(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的塩基配列を識別する方法であって、
試料２本鎖核酸と、標的塩基配列と同一の塩基配列を含む標準２本鎖核酸とを、一の反応液内において熱変性処理する熱変性工程と、
前記熱変性工程の後、前記反応液の温度を低下させることにより、前記試料２本鎖核酸と前記標準２本鎖核酸とにおいて競合的鎖組み換え反応を行う降温工程と、
前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定する測定工程と、
前記測定工程により得られた測定結果に基づき、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、
を有し、
前記降温工程において、前記標準２本鎖核酸のＴｍ値における前記反応液の降温速度が、（当該Ｔｍ値＋１０）℃超における降温速度より遅く、
前記降温工程において、前記反応液の降温速度が、（前記Ｔｍ値＋２）℃超では１０℃／分超であり、（前記Ｔｍ値＋２）℃〜（前記Ｔｍ値−１０）℃では０．２５℃／分〜１０℃／分であることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法。
【請求項２】
前記降温工程において、前記反応液の降温速度が、（前記Ｔｍ値＋２）℃超では１０℃／分超であり、（前記Ｔｍ値＋２）℃〜（前記Ｔｍ値−１０）℃では０．２５℃／分〜１０℃／分であり、（前記Ｔｍ値−１０）℃未満では１０℃／分超であることを特徴とする請求項１記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項３】
前記降温工程に要する時間が１〜３０分間であることを特徴とする請求項１又は２に記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項４】
前記測定工程における測定を、前記降温工程において経時的に行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項５】
前記測定工程における測定を、前記降温工程の開始時及び終了時に行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項６】
前記試料２本鎖核酸が、核酸増幅反応により増幅された２本鎖核酸であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項７】
前記標準２本鎖核酸を構成する２本の核酸鎖のうち、一方の鎖の３’端部が第１標識物質により、他方の鎖の５’端部が第２標識物質により、それぞれ標識されており、
前記第１標識物質と前記第２標識物質は、互いにエネルギー移動可能な物質であり、
前記第１標識物質及び前記第２標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを測定することにより、前記測定工程における標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項８】
前記標的塩基配列が、遺伝子変異の特定の遺伝子型の変異部位を含む領域と相同的な塩基配列であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法。
【請求項９】
標的塩基配列の識別に要する時間を短縮する方法であって、
試料２本鎖核酸と、塩基配列が既知である標準２本鎖核酸とを、一の反応液内において熱変性処理する熱変性工程と、
前記熱変性工程の後、前記反応液の温度を低下させることにより、前記試料２本鎖核酸と前記標準２本鎖核酸とにおいて競合的鎖組み換え反応を行う降温工程と、
前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定する測定工程と、
前記測定工程により得られた測定結果に基づき、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、
を有する標的塩基配列の識別方法において、
前記降温工程において、前記標準２本鎖核酸のＴｍ値における前記反応液の降温速度を、（当該Ｔｍ値＋１０）℃超における降温速度より遅くし、
前記降温工程において、前記反応液の降温速度を、（前記Ｔｍ値＋２）℃超では１０℃／分超に、（前記Ｔｍ値＋２）〜（前記Ｔｍ値−１０）℃では０．２５℃／分〜１０℃／分にすることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法の時短化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる核酸が、標的塩基配列を有する核酸であるか否かを識別する方法に関し、さらに詳述すると、鎖組み換え反応を利用したコンペティティブハイブリダイゼーションを用いて核酸の塩基配列の僅かな相違を識別する方法の識別に要する時間を短縮する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの解読、特にＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）地図を作成する国際ハップマッププロジェクトにより、ヒトゲノムに関する情報は増加の一途をたどっている。さらに、得られたゲノム情報と個人の体質との関連を見出し、遺伝子レベルで個人の体質の違いを把握し、個人の特性に応じた病気の診断・治療・予防や薬剤の投与を可能とする「個人の遺伝情報に応じた医療」（オーダーメード医療）の実現をめざした研究が、世界全体で大規模に展開されている。ここでの遺伝子の違いは、個々人のゲノムの塩基配列上での違いを意味し、その主たる違いは一塩基の違い（ＳＮＰ）である。また、最近では、短い塩基配列が繰り返される回数（コピー数）の違い（Ｃｏｐｙ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ：ＣＮＶ）も、ゲノム全体に広がっていることがわかり、このＣＮＶの違いと病気との関連性も指摘されている。
【０００３】
ここで、個人の遺伝子レベルでの違いを把握するためには、各個人の遺伝子型を調べる必要が生じてくる。たとえば、あるＳＮＰでは、その遺伝子型はＡＡ、ＡＧ、ＧＧの３種類であることが分かっているとする。Ａはアデニン、Ｇはグアニン塩基を示し、このＳＮＰは、ゲノムのその位置がアデニンの場合とグアニンの場合がある一例である。従って、当該ＳＮＰの遺伝子型を識別するための検査は、この３種類の遺伝子型のいずれであるかを決定することになる。すなわち、Ａについて０と１００のいずれであるか、Ｇについて０と１００のいずれであるか、又は、ＡとＧが５０と５０であるかどうかを見ればよい。このように、ＳＮＰ等の生殖細胞系列変異の検出は、ほぼ定性的な検出といってよく、その方法は比較的容易で簡便な各種方法が実用化されている。
【０００４】
一方、がん細胞においては、体細胞のレベルで変異が生じ、その変異ががんの引き金となって異常な増殖につながると考えられている。従って、ある特定の種類のがん細胞では、特定の遺伝子の変異がみられることがあり、当該変異を指標にがん細胞の検出を行うことも可能である。但し、がん細胞は多様性に富み、一種類の変異でがん細胞を特定することは必ずしも容易ではない。
【０００５】
また、最近の薬物療法においては、生体内の特定の分子（タンパク質等）を標的とした薬剤が開発され、副作用が少なく、効果が高いものが見出されてきている。これらは分子標的薬と呼ばれ、主にがん治療の領域で活発に開発されている。ごく最近、これら分子標的薬では、標的としている分子のシグナル伝達の下流のタンパク質に変異が生じている場合には当該薬剤の効果が発揮できないこと等が明らかになってきている。この場合、変異を生じているタンパク質をコードする遺伝子の変異を調べることにより、当該薬剤の効果を予測することが可能となってきており、ＳＮＰ検出とは異なる新たなオーダーメード医療の領域が開けつつある。
【０００６】
ここで述べた、がん細胞に特徴的な変異又は分子標的薬に抵抗性を示す変異は、そのほとんどが体細胞変異である。先に述べた生殖細胞系列変異の場合、どの細胞でも共通の変異が見られるのに対し、体細胞変異では変異を起こした細胞でのみ変異が見られ、変異を起こしていない細胞（通常は正常細胞）では変異は見られない。従って、通常、検体（検査の対象となる試料）中では、変異した細胞と正常細胞が混在する状況となっており、これらの細胞の存在比に応じて、変異した遺伝子と正常の遺伝子が存在することになる。つまり、試料の大部分が正常細胞であって一部変異細胞が含まれる場合、多くの正常な遺伝子中に存在するわずかな変異遺伝子を検出しなければならず、この点が生殖細胞系列における変異検出と異なる点で、体細胞の遺伝子変異検出をより困難にしている点である。
【０００７】
体細胞の遺伝子変異検出法には大きく分けて二つの方法がある。一つは、遺伝子増幅の段階で正常な遺伝子と変異遺伝子を区別する方法であり、具体的には、変異遺伝子のみを特異的に増幅する方法である。
【０００８】
例えば、最も感度がよいとされている方法は、正常な遺伝子のみを制限酵素を用いて切断し、切断されていない変異遺伝子のみを増幅する“ｍｕｔａｎｔ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ＰＣＲ”と呼ばれている方法である（例えば、非特許文献１参照。）。この方法では、変異遺伝子を増幅する反応を繰り返すことにより、正常遺伝子１０６分子中の１分子の変異遺伝子を検出できるとされている（例えば、非特許文献２参照。）。この方法はこのように高感度という点では優れているが、操作は非常に煩雑で一般の診断適用できる方法ではない。
【０００９】
また、ＰＣＲ等のプライマーの伸張反応において、一塩基の違いを区別して増幅する方法が開発されている。この方法は、“ＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）”（例えば、非特許文献３参照。）、“ＡＳＰＣＲ（ａｌｌｅｌｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）”（例えば、非特許文献４参照。）等とも呼ばれている。この方法は、比較的高感度であり、さらに一般的なＰＣＲの増幅反応以外の操作を必要とせず、反応のすべてを閉鎖系で行うことができ、かつ非常に簡便であり、ＰＣＲのキャリーオーバーコンタミネーションのない優れた方法である。しかしながら、一度でも一塩基識別を誤って正常遺伝子を増幅した場合、以後の増幅反応において、変異遺伝子の増幅と同じように正常遺伝子も増幅されてしまうため、擬陽性の危険が高い方法とも言える。この方法を用いる場合、反応条件、すなわち反応温度や塩濃度等を厳密に制御する必要があり、また鋳型量も厳密に同じにする必要があり（例えば、非特許文献５参照。）、不特定多数の検体を検査する臨床検査や、高い精度が要求される診断には不向きである。
【００１０】
体細胞の遺伝子変異を検出するもう一つの方法は、変異遺伝子と正常遺伝子を同時に増幅し、その後変異遺伝子と正常遺伝子を区別して検出する方法である。増幅された変異遺伝子と正常遺伝子を区別して検出する方法としては、電気泳動を利用する方法、ハイブリダイゼーションを利用する各種方法等がある（例えば、非特許文献５参照。）。しかしながら、ほとんどの方法において、多量の正常遺伝子に含まれる少量の変異遺伝子を精度よく検出することは困難である。例えば、変異遺伝子検出のゴールドスタンダードといわれている方法として、ジデオキシシークエンシング法がある。ジデオキシシークエンシング法は、変異遺伝子を比較的高感度で検出することが可能であるものの、変異遺伝子と正常遺伝子が混在する場合に、変異遺伝子の検出感度は１０％程度であり、それほど高感度の検出はできない。その他、ピロシークエンシング法では、５％程度まで検出感度を高めることができ、ジデオキシシークエンシング法より優れていることが報告されている（例えば、非特許文献６参照。）。
【００１１】
また、変異を含む配列をＰＣＲにより増幅し、その生成物の２本鎖ＤＮＡの融解曲線を求め、変異遺伝子と正常遺伝子の融解曲線の違いから変異遺伝子の割合を求める方法が開発されている。この方法でも、正常遺伝子に含まれる変異遺伝子を５％程度まで検出できるとされている（例えば、非特許文献７参照。）。
【００１２】
