(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む方法：
（ａ）個体由来のサンプル中における好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）タンパク質の単量体、二量体およびヘテロ二量体の形態の相対量を決定すること、および、
（ｂ）決定された量を比較すること、
であって、単量体および／またはヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質の量が、二量体のＮＧＡＬタンパク質と比較して優勢であるならば、ＮＧＡＬタンパク質が個体の腎臓に由来することを示し、一方で、二量体のＮＧＡＬタンパク質の量が、単量体またはヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質と比較して等しいかまたは優勢であるならば、ＮＧＡＬタンパク質が個体の好中球に由来することを示す、上記方法。
【請求項２】
前記個体における急性腎臓損傷を検出するための請求項１に記載の方法であって、単量体および／またはヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質の量が二量体のＮＧＡＬタンパク質と比較して優勢であるならば、ＮＧＡＬタンパク質が個体の腎臓に由来し、個体が急性腎臓損傷を有することを示し、一方で、二量体のＮＧＡＬタンパク質の量が単量体またはヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質と比較して等しいかまたは優勢であるならば、ＮＧＡＬタンパク質が個体の好中球に由来し、個体が急性腎臓損傷を有さないことを示す、上記方法。
【請求項３】
前記サンプル中のＮＧＡＬタンパク質のそれぞれの量が、サンプルをＮＧＡＬ抗体と接触させることによって決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＧＡＬ抗体がポリクローナルおよび／またはモノクローナルＮＧＡＬ抗体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＮＧＡＬ抗体が二種のポリクローナルＮＧＡＬ抗体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＧＡＬ抗体が二種の異なるモノクローナルＮＧＡＬ抗体を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ＮＧＡＬタンパク質の単量体、二量体およびヘテロ二量体の形態の相対量を決定する工程が、（ｉ）個体由来の体液サンプルを、ＮＧＡＬ抗体および検出可能な標識と接触させ、サンプル中のＮＧＡＬタンパク質をＮＧＡＬ抗体と複合体化すること、および（ｉｉ）サンプル由来のＮＧＡＬタンパク質の単量体、二量体およびヘテロ二量体の形態とＮＧＡＬ抗体との間で形成された複合体の相対量を、検出可能な標識を用いて決定すること、を含む、請求項３−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のＮＧＡＬタンパク質とＮＧＡＬ抗体との間で形成された複合体の量が、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
急性腎臓損傷の治療をモニターするための、請求項１−８のいずれかに記載の方法であって、治療計画の前およびその後に、または、その最中に採取された、個体由来の複数のサンプルを解析することを含む、前記方法。
【請求項１０】
前記サンプルが尿である、請求項１−９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中の好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）タンパク質の単量体、二量体およびヘテロ二量体の形態の相対量を決定するためのキットであって、体液サンプル中のＮＧＡＬタンパク質と複合体化するのに適した第一のＮＧＡＬ抗体、体液サンプル中のＮＧＡＬタンパク質と第一のＮＧＡＬ抗体の間で形成された複合体の量の決定に使用するのに適した第二のＮＧＡＬ抗体、および、体液サンプル中のＮＧＡＬと第一のＮＧＡＬ抗体との間で形成された複合体の量の決定に使用するのに適した検出可能な標識を含む、上記キット。
【請求項１２】
第一および第二のＮＧＡＬ抗体が、２種の異なるモノクローナルＮＧＡＬ抗体；モノクローナルＮＧＡＬ抗体とポリクローナルＮＧＡＬ抗体；または２種のポリクローナルＮＧＡＬ抗体を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記第一および第二のＮＧＡＬ抗体の一つがＮＧＡＬの単量体、二量体およびヘテロ二量体の形態と複合体化するのに適しており、前記第一および第二のＮＧＡＬ抗体のもう一つがＮＧＡＬのヘテロ二量体の形態のみと複合体化するのに適している、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
請求項１−１０のいずれかに記載の方法における、請求項１１−１３のいずれかに記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］本発明は、急性腎臓損傷を検出またはモニターするための方法、装置およびキットを対象とし、具体的には、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）タンパク質（またヒト好中球リポカリン（ＨＮＬ）としても知られている）の測定に基づく上記方法およびキットを対象とする。
【背景技術】
【０００２】
［０００２］急性腎臓損傷（ＡＫＩ）は、例えば心臓外科手術または腎臓移植の合併症、例えばＸ線造影剤または腎毒性の治療剤などの診断薬のインビボでの導入による副作用、および／または、例えば糖尿病、敗血症、出血性ショックなどのその他の病状に関連する副作用のような、手術後に起こる可能性がある重篤な状態である。一例として、急性腎臓損傷は、心臓外科手術を受けた全患者の３０％もの患者に起こる可能性があり、高い死亡率、より複雑な病院経過、透析への依存性、生活の質の悪化、および、より高い感染合併症への危険を伴う。急性腎不全の初期段階における治療介入は、死亡率を低くする、および／または、治療計画を短縮することがわかっているが、初期段階で急性腎不全を発見することが難しい場合が多かった。
【０００３】
［０００３］現在の臨床実践において、ＡＫＩの標準的な診断法は、血清クレアチニンの上昇または尿量減少のいずれかに基づいたＲＩＦＬＥ（Ｒｉｓｅ，Ｉｎｊｕｒｙ，Ｆａｉｌｕｒｅ，Ｌｏｓｓ，Ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）と呼ばれるものである。血清クレアチニンは一般的な腎臓機能の信頼できるマーカーであるが、腎臓機能が急激に変化している場合は、信頼性が低く遅い指標である。幸いにも、例えばＨＮＬ／ＮＧＡＬ（以降、ＮＧＡＬと称する）、腎障害分子−１（ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）、シスタチンＣおよびＩＬ−１８のような数種の有望な新規のバイオマーカーが見出されている。
【０００４】
［０００４］ＮＧＡＬタンパク質の急性腎臓損傷のマーカーとしての使用に大きな注目が向けられている。ＮＧＡＬは糖タンパク質であり、元々は好中球特異的な顆粒の構成要素、および、タンパク質のリポカリンファミリーの一種として同定された。このようなタンパク質は、２５ｋＤａの単量体と４５ｋＤａのジスルフィド結合したホモ二量体との両方として存在することが示されており、さらに、１３５ｋＤａのヘテロ二量体の形態として、好中球ゼラチナーゼ（また、マトリックスメタロプロテイナーゼ９、ＭＭＰ−９としても知られている）と分子間のジスルフィド架橋を介して共有結合で複合体化している場合もある。ＮＧＡＬは最初、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７１：２４５−２５２（１９９４）によりインビボおよびインビトロでの好中球活性の特異的なマーカーとしてのＨＮＬとして説明され、Ｖｅｎｇｅ（米国特許第６，１３６，５２６号）により炎症の診断マーカーとしての使用に関して説明された（これらは、参照により本明細書に含める）。
【０００５】
［０００５］つい最近になって、Ｄｅｖａｒａｊａｎ等の米国特許公報第２００４／０２１９６０３Ａ１号および２００５／０２７２１０１Ａ１号は、尿細管細胞損傷ならびにその他の腎疾患および損傷に関するバイオマーカーとしてのＮＧＡＬの使用を開示している。バイオボルト・ダイアグノスティクス（ＢｉｏＢｏｒｔｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ゲントフテ，デンマーク）は近年、急性腎不全を早期診断するための「ＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡキット」を提供しており、加えてマウスモノクローナル抗ヒトＮＧＡＬ抗体、および、マウスモノクローナル抗ラットＮＧＡＬ抗体も提供している。加えて、Ｄｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ，１１（６）：Ｒ１２７（２００７）は、バイオサイト社（Ｂｉｏｓｉｔｅ  Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア州）製の急性腎臓損傷のバイオマーカーとして、ＮＧＡＬの測定に使用するための蛍光性ナノ粒子に結合させたＮＧＡＬ特異的モノクローナル抗体を用いたトリアージ（Ｔｒｉａｇｅ（Ｒ））ＮＧＡＬデバイスを説明している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６，１３６，５２６号
【特許文献２】米国特許公報第２００４／０２１９６０３Ａ１号
【特許文献３】米国特許公報第２００５／０２７２１０１Ａ１号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Xu et al, Journal of Immunological Methods, 171:245-252 (1994)
【非特許文献２】Dent et al, Critical Care, 11(6):R127 (2007)
【発明の概要】
【０００８】
［０００６］しかしながら、急性腎臓損傷の検出および／またはモニターにおけるさらなる改善が求められる。
