(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体上に下記式（Ｉ）で表される構造単位から構成され、膜厚が０．２μｍ以上である重合体膜を有する、胚性幹細胞又は機能性組織細胞培養用基材。
【化１】
0005592842.tif 000015
（但し、式中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨを表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。また、ｌ、ｍは重合度を表す正の整数である。）
【請求項２】
細胞接着層として下記式（Ｉ）で表される重合体膜を膜厚０．２μｍ以上となるように基体上に形成する、胚性幹細胞又は機能性組織細胞培養用基材の製造方法。
【化２】
0005592842.tif 000016
（但し、式中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨを表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。また、ｌ、ｍは重合度を表す正の整数である。）
【請求項３】
上記重合体膜は、下記構造式（II）で表される原料を用い、化学蒸着法により基体上に重合させ形成させる、請求項２記載の胚性幹細胞又は機能性組織細胞培養用基材の製造方法。
【化３】
0005592842.tif 000017
（但し、式中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨを表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用基膜、細胞培養用基材、及び細胞培養用基材の製造方法に関し、より詳細には、生物学、医学、薬学、免疫学などの分野で用いられる細胞類の増殖、培養に好適に用いられる基材、株化されている一般的な細胞種に加え、マウスやラットなどの齧歯類やサル、ヒトなどの霊長類の胚性幹細胞（Embryonic Stem Cell: ES cell）や、人工皮膚、人工骨、人工臓器などに用いられる機能性組織細胞などの培養に好適な細胞培養用基膜、細胞培養用基材、及びその細胞培養用基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物や植物の細胞は、従来から種々のものが培養されており、培養技術も様々な態様のものが検討されている。細胞培養技術は、生物を対象とする様々な分野で用いられる基本技術である。特に、生命科学の分野では、医薬品の開発や病態メカニズムの解明などには欠くことのできない技術となっている。近年では、研究目的の細胞培養技術のみならず、生物学、医学、薬学、免疫学などの分野での利用を目的とした工業生産的培養方法も種々検討されている。また、医療などの分野においては、組織細胞を培養し、これを人工臓器、人工歯骨、人工皮膚などの代替組織として利用する研究も行われている。
【０００３】
このような細胞培養は、通常一定の容器の中で栄養成分である培養液とともに培養が行われる。細胞培養は、その性状から、培養液の中で浮遊した状態で培養されるものと容器の底面に付着した状態で培養されるものに大きく２分される。動物細胞の多くは、物質に付着して育成される接着依存性を有しており、一般に生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このため、このような接着依存性を有する細胞の培養には、細胞が付着するための基材が必要とされる。
【０００４】
細胞培養用基材として、シャーレ、フラスコ、マルチプレートなどが研究室レベルでは一般的である。このような器具は、主としてポリスチレン成形品の表面に低温プラズマ処理、コロナ放電処理などを施し、親水性を付与したものが市販されている。これらの器具は、足場依存性の細胞では、株化細胞、初代細胞を問わず、線維芽細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、角膜細胞などの培養に広く用いられている。また、血液系細胞として、株化したリンパ球であるいわゆる足場非依存性の浮遊細胞などにも広く使用されている。
【０００５】
しかしながら、細胞の種類によっては、これらの細胞培養器具上では細胞の増殖は認められるものの、その増殖が不十分であったり、細胞の増殖形態が悪かったりする。特に、初代培養においてはそれが顕著である。そこで、コラーゲン、ゼラチンといった細胞外マトリックスやファイブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンといった接着因子などを培養面にコートし、細胞の接着性、増殖性を高めることにより対処されることが多い。
【０００６】
例えば、下記の非特許文献１，２，３，４及び特許文献１，２，３などに記載のように、細胞培養基材として、シャーレにコートしたコラーゲン、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、分子架橋した三次元構造のコラーゲンシート、貫通孔を設けたコラーゲンスポンジなどを用い、これにヒト線維芽細胞やヒト角化細胞を播種、培養し、培養上皮・表皮を製造したり、ヒト線維芽細胞の上面にヒト角化細胞層を形成したりすることで、培養粘膜・皮膚を製造することが知られている。
【０００７】
コラーゲンコート膜を調製するために用いるコラーゲンは、動物の結合組織などから酸や酵素で可溶化したタイプＩコラーゲンである。このコラーゲンを培養皿などにコーティングし、乾燥すればコラーゲンコート膜が得られる。このような細胞培養用基材となるコラーゲンとしては、例えばウシあるいはブタの結合組織から可溶化し、抽出されたコラーゲンが使用されている。しかしながら、近年ＢＳＥ（牛海綿状脳症）や口蹄疫などの問題により、医療応用などを考慮する場合にその使用が困難になってきている。また、これら生体由来の材料は、アルコールなどの薬品によって容易に変性してしまい、またすぐに腐敗が進み長期に亘って保管することが困難であるという欠点を有する。さらに、これら従来の細胞培養用基材を使用した細胞培養方法よりも、さらに細胞増殖効率の改善された細胞培養方法が求められている。
【０００８】
また、神経系の細胞の培養においては、ポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジンといったポリリジンを培養面にコートして使用されることが多い。ポリリジンをコートすると、神経系細胞の接着がよく、株化神経系細胞では増殖形態が良好であり、神経突起の伸長度合もよい。また、ラット胎児の脳細胞の初代培養では、神経突起の伸長が良好であり、細胞の安定化度が高く、長期の培養が可能となる。
【０００９】
