(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなり、核酸配列が酵母細胞における高レベル発現のためコドン最適化されており、配列番号１のヌクレオチド配列からなる核酸分子。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞が、サッカロミセス  セレビシエ、ハンゼヌラ  ポリモルファ、ピキア  パストリス、クルイベロミセス  フラギリス、クルイベロミセス  ラクチス及びシゾサッカロミセス  ポンベからなる群から選択される、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞がサッカロミセス  セレビシエである、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）請求項１に記載の核酸分子で酵母を形質転換すること、
（ｂ）組換えパピローマウイルスタンパク質を産生するために、前記コドン最適化核酸分子の発現が可能な条件下で前記形質転換された酵母を培養すること、および
（ｃ）ＨＰＶ４５  ＶＬＰを産生するために、前記組換えパピローマウイルスタンパク質を単離すること、
を含む、ＨＰＶ４５ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法。
【請求項７】
酵母が、サッカロミセス  セレビシエ、ハンゼヌラ  ポリモルファ、ピキア  パストリス、クルイベロミセス  フラギリス、クルイベロミセス  ラクチス及びシゾサッカロミセス  ポンベからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵母がサッカロミセス  セレビシエである、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の治療に関する。より詳細には、本発明は、ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド並びに前記ポリヌクレオチドを含む組換えベクター及び宿主に関する。本発明は、酵母細胞中で組換えＨＰＶ  ４５  Ｌ１又はＬ１＋Ｌ２を発現させることによって産生されるＨＰＶ４５ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、並びにＨＰＶを予防し、治療するワクチン及び薬剤組成物におけるそれらの使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）には８０を超えるタイプがあり、それらの多くは、良性の増殖性いぼから悪性癌腫まで多種多様な生物学的表現型を伴う（総説としてＭｃＭｕｒｒａｙ等、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ８２（１）：１５−３３（２００１）を参照されたい）。ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１は、生殖器又は呼吸器粘膜の良性のいぼ及び／又は非悪性尖圭コンジローマに最も一般的に付随するタイプである。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８は、頚部、膣、外陰部及び肛門管の原位置の浸潤癌に最も頻繁に付随するハイリスクなタイプである。９０％を超える子宮頚癌がＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８の感染を伴い、又はそれよりも蔓延していない腫瘍形成タイプＨＰＶ３１、−３３、−４５、−５２及び−５８の感染を伴う（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ等、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８５（１２）：９５８−６４（１９９３））。９０％を超える子宮頚癌においてＨＰＶ  ＤＮＡが検出されるという観察結果は、ＨＰＶが子宮頚癌を引き起こすという強力な疫学的証拠である（Ｂｏｓｃｈ等、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８７（１１）：７９６−８０２（１９９５）参照）。
【０００３】
パピローマウイルスは、最高８個の初期遺伝子と２個の後期遺伝子をコードする小さく（５０から６０ｎｍ）、エンベロープを持たない正二十面体ＤＮＡウイルスである。ウイルスゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）はＥ１からＥ７並びにＬ１及びＬ２と称される。ここで、「Ｅ」は初期、「Ｌ」は後期を表す。Ｌ１及びＬ２はウイルスカプシッドタンパク質をコードし、Ｅ遺伝子はウイルスの複製、細胞の形質転換などの機能と関連がある。
【０００４】
Ｌ１タンパク質は、主要なカプシッドタンパク質であり、分子量が５５から６０ｋＤａである。Ｌ２タンパク質は、副次的なカプシッドタンパク質である。免疫学的データによれば、Ｌ２タンパク質の大部分は、ウイルスカプシッド中のＬ１タンパク質の内側にある。Ｌ１とＬ２の両方のタンパク質は、さまざまなパピローマウイルス間で高度に保存されている。
【０００５】
酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は細菌におけるＬ１タンパク質又はＬ１とＬ２タンパク質の組み合わせの発現によって、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が自己組織化される（総説として、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ及びＲｏｄｅｎ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；  Ｌａｃｅｙ，  ｅｄ．  Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ：  Ｌｅｅｄｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｐ  １０１−１２（１９９６）を参照されたい）。ＶＬＰは、真正のビリオンに形態学的に類似しており、動物に投与すると高力価の中和抗体を誘導することができる。ＶＬＰは、潜在的発癌性ウイルスゲノムを含んでいないので、ＨＰＶワクチン開発において、生きているウイルスの使用を安全に代替するものである（総説として、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ及びＨｉｄｅｓｈｅｉｍ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９：６７−７４（２０００）を参照されたい）。このため、Ｌ１及びＬ２遺伝子は、ＨＰＶ感染及び疾患の予防及び治療ワクチンを開発するための免疫学的標的とされてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＨＰＶワクチンの開発及び上市は、首尾よく形質転換された宿主生物において外来性遺伝子の高発現レベルを得ることに付随する困難によって妨げられ、精製タンパク質の製造を制限されてきた。したがって、ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質などのＨＰＶ  Ｌ１タンパク質をコードする野生型ヌクレオチド配列が特定されたにもかかわらず、目的宿主細胞における発現に対して最適化されたＨＰＶ４５  Ｌ１をコードするヌクレオチド配列を利用する容易に更新可能な粗製ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質源を開発することがきわめて望ましい。また、ワクチン開発において使用される未変性タンパク質の免疫感作特性を有する多量のＨＰＶ４５  Ｌ１  ＶＬＰを製造することが有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、子宮頚癌に関連するＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子によって発現されるタンパク質産物に対して免疫を誘発又は増強する組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、酵母細胞において高レベルで発現されるように、コドン最適化されている。本発明は、さらに、酵母細胞中で組換えＨＰＶ４５  Ｌ１又はＬ１＋Ｌ２を発現させることによって産生されるＨＰＶ４５ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を提供し、ＨＰＶに関連する癌の予防及び／又は治療用薬剤組成物及びワクチンにおけるＨＰＶ４５  ＶＬＰの使用を開示する。
【０００８】
