(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液又は他の生体液サンプルを試験化合物と混合するステップと、
血液又は他の生体液サンプルに対する試験化合物の効果として、血液又は他の生体液サンプルの組成の変化を後に分析するために、該血液又は他の生体液サンプルと試験化合物を混合したものを濾紙上にスポットするステップとを含むテスト方法。
【請求項２】
前記生体液が、脳脊髄液、腹水、嚢胞液、羊水、洗浄液、唾液、細胞抽出物又は組織抽出物である、請求項１に記載のテスト方法。
【請求項３】
前記試験化合物が、血液又は他の生体液サンプルにその組成が変化を起こす影響を与える、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、グリコサミノグリカン、ホルモン、ステロイド、ビタミン、低分子量合成化合物の中から選択される、請求項１又は請求項２に記載のテスト方法。
【請求項４】
前記試験化合物が、毒素、アレルゲン、自己抗原、細菌タンパク質若しくは多糖、ウイルスタンパク質、真菌タンパク質若しくは多糖、寄生虫タンパク質若しくは多糖、又は細菌リポ多糖である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のテスト方法。
【請求項５】
前記サンプルが、サイトカイン、ケモカイン及び増殖因子並びに／又は神経伝達物質又は他のポリペプチド及びタンパク質の含有量に関して分析される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のテスト方法。
【請求項６】
前記サンプルが、ＣＲＰ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、抗原特異的な抗体、トランスフェリン、アルブミン及び／又はトランスサイレチンのような臨床パラメータの含有量に関して分析される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のテスト方法。
【請求項７】
前記試験化合物の効果が、免疫測定法、生物検定法、質量分析法、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＧＣ−ＭＳによって分析される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のテスト方法。
【請求項８】
前記分析方法が、ＥＬＩＳＡ法、ＦＬＩＳＡ法、ＤＥＬＦＩＡ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（登録商標）、発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、放射免疫測定法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ及びＤＥＳＩ−ＭＳである、請求項７に記載のテスト方法。
【請求項９】
血液又は他の生体液サンプルを試験化合物と混合するステップと、
血液、生体液又はサンプルに対する試験化合物の効果として血液又は他の生体液サンプルの組成の変化を後に分析するに先立って、貯蔵、輸送及び／又は出荷のために該血液又は他の生体液サンプルと試験化合物を混合したものを濾紙上にスポットするステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液又は他の生体液若しくはサンプルを試験化合物と混合し、血液又は生体液サンプルに対する試験化合物の効果を後に分析するために、該血液を濾紙上にスポットする診断試験及び方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
血液は、血漿及び細胞からなる複合混合物である（参考文献１〜３）。血漿は、遠心分離法及び他の技術により細胞から分離され得る。血漿は、放置されると凝集により凝固し、血清が血塊から分離し得る。凝集は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ヘパリン、クエン酸塩及び他を含む種々の抗凝固剤を添加することにより抑制することができる。血液の細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、好中球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー細胞、赤血球、及び造血性幹細胞を含む種々の幹細胞を含んでいる。加えて、巨核球由来の血小板が多数存在している。血漿は、数千種のタンパク質、原則としてヒトプロテオームの任意のタンパク質を含んでいる（参考文献４、５）。数種のタンパク質は、輸送、血液凝固又は免疫防御に関与する一方、他は血液細胞と組織細胞間の情報伝達分子として機能する。詳細には、免疫系の細胞（樹状細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）の活性は、情報伝達分子（例、インターロイキン、ケモカイン、増殖因子）、組織抗原及び受容体の複合ネットワークにより調節されている（参考文献３、６〜９）。