(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応するケトンの還元による、式Ia又はIbの光学活性アルコール
【化１】
0005503534.tif 000009
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２はアルキル、アルケニル、アリール又はアルキルアリール基であり、これら自身はアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ２、ＯＨ、ＯＲ２、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯ、ＣＯＯＲ２、ＮＲ２Ｒ３又はＮＲ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘで１回以上置換されていてよく、ここで、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は互いに独立して、Ｈ又は低級アルキル若しくは低級アルコキシ基であり、そしてＸ−は対イオンであり、但し、Ｒ１はＲ２に等しくないものとする〕の製造方法であって、該還元が、配列番号２のポリペプチド配列を有する脱水素酵素を用いて、又はアミノ酸残基の５％までが欠失、挿入、置換若しくはそれらの組み合わせにより配列番号２と比べて変更されているポリペプチド配列を有する脱水素酵素を用いて行われる上記方法。
【請求項２】
脱水素酵素が宿主生物において組み換え発現され、そして反応溶液がこの宿主生物と共にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主生物が前もって殺されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
還元が２０〜４０℃の温度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
還元された補因子が前記酵素それ自身により再生されるか、或いは、グルコース脱水素酵素、亜リン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素又は別のアルコール脱水素酵素が補因子再生系として使用される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式 Ia 又は Ib の光学活性アルコールの製造方法に関する。
【化１】
0005503534.tif 000002
【背景技術】
【０００２】
生体触媒としての脱水素酵素の機能は一般に知られている [Chemico-Biological Interactions (2003) 143:247、Journal of Biological Chemistry (2002) 277:25677]。特に、ファインケミカルを製造するためのこの酵素クラスの工業的使用は文書化されている [Tetrahedron (2004) 60:633、Trends Biotechnol (1999) 17:487]。公知の脱水素酵素は、それらの活性及び特異性が基質に応じて異なる。それらは、それらの立体選択性により、いわゆる「プレログ」及び「アンチ」−プレログ酵素に区別される (Pure and Applied Chemistry, (1964), 9:119)。
【０００３】
このように、光学活性フェニルエタノール誘導体を製造するために記載されている生体触媒は主として「プレログ」選択性を示すものであり、反対のエナンチオ選択性を示す触媒は知られていなくもないが、より稀であろう [Trends Biotechnol (1999) 17:487、J. Org. Chem. (1992) 57:1532]。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、対応するケトンの還元による、式 Ia 又は Ib の光学活性アルコール
【化２】
0005503534.tif 000003
【０００５】
〔式中、
Ｒ１、Ｒ２はアルキル、アルケニル、アリール又はアルキルアリール基であり、これら自身はアルキル、ハロゲン、ＳＨ、ＳＲ２、ＯＨ、ＯＲ２、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯ、ＣＯＯＲ２、ＮＲ２Ｒ３又はＮＲ２Ｒ３Ｒ４＋Ｘで１回以上置換されていてよく、ここで、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は互いに独立して、Ｈ又は低級アルキル若しくは低級アルコキシ基であり、そしてＸ−は対イオンであり、但し、Ｒ１はＲ２に等しくないものとする〕
の製造方法であって、該還元が、配列番号２若しくは番号４のポリペプチド配列を有する脱水素酵素を用いて、又はアミノ酸残基の２５％までが欠失、挿入、置換又はそれらの組み合わせにより配列番号２若しくは番号４と比べて変更されているポリペプチド配列を用いて行われる上記方法に関する。
【０００６】
本発明の特に良好な実施形態は、Ｒ１がＣ１−Ｃ１０−アルキルであり、そしてＲ２がフェニルであり、ここで、基Ｒ１及び／又はＲ２が任意によりハロゲンで一置換されている式 Ia 又は Ib の光学活性アルコールの製造方法からなる。
【０００７】
本発明は特に、基Ｒ１がＲ２よりも嵩が小さい式 Ia の光学活性アルコールの製造方法に関する。
【化３】
0005503534.tif 000004
【０００８】
Ｒ２基がＲ１基よりも嵩が大きいならば、そのアルコールは、Prelog, V., Pure and Applied Chemistry, (1964), 9, 119-130 により、「アンチ」−プレログのカテゴリーに割り当てられる。
【０００９】
キラルアルコールは、それらの立体配置に基づいて、いわゆる「プレログ」及び「アンチ−プレログ」鏡像体に区別することができる。二つのカテゴリーの一方への割り当ては、アルコール基に隣接する二つの基の大きさ（嵩）、及びこれら二つの基に対するヒドロキシ官能基のアラインメントにより行われる。「アンチ−プレログ」立体配置を有する光学活性アルコールは、種々の活性成分の重要な前駆体である。
【００１０】
〔一般用語及び定義〕
別に指示しない限り、以下の一般的な意味が適用される：
「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素、特にフッ素又は塩素を表す。
【００１１】
「低級アルキル」は、１〜６個のＣ原子を有する直鎖状又は分枝状のアルキル基、例えばメチル、エチル、ｉ−又はｎ−プロピル、ｎ−、ｉ−、ｓｅｃ−又はｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル又は２−メチルブチル、ｎ−ヘキシル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルブチルを表す。
【００１２】
「低級アルケニル」は、単不飽和又は多不飽和の、好ましくは単不飽和又は二不飽和の、２〜６個の炭素原子を有する上記のアルキル基の類似体であって、二重結合が炭素鎖の任意の位置に存在していてよいものを表す。
【００１３】
「低級アルコキシ」は、上記のアルキル基の酸素末端類似体を表す。
【００１４】
「アリール」は、単核又は多核の、好ましくは単核又は二核の、任意により置換された芳香族基、特にフェニル又は任意の環の位置を介して結合するナフチル、例えば１−又は２−ナフチルを表す。これらのアリール基は、任意により１又は２個の同一の又は異なる置換基、例えば上記で定義されたハロゲン、低級アルキル、低級アルコキシ、又はトリフルオロメチルを有していてよい。
【００１５】
「エナンチオ選択性」は、本発明の文脈において、二つの可能な鏡像体の一方の鏡像体過剰率ｅｅ（％単位）が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％、特に少なくとも９０％、とりわけ少なくとも９５％であることを意味する。
【００１６】
ｅｅ（％）＝  鏡像体Ａ−鏡像体Ｂ／（鏡像体Ａ＋鏡像体Ｂ）×１００
〔生化学的実施形態〕
特に適する脱水素酵素 (EC 1.1.X.X) は、特にＮＡＤ−又はＮＡＤＰ−依存性脱水素酵素 (E.C. 1.1.1.x)、とりわけケトンから「アンチ−プレログ」アルコールへの選択的還元をもたらすアルコール脱水素酵素 (E.C.1.1.1.1 又は E.C.1.1.1.2) である。脱水素酵素は、好ましくは何れの場合にも株の収集機関に寄託されている微生物、特に好ましくは細菌、真菌、特に酵母から得られるか、又は自然源、例えば土壌サンプル、バイオマスサンプル等から、又はデノボ遺伝子合成により得ることができる。
【００１７】
脱水素酵素は、精製若しくは部分精製された形態で、又は脱水素酵素を発現する元の微生物若しくは組み換え宿主生物の形態で使用することができる。微生物から脱水素酵素を得る方法及び精製する方法は、例えば K. Nakamura & T. Matsuda, “Reduction of Ketones” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim から、当業者によく知られている。脱水素酵素を生成するための組み換え方法もまた、例えば W. Hummel, K. Abokitse, K. Drauz, C. Rollmann and H. Groger, Adv. Synth. Catal. 2003, 345, No. 1 + 2, pp. 153-159 から公知である。
