度不飽和脂肪酸は様々な分野での利用が期待されているが、動物体内で合成できないものも含まれている。そこで、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。また、植物で高度不飽和脂肪酸を生産させる試みもなされている。こうした場合、高度不飽和脂肪酸は、例えばトリアシルグリセロール等の貯蔵脂質の構成成分として、微生物の菌体内若しくは植物種子中に蓄積されることが知られている。【０００４】
高度不飽和脂肪酸の一種であるアラキドン酸は、プロスタグランジンやロイコトリエン等への中間代謝物として注目され、機能性食品や医薬品の素材に適用する試みが数多くなされている。さらに、アラキドン酸は、母乳中に含まれており乳児の発育、特に、胎児の身長や脳の発育において重要であり、乳児の発育に必要な成分として、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）とともに栄養学的見地からも注目されている。【０００５】
アラキドン酸は、図１に示した経路で生合成される。具体的には、新規脂肪酸合成により生成したパルミチン酸から、数回の鎖長延長反応と不飽和化反応により、アラキドン酸が生成する。この経路の中で、鎖長延長酵素及びΔ９不飽和化酵素はアシル−ＣｏＡに作用する。また、Δ１２不飽和化酵素、Δ６不飽和化酵素、Δ５不飽和化酵素はホスファチジルコリン等のリン脂質のアシル基に作用することが知られている（非特許文献２）。したがって、アラキドン酸等のＰＵＦＡ生合成においては、アシル基がアシル−ＣｏＡとリン脂質との間で転移されることが必要である。ＰＵＦＡの生合成に限らず、リン脂質が生合成された後、脂肪酸のみが置き換わることをリン脂質の「リモデリング」といい、当該反応にリゾリン脂質アシル基転移酵素（以下「ＬＰＬＡＴ」と記載する）が関与していることが知られている（非特許文献３）。【０００６】
トリアシルグリセロールの生合成
貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールは、生体内で以下のとおり生成される。すなわち、グリセロール−３−リン酸がグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（以下「ＧＰＡＴ」と記載する場合もある）により１位（α位）のヒドロキシル基がアシル化されてリゾホスファチジン酸（以下「ＬＰＡ」と記載する場合もある）となる。ＬＰＡは、アシル基が１つしかないリゾリン脂質であり、これがリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（以下「ＬＰＡＡＴ」と記載する場合もある）によりアシル化されてホスファチジン酸（以下「ＰＡ」と記載する場合もある）となる。このＰＡがホスファチジン酸ホスファターゼにより脱リン酸化されてジアシルグリセロールとなり、このジアシルグリセロールがジアシルグリセロールアシル基転移酵素（以下「ＤＧＡＴ」と記載する場合もある）によりアシル化されてトリアシルグリセロールとなる。また、アシル−ＣｏＡ：コレステロールアシル基転移酵素（以下「ＡＣＡＴ」と記載する場合もある）やリゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素（以下「ＬＰＣＡＴ」と記載する場合もある）等が間接的にトリアシルグリセロールの生合成に関与することが知られている。【０００７】
リン脂質の生合成
上記のようにしてＬＰＡからＬＰＡＡＴの作用により生成したＰＡは、様々なリン脂質生合成の前駆体となる。例えば、ＰＡから、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）等、重要なリン脂質が生合成される。ＰＡはこのように脂質生合成の中間体であるだけでなく、細胞増殖、血小板凝集効果、平滑筋収縮効果、がんの浸潤促進効果等非常に多岐にわたる生物学的、薬理的作用を有する脂質性の細胞内及び細胞間メディエーターでもある。【０００８】
リゾリン脂質アシル基転移酵素
上記のように、ＬＰＬＡＴは、ＰＵＦＡ生合成に関与すると考えられる。このＬＰＬＡＴとは、リゾリン脂質にアシル基を導入する活性を有する酵素の総称であり、基質に対する特異性の違いにより、つまり、基質となるリゾリン脂質の分子種の違いにより、様々な称呼のＬＰＬＡＴが存在する。その1つが、ＬＰＡを基質として、トリアシルグリセロールやリン脂質の合成に関与するＬＰＡＡＴである。ＬＰＬＡＴが作用するリゾリン脂質には、その他、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）等が含まれる。よって、各酵素が作用するリン脂質の分子種の違いから、ＬＰＡＡＴ、ＬＰＣＡＴ、リゾホスファチジルセリンアシル基転移酵素（ＬＰＳＡＴ）、リゾホスファチジルイノシトールアシル基転移酵素（ＬＰＩＡＴ）等と呼称される。各酵素は、１種のリゾリン脂質に特異的に作用する場合もあるが、複数種の特異的なリゾリン脂質に作用する場合もある。例えば、ＬＰＡＡＴといわれるＬＰＬＡＴの中にも、ＬＰＡのみでなくＬＰＣ、ＬＰＥ等にも作用するものが含まれる。【０００９】
配列上の特徴によるリゾリン脂質アシル基転移酵素の分類
ＬＰＬＡＴは、グリセロリン脂質アシル基転移酵素に分類される。このグリセロリン脂質アシル基転移酵素は、アミノ酸配列の比較から、ＬＰＡＡＴファミリー、ＭＢＯＡＴ（膜結合Ｏ−アシル基転移酵素）ファミリー及びＤＧＡＴ２ファミリーの３つのグループに分類されると考えられている（非特許文献５）。ＬＰＡＡＴファミリーに属する酵素は、共通して膜結合領域を有し、配列上、保存されたモチーフ（ＬＰＡＡＴモチーフ）があることを特徴とする。ＬＰＡＡＴファミリーに属するものには、ＬＰＡＡＴやＧＰＡＴ等が含まれる。ＭＢＯＡＴファミリーに含まれる酵素は、共通して膜結合領域を有することを特徴とする。ＭＢＯＡＴファミリーには、ＬＰＬＡＴのほかに、ＤＧＡＴやＡＣＡＴ等が含まれることが知られている。動物等では、ＭＢＯＡＴファミリーに属するいくつかの酵素が、膜リン脂質生合成に非常に重要なリモデリング反応を担う酵素であると考えられている。【００１０】
ＬＰＬＡＴは、細菌、酵母等の単細胞生物から哺乳動物等の高等生物に至るまで、幅広い生物で報告されている。菌類の酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、膜結合型のＬＰＬＡＴ遺伝子としては、ＳＬＣ１（ＹＤＬ０５２Ｃ）とＳＬＣ４（ＹＯＲ１７５Ｃ）（「ＡＬＥ１」又は「ＬＰＴ１」という場合もある）が知られている（非特許文献５）。動物では、ＬＰＬＡＴホモログが複数存在し、ｄｅ  ｎｏｖｏ  のトリグリセリド合成系でＬＰＡに作用しＰＡを生成する反応を担うものと、リン脂質のリモデリングに作用するものがあることが知られている（非特許文献６）。【００１１】
脂質生産菌であるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ（以下、「Ｍ．ａｌｐｉｎａ」と記載する場合もある）では、４種類のＬＰＬＡＴが得られているが、これらはいずれもＬＰＡＡＴファミリーに属するものである（特許文献１〜３）。しかしながら、Ｍ．ａｌｐｉｎａからＭＢＯＡＴファミリーに属するＬＰＬＡＴが得られたという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公報ＷＯ２００４／０８７９０２号
【特許文献２】米国特許出願公開公報ＵＳ２００６／００９４０９０号
【特許文献３】国際公報ＷＯ２００８／１４６７４５号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Lipids, 39, 1147 (2004)
【非特許文献２】J.B.C., 278(37), 35115-35126, (2003)
【非特許文献３】J.B.C., 276(29), 26745-26752, (2001)
【非特許文献４】Proc．Nath，Aca, Sci., 105(8), 2830-2835, (2008)
【非特許文献５】J.B.C., 282(42), 30845-30855, (2007)
【非特許文献６】J.B.C., 284(1), 1-5, (2009)
【非特許文献７】Trends Biochem. Sci. 25, 111-112, (2000)
【非特許文献８】Journal of lipid reserach 2009 R80035 JLR200v1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記のように、アラキドン酸等のＰＵＦＡ生合成においては、リン脂質のリモデリングが必須であり、この反応にはＬＰＬＡＴが関与すると考えられる。しかし、これまで知られていたＬＰＡＡＴホモログでは、宿主に導入して発現させても、総脂肪酸中のＰＵＦＡの比率を十分に高めることができないという課題があった。そこで、宿主に導入して発現させた場合に宿主の総脂肪酸中のＰＵＦＡの比率を十分に高めることができる新規な核酸及びタンパク質を同定することが求められている。また、利用価値の高い脂肪酸の含有量が高い油脂を生産しうる核酸及びタンパク質を同定し、これらを用いて、有用脂肪酸の生産を可能とし、或いは、有用脂肪酸の含有量を高める方法を開発することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、宿主細胞で発現させることで、宿主の脂質代謝に影響を与えたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたりして、有用な油脂生産を可能とするような、タンパク質及び核酸を提供することである。【００１６】
アラキドン酸等ＰＵＦＡ生合成においては、リン脂質のリモデリングが必須である。脂質生産菌Ｍ．ａｌｐｉｎａは、アラキドン酸等有用なＰＵＦＡを大量に蓄積することができるが、動物等で報告されているような、脂質のリモデリングに関与するＭＢＯＡＴファミリーに属するアシル基転移酵素は、Ｍ．ａｌｐｉｎａからは得られていない。本発明者は、この点に着目し、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、Ｍ．ａｌｐｉｎａから、ＭＢＯＡＴファミリーに属する酵素をコードするｃＤＮＡを獲得し、さらに、得られたｃＤＮＡを酵母等の高増殖能を有する宿主細胞に導入して脂肪酸組成物の産生を試みたところ、Ｍ．ａｌｐｉｎａから得られている既知のＬＰＡＡＴをコードする核酸を含有するベクターを導入した宿主が産生する脂肪酸組成物と比較して、異なる脂肪酸組成物、特にアラキドン酸比率の高い脂肪酸組成物を生成することができることを見いだした。よって、本発明者らは、既知のＬＰＡＡＴとは異なる新規なＬＰＬＡＴに関する遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。【００１７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）  以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（２）以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（３）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（４）以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかである、（３）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、前記核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（５）コードするタンパク質が膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼファミリーに属するものである、（１）〜（４）いずれか1項記載の核酸。
（６）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１又は６で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４又は９で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｄ）配列番号５又は１０で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、（７）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、リゾリン脂質アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（９）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、（９）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性を有するタンパク質
（１１）膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼファミリーに属するものである、（７）〜（１０）いずれか1項記載のタンパク質。
（１２）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（１３）（１）〜（６）のいずれか１項記載の核酸を含有する組換えベクター。
（１４）（１３）記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
（１５）（１４）に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物であって、当該脂肪酸組成物中の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率が、非形質転換体である宿主を培養して得られる脂肪酸組成物のアラキドン酸比率よりも高いことを特徴とする前記脂肪酸組成物。
（１６）（１４）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、（１５）記載の脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、前記脂肪酸組成物の製造方法。
（１７）（１５）記載の脂肪酸組成物を含む、食品。
（１８）（１３）記載の組換えベクターを用いて、当該ベクターが導入された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、当該ベクターを導入していない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高くする方法。