免疫系細胞の活性及び特異性は、数種の方法及びアッセイにより検査及び定量することができる。Ｔ細胞、Ｂ細胞及び他の細胞は、細胞表面マーカー分子に対する抗体を使用して蛍光活性化細胞選別により定量することができる（参考文献１０、１１）。特定のＴ細胞は、細胞毒性試験、クロム放出アッセイ及びサイトカイン放出アッセイ（例、ＥＬＩＳＰＯＴ）により（参考文献１２〜１６）、並びに種々のタンパク質−主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）タンパク質構築物を使用することにより評価することができる（参考文献１７、１８）。Ｂ細胞の活性は、Ｂ細胞から放出される特定の抗体のレベルを測定することにより評価することができる（参考文献１９、２０）。
【０００３】
血液細胞から放出される情報伝達分子の測定における主な問題点は、定量に関わる貯蔵及び輸送である。多数の血液成分（例、サイトカイン）が不安定であり、短命なため、インキュベーション、貯蔵及び輸送中に分解する。そのため、比較分析及び診断試験は、中央研究所内で血液収集及びインキュベーションした直後に行う必要がある。理想的には、比較するべき全サンプルは、目盛り付き器具を使用して連続的に分析される必要がある。
【０００４】
このことは、例えば遠隔地域で血液サンプルを採取する場合、インビトロ及びインビボでの時間研究を行う場合、又は多数の異なる個人由来のサンプルを比較する場合に、必ずしも実用的ではない。この問題に対する一つの解決法は、サンプルを輸送及び貯蔵のために冷凍することである。しかしながら、これは成分が保存されることを保証するものではなく、大きな冷凍、輸送及び貯蔵容量を必要とし、分析を行う度に解凍を必要とし、電力供給不足に関し脆弱である。そのため、信頼できる血液及び生体サンプルの保存方法が必要とされ、また信頼できるサンプル保存をサンプル操作と組み合わせて使用する診断試験が必要とされている。
【０００５】
例えば新生児の血液サンプルを先天性代謝疾患に関して分析するなど、後に続く分析のために濾紙を使用して血液をスポットすることは周知である（２１）。このことの利点は、血液成分の保存が良好で、輸送が簡単であり、長期間の貯蔵が容易なことである。しかしながら、試験化合物とのインキュベーション後に、血液サンプルを乾燥及び貯蔵するために濾紙を使用すること、及びそれと類似した方法は、おそらくそれが不可能又は非実用的と予想されるため、これまで使用又は記載されていなかった。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、血液又は他の生体液を試験化合物と混合し、乾燥、貯蔵、及び以後任意の時間において血液に対する試験化合物の効果を後に分析するために、該血液を濾紙上にスポットする診断試験及び方法を開示する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明は、血液又は他の生体液サンプルを試験化合物と混合し、血液に対する試験化合物の効果を後に分析するために、該血液を濾紙上にスポットすることを含む診断試験及び診断方法を開示する。生体液は、脳脊髄液、腹水、嚢胞液、羊水、洗浄液、唾液、細胞抽出物又は組織抽出物であってもよい。化合物は、血液にその組成が変化を起こす影響を与える、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、グリコサミノグリカン、ホルモン、ステロイド、ビタミン、低分子量合成又は天然化合物、例えば毒素、アレルゲン、自己抗原、細菌タンパク質若しくは多糖、ウイルスタンパク質、真菌タンパク質若しくは多糖、寄生虫タンパク質若しくは多糖、細菌リポ多糖、又は疾病に関連した任意の他の化合物の中から選択される。
【０００８】
本発明による診断試験及び診断方法は、サンプルを、サイトカイン、ケモカイン及び増殖因子並びに／又は神経伝達物質並びに他のポリペプチド及びタンパク質、例えばＣＲＰ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、特異的な（即ち、抗原特異的な）抗体、トランスフェリン、アルブミン及び／又はトランスサイレチンの含有量に関して分析する。
【０００９】
本診断試験において、試験化合物の効果は、免疫測定法、生物検定法、質量分析法、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＧＣ−ＭＳ、例えばＥＬＩＳＡ法、ＦＬＩＳＡ法、ＤＥＬＦＩＡ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（登録商標）、発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、放射免疫測定法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ及び環境−ＭＳ（例、ＤＥＳＩ−ＭＳ）により分析される。
【００１０】
