(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の界面活性剤モノマーと、少なくとも１種の架橋剤と、少なくとも１種の開始剤と、少なくとも１種のポロゲンとを含む混合物を提供する工程；および
前記混合物を重合させて界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムを形成する工程
を含む、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの製造方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種の界面活性剤モノマーが、約６〜約２０の範囲の炭素鎖長を有する炭化水素モノマー、官能性頭部基、および共役末尾基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記官能性頭部基がアミノ酸基を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種の界面活性剤モノマーが、疎水性炭素鎖と帯電基とを有する炭化水素モノマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１種の界面活性剤モノマーが、１１−アクリルアミドウンデカン酸、６−アクリルアミド−ヘキサン酸、７−アクリルアミド−ヘプタン酸、１７−アクリルアミド−ヘプタデカン酸、１８−アクリルアミド−オクタデカン酸、１９−アクリルアミド−ノナデカン酸、２０−アクリルアミド−エイコサン酸、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１種の界面活性剤モノマーが１１−アクリルアミドウンデカン酸を含み、前記少なくとも１種の架橋剤がエチレンジメタクリレートを含み、前記少なくとも１種の開始剤がアゾイソブチロニトリルを含み、さらに前記少なくとも１種のポロゲンが水、１，４−ブタンジオール、および１−プロパノールを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記提供および重合の工程を毛細管中で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記提供および重合の工程の前に前記毛細管をビニル化する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が少なくとも１種の第二のモノマーをさらに含み、前記重合工程が前記少なくとも１種の界面活性剤モノマーと前記少なくとも１種の第二のモノマーとを共重合させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１種の界面活性剤モノマーが、約０．５％（ｗ／ｗ）〜約７％（ｗ／ｗ）の範囲の量で前記混合物中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１種のポロゲンが、水、１，４−ブタンジオール、および１−プロパノールを含み、前記水が約２％（ｗ／ｗ）〜約１２％（ｗ／ｗ）の範囲の量で範囲の量で前記混合物中に存在し、前記１，４−ブタンジオールが約０％（ｗ／ｗ）〜約１２％（ｗ／ｗ）の範囲の量で前記重合混合物中に存在し、前記１−プロパノールが約６０％（ｗ／ｗ）〜約７４％（ｗ／ｗ）の範囲の量で前記重合混合物中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
界面活性剤をベースとしたポリマーモノリスを含む、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラム。
【請求項１３】
請求項１２に記載の界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムを含む、分離装置。
【請求項１４】
前記分離装置がクロマトグラフィーカラムである、請求項１３に記載の分離装置。
【請求項１５】
前記界面活性剤をベースとしたポリマーモノリスが疎水性部分と帯電部分とを含む、請求項１２に記載の界面活性剤をベースとしたモノリシックカラム。
【請求項１６】
前記帯電部分がアミノ酸基を含む、請求項１２に記載の界面活性剤をベースとしたモノリシックカラム。
【請求項１７】
前記界面活性剤をベースとしたポリマーモノリスが１１−アクリルアミドウンデカン酸ポリマーを含む、請求項１２に記載の界面活性剤をベースとしたモノリシックカラム。
【請求項１８】
界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムを提供する工程；
複数種の分子と移動相との混合物を提供する工程：および
前記混合物を前記界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムに通す工程
を含む、複数種の分子を互いに分離する方法。
【請求項１９】
キャピラリー電気泳動クロマトグラフィーを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
高速液体クロマトグラフィーを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数種の分子が複数種の極性分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記複数種の分子が複数種の無極性分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数種の分子が複数種の生体分子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムが疎水性部分および帯電部分を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記帯電部分がアミノ酸基を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムが１１−アクリルアミドウンデカン酸ポリマーモノリスを含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所から付与された助成金番号１Ｒ０１−ＧＭ−０６２３１４のもとで米国政府の支援を得て行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、クロマトグラフィー用のポリマーモノリシックカラムに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
粒子ベース充填クロマトグラフィーカラムの最近の使用は、スラリーに溶かした粒子を管に充填し、その後、充填管の両端のフリットをか焼して充填層を管中に保持することを含む。この手順は、科学というよりは技術であり、管に充填しフリットをか焼するためには熟練者が必要とされる。したがって、手作業で充填する粒子ベースクロマトグラフィーカラムは、個人差による重大な再現性の問題がある。
【０００４】
加えて、キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）で用いる粒子ベース充填カラムは、製造に時間がかかり、壊れやすく、泡が形成される傾向がある。泡が形成されると、保持時間およびピーク面積の再現性がなくなり、それゆえに粒子ベース充填カラムは、実世界の試料の分析に使用するには実用的でないものとなっている。
【０００５】
ポリマーモノリシック固定相は、伝統的な微粒子吸着剤の代替手段となり、試料分析に一定の利点をもたらす。従来の充填粒子固定相とは対照的に、モノリシック分離媒体は、多孔質構造を有する連続した硬質の棒状ポリマー（polymeric rod）からできている。粒子内空隙容量がないため、物質移動および分離効率が改善され、質の高い高速分離が可能になる。
【０００６】
ほぼ１０年の間、従来の充填カラムＣＥＣの代替手段としてのモノリシックカラムを使用したＣＥＣが、研究分野として成長してきた。ＣＥＣ用のモノリシックカラムの主な利点として次のような点がある：カラム調製の手順が複雑でなく、カラムの細孔構造が柔軟に調整され、フリットの必要性がなくなっており、カラム中の様々な官能性モノマーが選択的分離用として入手可能であり、さらに操作時の泡形成がなくなるかまたは減少している。それゆえに、モノリシックカラム技術の使用が増大してきており、新規の固定相およびカラム調製メカニズムが研究されつつある。さらに、多数の新規かつ魅力的な用途が、モノリシックカラム技術の使用から恩恵を受けることのできる生物学的分析、環境分析、および製剤分析において開発されてきた。
【０００７】
ＣＥＣに用いられる固定相は、分析物との望ましい相互作用をもたらす部位と電気浸透流（ＥＯＦ）を発生させる部位を提供するという二重の役割を果たす。例えば、ＣＥＣに使用されるメタクリレートベースモノリスの調製では、官能性モノマーの使用に加えて、帯電（charge-bearing）モノマー（２−アクリルアミド−２−メチル−１−プロパンスルホン酸など）が、安定したＥＯＦをもたらすために使用されることが多い。帯電可能な（chargeable）、それゆえにＣＥＣに適したモノリシックカラムが必要とされている。さらに、電気浸透流が向上したモノリシッククロマトグラフィーカラムが必要とされている。
【０００８】
従来の通常スケールの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に優るキャピラリーＨＰＬＣの利点も、認められてきた。そうした利点として、クロマトグラフィーの分解度（resolution）の増大、試料の消費の低減、興味を引く極めて少ない化合物を分析および分離できること、溶媒消費の低減およびエレクトロスプレー質量分析法との便利なオンライン接続がある。
【０００９】
１つまたは複数の前述の欠陥を低減または防止する、ＣＥＣおよびＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー用の更なるモノリシックカラムを提供することが望ましいであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、界面活性剤をベースとした（surfactant-based）モノリシックカラムの製造方法を提供する。本方法は、少なくとも１種の界面活性剤モノマーと、少なくとも１種の架橋剤と、少なくとも１種の開始剤と、少なくとも１種のポロゲン（porogen）とを含む混合物を提供する工程、およびその混合物を重合させて界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムを形成する工程を含む。
【００１１】
本開示はまた、界面活性剤をベースとしたポリマーモノリスを含む界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムを提供する。
【００１２】
本開示はさらに、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムを提供する工程、分子と移動相との混合物を提供する工程、および混合物を界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムに通す工程を含む、分子の分離方法を提供する。
【００１３】
本開示はさらに、１１−アクリルアミドウンデカン酸ポリマーの製造方法であって、その方法が、６〜２０個の炭素の鎖長および末尾基（tail group）を有するカルボン酸（ここで、末尾基がＮＨ２またはＯＨを含む）を提供する工程；カルボン酸を塩化アクリロイルと反応させて第１生成物を形成する工程；第１生成物を１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオンと反応させて第２生成物を形成する工程；および第２生成物をアミノ酸と反応させてアミノ酸官能基を含む界面活性剤モノマーを形成する工程を含む、１１−アクリルアミドウンデカン酸ポリマーの製造方法を提供する。
【００１４】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明、図面および請求項から明らかであろう。
【００１５】
本開示の多くの態様は、以下の図を参照することにより、よりよく理解することができる。図の更なる説明については、本文および実施例を参照されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の２つの実施態様（実施例１に記載したカラム７およびカラム１）におけるチオ尿素とアルキルベンゼン（Ａ１、Ｂ１）ならびにチオ尿素とアルキルフェニルケトン（Ａ２、Ｂ２）の分離に関する、電気クロマトグラムを示す。
