(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型の澱粉結合ドメインの炭水化物結合活性と比較して低下した炭水化物結合活性を有する改変された澱粉結合ドメインであって、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２または３のアミノ酸シーケンスの３２番目、４７番目、６７番目、８３番目、または９３番目のアミノ酸残基に変異を有するアミノ酸シーケンスを有することを特徴とする改変された澱粉結合ドメイン。
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２：ＡＳＩＰＳＳＡＳＶＱ ＬＤＳＹＮＹＤＧＳＴ ＦＳＧＫＩＹＶＫＮＩ ＡＹＳＫＫＶＴＶＩＹ ＡＤＧＳＤＮＷＮＮＮ ＧＮＴＩＡＡＳＹＳＡ ＰＩＳＧＳＮＹＥＹＷ ＴＦＳＡＳＩＮＧＩＫ ＥＦＹＩＫＹＥＶＳＧ ＫＴＹＹＤＮＮＮＳＡ ＮＹＱＶＳＴＳ
ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３：ＡＳＩＰＳＳＡＳＶＱ ＬＤＳＹＮＹＤＧＳＴ ＦＳＧＫＩＹＶＫＮＩ ＡＹＳＫＫＶＴＶＩＹ ＡＮＧＳＤＮＷＮＮＮ ＧＮＴＩＡＡＳＹＳＡ ＰＩＳＧＳＮＹＥＹＷ ＴＦＳＡＳＩＮＧＩＫ ＥＦＹＩＫＹＥＶＳＧ ＫＴＹＹＤＮＮＮＳＡ ＮＹＱＶＳＴＳ
【請求項２】
前記３２番目、４７番目、６７番目、８３番目、または９３番目のアミノ酸残基の変異は、アラニンへの置換であることを特徴とする、請求項１に記載の改変された澱粉結合ドメイン。
【請求項３】
請求項１に記載の改変された澱粉結合ドメインおよび標的ポリペプチドを含む組換えタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の改変された澱粉結合ドメインをコードする遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項５】
式
（Ｘ−Ｘ）ｎ
（式中、Ｘはグルコース分子であり、グルコースとグルコースとの間の連鎖がα−１，４−連鎖またはα−１，６−連鎖であり、ｎが１以上であり、その構造の一部に、主鎖、側鎖、または修飾残基を含む）で示される化合物を含有する親和性マトリックスと結合するための、請求項１に記載の改変された澱粉結合ドメインの使用。
【請求項６】
前記親和性マトリックスが、前記改変された澱粉結合ドメインの３２番目、４７番目、６７番目、８３番目、または９３番目のアミノ酸残基に結合することを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
（ａ）請求項３に記載の組換えタンパク質を含有する生物学的液体を親和性マトリックスに直接適用することと、
（ｂ）溶出緩衝液により前記組換えタンパク質を溶出することとを含み、前記親和性マトリックスが、
式
（Ｘ−Ｘ）ｎ
（式中、Ｘはグルコース分子であり、グルコースとグルコースとの間の連鎖が、α−１，４−連鎖またはα−１，６−連鎖であり、ｎは１以上であり、その構造の一部に、主鎖、側鎖、または修飾残基を含む）で示される化合物を含有することを特徴とする、組換えタンパク質を精製するための方法。
【請求項８】
前記親和性マトリックスが、前記改変された澱粉結合ドメインの３２番目、４７番目、６７番目、８３番目、または９３番目のアミノ酸残基に結合することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項４に記載の発現ベクターを含むことを特徴とする、組換えタンパク質を精製するためのキット。
【請求項１０】
前記改変された澱粉結合ドメインに結合する親和性マトリックスをさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記組換えタンパク質および前記親和性マトリックスを分離するために使用される溶出緩衝液をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真菌Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．におけるグルコアミラーゼの澱粉結合ドメイン（ＳＢＤ）の機能に関する。ＳＢＤを含む組換えタンパク質は、ＳＢＤを標識として用いることにより作製され、精製される。本発明はさらに、組換えタンパク質の新しい精製法およびキットと、ＳＢＤおよび組換えタンパク質の新しい応用例に関する。本発明は、澱粉結合ドメインを含む原線維を提供する。本発明はまた、澱粉酵素の候補における澱粉結合ドメインのリガンド結合部位の同定法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
微生物系において発現させ作製されたタンパク質は、価値の高い、医学的に重要なタンパク質の主な供給源となっている。組換えタンパク質の精製および回収は、発酵プロセスを計画する上で主要な検討事項である。従来のタンパク質精製法は生成物の分離に使用されるが、改良された方法には組換えタンパク質の使用が含まれる。組換えタンパク質は親和性カラムクロマトグラフィーにより精製され、親和性マトリックスと結合して、ポリペプチドへ共有結合することによって組換えタンパク質の任意の構成成分が精製される。
【０００３】
親和性カラムクロマトグラフィーの原理によりタンパク質を分離する所定のシステムは存在する。
【０００４】
特許文献１は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含むシステムが記載されている。クローン化した遺伝子をｍａＩＥから下流のｐＭＡＬベクターへ挿入し、ＭＢＰをコードする。そのベクターが宿主細胞へ形質転換され、その宿主細胞で組換えタンパク質が発現する。細胞可溶化物または培地画分を親和性マトリックスであるアミロースを含むカラムに負荷して数回洗浄し、大量のマルトースを用いて組換えタンパク質を溶出する。
【０００５】
