(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウーロン茶又は紅茶の茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、前記酢酸エチル抽出で抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、前記ブタノール抽出で抽出されたブタノール溶出成分を、含水アセトン溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーで分画して得られる抽出物のうち、３５〜５０％のアセトン濃度により溶出される画分であって、かつ、数平均分子量が９，０００〜１８，０００の範囲内であるポリフェノールを含む画分からなる抽出物を有効成分とする血糖値上昇抑制剤。
【請求項２】
ウーロン茶又は紅茶の茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、前記酢酸エチル抽出で抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、前記ブタノール抽出で抽出されたブタノール溶出成分を、含水アセトン溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーで分画して得られる抽出物のうち、３５〜５０％のアセトン濃度により溶出される画分であって、かつ、数平均分子量が９，０００〜１８，０００の範囲内であるポリフェノールを含む画分からなる抽出物を有効成分とするミトコンドリア膜電位上昇剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵茶から抽出された、ミトコンドリア活性化作用を有する高分子ポリフェノール、その高分子ポリフェノールを含有するミトコンドリア病治療剤及び糖尿病治療剤、並びに飲食物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリフェノールは、同一分子内にフェノール性水酸基を複数持つ化合物の総称であり、植物中に広く存在する。近年、ポリフェノール類には抗酸化作用、抗菌作用など多彩な作用があることが明らかになったことから注目され、現在、様々な種類のポリフェノールの発見・抽出や、そのポリフェノールの薬理作用などに関する研究が進んでいる。【０００３】
ポリフェノールは、フラボノイド系、クマリン系、クルクミン系、リグナン系、フェニルカルボン酸系などに大きく分類される。そのうち、フラボノイド系としては、カテキン類、アントシアニジン類、フラボン類、フラボノール類、イソフラボン類、フラバン類などがある。【０００４】
カテキン類は、Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６骨格にフェノール性水酸基を複数持つフラバン−３−オール骨格の物質群であり、特に、茶の葉に多量に含まれる。カテキン類としては、例えば、カテキン、カテキンガレート、エピカテキン、エピカテキンガレート、エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、ガロカテキン、ガロカテキンガレート、などがある。代表例として、カテキンの化学構造式を「化１」に示す。カテキン類（カテキン及びカテキン誘導体）は、「化１」の化学構造式に示す、Ａ環、Ｂ環、Ｃ環を基本骨格に持つ。例えば、ガロカテキンは、「化１」の化学構造式中のＢ環の５’位の水素（Ｈ）を水酸基（ＯＨ基）に置換したものである。
【化１】
0005439644.tif 000002
【０００５】
一方、アントシアニン類は、Ｃ６−Ｃ３−Ｃ６骨格からなるアントシアニジン（フラビリウム化合物）を非糖質成分とし、これに種々の糖質成分が結合した配糖体で、シアニジン配糖体、デルフィニジン配糖体などがある。主として、花・果実・葉などに多在する水溶性植物色素であり、抗酸化物質として知られる。【０００６】
また、ポリフェノールには、カテキン類、アントシアニン類などが高度に重合したもの（高分子ポリフェノール）も存在する。高分子ポリフェノールは、ワイン、発酵茶などに多く含まれ、発酵や熟成の過程で、カテキン類、アントシアニン類などが重合することにより生成されると考えられている。非特許文献１には、紅茶から抽出された高分子ポリフェノールの化学構造について記載されている。非特許文献１中に掲載されている高分子ポリフェノールの化学構造を、「化２」に示す。なお、「化２」に示す化学構造式中、Ｒ１はＨ（水素）又はガロイル、Ｒ２及びＲ３はＨ（水素）又はＯＨ（水酸基）である。
【化２】
0005439644.tif 000003
【０００７】
その他、特許文献１は、ポリフェノール類の抽出方法に関するものであり、「従来の技術」の欄に、ポリフェノールの抗酸化作用についての記載がある。特許文献２は、カテキン類、プロシアニジン類の皮膚老化防止作用に関するものである。この文献における皮膚老化防止作用は、ＭＭＰｓ（マトリックスメタロプロテアーゼ）の活性阻害に基づくものである。特許文献３は、紅茶ポリフェノールのメラニン生成抑制剤に関するものである。文献中に、その抑制剤が美白効果に優れることが記載されている。
【特許文献１】特開平７−１９９６４５号公報
【特許文献２】特開２００３−２５２７４５号公報
【特許文献３】特開２００１−１５８７２６号公報
