(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する、単離された若しくは精製された抗体またはそのフラグメントであって、
該抗体またはそのフラグメントが、軽鎖と重鎖を含むＦａｂフラグメントであり、軽鎖が可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）を有し、重鎖が可変領域（ＶＨ）及び第１定常領域（ＣＨ１）を有し、
ここで、可変領域（ＶＬ）が下記のアミノ酸配列：
ＣＤＲ１：ＲＡＳＥＳＶＳＦＬＧＩＮＬＩＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＣＤＲ２：ＱＡＳＮＫＤＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＣＤＲ３：ＬＱＳＫＮＦＰＰＹＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
を含み、
定常領域（ＣＬ）がカッパ定常部であり、
可変領域（ＶＨ）がアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を有し、
第１定常領域（ＣＨ１）がＩｇＧ重鎖である、
抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
図１のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を有する軽鎖を含む、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
完全ヒト型である、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項５】
重鎖がさらに第２抗体フラグメントへの共有結合に適したヒンジ部を含む、Ｆａｂ’フラグメントである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体フラグメント。
【請求項６】
細胞毒性物質またはマーキング剤から選択されるエフェクター部分にコンジュゲーションしている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項７】
エフェクター部分が放射性核種である、請求項６に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項８】
放射性核種が１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１８８Ｒｅ及び９９Ｔｃよりなる群から選択される、請求項７に記載の抗体またはフラグメント。
【請求項９】
請求項５に記載の２つの共有結合したＦａｂ’フラグメントにより形成される二量体。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントをコードする配列を含む核酸分子。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含み、その核酸が作動可能な状態で転写調節シグナルに結合している発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【請求項１３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントを含む、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）の過剰発現が関与する障害を治療、予防または診断するための医薬。
【請求項１６】
障害がヒトにおける卵巣癌である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント、および他の療法薬を含む、療法に同時、個別または逐次使用するための組合わせ製剤としての製品。
【請求項１８】
他の療法薬が、化学療法薬および放射線療法薬よりなる群から選択される、請求項１７に記載の製品。
【請求項１９】
卵巣癌の療法に同時、個別または逐次使用するための組合わせ製剤としての、請求項１７または１８に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト葉酸受容体アルファに特異的な高アフィニティーヒト抗体および抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメントに関する。本発明は、そのような抗体およびフラグメントの調製方法、ならびに療法および診断の場における、たとえば特に卵巣癌の放射免疫療法におけるそれらの使用に関する。本発明はさらに、これらの抗体およびフラグメントを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
上皮卵巣癌（ＥＯＣ）は、工業国および欧州における婦人科悪性疾患のうち最も致死性の高いものである。ＥＯＣは発病率が比較的低い（毎年約１／１００，０００の新症例）にもかかわらず高い致死率を示し、総５年生存率は約４４％にとどまっている（１），（２）。臓器限定腫瘍を伴う女性の予後はきわめて良好であるが、大部分の早期癌は無症候性であり、２／３を超える患者が進行疾患の状態で診断される。早期ＥＯＣは一般に無症候性であり、大部分の女性（７０〜７５％）が進行疾患を呈し、これはしばしば散在性の小容積腫瘍沈着物として拡散している。卵巣癌の疑いがある場合の管理には、組織学的確認、病期判定および腫瘍膨張防止のために、ほとんどの場合まず外科処置が必要である。診断時点での、主に早期疾患において達成できる細胞減数に有効な外科処置は、生存率改善と相関している。しかし、早期診断が困難でありかつ散在性の小容積疾患の傾向があるため、大部分のＥＯＣ患者は残存疾患を根除するための合併処置（ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）が必要である。
【０００３】
卵巣癌の効果的な処置に際して化学療法が重要な役割を果たすようになってきた（３），（４）。ＥＯＣは化学物質感受性腫瘍であると考えられ、事実、高活性の最先端化学療法を受けたＥＯＣ患者の７０〜８０％が臨床緩解期に入る。しかし、新たな療法が開発されて中央総生存率が改善されたにもかかわらず、進行期患者の大部分において初期処置に完全応答した後に再発が起き、これらの患者のうち少なくとも７０〜９０％が最終的に薬物（療法）抵抗性癌で死亡し、１０〜３０％が長期生存を示すにすぎない。
【０００４】
したがって、卵巣癌の代替処置法の要望が大きい。これらの代替処置法のひとつは、放射免疫療法である。卵巣癌は、化学療法抵抗性である転移を根除するために合併放射免疫療法で処置できる。放射免疫療法は、癌エピトープ特異的なモノクローナル抗体を放射性成分で標識することにある。次いでこの放射性標識モノクローナル抗体をインビ注射すると、それの特異性により癌塊に蓄積するであろう。この手法は療法薬（この場合は放射性成分）を癌細胞に濃縮することができ、部位特異的ではない化学療法と異なり毒性および副作用が少ない；これは、それの選択的ターゲティング、およびおそらく作用機序の相異、および処置全体に使用する療法薬の用量がより少ないことによる。
【０００５】
卵巣癌については幾つかの異なるマーカーがこれまでに同定され、多数の異なる抗体が作成された。それらのうち最も良く解明されているものは、抗−ＣＡ１２５抗体（５），（６）および抗ＭＵＣ−１抗体、ならびに抗−葉酸受容体抗体、たとえばＭｏｖ１８（７）である。後者は幾つかの重要な利点をもたらす。
【０００６】
葉酸受容体アルファ（ＦＲα）は、葉酸ならびにある還元葉酸、たとえば５−メチルテトラヒドロ葉酸およびテトラヒドロ葉酸に対する高いアフィニティーをもつ、グリコシルホスファチジルイノシトール結合タンパク質である。それは限られた数の上皮細胞、特に腎臓、胎盤および脈絡膜叢にも存在するが、それらの頂端側表面に発現し、抗体が到達できないようになっている。αＦＲが卵巣癌細胞に過剰発現し、かつ正常組織におけるそれの分布が限られていることは、放射免疫療法のための抗αＦＲ抗体を開発する好機となる。ＭＯｖ１８はアルファ葉酸受容体に特異的なモノクローナル抗体であり、この受容体は卵巣癌の９０％で過剰発現しているため放射免疫療法の理想的な標的である。１３１Ｉで放射性標識したＭＯｖ１８は既にＩ／ＩＩ相臨床試験に導入され、ある程度の成果が得られている。αＦＲに対して形成された他のネズミモノクローナル抗体にはＭＯｖ１９が含まれる。
【０００７】
ＭＯＶ１８を含めた多数の他のモノクローナル抗体が種々の臨床試験で有効性を示しているが、それらはネズミ由来であることによりそれらの臨床開発は限られている。それらの免疫原性を回避するために、臨床開発前または開発中に幾つかの抗体を工学的に処理してキメラ抗体またはヒト化抗体が形成され、最終世代は完全ヒト型であって臨床開発中である。
【０００８】
放射免疫療法がしばしば遭遇する制約は、抗体の半減期が長く、数日間に及ぶ可能性があることである。一方ではこの特性は利点であって、抗体が腫瘍をターゲティングするのに適切な長さの時間を得ることができる。しかし他方では、これは患者にとって、標識によっては放射性成分が全身の静脈内で崩壊するのに数日間かかる場合があることも意味する。この場合、抗体は患者の身体から低速でクリアランスされるので、腫瘍−対−血液または臓器比は、最も好ましい状態でもほとんどｌｏｇを超えないであろう。この観点からみて、抗体の半減期を短縮させると、健常組織における非特異的な放射線蓄積による副作用が低下することによって処置毒性が減少するであろう。
【０００９】
考慮すべき他の点は、腫瘍への侵入である。モノクローナル抗体分子の立体障害は、標的が血流中に単離した細胞である限り影響をもたないが、卵巣癌の場合のように固形腫瘍を考慮する際には重大となる（８），（９）。固形腫瘍への侵入はリガントに対する抗体のアフィニティーによっても影響を受ける；アフィニティーが低すぎると腫瘍局在化が妨げられ、これに対しアフィニティーが高すぎると腫瘍周辺への抗体結合が制限されることがこれまでに証明されており（１０）、後者の現象は抗原バリヤーとして記載されている。
【００１０】
前記の点（由来、サイズ、半減期およびアフィニティー）を考慮して、卵巣癌の放射免疫療法にヒト抗体フラグメント（Ｆａｂ）を用いることが提唱された。実際に、腫瘍への侵入のためには完全抗体より小さな分子の方が好ましいと思われ、それがヒト由来であることは免疫原反応を排除するはずである。さらに、半減期は短縮されるであろう。そのような分子のアフィニティーは、選択した抗体フラグメントの機能として具体的に対処する必要がある。Ｆａｂフォーマットの他の利点は、このタイプの分子が機能性であるために何らかのグリコシル化を必要としないことである。これは、微生物による製造およびそれに伴う利点と適合する。
【００１１】
そのような抗体フラグメントはこれまでに、ＭＯＶ１８を作成したものと同じ融合体から選択されたモノクローナル抗体（Ｍａｂ）であるＭＯｖ１９から出発してガイド付き選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により作成され、同一標的抗原、すなわちαＦＲ上の非交差反応性エピトープを認識する。Ｃ４と命名されたこの選択されたＦａｂフラグメント（１１）は、インビトロアッセイによりαＦＲを特異的に結合しうると記載されている。Ｃ４は、全ＥＯＣ細胞について実施したＳｃａｔｃｈａｒｄ分析により２００ｎＭの推定Ｋａｆｆを示した。
【００１２】
したがって、インビボ臨床用として卵巣癌の療法および診断に適切なＣ４−Ｆａｂフラグメントの開発が想定された。しかし本発明者らは、Ｃ４抗体Ｆａｂフラグメントの比較的低いアフィニティーおよびそれのインビボ半減期は臨床開発の要求に適合しないことを見いだした。実際に、本発明者らがＣ４  Ｆａｂフラグメントについて実施したインビボ実験により下記のことが示された：
−Ｃ４  Ｆａｂフラグメントのアフィニティーは効果的な腫瘍局在化のためには低すぎた；
−Ｃ４  Ｆａｂのインビボ半減期はきわめて短く、これはそれのアフィニティーが低いことと合わせていずれの腫瘍への局在化も妨げた；静脈内投与のわずか１時間後ですら、動物の血液中にＦａｂフラグメントを検出するのはほとんど不可能であった。この急速すぎるクリアランスは、固形腫瘍における抗体フラグメントの蓄積を妨げ、このため一貫しない生体内分布結果を生じた。
【００１３】
さらに本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えＣ４  Ｆａｂの産生、およびその後のそれの精製は、非機能性Ｌ鎖ホモ二量体混在物（Ｌ２）が同時に産生し、それを精製工程中に除去するのが困難なことによって著しく妨げられることを見いだした。
【００１４】
したがって本発明者らは、卵巣癌の放射免疫療法に適切な二量体Ｆａｂフラグメントの作成の可能性を調べることを決定した。ＦａｂからＦ（ａｂ’）２フォーマットに移行すると、幾つかの利点が得られる；たとえば二価性が得られ、これはフラグメントのアビディティーを高め、したがってそれの全体的アフィニティーを高める；対応するＦａｂフラグメントと比較して分子量が倍増し、これにより尿中への排出が減少して腎臓が保護され、結果的にそれのインビボ半減期が延長する（１２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Jemal A, Murray T, Ward E, et al. Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin 2005; 55: 10-30.
【非特許文献２】Cannistra SA. Cancer of the ovary. N Engl J Med 2004; 351: 2519-29.
【非特許文献３】Harries M, Gore M. Part I: chemotherapy for epithelial ovarian cancer-treatment at first diagnosis. Lancet Oncol 2002; 3: 529-36.
【非特許文献４】Vasey PA. Resistance to chemotherapy in advanced ovarian cancer: mechanisms and current strategies. Br J Cancer 2003; 89 Suppl 3: S23-S28.
【非特許文献５】Bast RC Jr, Klug TL, St John E, Jenison E, Niloff JM, Lazarus H, Berkowitz RS, Leavitt T, Griffiths CT, Parker L, Zurawski VR Jr, Knapp RC. A radioimmunoassay using a monoclonal antibody to monitor the course of epithelial ovarian cancer. N Engl J Med. 1983 Oct 13; 309(15): 883-7.
【非特許文献６】Lavin PT, Knapp RC, Malkasian G, Whitney CW, Berek JC, Bast RC Jr. CA 125 for the monitoring of ovarian carcinoma during primary therapy. Obstet Gynecol. 1987 Feb; 69(2): 223-7.
【非特許文献７】Miotti S, Canevari S, Menard S, Mezzanzanica D, Porro G, Pupa SM, Regazzoni M, Tagliabue E, Colnaghi MI. Characterization of human ovarian carcinoma-associated antigens defined by novel monoclonal antibodies with tumor-restricted specificity. Int J Cancer. 1987 Mar 15; 39(3): 297-303.
【非特許文献８】Netti PA, Baxter LT, Boucher Y, Skalak R, Jain RK Time-dependent behavior of interstitial fluid pressure in solid tumors: implications for drug delivery. Cancer Res. 1995 Nov 15; 55(22): 5451-58.
【非特許文献９】Jain RK. Physiological barriers to delivery of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumors. Cancer Res. 1990 Feb 1; 50(3 Suppl): 814s-819s.
【非特許文献１０】Adams GP, Schier R, McCall AM, Simmons HH, Horak EM, Alpaugh RK, Marks JD, Weiner LM. High affinity restricts the localization and tumor penetration of single-chain fv antibody molecules. Cancer Res. 2001 Jun 15; 61(12): 4750-5.
【非特許文献１１】Figini M et al., Cancer Res. 1998, Mar 1; 58 (5): 991-6.
