(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の標的ヌクレオチド配列を含む可能性のある生物試料を提供するステップと、
前記所定の標的ヌクレオチド配列を複製させ、前記複製された標的ヌクレオチド配列を形成させるために、遊離ヌクレオチドを備える作動可能な増幅手段を提供するステップと、
前記複製された標的配列を形成する前記ヌクレオチド間にインターカレートできる酸化還元可能な化合物を提供し、前記酸化還元可能な化合物を前記生物試料と接触させるステップと、
前記複製された標的配列を形成するために前記作動可能な増幅手段を作動させるステップと、
前記酸化還元可能な化合物を活性化させるために前記試料へ電界を与え、前記試料を流れる前記酸化還元可能な化合物の電気化学的活性を表す電流を測定するステップと、
前記複製された標的配列がインターカレートした前記酸化還元可能な化合物の電気化学的活性を抑制することによる前記電流の低下に基づいて、前記所定の標的ヌクレオチド配列の存在を決定するステップと、
からなることを特徴とする標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項２】
前記作動可能な増幅手段は一連の増幅サイクルに従い作動させ、それぞれの増幅サイクルにおいて前記複製された標的配列が複製されることを特徴とする請求項１に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項３】
前記試料中の前記標的ヌクレオチド配列の濃度を定量するために、前記電流の低下に対応する前記増幅サイクル数を記録することを特徴とする請求項２に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項４】
前記インターカレートした酸化還元可能な化合物を遊離させるために前記試料へ熱エネルギーを供給し、前記試料を流れる電流の変化を同時に記録するために前記試料へ電界を与えるステップと、
前記所定の標的ヌクレオチド配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）を同定するために、記録される電流の最大変化に対応する熱エネルギーＱの量を決定するステップと、を更に有することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項５】
前記試料の温度が緩やかに上昇するように、前記試料へ熱エネルギーを供給することを特徴とする請求項４に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項６】
前記温度の緩やかな上昇は４０℃から９８℃の間で起こることを特徴とする請求項５に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項７】
前記酸化還元可能な化合物の電気化学的活性を表す電流を、前記試料が所定の温度である時に測定することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項８】
前記所定の温度は、前記所定量の熱エネルギーＱに相当する前記試料の温度よりも著しく低いことを特徴とする請求項５〜７のいずれか１項に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項９】
前記電流を測定するために電圧電流計を使用することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項１０】
矩形波電圧電流計を使用することを特徴とする請求項９に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項１１】
前記提供される酸化還元可能な化合物は、遷移金属の錯体であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項１２】
前記酸化還元可能な化合物は、核酸配列にインターカレートする配位子を少なくとも一つ有することを特徴とする請求項１１に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項１３】
前記酸化還元可能な化合物は、ジピリドフェナジン配位子を有することを特徴とする請求項１１または請求項１２に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項１４】
前記酸化還元可能な化合物は、少なくとも一つのビピリジン配位子を有することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項１５】
前記所定の標的ヌクレオチド配列の複製と、核酸二重鎖構造を有する複製された標的ヌクレオチド配列の形成とが生じることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか１項に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項１６】
前記作動可能な増幅手段はＰＣＲ型から成ることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか１項に記載の標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定する方法。
【請求項１７】
所定の標的ヌクレオチド配列を含む可能性のある生物試料を受け入れるための受入手段と、
前記所定の標的ヌクレオチド配列の複製と前記複製された標的ヌクレオチド配列の形成とを生じさせるために、遊離ヌクレオチドから成る作動可能な増幅手段と、
前記複製された標的配列を形成する前記ヌクレオチド間にインターカレートできる化合物より選択される酸化還元可能な化合物であり、前記生物試料と接触している前記酸化還元可能な化合物と、
前記複製された標的配列を形成するために前記作動可能な増幅手段を作動させるための作動手段と、
