(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)であって、SIA I、SIA II、SIA III、またはそれらの組合せとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA Iは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなり、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなり、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度で直線状の会合であるSIA-II 90%からなる、超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項２】
前記インスリンが、組換えヒトインスリン、ウシもしくはブタのインスリン、またはインスリンの変異体/類似体である、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項３】
0.1から5.4ng/mlまでの範囲の速度でインスリンを放出し、インスリンの放出速度がin vivoで7から180日までの範囲のものである、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項４】
少なくとも7〜10日間で4〜5.4ng/mlの範囲の速度でインスリンを放出する、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項５】
少なくとも160日間で0.5〜1.8ng/mlの範囲の速度でインスリンを放出する、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項６】
少なくとも180日間で0.1〜0.7ng/mlの範囲の速度でインスリンを放出する、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項７】
糖尿病の対象への投与により、それを必要とする対象において少なくとも160日間、ほぼ正常の血糖レベル(120±30mg/dl)が維持される、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項８】
単回投与量の前記アセンブリーの投与により、それを必要とする対象において少なくとも7から180日間、ほぼ正常の血糖レベル(120±30mg/dl)が維持され、前記投与量における前記アセンブリーの濃度が0.125から3.75mg/kg体重の範囲である、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項９】
単回投与量の前記アセンブリーの投与により、それを必要とする対象において少なくとも160日間、ほぼ正常の血糖レベル(120±30mg/dl)が維持され、前記投与量における前記アセンブリーの濃度が0.75から1.25mg/kg体重の範囲である、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)。
【請求項１０】
非細胞毒性、非免疫原性、非アポトーシス性および非分裂促進性のプロドラッグである、請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー。
【請求項１１】
1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物であって、治療上有効な量の請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)を含む、組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容できる担体、添加剤、または希釈剤をさらに含む、請求項11に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
筋肉内、皮膚内または皮下投与される、請求項11に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
ポンプ、カテーテル、パッチ、およびインプラントからなる群から選択される、前記組成物を放出することができるデバイスによって投与される、請求項11に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
請求項1に記載の超分子インスリンアセンブリー(SIA)を調製するプロセスであって、
a.インスリンを、1.5から7.8の範囲のpHを有する溶液に25から60℃の温度で溶解するステップと、
b.前記溶液を絶えず振盪しながら6から48時間の期間インキュベートして超分子インスリンアセンブリー(SIA)を得るステップとを含み、SIAは、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含む、プロセス。
【請求項１６】
a.前記SIAをPBSで洗浄するステップと、
b.前記SIAをPBSに再懸濁するステップと
をさらに含む、請求項15に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記期間が8から12時間、好ましくは10時間である、請求項15に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記溶液が、1.5から2.5の範囲のpHを有する塩酸または酢酸水溶液;3.5から5.5の範囲のpHを有する酢酸ナトリウムバッファー;pH6〜7.8を有するリン酸バッファー(PBS);および4から6の範囲のpHを有するクエン酸バッファーから選択される、請求項15に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記温度が37℃である、請求項15に記載のプロセス。
【請求項２０】
前記溶液のpHが6.8から7.4、好ましくは7.2である、請求項15に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記期間が6〜192時間である、請求項15に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2008年4月7日出願のインド特許出願第914/DEL/2008からの優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、糖尿病および他の慢性疾患の処置のためのタンパク質治療薬に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質薬物治療は最も迅速に拡大するクラスの治療薬であり、数ある中でも、糖尿病、癌、心臓血管疾患、腎臓疾患、消化管疾患、リウマチ性疾患、および神経疾患の患者に貢献している。インスリン、エリスロポエチン、G-CSF、プラスミノーゲン活性化因子、およびインターフェロンを含む、治療薬としてのタンパク質の治療上および商業上の価値は議論の余地がない。改善されたタンパク質またはタンパク質製剤は、その効力、作用時間、および他の性質を増大することによって、これら親生成物の治療上の有効性を増強している。
【０００４】
糖尿病は、身体がインスリンを生成することができない(I型)、またはインスリンに反応することができない(II型)、いずれかによって特徴づけられる慢性疾患である(http://www.who.int/diabetes/en、King, H.、Aubert, R.E.、およびHerman、W. H. Global burden of diabetes、1995〜2025頁、Prevalence, numerical estimates, and projections.、Diabetes Care、21巻、1414〜1431頁(1998年))。I型およびII型の両方の形態の糖尿病の新たな世界的な蔓延がある。2005年には、110万人近くの糖尿病患者が死亡した(Dunstan, D. W.、Zimmet, P. Z.、Welborn, T. A.、De Courten, M. P.、Cameron ,A. J.ら、The rising prevalence of diabetes and impaired glucose tolerance: The Australian Diabetes、Obesity and Lifestyle Study.、Diabetes Care、25巻、829〜834頁、(2002年))。糖尿病に罹患した人々は何年間も生存することがあり、その死因はしばしば、両方とも糖尿病の二次的結果として生じる心臓疾患および腎不全と記録されるので、その経済的帰結はさらにより膨大である。外部からインスリンを投与することによって正常な代謝上の環境を回復し、それによって二次的な合併症の危険性を最小にすることが、糖尿病処置の本質的な特徴となっている。現在の治療は、毎日の複数のインスリンの皮下(SC)/筋肉内(IM)注射であり、これは患者に対してコンプライアンスの重荷をもたらす。これは、今度は代替の、侵襲性の少ない送達経路へと通じる。経鼻の、経口の、消化管の、および経皮の経路を利用する試みは、今日までほとんど不成功であった。1日2回のインスリン注射での、I型糖尿病に対する従来のインスリンレジメンは、食後血中グルコースレベルをコントロールするのに有効であるが、この処置は空腹時高血糖をコントロールできないので限られた価値しかない。真性糖尿病の患者は、1日1回または2回、内因性のインスリン供給を高めるためにインスリン治療を必要とする。また、食後のグルコース恒常性は、各食事前の規則的なインスリン注射によって維持される。集中的なインシュリン治療は二次的な合併症の発症を遅らせ、かつ/または進行を遅くするが、患者には依然として空腹時低血糖の危険性が高い。長期間コントロールされた様式でインスリンを放出するインスリン製剤により、患者は、多回投与量のインスリンを毎日投与する必要から解放されるであろう。本発明は、I型およびII型両方の糖尿病を処置するための、インスリンおよび/またはエキセンディン-4の持続放出のための組成物を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】インド特許出願第914/DEL/2008
【０００６】
【非特許文献１】http://www.who.int/diabetes/en
【非特許文献２】King, H.、Aubert, R.E.、およびHerman、W. H. Global burden of diabetes、1995〜2025頁、Prevalence, numerical estimates, and projections.、Diabetes Care、21巻、1414〜1431頁(1998年)
【非特許文献３】Dunstan, D. W.、Zimmet, P. Z.、Welborn, T. A.、De Courten, M. P.、Cameron ,A. J.ら、The rising prevalence of diabetes and impaired glucose tolerance: The Australian Diabetes、Obesity and Lifestyle Study.、Diabetes Care、25巻、829〜834頁、(2002年)
【非特許文献４】Paul Bevan、Insulin signalling.、  J. Cell Sci.、114巻、1429〜1430頁(2001年)
【非特許文献５】Le Vine、H. Quantification of  β-Sheet Amyloid Fibril Structures with Thioflavin T. Methods Enzyrnol、309巻、274〜284頁(1999年)
【非特許文献６】Klunk, W.E.、Jacob, R.F.、およびMason, R.P.、Quantifying amyloid by Congo red spectral shift assay.、Methods Enzymol、309巻、285〜305頁(1999年)
【非特許文献７】Nathan, D. M.、Cleary, P. A.、Backland, J. Y.ら、Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes.、N. Engl. J. Med.、353巻、2643〜53頁(2005年)
【非特許文献８】Paulsen, E.P.、Courtney, J.W.、およびDuckworth, W.C.、Insulin resistance caused by massive degradation of subcutaneous insulin.、Diabetes、28巻、640〜645頁(1979年)
【非特許文献９】Freidenberg, G.R.、White, N.、Cataland, S.、O'Dorisio, T.M.、Sotos, J.F.、およびSantiago, J.V.、Diabetes responsive to intravenous but not subcutaneous insulin: effectiveness of aprotinin、N. Engl. J. Med.、305巻、363〜368頁(1981年)
【非特許文献１０】Duckworth, W.C.、Bennett, R.G.、およびHamel, F.G.、Insulin degradation: progress and potential、Endocr. Rev.、19巻、608〜624頁(1998年)
【非特許文献１１】Pause, E.、Boi mer, O.、およびNustad, K.、Radio iodination of proteins with the iodogen method, in RIA and related procedures in medicine, international atomic agency、Vienna、161〜171頁(1982年)
【非特許文献１２】Schaogger, H.およびVon Jagow, G.、Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.、Anal Biochem、166巻、368〜379頁(1987年)
【非特許文献１３】Bjorntorp, P.、Karlsson, M.、Pettersson, P.、およびSypniewska,G.  、Differentiation and function of rat adipocyte precursor cells in primary culture.、J Lipid Res.、21巻、714〜723頁(1987年)
【非特許文献１４】Lee, G.およびLuna, H. T.、Manual of Histologic staining methods of armed forces institute of pathology.、第3版、McRaw-Hill book company(1960年))
【非特許文献１５】Sanz MJ、Marinova-Mutafchiev L、Green P、Lobb RR、Feldmann M、Nourshargh S.、IL-4-induced eosinophil accumulation in rat skin is dependent on endogenous TNF-alpha and alpha 4 integrin/VCAM-1 adhesion pathways.、J Immunol.、160巻、5637〜5645頁(1998年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、糖尿病および他の慢性疾患の処置のためのタンパク質治療薬を開示する。本発明は特に、超分子インスリンアセンブリーを開示し、超分子インスリンアセンブリーは、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンおよび/またはエキセンディン-4を含む。本発明はまた、超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を開示する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)に関し、アセンブリーは、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含む。
【０００９】
本発明の別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)に関し、アセンブリーは、SIA I、SIA II、SIA III、またはそれらの組合せとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA Iは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなり、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなり、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度の、直線状の会合であるSIA II約90%からなる。
【００１０】
本発明の別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)に関し、アセンブリーは、SIA Iとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA Iは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなる。
【００１１】
本発明のさらに別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)に関し、アセンブリーは、SIA IIとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなる。
【００１２】
本発明のさらに別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)に関し、アセンブリーは、SIA IIIとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度の、直線状の会合からなる。
【００１３】
本発明のさらなる一態様は、糖尿病の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)に関し、前記アセンブリーは、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のエキセンディン-4を含む。
【００１４】
本発明の別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物に関し、組成物は、治療上有効な量の本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)を含む。
【００１５】
本発明のさらに別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物に関し、前記組成物は、治療上有効な量の本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーII(SIA II)を含む。
【００１６】
本発明のさらに別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物に関し、組成物は、治療上有効な量の本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)および超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を含む。
【００１７】