このように、ポリリジンは神経系細胞の培養に良好な特性を有しているが、難点として不安定なことが挙げられる。すなわち、上述したような一般の培養器具にコートした場合、ポリリジンの効果は、室温保存で２週間、４℃では１ヶ月で失活する。また、この不安定さのため、コート後滅菌を施すこともできない。そのため、ポリリジンをコートした培養器具を使用するためには、予め滅菌してある培養器具に無菌的操作を行うという面倒な方法で、使用時にポリリジンをコートする必要があり、冷蔵庫で保存しても１ヶ月程度しか使用できないという欠点がある。
【００１０】
このように、ポリリジンを培養器具にコートしようとした場合には、ポリリジンの安定性と操作性に欠点があり、ポリリジンを予めコートした細胞培養器具を市販する場合には、無菌環境下での多数の作業とコート後の保存管理の困難さなどにより、コストが高くつくことになる。
【００１１】
これらに鑑み、本発明者らは、上述した欠点を改善するため、特許文献４に記載のように、ポリホルミルパラキシリレンのモノマー単位に少なくとも１個のシッフ塩基を形成する能力のあるアミノ基を含む重合体を反応させて得られたアミノ基を有する重合体を含有する構成の細胞培養用基材を提案している。
【００１２】
しかしながら、この手法によって製造された細胞培養用基材は、ポリホルミルパラキシリレンにシッフ塩基を反応させる条件によって、細胞接着の再現性が得られにくい場合があるという欠点がある。さらに、ポリパラキシリレンコート後にシッフ塩基を反応させる工程を含むことから、工程数が増え、コストが高くつくことになる。
【００１３】
なお、ポリパラキシリレンの応用例に関して、特許文献５、６には、ポリパラキシリレンのコーティングを含む表面を有する物品に蛋白質などの巨大分子を吸着させ反応容器として利用することや、その生体適合性を利用して糖尿病患者にインシュリンを送達するための生体内装置の一部に使用することが開示されている。さらに、特許文献７、８に記載のように、表面にアミノ基やアミノメチル基を有するポリパラキシリレン誘導体膜をＤＮＡチップ用結合剤として利用することも知られている。
【００１４】
しかしながら、細胞培養用途における基材の役割としては、細胞を接着させ、さらに培養させる特性が必要となる。そのため、特許文献６に記載の技術では実際の成長培地にはコラーゲンが使用されている。また、特許文献５及び６に記載されているポリパラキシリレンやポリモノクロロパラキシリレン、ポリジクロロパラキシリレンといったような一般的なポリパラキシリレン誘導体については、細胞に対する接着性がまったく無いに等しく、細胞培養用途には向かない。
【００１５】
このように、ポリパラキシリレン膜そのものに何ら化学的処理を施すことなく細胞培養用基材に利用した事例は無く、特許文献７、８においても、このような細胞培養用途に適することについての記載も示唆もまったくない。さらに付け加えるならば、上述したように細胞培養用途としては、基材に対する細胞の接着性が高く、また細胞を好ましい接着形態で接着させて増殖させることが重要となり、特許文献７、８に記載されているようにＤＮＡプローブとの結合を良好にして剥がれ落ちを抑制することとは、その要求される性能がまったく異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開平６−２９２５６８号公報
【特許文献２】特開平８−２４３１５６号公報
【特許文献３】特開平９−４７５０３号公報
【特許文献４】特開２００８−３５８０６号公報
【特許文献５】特開２００１−２３３９７７号公報
【特許文献６】特表２０００−５０７２０２号公報
【特許文献７】特開２００２−３４０９１６号公報
【特許文献８】特開２００３−２１２９７４号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】臨床科学３４巻９号 白方裕司・橋本公二：再生医学、 Ｘ。皮膚 表皮の再生機構と培養表皮シートを用いた熱傷，水ほう症治療 Ｐ１２８３〜１２９０
【非特許文献２】名古屋大学出版会１９９９／１０／１０発行「ティッシュ・エンジニアリング繊維工学の基礎と応用」上田実編 松崎恭一・熊谷憲夫：培養皮膚Ｐ１０７〜１１７
【非特許文献３】畠堅一郎・上田実：皮膚・粘膜 Ｐｈａｒｍａ Ｍｅｄｉａ Ｖｏｌ．１８ Ｎｏ．１ ２０００ Ｐ２５〜Ｐ２９ ２０００
【非特許文献４】名古屋大学出版会１９９９／１０／１０発行「ティッシュ・エンジニアリング繊維工学の基礎と応用」上田実編 畠堅一郎・上田実：口腔粘膜 Ｐ１１８〜Ｐ１２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
そこで、本発明は、生体由来の材料を使用せず、工業的な量産が容易でかつ長期保管性、耐薬品性に優れ、良好な細胞接着性、長期培養性を持ち、さらに一般的な細胞培養用基材として知られている生体由来のコラーゲンと類似の細胞培養形態が再現可能な細胞培養用基膜、細胞培養用基材、及びその細胞培養用基材の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、アミノアルキル基を有するポリパラキシリレン膜をある一定以上の膜厚でコーティングすることで特徴的な細胞接着特性を発現させることを見出し、本発明を完成させた。
【００２０】
すなわち、本発明に係る細胞培養用基膜は、基体上に下記式（Ｉ）で表される構造単位から構成される重合体膜からなり、０．２μｍ以上の膜厚を有する。
【００２１】
【化１】
0005592842.tif 000002
（但し、式中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨを表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。また、ｌ、ｍは重合度を表す正の整数である。）
【００２２】
また、本発明に係る細胞培養用基材は、基体上に下記式（Ｉ）で表される構造単位から構成され、膜厚が０．２μｍ以上である重合体膜を有する。
【００２３】
【化２】
0005592842.tif 000003
（但し、式中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨを表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。また、ｌ、ｍは重合度を表す正の整数である。）
【００２４】
また、本発明に係る細胞培養用基材の製造方法は、細胞接着層として下記式（Ｉ）で表される重合体膜を膜厚０．２μｍ以上となるように基体上に形成する。
【００２５】
【化３】
0005592842.tif 000004
（但し、式中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨを表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。また、ｌ、ｍは重合度を表す正の整数である。）
【００２６】
ここで、上記細胞培養用基材の製造方法において、上記重合体膜は、下記構造式（II）で表される原料を用い、化学蒸着法により基体上に重合させ形成させることができる。
【００２７】
【化４】
0005592842.tif 000005