発明の概要
［０００７］従って本発明は、急性腎臓損傷の検出、および、急性腎臓損傷の治療有効性のモニターのための方法、装置およびキットを提供する。
【０００９】
［０００８］一実施態様において、本発明は、個体における急性腎臓損傷を検出する方法を対象とし、本方法は、（ａ）個体由来の体液サンプルと、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）抗体および検出可能な標識を含む分析装置とを接触させて、サンプル中のＮＧＡＬタンパク質をＮＧＡＬ抗体と複合体化すること、および、（ｂ）サンプル由来のＮＧＡＬタンパク質と分析装置中のＮＧＡＬ抗体とで形成された複合体の量を、検出可能な標識を用いて決定することを含み、ここで装置中のＮＧＡＬ抗体は、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープとの結合能力を有しており、形成された複合体の量は、急性腎臓損傷のレベルを示す。
【００１０】
［０００９］その他の実施態様において、本発明は、個体における急性腎臓損傷を検出する方法を対象とし、本方法は、（ａ）個体由来の体液サンプルを、ポリクローナル好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）抗体と接触させること、および、（ｂ）サンプル由来のＮＧＡＬとポリクローナルＮＧＡＬ抗体の間で形成された複合体の量を、検出可能な標識を用いて決定することを含み、ここで該複合体の量は、急性腎臓損傷のレベルを示す。
【００１１】
［００１０］追加の実施態様において、本発明は、急性腎臓損傷治療の有効性をモニターする方法を対象とし、本方法は、以下の工程：（ａ）個体由来の第一の体液サンプルを、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）抗体および検出可能な標識を含む第一の分析装置と接触させ、第一のサンプル中のＮＧＡＬタンパク質をＮＧＡＬ抗体と複合体化すること、（ｂ）第一のサンプル由来のＮＧＡＬタンパク質と第一の分析装置中のＮＧＡＬ抗体とで形成された複合体の量を、検出可能な標識を用いて決定すること（ここで装置中のＮＧＡＬ抗体は、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープとの結合能力を有する）、（ｃ）治療を行った後に得られた個体由来の第二の体液サンプルを、ＮＧＡＬ抗体および検出可能な標識を含む第二の分析装置と接触させ、第二のサンプル中のＮＧＡＬタンパク質をＮＧＡＬ抗体と複合体化すること、（ｄ）第二のサンプル由来のＮＧＡＬと第二の分析装置中のＮＧＡＬ抗体との間に形成された第二の複合体の量を、検出可能な標識を用いて決定すること（ここで装置中のＮＧＡＬ抗体は、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープとの結合能力を有する）、および、（ｅ）第一の複合体の量と第二の複合体の量とを比較することを含み、ここで第二の複合体の量が第一の複合体の量と比較して減少していることは、治療が有効であることを示す。
【００１２】
［００１１］さらなる実施態様において、本発明は、急性腎臓損傷治療の有効性をモニターする方法を対象とし、本方法は、以下の工程：（ａ）治療前に得られた個体由来の第一の体液サンプルを、ポリクローナル好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）抗体と接触させること、（ｂ）第一のサンプル由来のＮＧＡＬタンパク質とポリクローナルＮＧＡＬ抗体との間に形成された第一の複合体の量を、検出可能な標識を用いて決定すること、（ｃ）治療を行った後に得られた個体由来の第二の体液サンプルを、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体と接触させること、（ｄ）第二のサンプル由来のＮＧＡＬとポリクローナルＮＧＡＬ抗体との間に形成された第二の複合体の量を、検出可能な標識を用いて決定す
ること、および、（ｅ）第一のサンプル由来のＮＧＡＬとポリクローナルＮＧＡＬ抗体との間に形成された第一の複合体の量を、第二のサンプル由来のＮＧＡＬとポリクローナルＮＧＡＬ抗体との間に形成された第二の複合体の量と比較することを含み、ここで第二の複合体の量が第一の複合体の量と比較して減少していることは、治療が有効であることを示す。
【００１３】
［００１２］さらなる追加の実施態様において、本発明は、個体における急性腎臓損傷を検出するためのキットを対象とする。一実施態様において、本キットは、体液サンプル中のＮＧＡＬとＮＧＡＬ抗体とで形成された複合体の量の決定に使用するのに適した好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）抗体および検出可能な標識を含む分析装置を含み、ここで装置中のＮＧＡＬ抗体は、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープとの結合能力を有する。
【００１４】
［００１３］その他の実施態様において、本キットは、体液サンプルとの接触に適した第一のポリクローナル好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）抗体、体液サンプル中のＮＧＡＬタンパク質と第一のポリクローナルＮＧＡＬ抗体の間で形成された複合体の量の決定に使用するのに適した第二のＮＧＡＬ抗体、および、体液サンプル中のＮＧＡＬと第一のポリクローナルＮＧＡＬ抗体とで形成された複合体の量の決定に使用するのに適した検出可能な標識を含む。
【００１５】
［００１４］さらなる実施態様において、本発明は、個体における急性腎臓損傷を検出するための分析装置を対象とし、本装置は、基板に固定された、体液サンプルとの接触に適したポリクローナルＮＧＡＬ抗体、および、ＮＧＡＬタンパク質と固定されたポリクローナルＮＧＡＬ抗体との複合体に結合するように適応させた検出可能な標識を含む。
【００１６】
［００１５］このような本発明の方法、装置およびキットは２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープとの結合能力を有するＮＧＡＬ抗体を用いるため、本方法およびキットは、驚くべきことに、ＮＧＡＬに関してバイオマーカーとして改善された感度を示し、それゆえに急性腎臓損傷の検出において改善された感度を示す。この改善された感度によってこのような損傷の早期発見を提供することができ、その結果として早期の治療効果が得られると予想される。
【００１７】
［００１６］さらなる実施態様において、本発明は、個体由来のサンプル中の好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）タンパク質の由来を決定する方法を対象とする。より具体的な実施態様において、本方法は、腎臓に由来するＮＧＡＬと好中球に由来するＮＧＡＬとを区別するのに用いることが可能である。具体的な一実施態様において、このような方法は、（ａ）サンプル中におけるＮＧＡＬタンパク質の単量体、二量体およびヘテロ二量体の形態の相対量を決定すること、および、（ｂ）決定された量を比較すること、を含み、ここで単量体および／またはヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質の量が、二量体のＮＧＡＬタンパク質と比較して優勢であるならば、個体の腎臓に由来するＮＧＡＬタンパク質であることを示し、一方で、二量体のＮＧＡＬタンパク質の量が、単量体またはヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質と比較して等しいかまたは優勢であるならば、個体の好中球に由来するＮＧＡＬタンパク質であることを示す。ＮＧＡＬタンパク質の由来を決定することは、状態を診断するのに役立つと予想され、とりわけ改善された標的治療を可能にすると予想される。
【００１８】
［００１７］以下の詳細な説明を参照することにより、上述の、および追加の利点および改善がよりよく理解されるものと予想される。
図面の簡単な説明
［００１８］以下の図面を参照することにより、詳細な説明がよりよく理解されるものと予想される：
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】［００１９］図１は、実施例１で説明されているように、血漿クレアチニンの手術前および手術後のレベルを示す。男性および女性の正常な上限レベルはそれぞれ、１００μｍｏｌ／Ｌおよび９０μｍｏｌ／Ｌである。手術前のレベルは、男性および女性両方の正常なレベルと比較して有意に高かった（ｐ＜０．００１）。
【図２Ａ】［００２０］図２Ａおよび２Ｂは、実施例１で説明されているように、ポリクローナル抗体を用いたＲＩＡ分析、および、２種のモノクローナル抗体を用いた分析それぞれを利用して測定された、尿中のＮＧＡＬの手術前および手術後のレベルを示す。健康な被検体のレベルも示した。水平線は上限の９７．５を示し、これは健康なコントロールの百分位数である。ＡＮＯＶＡで手術前および手術後レベル間の全体的な差を概算し、それを図に示した。両方の分析において、３つ全てのタイムポイントで、手術後レベルが手術前レベルと有意に異なっていた（ｐ＜０．００１）。
【図２Ｂ】［００２０］同上。
【図３Ａ】［００２１］図３Ａ〜３Ｃは、実施例１で説明されているように、ポリクローナル抗体を用いたＲＩＡ分析、ポリクローナルとモノクローナル抗体とを用いたＥＬＩＳＡ分析、および、２種のモノクローナル抗体を用いた分析それぞれを用いて測定された、手術後２時間における尿中のＮＧＡＬレベルと体外循環時間（ＥＣＣ時間）との関係のボックスプロットを示す。統計学的差異および中央値の増加倍率を示す。
【図３Ｂ】［００２１］同上。
【図３Ｃ】［００２１］同上。
【図４Ａ】［００２２］図４Ａおよび４Ｂは、実施例１で説明されているように、ポリクローナル抗体を用いたＲＩＡ分析、および、２種のモノクローナル抗体を用いた分析それぞれを利用して測定された、尿中のＮＧＡＬレベルとＧＦＲ（血漿シスタチンＣ）との関係を示す。線形回帰分析の結果を示す。
【図４Ｂ】［００２２］同上。
【図５】［００２３］図５は、実施例１で説明されているように、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体を用いたＲＩＡ、および、２種のモノクローナル抗体を用いた分析を利用した尿中のＮＧＡＬタンパク質測定の関係を示す。線形回帰分析は以下の通り：ｒ２＝０．８６、ｐ＜０．０００１、ｎ＝３３１。挿入図は、濃度の下端におけるこれら２つの分析間の関係を示す。
