(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸の桂皮酸エステルとを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、
キナ酸の桂皮酸エステルのキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したものと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
を備えたことを特徴とするキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。
【請求項２】
桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸の桂皮酸エステルとを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、
キナ酸の桂皮酸エステルのキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したものと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
前記エステル交換反応のステップにより得られたキナ酸ジエステル誘導体のメチルエステル結合を加水分解するステップと、
を備えたことを特徴とするキナ酸ジエステルの酵素合成法。
【請求項３】
カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ  ｃａｆｆｅａｔｅ）と、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、
カフェオイルキナ酸のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
を備え、ジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）を合成することを特徴とするキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。
【請求項４】
カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ  ｃａｆｆｅａｔｅ）と、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、
カフェオイルキナ酸のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップと、
を備え、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を合成することを特徴とするキナ酸ジエステルの酵素合成法。
【請求項５】
桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、
キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したキナ酸メチルと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
を備えたことを特徴とするキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。
【請求項６】
桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、
キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したキナ酸メチルと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
前記エステル交換反応のステップにより得られたキナ酸ジエステル誘導体のメチルエステル結合を加水分解するステップと、
を備えたことを特徴とするキナ酸ジエステルの酵素合成法。
【請求項７】
カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ  ｃａｆｆｅａｔｅ）と、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、
キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
を備え、ジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）を合成することを特徴とするキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。
【請求項８】
カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ  ｃａｆｆｅａｔｅ）と、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、
キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップと、
メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップと、
エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップと、
を備え、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を合成することを特徴とするキナ酸ジエステルの酵素合成法。
【請求項９】
前記疎水性イオン液体は、アニオンに[ＮＴｆ２]を有するものである請求項１，３，５，７のいずれかのキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法。
【請求項１０】
