(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血管細胞付着分子−１（ＶＣＡＭ−１）に特異的に結合しながら白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用を阻害する、ヒト単一クローン抗体であって、
（ａ）配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、
（ｂ）配列番号６で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号７で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１８で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１９で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、または、
（ｃ）配列番号１０で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１２で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２３で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２４で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と、を含む、
ヒト単一クローン抗体。
【請求項２】
前記（ｂ）または（ｃ）のヒト単一クローン抗体は、更にマウス血管細胞付着分子−１（ＶＣＡＭ−１）に特異的に結合する、請求項１に記載のヒト単一クローン抗体。
【請求項３】
前記（ａ）のヒト単一クローン抗体は、配列番号１で記載された重鎖アミノ酸配列及び配列番号１３で記載された軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト単一クローン抗体。
【請求項４】
前記（ｂ）のヒト単一クローン抗体は、配列番号５で記載された重鎖アミノ酸配列及び配列番号１７で記載された軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト単一クローン抗体。
【請求項５】
前記（ｃ）のヒト単一クローン抗体は、配列番号９で記載された重鎖アミノ酸配列及び配列番号２１で記載された軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト単一クローン抗体。
【請求項６】
前記白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用の阻害は、活性化された内皮細胞に対する白血球付着の阻害またはＲＯＳ(Reactive oxygen species)及びＲｈｏＡ(Ras homolog gene family，member A)の活性減少による内皮細胞間の間隙形成の阻害によって行われる、請求項１に記載のヒト単一クローン抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のうち、いずれか１項に記載のヒト単一クローン抗体を含む喘息、鼻炎、関節炎、多発性硬化症、大腸疾患、動脈硬化、心筋梗塞及び移植拒絶からなる群から選択された１種以上の、炎症性疾患または癌の診断用組成物。
【請求項８】
請求項１〜６のうち、いずれか１項に記載のヒト単一クローン抗体と、炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料のＶＣＡＭ−１との抗原−抗体反応により形成される複合体を検出する段階を含む、炎症性疾患または癌の診断のための情報の提供方法。
【請求項９】
請求項１〜６のうち、いずれか１項に記載のヒト単一クローン抗体を含む喘息の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＣＡＭ−１に特異的に結合するヒト単一クローン抗体及びそれを含む炎症性疾患または癌の治療用組成物に関するものである。より詳細には、ヒト血管細胞付着分子−１(ＶＣＡＭ−１)に対して強い特異性と、結合親和度(affinity)を示し、ＶＣＡＭ−１を発現する活性化された内皮細胞と白血球との間の相互作用を効果的に阻害するのみならず、低い免疫原性を示すＶＣＡＭ−１に特異的に結合するヒト単一クローン抗体及びそれを含む炎症性疾患または癌の治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
白血球などの免疫細胞は、血流から組職に移動する時、活性化された内皮細胞を通過して免疫反応を起こすようになり、このような白血球の内皮細胞への付着と組職への移動には、インテグリン、セレクチン、ＩＣＡＭ(intracellular adhesion molecule)、ＶＣＡＭ(vascular cell adhesion molecule)などの多くの細胞付着分子(Cell-adhesion molecules，ＣＡＭ)が関与する。 細胞付着分子は、機能的に白血球と内皮細胞との間の相互作用に関与するセレクチン類と、内皮細胞に対する白血球の付着に関与するインテグリン類と、免疫グロブリンなどに分けられる。これらの細胞付着分子などは、免疫反応、炎症だけでなく、血液の凝固など多くの生理反応に主要な役割を果たしている。
【０００３】
ＶＣＡＭ−１は、好中球を除いた大部分の白血球の表面に発現されるインテグリン(ＶＬＡ−４)と相互作用する血管内皮細胞付着分子である。ＶＣＡＭ−１は、炎症信号によって活性化された内皮細胞上で高度に誘導されて白血球の血管内皮細胞への付着と、以後に白血球の損傷部位への内皮間(transedothelial)移動に関与する。
【０００４】
炎症と癌においてＶＣＡＭ−１の役割とＶＣＡＭ−１−ＶＬＡ−４の相互作用に対する多くの報告(publication)にもかかわらず、ＶＣＡＭ−１を中和させる抗体の開発は活発に研究されていない。最近、マウスＶＣＡＭ−１に対する単一クローン抗体であるＭ／Ｋ−２.７が開発され、コラーゲン誘導された関節炎マウスモデルにおける関節炎を減少させる効果を示したが、これは、マウスのみに特異的に結合するので、臨床適用に困難さがある。
【０００５】
また、ＶＣＡＭ−１は、ＩｇＧ様ドメイン７個から構成され、その相手リガンドであるインテグリン(α４β１またはα４β７)と結合する際は、実質的にドメイン１とドメイン４が主に関与する(1995, PNAS，92:p5714; 1995，The journal of immunology，155: p3135など)。従って、(開発抗体)がＶＣＡＭ−１抗原とリガンドとの間の相互作用を阻害するためには、ドメイン１またはドメイン４に対する強い結合力を有しなければならないだろう。このような観点から、前臨床及び臨床の研究のために、マウスとヒトＶＣＡＭ−１との間に特異的交差反応性を示し、ＶＣＡＭ−１抗原とインテグリンとの相互作用を効果的に阻害しながら、免疫原性の危険性を最小化することができる十分且つ安全なヒト単一クローン抗体の開発が至急に要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明者らは、マウスとヒトＶＣＡＭ−１との間に特異的交差反応性を示し、ＶＣＡＭ−１抗原とインテグリンとの相互作用を効果的に阻害し、免疫原性の危険性を最小化することができるヒト単一クローン抗体を開発するために鋭意努力した。本発明者らは、ヒト抗体ライブラリーからヒト由来重鎖および軽鎖ドメインを含むヒト及びマウスＶＣＡＭ−１に特異的な新規なヒト単一クローン抗体を製作し、ＶＣＡＭ−１抗原のドメイン１−２またはドメイン３−４に結合してＵ３９７前単核球白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用を抑制する強い活性を確認して本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの目的は、ヒト由来重鎖(heavy chain ＶＨ)及び軽鎖(light chain ＶＬ)ドメインを含むヒト血管細胞付着分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して活性化された内皮細胞と白血球との相互作用を阻害するヒト単一クローン抗体を提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、ＶＣＡＭ−１に特異的に結合するヒト単一クローン抗体を含む炎症性疾患または癌の診断用組成物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、ＶＣＡＭ−１に特異的に結合するヒト単一クローン抗体と炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料のＶＣＡＭ−１との抗原−抗体反応を検出する段階を含む、炎症性疾患または癌の診断のための情報の提供方法を提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、ＶＣＡＭ−１で媒介された内皮細胞に対する白血球付着を阻害するヒト単一クローン抗体を用いて炎症性疾患または癌の治療用組成物を提供することである。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、個体に本発明による治療用組成物を投与することによって、炎症性疾患または癌を治療する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、本発明による単一クローン抗体を用いてＶＣＡＭ−１媒介された内皮細胞への白血球の付着を阻害させる方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によるヒト単一クローン抗体は、ヒトまたはマウス内皮細胞に発現されたＶＣＡＭ−１に対して強い親和力を示し、ＶＣＡＭ−１を発現する活性化された内皮細胞への白血球の付着を効果的に阻害するのみならず、低い免疫原性を示すヒト由来重鎖及び軽鎖ドメインを有するので、喘息、鼻炎、関節炎、多発性硬化症、大腸疾患、動脈硬化、心筋梗塞及び移植拒絶のような炎症性疾患または癌の治療に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ヒトＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４とマウスＶＣＡＭ−１抗原を用いて行ったパニングの結果を示したものである。
【図２】図２は、本発明による３種のヒト単一クローン抗体などの可変領域アミノ酸配列を示したものである。
【図３】図３は、酵素結合免疫吸着測定法(Enzyme-linked immuno-sorbent assay：ＥＬＩＳＡ)によってヒトＶＣＡＭ−１ドメインに応じて抗原特異的な抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などの抗原に対する親和度を示すものであって、ＶＤ２は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１−Ｄ２／Ｆｃキメラ、ＶＤ４は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１−Ｄ４／Ｆｃキメラ、ＶＤ７は、組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメインＤ１−Ｄ７／Ｆｃキメラを示したものである。
【図４】図４は、抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などの、精製されたヒト組換えＶＣＡＭ−１抗原とヒト白血球細胞との間の付着に対する阻害能を分析した結果であって、抗体で処理しない群に対比して蛍光強さの減少によって阻害能を決定した。
【図５】図５は、抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などのＴＮＦ−α(Tumor necrosis factor-α)によって活性化されたヒト内皮細胞とヒト白血球細胞との間の付着に対する阻害能を分析した結果であって、抗体で処理しない群に対比して蛍光強さの減少によって阻害能を決定した。