前記酸化還元可能な化合物を活性化させるように前記試料へ電界を与えるための手段、および前記試料を流れる前記酸化還元な化合物の電気化学的活性を表す電流を測定するための手段と、
前記複製された標的配列がインターカレートした前記酸化還元可能な化合物の電気化学的活性を抑制することによって前記電流が低下した際に、前記所定の標的ヌクレオチド配列の存在を決定するための手段と、を備える標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定するための装置。
【請求項１８】
前記作動手段は、それぞれの増幅サイクルにおいて前記複製された標的配列を複製するために、一連の増幅サイクルに従って前記作動可能な増幅手段を作動させるのに相応しい手段であることを特徴とする請求項１７に記載の同定装置。
【請求項１９】
前記試料中の前記標的ヌクレオチド配列の濃度を定量するために、前記電流の低下に対応する増幅サイクル数を記録するための記録手段を更に備えることを特徴とする請求項１８に記載の同定装置。
【請求項２０】
前記インターカレートした酸化還元可能な化合物を遊離させるように前記試料へ熱エネルギーを供給するための手段、および前記試料を流れる電流の変化を同時に記録するように前記試料へ電界を与えるための手段と、
前記所定の標的ヌクレオチド配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）を同定するために、記録される電流の最大変化に対応する熱エネルギー量を決定するための手段と、を更に備えることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の同定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定するための方法および装置に関するものである。
【０００２】
想定される１つの適用領域は、特に、バクテリアまたはウィルス、より一般的には任意の核酸を含む可能性のある生体試料の、迅速分析に関する領域である。
【背景技術】
【０００３】
公知の電気化学的検出方法によって、標的核酸配列を明らかにすることが既に可能となっている。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）型を例とした核酸増幅処理、およびサイクリック・電圧電流計処理の双方を利用する方法もある。これらの方法の１つによれば、所定の標的ヌクレオチド配列を示す核酸を含む生物試料を提供し、標的配列のヌクレオチド塩基の内の少なくとも一つを酸化することのできる酸化剤を生物試料に添加する。当該増幅手段は酸化可能なヌクレオチド塩基を有するタイプのヌクレオチドを備えている。ヌクレオチドは、複製された核酸配列の生産のため、増幅処理の実行中において当然ながら消費されることになる。同時に、もしくはそれぞれの増幅ステップの後に、酸化剤と酸化可能なヌクレオチド塩基とが反応するよう試料へ電界を与え、その結果、試料に流れる電流を測定する。より具体的には文献ＰＣＴ／ＦＲ２００７／０００３７３に記載されているが、本方法によれば、増幅過程を経て電流が減少した際に、所定の標的配列の存在とその初期量とが決定される。これは、増幅処理の間、遊離ヌクレオチドが合成された核酸中へ組み込まれるため、増幅手段を構成する遊離ヌクレオチドの数が減少するからである。従って、酸化剤が反応できるのは、次第に量が限られる遊離ヌクレオチのみとなる。その結果、酸化反応による電子移動は次第に減少し、電流は減少する。
【０００４】
このように、そのような手法によって、任意の生物試料中における特定の核酸の存在を迅速に検出し定量することが可能となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、生物試料中における標的ヌクレオチド配列の存在を検出可能なさらなる電気化学的検出法を提供すると供に、標的ヌクレオチド配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）の同定および定量も可能とすることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この課題の解決を目的とし、本発明の第１の側面として、標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定するための方法を提案する。本方法は、提供される所定の標的ヌクレオチド配列を含む可能性のある生物試料を提供するタイプの方法であり、所定の標的ヌクレオチド配列を複製させ、複製された標的ヌクレオチド配列を形成させるための、遊離ヌクレオチドを備える作動可能な増幅手段である。本方法によれば、ヌクレオチドと反応することのできる酸化還元可能な化合物も提供し、酸化還元可能な化合物を生物試料に接触させる。次に、作動可能な増幅手段を作動させ、酸化還元可能な化合物を活性化させるために試料へ電界を与え、試料を流れる、酸化還元可能な化合物の電気化学的活性を表す電流を測定する。従って、電流が減少した際に、所定の標的ヌクレオチド配列の存在が決定される。本発明では、複製中に、複製された標的配列を形成するヌクレオチド間にインターカレートできる酸化還元可能な化合物を提供する。複製された標的配列は、インターカレートした酸化還元可能な化合物の電気化学的活性を抑制し、その結果、電流は減少する。
【０００７】
遊離ヌクレオチドの他に、作動可能な増幅手段は、検出する標的ヌクレオチド配列に特異的かつ相補的なオリゴヌクレオチド酸のプライマーと、ポリメラーゼとを備える。さらに、以下に詳細に説明するように、試料へ複数の電極を接触させ、これらの電極間に電位差を加えることによって、前記試料へ電界を与える。
【０００８】
このように、本発明の一つの特徴は、前記先行技術文献の場合のような試料中の遊離ヌクレオチドのヌクレオチド塩基を酸化しない酸化還元可能な化合物を提供すると供に、複製された標的配列を形成するヌクレオチド間にインターカレートする酸化還元可能な化合物を提供することにある。
【０００９】
