(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の細胞質を酸性化できる薬学的に許容し得る薬剤もしくはその塩の、ヒトまたは動物において免疫抑制を引き起こすために有用な医薬組成物の製造のための使用であって、有効量の該薬剤がヒトまたは動物に本質的に非解離型で投与され、該組成物のｐＨが６．１から７．０の範囲であり、かつ該薬剤がシス−ウロカニン酸であり、該医薬組成物が皮膚の炎症症状、または口腔、眼または生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状の治療または予防のためのものであり、経皮、経粘膜または局所的に投与される使用。
【請求項２】
前記組成物のｐＨが６．５から７．０である請求項１記載の使用。
【請求項３】
皮膚の炎症症状、または口腔、眼または生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状が、乾癬、急性または慢性皮膚炎、歯周炎、結膜炎および膣炎からなる群より選択される請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
薬学的に許容し得る緩衝薬剤と組み合わせて、活性薬剤として細胞の細胞質を酸性化できる薬学的に許容し得る薬剤またはその塩を含む医薬組成物であって、該組成物のｐＨが６．１から７．０の範囲であり、かつ該薬剤がシス−ウロカニン酸であり、皮膚の炎症症状、または口腔、眼または生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状の治療または予防用であって、経皮、経粘膜および局所的に投与される医薬組成物。
【請求項５】
ｐＨが６．５から７．０の範囲である請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
皮膚の炎症症状、または口腔、眼または生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状が、乾癬、急性または慢性皮膚炎、歯周炎、結膜炎および膣炎からなる群より選択される請求項４または５記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトまたは動物において、細胞の細胞質を酸性化させ、そして続いて免疫抑制を引き起こすための薬学上許容し得る薬剤の使用に、および免疫抑制によって治療可能な疾患または障害の治療または予防に関する。
【０００２】
本発明は、ヒトまたは動物において、細胞の細胞質を酸性化させ、そして続いて免疫抑制を引き起こすことのできる薬学上許容し得る薬剤を包含する新規医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景を示すために本明細書において使用される刊行物および他の材料、および特に、実施に関するさらなる詳細を提供する事例は、参考文献により組込まれる。
【０００４】
皮膚におけるＵＶ照射の作用の様式は、光免疫学における主要な難問である。動物およびヒトにおける研究は、ＵＶ露光が、局所および全身の免疫学的反応の鈍さと寛容性の両方を生じさせることを確立した（Schwarz 1999年）。紫外線Ｂ（ＵＶＢ）波長（２８０〜３１５ｎｍ）は、ＵＶ照射の免疫抑制活性のほとんどを占めることが見い出された。表皮でのＵＶＢ光子の直接吸収を担う薬剤には、ウロカニン酸（ＵＣＡ）およびＤＮＡがある。皮膚の角質層でのヒスチジンの酵素的脱アミノ化により合成される内因性トランス−ＵＣＡは、ＵＶＢ照射にさらすことによりシス−ＵＣＡに直接的に光異性化される。インビトロおよびインビボの両方で、ＵＣＡの光異性化は、ＵＶＢで誘発される免疫抑制において役割を果たすことがよく示された。例えば、ＵＶＢ照射により誘発される全身性抑制は、マウスにおいて抗−シス−ＵＣＡ抗体により大部分をくつがえすことができる（Moodycliffe 1996年）。さらに、いくつかの動物モデルではシス−ＵＣＡの局所または全身投与は、ＵＶＢ処置と類似の免疫抑制効果を生じる（Gruner、1992年；el-Ghorr、1997年；Garssen、1999年、Wille 1999年）。いくつかの実験は、ＵＣＡが、抗原提示（Beissert 1997年、Holan 1998年）、ＮＫ−細胞の細胞毒性（Gilmour 1993年、Uksila 1994年）、脾臓細胞によるサイトカイン産生（Holan 1998年）、マスト細胞の脱顆粒化（Wille 1999年）および好中球の活性化（Kivistoe 1996年）のような、インビトロでの免疫系の単離細胞における特定の機能を調節する能力があることを示した。
【０００５】
インビボおよびインビトロのいずれの研究も、どの免疫細胞が、実際にＵＶＢ露出後にＵＣＡと相互作用するか、およびどの機序により、この分子が、分子レベルでの標的細胞の機能に影響を及ぼすかということをまだ明確にしていない。だれもが、ＵＣＡは、細胞表面受容体に結合し、そしてシグナリングカスケードを開始させる可溶性媒体であることを予測するであろう。しかし、ＵＣＡの推定受容体については、ほとんど知られていない。それは、ヒスタミンＨ1およびＨ2受容体アンタゴニストがシス−ＵＣＡで誘発される免疫抑制を部分的に遮断する（Hart 1997年）ため、ヒスタミン作動性系といくつかの共通の特性を共有する可能性がある。他方ではシス−ＵＣＡが、ヒスタミン受容体に直接的に結合しないことが示された（Laihia、1998年）。最近、代替研究は、ＵＣＡが、ＧＡＢＡ受容体に作用する可能性があることは示したが、しかしこの受容体に結合するＵＣＡの直接的証拠は、いずれにも示されなかった（Laihia、1998年；Uusi-Oukari、2000年）。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の発明者らは、これまで未知のシス−ウロカニン酸の作用機序を示した。彼らは、驚くべきことに、シス−ウロカニン酸が、サイトゾルでプロトンを放出することができる形態で細胞サイトゾルに移動し、続いて、細胞質を酸性化させ、そしてその結果、免疫抑制薬剤として作用することを示した。
【０００７】
したがって、第一の態様によって、本発明は、細胞の細胞質を酸性化できる薬学的に許容し得る薬剤もしくはその塩の、ヒトまたは動物において免疫抑制を引き起こすために有用な医薬組成物の製造のための使用であって、有効量の該薬剤がヒトまたは動物に本質的に非解離型で投与され、該薬剤が組成物のｐＨを６．１から７．０の範囲に調整する担体と混合される使用に関する。
【０００８】