【図２】本発明の実施態様におけるアルキルベンゼン分離の性能に関する回帰係数プロットを示す。
【図３】本発明の実施態様におけるアルキルフェニルケトン分離の性能に関する回帰係数プロットを示す。
【図４】本発明の実施態様による重合混合物中の成分のの関数として濃度の関数としてアルキルベンゼンの平均効率（Ｎａｖｇ）、平均分解度（Ｒｓ（ａｖｇ））および合計分析時間（Ｒｔ）に関して得られた等値線図（contour plot）を示す。
【図５】本発明の３つの実施態様の細孔径分布を示す図表である。
【図６】本発明の３つの実施態様で測定された移動相の流量に対する測定された圧力低下を示す図表である。
【図７】本発明の実施態様の移動相における、アセトニトリルの％（ｖ／ｖ）に対するアルキルベンゼンおよびアルキルフェニルケトンの対数保持係数（ｌｏｇ  ｋ’）のプロットを示す。
【図８】本発明の１つの実施態様における、チオ尿素、アルキルベンゼンおよびアルキルフェニルケトンについての見掛けの移動相流速の関数として平均段高さ（average plate height）を示すVan Deemterプロットである。
【図９】本発明の実施態様において得られたＮ−メチルカルバミン酸類（ＮＭＣ）殺虫剤のＣＥＣ分離のプロットである。
【図１０】本発明の２つの実施態様のタンパク質分離のクロマトグラムを示す。
【図１１Ａ】本発明の実施態様でのタンパク質分離性能の回帰係数プロットである。
【図１１Ｂ】本発明の実施態様でのタンパク質分離性能の回帰係数プロットである。
【図１１Ｃ】本発明の実施態様でのタンパク質分離性能の回帰係数プロットである。
【図１２】（Ａ〜Ｃ）等値線図であり、本発明の実施態様による重合混合物中の成分の濃度の関数としてタンパク質の平均効率（Ｎａｖｇ）、平均分解度（Ｒｓ（ａｖｇ））および合計分析時間（Ｒｔ）について得られたものである。
【図１３】本発明の３つの実施態様（実施例２に記載したカラム７、１０／ＯＨ−ｌ、およびＯＦ−１）の細孔径分布を示す図表である。
【図１４】本発明の２つの実施態様を用いたタンパク質分離のクロマトグラムである。
【図１５】本発明の３つの実施態様の細孔径分布を示す図表である。
【図１６】本発明の３つの実施態様（実施例２で記載したカラム７、１０／ＯＨ−１、およびＯＦ−１）での、測定された移動相流量に対する測定された圧力低下を示す図表である。
【図１７】本発明の２つの実施態様に従った、移動相の流速の関数としてタンパク質の平均段高さを示すVan Deemterプロットを示す（ａ：ＯＨ−１；  ｂ：ＯＦ−１）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
好ましい実施形態の詳細な説明
上に要約されているように、本開示は、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの製造方法、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラム、複数種の分子の分離方法、および界面活性剤モノマーの製造方法を包含する。本明細書で使用される「モノリス」および「モノリシック」という用語は、連続した相互連絡細孔構造（個々の粒子の集合とは区別される）を有する多孔質の三次元材料を包含する。本明細書で使用される「カラム」という用語は、円柱形状、円板形状、小片形状、細長い形状（例えば、多角形断面を有する毛細管形状）などの形状、あるいは移動相がカラムの少なくとも一部を通り抜けるのに適した任意の他の形状を有する、任意の三次元材料を指す。特に記載のない限り、％単位はすべて％（重量／重量）である。
【００１８】
特定の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは重合可能な界面活性剤モノマーから作られ、重合可能な界面活性剤モノマーは、少なくとも１種の架橋剤、少なくとも１種の開始剤、および少なくとも１種のポロゲンと一緒に、管またはカラム中で直接に重合される。
【００１９】
１つの実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの製造方法は、（ａ）炭素長が約６〜約２０の範囲である炭化水素鎖を有する界面活性剤モノマーの溶液を提供する工程、（ｂ）少なくとも１種の架橋剤、少なくとも１種の開始剤、および少なくとも１種のポロゲンを入れる工程、および（ｃ）原料（すなわち、重合混合物）を管またはカラム中で重合させて一体化させる工程を含む。
【００２０】
界面活性剤モノマーの実施態様は、界面活性剤の性質を有する。ある特定の実施態様では、界面活性剤モノマーは、官能基化された頭部基（カルボン酸（−ＣＯＯＨ）、アミノ酸基、スルホネート、サルフェート、アンモニウム、またはホスホニウムなど）と共役末尾基（アクリルアミドまたはアクリレートなど）とを有する、長さが約６〜約２０個の炭素の炭素鎖を含む。１つの実施態様では、界面活性剤モノマーは６〜１８個の炭素の鎖を含む。実施態様によっては、モノマーの鎖長は６より短くてもよいが、精製が難しくなりうる。他の実施態様では、重合可能な界面活性剤モノマーの鎖長は２０より長くてもよいが、モノマーの溶解度が減少しうる。界面活性剤モノマー、つまり帯電基を有する疎水性の長い炭化水素モノマーを使用することにより、別個の帯電分子（すなわち、荷電分子（charging molecule）または帯電可能分子）を重合混合物に加える必要がない。したがって、界面活性剤モノマーの特定の実施態様は、そのようモノマーから作られたポリマーのクロマトグラフィー保持能（chromatographic retention）は疎水性部分（例えば、長い炭素鎖）によってもたらされ、ＥＯＦは帯電分子によって提供されるので、「混合モード」と見なされる。
【００２１】
本開示の実施態様に用いられる好適な界面活性剤モノマーとしては、１１−アクリルアミドウンデカン酸（ＡＡＵＡ）、６−アクリルアミド−ヘキサン酸、７−アクリルアミド−ヘプタン酸、１７−アクリルアミド−ヘプタデカン酸、１８−アクリルアミド−オクタデカン酸、１９−アクリルアミド−ノナデカン酸、２０−アクリルアミド−エイコサン酸、またはこれらの組み合わせがあるが、それらに限定されない。１つの実施態様では、界面活性剤モノマーはキラルモノマーである。特定の実施態様では、界面活性剤モノマーは、約０．５％（ｗ／ｗ）〜約７％（ｗ／ｗ）の範囲の量で重合混合物中に存在する。
【００２２】
少なくとも１種の架橋剤として、使用するモノマーを架橋させるのに有効な任意の好適な架橋剤（市販の架橋剤を含む）を挙げることができる。好適な架橋剤の例として、エチレンジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、ペンタエリトリトールジアクリレートモノステアレート（ＰＥＤＡＳ）、ジビニルベンゼン、ピペラジンジアクリルアミド（ＰＤＡ）、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジアリル−Ｌ−酒石酸ジアミド、Ｎ，Ｎ’−ジアリル−酒石酸ジアミドまたはこれらの組み合わせがあるが、それらに限定されない。実施態様によっては、架橋剤は市販の架橋剤であってよい。特定の実施態様では、架橋剤は、約１８．５％（ｗ／ｗ）〜約２１．３％（ｗ／ｗ）の範囲の量で重合混合物中に存在する。
【００２３】
少なくとも１種の開始剤としては、選択された重合可能な界面活性剤モノマーの重合を開始させるのに有効な周知の開始剤を挙げることができる。好適な開始剤の例としては、アゾイソブチロニトリル（ＡＩＢまたはＡＩＢＮ）、ペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）／テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、またはこれらの組み合わせがあるが、それらに限定されない。実施態様によっては、開始剤は市販の開始剤であってよい。ほかの実施態様では、紫外線（５３０ｎｍ）および６０Ｃ０のγ放射線源を用いた光重合を使用して、重合を開始させることもできる。特定の実施態様では、開始剤は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）の範囲の量で重合混合物中に存在する。
【００２４】
少なくとも１種のポロゲンは、モノリスの重合において細孔構造の調節（例えば、細孔径の制御）に使用することもできる。好適なポロゲンとしては、１−プロパノール、１，４−ブタンジオール、水、アセトニトリル、メタノール、ドデカノール、デカノール、シクロヘキサノール、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドまたはこれらの組み合わせがあるが、それらに限定されない。
【００２５】
ポロゲンの濃度および比率を変更して、所望の細孔構造になるようにすることができる。特定の実施態様では、ポロゲンは、水（約２％（ｗ／ｗ）〜約１２％（ｗ／ｗ）の範囲の量で重合混合物中に存在する）、１，４−ブタンジオール（約０％（ｗ／ｗ）〜約１２％（ｗ／ｗ）の範囲の量で重合混合物中に存在する）、および１−プロパノール（約６０％（ｗ／ｗ）〜約７４％（ｗ／ｗ）の範囲の量で重合混合物中に存在する）を含みうる。
【００２６】
他の実施態様では、界面活性剤モノマーは、少なくとも１種の架橋剤、少なくとも１種の開始剤、および少なくとも１種のポロゲンを用いて、コポリマーモノマーと共重合させることができる。本開示の実施態様に用いるのに好適なコポリマーモノマーとしては、メタクリル酸メチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ベンジル、メタクリル酸グリセリル、ブチルアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、またはこれらの組み合わせがあるが、それらに限定されない。
【００２７】
モノリスの形成方法の１つの実施態様では、モノマーおよび他の成分を市販の毛細管またはカラム中でインサイチューで重合させる。管およびインサイチューの原料は、重合が起こっている間、重合温度に維持される。実施態様によっては、重合温度は室温より高い。他の実施態様では、重合温度は約４５℃〜約７０℃の範囲である。さらに別の実施態様では、重合温度は約６０℃である。重合温度は、重合および架橋が完了するかまたはほぼ完了するのに十分なほど長く維持される。したがって、特定の実施態様では、重合温度は約１０時間より長く維持される。他の実施態様では、重合温度は１５時間より長く維持される。さらに別の実施態様では、重合温度は約２０時間維持される。
【００２８】
ある特定の実施態様では、重合は、ビニル化（すなわち、シラン化処理）された毛細管で実施することができる。例えば、毛細管は、更なる重合を行うためのビニル基を提供するため、毛細管中で界面活性剤モノマーを重合させる前に、メタクリル酸３−（トリメトキシシリル）プロピルでビニル化することができる。メタクリル酸３−（トリメトキシシリル）プロピルはヒドロキシル基を含むので、それはシラン上のアルコキシ基を攻撃し、それに置き代わり、−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−共有結合を形成することになる（すなわち、シラン化処理）。
【００２９】
１つの実施態様では、重合可能な界面活性剤モノマーはＡＡＵＡであり、これは、スキーム１に示されているように、水性エタノールおよび水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）緩衝液の存在下で１１−アミノウンデカン酸および塩化アクリロイルから合成される。示されているように、合成されたＡＡＵＡモノマーは、疎水性相互作用を示す長さがＣ１１の炭化水素鎖、アクリルアミド末端の重合可能な基、およびＥＯＦを生み出す帯電可能部位となるカルボキシル基を有する。この種のモノリスは、官能性モノマーのほかにイオン化性モノマーも導入するということが必要ではなくなるので、有利である。同じくスキーム１に示されているように、ＥＤＭＡを架橋剤として入れ、ＡＩＢＮを開始剤として使用する。重合ポリマーの細孔構造は、一体化段階の間に、１−プロパノール、１，４−ブタンジオール、および水を含むポロゲンを添加することによって制御される。
【００３０】