好ましくは、作動可能な増幅手段は連続する増幅サイクルに従い作動し、それぞれの増幅サイクルにおいて、複製された標的配列は複製される。その後、酸化還元可能な化合物は複製された標的配列を形成するヌクレオチド間にインターカレートし、加えられる電界に対して自身の酸化還元活性を失う。その結果、増幅サイクルを繰り返すことによって、測定される電気信号は減少する。
【００１０】
次に、好ましくは、試料中の標的ヌクレオチド配列の濃度を定量するために、電流の減少に対応した増幅サイクル数を記録する。これは、測定される信号の減少は、複製された標的ヌクレオチド配列の量に比例するからである。この比例性より、試料中に当初存在する所定の標的ヌクレオチド配列の量を推定することが可能である。このように、一定の増幅サイクル数だけ作動可能な増幅手段を繰り返し作動させ、この場合、電流が減少する際の増幅手段のサイクル数を、試料中の標的ヌクレオチド配列の濃度を定量するために記録する。具体的には、生物試料が含む所定の標的ヌクレオチド配列が多いほど、電流強度が低下するために必要な増幅サイクル数は少なくなる。反対に、試料が含む所定の標的ヌクレオチド配列が少ないほど、増幅サイクル数は多くなる。このようにして、以下の記載においてより詳細に説明する通り、本方法により生物試料中の所定の標的配列の濃度を定量することも可能となる。
【００１１】
「酸化還元可能な化合物」という用語は、レドックス化合物のみならず、ある一定の条件下では酸化可能であり、また、ある一定条件下では還元可能である化合物のことも表すことを明記する。
【００１２】
特に好ましい本発明の一実施形態では、所定の標的ヌクレオチド配列が増幅された後、インターカレートした酸化還元可能な化合物を遊離させるために試料へ熱エネルギーも加え、同時に試料を流れる電流の変化を記録するため、前記試料に電界を与える。その後、所定の標的ヌクレオチド配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）を同定するために、記録される電流の最大変化に相当する熱エネルギーＱの大きさを決定する。好ましくは、試料の温度が緩やかに上昇するように、試料へ熱エネルギーを供給する。その結果、一定範囲における供給された熱エネルギーの関数、より具体的には、温度の関数として、電流変化が記録される。所定の温度における電流の最大変化率より、所定の標的ヌクレオチド配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）が同定される。これは、増幅された標的配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）によって、所定の温度における電流の最大変化率は複製された標的ヌクレオチド配列に固有のものとなるためである。
【００１３】
従って、試料および結果的に複製された標的ヌクレオチド配列へ十分な熱エネルギーを供給すれば、複製された標的ヌクレオチド配列の二重鎖は、二本の一本鎖へと解離し易くなる。その結果、インターカレートした酸化還元可能な化合物を遊離し易くなり、ひいては自身の電気化学的活性が回復する。所定の熱運動によって、即ち、所定の温度において、複製された標的ヌクレオチド配列の二重鎖は互いに解離する。その際、試料へ所定量の熱エネルギーを付与した際、実質的には不連続的に、即ち限られた温度範囲に渡り、酸化還元可能な化合物が急速に遊離し、その後、酸化還元可能な化合物は電極で発生する電流によって測定される。
【００１４】
好ましくは、例えば４０℃から９８℃の間において、試料の温度が緩やかに上昇するように試料へ熱エネルギーを供給する。この温度範囲において、複製された標的ヌクレオチド配列の二重鎖は、複製された標的配列のそれぞれのヌクレオチド塩基が相補的に結合した対の状態から、最終的にそれぞれの複製された標的配列が一本鎖となっている解離状態へと徐々に変化する。従って、二重鎖状態から一本鎖状態への変化は限られた温度範囲内で起こり、一般的にＴｍで表される「解離」温度により特徴付けられるが、それは複製された標的ヌクレオチド配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）の特性を示している。
【００１５】
さらに、試料が所定の温度のとき、即ち、例えばプライマーダイマーのような、既に形成されているもしくは形成しつつある他の分子が酸化還元可能な化合物を阻害しない温度のとき、酸化還元可能な化合物の電気化学的活性を表す電流を測定することが望ましい。前記所定の温度は、所定量の熱エネルギーＱに相当する試料の温度に比べ、十分に低いが近い温度であることが好ましい。そうすれば、このような高い温度においては、複製された標的ヌクレオチド配列よりもサイズが小さいその他全ての分子は脱ハイブリダイズされた状態となっている一方で、複製された標的ヌクレオチド配列は未変化のままの状態となっている。このようにして、様々なプライマーダイマーに由来する酸化還元可能な化合物の遊離に起因する電流量や、既に供給された熱エネルギーにより解離可能となった他の小さな分子に起因する電流量は、測定される電流から除外される。
【００１６】
好ましくは、電流または電流変化を測定し記録するために、電圧電流計を使用する。この動電位法の本質は、以下の説明においてより詳細に説明する通り、２つの電極間へ経時的に変化する電位を加えるとともに、そこから生じる電流の変化を記録することにある。好ましくは、矩形波電圧電流計が使用される。例えば、示差パルス電圧電流計、リニアスキャン電圧電流計やサイクリックスキャン電圧電流計、またはその他のサンプル電流電圧電流計（Ｓａｍｐｌｅｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ）や交流電圧電流計等の他の電気化学的技術も、当然ながら潜在的に使用が可能である。
【００１７】