（但し、式中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨを表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。）
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、コラーゲンなどの生体由来の材料を使用することなく、良好な細胞接着性を有するとともに長期培養性を有し、生体由来の材料と類似の良好な細胞接着形態で細胞を培養することができる。また、生体由来の材料を使用しないので、耐薬品性を有するとともに長期保管性を有し、取り扱いも容易で簡易な方法で培養作業を行うことができ、冷却などすることなく培養した細胞を長期に亘って安定的に保管することができる。
【００２９】
また、蒸着法などの処理のみによって基材上に細胞接着層を形成することができるので、無菌環境下での処理やコーティング後の処理を行う必要がなく、容易な処理で工業的な量産が可能であり、低価格で細胞培養用基材を提供することができる。さらに、例えば３次元形状を有するような様々な形状を持つ基体や種々の材質の基体にも細胞接着層を形成することができるため応用範囲も広い。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】細胞培養用基材を製造するための装置の概略構成の一例を示したブロック図である。
【図２】実施例１の３日後の培養状態を示す顕微鏡写真である。
【図３】比較例１のポリモノクロロパラキシリレンについて３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図４】比較例１のポリパラキシリレンについて３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図５】比較例１のポリテトラフルオロパラキシリレンについて３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図６】比較例１のモノアミノパラキシレンとパラキシリレンの共重合物について３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図７】比較例１のモノホルミルパラキシレンとパラキシリレンの共重合物について３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図８】比較例２の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図９】参考例１の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１０】実施例２の膜厚０．１μｍのサンプルについて３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１１】実施例２の膜厚０．２μｍのサンプルについて３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１２】実施例２の膜厚０．３μｍのサンプルについて３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１３】実施例３の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１４】実施例４の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１５】実施例５の１１日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１６】比較例３のＴＣ処理品について１１日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１７】比較例３のコラーゲンコート品について１１日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１８】比較例３の市販品について１１日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図１９】実施例６の膜厚０．２μｍのサンプルに対して３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２０】実施例６の膜厚０．３μｍのサンプルに対して３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２１】実施例７の膜厚０．２μｍのサンプルに対して３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２２】実施例７の膜厚０．３μｍのサンプルに対して３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２３】実施例８の膜厚０．２μｍのサンプルに対して３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２４】実施例８の膜厚０．３μｍのサンプルに対して３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２５】実施例９の膜厚０．７μｍのサンプルに対して３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２６】比較例４のＴＣ処理品に対してHUVEC細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２７】比較例４のＴＣ処理品に対してHEK293細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２８】比較例４のＴＣ処理品に対してMCF-7細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図２９】比較例４のＴＣ処理品に対してCaco-2細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３０】比較例４のコラーゲンコート品に対してHUVEC細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３１】比較例４のコラーゲンコート品に対してHEK293細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３２】比較例４のコラーゲンコート品に対してMCF-7細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３３】比較例４のコラーゲンコート品に対してCaco-2細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３４】比較例４の市販品に対してHUVEC細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３５】比較例４の市販品に対してHEK293細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３６】比較例４の市販品に対してMCF-7細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３７】比較例４の市販品に対してCaco-2細胞の３日後の培養状態を示す倍率１００倍の顕微鏡写真である。