【非特許文献１２】King DJ, Turner A, Farnsworth AP, Adair JR, Owens RJ, Pedley RB, Baldock D, Proudfoot KA, Lawson AD, Beeley NR, et al Improved tumor targeting with chemically cross-linked recombinant antibody fragments. Cancer Res. 1994 Dec 1; 54(23): 6176-85。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ところが本発明者らは、意外にもＣ４  Ｆａｂフラグメントを効率的に二量体化するのは不可能であることを見いだした。自然二量体化法または化学的二量体化法のいずれでも、許容できる収率のＣ４二量体は生成しなかった；適正な少量の二量体生成物には不適正な別の二量体種が多量に混在しており、これをゲル濾過クロマトグラフィー精製により除去することはできなかった。本発明者らは、Ｆａｂ二量体の作成には、Ｃ４ラムダＬ鎖をカッパＬ鎖で置換することを含めて、元のＣ４  Ｆａｂフラグメントを広範に修飾する必要があることを見いだした。これはガイド付き選択法により行なわれた。こうして選択したカッパＬ鎖を含む新規なＦａｂフラグメントをＡＦＲＡと命名し、改善された結合アフィニティーをもつＦａｂが生成した。この新規なカッパＬ鎖によりＬ鎖ホモ二量体形成の問題も回避され、かつ安定性が改善され、これは放射免疫療法に有利である（１３）。他の有益性は、カッパ鎖は大腸菌においてより容易に発現するという事実であり（１４）、これは、工業用の場合に特に有利である。本発明のＡＦＲＡカッパＬ鎖のアミノ酸配列を図１および７に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。比較のために、Ｃ４  Ｌ鎖のアミノ酸配列も図１に示す（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって本発明は、葉酸受容体アルファに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体、または抗体のフラグメントに関するものであり、その際、抗体またはフラグメントは、図１および７に示すＡＦＲＡアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を含むかもしくはそれからなるＬ鎖、またはこのＬ鎖の誘導体であって図１および７に示すもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と機能的に均等であるアミノ酸配列をもつものを含む。機能均等物は後記に定めるものである。
【００１８】
本発明に関して、下記の述語を用いる：
−用語”本発明の抗体およびフラグメント”または”ＡＦＲＡ抗体”または”ＡＦＲＡ抗体フラグメント”は、別途記載しない限り、図１および７に示すもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と同一のアミノ酸配列または図１および７に示すもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と機能的に均等であるアミノ酸配列を含むかもしくはそれからなるＬ鎖を含む、抗体またはフラグメントを表わす；
−用語”ＡＦＲＡ由来の抗体”または”ＡＦＲＡ由来の抗体フラグメント”は、図１および７に示すもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と機能的に均等であるアミノ酸配列をもつＬ鎖を含む抗体またはフラグメントを表わすために用いられる；
−用語”ＡＦＲＡ  Ｌ鎖”は、図１（ＡＦＲＡ）および図７に示すＬ鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を表わす。用語”ＡＦＲＡ由来のＬ鎖”は、図１（ＡＦＲＡ）および図７に示すもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と機能的に均等であるアミノ酸配列をもつＬ鎖を意味する；
−用語”抗体”は、用語”免疫グロブリン”（または’Ｉｇ’）と同義に用いられる。別途明記しない限り、用語”抗体”または用語”免疫グロブリン”は無傷の（または全）抗体分子を表わす。フラグメントはそのように表示される；
−抗体分子内のアミノ酸位置のナンバリングは、別途記載しない限り、Ｋａｂａｔナンバリング方式(Kabat, H. A., et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. (U.S. Dept. Health and Human Services, Bethesda, Md., 1991)を用いて行なう。
【００１９】
自然界では、抗体はＢリンパ球が産生する糖タンパク質分子である。本発明の抗体は、Ｂリンパ球により、ハイブリドーマにより、原核宿主細胞もしくは真核宿主細胞における組換え抗体の発現により、または合成法、たとえば既存の抗体から抗体の工学的処理により作成できる。それらはグリコシル化されていてもよく、されていなくてもよい。一般的に、抗体は抗原を高度の特異性で結合し、物理的および機能的特性に基づいてＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと表示される５クラス（またはイソ型）に小分類することができる。これらの異なるタイプの抗体は、約１５０，０００ダルトン（１５０ｋＤａ）の分子量をもつ共通の基本構造単位を共有し、システイン残基間の鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合により共有結合した２つの同一ポリペプチド重（Ｈ）鎖および２つの同一軽（Ｌ）鎖からなる。本発明の無傷の抗体もこの構造をもつ。好ましくはそれらはＩｇＧタイプのものである。
【００２０】
本発明に関して、’抗体フラグメント’は抗体のいずれかの部分、好ましくは抗原結合部分を意味し、そのような部分の変異型を含む。本発明による抗原結合フラグメントの例はＦａｂフラグメント；Ｆａｂ’フラグメント；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；およびミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）である。そのようなフラグメントの変異型には、天然ヒンジ配列、合成ヒンジ配列、ペプチドリンカーを用いて得ることができる、それらのフラグメントの二量体および三量体およびフラグメント間融合体、または化学的コンジュゲートが含まれる。本発明のフラグメントは、一価（たとえばＦａｂフラグメント）、二価（たとえばＦ（ａｂ’）２フラグメント）または多価（たとえば三量体Ｆａｂフラグメントを含む化学的コンジュゲート）であってもよい。
【００２１】
本発明のＡＦＲＡ抗体およびフラグメントが特異的に結合する抗原は、ヒト葉酸受容体アルファ（αＦＲ）である。葉酸受容体は３つのイソ型、アルファ、ベータおよびガンマをもち、それらはアミノ酸配列において約７０％の同一性を示す。これらの異なるイソ型は、葉酸に対するそれらの相対アフィニティーにおいて著しい差を示し、組織特異性が異なり、幾つかの悪性疾患における増加度が異なる。アルファイソ型は、普通はグリコシル−ホスファチジルイノシトール膜アンカーにより細胞表面に結合している１５。それは葉酸に対して高いアフィニティーをもち、受容体に結合した葉酸化合物および葉酸コンジュゲートの内部移行を仲介する。葉酸受容体アルファは正常組織ではきわめて限られた分布をもち（すなわち、限られた数の正常上皮細胞に存在する）が、婦人科組織の癌、たとえば卵巣癌では過剰発現する。本発明によれば、用語”葉酸受容体アルファ”は下記の用語と同義である：ＦＲ−アルファ；ＦＲα；葉酸受容体１；成体葉酸受容体；成体葉酸結合タンパク質；ＦＢＰ；卵巣腫瘍関連抗原ＭＯｖ１８。本発明に関して、この用語には細胞の表面に発現した受容体およびそれの可溶性形態も含まれる。ヒト葉酸受容体アルファの一次アミノ酸配列を図１０Ａに、可溶性形態を図１０Ｂに示す。
【００２２】
本発明の抗体およびフラグメントの重要な特徴は、葉酸受容体アルファに対するそれらの結合が特異的なことである。本発明の抗体およびフラグメントはＣ４およびＭｏｖ１９のものに重ね合わせることができる反応性をもつので、それらはベータおよびガンマイソ型の葉酸受容体には結合しない。用語”特異的に結合する”は、本発明の抗体およびフラグメントは高いアフィニティー(好ましくは少なくとも１００ｎＭのＫＤ、最も好ましくは少なくとも２０ｎＭのＫＤ）で哺乳動物細胞の表面に発現したＦＲαに結合し、同一エピトープ領域において９０％未満の同一性、好ましくは９５％未満の同一性、最も好ましくは９８％未満の同一性をもつタンパク質には結合しないことを意味する。本発明のモノクローナル抗体が認識するエピトープは、ヒト細胞の表面、好ましくはヒト卵巣癌細胞の表面で受容体がそれの天然立体配置をとった際に受容体により形成される連続エピトープであってもよく、不連続（コンホメーショナル）エピトープであってもよい。たとえば、本発明の抗体およびフラグメントは、９０％未満の全同一性、好ましくは９５％未満の全同一性、最も好ましくは９８％未満の全同一性をもつタンパク質には結合しない。したがって、本発明の抗体およびフラグメントは、図１０ＡおよびＢに示すヒト葉酸受容体アルファに対してきわめて高度の同一性をもつタンパク質、たとえば図１０の配列に対してアミノ酸１〜５個の差をもち本発明の抗体が認識するエピトープ領域（１以上）に関しては図１０の配列と実質的に同一である対立遺伝子変異型に結合することができる。
【００２３】
前記のように、ＦＲαは卵巣癌細胞に過剰発現するが、あるタイプの正常上皮細胞にも発現する。ただし、正常細胞における発現は頂端側表面においてであり、このため受容体はインビボ状況では本発明の抗体に到達できない。その結果、インビボでは、本発明の抗体およびフラグメントは卵巣癌細胞（ここではトランスフォーメーションの結果として細胞がそれらの極性を喪失し、次いでα葉酸受容体が細胞表面全体に発現する）（または他の癌）に発現したＦＲαに特異的に結合し、正常なヒト上皮細胞の表面に発現している受容体には結合できない。これに対し、本発明の抗体およびフラグメントをインビトロアッセイにより、単離された正常なヒト上皮細胞もしくは組織（たとえば、脳下垂体、子宮内膜、甲状腺または膵臓の上皮細胞）、または低レベルのＦＲαを発現している細胞系について試験した場合には、特異的な結合を検出できる。
【００２４】
本発明のＡＦＲＡ抗体およびＡＦＲＡ抗体フラグメントは特異的なＬ鎖を特徴とし、そのアミノ酸配列は図１に示されている（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）。図示したＡＦＲＡ  Ｌ鎖は、免疫グロブリンＬ鎖（Ｌ）に典型的な構造をもつ。実際に、一般的にＬ鎖（Ｌ）はアミノ酸約２２０個の長さであり、１つの可変ドメイン（”ＶＬ”）をＬ鎖のアミノ末端にもち（約１１０個のアミノ酸）、Ｌ鎖の残りのカルボキシル側半分からなる１つの定常ドメイン（”ＣＬ”）をもつ。本発明のＡＦＲＡ  Ｌ鎖（Ｌ）は２１８個のアミノ酸を含み、Ｎ末端の１１３個のアミノ酸が可変部（”ＶＬ”）を構成し、カルボキシ末端の残り１０５個のアミノ酸が定常ドメイン（”ＣＬ”）を構成する。このＬ鎖可変部のアミノ酸配列は、本発明のＡＦＲＡ抗体に独特である。これは、付随するＨ鎖の可変部と共に抗体の抗原結合部位を形成する。ＡＦＲＡ  Ｌ鎖の定常部は典型的なカッパＬ鎖である。
【００２５】
本発明のＡＦＲＡ抗体およびフラグメントのＬ鎖は通常は図１および７に示したものと同一であるけれども、本発明から逸脱することなくある変化をこの配列に生じさせることができる。実際に本発明は、図１および７に示したもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と機能均等なＬ鎖を含む”ＡＦＲＡ由来抗体”または”ＡＦＲＡ由来抗体フラグメント”にも関連する。そのような機能均等なＬ鎖は下記のアミノ酸配列である：
−その可変部に図１および７に示したＡＦＲＡ  Ｌ鎖の葉酸受容体アルファに対する特異性を決定する領域のうち少なくとも１つが含まれ、かつカッパ定常部を含む、Ｌ鎖を含む。特異性を決定する領域は、ＶＬ鎖の”超可変”部に相当し、これは”相補性決定領域”（ＣＤＲ）とも呼ばれる。これらのＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、またはＬ１、Ｌ２およびＬ３と表示される。ＡＦＲＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＦａｂ結晶構造により確認した相補性決定領域は下記のものである：
ＲＡＳＥＳＶＳＦＬＧＩＮＬＩＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＱＡＳＮＫＤＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＬＱＳＫＮＦＰＰＹＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。
【００２６】
これらの領域を図７に下線を施した太字で示す。したがって本発明のこの変異型によれば、ＡＦＲＡ由来抗体またはＡＦＲＡ由来抗体フラグメントは葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合し、その可変部は下記のアミノ酸配列のうち少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つ全部を含むＬ鎖を含む：
ＣＤＲ１：  ＲＡＳＥＳＶＳＦＬＧＩＮＬＩＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
ＣＤＲ２：  ＱＡＳＮＫＤＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
ＣＤＲ３：  ＬＱＳＫＮＦＰＰＹＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）。
【００２７】
上記のＣＤＲ配列は、好ましくはＡＦＲＡ由来Ｌ鎖中に、元のＡＦＲＡ  Ｌ鎖中のものと同じ位置に存在する；すなわちＣＤＲ１：２４−３８；ＣＤＲ２：５４−６０；ＣＤＲ３：９３−１０２（Ｋａｂａｔナンバリング方式を採用）。ＡＦＲＡ由来Ｌ鎖の可変部の残りの配列は、いずれかの枠組み(framework)配列であってよい；たとえば図１および７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とはアミノ酸１０または２０個までの、たとえばアミノ酸１、２、３、４または５個の置換、欠失または挿入により異なる枠組み配列であって、図１に示すＡＦＲＡ  Ｌ鎖枠組み配列と置き換えてＡＦＲＡ  ＣＤＲを含む抗体または抗体フラグメント中に用いた場合にヒト葉酸受容体アルファに対する抗体またはそのフラグメントの特異性を質的に変化させないもの。１態様において、ＡＦＲＡ由来Ｌ鎖の可変部は、図１および７の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とはアミノ酸１０または２０個までの、たとえばアミノ酸１、２、３、４または５個の置換、欠失または挿入により異なり、この置換、欠失または挿入はＣＤＲ内または外で行なうことができる。ＡＦＲＡ由来Ｌ鎖の定常部は、古典的なカッパ定常部、たとえば図７のＡＦＲＡ配列のアミノ酸１１４〜２１９（二重下線）と同一である。好ましくは、これらのＡＦＲＡ由来抗体またはＡＦＲＡ由来抗体フラグメントは、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に５０ｎＭ，未満、好ましくは２０ｎＭ未満のアフィニティー（ＫＤ）で結合する。