【００１８】
適切な細菌は、例えばバークホルデリア目 (Burkholderiale)、ヒドロゲノフィラ目 (Hydrogenophilale)、メチロフィラ目 (Methylophilale)、ナイセリア目 (Neisseriale)、ニトロソモナダ目 (Nitrosomonadale)、プロカバクテリア目 (Procabacteriales) 又はロドシクラ目 (Rhodocyclale) のものである。
【００１９】
特に好ましい脱水素酵素は、ロドシクラセアエ科 (Rhodocyclaceae) に由来するものである。
【００２０】
特に好ましい脱水素酵素は、アゾアルクス (Azoarcus)、アゾネクサス (Azonexu)、アゾスピラ （Azospira)、アゾビブリオ (Azovibrio)、デクロロモナス (Dechloromonas)、フェリバクテリウム (Ferribacterium)、ペトロバクター (Petrobacter)、プロピノビブリオ (Propionivibrio)、クアドリコッカス (Quadricoccus)、ロドシクルス (Rhodocyclus)、ステローリバクテリウム (Sterolibacterium)、タウエラ (Thauera) 及びズーグロエア (Zoogloea) の属に由来する。
【００２１】
とりわけ好ましい脱水素酵素は、アゾアルクス属の種に由来する。
【００２２】
脱水素酵素を用いる還元は、普通は補因子（補基質とも呼ばれる）の存在下に行われる。ケトンの還元のために普通に用いられる補因子は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨである。そのほかに、脱水素酵素は本質的に補因子を含む細胞系として用いることが可能であり、又は代替の酸化還元メディエータを加えることができる (A. Schmidt, F. Hollmann and B. Buehler “Oxidation of Alcohols” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim)。
【００２３】
脱水素酵素を用いる還元は、普通は、還元の間に酸化された補因子を再生する適切な還元剤の存在下に行われる。
【００２４】
適切な還元剤の例は、糖類、特にヘキソース、例えばグルコース、マンノース、フルクトース、及び／又は酸化性アルコール、特にエタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール又はイソプロパノール、及びギ酸塩、亜リン酸塩又は分子状水素である。還元剤を酸化するために、またこれに関して補酵素を再生するために、第二の脱水素酵素、例えば、還元剤としてグルコースが用いられる場合にはグルコース脱水素酵素、還元剤として亜リン酸塩が用いられる場合には亜リン酸脱水素酵素、又は還元剤としてギ酸塩が用いられる場合にはギ酸脱水素酵素等を用いることが可能である。この脱水素酵素は、遊離若しくは固定化酵素として、又は遊離若しくは固定化細胞の形態で用いることができる。それらの製造は、個別に又は（組み換え）脱水素酵素株における同時発現によって可能である。
【００２５】
本発明により用いられる脱水素酵素は、遊離型で又は固定化して使用することができる。固定化酵素は、不活性担体に固定化されている酵素を意味する。適切な担体材料及びその上に固定化される酵素は、EP-A-1149849、EP-A-1069183 及び DE-A 100193773、並びにそれらで引用されている文献に開示されている。これに関して、これらの刊行物の開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。適切な担体材料は、例えば粘土、粘土鉱物、例えばカオリン、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉末、陰イオン交換体材料、合成高分子、例えばポリスチレン、アクリル樹脂、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、ポリウレタン、並びにポリオレフィン、例えばポリエチレン及びポリプロピレンを包含する。担体材料は、普通は、担体に結合した酵素を製造するために微粉化粒状形態で用いられ、多孔質形態が好ましい。担体材料の粒径は、普通は、５ｍｍ以下、特に２ｍｍ以下である（粒度曲線）。脱水素酵素を全細胞触媒として使用する際に、同様に遊離又は固定化形態を選択することが可能である。担体材料の例は、アルギン酸Ｃａ及びカラギーナンである。酵素及び細胞の両者は、グルタルアルデヒドで直接架橋されていてもよい(架橋はＣＬＥＡを与える)。対応する及び更なる固定化方法は、例えば J. Lalonde and A. Margolin “Immobilization of Enzymes” in K. Drauz and H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002, Vol.III, 991-1032, Wiley-VCH, Weinheim に記載されている。
【００２６】
反応は、水性若しくは非水性の反応媒質中で、又は２相系又は（マイクロ）エマルジョンの中で行うことができる。水性反応媒質は好ましく緩衝溶液であり、これらは通常４〜８、好ましくは５〜８のｐＨを有する。水性溶剤は、水のほかに、少なくとも一つのアルコール、例えばエタノール若しくはイソプロパノール、又はジメチルスルホキシドを追加して含むことができる。
【００２７】
非水性反応媒質は、反応媒質の全重量に基づいて１重量％未満、好ましくは０．５重量％未満の水を含む反応媒質を意味する。反応は好ましくは有機溶剤中で行われる。適切な溶剤の例は、脂肪族炭化水素、好ましくは５〜８個の炭素原子を有するもの、例えばペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン、オクタン若しくはシクロオクタン、ハロゲン化脂肪族炭化水素、好ましくは１又は２個の炭素原子を有するもの、例えばジクロロメタン、クロロホルム、テトラクロロメタン、ジクロロエタン若しくはテトラクロロエタン、芳香族炭化水素、例えばベンゼン、トルエン、キシレン類、クロロベンゼン若しくはジクロロベンゼン、脂肪族の非環式及び環式エーテル又はアルコール、好ましくは４〜８個の炭素原子を有するもの、例えばジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、エチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、テトラヒドロフラン、又はエステル、例えば酢酸エチル若しくは酢酸ｎ−ブチル、又はケトン、例えばメチルイソブチルケトン、又はジオキサン、又はそれらの混合物である。
【００２８】
脱水素酵素を用いる還元は、例えば水性−有機性の、特に水性の反応媒質中で行われる。
【００２９】
還元されるべきケトンは、酵素還元において０．１ｇ／ｌ〜５００ｇ／ｌ、特に好ましくは１ｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられ、そして連続的又は非連続的に供給することができる。
【００３０】
酵素的還元は、通常、用いられる脱水素酵素の失活温度未満の反応温度で、好ましくは少なくとも−１０℃で行われる。反応温度は、特に好ましくは０〜１００℃、特に１５〜６０℃、具体的には２０〜４０℃の範囲、例えば約３０℃である。
【００３１】
可能な手順は、例えば、ケトンを脱水素酵素、溶剤、及び望ましいならば補酵素、望ましいならば補酵素を再生するための第二の脱水素酵素及び／又は更なる還元剤と、例えば攪拌又は振盪により十分に混合することである。しかしながら、脱水素酵素を反応器に、例えばカラムに固定化し、そしてケトン、及び望ましいならば補酵素及び／又は補基質を含む混合物を反応器に通すことも可能である。この目的のために、混合物を望ましい変換に達するまで反応器に通すことができる。この場合、ケトンのケト基はＯＨ基に還元されて、アルコールの二つの鏡像体の実質的に一方が生成する。還元は、普通は、混合物に存在するケトンに基づいて、少なくとも７０％、特に好ましくは少なくとも８５％、とりわけ少なくとも９５％になるまで行われる。この場合に反応の進行、すなわちケトンの逐次的還元は、従来法、例えばガスクロマトグラフィー又は高速液体クロマトグラフィーにより追跡することができる。
【００３２】
本発明の方法に用いられる脱水素酵素は、特に好ましくは下記の特性を有するアルコール脱水素酵素である：
配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するアゾアルクス由来のアルコール脱水素酵素、及び配列番号２又は番号４と比べてアミノ酸残基の２５％まで、好ましくは１５％まで、特に好ましくは１０％まで、とりわけ５％までが、欠失、挿入、置換又はそれらの混合により変更されているアミノ酸配列を有するアルコール脱水素酵素。
【００３３】
ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋の同時還元を伴って、簡単なアルコール、例えばイソプロパノール、ブタン−２−オール、ペンタン−２−オール又はシクロヘキサノール等を対応するカルボニルに酸化するもの。
