(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列
Ｂ-Ｘ１-Ｘ２-Ｚ-Ｘ３-Ｘ４-Ａ
（上式中、Ｂは、ヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖であり、Ａはヒトインスリン又はそのアナログのＡ鎖であり、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＡｌａからなる群から選択され、真菌細胞内でのより効果的なＫｅｘ２切断を促進する２つのアミノ酸残基のペプチド配列であり、Ｘ２はＫｅｘ２切断部位であり、Ｚは１から３５のアミノ酸残基のペプチド配列又はペプチド結合であり、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合である）のヒトインスリン又はヒトインスリンアナログの前駆体をコードするＤＮＡ配列を含む真菌細胞を培養することにより、成熟したヒトインスリン又はそのアナログを作製する方法であって、
ヒトインスリンの前記アナログは、天然インスリン中の少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失及び／又は置換し、及び／又は天然インスリンに少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって得られる方法。
【請求項２】
Ｘ１のＮ末端アミノ酸残基がＬｅｕである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｚが、同一でも異なっていてもよい１から５のアミノ酸残基を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｚが、同一でも異なっていてもよい３−５のアミノ酸残基を有する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｘ１がカルボキシペプチダーゼによりＢ鎖から続いて切断されて、成熟したヒトインスリン又はそのアナログを生じる請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
カルボキシペプチダーゼが培養培地に添加される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
真菌細胞が酵母細胞である請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
配列
Ｂ-Ｘ１-Ｘ２-Ｚ-Ｘ３-Ｘ４-Ａ
（上式中、Ｂは、ヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖であり、Ａはヒトインスリン又はそのアナログのＡ鎖であり、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＡｌａからなる群から選択され、真菌細胞内でのより効果的なＫｅｘ２切断を促進する２つのアミノ酸残基のペプチド配列であり、Ｘ２はＫｅｘ２切断部位であり、Ｚは１から３５のアミノ酸残基のペプチド配列又はペプチド結合であり、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合である）を有するヒトインスリン又はヒトインスリンアナログの前駆体であって、
ここで、ヒトインスリンの前記アナログは、天然インスリン中の少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失及び／又は置換し、及び／又は天然インスリンに少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって得られる、前駆体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母中で成熟インスリン又はインスリンアナログを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、ランゲルハンス島のベータ細胞で生産されるポリペプチドホルモンである。活性なインスリン分子は、２つのジスルフィド架橋により結合しているＢ鎖及びＡ鎖からなる２本鎖分子である。インスリンは構造Ｂ-Ｃ-Ａの前駆体分子プロインスリンとして合成され、ここでＣペプチド鎖は、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸残基をＡ鎖のＮ末端アミノ酸残基と連結している。成熟２本鎖インスリンは、Ａ鎖とＢ鎖の接合部に位置する塩基性アミノ酸残基対においてＣペプチドをインビボ切断することにより形成される。Ａ鎖及びＢ鎖は、それぞれＡ７とＢ７及びＡ２０とＢ１９Ｃｙｓ残基の間の２つのジスルフィド架橋により、互いに保持されている。さらに、生物学的に活性なインスリン分子は、Ａ６及びＡ１１位にあるＣｙｓ残基の間に内部ジスルフィド架橋を有している。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術が開発された後、遺伝的に修飾された宿主細胞においてインスリン及びその前駆体を生成するための多くの方法が開示されている。大腸菌は、発現したポリペプチドを折り畳むための細胞機構を有しておらず、成熟インスリンにおいてＡ鎖及びＢ鎖を結合させるジスルフィド架橋を確立しないため、この方法は、多くのインビトロプロセシング工程、例えば再折り畳み中のジスルフィド架橋のインビトロでの確立、続くＣペプチドの切断を含む。
【０００４】
大腸菌と対照的に、真核生物は、折り畳み、及びジスルフィド架橋の確立に必要な機構を有しており、よって、遺伝的に改変された生物における成熟インスリンの生産のための、良好な候補であると思われる。インスリンを生産させるための、多くの酵母プロセスが開発されている。これらの方法のほとんどにおいて、天然のＣペプチド又は修飾されたＣペプチドのいずれかを有するインスリンの前駆体が発現され、酵母細胞から分泌される。国際公開第９５３５３８４号には、このような方法が開示されている。前駆体分子はインスリンＢ鎖のＮ末端伸長を有していてもよい。修飾されたＣペプチド及び場合によってはＢペプチドのＮ末端伸長は、酵母細胞中で切断されないように設計されており、よって前駆体は、単鎖ペプチドとして分泌され、ここでＡ鎖及びＢ鎖は修飾されたＣペプチドによりなお結合しているが、正しく位置したジスルフィド架橋を有する。ついで、成熟したインスリン又はインスリンアナログ生成物が、Ｃペプチド及び場合によってはＮ末端伸長の切断により、多くの後続するインビトロ酵素工程で得られる。これらの酵素工程には、多大な時間がかかり、費用がかかることが多く、高価なクロマトグラフィー工程等のさらなる下流プロセス工程で除去されなければならない不純物が入り込んでしまう。
【０００５】
Thimら, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 第83巻, 6766-6770、及びThimら, FEBS Letters,第212巻, 2号, 307-312には、ヒトプロインスリン及びある種の修飾されたＣペプチドを有する多くのインスリン前駆体の発現が開示されている。さらに、国際公開第９７／０３０８９号には、式ＢＺＡを有するインスリン前駆体の発現が開示されており、ここでＢ及びＡは、少なくとも一のジスルフィド結合で結合しているヒトインスリンのＡ及びＢペプチド鎖であり、Ｚは少なくとも一のタンパク質分解的切断部位を有するポリペプチドである。しかしながら、開示されているインスリン前駆体では、培養培地に分泌される成熟インスリンは少量にしかならない。
自然には分泌顆粒を形成できない遺伝子操作動物細胞において成熟インスリンを作製する方法が米国特許第６３４８３２７号に開示されている。
【０００６】
本発明の目的は、高価で多大な時間がかかる下流の精製プロセス工程が回避されるように、高収率で、十分にプロセシングされた成熟インスリン又はインスリンアナログを生産可能な真菌株を開発することである。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本発明は成熟したヒトインスリン又はそのアナログを作製する方法に関し、該方法は、ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログの前駆体をコードするＤＮＡ配列を含有する真菌細胞を培養し、該前駆体は、ヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖、ヒトインスリン又はそのアナログのＡ鎖、Ｂ鎖とＡ鎖とを結合させるＣペプチドを含み、少なくとも一のＫｅｘ２切断部位を有し、Ｂ鎖が、真菌細胞内でのより効果的なＫｅｘ２切断を促進するＣ末端伸長を有しており、但し、Ｂ鎖がＫｅｘ２切断部位を一つだけ有しているならば、Ｎ末端から数えてＣ末端伸長における第１のアミノ酸残基がＭｅｔ残基ではなく、さらに培養培地から発現した生成物を単離することによりなされる。
【０００８】
一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長は、２−５のアミノ酸残基長である。
一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長は、２−４のアミノ酸残基長である。
一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長は、２−３のアミノ酸残基長である。
一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長は、２のアミノ酸残基からなる。
【０００９】
Ｃ末端伸長におけるアミノ酸残基は同一でも異なっていてもよい。
一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長におけるアミノ酸残基は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択される同一又は異なっている疎水性アミノ酸残基である。
他の実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長におけるアミノ酸残基は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＡｌａからなる群から選択される疎水性アミノ酸残基である。
他の実施態様では、Ｎ末端から数えて、Ｂ鎖のＣ末端伸長における第１のアミノ酸残基はＬｅｕである。
【００１０】
一実施態様では、Ｂ鎖のＮ末端伸長は、ＣペプチドにおけるＫｅｘ２部位に直接結合している。
一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長は、続いて、真菌細胞又は培養培地のいずれかにおいて、カルボキシペプチダーゼ活性により切断可能である。
さらなる実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長は、カルボキシペプチダーゼにより切断されて、成熟したヒトインスリン又はそのアナログが生じる。
【００１１】
よって、本発明の一実施態様は、１）ヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖、ヒトインスリン又はそのアナログのＡ鎖、及びＢ鎖とＡ鎖とを結合させるＣペプチドを含有し、少なくとも一のＫｅｘ２切断部位を有する、ヒトインスリン又はヒトインスリンのアナログの前駆体をコードするＤＮＡ配列を含む真菌細胞を培養し、ここでＢ鎖は、真菌細胞内でのより効果的なＫｅｘ２切断を促進するＣ末端伸長を有しており、但し、Ｂ鎖がＫｅｘ２切断部位を一つだけ有しているならば、Ｎ末端から数えてＣ末端伸長における第１のアミノ酸残基がＭｅｔ残基ではなく、２）培養培地にカルボキシペプチダーゼを添加するか又は内在性カルボキシペプチダーゼにより、Ｂ鎖のＣ末端伸長を切断し、３）培養培地から成熟したインスリン生成物を単離することによる、成熟したヒトインスリン又はそのアナログを作製する方法である。
【００１２】
カルボキシペプチダーゼ酵素は、Ｂ鎖のＣ末端伸長の効果的な除去を可能にする任意のカルボキシペプチダーゼ酵素でありうる。特に適した酵素は、カルボキシペプチダーゼＹ酵素(ＣＰＹ)である。
ＣＰＹが内在性ＣＰＹであるならば、ＣＰＹをコードする内在性遺伝子は過剰発現され、培養培地に分泌される。
【００１３】
一実施態様では、Ｃペプチドは、少なくとも一のアミノ酸残基により結合している２つのＫｅｘ２切断部位を有する。
さらなる実施態様では、２つのＫｅｘ２部位は、１から約３５のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、１から１０のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、１から５のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、２−１０、２−８、２−７、２−６、２−５又は２−４のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
他の実施態様では、Ｋｅｘ２部位は、３−５のアミノ酸残基を有するペプチド鎖により結合している。
【００１４】
一実施態様では、２つのＫｅｘ２部位を結合させるペプチド鎖は、配列ＤＬＧ、ＤＤＬＧ(配列番号１)、又はＤＤＤＬＧ(配列番号２)を有する。
