(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0005539881.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ、Ｈまたは式（Ａ）：
【化２】
0005539881.tif 000010
で表される基である）
で表される化合物、またはその塩。
【請求項２】
式（ＩＩ）：
【化３】
0005539881.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記と同義である）
で表される、請求項１に記載の化合物、またはその塩。
【請求項３】
式（ＩＩＩ）：
【化４】
0005539881.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記と同義である）
で表される、請求項１に記載の化合物、またはその塩。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がすべて式（Ａ）：
【化５】
0005539881.tif 000013
で表される基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含有する血管内皮機能改善剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物またはその塩を含有する医薬組成物。
【請求項７】
酸の存在下で、エピガロカテキンガレートまたはエピガロカテキンとホルムアルデヒドとを反応させることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なエピガロカテキンガレート４量体化合物、該化合物の製造方法、並びに、該化合物を含有する飲食品及び医薬組成物、特に血管内皮機能改善作用を奏する飲食品及び医薬組成物、に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリックシンドロームは、生活習慣や遺伝的素因により内臓脂肪蓄積量が増加した結果、インスリン抵抗性が誘発されて脂質代謝異常、高血圧、耐糖能異常などの症状が現れ、血管病変を引き起こしやすくなっている病態である。このような病態は最終的に心筋梗塞、脳梗塞などの動脈硬化症を引き起こし、最悪の場合は死に至ることもある。【０００３】
メタボリックシンドロームに起因するインスリン抵抗性がみられる場合には、血管内皮細胞の機能が障害されており、その原因として血管内皮細胞での一酸化窒素（以下ＮＯと略記）産生系の異常が示唆されている（非特許文献１）。【０００４】
ＮＯは、血管内皮細胞において内皮型ＮＯ合成酵素（以下ｅＮＯＳと略記）によりＬ−アルギニンと酸素分子から生成する。血管内皮由来の血管弛緩因子であるＮＯの役割は、主として増殖性変化、炎症性変化、血小板凝集、酸化ストレスに対する抑制作用であり、動脈硬化、高脂血症など種々の危険因子の存在下で、ＮＯの産生低下や作用不足が認められている（非特許文献２）。特に、メタボリックシンドロームに伴うインスリン抵抗性状態下ではｅＮＯＳの補酵素であるテトラヒドロビオプテリン（以下ＢＨ４と略記）産生酵素のＧＴＰシクロヒドラーゼＩ（以下ＧＴＰ−ＣＨ１と略記）活性が低下していることが知られている（非特許文献１）。ＮＯの産生低下、産生不足の機序は複雑であるが、Ｌ−アルギニンの代謝物であるａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ（以下ＡＤＭＡと略記）によりｅＮＯＳ活性が阻害されることが知られている。また、ｅＮＯＳ活性が低下した状態では、酸素分子は優先的にＮＡＤＰＨオキシダーゼにより代謝され、活性酸素を生じ、さらなる血管内皮機能低下を招く（非特許文献３）。一方で血管内皮細胞はＡＤＭＡ分解酵素であるｄｉｍｅｔｈｙｌａｒｇｉｎｉｎｅ  ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ２（以下ＤＤＡＨ２と略記）を産生することで、血管内皮機能を良好に保つことができる。また、血管内皮細胞に存在するＮＡＤＰＨオキシダーゼの活性を低下させることによっても、血管内皮機能は良好に保たれる。【０００５】
血管内皮機能改善効果を有する食品素材としては、緑茶に含まれる（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（以下、「ＥＧＣＧ」ともいう）が知られている（非特許文献４）。また、紅茶摂取によりヒト上腕の血流依存性血管拡張反応が改善されること（非特許文献５）、紅茶抽出物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏの検討でｅＮＯＳの活性化が促されること（非特許文献６）が示されているが、これらの活性成分は明らかにされていない。また、烏龍茶やその成分に関する検討は未だなされていない。【０００６】