本発明は、ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子に関する。合成分子のコドンは、酵母細胞に好ましいコドンを使用するように設計されている。合成分子は、自己集合してＶＬＰになることができるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質源として使用することができる。前記ＶＬＰは、ＶＬＰ系ワクチンに使用することができる。
【０００９】
本発明の例示的な実施態様は、配列番号２で示されるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードする合成核酸分子を含む。前記核酸分子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本明細書を通して開示される核酸分子を含む、組換えベクター及び原核生物と真核生物の両方の組換え宿主細胞も提供される。
【００１１】
本発明は、（ａ）ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、（ｂ）前記ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を発現させる方法にも関する。
【００１２】
本発明は、さらに、（ａ）ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階であって、前記核酸分子が、前記酵母宿主細胞における最適な発現用にコドン最適化された段階と、（ｂ）前記ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を発現させる方法にも関する。
【００１３】
好ましい実施態様においては、核酸は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列（４５  Ｌ１  Ｒ配列）を含む。
【００１４】
本発明は、酵母細胞において産生されるＨＰＶ４５ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ４５  ＶＬＰを産生する方法及びＨＰＶ４５  ＶＬＰを使用する方法にも関する。
【００１５】
本発明の好ましい実施態様においては、酵母は、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ハンゼヌラ  ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス  フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クルイベロミセス  ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）及びシゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）からなる群から選択される。
【００１６】
本発明の別の側面は、酵母細胞中でＨＰＶ４５  Ｌ１又はＨＰＶ４５  Ｌ１＋Ｌ２の組換え発現によって産生されるＨＰＶ４５  ＶＬＰである。
【００１７】
本発明のさらに別の側面は、コドン最適化されたＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子によってコードされるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ４５  ＶＬＰである。本発明のこの側面の例示的な実施態様においては、コドン最適化ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
本発明は、ＨＰＶ４５ウイルス様粒子を動物に投与する段階を含む、動物において免疫応答を誘導する方法も提供する。好ましい実施態様においては、ＨＰＶ４５  ＶＬＰは、コドン最適化された遺伝子によって産生される。
【００１９】
本発明のさらに別の側面は、ＨＰＶ４５  ＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与する段階を含む、ＨＰＶ関連子宮頚癌を予防又は治療する方法である。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、ＨＰＶ４５  ＶＬＰは酵母中で産生される。
【００２０】
本発明は、ＨＰＶ４５ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンにも関する。
【００２１】
本発明のこの側面の別の実施態様においては、ワクチンは、少なくとも１個の別のＨＰＶタイプのＶＬＰをさらに含む。少なくとも１個の別のＨＰＶタイプは、当分野で記述される任意のＨＰＶタイプ又は引き続き特定される任意のＨＰＶタイプを含めて、任意の目的とするＨＰＶタイプとすることができる。好ましい実施態様においては、ＨＰＶタイプは、いぼ、子宮頚癌などの臨床表現型に関連するタイプである。さらに好ましい実施態様においては、少なくとも１個のさらに別のＨＰＶタイプは、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９及びＨＰＶ６８からなる群から選択される。
【００２２】
本発明は、ＨＰＶ  ４５ウイルス様粒子を含む薬剤組成物にも関する。また、本発明は、ＨＰＶ４５  ＶＬＰ及び少なくとも１個の別のＨＰＶタイプのＶＬＰを含む薬剤組成物に関する。好ましい実施態様においては、少なくとも１個のさらに別のＨＰＶタイプは、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９及びＨＰＶ６８からなる群から選択される。
【００２３】
本明細書を通して、また、添付された特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特段の明示がない限り、複数形も含む。
【００２４】
本明細書及び添付された特許請求の範囲を通して、以下の定義及び略語が使用される。
【００２５】
「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖上の認識部位を指す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと開始複合体を形成して転写活動を惹起し、推進する。この複合体は、「エンハンサー」又は「上流活性化配列」と称される配列を活性化することによって、或いは「サイレンサー」と称される配列を阻害することによって改変することができる。
【００２６】
「ベクター」という用語は、宿主生物又は宿主組織にＤＮＡ断片を導入することができるいくつかの媒介手段を指す。プラスミド、（アデノウイルスを含めた）ウイルス、バクテリオファージ及びコスミドを含めて、さまざまなタイプのベクターがある。
【００２７】
「４５  Ｌ１野生型配列」という名称は、本明細書では配列番号３（４５  Ｌ１  ｗｔ）で示されるＨＰＶ４５  Ｌ１  ＤＮＡ配列を指す。ＨＰＶ  ４５  Ｌ１野生型ＤＮＡ配列はすでに記述されているが、臨床分離株から得られるＤＮＡ間の小さな配列変化を発見することは珍しいことではない。したがって、代表的な４５  Ｌ１野生型ＤＮＡ配列は、ＨＰＶ  ４５ＤＮＡを含むことがすでに判明している臨床試料から単離された（実施例１参照）。４５  Ｌ１野生型配列は、本明細書に開示されるコドン最適化４５  Ｌ１配列を比較するための参照配列として使用された（図１参照）。
【００２８】
「ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｒ」又は「４５  Ｌ１  Ｒ」という名称は、本明細書に開示される例示的な合成ＨＰＶ４５  Ｌ１ヌクレオチド配列（配列番号１）を指す。この配列は、酵母細胞による高レベル発現に好ましいコドンを含むように再構築されている。
【００２９】
「有効量」という用語は、十分なワクチン組成物が導入されて適切なレベルのポリペプチドが産生され、その結果、免疫応答が生じることを意味する。当業者は、このレベルが変わり得ることを認識している。
【００３０】
「保存的アミノ酸置換」とは、１個のアミノ酸残基が化学的に類似した別のアミノ酸残基で置換されることを指す。かかる保存的置換の例は、１個の疎水性残基（イソロイシン、ロイシン、バリン又はメチオニン）と別の疎水性残基との置換、１個の極性残基と別の同じ電荷の極性残基との置換（例えば、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸）である。
【００３１】
「哺乳動物の」という用語は、ヒトを含めて、任意の哺乳動物を指す。
【００３２】
「ＶＬＰ」又は「ＶＬＰｓ」とは、ウイルス様粒子又は複数のウイルス様粒子を意味する。
【００３３】