特に好ましい本発明の一実施形態では、提供される酸化還元可能な化合物は、例えばメンデレーエフ周期表８Ａ族の金属であるが、より具体的にはオスミウムのような遷移金属の錯体である。さらに、好ましい酸化還元可能な化合物は、例えば、複製された標的ヌクレオチド配列によって形成される対となったらせん構造の間にインターカレート可能なジピリドフェナジン配位子のように、少なくとも一つの核酸配列挿入配位子を有しているものである。
【００１８】
さらに、酸化還元可能な化合物は、少なくとも一つのビピリジン配位子を有しており、好ましくはこのタイプの配位子を二つ有している。ジピリドフェナジン配位子または二つのビピリジン配位子を伴うオスミウム錯体については、以下の説明においてより詳細に説明する。さらに、ある種の完全な有機化合物である酸化還元可能な化合物もまた、有効に使用可能であることが分かるであろう。これは、例えばメチレンブルーの場合である。
【００１９】
本発明の好ましい一実施形態においては、所定の標記ヌクレオチド配列を複製し、核酸二重鎖構造を有する複製された標的ヌクレオチド配列を形成する。従って、前記作動可能な増幅手段はＰＣＲ型の手法となる。
【００２０】
本発明の第２の側面は、標的ヌクレオチド配列を電気化学的に同定するための装置を提案することにある。本装置は、所定の標的ヌクレオチド配列を含む可能性のある生物試料を受け入れるための手段と、所定の標的ヌクレオチド配列を複製させ、複製された標的ヌクレオチド配列を形成させるための、遊離ヌクレオチドを備える作動可能な増幅手段とから成る。さらに、本装置は、ヌクレオチドと反応することが可能な酸化還元可能な化合物を備えており、酸化還元可能な化合物は生物試料と接触させる。作動可能な増幅手段を、作動手段により作動させることが可能となり、酸化還元可能な化合物が活性化するように、試料に対して電界を与えることが可能となる。一方、測定手段により、酸化還元可能な化合物の電気的活性を表す、試料を流れる電流を測定することが可能となる。最後に、決定手段により、電流が減少した際に所定の標的ヌクレオチド配列の存在を決定することが可能となる。本発明では、複製中に、複製された標的配列を形成するヌクレオチドの間、すなわち複製された標的ヌクレオチド配列の二重鎖内へインターカレートできる化合物より酸化還元可能な化合物が選択され、複製された標的配列により、インターカレートした酸化還元可能な化合物の電気化学的活性が抑制され、その結果、電流が減少する。
【００２１】
さらに、好ましい一実施形態では、同定装置はまた、インターカレートした酸化還元可能な化合物が遊離するよう熱エネルギーを試料へ供給する手段と、試料を流れる電流の変化を温度の関数として同時に記録するように、試料と接触した電極を用いて試料へ電界を与える手段と、さらに所定の標的ヌクレオチド配列の存在を確認するための、記録される電流の最大変化に対応する熱エネルギー量を決定する手段とを備えている。これらの手段により、記録される電流の最大変化に基づいて、検出する標的ヌクレオチド配列の存在の特性を表す解離温度（Ｔｍ）を決定する。本発明に従った方法の実施を可能とする上述の電気化学的同定装置については、以下、詳細に説明する。特に、それぞれの増幅サイクルにおいて複製された標的配列を複製するための、一連の増幅サイクルに従い作動可能な増幅手段を好ましく作動させることができる作動手段について説明する。さらに、本発明による前記同定装置は、試料中の標的ヌクレオチド配列の濃度を定量するように電流の減少に応じた増幅サイクル数を記録する記録手段を備えている。
【００２２】
さらに、本発明の他の特徴および利点は、後述の本発明の詳細な実施形態の説明から明らかとなるが、以下の通り添付の図面を参照し、限定しない表記で示す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明における電気化学的同定装置の線図である。
【図２】ＡからＣは、異なる実施形態における、図１で表されたものと同一の装置の構成要素の線図である。
【図３】ＡおよびＢは、図１で表されたものと同一の装置によって得られた電流／電位図である。Ｃは、ＡおよびＢで表された図の差し引きによって得られた図である。
【図４】図３Ｃの図に類似した形式の図である。
【図５】Ａは、図１および第１ステップで表されたものと同一の装置によって得られた、電流／温度図を示している。Ｂは、第２ステップにおいて、図５Ａで示された図の変換によって得られた図を示している。
【図６】特定の実施例における、図５Ｂで表された形式の図を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明における電気化学的同定法は、一方で最初に説明される制御及び測定手段と、他方で特定の生物的・化学的構成物とを備える電気化学的同定装置を使用する。本発明に係る電気化学的同定装置１０を図１に示す。図１は２つのマイクロキュベット１２、１４を示しており、後で説明するように、特性が明らかとなる生物試料を内部に受け入れるのに適切な構造となっている。これらのマイクロキュベット１２、１４は従来技術により既知のものであり、それぞれ底面１６、１８を有する。底面１６、１８上には、例えばスクリーン印刷により定着させた電極２０、対電極２２、および図示されない基準電極が存在し、それぞれポテンシオスタット２４へ接続しており、前の２つの電極は導線２６、２８を介して接続している。さらに、マイクロキュベットは、マイクロキュベットを支持するペルティエ効果モジュール３２と、発電機３４へ接続されたヒーティングキャップ３０との間に挟まれている。後で説明するように、ペルティエ効果モジュール３２により、マイクロキュベット１２、１４内の内容物へ所定量の熱エネルギーを与えることが可能となる。さらに、発電機３４とポテンシオスタット２４は、コンピュータプログラムおよび記録手段を有するマイクロコンピュータ３６により制御される。
【００２５】
このように、マイクロキュベット１２、１４は、検出しようとする所定の標的ヌクレオチド配列を有する核酸配列、特にＤＮＡを含む可能性のある生物試料を受け入れることが可能な、受入手段を備える。さらに、ペルティエ効果モジュール３２とマイクロコンピュータ３６により制御可能な発電機３４は作動可能な増幅手段の第１部を構成し、増幅手段の第２部は生物材料および化合物で構成される。
