(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染に起因する疾患から動物を保護するために、動物に細菌ロドコッカス・エクイに対する免疫応答を誘発する動物経直腸投与用組成物を製造するためのロドコッカス・エクイ抗原の使用。
【請求項２】
抗原が生菌のロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
組成物が少なくとも用量当たり１ｘ１０７ないし１ｘ１０１０ＣＦＵの弱毒化生菌を含むことを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
組成物が用量当たり１ｘ１０９ないし１ｘ１０１０ＣＦＵの細菌を含むことを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
組成物がプライム投与後に免疫応答を誘発することを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
組成物が離乳していない子馬向けの投与用であることを特徴とする請求項１ないし５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染に起因する疾患から動物を保護するために、動物に細菌ロドコッカス・エクイに対する免疫応答を誘発する、ロドコッカス・エクイ抗原を含む動物経直腸投与用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染から動物（用語「動物」にはヒトを含む）を保護する組成物用の新規な投与経路に関する。ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）（従前、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｉｕｍ属として知られていた）は、子馬の肺炎を引き起こすおそれがあり、免疫不全状態の被験者、特にエイズ患者における日和見感染にも関連する。
【背景技術】
【０００２】
細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染に起因する疾患から被験動物を保護するための組成物は、過去数年間に利用可能となった。当該組成物に対しては、例えば気管内投与、非経口投与および経口投与等の種々の投与経路が記載されている。気管内投与は良好な結果をもたらすかもしれないが、気管内に直接ワクチンを投与することが比較的に厄介であるという不利益がある。非経口投与は、特に人または馬をロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染から保護する予定のときには、しばしば重篤な膿瘍を起こし、従って好ましくない。従って経口投与が数十年来好ましい投与経路であったが（例えば、Ｊ．Ｍ．  Ｃｈｉｒｉｎｏ−Ｔｒｅｊｏ  ｅｔ  ａｌ；Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７，５１（４），ｐｐ．４４４−４４７）、保護の成功レベルは様々である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、免疫応答をすばやく発現させ病原性細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染に対する適切な保護を引き起こし、動物に細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する免疫応答を誘発する組成物用の簡便な投与経路を見出すことである。直腸内投与により本目的が達成されることが見出された。驚くべきことに、当該組成物の直腸内投与は、経口投与と比較して非常にすばやい免疫応答の発現を引き起こし、そしてまた適切な保護へと導く。より重要なことに直腸内ワクチン接種は、誘導免疫応答において全くまたは少なくとも顕著な変動へ導かないことが証明された。既存技術の投与法と比較すると、特に広く使用されている経口投与法と比較すると、これは非常に重要な改良である。経口または直腸内投与後の免疫応答の差異の理由は明らかではない。既存技術の知識に基づけば、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する経口および直腸内ワクチン接種を評価するとき、だれでも同等の免疫応答を期待するだろう。いずれにせよ、宿主動物における病原性微生物との干渉へと導く適切な免疫応答のすばやい誘導によって、感染またはそれにより生じた疾病の臨床徴候は、少なくとも減少するであろうし、あるいは完全に防止することができる。また疾病のそれ以上の環境内への拡散も停止または減少されるかもしれない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、動物に細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する免疫応答を誘発する動物投与用組成物を製造するために使用することができる。必要とされるロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）抗原は、細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に直接由来する任意の抗原性物質、または人工的に作成された抗原性物質（例えば、組換え抗原または物理化学的製造方法によって作成された抗原等）であってよい。当該抗原は、例えば、細菌細胞の外表面由来（莢膜抗原）または細胞内部由来（菌体抗原すなわちＯ抗原）のタンパク質または多糖類等の細菌サブユニットであってよい。