(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２’ヒドロキシルチオ炭素保護基を含むヌクレオシドモノマーであって、
前記２’ヒドロキシルチオ炭素保護基がチオノカルバメート保護基であり、
下記構造
【化１】
0005520818.tif 000056
（式中、
ＢＰは、保護されている複素環または保護されていない複素環であり、
Ｒ１またはＲ２の各々は、水素、保護基、およびホスホラミダイト基から独立に選択される。）
のいずれか一つを有するヌクレオシドモノマー。
【請求項２】
（ａ）保護されていないヒドロキシル基を有するヌクレオシド残基および２’保護ヌクレオシドモノマーを提供するステップであって、前記２’保護ヌクレオシドモノマーが、請求項１に記載の２’ヒドロキシルチオ炭素保護基を含むステップと、
（ｂ）前記２’保護ヌクレオシドモノマーを前記ヌクレオシド残基に共有結合させて、核酸を生成するのに十分な条件下で、前記ヌクレオシド残基を前記２’保護ヌクレオシドモノマーと接触させるステップと
を含む、核酸を合成する方法。
【請求項３】
前記核酸を酸化および脱保護剤に曝すステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記接触させるステップを少なくとも一度反復するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記２’ヒドロキシルチオ炭素保護基を除去するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレオシド残基が、固体支持体に共有結合をしている、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸を前記固体支持体から切断し、遊離核酸を生成するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記遊離核酸を化学的に修飾し、修飾された核酸を生成するステップをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記修飾された核酸を、製薬学的に許容可能なビヒクルと混合するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸を化学的に修飾して修飾された核酸を生成し、次いで前記化学修飾された核酸を前記固体支持体から切断するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
下記構造
【化２】
0005520818.tif 000057
（式中、
ＢＰは、保護されている窒素含有塩基または保護されていない窒素含有塩基であり、
Ｑは、請求項１に記載の２’ヒドロキシルチオ炭素保護基であり、
Ｒ１２は、水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリール、および置換アリールからなる群から選択され、
ｍは、１を超える整数である）
を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照文献
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）によって、２００７年５月１０日に出願された先の米国仮出願第６０／９２８，７２２号の利益を主張し、該出願の開示は参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【背景技術】
【０００２】
［序論］
ＲＮＡの化学合成は、リボース中の２’−ヒドロキシル基が化学合成の間に保護されなくてはならないため、ＤＮＡの化学合成よりもはるかに困難な課題である。保護された２’−ヒドロキシルがヌクレオチド間ホスフェートに近接していることは、ヌクレオチド間連結の形成、およびオリゴリボヌクレオチドが合成されたときの、２’−保護基の除去の両方に関して問題を提起する。さらに、ＲＮＡ中のヌクレオチド間結合は、ＤＮＡのそれよりもよりはるかに不安定である。
【０００３】
最近まで、ＲＮＡ合成への典型的なアプローチは、５’−ヒドロキシル基が酸に不安定なジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基（伸張しているオリゴリボヌクレオチドへのカップリング後に酸性条件下にて除去することができる）によって保護されているリボヌクレオシドモノマーを利用した。酸脱保護ステップの間のヌクレオチド間結合の異性化および切断を防ぐために、様々な酸に安定性の保護基が２’−ヒドロキシル上に置かれてきた。最も普及しているこれらの酸に安定性の保護基は、ＴＢＤＭＳとして知られているｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル基と思われる（Ｏｇｉｌｖｉｅら、１９７９）。ＴＢＤＭＳの２’−保護基としての使用は、非常に長い間、ＲＮＡ化学合成のための以前は小さかった市場を支配してきた（Ｕｓｍａｎら、１９８７；Ｏｇｉｌｖｉｅら、１９８８）。
【０００４】
しかし、ＴＢＤＭＳを使用して行うオリゴリボヌクレオチド合成は、決して満足のいくものではなく、典型的には低品質のＲＮＡ生成物を生成する。その結果、ＴＢＤＭＳ保護基は、２’位から３’位に転位する。さらに、モノマー（例えば、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−リボ−３’−Ｏ−（β−シアノエチル，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト）の合成の間に、２’−シリル基の導入は位置選択的ではなく、したがって２’または３’位に付加される場合がある。ホスホラミダイト生成の間のシリル基の転位を妨げるために加えられた化学的必要条件と相まって、モノマーの合成は難易度が高く費用がかかる。これらのモノマーのカップリング効率は、２’−ＴＢＤＭＳ保護基の立体障害によって大幅に減少し、完全な長さの生成物の収率および純度に影響を与えるだけでなく、この方法によって達成することができるオリゴリボヌクレオチドの長さを制限することもまた当技術分野で周知である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
合成ＲＮＡに対する需要は、主としてＲＮＡ干渉法の発見によって増加してきた。したがって、必要性の増大に対応するために、改善されたＲＮＡ合成スキーム、特に２’−保護基を開発することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様には、２’部位でチオ炭素保護基によって保護されている２’保護ヌクレオシドモノマーが含まれる。対象とするチオ炭素保護基には、チオカーボネート、チオノカーボネートおよびジチオカーボネート保護基、ならびにチオノカルバメート保護基が挙げられるが、これらに限らない。本発明の態様は、本発明の保護基を含む核酸、および本発明の保護基を使用した核酸の合成方法をさらに含む。
【０００７】
［定義］
本発明をさらに詳細に記載する前に、本出願において使用される用語は、別段の指示がない限り下記の通りに定義する。
【０００８】
「ヌクレオチド」または「ヌクレオチド部分」とは、リン酸基、糖基および複素環式塩基を含む核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡまたはその類似体）のサブユニットならびにこのようなサブユニットの類似体を意味する。他の基（例えば、保護基）は、ヌクレオチドの任意の成分（複数可）に結合することができる。
【０００９】
「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド部分」は、糖基および複素環式塩基を含む核酸サブユニット、ならびにこのようなサブユニットの類似体を意味する。他の基（例えば、保護基）をヌクレオシドの任意の成分（複数可）に結合することができる。
【００１０】
「ヌクレオシド残基」とは、（ヌクレオシドにおけるように）糖基および窒素含有塩基を、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはヌクレオシドホスホラミダイトにおけるなどのより大きな分子の一部として有する分子を意味する。
【００１１】
「ヌクレオチドモノマー」は、より大きなオリゴヌクレオチド鎖中またはポリヌクレオチド鎖中に組み込まれておらず、単一のヌクレオチドサブユニットに相当する分子を意味する。ヌクレオチドモノマーはまた、活性化基または保護基がヌクレオチドモノマーの使用目的のために必要である場合、活性化基または保護基を有し得る。
【００１２】
「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基、例えばアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはウラシル（Ｕ）を含有する部分だけでなく、修飾されている他の複素環式塩基を含有する部分もまた含むことを意図する。このような修飾には、メチル化プリンもしくはメチル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環が挙げられる。このような修飾には、例えば、ジアミノプリンおよびその誘導体、イノシンおよびその誘導体、アルキル化プリンもしくはアルキル化ピリミジン、アシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、チオール化プリンもしくはチオール化ピリミジンなど、または保護基の付加、例えばアセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバメート、もしくは同様のものなどの付加が挙げられる。プリン塩基またはピリミジン塩基はまた、上記の類似体でよい。適切な類似体は当業者には公知であり、関連するテキストおよび文献に記載されている。通常の類似体には、それだけに限らないが、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、１−メチルシュードウラシル、ケオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【００１３】
さらに、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語には、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけでなく、他の糖もまた含有する部分が含まれる。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分上の修飾を含み、例えば、ヒドロキシル基の１つまたは複数がハロゲン原子もしくは脂肪族基で置き換えられ、またはエーテル、アミン、もしくは同様のものとして官能化される。「類似体」とは、文字通り、類似の構造を有する模倣体、誘導体、または他の同様の用語として認識されている構造的特徴を有する分子を意味し、例えば、非天然（通常自然界に存在しない）ヌクレオチドを組み込んだポリヌクレオチド、非天然ヌクレオチド模倣体（２’−修飾ヌクレオシドなど）、ペプチド核酸、オリゴマーのヌクレオシドホスホネート、および保護基または連結基などの、付加された置換基を有する任意のポリヌクレオチドを含む。
【００１４】
「ヌクレオチド間結合」または「ヌクレオチド結合」とは、天然に見出される核酸中のリン酸ジエステル連結、または核酸および核酸類似体の合成の技術分野から周知の連結などの、２つのヌクレオシド部分の間の化学連結を意味する。ヌクレオチド間結合は、ホスホ基またはホスファイト基を含んでもよく、連結を含んでもよく、ホスホ基またはホスファイト基の１個もしくは複数の酸素原子は、置換基で修飾されているか、あるいは他の原子、例えば、硫黄原子、またはモノアルキルアミノ基もしくはジアルキルアミノ基の窒素原子で置き換えられている。
【００１５】
「基」には、置換形態および非置換形態の両方が含まれる。対象とする置換基には、１種または複数の低級アルキル、アミノ、イミノ、アミド、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルコキシ、アリールオキシ、チオ、アルキルチオ、アリールチオ、またはアリール、またはアルキル、アリール、アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシル、アミノ、アミド、スルホニル、チオ、メルカプト、イミノ、ハロ、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、カルボキシ、スルフィド、スルホン、スルホキシ、ホスホリル、シリル、シリルオキシ、およびボロニルが挙げられ、または１個もしくは複数の利用可能な炭素原子上で非ヒドロカルビル置換基、例えばシアノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、スルホン酸、スルフェート、ホスホン酸、ホスフェート、ホスホネート、または同様のものなどで任意選択的に置換されているものが挙げられる。任意の置換基は、反応収率に実質的に悪影響を与えないように選択される（例えば、そうでなければ特定の置換基または置換基の組合せなしに得られる収率の２０％（または１０％、または５％、または１％）を超えて低下させない）。さらに、置換基は、存在する他の基と化学的に適合性であり、当業者には公知の副反応を避けるように選択する。例えば、アルコールの水酸化物およびリチウム基は非適合性であり、互いに反応するので、アルコールはリチウム基で置換されないであろう。本開示における任意の基について、各置換基は、４０、３５、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４または３個までの炭素原子を含み得る。全体として、任意の基について全ての置換基中の炭素原子の総数は、特定の実施形態では、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１８、１６、１４、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４または３個以下である。
【００１６】
「複素環」、「複素環式」、「複素環基」または「ヘテロシクロ」という用語は、少なくとも１つの炭素原子含有環中に少なくとも１個のヘテロ原子を有する、芳香族（「ヘテロアリール」）または非芳香族（例えば、３〜１３員の単環式環系、７〜１７員の二環式環系、もしくは１０〜２０員の三環式環系）を含めた、完全飽和環式基または部分不飽和環式基もしくは完全不飽和環式基を意味する。ヘテロ原子を含有する複素環基の各環は、窒素原子、酸素原子および／または硫黄原子から選択される１、２、３、または４個のヘテロ原子を有してもよく、ここで窒素ヘテロ原子および硫黄ヘテロ原子は、任意選択的に酸化されていてよく、窒素ヘテロ原子は任意選択的に四級化されていてよい。複素環基は、環または環系の任意のヘテロ原子または炭素原子に結合し得る。多環複素環の環は、１つまたは複数のスピロ結合を介して縮合、架橋および／または結合し得る。窒素含有塩基は、複素環の例である。他の例には、ピペリジニル、モルホリニルおよびピロリジニルが挙げられる。
【００１７】
「置換複素環」、「置換複素環式」、「置換複素環基」および「置換ヘテロシクロ」という用語は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、オキソ、アリール、置換アリール、ヘテロシクロ、置換ヘテロシクロ、カルボシクロ（任意選択的に置換されている）、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ（任意選択的に置換されている）、アリールオキシ（任意選択的に置換されている）、アルカノイル（任意選択的に置換されている）、アロイル（任意選択的に置換されている）、アルキルエステル（任意選択的に置換されている）、アリールエステル（任意選択的に置換されている）、シアノ、ニトロ、アミド、アミノ、置換アミノ、ラクタム、尿素、ウレタン、スルホニルなどから好ましくは選択される１つまたは複数の基で置換されている複素環、複素環式、およびヘテロシクロ基を意味し、置換基の１つまたは複数の対は、それらが結合している原子と一緒になって、任意選択的に３〜７員環を形成する。
【００１８】
「電子吸引基」という用語は、隣接原子からの価電子を引き付ける傾向を有する部分を意味する（すなわち、置換基は、隣接原子に関して電気陰性である）。電子吸引能力のレベルの定量化は、ハメットσ定数によって与えられる。この周知の定数は、多くの参照文献、例えば、Ｍａｒｃｈ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２５１〜５９、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９７７）に記載されている。電子吸引基には、ニトロ、アシル、ホルミル、スルホニル、トリフルオロメチル、シアノ、クロリドなどが挙げられる。
【００１９】
「電子供与基」という用語は、隣接原子から価電子を放出する傾向を有する部分を意味する（すなわち、置換基は、隣接原子に対してより電気陰性でない）。電子供与基には、アミノ、メトキシ、アルキル（直鎖状構造または分岐状構造を有することができるＣ１〜６アルキルを含む）、Ｃ４〜９シクロアルキルなどが挙げられる。
【００２０】
「保護基」という語句は、本明細書で使用する場合、分子の部分が特定の化学反応を受けることを防ぎ、反応の完了後分子から除去可能な種を意味する。「保護基」は、例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第２版、１９９１において教示されているように、従来の化学的意味において所望の反応の特定の条件下で官能基を可逆的に非反応性とする基として使用される。所望の反応後、保護基を除去し、保護された官能基を脱保護し得る。全ての保護基は、合成された分子の大部分が分解されない条件下で、除去可能（したがって、不安定）であるべきである。保護基と対照的に、「キャッピング基」は、持続的に分子のセグメントに結合し、そのセグメントのさらなる化学的変換を妨げる。保護基によって保護されている官能基は、保護基と称されるものの一部であってもよく、一部でなくてもよいことに留意すべきである。
【００２１】
「ヒドロキシル保護基」または「Ｏ−保護基」とは、被保護基がヒドロキシルである保護基を意味する。「反応部位ヒドロキシル」は、３’−５’ポリヌクレオチド合成の間の末端５’−ヒドロキシル、または５’−３’ポリヌクレオチド合成の間の３’−ヒドロキシルである。「遊離反応部位ヒドロキシル」は、ポリヌクレオチド合成の間に反応してヌクレオチド間結合（例えば、ホスホラミダイト官能基とのヌクレオチド間結合）を形成することができる反応部位ヒドロキシルである。
【００２２】
「チオ炭素保護基」とは、カルボニル部分またはチオノカルボニル部分を介して連結し、水素、ヒドロカルビル、および置換ヒドロカルビルから独立に選択される１つまたは複数の基に連結している酸素、硫黄または窒素をさらに有する保護基を意味し、ただし、チオ炭素保護基が窒素を介してその基に連結している場合、その基は、アリール、置換アリール、複素環または置換複素環からさらに選択することができる。
【００２３】
「同時に脱保護する」という用語は、同じ工程において異なる保護基を除去することを目的とし、実質的に同時にまたは同時に行う工程を意味する。しかし、本明細書で使用する場合、この用語は、異なる保護基の脱保護が正確に同時にまたは同じ速度もしくは同じ動態で行われることを意味しない。
【００２４】
「ホスホ」基には、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、およびＨ−ホスホン酸基が挙げられる。ホスホ基またはホスファイト基のいずれかの場合、置換された５員フリル環以外の化学部分は、ホスホ基またはホスファイト基のＯに結合し、それによってフリル環とＰ原子との間が連結されることができる。
【００２５】
「ホスホラミダイト基」という用語は、構造−Ｐ−（ＯＲ１３）（ＮＲ１４Ｒ１５）（式中、Ｒ１３、Ｒ１４、およびＲ１５の各々は、独立に、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、複素環、置換複素環、アリールまたは置換アリールである）を含む基を意味する。いくつかの実施形態では、Ｒ１３、Ｒ１４、およびＲ１５は、低級アルキル、低級アリール、ならびに置換低級アルキルおよび低級アリールから選択し得る（好ましくは、１８、１６、１４、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２個までの炭素を含有する構造で置換されている）。いくつかの実施形態では、Ｒ１３は、２−シアノエチルまたはメチルであり、Ｒ１４およびＲ１５のいずれかまたは両方は、イソプロピルである。Ｒ１４およびＲ１５は、任意選択的に環状に結合することができる。
【００２６】
「アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、および２，３−ジメチルブチルなどの、１〜２４個、典型的には１〜１２個の炭素原子の飽和直鎖、分岐状または環状の炭化水素基を意味する。「低級アルキル」という用語は、１〜６個の炭素原子のアルキル基を意図し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、および２，３−ジメチルブチルが挙げられる。「シクロアルキル」という用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルなどの環状アルキル基を意味する。
【００２７】
さらに、「アルキル」という用語は、１〜２４個の炭素原子を有し、エーテル−、チオ−、アミノ−、ホスホ−、オキソ−、エステル−、およびアミド−から選択される１つまたは複数の連結などのさらなる基をさらに有し、ならびに／または低級アルキル、アリール、アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシル、アミノ、スルホニル、チオ、メルカプト、イミノ、ハロ、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、カルボキシ、スルフィド、スルホン、スルホキシ、ホスホリル、シリル、シリルオキシ、およびボロニルを含めた１つまたは複数のさらなる基で置換アルキル基を意味する「修飾アルキル」を含む。同様に、「低級アルキル」という用語は、１〜８個の炭素原子を有し、エーテル−、チオ−、アミノ−、ホスホ−、ケト−、エステル−、およびアミド−から選択される１つまたは複数の連結などのさらなる基をさらに有し、ならびに／または低級アルキル、アリール、アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシル、アミノ、スルホニル、チオ、メルカプト、イミノ、ハロ、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、カルボキシ、スルフィド、スルホン、スルホキシ、ホスホリル、シリル、シリルオキシ、およびボロニルを含めた１つまたは複数の基で置換されている基を意味する「修飾低級アルキル」を含む。「アルコキシ」という用語は、本明細書で使用する場合、置換基−Ｏ−Ｒ（式中、Ｒは上記定義のようなアルキルである）を意味する。「低級アルコキシ」という用語は、Ｒが低級アルキルであるそのような基を意味する。「チオアルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、置換基−Ｓ−Ｒ（式中、Ｒは上記定義のようなアルキルである）を意味する。
【００２８】
「アルケニル」という用語は、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、少なくとも１つの二重結合を含有する、２〜２４個、典型的には２〜１２個の炭素原子の分岐状、非分岐状、または環状（例えば、Ｃ５およびＣ６の場合）の炭酸水素基を意味する（エテニル、ビニル、アリル、オクテニル、デセニルなど）。「低級アルケニル」という用語は、２〜８個の炭素原子のアルケニル基を意図し、ビニルおよびアリルを特に含む。「シクロアルケニル」という用語は、環状アルケニル基を意味する。
【００２９】
「アルキニル」という用語は、本明細書で使用する場合、別段の指定がない限り、少なくとも１つの三重結合を含有する、２〜２４個、典型的には２〜１２個の炭素原子の分岐状または非分岐状の炭酸水素基を意味する（アセチレニル、エチニル、ｎ−プロピニル、イソプロピニル、ｎ−ブチニル、イソブチニル、ｔ−ブチニル、オクチニル、デシニルなど）。「低級アルキニル」という用語は、２〜８個の炭素原子のアルキニル基を意図し、例えば、アセチレニルおよびプロピニルを含み、「シクロアルキニル」という用語は、環状アルキニル基を意味する。
【００３０】
「ヒドロカルビル」という用語は、アルキル、アルケニルまたはアルキニルを意味する。「置換ヒドロカルビル」という用語は、炭化水素骨格の１つまたは複数の炭素上の水素を置き換える置換基を有するヒドロカルビル部分を意味する。このような置換基には、例えば、ヒドロキシル、ハロゲン、カルボニル（カルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、またはアシルなど）、チオカルボニル（チオエステル、チオアセテート、またはチオホルメートなど）、アルコキシル、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、複素環式、アラルキル、または芳香族もしくは複素環式芳香族部分を含めてもよい。炭化水素鎖上で置換された部分は、適切な場合それら自体が置換されていてもよいことは当業者であれば理解されよう。例えば、置換アルキルの置換基は、置換および非置換の形態のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネートおよびホスフィネートを含む）、スルホニル（スルフェート、スルホンアミド、スルファモイルおよびスルホネートを含む）、ならびにシリル基、ならびにエーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、およびエステルを含む）、−ＣＮなどを含み得る。シクロアルキルは、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル、−ＣＮなどでさらに置換されていてもよい。
【００３１】
「アルコキシ」という用語は、酸素に連結したアルキル基を意味し、式：Ｒ−Ｏ−（式中、Ｒはアルキル基を表す）によって表してもよい。一例は、メトキシ基ＣＨ３Ｏ−である。
【００３２】