別の態様によって、本発明は、薬学上許容し得る担体と組み合わせて、活性物質として細胞の細胞質を酸性化することができる薬学上許容し得る薬剤またはその塩を包含するものであって、その担体が、細胞外のｐＨで薬剤が解離するのを基本的に防止し、そしてその担体は、６．１から７．０までのｐＨ範囲に、組成物のｐＨを維持することができる医薬組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
好ましい実施態様により、薬学上許容し得る薬剤は、６．７から７．４までの範囲で、好ましくは６．９から７．３までの範囲で、最も好ましくは約７．０のその解離定数を有する酸である。
【００１０】
酸は、好ましくは、シス−ウロカニン酸またはその塩であるが、しかし、それらに限定されるものではない。上に定義される範囲でその解離定数を有し、そして細胞内側に蓄積することができるあらゆる他の薬学上許容し得る非毒性の薬剤が有用である。このような薬剤は、無機または有機酸、好ましくはシス−ウロカニン酸のような、飽和、またはさらに好ましくは不飽和カルボン酸部分が結合した複素環を有する有機酸であり得る。例えば、複素環基は、イミダゾール（シス−ウロカニン酸に関しては）または細胞質ｐＨでプロトンを供与し、そしてそれにより細胞質を酸性化する能力を有するあらゆる他の複素環または多複素環基であり得る。他の適切な複素環基の例としては、チアゾール、チオフェン、フラン、オキサゾール、チアゾール、テトラゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジンおよびトリアジンが言及され得る。
【００１１】
薬学上許容し得る薬剤は、１つの単独の成分、またはより好ましくは２つまたはそれより多くの成分の混合物であり得る担体と混合される。成分の内の１つは、適切には、組成物のｐＨを所望の値に調節する緩衝薬剤である。
【００１２】
特に、シス−ウロカニン酸が活性薬剤である場合、組成物のｐＨを、６．５から７．０まで、好ましくは６．７から７．０までに調節することが好ましい。このｐＨ範囲内では、シス−ウロカニン酸は、なお非解離である一方で、トランス−ウロカニン酸は、完全に解離される。したがって、このような組成物は、シス−ウロカニン酸に関して特異的である。
【００１３】
ｐＨを６．５〜７．０に調節する適切な緩衝薬剤の例としては、５５ｍＭ塩化ナトリウムを補足した５０ｍＭリン酸ナトリウム、１２０ｍＭ塩化ナトリウムを補足した５０ｍＭクエン酸ナトリウム、および１３３ｍＭ塩化ナトリウムを補足した１０ｍＭピペス（Pipes）が言及され得る。
【００１４】
本発明による方法および組成物は、免疫抑制が増大されることにより治療可能なあらゆる疾患または障害の治療または予防に有用である。本明細書で使用される用語「免疫抑制」は、免疫反応の望ましくない有害な影響を防止する手段での免疫系の細胞の活性および機能に影響を及ぼすことによる体の免疫系の調節、特に下方調節に該当する。本発明の方法および組成物の標的細胞の例は、顆粒球（好中球、エオシン好酸球、好塩基球）、ＮＫ細胞、Ｔ−およびＢ−リンパ球、単核細胞、マクロファージ、マスト細胞、および樹状細胞のような抗原提示細胞、およびそれらの前駆細胞および特異的機能性および表現型サブセットである。最も好ましくは、本発明の方法および組成物の標的細胞は、好中球およびＮＫ細胞のような生来の免疫系細胞である。
【００１５】
その免疫系の細胞の適切な機能は、生活環境で見られる、侵入病原体、寄生虫および物理的有害物質（例えば、吸入された顕微鏡下の粒子）にさえ対する宿主の生存に必須であることが十分に確立される。正常には、免疫細胞は、充分に編成された方法で、局所的に感染性／損傷を加える薬剤を認識し、単離し、そして排除する。この目的のために、免疫細胞は、種々の生化学反応機構を装備し、そしてそれは、感染性攻撃のあいだじゅう活性になる。例えば、好中球性白血球、好中球は、非常に特異的な酵素複合体ＮＡＤＰＨオキシダーゼ系を含有し、そしてそれは、細胞活性化に標的にされたときに、多量の毒性酸素代謝産物を発生でき、そして生物学的材料に対して多数の損傷影響を発揮でき、そして他の細胞型についての前炎症性シグナルとしても作用し得る。一般に、白血球活性化は、宿主の免疫応答の必須部分であり、そして感染性襲撃の解決を促進し、そして治癒過程を開始する局所炎症性反応にいたる。しかし、正常な宿主組織が、外来または損傷を受けた構造として、またはある種の病理学的状態に関連した宿主の免疫系の過剰活性化により不適切に識別される場合、正常な組織は、宿主それ自身に対するそれらの完全破壊能力を引き出す免疫細胞によって攻撃される。このような状態の例として、局所および全身性炎症性疾患、自己免疫疾患およびアレルギー症状のような群の症状が言及され得る。特異的疾患または障害の例としては、接触過敏症または遅延型過敏症のような過敏反応が言及され得る。好ましくは、本発明の方法および組成物により治療または予防され得る症状は、好ましい標的細胞の活性化を伴う局所または全身性炎症反応（乾癬、急性または慢性皮膚炎などの皮膚の炎症症状；歯周炎、結膜炎、膣炎のような口腔、眼および生殖器の粘膜または結合組織の炎症症状；乳腺炎などの乳腺の炎症症状など）；または脈管炎、急性移植拒絶反応、慢性閉塞性肺疾患、喘息、再灌流傷害、および敗血症関連組織損傷のような疾患の病因または進行において認識された炎症性成分を明示するあらゆる他の局所または全身症状である。しかし、本発明により治療または防止され得る症状は、前述の例に制限されない。
【００１６】
本発明の目的のために、薬学上許容し得る薬剤は、全身または局所のいずれかで、種々の経路によって投与することができる。適切な投与形態としては、例えば、経口処方；静脈内、筋肉内、皮内および皮下注射などの非経口注射；および粘膜、局所、経皮、吸入、鼻内または直腸処方が挙げられる。特に適切な処方は、軟膏、ゲル、クリーム、ペースト、溶液、懸濁液、ローションおよび乳液の形態での局所処方などの局所的送達のための処方である。
【００１７】
薬学上許容し得る薬剤の必要用量は、治療される特定の症状、症状の重篤度、治療の期間、投与経路および使用される特定の化合物によりで変化するであろう。局所処方において、薬学上許容し得る酸の量は、典型的には０．０１から５０％までの範囲、好ましくは０．１から１０％までの範囲にあり得る。
【００１８】
本発明は、以下の実験の部において詳細に説明される。
【００１９】
実験の部
