(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍および細胞系をクラスタリングしてゲノムサブグループを定義することに用いるアルゴリズムであって、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍または癌細胞系を含む、細胞系または腫瘍を含む複数のｍ個の試料を得るステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも１つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含むデータセットを取得するステップ、
（ｃ）
（１）腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
（２）機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、
（３）正常細胞を含有する確率が５０％以上であるとスコア化する各試料についてのデータをデータセットから削除すること、
を含む、データセットにおいて正常細胞が混入した試料から得られたコピー数の変化の情報を同定し、混入試料をデータセットから削除するステップ、
（ｄ）データセット内のサブグループの数ｒを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もるステップ、
（ｅ）データセット内の各試料を、
（１）乗法的更新を１００ステップ行うごとに、式（１）を用いてアルゴリズムの発散を計算するステップ、
【数１】
0005391279.tif 000056
（式中、Ｖｉｊは行列Ｖのｉ行ｊ列目であり、（ＷＨ）ｉｊは行列（Ｗ＊Ｈ）のｉ行ｊ列目であり、ｉは１からｎまでにわたり、ｎはデータセット内のセグメントの数であり、ｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数である。）
（２）ステップ（ｅ）（１）において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の１００ステップに対して計算された発散と比較して約０．００１％超減少していない場合にアルゴリズムを停止するステップ、
（３）アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、式（２）を用いてアルゴリズムの各実行に対してＨのピアソン相関係数行列を計算するステップ、
【数２】
0005391279.tif 000057
（式中、Ｃは相関行列であり、Ｃｉ，ｊは行列Ｃのｉ行ｊ列目であり、Ｈ，ｉおよびＨ，ｊは行列Ｈにおけるｉ列目およびｊ列目のベクトルであり、ρ（Ｈ，ｉ，Ｈ，ｊ）はＨ，ｉとＨ，ｊ間のピアソン相関係数であり、ｉおよびｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数であり、ｋは１からｒまでにわたり、ｒはステップ（ｄ）からのサブグループの数である。）
（４）ステップ（ｅ）（３）から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均するステップ、および
（５）データセット内の腫瘍および癌細胞系を、１引く（ステップ（ｅ）（４）において決定された平均相関行列）を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによってｒ個のサブグループに割り当て、デンドログラムをｒ個のクラスターにカットするステップ
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解（ｇＮＭＦ）アルゴリズムを用いて少なくとも１つのクラスターに割り当てるステップ、
（ｆ）コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または癌細胞系試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定するステップ、および
（ｇ）ステップ（ｆ）において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、１０倍の安定性検定を用いて評価するステップ
を含む、アルゴリズム。
【請求項２】
教師なしクラスタリングアルゴリズムが階層クラスタリングである、請求項１のアルゴリズム。
【請求項３】
データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにコーフェン相関が使用される、請求項１のアルゴリズム。
【請求項４】
データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにベイズ情報量規準が使用される、請求項１のアルゴリズム。
【請求項５】
データセットから最終的なクラスターの数を規定するためにコーフェン相関およびベイズ情報量規準が使用される、請求項１のアルゴリズム。
【請求項６】
ゲノムサブグループによる腫瘍および癌細胞系のパネルを構築する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍または癌細胞系を含む複数のｍ個の試料を得るステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも１つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含むデータセットを取得するステップ、
（ｃ）
（１）腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
（２）機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、および
（３）正常細胞を含有する確率が５０％以上であるとスコア化する各試料についてのデータをデータセットから削除すること
を含む、データセットにおいて正常細胞が混入した試料から得られたコピー数の変化の情報を同定し、混入試料をデータセットから削除するステップ、
（ｄ）データセット内のサブグループの数ｒを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
（ｅ）データセット内の各試料を、
（１）乗法的更新を１００ステップ行うごとに、式（１）を用いてアルゴリズムの発散を計算すること、
【数３】
0005391279.tif 000058
（式中、Ｖｉｊは行列Ｖのｉ行ｊ列目であり、（ＷＨ）ｉｊは行列（Ｗ＊Ｈ）のｉ行ｊ列目であり、ｉは１からｎまでにわたり、ｎはデータセット内のセグメントの数であり、ｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数である。）
（２）ステップ（ｅ）（１）において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の１００ステップに対して計算された発散と比較して約０．００１％超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
（３）アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、式（２）を用いてアルゴリズムの各実行に対してＨのピアソン相関係数行列を計算すること、
【数４】
0005391279.tif 000059
（式中、Ｃは相関行列であり、Ｃｉ，ｊは行列Ｃのｉ行ｊ列目であり、Ｈ，ｉおよびＨ，ｊは行列Ｈにおけるｉ列目およびｊ列目のベクトルであり、ρ（Ｈ，ｉ，Ｈ，ｊ）はＨ，ｉとＨ，ｊ間のピアソン相関係数であり、ｉおよびｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数であり、ｋは１からｒまでにわたり、ｒはステップ（ｄ）からのサブグループの数である。）
（４）ステップ（ｅ）（３）から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および
（５）データセット内の腫瘍および癌細胞系を、１引く（ステップ（ｖ）（４）において決定された平均相関行列）を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによって、ｒ個のサブグループに割り当て、デンドログラムをｒ個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解（ｇＮＭＦ）アルゴリズムを用いて少なくとも１つのクラスターに割り当てるステップ、
（ｆ）コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが各試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を選択するステップ、
（ｇ）ステップ（ｆ）において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、１０倍の安定性検定を用いて評価するステップ、および
（ｈ）ステップ（ｆ）において選択された各クラスターから少なくとも１つの腫瘍または細胞系を選択し、選択された細胞系をゲノムサブグループによって定義されたパネルに構築するステップ
を含む、方法。
【請求項７】
癌が、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌および黒色腫からなる群から選択される、請求項６の方法。
【請求項８】
コピー数の変化が、コピー数の増加または減少である、請求項６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願情報
本出願は、２００８年１０月３１日に出願された米国特許出願第６１／１１０，３１７号の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出された配列表を含有し、これによってその全体が参照により組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、９６７４ＷＯＯ１．ｔｘｔと名前が付けられており、サイズは１．８キロバイトである。
【０００３】
分野
本発明は、腫瘍および癌細胞系のゲノムサブグループを定義することに用いるためのバイオインフォマティクスアルゴリズムまたは方法に関する。本発明は、少なくとも１種の癌に罹患している対象を治療することにおいて、１種以上の医薬化合物の有効性を試験することに使用するために、ゲノムサブグループによって腫瘍および癌細胞系のパネルを構築するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
癌は、臨床経過、転帰および治療への応答性における相当な変動性を特徴とするゲノム疾患である。この変動性の根底にある主要因子は、ヒトの癌に固有の遺伝的異質性である。病理組織学的なサブタイプが同じである個々の腫瘍は、細胞ＤＮＡにおいて異なる異常を有することが実証されている。標的癌療法は、組織学的な疾患サブタイプではなく、特定の遺伝子異常を標的とすると認識されている。分子異常を標的とする薬物のいくつかの例は、メシル酸イマチニブ（慢性骨髄性白血病を治療するために使用される）およびトラスツズマブ（ＨＥＲ２陽性乳癌を治療するために使用される）である。
【０００５】
現在、腫瘍学的薬物試験のための前臨床モデルは、可用性、マウスにおける腫瘍形成への適応性、培養中での増殖ならびに他のパラメータに基づいて選択されている。この手法に伴う問題は、この手法では親腫瘍の遺伝的異質性が考慮されないことである。この結果、前臨床試験の間の腫瘍の分子サブタイプの表示が不十分になる。したがって、前臨床試験において頻繁に見られる高い応答率は、前臨床試験を実施している研究室において表された分子サブタイプの応答性を表すだけであり得る。このサブタイプが患者集団の一部のみを表す場合、および薬物がこの特定のサブタイプに対してのみ有効である場合、診察室における応答性は著しく低くなる。したがって、当技術分野において、すべての親腫瘍型を良好に表している、改良された前臨床試験モデルが必要とされている。そのような改良された前臨床試験は、新薬についての前臨床試験の予測性を上昇させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
一態様において、本発明は、腫瘍および細胞系をクラスタリングしてゲノムサブグループを定義することに用いるアルゴリズムに関する。アルゴリズムは、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍または癌細胞系を含む複数のｍ個の試料を得るステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも１つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含むデータセットを取得するステップ、
（ｃ）
（１）腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
（２）機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、
（３）正常細胞を含有する確率が５０％以上であるとスコア化する各試料についてのデータをデータセットから削除すること
を含む、データセットにおいて正常細胞が混入した試料から得られたコピー数の変化の情報を同定し、混入試料をデータセットから削除するステップ、
（ｄ）データセット内のサブグループの数ｒを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムをデータセットに適用することによって見積もるステップ、
（ｅ）データセット内の各試料を、
（１）乗法的更新を１００ステップ行うごとに、式（１）を用いてアルゴリズムの発散を計算するステップ、
【０００７】
【数１】
0005391279.tif 000002
（式中、Ｖｉｊは行列Ｖのｉ行ｊ列目であり、（ＷＨ）ｉｊは行列（Ｗ＊Ｈ）のｉ行ｊ列目であり、ｉは１からｎまでにわたり、ｎはデータセット内のセグメントの数であり、ｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数である。）
（２）ステップ（ｅ）（１）において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の１００ステップに対して計算された発散と比較して約０．００１％超減少していない場合にアルゴリズムを停止するステップ、
（３）アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、式（２）を用いてアルゴリズムの各実行に対してＨのピアソン相関係数行列を計算するステップ、
【０００８】
【数２】
0005391279.tif 000003
（式中、Ｃは相関行列であり、Ｃｉ，ｊは行列Ｃのｉ行ｊ列目であり、Ｈ，ｉおよびＨ，ｊは行列Ｈにおけるｉ列目およびｊ列目のベクトルであり、ρ（Ｈ，ｉ、Ｈ，ｊ）はＨ，ｉとＨ，ｊ間のピアソン相関係数であり、ｉおよびｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数であり、ｋは１からｒまでにわたり、ｒはステップ（ｄ）からのサブグループの数である。）
（４）ステップ（ｅ）（３）から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均するステップ、および
（５）データセット内の腫瘍および癌細胞系を、１引く（ステップ（ｅ）（４）において決定された平均相関行列）を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによってｒ個のサブグループに割り当て、デンドログラムをｒ個のクラスターにカットするステップ
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解（ｇＮＭＦ）アルゴリズムを用いて少なくとも１つのクラスターに割り当てるステップ、
（ｆ）コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから、それぞれが腫瘍または癌細胞系試料のそれぞれについてゲノムサブグループを定義する最終的なクラスターの数を規定するステップ、および
（ｇ）ステップ（ｆ）において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、１０倍の安定性検定を用いて評価するステップ
を含む。
【０００９】
上記アルゴリズムにおいて、教師なしクラスタリングアルゴリズムは階層クラスタリングである。さらに、上記アルゴリズムにおいて、コーフェン相関が、データセットからの最終的なクラスターの数を規定するために使用される。あるいは、上記アルゴリズムにおいて、ベイズ情報量規準が、データセットからの最終的なクラスターの数を規定するために使用される。さらに別の選択肢では、上記アルゴリズムにおいて、コーフェン相関とベイズ情報量規準が、データセットからの最終的なクラスターの数を規定するために使用される。
【００１０】
別の態様において、本発明は、ゲノムサブグループによって腫瘍および癌細胞系のパネルを構築するための方法に関する。方法は、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍または癌細胞系を含む複数のｍ個の試料を得ること、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた各試料から、各染色体からの少なくとも１つの遺伝子座からのコピー数の変化の情報を含むデータセットを取得すること、
（ｃ）
（１）腫瘍試料と正常試料の間の差異を表すパラメータに合わせた機械学習アルゴリズムをデータに適用すること、
（２）機械学習アルゴリズムによって決定される、正常細胞の混入に対する確率スコアを各試料に割り当てること、および
（３）正常細胞を含有する確率が５０％以上であるとスコア化する各試料についてのデータをデータセットから削除すること
を含む、データセットにおいて正常細胞が混入した試料から得られたコピー数の変化の情報を同定し、混入試料をデータセットから削除すること、
（ｄ）データセット内のサブグループの数ｒを、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリングをデータセットに適用することによって見積もること、
（ｅ）データセット内の各試料を、
（１）乗法的更新を１００ステップ行うごとに、式（１）を用いてアルゴリズムの発散を計算すること、
【００１１】
【数３】
0005391279.tif 000004
（式中、Ｖｉｊは行列Ｖのｉ行ｊ列目であり、（ＷＨ）ｉｊは行列（Ｗ＊Ｈ）のｉ行ｊ列目であり、ｉは１からｎまでにわたり、ｎはデータセット内のセグメントの数であり、ｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数である。）
（２）ステップ（ｅ）（１）において計算された発散が、アルゴリズムの乗法的更新の前の１００ステップに対して計算された発散と比較して、約０．００１％超減少していない場合にアルゴリズムを停止すること、
（３）アルゴリズムを、選択された実行回数ランダムに繰り返し、式（２）を用いてアルゴリズムの各実行に対してＨのピアソン相関係数行列を計算すること、
【００１２】
【数４】
0005391279.tif 000005
（式中、Ｃは相関行列であり、Ｃｉ，ｊは行列Ｃのｉ行ｊ列目であり、Ｈ，ｉおよびＨ，ｊは行列Ｈにおけるｉ列目およびｊ列目のベクトルであり、ρ（Ｈ，ｉ，Ｈ，ｊ）はＨ，ｉとＨ，ｊ間のピアソン相関係数であり、ｉおよびｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数であり、ｋは１からｒまでにわたり、ｒはステップ（ｄ）からのサブグループの数である。）