「合成」とは、指定された天然の野生型ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子（４５  Ｌ１  ｗｔ、配列番号３）中に存在するヌクレオチド配列と同じでないヌクレオチド配列を含むように、ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子が生成されたことを意味する。上述したとおり、酵母細胞による発現に好ましいコドンを含むヌクレオチド配列を含む合成分子が本発明では提供される。本発明によって提供される合成分子は、野生型ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子（配列番号２）と同じアミノ酸配列をコードする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
子宮頚癌の大多数は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の特定の腫瘍形成タイプの感染と関連がある。本発明は、発癌性ＨＰＶタイプの遺伝子によって発現されるタンパク質産物に対して免疫を誘発又は増強する組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、自己集合してＨＰＶ４５ウイルス様粒子（ＶＬＰ）になるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供し、ＨＰＶに関連する癌の予防及び／又は治療用薬剤組成物及びワクチンにおける前記ポリヌクレオチド及びＶＬＰの使用を開示する。
【００３５】
野生型ＨＰＶ４５  Ｌ１ヌクレオチド配列は報告されている（Ｇｅｎｂａｎｋ受託＃  ＮＣ＿００１５９０；Ｄｅｌｉｕｓ及びＨｏｆｍａｎｎ、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８６：１３−３１（１９９４）も参照されたい）。本発明は、ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子を提供する。本発明の合成分子は、高レベル発現のために酵母細胞に好ましいコドンを使用するようにその少なくとも一部が改変されたコドン配列を含む。合成分子は、自己集合してＶＬＰになることができるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の発現用コード配列として使用することができる。前記ＶＬＰは、パピローマウイルス感染に対して、中和抗体及び細胞性免疫による有効な免疫学的予防を提供するＶＬＰ系ワクチンに使用することができる。
【００３６】
酵母細胞におけるＨＰＶ  ＶＬＰの発現は、費用効果が高く、発酵槽中での大規模増殖に容易に適合する利点がある。しかし、ＨＰＶ４５  Ｌ１を含めて多数のＨＰＶ  Ｌ１タンパク質は、酵母細胞において、市販のスケールアップに望ましいレベルよりも低いレベルで発現される。
【００３７】
したがって、本発明は、酵母細胞環境における高レベル発現用に「最適化された」ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子配列に関する。
【００３８】
考えられる４個のヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンには６０個を上回る変形が存在し得る。これらのコドンは、わずか２０個の異なるアミノ酸（並びに転写開始及び終結）のメッセージしか与えないので、一部のアミノ酸は２個以上のコドンによってコードされる（コドンの重複性として知られる現象）。代替コドンは、完全には解明されていない理由のために、さまざまな細胞タイプの内因性ＤＮＡ中に均一には存在しない。実際、ある種の細胞タイプにおいてはある種のコドンに対して可変の自然階層又は「優先度」が存在すると考えられる。一例として、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ及びＴＴＧを含めた６個のＤＮＡコドンのいずれかによって指定される。微生物についてのゲノムコドン使用頻度の徹底的な分析によれば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内因性ＤＮＡは最も一般的にはＣＴＧロイシン指定コドンを含むが、酵母及び粘菌のＤＮＡは最も一般的にはＴＴＡロイシン指定コドンを含む。この階層を考慮すると、ロイシンの豊富なポリペプチドがＥ．コリ宿主によって高発現レベルで得られる可能性は、コドン使用頻度にある程度依存すると一般に考えられる。例えば、ＴＴＡコドンが豊富な遺伝子はＥ．コリ中で発現が不十分であるのに対し、ＣＴＧが豊富な遺伝子はこの宿主においておそらく高度に発現される可能性がある。同様に、酵母宿主細胞において、ロイシンが豊富なポリペプチドの発現に好ましいコドンはＴＴＡである。
【００３９】
組換えＤＮＡ技術に対するコドン優先現象の含意は明白であり、この現象は、首尾よく形質転換された宿主生物において外来性遺伝子の高発現レベルを達成する先の多数の失敗を説明するのに役立ち得る。すなわち、さほど「好まし」くないコドンが挿入遺伝子中に繰り返して存在し、宿主細胞の発現機構が効率的に働かない可能性がある。この現象によれば、計画された宿主細胞の好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子は、組換えタンパク質発現を実施するのに最適な形の外来遺伝物質を提供する。したがって、本発明の一側面は、酵母細胞における高レベル発現用にコドン最適化されたＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子である。本発明の好ましい実施態様においては、同じタンパク質配列をコードする代替コドンの使用は、酵母細胞によるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の発現に対する制約を排除できることが見出された。
【００４０】
本発明によれば、ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子セグメントは、同一の翻訳配列を有するが、Ｓｈａｒｐ及びＣｏｗｅによって記述されたように代替コドンの使用された配列に変換された（Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．  Ｙｅａｓｔ  ７：６５７−６７８（１９９１））。これを参照により本明細書に組込む。この方法は、一般に、高度に発現される酵母遺伝子に共通して関連しない野生型配列中のコドンを特定する段階と、酵母細胞における高発現に最適なコドンでそれを置換する段階とからなる。次いで、新しい遺伝子配列は、これらのコドン置換によって望ましくない配列が生成されたかどうか検査される（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライス認識部位の不意の生成、望ましくない制限酵素部位、高ＧＣ含量、酵母によって認識される転写終結シグナルの有無など）。望ましくない配列は、同じアミノ酸をコードする異なるコドンで既存のコドンを置換することによって除去される。次いで、合成遺伝子セグメントは、発現が改善されたかどうか試験される。
【００４１】
上記方法を使用してＨＰＶ４５  Ｌ１の合成遺伝子セグメントが作製され、酵母細胞環境における高レベル発現用に最適化されたコドンを含む遺伝子が得られた。上記手順は、ＨＰＶワクチンに使用されるコドン最適化遺伝子を設計する本発明者らの方法の概要であるが、類似のワクチン効力又は遺伝子発現の増大は、手順をわずかに変えることによって、又は配列をわずかに変えることによって達成できることを当業者は理解されたい。
【００４２】
したがって、本発明は、ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質或いはＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の生物学的に活性な断片又は変異型をコードするヌクレオチド配列を含み、ポリヌクレオチド配列が酵母宿主細胞における発現用に最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチドに関する。ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の前記変異型としては、保存的アミノ酸置換、アミノ末端切断、カルボキシ末端切断、欠失、付加などが挙げられるが、これらだけに限定されない。任意のかかる生物学的に活性な断片及び／又は変異体は、配列番号２で示されるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の免疫学的諸特性を少なくとも実質的に模倣したタンパク質又はタンパク質断片をコードする。本発明の合成ポリヌクレオチドは、治療又は予防ＨＰＶワクチンの開発に有用であるように機能的ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を発現するｍＲＮＡ分子をコードする。
【００４３】