本発明は、血液又は他の生体液若しくはサンプルを試験化合物と混合し、血液、生体液又はサンプルに対する試験化合物の効果を後に分析するに先立って、貯蔵、輸送及び／又は出荷のために該混合物を濾紙上にスポットする方法も開示する。
【００１１】
定義：
分析物とは、分析手段により検出又は定量し得る任意の化合物を意味する。
【００１２】
試験化合物の効果によって、血液又は任意の他の生体液若しくはサンプルの成分と試験化合物が相互作用して、任意の種類の血液組成が変化を起こすことが理解される。
【００１３】
乾燥は、水の除去を意味する。
【００１４】
濾紙は、血液の収集、乾燥及び貯蔵に適した、任意の一枚の紙、布又は他の材料を意味する。
【００１５】
ＰＫＵ紙は、新生児由来の血液サンプルのフェニルケトン尿症症候群に関するスクリーニングに使用される紙／濾紙を意味する。
【００１６】
スポット形成とは、血液サンプル又は任意の他の生体液若しくは抽出物若しくはサンプルを、正確な血液サンプル採取に適した一枚の標準化された紙に適用することを意味する。スポット形成は、固定容積の血液を一枚の紙に適用するか、又は規定面積が血液で覆われる迄、血液を紙に適用することにより行われる。続いて、紙を完全に乾燥させ、後の分析のために直ちに低湿度条件下で貯蔵するか、又は貯蔵場所に輸送する。
【００１７】
試験化合物とは、血液若しくは任意の他の生体液若しくはサンプルと混合され、又は血液若しくは任意の他の生体液若しくはサンプルに添加され得る、化学的、生物学的又は物理的な任意の化合物又は物質を意味する。
【００１８】
試験サンプルとは、試験化合物の任意の調合物又は混合物を意味する。
【００１９】
以下の略語が使用される：
ＢＣＧは、カルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）を意味する。
ＢＤＮＦは、脳由来神経栄養因子を意味する。
ＢＳＡは、ウシ血清アルブミンを意味する。
ＣＲＰは、Ｃ反応性タンパク質を意味する。
ＤＢＳＳは、乾燥された血液スポットサンプルを意味する。
ＥＧＦは、上皮増殖因子を意味する。
ＥＬＩＳＡは、酵素免疫吸着測定を意味する。
ＥＬＩＳＰＯＴは、酵素結合免疫スポット法を意味する。
ＥＳＩは、エレクトロスプレーイオン化を意味する。
ＦＬＩＳＡは、固相蛍光免疫検定を意味する。
ＧＣは、ガスクロマトグラフィーを意味する。
Ｇ−ＣＳＦは、顆粒球コロニー刺激因子を意味する。
ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を意味する。
ＨＰＬＣは、高速液体クロマトグラフィーを意味する。
ＩＦＮは、インターフェロンを意味する。
Ｉｇは、免疫グロブリンを意味する。
ＩＧＦ、インスリン様増殖因子を意味する。
Ｉｌは、インターロイキンを意味する。
ＬＰＳは、リポ多糖を意味する。
ＭＡＬＤＩは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法を意味する。
Ｍ−ＣＳＦは、マクロファージコロニー刺激因子を意味する。
ＭＣＰは、単球走化性タンパク質を意味する。
ＭＨＣは、主要組織適合性抗原を意味する。
ＭＩＦは、マクロファージ遊走阻止因子を意味する。
ＭＩＰは、マクロファージ炎症／抑制タンパク質を意味する。
ＭＭＰは、マトリックスメタロプロテアーゼを意味する。
ＭＳは、質量分析を意味する。
ＮＴは、ニューロトロフィンを意味する。
ＰＢＳは、リン酸緩衝生理食塩水を意味する。
ＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
ＰＫＵは、フェニルケトン尿症を意味する。
ＰＰＤは、精製タンパク誘導体を意味する。
ＴＧＦは、トランスフォーミング増殖因子を意味する。
ＴＮＦは、腫瘍壊死因子を意味する。
ＴＲＥＭは、骨髄細胞に発現する誘発性受容体を意味する。
ＶＥＧＦは、血管内皮増殖因子を意味する。
【００２０】
本発明は、試験化合物と血液サンプル又は任意の他の生体液若しくはサンプル間の反応を開始させ、反応を所定時間進行させた後、試験サンプルを濾紙上にスポットし及び／又は濾紙上で乾燥することにより停止させ、次に該濾紙を血液、生体液又はサンプル及びそれらの成分のいずれかに対する試験化合物の効果の後の分析のために使用する診断方法を開示する。
【００２１】
好ましい実施態様において、血液サンプル（例、１０ｍｌ）は、標準的な抗凝固ＥＤＴＡ、ヘパリン又はクエン酸塩血液容器若しくはガラス製品を用いてヒトから採取される。血液サンプルを２つのアリコートに分割し、試験化合物を血液アリコートの一方に加えるとともに、他方のアリコートを、緩衝液／試験化合物を溶解した溶液のみを加えた対照リファレンスとして使用する。試験化合物は、血液に直接溶解されるべき固体粉末として添加してもよい。血液サンプルを周囲室温又は規定温度（例、５℃、２０℃、３７℃）で、混合若しくは攪拌しながら、又は混合若しくは攪拌せずにインキュべートする。所定の時間間隔（例、０、１分、２分、５分、１０分、２０分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、２４時間、４８時間）にて、血液サンプルからアリコートを採取し、濾紙（例、ＰＫＵ紙）上にスポットし、出来る限り急速に乾燥させる。乾燥後、濾紙を分析のために直ちに使用し又は後の分析のために貯蔵し得る。特定の実施態様において、濾紙は、研究所内で貯蔵又は分析されるに先立って、（例えば普通郵便により）ある距離を輸送されてもよい。