（４）ステップ（ｅ）（３）から得られたアルゴリズムの各実行について、ピアソン相関係数行列を平均相関行列に達するまで平均すること、および、
（５）データセット内の腫瘍および癌細胞系を、１引く（ステップ（ｅ）（４）において決定された平均相関行列）を用いた教師なしクラスタリングアルゴリズムを適用することによって、ｒ個のサブグループに割り当て、デンドログラムをｒ個のクラスターにカットすること
を含む改変ゲノム非負値行列因子分解（ｇＮＭＦ）アルゴリズムを用いて少なくとも１つのクラスターに割り当てること、
（ｆ）コーフェン相関関数、ベイズ情報量規準またはこれらの組合せを適用して、データセットから最終的なクラスターの数を選択すること、
（ｇ）ステップ（ｆ）において選択された最終的なクラスターの数の安定性を、１０倍の安定性検定を用いて評価すること、および
（ｈ）ステップ（ｆ）において選択された各クラスターから少なくとも１つの腫瘍または細胞系を選択し、ゲノムサブグループによって定義されたパネルに構築すること
を含む。
【００１３】
上記方法において、癌は、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌および黒色腫からなる群から選択される。
【００１４】
上記方法において、コピー数の変化は、コピー数の増加または減少である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の方法に含まれるステップの概略を示す図である。具体的には、本図は、腫瘍および癌細胞系をそれらのコピー数のパターンに基づいて分類し、腫瘍および癌細胞系をそれらのコピー数の変化のパターンに基づいてゲノムサブグループに割り当て、次いで、特定の癌の型についてのゲノムサブグループを表すために細胞のパネルを構築することに伴うステップを示している。
【図２】実施例３に記載の通り、予想されるクラスター数を導くために、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のデータセットのデンドログラムを生成するために使用された階層クラスタリングを示す図である。
【図３】実施例３からの、ＮＳＣＬＣ腫瘍および細胞系のＣＧＨデータを、ゲノム非負値行列因子分解（ｇＮＭＦ）によって４つのクラスターに分類したヒートマップを示す図である。各行は試料を表し、各列はＳＮＰ遺伝子座を表す。赤色、白色および青色は、それぞれ、コピー数が多いこと、コピー数が正常であること、コピー数が少ないことを示す。水平な黒線は、異なるクラスターを分離している。垂直の空間は、染色体１−２２を分離している。細胞系は緑色の円で強調されている。
【図４】実施例４に記載の通り、予想されるクラスター数を導くために、結腸直腸癌（ＣＲＣ）のデータセットのデンドログラムを生成するために使用された階層クラスタリングを示す図である。
【図５】実施例４からの、ｇＮＭＦによって５つのクラスターに分類されたＣＲＣの腫瘍および細胞系のＣＧＨデータのヒートマップを示す図である。各行は試料を表し、各列はＳＮＰ遺伝子座を表す。赤色、白色および青色は、それぞれ、コピー数が多いこと、コピー数が正常であること、コピー数が少ないことを示す。水平な黒線は、異なるクラスターを分離している。垂直の空間は、染色体１−２２を分離している。細胞系は緑色の円で強調されている。
【図６】実施例５に記載の通り、予想されるクラスター数を導くために、黒色腫のデータセットのデンドログラムを生成するために使用された階層クラスタリングを示す図である。
【図７】実施例５に記載の通りｇＮＭＦによって６つのクラスターに分類された黒色腫の腫瘍および細胞系のＣＧＨデータのヒートマップを示す図である。各行は試料を表し、各列はＳＮＰ遺伝子座を表す。赤色、白色および青色は、それぞれ、コピー数が多いこと、コピー数が正常であること、コピー数が少ないことを示す。水平な黒線は、異なるクラスターを分離している。垂直の空間は、染色体１−２２を分離している。細胞系は緑色の円で強調されている。
【図８】（ａ）は４つのクラスターを別々に検討した、４つのＮＳＣＬＣクラスターにおいて臨床的にアノテートされた試料についての、再発するまでの時間のカプランマイヤー曲線を示すグラフである。（ｂ）はクラスター１と２を合わせた、４つのＮＳＣＬＣクラスターにおいて臨床的にアノテートされた試料についての、再発するまでの時間のカプランマイヤー曲線を示すグラフである。
【図９】（ａ）は４つのクラスターを別々に検討した、４つのクラスターに割り当てられた検証試料についてのＴＴＲのカプランマイヤー曲線を示すグラフである。（ｂ）はクラスター１と残りの３つのクラスターを比較した、４つのクラスターに割り当てられた検証試料についてのＴＴＲのカプランマイヤー曲線を示すグラフである。
【図１０】（ａ）は４つのクラスターを別々に検討した、４つのクラスターに割り当てられた検証試料間の全生存のカプランマイヤー曲線を示すグラフである。（ｂ）はクラスター１と残りの３つのクラスターを比較した、４つのクラスターに割り当てられた検証試料間の、全生存のカプランマイヤー曲線を示すグラフである。
【図１１】（ａ）はクラスターを表すために存在するすべての腫瘍および細胞系を使用した、４つのクラスターに割り当てられた検証試料間の、ＴＴＲのカプランマイヤー曲線を示すグラフである。（ｂ）はクラスターを表すために存在するすべての腫瘍および細胞系を使用した、４つのクラスターに割り当てられた検証試料間の、ＯＲのカプランマイヤー曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（詳細な記述）
一態様において、本発明は、少なくとも１つの型の癌に罹患している対象（例えばヒト患者）を治療することに使用され得る医薬組成物の前臨床試験のために腫瘍、癌細胞系および／または異種移植片のパネルを構築するための方法体系を提供する。本明細書に記載の方法を使用して、親腫瘍型のゲノムの多様性を表している癌細胞系のパネルが、癌細胞系を、それらのそれぞれが対応する腫瘍型の別個のゲノムサブグループに見合うように選択することによって開発され得る。
【００１７】
別の態様において、本発明は、腫瘍および癌細胞系のゲノムサブグループを定義または分類するために使用され得る独特の計算アルゴリズムを提供する。これらの腫瘍および癌細胞系から同定されたゲノムサブグループは、上記で考察したパネルを構築するために使用され得る。一般に、本発明の計算アルゴリズムは、
１．機械学習アルゴリズム（ランダムフォレストなど）を適用して、正常細胞が著しく混入した試料を同定し、削除するステップ、
２．教師なしクラスタリング（階層クラスタリングなど）を使用して、データをゲノム非負値行列因子分解（ｇＮＭＦ）モデルに適合させる前に、予想されるクラスター数を見積もるステップ、
３．ｇＮＭＦの多数のランダムスタートを使用し、続いてｇＮＭＦから得られたＨ行列の相関を距離行列として適用して試料を分類するステップ、
４．腫瘍および癌細胞系を、ｇＮＭＦアルゴリズムを使用していくつかの予想されるクラスター数に分類し、続いてコーフェン相関係数、ベイズ情報量規準（ＢＩＣ）またはこれらの組合せを使用して最良モデルを選択し、最終的なクラスターの数を決定するステップ、および
５．１０倍安定性検定を適用してクラスターの安定性を評価するステップ
を含む。
【００１８】
本発明の方法は、親腫瘍の完全な表示を提供することによって、前臨床試験モデルの合理的な選択を容易にし、前臨床試験の予測性を改善する。どんな理論にも縛られることは希望しないが、本発明の基本原理は、以下の通りである。ヒトの腫瘍の表現型を決定するために、コピー数の変化（ＣＮＡ）のパターンが示されている。したがって、腫瘍集団のサブグループがＣＮＡのパターンによって定義され、次いで少なくとも１つの細胞系が各サブグループに見合うように選択され、現在利用可能な腫瘍モデルのセットよりも腫瘍集団の多様性を適切に表す細胞系のパネルが構築され得る。
【００１９】
Ａ．定義
本明細書で使用する、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈からにそうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示対象を含む。本明細書における数的な範囲の詳説について、同じ精度を持つ、間に介在する数がそれぞれ明確に意図されている。例えば、範囲６−９について、６および９に加えて数７および８が意図されており、範囲６．０−７．０について、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明確に意図されている。
【００２０】
ａ）アレイ
本明細書で使用する、「アレイ」という用語は、固体支持体に付着した核酸プローブを含む。アレイは、一般には、異なる既知の位置で基質の表面に結合する、複数の異なる核酸プローブを含む。これらのアレイは、マイクロアレイとも記載され、「チップ」は、当技術分野において例えば米国特許第５，１４３，８５４号、５，４４５，９３４号、５，７４４，３０５号、５，６７７，１９５号、６，０４０，１９３号、５，４２４，１８６号および（Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．ら、「Ｌｉｇｈｔ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ，ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７−７７３（１９９１）を参照されたい）に一般に記載されている。これらのアレイは、一般に、フォトリソグラフィー法および固相合成法の組合せを組み込んだ機械的な合成方法または光指向性合成方法を使用して作製され得る。機械的な合成を使用するアレイの合成技法は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。平面のアレイ表面が好ましいが、アレイは実質的にどんな形状の表面にも作り上げることができ、多重の表面にさえ作り上げることができる。アレイは、例えば、米国特許第５，７７０，３５８号、５，７８９，１６２号、５，７０８，１５３号、６，０４０，１９３号および５，８００，９９２号に記載のように、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどのファイバー、ガラスまたは任意の他の適切な基質上の核酸であり得る。アレイは、すべてを含んだデバイスでの診断または他の操作が可能になるように一括され得る。例えば、米国特許第５，８５６，１７４号および５，９２２，５９１号を参照されたい。
【００２１】
アレイは、一塩基多型（ＳＮＰ）を使用して、ゲノム全体を包含するように設計され得る。例えば、アレイは、ヒトゲノム中の１１６，２０４個の一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子座を包含し得、マーカー間の平均距離は２３．６ｋｂ  ＳＮＰ遺伝子座である。
【００２２】
ｂ）ベイズ情報量規準（ＢＩＣ）
本明細書で使用する、「ベイズ情報量規準」または「ＢＩＣ」という語句は、モデル選択に対する統計的基準として使用されるパラメトリック法を指す。ＢＩＣは、Ｓｃｈｗａｒｚ，Ｇ．によって、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ６巻（２号）：４６１−４６４頁（１９７８年）において、「Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｄｅｌ」に記載されている。ＢＩＣは下記式（３）によって定義される：
ＢＩＣ＝−２＊ｌｎＬ＋ｋｌｎ（ｎ）  （３）
式中、Ｌは、モデルがデータにどれくらい正確に近似しているかを測定する尤度であり、ｋはモデルにおいて使用されるパラメータの数であり、ｎは試料の数である。二次の項、ｋｌｎ（ｎ）は、過剰適合を回避するためにモデルにおいて使用されるパラメータの数のペナルティとして機能する。
【００２３】
ｃ）クラスタリング解析
本明細書で使用する、「クラスタリング解析」という語句は、目的物（観測値、個体、事例またはデータ行とも称される）の集団をサブセット、サブグループまたは「クラスター」にグループ分けし、各クラスター内の目的物が互いに、異なるクラスターに割り当てられた目的物よりも密接に関連しているようにする。クラスタリング解析の目標のすべての中核をなすのは、クラスタリングされた個々の目的物間の類似性（または非類似性性）の程度の観念である。クラスタリングの種類の例は、階層クラスタリングおよびｋ−平均クラスタリングである。
【００２４】
ｄ）コーフェン相関係数またはコーフェン相関
本明細書で使用する、「コーフェン相関係数」または「コーフェン相関」という語句は、本明細書で互換的に使用され、最終的なクラスタリングを導くために使用されるデンドログラムが、元のモデル化されていないデータポイントとのペアワイズ距離をどれだけ忠実に保存したかを測定するために用いられるアルゴリズムを指す。本発明における使用に関して、元のデータＸｉがデンドログラムＴｉによってモデル化されている場合、距離の測定値は下記式によって定義される：
ｘ（ｉ，ｊ）＝｜Ｘｉ−Ｘｊ｜（ｉ番目の試料とｊ番目の試料の間の距離）
およびｔ（ｉ，ｊ）＝モデルポイント、ＴｉとＴｊの間のデンドログラムの距離であり、この距離はこれらの２つのポイントが最初に一緒に連結される結節の高さである。それから、ｘがｘ（ｉ，ｊ）の平均であり、ｔがｔ（ｉ，ｊ）の平均である場合、コーフェン相関係数ｃは下記式（４）によって定義される：
【００２５】
【数５】
0005391279.tif 000006
【００２６】
ｒが増加するにつれて、コーフェン相関は特定のポイントで劇的に減少し、したがって、最良のクラスター数に対応することが公知である（Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｍａｒｋｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１５０２−１３頁（２００６年）；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｉｎｉｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．９：３１３−２５頁（２００６年）を参照されたい）。
【００２７】
ｅ）直接検出可能な、および間接的に検出可能な
本明細書で使用する、「直接的に検出可能な」という語句は、検出可能な標識または検出可能な部分を参照することに使用される場合、検出可能な標識または検出可能な部分が、検出可能になるためにさらなる反応または操作を必要としないことを意味する。例えば、蛍光部分は、蛍光分光の方法によって直接的に検出可能である。対照的に、「間接的に検出可能な」という語句は、本明細書において、検出可能な標識または検出可能な部分を参照することに使用される場合、検出可能な標識または検出可能な部分が、さらなる反応または操作の後に検出可能になることを意味する。例えば、ハプテンは、蛍光色素などのレポーターに接着された適切な抗体と反応した後に検出可能になる。
【００２８】
ｆ）階層クラスタリング
本明細書で使用する、「階層クラスタリング」という語句は、クラスターの階層を構築すること（集塊性）または解体すること（分裂的）を指す。この階層の伝統的な表示は、木（デンドログラムと呼ばれる）であり、その一方の端に個々のエレメントがあり、他方にすべてのエレメントを含有する単一のクラスターがある。集塊性のアルゴリズムは、木の葉から始まるが、一方、分裂的なアルゴリズムは根から始まる。階層クラスタリングを行うための方法は、当技術分野で周知である。
【００２９】
階層クラスタリング手法は、生物医学的な研究において、生体試料をそのゲノムパターンに基づいてクラスタリングし、試料集団におけるサブグループ構造を導くために広く使用されている（Ｓｏｔｉｒｉｏｕ，Ｃら、「Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｆｏｒｍ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｔｕｄｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：１０３９３（２００３年）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ，Ａ．ら、「Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｂｙ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：１３７９０−１３７９５（２００１年）；Ｗｉｌｈｅｌｍ，Ｍ．ら、「Ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｅｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６２：９５７−９６０（２００２年２月１５日）；Ｈｅｄｅｎｆａｌｋ，Ｉ．ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｎｏｎ−ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１００：２５３２−２５３７（２００３年）を参照されたい）。例えば、Ｒｏｓｓ，Ｄ．Ｔ．ら（Ｒｏｓｓ，Ｄ．Ｔ．ら、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ」、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、２４：２２７−２３５（２０００年））において、階層クラスタリングは、６４のヒト腫瘍細胞系を、１１６１の選択された遺伝子の発現パターン基づいていくつかのクラスターにグループ分けし、異なるクラスターの分子的特徴を導くために使用された。
【００３０】
ｇ）ハイブリダイゼーション
本明細書で使用する、「ハイブリダイゼーション」という語句は、ワトソン・クリックの塩基対合または非標準の塩基対合によって複合体を形成するために十分相補的な核酸配列間の複合体の形成を指す。例えば、プライマーが標的配列（鋳型）と「ハイブリダイズする」際、そのような複合体（またはハイブリッド）は、例えば、ＤＮＡ合成を開始するためにＤＮＡポリメラーゼが必要とするプライマー機能を果たすために十分に安定である。ハイブリダイズする配列は、安定なハイブリッドをもたらすために完全な相補性を有する必要はないことが当業者には認識される。多くの場合、安定なハイブリッドは、約１０％未満の塩基がミスマッチである場合に形成される。したがって、本明細書で使用する、「相補的な」という用語は、アッセイ条件下で、一般に約８０％超、約８１％超、約８２％超、約８３％超、約８４％超、約８５％超、約８６％超、約８７％超、約８８％超、約８９％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超または約９９％超の相同性でその相補物と安定な二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドを指す。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定にハイブリダイズするが、低い相補性を有する配列は安定にハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション条件の厳密性をどのように見積もり、調整するかを理解している。ハイブリダイゼーション条件およびパラメータの例は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、１９９８年、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ：Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９４年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：Ｓｅｃａｕｃｕｓ、ＮＪに見出すことができる。