（１９）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（２０）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与するタンパク質
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＬＰＬＡＴは、アラキドン酸等の有用な脂肪酸や貯蔵脂質の生産能の向上を図ることができるため、微生物や植物中での高度不飽和脂肪酸の生産性を向上させるものとして、好ましい。それにより、所望の特性や効果を有する脂質を提供できるため、食品、化粧料、医薬品、石鹸等に適用できるものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、アラキドン酸の生合成経路を示した模式図である。なお、図１中、ＰＬはリン脂質、ＣｏＡはコエンザイムＡ、ＤＳはデサチュラーゼ（脂肪酸不飽和化酵素）、ＧＬＥＬＯは脂肪酸鎖長延長酵素、１８：０−はステアロイル基、１８：１−はオレオイル基、１８：２−はリノイル基、１８：３（ｎ−６）−はγ−リノレイル基、ＤＧＬＡ−はジホモ−γ−リノレイル基、ＡＲＡ−はアラキドイル基、をそれぞれ示す。
【図２】図２は、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＬＰＬＡＴ５のｃＤＮＡ全長配列（配列番号４）及びそれから導かれるアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。
【図３】図３は、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＬＰＬＡＴ６のｃＤＮＡ全長配列（配列番号９）及びそれから導かれるアミノ酸配列（配列番号７）を示した図である。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＬＰＬＡＴ５のゲノム配列（配列番号５）とＯＲＦの配列（配列番号１）を配列比較した図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＬＰＬＡＴ５のゲノム配列（配列番号５）とＯＲＦの配列（配列番号１）を配列比較した図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＬＰＬＡＴ５のゲノム配列（配列番号５）とＯＲＦの配列（配列番号１）を配列比較した図である。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＬＰＬＡＴ６のゲノム配列（配列番号１０）とＯＲＦの配列（配列番号６）を配列比較した図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＬＰＬＡＴ６のゲノム配列（配列番号１０）とＯＲＦの配列（配列番号６）を配列比較した図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＬＰＬＡＴ６のゲノム配列（配列番号１０）とＯＲＦの配列（配列番号６）を配列比較した図である。
【図６】図６は、Ｍ．ａｌｐｉｎａにおいてＬＰＬＡＴ６又はΔ５脂肪酸不飽和化酵素の発現を抑制した場合の、菌体内高度不飽和脂肪酸組成比を示すグラフである。図６中、ＧＬＡはγ−リノレン酸、ＤＧＬＡはジホモ−γ−リノレン酸、ＡＲＡはアラキドン酸、をそれぞれ示す。
【図７】図７は、Ｍ．ａｌｐｉｎａにおいてＬＰＬＡＴ６又はΔ５脂肪酸不飽和化酵素の発現を抑制した場合の、トリアシルグリセロール画分の高度不飽和脂肪酸組成比を示すグラフである。図７中、ＧＬＡはγ−リノレン酸、ＤＧＬＡはジホモ−γ−リノレン酸、ＡＲＡはアラキドン酸、をそれぞれ示す。
【図８】図８は、Ｍ．ａｌｐｉｎａにおいてＬＰＬＡＴ６又はΔ５脂肪酸不飽和化酵素の発現を抑制した場合の、リン脂質画分の高度不飽和脂肪酸組成比を示すグラフである。図８中、ＧＬＡはγ−リノレン酸、ＤＧＬＡはジホモ−γ−リノレン酸、ＡＲＡはアラキドン酸、をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、アラキドン酸の生合成過程において、アシル基をアシル−ＣｏＡとリン脂質との間で転移させることを特徴とする、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属由来の新規なリゾリン脂質アシル基転移酵素（「ＬＰＬＡＴ」）に関する。本発明のタンパク質はリゾリン脂質に作用しうる。アシル基供与体は、通常アシル−ＣｏＡであるが、これに限定されない。
【００２１】
以下、本発明の態様を具体的に説明する。
【００２２】
本発明のリゾリン脂質アシル基転移酵素をコードする核酸
本発明の核酸によってコードされるリゾリン脂質アシル基転移酵素（ＬＰＬＡＴ）は、その典型的な例として、ＬＰＬＡＴ５及び６を含む。ＬＰＬＡＴ５及び６は、以下の実施例で説明するように、公知のＭ．ａｌｐｉｎａ由来のＬＰＡＡＴを発現させた宿主が産生する脂肪酸組成物とは異なり、アラキドン酸の比率が高いことを特徴とする組成の脂肪酸組成物を宿主中に産生させることができた。よって、本発明のＬＰＬＡＴは、好ましくは公知のＭ．ａｌｐｉｎａ由来のＬＰＡＡＴと比してアラキドン酸産生効率が極めて高い。
【００２３】
本発明のＬＰＬＡＴ５及びＬＰＬＡＴ６をコードする核酸のｃＤＮＡ、ＣＤＳ、ＯＲＦ及びアミノ酸配列の対応関係を以下の表１に整理して記載した。
【００２４】
【表１】
0005539961.tif 000002
【００２５】
つまり、本発明のＬＰＬＡＴ５に関連する配列としては、ＬＰＬＡＴ５のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号１、ＬＰＬＡＴ５のアミノ酸配列である配列番号２、ＬＰＬＡＴ５のＣＤＳの領域を示す配列である配列番号３、そのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号４及びそのゲノム配列である配列番号５があげられる。このうち、ＬＰＬＡＴ５のｃＤＮＡ配列である配列番号４の第１６１−１６９３番目の塩基配列がＣＤＳ（配列番号３）に相当し、第１６１−１６９０番目の塩基配列がＯＲＦ（配列番号１）に相当する。図２にＬＰＬＡＴ５のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を記載する。ＬＰＬＡＴ５のゲノム配列（配列番号５）はイントロンを２つ含んでおり、エクソン領域は配列番号５の第１−３１４番目、第４６１−５８７番目、第６６８−１７５９番目の塩基配列の領域である。
【００２６】
同様に、本発明のＬＰＬＡＴ６に関連する配列としては、ＬＰＬＡＴ６のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号６、ＬＰＬＡＴ６のアミノ酸配列である配列番号７、ＬＰＬＡＴ６のＣＤＳの領域を示す配列である配列番号８、そのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号９及びそのゲノム配列である配列番号１０があげられる。このうち、ＬＰＬＡＴ６のｃＤＮＡ配列である配列番号９の第３８−１７５９番目の塩基配列はＣＤＳ（配列番号８）に相当し、第３８−１７５６番目の塩基配列がＯＲＦ（配列番号６）に相当する。図３にＬＰＬＡＴ６のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を記載する。ＬＰＬＡＴ６のゲノム配列（配列番号１０）はイントロンを１つ含んでおり、エクソンは配列番号１０の第１−１０９５番目及び第１３１８−１９４４番目の塩基配列の領域である。
【００２７】
本発明の核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。
【００２８】
本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号１若しくは６で示される塩基配列を含む核酸、（ｂ）配列番号２若しくは７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、（ｃ）配列番号４若しくは９で示される塩基配列を含む核酸又は（ｄ）配列番号５若しくは１０で示される塩基配列を含む核酸等があげられる。
【００２９】
上記塩基配列を得るためには、ＬＰＬＡＴ活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のＬＰＬＡＴ活性を有するタンパク質と同一性の高いタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。ＬＰＬＡＴ活性を有する生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質生産菌としてはＭ．ａｌｐｉｎａがあげられるが、これに限定されない。
【００３０】
ＥＳＴ解析を行う場合には、まず、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてもよい。本発明に適するｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、例えば以下のような方法があげられる。すなわち、脂質生産菌であるＭ．ａｌｐｉｎａの適当な株を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養する。本培養中に適時培養物を採取し、そこから菌体を回収して、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製には、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法等の公知の方法を用いることができる。得られた全ＲＮＡから市販のキットを用いてｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを精製することができる。さらに、市販のキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。その後、作製したｃＤＮＡライブラリーの任意のクローンの塩基配列を、ベクター上にインサート部分の塩基配列を決定できるように設計されたプライマーを用いて決定し、ＥＳＴを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）でｃＤＮＡライブラリーを作製した場合は、ディレクショナルクローニングを行うことができる。
【００３１】
配列番号１及び６について、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＸを用いて相同性解析を行うと、配列番号１から推定されるアミノ酸配列は真菌類由来のＬＰＬＡＴホモログと相同性を示し、配列番号６から推定されるアミノ酸配列は動物由来のＬＰＬＡＴホモログと相同性を示す。各配列のＯＲＦと、もっとも同一性の高かった配列に係る塩基配列の同一性及びアミノ酸配列の同一性をｃｌｕｓｔａｌＷにて求めると、配列番号１に対して最もＥ−ｖａｌｕｅの低い、すなわち同一性の最も高かったものはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来のリゾリン脂質アシル基転移酵素ホモログ（ＧＩ：１６１０８５６４８）で、ＯＲＦの塩基配列の同一性が４３．２％、アミノ酸配列の同一性が３３．３％である。同様に、配列番号６に対して同一性が最も高かったものはＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ由来の推定タンパク質（ＧＩ：５６７８８９１９）で、ＯＲＦの塩基配列の同一性が４１．２％、アミノ酸配列の同一性が２８．６％である。
【００３２】
ＬＰＬＡＴ５とＬＰＬＡＴ６の間の同一性は、ＯＲＦの塩基配列で４０．０％、アミノ酸配列で１９．１％である。
【００３３】
本発明はまた、上記配列番号１及び６で示される塩基配列（「本発明の塩基配列」と記載する場合もある）、並びに、配列番号２及び７で示されるアミノ酸配列（「本発明のアミノ酸配列」と記載する場合もある）からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸と同等の機能を有する核酸を含む。「同等の機能」を有するとは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が、「リゾリン脂質アシル基転移酵素活性（ＬＰＬＡＴ活性）」、「本発明のタンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性（以下、「アラキドン酸の比率を高めることができる活性」という場合もある）」、及び／又は「１８：１−ＣｏＡから１８：１−ＰＬへの変換、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換、及びＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換、からなる群より選択される１以上の変換に関与する活性（以下、アラキドン酸の生合成経路に関与する活性」という場合もある）」を有することをいう。好ましくはＬＰＬＡＴ５及び／又は６と同様の活性を有することを意味する。
【００３４】
本発明の「リゾリン脂質アシル基転移酵素（ＬＰＬＡＴ）活性」とは、アシル基をアシル−ＣｏＡとリゾリン脂質の間で転移させる活性をいう。「リゾリン脂質」とは、リン脂質からアシル基が１つとれた脂質をいう。本明細書において、リゾリン脂質は特に限定されず、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）、リゾホスファチジルセリン（ＬＰＳ）、リゾホスファチジルエタノールアミン（ＬＰＥ）、リゾホスファチジルイノシトール（ＬＰＩ）等が含まれる。
【００３５】
本発明のＬＰＬＡＴは、１種のリゾリン脂質に特異的に作用するものであっても、複数種の特異的なリゾリン脂質に作用するものであってもよい。
【００３６】
本発明のＬＰＬＡＴ活性は、公知の方法を用いて測定できるが、例えば、J.B.C.,282（47），34288-34298（2007）に記載の方法があげられる。
【００３７】