【００３４】
還元を少なくとも９５％ｅｅの鏡像体純度で触媒するアルコール脱水素酵素（ＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの存在下；３０℃及びｐＨ７．０）。
【００３５】
本発明は更に、上記の特性の少なくとも一つを有する「アンチ−プレログ」脱水素酵素にも関する。
【００３６】
アルコール脱水素酵素は次の溶剤：ヘプタン、ヘキサン、ＭｔＢＥ、ｎ−ブタノール、ブタン−２−オール、ｎ−ペンタノール、ペンタン−２−オール、ペンタン−３−オール、ＤＭＳＯ、ｉ−プロパノール，ｎ−プロパノール、エタノールの存在下に活性を示す。
【００３７】
それらは好ましくは２６±２キロダルトンの範囲の分子量を有する。
【００３８】
本発明の脱水素酵素の更なる修飾は以下のとおりである：
本発明は同様に、脱水素酵素活性を有する具体的に開示された酵素の「機能的同等物」、及び本発明の方法におけるそれらの使用を包含する。
【００３９】
具体的に開示された酵素の「機能的同等物」又は類似体は、本発明の文脈において、該酵素とは異なるが、それでもなお望ましい生物学的活性、例えば基質特異性等を有するポリペプチドである。従って、「機能的同等物」は、例えば、ケトンから対応する「アンチ−プレログ」アルコールに還元し、そして配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の一つを含む酵素の活性の少なくとも２０％、好ましくは５０％、特に好ましくは７５％、実に特に好ましくは９０％を有する酵素を意味する。機能的同等物は更に、好ましくはｐＨ４〜１０で安定であり、そして有利にはｐＨ５〜８の最適ｐＨ及び２０℃〜８０℃の範囲の最適温度を有する。
【００４０】
「機能的同等物」はまた、本発明によれば、特に、上記のアミノ酸配列の少なくとも一つの配列位置に、具体的に挙げられたもの以外のアミノ酸を有するが、それにもかかわらず上記の生物学的活性の一つを有する突然変異体を意味する。従って、「機能的同等物」は、１個以上のアミノ酸の付加、置換、欠失及び／又は反転により得ることのできる突然変異体を包含し、該修飾が本発明による特性プロフィールを有する突然変異体に導く限り、これらの修飾は任意の配列位置で行われていてよい。機能的同等物はまた、特に、反応性パターンが突然変異体と未修飾ポリペプチドとの間で質的に一致する場合に、すなわち例えば同一の基質が異なる速度で変換される場合に存在する。
【００４１】
適切なアミノ酸置換の例は、下記の表に見出すことができる：
元の残基        置換の例
Ａｌａ          Ｓｅｒ
Ａｒｇ          Ｌｙｓ
Ａｓｎ          Ｇｌｎ；Ｈｉｓ
Ａｓｐ          Ｇｌｕ
Ｃｙｓ          Ｓｅｒ
Ｇｌｎ          Ａｓｎ
Ｇｌｕ          Ａｓｐ
Ｇｌｙ          Ｐｒｏ
Ｈｉｓ          Ａｓｎ；Ｇｌｎ
Ｉｌｅ          Ｌｅｕ；Ｖａｌ
Ｌｅｕ          Ｉｌｅ；Ｖａｌ
Ｌｙｓ          Ａｒｇ；Ｇｌｎ；Ｇｌｕ
Ｍｅｔ          Ｌｅｕ；Ｉｌｅ
Ｐｈｅ          Ｍｅｔ；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ
Ｓｅｒ          Ｔｈｒ
Ｔｈｒ          Ｓｅｒ
Ｔｒｐ          Ｔｙｒ
Ｔｙｒ          Ｔｒｐ；Ｐｈｅ
Ｖａｌ          Ｉｌｅ；Ｌｅｕ
上記の意味での「機能的同等物」はまた、記載されたポリペプチドの「前駆体」、並びにこれらのポリペプチドの「機能的誘導体」及び「塩」である。
【００４２】
これに関して「前駆体」は、ポリペプチドの天然又は合成前駆体であって、望ましい生物学的活性を有するか又は有しないものである。
【００４３】
「塩」という用語は、本発明のタンパク質分子のカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩の両者を意味する。カルボキシル基の塩は、自体公知の方法で製造することができ、そして無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄及び亜鉛の塩等、並びに有機塩基、例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン等との塩等である。本発明はまた、酸付加塩、例えば無機酸、例えば塩酸又は硫酸等との塩、並びに有機酸、例えば酢酸及びシュウ酸との塩を包含する。
【００４４】
本発明のポリペプチドの「機能的誘導体」は同様に、機能的アミノ酸側基において、又はそれらのＮ若しくはＣ末端において、公知の技術を用いて製造することができる。当該誘導体は、例えばカルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニア又は第一級若しくは第二級アミンとの反応により得ることのできるカルボン酸基のアミド；アシル基との反応により製造される遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体；又はアシル基との反応により製造される遊離ヒドロキシ基のＯ−アシル誘導体を包含する。
【００４５】
タンパク質グリコシル化が可能な場合には、本発明の「機能的同等物」は、脱グリコシル化又はグリコシル化形態にある上記の型のタンパク質、及びグリコシル化パターンの変更により得ることのできる修飾形態を包含する。
【００４６】
「機能的同等物」はまた、もちろん、他の生物から得ることのできるポリペプチド、及び天然に存在する変異体を包含する。例えば、配列の比較により相同配列領域の範囲を確立し、そして本発明の特定の必要条件に基づいて同等の酵素を確認することができる。
【００４７】
「機能的同等物」は同様に、例えば、望ましい生物学的機能を有する本発明のポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメイン又は配列モチーフを包含する。
【００４８】
「機能的同等物」は更に、上記のポリペプチド配列又はそれらから誘導される機能的同等物の一つ、及びそれとは機能的に異なるが機能的なＮ又はＣ末端連結状態にある少なくとも一つの更なる異種配列を含む融合タンパク質である（すなわち、融合タンパク質の部分の相互の機能障害は無視できる）。当該異種配列の非限定的な例は、例えばシグナルペプチド又は酵素である。
【００４９】
本発明に包含される「機能的同等物」はまた、具体的に記載されたタンパク質の同族体である。これらは、Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448 のアルゴリズムにより計算して、具体的に開示されたアミノ酸配列の一つに対して少なくとも７５％、特に少なくとも特に８５％、例えば９０％、９５％、９７％又は９９％等の相同性を有する。本発明の相同性ポリペプチドのパーセント相同性は、特に、本明細書に具体的に記載されたアミノ酸配列の一つの全長に基づくアミノ酸残基のパーセント同一性を意味する。
【００５０】
本発明のタンパク質又はポリペプチドの同族体は、突然変異生成により、例えばタンパク質の点突然変異又は末端切断により作製することができる。
【００５１】
本発明のタンパク質の同族体は、突然変異体、例えば末端切断型突然変異体等のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングにより同定することができる。例えば、タンパク質変異体のまだらライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異生成により、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的結合により作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的同族体のプライマーを製造するために使用できる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で行うことができ、次いでこの合成遺伝子を適切な発現ベクターに結合することができる。遺伝子の縮重セットの使用は、一つの混合物中で潜在的タンパク質の望ましいセットをコードする全ての配列を与えることを可能にする。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は当業者に公知である（例えば、Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477）。
【００５２】