その他、同じ塩基配列をもつ２本鎖間での鎖の組み換え反応（鎖置換反応）を利用したＰＣＲ−ＰＨＦＡ法が開発された。ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法は、遺伝子型の識別対象であるサンプル（２本鎖核酸）と配列既知の標準２本鎖核酸との間で塩基配列がまったく同じであれば、それぞれの鎖を区別することができず、鎖の組換え（鎖置換）が起こるが、１塩基でも違いがあれば、完全に相補的な塩基配列を持つ鎖同士が優先的に２本鎖を形成するために、サンプルと標準２本鎖核酸との間で組換えが起こらないことを利用した変異検出法である。このＰＣＲ−ＰＨＦＡ法を用いることにより、実際の検体から１％程度という高感度で変異遺伝子を検出できることが報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献８参照。）。
【００１３】
ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法の改良法も幾つか提案されている。例えば特許文献２には、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法の改良法として、蛍光共鳴エネルギー移動を利用する方法が開示されている。微量の変異遺伝子を高感度で正確に測定するＰＣＲ−ＰＨＦＡ法においては、同じ配列をもつ二つの２本鎖核酸の間での鎖の組換えを検出する必要があるが、サンプルの２本鎖核酸は非標識とし、鎖の組換えを起こさせるための配列既知の標準核酸を標識する場合が多い。特許文献２記載の方法では、標準核酸の一方の鎖の５’末端付近に蛍光物質を結合させて標識し、他方の鎖の３’末端付近を別の蛍光物質で標識する。鎖組み換え反応が起こらず標準核酸が元の２本鎖の場合には、二つの異なる蛍光物質の間での蛍光共鳴エネルギー移動が観察される。これに対して、サンプルの２本鎖核酸との間での鎖組み換え反応が起こると、蛍光共鳴エネルギー移動は観察されなくなる。従って、この蛍光共鳴エネルギー移動の程度を測定することで鎖の組換えの程度を測定することができる。
【００１４】
具体的には、例えば、ある核酸配列のある位置（識別対象とする変異部位）がアデニンである場合とグアニンである場合とを区別する場合、当該位置を含み、かつ当該位置の塩基がアデニン（相補鎖ではチミン）である標準２本鎖核酸を準備する。さらに、その標準２本鎖核酸を、一方の鎖は蛍光物質Ｘで、他方の鎖は蛍光物質Ｘと互いにエネルギー移動可能な蛍光物質Ｙで、それぞれ標識する。つまり、標準２本鎖核酸では、二つの蛍光物質が近接しているために、そのままでは蛍光共鳴エネルギー移動が生じる状態にある。
一方で、サンプル由来の核酸を、核酸増幅反応により、標準２本鎖核酸とまったく同じ長さとなるように増幅して調製する。得られたサンプル由来２本鎖核酸と標準２本鎖核酸を混合し、熱を加えて２本鎖を変性させた後、徐々に温度を低下させて再び２本鎖を形成させる。このとき、サンプル由来２本鎖核酸の変異部位が、すべて標準２本鎖核酸と同じアデニンであった場合、サンプル由来２本鎖核酸と標準２本鎖核酸との間では鎖の組み換え反応が生じる。理論上は、サンプル由来２本鎖核酸と標準２本鎖核酸の分子数の比が１：１であった場合、組み換わる確率は１／２であり、また元の２本鎖にもどる確率も１／２であり、蛍光共鳴エネルギー移動の程度も１／２となる。サンプル由来２本鎖核酸の変異部位が、すべて標準２本鎖核酸とは異なるグアニンであった場合、鎖組み換え反応は起こらず、従って蛍光共鳴エネルギー移動の程度は変化しない。これをもって、サンプル中の検出（識別）したい目的の塩基がアデニンであるかグアニンであるかを検出することが可能となる。サンプル由来２本鎖核酸と標準２本鎖核酸との比を増大させることにより、組換えの程度を大きくすることができる。たとえば、サンプル由来２本鎖核酸と標準２本鎖核酸の比が２０：１である場合、組換えの割合は２０／２１、すなわち標準２本鎖核酸が元の２本鎖に戻る確率は１／２１となり、蛍光共鳴エネルギー移動の変化が大きくなり検出が容易になる。
【００１５】
このように、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法は、検出感度が高く、再現性に優れた方法であるが、長時間を要する、という問題がある。例えば、特許文献１や非特許文献８に記載の方法においては、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法において精度良く鎖組み換え反応を起こすためには、ＤＮＡの変性温度から、７０℃若しくはハイブリダイゼーションが完結するそれ以下の温度まで、非常に緩やかな温調（０．１℃／分）をかけて、ハイブリダイゼーションを行う必要があるとされている。蛍光ＰＨＦＡは非酵素反応であるため、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸の鎖交換効率は熱力学に支配されており、極端な温度変化は識別の精度を悪くすると言われているためである（例えば、非特許文献９参照。）。つまり、十分な精度で核酸を識別する場合には、ＰＨＦＡに数時間必要となり、本法による変異検査を実用化する上で大きな課題であった。
【００１６】
一方、近年の遺伝子検出技術の進展は著しく、微細加工技術と蛍光検出法を組み合わせた多数の遺伝子発現や変異を同時に検出する方法が開発されており、これらの技術と組み合わせることの可能な変異遺伝子の高感度検出が望まれるところである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】特許第２９８２３０４号公報
【特許文献２】特開２００３−１７４８８２号公報
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】チェン（Chen）、外１名、アナリティカル・バイオケミストリー（Analytical biochemistry）、１９９１年、第１９５巻、第５１〜５６ページ。
【非特許文献２】ジャコブソン（Jacobson）、外１名、オンコジーン（Oncogene）、１９９４年、第９巻、第５５３〜５６３ページ。
【非特許文献３】ニュートン（Newton）、外７名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic acids research）、１９８９年、第１７巻、第２５０３〜２５１６ページ。
【非特許文献４】ウ（Wu）、外３名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・ジ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）、１９８９年、第８６巻、第２７５７〜２７６０ページ。
【非特許文献５】ノラウ（Nollau）、外１名、クリニカル・ケミストリー（Clincal Chemistry）、１９９７年、第４３巻、第１１１４〜１１２８ページ。
【非特許文献６】オギノ（Ogino）、外９名、ザ・ジャーナル・オブ・モレキュラー・ダイアグノスティックス（The Journal of Molecular Diagnostics）、２００５年、第７巻、第４１３〜４２１ページ。
【非特許文献７】クリプィ（Krypuy）、外４名、ビーエムシー・キャンサー（BMC Cancer）、２００６年、第６巻、第２９５ページ。
【非特許文献８】タダ（Tada）、外７名、クリニカ・キミカ・アクタ（Clinica Chimica Acta）、２００２年、第３２４巻、第１０５ページ。
【非特許文献９】オカ（Oka）、外５名、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic acids research）、１９９４年、第２２巻、第９号、第１５４１〜１５４７ページ。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明はこのような状況下、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法を利用した塩基配列の識別方法において、塩基配列の相違を識別する精度を保持しつつ、従来法よりも非常に短時間で、試料に含まれる核酸が、標的塩基配列を有する核酸であるか否かを識別し得る方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法において、配列既知の標準２本鎖核酸と、標的塩基配列を有しているか否かを識別する対象である試料２本鎖核酸とを用いて鎖組み換え反応を行う際に、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近の特定の温度領域においてさえ穏やかな温調をかければ、その他の温度領域における降温速度が速くとも、識別精度を損なうことなく、塩基配列を識別できることを見出し、本発明を完成させた。
【００２１】
すなわち、本発明は、
（１）  試料２本鎖核酸と、標的塩基配列と同一の塩基配列を含む標準２本鎖核酸とを、一の反応液内において熱変性処理する熱変性工程と、前記熱変性工程の後、前記反応液の温度を低下させることにより、前記試料２本鎖核酸と前記標準２本鎖核酸とにおいて競合的鎖組み換え反応を行う降温工程と、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定する測定工程と、前記測定工程により得られた測定結果に基づき、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、を有し、前記降温工程において、前記標準２本鎖核酸のＴｍ値における前記反応液の降温速度が、（当該Ｔｍ値＋１０）℃超における降温速度より遅く、前記降温工程において、前記反応液の降温速度が、（前記Ｔｍ値＋２）℃超では１０℃／分超であり、（前記Ｔｍ値＋２）℃〜（前記Ｔｍ値−１０）℃では０．２５℃／分〜１０℃／分であることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法、
（２）  前記降温工程において、前記反応液の降温速度が、（前記Ｔｍ値＋２）℃超では１０℃／分超であり、（前記Ｔｍ値＋２）℃〜（前記Ｔｍ値−１０）℃では０．２５℃／分〜１０℃／分であり、（前記Ｔｍ値−１０）℃未満では１０℃／分超であることを特徴とする前記（１）記載の標的塩基配列の識別方法、
（３）  前記降温工程に要する時間が１〜３０分間であることを特徴とする前記（１）又は（２）に記載の標的塩基配列の識別方法、
（４）  前記測定工程における測定を、前記降温工程において経時的に行うことを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
（５）  前記測定工程における測定を、前記降温工程の開始時及び終了時に行うことを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
（６）  前記試料２本鎖核酸が、核酸増幅反応により増幅された２本鎖核酸であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
（７）  前記標準２本鎖核酸を構成する２本の核酸鎖のうち、一方の鎖の３’端部が第１標識物質により、他方の鎖の５’端部が第２標識物質により、それぞれ標識されており、前記第１標識物質と前記第２標識物質は、互いにエネルギー移動可能な物質であり、前記第１標識物質及び前記第２標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを測定することにより、前記測定工程における標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
（８）  前記標的塩基配列が、遺伝子変異の特定の遺伝子型の変異部位を含む領域と相同的な塩基配列であることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
（９）  標的塩基配列の識別に要する時間を短縮する方法であって、試料２本鎖核酸と、塩基配列が既知である標準２本鎖核酸とを、一の反応液内において熱変性処理する熱変性工程と、前記熱変性工程の後、前記反応液の温度を低下させることにより、前記試料２本鎖核酸と前記標準２本鎖核酸とにおいて競合的鎖組み換え反応を行う降温工程と、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定する測定工程と、前記測定工程により得られた測定結果に基づき、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、を有する標的塩基配列の識別方法において、前記降温工程において、前記標準２本鎖核酸のＴｍ値における前記反応液の降温速度を、（当該Ｔｍ値＋１０）℃超における降温速度より遅くし、前記降温工程において、前記反応液の降温速度を、（前記Ｔｍ値＋２）℃超では１０℃／分超に、（前記Ｔｍ値＋２）〜（前記Ｔｍ値−１０）℃では０．２５℃／分〜１０℃／分にすることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法の時短化方法、