【非特許文献１】Tetsuo Ozawa, Mari Kataoka, Keiko Morikawa, and Osamu Negishi, “Elucidation of the Partial Structure of Polymeric Thearubigins from Black Tea by Chemical Degration”, Biosci. Biotech. Biochem.,60(12), 2023-2027, 1996
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記の通り、ポリフェノールは多種多様であり、未だ分離・抽出されていないポリフェノールも多い。特に、カテキン類、アントシアニン類や、その他の物質が高度に重合・結合した高分子ポリフェノールは、その多くが未分離・未抽出であり、その薬理作用も解明されていないものが多い。【０００９】
そこで、本発明は、新規な高分子ポリフェノールを分離・抽出すること、及び、その高分子ポリフェノールの新規な薬理作用を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らの鋭意研究の結果、発酵茶から抽出された高分子ポリフェノールが、ミト
コンドリア活性化作用、血糖上昇抑制作用、体重上昇抑制作用などを有することを新規に
見出した。そこで、本発明では、ウーロン茶又は紅茶の茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、前記酢酸エチル抽出で抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、前記ブタノール抽出で抽出されたブタノール溶出成分を、含水アセトン溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーで分画して得られる抽出物のうち、３５〜５０％のアセトン濃度により溶出される画分であって、かつ、数平均分子量が９，０００〜１８，０００の範囲内であるポリフェノールを含む画分からなる抽出物を有効成分とする血糖値上昇抑制剤を提供する。
また、本発明では、ウーロン茶又は紅茶の茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、前記酢酸エチル抽出で抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、前記ブタノール抽出で抽出されたブタノール溶出成分を、含水アセトン溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーで分画して得られる抽出物のうち、３５〜５０％のアセトン濃度により溶出される画分であって、かつ、数平均分子量が９，０００〜１８，０００の範囲内であるポリフェノールを含む画分からなる抽出物を有効成分とするミトコンドリア膜電位上昇剤を提供する。
【００１１】
本発明に係る高分子ポリフェノールは、例えば、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、前記酢酸エチル抽出で抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、前記ブタノール抽出で抽出されたブタノール溶出成分を、含水アセトン溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーで高純度化することにより得ることができる。【００１２】
また、例えば、発酵茶葉中の水溶出成分を酢酸エチル抽出し、前記酢酸エチル抽出で抽出されなかった酢酸エチル非溶出成分をブタノール抽出し、前記ブタノール抽出で抽出されなかったブタノール非溶出成分を、酸性化した後、再度ブタノール抽出し、二度目のブタノール抽出で抽出されたブタノール溶出成分を、含水アセトン溶媒を用いたカラムクロマトグラフィーで高純度化することにより得ることができる。【００１３】
本発明に係る高分子ポリフェノールは、部分構造中に、カテキン構造（「化１」に示したＡ環、Ｂ環、Ｃ環を基本骨格として持つ構造）、カテキン構造に没食子酸残基がエステル結合した構造、プロシアニジン構造（カテキン構造中のＣ環と他のカテキン構造中のＡ環が結合した構造）、カテキン構造中のＡ環と他のカテキン構造中のＢ環が結合した構造、カテキン構造中のＢ環と他のカテキン構造中のＢ環が結合した構造、キノン構造、などを含むと考えられる（部分構造に重複部分がある場合を含む）。【００１４】
上記の通り、本発明に係る高分子ポリフェノールにはミトコンドリア活性化作用があることが明らかになったため、この高分子ポリフェノールを含有する組成物を、医薬品として用いることにより、ミトコンドリア病を改善できる。【００１５】
加えて、ミトコンドリアは、ＡＴＰ合成を主な役割とする主要な細胞内小器官で、細胞活動の基礎となるエネルギー産生を担っているため、ミトコンドリアを活性化することにより、細胞の活性化や細胞膜の安定化などを図ることができる。従って、本発明に係る高分子ポリフェノールを用いることにより、抗老化作用、美肌作用、エネルギー代謝促進作用、抗肥満作用、運動性貧血予防作用などを得ることができる。なお、本発明に係る高分子ポリフェノールを含有する組成物は、薬剤として、運動性貧血予防剤などに適用できるほか、化粧品としても適用できる。また、健康食品などとして、飲食物に本発明に係る高分子ポリフェノールを含有させてもよい。【００１６】