本研究の目的は、モデル細胞であるヒト抹消血好中球において放射性標識ＵＣＡの結合を調査することである。この細胞はＵＣＡによって影響を及ぼされることが示されている（Kivisto 1996年）。典型的なリガンド−受容体相互作用を示すことができる代わりに、我々は、ＵＣＡが、例外的な結合特性を有し、そしてそれは、無傷のＵＣＡをサイトゾルに迅速にそして不可逆的に蓄積させることを見出した。ウロカニン酸は、哺乳類の皮膚におけるでＵＶ照射−吸収物質である。シス−ＵＣＡは、インビボで動物モデルでの免疫抑制物質であるが、しかし標的細胞の種類および作用の様式は、はっきりしないままである。我々は、その機能がＵＣＡによって影響を及ぼされることが知られており、そして炎症反応で主要な役割を果たすことが知られている免疫細胞型である、生きているヒトの多形核好中球でのＵＣＡの結合および作用の部位を調査した。我々は、サイトゾルで集中するほぼ９５％の細胞結合分画で、予想外に高いインキュベーション濃度（≧３０ｍＭ）までの放射性標識シス−およびトランス−ＵＣＡの線状の濃度依存性蓄積を観察した。異性体は、サイトゾル中で未結合および非代謝形態であるように見えるので、我々は、ＵＣＡが、従来の受容体／タンパク質−リガンド相互作用と異なる機序を通して作用し得るかどうか疑問を持った。その異性体は、細胞内ｐＨに影響を及ぼした。ＦＡＣＳ分析は、細胞外ｐＨ６．５でシス−ＵＣＡによる好中球の細胞内区分の酸性化が、トランス−ＵＣＡ（ｐ＝０．０００３１）によるより明らかに大きかったのに対して、異性体は、中性より上のｐＨで酸性化しなかったことを示した。ｐＨ６．５での同じ条件でシス−ＵＣＡは、トランス−ＵＣＡ（ｐ＝０．０２３）より多くの好中球の呼吸バースト活性を阻害した。この型の立体特異性は、２つの異性体の異なったｐＫa値によって表現することができ、そして我々は、細胞内酸性化を通してシス−ＵＣＡ作用についてのモデルを提案する。我々は、シス−ＵＣＡが、細胞外ｐＨ６．１〜７．０枠での細胞内酸性化を通して好中球の活性化および機能を阻害することによって、生来の免疫性を抑制する可能性があると結論する。
【００２０】
方法
ウロカニン酸および［14Ｃ］標識異性体の合成
トランス−ウロカニン酸（トランス−ＵＣＡ、３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−２−プロペン酸）を、シグマ（Sigma）（米国ミズーリ州セントルイス（St.Louis,MO,USA））から購入した。シス−ＵＣＡを、ＵＶ光異性化を用いてトランス−ＵＣＡから製造した（下記参照）。ＵＣＡ異性体の化学的純度は、高圧液体クロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）によって９９．７％より上であった。
【００２１】
［14Ｃ］放射性標識トランス−およびシス−ＵＣＡの合成は、図１に概説される。我々は、いくつかの修正を伴ってGriffithら（1983年）の手法を利用して、液体アンモニア中で酢酸ホルムアミジン（１）およびジヒドロキシアセトン（２）を縮合させて、（３）を得ることによって、［14Ｃ］トランス−ＵＣＡ（６）の合成を開始した。遊離塩基（４）への（３）の中和の後、それを、４−イミダゾールカルボアルデヒド（５）に酸化させた（Lindgrenら、1980年）。Morrisonら（Mohammad 1991年）の改良法を使用して、ノエベナゲル条件下で、［２−14Ｃ］マロン酸（アマシャム・ファルマシア（Amersham Pharmacia）、英国リトル・シャールフォント（Little Chalfont,UK））と（５）の縮合は、トランス−ＵＣＡ（６）をもたらした。化合物（６）（１３８ｍｇ、１ミリモル）を、水（５００ｍｌ）に溶解させた。溶液は、固形水酸化カリウムでｐＨ９にされ、そしてその後、４時間、１０℃で、窒素雰囲気下で照射された。ハナウ（Hanau）のクウォーツ水銀高圧ランプ（５００Ｗ、２７０−３５０ｎｍ、溶媒として水）を備えたノルマグ（Normag）の下降フィルム光反応器で、光異性化を行った。得られた混合物（ＨＰＬＣによりトランス／シス約３０／７０）を、乾固するまで蒸散させ、そして残渣を、１２．５ｍＭ酢酸に溶解させた。この溶液を、ｐＨ９に調整し、そして継続溶離液として１２．５ｍＭ（５００ｍｌ）、２５ｍＭ（５００ｍｌ）および１００ｍＭ（１０００ｍｌ）酢酸を使用したイオン交換カラム（２５×２．３ｃｍ、２００〜４００メッシュ、酢酸塩形、バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１−×８）上でクロマトグラフィーにかけた。シス−ＵＣＡは、約１１００ｍｌの後に現れ、そしてトランス−ＵＣＡは、主に１３００ｍｌ溶離液体積の後に現れた。分画からの溶媒の除去、続いてジエチルエーテルで洗浄し、そして五酸化リン上で６５℃真空で乾燥させて、純粋［14Ｃ］トランス−および［14Ｃ］シス−異性体（６）および（７）を得た。前工程からの（６）の収量は、３５ｍｇ（２５％）、融点２２６℃であった。ＨＰＬＣ（下を参照）による生成物（６）の化学的純度は、９９．８％より上であり、そして特異的活性は、２．２ｍＣｉ／ミリモルであった。（７）の対応収量は、８５ｍｇ（５８％）、融点１７６〜１７８℃であった。ＨＰＬＣ分析は、材料が５．８Ｃｉ／ミリモルの特異的活性を有し、９９．５％より大きな化学的純度であることを示した。実験で使用される場合、放射性標識および非標識シス−およびトランス−異性体を、それぞれ、１００ｍＭおよび３０ｍＭ濃度まで、インキュベーション緩衝液中に直接溶解させた。トランス−ＵＣＡの解離は、必要な場合、水浴中で穏やかな加温により促進した。
【００２２】
ＵＣＡのＨＰＬＣ分析
アミノプロピル固定相カラム・リクロソルブ（Lichrosorb）ＮＨ2、ハイバー（Hibar）ＲＴ、２５０×４ｍｍ、５μｍ（メルク、ドイツ  ダームスダット（Darmstadt））を使用した。溶離液は、アセトニトリルと２％（ｖ／ｖ）酢酸および０．５％（ｗ／ｖ）酢酸アンモニウムの水溶液との５０％（ｖ／ｖ）混合物であった。異性体は、２６８ｎｍで検出され、そして滞留時間は、Ｔr（シス）３．７分およびＴr（トランス）５．４分であった。
【００２３】
シンチレーション計数
試料を、オプチフェーズＨｉＳａｆｅ２シンチレーション液（ＥＧ＆Ｇ  ワラック、フィンランド  ツルク（Turku））と混合し、そして［14Ｃ］ＵＣＡ放射性活性を、ラックベータ１２１４シンチレーションカウンター（ＥＧ＆Ｇ  ワラック）で測定した。計数効率は、９６．７％±０．１２％（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４８）であった。
【００２４】
好中球の精製
