(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポ酸のオリゴマーおよび対イオンの複合体を含む、ルテインエステルの安定化のために用いられる組成物であって、
（ａ）水溶液中で、塩基をリポ酸と反応させるステップと、
（ｂ）溶液を１〜５時間の間、高温（elevated temperature）で維持するステップと、
（ｃ）非溶媒の添加によって、リポ酸のオリゴマーおよび塩基性対イオンの複合体を、水溶液から沈殿させるステップ
の工程によって調製され、
前記オリゴマーの平均重合度が３〜６であり、
前記対イオンがアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムイオン、アミノ酸、アルキレンジアミン、一置換アミン、二置換アミンまたは三置換アミンである、組成物。
【請求項２】
次式（Ｉ）：
0005439173.tif 000038
［式中、各Ｒ+は独立して、前記対イオンを表し、
ｎは、２〜５０の間の値である。］
を含むリポ酸オリゴマーの複合体を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記平均重合度が４〜６である、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
対イオンが、アミノ酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
アミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記工程が、ｄ）沈殿した複合体を回収するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記工程における反応の温度が、３０℃と５０℃の間である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記工程において、溶液を３時間、高温で維持した、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記工程で用いる非溶媒が、アルコール、塩素化炭化水素、脂肪族ケトン、脂肪族エーテル、アルキル炭化水素、芳香族炭化水素またはそれらの混合物である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
非溶媒が、アセトニトリル、ジクロロメタン、アセトン、２−プロパノール、ジエチルエーテル、ヘキサン、オクタン、トルエン、石油エーテル、テトラヒドロフラン、オクタノール、ベンゼン、ジオキサンまたはそれらの混合物のうちの１種である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記工程で用いる塩基がアミノ酸である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
アミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物と、ルテインエステルとを含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物と、製薬上許容される担体とを含む、薬剤組成物。
【請求項１５】
ルテインエステルを安定化させる方法であって、
ルテインエステルを、請求項１に記載の組成物と接触させ、その結果、ルテインエステルが安定化されるステップを含む方法。
【請求項１６】
接触させる方法がコーティングすることによる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
接触させる方法が、ルテインエステルを、請求項１に記載の組成物と念入りに混合することによる、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、リポ酸のオリゴマーならびにリポ酸（チオクト酸）のオリゴマー複合体、特に、リポ酸のオリゴマーのアミノ酸塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−リポ酸は、まず、酢酸塩置換因子として単離された。わずかに水溶性であり、特定の有機溶媒に可溶性である。α−リポ酸は、最初、その単離後、ビタミンとしてとして同定されたが、後に、ヒトをはじめとする哺乳類によって、ならびに植物によって合成されることがわかった。ｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関与している完全酵素経路は、まだ決定的には解明されていない。いくつかの研究により、オクタン酸塩は、８−炭素脂肪酸鎖の直接前駆体として働き、システインが硫黄の供給源であるようであると示された。アミド（リポアミド）として、ピルビン酸塩、α−ケトグルタル酸および分枝鎖α−ケト酸などのα−ケト酸の酸化的脱炭酸を触媒する多酵素複合体において補因子として機能する。
【０００３】
α−リポ酸は、最強の天然に存在する抗酸化剤の１種である。α−リポ酸（ＬＡ）はまた、チオクト酸、１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸、１，２−ジチオラン−３−吉草酸および６，８−チオクト酸としても知られている。α−リポ酸は、キラル炭素原子を有し、２種の鏡像異性体の形（Ｒ−およびＳ−）で生じる。市販されるα−リポ酸の形は、天然異性体（Ｒ−）と非天然異性体（Ｓ−）の合成混合物である。Ｒ−ＬＡの天然型は、合成混合物ほど安定ではない。１つの製造業者、Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａは、糖尿病用Ｒ−ＬＡを販売しており、Ｔｒｉｓバッファー、よく用いられる合成であるが非天然のバッファーを用いて結晶化することによってＲ−ＬＡの安定な形を製造した。
【０００４】
α−ＬＡの種々の鏡像異性体の形およびそれらの組み合わせおよび誘導体（その還元型を含む）は、多数の症状を治療するために用いられている。例えば、ＬＡは、循環障害の治療において用いられている。ＬＡおよびビタミンは、鎮痛、抗炎症、抗壊死、抗糖尿病およびその他の治療効果を引き起こすのに有用であることがわかっている。ＬＡの特定のアルキル化誘導体は、レトロウイルス疾患の治療において用いられている。
【０００５】
α−リポ酸およびその還元型、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）は、抗酸化特性を有する。リポ酸塩（カルボン酸エステルおよび塩に対する用語）またはその還元型、ＤＨＬＡは、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル、次亜塩素酸、ペルオキシルラジカルおよび一重項酸素などの反応性酸素種と反応する。また、ビタミンＣおよびグルタチオンと相互作用することによって膜を保護し、順に、ビタミンＥを再利用できる。ＤＨＬＡは、その抗酸化活性に加え、酸化促進作用を発揮して鉄を還元し得る。α−リポ酸投与は、虚血−再潅流損傷（ＩＲＩ）、糖尿病（α−リポ酸およびＤＨＬＡの両方が、アルブミンなどのタンパク質との疎水性結合を示し、これが糖化反応を妨げ得る）、白内障形成、ＨＩＶ活性化、神経変性および放射線傷害などのいくつかの酸化ストレスモデルにおいて有益であることがわかっている。さらに、リポ酸塩は、ミオグロビン、プロラクチン、チオレドキシンおよびＮＦ−κ−Ｂ転写因子などのタンパク質の酸化還元レギュレーターとして機能し得る。
【０００６】
リポ酸塩はまた、その他の活性を有し得る。例えば、ＤＨＬＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、同時に、炎症性マクロファージからの一酸化窒素放出と相互作用し、標的細胞を酸素ラジカル攻撃から保護する抗炎症剤であることがわかっている。
【０００７】
リポ酸はまた、いくつかの酵素の補酵素でもある。リポ酸は、両α−ケト酸脱水素酵素複合体酵素（すなわち、ピルビン酸脱水素酵素複合体およびα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体）、分枝鎖α−ケト酸脱水素酵素複合体およびグリシン開裂系の補酵素である。この酵素系では、本体は、リポ酸を含む多酵素複合体を形成し、これは、初期の代謝において産生されたピルビン酸塩の分子を分解して、アセチル補酵素Ａと呼ばれる、わずかに小さい、高エネルギーの分子を形成する。これは、食物のエネルギーへの変換を完了する、クエン酸回路またはクレブス回路と呼ばれる一連の反応に入ることができる分子をもたらす。本質的に、リポ酸は、基礎グルコース輸送を刺激し、インスリンによって刺激されたグルコース取り込みに対して正の作用を有する。
【０００８】
生理学的条件下では、ＬＡは、少なくとも５種のタンパク質中にリポアミドとして存在し、ここでは、リシル残基と共有結合している。これらのタンパク質のうち４種は、α−ケト酸脱水素酵素複合体、ピルビン酸脱水素酵素複合体、分枝鎖ケト酸脱水素酵素複合体およびα−ケトグルタル酸脱水素酵素複合体である。３種のリポアミド含有タンパク質は、複合体の各々において異なっており、複合体の基質に対して特異的であるＥ２酵素ジヒドロリポイルアシルトランスフェラーゼ中に存在する。１種のリポイル残基は、各複合体において同一であるタンパク質Ｘ中に見られる。５番目のリポアミド残基は、グリシン開裂系中に存在する。
【０００９】
最近、ＬＡは、種々の天然供給源中でリポイルリシンの形で検出された。研究された植物材料では、リポイルリシン含量は、ホウレンソウにおいて最高であった。凍結乾燥された野菜の乾重あたりの重量として表される場合には、ホウレンソウ中に天然に存在するリポ酸塩の存在量は、ブロッコリーおよびトマト中のものの、それぞれ、３倍および５倍を超えて高い。エンドウマメ（ｇａｒｄｅｎ  ｐｅａ）、メキャベツおよび米ぬかでも、低濃度のリポイルリシンが検出された。
【００１０】
動物組織では、ウシアセトン粉末中のリポイルリシンの存在量は、以下の順：１）腎臓、２）心臓、３）肝臓、４）脾臓、５）脳、６）膵臓および７）肺で示される。
【００１１】
しかし、ＬＡは特定の欠点がある。特に、天然型Ｒ−ＬＡは、４０℃を超えると不安定であり、そのため、一部の倉庫保管条件下で分解し得る。また、ＬＡは吸湿性である。必要なことは、この天然型のＬＡの、天然塩を用いた安定化である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、利用可能な物質の１以上の同定されている現在の短所を克服するように、α−リポ酸組成物を調製する組成物および／または方法に対する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、驚くべきことに、オリゴマーである、αリポ酸の複合体を提供する。
【００１４】
本発明はまた、驚くべきことに、オリゴマーのαリポ酸を「遊離酸」として提供する。
【００１５】
オリゴマーのαリポ酸の複合体ならびにオリゴマーの「遊離酸」の両方とも、そうでなければ、熱、酸化、光または物質を分解させるその他の物理的ストレスに対して安定でないと考えられるカロテノイドなどの栄養物質を安定化するために使用できる。オリゴマーのαリポ酸の複合体およびオリゴマーの遊離酸は、栄養物質に安定化効果を提供するのに役立つよう併用できる。
【００１６】
本発明のαリポ酸複合体（以下、「ＡＬＡＣ」）の正確な性質は、明確にはなっておらず、理論に制限されるものではないが、それらは、スルフィド結合を介し、それによって２個以上の個々のαリポ酸ユニットの間でジスルフィドを形成する、２個以上のリポ酸の間の縮合産物であると考えられている。本発明の「ＡＬＡＣ」は、少なくとも１種の対イオン、例えば、金属塩、アミンまたはアミノ酸ならびに以下に記載されるその他のものと結合し得る。
【００１７】
やはり、理論に制限されるものではないが、本発明のＡＬＡＣは、「ポリマー」であるαリポ酸の複合体をさらに含むことが可能である。すなわち、５０個を超えるαリポ酸ユニットの縮合は、５０以上の個々のαリポ酸サブユニットの間の複数のジスルフィド結合を介して結合している物質に起因する。
【００１８】
一態様では、ポリマーのＡＬＡＣの量は、１０％（重量）未満、特に１％未満、さらには０．５％未満、特定の実施形態では、０．１重量％未満である。
【００１９】
本発明のオリゴマーのαリポ遊離酸（以下、「ＡＬＦＡ」）の正確な性質は、明確にはなっておらず、理論に制限されるものではないが、それらは、スルフィド結合を介し、それによって２個以上の個々のαリポ酸ユニットの間でジスルフィドを形成する、２個以上のリポ酸の間の縮合産物であると考えられている。ＡＬＦＡは、少なくとも１種の対イオン、例えば、金属塩、アミンまたはアミノ酸ならびに以下に記載されるその他のものと結合して、ＡＬＡＣを形成し得る。同様に、ＡＬＡＣは、水素原子で置換されてＡＬＦＡを形成する対イオンを有し得る。
【００２０】
理論に制限されるものではないが、本発明のＡＬＦＡは、「ポリマー」であるαリポ酸の縮合産物をさらに含むことが可能である。すなわち、５０個を超えるαリポ酸ユニットの縮合は、５０個以上の個々のαリポ酸サブユニットの間の複数のジスルフィド結合を介して結合している物質に起因する。
【００２１】
一態様では、ポリマーのＡＬＦＡの量は、１０％（重量）未満、特に１％未満、さらには０．５％未満、特定の実施形態では、０．１重量％未満である。
【００２２】
本発明のＡＬＡＣおよびＡＬＦＡは、本明細書に記載される種々の方法によって精製できる。すなわち、オリゴマー化／重合プロセスの後、リポ酸、リポ酸ポリマー、望ましくない副生成物などの除去によって、物質の洗浄、再結晶化、沈殿、分子量カットオフを用いた限外濾過、ダイアフィルトレーションなどによって、得られたオリゴマーを単離および精製できる。
【００２３】
一態様では、本発明は、オリゴマーのαリポ酸および１種以上の対イオンの複合体を含む組成物に関する。複合体は、塩、オリゴマーのαリポ酸と対イオン間の結合および／または２個以上のαリポ酸分子と少なくとも１個の対イオン間のキレートであり得る。
【００２４】
別な態様では、本発明は、次式（Ｉ）：
【００２５】
【化１】
0005439173.tif 000002
［式中、各Ｒ＋は独立して、対イオンを表し、
ｎは、約２〜約５０の間、特に、約１０〜約２０、特に、約４〜約６の間の値である］
を含むオリゴマーのαリポ酸複合体（ＡＬＡＣ）を含む組成物を提供する。
【００２６】
一態様では、各Ｒ＋は同一である。別な態様では、Ｒ＋は、２種以上の異なる対イオンであり得る。
【００２７】
なおさらにもう１つの実施形態では、本発明は、約４１２．６（ｎ＝２）〜約１０２６８．５（ｎ＝５０）ダルトンの間の平均（Ｍｗ）分子量を有するオリゴマーのαリポ酸（ＡＬＡＣ）と、対イオン（複数の対イオン）との複合体を含む組成物を提供する。
【００２８】
もう１つの態様では、本発明は、
水溶液中で、塩基をリポ酸と反応させるステップと、
溶液を約１〜約５時間の間、高温で維持するステップと、
非溶媒の添加によって、オリゴマーのリポ酸と塩基性対イオンの複合体を、水溶液から沈殿させるステップと
によって調製されたオリゴマーのαリポ酸複合体を提供する。
【００２９】
一実施形態では、沈殿した複合体を回収するステップによって、オリゴマーのリポ酸複合体を単離する。
【００３０】
特定の態様では、ＡＬＡＣは、αリポ酸および１個以上の対イオンの多数のサブユニットに基づいて（オリゴマー化プロセスからの混入がない）、約９０％超、特に約９５％超、さらには約９８％超、最も特別には約９９％（重量）超、例えば、９９．５％、９９．９％の純度を有する。
【００３１】
本発明の組成物に関して有用な適切な対イオンとして、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムイオン、アミノ酸、アルキレンジアミン、一置換アミン、二置換アミンまたは三置換アミンが挙げられる。
【００３２】
一態様では、対イオンは、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物を含み得るアミノ酸である。
【００３３】
別な態様では、本発明はまた、次式（Ｉａ）：
【００３４】
【化２】
0005439173.tif 000003
［式中、ｎは、約２〜約５０の間、特に、約１０〜約２０、特に、約４〜約６の間の値である］
を含むオリゴマーのαリポ酸遊離酸（ＡＬＦＡ）を含む組成物を提供する。
【００３５】
なおさらにもう１つの実施形態では、本発明は、約４１２．６（ｎ＝２）〜約１０２６８．５（ｎ＝５０）ダルトンの間の平均（Ｍｗ）分子量を有するオリゴマーのαリポ遊離酸（ＡＬＦＡ）を含む組成物を提供する。
【００３６】
別な態様では、本発明は、オリゴマーのαリポ酸遊離酸を調製する方法を提供する。
【００３７】
一実施形態では、沈殿したオリゴマーを回収するステップによってオリゴマーのリポ遊離酸を単離する。
【００３８】
特定の態様では、ＡＬＦＡは、αリポ酸の複数のサブユニットに基づいて（オリゴマー化プロセスからの混入がない）、約９０％超、特に約９５％超、さらには約９８％超、最も特別には約９９％（重量）超、例えば、９９．５％、９９．９％の純度を有する。
【００３９】
興味深いことに、本発明の組成物（ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ）は、リポ酸またはαリポ酸の塩（同様にアミノ酸塩であり得る）をさらに含み得る。適切なアミノ酸として、例えば、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物が挙げられる。
【００４０】
特定の態様では、本発明の組成物は、αリポ酸の塩を含んでも含まなくても、約１６５℃〜約１７０℃の間の融点を有する。