【図６】図６は、抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などのＲｈｏＡ(Ras homolog gene family、member A)活性阻害能分析結果を示したものである。
【図７】図７は、抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などによるＲＯＳ(Reactive oxygen species)活性阻害能分析結果を示したものである。
【図８】図８は、オボアルブミンによって誘導されたマウス喘息動物モデルで気管支肺胞洗浄液への炎症細胞の浸潤に対する抗ＶＣＡＭ−１抗体の阻害能分析結果である(正常群対比＃＃、ｐ＜０．０１；＃＃＃、ｐ＜０．００１、喘息誘発群対比＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１)。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
前記の目的を達成するための一つの態様として、本発明は、ヒト血管細胞付着分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合して白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用を阻害するヒト単一クローン抗体を提供する。
【００１６】
本願で使用される用語“抗体”は、免疫学的に特定抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を意味し、多クローン抗体及び単一クローン抗体の両方を含む。また、前記用語は、キメラ性抗体(例えば、ヒト化マウス(murine)抗体)及び異種結合抗体(例えば、両特異性抗体)のような遺伝子変形された形態を含む。
【００１７】
また、用語“抗体”は、抗原結合能力を持つ断片(例えば、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂ、Ｆｖ及びｒＩｇＧ)を含む、抗体の抗原結合形態を含む。また、前記用語は、組換え単一鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)を示す。また、用語“抗体”は、二価(bivalent)または両特異性分子、ジアボディー(diabodies)、トリアボディー(triabodies)、およびテトラボディー(tetrabodies)を含む。二価及び両特異性分子は、例えば、Kostelnyら(1992，J．Immunol.，148:15467)、Pack及びPluckthun(1992，Biochemistry，31:1579)、Hollingerら(1993，Supra)、Gruberら(1994，J．Immunol.，5368)、Zhuら(1997，Protein Sci.，6:781)、Huら(1996，Cancer Res.，56:3055)、Adamsら(1993，Cancer Res.，53:4026)及びMcCartneyら(1995，Protein Eng.、8:301)に記述されている。
【００１８】
また、本願で使用される用語“単一クローン抗体”は、実質的に同一の抗体集団から収得した抗体分子を指称し、このような単一クローン抗体は、特定エピトープに対して単一結合特異性及び親和度を示す。
【００１９】
典型的に、免疫グロブリンは、重鎖及び軽鎖を持つ。それぞれの重鎖及び軽鎖は不変領域及び可変領域(前記部位は、“ドメイン”としても知られている)を含む。軽鎖及び重鎖の可変領域は、“相補性決定領域”(complementarity-determining region)、または‘ＣＤＲ’と呼ばれる３つの多変異領域及び４つの“フレームワーク”領域を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープに結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から始めて順次にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、また、典型的に特定ＣＤＲが位置している鎖によって識別される。
【００２０】
また、本願で使用される用語“ヒト化抗体”は、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であって、相補性決定領域、及びフレームワーク領域を含んだ抗体を構成するすべてのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンから構成されていることを意味する。ヒト化抗体は、通常的にヒトの疾病治療に使用するための少なくとも３つ以上の潜在的な長所を有している。第一に、それはヒト免疫体系とより良好に相互作用し、例えば、補体−依存性細胞傷害性(ＣＤＣ)または抗体−依存性細胞性細胞傷害性(ＡＤＣＣ)によって目的細胞をより効率的に標的を破壊することができる。第二に、ヒト免疫体系は、前記抗体を外来のものとして認識しない。第三に、ヒト循環系内の半減期が天然発生抗体と類似して、より少ない量をより少ない頻度で投与することができる。従って、本発明によるヒト単一クローン抗体などは、ヒト内皮細胞に発現されたＶＣＡＭ−１に対して強い親和力を示し、ＶＣＡＭ−１を発現する活性化された内皮細胞に対する白血球の付着を効果的に阻害する。それのみならず、重鎖及び軽鎖ドメインのすべてがヒト由来であるから低い免疫原性を示すので、本発明によるヒト単一クローン抗体は、喘息、鼻炎、関節炎、多発性硬化症、大腸疾患、動脈硬化、心筋梗塞及び移植拒絶のような炎症性疾患または癌の治療に使用され得る。
【００２１】
本願で使用される用語“白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用の阻害”は、本発明のヒト単一クローン抗体が活性化された内皮細胞で発現するＶＣＡＭ−１に特異的に結合して、白血球上で発現されるＶＬＡ−４(very late antigen-4)及びα４β１インテグリンと内皮細胞で発現されるＶＣＡＭ−１との相互作用を阻害させる、または内皮細胞間の間隙形成を阻害するすべての機作を意味する。このような相互作用の阻害は、これに制限されないが、その例として、活性化された内皮細胞に対する白血球の付着阻害またはＲＯＳ(Reactive oxygen species)及びＲｈｏＡ(Ras homolog gene family、member A)の活性減少による内皮細胞間の間隙形成の阻害によって行われることができる。内皮細胞に白血球のような免疫細胞が結合すると、内皮細胞の信号経路で細胞内部のＲｈｏＡとＲＯＳが活性化されて細胞を連結している分子などの堅固な連結を緩める信号伝達を誘発するようになる。以後に、内皮細胞間の間隙が拡張されて穴(hole)が生成される。その穴を介して免疫細胞が通過し、炎症部位に移動する。しかし、本発明の抗体は、内皮細胞の信号経路のうち、ＲＯＳとＲｈｏＡの活性を減少させて内皮細胞間の間隙形成が阻害されて穴が生成されないようにする。結果的に、免疫細胞が炎症部位に移動されることを阻んで白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用を阻害することができる。
【００２２】
本発明の一実施態様によれば、本発明のヒト単一クローン抗体４Ｂは、０．１μｇ以上でヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する白血球の付着に対して８０％の阻害を示し、本発明のヒト単一クローン抗体７Ｃ及び７Ｈは、１０μｇでヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する白血球の付着に対して９０％以上の阻害を示すことを確認した(図４)。また、ヒト内皮細胞に対する白血球の付着に対して、本発明のヒト単一クローン抗体４Ｂは、０．１〜１０．０μｇで５０〜６０％の阻害を示し、本発明のヒト単一クローン抗体７Ｃ及び７Ｈは、１０μｇで５０〜６０％以上の阻害を示すことを確認した(図５)。前記の結果は、本発明の抗体が白血球の活性化された内皮細胞への付着を効果的に阻害することを確認した。また、ヒト単一クローン抗体４Ｂが約８０％のＲｈｏＡ阻害を示し、ヒト単一クローン抗体７Ｈが約３０％のＲｈｏＡ阻害することを確認し(図６)、ヒト単一クローン抗体４Ｂが約６５％のＲＯＳ阻害を示し、ヒト単一クローン抗体７Ｈが約２５％のＲＯＳ阻害することを確認し(図７)、本発明の抗体がＲｈｏＡ及びＲＯＳの活性を効果的に減少させて内皮細胞間の間隙形成を阻害することを確認した。このような結果は、抗体の白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用の阻害効果が炎症性疾患または癌のようなＶＣＡＭ−１関連疾患に対する診断及び治療方法に適用され得ることを示唆する。
【００２３】
好ましい一実施態様として、本発明のヒト単一クローン抗体は、配列番号２で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１４で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１５で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１６で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。より好ましくは、本発明のヒト単一クローン抗体は、配列番号１で記載された重鎖アミノ酸配列及び配列番号１３で記載された軽鎖アミノ酸配列を含み得る。本発明の一実施態様によれば、配列番号１で記載された重鎖アミノ酸配列及び配列番号１３で記載された軽鎖アミノ酸配列を含むヒト単一クローン抗体を４Ｂと命名した。
【００２４】
好ましい一実施態様として、前記ヒト単一クローン抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１に対する親和度を提供するが、ヒト単一クローン抗体のヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ 値)は、１×１０−１１Ｍ〜９×１０−９Ｍであり得る。これは、ビアコア(BIACORE)分析を用いて各抗体などのヒトＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ値)を決定することによって求めることができる。本発明の一実施態様によれば、ヒト単一クローン抗体４Ｂは、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対して約１ｎＭ水準の強い親和度を持つことを確認し(表１)、これは、本発明の抗体がＶＣＡＭ−１に強い特異的親和度を持つことを示唆することであって、従って、本発明の抗体は、ＶＣＡＭ−１に対する抗原認識を要求する任意の適用で使用され得る。
【００２５】
好ましい一実施態様として、本発明の前記ヒト単一クローン抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１だけでなく、マウス血管細胞付着分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合しながら白血球と活性化された内皮細胞との間の相互作用を阻害するヒト単一クローン抗体であり得る。このような単一クローン抗体は、ヒト及びマウスＶＣＡＭ−１に同時に結合可能であり、すなわち、交差反応性を有するので、マウスでの前臨床研究に有用な利点がある。
【００２６】