【００３１】
ｈ）標識されたまたは検出可能な標識で標識された
本明細書で使用する、「標識された」および「検出可能な標識（または作用剤または部分）で標識された」という用語は、本明細書で互換的に使用され、実体（例えば、ＤＮＡ断片、プライマーまたはプローブ）が、例えば、別の実体（例えば増幅産物）に結合した後に可視化され得ることを明示する。好ましくは、検出可能な標識は、その標識が測定され得るシグナルを生成し、その強度が結合した実体の量に関連する（例えば、比例する）ように選択される。プライマーおよびプローブなどの核酸分子を標識および／または検出するための多種多様なシステムが当技術分野において周知である。標識された核酸は、分光的な方法、光化学的な方法、生化学的な方法、免疫化学的な方法、電気的な方法、光学的な方法、化学的な方法または他の方法によって直接的または間接的に検出可能な標識を組み込むまたはこの標識とコンジュゲートすることによって調製され得る。適切な検出可能な作用剤としては、放射線核種、蛍光体、化学発光剤、微粒子、酵素、比色標識、磁気標識、ハプテンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
ｉ）機械学習
本明細書で使用する、「機械学習」という語句は、コンピュータに「学習」させることを可能にするアルゴリズムおよび技法を設計および開発することに関連する人工知能のサブフィールドを指す。一般に、帰納的学習および演繹的学習の２種類がある。帰納的な機械学習の方法は、データセットからルールおよびパターンを抽出する。機械学習研究の主要な焦点は、計算的方法および統計的方法によって、データから自動的に情報を抽出することである。分類学に系統立てられたいくつもの機械学習アルゴリズムは、アルゴリズムの所望の転帰に基づいて、当業者に公知である。これらとしては、（１）教師あり学習（例えば、ランダムフォレスト）、（２）教師なし学習（例えば、主成分分析、ベクトル量子化など）（３）半教師あり学習、（４）強化学習、（５）トランスダクションおよび（６）学習の学習が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
ｊ）非負値行列因子分解
本明細書で使用する、「非負値行列因子分解」または「ＮＭＦ」という語句は、部分に基づいた、非負データの線形表現を見出すためのアルゴリズムを指す。非負値行列因子分解は、元々は、画像解析において使用するための数学的ツールとして開発された（Ｌｅｅ，Ｄ．Ｄ．ら、「Ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｓ  ｏｆ  ｏｂｊｅｃｔｓ  ｂｙ  ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ．４０１：７８８−７９１（１９９９年）；Ｌｅｅ，Ｄ．Ｄ．ら、「Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｎｏｎ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｉｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．１４：５５６−５６２（２００１年）を参照されたい）。
【００３４】
ＮＭＦは、遺伝子発現データを分析するためにゲノム科学において採用された（Ｂｒｕｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｍｅｔａｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０１：４１６４−９（２００４年）を参照されたい）。具体的には、ＮＭＦは、遺伝子コピー数のデータの分析において使用するために適合された（Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｍａｒｋｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１５０２−１３（２００６年）；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｉｎｉｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．９：３１３−２５（２００６年）を参照されたい）。遺伝子コピー数の分析に使用されるこの方法の変形型はゲノム非負値行列因子分解（ｇＮＭＦ）と称される。データセットにおいて平滑化されたコピー数のデータのｎｘｍ行列Ｖ（ｎはセグメントの数であり、ｍは試料の数である）を与えると、ｇＮＭＦアルゴリズムは下記式（５）に示すように行列Ｖをｎｘｒ行列Ｗおよびｒｘｍ行列Ｈに因子分解する：
Ｖ＝Ｗ＊Ｈ＋ｅ  （５）
【００３５】
本発明において、Ｗは各サブグループに対する標準モデルとみなすことができ、Ｈは各サブグループに属する各試料の相対的な重量とみなすことができ、ｅはモデル適合の剰余を表し、ｒはクラスタリングされるサブグループの数である（通常ｍよりもずっと小さい））。入力としてｒおよびＶを与えると、ｇＮＭＦアルゴリズムはまずＷおよびＨの初期値をランダムに設定し、次いで、下記式（６）および（７）に従った乗法更新ルールを用いてＷおよびＨを繰り返し更新する：
【００３６】
【数６】
0005391279.tif 000007
【００３７】
【数７】
0005391279.tif 000008
式中、ａは１からｒまでにわたり、μは１からｍまでにわたり、ｉは１からｎまでにわたる。
【００３８】
ｋ）ピアソンの線形非類似性
本明細書で使用する、「ピアソンの線形非類似性」という語句は、下記式（８）を指す：
【００３９】
【数８】
0005391279.tif 000009
式中、ｘ→およびｙ→は長さｎの２つのベクトルであり、ρ（ｘ→、ｙ→）は下記式（９）を有するピアソンの線形相関である：
【００４０】
【数９】
0005391279.tif 000010
式中、試料の標準偏差ｓｘおよびｓｙは下記式（１０）を有し：
【００４１】
【数１０】
0005391279.tif 000011
試料の平均ｘは下記式（１１）を有する：
【００４２】
【数１１】
0005391279.tif 000012
【００４３】
ｌ）医薬組成物または薬物
本明細書で使用する、「医薬組成物」または「薬物」という用語は、本明細書で互換的に使用され、小分子（例えば、一般には非ペプチド性の活性薬剤を含有する薬物）であろうと生物製剤（例えば、ペプチド、タンパク質または抗体に基づいた薬物、これに限定されないがペグ化などの修飾を伴う任意の薬物を含む）であろうと、少なくとも１種の癌に罹患している対象または患者を治療するために使用され得る任意の作用剤を指す。
【００４４】
ｍ）プライマー
「プライマー」という用語は、ヌクレオチドおよび核酸重合のための酵素（例えば、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ）の存在下で適切な増幅条件（例えば、緩衝液、塩、温度およびｐＨ）下に置いたときに、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのすべての型）の相補鎖であるプライマー伸長産物の合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖である場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、まず、その鎖を分離できるように処理（例えば、変性）される。そのような変性ステップは、一般には熱を使用して行われるが、代替として、アルカリを使用した後中和して行われ得る。プライマーは、約１５から５０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長の長さを有し得る。プライマーは、追加のヌクレオチドも含有する。例えば、ＳＤＡにおいて使用されるプライマーは、標的結合性配列に対する制限エンドヌクレアーゼの認識部位５’を含み得る（米国特許第５，２７０，１８４号および５，４５５，１６６号を参照されたい）。ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡプライマーは、プライマーの標的結合性配列に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み得る。選択された増幅反応において使用するためのそのような特殊配列を標的結合性配列に連結させるための方法は当業者に周知である。さらに、特定の場合において、プライマーは、検出可能な標識で標識され得る。
【００４５】
「フォワードプライマー」という語句は、標的配列（例えば、鋳型鎖）とハイブリダイズ（またはアニーリングする）プライマーを指す。「リバースプライマー」という語句は、標的配列の相補鎖にハイブリダイズ（またはアニーリングする）プライマーを指す。フォワードプライマーは、リバースプライマーに対して、標的配列の５’とハイブリダイズする。
【００４６】
ｎ）プローブ
本明細書で使用する、「プローブ」という用語は、ＣＧＨマイクロアレイ、ＳＮＰマイクロアレイまたは適切な条件下で標的配列の少なくとも一部分と選択的にハイブリダイズすることができる、当技術分野で公知の任意の他のマイクロアレイと関連して使用するために設計されたオリゴヌクレオチドを指す。一般に、プローブ配列は、「相補的」（すなわち、コード鎖またはセンス鎖（＋）に対して相補的）または「逆相補的」（すなわち、アンチセンス鎖（−）に対して相補的）のいずれかであると同定される。プローブは、約１０−１００ヌクレオチド、好ましくは約１５−７５ヌクレオチド、最も好ましくは約１５−５０ヌクレオチドの長さを有することができる。
【００４７】
ｏ）ランダムフォレスト
本明細書で使用する、「ランダムフォレスト」という語句は、予測木を、独立にサンプリングされたランダムベクターの値に各木が依存するように、またフォレスト内のすべての木が同じ分布を持つように組み合わせて使用する、２００１年にＢｒｅｉｍａｎによって記載された（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｌ．、「Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓ」、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、４５（１）：５−３２（２００１年）を参照されたい）教師あり学習アルゴリズムを指す。
【００４８】
ランダムフォレストは、多くの分類木を成長させる。新しい目的物を入力ベクターから分類するために、入力ベクターをフォレスト内の木それぞれに置く。各木から分類が与えられ、それは木がクラスに「投票する」と言われる。フォレストは、最も多い票（フォレスト内のすべての木にわたって）を有する分類を選出する。各木は以下の通り成長する：
１．訓練セット内の事象の数がＮである場合、Ｎ個の事象をランダムにサンプリングするが、元のデータからの置き換えがある。この試料は、木を成長させるための訓練セットになる。
２．Ｍ個の入力変数がある場合、数ｍ＜＜Ｍは、各結節において、ｍ個の変数がＭからランダムに選択され、結節を分割するためにこれらのｍ個の変数に対する最良の分割が使用されるように特定される。ｍの値はフォレストが成長する間、一定に保たれる。
３．各木は可能な限りの最大規模まで成長させる。剪定はしない。
【００４９】
ランダムフォレストの予測エラー発生率は２つの因子に左右される：
１．フォレスト内の任意の２つの木間の相関。相関が大きくなるとフォレストのエラー発生率が増加する。
２．フォレスト内の個々の木それぞれの強度。エラー発生率が低い木は強力な分類器である。個々の木の強度が増加すると、フォレストのエラー発生率が減少する。
【００５０】
Ｂ．計算アルゴリズムならびに腫瘍および癌細胞系のゲノム分類におけるその使用。
【００５１】
本明細書において前記したように、本発明は、腫瘍および細胞系を、それらのゲノム全般にわたるコピー数（ＣＮ）のパターンに基づいて分類し、腫瘍および癌細胞系をそれらのＣＮの変化のパターンに基づいてゲノムサブグループに割り当て、特定の癌の型についてのゲノムサブグループを表すために腫瘍および癌細胞系のパネルを構築する方法に関する（図１を参照されたい）。上記の方法は、本明細書において詳細が記載される独特の計算アルゴリズムを使用する。
【００５２】
具体的には、本発明は、腫瘍および癌細胞系を含む複数（ｍ個）の試料を得ることに関する（ｍは１から５，０００，０００までの整数である。例えば、複数の試料は、２個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、１００個、２００個、５００個、１，０００個、１０，０００個、５０，０００個、１００，０００個の試料、２５０，０００個の試料、５００，０００個、１，０００，０００個の試料などであり得る。）。腫瘍および癌細胞系を得た後、得られた、選択された腫瘍および癌細胞系におけるコピー数およびコピー数の変化が、当技術分野で公知の常用の技法を使用して検出される。腫瘍は、１種以上の腫瘍または癌に罹患している対象（例えば、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨原性肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏枝神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに真性多血症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症および重鎖病）に罹患している対象など）から得られ得る。そのような腫瘍細胞は、当技術分野で公知の常用の技法を使用して得られ得る。例えば、腫瘍は、癌に罹患しているまたは罹患している疑いがある対象から、外科手術で解剖され、次いで−８０℃などで即座に凍結され得る。
【００５３】
あるいは、腫瘍および癌細胞系の試料は、商業的にまたは公共の供給源から得られ得る。そのような腫瘍または癌細胞系を得るまたは購入するために使用され得る商業的なまたは公的に利用可能な供給源の例としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓｕｓ、ＶＡ；Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＣＬＳ）、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
また、多様な腫瘍および癌細胞系についてのコピー数およびコピー数の変化の情報は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）から入手可能なＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）からオンラインで、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｐｏｒｔａｌからオンラインで、Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトからオンラインでなど、いくつもの市販の供給源または公共の供給源から得られ得るが、これらに限定されない。
【００５５】
商業的および公的に利用可能な供給源から入手可能な腫瘍および癌細胞系の例は、以下の表Ａ−Ｃに示されている。具体的には、表Ａは、非小細胞肺癌に関する情報を提供している。表Ｂは、結腸直腸癌に関する情報を提供している。表Ｃは、黒色腫に関する情報を提供している。
【００５６】
【表１】
0005391279.tif 000013
0005391279.tif 000014
【００５７】
【表２】
0005391279.tif 000015
0005391279.tif 000016
【００５８】
【表３】
0005391279.tif 000017
0005391279.tif 000018
【００５９】
必要な腫瘍および癌細胞系が得られたら、ゲノムＤＮＡは、フェノールクロロホルム抽出、塩析、消化なしの抽出などの当技術分野で公知の常用の技法を使用して、または（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から入手可能なＤＮｅａｓｙキットまたはＱＩＡａｍｐキットなどの市販のキットを使用することによって、腫瘍または細胞系のそれぞれから抽出される。次いで、腫瘍または細胞系のそれぞれから得られたゲノムＤＮＡは、残りの分析を容易にするために修飾または変更され得る。例えば、プライマー配列またはアダプター配列が、当技術分野で公知の常用の技法を使用してゲノムＤＮＡにライゲーションされ得る。例えば、ゲノムＤＮＡは最初に、当技術分野の常用の技法を使用して、制限エンドヌクレアーゼ（例えばＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩまたはこれらの組合せなど）で消化され得る（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の３０頁を参照されたい）。消化されたら、１つ以上のプライマー配列またはアダプター配列が、消化されたゲノムＤＮＡにライゲーションされ得る。使用されるアダプターは、粘着性の４塩基対突出を認識するものであることが好ましい。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが、Ｘｂａ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎｓｐ、Ｓｔｙまたは任意のこれらの組合せなどの１つ以上のアダプターを、消化されたゲノムＤＮＡにライゲーションするために使用され得る。使用され得るＸｂａアダプターの例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販されている、５’ＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＡＡ３’（配列番号２）の配列を有するものである（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の１２８頁を参照されたい）。使用され得るＨｉｎｄＩＩＩアダプターの例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販されている、５’ｐＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＡＡ３’（配列番号３）の配列を有するものである（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の１２９頁を参照されたい）。使用され得るＮｓｐアダプターの例は、いずれもＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販されている、５’ＡＴＴ  ＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴＣＡＴＧ３’（配列番号５）の配列を有するものおよび５’ｐＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＡＡ３’（配列番号６）を有するものである（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＰＮ  ７０１９３０  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００５−２００６年）の２８９頁を参照されたい）。使用され得るＳｔｙアダプターの例は、いずれもＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販されている、５’ＡＴＴＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴ３’（配列番号７）の配列を有するものおよび５’ｐＣＷＷＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＡＡ３’（配列番号８）の配��を有するものである（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＰＮ  ７０１９３０  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００５−２００６年）の２９２頁を参照されたい）。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを、ＸｂａアダプターおよびＨｉｎｄＩＩＩアダプターをゲノムＤＮＡにライゲーションするために使用するための技法は、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の３３頁に記載されている。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを、ＮｓｐアダプターおよびＳｔｙアダプターをゲノムＤＮＡにライゲーションするために使用するための技法は、例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＰＮ  ７０１９３０  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００５−２００６年）の２５３頁に記載されている。