前記疎水性イオン液体は、アニオンに[ＮＴｆ２]を有するものである請求項２，４，６，８のいずれかのキナ酸ジエステルの酵素合成法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なキナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法に関し、詳しくはイオン液体中でのエステル交換反応により、キナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成を簡便に安全に収率よく行う方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
既に、発明者らは、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステルと、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）を基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を施すことで、４，５−ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ；４，５−Ｄｉｃａｆｆｅｏｙｌ  Ｑｕｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）を酵素合成し得ることの知見を得ている（特許文献１の段落００５５〜００６５を参照。）。
【０００３】
ここで、一方の基質であるカフェ酸ビニルエステルは有機溶媒に溶けやすいといった性質であり、他方の基質のカフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）は水に溶けやすいといった性質である。すなわち、カフェ酸ビニルエステルは疎水性イオン液体に溶解させ易く、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）は疎水性イオン液体に溶解させ難い。また、特許文献１に記載しているように、発明者らは、疎水性イオン液体が親水性イオン液体と比較してリパーゼ酵素の触媒反応が優れていることの知見を得ている。
【０００４】
具体例として、クロロゲン酸（５−ＣＱＡ）で説明する。クロロゲン酸は、疎水性イオン液体に溶解しないが、親水性イオン液体には溶解する。しかしながら、親水性イオン液体中では固定化リパーゼの酵素が失活する。そこで、固定化リパーゼの触媒反応に適している疎水性イオン液体と、クロロゲン酸の溶解に優れた親水性イオン液体を混合して酵素合成することを試みた。
すなわち、図１に示すように、疎水性イオン液体と親水性イオン液体を混合して作製した混合イオン液体中で、クロロゲン酸とカフェ酸ビニルエステルとを基質として、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）の酵素合成を試みた。しかしながら、クロロゲン酸の溶解と酵素活性の発現を両立できる混合イオン液体を見出すことはできず、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）の酵素合成はできなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−２０７４９２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記状況下、本発明は、リパーゼ酵素の活性が優れている疎水性イオン溶液および微生物が生産する酵素を用いて、桂皮酸類、特に生理活性が高いカフェ酸から付加価値の高いジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を少ない工程で工業生産レベルに酵素合成することを目的とする。
すなわち、本発明は、かかる目的を達成すべく、イオン液体中でのエステル交換反応により、キナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成を簡便に効率よく行う方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記状況下、本発明者らは、クロロゲン酸に修飾基をつけて疎水性にしておき、リパーゼの触媒反応として優れている疎水性イオン液体に溶解させ易くすれば、その後の酵素反応がスムーズに進むのではないかと仮説を立てた。
本発明者らは、このような事情に鑑み鋭意研究を重ねた結果、クロロゲン酸を疎水性にできる修飾基はメチル基以外にもあるが（例えば、エチル基，プロピル基，ブチル基など）、リパーゼ（ＬｉｐｏｚｙｍｅＴＬ−ＩＭ）がカフェオイル基をエステル交換する基質に最も適しているのがメチルエステルであることを見出した。そして、キナ酸のカルボキシ基をメチル化し疎水性を上げたものと、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したものとを基質として、両者を疎水性イオン液体中で酵素によるエステル交換反応を施すことにより、少ない工程でキナ酸ジエステル誘導体を高い収率で酵素合成できることの知見を得て、本発明に至った。
【０００８】
すなわち、上記課題を達成すべく、本発明の第１の観点によれば、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸の桂皮酸エステルとを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、手順１−１〜１−２を備えたキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法が提供される。
（手順１−１）キナ酸の桂皮酸エステルのキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順１−２）メチルエステル化したものと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
【０００９】