また、精子運動能は、鞭毛中のミトコンドリアのＡＴＰ合成能に大きく依存するため、本発明に係る高分子ポリフェノールを含有する組成物は、男性（又はオス）に用いる不妊症の治療や、ヒト・牛などの人工授精における受精率の向上にも、適用できる。【００１７】
さらに、繊毛の運動能も、ミトコンドリアのＡＴＰ合成能に大きく依存するため、本発明に係る高分子ポリフェノールを用いることにより、去痰作用や輸卵管の繊毛運動などを亢進することができる。従って、本発明に係る高分子ポリフェノールを含有する組成物去痰剤、女性（又はメス）に用いる不妊症治療剤などに適用できる。【００１８】
以上のように、本発明に係る高分子ポリフェノールを含有する組成物は、薬剤、化粧品として、適用できる。また、健康食品などとして、飲食物に本発明に係る高分子ポリフェノールを含有させることができる。【００１９】
加えて、上述の通り、本発明に係る高分子ポリフェノールには血糖上昇抑制作用、体重上昇抑制作用などもあるため、糖尿病予防・治療剤又は抗糖尿病健康食品としても適用できる。【００２０】
以下、本発明に関わる用語の定義づけを行う。【００２１】
「発酵茶」とは、ウーロン茶、紅茶など、製造工程中に発酵させる段階を含む茶全般をいう。【００２２】
「水」とは、物質名としての水（Ｈ２Ｏ）をいう。即ち、本発明において、沸騰水、熱水、水蒸気なども「水」に包含される。従って、本発明における「水溶出成分」は、発酵茶葉を沸騰水、熱水、水蒸気などで抽出した場合に溶出する成分を包含する。【００２３】
「ミトコンドリア病」とは、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝的変異に由来してミトコンドリアの機能が低下する種々の先天性疾患の総称であり、濃赤染線維ミオパシー、進行性外眼筋麻痺、Ｌｅｉｇｈ症候群、濃赤染線維ミオパシーを伴ったミオクローヌスてんかん(ＭＥＲＲＦ)、ミトコンドリアミオパシー、脳症、ラクトアシドーシス、発作(ＭＥＬＡＳ)、Ｌｉｅｂｅｒ眼性ニューロパシーが含まれる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明に係る高分子ポリフェノールにより、細胞内ミトコンドリアを活性化できる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線を示すグラフ。
【図２】ウーロン茶抽出酸性画分の溶出曲線を示すグラフ。
【図３】紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線を示すグラフ。
【図４】紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線を示すグラフ。
【図５】発酵茶から抽出した有効画分を糖尿病モデルマウスに投与した場合における体重の変化を示すグラフ。
【図６】発酵茶から抽出した有効画分を糖尿病モデルマウスに投与した場合における血糖値の変化を示すグラフ。
【図７】高分子ポリフェノールと低分子ポリフェノールとを、それぞれマウスに投与した場合における血糖値の変化を示すグラフ。
【実施例１】
【００２６】
実施例１では、発酵茶抽出成分の分画を行った。ウーロン茶と紅茶のそれぞれについて、ブタノール抽出中性画分、ブタノール抽出酸性画分を抽出した後、カラムクロマトグラフィーを用いて、さらに細かく分画した。【００２７】
ウーロン茶の成分抽出は、次の手順で行った。【００２８】
まず、ウーロン茶葉から、水溶出成分を抽出した。沸騰水１０００ｍｌにウーロン茶葉３０ｇを加え、約１分間沸騰後、１０分間静置した。次に、ウーロン茶葉をろ過・除去し、ろ液を得た。以上の操作を４回行い、ウーロン茶葉１２０ｇから熱水抽出された水溶出成分を含む水溶液を得た。【００２９】
次に、水溶出成分を含有した水溶液から酢酸エチル溶出成分を抽出した。この手順は、ウーロン茶水溶出成分の中から、比較的低分子のポリフェノールを酢酸エチルで溶出・除去するために行った。水溶出成分を含有した水溶液５００ｍｌにつき、２００ｍｌの水飽和酢酸エチルを加え、撹拌し、静置した後、酢酸エチル相を分取した。この操作を１０回繰り返し、分取した酢酸エチル相を集め、酢酸エチル溶出成分を含有した抽出液を得た。【００３０】
次に、酢酸エチル溶出成分抽出の際に残された水相からブタノール溶出成分を抽出し、「ウーロン茶ブタノール抽出中性画分」を得た。まず、前記酢酸エチル溶出成分抽出の手順において酢酸エチル相の分取後残された水相を減圧濃縮し、残存する酢酸エチルを取り除いた。次に、その水相の溶液５００ｍｌにつき、２００ｍｌの水飽和ｎ−ブタノールを加え、前記と同様に、撹拌し、静置した後、ブタノール相を分取した。この操作を１０回繰り返し、分取したブタノール相を集め、ブタノール溶出成分を含有した抽出液を得た。次に、抽出液を減圧濃縮することによりブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含有した水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、「ウーロン茶ブタノール抽出中性画分」のサンプルとした（収量４．５ｇ／ウーロン茶葉１２０ｇ当たり）。【００３１】