【図３８】実施例１０、比較例５のマイクロアレイ解析の結果を表したクラスタ解析結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、本発明の具体的な実施形態について説明する。なお、本発明は、その要旨を変更しない限りにおいて、適宜変更することができる。
【００３２】
本実施の形態に係る細胞培養用基材は、基体上に細胞接着層を有するものであり、この細胞接着層は下記式（Ｉ）で表される構造単位から構成される重合体膜（細胞培養用基膜）を有している。そして、細胞培養用基材は、この下記式（Ｉ）で表される重合体膜を０．２μｍ以上の膜厚で基体上に形成（成膜）してなっている。
【００３３】
【化５】
0005592842.tif 000006
【００３４】
ここで、上記式（Ｉ）中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨ（水素）を表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。また、ｌ、ｍは、重合度を表す正の整数である。
【００３５】
この細胞培養用基材は、特に限定されるものではないが、例えば化学蒸着法、好ましくはＣＶＤ法などにより、上記式（Ｉ）で表される重合体膜を基体上に形成することによって製造することができる。
【００３６】
例えば、細胞培養用基材は、原料化合物を用意し、その原料化合物を所定の減圧環境下で蒸発、分解させ、これを基体上に重合・堆積させることによって重合体膜を成膜して製造することができる。
【００３７】
原料化合物としては、例えば下記式（II）で表される化合物を用いることができる。
【００３８】
【化６】
0005592842.tif 000007
【００３９】
上記式（II）中、Ｒ１、Ｒ２は、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基（ｎは１以上１０以下の整数を表す。）又はＨを表し、少なくともＲ１、Ｒ２のいずれかは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基である。
【００４０】
上記式（II）で表される化合物は、合成効率や経済合理性などの観点から、ｎ＝１〜１０、好ましくはｎ＝１〜３の化合物を使用することができる。特に、それらの中でも、合成のし易さから、Ｒ１がｎ＝１であり、Ｒ２がＨのモノアミノメチル（２，２）パラシクロファンを用いることがより好ましい。
【００４１】
なお、原料化合物として用いられる上記式（II）の化合物は、公知の方法又は公知の方法に準じた方法により合成することができる。例えば、特開２００３−２１２９７４号公報などに記載されている方法を用いて合成することができる。また、商品名diX AM（第三化成（株）製）として市販されているものをそのまま用いることもできる。
【００４２】
ここで、より具体的に、本実施の形態に係る細胞培養用基材の製造方法について、化学蒸着法により製造する方法について説明する。
【００４３】
化学蒸着は、例えば図１に示すような蒸着装置１を用いて行うことができる。この蒸着装置１は、蒸発部１１と、分解部１２と、蒸着部１３とを備えている。蒸発部１１には、蒸発材料（原料化合物）を導入する蒸着原料投入口１１ａが備えられ、さらに蒸着部１３には、トラップ１４を介して真空ポンプ１５が接続されている。
【００４４】
この蒸着装置１を用いた化学蒸着は、先ず蒸発部１１に、例えば上記式（II）で表されるような固体状の蒸発材料を導入する。この蒸発部１１では、蒸発部１１内の温度を蒸発材料が気化する温度、例えば８０〜２００℃、好ましくは１００〜１８０℃に加熱することによって、蒸発材料の化合物を気化させて原料ガスを生成させる。
【００４５】
次いで、生成した原料ガスを分解部１２に導入する。この分解部１２では、導入された原料ガスをその分解温度、例えば５００〜８００℃、好ましくは６００〜７５０℃に加熱することによって、原料ガスを熱分解させてモノマーガスとする。
【００４６】
次に、得られた原料モノマーガスを蒸着部１３内に導入する。また、蒸着部１３には、細胞培養用プレートなどの基体を導入する。蒸着部１３内は、所定の真空度、例えば１〜２０Ｐａ、好ましくは２〜１０Ｐａに保持されている。そして、蒸着部１３では、導入した原料モノマーガスを基体に接触させ、その基体表面で重合させることによって、上記式（Ｉ）で表される重合体膜を所定以上の膜厚となるように基体上に形成させる。
【００４７】
これにより、基体上に上記（Ｉ）で表される重合体膜が細胞接着層として形成された細胞培養用基材を製造することができる。
【００４８】
なお、細胞培養用基材の基体上に細胞接着層としての上記式（Ｉ）で表される重合体膜を形成させることに先立って、例えばクロロ置換（２，２）パラシクロファン、好ましくはジクロロ（２，２）パラシクロファンなどの化学蒸着物を下地として形成するようにしてもよい。これにより、細胞接着層の強度を向上させることができ、また基体との密着性を向上させることができる。
【００４９】
このように、上記式（Ｉ）で表される重合体膜を化学蒸着法によって基体上に形成させて細胞培養用基材を製造する方法によれば、原料を蒸発して熱分解させて得られたモノマーガスが細胞培養用基材を構成する基体表面上に接触することで重合体膜の形成が行われるため、基体上に均一でかつ所望とする膜厚の重合体膜を形成させることが可能となり、例えば三次元立体構造物などの複雑な構造を持つ基体への応用も可能となる。
【００５０】
なお、基体としては、特に限定されないが、透明なガラス、シリコン又はポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡなどのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートなどのポリマーであることが好ましい。また、その他、紙や金属、あるいは繊維などを基体として用いることもできる。また、体内に挿入したり、三次元構造を構築したりするための基体としては、組織適合性や生分解性などの特質を備えたものが望ましい。なお、用意した基体は、公知の手法にてシランカップ処理を行ってもよく、酸素プラズマ処理などの公知の表面処理を施すこともできる。これにより、細胞接着層との密着性を向上させることができる。
【００５１】
ここで、上述したように、細胞培養用基材の基体上に形成させる重合体膜は、その膜厚を約０．２μｍ以上とし、より好ましくは約０．３μｍ以上とする。このように、上記式（Ｉ）で表される重合体膜を約０．２μｍ以上の膜厚で基体上に形成させることにより、培養した細胞の接着形態を間葉細胞様に発現させることができる。すなわち、間葉系細胞に適した培養環境を形成することができる。