烏龍茶固有の発酵過程により生成するＥＧＣＧ重合物としては、二量体（ｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎＡおよびｏｏｌｏｎｇｈｏｍｏｂｉｓｆｌａｖａｎＢ）（非特許文献７）や三量体（特許文献１）が単離、同定されており、これらの化合物に非常に強い膵リパーゼ阻害活性があることが報告されている（非特許文献８、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００５／１１６００５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｏｌｉａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｊｐｎ．Ｖｏｌ．１２５：ｐ２８５−２９０，２００５
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．９５，ｐ１７４７−１７５５，１９９５
【非特許文献３】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１４８，ｐ３７７３−３７８０，２００７
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２７９，ｐ６１９０−６１９５，２００４
【非特許文献５】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．Ｖｏｌ．１０４，ｐ１５１−１５６，２００１
【非特許文献６】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．２７９，ｐ４６６３７−４６６４３，２００４
【非特許文献７】Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３７（１２），３２５５−３２６３,  １９８９
【非特許文献８】Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５３，４５９３−４５９８（２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献４には、ＥＧＣＧの血管内皮機能改善効果が記載されているが、培養細胞を用いた検討では、ｅＮＯＳ活性を上昇させるために最低３０〜５０μＭという比較的高い濃度が必要である。また非特許文献５には、紅茶の血管内皮機能改善効果が開示されているが、ヒトに１日９００ｍｌの紅茶を４週間摂取させた場合に対照群と比較して上腕の血流依存性血管拡張反応が改善することが記載されている。【００１０】
このように、ＥＧＣＧは血管内皮機能改善効果を奏するが、その効果は十分ではなく、ＥＧＣＧを含有する紅茶の摂取によってその効果を得るには、比較的多くの紅茶等を摂取することが必要であった。また、ＥＧＣＧは苦味や渋みの原因となることから継続摂取においては香味的な問題があり、さらに、紅茶の大量摂取はカフェインなどの大量摂取に繋がることからも、血管内皮機能の維持を目的とした継続的な摂取には適当ではないと考えられる。【００１１】
本発明の目的は、持続的に摂取可能で、血管内皮細胞からのＮＯの作用を増強すること等により血管内皮機能を改善する作用を有する化合物、さらには当該化合物を含有する飲食品を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これらの問題を解決するため発明者らは、ＥＧＣＧ等のクロマン環を有する化合物から誘導される化合物について検討を行なったところ、クロマン環を４つ有する新規な化合物が、ＥＧＣＧより優れた血管内皮機能を改善する作用を奏することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、
１．式（Ｉ）：【００１４】
【化１】
0005539881.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ、Ｈまたは式（Ａ）：【００１５】
【化２】
0005539881.tif 000003
で表される基である）
で表される化合物、またはその塩、
２．式（ＩＩ）：【００１６】
【化３】
0005539881.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記と同義である）
で表される、前記１に記載の化合物、またはその塩、
３．式（ＩＩＩ）：【００１７】
【化４】
0005539881.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記と同義である）
で表される、前記１に記載の化合物、またはその塩、
４．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がすべて式（Ａ）：【００１８】
【化５】
0005539881.tif 000006
で表される基である、前記１〜３のいずれか一つに記載の化合物またはその塩、
５．前記１〜４のいずれか一つに記載の化合物またはその塩を含有する血管内皮機能改善剤、
６．前記１〜４のいずれか一つに記載の化合物またはその塩を配合した飲食品、
７．前記１〜４のいずれか一つに記載の化合物またはその塩を含有する医薬組成物、
８．酸の存在下で、エピガロカテキンガレートまたはエピガロカテキンとホルムアルデヒドとを反応させることを含む、前記１〜４のいずれか一つに記載の化合物の製造方法、