【００２６】
言うまでもなく、図示しない他の周知の受入手段として、生物試料が置かれる底部へ至るチューブがある。チューブは、生物試料内に浸漬できかつポテンシオスタットへ接続できる電極を具備する。チューブは、所定回数のサイクルで所定の温度に生物試料を加熱するために、サーモサイクラーへ取り付けられる。さらに、図２Ａ〜２Ｃで図示される他の受入手段により、生物試料を受け入れることもできる。チューブは、例えば１μｌ〜１ｍｌ収容可能でかつ上部１３が開口した、例として図２Ａで表されるチューブキャップのような小容量の容器１１からなる。チューブは反応混合物を受け入れることができる。そして、チューブはフィルム１５によって密封されており、接続されていない３つの電極１７、１９、２１がフィルム１５にスクリーン印刷されている。電極１７、１９、２１は容器１１の内部側に向いており、それらは容器縁部とフィルム１５との間の結合点で、容器から外に出ている。次に、フィルム１５を備えた容器１１はペルティエ効果モジュールに対して反転する。その結果、当初容器１１の底部にあった反応混合物は電極１７、１９、２１と接触する状態となり、電極１１、１９、２１は混合物に浸漬される。
【００２７】
ここで使用される増幅手段はＰＣＲ法である。従って、ペルティエ効果モジュール３２により、以下の手順に従い、マイクロキュベット１２、１４の内部を設定時間、所定の温度に保持することができる。当該手順は、ポリメラーゼの種類に従い１〜１５分間保持する第１段階で始まり、マイクロキュベット１２、１４の内部を９４〜９５℃の温度とする。次に、複製された標的ヌクレオチド配列の検出に必要となる増幅に従い、所定回数（通常１０〜５０サイクル）の連続した温度サイクルをマイクロキュベット１２、１４へ適用する。各サイクルは、９４〜９５℃の温度で通常１〜６０秒間の第１「変性」段階、所定の標的ヌクレオチド配列に対する特異的なプライマーに特有となる４０〜７２℃の温度で、通常１〜６０秒間の第２「プライマー・アニーリング」段階、７２℃で通常１〜６０秒間の第３「伸長」段階、および電気化学的測定に必要となる時間で決定される４０〜９５℃の温度で数秒間の最終段階、という連続した４つの段階に従っている。特に生物材料および化合物から成る第２部を説明した後、この最初の増幅手段部を実施するための条件を下記で説明する。
【００２８】
本発明の目的の一つは、複製により核酸配列を増幅させ、媒体中におけるその存在を増幅処理中に電気化学的に測定することであるため、まず第一に、生物材料がこのように増幅できるようにすることが望ましい。ＰＣＲ法を実行するためには、ポリメラーゼ酵素と、一対のプライマーと、４種の遊離ヌクレオチドとを、増幅させる核酸に接触させることが望ましい。４種の遊離ヌクレオチドとは、ＤＮＡを構成するｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰのことであり、それぞれデオキシグアノシン三リン酸、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸およびデオキシシトシン三リン酸のことを指す。デオキシデアザグアノシン三リン酸のような、デオキシリボヌクレオチド三リン酸型の塩基類似化合物も同様に使用可能である。
【００２９】
従って、第１実施例においては、分析される生物試料、実際は２８３塩基対の標的核酸配列を有するサイトメガロウイルスＤＮＡの抽出物に加え、酵素であるＤＮＡポリメラーゼと、プライマーと、４種のヌクレオチドとを、マイクロキュベット１２の一つの中へ導入する。全体は、言うまでもなく、緩衝化された液体の反応混合物である。さらに、電気信号強度の測定を可能とするために、酸化還元可能な化合物を反応混合物へ加える。好適な酸化還元可能な化合物はオスミウム錯体：ビス（２，２’−ビピリジン）ジピリド［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］フェナジンオスミウム（ＩＩ）（ｂｉｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）ｄｉｐｙｒｉｄｏ［３，２−ａ：２’，３’−ｃ］ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｏｓｍｉｕｍ（ＩＩ））、ＣＡＳ番号３５５５３９５−３７−８）であり、本件では［ＯｓII（ｂｐｙ）２ＤＰＰＺ］２＋と表し、以下の化学式で示される。
【００３０】
【化１】
0005536762.tif 000002
【００３１】
他の酸化還元可能な化合物の使用も想定でき、オスミウムの代わりにルテニウムを有するものが良い。その他の配位子も同様に使用可能である。ジピリドフェナジン配位子を用いる利点は、標的核酸配列を形成するヌクレオチド間にインターカレートできることにある。他の想定される配位子として、例えば、ＤＰＰＸ：７，８−（ジメチル）ジピリド）［３，２−ａ：２，３−ｃ］フェナジン（７，８−（ｄｉｍｅｔｈｙｌ）ｄｉｐｙｒｉｄｏ［３，２−ａ：２，３−ｃ］ｐｈｅｎａｚｉｎｅ）；ＰＴＤＢ：（３−ピリジン−２−イル）−５，６−ジフェニル−ａｓ−トリアジン（３−（ｐｙｒｉｄｉｎｅ−２−ｙｌ）−５，６−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−ａｓ−ｔｒｉａｚｉｎｅ）；またはＤＰＴ：３−（ピラジン−２−イル）−ａｓ−トリアジノ［５，６−ｆ］フェナントレン（３−（ｐｙｒａｚｉｎｅ−２−ｙｌ）−ａｓ−ｔｒｉａｚｉｎｏ［５，６−ｆ］ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）が挙げられるが、その他にＰＨＩ：フェナントレンキノンジイミン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅｑｕｉｎｏｎｅ  ｄｉｉｍｉｎｅ）のようなキノン機能を有する配位子が挙げられる。
【００３２】