【図６】［００２４］図６は、実施例２で説明されているように、心臓外科手術を受けた２人の患者から得られた尿サンプルＵ１およびＵ２中のＮＧＡＬの異なる分子形態のウェスタンブロッティングの結果を示す。
【図７】［００２５］図７は、実施例２で説明されているように、異なる抗体に基づく分析を用いた、尿をスーパーデックス（ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ）−７５でゲルろ過することによって得られた分画中のＮＧＡＬの測定を示す。ピーク１およびピーク２におけるＮＧＡＬの主要な分子形態は、それぞれ二量体および単量体である。挿入図は、ピーク１を拡大した図である。
【図８】［００２６］図８は、実施例２で説明されているように、指定された時間で決定された、調整培地中で培養されたＨＫ−２細胞によるＮＧＡＬ合成の時間経過を示す。値は、３つの独立した実験の二連での分析からの平均±標準偏差である。マーカー＊および＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、および、ｐ＜０．０１を示す。
【図９Ａ】［００２７］図９Ａおよび９Ｂは、完全培地または刺激因子が添加された完全培地（図９Ａ）のいずれかのなかで増殖させたＨＫ−２細胞、または、ケラチノサイト無血清培地（Ｋ−ＳＦＭ）、または、刺激因子が添加されたＫ−ＳＦＭ（図９Ｂ）のなかで増殖させたＨＫ−２細胞のいずれかから分泌されたＮＧＡＬのレベルを示す。値は、３つの独立した実験の二連での分析からの平均±標準偏差である。マーカー＊、＊＊および＊＊＊は、それぞれｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、および、ｐ＜０．００１を示す。
【図９Ｂ】［００２７］同上。
【図１０】［００２８］図１０は、下のパネルに、調整培地で培養されたＨＫ−２細胞から分泌されたＮＧＡＬのウェスタンブロッティングによる検出を示し、上のパネルに、新しい培地（Ｃ）、または、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−βが添加された培地（Ｓ）添加後の指定されたタイムポイントで回収されたＨＫ−２細胞のＮＧＡＬのｍＲＮＡ発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［００２９］本発明の様々な形態、特徴および実施態様は、詳細な説明を考慮すればよ
りよく理解されるものと予想される。
詳細な説明
［００３０］ＮＧＡＬは、最初にヒト好中球から単離され、以前の研究によれば、血液中のＮＧＡＬの測定が、細菌およびウイルスによって引き起こされる急性感染と区別する優れた手段であることが示された。近年、例えば尿のような体液サンプル中へのＮＧＡＬ排出と、急性腎臓損傷との密接な関係が研究されている。驚くべきことに、ＮＧＡＬ測定と、モノクローナル−モノクローナル分析およびポリクローナル抗体を用いた分析との比較から、これらの分析の臨床能力における重要な違いが示された。この結果から、分析における抗体の選択が重要であり、特に、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープと反応する能力を有する抗体を使用すれば、高感度での分析が提供されることが証明され、従ってこれらの分析で、様々な条件下で排出された異なるＮＧＡＬ変異体が同定されることが証明される。それゆえに本発明の方法、装置およびキットは、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープと反応する能力を有するＮＧＡＬ抗体を用いる。これに関して、このようなＮＧＡＬ抗体は、以下でさらに詳細に説明されているように、１種またはそれ以上のポリクローナルＮＧＡＬ抗体、および／または、１種またはそれ以上のポリクローナルＮＧＡＬ抗体と、１種またはそれ以上のモノクローナルＮＧＡＬ抗体との組み合わせを含んでもよい。さらに、ＮＧＡＬ抗体または抗体群は、ＮＧＡＬタンパク質の捕獲のために用いられる場合もあるし、および／または、検出可能な標識と共に用いられる場合もある。
【００２１】
［００３１］個体における急性腎臓損傷を検出する方法は、あらゆるヒト個体に適合させることができ、具体的には急性腎臓損傷の危険性がある可能性がある個体に適合させることができる。このような個体としては、これらに限定されないが、心臓外科手術または腎臓移植、例えばＸ線造影剤または腎毒性の治療剤などの診断薬のインビボでの導入を受けた個体、および／または、糖尿病、敗血症、出血性ショックなどを有する個体が挙げられる。具体的な実施態様において、このような個体は心臓外科手術を受けた患者であり、サンプルは、心臓外科手術を受けた患者から心臓外科手術の３時間以内に得られる。追加の実施態様において、検出方法は、心臓外科手術後の連続した期間に得られたそれぞれのサンプルに対して繰り返され、例えば外科手術後の２時間および５時間、外科手術後の２時間および１２時間、外科手術後の２時間、１２時間および２４時間などに繰り返される。
【００２２】
［００３２］本方法は、検出のために体液サンプルを用いる。より具体的な実施態様において、このようなサンプルは、尿、血液、血清もしくは血漿、または、それらの精製した成分を含む。より具体的な実施態様において、このようなサンプルは尿である。
【００２３】
［００３３］一実施態様において、本方法は、（ａ）個体由来の体液サンプルと、ＮＧＡＬ抗体および検出可能な標識を含む分析装置とを接触させ、サンプル中のＮＧＡＬタンパク質をＮＧＡＬ抗体と複合体化すること、および、（ｂ）サンプル由来のＮＧＡＬタンパク質と分析装置中のＮＧＡＬ抗体とで形成された複合体の量を、検出可能な標識を用いて決定すること、を含み、ここで装置中のＮＧＡＬ抗体は、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープとの結合能力を有しており、形成された複合体の量は、急性腎臓損傷のレベルを示す。上記で考察したように、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープとの結合能力を有するＮＧＡＬ抗体は、１種またはそれ以上の異なるＮＧＡＬ抗体によって提供されてもよい。
【００２４】
［００３４］形成された急性腎臓損傷を示す複合体の、定性的または定量的な量を決定するために、特定の装置または技術を用いた較正を行ってもよい。測定がラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によってなされる具体的な実施態様において、急性腎臓損傷を示すＮＧＡＬタンパク質の量は、６０ｎｇ／ｍｌであるか、またはそれより高い。測定が酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によってなされるその他の実施態様において、急性腎臓損傷を示すＮＧＡＬタンパク質の量は、１００ｎｇ／ｍｌであるか、またはそれより高い。
【００２５】
［００３５］一実施態様において、本方法は、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体を用い、例えばＸｕ等，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１
７１：２４５−２５２（１９９４）（参照により本明細書に含める）によって開示されたポリクローナルＮＧＡＬ抗体を用いる。例えばＸｕ等によって説明されているように、ＮＧＡＬ（ＨＮＬ）に対するポリクローナル抗体は、フロイント完全および不完全アジュバント中でホモジナイズした合計７２μｇの精製タンパク質を、ウサギの複数の部位に皮内注射することによって、ウサギで発生させる。抗体の特異性は、アガロース中での二重免疫拡散法（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７−３９４（１９８４））によって評価することができ、さらに、好中性顆粒の抽出物、および、以下の精製タンパク質：カテプシンＧ、エラスターゼ、ミエロペルオキシダーゼ、リゾチーム、ラクトフェリン、好酸球カチオン性タンパク質（ＥＣＰ）、および、好酸球タンパク質Ｘ（ＥＰＸ／ＥＤＮ）に対して試験することができる。当然ながらその他のＮＧＡＬ抗体を用いてもよい。
【００２６】
［００３６］一実施態様において、本発明に係る方法は、（ａ）個体由来の体液サンプルをポリクローナルＮＧＡＬ抗体と接触させること、および、（ｂ）サンプル由来のＮＧＡＬとポリクローナルＮＧＡＬ抗体の間で形成された複合体の量を、検出可能な標識を用いて決定すること、を含み、ここで該複合体の量は、急性腎臓損傷のレベルを示す。具体的な実施態様において、例えばＮＧＡＬ抗体は、ポリクローナル抗体を含み、サンプル中のＮＧＡＬタンパク質とＮＧＡＬ抗体との間に形成された複合体の量は、従来のラジオイムノアッセイ技術によって決定される。このような技術は当業界公知であり、例えば、二重ラジオイムノアッセイ技術の使用などが挙げられ、この場合、２種のポリクローナル抗体を使用する場合もあるし、または、１種のポリクローナル抗体と１種のモノクローナル抗体が用いられる場合もある。その他の実施態様において、サンプル中のＮＧＡＬタンパク質とＮＧＡＬ抗体との間に形成された複合体の量は、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって決定され、ここでＥＬＩＳＡは、少なくとも１種のポリクローナルＮＧＡＬ抗体を用いる。ＥＬＩＳＡ技術も当業界公知である。ＥＬＩＳＡ法を用いる具体的な実施態様において、分析装置は、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体、および、モノクローナルＮＧＡＬ抗体を含み、これらＮＧＡＬ抗体のうち一方は基板に結合し、これらのＮＧＡＬ抗体のうち他方は検出可能な標識に結合する。より具体的な実施態様において、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体は基板に結合しており、すなわち基板に固定されている。さらなる実施態様において、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体は基板に結合しており、モノクローナルＮＧＡＬ抗体は検出可能な標識に結合する。あるいは、ＥＬＩＳＡは、２種の異なるポリクローナルＮＧＡＬ抗体を含む分析装置を用いてもよく、ここで、これらＮＧＡＬ抗体のうち一方は基板に結合し、これらのＮＧＡＬ抗体のうち他方は検出可能な標識に結合する。当業界でよく知られているその他の分析技術を用いてもよく、ここで、例えば、少なくとも１種のポリクローナルＮＧＡＬ抗体は基板に固定されており、より具体的な実施態様において、検出可能な標識は他方のＮＧＡＬ抗体に結合しており、ここでこの抗体は、モノクローナルＮＧＡＬ抗体または第二のポリクローナルＮＧＡＬ抗体のいずれであってもよい。