である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の４量体を飲食品に配合することで、血管内皮機能を改善し健康増進を目的とした飲料あるいはサプリメントが提供できる。またこれらの化合物は、飲食品に配合した場合も香味を損なうことがないため嗜好性が高く、安全性にも優れていることから、血管内皮機能維持のために持続的な摂取が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、化合物１の１ＨＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、化合物１の１３ＣＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】図３は、化合物２の１ＨＮＭＲスペクトルを示す。
【図４】図４は、化合物２の１３ＣＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】図５は、ｅＮＯＳの発現の結果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＧＴＰ−ＣＨ１の発現の結果を示すグラフである。
【図７】図７は、ＤＤＡＨ２の発現の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのＮｏｘ４サブユニット遺伝子発現の結果を示すグラフである。
【図９】図９は、ｅＮＯＳの発現の結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＧＴＰ−ＣＨ１の発現の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＤＤＡＨ２の発現の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼのＮｏｘ４サブユニット遺伝子発現の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、４個のクロマン環がメチレン基で連結された、式（Ｉ）で表される新規なＥＧＣＧ４量体化合物、式（Ｉ）の化合物の製造方法、及び式（Ｉ）の化合物を含有する血管内皮機能改善剤、飲食品及び医薬組成物に関する。以下、本発明について説明する。
＜ＥＧＣＧ４量体化合物＞
本発明の式（Ｉ）で表されるＥＧＣＧ４量体化合物は以下のようにして製造することができる。
【００２２】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がいずれも式（Ａ）で表される基（ガレート基）である式（Ｉ）の化合物は、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートを、溶媒中、酸の存在下でホルムアルデヒドと反応させることによって製造することができる。
【００２３】
反応に使用することができる溶媒としては、例えば、メタノール及びエタノール、ｎ−プロパノール、ｉｓｏ−プロパノール等のアルコール類が挙げられる。溶媒の使用量については特に制限はないが、例えば、１質量部のＥＧＣＧに対して２０〜２００質量部の溶媒を用いることができる。
【００２４】
酸としては、例えば、塩酸、硫酸及び硝酸等の無機酸、及び、蟻酸、酢酸等の有機酸等を用いることができる。酸の使用量については特に制限はないが、例えば、１モルのＥＧＣＧに対して０．０１〜２モルの酸を用いることができる。
【００２５】
ホルムアルデヒドは、例えば、１モルのＥＧＣＧに対して１〜１００モルで用いることができる。
【００２６】
反応の温度及び時間は、用いる溶媒量等によって変わり得るが、例えば、反応温度は−１０〜５０℃、反応時間は０．２〜１２時間である。典型的には、反応温度は室温（２５℃程度）である。
【００２７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がいずれもＨ（水素原子）である式（Ｉ）の化合物は、（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートの代わりに、（−）−エピガロカテキンを用いて、前記と同様にホルムアルデヒドと反応させることによって製造することができる。
【００２８】
なお、ホルムアルデヒドとの反応に（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートまたは（−）−エピガロカテキンを用いた場合、得られる式（Ｉ）の化合物において、各クロマン環の２位の置換基と３位の置換基との相対立体配置はシス（ｃｉｓ）である。
【００２９】
（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレートまたは（−）−エピガロカテキンとホルムアルデヒドとの反応によって得られる４量体の生成物は、通例、メチレン基によるクロマン環の連結様式が異なる式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）の三種の化合物の少なくとも二種の化合物を含有する４量体化合物の混合物である。そして、例えば、ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）などのスチレン系吸着樹脂やＳｈｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０のようなデキストラン系樹脂によるオープンカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等、公知の精製方法を用いて、そのような混合物から、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）及び式（ＩＶ）の各化合物を単離することができる。