【００２８】
葉酸受容体アルファに対する前記に定めたＡＦＲＡ由来抗体またはＡＦＲＡ由来抗体フラグメントの特異性は、インビトロおよび／またはインビボで、ＦＲαとの反応性を示し、かつ９０％未満の配列同一性、好ましくは９５％未満の配列同一性をもつ受容体タンパク質との交差反応性がないことを示すための一般的実験手段を用いて試験することができる。
【００２９】
Ｌ鎖（Ｌ）がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の変更していないＡＦＲＡ配列であるかまたは前記のようなそれらの誘導体であるかに関係なく、本発明による抗体またはフラグメントは、好ましくはさらに抗体Ｈ鎖の少なくとも一部、たとえば少なくとも可変部（ＶＨ）を含み、一般にＣＨ１と表示される第１定常部を含むかまたは含まない。本発明のＬ鎖と会合していてもよいＨ鎖の他の部分は、可変部（ＶＨ）、第１定常部（ＣＨ１）、およびヒンジ部の全部または一部を含む、Ｈ鎖フラグメントである。あるいは、Ｈ鎖は無傷であって、順にＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ部、ＣＨ２、ＣＨ３、および場合によりＣＨ４を含むこともできる。Ｈ鎖とＬ鎖の間の会合は、普通はＬ鎖のカルボキシ末端にあるシステインが関与するジスルフィド結合による共有結合である。
【００３０】
本発明に関して、ＡＦＲＡ  Ｌ鎖と会合していてもよい種々のＨ鎖セグメントは、無傷の免疫グロブリンＨ鎖（Ｈ）が通常はアミノ酸約４４０個の長さであることを留意して、下記のように定められる：可変ドメイン（ＶＨ）はＨ鎖のアミノ末端範囲である（通常は約１１０個のアミノ酸）。Ｈ鎖の残りの部分は、そのクラス内で高い（少なくとも３０％）配列相同性をもつアミノ酸約１１０個の反復配列を３または４つ（Ｈ鎖のクラスによる）含む。これらの領域はＨ鎖の定常部であり、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４と表示される。Ｈ鎖はＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に位置するヒンジ部をも含み、これは分子に柔軟性および鎖間ジスルフィド結合形成能を付与する。ヒンジ部は、各抗体分子の２つの抗原結合領域が抗原を結合するために独立して動くのを可能にする。
【００３１】
Ｈ鎖の可変部は、この場合も”相補性決定領域”（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変部を含み、これらはＨ１、Ｈ２およびＨ３、あるいはＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と表示される。Ｈ鎖のＣＤＲはアミノ酸約３〜２５個の長さをもち、抗体特異性において重要な役割を果たす。
【００３２】
自然界には５つの異なるＨ鎖、アルファ（α）、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）およびミュー（μ）が存在し、これらは互いにアミノ酸配列が異なる。ある抗体のイソ型（すなわち、それがＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭのいずれのクラスに属するか）は、その抗体のＨ鎖により決定される：アルファＨ鎖はＩｇＡイソ型を決定し、ガンマＨ鎖はＩｇＧイソ型を決定する、など。ＩｇＧクラス内には、ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４と表示される４つのサブクラスがある。本発明によれば、ＡＦＲＡ抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体のＨ鎖はこれらのイソ型のいずれであってもよいが、ＩｇＧイソ型、たとえばＩｇＧ１が特に好ましい。
【００３３】
ＡＦＲＡ  Ｌ鎖と共に存在するＨ鎖の具体的なサブ領域に応じて、さらに会合しているサブユニットの個数に応じて、本発明の抗体および抗体フラグメントは無傷の抗体の形態をとることができ、あるいはその抗原結合フラグメント、たとえばＦａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２などであってもよい。
【００３４】
本発明の特に好ましい態様によれば、ＡＦＲＡ抗体もしくはＡＦＲＡ由来抗体またはフラグメントは、下記のものを含むかまたはそれらからなるＦａｂフラグメントである：
ｉ）ＡＦＲＡ  Ｌ鎖（可変部（ＶＬ）と定常部（ＣＬ）の両方）：図１もしくは７に示すもの（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）または前記に定めたその誘導体、ならびに
ｉｉ）Ｈ鎖の可変部（ＶＨ）および第１定常部（ＣＨ１）。
【００３５】
好ましくは、Ｌ鎖とＨ鎖はＬ鎖のカルボキシ末端システインが関与するジスルフィド結合により互いに共有結合している。本発明のＦａｂフラグメントは、一般に約５５ｋＤａのサイズをもつ。
【００３６】
本発明のこの態様の特に好ましい例は、Ｈ鎖の可変部（ＶＨ）が図８のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をもつＦａｂフラグメントである。あるいは、Ｈ鎖の可変部（ＶＨ）は、図示した配列のＣＤＲ領域のうち少なくとも１つ、好ましくは２または３つを、図８に示したものと異なる枠組み配列内に含むアミノ酸配列をもつことができる。図８のＣＤＲ領域は下記のものである：
ＣＤＲ１：  ＤＹＡＭＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
ＣＤＲ２：  ＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）
ＣＤＲ３：  ＥＲＹＤＦＷＳＧＭＤＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）
本発明のこの態様の他の特に好ましい例は、Ｈ鎖（ＣＨ１）領域の定常部がガンマＨ鎖の、特にガンマ１  Ｈ鎖のＣＨ１領域であるＦａｂフラグメントである。代表的なＣＨ１  Ｈ鎖の例を図９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）に示す。
【００３７】
したがって、本発明の好ましいＦａｂフラグメントは下記の配列要素を含むか、またはそれらからなる：
ｉ）ＳＥＱ  ｎ°１のアミノ酸配列をもつＬ鎖
ｉｉ）可変部が図８に示すアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をもつＨ鎖であって、その第１定常部（ＣＨ１）が図９に示すアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）をもつもの。
【００３８】
本発明の他の観点によれば、抗体フラグメントはＦａｂ’フラグメントであってもよい。本発明に関して、Ｆａｂ’フラグメントは、ＦａｂフラグメントのＨ鎖がさらにそれのカルボキシ末端に第２抗体フラグメントへの共有結合に適した天然ヒンジ部を含むものである。ヒンジ部は、共有結合の形成に適した１個以上のアミノ酸残基または化学基、たとえば遊離システインを含み、これによりＦａｂ’フラグメントの二量体化が可能になる。ヒンジ部は抗体の天然ヒンジ部、たとえば自然界でアルファ（α）、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）およびミュー（μ）Ｈ鎖のいずれかに存在するヒンジ部の少なくとも一部であってもよい。特に好ましいものは、ガンマサブクラス、特にガンマ１の天然配列に相当するヒンジ部またはその一部、たとえばペンタペプチドＤＫＴＳＣ、またはヘキサペプチドＤＫＴＨＴＣである。Ｆａｂ’フラグメントの作成に用いるヒンジ部の一部は、一般に少なくとも１つの遊離システイン残基をたとえばカルボキシ末端に含むが、２または３つの遊離システイン残基を含むように工学処理されてもよい。
【００３９】
あるいは、たとえばインビボ環境での加水分解に対する抵抗性を付与する化学リンカーなどの非タンパク質部分により、Ｆａｂ’フラグメントを人工的に二量体化してもよい。そのような人工リンカーの一例はビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）であるが、他の幾つかのリンカーが文献に報告されている（１６），（１７）。
【００４０】
Ｆａｂ’フラグメントを使用する利点は、それらを二量体化して２つの抗原結合ドメインをもつＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成しうることである。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは二価であり、Ｆａｂ単量体と対比して結合のアビディティーが高くなる。二量体を構成する２つのＦａｂ’フラグメントは、Ｆａｂ’Ｈ鎖の２つのヒンジ部それぞれの間で結合することにより互いに結合している。Ｆａｂ’単量体は、Ｈ鎖のＣ末端にある遊離システインの自然酸化により二量体化することができる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは一般に約１００〜１１０ｋＤａのサイズをもつ。
【００４１】
非タンパク質人工リンカーにより二量体化する場合、Ｆ（ａｂ’）２二量体を構成する２つのＦａｂ’単量体は、この化学リンカーにより互いに共有結合する。たとえばビスマレイミドエタン（ＢＭＯＥ）は非加水分解性のマレイミド結合を生成し、したがって二量体にインビボ環境での安定性を付与する。
【００４２】
本発明のこの観点によれば、Ｆ（ａｂ’）２二量体の２つの抗原結合ドメインは同一の特異性をもつことができ、両方とも葉酸受容体アルファの特定のエピトープに特異的に結合する。あるいは、Ｆ（ａｂ’）２二量体は二重特異性であって、抗原結合ドメインのうち一方は葉酸受容体アルファの第１エピトープに特異的であり、他方は葉酸受容体アルファの第２エピトープに特異的であってもよい。他の可能性は、第２抗原結合ドメインが葉酸受容体アルファとは全く異なる抗原、たとえば第２の癌抗原に、またはエフェクター細胞のナチュラルキラーマーカーに結合することである。
【００４３】
本発明の抗体およびフラグメントは、好ましくは完全ヒト型である。本発明のＡＦＲＡ  Ｌ鎖はヒト由来である。したがって、このＬ鎖をヒト由来のＨ鎖と組み合わせることが有利である。あるいは、ＡＦＲＡ  Ｌ鎖をまずヒト以外、たとえばネズミに由来するＨ鎖と組み合わせ、次いで抗体工学的手法を用いてＨ鎖をヒト化することができる。
【００４４】
本発明の抗体およびフラグメントは、ヒト葉酸受容体アルファに対する高い結合アフィニティーおよびアビディティーを特徴とする。結合アフィニティーは、抗体またはそのフラグメント上にある１つの抗原結合部位とそれに特異的なエピトープとの間の相互作用の強さである。アフィニティーが高いほど、抗原と抗体またはフラグメントの間の会合はより緊密になり、抗原が結合部位にとどまる可能性はより大きくなる。用語”アビディティー”は、抗体またはフラグメント間の相互作用の全体的な強さを記述するために用いられ、相互作用のアフィニティーおよび給合価の両方に依存する。個々の抗体分子がより多数の結合部位をもつほど、抗原に対する抗体のアビディティーはより高くなる。
【００４５】
アフィニティーはアフィニティー定数ＫＡで表わすことができ、これは抗体と抗原の会合速度定数（ｋａｓｓ）と解離速度定数（ｋｄｉｓｓ）の比である。ＫＡはＭ−１で測定され；アフィニティーが高いほどＫＡはより高い。あるいは、アフィニティーは解離定数ＫＤで表わすことができ、ここでＫＤ＝１／ＫＡである。ＫＤの単位はＭであり、アフィニティーが高いほどＫＤはより低い。本発明に関して、アフィニティーは普通はＫＤで表わされる。大部分のアフィニティー測定方法は抗体またはフラグメントの結合部位の数を考慮に入れるので、ＫＡおよびＫＤアフィニティー値は実際には一価の抗体またはフラグメントに関するアフィニティーを反映し、アビディティーは多価の抗体またはフラグメントに関するものであるとみなすことができる。
【００４６】
本発明のＡＦＲＡ抗体およびフラグメントは、好ましくは葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に１００ｎＭ〜１ｐＭのアフィニティー（ＫＤ）で結合する。より好ましくは、それらは７５ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、より好ましくは３０ｎＭ未満、最も好ましくは５ｎＭ未満のアフテニティー（ＫＤ）をもつ。たとえば本発明の一価フラグメント、たとえばＦａｂフラグメントは、一般に５０ｎＭ未満のＫＤを示す。このアフィニティーは、既知の単量体Ｃ４  Ｆａｂフラグメントよりかなりの改善である。本発明の二価フラグメント、たとえばＦ（ａｂ’）２またはジＦａｂマレイミド（ＤＦＭ）は、一般に３０ｎＭ未満、たとえば５ｎＭ未満のＫＤを示す。これらの数値は、可溶性受容体または細胞表面発現受容体のいずれかを抗原として用いて得ることができる。
【００４７】
本発明によれば、結合アフィニティーは多数の一般的方法、たとえば平衡透析により、データのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を用いて測定できる。これによれば：
ｒ／ｃ＝Ｋ（ｎ−ｒ）
であり、ここで：
・ｒ＝平衡状態における結合したリガンドのモル数／抗体のモル数；
・ｃ＝平衡状態における遊離リガンド濃度；
・Ｋ＝平衡会合定数；および
・ｎ＝抗体分子当たりの抗原結合部位の数（結合価）。
【００４８】
ＥＬＩＳＡ競合結合アッセイもＫＡの測定のために使用でき、この場合もＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を使用する。あるいは、相対ＫＤをＥＬＩＳＡプラトー信号の半分が得られる濃度として判定することもできる。
【００４９】
結合アフィニティーを測定するために使用できる他の方法は、たとえばＢｉａｃｏｒｅ法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。この方法を用いると、アフィニティー定数のほか結合速度も測定できる。この方法によれば、ＫＤ＝ｋｄｉｓｓ／ｋａｓｓである；ここでｋｄｉｓｓは解離速度定数（ｋｏｆｆとも表示される）であり、ｋａｓｓは会合速度定数（ｋｏｎとも表示される）である。
【００５０】