本発明のさらに別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物に関し、組成物は、治療上有効な量の本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)および超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を含む。
【００１８】
本発明のさらに別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物に関し、組成物は、治療上有効な量の本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を含む。
【００１９】
本発明の別の一態様は、本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)を調製するプロセスに関し、プロセスは、インスリンを、約1.5から7.8の範囲のpHを有する溶液に約25から60℃の温度で溶解するステップと、前記溶液を絶えず振盪しながら約6から48時間の期間インキュベートして超分子インスリンアセンブリー(SIA)を得るステップとを含み、SIAは、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含む。
【００２０】
本発明のさらに別の一態様は、本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリーを調製するプロセスに関し、プロセスは、エキセンディン-4を、約2.0から7.6の範囲のpHを有する溶液に約25から60℃の温度で溶解するステップと、前記溶液を絶えず振盪しながら6から192時間の期間インキュベートして超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を得るステップとを含み、SEAは、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のエキセンディン-4を含む。
【００２１】
本発明のさらなる一態様は、障害の軽減に効果的である、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための方法に関し、方法は、本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーを含む治療上有効な量の薬剤組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２２】
本発明のさらに別の一態様は、障害の軽減に効果的である、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための方法に関し、方法は、本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー-II(SIA-II)を含む治療上有効な量の薬剤組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２３】
本発明のさらに別の一態様は、障害の軽減に効果的である、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための方法に関し、方法は、本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリーを含む治療上有効な量の薬剤組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２４】
本発明のさらに別の一態様は、障害の軽減に効果的である、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための方法に関し、方法は、本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーおよび超分子エキセンディン-4アセンブリーを含む治療上有効な量の薬剤組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００２５】
本発明の別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための、本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーの使用に関する。
【００２６】
本発明のさらに別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための、本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリーの使用に関する。
【００２７】
本発明のさらに別の一態様は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための、本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリーと組み合わせた超分子インスリンアセンブリーの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】組換えヒト(rH)インスリンおよびウシインスリンのTh-T50μMの蛍光でモニターした、pH2.0および7.0の原線維形成の動態学を示す図である。
【図２ａ】280nmの吸光度および内因性のチロシンの蛍光によってモニターした、ウシおよびrHインスリンの超分子インスリンアセンブリーII(プレアミロイドインスリンII中間体とも呼ばれる)からのインスリンのin vitroの放出を示す図である。0時間および15日の透析膜内側の溶液のTh-T強度も示してある。
【図２ｂ】様々な超分子インスリンアセンブリー中間体のウシインスリンからのin vitroのモノマーの放出の動態学を示す図である。
【図２ｃ】様々な超分子インスリンアセンブリー中間体のrHインスリンからのin vitroのモノマーの放出の動態学を示す図である。
【図２ｄ】一定のPBS溶液1mlの下でモニターした、pH7.0で形成されたSIA II(あるいはプレアミロイド)のin vitroの放出の動態学を示す図である。
【図３ａ】天然インスリン、超分子インスリンアセンブリーII(あるいはプレアミロイドインスリンII)、超分子インスリンアセンブリーIII(あるいはプレアミロイドインスリンIII)、およびインスリンアミロイド(ウシ)でのコンゴーレッド結合試験を示す図である。
【図３ｂ】天然インスリン、超分子インスリンアセンブリーII(あるいはプレアミロイドインスリンII)、超分子インスリンアセンブリーIII(あるいはプレアミロイドインスリンIII)、およびインスリンアミロイド(ヒト)でのコンゴーレッド結合試験を示す図である。
【図４】r-ヒトおよびウシインスリンのフーリエ変換赤外分光法(FTIR)の特徴づけを示す図である。
【図５】原子間力顕微鏡(AFM)によって試験した、超分子インスリンアセンブリー(あるいはプレアミロイドインスリン)中間体およびインスリン原線維の形態学を示す図である:  (a)インスリンモノマー  (b)ウシインスリンの超分子インスリンアセンブリーI(あるいはプレアミロイドインスリンI)中間体pH7.0  (c)ウシインスリンの超分子インスリンアセンブリーII(あるいはプレアミロイドインスリンII)、pH7.0  (d)ウシインスリンの超分子インスリンアセンブリーIII中間体(あるいはプレアミロイドインスリンIII) pH7.0  (e)rHインスリンの超分子インスリンアセンブリーI、pH7.0  (f)rHインスリンの超分子インスリンアセンブリーII、pH7.0  (g) rHインスリンの超分子インスリンアセンブリーIII、pH7.0  (h)pH7.0で完全に形成された原線維  (i)pH2.0、37℃で6時間で形成された超分子インスリンアセンブリー(あるいはプレアミロイドインスリン)中間体を示す  (j)pH2.0で形成されたアミロイド原線維。
【図６】超分子インスリンアセンブリーを形成する間のインスリン原線維および中間体のネガティブ染色TEM顕微鏡写真を示す図である:  (i)超分子インスリンアセンブリーI(あるいはプレアミロイドインスリンI)、pH7.0  (ii)超分子インスリンアセンブリーII(あるいはプレアミロイドインスリンII)、pH7.0  (iii)超分子インスリンアセンブリーIII(あるいはプレアミロイドインスリンIII)、pH7.0  (iv) pH7.0の成熟線維  (v)pH2.0、37℃で形成された線維。
【図７ａ】グルコース恒常性における、超分子インスリンアセンブリー(あるいはプレアミロイドインスリン)のin vivoの効果を示す図である。  (a)皮下および筋肉内の両方で投与した、様々な投与量の超分子インスリンアセンブリーII(ウシ)に反応した血中グルコースレベル。
【図７ｂ】グルコース恒常性における、超分子インスリンアセンブリー(あるいはプレアミロイドインスリン)のin vivoの効果を示す図である。  (b)皮下および筋肉内の両方で投与した、様々な投与量の超分子インスリンアセンブリーII(r-ヒト)に反応した血中グルコースレベル。
【図８ａ】ウシSIA-II投与後135日間の期間にわたってモニターした食後血中グルコースレベルを示す図である。  (a)ウシインスリン
【図８ｂ】ウシSIA-II投与後135日間の期間にわたってモニターした食後血中グルコースレベルを示す図である。  (b)rHインスリン
【図９ａ】ヒトSIA-IIの投与後160日間の期間にわたってモニターした食前血中グルコースレベルを示す図である。  (a)ウシインスリン
【図９ｂ】ヒトSIA-IIの投与後160日間の期間にわたってモニターした食前血中グルコースレベルを示す図である。  (a)ウシインスリン
【図１０】pH2.0および7.0で形成したインスリンアミロイドの投与後にモニターした血中グルコースレベルを示す図である。
【図１１】SIA-II処置した糖尿病ラット、糖尿病コントロール、および糖尿病非コントロールラットの体重プロファイルを示す図である。
【図１２】腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT)間の血中グルコースプロファイルを示す図である。
【図１３ａ】SCまたはIM注射した超分子インスリンアセンブリー(あるいはプレアミロイドインスリン)に反応したSTZ処置マウスにおける、対応するSIA-IIから放出された固体状態ELISAを用いた血清rHおよびウシインスリンの定量を示す図である。
【図１３ｂ】IPGTT実験の間の血清ウシインスリンの定量を示す図である。
【図１３ｃ】注入したグルコースに反応したインスリンの内因性レベルを測定するためにIPGTTに対して行われた血清ラットインスリンELISAを示す図である。
【図１４ａ】STZ糖尿病ラットの125I標識したウシインスリンSIA II処置を示す図である。  (a)標識した超分子インスリンアセンブリー100μgで最高25日処置した動物の血清におけるCPM/mlのプロファイルを示す図である。24時間に対するプロファイルを挿入図で示す。
【図１４ｂ】STZ糖尿病ラットの125I標識したウシインスリンSIA II処置を示す図である。  (b)36日間in vivoのプロファイルで放出された血中グルコース(mg/dL)およびウシインスリン(ng/ml)を示す図である。24時間に対するプロファイルを挿入図で示す。
【図１５】標識したSIA IIで処置した動物からの血清のトリシン-SDS-PAGEを示す図である。皮下(上パネル)または筋肉内(中央パネル)のいずれかで処置1〜28日後の血清の、クーマシー染色(左)および蛍光体画像(放置後静置)。下のパネルは、SIA IIからin vitroで放出されたモノマーを示す。
【図１６ａ】超分子インスリンアセンブリーIIで処置後の高血糖性のクランプ試験を示す図である。GIR-グルコース注入速度(mg/kg/分)。
【図１６ｂ】超分子インスリンアセンブリーIIで処置後の高血糖性のクランプ試験を示す図である。GIR-グルコース注入速度(mg/kg/分)。
【図１６ｃ】超分子インスリンアセンブリーIIで処置後の高血糖性のクランプ試験を示す図である。GIR-グルコース注入速度(mg/kg/分)。
【図１７ａ】(a)PBS、インスリン、SIA II、SIA IIから放出されたインスリンで処置し、インスリンシグナリングに対して分析したインスリンシグナリングカスケード脂肪細胞に対する培養脂肪細胞のウエスタンブロット(WB)分析を示す図である。
【図１７ｂ】(b)示した通りの血清で処置し、インスリンシグナリングに対して分析したインスリンシグナリングカスケード脂肪細胞に対する培養脂肪細胞のウエスタンブロット(WB)分析を示す図である。
【図１８ａ】STZで糖尿病にし、超分子インスリンアセンブリーII(あるいはプレアミロイドインスリンII)で皮下的に処置し、コンゴーレッドを用いて残留の超分子インスリンアセンブリーの存在に対して、および炎症の発生に対してそれぞれ調べたWistar系オスラットを示す図である。  (a)1週目から12週目までの、コンゴーレッド染色した皮下の切片(i〜v)、コンゴーレッド複屈折(vi〜x)、H&E染色した切片(xi〜xv)、および免疫染色した切片(xvi〜xx)を示す図である。
【図１８ｂ】STZで糖尿病にし、超分子インスリンアセンブリーII(あるいはプレアミロイドインスリンII)で皮下的に処置し、コンゴーレッドを用いて残留の超分子インスリンアセンブリーの存在に対して、および炎症の発生に対してそれぞれ調べたWistar系オスラットを示す図である。  (b)1週目から12週目までの、コンゴーレッド染色した筋肉内切片(i〜v)、コンゴーレッド複屈折(vi〜x)、H&E染色した切片(xi〜xv)、および免疫染色した切片(xvi〜xx)を示す図である。
【図１９ａ】(a)炎症細胞の浸潤の陽性コントロールとして大腸菌(E coli)からのLPSを皮下的および筋肉組織に注射したことを示す図である。免疫染色したSC(i)およびIM(ii)切片、ならびにH&E染色したSC(iii)およびIM(iv)切片。
【図１９ｂ】(b)pH2.0で形成したインスリンアミロイド線維をSC注射し、1、4、8、および12週間コンゴーレッド染色した切片(i〜iv)およびコンゴーレッド複屈折(v〜viii)を用いてモニターしたことを示す図である。
【図２０ａ】アロキサンを用いて糖尿病にしたラットのrHインスリンSIA II処置の血中グルコースプロファイルを示す図である。  (a)空腹時
【図２０ｂ】アロキサンを用いて糖尿病にしたラットのrHインスリンSIA II処置の血中グルコースプロファイルを示す図である。  (b)非空腹時血液
【図２０ｃ】アロキサンを用いて糖尿病にしたラットのrHインスリンSIA II処置の血中グルコースプロファイルを示す図である。  (c)製造元のプロトコールによって固体状態ELISAを用いた血清におけるヒトインスリンの定量
【図２１】(a)STZ処置ラット、(b)コントロールのラット、(c)〜(d)インスリン処置ラット、(e)超分子インスリンアセンブリー処置ラットにおける白内障の形成のモニターを示す図である。
【図２２】心臓、腎臓、および肝臓組織を切片にし、CRで染色することによってアミロイド沈着に対して試験したことを示す図である。H&E染色を用いて細胞の形態学も評価した。心臓、腎臓、および肝臓のコンゴーレッド複屈折(i〜iii)、コンゴーレッド染色した切片(iv〜vi)、心臓、腎臓、および肝臓のH&E染色(vii〜ix)。
【図２３】SIA IIで処置後のラットインスリン分解酵素(IDE)の検出を示す図である。
【図２４】SIA IIで処置したラット血清における抗インスリン抗体に対するスクリーニングを示す図である。
【図２５】細胞の増殖に対するMTTアッセイを示す図である。PBS、pH7.4、ヒト/ウシインスリン(20nM)、SIA II(ヒト/ウシインスリン)、SIAから放出されたインスリンモノマー(20nM)、インスリン様成長因子I(IGF-1)(6ng/ml)の投与によって、その増殖の動態学に対してMCF7細胞をアッセイした。
【図２６ａ】STZを用いて糖尿病にしたマウスにおける、皮下および筋肉内の両方で投与した様々な投与量の超分子インスリンアセンブリーに反応した血中グルコースレベルを示す図である。示した投与量のヒトSIA IIを皮下注射した。
【図２６ｂ】STZを用いて糖尿病にしたマウスにおける、皮下および筋肉内の両方で投与した様々な投与量の超分子インスリンアセンブリーに反応した血中グルコースレベルを示す図である。示した投与量のヒトSIA IIを筋肉内注射した。
【図２６ｃ】STZを用いて糖尿病にしたマウスにおける、皮下および筋肉内の両方で投与した様々な投与量の超分子インスリンアセンブリーに反応した血中グルコースレベルを示す図である。示した投与量のウシSIA IIを皮下注射した。
【図２７】STZを用いて糖尿病にしたウサギにおける、皮下投与した超分子インスリンアセンブリーに反応した血中グルコースレベルを示す図である。
【図２８ａ】35日の期間にわたって、図に示した様々な処置を与えたII型糖尿病ラットの血中グルコースプロファイルを示す図である。
【図２８ｂ】35日の期間にわたって、図に示した様々な処置を与えたII型糖尿病ラットの血中グルコースプロファイルを示す図である。
【図２９ａ】高インスリン性の、正常血糖/低血糖のクランプ試験を用いた、インスリンの対抗制御的な反応のモニターを示す図である。  (a)血中グルコースレベル
【図２９ｂ】高インスリン性の、正常血糖/低血糖のクランプ試験を用いた、インスリンの対抗制御的な反応のモニターを示す図である。  (b)グルカゴンレベル
【図２９ｃ】高インスリン性の、正常血糖/低血糖のクランプ試験を用いた、インスリンの対抗制御的な反応のモニターを示す図である。  (c)エピネフリンレベル
【図３０】様々な希釈の2mg/mlトリプシンおよびプロテイナーゼKでの、(i)rHインスリン、(ii)SIA I、(iii)SIA IIおよび(iv)SIA IIIの切断パターンを示す20%クーマシー染色したゲルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、糖尿病および他の慢性疾患/障害の処置のためのタンパク質治療薬を提供する。本発明は特に、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、SIAは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含む。本発明はまた、超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を提供し、SEAは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のエキセンディン-4を含む。本発明はまた、超分子インスリンアセンブリーおよび/または超分子エキセンディンアセンブリーを含む薬剤組成物を提供する。
【００３０】
本発明は、II型糖尿病を処置する可能性も提供する。
【００３１】
本明細書で用いる「超分子インスリンアセンブリー」または「SIA」の語は、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを意味する。
【００３２】
本明細書で用いる「超分子インスリンアセンブリー」または「SIA」の語は、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを意味し、プロテアーゼがこれらを切断するのを、より高次のオリゴマー型のSIA IIおよびIIIが防ぐ。トリプシンおよびプロテイナーゼKによる切断に対するSIA IIおよびSIA IIIの耐性は、これらのオリゴマーの構造上の組織における違いをさらに実証している。rHインスリンおよびSIA Iは、プロテアーゼの作用に対して耐性のより高次のオリゴマー型を採用するSIA IIおよびSIA IIIに比べると、プロテアーゼによる切断により感受性である。
【００３３】
本明細書で用いる「超分子インスリンアセンブリー」または「SIA」の語は、不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンである、超分子インスリンアセンブリーI、II、およびIIIを意味する。
【００３４】