他の実施態様では、Ｃペプチドは、Ａ鎖のＮ末端アミノ酸残基に結合する単一のＫｅｘ２切断部位を有する。
他の実施態様では、Ｃペプチドは、単一のＫｅｘ２切断部位と、Ａ鎖のＮ末端アミノ酸残基とＫｅｘ２部位との間に挿入されるアミノペプチダーゼ切断部位を有する。
【００１５】
他の実施態様では、インスリン前駆体は、配列
Ｂ-Ｘ１-Ｘ２-Ｚ-Ｘ３-Ｘ４-Ａ
[上式中、Ｂは、インスリン又はそのアナログのＢ鎖であり、Ａはヒトインスリン又はそのアナログのＡ鎖であり、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、真菌細胞内でのより効果的なＫｅｘ２切断を促進する１−５のアミノ酸残基のペプチド配列であり、Ｘ２はＫｅｘ２切断部位であり、Ｚは、１〜約３５のアミノ酸残基を有するペプチド配列又はペプチド結合であり、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位又はペプチド結合であり、Ｘ４はアミノペプチダーゼ切断部位又はペプチド結合であり、但しＸ３及びＸ４が双方ともペプチド結合である場合、Ｘ１におけるＮ末端から第１のアミノ酸残基はＭｅｔ残基ではない]
を有する。
【００１６】
他の実施態様では、Ｘ１は２−５のアミノ酸残基長である。
他の実施態様では、Ｘ１は２−４のアミノ酸残基長である。
他の実施態様では、Ｘ１は２−３のアミノ酸残基長である。
他の実施態様では、Ｘ１は２のアミノ酸残基からなる。
【００１７】
他の実施態様では、Ｘ１におけるアミノ酸残基は、同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択される疎水性アミノ酸残基である。
他の実施態様では、Ｘ１におけるアミノ酸残基は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ａｓｐ及びＧｌｙからなる群から選択される。
【００１８】
本発明の一実施態様では、Ｘ１はＬｅｕ-Ａｌａである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ１はＰｈｅ-Ｌｅｕである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ１はＬｅｕ-Ｇｌｙである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ１はＬｅｕ-Ｌｅｕである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ１はＬｅｕ-Ｍｅｔである。
本発明の他の実施態様では、Ｘ１はＬｅｕ-Ｉｌｅである。
【００１９】
本発明の一実施態様では、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合である。
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは同一でも異なっていてもよく、２−１０のアミノ酸残基のペプチド鎖である。
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは同一でも異なっていてもよく、２−８のアミノ酸残基のペプチド鎖である。
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは同一でも異なっていてもよく、３−５のアミノ酸残基のペプチド鎖である。
【００２０】
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択される２−５のアミノ酸残基を含み、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは同一でも異なっていてもよく、３−５のアミノ酸残基のペプチド鎖である。
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択される２-５のアミノ酸残基を含み、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは配列Ｄ-Ｘ５-ＤＬＧ(配列番号４)を有し、ここでＸ５はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶからなる群から選択される。
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択される２-５のアミノ酸残基を含み、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは配列ＤＤＸ６ＬＧ(配列番号２４)を有し、ここでＸ６はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶからなる群から選択される。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択される２のアミノ酸残基からなり、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは同一でも異なっていてもよく、３-５のアミノ酸残基のペプチド鎖である。
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択される２のアミノ酸残基からなり、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは配列Ｄ-Ｘ５-ＤＬＧ(配列番号４)を有し、ここでＸ５はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶからなる群から選択される。
本発明のさらなる実施態様では、Ｘ１は同一でも異なっていてもよく、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ及びＡｌａからなる群から選択される２のアミノ酸残基からなり、Ｘ３はＫｅｘ２切断部位であり、Ｘ４はペプチド結合であり、Ｚは配列ＤＤＸ６ＬＧ(配列番号２４)を有し、ここでＸ６はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶからなる群から選択される。
【００２２】
本発明の他の実施態様では、Ｘ３及びＺはペプチド結合であり、Ｘ４はアミノペプチダーゼ切断部位である。この実施態様では、適切なアミノペプチダーゼ切断部位はＥＡＥＡ(配列番号３)である。
【００２３】
Ｚは、１、２、３、４、５、７、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０  ３１、３２、３３、３４の３５アミノ酸残基からのサイズであってよい。
一実施態様では、Ｚは、１−３５、１−３４、１−３３、１−３１、１−３０、１−２９、１−２８、１−２７、１−２６、１−２５、１−２４、１−２３、１−２２、１−２１、１−２０、１−１９、１−１８、１−１７、１−１６、１−１５、１−１４、１−１３、１−１２、１−１１、１−１０、１−９、１−８、１−７、１−６、１−５、１−４、１−３又は１−２のアミノ酸残基のサイズのものである。
さらなる実施態様では、Ｚは、２−３５、２−３４、２−３３、２−３１、２−３０、２−２９、２−２８、２−２７、２−２６、２−２５、２−２４、２−２３、２−２２、２−２１、２−２０、２−１９、２−１８、２−１７、２−１６、２−１５、２−１４、２−１３、２−１２、２−１１、２−１０、２−９、２−８、２−７、２−６、２−５、２−４又は２−３のアミノ酸残基のサイズのものである。
【００２４】
さらなる実施態様では、Ｚは、３−３５、３−３４、３−３３、３−３１、３−３０、３−２９、３−２８、３−２７、３−２６、３−２５、３−２４、３−２３、３−２２、３−２１、３−２０、３−１９、３−１８、３−１７、３−１６、３−１５、３−１４、３−１３、３−１２、３−１１、３−１０、３−９、３−８、３−７、３−６、３−５又は３−４のアミノ酸残基のサイズのものであってよい。
さらなる実施態様では、Ｚは、４−３５、４−３４、４−３３、４−３１、４−３０、４−２９、４−２８、４−２７、４−２６、４−２５、４−２４、４−２３、４−２２、４−２１、４−２０、４−１９、４−１８、４−１７、４−１６、４−１５、４−１４、４−１３、４−１２、４−１１、４−１０、４−９、４−８、４−７、４−６及び４−５のアミノ酸残基のサイズのものであってよい。
【００２５】
他の実施態様では、Ｚは１〜１０のアミノ酸残基のサイズである。
他の実施態様では、Ｚは１〜５のアミノ酸残基のサイズである。
他の実施態様では、Ｚは２−１０、２−８、２−７、２−６、２−５又は２−４のアミノ酸残基のサイズである。
他の実施態様では、Ｚは３−５のアミノ酸残基のサイズである。
【００２６】
さらなる実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるアミノ酸残基は、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ及びＰｒｏからなる群から選択される。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＬｅｕである。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＩｌｅである。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＴｙｒである。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＡｒｇである。
【００２７】
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＬｙｓである。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＨｉｓである。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＰｒｏである。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＰｈｅである。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＭｅｔである。
一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるＺのアミノ酸残基はＶａｌである。
【００２８】
Ｚの残りのアミノ酸残基は、同一でも異なっていてもよい、任意のコード可能なアミノ酸残基であってよい。しかしながら、一実施態様では、切断部位Ｘ３に対し最後から２番目の位置にあるアミノ酸残基は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＡｌａではない。
【００２９】
一実施態様では、Ｚは、配列ＤＬＧ、ＤＤＬＧ(配列番号１)又はＤＤＤＬＧ(配列番号２)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＬＧを有する。
他の実施態様では、Ｚは配列Ｄ-Ｘ５-ＤＬＧ(配列番号４)を有し、ここでＸ５はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶからなる群から選択される。
さらなる実施態様では、Ｘ５はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｑ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｔ及びＹからなる群から選択される。
【００３０】
一実施態様では、Ｚは配列ＤＤＤＬＧ(配列番号２)を有する。
一実施態様では、Ｚは配列ＤＡＤＬＧ(配列番号５)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＲＤＬＧ(配列番号６)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＮＤＬＧ(配列番号７)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＱＤＬＧ(配列番号９)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＥＤＬＧ(配列番号１０)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＧＤＬＧ(配列番号１１)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＨＤＬＧ(配列番号１２)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＩＤＬＧ(配列番号１３)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＬＤＬＧ(配列番号１４)を有する。
【００３１】