【００５２】
間葉細胞様に接着した細胞は、細胞外マトリックスである重合体膜との接着性が高い。したがって、このように細胞を間葉細胞様の形態により接着させることができる細胞培養用基材によれば、より一層に細胞の接着強度を高めることができ、安定的に細胞を増殖させることができる。また、間葉細胞様に細胞を接着させることができることにより、接着した細胞の遊走能を高めることが可能となり、限られたスペースでも多量の細胞を増殖させて培養することができる。また、特に、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、人工皮膚、人工骨、人工臓器などに用いられる機能性組織細胞などの培養においては、間葉細胞様に細胞を接着させることによって分化の進行を制御できるため、これらの細胞の培養に好適に用いることができる。
【００５３】
なお、基体上の形成する重合体膜の膜厚の上限は、上述した効果を奏することができれば特に限定されるものではない。ただし、経済合理性などの観点からすれば、１０μｍ以下とするのがよい。
【００５４】
以上のように、本実施の形態に係る細胞培養用基材は、基体上に細胞接着層として上記式（Ｉ）で表される構造単位から構成され、膜厚が約０．２μｍ以上である重合体膜を有している。このような細胞培養用基材によれば、良好な接着強度で安定的に細胞を接着させることができ、細胞が剥がれることなく長期に亘って再現性よく培養することができる。また、間葉細胞様の接着形態で細胞を接着させることができるので、細胞を効果的に増殖させることができる。
【００５５】
また、従来のようなコラーゲンなどの生体由来の材料を使用していないことから、耐薬品性を有するとともに長期保管性を有する。すなわち、従来、細胞培養用基材に用いられてきたコラーゲンなど生体由来の材料は、アルコールなどの薬品により容易に変性、失活してしまうという欠点があった。また、生体由来の材料であることにより、すぐに腐敗が進み、保存に際しては所定の温度以下まで冷却することを要し、冷却環境下でも長期の保存は困難であった。これに対し、本実施の形態に係る細胞培養用基材では、生体由来の材料を使用していないことから、アルコールなどによっても変性や失活が生じず、したがってアルコールなどの薬品を用いた簡易的な殺菌、洗浄処理などの前処理のみによって培養に供することができる。また、冷却などすることなく培養した細胞を長期に亘って安定的に保管することができる。
【００５６】
さらに、本実施の形態に係る細胞培養用基材は、化学蒸着法などの処理のみによって基体上に上述した重合体膜を形成させて製造できるので、無菌環境下での処理やその細胞接着層をコーティングした後に別途化学的処理を行う必要がなく、簡易な処理で容易に工業的な量産を行うことができる。
【００５７】
なお、上述のようなアルコールなどによる簡易な殺菌、洗浄処理ではなく、培養に供するに先立ち、当然に、製造された細胞培養用基材を滅菌処理することもできる。滅菌方法については、特に限定されるものではなく、オートクレーブ、ガンマ線、電子線、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）などにより行うことができ、好ましくは電子線による滅菌、より好ましくは無酸素環境下での電子滅菌を用いることができる。
【実施例】
【００５８】
以下に、本発明の実施例を説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
【００５９】
＜細胞接着層を有する基材の作製・ヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養＞
［実施例１］
（細胞接着層を有する基材の作製）
（１）基体の準備
基体として市販されているポリスチレン製の２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレート（TC（Tissue Culture）処理品，BECTON DICKINSON社製）を準備し、細胞接着層の原材料として、下記構造式（II）で表される化合物であってＲ１が−ＣＨ２ＮＨ２、Ｒ２がＨを表す化合物であるモノアミノメチル（２，２）パラシクロファン（diX AM  第三化成（株）製）を準備した。
【００６０】
【化７】
0005592842.tif 000008
【００６１】
（２）重合体膜の形成
次いで、図１に示したような蒸着装置１において、蒸発部１１に、準備した固体状の蒸着原料であるモノアミノメチル（２，２）パラシクロファン８ｇを蒸着原料投入口１１ａから導入した。また、蒸着部１３に、基体であるポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレートを導入した。その後、真空ポンプ１５を使用し、装置系内を１．７Ｐａの真空度に保ち、１１０℃〜１１５℃に徐々に加熱した。すると、蒸着原料が気化してダイマーガスとなり、原料ガスが生成した。
【００６２】
次いで、生成した原料ガスを６００℃に加熱した分解部１２に導入した。この分解部１２においては、下記反応スキームに示されるように、導入した原料ガスを熱分解によってモノマーガス（III）とした。
【００６３】
次に、得られたモノマーガス（III）を蒸着部１３に導入した。蒸着部１３内は、最大６Ｐａの真空度に保持した。そして、導入したモノマーガス（III）を、蒸着部１３内に設置されたポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレートの表面で重合させ、下記反応スキームに示されるように上記式（Ｉ）で示される重合体の膜を形成させて、細胞培養用基材を作製した。このとき、形成された重合体膜の平均膜厚は１．１μｍであった。
【００６４】
【化８】
0005592842.tif 000009
【００６５】
（ヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養）
上述のようにして得られた細胞培養用基材について、７０％エタノールを２４ＷＥＬＬプレートの各ウェルにつき２ｍｌを入れ、１５分間クリーンベンチ内に静置した。その後、滅菌水にてウェルを洗浄し、乾燥させることでアルコール殺菌した後、ヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養を実施した。培養条件としては、２４ＷＥＬＬプレートに、１ＷＥＬＬにつき８．０×１０４の細胞を播種し、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ懸濁液、１％非必須アミノ酸を添加したＤＭＥＭ（低グルコース）を培地として、５％ＣＯ２大気下にて培養を行った。
【００６６】
図２に、実施例１において実施した３日後の培養状態を示す。
【００６７】
［比較例１］
（他のポリパラキシリレン誘導体での細胞培養用基材の作製・HepG2 細胞の培養）