次に、ブタノール溶出成分抽出の際に残された水相を酸性にした後、再度ｎ−ブタノール溶出成分を抽出し、「ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分」を得た。まず、前記ブタノール溶出成分抽出の手順においてブタノール相の分取後残された水相に塩酸を加え、ｐＨ約３に調整した。次に、前記と同様に、その水相の溶液５００ｍｌにつき、２００ｍｌの水飽和ｎ−ブタノールを加え、撹拌し、静置した後、ブタノール相を分取した。この操作を５回繰り返し、分取したブタノール相を集め、ブタノール溶出成分を含有した抽出液を得た。次に、抽出液を減圧濃縮することによりブタノールを除去し、ブタノール溶出成分を含有した水溶液を得た。この水溶液を凍結乾燥し、「ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分」のサンプルとした（収量３．２ｇ／ウーロン茶葉１２０ｇ当たり）。【００３２】
紅茶の成分抽出についても、ウーロン茶の場合と同様の手順で調製を行い、「紅茶ブタノール抽出中性画分」、「紅茶ブタノール抽出酸性画分」をそれぞれ得た。【００３３】
なお、紅茶の場合、各画分調製の前段階である水溶出成分の抽出は、沸騰水５００ｍｌに紅茶葉２５ｇを加え、１０分間、緩やかに沸騰後、直ちにブフナーロートで紅茶葉をろ過・除去することにより行った。【００３４】
今回の実験では、紅茶ブタノール抽出中性画分の収量は１．５ｇ、紅茶ブタノール抽出酸性画分の収量は１．９ｇだった。【００３５】
続いて、前記各有機溶媒抽出画分について、カラムクロマトグラフィーを行って、さらに細かく分画した。固定相にはトヨパールＨＷ−４０Ｆ（東ソー株式会社製、「トヨパール」は登録商標）を、移動相には含水アセトン溶液を用いた。【００３６】
まず、直径２．４ｃｍ×長さ３５ｃｍのカラムに、トヨパールＨＷ−４０Ｆを充填した。また、移動相に用いる溶媒として、２０％アセトン溶液６００ｍｌと５０％アセトン溶液６００ｍｌとを準備した。【００３７】
次に、前記有機溶媒抽出画分０．３ｇを２０％アセトン３ｍｌに溶解し、その溶液をカラムに流し込んだ。次に、前記有機溶媒抽出画分のうち、２０％アセトン溶液下で固定相（トヨパール）に吸着した成分を、前記二つの濃度のアセトン溶液を用いて２０〜５０％の直線的濃度勾配をかけることにより、順次溶出させた。そして、フラクションコレクターを用いて、溶出液を５ｇずつ試験管に分取した。溶出液は、流速０．３ｇ／分であった。【００３８】
次に、各試験管内の溶出液について、それぞれ３５０ｎｍにおける吸光度を測定し、溶出曲線を作成した。そして、溶出曲線に基づいて有機溶媒抽出画分をさらに細かく分画し、同じ画分に属する試験管内の溶出液を集めた後、減圧濃縮してアセトンを除去し、凍結乾燥した。【００３９】
以上の手順により細かく分画された発酵茶抽出成分を、サンプルとして後述する実験に用いた。【００４０】
なお、図１はウーロン茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線（溶出パターン）を、図２は、ウーロン茶抽出酸性画分の溶出曲線を、図３は、紅茶ブタノール抽出中性画分の溶出曲線を、図４は、紅茶ブタノール抽出酸性画分の溶出曲線を、それぞれ示している。図１から図４において、横軸は溶出液を回収した試験管番号（回収した順）を、縦軸は３５０ｎｍにおける吸光度を、それぞれ示している。【００４１】
また、図１〜図４中に記載された「画分」は、溶出曲線に基づいて細かく分画した際の画分を示している。図に示す通り、図１のウーロン茶ブタノール抽出中性画分及び図２のウーロン茶抽出酸性画分では１〜１５の画分に、図３の紅茶ブタノール抽出中性画分では１〜１６の画分に、図４の紅茶ブタノール抽出酸性画分では１〜１１の画分に、それぞれ、細分画した。
【実施例２】
【００４２】
実施例２では、実施例１で分画した各発酵茶抽出サンプルのミトコンドリア活性化作用について調べた。【００４３】
ミトコンドリア活性化作用は、原生動物のテトラヒメナに発酵茶抽出サンプルを与えた場合にミトコンドリア膜電位が上昇するかどうかを、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−１２３を用いて測定することにより、検出した。ここで、「Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−１２３」とは、ミトコンドリア内膜に結合し、水素イオンがミトコンドリアのマトリックス部分から膜間部分に汲み出されることで生じる電位差によって、強い蛍光を発する試薬である。本実験では、ＳＩＧＭＡ社製のものを用いた。実験手順は以下の通りである。【００４４】
まず、原生動物のテトラヒメナに発酵茶抽出サンプルを与えた。実施例１で分画した各発酵茶抽出サンプルをそれぞれ５％ＤＭＳＯ溶液に溶解し、１ｍｇ／ｍｌの発酵茶抽出サンプル溶液を調製した。コントロールには５％ＤＭＳＯ溶液を用いた。次に、全発酵茶抽出サンプル溶液（コントロールを含む、以下同じ）について、それぞれ、テトラヒメナ２．７ｍｌ（１〜２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に、発酵茶抽出サンプル溶液０．３ｍｌを加え（発酵茶抽出サンプル溶液の最終濃度は０．１ｍｇ／ｍｌ）、室温で１０〜１２時間振盪した。そして、テトラヒメナと発酵茶抽出サンプルとの反応を止めるために、手回し遠心機を用いて遠心し、上清を捨てた後、ＮＫＣ溶液（３４．７ｍＭＮａＣｌ、１．０７ｍＭＫＣｌ、１．０８ｍＭＣａＣｌ２）を加え、発酵茶抽出サンプルを洗い流した。【００４５】