末梢血好中球を、健全な提供者のヘパリン化血または軟膜から単離した。赤血球を、６％デキストランＴ−５００（ファルマシア、スウェーデン）で沈殿させた。好中球を、フィコール−ハイパーク（Ficoll-Hypaque）（ファルマシア）での遠心分離により白血球に富むデキストラン血漿から分離し、残りの赤血球の低張溶解により精製し、そしてＣａ−およびＭｇ−不含ＨＢＳＳで洗浄した。細胞内ｐＨ実験のために、好中球を、赤血球溶解なしに調製した。細胞、媒体および遠心分離機を、温度変動を避けるために、細胞調製のあいだ室温に保持させた。フローサイトメトリー分析により、９９．６％の分離好中球は、ＣＤ１１ｂ+／ＣＤ３５+、９８％ＣＤ４５+、９８％ＣＤ６２Ｌ+／ＣＤ３２+、２．０％ＨＬＡ−ＤＲ+、２．１％ＣＤ３+、１．０％ＣＤ８+、１．２％ＣＤ４+、および０．８％ＣＤ１４+細胞であった。
【００２５】
呼吸バースト活性の分析
呼吸バースト活性は、好中球機能の尺度として使用された。ＵＣＡ異性体は、記述されるとおり（Kivistoら、1996年）オプソニン化チモサンを用いた化学ルミネセンスアッセイで試験した。ピーク値を記録した。
【００２６】
全細胞結合アッセイ
単離好中球を、２〜１０×１０6細胞／ｍｌで、ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。［14Ｃ］シス−または［14Ｃ］トランス−ＵＣＡ保存溶液を添加して、０．１μＭ〜３０ｍＭまでの濃度範囲を生じ、そして二重に、管を、３０分間、４℃で（または２５℃および３７℃で）インキュベートした。その後、細胞を、氷冷ＨＢＳＳで１回洗浄し、そして液体シンチレーション容器に移した。各標準濃度から得たサンプルを測定することによって、インキュベーション管中の総［14Ｃ］ＵＣＡ活性を測定し、そしてブランクのシンチレーション値を、データ分析の前に差し引いた。洗浄工程において同じ緩衝液を使用して、示されるとおり、５０ｍＭクエン酸ナトリウム／１２０ｍＭ  ＮａＣｌ緩衝液で、いくつかの結合実験を行なった。
【００２７】
好中球サイトゾルおよび膜分画の調製
膜、サイトゾルおよび核内での細胞結合ＵＣＡの局在化を、前記のとおり［14Ｃ］シス−ＵＣＡとの全細胞のインキュベーションの後に調べた。ＨＢＳＳを用いた洗浄の後、細胞を、１０ｍＭピペス、１０ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2（ｐＨ７．０）を含有する氷冷溶解緩衝液（プロティナーゼ阻害剤として０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μＭロイペプチンおよび１０μＭペプスタチンＡ（全て、シグマから）を補足）中に懸濁させた（２００×１０6細胞／ｍｌ）。細胞膜を、氷上での超音波処理により破壊した。溶解液を、遠心分離（８００×ｇ、２５℃、１０分）し、そして後期核上清を、溶解緩衝液中のショ糖の不連続クッションに積層させた。超遠心分離（１２００００×ｇ、４℃、４５分）の後、注意深いピペット採取により、サイトゾル、膜、および核／残骸分画を回収し、そして［14Ｃ］活性を測定した。
【００２８】
好中球サイトゾルのゲル濾過
サイトゾルタンパク質の巨大分画のために、試料（０．５〜２．５ｍｌ）を、４℃で、平衡セファクリルＳ−２００ゲル濾過（ファルマシア）カラムにかけ、そしてタンパク質を、約０．６ｍｌ／分の流速で、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で溶出させた。タンパク質の溶出を、２５４ｎｍでのフロースルーＵＶモニターおよび電位差記録装置を用いて追跡した。典型的な作業は、３０の６ｍｌ分画から構成され、そしてほとんど６時間続いた。様々な分子量のタンパク質の溶出体積を、標準タンパク質と０．６〜２０００ｋＤａのサイズのペプチドとのカクテルを用いて測定した。
【００２９】
タンパク質濃度アッセイ
標準として仔ウシアルブミンを使用したバイオ−ラッド（ドイツ、ミュンヘン）タンパク質アッセイで、タンパク質濃度を測定した。
【００３０】
細胞内ｐＨの観察
好中球における細胞内ｐＨレベルを、ｐＨ感受性蛍光染料２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ、アセトキシメチルエステル；モレキュラー・プローブス、オランダ、ライデン）を利用したフローサイトメトリーで観察した。約３０×１０6細胞を、３０分間、２５℃で０．３５μＭ  ＢＣＥＣＦを含有する１０ｍｌ  ＨＢＳＳ（ｐＨ７．４）中でインキュベートし、ＨＢＳＳで２回洗浄し、そして１ｍｌの１５４ｍＭ  ＮａＣｌ中に再懸濁させた。既知ＵＣＡ濃度および照合されたｐＨを示す適量（２３５μｌ）のインキュベ−ション培地を、ポリスチレン管中で細胞（４．５×１０5細胞／１５μｌ  ＮａＣｌ）に適用し、約２０分間、２５℃でインキュベートし、そしてフローサイトメトリーで分析した。
【００３１】
細胞内ｐＨの検量を、Ｋ+／Ｈ+イオン透過担体ナイジェリシンを使用してインサイチュで行なった。過剰のｐＨ検量緩衝液（１０ｍＭピペス、１３１ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨを、６．１０、６．５０、６．８０、７．１０、７．４０および７．６０または７．７０に調整した）および１０μＭナイジェリシンを、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ中のＢＣＥＣＦ標識細胞に添加した。細胞を、室温に保持し、そして４５分以内にフローサイトメトリーによって分析した。ＵＣＡと共に、またはＵＣＡなしにインキュベートした細胞を、同時に、細胞内ｐＨについて分析した。検量緩衝液中のものと同じ値にｐＨを調整した。細胞内ｐＨは、ＢＣＥＣＦ蛍光強度検量曲線から決定した。
【００３２】
統計的分析
結果は、平均±ＳＥＭとして表した。結合研究および機能性試験でのデータの統計学的有意性は、二方向スチューデントｔ検定で計算した。パーソンの相関係数を、細胞試料のＨＰＬＣおよびシンチレーション計数により検出されるＵＣＡ異性体濃度について測定した。相関関係についてのｐ値は、フィッシャーのＺトランスフォーメーションの後測定した。
【００３３】
結果
好中球サイトゾルでのＵＣＡ蓄積物