比較例１では、蒸着原料として、ジクロロ（2,2）パラシクロファン（商品名 diX C  第三化成（株）製）、（２，２）パラシクロファン（商品名 diX N  第三化成（株）製）、オクタフルオロ（２，２）パラシクロファン（商品名 diX SF  第三化成（株）製）、モノアミノ（２，２）パラシクロファン（商品名 diX A  第三化成（株）製）、モノホルミル（２，２）パラシクロファン（商品名 diX H  第三化成（株）製）の５種類を準備し、実施例１と同様の手法にて重合体膜の形成を行い、細胞培養用基材を作製した。
【００６８】
次いで、得られた５種類の試験サンプル（細胞培養用基材）を用いて、実施例１と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養試験を実施した。
【００６９】
図３〜図７に、それぞれ、比較例１のポリモノクロロパラキシリレン、ポリパラキシリレン、ポリテトラフルオロパラキシリレン、モノアミノパラキシリレンとパラキシリレンの共重合物、モノホルミルパラキシリレンとパラキシリレンの共重合物を用いて実施した３日後の培養状態を示す。
【００７０】
［比較例２］
（一般的に用いられている細胞培養用基材でのHepG2 細胞の培養）
比較例２では、一般的に細胞培養に使用されているポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレート（TC（Tissue Culture）処理品）を用いて、実施例１と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養試験を実施した。
【００７１】
図８に、比較例２において実施した３日後の培養状態を示す。
【００７２】
［参考例１］
（コラーゲンコートされた細胞培養用基材でのHepG2 細胞の培養）
参考例１として、一般的に細胞培養に使用されているコラーゲンコートされたポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレートを用いて、実施例１と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養試験を実施した。
【００７３】
図９に、参考例１において実施した３日後の培養状態を示す。
【００７４】
表１に、実施例１、比較例１、２、及び参考例１にて実施したヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養結果を示す。なお、表１の細胞接着能の評価において、「◎」、「○」、「△」、「×」は接着強度を示し、その接着強度としては◎＞〇＞△＞×である。ただし、「×」については細胞接着能を有しないことを示す。
【００７５】
【表１】
0005592842.tif 000010
【００７６】
表１に示した培養結果から明らかなように、ポリパラキシリレン誘導体膜の中で、実施例１のモノアミノメチルパラキシリレンとパラキシリレンの共重合物以外は、細胞接着性が無く、又は接着してもその接着強度が非常に弱く、細胞培養用基材としては適当でないことが分かる。それに対して、実施例１のモノアミノメチルパラキシリレンとパラキシリレンの共重合物では、良好な細胞接着性を有し、またその接着強度も非常に強かった。また、実施例１のモノアミノメチルパラキシリレンとパラキシリレンの共重合物では、良好な細胞接着性を有していたとともに、参考例１に示したコラーゲンコートと同様に、間葉細胞様の細胞接着形態を示した。
【００７７】
＜細胞接着層の膜厚を変化させた場合のHepG2 細胞の培養＞
［実施例２］
実施例１と同様の手法に従って、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから、それぞれ膜厚０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、実施例１と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養を実施した。
【００７８】
図１０〜図１２に、それぞれ、実施例２の膜厚０．１μｍ、０．２μｍ、０．３μｍとしたときの３日後の培養状態を示す。
【００７９】
表２に、各膜厚の重合体膜を形成させた細胞培養用基材を用いて実施した培養結果を示す。なお、この表２には、上記実施例１及び比較例２の培養結果も併せて示す。表２の細胞接着能の評価において、「◎」、「○」は上記表１と同じく細胞接着能を有することを示し、その接着強度は◎＞〇である。
【００８０】
【表２】
0005592842.tif 000011
【００８１】
表２に示した培養結果から明らかなように、いずれの膜厚においても、細胞接着能を有していた。しかしながら、細胞接着層の膜厚が０．１μｍの場合では、比較例２のＴＣ処理品での培養と差異はなく、接着形態としても上皮細胞様となった。
【００８２】
一方で、細胞接着層の膜厚が０．２μｍ以上の場合には、良好な細胞接着能を有するとともにその接着強度も非常に強く、また接着形態も間葉細胞様が確認され、培養させた細胞が良好に増殖し得る細胞形態で接着しており、細胞接着層の効果が十分に発揮されていた。
【００８３】
＜無酸素環境下での電子線滅菌によるHepG2 細胞の培養＞
［実施例３］
実施例１と同様の手法に従って、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから膜厚０．６μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、無酸素環境下で１２ｋＧｙの電子線を照射することによって滅菌を行って、実施例１と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養を実施した。
【００８４】
その結果、実施例１の結果と同様に、良好な細胞接着能を有し、また間葉細胞様の接着形態を示し、細胞接着層の効果が十分に発揮されていた。なお、図１３に、実施例３において実施した３日後の培養状態を示す。
【００８５】
＜ポリパラキシリレン誘導体の積層によるHepG2 細胞の培養＞
［実施例４］
ポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレートの表面に膜厚２．４μｍのポリモノクロロパラキシリレンの重合体膜を形成した後に、実施例１と同様の手法に従ってモノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから膜厚１．１μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製した。すなわち、ポリモノクロロパラキシリレンを下地として形成した後に、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンにより重合体膜を形成した。
【００８６】
そして、得られた細胞培養用基材を用いて、実施例１と同様の培養条件でヒト肝癌由来 HepG2 細胞の培養を実施した。