本発明によれば、アフィニティー分析に用いる抗原は、全細胞（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ）、特にヒト細胞、たとえばヒト卵巣癌細胞、たとえばＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ）、ＩＧＲＯＶＩ(Dr J. Bｅnardにより寄贈, Institut Gustave Roussy, Villejuif, フランス)、またはヒト葉酸受容体アルファでトランスフェクションした細胞、たとえばＡ４３１−Ｆｒ細胞（１８）の表面に発現する葉酸受容体アルファであってもよい。あるいは、抗原は可溶性受容体の形態、たとえば図１０に示す組換えＦＲαであってもよい。可溶性受容体の使用は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析に特に有利であり、ヒトにおけるインビボ結合を推定するのに使用できる。
【００５１】
本発明のＡＦＲＡ抗体およびフラグメントは、多くの療法、診断およびイメージング用途に使用できる。したがって本発明は、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）の過剰発現が関与する障害を処置するための、本発明によるＡＦＲＡ抗体またはフラグメントに関する。特に、本発明のＡＦＲＡ抗体およびフラグメントは、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）の過剰発現が関与する障害、たとえば癌の処置のための医薬の製造に使用できる。したがって本発明の１観点は、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）の過剰発現が関与する障害を処置するための方法であって、その処置を必要とする対象に有効量の本発明によるＡＦＲＡ抗体またはフラグメントを投与することを含む方法に関する。
【００５２】
多くの療法、診断およびイメージング用途のために、抗体またはフラグメントをエフェクター部分、たとえば細胞毒性物質またはマーカーにコンジュゲーションさせる。これは、癌、たとえば婦人科癌などの障害の処置の場合に行なわれる。
【００５３】
ＡＦＲＡ抗体およびフラグメントの特に好ましい療法用途は、ヒトにおける卵巣癌の放射免疫療法における用途である。そのような用途のために、抗体およびフラグメントを細胞毒性放射性核種、たとえば１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１８８Ｒｅにコンジュゲーションさせる。最も好ましい放射性核種は１３１Ｉである。さらに、他の放射性核種、たとえば９９Ｔｃは、たとえば診断またはイメージングのセッティングに使用できる。
【００５４】
ＡＦＲＡ抗体およびフラグメントは、葉酸受容体アルファに対するそれらのＫＤ値が低く、既知のＣ４  Ｆａｂより著しく改善されているため、放射免疫療法に特に好適である。Ｃ４のアフィニティーと対比してＡＦＲＡ抗体およびフラグメントのアフィニティーがより高いことは、放射免疫療法にとって実質的な利点である；これは、腫瘍への局在化および抗体用量に直接影響を及ぼすからである。この場合、ＡＦＲＡ抗体およびフラグメントのアフィニティーがより高いことは、腫瘍結合抗体の量を直接反映する。すなわち、ＡＦＲＡ抗体およびフラグメントはＣ４よりはるかに低いＫＤ値をもつので、ＡＦＲＡ分子は同じ希釈度においてＣ４の場合より高い濃度で腫瘍組織に到達するであろう。これによりバックグラウンドが低下し、主に抗体の非特異的結合によるものである処置副作用も結果的に低減する。放射免疫療法の効果は腫瘍における特異的な放射能蓄積に基づいており、ＡＦＲＡ抗体およびフラグメントを用いて得られる腫瘍／健常組織比がより高いことは、療法効果の改善を明瞭に示すものとなる。
【００５５】
本発明の抗体またはフラグメントへの放射性核種のコンジュゲーションは、いずれかの一般的方法を用いて、たとえば抗体と放射性同位体の間にリンカーを用いて行なうことができる。好ましくは、放射免疫コンジュゲートは放射性核種に応じて約０．５〜約１５ｍＣｉ／ｍｇの比放射能をもち、静脈内その他の経路で投与できる。目的とする処置の期間および有効性に応じて、本発明の放射性核種−抗体コンジュゲートを１回または数回、他の療法薬または放射線増感剤と組み合わせて投与することができる。放射免疫コンジュゲートの適用量は、その癌の厳密な性質に依存する。投与当たりの放射能量は有効であるのに十分なほど高くなければならないが、線量限界毒性（ＤＬＴ）より低くなければならない。１回投与が好ましい；多数回投与も可能である。一般に、投与当たりの放射能量は、２０〜８０ｍＣｉ／ｍ２体表面積（ＢＳＡ）であろう。
【００５６】
本発明の好ましい態様によれば、放射免疫療法に用いるＡＦＲＡ抗体フラグメントは二量体フラグメント、たとえばＦ（ａｂ’）２または化学的Ｆａｂ二量体、たとえばＦ（ａｂ’）２−ＤＦＭである。放射免疫療法用の代表的なＡＦＲＡ  Ｆａｂ二量体は、ＡＦＲＡ  Ｌ鎖をＩｇＧ  Ｈ鎖と共に含み、これはたとえば図８に示す可変部、または図８の配列のＣＤＲ類を異なる枠組み配列中に含む可変部をもつ。
【００５７】
本発明の抗体およびフラグメントを単一の療法薬として、障害、たとえば癌、特に卵巣癌の処置に使用できる。あるいは、それらを他の療法薬と共に、複数の薬物および／または処置方法を伴う併用療法に使用できる。たとえば本発明の抗体またはフラグメントを化学療法、放射線療法、ホルモン療法または生物学的療法と併用できる。
【００５８】
したがって本発明のこの態様は、療法に同時、個別または逐次使用するための組合わせ製剤としての、本発明による抗体またはフラグメントおよび少なくとも１種類の他の療法薬を含有する製剤に関する。他の療法薬は、一般に化学療法薬および放射線療法薬よりなる群から選択される。併用療法のためのそのような製剤は、ヒトの癌、たとえば卵巣癌の処置に特に適切である。
【００５９】
そのような併用療法に関しては、本発明の抗体またはフラグメントを一次処置として、適切な二次処置と共に使用でき、二次処置はＡＦＲＡ抗体またはフラグメントと同時に、またはそれに続いて施すことができる。あるいは、本発明の抗体またはフラグメントを二次処置として、化学療法などの一次処置を補助するために使用してもよい。したがって本発明のこの観点には、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）の過剰発現が関与する障害を処置するための方法であって、その処置を必要とする対象に有効量の第１療法薬および有効量の第２療法薬を投与することを含む方法が含まれ、その際、第１および第２療法薬は対象に同時、逐次または個別に投与され、第１または第２療法薬は本発明によるＡＦＲＡ抗体またはフラグメントを含む。
【００６０】
したがって本発明の抗体またはフラグメントは、ヒトの癌、特に卵巣癌の処置のために他の療法薬、たとえば化学療法薬との補助療法または合併療法を実施するために使用できる。
【００６１】
本発明の他の観点によれば、ＡＦＲＡ抗体またはフラグメントは他の抗体またはフラグメントと共に、カクテルまたは混合物の形で存在してもよい。これらの他の抗体またはフラグメントは、葉酸受容体アルファに特異的な他のＡＦＲＡ抗体またはフラグメントであってもよく、あるいは異なる抗原に対する特異性をもつ抗体またはフラグメントであってもよい。本発明のカクテルまたは混合物は、異なるＡＦＲＡ抗体フォーマットを含むＡＦＲＡ抗体またはフラグメントの混合物、たとえば図１もしくは図７に示すＡＦＲＡアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をもつ少なくとも１つのＬ鎖またはこのＬ鎖の機能均等物を含む単量体および二量体ＡＦＲＡフラグメント（１以上）の混合物をも含有することができる。
【００６２】
したがって本発明にはＡＦＲＡ抗体またはフラグメントの混合物が含まれ、この混合物には下記のものを含むかまたはそれらからなる抗体フラグメントの不均一組成物が含まれる：
ｉ）ヒト葉酸アルファ受容体に特異的に結合する二価抗体フラグメント；この二価フラグメントは、図１もしくは図７に示すＡＦＲＡアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をもつＬ鎖またはこのＬ鎖の機能均等物をそれぞれが含む２つの共有結合したＦａｂ’フラグメントを含む、および
ｉｉ）図１もしくは図７に示すＡＦＲＡアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をもつ少なくとも１つのＬ鎖またはこのＬ鎖の機能均等物を含む、他の抗体フラグメント；
二価抗体フラグメント（ｉ）は、組成物の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、最も好ましくは少なくとも７０％を構成する。好ましくは、フラグメント（ｉｉ）は、組成物の２０％未満、最も好ましくは１０％未満を占める。
【００６３】
二価の種は、Ｆａｂ’フラグメントのヒンジ部間のジスルフィド結合により結合した天然二量体であってもよく、あるいは化学的二量体、たとえばＤＦＭ−ＡＦＲＡであってもよい。
【００６４】
たとえば、自然二量体化の条件では、精製後に約８０％のＡＦＲＡ二量体化生成物がＦ（ａｂ’）２であることが認められる。本発明のＡＦＲＡフラグメントが形成する抗原結合性二量体の割合が高いことは、既知のＣ４  Ｆａｂと比較したさらに他の利点となる。本発明者らは、二量体化に際して偽二量体が形成されることを観察した。この偽二量体は、２つのＬ鎖が１つのＨ鎖に共有結合し、第２のＨ鎖が疎水性相互作用によりこの構造体内に保持されたものからなる。この偽二量体はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２つの種、すなわち７５ｋＤａをもつもの（Ｌ２Ｈ）および２５ｋＤａをもつ他のもの（Ｈ鎖）に分離できるので、簡略化のためにＬ２Ｈと呼ばれた。Ｃ４  Ｆａｂ’の’自然’二量体化に際しては、適正な二量体Ｌ２Ｈ２は反応生成物の約３０％であるにすぎないのに対し、残り７０％の物質はＬ２Ｈ二量体に相当する。Ｃ４二量体をそれの代替物からクロマトグラフィーにより精製するのは不可能であり、偽二量体の割合が適正な二量体の割合よりはるかに高いので、Ｃ４分子を放射免疫療法用として開発することは実現不可能である。
【００６５】
化学的二量体化により得られる二量体について、ＡＦＲＡフラグメントは少なくとも５０％のＦ（ａｂ’）２を含む二量体化生成物混合物を生成する。組成物の２０％未満、最も好ましくは１０％未満を占めるＬ２Ｈ種は存在してもよく、これら２形態をクロマトグラフィー法で分離できない場合でも、不均一組成物は精製された形で存在する。Ｌ２Ｈ種が存在するにもかかわらず、この不均一なＡＦＲＡ−ＤＦＭ混合物は、ヒト葉酸アルファ受容体に対して、たとえば５０ｎＭ未満、好ましくは３０ｎＭ未満、最も好ましくは５ｎＭ未満のＫＤで高い結合アフィニティーをもつことが示された。
【００６６】
”自然”二量体形成に際してＣ４  Ｌ鎖が反応する強い傾向は、化学的二量体合成（ＤＦＭ）に際してはさらに顕著であり、幾つかのｐＨおよび温度条件を試験してもいかなる二量体組立てもほとんど阻止される。Ｃ４の化学的二量体化反応により得られる収率は５％未満であり、そのうちわずか約３０％が適正な二量体である。したがって、反応終了時に得られる二量体の総％はＡＦＲＡの場合より１０倍低い。Ｃ４  Ｆａｂのこの特有の特性は、単量体として使用できない低いアフィニティーと共に、放射免疫療法のためのＣ４抗体フラグメントの開発を妨げている。
【００６７】
本発明の他の観点は、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントのＬ鎖をコードする配列を含む核酸分子に関するものであり、その際、そのＬ鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列またはその機能均等物を含む。核酸はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれであってもよく、二本鎖または一本鎖のいずれであってもよい。
【００６８】
本発明は、上記の核酸配列を含む発現ベクターに関するものでもあり、その際、その核酸コード配列は作動可能な状態で転写調節シグナルに結合しており、これによりＡＦＲＡ  Ｌ鎖を適切な宿主細胞において発現させることができる。この核酸はさらに、抗体Ｈ鎖またはそのフラグメントをコードする配列を例えばビシストロン配置（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）で含むことができ、これにより宿主細胞におけるＬ鎖とＨ鎖の自然会合が促進される。
【００６９】
本発明は、ＡＦＲＡ  Ｌ鎖をコードする核酸を含む宿主細胞、たとえば本発明の発現ベクターで形質転換した宿主細胞にも及ぶ。宿主細胞は原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。原核宿主細胞の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が特に好ましい。適切な真核細胞の例には、ヒト、霊長類、ネズミまたは酵母の細胞が含まれる。
【００７０】
特に好ましい細胞は、ブダペスト条約の条項のもとに、ＣＮＣＭに２００６年３月１５日に寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３５８６で寄託された大腸菌株である。この微生物(大腸菌株ＢＷ２５１１３△ＰｙｒＣ：：ｋａｎ（ｌａｃＩｑ，ｒｒｎＢＴ１４，△ｌａｃＺＷＪＩ６，ｈｓｄＲ５１４，△ａｒａＢＡ−ＤＡＨ３３，△ｒｈａＢＡＤＬＤ７８））は、プラスミドＤｏＢ０１３４を含み、本発明のＡＦＲＡ  Ｆａｂを産生する。この寄託菌株から得ることができるＡＦＲＡ  Ｆａｂフラグメントも本発明の範囲に含まれる。
【００７１】
本発明はまた、葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである高アフィニティーのヒト抗体またはそのフラグメントを調製するための、下記の工程を含む方法に関する：
−前記の発現ベクターを適切な宿主にトランスフェクションし；
−発現したＡＦＲＡ抗体またはそのフラグメントを回収し；
−回収した抗体またはそのフラグメントを場合により変異形成及び／または二量体化する。
【００７２】
こうして発現した抗体またはフラグメントの変異形成を行なってヒンジ部またはシステイン残基を付加することができ、あるいは変異形成を利用して抗体／フラグメントのアフィニティーおよび特異性を微調整または改変することができる。
【００７３】
１態様においては、前記の発現ベクターを、細胞において、抗体Ｈ鎖またはそのフラグメントをコードする核酸配列を含みその核酸が作動可能な状態で転写調節シグナルに結合している第２発現ベクターと共発現させる。
【００７４】
本発明の抗体を作成するための別法は、下記の工程を含む：
−ヒトＶＨＣＨレパトアの構築；ヒトのレパトアは、卵巣癌患者であったけれども好ましくはレパトア構築時点ではその疾患を伴わない者、または健常なドナーに由来する、骨髄、リンパ節、脾臓または末梢血から得たヒトＢ細胞から構築することが好ましい。レパトアは合成により作成することもできる；
−葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する能力をもつヒト抗体Ｈ鎖の選択；この選択はガイド付き選択により実施され、ヒトＶＨＣＨレパトア上のガイド鋳型としてＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列のＬ鎖を含む抗体フラグメントを用い、続いてαＦＲまたは可溶性αＦＲタンパク質を過剰発現しているヒト細胞を選択する；