単離ヒト末梢血好中球に対するＵＣＡの結合を試験するために、放射性活性［14Ｃ］標識ＵＣＡ異性体を合成した。３０分間、４℃で、ＨＢＳＳ中でＵＣＡとインキュベートした細胞は、１００ｎＭから３０ｍＭまでの試験濃度範囲にわたって、線状の用量依存様式で両方の異性体を取込んだ（図２）。全結合の比率は、シス−ＵＣＡについて４．５％±１．１％（範囲２．９〜６．６％）、そしてトランス−ＵＣＡについて７．１％±３．２％（範囲３．７〜１７％）であった（両方の異性体について二重に、ｎ＝１２の測定値）。この取込の興味深い特性は、我々が、従来のリガンド−受容体結合で予測するような、［14Ｃ］ＵＣＡ放射性標識の非標識（「冷」）ＵＣＡによる置換を示すことができなかったことであった（図３）。サイトゾル、細胞膜および核区画中の細胞−結合ＵＣＡの分布を調査するために、細胞を、最初に上のとおり放射性標識ＵＣＡとインキュベートし、そしてその後、それらを溶解させ、そして１２０．０００×ｇショ糖クッション上に分画した。超遠心分離管中の内容物を、サイトゾル、膜および核分画に分けた。各分画の体積を正確に測定した。その後、適量の分画での［14Ｃ］ＵＣＡ活性を測定し、そして総ＵＣＡ含有量を、各分画について計算した。独立のインキュベーション実験（ｎ＝４）は、好中球取込シス−ＵＣＡの９２．０％±２．２％が、サイトゾルで回収されたことを示した（図４Ａ）。膜に対する結合（平均２．７％±１．８％）は、サイトゾルで見られたもの（ｐ＝３．７×１０-5）より明らかに低かった。残りの細胞結合シス−ＵＣＡ（５．３％±２．ｌ％）は、細胞溶解液の核（およびおそらく非溶解細胞）分画で検出された（図４Ａ）。
【００３４】
ＵＣＡは、サイトゾルタンパク質に結合されない。
細胞中に取込まれたＵＣＡのほとんどが、サイトゾルで見られたので、我々は、サイトゾルＵＣＡが、好中球サイトゾルの分子成分に結合されたかどうかを決定した。［14Ｃ］ＵＣＡ前インキュベートした細胞のサイトゾルを、ショ糖超遠心分離で分離し、そしてＳ−２００ゲル濾過カラムにかけた。その後、サイトゾル分画を収集し、そして放射活性を、各分画で測定した。図５Ａおよび５Ｂで示されるとおり、［14Ｃ］活性は、検出可能なタンパク質を含まない低分子量分画で見られた。この溶出パタ−ンは、［14Ｃ］シス−ＵＣＡ単独が、ゲル濾過カラムにかけられる経路と一致し（図５Ｃ）、そしてＵＣＡが、好中球サイトゾルでのいずれの主要な溶解性タンパク質分画にも結合されないことを示唆した。
【００３５】
別の溶解後標識試験は、［14Ｃ］ＵＣＡ前インキュベートされた細胞を用いた実験から得られる結果を立証するために行われた。この試験では、非標識好中球サイトゾルを、記述どおりに分離し、そしてその後、適量のサイトゾルを、氷上で、一晩、５ｍＭシス−またはトランス−［14Ｃ］ＵＣＡとインキュベートした。その後、サイトゾルを、Ｓ−２００で分画した。タンパク質関連［14Ｃ］ＵＣＡ活性は観察されず、そして溶解前インキュベーションに類似の溶出プロファイルを記録した。したがって、好中球サイトゾル中の主要な溶解性タンパク質分画は、細胞溶解の前後で、蓄積ＵＣＡを結合することができないということが示された。
【００３６】
ＵＣＡは、好中球サイトゾルにおいて無傷なままである。
次に、我々は、サイトゾル中の［14Ｃ］ＵＣＡが、放射性活性標識のどれくらいが無傷のＵＣＡと結合したかを測定することによって、取込後に好中球によって代謝されたかどうかを試験した。これは、氷上で、一晩、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて［14Ｃ］ＵＣＡ標識好中球のサイトゾルタンパク質を沈殿させることによって行われた。その後、放射活性標識の量を、シンチレーション計数により、沈殿およびタンパク質不含上清の両方で測定し、そして上清中の無傷のＵＣＡの含有量を、ＨＰＬＣによって測定した。全［14Ｃ］ＵＣＡ活性は、上清で見られ、そしてＴＣＡの添加の直後、およびタンパク質沈殿物を沈降させた後のサイトゾル中の放射活性を比較した場合、回収はシス−ＵＣＡについては１０２％±３．９％（ｎ＝９）であり、トランス−ＵＣＡについては１００．２％±０．９％（ｎ＝４）であった。タンパク質ペレットでは、放射活性は見られなかった。さらに重要には、無傷のシス−およびトランス−ＵＣＡのクロマトグラフィーで測定した濃度は、同じ試料中のシンチレーション計数によって達成された濃度と相関関係があり（図６）、ＵＣＡ異性体は、好中球サイトゾルにおいて代謝されなかったことを示した。ＵＣＡ異性体で前処理されなかった細胞では、ＨＰＬＣ分析によって内因性ＵＣＡは見られなかった（データは示されず）。
【００３７】
ＵＣＡは、細胞外および細胞内ｐＨを低下させる。
これまでに報告された結果は、典型的な細胞表層受容体アゴニストのような挙動をする代わりに、ＵＣＡは、好中球の内側に高濃度で蓄積し、そこで、ＵＣＡは溶解性の細胞内タンパク質に結合したりも、明らかな代謝にかけたりもしないことを示す。それ自体、ＵＣＡは、細胞に入り、そしてサイトゾルの物理−化学的微小環境（ｐＨ、イオン能力、イオン強度）を改変することによって細胞機能を調節する小イオン（例えば、Ｋ+、Ｎａ+、Ｈ+、Ｃｌ-）に類似する。したがって、我々は、高レベルの無傷のＵＣＡが、酸としてのサイトゾルにおけるその受動的存在により簡単に細胞変化をし得ることを仮定した。ｐＫaが、トランス−ＵＣＡ（Robertsら、1982年、KrienおよびKermici 2000年）については４．０および６．１、そしてシス−ＵＣＡ（Robertsら、1982年）については３．３および７．０の周辺であるので、１つの可能性のある作用の態様は、生理学的ｐＨでのサイトゾルの酸性化であり得る。最初に緩衝溶液で、そしてその後無傷の細胞で、ｐＨにおけるＵＣＡの効果を試験することによってそのような可能性が近づいた。異性体は、１ｍＭより上の濃度で、用量依存的様式で、標準ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）においてｐＨを低下させた（図７Ａ）。ＵＣＡ異性体を、ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に添加したとき、１ｍＭより上の濃度が、再度、用量依存的にｐＨを下降させた（図７Ｂ）。興味深いことに、ＨＢＳＳ緩衝溶液のｐＨを、ＵＣＡ添加前に６．５に、すなわちシス−ＵＣＡの第二のｐＫaより下に調整した場合、トランス−ＵＣＡのみが、ｐＨを際立って減じることができ（図７Ｂ）、シス−ＵＣＡが、このｐＨで部分的に脱プロトン化されるのみであることを示唆した。
【００３８】