スキーム１から分かるように、約２０時間にわたって６０℃という高温に維持することにより、モノマーおよび他の成分は一体化して多孔質ポリマーになる。その結果、架橋した界面活性剤をベースとしたポリマー（すなわち、ポリ（ＡＡＵＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ））が製造される。スキーム１に示されている反応の実施態様で用いられる重合混合物の成分の濃度範囲を表１に示す。
【化１】
0005539312.tif 000002
【００３１】
【表１】
0005539312.tif 000003
【００３２】
界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの製造方法の別の実施態様は、スキーム２Ａ〜Ｂから分かるように、アミノ酸官能基を含むモノマーを用いて合成される。この実施態様では、多孔質ポリマーは、ＯＨ末尾を有する６〜２０個の炭素のカルボン酸から出発して適切な離脱基を有するモノマーの溶液を合成し、スキーム２Ａ〜Ｂ（スキーム中、ＴＥＡはトリエチルアミンであり、ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミドである）に見られる反応によって、それを塩化アクリロイルと反応させてから、ｌ−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオンと反応させることにより、製造できる。本方法はさらに、任意のアミノ酸（Ｒ）から選択される官能基をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と水との緩衝溶液に入れて所望の選択特性を有する界面活性剤モノマーを作り出し、架橋剤、ＥＤＭＡ、および開始剤（ＡＩＢＮ）を入れ、一体化段階の間に、溶液中に存在するポロゲン（１−プロパノール、１，４−ブタンジオール、および水など）の濃度を変えることによって多孔質材料の細孔構造を変え、長時間にわたって高温にすることによって成分材料を一体化して重合モノリスカラムにすることを含む。
【化２】
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【化３】
0005539312.tif 000005
【化４】
0005539312.tif 000006
【化５】
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【化６】
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【００３３】
特定の理論に縛られるわけではないが、得られるモノリシックカラムの細孔径および選択性は、少なくとも１種の架橋剤、少なくとも１種の開始剤、および少なくとも１種のポロゲンの濃度および種類（identities）、ならびに界面活性剤モノマーの濃度および鎖長を変えることによって制御できると考えられる。特定の実施態様では、得られるクロマトグラフィー界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムのクロマトグラフィー選択性は、所望の選択性をもたらすのに適した特定のアミノ酸官能基を導入することによって制御できる。
【００３４】
スキーム３Ａ〜Ｂに示されている本発明の別の実施態様により、得られるクロマトグラフィー界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムのクロマトグラフィー選択性の制御が可能になる。このモノリスは、（ａ）ＮＨ２末尾を有する６〜２０個の炭素のカルボン酸から出発して適切な離脱基を有するモノマーの溶液を合成し、スキーム３Ａ〜Ｂ（ここで、ＴＥＡはトリエチルアミンであり、ＥｔＯＨはエタノールであり、ＮａＯＨは水酸化ナトリウムであり、ＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミドである）に見られる反応によって、それを塩化アクリロイルと反応させてから、１−ヒドロキシピロリジン−２，５−ジオンと反応させ、（ｂ）スキーム２中のアミノ酸（Ｒ）などのアミノ酸から選択される官能基を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）と水との緩衝溶液に入れて特定の選択特性を有する界面活性剤モノマーを作り出し；（ｃ）架橋剤（ＥＤＭＡなど）および少なくとも１種の開始剤（ＡＩＢＮなど）を入れ；（ｄ）ポロゲン（ｌ−プロパノール、１，４−ブタンジオール、水など）の濃度を変えることによって多孔質材料の細孔構造を変え；さらに（ｅ）ある期間にわたって高温にすることにより成分材料を一体化して重合モノリスカラムにすることによって製造される。
【化７】
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【化８】
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【００３５】
したがって、説明した方法で作られる界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの実施態様は、界面活性剤をベースとしたポリマーを含む。
【００３６】
本発明の実施態様に従って製造されるモノリシックカラムは、さまざまな分析分離に使用できる。実施態様によっては、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは分離装置の一部である。例えば、本発明によるカラムは、ＨＰＬＣ法（ナノＨＰＬＣおよびマイクロＨＰＬＣを含む）、ＣＥＣ、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、及び／または超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）に使用できる。１つの実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、ＣＥＣで用いるための陰イオン界面活性剤をベースとしたモノリシック固定相を含む。
【００３７】
本発明の実施態様に従って界面活性剤モノマーから作られるカラムは、小分子と生体分子の分析分離に特に好適であろう。本発明の実施態様によるモノリシックカラムは、モノマーの界面活性剤特性のゆえに、ナノＨＰＬＣ、マイクロＨＰＬＣ、およびＣＥＣに特に適している。そのようなモノリス材料は、例えば、分取ＨＰＬＣカラムおよび固相抽出ディスク（生体試料から正電荷を帯びた薬物を分離するのに用いられる）での使用に好適であろう。
【００３８】
Ｃ６以上の鎖長の界面活性剤モノマーから製造される本発明によるモノリシックカラムは、電気浸透流の向上を示す。
【００３９】
特定の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、約６０％〜約９０％の範囲の全孔隙率を有する。他の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、約１０−１４ｍ２〜約１０−１２ｍ２の範囲の比透過性を有する。さらに別の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、約１０００ｍｍ３／ｇ〜約３０００ｍｍ３/ｇの累積細孔容積を有する。さらに別の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、約０．１μｍ〜約１０μｍの範囲の平均細孔径を有する。別の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、約０．２ｇ／ｍ３〜約１．０ｇ／ｍ３の範囲のバルク密度を有する。他の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、約１０ｍ２／ｇより大きい表面積を有する。
【００４０】
本開示はさらに、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムを提供する工程、複数種の分子の混合物および移動相を提供する工程、および混合物を界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムに通す工程を含む、複数種の分子を互いに分離する方法を含む。
【００４１】
１つの実施態様では、この方法は、本明細書に記載したモノリシックカラムの実施態様を用いて小さな極性分子を分離することを含む。本開示はまた、本明細書に記載したモノリシックカラムの実施態様を用いて小さな無極性分子を分離する方法を含む。本開示はまた、本明細書に記載したモノリシックカラムの実施態様を用いて、大きな生体分子（タンパク質、タンパク質消化物、およびポリペプチドなど）を分離する方法を含む。
【００４２】
分離方法の実施態様では、移動相（アセトニトリル（ＡＣＮ）、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフランなど）および様々な種類の緩衝液（酢酸緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸塩緩衝液（borate buffer）、またはそれらの組み合わせなど）を使用する。１つの実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、平均分解度が約１．０〜約２．０である。別の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、分析時間が約３０分未満である。さらに別の実施態様では、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、平均効率が約１０４〜１０６の範囲である。
【００４３】
特定の理論に縛られるわけではないが、有機ポリマーモノリスの特性の調節の際に考慮されるのは、重合混合物の組成へのその特性の依存であるという点が注目される。カラム性能はモノリシック材料の形態に左右されるので、そのような考慮事項が考慮される。ポリマーモノリシックカラムでは、カラムの性能に影響を及ぼすのは、微小球（microglobule）の平均径と細孔径との組み合わせである。したがって、重合混合物の組成により、モノリスの細孔構造が制御される。それゆえに、重合混合物の成分比を変化させると、種々の特性（すなわち、物理的性質および化学的性質）を有するモノリシックカラムが生み出され、それによって種々の保持性能がもたらされる。
【００４４】
ここでもまた理論には縛られるわけではないが、ＥＯＦ速度（ｕｅｏｆ）は式Ｉを用いて計算できる：
【数１】
0005539312.tif 000011
（式中、Ｌｅｆｆは毛細管の有効長さであり、ｔ０はＥＯＦマーカー（EOF marker）の移動時間である。）
【００４５】
毛細管中で製造されるモノリスの実施態様の孔隙率は、フロー法で測定および検査することができる。例えば、移動相の線速度は、不活性トレーサー（チオ尿素）で測定することができ、容積流量も測定することができる。その後、周知の空の管の寸法を用いて、全孔隙率εＴを式ＩＩによって計算できる：
【数２】
0005539312.tif 000012
式中、εＴは全孔隙率であり、Ｖ（ｍＬ／分）は移動相の容積流量、ｒ（ｃｍ）は空のカラムの内部半径であり、ｃ（ｃｍ／分）は移動相の線速度（保持されない化合物であるチオ尿素によって求めた）である。様々な流量で得られた孔隙率の平均値は、モノリスの全孔隙率と見なすことができる。
【００４６】
多孔質媒体の透過性は、圧力低下を生じさせることによって生み出される流体伝達能力の尺度である。溶媒粘度およびカラム孔隙率と結びついているDarcyの法則により、比透過性Ｋ０の定義が導かれ、界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの実施態様の比透過性は、式ＩＩＩを用いて計算できる：
【数３】
0005539312.tif 000013
式中、ｕ（ｍ／ｓ）は溶離剤の線速度であり、η（Ｐａ・ｓ）は溶離剤の動的粘度であり、Ｌは有効カラム長（ｍ）であり、Δｐは圧力低下（Ｐａ）である。
【００４７】