かかるキナ酸ジエステルの酵素合成法によれば、桂皮酸類のビニルエステルから目的とするキナ酸ジエステル誘導体を簡便かつ安全に、また高い収率で得ることができる。一段階の反応で目的生成物が得られ効率がよく、また本発明のエステル交換反応は一相系で行われるため多様な基質と酵素を使用でき、また有機溶媒類を用いないので環境に優しく、イオン液体および酵素がリサイクル利用できるといった利点を有する。
【００１０】
ここで、上記のイオン液体は、疎水性のものであることが好適である。親水性のイオン液体よりも、疎水性のイオン液体の方が、エステル交換反応の変換率が極めて高いからである。
また、上記の固定化酵素は、リパーゼ類であることが好適である。更にかかるリパーゼ類は、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標） ＴＬ−ＩＭであることが好ましい。後述する酵素スクリーニング結果から、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標） ＴＬ−ＩＭが、キナ酸ジエステル誘導体のエステル交換反応を示すという知見を得たものである。
【００１１】
また、桂皮酸類は、特に制限はないが、コーヒーなどの植物等の天然物中の成分として存在するものが好ましく、例えば、桂皮酸、カフェ酸、ヒドロキシ桂皮酸、フェルラ酸、ヘスペリチン酸、３，４−ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、およびシナピン酸の群から選択されたものである。
また、酵素反応に必要な物質は、基質と固定化された酵素、イオン液体だけで、アセトンなどの有機溶媒やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加は行っていない。
また、疎水性イオン液体は、[Ｂｄｍｉｍ][ＮＴｆ２]，[Ｂｍｉｎ] [ＮＴｆ２]，[Ｂｍｐｒｏ] [ＮＴｆ２]のいずれかであることが好ましい。すなわち、疎水性イオン液体は、アニオンに[ＮＴｆ２]をもつことが好ましい。
【００１２】
次に、本発明の第２の観点によれば、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸の桂皮酸エステルとを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、手順１−１〜１−３を備えたキナ酸ジエステルの酵素合成法が提供される。
（手順１−２）キナ酸の桂皮酸エステルのキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順１−２）メチルエステル化したものと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（手順１−３）エステル交換反応のステップにより得られたキナ酸ジエステル誘導体のメチルエステル結合を加水分解するステップ
【００１３】
次に、本発明の第３の観点によれば、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ  ｃａｆｆｅａｔｅ）と、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、手順２−１〜２−２を備えたキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法が提供される。
（手順２−１）カフェオイルキナ酸のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順２−２）メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
【００１４】
次に、本発明の第４の観点によれば、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ  ｃａｆｆｅａｔｅ）と、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、手順２−１〜２−３を備えたキナ酸ジエステルの酵素合成法が提供される。
（手順２−１）カフェオイルキナ酸のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順２−２）メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（手順２−３）エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップ
【００１５】
次に、本発明の第５の観点によれば、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、手順３−１〜３−２を備えたキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法が提供される。
（手順３−１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順３−２）メチルエステル化したキナ酸メチルと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
【００１６】
次に、本発明の第６の観点によれば、桂皮酸類のカルボキシ基をビニル基にエステル交換した桂皮酸類ビニルエステルと、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応であって、手順３−１〜３−３を備えたキナ酸ジエステルの酵素合成法が提供される。
（手順３−１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順３−２）メチルエステル化したキナ酸メチルと桂皮酸類ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（手順３−３）エステル交換反応のステップにより得られたキナ酸ジエステル誘導体のメチルエステル結合を加水分解するステップ
【００１７】