【００２７】
［００３７］従って、本発明はまた、このような方法のための装置およびキットも対象とする。一実施態様において、本発明に係る分析装置は、基板に固定された、体液サンプルとの接触に適したポリクローナルＮＧＡＬ抗体、および、ＮＧＡＬタンパク質と固定されたポリクローナルＮＧＡＬ抗体との複合体に結合するように適応させた検出可能な標識を含む。具体的な実施態様において、検出可能な標識は、固定されたポリクローナルＮＧＡＬ抗体と複合体化するＮＧＡＬタンパク質に結合するように、モノクローナルまたはポリクローナルいずれかのＮＧＡＬ抗体と複合体化していてもよい。本分析装置は、医療関係者による使用を容易にする「ポイント・オブ・ケア（ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｅ）」のための装置またはキットとして提供されてもよい。
【００２８】
［００３８］当然のことながら、本発明はさらに、治療計画の前およびその後に、または、その最中に、複数の個体由来のサンプルを解析することによって急性腎臓損傷の治療をモニターするのにも使用できる。このような方法は、一般的には、個体由来の第一の体液サンプルを第一の分析装置と説明したようにして接触させること、および、第一のサン
プル由来のＮＧＡＬタンパク質と第一の分析装置中のＮＧＡＬ抗体とで形成された複合体の量を決定すること、治療を行った後に得られた個体由来の第二の体液サンプルを第二の分析装置と説明したようにして接触させること、および、第二のサンプル由来のＮＧＡＬと第二の分析装置中のＮＧＡＬ抗体との間に形成された第二の複合体の量を決定すること、および、第一の複合体の量と第二の複合体の量とを比較することを含む。第二の複合体の量が、第一の複合体の量と比較して減少していることは、治療が有効であることを示す。
【００２９】
［００３９］その他の実施態様において、本発明は、個体由来のサンプル中の好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）タンパク質の由来を決定する方法を対象とする。このような方法は特に、腎臓のＮＧＡＬタンパク質と好中球のＮＧＡＬタンパク質とを区別するのに有効である。一実施態様において、本方法は、（ａ）サンプル中におけるＮＧＡＬタンパク質の単量体、二量体およびヘテロ二量体の形態の相対量を決定すること、および、（ｂ）決定された量を比較すること、を含み、ここで、単量体および／またはヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質の量が、二量体のＮＧＡＬタンパク質と比較して優勢であるならば、個体の腎臓に由来するＮＧＡＬタンパク質であることを示し、一方で、二量体のＮＧＡＬタンパク質の量が、単量体またはヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質と比較して等しいかまたは優勢であるならば、個体の好中球に由来するＮＧＡＬタンパク質であることを示す。腎臓由来のＮＧＡＬタンパク質は、例えばウェスタンブロッティングで示したように、ＮＧＡＬタンパク質の二量体の形態を実質的に含まないことが発見されている。具体的な実施態様において、このようなサンプルは、尿を含む。その他の具体的な実施態様において、サンプル中のＮＧＡＬタンパク質それぞれの量は、サンプルを、モノクローナルＮＧＡＬ抗体を含む分析装置と接触させることによって決定される。その他の実施態様において、サンプル中のＮＧＡＬタンパク質それぞれの量は、サンプルを、ポリクローナルＮＧＡＬ抗体を含む分析装置と接触させることによって決定される。上述のような分析装置および技術、ウェスタンブロッティングまたはその他の従来技術および／または装置のどれを用いてもよい。
【００３０】
［００４０］以下の実施例２で示すように、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、単量体、二量体およびヘテロ二量体のＮＧＡＬタンパク質の形態を同定する（すなわち、それらと複合体化する）。しかしながら腎臓由来のＮＧＡＬにおいて、その結果は、実質的にＮＧＡＬタンパク質の二量体の形態を含まないが、一方で、ＮＧＡＬの二量体の形態は、好中球由来のＮＧＡＬタンパク質から得られた結果において優勢である。理論に拘束されることは望まないが、異なるＮＧＡＬは異なるエピトープを提示するため、それらは例えばモノクローナル抗体によって異なってピックアップされると考えられる。従って、説明したような比較によって、腎臓由来のＮＧＡＬタンパク質と、好中球由来のＮＧＡＬタンパク質とを区別することができる。
【００３１】
［００４１］以下の実施例で、本発明の様々な形態を説明する。
【実施例】
【００３２】
実施例１
［００４２］この実施例では、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープとの結合能力を有するＮＧＡＬ抗体を用いたＮＧＡＬ決定、および、モノクローナル抗体を２種だけ用いたＮＧＡＬ決定との比較の研究を説明する。
【００３３】
［００４３］患者およびサンプル
［００４４］本研究に、ウプサラ大学病院（Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で心臓外科手術を受けた合計５９人の成人患者を採用した。患者の年齢は２７〜８５歳の範囲（平均６３歳）であり、患者の４２人が男性で、１７人が女性であった。この心臓外科手術には、２３例の冠状動脈バイパス移植術、１５例の大動脈弁置換術、４例の僧帽弁修復、３例の複合術、８３例の左心室補助装置の埋め込み術、および、６３例のその他の手法が含まれる。
【００３４】
［００４５］手術前、および、心臓外科手術後の様々なタイムポイント（２、２４、４８および７２時間）で尿および血液サンプルを回収した。尿サンプルを即座に３，０００
ｒｐｍ、４℃で１５分間で遠心分離した。３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間血液を遠心分離することによって、ＥＤＴＡ−血漿を得た。全てのサンプルの上清をアリコートにして即座に−２０℃で保存した。加えて、健康な社員および生徒から追加の１０１種の尿サンプルを回収し、正常なコントロールとして利用した。
【００３５】
［００４６］尿中ＮＧＡＬ濃度の分析
［００４７］ＮＧＡＬレベルを３回の異なる分析で測定した。第一の分析技術では、全般的に上記のＸｕ等の教示に従って、ポリクローナルベースのＲＩＡが用いられた。第二の分析技術では、ポリクローナル−モノクローナルベースのＥＬＩＳＡが用いられた。第三の分析技術では、モノクローナル−モノクローナルベースの分析が用いられた。従って、最初の２つの技術は本発明に従って行われたが、第三の技術は比較目的で用いられた。
【００３６】
［００４８］より具体的に言えば、ポリクローナル抗体ベースのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）は、Ｘｕ等によってこれまでに述べられた通りに行われた（ただしいくつかの変更を含む）。５０μＬのサンプルまたは標準のいずれかの溶液（２μｇ／Ｌ〜１２８μｇ／Ｌ）を、５０μＬのＩ１２５で標識されたＮＧＡＬおよび５０μＬの特異的な抗体と連続的に混合し、ＲＩＡ分析緩衝液で適切に希釈した。この混合物を室温で３時間インキュベートした。その後、５００μＬの固相が第二抗体でコーティングしたセルロース懸濁液（ＡＡ−ＳＡＣ１、ＩＤＳ  ＬＴＤ，英国）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。抗ウサギＩｇＧ抗体でコーティングしたセルロースに結合させたＮＧＡＬ抗体複合体を分離し、遠心分離を３４００ｒｐｍで１５分間用いでペレット化した。デカンテーション後に、放射活性を測定した。イントラおよびインターアッセイの変動係数（ＣＶ）は、それぞれ６％および１０％未満であった。ＲＩＡ分析装置によって測定された尿中のＮＧＡＬ濃度の結果は、ＮＧＡＬ  ＲＩＡと名付けた。
【００３７】
［００４９］この研究で、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体ベースのＥＬＩＳＡ装置を開発した。簡単に言えば、マイクロタイタープレート（ヌンク・マックスソープ（Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｓｏｒｐ），アゴジェント（Ａｇｏｇｅｎｔ），デンマーク）を、４℃で、炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液（０．０５ＭのＮａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３，ｐＨ９．６，インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），英国）中で希釈した抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体（１００μＬ／ウェル，１μｇ／ｍＬ）で一晩コーティングした。追加の結合部位を、２％ウシ血清アルブミン（２００μＬ／ウェル，シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），シュタインハイム，ドイツ）を含む炭酸塩−炭酸水素塩緩衝液で３７℃で１時間ブロックした。１００μＬの標準（０．１ｎｇ／ｍｌ〜６．４ｎｇ／ｍｌ）、または、分析溶液（０．２％ウシ血清アルブミン、０．１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０、０．０５％ＣＴＡＢおよび０．０２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ）中で希釈した希釈サンプルを二連で添加し、室温で２時間インキュベートした。