別の態様を以下に実施例で示すが、それは、本開示の範囲に制限を加えるものとは決して解釈されるべきではない。それどころか、その中の説明を読んだ後、本開示の範囲および添付の特許請求の範囲から逸脱しない範囲で当業者に思い浮かびうる、それらの実施例の他の様々な態様、変更形態、および同等形態を用いることができることをはっきり理解すべきである。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例は、ＣＥＣおよびＨＰＬＣ用に調製および使用される界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの実施態様について説明している。界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムは、次の目的で使用した：（ａ）実施例１においては、ＣＥＣによる小さな無極性分子（例えば、アルキルベンゼンおよびアルキルフェニルケトン）および小さな極性分子（例えば、極性殺虫剤）の分離、（ｂ）実施例２においては、マイクロＨＰＬＣによる大きな分子（例えば、タンパク質およびタンパク質消化物）の分離（これは、勾配溶出が必要であり、アイソクラチックＣＥＣまたはミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）で分解するのが難しい）；および（ｃ）強力な発色団が欠如している化合物の検出能の向上。選択性および感受性の向上した形で分子および構造に関する情報得るために、ＣＥＣ−ＭＳおよび大気圧光イオン化を殺虫剤の分離に使用した。
【００４９】
界面活性剤をベースとしたモノリスの物理特性およびクロマトグラフィー特性の実験計画およびモデリングも、重合混合物の組成物に関して、これらの実施例で行った。モノリシックカラムの実験計画は、一度に１つの因子を変化させ、残りのものを一定に保つようにして行われることが多い（すなわち、一変量アプローチを使用）。残念ながら、複数因子の相互作用が関係している場合、一変量アプローチはうまくゆかない。したがって、一変量アプローチは大域解析を保証するものとはならない。多変量実験計画は有用な道具であり、これは、モノリシックカラム調製における実験因子を特定するのにより効率的な方法である。
【００５０】
重合混合物中のモノマー、架橋剤およびポロゲンの各濃度は、モノリスのクロマトグラフィー性能（例えば、分解度、効率および分析時間）に影響を及ぼすものであるが、それらはＤ最適実験計画によって体系的に評価された。その後、重合モデルの妥当性を予測条件での実験によって確認した。モノリスの物理的性質（形態、孔隙率、透過性、および機械的安定性など）も様々な分析技術を用いて評価した。
【００５１】
実施例１：ＣＥＣおよびＣＥＣ−ＭＳでの溶質のアルキルベンゼン／アルキルフェニルケトン
薬品および標準品。界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムを作り出すのに用いた試薬には、ＥＤＭＡ、１−プロパノール、ＡＩＢＮ、および１１−アミノウンデカン酸（すべて、Aldrich（Milwaukee，WI，USA）からのもの）；γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、塩化アクリロイルおよびＮ−メチルカルバミン酸（ＮＭＣ）標準品、アルキルベンゼン（ＡＢ。メチル基〜ブチル基の範囲の側鎖を有するもの）およびアルキルフェニルケトン（ＡＰＫ。メチル基〜オクチル基の範囲の側鎖を有するもの）（これらはすべてSigma（St．Louis，MO，USA）からのものである）が含まれていた。１，４−ブタンジオールおよびメタクリル酸ブチルはFluka（Buchs，Switzerland）から購入した。
【００５２】
ＥＤＭＡを除いて、試薬はすべて受け取ったままの状態で使用した。ＥＤＭＡは、使用前に以下の手順によって真空下で蒸留によって精製した：  ５０ｍＬのＥＤＭＡを最初に、３０ｍＬの真空漏斗を用いて２ｃｍのＡｌ２Ｏ３層によって濾過した。その後、濾過したＥＤＭＡを真空下で蒸留した。蒸留が始まったとき、装置を通ってきたＥＤＭＡの最初の数滴は捨てた。元の丸底フラスコ中に残る未蒸留のＥＤＭＡがおよそ５ｍＬだけになるまで、蒸留が行われるようにした。
【００５３】
１１−アクリルアミドウンデカン酸（ＡＡＵＡ）の合成。ＡＡＵＡの合成は、スキーム１に示すようにして実施した。最初に、エタノール水溶液（２５０ｍｌの無水エタノール／３５ｍｌの蒸留水）を用いて１０ｇの１１−アミノウンデカン酸を溶かした。この溶液に６ｇのＮａＯＨをゆっくり加えて、透明な溶液を得た。次に、６ｍｌの塩化アクリロイルを滴加し、反応混合物は、磁気撹拌子（magnetic stir bar）を用いて約７の速度において１０℃のすぐ下でおよそ３時間攪拌し、その後濾過した。濾過液を１Ｍ塩酸で酸性にし、３回脱イオン化した水で洗浄した。濾過液中に形成された白色の沈殿物を濾過で回収した。粗生成物を水性エタノールから再結晶させ、濾過し、凍結乾燥で乾燥させた。ＡＡＵＡの純度を、エレクトロスプレイイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、Ｈ１ＮＭＲおよび元素分析で調べた。
【００５４】
モノリシックカラムの調製。固定相の調製では、メタクリル酸３−（トリメトキシシリル）プロピルによって毛細管の内壁をビニル化した。その後、ＡＡＵＡ、ＥＤＭＡ、１−プロパノール、１，４−ブタンジオール、水、およびＡＩＢＮを、超音波によって混合して均一な溶液にし、窒素で１０分間洗浄した。長さが４５ｃｍのシラン化処理毛細管に、３５ｃｍの長さまで重合混合物を満たし、ゴムの隔壁で密閉し、次いでガスクロマトグラフィー（ＧＣ）オーブン中に入れて２０時間にわたり６０℃で重合させた。重合の反応スキームをスキーム１に示す。実験計画の各カラムは、２つずつ作成した。混合物が重合した後、ＨＰＬＣポンプを用いてモノリシックカラムをメタノールで１２時間洗浄して、未反応のモノマーおよびポロゲンを除去した。加熱電線ストリッパー（thermal wire stripper）を用いて、ポリマー床の横にオンカラム検出窓（on-column detection window）を作った。最後に、カラムを切断して４５ｃｍ（有効長さは３０ｃｍ）にした。
【００５５】
形態。細孔径および表面積の測定。モノリスの顕微鏡的形態は、Hitachi X-６５０（Hitachi，Japan）ＳＥＭ装置（７．５ｋＶおよびフィラメント電流４０ｍＡ）を用いて、走査型電子顕微鏡で評価した。モノリシックカラム試料を割って、２ｍｍの長さに切断し、両面カーボンテープを使用してアルミニウムスタブ上に配置した。その後、帯電を防止するために、SPI Sputter（SPI Supplies Division of Structure Probe，West Chester，PA，USA）（１分間、３０ｍＡ）を用いて、それらを金／パラジウム合金によるスパッタコーティングを行った。
【００５６】
細孔径分布データは、AutoPore IV ９５００水銀圧入ポロシメトリー（MIP，Micromeritics Instrument Corporation，GA，USA）によって得た。表面積データは、Micromeritics TriStar ３０００（Micromeritics Instrument Corporation，GA，USA）で実施した窒素吸着測定によって得た。細孔径分布および表面積を測定するための試験体を、同じ重合条件下で同じ混合物を用いて同時にガラスバイアル中で調製した。重合が完了したなら、モノリスのソックスレー抽出をメタノールで２４時間実施した。７０℃で２４時間、真空下でモノリスを乾燥させた後、窒素吸着および水銀圧入ポロシメトリーの実験を行った。
【００５７】
ＣＥＣの器械。電気クロマトグラフィーの実験はすべて、オートサンプラー、ダイオードアレー検出器、０〜３０ｋＶの高圧電源ならびにシステム制御およびデータ取得用のChemstationソフトウェア（Ｖ９．０）を備えた、Agilent CEシステム（Agilent Technologies，Palo Alto，CA）を用いて実施した。モノリシックカラムの洗浄および種々の移動相による平衡化には、Series III HPLCポンプ（Lab Alliance，State College，PA，USA）を使用した。溶融シリカ毛細管（ＯＤ  ３７５μｍ、ＩＤ  １００μｍ）は、Polymicro Technologies Inc．（Phoenix，AZ，USA）から入手した。
【００５８】
ＣＥＣの条件。ＣＥＣに用いた分離電圧は＋２５ｋＶであり、分離の間、１２バールの圧力を両端に加えた。移動相は、６０％（ｖ／ｖ）のＡＣＮと４０％（ｖ／ｖ）の５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）とから構成されていた。使用する前に、移動相を０．２μｍの膜に通して濾過した。試料を＋５ｋＶで３秒間注入し、カラム温度を２５℃に維持した。ＵＶ検出波長は２１４ｎｍに設定した。
【００５９】
計算。分解度（Ｒｓ）および効率（Ｎ）は、chemstationソフトウェア（Agilent Technologies，Palo Alto CA）で計算した。式Ｉを用いてＥＯＦ速度（ｕｅｏｆ）を計算した。
【００６０】
毛細管中に調製したモノリスの孔隙率はフロー法で調べた。簡単に言うと、移動相の線速度は、不活性トレーサー（チオ尿素）で測定し、容積流量も測定した。その後、知られている空の管の寸法を用いて、式ＩＩで全孔隙率εＴを計算した。種々の流量で得られた孔隙率の平均値をモノリスの全孔隙率と見なした。透過性は、式ＩＩＩを用いて計算した。
【００６１】
実験計画。Design−Expert（バージョン７．０．３，Stat-Ease，Inc．Minneapolis，MN）を用いて、データ処理（統計計算）のための実験計画を作り出し、等値線図を作り出した。実験計画変数は次の５つの因子を含む。Ａ：架橋剤の濃度（ＥＤＭＡの％）、Ｂ：モノマーの濃度（ＡＡＵＡの％）、Ｃ：１−プロパノールの濃度（１−プロパノールの％）、Ｄ：１，４−ブタンジオールの濃度（１，４−ブタンジオールの％）およびＥ：水の濃度（水の％）。
【００６２】
重合混合物中のＡＡＵＡの％、ＥＤＭＡの％、１−プロパノールの％、１，４−ブタンジオールの％および水の％は、予備試験に基づいて設定した。重合混合物中のＥＤＭＡの％は、１８．５％〜２１．３％の範囲に設定した。ＥＤＭＡの％が１８．５％未満であるとき、生み出されるモノリスは機械的安定性が小さくなることが見出された。その一方で、ＥＤＭＡの％が２１．３％より大きいと、モノリスの透過性効果が小さくなった。ＡＡＵＡの％が７．０％より大きいと、不均一な重合混合物になった。それゆえに、上限としてＡＡＵＡの％として７．０％を設定した。ＡＡＵＡの％が１．８％未満である場合、モノリシックカラムはＣＥＣ分離での性能が低下すること示した。１−プロパノールの％の範囲は６０．０％〜７４．０％であった。１，４−ブタンジオールの場合、１２．０％より高いと、不均一なモノリスマトリックスとなった。それゆえに、１，４−ブタンジオールの％は０％〜１２％に設定した。水分に関しては、水の％が２．０％より低いと、ＣＥＣ分離での分解度が低下した。しかし、水の％が１２．０％より高いと、不均一な重合混合物となった。５つの成分の総濃度は９９．５％に維持し、開始剤（ＡＩＢＮ）を０．５％に固定した。因子の上限および下限を表１に要約してある。
【００６３】
こうした限度により、直交性が得られない不規則な実験領域が生み出された。この実施例では、重合混合物の組成物をそうした制限条件に従わせ、この論理的根拠に基づいて上述の実験計画を用いた。なぜなら、それは、因子の幾つかを制限範囲で変化させることしかできない実験にとって適切だったからである。
【００６４】
２つのレベルで５つの設計変数を詳しく調べた。その結果、２５の実験から構成される最終実験行列が得られた。分子量の小さい溶質の２種類の同族列（５種類のＡＢおよび７種類のＡＰＫ）をモデル試験分析物として用いた。これら２種類の同族列分析物の平均分解度（Ｒｓ（ａｖｇ））、分析時間（Ｒｔ。ＡＢおよびＡＰＫの最後の同族体の保持時間として測定）および平均効率（Ｎａｖｇ）を、応答として使用した。実際の実験から得られたデータをすべてDesign-Expertソフトウェアに入力した。その後、データを、Ｆ−検定および不適合度検定に基づいて選択した線形モデルにあてはめた。観察された影響は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて検定した。界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの特性に影響を与える因子間の相互作用を示すため、二次元等値線図をソフトウェアで作成した。最後に、Design-Expertソフトウェアで利用可能なDerringerのディザイラビリティ関数のオプションを用いて、すべての変数の組み合わせの特に望ましい実施態様を見つけた。
【００６５】
