(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定をすべき位置を決定する前の試料（１）の初期走査の後に行われ、前記測定をすべき位置を決定した後、前記試料（１）に影響を及ぼす間及び試料（１）の測定動作を起動する間に、光源（３）の光ビーム（２）を用いて、再び試料（１）を走査するための方法であって、
ビーム偏向装置（４）を用いて前記光ビーム（２）を偏向するステップと、
制御装置（５）によって走査動作を制御するステップと、
走査位置（１０）の局所座標がミクロ注射針の先端の認識により自動的にまたは相互作用により決定されるステップであって、走査位置（１０）の局所座標は、ディジタル形式で前記制御装置（５）に伝送され、前記制御装置（５）は、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置（１０）の関数として、少なくとも１つの信号（１１）を発生するステップと、
それによって前記ミクロ注射針の先端からの化学薬品又は蛍光染料により前記試料（１）に影響を及ぼすステップおよび測定動作を起動するステップと、を含む方法。
【請求項２】
前記光ビーム（２）の現在位置を検知する追加的なステップを含み、前記光ビーム（２）の現在位置に関する利用可能な位置データ（１６）が前記ビーム偏向装置（４）によって供給される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光源（３）の光ビーム（２）を用いて試料（１）を走査するための方法が、共焦点走査型顕微鏡に適用されることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
光源（３）の光ビーム（２）を用いて試料（１）を走査するための装置であって、前記光ビーム（２）を偏向するためのビーム偏向装置（４）と、走査動作を制御する制御装置（５）であって、少なくとも１つの明確に定めることができ、局所座標がミクロ注射針の先端の認識により決定される走査位置（１０）の関数としての信号（１１）を、前記ミクロ注射針の先端からの化学薬品又は蛍光染料により前記試料（１）に影響を及ぼすパッチクランプ装置（１２）に供給するため、前記試料（１）に作用し、測定動作を起動するための前記信号（１１）を発生する制御装置（５）と、前記走査光ビーム（２）の走行時間における差を補償するための論理演算装置と、を含む装置。
【請求項５】
光源（３）の光ビーム（２）を用いて試料（１）を走査するための共焦点走査型顕微鏡であって、前記光ビーム（２）を偏向するためのビーム偏向装置（４）と、走査動作を制御する制御装置（５）であって、少なくとも１つの明確に定めることができ、局所座標がミクロ注射針の先端の認識により決定される走査位置（１０）の関数としての信号（１１）を、前記ミクロ注射針の先端からの化学薬品又は蛍光染料により前記試料（１）に影響を及ぼすパッチクランプ装置（１２）に供給するため、前記試料（１）に作用し、測定動作を起動するための前記信号（１１）を発生する制御装置（５）と、前記制御装置（５）が高速の走査速度で高いタイミング精度を備え、データ処理が少なくともほぼ実時間で実行されるようになっていることと、前記走査光ビーム（２）の走行時間における差を補償するための論理演算装置と、を含む共焦点走査型顕微鏡。  
【請求項６】
画像出力装置（１３）が前記試料（１）の記録画像を表示するために、前記顕微鏡に関連することと、明確に定めることができる走査位置（１０）の局所座標の規定がミクロ注射針の先端である位置指示装置によって実現されることと、を特徴とする請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡。  
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、好ましくは共焦点走査型顕微鏡法において、光源の光ビームを用いて試料を走査するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】  共焦点走査型顕微鏡法において、試料は、集光される光ビームを用いて走査される。これは、一般に、共焦点走査型顕微鏡のビーム経路に配置された２枚のミラーを傾斜させることによって実現される。試料から入ってくる光の強度は、走査中の明確に定めることができる時間間隔で測定される。画像を得るため、試料点の光強度値は、光ビームの関連する走査位置に明確に割り当てられなければならない。このため、通常は、ミラーの調整素子、すなわち検流計作動素子のための状態データも連続して測定される。【０００３】  特に生理学のさまざまな用途において、試料は、外部の影響を受けている最中またはその影響を受けた直後に、共焦点走査型顕微鏡を用いて観測されなければならない。