当該抗原は、分泌産物、死菌（全体）または生菌、好ましくは弱毒化細菌であってもよい。弱毒化細菌は、そのカウンターパートの病原性（しばしば野生型）細菌に通常付随する疾病の完全な症状を誘導することができない。弱毒化細菌は宿主において低下した生存能力を示し、一又は複数の病原性遺伝において一又は複数の変異を有しているのかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、ワクチン接種された動物についての血清力価と肺障害スコアの間の相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明を適用するためには、本組成物は直腸内投与に適した剤型であったほうがよい。当該剤型は、液剤（例えば、水または他の薬学的に許容可能な液体または混合液体剤）、ペースト剤（例えば、イベルメクチン等の駆虫性分子の投与用として既知）、ゲル剤、坐剤、スプレー剤（例えば套管経由での投与）、急速崩壊錠剤（例えば、ＵＳ５，３８４，１２４により特定された既知のＦａｒｍａｌｙｏｃ）または任意の他の適した剤型であってよい。
【０００７】
一般的に、本発明に使用するための組成物は、基本的に抗原（または抗原を含有する構成物）を薬学的に許容可能な担体に混合することを含む、技術的に既知の方法を使用して製造することができる。用途または要求されるワクチン特性に依存して他の物質、例えば、アジュバント、安定剤、粘度調整剤又は他の成分等（例えば、他の微生物、特にＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ、Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｓｐｐ又は消化管に感染する他の病原菌等由来の抗原等）が添加されてもよい。
【０００８】
本発明の適用のためには、抗原は生菌のロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）を含むのが好ましい。一実施態様において本組成物は、少なくとも用量当たり１ｘ１０７ないし１ｘ１０１０ＣＦＵ（コロニー形成単位）、好ましくは１ｘ１０９ないし１ｘ１０１０ＣＦＵの弱毒化細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）を含む。好ましくは、本組成物は単独のプライム投与後に適切な免疫応答を誘発する。
【０００９】
本発明は離乳していない子馬の治療に適している。当該子馬はロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に非常に感染し易い動物群である。感染した動物の多くは死亡し、一方生存した動物は永久に肺気量を失ってしまう。
【００１０】
また本発明は、動物に細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する免疫応答を誘発する動物投与用のロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）抗原を含む組成物にも関連し、当該組成物は直腸内投与に適した剤型である。また本発明は、細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染に起因する疾患から動物を保護するための方法にも関連し、当該方法にはロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）抗原を含有する組成物の直腸内投与が含まれる。本発明における「保護（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）」とは、疾病または疾患の防止、寛解または治療を手助けすることを意味し、当該疾病または疾患とは本発明に関連しては病原性細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染に付随する疾病または疾患である。
【００１１】
本発明を以下の実施例に基づいて説明する。
【００１２】
実施例１では、被験動物へ投与されると細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する免疫応答を誘発するいくつかの組成物について記述する。
【００１３】
実施例２では、高い抗体力価が細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）感染に対する保護に対応することを示す。
【００１４】
実施例３では、直腸内投与が経口投与よりも顕著に良好な結果をもたらすことを示す。
【００１５】
実施例４では、直腸内ワクチン接種に関する追加の結果を示す。
【００１６】
［実施例］
【実施例１】
【００１７】
細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する免疫応答を誘発する組成物は一般に当該技術分野で知られている。Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶに帰属する欧州特許出願第０９１５０３７９．７号（２００９年１月１２日出願）において、異なる三の変異細菌株が記載されている（特に「本発明による菌株」の項目下の「Ｂ１使用菌株」を参照）：菌株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ、菌株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢ−ＡＤ＋および菌株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２。当該菌株の各々に関し、当該菌株を薬学的に許容可能な担体と混合することよって細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する免疫応答を誘発する組成物を作成する。当該担体は、例えば、Ｎｏｂｉｖａｃ（登録商標）希釈剤（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ（Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダ）から入手可能）、アルギン酸ゲルまたはＰｒｏｎｕｔｒｉｎ懸濁液（Ｐｒｏｎｕｔｒｉｎは顆粒形状でＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（ドイツ）から入手可能）であってよい。