特許文献２では、セルロース結合ドメインを含むシステムについて詳述さ れている。セルロース・カラムを使用して、セルロース結合ドメインを含む組換えタンパク質が精製される。細胞可溶化物または培地画分をカラムに負荷して洗浄する。セルロース結合ドメインとセルロースとの間の相互作用は、ｐＨが中性時の疎水性相互作用に左右されると考えられる。一般的な溶出方法ではエチレングリコールなどの極性の低い溶媒が使用され、その後その極性の低い溶媒は、透析および濾過により除去される。
【０００６】
キチン結合ドメインおよび誘導型のスプライシングを受けたリンカー領域は、標的タンパク質のＣ末端またはＮ末端で融合され得る。細胞可溶化物または培地画分はカラムに負荷され、洗浄される。キチン結合ドメインがキチンカラムに結合して、組換えタンパク質を固定する。ＤＴＴまたはシステインなどのチオール類の存在下で、リンカー領域は特異的な自己切断を受け、キチンが結合したキチン結合ドメインから標的タンパク質を遊離させる。
【特許文献１】米国特許第５６４３７５８号明細書
【特許文献２】米国特許第５２０２２４７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これら現行のタンパク質精製システムにはいくつかの欠点がある。これらの精製過程は利便性が悪く、労力がかかる。精製で使用されるカラムは高価である。これらのシステムにおいてタンパク質を精製する上での制限は、ＥＤＴＡ含有試料など所定の条件下で組換えタンパク質を分離できないことと、使用されている現行のタンパク質標識が、本発明のタンパク質よりも大きな標的タンパク質と比較して比較的大きいことである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、特徴的な解離定数（Ｋｄ）０．５〜２．２９μＭを含む澱粉結合ドメインを提供する。本発明はまた、ポリペプチドと本発明の澱粉結合ドメインとを含む組換えタンパク質も提供する。本発明はまた、本発明の澱粉結合ドメインをコードする遺伝子を含む発現ベクターも提供する。本発明はまた、ベクターにより形質転換または形質移入される宿主細胞も提供し、目的のポリペプチドと本発明の澱粉結合ドメインとを含む組換えタンパク質をコードするＤＮＡを複製し、発現させる。本発明はさらに、ポリペプチドと本発明の澱粉結合ドメインとを含む組換えタンパク質を生物学的液体から精製する方法も提供する。本発明はさらに、組換えタンパク質を発現させるのに用いる発現ベクターを含む組み換えタンパク質を精製するキットも提供する。本発明はさらに、様々な炭水化物含有分子を含む試料において、炭水化物含有分子を選別する方法も提供する。本発明はさらに、澱粉結合ドメインを含む原線維も提供していて、その原線維はβシートとβシートの相互作用および／または電荷と電荷の相互作用により形成されることを特徴とする。本発明はまた、澱粉酵素候補における澱粉結合ドメインのリガンド結合部位の同定法も提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は、真菌Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、なかでもＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来酵素グルコアミラーゼの澱粉結合ドメイン（ＳＢＤ）の、特に高親和性および強力な結合能により提供される。グルコアミラーゼ（１，４‐α‐Ｄ‐グルカングルコヒドロラーゼ，ＥＣ３．２．１．３）とは、澱粉および関連基質において非還元性末端からのβ‐Ｄ‐グルコースの遊離を触媒するマルチドメインエキソ型グリコシドヒドロラーゼである。グルコアミラーゼは、触媒ドメイン（ＣＤ）および澱粉結合ドメイン（ＳＢＤ）を含むモジュールタンパク質であり、炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）に分類される。この独立する２つのドメインは、Ｏ‐グリコシル化リンカーに接続されている（詳細な情報については、ＵＲＬ ｈｔｔｐ：／／ａｆｍｂ．ｃｎｒｓ‐ｍｒｓ．ｆｒ／ＣＡＺＹ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ参照：Ｂｏｒａｓｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００４）３８２：７６９‐７８１。Ｆａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（１９９８）１１：１１９‐１２６。Ｓａｕｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：９３３６‐９３４６）。
【００１０】
ＣＢＭは、触媒ドメインを不溶性多糖の表面上に集中させることにより、グリコシドヒドロラーゼと基質との相互作用を仲介する（Ｂｏｌａｍら。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９８）３３１：７７５‐７８１）。タンパク質分解による切り出しと、グリコシドヒドロラーゼからのＣＢＭの切断により、可溶性多糖ではなく、不溶性多糖上の酵素の活性が顕著に低下する（Ｃｈａｒｏｎｃｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：５０１３‐５０２１。Ａｌｉら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００１）６５：４１‐４７）。すべてのＣ末端ＳＢＤがＣＢＭファミリー２０に属しているのとは異なって、グルコアミラーゼのＮ末端ＳＢＤはＣＢＭファミリー２１に分類されている。現在、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、およびＭｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ由来グルコアミラーゼのＣＢＭファミリー２１の澱粉結合ドメインは、Ｎ末端に位置づけられている（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ‐Ｌａｒｓｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００３）６２：２１０‐２１７）。