点突然変異又は末端切断により製造されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、及び選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡをスクリーニングするための幾つかの技術が当技術分野で公知である。これらの技術を、本発明の同族体のコンビナトリアル突然変異生成により作製された遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合させることができる。ハイスループット分析に付される大きい遺伝子ライブラリーのスクリーニングのために最も普通に使用される技術は、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローン化し、生成したベクターライブラリーで適切な細胞を形質転換し、そして遺伝子産物が検出されているその遺伝子をコードするベクターの検出が望ましい活性の検出によって容易にされる条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。再帰的アンサンブル突然変異体生成（ＲＥＭ）、ライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を増加させる技術は、同族体を同定するためにスクリーニング試験と組み合わせて使用することができる（Arkin and Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331）。
【００５３】
〔本発明の核酸配列のコーディングの更なる構成〕
本発明は、本発明に係る脱水素酵素活性を有する酵素をコードする核酸配列（一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ等）の使用に関する。好ましい核酸配列は、例えば配列番号２若しくは配列番号４に示されるアミノ酸配列又はそれらの特徴的部分配列をコードするか、又は配列番号１若しくは配列番号３に示される核酸配列又はそれらの特徴的部分配列を含む。
【００５４】
本明細書に記載される全ての核酸配列は、自体公知の方法で、ヌクレオチドビルディングブロックから化学合成により、例えば、二重らせんの個々のオーバーラップ相補的核酸ビルディングブロックのフラグメント縮合等により製造することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば公知の方法でホスホアミド化法により行うことができる（Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897）。合成オリゴヌクレオチドの付加及びＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いる間隙の充填及び結合反応、並びに一般的クローニング法は、Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press に記載されている。
【００５５】
本発明はまた、上記のポリペプチドの一つをコードする核酸配列（一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡ配列、例えばｃＤＮＡ及びｍＲＮＡ等）、及び例えば人工核酸類似体を用いて得ることのできるそれらの機能的同等物に関する。
【００５６】
本発明は、本発明のポリペプチド若しくはタンパク質又はそれらの生物学的に活性な部分をコードする単離核酸分子、並びに例えば本発明のコーディング核酸を同定又は増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーとしての用途に使用できる核酸断片に関する。
【００５７】
本発明の核酸分子は、コーディング遺伝子領域の３’及び／又は５’末端に由来する非翻訳配列を追加して含むことができる。
【００５８】
本発明は更に、具体的に記載されたヌクレオチド配列又はそれらの部分に相補的である核酸分子を包含する。
【００５９】
本発明のヌクレオチド配列は、他の細胞型及び生物における相同配列の同定及び／又はクローン化に使用できるプローブ及びプライマーの作製を可能にする。当該プローブ又はプライマーは、通常、「ストリンジェントな」条件下で（下記参照）、少なくとも約１２、好ましくは少なくとも約２５、例えば約４０、５０又は７５個等の、本発明の核酸配列のセンス鎖又は対応するアンチセンス鎖の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００６０】
「単離」核酸分子は、核酸の自然源に存在する他の核酸分子から分離され、そして更に、それが組み換え技術により製造されるならば、他の細胞物質若しくは培地が実質的に除去されていてよく、又はそれが化学的に合成されるならば、化学的前駆体若しくは他の化学物質が除去されていてよい。
【００６１】
本発明の核酸分子は、分子生物学の標準的技術により、そして本発明により提供される配列情報を用いて単離することができる。例えば、ｃＤＮＡは、具体的に開示された完全な配列の一つ又はそのセグメントをハイブリダイゼーションプローブとして用い、そして標準的ハイブリダイゼーション技術を用いて（例えば Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 に記載のようにして）、適切なｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。加えて、開示された配列の一つ又はそのセグメントを含む核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応により、この配列に基づいて構築されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単離することができる。この方法で増幅された核酸は、適切なベクターにクローン化することができ、そしてＤＮＡ配列分析により特性決定することができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、標準的合成法により、例えば自動ＤＮＡ合成装置を用いて製造することもできる。
【００６２】
本発明の核酸配列は、原則として全ての生物から同定及び単離することができる。本発明の核酸配列又はそれらの同族体は、真菌、酵母、古細菌又は細菌から有利に単離することができる。挙げることのできる細菌は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌である。本発明の核酸は、好ましくはグラム陰性菌、有利にはα−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリア又はγ−プロテオバクテリア、特に好ましくはバークホルデリアレス目（Burkholderiales）、ヒドロゲノフィラレス目（Hydrogenophilales）、メチロフィラレス目（Methylophilales）、ナイセリアレス目（Neisseriales）、ニトロソモナダレス目（Nitrosomonadales）、プロ化バクテリアレス目（Procabacteriales）又はロドシクラレス目（Rhodocyclales）の細菌に由来する。実に特に好ましくは、ロドシクラセアエ科（Rhodocyclaceae）の細菌に由来する。 特に好ましくは、アゾアルクス属（Azoarcus）に由来する。特に好ましくは、アゾアルクス・アンエーロビウス（Azoarcus anaerobius）、アゾアルクス・ブッケリイ（Azoarcus buckelii）、アゾアルクス・コムニス（Azoarcus communis）、アゾアルクス・エバンシイ（Azoarcus evansii）、アゾアルクス・インジゲンス（Azoarcus indigens）、アゾアルクス・トルクラスチクス（Azoarcus toluclasticus）、アゾアルクス・トルリチクス（Azoarcus tolulyticus）、アゾアルクス・トルボランス（Azoarcus toluvorans）、アゾアルクス sp.、アゾアルクス sp. 22Lin、アゾアルクス sp. BH72、アゾアルクス sp. CC-11、アゾアルクス sp. CIB、アゾアルクス sp. CR23、アゾアルクス sp. EB1、アゾアルクス sp. EbN1、アゾアルクス sp. FL05、アゾアルクス sp. HA、アゾアルクス sp. HxN1、アゾアルクス sp. mXyN1、アゾアルクス sp. PbN1、アゾアルクス sp. PH002、アゾアルクス sp. T 及びアゾアルクス sp. ToN1 の種に由来する。
【００６３】
アゾアルクス sp EbN1 に由来する脱水素酵素が特に好ましく用いられる。
【００６４】
本発明の核酸配列は、従来のハイブリダイゼーション法又はＰＣＲ技術により他の生物から、例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを通して単離することができる。これらのＤＮＡ配列は、標準的条件下で本発明の配列とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、当業者に公知の方法で本発明の脱水素酵素との比較により確認できる保存領域の短いオリゴヌクレオチド、例えば活性中心に由来するものを用いることが有利である。しかしながら、本発明の核酸のより長い断片、又は完全な配列をハイブリダイゼーションのために使用することもできる。これらの標準的条件は、用いられる核酸（オリゴヌクレオチド、より長い断片又は完全な配列）に応じて、又はどの型の核酸、ＤＮＡ若しくはＲＮＡがハイブリダイゼーションのために用いられるかに応じて変化する。従って、例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのための溶融温度は、同じ長さのＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのそれよりも約１０℃低い。