生理学用途の目的には、たとえば、共焦点画像を利用して、影響を受けている最中または影響を受けた直後に、影響に対する試料の反応を検出し、解析するために、検出対象である試料に「パッチクランプ」技術を用いて電圧を印加すること、または化学薬品を注入することなどがある。【０００４】  走査動作の直接的な同期化は、現在まで実現されていない。別法として、共焦点走査型顕微鏡の制御装置の内部電気回線同期信号が、この目的のために利用可能である同期信号を発生するために用いられる。これは、信号を各走査線の開始時に利用者にとって利用可能な状態にするだけに過ぎない。この同期方法では、光ビームが実際に外部によって作用される関連試料領域の位置に達するときを直接確認することはできない。その代わり、利用者は、光ビームが関連試料領域の対応する線に達するまで線の数を計数する別の論理演算装置を備えていなければならない。さらに、利用者は、光ビームが再び外部の論理演算装置によって行われた線の初めから関連試料領域まで進むために必要な時間の計算結果を保持していなければならない。
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  しかし、たとえば、光ビームの走査速度は一般に可変であり、このことは外部の論理演算装置によって考慮されなければならないため、この手続きは相当の困難を伴う。したがって、遅延値は、光ビームの走査速度および対応する線の数または局所的な座標の関数として計算されなければならない。
【０００６】  本発明の第一の目的は、外部の影響を受けている最中または受けた直後に測定動作を起動するために、時間に関して可能な限り正確に、光源の光ビームを用いて試料を走査するための方法について説明することにある。
【０００７】  また、本発明の第二の目的（別の目的）は、外部の影響を受けている最中または受けた直後に測定動作を起動するために、時間的に正確な精度を有するような装置および共焦点走査型顕微鏡を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  上述した第一の目的は、請求項１で明らかになる方法によって実現される。
【０００９】  本願の請求項１に係る方法は、光源の光ビームを用いて試料を走査するための方法であって、ビーム偏向装置を用いて前記光ビームを偏向するステップと、制御装置によって走査動作を制御するステップと、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置の関数として、前記制御装置によって少なくとも１つの信号を発生するステップであって、前記明確に定めることができる走査位置の局所座標が、検出される試料に基づいて自動的に規定され、好ましくはディジタル形式で前記制御装置に伝送されるステップと、それによって前記試料に作用するステップおよび／または測定動作を起動するステップと、を含んでいる。
【００１０】  また、上述した第二の目的（別の目的）はそれぞれ、請求項４に記載の装置および請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡によって実現される。
【００１１】  本願の請求項４に係る装置は、光源の光ビームを用いて試料を走査するための装置であって、前記光ビームを偏向するためのビーム偏向装置と、走査動作を制御し、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置を供給するための制御装置であって、前記試料に作用し、測定動作を起動するための信号を利用可能な状態にする制御装置と、前記走査光ビームの走行時間における差を補償するための論理演算装置と、を含んでいる。
【００１２】  本願の請求項５に係る共焦点走査型顕微鏡は、光源の光ビームを用いて試料を走査するための共焦点走査型顕微鏡であって、前記光ビームを偏向するためのビーム偏向装置と、走査動作を制御し、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置を供給するための制御装置であって、前記試料に作用し、測定動作を起動するための信号を利用可能な状態にする制御装置と、前記制御装置が高速の走査速度で高いタイミング精度を備え、データ処理が少なくともほぼ実時間で実行されるようになっていることと、前記走査光ビームの走行時間における差を補償するための論理演算装置と、を含んでいる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】  唯一の図面（図１）は、共焦点走査型顕微鏡の光源３の光ビーム２を用いて、試料１を走査するための装置を示している。光ビーム２は、ビーム偏向装置４によって偏向可能である。光ビーム走査動作は、制御装置５によって制御される。ビーム偏向装置４によって偏向された後に、光ビーム２は、顕微鏡光学系６を通過する。ビーム偏向装置４は、２つの互いに直交する方向に光ビームを偏向するジンバル搭載型ミラーを含む。試料からの反射光および／または蛍光は、顕微鏡光学系６およびビーム偏向装置４を逆方向に通過し、ビームスプリッタ７を通過した後、検出器８によって検出することができる。検出器８は、ディジタル化された強度値９を制御装置５に供給する。