【００１１】
これらの種由来ＳＢＤのアミノ酸シーケンスとＡ．ｎｉｇｅｒ ＳＢＤとの比較によれば、Ｒ． ｏｒｙｚａｅ ＳＢＤとＡ． ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのＳＢＤとの間の相同性は、それぞれ３５．４％、６７．３％、および２６．１％である。ＣＢＭ２０ファミリーとＣＢＭ２１ファミリーとの間のタンパク質シーケンスの差異は、これらのＳＢＤの生物学的機能および生化学的機能が異なることを意味する。
【００１２】
本発明によるＳＢＤのポリペプチドは、ＣＢＭ２０、ＣＢＭ２１、ＣＢＭ２５、ＣＢＭ２６、ＣＢＭ３４、およびＣＢＭ４１から、好ましくはＣＢＭ２０またはＣＢＭ２１から、より好ましくはＣＢＭ２１由来グルコアミラーゼの澱粉結合ドメインから、さらにより好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐから、もっとも好ましくはＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅから得ることである。ＳＥＱ ＩＤのＮｏｓ．１、Ｎｏｓ．２、およびＮｏｓ．３で示されたとおり、Ｓｉｍｐｓｏｎ株、野生型株、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４８６３８６４の株から得られるＳＢＤのアミノ酸シーケンスは、互いに異なる。対立遺伝子変異および誘導体を含むＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅのＳＢＤは、既知のＳＢＤと比較して澱粉との親和性が高く、強力な澱粉結合能を発現する。
【００１３】
本発明では、ＳＢＤをコードするＤＮＡ分子をＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ産物をクローニングして発現ベクターを作製し、宿主細胞へ形質転換する。形質転換された宿主細胞を誘導してＳＢＤを発現させる。細胞可溶化物を採取し、上清を親和性マトリックスに直接適用したのち洗浄・溶出する。溶出緩衝液は、塩、砂糖、および／または酸性またはアルカリ性と考えられる。本発明におけるＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ．におけるＳＢＤは第１に、広範なｐＨで安定しており、酸性またはアルカリ性の環境下で澱粉と一緒に解離することを特徴とする。本発明では第１に、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐにおけるＳＢＤの解離定数（Ｋｄ）値がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒなど既知の種よりも低く、また、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐのＳＢＤの澱粉結合能がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒなど既知の種を大幅に上回ることが確認されている。顆粒状のコーンスターチに対するＲｈｉｚｏｐｕｓのＳＢＤの解離定数（Ｋｄ）値の好適な実施形態は、０．５〜２．２９である。この解離定数（Ｋｄ）値のより好適な実施形態は１．０〜２．０である。この解離定数（Ｋｄ）のさらに好適な実施形態は１．３〜１．６である。この解離定数（Ｋｄ）のもっとも好適な実施形態は１．４３である。
【００１４】
本発明のＳＢＤは、炭水化物結合に関するシーケンスの芳香族アミノ酸残基３２、４７、６７、８３、および９３の上に活性部位を有していて、そのアミノ酸残基がチロシンまたは／およびトリプトファンであることを特徴とする。好適な実施形態では、この活性部位は残基３２のチロシン、残基４７のトリプトファン、残基８３のチロシン、および残基９３のチロシンである。より好適な実施形態では、活性部位は残基４７のトリプトファンおよび残基３２のチロシンである。本発明では、芳香族残基からなる活性部位は、二次構造の順次相関および位相的マッピングにより同定される。
【００１５】
本発明はまた、本発明のＳＢＤと目的のポリペプチドとを含む組換えタンパク質も提供する。以前述べたとおり、目的のポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングしてＳＢＤ発現ベクターを作製する。このクローニング部位はｓｂｄ遺伝子に隣接していて、ｓｂｄ遺伝子の上流または下流のいずれかである。このＳＢＤはＮ末端またはＣ末端においてポリペプチドと連結される。この融合遺伝子発現ベクターは、細菌、酵母菌、真菌、哺乳類の細胞、または昆虫の細胞を含む宿主細胞へ形質転換または形質移入され得る。組換えタンパク質は、形質転換または形質移入された細胞で発現される。したがって、本発明によるこの組換えタンパク質は、親和性マトリックスとして澱粉を使用することにより、ＳＢＤと澱粉との間の関係を介して精製される。
【００１６】
組換えタンパク質精製で使用される親和性マトリックスは、ＳＢＤにより認識される構成成分であると考えられる。本発明によるＳＢＤは、グルコースとグルコースの連鎖構造、すなわちα‐１，４‐連鎖とα‐１，６‐連鎖の両方を結合させ得る。この特徴により、親和性マトリックスは、
【００１７】
【化１】
0005494986.tif 000002
の化学式を含む構成成分と考えられる。Ｘはグルコース分子であり、グルコースとグルコースとの間の連鎖はα‐１，４‐連鎖またはα‐１，６‐連鎖であり、ｎは１以上である。構造の一部に、主鎖、側鎖、または修飾残基など以前の構造を含む構成要素が、親和性マトリックスとして選択され得る。例えば、澱粉、マンノース、デキストラン、またはグリコーゲンが親和性マトリックスとなり得る。