本発明の「アラキドン酸の比率を高めることができる活性」は、上記のとおり、本発明の核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性をいい、具体的には、本発明の塩基配列を含む核酸又は本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、前記ベクターで形質転換されていない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高めることができる活性ような活性をいう。当該活性の測定は、公知の方法を用いることができるが、例えば、上記本発明の塩基配列等を発現ベクターｐＹＥ２２ｍに挿入したものを、Δ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＧＬＥＬＯ脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入し発現させることによりアラキドン酸を生産できるように育種した酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主として形質転換させ、得られた形質転換体を培養して回収した菌体を、以下の実施例に記載の方法で脂肪酸解析をする方法等があげられる。
【００３８】
本発明の「アラキドン酸の生合成経路に関与する活性」は、１８：１−ＣｏＡから１８：１−ＰＬへの変換、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換、及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与する活性をいう。好ましくは、当該活性は１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換、及び／又はＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与する活性をいう。ここで、１８：１−はオレオイル基を、１８：３（ｎ−６）−はγ−リノレイル基を、ＤＧＬＡ−はジホモ−γ−リノレイル基を、ＰＬはリン脂質を、ＣｏＡはコエンザイムＡをそれぞれ示す。よって、例えばＤＧＬＡ−ＣｏＡはジホモ−γ−リノレイル基を含むアシル−ＣｏＡを意味し、ＤＧＬＡ−ＰＬはジホモ−γ−リノレイル基を含むリン脂質を意味する。アラキドン酸の生合成経路に関与する活性の確認は、各々の出発基質から生成基質への変換を確認することにより行うことができる。あるいは、本発明のタンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主若しくは細胞において、本発明のタンパク質を過剰発現するか、又はアラキドン酸を生産能を有する細胞において当該タンパク質の発現を抑制することにより確認することができる。例えば、以下の実施例に記載の方法で、本発明のタンパク質を過剰発現させた宿主若しくは細胞の、又は本発明のタンパク質の発現を抑制した宿主若しくは細胞の脂肪酸組成の解析を行い、その脂肪酸組成の変化から、上記の各々の出発基質から生成基質への変換を確認する方法等があげられる。
【００３９】
さらに好ましくは、本発明の塩基配列等は、ＬＰＬＡＴ活性、上記アラキドン酸の比率を高めることができる活性、及び／又は上記アラキドン酸の生合成経路に関与する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。
【００４０】
さらに特に好ましくは、本発明の核酸によってコードされるリゾリン脂質アシル基転移酵素（ＬＰＬＡＴ）は、ＬＰＬＡＴのうち、膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＭＢＯＡＴ）ファミリーに属する酵素をいう。
【００４１】
「ＭＢＯＡＴファミリー」とは、ＰＦＡＭのアクセッション番号ＰＦ０３０６２のタンパク質に属するファミリーで、グリセロリン脂質アシル基転移酵素のうちアミノ酸配列中に膜貫通領域を有する酵素群をいう。ＰＦＡＭ（http://pfam.sanger.ac.uk/）とは、タンパク質ファミリーのアライメントから得られるプロファイルのデータベースであり、Sanger Institute により提供されている。各プロファイルは類似の配列からなり、隠れマルコフモデルにより解析される。対象となるタンパク質名のほか、キーワード、当該タンパク質をコードする核酸配列、当該タンパク質のアミノ酸配列、アクセッション番号等の情報を用いて、所望のタンパク質がどのタンパク質ファミリーに属するかを検索することができる。本発明で得られたＬＰＬＡＴをコードする核酸配列又はＬＰＬＡＴのアミノ酸配列を用いた検索によれば、当該タンパク質はアクセッション番号ＰＦ０３０６２のＭＢＯＡＴファミリーに属することが明らかである。さらに、ＭＢＯＡＴファミリーに属する酵素には、共通して、保存されたヒスチジン残基が活性中心として存在しており、例えば、ＬＰＬＡＴ５ではアミノ酸配列中の第３１７番目のヒスチジン残基、ＬＰＬＡＴ６ではアミノ酸配列中の第４５６番目のヒスチジン残基がその活性中心に相当する。
【００４２】
また、ＭＢＯＡＴファミリーはＬＰＡＡＴファミリーと異なり、ＬＰＡＡＴモチーフを含まない。ＬＰＡＡＴモチーフとは、特許文献３に記載されたＬＰＡＡＴタンパク質のアミノ酸配列中に４カ所存在する保存モチーフの「ＨＸＸＸＸＤ（ＨＸ4Ｄ）」をいう。例えば、特許文献３に記載の脂質生産菌であるＭ．ａｌｐｉｎａ由来のＬＰＡＡＴ３では、特許文献３中の配列番号２のアミノ酸残基１１５―１２０、ＬＰＡＡＴ４では、配列番号４のアミノ酸残基１１５―１２０がＬＰＡＡＴモチーフに相当する。しかし、本発明のＬＰＬＡＴタンパク質は、このようなモチーフを有しない。
【００４３】
Ｍ．ａｌｐｉｎａでは、今までにＬＰＬＡＴは、４種類見出されている（特許文献１〜３）が、ＭＢＯＡＴファミリーに属するＬＰＬＡＴ酵素は未だ発見されていなかった。そこで、本発明のＬＰＬＡＴは、特に好ましくは、ＭＢＯＡＴファミリーに属するＬＰＬＡＴであって、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。
【００４４】
上記のような、本発明の核酸と同等の機能を有する核酸としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸があげられる。なお、以下にあげる塩基配列の記載において、「本発明の上記活性」とは、上記の「ＬＰＬＡＴ活性、アラキドン酸の比率を高めることができる活性、及び／又はアラキドン酸の生合成経路に関与する活性」を意味する。
【００４５】
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。「本発明の上記活性」については上記のとおりである。
【００４６】
具体的には、配列番号２又は７に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜400個、1〜200個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個））のアミノ酸が欠失、置換及び/または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。ここで、アミノ酸配列が欠失、置換及び/または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換及び/または付加があることを意味する。当該欠失、置換及び/または付加は、これらのうち２種以上が同時に生じてもよいが、当該欠失、置換及び/または付加の数は、一般的に小さいほど好ましい。
【００４７】
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
【００４８】
保存的置換は、一般的には、生物学的系合成や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
【００４９】
以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸及び２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸及び２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン及び４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
【００５０】
また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
【００５１】
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
【００５２】
Ｄ−アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
【００５３】
なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。
【００５４】
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている分子の残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
【００５５】
当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
【００５６】
上記したように、配列番号２又は７で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ）等を用いて行うことができる。
【００５７】
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
【００５８】
本発明の核酸は、好ましくは、配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。本発明のタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の部位は、本発明の上記活性が保持される限り制限はない。本発明の上記活性の測定方法は上記のとおりである。
【００５９】
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。「本発明の上記活性」については上記のとおりである。
【００６０】
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
【００６１】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
【００６２】
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
【００６３】
具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４２℃〜５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、４５℃〜５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４０℃〜６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％〜０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
【００６４】
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。
【００６５】
特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
【００６６】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
【００６７】
本発明に含まれる核酸としては、好ましくは、配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸があげられる。
【００６８】
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号１又は６に示される核酸配列に対して少なくとも同一性が８０％以上の塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。「本発明の上記活性」については上記のとおりである。
【００６９】
好ましくは、配列番号１又は６に示される塩基配列に対して少なくとも８０％、さらに好ましくは８５％、さらに一層好ましくは９０％（例えば、９２％以上、より一層好ましくは９５％以上、さらには９７％、９８％又は９９％）の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
【００７０】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるＢＬＡＳＴＮプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン２．２．７又はＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム等があげられる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
【００７１】
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。及び「本発明の上記活性」については上記のとおりである。
【００７２】
具体的には、配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは、９７％（例えば、９８％、さらには、９９％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
【００７３】
本発明の核酸は、好ましくは、配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。さらに好ましくは、配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９８％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
【００７４】
２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性パーセントを決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス）、ＤＩＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ）等のプログラムを用いて決定することもできる。