「アリール」という用語は、０〜４個のヘテロ原子を含み得る、５、６、および７員の単環芳香族基を意味する（例えば、ベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジンおよびピリミジンなど）。環状構造中にヘテロ原子を有するそれらのアリール基はまた、「アリール複素環」または「複素環式芳香族」と称し得る。「アリール」という用語はまた、２つ以上の環状環を有する多環式環系を含み、ここで２個以上の炭素は２つの隣接する環（環は「縮合環」である）に共通しており、環の少なくとも１つは芳香族である（例えば、他の環状環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、および／または複素環でよい）。「低級アリール」は、１８個までの炭素（１４、１２、１０、８または６個までの炭素など）を含有する。
【００３３】
芳香環は、１つまたは複数の環位置において、置換ヒドロカルビルについて上記のような置換基（例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、複素環式、芳香族もしくは複素環式芳香族部分、−ＣＦ３、−ＣＮ、または同様のもの）で置換されている場合がある。
【００３４】
「ハロゲン」および「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味する。
【００３５】
「連結」は、本明細書で使用する場合、第１の部分が２つの他の部分に結合し、その２つの他の部分は第１の部分を介して連結していることを意味する。典型的な連結には、エーテル（−Ｏ−）、オキソ（−Ｃ（Ｏ）−）、アミノ（−ＮＨ−）、アミド（−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−）、チオ（−Ｓ−）、ホスホ（−Ｐ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−）が挙げられる。
【００３６】
「官能化された」は、材料に結合した特定の部分を有するように材料を修飾する工程を意味し、例えば、分子または基質を特定の部分を有するように修飾する。このようにして修飾された材料（例えば、分子または支持体）は、官能化された材料（例えば、官能化された分子または官能化された支持体）と称される。
【００３７】
「置換されている」という用語は、化学構造、基、または部分について記載するために使用される場合、１個または複数の置換基を含む構造、基、または部分を意味する。本明細書で使用する場合、第１の基が第２の基「で置換されている」場合、第２の基は、第１の基に結合しており、それによって第１の基の部分（典型的には水素）が、第２の基で置き換えられている。
【００３８】
「置換基」は、化学構造中の他の基を置き換える基を意味する。典型的な置換基には、非水素原子（例えば、ハロゲン）、官能基（これらに限定されないが、アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル、アルコキシ、カルボキシル、シリル、シリルオキシ、ホスフェートなど）、ヒドロカルビル基、および１個または複数のヘテロ原子で置換されたヒドロカルビル基が挙げられる。例示的な置換基には、アルキル、低級アルキル、アリール、アラルキル、低級アルコキシ、チオアルキル、ヒドロキシル、チオ、メルカプト、アミノ、イミノ、ハロ、シアノ、ニトロ、ニトロソ、アジド、カルボキシ、スルフィド、スルホン、スルホキシ、ホスホリル、シリル、シリルオキシ、ボロニル、および修飾された低級アルキルが挙げられる。
【００３９】
ハイフン、またはダッシュは、結合を示すためにこの明細書を通して様々な箇所で使用されており、例えば２つの指定された基がテキスト中でダッシュに直ちに隣接している場合、これは２つの指定された基が互いに結合していることを示す。同様に、テキスト中の指定された基の各々の間にダッシュがある一連の指定された基は、指定された基が示された順番で互いに結合していることを示す。また、テキストにおいてダッシュに隣接した単一の指定された基は、その指定された基が、典型的にはいくつかの他の指定されていない基に結合していることを示す。いくつかの実施形態では、ダッシュによって示される結合は、例えば、隣接する指定された基の間の共有結合であり得る。明細書を通して様々な箇所で、基は、テキストにおいて隣接するダッシュを伴って、または伴わずに記載される場合があり（例えば、アミドまたはアミド−、さらに例えば、アルキルまたはアルキル−、またさらには、Ｌｎｋ、Ｌｎｋ−または−Ｌｎｋ−）、ここで基は他の基に結合している（または、結合する可能性を有する）ことが意図されていることを文脈は示し、このような場合、その基の同一性は、（テキストにおいて隣接するダッシュのあるなしを問わず）基名によって表示される。文脈が示す場合、単一の基は、複数の他の基に結合している場合（例えば、連結基など連結が意図されている場合）があることに留意されたい。
【００４０】
点線、例えば、
【化１】
0005520818.tif 000002
は、明細書を通して、いくつかの他の指定されていない基への結合を示すために指定された基に隣接して使用される。
【００４１】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、引き続いて記載される状況が起こり得るまたは起こり得ないことを意味し、記載はその状況が起こる場合および起こらない場合を含む。例えば、「任意選択的に置換された」という語句は、水素でない置換基が存在し得るまたは存在し得ないことを意味し、したがって記載は、水素でない置換基が存在する構造、水素でない置換基が存在しない構造を含む。明細書を通して様々な箇所で、部分がゼロ時間以上存在すると記載し得る。これは部分が任意選択的であることと等しく、その部分が存在する実施形態およびその部分が存在しない実施形態を含む。任意選択的な部分が存在しない（構造中でゼロ時間存在する）場合、任意選択的な部分によって連結していると記載された隣接する基は、互いに直接連結している。同様に、部分は、（１）２つの隣接する基を連結する基、または（２）２つの隣接する基を連結する結合として記載されている場合がある。これは、部分が任意選択的であり、部分が存在する実施形態、および部分が存在しない実施形態を含むことと等しい。任意選択的な部分が存在しない（構造中でゼロ時間存在する）場合、任意選択的な部分によって連結していると記載された隣接する基は、互いに直接連結している。
【００４２】
「結合した（Ｂｏｕｎｄ）」は、本明細書において直接または間接の結合を示すために使用し得る。化学構造との関連において、「結合した（ｂｏｕｎｄ）」（または「結合した（ｂｏｎｄｅｄ）」）は、２つの部分を直接結合する、または（例えば、連結基もしくは分子の任意の他の介在部分を介して）２つの部分を間接的に結合する化学結合の存在を意味し得る。化学結合は、共有結合、イオン結合、配位錯体、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または疎水性スッタキングでよく、または多数のタイプの化学結合の特徴を示し得る。場合によっては、「結合した（ｂｏｕｎｄ）」は、結合が直接である実施形態、およびまた結合が間接である実施形態を含む。「遊離」は、遊離である部分との関連で使用される場合、その部分が反応するのに利用可能であり、またはその部分が一部となっている溶液の他の成分によって接触されていることを示す。
【００４３】
「評価する」という用語は、任意の形態の測定を含み、要素が存在するか、またはしないかを決定することを含む。「決定する」、「測定する」、「検査する」、「評価する」および「アッセイする」という用語は、互換的に使用され、定量的および／または定性的決定を含み得る。評価は、相対的または絶対的であり得る。「の存在を評価する」は、存在する何かの量を決定すること、および／またはそれが存在するかもしくは存在しないかを決定することを含む。
【００４４】
「単離された」または「精製された」は、物質がその物質が存在する試料中の実質的な部分を構成する（溶媒を除いて）、すなわち、物質がその自然または単離されていない状態において典型的には見出されるより多いような、物質（化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド、染色体など）の単離を一般に意味する。典型的には、試料の実質的な部分は、試料の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、またはさらに好ましくは少なくとも約９０％を構成する（溶媒を除く）。例えば、単離したＲＮＡの試料は、典型的には少なくとも約５％の全ＲＮＡを含み、パーセントは、この文脈では試料中の全ＲＮＡの質量（例えば、マイクログラム）を（試料中の全ＲＮＡ＋他の構成要素（溶媒を除く））の和の質量（例えば、マイクログラム）で割ったものとして計算される。対象とするポリヌクレオチドおよびポリペプチドを精製するための技術は当技術分野で周知であり、例えば、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、フローソーティング、および密度による沈殿を含む。典型的な実施形態では、ヌクレオチド組成物（複数可）の１種または複数は、単離された形態である。より典型的には、３種全ては、本方法において使用する前に単離された形態で得る。
【００４５】
「所定の」という用語は、その使用前にその同一性が公知である要素を意味する。例えば、「所定の配列」は、配列を有するポリヌクレオチドの使用または合成の前に、その同一性が公知である配列である。その要素は、名称、配列、分子量、その機能、または任意の他の特性もしくは識別子によって知られている場合がある。
【００４６】
「上流」は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ分子に沿って５’方向を意味する。「下流」とは、ポリヌクレオチドに沿って３’方向を意味する。「３’−」および「５’−」は、当技術分野において公知のそれらの従来の意味を有する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明の態様には、２’部位でチオ炭素保護基によって保護されている２’保護ヌクレオシドモノマーが含まれる。対象とするチオカーボネート保護基には、チオカーボネート基およびジチオカーボネート基、ならびにチオノカルバメート保護基が挙げられる。本発明の態様には、本発明の保護基を含む核酸、および本発明の保護基を使用した核酸の合成方法がさらに含まれる。
【００４８】
本発明をより詳細に記載する前に、本発明は、記載されている特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。実施形態は当然ながら変化し得るためである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであり、限定的なものではないことがまた理解される。
【００４９】
値の範囲が提供されている場合、その範囲の上限と下限との間の各々のその間の値（文脈が明らかにそれ以外のことを示さない限り、下限のユニットの１０分の１まで）、ならびにその示された範囲内の任意の他の示された値またはその間の値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立にそのより小さな範囲内に含まれる場合があり、示された範囲内の任意の特に除外された限度を前提として、本発明内にまた包含される。示された範囲が該限度の一方または両方を含む場合、それらの含められた限度の一方または両方を除外した範囲もまた、本発明に含められる。
【００５０】
特定の範囲は、本明細書において「約」という用語が先行して数値が提示される。「約」という用語は、本明細書において、約が前に置かれる正確な数字、およびその用語が前におかれる数の近くの数、または概ねその数に対して文字通りの根拠を提供するために使用される。ある数が特に列挙した数に近い数または概ねその数であるかを決定することにおいて、列挙していない数に近い数または概ねその数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙した数と実質的な同等のものを提供する数であり得る。
【００５１】
他に定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または同等の任意の方法および材料はまた、本発明の実施または試験において使用することができるが、代表的な例示的方法および材料を、ここで記載する。
【００５２】
本明細書で引用されている全ての出版物および特許は、各々の個々の出版物または特許が参照することにより本明細書の一部をなすことが明確におよび個々に示されているかのように、参照することにより本明細書の一部をなすものとし、それとの関連で出版物が引用されている方法および／または材料を開示および記載するために参照することにより本明細書の一部をなすものとする。任意の出版物の引用は、出願日より前のその開示のためであり、先行発明に基づいて、本発明がこのような出版物に先行する資格がないことを承認すると解釈するべきではない。さらに、提供された出版物の日付は、個々に確認する必要があり得る実際の出版物の日付とは異なる場合がある。
【００５３】
本明細書で使用する場合、および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそれ以外のことを示さない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は、任意の任意選択的な要素を除外するように作成される場合があることをもまた留意されたい。それ自体として、この記述は、構成要素の列挙に関連して「単独で」、「のみ」などのこのような排他的な用語の使用、または「消極的な」限定の使用のための根拠の役割を果たすことを意図している。
【００５４】
いくつかの化学構造の描写では通常であるように、ヒドリド基のいくつかは、明確にする目的のために描かれた構造から省略されているが、例えば、描かれた構造中の炭素の原子価結合を完全に記入するために必要に応じ存在すると理解するべきであることに留意すべきである。
【００５５】
この開示を読んだ当業者には明らかなように、本明細書において記載され例示されている個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または精神から逸脱することなしに、他のいくつかの実施形態のいくつかの特徴から容易に分離することができ、または合わせることができる個別の成分および特徴を有する。任意の列挙した方法は、列挙した事象の順番または論理的に可能な任意の他の順番で行うことができる。
【００５６】
［チオ炭素保護基で保護されたモノマー］
上記で簡潔に述べたように、本発明の態様は、２’−チオ炭素保護基と、モノマーの２’酸素を保護しているチオ炭素保護基を含むモノマーとを含む。チオ炭素保護基とは、炭素原子に結合した硫黄原子（硫黄原子は、炭素原子に単結合または二重結合によって結合している場合がある）を含む保護基を意味する。保護基は、さらなるヘテロ原子、例えば、酸素、窒素などを含む場合もあり、含まない場合もある。特定の実施形態では、保護基は、チオカーボネートまたはジチオカーボネート保護基である。また他の実施形態では、下記でより詳細に記載する本発明のチオノカルバメート保護基中に存在するように、窒素原子が存在する。これらの保護基は、チオノカルバメート以外は、フェニル基を基として含有しない。それ自体として、本発明のチオ炭素保護基は、フェニルチオノカーボネート、フェニルチオカーボネートおよびフェニルジチオカーボネートを含まず、それらは本発明から除外される。
【００５７】
本発明の実施形態は、２’チオカーボネート保護基（「チオカーボネート」は、例えば、下記式（Ｉ）によって記載されているように、ジチオカーボネートを含む）を有するヌクレオシドモノマーを含む。
【化２】
0005520818.tif 000003
（式中、
ＢＰは、保護されている複素環または保護されていない複素環であり、
Ｒ１またはＲ２の各々は、水素、保護基、およびホスホラミダイト基から独立に選択され、
ＸおよびＹは、独立に、硫黄または酸素であり、ＸおよびＹの少なくとも１つは、硫黄であり、
Ｒ３は、ヒドロカルビルおよび置換ヒドロカルビルから独立に選択される。）
【００５８】
Ｒ３が第二級（−ＣＨ−Ｒ’Ｒ’’）ヒドロカルビル基または置換された第二級（−ＣＨ−Ｒ’Ｒ’’）ヒドロカルビル基である特定の実施形態では、Ｒ’およびＲ’’は、水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリールおよび置換アリールから独立に選択され、Ｙが酸素である特定の実施形態では、Ｒ３は第三級ヒドロカルビルではない、すなわち、Ｒ３は、
【化３】
0005520818.tif 000004
ではない。
【００５９】
式Ｉによって記述される化合物には、チオカーボネート、ジチオカーボネート、およびチオノカーボネートが挙げられるが、これらだけに限らない。これらの化合物の実施形態には、下記の式Ｉｃおよび式Ｉｄおよび式Ｉｅによって表されるものが挙げられる。
【化４】
0005520818.tif 000005
（式中、
Ｒ３は、ヒドロカルビル、および置換ヒドロカルビルから独立に選択されるが、ただし、Ｒ３が第二級（−ＣＨ−Ｒ’Ｒ’’）ヒドロカルビル基または置換された第二級（−ＣＨ−Ｒ’Ｒ’’）ヒドロカルビル基である場合、Ｒ’およびＲ’’の各々は水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリールおよび置換アリールから独立に選択され、さらにただし、構造Ｉｅにおいて示される化合物のみに関して、Ｒ３は、下記構造
【化５】
0005520818.tif 000006
によって記述されるような第三級ヒドロカルビルではなく、このことはＲ３’、Ｒ３’’、Ｒ３’’’の少なくとも１つはＨであることを意味している。）
【００６０】
適切なＲ３基のさらなる例は、「Ｍｏｎｏｍｅｒ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ」という表題で、２００６年３月２３日に出願された係属中の米国特許出願第１１／３８８，１１２号において見出すことができ、その開示は参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００６１】
本発明のまた他の実施形態では、式ＩのＲ３は、メチル基、エチル基、イソプロピル基、またはベンジル基である。このような実施形態の例には、下記の構造の化合物が含まれる。
【化６】
0005520818.tif 000007
【００６２】
特定の実施形態では、本発明のモノマーは、例えば、下記式ＩＩにおいて示される構造による化合物において見出されるような２’チオノカルバメート保護基を含む。
【化７】
0005520818.tif 000008
（式中、
ＢＰは、保護されている複素環または保護されていない複素環であり、
Ｒ１またはＲ２の各々は、水素、保護基、およびホスホラミダイト基から独立に選択され、
Ｎは、ＮＨ２または第二級アミン（−ＮＨ−Ｚ）、第二級ヒドロキシルアミン（−ＮＨ−Ｏ−Ｚ）、第三級アミン（−Ｎ−ＺＺ’’）（式中、ＺおよびＺ’’は、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリール、置換アリールから独立に選択され、ＺもしくはＺ’’は、Ｎに環状連結することができる）、または第三級ヒドロキシルアミン（−Ｎ−Ｚ−ＯＺ’’）（式中、ＺおよびＺ’’は、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリール、置換アリールから独立に選択され、ＺもしくはＺ’’は、Ｎに環状連結することができる）である。）
【００６３】
本発明のカルバメート保護基には、第一級、第二級、および第三級チオノカルバメートが挙げられる。これらの化合物の実施形態には、下記の式ＩＩｃおよび式ＩＩｄおよび式ＩＩｅおよび式ＩＩｆおよび式ＩＩｇおよび式ＩＩｈによって表されるものが挙げられる。
【化８】
0005520818.tif 000009
（式中、
Ｒ３は、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリール、置換アリールから選択され、ただし、ＩＩｃのみについては、Ｒ３は、２−（Ｎ−アミド）で置換されたフェニルではなく、
Ｒ４およびＲ５は、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリール、置換アリールから独立に選択され、ただし、Ｒ４およびＲ５は、Ｎに環状連結することができる。）
【００６４】
対象とする特定の化合物には、下記の構造によって記述されるものが含まれる。
【化９】
0005520818.tif 000010
【００６５】
上記の式に関して、ＢＰ基は、保護されている複素環または保護されていない複素環である。複素環は、天然プリンおよびピリミジン塩基、例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはウラシル（Ｕ）、または修飾プリンおよびピリミジン塩基、ならびに通常の類似体、例えば、本明細書において記載されているものなどから選択し得る。この文脈において検討される特定のプリンまたはピリミジン類似体には、２００２年１２月１８日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」という表題の米国特許出願第１０／３２４，４０９号において記載されているもの、およびまた１９９９年７月２０日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」という表題の米国特許出願第０９／３５８，１４１号（現在は放棄されている）において記載されているものが含まれる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、複素環は、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、擬似ウラシル、１−メチル擬似ウラシル、ケオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリンから選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、複素環は、ポリヌクレオチド合成の技術分野において通常公知であるように、保護基を有し得る。特定の実施形態では、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン、またはＮ，Ｎ−ジフェニルカルバメートから選択される複素環保護基は、複素環に結合している。
【００６８】
［２’チオ炭素保護基で保護されたモノマーの合成］
本発明のヌクレオシドモノマーを含有するチオ炭素保護基は、任意の都合のよいプロトコルを使用して生成することができる。特定の実施形態では、本発明の保護されたヌクレオシドモノマーは、式（ＩＩＩ）
【化１０】
0005520818.tif 000011
（式中、
ＢＰは、保護されているまたは保護されていない窒素含有塩基であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立に、Ｈ、ホスホロアミデート基、ヒドロキシル保護基であり、またはＲ１およびＲ２は、連結して、１，３−テトライソプロピルジシロキサン（ＴＩＰＳ）基などの二座保護基を形成する。）
において示される構造を有するヌクレオシドモノマーを、構造：Ｑ−ＬＧ、
（式中、
Ｑは、チオ炭素保護基、例えば、上記のようなものであり、
ＬＧは、ハロ基などの脱離基である。）
を有する化合物と、式（ＩＶ）
【化１１】
0005520818.tif 000012
の構造の２’保護ヌクレオシドモノマーを生成するのに十分な条件下で、接触させるプロトコルを使用して生成される。
【００６９】
ＬＧは、任意の都合のよい脱離基でよい。脱離基または活性化基には、イミダゾール、クロロ、ｐ−ニトロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、Ｏ−スクシンイミジル、トリクロロメチル、ブロモ、およびヨードが挙げられるが、これらに限られない。
【００７０】
特定の実施形態では、下記に例示するように、本発明のモノマーの合成は、Ｍａｒｋｅｗｉｃｚ  ＴＩＰＳ試薬などの試薬を用いて、保護基を合成下の組成物の２’−ＯＨ部位に局在させる、すなわち位置選択性を与える。下記のスキームでは、Ｒｉは、チオ炭素保護基である。２’−ヒドロキシル保護基上の特異的導入は、５’ −ヒドロキシル基および３’−ヒドロキシル基の一時的保護によって、例えば、Ｍａｒｋｅｗｉｃｚジシリルオキサン保護基の使用によって行われる。下記のスキームにおいて示される１，３−テトライソプロピルジシロキサン（ＴＩＰＳ）は、５’ ヒドロキシルおよび３’ヒドロキシルを同時に遮断するために使用され、２’−ヒドロキシルを位置選択的に保護することを可能にする一時的な二座保護基である。他の一時的二座保護基をまた用いてもよい。１，３−テトライソプロピルジシロキサン基は、フッ化物イオンの溶液を使用して、続いて除去される。
【００７１】
スキーム１
【化１２】
0005520818.tif 000013
したがって、本発明の態様は、式Ｖ
【化１３】
0005520818.tif 000014
（式中、Ｂｐは、保護されている窒素含有塩基または保護されていない窒素含有塩基である。）
の化合物を、式Ｃｌ−Ｃ（Ｓ）−Ｒ３（式中、Ｒ３は、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビルから独立に選択されるが、ただし、Ｒ３は、第三級ヒドロカルビルでなく、Ｒ３が第二級（−ＣＨ−Ｒ’Ｒ’’）ヒドロカルビル基または置換された第二級（−ＣＨ−Ｒ’Ｒ’’）ヒドロカルビル基である場合、Ｒ’およびＲ’’は、水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリールおよび置換アリールから独立に選択される）のクロロチオホルメートと反応させることによって、５’，３’−ＴＩＰＳ−２’−Ｏ−（Ｒ３−チオ）カルボニル中間体を生成するステップと、
ｂ）５’，３’−テトライソプロピルジシロキサン保護基を１５当量〜４０当量のＨＦ／ピリジンで除去し、２’−Ｏ−（Ｒ３−チオ）カルボニルリボヌクレオシド中間体を生成するステップと、
ｃ）ステップｂ）の中間体を、ＤＭＴｒＣｌおよび５当量〜１０当量のコリジンまたはルチジンと反応させ、任意選択的にＤＭＡＰまたはＮＭＩを加え、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−チオカルボニル−リボヌクレオシド誘導体を生成するステップと、
ｄ）ステップｃ）からの中間体を、ＣＮＥＯ−Ｐ（Ｃｌ）−Ｎ（ｉＰｒ）２または（ジイソプロピル）アミノメトキシクロロホスフィンから選択されるホスフィチル化試薬と反応させて、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−Ｒ３−チオカルボニル−３’−Ｏ−メチル（−またはシアノエチル）ホスホラミダイトを精製するステップと