その後、１ウェルあたり１００μＬの希釈したウサギ抗ＮＧＡＬポリクローナル抗体を添加し、室温で１時間インキュベートし、続いて１００μＬの希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗体（ＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），英国）を添加し、室温でもう１時間インキュベートした。プレートの酵素反応を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（１００μＬ／ウェル，シグマ−アルドリッチ，シュタインハイム，ドイツ）で室温で２０分間可視化し、１００μＬ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって止めた。全ての工程の間に、マイクロプレート洗浄機（アントス・フルイド（Ａｎｔｈｏｓ  ｆｌｕｉｄｏ），ザルツブルク，オーストリア）を用いて洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン−２０を含むＰＢＳ）でプレートを４回洗浄した。吸光度を、マイクロプレートリーダー（スペクトラマックス（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ）２５０，ＧＭＩ社（ＧＭＩ，Ｉｎｃ．），米国）で、ブランクウェルにおける５４０ｎｍでの測定値を参照にして、４５０ｎｍで測定した。平均イントラアッセイＣＶは２．８％（０．５％〜４．７％の範囲）であり、インターアッセイＣＶは６．３（２．１〜１０．４％の範囲）であった。平均回収率は９９％（９３〜１０５％の範囲）であった。ＥＬＩＳＡによって測定された尿中のＮＧＡＬ濃度の結果は、ＮＧＡＬ  ＥＬＩＳＡと名付けた。
【００３８】
［００５０］二重のモノクローナル分析におけるＮＧＡＬの分析を、製造元の説明書に従って行った。イントラおよびインターアッセイの変動係数（ＣＶ％）は、６％未満であった。この装置によって測定された尿中のＮＧＡＬ濃度の結果は、ＮＧＡＬモノ−モノと名付けた。
【００３９】
［００５１］一般的なウプサラ大学病院の臨床化学科（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）におけるアーキテクト（Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ）装置で尿中クレアチニン濃度を測定し、これを、尿で希釈される際の変動について尿中ＮＧＡＬ濃度を修正するのに利用した。従って、尿中ＮＧＡＬ濃度は、ＮＧＡＬ（μｇ／ｍｍｏｌクレアチニン）として示された。全ての測定を二連で行い、実験室の研究者には、実験が終わるまでサンプル源と臨床評価を知らせなかった。
【００４０】
［００５２］尿中のＮＧＡＬのウェスタンブロッティング
［００５３］ウェスタンブロッティングは、Ｔｏｗｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：４３５０−４（１９７９）によってこれまでに述べられた通りに行われた。簡単に言えば、２０μＬの尿サンプルを、Ｎｕ−ＰＡＧＥ（Ｒ）４〜１２％ビストリスゲル（インビトロジェン社，米国）に適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、Ｎｕ−ＰＡＧＥ（Ｒ）トランスファーバッファー（インビトロジェン社，米国）を２５Ｖで１時間用いることによってタンパク質をＰＶＤＦメンブレン上に移した。ＰＶＤＦメンブレンの追加の結合部位を、ブロッキング溶液（ＧＥヘルスケア，英国）で１時間ブロックした。ブロットを、マウス抗ＮＧＡＬモノクローナル抗体と１時間インキュベートし、続いてペルオキシダーゼ標識二次抗体（ＧＥヘルスケア，英国）と４５分間インキュベートした。免疫ブロットを、製造元（アマシャムＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬＴＭ）ウェスタンブロッティングシステム，ＧＥヘルスケア，英国）の説明書に従って強化された化学発光を用いて検出した。
【００４１】
［００５４］追加の分析
［００５５］クレアチニンおよびシスタチンＣの血漿濃度を、ウプサラ大学病院臨床化学科で慣例的な手法を用いて測定した。
【００４２】
［００５６］統計的分析
［００５７］対応のない（unpaired）、および、対応のある(paired)比較のためのマン‐ホイットニーおよびウィルコクソンのノンパラメトリック検定、線形回帰分析、一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、メディカルク９．５（Ｍｅｄｃａｌｃ  ９．５）（メディカルク・ソフトウェア（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ），マリアケルク（Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ），ベルギー）、および、スタティスティカ８．０（ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ
８．０）（スタットソフト社（ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．），タルサ，米国）によって行った。統計的有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。
【００４３】
［００５８］結果
［００５９］図１に、手術前および手術後の７８時間までの血漿クレアチニン濃度を示し、これは、期間の間に差がないことを示す。臨床転帰から、３つの被検体は急性腎臓損傷の徴候を示し、手術後の血漿クレアチニンが５０％より多く上昇していたことが示された。
【００４４】
［００６０］尿中ＮＧＡＬ濃度
［００６１］健康な被検体および心臓外科手術を受けた患者から得られた尿中のＮＧＡＬ濃度を、３つの上述した技術を用いて測定した。図２Ａおよび２Ｂに、ＲＩＡおよびモノ−モノ技術それぞれを用いて決定された結果を示す。手術前のレベルは、正常なコントロールと類似していた。手術の２時間後、レベルは有意に増加し（ｐ＜０．０００１）、約半分の患者が、正常値上限を超えるレベルを示した。中央値の増加倍率は、ＲＩＡで測定した場合は１８．７であり、ＥＬＩＳＡおよびモノ−モノ分析で測定した場合はそれぞれ、１５．６および１１．４倍の増加であった。２４時間後、このレベルは再度減少したが、それでもなお手術前のレベルよりも高かった。このレベルは、手術後の期間中ずっとより有意に高い状態を維持した（ｐ＜０．０００１）。７２時間で、増加倍率は、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡおよびモノ−モノ分析でそれぞれ６．８、８．５および５．９であった。３つ
全ての分析で、長期にわたり類似のパターンが観察された。
【００４５】
［００６２］体外循環時間（ＥＣＣ）との関係
［００６３］ＲＩＡ技術（ｒ２＝０．３０、ｐ＜０．０００１）、および、ＥＬＩＳＡ技術（ｒ２＝０．１６、ｐ＝０．００６）で尿で測定した際に、ＥＣＣ時間と手術後２時間で得られたＮＧＡＬレベルとの有意な正相関が見出された。しかしながらこれらの相関はモノ−モノ技術では見出されなかった。９０分間より長い、または、それより短いＥＣＣ時間でさらに分けたところ、ＲＩＡの結果は手術後２時間のサンプルで１２．６倍増加した（ｐ＝０．００６）。図３Ａ〜３Ｃで示されるように、ＥＬＩＳＡの結果は６．５倍増加し（ｐ＝０．０２７）、モノ−モノの結果は５．２倍増加した（ｐ＝０．０７）。
【００４６】
［００６４］尿中ＮＧＡＬ濃度と腎臓機能との関係
［００６５］腎臓機能の指標としてクレアチニンおよびシスタチンＣの血漿濃度を測定した。上記で示したように、ほとんどの被検体においてクレアチニン濃度は変わらないままであり、手術後に急性腎臓損傷の徴候（５０％を超える増加で定義される）を示したのは３人の被検体だけであった。シスタチンＣ濃度を用いて、糸球体ろ過率（ＧＦＲ）を計算した。単変量解析において、図４Ａおよび４Ｂで示されるように、ＧＦＲは、ＮＧＡＬ（ＲＩＡ）（ｒ２＝０．２８、ｐ＜０．００１）、および、ＮＧＡＬ（モノ−モノ）（ｒ２＝０．２５、ｐ＜０．００１）に関連していた。また尿中のＮＧＡＬと血漿クレアチニンとの関係も解析した。手術後７２時間の間、基準と比較して血漿クレアチニンが増加したパーセンテージ（＜１２０％、または、＞１１９％）に従って、被検体を２つのグループに分類した。手術後２時間でのＮＧＡＬレベル（ＲＩＡ）は、クレアチニン濃度が１１９％（ｐ＝０．０３）より多く上昇したグループでより有意に上昇したが、それに対してＮＧＡＬレベル（モノ−モノ）は有意に上昇しなかった（結果は示さず）。
【００４７】
［００６６］３つのＮＧＡＬ分析の相関
［００６７］ＮＧＡＬ（ＲＩＡ）とＮＧＡＬ（モノ−モノ）との全体的な相関を、図５（ｒ２＝０．８６、ｐ＜０．０００１、ｎ＝３３１）にに示す。表１に異なるタイムポイントにおける相関を示したところ、ｒ２との極めて優れた相関が０．９５２〜０．９９６の範囲で示された（ただし手術後２時間で得られた結果を除く）。この段階では、ｒ２は０．６８０であり、その他よりも有意に低かった（ｐ＜０．０００１）。外見的に健康な被検体の同齢集団におけるＮＧＡＬ（ＲＩＡ）とＮＧＡＬ（モノ−モノ）との関係はｒ２＝０．８８７であり、これもまた２時間での結果とは有意に異なっていた（ｐ＝０．００１）。３３１の全ての結果のパッシング−バブロック（Ｐａｓｓｉｎｇ−Ｂａｂｌｏｋ）の回帰分析によれば、ＨＮＬ（ＲＩＡ）＝０．６５５３±０．５３５８×ＮＧＡＬ（モノ−モノ）の方程式が線形性からの有意な逸脱（ｐ＜０．０１）と共に示され、またこれは、ＮＧＡＬ（モノ−モノ）分析とＮＧＡＬ（ＥＬＩＳＡ）分析とを比較した場合、ＮＧＡＬ（ＥＬＩＳＡ）＝０．０３７０±０．１１３５×ＮＧＡＬ（モノ−モノ）であった。しかしながら、ＮＧＡＬ（ＲＩＡ）分析とＮＧＡＬ（ＥＬＩＳＡ）分析との比較から、方程式ＮＧＡＬ（ＥＬＩＳＡ）＝−０．００２１９２±０．２００２×ＮＧＡＬ（ＲＩＡ）が得られ、線形性からの逸脱もなかった。
【００４８】
［００６８］尿中のＮＧＡＬの分子形態
［００６９］心臓外科手術後前および手術後の尿中に見出されたＮＧＡＬの主要な形態の見かけの分子量は、それぞれ２５（単量体）、４５（ホモ二量体）、および、９０〜１３０ｋＤａ（ＭＭＰ−９との複合体）であった。これらの異なる形態の存在は外科手術の前後で変動した。ウェスタンブロットによるスキャンに基づくホモ二量体と単量体との比率を試験した。相対的なホモ二量体の存在量は、手術後２４時間までに（ｐ＝０．０２）増加し、その後、比率は減少傾向を示したことが示された。
【００４９】