細胞内ｐＨに対するＵＣＡの効果を試験するために、好中球に、蛍光ｐＨ指標染料ＢＣＥＣＦを加え、そしてＵＣＡ処理細胞の蛍光を、ＦＡＣＳで測定した。上のデ−タが示すとおり、ＵＣＡそれ自身は、異性体およびその溶液の初期ｐＨに依存して、試験溶液のｐＨを低下させることができる。他方では、細胞内ｐＨが、環境のｐＨによって影響を受けることが充分に知られている。したがって、ＵＣＡ添加による試験溶液の酸性化が、細胞内のＢＣＥＣＦ蛍光に影響を及ぼす可能性がある人工産物（artefact）を避けるために、我々は、ＵＣＡの添加後、試験溶液のｐＨを、当初のｐＨに戻して調整した。これらのｐＨ制御条件下で、３ｍＭトランス−およびシス−ＵＣＡは、ｐＨ７．４で、細胞内ＢＣＥＣＦ信号に対する明らかな影響を示さなかった（図８Ａ、下部棒線）。対照的に、ｐＨが、６．５に調整された場合、シス−ＵＣＡは、サイトゾル酸性化の指標として蛍光信号で、１５％±４．０％まで明らかな減少を引き起こした（ｐ＝０．０２２、ｎ＝４、対のｔ検定（paired t test））（図８Ａ、上部棒線）。図８は、細胞のＢＣＥＣＦ信号および呼吸バースト活性を同時に測定する３つの独立した実験から得られるデ−タを示す（以下参照）。第四の実験は、細胞内ＢＣＥＣＦ蛍光測定のみについて行なわれた。さらに、トランス−ＵＣＡは、ｐＨ６．５で９．４％±４．１％まで明らかに蛍光信号を減少させた（ｐ＝０．０３２、ｎ＝４）が、しかしその効果は、ほとんど伝えられなかった。しかし、３ｍＭシス−ＵＣＡとトランス−ＵＣＡのあいだの対応のＢＣＥＣＦ蛍光減少の違いは、非常に際立っていた（ｐ＝０．０００３１、ｎ＝４）（図８Ａ、上部棒線）。
【００３９】
サイトゾルを酸性化するシス−ＵＣＡの能力のさらに特定の調査を達成するために、正確な細胞内ｐＨを、Ｋ+／Ｈ+イオン透過担体ナイジェリシンの使用により測定した。６．１〜７．７の範囲のいくつかのｐＨの緩衝溶液中でのＵＣＡとの好中球のインキュベーションは、３ｍＭシス−ＵＣＡが、ｐＨ７より下では用量−および細胞外ｐＨ−依存的様式で、細胞内ｐＨを低下させるのに対して、トランス−ＵＣＡは、些細な効果のみを示すことを示した（図９）。０．３ｍＭ濃度のシス−ＵＣＡは、同じｐＨ範囲で非常に小さな効果を示した（示されなかった）。
【００４０】
ＵＣＡは、立体特異的に、そしてｐＨ依存的に好中球の呼吸バーストを阻害する。
上に示されるデータは、僅かに酸性の環境でシス−ＵＣＡのみが、サイトゾルｐＨを際立って減少させるとができるのに対して、生理学的ｐＨでは、トランス−も、シス−異性体もなんらの影響を示さなかったことを示唆する。どのようにＵＣＡのサイトゾル酸性化効果が、先に報告された好中球呼吸バースト活性の阻害と相関関係にあるかを試験するために、我々は、好中球の同じバッチにより、そして上に記述されたのと同じ実験条件下で、すなわち、試験溶液のｐＨが、ＵＣＡ添加の後にそれの当初のレベルに戻して調整される場合、オプソニン化チモサムで誘導される化学ルミネセンスに対する３ｍＭ  ＵＣＡの影響を測定した。図８Ｂに示されるとおり、トランス−ＵＣＡは、ｐＨ７．４で化学ルミネセンスに影響を示さなかったのに対して、１４％±４．０％（ｎ＝３）の阻害が、ｐＨ６．５で観察された。同じ条件下でシス−ＵＣＡは、それぞれ、１５％±８．４％および４４％±１．３％まで呼吸バースト活性を抑制した。興味深いことには、試験溶液のｐＨが、ＵＣＡ補足後、調整されないままであった場合、トランス−ＵＣＡは、それぞれ、ｐＨ６．２２±０．０２（名目上ｐＨ７．４）および５．８７±０．０６（名目上ｐＨ６．５）で、３１％±８．４％および４８％±４．０％まで化学ルミネセンスを阻害した。シス−ＵＣＡについての対応の阻害は、ｐＨ６．６０±０．０２（名目上ｐＨ７．４）で、４１％±１０％、そしてｐＨ６．３３±０．０７（名目上ｐＨ６．５）で、４８％±１．６％であった。
【００４１】
得られた呼吸バースト応答データを、インキュベーション培地中の測定されたｐＨに対してプロットした場合、細胞外ｐＨを低下させることが、３ｍＭ  ＵＣＡの存在下で呼吸バースト活性を抑制することは明らかである（図８Ｃ）。そのプロットは、シス−ＵＣＡが、トランス−ＵＣＡより細胞外ｐＨ範囲６．１〜７．０において細胞に対するより顕著な阻害活性を保有するのに対して、ｐＨ７より上では差異が見られないことも示す。呼吸バースト活性が、同じ細胞中の別個の細胞内ＢＣＥＣＦ蛍光の機能として計算される場合、呼吸バースト活性の抑制は、細胞外または細胞内酸性化のいずれかを通してＵＣＡ異性体により引き起こされる細胞内ｐＨの減少に関連することが観察され得る（図８Ｄ）。
【００４２】
結論
ＵＣＡは弱い有機酸であるので、細胞の内側のＵＣＡの蓄積が、サイトゾルのｐＨを調節し得る。しかし、これは、一般に、入ってくるＵＣＡ分子のプロトン化状態による。ＵＣＡは、２つのプロトン供与部分、カルボキシル基およびイミダゾール基を有する多塩基酸である。カルボキシル基のｐＫaは、トランス−ＵＣＡについては４．０で、そしてシス−ＵＣＡについては３．３であり（Roberts 1982年）、そしてそれから、特に全てのＵＣＡ分子が、ヘンダーソン−ヘーゼルバルチ方程式（Ｈ−Ｈ方程式）によって、４より上のｐＨでカルボキシル基で脱プロトン化されるという結果になる。したがって、生理学的ｐＨ範囲で、イミダゾリル基単独のプロトン化状態は、分子がプロトンを供与でき、そしてそれにより酸性化を促進するかどうかを決定する。トランス−ＵＣＡのイミダゾリルｐＫaは、６．１（Robertsら  1982年、KrienおよびKermici 2000年）であり、一方シス−ＵＣＡのｐＫaは、潜在的に、カルボキシル部分とイミダゾリル部分のあいだの分子内水素結合により生じるシス−異性体の安定化互変異性体形態により、明らかに高い７．０である（Roberts 1982年）。結局、ｐＨ７．０およびその上でのみ、シス−ＵＣＡのイミダゾリル基が、脱プロトン化を好むのに対して、トランス−ＵＣＡは、同じｐＨでほとんど完全に脱プロトン化される。本研究で、これは、ｐＨ６．５に調整されたＨＢＳＳ緩衝液中のトランス−ＵＣＡの添加がｐＨを下降させた一方で、シス−ＵＣＡは、ほとんど影響を示さなかった実験によって明瞭に示し得た。
【００４３】
生きている細胞におけるサイトゾルを酸性化するＵＣＡの能力が、２つの主要なパラメーターによることが推定され得る：細胞外空間のｐＨとサイトゾルの当初のｐＨ。ＵＣＡは、皮膚に主に見られるので、誰もが、生理学的環境の状況でこれらの２つのパラメーターを考慮するに違いない。ヒトの皮膚は、４〜６付近の表面ｐＨを示す酸マントルを有することがよく知られている。
【００４４】