−選択したヒト抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列をもつＬ鎖をコードする遺伝子と共に、適切な宿主細胞において、これらのＬ鎖およびＨ鎖の組み立てが可能な条件で発現させる。
１態様において、選択したヒト抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列をもつＬ鎖をコードする遺伝子は、選択したヒト抗体Ｈ鎖およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列をコードする核酸配列が転写調節シグナルに作動可能な状態で結合したものを含む発現ベクターにより、細胞において発現される。
【００７５】
別法では、選択したヒト抗体Ｈ鎖をコードする核酸配列が転写調節シグナルに作動可能な状態で結合したものを含む第１発現ベクターにより、選択したヒト抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を細胞において発現させ、そしてＡＦＲＡ  Ｌ鎖をコードする核酸配列が転写調節シグナルに作動可能な状態で結合したものを含む第２発現ベクターにより、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列をもつＬ鎖をコードする遺伝子を細胞において発現させる。
【００７６】
この方法により、ＡＦＲＡ  Ｌ鎖と結合した際に葉酸受容体アルファに特異的な結合ドメインを形成する種々のＨ鎖の選択が可能になる。このタイプの方法の具体的な詳細を後記の実施例に示す。
【００７７】
本発明の他の観点は、本発明の抗体またはフラグメントを医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む医薬組成物に関する。そのような組成物においては、抗体またはそのフラグメントを、一般に抗体に結合させて用いるエフェクター部分、たとえば１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１８８Ｒｅ、または毒素もしくは化学療法薬もしくはプロドラッグもしくは酵素にコンジュゲートさせることができる。９９Ｔｃは診断用に使用できる。
【００７８】
本発明は、卵巣癌またはその転移の診断またはイメージングのための方法であって、たとえば対象の組織またはその試料を本発明による抗体またはそのフラグメントと接触させることを含む方法を提供し、その抗体またはフラグメントは放射性核種などの適切な標識に結合している。この診断法またはイメージング法はインビボで実施でき、その際、組織への有意の抗体結合が検出されたことは、葉酸受容体アルファの過剰発現があることの指標であり、これは細胞の悪性トランスフォーメーションを示唆する。あるいは、この診断法またはイメージング法は体外で、たとえばインビトロで、対象から得た生物試料、たとえば組織試料について実施できる。後者の場合、そのような組織のトランスフォーメーションしていない正常な細胞において頂端側に発現している葉酸受容体アルファの検出を考慮するために、本発明の抗体またはフラグメントの結合レベルを正常組織試料について観察された結合レベルと比較することを推奨する。
【００７９】
本発明の多様な観点を図面で説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】Ｃ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）とＡＦＲＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のＬ鎖アミノ酸配列のアラインメント。ＡＦＲＡ  Ｌ鎖は２１８個のアミノ酸を含み、そのうち最初の１１３個のアミノ酸はカッパ可変部を構成し、残りの１０５個のアミノ酸はカッパ定常部である。Ｃ４抗体とＡＦＲＡ抗体の主な相異はＣＤＲにある。
【図２】ＡＦＲＡ  Ｆａｂを大腸菌において発現させるのに適したビシストロン発現ベクターＤｏＢ０１３４の模式図。図１に示すＡＦＲＡ  Ｌ鎖（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＡＦＲＡ  Ｈ鎖（Ｑ１Ｎ変異を含む）をコードする核酸配列を含むこのベクターを大腸菌に導入したものは、ＣＮＣＭに２００６年３月１５日に寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３５８６で寄託された。ＢＷ２５１１３△ＰｙｒＣ：：Ｋａｎ（ｌａｃＩｑ，ｒｒｎＢＴ１４，△ｌａｃＺＷＪＩ６，ｈｓｄＲ５１４，△ａｒａＢＡ−ＤＡＨ３３，△ｒｈａＢＡＤＬＤ７８）。
【図３】（ＢＩＡｃｏｒｅ結合）：アルファ葉酸受容体における抗体フラグメント結合パラメーターの測定。このために、数種類の濃度（３〜２００ｎＭ）のＦａｂ単量体を、予め組換え受容体でコーティングしたセンサーチップセルに流し、結合を３０分間記録した。この期間の後、さらに２０分間、洗液をモニターした。ＡＦＲＡについては１．８５のＣｈｉ２でＫＤが４３．９ｎＭと判定された（パネルＡ）のに対し、Ｃ４については２．１９のＣｈｉ２でＫＤが１６８ｎＭと判定された（パネルＢ）。
【図４】（自然二量体化）：Ｆａｂ  ＡＦＲＡおよびＣ４を緩和に還元し、そして穏やかに酸化して、自然二量体を得た。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、結果を上側のパネルＡにＡＦＲＡについてそれの相対濃度測定分析と共に報告し、一方、パネルＢはＣ４に対応する。Ｌ２Ｈ種の生成をＣパネル画像に報告する。
【図５】（免疫組織化学）：抗ＣＡ１２５モノクローナル抗体を内部陽性対照として卵巣癌に対応するヒト生検試料において調べた（Ａパネル）。同じ方法で、ＡＦＲＡ−ＤＦＭ（０．５μｇ／ｍｌ）を同一組織において評価した（Ｂパネル）。両抗体ともＦＩＴＣ処理し、バックグラウンドをＣスライドで推定した。
【図６】（ＡＦＲＡ−ＤＦＭ−１３１Ｉの生体内分布）：１３１Ｉで放射性標識したジ−Ｆａｂ−マレイミドを腫瘍保有マウスに静脈内注射した。動物を注射後１、３、６、１５、２４および４８時間目に屠殺した。腫瘍、血液および予め定めた臓器を摘出、秤量および計数して、ＡＦＲＡ−ＤＦＭの濃度を判定した。生体内分布の結果をこの図にグラム当たりの注射量（ＩＤ）に対するパーセントとして報告する。
【図７】ＡＦＲＡカッパＬ鎖アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）：下記を示す：  −アミノ酸１〜１１３にわたる可変部（Ｖκ）；  −結晶構造から確認した超可変部：ＣＤＲ１（アミノ酸２４〜３８）、ＣＤＲ２（アミノ酸５４〜６０）およびＣＤＲ３（アミノ酸９３〜１０２）（太字、下線）；  −アミノ酸１１４〜２１９にわたるカッパ定常部（Ｃκ）（二重下線）。
【図８】ＡＦＲＡ  Ｈ鎖（可変部）アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）：  −アミノ酸１〜１２０にわたる可変部（Ｖκ）；  −超可変部：ＣＤＲ１（アミノ酸３１〜３５）、ＣＤＲ２（アミノ酸５０〜６６）およびＣＤＲ３（アミノ酸９９〜１１０）（太字、下線）。
【図９】ＡＦＲＡ  Ｈ鎖（定常部：ＩｇＧ１  ＣＨ１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）。
【図１０】（アルファ葉酸受容体）：  Ａ：葉酸受容体アルファのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）：  −シグナル配列：アミノ酸１〜２４  −成熟受容体配列：アミノ酸２５〜２３４  −プロペプチド配列：アミノ酸２３５〜２３７、成熟形においては除去される  −グリコシル化部位：アミノ酸６９、１６１および２０１  Ｂ：精製用Ｈｉｓ６タグ付きの組換え可溶性アルファ葉酸受容体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）。
【図１１】マウスに異種移植した腫瘍における、平均線量１ｍＣｉ／マウスの放射性標識ＡＦＲＡ−ＤＦＭのインビボ有効性。黒色棒：ヒト葉酸受容体アルファでトランスフェクションしたＡ４３１細胞（Ａ４３１ＦＲ）の腫瘍。斜線を施した棒：ヒト葉酸受容体アルファでトランスフェクションしていないＡ４３１細胞（Ａ４３１）の腫瘍。白い棒：対照。
【図１２】腹腔内投与後のインビボ局在化。腹腔内増殖したＩＧＲＯＶ１腫瘍細胞を保有するマウスに、１３１Ｉで放射性標識したＡＦＲＡ−ＤＦＭを腹腔内注射した（平均線量＝０．０７４ｍＣｉ／マウス）。動物を、注射後１、３、６、１５および２４時間目に屠殺した。腹水、腹腔内固形腫瘍塊、血液および予め定めた臓器を摘出、秤量および計数して、ＡＦＲＡ−ＤＦＭの濃度を判定した。生体内分布の結果をグラム当たりの注射量に対するパーセントとして報告する。
【図１３】マウスに異種移植した卵巣癌細胞における、放射性標識ＡＦＲＡ−ＤＦＭのインビボ有効性。Ａ：ヒト葉酸受容体アルファを自然に過剰発現するＩＧＲＯＶ１細胞を腹腔内注射し、＋２日目に１ｍＣｉ／マウスの１３１Ｉ−ＤＦＭ−ＡＦＲＡまたは生理食塩水（対照）で腹腔内処理したマウスの総生存率。Ｂ：ヒト葉酸受容体アルファを自然に過剰発現するＯＶＣＡＲ３細胞を腹腔内注射し、＋２日または＋４日目に１ｍＣｉ／マウスの１３１Ｉ−ＤＦＭ−ＡＦＲＡまたは生理食塩水（対照）で腹腔内処理したマウスの総生存率。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００８１】
１．アルファ葉酸受容体に特異的な高アフィニティーヒトＦａｂフラグメントの作成
結合アフィニティーの増大を含む改善された結合特性をもつヒトＦａｂフラグメントを得るために、Ｃ４  Ｆａｂフラグメントを有意に改変した。これらの改変を以下に記載する：
ａ）鎖シャフリング：アルファ葉酸受容体に特異的なカッパＬ鎖の選択
まずＣ４ラムダＬ鎖をカッパＬ鎖で置換することを決定した。このＦａｂ  Ｌ鎖置換は、Ｃ４フラグメントについて先に記載されたファージディスプレーガイド付き選択により実施された（１１）。
【００８２】
具体的には、抗体カッパＬ鎖（ＶκＣκ）ライブラリーをヒトＢ細胞から作成した。
このライブラリーは、以前に卵巣癌に罹患していたが採血時点では疾患を伴わない４人の女性から得た末梢血リンパ球からプールしたｍＲＮＡに由来していた。これらの女性は採血前の数年間、疾患を伴わない状態にあった。３人の女性は以前にＩＩＩまたはＩＶ期の疾患と診断された重篤な組織学的タイプの癌に罹患していた。４人目の患者は以前に、ＩＩＩ期と診断された子宮内膜様の組織学的タイプの卵巣癌を伴っていた。ライブラリー作成のために、各患者から２．０ｘ１０７〜５．０ｘ１０７のＰＢＭＣを採集した。プライマーアニーリング温度に従ったＰＣＲ比効率を補償するために、適切なプライマー対によりそれぞれの鎖ファミリーを個別に増幅させた。
【００８３】
患者は以前に葉酸受容体アルファ抗原の過剰発現に曝露されていたので、こうして得たユニークＶκＣκレパトアはナイーブレパトアではなかった。それは特定の腫瘍に対して、おそらくその疾患を伴う女性に発現したアルファ葉酸受容体に対して形成された抗体の遺伝子を含んでいた可能性がある。
【００８４】
こうして得たライブラリーを用いてＣ４  Ｈ鎖と適合する新規なＬ鎖を選択した。本発明者らはアルファ葉酸受容体に対してＣ４分子と同じ特異性を共有する抗体フラグメントを探求していたので、ガイド付き選択プロトコルを適用した。新規なカッパＬ鎖を選択するためのガイド鋳型としてＣ４  Ｈ鎖を用い、卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ−３細胞）について３回のパンニングを行なった後、幾つかのファージをランダムに採取し、それらがこれらの細胞に結合する能力を評価した。最良結合体を同定し、ＡＦＲＡ（Ａｎｔｉ  Ｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｌｐｈａ、抗−葉酸受容体アルファ）と命名し、それのＬ鎖配列を決定した。
【００８５】
選択したカッパＬ鎖アミノ酸配列を図１に報告する。ＡＦＲＡとＣ４フラグメントは、実施例１ｃに報告するように、ＡＦＲＡ  Ｈ鎖の第１アミノ酸にＱ１Ｎ変異が導入されていること以外は同一のＨ鎖をもつ。
【００８６】
ｂ）大腸菌におけるＦａｂの発現：
次いで、ＡＦＲＡ  ＦａｂフラグメントおよびＣ４  Ｆａｂフラグメントを大腸菌において発現させるのに適切な発現構築体を作成した：フラグメント合成を大腸菌周辺細胞質コンパートメントで行なわせるために、ＡＦＲＡまたはＣ４のＨ鎖およびＬ鎖をコードする遺伝子をリーダー配列（大腸菌の耐熱性エンテロトキシンＩＩ由来のＳｔＩＩリーダー配列）と読み枠を一致させてクローニングした。この発現ベクターは、Ｌ鎖とＨ鎖の両方をコードするビシストロン構築体を、アラビノースａｒａＰプロモーターの制御下に、ジヒドロオロターゼをコードするｐｙｒＣ選択マーカーと一緒に含むように、発酵用として特別に設計された（基本の発現カセットは下記に記載されている：欧州特許出願ＥＰ  ０５１０９２７４．０、Ｄｏｍｐｅ  Ｓ．ｐ．ａ．の名で２００５年１０月６日出願、本明細書に援用する；およびＷＯ  ２００７／０３９６３２）。ビシストロンベクターは、第２（Ｈ）鎖の発現と比較して第１（Ｌ）鎖をわずかに過剰に発現するように設計された。この場合、Ｈ鎖は単独で発現すると大腸菌に対して有毒となる可能性があるからである。
【００８７】
ＡＦＲＡを発現するベクターはＤｏＢ０１３４と表示され（図２を参照）、ＣＮＣＭに寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−３５８６で寄託された（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15、２００６年３月１５日、大腸菌株ＢＷ２５１１３内、△ＰｙｒＣ：：Ｋａｎ（ｌａｃＩｑ，ｒｒｎＢＴ１４，△ｌａｃＺＷＪＩ６，ｈｓｄＲ５１４，△ａｒａＢＡ−ＤＡＨ３３，△ｒｈａＢＡＤＬＤ７８））。この菌株は、ＡＦＲＡ  Ｌ鎖、実施例１ｃに記載するＮ末端修飾、および天然ヒンジ部を含むＨ鎖を発現する。
【００８８】
発現ベクターＤｏＢ０１３４を大腸菌内へ形質転換し、ＡＦＲＡ抗体フラグメントを発現させ、精製した。比較のために、既知のＣ４  Ｆａｂを発現する対応する構築体を用いて同様な実験を行なった。
【００８９】
Ｃ４の産生に際しては、著しいホモＬ鎖二量体（Ｌ２）蓄積が観察され、これは組換えタンパク質合成の５０％に達した。これは一部は、第２鎖の発現と比較してわずかに過剰の第１鎖を発現する発現ベクターの設計による可能性がある。しかし、この発現ベクターは幾つかの異なるＦａｂの産生に用いられており、これまで他の配列についてはホモ二量体Ｌ鎖の産生は観察されていない。このＬ２ホモ二量体は無用な微生物副産物であり、生産プロセスにおいてかなりの欠点となる。実際、それは宿主代謝に著しい負荷をかけ、有用なＦａｂ’から分離するのが困難であり、標的結合能をもたず、目的フラグメントの代わりに産生される。
【００９０】
これに対し本発明のＡＦＲＡ  Ｆａｂは、同じ発現ベクターおよび同じ大腸菌株から、検出可能なホモ二量体Ｌ鎖を産生しない。したがって全生産収率が人為的に高められ、樹脂結合に対する目的Ｆａｂ’フラグメントとホモＬ鎖二量体の間の競合がないのでクロマトグラフィーカラム容量が著しく縮小する。
【００９１】
ＡＦＲＡ  Ｆａｂの特異性をＦＡＣＳにより評価した。ヒトアルファ葉酸受容体を発現する細胞についてのみ蛍光シフトが記録された。