【００１８】
本発明は、本発明の澱粉結合ドメインおよび親和性マトリックスを使用することにより、組換えタンパク質を精製する方法を提供する。本法は、（ａ）組換えタンパク質を含有する生物学的液体を親和性マトリックスに直接適用することと、（ｂ）溶出緩衝液により組換えタンパク質を溶出することと、（ｃ）組換えタンパク質を含有する溶出液を透析することを含む。本発明を使用して、組換えタンパク質およびポリペプチドの作製、活性、安定性、または可溶性が増加され得る。本発明は、広範な至適ｐＨを用いる大規模なタンパク質精製に適している。精製組換えタンパク質の収量は高く、純度も十分である（９５％超）。本発明の利点には、様々な溶出緩衝液および親和性マトリックスが選択され得ることと、商業利用が可能になることも含まれ、前者には砂糖、塩、および／またはｐＨが含まれ、後者には澱粉、マンノース、デキストラン、またはグリコーゲンが含まれる。さらに、ＳＢＤは、グルタチオン‐Ｓ‐転移酵素、（ＧＳＴ）、ＭＢＰ、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、またはＮｕｓを含む通常使用される融合タンパク質の標識よりも小さく、また、本システムはＥＤＴＡ‐、ＥＧＴＡ‐、またはＤＴＴ‐含有試料を含む特定の試料を精製するのに適している。
【００１９】
本発明は、組換えタンパク質とその応用例を精製するキットを提供する。このキットは、本発明による組換えタンパク質を発現する発現ベクターを含む。このキットはさらに、親和性マトリックスおよび溶出緩衝液を含む。この親和性マトリックスは、ＳＢＤと結合して組換えタンパク質を分離する。溶出緩衝液を使用して、ＳＢＤと親和性マトリックスとの間の関係を断つ。
【００２０】
以前述べたとおり、目的のポリペプチドは、抗体、抗原、治療用化合物、酵素、またはタンパク質と考えられる。本発明により提供されるキットを介して、これらの生成物が過剰産生また、速やかに精製され得る。これらの生成物の応用例は、以下のとおりである。
【００２１】
目的のポリペプチドは、病原の損傷／破壊または検出を標的とし、これを可能にする抗体または治療用化合物と考えられる。本発明は、澱粉を用いて抗体または治療用化合物が容易に精製され、さらにＳＢＤ領域を切断することにより分離され得るようになる。この精製された生成物を使用して、病原が治療または検出される。
【００２２】
目的のポリペプチドは、免疫反応を誘導する抗体または抗原化合物と考えられる。この融合タンパク質は、澱粉などの親和性マトリックスと結合する。この融合タンパク質結合澱粉は、食糧源として供給され得る。融合タンパク質結合澱粉を食するとき、使用者はワクチン効果を得ることができる。融合タンパク質結合澱粉は、経口ワクチンとなり得る。
【００２３】
本発明はさらに、口腔ケアの構成物に関する応用例を提供する。この口腔ケアの構成物は本発明のＳＢＤを含んでいて、その構成物は、練り歯磨き、デンタルクリーム、ジェルまたは歯磨き粉、歯用洗浄剤、口腔用洗浄剤、歯磨きの前または後のすすぎ液、チューインガム、口内錠、およびキャンディからなるグループから選択されることを特徴とする。この口腔ケアの構成物はさらに、１またはそれ以上のＳＢＤ間の融合産物と、酸化酵素、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、デアミナーゼ、ウレアーゼ、および多糖加水分解酵素からなるグループから選択される酵素とを含む。この口腔ケア産物は経口多糖を消化し、虫歯を予防する。
【００２４】
本発明はさらに、炭水化物結合ドメインの様々なＫｄ値を使用することにより、炭水化物含有分子を選別する方法も提供する。炭水化物含有分子は様々な糖タンパク質の混合物であり、その炭水化物は単糖、二糖、または多糖と考えられる。例えば使用者は、セパレータ（おそらくカラム）として澱粉結合ドメイン（ＳＢＤ）を使用して糖タンパク質を選別することができる。様々なＫｄ値を用いて、勾配のあるリガンド結合能を有する一連のマトリックスを生成する。このＳＢＤは、野生型および突然変異型を含む、本発明のＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐから得られると考えられる。このＳＢＤは、ＣＢＭファミリー２１およびＣＢＭファミリー２０などのＳＢＤを産生することがわかっている種から得られると考えられる。この既知の種には、Ａｒｘｕｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒが含まれる。
【００２５】
試料を一組のセパレータに負荷すると、ＳＢＤ結合分子がカラムに保持され、非結合分子は排除される。したがって、この試料はＳＢＤ結合群と非結合群とに選別され得る。一つの容器に非結合分子を収集し、別の容器にＳＢＤ結合分子を溶出し、どちらもさらに選別することもできる。さらなる選別法は、液体カラムクロマトグラフィ解析、質量分析、レクチン免疫センサ法、二次元ゲル電気泳動、酵素学的方法、および化学的誘導体化など、化学的特性、物理的特性、または生物学的特性に基づくと考えられる。
【００２６】
本発明はさらに、ベータシートとベータシートの相互作用によりモノマーが互いに相互作用する澱粉結合ドメインを含む原線維も提供していて、その澱粉結合ドメインが、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ａｒｘｕｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒから選択されることを特徴とする。好適な実施形態では、澱粉結合ドメインはＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来である。原線維の実施形態では、この原線維は管状構造である。この原線維は、炭水化物分離および薬物送達システムに適用される。