次に、本発明の第７の観点によれば、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ  ｃａｆｆｅａｔｅ）と、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、手順４−１〜４−２を備えたキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成法が提供される。
（手順４−１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順４−２）メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
【００１８】
次に、本発明の第８の観点によれば、カフェ酸のカルボキシ基をビニル基にエステル交換したカフェ酸ビニルエステル（Ｖｉｎｙｌ  ｃａｆｆｅａｔｅ）と、キナ酸とを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応であって、手順４−１〜４−３を備えたキナ酸ジエステルの酵素合成法が提供される。
（手順４−１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（手順４−２）メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（手順４−３）エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップ
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、イオン液体中でのエステル交換反応により、キナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体の酵素合成を簡便に効率よく行う方法が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】従来検討した酵素合成法のイメージ
【図２】クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）からクロロゲン酸メチル（５−カフェオイルキナ酸メチル）への酵素変換のイメージ
【図３】クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）のメチル化試験におけるＨＰＬＣクロマトグラム
【図４】５−カフェオイルキナ酸メチルの構造図
【図５】クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）からクロロゲン酸メチル（５−カフェオイルキナ酸メチル）への酵素変換とその条件および変換率を示す図
【図６】５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルからジカフェオイルキナ酸メチルへの変換イメージ
【図７】クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）とカフェ酸ビニルを用いた酵素反応試験におけるＨＰＬＣクロマトグラム
【図８】酵素反応液から新規ピークを精製した後のＨＰＬＣクロマトグラム
【図９】クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）とカフェ酸ビニルを用いた酵素反応試験における生成物質のＬＣ−ＭＳ分析結果を示す図
【図１０】ジカフェオイルキナ酸メチルの構造図
【図１１】４、５−ジカフェオイルキナ酸メチルの構造図
【図１２】ｄｉＣＱＡ合成における最適なイオン液体のスクリーニングに供したイオン液体の構造図
【図１３】ｄｉＣＱＡ合成における最適なイオン液体のスクリーニング結果の結果を示す図
【図１４】５−ＣＱＡの構造図において、キナ酸の３位の位置、４位の位置がカフェ酸に置換されている３−ＣＱＡ，４−ＣＱＡの説明に用いる図
【図１５】キナ酸からキナ酸メチルへの変換イメージ
【図１６】キナ酸メチルの構造図
【図１７】キナ酸メチルとカフェ酸ビニルからカフェオイルキナ酸メチル（４−ＣＱＡメチル）への変換イメージ
【図１８】カフェオイルキナ酸メチル合成における最適な酵素のスクリーニング結果を示す図
【図１９】カフェオイルキナ酸メチル合成における最適なイオン液体のスクリーニング結果を示す図
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
実施例１は、以下の（１）〜（３）の処理を行って、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を酵素合成する方法について、カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）としてクロロゲン酸（５−ＣＱＡ）を用いた処理を詳細に説明する。
（１）カフェオイルキナ酸（ＣＱＡ）のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（２）メチルエステル化したカフェオイルキナ酸メチル（ＣＱＡ−Ｍｅ）とカフェ酸ビニルエステルとを基質として、疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（３）エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップ
【００２３】
（５−ＣＱＡ−Ｍｅの合成）
先ず、クロロゲン酸（５−ＣＱＡ）のキナ酸部位のカルボキシ基をメチルエステル化するステップについて説明する。図２に、クロロゲン酸からクロロゲン酸メチル（５−ＣＱＡ−Ｍｅ；５−カフェオイルキナ酸メチル）への酵素変換のイメージを示す。
図５に示すように、クロロゲン酸からクロロゲン酸メチルへの酵素変換は、具体的には、１０.０ｍｌ用スクリューキャップ付きバイアル瓶に５−ＣＱＡ １７.７ｍｇと、もう１種類の基質であるメタノール
