(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地（２０）において細胞を培養するために企図された柔軟バイオリアクタであっ
て、前記バイオリアクタ（１）は、使用時に前記バイオリアクタの流体不透過性下部壁（
２）を形成する柔軟壁を備え、前記柔軟下部壁の複数の柔軟部分（３）には、前記柔軟下
部壁の少なくとも１個の剛性要素（４）が割り込んでおり、前記剛性要素（４）および前
記柔軟部分（３）は流体密で連結され、前記剛性要素は、使用時に前記バイオリアクタの
中の細胞活性を損なうことなく監視することを可能にする測定手段（１０；１１０）を備
え、前記剛性要素は、少なくとも１個の測定手段を取り囲む壁を備え、それによって測定容器を形成する、バイオリアクタ。
【請求項２】
前記剛性要素（４）は、前記下部壁（２）の前記柔軟部分（３）と流体密連結を形成す
るように、前記柔軟部分（３）に封止連結される結合要素（７）を備え、前記剛性要素は
、前記結合要素と流体密連結を形成するように、前記結合要素に封止連結される挿入要素
（８）をさらに備える、請求項１に記載のバイオリアクタ。
【請求項３】
前記結合要素は、固締によって前記挿入要素（８）を保持するホース・バーブ（７）で
あり、前記挿入要素は、楔形状である、請求項２に記載のバイオリアクタ。
【請求項４】
前記測定手段は、透明で非蛍光性の材料の表面（９）を有し、この表面は平面的な表面
を有する前記剛性要素（４）によって形成され、前記表面には、前記バイオリアクタ（１
）の内部に面する少なくとも１個のセンサ要素（１０）が設けられる、請求項１から３の
いずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項５】
前記少なくとも1個のセンサ要素（１０）は、発光または蛍光染料を含むセンサであり、前記センサは（平面）酸素センサまたはｐＨセンサである、請求項４に記載のバイオリアクタ。
【請求項６】
前記測定手段は、少なくとも１つの検体の通過を可能にする膜（１１０）が介在する前
記剛性要素（４）によって形成され、前記検体は細胞活性の指標である、請求項１から３
のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項７】
壁（１１）は前記バイオリアクタ（１）の内部空間の中へ突き出す、請求項６に記載の
バイオリアクタ。
【請求項８】
壁（１１）は、前記バイオリアクタの使用時に、前記下部壁（２）の前記柔軟部分（３
）の下方に位置する測定容器を形成するために、前記バイオリアクタ（１）の内部空間か
らそれる、請求項７に記載のバイオリアクタ。
【請求項９】
前記剛性要素は、前記バイオリアクタを収容または保持するための支持構造（５）に前
記バイオリアクタの前記下部壁を着脱自在に固定することをさらに可能にする、請求項１
〜８のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項１０】
前記剛性要素（４）は、前記剛性要素およびアダプタ要素が真空圧を利用して相互に固
定可能になるように、前記アダプタ要素（６）と協働するように配置されており、前記ア
ダプタ要素は、前記支持構造（５）に固定して連結されるように配置される、請求項９
に記載のバイオリアクタ。
【請求項１１】
前記下部壁（２）の前記柔軟部分（３）は、透明または透光性の柔軟プラスチックから
作製され、この柔軟プラスチックはポリエチレンまたはポリプロピレンから成る、請求項
１〜１０のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項１２】
前記剛性要素（４）は少なくとも一部が、透明の硬化プラスチックから作製され、この
硬化プラスチックはポリエチレンまたはポリカーボネートから成る、請求項１〜１１のい
ずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項１３】
前記バイオリアクタ（１）が使い捨てで滅菌可能なプラスチック・バッグ（１）であり、このプラスチック・バッグは波動を利用して細胞を培養するためのバッグである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のバイオリアクタ。
【請求項１４】
前記バッグ（１）の下部を形成する前記柔軟壁（２）は、実質的に前記バッグの前記下
部壁（２）の対称軸（１２）に沿って配置された少なくとも２個の前記剛性要素（４）を
備え、前記少なくとも２個の剛性要素の少なくとも一つには測定手段（１０；１１０）が
設けられる、請求項１３に記載のバイオリアクタ。
【請求項１５】
前記バッグの下部を形成する前記柔軟壁（２）には、使用時に前記バッグ（１）の有効
容積を調整する調整手段（１４、１５）がさらに設けられ、前記調整手段は、押付具（２
１）と協働して動作することができる、請求項１３または１４に記載のバイオリアクタ。
【請求項１６】
前記バッグ（１）は実質的に長方形または正方形の形状であり、前記調整手段は、前記
バッグの前記下部壁（２）に設けられた中空シーム（１５）の中に収納される２本の棒（
１４）を備え、２本の前記棒のそれぞれが、２つの前記シームのそれぞれの中に収納され
て、相互に平行にかつ前記バッグの対になった対向する２つの平行縁部（１６）のそれぞ
れに平行に配置され、各棒およびそれに対応するシームが、前記対になった対向する２つの平行縁部（１６）から、前記２つの対向する平行縁部間の間隔の５分の１から３分の１の間隔をおいて位置決めされる、請求項１５に記載のバイオリアクタ。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の柔軟バイオリアクタ（１）において細胞を培
養する装置であって、前記バイオリアクタと、使用時に前記バイオリアクタの中の細胞活
性を損なうことなく監視することを可能にするために、前記バイオリアクタの前記測定手
段（１０；１１０）と協働して動作するように適合された少なくとも１つの監視具（１７