【００７５】
複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
【００７６】
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
【００７７】
「本発明の上記活性」及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。
【００７８】
さらに、本発明の核酸には、配列番号１又は６からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、配列番号１又は６に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、１〜1500個、１〜1000個、１〜500個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１個））の塩基が欠失、置換及び/または付加された塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。ここで、塩基配列が欠失、置換及び/または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１若しくは複数の塩基配列中の位置において、１又は複数の塩基の欠失、置換及び／または付加があることを意味する。当該欠失、置換及び／または付加は、これらのうち２種以上が同時に生じてもよいが、当該欠失、置換及び/または付加の数は、一般的に小さいほど好ましい。
【００７９】
本発明の核酸の好ましい態様としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸も含まれる。
（ａ）配列番号１又は６で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４又は９で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｄ）配列番号５又は１０で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ａ）配列番号１又は６で示される塩基配列を含む核酸、（ｂ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、（ｃ）配列番号４又は９で示される塩基配列を含む核酸については、上記のとおりである。上記配列の部分配列とは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
【００８０】
なお、本発明の核酸は、好ましくは、膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼファミリーに属するタンパク質をコードする核酸である。「膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼファミリー」については上記のとおりである。
【００８１】
また、本発明の核酸には、以下の核酸も含まれる。
（１）（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、及び、
（２）  以下の(ａ)〜（ｅ）のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１又は６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸。
【００８２】
本発明のリゾリン脂質アシル基転移酵素タンパク質
本発明のタンパク質は、「リゾリン脂質アシル基転移酵素活性（ＬＰＬＡＴ活性）」、「アラキドン酸の比率を高めることができる活性」、及び／又は「アラキドン酸の生合成経路に関与する活性」を有することを特徴とする。本発明のタンパク質は、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
【００８３】
本発明のタンパク質は好ましくは、配列番号２又は７で示されるアミノ酸配列からなるＬＰＬＡＴ５及びＬＰＬＡＴ６である。さらに、ＬＰＬＡＴ５及びＬＰＬＡＴ６の変異体、即ち、「リゾリン脂質アシル基転移酵素活性（ＬＰＬＡＴ活性）」、「アラキドン酸の比率を高めることができる活性」、及び／又は「アラキドン酸の生合成経路に関与する活性」を有するという要件を満たす変異体も本発明に含まれる。
【００８４】
「リゾリン脂質アシル基転移酵素活性」、「アラキドン酸の比率を高めることができる活性」及び「アラキドン酸の生合成経路に関与する活性」は、上記『本発明のリゾリン脂質アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおりである。なお、以下の「本発明の上記活性」とは、上記「ＬＰＬＡＴ活性、アラキドン酸の比率を高めることができる活性、及び／又はアラキドン酸の生合成経路に関与する活性」を意味する。
【００８５】
本発明のタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質が含まれる。
（ａ）配列番号２又は７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」、「同一性が８０％以上」の定義については、上記、『本発明のリゾリン脂質アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおりである。
【００８６】
本発明のタンパク質には、配列番号１又は６の塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質の変異体、又は、配列番号２又は７に示されるアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加等の多くの種類の修飾により変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質も含まれる。
【００８７】
本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００８８】
さらに、本発明のタンパク質は、好ましくは、膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼファミリーに属するタンパク質である。「膜結合性Ｏ−アシルトランスフェラーゼファミリー」の定義等は、上記、『本発明のリゾリン脂質アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおりである。
【００８９】
また、本発明のタンパク質には、以下のタンパク質も含まれる。
（１）（ａ）配列番号２又は７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）  以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載の（１）のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は７において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２又は７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質。
【００９０】
本発明の核酸のクローニング
本発明のＬＰＬＡＴタンパク質をコードする核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
【００９１】
例えば、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Stratagene）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega）、ｐＡｍｐ（TM: Gibco-BRL）、ｐ−Ｄｉｒｅｃｔ（Clontech）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号１又は６等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、例えば、以下の実施例１にあげるプライマーである。そして、Ｍ．ａｌｐｉｎａ 菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))』等に従い、当業者であれば容易に行うことができる。
【００９２】
得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(ＱＩＡＧＥＮ)、ExoSAP-IT（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡ断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(ＱＩＡＧＥＮ)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
【００９３】
クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて決定することができる。
【００９４】
本発明の発現用ベクター構築及び形質転換体の作製
本発明はまた、本発明のＬＰＬＡＴタンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
【００９５】
このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、本発明のＬＰＬＡＴタンパク質をコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。このＤＮＡ断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、ＬＰＬＡＴタンパク質発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。
【００９６】
このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌として、脂質生産菌であるＭ．ａｌｐｉｎａ等の糸状菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ (サッカロミセス・セレビシエ)等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌やバチルス・ズブチリス等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。
【００９７】
脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol.XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍ．ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２８．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等のモルティエレラ亜属に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）ＣＢＳ１９４．２８、ＩＦＯ６３３６、ＩＦＯ７８２４、ＩＦＯ７８７３、ＩＦＯ７８７４、ＩＦＯ８２８６、ＩＦＯ８３０８、ＩＦＯ７８８４、モルティエレラ・ナナ（Ｍ．ｎａｎａ）ＩＦＯ８１９０、モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ）ＩＦＯ５４２６、ＩＦＯ８１８６、ＣＢＳ１１２．０８、ＣＢＳ２１２．７２、ＩＦＯ７８２５、ＩＦＯ８１８４、ＩＦＯ８１８５、ＩＦＯ８２８７、モルティエレラ・ヴィナセア（Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ）ＣＢＳ２３６．８２等のマイクロムコール亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ  Ｍｉｃｒｏｍｕｃｏｒ）に属する微生物等があげられる。とりわけ、Ｍ．ａｌｐｉｎａが好ましい。
【００９８】
真菌類を宿主として用いる場合は、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主としてＭ．ａｌｐｉｎａを使用する場合、発現ベクターとして、例えば、ｐＤ４、ｐＤｕｒａＳＣ、ｐＤｕｒａ５等があげられる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるプロモーターを用いてもよく、例えば、ｈｉｓｔｏｎＨ４．１遺伝子プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、ＴＥＦ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）遺伝子プロモーターといったＭ．ａｌｐｉｎａに由来するプロモーターが用いられる。
【００９９】
Ｍ．ａｌｐｉｎａ等の糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
【０１００】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、ｐＹＥ２２ｍ等があげられる。また、ｐＹＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）やｐＥＳＣ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）等の市販の酵母発現用ベクターを用いてもよい。また本発明に適する宿主としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＨ１３−１５株（ｔｒｐ１、ＭＡＴα）等があげられるがこれらに限定されない。プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター等の酵母等に由来するプロモーターが用いられる。
【０１０１】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。
【０１０２】
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のｐＧＥＸ、ｐＵＣ１８等があげられる。プロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
【０１０３】