本発明の一側面は、配列番号２で示されるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードするコドン最適化核酸分子を含む。前記核酸分子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００４４】
本発明は、本明細書を通して開示される核酸分子を含む、組換えベクター及び原核生物と真核生物の両方の組換え宿主細胞にも関する。
【００４５】
本明細書に記載の方法によって構築される合成ＨＰＶ４５  ＤＮＡ又はその断片は、適切なプロモーターと他の適切な転写制御要素とを含む発現ベクター中への分子クローニングによって組換え発現され、原核生物又は真核生物宿主細胞に移されて組換えＨＰＶ４５  Ｌ１を産生することができる。かかる操作技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ、Ｒｏｓｅ等、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９９０））に詳細に記載されている。これらは参照により全体が組込まれる。
【００４６】
したがって、本発明は、（ａ）ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、（ｂ）前記ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を発現させる方法に関する。
【００４７】
本発明は、さらに、（ａ）ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質をコードする核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階であって、前記核酸分子のコドンが、前記酵母宿主細胞における最適な発現用に最適化された段階と、（ｂ）前記ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を発現させる方法にも関する。
【００４８】
本発明は、さらに、（ａ）配列番号１で示される核酸を含むベクターを酵母宿主細胞に導入する段階と、（ｂ）前記ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質の発現を可能にする諸条件下で前記酵母宿主細胞を培養する段階とを含む、組換え宿主細胞中でＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を発現させる方法にも関する。
【００４９】
本発明の合成遺伝子は、宿主細胞においてＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を効率的に発現するように設計された配列を含む発現カセットに組み立てることができる。このカセットは、好ましくは、合成遺伝子と、プロモーター、終結配列などの作用可能にそれに連結された関係する転写及び翻訳制御配列とを含む。好ましい実施態様においては、プロモーターはＳ．セレビシエＧＡＬ１プロモーターである。ただし、当業者は、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＡＤＨ１、ＴＤＨ３、ＰＧＫプロモーターなどのいくつかの他の公知の酵母プロモーター又は他の真核生物遺伝子プロモーターのいずれかを使用できることを承知しているはずである。好ましい転写ターミネーターはＳ．セレビシエＡＤＨ１ターミネーターであるが、他の公知の転写ターミネーターも使用することができる。ＧＡＬ１プロモーター−ＡＤＨ１ターミネーターの組み合わせが特に好ましい。
【００５０】
本発明の別の側面は、遺伝子酵母細胞においてＨＰＶ４５  Ｌ１又はＬ１＋Ｌ２を組換え発現することによって産生されるＨＰＶ４５ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ＨＰＶ４５  ＶＬＰを産生する方法及びＨＰＶ４５  ＶＬＰを使用する方法である。ＶＬＰは、ヒト及び動物パピローマウイルスの主要なカプシッドタンパク質であるＬ１が、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は細菌において発現されるときに自己集合することができる（総説として、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ及びＲｏｄｅｎ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｉｅｗｓ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ；  Ｌａｃｅｙ，  ｅｄ．  Ｌｅｅｄｓ、ＵＫ：  Ｌｅｅｄｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｐ  １０１−１２（１９９６）を参照されたい）。形態学的に不明瞭なＨＰＶ  ＶＬＰも、Ｌ１とＬ２カプシッドタンパク質の組み合わせを発現させることによって産生することができる。ＶＬＰは、Ｔ＝７正二十面体構造中の７２個のＬ１  ５量体で構成される（Ｂａｋｅｒ等、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ６０（６）：１４４５−５６（１９９１））。
【００５１】
ＶＬＰは、真正のビリオンに形態学的に類似しており、動物に投与すると高力価の中和抗体を誘導することができる。ウサギ（Ｂｒｅｉｔｂｕｒｄ等、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９（６）：３９５９−６３（１９９５））及びイヌ（Ｓｕｚｉｃｈ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２（２５）：１１５５３−５７（１９９５））をＶＬＰで免疫すると、中和抗体を誘発し、実験的なパピローマウイルス感染を防御することが示された。しかし、ＶＬＰは、潜在的発癌性ウイルスゲノムを含んでおらず、単一遺伝子から発現されたときに自己集合することができるので、ＨＰＶワクチン開発において、生きているウイルスの使用を安全に代替するものである（総説として、Ｓｃｈｉｌｌｅｒ及びＨｉｄｅｓｈｅｉｍ、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９：６７−７４（２０００）を参照されたい）。
【００５２】
Ｍａｒａｉｓ及び同僚（Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０：３３１−３３６（２０００））は、バキュロウイルスから発現されるＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子から昆虫細胞中で産生されたＨＰＶ  ４５  ＶＬＰを開示している。昆虫細胞におけるＶＬＰの発現は、付随するコストが高いのでワクチン開発に有利ではない。また、昆虫細胞培養においてＨＰＶ  Ｌ１遺伝子の発現を市販製品開発に必要な大容量にスケールアップすることは困難なことが多い。酵母細胞において産生されるＨＰＶ  ４５  ＶＬＰはまだ記述されていない。酵母細胞におけるＨＰＶ  ＶＬＰの発現は、費用効果が高く、発酵槽中での大規模増殖に容易に適合する利点がある。また、酵母ゲノムは、潜在的な増殖及び発現能力が増強された組換え形質転換酵母が確実に選択されるように容易に変更することができる。
【００５３】
したがって、本発明は、酵母細胞中で発現されるＨＰＶ４５の組換えＬ１タンパク質又は組換えＬ１＋Ｌ２タンパク質を含むウイルス様粒子に関する。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様においては、ＨＰＶ４５  ＶＬＰは、サッカロミセス  セレビシエ、ハンゼヌラ  ポリモルファ、ピキア  パストリス、クルイベロミセス  フラギリス、クルイベロミセス  ラクチス及びシゾサッカロミセス  ポンベからなる群から選択される酵母中でＨＰＶ  ４５  Ｌ１又はＨＰＶ  ４５  Ｌ１＋Ｌ２を発現させることによって産生される。
【００５５】
本発明の別の側面は、コドン最適化されたＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子を発現させることによって産生されるＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質を含むＨＰＶ４５  ＶＬＰである。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、コドン最適化ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
本発明のさらに別の側面は、（ａ）ＨＰＶ４５  Ｌ１タンパク質又はＨＰＶ４５  Ｌ１＋Ｌ２タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子で酵母を形質転換する段階と、（ｂ）前記組換えＤＮＡ分子の発現が可能な諸条件下で、前記形質転換された酵母を培養して、組換えＨＰＶ４５タンパク質を産生する段階と、（ｃ）前記組換えＨＰＶ４５タンパク質を単離して、ＨＰＶ４５  ＶＬＰを産生する段階とを含む、ＨＰＶ４５  ＶＬＰを産生する方法である。