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＫＤＬＧ(配列番号１５)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＭＤＬＧ(配列番号１６)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＦＤＬＧ(配列番号１７)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＰＤＬＧ(配列番号１８)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＳＤＬＧ(配列番号１９)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＴＤＬＧ(配列番号２０)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＷＤＬＧ(配列番号２１)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＹＤＬＧ(配列番号２２)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＶＤＬＧ(配列番号２３)を有する。
【００３２】
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＸ６ＬＧ(配列番号２４)を有し、ここでＸ６はＡ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ及びＶからなる群から選択される。
他の実施態様では、Ｘ６はＲ、Ｎ、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｈ、Ｋ及びＳからなる群から選択される。
【００３３】
一実施態様では、Ｚは配列ＤＤＡＬＧ(配列番号２５)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＲＬＧ(配列番号２６)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＮＬＧ(配列番号２７)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＱＬＧ(配列番号２９)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＥＬＧ(配列番号３０)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＧＬＧ(配列番号３１)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＨＬＧ(配列番号３２)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＩＬＧ(配列番号３３)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＬＬＧ(配列番号３４)を有する。
【００３４】
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＫＬＧ(配列番号３５)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＭＬＧ(配列番号３６)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＦＬＧ(配列番号３７)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＰＬＧ(配列番号３８)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＳＬＧ(配列番号３９)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＴＬＧ(配列番号４０)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＷＬＧ(配列番号４１)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＹＬＧ(配列番号４２)を有する。
他の実施態様では、Ｚは配列ＤＤＶＬＧ(配列番号４３)を有する。
【００３５】
標的インスリン分子は、修飾が該標的インスリン分子のインスリン活性に悪影響を及ぼさない限りは、Ａ及び／又はＢ鎖がさらに修飾されたインスリンアナログであってもよい。
ここで使用される「インスリンアナログ」とは、天然インスリン中に生じる少なくとも一つのアミノ酸残基を欠失させ、及び／又は置換することにより、及び／又は少なくとも一つのアミノ酸残基を付加することによって、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリンの構造から形式的には誘導することができる分子構造を有し、インスリン活性を伴うポリペプチドを意味する。付加された及び／又は置換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じるアミノ酸残基又は純粋に合成のアミノ酸残基の何れかでありうる。
インスリンアナログは、ヒトインスリンと比較して、典型的には約７を越える変異、より典型的には５を越える変異、最も典型的には３を越える変異を含まない。
【００３６】
長年にわたって、インスリンＡ及び／又はＢ鎖におけるかなり多数の変異が開示されている。例えば、Ｂ鎖の２８位は、天然のＰｒｏ残基から、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、又はＩｌｅに修飾されていてもよく、またＢ２９位のＬｙｓはＰｒｏに修飾されていてもよい。
また、Ａ２１位のＡｓｎは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ又はＶａｌ、特にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ、特にＧｌｙに修飾されてもよい。さらに、Ｂ３位のＡｓｎは、Ｌｙｓ又はＡｓｐに修飾されてもよい。インスリンアナログのさらなる具体例は、ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、Ｂ１及びＢ２の一方又は双方が欠失したインスリンアナログ；Ａ鎖及び／又はＢ鎖がＮ末端伸長を有するインスリンアナログ、及びＡ鎖及び／又はＢ鎖がＣ末端伸長を有するインスリンアナログである。またＡ１８位にある天然アミノ酸残基はＧｌｎ残基に変化していてもよく、またＢ２６−Ｂ３０位又はＢ２７−３０位にある一又は複数のアミノ酸残基は欠失している。
【００３７】
本方法で生産可能なインスリンアナログの具体例は、ＧｌｙＡ２１ヒトインスリン、ＧｌｙＡ２１ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、ｄｅｓＢ１ヒトインスリン、ｄｅｓ Ｂ３０ヒトインスリン、ＡｓｐＢ２８ヒトインスリン、及びＬｙｓＢ２８ＰｒｏＢ２９ヒトインスリンである。
インスリンアナログのさらなる具体例は、Ａ２１、Ｂ１０、Ａ８、Ａ１４、Ｂ２５、Ｂ２７及びＢ１の一又は複数の位置に変異を含むヒトインスリンアナログである。
また標的インスリン分子は、Ｂ鎖のＣ末端伸長が後続する切断工程で切断されないインスリン分子であってもよい。
このようなインスリンアナログは構造Ｂ-Ｘ１……Ａを有し、ここでＢ、Ａ及びＸ１は上述した意味を有し、Ｂ及びＡ鎖はヒトインスリンと同様、２つのジスルフィド架橋により結合している。
【００３８】
真菌細胞は、全ての真菌が、本タイプのインスリン前駆体分子を切断し、連結ペプチドを切断し、２つの鎖分子を遊離させるのに必要なタンパク質分解活性を有しているので、任意の真菌細胞であってよい。しかしながら、長年をかけて、酵母が、インスリンサイズの小ペプチドの発現及び分泌に効果的な細胞腫であることが分かってきた。特に、酵母Saccharomyces cerevisiaeが有用であることが判明している。
よって、本発明の一実施態様では、真菌細胞は酵母細胞であり、さらなる実施態様では、酵母細胞はSaccharomyces cerevisiaeである。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、ヒトインスリンのＢ鎖のＣ末端伸長を有するインスリンアナログに関する。この伸長は、典型的にはＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ及びＡｌａからなる群から選択される１−５のアミノ酸残基を有するであろう。
Ｃ末端伸長を有するインスリンアナログの非限定的な例は、Ｂ３１Ｌｅｕ、Ｂ３２Ａｌａヒトインスリン；Ｂ３１Ｌｅｕ、Ｂ３２Ａｌａ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、Ｂ３１Ｐｈｅ、Ｂ３２Ｌｅｕヒトインスリン、及びＢ３１Ｐｈｅ、Ｂ３２Ｌｅｕ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンである。
【００４０】
本発明のヒトインスリンアナログは、インスリンに対して感受性である状態の治療に使用されうる。よって、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病及び高血糖症、例えば重篤に傷害を被った人及び大手術を受けた人にしばしば見られる場合に使用することができる。
さらなる態様では、本発明は、適切な製薬的に許容可能なアジュバント及び添加剤、例えば安定化、保存（防腐）又は等張性に関して適切な一又は複数の薬剤と組合せて、ヒトインスリンアナログを含有する製薬用製剤に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、ＥＳＩ４２-３３と呼ばれる酵母プラスミドの例を示す。プラスミドは、S. cerevisiaeＴＰＩ遺伝子の転写プロモーター及び転写ターミネーターの間に、プラスミド中に挿入されるＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片を含む発現カセットを含んでいる。
【図２】図２は、インスリン前駆体Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号４５)-(Ａ１-２１)ヒトインスリンをコードするＮｃｏＩ-ＸｂａＩ ＤＮＡ断片(配列番号４４)と短い上流配列を含むインスリン前駆体のアミノ酸配列(配列番号４６)を示す。
【図３】図３は本発明の一実施態様の切断配列を示す。
【図４】図４は本発明の他の実施態様の切断配列を示す。
【図５】図５は本発明のさらなる実施態様の切断配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発酵ブロスに成熟生成物を直接分泌させることによるインスリンの生産には、各末端に切断部位に隣接する連結ペプチドを含むインスリン前駆体の細胞内プロセシングが必要である。このような連結ペプチドはＢ-ＫＲ(Ｗ)ｎＫＲ-Ａ型のものであり得、ここでＢはヒトインスリンのＢ鎖であり、ＡはヒトインスリンのＡ鎖であり、Ｗは可変長のペプチドである。細胞内プロセシングはゴルジペプチダーゼＫｅｘ１及びＫｅｘ２により促進される。このプロセスには２つの重要な問題があった：１）Ｂ鎖に結合したＫｅｘ２部位を消化するＫｅｘ２の能力は、Ｂ鎖の残基２９及び３０によって強く影響される、２）細胞から分泌される生成物は、成熟インスリンとＢ３０スレオニンを欠くインスリンの混合物である。Ｂ３０Ｔｈｒの除去の原因となるタンパク質分解活性は、Ｋｅｘ１である蓋然性が高い。しかし、インスリンの２つの形態は下流プロセシングで分離できず、より均質な生成物の形成の確保が重要になる。
【００４３】
本発明の修飾されたＣペプチドは、インスリン分子のＡ鎖及びＢ鎖から修飾されたＣペプチドの効果的な切断を促進させ、成熟インスリン分子が形成されるように設計される。上述の問題に対処している新型のＣペプチドが開発された。本発明では、Ｂ鎖は、ＣペプチドのＫｅｘ２部位にその他端が結合した短いペプチド配列で、そのＣ末端が伸長している。この位置に短いアミノ酸配列が挿入されると、Ｎ末端Ｋｅｘ２部位が最適化されて、より効果的なＫｅｘ２切断が可能となる。Ｋｅｘ１及びＫｅｘ２による完全なプロセシングで、Ｂ-(Ｘ)ｎ……Ａの形態でＢ鎖のＣ末端の伸長を有する２本鎖インスリン前駆体分子になり、ここでＸはＢ鎖に対するＣ末端伸長であり、Ａ鎖及びＢ鎖は２つのジスルフィド架橋により結合している。
【００４４】
液胞型酵母プロテアーゼのカルボキシペプチダーゼＹ(ＣＰＹ)は、それがＴｈｒ(ヒトインスリン分子におけるこの位置の天然アミノ酸残基)であるならば、Ｂ３０アミノ酸残基の除去には効果的でないことが判明している。さらに、連結ペプチドのＫｅｘ２部位のＮ末端とＢ３０アミノ酸残基のＣ末端の余分なアミノ酸残基は、最終的により均質な生成物の形成に至るＣＰＹのための最適な基質になるように設計されうる。
【００４５】
ＣＰＹにより触媒されるタンパク質分解工程は、次の３つの方法により、起こりうる：
１）細胞から分泌されているＣ末端が伸長した２本鎖産物Ｂ-(Ｘ)ｎ……Ａをプロセシングするために、発酵ブロスにＣＰＹを直接添加することによる；
２）分泌経路を介して向かっている内在性ＣＰＹによってＣ末端伸長した２本鎖産物Ｂ-(Ｘ)ｎ……Ａをプロセシングすることによる、又は
３）ＣＰＹをコードする遺伝子ＰＲＣ１の過剰発現、もしくは培養培地へのＣＰＹの誤った局在化に至らしめる変異により、ＣＰＹで２本鎖生成物Ｂ-(Ｘ)ｎ……Ａをプロセシングすることによる。
【００４６】