【００４１】
その他の態様では、本発明の組成物は、αリポ酸の塩を含んでも含まなくても、２０ｍｌの中性水（neutral water)中に０．５グラムの物質を溶解した場合に、約７．５のｐＨ値を有する。
【００４２】
本発明の組成物は、固体の形のもの、例えば、顆粒、結晶、粉末などであり得る。
【００４３】
本発明の組成物はまた、液体担体も含み得る。
【００４４】
本発明の組成物は、特に、Ｒ立体配置、Ｓ立体配置、光学活性がラセミではないが純粋なＲまたはＳオリゴマー未満であるＲおよびＳ立体配置の組み合わせ、およびまたラセミ混合物、を有するαリポ酸のオリゴマーを提供し得る。
【００４５】
本発明の組成物は、医薬品または栄養補助製剤に使用できる。
【００４６】
本発明の組成物はさらに、炎症の治療のために、抗酸化剤として、循環障害の治療のために、鎮痛薬として、抗壊死剤として、レトロウイルス疾患の治療のために使用できる。
【００４７】
本発明の組成物はまた、そうでなければ、周囲条件で不安定である栄養物質を安定化するのに役立つよう使用できる。
【００４８】
複数の実施形態が開示されているが、以下の詳細な説明から、本発明のさらなる他の実施形態は当業者に明らかだろう。当然のことながら、本発明は、すべて本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の明らかな点において改変できる。したがって、詳細な説明は、実際は例示として考えられるべきであって、制限ではない。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】水に溶解後の、経時的なＬＡＯＲＮからのリポ酸の遊離を実証する図である。
【図２】α−リポ酸のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す図である。
【図３】ＬＡＯＲＮのＦＴ−ＩＲスペクトルを示す図である。
【図４】ＬＡＯＲＮのＨＮＭＲ−スペクトル（液体）を提供する図である。
【図５】３ｍｍｏｌの対応する化合物／Ｌを含有するサンプルの総抗酸化能をｍｍｏｌ／Ｌで示す図である。
【図６】種々の濃度のＬＡＯＲＮの結果を示す図である。
【図７】自己酸化の相対誘導の種々の経時変化を示す図である。
【図８】自己酸化の相対誘導の種々の経時変化を示す図である。
【図９】還元力アッセイの結果を提供する図である。
【図１０】ＬＡおよびＯＲＮの単純混合物と比較した場合に、ＬＡＯＲＮが強力な相乗作用を有していたことを示す図である。
【図１１】ＬＡＯＲＮ形成に対する反応時間および温度の影響を示す図である。
【図１２】ＬＡＯＲＮ形成に対する、２種の試薬［ＬＡ＋ＯＲＮ］（濃度は各試薬の濃度の合計であり、それらのモル比は１：１である）濃度の効果を示す図である。
【図１３】人工胃液における、コーティングされていないルテイン−エステルの安定性を提供する図である。
【図１４】人工回腸液における、コーティングされていないルテイン−エステルの安定性を提供する図である。
【図１５】人工胃液における、ルテイン−エステル（１％のオリゴマー化され、コーティングされたリポ酸）の安定性を提供する図である。
【図１６】人工回腸液における、コーティングされていないルテイン−エステル（オリゴマー化されていない１％のリポ酸）の安定性を提供する図である。
【図１７】人工胃液における、ルテイン−エステル（３％のオリゴマー化され、コーティングされたリポ酸）の安定性を提供する図である。
【図１８】人工回腸液における、コーティングされていないルテイン−エステル（オリゴマー化されていない３％のリポ酸）の安定性を提供する図である。
【図１９】リポ酸含量およびルテインエステルの残存割合の曲線を表す図である。
【図２０】リポ酸の滴定曲線を表す図である。
【図２１】リポ酸の滴定曲線を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本発明は驚くべきことに、オリゴマーであるαリポ酸の複合体を提供する。本発明のαリポ酸複合体（「ＡＬＡＣ」）の正確な性質は、明確にはなっておらず、理論に制限されるものではないが、それらは、スルフィド結合を介し、それによって２個以上の個々のαリポ酸ユニットの間でジスルフィドを形成する、２個以上のリポ酸の間の縮合産物であると考えられている。ＡＬＡＣは、少なくとも１種の対イオン、例えば、金属塩、アミンまたはアミノ酸ならびに以下に記載されるその他のものと結合し得る。
【００５１】
やはり、理論に制限されるものではないが、本発明のＡＬＡＣは、「ポリマー」であるαリポ酸の複合体をさらに含むことが可能である。すなわち、約５０個を超えるαリポ酸ユニットの縮合は、５０個以上の個々のαリポ酸サブユニットの間の複数のジスルフィド結合を介して結合している物質に起因する。
【００５２】
一態様では、本発明は、オリゴマーのαリポ酸と１個以上の対イオンとの複合体を含む組成物に関する。複合体は、塩、オリゴマーのαリポ酸と対イオン間の結合および／または２個以上のαリポ酸分子と少なくとも１個の対イオン間のキレートであり得る。
【００５３】
別な態様では、本発明は、「遊離酸」としてのオリゴマーのαリポ酸（ＡＬＦＡ）に関する。
【００５４】
別な態様では、本発明は、ＡＬＦＡと１種以上のＡＬＡＣの混合物に関する。
【００５５】
さらにもう１つの実施形態では、ＡＬＡＣは、部分的に複合体化されているだけであってもよく、このことは、プロトン化されているオリゴマーの一部と、１個以上の対イオンと複合体化されている一部であり得るということを意味する。これは以下の式ＩＩに表されている。
【００５６】
用語「αリポ酸」および「リポ酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、チオクト酸、１，２−ジチオラン−３−ペンタン酸、１，２−ジチオラン−３−吉草酸および６，８−チオクト酸を指し、当技術分野ではよく知られている。本出願を通じて、用語「αリポ酸」は、リポ酸の任意の異性体を含むものとするが、制限ではないということは理解されたい。
【００５７】
用語「オリゴマーの」とは、例えば、αリポ酸自体を超える分子量を有する物質を生じるよう、何らかの様式で縮合されている、αリポ酸の少なくとも２個のサブユニットを有する物質を含むものとする。一般に、本発明のオリゴマーは、オリゴマー構造内に含まれる、約２〜約５０個の間のαリポ酸のサブユニットを有する。
【００５８】
興味深いことに、本発明の「オリゴマーの」ＡＬＡＣおよびＡＬＦＡは、生理学的条件、例えば、胃または回腸内条件下で経時的に分解する。しかし、「ポリマーの」ＡＬＦＡは、特に、同様の環境において容易に分解しないということがわかった。この相違によって、特に、リポ酸誘導体がＡＬＡＣ、例えば、アミノ酸複合体である場合には、本発明のオリゴマーを使用して、栄養成分を送達すること、ならびにその分解時にリポ酸自体の有益な効果を提供することが可能になる。
【００５９】
用語「ポリマーのαリポ酸」は、分子内に、５０個を超えるαリポ酸のサブユニットを有する物質を含むものとする。
【００６０】
語句「αリポ酸の塩」または「リポ酸の塩」とは、対イオンがαリポ酸のカルボン酸と結合するようになるような、リポ酸分子と塩基性分子の間の酸塩基反応を意味するものとする。
【００６１】
用語「遊離酸」とは、例えば、プロトン化されているオリゴマー化リポ酸のカルボン酸部分を意味するものとする。
【００６２】
本明細書において、用語「複合体」とは、対イオンと、αリポ酸のカルボン酸などの分子との間の結合を意味するものとする。結合はイオン性であってもよいし、共有結合であってもよいし、ファンデルワールス相互作用であってもよく、および／またはキレート化などによるものであってもよい。この用語は、イオン（陰イオンと陽イオン）、例えば、カルボキシル基と塩またはアミノ酸などの対イオンの間に物理的引力があるということを意味するものとする。
【００６３】
許容される塩として、親化合物、例えば、αリポ酸中に存在する酸性プロトンが金属イオン（例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンまたはアルミニウムイオン）によって置換されるか、有機塩基（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、モルホリン、ピペリジン、ジメチルアミン、ジエチルアミンなど）と配位する場合に形成される塩が挙げられるということは理解されなくてはならない。また、アルギネートなどのアミノ酸の塩、グルクロン酸またはガラクツロン酸などのような有機酸の塩も含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅら、１９７７年、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１〜１９頁参照のこと）。
【００６４】
「製薬上許容される塩」はまた、適切な対イオンとして含まれ、本発明の化合物の比較的非毒性の、無機および有機塩基付加塩を指す。これらの塩は、化合物の最終単離および精製の間にin situで調製できるか、または遊離酸の形の精製された化合物（ＡＬＦＡ）を、金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩などの適切な塩基と、アンモニアと、または製薬上許容される有機第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンまたは第四級アミンと別個に反応させることによって調製できる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩として、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム塩などが挙げられる。塩基付加塩の形成にとって有用な代表的な有機アミンとして、エチルアミン、水酸化テトラメチル−アンモニウム、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが挙げられる（例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ」前掲参照のこと）。
【００６５】
用語「アルカリ金属イオン」とは、水素を除く、周期表の群Ｉａ中の原子を意味するものとする。
【００６６】
適切なアルカリ金属イオンとして、例えば、ナトリウムおよびカリウムイオンが挙げられる。
【００６７】
用語「アルカリ土類金属イオン」は、周期表の群２（ＩＩＡ）原子を意味するものとする。
【００６８】
適切なアルカリ土類金属イオンとして、例えば、マグネシウムおよびカルシウムが挙げられる。
【００６９】
その他の適切なイオンとして、例えば、アルミニウム、亜鉛、銅または鉄が挙げられる。
【００７０】
本明細書において、用語「アミノ酸」とは、それだけには限らないが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン、システイン、シスチン、メチオニン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、オルニチン、ヒドロキシリジン、カルニチンおよびその他の天然に存在するアミノ酸およびそれらの類似体の鏡像異性体およびラセミ混合物を含む。一実施形態では、アミノ酸は「Ｌ」型である。
【００７１】
例えば、オルニチン「類似体」などのアミノ酸類似体は、アセチル化産物、フマル酸誘導体など、およびそれらの許容されるアンモニウムおよび金属塩を含む。
【００７２】
用語「一置換アミン」は、アミン窒素上に単一の置換基を有するアミンを意味するものとする。置換基は、アルキルまたはアリール基であり得る。
【００７３】
適切な一置換アミンとして、例えば、メチルアミン、エチルアミン、フェニルアミンなどが挙げられる。
【００７４】
用語「ジアルキル置換アミン」は、アミン窒素上に２個の置換基を有するアミンを意味するものとする。置換基は、アルキル基、アリール基またはそれらの組み合わせであり得る。
【００７５】
適切なジアルキル置換アミンとして、例えば、ジエチルアミン、ジメチルアミン、ジフェニルアミンなどが挙げられる。
【００７６】
用語「トリアルキル置換アミン」とは、アミン窒素について３個の置換基を有するアミンを意味するものとする。置換基は、アルキル基、アリール基またはそれらの組み合わせであり得る。
【００７７】
適切なトリアルキル置換アミンとして、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリフェニルアミンなどが挙げられる。
【００７８】
用語「アルキレンジアミン」とは、炭素骨格内に２つのアミンを有する化合物を意味するものとする。アミンは、末端である場合も、炭素骨格内にある場合もある。
【００７９】
適切なアルキレンジアミンとして、例えば、エチレンジアミンまたはヘキサメチレンテトラアミンが挙げられる。
【００８０】
アルキル基として、最大約２０個の炭素を含有する直鎖、分枝および環状アルキル基が挙げられる。適切なアルキル基は、飽和であっても、不飽和であってもよい。さらに、アルキルはまた、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ６複素環、アリール、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルコキシおよびスルホニルからなる群から選択される１個以上の置換基で、１個以上の炭素で１回以上置換されていてもよい。さらに、アルキル基は、最大１０個のヘテロ原子またはヘテロ原子置換基を含み得る。適切なヘテロ原子として、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられる。
【００８１】
アリール基として、最大１０個のヘテロ原子を含み得るアリール基がある。アリール基はまた、アリール基または低級アルキル基で１回以上、場合により置換されていてもよく、また、その他のアリールまたはシクロアルキル環と融合していてもよい。適切なアリール基として、例えば、フェニル、ナフチル、トリル、イミダゾリル、ピリジル、ピロイル、チエニル、ピリミジル、チアゾリルおよびフリル基が挙げられる。
【００８２】
用語「環」とは、１個以上の窒素、酸素、硫黄またはリン原子を含み得る最大２０個の原子を有すると定義される（ただし、環は、水素、アルキル、アリル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、クロロ、ヨード、ブロモ、フルオロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、カルボキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、カルボキサミド、シアノ、オキソ、チオ、アルキルチオ、アリールチオ、アシルチオ、アルキルスルホネート、アリールスルホネート、リンおよびスルホニルからなる群から選択される１個以上の置換基を有することができ、ただし、環はまた、１個以上の縮合環、例えば、炭素環式環、複素環式環、アリールまたはヘテロアリール環も含み得る）。
【００８３】
用語「アルキレン」とは、一実施形態では、約１〜約２０個の炭素原子を有する、もう１つの実施形態では、１〜１２個の炭素を有する、直鎖、分枝または環状、特定の実施形態では、直鎖または分枝、二価脂肪族炭化水素基を指す。さらなる実施形態では、アルキレンとして、低級アルキレンが挙げられる。場合により、窒素置換基がアルキルである場合には、アルキレン基に沿って１個以上の酸素、硫黄または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよい。アルキレン基として、それだけには限らないが、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、プロピレン（−（ＣＨ２）３−）、メチレンジオキシ（−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−）およびエチレンジオキシ（−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−）が挙げられる。用語「低級アルキレン」とは、１〜６個の炭素を有するアルキレン基を指す。特定の実施形態では、アルキレン基として、低級アルキレン、例えば、１〜３個の炭素原子のアルキレンがある。
【００８４】
用語「重量平均分子量」（Ｍｗ）は、当技術分野で認識されており、重量平均分子量は、光散乱、小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）、Ｘ線散乱、沈降速度、ヨー素酸化滴定によって、またはゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって求めることができる。オリゴマーのＡＬＡＣ（複数のＡＬＡＣ）およびＡＬＦＡのＭｗは、通常、約４１２．６（ｎ＝２）〜約１０２６８．５（ｎ＝５０）、特に、約４１２．６（ｎ＝２）〜約３０８１．９５（ｎ＝１５）、より具体的には、約４１２．６（ｎ＝２）〜約２０５５．３（ｎ＝１０）、さらにより具体的には、約４１２．６（ｎ＝２）〜約１２３３．９８（ｎ＝６）である。
【００８５】
別な態様では、本発明は、次式（Ｉ）を含むオリゴマーのαリポ酸複合体を含む組成物を提供する：
【００８６】
【化３】
0005439173.tif 000004
［式中、各Ｒ＋は独立して、対イオンを表し、
ｎは、約２〜約５０の間、特に、約４〜約２０、特に、約１０〜約１５、特に、約４〜約１２の間、例えば、約４、約６、約８、約１０または約１２の値である］。
【００８７】