【００５７】
本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、酵母は、コドン最適化ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子で形質転換されてＨＰＶ４５  ＶＬＰを産生する。特に好ましい実施態様においては、コドン最適化ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含む。
【００５８】
本発明は、ＨＰＶ４５ウイルス様粒子を動物に投与する段階を含む、動物において免疫応答を誘導する方法も提供する。好ましい実施態様においては、ＨＰＶ４５  ＶＬＰは、コドン最適化された遺伝子によって産生される。
【００５９】
本発明のさらに別の側面は、ＨＰＶ４５  ＶＬＰを含むワクチンを哺乳動物に投与する段階を含む、ＨＰＶ関連子宮頚癌を予防又は治療する方法である。本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、ＨＰＶ４５  ＶＬＰは酵母中で産生される。
【００６０】
本発明は、ＨＰＶ４５ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンにも関する。
【００６１】
本発明のこの側面の別の実施態様においては、ワクチンは、少なくとも１個のさらに別のＨＰＶタイプのＶＬＰをさらに含む。好ましい実施態様においては、少なくとも１個のさらに別のＨＰＶタイプは、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９及びＨＰＶ６８からなる群から選択される。
【００６２】
本発明のこの側面の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにＨＰＶ１６  ＶＬＰを含む。
【００６３】
別の本発明の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにＨＰＶ１６  ＶＬＰ及びＨＰＶ  １８  ＶＬＰを含む。
【００６４】
さらに別の本発明の好ましい実施態様においては、ワクチンはさらにＨＰＶ６  ＶＬＰ、ＨＰＶ１１  ＶＬＰ、ＨＰＶ  １６  ＶＬＰ及びＨＰＶ１８  ＶＬＰを含む。
【００６５】
本発明は、ＨＰＶ  ４５ウイルス様粒子を含む薬剤組成物にも関する。また、本発明は、ＨＰＶ４５  ＶＬＰ及び少なくとも１個のさらに別のＨＰＶタイプのＶＬＰを含む薬剤組成物に関する。好ましい実施態様においては、少なくとも１個のさらに別のＨＰＶタイプは、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９及びＨＰＶ６８からなる群から選択される。
【００６６】
本発明のワクチン組成物は、あらゆる潜在的毒性を最小限に抑えながらＨＰＶ４５感染を最適に阻害するために、定常試験によって規定される適切な投与量で単体で使用することができる。また、他の薬剤の同時投与又は逐次投与が望ましい場合もある。
【００６７】
ワクチンレシピエントに導入されるウイルス様粒子の量は、発現される遺伝子産物の免疫原性によって決まる。一般に、ＶＬＰの約１０μｇから１００μｇ、好ましくは約２０μｇから６０μｇの免疫学的又は予防的有効量が筋組織に直接投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入及び腹腔内、静脈内、吸入送達などの他の投与方法も企図される。追加免疫ワクチン接種を施し得ることも企図される。本発明のワクチンの非経口導入と同時の、又はそれに続く、静脈内、筋肉内、皮下などの非経口投与又はミョウバン、Ｍｅｒｃｋアルミニウムアジュバントなどのアジュバントを用いた他の投与手段も有利である。
【００６８】
本発明に関連して使用することができる方法及び材料を説明し、開示するために、本明細書に記載するすべての刊行物は参照により本明細書に組込まれる。本発明が、先行発明の効力によってかかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００６９】
添付図面を参照して本発明の好ましい実施態様を説明したが、本発明はこれらの厳密な実施態様に限定されず、さまざまな変更及び改変が、添付された特許請求の範囲に規定される本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、当業者によって実施され得ることを理解されたい。
【００７０】
以下の実施例は、本発明を説明するものであって、限定するものではない。
【実施例１】
【００７１】
代表的ＨＰＶ  ４５  Ｌ１配列の決定
ＨＰＶ  ４５  Ｌ１配列はすでに記述されている（Ｇｅｎｂａｎｋ受託＃  ＮＣ＿００１５９０；Ｄｅｌｉｕｓ及びＨｏｆｍａｎｎ  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８６：１３−３１（１９９４）参照）。しかし、臨床分離株から得られるＤＮＡ間の小さな配列変化を発見することは珍しいことではない。代表的ＨＰＶ４５  Ｌ１野生型配列を決定するために、ＨＰＶ  ４５ＤＮＡを含むことがすでに判明している４個の臨床試料からＤＮＡが単離された。ＨＰＶ  ４５  Ｌ１配列は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び以下のプライマー、すなわち、ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｆ
【００７２】
【化１】
0005451960.tif 000002
とＨＰＶ４５Ｌ１Ｂ
【００７３】
【化２】
0005451960.tif 000003
を用いたポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって増幅された。増幅された生成物をアガロースゲル上で電気泳動させ、臭化エチジウム染色によって可視化した。約１５００ｂｐのＬ１バンドを切り取り、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＤＮＡを精製した。次いで、ＤＮＡをＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に連結し、Ｅ．コリを連結混合物で形質転換し、アンピシリン＋ＩＰＴＧ及びＸ−ｇａｌを含む青／白コロニー選択用ＬＢ寒天上に蒔いた。プレートを反転させ、３７℃で１６時間インキュベートした。
【００７４】
ＰＣＲ増幅された４個の臨床分離株の各々に由来する８個の白コロニーについてコロニーＰＣＲを実施した。ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＤＮＡは、プライマーＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｆ及びＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｂを用いてＰＣＲ増幅された。特定のＰＣＲプロトコルは、９８℃１５秒（変性）、５０℃３０秒（アニーリング）及び６８℃２分（伸長）の２５サイクルからなった。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動後に臭化エチジウム染色によって可視化された。各分離株由来のいくつかのコロニーはＬ１バンドを含んだ。各分離株由来の第２のコロニーは、アンピシリンを含むＬＢ培地中で３７℃で１６時間振とうしながら培養された。ミニプレップを実施してコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００７５】
４個の臨床分離株由来の増幅されクローン化されたＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＤＮＡを含むプラスミドについてＤＮＡ配列を決定した。ＤＮＡと翻訳されたアミノ酸配列を互いに比較し、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＨＰＶ  ４５  Ｌ１配列と比較した。４個の臨床分離株の配列分析によれば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列と同一な配列のないことが判明した。分離株＃３３由来のＨＰＶ  ４５  Ｌ１プラスミドが代表的な４５  Ｌ１野生型（ｗｔ）配列として選択され、本明細書では「４５  Ｌ１野生型配列」（配列番号３、図１参照）と称される。この配列は、９個のヌクレオチド、３個のアミノ酸、後続の配列読み枠を維持する欠失、５つのアミノ酸変化を生じる５個の点突然変異及び８つのさらなるサイレントな点突然変異を含んだ。Ｇｅｎｂａｎｋ配列のアミノ酸４９５から４９７は４５  Ｌ１  ｗｔにおいて欠失している。Ｇｅｎｂａｎｋアミノ酸番号２３（Ｓ−＞Ｎ）、５５（Ｎ−＞Ｓ）、３０３（Ｉ−＞Ｔ）、３５７（Ｓ−＞Ｎ）及び３５６（Ｑ−＞Ｈ）は、５つのアミノ酸変化を表す（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａａ−＞４５  Ｌ１  ｗｔ  ａａ）。８つのサイレントな突然変異は配列全体に分布した。図１を参照されたい。