本明細書で用いる「SIA I」の語はステージIの「超分子インスリンアセンブリー」を意味し、「SIA I」は不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、オリゴマーは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなる。
【００３５】
本明細書で用いる「SIA II」の語はステージIIの「超分子インスリンアセンブリー」を意味し、「SIA II」は不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、インスリンのオリゴマーは、超オリゴマーの構造上の組織を有する独特な実体を有する、上記に記載した細長いクラスターの直線状の会合として配列されている。
【００３６】
本明細書で用いる「SIA III」の語はステージIIIの「超分子インスリンアセンブリー」を意味し、「SIA III」はオリゴマー型のインスリンの高密度の、直線状の会合からなる。
【００３７】
ステージIIIのSIA、すなわちSIA IIIは約90%のSIA IIからなる。
【００３８】
本発明によると、一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびその合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、前記アセンブリーは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含む。
【００３９】
本発明の別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびその合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーは、SIA I、SIA II、SIA IIIまたはこれらの組合せとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA Iは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなり、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなり、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度の、直線状の会合であるSIA II約90%からなる。
【００４０】
本発明の別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびその合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーはSIA Iとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA Iは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなる。
【００４１】
本発明のさらに別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびその合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーはSIA IIとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなる。
【００４２】
本発明のさらに別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびその合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーはSIA IIIとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度の、直線状の会合からなる。
【００４３】
一実施形態は、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、インスリンは組換えヒトインスリン、ウシもしくはブタのインスリン、またはインスリンの変異体/類似体である。
【００４４】
本発明の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、アセンブリーは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、アセンブリーはin vitroで1時間あたり約0.2から0.6IUまでの範囲の速度でインスリンを放出する。
【００４５】
本発明の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、アセンブリーは、SIA I、SIA II、SIA III、またはそれらの組合せとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA Iは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなり、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなり、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度の、直線状の会合であるSIA II約90%からなり、アセンブリーはin vitroで1時間あたり約0.2から0.6IUまでの範囲の速度でインスリンを放出する。
【００４６】
本発明の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、アセンブリーは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、アセンブリーは0.1から5.4ng/mlまでの範囲の速度でインスリンを放出し、インスリンの放出速度はin vivoで約7から180日の範囲である。
【００４７】
本発明の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、アセンブリーは、SIA I、SIA II、SIA IIIまたはこれらの組合せとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA Iは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなり、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなり、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度の、直線状の会合であるSIA-II約90%からなり、アセンブリーは0.1から5.4ng/mlまでの範囲の速度でインスリンを放出し、インスリンの放出速度はin vivoで約7から180日の範囲である。
【００４８】
本発明の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、アセンブリーは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、アセンブリーはin vitroで1時間あたり約0.2から0.6IUまでの範囲の速度でインスリンを放出し、インスリンの放出速度は少なくとも7〜10日間に4〜5.4ng/mlの範囲である。
【００４９】
本発明の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、アセンブリーは、SIA I、SIA II、SIA IIIまたはこれらの組合せとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA Iは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターからなり、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなり、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度の、直線状の会合であるSIA-II約90%からなり、アセンブリーはin vitroで1時間あたり約0.2から0.6IUまでの範囲の速度でインスリンを放出し、インスリンの放出速度は少なくとも7〜10日間、4〜5.4ng/mlの範囲である。
【００５０】
本発明のさらに別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーはSIA IIとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなり、インスリンの放出速度は少なくとも160日間、0.5〜1.8ng/mlの範囲である。
【００５１】
本発明のさらに別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーはSIA IIIとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA IIIはインスリンオリゴマーの高密度の、直線状の会合からなり、インスリンの放出速度は少なくとも180日間、0.1〜0.7ng/mlの範囲である。
【００５２】
本発明のさらに別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーはSIA IIとして不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含み、SIA IIは真珠様配列のインスリンモノマーを有する細長いクラスターの直線状の会合からなり、アセンブリーは、糖尿病の対象への投与により、それを必要とする対象において少なくとも160日間、ほぼ正常の血糖レベル(120±30mg/dl)が維持される。
【００５３】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)において、単回投与量のアセンブリーの投与により、それを必要とする対象において少なくとも7から180日間、ほぼ正常の血糖レベル(120±30mg/dl)が維持され、投与量におけるアセンブリーの濃度は25から750μgの範囲である。
【００５４】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)において、単回投与量のアセンブリーの投与により、それを必要とする対象において少なくとも160日間、ほぼ正常の血糖レベル(120±30mg/dl)が維持され、投与量におけるアセンブリーの濃度は150から250μgの範囲である。
【００５５】
本発明の一実施形態は、糖尿病の処置のためのタンパク質治療薬として有用な超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を提供し、アセンブリーは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のエキセンディン-4を含む。
【００５６】
本発明の別の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリーを提供し、アセンブリーは、非細胞毒性、非免疫原性、非アポトーシス性および非分裂促進性のプロドラッグである。
【００５７】
本発明の別の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリーを提供し、アセンブリーは、非細胞毒性、非免疫原性、非アポトーシス性および非分裂促進性のプロドラッグである。
【００５８】
本発明の一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物を提供し、組成物は、治療上有効な量の本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)を含む。
【００５９】
本発明の別の一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物を提供し、組成物は、治療上有効な量の超分子インスリンアセンブリーII(SIA II)を含む。
【００６０】
本発明のさらに別の一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物を提供し、組成物は、治療上有効な量の超分子インスリンアセンブリー(SIA)および超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を含む。
【００６１】
本発明のさらに別の一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物を提供し、組成物は、治療上有効な量の超分子インスリンアセンブリー(SIA)および超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を含む。
【００６２】
本発明のさらなる実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための薬剤組成物を提供し、組成物は、治療上有効な量の超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を含む。
【００６３】
本発明として開示する薬剤組成物は、薬学的に許容できる担体、添加剤、または希釈剤を任意選択で含む。
【００６４】
本発明として開示する薬剤組成物は、筋肉内、皮膚内または皮下投与される。
【００６５】
本発明として開示する薬剤組成物は、前記組成物を放出することができるデバイスによって投与され、前記デバイスは、ポンプ、カテーテル、パッチ、およびインプラントからなる群から選択される。
【００６６】
一実施形態では、超分子インスリンアセンブリー(SIA)を調製するプロセスが提供され、プロセスは、インスリンを、約1.5から7.8の範囲のpHを有する溶液に約25から60℃の温度で溶解するステップと、前記溶液を絶えず振盪しながら約6から48時間の期間インキュベートして超分子インスリンアセンブリー(SIA)を得るステップとを含み、SIAは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のインスリンを含む。
【００６７】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)の調製のプロセスにおいて、プロセスは、SIAをPBSで洗浄するステップと、洗浄したSIAをPBSに再懸濁するステップとをさらに含む。
【００６８】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)の調製のプロセスにおいて、インキュベーション時間は10時間である。
【００６９】
本発明の別の一実施形態では、超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)の調製のプロセスが提供され、プロセスは、エキセンディン-4を、約2.0から7.6の範囲のpHを有する溶液に約25から60℃の温度で溶解するステップと、前記溶液を絶えず振盪しながら6から192時間の期間インキュベートして超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を得るステップとを含み、SEAは不溶性かつ凝集したオリゴマー型のエキセンディン-4を含む。
【００７０】
本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリーの調製のプロセスは、SEAをPBSで洗浄するステップと、洗浄したSEAをPBSに再懸濁するステップとをさらに含む。
【００７１】
本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)の調製のプロセスにおいて、インキュベーション時間は148時間である。
【００７２】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)の調製のプロセスにおいて、溶液は、約1.5から2.5の範囲のpHを有する塩酸または酢酸の水溶液;約3.5から5.5の範囲のpHを有する酢酸ナトリウムバッファー; pH6〜7.5を有するリン酸バッファー(PBS)、および約4から6の範囲のpHを有するクエン酸バッファーからなる群から選択される。
【００７３】
本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリーの調製のプロセスにおいて、溶液は、約1.5から2.5の範囲のpHを有する塩酸または酢酸の水溶液;約3.5から5.5の範囲のpHを有する酢酸ナトリウムバッファー;6〜7.5の範囲のpHを有するリン酸バッファー(PBS)、および約4から6の範囲のpHを有するクエン酸バッファーからなる群から選択される。
【００７４】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)の調製のプロセスにおいて、温度は37℃である。
【００７５】
本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)の調製のプロセスにおいて、温度は37℃である。
【００７６】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)の調製のプロセスにおいて、前記溶液のpHは7.2である。
【００７７】
本発明として開示する超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)の調製のプロセスにおいて、前記溶液のpHは7.2である。
【００７８】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)の調製のプロセスにおいて、前記期間は6〜192時間である。
【００７９】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリー(SIA)の調製のプロセスにおいて、前記期間は6〜192時間である。
【００８０】
本発明の一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための方法に関し、方法は、障害の軽減に効果的である超分子インスリンアセンブリーを含む治療上有効な量の薬剤組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００８１】
本発明のさらに別の一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための方法を提供し、方法は、障害の軽減に効果的である超分子インスリンアセンブリーII(SIA II)を含む治療上有効な量の薬剤組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００８２】
本発明のさらに別の一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための方法を提供し、方法は、障害の軽減に効果的である超分子エキセンディン-4アセンブリーを含む治療上有効な量の薬剤組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００８３】
本発明のさらに別の一実施形態は、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害を処置するための方法を提供し、方法は、障害の軽減に効果的である超分子インスリンアセンブリーおよび超分子エキセンディン-4アセンブリーを含む治療上有効な量の薬剤組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００８４】
本発明のさらなる実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための、超分子インスリンアセンブリーの使用が提供される。
【００８５】