【００６０】
次いで、ＤＮＡは、特定の増幅条件および増幅試薬を用いた常用の核酸増幅方法を使用して増幅される。この段落において、ＤＮＡの増幅に関連して使用される、「増幅条件」という用語は、プライマー配列のアニーリングおよび／または伸長を促進する条件を指す。そのような条件は、当技術分野で周知であり。選択された増幅方法に左右される。例えば、ＰＣＲ増幅条件は、一般に熱循環、例えば、反応混合物を２つ以上の温度間を循環させることを含む。恒温の増幅反応では、増幅は、反応を開始させるために初期温度を上昇させる必要があり得るが、熱循環なしで起こる。増幅条件は、これらに限定されないが、温度および温度循環、緩衝液、塩、イオン強度、ｐＨなどを含めたすべての反応条件を包含する。同様に、この段落において、ＤＮＡ増幅に関連して使用される、「増幅試薬」という語句は、核酸増幅反応において使用される試薬を指す。増幅試薬の種類は、選択された核酸増幅方法の種類に応じて変動する。核酸増幅方法において使用するための増幅試薬の選択は、当業者に周知である。当技術分野で公知の増幅試薬の例としては、緩衝液、試薬、逆転写酵素活性および／またはポリメラーゼ活性またはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素；マグネシウムまたはマンガンなどの酵素の補助因子；塩；およびデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）およびデオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）などのデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。核酸増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、これに限定されない。ＰＣＲは、これらに限定されないが、それぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０年）；「ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ（編集）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５年）；「Ｐｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｂａｓｉｃ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＰＣＲ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら（編集）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ：Ｏｘｆｏｒｄ（１９９１年）；Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３２４：１６３頁（１９８６年）；および米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号および４，８８９，８１８号などのいくつもの参照文献に記載されている．ＰＣＲの変形としては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）に基づいたアッセイ（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：７２７６−７２８０頁（１９９１年）を参照されたい）が挙げられ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（またはＲＴ−ＰＣＲ、例えば、それぞれが参照により組み込まれている、米国特許第５，３２２，７７０号および５，３１０，６５２号に記載されている）も挙げられる。
【００６１】
一般に、ＰＣＲにおいて、単一のプライマーまたはプライマーの対が、標的核酸の相補鎖とハイブリダイズさせるために、上記の腫瘍または癌細胞系から得られたＤＮＡに過剰に添加される。腫瘍または癌細胞系から得られたゲノムＤＮＡが消化され、プライマー配列またはアダプター配列にライゲーションされる場合、増幅方法において使用されたプライマーの１つがアダプター配列を認識することが好ましい。上の段落に記載の方法などの増幅方法において使用された（１つまたは複数の）プライマーが、２５０から２０００までの塩基対のサイズ範囲で断片を増幅することも好ましい。本発明において使用され得るプライマーの例は、それぞれＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販されている、５’ＡＴＴＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴ３’（配列番号１の配列を有するＰＣＲプライマー００１および５’ＡＴＴＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴ３’（配列番号４）の配列を有するＰＣＲプライマー００２である（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の１２８頁（ＰＣＲプライマー００１）およびＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＰＮ  ７０１９３０  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００５−２００６年）の２８９頁（ＰＣＲプライマー００２）を参照されたい）。（１つまたは複数の）プライマーは、それぞれ、標的配列を鋳型として用いて、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。伸長産物は、元の標的鎖から解離（変性）した後、それ自体が標的になる。次いで、新しい（１つまたは複数の）プライマーがハイブリダイズされ、ポリメラーゼによって伸長され、このサイクルが、増幅されるＤＮＡのコピー数が指数関数的に増加するまで繰り返される。ＰＣＲ反応においてプライマー伸長産物を産生することができるＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、種々の供給源（例えば、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から入手可能なサーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ））、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、  ＯＨ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から単離された熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）Ｅｎｚｙｍｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、組換えサーマス・サーモフィルス（ｒＴｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）またはサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）（「Ｖｅｎｔ」ポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない��ＲＮＡ標的配列は、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ）し、次いで、上記の通りＰＣＲを行うことによって増幅され得る。あるいは、単一の酵素が、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第５，３２２，７７０号に記載の通り両方のステップのために使用され得る。
【００６２】
増幅が完了すると、生じた増幅ＤＮＡは、当技術分野における常用の技法を使用して精製され得る（例えば、その技法のためのプロトコールがＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の４２頁に記載されている、Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡから入手可能なＱｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ９６  ＵＦ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍまたはその技法のためのプロトコールがＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＰＮ  ７０１９３０  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００５−２００６年）の７４頁に記載されている、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｐｌａｔｅを使用することによってなど）。精製された後、増幅ＤＮＡは、次いで、例えば超音波処理によって、またはＤＮａｓｅＩなどの酵素を使用することによってなど、当技術分野で公知の常用の技法を使用して断片化される。断片化された後、ＤＮＡは検出可能な標識で標識される。ＤＮＡおよびＤＮＡ断片を標識するための方法は当業者に周知である。標識のプロトコールおよび標識の検出技法の総説は、例えば、Ｌ．Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３９：１１４−１２９頁（２００２年）；ｖａｎ  Ｇｉｊｌｓｗｉｊｋら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．、１：８１−９１頁（２００１年）；およびＪｏｏｓら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３５：１３５−１５３頁（１９９４年）において見られ得る。標準の核酸標識方法としては、放射性作用剤を組み込むこと、蛍光色素を直接接着させること（Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１３：２３９９−２４１２頁（１９８５年）を参照されたい）または酵素を直接接着させること（Ｃｏｎｎｏｌｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、１３：４４８５−４５０２頁（１９８５年）を参照されたい）；核酸分子を免疫化学的にまたは他の親和性反応によって検出可能にする、核酸分子の化学修飾（Ｂｒｏｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、５：３６３−３８４頁（１９７８年）；Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎａｌｙｓｉｓ、２６：１−４５頁（１９８０年）；Ｌａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：６６３３−６６３７頁（１９８１年））；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１：６１６７−６１８４頁（１９８３年）；Ｂｒｉｇａｔｉら、Ｖｉｒｏｌ、１２６：３２−５０頁（１９８３年）；Ｔｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３４６６−３４７０頁（１９８４年）；Ｌａｎｄｅｇｅｎｔら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、１５：６１−７２頁（１９８４年）およびＡ．Ｈ．Ｈｏｐｍａｎら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、１６９：３５７−３６８頁（１９８７年を参照されたい）；およびランダムプライミング、ニックトランスレーション、ＰＣＲおよびターミナルトランスフェラーゼを用いたテーリングなどの酵素媒介性の標識方法（酵素的標識の総説については、例えば、Ｔｅｍｓａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．��ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、：２２３−２３２頁（１９９６年）を参照されたい）。
【００６３】
多種多様な検出可能な標識はいずれも使用され得る。適切な検出可能な標識としては、種々のリガンド、放射線核種（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１４Ｃ、１２５１、１３１Ｉなど）；蛍光色素；化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステル、安定化ジオキセタンなど）；スペクトルで解像可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（例えば、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅および白金）またはナノクラスター；酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；比色標識（例えば、色素、コロイド金など）；磁気標識（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））；およびビオチン、ジゴキシゲニンまたは他のハプテンおよびタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
増幅されたら、断片化されたＤＮＡは検出可能な標識で標識され、当技術分野で知られている常用の技法を使用してマイクロアレイにハイブリダイズされる。マイクロアレイは、ゲノムの増加および減少または疾患状態に関与する特定の遺伝子のコピーの数の変化を探すために比較的なゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）において使用され得るオリゴヌクレオチド、遺伝子またはゲノムクローンを含有し得る。あるいは、マイクロアレイは、一塩基多型（ＳＮＰ）などの突然変異または多型を含有するオリゴヌクレオチド、遺伝子またはゲノムクローンを含有し得る。マイクロアレイは、当技術分野で公知の常用の技法を使用して製造され得る。あるいは、市販のマイクロアレイが使用され得る。使用され得るマイクロアレイの例は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ｓｅｔ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈら、「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｖｅｒ  １００，０００  ＳＮＰｓ  ｏｎ  ａ  ｐａｉｒ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１：１０９−１１（２００４年）を参照されたい）；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔｓ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０  ＮＳＰ  ＡｒｒａｙもしくはＫＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ２５０Ｋ  Ｓｔｙ  Ａｒｒａｙ）またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｒｒａｙ  Ｓｅｔ（それぞれ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡから市販されている）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａＣＧＨ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４４Ｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡから入手可能）、Ｉｌｌｕｍｉｎａマイクロアレイ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ  ａＣＧＨマイクロアレイ（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などである。
【００６５】