ｃ）Ｎ末端Ｑ１Ｎ変異ＡＦＲＡの修飾：
Ｃ４  Ｈ鎖をガイド鋳型として用いる最初のガイド付き選択プロトコルの結果、ＡＦＲＡフラグメントとＣ４フラグメントは最初は同一Ｈ鎖をもち、その第１アミノ酸はグルタミンであった。しかし、この位置のグルタミンはピログルタミン酸への変換を受ける可能性のあることが知られており（１９）、これは生成物の不均一性を生じる。したがってＮ末端グルタミンを部位特異的変異誘発によりアスパラギンで置換した。そのような置換によりアミノ酸側鎖長さが炭素１個分短かくなり、それの環化が阻止される。部位特異的変異誘発は、ＡＦＲＡ  Ｈ鎖の第１アミノ酸に対応するＤＮＡトリプレットコドンを改変して、それを目的とするアスパラギン残基に変更するように行なわれた。
【００９２】
ＰＣＲ増幅中にこの変異以外の他の予定外の変異が導入されていないことを証明するために、全遺伝子の配列を決定することにより部位特異的変異を確認した。対応するタンパク質を産生させ、均一になるまで精製した。その際、ｄｉ−Ｐｈｅｎｙｌカラム上での逆相ＨＰＬＣ分析により、いずれのｐＨにおいてもユニーク種に対応する単一ピークが示された。これは、エレクトロスプレー質量分析により確認され、その際、ＡＦＲＡ分子量はそれの一次構造から計算したものと一致した。
【００９３】
２．ヒト葉酸受容体アルファに対するＡＦＲＡ  Ｆａｂフラグメントの結合特性：
新規なＡＦＲＡヒトＦａｂフラグメントがヒト葉酸受容体アルファを結合する能力を評価し、それの結合をＣ４の結合と比較した。ＢＩＡｃｏｒｅ装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるプラズモン共鳴により、可溶性組換えヒトアルファ葉酸受容体を標的タンパク質として用いて反応速度分析を実施した（図８を参照）。
【００９４】
ａ）可溶性アルファイソ型葉酸受容体（αＦＲ）の精製
アルファイソ型葉酸受容体（αＦＲ）を発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞系を構築した。精製を容易にするために、可溶性αＦＲ遺伝子をｐＩＲＥＳｎｅｏ発現ベクターにサブクローニングして、Ｈｉｓタグ付きの可溶性アルファイソ型葉酸受容体糖タンパク質を発現させた。
【００９５】
可溶性タンパク質を生成させるために、適切なプライマー対を用いるＰＣＲ法により、アミノ酸位置２３４で終わる短縮形のαＦＲを工学的に作成して、細胞膜へのタンパク質の固着を仲介する受容体カルボキシ末端部分（ＧＰＩ−アンカー）を除去した。
【００９６】
ＰＣＲプライマーは、ｐＩＲＥＳ−ｎｅｏベクター多重クローニング制限部位と適合する制限部位をもつように設計された：半ＥｃｏＲＶをフォワードプライマー中に、ＥｃｏＲＩをリバースプライマー中に。ＰＣＲ生成物をＱｕｉａｅｘゲル抽出キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）により精製し、ＥｃｏＲＩで消化した。消化生成物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶで消化しかつ脱リン酸したｐＩＲＥＳ−ｎｅｏベクターに、Ｔ４ライゲーションシステム（Ｂｉｏｌａｂｓ）により一夜ライゲートさせた。ライゲートした試料を大腸菌ＤＨ５α内へ形質転換し、ＬＢ−寒天アンピシリンプレートに播種した。
【００９７】
幾つかのアンピシリン耐性コロニーを採取し、ＰＣＲ法により検査した。適正なパターンを示した１クローンをＤＮＡ抽出および発現試験のために選択した。発現ベクターのＤＮＡ配列を自動配列決定法により確認した。
【００９８】
次いでこの発現ベクターをＣＨＯ細胞内へトランスフェクションし、安定なクローンをネオマイシン耐性により選択した。それらのうち最良の生産を示すクローンを培養上清のウェスタンブロット分析により確認し、生産規模を１リットルに拡大した。１００００ｘｇで１５分間の遠心により培養上清を澄明にして上清を細胞から分離し、０．２２μｍで濾過し、４℃で精製を行なった；その際、すべての緩衝液はＴｗｅｅｎ−２０を０．０５％含有していた。
【００９９】
葉酸受容体タンパク質を上清から下記に従って精製した。第１工程では、Ｎｉ＋＋−Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を記載に従って用いる固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（immobilized metal affinity chromatography）（ＩＭＡＣ）により、Ｈｉｓ−タグ付き糖タンパク質を濃縮した。ＣＨＯ細胞培養上清を、予め２０ｍＭリン酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０で平衡化したこのカラムに５ｍｌ／分の流速で付与した。すべての上清をカラムに付与した後、これを溶出液のＡ２８０ｎｍがベースラインに戻るまで出発緩衝液で洗浄した。０．５Ｍのイミダゾールを含有する同じ緩衝液で上記タンパク質を溶離した。Ａ２８０ｎｍピークを次ぎの工程のために採集した。この時点で、１Ｍ  ＨＣｌの滴加によりｐＨを３．０に低下させ、氷浴内で１時間撹拌することによって、内因性葉酸分子をαＦＲから解離させた。次いで試料をＧ−２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０  脱塩、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で２０ｍＭリン酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０と緩衝液交換した。最後に、試料を低速で（０．５ｍｌ／分）、５カラム容積の２０ｍＭリン酸塩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０で平衡化した葉酸−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の２ｍｌカラムに通した。流出液を分析のために採集した。カラムを平衡化用緩衝液で洗浄した後、αＦＲをアフィニティー樹脂から０．１Ｍグリシン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ２．８で溶離した。
【０１００】
５０ｍＬの１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を入れたポリプロピレン試験管に画分を採集して、溶出液のｐＨを７．０に高めた。この調製物中のαＦＲの純度を、ＳＤＳ（１５％）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により非還元条件下でＬａｅｍｍｌｉ（１３）の方法に従って測定し、ゲルをクーマシーブリリアントブルーでタンパク質につき染色した。純度１００％と思われる画分をプールし、ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）により標準としてＢＳＡを用いてタンパク質濃度を測定した（１４）。精製したαＦＲを小分けして−２５℃に保存した。
【０１０１】
ｂ）アフィニティー測定
標的タンパク質をＣ５  ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップ上にコーティングし、数種類の濃度の両抗体フラグメントを用いて結合速度を測定した。具体的には、ＣＭ５センサーチップにアミン結合キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、組換えＦＲを１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８中において抗原濃度０．６μｇ／ｍｌで共有結合させ、２８０ＲＵの表面を得た。残存する活性基を３５μｌのエタノールアミン（１．０Ｍ  ｐＨ８．５）の注入によりブロックした。見掛け解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を、抗体２００〜３．１２５ｎＭ、緩衝液流速５０μｌ／分の飽和条件下で、ｗｉｚａｒｄプログラムを用いて計算した。少なくとも３０分間、評価を行なった。続いて、１００ｍＭグリシン緩衝液、ｐＨ２．７によりセンサーチップに結合した残存抗体の脱着を行なった。
【０１０２】
それぞれのアフィニティーを結合曲線から演繹した。Ｃ４およびＡＦＲＡの両方とも固定化抗原に結合することができた。しかし、ＡＦＲＡにつき計算したＫＤ（４３，９ｎＭ）はＣ４のもの（１６８ｎＭ）より３倍以上低く、これは、アフィニティーがより高いことを示す。結果を図３に報告する。ＡＦＲＡ単量体の結合速度は、会合速度がきわめて高いが、解離定数も高いことを示す；これは、放射免疫療法に用いる抗体にとって時には欠点となる可能性がある；効果的な腫瘍照射のためには、抗体がいったん腫瘍に結合するとそれの持続効果が必須だからである。
【０１０３】
３．自然二量体Ｆ（ａｂ’）２の調製およびＦ（ａｂ’）２のインビトロ結合特性：
ａ）自然二量体化
ＡＦＲＡ  Ｆａｂの解離速度を低下させるために、かつフラグメントのアビディティーをさらに高めるために、Ｆａｂフラグメントを二量体化することを決定した。このために、ガンマ１ヒトファミリーの天然ヒンジ配列に対応するペンタペプチドＤＫＴＳＣをＡＦＲＡおよびＣ４両方のＨ鎖のカルボキシ末端に付加して、Ｆａｂ’と表示されるフラグメント（すなわち、カルボキシ末端にヒンジ部に属する余分な遊離システインをもつＦａｂ）を形成した。次いでこのＦａｂ’フォーマットから、抗体Ｈ鎖のカルボキシ末端に意図的に付加した、天然全長抗体ヒンジ部の第１システインに対応するこの遊離システイン残基（２０）の自然酸化により、Ｆ（ａｂ’）２二量体を得ることができた。
【０１０４】
ＡＦＲＡおよびＣ４両フラグメントをＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）と共に緩和な条件下で保温して、カルボキシ末端Ｈ鎖システインを還元し、緩衝液を交換して還元剤を除去し、ｐＨを８に調整した；これは、ジスルフィド結合の形成に化学的に好ましいことが知られている。
【０１０５】
ゲル濾過クロマトグラフィーにより二量体を反応混合物から分離すると、それらは単一ピークとして分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、二量体調製物は予想したように均一ではなく、それらのピークはゲル上では数個のバンドを生じることが明らかになった：
−ＡＦＲＡフラグメントについて、材料の８０％を占める主バンドは予想どおり１００ｋＤａの範囲に移動し、ＡＦＲＡ二量体と特定された。全材料の１６％を占め、見掛け分子量７５ｋＤａをもつもうひとつのバンドを検出でき、これは普通の単量体が他のＦａｂ  Ｌ鎖に共有結合したものからなる”二量体”（Ｌ２Ｈ）と特定された。この”二量体”は、第１単量体からのカルボキシ末端システインが第２のＦａｂ単量体のＬ鎖のカルボキシ末端システインを異例に攻撃した結果、生成した。このＬ鎖システインは普通はＨ鎖とのジスルフィド結合に関与しているものであり、したがって他のいずれのジスルフィド結合形成にも利用される可能性はない。得られたこの二量体において、Ｆａｂ  Ｈ鎖はもはや分子の残部に共有結合しておらず、ファン−デル−ワールス力および疎水性相互作用によりＬ鎖と相互作用しているにすぎないので、この物質は自然条件で実施するゲル濾過精製に際しては普通の二量体として溶出するが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に際しては界面活性剤（ＳＤＳ）濃度が分子を分解するのに十分なものであれば、２つのバンドとして分離する（図４）。実際にこの列には、Ｌ２Ｈと共に、代替二量体からもぎ取られた共有結合していないＨ鎖に対応するもうひとつのバンドをゲル底部に検出でき、これは全材料の４％を占める；
−Ｃ４  Ｆａｂの場合、意外にも状況はさらに悪かった；この場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてＬ２Ｈ化合物、すなわちＡＦＲＡ反応の不純物に対応する主バンド（全材料の４３％）が今回はＣ４二量体化反応の最多量の生成物となったからである。共有結合した二量体は全材料の２９％を占めるにすぎず、ＳＤＳ分離したＨ鎖は混合物の２５％であった；
この分析をさらにＬＣ−質量分析により確認して、ゲル濾過精製後に得られた材料中に存在するすべての種を明瞭に同定することができた。
【０１０６】
自然の水性条件では、適正な二量体と、共有結合していないＨ鎖を含む”二量体”に対応する不純物とのクロマトグラフィー挙動には、これらの２種を分離するために利用できる差がない。本発明者らは、純粋な二量体を得るためにイオン交換または疎水性相互作用クロマトグラフィーにより両種の分離を試みたが成功しなかった。本発明者らは、選択的熱変性により不純物を二量体から除去することも試みたが成功しなかった。
【０１０７】
ｂ）ＥＬＩＳＡ：Ｆ（ａｂ’）２のアルファ葉酸受容体直接結合
次いで２種類のＦ（ａｂ’）２二量体を、ヒトアルファ葉酸受容体でトランスフェクションしたＡ４３１細胞系において、ならびにヒト卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ３およびＩＧＲＯＶＩにおいて、ＥＬＩＳＡ方式で結合を直接に試験した。
【０１０８】
細胞４ｘ１０４個（ヒト卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ）およびＩＧＲＯＶＩ（Dr J.Benardからの寄贈, Institut Gustave Roussy, Villejuif,フランス）、ならびに葉酸受容体アルファでトランスフェクションしたヒト類表皮癌細胞であるＡ４３１−ＦＲ（１７）細胞）を、９６ウェルフォーマットプレートの各ウェルに播種し、集密単層が得られるまで増殖させた。細胞を室温で５分間、ＰＢＳ中の０．１％グルタルアルデヒドで固定した。プレートをＰＢＳで２回、次いでＰＢＳ＋０．０２％  ＮａＮ３中の０．１Ｍグリシンで１回（５分間）、ＰＢＳで連続５回、最後に１％のＢＳＡおよび０．０２％のＮａＮ３を含有するＰＢＳで洗浄した。
【０１０９】
抗体フラグメント（Ｃ４またはＡＦＲＡ）の系列希釈液を室温でＰＢＳ＋０．０３％  ＢＳＡ中において１時間結合させ、ＰＢＳで３回洗浄した。
ＰＢＳ＋０．０３％  ＢＳＡ中に１：１０００希釈したペルオキシダーゼ結合−抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的，Ｓｉｇｍａ）を用いて、抗体フラグメント結合を解明した。１００μｌのＴＭＢ溶液（Ｓｉｇｍａ）を室温で３０分間添加することによりＥＬＩＳＡプレートを呈示させ、５０μｌのＨ２ＳＯ４溶液（１Ｍ）の添加により停止し、４５０ｎｍで読みとった。
【０１１０】
空のベクターでトランスフェクションしたＡ４３１  ｍｏｃｋ細胞にはＦＲ−アルファでトランスフェクションした細胞と比較して信号を検出できなかったので、ＡＦＲＡおよびＣ４抗体の両方ともアルファ葉酸受容体に特異的であると判定された。両フラグメントとも低いナノモル濃度範囲でほぼ同じ総アフィニティーを示し、効力は放射免疫療法用に適合していた（ただし、Ｃ４のＦ（ａｂ’）２は偽二量体Ｌ２Ｈで著しく汚染されていたので、実際の使用、特に放射免疫療法における実用には適さないことを留意されたい）。表Ｉに、Ｃ４およびＡＦＲＡ抗体フラグメントのＦ（ａｂ’）２のＫＤのＥＬＩＳＡ測定値を報告する。ＫＤは、ＥＬＩＳＡプラトー信号の半分が得られる濃度として判定された。