各Ｒ＋は、同一であってもよいし、またはオリゴマー中のＲ＋は、異なる対イオンを有し得るということは理解されなくてはならない。
【００８８】
例えば、オリゴマー化度ｎが２である場合には、本発明の化合物の構造は以下のとおりであると考えられる：
【００８９】
【化４】
0005439173.tif 000005
［式中、各Ｒ＋は、個々に、上記のとおり定義される］。
【００９０】
オリゴマー化度ｎが３である場合には、本発明の化合物の構造は以下のとおりであると考えられる：
【００９１】
【化５】
0005439173.tif 000006
［式中、各Ｒ＋は、個々に、上記のとおり定義される］。
【００９２】
αリポ酸サブユニットの反復鎖は、より多くのユニットによって延ばすことができる（ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２０など、最大５０までで５０を含む）。最終構造は、さらなるオリゴマー化が起こる場所（すなわち、どのスルフィド基で）に応じて変わる。分子重量分布は平均値であり、従って、全値（整数）の割合も考慮され、含まれるので、値は非整数であり得るということはさらに理解されなければならない。
【００９３】
本明細書を通じて、本発明の組成物は、種々の程度のオリゴマー化度、ｎをそれぞれ有する化合物の混合物として存在でき、αリポ酸の単量体の複合体または塩をさらに含み得るということは理解されなければならない。
【００９４】
また、例えば、ＡＬＦＡ（すべてのＲ＋が水素である）を提供するために１以上のＲ＋が水素原子によって置換されてもよいということも理解されなければならない。
【００９５】
なおさらにもう１つの実施形態では、本発明は、約４１２．６（ｎ＝２）〜約１０２６８．５（ｎ＝５０）ダルトンの間の平均（Ｍｗ）分子量を有するオリゴマーのαリポ酸と、対イオン（複数の対イオン）との複合体を含む組成物を提供する。
【００９６】
別な態様では、本発明はまた、次式（Ｉａ）を含むオリゴマーのαリポ酸遊離酸（ＡＬＦＡ）を含む組成物を提供する：
【００９７】
【化６】
0005439173.tif 000007
［式中、ｎは上記のとおりであり、約２〜約５０の間、特に、約１０〜約２０、特に、約４〜約６の間の値である］。
【００９８】
なおさらにもう１つの実施形態では、本発明は、約４１２．６（ｎ＝２）〜約１０２６８．５（ｎ＝５０）ダルトンの間の平均（Ｍｗ）分子量を有するオリゴマーのαリポ遊離酸（ＡＬＦＡ）を含む組成物を提供する。
【００９９】
別な態様では、本発明はまた、次式（ＩＩ）を含む、混合されたオリゴマーのαリポ酸複合体を含む組成物を提供する：
【０１００】
【化７】
0005439173.tif 000008
［式中、ｎは上記のとおりであり、
各Ｒ１は、独立して、水素原子または対イオンであり、ただし、少なくとも１個のＲ１は対イオンである］。
【０１０１】
さらに別な態様では、本発明はまた、次式（ＩＩＩ）を含むαリポ酸オリゴマーを含む組成物を提供する：
【０１０２】
【化８】
0005439173.tif 000009
［式中、ｎは上記のとおりであり、
各Ｒ２は、独立して、水素原子または対イオンである］。
【０１０３】
すべてのＲ２が水素原子である場合には、その結果は、ＡＬＦＡである。
【０１０４】
本発明は、リポ酸を、塩基と接触させて混合物を形成することと、この混合物を、約０℃〜約１００℃の間の温度に加熱することと、リポ酸の重合の程度が、約２〜約５０の間、例えば、約４〜約２０の間である、オリゴマーのリポ酸複合体を回収することとによって、オリゴマーのリポ酸複合体を調製する方法を提供する。
【０１０５】
特定の態様では、モル等量のカルボン酸あたり１モル等量の塩基を加える。その他の態様では、モル等量のカルボン酸あたり１モル等量未満の塩基を加え、それによって、「混合された」ＡＬＡＣを提供する。
【０１０６】
別な態様では、本発明は、以下の工程によって製造された生成物を提供する：
ａ）水溶液中で、塩基をリポ酸と反応させるステップと、
ｂ）溶液を約１〜約５時間の間、高温で維持するステップと、
ｃ）非溶媒の添加によって、オリゴマーのリポ酸と塩基性対イオンの複合体を、水溶液から沈殿させるか、溶液を噴霧乾燥してオリゴマーのリポ酸塩複合体を得るステップ。
【０１０７】
一実施形態では、オリゴマーのリポ酸複合体を、沈殿した複合体を回収するステップによって単離する。
【０１０８】
通常、オリゴマー化反応は、約０℃〜約１００℃の間、特に、約３０℃〜約６０℃の間の温度範囲において実施する。反応の間は過剰の塩基が存在し得るが、過剰の未反応塩基または複合体化されていない塩基はいずれも、精製時に除去できる。アルカリ条件下で反応を実施することによって、低い温度範囲、例えば、約３０℃〜約６０℃の間で生じるオリゴマー化反応が提供され、オリゴマー化ＡＬＡＣの良好な収率が提供されるということがわかった。
【０１０９】
驚くべきことに、水溶液中でアミノ酸などの塩基とαリポ酸を反応させ、溶液を高温で、上記で定義される一定期間の間維持する場合、オリゴマーの複合体が生じることがわかった。
【０１１０】
塩基は、通常、ステップａ）において用いられるアミノ酸であり、オルニチン、アルギニンおよびリシンから選択される。アミノ酸は、そのＬ型で提供されることが好ましいが、Ｒ型も可能である。Ｌ−オルニチンが塩基として用いられることが最も好ましい。
【０１１１】
一実施形態では、ステップａ）においてオルニチンが用いられる場合には、約９．５〜約１０．０、例えば、９．６のｐＨ値を有する水溶液の形で提供される。オルニチンの等電点（９．６）に近いこの範囲のｐＨ値では、オルニチンは、１つの正電荷を有する形で存在し、したがって、１つの負電荷を示すα−リポ酸と塩複合体を形成し得る。
【０１１２】
１つの例示的実施形態では、ステップａ）に用いられるオルニチンの水溶液は、オルニチンの塩酸塩を含有する溶液に、所望のｐＨ値が得られるまでＮａＯＨを添加することによって製造できる。
【０１１３】
ステップａ）に用いられるα−リポ酸は、そのＲ（＋）型、Ｓ（−）型またはラセミ型で提供され得る。
【０１１４】
ステップｂ）は、水溶液を濃縮するステップを含み得る。例えば、反応混合物は、ステップｂ）の最後に向けて、約５０％の水が除去されるまで濃縮され得る。
【０１１５】
高温での処理に加え、本発明の工程に用いられるα−リポ酸のオリゴマー化は、ある程度、反応混合物中の２種の試薬の濃度の合計に応じて変わるということがわかった。一実施形態では、ステップａ）における水溶液中の、塩基、例えば、オルニチンなどのアミノ酸と、α−リポ酸のそれぞれの濃度の合計は、約１５％〜約４５％（ｗ／ｖ）、より特に、約２５％〜約３５％（ｗ／ｖ）（重量対容積、ｍｇ／ｍｌ）であり、アミノ酸対リポ酸のモル比は、０．１：１〜１０：１の範囲内である。オリゴマー化は、高濃度で、より顕著であり得るが、得られる反応混合物の粘度が高いほど、これを用いる作業が困難となる。
【０１１６】
通常、本工程のステップａ）における塩基、例えば、アミノ酸と、α−リポ酸のモル比は、約１：１である。
【０１１７】
ステップｂ）における反応混合物の温度は、約３０℃以上であり、特に、約４０℃〜約５０℃である。これに関連して、低温は、オリゴマー化を促進すると思われるが、３０℃を下回る温度は、反応混合物の粘度が高まり、操作をより困難にするので望ましいものではないが不可能ではない。
【０１１８】
ステップｃ）に用いられる非溶媒は、アルコールであってよく、一実施形態では、エタノール溶液である。
【０１１９】
水溶液と、ステップｃ）においてＡＬＡＣを沈殿させるために用いられる非溶媒（例えば、エタノール）溶液との混合物の含水量は、通常１２％以下でなくてはならない。溶液の含水量がかなり高い場合には、沈殿した複合体が粘着性となる傾向があり、乾燥が困難である傾向がある。しかし、含水量が低すぎる場合には、通常、エタノールなどの非溶媒のパーセンテージの増大が必要となり、これは製造コストを高め得る。一実施形態では、８８％の最終エタノール含量が、最終生成物の収率および純度の点で、経済的かつ有益であることがわかった。
【０１２０】
ＡＬＡＣは、オリゴマーであろうとなかろうと、複合体が塩、緩く結合している陰イオン−陽イオン複合体、キレートまたは何らかのその他の結合であろうとなかろうと、α−リポ酸と比較して極めて熱安定性である。本発明のＡＬＡＣは、驚くべきほど高い抗酸化効果を有する。
【０１２１】
さらに、本発明のＡＬＡＣは、α−リポ酸を、経時的に比較的等量で放出すると思われ、すなわち、従って、α−リポ酸様の効果を有する「制御放出」製剤として使用できる。
【０１２２】
ＡＬＡＣは、α−リポ酸とは対照的に、経口的に投与した場合にαリポ酸が引き起こし得るような、咽頭の刺激作用を引き起こさない。
【０１２３】
本発明のＡＬＡＣは、好都合なゲル化特性を有し、従って、錠剤を製造するための結合剤の必要性が軽減され得るか、さらには排除され得る。α−リポ酸は、それと対照的に、その低い融点のために錠剤に打錠できない。
【０１２４】
ＡＬＦＡは、エタノールなどのアルコールにリポ酸を溶解することと、約３０℃〜約６０℃の間の温度に溶液を加熱することによって調製できる。冷却すると、選択したアルコールまたは溶媒に応じて、溶液から黄色の沈殿が形成し、回収、単離、さらに必要な場合には精製することができる。オリゴマー化ＡＬＦＡは水溶性ではなく、そのため、水を使用して、不要な水溶性物質をいずれも除去できる。あるいは、前記溶液を噴霧乾燥して、通常約３〜約４の重合度を有するＡＬＦＡを得ることもできる。
【０１２５】
ＡＬＦＡは、α−リポ酸と比較して、極めて熱安定性である。本発明のＡＬＦＡは、驚くほど高い抗酸化効果を有する。
【０１２６】
さらに、本発明のＡＬＦＡは、α−リポ酸を、経時的に比較的等量で放出すると思われ、すなわち、従って、α−リポ酸様の効果を有する「制御放出」製剤として使用できる。
【０１２７】
ＡＬＦＡは、α−リポ酸とは対照的に、経口的に投与した場合にαリポ酸が引き起こし得るような、咽頭の刺激作用を引き起こさない。
【０１２８】
本発明のＡＬＦＡは、好都合なゲル化特性を有し、従って、錠剤を製造するための結合剤の必要性が軽減され得るか、さらには排除され得る。α−リポ酸は、それと対照的に、その低い融点のために錠剤に打錠できない。
【０１２９】
一態様では、本発明のＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡは、熱、光、酸素およびその他の環境ストレス、例えば、湿度、オゾンなどに対して不安定である栄養物質と組み合わせることができる。ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡは、栄養物質（例えば、カロテノイドおよび例えば、パルミチン酸、クエン酸、没食子酸、ビタミンＥ、リポ酸エステルを含めたエステルなどのその誘導体）上にコーティングしてもよいし、栄養物質を安定化するのに役立つよう、栄養物質と念入りに混合してもよい。
【０１３０】
栄養成分をコーティングすることは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡの溶液中に栄養成分を単純に浸漬すること、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡと組合せた物質を噴霧乾燥すること、栄養成分をＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡとともに凍結乾燥することなどによって達成できるということは理解されなくてはならない。また、特定の例では、均一なコーティングが好ましいが、コーティングは、栄養物質について完全に均一でなくてもよいということも理解されなくてはならない。
【０１３１】
カロテノイドは、天然に広く分布している黄色、赤色および橙色の色素である。種々の果実および野菜、鳥の羽、卵黄、家禽の皮膚、甲殻類および黄斑眼領域において、特定のカロテノイドが同定されているが、それらはマリーゴールドの花弁、トウモロコシおよび葉菜中に特に豊富である。食事由来のカロテノイドとヒト血清および血漿中に見られるカロテノイドの間の相関は、選択された群のカロテノイドのみが、ヒト血流へ入り、その効果を発揮することを示す。
【０１３２】
カロテノイドは、可視スペクトルの４００〜５００ｎｍの領域において光を吸収する。この物理的特徴によって、色素に黄色／赤色を与える。カロテノイドは、イソプレンユニットからなる共役骨格を含み、これは通常、分子の中心で反転しており、これが対称性を付与している。二重結合についての幾何学的立体配置の変更は、多数のシスおよびトランス異性体の存在をもたらす。哺乳類種は、カロテノイドを合成せず、したがって、これらは、果実、野菜および卵黄などの食事性供給源から得られなければならない。近年、カロテノイドは、重大な健康障害からの予防およびまたは保護を含む、いくつかの健康上の利益をもたらすと考えられている。
【０１３３】
カロテノイドは、２つのサブクラス、すなわち、キサントフィルまたはオキシ−カロテノイドと呼ばれるより極性の化合物と、非極性の炭化水素カロテン様［β］−カロテン、リコペンなどとに分類される、非極性化合物である。両サブクラスとも、カロテノイドの特徴的な色に関与している、少なくとも９つの共役二重結合を有する。キサントフィルは、ヒドロキシルまたはケト基などの極性官能基を含む、共役二重結合鎖の末端に環構造を有する。キサントフィルの例として、ルテイン、ゼアキサンチン、カプサンチン（ｃａｐｓａｎｔｈｉｎ）、カンタキサンチン、β−クリプトキサンチン、アスタキサンチンなどが挙げられる。天然色素として、またヒトの健康におけるその役割のために、ルテインおよびゼアキサンチンを含むキサントフィルは、近年、生物医学、化学および栄養の分野において科学者および研究者の新たな関心を引き付けている。
【０１３４】
ルテインおよびゼアキサンチンは、それぞれ、黄色および橙−黄色の一因となっている。ルテインおよびゼアキサンチンは、植物材料中に遊離型（非エステル化）で、また、エステルとして存在し得る。ルテインは、ホウレンソウ、ケールおよびブロッコリーのような緑色の葉菜中に、遊離型で、さらにマンゴー、オレンジ、パパイヤのような果実、レッドパプリカ、藻およびイエローコーン中に存在する。これらの供給源は、通常、エステルなどの形のルテインを含む。ルテインはまた、血流およびヒト身体中の種々の組織、特に、眼の黄斑、レンズおよび網膜中に存在する。
【０１３５】
したがって、本発明は、カロテノイドの誘導体とも呼ばれる、エステル化カロテノイドならびに非エステル化カロテノイドをコーティングするための種々のＡＬＡＣおよびＡＬＦＡの使用を含むということは理解されなくてはならない。エステル化カロテノイドを得るために、非エステル化カロテノイドと結合されることが多い一般的な酸として、例えば、当技術分野で公知のパルミチン酸、クエン酸、没食子酸、ビタミンＥ、リポ酸などが挙げられる。
【０１３６】
マリーゴールド（テーゲテス・エレクタ（Ｔａｇｅｔｅｓ  ｅｒｅｃｔａ））の花弁は、エステル化型のルテインの豊富な供給源である。エステル部分（複数の部分）は脂肪酸である。乾燥マリーゴールド花は、約１〜１．６重量％のカロテノイドを含み、ルテインエステル含量は、全カロテノイドの９０％を占める。マリーゴールドオレオレジン中のキサントフィル脂肪酸エステル組成は、主に、ジパルミテート、ミリステート−パルミテート、パルミテート−ステアレート、ジミリステートおよびモノエステルのようなエステル型のルテインからなる。
【０１３７】
マリーゴールドからのルテインエステルの加水分解によって得られたルテインは、果実、野菜中、およびヒト血漿および黄斑領域中に見られるルテインと同一であることがわかった。ヒト身体は、吸収後、ルテインの供給源を区別することはできない。したがって、食品および飼料工業によってすでに用いられている、マリーゴールドのような広く栽培され、商業的に加工された原材料は、豊富な入手可能性および経費検討の点から、ルテインの魅力的な供給源である。
【０１３８】
本質的に、ルテインエステルおよび遊離型のルテインは、マリーゴールドの花から得られる商業的に重要な栄養補助食品である。乾燥花が、マリーゴールド抽出物またはオレオレジン得るために用いられている。抽出物／オレオレジンをけん化に付すことによって、遊離型のキサントフィルが得られる。けん化から得られた脂肪酸の、結果として生じたアルカリ塩を回収し、ルテインおよびゼアキサンチンの混合物を含有するキサントフィルをさらに精製した。
【０１３９】
新鮮なマリーゴールドの花では、ルテインエステルは、トランス異性体の形で存在するが、熱、光、酸素、酸などに対する曝露によって、トランスからシスルテイン幾何異性体の形への異性化が触媒される。栄養補助食品および食品添加剤としては、ルテインのトランス異性体の形が、より良好なバイオアベイラビリティーおよびより深い黄色のために、対応するシス異性体の形と比較して好ましい。
【０１４０】
特に、カロテノイドは、炭化水素（カロテン）のクラスであり、対応する酸素化誘導体はキサントフィルである。それらは、イソプレノイドユニットの配置が分子の中心で反転され、その結果、２つの中心メチル基が、１，６−位関係にあり、残りの非終端メチル基が１，５−位関係にあるような方法で結合している８個のイソプレノイド単位からなる。すべてのカロテノイドは、（Ｉ）水素化、（２）脱水素化、（３）環化または（４）酸化またはこれらの工程の任意の組み合わせによって、共役二重結合の長い中心鎖を有する、環状Ｃ４０Ｈ５６構造（Ｉ）（化合物Ｉ）から形式上誘導され得る。このクラスはまた、炭素骨格（Ｉ）（リコペン）の特定の転位または分解から生じる（ただし、２つの中心メチル基は保持されている）化合物も含む。
【０１４１】
【化９】
0005439173.tif 000010
【０１４２】