［００７０］考察
［００７１］本明細書で示した結果によれば、様々な条件下で尿中に排出された多くの様々なＮＧＡＬ変異体を同定するために、ＮＧＡＬ分析における抗体の選択が重要であることが示される。特に、２種より多くのＮＧＡＬタンパク質エピトープと反応する能力を有するＮＧＡＬ抗体を用いる分析は、改善された感度を提供する。
【００５０】
［００７２］この研究では、心臓外科手術を受けた成人患者を用いた。急性腎臓損傷は、これらの患者に影響を与える可能性がある最も重篤な手術後合併症の１つである。この研究において、血漿クレアチニンの平均レベルは変わらないままであり、急性腎臓損傷の徴候として５０％を超える上昇を示した被検体は３人だけであった。それにもかかわらず、手術終了後のたった２時間で、約半分の患者に尿中ＮＧＡＬ濃度の１０〜１００倍の増加が見出された。その上、ＮＧＡＬレベルは観察期間全体にわたり高いままであった。総合的に言えば、尿中ＮＧＡＬ濃度から、シスタチンＣまたはクレアチニンの血漿濃度によって測定されたように腎臓機能と弱いが有意な関係が示され、これは、ＮＧＡＬは、腎臓機能不全の早期のより高感度のマーカーであるという考えの裏付けとなる。実際に、５０％を超えるクレアチニンの上昇を示した３人の患者のうち２人は、手術後２時間で高度に増加したＮＧＡＬレベルを示した。この研究から、ＮＧＡＬの主な増加は、患者の半分において手術後初期に起こるが、この増加は単に一時的なものであり、続いて数日のうちに、全ての患者において段階的な増加が起こることが明らかになった。従って、理論に制限されることは望まないが。このようなパターンは、尿中におけるＮＧＡＬの尿中排出に関して異なるメカニズムがあることを反映している可能性がある。初期は、腎臓上皮や蓄積した好中球のような異なる源から予め形成されたＮＧＡＬの排出を反映している可能性があり、それに対してそれに遅れて起きる排出は腎臓でのデノボ合成を反映している可能性がある。また多くの様々な分子サイズのＮＧＡＬが異なる時点で尿中に発生する程度にばらつきがあるという発見から、異なるメカニズムが関与していることも示唆される。
【００５１】
［００７３］３回の異なる分析の比較から、有意差が示された。総合的に言えば、これらの分析は高度に相関しているが、明らかな例外がいくつかある。これらの環境下で行われた３回の分析は、ＮＧＡＬの異なる分子変異体を部分的に測定しているという予測から、これらの例外は、手術後２時間で得られたサンプル中に集中していることがわかった。これらの差はさらに、ポリクローナル抗体を用いたＲＩＡおよびＥＬＩＳＡ分析の結果から、モノ−モノ分析に比べて、体外循環時間の長さや腎臓機能のような臨床的変数とより密接な関係が示されたことによっても証明された。それゆえにこれらの結果によれば、分析の臨床能力にとって、尿中の全てのＮＧＡＬの形態の同定が重要であることが示される。ＲＩＡは、ポリクローナルベースの分析であり、この分析は分子中の全ての利用可能なエピトープを扱えるようであるが、それに対してモノクローナル−モノクローナルベースの分析は選択されたエピトープしか扱えず、そのうちいくつかは、複合体形成およびその他の分子の改変によって変化する場合もあるし、そうでない場合もある。ポリクローナル−モノクローナルベースのＥＬＩＳＡ分析は、これらの２つの極端な例のだいたい中間の特徴を有しており、このことは、この立体配置によれば、二重のモノクローナル分析よりも多くのエピトープの認識が可能になるが、純粋なポリクローナルベースの分析よりもいくらか少ないというということからも証明することができる。まとめると、説明した結果は、尿で測定する場合、ＮＧＡＬは、手術後の腎臓損傷の有用な初期のバイオマーカーであることを立証するものであり、さらに、ＮＧＡＬの形態のうちいくつかは制限された抗体特異性での分析では同定されない場合があることから、これらの分析における抗体の立体配置が分析の臨床能力に強い影響を与えていることも新たに示された。
【００５２】
実施例２
［００７４］この実施例は、ＮＧＡＬタンパク質の由来を決定することにおいて、ＮＧＡＬが単量体、二量体およびヘテロ二量体の形態のいずれであるかを決定する実験を説明する。
【００５３】
［００７５］尿サンプルおよびゲルろ過での分離
［００７６］手術前、ならびに心臓外科手術後２時間および２４時間で、合計で３３種の尿サンプルを回収した。これらの尿サンプルを即座に、４℃、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、アリコートにして−２０℃で保存した。手術後２時間における１つの尿サンプルのゲルろ過は、ＦＰＬＣ−システムを用いたスーパーデックスＴＭ７５ＨＲ１０／３０プレ充填カラム（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ），ウプサラ，スウェーデン）で行われた。２
５０Ｌの分画を回収し、−２０℃で保存した。溶出緩衝液はＰＢＳであった。分画中のＮＧＡＬを、以下で説明されているように、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡを用いて決定した。
【００５４】
［００７７］ＮＧＡＬ定量化のための高感度ＥＬＩＳＡ
［００７８］ＮＧＡＬの定量化のための異なる抗体をベースとした６種のＥＬＩＳＡを用いた：すなわち、１）Ｍａｂ６９７−ポリクローナル（実施例１で説明されているようなモノクローナル−ポリクローナルＥＬＩＳＡ）、２）Ｍａｂ７６４−Ｍａｂ７６５、３）Ｍａｂ７６４−ポリクローナル、４）ポリクローナル−Ｍａｂ７６５、５）ポリクローナル−ポリクローナル、および、Ｍａｂ−６９７−Ｍａｂ７６５である。これら５種のＥＬＩＳＡの基本的なプロトコールは、実施例１で説明したものと同じであるが、分析では特異的な抗体が用いられた。簡単に言えば、９６−ウェルのマイクロタイタープレート（ヌンク・マックスソープ，アゴジェント（Ａｇｏｇｅｎｔ），デンマーク）を、ヒトＮＧＡＬ％に対するウサギポリクローナルまたはマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ６９７およびＭａｂ７６４）でコーティングした。（ダイアグノスティクス・デベロップメント（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ），ウプサラ，スウェーデン）。サンプルおよび標準（０．０３９〜５μｇ／Ｌの範囲）（１００μＬ／ウェル）を、６０分間（尿サンプルおよびゲルろ過分画）または９０分間（細胞培養上清）、室温（ＲＴ）でインキュベートした。その後、１００μＬ／ウェルのヒトＮＧＡＬに対する希釈したビオチン化ウサギポリクローナル抗体、または、マウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ７６５）を添加し、室温で６０分間インキュベートし、続いて１００μＬ／ウェルの希釈したストレプトアビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＧＥヘルスケア，英国）（室温で３０分間）を添加した。全ての工程の間に、マイクロプレート洗浄機（アントス・フルイド，ザルツブルク，オーストリア）を用いて洗浄緩衝液（０．０５％トゥイーン−２０を含むＰＢＳ）でプレートを４回洗浄した。酵素反応を、基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン溶液（１００μＬ／ウェル）（シグマ−アルドリッチ，シュタインハイム，ドイツ）を室温で１５分間用いて可視化し、１ＭのＨ２ＳＯ４（１００μＬ／ウェル）を添加することによって反応を止めた。吸光度を分光光度計（スペクトラマックス２５０，ＧＭＩ社，米国）を用いて４５０ｎｍで読んだ。
【００５５】
［００７９］ＮＧＡＬ定量化のためのポリクローナル抗体ベースのＲＩＡ
［００８０］ＲＩＡを上述のようにして行った。簡単に言えば、５０μＬのサンプルまたは標準のいずれか（２μｇ／Ｌ〜１２８μｇ／Ｌ）を、５０μＬのＩ１２５で標識されたＮＧＡＬおよび５０μＬの特異的な抗体と混合した。この混合物を室温で３時間インキュベートした。その後、５００μＬの固相の第二抗体でコーティングしたセルロースの懸濁液（ＡＡ−ＳＡＣ１，ＩＤＳＬＴＤ，英国）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。抗ウサギＩｇＧ抗体でコーティングしたセルロースに結合したＮＧＡＬ−抗体複合体を遠心分離でペレット化した。デカンテーション後に、放射活性を測定した。
【００５６】
［００８１］ＨＫ−２の培養およびＮＧＡＬタンパク質の発現
［００８２］ＨＫ−２（ヒト腎臓２，ＣＲＬ−２１９０）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）から購入した。これは、正常な腎臓から誘導されたヒト腎近位尿細管の上皮細胞系である。この細胞をヒトパピローマウイルス１６（ＨＰＶ−１６）Ｅ６／Ｅ７遺伝子の導入によって不死化した。この細胞を、５％ＣＯ２を含む湿気のある雰囲気中、３７℃で、完全増殖培地（０．０５ｍｇ／ｍｌウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、および、５ｎｇ／ｍｌヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ）が添加されたケラチノサイト無血清培地（Ｋ−ＳＦＭ）（インビトロジェン−ギブコ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ（Ｒ）），英国））、または、不完全な増殖培地のいずれかで培養した。加えて、この細胞を、サイトカイン（ＩＬ−１βまたはＴＮＦ−α）（シグマ−アルドリッチ，シュタインハイム，ドイツ）、および、ＬＰＳ（インビトロジェン−ギブコ（Ｒ），英国）などの特異的な刺激因子と共に培養した。ウェルあたり０．５×１０５個の細胞および１ｍｌの完全増殖培地を２４ウェルプレート（ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ（Ｒ）），米国）にシーディングした。４８時で継代培養した後、完全増殖培地を除去し、単分子層（約９０％の密集
度）をＰＢＳ（インビトロジェン−ギブコ（Ｒ），英国）で２回洗浄した。この細胞を調整培地で７２時間培養した。ＮＧＡＬ定量化のために、培地の上清を２時間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間それぞれの時点で回収した。
【００５７】
［００８３］ＲＴ−ＰＣＲによるＮＧＡＬの遺伝子発現の評価