【００８７】
その結果、実施例１の結果と同様に、良好な細胞接着能を有し、また間葉細胞様の接着形態を示し、細胞接着層の効果が十分に発揮されていた。なお、図１４に、実施例４において実施した３日後の培養状態を示す。
【００８８】
＜HepG2 細胞の長期培養＞
［実施例５］
実施例１と同様の手法に従って、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから膜厚１．０μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト肝癌由来 HepG2 細胞の最長１１日間の長期培養試験を行った。
【００８９】
培養条件としては、重合体膜を形成した２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレートの各ウェルに１ｍｌの細胞培養用液体培地を入れ、HepG2細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２大気下において１１日間細胞培養を行った。なお、細胞培養用液体培地は、一般的に使用されているＤＭＥＭ（低グルコース）を使用し、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン−ストレプトマイシン−アムホテリシンＢ懸濁液、１％非必須アミノ酸を添加したものを用いた。なお、本試験は長期培養のため、１日おきに培地交換を実施した。
【００９０】
図１５に、実施例５において実施した１１日後の培養状態を示す。
【００９１】
［比較例３］
（一般的に使用されている細胞培養用基材でのHepG2 細胞の長期培養）
比較例３では、一般的に細胞培養に使用されているポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレート（ＴＣ処理品）、コラーゲンコートされたポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレート、及び市販品（ＢＤ社製  PureCoat Amine）を用いて、実施例５と同様の培養条件にてヒト肝癌由来 HepG2 細胞の長期培養試験を実施した。
【００９２】
図１６〜図１８に、それぞれ、比較例３のＴＣ処理品、コラーゲンコート品、市販品を用いて実施した１１日後の培養状態を示す。
【００９３】
表３に、実施例５及び比較例３にて実施したヒト肝癌由来 HepG2 細胞の長期培養結果を示す。なお、表３の細胞接着能の評価において、「◎」及び「○」については共に細胞接着能を有することを示し、その接着強度としては◎＞○である。
【００９４】
【表３】
0005592842.tif 000012
【００９５】
表３に示した培養結果から明らかなように、比較例３のＴＣ処理品では細胞接着能は有していたものの、その接着強度は弱く完全には接着していない細胞も存在していた。また、ＴＣ処理品では、細胞の接着形態として上皮細胞様に接着しており、培養した細胞が十分に増殖し得る形態ではなかった。また、ＢＤ社製PureCoat Amineでは、短期的には十分な強度で細胞を接着させ、また各プレートにおいて各々の形態を保持しつつ増殖したが、細胞が剥がれてしまい、長期培養を行うことができなかった。
【００９６】
これらに対し、実施例５では、細胞接着能を有し、その接着強度も非常に強く良好であった。また、接着した細胞の形態も間葉細胞様であり、培養した細胞が十分に増殖し得る形態であった。さらに、増殖した細胞が剥がれてしまうことなく長期間に亘って細胞を保持しつつ増殖し、長期培養を行うことができた。
【００９７】
＜その他の細胞の培養＞
［実施例６］
（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞HUVECの培養）
実施例１と同様の手法に従って、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから膜厚０．２μｍ、０．３μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞HUVECの培養を行った。
【００９８】
培養条件としては、重合体膜を形成した２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレートの各ウェルに１ｍｌの細胞培養用液体培地を入れ、HUVECを播種し、３７℃、５％ＣＯ２大気下において１１日間細胞培養を行った。なお、細胞培養用液体培地は、HUVEC培養時に一般的に使用されているＥＧＭ−２を使用した。
【００９９】
図１９に、実施例６において膜厚０．２μｍの重合体膜を用いて実施した３日後の培養状態を示す。また、図２０に、実施例６において膜厚０．３μｍの重合体膜を用いて実施した３日後の培養状態を示す。
【０１００】
［実施例７］
（ヒト胎児腎由来HEK293細胞の培養）
実施例１と同様の手法に従って、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから膜厚０．２μｍ、０．３μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト胎児腎由来HEK293細胞の培養を行った。培養条件、培養手法は、実施例６の手法に従って同様に行った。
【０１０１】
図２１に、実施例７において膜厚０．２μｍの重合体膜を用いて実施した３日後の培養状態を示す。また、図２２に、実施例７において膜厚０．３μｍの重合体膜を用いて実施した３日後の培養状態を示す。
【０１０２】
［実施例８］
（ヒト乳癌由来MCF-7細胞の培養）
実施例１と同様の手法に従って、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから膜厚０．２μｍ、０．３μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト乳癌由来MCF-7細胞の培養を行った。培養条件、培養手法は、実施例６の手法に従って同様に行った。
【０１０３】
図２３に、実施例８において膜厚０．２μｍの重合体膜を用いて実施した３日後の培養状態を示す。また、図２４に、実施例８において膜厚０．３μｍの重合体膜を用いて実施した３日後の培養状態を示す。
【０１０４】
［実施例９］
（ヒト結腸癌由来Caco-2細胞の培養）
実施例１と同様の手法に従って、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから膜厚０．７μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、ヒト結腸癌由来Caco-2細胞の培養を行った。培養条件、培養手法は、実施例６の手法に従って同様に行った。
【０１０５】
図２５に、実施例９において膜厚０．７μｍの重合体膜を用いて実施した３日後の培養状態を示す。
【０１０６】
［比較例４］
（一般的に用いられている細胞培養用基材での細胞培養）