【００２２】
血液のスポット形成、乾燥及び貯蔵は、以下のように行われる：毛細管、ピペット又は同様物を用いて血液を濾紙上に一層にてスポットし、室温にて、例えば良く換気されたフード内又は周囲場所内で乾燥する。貯蔵のために、濾紙を紙封筒、プラスチック袋又は同様の容器内、好ましくは湿度を出来る限り低く保つために気密容器内に保管し得る。−２０℃以下の貯蔵温度が好ましいが、紙が乾燥した状態に保たれる限り室温も可能である。しかしながら、サンプルの劣化を避けるために、低湿度状態に保たれることを条件として、貯蔵は周囲温度又は０℃未満の温度（例、−２０℃、−５０℃、−８０℃、−１８０℃）で実施し得る。サンプルは、延長期間（例、数か月〜数年）貯蔵することができる。
【００２３】
試験化合物は、血液にその組成が測定可能な変化を起こす影響を与える任意の化合物（例、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、炭水化物、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、グリコサミノグリカン、ホルモン、ステロイド、ビタミン、低分子量合成又は天然化合物）であってもよい。
【００２４】
特に有用な試験化合物は、毒素、アレルゲン、自己抗原、細菌タンパク質及び多糖、ウイルスタンパク質、真菌タンパク質及び多糖、寄生虫タンパク質及び多糖、細菌リポ多糖、並びに疾病に関連した任意の他の化合物である。これらの試験化合物の使用は、所定の化合物が細胞に、及び細胞間の情報伝達にいかに影響するかの重要な知識を導くと思われる。
【００２５】
一実施態様において、本診断試験及び診断方法は、例えば毒性試験プログラム又は前臨床試験プログラムの一部として、血液に対する毒性化合物の効果を測定するために使用される。
【００２６】
乾燥された血液サンプルは、多数の異なる技術（例、免疫測定法、生物検定法、質量分析法、ＨＰＬＣ、ＧＣ、ＧＣ−ＭＳ）により分析され得る。好ましい分析方法は、ＥＬＩＳＡ法、ＦＬＩＳＡ法、ＤＥＬＦＩＡ法、Ｌｕｍｉｎｅｘ法（登録商標）、発光アッセイ、電気化学発光アッセイ、シンチレーション近接アッセイ、放射免疫測定法、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＰＣＲである。
【００２７】
ＤＢＳＳの抽出は、任意の適切な緩衝液又は溶媒を用いて実施し得る。好ましい実施態様において、例えば直径３．２ｍｍの濾紙円盤をＤＢＳＳから又は濾紙上の基準物質から型抜きし、マイクロタイターウェル内に共に配置する。１４０μｌ又は１８０μｌ（各々、二重又は三重測定用）の抽出緩衝液、アッセイ緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）２５ｍｌ当たり１錠を溶解した「エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む完全プロテアーゼ阻害剤カクテル」（ロシュ、ドイツ）を含有するＰＢＳを各ウェルに加え、分析物を光から保護しながら、室温にて６００ｒｐｍに設定したプレートシェーカー上で６０分間抽出する。
【００２８】
本発明の一実施態様において、分析物はＬｕｍｉｎｅｘ法（登録商標）により以下のように測定される：製造業者の指示に従い、捕捉抗体をカルボキシル化ビーズ（ルミネックス社、米国テキサス州オースティン）に結合させる：２．５×１０６ビーズを活性化緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２）で２回洗浄し、活性化緩衝液８０μｌ中に再懸濁し、ビーズの均質な分配が観察される迄超音波処理する。両方とも活性化緩衝液中で５０ｍｇ／ｍｌに希釈された、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ピアス、米国ロックフォード製のスルホ−ＮＨＳ）溶液１０μｌと塩酸１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ピアス製のＥＤＣ）１０μｌを加えて反応を安定化し、ビーズを活性化する。混合した後、ビーズを暗所内にて室温で回転させて２０分間インキュベートする。続いて、活性化ビーズを結合緩衝液（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｍｍｏｌ／ｌ  ２（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸、ＭＥＳ）、ｐＨ５．０）で洗浄し、捕捉抗体のアジ化物フリー溶液（１００μｇ／ｍｌ）５００μｌを加え、回転させながら２時間又は一夜インキュベートする。抗体からアジ化物を透析により（ピアス製のＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット、ＭＷＣＯ＝１００００）、４℃で一夜、ＰＢＳ  ３ｌ中に除去する。インキュベーション後、ビーズを洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、ブロッキング／貯蔵緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）７５μｌ中に再懸濁する。