［００８４］トータルＲＮＡの単離のために、正常な培養したＨＫ−２細胞、および、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−１βで誘導されたＨＫ−２細胞を２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間および２４時間で回収した。ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ（Ｒ））ミニキット（Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ），英国）を製造元のプロトコールに従って用いて、ＲＮＡを抽出した。スーパースクリプトＩＩＩ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）逆転写酵素（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ），英国）を２００ｎｇのトータルＲＮＡと共に用いて第一のｃＤＮＡ鎖を合成した。ＤＮＡエンジン（ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ）ＰＣＲ装置（ＰＴＣ−２００）（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ），米国）でＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン，英国）を用いることによってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＮＧＡＬ（５’−ＴＣＡＣＣＴＣＣＧＴＣＣＴＧＴＴＴＡＧＣ−３’、および、５’−ＣＧＡＡＧＴＣＡＧＣＴＣＣＴＴＧＧＴＴＣ−３’）、および、β−アクチン（５’−ＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧＧ−３’、および、５’−ＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＴ−３’）に関する特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの配列を文献に従って選択し、サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）（ドイツ）が合成した。最初の変性条件は、９４℃で２分間である。ＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒の変性工程、続いて６０℃（ＮＧＡＬの場合）または５９℃（β−アクチンの場合）で３０秒のアニーリング工程、および、７２℃で３０秒の伸長を用いて行われた。両方の遺伝子で合計３０サイクルを行い、続いて最終的な伸長を７２℃で１０分間行った。２％アガロースゲル電気泳動でＰＣＲ産物を分離し、エチジウムブロマイド染色で検出した。５０ｂｐのＤＮＡラダー（ダイレクトロード（ＤｉｒｅｃｔＬｏａｄＴＭ）ＤＮＡマーカー）（シグマ−アルドリッチ，シュタインハイム，ドイツ）を参照することによって、ＰＣＲ産物の期待されるサイズ（ＮＧＡＬおよびβ−アクチンそれぞれについて、２４２ｂｐおよび１１９ｂｐ）を検証した。
【００５８】
［００８５］ウェスタンブロッティング
［００８６］好中球顆粒放出産物を、説明されているようにして得た。７２時間の時点でのＨＫ−２調整培地上清を回収し、０．１ｍＭのＰＭＳＦ（シグマ−アルドリッチ，シュタインハイム，ドイツ）、および、コンプリート（ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭ）プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ），マンハイム，ドイツ）を添加した。アミコン（Ａｍｉｃｏｎ（Ｒ））・ウルトラ−４（Ｕｌｔｒａ−４）遠心ろ過装置（１０，０００ＭＷ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），米国）を用いて上清を濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを製造元の説明書に従って行った。簡単に言えば、２５μＬの尿または濃縮した上清のいずれか、または、好中球放出産物を、非還元条件下でＮｕ−ＰＡＧＥ（Ｒ）４〜１２％ビストリスゲル（インビトロジェン，米国）に適用した。Ｎｕ−ＰＡＧＥ（Ｒ）トランスファーバッファー（インビトロジェン，米国）を２５Ｖで１時間用いることによってタンパク質をハイボーン−Ｐ（Ｈｙｂｏｎｅ−Ｐ）ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥヘルスケア，英国）上に移した。ＰＶＤＦメンブレンの追加の結合部位を、ブロッキング溶液（ＧＥヘルスケア，英国）で１時間ブロックした。このブロットを、ヒトＮＧＡＬに対するウサギポリクローナル抗体もしくはマウスモノクローナル抗体（Ｍａｂ６９７、Ｍａｂ６９９、Ｍａｂ７６３、Ｍａｂ７６４またはＭａｂ７６５）、または、モノクローナル抗体の混合物のいずれかと共に室温で一晩インキュベートし、続いてペルオキシダーゼ標識二次抗体（ＧＥヘルスケア，英国）と共に１時間インキュベートした。免疫ブロットを、製造元の説明書（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＥＣＬＴＭウェスタンブロッティングシステム，ＧＥヘルスケア，英国）に従って強化された化学発光を用いて検出した。
【００５９】
［００８７］統計的分析
［００８８］スチューデントのｔ検定および一元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を、スタティスティカ８．０（スタットソフト社，タルサ，米国）、および、メディカルク（Ｍｅｄｃａｌｃ）９．５（メディカルク（Ｍｅｄｃａｌｃ）ソフトウェア，マリアケルク（Ｍａｒｉａｋｅｒｋｅ），ベルギー）によって行った。値は、平均±標準偏差、および、四分位数間範囲と共に中央値として示した。ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【００６０】
［００８９］結果
［００９０］ウェスタンブロッティングによる尿中のＮＧＡＬ分子の形態の検出
［００９１］ＮＧＡＬに対する１種のウサギポリクローナル、および、５種のマウスモノクローナル抗体を用いて、心臓外科手術を受けた患者から得られた尿中に存在するＮＧＡＬ分子の形態を同定した。ビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ）の実験により、５種のモノクローナル抗体は、異なるエピトープと反応することが示された。２つの代表的な尿サンプル（Ｕ１およびＵ２）を示した図６からわかるように、抗体間の性能に顕著な差があることが見出された。ポリクローナル抗体によって３つの主要なバンドが定期的に同定され、ＮＧＡＬの単量体および二量体の形態、ならびにＮＧＡＬの複合体化したヘテロ二量体の形態として同定された。またこれらの３つの形態は、Ｍａｂｓ７６４および７６５によっても検出された。しかしながら、追加のバンドもいずれかの抗体で観察された。しかしながら、ポリクローナル抗体は、二量体に対して、２種のモノクローナル抗体よりも強い親和性を有し、ヘテロ二量体に対して、それよりも弱い親和性を有するようである。Ｍａｂｓ７６４および７６５は、３種全ての分子形態の検出において極めて類似した性能を有していた。Ｍａｂ７６４およびＭａｂ７６５のＮＧＡＬに対する親和性は、高いほうから低いほうに言えば、それぞれ単量体、ヘテロ二量体および二量体の形態であった。また、Ｍａｂ７６３、６９９および６９７は、ヘテロ二量体の形態に強い親和性を有するが、それに対して二量体および単量体の形態への親和性は弱いことも示された。しかしながら、刺激された好中球顆粒球の上清中の単量体および二量体の形態を検出することにおけるポリクローナル抗体、ならびにＭａｂｓ７６５および６９７の能力は、極めて類似しているようである。
【００６１】
［００９２］尿中のＮＧＡＬを測定するためのＲＩＡおよび５種のＥＬＩＳＡの性能
［００９３］表１に、ＲＩＡおよび５種のＥＬＩＳＡの性能特性を示す：
【００６２】
【表１】
0005438770.tif 000002
【００６３】
［００９４］手術前、ならびに手術後２時間および２４時間で得られた尿中ＮＧＡＬ濃度を測定し、表１に、上記分析により得られたＮＧＡＬの中央値レベルを示した。ＲＩＡによって測定された手術前および手術後２時間のＮＧＡＬの中央値レベルは、７種の分析のなかでも最高であった。一方で、Ｍａｂ６９７ベースのＥＬＩＳＡ（ＥＬＩＳＡ１およびＥＬＩＳＡ６）により得られたレベルは、その他の分析よりも有意に低かった。表１は、手術前および手術後２時間のレベルにおける差、加えて２４時間にわたる全体的な差を示す。全ての分析で、手術前および手術後における高度な有意差が観察された。手術前と手術後２時間とを比較した中央値レベルの増加倍率は最高であり、ＥＬＩＳＡ３（Ｍａｂ７６４−ポリクローナル）、ＥＬＩＳＡ５（ポリクローナル−ポリクローナル）、または、ＥＬＩＳＡ４（ポリクローナル−Ｍａｂ７６５）によって測定した場合は７０を超え、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ２（Ｍａｂ７６４−Ｍａｂ７６５）、ＥＬＩＳＡ１（Ｍａｂ６９７−ポリクローナル）、または、ＥＬＩＳＡ６（Ｍａｂ６９７−Ｍａｂ７６５）によって測定した場合、２３〜３４倍であった。
【００６４】
［００９５］尿のゲルろ過後の様々な分析によるＮＧＡＬの測定
［００９６］ウェスタンブロッティングの結果に基づいて、以下の２セットの実験を行い、ＮＧＡＬの異なる形態の検出における分析の性能を調査した。手術後２時間における１つの尿サンプルのゲルろ過を、スーパーデックスＴＭ７５ＨＲカラムで行った。分画中のＮＧＡＬレベルをＲＩＡおよび５種のＥＬＩＳＡで測定し、図７に示した。５種のＥＬＩＳＡでは、それぞれ単量体および二量体の形態の溶出量に相当する２つのピークが得られたが、ＲＩＡでは１つのピークしか得られなかった。後者は恐らく、ＲＩＡの感度が不十分であることによるものである。ＲＩＡでは、ピーク２においてＮＧＡＬの最高レベルが得られ、ＥＬＩＳＡ１（Ｍａｂ６９７−ポリクローナルベースのＥＬＩＳＡ）では最も低いレベルが得られた。ＥＬＩＳＡ１以外の全てのＥＬＩＳＡ分析では、ピーク１で、すなわち二量体のＮＧＡＬの同様のレベルが測定された（図２の挿入図）。ＥＬＩＳＡ１では、二量体のＮＧＡＬのより高レベルが測定された。