比較例４では、一般的に細胞培養に使用されているポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレート（ＴＣ処理品）、コラーゲンコートされたポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレート、及び市販品（BD社製  PureCoat Amine）を用いて、上述した実施例６〜９と同様の手法にてヒト臍帯静脈血管内皮細胞HUVEC、ヒト胎児腎由来HEK293細胞、ヒト乳癌由来MCF-7細胞、及びヒト結腸癌由来Caco-2細胞の培養を実施した。
【０１０７】
図２６〜図２９に、それぞれ、比較例４のＴＣ処理品を用いて実施したHUVEC細胞、HEK293細胞、MCF-7細胞、Caco-2細胞の３日後の培養状態を示す。また、図３０〜図３３に、それぞれ、比較例４のコラーゲンコート品を用いて実施したHUVEC細胞、HEK293細胞、MCF-7細胞、Caco-2細胞の３日後の培養状態を示す。また、図３４〜図３７に、それぞれ、市販品を用いて実施したHUVEC細胞、HEK293細胞、MCF-7細胞、Caco-2細胞の３日後の培養状態を示す。
【０１０８】
表４に、実施例６〜９にて実施した各種細胞の培養結果を示し、表５に、比較例４にて実施した各種細胞の培養結果を示す。なお、表４及び表５に示す接着性の検討結果は、培養５日目における結果であり、「○」は細胞接着能を有することを示し、「×」は細胞接着能を有しないことを示す。「−」は試験を実施していない条件であることを示す。
【０１０９】
【表４】
0005592842.tif 000013
【０１１０】
【表５】
0005592842.tif 000014
【０１１１】
表４及び表５の培養結果から明らかなように、HUVEC及びCaco-2細胞は、どのプレートにおいても接着していたが、HEK293細胞及びMCF-7細胞は、比較例４で使用したBD社製PureCoat Amineには接着していなかった。これに対し、実施例６〜９で使用した細胞培養用基材では、全ての細胞が接着し、良好な細胞接着能を有した。このことから、実施例６〜９で使用した細胞培養用基材には、細胞種依存性がないことが分かった。
【０１１２】
＜培養したヒト肝癌由来 HepG2 細胞のマイクロアレイ解析＞
［実施例１０］
実施例１と同様の手法に従ってモノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから膜厚０．５μｍの重合体膜を形成して細胞培養用基材を作製し、実施例５と同様の手法に従ってHepG2細胞の培養を行った。次いで、培養したHepG2細胞から、RNeasy Mini Kit （QIAGEN）を用いて全ＲＮＡの抽出・精製を行い、全ＲＮＡをタカラバイオ社に送付し、マイクロアレイ解析を委託した。その後、得られた解析データの品質管理を行い、通常のＴＣ処理プレートでの培養時に比べて２倍以上上昇した遺伝子を抽出し、Cluster 3を用いてクラスタ解析を行った。また、可視化にはJava TreeViewを使用した。
【０１１３】
［比較例５］
（一般的に用いられている細胞培養用基材でヒト肝癌由来 HepG2 細胞を培養した場合のマイクロアレイ解析）
比較例５では、一般的に細胞培養に使用されているポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレート（ＴＣ処理品）、コラーゲンコートされたポリスチレン製２４ＷＥＬＬ細胞培養用マルチウェルプレート、及び市販品（BD社製  PureCoat Amine）を用いて、上述した実施例１０と同様の手法にて培養したHepG2細胞のマイクロアレイ解析を実施した。
【０１１４】
図３８に、実施例１０及び比較例５にて培養したヒト肝癌由来 HepG2 細胞のマイクロアレイ解析結果を示す。
【０１１５】
図３８から明らかなように、クラスタ解析の結果、モノアミノメチル（２，２）パラシクロファンから得られた重合体膜で培養した場合と、コラーゲンコートプレートで培養した場合とで、発現上昇してくる遺伝子のパターンが似ていることが分かる。一方、PureCoat Amineで培養した場合では、全体的にあまり遺伝子の変動がなく、コラーゲンコートプレートにおける培養とは異なっていることが見て取れる。
【符号の説明】
【０１１６】
１１蒸発部、１１ａ  蒸着原料投入口、１２  分解部、１３  蒸着部、１４  トラップ、１５  真空ポンプ
【図１】
0005592842.tif 000018
【図２】
0005592842.tif 000019
【図３】
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【図４】
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【図５】
0005592842.tif 000022
【図６】
0005592842.tif 000023
【図７】
0005592842.tif 000024
【図８】
0005592842.tif 000025
【図９】
0005592842.tif 000026
【図１０】
0005592842.tif 000027
【図１１】
0005592842.tif 000028
【図１２】
0005592842.tif 000029
【図１３】
0005592842.tif 000030
【図１４】
0005592842.tif 000031
【図１５】
0005592842.tif 000032
【図１６】
0005592842.tif 000033
【図１７】
0005592842.tif 000034
【図１８】
0005592842.tif 000035
【図１９】
0005592842.tif 000036
【図２０】
0005592842.tif 000037
【図２１】
0005592842.tif 000038
【図２２】
0005592842.tif 000039
【図２３】
0005592842.tif 000040
【図２４】
0005592842.tif 000041
【図２５】
0005592842.tif 000042
【図２６】
0005592842.tif 000043
【図２７】
0005592842.tif 000044
【図２８】
0005592842.tif 000045
【図２９】
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【図３０】
0005592842.tif 000047
【図３１】
0005592842.tif 000048
【図３２】
0005592842.tif 000049
【図３３】
0005592842.tif 000050
【図３４】
0005592842.tif 000051
【図３５】
0005592842.tif 000052
【図３６】
0005592842.tif 000053
【図３７】
0005592842.tif 000054
【図３８】
0005592842.tif 000055