前記ヒト及びマウス血管細胞付着分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合するヒト単一クローン抗体は、配列番号６で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号７で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号８で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１８で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１９で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２０で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。より好ましくは、前記ヒト単一クローン抗体は、配列番号５で記載された重鎖アミノ酸配列及び配列番号１７で記載された軽鎖アミノ酸配列を含む。本発明の一実施態様によれば、配列番号５で記載された重鎖アミノ酸配列及び配列番号１７で記載された軽鎖アミノ酸配列を含むヒト単一クローン抗体を７Ｃと命名した。
【００２７】
また、前記ヒト及びマウス血管細胞付着分子−１(ＶＣＡＭ−１)に特異的に結合するヒト単一クローン抗体は、配列番号１０で記載された重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で記載された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１２で記載された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２２で記載された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号２３で記載された軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号２４で記載された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。より好ましくは、前記ヒト単一クローン抗体は、配列番号９で記載された重鎖アミノ酸配列と配列番号２１で記載された軽鎖アミノ酸配列を含む。本発明の一実施態様によれば、配列番号９で記載された重鎖アミノ酸配列と配列番号２１で記載された軽鎖アミノ酸配列を含むヒト単一クローン抗体を７Ｈと命名した。
【００２８】
好ましい一実施態様として、前記ヒト単一クローン抗体などは、ヒトＶＣＡＭ−１に対する親和度を提供するが、ヒト単一クローン抗体のヒト及びマウスＶＣＡＭ−１抗原に対する結合／解離定数(ＫＤ値)は、１×１０−１０Ｍ〜９×１０−８Ｍであり得る。これは、ビアコア分析を用いて各抗体などのヒトＶＣＡＭ−１に対する結合／解離定数(ＫＤ値)を決定することによって求めることができる。本発明の一実施態様によれば、ヒト単一クローン抗体７Ｃ及び７Ｈは、ヒト及びマウスＶＣＡＭ−１抗原に対して約５〜１００ｎＭ水準の高い親和度を持つことを確認し(表１)、これは、本発明の抗体がヒト及びマウスＶＣＡＭ−１に強い特異的親和度を持つことを示唆することであって、本発明の抗体は、ＶＣＡＭ−１に対する抗原認識を要求する任意の適用で有用であり得る。すなわち、本発明のヒト単一クローン抗体は、ヒトＶＣＡＭ−１またはヒト及びマウスＶＣＡＭ−１に強い特異的親和度を持つから、活性化された内皮細胞に対する白血球の付着を効果的に阻害させるので、炎症性障害または癌のようなＶＣＡＭ−１関連疾患に対する効果的な診断及び治療方法を提供することができる。
【００２９】
また一つの態様として、本発明は、ヒトまたはヒト及びマウスＶＣＡＭ−１に特異的に結合するヒト単一クローン抗体の製造方法に関するものである。
【００３０】
本発明の単一クローン抗体は、公知の単一クローン抗体製造技術で容易に製造され得る。例えば、単一クローン抗体を製造する方法は、免疫された動物から得たＢリンパ球を使用してハイブリドーマを製造することによって行われることができるとか(Koeher and Milstein，1976，Nature，256:495)、ファージディスプレイ(phage display)技術を用いることによって行われることができるが、これに制限されるのではない。
【００３１】
ファージディスプレイを用いた抗体ライブラリーは、ハイブリドーマを製作せず、直ぐＢリンパ球から得られた抗体遺伝子を有したファージ表面に抗体を発現させる方法である。ファージディスプレイ技術を用いると、Ｂ−細胞不滅化によって単一クローン抗体を生成するのに係わる多くの困難さが克服され得る。一般的にファージディスプレイは、１）ファージの外皮タンパク質ｐIII(または、ｐＩＶ)Ｎ−末端に該当する遺伝子部位にランダム配列のオリゴヌクレオチドを挿入する段階；２）天然型の外皮タンパク質と前記ランダム配列のオリゴヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドの融合タンパク質を発現させる段階；３）前記オリゴヌクレオチドによってコーディングされたポリペプチドと結合し得る受容体物質で処理する段階；４）受容体に結合されたペプチド−ファージ粒子などを低いｐＨや結合競争力のある分子を用いて溶出させる段階；５）パニングによって溶出されたファージを宿主細胞内で増幅させる段階；６）所望の量のファージを得るために前記方法を繰り返す段階；及び７）パニングによって選別されたファージクローンなどのＤＮＡ配列から活性があるペプチドの配列を決定する段階から構成される。
【００３２】
好ましい一実施態様として、本発明の単一クローン抗体の製造方法は、ファージディスプレイによって行われることができる。当業者は、公知のファージディスプレイ技術、例えば、Barbasら(METHODS:A Companion to Methods in Enzymology 2: 119，1991及びJ．Virol．2001 Jul;75(14):6692-9)及びWinterら(Ann．Rev．Immunol．12:433，1994)の論文などに公知された方法を参考して前記本発明の製造方法の各段階を容易に行うことができる。抗体ライブラリーを構築するために使用され得るファージは、例えば、フィラメント性ファージであって、ｆｄ、Ｍ１３、ｆ１、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｚｊ／Ｚ、Ｆｆ、×ｆ、Ｐｆ１またはＰｆ３ファージがあるが、これに制限されるのではない。また、前記フィラメント性ファージの表面上に異種遺伝子の発現のために使用され得るベクターには、例えば、ｆＵＳＥ５、ｆＡＦＦ１、ｆｄ−ＣＡＴ１またはｆｄｔｅｔＤＯＧなどのファージベクター、またはｐＨＥＮ１、ｐＣｏｍｂ３、ｐＣｏｍｂ８またはｐＳＥＸなどのファージミドベクターがあるが、これに制限されるのではない。
【００３３】
また、組換えファージの成功的な再感染のために要求される天然型外皮タンパク質を提供するために使用され得るヘルパーファージは、Ｍ１３Ｋ０７またはＶＳＣＭ１３によって増幅されることができるが、これに制限されるのではない。
【００３４】
本発明の一実施態様によれば、組換え技術で収得したＶＣＡＭ−１の分子量及び純度を確認した後、単一クローン抗体の製造に用いた。ヒト及びマウスＶＣＡＭ−１に対する特異的なヒト抗体をファージディスプレイ技術によってヒト由来ｓｃＦｖ(single-chain variable fragment)で収得し、単一ファージクローンでスクリーニングすることによって、ヒト、またはヒト及びマウスＶＣＡＭ−１のすべてに特異的な２２種の単一クローンファージを収得した。前記の単一クローンファージは下記のように収得した。第１に、前記ＶＣＡＭ−１を多様性を有したヒト純粋ｓｃＦｖライブラリー細胞からのライブラリーファージと反応させた後、ＶＣＡＭ−１抗原に強く結合する単一クローンをパニングしてスクリーニングした(表１及び図２)。前記選別された単一クローンなどをフィンガープリンティングで確認した後、それぞれの配列を分析して抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ部位を確認した。前記抗体と生殖系抗体群の類似性をＮＣＢＩのＩｇＢＬＡＳＴプログラム(//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)を用いて確認した。その結果、ＶＣＡＭ−１に特異的な２２種のファージ抗体を得た。
【００３５】
また、本発明の一実施態様によれば、前記選別された２２種のヒト抗体ファージの重鎖及び軽鎖またはその免疫学的活性を有した断片を暗号化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを製作した。前記発現ベクターの製作時には、前記ヒト抗体の軽鎖及び重鎖またはその断片を生産しようとする宿主細胞の種類に応じてプローモーター、ターミネーター、エンハンサーなどのような発現調節要素、及び膜標的化または分泌のための配列などを適切に選択し、目的に応じて様々に組み合わせして使用することができる。
【００３６】
本発明の発現ベクターには、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター及びウイルスベクターなどが含まれるが、これらに制限されない。適切な発現ベクターは、プローモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節要素だけでなく、膜標的化または分泌のためのシグナル配列またはリーダー配列を含み、目的に応じて様々な形態で製造され得る。
【００３７】
また、本発明の一実施態様によれば、本発明はヒト抗体と結合するヒトＶＣＡＭ−１抗原の結合ドメインの位置を確認する方法を提供することができる。ＶＣＡＭ−１は、７個のＩｇＧ様ドメインから構成されており、実質的にドメイン１と４がその相手リガンドであるインテグリン(α４β１またはα４β７)との結合に関与すると知られている。本発明の一実施態様によれば、ヒトＶＣＡＭ−１抗原をドメイン別(Ｄ１−Ｄ２、Ｄ１−Ｄ４、Ｄ１−Ｄ７)で発現精製した後、ＥＬＩＳＡを行って２２種抗体などの抗原結合部位を分析した。その結果、抗体ごとに抗原結合部位が様々であり、それらのうち、ドメインＤ１−Ｄ２に結合する抗体４Ｂ、７Ｈ、及びドメインＤ３−Ｄ４に結合する７Ｃを確保することができた(図３)。
【００３８】
また、本発明では、白血球と活性化された内皮細胞間の相互作用がＶＣＡＭ−１によって媒介されるから、ヒト白血球(Ｕ９３７細胞)と組換えヒトＶＣＡＭ−１またはヒトＴＮＦ−αで刺激させたヒト内皮細胞(ＨＵＶＥＣ)との間の相互作用に対する前期抗体の阻害能を分析することができる。本発明の一実施態様によれば、ヒトＶＣＡＭ−１−固定された固体支持体または、ＨＵＶＥＣ単層プレートに前記の抗体などを様々な濃度で処理した。抗体が蛍光ラベリングされたＵ９３７細胞と抗原の結合を阻害することができるかどうかを確認するために、蛍光強度を測定した。その結果、前記抗体３種のいずれも阻害能を示した。特に、ヒトＶＣＡＭ−１抗原に対して、最も強い親和度を示す４Ｂ抗体は、低い抗体濃度でも強い阻害能を示すことを確認することができる(図４及び図５)。
【００３９】
このような本発明の単一クローン抗体は、ヒトまたはマウスのような様々な細胞類型で発現されるＶＣＡＭ−１と強い親和性を持つから、ＶＣＡＭ−１に対する抗原認識を使用する任意の適用で使用され得る。特に、単一クローン抗体は、活性化された内皮細胞に対する白血球の結合を強力に阻害させる。従って、本発明は、炎症性疾患などのようなＶＣＡＭ−１関連疾患に対する効果的な診断及び治療方法を提供することができる。
【００４０】
従って、本発明のヒト、またはヒト及びマウスのＶＣＡＭ−１と特異的に結合するヒト単一クローン抗体は、単独でまたは通常の薬剤学的に許容される担体と共にＶＣＡＭ−１関連疾患に対する診断及び治療用薬剤学的組成物の形態で使用可能である。
【００４１】
また、本発明の単一クローン抗体は、様々な目的のために他の抗体、生物学的活性を有する製剤または物質と共に使用され得る。例えば、本発明の単一クローン抗体は、内皮細胞のＶＣＡＭ−１発現によって特徴付ける疾患などの治療において４Ｂ９または他の抗ＶＣＡＭ−１抗体と共に使用され得る。また、本発明の単一クローン抗体は、炎症反応において示される別の内皮細胞受容体(例えば、ＥＬＡＭ１及びＩＣＡＭ１など)を認識する抗体などと併用して使用され得るだけでなく、公知の炎症性疾患治療薬物と併用して使用され得る。
【００４２】