【００３０】
【化６】
0005539881.tif 000007
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４の１乃至４個がＨである式（Ｉ）の化合物は、また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がいずれもガレート基である式（Ｉ）の化合物から、ガレート基を加水分解によって除去することによって製造することもできる。そのような加水分解は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基性化合物の水溶液を用いて、またはタンナーゼ活性を有する酵素等の加水分解酵素を用いて、行なうことができる。
【００３１】
このような加水分解では、通例、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４がいずれもガレート基である式（Ｉ）の化合物からガレート基が１個、２個、３個または４個が除去された、複数種の化合物の混合物を与える。この場合、例えば、ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）などのスチレン系吸着樹脂やＳｈｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０のようなデキストラン系樹脂によるオープンカラムクロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等、公知の精製方法を用いて、そのような混合物から各化合物を単離することができる。
【００３２】
本発明はまた、式（Ｉ）の化合物の塩にも関する。
【００３３】
そのような塩としては、式（Ｉ）の化合物から形成できる塩であれば特に制限はないが、医薬的に許容可能な塩が好ましい。
【００３４】
そのような塩としては、例えば、式（Ｉ）の化合物のリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等の、周期表の１族または２族の金属元素との金属塩が挙げられる。このような金属塩は、例えば、式（Ｉ）の化合物の水酸基（フェノール性水酸基、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のいずれかまたはすべてがＨの場合の水酸基）において形成することができる。
【００３５】
例えば、非プロトン性溶媒中、式（Ｉ）の化合物と、金属ナトリウムまたは水素化ナトリウムとを反応させて、水酸基（−ＯＨ）をナトリウムアルコキシド基（−ＯＮａ）に変換することによって、式（Ｉ）の化合物のナトリウム塩を製造することができる。そして、金属ナトリウムまたは水素化ナトリウムの使用量を調節することによって、式（Ｉ）の化合物に含まれる水酸基の総てをナトリウムアルコキシド基に変換することができ、また、水酸基の一部のみをナトリウムアルコキシド基に変換することもできる。
【００３６】
本発明の式（Ｉ）の化合物は新規化合物であるが、発明者らが製造した式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物を標準品として用いて検討を行なったところ、実施例に後述するとおり、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物が烏龍茶中にも存在することが判明した。そのため、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物は、Camellia sinensisの葉を原料とする茶類、好ましくは烏龍茶、紅茶などの発酵茶や焙じ茶から抽出、精製することによって、単離することもできる。
【００３７】
これら茶類からの式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物の単離は、例えば、吸着カラムクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等によって行なうことができる。
＜血管内皮機能改善剤、飲食品及び医薬組成物＞
本発明の化合物は血管内皮機能の改善作用を示す。
【００３８】
すなわち、本発明の化合物は、ｅＮＯＳ遺伝子の発現を増強することによって、ＧＴＰ−ＣＨ１遺伝子の発現を増強することによって、ＤＤＡＨ２遺伝子の発現を増強することによって、及び／または、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ遺伝子の発現を低下させることによって、血管内皮機能の改善作用を奏することができる。ｅＮＯＳ遺伝子、ＧＴＰ−ＣＨ１遺伝子、ＤＤＡＨ２遺伝子及びＮＡＤＰＨオキシダーゼ遺伝子の発現の評価は、文献公知の方法によって、または、以下の実施例に記載の方法によって行なうことができる。