次に、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−１２３染色を行った。それぞれの発酵茶抽出サンプルで処理したテトラヒメナに、ＮＫＣ溶液とＲｈｏｄａｍｉｎｅ−１２３（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を加えて３ｍｌにし、４５分間振盪して染色を行った。そして、テトラヒメナを遠心し、上清を捨てた後、ＮＫＣを加える手順を７回繰り返し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−１２３を洗い流した。【００４６】
続いて、ミトコンドリア膜電位測定を行った。まず、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−１２３染色したそれぞれのテトラヒメナを４時間振盪後、各サンプルの細胞数をそろえた。次に、９６穴プレートに、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−１２３染色したテトラヒメナを、それぞれ１００μｌ／ｗｅｌｌずつ入れ、１時間静置した。前記９６穴プレートは、室温で１時間静置するものと、氷上で１時間静置するものと、二つ作成した。【００４７】
そして、１時間静置後、９６穴プレートをマイクロプレートリーダー（励起：４８５ｎｍ、吸収：５３５ｎｍ）にセットし、蛍光光度を測定した。【００４８】
次に、ミトコンドリア膜電位の上昇の度合いを算出した。氷上で１時間静置した場合、テトラヒメナの運動能が低下しているため、サンプルにミトコンドリア活性化能があるかどうかにかかわらず、ミトコンドリア活性は低いままである。そこで、室温で１時間静置したものと氷上で１時間静置したものとの蛍光光度の差を算出し、その数値を、ミトコンドリア膜電位上昇の度合いを示す値とした。なお、本実験では、室温で１時間静置したものと氷上で１時間静置したものとの蛍光光度の差を求めた後、コントロールの蛍光光度の差を１としたときの相対値に換算し、ミトコンドリア膜電位上昇の度合いを示す値とした。【００４９】
結果（ミトコンドリア膜電位上昇の度合いを示す相対値）を表１から表４に示す。それぞれ、表１はウーロン茶ブタノール中性画分について、表２はウーロン茶ブタノール酸性画分について、表３は紅茶ブタノール抽出中性画分について、表４は紅茶ブタノール抽出酸性画分についてのミトコンドリア膜電位上昇の度合いを示している。なお、表１から表４中、「収量」は、発酵茶抽出サンプル０．３０〜０．３５ｇをカラムにかけたときに回収できた量であり、各画分のそれぞれに、どの程度の高分子ポリフェノールが含有しているかを示す参考値である。【００５０】
【表１】
0005439644.tif 000004
【００５１】
【表２】
0005439644.tif 000005
【００５２】
【表３】
0005439644.tif 000006
【００５３】
【表４】
0005439644.tif 000007
【００５４】
表１から表４に示すとおり、ウーロン茶ブタノール中性画分、ウーロン茶ブタノール酸性画分、紅茶ブタノール抽出中性画分、紅茶ブタノール抽出酸性画分のいずれの場合も、カラムクロマトグラフィーで後半（アセトン濃度３５〜５０％）に溶出した画分において、ミトコンドリア膜電位上昇の度合いが高かった。即ち、ウーロン茶ブタノール中性画分（表１）では画分１２以降、ウーロン茶ブタノール酸性画分（表２）では画分１０以降、紅茶ブタノール抽出中性画分（表３）では画分１０以降、紅茶ブタノール抽出酸性画分（表４）では画分７以降において、ミトコンドリア膜電位上昇の度合いが高かった。【００５５】
カラムクロマトグラフィーで後半に溶出した画分は、カテキン類などが複雑に重合した高分子ポリマーであると推測できる。従って、カテキン類などが複雑に重合した高分子ポリマーによって、ミトコンドリア膜電位が上昇したと考えることができる。【００５６】
ミトコンドリア膜電位は、ＡＴＰ産生時に呼吸鎖酵素複合体が活発に働き、水素イオンを膜間部分に汲み出す際に上昇する。従って、これらの結果は、発酵茶に含まれる高分子ポリフェノールが、ミトコンドリアの酸素呼吸を活性化する作用を有することを示唆する。
【実施例３】
【００５７】
実施例３では、実施例１において分画したウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の画分１５（以下、本実施例及び下記実施例４において、「ウーロン茶活性画分」とする）、及び、同じく実施例１において分画した紅茶ブタノール抽出中性画分の画分１５（以下、本実施例及び下記実施例４において、「紅茶活性画分」とする）について、タンナーゼ分解を行った。ここで、「タンナーゼ」は、カテキン類、タンニン類などから没食子酸残基を切り離す酵素である。【００５８】
なお、「ウーロン茶活性画分」は、実施例２においてミトコンドリア活性化作用のあった画分のうち、ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の画分１５を選んで本実験に用いたことを示すものに過ぎず、ミトコンドリア活性化作用を持つ画分が、それのみに限局されることを意味するわけではない（以下同じ）。「紅茶活性画分」についても同様である。【００５９】