を提供するものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の標的塩基配列の識別方法により、識別精度を損なうことなく、識別に要する時間を従来法よりも大幅に短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】遺伝子型が異なる場合のドナー標識物質の蛍光挙動の一例を模式的に示した図である。
【図２】遺伝子型が異なる場合のアクセプター標識物質の蛍光挙動の一例を模式的に示した図である。
【図３】図１と同様にしてＰＣＲ産物（試料２本鎖核酸）、標準２本鎖核酸（マッチ）、標準２本鎖核酸（ミスマッチＡ）、及び標準２本鎖核酸（ミスマッチＢ）を調製し、競合的鎖組み換え反応を行った場合の、ドナー標識物質のΔＦを示した図である。
【図４】実施例１において、標準２本鎖核酸（野生型）と、試料２本鎖核酸（野生型又はＧ１２Ｓ型）とを混合し鎖組み換え反応を行った場合の、各温度における反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定した結果を示した図である。
【図５】実施例２において、標準２本鎖核酸（野生型）と、試料２本鎖核酸（野生型又はＧ１２Ｓ型）とを混合し鎖組み換え反応を３つの異なる降温条件で行った場合の、各温度における反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定した結果を示した図である。
【図６】実施例３において、標準２本鎖核酸（Ｇ１２Ｓ型）と、試料２本鎖核酸（野生型又はＧ１２Ｓ型）とを混合し鎖組み換え反応を１０の異なる降温条件で行った場合の、各温度における反応液の蛍光強度のＩＮＤＥＸ値(％)を算出した結果を示した図である。
【図７】実施例４において、標準２本鎖核酸（Ｇ１２Ｓ型）と、野生型とＧ１２Ｓ型の混合比率の異なる試料２本鎖核酸とを混合し鎖組み換え反応を行った場合の、各温度における反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定した結果を示した図である。
【図８】実施例５において、Ｔｍ値付近を緩やかに降温させた条件１で蛍光ＰＨＦＡを行った場合(Ａ)と、Ｔｍ値付近から５℃程度低い温度域から緩やかに降温させた条件２で蛍光ＰＨＦＡを行った場合(Ｂ)の蛍光挙動を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明及び本願明細書において、「標的塩基配列を識別する」とは、試料に含まれる核酸が、標的塩基配列を有する核酸であるか否かを識別することを意味する。
【００２５】
本発明の標的塩基配列の識別方法（以下、「本発明の識別方法」ということがある。）は、試料２本鎖核酸（試料由来の２本鎖核酸）の塩基配列が、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法を用いて試料２本鎖核酸の塩基配列が標的塩基配列を含むか否かを識別する方法において、試料２本鎖核酸と、標的塩基配列と同一の塩基配列を含む標準２本鎖核酸とを混合して熱変性させた後、温度を低下させて競合的鎖組み換え反応を行う際に、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近の温度範囲における降温速度を、当該温度範囲よりも高温における降温速度よりも遅くすることを特徴とする。Ｔｍ値付近の温度範囲における降温速度を、十分な識別精度が保持し得る程度に遅くしつつ、高温時における降温速度を速くすることにより、識別精度を損なうことなく、識別に要する時間を大幅に短縮することができる。
【００２６】
ここで、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近の温度範囲は、当該標準２本鎖核酸の融解曲線において、吸光度又は蛍光強度の温度に対する平均変化率、あるいは微分値（蛍光強度の場合には、温度に対する蛍光強度の変化量；ｄＦ／ｄＴ）が最大となる温度、すなわち相転移付近の温度範囲である。
【００２７】
一般的にはＰＨＦＡによる遺伝子変異等の標的塩基配列の識別は、２本鎖核酸の熱変性温度から緩やかな温度勾配（０．１℃／分）中のハイブリダイゼーションにおいて、塩基配列が完全に相同的である１本鎖核酸同士が優先的に２本鎖核酸を形成すると言われている。つまり、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換え（交換）反応が生じた場合には、両者が同一の塩基配列を有している、と識別することができる。一方で、両者の間に鎖組み換え（交換）反応が生じなかった場合には、試料２本鎖核酸の塩基配列は標準２本鎖核酸とは異なる、と識別することができる。この鎖組み換え（交換）反応の際の降温速度が速い場合には、塩基配列の識別精度が十分ではなく、特に１〜２塩基の違いを識別することができずに、塩基配列が相違する核酸鎖同士の間で鎖組み換え反応が生じてしまい、擬陽性を出してしまう。
【００２８】
このような従来法に対して、本発明は、後記実施例１及び図４において示すように、十分な識別精度を保持するために必要な最小限の温度範囲が存在し、その他の温度範囲においては、降温速度を速くしたとしても識別精度が損なわれない、という新規な知見に基づきなされた発明である。そして、当該知見は、ＰＨＦＡ法においては非常に緩やかにハイブリダイゼーションを行うことが重要である、とする一般論を覆すものであり、本発明者らにより初めて見出された知見である。従来のＰＣＲ−ＰＨＦＡ法は、特許文献２等に示すように、鎖組み換え反応を固相担体上で酵素を用いて検出しており、後記実施例１のようなリアルタイムの測定ではなくエンドポイント（鎖組み換え反応の終点)で観察しているため、当該知見に気付かなかったと推察される。
【００２９】
具体的には、本発明の識別方法は、試料２本鎖核酸と、標的塩基配列と相同的な塩基配列を含む標準２本鎖核酸とを、一の反応液内において熱変性処理する熱変性工程と、前記熱変性工程の後、前記反応液の温度を低下させることにより、前記試料２本鎖核酸と前記標準２本鎖核酸とにおいて競合的鎖組み換え反応を行う降温工程と、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定する測定工程と、前記測定工程により得られた測定結果に基づき、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、を有し、前記降温工程において、前記標準２本鎖核酸のＴｍ値における前記反応液の降温速度が、（当該Ｔｍ値＋１０）℃における降温速度より遅いことを特徴とする。
【００３０】
標的塩基配列としては、類似するその他の塩基配列と識別可能な程度に配列が既知であれば、特に限定されるものではない。本発明の識別方法においては、特に、遺伝子の部分塩基配列であることが好ましく、遺伝子変異の変異部位を含む領域の塩基配列であって、特定の遺伝子型と相同的な塩基配列であることがより好ましい。標的塩基配列を特定の遺伝子型の変異部位を含む領域の塩基配列とした場合には、本発明の識別方法により、試料二本鎖核酸が、当該遺伝子型と同一の遺伝子型であるのか、それとも別の遺伝子型であるのかを、識別することができる。
【００３１】
本発明において遺伝子変異とは、同一生物種の個体間において存在する遺伝子の塩基配列の相違を意味し、変異部位とは、塩基配列中の相違する部位を意味する。具体的には、塩基配列中の１又は複数の塩基が置換・欠失・挿入されていることにより、塩基配列の相違は生じる。すなわち、本発明において遺伝子変異とは、ＳＮＰやマイクロサテライト多型等の遺伝子多型のような先天的な変異に加えて、同一個体中の細胞間において存在する遺伝子の塩基配列の相違である体細胞変異等のように後天的な変異も含む。
【００３２】
本発明の識別方法において、標的塩基配列が遺伝子変異の変異部位を含む領域の塩基配列である場合に、当該変異部位（識別対象とする変異部位）としては、がん関連遺伝子、遺伝病に関連する遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスクファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子等に存在するものが挙げられる。がん関連遺伝子としては、例えばｋ−ｒａｓ遺伝子、ＢＲＡＦ遺伝子、ＰＴＥＮ遺伝子、ＡＬＫ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、又はＡＰＣ遺伝子等が挙げられる。遺伝病に関連する遺伝子としては、各種先天性代謝異常症等との関連が報告されている遺伝子等が挙げられる。ウィルス遺伝子、細菌遺伝子としては、例えばＣ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス等の遺伝子が挙げられる。多型性を示す遺伝子としては、例えば、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）や血液型に関する遺伝子のように、病気等の原因とは必ずしも直接は関係のない、個体によって異なる塩基配列を持つ遺伝子や、高血圧、糖尿病等の発症に関係するとされている遺伝子等が挙げられる。これらの遺伝子は、その大部分が宿主の染色体上に存在するものであるが、ミトコンドリア遺伝子にコードされている場合もある。
【００３３】
本発明において、Ｔｍ値とは、標準２本鎖核酸のＴｍ値（融解温度）を意味する。Ｔｍ値は、常法により、融解曲線から求めることができる。融解曲線は、例えば、標準２本鎖核酸のみを含有する溶液の温度を、熱変性を生じさせる高温から低温へと変化させる際に、当該溶液の吸光度や蛍光強度を経時的に（リアルタイムに）測定することにより求めることができる。得られた融解曲線において、吸光度や蛍光強度の温度に対する平均変化率、あるいは微分値が最大となる温度がＴｍ値である。
【００３４】
本発明において、Ｔｍ値は、融解曲線から求めた実測値であることが好ましいが、算出値を用いてもよい。例えば、汎用されているプライマー／プローブ設計ソフトウェア等を用いることにより、標準２本鎖核酸の塩基配列情報から、Ｔｍ値を算出することができる。
【００３５】
熱変性工程は、試料２本鎖核酸と標準２本鎖核酸とを、一の反応液内において熱変性処理する工程である。具体的には、適当な組成の反応液に、試料２本鎖核酸と標準２本鎖核酸とをそれぞれ添加した後、当該反応液を加熱することにより熱変性処理を行う。例えば、当該反応液を９０〜１００℃、好ましくは９５〜１００℃に一定時間加熱することにより、当該反応液に含有される試料２本鎖核酸と標準２本鎖核酸とを変性させることができる。なお、試料２本鎖核酸又は標準２本鎖核酸は、それぞれを含有する溶液として、反応液に添加してもよい。
【００３６】
本発明の識別方法において、標準２本鎖核酸とは、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法において、識別対象である試料２本鎖核酸と競合的に鎖組み換えをさせる塩基配列既知の２本鎖核酸であって、標的塩基配列と同一の塩基配列を含む塩基配列を有する２本鎖核酸を意味する。例えば、標準２本鎖核酸は、対象の遺伝子の変異部位を含む部分領域であって、変異部位が特定の遺伝子型である配列と同一の塩基配列を含む２本鎖核酸（標的塩基配列と同一の塩基配列を含む２本鎖核酸）を用いた場合に、この標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換え反応が起こった場合には、当該試料２本鎖核酸が含まれている試料中に含まれている遺伝子は、標準２本鎖核酸と同一の遺伝子型であり、鎖組み換え反応が起こらなかった場合には、標準２本鎖核酸とは異なる遺伝子型であると識別することができる。
【００３７】
標準２本鎖核酸は、例えば、公知の化学合成によって調製することができる。化学合成法としては、トリエステル法、亜リン酸法等が挙げられる。例えば、液相法又は不溶性の担体を使った固相合成法等を利用した通常の自動合成機（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社３９２等）を使用して１本鎖のＤＮＡを大量に調製し、その後アニーリングを行うことにより２本鎖ＤＮＡを調製することができる。
【００３８】