【００２７】
本発明はまた、澱粉酵素候補における澱粉結合ドメインのリガンド結合部位の同定法も提供していて、その同定法は、（ａ）候補酵素および既知のリガンド結合部位を含む既知の澱粉酵素の構造に基づく多重シーケンスアラインメントおよび芳香族残基を作製することと、（ｂ）二次構造の順次相関アルゴリズム（ＰＳＳＣ）による、既知の酵素と候補酵素との間でシーケンスアラインメントのトポロジーを比較することと、（ｃ）既知の酵素の既知のリガンド結合部位を、候補酵素において相当する位置に存在する残基に相関させることを含む。
【００２８】
結果として生じる候補酵素の残基の機能を同定するため、本発明の方法はさらに、部位特異的突然変異、化学修飾、ＵＶ差分光法、または定性的および定量的結合アッセイなどの測定法を含む。
【００２９】
本願明細書で使用される「リガンド」という用語は、澱粉、シクロデキストリン、マルトヘプタオース、マルトヘキサオース、およびマルトペンタオースからなるグループから選択されるが、それに限定されない。
【００３０】
この候補酵素は、ＣＢＭ２０、ＣＢＭ２１、ＣＢＭ２５、ＣＢＭ２６、ＣＢＭ３４、およびＣＢＭ４１からなるグループから選択される。好適な酵素は、ＣＢＭ２０およびＣＢＭ２１から選択される。より好適な酵素は、真菌属Ｒｈｉｚｏｐｕｓから得られる。もっとも好適な酵素は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅから得られる。
【００３１】
この候補酵素は、グルコアミラーゼ、α‐アミラーゼ、β‐アミラーゼ、ａｃａｒｖｉｏｓｅ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、グルコシルトランスフェラーゼ、グルカノトランスフェラーゼ、シクロデキストリン、グルコシルトランスフェラーゼ、マルトペンタオヒドロラーゼ、マルトジェニックα‐アミラーゼ、アミロプルラナーゼ、α‐グルカン水ジキナーゼ、ｇｅｎｅｔｈｏｎｉｎ‐１、ラフォリン、催色強調タンパク質、またはプロテインフォスファターゼであるが、それに限定されない。
【００３２】
この候補酵素のリガンド結合部位を予測するのに使用される既知の酵素は、ＣＢＭ２０、ＣＢＭ２５、ＣＢＭ２６、またはＣＢＭ３４から選択される。この既知の酵素の好適な実施形態は、ＣＢＭ２０またはＣＢＭ３４から選択される。この既知の酵素のより好適な実施形態は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒから選択される。
【００３３】
本法では、二次構造の順次相関（ＰＳＳＣ）アルゴリズムは、（１）αヘリックスとβストランドの位置および境界を割当てるための既存の予測システムを用いて多くの二次構造を得ることと、（２）αヘリックスおよびβストランドを象徴化し、制約された残基として予め規定される、芳香族残基Ｙ、Ｗ、Ｆが選択され、標識化することにより、予測される二次構造をそれぞれ新しいシーケンスに変換することと、（３）テンプレートとして分解した三次元構造を用いて、１つのタンパク質シーケンス上で順次相関操作を実施することの３つのステップを含む。
【００３４】
具体的には、予測される二次構造と既知のテンプレートとの間で考え得るすべてのアラインメントのセットからスコアが計算される。最高値を示すアラインメントは、テンプレート構造の残基に相当する主要な残基を同定し得る最善のアラインメント候補である。相関操作を実施して、二次構造および制約された芳香族残基の位置に関して、最善のアラインメントを提供する。
【００３５】
本発明では、トポロジーは免疫グロブリン様トポロジーである（ＣＡＴＨ ｃｏｄｅ ２．６０．４０）。
【００３６】
以下の実施例は、制限のためではなく、例示のために提供するものである。
【実施例１】
【００３７】
（Ａ）ＳＢＤ‐６Ｈの構築
【００３８】
フォワードプライマー５’‐ＣＡＴＡＴＧＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＧＣＡＧＴ‐３’およびリバースプライマー５’ＣＴＣＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴＡＣＴＴＧＧＴ‐３’（太字で示した制限酵素認識部位はこの２つのプライマーへ組み込まれた）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により残基２６〜１３１からグルコアミラーゼのＳＢＤをコードする遺伝子を精製した。ＰＣＲ産物をクローニングしてｐＧＥＭ‐Ｔ簡易クローニングベクター（Ｐｒｏｍａｇａ）を作製し、ＤＮＡ塩基配列決定により検証した。その後、ｓｂｄ遺伝子のフラグメントをＮｏｄｅＩ部位およびＸｈｏＩ部位でｐＥＴ２３ａ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に結合し、ｐＥＴ‐ＳＢＤを生成した。ｐＥＴ‐ＳＢＤによりコードされたＳＢＤ‐６Ｈは、Ｃ末端にＨｉｓ６タグを含む。この構築物を形質転換の受容性のあるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１‐Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）へ形質転換して、タンパク質を発現させた。
【００３９】
ＳＢＤ‐６Ｈの発現および精製
【００４０】