【００２９】
ビーズを血球計数器で計数し、ブロッキング／貯蔵緩衝液を用いて濃度２０×１０６ビーズ／ｍｌに調整し、光から保護した状態で２〜８℃で貯蔵する。
【００３０】
アッセイ手順は、以下のように行われる：濾板（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＭＡＢＶＮ  １．２μｍ  ９６ウェル、ミリポア、米国バーリントン）をアッセイ緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で予め湿潤させることにより準備する。各ウェルに、抽出後マイクロタイターウェルからピペットで取ったサンプル５０μｌ（１００μｌを２分割、又は１５０μｌを３分割）と、捕捉抗体結合ビーズの懸濁液５０μｌとを、１％モルモット/ブタ血清（１：１）を含有するアッセイ緩衝液中、分析物当たり１５００ビーズで加える。捕捉抗体は、１  １／２時間のインキュベーション中、それらの対応する抗原と反応し、未結合材料は、それをＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ（ミリポア）を使用してウェルを通して濾過することによりビーズから除去される。ビーズをウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ）を用いて、２回洗浄する。今捕捉した抗原を、各々アッセイ緩衝液中で１：１０００に希釈したビオチン化検出抗体の混合物（５０μｌ）と１  １／２時間反応させる。アッセイ緩衝液中２０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリスリン（モレキュラープローブ、オランダ）５０μｌをウェルに加え、インキュベーションを更に３０分間継続する。ビーズを最後に洗浄緩衝液２００μｌで２回洗浄し、緩衝液１２５μｌ中に再懸濁する。１５分間振とうした後、サンプルを製造業者の指導に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００（登録商標）上で分析する。
【００３１】
好ましい実施態様において、サンプルは、サイトカイン、ケモカイン及び増殖因子（例、例えばＩｌ−１、Ｉｌ−２、Ｉｌ−３、Ｉｌ−４、Ｉｌ−５、Ｉｌ−６、Ｉｌ−７、Ｉｌ−８、Ｉｌ−９、Ｉｌ−１０、Ｉｌ−１１、Ｉｌ−１２、Ｉｌ−１３、Ｉｌ−１４、Ｉｌ−１５、Ｉｌ−１６、Ｉｌ−１７、Ｉｌ−１８、Ｉｌ−１９、Ｉｌ−２０、Ｉｌ−２１、Ｉｌ−２２、Ｉｌ−２３、Ｉｌ−２４、Ｉｌ−２５、Ｉｌ−２６等のインターロイキン、ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＭＣＰ、ＭＩＰ、ＭＭＰ−９、ＴＲＥＭ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、例えばＣＣ、ＣＸＣ等のケモカイン、例えばＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＧＦＩ、ＩＧＦＩＩ等の増殖因子、インスリン、例えばヒスタミン、プロスタグランジン、ロイコトリエン、トロンボキサン等の炎症メディエータ）並びに／又は神経伝達物質の含有量に関して分析される。
【００３２】
別の一実施態様において、サンプルは、例えばＣＲＰ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、特異的な（即ち、抗原特異的な）抗体、トランスフェリン、アルブミン、トランスサイレチン等の標準的及び特異的な臨床パラメータに関して分析される。
【００３３】
別の一実施態様において、分析されるべき生体液は、脳脊髄液、腹水、嚢胞液、羊水、洗浄液、唾液、細胞抽出物又は組織抽出物である。
【００３４】
更に別の一実施態様において、細胞源は、細胞株又は単離された血液細胞、操作された細胞、トランスジェニック細胞、トランスフェクト細胞、又は任意の細胞型若しくは改変若しくは操作された細胞型である。
【００３５】
本発明は、トランスジェニック動物を含む任意の種及び型の動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、雌ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、トリ、魚及び任意の他の種）由来の血液及び他の体液並びに組織抽出物に適用することができる。
【００３６】