）とを収容または保持するための支持構造（５）を備える装置。
【請求項１８】
前記剛性要素およびアダプタ要素が真空圧を利用して相互に固定可能になるように、前
記バイオリアクタの前記下部壁（２）の前記剛性要素（４）と協働するための前記アダプ
タ要素（６）をさらに備え、前記アダプタ要素は、前記支持構造（５）に固定して連結さ
れるように配置される、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記監視具は光ファイバであり、前記光ファイバは、前記光ファイバが、前記バイオリ
アクタ（１）の前記下部壁（２）に設けられたセンサ要素（１０）によって生成されたセ
ンサ信号を読取りできるように配置される、請求項１７または１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記光ファイバ（１７）は前記アダプタ要素（６）に連結される、請求項１８に従属す
る限りにおいて、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記液体培地（２０）の波動を利用して細胞を培養する装置である、請求項１８から２
０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２２】
前記バイオリアクタ（１）を動かし、それによって前記液体培地（２０）の前記波動を
誘発するように、前記支持構造（５）の少なくとも一部を動かすための駆動機構を備え、
前記駆動機構は、少なくとも１つの空圧式または油圧式のシリンダ−ピストン・アセンブ
リ（１８）を備える、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
少なくとも１つのエネルギー吸収配置物（１９）が設けられ、前記エネルギー吸収配置
物は、動作に際して前記支持構造（５）に当接するように配置された、ばねベースの衝撃
吸収体から成る、請求項２２に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野と液体増殖培地における細胞の培養とに関する。本発明は、とりわけ、バイオリアクタをバイオリアクタ支持構造に着脱自在に固定することを可能にするように特定的に適合された柔軟で使い切りのバイオリアクタ・バッグに関する。本発明は、特に、細胞の細胞活性、例えば代謝活性、を損なうことなくかつ精確に監視するように特定的に適合された柔軟バイオリアクタに関する。また本発明は、この改良バイオリアクタを使用して細胞を培養する装置および細胞を培養する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
液体培地において細胞を培養するための柔軟な使い捨てのバイオリアクタが当業界で知られている。米国特許第６１９０９１３号は、様々なタイプの細胞に対する滅菌使い捨て培養チャンバとなる膨張式プラスチック・バッグの使用を開示する。このバッグは、内部に収容された液体に穏やかな波状運動を誘発するために揺動台の上に置かれて、液体を混合させ、ヘッドスペース・ガスから、細胞増殖および代謝にとって不可欠である液相への酸素移動を向上させる。拘束紐が、この台からバッグが滑脱するのを防止する。揺動速度は、１分間当たり１揺れから３０揺れである。
【０００３】
また欧州特許第１１７３５４２号は、波動を利用して細胞を培養するためのバイオリアクタ・バッグに関する。この特許では、バッグが、固締具によって水盤形容器の中の両側に保持される。この水盤形容器は、振動水平軸回りに振動できる振動枠の中に配置される。可動または揺動台の上にバイオリアクタを保持するための同様の構造が、国際公開第２００６／０１７９５１号に提案されている。
【０００４】
国際公開第０３／０２８８６９号は、流体撹拌要素、例えば磁気羽根車、のための収納器を有する混合用バッグまたは容器を開示する。この容器は、流体撹拌要素が容器の中に位置決めされるときに、その要素をホーム位置に収納しかつ保持するための第１の収納器を含む剛性部分を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一態様は、柔軟バイオリアクタをその支持構造に固定する方法に関する。支持構造に所定の位置で着脱自在にかつ安定して固定可能であり、しかも最小限の取扱いのみで済む使い捨てのバイオリアクタ、例えばバイオリアクタ・バッグ、が開示される。特定の態様が、揺動台に固定可能であり、たとえ高い撹拌速度、例えば国際公開第２００７／００１７３号に開示された毎分４０〜５０回転を超える速度、を使用する場合であっても、使用中にバッグの精確で安定的な位置決めを保証する柔軟バイオリアクタ・バッグに関する。
【０００６】
液体培地を含む流体の中で細胞を培養することが企図された柔軟バイオリアクタが開示されるが、このバイオリアクタは、使用時にバイオリアクタの流体不透過性下部壁を形成する柔軟壁を備え、該柔軟下部壁の複数の柔軟部分には、該柔軟下部壁の少なくとも１個の剛性要素が割り込んでおり、この剛性要素は、バイオリアクタを収容または保持するための支持構造にバイオリアクタの下部壁を着脱自在に固定することを可能にする。少なくとも１個の剛性要素は、バイオリアクタをバイオリアクタ支持構造の中に精確に位置決めすることを可能にし、バイオリアクタの使用時に、支持構造に設けられたアダプタ要素と協働して動作する。例えばその柔軟下部壁の中に多剛性要素を備えるバイオリアクタが、対応する個数のアダプタ要素を介して支持構造の上に着脱自在に固定される。完全に柔軟な壁とは異なり、バイオリアクタの局部的に「剛性化された」下部は、バイオリアクタをバイオリアクタ筐体に安全に装着および脱着するのに必要とされる圧力および取扱いに耐えうる。任意の種類の適切な構造対が、剛性要素−アダプタ要素の組合せ、例えばプラグ・アンド・ソケット構造、に使用されうる。その構造は、着脱自在の固定システムを設けるために、戻止め機構および／または楔形構造の使用を伴ってよい。
【０００７】