約６００種のカロテノイドが、天然供給源から単離されている。これらのカロテノイドは、Ｋｅｙ  ｔｏ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ（Ｐｆａｎｄｅｒ、１９８７）およびその分光学的特性およびその他の特性についての文献参照も含むＡｐｐｅｎｄｉｘ  ｏｆ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ、１Ａ巻（ＫｕＩｌ  ＆  Ｐｆａｎｄｅｒ  １９９５）に、その慣用名および半組織名を用いて列挙されている。多数のカロテノイドについては、立体化学的配置をはじめとする構造は依然として不明確である。構造が不明確である場合には、分割と、それに続く最新の分光学的方法（高分解能核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を含む）を用いた構造解明が必要である。約３７０種の天然に存在するカロテノイドは、キラルであり、１〜５個の不斉炭素原子を有し、天然では、ほとんどの場合には、１種のカロテノイドは１つの立体配置のみにおいて生じる。
【０１４３】
カロテノイドのすべての具体的な名称は、語幹の名称カロテンに基づいており、これは、化合物２（カロテン）におけるように、構造および番号付けに対応している。
【０１４４】
【化１０】
0005439173.tif 000011
【０１４５】
具体的な化合物の名称は、語幹の名称カロテンに接頭辞として２つのギリシャ文字を付加することによって構成される（化合物断片３）。ギリシャ文字の接頭辞は、アルファベット順に引用され、化合物ＩＩａに記載される。
【０１４６】
【化１１】
0005439173.tif 000012
【０１４７】
酸素化されたカロテノイド（キサントフィル）は、最も頻繁に、ヒドロキシ、メトキシ、カルボキシ、オキソおよびエポキシ官能基を含む。重要な、特徴的なカロテノイド（化合物ＩＩＩ〜Ｘ）として、リコピン（γ，γ−カロテン）（Ｉ）、β−カロテン（β，β−カロテン）（ＩＩＩ）、α−カロテン（（６’Ｒ）−β，ε−カロテン）（ＩＶ）、β−クリプトキサンチン（（３Ｒ）−β，β−カロテン−３−オール）（Ｖ）、ゼアキサンチン（（３Ｒ，３’Ｒ）−β，βカロテン−３，３’−ジオール）（ＶＩ）、ルテイン（「キサントフィル」、（３Ｒ，３’Ｒ，６’Ｒ）−β，ε−カロテン−３，３’−ジオール）（ＶＩＩ）、ネオキサンチン（（３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，３’Ｓ，５’Ｒ，６’Ｓ）−５’，６’−エポキシ−６，７−ジデヒドロ−５，６，Ｓ’，６’−テトラヒドロ−β，β−カロテン−３，５，３’−トリオール）（ＶＩＩＩ）、ビオラキサンチン（（３Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，３’Ｓ，５’Ｒ，６’Ｓ）−５，６，５’，６’−ジエポキシ−５，６，５’，６’−テトラヒドロ−β，β−カロテン−３，３’−ジオール）（ＩＸ）、フコキサンチン（（３Ｓ，５Ｒ，６Ｓ，３’Ｓ，５’Ｒ，６’Ｒ）−５，６−エポキシ−３，３’，５’−トリヒドロキシ−６’，７’−ジデヒドロ−５，６，７，８，５’，６’−ヘキサヒドロ−β，β−カロテン−８−オン３’−アセテート）（Ｘ）、カンタキサンチン（β，β−カロテン−４，４’−ジオン）（ＸＩ）およびアスタキサンチン（（３Ｓ，３’Ｓ）−３，３’−ジヒドロキシ−β，β−カロテン−４，４’−ジオン）（ＸＩＩ）がある。
【０１４８】
【化１２】
0005439173.tif 000013
【０１４９】
通常、天然では、カロテノイドは、（すべてＥ）異性体として生じる。一部のカロテノイドは、処理の間に極めて容易に異性化を受ける。処理には、カロテノイドが溶液中で維持される場合には、（Ｅ／Ｚ）異性化が生じ得るということを留意しなくてはならない。通常、（Ｚ）−異性体のパーセンテージはかなり低いが、高温では高まる。さらに、（Ｚ）−異性体の形成は、光に対して曝露することによって増大する。
【０１５０】
商習慣では、食品グレードでＺ−ルテイン異性体を含まないキサントフィルは、原材料において選択性がないことと、高温乾燥をはじめとする不適切な処理条件のためにほとんど達成されない。これは、食品グレードのキサントフィルの形成をもたらすが、より高レベルのＺ−ルテインを有する。本発明は、幾分かは、工程中で用いられる比較的低い温度のために、このような望ましくないＺ−ルテインレベルの増大を防止する。
【０１５１】
ヒトおよび動物は、ルテインおよびゼアキサンチンのようなキサントフィルを合成できず、この供給源は食事からでなくてはならない。黄斑におけるルテインおよびゼアキサンチンの発生は、特定の機能、すなわち、紫外線光からの細胞および組織の保護を有し、白内障の危険を低減する。ルテインおよびゼアキサンチンは、黄斑色素を含むとわかっており、黄斑では、ルテインはゼアキサンチンに異性化する。
【０１５２】
ルテインは、乳房、結腸、肺、皮膚、子宮頸部および卵巣の癌に対する保護効果を有する可能性があり、心血管疾患の治療に見込みを有し得るということを示唆する証拠がある。したがって、個体に、その食事において使用するための、または栄養補助食品としてルテインを提供することは、より良好なヒトの健康および健常視力を支援する。
【０１５３】
したがって、抗酸化剤、白内障および黄斑変性の予防として、肺癌予防剤として、日光からの有害な紫外線の吸収のための薬剤および光誘起フリーラジカルおよび反応性酸素種のクエンチャーなどとしての使用のために、多量のトランス（Ｅ）−ルテインおよび／またはゼアキサンチンを含有するキサントフィル結晶の需要は高い。
【０１５４】
その結果として、本発明の１種以上のＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡの組み合わせは、典型的な分解に対して安定化されたカロテノイドを提供する。したがって、本発明は、ルテインなどのカロテノイドを安定化するのに役立つ方法を提供する。
【０１５５】
本発明の組成物は、種々の食品、飲料、スナック菓子などに組み込むことができる。一態様では、本組成物は、消費の前に食品上に振りかけることができる。食品上に振りかけられる場合には、デンプン、スクロースまたはラクトースなどの適切な担体を、組成物の濃度を分布させるのに役立つよう使用することができ、これによって食品へ適用するのがより容易になる。
【０１５６】
本発明の組成物はまた、種々の調製された食品において栄養補助食品として提供できる。本出願の目的上、調製された食品とは、本発明の組成物が添加されている、任意の自然食品、加工食品、ダイエット食品または非ダイエット食品を意味する。本発明の組成物は、多数の調製されたダイエット食品、例えば、それだけには限らないが、ダイエットドリンク、ダイエットバーおよび調製された冷凍食品に直接組み込むことができる。さらに、本発明の組成物は、多数の調製された非ダイエット製品、例えば、それだけには限らないが、飴、スナック菓子製品、例えば、チップス、調製された肉製品、ミルク、チーズ、ヨーグルト、スポーツバー、スポーツドリンク、マヨネーズ、サラダドレッシング、パンおよび任意のその他の脂肪またはオイル含有食品に組み込むことができる。本明細書において、用語「食品」とは、ヒトまたは動物の消費に適合している任意の物質を指す。
【０１５７】
本発明の組成物は、フルーツジュース、ミルクシェーク、ミルクなど、種々の飲料に添加することができる。
【０１５８】
好ましい投与方法として経口がある。本発明の組成物は、デンプン、スクロースまたはラクトースなどの適切な担体とともに、錠剤、カプセル剤、溶液剤、シロップ剤およびエマルション剤に製剤することができる。本発明の錠剤またはカプセル剤は、約６．０〜７．０のｐＨで溶解する腸溶コーティングでコーティングされてもよい。小腸において溶解するが、胃では溶解しない、適切な腸溶コーティングとして、酢酸フタル酸セルロースがある。
【０１５９】
本発明の組成物の、ソフトゲルカプセル剤への製剤は、当技術分野で公知の多数の方法によって達成できる。製剤は、オイルなどの許容される担体またはその他の懸濁剤もしくは乳化剤を含むことが多い。
【０１６０】
適切な任意の担体として、例えば、制限するものではないが、天然または合成オイル、脂肪、ワックスまたはそれらの組み合わせをはじめとする任意の供給源に由来し得る脂肪酸、そのエステルおよび塩が挙げられるがそれだけには限らない。さらに、脂肪酸は、制限するものではないが、非硬化油、部分硬化油、完全硬化油またはそれらの組み合わせに由来するものであり得る。脂肪酸（そのエステルおよび塩）の非限定的例示である供給源として、種子油、魚油または海産油、菜種油、植物油、サフラワー油、ヒマワリ油、キンレンカ種子油、カラシ油、オリーブオイル、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシオイル、ピーナッツオイル、綿実油、ヌカ油、ババスナッツ油、ヤシ油、低エルカ酸菜種油、パーム核油、ルーピン油（ｌｕｐｉｎ  ｏｉｌ）、ココナッツ油、アマニ油、マツヨイグサ油、ホホバ、小麦胚芽油、獣脂、牛脂、バター、鶏脂、ラード、乳製品乳脂肪、シアバターまたはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１６１】
具体的な、非限定的例示である魚油または海産油供給源として、貝類オイル、マグロ油、サバ油、サーモン油、メンハーデン、アンチョビ、ニシン、マス、イワシまたはそれらの組み合わせが挙げられる。特に、脂肪酸の供給源は、魚油または海産油（ＤＨＡまたはＥＰＡ）、ダイズ油またはアマニ油である。あるいは、または上記で同定された担体のうちの１種と組み合わせて、蜜蝋も適切な担体として、ならびにシリカ（二酸化ケイ素）などの懸濁剤も使用できる。
【０１６２】
本発明の組成物はまた、栄養補助食品であるとも考えられる。用語「栄養補助食品」とは、当技術分野で認識され、疾患を予防または望ましくない状態を改善できる食品中に見られる特定の化合物を説明するよう意図される。
【０１６３】
本発明の組成物は、安定化に役立つか、本発明の有益な組成物の成分のバイオアベイラビリティを促進するのに役立つ、または個体の食事へのさらなる栄養として働く、種々の成分をさらに含み得る。適切な添加剤は、ビタミンおよび生物学的に許容されるミネラルを含み得る。ビタミンの非限定的例として、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫおよび葉酸が挙げられる。ミネラルの非限定的例として、鉄、カルシウム、マグネシウム、カリウム、銅、クロム、亜鉛、モリブデン、ヨウ素、ホウ素、セレン、マンガン、それらの誘導体またはそれらの組み合わせが挙げられる。これらのビタミンおよびミネラルは、任意の供給源または供給源の組み合わせに由来するものであり得るが、これに限定されない。非限定的例示であるビタミンＢ類として、チアミン、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、シアノコバラミン、ビオチン、パントテン酸またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
【０１６４】
種々の添加剤を本組成物に組み込むことができる。本組成物の任意の添加剤として、ヒアルロン酸、リン脂質、デンプン、糖、脂肪、抗酸化剤、アミノ酸、タンパク質、矯味剤、着色剤、加水分解デンプン（複数の加水分解デンプン）およびそれらの誘導体またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。
【０１６５】
本明細書において、用語「抗酸化薬」は、当技術分野で認識されており、化合物の酸化変質を予防または遅延する合成または天然物質を指す。例示的抗酸化剤として、トコフェロール、フラボノイド、カテキン、スーパーオキシドジムスターゼ、レシチン、γオリザノール；ビタミンＡ、Ｃ（アスコルビン酸）およびＥなどのビタミンならびにβ−カロテン；ローズマリーおよびサンザシ抽出物中に見られるカモソール（ｃａｍｏｓｏｌ）、カモシックアシッド（ｃａｍｏｓｉｃ  ａｃｉｄ）およびロスマノール、プロアントシアニジン、例えば、グレープシードまたは松樹皮抽出物および緑茶抽出物中に見られるものなどの天然成分が挙げられる。
【０１６６】
本発明のＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物を含む組成物は、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）磨砕（ｌａｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥工程の方法によって製造できる。本組成物は、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物を、使用され得る製剤に加工するのを促進する、１種以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤または助剤を用いて従来の方法で製剤できる。
【０１６７】
本発明の組成物は、例えば、経口、口内、全身、注射、経皮、直腸の、経膣などをはじめとする、実質的にいずれの投与様式にも適した形、または吸入または吹送による投与に適した形をとることができる。
【０１６８】
全身製剤として、注射、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内または腹膜内注射による投与のために設計されたもの、ならびに経皮、経粘膜経口または肺投与のために設計されたものが挙げられる。
【０１６９】
有用な注射用製剤として、水性または油性ビヒクル中の、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物の滅菌懸濁液、溶液またはエマルションが挙げられる。本組成物はまた、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの配合剤を含み得る。注射用製剤は、単位投与形で、例えば、アンプルで、または複数回投与容器として提示でき、添加された保存料を含み得る。
【０１７０】
あるいは、注射用製剤は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、それだけには限らないが、滅菌発熱物質不含水、バッファー、デキストロース溶液などを用いて再構成するための粉末の形で提供できる。この目的のために、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物を、凍結乾燥などの任意の当技術分野で公知の技術によって乾燥し、使用前に再構成することができる。
【０１７１】
経粘膜投与には、製剤に、透過障壁に適した浸透促進剤を用いる。このような浸透促進剤は、当技術分野で公知である。
【０１７２】
経口投与には、本発明の組成物は、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬上許容される賦形剤を用い、従来の手段によって調製される、例えば、トローチ剤、錠剤またはカプセル剤の形をとることができる。錠剤は、例えば、糖、フィルムまたは腸溶コーティングを用い、当技術分野で周知の方法によってコーティングしてもよい。
【０１７３】
経口投与のための液体製剤は、例えば、エリキシル、溶液、シロップまたは懸濁液の形をとることができ、または使用前に、水またはその他の適切なビヒクルを用いて構成するための乾燥製剤として提示することができる。このような液体製剤は、懸濁剤（例えば、ソルビロールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用脂）、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアガム）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分画された植物油）および保存料（例えば、メチルまたはプロピルｐヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）などの製薬上許容される添加剤を用い、従来の手段によって調製できる。製剤はまた、必要に応じて、バッファー塩、保存料、矯味剤、着色剤および甘味剤を含み得る。
【０１７４】
経口投与のための製剤は、周知のとおり、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物の制御放出を与えるよう適宜製剤化できる。
【０１７５】
口内投与には、本組成物は、従来の方法で製剤された錠剤またはトローチ剤の形をとることができる。
【０１７６】
直腸および経膣経路の投与には、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物は、ココアバターまたはその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を含有する溶液（保留浣腸のための）坐剤または軟膏として製剤化できる。
【０１７７】
鼻腔投与または吸入もしくは吹送による投与には、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物は、都合のよいことに、適切な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、フッ化炭素、二酸化炭素またはその他の適切なガスを用いる加圧パックまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形で送達され得る。加圧エアゾールの場合には、投与単位は、定量を送達するバルブを提供することによって決定することができる。化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの適切な散剤基剤の散剤混合物を含有する、吸入または吹送において使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えば、ゼラチンからなるカプセルおよびカートリッジ）を製剤化できる。