９８ μｌ、[Ｂｍｉｍ][ＮＴＦ２] ０．９０２ ｍｌ、３オングストローム モレキュラーシーブ １５ｍｇを加え、オイルバス中で４０℃、１０分間予備加温した。ここに、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ４３５を１．５×１０４
Ｕを加え、４０℃、２００ｒｐｍ  （Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｔｉｒｒｅｒ ＳＷ−ＲＳ７７７Ｄ、ＮＩＳＳＩＮ)  で撹拌した。経時的にサンプリングし、ＨＰＬＣ分析に供した。クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）からクロロゲン酸メチル（５−カフェオイルキナ酸メチル）への酵素変換の変換率は、９３％であった。
【００２４】
反応液からサンプルを採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；High
Performance Liquid Chromatography)にて分析を行なった。ＨＰＬＣ分析は、ＨＩＴＡＣＨＩ Ｄ−２０００ Ｅｌｉｔｅ（日立ハイテクノロジー）とＣｏｓｍｏｓｉｌ
５Ｃ１８−ＡＲIIカラム(４．６  ｍｍ Ｉ．Ｄ．×  ２５０  ｍｍ、Ｎａｃａｒａｉ
ｔｅｓｑｕｅ Ｉｎｃ.) を用い、移動相に０．２％（ｖ／ｖ）酢酸とメタノールを用いた。１０分間でメタノールが３０％から６０％（ｖ／ｖ）になるようにグラジエントをかけ、その後１５分間１００％メタノールを流した。カラム温度４０℃、流速１．０
ｍｌ／ｍｉｎで分析し、３３０ ｎｍにおける吸光度を検出した。
ＨＰＬＣの分析結果を図３に示す。分析結果から、５−カフェオイルキナ酸のリテンションタイムとは全く異なる場所に新規ピークが生じていることが確認できた。
【００２５】
５−ＣＱＡとメタノールをイオン液体[Ｂｍｉｍ][ＮＴｆ２]の存在下で、酵素反応によって生じた物質を単離し、ＮＭＲ(Nuclear
Magnetic Resonance Spectroscopy)分析を行なった。ＮＭＲ分析の結果、この酵素反応によって生じた物質は、図４に示す構造の５−ＣＱＡ−Ｍｅ（５−カフェオイルキナ酸メチル）であることが確認できた。なお、ＮＭＲ分析に用いた分析機器は、BRUKER ULTRASHIELD 400 PLUSである。
ＮＭＲ分析の結果について、下表１に示す。なお、対応する符号数字（１〜６，１´〜９´）は、図４の構造図に表記しているものに対応している。
【００２６】
【表１】
0005568829.tif 000002
【００２７】
（ｄｉＣＱＡの合成：酵素スクリーニング）
５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルからジカフェオイルキナ酸メチルへの変換が可能かどうかについて、市販の酵素製剤１２種類を用いて酵素のスクリーニングを行なった。スクリーニングに用いたのは、５−カフェオイルキナ酸メチル（１５ｍＭ；５．５０ｍｇ）とカフェ酸ビニルエステル（８５ｍＭ；１７．５ｍｇ）である。これらを１０．０ ｍｌ容スクリューキャップ付きバイアル瓶にイオン液体[Ｂｍｉｍ] [ＮＴｆ２]  ０．５ｍｌ、３オングストローム モレキュラーシーブ １５  ｍｇとともに添加し、オイルバス中で４０℃、１０分間予備加温した。さらに、リパーゼ酵素製剤５ｍｇと共に、６０℃，１７０
ｒｐｍで撹拌し反応開始した。１４４時間インキュベートしたところ（図６を参照）、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ−ＩＭを使用したときのみ新規ピークの出現が確認できた。
【００２８】
反応液からサンプルを採取し、ＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣクロマトグラムを図７に示す。分析の結果、５−カフェオイルキナ酸およびカフェ酸ビニルのリテンションタイムとは全く異なる場所に新規ピークが生じていた（図８のＨＰＬＣクロマトグラムの拡大図を参照）。
【００２９】
【表２】
0005568829.tif 000003
【００３０】
（反応生成物の精製）
反応液に対して、ｎ−ヘキサン：２−プロパノール
／ ２：１（ｖ／ｖ） ３．０ ｍｌを加えて激しく攪拌し、生成物と残存する基質を抽出した。得られた抽出液を減圧濃縮してシリカゲルカラム（径２６ｍｍ×４００ｍｍ、
ワコーゲル Ｃ−２００）に供して、クロロホルム : 酢酸エチル／１ : １（ｖ／ｖ）でカフェ酸ビニルエステルと反応副産物を溶出した。その後、メタノールで５−カフェオイルキナ酸メチルと新規ピーク物質を溶出させた。
次に、この工程で得たメタノール溶出画分を減圧乾固させ、ＨＣｌ酸性水（ｐＨ３）に再溶解した。その後、ＨＣｌ酸性水で活性化させたＳＰ２０７カラム（径２６ｍｍ×４００ｍｍ）にサンプルをアプライした。ＨＣｌ酸性水でＳＰ２０７樹脂にサンプルを吸着させた後、まず３０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液（ｐＨ３）で５−カフェオイルキナ酸メチルを溶出させ、その後、１００％エタノールで新規ピーク物質を溶出させた。溶出画分を一つにまとめ、濃縮、凍結乾燥を行なった。
【００３１】
（ＬＣ−ＭＳによる分析）
５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルをイオン液体[Ｂｍｉｍ] [ＮＴｆ２]の存在下で、リパーゼ（ＬｉｐｏｚｙｍｅＴＬ−ＩＭ）によって新たに生成した物質について、ＬＣ−ＭＳ分析（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ）を行なった。ＬＣ−ＭＳは以下のものを使用した。
・ＨＰＬＣ：Ａｌｌｉａｎｃｅ
ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏ．ＵＳＡ）
・ＭＳ：Ｑ−ＴＯＦ
Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏ．ＵＳＡ）