野生型の酵母株では、ＣＰＹは液胞に局在している。ゴルジ体から液胞への、不活性な前駆体、プロＣＰＹの移動は、液胞型タンパク質選別機構により媒介される。ＰＲＣ１の過剰発現により、液胞型タンパク質選別の飽和に至り、それによってＣＰＹが外部に分泌される(Stevensら, J. Cell Biol. 102 (1986),1551-1557)。また、培養培地への分泌は、液胞型タンパク質選別に関与するタンパク質をコードする遺伝子におけるある種の変異によってもまた達成されうる(Rothman及びStevens, Cell, 47 (1986), 1041-1051)。例えば、ＶＰＳ１が欠失すると、ＣＰＹが効果的に分泌される(Nielsenら, App. Microbiol. Biotech. 33 (1990) 307-312)。また、ＣＰＹのプロペプチドにおける変異により、分泌フェノタイプが生じる(Vallsら, J. Cell Biol. 111 (1990), 361-368)。
【００４７】
Ａ鎖のＮ末端から可能な伸長を除去するタンパク質分解工程は、アミノペプチダーゼにより触媒されうる。ジペプチジルアミノペプチダーゼは、ポリペプチドのＮ末端からのジペプチドの逐次的除去を触媒する。ＣＰＹプロセシングと同様、タンパク質分解工程は、発酵ブロスに直接添加されるか、又は細胞内部に存在して培養培地に分泌されるジペプチジルアミノペプチダーゼにより行うことができる。酵母Saccharomyces cerevisiaeは２つの内在性ジペプチジルアミノペプチダーゼ、液胞型タンパク質Ｄａｐ２ｐ及びゴルジ膜内在性タンパク質Ｓｔｅ１３ｐを内部に有している(Robertsら, (1989), J. Cell Biol. 108:1363-1373; Juliusら, (1983), Cell 32:839-852)。Ｓｔｅ１３ｐはＸ-Ａｌａ-又はＸ-Ｐｒｏ-配列(ここでＸはアミノ酸である)のカルボキシル側で切断され、分泌経路を横切るインスリン前駆体分子のプロセシングに寄与しうる。
【００４８】
本発明の種々のプロセシングパターンを図３−５に模式的に示す。
図３において、インスリン前駆体コンストラクトは、連結ペプチド内に、配列ＸＸにより例証される、Ｂ鎖のＣ末端伸長、ＫＲ、及び一つのＫｅｘ２を有する。第１の切断は、Ｋｅｘ２によるＫｅｘ２部位の切断であり、単鎖構造を、Ｂ鎖に結合し、配列ＸＸＫＲを有する２本鎖構造に開裂させる。ついで、酵素Ｋｅｘ１はＫＲ配列を切断し、最終的にカルボキシペプチダーゼはＢ鎖のＸＸ伸長部を切断して、成熟した２本鎖インスリン生成物が付与されるであろう。
【００４９】
図４には、他の実施態様が例証されている。この実施態様では、インスリン前駆体は、連結ペプチド内に、単一のＫｅｘ２部位とアミノペプチダーゼ切断部位、ＹＹを有する。図３におけるように、Ｋｅｘ２、Ｋｅｘ１及びカルボキシペプチダーゼは、ＸＸ-ＫＲ配列を除去するであろう。しかしながら、この実施態様では、最終的なアミノペプチダーゼ切断はＹＹ配列を除去し、成熟した２本鎖インスリン生成物を生じるであろう。
【００５０】
図５に示された実施態様では、インスリン前駆体は、ペプチダーゼ鎖Ｚにより結合された２つのＫｅｘ２切断部位を有している。Ｋｅｘ２による第１の切断でＺ-ＫＲ配列が除去され、Ｋｅｘ１がＫＲ配列を切り離し、最後にカルボキシペプチダーゼがＸＸ配列を除去する。
Ｋｅｘ２及びＫｅｘ１切断の双方は、真菌細胞内で生じるが、上で説明したように、カルボキシペプチダーゼによる切断は真菌細胞又は培養培地のいずれかで生じうることに留意すべきである。さらに、カルボキシペプチダーゼは内在性酵素であってもよいし、培養培地に添加されてもよい。同じことが、図４に示されるアミノペプチダーゼ切断にも当てはまる。
【００５１】
該プロセスの標的インスリン産物は、２本鎖ヒトインスリン又は２本鎖ヒトインスリンアナログで、Ｂ鎖に短いＣ末端伸長を有するものであってもなくてもよい。標的インスリン産物がＢ鎖のＣ末端伸長を有していない場合、Ｂ鎖のＣ末端伸長は、さらなる精製工程の前に、Ｂ鎖から続いて切断され得なければならない。Ｂ３０位にあるアミノ酸残基に応じて、カルボキシペプチダーゼはＢ３０アミノ酸残基を切り離し、ｄｅｓＢ３０インスリンアナログを生じる。
【００５２】
Ｂ鎖のＣ末端伸長の除去は、典型的にはカルボキシペプチダーゼ活性により行われる。このようなカルボキシペプチダーゼ活性により触媒されるタンパク質分解工程は、発酵ブロスに適切な酵素を直接添加することにより達成することができ、細胞により分泌される前駆体分子中のＢ鎖のＣ末端伸長がプロセシングされる。
カルボキシペプチダーゼは、任意の適切な天然のカルボキシペプチダーゼ、例えばＣＰＹ、又はその突然変異体であってよい。
【００５３】
あるいは、伸長は、分泌経路を介して出てくる細胞内の前駆体分子のカルボキシペプチダーゼ(内在性又はプラスミドから発現)によりプロセシングされうる。
よって一実施態様では、Ｂ鎖のＣ末端伸長は、真菌細胞内で切断され、他の実施態様では、培養培地において切断され、成熟したヒトインスリン又はそのアナログが形成される。
【００５４】
Ｃペプチドは、典型的には２つのＫｅｘ２切断部位を有し、２つのＫｅｘ２部位の間にはペプチド配列が挿入されている。２つのＫｅｘ２部位の間にあるペプチド配列の長さ及びアミノ酸組成は、発現した単鎖インスリン前駆体の折り畳みと、前駆体分子における正しく位置したジスルフィド架橋の確立を可能にする限り、変化してもよい。
天然のＣペプチドのサイズは３５アミノ酸残基である。よって、本発明の一態様では、２つのＫｅｘ２部位の間にあるペプチド配列は、天然Ｃペプチドとほぼ同じ長さのものであろう。
Ａ鎖に結合したＫｅｘ２部位の切断は、２つのＫｅｘ２部位の間に挿入されるペプチド配列が、Ａ鎖に隣接するＫｅｘ２部位に対して最後から２番目の位置に、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ又はＶａｌアミノ酸残基を有するならば高められうる。また我々は、同位置のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ又はＡｌａではないことを見出した。
【００５５】
真菌細胞から大量の成熟したインスリン又はインスリンアナログが生成されると、製薬目的のために十分に高い純度のインスリン産物を生産するのに必要な下流の精製工程の数を有意に減少させることができる。例えば、米国特許第４９１６２１２号に開示されている酵母中でインスリンを作製する方法では、インスリン前駆体は２つの工程、すなわち単鎖インスリン前駆体Ｂ(１-２９)-Ａｌａｌ-Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ａ(１-２１)をヒトインスリンのエステルへ転換させるペプチド転移と、次のインスリンエステルのヒトインスリンへの加水分解によって、ヒトインスリンに転換される。各転換工程は、最初の分離工程と、後続する少なくとも一の精製工程が必要である。よって、成熟したインスリンの生産には、少なくとも一の酵素転換を含む少なくとも６つの付加的な工程が必要である。
【００５６】
酵素的切断は、１００％切断には達せず、製薬用製品の場合には効果的に除去されなければならない未切断の不純物又は部分的に切断された不純物を残すことはよく知られている。よって、各切断工程には、少なくとも一の単離又は精製工程、典型的には交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によるクロマトグラフィー精製が続くであろう。
商業的規模で使用されるクロマトグラフィー用カラム材料は、非常に高価であり、よって、このようなクロマトグラフィー工程の数を減らすことは、生産経済において、顕著な影響を持っている。また下流の転換及び精製工程を減らすと、労働者の仕事量及びプロセスに費やされる時間がさらに減少し、よって生産経済がさらに改善される。
【００５７】
本プロセスでは、成熟したインスリン又はそのアナログは、培養ブロスから直接、高収率で単離することができ、製薬用途に十分な純度の生成物を生成させるのに必要な下流のプロセス工程がさらに減少する。
【００５８】
インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列は、ゲノム又はｃＤＮＡ由来のものであり、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、標準的な技術(例えば、Sambrook, J, Fritsch, EF及びManiatis, T,  Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York、1989)に従い、合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションにより、ポリペプチドの全体又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることにより得られる。またインスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869に記載されたホスホアミダイト法、又はMatthesら, EMBO Journal 3 (1984), 801-805により記載された方法により合成的に調製することもできる。さらに、ＤＮＡ配列は、例えば米国特許第４６８３２０２号、又はSaikiら, Science 239 (1988), 487-491に記載されたようにして、特定のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により調製されうる。
【００５９】
ＤＮＡ配列は、組換えＤＮＡ手順を施しうる任意のベクターに挿入することができ、ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞にしばしば依存する。よって、ベクターは、自己複製ベクター、つまり染色体外体として存在し、その複製が染色体複製に独立であるベクター、例えばプラスミドでありうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれる染色体(群)と共に複製されるものであってもよい。
【００６０】
ベクターは好ましくはインスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列がプロモーターのようなＤＮＡの転写に必要とされる更なるセグメントに作用可能に結合している発現ベクターである。プロモーターは選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、宿主細胞に相同的又は異種性のタンパク質コード遺伝子から誘導されうる。
【００６１】
酵母宿主細胞への使用に適したプロモーターの例には、酵母解糖遺伝子(Hitzemanら, J. Biol. Chem. 255(1980), 12073-12080; Alber及びKawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1(1982), 419-434、又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子(Youngら, Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaenderら編), Plenum Press, New York, 1982)、又はＴＰＩ１(米国特許第４５９９３１１号)又はＡＤＨ２-４ｃ(Russellら, Nature 304(1983), 652-654)プロモーターが含まれる。
【００６２】
また、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列は、必要であるならば、適切なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写エンハンサー配列、及び翻訳エンハンサー配列に作用可能に結合していてもよい。さらに本発明の組換えベクターは、ベクターが当該宿主細胞内で複製するのを可能にするＤＮＡ配列をさらに含みうる。
【００６３】
宿主細胞の分泌経路にインスリンを方向付けるために、分泌シグナル配列(リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られている)が、組換えベクター内に提供されてもよい。分泌シグナル配列は正確なリーディングフレームにおいて、インスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列に結合している。分泌シグナル配列は、通常、ペプチドをコードするＤＮＡ配列に対し、５'に位置している。シグナルペプチドは、天然に生じるシグナルペプチド、又はその機能的部分であってよく、又は合成ペプチドであってもよい。
酵母における効果的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列を、シグナル配列の下流とインスリン前駆体をコードするＤＮＡ配列の上流に挿入してもよい。
【００６４】