【０１１１】
【表１】
0005513114.tif 000002
【０１１２】
４．Ｆａｂ’の化学的二量体化およびインビボ結合特性：
腫瘍特異性および局在化を証明するために、インビボアッセイを実施した。ただしインビボでは、Ｆ（ａｂ’）２分子の２半分を互いに保持するジスルフィド橋が急速に加水分解されてＦ（ａｂ’）２は速やかにＦａｂフラグメントに再変換され、血流から排除される。したがって、インビボでＦ（ａｂ’）２フォーマットを保持するために、以下に記載する化学的二量体化を行なう。
【０１１３】
ａ）ビスマレイミド（ＢＭＯＥ）によるＦａｂ’フラグメントの二量体化
インビボでＦ（ａｂ’）２フォーマットを保存するために、２つのＦａｂ’を結合してＦ（ａｂ’）２を形成する非加水分解性リンカーを用いた（２１）。より具体的には、Ｆａｂ’フラグメントを二量体化してジＦａｂマレイミド（ＤＦＭ）にするためにビスマレイミドエタンリンカー（ＢＭＯＥ）を同定した（２２）。臨床開発のための最良の候補を同定するためにＡＦＲＡおよびＣ４  Ｆａｂの両フラグメントにこの処理を施し、インビボ生体内分布実験で検査した。
【０１１４】
Ｆａｂ’を化学的に二量体化してＤＦＭにすることは、既に文献に報告されている。この化学反応は、システイン残基がマレイミド複素環と特異的に反応するという独特の能力に基づく。この化学反応により、システイン残基とマレイミドの間に化学結合が形成される。本発明の場合、Ｆａｂ’タンパク質上の独自の遊離システインがＦａｂ’  Ｈ鎖のカルボキシ末端にあった。したがって、マレイミドの攻撃は部位特異的であり、葉酸受容体結合部位の反対側に対して行なわれた。
【０１１５】
タンパク質をＦａｂ’のモル当たり７０モルのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩）と共に室温で５時間保温して、Ｈ鎖カルボキシ末端システイン残基を還元した。ＭＥＳ  ４０ｍＭ  ｐＨ６．０中で予め平衡化したＨｉＰｒｅｐ脱塩クロマトグラフィー２６／１０（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃｓ）によりＴＣＥＰを除去した。タンパク質を８ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、室温で２．５時間、穏やかに撹拌して、Ｆａｂ鎖間に存在するジスルフィド結合を再酸化した。反応速度をＲＰ−ＨＰＬＣ分析によりモニターした。ＢＭＯＥリンカー（Ｓｉｇｍａ）をタンパク質溶液（１ｍｇ／ｍｌ，ＤＭＳＯ中）にモル比０．３５のリンカー／タンパク質で添加し、室温で１６時間、穏やかに撹拌しながら保温した。
【０１１６】
自然Ｆ（ａｂ’）２を除去するために、反応混合物をＦａｂ’のモル当たり７０モルのＴＣＥＰにより室温で３．５時間、再還元した。ＭＥＳ  ４０ｍＭ  ｐＨ６．０で予め平衡化したＨｉＰｒｅｐ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲカラムで二量体を精製した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、Ｂｒａｄｆｏｒｄにより定量した。
【０１１７】
この方法でＡＦＲＡ−ＤＦＭがほぼ同量のＬ２Ｈ不純物と共に得られた。しかし意外にも適正なＣ４−ＤＦＭを得ることは実際上不可能であった。ジスルフィド還元後に行なった”自然”二量体を除去するためのゲル濾過により、リンカーと反応してＤＦＭを形成するのはわずか４％のＣ４分子であると推定された。Ｃ４  Ｆａｂ’についてこのプロトコルを数回繰り返し、種々の条件を採用したが、本発明者らはこれより高い二量体濃度を得るのに決して成功しなかった。この反応を工程毎に質量分析により追跡して、この反応はＢＭＯＥ分子がＦａｂ’に付加した以後は進行しなかったことが示された。おそらく、ＡＦＲＡとＣ４のＦａｂフラグメント間の唯一の相異をなすＣ４のラムダＬ鎖のため、リンカーは予想外の様式で反応したのであろう。これに対し、ＡＦＲＡ部分については同一条件で常に二量体化が観察された（表ＩＩ）。
【０１１８】
【表２】
0005513114.tif 000003
【０１１９】
この表から、Ｃ４については６０ｋＤａに予想外の生成物があることを解明できるが、残りの二量体化反応ではほぼ同じ生成物が同量で得られることが分かる。ＡＦＲＡとＣ４には、反応終了時に得られた二量体の％に関してこれら２分子間に１０倍を超える有意差があり、ＡＦＲＡが優位である。
【０１２０】
ｂ）生検試料における免疫組織化学的アッセイ
前記で報告したアッセイ法は、トランスフェクションした細胞または卵巣癌細胞系においてインビトロで実施された。しかし、異なる細胞系はそれぞれ異なる量および異なるグリコシル化変異型の受容体を発現する可能性がある。したがって、Ｆａｂ二量体をインビボ状況で試験することが重要である。免疫組織化学的アッセイにおいて、卵巣癌から発現したアルファ葉酸受容体をＡＦＲＡがインサイチューで認識する能力を試験した。
【０１２１】
ＡＦＲＡ−ＤＦＭ二量体をインビトロでＦＩＴＣ標識し、染色用の生検試料を調製した。具体的には、厚さ５ｍｍの生検試料凍結切片を切り取り、乾燥させ、冷アセトン中で５分間固定した。スライドをＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で洗浄することにより、過剰のアセトンを除去し、次いで風乾した。凍結固定切片を３％  ＢＳＡ、１０％ヒト血清（３％スキムミルク中）により室温で６０分間ブロックした。ＦＩＴＣ  ＤＦＭ−ＡＦＲＡ標識抗体フラグメントを、まず４℃で一夜、３種類の異なる希釈度で保温した。
【０１２２】
ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ緩衝液洗浄を行なった。抗ＦＩＴＣ  ｍＡｂ（ウサギ、希釈度１：２００）を室温で３０分間添加した。スライドをａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ緩衝液で連続洗浄した。次いで、ブタ−抗ウサギＩｇ−アルカリホスファターゼ結合ｍＡｂ（希釈度１：８０）を室温で３０分間添加した。スライドをａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ緩衝液で洗浄した。続いてＲｅｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｖｅｃｔｏｒにより供給）を添加し、洗浄し、最終洗浄を蒸留水中で実施した。ヘマトキシリンを室温で１５秒間添加した。スライドを水道水中で洗浄し、脱水し、清浄にし、顕微鏡観察のためにマウントした。
【０１２３】
ＡＦＲＡ−ＤＦＭは、この場合も腫瘍領域に局在化することができ、周囲の健常組織を染色せず（図５）、これによりインビボ状況でのＡＦＲＡ−ＤＦＭ二量体の特異性が確認された。
【０１２４】
ｃ）インビボ生体内分布
ＡＦＲＡ−ＤＦＭの特異性が証明されたので、生体内分布実験を行なった。このために、前記の高分子を、Ｉｏｄｏｇｅｎプレコーテッドヨウ素化試験管によりＣｈｉｚｚｏｎｉｔｅ法を用いてＩ１３１で放射性標識した；本質的に製造業者（Ｐｉｅｒｃｅ）の記載に従い、発熱物質を含まない臨床用試薬を使用した（１７）。Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ法は、分子の統合性および機能性をより良好に保存することができる；事実、５ｍＣｉ／ｍｇの比放射能で放射性標識した最終生成物は、少なくとも６５％の平均免疫反応性を示した。この１３１Ｉ標識ＡＦＲＡ−ＤＦＭを動物の血中に注射した。
【０１２５】
注射後、予め定めた幾つかの時点で動物を屠殺し、臓器を摘出、秤量および計数して、それらのそれぞれにおける放射能の蓄積および排出の速度を判定した。予め動物の皮下に移植した腫瘍に対する標準として正常組織を用いた。
【０１２６】
より具体的には、５〜６週令の雌ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕマウス（無胸腺）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ，イタリア）から入手した。１週間の順化の後、ヒト葉酸受容体アルファでトランスフェクションしたＡ４３１細胞またはＡ４３１ｔＭｏｃｋ細胞３．５ｘ１０６個を、０．１ｍＬの０．９％  ＮａＣｌ中においてマウスの皮下に異種移植した。腫瘍細胞を注射した２〜３週間後、マウスをランダムにグループ分けし、放射性標識抗体フラグメント（１３１Ｉ−ＤＦＭ−ＡＦＲＡ  ５．３）を尾の側脈に静脈内注射した。この放射性同位体について実験を行ない、詳細を下記の表ＩＩＩに報告する：
【０１２７】
【表３】
0005513114.tif 000004
【０１２８】
ｄ）放射能局在化
解剖後、腫瘍および他の組織／臓器（脾臓、腎臓、肝臓、尿を含む膀胱、胸骨、心臓および筋肉）を採取し、湿潤重量を測定した。各組織に付随する放射能を、ガンマ計数計で内部標準を用いて評価した（５および１０μｌの注射液）。
【０１２９】
結果を図６に示す；これは組織グラム当たりの注射量に対するパーセント（％ＩＤ／ｇ）として表わし、放射能減衰に対して補償したものである。この方法で正規化することにより臓器または動物の直接比較が可能になる。放射免疫療法に理想的な分子は、腫瘍に高度に蓄積し、長い持続時間をもち、健常組織におけるバックグラウンドは可能な限り最低であろう。
【０１３０】
この生体内分布実験の結果は、ＡＦＲＡ−ＤＦＭが腫瘍に特異的に蓄積することを証明する。膀胱および尿に対応する高い数値は、予想したＤＦＭ排出と良好に一致し、解毒経路の確証となる。予想どおりＤＦＭは腫瘍に蓄積し、ここでは注射の６時間後に他の臓器で測定された濃度より濃度が高くなり始めた。
【０１３１】
５．放射性標識ＡＦＲＡ−ＤＦＭのインビボ有効性の原理の証明
放射性標識抗体フラグメント１３１Ｉ−ＤＦＭ−ＡＦＲＡはＦＲを異所性発現している腫瘍（Ａ４３１ＦＲ）に特異的に蓄積することが証明されたので、それが腫瘍の増殖を抑制する能力を評価した。全注射量を薬物動態に従って決定した。この高分子を１３１Ｉで放射性標識し、皮下移植した腫瘍細胞を保有する動物の血流中に注射した。
【０１３２】
より具体的には、７週令の雌ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕマウス（無胸腺）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ，イタリア）から入手した。１週間の順化の後、ヒト葉酸受容体アルファでトランスフェクションしたＡ４３１細胞（Ａ４３１ＦＲ）またはＡ４３１ｔＭｏｃｋ細胞３．５ｘ１０６個を、０．１ｍＬの０．９％  ＮａＣｌ（生理食塩水）中においてマウスの皮下に異種移植した。腫瘍細胞を注射した１週間後、マウスをランダムにグループ分けし、生理食塩水中の放射性標識抗体ＡＦＲＡ−ＤＦＭまたは対照としての生理食塩水のみ０．３ｍＬを尾の側脈に静脈内注射した。腫瘍の増殖を２〜３日毎にモニターし、カリパスで測定した；腫瘍容積を下記に従って判定した：Ｄｘｄ２ｘ１／６ｘπ；ここで、Ｄ＝主直径、ｄ＝副直径。独立した３回の実験を行ない、詳細を下記の表ＩＶに報告する：
【０１３３】
【表４】
0005513114.tif 000005
【０１３４】
結果を図１１に示し、生理食塩水のみで処理した対照に対比した腫瘍増殖率パーセントとして表わす。１３１Ｉで標識したＡＦＲＡ−ＤＦＭを腫瘍保有マウスに平均線量１ｍＣｉ／マウスで注射した。注射後、２〜３毎に腫瘍の増殖をモニターした。独立した３回の実験で記録された腫瘍増殖遅延の結果を、各対照に対比した平均腫瘍増殖率パーセントとして図１１に報告する。各実験において、各処理グループ、すなわちＡ４３１ＦＲまたはＡ４３１ｍｏｃｋの平均容積を各対照グループの平均容積と比較した。これらの有効性実験の結果は、放射性標識ＡＦＲＡ−ＤＦＭは目的とする標的抗原を発現している腫瘍（Ａ４３１ＦＲ）の増殖を特異的に遅延させたが、無関係な腫瘍の抗原を発現している腫瘍（Ａ４３１ｍｏｃｋ）の増殖は遅延させず、腫瘍縮小率パーセントは処理後１１および１６日目の両方とも有意であったことを証明する（それぞれｐ＝０．００６およびｐ＝０．０５）。
【０１３５】
６．腹腔内腫瘍として増殖している卵巣癌細胞への放射性標識ＡＦＲＡ−ＤＦＭの局在化
放射性標識抗体フラグメント１３１Ｉ−ＤＦＭ−ＡＦＲＡは静脈内注射後にＦＲ（Ａ４３１ＦＲ）を異所性発現している腫瘍に特異的に蓄積して増殖を抑制しうることが証明されたので、葉酸受容体を自然に過剰発現している卵巣癌細胞にそれが局在化する能力を評価した。卵巣癌細胞を腹腔内移植した動物、すなわちヒト上皮卵巣癌の自然増殖と内転移を模倣したモデルの腹腔内に１３１Ｉ−ＤＦＭ−ＡＦＲＡを注射した。
【０１３６】
より具体的には、７週令の雌ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕマウス（無胸腺）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ，イタリア）から入手した。１週間の順化の後、ヒト葉酸受容体アルファを過剰発現しているＩＧＲＯＶ１細胞８〜１０ｘ１０６個を、０．３ｍＬの０．９％  ＮａＣｌ（生理食塩水）中においてマウスの腹腔内に異種移植した。腹水生成が顕性になった時点で（腫瘍細胞注射の１４〜２０日後）、生理食塩水０．３ｍＬ中の放射性標識抗体ＡＦＲＡ−ＤＦＭを腹腔内注射し、マウスをランダムにグループ分けし、種々の時点で腹水、腹膜に付着して増殖している固形腫瘍塊、および他の組織／臓器（血液、腎臓、肝臓および筋肉）を採集し、湿潤重量を測定した。腹水を遠心し、ペレット化した腹水腫瘍細胞を体液から分離し、個別に計数した。各組織に付随する放射能を、ガンマ計数計で内部標準を用いて評価した（５および１０μｌの注射液）。独立した３回の実験を行ない、詳細を下記の表Ｖに報告する：
【０１３７】
【表５】
0005513114.tif 000006
【０１３８】
結果を図１２に示す；これは組織グラム当たりの注射量に対するパーセント（％ＩＤ／ｇ）として表わし、放射能減衰に対して補償したものである。この方法で正規化することにより臓器または動物の直接比較が可能になる。これらの実験の結果は、放射性標識抗体ＡＦＲＡ−ＤＦＭは腹水中に存在する卵巣癌細胞（ＩＧＲＯＶ１）の表面に特異的に結合し、放射性標識抗体ＡＦＲＡ−ＤＦＭはこれらの細胞表面および固形腫瘍塊に最高１５時間存続することを証明する。
【０１３９】
７．腹腔内腫瘍として増殖している卵巣癌細胞に対する放射性標識抗体ＡＦＲＡ−ＤＦＭの有効性
１３１Ｉ−ＤＦＭ−ＡＦＲＡは腹腔内注射後にＦＲを自然発現している腫瘍（ＩＧＲＯＶ１）に特異的に蓄積しうることが証明されたので、それが卵巣癌の腹腔内腫瘍の内転移を抑制する能力を評価した。抗体フラグメント投与の２〜４日前に移植した腹腔内卵巣癌細胞を保有する動物の腹腔内に１３１Ｉ−ＤＦＭ−ＡＦＲＡを注射した。
【０１４０】