また一つの態様として、本発明は、前記ヒト単一クローン抗体を含む炎症性疾患または癌の診断用組成物を提供する。
【００４３】
すなわち、ヒト、またはヒト及びマウスＶＣＡＭ−１に特異的に結合する単一クローン抗体を含む診断用組成物を使用して、ＶＣＡＭ−１の発現と関連された疾患またはＶＣＡＭ−１媒介される疾患、例えば、炎症性疾患または癌を診断することができる。
【００４４】
本願で使用される用語、“炎症性疾患”は、ＶＣＡＭ−１と関連された炎症性疾患は制限なく含まれることができるが、その例として、喘息、鼻炎、関節炎、多発性硬化症、大腸疾患、動脈硬化、心筋梗塞または移植拒絶を意味する。
【００４５】
本発明の炎症性疾患または癌の診断用組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含むことができ、担体と共に製剤化され得る。本願で使用される用語、“薬学的に許容可能な担体”とは、有効成分の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬剤学的担体としては、滅菌されて生体に適したものでなければならない。例えば、薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち、１つ成分以上を混合して使用することができる。必要に応じて抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑沢剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤型、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤で製剤化することができる。
【００４６】
また一つの態様として、本発明は、前記単一クローン抗体及び炎症性疾患または癌が疑われる個体の生物学的試料のＶＣＡＭ−１を抗原−抗体反応を介して検出する段階を含む、炎症性疾患または癌の診断のための情報の提供方法を提供する。すなわち、本発明の組換えヒト単一クローン抗体を生物学的試料と反応させ、抗原−抗体複合体形成を検出することによってＶＣＡＭ−１タンパク質を検出することができる。結果的に、これを介して炎症性疾患または癌の診断のための情報を提供することができる。
【００４７】
本願で使用される用語“個体”とは、犬、猫、豚、ヤギ、ウサギ、ハムスター、サル、モルモット(guinea pigs)、ラット、マウス、トカゲ、ヘビ、ヒツジ、牛、魚及び鳥を制限なく含み、任意の動物(例えば、ヒト)を意味する。
【００４８】
本願で使用される用語“生物学的試料”とは、組職、細胞、全血、血清、血漿、組職剖検試料(脳、皮膚、リンパ節、脊髓など)、細胞培養上澄液、破裂した真核細胞及び細菌発現系などが挙げられるが、これらに制限されるのではない。これらの生物学的試料を操作するとか操作しない状態で本発明の単一クローン抗体と反応させてＶＣＡＭ−１タンパク質の存在、炎症性疾患または癌の有無を確認することができる。
【００４９】
本願で使用される用語“抗原−抗体複合体”とは、試料中のＶＣＡＭ−１タンパク質抗原とこれを認識する本発明による単一クローン抗体の結合物を意味する。このような抗原−抗体複合体の形成は、比色法、電気化学法、蛍光法、発光法、粒子計数法、目視測定法及び閃光計数法からなる群から選択される任意の方法で検出することができる。しかし、必ずしもこれらにのみ制限されなく、様々な応用と適用が可能である。
【００５０】
本発明では、抗原−抗体複合体を検出するためのものとして、様々な標識体を使用することができる。具体的な例としては、酵素、蛍光物、リガンド、発光物、微小粒子、放射性同位元素からなる群から選択されることができ、必ずしもこれらにのみ限定されるのではない。
【００５１】
標識として使用される物質の適切な例として、酵素としてはアセチルコリンエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ラクタマーゼなどを含み、蛍光物としてはフルオレセイン、Ｅｕ３＋、Ｅｕ３＋キレートまたはクリプテートなどを含み、リガンドとしてはビオチン誘導体などを含み、発光物としてはアクリジニウムエステル、イソルミノール誘導体などを含み、微小粒子としてはコロイド金、着色されたラテックスなどを含み、放射性同位元素としては５７Ｃｏ、３Ｈ、１２５Ｉ、１２５Ｉ−ボルトンハンター試薬などを含む。
【００５２】
好ましくは、抗原−抗体複合体を酵素免疫吸着法(ＥＬＩＳＡ)を用いて検出することができる。酵素免疫吸着法には、支持体に付着された抗原を認識する標識された抗体を用いる直接的ＥＬＩＳＡ、支持体に付着した抗原を含む抗原−抗体複合体の捕獲抗体を認識する標識された２次抗体を用いる間接的ＥＬＩＳＡ、支持体に付着した抗原−抗体複合体で抗原を認識する標識された他の抗体を用いる直接的サンドイッチＥＬＩＳＡ、及び支持体に付着した抗原−抗体複合体で抗原を認識する抗体と反応させた後、この抗体を認識するまた他の標識された２次抗体を用いる間接的サンドイッチＥＬＩＳＡ方法を含む。前記単一クローン抗体は、検出標識を持つことができ、検出標識を持たない場合は、本発明の単一クローン抗体を捕獲することができ、検出標識を持つ他の抗体を処理して抗原−抗体複合体で検出することができる。
【００５３】
また一つの態様として、本発明は、前記ヒト単一クローン抗体を含む炎症性疾患または癌の治療用組成物、及び前記治療用組成物を個体に投与する段階を含む、炎症性疾患または癌の治療方法を提供する。
【００５４】
本発明の炎症性疾患または癌の治療用組成物は、薬学的に許容可能な担体を更に含むことができ、担体と共に製剤化され得る。使用され得る担体は、前記で説明したことと同様である。
【００５５】
この時、前記炎症性疾患は、喘息、鼻炎、関節炎、多発性硬化症、大腸疾患、動脈硬化、心筋梗塞及び移植拒絶からなる群から選択され得るが、これらに制限されるのではない。
【００５６】
本発明の一実施態様によれば、本発明によるヒト単一クローン抗体が生体内抗炎症効果を有するかどうかを検証するためにマウス喘息に対する効能実験を実施した。前記の抗ＶＣＡＭ−１ヒト抗体を投与した後、全体炎症細胞数が、特に、リンパ球と好酸球、大食細胞が有意に減少した。つまり、前記抗体の喘息炎症細胞の流入における抑制効能は、現在、喘息治療剤として使用されているアミノフィリンと類似することを確認することができる(図８)。
【００５７】
本発明のヒト単一クローン抗体を含む治療用組成物は、薬学的に有効な量で単一または多重投与され得る。この時、組成物は、液剤、散剤、エアロゾル、カプセル剤、腸溶性錠剤またはカプセル剤または坐剤の形態で投与することができる。投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これらに制限されない。しかし、経口投与の時、ペプチドは消化されるから、経口用組成物の活性成分は、コーティングするとか胃での分解から保護されるように剤型化されるべきである。また、製薬組成物は、活性成分が標的細胞へ移動できる任意の装置によって投与され得る。
【００５８】
本発明の単一クローン抗体を含む組成物は、薬剤学的に有効な量で投与する。“薬剤学的に有効な量”とは、医学的治療または予防に適用可能な合理的な受恵／危険の比率で疾患を治療または予防するのに十分な量を意味し、有効用量水準は、疾患の重症度、薬物の活性、患者の年齢、体重、健康、性別；患者の薬物に対する敏感度；投与時間、投与経路及び排出比率；治療期間；または、本発明の組成物と配合または同時に使用される薬物を含む要素、またはその他の医学分野によく知られた要素に応じて決定することができる。また、本発明の単一クローン抗体を含む組成物は、個別治療剤として投与するとか他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤とは順次または同時に投与され得る。
【００５９】
本発明の薬剤学的組成物を薬学的に有効な量で投与する場合、ＶＣＡＭ−１と強い親和性を有した本発明の単一クローン抗体が内皮細胞に発現されたＶＣＡＭ−１に特異的に結合することによってＶＣＡＭ−１を中和させる。結局、本発明の単一クローン抗体は、前記内皮細胞に対する白血球の付着を阻害することによってＶＣＡＭ−１関連疾患を治療することができる。好ましいＶＣＡＭ−１関連疾患は、炎症性疾患または癌であり、より好ましく前記炎症性疾患は、関節炎、鼻炎、多発性硬化症、大腸疾患、喘息、動脈硬化、心筋梗塞または移植拒絶である。
【００６０】
また一つの態様として、本発明は、本発明によるヒト単一クローン抗体を使用してＶＣＡＭ−１媒介された内皮細胞への白血球の付着を阻害させる方法を提供する。つまり、ＶＣＡＭ−１は、炎症及び免疫拒否において活性化された白血球上で発現されるＶＬＡ−４及びα４β１インテグリンと結合して内皮細胞と単核球及びＴ細胞を含む白血球の間の相互作用を促進する重要な役割を果たす。本発明による単一クローン抗体は、ＶＣＡＭ−１に特異的に結合して内皮細胞への白血球の付着を阻害させ得る。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものだけであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。
【００６２】
実施例１：ヒト及びマウスＶＣＡＭ−１抗原の確保
＜１−１＞ヒトＶＣＡＭ−１のクローニング
韓国生命工学研究院ヒト遺伝体機能研究事業団のＫＵＧＩ(Korean UniGene Information)からヒトＶＣＡＭ−１遺伝子を含有しているプラスミド(hMU012650)(Kugi # IRAU-75-G02)の分譲を受けた。前記プラスミドを鋳型ＤＮＡにし、前記ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ２ドメインとＤ１−Ｄ４ドメインのみを発現させるために、ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ２ドメインの場合、正方向プライマー(５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣ−３’、配列番号２５)及び逆方向プライマー(５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＧＣＣＴＧ−３’、配列番号２６)を使用し、ＶＣＡＭ−１のＤ１−Ｄ４の場合、正方向プライマー(５’−ＣＡＧＧＧＧＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣ−３’、配列番号２７)と逆方向プライマー(５’−ＴＡＧＣＧＧＣＣＧＡＣＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＣＣＴ−３’、配列番号２８)を使用して各遺伝子を増幅させた。ｓｆｉＩで処理した後、リガーゼを用いてｐＹＫ６０２−ＦｃベクターとｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ  ｏｎｌｙベクター(ＫＲＩＢＢで製造したベクター)にそれぞれ遺伝子をクローニングした。ＰＣＲ条件は、全体反応液が５０μｌである時、鋳型は、１００ｎｇを９４℃で２分間反応させた後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒(Ｄ１−Ｄ４)、４５秒(Ｄ１−Ｄ２)で３０サイクル、７２℃で１０分間反応させてＰＣＲ産物を得た。合わせて、前記クローニングされたｐＹＫ６０２−ＦＣ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２、ｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２、ｐＹＫ６０２−ＦＣ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４及びｐＹＫ６０２−Ｈｉｓ−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４ベクターなどの塩基配列を確認した。
【００６３】
＜１−２＞ＶＣＡＭ−１タンパク質の発現及び精製