ハイブリダイゼーションされた後、マイクロアレイは、当技術分野で知られている常用の技法を使用して洗浄される。洗浄された後、マイクロアレイは、解析のためにリーダーまたはスキャナーに置かれる。使用され得るリーダーおよびスキャナーの例としては、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  Ｇ７（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡから入手可能）、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡから入手可能）、ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡから入手可能）などが挙げられる。マイクロアレイに含有されるプローブから集められたシグナルは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって供給されているものなどの市販のソフトウェアを使用して分析され得る。例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘからのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  Ｇ７が使用される場合、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅが使用され得る。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅは、すべてのプローブからのシグナルを検出するＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）スキャナーからの生データ（シグナル）または特徴データ（シグナル）を収集し、抽出する。生データまたは特徴データは、ＣＥＬファイル（ＣＥＬファイルの形式はＷｉｎｄｏｗｓ  ＩＮＩ形式と同様のＡＳＣＩＩテキストファイルである。）、ＣＨＩＰファイル、ＣＮＴファイル、メタプローブセットファイルまたはさらにプレーンテキストファイルとしてなど任意の適切なファイル形式の１つに電子的に保管され得るが、これらに限定されない。
【００６６】
マイクロアレイから収集および抽出されたデータは、腫瘍および癌細胞系の試料それぞれからの各染色体からの少なくとも１つの遺伝子座からのコピー数の変化（例えば、コピー数の増加または減少）の情報を含むデータセットをもたらすために処理される。このコピー数の変化の情報は、これらの試料それぞれについて、ゲノム全般にわたる規模におけるコピー数の変化領域（またはパターン）を定義するために使用される。そのような処理は、これらに限定されないが、バイナリーサーキュラー分割（Ｏｌｓｈｅｎ，Ａ．Ｂ．、ら、「Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｂｉｎａｒｙ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ＤＮＡ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ｄａｔａ．」、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ５（４）：５５７−７２頁（２００４年）を参照されたい）、ＤＮＡの増加および減少の分析（ＧＬＡＤ）（Ｈｕｐｅ，Ｐ．ら、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ｄａｔａ：ｆｒｏｍ  ｓｉｇｎａｌ  ｒａｔｉｏ  ｔｏ  ｇａｉｎ  ａｎｄ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅｇｉｏｎｓ．」、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０（１８）：３４１３−２２頁（２００４年）を参照されたい）、隠れマルコフモデルに基づいた手法（Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ，Ｊ．ら、「Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ｄａｔａ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、９０（１）：１３２−１５３頁（２００４年）；Ｚｈａｏ，Ｘ．ら、「Ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ａｌｌｅｌｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｒｒａｙｓ．」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４（９）：３０６０−７１頁（２００４年）を参照されたい。）、またはクラスタリングに基づいた方法（Ｗａｎｇ，Ｐ．ら、「Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃａｌｌｉｎｇ  ｇａｉｎｓ  ａｎｄ  ｌｏｓｓｅｓ  ｉｎ  ａｒｒａｙ  ＣＧＨ  ｄａｔａ．」、Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、６（１）：４５−５８頁（２００５年）を参照されたい。）などの当技術分野で公知のアルゴリズムを用いて行われ得る。あるいは、これらに限定されないが、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ（商標）ソフトウェア、例えば６．０８．０１０３バージョン（Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉから入手可能）、ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ（オンラインで入手可能；Ｒｅｉｃｈ  Ｍ、Ｌｉｅｆｅｌｄ  Ｔ、Ｇｏｕｌｄ  Ｊ、Ｌｅｒｎｅｒ  Ｊ、Ｔａｍａｙｏ  Ｐ、Ｍｅｓｉｒｏｖ  ＪＰ（２００６年）、「ＧｅｎｅＰａｔｔｅｒｎ  ２．０」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３８：５、５００−５０１頁（２００６年）を参照されたい）、およびｄＣｈｉｐ（オンラインで入手可能；Ｃｈｅｎｇ  Ｌｉら、「Ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ：ｍｏｄｅｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ、  ｄｅｓｉｇｎ  ｉｓｓｕｅｓ  ａｎｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏ��  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２（８）：ｒｅｓｅａｒｃｈ００３２．１−００３２．１１（２００１年）；Ｃｈｅｎｇ  Ｌｉら、「Ｍｏｄｅｌ−ｂａｓｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｕｔｌｉｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ９８巻、３１−３６頁（２００１年）を参照されたい）などの市販のソフトウェアが使用され得る。
【００６７】
例えば、Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）ＧｅｎｏｍｉｃＳｕｉｔｅ（商標）ソフトウェア、例えば６．０８．０１０３バージョンが使用される場合、スキャナーによって検出される、マイクロアレイ中のすべてのプローブからのシグナルを含有する、腫瘍および癌細胞系資料のためのＣＥＬファイルがソフトウェアにローディングされ得る。コピー数は、あらかじめ設定した基線（あらかじめ設定した基線を確立するために使用された数は決定的ではなく、整数（ｎ）であり、ｎは１から１００までである。例えば、あらかじめ設定した基線は２であり得る。）に対して補正した後、マイクロアレイから決定された腫瘍または癌細胞系の試料についてのシグナル強度と、参照または対照のシグナル強度を比較することによって計算される。使用される参照または対照は、同じマイクロアレイプラットフォームによって測定される腫瘍試料と同じ患者からの正常な組織試料のセットまたは正常な組織の対であり得る。参照または対照は、試料約１個から１０００個までの整数（ｎ）である。例えば、参照または対照は、少なくとも５個の試料、少なくとも１０個の試料、少なくとも１５個の試料、少なくとも２０個の試料、少なくとも２５個の試料、少なくとも３０個の試料、少なくとも３５個の試料、少なくとも４０個の試料、少なくとも４５個の試料、少なくとも５０個の試料、少なくとも７５個の試料、少なくとも１００個の試料、少なくとも１５０個の試料、少なくとも２００個の試料、などを含むことができる。
【００６８】
次いで、得られたコピー数のデータは分割され、各試料においてコピー数の変化領域が検出される。コピー数の変化領域の分割および検出は、特定の制御パラメータを使用して得られ得る。例えば、以下の対照パラメータ：
（ｉ）コピー数領域は少なくとも１００個のプローブを含有しなければならない、
（ｉｉ）コピー数領域の平均コピー数と隣接するコピー数領域を比較したｐ値は０．００００１未満でなければならない、および
（ｉｉｉ）トランジションのシグナル／ノイズ比は０．１超でなければならない。
が使用され得る。コピー数の変化領域は、これらの領域における平均コピー数が統計的に約１．６５未満（欠失に対して）（例えば、１．６５未満、１．６０未満、１．５５未満、１．５０未満、１．４５未満、１．４０未満、１．３５未満、１．３０未満、１．２５未満など）または約２．６５超（増加に対して）（例えば、２．６５超、２．７０超、２．７５超、２．８０超、２．８５超、２．９０超、３．０超、３．０５超など）であり、Ｐ値が０．０１を下回る場合に検出され得る。
【００６９】
腫瘍試料は、コピー数の変化のシグナルを弱める可能性がある、相当な割合（「相当な割合」という語句は、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超または９０％超を意味している）の正常（例えば、非癌性）細胞を含有する可能性があるので、データセットは、相当な割合の正常細胞が混入した試料から得られたどんなコピー数の変化の情報も同定し、排除するために精査される。機械学習アルゴリズムは、腫瘍試料および癌細胞系試料のコピー数のパターンと正常試料のコピー数のパターンの間の差異を同定および捕捉するために使用され得る。そのようなアルゴリズムは、さらなる分析から正常細胞が混入した腫瘍試料を同定し、排除するために使用され得る。したがって、機械学習アルゴリズムは、データセットのデータの品質管理に役立ち、本明細書で「データの品質管理アルゴリズム」と称される。
【００７０】
データの品質管理アルゴリズムは、本明細書で前記したように、腫瘍試料および癌細胞系試料からのコピー数の変化領域の数が最も多い試料のサブセット（以下、第１の試料セット）を選択することを含む。正常な試料セットも選択される（以下、第２の試料セット）。これらの第１の試料セットおよび第２の試料セットは、第１の試料セットと第２の試料セットの間の差異を最もよく表すようにアルゴリズムのパラメータを合わせることによって、試料が「正常」試料または「腫瘍」試料のいずれであるかを分類するための機械学習アルゴリズムを開発するための訓練セットとして使用される。訓練された分類器は、各試料に対して正常細胞混入含有に対する確率スコアを割り当てるために、残りの腫瘍または癌細胞系の試料に適用される。この確率スコアは、各試料の、正常細胞が混入している確率を表す。５０パーセント（５０％）を超える混入確率を有する試料は、データセットから、したがって続くクラスタリング解析から除外または除去される。使用され得る機械学習アルゴリズムの例としては、ランダムフォレスト（ＲＦ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）（Ｖａｐｎｉｋ，Ｖ．、Ｔｈｅ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｔｈｅｏｒｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９５年）を参照されたい）、再帰的ＳＶＭ（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ら、「Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ＳＶＭ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｓｓ−ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏａｒｒｙ  ｄａｔａ」、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｍｆｏｒｍａｔｉｃｓ、７：１９７（２００６年４月１０日）を参照されたい）、最小角度回帰（ＬＡＲＳ）（Ｅｆｒｏｎ，Ｂ．ら、「Ｌｅａｓｔ  ａｎｇｌｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ」、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、３２：４０７−４５１（２００４年））などが挙げられる。
【００７１】
マイクロアレイから得られたコピー数のデータは密度が高くノイズが多い傾向があるので、コピー数のデータは、ノイズレベルを低下させ、次元を縮小させ（「次元縮小」とも称される）、データセットの複雑さを低減するために平滑化され得る。データセットの平滑化は、最初に、当技術分野で知られている常用の技法を使用して、各試料において有意に増加または欠失したコピー数領域を検出することによって行われ得る。そのような領域が同定されたら、隣接する領域が、同様のコピー数の変化を有する場合、およびこれらの領域間の距離が５００キロ塩基未満である場合、合併され得る。次いで、ゲノム全体が、データ内のすべての試料からの区切り点の連結を使用して分割され得、各セグメントのコピー数が、各セグメント内のＳＮＰプローブのコピー数を平均することによって計算され得る（Ｃａｒｒａｓｃｏら、「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｉｎｉｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ、９：３１３−３２５頁（２００６年）を参照されたい）。このデータの平滑化の結果として、データセット内の試料それぞれからのコピー数の増加および欠失の良好な解像が得られ得る。
【００７２】
データの平滑化および次元縮小をした後、データセットは、腫瘍および癌細胞系の試料のそれぞれの間の相対的な類似性の概要を得るため、およびこれまでにデータ内に存在しており、最終的にクラスタリングされるサブグループの数（本明細書ではｒ個のサブグループとも称される）の見積もり（例えば、大まかな見積もり）を得るために、教師なしクラスタリング手法に供される。データの平滑化および次元縮小をした後、ピアソンの線形非類似性アルゴリズムを用いた教師なしクラスタリング手法が、「データセット」（Ｖ）と称される平滑化された腫瘍および細胞系のコピー数のデータに適用される。クラスタリングパターンが、データセット内の予想されるサブグループの数、ｒの範囲を導くために、プロットされ、視覚的に検査され得る（データセット内の予想されるサブグループの数の範囲は、１から１００までの整数（ｎ）になる）。使用され得る教師なしクラスタリング手法の例としては、階層クラスタリング、主成分分析（ＰＣＡ）（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｋ．、「Ｏｎ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｅｓ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｅｓｔ  Ｆｉｔ  ｔｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｐｏｉｎｔｓ  ｉｎ  Ｓｐａｃｅ」、Ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｉｃａｌ  Ｍａｇａｚｉｎｅ．２：５５９−５７２（１９０１年）を参照されたい）または多次元尺度構成法（ＭＤＳ）（Ｂｏｒｇ，Ｉ．およびＰ．Ｇｒｏｅｎｅｎ、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｓｃａｌｉｎｇ：ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００５年）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、サブグループの数（それぞれが「ｒ値」と称され、各ｒ値は１から１００までの整数である。）が、ゲノム非負値行列因子分解（「ｇＮＭＦ」）を使用したクラスタリング解析において入力として使用される。
【００７３】
以前のｇＮＭＦのクラスターＣＧＨデータへの適用において（Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｍａｒｋｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６６：１１５０２−１３２００６年；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｉｎｉｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．９：３１３−２５（２００６年）を参照されたい）、アルゴリズムは、所定のステップ数（例えば１００）の後、腫瘍または癌細胞系の試料のサブグループの割り当てに変化がなかったところで停止された。模擬データならびに実際のＣＧＨデータを用いた試験に基づいて、この基準は、ｇＮＭＦアルゴリズムをあまりにも早く停止する（例えば、終結させる）と考えられる。したがって、ｇＮＭＦアルゴリズムは、選択されたステップ数（選択されたステップ数は決定的ではなく、例えば、５ステップ、１０ステップ、２５ステップ、５０ステップ、１００ステップ、２００ステップなど、１から１０００までの整数（ｎ）である。）の乗法的更新の後に、データセットからのアルゴリズムの発散が下記式（１）を使用して計算されるように改変され得る：
【００７４】
【数１２】
0005391279.tif 000019
（式中、Ｖｉｊはデータセットのｉ行ｊ列目であり、（ＷＨ）ｉｊは行列（Ｗ＊Ｈ）のｉ行ｊ列目であり、ｉは１からｎまでにわたり、ｎは平滑化されたデータセットＶ内のセグメントの数であり、ｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数である。）。
【００７５】
上記の式を使用して、反復性のアルゴリズムは、上記で計算された発散が、前の、または事前に選択された、アルゴリズムの乗法的更新のステップ数（例えば１００）に対して計算された発散と比較して、約０．００１％超減少していない場合に停止する（本明細書では「停止基準」とも称される）。ｇＮＭＦアルゴリズムに対するこの改変によってクラスタリングの正確度が有意に改善されたことがわかっている。
【００７６】
ｇＮＭＦは確率論的な手順であるので、アルゴリズムは、異なる初期値から開始された場合、異なる転帰を生成し得る。クラスタリングアルゴリズムの性能をさらに改善するために、新規の複数開始戦略が開発された。各データセットについて、この戦略は上記の停止基準を使用し、ｇＮＭＦアルゴリズムをランダムに開始し、選択された実行回数繰り返す（アルゴリズムがランダムに開始され繰り返され得る、選択された実行回数は、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０など、１から１０００までの整数（ｎ）である。）ことを含む。アルゴリズムがそのランダムに選択された実行回数を完了したら、これらの実行のそれぞれに対して、下記式（２）を使用してＨのピアソン相関係数行列が計算される：