また、試料２本鎖核酸は、その塩基配列が標的塩基配列と同一か否かを識別する対象となる２本鎖核酸である。本発明の識別方法においては、特に、遺伝子の部分領域の塩基配列を有する核酸であることが好ましく、生体から採取された試料中に含まれる核酸であることがより好ましい。このような試料としては、例えば、細菌、ウィルス等の病原体、ヒト等の生体から分離された血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙げられる。更に、出生前診断を行う場合は、羊水中に存在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部を検体とすることもできる。また、これらの試料は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、或いはこれらの組み合わせ等による細胞破壊処理を予め施したものを、反応液に添加することができる。なお、細胞破壊処理の具体的な方法は、ＰＣＲプロトコルス・アカデミック・プレス・インク（ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ｐ１４、ｐ３５２（１９９０））等の文献に記載された公知の方法に従って行うことができる。
【００３９】
生体から採取された試料中に含まれる核酸は、一般的に非常に微量である。このように、もともと微量の核酸を識別対象とする場合には、予め標的塩基配列を含む核酸断片を核酸増幅反応により増幅し、得られた増幅産物を、標準２本鎖核酸とともに反応液に添加することが好ましい。
【００４０】
核酸増幅反応としては、特に限定されるものではなく、ＰＣＲ法、ＬＣＲ（Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等の公知の核酸増幅反応の中から適宜選択して用いることができる（Ｍａｎａｋ，ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｐ２５５〜２９１，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９３））。本発明においては、特にＰＣＲ法が好適である。
【００４１】
例えば、変異部位を含む増幅する領域を挟むようにプライマーを設計し、ポリメラーゼを用いたプライマーの伸長反応を繰り返し行うことにより、試料２本鎖核酸を調製することができる。この伸長反応に用いられるｄＮＴＰ、ポリメラーゼ等の試薬は、核酸増幅を行う場合に通常用いられている試薬の中から、適宜選択して用いることができる。例えば、ポリメラーゼとしては、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ等の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることができるが、特にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、これによりサイクル毎に新たな酵素の添加の必要性がなくなり、自動的にサイクルを繰り返すことが可能になり、更にアニーリング温度を５０〜６０℃に設定することが可能なためプライマーによる標的塩基配列認識の特異性を高めることができ、迅速かつ特異的に遺伝子増幅反応を行うことができる（詳細については特開平１−３１４９６５号公報、特開平１−２５２３００号公報参照）。また、この伸長反応を行う際の反応条件等の具体的な方法については、実験医学第８巻第９号（羊土社、（１９９０））、ＰＣＲテクノロジー・ストックトン・プレス（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ ｐｒｅｓｓ）（１９８９）等の文献に記載された公知の方法に従い行うことができる。例えば、増幅反応の反応液中の核酸は、トータル量で５〜５０ｎｇ程度であることが好ましいが、５ｎｇ以下でも充分増幅可能である。
【００４２】
例えば、遺伝子変異の変異部位を含む遺伝子の部分配列を標的塩基配列とし、試料２本鎖核酸が標準２本鎖核酸と同一の遺伝子型であるのか否かを識別する場合には、変異部位を含む遺伝子中の領域のうち、標準２本鎖核酸と完全に同一の領域を核酸増幅して得られた２本鎖核酸を試料２本鎖核酸とすることが好ましい。この場合には、試料２本鎖核酸と標準２本鎖核酸とは、変異部位のみが異なるため、変異部位が１塩基のみである場合の識別精度をより向上させることができる。
【００４３】
次いで、降温工程として、熱変性工程後の反応液の温度を低下させることにより、前記試料２本鎖核酸と前記標準２本鎖核酸とにおいて競合的鎖組み換え反応を行う。競合的鎖組み換え反応は、相同な塩基配列を持つ２本鎖核酸と１本鎖核酸との間、或いは相同な塩基配列を持つ２本鎖核酸と２本鎖核酸との間で起こる競合的な核酸鎖の置換反応（コンペティティブハイブリダイゼーション）であり、熱変性させた標準２本鎖核酸及び試料２本鎖核酸の混合溶液の温度を、高温（一般的には、変性温度であり、例えば、９０〜１００℃の範囲のいずれかの温度）から降下させてアニーリングすることにより行うことができる。
【００４４】
なお、以降の降温工程における競合的鎖組み換え反応においては、反応液中の塩濃度が最適になるように調製することが好ましい。最適な塩濃度は、一般的には鎖長に依存する。一般に、ハイブリダイゼーションにおいては、ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム）やＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ：３．６Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ）が使われており、本発明の識別方法においても、これらの溶液を好適な濃度に希釈して使用することができる。また、必要に応じてジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒を添加することもできる。特にＤＭＳＯをＰＨＦＡの反応系（反応液）に添加することにより、標準２本鎖核酸のＴｍ値を下げることが可能であり、このため、塩基配列が異なる、すなわち、反応液の組成が同一である場合にはＴｍ値が異なる標準２本鎖核酸同士であっても、降温工程を同じ温度条件により行うことができる。
【００４５】
反応液の塩濃度の調整は、降温工程開始前に行えばよく、予め塩濃度を最適化した反応液に標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸とを添加して熱変性処理を行ってもよく、熱変性処理後に塩濃度を調整してもよい。
【００４６】
反応液の降温速度は、標準２本鎖核酸のＴｍ値における降温速度が、（当該Ｔｍ値＋１０）℃超における降温速度より遅いことを特徴とする。Ｔｍ値付近の温度範囲における降温速度を、十分な識別精度が得られる速さとし、当該温度範囲よりも高い温度においては、降温速度をより速くすることにより、降温工程に要する時間を短縮することができる。降温工程に要する時間は、標準２本鎖核酸の種類や、反応に用いる装置の仕様等により決定されるが、１〜３０分間であることが好ましい。
【００４７】
Ｔｍ値及びＴｍ値付近の温度範囲（Ｔｍ値±１０）℃において、反応液の温度低下がゆっくりであるほど、非相補的な塩基配列を有する１本鎖同士がハイブリダイズする確率が低減され、精度よく競合的鎖組み換え反応を行うことができる。例えば、当該温度範囲おける降温速度は、０．２５℃／分〜１０℃／分であることが好ましい。Ｔｍ値付近の温度範囲における反応液の温度低下を、０．２５℃／分〜１０℃／分で行うことにより、長時間緩やかに降温させてハイブリダイゼーションを行った場合と同等の塩基識別能を有する。
【００４８】
なお、Ｔｍ値付近（相転移付近）でも早い速度(１０℃／分超)で降温させると、試料２本鎖核酸と標準２本鎖核酸との塩基配列が異なる場合であっても、誤って鎖組み換え反応を起こし、擬陽性に繋がる可能性が高くなり、標的塩基配列の識別性が大きく損なわれてしまう。一方で、また、Ｔｍ値付近を非常に緩やかな速度（０．２５℃／分未満）で降温させると、測定時間に長時間を要することになる。
【００４９】
Ｔｍ値付近の温度範囲よりも高い温度範囲における降温速度は、少なくともＴｍ値における降温速度よりも速ければ、特に限定されるものではないが、１０℃／分超であることが好ましく、５０℃／分超であることがより好ましく、使用する装置の最大速度とすることがさらに好ましい。降温速度が速いほど、識別に要する時間をより短縮することができる。
【００５０】
本発明においては、Ｔｍ値付近の温度範囲よりも低い温度範囲における降温速度も、当該温度範囲よりも高い温度範囲と同様に、Ｔｍ値における降温速度よりも速いことが好ましい。Ｔｍ値付近の温度範囲のみを、０．２５℃／分〜１０℃／分で降温し、その他の温度においてはより迅速に反応液の温度を低下させることにより、識別に要する時間を、従来法よりも大幅に短縮することができる。Ｔｍ値付近の温度範囲よりも低い温度範囲における降温速度は、少なくともＴｍ値における降温速度よりも速ければ、特に限定されるものではないが、１０℃／分超であることが好ましく、５０℃／分超であることがより好ましく、使用する装置の最大速度とすることがさらに好ましい。
【００５１】
具体的には、記反応液の降温速度が、（Ｔｍ値＋２）℃超では１０℃／分超であり、（Ｔｍ値＋２）℃〜（Ｔｍ値−１０）℃では０．２５℃／分〜１０℃／分であり、（Ｔｍ値−１０）℃未満では１０℃／分超であることが好ましい。
【００５２】
なお、降温工程における反応終了時点の反応液の温度等の反応条件は、降温速度以外は、標準２本鎖核酸及び試料２本鎖核酸の鎖長や塩基配列に応じて適宜設定することができる。
【００５３】
また、測定工程として、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定し、識別工程として、得られた測定結果に基づき、前記標準２本鎖核酸と前記試料２本鎖核酸との同一性を識別する。標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度は、いずれかの核酸を標識物質により標識し、当該標識を指標として測定することができる。例えば、標準２本鎖核酸を構成する２本の核酸鎖のうち、一方の鎖をある標識物質で標識し、他方の鎖を別の標識物質で標識する。この場合、鎖組み換え反応が起こらなかった場合には、２種類の標識物質は全て同じ分子から検出される。一方、鎖組み換え反応が起こった場合には、２種類の標識物質のうちのいずれか一方のみ検出される分子が存在する。よって、反応液中の２本鎖核酸の各分子がいずれの標識物質で標識されているかを検出することにより、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定することができる。なお、標準２本鎖核酸に代えて試料２本鎖核酸を同様に標識してもよい。さらに、標準２本鎖核酸の一方の核酸鎖をある標識物質で標識し、この標識した核酸鎖と鎖組み換え反応が起こり得る試料２本鎖核酸の一方の核酸鎖を別の標識物質で標識してもよい。
【００５４】
標識物質としては、非放射性、放射性物質のどちらを用いてもよいが、好ましくは非放射性物質が用いられる。非放射性の標識物質としては、直接標識可能なものとして蛍光物質［例えばフルオレッセイン誘導体（フルオレッセインイソチオシアネート等）、ローダミン及びその誘導体（テトラメチルローダミンイソチオシアネート等）］、化学発光物質（例えばアクリジン等）等が挙げられる。 また、標識物質と特異的に結合する物質を利用することにより、間接的に標識物質を検出することができる。このような標識物質としては、ビオチン、リガンド、特定の核酸あるいはタンパク質ハプテン等が挙げられる。そして、標識物質と特異的に結合する物質としては、ビオチンの場合にはこれに特異的に結合するアビジンあるいはストレプトアビジンが、ハプテンの場合はこれに特異的に結合する抗体が、リガンドの場合はレセプターが、特定の核酸あるいはタンパク質の場合はこれと特異的に結合する核酸、核酸結合タンパク質あるいは特定のタンパク質と親和性のあるタンパク質等が利用できる。 上記ハプテンとしては２，４−ジニトロフェニル基を有する化合物やジゴキシゲニンを使うことができ、更にはビオチンあるいは蛍光物質等もハプテンとして使用することができる。これらの標識物質は、いずれも単独又は必要があれば複数種の組み合わせで公知の手段（特開昭５９−９３０９９号公報、特開昭５９−１４８７９８号公報、特開昭５９−２０４２００号公報参照。）により、導入することができる。
【００５５】
また、２種類の標識物質のうち、いずれかの標識物質を固相単体に結合可能な物質とした場合には、汎用されている固液分離作業を行うことにより、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定することができる。例えば、標準２本鎖核酸の一方の鎖を標識物質Ａで標識し、他方の鎖を固相単体に結合可能な標識物質Ｂで標識し、鎖組み換え反応後の反応液を標識物質Ｂが結合可能な固相単体に接触させる。その後、当該固相担体に結合している２本鎖核酸中の標識物質Ａを測定する。鎖組み換え反応が起こった場合には、固相担体に結合している２本鎖核酸中の標識物質Ａにより標識されている２本鎖核酸の割合が減少する。