ｈＶＣＡＭ−１に高い親和度を有する抗体のうちからｍＶＣＡＭ−１とも交差反応性を有している抗体を選別するために、様々なタンパク質を準備した。そのうち、分子全体を含むｈＶＣＡＭ−Ｆｃ−キメラ(R&D system，cat#: 862-VC)とｍＶＣＡＭ−１−Ｆｃキメラ(R&D systems，Cat#: 643-VM)は、商業的に購買し、各ＶＣＡＭ−１ドメインの断片の精製及び切断は、次のように行った。
【００６４】
先ず、１５０ｍｍディッシュ１０枚に５×１０６の２９３Ｅ細胞をまいた後、翌日に前記クローニングされたｐＹＫ６０２−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２ベクターとｐＹＫ６０２−ＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４ベクターをそれぞれ２０μｇずつＰＥＩ(23966: Polysciences，Inc，USA)で処理して形質転換した。翌日、培地を無血清ＤＭＥＭに置換した後、一日おきに上澄液を得て１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、ウェスタンブロッティングで発現量を確認した。
【００６５】
ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ＦｃとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−Ｆｃの発現が確認された上澄液を収集した後、０．２２μｍのトップフィルター(Millipore，Cat#: SCGP T05 RE)を使用してフィルタリングして十分なタンパク質量を得た。タンパク質を使用前に精製し、精製過程は、次の通りである。先ず、エコノ−カラム(Bio-Rad Cat．No 737-1006，1×5cm)をＰＢＳで洗浄した後、プロテインＡ(Amersham Cat．No.17-1279-30)５００μｌをパッキングした。パッキングする間にＰＢＳ(ｐＨ７．４)を１０ｍｌ程度流してビーズを洗浄し、結合バッファーである２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー(ｐＨ７．０)を３０ｍｌ程度流した。その後、得られた上澄液をぜん動ポンプ(Peri-staltic pump)(Bio-Rad Cat．No．731-8142)を用いて０．５ｍｌ／分の流速で流した。カラムに結合させた後、ＰＢＳで２ｍｌ／分の流速で１時間程度洗浄した後、溶出するようにした。０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ(ｐＨ２．５)の５００μｌで溶出し、１／１０体積の１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)を入れて中和させた。６個の溶出分画のうち、＃１〜＃２分画で大部分のタンパク質が溶出された。この２つの分画は、１０Ｋの透析膜に入れて４ＬのＰＢＳで一晩(o/n)透析した。前記のすべての過程は、４℃冷蔵室で行った。定量した後、生成物を分割して−７０℃に保管した。精製した後、生成物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ＦｃとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−Ｆｃは、それぞれ２．８ｍｇと８００μｇの量で収得した。ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ２−ｈｉｓとｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−ｈｉｓは、発現が確認された上澄液を収集した後、０．２２μｍのトップフィルター(Millipore，Cat#: SCGP T05 RE)を使用してフィルターリングした後、LabScale TFFシステム(Millipore，Cat#: XX42LSS11)のペリコンＸＬメンブレン(Millipore，8K,cat #: PXB0 08A 50)を用いて１／１０体積に濃縮した。濃縮物に１０倍体積のＩＭＡＣ緩衝溶液(３００ｍＭ  ＫＣｌ，５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，５ｍＭ  イミダゾール，ｐＨ８．０)を入れてＩＭＡＣ緩衝溶液に置き換えた。Bio-RadのProfiniaTMタンパク質精製システムのBio-Scle Mini profinity IMAC cartridge(cat#:732-4610)を使用して１ｍｌ／分の速度で製造社のマニュアルに明示されたとおりに精製した。前記溶離液をメンブレイン(10K，132574:SPECTRAPOR，USA)を使用して４℃で４ＬのＰＢＳ溶液に４時間以上緩衝溶液を透析し、再び、予冷しておいた４ＬのＰＢＳ溶液に入れて一晩透析した。一晩透析した後、結果物を電子管(e-tube)に移し、ブラッドフォード方法でタンパク質濃度を測定した。結果的に、４００μｇのｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４−ｈｉｓタンパク質を得て、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。
【００６６】
実施例２：ライブラリーファージの製造
多様性を持ったヒトｓｃＦｖ(single-chain variable fragment)ライブラリー細胞２．７×１０１０を２×ＹＴＣＭ[Tryptone(CONDA，1612.00)１７ｇ、イースト抽出物(CONDA，1702.00)１０ｇ、ＮａＣｌ(Sigma，S7653-5Kg)５ｇ、クロラムフェニコール(Sigma，C0857)]３４μｇ／ｍｌ、２％グルコース(Sigma，G5400)及び５ｍＭのＭｇＣｌ２(Sigma，M2393)を含む培地(３Ｌ)で３７℃で２〜３時間培養した(ＯＤ６００＝０．５〜０．７)。以後、ヘルパーファージを感染させて２×ＹＴＣＭＫ[２×ＹＴＣＭ、カナマイシン(Sigma，K1876)７０μｇ／ｍｌ、１ｍＭのＩＰＴＧ(ELPISBIO，IPTG025)]培地で３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離(４５００ｒｐｍ、１５分、４℃)した後、上澄液を得て４％ＰＥＧ(Fluka，81253)６０００と３％ＮａＣｌ(Sigma，S7653)を添加した溶液に溶解した後、氷で１時間反応させた。反応物を再び遠心分離(８０００ｒｐｍ、２０分、４℃)した。ペレットにＰＢＳを添加して溶解した後、遠心分離(１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃)した。結果として、ライブラリーファージを含む上澄液を得て新しいチューブに入れて４℃で保管した。
【００６７】
実施例３：ファージディスプレイを介したパニング
７個のＩｇＧ様ドメインから構成されたＶＣＡＭ−１がそのリガンドであるアルファ４ベータ１インテグリン(α４β１インテグリン)と結合する時、ドメイン１とドメイン４が結合部位として機能をすると知られている。従って、ＶＣＡＭ−１全体分子だけでなく、ヒトＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４(hVCAM-1-D1-D4)を用いてパニングを行った。本実施例では、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４に対するパニング方法と結果を記載した。
【００６８】
＜３−１＞ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４に対するパニング
４ｍｌのコーティング緩衝溶液[coating buffer；Ｎａ２ＣＯ３(Sigma，S7795)１．５９ｇ、ＮａＨＣＯ３(Sigma，S8875)２．９３ｇ、ＮａＮ３(Sigma，S2002)、０．２ｇ]を使用してImmunosorbチューブ(Nunc 470319)をｈＶＡＣＭ１−Ｄ１−Ｄ−Ｈｉｓ抗原３０μｇで４℃で１６時間程度回転機でコーティングした。以後、抗原を室温で２時間ＰＢＳに溶解して脱脂乳[(BD, 232100)−１ＸＰＢＳ中４％]を使用して免疫チューブでブロッキングした。免疫チューブに前記で製造したライブラリーファージ２ｍｌを添加して室温で２時間反応させた。免疫チューブをＰＢＳＴ(０．０５％)で５回、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、抗原特異的ｓｃＦｖ−ファージを１００ｍＭ  ＴＥＡ(Sigma，T-0886)で溶離した。溶出されたファージなどを大膓菌(XL1-Blue，stratagene，200249)に感染させて増幅した。１次パニングで増幅されたファージをＰＢＳＴで１３回、ＰＢＳで２３回洗浄し(２次：１３回、３次：２３回)、洗浄回数が増加したことの他に、前記記載されたものと同一の方法で２次及び３次パニングを行った。これらの３次多クローンファージ抗体のファージ抗体でマウスＶＣＡＭ−１に交差反応性を有した抗体をスクリーンするために、ｍＶＣＡＭ−１−Ｈｉｓを抗原として４次パニングを行った。その結果、ｍＶＣＡＭ−１−Ｈｉｓに結合されたファージ抗体数の増加は起きなかった。しかし、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−４に対する結合力を持ったファージ抗体でｍＶＣＡＭ−１−Ｈｉｓ抗原に対して４次パニングをしたものであるので、結果として、ファージ抗体が交差反応性を持ったことが分かった。また、これらの４次パニングのファージ抗体でｍＶＣＡＭ−１−Ｈｉｓに対して５次パニングした。その結果、ｍＶＣＡＭ−１−Ｈｉｓ抗原に対するファージのコロニータイターが１０倍以上増幅された(表１及び図１)。
【００６９】
【表１】
0005438819.tif 000002
【００７０】
＜３−２＞ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４とｍＶＣＡＭ−１に対するパニング結果確認
１次から５次までパニングして凍らせておいた細胞貯蔵物を５ｍｌの２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含んだ培地にＯＤ６００＝０．１になるように溶解した。次に、細胞を３７℃で２〜３時間(ＯＤ６００＝０．５〜０．７)培養してＭ１ヘルパーファージを感染させた。以後、細胞を２×ＹＴＣＭＫ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＩＰＴＧを含む培地で３０℃で１６時間培養した。培養細胞を遠心分離した後(４５００ｒｐｍ、１５分、４℃)、上澄液(１次〜３次パニングポリｓｃＦｖ−ファージ)を新しいチューブに移した。９６ウェル免疫プレート(NUNC 439454)にＶＣＡＭ−１抗原を(１００ｎｇ／ウェル)４℃で１６時間程度コーティング緩衝溶液で処理してコーティングした後、ＰＢＳに溶解した脱脂乳(４％)を使用してブロッキングした。各ウェルごとにＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで洗浄した。１次〜３次パニングポリｓｃＦＶ−ファージを各ウェルに１００μｌずつ入れて室温で２時間反応させた。各ウェルをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで４回洗浄した。２次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰ(Amersham 27-9421-01)を１：２０００に希釈して室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで洗浄した後、ＯＰＤ錠剤(Sigmap 8787-TAB)をＰＣ緩衝溶液[Ｃ６Ｈ８Ｏ７Ｈ２Ｏ(Sigma，C0706)５．１ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４(Sigma，S7907)7.3g]に加えて基質溶液を作って各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ入れて１０分間発色させた。ＯＤ４９０を分光光度計(Spectrometer，MolecularDevice，米国)で測定した。ポリファージＥＬＩＳＡの結果、４次パニングからのファージ抗体群でｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４に対する結合能が飽和状態に至り、ｍＶＣＡＭ−１に対する結合能は、５次パニングからのファージ抗体で飽和状態であることを確認した。また、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４とｍＶＣＡＭ−１−Ｈｉｓに対して、対照群と比較の時、高い親和力の交差反応性を示した(図１)。