ＤＮＡ配列又は組換えベクターが挿入される酵母宿主細胞は、インスリン前駆体を発現可能な任意の酵母細胞であってよく、Saccharomyces種、又はSchizosaccharomyces種、特にSaccharomyces cerevisiae又はSaccharomyces kluyveriの株が含まれる。適切な酵母細胞のさらなる例は、Kluyveromyces種、例えばK. lactis、Hansenula、H. polymorpha、又はPichia種、例えばP. pastoris(Gleesonら, J. Gen. Microbiol. 132、1986, pp.3459-3465；米国特許第４８８２２７９号を参照)ある。
【００６５】
異種ＤＮＡで酵母細胞を形質転換させ、異種ポリペプチドを生成させる方法は、例えば米国特許第４５９９３１１号、米国特許第４９３１３７３号、米国特許第４８７０００８号、同５０３７７４３号、及び米国特許第４８４５０７５号に記載されている。形質転換細胞は、選択可能マーカーにより決定されたフェノタイプ、一般的には薬剤耐性、又は特定の栄養素、例えばロイシンの不在下で成長する能力によって選択される。酵母に使用される好ましいベクターは、米国特許第４９３１３７３号に記載のＰＯＴ１ベクターである。
【００６６】
本発明に係る方法は、いわゆる発酵プロセスである。発酵は、好ましくは、限定されないが、空気、酸素及びアンモニアからなる圧縮滅菌ガスを加えるための供給ラインを具備した無菌の攪拌タンクで実施される。発酵槽はｐＨ、温度、圧力、攪拌速度、溶存酸素レベル、液体含有量、発泡レベル、供給添加速度、及び酸と塩基の添加速度をモニターする装置／センサーを含むことができる。さらに、発酵槽には、細胞密度、生理化学的形態の如何にかかわらず代謝産物及び生成物の濃度をモニターするための光学装置を具備可能である。揮発性化合物の形成及び消費は、発酵槽へのガス入口及び発酵槽からのガス出口におけるガス分析を使用してモニターされる。モニターされた変数の全ての信号は、変数を予め定められた範囲内に維持するか、又は時間に関して予め定められたプロファイルに従い連続的に変化させることを可能にする制御目的に使用することができる。また、変数は、他のモニターされた変化からの信号変化に応じて制御される。
【００６７】
発酵中に生成された所望の産物は、可溶性細胞外物質として、又は可溶性物質の形態か又は凝集物質を含む不溶性物質としての細胞内物質として存在する。生成物の形成は、構成的又は誘導的なものであり、微生物増殖に依存するか又は独立している。発酵プロセスは、１００ｍＬ〜２０００００Ｌの範囲の作業容量を有するタンク中で実施される。発酵プロセスは、バッチプロセス、流加(フェドバッチ)プロセス、繰り返しフェドバッチプロセス、又は連続プロセスとして操作されうる。
【００６８】
発酵プロセスで細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞の増殖に適した任意の一般的な培地、例えば適切な栄養補助剤(サプリメント)を含む最小又は複合培地でありうる。適切な培地は商業的供給者から入手可能であり、又は公開されているレシピ(例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)に従い調製することができる。例えば、培地は、少なくとも一の炭素源、一又は数種の窒素源、カリウム、ナトリウム、マグネシウムの塩、リン酸塩、硝酸塩及び硫酸塩を含む必須の塩、微量金属、水溶性ビタミン類、限定されるものではないが、プロセス補助剤、例えばプロテアーゼインヒビター、安定剤、リガンド、消泡剤及び誘導因子を含む。培地は、熱による滅菌を含むいくつかの操作条件において、液体培地に部分的に沈殿するか又は分散する成分を含んでいてもよい。培地は、数種の液体とガス状溶液を混合することにより作製することができる。これらの溶液は発酵槽に入れる前に混合することもできるし、予め定められた比率で添加された別々の液体流として発酵槽に供給される。培地成分の異なる液体溶液の比率は、発酵プロセスの様々な段階で変化し、これは培地の全体的な成分が、発酵の過程において変化することを意味する。
【００６９】
適切な発酵培地は、２０〜６０ｍＭのＰＯ４３−、５０〜７０ｍＭのＫ＋、２０〜３５ｍＭのＳＯ４２−、４〜６ｍＭのＮａ＋、６〜１３ｍＭのＭｇ２＋、０．５〜１．５ｍＭのＭｎ２＋、０．０２〜０．０４ｍＭのＣｕ２＋、０．１〜０．３ｍＭのＦｅ２＋、０．０１〜０．０５ｍＭのＺｎ２＋の塩、複合アミノ酸源の一部として添加される微少量のＣｏ、Ｍｏ及びＮｉ、１〜４０ｇ／Ｌの酵母抽出物、ビタミン類、例えばｍ-イノシトール(１００〜２５０ｍｇ／Ｌ)、Ｃａ-パントテン酸塩(２〜２０ｍｇ／Ｌ)、チアミン、ＨＣｌ(０．５〜２０ｍｇ／Ｌ)、ピリドキシン(０．２〜２０ｍｇ／Ｌ)、ナイアシンニコチンアミド(２〜７ｍｇ／Ｌ)、ビオチン(０．０３〜０．８ｍｇ／Ｌ)、及びコリン-クエン酸二水素(０．１〜０．２ｍｇ／Ｌ)、リガンド、例えばクエン酸、Ｈ２Ｏ(０．５〜７ｇ／Ｌ)、及び炭素源としてのグルコース(５０〜２００ｇ／Ｌ)を含んでいてもよい。窒素は、４００〜１８００ｍＭの量で、ガス状ＮＨ３又は液状ＮＨ４ＯＨとして連続的に添加される。カルシウム及びＣｌ−の天然源として水道水が使用される。
【００７０】
ついで、細胞により生成されるペプチドは、遠心分離又は濾過、硫酸アンモニウム等の塩により上清又は濾液のタンパク質様成分を沈殿させることによって、培地から宿主細胞を分離させ、当該ペプチドのタイプに応じて、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の多様なクロマトグラフィー手順により精製することを含む常套的な手順により、培養培地から回収されうる。
【００７１】
培養ブロスからの単離後、成熟したインスリン又はインスリンアナログを、特にＢ２９Ｌｙｓ残基のε-アミノ基をアシル化することにより、例えばアシル化形態に転換させることができる。インスリンをアシル化させる方法は当該分野でよく知られており、例えば欧州特許第７９２２９０号及び同８９４０９５号、米国特許第５６９３６０９号、同５６４６２４２号、同５９２２６７５号、同５７５０４９７号及び同６０１１００７号に開示されている。
【００７２】
アシル化されたインスリンの例は、ＮｅＢ２９-テトラデカノイルｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＮεＢ２９-リトコロリル-γ-グルタミルｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、ＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１４ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、又はＮεＢ２９-(Ｎα-(ＨＯＯＣ(ＣＨ２)１６ＣＯ)-γ-Ｇｌｕ)ｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリンである。
【００７３】
「ｄｅｓＢ３０」又は「Ｂ(１-２９)」とは、Ｂ３０アミノ酸残基を欠く天然インスリンＢ鎖又はそのアナログを意味する。
Ｂ(１-３０)はヒトインスリンの天然Ｂ鎖を意味し、「Ａ(１-２１)」は天然インスリンＡ鎖を意味する。
Ａ１８Ｑヒトインスリンは、ヒトインスリンＡ鎖のＡ１８位にＧｌｎを有するインスリンアナログである。Ｂ１０Ｅ、Ａ８Ｈ、Ａ１４Ｅは、それぞれＢ１０位にＧｌｕ、Ａ８位にＨｉｓ、及びＡ１４位にＧｌｕを有するインスリンアナログである。
「Ｂ１」、「Ａ１」等とは、それぞれインスリンのＢ鎖の１位(Ｎ末端から数える)のアミノ酸残基及びインスリンのＡ鎖の１位(Ｎ末端から数える)のアミノ酸残基を意味する。特定の位置にあるアミノ酸残基は、例えばＢ１位のアミノ酸残基がフェニルアラニン残基であることを意味するＰｈｅＢ１として表すことができる。
【００７４】
「Ｃペプチド」とは、インスリン分子のＡ及びＢペプチド鎖を互いに結合させるペプチド配列を意味する。
「成熟したインスリン」とは、正しいアミノ酸残基組成と、天然のヒトインスリン分子と同じ立体構造、すなわちＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７との間、及びＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９との間のジスルフィド架橋、及びＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１との間の内部ジスルフィド架橋、及びインスリン活性を有する２本鎖インスリンを意味する。よって、本発明の成熟したインスリンはヒトインスリンである。成熟したヒトインスリンのアナログは、先に説明したように、インスリン分子に一又は複数の変異を有するであろう。よって、成熟したインスリンアナログは、Ｂ２８Ａｓｐヒトインスリン、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン、Ａ１４Ｇｌｕ、Ｂ２５Ｈｉｓヒトインスリン、及びＢ３１Ｌｅｕ、Ｂ３２Ａｌａヒトインスリンであってもよい。
ここで使用される「インスリン誘導体」なる用語は、例えばインスリン骨格の一又は複数の位置に側鎖が導入されることにより、もしくはインスリンのアミノ酸残基の基を酸化又は還元することにより、もしくは遊離のアミノ基又はヒドロキシ基をアシル化することにより、化学的に修飾された天然に生じるインスリン又はインスリンアナログを意味する。
【００７５】
「Ｋｅｘ２」又は「Ｋｅｘ２ｐ」とは、２つの塩基性残基(リジン又はアルギニン)の配列の後に切断を優先的に触媒するサブチリシン様エンドプロテアーゼを意味する(Rockwell, NC, Krysan、DJ、Komiyama, T & Fuller, RS 2002 Precursor Processing by Kex2/Furin Proteases. Chem. Rev. 102: 4525-4548)。
「Ｋｅｘ１」又は「Ｋｅｘ１ｐ」とは、Ｃ末端のリジル及び／又はアルギニル残基の除去を優先的に触媒するセリンカルボキシペプチダーゼを意味する(Shilton BH, Thomas DY, Cygler M 1997 Crystal structure of Kex1deltap, a prohormone-processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry 36: 9002-9012)。
ＣＰＹとは、疎水性又は大きなＣ末端アミノ酸残基、例えばＰｈｅ及びＬｅｕの除去を優先的に触媒するカルボキシペプチダーゼＹを意味する(Remington, S.J. & Breddam, K. (1994) Carboxypeptidases C and D. Methods Enzymol. 244、231-248)。
【００７６】
「正しくプロセシングされる」とは、正しいアミノ酸残基配列を有する所望の生成物が得られるように、所望の切断点で酵素的に切断することを意味する。
「効果的な切断」とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９５％の切断を意味することを意図している。
「ＰＯＴ」は、Schizosaccharomyces pombeトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、「ＴＰ１１」はS. cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
「リーダー」は、プレペプチド(シグナルペプチド)及びプロペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
【００７７】
「シグナルペプチド」なる用語は、タンパク質の前駆体型においてＮ末端配列として存在するプレペプチドを意味するものと理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパク質が小胞体中への転位置を容易にすることを可能にすることである。もちろん、シグナルペプチドはこのプロセス中に通常は切断される。シグナルペプチドはタンパク質を生産する宿主生物に対して異種又は同族であってもよい。
糸状菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域は、Aspergillus oryzaeのＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、Aspergillus nigerの中性アミラーゼ遺伝子、Rhizomucor mieheiのアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、Humicola lanuginosaのセルラーゼ又はリパーゼ遺伝子、又はRhizomucor mieheiのリパーゼ又はプロテアーゼ遺伝子、Aspergillus種のアミラーゼ又はグルコアミラーゼ、Rhizomucor mieheiのリパーゼ又はプロテアーゼをコードする遺伝子から得られたシグナルペプチドコード領域である。シグナルペプチドは、好ましくはA. oryzaeのＴＡＫＡアミラーゼ、A. nigerの中性ａ-アミラーゼ、 A. nigerの酸安定性アミラーゼ、又はA. nigerのグルコアミラーゼをコードする遺伝子から誘導される。
【００７８】
酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドは、Saccharomyces cerevisiaeのａ因子及びSaccharomyces cerevisiaeのインベルターゼに対する遺伝子から得られる。本発明のＤＮＡコンストラクトと共に使用されうる多くのシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド、又は任意の機能的アナログ(Egel-Mitaniら、(1990) YEAST 6:127-137及び米国特許第５７２６０３８号)、ＭＦα１遺伝子のα-因子シグナル(Thorner(1981)、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathern等編, pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY、及び米国特許第４８７０００８号)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchleら, Nature 289、1981、pp. 643-646を参照)、修飾されたカルボキシペプチダーゼのシグナルペプチド(L.A. Vallsら, Cell 48、1987、pp. 887-897を参照)、及び酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド(国際公開第８７／０２６７０号を参照)が含まれる。
【００７９】
「プロペプチド」なる用語は、その機能が、発現したポリペプチドを小胞体からゴルジ体へ、さらには培地中への分泌のために分泌小胞へ向けることを可能にすることであるポリペプチド配列を意味する(すなわち、ポリペプチドは、酵母細胞のペリプラズム空間中に細胞壁又は少なくとも細胞膜を通って出て行く)。プロペプチドは酵母α因子プロペプチドであってもよい。米国特許第４５４６０８２号及び同４８７０００８号を参照。あるいは、プロペプチドは、合成プロペプチド、つまり天然には見出されないプロペプチドであってもよい。適切な合成プロペプチドは米国特許第５３９５９２２号；同５７９５７４６号；同５１６２４９８号、国際公開第８９／０２４６３号、国際公開第９２／１１３７８号及び国際公開第９８／３２８６７号に開示されているものである。
【００８０】
また、本発明のポリヌクレオチド配列は、混合ゲノム、ｃＤＮＡ、及び合成由来のものであってよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列を、Ａ鎖及びＢ鎖をコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列に結合させた後、よく知られた手順に従って相同組換えのために所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入し、又は好ましくは適当なオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって所望の配列を生産することによって、所定部位でＤＮＡ配列を修飾してもよい。
【００８１】
本発明は、選択された微生物又は宿主細胞中で複製可能であり、所望のインスリン産物をコードするポリヌクレオチド配列を担持するベクターを包含する。組換えベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外体として存在するベクターで、その複製が染色体複製とは独立しているもの、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でありうる。ベクターは自己複製を保証する任意の手段を含みうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。さらに、単一のベクター又はプラスミド、又は宿主細胞のゲノムに導入されることになる全ＤＮＡを併せて含む２つ又はそれ以上のベクター又はプラスミド、あるいはトランスポゾンが使用されてもよい。ベクターは直鎖又は閉環状プラスミドであってよく、宿主細胞のゲノム中へのベクターの安定した組込み、又はゲノムとは独立した細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメント(群)を好ましくは含む。
一実施態様では、組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。ベクターを酵母中で複製させることができる配列の例は、酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１-３及び複製起点である。
【００８２】
またベクターは、選択可能なマーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、又は薬剤に耐性を付与するもの、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートをさらに含みうる。
糸状菌宿主細胞における使用される選択可能マーカーには、ａｍｄＳ(アセタミダーゼ)、ａｒｇＢ(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、ｐｙｒＧ(オロチジン-５'-ホスファートデカルボキシラーゼ)及びｔｒｐＣ(アントラニル酸シンターゼ)が含まれる。
酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。酵母にとって好ましい選択可能なマーカーはSchizosaccharomyces pompeＴＰＩ遺伝子(Russell (1985) Gene 40:125-130)である。
【００８３】
ベクター中において、ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーター配列に作用可能に結合している。プロモーターは、変異、切断、及びハイブリッドプロモーターを含む選択宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞に相同か又は異種性である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
糸状菌宿主細胞において転写を行わしめるのに適切なプロモーターの例は、Aspergillus oryzaeのＴＡＫＡアミラーゼ、Rhizomucor mieheiのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Aspergillus nigerの中性アルファ-アミラーゼ、及びAspergillus nigerの酸安定性アルファ-アミラーゼから得られるプロモーターである。
酵母宿主では、有用なプロモーターは、Saccharomyces cerevisiaeＭａ１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
本発明のポリヌクレオチドコンストラクトは典型的には適切なターミネーターに作用可能に結合しているであろう。酵母において、適切なターミネーターはＴＰＩターミネーター(Alberら(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)である。
【００８４】
インスリン産物をコードするＤＮＡ配列、プロモーター、及び場合によってはターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれライゲーションし、複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている(例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989を参照)。
ベクターは、まず本発明のインスリン前駆体をコードする全ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを調製し、続いて適切な発現ベクターにこの断片を挿入するか、又は個々のエレメント(例えば、シグナル、プロペプチド、修飾されたＣペプチド、Ａ鎖及びＢ鎖)についての遺伝的情報を含むＤＮＡ断片を挿入し、続いてライゲーションすることにより構築されうることが理解されるであろう。
【００８５】
また本発明は、所望のインスリン産物をコードするポリヌクレオチド配列を含む組換え真菌細胞に関する。このようなポリヌクレオチド配列を含むベクターは、上述したように、ベクターが染色体組込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入する。「宿主細胞」なる用語は、複製中に生じる変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。
【００８６】
本発明で使用される宿主細胞は真菌細胞である。ここで使用される「真菌」には、子嚢菌門、担子菌門、ツボカビ門、及び接合菌門(Hawksworthら, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge、UKにより定義)、並びに卵菌門(Hawksworth, 1995, 上掲, 171頁に引用)及び全ての栄養胞子形成菌(Hawksworthら, 1995, 上掲)が含まれる。
【００８７】
一実施態様では、真菌宿主細胞は酵母細胞である。ここで使用される「酵母」には、ascosporogenous酵母(エンドマイセス属)、basidiosporogenous酵母、及び不完全菌類に属する酵母(ブラストミセス属)が含まれる。ascosporogenous酵母はSpermophthoraceaeとSaccharomycetaceae種に分割される。後者は、４つのサブファミリーSchizosaccharomycoideae(例えば、Schizosaccharomyces属)、Nadsonioideae、Lipomycoideae、及びSaccharomycoideae (例えば、Pichia、Kluyveromyces及びSaccharomyces属)からなる。basidiosporogenous酵母には、Leucosporidim属、Rhodosporidium属、Sporidiobolus属、Filobasidium属、及びFilobasidiella属が含まれる。不完全菌類に属する酵母は、２つのファミリー、Sporobolomycetaceae(例えば、Sorobolomyces属及びBullera属)、及びCryptococcaceae(例えば、Candida属)に分割される。酵母の分類は、今後、変化する可能性もあるため、この発明の目的のためには、酵母はBiology and Activities of Yeast(Skinner, F.A., Passmore, S.M., 及びDavenport, R.R.編, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)に記載されているよう定義されるべきである。酵母の生物学及び酵母遺伝子のマニピュレーションは、当該分野においてよく知られている(例えば、Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J., 及びStopani, A.O.M.編, 第2版, 1987；The Yeasts, Rose, A.H., 及びHarrison, J.S.編, 第2版, 1987；及びThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathernら編, 1981)。
【００８８】
酵母宿主細胞は、Candida種、Kluyveromyces種、Saccharomyces種、Schizosaccharomyces種、Pichia種、Hansenula種、 Yarrowia種の細胞から選択されうる。一実施態様では、酵母宿主細胞は、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces diastaticus、Saccharomyces douglasii、Saccharomyces kluyveri、Saccharomyces norbensis、Saccharomyces oviformis、Schizosaccharomyces pombe、Sacchoromyces uvarum、Pichia kluyveri、Yarrowia lipolytica、Candida utilis、Candida cacaoi、及びGeotrichum fermentansである。他の有用な酵母宿主細胞は、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris、Yarrowia lipolytica、Schizosaccharomyces pombe、Ustilgo maylis、Candida maltose、Pichia guillermondii及びPichia methanoliolである(Gleesonら, J. Gen. Microbiol. 132, 1986,pp.3459-3465；米国特許第４８８２２７９号及び米国特許第４８７９２３１号を参照)。
【００８９】