ｐＥＴ‐ＳＢＤを用いて形質転換したＢＬ２１‐Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞を、ＯＤ６００が０．６に達するまで、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培養液中で、３７℃で増殖させた。次に温度を２０℃まで下げ、最終濃度４００μＭまでイソプロピルβ‐Ｄ‐チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して、組換えタンパク質を発現させた。さらに１６時間インキュベートしたのち、４℃で３，７００ ｇ、１５分間の遠心により細胞を採取し、その結果生じたペレットを結合緩衝液２０ ｍｌ（５０ ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）中で再懸濁後、破砕した（細胞破砕機ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ‐Ｃ５）。４℃で１６，０００ ｇ、１５分間の遠心により、細胞の破片を除去した。上清を顆粒状のコーンスターチ（あらかじめ結合緩衝液で洗浄）に直接適用後、２５℃で軽く振盪しながらインキュベートした。その澱粉を１０カラム容量の結合緩衝液を用いて２回洗浄し、次に２カラム容量の溶出緩衝液（５０ ｍＭグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ１０）を用いて溶出した。ＰＭ‐１０膜（カットオフ値１０ ｋＤａ）を備えたＡｍｉｃｏｎ攪拌型濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、その溶液を結合緩衝液に対し透析した。１５％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルにより各画分を解析し、次にクマシーブリリアントブルーで染色した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定した。
【００４１】
融合ＳＢＤ‐６Ｈは、至適条件においてＥ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１‐Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）で発現させた。誘導期ののち、顆粒状のコーンスターチにより可溶性画分をワンステップで精製した。以前報告された方法を採用して溶出剤としてマルトースを使用したときのＳＢＤの溶出効率が低かったため（Ｐａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００３）３７２：９０５‐９１０）、本願明細書ではグリシン／ＮａＯＨ（ｐＨ１０）を使用してＳＢＤを溶出する代替法を適用した。１５％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより精製ＳＢＤ‐６Ｈを解析し、図１に示したとおり、クマシーブリリアントブルーで染色した。単一ステップで精製されて生じたＳＢＤ‐６Ｈは均質である。この改良された方法により、細菌可溶化液からＳＢＤを迅速かつ効率的に精製できるようになった。純度（＞９８％）および収率（＞９０％）は高値となる。
【実施例２】
【００４２】
結合能および安定性に対するｐＨの効果
【００４３】
澱粉結合アッセイで詳述したとおり、結合能を測定するため、ＳＢＤ‐６Ｈおよび顆粒状のコーンスターチを緩衝液に入れ、様々なｐＨ値で１時間インキュベートした。安定性については、グリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３）、酢酸ナトリウム／酢酸（ｐＨ４〜５）、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ６〜７）、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８）、およびグリシン／ＮａＯＨ（ｐＨ９〜１０）を含む異なる緩衝液にＳＢＤ‐６Ｈを入れ、２５℃で３０分間保持することにより測定した。残る結合能については、酢酸ナトリウム緩衝液（５０ ｍＭ、ｐＨ５．５）に入れ、２５℃で１時間測定した。ｐＨ５のときに測定されたＳＢＤ‐６Ｈの相対的結合能を１００％として基準とした。
【００４４】
ＳＢＤ‐６Ｈの安定性について、ｐＨ３〜１０の範囲で解析したところ、ＳＢＤ‐６Ｈは広範なｐＨ、すなわち極度の酸性およびアルカリ性の条件でも安定していた（図２）。結合アッセイを用いて、不溶性澱粉の吸収に関する至適ｐＨの範囲を同定した。図２に示したとおり、ＳＢＤ‐６Ｈの結合が最大となるｐＨの範囲は５〜６であり、ｐＨ４およびｐＨ８の相対的結合能は、それぞれわずか６０．６％および５５．１％であった。
【００４５】
図２に示したとおり、ＳＢＤ‐６Ｈは広範な範囲のｐＨ、すなわち極度の酸性およびアルカリ性のｐＨでも安定していた。これにより、ＳＢＤの澱粉に対する結合能がｐＨ依存性であることも示された。結合のための至適ｐＨは約５〜６であり、マルトースを使用した以前の試験と同等であった。この以前の試験では、マルトースは至適溶出剤ではなかったが、澱粉からＳＢＤを放出させるために使用された。ここでわれわれは、ｐＨ依存性の結合能という特性に基づいて、この問題を克服した。溶出剤としてアルカリ性緩衝液を用いて、溶出効率を増加させた（＞９０％）。
【実施例３】
【００４６】
ＳＢＤ−６Hの不溶性澱粉に対する会合定数
【００４７】
１５．６〜２７．２ μＭの濃度範囲の精製ＳＢＤ‐６Ｈをあらかじめ洗浄した顆粒状のコーンスターチ１ｍｇ／ｍｌに添加し、２５℃で軽く攪拌しながら５時間インキュベートした。澱粉の沈殿ごとに、様々な時間間隔で結合を終了した。４℃で１６，０００ｇ、１０分間の遠心後、ＢＣＡアッセイにより上清のタンパク質濃度（非結合タンパク質）を測定し、最初のタンパク質濃度と非結合タンパク質濃度との間の差から結合タンパク質量を計算した。澱粉グラム当たりのタンパク質（マイクロモル）として表される平衡時の結合タンパク質は、測定されたタンパク質濃度の範囲では遊離（非結合）タンパク質の一次関数となっていた。
【００４８】