【００６５】
標準的条件は、例えば、核酸に応じて、０．１〜５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ ＭのＮａＣｌ、１５ ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）の濃度を有するバッファー水溶液中で４２〜５８℃の温度、又は更に５０％のホルムアミドの存在下で、例えば５×ＳＳＣ、５０％のホルムアミド中で４２℃等を意味する。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、約２０℃〜４５℃、好ましくは約３０℃〜４５℃の温度と共に０．１×ＳＳＣが有利である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、約３０℃〜５５℃、好ましくは約４５℃〜５５℃の温度と共に０．１×ＳＳＣが有利である。ハイブリダイゼーションのためのこれら記載された温度は、一例として約１００ヌクレオチドの長さ及び５０％のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸についてホルムアミドが存在しない場合の溶融温度に関する計算値である。ＤＮＡハイブリダイゼーションのための実験条件は、遺伝学の関連教科書、例えば Sambrook et al., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989 等に記載されており、そして当業者に公知の式により、例えば核酸の長さ、ハイブリッドの型又はＧ＋Ｃ含有量に応じて計算することができる。当業者はハイブリダイゼーションに関する更なる情報を次の教科書： Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford に見出すことができる。
【００６６】
本発明はまた、具体的に開示されたか又は誘導可能な核酸配列の誘導体に関する。
【００６７】
従って、本発明の更なる核酸配列は、配列番号１又は配列番号３から誘導することができ、そして単一若しくは又は複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入又は欠失によりそれらとは異なるが、それでも望ましい特性プロフィールを有するポリペプチドをコードすることができる。
【００６８】
本発明はまた、いわゆるサイレント突然変異を含むか、又は特定の元の若しくは宿主生物のコドン使用頻度により、具体的に記載された配列と比べて修飾されている核酸配列、並びにそれらの天然に存在する変異体、例えばスプライス変異体又は対立遺伝子変異体等を包含する。
【００６９】
本発明は同様に、同類ヌクレオチド置換（すなわち、関連するアミノ酸が同じ電荷、大きさ、極性及び／又は溶解度のアミノ酸により置き換えられること）により得ることのできる配列に関する。
【００７０】
本発明はまた、具体的に開示された核酸から配列多型により誘導される分子に関する。これらの遺伝的多型は、自然変異のために集団内の個体間に存在することがある。これらの自然変異は、普通は遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の分散を生じさせる。
【００７１】
本発明の核酸配列の誘導体は、例えば、全配列領域にわたって誘導アミノ酸レベルで、少なくとも４０％の相同性、好ましくは少なくとも６０％の相同性、実に特に好ましくは少なくとも８０、８５、９０、９３、９５又は９８％の相同性（アミノ酸レベルでの相同性に関する、ポリペプチドについての上記の記載を参照できる）を示す対立遺伝子変異体を意味する。相同性は、配列の部分的領域にわたってより高いことが有利なことがある。
【００７２】
誘導体はまた、本発明の核酸配列の同族体に加えて、例えば真菌又は細菌同族体、末端切断型配列、コーディング及び非コーディング配列の一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。それらは、例えば、示された全ＤＮＡ領域にわたってＤＮＡレベルで、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも７０％、実に特に好ましくは少なくとも８０％の相同性を有する。
【００７３】
誘導体は更に、例えばプロモーターとの融合物を意味する。示された核酸配列の上流にあるプロモーターは、一つ以上のヌクレオチドの交換、挿入、反転及び／又は欠失により、しかしプロモーターの機能性又は活性を損なうことなく、修飾することができる。プロモーターは更に、それらの配列の修飾により高められたそれらの活性を有することができるか、又は異なる種の生物のより効率的なプロモーターによって完全に置き換えられていてよい。
【００７４】
誘導体はまた、開始コドンの−１〜−１０００塩基上流又は終止コドンの１〜１０００塩基下流の領域にある変異体のヌクレオチド配列が、遺伝子発現及び／又はタンパク質発現が変更されるように、好ましくは増加するように修飾されている変異体を意味する。
【００７５】
本発明は更に、「ストリンジェントな条件」下で上記のコーディング配列とハイブリダイズする核酸配列をも包含する。これらのポリヌクレオチドは、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより見出すことができ、そして適切ならば、適切なプライマーを用いてＰＣＲによりライブラリーから増幅し、次いで例えば適切なプローブを用いて単離することができる。更に、本発明のポリヌクレオチドを化学的経路によって合成することも可能である。この特性とは、ポリ−又はオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下で事実上相補的な配列に結合する能力を意味するが、これらの条件下で非相補的パートナー間での非特異的結合は生じない。この目的のために、配列は７０〜１００％、好ましくは９０〜１００％が相補的であるべきである。互いに特異的に結合できる相補的配列の特性は、例えば、ノーザン若しくはサザンブロット技術に、又はプライマー結合の場合にはＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲに用いられる。３０塩基対又はそれ以上の長さを有するオリゴヌクレオチドがこの目的のために普通に用いられる。ストリンジェントな条件は、例えばノーザンブロット技術では、非特異的にハイブリダイズしたｃＤＮＡプローブ又はオリゴヌクレオチドを溶離するために５０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃の洗浄溶液、例えば０．１％のＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣバッファー（２０×ＳＳＣ：３ＭのＮａＣｌ、０．３Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ７．０）を用いることを意味する。この場合には、上記のように、高度の相補性を有する核酸だけが互いに結合したままである。ストリンジェントな条件のセットアップは当業者に公知であり、そして例えば Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 に記載されている。
【００７６】
〔本発明の構築物の構成〕
本発明は更に、本発明のポリペプチドをコードし、そして調節核酸配列の遺伝的制御下にある核酸配列を含む発現構築物；及びこれらの発現構築物の少なくとも一つを含むベクターに関する。
【００７７】
本発明の当該構築物は、好ましくは、個々のコーディング配列に由来するプロモーター５’上流及びターミネーター配列３’下流、並びに望ましいならば、更なる従来の調節要素、特に何れの場合にもコーディング配列に作用しうる形で連結されたものを含む。
【００７８】
「作用しうる形での連結」は、調節要素のそれぞれがコーディング配列の発現において意図されるとおりのその機能を行いうるような方法で、プロモーター、コーディング配列、ターミネーター及び望ましいならば、更なる調節要素が連鎖配列していることを意味する。作用しうる形で連結できる配列の例は、標的配列、及びエンハンサー、ポリアデニル化シグナル等である。更なる調節要素は、選択可能マーカー、増幅シグナル、複製起点等を包含する。適切な調節配列は、例えば Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) に記載されている。
【００７９】
本発明の核酸構築物は、特に、本発明の脱水素酵素のための遺伝子が、遺伝子発現を制御するため、例えば増加させるために、一つ以上の調節シグナルに作用しうる形で又は機能しうる形で連結されているものを意味する。
【００８０】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の自然調節を、依然として実際の構造遺伝子の前に存在させること、並びに望ましいならば、自然調節のスイッチが切られており、そして遺伝子の発現が増加されているように遺伝子組み換えされていることが可能である。しかしながら、核酸構築物はより簡単な構造を有していてもよく、すなわち追加の調節シグナルはコーディング配列の前に挿入されておらず、そしてその調節を有する自然プロモーターは欠失されている。