【００７１】
＜３−３＞単一クローン抗体選別
前記強い結合能を有する多クローン抗体から得られたコロニーを(全体ｈＶＣＡＭ−１抗原を使用した３次パニングと、ｈＶＣＡＭ−１−Ｄ１−Ｄ４抗原を使用した４、５パニング)２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭのＭｇＣｌ２を補充した培地を１ｍｌ／ウェルで含んだ９６ディープウェルプレート(Bioneer，90030)で３７℃で１６時間培養した。ＯＤ６００が０．１に至るまで細胞を培養した。９６ディープウェルプレートに盛られた２×ＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭのＭｇＣｌ２を補充した培地に１００〜２００μｌの培養溶液を接種した後、３７℃でＯＤ６００値が０．５〜０．７になるように２〜３時間培養した。細胞をＭ１ヘルパーファージで(ＭＯＩ＝１：２０)感染させた後、感染された細胞を２×ＹＴＣＭＫ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＩＰＴＧを補充した培地で３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離(４５００ｒｐｍ、１５分、４℃)した後、上澄液を取って４％ＰＥＧ６０００と３％ＮａＣｌを添加した。完全に溶解した後、氷で１時間反応させた。反応物を遠心分離(８０００ｒｐｍ、２０分、４℃)した後、ペレットをＰＢＳに溶解した。再び遠心分離(１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃)して上澄液を取り、それよりパニング単一クローンｓｃＦＶ−ファージを得た。ファージを新しいチューブに移して４℃で保管した。
【００７２】
以後、９６ウェル免疫プレートをｈＶＣＡＭ−１−Ｆｃキメラ(Ｒ＆Ｄシステム)(１００ｎｇ／ウェル)で４℃で１６時間コーティングした後、ＰＢＳに溶解した脱脂乳(４％)でブロッキングした。９６−ウェル免疫プレートの各ウェルをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌを使用して洗浄した。３次パニング単一クローンｓｃＦｖ−ファージ(各１００ｓｃＦｖ−ファージ)を各ウェルに１００μｌずつ入れて室温で２時間反応させた。各ウェルをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで４回洗浄した。２次抗体である抗−Ｍ１３−ＨＲＰを１：２０００で希釈して室温で１時間反応させた。その後、プレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ２０(０．０５％)０．２ｍｌで洗浄した後に発色させた。ＯＤ４９０を測定した。
【００７３】
その結果、様々なＶＣＡＭ−１抗原に対して６８個の単一クローンなどの結合能を比較し、これらの種類をフィンガープリンティングと配列分析で確認した。最終的に２２種の互いに異なるファージ抗体を選別した。
【００７４】
実施例４：全ＩｇＧ形態へのクローニング
ｈＶＣＡＭ−１に対する単一クローンファージ抗体などをファージからＩｇＧ全体ベクターに転換するために、単一クローンＤＮＡ１μｌと１０ｐｍｏｌｅ／μｌの４Ｂ ＰＣＲのための重鎖正方向プライマー(ＴＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣ、配列番号２９)と重鎖逆方向プライマー(ＧＡＧＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡ、配列番号３０)、７Ｃ ＰＣＲのための重鎖正方向プライマー(ＴＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ、配列番号３１)と重鎖逆方向プライマー(配列番号３０)及び７Ｈ ＰＣＲのための重鎖正方向プライマー(配列番号２９)と重鎖逆方向プライマー(配列番号３０)、１０Ｘバッファー５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰｍｉｘ１μｌ、ｐｆｕ ＤＮＡ重合酵素(Solgent、２．５Ｕ／μｌ)０．５μｌ、蒸留水でコロニーＰＣＲ(iCycler iQ、 BIO-RAD)を行って重鎖を得た。また、４Ｂ ＰＣＲのための軽鎖正方向プライマー(ＴＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ、配列番号３２)と軽鎖逆方向プライマー(ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＴＧＧＴＣＣＣ、配列番号３３）、７Ｃ ＰＣＲのための軽鎖正方向プライマー(ＴＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＡＴＣ、配列番号３４)と軽鎖逆方向プライマー(ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＡＧＧＡＣＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ、配列番号３５)、７Ｈ ＰＣＲのための軽鎖正方向プライマー(ＴＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＣＣＧＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ、配列番号３６)と軽鎖逆方向プライマー(ＧＡＧＧＡＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴ、配列番号３７)を使用して同様の方法でコロニーＰＣＲを行って軽鎖を得た。ＰＣＲは、次の条件下で行った；９４℃で１分間、５５℃で１分、７２℃で１分を３０回繰り返し。
【００７５】
ＰＣＲの結果収得した重鎖遺伝子をＤＮＡ−ゲル溶離キットで(Ｑｉａｇｅｎ、ＮＤ)溶離した後、ｐＮＡＴＡＢ  Ｈベクター１μｌ(１０ｎｇ)、重鎖(１００〜２００ｎｇ)１５μｌ、１０Ｘバッファー２μｌ、リガーゼ(１Ｕ／μｌ)１μｌ、蒸留水と混合して前記のベクターとの結合のために室温で１〜２時間放置した。前記ベクターに適格細胞(ＸＬ１−ｂｌｕｅ)を加えて氷に３０分間放置した後、４２℃で９０秒間熱ショックを加えて形質転換した。混合物を再び、氷に５分間放置した後、ＬＢ培地１ｍｌを注入した。１時間３７℃で培養した後、細胞をＬＢＡｍｐ固体培地に塗抹した後、３７℃で１６時間培養した。収得した単一コロニーをＬＢＡｍｐ液体培地５ｍｌに接種して３７℃で１６時間培養した。前記培養液からＤＮＡ−ｐｒｅｐ．キット(Ｎｕｃｌｏｇｅｎ)を用いてＤＮＡを抽出した。また、軽鎖ＤＮＡは、ｐＮＡＴＡＢ Ｌベクターを使用して前記と同一の方法で抽出した。前記収得したＤＮＡの配列分析をＣＭＶ−ｐｒｏＦプライマー(ＡＡＡ  ＴＧＧ  ＧＣＧ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＧＴＧ、配列番号３８)を用いて行った(Solgent, Korea)。その結果、ＶＣＡＭ−１に対する２２個のクローンから転換した全体ＩｇＧの重鎖と軽鎖の配列は、ファージ抗体の配列と一致することを確認した。
【００７６】
実施例５：抗体の一過性遺伝子発現
前記クローニングされた全体ＩｇＧ重鎖ＤＮＡと軽鎖ＤＮＡから抗体遺伝子の一過性遺伝子発現を行った。
【００７７】
一過性遺伝子発現のための宿主細胞としてＣＨＯ(Chinese Hamster Ovary)−Ｓ細胞を使用してリポフェクタミン２０００(Cat no．11668-019，Invitrogen)とＤＮＡ(１：１)でＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ(GIBCO 31985，Invitrogrn)混合した溶液で形質転換を誘導した。一過性発現を最大化させるために重鎖ＤＮＡと軽鎖ＤＮＡを１：１の比率で使用した。形質転換のために、ＲＰＭＩ１６４０培地(GIBCO 22400，Invitrogen)を使用し、細胞は、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で使用した。混合溶液を２０分間反応させた後、形質転換用培地と１：９の比率で混合し、これをＣＯ２５％、３７℃の振盪培養器で１１０ｒｐｍで４時間培養させた。以後、８ｍＭグルタミン(GIBCO 25030，L-Glutamine 200mM，100X，Invitrogen)とＨＴＳ(GIBCO，HT Supplement，Cat no.11067-030，Invitrogen)が含まれたＣＤ−ＣＨＯ培地(GIBCO 10743、 Invitrogen)を形質転換された培地と同一の体積で添加した。フラスコは、ＣＯ２８％、３７℃の振盪培養器に１００ｒｐｍで４日間培養した。このように培養された試料は、８、０００ｇで１５分間遠心分離して細胞残物を除去した後、上澄液は、０．２２μｍの濾過器(Corning)で濾過して抗体分離精製のための培養液を準備した。
【００７８】
実施例６：抗体の分離と精製
前記実施例５で準備された上澄液を平衡化緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．４)、１００ｍＭのＮａＣｌ)で平衡化させた組換えプロテインＡセファロースカラム(ハイトラップｒプロテインＡ  ＦＦ、５ｍＬ、ＧＥヘルスケア)に通過させた。カラムに結合された抗体を０．１Ｍナトリウム−クエン酸塩(ｐＨ３．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ溶液で溶出させた後、１Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)で中和させてＰＢＳ(phosphate buffered saline，pH 7.4，Welgene)緩衝液で透析させた。精製された抗体をビス−トリス４−１２％濃度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル(NuPAGE gel，Invitrogen)上で還元条件で電気泳動した。その結果、約５５ｋＤａの重鎖と約２５ｋＤａの軽鎖を確認した。
【００７９】
実施例７：抗体の抗原親和度分析
＜７−１＞抗原ドメインとの親和度分析
前記実施例６で分離精製された抗体をそれぞれ４Ｂ、７Ｃ及び７Ｈと命名した。それぞれ配列番号１である重鎖と配列番号１３である軽鎖(４Ｂ)、配列番号５である重鎖と配列番号１７である軽鎖(７Ｃ)及び配列番号９である重鎖と配列番号２１である軽鎖(７Ｈ)を含むことを確認した。このように分離した抗体の抗原親和度分析を下記のように行った。
【００８０】