特別な実施態様において、試験化合物を固体表面（例、濾紙）上に固定化し、次に血液サンプル又は生体液若しくは抽出物と共にインキュベートする。インキュベーション後、濾紙を乾燥させるか、又は血液を濾紙上にスポットし乾燥する。
【００３７】
本発明の特定の使用において、血液、生体液又は抽出物の容積は、固定化化合物又は溶液中の化合物と一定時間相互作用するとともに、同時に濾紙上で乾燥するように調整される。
【００３８】
本発明の一つの使用において、生きた被験者又は患者に試験化合物を注入し、被験者から血液サンプルを所定の時間間隔にて採取し、濾紙上にスポットし、乾燥し、後に分析する。
【００３９】
血液サンプルは、標準的な針及び器具を使用して被験個体から採取されてもよく、熟練した職員により行われる。しかしながら、血液の採取は、地方での個々のサンプル採取を可能にする装置により行われてもよい。
【実施例】
【００４０】
実施例１  血液の採取、インキュベーション、スポット形成、乾燥及び貯蔵
滅菌針及び注射器を用いて、被験者から血液１０ｍｌを抗凝固剤入り試験管内に採取する。滅菌した抗凝固剤入り試験管を用いて、該血液を１ｍｌのアリコートに分割する。一サンプルから血液サンプルを、マークした円形が満たされる迄、紙上に直接スポットする（使用した容積は、約０．２ｍｌ）。他方の試験管に、試験するべきサンプルを所定の濃度にて加え、試験管を３７℃又は周囲温度で１時間インキュベートさせる。次に、各々からサンプル０．２ｍｌを濾紙上にスポットする。毛細管、ピペット又は同様物を用いて血液サンプルを濾紙上に一層にてスポットし、室温にて、例えば良く換気されたフード内又は周囲場所内で乾燥する。次に、紙が乾燥した状態を保つように、サンプルを−２０℃又は室温にて低湿度下で貯蔵する。この目的のために、通常の冷凍庫を使用してもよく、また紙を封筒又デシケーター内に保管してもよい。
【００４１】
実施例２  濾紙の抽出及び分析
直径３．２ｍｍの２枚の濾紙円盤をＤＢＳＳから又は濾紙上の基準物質から型抜きし、マイクロタイターウェル内に共に配置する。１４０μｌ又は１８０μｌ（各々、二重又は三重測定用）の抽出緩衝液、アッセイ緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）２５ｍｌ当たり１錠を溶解した「エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む完全プロテアーゼ阻害剤カクテル」（ロシュ、ドイツ）を含有するＰＢＳを各ウェルに加え、分析物を光から保護しながら、室温にて６００ｒｐｍに設定したプレートシェーカー上で６０分間抽出する。
【００４２】
実施例３  Ｌｕｍｉｎｅｘ法（登録商標）
抗体のビーズに対する結合：
製造業者の指示に従い、捕捉抗体をカルボキシル化ビーズ（ルミネックス社、米国テキサス州オースティン）に結合させる：２．５×１０６ビーズを活性化緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム、ｐＨ６．２）で２回洗浄し、活性化緩衝液８０μｌ中に再懸濁し、ビーズの均質な分配が観察される迄超音波処理する。両方とも活性化緩衝液中で５０ｍｇ／ｍｌに希釈された、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ピアス、米国ロックフォード製のスルホ−ＮＨＳ）溶液１０μｌと塩酸１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ピアス製のＥＤＣ）１０μｌを加えて反応を安定化し、ビーズを活性化する。混合した後、ビーズを暗所内にて室温で回転させて２０分間インキュベートする。続いて、活性化ビーズを結合緩衝液（ｍｍｏｌ／ｌ  ２（Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸、ＭＥＳ）、ｐＨ５．０）で洗浄し、捕捉抗体のアジ化物フリー溶液（１００μｇ／ｍｌ）５００μｌを加え、回転させながら２時間又は一夜インキュベートする。抗体からアジ化物を透析により（ピアス製のＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット、ＭＷＣＯ＝１００００）、４℃で一夜、ＰＢＳ  ３ｌ中に除去する。インキュベーション後、ビーズを洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ）で洗浄し、ブロッキング／貯蔵緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０５％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）７５μｌ中に再懸濁する。
【００４３】
ビーズを血球計数器で計数し、ブロッキング／貯蔵緩衝液を用いて濃度２０×１０６ビーズ／ｍｌに調整し、光から保護した状態で２〜８℃で貯蔵する。
【００４４】
実施例４  アッセイ手順：