による本発明の化合物の作製方法を含む。上記の反応条件は例示的であり、類似の条件およびプロトコルはまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００７２】
本明細書に記載する保護された２’−ヒドロキシル化合物、およびＴＩＰＳ基を脱保護するために開発された条件について、この位置特異的な一時的保護は、前例のない効率で行うことができることが示されてきた。ＴＩＰＳ保護を選択的に脱保護し、一方２’−保護基を保存するために、特定の組成物および方法が開発されてきた。例えば、ＨＦ／ピリジンの使用は、チオ炭素保護基が保存される一方で、ＴＩＰＳの選択的脱保護を可能にする。
【００７３】
ＴＩＰＳ保護基の選択的除去の後または間の、環状カーボネートを形成する遊離３’−ヒドロキシルのさらなる反応の可能性を考慮することは重要である。２’位上のチオカーボネートは、ＨＦ／ピリジン／ＣＨ３ＣＮによるＴＩＰＳ除去の間に環化を受けない。他方、チオカーボネートまたはカーボネートは、ＨＦ／ピリジン／ＣＨ３ＣＮの代わりにＨＦ／ＴＥＡが使用される場合、ある程度環化する（下記のスキーム２を参照されたい）。
【００７４】
スキーム２
【化１４】
0005520818.tif 000015
【００７５】
この環化は望ましくない一方で、所望の生成物から容易に分離することができるデッドエンド環状カーボネート生成物を生じさせる。したがって、この環状種の形成は、最終のモノマー生成物および最終的なＲＮＡオリゴヌクレオチドの完全性を確実にする好ましい副反応および利点である。この知見は、２’−ヒドロキシルから３’−ヒドロキシルに異性化し、問題のある５’から３’への連結が完全であるＲＮＡ生成物をもたらす場合がある、２’−ヒドロキシルについてのシランまたは他の保護基の使用と対照的である。ＨＦを用いるこれらの脱保護反応において、ＨＦ錯体、例えば、ＨＦ−ＴＥＭＥＤまたはＨＦ−ＴＭＡなどもまた使用することができる。他の溶媒、例えば、ジオキサン、ＴＨＦ、または塩化メチレンは、特定の条件下で環状カーボネートの形成によってチオカーボネート基の部分的な損失をもたらし得るが、このような溶媒もまた使用することができる。さらに、環状カーボネートは、所望の生成物から容易に分離可能である。
【００７６】
これらの新規なＲＮＡモノマーのための核酸塩基は、任意の都合のよいアプローチを使用して保護し得る。対象とする１つのアプローチは、Ｔｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０４、１３１６〜１３１９（１９８２）によって最初に記載されたジョーンズ手順として当技術分野において公知である。ジョーンズ手順は、塩化トリメチルシリルによる保護されていないヌクレオシドの一時的シリル化を使用して、ハロゲン化カルボニル基、活性化カルボニル基またはカルボニル無水物が核酸塩基の環外アミンと位置特異的に反応することを可能にする。この反応において、大幅に過剰の塩化トリメチルシリルを、ヌクレオシドのピリジンおよびジクロロメタン溶液に加える。これによって、環外アミン基と共に糖残基のヒドロキシル基の全てのトリメチルシリル化、および潜在的にヘテロ塩基上のイミノのトリメチルシリル化がもたらされる。シリル化される場合、環外アミン基は、ハロゲン化カルボニル基、活性化カルボニル基またはカルボニル無水物へのそれらの反応性を保持する一方、糖残基のヒドロキシル基は、同じ試薬との反応から保護される。これは環外アミンの位置特異的保護をもたらす。典型的な手順において、トリメチルシリル基は、炭酸水素ナトリウムの存在下で水性後処理（ａｑｕｅｏｕｓ  ｗｏｒｋｕｐ）によってヒドロキシル部分から除去される。極性溶媒中にトルエンスルホン酸を添加することによって、この手順を改変して、非水性後処理を支持することができる。Ｍａｒｋｅｗｉｃｚ保護基ＴＩＰＳを使用して合成したＲＮＡモノマーについて、特定の実施形態では、ジョーンズ反応を行う前に保護されていないヌクレオシドをＴＩＰＳ基と最初に反応させることは有利である。このような条件下では、ＴＩＰＳで保護されたヌクレオシドは、有機溶媒中で有意により可溶性であり、５’ ヒドロキシルおよび３’ヒドロキシルが予め保護されている結果として、より少量の過剰な塩化トリメチルシリルを使用することが可能である。後処理の後、これらの反応からの生成物は、Ｎ−保護−３’，５’−テトライソプロピルジシロキサンヌクレオシドである。次いで、この化合物は、２’−保護基と直接反応することができる。
【００７７】
窒素含有塩基のＲ３−チオカーボネート、Ｒ３−ジチオカーボネート、またはＲ３−チオノカーボネート保護基による保護はまた、下記でより詳細に論じるように、ＲＮＡのワンステップの最終的脱保護を可能にし、塩基および２’−ヒドロキシル基は同時に脱保護される。
【００７８】
本発明のいくつかの他の実施形態では、窒素含有塩基は、相当する２’−Ｏ−チオカーボネート以外の封鎖基によって保護される。ここで再び、ＲＮＡのワンステップの最終的脱保護、ならびに塩基および２’−ヒドロキシル基の同時の脱保護を行うことができる。これらの種類のヌクレオシドモノマーは、例えば、アセチル（Ａｃ）、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル（ｉＢｕ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、フェノキシアセチル（Ｐａｃ）、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル（Ｔａｃ）、イソプロピルフェノキシアセチル（ｉＰｒＰａｃ）、フェニルオキシカルボニル、トリフルオロメチルオキシカルボニル、ジフルオロメチルオキシカルボニル、フルオロメチルオキシカルボニル、トリフルオロエチルオキシカルボニル、４−メチルフェニルオキシカルボニル、４−エチルフェニルオキシカルボニル、４−イソプロピルフェニルオキシカルボニル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルオキシカルボニル、２−メチルフェニルオキシカルボニル、２−エチルフェニルオキシカルボニル、２−イソプロピルフェニルオキシカルボニル、２−ｔｅｒｔ−ブチルフェニルオキシカルボニル  ４−メトキシフェニルオキシカルボニル、４−エトキシフェニルオキシカルボニル、４−イソプロピルオキシフェニルオキシカルボニル、４−ブチルオキシフェニルオキシカルボニル、２−メトキシフェニルオキシカルボニル、２−エトキシフェニルオキシカルボニル、２−イソプロピルオキシフェニルオキシカルボニル、２−ブチルオキシフェニルオキシカルボニル、ベンジルチオカルボニル、２−クロロベンジルチオカルボニル、４−クロロベンジルチオカルボニル、２，４−ジクロロベンジルチオカルボニル、２−フルオロベンジルチオカルボニル、３−フルオロベンジルチオカルボニル、４−フルオロベンジルチオカルボニル、２−トリフルオロメチルベンジルチオカルボニル、３−トリフルオロメチルベンジルチオカルボニル、４−トリフルオロメチルベンジルチオカルボニル、４−ニトロベンジルチオカルボニル、メチルチオカルボニル、エチルチオカルボニル、イソプロピルチオカルボニル、ジメチルホルムアミジン、ジブチルホルムアミジン  Ｎ，Ｎ−ジフェニルカルバメートなどによって、窒素含有塩基がすでに保護されているヌクレオシドから出発することによって合成することができる。
【００７９】
特定の実施形態では、核酸塩基上の環外アミン基は、同じ試薬（ハロゲン化カルボニル基、活性化カルボニル基またはカルボニル無水物など）を使用して、２’−ヒドロキシルと同時に保護される。この反応スキームにおいて、保護されていないヌクレオシドは、無水ピリジンに溶解し、最初に１モル当量の１、３−ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサンと反応し得る。試薬は特異的に反応し、３’−５’環状保護されたヌクレオシドを形成し、環外アミンおよび２’−ヒドロキシル部分を次のステップにおいてハロゲン化カルボニル、活性化カルボニル基またはカルボニル無水物と反応できるようにする。下記のスキーム３を参照されたい。
【００８０】
スキーム３
【化１５】
0005520818.tif 000016
本発明のいくつかの他の実施形態では、窒素含有塩基は、チオカーボネート以外の封鎖基によって保護される。これらの種類のヌクレオシドモノマーは、例えば、アセチル、ジフルオロアセチル、トリフルオロアセチル、イソブチリル、ベンゾイル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フェノキシアセチル、ジメチルホルムアミジン、またはＮ，Ｎ−ジフェニルカルバメートによって窒素含有塩基がすでに保護されているヌクレオシドから出発することによって合成することができる。次いで、ヌクレオシドは、ＴＩＰＳＣｌ２およびジチオクロロホルメートまたはチオカルボニルクロロホルメートと反応することができ、上記のスキーム１において記載されているように処理される。
【００８１】
Ｒ３−チオカーボネート保護基、Ｒ３−ジチオカーボネート保護基、またはＲ３−チオノカーボネート保護基を有するモノマーは、活性化Ｒ３−チオカーボネート、Ｒ３−ジチオカーボネート、またはＲ３−チオノカーボネートを使用して合成することができる。適切なスキームの実施形態を、下記のスキーム４〜６に示す。
【００８２】
スキーム４
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ヒドロカルビルチオカルボニル−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトウリジンの合成
【化１６】
0005520818.tif 000017
ＮＭＩ（Ｎ−メチルイミダゾール）
ＨＦ／ピリジンは、ＨＦ／ピリジン：７０／３０：ｗ／ｗでできている錯体である。
Ｒによって、トリチル化反応は遅くすることができ、ＮＭＩまたはＤＭＡＰを少量（０．１当量）加えて、反応を加速することができる。
【００８３】
スキーム５
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ヒドロカルビルチオカルボニル−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−Ｎ４−フェニルオキシカルボニルシチジンモノマー
【化１７】
0005520818.tif 000018
ＴＭＳＣｌ＝塩化トリメチルシリル
ＰｈＣ（Ｏ）ＯＣｌ＝フェニルクロロホルメート
ｐＴＳＯ３Ｈ＝パラ−トルエンスルホン酸
Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＳＣｌ＝チオクロロホルメート（エチルチオクロロホルメート）
ＤＭＡＰ−４，４’−ジメチルアミノピリジン
ＨＦ／ピリジンは、ＨＦ／ピリジン：７０／３０：ｗ／ｗでできている錯体である。
コリジンは、２，４，６−コリジンである。
ＮＭＩ−Ｎ−メチルイミダゾール
【００８４】
スキーム６
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ヒドロカルビルチオカルボニル−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−Ｎ６−フェニルオキシカルボニルアデノシンおよび５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ヒドロカルビルチオカーボネート−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−Ｎ４−フェニルオキシカルボニルグアニジンの合成
Ａ）環外アミンの保護
【化１８】
0005520818.tif 000019
Ｂ）２’−ヒドロキシルの選択的保護および３’ホスフィチル化
【化１９】
0005520818.tif 000020
【００８５】
例えば、ｔｅｒｔブチルクロロチオホルメートなどの他の試薬が利用可能でない場合、２’−Ｏ−ｔ−ブチルチオカーボネート（ＢＳＣ）ウリジンを合成するために、５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）２’−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートで保護されたウリジンを前駆体として使用し得る。次いで、スキーム７において下記に示すように、ナトリウム２−メチル−２−プロパンチオレートを使用して、ｐ−ニトロフェニルカーボネートを置換する。
【化２０】
0005520818.tif 000021
【００８６】
したがって、相当するクロロチオホルメートが利用できない場合、２’−チオカーボネートを合成するための一般のアプローチとして、相当するメルカプタン誘導体を使用し、それをホスゲンと反応させて、相当するクロロチオホルメートを得ることは可能であり、またはメルカプタンを２’Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートで保護されたヌクレオシドと反応させることもまた可能である。
【００８７】
したがって、２’−チオノカルバメートの合成への一般のアプローチとして、式（Ｖ）のジシロキサンで保護されたヌクレオシドを、触媒量の４−（ジメチル）アミノピリジンの存在下で、アセトニトリル中の１，１’−チオカルボニルジイミダゾールと反応させることができる。これらの反応によって、保護されたヌクレオシドの式ＶＩのイミダゾールチオノカルバメートおよび結晶性生成物への定量的変換がもたらされる。
【化２１】
0005520818.tif 000022
【００８８】
式の化合物と、１．１当量のアンモニア、第一級アミンまたは第二級アミンとの、触媒量の４−（ジメチル）アミノピリジンを含むアセトニトリル中の反応は、所望の２’−チオノカルバメートへの定量的変換をもたらす。アニリンまたは他の弱い求核試薬の場合、１当量の４−（ジメチル）アミノピリジンを、相当するチオノカルバメートへの完全な変換を達成するために使用し得る。ジシアノエチルアミンなどの立体的に束縛されている弱い求核試薬の場合、反応は、アセトニトリル中で１当量の４−（ジメチル）アミノピリジンとの一晩の還流を用いてもよく、このように得られた生成物は、７０％収率で単離し得る。これらの生成物は、５’，３’−テトライソプロピルジシロキサン保護基を１５当量〜４０当量のＨＦ／ピリジンで最初に除去し、２’−Ｏ−チオノカルバメート−リボヌクレオシド中間体を生成することによって、活性ＲＮＡ合成モノマーに変換し得る。次いで、この中間体は、５当量〜１０当量のコリジンＮＭＩを有するＤＭＴｒＣｌと反応して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−チオノカルバメート−リボヌクレオシド誘導体を生成し得る。次いでその生成物は、ＣＮＥＯ−Ｐ（Ｃｌ）−Ｎ（ｉＰｒ）２または（ジイソプロピル）アミノメトキシクロロホスフィンから選択されるホスフィチル化試薬と反応して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−チオノカルバメート−リボヌクレオシド−３’−Ｏ−メチル（−またはシアノエチル）ホスホラミダイトを生成し得る。
【００８９】
［チオ炭素保護基を使用した核酸合成］
本発明のヌクレオシドモノマーは、核酸、例えば、リボ核酸を効率的に合成するために使用できる。合成は、３’から５’への、または５’から３’へのいずれの方向にも行うことができる。例えば、３’から５’への方向では、５’−ＯＨおよび３’−保護基を有する第１のヌクレオシドモノマーを、３’−ホスホラミダイトおよび５’−保護基を有する第２のヌクレオシドモノマーとカップリングする。第１のヌクレオシドモノマーは、固体支持体に任意選択的に結合している。または、合成を溶液中で行うことができる。５’−ＯＨおよび３’−ホスホラミダイトを縮合させてホスファイトトリエステル連結を形成させ、ジヌクレオチドをもたらすカップリングステップの後、ジヌクレオチドをキャップ／酸化し、５’−保護基を除去する（脱保護）。次いで、ジヌクレオチドは、３’−ホスホラミダイトおよび５’−保護基を有する他のヌクレオシドモノマーとのカップリングに使用できる。核酸が所望の長さおよび／または配列に達するまでこれらのステップを繰り返し、２’−保護基を上記のように除去することができる。本発明のいくつかの実施形態では、ヌクレオシドモノマーは、２’−ＯＨと同じ保護基によって保護される塩基を含有し、従ってこれらの保護基の両方は同時に除去することができる。
【００９０】
２’−ヒドロキシル上および任意選択的に塩基上のチオ炭素保護は、これらの保護基を除去する容易性および効率のために、以前は化学的に合成することが可能でなかったＲＮＡの長い配列の合成を可能とする。本明細書において開示されている方法の実施形態によって合成された核酸は、長さで２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０個またはそれ以上のヌクレオチドと同じくらいの場合がある。さらに、本発明によって合成した核酸を他の核酸と合わせ、より長い核酸を形成することができる。例えば、７０塩基の核酸は、７０塩基の他の核酸と化学的ライゲーションによってカップリングすることができる。他の例として、２つの核酸は、ＲＮＡリガーゼで連結することができる。この場合、２’−保護基は、連結の前に除去するべきである。
【００９１】
本発明の合成法は、化学物質が結合し得る表面を有する固体支持体上で行ってよい。いくつかの実施形態では、合成されている多数のオリゴヌクレオチドは、同じ固体支持体に直接的または間接的に結合し、アレイの一部を形成し得る。「アレイ」は、各配列の位置が知られているような、各々が空間的に画定され物理的にアドレス可能な態様で配置されている公知のモノマー配列の別々の分子の集まったものである。アレイ上に含有することができる分子数または「フィーチャー」は、大部分が基質の表面積、フィーチャーのサイズおよびフィーチャー間の間隔によって決定されるであろう（アレイ表面は、非フィーチャー領域によって表されるローカルバックグランド領域を含む場合もあり、含まない場合もある）。アレイは、１ｃｍ２当たり数十万以上までのフィーチャーの密度、例えば２，５００〜２００，０００フィーチャー／ｃｍ２を有することができる。フィーチャーは、基質に共有結合している場合もあり、またはしていない場合もある。互換的に使用される「アレイ」または「化学アレイ」は、領域と関連する特定の化学部分または部分（リガンド、例えば、生体高分子（ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列（核酸）など）、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、炭水化物、脂質など）を有するアドレス可能領域の任意の一次元、二次元または実質的に二次元（および三次元）の配置を含む。アレイ上の特定の所定の場所（すなわち、「アドレス」）における領域（すなわち、アレイの「フィーチャー」または「スポット」）は、特定の標的または標的の類を検出するように（フィーチャーは、そのフィーチャーの非標的を偶発的に検出し得るが）、アレイは、それが異なる部分（例えば、異なるポリヌクレオチド配列）の多数の領域を有する場合「アドレス可能」である。アレイフィーチャーは、そうである必要はないが典型的には、介在する空間によって分離されている。アレイの場合、「標的」は、様々な領域で基質に結合しているプローブ（「標的プローブ」）によって検出される移動相（典型的には流体）中の部分として言及されるであろう。しかし、「標的」または「プローブ」のいずれかは、他によって評価されるものであり得る（したがっていずれも、他と結合することによって評価される分析物、例えば、ポリヌクレオチドの未知の混合物であり得る）。
【００９２】
いくつかの他の実施形態では、合成されているオリゴヌクレオチドは、ビーズに直接的または間接的に結合している。適切な固体支持体は、種々の形態および組成物を有してもよく、天然材料、合成的に修飾されている天然材料、または合成材料由来であってよい。適切な支持体材料の例には、シリカ、テフロン（登録商標）、ガラス、アガロース（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａからのＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））およびデキストラン（例えば、またＰｈａｒｍａｃｉａからのＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）およびＳｅｐｈａｃｙｌ（登録商標））などの多糖類、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、メタクリル酸ヒドロキシエチルおよびメタクリル酸メチルのコポリマーなどが挙げられるがこれらに限定されない。基質表面上で合成されるオリゴヌクレオチドの最初のモノマーは、典型的には連結部分に結合しており、連結部分は次にシリカ基質上にある表面の親水基、例えば、表面のヒドロキシル部分に結合している。いくつかの実施形態では、ユニバーサルリンカーが使用される。いくつかの他の実施形態では、最初のモノマーは、例えば、表面のヒドロキシル部分と直接反応する。代わりに、オリゴヌクレオチドを、本発明によって最初に合成し、合成後に当技術分野において公知の方法によって固体基質に結合することができる。したがって、本発明は、オリゴヌクレオチドのアレイを調製するために使用することができ、ここでは、オリゴヌクレオチドは、アレイ上で合成されるか、または合成後にアレイ基質に結合される。
【００９３】
本方法の効率および容易性によって、オリゴヌクレオチド合成は、小さなスケールまたは大きなスケールで行うことができる。したがって、本方法の１回の完全な操作（１つの容器中）で作製されるオリゴヌクレオチドの量は、マイクログラム未満、またはマイクログラム、数十マイクログラム、数百マイクログラム、グラム、数十グラム、数百グラム、またはさらにキログラムの場合がある。
【００９４】
本発明の特定の実施形態では、本発明の二重に保護されたモノマーは、リボ核酸の合成において、例えば、リボ核酸の固相合成または溶相合成において使用される。本発明による合成は、いずれの方向でも（例えば、３’から５’へ、または５’から３’へ）行うことができる。例えば、３’から５’への方向では、５’−ＯＨおよび３’保護基を有する第１のヌクレオシドモノマーは、３’ホスホラミダイト基および５’保護基を有する第２のヌクレオシドモノマーとカップリングする。第１のヌクレオシドモノマーは、例えば、合成が固相合成プロトコルを使用して行われる場合、任意選択的に固体支持体に結合している。あるいは、この合成は、溶液中で行うことができる。
【００９５】
５’−ＯＨおよび３’−ホスホラミダイトを縮合させてホスファイトトリエステル連結を形成させ、ジヌクレオチドをもたらすカップリングステップの後、ジヌクレオチドを、キャップ／酸化し、５’−保護基を除去（脱保護）する。次いで、ジヌクレオチドを、３’−ホスホラミダイト基および５’−保護基を有する他のヌクレオシドモノマーとのカップリングに使用できる。オリゴヌクレオチドが所望の長さおよび／または配列に達するまで、これらのステップを繰り返す。
【００９６】
それ自体として、本発明の態様は、保護されていないヒドロキシル基を有するヌクレオシド残基および２’チオカーボネート保護基を有するヌクレオシドモノマーを提供するステップと、２’チオカーボネートで保護されたヌクレオシドモノマーをヌクレオシド残基に共有結合させ、核酸を生成するのに十分な条件下で、ヌクレオシド残基と２’チオカーボネートで保護されたヌクレオシドモノマーとを接触させるステップとを含む核酸の合成方法を含む。上記の項は、合成プロトコルの単一のモノマー付加ステップを説明し、所望の通りさらなるモノマーで上記の方法を反復し、所望の長さおよび配列のポリマーを生成する。上記で概説したように、各モノマー付加ステップの間に、この方法は、核酸を酸化および脱保護剤に曝露するステップを含み得る。
【００９７】
ヌクレオシドモノマーおよびオリゴヌクレオチドの合成における使用に加えて、チオ炭素保護基は、環状カーボネート形成を最小限にする一方で、１，２−ジオール部分または１，３−ジオール部分を保護することが望ましい他の分子中で有利に使用することができる。例えば、チオ炭素保護基はまた、保護基を除去しない一方で、ＴＩＰＳ以外のシロキサン保護基、例えばＴＢＤＭＳ、トリメチルシリル、トリエチルシリル、およびトリイソプロピルシリルなどを有するアルコールの位置選択的脱保護のために使用することができる。保護されているアルコールは、ヌクレオシドモノマーまたはオリゴヌクレオチド以外の分子である場合がある。
【００９８】
［ＲＮＡ脱保護］
種々の異なる脱保護プロトコルを用いてもよい。例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒらへの米国特許第６，２２２，０３０号、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒらへの米国特許第７，１３５，５６５号、Ｓｅｉｏら（２００１）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４２（４９）：８６５７〜８６６０において記載されているように、脱保護／酸化反応は本質的に、ポリヌクレオチドの合成のために使用される報告された条件下で行ってよい。当業者は理解するであろうが、本明細書における開示を考えると、脱保護／酸化ステップのための条件は、使用される保護基の性質によって変化し得る。本明細書に記載するような２’−Ｏ上の保護基と適合性であるように、同時の脱保護および酸化ステップのための条件（すなわち、３’−ヒドロキシル保護基または５’−ヒドロキシル保護基の放出のために必要な条件）は、３’−ヒドロキシル保護基または５’−ヒドロキシル保護基の脱保護をもたらす条件下で、新生ポリヌクレオチドの２’−Ｏ部位（複数可）の各々の上の保護基が新生ポリヌクレオチドに安定的に結合し続けるように選択するべきである。いくつかの実施形態では、脱保護／酸化反応のための条件は、中性から中程度に塩基性の範囲のｐＨを含む。さらなる実施形態では、脱保護／酸化反応のｐＨは、少なくとも約６．５のｐＨを含み、さらに少なくとも約７．０のｐＨを含み、またさらに少なくとも約７．５のｐＨを含み、少なくとも約６．０である。さらなる実施形態では、ｐＨは、約１１未満のｐＨを含み、さらに約１０．５未満のｐＨを含み、またさらに約１０未満のｐＨを含み、約１２未満である。
【００９９】