特定の態様では、剛性要素およびアダプタ要素が、真空圧を利用して相互に固定可能になるように、剛性要素は、アダプタ要素と協働するように配置され、アダプタ要素は、支持構造に固定して連結されるように配置される。一旦、本発明のバイオリアクタが筐体の上に適切に位置決めされると、バイオリアクタをその位置に固定するために、真空が、例えばアダプタ要素を介して、印加される。動作中、例えば揺動中、真空が維持される。培養過程の終了後、真空が解除されて、バイオリアクタは簡便に支持構造から取り外される。アダプタ要素からの解放をさらに容易化するために、正の圧力が印加されうる。この方法は、バイオリアクタに大量の（仕上がった）細胞培養物が満たされている場合に煩雑で危険性が高くなりうる、バイオリアクタの下部における多大な手作業による脱着を必要としない。
【０００８】
この少なくとも１個の剛性要素は、様々な形状および寸法を有しうる。それらは、未使用時に、柔軟バイオリアクタのコンパクトな容積を可能にする程に十分に小さいことが好ましい。一般に、剛性下部部分の総面積は、バイオリアクタの下部壁全体の１０パーセントを超えることがなく、好ましくは５パーセント以下である。剛性要素の断面は、円形、長方形、または正方形でありうるが、しかし他の形状も包含される。個々の剛性要素の総数も様々でありうる。製造過程の観点でも、下部が１０個までの、好ましくは８個までの、より好ましくは６個までの、最も好ましくは４個までの剛性要素を含むことが推奨される。剛性要素の相対的な位置決めは、自由に選択されうる。バイオリアクタを安定的かつ均衡して固定する観点では、多少均一な分布が推奨されうる。剛性要素は、対称軸、好ましくは中心対称軸に沿って位置決めされうる。バイオリアクタの有効容積が調整可能である場合には（例えば国際公開第２００７／００１７３号とさらには本明細書の以下とを参照されたい）、使用時にバイオリアクタの下部をその最小容積構成で形成する下部壁の区分の中に剛性要素を位置決めすることが実践的である。
【０００９】
剛性要素の総個数、形状、および寸法ばかりでなく、それらの空間配向も、筐体上の対応するアダプタの総個数、形状、寸法、および空間配向に合わせて調節されることを当業者は理解しよう。
【００１０】
剛性要素は、様々な手段によってバイオリアクタの柔軟下部壁に流体密で連結されうる。柔軟および剛性下部区分のそれぞれの材料に応じて、これらの区分は、流体密連結を形成するために一体に封止されうる。例えば剛性要素を備えるフランジ部品が、加熱によって柔軟壁部分に緊密に封止されうる。
【００１１】
別法として、例えばこれらの材料が一体に封止されえない場合に、剛性要素は、下部壁の柔軟部分と流体密連結を形成するようにこれらの柔軟部分に封止連結される結合要素を備え、他方で剛性要素は、この結合要素と流体密連結を形成するようにこの結合要素に封止連結される挿入要素をさらに備える。結合要素は、例えば固締によって挿入要素を保持するホース・バーブであり、挿入要素は、当該目的では僅かにテーパ付きであるかまたは別様に楔形状であることが好ましい。
【００１２】
柔軟壁は一般に、バイオリアクタの中へ光の進入を可能にし、かつ所望であればバイオプロダクション／バイオプロセスの視覚的検査を許容するために、透明または透光性の柔軟プラスチックから作製される。適切な柔軟プラスチックは、ＰＶＣ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、Ｈｙｐａｌｏｎ（登録商標）、ＨＤＰＥ、ＥＰＤＭ、ＸＲ−５（商標）、Ｃｏｏｌｇｕａｒｄ（商標）、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）である。プラスチックの種類および厚さは、支持構造のサイズを含む幾つかの変数に応じる。
【００１３】
剛性要素に適切な材料には、ポリエチレン、ポリカーボネート、および同様の重合体材料が含まれる。以下でさらに詳説されるように、一実施形態では、剛性要素が透明で非蛍光性の材料から作製される。
【００１４】
本明細書で使用される「剛性」という用語は、過剰な曲げまたは変形が不可能であるか、またはこれらに耐える任意の非柔軟性または固い材料を指す。剛性要素が、使用時にバイオリアクタの下部を形成する壁の柔軟部分の材料よりも柔軟性が低い材料から作製される。しかし、剛性要素の材料と柔軟壁の材料とは、これらの化学的組成の点では同じであるかまたは異なりうる。両方の材料が、バイオリアクタを滅菌するために利用されことになる滅菌処理の種類に耐えうることが推奨される。
【００１５】
一態様では、下部壁の柔軟部分と剛性要素とは同じ材料から作製される（例えば柔軟なポリエチレンの下部壁および硬化ポリエチレン製の少なくとも１個の剛性要素）。上で示唆されたように、下部壁の剛性要素および柔軟部分の材料は、これらが剛性および柔軟材料を一体に封止することを可能にし、それによって流体密連結を形成するように選択されうる。別の態様では、下部壁の剛性要素材料および柔軟部分材料は、これらの化学的組成の点で異なる。下部壁の柔軟部分は、剛性要素のポリエチレン結合要素が封止される柔軟ポリエチレン・シートによって形成されうる。この実施形態では、剛性要素は、ポリカーボネートのような透明材料から作製される挿入要素を備える。この透明な挿入要素は結合要素の中に固締されうる。
【００１６】
また本発明は、バイオリアクタ支持構造の上に存在する手段と共に動作する、バイオリアクタの下部壁の中に存在する手段によって、バイオリアクタをこの支持構造に着脱自在に固定するステップを含む、液体培地を含む流体の中で柔軟バイオリアクタを使用して、好ましくは波動を利用して細胞を培養する方法に関する。該手段は、本発明による１個または複数の剛性要素およびアダプタ要素を備えることが好ましい。
【００１７】