【００５６】
なお、測定工程における標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度の測定は、降温工程の終了時、すなわち鎖組み換え反応後（エンドポイント）において行ってもよく、降温工程の開始時及び終了時に行い、両者の測定値を比較することにより、試料２本鎖核酸が標準２本鎖核酸と同一であるか否かを識別してもよい。また、測定工程における測定は、降温工程において経時的に（リアルタイムに）行ってもよい。
【００５７】
特に、本発明においては、互いにエネルギー移動可能な２種類の標識物質（例えば、励起により蛍光を発生するドナー標識物質と、その蛍光を吸収するアクセプター標識物質）を用いて、これらの標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを指標として、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定することが好ましい。
【００５８】
標識物質間のエネルギー移動とは、エネルギーを発生するドナー標識物質とこのドナー標識物質から発生したエネルギーを吸収するアクセプター標識物質との少なくとも２種の標識物質が、互いに近接した状態にある場合に、ドナー標識物質からアクセプター標識物質へのエネルギーの移動をいう。例えば、２種の標識物質が蛍光物質である場合、ドナー標識物質を励起して生じる蛍光をアクセプター標識物質が吸収し、このアクセプター標識物質が発する蛍光を測定するか、又はドナー標識物質を励起して生じる蛍光をアクセプター標識物質が吸収することにより起こるドナー標識物質の消光を測定することができる（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４，３５７−３６２（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，４９−５３（１９９８））。なお、ドナー標識物質の蛍光波長とアクセプター標識物質の吸収波長に重なりがなくてもエネルギー移動が起こる場合があるが、このようなエネルギー移動も本発明に含まれるものである。また、アクセプター標識物質はクエンチャーであってもよい。このようなくクエンチャーとして、例えばｄｕｂｃｙｌやブラックホール等が挙げられる。
【００５９】
具体的には、標準２本鎖核酸として、構成する２本の核酸鎖のうち、一方の鎖の３’端部を第１標識物質により標識し、他方の鎖の５’端部を第１標識物質と互いにエネルギー移動可能な第２標識物質により標識したものを用いる。第１標識物質と第２標識物質のいずれがドナー標識物質であってもよい。この標準２本鎖核酸は、第１標識物質と第２標識物質が近接した状態にあるため、エネルギー移動が生じる。一方、試料２本鎖核酸との間で競合的鎖組み換え反応が起こると、鎖の組み換えが起こった２本鎖核酸では、第１標識物質と第２標識物質とが離れているため、エネルギー移動が生じず、反応液中のエネルギー移動が生じた２本鎖核酸の割合が減少する。そこで、第１標識物質又は第２標識物質から発されるエネルギー（蛍光物質である場合には蛍光強度）を測定することにより、エネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを測定し、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定することができる。
【００６０】
遺伝子型が異なる（変異部の塩基配列が相違する）核酸鎖同士に比べて、遺伝子型が同一の（完全に相補的な塩基配列を持つ）核酸鎖同士のほうがより優先的に２本鎖を形成する。このため、これに伴って標識物質間でのエネルギー移動によるエネルギー変化の度合、すなわち、鎖置き換え反応によって生じたり消失したりするエネルギー移動の変化の度合を任意の検出器を用いて測定することにより、試料中に含まれていた遺伝子の変異部位の遺伝子型が、標準２本鎖核酸と同一であるかどうかや、試料中に含まれていた標準２本鎖核酸と同一の遺伝子型の割合を検出することができる。例えば、検出に蛍光エネルギー移動を利用する場合には、分光蛍光光度計、蛍光プレートリーダーなどで特定波長の蛍光スペクトルを測定することにより、標準２本鎖核酸と同一の遺伝子型を持つ遺伝子の有無や割合を容易に検出することができる。
【００６１】
標準２本鎖核酸は標識せず、試料２本鎖核酸を構成する２本の核酸鎖のうち、一方の鎖の３’端部を第１標識物質により標識し、他方の鎖の５’端部を第２標識物質により標識したものを用いてもよい。この場合には、標準２本鎖核酸を標識した場合と同様に、鎖の組み換えが起こった２本鎖核酸ではエネルギー移動が生じず、反応液中のエネルギー移動が生じた２本鎖核酸の割合が減少する。
また、標準２本鎖核酸の一方の核酸鎖の３’端部（又は５’端部）を第１標識物質により標識し、この標識した核酸鎖と鎖組み換え反応が起こり得る試料２本鎖核酸の一方の核酸鎖（第１標識物質により標識した核酸鎖の相補鎖）の５’端部 （又は３’端部）を第２標識物質により標識したものを用いてもよい。この場合には、鎖の組み換えが起こった２本鎖核酸ではエネルギー移動が生じ、反応液中のエネルギー移動が生じた２本鎖核酸の割合が増大する。
【００６２】
このように、標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを測定することによって、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定することにより、固液分離作業等の煩雑な作業を要することなく、迅速かつ簡便に標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との同一性を識別することができる。しかも、両標識物質を、互いに近接する３’端部と５’端部とに導入することにより、鎖の置き換えが生じた程度を正確かつ確実に捕えることができる上、標準２本鎖核酸又は試料２本鎖核酸が鎖の長い遺伝子断片であっても、常に良好な感度をもって正確かつ確実に相補鎖の置換の程度を測定し得、遺伝子型の同一性を正確かつ安定的に識別することができる。特に、従来の煩雑な固液の分離作業を必要としない簡易な方法であることから、自動化も可能となり、最前線の医療現場での要望に応えることができる。
【００６３】
第１標識物質又は第２標識物質として用いることができる標識物質としては、互いに近接した状態でエネルギー移動可能なものであれば特に制限されないが、中でも蛍光物質、遅延蛍光物質が好ましく、場合によっては化学発光物質、生物発光物質等を用いることもできる。このような標識物質の組み合せとしては、フルオレセイン及びその誘導体（例えばフルオレセインイソチオシアネート等）とローダミン及びその誘導体（例えばテトラメチルローダミンイソチオシアネート、テトラメチルローダミン−５−（ａｎｄ−６−）ヘキサノイックアシッド等）との組み合わせ、フルオレセインとダブシルとの組み合わせ等が挙げられ、これらの中から任意の組み合わせを選択することができる（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。その他、近接させた場合に熱エネルギーの放出が生じる組み合わせの分子であってもよい。このような標識物質の組み合わせとしては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（インビトロジェン社製）、ＡＴＴＯ  ４８８（ＡＴＴＯ-ＴＥＣ  ＧｍｂＨ社製）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（インビトロジェン社製）、及びＲＯＸ（Ｃａｒｂｏｘｙ-Ｘ-ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）からなる群より選択される１とＢＨＱ（登録商標、Ｂｌａｃｋ  ｈｏｌｅ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ）−１又はＢＨＱ（登録商標）−２との組み合わせ等が挙げられる。
なお、グアニンは、ＦＡＭが近接した場合にクエンチする能力があるため(Nucleic acids Research 2002,vol.30.no.9 2089-2195)、これを利用してもよい。例えば、標準２本鎖核酸の一方の鎖の３’端部をＦＡＭで標識した場合であって、他方の鎖の５’末端の塩基がグアニンである場合には、当該他方の鎖を標識物質で標識せずともよい。
【００６４】
標準２本鎖核酸又は試料２本鎖核酸に、第１標識物質又は第２標識物質を導入する方法としては、一般的な核酸への標識導入方法を採用することができる。例えば、標識物質を核酸に直接化学的に導入する方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４，４８４−４８９（１９９８））、ＤＮＡポリメラーゼ反応あるいはＲＮＡポリメラーゼ反応により標識物質結合モノヌクレオチドを導入する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，３３６−３３４１（１９８７））、標識物質を導入したプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより導入する方法（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２，３４−４０（１９９２））等が挙げられる。
【００６５】
標準２本鎖核酸又は試料２本鎖核酸に標識物質を導入する位置は、鎖置き換え反応によりエネルギー移動が生じたり、消失する位置、すなわち、核酸鎖の３’端部及び／又は５’端部である必要がある。具体的には、本発明において、５’端部及び３’端部とは、核酸鎖の５’末端及び３’末端からそれぞれ３０塩基以内の範囲を示すが、両方の標識物質が近ければ近いほどエネルギー移動を起こし易いため、好ましくはそれぞれの末端から１０塩基以内であり、最も好ましくは５’末端及び３’末端である。ここで、標識物質を相補鎖とハイブリダイズする塩基部分に多数導入すると１塩基程度の置換が検出できなくなる可能性があるため、それぞれの核酸鎖の端部分のみに導入することが好ましい。例えば、２種の標識物質の一方を一方の核酸鎖の５’端部（３’端部）に導入すると共に、これと相補的な他方の核酸鎖の３’端部（５’端部）に他方の標識物質を導入することにより、ハイブリダイゼーション反応に影響を与えることなく、両核酸鎖は鎖置き換え反応により、エネルギー移動を生じたり、消失したりする。
【００６６】
具体的には、５’端部に標識を有する核酸鎖を調製するには、５’端部に標識物質が導入されたリンカーと任意の核酸鎖をリガーゼにより結合させる方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，９２２−９２３（１９９７））、あるいは５’端部に標識物質が導入されたプライマーを用いてＰＣＲ反応を行う方法（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２，３４−４０（１９９２））等が挙げられる。 
【００６７】
一方、３’端部に標識を有する核酸鎖を調製するには、上記５’端部に標識物質を導入する場合と同様に、３’端部に標識物質が導入されたリンカーと任意の核酸鎖をリガーゼにより結合させる方法がある。なお、核酸鎖がＤＮＡではなくＲＮＡであったり、ＤＮＡの３’端部がＲＮＡである場合には、その末端のＲＮＡの糖（リボース）部を選択的に開環させて、生じたアルデヒド基を利用して標識することもできる。 
【００６８】
さらに、標識物質を導入したモノヌクレオチド三リン酸を、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの働きにより核酸鎖の３’端部に導入することもできる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５，４８６−４９６（１９９３））。 
【００６９】
なお、標準２本鎖核酸が１００塩基以下の比較的短い核酸鎖である場合には、直接化学合成により標識核酸を調製することもできる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，２６５９−２６６９（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３，８５−８７（１９９２））。