【００７６】
４５  Ｌ１野生型配列をＬＳ−１１２
【００７７】
【化３】
0005451960.tif 000004
とＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＥＡＳ
【００７８】
【化４】
0005451960.tif 000005
プライマーを用いて増幅してＢｇｌＩＩ伸長部を付加した。ＰＣＲは、Ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて実施された。ＰＣＲ産物はアガロースゲルの臭化エチジウム染色によって可視化された。約１５００ｂｐのバンドを切り取り、ＱＩＡＥＸ  ＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを精製した。次いで、ＰＣＲ産物は、ＢｇｌＩＩを用いて３７℃で２時間消化され、ＱＩＡ  ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製された。ＢｇｌＩＩによって消化されたＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＰＣＲ産物を、（Ｈｏｆｍａｎｎ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０９：５０６−１８（１９９５）に記載された）ＢａｍＨＩによって消化されたｐＧＡＬ１１０に連結し、Ｅ．コリＤＨ５をこの連結混合物で形質転換した。
【００７９】
コロニーを正確な配向のＨＰＶ  ４５  Ｌ１挿入断片についてＰＣＲによってスクリーニングした。配列及び配向はＤＮＡ配列決定によって確認された。選択されたクローンは、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＃６と命名された。このクローンは、ＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化されて、ｐＧＡＬ１１０ベクター内のＨＰＶ  ４５  Ｌ１遺伝子の制限酵素断片プロファイルが求められた。ＤＮＡ断片はアガロースゲル上を電気泳動された。得られた制限酵素断片プロファイルは臭化エチジウム染色によって可視化され、ＵＶ光を用いて観察された。
【００８０】
Ｍａｘｉｐｒｅｐ  ＤＮＡを調製した。サッカロミセス  セレビシエ細胞は、Ｇｌｕｓｕｌａｓｅを用いたスフェロプラスト化によって形質転換受容性とされ、ｐＧＡＬ１１０−ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＃６で形質転換された。酵母形質転換混合物は、Ｌｅｕ（−）ソルビトールプレート上のＬｅｕ（−）ソルビトール上層寒天中に蒔かれ、３０℃で５から７日間反転インキュベートされた。コロニーが選択され、Ｌｅｕ（−）ソルビトールプレート上でのクローン単離のために画線された。続いて、単離されたコロニーは、回転試験管培養物中の１．６％グルコース及び４％ガラクトースを含む５×  Ｌｅｕ（−）Ａｄｅ（−）ソルビトール５ｍＬ中で３０℃で増殖されてＬ１転写及びタンパク質発現が誘発された。
【実施例２】
【００８１】
酵母コドン最適化
酵母に好ましいコドンは記述されている（Ｓｈａｒｐ，Ｐａｕｌ  Ｍ及びＣｏｗｅ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  １９９１  Ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＥＡＳＴ  ７：６５７−６７８）。ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ｗｔタンパク質の発現は検出可能であった。しかし、市販の製品開発に必要な高い発現を得るために、酵母に好ましいコドンを用いてＨＰＶ  ４５  Ｌ１遺伝子を再構築した。前記再構築配列は、ワクチン開発に使用される野生型をかなり上回る高いＨＰＶ４５  Ｌ１発現をもたらす。４５  Ｌ１  ｗｔのヌクレオチド配列は、酵母に最適化なコドン配列を利用して配列が再構築されると、３９２位が変化して４５  Ｌ１  Ｒ（Ｒ＝再構築）が生成された。しかし、アミノ酸配列は変わらなかった。ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｒのヌクレオチド（配列番号１）及びアミノ酸（配列番号２）配列を図２に示す。
【００８２】
遺伝子再構築のために採用された戦略は、遺伝子にまたがり、長くオーバーラップするセンスオリゴマーとアンチセンスオリゴマーを設計し、もとのアミノ酸配列を維持しながら酵母に好ましいコドン配列でヌクレオチドを置換することであった。これらのオリゴマーは、ＰＣＲ反応においてテンプレートＤＮＡの代わりに使用された。テンプレートオリゴマー由来の再構築配列を増幅するために、追加の増幅プライマーが設計され、使用された。２５サイクルのＰＣＲにおいてＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼが使用された。
【００８３】
最適増幅条件はセクション特異的（ｓｅｃｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）であったが、９４℃５分（変性）と、それに続く９５℃３０秒（変性）、５５から５０℃３０秒（アニール）及び７２℃１．５分（伸長）の２５サイクルと、それに続く７２℃７分の最終伸長並びに４℃保持に類似したプログラムが最も使用された。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動によって検査された。適切なサイズのバンドが切り取られ、ＤＮＡゲルが精製された。次いで、増幅断片は、１５３３  ｎｔ  再構築ＨＰＶ  ４５  Ｌ１遺伝子を組み立てるためのテンプレートとして使用された。
【００８４】
再構築後、１５３３  ｎｔバンドはゲル精製され、ｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結され、Ｅ．コリＴＯＰ１０細胞はこの連結混合物で形質転換された。コロニーは、アンピシリンを含むＬＢ  ４ｍＬ中で増殖され、プラスミドＤＮＡが標準ミニプレップ技術によって抽出された。プラスミドＤＮＡは、４５  Ｌ１再構築のための所望の変化の存在を確認するために配列決定された。４５  Ｌ１  Ｒ（再構築）は、ＢａｍＨＩ伸長部を両末端に付加し、さらにＡＴＧ開始コドンの上流の酵母５’非翻訳リーダー配列を付加するためにｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−４５  Ｌ１  Ｒから再増幅された。増幅断片は上記のようにクローン化され、プラスミドＤＮＡは配列決定された。プラスミドｐＣＲ４  Ｂｌｕｎｔ−４５  Ｌ１  Ｒ（Ｂａｍ）はＢａｍＨＩで消化され、ＤＮＡ断片はアガロースゲル上を電気泳動された。約１５５０ｂｐの４５  Ｌ１  Ｒ（Ｂａｍ）断片はゲル精製され、ＢａｍＨＩで消化されたｐＧＡＬ１１０に連結され、ＴＯＰ１０Ｆ’  Ｅ．コリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換された。
【００８５】
コロニーは、ｐＧＡＬ１１０における正確な配向のＨＰＶ  ４５  Ｌ１挿入断片についてＰＣＲによってスクリーニングされた。配列及び配向はＤＮＡ配列決定によって確認された。ＭａｘｉｐｒｅｐプラスミドＤＮＡが調製され、スフェロプラスト化によって形質転換受容性とされたＳ．セレビシエ細胞の形質転換に使用された。形質転換された酵母は、Ｌｅｕ（−）ソルビトールプレート上のＬｅｕ（−）ソルビトール上層寒天中に蒔かれ、７日間反転インキュベートされた。コロニーは、Ｌｅｕ（−）ソルビトールプレート上でのクローン単離のために画線された。続いて、単離されたコロニーは、回転試験管培養物中の１．６％グルコース及び４％ガラクトースを含む５×  Ｌｅｕ（−）Ａｄｅ（−）ソルビトール５ｍＬ中で３０℃で増殖されてＬ１転写及びタンパク質発現が誘発された。４８時間後、ＯＤ６００＝１０相当の培養体積をペレット化し、上清を除去し、ペレットを凍結し、−７０℃で保存した。
【実施例３】
【００８６】
ＲＮＡ調製