【００８１】
その代わりに、自然調節配列は、調節がもはや行われず、そして遺伝子発現が増加するような方法で突然変異される。
【００８２】
好ましい核酸構築物はまた、有利には、核酸配列発現の増加を可能にする、プロモーターに機能しうる形で連結された上記の「エンハンサー」配列の一つ以上を含む。追加の有利な配列は、ＤＮＡ配列、例えば更なる調節要素又はターミネーターの３’末端で挿入されていてもよい。本発明の核酸は構築物中の一つ以上のコピーに存在していてよい。構築物はまた、望ましいならば構築物のスクリーニングのために、更なるマーカー、例えば抗生物質耐性物又は栄養素要求性−相補遺伝子を含むこともできる。
【００８３】
本発明の方法にとって有利な調節配列は、例えばプロモーターに、例えばｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｔｒｐ−ｔｅｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｒｈａＰ（ｒｈａＰＢＡＤ）ＳＰ６、ラムダ−ＰＲに又はラムダ−ＰＬプロモーターに存在し、これらはグラム陽性菌に有利に用いることができる。更なる有利な調節配列は、例えばグラム陽性プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２に、酵母又は真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦアルファ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨに存在する。これに関し同様に有利なものは、例えばハンゼヌラ (Hansenula) に由来するピルビン酸脱炭酸酵素及びメタノール酸化酵素である。調節のために人工プロモーターを用いることも可能である。
【００８４】
宿主生物における発現のために、核酸構築物はベクターに、例えば、宿主における最適発現を可能にするプラスミド又はファージ等に有利に挿入される。ベクターは、プラスミド及びファージは別として、当業者に公知の他の全てのベクター、例えばウイルス、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュロウイルス及びアデノウイルス、トランスポゾン、ＩＳ要素、ファスミッド、コスミッド、線状又は環状ＤＮＡ等をも意味する。これらのベクターは、宿主生物における自律的複製又は染色体複製を行う。これらのベクターは、本発明の更なる構成を表す。適切なプラスミドは、例えば大腸菌ではｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、ｌｇｔ１１若しくはｐＢｄＣＩ、ストレプトマイセス属ではｐＩＪ１０１、ｐＩＪ３６４、ｐＩＪ７０２若しくはｐＩＪ３６１、バシラス属ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４若しくはｐＢＤ２１４、コリネバクテリウム属ではｐＳＡ７７若しくはｐＡＪ６６７、真菌ではｐＡＬＳ１、ｐＩＬ２若しくはｐＢＢ１１６、酵母では２アルファＭ、ｐＡＧ−１、Ｅｐ６、ＹＥｐ１３若しくはｐＥＭＢＬＹｅ２３、又は植物ではｐＬＧＶ２３、ｐＧＨｌａｃ＋、ｐＢＩＮ１９、ｐＡＫ２００４若しくはｐＤＨ５１である。該プラスミドは可能なプラスミドの小さい選択を表す。更なるプラスミドは当業者によく知られており、そして例えば書籍 Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) に見出すことができる。
【００８５】
核酸構築物は有利には、存在する遺伝子の発現のために、発現を増加させる３’及び／又は５’末端調節配列を追加して含み、これらは一つ以上の遺伝子及び選ばれた宿主生物に応じて選択される。
【００８６】
これらの調節配列は、遺伝子の特異的発現及びタンパク質発現を可能にすることを意味している。これは、例えば宿主生物に応じて、挿入後に初めて遺伝子が発現又は過発現されること、又はそれが直ちに発現及び／又は過剰発現されることを意味することもある。
【００８７】
調節配列又は因子は更に、好ましくは導入遺伝子の発現に良い影響を与え、従ってそれを増加させることができる。従って、調節要素の増強は有利には転写レベルで、強力な転写シグナル、例えばプロモーター及び／又は「エンハンサー」を用いて行うことができる。しかしながら、例えば、ｍＲＮＡの安定性の改善により、翻訳を増強することも更に可能である。
【００８８】
ベクターのもう一つの実施形態において、本発明の核酸構築物又は本発明の核酸を含むベクターはまた、線状ＤＮＡの形態で微生物に有利に導入することができ、そして非相同又は相同組み換えにより宿主生物のゲノムに組み込むことができる。この線状ＤＮＡは、線状化ベクター、例えばプラスミドから又は本発明の核酸構築物若しくは核酸だけから構成されていてよい。
【００８９】
生物における異種遺伝子の最適発現のためには、核酸配列を修飾して生物で用いられる特定のコドン使用頻度と調和させることが有利である。コドン使用頻度は、関連生物における他の公知の遺伝子のコンピュータ分析に基づいて容易に確認することができる。
【００９０】
本発明の発現カセットは、適切なプロモーターを適切なコーディングヌクレオチド配列及びターミネーター又はポリアデニル化シグナルに融合させることにより製造される。従来の組み換え及びクローン化技術は、例えば T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)、及び T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) 及び Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) に記載されているように、この目的のために用いられる。
【００９１】
適切な宿主生物における発現のために、組み換え核酸構築物又は遺伝子構築物は、有利には、宿主における遺伝子の最適発現を可能にする宿主特異的ベクターに挿入される。ベクターは当業者によく知られており、そして例えば “Cloning Vectors” (Pouwels P. H. et al., editors, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) に見出すことができる。
【００９２】
〔本発明により使用できる宿主生物〕
本発明のベクター又は構築物を用いて、例えば、少なくとも一つの本発明のベクターで形質転換されており、そして本発明のポリペプチドの生成に使用できる組み換え微生物を製造することが可能である。上記の本発明の組み換え構築物は、有利には適切な宿主系に導入され、そして発現される。当業者によく知られている普通のクローニング及びトランスフェクション方法、例えば共沈、原形質体融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクション等は、特定の発現系における該核酸の発現をもたらすために好ましく用いられる。適切な系は、例えば Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., editors, Wiley Interscience, New York 1997、又は Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 に記載されている。
【００９３】
本発明によれば、相同的組み換え微生物を製造することも可能である。これには、本発明の遺伝子の少なくとも一つのセグメント、又は望ましいならば、本発明の配列を修飾するため、例えば機能的に破壊するために、少なくとも一つのアミノ酸の欠失、付加又は置換が導入されているコーディング配列を含むベクター（ノックアウトベクター）の製造を必要とする。導入配列は、例えば、関連微生物に由来する同族体であってもよく、又は哺乳動物、酵母若しくは昆虫源から誘導することができる。別法として、相同的組み換えのために用いられるベクターは、内在性遺伝子が相同的組み換え中に突然変異されるか又はそうでなければ修飾されるが、それでも機能タンパク質をコードするように設計することができる（例えば、上流に位置する調節領域を、これが内在性タンパク質の発現を修飾するような方法で修飾することができる）。本発明の遺伝子の修飾セグメントは、相同的組み換えベクターに存在する。相同的組み換えに適切なベクターの構築は、例えば Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 に記載されている。
【００９４】