【００３９】
このように、本発明の化合物は血管内皮機能の改善作用を示すことから、血管内皮機能改善剤として用いることができる。また、本発明の化合物は血管内皮機能の改善作用を示すことから、本発明の化合物を飲食品に配合したり、医薬組成物の形態とすることによって、ヒト等の哺乳動物の摂取に適した形態とし、そして、当該飲食品または医薬品を用いて、哺乳動物において血管内皮機能の改善作用を奏することができる。
【００４０】
したがって、本発明はまた、本発明の化合物またはその塩を配合した飲食品、及び本発明の化合物またはその塩を含有する医薬組成物、に関する。
【００４１】
本発明の化合物は、各種飲食品に配合することができる。本発明の化合物を配合することができる飲食品には特に制限はなく、既存の、各種飲食品に配合することができる。飲食品としては、例えば、清涼飲料、茶飲料、液状強壮剤、健康飲料、栄養補給飲料、スポーツドリンク及び炭酸飲料（これら飲料の濃縮原液および調製用粉末を含む）等の飲料、及び、ガム、キャンディー、ゼリー、錠菓、健康食品、栄養補給食品及びサプリメント等の食品である。そして、これらの飲食品における本発明の化合物の割合が、例えば、０．０１〜１００００ｐｐｍ（μｇ／ｍｌ）となるように配合することができる。より好ましくは０．０６〜２０００ｐｐｍ、さらに好ましくは０．１〜1０００ｐｐｍとなるように配合することができる。
【００４２】
本発明の化合物を医薬として用いる場合には、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤及び注射剤等の形態で提供される。本発明の化合物またはその塩をそのまま、あるいは水等で希釈して、経口的に投与できる。もしくはこれを公知の医薬用担体と共に製剤化することにより調製される。例えば、本発明の化合物またはその塩をシロップ剤などの経口液状製剤として、またはエキス、粉末などに加工して、薬学的に許容される担体と配合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤，散剤などの経口固形製剤として投与できる。薬学的に許容できる担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、賦形剤、懸濁化剤、結合剤などとして配合される。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色料、甘味剤などの製剤添加物を用いることもできる。
【００４３】
また、有効な用量は、患者の年齢及び体重、疾病の種類及び重篤度並びに投与の経路により適宜決定することができる。
【実施例】
【００４４】
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明はこれらによって制限されるものではない。
［実施例１］  式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物の合成と単離
ア．合成とオープンカラムによる分画
６ｇ（１３ミリモル）の（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート（ＥＧＣＧ）（ＴｅａｖｉｇｏＴＭ、ロッシュ社製）をＨＣｌのエタノール溶液１２０ｍＬ（０．０２規定、ＨＣｌとして２．４ミリモル）に溶解し、ホルムアルデヒドのエタノール溶液１８０ｍＬ（４質量％、ホルムアルデヒドとして２４０ミリモル）を加え、そして、室温で４時間、撹拌した。反応終了後、純水で１０倍に希釈し、吸着樹脂ＣＨＰ−２０Ｐカラム（６００ｍＬ、３７−７５μｍ、三菱化学株式会社）に負荷した。１２００ｍＬの水で洗浄後、９００ｍＬの２５Ｖ／Ｖ％アセトニトリル水溶液、１２００ｍＬの３０％Ｖ／Ｖ％アセトニトリル水溶液で順次溶出し、２５Ｖ／Ｖ％アセトニトリル水溶液での溶出画分は３００ｍＬずつ３フラクション（ｆｒ．１からｆｒ．３）に分け、３０％Ｖ／Ｖ％アセトニトリル水溶液での溶出画分は３００ｍＬずつ４フラクション（ｆｒ．４からｆｒ．７）に分画した。
イ．分取ＨＰＬＣ条件
ＣＨＰ−２０Ｐカラム精製で得られた分画物をさらに逆相の分取ＨＰＬＣで精製した。
＜条件＞
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５（５ｃｍφｘ５０ｃｍ、野村化学株式会社）
移動相Ａ：０．０５Ｖ／Ｖ％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸）
移動相Ｂ：９０Ｖ／Ｖ％ＣＨ３ＣＮ、０．０５Ｖ／Ｖ％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ
流速：３２ｍＬ／分
グラジエントプログラム：Ａ／Ｂ＝８０／２０（３０分）、Ａ／Ｂ＝８０／２０→６０／４０（１００分）、Ａ／Ｂ＝６０／４０（３０分）
検出器：紫外可視吸光検出器ＳＰＤ−６ＡＶ（（株）島津製作所）
検出波長：Ａ２８０ｎｍ
サンプル：ＣＨＰ−２０Ｐカラム精製で得られたｆｒ．２からｆｒ．７を、それぞれ２０Ｖ／Ｖ％アセトニトリル水溶液に溶解し、数回に分けて全量を負荷した。
＜分画＞