タンナーゼ分解は以下の手順で行った。まず、ウーロン茶活性画分１．１０ｍｇ及び紅茶活性画分０．８６ｍｇのそれぞれを、水０．２ｍｌで溶解し、タンナーゼ水溶液０．３ｍｌを加え、３０℃、３時間条件下で、酵素反応を進行させた。タンナーゼ水溶液は、タンナーゼ（和光純薬工業株式会社製）を水で１７．３Ｕに調製し用いた。【００６０】
次に、酵素反応液（酵素反応による分解生成物を含む）について、ペーパークロマトグラフィーを行った。展開溶媒には、次の二つをそれぞれ用いた。
（１）２％酢酸水溶液。
（２）ｎ−ブタノール、酢酸、水を、４：１：５（容積比）に混合した溶媒の上層。【００６１】
没食子酸（コントロール）と酵素反応液をペーパークロマトグラフで同時に展開させ、０．５％鉄明礬と０．５％赤血塩を噴霧して、展開した反応生成物を検出し、Ｒｆを求めた。ここで、「Ｒｆ（ｒａｔｅ  ｏｆ  ｆｌｏｗ）」は、ペーパークロマトグラフィーにより原点から展開物質が移動した距離を表す。【００６２】
その結果、ウーロン茶活性画分、紅茶活性画分ともに、（１）の溶媒で展開した場合にはＲｆ０．３７、（２）の溶媒で展開した場合にはＲｆ０．５９に、スポットが検出された。このスポットは、没食子酸のスポットとＲｆが一致する。【００６３】
従って、この結果は、ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分及び紅茶ブタノール抽出中性画分に含有するミトコンドリア活性化成分が、高次的な化学構造の中に、エピカテキン又はエピガロカテキン若しくはそれらの没食子酸エステルと同じ化学構造を含むことを示す。【００６４】
なお、本発明者らは、別途、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分及び紅茶ブタノール抽出酸性画分についても、同様の実験を行った。その結果、同様の結果が得られた。この結果は、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分及び紅茶ブタノール抽出酸性画分に含有するミトコンドリア活性化成分も、前記と同様、高次的な化学構造の中に、エピカテキン又はエピガロカテキン若しくはそれらの没食子酸エステルと同じ化学構造を含むことを示す。
【実施例４】
【００６５】
実施例４では、実施例１において分画したウーロン茶ブタノール抽出酸性画分のウーロン茶活性画分、及び、同じく実施例１において分画した紅茶ブタノール抽出中性画分の紅茶活性画分について、塩酸−ブタノール分解を行った。手順は以下のとおりである。【００６６】
まず、塩酸１．１ｍｌとｎ−ブタノール８．９ｍｌの混合試薬を準備した。次に、ウーロン茶活性画分及び紅茶活性画分を各０．５ｍｇ、それぞれの小反応容器に取り、前記混合試薬１．０ｍｌを加え、スクリューキャップを付けて、１０５℃のオートクレーブ中で５０分加熱した。【００６７】
次に、反応生成物について、ペーパークロマトグラフィーを行った。展開溶媒には、次の二つをそれぞれ用いた。
（１）酢酸、塩酸、水を、３０：３：１０（容積比）で混合した溶媒。
（２）ｎ−ブタノール、酢酸、水を、４：１：５（容積比）に混合した溶媒の上層。【００６８】
その結果、ウーロン茶活性画分では、（１）の溶媒で展開した場合にはＲｆ０．５７とＲｆ０．３６、（２）の溶媒で展開した場合にはＲｆ０．４６とＲｆ０．２７に、アントシアニン特有のピンク色のスポットが検出された。また、紅茶活性画分でも、（１）の溶媒で展開した場合にはＲｆ０．５６とＲｆ０．３６、（２）の溶媒で展開した場合にはＲｆ０．４６とＲｆ０．２７に、アントシアニン類特有のピンク色のスポットが検出された。これらのスポットは、Ｒｆ値の高いほうがシアニジン、Ｒｆ値の低いほうがデルフィニジンであると考える。【００６９】
従って、この結果は、ウーロン茶ブタノール抽出酸性画分及び紅茶ブタノール抽出中性画分に含有するミトコンドリア活性化成分が、高次的な化学構造の中に、プロシアニジン構造を含むことを示す。【００７０】
なお、本発明者らは、別途、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分及び紅茶ブタノール抽出酸性画分についても、同様の実験を行った。その結果、同様の結果が得られた。この結果は、ウーロン茶ブタノール抽出中性画分及び紅茶ブタノール抽出酸性画分に含有するミトコンドリア活性化成分も、前記と同様、高次的な化学構造の中に、プロシアニジン構造を含むことを示す。【００７１】
実施例３及び実施例４の結果を総合すると、実施例２においてミトコンドリア活性化作用を示した成分は、高次的な化学構造を持つ高分子ポリフェノールであって、その部分構造中に、エピカテキンやエピガロカテキン及びそれらの没食子酸エステルが重合したプロシアニジン構造を含むと推測する。
【実施例５】
【００７２】
実施例５では、発酵茶から抽出した有効画分の平均分子量を測定した。【００７３】
サンプルには、実施例１において分画したウーロン茶ブタノール抽出中性画分の画分１５、同じく実施例１において分画したウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の画分１４、同じく実施例１において分画した紅茶ブタノール抽出中性画分の画分１５、同じく実施例１において分画した紅茶ブタノール抽出酸性画分の画分１１、の４種類を用いた。【００７４】