ここで、ＬＣ−ＭＳ分析条件は、０．２％（ｖ／ｖ）酢酸:メタノール／ ７０:３０（ｖ／ｖ）で平衡化したカラムに、２５．０分間でメタノールが３０％から６０％（ｖ／ｖ）になるようにグラジエントをかけ、その後３７分間１００％メタノールを流した後、１３分間、最初の溶媒比率でカラムを再平衡化した。
【００３２】
ＬＣ−ＭＳ分析結果を図９に示す。図９に示すように、ＬＣ−ＭＳ分析の結果、衝突エネルギーが５Ｖのときで５２９（ｍ／ｚ）が得られた。この新規反応生成物質の分子イオンピーク５２９（ｍ／ｚ）は、ジカフェオイルキナ酸メチルの分子量５３０と一致した。さらに衝突エネルギーが２０Ｖのとき３６７（ｍ／ｚ）と１７９（ｍ／ｚ）が観察された。これらはそれぞれ、新規反応生成物質が開裂しカフェオイル基が脱離したもの、および脱離したカフェオイル基のフラグメントピークの（ｍ／ｚ）と一致した。これらの結果から、新規ピーク物質はジカフェオイルキナ酸メチルと同定した。
【００３３】
（４,５−ｄｉＣＱＡ−Ｍｅの同定）
５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルをイオン液体[Ｂｍｉｍ]
[ＮＴｆ２]の存在下で、酵素反応によって生じた物質を単離し、ＮＭＲ分析を行なった。ＮＭＲ分析の結果、この酵素反応によって生じた物質は、図１０に示す構造の４，５−ｄｉＣＱＡメチル（４、５−ジカフェオイルキナ酸メチル）であることが確認できた。
ＮＭＲ分析の結果について、下表３に示す。なお、対応する符号数字（１〜６，１´〜８´等）は、図１１の構造図に表記しているものに対応している。
【００３４】
【表３】
0005568829.tif 000004
【００３５】
（ｄｉＣＡＱ−Ｍｅを合成できるイオン液体の探索）
５−カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルからジカフェオイルキナ酸メチルへの変換において、どのようなイオン液体を用いれば最も収率が適切かについて、下表４に示すイオン液体および有機溶媒（合計９種類）を用いて反応溶媒のスクリーニングを行なった。
【００３６】
【表４】
0005568829.tif 000005
【００３７】
反応溶媒のスクリーニングは、カフェオイルキナ酸メチル（１０．８ｍＭ；３．９６ｍｇ）とカフェ酸ビニルエステル（４３．２ｍＭ；８．９０ｍｇ）、３オングストローム
モレキュラーシーブ ５ｍｇとを上記表４に示すイオン液体および有機溶媒（合計９種類）０．２５ｍｌ中に添加し、オイルバス中で６０℃、１０分間予備加温した。その後、ＬｉｐｏｚｙｍｅＴＬ−ＩＭ
５ｍｇと共に６０℃、１７０ｒｐｍで１４４時間インキュベートした。
反応液からサンプルを採取し、ＨＰＬＣ分析を行なった。ＨＰＬＣ分析は、ＨＩＴＡＣＨＩ
Ｄ−２０００ ＥｌｉｔｅとＣｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ１８−ＡＲIIカラム(４．６
ｍｍ Ｉ.Ｄ.×２５０ｍｍ)
を用い、移動相に０．２％（ｖ／ｖ）酢酸とメタノールを用いた。２０分間でメタノールが２０％(ｖ／ｖ)から１００％になるようにグラジエントをかけ、その後１５分間１００％メタノールを流した。カラム温度４０℃、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで分析し、３３０ｎｍにおける吸光度を検出した。その結果、[Ｂｄｍｉｍ][ＮＴｆ２]が最も効率よくジカフェオイルキナ酸メチルを生成することが確認できた。
ここで、図１２は、上記表４に示すイオン液体の構造を示している。
【００３８】
図１３は、ｄｉＣＱＡの酵素合成における最適なイオン液体のスクリーニング結果を示したものである。図１３から、カフェオイルキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを基質として、イオン液体中で固定化酵素によるエステル交換反応させるのに適したイオン液体としては、[Ｂｄｍｉｍ] [ＮＴｆ２]（１−Ｂｕｔｙｌ−２，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｂｉｓ(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ) ｉｍｉｄｅ）が最も相対活性が高く、次いで、[Ｂｍｉｍ] [ＮＴｆ２]（１−Ｂｕｔｈｙｌ−３−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ ｂｉｓ(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ) ｉｍｉｄｅ）、[Ｂｍｐｒｏ] [ＮＴｆ２]（Ｎ−Ｂｕｔｈｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｉｕｍ ｂｉｓ(ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ) ｉｍｉｄｅ）であった。アニオンに[ＮＴｆ２]をもつ疎水性イオン液体は、[ＣＦ３ＳＯ３]をもつ親水性イオン液体や有機溶媒よりも新規ピーク物質の酵素合成に適していた。
【実施例２】
【００３９】
次に、実施例２は、以下の（１）〜（３）の処理を行って、ジカフェオイルキナ酸（ｄｉＣＱＡ）を酵素合成する方法について、キナ酸とカフェ酸ビニルエステルとを基質として、イオン液体中で固定化リパーゼによるエステル交換反応を行わせる処理を詳細に説明する。
（１）キナ酸のカルボキシ基をメチルエステル化するステップ
（２）メチルエステル化したキナ酸メチルとカフェ酸ビニルエステルとを疎水性イオン液体中でエステル交換反応させるステップ
（３）エステル交換反応で得られたジカフェオイルキナ酸メチル（ｄｉＣＱＡ−Ｍｅ）のメチルエステル結合を加水分解するステップ
【００４０】