【００１４】  本発明によれば、試料１に作用するための信号１１は、明確に定めることができる走査位置１０の関数として、制御装置５によって利用可能である。試料１における作用は、電圧によって試料１に作用するパッチクランプ装置１２および化学薬品または蛍光染料も試料に注入されることができるパッチクランプ装置１２によって加えられる。
【００１５】  明確に定めることができる走査位置１０の局所座標は、検出される試料データに基づいて規定することができる。そのため、第一に試料１の２次元共焦点画像が、コンピュータシステム１４の画像出力装置１３に記録および表示される。明確に定めることができる走査位置１０の局所座標の規定は、コンピュータマウス（図示せず）によって、共焦点走査型顕微鏡の利用者によって相互作用により達成される。明確に定めることができる走査位置１０の局所座標は、線１５によってディジタル方式で制御装置５に伝送される。
【００１６】  走査動作中の光ビーム２の現在位置は、制御装置５によって検知される。そのため、ビーム偏向装置４は、ディジタル形式で制御装置５に伝送される位置データ１６を利用できるようにする。
【００１７】  次に、制御装置５は、信号１１の発生の間のタイムスパン、または別の言い方をすれば光ビーム２が明確に定めることができる走査位置に達するまでの経過時間を再びディジタル形式で決定する。光ビーム２の走査速度および光ビーム２の瞬間的な位置は、この測定に組込まれる。光ビームに関する現在の位置データ１６は、走査中、明確に定めることができる走査位置１０に関する位置データと比較される。
【００１８】  このような具体的な用途において、制御装置５は、光ビーム２が明確に定めることができる走査位置１０に達する正確に２５０ナノ秒前に、信号１１を利用できるように構成される。この２５０ナノ秒は、正確には、所望の形式で最終的に試料１に作用させるために、対応する操作装置１７（概略的にのみ示す）を用いて、パッチクランプ装置１２に必要な時間である。明確に定めることができる位置１０への光ビーム２の到達と信号１１の発生との間のタイムスパン（すなわち２５０ナノ秒）は、入力手段１８によって制御装置５に入力される。
【００１９】  制御装置５は、光信号１１をパッチクランプ装置１２に対して利用可能であるようにし、光信号１１が単なる単一の光パルスであるようにする。操作装置１７を備えたパッチクランプ装置１２は、２５０ナノ秒の反応時間を有するため、試料の作用および明確に定めることができる走査位置１０への光ビーム２の到達が同時に起こる。
【００２０】  なお、本発明の教示を有利に具体化し、展開するためのさまざまな方法がある。図面を参照されたい。
【発明の効果】
【００２１】  この発明に係る方法は、光源の光ビームを用いて試料を走査するための方法であって、ビーム偏向装置を用いて前記光ビームを偏向するステップと、制御装置によって走査動作を制御するステップと、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置の関数として、前記制御装置によって少なくとも１つの信号を発生するステップであって、前記明確に定めることができる走査位置の局所座標が、検出される試料に基づいて自動的に規定され、好ましくはディジタル形式で前記制御装置に伝送されるステップと、それによって前記試料に作用するステップおよび／または測定動作を起動するステップと、を含んでいる。
【００２２】  また、この発明に係る装置は、光源の光ビームを用いて試料を走査するための装置であって、前記光ビームを偏向するためのビーム偏向装置と、走査動作を制御し、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置を供給するための制御装置であって、前記試料に作用し、測定動作を起動するための信号を利用可能な状態にする制御装置と、前記走査光ビームの走行時間における差を補償するための論理演算装置と、を含んでいる。
【００２３】  また、この発明に係る共焦点走査型顕微鏡は、光源の光ビームを用いて試料を走査するための共焦点走査型顕微鏡であって、前記光ビームを偏向するためのビーム偏向装置と、走査動作を制御し、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置を供給するための制御装置であって、前記試料に作用し、測定動作を起動するための信号を利用可能な状態にする制御装置と、前記制御装置が高速の走査速度で高いタイミング精度を備え、データ処理が少なくともほぼ実時間で実行されるようになっていることと、前記走査光ビームの走行時間における差を補償するための論理演算装置と、を含んでいる。