本発明のさらに別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための、超分子エキセンディン-4アセンブリーの使用が提供される。
【００８６】
本発明のさらに別の一実施形態では、1型、2型真性糖尿病およびそれらの合併症からなる群から選択される代謝障害の処置のための、超分子エキセンディン-4アセンブリーと組み合わせた超分子インスリンアセンブリーの使用が提供される。
【００８７】
付加的な実施形態では、超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーはフーリエ変換赤外分光法(FTIR)において1647〜1645cm-1に鋭いピークを示す。
【００８８】
一実施形態では、本発明は超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、インスリンは組換えヒトインスリンである。
【００８９】
別の一実施形態では、本発明は超分子インスリンアセンブリー(SIA)を提供し、インスリンは、ヒト、ウシ、またはブタのインスリンである。
【００９０】
さらに別の一本発明の実施形態では、超分子インスリンアセンブリー(SIA)が提供され、アセンブリーは投与によりインスリンモノマーを放出する。
【００９１】
さらに本発明は超分子タンパク質アセンブリーを提供し、アセンブリーにおけるペプチドは小分子薬物と連結している。
【００９２】
本発明の一実施形態は、プロドラッグとして作用する本発明として開示する超分子タンパク質アセンブリーを提供する。
【００９３】
本発明として開示する薬剤組成物は、薬学的に許容できる担体、添加剤、または希釈剤を含む。
【００９４】
本発明として開示する薬剤組成物は、筋肉内または皮下投与される。
【００９５】
本発明として開示する薬剤組成物は、組成物を放出することができるデバイスによって投与され、デバイスはポンプ、カテーテル、パッチ、および埋め込みからなる群から選択される。
【００９６】
本発明として開示する薬剤組成物において、単回投与量の組成物の投与により前記タンパク質が長時間放出される。
【００９７】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーの調製のプロセスは、インスリン溶液の10時間のインキュベーションを含む。
【００９８】
本発明として開示する超分子タンパク質アセンブリーの調製のプロセスは、タンパク質溶液の6〜192時間のインキュベーションを含む。
【００９９】
本発明として開示する薬剤組成物を用いた処置のための方法において、組成物は筋肉内、腹腔内または皮下投与される。
【０１００】
さらに別の一実施形態では、本発明は、安定で、プロテアーゼ耐性であり、貯蔵期間の長い超分子インスリンアセンブリー(SIA)を含む組成物を提供する。
【０１０１】
さらに別の一実施形態では、本発明は、安定で、プロテアーゼ耐性であり、貯蔵期間の長い超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を含む組成物を提供する。
【０１０２】
さらに別の一実施形態では、本発明は、安定で、プロテアーゼ耐性であり、約10日から150日の範囲またはそれを超えるより貯蔵期間の長い超分子インスリンアセンブリー(SIA)を含む組成物を提供する。
【０１０３】
さらに別の一実施形態では、本発明は、安定で、プロテアーゼ耐性であり、約10日から150日の範囲またはそれを超える貯蔵期間のより長い超分子エキセンディン-4アセンブリー(SEA)を含む組成物を提供する。
【０１０４】
当業者であれば理解するように、知られているバッファーなどの様々な溶液を、本発明として開示する超分子タンパク質アセンブリーの再懸濁および洗浄に用いることができる。
【０１０５】
本明細書で用いる「治療上有効な量」の語は、望まれる疾患または病状を処置し、軽減し、もしくは予防するための、または検出可能な治療上もしくは予防上の効果を表す治療用物質の量を意味する。対象に対する正確な有効量は、対象のサイズおよび健康、病状の性質および程度、ならびに投与に選択される治療薬または治療薬の組合せに依存する。所与の状況に対する有効量は、ルーチンの実験によって決定され、医師の判断の範囲内である。
【０１０６】
本発明の目的では、SIAの有効投与量は、一般的に、投与する対象において、本発明の組成物約0.1mg/kgから約1.0mg/kg、または約0.2mg/kgから約2.0mg/kg、または約0.5mg/kgから約3.0mg/kgである。
【０１０７】
薬剤組成物は、薬学的に許容できる担体も含むことができる。「薬学的に許容できる担体」の語は、抗体またはポリペプチド、遺伝子、および他の治療用物質など治療用物質を投与するための担体を意味する。この語は、それ自体が組成物を投与する個体に有害である抗体の生成を誘発せず、過度の毒性なしに投与することができるあらゆる薬剤上の担体を意味する。適切な担体は、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーのアミノ酸、アミノ酸共重合体、および非活性のウイルス粒子など、大型の代謝の遅い巨大分子であり得る。このような担体は当業者にはよく知られている。治療用組成物における薬学的に許容できる担体には、水、食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれ得る。湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質などの補助的な物質も、このようなビヒクル中に存在することができる。典型的には、治療用組成物を、液体の溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製し、注射前に液体のビヒクルにおける溶液または懸濁液に適する固体の形態を調製することもできる。薬学的に許容できる担体の定義内には、リポソームおよびネオソーム(neosome)が含まれる。薬学的に許容できる塩(たとえば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、ならびに、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩、などの有機酸の塩)も、薬剤組成物に存在することができる。
【０１０８】
薬剤組成物を、顆粒剤、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル剤、懸濁剤、軟膏剤、ローション剤などの様々な形態で調製することができる。薬剤用グレードの有機または無機の担体、および/または経口もしくは局所の使用に適する希釈剤を用いて、治療上活性な化合物を含む組成物を作ることができる。当技術分野で知られている希釈剤には、水性の媒体、植物油および動物油、ならびに脂肪が含まれる。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩および十分なpH値を確実にするためのバッファー、ならびに皮膚浸透増強剤を補助剤として用いることができる。
【０１０９】
本発明として開示する組成物は、関連する/適用可能な治療用タンパク質の超分子タンパク質アセンブリーを含み、数々の慢性疾患および急性徴候の処置に適用可能である。
【０１１０】
本発明として開示する組成物は、治療用タンパク質のオリゴマー、特にタンパク質の徐放のためのタンパク質の超分子アセンブリーを含む。
【０１１１】
インスリン、グルカゴン、およびカルシトニンなど、広く用いられているいくつかの生物薬剤を誘発してアミロイドを形成することができる。可溶性の前駆体のタンパク質に比べると、アミロイド形成に対する前兆として形成される無定形の凝集物は、安定性の増強、プロテアーゼ耐性、自己増殖、貯蔵期間の延長、高度に組織化された構造などの新規な性質を獲得し、純粋な分子の濃縮された緻密な供給源として働くことができる。
【０１１２】
本発明で開示する分子インスリンアセンブリーは、αへリックスおよびβシート成分の両方を有する規定された構造で存在する。上記に記載した独特の構造を採用することで、溶液における天然インスリン分子からの、その溶解性およびその構造における変化がもたらされる。この超分子構造からのインスリンモノマーの放出は生物学的に活性であり、したがって天然インスリンの構造に類似していることは意義深い。形成されたこの超分子構造に新規な溶解の性質が付与され、この超分子構造がプロドラッグとして、すなわちそれ単独として作用する。そのプロドラッグの形態では、インスリン感受性の脂肪細胞のシグナリング事象またはグルコースの恒常性に対して作用または効果がないことが見いだされていた。これは、in vivoでデポーまたは注射部位からインスリンモノマーの放出によって薬物に変換される。in vitroおよびin vivo両方の結果が、グルコースの恒常性およびI型およびII型糖尿病に対して通常評価される他の臨床パラメータに対する効果を示す生理活性のインスリン分子を放出する製剤の独自性を実証している。
【０１１３】
本発明は、真性糖尿病の処置に有用な超分子インスリンアセンブリーを含む組成物を提供する。超分子インスリンは無定型および発生期のインスリンの原線維オリゴマーのハイブリッドであり、生理活性のインスリンを放出するための徐放製剤として働く。グルコース制御性のホルモンであるインスリンは、環境に応じて六量体、二量体、およびモノマーを含めた様々なオリゴマーの状態の混合として平衡で存在する残基51個のポリペプチドである。膵臓の分泌性の小胞ではインスリンは生理学的pHで六量体として貯蔵され、一方ではモノマーとしてその受容体と相互作用する。低pHまたは強力な変性剤の存在下などの変性の条件下では、インスリンは凝集してアミロイド原線維を形成する(Paul Bevan、Insulin signalling.、  J. Cell Sci.、114巻、1429〜1430頁(2001年))。
【０１１４】
本発明として開示するインスリンの超分子オリゴマーは、6.8から7.8間までの範囲の、好ましくは7.2のpHで調製される。
【０１１５】
本発明は、インスリンモノマーの徐放が可能である超分子インスリンアセンブリーを含む組成物を提供する。所与の超分子インスリンアセンブリーを含む組成物(すなわち、SIA I、II、III、またはこれらの組合せ)は、より良好な血糖コントロールを達成するのに有用である。
【０１１６】
本発明は、インスリンの徐放を達成することによってより厳重な血糖コントロールを達成するのに有用である、インスリンオリゴマーである超分子インスリンアセンブリーIIを提供する。超分子インスリンアセンブリーIIを皮下または筋肉内に投与する場合、約10日から180日までの範囲またはそれを超える長期間、STZ誘導した糖尿病ラットにおいてインスリンの基底レベルを維持し、同時に厳重な血糖コントロールを維持し、したがって真性糖尿病に対して長時間持続する処置を提供する。
【０１１７】
本発明によると、一実施形態は、筋肉内または皮下に投与する場合、0.5〜1.5ng/mlの間の範囲のインスリンモノマーの徐放を引き起こし、少なくとも約180日間続く、超分子インスリンアセンブリーIIを含む組成物を提供する。
【０１１８】
本発明の別の一実施形態は超分子インスリンアセンブリーIIを含む組成物を提供し、超分子インスリンアセンブリーIIから放出されるインスリンモノマーの量は、血清において0.5〜1.5ng/mlの範囲である。
【０１１９】
本発明の一実施形態では、インスリンの超分子オリゴマーを含む組成物の、血中糖レベルのコントロールに対するin vivoの効果を、STZ誘導した糖尿病ラットを用いて立証している。
【０１２０】
本発明の別の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリーを含む組成物の投与量を提供し、約50μgから約400μgまでの範囲の投与量のインスリンを、実験期間中モニターした。
【０１２１】
本発明の別の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリーを含む組成物の投与量を提供し、投与量はインスリン200μgである。
【０１２２】
本発明の別の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリーを含む組成物の投与量を提供し、投与量はインスリン100μgである。
【０１２３】
本発明のさらに別の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリーを含む組成物を提供し、組成物は、約10日から180日までの範囲またはそれを超える期間、注射部位およびその周辺においてインスリン分解酵素活性(IDE)を誘発しない。
【０１２４】
本発明のさらに別の一実施形態では、約10日から150日までの範囲またはそれを超える期間、対象の血清において抗インスリン抗体は非存在である。
【０１２５】
さらに別の一実施形態では、本発明は、安定であり、プロテアーゼ耐性で、約10日から150日までの範囲またはそれを超えるより長い貯蔵期間を有する超分子インスリンアセンブリーを含む組成物を提供する。
【０１２６】
本発明のさらに別の一実施形態では、あらゆる突発的な急速な放出なしに長期間、コントロールされた様式でインスリンモノマーを放出することができる超分子インスリンアセンブリーを含む組成物が提供される。形質転換の動態学はin vivoとin vitroの両方でコントロールできる。
【０１２７】
さらに、本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーを含む組成物は、多回投与のインスリンを毎日投与する必要から患者を解放する、長時間持続する効果を有する単回投与として用いることができる。
【０１２８】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーを含む組成物はインスリンの突発的な大量の放出を示さず、糖尿病の対象における低血糖状態を妨害する。
【０１２９】
本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーを含む組成物は、in vitroおよびin vivoの両方で一定の速度でインスリンモノマーを放出することができる。
【０１３０】
本発明のさらに別の一実施形態では、超分子インスリンアセンブリーのより高次のオリゴマー状態は、糖尿病の対象において空腹時低血糖なしで厳重に制御された血糖のコントロールを達成する。
【０１３１】
本発明のさらに別の一実施形態では、超分子インスリンアセンブリーのより高次のオリゴマー状態は、I型糖尿病の対象において空腹時低血糖なしで厳重に制御された血糖のコントロールを達成する。
【０１３２】
本発明のさらに別の一実施形態では、超分子インスリンアセンブリーのより高次のオリゴマー状態は、2型糖尿病の対象において空腹時低血糖なしで厳重に制御された血糖のコントロールを達成する。
【０１３３】
本発明のさらに別の一実施形態では、本発明の超分子インスリンアセンブリーまたは超分子インスリンアセンブリーを含む組成物で対象を処置した場合、対象の体重の急激な増加は存在しない。
【０１３４】
本発明のさらに別の一実施形態では、対象の腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT)の血中グルコースプロファイルにおいて、超分子インスリンアセンブリーIIからの生理活性のインスリンモノマーの放出において、遊離のインスリンの投与と同様、ラグ期は見られない。
【０１３５】
本発明のさらに別の一実施形態では、超分子インスリンアセンブリーIIからのインスリンモノマーのin vivoの放出に対して、ゼロ次の動態学または徐放が観察される。
【０１３６】
本発明のさらに別の一実施形態では、超分子インスリンアセンブリーIIから放出されるインスリンは、生物学的機能において可溶性インスリンに等しい。
【０１３７】
さらに、本発明の別の一実施形態では、超分子インスリンアセンブリーの毒性は、血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ(SGOT)、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(SGPT)、総ビリルビン、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、血清総タンパク、血清アルブミン、血清グロブリン、血清A/G比、腎機能試験(KFT)、白内障形成、脂肪組織重量、体重および外観に対する生物学的アッセイを行うことによって除外される。
【０１３８】
さらに別の一実施形態では、グルコース注入の速度は処置動物では同じままである。これは、注射部位のデポーから放出されるモノマーは生物学的に活性であり、筋肉および肝臓にグルコースを吸収させるよう刺激することと結論づけられる。
【０１３９】
さらに別の一実施形態では、MCF7細胞に対してMTTアッセイを行って、SIA IIから放出されたインスリンモノマーの構造および結合の動力学が不変であることが実証された。
【０１４０】
さらに、本発明の別の一実施形態では、Wistar系オスラットを、別の化学物質であるアロキサンを用いて糖尿病にした。これらの糖尿病ラットをさらにSIA IIで処置し、STZ誘発した糖尿病ラットと類似する結果が示された。厳重な血糖コントロールが観察された。
【０１４１】
本発明のさらに別の一実施形態では、C57BL/6マウスを、ストレプトゾトシンを用いて糖尿病にし、その後SIA IIで処置し、やはり正常血糖レベルが示された。
【０１４２】
本発明の別の一実施形態は、超分子インスリンアセンブリーは、超分子インスリンアセンブリーの終端から活性のペプチド薬物をコントロール放出するのに有用な安定なデポーであるということである。
【０１４３】
本発明の一実施形態によると、超分子インスリンアセンブリーIIは、糖尿病に対する長時間持続性の処置を提供することができる。
【０１４４】
別の一実施形態では、超分子インスリンアセンブリーの調製に用いられるインスリンは、組換えヒトインスリン、ウシ、およびブタのインスリンであるのが好ましい。
【０１４５】
さらに別の一実施形態では、本発明として開示する超分子インスリンアセンブリーIおよびII(SIA IおよびII)またはこれらの組合せを含む組成物は、II型糖尿病を誘発するためにストレプトゾトシンで処置した動物対象において血中グルコースレベルを低下させることができる。
【０１４６】
さらに別の一実施形態では、より速い速度でインスリンモノマーを放出するSIA Iを、II型真性糖尿病(DMII)に罹患しているラットに投与した。
【０１４７】
本発明の一実施形態にしたがって、SIA IIを処置のためにDMIIラットにやはり投与した。
【０１４８】
さらに別の一実施形態では、SIA IおよびIIの両方で処置した糖尿病ラットは、食前および食後の(180±15mg/dl)の状態において、高い方の側と隣接しているほぼ正常の血糖レベルを示した。
【０１４９】
本発明のさらに別の一実施形態では、注射するSIA IIの投与量は、皮下および筋肉内の両方の2ヶ所において150μgであった。
【０１５０】
本発明の別の一実施形態は、最高30日間ほぼ正常の血糖レベルを維持する、SIA IおよびIIの能力を実証する。
【０１５１】
さらに別の一実施形態では、インスリン治療と一緒のエキセンディン-4の投与は、最高45日間、ほぼ正常の血糖レベルを維持することができ(135±10mg/dl)、DMIIを処置するためのより良好な製剤であった。
【０１５２】
さらに別の一実施形態において、非常に遅い速度であるが(0.05〜0.3ng/ml)インスリンモノマーを放出するSIA IIIは、境界型の糖尿病患者、すなわち治療として非常に少量のインスリンを必要とする、前糖尿病の対象、またはグルコース負荷試験において予後の劣る対象の処置に有用であり得る。
【０１５３】
本発明のさらに別の一実施形態では、糖尿病ラットの血清において検出されるヒトインスリンのレベルは、約0.7〜0.85ng/mlである。
【０１５４】
本発明のさらに別の一実施形態では、処置の有効性を実証するために、トリグリセリド(TAG)、遊離脂肪酸(FFA)など、さまざまな血清パラメータを評価した。
【０１５５】