本発明の目的は、細胞の細胞活性、例えば代謝活性、を損なうことのない精確な監視、好ましくはオンライン監視に特定的に適合される柔軟バイオリアクタを提供することである。特定の目的は、特に細胞が波動を利用して培養される場合に、信頼性があり精確なオンライン読取りを可能にするバイオリアクタ・バッグを提供することである。細胞の代謝活性を監視する手段を備える柔軟バイオリアクタが当業界で知られている。例えば国際公開第２００６／０１７９５１号は、リアクタ・バッグの上側に配置された筐体支持体を有するバッグ形状の柔軟バイオリアクタを開示する。この筐体支持体は、バッグの内部の中へ張り出して、バイオリアクタの内容物と接触する透明センサ部品および指標タイルを備え、この内容物は、筐体支持体の中へそれ自体が導入されかつ表示機器に接続されうる光ファイバによって走査されうる。筐体支持体には、容器壁に緊密封止されたフランジ部品が設けられる。国際公開第２００６／０１７９５１号は、このフランジ部品が管状連結体部品によってセンサ部品に連結されうることを示唆し、その場合に連結体部品の長さが、センサ部品が反応物質の中へ常時届くようになっている。
【００１８】
国際公開第２００６／０１７９５１号で提案されたセンサおよび光ファイバの配置は、細胞の代謝活性の滅菌測定を行うことを可能にしうるが、一方で本発明者らは、特に細胞が波動を利用して培養される場合に、信頼性のある精確なオンライン読取りを実現することが非常に困難であることを経験した。波動を利用して細胞を培養することが当業界で知られており、例えば米国特許第６１９０９１３号および国際公開第２００７／００１７３号を参照されたい。それは、所定の様態で揺動される揺動台に固定されたバッグ形状のバイオリアクタの使用を典型的に含む。揺動運動は、バッグの中で、液体混合を実現しかつヘッドスペース・ガスから、細胞増殖および代謝にとって不可欠である液相への酸素移動を向上させる波形成を促進する。しかし、国際公開第２００６／０１７９５１号のバイオリアクタを使用するとき、しばし揺動運動は、センサ部品が、反応物質と接触するのではなくて、バッグの内部の気相と一時的に接触するように、筐体支持体を増殖培地から揺り出させる。その結果として、得られた信号、例えばｐＨまたは酸素水準、が細胞の代謝活性を精確に反映しない。
【００１９】
国際公開第２００６／０１７９５１号に説明された配置の別の欠点は、光ファイバが、培地の中に突っ込む筐体の一部であり、したがって波動の影響を同様に受けることに関する。この運動は、恐らくは光ファイバの先端とセンサ部品との間の間隔における変動により、読取精度に悪影響を及ぼす。
【００２０】
本発明者らは、驚くべきことに、柔軟バイオリアクタの下部の中にある剛性要素が細胞活性を監視するために有利に使用されうることを見いだした。より具体的には、剛性下部区分は、バイオリアクタの下部を支持構造に固定する手段として使用されうるばかりでなく、それは、別法としてまたは追加的に細胞活性を損なうことなく監視することを可能にする手段のための担持体としての役目を果たすことも可能であり、例えばその場合にこの手段はセンサ要素を備える。したがって、本発明は液体培地において細胞を培養するために企図された柔軟バイオリアクタに関し、このバイオリアクタは、使用時にバイオリアクタの流体不透過性下部壁を形成する柔軟壁を備え、該柔軟下部壁の複数の柔軟部分には、該柔軟下部壁の少なくとも１個の剛性要素が割り込んでおり、これらの剛性要素および柔軟部分は流体密で連結されて、剛性要素は、使用時に該バイオリアクタの中の細胞活性を損なうことなく（オンライン）監視することを可能にする測定手段を備える。
【００２１】
本明細書で使用されるように、該「損なうことなく監視することを可能にする手段」とは、バイオリアクタの滅菌内部に到達する必要性を回避する、細胞活性を監視する際に関与したりまたはその際に手段となったりする任意の要素、構造、または器具を指す。したがって、それは測定手段それ自体ばかりでなく、バイオリアクタの外側で行われる実際の測定を可能とするかまたは容易にする手段も包含する。
【００２２】
一実施形態では、この測定手段は、透明で非蛍光性の材料の表面、好ましくは平面的な表面を有する剛性要素によって形成され、該表面には、バイオリアクタの内部に面する少なくとも１個のセンサ要素が設けられる。したがって、一態様では、本発明は、液体培地を含む流体の中で細胞を培養する柔軟バイオリアクタを提供するものであり、このバイオリアクタは、使用時にバイオリアクタの流体不透過性下部壁を形成する柔軟壁を備え、該柔軟下部壁の複数の柔軟部分には該柔軟下部壁の少なくとも１個の剛性要素が割り込んでおり、この剛性要素は、透明で非蛍光性の材料の表面、好ましくは平面的な表面を有して、該表面にはバイオリアクタの内部に面する少なくとも１個のセンサ要素が設けられる。
【００２３】
バイオリアクタの下部の下方に位置決めされた光ファイバ・プローブ、例えば支持構造に取り付けられたプローブ、と組み合わせると、センサとプローブとのこの組合せは、バイオリアクタの中の代謝活性を精確でかつ信頼性があって損なうことなく監視することを可能にする。有利なことに、このプローブは、支持構造に取り付けられたアダプタ要素の中に保持され、かつそれに対応する剛性要素のセンサ要素を検出することを可能にする様態で配置される。国際公開第２００６／０１７９５１号に開示された配置とは異なって、このセンサは、下部の一部であるので、細胞培養物から揺れ出ることは不可能であり、かつ反応物質とより適切な接触状態にあることになる。さらには、光ファイバ・プローブはバイオリアクタの一部ではなく、したがって波動の影響を受けることがない。少なくとも１個のセンサを備えるバイオリアクタを、例えば真空を使用して、確実にかつ精確に位置決めすることは、センサ要素と光ファイバ・プローブとの間の間隔が、高い揺動速度においてさえも、最小限に変動するに過ぎないことを保証する。
【００２４】
センサ要素のような、少なくとも１つの測定手段が設けられている剛性要素は、以降では「センサ用剛性要素」と呼ばれることに留意される。測定手段が設けられていない剛性要素は、以降では「固定用剛性要素」と呼ばれる。しかし、「センサ用剛性要素」も同様に固定手段としての役目を果たしうることが理解されるべきである。別途に示唆されていない限り、「剛性要素」という用語は、「センサ用剛性要素」ばかりでなく「固定用剛性要素」も指す。