平均分子量の測定は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ；ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）法により行った。【００７５】
高速クロマトグラフ装置として、ＬＣ−１０Ａシステム（株式会社島津製作所製）を用いた。カラムには、ＴＳＫ−ＧＥＬα−３０００（カラム寸法７．８ｍｍＩ．Ｄ．×３０ｃｍ、東ソー株式会社製）を用いた。カラム温度は４０℃にした。展開溶媒には、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）１０ｍＭを含有したジメチルホルムアミドを用いた。流速は、０．６ｍｌ／ｍｉｎに設定した。検出器には、ＬＣ−１０Ａシステムに含まれるＵＶ検出器を用いた。検出波長は２７５ｎｍに設定した。【００７６】
まず、カラムに分子量標準化合物を流し込み、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、較正曲線を作成した。分子量標準化合物には、ＴＳＫ標準ポリスチレン（東ソー株式会社製）を用いた。【００７７】
次に、カラムに各サンプルを流し込み、溶出時間を横軸に、ＵＶ検出値を縦軸にしてプロットし、較正曲線に基づいて平均分子量を算出した。平均分子量として、数平均分子量と重量平均分子量の両者を算出した。【００７８】
結果を表５に示す。
【表５】
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【００７９】
表５の結果より、発酵茶から抽出した有効画分の数平均分子量は９，０００〜１８，０００、重量平均分子量は、１４，０００〜２５，０００であることが分かった。
【実施例６】
【００８０】
実施例６では、熱分解−ガスクロマトグラフ−マススペクトル（Ｐｙ−ＧＣ−ＭＳ）分析装置を用いて、発酵茶から抽出した有効画分の構造解析を行った。【００８１】
サンプルを熱分解装置（Ｐｙ）で熱分解した後、その分解生成物をガスクロマトグラフ装置（ＧＣ）に導入して分別し、さらに、マススペクトル装置（ＭＳ）で分別した化合物を解析することにより、サンプル化合物の熱的性質や化学構造に関する知見を得ることができる。【００８２】
サンプルには、実施例５と同様、実施例１において分画したウーロン茶ブタノール抽出中性画分の画分１５、同じく実施例１において分画したウーロン茶ブタノール抽出酸性画分の画分１４、同じく実施例１において分画した紅茶ブタノール抽出中性画分の画分１５、同じく実施例１において分画した紅茶ブタノール抽出酸性画分の画分１１、の４種類を用いた。【００８３】
熱分解（Ｐｙ）には、キューリーポイント熱分解装置「ＪＨＰ−５（日本分析工業株式会社）」を用いた。【００８４】
まず、炉内及びガスクロマトグラフ導入部の温度を、２５０℃にした。次に、フェロマグネティック−パイロホイル（厚さ５０μｍ）にサンプルを包み、１０％テトラメチルヒドロキサイドアンモニウムメタノール溶液５μＬをサンプルに加え、炉内に入れ、３１５℃、４秒間処理して熱分解を行った後、分解生成物をガスクロマトグラフへ送った。なお、１０％テトラメチルヒドロキサイドアンモニウムメタノール溶液は、サンプル中の化合物をメチル化することにより、質量分析の段階で揮発性・熱安定性が得られるようにするため、用いた。【００８５】
ガスクロマトグラフ−マススペクトル（ＧＣ−ＭＳ）には、ガスクロマトグラフ質量分析計「ＪＭＳ−６００Ｍ（日本電子株式会社製）」を用いた。また、データ処理装置として、ＴＳＳ−２０００（日本分析興行株式会社製）を用いた。ガスクロマトグラフ用のカラムには、キャピラリーカラム「ＨＰ−１ＭＳ（カラム寸法０．２５ｍｍ×３０ｍ、コーティングした液層の厚さ０．２５μｍ、アジレント＝テクノロジイズ製）」を用いた。【００８６】
熱分解生成物とキャリアガスとをカラム内に流し入れ、熱分解生成物中に存在する物質を分離し、また、保持時間に関するデータを取得した。また、分離した各物質について質量分析を行い、化学構造などに関する知見を得た。カラム内の温度は、はじめ５０℃を１分間保持し、次に、５℃／ｍｉｎで３００℃まで直線的に昇温させ、次に、３００℃を１４分間保持した。キャリアガスには、ヘリウムを用いた。その流速は、１．０ｍｌ／ｍｉｎに設定した。その他、質量分析は、イオン源温度２５０℃、イオン化電圧７０ｅＶの条件で行った。【００８７】
そして、ガスクロマトグラフ−質量分析により得られたデータと合成標準物質の既知データとを比較し、サンプル中に含まれる物質の化学構造などを検討した。【００８８】
その結果、各サンプルの熱分解物から、下記１０種類の化合物が検出された。それらの化合物の化学式を「化３」から「化５」に示す。なお、それらの化合物の保持時間（ｔＲ；ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）及び分子量は次の通りである。化合物１（ｔＲ２３．０ｍｉｎ；分子量１６８）、化合物２（ｔＲ２２．１ｍｉｎ；分子量１６６）、化合物３（ｔＲ３０．３ｍｉｎ；分子量１９６）、化合物４（ｔＲ３０．５ｍｉｎ；分子量２２６）、化合物５（ｔＲ３１．１ｍｉｎ；分子量２５４）、化合物６（ｔＲ３２．４ｍｉｎ；分子量２５４）、化合物７（ｔＲ３２．９ｍｉｎ；分子量２５４）、化合物８（ｔＲ３５．２ｍｉｎ；分子量２８４）、化合物９（ｔＲ３６．９ｍｉｎ；分子量３１２）、化合物１０（ｔＲ４６．５ｍｉｎ；分子量４５０）。