さらに別の一実施形態では、血清におけるTAGのレベルはエキセンディン-4処置ラットに対して0.45〜0.6mmol/lの範囲であったが、これはコントロールとほとんど同じである。
【０１５６】
さらに別の一実施形態では、血清におけるFFAレベルはエキセンディン-4処置ラットに対して約0.85〜0.9mmol/lであると推定されたが、これはコントロールとほとんど同じである。
【０１５７】
本発明のさらに別の一実施形態では、処置動物の体重の増加はコントロールのラットの増加とほとんど同じであった。
【０１５８】
さらに別の一実施形態では、現在の方法論は、ペプチド、タンパク質、または小分子を用いて持続的かつ連続的な治療が必要とされる慢性および炎症性疾患に拡張することができる。
【０１５９】
本発明の実施例1および2は、超分子インスリンアセンブリーIIを調製するためのプロセスを提供する。図1は、チオフラビンT(Th-T)の蛍光を用いてモニターしたインスリン(ヒトおよびウシの両方)原線維の形成の詳細を提供する  (Le Vine、H. Quantification of β-Sheet Amyloid Fibril Structures with Thioflavin T. Methods Enzyrnol、309巻、274〜284頁(1999年))。ウシインスリンによる原線維の形成は、インスリンをpH7.0(50mM PBS)およびpH2.0(塩酸水溶液)の両方で、37℃、180rpmで撹拌した場合、Th-T蛍光の獲得によって注目されていた(図1)。インスリン原線維へのその結合によって生じたTh-T蛍光における増大は、pH7.0でインキュベートしたインスリンでは48時間で最大値に達したが、一方pH2.0では原線維の形成は急速であり、したがってTh-Tの蛍光は20時間で最大値を達成した。図1は、ウシおよびヒト両方のインスリンによる原線維の形成を比べたものである。
【０１６０】
本発明の実施例3は、超分子インスリンアセンブリーIIからのインスリンモノマーの放出の動態学を提供する。超分子インスリンアセンブリーの形態のインスリンは、長時間、インスリンモノマーの徐放のための貯蔵所として作用する(図2a)。そのアミロイドからのインスリンモノマーの放出、およびインスリンの様々な超分子アセンブリーが注目され、図2bおよびcに図示してある。十分に形成されたアミロイド線維は、pHに関係なく、ごくわずかなインスリンを放出する。pH2.0では、超分子インスリンアセンブリー中間体、特に超分子インスリンアセンブリーIIは非常にゆっくりとした速度でインスリンを放出し、これらのオリゴマーが頑丈かつ厳重に会合していることを示唆している。しかし、pH7.0の中間体(超分子インスリンアセンブリーIIと呼ぶ)は600nmで濁度0.9〜1.3を示し、かなりの速度でインスリンを放出する。15±5日の期間にわたる、280nmの吸光度でのインスリンモノマーの放出における直線状の増大が観察される。1mlという一定の体積のもとでSIAからのインスリンの放出を観察した場合は、ベル型の曲線が観察された(図2d)。これは、オリゴマー形成の手順が可逆的であり、遊離インスリンとSIAとの間に平衡が存在することを実証している。放出されたサンプルのチロシンの蛍光は、図2aで提供されるこれらの知見を確証するものであった。インスリンアミロイドの中間体である、超分子インスリンアセンブリーII(あるいはインスリンプレアミロイドIIと呼ぶ)は、in vitroで1時間あたりインスリンモノマー2〜4μM(0.4〜0.1IU)を徐放するという必要性を満たしており、それによって、in vivoで、身体におけるインスリンの基底レベルを維持するための一定であるがゆっくりとした放出を実現している。
【０１６１】
実施例4は、コンゴーレッド(CR)結合を用いた超分子インスリンアセンブリーの特徴づけを提供する(Klunk, W.E.、Jacob, R.F.、およびMason, R.P.、Quantifying amyloid by Congo red spectral shift assay.、Methods Enzymol、309巻、285〜305頁(1999年))。Th-T同様、CRもアミロイドのβシートリッチな構造に特異的に結合し、これらの検出にルーチンに用いられていた。50μM CRのPBS溶液中、37℃で1時間インキュベートしたサンプルに対するCRの結合を、400〜600nm領域をスキャンすることにより、その吸収極大における赤色のシフトによってモニターした。図3は、超分子インスリンアセンブリー(rHおよびウシ)はCRに対して弱い結合を表すが、pH2.0および7.0で十分成長させた線維は著しい結合を示したことを提供するものである。
【０１６２】
実施例5はチロシン蛍光試験を提供する。実施例6はフーリエ変換赤外線分光法試験を提供する。超分子インスリンアセンブリーI、II、およびIIIを、また、ATR-FTIRを用いて特徴付けた。各ステージに対応する別々のスペクトルが観察された(図4)。より低い振動数へのIRバンドのシフトが観察される。超分子インスリンアセンブリーIIは1647〜1645cm-1に鋭いピークを有し、一方、十分に形成されたインスリン原線維(アミロイド)は、ウシおよびrHインスリンそれぞれに対して1630〜1628 cm-1にピークを有する。超分子インスリンアセンブリーIIのFTIRスペクトルは、CRのデータとよく一致し、ランダムコイル構造の内容物において増大があるものの、タンパク質がいまだ大部分がらせん状であることを示している。
【０１６３】
pH2.0および7.0で形成した線維の形態学を、それぞれ実施例7および8に提供するように、原子間力顕微鏡(AFM)および透過型電子顕微鏡(TEM)によって評価した。pH7.0およびpH2.0の天然インスリン分子は(ウシおよびrHの両方とも)、1.3±0.21nmの高さのランダムな分布を示し、これはインスリンモノマー(1.11nm)およびダイマー(1.49nm)の次元に相関している(図5(i))。pH7.0の線維化プロセスの中間体を、ウシインスリンに関して図5(ii〜iv)、rHインスリンに関して図5(v〜vi)に示す。SIA Iは真珠様配列を有する細長いクラスターを表している。その間に、高さ12±2nmのいくつかの細長い直線状の粒子が存在し、より高いオリゴマー状態へのさらなる会合を示唆している。SIA II中間体は、ウシおよびrHインスリン両方の場合に上記に記載した細長いクラスターの直線状の会合として見られ、超オリゴマーの構造上の組織との独特な実体を有している。SIA III(SIA IIに続く原線維状態)は、より高いオリゴマー構造の密度における増大を示した。pH7.0で十分に成長した線維は、インスリンアミロイドの典型的な交差β構造を表している(図5(vii))。6〜7時間の、pH2.0の線維化プロセスの中間体は、高さ7.2〜8.3nmの2つの原線維の横方向の会合を明らかにしており、20時間後には幅10〜12nmの大型のねじれた線維が観察された(図5ixおよびx)。
【０１６４】
実施例8は、可能なインスリンのアセンブリーの存在を評価するための透過型電子顕微鏡観察(TEM)を提供する。TEMの顕微鏡写真は、超分子インスリンアセンブリーIIステージにおけるいくつかの無定形かつより高いオリゴマーの構造の存在を示している(図6i)。超分子インスリンアセンブリーII後のステージ(図6ii)は、(図6iiiおよびiv)に示すものよりも多い原線維構造を有する。これとは対照的に、インスリンをpH2.0でインキュベートした場合には、原線維の形態が大量に存在する(図6v)。
【０１６５】
実施例9は、アミロイドおよび超分子インスリンアセンブリーの形態の有効性を試験するために用いられる動物モデルの詳細を提供する。本発明者らは、糖尿病の処置において、SIAの仮説および治療上の可能性を試験するために4つの異なる糖尿病モデル、すなわち(a)STZ処置ラット、(b)アロキサン処置ラット、および(c)STZ処置マウス、(d)STZウサギを用いた。
【０１６６】
投与量を標準化するために、超分子インスリンアセンブリーII50μg、100μg、200μg、および400μgを、糖尿病ラットに皮下的に、および代替的に筋肉内に注射した。図7aおよびbにまとめたように、ウシおよびヒトそれぞれの超分子インスリンアセンブリー200μgを用いた場合の135および160日に比べて、超分子インスリンアセンブリー50μgおよび100μgの単回投与は、それぞれ最高10および30日のみほぼ正常の血糖レベルを維持した。投与量400μgの場合は、用いた経路に関係なく急激な食後正常血糖および空腹時低血糖が観察され、ウシインスリンのSIAデポーからの基底レベルのインスリンモノマーの最初のボーラスの放出を示唆していた。治療用投与量として超分子インスリンアセンブリー200μgの使用が、詳細な長期の前向き研究に選択された。
【０１６７】
実施例10は、超分子インスリンアセンブリー形態のインスリンでの、糖尿病動物の処置を提供する。複数のグループに割り当てられたSTZ誘発した糖尿病ラットを、血中糖レベルのコントロールに対する超分子インスリンアセンブリー治療のin vivo効果を試験するために、インスリン(4IU/kg、IP)、超分子インスリンアセンブリー(SCおよびIMの両方200μg)でそれぞれ処置した。さらに、PBS処置した糖尿病ラットの1グループおよび正常ラットの別の1グループを、糖尿病および非糖尿病のコントロールとして供した。ラットの食前および食後の血中グルコースレベルを、インスリンの生理学的効果が観察されるまでの期間、モニターした。図8aおよびbに示すように、超分子インスリンアセンブリー200μgでの処置は、STZ誘発糖尿病ラットにおける超分子インスリンアセンブリーデポーからのインスリンモノマーの持続的かつゆっくりとした放出によって基底レベルのインスリンを維持し、空腹時低血糖なしに食後血中グルコースレベルにおける著しい低減がもたらされた(図9aおよびb)。超分子インスリンアセンブリーを皮下の経路で注射しても、筋肉内の経路で注射しても、有意差は観察されなかった。遊離インスリン(すなわちその正常の対応物、超分子的に組織化された形態ではないもの)処置の場合は(4IU/kgの単回投与量)、日常の血中グルコースは食後値の350〜450mg/dlおよび空腹時300〜400mg/dlのみに低下した。インスリンを毎日腹腔投与した糖尿病ラットは、高血糖性の血中グルコースレベルを維持した(300±100mg/dl)。遊離インスリン処置とは対照的に、毎日の投与が、血中グルコースが非常に高レベルに下降するのを防ぐのに必要とされていた場合、糖尿病ラットにおいて3カ月間空腹時低血糖(90±50mg/dl)なしにほぼ正常の血糖レベル(150±60mg/dl)を達成するのに、超分子インスリンアセンブリーの1回の注射で十分であった。図8bおよび9bに図示するように、ヒトインスリンから形成した超分子インスリンアセンブリーで同様の結果が得られた。図10から明らかであるように、pH7.0および2.0で形成したインスリンアミロイドを投与しても、糖尿病ラットの糖血症の状態に有益な効果はなかった。さらに、処置の全期間にわたって全ての場合において、正常な健康の指標である体重を、BGLと一緒にモニターした。図11に示すように、STZ処置直後に体重の最初の減少があったが、超分子インスリンアセンブリーIIでの処置後の糖尿病ラットに進行性の体重の増加が達成され、超分子インスリンアセンブリー処置動物の曲線は、非糖尿病のコントロールのものと平行していた。このように、真性糖尿病の長期処置に用いるための超分子インスリンアセンブリーIIの驚くべき有効性は、従来の方法を凌ぐ改善と考えられている。
【０１６８】
実施例11は、超分子インスリンアセンブリーが持続的にインスリンを放出する効力を評価するための腹腔内グルコース負荷試験を提供する。インスリンのin vivoの放出をモニターした。放出されたモノマーの生物学的活性を、血液からの血糖処理によって評価した。行った独立した実験の詳細を図12に示す。PBS、超分子インスリンアセンブリーII、およびインスリン処置時、グルコースレベルを、空腹正常マウスおよびSTZ処置マウスにグルコースを投与前(T0)、ならびに後30、90、150、270、および330分に測定した。図12に示すように、インスリン注射、超分子インスリンアセンブリーII処置、またはin vitroで放出されたモノマー単独は、処置動物におけるグルコース負荷試験を著しく改善し、これら上昇した血中グルコースレベルはグルコース注入後、1.5時間以内に誘発前のレベルに復帰した。
【０１６９】
実施例12は、超分子インスリンアセンブリー投与時のウシおよびrHインスリンの血清インスリン定量を記載したものである(図13a)。血清インスリンは、ウシおよびrHインスリンSIA IIに対してそれぞれ最高150および180日の期間検出可能であり、これらはBGLにおける低減に対応していた。血中グルコースレベルにおける低減は、ウシおよびrHインスリンSIA IIに対してそれぞれ最高150および180日の期間持続し、超分子インスリンアセンブリーIIの単回投与で20〜25週を超える間、ほぼ正常のグルコース値を維持した。固体状態ELISAを行って、正常血中グルコース値の維持を担うインスリンSIA IIから放出されるインスリンの血漿レベルを定量した。予想通り、PBS処置糖尿病ラットではインスリンレベルは検出不可能(0.08ng/ml)であったにのに比べて、超分子インスリンアセンブリー処置糖尿病ラットの場合には、基底レベルまたはわずかに基底を上回る(0.5〜1.2ng/ml)レベルのインスリンの放出が達成された(図13aおよびc)。経路に関係なく、最高150〜180日の注射の日からインスリンの徐放(0.8〜1.1ng/ml)が観察され、超分子インスリンアセンブリー処置した動物におけるほぼ正常の血糖値に寄与していた。動物によっていくつかの変動が見られたものの、インスリン放出の顕著な値が、0.5〜1.2ng/mlの範囲で達成され得た。この基底レベルは、超分子インスリンアセンブリーが消耗するまで正常血糖レベルを維持するのに十分であった。しかし、インスリン処置糖尿病動物では比較的高い血清レベルの平均値が検出されたが、動物間で高度の変動があった。これは、インスリン処置単独による、対象間のBGLにおける変動性に起因し得る。血清インスリンレベルも、それに対するグルコースデータがすでに示されている、行ったグルコース負荷試験に対して定量した。図13bは、IPGTT実験における最高270分のラット血清におけるウシインスリン値を記載している。PBSだけを投与したコントロールおよびSTZ処置ラットの両方の場合、ウシインスリンの値はほとんど無視できる(図13b)。ところが、インスリン投与の場合は、インスリン値は30分で〜0.9ng/mlに増大し、次いである期間の時間にわたって低下する。遊離のインスリンに等しい定期に放出されたインスリンを用いた場合、同様のプロファイルが観察された。これは、血中グルコースレベルにおける低下に相当し、その後、インスリンの取り込みおよび分解によりグルコースレベルは増大する。一方、超分子インスリンアセンブリー処置では、ウシインスリンの定量によって見られるように、血清におけるインスリンレベルは30分で基底レベルに等しい0.8〜0.9gn/mlに到達し、次いで試験の期間にわたって一定であり続けた。この持続性の基底レベルにより、レベルを大幅に低下させ動物を低血糖にする代わりに、正常血糖レベルを確実にしている。さらに、ラットインスリンELISAを行って、コントロールラットおよびSTZ処置ラットの両方に対して血清インスリンレベルを評価した。図13cに示すように、ラットの基底インスリンレベルは0.501ng/mlであり、増大は注入したグルコースに反応して多様である。STZ処置ラットの場合は、STZにより膵臓β細胞が破壊されるので、インスリンの基底レベルはほとんど無視できる。これは、超分子インスリンアセンブリー処置の場合に見られる血中グルコースレベルの低下は、SIA IIから���出されたウシ/rHインスリンの放出によることを確証している。インスリンSIA IIの調製のプロセスにおいては、それだけには限定されないがブタインスリンからなる群から選択される、ウシおよびrHインスリン以外のインスリンが用いられる。
【０１７０】
実施例13は、SIA IIの末端からのin vitroの放出を実証し定量するためのインスリンのI125標識化を提供する。標識したインスリンから形成された超分子インスリンアセンブリーIIは、49912CPM/ml/μgの特異的な活性を有する。超分子インスリンアセンブリー(4991200CPM)50μlを皮下および筋肉内に注射し、血中グルコースレベルをモニターし、血清サンプルを0、30分、1時間、4時間、10時間、24時間、それ以降は1日1回、次いで隔日または週1回採取した。血清1mlあたりの計数値を測定した(図14a)。示したように、血中グルコースプロファイルは、非標識のSIA IIで観察されたものと同じであった。計算したCPM/mlは、処置の日数に対してプロットした場合、ほぼ一定のままであった(図14a)。しかし、30分〜4時間には最初の高計数値があり、これは次いで徐々に低下して10時間で2000〜3000の一定レベルになった。血液中に放出されたインスリンの量を計算し、これは0.5〜1.2ng/mlの範囲であり、ELISAで観察された血清におけるインスリンの基底レベルに対応し、またはわずかに基底レベルを上回っていた(図14b)。超分子インスリンアセンブリーから放出されたインスリンがモノマーであることをさらに証明するために、様々な時間点の血清をトリシン-SDS-PAGE上で分離し、放射線写真を蛍光体画像を用いて現像した。図15に示すように、血清におけるバンドは遊離のインスリンモノマーに対応し、その強度は、等量の血清をロードした場合に長時間一定のままであった。20日後、強度における低減が観察され、放射標識それ自体の崩壊のいくつかの効果とともに、ある期間にわたる超分子インスリンアセンブリーのデポーの使用および枯渇が示された。
【０１７１】
実施例14は、注射したSIA IIからのインスリンモノマーのゆっくりとした、連続的な放出を評価するために行われた高血糖クランプ試験を記載している。1週間、1カ月、および3カ月の時間間隔では、高血糖状態を維持するために注入するグルコースの速度は、実験の経過中、変化しないままであった。これは、注射部位のデポーからインスリンの一定の放出が存在することを示している。遊離インスリンを投与した群の場合は、注入したグルコースの量は時間とともに低下したが、これは遊離インスリンの連続的な供給の非存在下において、筋肉および肝臓による血中グルコースの取り込みが低下するためである。
【０１７２】