【００２５】
本発明で使用するためのセンサ要素は当業界で知られている。それは、例えば酸素センサまたはｐＨセンサである。より好ましくは、少なくとも酸素センサおよびｐＨセンサが存在する。このセンサは、発光または蛍光染料を含みうる。別法として、それは滅菌可能な電極でありうる。一実施形態では、剛性要素には、ｐＨガラスを通る陽子の選択的拡散と、内部電解質と基準電極との間の電位測定とに基づいた従来のｐＨ電極が設けられる。基準電極は、外部にあっても（別体のセンサ）または内部にあってもよい。この電極は、ｐＨ感応先端がバイオリアクタの液体内容物に接触するように、液体密連結を実現するために、例えばシリコンを使用して、剛性挿入体の中に取り付けられる。
【００２６】
多センサ要素が単一の剛性要素の中に含まれることも企図されるけれども、異なるセンサが、別体の剛性要素の上に、好ましくは剛性要素の平面的な表面の上にまたはそれを貫通して設けられることが好ましい。センサ信号は、剛性要素の透明で非蛍光性の材料を介して、好ましくはパーソナル・コンピュータ制御式様態で外側から簡便に読み出される。
【００２７】
適切なセンサには、平面センサ要素、例えば独国のレーゲンスブルク市在のプレセンス  プレシジョン  センシング  ゲーエムベーハー（ＰｒｅＳｅｎｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  ＧｍｂＨ）によって供給されるセンサ・スポット、が含まれる。これらは、当業界で知られた柔軟バイオリアクタの下部に取り付けられることが不可能である。すなわち、バイオリアクタに使用される柔軟で透明な不活性のプラスチック材料は、例えば接着によって、センサ要素を取り付けるのに要求される条件と適合性がない。対照的に、本発明の剛性要素は、センサ要素が表面上に容易に取り付けられうる選り抜きの透明で非蛍光性の剛性材料から作製されうる。ポリカービネートが非常に適切である。別の実施形態では、細胞活性を損なうことなく監視することを可能にする手段は、少なくとも１つの検体のバイオリアクタ外部への透過を可能にする膜が介在する剛性要素を備える。この検体は細胞活性の指標である。検体が受動拡散によって膜を通過すると、検体は、輸送培地、好ましくは検体が中で溶解可能である流体に取り込まれ、検体を検出できる検体試験チャンバに輸送されうる。この概念それ自体は当業界で知られており、例えば欧州特許第１８７００３３号を参照されたい。しかし、柔軟バイオリアクタの下部に位置する剛性挿入体の中に膜を使用することは、決して開示または示唆されてこなかった。該膜は、例えば選択された孔径を有する透析膜またはフィルタ膜である。特定の実施形態では、剛性要素には酢酸セルロース膜が設けられる。この膜は、当業界で知られた方法によって剛性要素に封止または連結される。測定されうる対象となる検体には、炭水化物のような細胞増殖基質、特にグルコースと、有機酸（例えば乳酸）およびペプチドのような、細胞によって分泌される分子とが含まれる。気体の検体には酸素および二酸化炭素が含まれる。
【００２８】
本発明のバイオリアクタを使用して細胞活性を測定する他の実施形態が、例えば光学的または非光学的方法を使用する、細胞密度の測定を含む。例えば電気インピーダンス測定が実施されうる。
【００２９】
細胞活性を監視する手段、例えばセンサ要素、が細胞培養中に、例えば国際公開第２００７／００１７３号に開示された波動を利用するバッグ形状のバイオリアクタの強力な撹拌中に、乾燥状態にならないことをさらに保証するために、剛性要素が、細胞活性を監視する該手段を包囲する壁を備え、それによって測定容器を形成することが推奨される。この測定容器の寸法および形状は様々でありうる。その断面は、円形、正方形、または楕円形でよい。一実施形態では、容器が円筒ウェルである。好ましくは、このウェルの寸法が包囲壁の高さの少なくとも３倍である。一実施形態では、剛性要素は、バイオリアクタの内部空間の中に突き出しかつセンサ要素を包囲する壁（図１および２参照）を備える。したがって、たとえバイオリアクタが強烈な揺動を蒙る場合であっても、必要とされる最小液量を常に含むことになる測定用「容器」が形成される。別の実施形態では、包囲壁は、バイオリアクタの使用時に柔軟下部壁の表面の下方に位置する測定容器を形成するために、内部からそれる（図３参照）。こうして測定容器を位置決めすると、一層より信頼性のある（オンライン）測定が実現されうるように、容器中の液体と、バイオリアクタの残りの部分に存在する「バルク液体」の液体との間の最適交換を可能にすることが判明した。測定手段、例えばセンサ要素、を備えていてもまたは備えていなくても、着脱自在の様態でバイオリアクタ支持構造に容易に固定されることから、かつ／または細胞活性の精確で信頼性のある監視から利益を得ることになる剛性要素は、任意の種類の柔軟バイオリアクタで有利に使用されることが当業者によって理解されよう。好ましくは、それは使い捨てのバイオリアクタである。それは、撹拌タンク式リアクタ・システムで使用する、液体培地において細胞を培養するための使い捨ての滅菌タンク・ライナでありうる。推奨される実施形態では、それは、好ましくは波動を利用して、液体培地において細胞を培養するように企図された使い捨てで滅菌可能なプラスチック・バッグである。当然のことであるが、バイオリアクタには、他の必要な要素、例えば物質（例えば、液体培地または試料）の追加または除去を容易にする手段、が設けられる。以上で本明細書に説明したもの以外の監視用またはセンサ用器具を含めて、当業界で知られた他の付属品または特徴構造も存在しうる。
【００３０】