特定の実施形態は、本明細書に記載するように特に有利な合成条件および特性をもたらすように選択し得る組み合わせた脱保護／酸化試薬を用いる。いくつかの実施形態では、組み合わせた脱保護／酸化ステップは、中性または穏やかに塩基性の水性条件下で、伸長しているポリヌクレオチド鎖をα効果求核試薬と接触させ、反応性部位ヒドロキシル保護基（例えば、３’から５’への方向における合成のために５’末端、または５’から３’への方向における合成のために３’末端）を除去することを提供する。ここで、この保護基は求核攻撃に対して不安定である。α効果求核試薬はまた、新規に形成されたホスファイトトリエステル連結を酸化し、ホスホトリエステル連結を生じさせる。
【０１００】
脱保護／酸化試薬は、ポリヌクレオチドの合成と適合性の任意の化合物または化合物の混合物でよく、本明細書において議論される特性を有する。いくつかの実施形態では、脱保護／酸化試薬は、新規に形成されたホスファイトヌクレオチド間連結を急速に酸化するのに十分に高い酸化剤の濃度を含む。特定の実施形態では、この濃度は、少なくとも０．１％ｖｏｌ／ｖｏｌであり、少なくとも０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌを含み、さらに少なくとも約１．０％ｖｏｌ／ｖｏｌを含み、またさらに少なくとも約３．０％ｖｏｌ／ｖｏｌを含む。これらの実施形態において、酸化剤の濃度は、核酸塩基または保護された核酸塩基のかなり（例えば、合成サイクルの反復毎に１％未満）の量の酸化分解を回避するのに十分に低くあるべきである。特定の実施形態では、この濃度は、１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ未満であり、９％ｖｏｌ／ｖｏｌ未満を含み、さらに７％ｖｏｌ／ｖｏｌ未満を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、脱保護／酸化試薬は、脱保護／酸化反応の間に反応混合物中で中性から穏やかな塩基性ｐＨでペルオキシアニオンの源を提供する。ペルオキシアニオンの濃度は、平衡状態でヒドロペルオキシド種の酸解離定数と関連するであろう。ペルオキシアニオンの濃度は、総ヒドロペルオキシド濃度（すなわち、全てのヒドロペルオキシド種、例えば、プロトン化形態および非プロトン化形態の合計）の０．０１％〜９９％の範囲内であり、総ヒドロペルオキシド濃度の０．０５％〜９０％の範囲を含み、さらに総ヒドロペルオキシド濃度の０．１％〜５０％の範囲を含み、またさらに総ヒドロペルオキシド濃度の１．０％〜３０％の範囲を含む。
【０１０２】
特定の実施形態では、α効果を示す求核性脱保護試薬は、ペルオキシドまたはペルオキシドの混合物である。いくつかの実施形態では、脱保護／酸化反応が行われるｐＨは一般に、求核性脱保護試薬のｐＫａ（すなわち、相当するペルオキシアニオンの形成のためのｐＫａ）未満の約３ｐＨユニットから、求核性脱保護試薬のｐＫａを超える約３ｐＨユニットまでの範囲である。さらなる実施形態では、脱保護／酸化反応のｐＨは、求核性脱保護試薬のｐＫａの約１ｐＨユニット下から約ｐＨ１１までの範囲である。他の実施形態では、ｐＨは、十分高い濃度のペルオキシアニオンの形成を可能にする範囲であろう（例えば、ペルオキシドのｐＫａから約１１のｐＨまで）。ペルオキシドは、無機または有機であってよい。有機過酸化物中で適切なものは、式Ｍ＋ＯＯＨ−のものを含む（式中、Ｍ＋は、例えば、Ｈ＋、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋、または同様のものを含めた任意の対イオンである）。いくつかの実施形態では、過酸化リチウムまたは過酸化水素およびそのアルカリ性の安定化した形態が使用される。適切な有機過酸化物には、式ＲＯＯＨ（式中、Ｒは、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリール、および修飾アルキルからなる群から選択される）のものが含まれる。より詳細には、有機過酸化物は、式（ＶＩ）、式（ＶＩＩ）、または式（ＶＩＩＩ）
【化２２】
0005520818.tif 000023
（式中、Ｒ１３からＲ１９は、ヒドリド、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリール、および置換アリールからなる群から独立に選択される。）
の構造を有する。いくつかの実施形態では、α効果求核試薬は、ｔ−ブチル−ヒドロペルオキシドまたはメタクロロ過安息香酸である。例えば、ｍ−クロロ過安息香酸（ｍＣＰＢＡ）ペルオキシアニオンは、反応性部位ヒドロキシル上の保護基の除去のために有用であることが見出されてきた。
【０１０３】
上記で示したように、合成サイクルのステップは、カップリングステップおよび同時の脱保護／酸化ステップを含むことができる。本発明によるポリヌクレオチドの合成方法の一実施形態では、合成サイクルのこれらのステップは、複数回繰り返され、所望の配列を有するポリヌクレオチドを生成し得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、所望の配列および長さを有するオリゴヌクレオチドをもたらす一連のカップリングおよび脱保護／酸化ステップ後、このように得られたオリゴヌクレオチドは、合成後の脱保護ステップを経て、そこで複素環および／または２’−酸素上の保護された部位は脱保護される。例えば、このように得られたヌクレオチドのヌクレオチドサブユニットの複素環および／または２’−部位に結合した保護基を除去し、脱保護されたオリゴヌクレオチドを生じさせ得る。
【０１０５】
本発明によるいくつかの実施形態は、下記のスキーム８（Ａｃはチオ炭素保護基を表す）において示されているように、合成後のＲＮＡ脱保護のための方法および組成物、特にＨＢＦ４／ＴＥＭＥＤなどの２’−ベンゾジチオラン（ＢＤＴ）基をｐＨ３．８で除去するために使用される組成物を提供する。
【化２３】
0005520818.tif 000024
【０１０６】
スキーム８
上記で簡潔に述べたように、合成されたポリマーからチオ炭素保護基を除去するために、種々のプロトコルを用いてもよい。特定の実施形態では、フッ化テトラアルキルアンモニウム塩（テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウムまたはテトラブチルアンモニウムなど）などのフッ化物イオン含有溶液を使用して、保護基を直接除去する。これらの塩は、適切な濃度、例えば、１モルの濃度でテトラヒドロフラン、ジオキサン、またはアセトニトリルなどの非プロトン性極性溶媒に溶解し得る。ＴＢＡＦ（テトラブチルアモニウムフルオリド）などの酸性プロトンを含有しない溶液は、２’−ヒドロキシルからのチオカーボネート保護基、ジチオカーボネート保護基またはチオノカーボネート保護基の脱保護において、ＨＦ／ＴＥＭＥＤまたはＨＦ／ＴＥＡ（トリエチルアミン）などのフッ化水素酸塩より有意により良好に作用する。ＴＢＡＦによるカルバメートの脱保護が、最近報告されている（Ｊａｃｑｕｅｍａｒｄら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ６０：１００３９〜４７（２００４））。脱シリル化反応における非フッ化水素酸を含有するＴＢＡＦなどのフッ化物イオン塩の効率は、水分含有率を５％未満に維持することによって非常に改善されたことがこれまで示されてきた（Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ２１：４７９〜４１（１９９３））。チオカーボネート、ジチオカーボネートまたはチオノカーボネートの脱保護効率は、溶液の水分含有率を下げることによって非常に増強されることもまた示された。これらの溶液は、２％〜４％の水を含めた２％〜６％の水などの、２％〜１０％の水（ｖ：ｖ）を含有することができる。しかし、これらの溶液に分子ふるいを加えることによりＴＢＡＦ溶液中の水分含有率を下げることによってまた、室温でのホフマン脱離と称される化学反応によって、ＴＢＡＦの分解をもたらすことができる（Ｃｏｘら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．：４９  ３２１６〜１９（１９８４））。このように得られた分解生成物は、酸性塩テトラブチルアンモニウム−ヒドロビフルオリド（ＨＦ２ＴＢＡまたはビフルオリド）を生じさせる。ビフルオリドが存在しないＴＢＡＦの溶液は、ビフルオリドを含有する溶液より、チオカーボネート、ジチオカーボネートまたはチオノカーボネート保護基をさらにより急速および効率的に脱保護することが示された。１９Ｆフッ素ＮＭＲを使用し（ＳｕｎおよびＤｉＭａｇｎｏ、Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．：１２７、２０５０〜５１（２００５））、強塩基（例えば、これらだけに限定されないが、水酸化ナトリウムまたは炭酸カリウムなど）上でＴＢＡＦ溶液を保存することによりそれを除去することによって、あるいは第三級アミン（例えば、これらだけに限定されないが、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなど）、またはテトラアルキルアンモニウム水酸化物（水酸化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＯＨ）など）などを添加することによってビフルオリド含量を決定することが可能である。２’−ヒドロキシル上のチオカーボネート保護基、ジチオカーボネート保護基、チオノカルバメート保護基、またはチオノカーボネート保護基の脱保護のために使用されるＴＢＡＦの溶液は、特定の実施形態では、５％未満などの３０％未満のビフルオリド、特定の実施形態では２％未満のビフルオリドを含有する。
【０１０７】
特定の実施形態では、ＴＢＡＯＨ自体が、２’−チオカーボネート、ジチオカーボネートまたはチオノカーボネート保護基を脱保護することができる試薬として作用する。実際に、過剰のテトラアルキルアンモニウム水酸化物中で処理したＴＢＡＦ溶液は、溶液中に１０％超の水分が含有する場合でさえ、これらの新規の２’−保護基の脱保護において高度に活性である場合があることが見出された。しかしＴＢＡＯＨを、ビフルオリドを含有するＴＢＡＦの溶液にビフルオリドと等しいモルで加える場合、チオカーボネート、ジチオカーボネートまたはチオノカーボネート保護基の脱保護において高度に活性であるためには、脱保護溶液のこのように得られた水分含有率は低くあるべきである。これらのＴＢＡＦ／ＴＢＡＯＨ溶液は、２％〜４％の水を含めた２％〜６％の水などの、２％〜１０％の水を含有することができる。ＴＢＡＯＨをＴＢＡＦ溶液にビフルオリド含量を超えて加える場合、このように得られた溶液は、水分含有率に関わらず、チオカーボネート、ジチオカーボネートまたはチオノカーボネート、またはチオノカルバメート保護基の脱保護において高度に活性である場合がある。したがって、要約すると、
［ＴＢＡＯＨ］≒［ＨＦ２ＴＢＡ］である場合、ＴＢＡＦ／ＴＢＡＯＨ中で［Ｈ２Ｏ］＜５％である。
［ＴＢＡＯＨ］＞［ＨＦ２ＴＢＡ］である場合、ＴＢＡＦ／ＴＢＡＯＨ中で［Ｈ２Ｏ］＜３０％である。
【０１０８】
しかし、ＲＮＡ上の２’−ヒドロキシル基の脱保護に使用することができる過剰の水酸化テトラアルキルアンモニウムおよび水の両方には限度がある。過剰な水酸化テトラアルキルアンモニウムの存在下で、極性非プロトン性溶媒脱保護溶液の水分含有率が高くなりすぎた場合、このように得られたＲＮＡ生成物は、当技術分野で周知の一般の塩基機構によって分解される場合がある。特定の実施形態では、これらの溶液の水分含有率は、５％以下を含めた１０％以下などの３０％以下である。同様に、水酸化テトラアルキルアンモニウムの濃度が極性非プロトン性溶媒溶液中で高くなりすぎると、ＲＮＡ生成物はまた分解される場合がある。水酸化テトラアルキルアンモニウムは、２０％以下を含めた２５％以下などの３０％以下の濃度で溶解するはずである。ＴＢＡＯＨ単独（すなわち、ＴＢＡＦを含まない）はまた、極性非プロトン性溶媒中で希釈されて、２’−ヒドロキシルからチオカーボネート保護基、ジチオカーボネート保護基、チオノカーボネート保護基、またはチオノカルバメート保護基を脱保護することができる。しかし、同じ希釈濃度のＴＢＡＯＨを含有するＴＢＡＦ溶液と比較して脱保護速度は遅い。希釈したＴＢＡＯＨ溶液へのＲＮＡの曝露は、数日後２’−チオカーボネート保護基の完全な脱保護によって部分的ＲＮＡ分解をもたらした。同じ希釈されたＴＢＡＯＨ濃度で過剰なＴＢＡＯＨを含有する１モルのＴＢＡＦ溶液（すなわち［ＴＢＡＯＨ］＞［ＨＦ２ＴＢＡ］）は、数時間内でＲＮＡの完全な脱保護をもたらした。さらに、このＴＢＡＯＨ／ＴＢＡＦ溶液へのＲＮＡの数日間の曝露は、所望のＲＮＡ生成物の観察可能な分解を何らもたらさなかった。したがって、ＴＢＡＦ溶液は、脱保護反応の促進およびＲＮＡ骨格の分解からの保護の両方において役割を有するようである。ＴＢＡＦの代わりに、極性非プロトン性溶媒（例として、ジオキサン、ＴＨＦおよびアセトニトリルなどがあるが、これらに限定されない）に１モラーで溶解した他のテトラアルキルアンモニウム塩（例えば臭化テトラブチルアンモニウム、および酢酸テトラブチルアンモニウムなど）、およびＴＢＡＯＨの添加に加えたものの両方が、ＲＮＡ骨格を分解から保護する一方で、チオカーボネート保護基、ジチオカーボネート保護基、チオノカーボネート保護基、またはチオノカルバメート保護基の脱保護を促進することができることを、本発明者らはさらに見出した。これらのテトラアルキルアンモニウム塩は、極性非プロトン性溶媒溶液に、０．５モル以上の濃度を含めた０．２５モル以上の濃度などの０．１モル以上の濃度で溶解するはずである。
【０１０９】
本発明の実施形態は、２’−Ｏ−チオカルボニル、２’−Ｏ−ジチオカルボニル、２’−Ｏ−チオノカルボニル、または２’−Ｏ−チオノカルバメート保護基を含む、ＲＮＡを脱保護するために使用される溶液のための組成物を含む。このような組成物は、ＴＢＡＦ、制御された量の強塩基（例えば、ＴＢＡＯＨ、ＮａＯＨ、炭酸カリウム、水酸化テトラアルキルアンモニウムなどであるが、これらに限定されない）および無機水酸化物（例えば、ＬｉＯＨ、ＣｓＯＨなどであるが、これらに限定されない）および制御された量の水を含むが、ただし、［ＴＢＡＯＨ］≒［ＨＦ２ＴＢＡ］である場合、ＴＢＡＦ／ＴＢＡＯＨ溶液は、２％〜４％の水を含めた２％〜６％の水などの、２％〜１０％の水を許容することができ、［ＴＢＡＯＨ］＞［ＨＦ２ＴＢＡ］である場合、ＴＢＡＦ／ＴＢＡＯＨ溶液は、５％以下の水を含めた１０％以下の水などの３０％以下の水を含有することができる。
【０１１０】
他の組成物は、極性非プロトン性溶媒（例として、ジオキサン、ＴＨＦおよびアセトニトリルなどがあるが、これらに限定されない）中に１モラーの濃度で溶解したテトラアルキルアンモニウム塩（臭化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＢ）、および酢酸テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＡ）など）を含む。極性非プロトン性溶媒に可溶性の強塩基（例えば、ＴＢＡＯＨ、水酸化テトラアルキルアンモニウムなどであるが、これらに限定されない）および無機水酸化物（例えば、ＬｉＯＨ、ＣｓＯＨなどであるが、これらに限定されない）をこれらの溶液に加えることによって、ＲＮＡ骨格を分解から防ぐ一方で、チオカーボネート保護基、ジチオカーボネート保護基、チオノカーボネート保護基、またはチオノカルバメート保護基の脱保護を加速する。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態は、本明細書において記載されたような組成物を含む。ＲＮＡ脱保護溶液は、ＴＨＦ、ジオキサン、およびアセトニトリルから選択される極性非プロトン性溶媒中に溶解したＴＢＡＦ、ＴＢＡＢおよびＴＢＡＡから選択されるテトラブチルアンモニウム塩の１Ｍ溶液に加えた、ＭｅＯＨまたはＨ２Ｏに溶解した水酸化テトラアルキルアンモニウムおよび無機水酸化物から選択される１０％〜３０％（ｖ／ｖ）の強塩基の１Ｍ溶液を含み、前記ＲＮＡ脱保護溶液中の水の最終含量は、２０％（ｖ／ｖ）未満、さらに好ましくは１０％未満、最も好ましくは５％未満である。
【０１１２】
さらなる実施形態では、チオノカーボネートおよびチオノカルバメートは、ＲＮＡ鎖の破壊をもたらさない条件下で、アミンを使用して脱保護することができる。
【化２４】
0005520818.tif 000025
【０１１３】
周知の通り、ＲＮＡは、２−ヒドロキシル基を伴うエステル交換反応によって塩基条件下にて切断および分解を受ける。［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９１、５６（１８）、５３９６〜５４０１頁；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９９９、１２１（２３）、５３６４〜５３７２頁；Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９８、９８（３）、９６１〜９９０頁］。「水溶液中のＲＮＡの２’−ヒドロキシルのｐＫａは、塩濃度および塩基配列によって変化する場合があるが、典型的には概ね１３である［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００１、１２３（１２）、２８９３〜２８９４頁；Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ、２００３、６８（５）、１９０６〜１０頁］。（プロトン化）アンモニアのｐＫａは、約９．２である。これは、合成的に調製されたオリゴヌクレオチドから保護基を除去するために典型的に使用される濃縮した水酸化アンモニウム水溶液は、１２を超えるｐＨを有することを意味する。これらの高ｐＨで、かなりの量の２’−ヒドロキシルが脱保護され、周知の塩基触媒のエステル交換反応によって、骨格切断がもたらされる。
【化２５】
0005520818.tif 000026
【０１１４】
メチルアミン（ｐＫａ１０．６）またはトリエチルアミン（ｐＫａ１０．６）などのより強い塩基は、典型的な水性条件下で、アンモニアよりもさらに速くＲＮＡ骨格切断を促進するであろう。オリゴヌクレオチド合成は典型的には、アンモニアまたはメチルアミンなどのアミン塩基の水溶液と共に除去される塩基上の保護基を使用する。ＲＮＡの場合、塩基によって触媒される骨格切断を避けるために、この手順の間２’−ヒドロキシル保護が損なわれていないことが望ましい。
【０１１５】
しかし、アミン塩基および２’−ヒドロキシルについて先に記載したｐＫａは、水性条件についてである。弱酸および塩基のイオン化定数は、有機溶媒の存在下で実質的に変化する場合があることが知られている［Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９９、３８（２）、１２３〜３７頁］。双極性非プロトン性溶媒中、特にジメチルスルホキシド中の有機分子の酸性度は、広範に研究されてきた。水中で４．７のｐＫａを有する酢酸は、ＤＭＳＯ中で１２．３のｐＫａを有し、はるかにより弱い酸である。水中で約１５のｐＫａを有するメタノールは、ＤＭＳＯ中で約２８のｐＫａを有する。一般に、荷電したアニオン種にイオン化する中性化合物（アルコキシアニオンにイオン化するヒドロキシル基など）について、溶媒の誘電体の減少は一般に、下記の平衡状態について酸平衡定数の減少（ｐＫａの増加）をもたらす。
【化２６】
0005520818.tif 000027
【０１１６】
したがって、フェノールは、水（誘電率＝７８）中でｐＫａが約１０であり、一方ＤＭＳＯ（誘電率＝４７）中でｐＫａが約１６であり、アセトニトリル（誘電率＝３６）中でｐｋａが約２７であり［Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．、１９６５、６９（９）、３１９３〜３１９６頁；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６８、９０（１）、２３〜２８頁；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、７１（７）、２８２９〜２８３８頁］、１６桁の変化である。したがって、アセトニトリル中で、フェノールは非常に弱い酸である（相当するアニオンは、非常に強い塩基である）。溶媒の誘電強度は、化合物のｐＫａに影響を与えることができる唯一の変数ではないことを理解すべきである。溶媒の塩基性度、極性、水素結合、ならびに他の特異的および非特異的な相互作用は、溶媒の溶媒和能力に影響を与えることができ、溶解した溶質のｐＫａに有意な効果を有することができる。
【０１１７】
プロトン化アミンの解離など、中性化合物に解離する荷電した化合物について、溶媒の誘電体の減少は一般に、ｐＫａの比較的小さな変化のみをもたらす。
【化２７】
0005520818.tif 000028
【０１１８】
したがって、水中の（プロトン化）トリエチルアミンは、ｐＫａが約１１であり、一方ＤＭＳＯ中でｐＫａは約９であり、アセトニトリル中でｐＫａは約１８である。アセトニトリル中で、トリエチルアミンは、水中よりもいくぶんより強い塩基であり（水からアセトニトリルへのΔｐＫａは約７である）、一方ＤＭＳＯ中ではそれは実際により弱い塩基である。
【０１１９】
結果として、ＲＮＡは、有機溶媒中のアミンを使用して２’−脱保護される場合がある。ＲＮＡの分解のための塩基によって触媒される機構は、環化および切断反応が有意な速度で起こることができるように、十分な程度までヒドロキシルを脱プロトンする塩基の能力によって決まる。２’−ヒドロキシルを脱プロトン化するアミン塩基の水溶液の場合、約４ｐＫａユニットの差異があり、これは大差がなく、その結果アミン塩基の濃縮された溶液はヒドロキシルを有意に脱プロトン化することができる。しかし、有機溶媒が使用される場合、２’−ヒドロキシルのｐＫａは、アミン塩基のそれより有意に増加する。アセトニトリルなどの溶媒中で、アンモニアまたはメチルアミンなどの通常のアミンは、２’−ヒドロキシルを脱プロトン化するのに十分に強い塩基ではない。実際は、アセトニトリル中のアミン塩基は、フェノールでさえ脱プロトン化するほど十分に強くない。アンモニアは、アセトニトリル中でより強い塩基になるが（共役酸のｐＫａは、水からアセトニトリルに行くときに９．２から１６．５に上昇する、約７のΔｐＫａ）［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９６８、９０（１）、２３〜２８頁］、フェノールは、比較的より弱い酸となり、ｐＫａは約１０から２７に増加する（ΔｐＫａ約１７）。水中で１未満のｐＫａユニットのｐｋａ差異を有するフェノールおよびアンモニアの酸塩基対は、アセトニトリル中で約１０ｐＫａユニットのｐＫａ差異を有する。ＲＮＡの２’−ヒドロキシルなどの脂肪族ヒドロキシルのアセトニトリル中の実際のｐＫａは、測定するのが困難な点まで増加する（計算によって、約３５のｐＫａとなる）。アセトニトリルおよび多くの他の有機溶媒中で、アミン塩基と脂肪族アルコールとの間の溶媒が媒介する平衡状態は、１０桁を超えて２種の中性種を支持し、ＲＮＡの分解は感知できるほどの速度では起こらないであろう。
【化２８】
0005520818.tif 000029
【０１２０】
したがって、ＲＮＡを有機溶媒中のアミン塩基の溶液に曝すことは、環外アミン保護基および２−ヒドロキシル保護基の両方のＲＮＡの脱保護を実現する実用的方法である。アミン塩基の求核性、したがって脱保護速度は、いくつかの有機溶媒中で増強されさえする場合がある。環外アミンおよび２’−ヒドロキシルの脱保護は、同時にまたは順次に行うことができる。溶液が、保護基の適切な選択に加え、アミンおよびヒドロキシルの好ましいｐＫａ差異を有意に変化させるための十分な水を含有する限り、ＲＮＡの分解は脱保護速度と比較して非常に遅いであろう。
【０１２１】
他の実施形態では、試薬の溶液の送達を避けることが望ましい。アンモニアまたはメチルアミンなどのアミン塩基は、室温および室内圧力で気体であり、多くの他のアミン塩基は、このような条件下ではかなりの蒸気圧を有する。それらは、気体として、または他の成分が窒素またはアルゴンなどの不活性ガスであるガス混合物の成分として送達することができる。
【０１２２】
気相中で、アミンの塩基性度およびアルコールの酸性度はまた、ＲＮＡの安定性のために好ましい。（メチルアミンのプロトン親和力は約２１４ｋｃａｌ／モルであり、一方アルコール（例えばエタノール）の気相酸性度は、約３７０ｋｃａｌ／モルである。）しかし、気相送達の場合、任意の実際の化学反応および平衡は、固相表面、ならびに水を含めた吸着された溶媒の不定の残留する量によって影響を受ける可能性があることは理解すべきである。アミンの気相送達が、有効であり、時には好ましい液相送達の代替形態であることを本発明者らは示した。あるいは、アミン塩基は、アセトニトリルまたはジオキサンなどの有機溶媒に溶解したアミンの溶液からの気相ヘッドスペース成分として送達することができる。この場合、有機溶媒蒸気もまた送達され、特定の条件下で固体支持体上にて凝縮し得る。他の代替形態は、未希釈アミンを加えるが、液体を樹脂のバルクと直接接触しないようにすることである。これは、例えば、別々の容器中にあることによって液体との接触から隔てる器へ液体を加えることによって、または少量の未希釈アミンを比較的より多い量の樹脂に加えることによって行うことができ、このようにして樹脂を部分的に湿らせるのみである。アンモニアおよびメチルアミンなどのアミンは、加圧下でのみ液体であり、（閉鎖系中で）平衡状態に達するまで気相中に自然に気化する。プロピルアミンおよびブチルアミンなどのアミンは、室温で顕著な蒸気圧を有する液体であり、より少ない程度に気化するであろう。他の代替の送達方法は、有機溶媒中にアミンを加えるが、溶液を樹脂のバルクと直接接触しないようにすることである。これは、未希釈アミン送達と同様に挙動するであろうが、このように得られた気相はまた、溶媒の蒸気圧によって決定されるように有機溶媒蒸気を含有するであろう。未希釈アミン送達の場合のように、これは閉鎖系中で行うことができ、アミンおよび溶媒は、気相と平衡状態に達し、または不活性ガス流もしくは溶媒蒸気は、開放系中で動的平衡をもたらすために使用することができる
【０１２３】
他の実施形態では、ＲＮＡを固体支持体の表面に共有結合しているリンカーは、アンモニアなどの塩基によって切断される場合があるが、ＲＮＡ自体は樹脂から移動しないため、適切な有機溶媒中または気相中にアミン塩基の溶液を送達することには有意な利点がある。多くの有機溶媒（例えばイソプロパノールおよびアセトニトリル）中で、ＲＮＡはあまり可溶性ではなく、かつ／または固体支持体に吸着されたままであるか、結合したままであろう。これは、アミンの水溶液またはＤＭＳＯ溶液による固体支持体の処理と対照的であり、リンカーの切断およびそれに続くＲＮＡの水またはＤＭＳＯ溶液への溶解をもたらす。
【０１２４】
一実施形態では、チオノカーボネートおよびチオノカルバメートを、合成ＲＮＡの２’−ヒドロキシルから切断することができ、アミンは所望のＲＮＡの分解をもたらさない。