図３に示したとおり、異なるタンパク質濃度時に、顆粒状のコーンスターチに対するＳＢＤ‐６Ｈの吸着速度を測定した。最初の１０分間で、ＳＢＤ‐６Ｈの約５０％が不溶性澱粉と結合した（平衡状態時の結合タンパク質量に対し）。初回期間（４０分まで）に、吸着は線形位相を示した。結合タンパク質量は、培養時間に比例した。異なるＳＢＤ‐６Ｈ濃度時の初回結合曲線の傾きにより示された会合定数はほぼ同じであった（０．１８±０．１ μｍｏｌ／ｍｉｎ・ｇ）。線形位相後（４０分後）、延長された培養時間内に結合タンパク質が徐々に増加した。１２０分後には、相対的結合が９５％超に達した。平衡に達するのに必要な時間は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ＳＢＤとほぼ同じであった（Ｐａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．（２００３）３７２：９０５‐９１０）。
【実施例４】
【００４９】
澱粉結合アッセイ
【００５０】
飽和結合アッセイとして、澱粉結合等温線を解析した。ＳＢＤ‐６Ｈをあらかじめ洗浄した顆粒状のコーンスターチ１ ｍｇ／ｍｌと混和し、２５℃軽く攪拌しながら１６時間インキュベートした。４℃で１６，０００ ｇ、１０分間の遠心後、結合タンパク質量を計算した。アッセイ期間中に沈殿が生じていないことを確認するために、澱粉ではなく、タンパク質を含む対照を含めた。結合タンパク質（Ｂｍａｘ）の解離定数（Ｋｄ）および最大量は、非線形回帰を示す結合等温線にあてはめることにより計算し、また、方程式（１）を用いて結合部位１箇所の飽和結合を求めた。
【００５１】
【数１】
0005494986.tif 000003
ここではＢ（μｍｏｌ）は結合タンパク質を示し、Ｂｍａｘ（μｍｏｌ）は結合タンパク質の最大量、Ｆ（μｍｏｌ）は本システムの遊離タンパク質、Ｋｄ（μｍｏｌ）は平衡解離定数であった。ＢｍａｘおよびＫｄの計算値の単位は、それぞれμｍｏｌ／ｇおよびμＭに変換した。
【００５２】
ＳＢＤの結合親和性および結合能
【００５３】
図４に示したとおり、澱粉結合等温線を用いて精製ＳＢＤ‐６Ｈの親和性および結合能について試験した。方程式（１）を用いて非線形回帰曲線を示す平衡等温線を計算し、結合パラメータ（ＢｍａｘおよびＫｄ）を算出した。結合部位１箇所の飽和結合について２つのパラメータモデルにより算出された結合パラメータ（ＫｄおよびＢｍａｘ）は、それぞれ１．４３±０．１４ μＭおよび４１．１４±１．０５ μｍｏｌ／ｇであった。さらに、改変され、タンパク質分解により作製されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのＳＢＤの解離定数（それぞれ３．２±０．９ μＭおよび１２．７±０．５ μＭ）は、ＳＢＤ‐６Ｈより約２〜１０倍高かった（Ｐａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（２００３）３７２：９０５‐９１０。Ｂｅｌｓｈａｗら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（１９９０）２６９：３５０‐３５３）。これらの観察結果は、不溶性澱粉に対するＳＢＤ‐６Ｈの結合親和性のほうがＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのＳＢＤを上回ることを示している。一方、この改変された、タンパク質分解的に作製されたＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのＳＢＤ（それぞれ０．５６ μｍｏｌ／ｇおよび１．０８±０．０２ μｍｏｌ／ｇ）は、ＳＢＤ‐６Ｈと著しく異なっていた。ＳＢＤ‐６ＨのＫｄはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのＳＢＤの約２分の１であるが、ＳＢＤ‐６ＨのＢｍａｘはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのＳＢＤ‐６Ｈの約７０倍と顕著に高い。これらの結果から、ＳＢＤ‐６Ｈの澱粉結合の親和性および結合能は、いずれもＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのＳＢＤを上回っていることが示された。
【実施例５】
【００５４】
（Ａ）ＳＢＤ‐ｅＧＦＰの構築
【００５５】
続いて、ｅＧＦＰ遺伝子のフラグメントをＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ部位でｐＥＴ‐ＳＢＤに結合し、ｐＳＢＤ‐ｅＧＦＰを生成した。図５に示したとおり、プラスミドを構築した。ｐＳＢＤ‐ｅＧＦＰによりコードされたＳＢＤ‐ｅＧＦＰは、Ｎ末端にＳＢＤ‐６Ｈを、Ｃ末端にｅＧＦＰを含む。この構築物を形質転換受容性のあるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１‐Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）へ形質転換して、タンパク質を発現させた。
【００５６】
（Ｂ）ＳＢＤ‐ｅＧＦＰの発現および精製
【００５７】
ｐＥＴ‐ＳＢＤを用いて形質転換したＢＬ２１‐Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞を、ＯＤ６００が０．６に達するまで、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培養液中で、３７℃で増殖させた。次に温度を２０℃まで下げ、最終濃度４００μＭまでイソプロピルβ‐Ｄ‐チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加して、組換えタンパク質を発現させた。さらに１６時間インキュベートしたのち、４℃で３，７００ ｇ、１５分間の遠心により細胞を採取し、その結果生じたペレットを結合緩衝液２０ ｍｌ（５０ ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５）中で再懸濁後、破砕した（細胞破砕機ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ‐Ｃ５）。