実施例15は、インスリンが細胞表面上のインスリン受容体に結合した後に開始する細胞内シグナリングカスケードによって媒介されるラット脂肪細胞の1次培養を行うことによる、脂肪組織におけるグルコース輸送および他の代謝事象に対するインスリンの効果を提供する(Paul Bevan、Insulin signalling.、J. Cell Sci.、114巻、1429〜1430頁(2001年))。細胞におけるインスリンの効果は、PI3K、AKT、およびERKなどの細胞内メディエーターの活性化によって媒介される。PI3キナーゼおよびAktの活性化はインスリン誘導性のグルコースの取り込みおよびGLUT-4小胞の原形質膜への移行を媒介し、脂肪分解の阻害、ならびに脂肪酸、グリコーゲン、タンパク質、およびDNA合成の活性化を含めた様々な他のインスリンの効果に関与している。一方、細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)経路の活性化は、前脂肪細胞の成長因子への分裂促進的な反応に関係している。インスリンシグナリングの下流の第1のキナーゼであるPI3Kのレベルを試験した。図17aに示したように、超分子インスリンアセンブリーおよびこれからin vitroで放出されたインスリンを用いてコントロールと比べた場合、PI3Kのレベルは著しく増大する。インスリンに比べて、著しい相違は観察されなかった。総タンパク質、およびAktのレベルの活性化、インスリンの作用の制御に重要なスレオニン/セリンキナーゼ、および脂肪細胞におけるその様々な代謝上の反応も評価した。遊離インスリンで観察された反応と再び類似する、p-Aktレベルにおける著しい増大が観察された。Akt総タンパク質レベルにおける違いは存在せず、それゆえ、インスリンまたはその超分子インスリンアセンブリーIIの存在におけるその発現における違いは観察されなかった。観察される時間的なプロファイルおよび脂肪細胞におけるAktリン酸化のレベルが、Akt活性における違いに平行するか否かを評価するために、内因性のAkt基質であるGSK3βを、GSK3βおよびp-GSK3β〜に対する抗体を用いて免疫ブロッティングによってモニターした。GSK3βはAktによってser-21上で直接リン酸化され、そのリン酸化後に不活性化された。GSK3βのリン酸化は、コントロールに比べて、遊離インスリンまたは超分子インスリンアセンブリーIIのいずれかで処置した脂肪細胞において数倍増大し、処置細胞間で著しい違いはなかった。全GSK3βタンパク質レベルにおける違いは観察されず、処置後のその発現における変化がないことが示唆された。したがって、AktもGSK3βも、超分子インスリンアセンブリーII、および超分子インスリンアセンブリーから放出されたインスリンに対して迅速かつ明白な反応を示し、コントロールとして用いた遊離インスリンでの刺激に観察された反応に類似していた。このキナーゼは脂肪細胞の転写因子のインスリン媒介性の制御および脂肪組織の発生に関わっているので、超分子インスリンアセンブリーでの処置におけるERKの活性化、および脂肪細胞においてそれから放出されるインスリンが観察された。インスリン、超分子インスリンアセンブリー、および超分子インスリンアセンブリーから放出されたインスリンでの脂肪細胞を処置した時に、コントロールに比べて、ERK1/2の著しい活性化が観察された。ERK2のリン酸化はERK1よりも2倍高く、処置時にERK2がより発現することを示唆していた。SIA、インスリン、または血清処置した細���において、ERK1/2のリン酸化パターンにおける著しい違いはなかった。したがって、超分子インスリンアセンブリーIIおよびインスリン処置細胞におけるERKのリン酸化は、PI3K、Akt、およびGSK3βが媒介するシグナリングの状況において類似していた。インスリンまたはそのSIA II処置した動物からの血清を培養脂肪細胞に加えた場合、シグナリングメディエーターの同様の活性化が観察された(図17b)。まとめると、これらのデータは、超分子インスリンアセンブリーIIから放出されたインスリンは、インスリンそれ自体として脂肪細胞におけるインスリンシグナリング経路を活性化することができることを実証している。そのモノマーの形態におけるインスリンは、その超分子インスリンアセンブリーから主に放出されているので、観察される効果はさらに良好である。
【０１７３】
実施例16は、インスリン、超分子インスリンアセンブリー、およびin vitroで放出されたインスリン(モノマー)、ならびにインスリン、超分子インスリンアセンブリー、およびPBSで処置したラットからの血清のウエスタンブロット分析を記載している。
【０１７４】
実施例17は、インスリンの超分子インスリンアセンブリーの組織学的および免疫組織学的な詳細を記載している。超分子インスリンアセンブリーで処置した糖尿病ラットを、1週間から12週間までの注射の日からの、超分子インスリンアセンブリーの残留量の存在に対してモニターした。皮下および筋肉組織における超分子インスリンアセンブリーの沈着物を、コンゴーレッドを用いて検出した。皮下および筋肉組織の切片を、材料と方法に記載した通りに調製し、染色し、分析した。超分子インスリンアセンブリーの注射24時間後に得た組織は、コンゴーレッドと効果的に結合していることが見出され、より多量の超分子インスリンアセンブリー原線維が存在することが確証していた(図18)。コンゴーレッドの結合は時間依存性の様式で低下し、16週間後にはごくわずかであり(図18a(i〜x)、およびb(i〜x))、超分子インスリンアセンブリー沈着物の末端からインスリンが放出されていることを確証していた。同じ組織を、H&Eおよび免疫染色によって、超分子インスリンアセンブリーによって引き起こされる炎症に対してやはり調べた。代表的なスライドをH&E染色法、および炎症細胞の存在に対する免疫組織化学に供した(図18a(xi〜xx)、およびb(xi〜xv))。
【０１７５】
炎症誘発性の細胞の浸潤がH&E染色した皮下および筋肉組織の両方で観察可能である、LPS注射したラットからの切片に比べて(図19a(i〜ii))、超分子インスリンアセンブリーを注射した切片は16週間後でも炎症のあらゆる徴候を示さなかった(図18a(xi〜xv)およびb(xi〜xv))。同様の結果が、大腸菌からのLPSが注射部位に72時間後に炎症誘発性の細胞を大量に誘引するのに十分であった免疫染色したスライドの場合に観察されたが(図19a(iii〜iv))、超分子インスリンアセンブリーで処置した動物ではそのような反応は観察されなかった(図18a(xv〜xx)およびb(xi〜xv))。これらの知見は、非毒性の性質の超分子インスリンアセンブリーが用いられたことを強調している。図19bに見られるように、皮下注射した場合、pH2.0で形成されたアミロイドは非常に効率的にコンゴーレッド色素に結合している。さらに、デポーにおける低下はなく、完全に形成されたアミロイドからインスリンモノマーの放出は起こらないというデータを裏付けている(図19b i〜viii)。
【０１７６】
実施例18は、糖尿病のアロキサンモデルを記載している。Wistar系オスラットをアロキサンを用いて糖尿病にし、その血中グルコースレベルをモニターした。超分子インスリンアセンブリーIIを糖尿病ラットに投与すると、血中グルコースレベルをほぼ正常の血糖レベルに低下させ、食前および食後の状態両方において、>120日までの間厳重な糖コントロールを維持した(図20aおよびb)。ELISAを用いて血清インスリンの定量を行った。処置ラットの血清において、注射の日からヒトインスリンの持続的かつ一定の放出が観察される(0.5〜0.9ng/ml)(図20c)。このように、糖尿病ラットにおけるグルコースレベルの低下によって見られる生理学的効果は、注射部位に形成されたSIA IIデポーからのインスリンモノマーの連続的な放出によるものである。
【０１７７】
実施例19は、I型糖尿病における高血糖に関連する2次合併症の低減である。1型糖尿病病では、インスリンの供給が不十分であり、そのため骨格筋におけるタンパク質の分解および脂肪細胞における脂肪分解の増大がもたらされる。糖尿病ラットは、骨格筋(〜20〜40%)および腹部脂肪(>60%)における顕著な低減を示した(Nathan, D. M.、Cleary, P. A.、Backland, J. Y.ら、Intensive diabetes treatment and cardiovascular disease in patients with type 1 diabetes.、N. Engl. J. Med.、353巻、2643〜53頁(2005年))。これとは対照的に、超分子インスリンアセンブリー処置した糖尿病動物は、これらの組織に対して体重は正常であり、健康であった。糖尿病ラットおよびインスリン処置したラットにおいて白内障の発症が観察された(図21)。一方、図21で実証されるように、SIA IIで処置した動物には白内障の形成は観察されず、非処置のラットの大多数は白内障を示した。さらに、糖尿病において典型的かつ重篤に冒される身体の2つの主要な器官である肝臓および腎臓の機能は、非処置または遊離のインスリンを注入したラットに比べて、超分子インスリンアセンブリーII処置ラットにおいて正常であり、これを表1にまとめてある。
【０１７８】
心臓、腎臓、および肝臓の切片を、12週間後、糖尿病ラットに、より高いオリゴマーのSIA IIを注入した沈着に対して試験し、コンゴーレッド色素を用いて可視化した(図22)。あらゆる組織切片において、オリゴマーの沈着物は観察されなかった。
【０１７９】
実施例20は、インスリン分解酵素(IDE)の検出の詳細、およびインスリンに対する抗体のスクリーニングを提供する。1型糖尿病におけるインスリンに対する皮下の耐性は、希な症候群であり((Paulsen, E.P.、Courtney, J.W.、およびDuckworth, W.C.、Insulin resistance caused by massive degradation of subcutaneous insulin.、Diabetes、28巻、640〜645頁(1979年)、ならびにFreidenberg, G.R.、White, N.、Cataland, S.、O'Dorisio, T.M.、Sotos, J.F.  、およびSantiago, J.V.、Diabetes responsive to intravenous but not subcutaneous insulin: effectiveness of aprotinin、N. Engl. J. Med.、305巻、363〜368頁(1981年))、皮下注射したインスリンの生物学的活性の欠如と定義されるが、それでもやはり静脈内注入されたインスリンの効力は保持される。これは、主に、皮下組織においてIDEがインスリンの分解を増大するゆえである。IDEはインスリンを特異的に分解し(Duckworth, W.C.、Bennett, R.G.、およびHamel, F.G.、Insulin degradation: progress and potential、Endocr. Rev.、19巻、608〜624頁(1998年))、部分的に分解されたインスリンはは循環中に再吸収され、免疫原性は増大するが生物学的活性はない。IDEはインスリン反応性の組織に、ならびに単球およびリンパ球などのインスリン非感受性細胞に存在する。超分子インスリンアセンブリー処置した動物におけるこのような耐性の発生を調べるために、IDEの生物学的活性および高インスリン抗体の存在を方法のセクションで記載する通りに決定した。IDE活性は、超分子インスリンアセンブリー処置した動物からの血清サンプル全て(1〜12週)でごくわずかであった(図23)。同様に、処置12週後でも抗インスリン抗体の存在はなく、IDE活性の非存在を支持していた(図24)。
【０１８０】
超分子インスリンアセンブリーIIから放出されたインスリンモノマーが、その構造またはその結合の動力学においていかなる変化を受けたか否かを見るために、MCF7細胞系に対してMTTアッセイを行った。MCF7細胞の増殖は、培養物にSIAを加えた場合、天然インスリンを加えたこれらの細胞の増殖に類似していた。さらに、形成されたSIA IIから放出されたモノマーも、同じ細胞増殖の動態学を示した。インスリン様成長因子Iを、MCF7細胞に対する増殖の陽性コントロールとして用いた(図25)。インスリンおよびIGF1は類似の構造を有しており、他者の非存在下において各々が他方の受容体に結合することができる。しかし、IGF1は分裂促進的であるが、インスリンがインスリン受容体またはIGF受容体に結合しても、細胞の増殖を引き起こさない。このように、SIA IIから放出されたモノマーは、天然のインスリンと同じ結合の動態学を有し、あらゆる構造的変化を経験しない。
【０１８１】
実施例21は、マウスにおける糖尿病の誘発に対するストレプトゾトシンモデルを記載している。STZを用いて糖尿病にしたマウスにおけるヒトおよびウシSIAに対する投与量反応である。糖尿病マウスに、様々な投与量のSIAをそれぞれ、20、50、100、および200μg投与すると、それぞれ5、15、30、120日間、正常/ほぼ正常の血糖を維持した(図26a〜c)。
【０１８２】
実施例22は、ウサギにおける糖尿病の誘発に対するストレプトゾトシンモデルを記載している。糖尿病ウサギに、1mg/kg体重のrHインスリンSIA IIを投与すると、少なくとも80日間正常/ほぼ正常の血糖を維持した(図27)。
【０１８３】
実施例23は、エキセンディン-4と一緒に超分子インスリンアセンブリーで行った実験の詳細を提供する。II型糖尿病を処置するために、超分子インスリンアセンブリーまたはエキセンディン-4を投与した。投与した治療は、血中グルコースレベルを低下させることができ、糖尿病ラットで>30日まで、ほぼ正常の血糖レベルを維持した(図28)。TAGおよびFFAのレベルも、インスリンのみ、またはPBS処置ラットに比べてほとんどおよそ正常に留まり、表2に示すように、レベルは血清において最高1.5倍に増大した。
【０１８４】
本発明の超分子インスリンアセンブリー製剤は、長期間インスリンモノマーを放出するという驚くべき結果を示す。さらに、本発明の超分子インスリンアセンブリーIIは急激に大量のインスリンの放出を表さず、STZ処置糖尿病ラットにおける低血糖状態を妨害する。上記の予期せぬ結果を検証するために、pH7.0のインスリンの線維化プロセス間に得られたインスリン超分子アセンブリーIIの中間体を評価した。中間体の超分子インスリンアセンブリーIIは、長期間インスリンモノマーを一定の速度で放出することが見出されている。選択された中間体(超分子インスリンアセンブリーII)は、コンゴーレッドとの著しい結合を示さず、それがアミロイド状態に進行できないことを示しており、また、AFM分析により優勢な種として細長いオリゴマーの直線状の会合の存在が確認された。高度にねじれた完全に成長した線維の高さが12±5nmであるのに比べてこの独特な実体の高さは18±5nmであり、超分子インスリンアセンブリーを形成する細長いオリゴマーは膨張し、天然様の構造を保持していることを示唆している。同様の、非線維の構造が、TEM試験によってやはり観察される。インスリンの生物学的有効性は、血液における血糖レベルを制御するその能力によって一般的に評価される。血中グルコース濃度における得られた低下は、最も注目すべき、かつ治療上最も重要なインスリンの効果を表している。1日1回のインスリン注射との比較を超分子インスリンアセンブリーの単回投与で処置したSTZ誘発した糖尿病ラットにおける血糖コントロールの効率を評価した。超分子インスリンアセンブリー処置およびインスリン注射の両方とも、高血糖の重症度を低減した。インスリン処置に比べて、本発明の超分子インスリンアセンブリーの単回投与は、約150〜180日の期間、糖尿病動物においてほぼ正常の血糖レベル(120mg/dL)を維持する。
【０１８５】
本発明は、血中グルコースレベルの制御における超分子インスリンアセンブリーII治療の効果をさらに評価するものである。超分子インスリンアセンブリー処置した糖尿病動物を一夜絶食させた。これらの絶食動物は正常範囲内(60〜100mg/dl)に空腹時血中グルコースレベルを維持することができ、食前低血糖は観察されなかった。まとめると、これらのデータは、従来のインスリン治療に比べて、超分子インスリンアセンブリーIIのより高いオリゴマー状態は、糖尿病動物において空腹時低血糖なしに厳密に制御された血糖コントロールを達成することを示している。
【０１８６】
本発明は、超分子インスリンアセンブリーII処置の、体重に対する効果をさらに評価する。腹腔内グルコース負荷試験を行って、重症の高血糖の場合の超分子インスリンアセンブリーの作用の開始を決定した。IPGTT血中グルコースプロファイルは、インスリンおよび超分子インスリンアセンブリー処置の両方とも30分以内にその効果を示したことを示しており、超分子インスリンアセンブリーIIデポーからの生物活性のインスリンモノマーの放出にラグ期がないことを示唆していた。
【０１８７】
本発明は、ELISAを用いた血清中のウシ/ヒトインスリンの定量によって、超分子インスリンアセンブリーからのin vivoのインスリン放出のプロファイルを提供する。in vitroで観察されるS字形の放出の動態学とは対照的に、超分子インスリンアセンブリーからのインスリンモノマーのin vivoの放出は、徐放に対して予想されるゼロ次の動態学にしたがった。正常血糖を維持するためのインスリンの基底および基底を上回るレベル(0.5〜1.2ng/ml)の徐放が見られ、これは処置の期間との相関が良好であった。上記の放出の動態学を確証するために、125Iでインスリンの放射標識を行い、125I標識した超分子インスリンアセンブリーを、STZ処置動物に皮下または筋肉内のいずれかで注射した。インスリンの放出量を、CPM/mlをモニターすることによって測定した。特定の時間点で血清に放出されるインスリンを定量するためにCPM/ml/μg(49912)を用い、これはELISAを用いて定量したウシインスリンの量と平行していた。計数値を測定した後、血清サンプルをトリシン-SDS-PAGE上で分離した。発色させた蛍光体画像は、インスリンモノマーに対応するバンドを示した。超分子インスリンアセンブリーデポーから放出されたインスリンモノマーは、インスリン反応性脂肪細胞におけるインスリンシグナリングカスケードを効果的に誘発した。in vitroおよびin vivo(血清)で超分子インスリンアセンブリーから放出されたインスリンを単離した脂肪細胞に加えると、シグナリング経路の細胞内メディエーター(すなわち、PI3K、Akt、ERK1/2、およびGSK3β)を活性化することができた。したがって、超分子インスリンアセンブリーデポーから放出されたインスリンモノマーは生物学的に活性であり、身体におけるグルコース恒常性を制御するインスリンと同じ機序にしたがう。組織化学も、動物に注射した超分子インスリンアセンブリーIIが、そこから生物活性のインスリンのゆっくりとした持続的な放出が存在するデポーを形成することを提供している。さらに、皮下または筋肉内に注射したLPSに反応した白血球の浸潤に対抗した炎症は観察されない。
【０１８８】
本発明は、超分子インスリンアセンブリー治療が、糖尿病動物に重大な生理学的利益を付与することを提供するものである。これは、血糖コントロールの著しい改善、ならびに、表1に提供するような糖尿病ラットにおける肝臓および腎臓の機能の改善による尿素およびクレアチニン濃度の明らかな低下に部分的に反映される。
【０１８９】
本発明は、超分子インスリンアセンブリー投与時の、血清における抗インスリン抗体およびインスリン分解酵素(IDE)の詳細を提供する。12週目の終わりまでに抗インスリン抗体が非存在であることによって、真性糖尿病に対する処置としての超分子インスリンアセンブリーの価値が加わる。注射部位またはその周囲にIDEを誘発する能力がないことが、超分子インスリンアセンブリーからのインスリンの放出の延長、およびそれに付随する有益な抗糖尿病効果における重要な因子である。
【０１９０】
本発明は、超分子インスリンアセンブリーIIから放出されるインスリンモノマーは可溶性のインスリンと等しい生物学的機能を有することを提供する。作用の期間に著しい違いがあり、標準のインスリン注射に対しては6〜10時間にすぎないが、驚くべきことに、超分子インスリンアセンブリーIIの投与量に応じて約10日から約180日までまたはそれを超える。これは、長期間、最も生理学的に関連のある形態のインスリン、すなわちインスリンモノマーを供給するために注射部位にデポーを形成する、超分子インスリンアセンブリーにおけるインスリンの明らかな安定性に起因し得る。
【０１９１】
ヒトインスリンの超分子アセンブリーIIを投与することにより、135〜180日の期間にわたって観察されるさらに良好な血糖コントロールがもたらされる。インスリンオリゴマーの皮下および筋肉内注射の両方により、図8bおよび9bから明らかであるように、ほぼ正常の血糖がもたらされる。
【０１９２】
血清における放出されたインスリンをELISAを用いて定量し、デポーからのゆっくりとした持続的な放出に起因するほぼ一定のレベルを維持することが観察された。
【０１９３】
アロキサンで糖尿病にしたWistar系オスラット、およびストレプトゾトシン処置糖尿病C57bl/6マウス(糖尿病の別のモデルとして役立つ)は、超分子インスリンアセンブリーIIで処置したとき、両方ともほぼ正常の血中グルコースレベルを示した。
【０１９４】
ヒト超分子アセンブリーIIインスリンに対して得られたウエスタンブロットのデータは本質的に同じであり、放出されたインスリンモノマーによってシグナリング経路が活性化されることを示している。
【０１９５】