【０１２５】
一実施形態では、チオノカルバメートで保護された２’−ヒドロキシルの脱保護は、チオノカルバメートの切断条件および構造の両方によって決まる。一般に、チオノカルバメートの切断についていくつかの可能な機構があり、下記に適切なアミン塩基の例として使用されるアンモニアを示す。示される第１の機構は、第二級窒素を含有するチオノカルバメートについてであり、これは、イソチオシアネートの形成を介して進行する塩基によって触媒される反応を示す［Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｒｅｖｕｅ  Ｃａｎａｄｉｅｎｎｅ  Ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ、２００５、８３（９）、１４８３〜１４９１頁］。
【化２９】
0005520818.tif 000030
【０１２６】
第２の機構は、カルボニル上のアンモニアの攻撃、チオノウレアおよびアルコールのそれに続く形成を伴う反応を示す［Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００６、２７（１）、１４３〜１４６頁］。
【化３０】
0005520818.tif 000031
【０１２７】
酸性水素のｐＫａは、Ｒ＝エチルについて約１３．６であると推定される［Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ｒｅｖｕｅ  Ｃａｎａｄｉｅｎｎｅ  Ｄｅ  Ｃｈｉｍｉｅ、２００５、８３（９）、１４８３〜１４９１頁］。アンモニアなどの比較的弱い塩基では、アニオン中間体への反応は、窒素のｐＫａを減少させる場合があるＲ基によって支持され、共鳴または電子求引性誘起効果によって窒素上の負の電荷を安定化させるはずである。しかし、窒素上の負の電荷を安定化するＲ基はまた、アニオン中間体のイソチオシアネートへの分解を減速させるであろう。それに続くチオノウレアおよびアルコールの形成の競合する機構は、カルボニルを求核攻撃に対して活性化させるのに十分な電気陰性であるＲ基、および攻撃する求核試薬のための少ない立体障害によって支持されるはずである。第三級窒素化合物の場合、競合するイソチオシアネート機構についての可能性はなく、化合物は求核攻撃によってアミノ分解を受けるのみの場合がある。
【化３１】
0005520818.tif 000032
【０１２８】
上記の機構の１つの可能性のある初期生成物［Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、２００６、２７（１）、１４３〜１４６頁］は、下記に示される四面体の中間体である。
【化３２】
0005520818.tif 000033
【０１２９】
このような中間体は、１つまたは複数のプロトン移動ステップが、２’−ヒドロキシルの排除および生成物形成が起こる前に起こることを示唆する。適切なプロトン供与種の存在および反応性、または溶媒の介在は、反応が起こるために重要であり得る。
【０１３０】
下記に示す代替の協奏的な４中心遷移状態もまた可能である場合があり、アリールＮ−エチルチオノカルバメートのアセトニトリル中のアミノ分解と共に作用することが示された［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５、７０（１４）、５６２４〜５６２９頁］。
【化３３】
0005520818.tif 000034
【０１３１】
協奏的機構では、遷移状態を安定化させる保護基および攻撃する求核試薬の構造的修飾が、一番大事なことである。
【０１３２】
さらなる実施形態では、チオカーボネートは、アミンを使用してカルバメートに変換されることができる。２’−Ｏ−チオカーボネートは、第一級アミンまたは第二級アミンを使用して、チオールの置き換えによって安定した修飾された２’−ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに変換することができる。
【化３４】
0005520818.tif 000035
【０１３３】
［核酸生成物］
本発明の態様は、本発明の方法の核酸生成物をさらに含む。本発明の方法の核酸生成物、例えば、ＲＮＡは、特定の実施形態では、２〜５０個以上の長さのモノマー単位を含めた２〜１００個以上の長さのモノマー単位などの、２〜２００個以上の長さのモノマー単位の範囲でサイズが異なってよい。特定の実施形態では、核酸生成物のサイズは、２〜２５個の長さのモノマー単位、例えば、１９、２０、２１、または２２個の長さのモノマー単位を含めた１７〜２３個の長さのモノマー単位などの、１５〜２５個の長さのモノマー単位の範囲である。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明の核酸生成物は、式（ＶＩ）
【化３５】
0005520818.tif 000036
（式中、
ＢＰは、上記定義のような保護されている窒素含有塩基または保護されていない窒素含有塩基であり、
Ｑは、例えば、上記のようなチオ炭素保護基であり、
Ｒ１２は、水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、アリール、および置換アリールからなる群から選択され、
Ｍは、１を超える整数である。）
の構造を有する。
【０１３５】
さらなる実施形態では、核酸は、下記の式Ｉｘａ〜ＩＸｃの構造を有する。
【化３６】
0005520818.tif 000037
【０１３６】
さらなる実施形態では、核酸は、下記の式Ｘの構造を有する。
【化３７】
0005520818.tif 000038
式中、上記の構造における変数は、上記定義の通りである。
【０１３７】
［用途］
本発明の方法によって生成される核酸生成物は、研究、診断および治療への用途を含めて種々の用途に使用される。例えば、核酸生成物は、例えば、プローブ、プライマーなどとして研究用途に使用される。診断用途に関して、核酸生成物はまた、プローブ、プライマー、または診察プロトコルにおいて用いられる他の作用剤としての使い道を見つけることができる。治療への用途に関して、核酸生成物は、任意のＤＮＡ、ＲＮＡまたは他の核酸療法（遺伝子治療用途におけるアンチセンス核酸、干渉ＲＮＡ（すなわち、ｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ）用途など）としての使い道を見つける。
【０１３８】
核酸が合成される用途によって、核酸は、それらの合成の後にいくつかの態様で修飾される場合もあり、されない場合もある。それ自体として、特定の実施形態では、核酸生成物は、合成の後にさらに修飾されない。また他の実施形態では、核酸は、それらの合成の後にいくつかの態様で修飾される。
【０１３９】
種々の異なる修飾は、所望の通り核酸生成物に行い得る。例えば、核酸生成物が干渉リボ核酸（ｉＲＮＡ）である場合、種々の合成後の修飾が望ましい場合がある。ｉＲＮＡ剤は、作用剤、例えば、コレステロールの安定性、分布または細胞取込みを改善するために選択されるリガンドに結合するようにさらに修飾することができる。下記の合成後修飾は、便宜上主にｉＲＮＡの実施形態に関して記載する。しかし、このような修飾は、ＤＮＡの実施形態に容易に適合され、以下の説明は、そのような実施形態もまた包含する。
【０１４０】
下記の修飾は、所望の通り支持体からの核酸の切断の前または後に行い得る。
【０１４１】
修飾されていないＲＮＡは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびホスフェート部分が、天然に生じるもの、例えば、人体中に天然に生じるものと同じ、または本質的に同じ分子を意味する。当該技術では、まれな、または通常ではないが、天然に存在するＲＮＡを、修飾したＲＮＡとして称してきた。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２、２１８３〜２１９６を参照されたい。修飾されたＲＮＡと称される場合が多いこのようなまれまたは通常ではないＲＮＡ（明らかにこれらは典型的には転写後修飾の結果であるため）は、本明細書で使用する場合、修飾されていないＲＮＡという用語の範囲内である。本明細書で使用する場合、修飾されたＲＮＡは、核酸の成分の１つまたは複数、すなわち糖、塩基、およびホスフェート部分が、天然に生じたものと違う、例えば、人体に生じたものと違う分子を意味する。それらは修飾された「ＲＮＡ」と称される一方、それらは当然ながら、修飾のためにＲＮＡでない分子を含むであろう。ヌクレオシド代用物は、ハイブリダイゼーションがリボホスフェート骨格、例えば、リボホスフェート骨格の非荷電模倣体で見られるものと実質的に同様であるように、塩基が正しい空間的関係に存在することを可能にする、リボホスフェート骨格が非リボホスフェート構築体と置き換えられている分子である。上記の各々の例は、本明細書において議論されている。
【０１４２】
本明細書に記載する修飾は、本明細書に記載する任意の二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子、例えば、ｉＲＮＡ剤に組み込むことができる。ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい場合がある。核酸はサブユニットまたはモノマーのポリマーであるので、下記の修飾の多くは、核酸内で繰り返される位置で行われ、例えば、塩基、またはホスフェート部分、またはホスフェート部分の非連結Ｏの修飾である。場合によっては、修飾は核酸において対象の位置の全てで起こるであろうが、多くの場合、実は大部分の場合、起こらないであろう。例示として、修飾は、３’ 末端または５’末端の位置でのみ起こる場合があり、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中でのみ起こる場合がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方で起こる場合がある。例えば、非連結Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ起こる場合があり、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中でのみ起こる場合があり、または二本鎖および一本鎖領域、特に末端で起こる場合がある。同様に、修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方上で起こる場合がある。場合によっては、センス鎖およびアンチセンス鎖は、同じ修飾または同じ種類の修飾を有するが、他の場合では、センス鎖およびアンチセンス鎖は、異なる修飾を有し、例えば、場合によっては１つの鎖のみ、例えばセンス鎖を修飾することが望ましい場合がある。
【０１４３】
ｉＲＮＡ剤への修飾の導入の２つの主要な目的は、生物環境中での分解に対するそれらの安定化および薬理学的特性、例えば、薬力学的特性の改善であり、これらを下記でさらに議論する。ｉＲＮＡ剤の糖、塩基、または骨格への他の適切な修飾は、２００４年１月１６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３号に記載されている。ｉＲＮＡ剤は、２００４年４月１６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２号に記載されている塩基などの非天然塩基を含むことができる。ｉＲＮＡ剤は、非炭水化物環状担体分子などの非天然糖を含むことができる。ｉＲＮＡ剤中に使用するための非天然糖の例示的な特徴は、２００３年４月１６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９号に記載されている。
【０１４４】
ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性を増加させるために有用なヌクレオチド間連結（例えば、キラルホスホロチオエート連結）を含むことができる。さらに、または代わりに、ｉＲＮＡ剤は、増加したヌクレアーゼ耐性のためにリボース模倣体を含むことができる。増加したヌクレアーゼ耐性のための例示的なヌクレオチド間連結およびリボース模倣体は、２００４年３月８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されている。
【０１４５】
ｉＲＮＡ剤は、オリゴヌクレオチド合成のためのリガンド結合モノマーサブユニットおよびモノマーを含むことができる。例示的なモノマーは、２００４年８月１０日に出願された米国特許出願第１０／９１６，１８５号に記載されている。ｉＲＮＡ剤は、２００４年３月８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されているものなどのＺＸＹ構造を有することができる。ｉＲＮＡ剤は、両親媒性部分と複合体を形成することができる。ｉＲＮＡ剤と共に使用するための例示的な両親媒性部分は、２００４年３月８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されている。
【０１４６】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、モジュール複合体を特徴とする送達剤と複合体を形成することができる。複合体は、（ａ）縮合剤（例えば、例えばイオン相互作用または静電相互作用を介して、核酸を引き付ける、例えば、結合することができる作用剤）、（ｂ）融合誘導因子（例えば、細胞膜を通して融合および／または輸送されることのできる作用剤）、および（ｃ）ターゲッティング基、例えば、細胞または組織ターゲッティング剤、例えば、指定された細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体の１種または複数（３種全てを含めた、２種以上などの）と連結している担体剤を含むことができる。送達剤と複合体を形成したｉＲＮＡ剤は、２００４年３月８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されている。
【０１４７】
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ二本鎖のセンスおよびアンチセンス配列間などの非標準的対合を有することができる。非標準的ｉＲＮＡ剤の例示的な特徴は、２００４年３月８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号に記載されている。
【０１４８】
ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼに対して増強された耐性を有することができる。増加したヌクレアーゼ耐性および／または標的への結合親和性のために、ｉＲＮＡ剤、例えば、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、例えば、２’−修飾リボースユニットおよび／またはホスホロチオエート連結を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、いくつかの異なる「オキシ」置換基または「デオキシ」置換基で修飾または置き換えることができる。
【０１４９】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）（２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン橋によって同じリボース糖の４’炭素に結合している）、Ｏ−ＡＭＩＮＥおよびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、アミン＝ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含有するオリゴヌクレオチドは、強いホスホロチオエート修飾で修飾されたものに相当するヌクレアーゼの安定性を示すことは注目すべきである。
【０１５０】
「デオキシ」修飾には、例えば、アミノ官能基で任意選択的に置換されていてもよい、水素（すなわち、部分的二本鎖ＲＮＡのオーバーハング部分に特に関連するデオキシリボース糖）、ハロ（例えば、フルオロ）、アミノ（例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）、ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（アミン＝ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ、メルカプト、アルキル−チオ−アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられる。
【０１５１】
耐性を増加させる１つの方法は、２００４年５月４日に出願された米国特許出願第６０／５５９，９１７号に記載されているように、切断部位を同定し、そのような部位を修飾して、切断を阻害することである。例えば、ジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’，５’−ＵＧ−３’，５’−ＣＡ−３’，５’−ＵＵ−３’、または５’−ＣＣ−３’は、切断部位としての機能を果たすことができる。したがって、５’ヌクレオチドを修飾することによって増強されたヌクレアーゼ耐性を達成し、例えば、少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド（ウリジンは、２’−修飾ヌクレオチドである）、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド（５’−ウリジンは、２’−修飾ヌクレオチドである）、少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド（５’−シチジンは、２’−修飾ヌクレオチドである）、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド（５’−ウリジンは、２’−修飾ヌクレオチドである）、または少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチド（５’−シチジンは、２’−修飾ヌクレオチドである）をもたらすことができる。ｉＲＮＡ剤は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのこのようなジヌクレオチドを含むことができる。特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤の全てのピリミジンは、２’−修飾を有し、したがってｉＲＮＡ剤は、エンドヌクレアーゼに対して増強された耐性を有する。
【０１５２】
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、１つまたは複数のホスフェートリンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて２’修飾を使用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含有するものである。
【０１５３】
オリゴヌクレオチド骨格中にフラノース糖を含むことはまた、エンドヌクレアーゼ的切断を減少させることができる。ｉＲＮＡ剤は、３’カチオン基を含むことによって、またはヌクレオシドを３’−末端にて３’−３’連結で反転させることによって、さらに修飾することができる。他の代替形態では、３’−末端は、アミノアルキル基、例えば、３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴで遮断することができる。他の３’結合体は、３’−５’エキソヌクレオチドの切断を阻害することができる。理論に束縛されるものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの３’結合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの３’−末端に結合することから立体的に遮断することによってエキソヌクレオチドの切断を阻害し得る。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環式結合体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえ、３’−５’−エキソヌクレアーゼを遮断することができる。
【０１５４】
同様に、５’結合体は、５’−３’エキソヌクレオチドの切断を阻害することができる。理論に束縛されるものではないが、ナプロキセンまたはイブプロフェンなどの５’結合体は、エキソヌクレアーゼがオリゴヌクレオチドの５’−末端に結合することから立体的に遮断することによってエキソヌクレオチドの切断を阻害し得る。小さなアルキル鎖、アリール基、または複素環式結合体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコースなど）でさえ、３’−５’−エキソヌクレアーゼを遮断することができる。
【０１５５】
ｉＲＮＡ剤は、二重ｉＲＮＡ剤が少なくとも一端上に一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む場合、ヌクレアーゼに対して増加した耐性を有することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１〜４個の対を成さないヌクレオチド、他の実施形態では２〜３個の対を成さないヌクレオチドを含む。一実施形態では、末端ヌクレオチド対に直接隣接した一本鎖オーバーハングの対を成さないヌクレオチドは、プリン塩基を含有し、末端ヌクレオチド対は、Ｇ−Ｃ対であり、または最後の４つの相補的ヌクレオチド対の少なくとも２つは、Ｇ−Ｃ対である。さらなる実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１つまたは２つの対を成さないヌクレオチドを有してもよく、例示的な実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、５’−ＧＣ−３’である。特定の実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’−末端上にある。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２−ヌクレオチドオーバーハング５’−ＧＣ−３’が形成されるようにアンチセンス鎖の３’−末端上のモチーフ５’−ＣＧＣ−３’を含む。
【０１５６】
したがって、ｉＲＮＡ剤は、例えば、対象の体内に見出されるヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる分解を阻害するための修飾を含むことができる。これらのモノマーは、本明細書においてＮＲＭまたはヌクレアーゼ耐性促進モノマーと称され、相当する修飾はＮＲＭ修飾と称される。多くの場合、これらの修飾は、ｉＲＮＡ剤の他の特性、例えば、タンパク質、例えば、輸送タンパク質、例えば、血清アルブミン、もしくはＲＩＳＣのメンバーと相互作用する能力、または第１および第２の配列が、互いに二本鎖を形成するか、もしくは他の配列、例えば、標的分子と二本鎖を形成する能力もまた調節するであろう。
【０１５７】
１種または複数の異なるＮＲＭ修飾を、ｉＲＮＡ剤またはｉＲＮＡ剤の配列中に導入することができる。ＮＲＭ修飾は、配列またはｉＲＮＡ剤中で２回以上使用することができる。
【０１５８】
ＮＲＭ修飾は、末端にのみ置くことができるもの、および任意の場所に置くことができる他のものを含む。ハイブリダイゼーションを阻害することができるいくつかのＮＲＭ修飾を、切断部位または特にアンチセンス鎖上の対象配列または遺伝子を標的とする配列の切断領域中ではなく、末端領域のみで使用してもよい。それらは、二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本の鎖間の十分なハイブリダイゼーションが維持されるならば、センス鎖中のどこでも使用することができる。いくつかの実施形態では、オフターゲットサイレンシングを最小化することができるため、切断部位またはセンス鎖の切断領域中にＮＲＭを置くことが望ましい。
【０１５９】
特定の実施形態では、ＮＲＭ修飾は、それらがセンス鎖またはアンチセンス鎖上に含まれているかによって、異なって分布するであろう。アンチセンス鎖上にある場合、エンドヌクレアーゼ切断を妨げるまたは阻害する修飾は、（参照することにより本明細書の一部をなすものとするＥｌｂａｓｈｉｒら、２００１、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１５：１８８に記載されているように）ＲＩＳＣによって媒介される切断、例えば、切断部位または切断領域に供される領域中に挿入するべきではない。標的の切断は、２０または２１のヌクレオチドアンチセンス鎖のほぼ中央で、またはアンチセンス鎖と相補的である標的ｍＲＮＡ上の第１のヌクレオチドの約１０または１１ヌクレオチド上流で起こる。本明細書で使用する場合、切断部位は、標的ｍＲＮＡ上、またはそれとハイブリダイズするするｉＲＮＡ剤鎖上の切断部位のいずれかの側におけるヌクレオチドを意味する。切断領域は、切断部位のいずれかの方向の１、２、または３ヌクレオチド以内のヌクレオチドを意味する。
【０１６０】
このような修飾は、末端領域、例えば、対象中の配列を標的とする配列もしくは標的としない配列の末端位置または末端の２、３、４、もしくは５位に導入することができる。
【０１６１】
その薬理学的特性を含めたｉＲＮＡ剤の特性は、例えばリガンド、例えばテザーリガンドの導入によって影響を与え調整することができる。多種多様の物質、例えばリガンドは、ｉＲＮＡ剤、例えば、リガンド結合モノマーサブユニットの担体に結合することができる。リガンド結合モノマーサブユニットとの関連で例を下記に記載するが、それは単に好ましいものである。実態は、他のポイントでｉＲＮＡ剤にカップリングすることができる。
【０１６２】
重要であるのは、介在テザーを介して、直接または間接に共有結合的に担体にカップリングしているリガンドである。特定の実施形態では、リガンドは、介在テザーを介して担体に結合している。リガンドまたはテザーリガンドは、リガンド結合モノマーが伸長している鎖中に組み込まれている場合、リガンド結合モノマー上に存在し得る。いくつかの実施形態では、「前駆体」リガンド結合モノマーサブユニットが伸長している鎖中に組み込まれた後で、リガンドが「前駆体」リガンド結合モノマーサブユニット中に組み込まれる場合がある。例えばアミノ末端テザー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーは、例えば、伸長しているセンス鎖またはアンチセンス鎖中に組み込み得る。それに続く操作において、すなわち、前駆体モノマーサブユニットの鎖への組込み後、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、リガンドの求電子基を前駆体リガンド結合モノマーサブユニットテザーの末端求核基とカップリングすることによって、引き続いて前駆体リガンド結合モノマーに結合させることができる。