上記の分析条件おいて、保持時間１０９分（化合物１）、１１３分（化合物２）、並びに、保持時間８５分（化合物３）、保持時間１０６分（化合物４）、保持時間１０４分（化合物５）及び保持時間１３５分（化合物６）に相当する各ピークを集めた。
ウ．化合物の構造解析
分取ＨＰＬＣで単離した化合物について、ＭＳおよびＮＭＲ測定を行った。【００４５】
化合物３〜６のＭＳをＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、英国）により、ネガティブ、Ｖモード測定したところ、それぞれｍ／ｚ９２７．１６０、９２７．１６３、１３９７．２４８、９２７．１６１、の［Ｍ−Ｈ］−のイオンピークが認められた。また、化合物３のＮＭＲスペクトルデータは文献（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３７（１２），３２５５−３５６３（１９８９））に記載のウーロンホモビスフラバン−ＡのＮＭＲスペクトルデータと一致した。化合物４のＮＭＲスペクトルデータは文献（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３７（１２），３２５５−３５６３（１９８９））に記載のウーロンホモビスフラバン−ＢのＮＭＲスペクトルデータと一致した。さらに、化合物５のＮＭＲスペクトルは国際公開第２００５／１１６００５号の図４及び図５に記載のＮＭＲスペクトルと一致した。化合物６のＮＭＲスペクトルは国際公開第２００５／１１６００５号の図２及び図３に記載のＮＭＲスペクトルと一致した。これらの結果から、化合物３はウーロンホモビスフラバン−Ａと、化合物４はウーロンホモビスフラバン−Ｂと、化合物５は下記の式（Ｖ）の化合物（式中、Ｒはガレート基を表す）と、化合物６はウーロンホモビスフラバン−Ｃと確認された。【００４６】
【化７】
0005539881.tif 000008
化合物１および化合物２については、以下のＭＳ、ＮＭＲにより構造解析を行った。【００４７】
ＭＳはＱ−ＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社製、英国）でイオン源にＺスプレーイオンソースをつけたＥＳＩを用い、ネガティブ、Ｖモードで測定した。Ｃｏｎｅ  ｖｏｌｔ．：４５Ｖ、Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：３ＫＶ、Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐ：１８０℃、ロックスプレーによる質量補正を行い、リファレンスにはロイシンエンケファリン（ｍ／ｚ５５４．２６１５［Ｍ−Ｈ］−）を用いた。【００４８】
その結果、化合物１はｍ／ｚ１８６７．３１１２［Ｍ−Ｈ］−の分子イオンおよび２価の９３３．１５１７［Ｍ−２Ｈ］２−を与え、分子式Ｃ９１Ｈ７２Ｏ４４（ｅｒｒ．：−１１．０ｐｐｍ）、化合物２はｍ／ｚ１８６７．３１００［Ｍ−Ｈ］−の分子イオンおよび２価の９３３．１１５１［Ｍ−２Ｈ］２−を与え、分子式Ｃ９１Ｈ７２Ｏ４４（ｅｒｒ．：−１１．７ｐｐｍ）と算出され、どちらの化合物もＥＧＣＧ４分子が３つのメチレン基により架橋された化合物であると推定された。【００４９】
ＮＭＲは以下の条件により測定を行った。化合物１および化合物２はＤＭＳＯ−ｄ６（（ＣＤ３）２ＳＯ）に溶解し、１Ｈと１３Ｃの残存ピークδ２．５０、δ３９．４３を内部標準としてＮＭＲ測定を行った。測定項目は１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＳＱＣ、１Ｈ｛１３Ｃ｝−ＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹおよびＤＱＦ−ＣＯＳＹをＤＭＸ−７５０ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＢＲＵＫＥＲ  ＢＩＯＳＰＩＮ、ドイツ）で測定した。ＮＭＲの結果、化合物１はＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧで結合した化合物（式（ＩＩ））、化合物２はＥＧＣＧ８：６ＥＧＣＧ８：８ＥＧＣＧ６：８ＥＧＣＧで結合した化合物（式（ＩＩＩ））であることが明らかになった。化合物１の１ＨＮＭＲ及び１３ＣＮＭＲスペクトルを図１及び図２に、化合物２の１ＨＮＭＲ及び１３ＣＮＭＲスペクトルを図３及び図４に、それぞれ示す。
化合物１：
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６中）は、δ 10.34, 9.37, 9.17, 9.09, 9.01, 8.88, 8.75, 8.71, 8.68, 8.08, 8.04, 7.62, 6.81,6.77, 6.72, 6.55, 6.49, 6.39, 6.04, 5.86, 5.55, 5.47, 5.34, 5.23, 4.96, 4.79, 4.64, 4.04, 4.02, 3.92, 3.90, 3.85, 3.83, 3.73, 3.71, 3.64, 3.62, 3.54, 3.52, 3.07, 3.05, 2.96, 2.93, 2.74, 2.72, 2.70のシグナルが認められた。【００５０】