より具体的には、７週令の雌ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕマウス（無胸腺）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ，イタリア）から入手した。１週間の順化の後、ヒト葉酸受容体アルファを過剰発現している卵巣癌細胞（ＩＧＲＯＶ１またはＯＶＣＡＲ３）８〜１０ｘ１０６個を、０．３ｍＬの０．９％  ＮａＣｌ（生理食塩水）中においてマウスに腹腔内異種移植した。腫瘍細胞注射の２または４日後、マウスをランダムにグループ分けし、生理食塩水中の放射性標識抗体ＡＦＲＡ−ＤＦＭまたは対照としての生理食塩水のみ０．３ｍＬを腹腔内注射した。２〜３日毎に腫瘍の増殖をモニターし、秤量し、腹水生成または腹腔内固形腫瘍塊の発達をモニターした。動物の生存を記録した。独立した２回の実験を行ない、詳細を下記の表ＶＩに報告する：
【０１４１】
【表６】
0005513114.tif 000007
【０１４２】
結果を図１３に示し、生存曲線として表わす。生存率の上昇を記録順位検定（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ａｓｓａｙ）により評価した。これらの実験の結果は、腹腔に腫瘍を移植した後４日目までに放射性標識ＡＦＲＡ−ＤＦＭを注射すると、両方の同所性腫瘍モデルにおいて腫瘍の増殖を有意に遅延させ、したがって動物の生存を延長しうることを証明する（ＩＧＲＯＶ１およびＯＶＣＡＲ３モデルにおいてそれぞれｐ＝０．００１４およびｐ＜０００１）。
【０１４３】  
本願発明の他の態様は、以下の通りである；
【態様１】  葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントであって、その可変部に下記のアミノ酸配列のうち少なくとも１つが含まれるＬ鎖：
−ＲＡＳＥＳＶＳＦＬＧＩＮＬＩＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
−ＱＡＳＮＫＤＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
−ＬＱＳＫＮＦＰＰＹＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
を含み、かつそのＬ鎖の定常部がカッパ定常部である、抗体またはそのフラグメント。
【態様２】  図１のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をもつＬ鎖を含む、態様１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様３】  さらに、抗体Ｈ鎖の少なくとも一部を含む、態様１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様４】  Ｌ鎖をＨ鎖の可変部（ＶＨ）および第１定常部（ＣＨ１）と共に含むＦａｂフラグメントである、態様３に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様５】  Ｈ鎖の可変部（ＶＨ）が図８のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）をもつ、態様４に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様６】  ＣＨ１領域のＨ鎖がＩｇＧのＨ鎖、特にＩｇＧ１のＨ鎖である、態様４に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様７】  Ｆａｂ’フラグメントであり、Ｈ鎖がさらに第２抗体フラグメントへの共有結合に適したヒンジ部を含む、態様４に記載の抗体フラグメント。
【態様８】  ヒンジ部が、遊離システインを含む抗体ヒンジ部の少なくとも一部を含む、態様７に記載の抗体フラグメント。
【態様９】  ２つのＦａｂ’フラグメントを含むＦ（ａｂ’）２二量体である、態様７に記載の抗体フラグメント。
【態様１０】  ２つのＦａｂ’単量体がジスルフィド結合により互いに共有結合している、態様９に記載の抗体フラグメント。
【態様１１】  ２つのＦａｂ’単量体が、マレイミドなど非加水分解性の化学的リンカーにより互いに共有結合している、態様９に記載の抗体フラグメント。
【態様１２】  二重特異性二量体である、態様９に記載の抗体フラグメント。
【態様１３】  完全ヒト型である、態様１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様１４】  葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に５０ｎＭ未満のアフィニティー（ＫＤ）で結合する、態様１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様１５】  細胞毒性物質またはマーキング剤などのエフェクター部分にコンジュゲーションしている、態様１または２に記載の抗体またはフラグメント。
【態様１６】  細胞毒性物質が放射性核種である、態様１５に記載の抗体またはフラグメント。
【態様１７】  放射性核種が１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１８８Ｒｅよりなる群から選択される、態様１６に記載の抗体またはフラグメント。
【態様１８】  エフェクター部分が９９Ｔｃなどのマーキング剤である、態様１５に記載の抗体またはフラグメント。
【態様１９】  葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する抗体フラグメントであって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＮＣＭ  Ｉ−３５８６から得られる抗体フラグメント。
【態様２０】  モノクローナル抗体である、態様１〜１９のいずれか１項に記載の抗体。
【態様２１】  抗体または抗体フラグメントのカクテルであって、態様１〜２０のいずれか１項に記載の抗体または抗体フラグメントを含むカクテル。
【態様２２】  葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントをコードする配列を含む核酸分子であって、抗体またはそのフラグメントはその可変部に下記のアミノ酸配列のうち少なくとも１つが含まれるＬ鎖：
−ＲＡＳＥＳＶＳＦＬＧＩＮＬＩＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、
−ＱＡＳＮＫＤＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）、
−ＬＱＳＫＮＦＰＰＹＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
を含みかつそのＬ鎖の定常部はカッパ定常部である、核酸分子。
【態様２３】  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む抗体またはそのフラグメントをコードする、態様２２に記載の核酸分子。
【態様２４】  態様２２または２３に記載の核酸を含み、その核酸が作動可能な状態で転写調節シグナルに結合している発現ベクター。
【態様２５】  核酸がさらに、抗体Ｈ鎖またはそのフラグメントをコードする配列を含む、態様２４に記載の発現ベクター。
【態様２６】  態様２４または２５のいずれか１項に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
【態様２７】  原核細胞である、態様２６に記載の宿主細胞。
【態様２８】  大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、態様２７に記載の宿主細胞。
【態様２９】  態様１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントを医薬的に許容できるキャリヤーと共に含む、医薬組成物。
【態様３０】  抗体またはそのフラグメントが細胞毒性物質またはマーキング剤などのエフェクター部分にコンジュゲーションしている、態様２９に記載の医薬組成物。
【態様３１】  細胞毒性物質が放射性核種である、態様３０に記載の医薬組成物。
【態様３２】  放射性核種が１３１Ｉ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１８８Ｒｅから選択される、態様３１に記載の医薬組成物。
【態様３３】  エフェクター部分が９９Ｔｃなどのマーキング剤である、態様３２に記載の医薬組成物。
【態様３４】  療法に使用するための、態様１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様３５】  放射免疫療法に使用するための、態様１６または２０に記載の抗体またはそのフラグメント。
【態様３６】  葉酸受容体アルファ（ＦＲα）の過剰発現を伴う障害を治療または予防するための医薬の製造における、態様１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントの使用。
【態様３７】  抗体またはそのフラグメントが放射性核種に結合しており、医薬が放射免疫療法に適切である、態様３６に記載の使用。
【態様３８】  障害がヒトにおける卵巣癌である、態様３７に記載の使用。
【態様３９】  卵巣癌またはその転移の診断またはイメージングのための方法であって、対象の組織または組織試料を態様１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントと接触させることを含み、抗体またはそのフラグメントは放射性核種など適切な標識に結合している方法。
【態様４０】  態様１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメント、および他の療法薬を含む、療法に同時、個別または逐次使用するための組合わせ製剤としての製品。
【態様４１】  他の療法薬が、化学療法薬および放射線療法薬よりなる群から選択される、態様４０に記載の製品。
【態様４２】  ヒトの癌、たとえば卵巣癌の療法に同時、個別または逐次使用するための組合わせ製剤としての、態様４０または４１に記載の製品。
【態様４３】  癌の処置に用いる組合わせ医薬製剤を製造するために、抗体またはそのフラグメントおよび他の療法薬を同時、個別または逐次投与する、態様１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントおよび他の療法薬の使用。
【態様４４】  他の療法薬が、化学療法薬および放射線療法薬よりなる群から選択される、態様４３に記載の使用。
【態様４５】  ヒトの癌、たとえば卵巣癌の処置のための他の療法薬との補助療法または合併療法を実施するのに用いる医薬を製造するための、態様１〜２１のいずれか１項に記載の抗体またはそのフラグメントの使用。
【態様４６】  葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである高アフィニティーのヒト抗体またはそのフラグメントを調製するための、下記の工程を含む方法：
ｉ）葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する能力をもつヒト抗体Ｈ鎖を選択し、その選択はガイド付き選択により実施され、ヒトＶＨＣＨレパトア上のガイド鋳型として、その可変部に下記のアミノ酸配列のうち少なくとも１つが含まれ：
−ＲＡＳＥＳＶＳＦＬＧＩＮＬＩＨ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
−ＱＡＳＮＫＤＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）
−ＬＱＳＫＮＦＰＰＹＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）
かつその定常部がカッパ定常部であるＡＦＲＡ  Ｌ鎖と表示されるＬ鎖を含む抗体フラグメントを用い、続いてαＦＲを過剰発現しているヒト細胞上のＨ鎖を選択し、
ｉｉ）選択したヒト抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を、ＡＦＲＡ  Ｌ鎖をコードする遺伝子と共に、適切な宿主細胞において、これらのＬ鎖およびＨ鎖の組み立てが可能な条件で発現させる。
【態様４７】  ＡＦＲＡ  Ｌ鎖がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を含む、態様４６に記載の方法。
【態様４８】  ヒトＶＨＣＨレパトアは、卵巣癌に罹患していたがレパトア構築時点ではその疾患を伴わない患者に由来するヒトＢ細胞から構築される、態様４６に記載の方法。
【態様４９】  宿主細胞における工程（ｉｉ）で、選択したヒト抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子およびＡＦＲＡ  Ｌ鎖をコードする遺伝子を、選択したヒト抗体Ｈ鎖およびＡＦＲＡ  Ｌ鎖をコードする核酸配列が作動可能な状態で転写調節シグナルに結合したものを含む発現ベクターにより発現させる、態様４６に記載の方法。
【態様５０】  宿主細胞における工程（ｉｉ）で、選択したヒト抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を、選択したヒト抗体Ｈ鎖をコードする核酸配列が作動可能な状態で転写調節シグナルに結合したものを含む第１発現ベクターにより発現させ、そしてＡＦＲＡ  Ｌ鎖をコードする遺伝子を、ＡＦＲＡ  Ｌ鎖をコードする核酸配列が作動可能な状態で転写調節シグナルに結合したものを含む第２発現ベクターにより発現させる、態様４６に記載の方法。
【態様５１】  葉酸受容体アルファ（ＦＲα）に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである高アフィニティーのヒト抗体またはそのフラグメントを調製するための、下記の工程を含む方法：
−態様２４または２５に記載の発現ベクターを適切な宿主細胞において発現させ；
−発現した抗体またはそのフラグメントを回収し；
−回収した抗体またはそのフラグメントを場合により二量体化する。
【態様５２】  発現ベクターが態様２４に記載の発現ベクターであり、細胞において、抗体Ｈ鎖またはそのフラグメントをコードする核酸配列を含む第２発現ベクターと共発現させ、その核酸は作動可能な状態で転写調節シグナルに結合している、態様５１に記載の方法。
参考文献一覧
【０１４４】
【数１】
0005513114.tif 000008
【０１４５】
【数２】
0005513114.tif 000009
【図５Ａ】
0005513114.tif 000010
【図５Ｂ】
0005513114.tif 000011
【図５Ｃ】
0005513114.tif 000012
【図１】
0005513114.tif 000013
【図２】
0005513114.tif 000014
【図３】
0005513114.tif 000015
【図４】
0005513114.tif 000016
【図６】
0005513114.tif 000017
【図７】
0005513114.tif 000018
【図８】
0005513114.tif 000019
【図９】
0005513114.tif 000020
【図１０】
0005513114.tif 000021
【図１１】
0005513114.tif 000022
【図１２】
0005513114.tif 000023
【図１３】
0005513114.tif 000024