【０１６３】
特定の実施形態では、リガンドは、それが組み込まれているｉＲＮＡ剤の分布、ターゲッティングまたは寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドがない種と比較して、選択した標的、例えば、分子、細胞または細胞型、区画、例えば、細胞または器官の区画、組織、器官または体の領域について増強された親和性を提供する。
【０１６４】
対象とするリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を改良することができ、また得られた天然もしくは修飾されたオリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載するモノマーの任意の組合せを含むポリマー分子および／または天然もしくは修飾されたリボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を改良し得る。リガンドは一般に、例えば、取込みを増強するための治療用修飾因子、例えば、分布をモニターするための診断用化合物またはレポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ−耐性付与部分、および天然または通常でない核酸塩基を含むことができる。一般例には、親油性分子、脂質、レクチン、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えば、サルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール誘導体化リトコール酸）、ビタミン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリンターゲッティング分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体が挙げられる。
【０１６５】
リガンドは、天然または組換えまたは合成分子（合成ポリマーなど、例えば、合成ポリアミノ酸）でよい。ポリアミノ酸の例にはポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン部分、例えば、カチオン脂質、カチオンポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαヘリカルペプチドが挙げられる。
【０１６６】
リガンドはまた、ターゲッティング基、例えば、細胞ターゲッティング剤または組織ターゲッティング剤、例えば、サイロトロピン、メラノトロピン、界面活性タンパク質Ａ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパルテート、またはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体を含むことができる。
【０１６７】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはアルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはペプチド、例えば、コリガンドに対して特異親和性を有する分子、または抗体、例えば、特定の細胞型（癌細胞、内皮細胞、または骨細胞など）に結合する抗体である場合がある。リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体を含み得る。それらはまた、共同因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、または多価フコースなどの非ペプチド種を含むことができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子でよい。
【０１６８】
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することにより、細胞へのｉＲＮＡ剤の取込みを増加させることができる物質、例えば、薬物でよい。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンでよい。
【０１６９】
一態様によれば、リガンドは、脂質または脂質をベースとする分子である。このような脂質または脂質をベースとする分子は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、結合体の標的組織、例えば、肝臓の実質細胞を含めた肝臓組織への分布を可能にする。ＨＳＡに結合することができる他の分子はまた、リガンドとして使用することができる。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質をベースとするリガンドは、（ａ）結合体の劣化に対する抵抗を増加させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜へのターゲッティングもしくは輸送を増加させ、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調節するために使用することができる。
【０１７０】
脂質をベースとするリガンドは、結合体の標的組織への結合を調節、例えば制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強力に結合する脂質または脂質をベースとするリガンドは、腎臓を標的とする可能性がより低く、したがって体から排出される可能性がより低い。ＨＳＡにより弱く結合する脂質または脂質をベースとするリガンドを使用して、結合体を腎臓に標的することができる。また重要なのは、その開示が参照することにより本明細書中の一部をなすものとするＷＯ／２００５／０２３９９４に記載されている脂質修飾である。
【０１７１】
他の態様では、リガンドは、部分、例えば、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれるビタミンまたは栄養素である。これらは、望ましくない細胞増殖、例えば、悪性または非悪性型のもの、例えば、癌細胞によって特徴付けられる障害を治療するために特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンには、Ｂビタミン、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。
【０１７２】
他の態様では、リガンドは、細胞浸透剤、ヘリカル細胞浸透剤である。いくつかの実施形態では、作用剤は両親媒性である。例示的な作用剤は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。作用剤がペプチドである場合、それはペプチジル模倣体、インバートマー、非ペプチド連結または擬似ペプチド連結、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて修飾することができる。ヘリカル剤は、親油性および疎油性相を有し得るα−ヘリカル剤でよい。
【０１７３】
特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は５’リン酸化されており、または５’末端でホスホリル類似体を含む。アンチセンス鎖の５’−ホスフェート修飾は、ＲＩＳＣによって媒介される遺伝子発現抑制と適合性のものを含む。適切な修飾には、５’−モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾されたまたは修飾されていないヌクレオチドキャップ構造が挙げられる。他の適切な５’−ホスフェート修飾は、当業者には公知であろう。
【０１７４】
センス鎖を不活性化して、活性ＲＩＳＣの形成を妨げ、それによって潜在的なオフターゲット効果を減少させるために、センス鎖を修飾することができる。これは、センス鎖の５’−リン酸化を妨げる修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドによる修飾によって達成することができる（Ｎｙｋａｎｅｎら、（２００１）ＡＴＰ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙ、Ｃｅｌｌ、１０７、３０９〜３２１を参照されたい）。リン酸化を妨げる他の修飾もまた使用することができる、例えば、５’−ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨと単に置換する。代わりに、大きなかさ高い基を、５’−ホスフェートに加え、それをリン酸ジエステル連結に変えることができる。
【０１７５】
所望である場合、本明細書に記載する核酸（例えば、ｉＲＮＡ、ＤＮＡなど）剤は、非経口的に、例えば注射、経口、局所、目へなどによって、対象への投与のために配合することができる。それ自体として、核酸は、製薬学的に許容可能なビヒクルを混合して、医薬組成物を提供することができる。説明を容易にするために、この項における配合物、組成物、および方法は、修飾されていないｉＲＮＡ剤に関して主として議論される。しかし、これらの配合物、組成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾されたｉＲＮＡ剤と共に行うことができ、この実施は本発明の範囲内であることを理解すべきである。
【０１７６】
配合されたｉＲＮＡ剤組成物は、種々の状態をとることができる。いくつかの例では、組成物は、少なくとも部分結晶性、不均一に結晶性、および／または無水（例えば、８０、５０、３０、２０、または１０％未満の水）である。他の例では、ｉＲＮＡ剤は、水相中に、例えば、水を含めた溶液中にあり、この形態が吸入による投与のために好ましい形態である。水相組成物または結晶性組成物は、送達ビヒクル、例えば、リポソーム（特に、水相のための）、または粒子（例えば、結晶性組成物のために、必要に応じて微粒子）中に組み込むことができる。一般に、ｉＲＮＡ剤組成物は、意図した投与方法と適合性のある態様で配合される。
【０１７７】
ｉＲＮＡ剤製剤は、他の作用剤、例えば、他の治療剤またはｉＲＮＡ剤を安定化する作用剤、例えば、ｉＲＮＡ剤と複合体を形成してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて配合することができる。また他の作用剤には、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えば、Ｍｇ２４などの二価カチオンを除外するため）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎなどの広い特異性のＲＮＡｓｅ阻害剤）などが挙げられる。
【０１７８】
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤製剤は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、第２の遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介することができる第２のｉＲＮＡ剤を含む。また他の製剤は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００以上の異なるｉＲＮＡ種を含むことができる。いくつかの実施形態では、作用剤は、同じ遺伝子であるが異なる標的配列を対象にする。
【０１７９】
核酸は、適切な製薬学的に許容可能なビヒクル、すなわち、担体または希釈剤と組み合わせることによって医薬組成物に配合することができ、固体、半固体、液体または気体の形態の製剤、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液剤、坐薬、注射剤、吸入剤およびエアゾール剤などに配合し得る。それ自体として、作用剤の投与は、経口、口腔、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮的、気管内などの投与を含めて様々な方法で達成することができる。
【０１８０】
医薬品剤形において、作用剤は、単独でまたは適切な関連物中で、および他の医薬活性化合物と組み合わせて投与し得る。下記の方法および賦形剤は、単に例示的なものであり、決して限定するものではない。
【０１８１】
経口製剤のために、作用剤は、単独で、あるいは適切な添加剤、例えば、ラクトース、マンニトール、コーンスターチまたはジャガイモデンプンなどの従来の添加剤、結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤、コーンスターチ、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに所望であれば、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および香味剤と組み合わせて、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を作製することができる。
【０１８２】
作用剤は、水性溶媒または非水溶媒、例えば野菜油または他の同様の油、合成脂肪族酸グリセリド、より高級な脂肪族系酸のエステルまたはプロピレングリコール中でそれらを溶解、懸濁または乳化することによって、所望であれば、従来の添加剤、例えば可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤などと共に、注射のための製剤に配合することができる。
【０１８３】
作用剤は、吸入によって投与されるエアロゾル配合物において用いることができる。本発明の化合物は、加圧した許容できる噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などに配合することができる。
【０１８４】
さらに、作用剤は、乳化基剤または水溶性基剤などの種々の基剤と混合することによって、坐薬に作製することができる。本発明の化合物は、坐薬によって直腸に投与することができる。坐薬は、体温で溶融するが室温で凝固する、カカオバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができる。
【０１８５】
シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤などの経口または直腸投与のための単位剤形を提供してもよく、各投与単位、例えば、スプーン１杯、テーブルスプーン１杯、錠剤または坐薬は、１種または複数の阻害剤を含有する所定の量の組成物を含有する。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、生理食塩水または他の製薬学的に許容可能な担体中の溶液として、組成物中に阻害剤（複数可）を含み得る。
【０１８６】
「単位剤形」という用語は、本明細書で使用する場合、ヒトおよび動物対象のための単位投与量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、製薬学的に許容可能な希釈剤、担体またはビヒクルと関連して所望の効果を生じさせるのに十分な量で計算された所定の量の本発明の化合物を含有する。本発明の新規な単位剤形についての明細は、用いられる特定化合物および達成される効果、および宿主における各化合物と関連する薬力学によって変わる。
【０１８７】
ビヒクル、補助剤、担体または希釈剤などの製薬学的に許容可能な賦形剤は、一般で容易に利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤および緩衝剤、等張化剤、安定剤、湿潤剤などの製薬学的に許容可能な補助物質は、一般で容易に利用可能である。
【０１８８】
核酸はまた、マイクロインジェクション、または小胞の融合を含めて他の経路によって組織もしくは宿主細胞中に導入し得る。Ｆｕｒｔｈら（１９９２）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ２０５、３６５〜３６８において記載されているように、ジェット式注射もまた筋肉内投与のために使用し得る。文献（例えば、Ｔａｎｇら（１９９２）、Ｎａｔｕｒｅ３５６、１５２  １５４を参照されたい）に記載されているように、核酸を金微粒子上にコーティングし、微粒子銃装置または「微粒子銃」によって皮内に送達することができ、ここでは、金微粒子をＤＮＡでコーティングし、次いで皮膚細胞中に衝突させる。対象とするさらなる核酸送達プロトコルには、それだけに限らないが、第５，９８５，８４７号および第５，９２２，６８７号を含む対象とする米国特許（その開示は、参照することにより本明細書の一部をなすものとする）；ＷＯ／１１０９２；Ａｃｓａｄｉら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．（１９９１）３、７１〜８１；Ｈｉｃｋｍａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．（１９９４）５、１４７７〜１４８３；およびＷｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４７、１４６５〜１４６８などにおいて記載されているものが挙げられる。例えば、上記のウイルスおよび非ウイルスによって媒介される送達プロトコルを参照されたい。したがって、重要なのは、このような送達方法において使用するための薬剤ビヒクルである。
【０１８９】
この方法の実施形態によって生成されるリボ核酸は、種々の異なる用途に使用され、それだけに限らないが、識別的遺伝子発現分析、遺伝子サイレンシング用途、核酸ライブラリー作製用途および治療用途が挙げられる（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの生成における用途）。本発明の実施形態に従って生成されたＲＮＡについてのこれらのタイプの有用性に関するさらなる詳細は、その開示が参照することにより本明細書の一部をなすものとする、「Ａｒｒａｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」という表題で、２００６年４月１３日にＵＳ−２００６−００７８８８９−Ａ１として公開され、２００４年１０月８日に出願された、係属中の米国特許出願第１０／９６１，９９１号において提供されている。
【０１９０】
［キット］
また対象となるものは、本発明の特定の実施形態の実施において使用するためのキットである。特定の実施形態では、キットは、少なくとも２種の異なる保護されたモノマー、例えば、本発明による２’チオ炭素によって保護されたヌクレオシドモノマーを含み、キットは、同じ核酸塩基を有するモノマーまたは異なる核酸塩基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣおよびＵを有するモノマーを含み得る。キットには、本発明の方法において用いられるさらなる試薬、例えば、緩衝液、酸化剤、キャッピング剤、切断剤などをさらに含み得る。
【０１９１】
特定の実施形態は、各々、アデニン、ウラシル、グアニン、およびシトシンを含む４種のこのようなヌクレオシドモノマーを含む。アデニン、グアニン、およびシトシンの各々は、ヌクレオシドの２’−ＯＨを保護する同じチオ炭素保護基によるなど任意選択的に保護されている。ヌクレオシドモノマーは、ＤＭＴなどの５’−保護基、３’−保護基、および／またはホスホラミダイト基を任意選択的に含む。キットは、ＴＢＡＦ、ｔＢｕＯＯＨ、Ｈ２Ｏ２、ＨＦ、ＨＦ−ピリジン、ＨＦ−ＴＥＭＥＤ、ＨＦ−ＴＥＡ、ピリジン、ＴＥＭＥＤ、未希釈アルキルアミン、有機溶媒中のアミン、未希釈もしくは溶媒系中のアミンの混合物、および／またはＴＥＡまたはＴＢＡＨなどの、合成後のＲＮＡ脱保護のための試薬をさらに含み得る。
【０１９２】
いくつかの他のキットの実施形態は、ヌクレオシドモノマー前駆体の調製に有用な成分を含む。キットは、ＴＩＰＳＣｌ２およびジチオクロロホルメートまたはチオカルボニルクロロホルメートを含み得る。キットは、ＨＦ、ピリジン、ＣＨ３ＣＮ、ＤＭＴ含有遮断剤（ＤＭＴクロリドなど）、および／またはＣＨ３ＯＰ（ＮｉＰｒ２）２などの試薬をさらに含み得る。キットは、脱保護試薬／組成物、例えば、上記のようなものを含み得る。キットはまた、保護されていないリボヌクレオシドモノマー、例えば、アデノシン、グアノシン、ウリジン、および／またはシチジンなどを含み得る。
【０１９３】
特定の実施形態では、キットは、対象の方法を実施するための取扱説明、または取扱説明を得るための手段（例えば、使用者に取扱説明を提供するウェブページを指示するウェブサイトのＵＲＬ）をさらに含み、これらの取扱説明は、被印刷物上に印刷されている場合があり、被印刷物は添付文書、包装、試薬容器などの１つまたは複数でよい。対象となるキットにおいて、１種または複数の成分は、好都合または所望のように同じ容器中または異なる容器中に存在する。
【０１９４】
下記の例は、本発明の化合物の合成を例示するものであり、本明細書に添付の特許請求に記載されている本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【０１９５】
［実験］
Ｉ．  様々な２’−チオカーボネートモノマーの合成
Ａ．  ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−チオカルボニル−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトウリジンの合成
【化３８】
0005520818.tif 000039
ＮＭＩ（Ｎ−メチルイミダゾール）
ＨＦ／ピリジンは、ＨＦ／ピリジン：７０／３０：ｗ／ｗで作られた錯体である。
Ｒによって、トリチル化反応は遅くなる場合があり、ＮＭＩまたはＤＭＡＰは、反応を促進するために少量（０．１当量）加えることができる。２’−Ｏ−ｔ−ブチルチオカーボネート（ＢＳＣ）ウリジンを合成するために、５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）２’−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートで保護されたウリジンを前駆体として使用してよい。下記で示すように、ｐ−ニトロフェニルカーボネートを置き換えるためにナトリウム２−メチル−２−プロパンチオレートを使用してよい。
【０１９６】
相当するクロロチオホルメートが利用できない場合、２’−チオカーボネートの合成への一般のアプローチとして、相当するメルカプタン誘導体を使用して、それをホスゲンと反応させて、相当するクロロチオホルメートを得ることが可能であり、またはメルカプタンを２’Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）オキシカルボニルで保護されたヌクレオシドと反応させることもまた可能である。
【０１９７】
Ｂ．  ５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）２’−Ｏ−ｔ−ブチルチオカルボニル（ＢＳＣ）ウリジンの合成
５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）２’−Ｏ−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートで保護されたウリジン（１５ｍｍｏｌｅ）を、ピリジンと３度同時蒸発させ、次いで真空ポンプで４時間乾燥させた。無水ピリジン（１５０ｍＬ）およびナトリウム２−メチル−２−プロパンチオレート（２４ｍｍｏｌｅ）を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。生成物を、ＥｔＯＡｃ（０〜３０％）のグラジエントと共にヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。収率７６．４％、ＥＳＩ  ＭＳ：６０９（Ｍ＋Ｌｉ）、６３７（Ｍ＋Ｃｌ）
【０１９８】
Ｃ．  ５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）２’−Ｏ−エチルチオカルボニル（ＥＳＣ）ウリジンの合成
５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（１５ｍｍｏｌｅ）を、ピリジンと３度同時蒸発させ、次いで真空ポンプ上で１２時間乾燥させた。無水ピリジン（１５０ｍＬ）、およびエチルクロロチオホルメート（１８ｍｍｏｌｅ）を加え、混合物を室温で１６時間撹拌した。生成物を、クロロホルム（５０〜１００％）のグラジエントと共にヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
収率７４．３％
ＥＳＩ  ＭＳ：５８１（Ｍ＋Ｌｉ）、６０９（Ｍ＋Ｃｌ）
【０１９９】
Ｄ．  ＴＩＰＳ２’−Ｏ−チオカルボニルで保護されたウリジンの除去
フッ化水素−ピリジン錯体（ＨＦ：Ｐｙ７：３、７ｍＬ）を、氷冷のピリジン（８ｍＬ）のアセトニトリル（４６．５ｍＬ）溶液に注意深く加えた。次いで、このように形成されたピリジン−ＨＦ試薬（３２ｍＬ）を、５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）２’−Ｏ−カーボネートで保護されたウリジン（１０ｍｍｏｌｅ）を有するフラスコに移し、混合物を室温で２時間撹拌した。反応物を水（３００ｍＬ）中の塩化カルシウムの５％溶液でクエンチした。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し（３〜５回）、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、有機層を濃縮乾燥し、真空ポンプ上に１６時間置いた。
収率８５〜１００％
ＥＳＩ  ＭＳ：
ＢＳＣ類似体：３６１（Ｍ＋１）、３８３（Ｍ＋Ｎａ）、３９９（Ｍ＋Ｋ）
ＥＳＣ類似体：３３３（Ｍ＋１）、３５５（Ｍ＋Ｎａ）、３７１（Ｍ＋Ｋ）
【０２００】
Ｅ．  ５’−Ｏ−ＤＭＴ２’−Ｏ−チオカルボニルで保護されたウリジン３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトの合成