本発明の脂肪酸組成物の製造方法
本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
【０１０４】
本発明のタンパク質を発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、酵母を形質転換してＬＰＬＡＴ５及び６を発現させた場合は、ＳＣ−Ｔｒｐ、Ｌｅｕ，Ｕｒａ培地、ＹＰＤ培地、ＹＰＤ５培地等を用いることができるが、これらに限定されない。
【０１０５】
培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。
【０１０６】
本発明の脂肪酸組成物
本発明はまた、本発明のＬＰＬＡＴタンパク質が発現している細胞における１又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物であって、当該脂肪酸組成物中の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率が、非形質転換体である宿主を培養して得られる脂肪酸組成物のアラキドン酸比率よりも高いことを特徴とする前記脂肪酸組成物を提供する。好ましくは、本発明のＬＰＬＡＴ５及び６が発現している形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物である。以下の実施例では、アラキドン酸生産酵母においてＬＰＬＡＴ５又は６で形質転換させた場合、アラキドン酸の比率がコントロールの脂肪酸組成物のアラキドン酸比率よりも、少なくとも１．５倍上昇した。
【０１０７】
脂肪酸は、遊離脂肪酸でもよいし、トリグリセリド、リン脂質等でもよい。
【０１０８】
本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸としては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐状のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）（１４：０）、ミリストレイン酸（テトラデセン酸）（１４：１）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）（１６：０）、パルミトレイン酸（９−ヘキサデセン酸）（１６：１）、ステアリン酸（オクタデカン酸）（１８：０）、オレイン酸（ｃｉｓ−９−オクタデセン酸）（１８：１（９）、又は単に１８：１と表記することもある）、バクセン酸（１１−オクタデセン酸）（１８：１（１１））、リノール酸（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２オクタデカジエン酸）（１８：２（９，１２）、又は単に１８：２と表記することもある）、α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）（１８：３（９，１２，１５））、γ−リノレン酸（６，９，１２−オクタデカトリエン酸）（１８：３（６，９，１２）、ＧＬＡ又は１８：３（ｎ−６）と表記することもある）、ステアリドン酸（６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸）（１８：４（６，９，１２，１５））、アラキジン酸（イコサン酸）（２０：０）、（８，１１−イコサジエン酸）（２０：２（８，１１））、ミード酸（５，８，１１−イコサトリエン酸）（２０：３（５，８，１１））、ジホモ−γ−リノレン酸（８，１１，１４−イコサトリエン酸）（２０：３（８，１１，１４）又はＤＧＬＡと表記することもある）、アラキドン酸（５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸）（２０：４（５，８，１１，１４）又はＡＬＡと表記することもある）、エイコサテトラエン酸（８，１１，１４，１７−イコサテトラエン酸）（２０：４（８，１１，１４，１７）、エイコサペンタエン酸（５，８，１１，１４，１７−イコサペンタエン酸）（２０：５（５，８，１１，１４，１７））、ベヘン酸（ドコサン酸）（２２：０）、（７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸）（２２：４（７，１０，１３，１６））、（７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）（２２：５（７，１０，１３，１６，１９））、（４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸）（２２：５（４，７，１０，１３，１６））、（４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）（２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９））、リグノセリン酸（テトラドコサン酸）（２４：０）、ネルボン酸（ｃｉｓ−１５−テトラコセン酸）（２４：１）、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）（２６：０）等があげられるが、これらに限定されない。なお、上記物質名はＩＵＰＡＣ生化学命名法で定義された慣用名であり、組織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、カッコ内に記載した。
【０１０９】
本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸のうち、１またそれ以上の脂肪酸の組み合わせであれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪酸からなる組成物でもよい。
【０１１０】
上記本発明の脂肪酸組成物の製造方法により得られた凍結乾燥した菌体に、適当な比率で調整したクロロホルム：メタノールを添加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理をする。さらに遠心分離により菌体を分離して、溶媒を回収することを数回繰り返す。その後、適当な方法を用いて脂質を乾固させてから、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質を溶解する。この試料を適当量分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで分析を行う。
【０１１１】
なお、本発明の核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物中の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率は、公知のＬＰＬＡＴ脂肪酸組成物のアラキドン酸比率よりも高い。これは、本発明のＬＰＬＡＴがアシル基のアシル−ＣｏＡからリン脂質への転移、あるいはリン脂質からＣｏＡへの転移が必要な脂肪酸の変換率を上昇させることができるからである。具体的には、以下の実施例にも記載するように、アラキドン酸生産酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で本発明の好ましい態様であるＬＰＬＡＴ５及びＬＰＬＡＴ６を発現させた場合、当該ＬＰＬＡＴ５及びＬＰＬＡＴ６が発現した酵母により産生される脂肪酸組成物中におけるアラキドン酸の比率が高いことがあげられる。この場合、ＬＰＬＡＴ５は、１８：１−ＣｏＡから１８：１−ＰＬへの変換、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及びＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与し、ＬＰＬＡＴ６は、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及びＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与していることが見出されている。
【０１１２】
また、後述の実施例において記載するように、Ｍ．ａｌｐｉｎａにおいても、ＬＰＬＡＴ６は、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及びＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与していることが見出されている。
【０１１３】
したがって、本発明はまた、組換えベクターを用いて、当該ベクターが導入された宿主の脂肪酸組成におけるアラキドン酸の比率を、当該ベクターを導入していない宿主の脂肪酸組成における比率よりも高くする方法をも提供する。
【０１１４】
本発明の脂肪酸組成物を含む食品等
また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料（化粧料、医薬（例えば、皮膚外用薬）、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。化粧料（組成物）又は医薬（組成物）の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。
【０１１５】
さらに、本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等があげられるが、これらに限定されない。本明細書においては、食品とは、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称をいう。
【０１１６】
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
【０１１７】
これらの食品としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげることができる。しかしながら、本発明の食品は、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられる。
【０１１８】
本発明のＬＰＬＡＴタンパク質をコードする核酸又はＬＰＬＡＴタンパク質を用いた菌株の評価・選択方法
本発明はまた、本発明のＬＰＬＡＴタンパク質をコードする核酸又はＬＰＬＡＴタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。
【０１１９】
（１）評価方法
本発明の一態様として、本発明のＬＰＬＡＴタンパク質をコードする核酸又はＬＰＬＡＴタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。本発明の上記評価方法としては、まず、本発明の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質生産菌株の本発明の上記活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットＷＯ０１／０４０５１４号、特開平８−２０５９００号公報等に記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
【０１２０】
まず、被検菌株のゲノムを調製する。調製方法は、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ法や酢酸カリウム法等、いかなる公知の方法をも用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)参照）。
【０１２１】
本発明の塩基配列、好ましくは、配列番号１又は６に基づいてプライマー又はプローブを設計する。上記プライマー又はプローブは本発明に関する塩基配列のいずれの部分をも用いることができ、またその設計は公知の手法を用いて行うことができる。プライマーとして用いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０塩基以上であり、１５〜２５塩基であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００塩基が適当である。
【０１２２】
上記で作製したプライマー又はプローブを用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明の塩基配列と特異的な配列が存在するか否かを調べる。本発明の塩基配列と特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明の塩基配列に特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、例えば、ＰＣＲ法等によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさ等を測定することができる。
【０１２３】
本発明の方法に適するＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されない。得られた反応生成物である増幅産物を、アガロースゲル等を用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株の本発明の上記活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらに本発明の上記活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、本発明の上記活性の評価方法は、上記のとおりである。
【０１２４】
また、本発明の上記評価方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１又は６等の本発明の塩基配列がコードするＬＰＬＡＴタンパク質の発現量を測定することによって、被検菌株の本発明の上記活性を評価することもできる。なお、ＬＰＬＡＴタンパク質の発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し、ＬＰＬＡＴタンパク質のｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することにより測定できる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、ウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
【０１２５】
（２）選択方法