１３ＣＮＭＲは、δ165.29, 165.13, 165.02, 165.01,154.45, 154.44, 154.25, 152.33, 152.20, 151.97, 151.66, 151.62, 150.82, 150.66, 150.52, 149.66, 145.63, 145.56, 145.54, 145.50, 145.50, 145.27, 145.23, 145.18, 138.46, 138.38, 132.77, 132.26, 132.12, 128.50, 127.61, 119.20, 119.17, 118.96, 118.90, 108.73, 108.55, 107.05, 106.19, 105.19, 105.05, 104.31, 103.77, 99.01, 98.52, 77.44, 76.65, 76.51, 76.10, 67.53, 67.50, 66.95, 66.63, 25.94, 25.63, 25.49, 25.30, 17.14, 16.74, 15.81のシグナルが認められた。
化合物２：
１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）は、δ 9.91, 9.25, 9.16, 8.09, 7.22, 6.81, 6.76,  6.74,  6.52,  5.94, 5.50, 5.38, 4.77, 4.52, 3.95, 3.95, 3.80, 3.54, 2.80, 2.74, 2.73, 2.67のシグナルが認められた。【００５１】
１３ＣＮＭＲは、δ 165.08, 165.01, 154.06, 152.83, 152.35, 151.45, 150.78, 150.26, 145.52, 145.52, 145.24, 145.18, 138.49, 138.44, 132.21, 132.10, 128.42, 127.63, 119.05, 118.95, 108.58, 108.46, 108.46, 106.95, 105.74,  104.92, 104.06, 98.32, 97.81,  76.59, 75.94, 66.69, 66.35,26.33, 25.26, 16.72, 15.99のシグナルが認められた。【００５２】
この合成、精製により得られた各化合物の収量は、化合物３（ウーロンホモビスフラバン−Ａ、９８４ｍｇ）、化合物４（ウーロンホモビスフラバン−Ｂ、３７４ｍｇ）、化合物５（４６８ｍｇ）、化合物６（ウーロンホモビスフラバン−Ｃ、３３ｍｇ）、化合物１（１５ｍｇ）、化合物２（４４ｍｇ）であった。
［実施例２］  培養血管内皮細胞を用いた血管内皮機能改善効果検討
（ア）式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）の血管内皮機能改善効果
実施例１で合成・精製した式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）の化合物について、血管内皮機能関連遺伝子の発現に及ぼす影響について検討を行った。また、比較対象として、血管内皮機能改善作用の知られているＥＧＣＧ単量体（和光純薬工業株式会社製）とテアフラビン、テアフラビン  ３−Ｏ−ガレート、テアフラビン  ３’−Ｏ−ガレートおよびテアフラビン  ３，３’−Ｏ−ジガレート（長良サイエンス株式会社製）を用いた。【００５３】
これらの化合物を滅菌済みジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ナカライテスク株式会社）に溶解し、濃度が１０ｍＭの溶液を調製した。【００５４】
これらの溶液をＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２培地（倉敷紡績株式会社）を用いて１０００倍希釈し、最終濃度が１０μＭである溶液を調製した（ＤＭＳＯの最終濃度は０．１Ｖ／Ｖ％）。これらサンプル溶液を６−ウェルプレートに培養したヒト臍帯血管内皮細胞（倉敷紡績株式会社）に３ｍＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で８時間インキュベートした。【００５５】
細胞をＩＳＯＧＥＮ（株式会社ニッポンジーン）で回収し、細胞からＲＮＡを抽出した。さらに、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＲＮＡを精製した。精製した総ＲＮＡ２００ｎｇを鋳型としてＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （アプライドバイオシステムズ株式会社）を用いてｃＤＮＡを合成し、定量ＰＣＲを行った。内部標準としてグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を用いた比較Ｃｔ法で解析し、無処置細胞を対照として、被験サンプルの遺伝子発現変化率（対照に対する倍率）を算出した。【００５６】
ＥＧＣＧ、式（ＩＩ）（ＯＨＢＦ−Ｔｅｔ１）、式（ＩＩＩ）（ＯＨＢＦ−Ｔｅｔ２）、テアフラビン（ＴＨＦ）、テアフラビン  ３−Ｏ−ガレート（ＴＨＦ３Ｇ）、テアフラビン  ３’−Ｏ−ガレート（ＴＨＦ３’Ｇ）およびテアフラビン  ３，３’−Ｏ−ジガレート（ＴＨＦＤｉＧ）の各種遺伝子発現変化率を図５〜８に示した。【００５７】