結果および考察。簡単に言えば、実験計画は、電気クロマトグラフィーのパラメーターが、重合混合物中のＡＡＵＡモノマーおよび水ポロゲンの濃度に強く依存することを示している。効率、分解度、および保持時間に関して、予測値と実験値との間の相対標準偏差（ＲＳＤ）の差がそれぞれ６％、８％および１３％であったことは、提案されたアプローチが実際的であることを確証した。モノリシックカラム３を用いて、５種類のＡＢをおよそ１５分間で完全に分離することができ、６種類のＡＰＫを１９分たたない間に分離することができた。クロマトグラフィーの結果は、モノリシックカラムの特に望ましい実施態様によって、アルキルベンゼン（ＡＢ）およびアルキルフェニルケトン（ＡＰＫ）の同族体の分離を１０８，０００段数／ｍまでの効率で行うことができたことを示す。したがって、このタイプの混合モード界面活性剤（帯電可能部位と疎水性部位の両方を含む）をＣＥＣ固定相として使用できることが示された。
【００６６】
電気クロマトグラフィー特性への重合混合物の組成の影響。表２は、２５の実験の実験計画および応答を示す。
【００６７】
【表２】
0005539312.tif 000014
【００６８】
Ｒｓ（ａｖｇ）の範囲は、ＡＢの場合０〜２．６であり、ＡＰＫの場合０〜３．５であるが、Ｎａｖｇは、ＡＢの場合３，０００〜１０８，０００の範囲であり、ＡＰＫの場合３，２００〜９８，１００の範囲であった。加えて、Ｒｔは、ＡＢおよびＡＰＫのそれぞれについて、それぞれ１．０分および０．８分という短いものと、１８．８分および２２．６分という長いものがあった。図１は、実験計画の実験で得られた、ＡＢおよびＡＰＫの同族列についての代表的な電気クロマトグラムうちの３つ［すなわち、それぞれカラム（すなわち、実験）１、カラム３およびカラム７（表２を参照）］を示す。要約すると、条件は以下のとおりであった：移動相、５ｍＭリン酸緩衝液中に６０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮ（ｐＨ７．０）；印加電圧  ＋２５ｋＶ；検出、２１４ｎｍ；試料濃度、０．８ｍｇ／ｍｌ；動電注入（electrokinetic injection)、５ｋＶ、３秒間；ＡＢ（Ａ）の場合：ピーク１、チオ尿素；ピーク２、ベンゼン；ピーク３、トルエン；ピーク４、エチルベンゼン；ピーク５、プロピルベンゼン；ピーク６、ブチルベンゼン；ＡＰＫ（Ｂ）の場合：ピーク１、チオ尿素；ピーク２、アセトフェノン；ピーク３、プロピオフェノン；ピーク４、ブチロフェノン；ピーク５、バレロフェノン；ピーク６、ヘプタノフェノン；ピーク７、オクタノフェノン。
【００６９】
カラム７は、同族ＡＢまたはＡＰＫの分離がほとんどまったく行われなかったので、全実験の中であまり望ましくない結果の１つに相当する。しかし、カラム３およびカラム１は、同族試験混合物の同じ２つの種類に関してより、望ましい分離の１つを示した。この傾向は、重合混合物の組成が、得られたモノリスのクロマトグラフィー性能に影響を及ぼすことを示していた。
【００７０】
応答パラメーターのそれぞれについてモデルを開発した。得られたモデルは、因子係数を直接比較することによって各因子の相対的影響を特定するのに役立つ数学的方程式だった。線形回帰モデルでは、あてはめた式は以下の形であった。
ｙ＝β０＋β１Ａ＋β２Ｂ＋β３Ｃ＋β４Ｄ＋β５Ｅ          式ＩＶ
式中、ｙは予測応答であり；β０は切片であり；β１、β２、β３、β４、β５はそれぞれ、５つの因子（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）の係数である。正の相互作用係数は、対応する因子が応答に正比例することを示した。一方、負の相互作用係数は、因子が応答と逆比例する、すなわち、因子が大きくなるほど、応答が小さくなることを意味した。
【００７１】
計算された経験的モデルはＡＮＯＶＡで評価したが、モデルの有効性はモデルの不適合度を検定することによって確かめた。全モデルのＡＮＯＶＡデータ（平方和、平均平方、Ｆ値、およびＰｒｏｂ＞Ｆ値を含む）を表３に列挙する。Ｎａｖｇの場合、最大応答と最小応答との比が１０より大きかったので（ＡＢの場合は３６、ＡＰＫの場合は４９）、ＡＮＯＶＡを有効にするために変換が必要であった。この例では、底が１０のＬｏｇがソフトウェアで推奨されていた。それぞれの応答（すなわち、Ｒｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇ）について、モデルおよび残留誤差の平方和を最初に計算した。次に、平方和を自由度で除算することによって平均平方を得た。加えて、２つの試料の分散を比較するのに用いられたＦ値は、モデルの平均平方を残差平均平方で除算することによって計算した。Ｐｒｏｂ＞Ｆは、Ｆ値に関連した確率値である。一般に、０．０５未満のＰｒｏｂ＞Ｆ値を有する項は、顕著な影響と見なされるであろうが、０．１０より大きいＰｒｏｂ＞Ｆ値は一般に有意ではないと見なされた。さらに、剰余の一部である不適合度値も、モデルの有効性を評価するために報告した。
【００７２】
表３に列挙してあるデータは、ＡＢおよびＡＰＫの応答（Ｒｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇ）のモデルはすべて注目すべきである（Ｐｒｏｂ＞Ｆ値が０．０５未満である）ことを明らかにした。加えて、不適合度値は有意ではないという点が注目されたが、これは全モデルがぴったりあてはまることを明らかにしている。例えば、ＡＢのＲｓ（ａｖｇ）は、「不適合のＦ値」が７．１５であることを示したが、これは不適合度が純粋な誤差に対して有意ではないことを暗示した。この大きさの「不適合のＦ値」がノイズのせいで起こる確率は６．６％あった。有意でない不適合度は、モデルがぴったりあてはまることを意味する。
【００７３】
【表３】
0005539312.tif 000015
【００７４】
モデルの適合性をさらに調査するために、モデルのＲ２（重相関係数）、調節Ｒ２、予測Ｒ２および十分な精度値も評価し、表４に示した。
【００７５】
【表４】
0005539312.tif 000016
【００７６】
［０００１］良好な統計モデルであるためには、Ｒ２値が１．０に近く、調節Ｒ２と予測Ｒ２との差が０．２よりも小さくなっているべきである。全モデルについて、それら３つの値がすべて許容範囲内に入っていた。表４は「十分な精度値」も列挙している。この値は、信号対ノイズ比の指標であり、値が４より大きい場合、モデルがぴったりあてはまることを示唆する。モデルの「十分な精度値」は１１〜１６の範囲であった。これは、設計空間を移動するのにモデルを使用できることを示した。
【００７７】
［０００２］図２および３は、ＡＢ（Ａｌ〜Ｃｌ）およびＡＰＫ（Ａ２〜Ｃ２）の３つの応答の回帰係数プロットを示す。Ａ１：平均分解度（Ｒｓ（ａｖｇ））；  Ｂ１：平均段数（Ｎａｖｇ）；  Ｃｌ：分析時間（Ｒｔ）；  Ａ２：平均分解度（Ｒｓ（ａｖｇ））；  Ｂ２：平均段数（Ｎａｖｇ）；  Ｃ２：分析時間（Ｒｔ）。９５％信頼区間は、係数の上のエラーバーとして表した。係数がその区間よりも小さかった場合、それは係数がゼロと著しく違わないことを示していた。その結果、対応する因子は有意ではないと見なされた。
【００７８】
［０００３］ＡＢ（Ａ１）およびＡＰＫ（Ａ２）の両方のＲｓ（ａｖｇ）の回帰係数を評価した。少なくとも２つの変数（Ｂ：ＡＡＵＡの％、Ｅ：水の％）が、ＡＢとＡＰＫの両方のＲｓ（ａｖｇ）値に影響を及ぼした。バーの絶対高さから判断すると、ＡＡＵＡの％がＲｓ（ａｖｇ）に対して最も影響を及ぼすと思われた。これは、ＡＡＵＡの％が増大すると、固定相の相互作用部位が増えることになり、したがって分析物の分解度が高くなることを示唆した。しかし、架橋剤ＥＤＭＡの濃度は、９５％係数が係数区間よりも小さかったので、分解度に著しい影響を及ぼさなかった。したがって、調査範囲においてはＥＤＭＡの架橋能力に大きな変化はなかった。水の％は、影響を及ぼし、両方の種類の分析物のＲｓ（ａｖｇ）に正比例することが見出された。その一方で、１−プロパノールの％は、分解度に対して反比例の影響をもたらす。ポロゲン組成物のこの傾向は、水の濃度が高くなり、１−プロパノールの濃度が低くなると、重合溶液の極性が大きくなることを示していた。したがって、重合溶液中での相分離の開始がもっと早く起こり、形成されるクラスターが小さくなり、マクロ細孔も小さくなることになった。それゆえに、表面積が大きくなり、分解度が高くなった。
【００７９】
［０００４］図２および３のＢｌおよびＢ２はそれぞれ、ＡＢおよびＡＰＫの応答パラメーターＲｔに関連したモデル係数をそれぞれ示す。明らかに、ＡＡＵＡの％および水の％は両方ともＲｔに対して正比例的に影響を及ぼした。理論に縛られるわけではないが、ＡＡＵＡの％を増大させることにより、モノリスの表面にＣ１１炭化水素鎖の大きな集団が存在することになると考えられる。それゆえに、分析物と固定相との間の疎水性相互作用が強力になり、クロマトグラフィー保持能が強くなるであろう。前述のように、水の％が増大するにつれ、重合溶液の極性は大きくなり、マクロ細孔は小さくなるであろう。それゆえに、存在する細孔が小さくなることにより、溶離剤の流れが減少し、その結果として分析速度も減少するであろう。
【００８０】
［０００５］Ｒｓ（ａｖｇ）およびＲｔ加えて、ＡＢおよびＡＰＫのＬｏｇ１０Ｎａｖｇも調査した。図２および３のＣ１およびＣ２にそれぞれ示されているように、５つの因子はすべて分離効率に対して正比例的に影響を及ぼす。しかし、Ｌｏｇ１０Ｎａｖｇは、モノマーＡＡＵＡおよびポロゲン（水および１，４−ブタンジオール）の濃度が増大するにつれて、もっと増大した。しかし、水の％は、１，４−ブタンジオールの％よりもＬｏｇ１０Ｎａｖｇに対してもっと大きな影響を及ぼした。理論に縛られるわけではないが、Ｎａｖｇは保持時間およびピーク幅に左右される。保持時間の増大およびピーク幅の減少により、理論段数が増大することになる。前述のように、ＡＡＵＡの％および水の％はＲｔに対して正比例的に影響を及ぼすので、これら２つの因子はＬｏｇ１０Ｎａｖｇにも影響を及ぼすことは道理にあったことであった。１，４−ブタンジオールの％が増大するにつれて、重合溶液の極性が大きくなる。その結果として、重合混合物の可溶性は減少し、それによって相分離が早められる。このようにして、より小さいクラスターが得られる。それゆえに、１，４−ブタンジオールの％は、分離効率に対して正比例的に影響を及ぼした。
【００８１】
計算されたモデルに基づく等値線図は、予測応答についての直接的な情報を提供する。これは、考慮される応答の同じ予測値を持つ等値線（等応答線（isoresponse lines)とも呼ばれる）が因子についての洞察を与えるからである。上に示し論じたように、ＡＢとＡＰＫは共に似たような傾向を示すので、ＡＢだけの二次元（２−Ｄ）プロットを示す。図４（Ａ〜Ｃ）はそれぞれ、Ｒｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇの２−Ｄ等値線図を示す。それぞれの応答について、より大きな影響を及ぼす３つの因子を、Ｘ１軸、Ｘ２軸およびＸ３軸に設定し、他の２つの因子は固定した。Ｒｓ（ａｖｇ）の場合、ＡＡＵＡの％、水の％および１−プロパノールの％が、より大きな影響を及ぼす３つの因子なので、Ｂ、ＥおよびＣで示された角のこれら３つの因子を３つのＸ軸として設定したが、他の２つの因子（ＥＤＭＡの％および１−プロパノールの％）は固定した。一方、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇの場合、ＡＡＵＡの％、水の％および１，４−ブタンジオールの％を３つのＸ軸として設定した。図のそれぞれの角は、各因子の上限を表すポイントに相当し、角の反対側の辺は対応する因子の下限を表す。例えば、図４（Ａ）では、Ｂで示されている角は、ＡＡＵＡの％に関して定義された上限を表し、このポイントから離れると、ＡＡＵＡの％は減少する。因子の制約（表１に示されている）は図の領域を画定した。これにより、混合物設計によって扱われない幾つかの複雑な領域がもたらされる。２−Ｄ等値線図から、水の％の増大につれ、１−プロパノールの％の減少、ＡＡＵＡの％の増大、分解度の増大をもたらすことができることが示された。加えて、ＡＡＵＡの％および水の％が増大し、１，４−ブタンジオールの％が減少するにつれて、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇも増大することになる。
【００８２】
Ｒｓ（ａｖｇ）およびＮａｖｇが最高であり、Ｒｔが最も短い、ＡＢおよびＡＰＫの分離用の重合混合物の組成。図４に示す等値線図からは、Ｒｓ（ａｖｇ）およびＮａｖｇを最高にするために必要な重合条件は、Ｒｔを最も短くするのに必要な値と相いれないように見える。この問題に対処する１つの方法は、Derringerのディザイラビリティ関数Ｄ（Ｘ）を適用することであった。この関数により、式Ｖに示される形のすべての変換応答の相乗平均が計算される。