ガラクトース誘導によってＨＰＶ  ４５  Ｌ１を発現するように誘導された形質転換酵母の細胞ペレットを氷上で解凍し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）０．８ｍＬに懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。クロロホルム１／５体積をバイアルに添加した。次いで、それを１５秒間激しく振とうして混合し、室温で３分間インキュベートした。１３ｋｒｐｍで５分間遠心分離した後、上相を収集し新しいバイアルに移した。イソプロパノール０．４ｍＬを添加し、室温で１０分間インキュベートした。１３ｋｒｐｍで１０分間遠心分離してＲＮＡをペレット化した。上清をデカントし、ＲＮＡペレットを７５％ＥｔＯＨで洗浄し、遠心分離を繰り返した。上清をデカントし、ＲＮＡペレットを１５分間風乾し、続いてＲＮａｓｅを含まない水に懸濁させた。分光測光法を実施し、Ａ２６０／２８０が１．７から２．０であるときの１のＡ２６０の読み＝４０μｇ／ｍｌ  ＲＮＡと仮定して試料中のＲＮＡ濃度を求めた。
【実施例４】
【００８７】
ノーザンブロット分析
１．１％アガロースホルムアルデヒドゲルを成型した。ＲＮＡ  ５及び１０マイクログラムを変性緩衝剤（最終濃度：６％ホルムアルデヒド、５０％ホルムアミド及び０．１×ＭＯＰＳ）と混合し、６５℃に１０分間加熱した。ゲルローディングバッファー１／１０体積を添加し、試料をゲルに載せた。電気泳動を１×ＭＯＰＳ緩衝剤中７５ボルトで約３時間実施した。ゲルを１０×ＳＳＣで６０分間洗浄した。
【００８８】
ＲＮＡを１０×ＳＳＣ中で毛管作用によって１６時間かけてＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に移した。次いで、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）自動架橋機能を用いた架橋によってＲＮＡをナイロン膜に固定した。固定後、ナイロン膜を風乾させた。
【００８９】
Ｒｏｃｈｅ  ＤＩＧ  Ｈｉｇｈ  Ｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ（Ｆ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  Ｌｔｄ．、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、ノーザンブロットで４５  Ｌ１  Ｒ  ＲＮＡを検出するプローブとして使用されるＤＩＧで４５  Ｌ１  Ｒ  ＤＮＡ配列を標識した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ複合抗体を用いた免疫発生（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）を製造者の推奨に従って実施した。手短に述べると、ブロットを静かに振とうしながら３７℃で３０分間プレハイブリッド形成させた。プローブを９５℃で５分間加熱して変性させ、氷上でクエンチした。プローブをプレハイブリダイゼーション溶液に添加し、静かに振とうしながら膜に４４．６℃で４時間塗布した。次いで、ハイブリダイゼーション溶液を除去し、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣを用いてブロットを室温で５分間２回洗浄し、続いて０．５×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いて６５℃でさらに洗浄した。次いで、ブロットを３０分間ブロックし、抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ複合抗体を１：５０００希釈で３０分間塗布した。ブロットを洗浄し、プローブに結合したＲＮＡの有無をアルカリホスファターゼ複合抗ＤＩＧ結合抗体のＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質検出によって求めた。
【００９０】
４５  Ｌ１  ｗｔを発現する酵母の初期の分析によれば、機能的ＨＰＶ  ４５  Ｌ１転写及び翻訳が存在することが示唆された。しかし、配列は、酵母に好ましいコドン配列で再構築され、ワクチン開発に有用な高い発現レベルが得られた。再構築４５  Ｌ１配列は、考えられるあらゆる中途の転写終結点を取り除いて頑強な転写が確実になされるように操作された。４５  Ｌ１  Ｒ転写物のノーザンブロット分析によって、完全長転写物が生成されたことが判明した（図３）。
【実施例５】
【００９１】
ＨＰＶ  ４５  Ｌ１タンパク質発現
ガラクトースによって誘導されたＯＤ６００＝１０相当の培養物の凍結酵母細胞ペレットを氷上で解凍し、ＰＣ緩衝剤（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４及び０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）３００μｌに２ｍＭ  ＰＭＳＦと一緒に懸濁させた。酸洗された０．５ｍｍガラスビーズを約０．５ｇ／試験管で添加した。１分間の中断をはさみ４℃５分間の３サイクルで試験管をボルテックス撹拌した。２０％Ｔｒｉｔｏｎ１００  ７．５μｌを添加し、ボルテックス撹拌を４℃で５分間繰り返した。試験管を氷上に１５分間置き、次いで４℃で１０分間遠心分離した。上清を無菌微量遠心管に移し、全酵母タンパク質抽出物のラベルを貼り、日付けを記入し、−７０℃で保存した。
【実施例６】
【００９２】
ウエスタンブロット分析
各４５  Ｌ１構築体に対する２０個の単離酵母コロニーから得られた全酵母タンパク質抽出物は、ウエスタンブロットによって分析されてガラクトース誘導後の４５  Ｌ１タンパク質の発現が確認された。
【００９３】
全酵母タンパク質抽出物１０マイクログラムをＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーと混合し、９５℃に１０分間加熱した。タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに載せ、Ｔｒｉｓ−グリシン緩衝剤中で電気泳動させた。タンパク質分離後、タンパク質をウェスタン法によってゲルからニトロセルロースに移し、ブロットを揺動させながら１×希釈緩衝剤（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で室温で１時間ブロックした。ブロットを３回洗浄し、次いでヤギ抗ｔｒｐＥ−ＨＰＶ  ４５  Ｌ１血清の１：２５００希釈物と一緒に室温で１６時間インキュベートした。次いで、ブロットを３回洗浄し、抗ヤギ−ＨＲＰ複合抗体の１：２５００希釈物と一緒に１時間インキュベートした。ブロットを再度３回洗浄し、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ検出基質を塗布した（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。免疫反応性タンパク質は、ブロット上で紫色のバンドとして検出された。
【００９４】
その結果、すべての場合において、４５  Ｌ１タンパク質は、ニトロセルロース上で約５７ｋＤａに相当する明瞭な免疫反応性バンドとして検出された（図４）。約５５ｋＤａである１６  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ  Ｌ１を含まない負の対照の全酵母タンパク質抽出物と一緒に、正の対照として含まれた（データ示さず）。
【実施例７】
【００９５】
ＥＬＩＳＡアッセイ
ＨＰＶ  ４５  Ｌ１を発現する酵母細胞は、回転試験管培養、振とうフラスコ及び発酵槽を含めてさまざまな方法によって増殖された。酵母を溶解し、総タンパク質量の１マイクログラム当たり産生されるＨＰＶ  ４５  Ｌ１ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の量を測定するためにタンパク質抽出物を調製した。ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＶＬＰ発現を実証するためにサンドイッチＥＬＩＳＡが設計された。
【００９６】
酵母タンパク質抽出物中に存在する４５  Ｌ１  ＶＬＰに結合させるために、ＨＰＶタイプ１８と４５  Ｌ１  ＶＬＰの両方を認識するＨ１８Ｒ．５モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用した。非結合タンパク質を洗浄除去し、ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＶＬＰタイプの高次構造特異的ｍＡｂであるＨ４５．１０Ｂ１１．Ａ５を検出抗体として塗布した。真の高次構造的に正しい４５  Ｌ１  ＶＬＰは結合し、抗マウスＩｇＧ１  ＨＲＰ複合抗体及びＴＭＢ基質を使用することによって検出が容易になった。
【００９７】