【００７０】
標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いの測定は、一般的に、標識物質から発される蛍光を測定することにより行われるが、この蛍光測定は、多数の検体を同時に測定でき、しかも多彩な温度制御ができるいわゆるリアルタイムＰＣＲ装置等を使う場合が多い。しかしながら、このような装置では、検出ごとの蛍光測定精度は必ずしも高くなく、バラツキの大きい結果となる場合が多い。また、添加する標準２本鎖核酸の添加量のバラツキも、測定精度に大きな影響を与える要因となり得る。反応を微量で行うための装置では、このような測定のバラツキ、標準物質の添加量のバラツキはさらに大きくなることが危惧される。従って、定量的な測定を行う場合には、それら測定間でのバラツキを補正することが好ましい。
【００７１】
一般的に測定間のバラツキを補正する方法として、各測定間で同じ結果となることが明らかな標準物質を用いる方法がある。例えば、各反応液に、第１標識物質及び第２標識物質のいずれとも異なる蛍光物質を共通に添加しておき、当該蛍光物質の値に基づき、目的の蛍光測定値を補正することが可能である。しかしながら、このような補正方法は、間接的である上に、標準２本鎖核酸の添加量のバラツキを補正することはできない。
【００７２】
また、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した検出法においては、一般的に、ドナーとなる蛍光物質とアクセプターとなる蛍光物質の両方蛍光値の比を求めることにより、測定間のバラツキを補正する方法が行われている。すなわち、ドナーを励起して生じる蛍光と、ドナーからのエネルギー移動で励起されて発光したアクセプターの蛍光との両方を測定し、その比を求める方法である。そこで、本発明者は、本発明の識別方法において、標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを測定する際に、ドナー標識物質の蛍光値とアクセプター標識物質の蛍光値との比を求めることによりバラツキが低減できるかどうかを検討したが、満足できる結果には到らなかった。これは、鎖組み換え反応後のドナー標識物質の蛍光値は非常に小さく、このような状態での蛍光測定はバラツキが非常に大きくなり易く、このため、ドナー標識物質の蛍光値とアクセプター標識物質の蛍光値との比も非常に大きなバラツキを生じることになるためと考えられる。なお、ドナー標識物質の蛍光値が小さいのは、鎖組み換え反応が起こらずに、変性後の標準２本鎖核酸が元の２本鎖核酸に戻ったときには、エネルギー移動が生じるため、ドナー標識物質の蛍光はほとんどアクセプター標識物質にエネルギー移動される結果、非常に弱い発光となるためである。
【００７３】
さらに、本発明の識別方法では、標識物質の種類、標的塩基配列の種類、標準２本鎖核酸や試料２本鎖核酸の塩基配列の種類等により、標識物質の蛍光値の変化、特にドナー標識物質の蛍光値の変化の挙動が影響を受けるという問題があることを、本発明者は見出した。図１は、遺伝子型が異なる場合のドナー標識物質の蛍光挙動の一例を模式的に示した図であり、図２は、同じく遺伝子型が異なる場合のアクセプター標識物質の蛍光挙動の一例を模式的に示した図である。まず、３種類の遺伝子型がある遺伝子変異に対して、一の遺伝子型であるＰＣＲ産物を試料２本鎖核酸とし、このＰＣＲ産物と同一の遺伝子型の標準２本鎖核酸（マッチ）と、このＰＣＲ産物と異なる遺伝子型の標準２本鎖核酸（ミスマッチＡ）と、両者いずれとも異なる遺伝子型の標準２本鎖核酸（ミスマッチＢ）とを用意し、各標準２本鎖核酸は、構成する２本の核酸鎖のうち、一方の鎖の３’端部をドナー標識物質により標識し、他方の鎖の５’端部をアクセプター標識物質により標識した。試料２本鎖核酸と各標準２本鎖核酸をそれぞれ混合し、変性させた後、９５℃から３５℃まで反応液の温度を降下させ、各温度における蛍光強度を測定したところ、標準２本鎖核酸（ミスマッチＡ）と標準２本鎖核酸（ミスマッチＢ）とでは、ドナー標識物質の蛍光値が大きく異なり、特にエンドポイント（３５℃）では、標準２本鎖核酸（ミスマッチＢ）の蛍光強度は、標準２本鎖核酸（ミスマッチＡ）の蛍光強度よりも大幅に大きく、標準２本鎖核酸（マッチ）の蛍光強度に近くなっている。このように、遺伝子型の塩基の種類、すなわち標的塩基配列の種類によって、蛍光強度が影響を受ける場合があり、本発明の識別方法では、ドナー標識物質の蛍光値とアクセプター標識物質の蛍光値との比を求めることによっては、データのバラツキを補正することにはつながらない。
【００７４】
そこで、本発明者は、さらに検討を重ねた結果、鎖組み換え反応後（エンドポイント）における蛍光強度のみではなく、反応液の温度低下による蛍光強度の変化量、つまり、変性により１本鎖の状態における蛍光強度と、アニーリング後の２本鎖核酸の状態における蛍光強度との変化量ΔＦ（フルオラセンス）に基づいて補正することにより、測定間のバラツキをよく補正できることを見出した。ΔＦは、ドナー標識物質の変化量であってもよく、アクセプター標識物質の変化量であってもよい。ドナー標識物質のΔＦは、具体的には、下記式（１）により求めることができる。同じくアクセプター標識物質のΔＦは、下記式（２）により求めることができる。下記式（１）及び（２）中、「Ｆ［start-point］」は、反応液の温度降下開始時点の温度における蛍光強度、「Ｆ［end-point］」は、反応液の温度降下終了時点の温度における蛍光強度を意味する。
【００７５】
【数１】
0005568935.tif 000002
【００７６】
また、ΔＦは、ドナー標識物質とアクセプター標識物質のいずれであっても、下記式（３）により求めることもできる。下記式（３）中、「Ｆ［max］」は、反応液の温度降下開始から終了までの温度依存的な蛍光挙動内で最も高い蛍光強度を意味し、「Ｆ［min］」は、同じく温度依存的な蛍光挙動内で最も低い蛍光強度を意味する。
【００７７】
【数２】
0005568935.tif 000003
【００７８】
図３は、図１と同様にしてＰＣＲ産物（試料２本鎖核酸）、標準２本鎖核酸（マッチ）、標準２本鎖核酸（ミスマッチＡ）、及び標準２本鎖核酸（ミスマッチＢ）を調製し、競合的鎖組み換え反応を行った場合の、上記式（１）に基づき求めたドナー標識物質のΔＦを示した図である。図３において、標準２本鎖核酸（マッチ）のΔＦがマイナス値となっているのは、Ｔｒｉｓ緩衝液の温度依存的なｐＨ変化による蛍光物質の変化、あるいは蛍光物質の温度依存性によるものである。特に、ドナー標識物質としてフルオラセインを用いた場合には、このようにΔＦがマイナス値となるような挙動を示す。つまり、試料２本鎖核酸とは遺伝子型が異なる場合（ミスマッチの場合）のΔＦ値は大きくなり、試料２本鎖核酸と遺伝子型が同一の場合（マッチの場合）のΔＦ値はマイナスから０に近い値となる。逆に、アクセプター標識物質のΔＦ値を指標とした場合、試料２本鎖核酸と遺伝子型が同一の場合のΔＦ値は大きくなり、試料２本鎖核酸とは遺伝子型が異なる場合のΔＦ値はマイナスから０に近い値となる。そして、これらのΔＦ値を算出することにより、遺伝子型等の標的塩基配列の種類を識別することができる。
【００７９】
鎖組み換え反応が起こらずに、変性後の標準２本鎖核酸が元の２本鎖核酸に戻ったときには、鎖組み換え反応後のドナー標識物質の蛍光は弱く、また、１本鎖の状態におけるアクセプター標識物質の蛍光も弱いものの、ΔＦのバラツキは、ドナー標識物質の蛍光値とアクセプター標識物質の蛍光値との比をとった場合ほど大きくなく、測定間のバラツキをよく補正できることがわかった。
【００８０】
測定機器の種類により蛍光強度の測定値は変動する傾向があるが、ΔＦによる補正では、測定機器間のバラツキを補正することは困難である。そこで、本発明者は、試料２本鎖核酸と標準２本鎖核酸うち、標識物質で標識されていない２本鎖核酸を含有しない対照反応液を調製し、この対照反応液の温度低下による蛍光強度の変化量ΔＦを用いることにより、測定装機器のバラツキをより低減できることを見出した。これは、対照反応液のΔＦを測定ごと、あるいは測定装機器ごとに参照することにより、蛍光測定時の外部標準としての役割を果たしているためである。
【００８１】
つまり、標準２本鎖核酸を標識物質で標識した場合に、試料２本鎖核酸を含まず標準２本鎖核酸を含むものを対照反応液とし、反応液のΔＦと対照反応液のΔＦとの比を測定することにより、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定する。この比は、具体的には下記式（４）により求めることができる。なお、式（４）中、「ΔＦ［反応液］」は、反応液の蛍光変化量ΔＦ、「ΔＦ［対照反応液］」は、対照反応液の蛍光変化量ΔＦを意味する。
【００８２】
【数３】
0005568935.tif 000004
【００８３】
標識した２本鎖核酸のみの蛍光共鳴エネルギー移動の程度、つまりΔＦ［対照反応液］を１００％とし、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸の組み換えがどの程度起こっているかを求めることができる。標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸とを混合し、鎖組み換え反応を行った場合に、ＩＮＤＥＸ値が１００％に近い場合には、鎖組み換えが起こらなかったことを示し、試料２本鎖核酸の塩基配列は標準２本鎖核酸とは異なると識別される。一方、ＩＮＤＥＸ値が０％に近い場合には、鎖組み換えが起こったことを示し、試料２本鎖核酸の塩基配列は標準２本鎖核酸と同一であると識別される。
【００８４】
また、前述したように、鎖組み換え反応では、反応液の温度をゆっくりと低下させていくことが重要であるが、降温速度を低下させることにより、鎖組み換え反応に非常に長時間を要するという問題もある。そこで、標識物質間のエネルギー移動によるエネルギー変化の度合いを測定することによって、標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸との間で鎖組み換えが生じた程度を測定する場合には、予め、標識した２本鎖核酸の融解曲線を描き、第１標識物質又は前記第２標識物質の蛍光強度の温度に対する平均変化率（ｄＦ／ｄＴ；温度に対する蛍光強度の変化量）を求め、この平均変化率が大きい温度範囲において反応液の降温速度を十分に小さくし、その他の温度範囲についてはより大きな降温速度で行うことにより、鎖組み換え反応における識別精度を損なうことなく、短時間で鎖組み換え反応を行うことができる。
【００８５】
具体的には、蛍光強度の温度に対する平均変化率が最大となる温度の±３〜５℃の温度範囲にのみを、十分に小さな降温速度、例えば０．１℃／分〜０．３℃／分、より好ましくは０．１℃／分という非常に緩やかな降温速度とし、他の温度範囲ではより早い降温速度とする。事前に標識した２本鎖核酸の相転移付近の温度を把握することにより、効率的な測定を行うことができ、測定時間の短縮化に繋がる。
【００８６】
本発明の識別方法は、遺伝子型等の１又は数塩基のみが相違する塩基配列同士の識別精度が非常に優れており、ＳＮＰ等の生殖細胞系列変異のみならず、がん細胞等で観察されるような体細胞変異をも十分な精度で識別することが可能である。
【００８７】
本発明の識別方法は、その高い識別精度及び迅速性から、臨床検査等においても有用である。医療現場における遺伝子検査の実用性を考えた場合に、測定時間の短縮は非常に重要である。本発明の識別方法並びに標的塩基配列の識別方法の時短化方法により、ＳＮＰ等の生殖細胞変異のみならず、体細胞変異も高精度にかつ超短時間で識別することができる。
【００８８】
例えば、Ｋ−ｒａｓはシグナル伝達系のタンパク質であり、プロトオンコ―ジーンである。多くのがん細胞においてＫ−ｒａｓ遺伝子に変異が生じていることが報告されている。特にＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２、１３にアミノ酸置換を伴う変異が顕著に見られ、１３種類の変異パターンが存在することが知られている。最近、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に変異がある患者では、抗がん剤であるＥＧＦＲ抗体薬(セツキシマブ、パニツムマブ)等が効力を発揮できないことが次々に明らかとなっている。このような抗がん剤治療は副作用のみならず高額な費用を要する。したがって、治療前にＫ−ｒａｓ変異の検査を行い、効く患者のみを選別して治療することがオーダーメード医療の一環として提案されている。
【００８９】