一実施態様では、真菌宿主細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌」には、真性動菌亜門及び卵菌亜門(Hawksworthらにより定義, 1995, 上掲)の全ての糸状菌形態が含まれる。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖類からなる植物性菌糸により特徴付けられる。糸状菌宿主細胞は、Acremonium、Aspergillus、Fusarium、Humicola、Mucor、Myceliophthora、Neurospora、Penicillium、Thielavia、Tolypocladium、及びTrichodermaからなる群から選択されうる。
【００９０】
「コード可能なアミノ酸」又は「コード可能なアミノ酸残基」なる表現は、ヌクレオチドのトリプレット(「コドン」) によりコード可能なアミノ酸又はアミノ酸残基を示すために使用される。
本文脈において、アミノ酸の３文字又は１文字標記を、次に示すようにその一般的な意味で使用した。明示的に示さない限り、ここに述べるアミノ酸はＬアミノ酸である。さらに、ペプチドのアミノ酸配列の左及び右端は、特に記載しない限り、それぞれＮ末端及びＣ末端である。
0005503968.tif 000002
【００９１】
発酵とは、液体培地に浸される微生物を繁殖させるために用いる無菌の方法を意味する。好ましくは、発酵は、限定するものではないが、空気、酸素及びアンモニアからなる加圧した無菌ガスの添加のための供給ラインを有する無菌の撹拌タンク内で実施される。発酵槽は、ｐＨ、温度、圧力、撹拌速度、溶存酸素レベル、液内容、泡レベル、供給添加速度及び酸と塩基の添加速度をモニターするための装置／センサーを含みうる。さらに、発酵槽は、細胞密度のレベル、代謝産物の濃度及びそれらの生理化学的な形状にかかわらない生成物をモニターするための光学装置を具備しうる。揮発性化合物の形成及び消費は、発酵槽へのガス入口及び発酵槽からのガス出口におけるガス分析を使用してモニターされる。モニターされた変数の全ての信号は、変数を予め定められた範囲内に維持するか、又は時間に関して予め定められたプロファイルに従い連続的に変化させることを可能にする制御目的に使用することができる。また、変数は、他のモニターされた変化からの信号変化に応じて制御される。
【００９２】
発酵中に生産される所望の生成物は、可溶性細胞外物質として又は可溶性物質ないしは凝集した物質を含む不溶性物質のいずれかの形態の細胞内物質として存在する。生成物の形成は、恒常的又は誘導されるものであり、微生物の成長に依存しているか又は独立したものである。発酵プロセスは、１００ｍＬから２０００００Ｌの範囲の作業容量を有するタンク内で実施される。発酵プロセスは、バッチプロセス、流加(フェドバッチ)プロセス、反復流加プロセス又は連続プロセスとして操作されうる。
【００９３】
バッチプロセスとは、微生物がタンクに加えられる前に、無菌の培地が発酵槽内に含まれている発酵を意味する。この工程の間、酸、塩基、消泡剤、阻害薬、安定剤及びインデューサーが自動的に又は手動で加えられる。酸及び塩基は、溶液として又はガス状成分として加えられる。これらの成分は１つの供給ラインから添加されてもよいし、異なるラインで発酵槽に供給されてもよい。発酵槽内容物は、発酵プロセスの間に分析のために取り出されるだけである。発酵槽の全ての内容物は発酵プロセス終了時に回収される。しかしながら、逐次のバッチプロセスでは、発酵糟の内容物は部分的に回収されるのみであって、発酵糟に新鮮な無菌の培地を再度充填し、更なるバッチ発酵を実行させる。
【００９４】
流加プロセスは、微生物が加えられる前に、一部の培地のみが発酵槽に充填される発酵である。残りの培地成分又は既に一部が添加された培地成分の残りの量は、一パルスとして、一連の不連続なパルスとして、又は一定速度ないしは可変速度で添加される連続流量として、発酵槽に供給される。流加プロセスに先立ち、バッチプロセスを行い、続いて流加運転モードを行うことができる。この工程の間に発酵槽に加えられる培地成分は、限定するものではないが、増殖制限成分、微量可溶性成分、揮発性成分又は液体環境中で限られた安定性を有する成分からなる。微生物の成長速度は、発酵槽に加えられる培地成分の速度の調整によって制御されうる。このプロセスの間、酸、塩基、消泡剤、阻害薬、安定剤及びインデューサーが、自動又は手動で加えられる。酸及び塩基は、溶液の一部として又はガス状の成分として加えられる。流加プロセスの間に加えられる全ての成分は、１つの供給ラインから添加されてもよいし、異なるラインで発酵槽に供給されてもよい。発酵槽内容物は、発酵工程の間に分析のために取り出されるだけである。発酵槽の全ての内容物は工程の終了時に回収される。
【００９５】
流加プロセスの変法は反復流加プロセスである。反復流加発酵は流加プロセスと同様に実施するが、一部の発酵槽内容物を工程の間に一又は数回取り除く。一部の発酵槽内容物の除去の後に、新鮮な培地を加えてもよい。新鮮な培地の添加の後にバッチプロセスを行い、流加プロセス操作を再開してもよい。新鮮な培地の組成物と流加プロセスの間に加えられる培地は、必ずしも同一であるというわけではない。
【００９６】
連続プロセスとは、微生物が加えられ、発酵が始まる前に、いくらかの培地が加えられるタンク内での発酵を意味する。阻害薬、インデューサー、消泡剤、酸、塩基及び生成物を安定させる成分と共に増殖のために必要な全ての培地成分を含む新鮮な培地が、連続的に加えられる。用いた培地の安定性を増すかその質を改善するために、これらの成分は異なる供給ラインで発酵槽に供給されてもよいし、１つの供給ラインから添加されてもよい。酸及び塩基は、溶液の一部として又はガス状の成分として加えられる。すべての成分は、一連の不連続なパルスとして、又は一定速度ないしは可変速度で添加される連続流として、発酵槽に加えられる。発酵槽内容物の回収は、所定の範囲内に発酵槽の内容物を維持するために、連続的に行われる。微生物の増殖は、発酵糟への培地添加の速度、並びに発酵槽内容物の調整によって、制御されてもよい。
【００９７】
培地とは、少なくとも一の炭素源、一又は複数の窒素源、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、リン酸塩、硝酸塩及び硫酸塩の塩類を含む必須塩類、微量金属、水溶性ビタミン、限定するものではないがプロテアーゼインヒビター、安定剤、リガンド、消泡剤及びインデューサーを含むプロセス助剤を含有する溶液を意味する。培地は、熱による殺菌を含むいくつかの操作条件下で液体培地中に分散するか又は部分的に沈殿する成分を含有してもよい。培地は、いくつかの液体とガス状の溶液を混合することによって作製してもよい。これらの溶液は発酵槽に入れる前に混合されうるか、又は所定の比率で加えられる異なる液体流として発酵槽に供給される。培地成分の異なる溶液間の比率は、発酵プロセスの様々な段階で変化してもよく、これは、培地の組成物全体が発酵プロセスの間に異なってもよいことを意味している。以下の表は、異なる培地成分の濃度範囲の一覧を含む。これらの濃度は、加えた培地成分の全量を発酵糟中の培地の初期容量で除して算出される。連続的な培養のための培地濃度は、発酵槽に入れる培地中の濃度として含まれる。
【００９８】
以下の表は、発酵培地の典型的な成分の概要である。
0005503968.tif 000003
0005503968.tif 000004
【００９９】
この発明のインスリンアナログを含む製薬用組成物は、インスリンに対して感受性である状態の治療に使用することができる。よって、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病  及び高血糖症、例えば重篤に傷害を被った人及び大手術を受けた人にしばしば見られる場合に使用することができる。任意の患者に最適な服用レベルは、使用する特定のインスリンアナログの有効性、患者の年齢、体重、身体活動性及び食餌を含む様々な因子、他の薬剤との考えられる組み合わせ、そして治療される症状の重症度に依存する。本発明のインスリンアナログの１日の投与量は、既知のインスリン組成物に関するものと同様に、当業者によって個々の患者について決定されることが推奨される。
【０１００】
インスリンアナログの製薬用組成物は通常のアジュバント及び添加剤を含み、好ましくは水溶液として製剤化される。水性媒体は、例えば塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム又はグリセロールを用いて等張にされる。さらに水性媒体は、亜鉛イオン、バッファー及び保存料を含みうる。組成物のｐＨ値は所望値に調節され、約４〜約８．５であってよい。
製薬用組成物は、通常のアジュバント、例えば安定化、保存又は等張に適した一又は複数種の薬剤、例えば亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールを含む。
【０１０１】
医薬に使用されるバッファーは、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択されうる。
【０１０２】
製薬的に許容可能な保存料は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサール(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（３ｐ-クロロフェノキシプロパン-１,２-ジオール）又はそれらの混合物からなる群から選択され得る。本発明のさらなる実施態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様では、保存料は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる態様では、保存料は５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる実施態様では、保存料は１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の保存料の各一が本発明の別の実施態様を構成する。製薬用組成物に保存料を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１０３】
等張剤は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、１,３-ブタンジオール)ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用することもできる。一実施態様では、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述の糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用することができる。糖又は糖アルコールが液状調製物に可溶性であり、本発明の方法を使用して達成される安定化効果に悪影響を与えない限りは、使用量に決まった限界はない。一実施態様では、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。本発明のさらなる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している、本発明のさらなる実施態様では、等張剤は１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる実施態様では、等張剤は８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。本発明のさらなる実施態様では、等張剤は２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。製薬用組成物に等張剤を使用することは、当業者によく知られている。簡便には、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が参照される。
【０１０４】
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに説明されるかの如く、その全体が出典明示によりここに援用される(法律により許容される最大範囲)。全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決して本発明を限定するものと解してはならない。ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語（例えば「等」）の使用は、単に本発明をより明らかにすることを意図しており、特に請求項に記載がない限り、本発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素が本発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。この発明は、適用される法律に容認される場合、ここに添付される特許請求の範囲に記載された全ての主題事項の変形態様及び均等物を含む。
【実施例】
【０１０５】
一般的手順