【０１７８】
長期送達には、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物を、埋め込み（implantation）または筋肉内注射によって投与するためのデポー製剤として製剤できる。ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物は、適切な高分子材料または疎水性材料（例えば、許容されるオイル中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂を用いて、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として製剤できる。あるいは、経皮吸収のためにＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物をゆっくりと放出する、粘着ディスクまたはパッチとして製造された経皮送達系を使用できる。この目的のために、透過促進剤を用いて、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物の皮膚透過を促進することができる。適切な経皮パッチは、例えば、米国特許第５，４０７，７１３号、同５，３５２，４５６号、同５，３３２，２１３号、同５，３３６，１６８号、同５，２９０，５６１号、同５，２５４，３４６号、同５，１６４，１８９号、同５，１６３，８９９号、同５，０８８，９７７号、同５，０８７，２４０号、同５，００８，１１０号、同４，９２１，４７５号に記載されている。
【０１７９】
あるいは、他の送達系を使用してもよい。リポソームおよびエマルションは、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物を送達するために使用できる送達ビヒクルのよく知られている例である。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの特定の有機溶媒も使用できるが、通常、より高い毒性という代償を払う。
【０１８０】
必要に応じて、本組成物は、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物を含有する、１以上の単位投与形を含み得るパックまたはディスペンサー装置で提示できる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための使用説明書を添付してもよい。
【０１８１】
ソフトゲルまたはソフトゼラチンカプセルは、例えば、限定するものではないが、適当なビヒクル（例えば、ヌカ油、および／または蜜蝋）に製剤を分散させて高粘度混合物を形成することによって調製できる。次いで、この混合物を、ゼラチンベースのフィルムを用い、ソフトゲル工業の当業者に公知の技術および機械を用いてカプセル化する。次いで、このように形成されたカプセル剤を一定重量に乾燥させる。通常、カプセルの重量は、約１００〜約２５００ミリグラムの間、特に、約１５００〜約１９００ミリグラムの間の重量、より具体的には、約１５００〜約２０００ミリグラムの間の重量である。
【０１８２】
例えば、ソフトゼラチンシェルを調製する場合には、シェルは約２０〜７０パーセントのゼラチン、通常、可塑剤および約５〜約６０重量％のソルビトールを含み得る。ソフトゼラチンカプセル剤の中身は、液体であり（主に、必要に応じて、ヌカ油、小麦胚種油および／または蜜蝋などの担体）、ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物の他に親水性マトリクスを含み得る。親水性マトリックスは、存在する場合、約２００〜１０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールである。さらなる成分として、場合により、増粘剤および／または乳化剤（複数の乳化剤）があってもよい。一実施形態では、親水性マトリックスは、約２００〜１０００の平均分子量を有するポリエチレングリコール、５〜１５％のグリセロール、および５〜１５重量％の水を含む。ポリエチレングリコールはまた、プロピレングリコールおよび／または炭酸プロピレンと混合できる。
【０１８３】
もう１つの実施形態では、ソフトゲルカプセル剤は、ゼラチン、グリセリン、水および種々の添加剤から調製する。通常、ゼラチンのパーセンテージ（重量）は、約３０〜約５０重量パーセントの間、特に、約３５〜約重量パーセントの間、より具体的には、約４２重量パーセントである。本製剤は、約１５〜約２５重量パーセントのグリセリン、特に、約１７〜約２３重量パーセントの間、より具体的には、約２０重量パーセントのグリセリンを含む。
【０１８４】
カプセル剤の残りの部分は、通常、水である。量は、約２５重量パーセント〜約４０重量パーセントの間、特に約３０〜約３５重量パーセントの間、より具体的には、約３５重量パーセントで変わる。カプセル剤の残りの部分は、通常、約２〜約１０重量パーセントの間で変わり得、矯味剤（複数の矯味剤）、糖、着色剤（複数の着色剤）などまたはそれらの組み合わせからなる。カプセル剤を処理した後、最終カプセル剤の含水量は、約５〜約１０重量パーセントの間、特に７〜約１２重量パーセント、より具体的には、約９〜約１０重量パーセントの間であることが多い。
【０１８５】
製造に関しては、標準ソフトシェルゼラチンカプセル剤製造技術を用いて、ソフトシェル製剤を調製できるということが考慮される。有用な製造技術の例として、Ｒ．Ｐ．Ｓｃｈｅｒｅｒによって最初に開発されたプレートプロセス（ｐｌａｔｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ）、ロータリーダイプロセス（ｒｏｔａｒｙ  ｄｉｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ）、Ｎｏｒｔｏｎ  ｃａｐｓｕｌｅ機械およびＡｃｃｏｇｅｌ機械を用いるプロセスおよびＬｅｄｅｒｌｅによって開発されたプロセスがある。これらのプロセスの各々は、成熟技術であり、ソフトゼラチンカプセルを調製しようとするいずれにも、すべて広く利用可能である。
【０１８６】
乳化剤は、ソフトゼラチンカプセル剤内の成分を可溶化するのに役立つよう使用できる。界面活性剤、乳化剤または発泡剤の具体的な例として、Ｄ−ソルビトール、エタノール、カラギーナン、カルボキシビニルポリマー、カルメロースナトリウム、グアーガム、グリセロール、グリセロール脂肪酸エステル、コレステロール、白蜜蝋、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、スクロース脂肪酸エステル、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ステアリン酸ポリオキシル４０、セスキオレイン酸ソルビタン、セタノール、ゼラチン、ソルビタン脂肪酸エステル、タルク、トリオレイン酸ソルビタン、パラフィン、ジャガイモデンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ペクチン、ポリオキシエチレン（１０５）ポリオキシプロピレン（５）グリコール、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、マクロゴール４００、ミリスチン酸オクチルドデシル、メチルセルロース、ソルビタンモノオレエート、グリセロールモノステアレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノラウレート、ラウリルジメチルアミンオキシド液、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロマクロゴール、乾燥炭酸ナトリウム、酒石酸、水酸化ナトリウム、精製大豆レシチン、ダイズレシチン、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、中鎖トリグリセリド、クエン酸無水物、綿実油−ダイズ油混合物および流動パラフィンが挙げられる。
【０１８７】
本発明はまた、本発明の組成物と適当な状態（複数の状態）のために製剤を使用するための使用説明書とのパッケージ化された製剤を提供する。通常、パッケージ化された製剤を、いかなる形であれ、それを必要とする個体に投与する。通常、投与形必要量は、１日あたり約１〜約４投与形の間である。
【０１８８】
本発明は、種々の状態の治療のための、ソフトゼラチンカプセル剤中の本発明の組成物の調製、使用、製造およびパッケージングを説明するが、ソフトゼラチンカプセル剤のみに限定されると考えてはならない。本発明の摂取可能な組成物は、上記のように、従来の錠剤、丸剤、トローチ剤、エリキシル剤、エマルジョン、ハードカプセル剤、液体、懸濁液などで送達できる。
【０１８９】
本発明のＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物またはそれらの組成物は、通常、意図される結果を達成するのに有効な量で、例えば、治療されている特定の炎症関連状態を治療または予防するのに有効な量で用いられる。本組成物は、治療上の利益を達成するよう治療的に、または予防上の利益を達成するよう予防的に投与できる。治療上の利益とは、治療されている根底にある障害を根絶もしくは改善することおよび／または根底にある障害と関連している１種以上の症状を根絶もしくは改善し、その結果、患者が依然として、根底にある障害に苦しみ得るにもかかわらず患者が感覚または状態の改善を報告することを意味する。例えば、疼痛に苦しんでいる患者への本発明の組成物の投与は、根底にある状態が根絶されるか、改善される場合だけでなく、患者が、疼痛と関連している身体的な不快感の重篤度または期間の低減を報告する場合にも治療上の利益を提供する。
【０１９０】
予防的投与のために、本組成物を、先に記載した状態のうち１種を発症する危険のある患者に投与できる。
【０１９１】
投与される組成物の量は、例えば、治療されている特定の適応症、所望の利益が予防的なものであるか治療的なものであるかにかかわらず投与様式、治療されている適応症の重篤度ならびに患者の年齢および体重などをはじめとする種々の因子に応じて異なる。有効量を決定することは、十分に、当業者の能力の範囲内にある。
【０１９２】
ＡＬＡＣおよび／またはＡＬＦＡ組成物の総投与形量は、通常、約０．０００１または０．００１または０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、その他の因子の中でも、成分の活性、そのバイオアベイラビリティー、投与様式および上記で論じられた種々の因子に応じて、より高い場合も、より低い場合もある。投与量および間隔は、治療的または予防的効果を維持するのに十分である、化合物（複数の化合物）の血漿レベルを提供するよう個々に調整できる。例えば、本化合物は、とりわけ、投与様式、治療されている具体的な適応症および処方医師の判断に応じて週に１回、週に数回（例えば、１日おき）、１日１回または１日に複数回投与できる。当業者ならば、過度の実験を行うことなく、有効な局所投与量を最適化することができる。
【０１９３】
結果として１〜６３に列挙された以下段落は、本発明の種々の態様を提供する。
最初の段落（１）において、一実施形態では、本発明は、オリゴマーのリポ酸と、対イオン（複数の対イオン）との複合体を含む組成物を提供する。
【０１９４】
２．複合体が塩である、段落１の組成物。
【０１９５】
３．複合体が、オリゴマーのリポ酸と、対イオンとの間の結合である段落１の組成物。
【０１９６】
４．結合がキレート化である、段落３の組成物。
【０１９７】
５．対イオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムイオン、アミノ酸、アルキレンジアミン、一置換アミン、二置換アミンまたは三置換アミンである、段落１の組成物。
【０１９８】
６．対イオンがアミノ酸である、段落１の組成物。
【０１９９】
７．アミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、段落６の組成物。
【０２００】
８．リポ酸の塩をさらに含む、段落１〜７のうちのいずれかの組成物。
【０２０１】
９．リポ酸の塩が、アミノ酸を含む、段落８の組成物。
【０２０２】
１０．リポ酸のアミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、段落９の組成物。
【０２０３】
１１．組成物が固体の形である、段落１〜１０のいずれかの組成物。
【０２０４】
１２．組成物が液体担体をさらに含む、段落１〜１０のいずれかの組成物。
【０２０５】
１３．次式（Ｉ）を含むオリゴマーのリポ酸複合体を含む組成物：
【０２０６】
【化１３】
0005439173.tif 000014
［式中、各Ｒ＋は独立して、対イオンを表し、ｎは、約２〜約５０の間の値である］。
【０２０７】
１４．複合体が塩である、段落１３の組成物。
【０２０８】
１５．複合体が、オリゴマーのリポ酸と、対イオンとの間の結合である、段落１３の組成物。
【０２０９】
１６．結合がキレート化である、段落１５の組成物。
【０２１０】
１７．各Ｒ＋が独立して、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムイオン、アミノ酸、アルキレンジアミン、一置換アミン、二置換アミンまたは三置換アミンである、段落１３の組成物。
【０２１１】
１８．各Ｒ＋がアミノ酸である、段落１３の組成物。
【０２１２】
１９．アミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、段落１８の組成物。
【０２１３】
２０．リポ酸の塩をさらに含む、段落１３〜１９のいずれかの組成物。
【０２１４】
２１．リポ酸の塩が、アミノ酸を含む、段落２０の組成物。
【０２１５】
２２．リポ酸のアミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、段落２１の組成物。
【０２１６】
２３．組成物が固体の形である、段落１３〜２２のいずれかの組成物。
【０２１７】
２４．組成物が液体担体をさらに含む、段落１３〜２２のいずれかの組成物。
【０２１８】
２５．約４１２．６〜約１０２６８．５ダルトンの間の平均（Ｍｗ）分子量を有するオリゴマーのリポ酸と、対イオンとの複合体を含む組成物。
【０２１９】
２６．複合体が塩である、段落２５の組成物。
【０２２０】
２７．複合体が、オリゴマーのリポ酸と、対イオンとの間の結合である段落２５の組成物。
【０２２１】
２８．結合がキレート化である、段落２７の組成物。
【０２２２】
２９．対イオンが、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムイオン、アミノ酸、アルキレンジアミン、一置換アミン、二置換アミンまたは三置換アミンである、段落２５の組成物。
【０２２３】
３０．対イオンがアミノ酸である、段落２５の組成物。
【０２２４】
３１．アミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、段落３０の組成物。
【０２２５】
３２．リポ酸の塩をさらに含む、段落２５〜３１のいずれかの組成物。
【０２２６】
３３．リポ酸の塩が、アミノ酸を含む、段落３２の組成物。
【０２２７】
３４．リポ酸のアミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、段落３３の組成物。
【０２２８】
３５．組成物が固体の形である、段落２５〜３４のいずれかの組成物。
【０２２９】
３６．組成物が液体担体をさらに含む、段落２５〜３４のいずれかの組成物。
【０２３０】
３７．ａ）水溶液中で、塩基を、リポ酸と反応させるステップと、
ｂ）溶液を高温で約１〜約５時間の間、維持するステップと、
ｃ）非溶媒の添加によって、オリゴマーのリポ酸と塩基性対イオンの複合体を、水溶液から沈殿させるステップ
の工程によって調製されるオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３１】
３８．ｄ）沈殿した複合体を回収するステップ
をさらに含む、段落３７の工程のオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３２】
３９．反応の温度が、約３０℃〜約５０℃の間である、段落３７または３８のいずれかのオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３３】
４０．溶液が約３時間高温で維持される、段落３７〜３９のいずれかのオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３４】
４１．非溶媒がアルコール、塩素化炭化水素、脂肪族ケトン、脂肪族エーテル、アルキル炭化水素、芳香族炭化水素またはそれらの混合物である、段落３７〜４０のいずれかのオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３５】
４２．非溶媒が、アセトニトリル、ジクロロメタン、アセトン、２−プロパノール、ジエチルエーテル、ヘキサン、オクタン、トルエン、石油エーテル、テトラヒドロフラン、オクタノール、ベンゼン、ジオキサンまたはそれらの混合物である、段落４１のオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３６】