本発明の核酸又は核酸構築物に適切な組み換え宿主生物は、原則として全ての原核又は真核生物である。宿主生物としては、微生物、例えば細菌、真菌又は酵母を用いることが有利である。グラム陽性菌又はグラム陰性菌、好ましくは腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、シュードモナス科（Pseudomonadaceae）、根生菌科（Rhizobiaceae）、ストレプトマイセス科（Streptomycetaceae）又はノカルジア科（Nocardiaceae）の細菌、特に好ましくは大腸菌属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、ノカルジア属（Nocardia）、バークホルデリア属（Burkholderia）、サルモネラ属（Salmonella）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）又はロドコッカス属（Rhodococcus）の細菌を用いることが有利である。大腸菌の属及び種が実に特に好ましい。更なる有利な細菌は、α−プロテオバクテリア、β−プロテオバクテリア又はγ−プロテオバクテリアの群に見出すことができる。
【００９５】
本発明の一つ以上の宿主生物は、本明細書に記載され、かつ本発明に係る脱水素酵素活性を有する酵素をコードする核酸配列、核酸構築物又はベクターの少なくとも一つを更に含む。
【００９６】
本発明の方法に用いられる生物は、宿主生物に応じて当業者に公知の方法で合成又は培養される。微生物は、一般に、炭素源、普通は糖の形態のもの、窒素源、普通は有機窒素源の形態のもの、例えば酵母抽出物又は硫酸アンモニウム、微量元素、例えば鉄、マンガン、マグネシウムの塩、及び望ましいならばビタミンを含む液体培地中で、０℃〜１００℃、好ましくは１０℃〜６０℃の温度で、酸素に通しながら培養される。この間に栄養素液体のｐＨを固定値に保つことができ、すなわち培養中に制御することができ、又はそうしなくてもよい。培養は回分式、半回文式又は連続的に行うことができる。栄養素は発酵の開始時に導入することができるか、又はその後に半連続的又は連続的に供給することができる。ケトンは、培養のために直接に又は有利には培養後に加えることができる。
【００９７】
〔本発明のポリペプチドの組み換え製造〕
本発明は更に、本発明のポリペプチド又はそれらの生物学的に活性な機能的断片の組み換え製造方法であって、ポリペプチド生産微生物を培養し、望ましいならばポリペプチドの発現を誘発させ、そして後者を培養物から単離する方法に関する。このようにして、ポリペプチドを工業的規模で（これが望ましいならば）製造することもできる。
【００９８】
組み換え微生物は公知の方法により培養及び発酵することができる。細菌を、例えばＴＢ又はＬＢ倍地中で、２０〜４０℃の温度及び６〜９のｐＨで培養することができる。適切な培養条件は、例えば T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) に記載されている。
【００９９】
ポリペプチドが培地に分泌されない場合には、細胞は破壊され、そして生成物は公知のタンパク質単離方法により溶解物から得られる。別法として、高周波数超音波により、高圧、例えばフレンチ圧力セル等により、オスモリシスにより、界面活性剤、溶解酵素若しくは有機溶剤の作用により、ホモジナイザーにより、又は複数の上記の方法を組み合わせて、細胞を破壊することができる。
【０１００】
ポリペプチドは、公知のクロマトグラフ法により、例えば分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、例えばＱ−セファロースクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィーにより、そして他の一般的な方法、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析及び天然ゲル電気泳動により精製することができる。適切な方法は、例えば Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York 又は Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin に記載されている。
【０１０１】
組み換えタンパク質の単離には、特定のヌクレオチド配列によりｃＤＮＡを延長し、従って、例えばより簡単な精製に役立つ修飾ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするベクター系又はオリゴヌクレオチドを用いることが有利な場合がある。これらの種類の適切な修飾は、いわゆる標識であって、アンカーとして作用するもの、例えばヘキサヒスチジンアンカーとして知られている修飾等として作用するもの、又は抗体により抗原として認識されうるエピトープ（例えば Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press) に記載されている）である。これらのアンカーは、タンパク質を、例えばクロマトグラフィー用カラムに充填されていてよい固体支持体、例えばポリマーマトリックス等に結合するために使用することができるか、又はマイクロタイタープレート若しくはアンカー支持体上で使用することができる。
【０１０２】
これらのアンカーは、タンパク質の認識のために同時に使用することもできる。タンパク質の認識のためには、従来のマーカー、例えば蛍光染料、基質との反応後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー、又は放射性カーマーを、単独で又はタンパク質の誘導体化のためのアンカーと組み合わせて使用することも可能である。
【０１０３】
〔本発明の酵素還元方法を行うための更なる構成〕
脱水素酵素は、遊離若しくは固定化酵素として又は組み換え型生産生物になお存在している触媒として、本発明の方法に使用することができる。
【０１０４】
本発明の方法は、有利には、０℃〜９５℃、好ましくは１０℃〜８５℃、特に好ましくは１５℃〜７５℃の温度で行われる。
【０１０５】
本発明の方法におけるｐＨは、有利には、ｐＨ４〜１２、好ましくはｐＨ４．５〜９、特に好ましくはｐＨ５〜８に保持される。
【０１０６】
エナンチオピュアな又はキラル生成物は、本発明の方法において、鏡像体濃縮を示す鏡像体を意味する。本方法において、少なくとも７０％ｅｅ、好ましくは少なくとも８０％ｅｅ、特に好ましくは少なくとも９０％ｅｅ、実に特に好ましくは９８％ｅｅの鏡像体純度が好ましく達成される。
【０１０７】
本発明の方法には、本発明の核酸、核酸構築物又はベクターを含む増殖細胞を用いることが可能である。静止又は破壊細胞を用いることもできる。例として、破壊細胞は、例えば溶剤での処理により透過性にされている細胞、又は酵素処理、機械的処理（例えばフレンチ圧力若しくは超音波）若しくは別の方法により崩壊されている細胞を意味する。このようにして得られた粗製抽出物は、本発明に係る方法のために有利に適している。精製又は部分精製酵素を本方法に用いることもできる。同様に適切なものは、反応に有利に使用できる固定化微生物又は酵素である。
【０１０８】
本発明の方法は回分式、半回文式又は連続的に行うことができる。
【０１０９】
本方法は、例えば Biotechnology, Volume 3, 2nd edition, Rehm et al. editors, (1993)、特に第 II 章に記載されているようにバイオリアクター中で有利に行うことができる。
【０１１０】
下記の実施例は本発明を説明しようと意図されるものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１１１】
〔実施例１〕：アゾアルクス sp. EbN1 に由来するアルコール脱水素酵素 EbN2 のクローニング。
【０１１２】
アゾアルクス sp. EbN1 に由来する EbN2 脱水素酵素遺伝子の配列はデータベースに寄託されている (配列番号１、[Genbank ID 56475432, Region: 2797788..2798528])。この遺伝子の核酸配列からオリゴヌクレオチドを誘導し、そしてアゾアルクス sp. EbN1 のゲノムＤＮＡに由来する遺伝子を公知の方法により増幅するために使用した。生成した配列は刊行された配列に対応する。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は表１にまとめられている。
【０１１３】
0005503534.tif 000005
【０１１４】
ＰＣＲ産物（約７５１ｂｐ）を制限エンドヌクレアーゼ NdeI 及び BamHI で消化し、そして対応して消化した pDHE19.2 ベクター (DE19848129) にクローン化した。この結合混合物を大腸菌 XL1 Blue (Stratagene) に形質転換した。
【０１１５】
生成したプラスミドpDHE-PDH-L を大腸菌の菌株 TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: 大腸菌 TG1 の RhaA- 誘導体 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413) に形質転換した。
【０１１６】
この組み換え大腸菌は LU 13151 と呼ばれる。
【０１１７】
〔実施例２〕：アゾアルクス sp. EbN1 に由来するアルコール脱水素酵素 ChnA のクローニング。
【０１１８】
アゾアルクス sp. EbN1 に由来する脱水素酵素遺伝子 ChnA の配列はデータベースに寄託されている（[Genbank ID 56475432, 領域: (相補的) 192247..192993])。この遺伝子の核酸配列からオリゴヌクレオチドを誘導し、そしてアゾアルクス sp. EbN1 のゲノムＤＮＡに由来する遺伝子を公知の方法により増幅するために使用した。生成した配列は刊行された配列に対応する。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は表２にまとめられている。