角質層を、層ごとに切り離した場合、ｐＨは徐々に増大し、そして角質層の全除去の後、残りの表皮でのｐＨは、約６．９である（OehmanおよびVahlquist、1994年）。深部層では、内側の体のほぼ中性のｐＨが達成された。最近の分析は、ＵＣＡが、ヒトの角質層で主要なｐＨ調節因子であるという証拠を提供する（KrienおよびKermici 2000年）。ＵＣＡの大半は、角質層にある；しかし、シス−ＵＣＡレベルの上昇が、１〜４時間以内に尿で、続いて総体ＵＶＢ露出で検出されうる（Kamｍayerら、1997年）ので、明らかな量のＵＣＡが、（表）皮膚中に、およびそれを通しても明らかに拡散する。細胞内環境を考慮すると、休止中の好中球サイトゾルのｐＨは、７．０〜７．４、すなわちイミダゾリルｐＫaの上であり、そしてそれは、両方のＵＣＡ異性体が、好中球サイトゾル中で脱プロトン化状態で主に存在することを示唆する。イミダゾリルｐＫaより上の細胞外ｐＨ（トランス−ＵＣＡについては６．１、そしてシス−ＵＣＡについては７．０）では、ＵＣＡ分子の大半は、脱プロトン化形態にあり、そして、サイトゾルに入った後に明らかな酸性化は起こらない。対照的に、イミダゾリルｐＫaの値より下のｐＨでは、ＵＣＡは、主に、細胞参入時にサイトゾルの酸性化を促進する能力のあるプロトン化形態で存在するであろう。さらに、Ｈ−Ｈ方程式により、ＵＣＡ関連プロトンの量、したがってサイトゾルｐＨの減少は、サイトゾルおよび酸性の細胞外環境のあいだの膜間ｐＨ差異に直接比例することが、推測されうる。これらの仮説についての実験的支持を提供するために、我々は、ＵＣＡ処理細胞でのサイトゾルｐＨにおける変化を測定した。細胞外ｐＨが、インキュベーション混合物中で７．４に、すなわち、両方のＵＣＡ異性体のイミダソリル基のｐＫaの値より上に厳密に制御された場合、誰もが予想し得るとおり酸性化は観察されなかった。他方では、制御されたｐＨ６．５で、７．０のイミダゾリルｐＫaを有するシス−ＵＣＡは、サイトゾルｐＨを明らかに減少させた一方で、トランス−ＵＣＡ（ｐＫa６．１）は、些細な影響のみを示した。これは、Ｈ−Ｈ方程式を使用した計算から推定可能でもある：ｐＨ６．５で、シス−ＵＣＡの７０％を超えるものがプロトン化されおり、そしてトランス−ＵＣＡの７０％が脱プロトン化状態にある。理論上、細胞外ｐＨを６．１より下に低下させることは、我々に、サイトゾルｐＨでのトランス−ＵＣＡで誘発される低下を検出させたが、しかし、その限定された操作上のｐＨ範囲のために、ＢＣＥＣＦ染料を用いてこれを試験することが可能ではなかった。一緒に考慮して、表皮の上部の生存可能な層（upper viable layer）でのように僅かに酸性の環境で、シス−ＵＣＡは、事実上、サイトゾルｐＨを減少させるプロトンシャトルとして作用できることは明らかである。ＵＣＡのこの独特の特性は、トランスからシスへの光異性化によるＵＣＡの変化した空間構造に起因するイミダゾリルｐＫaのシフトから生ずる。
【００４５】
ＵＣＡ製剤が、本発明で提案されたｐＨ範囲で処方されるべきであると示唆する科学および特許文献における先のデータはない。Stabらによる米国特許第５，４９４，６７６号明細書には、１％トランス−ＵＣＡの光異性化反応が、ＵＶ光で照射する前にＮａＯＨでｐＨが６．９に調節された水溶液中で行なわれたことが記述された。等量のトランス−ＵＣＡおよびシス−ＵＣＡを含有するこの溶液は、その後、局所のＯ／Ｗクリーム処方を製造するために使用された。しかし、局所製剤のｐＨは、本発明の好ましいｐＨ範囲にｐＨ調節も、あるいはｐＨ緩衝化もなされなかった。
【００４６】
結論として、本研究は、初めて、インビボで免疫細胞におけるＵＣＡの立体特異的作用を説明し得るデータを示す。逆説的には、ＵＣＡによる細胞機能の調節は、直接的に立体異性化に依存するものではなく、むしろトランスからシス−ＵＣＡへの光変換の後に、分子の酸−塩基特性における微細であるが重要な変化にあるように見える。
【００４７】
本発明は、さらに、以下の限定されない実施例によって例示される。
【００４８】
本発明による処方の例
ゲル組成物１（％ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸                        ０．１〜１０
カルボポール９７４                        １．５
プロピレングリコール                      １２．５
緩衝剤                                    ０．０１〜１
精製水                                    残部
【００４９】
ゲル組成物２（％ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸                        ０．１〜１０
ナトロゾル（ヒドロキシエチルセルロース）  １．０
緩衝剤                                    ０．０１〜１
精製水                                    残部
【００５０】
クリーム組成物１（％ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸                        ０．１〜１０
プロピレングリコール                      ５０
セトステアリルアルコール                  １５
ラウリル硫酸ナトリウム                    １
緩衝剤                                    ０．０１〜１
精製水                                    残部
【００５１】
クリーム組成物２（％ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸                        ０．１〜１０
セトステアリルアルコール                  ６．７５
プロピレングリコール                      ４０
ラウリル硫酸ナトリウム                    ０．７５
ポロキサマー４０７                        １
鉱油                                      ５
線状ペトロラタム１２．                    ５
緩衝剤                                    ０．０１〜１
精製水                                    残部
【００５２】
軟膏組成物（％ｗ／ｗ）
シス−ウロカニン酸                        ０．１〜１０
鉱油                                      ５
緩衝剤                                    ０．０１〜１
ペトロラタム                              残部
【００５３】