実施例１に示したように、イオン液体にクロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）とメタノールを溶解し、リパーゼを反応させるとクロロゲン酸メチル（５−カフェオイルキナ酸メチル）を得ることができた。
そこで、他のカフェオイルキナ酸、具体的には、３−ＣＱＡ（３−カフェオイルキナ酸）、４−ＣＱＡ（４−カフェオイルキナ酸）でも同様の反応生成物が得られるか否か実験を行なった。しかしながら、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡではメチル化反応を行うことは困難であった。
なお、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡの構造は、図１４のクロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）の構造式において、キナ酸の３位の位置、４位の位置がカフェ酸に置換されているものがそれぞれ３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡである。
【００４１】
実施例２においては、３−ＣＱＡ（３−カフェオイルキナ酸）、４−ＣＱＡ（４−カフェオイルキナ酸）では、クロロゲン酸（５−カフェオイルキナ酸）とは異なり、メチル化物が生成され難いことに鑑みて、先ず、キナ酸をメチル化してから、メチル化されたキナ酸メチルとカフェ酸ビニルとを作用させて、エステル交換によりクロロゲン酸メチルを合成する方法を説明する。
【００４２】
（キナ酸メチルの合成）
キナ酸メチルの合成は、キナ酸とメタノールの存在下において、塩酸を添加し６０℃で１日反応させることにより合成した。そして、反応液を減圧乾固させ、クロロホルムに懸濁し、クロロホルム：メタノール＝９０：１０（v/v）で抽出を行った。この抽出液をサンプルとして薄層クロマトグラフィー（展開溶媒＝クロロホルム：メタノール＝７０：３０（v／v））を行い、リンモリブデン酸試薬によってキナ酸メチルと同じＲｆ値にあるスポットを確認した。
そして、この薄層上にあるスポット部分を回収して、ＮＭＲ分析に供した。
図１５は、キナ酸からキナ酸メチルへの変換イメージを示している。
【００４３】
（キナ酸メチルの同定）
キナ酸とメタノールの存在下において、塩酸を添加し６０℃で１日反応させた。生じた物質を単離し、ＮＭＲ分析を行なった。その結果、キナ酸メチルであることを確認できた。また、収率は６０．２％であった。
ＮＭＲ分析の結果について、下表５に示す。なお、対応する符号数字（１〜６）は、図１６の構造図に表記しているものに対応している。
【００４４】
【表５】
0005568829.tif 000006
【００４５】
（カフェオイルキナ酸メチルの合成における酵素スクリーニング）
キナ酸メチルとカフェ酸ビニルからカフェオイルキナ酸メチルへの変換が可能かどうかについて、市販の酵素製剤７種類（下記表６を参照）を用いて酵素のスクリーニングを行なった。
カフェ酸ビニル、キナ酸メチルをイオン液体[Ｂｍｉｍ] [ＮＴｆ２]に添加し、さらにリパーゼ酵素製剤と共に６０℃でインキュベートした。この反応液からサンプルを採取し、ヘキサンと２−プロパノール＝２：１の混合液で抽出を行い、ＨＰＬＣにて分析を行なった。その結果、リパーゼＰＬを用いたときは図にみられるように４−カフェオイルキナ酸メチルおよび５−カフェオイルキナ酸メチルと思われるピークが多く生じていた。
図１７に、キナ酸メチルとカフェ酸ビニルからカフェオイルキナ酸メチル（４−ＣＱＡメチル）への変換イメージを示す。
また、図１８は、カフェオイルキナ酸メチル合成における最適な酵素のスクリーニング結果を示すグラフである。
【００４６】
【表６】
0005568829.tif 000007
【００４７】
（カフェオイルキナ酸メチルを合成できるイオン液体のスクリーニング）
キナ酸メチルとカフェ酸ビニルからカフェオイルキナ酸メチルへの変換において、どのようなイオン液体を用いれば最も収率が良いかについて、下記表７に示すイオン液体および有機溶媒（合計７種類）を用いて反応溶媒のスクリーニングを行なった。カフェ酸ビニルおよびキナ酸メチルを表に示すイオン液体に添加し、リパーゼＰＬと共に４０℃、２００ｒｐｍで１４４時間インキュベートした。反応液からサンプルを採取し、ヘキサンと２−プロパノール＝２：１の混合液で抽出を行い、ＨＰＬＣにて分析を行なった。ＨＰＬＣ分析の結果、[Ｂｄｍｉｍ] [ＮＴｆ２]をはじめ、疎水性イオン液体が効率よくカフェオイルキナ酸メチルを生成することが確認できた。
図１９は、カフェオイルキナ酸メチル合成における最適なイオン液体のスクリーニング結果を示すグラフである。
【００４８】
【表７】
0005568829.tif 000008
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、キナ酸ジエステル及びキナ酸ジエステル誘導体を簡便かつ安全に高い収率で酵素合成できる方法として有用である。
【図１】
0005568829.tif 000009
【図２】
0005568829.tif 000010
【図３】
0005568829.tif 000011
【図４】
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【図５】
0005568829.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0005568829.tif 000017
【図１０】
0005568829.tif 000018
【図１１】
0005568829.tif 000019
【図１２】
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【図１３】
0005568829.tif 000021
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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