【００２４】  本発明によって認識されてきたことは、第一に、試料に作用するための信号または測定動作を起動するための信号が、厳密に正確な時間で制御装置によって利用可能な状態にされる場合には、試料における外部の影響および測定動作の同期化を容易に実現することができることである。したがって、外部論理演算装置が不必要になるため、好都合なことに、たとえば、試料に作用するための装置と共焦点走査型顕微鏡との間の直接結合を実現することができる。
【００２５】  本発明によれば、制御装置は、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置の関数として、信号を利用可能な状態にする。このような明確に定めることができる走査位置は、影響に対する試料の反応の観測が、正確にタイミングを計った画像によって実現することができるため、たとえば、試料が外部の影響を受けている最中または受けた後に走査対象である正確な画像点であってもよい。きわめて一般的に言えば、明確に定めることができる走査位置は、関連試料領域である。制御装置は試料走査動作を制御するため、光ビームが明確に定めることができる走査位置に達する瞬間も確認するような方法で、制御装置を構成してもよい。
【００２６】  明確に定めることができる走査位置の局所座標は、検出される試料データに基づいて規定されてもよい。たとえばミクロ注入用の試料は、対応するミクロ注入装置と共に準備されてもよく、この準備は従来の透過光顕微鏡法モードで実行されてもよい。このような場合には、試料の共焦点走査型顕微鏡画像が検出され、指定された焦点面がミクロ注入針の先端の位置する試料面であろう。検出される共焦点走査型顕微鏡画像に基づいて、ミクロ注入針の先端は、明確に定めることができる走査位置として正確に規定されてもよい。
【００２７】  明確に定めることができる走査位置の局所座標の規定は、自動的または相互作用により決定されてもよい。たとえば、ミクロ注入針の先端の画像は、パターン認識アルゴリズムを用いて、そのパターンに基づいて自動的に認識されてもよい。別法として、利用者は、明確に定めることができる走査位置の局所座標を相互作用により規定してもよい。明確に定めることができる走査位置の自動的に決定した後、追加的な別の明確に定めることができる走査位置に関して、相互作用により実現することも同様に考えられる。たとえば、自動的に決定される明確に定めることができる走査位置（ミクロ注入針の先端）に加えて、別の明確に定めることができる走査位置が利用者によって相互作用により実現されてもよい。たとえば、ミクロ注入操作に対する機能的な関係を有する試料点は、別の明確に定めることができる走査位置として選択されてもよい。したがって、この実施例では、一方では走査光ビームがミクロ注入針の位置に達するときに、他方では光ビームが試料点に達するときに、信号は制御装置によって利用可能になる。
【００２８】  明確に定めることができる走査位置の局所座標の相互作用による規定は、位置指示装置、好ましくは共焦点走査型顕微鏡の制御コンピュータに接続されるコンピュータマウスを用いて実現される。
【００２９】  明確に定めることができる走査位置の規定される局所座標は、好ましくはディジタル方式で制御装置に伝送される。したがって、たとえば、試料に作用する準備がなされている明確に定めることができる走査位置は、制御装置によって認識される。
【００３０】  また、検知すべき光ビームの現在位置に関して、設備を備えている。このため、たとえば、ビーム偏向装置は、光ビームの現在位置に関しての位置データを利用してもよい。このような位置データは、電子処理可能なデータまたはディジタルデータに変換されてもよい。したがって、電子処理可能な状態にされた位置データは、電子処理可能なデータすなわちディジタルデータに変換されてもよい。次の方法ステップにおいて、位置データは制御装置に伝達される。
【００３１】  信号が利用可能になるまでの経過時間または光ビームが明確に定めることができる走査位置に達するまでの経過時間は、同様に電子処理可能なデータまたはディジタルデータに変換されてもよい。秒からナノ秒の範囲でディジタル化されるタイムスパンが対応する高解像度によりディジタル方式で表現されなければならないため、ディジタル化には少なくとも１６ビット必要である。
【００３２】  具体的な方法ステップにおいて、光ビームの走査速度および明確に定めることができる走査位置の局所座標に基づき、信号が利用可能になるまでの経過時間または光ビームが明確に定めることができる走査位置に達するまでの経過時間の計算を実行するために、論理演算装置が設けられる。このような論理演算装置は制御装置に関連していることが好ましいが、制御装置に組込まれていてもよい。光ビームの特定の走査モード、たとえば多重線平均化も、論理演算装置によって考慮される。付加的に、光ビームの現在位置に関しても、経過時間の計算が考慮される。