４３．塩基がアミノ酸である、段落３７〜４２のいずれかのオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３７】
４４．アミノ酸を含有する水溶液が、アミノ酸の塩酸塩を含有する水溶液に、（Ｉ−０．４）〜（Ｉ＋０．４）の値を有するｐＨ値が得られるまでＮａＯＨを添加することによって製造され、Ｉがアミノ酸の等電点である、段落４３のオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３８】
４５．ｐＨ値がＩ−０．１〜Ｉである、段落４４のオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２３９】
４６．水溶液のｐＨ値が９．５〜１０．０である、段落３７〜４５のいずれかのオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２４０】
４７．アミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、段落４３〜４６のいずれかのオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２４１】
４８．リポ酸のアミノ酸塩をさらに含む、段落３７〜４７のいずれかのオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２４２】
４９．リポ酸のアミノ酸が、オルニチン、アルギニン、リシンまたはそれらの混合物である、段落４８のオリゴマーのリポ酸複合体。
【０２４３】
５０．融点が、約１６５℃〜約１７０℃の間である、段落１〜４９のいずれかの物質。
【０２４４】
５１．０．５グラムの物質を２０ｍｌの中性水（neutral water)に溶解した場合に、ｐＨ値が約７．５である、段落１〜４９のいずれかの物質。
【０２４５】
５２．リポ酸および／またはオリゴマーのリポ酸および／または式（Ｉ）が、Ｒ鏡像異性体である、段落１〜４９のいずれかの物質。
【０２４６】
５３．リポ酸および／またはオリゴマーのリポ酸および／または式（Ｉ）が、Ｓ鏡像異性体である、段落１〜４９のいずれかの物質。
【０２４７】
５４．リポ酸および／またはオリゴマーのリポ酸および／または式（Ｉ）が、ラセミ化合物である、段落１〜４９のいずれかの物質。  
【０２４８】
５５．リポ酸のアミノ酸および／またはオリゴマーのリポ酸および／または式（Ｉ）が、Ｌ型である、段落６、７、９、１０、１８、１９、２０、２１、３０、３１、３２、３３および４３〜４９のいずれかの物質。
【０２４９】
５６．段落１〜１１、１３〜２３、２５〜３５および３７〜５５のいずれかと、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
【０２５０】
５７．次式（Ｉａ）を含むオリゴマーのリポ酸を含む組成物：
【０２５１】
【化１４】
0005439173.tif 000015
［式中、ｎは、約２〜約５０の間の値である］。
【０２５２】
５８．段落５７のオリゴマーのリポ酸と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
【０２５３】
５９．次式（ＩＩ）を含む、混合された、オリゴマーのαリポ酸複合体を含む組成物：
【０２５４】
【化１５】
0005439173.tif 000016
［式中、ｎは、約２〜約５０の値であり、各Ｒ１は、独立して、水素原子または対イオンであり、ただし、少なくとも１個のＲ１は対イオンである］。
【０２５５】
６０．段落５９の混合された、オリゴマーのαリポ酸複合体と、製薬上許容される担体とを含む薬剤組成物。
【０２５６】
６１．段落１〜１１、１３〜２３、２５〜３５、３７〜５５、５７および５９のいずれかのオリゴマー組成物と、カロテノイドまたはカロテノイド誘導体との混合物を含む、安定化されたカロテノイドまたはカロテノイド誘導体。
【０２５７】
６２．カロテノイドまたはカロテノイド誘導体上に、オリゴマー組成物がコーティングされている、段落６１の安定化されたカロテノイドまたはカロテノイド誘導体。
【０２５８】
６３．カロテノイドまたはカロテノイド誘導体を、段落１〜１１、１３〜２３、２５〜３５、３７〜５５、５７および５９のいずれかのオリゴマー組成物と接触させ、その結果、カロテノイドまたはカロテノイド誘導体が安定化されるステップを含む、カロテノイドまたはカロテノイド誘導体を安定化する方法。
【実施例】
【０２５９】
以下の実施例は限定を意味するものではなく、さらなる情報を提供し、本発明を支援するために提示される。
【０２６０】
以下の実施例では、アミノ酸残基としてオルニチンを含む式Ｉのオリゴマーの化合物を、より詳細に論じる。この化合物は、用語「ＬＡＯＲＮ」で表す。
【０２６１】
ＬＡＯＲＮの溶解度
ＬＡＯＲＮは、水への高い溶解度（＞１０％ｍ／ｍ；質量／質量）を有するが、有機溶媒には十分に溶解しない。
【０２６２】
リポ酸およびオルニチン間の１：１の比の実証：
理論上の計算によれば、１分子の［オルニチン（＋）リポ酸（−）］は、３９％のオルニチンを含むはずである。オルニチンは、２個の原子窒素を有する。上記の分子１ｇの窒素含量の計算によって、８３．４ｍｇ／ｇが得られた。Ｋｊｅｌｄｈａｌ分析に従って窒素含量を調べることによって、８６．１ｍｇ／ｇが提供された。そのことは、オリゴマー物質中の１：１の比の証拠を提供する。
【０２６３】
リポ酸のチオラン環がないこと
リポ酸中のチオラン環は、３２０ｎｍ付近に吸収バンドを有し、これはまた、リポ酸の既知塩（例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋）の溶液中にも存在する。ＬＡＯＲＮという新規オリゴマー物質は、水に溶解した直後に測定した場合、３２０ｎｍ付近の吸光度を欠き、このことは、チオラン環が新規オリゴマー物質の調製の間に開裂しているということを示す。
【０２６４】
α−リポ酸の遊離
ＬＡＯＲＮは、水に溶解した場合に、７．５というｐＨ値を示す。水に溶解した後の経時的なＬＡＯＲＮからのリポ酸の遊離が図１に表されている。
【０２６５】
ＬＡＯＲＮの溶解度
種々の溶媒におけるＬＡＯＲＮの溶解度を試験し、α−リポ酸の溶解度と比較した。結果が以下の表１に示されている：
【０２６６】
【表１】
0005439173.tif 000017
【０２６７】
溶解度パターンは、塩を示唆する。ＬＡＯＲＮは、α−リポ酸とは対照的に、良好な水溶性（＞１０％）を有することが最も興味深い。
【０２６８】
ＦＴ−ＩＲ分光法：
図２および３は、それぞれ、α−リポ酸（図２）およびＬＡＯＲＮ（図３）のＦＴ−ＩＲスペクトルを示す（固体ＫＢｒ錠剤）。
【０２６９】
これらのスペクトルは、α−リポ酸がＬＡＯＲＮ中に存在しないということを示す。リポ酸中に存在するジスルフィド架橋チオラン環の典型的なＦＴ−ＩＲバンド（１６９３ｃｍ−１に見られる）は、ＬＡＯＲＮ物質中では、失われている。
【０２７０】
ＮＭＲ−分光法：
図４は、ＬＡＯＲＮの１Ｈ  ＮＭＲ−スペクトル（ＣＤＣｌ３液体）を提供する。
【０２７１】
遊離状態のアミノ酸−ＣＨ−プロトンを表すバンドが、３ｐｐｍでトリプレットとして見える。このことは、アミノ酸がリポ酸残基と化学結合していない（アミドバンドがない）という証拠を提供する。
【０２７２】
ＬＡＯＲＮのその他の特性
ＬＡＯＲＮの濃縮溶液（＞５％  ｍ／ｍ）に、少量の酸を加えると（酸に関係なく）、直ちにゴム状の塊が形成される。ＬＡＯＲＮのより希釈した溶液（＜１％  ｍ／ｍ）に少量の酸を添加すると（酸に関係なく）、直ちに安定なエマルジョンが形成される。
【０２７３】
ＬＡＯＲＮは、ジエチルエーテルに可溶性ではないので、水に溶解し、ジエチルエーテルで抽出した。これらの条件下で、薄層クロマトグラフィーによって何も同定されなかったので、ポリマーの存在は排除できる。ＵＶ／ＶＩＳ分光法によって、水に溶解したＬＡＯＲＮについて、３２０ｎｍでなんら吸収がないことを実証した。測定は、ＬＡＯＲＮ物質を溶解すると直ちに行った。このことは、ＬＡＯＲＮ物質中にリポ酸（チオラン環）がないことの証拠を提供する。
【０２７４】
生成物は、ｏ−フタルデヒドならびにリポ酸およびオルニチンの人工混合物と積極的に反応する。これらの観察結果は、少なくとも一部の遊離チオール基を遊離する可能性および遊離アミノ酸基の存在を提供する。
【０２７５】
ＬＡＯＲＮは、ＦｅＳＯ４との即時反応を示す（褐色のＦｅ（ＯＨ）３）が現れる）。
【０２７６】
濾過すると、透明溶液が得られ、これは、酸の添加時にいずれのポリマーも構築しない。このことは、ＬＡＯＲＮは還元され得る、また、それによって重合プロセスが遮断され得るという事実を示している。
【０２７７】
ＬＡＯＲＮをメルカプトエタノールで処理すると、リポ酸およびジヒドロリポ酸が１：５の比で見られる。対照的に、リポ酸をメルカプトエタノールで処理すると、１：０．６の比でそれぞれ生じる。このことは、ＬＡＯＲＮ中の分子間−Ｓ−Ｓ結合の存在を実証するのに役立つ。
【０２７８】
中性溶液中での、Ｈ２Ｏ２を用いたＬＡＯＲＮの処理によって、他のピークがないリポ酸が得られることがＨＰＬＣによって同定された。中性溶液中でのリポ酸の、Ｈ２Ｏ２での処理によって、リポ酸よりも前に、かなりはっきりと異なるピーク溶出が得られる。このピークは、オルニチンの有無によって影響を受けず、またオルニチン単独の処理によっては見られないということが確認された。このことは、ＬＡＯＲＮはリポ酸とは異なるということを確認するのに役立つ。
【０２７９】
リポ酸の、対応するチオスルフィネートおよびチオスルホネートへの酸化が、文献に記載されている。従って、やはりＬＡＯＲＮ中のリポ酸の存在は排除できる。アルカリ溶液中での、ＬＡＯＲＮの、ＮａＯＨ４での処理によって、ほとんど即座に、ジヒドロリポ酸の理論の１００％が得られる。この点において、リポ酸は同様に反応する。
【０２８０】
ＬＡＯＲＮの抗酸化能
ＬＡＯＲＮを、十分に確立された試験アッセイを用いてその総抗酸化能について試験した。この試験アッセイ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号６１５７００）は、ラジカルの形成を抑制する所与の化合物の能力を測定する。ＡＢＴＳ＋ラジカルが生じる、メトミオグロビンを用いる２，２’−アチノ（Ａｔｉｎｏ）−ジ−（３−エチルベンズ−チアゾリンスルホネート）（ＡＢＴＳ）の酸化を選択した。形成されるラジカルは、６００ｎｍの吸光度を分析することによってモニターできる。ラジカルスカベンジャーが導入されていない状況では、ラジカルは急速に生じる。反対に、ラジカルスカベンジ特性を有する化合物が存在する場合には、６００ｎｍでのバンドの発生は抑制される。結果を、１．７８ｍｍｏｌの抗酸化物質濃度で標識した標準に対して較正した。
【０２８１】
サンプル調製：
純粋なα−リポ酸およびオルニチンならびに（ＬＡＯＲＮ）を、水に溶解し、ＮａＯＨを用いてｐＨ＝７．５に調整した。以下の濃度を試験した：
【０２８２】
６．１ｍｇ  α−リポ酸／１０ｍＬ
３．９ｍｇ  オルニチン／１０ｍＬ
６．１ｍｇ  α−リポ酸および３．９ｍｇ  オルニチン／１０ｍＬ
１０ｍｇ  ＬＡＯＲＮ／１０ｍＬ。
【０２８３】
濃度は、α−リポ酸およびオルニチンについて、１：１のモル比に基づいて選択した。したがって、４サンプルすべてが、３ｍｍｏｌの対応する化合物を含んでいた。用量比例応答を調べるために、２．５、５および１０ｍｇのＬＡＯＲＮ／１０ｍＬ（０．７５、１．５および３ｍｍｏｌに対応）の設定を試験した。各サンプルを３回試験し、提供された結果は、平均値である。３回の測定の精度は、３％よりも良好であった。
【０２８４】
結果
図５は、３ｍｍｏｌの対応する化合物／Ｌを含有するサンプルの、ｍｍｏｌ／Ｌでの総抗酸化能を示す。
【０２８５】
図５から明らかであるように、ＬＡＯＲＮは、純粋なリポ酸、オルニチンおよびリポ酸とオルニチンの等モル混合物と比較した場合に相乗的に作用する。
【０２８６】
ＬＡＯＲＮは、リポ酸より約７倍より有効であり、リポ酸とオルニチンの混合物より、約４．５倍より有効である。
【０２８７】
図６は、種々の濃度のＬＡＯＲＮの結果を示す。
【０２８８】
ＬＡＯＲＮの総抗酸化能の直線的な用量比例的増大が観察された。
【０２８９】
リノール酸の自己酸化の阻害
このアッセイは、５０℃で測定されるリノール酸の自己酸化の促進の阻害に基づくものである。結果は、陰性対照（阻害なし）と比較した場合の自己酸化の相対誘導として表される。
【０２９０】
陽性対照（完全阻害）として、１０ｍＭのブチル−ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）／Ｌを取り入れた。各サンプルは、３つの複製で調製した。
【０２９１】
図７は、
５ｍＭ  リポ酸（「ＬＡ」）／Ｌ
５ｍＭ  オルニチン（「ＯＲＮ」）／Ｌ
５ｍＭ  リポ酸／Ｌ＋５ｍＭ  オルニチン／Ｌおよび
１０ｍＭ  ＬＡＯＲＮ
について得られた誘導の経時的推移を示す。
【０２９２】
さらに、このグラフは、誘導期間を示す１．５の閾値（より低い値は、保護を示し、上回る値は、もはや保護がないことを示す）を示す。
【０２９３】
陽性対照は、５０℃で７２時間、リノール酸の自己酸化を阻害するとわかった。同様に、５ｍＭのＬＡ／Ｌは、試験された期間にわたって完全保護をもたらした。予想どおり、陰性対照は、１２時間のインキュベーション後に、かなりの自己酸化をもたらした。
【０２９４】
１２時間インキュベーションした後、５ｍＭ  ＯＲＮ／Ｌについて得られた結果は、オルニチンは、リノール酸の自己酸化に対して保護効果を有さなかったということを強力に示す。
【０２９５】
５ｍＭ  ＬＡ／Ｌと５ｍＭ  ＯＲＮ／Ｌの混合物は、その保護的挙動においてボーダーラインにあることがわかったが、１０ｍＭ  ＬＡＯＲＮ／Ｌは完全保護をもたらすことがわかった。
【０２９６】
図８は、５０ｍＭ  ＬＡ／Ｌ、５０ｍＭ  ＯＲＮ／Ｌ、５０ｍＭ  ＬＡ／Ｌ＋５０ｍＭ  ＯＲＮ／Ｌおよび１００ｍＭ  ＬＡＯＲＮ／Ｌについて得られた誘導の経時的推移を示す。
【０２９７】
さらに、このグラフは、誘導期間を示す１．５の閾値（より低い値は、保護を示し、上回る値は、もはや保護がないことを示す）を示す。
【０２９８】
陽性対照は、５０℃で７２時間、リノール酸の自己酸化を阻害することがわかった。同様に、５０ｍＭ  ＬＡ／Ｌは、試験された期間にわたって完全保護をもたらした。予想どおり、陰性対照は、１２時間のインキュベーション後に、かなりの自己酸化をもたらす。
【０２９９】
２４時間インキュベーションした後、５０ｍＭ  ＯＲＮ／Ｌについて得られた結果は、オルニチンは、リノール酸の自己酸化に対して保護効果を有さなかったということを強力に示す。
【０３００】
５０ｍＭ  ＬＡ／Ｌおよび５０ｍＭ  ＯＲＮ／Ｌおよび１００ｍＭ  ＬＡＯＲＮ／Ｌの混合物は、完全保護をもたらすことがわかった。
【０３０１】
方法
対照：  Ｈ２Ｏ（陰性）
ブチル−ヒドロキシトルエン（陽性）１０、５０および１００ｍｇ／１０ｍＬ（Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝８．０）
【０３０２】
サンプル：
ａ）ＬＡ０．１、０．６１、１、５、６．１および１０ｍｇ／ｍＬ（Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝８．０）
ｂ）ＯＲＮ０．１、０．３９、１、３．９、５および１０ｍｇ／ｍＬ（Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝８．０）
ｃ）ＬＡ＋ＯＲＮ０．１、１、５および１０ｍｇ／１ｍＬ（Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝８．０）各レベルで、６１／３９の割合
ｄ）ＬＡＯＲＮ０．１、１、５および１０ｍｇ／１０ｍＬ（Ｈ２Ｏ、ｐＨ＝８．０）
【０３０３】
試薬：
２５ｍＬの０．１Ｍ  Ｎａ−リン酸バッファー、ｐＨ＝７．０
３５０ｍｇのリノール酸／２５ｍＬのエタノール（９５％）
エタノール７５％
３．５％（ｍｇ／ｍｌ）塩酸
１．５ｇ  アンモニウムチオシアネート／５ｍＬのＨ２Ｏ
２５．０ｍｇ  塩化鉄−ＩＩ／１０ｍＬ  ３．５％  ＨＣｌ
【０３０４】
サンプル誘導：
０．２５ｍＬの各サンプル＋０．５ｍＬのバッファー＋０．５ｍＬのリノール酸溶液を、２ｍＬの堅いねじぶたのついたプラスチックバイアルに移した。各サンプルは、３つの複製で調製した。
【０３０５】
サンプルを５０℃で光保護してインキュベートした。
【０３０６】
自己酸化は、時点ゼロならびに１２、２４および７２時間後に試験した。
【０３０７】
試験アッセイ：２５μＬのインキュベートされたサンプルを、１．２０ｍＬのエタノール７５％および２５μＬのアンモニウムチオシアネートおよび２５μＬの塩化鉄−ＩＩと混合する。
混合の３分後、５００ｎｍの吸収を読み取る。
【０３０８】
還元力のアッセイの結果：
このアッセイは、鉄−ＩＩＩの鉄−ＩＩへの還元に基づいている。結果は、５ｍｇ／ｍＬの濃度ですべての鉄−ＩＩＩを還元した対照と比較した場合の還元％として表されている。
【０３０９】
図９は、還元力アッセイの結果を提供する。
【０３１０】
さらに、表２は、還元力アッセイの結果を要約している。
【０３１１】
【表２】
0005439173.tif 000018
【０３１２】
さらなる試験では、ＬＡおよびＯＲＮを、５ｍＭ／Ｌの濃度で別個に分析した。さらに、５ｍＭ  ＬＡ／Ｌおよび５ｍＭ  ＯＲＮ／ＬからなるＬＡおよびＯＲＮの混合物を試験した。最後に、１０ｍＭ  ＬＡＯＲＮ／Ｌを試験した。図１０に示されるように、ＬＡＯＲＮは、ＬＡおよびＯＲＮの単純混合物と比較した場合に、強力な相乗作用を有していた。