具体的には、Ｈ１８Ｒ．５を使用してＩｍｍｕｌｏｎ  ４  ＨＢＸ９６ウェルプレートの底部を終夜４℃で被覆した。プレートをＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で３回洗浄し、続いてブロッキング溶液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０＋１％ＢＳＡ）でブロックした。プレートを３回洗浄し、抗原（ブロッキング溶液で１００μｇ／ｍｌに希釈された全酵母細胞溶解物）を列Ａに２つ組で塗布した。精製ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＶＬＰの比較基準を列Ａカラム１及び２に１００μｇ／ｍｌ全酵母タンパク質中３３００ｎｇ／ｍｌで塗布した。次いで、基準試料と試験試料を各カラム連続して２倍希釈した。室温で３時間後、過剰の抗原を吸引除去し、プレートを３回洗浄した。ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＶＬＰ高次構造特異的ｍＡｂ  Ｈ４５．１０Ｂ１１．Ａ５を含む細胞上清をブロッキング溶液で１：８０希釈し、各ウェルに室温で１時間適用した。プレートを３回洗浄し、ブロッキング溶液で１：８０００希釈された抗マウスＩｇＧ１  ＨＲＰ複合抗体を室温で１時間塗布した。プレートを洗浄し、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）を５分間適用して、ＨＲＰ複合抗体複合体を検出した。２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を添加して検出反応を停止した。プレートを波長４５０ｎｍで読取り、比較基準と比較してＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＶＬＰの濃度をｎｇ  ＶＬＰ／μｇ総タンパク質量単位で測定した。
【００９８】
すべて２回分析された４５  Ｌ１  ｗｔと２個の別個の４５  Ｌ１  Ｒクローンの比較を図５に示す。再構築ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＶＬＰ発現は４５  Ｌ１  ｗｔの観測結果の約２倍であった（図６）。
【実施例８】
【００９９】
透過型電子顕微鏡法
４５  Ｌ１タンパク質が実際に自己集合して（自己集合してウイルス様粒子になる）５量体Ｌ１カプソメアを形成することを実証するために、ある程度精製された４５  Ｌ１  Ｒタンパク質抽出物を透過型ＥＭによって分析した。
【０１００】
酵母細胞を小規模発酵条件下で増殖させ、ペレット化し、ペレットを精製処理した。Ｌ１タンパク質が発現され精製手順を通して保持されることを実証するために、ペレット及び浄化された酵母エキスを免疫ブロットによって分析した。次いで、浄化酵母エキスを４５％スクロースクッション上で遠心分離にかけ、生成したペレットを緩衝剤に懸濁させて透過型電子顕微鏡法（ＥＭ）によって分析した。
【０１０１】
産生された４５  Ｌ１  Ｒ  ＶＬＰの代表的試料を図６に示す。この粗製試料中の球状粒子の直径は４０から６０ｎｍであり、一部の粒子は、規則的な配列のカプソメアを示した。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１Ａ】本発明の合成ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子（「４５  Ｌ１  Ｒ」と示された配列番号１）中の変化したヌクレオチドを示すＤＮＡ配列アラインメントを示す図である（実施例２参照）。参照配列は、４５  Ｌ１野生型配列（「４５  Ｌ１  ｗｔ」と示された配列番号３；実施例１参照）である。変化したヌクレオチドは、その対応する場所に示されている。ヌクレオチド番号は括弧内に記載されている。４５  Ｌ１再構築配列中の同一ヌクレオチドはドットで示されている。
【図１Ｂ】本発明の合成ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子（「４５  Ｌ１  Ｒ」と示された配列番号１）中の変化したヌクレオチドを示すＤＮＡ配列アラインメントを示す図である（実施例２参照）。参照配列は、４５  Ｌ１野生型配列（「４５  Ｌ１  ｗｔ」と示された配列番号３；実施例１参照）である。変化したヌクレオチドは、その対応する場所に示されている。ヌクレオチド番号は括弧内に記載されている。４５  Ｌ１再構築配列中の同一ヌクレオチドはドットで示されている。
【図１Ｃ】本発明の合成ＨＰＶ４５  Ｌ１遺伝子（「４５  Ｌ１  Ｒ」と示された配列番号１）中の変化したヌクレオチドを示すＤＮＡ配列アラインメントを示す図である（実施例２参照）。参照配列は、４５  Ｌ１野生型配列（「４５  Ｌ１  ｗｔ」と示された配列番号３；実施例１参照）である。変化したヌクレオチドは、その対応する場所に示されている。ヌクレオチド番号は括弧内に記載されている。４５  Ｌ１再構築配列中の同一ヌクレオチドはドットで示されている。
【図２Ａ】再構築合成ＨＰＶ  ４５  Ｌ１ヌクレオチド及び単一コードアミノ酸配列（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｄｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示す図である。ヌクレオチド番号は左側に示されている。
【図２Ｂ】再構築合成ＨＰＶ  ４５  Ｌ１ヌクレオチド及び単一コードアミノ酸配列（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｄｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示す図である。ヌクレオチド番号は左側に示されている。
【図２Ｃ】再構築合成ＨＰＶ  ４５  Ｌ１ヌクレオチド及び単一コードアミノ酸配列（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｄｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を示す図である。ヌクレオチド番号は左側に示されている。
【図３】厳密性の高い条件下でＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＲＮＡを特異的に探索したノーザンブロットである（実施例４参照）。レーン（１）はＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｒ  ＲＮＡ  ５μｇを含み、レーン（２）はＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｒ  ＲＮＡ  １０μｇを含む。単一完全長ＲＮＡ転写物はこのブロットで明らかである。左側の矢印は、完全長ＨＰＶ  ４５  Ｌ１転写物の予測位置を示す。
【図４】ＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ｗｔ及び３個のＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｒ分離株のウエスタンブロットである。レーンの内容は、４５  Ｌ１  ｗｔ（レーン１）、４５  Ｌ１  Ｒ  ＃４（レーン２）、４５  Ｌ１  Ｒ  ＃７（レーン３）、４５  Ｌ１  Ｒ  ＃１１（レーン４）、ＨＰＶ  １６  Ｌ１対照（レーン５）である。全酵母タンパク質抽出物１５マイクログラムを、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの各レーンに充填した。ＴｒｐＥ−ＨＰＶ  ４５  Ｌ１融合タンパク質に対するヤギポリクローナル抗血清を使用してＨＰＶ  ４５  Ｌ１タンパク質を特定した。左側の矢印は５５ｋＤａの位置を示す。
【図５】２つのＥＬＩＳＡ実験から得られたｎｇ  ＶＬＰ／μｇ総タンパク質量単位のデータの一部を示す表である（実施例７参照）。４５  Ｌ１  ｗｔと４５  Ｌ１  Ｒの２個の別個のクローンとの比較を示す。再構築されたＨＰＶ  ４５  Ｌ１  ＶＬＰの発現は４５  Ｌ１  ｗｔの約２倍であった。
【図６】透過型電子顕微鏡法によって可視化された、本明細書に記載されたＨＰＶ  ４５  Ｌ１  Ｒタンパク質分子で構成されたＨＰＶ  ４５  ＶＬＰの代表的な試料を示す図である（実施例８参照）。バーは約１００ｎｍである。（配列表）
【図１Ａ】
0005451960.tif 000006
【図１Ｂ】
0005451960.tif 000007
【図１Ｃ】
0005451960.tif 000008
【図２Ａ】
0005451960.tif 000009
【図２Ｂ】
0005451960.tif 000010
【図２Ｃ】
0005451960.tif 000011
【図３】
0005451960.tif 000012
【図４】
0005451960.tif 000013
【図５】
0005451960.tif 000014
【図６】
0005451960.tif 000015
【配列表】
0005451960000001.xml