本発明の方法は、多様な実施態様の形態で組込まれ、その少数のみが、本明細書に開示されることがよく理解される。他の実施態様が存在し、そして本発明の概念から逸脱しないことは、当業者にとって明らかである。したがって、記述された実施態様は、例示であって、そして限定的に見なされるべきでない。
【００５４】
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【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】［14Ｃ］放射線標識されたトランス−およびシス−ＵＣＡの化学合成についての略図である。
【図２】生きた好中球へのＵＣＡの蓄積を示す。データ点は、ブランク値を差し引いた後の二重の管（duplicate tubes）での平均±ＳＥＭを表す。細胞（７．０×１０6細胞／ｍｌ  ＨＢＳＳ）を、３０分間、４℃で、［14Ｃ］ＵＣＡ異性体とインキュベートし、洗浄し、そしてシンチレーション容器に移した。「総ＵＣＡ」と名づけられた細胞なしのコントロール容器は、インキュベーション管によるあらゆる非特異的結合効果を排除するために同様のインキュベーションを受けた。陰影線付記号、概算ｃｐｍ値は、技術上の最大計数限界により、＞１０7ｃｐｍを示す総ＵＣＡ試料について使用された。
【図３】非標識シス−ＵＣＡによる［14Ｃ］シス−ＵＣＡ取込みの置換を示す。単一の提供者の新たに抜かれた静脈血から単離された好中球を、ｐＨ７．４での置換について２回の機会（７日離れて）で分析した。細胞（実験１では７．４×１０6／ｍｌ、および実験２では６．３×１０6／ｍｌ）を、１時間、所定の温度で、１０ｍＭ非標識シス−ＵＣＡを伴うか、または伴わない１ｍＭ［14Ｃ］シス−ＵＣＡを含有するＨＢＳＳ（総体積２００μｌ）中でインキュベートした。実験１では、細胞をインキュベートした後にペレットとしてのみ洗浄したのに対して、実験２では、洗浄媒体（ＨＢＳＳ）中に細胞を再懸濁させた。データは、三重のインキュベーションから得られる。
【図４】細胞分画中、そしてインキュベーション温度による取込まれたシス−ＵＣＡの分布を示す。Ａ、４℃でインキュベートされた細胞の種々の分画における対応（proportional）［14Ｃ］活性（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４つの独立実験）。軟膜から単離された好中球（５０〜２００×１０6細胞／ｍｌ）を、２０〜３０分間、４℃で、１または５ｍＭ［14Ｃ］シス−ＵＣＡとインキュベートした。超音波処理により細胞を破壊し、細胞分画を、ショ糖超遠心分離により分離し、そしてその結合活性を各分画で測定した。Ｂ、末梢血の好中球へのシス−ＵＣＡの取込に対するインキュベーション温度の効果（平均±ＳＥＭ、ｎ＝４つの独立実験）。Ｃ、インキュベーション温度による細胞の分画におけるシス−ＵＣＡの分布（二重のインキュベーションの平均±ＳＥＭ）。
【図５】Ｓ−２００ゲル濾過でのサイトゾル関連［14Ｃ］シス−ＵＣＡの溶出を示す。好中球（１６０〜１９０×１０6）を、２０分間、４℃で、１ｍＭ［14Ｃ］ＵＣＡ異性体とインキュベートし、洗浄し、溶解させ、そしてショ糖超遠心分離で分画した。サイトゾル分画を、ゲルに載せ、そしてタンパク質含有量およびＵＣＡ活性を、溶出で測定した。Ａ、［14Ｃ］シス−ＵＣＡとインキュベートした細胞のサイトゾル。Ｂ、［14Ｃ］トランス−ＵＣＡとインキュベートした細胞のサイトゾル。Ｃ、同じ条件での標準分子量タンパク質マーカーおよびシス−ＵＣＡ単独での溶出。
【図６】実験条件下でのＵＣＡ代謝の欠如を示す。種々の結合アッセイから得られる［14Ｃ］ＵＣＡ標識好中球のサイトゾルタンパク質を、一晩、氷上で１０％ＴＣＡで沈殿させた。放射活性標識の量を、シンチレーション計数により沈殿物およびタンパク質不含上清中で測定し、そしてその上清中の無傷（非代謝）ＵＣＡ異性体の含有量を、ＨＰＬＣにより測定した。データは、シス−ＵＣＡ（ｎ＝７）およびトランス−ＵＣＡ（ｎ＝２）を用いた１組の全細胞インキュベーションから、そして両方の異性体（矢印）との溶解後インキュベーションを用いた２つの実験から得られる結果を表す。パーソンの相関係数およびｐ値は、両方の異性体について計算された。
【図７】標準インキュベーション緩衝液でのＵＣＡ異性体のｐＨ効果を示す。シス−ＵＣＡおよびトランス−ＵＣＡの勾配濃度を含む、（Ａ）ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中で、そして（Ｂ）ＨＢＳＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中でｐＨを測定した。
【図８】ＵＣＡ異性体によるサイトゾルの呼吸バースト活性と酸性化との関係を示す。３つの独立の実験で、好中球を、３ｍＭシス−またはトランス−ＵＣＡとインキュベートし、そして呼吸バースト化学ルミネセンスおよびｐＨ指標蛍光について同時に分析した。Ａ、同じ細胞外ｐＨでのコントロールレベルと比較した細胞内ｐＨ指標染料蛍光。細胞を、ＢＣＥＣＦに載せ、洗浄し、ＵＣＡとインキュベートし、そしてフローサイトメトリーで分析した。含有率を、幾何学上の平均蛍光強度から計算した。Ｂ、同じｐＨでのＵＣＡなしのコントロールレベルに比較した呼吸バースト応答。結果は、３つの実験の各々の内の２つの平行の分析から得られる。ＡおよびＢでは、細胞外培地のｐＨを、ＵＣＡを添加した後に、６．５または７．４に調節した。Ｃ、細胞外ｐＨの機能としてのＵＣＡとの呼吸バースト応答。データは、ｐＨが測定されるのみであって、３ｍＭ  ＵＣＡの添加の後に調整されない同時インキュベーションで補足された上の３つの実験から得られる。Ｄ、細胞内酸性化への呼吸バーストの従属性。シス−ＵＣＡ（ｐ＝０．０４８，ｎ＝１２）およびトランス−ＵＣＡ（ｐ＝０．０６５，ｎ＝１１）についての相関係数を、Ｂと同じ実験から計算した。
【図９】インサイチュで、ＵＣＡで処理した好中球での細胞内ｐＨ検量を示す。ＢＣＥＣＦ標識細胞を、種々のｐＨで高カリウム・ピペス緩衝液においてプロトンイオン透過担体ナイジェリシンを用いた処理の後、ｐＨ参照細胞として使用した。他のＢＣＥＣＦ標識細胞を、検量緩衝液のものと同じｐＨレベルに調節した低カリウム・ピペス緩衝液中の３ｍＭ  ＵＣＡと共に、または伴わずにインキュベートした。フローサイトメトリーで得られたＢＣＥＣＦ中央蛍光強度を使用して、細胞内ｐＨを計算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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