【０１１９】
0005503534.tif 000006
【０１２０】
ＰＣＲ産物（約７４３ｂｐ）を制限エンドヌクレアーゼ NdeI 及び BglII で消化し、そして NdeI 及び BamHI で制限した pDHE19.2 ベクター (DE19848129) にクローン化した。この結合混合物を大腸菌 XL1 Blue (Stratagene) に形質転換した。
【０１２１】
生成したプラスミドpDHE-PDH-L を大腸菌の菌株 TG10 pAgro4 pHSG575 (TG10: 大腸菌 TG1 の RhaA- 誘導体 (Stratagene); pAgro4: Takeshita, S; Sato, M; Toba, M; Masahashi, W; Hashimoto-Gotoh, T (1987) Gene 61, 63-74; pHSG575: T. Tomoyasu et al (2001), Mol. Microbiol. 40(2), 397-413) に形質転換した。
【０１２２】
この組み換え大腸菌は LU 13283 と呼ばれる。
【０１２３】
〔実施例３〕：組み換え「アンチ−プレログ」脱水素酵素の提供
LU 13151 又は LU 13283 を、１００ｍｌ三角フラスコ（バッフル）中で、２０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ／Ｓｐｅｃ／Ｃｍ (100 μg/l のアンピシリン; 100 μg/l のスペクチノマイシン; 20 μg/l のクロラムフェニコール)、０．１ ｍＭのＩＰＴＧ、０．５ ｇ／ｌのラムノースの中で、３７℃で１８時間培養し、５０００＊ｇ／１０ 分で遠心分離し、１０ ｍＭのトリス＊ＨＣｌ、ｐＨ７．０で１回洗浄し、そして２ｍｌの同じバッファーに再懸濁した。
【０１２４】
LU 13151 又は LU 13283 細胞ペーストを、振動ミル中で０．７ｍｌのガラスビーズ (d = 0.5 mm) と共に破壊することにより (氷上で中間的に冷却しながら 3 x 5 分)、細胞不含の粗製タンパク質抽出物を製造した。
【０１２５】
〔実施例４〕：アゾアルクス sp. EbN1 に由来する組み換え「アンチ−プレログ」脱水素酵素の活性の測定
何れの場合にも６つの形質転換体を、１００ｍｌ三角フラスコ（バッフル）中で、２０ｍｌのＬＢ Ａｍｐ／Ｓｐｅｃ／Ｃｍ (100 μg/l のアンピシリン; 100 μg/l のスペクチノマイシン; 20 μg/l のクロラムフェニコール)、０．１ ｍＭのＩＰＴＧ、０．５ ｇ／ｌのラムノースの中で、３７℃で１８時間培養し、５０００＊ｇ／１０ 分で遠心分離し、１０ ｍＭのトリス＊ＨＣｌ、ｐＨ７．０で１回洗浄し、そして２ｍｌの同じバッファーに再懸濁した。
【０１２６】
振動ミル中で０．７ｍｌのガラスビーズ (d = 0.5 mm) と共に破壊することにより (氷上で中間的に冷却しながら 3 x 5 分)、脱水素酵素遺伝子を含む、組み換え大腸菌細胞不含の粗製タンパク質抽出物を得た。
【０１２７】
LU 13151 又は LU 13283 細胞ペーストを、振動ミル中で０．７ｍｌのガラスビーズ (d = 0.5 mm) と共に細胞破壊することにより (氷上で中間的に冷却しながら 3 x 5 分)、脱水素酵素遺伝子を含む組み換え大腸菌の細胞不含の粗製抽出物を得た。
【０１２８】
還元された補基質の消費量は、ケトンの還元中に光度計で３４０ｎｍにおいて追跡することができる。１０μｌの細胞不含の希釈粗製抽出物（約１０μｇのタンパク質）、１０μｍｏｌのケトン及び２５０ｎｍｏｌのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを、１ ｍｌの５０ｍＭのＫＰｉ、１ ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ ６．５の中で、３０℃でインキュベートした。１単位（１Ｕ）は、１分間に１μｍｏｌのケトンを還元する酵素の量に対応する。
【０１２９】
〔実施例５〕：フェニルエタノールの分析
アセトフェノン及びフェニルエタノールの濃度はＨＰＬＣにより測定することができる。固定及び移動相の選択に応じて、濃度に加えてｅｅを測定することが可能である。
【０１３０】
0005503534.tif 000007
【０１３１】
検定シリーズは真正物質を用いて構築され、そして未知サンプルの濃度を測定できるようにする。
【０１３２】
〔実施例６〕：補因子再生のためのグルコース脱水素酵素の提供及びグルコース脱水素酵素を用いる補因子再生（酵素カップリング）
補因子再生のためにグルコース脱水素酵素を用いることができる。この酵素は市販品（例えば Juelich Fine Chemicals Order No. 22.10 又は 19.10）又は独自の源から得ることができる。後者は、プラスミド pUC19 内に枯草菌由来のグルコース脱水素酵素 (Genbank Acc.No. M12276) を含む大腸菌 XL10 Gold クローン（この構築物は大腸菌 LU11293 と呼ばれる）である。
【０１３３】
大腸菌 LU11293 を発酵するために下記の培地を作った：
0005503534.tif 000008
【０１３４】
培地の１５０ｍｌ部分を２つの１リットル三角フラスコ中で滅菌し、そして５ｍｌの滅菌塩溶液を補って完成させた。ＬＢ−アンピシリン寒天プレートからの接種に続いて、この前培養物を３７℃及び２００ｒｐｍで１２時間インキュベートし、そして発酵培地に加えた。３７℃、０．１バールの内圧、ｐＨ７．０（２０％リン酸及び２５％ＮａＯＨで調節）で、７．５リットル／分及び３００ｒｐｍの通気量（１０〜２０リットル／分の入口空気及び５００〜１５００ｒｐｍを用いて酸素分圧を２０〜５０％に調節）を用いて発酵を開始した。２時間後に、誘発のために０．１ｍＭのＩＰＴＧを加え、合計１３時間後に発酵を終了した。細胞（１．３ｋｇ）を収穫して洗浄した後、それらを使用するまで−２０℃で貯蔵した（混合物中２〜２０ｇ／リットル）。
【０１３５】
等モル量のグルコース及びケトンを１〜３０Ｕ／ｍｌのグルコース脱水素酵素粗製抽出物及び１〜３０Ｕ／ｍＬのアルコール脱水素酵素粗製抽出物、０．０２〜１ｍｍｏｌ／リットルのＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ、又はＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨと共にバッファーに溶解し、そして１０〜６０℃でインキュベートした。塩基の自動添加によりｐＨを一定に保った。
【０１３６】
〔実施例７〕：基質カップリングを用いる補因子の再生
補因子の再生は二つのアルコール脱水素酵素それら自身により行うこともできる。この場合、別の再生酵素を添加する必要はない。アルコール脱水素酵素 ChnA 及び Ebn2 は種々の簡単なアルコールを還元剤として受け入れる。それらは対応するカルボニル化合物に酸化される。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの再生に適する簡単なアルコールは、イソプロパノール、ブタン−２−オール及びペンタン−２−オールである。
【０１３７】
〔実施例８〕：ギ酸脱水素酵素を用いる補因子の再生（酵素カップリング）
補因子再生のためにギ酸脱水素酵素を用いることができる。この酵素は市販品（例えば Juelich Fine Chemicals Order No. 09.11、24.11 又は 25.10）又は独自の源から得ることができる。こうして、補因子の再生は実施例６と同様にしてギ酸脱水素酵素を用いて行うことができる。この場合、等モル量のギ酸塩及びケトンを１〜３０Ｕ／ｍｌのギ酸脱水素酵素粗製抽出物及び１〜３０Ｕ／ｍｌのアルコール脱水素酵素粗製抽出物、０．０２〜１ｍｍｏｌ／リットルのＮＡＤ若しくはＮＡＤＰ、又はＮＡＤＨ若しくはＮＡＤＰＨと共にバッファーに溶解し、そして１０〜６０℃でインキュベートした。酸の自動添加によりｐＨを一定に保った。
【０１３８】
〔実施例９〕：組み換えアンチ−プレログ脱水素酵素を用いるＲ−フェニルエタノールの製造
実施例３に従って、大腸菌 LU 13151 又は LU 13283 を培養し、収穫し、そして破壊した。
【０１３９】
１リットルの反応体積当たり、０．２ｍｍｏｌのＮＡＤ、５００Ｕのグルコース脱水素酵素、１ｍｏｌのＤ−グルコース、１ｍｏｌのアセトフェノン、LU 13283 又は LU 13151 に由来する１００〜１０００Ｕのアルコール脱水素酵素を、ＫＰｉバッファー （５０ｍＭのＫＰｉ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ６．５）に溶解し、そして３０℃でインキュベートした。２ＭのＮａＯＨの自動添加によりｐＨを一定に保った。
【０１４０】
反応の経過中にアセトフェノンを計量送入する（供給−バッチ手順）場合に、より高濃度のＲ−フェニルエタノールに達することができることは十分にあり得る、。
【０１４１】
同様に、水に不溶の有機溶剤の存在下に反応させることも可能である。
【配列表】
0005503534000001.app