超分子インスリンアセンブリーIは、高さ18±2nmの膨張した、より球状の種によって特徴付けられる。アミロイド形成のプロセスの間のペプチド構造のアンフォールディングにより、個々に表面に渡ってランダムに分配される球状のモノマー種がもたらされる。その膨張した形態を維持しているものの、さらに前方に、ヒトインスリン超分子アセンブリーIIのステージIIのこれらモノマーの直線状の会合が存在する。形成されたオリゴマーは、高さ18±4nmのウシインスリンと同じ、細長いクラスターを表す。超分子インスリンアセンブリーIIIの場合は(SIA IIを引き継ぐ原線維のステージにより近く)、より高いオリゴマー構造の密度における増大が見られる。構造は、よりコンパクトであり、高さは5±1nmである。全体の構造上の形態学はウシSIAステージに類似しており、完全に形成した線維がさらに前方に見られる。
【０１９６】
本発明は、STZ誘発した糖尿病動物モデルにおいて、空腹時低血糖を引き起こさずに血中グルコースレベルを著しく改善するための超分子インスリンアセンブリー治療の、有効性および可能性を提供するものである。低血糖の危険性の付随するインスリン注射の頻度を増大することで血中グルコースレベルをコントロールする集中的なインスリン治療とは異なり、超分子インスリンアセンブリー治療を用いた、大幅に改善された血糖コントロールが、多数回のインスリン注射を必要とせずに、かつ過度の体重の増加なしに達成される。
【０１９７】
この技術革新に対するさらなる価値が、II型真性糖尿病(DMII)の場合におけるように、治療としてインスリンの持続的および連続的な注入を必要とするこれらの不調に対するこれらの研究の延長によって加えられる。エキセンディン-4およびインスリンの両方が組み合わされて、DMIIに対する強力な治療として利用される。エキセンディン-4は、胃からの食物の吸収を低減することによって血中グルコースレベルを低下させることが知られている。これは、また、胃排出も遅らせ、HbAcのレベルを低下させ、インスリン治療による観察される体重の大幅な増大を防ぐ。エキセンディン-4は凝集してオリゴマーの複合体になり、上記のセクションで報告されたインスリンの場合のように、これからエキセンディン-4の天然のモノマーが放出される。エキセンディン-4は、動物対象におけるDMIIを処置するために、SIA IおよびIIと一緒に補助的療法として用いられる。
【０１９８】
実施例24は、対抗制御性ホルモンのモニターを記載しており、高インスリン性の、正常血糖性の/低血糖性のクランプ試験を行って、グルカゴンおよびエピネフリンなどの、インスリンの対抗制御性ホルモンのレベルをモニターした。正常コントロールのWistar系ラットに比べて、SIA II処置したラットに対するグルカゴンのピークレベルに40%の低下が観察された(図29)。これとは対照的に、毎日インスリン処置したラットはグルカゴン反応に80〜90%の低下を示した。このように、SIA IIからの基底のインスリンの放出は身体の生理を擬するものであり、毎日のインスリン処置と異なり、グルコースの恒常性を維持するための身体の対抗制御的な機序における著しい変更を引き起こさない。
【０１９９】
糖尿病ラットにおけるSIA II処置の間の低血糖の再発は、様々な処置グループで誘発された低血糖に反応したインスリンの対抗制御性ホルモンをモニターすることによって除外された。インスリンの対抗制御による血糖の制御は、SIA II処置ラットで維持された。
【０２００】
実施例25は、超分子インスリンアセンブリーI、II、およびIIIの安定性を評価するためのプロテアーゼ耐性試験を記載している。
【０２０１】
トリプシンおよびプロテイナーゼKによる切断に対するSIA IIおよびSIA IIIの耐性は、これらオリゴマーの構造上の組織における違いをさらに実証している。rHインスリンおよびSIA Iは、プロテアーゼの作用に耐性であるより高次のオリゴマー型を採用しているSIA IIおよびSIA IIIに比べて(図30)プロテアーゼによる切断により感受性である。
【０２０２】
このように、本発明は、I型およびII型両方の糖尿病などの代謝疾患を包含するだけではなく、治療薬を連続的に注入することが必要とされる慢性の疼痛、敗血症、関節炎、骨粗しょう症、炎症など、これらの疾患全てにさらに拡張することができ、ペプチド、タンパク質、または小分子薬物であることができる。本発明は、DMI、DMII、および境界型の糖尿病の症例の処置のための、インスリンオリゴマー(SIA I、SIA II、およびSIA III)を用いる可能性も論じるものである。処置のためのデポーとして薬物のオリゴマーを利用するこの方法論は、多数のより多くの疾患に拡張することができ、多彩な、広域な適用性を有する。
【０２０３】
以下の実施例は、本発明に含まれる本発明の説明によって与えられるものであり、したがって本発明の範囲を限定するものと解釈してはならない。
【０２０４】
(実施例)
本明細書に記載する以下の実施例は、例示の目的にすぎず、本明細書に照らし合わせた様々な修飾または変更は当業者には示唆的であり、本出願の精神および権限、ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることを理解されたい。
【０２０５】
(実施例1)
インスリンの線維化
ウシおよびrHインスリン2mg/mlをリン酸緩衝食塩水(50mM、pH7.0)またはpH2.0(塩酸水溶液)に溶解し、180rpmで絶えず振盪しながら72時間〜7日間、37℃でインキュベートした。原線維の形成の動態学を、チオフラビンT(ThT)による蛍光の獲得をモニターすることによってモニターした。
【０２０６】
(実施例2)
チオフラビンTの蛍光
Th-Tの蛍光を、Jobin Yvon Fluoromax分光蛍光光度計上、励起および発光にそれぞれ幅3nmおよび5nmのスリットを用いて測定した。50μM Th-Tで15分間インキュベートしたサンプルを450nmで励起し、その発光を460〜560nmの範囲でモニターした。データを、以下の等式:Fc=Fantilog[(Aex+Aem)/2]を用いてブランクおよび内部フィルター効果に対して補正した。
【０２０７】
Fcが補正した蛍光であり、Fが測定した蛍光である場合、AexおよびAemは、それぞれ励起および発光波長の反応溶液の吸光度である。
【０２０８】
37℃でのウシおよびrHインスリンによる原線維の形成の動態学を、図1に示す。図1(a)は、50μMTh-T蛍光でモニターした、pH7.0の原線維の形成の動態学を実証している。
【０２０９】
(実施例3)
pH2.0および7.0で形成した中間体および完全に形成した原線維のin vitroのモノマー放出の動態学
200μl(インスリン400μgに等しい)のアリコートを、37℃、pH2.0および7.0で、インスリン線維化反応からの様々な時間点で回収した。生成した超分子インスリンアセンブリー中間体を、遠心分離により単離した。得られたペレットをPBSで洗浄し、エッペンドルフ中1mlPBSに再懸濁した。中間体を含むエッペンドルフのキャップを除去し、エッペンドルフを12kDaカットオフ透析膜で密封した。次いで、エッペンドルフを、その膜側を通して、0.02%アジ化ナトリウムを含む20ml PBSを含む50mlFalconチューブ中に挿入し、絶えず撹拌しながらインスリン放出の動態学を15日間モニターした。放出の動態学は、280nmでの分光測定によって、およびその内因性(チロシン)の蛍光によってモニターした。1時間あたりに放出されたインスリンの量を計算した。図2aは、280nmの吸光度および内因性のチロシンの蛍光によってモニターした、超分子インスリンアセンブリーII中間体からのインスリンのin vitroの放出を提供する。0時間および15日の透析膜の内側の溶液のTh-T強度も提供する。
【０２１０】
様々な中間体の放出プロファイルを試験するために、中間体の少量のアリコート、および37℃、pH2.0および7.0の両方で完全に形成したアミロイド原線維を、規則的な間隔で線維化プロセスから回収し、10分間、10000rpmで遠心分離した。上清を除去し、ペレットをPBSで2回洗浄後、新鮮なPBSに再懸濁した。モノマーのインスリンの放出を、37℃、280nmで分光測定によりモニターした。放出の動態学を、2つの異なる条件で試験した。第1に、ペレットをPBSに懸濁し、絶えず撹拌しながらPBS20ml中、12kDaのカットオフ膜によって透析した(図2a〜c)。第2に、得られたペレットをPBS1mlに懸濁し、上清の280nmの吸光度を読み取った(図2d)。
【０２１１】
(実施例4)
コンゴーレッド結合
インスリンオリゴマー/アミロイドに結合したコンゴーレッドの量を、先に報告されているように、結合したコンゴーレッド結合のモル/アミロイド懸濁液のL=A 540nm/25295-A477nm/46306の等式を用いて推定した(Klunk, W.E.、Jacob, R.F.、およびMason, R.P.、Quantifying amyloid by Congo red spectral shift assay.、Methods Enzymol、309巻、285〜305頁(1999年))。
【０２１２】
図3は、天然インスリン、超分子インスリンアセンブリーII、超分子インスリンアセンブリーIII、およびアミロイドインスリンでのコンゴーレッド結合試験を示す。
【０２１３】
(実施例5)
チロシン蛍光
0.2ml石英キュベット中、様々な時間間隔で回収した超分子インスリンアセンブリーの透析物を270nmで励起し、320nmから370nmの間の発光を記録した。励起および発光の両方に、5nmのスリット幅を使用した。図2(a)は、280nmの吸収および内因性のチロシンの蛍光によってモニターした、超分子インスリンアセンブリーII中間体からのインスリンのin vitroの放出を示すものである。0時間および15日の透析膜の内側の溶液のTh-T強度も示す。
【０２１４】
(実施例6)
フーリエ変換赤外分光光度法(FTIR)
液体N2-冷却水銀カドミウムテルル検出器を装備したBruker Tensor 27ベンチトップFTIR分光光度計でIRスペクトルを記録した。インスリンサンプルを、Bio-ATR上で分析し、256のインターフェログラムを、室温で、2cm-1の解像度で記録した。各スペクトルに対して、水蒸気を差し引き、ベースラインを補正した。
【０２１５】
SIA I、II、およびIIIもATR-FTIRを用いて特徴付けた。各ステージに相当する特徴的なスペクトルが観察された(図4)。
【０２１６】
ウシおよびrHインスリンの超分子インスリンアセンブリーI、II、およびIIIも、ATR-FTIRを用いて特徴付けた。各ステージに相当する特徴的なスペクトルが観察された(図4)。線維化の間、低振動数方向のIRバンドのシフトが観察される。超分子インスリンアセンブリーII(SIA II)は、ウシおよびrHインスリンそれぞれに対して1647cm-1および1645cm-1に鋭いピークを有し、一方、完全に形成したアミロイドは、同じものに対して1630cm-1および1628cm-1にピークを有する。FTIRスペクトルは、CR結合データと良好に一致し、ランダムコイル構造の含有量が増大しても、SIA IIの立体配座は依然として主にらせん状であることを示している。
【０２１７】
(実施例7)
原子間力顕微鏡(AFM)
Picoプラス原子間力顕微鏡(Agilient Technologies)を、画像化用にマグネチックアコースティック(magnetic acoustic)MAC(コンタクト)モードで用いた。露出した雲母の表面、またはMACカンチレバータイプIIを用いたサンプルと雲母のいずれかで(カンチレバーの弾力計数:2.8N/m、周波数:59.722kHz)、画像をエア中に記録した。様々な時間点でサンプルを線維化反応混合液から回収し、水で20倍希釈し、新たに切断した雲母上に2分間固定した。サンプルをナノピュア(nanopure)水で洗浄し、N2下で乾燥し、AFM分析にかけた。
【０２１８】
図5は、原子間力顕微鏡によって試験した超分子インスリンアセンブリー中間体およびインスリン原線維の形態学を示す。図5(a)インスリンモノマー、(b)超分子インスリンアセンブリーI中間体、pH7.0、(c)超分子インスリンアセンブリーII、pH7.0、(d)超分子インスリンアセンブリーIII中間体、pH7.0、(e)ヒトSIA I、(f)ヒトSIA II、(g)ヒトSIA III、および(h)pH7.0で完全に形成された原線維、(i)37℃、pH2.0で、6時間で形成された超分子インスリンアセンブリー中間体を示し、(j)はpH2.0で形成した完全に形成したアミロイド原線維を示す。
【０２１９】
(実施例8)
透過型電子顕微鏡(TEM)
TEM試験用に、サンプルをボルテックスにかけ、そのままフォルムバールコーティングした300メッシュの銅格子に吸収させ、またはミリ-Q水で1:2〜20倍に希釈し、脱イオン水で洗浄した。格子を3%酢酸ウラニルで2〜5分間インキュベートし、ネガティブ染色によってサンプルを試験するために赤外線下で乾燥した。格子を80kVでPhillips CM-10で可視化した。像をMegaViewIIIカメラを用いて捕え、Imaging System PhillipsからのImaging Softwareを用いて分析した。図6は、インスリン原線維および超分子インスリンアセンブリー中間体のネガティブ染色TEM顕微鏡写真を提供し、図6(a)は超分子インスリンアセンブリーI中間体、pH7.0を提供し、図6(b)は超分子インスリンアセンブリーII、pH7.0を提供し、図6(c)は超分子インスリンアセンブリー中間体III、pH7.0を提供し、図6(d)はpH7.0の成熟線維を提供し、図6(e)は37℃、pH2.0で形成した線維を提供する。
【０２２０】
(実施例9)
糖尿病のラットモデル
体重210±10gの9週齢のWistar系オスラット(哺乳類、げっ歯目、Rattus norvegicus albinus)を用いた。ラットを市販のポリプロピレンケージで飼育し、12時間の明-暗サイクルで、温度制御の条件下に維持し、適宜食餌および水を摂取させた。
【０２２１】
ラットに糖尿病を誘発するためのストレプトゾトシンモデル
体重250〜300gのWistar系オスラットを4グループに分け、Roche Accu Checkグルコースストリップを用いて血中グルコースの推定を行った。ラットを48時間絶食させた。クエン酸バッファー(pH4.5)中新たに調製したストレプトゾトシン50mg/kg体重を、10〜20匹のラットに腹腔内投与した。直ちに食餌を供給し、3日後に血中グルコースレベルを調べた。その血中グルコースレベルにしたがって動物をグループ分けした(グループI:250〜350mg/dl、グループII: 350〜450mg/dl、およびグループIII:>450mg/dL)。ウシインスリン2〜6U/kg体重(b.wt)で、1週間、高レベルの血中グルコースが維持された。STZ処置ラットは全て、STZ注射5日後に高血糖を発症し(血中グルコースレベル>250mg/dl)、これらの血清インスリンレベルを、ラットインスリン固相酵素結合免疫測定法(ELISA)(Mercodia)を用いて定量した。グルコース>250mg/dL、およびごくわずかな血清インスリンレベルの(〜0.08ng/ml)ラットを糖尿病とみなし、実験に用いた。
【０２２２】
(実施例10)
超分子インスリンアセンブリー処置
インスリンで高レベルの血中グルコースを1週間維持した後、ラットを、各々がラット5匹を含む3グループに分けた。グループIのラットには、1日あたりウシインスリン4U/kgb.wtの単回投与を腹腔内投与した。グループIIのラットには、インスリン4U/kgb.wtを、1日2回注射した。グループIIIはPBS100μl中超分子インスリンアセンブリーII200μgで処置し(皮下および筋肉内)、グループIVのラットにはPBS100μlを投与し、糖尿病コントロールを構成した。PBS100μlを注射した正常ラット5匹のグループを、非糖尿病のコントロールとした。8〜10時間絶食後の食前および食後両方の、体重および血中グルコースレベルを、最初に毎日チェックし、次いで頻度を低減した。図7は、超分子インスリンアセンブリー(あるいはプレアミロイドのインスリン)の、グルコース恒常性におけるin vivoの有効性を示す。(a)皮下および筋肉内両方で投与した、様々な投与量の超分子インスリンアセンブリーII(ウシ)に反応した血中グルコースレベル。(b)皮下および筋肉内両方で投与した、様々な投与量の超分子インスリンアセンブリーII(r-ヒト)に反応した血中グルコースレベル。
【０２２３】
図8は、ウシSIA II(a)ウシインスリン、(b)rHインスリン投与後135日の期間にわたってモニターした食後血中グルコースレベルを示す。図9はヒトSIA II(a)ウシインスリン、(b)rHインスリン投与後160日の期間にわたってモニターした食前の血中グルコースレベルを示す。図10は、pH2.0および7.0で形成したインスリンアミロイドの投与後モニターした、血中グルコースレベルを示す。図11は、SIA-II処置糖尿病ラット、糖尿病コントロール、および非糖尿病コントロールラットの体重プロファイルを示す。
【０２２４】
(実施例11)
腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT)
STZ処置(n=12)および正常ラット(n=4)を12時間絶食させた。上記に記載したように血中グルコースレベルをモニターした。グルコース負荷試験を行った。簡潔に述べると、動物に3g/kg体重のグルコースを腹腔内注入し、その後、グループIにはウシインスリン4U/kgb.wtを、グループIIにはアミロイドインスリン100μlを、グループIIIのラットにはPBS(ビヒクル)100μlを注射した。血中グルコースレベルを、処置0、30、90、150、270、および330分後にモニターした。様々な時間点に対して血清を単離し、血中グルコースレベルと時間との間でグラフをプロットした。図12は腹腔内グルコース負荷試験(IPGTT)の血中グルコースプロファイルを示すものである。
【０２２５】
(実施例12)
血清インスリンの定量
採取した血液サンプルから血清を単離し、さらなる分析まで-20℃で貯蔵した。ウシおよびラットのインスリンレベルを、Mercodia(スウェーデン)からの固相2部分酵素免疫アッセイ(ELISA)を用いて、製造元のプロトコールにしたがって定量した。図13aは、SCまたはIM注射した超分子インスリンアセンブリーに反応したSTZ処置マウスにおけるELISAを用いた血清ヒトおよびウシインスリンの定量を提供し、図13(b)はIPGTTの血清ウシインスリンの定量を提供し、図13(c)はIPGTT用に行った血清ラットインスリンELISAを提供する。
【０２２６】
(実施例13)
インスリンのI125標識化
インスリンSIA IIの末端からのin vitroの放出をさらに確証し定量するために、I125でのインスリンの標識化を行った(Pause, E.、Boi mer, O.、およびNustad, K.、Radioiodination of proteins with the iodogen method, in RIA and related procedures in medicine, international atomic agency、Vienna、161〜171頁(1982年))。標識したインスリンから形成した超分子インスリンアセンブリーは、49912CPM/ml/μgの特異的な活性を有していた。超分子インスリンアセンブリー50μl(4991200CPM)を、皮下または筋肉内のいずれかで注射し、血中グルコースレベルをモニターし、0、30分、1時間、4時間、10時間、24時間、それ以降は1日1回、次いで隔日または週1回血清サンプルを採取した。血清1mlあたりの計数値を計測した(図14a)。図14bに示すように、血中グルコースプロファイルは非標識のSIA IIで観察されたものと同じであった。計算したCPM/mlは、処置の日数に対してプロットした場合、ほぼ一定のままであった(図14a)。しかし、30分〜4時間に最初の高計数があり、次いでこれは徐々に低減して10時間で2000〜3000の一定レベルになった。血液に放出されたインスリンの量を計算し、これは、ELISAで観察された血清におけるインスリンの基底レベルに相当し、または基底レベルをわずかに上回る0.5〜1.2ng/mlの範囲であった(図14b)。超分子インスリンアセンブリーから放出されたインスリンがモノマーであることをさらに証明するために、様々な時間点の血清を、トリシン-SDS-PAGE上で分離し(Schaogger, H.およびVon Jagow, G.、Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.、Anal Biochem、166巻、368〜379頁(1987年))、蛍光体画像を用いてX線像を現像した。図15に示すように、血清におけるバンドは遊離インスリンのモノマーに相当し、その強度は、等量の血清をロードした場合、長期間一定のままであった。20日後に強度における低減が観察され、ある期間にわたって、放射標識それ自体の崩壊のいくつかの効果と一緒に、超分子インスリンアセンブリーのデポーの利用および枯渇が示された。