ＤＮＡへインターカレートできる酸化還元可能な有機化合物もまた、本発明の要旨をなす方法において使用することができる。そのような酸化還元可能な有機化合物の例として、エチジウムブロマイド、アクリジンおよびその誘導体、アクリドン誘導体、あるいはフェナジン誘導体が挙げられる。
【００３３】
実験のための比較物として、テストされる生物試料を除いて全く同一の前記成分を別のマイクロキュベット１４内へ導入する。一例として、マイクロキュベット１２、１４へ導入する各種成分の濃度を、下記表１に掲げる。
【００３４】
【表１】
0005536762.tif 000003
【００３５】
従って、２つのマイクロキュベット１２、１４に含まれる反応混合物を、ペルティエ効果モジュール３２を用い、マイクロコンピュータ３６で制御して所定時間、様々な温度とする。反応混合物を一旦１５分間、９５℃の温度とする予備段階の後、第１段階において標的核酸配列が脱ハイブリダイズ、すなわち標的核酸配列の２本の相補鎖が解離するように、反応混合物を３０秒間、９４℃の温度とする。次に、第２段階において、解離したＤＮＡ鎖へそれぞれのプライマーがハイブリダイズするように、６０秒間、５３℃とする。そして、第３段階において、ポリメラーゼが相補鎖を合成し、結果的に増幅産物と、増幅産物が含む複製された標的配列とを形成するように、６０秒間、７２℃とする。最後に、第４段階において、反応混合物を１０秒間、８５℃の温度とするが、その間、ポテンシオスタット２４の使用はマイクロコンピュータ３６により制御される。
【００３６】
前記した第１の適用例では、所定の第４段階において１０秒間、酸化還元可能な化合物の標準電位を構成する電位領域における電流／電位曲線を、ポテンシオスタット２４を用いて矩形波電圧電流計で記録する。従って、電極２０と対電極２２との間に電位差を加え、この電位差を矩形波形に従い変化させる。同時に、これらの電極を流れる電流を測定すると、最大電流値がピーク形状となる電流／電位曲線が得られる。ベースラインを差し引いた後の最大電流値は、インターカレートせずに溶液中に存在している酸化還元可能な化合物の濃度を表す。
【００３７】
まず図３Ａ〜３Ｂについて、その後、図３Ｃについて説明する。具体的には、マイクロキュベット１２、１４に入った生物試料に対し、複製サイクルを３１回適用した。図３Ａは、検出する標的ヌクレオチド配列を含む生物試料に関する、サイクルの関数としての電流／電位曲線の変化を図示している。一方、図３Ｂは、標的配列を含まない反応混合物に関する、サイクルの関数としての電流／電位曲線の変化を表している。図３Ａにおいて、曲線の頂点３３は、第１８サイクル目の中間値３１から第２２サイクル目における中間値３５まで著しく低下している。即ち、酸化還元可能な化合物の消費量を明確に認識できるということである。第３１サイクル目において、曲線３７は実質的に平坦となっており、その頂点は、第１サイクルの電流値の５％よりも小さい電流値となっている。従って、酸化還元可能な化合物は、形成された二重鎖ＤＮＡ分子内へ組み込まれているということになる。これは、検出しようとする標的ヌクレオチド配列が、実際に生物試料中に存在していたことを示唆する。
【００３８】
反対に、図３Ｂでは、前の曲線と比較すると、曲線の極大値３９は第３１サイクル目まで略一定値のままである。というのは、これらの試料には検出しようとする標的ヌクレオチド配列が存在しないからである。それでもなお、特に反応混合物中におけるプライマーダイマーの形成に起因して、極大値は若干減少している。
【００３９】
このように、上記の方法を用い、任意の生物試料において、検出しようとする標的ヌクレオチド配列の存在が迅速に検出される。
【００４０】
増幅サイクルの初期、すなわち、例えば第５サイクル目のように、複製された標的ヌクレオチド配列の量が測定される最大電流値を有意に低下させるほど十分ではない時点において、得られる最大電流のずれに対して補正された平均値で最大電流値を割ることにより、最大電流値は標準化されることが分かる。
【００４１】
図３Ｃについての説明を行う。図３Ｃは、前述の２系統の曲線より抽出した曲線を示しており、２つのマイクロキュベット１２、１４に関し、実行したサイクル数の関数として標準化した最大電流値を表している。２つのマイクロキュベット１２、１４はそれぞれ、検定する生物試料と複製のための生物材料と酸化還元可能な化合物との構成物、他方は、単に酸化還元可能な化合物を含んだ生物材料、を含んでいる。
【００４２】
このように、第２５サイクル目まで、２つのマイクロキュベット１２、１４の反応混合物を流れる電流値はほぼ等しく、比較的一定であることが分かる。一方、第２５サイクル目から第３０サイクル目を超えるサイクルまでの間において、検定する生物試料を含むマイクロキュベット１２を流れる電流値は、所定の標的核酸配列を含まないもう一つのマイクロキュベット１４を流れる電流に比べて急激に減少していることが分かる。cをサイクル数、eを２に近似する増幅強度とすると、電流が関数ecに比例して急激に、指数関数的に減少していることは、プライマーに特異的な所定の標的ヌクレオチド配列が増幅され、結果的に、複製された標的配列が生産されていることの証明となる。特に、複製された標的核酸配列分子が生産される結果、複製された核酸配列において形成された二重鎖中へ前記化合物がインターカレーションすることによって、上述の酸化還元可能な化合物が不活性化する。このようにして不活性化した酸化還元可能な化合物は電極２０、２２の表面と電荷を交換することがもはや不可能となり、その結果、電気化学的に検出することができなくなる。これは電気信号の低下をもたらし、結果的に、調査した生物試料中において、特異的プライマーにより所定の標的ヌクレオチド配列が形成されたことが明らかとなる。
【００４３】
電流は、プライマーダイマーおよび／または他のＤＮＡ配列が特異的に増幅しない「解離」温度を超える温度において記録する。測定を行う温度の選択は、偽陽性試料と真陽性試料とを区別するための重要なパラメーターである。
【００４４】
さらに、第２実施例に従って、所定の試料中における所定の標的ヌクレオチド配列の定量の原理を説明するために、図４で示すグラフについてこれから言及する。