【００１８】
このようにして、Ｎｏｂｉｖａｃ希釈剤（「Ａ」型）、アルギン酸ゲル（「Ｂ」型）またはＰｒｏｎｕｔｒｉｎ懸濁液（「Ｃ」型）中に菌株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢおよびＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２を含む組成物を作成した。
【００１９】
Ａ型の組成物は、生菌を希釈剤と混合して作成した。
【００２０】
Ｂ型の組成物は、アルギン酸ゲル混合液７５ｍｌとなるようＡ型の組成物９ｍｌをアルギン酸ゲル６６ｍｌ（０．０４Ｍリン酸緩衝食塩水の５％ｗ／ｗアルギン酸ナトリウム溶液）と混合し作成した。
【００２１】
Ｃ型の組成物は、最初にＰｒｏｎｕｔｒｉｎ１４グラムを水４２．５ｍｌと混合して作成した（混合液Ａ）。これに続いて、生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）１．５ｍｌとＡ型組成物６ｍｌを含む混合液Ｂを作成した。投与直前に混合液ＡとＢを混合し、次にＨｏｒｓｅｆｏｏｄ「電解液混合物」（Ｖａｎ  Ｇｏｒｐ  Ｄｉｅｒｖｏｅｄｅｒｓ（Ｗａａｌｗｉｊｋ、オランダ）から入手可能）４グラムを添加した。このようにしてＣ型の組成物を得た。
【実施例２】
【００２２】
試験設計
試験には子馬４６頭を使用した。子馬１１頭（群１）に経口で２回（２週間隔）、用量当たり菌株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢの５ｘ１０７〜５ｘ１０９の菌数を含有する組成物Ａ１ｍｌをワクチン接種した（子馬４頭の用量は５ｘ１０７のＣＦＵ、他の子馬３頭の用量は５ｘ１０８、および残りの子馬４頭の用量は５ｘ１０９のＣＦＵであった）。子馬８頭に経口で２回（２週間隔）、用量当たり菌株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２の１ｘ１０７の菌数を含有する組成物Ａ１ｍｌをワクチン接種した（群２）。子馬８頭に経口で１回、同様の用量を含有する組成物Ａ１ｍｌをワクチン接種した（群３）。子馬３頭に経胃で１回（２週間隔）、用量当たり菌株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢの１ｘ１０１０の菌数を含有する組成物Ａ１００ｍｌをワクチン接種した（群４）。
【００２３】
子馬１６頭は対照群としてワクチン未接種とした。再投与ワクチン接種後２週目または単回投与ワクチン接種後３週目に、ｍｌ当たり４ｘ１０４ＣＦＵの細菌を含有するＰＢＳ１００ｍｌを投与することによってＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｉの強毒性菌株により子馬４６頭全頭を気管内に抗原投与した。抗原投与後３週間にわたり子馬を臨床的に評価した。
【００２４】
子馬は、最初のワクチン接種日、抗原投与日および死体解剖日に体重を測定した。抗体力価を測定するために、各ワクチン接種日、抗原投与日および死体解剖日に血清を採取した。抗原投与後３週目（または臨床徴候が重篤な場合はより早い時期）に子馬の体重を測定し安楽死させ、肺および呼吸器のリンパ節に特別の注意を払って全ての検死解剖を実施した。肺と体重の比を算出するために肺の重量を測定した。細菌検査および菌数測定のために、全ての肺葉由来の組織試料を採取した。死体解剖の間に見出された全ての異常から、微生物学および組織学用の追加の試料を採取した。
【００２５】
結果および考察
肺障害スコアは、欧州特許出願第０９１５０３７９．７号の表７に関連する記載を基礎として用いた。抗原投与日の血清は、ＥＬＩＳＡ試験により細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する抗体を検査した。対照群は全て抗体力価が低いか陰性であった。
【００２６】
特筆すべき効果は次の通りであった。群１において、子馬１１頭中の５頭が、病原性ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）による抗原投与に対し保護された（その肺障害スコアは５０以下であった）。子馬６頭は保護されず、軽度ないし重篤な肺炎にかかった（肺障害スコア約１００から３５０）。本群では用量と応答の間に相関関係はなかった。群２と３を併せた群では、群２の子馬２頭および群３の子馬２頭の子馬４頭が保護された。当該二群の子馬１２頭は肺炎に罹患した。群４の子馬３頭の全ては、保護されることが分かった。
【００２７】