【数４】
0005539312.tif 000017
式中、ｄｉは、注目している応答（この実施例では、ＡＢおよびＡＰＫのＲｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＮａｖｇ）であり、ｎは混合物設計中の応答の数（この実施例では、６個）である。Ｄは、０（最も望ましくない）〜１（最も望ましい）の範囲のディザイラビリティ（desirability）である。Design Expertソフトウェアを使用して、与えられた判定基準に基づいて、Ｒｓ（ａｖｇ）またはＮａｖｇとＡＢおよびＡＰＫのＲｔとの間の釣り合いを取ることが可能であった。
【００８３】
目標の特性は、種々の応答の重みを与えることによって変えることができる。ディザイラビリティ目標関数Ｄ（Ｘ）では、他の応答を基準にして、各応答に相対的な重みを割り当てることができる。重み値（ｒｉ）は、最小の重み（値１）からもっと大きい重み（値５）まで様々である。様々な重みの度合いを種々の応答に割り当てる場合、目標関数は式ＶＩで示される：
【数５】
0005539312.tif 000018
【００８４】
すべての応答に重みを等しく付けると、同時目標関数（simultaneous objective function）はディザイラビリティの標準形に縮小する。
【００８５】
この実施例では、応答に関して種々の重みを設定した。例えば、分析時間と分解度または効率との兼ね合いを最適化するために、表５から分かるように、Ｒｔについては重み値３を設定したが、Ｒｓ（ａｒｖ）およびＮａｖｇについては重み値が５であった。求められた要求は、以下の溶液によって満たした：１８．５％のＥＤＭＡ、７．０％のＡＡＵＡ、６０．０％の１−プロパノール、２．０％の１，４−ブタンジオールおよび１２％の水（これは、カラム３に相当した）。
【００８６】
【表５】
0005539312.tif 000019
【００８７】
この実験計画アプローチの実行可能性を評価するために、予測値（モデルからのもの）と実験値との差を、特に望ましいカラム（カラム３など）で比較した。結果を表６に列挙してある。表６は、ＡＢおよびＡＰＫのＲｓ（ａｖｇ）がそれぞれ２．６および３．３であることを示しており、それらは、予測値とは８％および３％異なっていた。Ｒｔはそれぞれ１５．４分間および１８．９分間であり、それらは予測値とは１６％および１３％異なっていた。効率値も予測値と非常に近かった（ＲＳＤ６％）。実験値と予測値との間の差はすべて許容範囲内であるので、この混合物の実験計画およびモデリングは有効でありうまくゆくことが証明された。
【００８８】
【表６】
0005539312.tif 000020
【００８９】
モノリシックカラムの形態。モノリスの形態は、ポリマーモノリシックカラムの分離能力に影響を及ぼす因子の１つである。高い効率を得るためには、ポリマー床の均一性および剛性が必要である。ＳＥＭ顕微鏡写真によると、カラム１およびカラム３で形成されたポリ（ＡＡＵＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）モノリスの形態は非常に似ていたが、カラム７とはかなり異なっていた。カラム７は、溶出が非常に速い（１．９分以内）が、分解が行われず、最大のクラスターおよび大きな貫通細孔（through-pores)を有していた。一方、カラム１は密度の高い微小球およびいっそう小さな貫通細孔を含んでおり、その結果として表面積が大きくなっていた。カラム３は、さらに少し密度が高い形態の、しっかり結合した微小球から構成されていた。顕微鏡写真によると、モノマーＡＡＵＡのパーセンテージを高くし、それと共にポロゲン中の水の含有量を比較的高くすると、小さな微小球を有する密度の高いモノリスの形成に有利に働くように思われた。それゆえに、モノマーおよびポロゲン溶媒の両方の組成は、ポリ（ＡＡＵＡ−ＥＤＭＡ）モノリスの形態を制御するのに架橋剤の％よりもさらに効果があると思われた。
【００９０】
モノリシックカラムの孔隙率。モノリシックカラムを特徴付ける点で主な問題の１つとなるのは、孔隙率データの一貫性である。この問題を扱うために、調製したモノリスの孔隙率は水銀圧入ポロシメトリー（ＭＩＰ）で調べた。水銀圧入ポロシメトリーは、液流条件での湿潤方法と対照をなす乾燥方法である。最初に、毛細管中で調製したモノリスの孔隙率をフロー法で調べた。移動相の線速度は、不活性デッドボリュームトレーサー（inert dead volume tracer)（チオ尿素）で測定し、容積流量も測定した。次に、知られている空の管の寸法を用いて、式ＩＩで全孔隙率εＴを計算した。表７に示すように、調べたモノリス（１、３および７）の全孔隙率はそれぞれ、６６．５％、７４．５％および９０．６％であった。
【００９１】
【表７】
0005539312.tif 000021
【００９２】
モノリシックカラムを調製したとき、ガラスバイアル中で同じ条件下において同じ混合物を用いて同時重合も行った。窒素吸着およびＭＩＰの実験を実施して、乾燥状態のバルクモノリスの細孔径分布、表面積および全孔隙率を試験した。ＭＩＰで試験したεＴ値の傾向（表７に示されている）は以下の順序で増大している：モノリス１＜モノリス３＜モノリス７（これは、フロー法と十分に相関していた）。しかし、ＭＩＰで求めたεＴ値は、フロー法で計算された値よりも少しだけ小さくなっていた。前者の方法で得られたこうした低い値は、試料の状態（湿潤と乾燥）の相違が原因である可能性がある。加えて、重合容器の違い（フロー法の試料は毛細管カラム中で重合させたが、ＭＩＰの試料はガラスバイアル中で重合させた）が、εＴに影響を与えた可能性もある。
【００９３】
図５は、３種類のモノリシックカラム（カラム１は分解度の高いカラムであり、カラム３、カラム７は、分解度の低いカラムである）の細孔径分布を示している。３種類の代表的なモノリスの細孔径分布は、図５において１つの鋭い最大を示している。各分析物を、０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度（３５％ＡＣＮ／Ｈ２Ｏで調製）で注入した。示されているように、モノリス１およびモノリス３の固有の細孔径は、モノリス７（１０μｍ）と比べてかなり小さかった（それぞれ０．３μｍおよび１〜２μｍ）。細孔径分布に加えて、モノリスの幾つかの他のパラメーター（累積細孔容積（Ｖ）、平均細孔直径（ｄ）、バルク密度（ρ）および表面積（ｒ）など）も求めた。それらを表８に要約してある。予想されるように、ポリ（ＡＡＵＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）のカラム１およびカラム３は、同じようなｄおよびｒを示した。例えば、ＣＥＣの分解度および保持が最低となっているモノリシックカラム７と比べて、これら２つのモノリシックカラムの細孔直径はかなり小さく、表面積はかなり大きくなっていた。さらに、カラム１で得られた最低のＶ値およびρ値は、ＭＩＰ方法およびフロー法の両方を用いて得られた最低のεＴ値と十分に一致していた。
【００９４】
【表８】
0005539312.tif 000022
【００９５】
透過性および機械的安定性。様々な流量でのカラムにおける圧力低下を測定するのにＡＣＮを使用したが、これは、カラムの機械的安定性および透過性を表すのにも使用できた。３種類のモノリシックカラム（１、３および７）では、比透過性Ｋ０はそれぞれ１．１１×１０−１４ｍ２、２．８８×１０−１４ｍ２および２．２３×１０−１２ｍ２であった（表８）。モノリシックカラムは、予想外に高い透過性値を有しており、その値は３μｍ粒子充填毛細管カラムより少なくとも２桁大きい。この透過性は、主にモノリスの大きな全孔隙率によるものであり、これにより、液体は低圧下においてカラム中を流れることが可能になる。モノリシックカラム１、３および７に関して、加えた圧力に対してＡＣＮの容積流量をプロットしたものを図６に示す。各測定カラムに関して、溶媒の流量に対する逆圧の依存性は、直線であり、相関係数Ｒが０．９９９よりも良い。このことは、モノリスの透過性および機械的安定性が両方とも良好であることを示した。
【００９６】
モノリシックカラムの電気クロマトグラフィーの保持能および効率に対するアセトニトリルの影響。同族のＡＢおよびＡＰＫを用いて、カラム３に関して電気クロマトグラフィーの保持および効率を試験した。ＡＢおよびＡＰＫ同族体のクロマトグラフィー保持能力に対するＡＣＮの濃度の影響を、５０〜８０％（ｖ／ｖ）の範囲で調べた。移動相中のＡＣＮの濃度（ｖ／ｖ）に対するＡＢおよびＡＰＫのｌｏｇ  ｋ’の線形従属性プロットを図７に示す。ＡＡＵＡ−ＥＤＭＡモノリシックカラム３により広範囲のＡＣＮ組成で逆相分離メカニズムが提供されることが、十分な直線性により確証された。予想されるように、アセトニトリルの濃度が等しい場合、もっと極性のあるＡＰＫ同族体は対応するＡＢよりも下にとどまる。それにも関わらず、両方の同族系列で、移動相中に７０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル組成の場合に、分析時間に対して分解度および効率の折り合いが最善のものとなることが見出された。
【００９７】
３つのモノリシックカラムのピーク効率も評価した。異なる電圧下での分離性能を調査するために、印加電圧を２〜３０ｋＶまで変化させて、段高さを移動相の線速度に対して測定した。図８にある調査したカラムについてのＶａｎＤｅｅｍｔｅｒプロットは、同族ＡＢおよびＡＰＫならびにチオ尿素の平均段高さが、カラム３のＥＯＦおよび印加電圧に依存することを示している。段高さはＡＢおよびＡＰＫ同族系列からとった平均である。チオ尿素の場合、印加電圧が増大するにつれて、線形流量（linear flow rate)が増大し、段高さが最初に鋭く減少している。しかし、１５ｋＶより高い電圧では、段高さはほぼ一定に保たれた。予想されるように、ＡＢおよびＡＰＫの場合、同じ電圧では、効率がチオ尿素より少し低かった。高流速でＡＢおよびＡＰＫに関して得られたVan Deemter曲線の双曲線形状および最低のＨは、他のタイプのモノリシック相の文献で報告されたものと似ていた。平均すると、実験の速度範囲では、ＡＢおよびＡＰＫについての段高さはそれぞれおよそ３９μｍおよび２７μｍであった。
【００９８】
再現性。カラム製造の再現性は、（ａ）バッチ内（カラム間）および（ｂ）バッチ間（バッチとバッチの間）で評価した。モノリシックカラムの３つの別個のバッチを調製し、合計９個のカラムとなるよう、それぞれのバッチについて３つのカラムを作成した。３つのバッチそれぞれについて重合混合物を調製した。ＡＢおよびＡＰＫの保持時間は、製造方法の再現性を評価するために選択した。表９に示されているデータから、保持時間のＲＳＤ値が３％未満であることが分かる。保持時間のバッチ内精度は０．９８〜２．１４の範囲であったが、保持時間のバッチ間精度（３つのバッチの平均として計算）は０．７９〜２．７５の範囲であった。これらのデータは、モノリスの調製が再現性のあるものであったことを示唆している。
【００９９】
【表９】
0005539312.tif 000023
【０１００】
図９は、モノリシックカラム３で得られたＮ−メチルカルバミン酸類（ＮＭＣ）殺虫剤のＣＥＣ−ＭＳを示す。条件：モノリシックカラム、全長６０ｃｍ（有効長４０ｃｍ）×ｌ００μｍＩＤ；  移動相、５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ６．５（３５％（ｖ／ｖ）ＡＣＮで）；  印加電圧、＋３０ｋＶ；  １２バールの入口圧力；  動電注入、＋１０ｋＶ（５秒間）。  ＡＰＰＩパラメーター：ＳＩＭモード；  フラグメント電圧（fragment voltage)、６０ｖ；  噴霧器の圧力、５ｐｓｉ；  乾燥ガス流量、２Ｌ／分；  乾燥ガス温度、１００℃；  蒸発器の温度２５０℃；  毛細管電圧、２５００ｖ。被覆液（Ｓｈｅａｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ）、５ｍＭ酢酸アンモニウム、２％（ｖ／ｖ）アセトン−５０／５０（ｖ／ｖ）ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ；  被覆液の流量２０μＬ／分。  分析物：１、オキサミ（oxamy)；  ２、メトミル；  ３、アルジカルブ；  ４、プリミカルブ（primicarb)；  ５、プロポクスル；  ６、ベンジオカルブ；  ７、イソプロカルブ；  ８、カルバリル；  ９、メチオカルブ。