式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物はｅＮＯＳ遺伝子の発現を３倍程度（図５）、ＧＴＰ−ＣＨ１遺伝子の発現を７倍程度（図６）、ＤＤＡＨ２遺伝子の発現を３倍程度増強させた（図７）。また、血管内皮細胞にて活性酸素を産生し、血管内皮機能を低下させるＮＡＤＰＨオキシダーゼのＮｏｘ４サブユニット遺伝子の発現は式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物の存在下で劇的に低下することが示された（図８）。【００５８】
一方、ＥＧＣＧ単量体およびテアフラビン類は今回検討した濃度では、すべての遺伝子発現をほとんど変化させず、本発明のＥＧＣＧ４量体は、ＥＧＣＧ単量体やテアフラビン類よりも低濃度で有効であることが明らかとなった。
（イ）各種ＥＧＣＧ重合体の血管内皮機能改善効果
ＥＧＣＧ２量体および３量体が血管内皮機能関連遺伝子の発現に及ぼす影響について検討を行った。評価に用いたＥＧＣＧ重合体のうち、テアシネンシン（ＴＳＮ）−Ａは論文（Hashimoto, F. Nonaka, G. Nishioka, I. Chem. Pharm. Bull. 36 (5), 1676-1684 (1988)）に準じて合成したものを用い、ウーロンホモビスフラバン−Ａ、ウーロンホモビスフラバン−Ｂ、ウーロンホモビスフラバン−Ｃ及び化合物５は実施例１で合成・精製したものを用い、評価は上記（ア）と同様の方法で行った。【００５９】
ウーロンホモビスフラバン−Ａ（ＯＨＢＦ−Ａ）、ウーロンホモビスフラバン−Ｂ（ＯＨＢＦ−Ｂ）、ウーロンホモビスフラバン−Ｃ（ＯＨＢＦ−Ｃ）、化合物５（ＯＨＢＦＴｒｉ−１）、テアシネンシン−Ａ（ＴＳＮ−Ａ）の各種遺伝子発現変化率を図９〜１２に示した。【００６０】
図９〜１２に示す通り、ＥＧＣＧ２量体であるウーロンホモビスフラバン−Ａ、ウーロンホモビスフラバン−Ｂ、ウーロンホモビスフラバン−Ｃ、テアシネンシンＡおよびＥＧＣＧ３量体である化合物５は、上記アで検討した式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）の化合物と同一の濃度で何れの遺伝子発現も殆ど変化させなかった。【００６１】
以上の結果から本発明のＥＧＣＧ４量体の血管内皮機能改善効果は、ＥＧＣＧ重合体の中でも本発明の化合物に特徴的な作用であることが明らかとなった。
［実施例３］ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定条件と黒烏龍茶の測定
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの測定は、４０００  Ｑ  ＴＲＡＰ（アプライド社製）で、ターボイオンスプレーを用い、ネガティブモードで、以下の条件で測定した；Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：４６ｅＶ（ｎｅｇａ．）、Ｉｏｎｓｐｒａｙ  ｖｏｌｔａｇｅ：４５００Ｖ、温度：４５０℃。【００６２】
ＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）における測定チャンネルはＥＧＣＧ４量体化合物；９３３．１６／１６８．９０（ｎｅｇａ．２価）、で以下の測定条件で行った。標準物質には式（ＩＩＩ）の化合物を用いた。【００６３】
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  Ｃ３０−ＵＧ−３（野村化学、３ｍｍφ×１５０ｍｍ）
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１Ｖ／Ｖ％ＨＣＯＯＨ／Ｈ２Ｏ
移動相Ｂ：０．１Ｖ／Ｖ％ＨＣＯＯＨ／ＣＨ３ＣＮ
グラジエントプログラム：Ａ／Ｂ＝９１／９（０分）→Ａ／Ｂ＝４０／６０（１７分）→Ａ／Ｂ＝１５／８５（１７．１分）→Ａ／Ｂ＝１５／８５（１７．１分〜１９分）
上記の条件を用いて黒烏龍茶の測定を行なった。【００６４】
黒烏龍茶の調合液（殺菌前の溶液）をＣＨＰ−２０Ｐカラム（三菱化学株式会社）でステップワイズに分画し、各フラクションの定量を行った。各フラクションに検出された濃度を合算して調合液中の濃度とした。調合液中の濃度はＥＧＣＧの４量体として検出された、４成分を合算し、式（ＩＩＩ）の化合物換算で５５ｎｇ／ｍＬであった。
【図１】
0005539881.tif 000014
【図２】
0005539881.tif 000015
【図３】
0005539881.tif 000016
【図４】
0005539881.tif 000017
【図５】
0005539881.tif 000018
【図６】
0005539881.tif 000019
【図７】
0005539881.tif 000020
【図８】
0005539881.tif 000021
【図９】
0005539881.tif 000022
【図１０】
0005539881.tif 000023
【図１１】
0005539881.tif 000024
【図１２】
0005539881.tif 000025