【００７７】
【数１３】
0005391279.tif 000020
（式中、Ｃは相関行列であり、Ｃｉ，ｊは行列Ｃのｉ行ｊ列目であり、Ｈ，ｉおよびＨ，ｊは行列Ｈにおけるｉ列目およびｊ列目のベクトルであり、ρ（Ｈ，ｉ，Ｈ，ｊ）はＨ，ｉとＨ，ｊ間のピアソン相関係数であり、ｉおよびｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数であり、ｋは１からｒまでにわたり、ｒはサブグループの数（本明細書においてあらかじめ決定された）である）。各実行に対してＨのピアソン相関係数行列が決定されたら、相関行列が平均される。最終的なクラスタリングの結果は、１引く（距離行列として平均相関行列）を用いた教師なしクラスタリング手法（例えば、階層クラスタリングアルゴリズムなど）を実行し、デンドログラムをｒ個のサブグループにカットすることによって導かれ得る。
【００７８】
例えば、ｇＮＭＦアルゴリズムがランダムに２００回実行された場合、２００回の実行後、２００回のランダムなｇＮＭＦの実行のそれぞれの出力からのＨのピアソン相関係数行列が、上記の式を使用して計算される。次いで、２００回の実行を通して相関行列が平均される。最終的なクラスタリングの結果は、１引く（距離行列として平均相関行列）を使用した階層クラスタリングアルゴリズムを実行し、デンドログラムをｒ個のサブグループにカットすることによって導かれ得る。
【００７９】
最終的なクラスタリングの結果が得られたら、次いで、コーフェン相関係数、ベイズ情報量規準（ＢＩＣ）またはコーフェン相関とＢＩＣの組合せが、これらの腫瘍および細胞系の試料の遺伝子パターンの分布を最も反映する最良のモデル（すなわち、最良のクラスター数およびクラスターの１つへの各試料の最良の割り当て）を選択するために用いられる。対数正規分布が、ＤＮＡコピー数の適合に広く使用されているので（Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２９：４５９（２００１年）を参照されたい）、この分析において使用され得る。尤度を計算するために、各クラスター内の試料は、各セグメントの平均コピー数が対数正規分布に従う場合、同じ多変量対数正規分布に由来すると仮定され得る。セグメント間の相関が弱い場合、独立性が計算におけるセグメント間に仮定され得る。この場合、得られる対数尤度は、式（１２）で以下に示される：
【００８０】
【数１４】
0005391279.tif 000021
（式中、ｒはクラスターの数であり、ｎｉはクラスターｉ内の試料の数であり、ｍはセグメントの数であり、ｙｉｊはｉ番目のクラスター内のｊ番目の試料のｔ番目の対数変換されたコピー数であり、μｉｔはｉ番目のクラスター内のｔ番目の対数変換されたコピー数の平均であり、σｉｔはｉ番目のクラスター内のｔ番目の対数変換されたコピー数の標準偏差である。このとき、特定されたモデルにおけるパラメータの数ｋは２×ｒ×ｍになる。）である。
【００８１】
何度も、教師なしクラスタリングにおいて最良のモデルを選択するための基準としてコーフェン相関係数およびＢＩＣの両方を用いる場合、これらの２つのアルゴリズムは多くの場合同じモデルを選択する。
【００８２】
１０倍安定性検定の手順が、クラスタリングの結果の安定性を評価するために使用され得る。１０倍安定性検定は以下の通り行われ得る。データセットに対してｇＮＭＦを実行し、試料をクラスターに割り当てた後、少なくとも約１０％の腫瘍および癌細胞系の試料が除外され、２回目の上記の改変ｇＮＭＦアルゴリズムが、残りの９０％の腫瘍および癌細胞系の試料に対して実行される（少なくとも約１５％の腫瘍および癌細胞系の試料が除外される場合、２回目の上記のｇＮＭＦアルゴリズムが、残りの８５％の腫瘍および癌細胞系の試料に対して実行される、など。）。次いで、異なるクラスターに割り当てられた試料の数が、この並べ替えの結果として計算される。この検定は、当技術分野で公知の常用の技法を使用してエラー発生率を導くために、選択された回数繰り返される（この検定は、１回から１０００回まで繰り返され得る。例えば、この検定は、１回、２０回、２５回、５０回、１００回、２００回、５００回、７５０回、１０００回など、繰り返され得る。）。このエラー発生率は、腫瘍および癌細胞系の試料の並べ替えに関してクラスタリングの結果の安定性を表す。この１０倍安定性検定は、同じデータセット（腫瘍および癌細胞系の試料）を用いた教師なしクラスタリング手法（例えば階層クラスタリング）において使用され得る。
【００８３】
Ｃ．腫瘍および癌細胞系のゲノム分類に基づいた腫瘍および細胞系のパネルの構築
上のセクションＢに記載した方法を使用して、同じ腫瘍型の腫瘍および癌細胞系が、ゲノムサブグループに分類され得る。最初に、複数（ｍ個）の、対象とする癌の型の腫瘍および癌細胞系が、上のセクションＢに記載した方法体系を使用して別個のサブグループにクラスタリングされる。これらのサブグループのそれぞれから、少なくとも１つの細胞系が選択され、パネルに加えられる。したがって、生じたパネルは、対象とする癌の型のすべてのゲノムサブグループを表している。これらの腫瘍および癌細胞系のパネルは、特定の癌のサブカテゴリーのそれぞれに対して医薬組成物または薬物を試験するための前臨床モデルとして使用され得、したがって、検討している腫瘍型のゲノムの多様性の総括的な適用範囲をもたらす。通常、腫瘍のゲノム構成とその表現型（薬物応答を含む）の間に相関が認められるので、コピー数の変化のパターンは、細胞系における薬物感受性と相関し、患者における薬物応答性を決定することが予想される。
【００８４】
ここで、限定するものではなく例として本発明の実施例が示される。
【実施例１】
【００８５】
細胞系および／または異種移植片のパネルを構築するための一般的な方法体系およびアルゴリズム
【００８６】
１．ＤＮＡの抽出およびＳＮＰアレイへのハイブリダイゼーション
ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ｓｅｔ  ＳＮＰアレイ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、「Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｖｅｒ  １００、０００  ＳＮＰｓ  ｏｎ  ａ  ｐａｉｒ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ」、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１：１０９−１１頁（２００４年）を参照されたい；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡから市販されている）は、ヒトゲノムにおける一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝子座１１６，２０４個を包含し、マーカー間の平均距離は２３．６ｋｂである。アレイセットは、２つのチップ、Ｘｂａ２４０およびＨｉｎｄ２４０を含む。チップおよび試薬は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから入手され、アッセイは製造者の指示に従って行われた。簡単に述べると、各腫瘍からの組織３０ｍｇまたは各細胞系からの細胞５百万個が、ＤＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して高分子量のゲノムＤＮＡを抽出するために使用された。ゲノムＤＮＡ２５０ｎｇが、ＨｉｎｄＩＩＩまたはＸｂａＩのいずれかによって消化され、次いで、そのそれぞれが粘着性４塩基対（ｂｐ）突出を認識するアダプターＸｂａ（５’ＴＣＴＡＧＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＡＡ３’（配列番号２））およびアダプターＨｉｎｄＩＩＩ（５’ｐＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＣＡＴＡＡ３’（配列番号３））に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の３３頁に記載の通りライゲーションされた。アダプター配列を認識する、５’ＡＴＴＡＴＧＡＧＣＡＣＧＡＣＡＧＡＣＧＣＣＴＧＡＴＣＴ３’の配列を有する（配列番号１、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘから市販されている（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）を参照されたい）一般的なプライマーであるＰＣＲプライマー００１が、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において２５０−２，０００ｂｐのサイズ範囲で断片を優先的に増幅するように最適化されたＰＣＲ条件を用いてアダプター−ライゲーションされたＤＮＡ断を増幅させるために使用された（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の３６頁を参照されたい）。Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ９６  ＵＦ  ＰＣＲ  精製システムを用いた精製後（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の４２頁を参照されたい）、ＰＣＲ産物は断片化され（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の４５頁を参照されたい）、ビオチンで標識され（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の４９頁を参照されたい）、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ｓｅｔに１６時間ハイブリダイズされた（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の５１頁を参照されたい）。アレイは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０を使用して洗浄され、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用してスキャンされた（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の５７頁を参照されたい）。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＣＯＳ）でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒｓから特徴データを収集し、抽出した（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  １００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ７０１６８４  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００４年）の９３頁を参照されたい）。
【００８７】
２．コピー数の決定およびコピー数の変化の検出。
Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ（商標）ソフトウェア（バージョン６．０８．０１０３）が、各遺伝子座のコピー数を決定し、コピー数の変化領域を定義するためのデータを低レベル処理するために使用された。すべてのＳＮＰプローブに対するシグナルを含有するＣＥＬファイルが、ソフトウェアにローディングされ、コピー数が、腫瘍または細胞系の試料に対するシグナル強度を、基線２に対して補正された、正常な雌性組織試料４８個の参照セットに対するシグナル強度と比較することによって計算された。参照セットは、同じマイクロアレイプラットフォームによって測定された、他の正常試料のセットまたは腫瘍試料と同じ患者からの対合正常組織からなってもよい。
【００８８】
得られたプローブレベルのコピー数のデータは分割され、各試料におけるコピー数の変化領域が検出された。具体的には、プローブレベルのコピー数は、以下の制御パラメータを使用して領域に分割された：
（ｉ）領域は少なくとも１００個のプローブを含有しなければならない；
（ｉｉ）領域の平均コピー数と隣接するコピー数領域を比較したｐ値は０．００００１未満でなければならない；
（ｉｉｉ）トランジションのシグナル／ノイズ比は０．１超でなければならない。次いで、コピー数の変化領域は、これらの領域の平均コピー数が統計的に１．６５未満である（欠失）または２．６５超である（増加）場合に、０．０１を下回るｐ値を伴って検出された。
【００８９】
３．データの品質管理。
腫瘍試料は、コピー数の変化のシグナルを弱める、相当な割合の正常細胞を含有する可能性がある。腫瘍試料と正常試料のコピー数のパターン間の差異を捕捉するための機械学習アルゴリズムが展開され、さらなる分析から、正常物が混入した試料を同定し、排除するために使用された。最初に、コピー数の変化領域の数が最も多い試料のサブセットおよび正常試料のセットが選択された。これら２つの試料群は、パラメータを、腫瘍と正常試料との間の差異を最もよく表すように合わせることによって正常試料と腫瘍試料を分類するために、機械学習アルゴリズム［ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｌ．、「Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓ」、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、４５（１）：５−３２（２００１年）を参照されたい）］を訓練するために訓練セットとして使用された。訓練された分類子は、残りの試料に適用されて、正常細胞が混入している試料の確率を表すスコアを各試料に割り当てた。正常混入の確率が５０％を超える試料は、クラスタリング解析から除外された。
【００９０】
４．データの平滑化および次元の縮小。
ＳＮＰマイクロアレイによって得られたコピー数のデータ密度が高く、相当量のノイズがあるので、コピー数のデータは、ノイズレベルを低減し、次元およびクラスタリング解析の複雑さを縮小するために平滑化される必要がある。各試料における有意に増加または欠失した領域の検出後、隣接する領域は、それらの領域が同様のコピー数変化を有し、それらの領域の距離が５００ｋｂ未満の場合、合併された。ＤＮＡセグメントが、データセット内のすべての試料からの区切り点の連結を使用することによって形成された。各セグメント内のプローブの平均コピー数が、さらなる分析に使用された。このステップにより、ハイスループット分析におけるＤＮＡの増加および欠失の明確な解像が可能になった。
【００９１】
５．予想されるサブグループの数を決定するための階層クラスタリングを用いたパイロットクラスタリング解析。
多くの応用において広く使用されているが、階層クラスタリングはゲノム研究に対するいくつかの欠点を有している。第１に、階層クラスタリングは、データセット内のサブグループの数を一貫して、かつ客観的に見積もることができない。第２に、階層クラスタリングパターンは安定でない可能性がある。具体的には、クラスタリングパターンは、少数の試料がデータセットに加えられるまたはデータセットから消されると劇的に変化し得る。さらに、この分析において、階層クラスタリングの１０倍安定性検定の結果をゲノム非負値行列因子分解（ｇＮＭＦ；以下のセクション８を参照されたい）に対する１０倍安定性検定の結果と比較したとき、はるかに高いエラー発生率が観察された。
【００９２】
しかし、階層クラスタリングは、試料間の相対的な類似性の概要を速やかに導き、データ内に存在する、予想されるサブグループの数の大まかな見積もりをもたらすための有用なツールとして役立ち得る。各データセットについて、腫瘍および細胞系のＣＧＨデータが、ピアソンの線形非類似性を用いて階層的にクラスタリングされた。階層クラスタリングパターンが、データセット内の予想されるサブグループの数の範囲を導くためにプロットされ、視覚的に検査された。次いで、これらの数が、ｇＮＭＦを用いたクラスタリング解析において入力として使用された（以下のセクション６を参照されたい）。
【００９３】
６．腫瘍および細胞系のＣＧＨデータのｇＮＭＦクラスタリング。
ＮＭＦは、遺伝子発現データを分析するためのゲノム科学において最初に採用された（Ｂｒｕｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｍｅｔａｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０１：４１６４−９頁（２００４年）を参照されたい）。そのあと、この方法体系は、遺伝子コピー数データの分析に使用するために採用された（Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｍａｒｋｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１５０２−１３頁（２００６年）；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｉｎｉｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．９：３１３−２５頁（２００６年）を参照されたい）。試料セット（すなわちデータセット内の）に対して、平滑化されたコピー数のデータのｎｘｍ行列Ｖ、ここでｎはセグメントの数であり、ｍは試料の数である、を与えると、ｇＮＭＦアルゴリズムは下式（５）に示すように行列Ｖをｎｘｒ行列Ｗおよびｒｘｍ行列Ｈに因子分解する：
Ｖ＝Ｗ＊Ｈ＋ｅ  （５）
【００９４】
上式（５）中、Ｗは各サブグループに対する標準モデルとみなすことができ、Ｈは各サブグループに属する各試料の相対的な重量とみなすことができ、ｅはモデル適合の剰余を表し、ｒはクラスタリングされるサブグループの数である（通常、ｍよりはるかに小さい））。入力としてｒおよびＶを与えると、ｇＮＭＦアルゴリズムはまずＷおよびＨの初期値をランダムに設定し、次いで、下式（６および７）に従った乗法更新ルールを用いてＷおよびＨを繰り返し更新する：
【００９５】
【数１５】
0005391279.tif 000022
【００９６】
【数１６】
0005391279.tif 000023
式中、αは１からｒまでにわたり、μは１からｍまでにわたり、ｉは１からｎまでにわたる。
【００９７】
ＣＧＨデータをクラスタリングするための以前のｇＮＭＦの適用において（Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｍａｒｋｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１５０２−１３頁（２００６年）；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｉｎｉｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．９：３１３−２５頁（２００６年）を参照されたい）、アルゴリズムは所定のステップ数（例えば１００）の後、試料のサブグループの割り当てに変化がなかったところで停止された。模擬データならびに実際のＣＧＨデータを用いた試験に基づいて、この基準は、手順をあまりにも早く停止し得ることが決定され、これは、結果が、アルゴリズムがより多くのステップを実行可能であったならば、さらに改善される可能性があり得たことを示唆している。したがって、アルゴリズムは、乗法的更新を１００ステップ行うごとに、データからの現在のモデルの発散が下式（１）に従って計算されるように改変された。