【００６５】
［００９７］ストレスの多い条件下で増殖させた場合、ＨＫ−２細胞においてＮＧＡＬはアップレギュレートされる
［００９８］ＨＫ−２細胞を、異なる時間の長さで、ケラチノサイト無血清培地（Ｋ−ＳＦＭ）、０．０５ｍｇ／ｍＬのウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、もしくは、５ｎｇ／ｍＬのヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ）のいずれかが添加されたＫ−ＳＦＭ、または、ＡＴＣＣ推奨の完全増殖培地（０．０５ｍｇ／ｍＬのＢＰＥおよび５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが添加されたＫ−ＳＦＭ）で培養し、続いて標準条件下で４８時間培養した。培養上清中のＮＧＡＬレベルを、ＥＬＩＳＡ４によって、７２時間にわたり、異なるタイムポイント（２時間、１２時間、２４時間、４８時間および７２時間）で決定した。培養の１２時間〜７２時間後に、Ｋ−ＳＦＭ培養上清中のＮＧＡＬレベルは、その他の３つの培養培地よりも高かった（図８）。完全増殖培地で増殖させた細胞に、最も低いレベルが見出された。また結果から、ＢＰＥが添加されたＫ−ＳＦＭ中で増殖させた細胞の上清中のＮＧＡＬレベルは、ｒＥＧＦが添加されたＫ−ＳＦＭ中で増殖させた細胞と比較してより高かったこともわかる。総合的に言えば、これらの結果から、細胞を必須の増殖因子を欠乏させた状態にしたストレスの多い条件下では、ＮＧＡＬ生産がアップレギュレーションされることが示された。
【００６６】
［００９９］ＨＫ−２細胞中で、ＩＬ−β、ＬＰＳおよびＴＮＦ−αによってＮＧＡＬはアップレギュレートされる
［０１００］ＨＫ−２細胞を完全増殖培地で４８時間増殖させ、その後にこの細胞を、ＩＬ−β（１ｎｇ／ｍＬ，ヒト）、ＬＰＳ（１２５ｎｇ／ｍＬ，クレブシェラ肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ））、または、ＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ，ヒト）のいずれかが添加された完全増殖培地の存在下で、様々なの長さの時間さらに増殖させた。図９Ａに示したように、ＩＬ−βは、上清中でＮＧＡＬレベルの非常に有意な上昇を誘導した（８．９〜４１．９倍の増加）。またＴＮＦ−αおよびＬＰＳとインキュベートすることによっても、上清中である程度のＮＧＡＬ上昇（それぞれ２．２および１．６倍）を誘導したが、ＩＬ−βよりも有意に低かった（ｐ＜０．００１）。またＨＫ−２細胞を、ＩＬ−β、ＴＮＦ−αまたはＬＰＳが添加されたＫ−ＳＦＭでも培養した。ＩＬ−βではＮＧＡＬの有意な上昇（１．３〜１２．８倍の増加）が観察されたが、ＴＮＦ−αまたはＬＰＳでは観察されなかった（図９Ｂ）。しかしながら、完全増殖培地中で増殖させた細胞と比較すると、これらの上昇は、有意に低かった（ｐ＜０．００１）。
【００６７】
［０１０１］ＨＫ−２細胞によって生産されたＮＧＡＬの分子の形態
［０１０２］ＨＫ−２細胞によって分泌されたＮＧＡＬの分子の形態を、抗体を検出する際に、混合型のモノクローナル抗体（Ｍａｂ６９７、Ｍａｂ７６４およびＭａｂ７６５）を用いたウェスタンブロッティングによって決定した。図１０（下のパネル）に示した結果によれば、完全培養培地、または、ストレスの多い条件下では、Ｋ−ＳＦＭ、もしくは、サイトカイン（ＩＬ−β、または、ＴＮＦ−α）またはＬＰＳが添加された培地のいずれかで増殖させたＨＫ−２細胞によって分泌されたＮＧＡＬの主要な形態は、単量体の形態であることが示される。またＩＬ−βで刺激した後はＮＧＡＬのヘテロ二量体の形態も観察されたが、一方で、ヒト好中球の上清中に見出されたのとは対照的に、二量体の形態は見出されなかった（図６）。図１０で、ＩＬ−βとインキュベートした後の、ＨＫ−２細胞中のＮＧＡＬのｍＲＮＡレベルを示す。結果から発現が増加したことがわかり、これは、ＨＫ−２細胞によるＮＧＡＬの活性な合成を示す。
【００６８】
［０１０３］考察
［０１０４］元々ＮＧＡＬはヒト好中球から単離されたが、これまでに、血液中のＮＧＡＬの測定は、細菌またはウイルスによって引き起こされる急性感染を区別する優れた手段であることが示されてきた。それに続く研究では、ＮＧＡＬはまた、所定の条件下で、腎臓、肝臓および上皮組織のようなその他の細胞でも発現される可能性があること、および、尿および血漿中のＮＧＡＬの測定は、急性腎臓損傷のバイオマーカーとして役立つ可能性があることが見出された。実施例１によれば、ＮＧＡＬ分析の抗体の立体配置は、分析の臨床能力に強い影響を与えることが示される。ＡＫＩを有する患者の尿中で、数種のＮＧＡＬの形態が同定された。さらにこの実施例によれば、尿細管上皮細胞によって生産された優勢な形態は、単量体の形態およびある程度のヘテロ二量体の形態であることが示さ
れる、それに対して、二量体の形態は、好中球に特有であると考えられる（図６を参照）。また単量体の形態も好中球によって生産される。本発明の研究における一つの興味深い発見は、好中球に由来する単量体および二量体の形態は、全てのモノクローナル抗体、加えてポリクローナル抗体によって同定されたことから、これらの異なる形態の用いられる抗体による認識に差があることである。これは、Ｍａｂ６９７は、これらの尿中の形態をほぼ完全に認識することができないこととは対照的である。またＭａｂ７６５は好中球の上清中のこれらの形態に対しても強い反応を示したが、尿中の二量体の形態はわずかな認識しか示さなかった。理論に制限されることは望まないが、異なるＮＧＡＬ形態のエピトープへの曝露における差、従って分子構造における差が原因であると考えられる。
【００６９】
［０１０５］また尿中の異なるＮＧＡＬの分子の形態の存在、および、抗体のエピトープ認識における差は、用いられる分析によって、尿中のＮＧＡＬの定量化に大きい差が生じることによっても反映される。分析で用いられる較正物質が同じなのに、手術前のレベルが極めて異なっており、加えて手術後の相対的な変化も異なっていた。ポリクローナル抗体を単独で用いるか、または、ポリクローナル抗体をＭａｂ７６４またはＭａｂ７６５のいずれかと組み合わせて用いるかのいずれかのＥＬＩＳＡで、増加倍率が最高であったことは明白である。これらの２種のＭａｂはまた、ウェスタンブロッティングで尿中のほとんどの形態を認識した。しかしながらこれら２種のＭａｂの組み合わせが認識したものはより少なく、これは、ポリクローナル抗体によって追加の分子の形態がピックアップされたことを示す。ゲルろ過実験において、たった１つの分析でも二量体の形態が異なって認識されていることから、これらの様々な形態の認識における差は主として単量体のＮＧＡＬの認識における差に関連しているようである。このような差は、全てが似たような感度、不正確、回収率等を示したため、分析の全体的な分析性能で説明することができなかった。
【００７０】
［０１０６］以前の報告では、ヒトにおけるＮＧＡＬ（ＣＮＧＡＬ／ＣＣｒ）の分画排出率、マウスにおけるインサイチュハイブリダイゼーション、および、ＮＧＡＬは急性期のタンパク質であるということに基づいて、尿中のＮＧＡＬ蓄積は、腎臓での局所的な合成（これが尿中ＮＧＡＬの大部分を構成する）、ならびに遠隔臓器および免疫細胞に起因する可能性があると主張していた。しかしながら、腎臓において、糸球体ろ過率、尿細管での再吸収および尿での希釈という観点でのＮＧＡＬ処理に関していくつか疑念があることにより、加えてマウスでインサイチュハイブリダイゼーションが行われたこと、および、このような技術では、細胞がタンパク質を生産する能力を十分に反映していないことからも、このような結論は弱くなる。しかしながら、我々の発見は、例えば体外循環を行っている間に観察されるようなストレスの多い条件または炎症を起こした条件下で生きている腎臓に関連するいくつかの条件によってｍＲＮＡ発現およびタンパク質生産が誘導されることから、ヒト尿細管上皮細胞は、ＮＧＡＬを生産する能力を有するという観念を実際に裏付けるものである。我々は、サイトカインＩＬ−１Ｒが最も有力な刺激因子であることを見出し、これは、肺上皮細胞系を用いた他者の研究とも一致する。多くの以前の研究でも、高レベルの好中球分泌タンパク質、および、ＩＬ−βやＴＮＦ−αのようなサイトカインは、心臓外科手術中と心臓外科手術後に観察されている。それゆえに本発明の結果は、ＮＧＡＬは、尿中に多くの様々な形態で存在すること、および、この多様性の原因となる尿中のＮＧＡＬを定量化するための分析が有利であること実証する。従って、一実施態様において、本発明は、ＮＧＡＬの分子構造が、好中球由来のＮＧＡＬの構造とわずかに異なっているようであることから、尿細管上皮に由来するＮＧＡＬを選択的に同定する分析を対象とする。従ってこのような分析は、より高度に特異的であり、ＡＫＩ検出における感度が高く、腎臓機能障害を発症させる危険性がある患者にとって特に有用である。
【００７１】
［０１０７］本発明の方法、装置およびキットを具体的な実施態様を参照しながら説明し、さらに実施例で本発明の具体的な形態を示した。しかし当然のことながら、本発明の追加の実施態様、形態、バリエーションおよび改変は、当業界における通常の技術を有するものによって、本発明の範囲から逸脱することなく、特許請求されたように実行することが可能である。
【図１】
0005438770.tif 000003
【図２Ａ】
0005438770.tif 000004
【図２Ｂ】
0005438770.tif 000005
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
0005438770.tif 000009
【図４Ｂ】
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【図５】
0005438770.tif 000011
【図６】
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【図７】
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【図８】
0005438770.tif 000014
【図９Ａ】
0005438770.tif 000015
【図９Ｂ】
0005438770.tif 000016
【図１０】
0005438770.tif 000017
【配列表】
0005438770000001.app