【０３１３】
調製方法：
【０３１４】
実施例１：
１６０ｍｌの水に、１６．８ｇ（０．１ｍｏｌ）のＬ−オルニチン−ＨＣｌ−塩を溶解した。この溶液を、Ｌ−オルニチンＨＣｌ塩が完全に溶解するまで撹拌した。溶液のｐＨ値は４．６であった。
【０３１５】
上記の溶液に４ｇ（０．１ｍｏｌ）のＮａＯＨを加えた。この混合物を、ＮａＯＨが完全に溶解するまで撹拌した。溶液のｐＨ値は９．６であった。
【０３１６】
上記溶液に、２０．６グラムのα−リポ酸（０．１ｍｏｌ）をゆっくりと加えた。この混合物を、α−リポ酸が完全に溶解するまで撹拌した。
【０３１７】
この混合物を、４０℃で３５時間維持した。この期間の最後に、５０％の水が除去されるまで、溶液を減圧下（５０℃、０．０９ｍｐａの真空）で濃縮した。そのようにすることによって、原材料中のすべてのあり得る有機溶媒が蒸発する。これには約５時間かかった。残存する溶液の容積は、約１００ｍｌであり、ｐＨ値は７．５であった。
【０３１８】
１２５０ｍｌのエタノール（９５％）に、濃縮した溶液を注ぎ入れた。得られた溶液を撹拌し、白色沈殿が形成された。溶液の含水量は、１１％を下回るよう制御した。この溶液を濾過して沈殿を得た。母液は、エタノールを回収するために再度使用し、さらなる生成物を得ることができる。
【０３１９】
沈殿は、約３５℃で６時間乾燥させた。２７グラムの生成物、本発明のＬＡＯＲＮが得られる。
【０３２０】
外観：わずかに黄色味を帯びた粉末
融点：１６５〜１７０℃
ｐＨ値：７．５６（２０ｍｌの水に溶解した０．５グラム）
【０３２１】
反応時間、試薬の濃度および温度の影響
反応時間、試薬の濃度および温度の影響に関して、いくつかの試験を実施した。α−リポ酸出発物質のオリゴマー化度を、反応溶液の比旋光度に関して測定した。リポ酸のオリゴマー化によって、リポ酸のＳ−Ｓ−結合が分解され、これが、比旋光度の変化になる。比旋光度が低いほど、本発明のオリゴマー化化合物の形成が多い。
【０３２２】
光旋光度の測定（偏光計、タイプ：ＷＺＺ−３、製造業者：Ｓｈａｎｇｈａｉ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ，．Ｌｔｄによる）
２５ｍｌのメスフラスコに、０．２５４４ｇのＬＡＯＲＮ（実施例１サンプル）を入れ、総容積が２５ｍＬに等しくなるまで脱イオン水で希釈し、０．１０７６ｇ／１００ｍｌの得られた濃度を提供した。脱イオン水を対照として用い、脱イオン水の光旋光度を調べた。次いで、ＬＡＯＲＮの水性サンプルを試験し、サンプルの比旋光度５．４５°を有するとわかった。
【０３２３】
図１１は、ＬＡＯＲＮ形成に対する反応時間および温度の影響を示す。
【０３２４】
ＬＡＯＲＮ形成は、低温でより多いということがわかる。しかし、溶液の粘度が最低温度をある程度制限し得る。したがって、３０℃〜５０℃の温度が最適であるとわかった。
【０３２５】
さらに、図１１から、所与の反応条件下では、３時間の反応時間後にＬＡＯＲＮの有意な生成はないようである。
【０３２６】
図１２は、ＬＡＯＲＮ形成に対する、２種の試薬の濃度［ＬＡ＋ＯＲＮ］（濃度は、各試薬の濃度の合計であり、それらのモル比は１：１である）の効果を示す。濃度が高いほど、ＬＡＯＲＮ形成が多いということがわかった。しかし、やはり、溶液の高粘度が、最大濃度に限定を与える。したがって、濃度は２５％〜３５％が好ましい。
【０３２７】
ヨウ素酸化滴定法による、ＬＡＯＲＮ中のリポ酸の平均重合度の測定
試験原理
ヨウ素は、スルフヒドリル（−ＳＨ）基を定量的に酸化し得る。過剰なヨウ素を、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３標準溶液によって滴定する。ヨウ素の消費を測定することによって、系中の−ＳＨ基の含量を求めることができ、次いで、平均重合度を算出することができる。
【０３２８】
試薬
すべての分析試薬は分析用純度のものであった。脱イオン水を用いた。
【０３２９】
塩酸（ＨＣｌ）溶液：３６％濃塩酸および脱イオン水（ｖ／ｖ、１／１）を用いて調製した。
【０３３０】
重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）標準溶液：Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７（１０５℃で２時間乾燥させた）４９０３．０ｍｇを、メスフラスコ中で脱イオン水を用いて１０００ｍｌに希釈した。
【０３３１】
デンプン−ヨウ素指示薬：１ｇの可溶性デンプンを、ペーストを形成するのに十分な水に加えた。次いで、このペーストを、さらなる水で１００ｍｌに希釈した。
【０３３２】
Ｎａ２Ｓ２Ｏ３標準溶液
調製
２４．５ｇのＮａ２Ｓ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏおよび０．２ｇのＮａ２ＣＯ３を水で溶解し、１０００ｍｌの褐色のガラス製メスフラスコに移し、さらなる水で容積に希釈した。得られた溶液は十分に混合した。
【０３３３】
滴定
反応方程式
３Ｎａ２Ｓ２Ｏ３＋Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７＋６ＨＣｌ→２Ｃｒ（ＯＨ）ＳＯ４＋４ＮａＣｌ＋３Ｓ＋Ｎａ２ＳＯ４＋２ＫＣｌ
２５０ｍＬのヨウ素ヌモエ（ｎｕｍｏｅ）フラスコに、１ｇのヨウ化カリウム（ＫＩ）および５０ｍＬの水を加え、そのフラスコに、１５．００ｍＬのＫ２Ｃｒ２Ｏ７標準溶液および５ｍｌのＨＣｌ（ｖ／ｖ、１／１）を加えた。このフラスコを閉じ、溶液を十分に混合し、暗所で５分間、静置させた。この溶液を、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液を用いて淡黄色に滴定すると、０．５ｍｌのデンプン−ヨウ素指示薬を加えた。この滴定は、青色が消失した時点で停止した。標準溶液量を記録し、同時に、ブランク溶液を滴定した。
【０３３４】
以下のとおりである、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３標準溶液濃度の算出：
【０３３５】
【数１】
0005439173.tif 000019
ａ  Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７の重量、ｍｇ
Ｖ１  Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７  溶液を滴定するのに用いたＮａ２Ｓ２Ｏ３溶液の容積、ｍｌ
Ｖ２  ブランク溶液を滴定するのに用いたＮａ２Ｓ２Ｏ３溶液の容積、ｍｌ
【０３３６】
希釈
Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液は、使用前に元の濃度の１／１０に希釈した。ヨウ素標準溶液は、１０００ｍｌのメスフラスコ中で１．２７ｇのヨウ素および４．０ｇのＫＩを組合せることと、水で１０００ｍｌに希釈することとによって調製した。
【０３３７】
試験法
約２０ｍｇのサンプルを正確に秤量し、それに、５ｍｌのＤＭＦ、５ｍｌのＨＣｌ溶液（１／１、ｖ／ｖ）および１０．００ｍｌのヨウ素標準溶液を加えた。サンプルを気密にし、暗所に１０分間置き、次いで、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液で滴定した。溶液の色が淡黄色に変わった時点で、０．２ｍｌのデンプン−ヨウ素指示薬を加えた。滴定は、得られた青色が消失するまで続けた。この容積をＶ４として記した。
【０３３８】
ブランク滴定のために、１０．００ｍｌのヨウ素標準溶液、５ｍｌのＨＣｌ溶液（１／１、ｖ／ｖ）を用いて１つのブランクサンプルを調製した。滴定は、上記に概説されるように実施し、この容積をＶ３として記した。
【０３３９】
反応方程式
２Ｎａ２Ｓ２Ｏ３＋Ｉ２→２ＮａＩ＋Ｎａ２Ｓ４Ｏ６
【０３４０】
【数２】
0005439173.tif 000020
ｃ＝Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液の濃度、ｍｏｌ．Ｌ−１
Ｖ３  ブランク溶液を滴定するのに用いたＮａ２Ｓ２Ｏ３溶液の容積、ｍｌ
Ｖ４  サンプルを滴定するのに用いたＮａ２Ｓ２Ｏ３溶液の容積、ｍｌ
【０３４１】
以下のとおりである、平均重合度ｎを算出。
【０３４２】
【数３】
0005439173.tif 000021
Ｍ  ＬＡＯＲＮの重量、ｍｇ
【０３４３】
遊離リポ酸の補正
サンプル中には、いくらかの遊離（重合されていない）リポ酸があるので、算出のためにこの部分のリポ酸を明らかにする必要があった。この補正は以下のとおり提供される：
２、５、７、１０、１５、２０ｍｇのリポ酸標準を測定し、容積を１０ｍｌに測定し、ＨＰＬＣ、２２０波長でのＵＶ検出器を用いて分析した。
【０３４４】
較正曲線は以下のとおりに調製した（図２０参照）：
【０３４５】
【数４】
0005439173.tif 000022
【０３４６】
リポ酸によって消費されたヨウ素の補正
滴定工程では、リポ酸は、ジチアン環をゆっくりと開環し、これがまたヨウ素をいくらか消費する。平均重合度を正確に調べるためには、ヨウ素取り込みの測定において、これも明らかにされる必要があった。
【０３４７】
０．５、１、５、７、１０、１５、２０ｍｇリポ酸標準を秤量し、上記の方法を用いて測定し、各サンプルのヨウ素消費を算出した。結果は以下、図２１において提供されている。
【０３４８】
【数５】
0005439173.tif 000023
【０３４９】
試験実施例
標準溶液調製
１０００ｍｌのメスフラスコに、Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７試薬（１０５℃で２時間乾燥）５３７３．４ｍｇを加え、容積に水で希釈することによって、重クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）標準溶液を調製した。
【０３５０】
ヨウ素標準溶液は、１０００ｍｌのメスフラスコ中で１．２７４ｇのヨウ素と４．０ｇのＫＩを組み合わせ、容積に水で希釈することによって調製した。この溶液を十分に混合した。
【０３５１】
Ｎａ２Ｓ２Ｏ３標準溶液は、２４．５ｇのＮａ２Ｓ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏおよび０．２ｇのＮａ２ＣＯ３を、水と組み合わせ、１０００ｍｌの褐色ガラス製メスフラスコに移し、容積に水で希釈することによって調製した。この溶液を十分に混合した。滴定によって、Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７標準溶液消費は、１６．８ｍｌである。したがって、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３標準溶液の濃度は、０．０４８９ｍｏｌ／Ｌ−１であると決定した。
【０３５２】
サンプル試験
上記試験方法によれば、２０．６４ｍｇのＬＡＯＲＮ（実施例１から得られた）は、７．３ｍｌのＮａ２Ｓ２Ｏ３溶液を消費し、従って、ヨウ素消費は０．０１４５ｍｍｏｌである。平均重合度ｎは、したがって、４．２１であった。
【０３５３】
結果補正
遊離リポ酸補正
サンプル重量は、１００．０８ｍｇであった。ＨＰＬＣにより、リポ酸のピーク面積が、２９７．９ｍＡｓであるということが提供され、従って、サンプルは約４．３％の遊離リポ酸を含んでいると決定した。この量を、サンプル重量Ｍから差し引いた。
【０３５４】
ヨウ素消費の補正
滴定のサンプルは、２０．６４ｍｇであったので、遊離リポ酸は０．８８８ｍｇであり、ヨウ素消費の補正は０．０００９ｍｍｏｌであった。これを、ヨウ素消費ｄから差し引いた。
【０３５５】
２つの補正した値を含めた後、補正された平均重合度が、約４．１７であると決定した。
【０３５６】
実施例（ナトリウム−リポ酸）
１６０ｍｌの水に０．１ｍｏｌのＮａＯＨを溶解し、それに２０．６ｇのα−リポ酸（０．１ｍｏｌ）を撹拌しながらゆっくりと加えた。α−リポ酸が完全に溶解した後、混合物を４０℃で３時間維持した。この溶液を５０℃、減圧下（−０．０９ｍｐａの真空）で、約５０％の水が除去されるまで濃縮した。
【０３５７】
濃縮溶液を、１２５０ｍｌのエタノール（９５％）に注ぎ入れた。得られた溶液を撹拌し、白色沈殿が形成された。沈殿を回収し、次いで、約３５℃で６時間乾燥させた。得られた沈殿は、平均重合度が約１４である（上記の試験法によって求めた）ナトリウム−リポ酸塩と決定した。
【０３５８】
実施例（カリウム−リポ酸）
１６０ｍｌの水に、０．１ｍｏｌのＫＯＨを溶解し、それに２０．６ｇのα−リポ酸（０．１ｍｏｌ）を、撹拌しながらゆっくりと加えた。α−リポ酸が完全に溶解した後、混合物を５０℃で５時間維持した。この溶液を５０℃、減圧下（−０．０９ｍｐａの真空）で、約５０％の水が除去されるまで濃縮した。
【０３５９】
濃縮溶液を噴霧乾燥して、平均重合度が約１４である（上記の試験法によって求めた）カリウム−リポ酸塩を得た。
【０３６０】
実施例（アンモニウム−リポ酸）
１６０ｍｌの水に、０．１ｍｏｌのアンモニア水を加え、それに２０．６ｇのα−リポ酸（０．１ｍｏｌ）を、撹拌しながらゆっくりと加えた。α−リポ酸が完全に溶解した後、混合物を４５℃で５時間維持した。この溶液を５０℃、減圧下（−０．０９ｍｐａの真空）で、約５０％の水が除去されるまで濃縮した。
【０３６１】
濃縮溶液を噴霧乾燥乾燥して、平均重合度が約１１である（上記の試験法によって求めた）カリウム−リポ酸塩を粉末として得た。
【０３６２】
実施例（エチレンジアミン−リポ酸）
１６０ｍｌの水に０．１ｍｏｌのエチレンジアミンを溶解し、それに２０．６ｇのα−リポ酸（０．１ｍｏｌ）を、撹拌しながらゆっくりと加えた。α−リポ酸が完全に溶解した後、混合物を４０℃で５時間維持した。この溶液を５０℃、減圧下（−０．０９ｍｐａの真空）で、約５０％の水が除去されるまで濃縮した。
【０３６３】
濃縮溶液を、１２５０ｍｌのエタノール（９５％）に注ぎ入れた。得られた溶液を撹拌し、白色沈殿が形成された。沈殿を回収し、約３５℃で６時間乾燥させた。得られた沈殿は、平均重合度が約８である（上記の試験法によって求めた）ナトリウム−リポ酸塩であると決定した。
【０３６４】
実施例（ジエチルアミン−リポ酸）
１６０ｍｌの水に０．１ｍｏｌのジエチルアミンを加え、それに２０．６ｇのα−リポ酸（０．１ｍｏｌ）を撹拌しながらゆっくりと加えた。α−リポ酸が完全に溶解した後、混合物を４５℃で５時間維持した。この混合物を５０℃、減圧下（−０．０９ｍｐａの真空）で、約５０％の水が除去されるまで濃縮した。
【０３６５】
濃縮溶液を噴霧乾燥して、平均重合度が約８である（上記の試験法によって求めた）カリウム−リポ酸塩を粉末として得た。
【０３６６】
実施例（カルシウム塩）
７．４ｇ（０．１ｍｏｌ）の水酸化カルシウムおよび１６０ｍｌの水に、２０．６ｇ（０．１ｍｏｌ）のリポ酸を加えた。反応混合物中に淡黄色の沈殿が現れた。混合物は、約５０℃で約４時間維持した。この混合物を、約５０％の水が除去されるまで減圧下で濃縮した。沈殿を濾過し、５０ｍｌの水で洗浄し、次いで、真空乾燥した。重合度は約４であった（上記の試験法によって求めた）。
【０３６７】
実施例（キノリン−リポ酸塩）
１２．９ｇ（０．１ｍｏｌ）のキノリンおよび５０ｍｌの水に、２０．６ｇ（０．１ｍｏｌ）のリポ酸を加えた。反応混合物を、約３０分間撹拌し、続いて、５０℃、真空下で約２時間、水を除去した。得られた生成物を真空乾燥した。平均重合度は約４であった（上記の試験法によって求めた）。
【０３６８】
実施例（イソキノリン−リポ酸塩）
０．ｌｍｏｌのイソキノリンおよび５０ｍｌの水に、２０．６ｇ（０．１ｍｏｌ）のリポ酸を加えた。混合物を約３０分間撹拌し、続いて、５０℃、真空下で約２時間、水を除去した。得られた生成物を真空乾燥した。平均重合度は約４であった（上記の試験法によって求めた）。
【０３６９】
ＬＡと比較した、ＬＡＯＲＮのＣＡＣＯ−２吸収試験
方法
ＣａＣｏ−２細胞の培養
３７℃、５％  ＣＯ２および９５％空気の雰囲気において、２０％のウシ胎児血清、１．２％の非必須アミノ酸、０．８３ｍＭのＬ−グルタミン、１．２％のペニシリン−ストレプトマイシンおよび０．１％のメルカプトエタノールを含有するダルベッコの改変イーグル培地でＣａＣｏ−２細胞を培養した。
【０３７０】
細胞を、７５ｃｍ２培養フラスコ（Ｔ７５）で増殖させ、１週間後に継代培養した（１日おきに、ＰＢＳバッファーで洗浄し、トリプシンを用いて回収し、新規培養フラスコに移した）。
【０３７１】
ＣａＣｏ−２試験
実験のために、細胞を、６ウェルプレートに、ウェルあたり３×１０５個細胞の密度で播種し、コンフルエントになるまで、３７℃、５％  ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気において、７〜８日増殖させた。細胞をＰＢＳバッファーで洗浄し、リポ酸（１ｍｇ／ｍＬ培地）またはＬＡＯＲＮ（１．４５ｍｇ／ｍＬ培地、１ｍｇ  ＬＡに相当）を含有する４ｍｌの培地とともに、３０および６０分間インキュベートした。
【０３７２】
インキュベートした後、細胞をＰＢＳバッファーで洗浄し、１ｍｌ  ０．１ＰＢＳバッファーを用いて回収した。細胞を、３０秒間で３回超音波処理し、１０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。上清を、さらなる分析のサンプルとして用いた。
【０３７３】
安定性研究のために、インキュベーション培地を、３７℃で１時間インキュベートした。その後、培地を遠心分離し、さらなる分析のために用いた。
【０３７４】
分析用サンプル調製
ａ）遊離ＬＡおよびＤＨＬＡの分析
【０３７５】
獲得したサンプルを、以下に記載されるさらなるサンプル調製を施し、ＨＰＬＣ分析に供した。