【００４５】
グラフのｘ軸５１は増幅手段における複製サイクル数、ｙ軸５３は標準化された最大電流値である。標準化された最大電流値は、図３Ａで示される実施形態に従って、各サイクルにおいて記録したものである。
【００４６】
この図４のグラフにおいて、９本の検量線は、右から左向きに７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４および８６で示されている。これらの検量線は、互いに略平行で、かつ略垂直方向の中間部を示している。これらの曲線は、９本の曲線の第一番目の曲線（曲線７０）に対応するサイトメガロウイルスゲノムに含まれる１０３コピーの標的配列を含有する生物試料に始まり、第９番目の曲線（曲線８６）に対応する１０１１コピーの標的配列を含有する生物試料に至るまで、得られた様々なプロットにそれぞれ対応している。第一の曲線７０から最後の曲線８６まで、それぞれ次の曲線に対し、コピー数を１０倍としている。
【００４７】
このように、生物試料に含まれる所定の標的ヌクレオチド配列の量が多くなるに従い、電極を流れる電流は、サイクル数の関数としてより早く減少していることが分かる。これは、試料が最初に含有するものに所定の標的配列が組み込まれている核酸が多くなると、同量の所定の標的ヌクレオチド配列を複製して生産するために必要となるサイクル数は少なくなり、その結果、酸化還元可能な化合物の複製された標的ヌクレオチド配列の二重鎖中へのインターカレーションによる電流の減少がより早くなるからである。このように、試料を流れる電流量が低下し始めるサイクル数を特定することにより、標的配列が組み込まれている核酸量を測定可能であることが理解できる。さらに、図４の第１曲線７０は、試料中に最初に存在する標的配列がわずか１０００コピーの場合でも、標的配列の存在が検出可能であることを示している。
【００４８】
このようにしてある濃度の所定の標的核酸配列を最初に含む抽出物を分析すると、その曲線８８は、１０４コピーの標的配列に対応する２番目の検量線７２に沿った破線のように表すことができる。
【００４９】
従って、所定の標的ヌクレオチド配列を含む可能性のある生物試料に対し本発明による方法を適用すれば、増幅手段の実施と、二重鎖ＤＮＡにインターカレートする酸化還元可能な試薬の電気化学的測定とにより、所定の標的ヌクレオチド配列の有無を明らかにすることが可能となるだけではなく、先行技術による他の電気化学的手段に比べて改善された信号強度、再現性および感度で定量することも可能となる。本手法は、二重鎖を形成する核酸配列にインターカレートする試薬の酸化還元特性を活用するものであり、標的核酸配列の存在を明らかにするための従来の増幅手段においては全く利用されていない。
【００５０】
検出手段の検出精度を高めることを目的として、特に、増幅された標的配列を同定するという特殊性の観点から、インターカレートした酸化還元可能な化合物を遊離させるため、増幅の最後において、試料の温度を次第に上昇させることにより、全ての複製された標的配列を徐々に脱ハイブリダイゼーションさせることとした。その結果、この酸化還元可能な化合物は電気化学的に再び検出可能となるため、再度電極に対し電気信号を供給することが可能となる。その電気信号は遊離した酸化還元可能な化合物の量を表すが、結果的に所定の標的ヌクレオチド配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）を表し、ひいては、所定の標的ヌクレオチド配列の長さを表している。
【００５１】
この脱ハイブリダイゼーションは、全ての二重鎖が対となっている約４０℃から、全ての二重鎖が解離している約９８℃まで、適切な温度勾配に従ってＤＮＡ分子を加熱することにより行われ、前述のペルティエ効果モジュール３２がこれにふさわしい手段となる。実際は後者により、複製された標的ヌクレオチド配列の脱ハイブリダイゼーションと、その結果として、インターカレートされた酸化還元可能な化合物の解離とが起こるように、図１で示される２つのマイクロキュベット１２、１４中に含まれる反応混合物へ熱エネルギーを供給することが可能となる。さらに、ポテンシオスタット２４およびマイクロコンピュータ３６を用いて、その後電極２０と対電極２２との間に電位差を加え、この電位差を前述の矩形波形に従って変化させる。これらの電極を流れる電流を測定し、最大電流が決定される。
【００５２】
このように、ペルティエ効果モジュール３２を用いて、例えば７０℃から９５℃の間で１℃ずつ反応混合物の温度を上昇させる。同時に、反応混合物の温度が１℃上昇し次第、電極２０、２２間に電位差を加え、前述の電圧電流計法に従って反応混合物を流れる電流を測定する。
【００５３】
次に、第３実施例に従い、２つのマイクロキュベット１２、１４に対し温度の関数として得られた最大電流の図を示す図５Ａについて説明する。一方のマイクロキュベットには検出する標的ヌクレオチド配列を含む反応混合物が入っており、他方のマイクロキュベットには本標的配列を含まない反応混合物が入っている。
【００５４】
このようにして得られた下側の曲線４０は、標的ヌクレオチド配列を含む反応混合物に対応しており、結果的に、複数の複製された標的ヌクレオチド配列を含む反応混合物に対応している。従って、７０℃から８８℃の間で反応混合物の温度を上昇させても、標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に対しては何ら影響を及ぼさないことが分かる。一方で、８８℃から９２℃の間では、最大電流は７倍となる。このように、最大電流は、遊離する酸化還元可能な化合物の量に正比例しており、結果的に所定の標的核酸配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）、ひいては所定の標的核酸配列の長さに正比例していることとなる。本事例の場合、所定の標的核酸配列の長さは２８３塩基対である。
【００５５】