また、ＥＧＦＲ抗体薬であるセツキシマブは、大腸がん治療薬として使用されている。大腸がんの年間罹患数は１０万人弱であり、平成１７年の死亡者数は４万８００人であった。食生活の欧米化により増え続ける傾向にあり、４年後には４０，０００人の大腸がん患者がＥＧＦＲ抗体薬治療の対象となるとのＥＧＦＲ抗体薬のメーカーによる試算もある。当該試算が正しければ、Ｋ−ｒａｓの検査市場は日本国内だけで４年後には４億円を越すものと予想される。
【００９０】
しかしながら、従来の識別法では、体細胞変異を十分な精度で迅速に識別することは困難であり、擬陽性が多い、と言う問題があった。本発明の識別方法は、体細胞変異をも非常に精度よく迅速に識別可能であることから、臨床検査における精度改善のみならず、医療費の削減にも資することが期待できる。
【実施例】
【００９１】
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００９２】
［実施例１］
がん遺伝子であるＫ−ｒａｓのコドン１２の遺伝子変異を識別対象の変異部位とし、特定の遺伝子型のＫ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２を含む部分領域の塩基配列を標的塩基配列として、試料２本鎖核酸の遺伝子型が、標準２本鎖核酸の遺伝子型と同一か否かを、本発明の識別方法を用いて識別した。なお、使用する標準２本鎖核酸及び試料２本鎖核酸は、常法の化学合成法により調製した。
まず、コドン１２の遺伝子変異の遺伝子型に対して、表１記載の遺伝子型の標準２本鎖核酸をそれぞれ作製した。各標準２本鎖核酸は、一方の核酸鎖の両末端をＦＡＭ標識（グレンリサーチ社製）し、他方の核酸鎖の両末端をＤＡＢＣＹＬ標識（グレンリサーチ社製）した。各遺伝子型の標準２本鎖核酸は、プライマーを設計してＰＣＲにより調製することもできるが、本実施例においては、構成する２本の核酸鎖を１本ずつ化学合成したものをハイブリダイズさせることにより調製した。表１に、化学合成した核酸鎖の配列を、遺伝子型ごとに示す。
【００９３】
表１中、コドン１２は下線で示し、変異部位は小文字で表した。また、「Ｗｉｌｄ」はＫ−ｒａｓ遺伝子の野生型を、「Ｇ１２Ｓ」はコドン１２の点突然変異により、グリシンがセリンに改変されている変異型を、「６−ＦＡＭ」はＦＡＭ標識を、「ＤＡＢ」はＤＡＢＣＹＬ標識を、右欄の数字は配列表中の対応する配列番号を、それぞれ示す。
【００９４】
【表１】
0005568935.tif 000005
【００９５】
さらに、試料２本鎖核酸の調製をＰＣＲにて行った。ＰＣＲ反応液の組成は、２５０ｎＭ ＫＦプライマー、２５０ｎＭ ＫＲプライマー、２５０μＭ ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲバッファー、２．５ユニット Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ）、とし、全体の反応液を４７．５μＬとした。このＰＣＲ反応液に１０ｎｇ／μｌの鋳型ＤＮＡを２．５μｌ添加し、全体の反応容量を５０μｌとした。ＰＣＲの反応条件は９５℃３分間の処理後、９５℃（２０秒間）→５７℃（３０秒間）→７２℃（３０秒）の変性、アニーリング、伸長反応を、４０サイクル行った。使用したＫＦプライマー及びＫＲプライマーの塩基配列を表２に示す。表中の右欄の数字は配列表中の対応する配列番号を示す。なお、鋳型ＤＮＡはがん細胞由来ＤＮＡ(ＤＬＤ−１とＡ５４９)を用いた。ＤＬＤ−１のｋ−ｒａｓの遺伝子型は野生型(ホモ)であり、Ａ５４９のｋ−ｒａｓの遺伝子型はＧ１２Ｓの変異型(ホモ)である。これらの配列についてはダイレクトシークエンスにより配列を確認している。
【００９６】
【表２】
0005568935.tif 000006
【００９７】
得られたＰＣＲ反応液（１４．４μＬ）、５００ｎＭ ｗｉｌｄ−ＦＡＭ（野生型の標準２本鎖核酸のうちのＦＡＭ標識された１本鎖核酸）（１μＬ）、５００ｎＭ ｗｉｌｄ−ＤＡＢ（野生型の標準２本鎖核酸のうちのＤＡＢＣＹＬ標識された１本鎖核酸）（１μＬ）、２Ｍ ＮａＣｌ（１μＬ）、ＲＯＸ(０．６μｌ)を混合し、蛍光ＰＨＦＡ反応液とした。この調製した蛍光ＰＨＦＡ反応液を、蛍光強度（蛍光共鳴エネルギー移動）の測定装置（ＡＢＩ−７９００）にセットし、９５℃で５分間保持して変性させた後、９０℃から７５℃の温度範囲を０．２５℃／分の降温速度で温度を下げ、それ以外の温度については本装置の最高の降温速度(９６℃／分)で実施し、３５℃まで温度を下げた。なお、ＲＯＸは内部標準物質として添加し、ｗｅｌｌ間差のＦＡＭの蛍光強度を補正した値(ＦＡＭ／ＲＯＸ)を求めた。
【００９８】
各温度における反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定した結果を図４に示す。図４中、「温度変化」は蛍光強度測定時の反応液の温度を示す。また、同じく図中、「野生型サンプル（マッチ）」は野生型の標準２本鎖核酸と野生型の試料２本鎖核酸とを用いた場合の、「Ｇ１２Ｓサンプル（ミスマッチ）」は野生型の標準２本鎖核酸とＧ１２Ｓ遺伝子型の試料２本鎖核酸とを用いた場合の、反応液の蛍光強度をそれぞれ示す。この結果、野生型の標準２本鎖核酸とＧ１２Ｓ遺伝子型の試料２本鎖核酸とを用いた場合（「Ｇ１２Ｓサンプル（ミスマッチ）」）の蛍光値は９５℃から８６℃までは蛍光値が変化せず、８５℃から温度変化に応じて蛍光値が変化していることが分かった。また、９０℃から７５℃の範囲において降温速度を０．２５℃／分とするために、各温度において３分間保持させ、約１分間かけて１℃ずつ降温させているが、蛍光値は、同一の温度で保持している時間もほとんど変化しておらず、１℃温度を降温させる際に劇的に変化していることが分かった。つまり、１℃降温させている降温速度で蛍光値が変化しており、保持している時間は実質的に蛍光値が変化していない測定上無駄な温調時間であることが分かった。特に９０℃から８５℃の温度範囲はほとんど蛍光強度が変化していないにも関わらず、全体の測定時間の２分の１を占めており、これらの時間を無駄にしていることになる。さらに、温度変化に対する蛍光値の変化は、８５℃、８４℃、８３℃で大きく変化していた。ここで、反応に用いた標準２本鎖核酸のＴｍ値は８４℃である。また、７５℃付近の蛍光強度と３５℃付近の蛍光強度はほとんど変化しておらず、鎖組み換えに伴うハイブリダイゼーションは、７５℃付近において概ね安定したと考えられた。よって、標準２本鎖核酸のＴｍ値から−５℃〜１０℃までの蛍光強度を追跡することで、競合的鎖組換え反応は評価でき、それ以下の温度について蛍光挙動を追跡する必要はなく、ここでも無駄な時間を削除することができることがわかった。つまり、反応液の蛍光強度は、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近において大きく変化しているものの、その他の温度範囲においては、単に降温速度依存的に変化していることが分かった。
【００９９】
これらの結果から、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近の温度範囲において、ほとんどの割合の標準２本鎖核酸は試料２本鎖核酸が同一の塩基配列であるか否かを識別しており、よってＰＨＦＡにおいて標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸とが正確なハイブリッドを形成するためには、Ｔｍ値付近、特に（Ｔｍ値＋２）℃〜（Ｔｍ値＋５）℃から（Ｔｍ値−５）℃〜（Ｔｍ値−１０）℃までの温度範囲における降温速度をある程度緩やかに制御することが重要であり、それ以外の温度域は降温速度を緩やかにしても識別精度の点からは意味がないと考えられた。このように、熱変性の温度から低温まで一律にゆっくりと反応液の温度を低下させていく従来のＰＣＲ−ＰＨＦＡ法においては、識別精度に影響しない無駄な温調時間が存在することは、蛍光で修飾した標準２本鎖核酸を用い、注意深く蛍光強度変化をリアルタイムで観察した結果初めて見出された知見であり、エンドポイントにおいてのみ鎖組み換えが生じた程度を測定する従来のＰＣＲ−ＰＨＦＡ法では各温度における鎖組換え効率が把握できないため、全く気付かなかった点である。
【０１００】
すなわち、本実施例の結果から、特許文献１や非特許文献８で報告されているような非常に緩やかな降温速度は必ずしも必要ではないこと、及び、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近の温度変化は識別性に重要な温度域であるということが分かった。
【０１０１】
［実施例２］
実施例１において用いた標準２本鎖核酸と試料２本鎖核酸とを用いて、実施例１と同様の反応液組成にて競合的鎖組換え反応を行った。さらに、試料２本鎖核酸を混合せず、標準２本鎖核酸のみを添加した反応液を、他と同様にして蛍光強度をリアルタイムに測定した。なお、標準２本鎖核酸のみの反応では、試料２本鎖核酸の代わりに１×ＰＣＲバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），５０ｍＭ ＫＣｌ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ ）を１４．４μｌ、５００ｎＭ ｗｉｌｄ−ＦＡＭ（１μＬ）、５００ｎＭ ｗｉｌｄ−ＤＡＢ（１μＬ）、２Ｍ ＮａＣｌ（１μＬ）、ＲＯＸ(０．６μｌ)を混合し、蛍光ＰＨＦＡ反応液(標準２本鎖核酸のみ)とした。
【０１０２】
蛍光強度測定は実施例１で用いた測定装置ＡＢＩ７９００を用い、下記の３つの温度条件にて連続的に蛍光測定を行った。なお、測定条件１及び２は、実施例１の結果より蛍光強度が変化していない温度範囲については本装置最大の速度で降下させ、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近(８５℃〜７５℃)のみを緩やかな温調として、測定時間を短縮した条件である。さらに測定条件２では、Ｔｍ値付近(８５℃〜７５℃)を、従来よりも降下速度が速い０．９６℃／分で実施した。
条件１：９５℃で５分間変性し、８５℃から７５℃の間を０．２５℃／分の降温速度で温度を下げ、それ以外の温度範囲については本装置の最高の降温速度(９６℃／分)で実施し、３５℃まで温度を下げた。測定時間は約６０分間であった。
条件２：条件１終了後、９５℃で３０秒間変性し、８５℃から７５℃の温度域を０．９６℃／分の降温速度とし、それ以外の温度域については本装置の最大の降温速度(９６℃／分)で実施し、３５℃まで温度を下げた。測定時間は約１３分間であった。
条件３：条件２終了後、９５℃で３０秒間変性し、３５℃まで本装置の最大の降温速度(９６℃／分)で実施し、３５℃まで温度を下げた。測定時間は約数十秒間であった。
【０１０３】
各温度における反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定した結果を図５に示す。図５（Ａ）は各反応液の蛍光強度の変化を、図５（Ｂ）は各反応液の温度プロフィールを、それぞれ示す図である。図５中、「野生型サンプル（マッチ）」及び「Ｇ１２Ｓサンプル（ミスマッチ）」は図４と同様である。また、同じく図中、「野生型標準２本鎖核酸のみ」は、蛍光ＰＨＦＡ反応液(標準２本鎖核酸のみ)の結果を示す。図５（Ａ）に示すように、測定条件１及び２では、野生型の標準２本鎖核酸とＧ１２Ｓ遺伝子型の試料２本鎖核酸とを用いた場合（「Ｇ１２Ｓサンプル（ミスマッチ）」）の蛍光強度は、野生型標準２本鎖核酸のみが存在する場合（「野生型標準２本鎖核酸のみ」）の蛍光強度とほぼ同様の挙動を示した。これらの結果から、測定条件１及び２は、いずれも野生型とＧ１２Ｓ変異型とを高精度に識別し得ることが明らかである。特に測定条件２では、識別精度を損なうことなく、測定時間（識別に要する時間）が約１３分と、数時間を要していた従来法に比べ、大幅に短縮することができた。一方で、測定条件３では、野生型の標準２本鎖核酸とＧ１２Ｓ遺伝子型の試料２本鎖核酸とを用いた場合（「Ｇ１２Ｓサンプル（ミスマッチ）」）の蛍光強度は、野生型標準２本鎖核酸のみが存在する場合（「野生型標準２本鎖核酸のみ」）の蛍光強度よりもむしろ野生型の標準２本鎖核酸と野生型の試料２本鎖核酸とを用いた場合（「野生型サンプル（マッチ）」）の蛍光強度の挙動に近く、降下速度が速すぎるために、誤ってＧ１２Ｓ型の試料２本鎖核酸が野生型の標準２本鎖核酸と鎖組み換え反応を行っていると推察できる。つまり、Ｔｍ値付近の温度範囲における降下速度が速すぎることにより、ミスマッチの識別性が劇的に低下することが確認された。すなわち、本実施例の結果から、識別性を保持できるＴｍ値付近の温度範囲における降温速度にも幅があることが推察された。
【０１０４】