【００３３】  さらに、走査中の光ビームに関する位置データおよび明確に定めることができる走査位置の位置データとの間の比較も行われる。付加的に、ビーム偏向装置（すなわち光ビームの）の実際の位置と制御装置によって規定された参照位置との間の比較のための対策も行われる。この比較は、特に、高精度の同期化に重要な必要条件を表す。この方法ステップは、制御装置にも組込まれる論理演算装置によって実行されてもよい。
【００３４】  特に好都合な方式において、光ビームが明確に定めることができる走査位置に達する前および／または後に、制御装置は、試料に作用する信号および／または測定動作を起動するための信号を利用可能にする。特に、光ビームが明確に定めることができる走査位置に達する前に、制御装置が信号を利用可能にする場合には、それによって、たとえば試料に作用する装置の反応／作動時間に対応する対応遅延時間を保証することができる。特に、試料における作用が光ビーム自体によって引き起こされるような「ケージ化化合物」用途では、光ビームが明確に定めることができる走査位置に達するまで信号が利用可能でない場合にはきわめて好都合である可能性がある。この場合には、たとえば、細胞膜の電位の変化の測定が起動されてもよい、すなわち測定動作が十分に定義された時間に実行され得る。
【００３５】  特に好都合な方式において、タイムスパンは、明確に定めることができる走査位置に光ビームの到達と信号の生成との間で定義される。この定義は、特に最終的に試料に作用するために、試料に作用するための装置が一定の時間を必要とする場合に、試料に作用するための装置の可能起動時間を考慮することができる。この場合には、タイムスパンは、光ビームが明確に定めることができる走査位置に達する前に、制御装置が信号を利用可能であるように選択する必要があるであろう。
【００３６】  制御装置は、電気信号を利用可能にすることが好ましい。光信号または音響信号もまた考えられる。本願明細書では、特に、試料のきわめて小さな電圧および／または電流が測定され、試料に作用するまたは試料を測定するための装置からの共焦点走査型顕微鏡の電気的切離しは、このための重要な変数を表すため、たとえば、特にパッチクランプ用途では、光信号は、信号の零電位伝送に関して重要であってもよい。
【００３７】  本願明細書では、光源の光ビームを用いて試料を走査するための本発明による装置は、共焦点走査型顕微鏡で実現されることができ、光ビームはビーム偏向装置を用いて偏向することができる。ビーム偏向装置は一般に、検流計作動素子によって枢動または回転される１枚以上のミラーを含む。
【００３８】  本発明によれば、制御装置は、少なくとも１つの明確に定めることができる走査位置の関数として、試料に作用するための信号および／または測定動作を起動するための信号を利用可能な状態にすることができる。したがって、本発明による共焦点走査型顕微鏡は、試料に作用するための信号または測定動作を起動するための信号が、対応する作用装置または測定装置にピックオフされることができる電子的インターフェイスおよび／または光学的インターフェイスを備える。
【００３９】  好ましい実施形態において、高いタイミング精度のために、走査ビームの走行時間における差を補償することができる具体的な論理演算装置が設けられる。この論理演算装置は、制御装置に関連していることが好ましい。
【００４０】  特に好都合な方式において、論理演算装置および制御装置におけるデータ処理は、現場でプログラム可能なゲートアレイ（ＦＰＧＡ）によって実現される。現在、たとえば約２５０ＭＩＰＳ（毎秒百万回の命令）まで実行することができるため、高い光ビーム走査速度であっても情報処理を行うことができる。しかし、ＦＰＧＡを用いる実質的な利点は、その絶対的な実時間処理能力にあり、１ナノ秒範囲で保証される応答を利用して再現可能な処理を実現することができることにある。したがって、データ処理は少なくともほぼ実時間で実行される。
【００４１】  以上説明したように、本願発明の方法によれば、外部の影響を受けている最中または受けた直後に測定動作を起動するために、時間に関して可能な限り正確に、光源の光ビームを用いて試料を走査することができ、また本願発明の装置および共焦点走査型顕微鏡によれば、外部の影響を受けている最中または受けた直後に測定動作を起動するために、時間的に正確な精度を有するような装置および共焦点走査型顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明による方法を実現するための本発明による装置を概略的に示した図である。
【符号の説明】１  試料、  ２  光ビーム、  ３  光源、  ４  ビーム偏向装置、  ５  制御装置、  ６  顕微鏡光学系、  ７  ビームスプリッタ、  ８  検出器、  ９  ディジタル化された強度値、  １０  明確に定めることができる走査位置、  １１  信号、  １２  パッチクランプ装置、  １３  画像出力装置、  １４  コンピュータシステム、  １５  線、  １６、現在の位置データ、  １７  操作装置、  １８  入力手段、
【図１】
0005439679.tif 000002