所定の標的核酸配列を含まない反応混合物に対応する上側の曲線４２では、７０℃から８５℃の間で、測定される電気信号は２倍になることが分かる。これは、所定の標的核酸配列よりも小さいプライマーダイマーや、非特異的に合成された他の二重鎖にインターカレーションした結果である。
【００５６】
図５Ａで表される曲線のそれぞれの点をその点における微分値へ変換すれば、検出する標的ヌクレオチド配列を明らかにすることの証明性がより高くなる。このようにして、図５Ｂで表される融合曲線が得られる。
【００５７】
その結果、標的配列を含む反応混合物に対応する下側の曲線４０は、９０℃の温度において有意なピーク４６を有する特有な曲線４４へと変換される。当然のことながら、この有意なピーク４６は、図５Ａの下側の曲線４０において見られる最大電流の急激な変化に対応するものである。この有意なピーク４６は、ピークが出現する温度によって所定の標的配列の由来（Ｎａｔｕｒｅ）を表しており、従って、ピークが出現する温度によって標的配列の長さを表すことになる。具体的に言うと、検出する標的配列に長いものが多くなると、増幅産物中に含まれる酸化還元可能な化合物の量が、増幅産物の当量の割に、かなり明白に多くなる。従って、酸化還元可能な化合物の分子を遊離させるためには、所定の標的配列により形成された二重鎖を脱ハイブリダイズさせるために、より多くの熱エネルギーを与える必要がある。その結果、この脱ハイブリダイゼーションが起こる温度はそれだけ高くなる。さらに、増幅産物に含まれる酸化還元可能な化合物の分子の量が多くなるため、一旦それが遊離すると、記録される電気信号もそれに応じて大きくなる。
【００５８】
その結果、検出する標的ヌクレオチド配列に主として元々長いものが多くなると、有意なピーク４６はより高くなり、より高温側にシフトする。
【００５９】
一方、図５Ａで示される上側の曲線４２については、図５Ｂで示される導曲線４８へ変換することにより、７５℃〜８０℃の間の温度における幅広のピーク５０が明らかとなる。この幅広のピーク５０はまさに、プライマーダイマー、および非特異的に合成され所定の標的核酸配列よりも小さい他の二重鎖の脱ハイブリダイゼーションに対応しており、この脱ハイブリダイゼーションにより、酸化還元可能な化合物が遊離する。この幅広のピーク５０は、有意なピーク４６の温度よりも低い温度範囲において出現し、より広がっていることが分かる。
【００６０】
第４実施例では、本発明に従った同定方法により、同様の生物試料中における少なくとも２つの異なった標的ヌクレオチド配列の存在が検出可能であることを示している。
【００６１】
本方法を実施するためには、図１で示される同定装置を当然使用することができ、前述の実施例に従って一連の測定を３回行う。本実施例の目的は、同様の生物試料において、標的ヌクレオチド配列のサイズが１００塩基対のバクテリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）、および前述で使用した標的ヌクレオチド配列のサイズが２８３塩基対のヒトサイトメガロウイルスの存在が同定可能であるということを明らかにすることである。１回目の測定はヒトサイトメガロウイルスに対応しており、前述の条件と同様の条件の下で実施する。２回目の測定はバクテリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に的確に対応しており、従って、増幅試料は対応する標的配列に特異的なプライマーを含んでいる。さらに、３回目の測定は、ヒトサイトメガロウイルスと、バクテリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）との混合物に対応しており、従って、この場合における増幅試料は、対応する２つの特異的プライマーを混合物中に含んでいる。
【００６２】
その結果、第３実施例に従って、一連する３回の測定に対する融合曲線が得られる。
【００６３】
このようにして得られた３つの曲線は図６に示されているが、より明瞭にするため、それらの曲線はy軸に沿って互いにずらしている。このように、図６において、ヒトサイトメガロウイルスに関連し、かつ、図５Ｂで示される典型的な曲線４４に対応する第一の曲線５０が確認できる。このように、９０℃に相当する温度値に対し、有意な１番目のピーク５２が確認できる。さらに、バクテリア、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）については、２回目の測定に対応する融合曲線５４が、約８５℃の温度値に対する２番目の有意なピーク５６によって特徴付けられる。
【００６４】
さらに、最終的に、３回目の測定により第３の曲線５８となるが、９０℃および８５℃に相当する温度値それぞれに対し、３番目の有意なピーク６０および４番目の有意なピーク６２を示している。これらの値は、バクテリア単独の場合の値、およびヒトサイトメガロウイルス単独の場合の値に正確に対応する。
【００６５】
本発明に従った同定方法を用いて、同一生物試料中における複数の標的ヌクレオチド配列の検出が可能であることは、このように、この第４実施例によって示される。
【００６６】
特に好ましく、ここには示していない本発明の一実施形態によれば、本発明に従うことによって、配列に若干の相違を有する可能性のある標的配列を増幅し、前述のような融合曲線を用いてこれらの相違の有無を同定することができるものと想定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
0005536762.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005536762.tif 000009
【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
0005536762.tif 000012
【図５Ｂ】
0005536762.tif 000013
【図６】
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