２’−Ｏ−チオカーボネートで保護されたウリジン（３ｍｍｏｌｅ）を、真空ポンプ上で６時間乾燥させた。無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）、２，４，６−コリジン（２２．５ｍｍｏｌｅ）およびジメトキシトリチルクロリド（３．３ｍｍｏｌｅ）を加え、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ９：１）がヌクレオシド基質の完全な消失を示すまで混合物を室温で撹拌した（１６〜２４時間）。２，４，６−コリジン（３ｍｍｏｌｅ）および１−メチルイミダゾール（１．５ｍｍｏｌｅ）を、一度に加え、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミド酸クロリドを反応混合物に１０〜１５分間にわたりゆっくりと加えた。次いで、反応混合物をさらに２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物を、ＥｔＯＡｃ（０〜５０％）のグラジエントと共にヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
収率６０〜６５％
ＥＳＩ  ＭＳ：
ＥＳＣモノマー：８０２（Ｍ＋Ｌｉ）、８３０（Ｍ＋Ｃｌ）
ＢＳＣモノマー：８３０（Ｍ＋Ｌｉ）、８５８（Ｍ＋Ｃｌ）
３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
ＥＳＣモノマー：１５２．３３、１５１．７２
【０２０１】
Ｆ．  ５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）２’−Ｏ−エチルチオカルボニル（ＥＳＣ）Ｎ４−フェニルオキシカルボニルシチジンの合成
５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）リボシチジン（１０ｍｍｏｌｅ、４．８５ｇ）を、乾燥ピリジンと同時蒸発させることによって乾燥させた。この化合物を１００ｍｌの乾燥ピリジンに溶解し、トリメチルクロロシラン（５当量、５０ｍｍｏｌｅ、６．３４ｍｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、クロロギ酸フェニルを加えた（１．２当量、１２ｍｍｏｌｅ、１．５１ｍｌ）。反応物を室温で２時間撹拌した。２ｍｌのメタノールを加えることによって過剰のクロロホルメートをクエンチし、反応物を水中の炭酸水素ナトリウムの飽和溶液によって希釈した。この溶液をジクロロメタンで抽出した。次いで、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。
【０２０２】
この反応の粗生成物を、１６０ｍｌのジクロロメタンおよび３０ｍｌのＴＨＦ中の５．７ｇのｐ−トルエンスルホン酸中で希釈した。反応物を室温で１５分間撹拌した。炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液２００ｍｌを加えることによって、反応物をクエンチした。この溶液をジクロロメタンで抽出し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。
【０２０３】
粗生成物を乾燥ピリジンと同時蒸発させることによって乾燥させ、１００ｍｌの乾燥ピリジンに溶解し、エチルクロロチオホルメート（１．７当量、１．７６ｍｌ）およびＤＭＡＰ（０．１当量、０．１２２ｇ）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌し、次いで炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で希釈した。この混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗製物をカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル  ７５／２５）によって精製した。生成物を泡として得た（４ステップにわたり４ｇ、６０％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）：８．２（ｓ，１Ｈ）；７．４５−７．２（ｍ，５Ｈ）；５．９５（ｓ，１Ｈ）；５．５５（ｄ，１Ｈ）；４．３５（ｍ，１Ｈ）；４．３（ｄ，１Ｈ）；４．２−３．９５（ｍ，２Ｈ）；２．９５−２．８（ｍ，２Ｈ）；１．３（ｔ，３Ｈ）；１．１５−０．９５（ｍ，２７Ｈ）Ｇ
質量スペクトル  ＥＳＩ：７００．２２７４［Ｍ＋Ｌｉ］＋
【０２０４】
Ｇ．  ２’−Ｏ−エチルチオカルボニルＮ４−フェニルオキシカルボニルシチジンの合成
５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）２’−Ｏ−エチルチオカーボネートＮ４−フェニルカルバメートシチジン（２．５７ｇ、５．７ｍｍｏｌｅ）を乾燥アセトニトリルと同時蒸発させることによって乾燥させ、次いで４０ｍｌの乾燥アセトニトリルで希釈し、ＨＦ／ピリジン（３０当量のＨＦ、４．３３ｍｌ）を加え、反応物を室温で５時間撹拌した。ＣａＣｌ２の溶液を加えることによってフッ化物をクエンチし、生成物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。
【０２０５】
粗製物を乾燥アセトニトリルと同時蒸発させ、次いで４０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、１０当量（７．５５ｍｌ）の２，４，６−コリジンを反応物に加えた。ＤＭＴＣｌ（１．２当量、２．３１ｇ）を加え、反応物を室温で３時間３０分撹拌した。さらに５当量の２，４，６−コリジン（３．３ｍｌ）、０．５当量（０．２２ｍｌ）のＮ−メチルイミダゾールおよび２．５当量（２．７５ｍｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルメチル−ホスホンアミド酸クロリドを加えた。反応物を室温で４時間撹拌した。混合物を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗製物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／ピリジン７５／２０／５〜２０／７５／５）によって精製した。所望の生成物を僅かに黄色の泡として得た（３ステップにわたり１．６４ｇ、３１％）。
３１Ｐ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＣＤ３ＣＮ）：１５１．７０９−１５１．３２５
質量スペクトル  ＥＳＩ：９２１．３３２［Ｍ＋Ｌｉ］＋
【０２０６】
Ｈ．  環外アデノシルアミノ基の保護
５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）アデノシン（３．９ｍｍｏｌｅ、２ｇ）を、乾燥ピリジンと２度同時蒸発させた。この化合物を２０ｍｌの乾燥ピリジンに溶解し、トリメチルクロロシラン（５当量、１９．６ｍｍｏｌｅ、２．４８ｍｌ）を加えた。混合物を室温で３０分間撹拌し、クロロギ酸フェニルを加えた（２当量、７．８４ｍｍｏｌｅ、０．９８ｍｌ）。反応物を室温で２時間撹拌した。次いで、５ｍｌの水を反応物に加え、混合物を室温でさらに２時間撹拌した。次いで、反応物を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で希釈した。この溶液をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗製物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２からＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９０／１０）によって精製した。生成物を白色の泡として得た（０．６２ｇ、２５％）。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）：９．８５（ｓ，１Ｈ）；８．７５（ｓ，１Ｈ）；８．２（ｓ，１Ｈ）；７．４−７．２（ｍ，５Ｈ）；６．０５（ｓ，１Ｈ）；５．０５（ｍ，１Ｈ）；４．６５（ｄ，１Ｈ）；４．１５−４（ｍ，４Ｈ）；３．７５（ｓ，１Ｈ）；１．１５−０．９５（ｍ，２７Ｈ）
【０２０７】
Ｉ．  ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−エチルチオカルボニル−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−Ｎ６−フェニルオキシカルボニルアデノシンの合成
５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）Ｎ６−フェニルオキシカルボニルアデノシン（０．６２ｇ、１ｍｍｏｌｅ）を無水ピリジンと同時蒸発させることによって乾燥させ、５ｍｌの乾燥ピリジンに溶解した。エチルクロロチオホルメート（１．７当量、２ｍｍｏｌｅ、０．２０８ｍｌ）およびＤＭＡＰ（０．１当量、０．０１２ｇ）を加えた。反応物を室温で一晩撹拌し、次いで炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液によって希釈した。粗反応混合物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。
【０２０８】
粗生成物を乾燥アセトニトリルと同時蒸発させることによって乾燥させ、次いで５ｍｌの乾燥アセトニトリル中で希釈した。ＨＦ／ピリジン（３０当量のＨＦ、０．３７５ｍｌ）を加え、反応物を室温で５時間撹拌した。ＣａＣｌ２の溶液を加えることによってフッ化物をクエンチし、生成物をジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。
【０２０９】
乾燥アセトニトリルと同時蒸発させることによって粗生成物を乾燥させ、次いで５ｍｌの乾燥ＴＨＦ、１０当量（１．３５ｍｌ）の２，４，６−コリジンを加えた。ＤＭＴＣｌ（１．２当量、０．４ｇ）を加え、反応物を室温で２時間撹拌した。さらに５当量の２，４，６−コリジン（０．７ｍｌ）、０．５当量（０．０３９ｍｌ）のＮ−メチルイミダゾールおよび２．５当量（１．４５ｍｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルメチル−ホスホンアミド酸クロリドを加えた。反応物を室温で２時間撹拌した。混合物を炭酸水素ナトリウムの飽和水溶液で希釈し、ジクロロメタンで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、蒸発乾固させた。粗製物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル／ピリジン７５／２０／５〜２０／７５／５）によって精製した。所望の生成物を白色の泡として得た。
３１Ｐ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＣＤＣｌ３）：１５２．９２５−１５２．０４０
【０２１０】
Ｊ．  ５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−チオカルボニル−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトＮ４−チオカルボニルシチジン、Ｎ４−チオカルボニルグアノシン、およびＮ６−チオカルボニルアデノシンの合成
【化３９】
0005520818.tif 000040
【０２１１】
ＩＩ．  モノマー上の異なる２’−チオカーボネート基の切断／脱保護研究
フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）（１Ｍ）のＴＨＦ溶液を使用して、様々な２’−チオカルボニル保護基を切断した。全てのチオカーボネートは、この溶液によって切断され、予想どおりより多いアルキル基を有するチオカーボネートについて半減期が増加したように思われる。
【表１】
0005520818.tif 000041
【０２１２】
ＩＩＩ．  様々な２’−チオカルボニルカーボネートおよびジチオカーボネートモノマーの合成
Ａ．  ５’，３’−ＴＩＰＳ−２’ペンタフルオロフェニルオキシチオカルボニル−ウリジンの合成
５’，３’ＴＩＰＳ−ウリジン（５ｍｍｏｌ）をピリジンと２度同時蒸発させ、ＤＣＭ／Ｐｙ（９ｍｌ／４ｍｌ）溶液に溶解した。ＤＭＡＰ（１２２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を加え、（２０摂氏温度で）溶液を水浴に浸した。ペンタフルオロフェニルクロロチオノホルメート（１．６ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え（１分間にわたり）、反応物を５時間撹拌し、そこで水を加えた。溶液をＤＣＭ）で２度抽出し、水で２度洗浄し、乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、濃縮した。粗製物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）上で精製し、表題化合物（６４％収率）を得た。質量計算値：７１２．１７、観測値：７１９．１８［Ｍ＋Ｌｉ］＋、７４６．２［Ｍ＋Ｃｌ］−。
【０２１３】
Ｂ．  チオノおよびジチオカーボネートの合成のための一般法
３’，５’−ＴＩＰＳ２’−Ｏ−ペンタフルオロフェニルオキシチオカルボニルウリジンを１，４−ジオキサンと２度同時蒸発させ、ＴＨＦ（３ｍｌ）に溶解し、アルゴン下に置いた。関連するアルコキシド／チオアルコキシド（２．１当量）を加え、反応混合物を１時間撹拌し、そこで飽和ＮａＨＣＯ３を加え、溶液をＥｔＯＡｃで２度抽出し、１度洗浄し、ブラインで１度洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製した。
【０２１４】
ＩＶ．  様々なチオノカルバメートで保護されたモノマーの合成
Ａ．  ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−２’−Ｏ−モルホリノチオノカルバメートウリジンの合成
３’−５’−テトライソプロピルジシロキサンウリジン（ＣｈｅｍｅＧｅｎｅｓ）、１０ｍｍｏｌ（４．８グラム）を、セラムストッパーを備えた５００ｍｌの丸底フラスコ中の１００ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した。反応物に、１．９グラムの１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．２グラムの４−（ジメチル）アミノピリジンと共に加えた。ヒートガンを使用して反応物を加熱し、試薬が溶解して溶液が透明となるまで撹拌した。反応物を一晩（１２時間）撹拌した。１２時間後、反応混合物は結晶のスラリーであった。結晶を、中型焼結ガラス漏斗を通した濾過によって単離した。生成物を冷たいアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。ＴＬＣ分析によって、生成物は５．９７グラムの生成物（１００％）をもたらす単一の種であることが確認された。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって、生成物をＭ＋１、５９７．１２ｍ／ｅの質量を有する５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１、３−ジイル）−２’−チオノイミダゾールであると確認した。生成物を、ヒートガンを使用して加熱することによって１００ｍｌの無水アセトニトリルに再溶解した。反応物に、１１ｍｍｏｌのモルホリンを加えた。反応物を栓でふさぎ、３時間撹拌した。ＴＬＣ分析は、出発物質からより速く流れる生成物へのスポットからスポットへの変換を示した。その生成物を、ガラスへのアセトニトリルの蒸発によって単離した。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって、生成物をＭ＋１、６１５．２１ｍ／ｅの質量を有する５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１、３−ジイル）−２’−モルホリノ−チオノカルバメートと確認した。フッ化水素−ピリジン錯体（ＨＦ：Ｐｙ  ７：３、７ｍＬ）を、氷冷のピリジン（８ｍＬ）のアセトニトリル（４６．５ｍＬ）溶液に注意深く加えた。次いで、このように形成したピリジン−ＨＦ試薬（３２ｍＬ）を、５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−モルホリノ−チオノカルバメートで保護されたウリジン（１０ｍｍｏｌｅ）を有するフラスコに移し、混合物を室温で２時間撹拌した。反応物を、水（３００ｍＬ）中の塩化カルシウムの５％溶液でクエンチした。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し（３〜５回）、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、有機層を粘性油へと濃縮し、ＴＬＣによって単一のスポットとして示される３．５グラム（９４％収率）の生成物（ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によってＭ＋１、３７３．１０ｍ／ｅの質量を有する２’−モルホリノ−チオノカルバメートで保護されたウリジンの確認された同一性を有する）を得た。２’−Ｏ−モルホリノチオノカルバメートで保護されたウリジン（９．４ｍｍｏｌｅ）を無水ＴＨＦ（９５ｍＬ）に再溶解し、２，４，６−コリジン（７０．５ｍｍｏｌｅ）およびジメトキシトリチルクロリド（１１．７５ｍｍｏｌｅ）を加え、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ９：１）がヌクレオシド基質の完全な消失を示すまで混合物を室温で撹拌した（１６〜２４時間）。２，４，６−コリジン（９．４ｍｍｏｌｅ）および１−メチルイミダゾール（４．５ｍｍｏｌｅ）を一度に加え、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンア���ド酸クロリド（２３ｍｍｏｌ）を、反応混合物に１０〜１５分間にわたりゆっくりと加えた。次いで、反応混合物をさらに２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物を、ＥｔＯＡｃ（０〜５０％）のグラジエントと共にヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０２１５】
Ｂ．  ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−２’−Ｏ−チオモルホリノ−１，１−ジオキシドチオノカルバメートウリジンの合成
３’−５’−テトライソプロピルジシロキサンウリジン（ＣｈｅｍｅＧｅｎｅｓ）、１０ｍｍｏｌ（４．８グラム）を、セラムストッパーを備えた５００ｍｌの丸底フラスコ中の１００ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した。反応物に、１．９グラムの１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．２グラムの４−（ジメチル）アミノピリジンと共に加えた。ヒートガンを使用して反応物を加熱し、試薬が溶解して溶液が透明となるまで撹拌した。反応物を一晩（１２時間）撹拌した。１２時間後、反応混合物は結晶のスラリーであった。結晶を、中型焼結ガラス漏斗を通した濾過によって単離した。生成物を冷たいアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。ＴＬＣ分析によって、生成物は５．９７グラムの生成物（１００％）を生じさせる単一の種であることを確認した。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって、生成物をＭ＋１、５９８．１２ｍ／ｅの質量を有する５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１、３−ジイル）−２’−チオノイミダゾールであると確認した。生成物を、ヒートガンを使用して加熱することによって１００ｍｌの無水アセトニトリルに再溶解した。反応物に、１１ｍｍｏｌのチオモルホリン−１，１−二酸化物（ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ）および１．１ｍｍｏｌの４−（ジメチル）アミノピリジンを加えた。反応物に栓をし、１２時間撹拌した。１２時間後、反応混合物は、結晶のスラリーであった。結晶を、中型焼結ガラス漏斗を通した濾過によって単離した。生成物を冷たいアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。ＴＬＣ分析によって、生成物は６．６１グラムの生成物（９９％）を生じさせる単一の種であることを確認した。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって、生成物をＭ＋１、６６４．２１ｍ／ｅの質量を有する５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１、３−ジイル）−２’−Ｏ−チオモルホリノ−１，１−ジオキシドチオノカルバメートであると確認した。フッ化水素−ピリジン錯体（ＨＦ：Ｐｙ７：３、７ｍＬ）を、氷冷のピリジン（８ｍＬ）のアセトニトリル（４６．５ｍＬ）溶液に注意深く加えた。次いで、このように形成されたピリジン−ＨＦ試薬（３２ｍＬ）を、５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−チオモルホリノ−１，１−ジオキシドチオノカルバメートで保護されたウリジン（１０ｍｍｏｌｅ）を有するフラスコに移し、混合物を室温で２時間撹拌した。反応物を、水（３００ｍＬ）中の塩化カルシウムの５％溶液でクエンチした。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し（３〜５回）、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、有機層を粘性油となるまで濃縮し、ＴＬＣによって単一のスポットとして示される３．４グラム（８０％収率）の生成物（ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によってＭ＋１、４２２．１０ｍ／ｅの質量を有する２’−Ｏ−チオモルホリノ−１，１−ジオキシドチオノカルバメートで保護されたウリジンの確認された同一性を有する）を得た。２’−Ｏ−チオモルホリノ−１，１−ジオキシドチオノカルバメートで保護されたウリジン（８．０ｍｍｏｌｅ）を無水ＴＨＦ（８０ｍＬ）に再溶解し、２，４，６−コリジン（６０ｍｍｏｌｅ���およびジメトキシトリチルクロリド（１０．０ｍｍｏｌｅ）を加え、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ９：１）がヌクレオシド基質の完全な消失を示すまで混合物を室温で撹拌した（１６〜２４時間）。２，４，６−コリジン（８．０ｍｍｏｌｅ）および１−メチルイミダゾール（４．０ｍｍｏｌｅ）を一度に加え、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミド酸クロリド（２０ｍｍｏｌ）を反応混合物に１０〜１５分間にわたりゆっくりと加えた。次いで、反応混合物をさらに２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物を、ＥｔＯＡｃ（０〜５０％）のグラジエントと共にヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０２１６】
Ｃ．  ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−２’−Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミノチオノカルバメートウリジンの合成
３’−５’−テトライソプロピルジシロキサンウリジン（ＣｈｅｍｅＧｅｎｅｓ）、１０ｍｍｏｌ（４．８グラム）を、セラムストッパーを備えた５００ｍｌの丸底フラスコ中で１００ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した。反応物に、１．９グラムの１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．２グラムの４−（ジメチル）アミノピリジンと共に加えた。ヒートガンを使用して反応物を加熱し、試薬が溶解して溶液が透明となるまで撹拌した。反応物を一晩（１２時間）撹拌した。１２時間後、反応混合物は結晶のスラリーであった。結晶を、中型焼結ガラス漏斗を通した濾過によって単離した。生成物を冷たいアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。ＴＬＣ分析によって、生成物は５．９７グラムの生成物（１００％）を生じさせる単一の種であることを確認した。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって、生成物をＭ＋１，５９８．１２ｍ／ｅの質量を有する５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−チオノイミダゾールであると確認した。生成物を１００ｍｌの無水アセトニトリルに懸濁させた。反応混合物に、１１ｍｍｏｌのＮ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（Ａｌｄｒｉｃｈ）、１５ｍｍｏｌのジイソプロピルエチルアミンおよび１．１ｍｍｏｌの４−（ジメチル）アミノピリジンを加えた。ヒートガンを使用して反応物を加熱し、試薬を溶解させ、透明な溶液を得た。混合物を栓でふさぎ、１２時間撹拌した。１２時間後、反応混合物を油となるまで蒸発させ、真空下で乾燥させた。ＴＬＣ分析によって、生成物は５．９グラムの生成物を生じさせる単一の種であることを確認した。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって、生成物をＭ＋１、５９０．２４ｍ／ｅの質量を有する５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミノチオノカルバメートであると確認した。フッ化水素−ピリジン錯体（ＨＦ：Ｐｙ７：３、７ｍＬ）を、氷冷のピリジン（８ｍＬ）のアセトニトリル（４６．５ｍＬ）溶液に注意深く加えた。次いで、このように形成されたピリジン−ＨＦ試薬（３２ｍＬ）を、５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミノチオノカルバメートで保護されたウリジン（１０ｍｍｏｌｅ）を有するフラスコに移し、混合物を室温で２時間撹拌した。反応物を、水（３００ｍＬ）中の塩化カルシウムの５％溶液でクエンチした。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し（３〜５回）、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、有機層を粘性油となるまで濃縮し、ＴＬＣによって単一のスポットとして示される３．１グラム（８６％収率）の生成物（ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によってＭ＋１，３４８．０９ｍ／ｅの質量を有する２’−Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミノチオノカルバメートで保護されたウリジンの確認された同一性を有する）を得た。２’−Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミノチオノカルバメートで保護されたウリジン（８．７ｍｍｏｌｅ）を無水ＴＨＦ（９０ｍＬ）に再溶解し、２，４，６−コリジン（６１ｍｍｏｌｅ）およびジメトキシトリチルクロリド（１０．０ｍｍｏｌｅ）を加え、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ９：１）がヌクレオシド基質（１６〜２４時間）の完全な消失を示すまで混合物を室温で撹拌した。２，４，６−コリジン（９．０ｍｍｏｌｅ）および１−メチルイミダゾール（４．５ｍｍｏｌｅ）を一度に加え、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミド酸クロリド（２２ｍｍｏｌ）を反応混合物に１０〜１５分間にわたりゆっくりと加えた。次いで、反応混合物をさらに２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物を、ＥｔＯＡｃ（０〜５０％）のグラジエントと共にヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０２１７】