本発明の他の態様として、本発明のＬＰＬＡＴタンパク質をコードする核酸又はＬＰＬＡＴタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１又は６等の本発明の塩基配列がコードするＬＰＬＡＴタンパク質の発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株及び被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、ＬＰＬＡＴタンパク質の発現量を測定する方法があげられる。
【０１２６】
また、本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養して、本発明の上記活性が高いか若しくは低い菌株を選択することにより、所望の活性を有する被検菌株を選択することもできる。所望の活性には、上記のように、ＬＰＬＡＴタンパク質の発現量を測定する方法があげられる。
【０１２７】
被検菌株又は基準菌株としては、例えば、上記の本発明のベクターを導入した菌株、上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、突然変異処理が施された菌株、自然変異した菌株等を用いることができるがこれらに限定されない。突然変異処理としては、例えば、紫外線照射や放射線照射等の物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン等の薬剤処理による化学的方法等があげられる（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センター等参照）が、これらに限定されない。
【０１２８】
なお、本発明の基準菌株、被検菌株として用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又は酵母等があげられるが、これらに限定されない。具体的には、基準菌株、被検菌株は、異なる属や種に属するいかなる菌株を組み合わせて用いてもよく、被検菌株は１又はそれ以上の菌株を同時に用いてもよい。
【０１２９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３０】
〔実施例１〕
Ｍ．ａｌｐｉｎａのゲノム解析
Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株を１００ｍｌのＧＹ２：１培地（２％グルコース、１％酵母エキスｐＨ６．０）に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、ＤＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。【０１３１】
上記ゲノムＤＮＡの塩基配列を、Ｒｏｃｈｅ４５４ＧＳ  ＦＬＸ  Ｓｔａｎｄａｒｄを用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を２ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を３ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、３００個のＳｕｐｅｒ  Ｃｏｎｔｉｇが得られた。【０１３２】
ｃＤＮＡライブラリーの作製
Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株を１００ｍｌの培地（１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、３日間２８℃で前培養した。１０Ｌ培養槽（ＡｂｌｅＣｏ．，東京）に５Ｌの培地（１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％Ｎａ2ＳＯ4、０．０５％ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０５％ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ６．０）を入れ、前培養物を全量植菌し、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃の条件で８日間通気攪拌培養した。培養１、２、及び３日目に各々２％、２％、及び１．５％相当のグルコースを添加した。培養１、２、３、６、及び８日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアジニン／ＣｓＣｌ法でｔｏｔａｌＲＮＡを調製した。Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡの精製を行った。各ステージのｃＤＮＡライブラリーを、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を用いて作製した。【０１３３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＳＬＣ４ホモログの探索
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＭＢＯＡＴファミリー（ＰｆａｍＰＦＯ３０６２）のＬＰＬＡＴをコードするＳＬＣ４（ＹＯＲ１７５ｃ）から導かれるアミノ酸配列をＭ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４のゲノム塩基配列に対し、ｔｂｌａｓｔｎ解析した結果、配列番号５と配列番号１０に示す配列を含むＳｕｐｅｒ  ｃｏｎｔｉｇがヒットした。【０１３４】
プローブの作製
配列番号５と配列番号１０に対応するｃＤＮＡをクローン化をするために、以下のプライマーを作製した（表２）。【０１３５】
【表２】
0005539961.tif 000003
【０１３６】
ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、上記プライマーのうち、ＭａＬＰＡＡＴ５−１ＦとＭａＬＰＡＡＴ５−３Ｒ、ＭａＬＰＡＡＴ６−２ＦとＭａＬＰＡＡＴ５−３Ｒの組み合わせで、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片をＴＯＰＯ−ＴＡｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いてクローニングし、配列番号４の１９５番目から９３１番目の塩基配列を含むプラスミドをｐＣＲ−ＬＰＬＡＴ５−Ｐ、配列番号９の７６６番目から１４１４番目の塩基配列を含むプラスミドをｐＣＲ−ＬＰＬＡＴ６−Ｐとした。次に、これらのプラスミドを各々鋳型として、上記プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応には、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いたが、添付のｄＮＴＰミックスの代わりにＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて、増幅されるＤＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルしたプローブを作製した。このプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。【０１３７】
ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド；
温度：４２℃（一晩）；
洗浄条件：０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中（６５℃）で、２０分間×３回；
検出は、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、ｉｎ  ｖｉｖｏエキシジョンにより、プラスミドを切り出し、各プラスミドＤＮＡを得た。ＬＰＬＡＴ５プローブ１でスクリーニングして得られたプラスミドのうちインサート長の最も長いものをｐＢ−ＬＰＬＡＴ５、ＬＰＬＡＴ６プローブ１でスクリーニングして得られたプラスミドのうちインサート長の最も長いものをｐＢ−ＬＰＬＡＴ６とした。プラスミドｐＢ−ＬＰＬＡＴ５のインサート、すなわちＬＰＬＡＴ５のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号４、プラスミドｐＢ−ＬＰＬＡＴ６のインサート、すなわちＬＰＬＡＴ６のｃＤＮＡの塩基配列は配列番号９であった。【０１３８】
配列解析
ＬＰＬＡＴ５のｃＤＮＡ配列である配列番号４には、１６１番目から１６９３番目の塩基配列からなるＣＤＳ（配列番号３）が含まれており、１６１番目から１６９０番目の塩基配列からなるＯＲＦ（配列番号１）が含まれていた。図２にＬＰＬＡＴ５のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を記載した。【０１３９】
一方、ＬＰＬＡＴ６のｃＤＮＡ配列である配列番号９には、３８番目から１７５９番目の塩基配列からなるＣＤＳ（配列番号８）が含まれており、３８番目から１７５６番目の塩基配列からなるＯＲＦ（配列番号６）が含まれていた。図３にＬＰＬＡＴ６のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を記載した。【０１４０】
配列番号１及び配列番号６をＧＥＮＥＢＡＮＫに登録されているアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＸを用いて相同性解析を行った。配列番号１から推定されるアミノ酸配列は真菌類由来のＬＰＬＡＴホモログと相同性を示し、配列番号６から推定されるアミノ酸配列は動物由来のＬＰＬＡＴホモログと相同性を示した。各配列に対して最もＥ−ｖａｌｕｅの低かった、すなわち同一性の最も高かったアミノ酸配列は以下のとおりであった。各配列のＯＲＦと、もっとも同一性の高かった配列に係る塩基配列の同一性、及びアミノ酸配列の同一性をｃｌｕｓｔａｌＷにて求め、以下に合わせて記載した。【０１４１】
配列番号１は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来のリゾリン脂質アシル基転移酵素ホモログ（ＧＩ：１６１０８５６４８）と、ＯＲＦの塩基配列で４３．２％、アミノ酸配列で３３．３％の同一性であった。一方、配列番号６は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ由来の推定タンパク質（ＧＩ：５６７８８９１９）とＯＲＦの塩基配列で４１．２％、アミノ酸配列で２８．６％の同一性であった。またＬＰＬＡＴ５とＬＰＬＡＴ６の間の同一性は、ＯＲＦの塩基配列で４０．０％、アミノ酸配列で１９．１％であった。【０１４２】
ＬＰＬＡＴ５のＣＤＳ（配列番号３）及びＬＰＬＡＴ６のＣＤＳ（配列番号８）を含むゲノム配列をそれぞれ配列番号５及び配列番号１０に記載した。配列番号５はイントロンを２つ含んでおり、エクソンは１−３１４、４６１−５８７、６６８−１７５９であった。また、配列番号１０はイントロンを１つ含んでおり、エクソンは１−１０９５、１３１８−１９４４であった。図４にＬＰＬＡＴ５のゲノム配列とＯＲＦ配列のアラインメントを、図５にＬＰＬＡＴ６のゲノム配列とＯＲＦのアラインメントを記載した。【０１４３】
〔実施例２〕
酵母発現用ベクターの構築
ＬＰＬＡＴ５及びＬＰＬＡＴ６を酵母で発現させるために、以下の通りベクターを構築した。
ｐＢＬＰＬＡＴ５を鋳型として、
プライマーＥｃｏ−ＭａＬＰＬＡＴ５−Ｆ（配列番号１５）：
ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＡＣＧＣと
プライマーＸｈｏ−ＭａＬＰＬＡＴ５−Ｒ（配列番号１６）：
ＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＧＣＧＴＣＴＴＧＡＴＴＴＴＡＡＣＴＧＣＡＧＣ
を用いて、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）により、ＰＣＲ反応を行った。【０１４４】
得られたＤＮＡ断片について、ＴＯＰＯ−ＴＡｃｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて、ＴＡ−クローニングを行い、インサート部分の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を持つプラスミドをｐＣＲ−ＬＰＬＡＴ５とした。このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化して得られた約１．６ｋのＤＮＡ断片を、酵母発現用ベクターｐＹＥ２２ｍ（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989）のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩサイトに挿入し、プラスミドｐＹＥ−ＭＡＬＰＬＡＴ５を構築した。【０１４５】
一方、ｐＢＬＰＬＡＴ６を制限酵素ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化し、得られた１．９ｋｂのＤＮＡ断片を酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩサイトに挿入し、プラスミドｐＹＥ−ＬＰＬＡＴ６を構築した。【０１４６】
アラキドン酸生産酵母での発現
（１）アラキドン酸生産酵母の育種
アラキドン酸生産酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を育種するために、以下のプラスミドを構築した。【０１４７】
まず、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株から調製したｃＤＮＡを鋳型として、Δ１２−ｆとΔ１２−ｒ、Δ６−ｆとΔ６−ｒ、ＧＬＥＬＯ−ｆとＧＬＥＬＯ−ｒ又はΔ５−ｆとΔ５−ｒといった、プライマーの組み合わせでＥｘＴａｑを用いてＰＣＲを行い、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株のΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＧＬＥＬＯ脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子及びΔ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を増幅した。
Δ１２−ｆ：ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＴＴＧ
（配列番号１７）
Δ１２−ｒ：ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣＡＣＧＴＣ
（配列番号１８）
Δ６−ｆ：ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧ
（配列番号１９）
Δ６−ｒ：ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧ
（配列番号２０）
ＧＬＥＬＯ−ｆ：ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＴＧＣＧＣＡＡＴＴＣＣ
（配列番号２１）
ＧＬＥＬＯ−ｒ：ＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣ
（配列番号２２）
Δ５−ｆ：ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣ
（配列番号２３）
Δ５−ｒ：ＡＡＧＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＣＣ
（配列番号２４）
これらをＴＯＰＯ−ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇＫｉｔによりクローン化した。塩基配列を確認し、それぞれの塩基配列を含むクローンをそれぞれプラスミドｐＣＲ−ＭＡΔ１２ＤＳ（配列番号２５の塩基配列を含む）、ｐＣＲ−ＭＡΔ６ＤＳ（配列番号２６の塩基配列を含む）、ｐＣＲ−ＭＡＧＬＥＬＯ（配列番号２７の塩基配列を含む）、ｐＣＲ−ＭＡΔ５ＤＳ（配列番号２８の塩基配列を含む）とした。【０１４８】
一方、プラスミドｐＵＲＡ３４（特開２００１−１２０２７６号公報）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片を、ベクターｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｐｈＩで消化したあと末端を平滑化し、セルフライゲーションして得られたベクターのＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ベクターのＥｃｏＲＩサイト側がＵＲＡ３の５’側であるクローンをｐＵＣ−ＵＲＡ３とした。また、ＹＥｐ１３を制限酵素ＳａｌＩとＸｈｏＩで消化して得られた約２．２ｋｂのＤＮＡ断片をベクターｐＵＣ１８のＳａｌＩサイトに挿入し、ベクターのＥｃｏＲＩ側がＬＥＵ２の５’側であるクローンをｐＵＣ−ＬＥＵ２とした。【０１４９】
次に、プラスミドｐＣＲ−ＭＡΔ１２ＤＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素ＸｂａＩで消化して得られた約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を制限酵素ＳａｃＩで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素ＳｐｅＩで消化した約６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＥＳＣ−Ｕ−Δ１２を得た。プラスミドｐＣＲ−ＭＡΔ６ＤＳを制限酵素ＸｂａＩで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＥＳＣ−Ｕ−Δ１２を制限酵素ＳａｌＩで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した約８ｋｂｐのＤＮＡ断片と連結し、プラスミドｐＥＳＣ−Ｕ−Δ１２：Δ６を得た。これを制限酵素ＰｖｕＩＩで部分消化して得られた約４．２ｋｂの断片をｐＵＣ−ＵＲＡ３のＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ−Δ１２：Δ６を得た。【０１５０】
また、プラスミドｐＣＲ−ＭＡＧＬＥＬＯを制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで消化して得られた約０．９５ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩで消化して得られた約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片と連結し、プラスミドｐＥＳＣ−Ｌ−ＧＬＥＬＯを得た。プラスミドｐＣＲ−ＭＡΔ５ＤＳを制限酵素ＸｂａＩで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片とプラスミドｐＥＳＣ−Ｌ−ＧＬＥＬＯを制限酵素ＡｐａＩで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約８．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結して、プラスミドｐＥＳＣ−Ｌ−ＧＬＥＬＯ：Δ５を得た。これを制限酵素ＰｖｕＩＩで消化して得られた約３．２ｋｂ断片をｐＵＣ−ＬＥＵ２のＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドｐＵＣ−ＬＥＵ−ＧＬＥＬＯ：Δ５を得た。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹＰＨ４９９株（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）をプラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ−Δ１２：Δ６とプラスミドｐＵＣ−ＬＥＵ−ＧＬＥＬＯ：Δ５でｃｏ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎした。形質転換株は、ＳＣ−Ｌｅｕ，Ｕｒａ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。こうして得られた株のうち、任意の一株をＡＲＡ３−１株とした。この株は、ガラクトースを含む培地で培養することにより、ＧＡＬ１／１０プロモーターからΔ１２脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、ＧＬＥＬＯ脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現することによって、アラキドン酸を生産することができる。【０１５１】
（２）アラキドン酸生産酵母の形質転換
ＡＲＡ３−１株をプラスミドｐＹＥ２２ｍ、ｐＹＥ−ＭＡＬＰＬＡＴ５、ｐＹＥ−ＭＡＬＰＬＡＴ６でそれぞれ形質転換した。形質転換株は、ＳＣ−Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｕｒａ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。
それぞれのプラスミド導入株の中から任意の３株を以下の培養に使用した。以下の表３−８において、コントロールとはプラスミドｐＹＥ２２ｍで形質転換された株をいい、ＬＰＬＡＴ５はプラスミドｐＹＥ−ＭＡＬＰＬＡＴ５で形質転換された株をいい、ＬＰＬＡＴ６はプラスミドｐＹＥ−ＭＡＬＰＬＡＴ６で形質転換された株をいう。【０１５２】
（３）脂肪酸無添加培地での培養
上記形質転換株をＳＣ−Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｕｒａ液体培地１０ｍｌで３０℃、１日間振とう培養し、そのうち１ｍｌをＳＧ−Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｕｒａ（１Ｌあたり、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗ／ｏ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  （ＤＩＦＣＯ）６．７ｇ、ガラクトース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇを混合したもの）１．３ｇ）液体培地１０ｍｌで１５℃、６日間振とう培養した。集菌し、水洗した後、凍結乾燥し、菌体の脂肪酸分析を行った。
結果を表３に示す。【０１５３】
【表３】
0005539961.tif 000004
【０１５４】
さらに、表３の結果をもとに、アラキドン酸生成経路においてある脂肪酸が次の脂肪酸に変換されたかを求めた。たとえば、１８：２→１８：３（ｎ−６）の変換率を求める場合、
変換率＝（18：3(ｎ-6)+DGLA+ARA）/（18：2+18：3(ｎ-6)+DGLA+ARA）ｘ100
となる。
結果を表４に示す。【０１５５】
【表４】
0005539961.tif 000005
【０１５６】
表３及び表４に示したとおり、総脂肪酸に占めるアラキドン酸の比率がコントロールに比べて、ＬＰＬＡＴ５発現株では１．５倍、ＬＰＬＡＴ６発現株では２．３倍上昇した。また、アラキドン酸生合成経路における脂肪酸の変換率をみると、ＬＰＬＡＴ５発現株では、１８：１→１８：２、１８：３（ｎ−６）→ＤＧＬＡ、ＤＧＬＡ→ＡＲＡの変換率が上昇しており、ＬＰＬＡＴ６発現株では、ＤＧＬＡ→ＡＲＡの変換率が顕著に上昇していた。これらの変換には、図１で示したとおり、アシル基のアシル−ＣｏＡからリン脂質への転移、あるいはリン脂質からＣｏＡへの転移が必要であり、ＬＰＬＡＴ５及びＬＰＬＡＴ６が、これに関与していることが示唆された。【０１５７】
（４）リノール酸添加培地での培養
上記形質転換株を、ＳＣ−Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｕｒａ液体培地１０ｍｌで３０℃、１日間振とう培養し、そのうち１ｍｌを、５ｍｇ／ｍｌリノール酸及び０．１％トリトンＸ−１００を含むＳＧ−Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｕｒａ液体培地１０ｍｌに植菌し、１５℃、６日間振とう培養した。集菌し、水洗した後、凍結乾燥し、菌体の脂肪酸分析を行った。結果を表５に示す。【０１５８】
【表５】
0005539961.tif 000006
【０１５９】
さらに、表５の結果をもとにアラキドン酸生成経路においてある脂肪酸が次の脂肪酸に変換されたかを求めた。表６に結果を示す。【０１６０】
【表６】
0005539961.tif 000007
【０１６１】
表５に示したとおり、総脂肪酸に占めるアラキドン酸の比率がコントロールに比べて、ＬＰＬＡＴ５発現株では２倍、ＬＰＬＡＴ６発現株では３．５倍上昇した。また、ＬＰＬＡＴ５発現株では、添加したリノール酸の比率がコントロールに比べて上昇していた。アラキドン酸生合成経路における脂肪酸の変換率をみると（表６）、ＬＰＬＡＴ５発現株、ＬＰＬＡＴ６発現株ともに１８：３（ｎ−６）→ＤＧＬＡ、ＤＧＬＡ→ＡＲＡの変換率が上昇しており、特にＬＰＬＡＴ６発現株で顕著に上昇していた。【０１６２】
（５）γ−リノレン酸添加培地での培養
上記形質転換株を、ＳＣ−Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｕｒａ液体培地１０ｍｌで３０℃、１日間振とう培養し、そのうち１ｍｌを、５ｍｇ／ｍｌ  γ−リノレン酸及び０．１％トリトンＸ−１００を含むＳＧ−Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｕｒａ液体培地１０ｍｌに植菌し、１５℃、６日間振とう培養した。集菌し、水洗した後、凍結乾燥し、菌体の脂肪酸分析を行った。結果を表７に示す。【０１６３】
【表７】
0005539961.tif 000008
【０１６４】
さらに、表７の結果をもとに、アラキドン酸生成経路においてある脂肪酸が次の脂肪酸に変換されたかを求めた（表８）。【０１６５】
【表８】
0005539961.tif 000009
【０１６６】
表７に示したとおり、ＬＰＬＡＴ５発現株では添加したγ−リノレン酸の総脂肪酸に占める割合が上昇していた。しかし、その下流の生成物であるジホモ−γ−リノレン酸やアラキドン酸の割合は上昇しなかった（表８）。一方、ＬＰＬＡＴ６発現株ではアラキドン酸の総脂肪酸に占める割合がコントロールに比べて２．８倍上昇し、ＤＧＬＡ→ＡＲＡの変換率が顕著に上昇した（表８）。【０１６７】
以上のように、ＬＰＬＡＴ５及びＬＰＬＡＴ６は、アシル基のアシル−ＣｏＡからリン脂質への転移、あるいはリン脂質からＣｏＡへの転移が必要な脂肪酸の変換率を上昇させることができる。ＬＰＬＡＴ５は、１８：１−ＣｏＡから１８：１−ＰＬへの変換、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及びＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与していることが示唆された。一方、ＬＰＬＡＴ６は、１８：３（ｎ−６）−ＰＬから１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡへの変換及びＤＧＬＡ−ＣｏＡからＤＧＬＡ−ＰＬへの変換に関与していることが示唆された。【０１６８】
〔実施例３〕  ＬＰＬＡＴ６のＭ．ａｌｐｉｎａでの機能解析
モルティエレラ発現ベクターの構築
アダプターとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
Ａ−１：ＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡ  （配列番号２９）
Ａ−２：ＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧ  （配列番号３０）
Ａ−１とＡ−２をアニーリングし、プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したものと連結して、ｐＵＣ１８−Ｒを構築した。【０１６９】
Ｍ．ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４株より調製したゲノムＤＮＡ、あるいはプラスミドを鋳型として、以下のプライマーの組み合わせで、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いて、ＰＣＲによりそれぞれのＤＮＡ断片を増幅し、TOPO-TAcloning Kit（Invitrogen）を用いてクローン化した。【０１７０】
具体的には、ゲノムＤＮＡを鋳型として、
プライマーＵＲＡ５ｇ−Ｆ１：ＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＡＧＴＴＴＧＣ  （配列番号３１）、および