全ての発現プラスミドは、欧州特許第１７１１４２号に記載されているものと類似するＣ-ＰＯＴタイプのものである。これらは、S. cerevisiaeにおけるプラスミドの選択及び安定化の目的のために、Schizosaccharomyces pombeトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(ＰＯＴ)を含むことにより特徴付けられる２μベースの発現ベクターである。また、該プラスミドは、S. cerevisiaeトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター及びターミネーター(図１)を含む。これらの配列は、１）リーダー及びインスリン産物の融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ-Ｘｂａｌ断片の配列、及び２）発現ベクターの２μ領域におけるＮｃｏＩ部位の除去を生じるサイレント変異が導入された点を除き、全ての配列が、プラスミドｐＫＦＮ１００３(国際公開第９０１００７５号に記載)における対応配列に類似している。異なった融合タンパク質のクローニングを容易にするために、ＭＦα１プレプロリーダーをコードするＤＮＡ配列が改変されてＮｃｏＩ部位が導入され(図２を参照)、ＭＦα１＊プレプロリーダーと呼ばれる。このようにＮｃｏＩ-Ｘｂａｌ断片は、関心あるインスリンコンストラクトをコードするＮｃｏＩ-Ｘｂａｌ断片によって単に置き換えられる。このようなＮｃｏＩ-Ｘｂａｌ断片は、標準的な技術に従い、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲを使用して合成されうる。アルファ-リーダーに加えて、他のリーダーを使用することもできる。
【０１０６】
酵母形質転換体は、宿主菌株であるS. cerevisiae株ＭＴ６６３又はＭＥ１７１９の形質転換により調製した。酵母菌株ＭＴ６６３(ＭＡＴａ／ＭＡＴα ｐｅｐ４-３／ｐｅｐ４-３ ＨＩＳ４／ｈｉｓ４  Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２／Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２ Ｃｉｒ’)は、国際公開第９２ｌ１１３７８号に関連して、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託されており、寄託番号ＤＳＭ６２７８が付与されている。S. cerevisiae菌株ＭＥ１７１９(ＭＡＴａ／α ｌｅｕ２／ｌｅｕ２  ｐｅｐ４-３／ｐｅｐ４-３ Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２／Δｔｐｉ：：ＬＥＵ２ Δｕｒａ３／Δｕｒａ３ Δｙｐｓ１：：ＵＲＡ３／Δｙｐｓ１：：ｕｒａ３ Ｃｉｒ＋)は国際公開第９８／０１５３５号に記載されている。
【０１０７】
ＭＴ６６３又はＭＥ１７１９を、ＹＰＧａＬ(１％バクトイースト抽出物、２％バクトペプトン、２％ガラクトース、１％ラクテート)上で６００ｎｍでのＯ.Ｄ.が０．６になるまで増殖させた。培養物１００ｍｌを遠心分離にて回収し、１０ｍｌの水で洗浄し、再遠心分離し、１．２Ｍ ソルビトール、２５ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ＝８．０及び６．７ｍｇ／ｍｌのジチオトレイトールを含む１０ｍｌの溶液に再懸濁させた。該懸濁液を３０℃で１５分インキュベートし、遠心分離し、細胞を、１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ０５．８、及び２ｍｇのNovozymC3234を含む１０ｍｌの溶液に再懸濁した。懸濁液を３０℃で３０分インキュベートし、遠心分離により細胞を収集し、１０ｍｌの１．２Ｍソルビトールと１０ｍｌのＣＡＳ(１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣＩ２、１０ｍＭのトリスＨＣＩ(トリス＝トリス(ヒドロキシメチル１)-アミノメタン)ｐＨ＝７．５)で洗浄し、２ｍｌのＣＡＳに再懸濁させた。形質転換のために、１ｍｌのＣＡＳ懸濁細胞を、約０．１ｍｇのプラスミドＤＮＡと混合し、室温で１５分放置した。１ｍｌの(２０％のポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭのＣａＣＩ２、１０ｍＭのトリスＨＣＩ、ｐＨ＝７．５)を添加し、混合物を室温でさらに３０分放置した。この混合物を遠心分離し、ペレットを０．１ｍｌのＳＯＳ(１．２Ｍのソルビトール、３３％ｖｌｖのＹＰＤ、６．７ｍＭのＣａＣＩ２)に再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。ついで、懸濁液を遠心分離し、ペレットを０．５ｍｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁した。ついで、６ｍｌのトップアガー(１．２Ｍのソルビトールと２．５％の寒天を含む、Shermanら (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor LaboratoryのＳＣ培地)を５２℃で添加し、同じアガーを固化させたソルビトール含有培地を含むプレートの上に懸濁液を注いだ。
【０１０８】
実施例１
インスリン前駆体Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号４５)-Ａ(１-２１)のための酵母発現系の構築
図１には、ｐＥＳＩ４２-３３と呼ばれる酵母プラスミドが示されている。該プラスミドは、S. cerevisiaeＴＰＩ遺伝子の転写プロモーターと転写ターミネーターとの間のプラスミドに挿入されたＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片を含む発現カセットを含んでいる。プラスミドｐＥＳＩ４２-３３において、ＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩ断片は、ＭＦα１＊プレプロリーダー、二塩基プロセシングエンドペプチダーゼＫｅｘ２に対するＬｙｓ-Ａｒｇ切断部位、及びインスリン前駆体Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号４５)-Ａ(１-２１)からなる融合産物をコードしている。
【０１０９】
インスリン前駆体Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号４５)-Ａ(１-２１)をコードする配列を含むＤＮＡ断片を、合成オリゴヌクレオチド及び標準的なＰＣＲ増幅を使用して構築した。得られたＰＣＲ断片を精製し、ＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、修飾されたｃＰＯＴ型の発現ベクターのＮｃｏＩ-ＸｂａＩベクター断片にライゲーションさせた(図１)。発現プラスミドを、大腸菌中で増殖させ、アンピシリンの存在下で増殖させ、標準的な技術を使用して単離した(Sambrookら, 1989)。プラスミドＤＮＡを適切な制限ヌクレアーゼによる挿入についてチェックし(例えば、ＥｃｏＲＩ、ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ)、配列分析により、インスリン前駆体Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号４５)-Ａ(１-２１)の適切な配列を含むことが示された。図２に、ＮｃｏＩ-ＸｂａＩ断片のＤＮＡ配列、及び配列番号４６に対応する対応のアミノ酸配列が示されている。プラスミドをS. cerevisiae菌株ＭＴ６６３に形質転換させた。プラスミドを有する酵母形質転換体を、ＹＰＤ(１％の酵母抽出物、２％のペプトン、２％のグルコース)アガー(２％)プレート上で炭素源としてのグルコース利用率によって選別した。
【０１１０】
実施例２
発酵ブロスへのＣＰＹの直接添加によるインスリン前駆体のプロセシング
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ(１-３０)-ＬＡＲＲＤＬＧＫＲ(配列番号４５)-Ａ(１-２１)の発現についてプラスミドを用いて形質転換されたS. Cerevisiae菌株ＭＴ６６３を、５ｇ／Ｌの(ＮＨ４)２ＳＯ４、１８４ｍｇ／Ｌの(ＮＨ４)２ＨＰＯ４、２．８８ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１．４２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・Ｈ２Ｏ、１．２８ｇ／ＬのＫ２ＳＯ４、１０．００ｇ／Ｌのコハク酸、１０．００ｇ／Ｌのカザミノ酸、０．０１１２ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００８６ｇ／ＬのＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、０．００１４ｇ／ＬのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．００１８５ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１２９ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０７１ｇ／Ｌのクエン酸、２８．０ｍｇ／Ｌのｍ-イノシトール、１４．０ｍｇ／Ｌの塩化コリン、２．８ｍｇ／Ｌのチアミン、２．８ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド、２．１ｍｇ／ＬのＣａ-パントテン酸、０．１４ｍｇ／Ｌのビオチン、０．１４ｍｇ／Ｌの葉酸、４０ｇ／Ｌのグルコースからなる５ｍｌの培地に播種した。３０℃で３日間培養した。発酵ブロスのＬＣ-ＭＳ分析により、分泌された全インスリン種の〜５０％が、十分にプロセシングされたことが示唆された(Ｍｗ＝５７６３)。残った〜５０％は、ＬＡで伸長したＢ鎖のＣ末端を有するインスリン(Ｍｗ＝５９４７)であった。ＬＡ伸長のタンパク質分解的除去について、１００μｌの発酵ブロスを、S.cerevisiae(〜０．１単位)から精製された０．８μｌのＣＰＹに添加し、ＬＣ-ＭＳ分析の前に、３０℃で５分、インキュベートした。このことにより、ＬＡ伸長が完全に除去されたことが示された。
【０１１１】
実施例３
実施例１に記載されたようにしてさらなるインスリンアナログを調製した。発現収率を、欧州特許第１６３５２９号に開示されたインスリン前駆体：Ｂ(１-２９)-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ａ(１-２１)(ＭＴ７４８)の発現収率と比較した。さらに、Ｋｅｘ２により十分にプロセシングされた割合を測定し、Ｂ鎖のＣ末端伸長を有していないインスリンと比較した。全てのインスリンアナログはＡ１４Ｅ及びＢ２５Ｈ変異を有している。
結果を以下の表に表す。
0005503968.tif 000005
【０１１２】
実施例４
発酵ブロスへのＣＰＹ及びＤＡＰ１の直接添加による単一Ｋｅｘ２部位でのインスリン前駆体のプロセシング
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ(１-３０)-ＬＧＲＲＥＡＥＡ(配列番号４７)-Ａ(１-２１)の発現についてプラスミドを用いて形質転換されたS. cerevisiae菌株ＭＴ６６３を、実施例２に記載されたようにして、５ｍｌの培地に播種した。
３０℃で３日間培養した。発酵ブロスのＬＣ-ＭＳ分析により、分泌された全インスリン種の〜５０％が、Ｋｅｘ１及びＫｅｘ２によりプロセシングされ、ＬＧで伸長したＢ鎖のＣ末端、及びＥＡＥＡで伸長したＡ鎖のＮ末端を有する形態(Ｍｗ＝６３３３)に至ることが示唆された。残った〜５０％はプロセシングされていない前駆体(Ｍｗ＝６６２８)であった。
ＬＧ伸長のタンパク質分解的除去について、１００μｌの発酵ブロスを、S.cerevisiae(〜０．２単位)から精製された１．６μｌのＣＰＹに添加した。ＥＡＥＡ(配列番号３)を除去するために、ニワトリの肝臓から精製された５μｌ(〜０．１単位)のＤＡＰ１(カテプシンＣ、ＥＣ３．４．１４．１)を添加した。ＬＣ-ＭＳ分析の前に、混合物を３０℃で２００分インキュベートした。このことにより、ＬＧ伸長が完全に除去され、〜７５％のＥＡＥＡ(配列番号３)伸長が除去され、成熟したインスリンアナログＡ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ-ＬＧＲＲＥＡＥＡ(配列番号４７)-(Ａ１-２１)(Ｍｗ＝５７６３)が得られたことが示された。
【０１１３】
実施例５
実施例１に記載されたようにしてさらなるインスリンアナログを調製した。発現収率を、上述したインスリン前駆体ＭＴ７４８の発現収率と比較した。全てのインスリンアナログはＡ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ変異を有する。
結果を以下の表に表す。
0005503968.tif 000006
【０１１４】
実施例６
実施例１に記載されたようにしてさらなるインスリンアナログを調製した。これらのアナログにおいて、Ｘ１はＬＡであり、Ｘ２はＲＲであり、Ｘ３はＫＲであり、及びＸ４は結合であり、変異はＡ１４Ｅ及びＢ２５Ｈであり、ここでＺは変化する。発現収率を、上述したインスリン前駆体ＭＴ７４８の発現収率と比較した。
結果を以下の表に表す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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