【００９８】
【数１７】
0005391279.tif 000024
式中、Ｖｉｊは、行列Ｖのｉ行ｊ列目であり、（ＷＨ）ｉｊは、行列（Ｗ＊Ｈ）のｉ行ｊ列目であり、ｉは１からｎまでにわたり、ｎはデータセット内のセグメントの数であり、ｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数である。
【００９９】
反復性のアルゴリズムは、発散が、１００ステップ前に計算された前の発散より０．００１％超減少していない場合に停止する。この改変によって、計算的な複雑さが増すという代償を払って、クラスタリングの正確度が有意に改善された。
【０１００】
ｇＮＭＦは確率論的な手順であるので、アルゴリズムは、異なる初期値から開始された場合、異なる転帰を生成し得る。クラスタリングアルゴリズムの性能をさらに改善するために、新規の複数開始戦略が実行された。各データセットについて、（ａ）ｇＮＭＦアルゴリズムが、上記の停止基準に従って２００回実行された；（ｂ）２００回のランダムなｇＮＭＦの各実行の出力からのＨのピアソン相関係数行列が計算された：（ｃ）２００回の実行にわたる相関行列が平均された。最終的なクラスタリングの結果が、１引く（距離行列として平均相関行列）を用いた階層クラスタリングアルゴリズムを実行し、デンドログラムをｒ個のサブグループにカットすることによって導かれた。
【０１０１】
７．コーフェン相関およびベイズ情報量規準（ＢＩＣ）を用いたモデルの選択
上のセクション６に記載したｇＮＭＦ手順が、最初の階層クラスタリング解析において選出された、いくつかの予想されるｒ値（サブグループの数）を用いて実行された。次いで、コーフェン相関係数およびベイズ情報量規準（ＢＩＣ）が、最良のモデルを選択するために使用された。
【０１０２】
対数正規分布は、ＤＮＡコピー数の適合に広く使用されている（Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２９：４５９頁（２００１年）を参照されたい）。尤度を計算するために、各クラスター内の試料は、各セグメントの平均コピー数が対数正規分布に従う場合、同じ多変量対数正規分布に由来すると仮定された。セグメント間の相関が弱かったので、独立性が、計算におけるセグメント間に仮定された。得られた対数尤度は式（１２）を用いて決定された：
【０１０３】
【数１８】
0005391279.tif 000025
式中、ｒはクラスターの数であり、ｎｉはクラスターｉ内の試料の数であり、ｍはセグメントの数であり、ｙｉｊｔはｉ番目のクラスター内のｊ番目の試料のｔ番目のセグメントの対数変換されたコピー数であり、μｉｔはｉ番目のクラスター内のｔ番目のセグメントの対数変換されたコピー数の平均であり、σｉｔはｉ番目のクラスター内のｔ番目のセグメントの対数変換されたコピー数の標準偏差である。このとき、特定されたモデルにおけるパラメータの数ｋは２×ｒ×ｍになる。
【０１０４】
最良のｇＮＭＦモデルを選択するための基準としてコーフェン相関係数およびＢＩＣの両方が用いられ、これらの２つの基準が多くの場合同じモデルを選択することがわかった。
【０１０５】
８．クラスタリングの安定性の１０倍安定性検定。
１０倍安定性検定の手順が、分類結果の安定性を評価するために展開された。データセットに対してｇＮＭＦを実行し、試料をクラスターに割り当てた後、１０％の試料がランダムに除外され、同じ手順が残りの９０％の試料に適用された。この並べ替えによって異なるサブグループに割り当てられた試料の数が計算された。この除外検定は、試料の並べ替えに関してクラスタリングの結果の安定性を表したエラー発生率を導くために、２００回繰り返された。同じデータセットに対して同じ手順を用いた階層クラスタリングの安定性も評価され、常にｇＮＭＦクラスタリングよりもはるかに高いことが見出された。
【０１０６】
以下の実施例３−４において、本実施例１における方法が、２つの型の癌、すなわち、非小細胞肺癌および結腸直腸癌に対して適用される。実施例において使用されるステップの数は本実施例１において上記したステップに対応する。
【実施例２】
【０１０７】
細胞系および／または異種移植片のパネルを構築するための第２の一般的な方法体系およびアルゴリズム
【０１０８】
１．細胞系および腫瘍についてのＣＧＨデータの取得
細胞系および腫瘍についてのＣＧＨデータが、公共のデータベースからダウンロードされた。公共のデータベースからの元データはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ２５０Ｋ  Ｓｔｙ  ａｒｒａｙｓを製造者の指示に従って使用して生成された（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｍａｐｐｉｎｇ  ５００Ｋ  Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＰＮ  ７０１９３０  Ｒｅｖ．３、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（２００５−２００６年）を参照されたい）。
【０１０９】
２．コピー数の決定およびコピー数の変化の検出。
Ｐａｒｔｅｋ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｕｉｔｅ（商標）ソフトウェア（バージョン６．０８．０１０３）が、各遺伝子座のコピー数を決定し、コピー数の変化領域を定義するためにデータを低レベル処理することに使用された。すべてのＳＮＰプローブに対するシグナルを含有するＣＥＬファイルがソフトウェアにローディングされ、コピー数が、腫瘍または細胞系の試料に対するシグナル強度と、基線２に対して補正された、正常な雌性組織試料９０個の参照セットに対するシグナル強度を比較することによって計算された。参照セットは、同じマイクロアレイプラットフォームによって測定された、他の正常試料のセットまたは腫瘍試料と同じ患者からの対合正常組織からなってもよい。
【０１１０】
得られたプローブレベルのコピー数のデータは分割され、各試料におけるコピー数の変化領域が検出された。具体的には、プローブレベルのコピー数は、以下の制御パラメータを使用して領域に分割された：
（ｉ）領域は少なくとも１００個のプローブを含有しなければならない；
（ｉｉ）領域の平均コピー数を隣接領域と比較したｐ値は０．００００１未満でなければならない；
（ｉｉｉ）トランジションのシグナル／ノイズ比は０．１超でなければならない。
次いで、コピー数の変化領域が、これらの領域の平均コピー数が統計的に１．６５未満である（欠失）または２．６５超である（増加）場合に、０．０１を下回るｐ値を伴って検出された。
【０１１１】
３．データの品質管理
腫瘍試料は、コピー数の変化のシグナルを弱める、相当な割合の正常細胞を含有する可能性がある。機械学習アルゴリズムが、腫瘍試料と正常試料のコピー数のパターン間の差異を捕捉するために展開され、次いでさらなる分析から、正常物が混入した試料を同定し、排除するために使用された。最初に、コピー数の変化領域の数が最も多い試料のサブセットおよび正常試料のセットが選択された。これら２つの試料群は、パラメータを、腫瘍試料と正常試料の間の差異を最もよく表すように合わせることによって正常試料と腫瘍試料を分類するために、機械学習アルゴリズム（ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ，Ｌ．「Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔｓ」、Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ、４５（１）：５−３２頁（２００１）年）を参照されたい））を訓練するために訓練セットとして使用された。訓練された分類器は、試料に正常細胞が混入している確率を表すスコアを各試料に割り当てるために残りの試料に適用された。正常細胞混入の確率スコアが５０％を超える試料が、クラスタリング解析から除外された。
【０１１２】
４．データ平滑化および次元の縮小。
ＳＮＰマイクロアレイによって得られたコピー数のデータは、密度が高く、相当量のノイズがあるので、コピー数のデータは、ノイズレベルを低下させ、次元およびクラスタリング解析の複雑さを縮小するために平滑化される必要がある。各試料における有意に増加または欠失した領域の検出後、隣接する領域は、それらの領域が同様のコピー数変化を有し、それらの領域の距離が５００ｋｂ未満の場合、合併された。ＤＮＡセグメントが、データセット内のすべての試料からの区切り点の連結を使用することによって形成された。各セグメント内のプローブの平均コピー数が、さらなる分析に使用された。このステップにより、ハイスループット分析におけるＤＮＡの増加および欠失の明確な解像が可能になった。
【０１１３】
５．予想されるサブグループの数を決定するための階層クラスタリングを用いたパイロットクラスタリング解析。
多くの応用において広く使用されているが、階層クラスタリングはゲノム研究に対するいくつもの欠点を有している。第１に、階層クラスタリングは、データセット内のサブグループの数を一貫して、かつ客観的に見積もることができない。第２に、階層クラスタリングパターンは安定でない可能性がある。具体的には、クラスタリングパターンは、少数の試料がデータセットに加えられるまたはデータセットから消されると劇的に変化し得る。さらに、この分析において、階層クラスタリングの１０倍安定性検定の結果をｇＮＭＦ（セクション８を参照されたい）に対する１０倍安定性検定の結果と比較したとき、はるかに高いエラー発生率が観察された。
【０１１４】
しかし、階層クラスタリングは、試料間の相対的な類似性の概要を速やかに導き、データ内に存在する、予想されるサブグループの数の大まかな見積もりをもたらすための有用なツールとして役立ち得る。各データセットについて、腫瘍および細胞系のＣＧＨデータが、ピアソンの線形非類似性を用いて階層的にクラスタリングされた。階層クラスタリングパターンが、データセット内の予想されるサブグループの数の範囲を導くためにプロットされ、視覚的に検査された。次いで、これらの数が、ゲノム非負値行列因子分解を用いたクラスタリング解析において入力として使用された（以下のセクション６を参照されたい）。
【０１１５】
６．腫瘍および細胞系のＣＧＨデータのｇＮＭＦクラスタリング。
ＮＭＦは、遺伝子発現データを分析するためのゲノム科学において最初に採用された（Ｂｒｕｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．ら、Ｍｅｔａｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ  ｆａｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０１：４１６４−９頁（２００４年）を参照されたい）。そのあと、この方法体系は、遺伝子コピー数データの分析に使用するために採用された（Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｍａｒｋｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１５０２−１３頁（２００６年）；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｉｎｉｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．９：３１３−２５頁（２００６年）を参照されたい）。試料セット（すなわちデータセット内の）に対して、平滑化されたコピー数のデータのｎｘｍ行列Ｖ、ここでｎはセグメントの数であり、ｍは試料の数である、を与えると、ｇＮＭＦアルゴリズムは下式（５）に示すように行列Ｖをｎｘｒ行列Ｗおよびｒｘｍ行列Ｈに因子分解する：
Ｖ＝Ｗ＊Ｈ＋ｅ  （５）
上式（５）中、Ｗは各サブグループに対する標準モデルとみなすことができ、Ｈは各サブグループに属する各試料の相対的な重量とみなすことができ、ｅはモデル適合の剰余を表し、ｒはクラスタリングされるサブグループの数である（通常ｍよりもずっと小さい）。入力としてｒおよびＶを与えると、ｇＮＭＦアルゴリズムはまずＷおよびＨの初期値をランダムに設定し、次いで、下式（６および７）に従った乗法更新ルールを用いてＷおよびＨを繰り返し更新する：
【０１１６】
【数１９】
0005391279.tif 000026
【０１１７】
【数２０】
0005391279.tif 000027
式中、αは１からｒまでにわたり、μは１からｍまでにわたり、ｉは１からｎまでにわたる。
【０１１８】
ＣＧＨデータをクラスタリングするための以前のｇＮＭＦの適用において（Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ａ．ら、「Ｍａｒｋｅｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｔｗｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６：１１５０２−１３頁（２００６年）；Ｃａｒｒａｓｃｏ，Ｄ．Ｒ．ら、「Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｃｌｉｎｉｃｏ−ｐａｔｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｕｂｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．９：３１３−２５頁（２００６年）を参照されたい）、アルゴリズムは所定のステップ数（例えば１００）の後、試料のサブグループの割り当てに変化がなかったところで停止された。模擬データならびに実際のＣＧＨデータを用いた試験に基づいて、この基準は、この手順をあまりにも早く停止し得ることが決定され、これは、結果が、アルゴリズムがより多くのステップを実行可能であったならば、さらに改善される可能性があり得たことを示唆している。したがって、アルゴリズムは、乗法的更新を１００ステップ行うごとに、データからの現在のモデルの発散が下式（１）に従って計算されるように改変された。
【０１１９】
【数２１】
0005391279.tif 000028
式中、Ｖｉｊは、行列Ｖのｉ行ｊ列目であり、（ＷＨ）ｉｊは、行列（Ｗ＊Ｈ）のｉ行ｊ列目であり、ｉは１からｎまでにわたり、ｎはデータセット内のセグメントの数であり、ｊは１からｍまでにわたり、ｍはデータセット内の試料の数である。
【０１２０】
反復性のアルゴリズムは、発散が、１００ステップ前に計算された前の発散より０．００１％超減少していない場合に停止する。この改変によって、計算的な複雑さが増すという代償を払って、クラスタリングの正確度が有意に改善された。
【０１２１】
ｇＮＭＦは確率論的な手順であるので、アルゴリズムは、異なる初期値から開始された場合、異なる転帰を生成し得る。クラスタリングアルゴリズムの性能をさらに改善するために、新規の複数開始戦略が実行された。各データセットについて、（ａ）ｇＮＭＦアルゴリズムが、上記の停止基準に従って２００回実行された；（ｂ）２００回のランダムなｇＮＭＦの各実行の出力からのＨのピアソン相関係数行列が計算された：（ｃ）２００回の実行にわたる相関行列が平均された。最終的なクラスタリングの結果が、１引く（距離行列として平均相関行列）を用いた階層クラスタリングアルゴリズムを実行し、デンドログラムをｒ個のサブグループにカットすることによって導かれた。
【０１２２】
７．ベイズ情報量規準（ＢＩＣ）を用いたモデルの選択
上のセクション６に記載したｇＮＭＦ手順が、最初の階層クラスタリング解析において選出された、いくつかの予想されるｒ値（サブグループの数）を用いて実行された。次いで、ベイズ情報量規準（ＢＩＣ）が、最良のモデルを選択するために使用された。
【０１２３】
対数正規分布は、ＤＮＡコピー数の適合に広く使用されている（Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２９：４５９頁（２００１年）を参照されたい）。尤度を計算するために、各クラスター内の試料は、各セグメントの平均コピー数が対数正規分布に従う場合、同じ多変量対数正規分布に由来すると仮定された。セグメント間の相関が弱かったので、独立性が、計算におけるセグメント間に仮定された。得られる対数尤度は下式（１２）を用いて決定された：
【０１２４】
【数２２】
0005391279.tif 000029
式中、ｒはクラスターの数であり、ｎｉはクラスターｉ内の試料の数であり、ｍはセグメントの数であり、ｙｉｊｔはｉ番目のクラスター内のｊ番目の試料のｔ番目のセグメントの対数変換されたコピー数であり、μｉｔはｉ番目のクラスター内のｔ番目のセグメントの対数変換されたコピー数の平均であり、σｉｔはｉ番目のクラスター内のｔ番目のセグメントの対数変換されたコピー数の標準偏差である。このとき、特定されたモデルにおけるパラメータの数ｋは２×ｒ×ｍになる。
【０１２５】
ＢＩＣは、教師なしクラスタリングにおいて最良のモデルを選択するための基準として用いられた。
【０１２６】
８．クラスタリングの安定性の１０倍安定性検定。
１０倍安定性検定の手順が、クラスタリングの結果の安定性を評価するために展開された。データセットに対してｇＮＭＦを実行し試料をクラスターに割り当てた後、１０％の試料がランダムに除外され、同じ手順が残りの９０％の試料に対して適用された。この並べ替えによって異なるサブグループに割り当てられた試料の数が計算された。この「除外」検定は、試料の並べ替えに関してクラスタリングの結果の安定性を表すエラー発生率を導くために、２００回繰り返された。階層クラスタリングの安定性も同じデータセットに対して同じ手順を用いて評価され、常にｇＮＭＦクラスタリングよりもはるかに高いことがわかった。
【０１２７】
以下の実施例５において、本実施例２における方法が黒色腫に対して適用される。実施例において使用されるステップの数は本実施例２において上記したステップに対応する。
【実施例３】
【０１２８】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の腫瘍および細胞系の分類
【０１２９】
ステップ１−２。ＤＮＡの抽出およびハイブリダイゼーションならびにコピー数の決定およびコピー数の変化の検出。我々は、本試験において、５７の細胞系および２４５の腫瘍試料を使用した（すべての細胞系は表Ａに列挙されており、すべての腫瘍試料は表１に列挙されている）。ＮＳＣＬＣの腫瘍および細胞系の試料が調製され、データは実施例１に記載の通り処理された。全部で１１４１９のコピー数が有意に変化したセグメントが検出された。
【０１３０】
【表４】
0005391279.tif 000030
0005391279.tif 000031
0005391279.tif 000032
0005391279.tif 000033
0005391279.tif 000034
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0005391279.tif 000036