したがって、本発明はまた、液体細胞培養物における細胞活性、例えば代謝活性、を監視する方法を提供するものであり、柔軟バイオリアクタには、バイオリアクタ支持構造上に取り付けられたプローブまたは他の種類の検出器と協調して動作する、センサ要素を担持する透明の下部区分のような測定手段を備える剛性要素が設けられる。バイオリアクタは、液体培地、例えば原核または真核細胞（藻類細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、ウイルス細胞、またはこれらの任意の組合せのような）、において培養されうる任意のタイプの細胞を収容しうる。本発明は特に細胞培養で使用するのに適切である一方で、本明細書に開示した測定手段が設けられたバイオリアクタはまた、他の種類の用途で、例えば細胞を含まない培養液または緩衝液のような内部に収容された液体の特性（例えばｐＨまたは導電性）を（オンライン）試験または監視する際に、使用されうる。
【００３１】
本発明の特定の一態様がバイオリアクタ・バッグに関し、このバッグの下部を形成する柔軟壁は、少なくとも２個の、好ましくは３個の、より好ましくは４個の上記のような剛性要素を備え、かつ少なくとも２個の剛性要素の少なくとも一方は、センサ用剛性要素である。好ましくは、これらの多剛性要素が、実質的にバッグの下部壁の対称軸に沿って配置される。このバッグは、任意の形状を有しうるが、好ましくは標準化された寸法を有し、例えばそれは空の状態で上から眺めたときに本質的に長方形の形状である。一実施形態では、それは長方形の形状であり、円形断面を有する４個の剛性要素を備える。これらの剛性要素は、バイオリアクタ・バッグの長い縁部に平行な中心対称軸に沿って位置決めされる。これらの剛性要素の２個には、それぞれに別個のセンサ要素、例えば酸素センサおよびｐＨセンサ、が設けられる。使用時に、４個の剛性要素はすべてが、支持構造上にバッグを確実かつ精確に位置決めすることに寄与する。さらには、２個のセンサ用剛性要素は、バッグの中に収容された細胞の代謝活性をオンライン監視することを可能にする。
【００３２】
バイオリアクタが単一の配向のみで支持構造に着脱自在に固定されうることを保証するために、多剛性要素ばかりでなく、それらに対応するアダプタ要素も、支持構造の上に相互に対して非対称的な構成で設置することが有利でありうる。このことは、２個以上の別個のセンサ用剛性要素が関与し、それぞれがセンサ信号を読み取るのに特定の光学的プローブを必要とする場合に、特に妥当性を有する。
【００３３】
本発明のさらに他の態様では、バイオリアクタ・バッグが提供されるが、このバッグの下部を形成する柔軟壁には、少なくとも１個の剛性挿入体に加えて、使用時にバッグの有効容積を調整する調整手段が設けられる。該調整手段は、バッグを隔室化し、それによって細胞培養中にバイオリアクタの有効容積を調整または調節することを可能にするために、押付具と協働して動作することができる。「有効容積」という用語は、液体細胞培養物によって占有されうるバイオリアクタの容積を示そうとするものである。有効容積を調整または制限することは、特に培養過程の開始時にバイオリアクタの１つまたは複数の柔軟壁を制限し、他方で細胞培養物容積の拡大と共にその制限を徐々にまたは段階的に解除することを伴う。
【００３４】
一実施形態では、このバイオリアクタが実質的に長方形または正方形の形状のバッグであり、該調整手段は、このバッグの下部壁に設けられた中空シームの中に収納される少なくとも１本の棒を備える。バッグの有効容積の調整を可能にするために、この少なくとも１本の棒は、バッグの周辺部内に位置決めされ、かつバッグの１対の対向する２つの平行縁部のそれぞれに平行に配置される。好ましくは、各棒およびそれに対応するシームが、上記のような対向縁部から、２つの対向する平行縁部間の間隔の約５分の１から３分の１の間隔をおいて位置決めされる。好ましくは、該調整手段が、上記のような２つのシームのそれぞれの中に収納された上記のような２本の棒をそれぞれ備え、各棒は、中心に位置決めした１個または複数の剛性要素の両側に位置する。少なくとも１本の棒は、有効容積が小さくなければならない場合に、下部および上部柔軟壁と一緒に固締具によって固締される。例えば使い捨てバッグが「最小容積」構成で販売されており、これらの棒には、バッグの中心部（例えばこの部分は、入り口（１つまたは複数）、出口（１つまたは複数）、および１個または複数の（センサ用）剛性要素を含む）と、バッグの残りの部分との間に液体密障壁を形成するために、固締具が設けられる。このバッグは膨らまされて、適切な細胞密度で細胞培養を開始するために少量の培養液が満たされうる。細胞密度が増大すると、固締具は、バッグの全容積が利用可能になりかつより大きな増殖培地が追加されうるように、棒および上部柔軟壁を解放するために取り除かれうる。固締具は、例えばそれが円形断面を有する棒の周囲に緊密であるが可逆的に嵌りうるように設計されたオメガ形状の断面を有する半柔軟性のプラスチックプロファイルである。
【００３５】
本発明の他の態様は、本発明による柔軟バイオリアクタにおいて細胞を培養する装置に関するものであり、本装置は、バイオリアクタと、使用時にバイオリアクタ中の細胞活性の精確な読取りを実現するために、バイオリアクタの測定手段と協働して動作するように適合された少なくとも１つの監視用器具とを収容または保持するための支持構造を備える。監視用器具は、例えばセンサ用剛性要素の中に含まれるセンサ要素によって生成されたセンサ信号を読取りできる光ファイバ・プローブである。適切なプローブが当業界で知られており、例えばそれは独国のレーゲンスブルク市在のプレセンス  プレシジョン  センシング  ゲーエムベーハーによって供給される重合体光ファイバ（ＰＯＦ）である。別の実施形態では、本装置には、膜を通過した少なくとも１つの検体の検出を可能にするセンサ・チャンバが設けられる。例えば欧州特許第１８７００３３号を参照されたい。推奨される実施形態では、本装置は、剛性要素およびアダプタ要素が、真空圧を使用して相互に固定可能になるように、バイオリアクタの下部壁の剛性要素と協働するためのアダプタ要素をさらに備え、このアダプタ要素は支持構造に固定して連結されるように配置される。
【００３６】
本装置は、本発明による使い捨ての柔軟タンク・ライナを保持できる撹拌タンク式リアクタ・システムでありうる。
【００３７】