プライマーＵＲＡ５ｇ−Ｒ１：ＧＴＣＧＡＣＴＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＡＣＧ  （配列番号３２）
の組み合わせで、ＵＲＡ５遺伝子を含むゲノムＤＮＡ、約２ｋｂｐを増幅し；
プライマーＧＡＰＤＨｐ−Ｆ１：ＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＡＣＧＴＣＧＧＧＴＧＡＴＧＡＧＴＴＧ  （配列番号３３）、および
プライマーＧＡＰＤＨｐ−Ｒ１：ＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＴＧ  （配列番号３４）
の組み合わせで、ＧＡＰＤＨプロモーター、約０．９ｋｂｐを増幅し；
プライマーＧＡＰＤＨｔ−Ｆ１：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＡＧＴＧＡＡＴＣＧＣ  （配列番号３５）、および
プライマーＧＡＰＤＨｔ−Ｒ１：ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣ  （配列番号３６）
の組み合わせで、ＧＡＰＤＨターミネーター、約０．５ｋｂｐを増幅した。
また、プラスミドｐＢ−ＬＰＬＡＴ６を鋳型として、
プライマーＸｂａＩ−ＬＰＬＡＴ６−Ｆ１：ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＡＣＣＡＧＧ  （配列番号３７）、および
プライマーＮｏｔＩ−ＬＰＬＡＴ６−Ｒ１：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＴＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧ  （配列番号３８）
の組み合わせで、ＬＰＬＡＴ６遺伝子ＣＤＳ、約１．６ｋｂｐを増幅し；
プライマーＥｃｏＲＶ−ＬＰＬＡＴ６−Ｆ２：ＧＡＴＡＴＣＧＧＧＴＡＡＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＡＣＧ  （配列番号３９）、および
プライマーＸｂａＩ−ＬＰＬＡＴ６−Ｒ２：ＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＣＡＧＴＣＴＴＧＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＧ  （配列番号４０）
の組み合わせで、ＬＰＬＡＴ６遺伝子ＣＤＳ  ３’側  約０．７ｋｂｐを増幅した。
さらに、プラスミドｐＣＲ−ＭＡΔ５ＤＳを鋳型として、
プライマーＸｂａＩ−Δ５ＤＳ−Ｆ１：ＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＧＴＧＣＧＧＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＡＣ  （配列番号４１）、および
プライマーＮｏｔＩ−Δ５ＤＳ−Ｒ１：ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧ  （配列番号４２）
の組み合わせで、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＣＤＳ、約１．３ｋｂｐを増幅し；
プライマーＮｄｅＩ−Δ５ＤＳ−Ｒ２：ＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣＧＡＡＧ  （配列番号４３）、および
プライマーＸｂａＩ−Δ５ＤＳ−Ｆ２：ＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＧ  （配列番号４４）
の組み合わせで、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＣＤＳ  ３’側  約０．５ｋｂｐを増幅した。【０１７１】
プラスミドｐＵＣ１８−Ｒの制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに、ＧＡＰＤＨターミネーターを同じ制限酵素で切り出した断片を挿入し、プラスミドｐＵＣ−ＧＡＰＤＨｔを構築した。続いて、プラスミドｐＵＣ−ＧＡＰＤＨｔを制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで切断し、ＧＡＰＤＨプロモーターを同じ制限酵素で切り出した断片を挿入し、プラスミドｐＵＣ−ＧＡＰＤＨｐｔを構築した。プラスミドｐＵＣ−ＧＡＰＤＨｐｔを制限酵素ＳａｌＩで切断し、ＵＲＡ５遺伝子を含むゲノムＤＮＡを同じ制限酵素で切断した断片を挿入した。挿入された向きを確認し、ＵＲＡ５遺伝子の向きが、ベクターの制限酵素サイトＥｃｏＲＩ→ＨｉｎｄＩＩＩと同じ向きに挿入されているものをプラスミドｐＤＵｒａＲＳＣとした。【０１７２】
プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣを制限酵素ＸｂａＩとＮｏｔＩで切断し、ＬＰＬＡＴ６遺伝子ＣＤＳを同じ制限酵素で切り出したＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−ＬＰＬＡＴ６とした。プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−ＬＰＬＡＴ６を制限酵素ＥｃｏＲＶとＸｂａＩで切断して得られた約７ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ＬＰＬＡＴ６遺伝子ＣＤＳ  ３’側  約０．７ｋｂｐを同じ制限酵素で切り出したＤＮＡ断片を連結し、プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−ＬＰＬＡＴ６−ＲＮＡｉを構築した。【０１７３】
Δ５ＤＳ発現抑制（ＲＮＡｉ）ベクターの構築
プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣを制限酵素ＸｂａＩとＮｏｔＩで切断し、Δ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＣＤＳを同じ制限酵素で切り出したＤＮＡ断片を挿入し、プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−Δ５ＤＳを構築した。プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−Δ５ＤＳを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｄｅＩで切断して得られた約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片と、制限酵素ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断して得られた約５．５ｋｂｐのＤＮＡ断片、さらにΔ５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子ＣＤＳ  ３’側  約０．５ｋｂｐを制限酵素ＮｄｅＩとＸｂａＩで切り出したものを連結し、プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−Δ５ＤＳ−ＲＮＡｉを構築した。【０１７４】
Ｍ．ａｌｐｉｎａ形質転換株の取得
プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−ＬＰＬＡＴ６−ＲＮＡｉまたはプラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−Δ５ＤＳ−ＲＮＡｉで、Ｍ．ａｌｐｉｎａより特許文献（ＷＯ２００５／０１９４３７「脂質生産菌の育種方法」）方法にしたがって誘導したウラシル要求性株Δｕｒａ−３を宿主として、パーティクルデリバリー法で形質転換を行った。形質転換株の選択には、ＳＣ寒天培地（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate（Difco）０．５％、硫酸アンモニウム０．１７％、グルコース２％、アデニン０．００２％、チロシン０．００３％、メチオニン０．０００１％、アルギニン０．０００２％、ヒスチジン０．０００２％、リジン０．０００４％、トリプトファン０．０００４％、スレオニン０．０００５％、イソロイシン０．０００６％、ロイシン０．０００６％、フェニルアラニン０．０００６％、寒天２％）を用いた。【０１７５】
Ｍ．ａｌｐｉｎａ形質転換株の評価
各プラスミドにより形質転換して得られた約５０株ずつを、ＧＹ培地（グルコース２％、酵母エキス１％、ｐＨ６．０）４ｍｌに植菌し、２８℃で４日間振とう培養した。培養終了後、菌体をろ過により回収し、凍結乾燥した。乾燥菌体の一部（約１０−２０ｍｇ程度）をとり、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行い、脂肪酸分析を行った。それぞれのプラスミドで形質転換した株のうち、ジホモ−γ−リノレン酸の組成比がアラキドン酸の組成比を上回る株、ＬＰＬＡＴ６−Ｄ＃６（プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−ＬＰＬＡＴ６−ＲＮＡｉにより形質転換）とΔ５ＤＳ−Ｄ＃４５（プラスミドｐＤＵｒａＲＳＣ−Δ５ＤＳ−ＲＮＡｉにより形質転換）をそれぞれ選抜した。【０１７６】
これら２株と、コントロール（野生株であるＭ．ａｌｐｉｎａ  １Ｓ−４株）を、ＧＹ培地４ｍｌ、２８℃で４日間振とう培養した。培養終了後、菌体をろ過により回収し、凍結乾燥した。乾燥菌体の一部（約１０−２０ｍｇ程度）をとり、物理的に細かく砕いた。クロロホルム：メタノール（２：１）４ｍｌを添加し、時々撹拌しながら、７０℃で１時間保持したあと、遠心分離して上清を回収した。残った菌体に、さらにクロロホルム：メタノール（２：１）４ｍｌを添加し、時々撹拌しながら、７０℃で１時間保持したあと、遠心分離して上清を先の上清とあわせて回収した。スピードバック遠心濃縮装置により、脂質を乾固させ、５ｍｌのクロロホルムに溶解した。このうち、１ｍｌを上記と同様に乾固させ、塩酸メタノール法により脂肪酸をメチルエステルに誘導し、脂肪酸分析を行った。一方、クロロホルムに溶解したうちの、２ｍｌも上記と同様に乾固させ、少量のクロロホルムに溶解し、全量を以下の薄層クロマトグラフィーに供した。すなわち、シリカゲル６０  プレート（メルク）、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸７０：３０：１の条件で薄層クロマトグラフィーを行い、脂質を分画した。０．０１５％プリムリン、８０％アセトン水溶液（プリムリン溶液）を噴霧し、ＵＶ照射により脂質を可視化して、トリアシルグリセロール（ＴＧ）画分およびリン脂質（ＰＬ）画分に鉛筆でしるしをつけ、シリカゲルをそれぞれかきとって試験管に集めた。塩酸メタノール法により、脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸分析した。すなわち、ジクロロメタン  １ｍｌ、１０％塩酸メタノール  ２ｍｌを加え、５０℃で３時間反応させ、脂肪酸をメチルエステルに誘導した。つづいて、ヘキサン４ｍｌ、水１ｍｌを添加し、激しく撹拌した後、遠心分離し、上層を分取した。スピードバックで溶媒を留去し、アセトニトリルに溶解してガスクロマトグラフィーに供し、脂肪酸分析を行った。結果を図６−８に示す。【０１７７】
図６は、クロロホルム：メタノール（２：１）で抽出された全脂質中の高度不飽和脂肪酸の組成比を示す。コントロールでは、アラキドン酸が多いのに対して、ＬＰＬＡＴ６−Ｄ＃６株とΔ５ＤＳ−Ｄ＃４５株では、ジホモ−γ−リノレン酸からアラキドン酸への変換が抑制されるため、ジホモ−γ−リノレン酸とアラキドン酸の比率は同程度であった。図７に、菌体内の脂質の大部分を占めるトリアシルグリセロール中の高度不飽和脂肪酸組成比を示した。菌体内全脂質同様、コントロールに比べて、ＬＰＬＡＴ６−Ｄ＃６株とΔ５ＤＳ−Ｄ＃４５株ではジホモ−γ−リノレン酸の組成比が高くなっていた。一方、図８に示したリン脂質画分では、ＬＰＬＡＴ６−Ｄ＃６株とΔ５ＤＳ−Ｄ＃４５株の脂肪酸組成は大きく異なっていた。すなわち、Δ５ＤＳ−Ｄ＃４５株では、ジホモ−γ−リノレン酸の比率が高いのに対し、ＬＰＬＡＴ６−Ｄ＃６株では、コントロールには及ばないもののアラキドン酸の比率が高く、更に、コントロールやΔ５ＤＳ−Ｄ＃４５株に比べてγ−リノレン酸の比率も高くなっていた。【０１７８】
Ｍ．ａｌｐｉｎａ内でのアラキドン酸の生合成経路は、図１のように推定されている。上記の実験からも、Δ５脂肪酸不飽和化酵素は、ＤＧＬＡ−ＰＬに作用し、アラキドン酸を生成することが強く示唆された。一方、ＬＰＬＡＴ６発現抑制株では、１８：３（ｎ−６）−ＰＬが蓄積した。また、ＴＧ画分のＤＧＬＡ比率は上昇するもののＰＬ画分ではＤＧＬＡ比率の顕著な上昇は見られなかった。これらのことから、ＬＰＬＡＴ６はＭ．ａｌｐｉｎａ内において、１８：３（ｎ−６）−ＰＬの１８：３（ｎ−６）−ＣｏＡの変換とＤＧＬＡ−ＣｏＡのＤＧＬＡ−ＰＬへの変換を担っていることが強く示唆された。
【配列表フリーテキスト】
【０１７９】
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：プライマー
配列番号２３：プライマー
配列番号２４：プライマー
配列番号２９：アダプター  Ａ−１
配列番号３０：アダプター  Ａ−２
配列番号３１：プライマー  ＵＲＡ５ｇ−Ｆ１
配列番号３２：プライマー  ＵＲＡ５ｇ−Ｒ１
配列番号３３：プライマー  ＧＡＰＤＨｐ−Ｆ１
配列番号３４：プライマー  ＧＡＰＤＨｐ−Ｒ１
配列番号３５：プライマー  ＧＡＰＤＨｔ−Ｆ１
配列番号３６：プライマー  ＧＡＰＤＨｔ−Ｒ１
配列番号３７：プライマー  ＸｂａＩ−ＬＰＬＡＴ６−Ｆ１
配列番号３８：プライマー  ＮｏｔＩ−ＬＰＬＡＴ６−Ｒ１
配列番号３９：プライマー  ＥｃｏＲＶ−ＬＰＬＡＴ６−Ｆ２
配列番号４０：プライマー  ＸｂａＩ−ＬＰＬＡＴ６−Ｒ２
配列番号４１：プライマー  ＸｂａＩ−Δ５ＤＳ−Ｆ１
配列番号４２：プライマー  ＮｏｔＩ−Δ５ＤＳ−Ｒ１
配列番号４３：プライマー  ＮｄｅＩ−Δ５ＤＳ−Ｆ１
配列番号４４：プライマー  ＸｂａＩ−Δ５ＤＳ−Ｒ１
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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