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0005391279.tif 000038
0005391279.tif 000039
0005391279.tif 000040
0005391279.tif 000041
【０１３１】
ステップ３。データの品質管理。我々は、実施例１に記載したデータの品質管理の手順を、我々のＮＳＣＬＣのＣＧＨデータに対して適用した。正常細胞が著しく混入していることがわかった腫瘍試料はなかった。したがって、我々はすべての試料を我々の分析に使用した。
【０１３２】
ステップ４。データの平滑化および次元の縮小。実施例１に記載した方法を使用して、我々はＣＧＨデータの次元を８１７２セグメントまで縮小し、我々のその後の分析においてこのデータをデータセット（Ｖ）として使用した。
【０１３３】
ステップ５。最初のクラスタリング解析。階層クラスタリングが、クラスターの数を見積もるための我々のＮＳＣＬＣデータセットに対する最初の解析として使用された。クラスタリングのデンドログラムは図２に示されている。デンドログラムの視覚的な検査により、データセットに３−８個の主要なクラスターが存在することが示唆された。
【０１３４】
ステップ６。ｇＮＭＦを使用したＮＳＣＬＣの腫瘍および細胞系の分類。ｇＮＭＦアルゴリズムが、腫瘍および細胞系のＣＧＨデータを分類するために、３−８個の範囲のクラスター数を用いて実施例１に記載の通り使用された。ｇＮＭＦアルゴリズムは、各クラスター数について、開発された停止基準を用いて２００回実行された（実施例１を参照されたい）。次いで、分類モデルが、１引く（Ｈの相関行列の平均）に対する階層クラスタリングによって導かれた。
【０１３５】
ステップ７。コーフェン相関およびＢＩＣを使用したモデル選択。我々は、ステップ６において開発されたｇＮＭＦモデルに対して、実施例１に記載の通りコーフェン相関およびＢＩＣを計算した。結果は表２において以下に示される。この表において、ｒは各モデルにおけるクラスターの数を示す。表２から、我々は、４つのクラスターを持つモデルが最小のＢＩＣを有し、クラスター数４とクラスター数５の間で、コーフェン相関が最大の減少を示すことを見出した。したがって、４個のクラスターが、このデータセットに対して最良の選出である。４個のクラスターを持つｇＮＭＦの出力のヒートマップは図３に示されている。
【０１３６】
【表５】
0005391279.tif 000042
【０１３７】
ステップ８。クラスタリングの安定性の１０倍検定。我々は、実施例１に記載した１０倍安定性検定を、４つのクラスターを持つｇＮＭＦモデルに対して適用した。エラー発生率は１４．２４％であった。比較として、我々は、ステップ５において平滑化されたコピー数のデータを用いて導かれた階層クラスタリングのデンドログラムも３−８個のクラスターにカットし、同じ１０倍検定を使用してクラスターの安定性を試験した。エラー発生率は１９．４５％−２５．６５％であり、ｇＮＭＦモデルのエラー発生率よりもはるかに高かった。
【実施例４】
【０１３８】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）の腫瘍および細胞系の分類
【０１３９】
ステップ１−２。ＤＮＡの抽出およびハイブリダイゼーションならびにコピー数の決定およびコピー数の変化の検出。我々は本研究において３５の細胞系および１４４の腫瘍試料を使用した（すべての細胞系は表Ｂに列挙されており、すべての腫瘍試料は以下の表３に示されている）。ＣＲＣの腫瘍および細胞系の試料が調製され、データが実施例１に記載の通り処理された。有意に変化したコピー数を持つセグメントが全部で５２４０検出された。
【０１４０】
【表６】
0005391279.tif 000043
0005391279.tif 000044
0005391279.tif 000045
0005391279.tif 000046
【０１４１】
ステップ３。データの品質管理。我々は、実施例１に記載したデータの品質管理の手順を、我々のＣＲＣのＣＧＨデータに対して適用した。全部で４３の腫瘍試料について、正常細胞が著しく混入していることがわかった。我々は残りの１０１の腫瘍試料を３５の細胞系と一緒に我々の分析に使用した。
【０１４２】
ステップ４。データの平滑化および次元の縮小。実施例１に記載した方法を使用して、我々はＣＧＨデータの次元を３５７５セグメントまで縮小し、我々のその後の分析においてこのデータをデータセット（Ｖ）として使用した。
【０１４３】
ステップ５。最初のクラスタリング解析。階層クラスタリングが、クラスターの数を見積もるための我々のＣＲＣデータセットに対する最初の解析として使用された。クラスタリングのデンドログラムは図４に示されている。デンドログラムの視覚的検査により、データセット内に３−６個の主要なクラスターの存在が示唆された。
【０１４４】
ステップ６。ｇＮＭＦを用いたＣＲＣの腫瘍および細胞系の分類。ｇＮＭＦアルゴリズムが、腫瘍および細胞系のＣＧＨデータを分類するために、３−６個の範囲のクラスター数を用いて実施例１に記載の通り使用された。各クラスター数について、ｇＮＭＦアルゴリズムが、開発された停止基準（実施例１を参照されたい）を用いて２００回実行された。次いで、分類モデルが、１引く（Ｈの相関行列の平均）に対する階層クラスタリングによって導かれた。
【０１４５】
ステップ７。コーフェン相関およびＢＩＣを用いたモデルの選択。我々は、ステップ６において展開されたｇＮＭＦモデルについて、コーフェン相関およびＢＩＣを実施例１に記載の通り計算した。結果は表４に示されている。この表において、ｒは各モデルにおけるクラスターの数を示す。表４から、我々は、５つのクラスターを持つモデルが最小のＢＩＣを有し、同時にクラスター数４とクラスター数５の間でコーフェン相関が最大の減少を示したことを見出した。最終的に、我々は、このデータセットに対して、５つのクラスターが最良の選択であると決定した。５つのクラスターを持つｇＮＭＦの出力のヒートマップは図５に示されている。
【０１４６】
【表７】
0005391279.tif 000047
【０１４７】
ステップ８。クラスタリングの安定性の１０倍検定。我々は、実施例１に記載した１０倍安定性検定を、５つのクラスターを持つｇＮＭＦモデルに対して適用した。エラー発生率は１６．７８％であった。比較として、我々は、ステップ５において平滑化されたコピー数のデータを用いて導かれた階層クラスタリングのデンドログラムも３−６個のクラスターにカットし、同じ１０倍検定を使用してクラスターの安定性を試験した。エラー発生率は１４．５１％−１８．９８％であった。
【実施例５】
【０１４８】
黒色腫の腫瘍および細胞系の分類
【０１４９】
ステップ１−２。ＤＮＡの抽出およびハイブリダイゼーションならびにコピー数の決定およびコピー数の変化の検出。我々は本研究において３０の細胞系および１０９の腫瘍の短期培養物を使用した（すべての細胞系は表Ｃに列挙されており、すべての腫瘍のＣＧＨデータはＢｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手可能であり、Ｌｉｎ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ、２００８年、６８（３）：６６４−７３頁に記載されている）。黒色腫の腫瘍の短期培養物および細胞系についてのＣＧＨデータが、実施例２に記載の通りダウンロードされ、分析された。有意に変化したコピー数を持つセグメントが全部で５６１６検出された。
【０１５０】
ステップ３。データの品質管理。我々は、実施例１に記載したデータの品質管理の手順を、我々の黒色腫のＣＧＨデータに対して適用した。全部で２９の腫瘍試料について、正常細胞が著しく混入していることがわかった。したがって、我々は残りの８０の腫瘍の短期培養物を３０の細胞系と一緒に我々の分析に使用した。
【０１５１】
ステップ４。データの平滑化および次元の縮小。実施例１に記載した方法を使用して、我々はＣＧＨデータの次元を４６３７セグメントまで縮小し、我々のその後の分析においてこのデータをデータセット（Ｖ）として使用した。
【０１５２】
ステップ５。最初のクラスタリング解析。階層クラスタリングが、クラスターの数を見積もるための我々の黒色腫データセットに対する最初の解析として使用された。クラスタリングのデンドログラムは図６に示されている。デンドログラムの視覚的検査により、データセット内に２−７個の主要なクラスターの存在が示唆された。
【０１５３】
ステップ６。ｇＮＭＦを用いた黒色腫の腫瘍および細胞系の分類。実施例２に記載したｇＮＭＦアルゴリズムが、腫瘍および細胞系のＣＧＨデータを分類するために、２−７個の範囲のクラスター数を用いて使用された。各クラスター数について、ｇＮＭＦアルゴリズムが、開発された停止基準（実施例２を参照されたい）を用いて２００回実行された。次いで、分類モデルが、１引く（Ｈの相関行列の平均）に対する階層クラスタリングによって導かれた。
【０１５４】
ステップ７。ＢＩＣを用いたモデルの選択。我々は、ステップ６において展開されたｇＮＭＦモデルについて、ＢＩＣを実施例２に記載の通り計算した。結果は表５に示されている。この表において、ｒは各モデルにおけるクラスターの数を示す。表５から、我々は、６つのクラスターを持つモデルが最小のＢＩＣを有することを見出した。したがって、我々は、このデータセットに対して、６つのクラスターが最良の選択であるはずであると決定した。６つのクラスターを持つｇＮＭＦの出力のヒートマップは図７に示されている。
【０１５５】
【表８】
0005391279.tif 000048
【０１５６】
ステップ８。クラスタリングの安定性の１０倍検定。我々は、実施例２に記載した１０倍安定性検定を、６つのクラスターを持つｇＮＭＦモデルに対して適用した。エラー発生率は２６．４２％であった。比較として、我々は、ステップ５において平滑化されたコピー数のデータを用いて導かれた階層クラスタリングのデンドログラムも２−７個のクラスターにカットし、同じ１０倍検定を使用してクラスターの安定性を試験した。エラー発生率は１７．９４％−３２．１４％であった。
【実施例６】
【０１５７】
前臨床試験において使用するための細胞系のパネルの構築
上の実施例１−５において記載した方法を使用して、我々は、我々の非小細胞肺癌、結腸直腸癌および黒色腫の細胞系および腫瘍のＣＧＨデータを、それぞれ、４つ、５つおよび６つのクラスターに分類した（以下の表４−６を参照されたい）。これらのクラスターのそれぞれから、少なくとも１つの細胞系が、検討している癌の型のすべてのゲノムサブグループを表すパネルを組み立てるために選択された。
【０１５８】
構築された細胞系のパネルは、特定の癌のサブカテゴリーそれぞれに対して腫瘍学的薬物試験のための前臨床モデルとして使用され得る。例えば、以下の表６に示したＮＳＣＬＣの４つのクラスターについて、パネルは、クラスターＡからのＨＣＣ８２７、クラスターＢからのＮＣＩ−Ｈ２４０５およびクラスターＣからのＡ５４９を含み得る。クラスターＤを表す癌細胞系はなかった。
【０１５９】
以下の表７に示したＣＲＣの５つのクラスターについて、パネルは、クラスターＡからのＨＣＴ−８、クラスターＢからのＣａｃｏ−２およびクラスターＣからのＣｏｌｏ  ３２０ＤＭを含み得る。クラスターＤおよびクラスターＥを表す癌細胞系はなかった。
【０１６０】
以下の表８に示した６つの黒色腫のクラスターについて、パネルは、クラスターＡからのＳＫＭＥＬ１１９、クラスターＢからのＷＭ３２４８、クラスターＣからの１２０５ＬＵ、クラスターＤからの４５１ＬＵ、クラスターＥからのＷＭ３２１１およびクラスターＦからのＭＡＬＭＥ３Ｍを含み得る。
【０１６１】
【表９】
0005391279.tif 000049
【０１６２】
【表１０】
0005391279.tif 000050
【０１６３】
【表１１】
0005391279.tif 000051
【実施例７】
【０１６４】
転帰−アノテートされた腫瘍試料を使用したゲノムクラスタリングの結果の検証
【０１６５】
同定されたＮＳＣＬＣゲノムクラスターが生物学的に有意義な差異を有するかどうかを決定するために、２セットの腫瘍試料が、疾患転帰のアノテーションに使用された。２つの転帰パラメータ、再発するまでの時間（ＴＴＲ）および全生存（ＯＳ）が使用された。
【０１６６】
ＮＳＣＬＣの分類に使用された２４５のＮＳＣＬＣ腫瘍試料（実施例３、表１を参照されたい）の中で、疾患転帰の情報（全生存および再発するまでの時間）は、Ｒｕｓｈ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓにおいて収集された１１１の試料について利用可能であった。クラスター１、２、３および４において転帰−アノテートされた試料の数は、それぞれ、９、３、２１および７８であった。それらのＴＴＲを比較するログランク検定により、０．０００６の有意なＰ値が示された。クラスター２は３つの試料のみであったので、クラスター１とクラスター２を一緒に合わせようと努めた。組み合わされた試料は、他の２つのクラスターよりも有意に少ないＴＴＲを有し、Ｐ値は０．０３９７であった。カプランマイヤー曲線が図８に示されている。
【０１６７】
コピー数の変化に基づいた癌分類についての教師なしクラスタリングアルゴリズムおよび癌患者の異なるサブグループを表すように選択された細胞系モデルをさらに検証するために、７１のＮＳＣＬＣ腫瘍試料を使用した追加試験が、転帰の情報に関連して使用された（以下の表９）。
【０１６８】
【表１２】
0005391279.tif 000052
0005391279.tif 000053
0005391279.tif 000054
0005391279.tif 000055
【０１６９】
試料は処理され、ＤＮＡは抽出され、増幅され、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの実験プロトコールに従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ  ６．０アレイにハイブリダイズされた（実施例１および３を参照されたい）。これらの腫瘍のコピー数は、２７０の正常対照のＨａｐＭａｐセットと比較することによって計算された。コピー数は、Ｐａｒｔｅｋソフトウェア６．０９．０３１０を使用して分割された（実施例２を参照されたい）。
【０１７０】
検証試料を４つのＮＳＣＬＣクラスターに割り当てるために、転帰−アノテートされた腫瘍試料のピアソン相関係数が、最初の３つのクラスターの代表的な細胞系のそれぞれに対して計算された（実施例１−３を参照されたい）。４番目のクラスターは代表的な細胞系を有さなかったので、４番目のクラスター内のすべての腫瘍試料がその代表として使用され、検証試料に対するそれらのピアソン相関係数が計算された。次いで、検証試料は検証試料と最も高い相関係数を有する代表的な細胞系または腫瘍を含有したクラスターに割り当てられた。最後に、異なるクラスターに割り当てられた検証試料のＴＴＲおよびＯＳの差異が、ログランク検定を使用して比較され、それらのカプランマイヤー曲線がプロットされた（実施例１−３を参照されたい）。
【０１７１】
４つのクラスター間のＴＴＲの差異は、検証試料に対してＰ値が０．０４５４で、有意である。さらに、カプランマイヤー曲線は、他のクラスターと比較してクラスター１内の試料に対して有意に少ないＴＴＲを示した（図９を参照されたい）。クラスター２、３および４内の試料を合わせ、クラスター１内の試料と比較すると、Ｐ値は０．００９４である。
【０１７２】
４つのクラスター間のＯＳにおける差異は、検証試料に対して有意でなかったが（Ｐ値＝０．２５）、カプランマイヤー曲線は、他のクラスターと比較してクラスター１内の試料に対してＯＳが低い傾向を示した（図１０を参照されたい）。クラスター２、３および４内の試料を合わせ、クラスター１内の試料と比較すると、Ｐ値はわずかに有意である（Ｐ値＝０．１１６）。
【０１７３】
あるいは、我々がすでに定義したクラスター内のすべての腫瘍および細胞系が、クラスターを表すために使用され、検証試料と現存試料の間の最も高いピアソン相関係数によって検証試料を４つのクラスターに割り当てた。この分析において、ＴＴＲおよびＯＳのどちらも、４つのクラスター間の有意差を示し、Ｐ値はそれぞれ、４．７Ｅ−５および０．００２４であった。クラスター１に割り当てられた試料は、他のクラスターに割り当てられた試料よりも有意に少ないＴＴＲおよびＯＳを有した（図１１を参照されたい）。
【０１７４】
結論として、転帰−アノテートされた試料は、同定されたＮＳＣＬＣゲノムのクラスターが生物学的に有意義な差異を有するかどうかを決定するために、データセットならびに独立した試料において使用された。結果は、患者における再発するまでの時間および全生存においてクラスターは有意に異なり、これはゲノム分類が疾患の経過における差異と相関していることを示し、また、異なるクラスターを表している細胞系は、異なる臨床転帰を予測するためのモデルとして使用され得ることを示している。
【０１７５】
当業者は、本開示が、目的を実行し、言及した結果および利点ならびにそこに固有の結果および利点を得ることによく適合されていることを容易に正しく認識するであろう。本明細書に記載の分子複合体および方法、手順、処理、分子、特定の化合物は、現在好ましい実施形態を表しており、例示的であり、本発明の範囲を限定するものではない。当業者は、可変の代替および改変が、本明細書に開示した発明に対して本発明の範囲および主旨から逸脱せず行われ得ることを容易に正しく認識する。
【０１７６】
本明細書において言及したすべての特許および出版物は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示している。すべての特許および出版物は、各出版物がそれぞれ、具体的かつ個々に、参照により組み込まれることが示されたのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
本明細書に適切に例示的に記載した本発明は、本明細書に具体的に開示されていないどんな（１つまたは複数の）要素、（１つまたは複数の）限定もなしで実行され得る。したがって、例えば、本明細書中の各場合において、「含む」「から本質的になる」および「からなる」という用語は、他の２つの用語のいずれとも置き換えられ得る。使用されている用語および表現は、説明するための用語として使用されており、限定するために使用されているのではなく、そのような用語および表現を使用することは、示され、記載されている特徴またはそれらの部分の任意の等価物を排除するものではないが、種々の改変が、特許請求された発明の範囲内で可能であることが認識されている。したがって、当然のことながら、本開示は好ましい実施形態および場合による特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の改変および変形が、当業者によって使用され得、また、そのような改変および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の範囲内であるとみなされる。
【図１】
0005391279.tif 000060
【図２】
0005391279.tif 000061
【図３】
0005391279.tif 000062
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0005391279.tif 000066
【図８】
0005391279.tif 000067
【図９】
0005391279.tif 000068
【図１０】
0005391279.tif 000069
【図１１】
0005391279.tif 000070
【配列表】
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