推奨される実施形態では、本装置は、本発明のバッグ形状の柔軟バイオリアクタを使用して波動を利用する細胞培養のために設計される。それは、例えば米国特許第６１９０９１３号の教示に基づく揺動装置であるが、しかし、それには、培養バッグを揺動台中の所定の位置に精確に固定するアダプタ手段が追加的に設けられる。好ましくは、この支持構造にはさらに、バッグの下部の中に収容された少なくなくとも１個のセンサ用剛性要素を使用して、細胞の代謝活性を監視するための少なくとも１つの光ファイバ・プローブが設けられる。特定の実施形態では、この支持構造には、それぞれのセンサ要素と協働して、培養物のｐＨを検出するための少なくとも第１のプローブと、培養物の酸素水準を検出するための第２のプローブとが設けられる。
【００３８】
推奨される実施形態では、本装置は液体培地の波動を利用して細胞を培養するための装置であり、例えばバイオリアクタは、液体培地の中で波動を誘発するために、このバイオリアクタが周期的な閉ループ経路を辿りながら実質的に水平枢動軸に対してスイベル旋回するように動かされる。この種のスイベル旋回は、国際公開第２００７／００１７３号に詳細に説明されている。本装置は、バイオリアクタを動かし、それによって液体培地の波動を誘発するために、支持構造の少なくとも一部を動かすための駆動機構を備えうる。この駆動機構は、少なくとも１つのシリンダ−ピストン・アセンブリを備えうることが好ましい。このシリンダ−ピストン・アセンブリは空圧式または油圧式のものでよく、空圧式のものは、大規模なかつ／または産業規模の細胞培養環境により適合性がある。
【００３９】
装置によってもたらされる高振動数の強力なスイベル旋回運動は、上記のようなシリンダ−ピストン・アセンブリに対してかなりの全体的な衝撃を引き起こすことに留意される。したがって、シリンダ−ピストン・アセンブリの耐用年数を延ばすために、本装置には有利なことに、少なくとも１つのエネルギー吸収配置物、好ましくは動作に際して支持構造に当接するように配置された、ばねベースの衝撃吸収体が設けられる。
【００４０】
本発明は、独立請求項において具現化されている。本発明のさらなる具体的な実施形態は、従属請求項に記載されている。
【００４１】
本発明のさらなる特徴構造、効果、および細部は、添付図面中の模式図を参照して以下に説明されかつ明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明による柔軟バイオリアクタの実施形態に関する一例の下部壁の一部を示す断面図である。
【図２】これも図１の例を示す図であるが、下部壁の一部はアダプタ要素に固定され、このアダプタ要素はバイオリアクタ用の支持構造に固定して連結されている。
【図３】本発明による柔軟バイオリアクタの他の実施形態に関する一例の下部壁の一部を示す断面図である。
【図４】本発明による装置の実施形態に関する一例の支持構造の一例を示す斜視部分図である。
【図５】これも図４の例を示す図であるが、支持構造の幾つかの追加的な部分と一緒になっている。
【図６】本発明による柔軟バイオリアクタに使用する押付具の一例を示す斜視図である。
【図７】本発明による柔軟バイオリアクタの実施形態に関する一例を示す底面図である。
【図８】図７の線Ｉ−Ｉに沿って図７のバイオリアクタを示す断面図であり、バッグは第１の有効容積を有する状態にある。
【図９】同様に図７の線Ｉ−Ｉに沿って図７のバイオリアクタを示す断面図であるが、バッグは第１の有効容積よりも大きい第２の有効容積を有する状態にある。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
図１、２、７、８、および９は、液体培地２０を含む流体の中で細胞を培養するための柔軟バイオリアクタ１を示す。このバイオリアクタ１は、使用時にバイオリアクタの流体不透過性下部壁２を形成する柔軟壁を備える。該柔軟下部壁２の複数の柔軟部３には、該柔軟下部壁２の少なくとも１個の剛性要素４が割り込んでいる。剛性要素４は、バイオリアクタ１を収容しかつ保持するための支持構造５にバイオリアクタの下部壁を着脱自在に固定することが可能である。
【００４４】
図７の例では、バイオリアクタ１が、上記のような４個の剛性要素２を有する。しかし、本発明によるバイオリアクタは、上記のような剛性要素を任意適切な個数有してよい。図１、２、および３の例では、下部壁２の一部の断面が示されているが、その部分は上記のような１個の剛性要素２を有する。
【００４５】
図１、２、および３は、下部壁２の剛性要素４および柔軟部分３が、相互間に流体密連結を形成するために相互に封止連結されることを示す。この連結は、図示した例では、剛性要素４が、下部壁２の柔軟部分３と流体密連結を形成するように、この柔軟部分に封止連結される結合要素７を備え、かつ剛性要素が、結合要素７と流体連結を形成するように、この結合要素に封止連結される挿入要素８をさらに備えることで実現される。図示した例では、この結合要素が、固締によって挿入要素８を保持するホース・バーブ７である。
【００４６】
図１の最下部には、例えばボルトによってまたは別様に、支持構造５に固定して連結されるアダプタ要素６が示されている。剛性要素およびアダプタ要素が、真空圧を利用して相互に固定可能であるように、剛性要素４は、アダプタ要素６と協働するように配置される。こうしてアダプタ要素６を介してバイオリアクタ１を支持構造５に固定するために、バイオリアクタ１は、取付け方向２４へ移動可能である。図２は、バイオリアクタが、こうして支持構造５に固定されている状態を示す。参照符号２５は、アダプタ要素６の中の導路を示すが、この導路を介して該真空圧が印加されうる。参照符号２６は、アダプタ要素６の周辺部の中に埋め込まれたＯリングを指す。
【００４７】
図示した例では、剛性要素４の挿入要素８が、透明で非蛍光性の材料の平面的な表面９を有する。この表面９には、バイオリアクタの中の細胞活性を損なうことなく監視することを可能にするために、バイオリアクタ１の内部に面するセンサ要素１０が設けられる。図示した例では、剛性要素４の挿入要素８が、バイオリアクタ１の内部空間の中へ突き出しかつセンサ要素１０を包囲する壁１１をさらに備え、それによって測定容器を形成する。別法として、上記のような壁１１は、挿入要素８の一部ではなく、ホース・バーブ７の一部であってもよい。