さらに本結果をより正確に捉えるため、それぞれの反応における温度低下による蛍光強度の変化量ΔＦを求めた。具体的には、前記式（１）に基づき、９５℃における蛍光値から３５℃における蛍光値を差し引いた値をΔＦとした。前記式(４)からＩｎｄｅｘ（％）を求めた値を表３に示す。この結果からも、温度条件２における標準２本鎖核酸の識別性は、温度条件１と同等に保持されていることが分かる。なお、本実施例において示された本発明の識別方法及び標的塩基配列の識別方法の時短化方法の効果は、蛍光標識されていない、あるいはリアルタイムで測定を行わない場合においても有効である。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
［実施例３］
実施例１において用いた標準２本鎖核酸（Ｇ１２Ｓ型）と試料２本鎖核酸（野生型又はＧ１２Ｓ型）とを用いて、実施例１と同様の反応液組成にて競合的鎖組換え反応を行った。また、試料２本鎖核酸を混合せず、標準２本鎖核酸のみを添加した反応液については、実施例２と同様にして行った。
蛍光強度測定は実施例１で用いた測定装置ＡＢＩ７９００を用い、Ｔｍ値付近の温度範囲（８５〜７５℃）における降温速度がそれぞれ異なる１０の条件（条件１〜１０）にて連続的に蛍光測定を行った。すなわち、９５℃で５分間変性し（条件１以外は、前の条件終了後９５℃で３０秒間変性し）、８５℃から７５℃の間を０．２５℃／分の降温速度で温度を下げ、それ以外の温度範囲については本装置の最高の降温速度(９６℃／分)で実施し、３５℃まで温度を下げた。各条件の８５〜７５℃における降温速度（Ｔｍ値付近温度降下速度）を表４に示す。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
さらに、各温度条件におけるΔＦを前記数式(１)から算出し、各条件における９５℃終点から７５℃終点の蛍光強度を差し引きし、ΔＦとした。さらに前記数式(４)より各条件におけるＩＮＤＥＸ(％)を算出した。算出結果を図６及び表５に示す。
【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
全ての条件において、Ｇ１２Ｓ型の標準２本鎖核酸とＧ１２Ｓ型の試料２本鎖核酸とを混合した反応液のＩＮＤＥＸの値はほぼ０を示し、鎖組換え効率に目立った相違はなかった。しかしながら、条件７〜１０では、野生型の標準２本鎖核酸とＧ１２Ｓ型の試料２本鎖核酸とを混合した反応液のＩＮＤＥＸの値は、両者の塩基配列が１塩基相違しているにも関わらず、５０％以上も誤って鎖組換え反応が起きていることが示された。
【０１１１】
条件１〜４は、いずれもほぼ同様の高い識別性を保持していることが分かった。すなわち、本発明の標的塩基配列の識別方法の時短化方法により、従来のＰＨＦＡ法ではその測定時間に数時間要していたのが、わずか５〜１５分間で標的塩基配列を識別できることが明らかとなった。つまり、ミスマッチの識別性を損なわずに時短化するためには、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近の±５℃〜１０℃の温度域の降温速度を、Ｔｍ値付近以外の温度域の降温速度よりも遅くすることが必要であり、その速度差が２倍程度あれば、充分に時短化することが可能であることが分かる。また、条件７〜１０では明らかにミスマッチの識別性が欠如しているため、本発明の識別方法及び標的塩基配列の識別方法の時短化方法に有効な、Ｔｍ値付近の温度範囲における降温速度は０．２５℃／分〜１０℃／分であることがわかった。
【０１１２】
生殖細胞系列遺伝子変異の場合は、条件１０のようなＳ／Ｎ比であったとしても、遺伝子型の判定は可能であると考えられる。一方で、条件１〜６のような降温条件とすることにより、体細胞変異のように過剰な野生型が存在する中で微量な変異をも精度よく検出することができる。
【０１１３】
［実施例４］
実施例３の条件１において、微量なＫ−ｒａｓ遺伝子変異(Ｇ１２Ｓ)を検出できるかを検討した。
具体的には、まず、実施例１において試料２本鎖核酸の調製の際に鋳型ＤＮＡとして用いたＤＬＤ−１(野生型)とＡ５４９(Ｇ１２Ｓ型)の混合比を変化させて、Ａ５４９の含有割合（変異の割合）を０％、２．５％、５％、１０％、２５％、５０％、１００％と変化させたサンプルを準備し、それらをそれぞれ鋳型ＤＮＡとして用いて、実施例１と同様の方法でＰＣＲにより各サンプルの試料２本鎖核酸を調製した。なお、鋳型ＤＮＡの代わりに蒸留水（ＤＷ）を加えてＰＣＲを行い調整し対照試料とした。得られた各試料２本鎖核酸と標準２本鎖核酸（Ｇ１２Ｓ型）とを用いて、実施例２と同様にしてＰＨＦＡ反応液を調製し、実施例１と同様の反応液組成にて競合的鎖組換え反応を行った。
【０１１４】
実施例１で用いた測定装置ＡＢＩ７９００を用い、これらのＰＨＦＡ反応液の温度変化に伴う蛍光変化（蛍光強度変化）を測定した。温度条件は、９５℃で３０秒間変性し、８５℃から７５℃の間を０．９６℃／分の降温速度で温度を下げ、それ以外の温度については本装置の最高の降温速度(９６℃／分)にて実施した(実施例３の測定条件１)。
【０１１５】
各温度における反応液の蛍光強度をリアルタイムで測定した結果を図７に示す。図７中、「温度変化」は蛍光強度測定時の反応液の温度を示す。また、同じく図中、「変異Ｘ％」は、反応液に添加した試料２本鎖核酸の調製に用いた鋳型ＤＮＡ中のＡ５４９（Ｇ１２Ｓ型のＫ−ｒａｓ遺伝子）の含有割合がＸ％であることを、「ＮＣ（ＰＣＲ）」は、反応液に添加した試料２本鎖核酸の調製に鋳型ＤＮＡの代わりにＤＷを加えた対照試料の結果を、それぞれ示す。さらに「温度変化」は蛍光強度測定時の反応液の温度を示す。この結果、条件１のように測定時間を大幅に短縮させた場合であっても、２．５％のＫ−ｒａｓ変異遺伝子(Ｇ１２Ｓ)を検出することが可能であった。すなわち、これらの結果から、本発明の識別方法及び標的塩基配列の識別方法の時短化方法により、識別性を損なうことなく、識別に要する時間を大幅に短縮することができること、特に、生殖細胞遺伝子系列遺伝子(ＳＮＰ)や体細胞変異を高感度かつ迅速に検出できることが示された。
【０１１６】
［実施例５］
標準２本鎖核酸のＴｍ値付近の降温速度を緩やかにすることが重要であることを、ＥＧＦＲ遺伝子変異（Ｌ８５８Ｒ）の検出例から示した。ＥＧＦＲのＬ８５８Ｒの変異はｅｘｏｎ２１上に起きる高頻度で出現する点突然変異である。がん遺伝子であるＥＧＦＲのＬ８５８Ｒの遺伝子変異を識別対象の変異部位とし、試料２本鎖核酸の遺伝子型が、標準標識２本鎖核酸の遺伝子型と同一か否かを、本発明の識別方法を用いて識別した。なお、使用する標準２本鎖核酸及び試料２本鎖核酸は、常法の化学合成法により調製した。
まず、Ｌ８５８Ｒの遺伝子変異の変異型に対して、標準２本鎖核酸を作製した。標準２本鎖核酸は、一方の核酸鎖の両末端をＦＡＭ標識（グレンリサーチ社製）し、他方の核酸鎖の両末端をＤＡＢＣＹＬ標識（グレンリサーチ社製）した。当該標準２本鎖核酸は、プライマーを設計してＰＣＲにより調製することもできるが、本実施例においては、構成する２本の核酸鎖を１本ずつ化学合成したものをハイブリダイズさせることにより調製した。表６に、化学合成した核酸鎖の配列を示す。表６中、「Ｌ８５８Ｒ」はコドン８５８の点突然変異により、ロイシンがアルギニンに改変されている変異型を、「６−ＦＡＭ」はＦＡＭ標識を、「ＤＡＢ」はＤＡＢＣＹＬ標識を、右欄の数字は配列表中の対応する配列番号を、それぞれ示す。
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
さらに、試料２本鎖核酸の調製をＰＣＲにて行った。ＰＣＲ反応液の組成は、２５０ｎＭ  Ｆプライマー、２５０ｎＭ  Ｒプライマー、２５０μＭ ｄＮＴＰ、１×ＰＣＲバッファー、２．５ユニット Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ）、とし、全体の反応液を４７．５μＬとした。このＰＣＲ反応液に１０ｎｇ／μｌの鋳型ＤＮＡを２．５μｌ添加し、全体の反応容量を５０μｌとした。ＰＣＲの反応条件は９５℃３分間の処理後、９５℃（２０秒間）→５７℃（３０秒間）→７２℃（３０秒）の変性、アニーリング、伸長反応を、４０サイクル行った。使用したＦプライマー及びＲプライマーの塩基配列を表７に示す。表中の右欄の数字は配列表中の対応する配列番号を示す。なお、鋳型ＤＮＡはｆｅｍａｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ(ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用いた。本ゲノムはインベーダーアッセイなどの他手法により野生型(Ｌ８５８のホモ、もしくは変異があっても１％以下である)であることを既に確認している。
【０１１９】
【表７】
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【０１２０】
得られたＰＣＲ反応液（１４．４μＬ）、５００ｎＭ Ｒ８５８−ＦＡＭ（変異型の標準２本鎖核酸のうちのＦＡＭ標識された１本鎖核酸）（１μＬ）、５００ｎＭ Ｒ８５８−ＤＡＢ（変異型の標準２本鎖核酸のうちのＤＡＢＣＹＬ標識された１本鎖核酸）（１μＬ）、２Ｍ ＮａＣｌ（１μＬ）、ＲＯＸ(０．６μｌ)を混合し、蛍光ＰＨＦＡ反応液とした。この調製した蛍光ＰＨＦＡ反応液を、蛍光強度（蛍光共鳴エネルギー移動）の測定装置（ＡＢＩ−７９００）にセットし、９５℃で３０秒間保持して変性させた後、９０℃から７０℃の温度範囲を０．９６℃／分の降温速度で温度を下げた場合(条件１)と９５℃で３０秒間保持して変性させた後、８０℃から７０℃の温度範囲を０．９６℃／分の降温速度で温度を下げた場合(条件２)により標識標準２本鎖核酸の識別性がどのように変化するか観察した。なお、両温度条件ともにそれ以外の温度については本装置の最高の降温速度(９６℃／分)で実施した。標準２本鎖核酸のみの蛍光挙動を観察する場合は、ＰＣＲ反応液の代わりとして１×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒを１４．４μｌ加えた。
【０１２１】
また、図８の蛍光強度はＦＡＭの値をＲＯＸで補正(ＦＡＭ／ＲＯＸ)した値である。図８の(Ａ)に条件１、(Ｂ)に条件２で蛍光ＰＨＦＡを行った結果を示す。図中、「温度変化」は蛍光強度測定時の反応液の温度を示す。また、同じく図中、「標準２本鎖核酸のみ」はＰＣＲ反応液を添加しなかった蛍光ＰＨＦＡ反応液の結果を、「ゲノムサンプル」はＰＣＲ反応液を添加した蛍光ＰＨＦＡ反応液の結果を、それぞれ示す。図８(Ａ)では、Ｒ８５８を検出する標準２本鎖核酸の蛍光挙動は、温度変化に伴って大きく変化していることが分かる。このことからハイブリダイゼーションに伴って、標準２本鎖核酸は試料２本鎖核酸と鎖組換えを起こさず、元の２本鎖を形成していることが分かる。すなわち、標準２本鎖核酸は、サンプルＤＮＡ（試料２本鎖核酸）とミスマッチであることを示している。また、本蛍光挙動からこの標準２本鎖核酸のＴｍ値は８５℃付近に存在していることが分かる。
【０１２２】
一方、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近を緩やかにせず、Ｔｍ値よりも−５℃あたりから緩やかにして蛍光ＰＨＦＡを行った条件２の場合は、標準２本鎖核酸の蛍光挙動が温度変化によってほとんど変化しておらず、見かけ上、サンプルＤＮＡ（試料２本鎖核酸）中にＲ８５８（標準２本鎖核酸）とマッチのものが少なくとも５０％以上存在していることを示している。これは、標準２本鎖核酸のＴｍ値付近を急激に温度変化させてハイブリダイゼーションを行ったため、試料２本鎖核酸と標準２本鎖核酸との間でｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ(不安定なハイブリッド)が多く形成されているためだと推測できる。この結果から、標準２本鎖核酸のＴｍ値を考慮せずに降温速度の制御を行って測定時間の短縮化を図ると、蛍光ＰＨＦＡにおいて擬陽性を出す恐れがあること、よって、本発明のように標準２本鎖核酸のＴｍ値、あるいはそれよりも前から緩やかな降温速度で蛍光ＰＨＦＡを実施する必要があることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明の標的塩基配列の識別方法は、遺伝子型等の１又は数塩基程度の相違しかない塩基配列同士を、高精度かつ迅速に識別することができるため、臨床検査等の分野、特に体細胞変異の検査等の分野において利用が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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