濾板（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＭＡＢＶＮ  １．２μｍ  ９６ウェル、ミリポア、米国バーリントン）をアッセイ緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０及び１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で予め湿潤させることにより準備する。各ウェルに、抽出後マイクロタイターウェルからピペットで取ったサンプル５０μｌ（１００μｌを２分割、又は１５０μｌを３分割）と、捕捉抗体結合ビーズの懸濁液５０μｌとを、１％モルモット/ブタ血清（１：１）を含有するアッセイ緩衝液中、分析物当たり１５００ビーズで加える。捕捉抗体は、１  １／２時間のインキュベーション中、それらの対応する抗原と反応し、未結合材料は、それをＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  Ｖａｃｕｕｍ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ（ミリポア）を使用してウェルを通して濾過することによりビーズから除去される。ビーズをウェル当たり２００μｌの洗浄緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳ）を用いて、２回洗浄する。今捕捉した抗原を、各々アッセイ緩衝液中で１：１０００に希釈したビオチン化検出抗体の混合物（５０μｌ）と１  １／２時間反応させる。アッセイ緩衝液中２０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリスリン（モレキュラープローブ、オランダ）５０μｌをウェルに加え、インキュベーションを更に３０分間継続する。ビーズを最後に洗浄緩衝液２００μｌで２回洗浄し、洗浄緩衝液１２５μｌ中に再懸濁する。１５分間振とうした後、サンプルを製造業者の指示に従い、Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００（登録商標）上で分析する。
【００４５】
実施例５  Ｇｃグロブリン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及びリポ多糖（ＬＰＳ）のサイトカイン放出に関する試験
以下の８種の溶液を、異なるヒト由来の血液と混合し、３７℃でインキュベートする：
【００４６】
１）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＸ）１ｍｌ＋Ｇｃバッチ１１  ３０μｌ
２）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＸ）１ｍｌ＋Ｇｃバッチ１３  ３０μｌ
３）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋Ｇｃバッチ１１  ３０μｌ
４）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋Ｇｃバッチ１３  ３０μｌ
５）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＸ）１ｍｌ＋ＰＢＳ  ３０μｌ
６）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋ＰＢＳ  ３０μｌ
７）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＸ）１ｍｌ＋Ｇｃバッチ１１  ３０μｌ＋肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来のＬＰＳ（５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ
８）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＸ）１ｍｌ＋肺炎桿菌由来のＬＰＳ（５ｍｇ／ｍｌ）５０μｌ
９）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＺ）１ｍｌ＋ジフテリアトキソイド（５．７８ｍｇ／ｍｌ）３０μｌ
１０）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＺ）１ｍｌ＋破傷風トキソイド（９９３Ｌｆ／ｍｌ）３０μｌ
１１）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＺ）１ｍｌ＋肺炎桿菌由来のＬＰＳ（５ｍｇ／ｍｌ）３０μｌ
１２）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＺ）１ｍｌ＋ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のＬＰＳ（５ｍｇ／ｍｌ）３０μｌ
１３）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＺ）１ｍｌ＋ｍｉｌｌｉＱ水  ３０μｌ