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【００８９】
これらの結果は、各サンプルに含有する化合物の化学構造中に、上述の１０種類の分解生成物を与える化学構造が含まれることを示す。【００９０】
また、質量分析の結果より、その化合物が、カテキン類又はその没食子酸エステル類の化学構造中のＣ２’、Ｃ５’、Ｃ６’部位、カテキン類同士のＣ４−Ｃ８間、Ｃ６−Ｃ６’間、又は、Ｃ６’−Ｃ６’間に、重合部位を有することが示唆された。【００９１】
実施例３から実施例６の結果を総合すると、実施例２においてミトコンドリア活性化作用を示した成分は、部分構造中に、カテキン類及び／又はその没食子酸エステル類が重合したプロシアニジン構造、並びにカテキン類及び／又はその没食子酸エステル類のＢ環同士が結合した構造を含む数平均分子量９，０００〜１８，０００（重量平均分子量１４，０００〜２５，０００）の高分子ポリフェノールであると推測する。【００９２】
上記知見に基づき、本発明に係る高分子ポリフェノールの化学構造式の一例を「化６」に示す。なお、本発明に係る高分子ポリフェノールの化学構造は、これに狭く限定されない。
【化６】
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【実施例７】
【００９３】
実施例７では、発酵茶から抽出した有効画分を糖尿病モデルマウスに投与し、その成分に血糖値上昇抑制効果があるかどうかを調べた。【００９４】
まず、実施例２における有効画分をＰＢＳに溶解し、２．７ｍｇ／ｍｌと０．９ｍｇ／ｍｌの投与液を得た。次に、II型糖尿病モデルマウス（ＢＳＫ．Ｃｇ−＋Ｌｅｐｒ＜ｄｂ＞／＋Ｌｅｐｒ＜ｄｂ＞／Ｊｃｌ、雄６週齢、日本クレア社より購入）に、０．１ｍｌ／日（０．２７ｍｇ／日又は０．０９ｍｇ／日）、毎日腹腔投与した。また、コントロールとして、ＰＢＳを０．１ｍｌずつ毎日腹腔投与した。そして、毎日、尾静脈より採血し、血糖値を測定した。【００９５】
結果を図５及び図６に示す。図５は、発酵茶から抽出した有効画分を投与した場合における体重の変化を示すグラフ、図６は、発酵茶から抽出した有効画分を投与した場合における血糖値の変化を示すグラフである。図５及び図６の横軸は、投与開始からの週数を表す。図５の縦軸はマウスの体重（ｇ）を、図６の縦軸は血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を、それぞれ表す。なお、各グラフにおける投与個体数は５匹又は６匹である。【００９６】
０．２７ｍｇ／日投与群では、図５に示す通り、ＰＢＳ投与群（コントロール）と比較して、１０週経過時において、約５ｇ体重が低かった。また、図６に示す通り、４週経過した頃から血糖値の上昇抑制が観察され、また、ＰＢＳ投与群と比較して、１０週経過時において、血糖値が約３３％下がった。【００９７】
一方、０．０９ｍｇ／日投与群では、図５に示す通り、ＰＢＳ投与群（コントロール）と比較して、１０週経過時に僅かな体重増加抑制が観察された。また、図６に示す通り、６週経過した頃から血糖値の上昇抑制が観察され、また、ＰＢＳ投与群と比較して、１０週経過時において、血糖値が約２０％下がった。【００９８】
これらの結果は、発酵茶から抽出した有効画分を比較的高濃度に投与した場合、早期の体重増加抑制と血糖値上昇抑制を抑制でき、かつ、比較的低濃度に投与した場合でも、長期的な投与により、体重増加抑制と血糖値上昇抑制を抑制できることを示す。
【実施例８】
【００９９】
実施例８では、本発明に係る高分子ポリフェノールと低分子ポリフェノールとを、それぞれマウスに投与し、血糖値上昇抑制効果を比較した。【０１００】
実験手順は実施例７とほぼ同様である。本実験では、Ｂ６マウス（Ｃ５７ＢＬ、日本クレア社より購入）を用いた。高分子ポリフェノール投与群では、実施例２における有効画分のＰＢＳ溶解液を、０．２７ｍｇ／日、毎日腹腔投与し、低分子ポリフェノール投与群では、エピカテキンのＰＢＳ溶解液を、０．２７ｍｇ／日、毎日腹腔投与した。そして、投与初日と投与開始から１５日後に尾静脈より採血し、血糖値を測定した。【０１０１】
結果を図７に示す。図７は、高分子ポリフェノールと低分子ポリフェノールとを、それぞれマウスに投与した場合における血糖値の変化を示すグラフである。図中の横軸は投与開始からの日数を、縦軸は投与初日の血糖値を１００とした場合における血糖値の変化の割合（％）を、それぞれ表す。【０１０２】
図７に示す通り、高分子ポリフェノール投与群では、血糖値が約１６％低下したのに対し、低分子ポリフェノール投与群では、血糖値はほとんど変化しなかった。【０１０３】
この結果は、本発明に係る高分子ポリフェノールには、低分子ポリフェノールよりも強力な血糖値上昇抑制作用があることを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明に係る高分子ポリフェノールを含有する組成物は、医薬品、化粧品として、適用できる。また、また、健康食品などとして、飲食物に本発明に係る高分子ポリフェノールを含有させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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