Ｄ．  ５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイト−２’−Ｏ−フェニルアミノチオノカルバメートウリジンの合成
３’−５’−テトライソプロピルジシロキサンウリジン（ＣｈｅｍｅＧｅｎｅｓ）、１０ｍｍｏｌ（４．８グラム）を、セラムストッパーを備えた５００ｍｌの丸底フラスコ中の１００ｍｌの無水アセトニトリルに溶解した。反応物に、１．９グラムの１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．２グラムの４−（ジメチル）アミノピリジンと共に加えた。ヒートガンを使用して反応物を加熱し、試薬が溶解して溶液が透明となるまで撹拌した。反応物を一晩（１２時間）撹拌した。１２時間後、反応混合物は結晶のスラリーであった。結晶を、中型焼結ガラス漏斗を通した濾過によって単離した。生成物を冷たいアセトニトリルで洗浄し、真空下で乾燥させた。ＴＬＣ分析によって、生成物は５．９７グラムの生成物（１００％）を生じさせる単一の種であることを確認した。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって、生成物をＭ＋１，５９８．１２ｍ／ｅの質量を有する５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−チオノイミダゾールであると確認した。生成物を１００ｍｌの無水アセトニトリルに懸濁させた。反応混合物に、１１ｍｍｏｌのアニリン（Ａｌｄｒｉｃｈ）、および１１ｍｍｏｌの４−（ジメチル）アミノピリジンを加えた。反応物に還流凝縮器を適合させ、１２時間加熱還流した。１２時間後、反応混合物を油へと蒸発させて、真空下で乾燥させた。生成物は、２．２−アンヒドロウリジンと共に約８０％収率で存在することがＴＬＣ分析によって確認された。生成物を、メタノール／塩化メチレングラジエント（０〜５％）を使用してシリカゲル上で精製した。ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によって、生成物をＭ＋１，６２１．３３ｍ／ｅの質量を有する５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−フェニルアミノチオノカルバメートであると確認した。フッ化水素−ピリジン錯体（ＨＦ：Ｐｙ  ７：３、７ｍＬ）を、氷冷のピリジン（６．５ｍＬ）のアセトニトリル（３７．２ｍＬ）溶液に注意深く加えた。次いで、このように形成されたピリジン−ＨＦ試薬（２５ｍＬ）を、５’，３’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミノチオノカルバメートで保護されたウリジン（８ｍｍｏｌｅ）を有するフラスコに移し、混合物を室温で２時間撹拌した。反応物を、水（３００ｍＬ）中の塩化カルシウムの５％溶液でクエンチした。粗生成物をＥｔＯＡｃで抽出し（３〜５回）、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、有機層を粘性油となるまで濃縮し、ＴＬＣによって単一のスポットとして示される２．４グラム（８１％収率）の生成物（ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析によってＭ＋１，３７９．１８ｍ／ｅの質量を有する２’−Ｏ−フェニルアミノチオノカルバメートで保護されたウリジンの確認された同一性を有する）を得た。２’−Ｏ−フェニルアミノチオノカルバメートで保護されたウリジン（６．４ｍｍｏｌｅ）を無水ＴＨＦ（６５ｍＬ）に再溶解し、２，４，６−コリジン（４５ｍｍｏｌｅ）およびジメトキシトリチルクロリド（８．０ｍｍｏｌｅ）を加え、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ９：１）がヌクレオシド基質（１６〜２４���間）の完全な消失を示すまで混合物を室温で撹拌した。２，４，６−コリジン（６．４ｍｍｏｌｅ）および１−メチルイミダゾール（３．２ｍｍｏｌｅ）を一度に加え、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホンアミド酸クロリド（１６ｍｍｏｌ）を反応混合物に１０〜１５分間にわたりゆっくりと加えた。次いで、反応混合物をさらに２時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、粗生成物を、ＥｔＯＡｃ（０〜５０％）のグラジエントと共にヘキサンを使用してカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【０２１８】
Ｖ．  固体支持体上のオリゴウリジン合成のための一般手順
標準的ＲＮＡサイクルによってＧｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈからのｄＴ−Ｑ−ＣＰＧカラムを使用して１マイクロモルスケールで全ての合成を行った。カップリングステップのために、ホスホラミダイトおよびテトラゾールを合成カラムに送達し、１０分間置いた。
【０２１９】
全ての合成ステップの完了後、ホスフェート部分上のメチル保護基を除去するために、オリゴリボヌクレオチド（まだＣＰＧに結合している）を二ナトリウム２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートのＤＭＦ（１ｍＬ）溶液（１Ｍ）で３０分間室温にて処理し、次いで水、その後アセトニトリルによって洗浄し、アルゴンによって乾燥させた。
【０２２０】
２’−保護されたオリゴヌクレオシドを含有するチオノカルバメートについて、シアノエチルホスフェート保護基を、無水アセトニトリル中の２０％ジエチルアミンを使用して室温にて１時間で切断することができる。
【０２２１】
オリゴマーを固体支持体から切断し、ＴＨＦ（１ｍＬ）中のＴＢＡＦ溶液（１Ｍ）による処理によって２’−脱保護した。ＴＢＡＦ溶液は５％未満の水分含有率で乾燥させなければならないことに留意するのが重量である。Ｕ４Ｔ五量体について、脱保護は１時間（ＥＳＣ保護）および６時間（ＢＳＣ保護）以内に完了した。
【０２２２】
０．１ＭのＴＥＡＡで反応物をクエンチし、標準的手順を使用してＰｏｌｙ−ｐａｋカートリッジ上で乾燥させ、蒸発乾固させた。このように得られた反応生成物を水に溶解し、ＨＰＬＣによって分析した［ＯＤＳ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（５ｍ）、カラム４．０×２５０、流量１．５ｍＬ／ｍｉｎ、５０ｍＭのＴＥＡＢ中の０〜２０％ＭｅＣＮ（直線勾配）、４０分間］。
【０２２３】
場合によっては、オリゴマーを、ＴＥＭＥＤ／ＨＦ／ＭｅＣＮ混合物（２：１：７、１ｍＬ）で室温にて４０分間処理することによって、（２’−脱保護を行わずに）固体支持体から切断した。上記のように、反応物をクエンチし、脱塩、分析した。
【０２２４】
チオノカーボネートおよびチオノカルバメート保護基について、無水アミンを使用して、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、脱保護した。典型的な条件は、８０ｐｓｉの無水アンモニアガス、室温、６〜２４時間；３０ｐｓｉの無水メチルアミン、室温、１〜６時間；アンモニアを無水アセトニトリルに溶解、６〜２４時間；エチレンジアミンをフェノールに溶解、６〜１２時間；１、３−プロパンジアミン、未希釈、４〜１６時間、モルホリン、未希釈、１６〜４８時間；無水アセトニトリル中のヒドロキシメチルアミン、４〜１２時間であった。
【０２２５】
気体状アミンを排気し、固体支持体を無水アルゴンガス流で洗浄した。次いで、固体支持体を真空下に２〜１２時間置き、次いで緩衝化した水溶液を使用してオリゴヌクレオチドを支持体からすすぎ、ＨＰＬＣによって分析した［ＯＤＳ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（５ｍ）、カラム４．０×２５０、流量１．５ｍＬ／ｍｉｎ、５０ｍＭのＴＥＡＢ中の０〜２０％ＭｅＣＮ（直線勾配）、４０分間］。無水溶媒に溶解した無水未希釈アミンまたはアミンを、３〜１０容のアセトニトリルを使用して支持体からすすいだ。このように得られた支持体を無水アルゴンガス流で洗浄した。次いで、固体支持体を真空下に２〜１２時間置き、次いで緩衝化した水溶液を使用してオリゴヌクレオチドを支持体からすすぎ、ＨＰＬＣによって分析した［ＯＤＳ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（５ｍ）、カラム４．０×２５０、流量１．５ｍＬ／ｍｉｎ、５０ｍＭのＴＥＡＢ中の０〜２０％ＭｅＣＮ（直線勾配）、４０分間］。
【０２２６】
ＶＩ．  固体支持体上の３’−ＴＵ（２’ＥＳＣ）ＣＰＯＣ（２’ＥＳＣ）ＡＰＯＣ（２’ＥＳＣ）−ＣＰＯＣ（２’ＥＳＣ）ＡＰＯＣ（２’ＥＳＣ）の混合配列の合成
標準的ＲＮＡサイクルによってＧｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈからのｄＴ−Ｑ−ＣＰＧカラムを使用して１マイクロモルスケールで合成を行った。カップリングステップのために、ホスホラミダイトおよびテトラゾールを合成カラムに送達し、１０分間置いた。
【０２２７】
このオリゴリボヌクレオチド合成において使用されるホスホラミダイトは、Ｕ２’ＥＳＣ２’Ｏ−エチル−チオカルボニル５’−Ｏ−ＤＭＴ３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトウリジン；ＣＰＯＣ２’ＥＳＣ（２’Ｏ−エチルチオカルボニル５’−Ｏ−ＤＭＴ３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトＮ４−フェニルオキシカルボニルシチジン）およびＡＰＯＣ２’ＥＳＣ２’Ｏ−エチルチオカルボニル５’−Ｏ−ＤＭＴ３’−Ｏ−［メチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホラミダイトＮ４−フェニルオキシカルボニルシチジン）であった。
【０２２８】
全ての合成ステップの完了後、およびホスフェート部分上のメチル保護基を除去するために、オリゴリボヌクレオチド（まだＣＰＧに結合している）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の二ナトリウム２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレートの１Ｍの溶液で３０分間室温にて処理し、次いでＤＭＦ、次にメタノール、次にアセトニトリルで洗浄し、アルゴンによって乾燥させた。
【０２２９】
オリゴマーを固体支持体から切断し、ＴＨＦ（１ｍＬ）中のＴＢＡＦ溶液の１Ｍの溶液による一晩の処理によって２’−脱保護し、それに１０％（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ中のＴＢＡＯＨ（１Ｍ）を加えた。
【０２３０】
０．１ＭのＴＥＡＡで反応物をクエンチし、標準的手順を使用してＰｏｌｙ−ｐａｋカートリッジ上で脱塩し、蒸発乾固させた。このように得られた反応生成物を水に溶解し、ＨＰＬＣによって分析した［ＯＤＳ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（５ｍ）、カラム４．０×２５０、流量１．５ｍＬ／ｍｉｎ、５０ｍＭのＴＥＡＢ中の０〜２０％ＭｅＣＮ（直線勾配）、４０分間］。
【０２３１】
ＶＩＩ．  脱保護
ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリドの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、４．３％であると見出した。−６０℃での溶液の１９Ｆ  ＮＭＲを使用して、１０％でのビフルオリド濃度を決定した。溶液を無水水酸化ナトリウムペレット上で９日間保存すると、水分含有率は３．１％に下がり、ビフルオリド含量は１％に下がった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を１時間で脱保護することが示された。
【０２３２】
ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリドの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、４．３％であると見出した。溶液の１９Ｆ  ＮＭＲを使用して、１０％でのビフルオリド濃度を決定した。溶液を無水炭酸カリウム上で９日間保存すると、水分含有率は３．７％に下がり、ビフルオリド含量は０％に下がった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を１．５時間で脱保護することが示された。
【０２３３】
ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリドの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、４．３％であると見出した。−６０℃での溶液の１９Ｆ  ＮＭＲを使用して、１０％でのビフルオリド濃度を決定した。水１０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。水の最終濃度は、カールフィッシャー滴定によって１２％、および１９Ｆ  ＮＭＲを使用してビフルオリド０％であった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を３時間で脱保護することが示された。
【０２３４】
ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリドの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、４．３％であると見出した。溶液の１９Ｆ  ＮＭＲを使用して、１０％でのビフルオリド濃度を決定した。メタノール１０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。水の最終濃度は、カールフィッシャー滴定によって３．２％、および１９Ｆ  ＮＭＲを使用してビフルオリド０％であった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を４５分間で脱保護することが示された。
【０２３５】
ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリドの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、４．３％であると見出した。溶液の１９Ｆ  ＮＭＲを使用して、１０％でのビフルオリド濃度を決定した。メタノール２０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。水の最終濃度は、カールフィッシャー滴定によって３．４％、１９Ｆ  ＮＭＲを使用してビフルオリド０％であった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を３０分間で脱保護することが示された。
【０２３６】
ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムブロミドの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、１．８％であると見出した。水１０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。この溶液は、ＲＮＡ五量体を１．２時間で脱保護することが示された。
【０２３７】
ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムブロミドの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、１．８％であると見出した。水２０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。この溶液は、ＲＮＡ五量体を４５分間で完全に脱保護することが示されたが、いくらかの分解生成物があった。
【０２３８】
ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムブロミドの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、１．８％であると見出した。メタノール２０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。水の最終濃度は、カールフィッシャー滴定によって２．１％であった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を３０分間で脱保護することが示された。
【０２３９】
ＴＨＦ中の酢酸テトラブチルアンモニウムの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、２．２％であると見出した。メタノール２０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。水の最終濃度は、カールフィッシャー滴定によって２．４％であった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を３０分間で脱保護することが示された。
【０２４０】
ジオキサン中の酢酸テトラブチルアンモニウムの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、１．８％であると見出した。メタノール２０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。水の最終濃度は、カールフィッシャー滴定によって２．１％であった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を１．５時間で脱保護することが示された。
【０２４１】
アセトニトリル中の酢酸テトラブチルアンモニウムの１．０モル溶液を、カールフィッシャー滴定によって水分含有率について分析し、１．６％であると見出した。メタノール２０％中の水酸化テトラブチルアンモニウム１．０モル（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を、この溶液に加えた。水の最終濃度は、カールフィッシャー滴定によって１．８％であった。この溶液は、ＲＮＡ五量体を３０分間で脱保護することが示された。
【０２４２】
Ａ．  ２’−エチルチオカーボネートで保護された化合物上のＤＭＳＯ中のＴＢＡＦを使用したＲＮＡオリゴヌクレオチドの脱保護
ＴＵ２０
ＨＰＬＣ
分析
【表２】
0005520818.tif 000042
ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ質量分析
【表３】
0005520818.tif 000043
Ｍ（測定値）：６３６４．０
Ｍ（Ｕ２０Ｔ、計算された最も強いピーク）：６３６４．６
【表４】
0005520818.tif 000044
ＴＵ４０
ＨＰＬＣ分析
【表５】
0005520818.tif 000045
【０２４３】
Ｂ．  アンモニアガスを使用したＴＵ４２’−チオノカルバメートの脱保護
２’−チオノモルホリノカルバメート
【化４０】
0005520818.tif 000046
８０ｐｓｉでのアンモニアガスによる処理
ＨＰＬＣ分析
【表６】
0005520818.tif 000047
ＥＳＩ−トラップ質量分析
【表７】
0005520818.tif 000048
気体メチルアミン（３０ｐｓｉ）による処理
ＨＰＬＣ分析
【表８】
0005520818.tif 000049
ＥＳＩ−トラップ質量分析
【表９】
0005520818.tif 000050
【０２４４】
Ｃ．  ２’−チオノチオモルホリノ−１，１−ジオキシドカルバメート
【化４１】
0005520818.tif 000051
８０ｐｓｉでのアンモニアガスによる処理
ＨＰＬＣ分析
【表１０】
0005520818.tif 000052
ＥＳＩ−トラップ質量分析
【表１１】
0005520818.tif 000053
３０ｐｓｉでの気体メチルアミンによる処理
ＨＰＬＣ分析
【表１２】
0005520818.tif 000054
ＥＳＩ−トラップ質量分析
【表１３】
0005520818.tif 000055
【０２４５】
略語
本開示では、下記の略語は下記の意味を有する。定義されていない略語は、それらの一般に受け入れられる意味を有する。
℃＝摂氏温度
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分
ｓｅｃ＝秒
μＭ＝マイクロモル
ｍＭ＝ミリモル
Ｍ＝モル
ｍｌ＝ミリリットル
μｌ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
μｇ＝マイクログラム
ＤＭＡＰ＝４，４’−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＴ＝ジメトキシトリチル
ＮＭＩ＝Ｎ−メチルイミダゾール
ＴＢＡＦ＝フッ化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＡＯＨ＝水酸化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＡＡ＝酢酸テトラブチルアンモニウム
ＴＢＡＢ＝臭化テトラブチルアンモニウム
ＴＢＤＭＳ＝ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル
ＴＩＰＳ＝１，３−テトライソプロピルジシロキサン
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ＴＥＡＡ＝酢酸トリエチルアンモニウム
ＴＥＡＢ＝炭酸水素トリエチルアンモニウム
ＴＥＭＥＤ＝Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン
ＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー
【０２４６】
文献
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Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．２：４３−５５  （１９９３）．
Ｒｅｅｓｅ  ＣＢ，  Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３（２１）：３８５１−６８  （２００５）．
Ｓａｋａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７：８７１７−  ８７２８  （１９９１）．
Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １８（１８）：５４３３−５４４１  （１９９０）．
Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５（１９８７）．
【０２４７】
理解を明確にする目的のために上記の発明を説明および例として少し詳しく説明してきたが、本発明の教示の観点から、添付の特許請求の趣旨または範囲を逸脱することなく、一定の変化および修飾をそれに対して行い得ることは当業者には容易に明らかである。
【０２４８】
したがって、上記は、本発明の原理を単に例示する。当業者であれば、本明細書において明示的に記載または示していないが、本発明の原理を具体化し、その精神および範囲内に含まれる様々な組合せを考案することができるであろうことを理解されたい。さらに、本明細書において記載された全ての例および条件的な言語は、本発明の原理および当該技術を推進するために本発明者らが寄与する概念の理解において読者の助けとなることを主として目的としており、このように明確に列挙した例および条件に限定されるものではないと解釈される。さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体例を列挙した本明細書における全ての記述は、その構造的および機能的両方の等価物を包含することを意図する。さらに、このような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物、すなわち、構造に関わらず同じ機能を遂行する開発された任意の要素の両方を含むことを意図する。したがって、本発明の範囲は、本明細書に示され記載された例示的な実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本発明の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化されている。