７個のドメインから構成されたＶＣＡＭ−１で抗ＶＣＡＭ−１抗体結合領域の位置をＥＬＩＳＡで確認した。組換えヒトＶＣＡＭ−１ドメイン１〜２／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ２’という、A&R therapeutics)、ＶＣＡＭ−１ドメイン１〜４／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ４’という、A&R therapeutics)、ＶＣＡＭ−１ドメイン１〜７／Ｆｃキメラ(以下、‘ＶＤ７’という、R&D、 862-VC)をそれぞれ２ｇ／ｍｌの濃度でマイクロプレートの各ウェルに４℃で一晩コーティングした。ＰＢＳを使用して前記プレートを１回洗浄した後、３％ＢＳＡ(bovine serum albumin)が添加されたＰＢＳを使用して２時間３７℃でブロッキングし、抗体を含んでいる細胞培養液(１：５０)で２時間３７℃で培養した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳを使用してプレートを４回洗浄した後、組換えヒトＶＣＡＭ−１抗原に結合した抗ＶＣＡＭ−１抗体の量を抗−Ｆａｂ単一クローン抗体西洋ワサビペルオキシダーゼが結合化(conjugated)された抗−Ｆ(ａｂ’)２抗体で検出した。プレートをＴＭＢ基質溶液(３,３,５,５−テトラメチルベンジジン)と室温で約５分間反応させ、１Ｎ(ノーマル)硫酸溶液で反応を止めた後、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【００８１】
図３に示されたように、４Ｂと７Ｈは、ＶＣＡＭ−１ドメインの１〜２のみ有するＶＤ２に強い結合能を持つ一方、７Ｃは、ＶＤ２に対する結合能は殆ど無く、ＶＤ４とＶＤ７に結合能を有することと示された。つまり、４Ｂと７Ｈは、ＶＣＡＭ−１の７個のドメインのうち、１〜２ドメインに結合し、７Ｃは、３〜４ドメインに結合する。
【００８２】
＜７−２＞ビアコアを用いた親和度分析
ヒト及びマウスＶＣＡＭ−１抗原に対する抗ＶＣＡＭ−１抗体４Ｂ、７Ｃ及び７Ｈの結合親和度を確認するために各抗原をリガンドとして、センサチップ(Sensor chip CM5，BIACORE，BR-1003-99)に固定化させた後、ヒト抗体を各濃度別に希釈してビアコア機器を用いて固定化されたリガンドに流して抗原−抗体間の結合及び解離反応を誘導することによって、該当抗原−抗体間結合相互作用を示す結合／解離定数ＫＤ値を確認した。これに対する実験結果を図１に示した(参考文献：Thomas Hofer, Wisit Tangkeangsirisin, Michael G. Kennedy, Rose G. Mage, Stephen J. Raiker, Karthik Venkatesh, Hakjoo Lee, Roman J. Giger, Christoph Rader Chimeric rabbit/human Fab and IgG specific for members of the Nogo-66 receptor family selected for species cross-reactivity with an improved phage display vector Journal of Immunological Methods 318 (2007) 75.87; Paula Gomes a, David Andreu Direct kinetic assay of interactions between small peptides and immobilized antibodies using a surface plasmon resonance biosensor Journal of Immunological Methods 259, 2002.217-230, and Kikuchi Y, Uno S, Nanami M, Yoshimura Y, Iida S, Fukushima N, Tsuchiya M. Determination of concentration and binding affinity of antibody fragments by use of surface plasmon resonance. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 100, No. 3, 311-317, 2005)。
【００８３】
ビアコア分析は、１）センサチップとリガンドの間のカップリング条件を確認する緩衝液選別段階(Pre-concentration)、２）リガンドをセンサチップに固定化させる段階、３）固定化されたリガンドに分析物質を結合させる段階の３段階から構成される。
【００８４】
１）緩衝液選別段階
本試験は、通常、該当実験用として使用されるビアコア用センサチップＣＭ５(Sensor chip CM5，BIACORE，BR-1003-99)を使用し、リガンドをチップに固定化させる前に、チップ表面に対するリガンドの静電気的相互作用をカップリング緩衝液として使用する酢酸ナトリウム溶液のｐＨ４．０〜５．５での変化を介して決定した。
【００８５】
２）リガンド固定化段階
センサチップＣＭ５にリガンドを固定化させるために、先ず、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)とＮ−エチル−Ｎ’−(ジメチルアミノプロピル)(ＥＤＣ)(Amine Coupling Kit，BR-1000-50)の混合物でチップを活性化させてアミノ基に対する高い反応性のＮＨＳ−エステル活性化チップ表面を準備する。固定化させようとする１ｍｇ／ｍｌ濃度のリガンドを各４．０〜５．５のｐＨ範囲で変化する酢酸ナトリウム溶液９７μｌを用いて３／１００の比率で希釈した後、流速を１０μｌ／分にして約３分間注入した(陰性対照群としてランニングバッファーであるＨＢＳ−ＥＰ緩衝液(BIACORE AB, スウェーデン)を用いて同様に希釈したリガンドを使用した)。リガンドを予め設定した数値であるターゲットＲＵ(resonance unit)で固定化するために、ターゲットＲＵに至るまで自動に順次注入を行った。リガンドが固定化チップを不活性化させるために、１Ｍエタノールアミン(Amine Coupling Kit、 BR-1000-50)を流速１０μｌ／分で約３分間注入した。最終リガンドの固定化数値(ＲＵ)は、エタノールアミン注入前と後のＲＵ値の差を提供する固定化レポートで最終確認した。
【００８６】
３）固定化されたリガンドを用いて分析物質を結合させる段階
該当の試験は、非特異的結合を除去するために、ビアコア機器で提供されるフローセル２−フローセル１方法を選択した。この時、フローセル２には、リガンドとして組換えＶＣＡＭ１／Ｆｃ抗原を固定化させ、フローセル１には、ＢＳＡ(Bovine Serum Albumin)を固定化させた。以後、分析物として抗ＶＣＡＭ−１抗体である４Ｂ、７Ｃ及び７Ｈのぞれぞれを同時にフローセル１、２に流した。フローセル２のセンソグラムＲＵからフローセル１のセンソグラムＲＵを自動的に差し引いた。以後、流速を３０μｌ／分にして約３分間分析試料を注入させた後、１２０秒間解離を誘導させた。このような過程を介して該当抗原と抗体との間の結合／解離曲線を得ることができ、以後、BIAevaluationプログラム(BIACORE AB，スウェーデン)を介して下記表２のように結合／解離定数ＫＤ値を算出した。
【００８７】
【表２】
0005438819.tif 000003
【００８８】
前記表２は、ヒト及びマウスＶＣＡＭ−１抗原に特異的な抗ＶＣＡＭ−１ヒト単一クローン抗体などの抗原に対する結合能または親和度を示すものであって、タンパク質親和度分析機器であるビアコア(BIACORE，BIACORE AB，スウェーデン)を用いて生物学的に異なる種であるヒトとマウス抗原に対する種特異的抗原−抗体親和度を確認した。該当抗原−抗体間の親和度定数であるＫＤ値は、１：１結合モードで計算された。
【００８９】
その結果、ヒト抗原に対して４Ｂ、７Ｃ及び７Ｈのいずれも優れた結合力を有することを確認し、このうち、４Ｂ抗体の場合、約１ｎＭ水準の優れた結合力を有することを確認した。また、４Ｂを除いた７Ｃ及び７Ｈ抗体の場合、マウス抗原に対しても約１０〜１００ｎＭ水準の結合能を有することを確認することができた。
【００９０】
実施例８：抗体による白血球細胞付着阻害効果
＜８−１＞ヒトＶＣＡＭ−１抗原と白血球間の付着に対する阻害効果
９６−ウェルプレート(Maxisorp，Nunc)のそれぞれのウェルを組換えヒトＶＣＡＭ−１(10μg/ml，Cat．No.: 809-VR-200，R&D systems)１００μｌで１時間コーティングした後、ヒト抗体４Ｂ、７Ｃ及び７Ｈをそれぞれ０．０１、０．１、１．０及び１０．０μｇずつＶＣＡＭ−１がコーティングされたウェルに添加して１時間抗原に結合するようにした。この時、陽性対照群として、１．０及び１０．０μｇの４Ｂ２マウス抗−ヒトＶＣＡＭ−１単一クローン抗体(Cat．No.: BBA5，R&D)を、陰性対照群として、抗体処理せずに抗原のみを使用した。抗体が抗原に結合する間にヒト白血球細胞であるＵ９３７(Cat．No.:CRL-1593.2，ATCC)を５μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ(Cat．No.:216254，Calbiochem)で蛍光染色させた。その次の過程でＵ９３７細胞表面にあるＦｃ受容体を不活性化させるために、１００％ヒト血清(Cat．No.:H4522，Sigma)で処理した。蛍光染色とＦｃ受容体の不活性化過程を経た白血球細胞を１％ウシ胎児血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０(Cat．No,:22400-089，Invitrogen)培地に１．０×１０６細胞／ｍｌになるように浮遊させた。準備されたＵ９３７細胞を抗原と抗体が処理されたプレートに各ウェルに１００μｌずつ入れてアルミホイルで光を遮断した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２静止培養器で１５分間培養させた後、１％ウシ胎児血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地をウェルにいっぱいになるまで入れ、シールテープで堅固に封じた。プレートを覆したまま２００×重力で５分間遠心分離した。プレートを覆したままシールテープを除去した。培地及び接着しないＵ９３７細胞を完全に除去した後、細胞溶解緩衝液(５０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．５）、０．１％ＳＤＳ)をウェル当り１５０μｌずつ入れて１５分間付着されているＵ９３７細胞を溶解した。その後、プレートを蛍光分析機(GeminiX，Molecular Device)に挿入し、吸収波長４８５ｎｍ／放出波長５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。(各実験の条件当り)３回繰り返し(triplicate)から出た平均値を算出し、抗体で処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害能程度を分析した。分析の結果、４Ｂは、０．１μｇ以上で８０％以上の阻害能を示した。７Ｃと７Ｈは、低い量(０．０１〜１．０μｇ)では、阻害効果が微弱であったが、１０μｇで処理すると、９０％以上の阻害能を示した(図４)。
【００９１】
＜８−２＞ヒト内皮細胞と白血球細胞間の付着に対する阻害効果