【０２２７】
(実施例14)
超分子インスリンアセンブリーIIで処置後の高血糖クランプ
Wistar系オスラットを麻酔し(2%イソフルラン)、頚動脈(carotid)および頚動脈(jugular)のカテーテルを設置して血液の回収、および血中グルコースレベルを600mg/dLに固定するためのグルコースの注射(20%グルコース溶液)を可能にした。12時間の絶食期間の後、全グループにグルコースを注入して高血糖にした。この後、示された時間間隔で血中グルコース測定用に血液を回収し、これらを高血糖に維持するためのグルコース注入の速度を計算した。この手順を、SIA II投与の1および3ヵ月後に繰り返した(図16a〜c)。
【０２２８】
(実施例15)
ラット脂肪細胞の単離および1次培養
Bjorntorpらによって記載された方法にしたがって、ラット脂肪細胞を単離し、培養した(Bjorntorp, P.、Karlsson, M.、Pettersson, P.、およびSypniewska,G.、Differentiation and function of rat adipocyte precursor cells in primary culture.、J Lipid Res.、21巻、714〜723頁(1987年))。自由に摂食させたWistar系オスラットを屠殺し、精巣上体の脂肪組織を解剖し、試薬A(HBSS、ペニシリン100U/ml、ストレプトマイシン100μg/ml、およびゲンタマイシン50μg/L)中に採取した。組織をHBSS中、適切に洗浄した。次いでこの組織を切開し、細かく刻み、ファルコンに移し、200gで2分間遠心分離した。透明な油層を除去し、脂肪細胞の細胞層(濃く、濃密度)を、フラスコ中の3倍体積の試薬B(0.1%BSAおよび1mg/mlコラゲナーゼを含む試薬A)に加えた。フラスコを、絶えずゆっくりと振盪しながら37℃で60分インキュベートした。3倍体積のDMEM完全培地(HEPES15mM、グルコース、0.1%BSA、アデノシン50nM、および1%ウシ胎児血清を含む)を加えることによって反応を停止し、室温で5分間インキュベートした。反応物をファルコンに移し、200gで10分間遠心分離した。油の上層を廃棄することによって脂肪細胞を採取し、試薬Aで200gで10分間遠心分離することによって2回洗浄した。細胞を、好適な体積のDMEM完全培地を含むフラスコ中に分配し、37℃で24時間インキュベートした。インスリンシグナリング用に、脂肪細胞を遠心分離し、無血清培地中に12時間維持し、その後6ウェル培養プレート中に約2mlプレーティングし、さらに2時間インキュベートした。
【０２２９】
(実施例16)
全細胞可溶化物のウエスタンブロット分析
プレーティングした細胞を、インスリン20nM、超分子インスリンアセンブリー50μl、およびin vitroで放出されたインスリン(モノマー)、またはインスリン処置したラットからの血清50μl、超分子インスリンアセンブリー、およびPBSのどちらかと、10分間インキュベートした。インキュベート後、細胞をファルコンチューブに採取し、200gで10分間遠心分離した。脂肪細胞の上層をエッペンドルフ中に採取し、氷中に維持した。溶解バッファー500μl(20mM Tris pH8.0、1%NP40、137mM NaCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、1mM DTT、10%グリセロール、1mM PMSF、オルトバナジン酸ナトリウム0.4mM、およびプロテアーゼ阻害薬のカクテル)を加え、サンプルを-80℃で2時間凍結した。この後、一定に回転させながら4℃で4時間、解凍およびインキュベートした。上清を13000rpmで30分間遠心分離後採取し、細胞溶解物におけるタンパク質濃度をBradford試薬を用いて推定した。全細胞タンパク質の50マイクログラムを各レーンに適用し、10%SDS-PAGE上で分離し、Bio-rad製ウエットトランスファー装置を用いて、4℃で一夜、ニトロセルロース膜に移動させた。移動後、ブロットを除去し、移動したバンドを可視化するためにPonceau-Sで染色し、水でさらに脱染した。膜をPBS中5%スキムミルク、pH7.4で、37℃で1時間ブロックし、洗浄し、次いで4℃で、PI3K、p-Akt、total Akt、p-Gsk3β、Gsk3β、ERK1/2、GAPDH、およびβアクチン(細胞シグナリングからの抗体)の1次抗体(PBS中1%スキムミルクを用いて1:1000希釈)中、一夜インキュベートした。PBSTで洗浄後、ブロットをそれぞれの2次抗体(HRPコンジュゲートした)中1時間インキュベートし、ECLウエスタンブロッティングプロトコール(Amersham)を用いて免疫反応性のバンドを可視化した。図17は、インスリンシグナリングカスケードのための培養脂肪細胞のウエスタンブロット(WB)分析を提供する。脂肪細胞を、(a)PBS、インスリン、SIA-II、SIA IIから放出されたインスリン、(b)示した通りの血清と処置し、インスリンシグナリングに対して分析した。
【０２３０】
(実施例17)
組織学および免疫組織化学
ラットにインスリンSIA II 200μg、または大腸菌からのリポ多糖(LPS)150μg(Sigma-Aldrich、MO、米国)を、筋肉内または皮下注射のいずれかによって、それぞれ大腿筋および背側皮膚中に注射した。LPS注射したラットを注射48時間後に屠殺し、インスリンSIA IIを注射したラットを1から12週間モニターし、7日毎の間隔で組織切片を切除した。ラットをケタミンによって麻酔し、4%パラホルムアルデヒドで潅流した。皮膚および大腿筋を除去し、注射部位を切り出した。次いで、組織をパラフィン包埋用に処理加工し、10μmの厚さに矢状に切断し、ルーチンのヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色用にさらに処理加工して、炎症細胞の組織像および浸潤、残渣のSIAの存在および免疫組織化学用にコンゴーレッド染色を(Lee, G.およびLuna, H. T.、Manual of Histologic staining methods of armed forces institute of pathology.、第3版、McRaw-Hill book company(1960年)) (Sanz MJ、Marinova-Mutafchiev L、Green P、Lobb RR、およびFeldmann M、Nourshargh S.、IL-4-induced eosinophil accumulation in rat skin is dependent on endogenous TNF-alpha and alpha 4 integrin/VCAM-1 adhesion pathways.、J Immunol.、160巻、5637〜5645頁(1998年))CDllb、RT-IA、およびCD6に対する抗体  (BD Pharmigen、CA、USA)で観察した。免疫蛍光のスライドを全て、褪色防止試薬+封入剤(Molecular probes、Eugene、Oregon、米国)で永久的にマウントし、蛍光下でFITCコンジュゲートした抗体に対して観察した。CRおよびH&E染色したスライドをシトラマウント(citramount)媒体(Polysciences、PA、米国)でマウントした。H&E切片を明所下で観察し、CR染色したスライドを明所および偏光光線下(Nikon Eclipse 80i、Nikon、日本)で観察した。画像を、DS SMcCCDカメラ(Nikon、日本)を用いて捕え、NIS-Elementソフトウエア(Nikon、日本)によって分析した。
【０２３１】
(実施例18)
ラットにおいて糖尿病を誘発するためのアロキサンモデル
体重250〜300gのWistar系オスラットを4グループにわけ、Roche Accu Checkグルコースストリップを用いて血中グルコースの推定を行った。ラットを24時間絶食させた。クエン酸バッファー(pH4.5)中新たに調製したアロキサン150mg/kgb.wtを、10〜20匹のラットに腹腔内投与した。直ちに食餌を供給し、3日後に血中グルコースレベルを調べた。その血中グルコースレベルにしたがって動物をグループ分けした(グループI:250〜350mg/dl、グループII:350〜450mg/dl、およびグループIII:>450mg/dL)。2〜6U/kg体重(b.wt)のウシインスリンで、1週間、高レベルの血中グルコースを維持した。アロキサン処置ラットの60%が注射5日後に高血糖を発症し(血中グルコースレベル>250mg/dl)、これらの血清インスリンレベルをラットインスリン固体酵素結合免疫測定法(ELISA)(Mercodia)を用いて定量した。グルコース>250mg/dLおよびごくわずかな血清インスリンレベルの(〜0.18ng/ml)ラットを糖尿病とみなし、実験に用いた。
【０２３２】
(実施例19)
試験した臨床パラメータの例
超分子インスリンアセンブリー処置の毒性を評価するために、生化学アッセイを行った。血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ(SGOT)、血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(SGPT)、総ビリルビン、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、血清総タンパク、血清アルブミン、血清グロブリン、血清A/G比、腎機能試験(KFT)、白内障形成、脂肪組織重量、体重、および外観を、Merck India Ltdから入手できるアッセイキットを用いて推定した。表1は、インスリンSIA IIの毒性を評価するための臨床パラメータの分析を提供する。血清を、3カ月の試験の終わりに採取した血液サンプルから単離し、表に示した様々な試験にかけた。結果は、各グループn=4の動物を有する3つの異なる実験の、平均値±標準偏差である。
【０２３３】
(実施例20)
血清における抗インスリン抗体およびインスリン分解酵素(IDE)の検出
標準のELISAのプロトコールにしたがうことによってラット血清における抗インスリン抗体を検出するために、間接ELISAを行った。簡潔に述べると、50mM炭酸塩バッファー、pH9.6、中2mg/mlウシインスリンの200μlを96ウェルELISAプレート上にコーティングし、4℃で一夜保った。PBS中5%BSAを用いて、37℃で1時間ブロックした。次いで、プレートをPBST(0.02%Tween20)で洗浄し、1:100希釈した血清の200μlを加えて、37℃で1時間保った。さらなるラウンドのPBSTでの洗浄の後、1:10000希釈した抗ラットIgG-HRPコンジュゲートした2°抗体を加え、37℃で2時間インキュベートした。基質としてTMBを用いて発色させ、濃H2SO4を加えることによって反応を停止した。プレートを450nmの分光測定によって読み取った。抗インスリン抗体を、反応に対する陽性コントロールとして用いた。IDEを、Insulysin/IDE InnoZyme(商標)Immunocapture Activity Assay Kit (Calbiochem)を用いて、製造元のプロトコールにしたがって血清から定量した。キットで提供されたラットIDEを陽性コントロールとして供した。
【０２３４】
細胞増殖アッセイ
細胞を、24ウェルプレート中、10%FBSを含む通常のDMEM培地に10000細胞/ウェルでプレーティングした。細胞を12時間、無血清培地に切り替え、次いで図25の凡例に示すように処置した。処置は全て3回ずつ行った。処置3日後に増殖を測定した。増殖をMTTアッセイによってアッセイした。5mg/ml MTTのPBS溶液の全50μlを各ウェルに加えた。37℃で4時間インキュベート後、ホルマザンの結晶を可溶化溶液(20%SDS、50%DMSO)500μlで溶解した。670nmの微分フィルターを用いて、プレートリーダーで570nmの吸光度を測定した。
【０２３５】
(実施例21)
マウスに糖尿病を誘発するためのストレプトゾトシンモデル
12〜16週齢の近交系C57BL/6オスマウスを用いた。5日間毎日、マウスに50mg/kgb.wtのストレプトゾトシンを腹腔内注射した。2週間後、血中グルコースレベルを推定した。血中グルコース>300mg/dlのマウスを糖尿病とみなし、さらなる実験用に選択した。各グループ各マウス6匹からなる全6グループを作成した。10μl、25μl、50μl、および100μlのウシ/ヒトインスリンSIA IIなどの様々な投与量を、ストレプトゾトシンを用いて糖尿病にしたマウスに皮下または筋肉内のいずれかで投与し、他の2グループは糖尿病および非糖尿病グループとして供した。Roche Accu Checkグルコースストリップを用いて、空腹時および満腹時血中グルコースレベルの両方をモニターした。
【０２３６】
(実施例22)
ウサギに糖尿病を誘発するためのストレプトゾトシンモデル
体重1000gと1200gとの間のNew Zealandオスウサギを用いた。動物を、湿度、温度(22±2℃)および12時間の明暗サイクルの制御された条件下に維持した。実験プロトコールおよび動物の取扱いは、インド、ニューデリー、Institutional animal ethics committee of the National Institute of Immunologyにしたがった。実験的糖尿病を誘発するために、用いるウサギを12時間絶食させ、その後、クエン酸バッファー、pH4.5中調製したストレプトゾトシン80mg/kgb.wtを投与した。血中グルコースレベルを3日後に調べた。BGL>450mg/dLを示したウサギを糖尿病と呼び、ウサギ各3匹の3グループにさらに分けた。グループI-正常の健康なウサギ、グループII-インスリン処置した糖尿病、グループIII-SIA II(SC)処置した糖尿病、およびグループIV-PBS処置した糖尿病。
【０２３７】
(実施例23)
Wistar系ラットにII型糖尿病を誘発するためのモデル、およびSIAを用いたその処置
7週齢の、体重約200gのWistar系オスラットを全試験に用いた。動物には、脂肪12%、炭水化物60%、およびタンパク質28%(全kcalのパーセント値として)からなる普通固形飼料食、または脂肪40%、炭水化物41%、およびタンパク質18%からなる高脂肪食のいずれかを摂食させた。いずれかの食餌で2週間後、動物(非注射のコントロールを除いて)を一夜絶食させた後の尾静脈に、一時的に留置した24ゲージカテーテルによって、STZ(50mg/kg)を注射した。STZ注射後、動物に食餌および水を自由に摂取させ、STZ注射および非注射の動物の両方とも、試験期間中はそのもともとの食餌(固形飼料または脂肪)を継続させた。血中グルコースレベルが高い動物に、ビヒクルとしてPBS、インスリンSIA、またはインスリンSIAをエキセンディン-4aと一緒に皮下投与した。血液を採取し、血清を遠心分離によって分離し、グルコース(グルコースストリップ、Accucheck、Roche)、インスリン(Insulin Elisa Kit、Mercodia)、中性脂肪(TG)(グリセロールリン酸オキシダーゼ[GPO]-Trinder法、Sigma)、および遊離脂肪酸(アシルコエンザイムA合成酵素[ACS-ACOD]法、Wako Diagnosis、Richmond、VA)の濃度について分析した。
【０２３８】
II型糖尿病:Db/dbモデル
C57BL/6バックグラウンド上のDb/dbマウスに、標準食を適宜接触させ、12時間の明/暗サイクル下に維持した。血液サンプルをマウスの尾の出血によって採取し、循環グルコースレベルをグルコメーター(glucometer)(Roche Accu Checkグルコースストリップ)を用いて測定した。血清インスリンレベルを、血清サンプルから、インスリン酵素結合免疫測定法キット(Mercodia)を用いて測定した。空腹時血中グルコースおよびランダムに摂食させたグルコースを、隔日の朝に行った。
【０２３９】
(実施例24)
インスリン対抗制御ホルモンのモニター
高インスリン性のグルコース-クランプ手順にしたがって、一定の低血糖刺激をラットにもたらした。動物を上記に記載したようにカテーテル処置した。意識があり、ストレス無負荷のラットを、実験開始前に12〜14時間絶食させた。30mU/kg.分の一定のインスリン注入を外来性のグルコースの様々な注入と一緒に開始し、注入は、望ましいグルコースレベルを達成するために10分間隔で得られた血中グルコース測定に基づいて調節した。実験の最初の90分の間、ラットは正常血糖である〜110mg/dLになされた。その後、血中グルコースレベルを〜50mg/dLに低下させ(インスリンの注入による誘発性の低血糖)、次なる90分間維持した。正常血糖期および低血糖期に、それぞれグルコースレベルが80mg/dLおよび40mg/dL未満に低下した場合に、実験を終了した。図29に示すように、グルカゴンおよびエピネフリンの測定用に、血液サンプルを様々な時間間隔で回収した。
【０２４０】
(実施例25)
プロテアーゼ耐性
20μlの、2mg/mlのrHインスリン、SIA I、SIA II、およびSIA IIIに、1:5、1:10、および1:50希釈の2mg/mlトリプシン、ならびに1:1000、1:2000、および1:5000希釈の2mg/mlプロテイナーゼKを加えた。反応混合液を、37℃で12時間、インキュベーターでインキュベートした。サンプルを20%SDS-PAGE上にロードし、クーマシー染色を用いて分析した。
【０２４１】
【表１】
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【０２４２】
【表２】
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【図２ｃ】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｃ】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９ａ】
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【図１９ｂ】
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【図２０ａ】
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【図２０ｂ】
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【図２０ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２７】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２９ａ】
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【図２９ｂ】
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【図２９ｃ】
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【図３０】
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