【００４７】
１分（Ａ）、２時間（Ｂ）、２４時間（Ｃ）及び４８時間（Ｄ）後、８種の溶液の各１８０μｌを濾紙上にスポットし、乾燥させる。後にサンプルを（−２０℃で１４日間貯蔵した後）、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術を用いてサイトカイン含有量に関して分析する（２２）。結果を表１に示す。表から、ＬＰＳはＩＬ−１ｂ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂの多大な増加を誘く一方、他の分析物に関して少量であるが統計的に有意な変化が見られることが分かる。ジフテリアトキソイドは、ＭＩＰ−１ｂの増加を導く。
【００４８】
表１  Ｇｃグロブリン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及びリポ多糖（ＬＰＳ）のサイトカイン放出に関する試験（詳細には、実施例５を参照）
結果は全て、特に記載がない限り、ｐｇ／ｍｌで表す。
【００４９】
【表１】
0005539724.tif 000002
0005539724.tif 000003
【００５０】
実施例６  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ツベルクリンＰＰＤ及びＢＣＧのサイトカイン放出に関する試験
以下の６種の溶液を混合し、３７℃でインキュベートする：
【００５１】
１）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋ジフテリアトキソイド（５．７８ｍｇ／ｍｌ）３０μｌ
２）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋破傷風トキソイド（９９３Ｌｆ／ｍｌ）３０μｌ
３）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋ＢＣＧ（４〜１６×１０６ｃｆｕ／ｍｌ）３０μｌ
４）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋ツベルクリンＰＰＤ（０．４μｇ／ｍｌ）３０μｌ
５）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋ｍｉｌｌｉＱ水  ３０μｌ
６）ＥＤＴＡ−血液（ヒトＹ）１ｍｌ＋ＢＣＧワクチン溶剤（対照）３０μｌ
【００５２】
１分（Ａ）、２時間（Ｂ）、４時間（Ｃ）、６時間（Ｄ）及び２４時間（Ｅ）後、６種の溶液の各１８０μｌを濾紙上にスポットし、乾燥させる。後にサンプルを（−２０℃で３０日間貯蔵した後）、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）技術を用いてサイトカイン含有量に関して分析する（２２）。結果を表２に示す。表から、ＢＣＧは、対照と比較してＩＬ−８及びＭＩＰ−１ｂの多大な増加を導くことが分かる。同様に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及びＰＰＤは、ＩＬ−８及びＭＩＰ−１ｂの増加を導くとともに、他の分析物に関して少量であるが統計的に有意な変化が見られる。
【００５３】
表２  ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ツベルクリンＰＰＤ及びＢＣＧのサイトカイン放出に関する試験（詳細には、実施例６を参照）
結果は全て、特に記載がない限り、ｐｇ／ｍｌで表す。
【００５４】
【表２】
0005539724.tif 000004
0005539724.tif 000005
0005539724.tif 000006
【００５５】
実施例７  延長期間におけるサンプルの貯蔵
乾燥された血液スポットサンプル（ＤＢＳＳ）は、乾燥状態で好ましくは約−２０℃で貯蔵する必要がある。サンプルが湿気から保護される限り、室温も使用できる。
【００５６】
デンマークでは、１９８２年以来、全ての余剰ＤＢＳＳが、厚生省の規定に従って、生物試料バンクにて−２４℃で貯蔵されている（２３）。安定性試験のために、デンマークのＤＢＳＳ試料バンクから、各々２３年、３年及び１か月間貯蔵されたＤＢＳＳを匿名で取得した。各期間からの各分析物の平均濃度を１０個のサンプルから計算し、研究所内にて−２０℃で２週間貯蔵された、通常通り収集した匿名ＤＢＳＳと比較した（表３）。２３年間の貯蔵後でも、実験誤差の範囲内においてサンプルの劣化は存在しないことが理解される。
【００５７】
表３  短期間（１ヵ月）、長期間（３年）及び延長（２３年）期間貯蔵したサンプルの分析。結果は、ＰＫＵバイオバンクに未だ貯蔵されていない２週齢のＤＢＳＳにて検出可能な濃度の百分率で表わす。サンプルは、実施例２〜４に記載したように抽出及び分析した。
【００５８】
【表３】
0005539724.tif 000007
【００５９】
参考文献
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