図１に、ワクチン接種された動物についての血清力価と肺障害スコアの間の相関関係を示す。力価５以上（２進対数目盛上、すなわち２倍の段階希釈作）の血清抗体と経胃腸ワクチン接種後の病原性細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）による抗原投与に対する保護の間には１００％の相関関係があることが分かる。当該相関関係は、抗体が保護効果を与えることを必ずしも意味するものではない。おそらく保護効果は細胞免疫によって与えられるのかもしれず、同時に抗体力価は（抗原の経胃腸投与後に）誘導された細胞免疫レベルに一致するのかもしれない。
【００２８】
用量応答性を欠くことはもちろん保護された子馬が少ないことは、試験設計および得られた結果にもとづいては説明され得ない。おそらく用量、用量の容量、ワクチン接種方法もしくは構成、胃のｐＨ、他の未知の要因（例えば子馬の出血等）またはこれらの組み合せと関連するのであろう。しかし明確に確立されたことは、経胃腸ワクチン接種について５以上の力価の血清は、病原性ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）による抗原投与に対する適切な保護と互いに関係があるということである。
【実施例３】
【００２９】
本実施例においては、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）抗原を含有するいくつかの異なる組成物に関して、経口ワクチン接種と直腸内ワクチン接種との間の比較について記載する。このために、実施例１で述べた各々がロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）菌株ＲＥ１ΔｉｐｄＡＢｉｐｄＡＢ２を含有する、組成物Ａ、ＢおよびＣを使用した。
【００３０】
組成物Ａは直腸内ワクチン接種に使用した。各用量は、組成物３ｍｌ（１０１０ＣＦＵの細菌用量に相当）を含有した。組成物Ｂは経口ワクチン接種に使用した。各用量は、ゲル混合液２５ｍｌ（１０１０ＣＦＵの細菌用量に相当）を含んでいた。組成物Ｃも経口ワクチン接種に使用した。本組成物Ｃの各用量は、Ｐｒｏｎｕｔｒｉｎ懸濁液２５ｍｌ（１０１０ＣＦＵの細菌用量に相当）を含んでいた。
【００３１】
子馬２頭からなる第一の群は、組成物Ａによるプライムワクチン接種単独によって経直腸でワクチン接種した（群１）。子馬３頭からなる第二の群は、組成物Ａによるプライムおよびブーストワクチン接種（２週間隔）によって経直腸でワクチン接種した（群２）。子馬３頭からなる次の群は、組成物Ｂによるプライムおよびブーストワクチン接種によって経口的にワクチン接種した（群３）。最後に、子馬２頭からなる群は、組成物Ｃによるプライムおよびブーストワクチン接種（２週間隔）によって経口的にワクチン接種した。細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する力価は実施例２に即して測定した。結果（平均）を下記の表に示す。
【表１】
0005520389.tif 000002
【００３２】
驚くべきことには、プライムワクチン接種単独かまたは追加のブーストワクチン接種も受けたかにかかわらず、経直腸でワクチン接種された全ての子馬は、非常に急速に（第一のワクチン接種後１４日未満で）５．０以上の力価を発現させた。アルギン酸ゲルを接種した子馬も保護力価を発現させたが、これには約３週間を要した。最後の群は保護力価を発現させなかった。これに対する明確な解釈はないが、そのことはなぜ既存技術におけるロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する経口ワクチン接種がきまったように満足な結果を出さなかったかを説明しているかもしれない。４群間の唯一の本質的相違が投与経路であることを考えれば、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）抗原（すなわち細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する免疫応答を誘導する抗原）を含有する任意の組成物にとっては、経直腸でのワクチン接種がワクチン接種を受けた被験者において非常に適切な免疫応答を与えるであろうと結論されるかもしれない。
【実施例４】
【００３３】
本実施例においては、結果が一貫しているかどうかを確認し、１０倍低い用量でも適切な結果を与えるのかどうかを確認し、ならびにワクチン接種後の最初の１４日の間にどのように抗体力価が発現するのかをより詳細に確認するために、実施例３の試験を繰り返して行った。
【００３４】
実施例３に記載した通りの同じワクチンおよび試験設計を使用した。再度、経直腸でのワクチン接種については組成物Ａを使用した。子馬３頭からなる第一の群は、組成物Ａによる単独の単回のプライムワクチン接種によって、０日目に１０１０ＣＦＵの用量で経直腸でワクチン接種した（群１）。子馬３頭からなる第二の群は、組成物Ａによる０および１日目の２倍のプライムワクチン接種、各々１０１０ＣＦＵの用量でのワクチン接種、によって経直腸でワクチン接種した（群２）。子馬３頭からなる次の群は、組成物Ａによる単独の単回のプライムワクチン接種によって、０日目に１０９ＣＦＵの用量で経直腸でワクチン接種した（群３）細菌ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）に対する力価は実施例２に即して測定した。結果（平均）を下記の表に示す。
【表２】
0005520389.tif 000003
【００３５】
全てのグループにおいて、１４日以内または１０日以内でさえも保護力価が獲得されることが確認できる。経口ワクチン接種と比較すると、これは極めて急速かつ明確である（すなわち、免疫応答に顕著な変動がなく、全ての子馬はワクチン接種後１４日目に保護力価を有した）。２倍量のプライムワクチン接種を受けた群２においては、７日以内でさえも保護力価が獲得された。
【図１】
0005520389.tif 000004