９６−ウェルプレート(Microtest tissue culture 96-well plate，BD-Falcon)の各ウェルにヒト内皮細胞であるＨＵＶＥＣ、２×１０４細胞数を播き、約３日間ＥＧＭ−２培地(Lonza)で製造社の指示に従って培養した。細胞単層を顕微鏡で確認し、２０ｎｇ／ｍｌの濃度のヒトＴＮＦ−αで２４時間刺激させた。以後に、ＴＮＦ−αを除去するために、ＥＧＭ−２培地２００μｌで各ウェルを２回洗浄した後、ヒト抗体４Ｂ、７Ｃ及び７Ｈをそれぞれ０．０１、０．１、１．０及び１０．０μｇずつＨＵＶＥＣ単層が播かれたウェルに添加して１時間抗原−抗体結合を誘導した。この時、陽性対照群として、１．０及び１０．０μｇの４Ｂ２マウス抗−ヒトＶＣＡＭ−１単一クローン抗体(Cat．No.:BBA5，R&D)とマウス抗−α４インテグリン抗体を、陰性対照群としては、抗体処理をせずに抗原のみを使用した。抗体が抗原に結合する間にヒト白血球細胞であるＵ９３７(Cat．No.:CRL-1593.2，ATCC)を５μＭのＢＣＥＣＦ−ＡＭ(Cat．No.:216254，Calbiochem)で蛍光染色をさせた。その次の過程でＵ９３７細胞表面にあるＦｃ受容体を不活性化させるために１００％ヒト血清(Cat．No.:H4522，Sigma)で処理した。蛍光染色とＦｃ受容体不活性化過程を経たＵ９３７細胞を１％ウシ胎児血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０(Cat．No.:22400-089，Invitrogen)培地に１．０×１０６細胞／ｍｌになるように浮遊させた。準備されたＵ９３７細胞を抗体が結合されたＨＵＶＥＣの各ウェルに１００μｌずつ入れてアルミホイルで光を遮断した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２静止培養器で１０分間付着させた後、覆したまま培地及び付着しなかった細胞を除去した。各ウェルを１％ウシ胎児血清が含まれたＲＰＭＩ１６４０培地で満たし、シールテープで堅固に封じた。プレートを覆したまま４００×重力で５分間遠心分離した。遠心分離したプレートを覆したままシールテープを除去した。培地及び付着しないＵ９３７細胞を完全に除去した後、細胞溶解緩衝液(５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、０．１％ＳＤＳ)をウェル当り１５０μｌずつ入れて１５分間付着されているＵ９３７細胞を溶解した。その後、プレートを蛍光分析機(GeminiX，Molecular Device)に挿入し、吸収波長４８５ｎｍ／放出波長５３０ｎｍで蛍光強度を測定した。(各実験の条件当り)３回繰り返して出た平均値を算出し、抗体で処理しない群に比べて蛍光強度がどのくらい減少したかを計算して阻害能程度を分析した。分析の結果、４Ｂは、０．１μｇ〜１０．０μｇで約５０〜６０％の阻害能を示した。７Ｃと７Ｈは、低い量(０．０１〜１．０μｇ)では、阻害効果が微弱であったが、１０μｇで処理すると、５０〜６０％以上の阻害能を示した(図５)。このような結果は、前記実施例＜８−１＞のＶＣＡＭ−１抗原と白血球細胞付着に対する阻害効果の分析結果と類似する様相を示した。
【００９２】
実施例９：ＲｈｏＡ(Ras homolog gene family，member A)及びＲＯＳ(Reactive oxygen species)活性に対する抗体の阻害効果
＜９−１＞ＲｈｏＡ(Ras homolog gene family，member A)活性に対する阻害効果
ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯静脈内皮細胞)２×１０４細胞を６−ウェルプレートに接種し、約３日間培養して各ウェルにコンフルエントに培養した。培養液に存在する血清を除去するために、ＥＢＭ−２培地(Cat．No.:CC-3156，Lonza)でプレートを１回洗浄し、ヒトＴＮＦ−αを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で０．２５％のウシ胎児血清が含まれたＥＢＭ−２培地に希釈して入れた後、一晩(約１４〜１６時間)培養して細胞を刺激させた。培養液を除去し、抗ＶＣＡＭ−１抗体と対照抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で入れた後、３０分間３７℃で反応させた。細胞表面のＶＣＡＭ−１を交差結合させるのに使用される抗ＶＣＡＭ−１抗体(Cat．No.:BBA5，BD)を１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、３０分間３７℃で反応させた。ＨＲＰが複合化(conjugated)された抗−マウス抗体(Cat．No.:A9917，Sigma)を１：１００の比率で添加して１５分間３７℃で反応させた。反応が終わった直ちに氷の上にプレートを載せて培地を除去し、冷たいＰＢＳで１回洗浄した。プレートから残余ＰＢＳを完全に除去した後、ＲｈｏＡ活性化キット(Cat．No.:BK124，Cytoskeleton)に含まれた細胞溶解緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ入れ、細胞を溶解して回収した。以後の過程は、キットのマニュアル通りに実験を行い、３回繰り返した。
【００９３】
その結果、細胞表面に発現されたＶＣＡＭ−１を交差結合させることによって誘導されたＲｈｏＡ活性は、４Ｂ抗体によって約８０％、７Ｈ抗体によって約３０％阻害される効果を確認することができた(図６)。
【００９４】
＜９−２＞ＲＯＳ(Reactive oｘygen species)活性に対する阻害効果
ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯静脈内皮細胞)２×１０４細胞を６−ウェルプレートに接種し、約３日間培養して各ウェルにコンフルエントに培養した。培養液に存在する血清を除去するために、ＥＢＭ−２培地(Cat．No.:CC-3156，Lonza)でプレートを１回洗浄し、ヒトＴＮＦ−αを２０ｎｇ／ｍｌの濃度で０．２５％のウシ胎児血清が含まれたＥＢＭ−２培地に希釈して入れた後、一晩(約１４〜１６時間)培養して細胞を刺激させた。培養液を除去してＥＢＭ−２培地で２回洗浄した後、抗ＶＣＡＭ−１抗体と対照抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で入れた後、３０分間３７℃で反応させた。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄し、細胞表面のＶＣＡＭ−１を交差結合させるのに使用される抗ＶＣＡＭ−１抗体(Cat．No.:BBA5，BD)を１０μｇ／ｍｌの濃度で入れて３０分間３７℃で反応させた。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄し、ＨＲＰが複合化(conjugated)された抗−マウス抗体(Cat．No.:A9917，Sigma)を１：１００の比率で入れた後、３７℃で３０分間反応させた。各ウェルをＥＢＭ−２培地で２回洗浄した。培地を完全に除去した後、ＥＢＭ−２培地で希釈した１０μＭＤＣＦ(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate)を１５０μｌずつ各ウェルに処理した。以後、蛍光値(測定波長４９５ｎｍ〜５２７ｎｍ)を１０分おきで３時間観察し、３時間目に測定された値で抗体の効能を評価した。実験は、３回繰り返した。
【００９５】
その結果、細胞表面に発現されたＶＣＡＭ−１を交差結合させることによって誘導されたＲＯＳ活性は、４Ｂ抗体によって約６５％、７Ｈ抗体によって約２５％阻害される効果を確認することができた(図７)。
【００９６】
前記のような結果は、本発明による抗体がＲｈｏＡ活性及びＲＯＳ活性を有意的に阻害させることができることを示唆し、即ち、免疫細胞が内皮細胞に結合する時、内皮細胞の信号伝達によって内皮細胞の間隙が拡張されて穴が生じ、その穴を介して免疫細胞が通過するようになり、炎症部位に移動するようになる。しかし、本発明による抗体が前記内皮細胞信号経路でＲＯＳとＲｈｏＡを有意的に抑制して穴を形成しないように内皮細胞間の間隙生成を抑制する。結果的に、炎症部位への免疫細胞の移動を阻止する。
【００９７】
実施例１０：薬動学(Pharmacokinetics)分析
本実施例では、本発明者らによって以前に出願された抗ＶＣＡＭ−１キメラ単一クローン抗体(大韓民国特許出願第１０−２００７−００５３５２６号、“ＶＣＡＭ−１特異的単一クローン抗体”)と本発明によるヒト単一クローン抗体の体内半減期を比較することによって薬動学的分析を行った。つまり、ＢＡＬＢ／ｃマウス７週齢(メス、オリエント)に抗ＶＣＡＭ−１キメラ単一クローン抗体とヒト抗体である４Ｂと７Ｃのそれぞれを５００μｇずつ腹腔内投与した。投与直前及び３０分、１、２、４、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２及び９６時間が経った後、マウスの尾静脈から採血した。ＥＬＩＳＡ方法で血漿内ＩｇＧの濃度と半減期(血中最高濃度の１／２に減少するのに要求される時間)を測定した後、その結果を下記表３に示した。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
前記表３を参考すると、４Ｂと７Ｃの生体内半減期は、それぞれ約８９時間で抗ＶＣＡＭ−１キメラ単一クローン抗体の半減期に比べて約３倍以上増加したことを確認することができる。
【０１００】
実施例１１：マウス喘息効能の実験
＜１１−１＞喘息動物モデルの確立
マウスＶＣＡＭ−１抗原に特異的なヒト抗体７Ｃ及び７Ｈの生体内効能を確認するために、喘息動物モデルを確立した。６週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス(オリエント)に０、２及び７日目にオボアルブミン(Sigma，A5503)７５μｇとアジュバント(adjuvant)である明礬(alum)(ピアース、 77161)２ｍｇを混合して腹腔内投与した。１４日目から２０日目まで一週間２％オボアルブミンで３０分ずつネブライザー(オムロン)を使用して局所感作することによって喘息を誘導した(参考文献：S. J. Park, W. H. Shin, J. W. Seo, et al. Anthocyanins inhibit airway inflammation and hyperresponsiveness in a murine asthma model. Food and Chemical Toxicology 45 (2007) 1459-1467)。抗体は、０．２ｍｇ／マウス(８ｍｇ／ｋｇ)、０．０５ｍｇ／マウス(２ｍｇ／ｋｇ)の用量で１４日目に１回腹腔内投与した。対照薬物として、アミノフィリン(デウォン製薬)を１４日目から２０日目まで毎日１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与して治療効能を比較した。２１日目に炎症の解剖学的様相を分析した。
【０１０１】
＜１１−２＞喘息動物モデルにおける抗体の効能
最後のオボアルブミン感作が終わった後、２４時間目にマウスをエーテル(純正)で麻酔し、解剖テーブルに固定した。胸部を切開して気管を露出させ、結紮してカテーテルを挿入した。ＰＢＳを１ｍｌ及び０．８ｍｌずつそれぞれ注入して気管支肺胞洗浄を行った。収得した気管支肺胞洗浄液を４℃、２、０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞にＰＢＳを入れて浮遊させて細胞数を測定した。２万個の細胞を２、０００ｒｐｍで３分間サイトスピン(Thermo scientific)を行ってスライドに塗抹し、デフクイック(Diff Quik)染色を行った。デフクイック染色(Sysmex，38721)は、スライドを溶液Ｉで１５秒、溶液ＩＩで６０秒、溶液ＩＩＩで４０秒間順に漬け、流れる水道水でスライドを濯いて行った。スライドを空気中で一晩乾かした後、マウント溶液(Fluka，44581)で固定した。光学顕微鏡(１００倍)で２００個以上の炎症細胞を観察して好酸球、大食細胞、好中球、リンパ球に分類して比較した(参考文献：D. Y. Kim, S. Y. Ryu, J. E. Lim, et al. Anti-inflammatory mechanism of simvastatin in mouse allergic asthma model. European Journal of Pharmacology 557 (2007) 76-86)。
【０１０２】
比較結果、前記の抗ＶＣＡＭ−１ヒト抗体を０．２ｍｇ／マウスの用量で投与した場合、全体炎症細胞数が有意に減少した。７Ｈを０．０５ｍｇ／マウス及び０．２ｍｇ／マウスで処理した群で、特に、リンパ球と好酸球の数が減少したことを確認することができた。７Ｃを０．０５ｍｇ／マウス及び０．２ｍｇ／マウスの用量で１回投与した場合、全体炎症細胞数が減少し、特に、大食細胞と好酸球の数が有意に減少した。つまり、２つの抗体の喘息で炎症細胞流入に対する抑制効能は、現在、喘息治療に使用されているアミノフィリンと類似することとして示された(図８)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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