【００４８】
図３のＡは、センサ要素１０を包囲する壁１１が、使用時にバイオリアクタの柔軟部分３の下方に位置する測定容器を形成するために、バイオリアクタの内部空間からそれる別法の実施形態を示す。
【００４９】
図３のＢは、剛性要素に膜１１０が設けられることを除けば図３Ａに対応する。
【００５０】
上で説明したように、本発明のバイオリアクタは、例えば撹拌タンク式リアクタ・システムの中で細胞を培養するための使い捨ての滅菌タンク・ライナでありうるけれども、以降では、バイオリアクタ１が、波動を利用して細胞を培養するための使い捨てで滅菌可能なプラスチック・バッグ１であると想定する。上記のような細胞培養は本発明に係る装置において実施され、この装置は、バイオリアクタ１を収容または保持するための支持構造５を備える。図４および５は、上記のような装置の支持構造の幾つかの他の細部を示す。
【００５１】
図４は、支持構造５の第１の枠構造２７を示す。アダプタ要素６は、この場合では４個であるが、この第１の枠構造２７の上に設けられる。参照符号３０が、支持構造５のスイベル旋回軸を指す。本装置は、バイオリアクタ１を動かし、それによって液体培地２０の波動を誘発するために、支持構造５の少なくとも一部を動かすための駆動機構を備える。簡明化のために、この駆動機構は詳細に示されていない。実際には、ただ１つのシリンダ−ピストン・アセンブリ１８が、上記のような駆動機構の一部であることが示されているに過ぎない。本装置には、先に説明したように少なくとも１つのエネルギー吸収配置物がさらに設けられる。これは、動作に際して支持構造５の第１の枠構造２７に当接するように配置された、ばねベースの２つの衝撃吸収体１９によって、図４に示されている。
【００５２】
図５は、第１の枠構造２７の上部に取り付けられた第２の枠構造２８を示す。この第２の枠構造２８は、図７、８、および９に示したバイオリアクタ・バッグ１を収容するために直立側壁を有する幾分トレーに似た形状を有する。簡明化のために、バイオリアクタ１は、図５に完全には示されておらず、バイオリアクタ・バッグ１の４個の剛性要素２のみが図５に示されている。
【００５３】
ここで図７、８、および９を参照するが、これらの図はバイオリアクタ・バッグ１を示す。図示した例では、バッグ１の下部を形成する柔軟壁２が、実質的にバッグ１の下部壁２の対称軸１２に沿って配置された４個の剛性要素４を備える。例えば図示した４個の剛性要素４のうち中間にある２個がセンサ用剛性要素であり、他方で外側の２個が固定用剛性要素である。各センサ用剛性要素に対し、本装置は、説明したように、それぞれのアダプタ要素６（図１および２参照）に連結された光ファイバ１７を備え、該光ファイバは、それがセンサ用剛性要素４のセンサ要素１０によって生成されたセンサ信号を読取りできるように配置される。
【００５４】
図示した例では、複数の剛性要素４ばかりでなく、それらに対応するアダプタ要素６も、先に説明したように、バイオリアクタが支持構造に単一の配向のみで着脱自在に固定されうることを保証するために、相互に対して非対称的な構成で支持構造５の上に配置される。これは、図５で右端側にある３個の剛性要素２の隣接する剛性要素の各対における剛性要素間を第１の等間隔とし、他方で左端側にある２個の隣接する剛性要素２の間を第２の間隔とし、該第２の間隔を該第１の間隔と別にすることで実現される。類似の見解は、図７の上端側の２個に対する下端側の３個の剛性要素２に関するばかりでなく、当然であるが、図４のアダプタ要素６間の間隔に関しても当てはまる。
【００５５】
図７、８、および９では、バッグ１の下部を形成する柔軟壁２には、使用時にこのバッグの有効容積を調整する調整手段１４、１５がさらに設けられ、該調整手段は、図６に示した押付具２１と協働して動作することができる。この調整は以下で明らかにされる。
【００５６】
図示したバイオリアクタ・バッグ１は、実質的に長方形の形状である。該調整手段は２本の棒１４を備え、各棒が、バッグの下部壁２に設けられた中空シーム１５のそれぞれの中に収納される。これらの棒１４は相互に平行に、かつバッグの対になった対向する２つの平行縁部１６のそれぞれに平行に配置される。２本の棒１４のそれぞれに、対応する押付具２１が設けられる。この押付具２１は、それが、円形断面を有する棒１４の周囲に緊密であるが可逆的に嵌りうるように設計されたオメガ形状の断面を有する半柔軟性のプラスチックプロファイル２２である。このオメガ・プロファイルは、押付具２１の本体プロファイル２３の中に埋め込まれる。
【００５７】
図８は、上記のようにしっかりと嵌合わせたバッグ１の状態を示す。このように第１の状態にあるバッグは、第１の有効容積を有することとなる。この第１の状態では、本体プロファイル２３の２つの対向する端部が、第２の枠構造２８（図５参照）の直立壁のスリット３１の中へ受け入れられることになる。
【００５８】
図９は、上記のしっかりとした嵌合いが解かれたバッグ１の状態を示す。このように第２の状態にあるバッグは、第１の有効容積よりも大きい第２の有効容積を有することとなる。随意選択的に、押付具２１は、この第２の状態で、本体プロファイル２３の２つの対向端部が、第２の枠構造２８の直立壁の上部フランジ中のねじ受け穴３２を介して第２の枠構造２８に固定して連結されうるように設計可能である（図５参照）。この第２の状態で、押付具２１は、本装置の（スイベル旋回）動作中にバッグ１を定位置に維持するのを助ける。この第２の状態では、押付具２１が図８の配向に対して逆さまに取り付けられるが、この第２の状態では、バッグ１に接触する押付具２１の領域が、滑り難くかつ破壊することなくバッグ１に接触係合することを見据えて設計されていることが好ましい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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