【０１０１】
結論。界面活性剤をベースとしたポリ（ＡＡＵＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）モノリスは、（ＡＡＵＡモノマーを合成した後）１段階重合で調製した。重合混合物の評価（架橋剤、モノマーおよびポロゲンの濃度）は、混合物の実験計画を用いて行った。モノリス形成に一番影響を及ぼす調査された２つの因子は、モノマー（ＡＡＵＡ）および水の濃度である。ディザイラビリティ関数から予測された重合条件を試験した。実験データは、予測結果と非常にぴったり一致、ないし最高に一致していた。結果は、この実験計画方法が望ましい重合条件を得るための非常に見込みのあるアプローチであり、モノリシック固定相をうまく形成させることができることを示していた。加えて、カラムは、典型的なポリマーベースモノリス形態、優れた透過性および良好な機械的安定性をもたらした。さらに、カラム製造のバッチ間およびバッチ内再現性は、実用上十分なものだった。
【０１０２】
実施例２：ＨＰＬＣの場合のタンパク質溶質
薬品および標準品。実施例１で用いた界面活性剤をベースとしたモノリシックカラムの実施態様の形成用の材料および方法を、実施例２でも使用した。加えて、リボヌクレアーゼＡ、シトクロムｃおよびミオグロビンをSigma(St. Louis, MO, USA)から購入し、受け取った状態のまま使用した。
【０１０３】
キャピラリーＨＰＬＣの器械。ＨＰＬＣクロマトグラフィーの実験を、Data Module UV−可視検出装置（波長の連続調節可能）およびChrom Perfect（登録商標）（バージョン５．１，Justice Laboratory Software，New Jersey）ソフトウェアを備えたUltra−Plus ＆ Ultra−Plus II Micro LCシステム（Micro−Tech Scientific，Sunnyvale，CA，USA）で実施した。モノリシックカラムの洗浄および平衡化に、Series III HPLCポンプ（Lab Alliance，State College，PA，USA）を用いた。
【０１０４】
ＨＰＬＣクロマトグラフィー条件。キャピラリーＨＰＬＣでのタンパク質分離に勾配溶出を用いた。移動相Ａは９８％のＡＣＮと０．１％のＴＦＡを含んでおり、移動相Ｂは２％のＡＣＮと０．１％のＴＦＡを含んでいた。直線勾配プログラムは、０分で１６％のＡ、０．５分で４０％のＡであった。紫外線（ＵＶ）検出を２１４ｎｍで実施した。
【０１０５】
タンパク質のトリプシン消化物。ミオグロビンを５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中に溶かして、濃度を１ｍｇ／ｍＬにした。トリプシンを基質と酵素との比が１００：１となるように添加し、その後、溶液を一晩３７℃で保温した。その後、消化物を真空乾燥し、水で戻したが、分析前に更なる清浄化工程は行わなかった。
【０１０６】
計算。分解度（Ｒｓ）および効率（Ｎ）は、Chrom Perfect（登録商標）ソフトウェアで計算した。
【０１０７】
実験計画。Design-Expert（バージョン７．０．３，Stat−Ease．Inc．Minneapolis，MN）を用いて、Ｄ最適実験計画と等値線図を作り出し、データ処理（統計計算）を行った。実験計画変数には、実施例１の実験計画と同じ５つの因子（同じ上限と下限を持つ）が含まれる。３種類のタンパク質（リボヌクレアーゼＡ、シトクロムｃおよびミオグロビン）をモデル試験分析物として使用した。平均分解度（ＲＳ（ａｖｇ））、分析時間（Ｒｔ。最後のタンパク質であるミオグロビンの保持時間として測定）および平均効率（Ｎａｖｇ）を応答として使用した。実際の実験から得られたデータはすべて、Design-Expertソフトウェアに入力した。そのデータを、Ｆ−検定および不適合度検定に基づいて選択された線形モデルにあてはめた。ＡＮＯＶＡを用いて、観察された影響の有意性検定を行った。ソフトウェアによって２−Ｄ等値線図を作成して、因子間の相互作用を示した。最後に、Design-Expertソフトウェアで利用可能なディザイラビリティ関数を用いて、すべての変数の組み合わせの特に望ましい実施態様を見つけた。
【０１０８】
結果および考察。表１０は、２５の実験の実験計画および応答を示す。
【０１０９】
【表１０】
0005539312.tif 000024
【０１１０】
Ｒｓ（ａｖｇ）の範囲は０．９〜１２．８であることが見出されたが、Ｎａｖｇは１６００〜５０２，０００の範囲であった。さらに、Ｒｔはたった１．９分のものと、３６．０分という長いものがあった。図１０は、実験計画の実験から得られた、タンパク質に関する代表的なクロマトグラムのうちの２つ（すなわちカラム３およびカラム７）をそれぞれ示している。条件：移動相Ａ、０．０１％ＴＦＡ／ＡＣＮ、移動相Ｂ、２％ＡＣＮ、０．０１％ＴＦＡ／水；  直線勾配プログラム、０分で１６％のＡ、０．５分で４０％のＡ；  注入サイズ、０．６ｓ；  合計流量、１００μＬ／分；  検出、２１４ｎｍ。ピーク１、リボヌクレアーゼＡ；  ピーク２、シトクロムｃ；ピーク３、ミオグロビン。各分析物は、０．３ｍｇ／ｍＬ（水中）の濃度のものを注入した。カラム７（ａ）は、全実験の中で最速分離の１つに相当した。しかし、カラム３（ｂ）は、３種類のタンパク質に関して分解度が最高である分離の１つであることを示した。この傾向は、重合混合物の組成が、得られたモノリスのクロマトグラフィー性能に影響することを示した。
【０１１１】
混合物の二次モデルを、応答パラメーターのそれぞれについて開発した。得られたモデルは、因子係数を直接比較することによって因子の相対的影響を特定するのに役立つ数学的方程式だった。混合物の二次モデルでは、あてはめた式は次の形である。
ｙ＝β０＋β１Ａ＋β２Ｂ＋β３Ｃ＋β４Ｄ＋β５Ｅ＋β１２ＡＢ＋β１３ＡＣ＋β１４ＡＤ＋β１５ＡＥ＋β２３ＢＣ＋β２４ＢＤ＋β２５ＢＥ＋β３４ＣＤ＋β３５ＣＥ＋β４５ＤＥ
式ＶＩＩ
式中、ｙは予測応答である。β０は切片である。一次混合物モデル係数βｎ（ｎ＝ｌ、２、３、４、５）は、純粋成分から応答を予測する入力因子（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）の係数である。β１２、β１３、β１４．．．．は、２つの因子の相互作用（ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ．．．）の係数であり、これは応答に対するそれらの相互作用の影響を記述する。正の相互作用係数は、対応する因子が応答に正比例することを示す。一方、負の相互作用係数は、因子が応答と逆比例する、すなわち、因子が大きくなるほど、応答が小さくなることを意味する。Ｎａｖｇの場合、最大応答と最小応答との比である３１４が、１０より非常に大きいため、ＡＮＯＶＡを有効なものとするために変換が必要であったことを述べておかなければならない。この実施例では、底が１０のＬｏｇがソフトウェアで推奨されていた。言い換えれば、Ｌｏｇ１０Ｎａｖｇのモデルを得た。
【０１１２】
計算された経験的モデルはＡＮＯＶＡで評価したが、モデルの有効性はモデルの不適合度を検定することによって確かめた。全モデルのＡＮＯＶＡデータ（平方和、平均平方、Ｆ値およびＰｒｏｂ＞Ｆ値、Ｒ２、調節Ｒ２、予測Ｒ２、十分な精度値Ｒ２を含む）を表１１に列挙する。それぞれの応答（すなわち、Ｒｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇ）について、モデルおよび残留誤差の平方和を最初に計算した。次に、平方和を自由度で除算することによって平均平方を得た。加えて、２つの試料の分散を比較するのに用いられたＦ値は、モデルの平均平方を残差平均平方で除算することによって計算した。Ｐｒｏｂ＞Ｆは、Ｆ値に関連した確率値である。一般に、０．０５未満のＰｒｏｂ＞Ｆ値を有する項は、顕著な影響と見なされるであろうが、０．１０より大きいＰｒｏｂ＞Ｆ値は一般に有意ではないと見なされる。さらに、剰余の一部である不適合度値も、モデルの有効性を評価するために報告する。
【０１１３】
【表１１】
0005539312.tif 000025
【０１１４】
表１１に列挙されているデータは、タンパク質の応答（Ｒｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇ）のモデルが０．０５未満のＰｒｏｂ＞Ｆ値を有することを明らかにした。加えて、不適合度値は有意ではなく（０．１より大きいＰｒｏｂ＞Ｆ値を有する）、このことは、全モデルが十分にあてはまることを明らかにしていることに留意されたい。例えばＲｓ（ａｖｇ）に関して言えば、「不適合度のＦ値」が５．７５Ｅ−２であることは、不適合度が純粋な誤差に対して有意ではないことを暗に示した。この大きさの「不適合度のＦ値」がノイズのせいで起こる確率は５．２３％であった。有意でない不適合度は、モデルがぴったりあてはまることを意味した。
【０１１５】
モデルの適合性をさらに調査するために、モデルのＲ２（重相関係数）、調節Ｒ２、予測Ｒ２および十分な精度値（Ａｄｅｑ−Ｒ２）を評価した（表１１）。良好な統計モデルであるためには、Ｒ２値が１．０に近く、調節Ｒ２と予測Ｒ２との差が０．２より小さくなっているべきである。全モデルについて、それら３つの値がすべて許容範囲内に入っていた。表１１は、Ａｄｅｑ−Ｒ２も列挙している。この値は、信号対ノイズ比の指標であり、値が４より大きい場合、モデルがぴったりあてはまることを示唆する。モデルのａｄｅｑ−Ｒ２はそれぞれ１８、１８および１３であった。これは、設計空間を移動するのにモデルを使用できることを示した。
【０１１６】
図１１Ａ〜Ｃは、３つの応答（Ｒｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇであり、この順序）の回帰係数プロットを示す。９５％信頼区間は、係数の上のエラーバーとして表してある。係数がその区間よりも小さかった場合、それは係数がゼロと著しく違わないことを示した。その結果、対応する因子は有意ではないと見なされた。二次項目の係数は、化学記号がないため、続く節では説明しない。
【０１１７】
回帰係数プロットから、因子Ｄ（１，４−ブタンジオールの％）およびＥ（水の％）は、応答Ｒｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＮａｖｇに対して正比例的に影響を及ぼすことが分かった。これは、１，４−ブタンジオールの％および水の％の増大によって重合過程時に相分離の開始が早められ、形成されるクラスターが小さくなり、マクロ細孔も小さくなったという事実が原因でありうる。それゆえに、表面積が大きくなり、その結果、分解度が高くなった。加えて、保持時間はマクロ細孔のサイズに大きく左右されるという理論によれば、１，４−ブタンジオールの％が大きくなり、さらに水の％が大きくなると、マクロ細孔径のいっそう小さいモノリシックカラムが作られることになる。それによって、溶離剤の流れる速度が影響を受け、それゆえに分析速度も影響を受ける。さらに、予想されるように、クラスターが小さくなり、表面積が大きくなり、マクロ細孔が小さくなるにつれ、分離効率が高くなるであろう。
【０１１８】
図１１Ａ〜Ｃを詳しく調べると、１次項に加えて、２つの交差項（ＣＥおよびＤＥ）がＲｓ（ａｖｇ）およびＲｔに対して顕著に影響すること、４つの交差項（ＡＣ、ＡＤ、ＡＥおよびＤＥ）がＮａｖｇに対して顕著に影響することが明らかになった。こうした交差項の影響は、単一項が重要でないとしても、それらが他の項と組み合わさると、顕著な影響を与えることを示す。例えば、因子Ｃ（１−プロパノールの％）は、Ｒｓ（ａｖｇ）またはＲｔにとって重要ではないが、Ｅ項（水の％）と組み合わさると、協力項として影響を与える。同様に、Ａ項（ＥＤＭＡの％）は、単一因子としてはＮａｖｇにとって重要ではないが、因子Ｃ、ＤまたはＥと組み合わさると、影響を与える。
【０１１９】