【０３７６】
ｂ）ＬＡまたはＬＡＯＲＮのＤＨＬＡへの還元
１ｍｌのサンプル（培地または細胞）を、１ｍｌのＮａＢＨ４（２００ｍｇ／１００ｍＬ  ０．１Ｎ  ＮａＯＨ）と混合し、６０℃で１０分間インキュベートした。その後、２ｍｌの２Ｍ  ＨＣｌを加え、サンプルを、３×２ｍｌのジエチルエーテルで抽出した。合わせた有機相を蒸発させ、１ｍｌの移動相で再構成した。
【０３７７】
ＨＰＬＣ分析
カラム：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ（２５０×４．６ｍｍ）
移動相：水中、４０％アセトニトリル
フロー：０．８ｍｌ／分
検出：２２０ｎｍ
注入容積：５０μｌ
【０３７８】
【表３】
0005439173.tif 000024
【０３７９】
【表４】
0005439173.tif 000025
【０３８０】
表５に示されるように、３０および６０分後に、細胞から遊離ＬＡ／ＤＨＬＡを回収した。驚くべきことではないが、ＬＡとともにインキュベートした後に回収した遊離ＬＡ／ＤＨＬＡの量は、ＬＡＯＲＮとともにインキュベートした後よりもかなり多かった。しかし、遊離ＬＡ／ＤＨＬＡは培地中で同定できるので、これらの結果は、ＬＡＯＲＮからのＬＡの「徐放（slow release）」の証拠を提供する。
【０３８１】
【表５】
0005439173.tif 000026
【０３８２】
表６は、ＬＡまたはＬＡＯＲＮとともにインキュベートした後の総ＬＡ／ＤＨＬＡ回収の結果が示されていることを提供する。示されるように、総ＬＡ量は、ＬＡとのインキュベーションと比較した場合、ＬＡＯＲＮインキュベーション後よりもかなり多いことがわかった。これらの知見は、オリゴマー状態のＬＡＯＲＮの吸収という考えを支持する。
【０３８３】
【表６】
0005439173.tif 000027
【０３８４】
得られたこれらの結果は、ＬＡＯＲＮは、オリゴマーの形で吸収されるという証拠を提供する。ＬＡＯＲＮとともにインキュベートされた細胞中の遊離および総ＬＡ／ＤＨＬＡ間の比較から、細胞中に見られた総ＬＡ／ＤＨＬＡの約８０％が、オリゴマーの形で吸収されたと導くことができる。
【０３８５】
選択された試験条件下で、ＬＡとともに６０分間インキュベートした後に、細胞において９．３９％が回収されたのに対し、同一条件下で、ＬＡＯＲＮとともにインキュベートした後には１７．３％が回収されたと実証された。細胞に対して、溶液中でＬＡが提示されることを考慮すると、ＬＡＯＲＮとはかなり対照的に、ＬＡが溶解度がかなり低いｉｎ−ｖｉｖｏ条件では、吸収の差はかなり高く、ＬＡＯＲＮにより有利であると決定できる。
【０３８６】
結果
サンプル中に存在するＬＡおよびＤＨＬＡの（「遊離ＬＡ／ＤＨＬＡ」と呼ばれる）量を、ＬＡおよびＬＡＯＲＮのＤＨＬＡへの還元後に同一サンプル中に観察される量（「総ＬＡ／ＤＨＬＡ」と呼ばれる）と比較した。
【０３８７】
表５に示されるように、培地でのＬＡおよびＬＡＯＲＮのインキュベーションによって、種々の量の遊離ＬＡ／ＤＨＬＡが得られた。これらの知見は、ＬＡＯＲＮは、試験アッセイ条件の間、そのオリゴマー構造を保持するということを支持する。
【０３８８】
表４に示されるように、ＬＡおよびＬＡＯＲＮの両方とも、ＤＨＬＡへの還元後にほとんど完全に回収でき、したがって、ＬＡおよびＬＡＯＲＮは、試験アッセイ条件下で安定であると考えられる。
【０３８９】
リポ酸コーティングのオリゴマー化度
材料
リポ酸（ＬＡ）  Ｓｉｇｍａ
硫酸ナトリウム  Ｓｉｇｍａ
無水エタノール  Ｓｉｇｍａ
【０３９０】
実験
５ｇの硫酸ナトリウムを含む１００ｇの無水エタノールに、３．０ｇのリポ酸（１４．５ｍｍｏｌ）を溶解した。この混合物を１０分間撹拌し、濾過した。残渣の湿重を測定した。残渣を真空乾燥し、残渣の乾重を測定した。
【０３９１】
無水硫酸ナトリウム中の、リポ酸の含量を測定し、約３．５％のリポ酸（ｗ／ｗ）を含んでいた。
【０３９２】
リポ酸／硫酸ナトリウム残留物を、例えば、５０℃の温度に１時間付して、コーティングされた硫酸ナトリウムを乾燥させた。平均重合度は、ヨウ素滴定法によって測定した。以下の表は、オリゴマー化および乾燥回数および温度を提供する。
【０３９３】
【表７】
0005439173.tif 000028

【０３９４】
考察
硫酸ナトリウムの表面上のリポ酸は、最少の昇温下でオリゴマー化することが確定された。加熱サイクルの期間を増大することによって、オリゴマー化度が増大するということがわかった。コーティングが室温で乾燥される場合には、平均重合を調べることが困難であり、ほとんどのリポ酸がオリゴマー化されていないリポ酸として残存していた。
【０３９５】
人工胃酸におけるルテイン−エステルの消化
ルテイン−エステルは、ルテインの天然に存在する誘導体である。遊離ルテインは、光、温度および／または酸素による分解に感受性がある。さらに、ルテインは、経口摂取後の消化過程の間、分解する。ルテイン−エステルは、消化過程の間、ルテインの安定性を増大すると考えられている。
【０３９６】
安定性ルテイン−エステルをさらに増大するために、ルテイン−エステルを、硫酸ナトリウムを含む上記のリポ酸でコーティングした。コーティングのオリゴマー化度は、直接は調べなかったが、これは、ほとんどのヨウ素がルテインエステルによって消費されるからである。オリゴマー化度は、必要に応じて（これは実施されていないが）、ルテイン−エステルによって消費されたヨウ素の量を測定することによって間接的に算出できる。次いで、この値を用いて、コーティングのオリゴマー化度を調べることができるが、ルテインおよびヨウ素間の反応はきわめて複雑であり、そのため、実験室で実施するのは極めて困難であった。したがって、硫酸ナトリウム「モデル」は、コーティングされたカロテノイド材料のコーティングのオリゴマー化度の妥当な値を提供すると仮定した。
【０３９７】
方法
１０±０．５ｍｇのルテイン−エステルを、２５０ｍＬの丸底フラスコに秤量して入れ、１００ｍＬの人工胃液または回腸液を加えた。このフラスコを、懸濁液を継続的に撹拌しながら、３７℃で維持し、光から保護した。選択した時点（０、４０、６０、８０、１００分）で、ルテイン−エステルをＴＢＭＥ（ｔ−ブチルメチルエーテル）（３×３０ｍＬ）中に抽出した。該当する場合には、リポ酸の測定のために５ｍＬのサンプルを採取し、その後、ＴＢＭＥで抽出した。リポ酸は、ｐＨを９．０（ＫＯＨ）に調整し、５６℃で６０分間インキュベートした後にＨＰＬＣによって調べた。
【０３９８】
合わせたＴＢＭＥ抽出物をＴＢＭＥで１００ｍＬまで満たし、１：２５希釈し、溶媒に対して４５０ｎｍでＵＶ／ＶＩＳ分光法によって吸光度を測定した（必要に応じて、０．９０００を下回る吸収値を達成するようサンプルを希釈した）。吸光度は、実際のサンプル重量によって補正し、吸収／ｍｇサンプルを得た。
【０３９９】
合わせたＴＢＭＥ抽出物はまた、ＨＰＬＣ系に注入し、ルテイン−エステルの存在を定性的に確認し、エステル加水分解の場合のルテインの推定される増大をたどった。
【０４００】
ルテイン−エステルサンプル
１）コーティングされていないルテイン−エステル
２）１％リポ酸でコーティングされたルテイン−エステル
３）３％リポ酸でコーティングされたルテイン−エステル
【０４０１】
【表８】
0005439173.tif 000029
【０４０２】
ＨＰＬＣ
ポンプ：アイソクラティックＨＰＬＣポンプ
カラム：ＹＭＣ  Ｃ−３０  ２５０×４．６ｍｍ
移動相：ＴＢＭＥ／ＭｅＯＨ＝５０／５０（ｖ／）
フロー速度：１ｍＬ／分
温度：３０℃
検出：４５０ｎｍ（ＵＶ／ＶＩＳ検出器）
【０４０３】
結果
人工胃液または回腸液における、コーティングされていないルテインーエステルの安定性が図１３および１４に示されている。見られるとおり、コーティングされていないルテイン−エステルは、胃の消化の間、安定であるとわかったのに対し、回腸液消化の１００分以内に２０％の崩壊が観察された。
【０４０４】
人工胃液または回腸液における１％オリゴマー化リポ酸でコーティングされたルテイン−エステルの安定性は、図１５および１６（オリゴマー化されていない）に示されている。示されるように、１％リポ酸でコーティングされたルテイン−エステルは、胃および回腸消化の間、安定であるとわかった。
【０４０５】
結論：
コーティングされていないルテイン−エステルは、ｐＨ＝２．０（人工胃液）で安定であり、したがって、コーティングは胃酸消化の間は効果を発揮しないとわかった。他方、１または３％リポ酸でのコーティングは、人工回腸消化の間、分解を防ぐ。濃度依存的効果は見られなかった。
【０４０６】
リポ酸の予備測定に基づいて、コーティングは、ｐＨ＝２．０で安定であり、ｐＨ＝７．５で分解される。
【０４０７】
ルテインの保護における、リポ酸とクエン酸の比較
実験
５ｇのルテインエステルを含む１００ｇの無水エタノールに、１．０ｇのクエン酸を加えた。この混合物を、１０分間撹拌し、濾過した。残渣の湿重を調べた。残渣を真空乾燥し、残渣の乾重を調べた。ルテインエステル中のクエン酸の含量を調べ、約１％のクエン酸（ｗ／ｗ）を含んでいた。
【０４０８】
乾燥されたクエン酸ルテインエステル混合物を、５０℃の高温に２４時間付した。上記のように、ＵＶ−可視分光光度法によってルテイン含量を測定した。
【０４０９】
クエン酸をリポ酸と置き換えて、クエン酸について上記されるように、オリゴマー化リポ酸でコーティングされたルテインエステルを調製し、乾燥させた。
【０４１０】
【表９】
0005439173.tif 000030
【０４１１】
結論
クエン酸でコーティングされたルテインエステルは、未処理サンプルルテインサンプル（ブランクサンプルと比べて安定化されているとわかった。
【０４１２】
クエン酸の保護効果は、オリゴマー化リポ酸コーティングよりも、特に、重量ベースを考慮して小さかった。
【０４１３】
ルテインエステルの保護における、リポ酸とポリフェノールの比較
実験
５ｇのルテインエステルを含む１００ｇの無水エタノールに、１．０ｇの没食子酸を溶解した。この混合物を１０分間撹拌し、濾過した。残渣の湿重を調べた。残渣を真空乾燥し、残渣の乾重を調べた。
【０４１４】
ルテインエステル中の没食子酸の含量は、約１％の没食子酸（ｗ／ｗ）と測定された。
【０４１５】
次いで、没食子酸／ルテインエステル混合物を、６０℃の高温に９時間付した。ルテイン含量を、上記のようにＵＶ−可視分光光度法を用いて測定した。
【０４１６】
没食子酸をリポ酸と置き換えて、没食子酸について、上記されたように、オリゴマー化されたリポ酸でコーティングされたルテインエステルを、調製し、乾燥させた。
【０４１７】
【表１０】
0005439173.tif 000031
【０４１８】
結論
オリゴマー化リポ酸でコーティングされたルテインエステルは、安定であり、ポリフェノールもルテインエステルに対して保護効果を有する。
【０４１９】
ルテインエステルの保護における、リポ酸とビタミンＥの比較
実験
乳鉢に、３００ｍｇのルテインエステルおよび３０ｍｇのα−トコフェロールを加え、完全に製粉し、６０℃の温度で４時間維持した。ルテイン含量を、上記のようにＵＶ−可視分光光度法を用いて測定した。
【０４２０】
１％リポ酸（エステルの重量に基づいて）を用いてコーティングされたルテインエステルのサンプルは、２種の材料を完全に製粉し、続いて、６０℃の高温で４時間処理して、ルテインエステルを含有するオリゴマー化リポ酸を取得し、エステルの早期分解をシミュレートすることにより調製した。ルテイン含量は、上記のように、ＵＶ−可視分光光度計を用いて測定した。
【０４２１】
【表１１】
0005439173.tif 000032
【０４２２】
結論
オリゴマー化リポ酸およびα−トコフェロールの両方が、ルテインエステルを分解から保護したが、必要なリポ酸オリゴマーの量は、必要なα−トコフェロールの量よりもかなり少なかった。
【０４２３】
ルテインエステルを安定化する方法
材料
ルテインエステル  マリーゴールドオレシン（Marigold Olesin）由来の抽出物
リポ酸            Ｓｉｇｍａ
没食子酸          Ｓｉｇｍａ
レスベラトロール  Ｓｉｇｍａ
無水エタノール    Ｓｉｇｍａ
【０４２４】
実験
混合法
乳鉢に、３００ｍｇのルテインエステルおよび所定量のリポ酸を入れ、製粉し、次いで、６０℃の高温に４時間付した。ルテイン含量は、上記のＵＶ−可視分光光度法によって調べた。
【０４２５】
コーティング法
５ｇのルテインエステルを含む１００ｇの無水に、３．０ｇのリポ酸（１４．５ｍｍｏｌ）を溶解した。この混合物を１０分間撹拌し、濾過した。残渣の湿重を調べた。残渣を真空乾燥し、残渣の乾重を調べた。ルテインエステル中のリポ酸の含量を調べ、約３．５％のリポ酸（ｗ／ｗ）を含んでいた。
【０４２６】
次いで、リポ酸／ルテインエステルの混合物を、６０℃の高温に９時間付し、リポ酸のオリゴマー化を達成した。ルテイン含量は、上記のＵＶ−可視分光光度法によって調べた。
【０４２７】
結果
混合法
【０４２８】
【表１２】
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【０４２９】
コーティング法
【０４３０】
【表１３】
0005439173.tif 000034
【０４３１】
没食子酸およびレスベラトロールでコーティングされたサンプルは、没食子酸またはレスベラトロールのいずれかをリポ酸と置換することによって、上記のリポ酸でコーティングされたサンプルと同様に調製した。
【０４３２】
結論
オリゴマー化リポ酸は、ルテインエステルを保護し、投与量が増大するにつれ、ルテインエステルの安定性も増大するということがわかった。成分を一緒に混合するには、リポ酸の理想的な投与量は、約１０％（ルテインエステルの総重量に基づいて）であった。また、コーティング法によって、ポリフェノールとオリゴマー化リポ酸の両方とも、ルテインエステルを分解から保護できるが、オリゴマー化リポ酸は、分解の防止についてかなりより有効であるということも調べられた。コーティング法は、成分を念入りに一緒に単純に混合することよりも、有効であるということもさらにわかった。混合成分に、当量のリポ酸またはその他の利用される安定化剤および長期の加熱時間を用いることで、コーティング法サンプルは、成分を一緒に混合することよりも高い残存割合を有するということも注目すべきであった。
【０４３３】
コーティング材料としてのリポ酸誘導体の重合度
コーティング法
５ｇのシリカゲルを含む１００ｇの水に、３．０ｇのＬＡＯＲＮ（８．４２ｍｍｏｌ）を溶解した。この混合物を１０分間撹拌し、濾過した。材料の湿重を調べ、次いで、真空乾燥させた。次いで、材料の乾重を調べた。
【０４３４】
シリカゲル上にコーティングされたＬＡＯＲＮの量を調べ、約２．６％のＬＡＯＲＮ（ｗ／ｗ）であるとわかった。
【０４３５】
平均重合度は、上記のヨウ素滴定法によって調べた。オリゴ−リポ酸塩のその他のサンプルは、ＬＡＯＲＮについて記載されるように調製した。
【０４３６】
重合度の決定
種々のオリゴ−リポ酸塩の平均重合度は、上記のヨウ素滴定法によって調べた。
【０４３７】
結果
【０４３８】
【表１４】
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【０４３９】
【表１５】
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【０４４０】
結論
種々のオリゴ−αリポ酸塩の重合度は、コーティング工程の前後で安定である。
【０４４１】
安定性試験
調製：
５ｇのルテインエステルを含む１００ｇの水に、３．０ｇのＬＡＯＲＮ（８．４２ｍｍｏｌ）を溶解した。この混合物を１０分間撹拌し、濾過した。固体の湿重を測定した。次いで、固体を真空乾燥させ、乾燥した時点で残渣を測定した。
【０４４２】
平均重合度は、上記のヨウ素滴定法によって調べた。オリゴ−リポ酸塩のさらなるサンプルは、ＬＡＯＲＮのものと同様に作製した。
【０４４３】
試験：
サンプルを、５０℃の温度に２４時間付した。次いで、ルテイン含量を、ＵＶ−可視分光光度法によって測定した。
【０４４４】
実験結果：
【０４４５】
【表１６】
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【０４４６】
結論：
上記のコーティングされたルテインエステルは、老化試験において安定であるとわかった。保護効果は、種々のオリゴマーのリポ酸複合体試験の間で同様であり、混合物の乾燥温度は、複合体の、ルテインエステルを保護する能力には効果を及ぼさないということがわかった。
【０４４７】
Ａｒｇ−ＬＡ塩の調製：
１７．４ｇ（０．１ｍｏｌ）のアルギニン塩基および７２０ｍｌの水に、撹拌しながら２０．６ｇ（０．１ｍｏｌ）のリポ酸を加えた。リポ酸はゆっくりと溶解し、透明な黄色の液体を形成した。次いで、この液体を噴霧乾燥させると、約４０ｇの、重合度が約２．５５〜２．９１のＡｒｇ−ＬＡ塩が得られた。
【０４４８】
本発明は、好ましい実施形態を参照して記載したが、当業者ならば、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、形式および細部にわたって変更を行うことができるということを認識できよう。背景技術中のものを含めて、本明細書を通じて引用されたすべての参照文献は、その全文が本明細書に組み込まれる。当業者ならば、ただ慣例の実験を用いるだけで、本明細書に具体的に記載される本発明の具体的な実施形態の多数の等価物を認識し、解明することができるであろう。このような等価物は、特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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