図１２Ａ〜Ｃはそれぞれ、Ｒｓ（ａｖｇ）、ＲｔおよびＬｏｇ１０Ｎａｖｇの２−Ｄ等値線図を示す。それぞれの応答では、応答に対していっそう大きな影響を与えるこれら３つの因子はＸ１軸、Ｘ２軸およびＸ３軸に設定され、残りの２つの因子は固定された。この実施例では、ＡＡＵＡの％、１，４−ブタンジオールの％および水の％はＲｓ（ａｖｇ）およびＲｔに対していっそう大きな影響を与えるので、Ｂ、ＥおよびＣで示されている角のこれら３つの因子は３つのＸ軸に設定され、他の２つの因子（ＥＤＭＡの％および１−プロパノールの％）は固定された。しかし、Ｌｏｇ１０Ｎａｖｇについては、ＡＡＵＡの％、１，４−ブタンジオールの％および水の％をＸ１軸、Ｘ２軸およびＸ３軸に設定した。プロットのそれぞれの角は、各因子の上限を表すポイントに相当し、角の反対側の辺は対応因子の下限を表す。例えば、図１２Ａでは、Ｂで示されている角は、ＡＡＵＡの％に関して定められた上限を表し、このポイントから離れると、ＡＡＵＡの％は減少する。因子の制約（表１に示されている）は図の領域を画定した。これにより、混合物設計によって扱われない幾つかの複雑な領域がもたらされる。２−Ｄ等値線図（図１２Ａ〜Ｃに示す）から、水の％の増大、１−プロパノールの％の減少、およびＡＡＵＡの％の増大に伴って分解度が高くなり、保持時間が長くなりうることが分かる。加えて、水の％の増大、および１，４−ブタンジオールの％の減少に伴って、Ｌｏｇ１０Ｎａｖｇが減少することになる。
【０１２０】
タンパク質分離用の重合混合物。図１２Ａ〜Ｃに示されている等値線図から、Ｒｓ（ａｖｇ）およびＮａｖｇを向上させるのに必要な重合条件は、高速タンパク質分離および高分解度分離のためにＲｔを向上させるのに必要な値と対立すると思われる。この問題に対処する１つの方法は、Derringerのディザイラビリティ関数Ｄ（Ｘ）を使用することである。
【０１２１】
この実施例では、応答について様々な重みを設定した。高速分離溶液では、分析時間と分解度との兼ね合いを最適化するために、表１２に示すように、Ｒｔの最小化のために重み値５を設定したが、Ｒｓ（ａｖｇ）については重み値を１にした。
【０１２２】
【表１２】
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【０１２３】
求められた要求は、以下の溶液によって満たされた：２０．３％のＥＤＭＡ、７．０％のＡＡＵＡ、６８．３％の１−プロパノール、０％の１，４−ブタンジオールおよび３．９％の水。高分解度分離溶液では、効率と分解度との間の折り合いをつけるために、Ｎａｖｇの最大化のために重み値３を設定し、Ｒｓ（ａｖｇ）については重み値を５にした。求められた要求は、以下の溶液によって満たされた：１８．５％のＥＤＭＡ、７．０％のＡＡＵＡ、６０．０％の１−プロパノール、２．０％の１，４−ブタンジオールおよび１２％の水。
【０１２４】
溶液モノリシックカラムを使用したタンパク質分離のクロマトグラムを図１３に示す。クロマトグラムから判断すると、３種類のタンパク質は高速分離カラム（ＯＦ−１）では平均分解度５．０で２．５分間のうちに分離することができたが、一方、同じ分析物が、高分解度カラム（ＯＨ−１）では１２．８という高い分解度で、かつ５０２，０００という高い効率で３２分間のうちに分離できた。
【０１２５】
この実験計画アプローチの実現可能性を評価するために、予測値（モデルからのもの）と実験値（溶液カラムによる）との差を比較した。結果は、図１３中の挿入表として示してある。高速分離カラムの場合、Ｒｓ（ａｖｇ）およびＲｔはそれぞれ５．０および２．５分（５．７％および４．２％だけ予測値と異なる）であることが見出された。高分解度分離カラムの場合、Ｒｓ（ａｖｇ）およびＮａｖｇはそれぞれ１２．８および５０２，０００（１．６％および０．２％だけ予測値と異なる）である。効率値も予測値と近かった。実験値と予測値との間の差はすべて許容範囲内であるので、この混合物実験計画およびモデリングは有効でありうまくいくことが証明された。
【０１２６】
加えて、ミオグロビンのトリプシン消化物を用いてμ−ＨＰＬＣにおける高分解度カラムの性能をさらに評価した。高速分離カラムＯＦ−１（図１４（ａ））と比べて、高分解度カラムＯＨ−１（図１４（ｂ））は、ミオグロビンのトリプシン消化物の１３個のピークをうまく分離することができた。条件：移動相Ａ、０．０１％ＴＦＡ／ＡＣＮ、移動相Ｂ、２％ＡＣＮ、０．０１％ＴＦＡ／水；  直線勾配プログラム、０分で１６％のＡ、１０分で２０％のＡ、１５分で５０％のＡ、２０分で８０％のＡ；  注入サイズ、０．６ｓ；  合計流量、１００μＬ／分；  検出、２１４ｎｍ。試料は、水中に１．０ｍｇ／ｍＬのミオグロビンのトリプシン消化物。
【０１２７】
モノリシックカラムの形態。カラム７およびＯＦ−１中で形成されたポリ（ＡＡＵＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）モノリスの形態は非常に似ていたが、カラム１０とはかなり異なっていた。カラム７は、溶出が非常に速く（１．９分以内）、最大のクラスターおよび最大の貫通細孔を有していた。高速分離モノリス（カラムＯＦ−１）は、少しだけもっと密度の高い形態でしっかり結合した微小球で構成されていた。その一方で、カラム１０（高分解度カラム）は、より高い密度の微小球およびより小さい貫通細孔を含み、結果として表面積が大きくなっていた。２つのモノリスを比較すると、ＯＨ−１は、もっと小さいクラスターおよびビーズから構成されていたが、一方、カラムＯＦ−１は、もっと密度の低いクラスターおよびもっと大きな貫通細孔を含んでおり、このため、高い透過性および対流物質移動が可能になった。
【０１２８】
モノリシックカラムの孔隙率。孔隙率データの一貫性は、実施例１に記載した方法を用いて評価した。表１３に示すように、調べたモノリス７、１０（ＯＨ−１）およびＯＦ−１の全孔隙率はそれぞれ８６％、７２％および７９％であった。
【０１２９】
【表１３】
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【０１３０】
ＭＩＰで試験されたεＴ値の傾向（表１３に示されている）は以下の順序で増大している：モノリス１０（ＯＨ−１）＜モノリスＯＦ−１＜モノリス７（これは、フロー法と十分に相関していた）。しかし、ＭＩＰで求められたεＴ値は、フロー法で計算された値よりも少しだけ小さくなっていた。前者の方法で得られたこうした低い値は、試料の状態（湿潤と乾燥）の相違が原因である可能性がある。加えて、重合容器（フロー法の試料は毛細管カラム中で重合させたが、ＭＩＰの試料はガラスバイアル中で重合させた）が、εＴに影響を与えた可能性もある。
【０１３１】
３つの代表的なモノリスの細孔径分布は、図１５において鋭い最大を示している。示されているように、モノリス１０の固有の細孔径は、モノリス７（約１０μｍ）およびカラムＯＦ−１（約８μｍ）と比べてサイズが小さくなっていた（１〜２μｍ）。細孔径分布に加えて、モノリスの他の幾つかのパラメーター（累積細孔容積（Ｋ）、平均細孔直径（ｄ）、バルク密度（ｐ）および表面積（ｒ）など）も求めた。それらを表１３に要約してある。予想されるように、ポリ（ＡＡＵＡ−ｃｏ−ＥＤＭＡ）のカラム７およびカラムＯＦ−１は、似たようなｄおよびｒを示した。例えば、タンパク質の分解度および保持能が最高となっているモノリシックカラム１０と比べて、これら２つのモノリシックカラムの細孔直径は、かなり大きくなっており、表面積がかなり小さくなっていた。さらに、カラム１０で得られた最低のＶ値およびρ値は、ＭＩＰ方法およびフロー法の両方を用いて得られた最低のεＴ値と十分に一致していた。
【０１３２】
透過性および機械的安定性。様々な流量でのカラムにおける圧力低下を測定するのにＡＣＮを使用したが、これは、カラムの機械的安定性および透過性を表すのにも使用できた。３種類のモノリシックカラム（７、１０（ＯＨ−ｌ）およびＯＦ−１）では、比透過性Ｋ０はそれぞれ２．２３×１０−１２ｍ２、４．６０×１０−１４ｍ２、１．３３×１０−１２ｍ２であった。モノリシックカラムは高い透過性値を有しており、それは３μｍ粒子充填キャピラリーカラムよりも少なくとも２桁大きかった。この高い透過性は、主にモノリスの大きな全孔隙率によるものであり、これにより、液体は低圧下においてカラム中を流れることが可能になった。モノリシックカラム７、ＯＨ−１およびＯＦ−１に関して、加えた圧力に対して１００％ＡＣＮの容積流量をプロットしたものを図１６に示す。デッドタイムマーカー（dead time marker）としてチオ尿素を使用した。各測定カラムに関して、溶媒の流量に対する逆圧の依存性は、直線であり、相関係数Ｒが０．９９９よりも良い。この相関係数は、モノリスの透過性および機械的安定性がどちらも良好であることを示した。
【０１３３】
カラムのクロマトグラフィー特性。３種類のモノリシックカラムの最大の効率も評価した。異なる電圧下での分離性能を調べるために、移動相の線速度の関数として段高さを測定した。移動相の流速の関数としてタンパク質の平均段高さを示すVan Deemterプロットを図１７に示す。カラムＯＨ−１では分離効率が高くなった。また、０．５〜４．０ｍｍ／秒の範囲内の０．３ｍｍ／秒の流速においては０．７μｍという低い段高さになりうるし、段高さの変動は少しである。カラムＯＦ−１の場合、８ｍｍ／秒の流量では、最低の段高さはおよそ４μｍであった。したがって、モノリシックカラムは、特に充填キャピラリーカラムと比較した場合、分離効率を大きく犠牲にすることなく、高速分離を達成できた。
【０１３４】
安定性および再現性。クロマトグラフィーの安定性を評価するために、ＯＦ−１およびＯＨ−１の重合混合物で作られたモノリシックカラムを利用して、連続３日間にわたって１日に連続して５回の注入を行った（すなわち、各カラムで合計１５回の注入）。カラムＯＦ−１およびＯＨ−１に関して、保持時間のＲＳＤ値および段数を表１４に示す。カラムＯＦ−１の場合、保持時間の日間精度（inter-day precision）は０．２０％から０．５３％の間の範囲であり、段数のＲＳＤは４．１５％〜７．２４％の範囲であり、３日間の平均としての保持時間の日内（intra-day）精度は０．３８％から０．７５％の間の範囲であり、段数のＲＳＤは６．３１％〜８．５９％の範囲であることが見出された。カラムＯＨ−１の場合、保持時間の日間精度は０．４４％〜０．７６％の間の範囲であり、段数のＲＳＤは４．２３％〜８．２６％の範囲であり、３日間の平均としての保持時間の日内精度は０．５６％〜０．８７％の間の範囲であり、段数のＲＳＤは６．５７％〜９．００％の範囲内であることが見出された。したがって、モノリスのクロマトグラフィー性能の安定性は許容できるものであった。
【０１３５】
【表１４】
0005539312.tif 000028
【０１３６】
バッチ間のカラム再現性を調査するため、カラムの３つのバッチを調製し、各バッチについて同じ重合混合物を用いて３つのカラムを作った。したがって、調製の再現性を調査するために３つのバッチで９つのカラムを作ったことになる。表１５に示す結果から、カラムＯＦ−１の場合、保持時間のすべてのＲＳＤ値が１．７６％未満であり、カラムＯＨ−１の場合、保持時間のすべておＲＳＤ値が２．０４％未満であることが見出された。これらは、モノリスの調製が再現可能なものであることを証明した。
【０１３７】
【表１５】
0005539312.tif 000029
【０１３８】
結論。重合混合物の評価（架橋剤、モノマーおよびポロゲンの濃度）は、混合物の実験計画を用いて行った。モノリス形成に一番影響する調べられた２つの因子は、１，４−ブタンジオールおよび水の濃度である。高速分離カラムおよび高分解度カラム用の重合混合物は、実験計画にしたがって処理した。ディザイラビリティ関数から予測されるこうした重合条件を検定した。実験データは予測結果と十分に一致していた。効率、分解度、および保持時間に関して予測値と実験値との間の差が６％未満であるので、提案されたアプローチが実際的であることが確かに確証された。ＯＦ−１およびＯＨ−１のカラムを使用すると、２．５分間のうちにタンパク質の高速分離を完了でき、またミオグロビンのトリプシン消化物分離が高分解度カラムでうまく実施された。これらのカラムに関して、タンパク質およびタンパク質消化物を用いてさらに確認した。これらの結果により、この実験計画法が、所望の重合条件を得るための非常に見込みのあるアプローチであり、これによりモノリシック固定相をうまく開発できることが示された。カラムにより、ポリマーベースモノリス形態、優れた透過性、および良好な機械的安定性が提供された。さらに、モノリシックカラムは、カラム製造に関して良好な日間および日内再現性ならびに優れたバッチ間およびバッチ内再現性があることを実証した。
【０１３９】
前記の事柄は特定の態様に関係しており、以下の請求項によって定義される本開示の範囲から逸脱しない範囲で、多数の変更をそれに加えうることを理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
0005539312.tif 000041
【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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