４℃で１６，０００ ｇ、１５分間の遠心により、細胞の破片を除去した。上清を顆粒状のコーンスターチ（あらかじめ結合緩衝液で洗浄）に直接適用後、２５℃で軽く振盪しながらインキュベートした。その澱粉を１０カラム容量の結合緩衝液を用いて２回洗浄し、次に２カラム容量の溶出緩衝液（５０ ｍＭグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ１０）を用いて溶出した。ＰＭ‐１０膜（カットオフ値１０ ｋＤａ）を備えたＡｍｉｃｏｎ攪拌型濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、その溶液を結合緩衝液に対し透析した。１５％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルにより各画分を解析し、次にクマシーブリリアントブルーで染色した。タンパク質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定した。
【００５８】
１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより精製ＳＢＤ‐ｅＧＦＰを解析し、図６に示したとおり、クマシーブリリアントブルーで染色した。
【実施例６】
【００５９】
（Ａ）構造に基づく多重シーケンスアラインメント
【００６０】
Ｊｐｒｅｄ ｓｅｒｖｅｒ（ＵＲＬ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｐｂｉｏ．ｄｕｎｄｅｅ．ａｃ．ｕｋ／〜ｗｗｗ‐ｊｐｒｅｄ／Ｃｕｆｆ，Ｊ．Ａ．，Ｃｌａｍｐ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，Ａ．Ｓ．，Ｆｉｎｌａｙ，Ｍ．およびＢａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．（１９９８）Ｊｐｒｅｄ：共通二次構造予測サーバー。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１４、８９２‐８９３）およびＮｅｔｗｏｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮＰＳＡ）サーバー（ＵＲＬ、ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ‐ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／Ｃｏｍｂｅｔ，Ｃ．，Ｂｌａｎｃｈｅｔ，Ｃ．，Ｇｅｏｕｒｊｏｎ，Ｃ．およびＤｅｌｅａｇｅ，Ｇ．（２０００）ＮＰＳ＠：ネットワークタンパク質シーケンス解析。Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５、１４７‐１５０）で、二次構造予測を実施した。ＣｌｕｓｔａｌＸプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｐｌｅｗｎｉａｋ，Ｆ．，Ｊｅａｎｍｏｕｇｉｎ，Ｆ．およびＨｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．（１９９７）。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘウィンドウズ・インターフェース：品質管理ツール支援下の柔軟な多重シーケンスアラインメント戦略。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５、４８７６‐４８８２）を活用し、二次構造予測結果を用いて、Ｒ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、およびＡ．ｎｉｇｅｒ由来ＧＡの４つの澱粉結合ドメインの多重シーケンスアラインメントを求め、二次構造プロファイルアラインメントを選択した。
【００６１】
（Ｂ）累進的二次構造相関アルゴリズム
【００６２】
本試験において、われわれはＰＳＳＣアルゴリズムを開発したが、これはタンパク質ファミリーの関連シーケンスから二次構造および機能的に重要な残基を予測する組み合わせの情報科学を基礎とした。ＰＳＳＣは、（１）αヘリックスとβストランドの位置および境界を割当てるための既存の予測システムを用いて多くの二次構造を得ることと、（２）αヘリックスおよびβストランドを象徴化し、制約された残基として予め規定される、芳香族残基Ｙ、Ｗ、Ｆが選択され、標識化することにより、予測される二次構造をそれぞれ新しいシーケンスに変換することと、（３）テンプレートとして分解した三次元構造を用いて、１つのタンパク質シーケンス上で順次相関操作を実施することの３つのステップを含む。予測されるすべての二次構造のなかで、最高スコアを示す二次構造は、テンプレート構造の残基に相当する主要な残基を同定し得る最善の候補である。注釈をつけたαヘリックスおよびβストランドのセグメントは、それぞれ「α」および「β」という記号で簡略化し、ループ構造は、制約された規定の残基か、あるいは芳香族残基が割当てられていないときは記号「Ｎ」を代用した。最終ステップでは相関操作を実施し、二次構造および制約された芳香族残基の位置に関して最善のアラインメントを提供した。スコアを適合させるため、様々な重み付けを割当てて、二次構造の関係性を強化した。記号「α」および「β」にマッチしたときはスコア２を、「Ｙ」、「Ｗ」、「Ｆ」、「Ｎ」にマッチしたときはスコア１を、ミスマッチのときはペナルティとしてスコア−１を割当てた。主要な残基を同定するため、さらなる相関アラインメントにより、最高スコアを示すと予測される二次構造を選択した。
【００６３】
（Ｃ）モデル構築 
【００６４】
ＲｏＧＡＣＢＭ２１の分子モデルは、テンプレートとしてＡｎＧＡＣＢＭ２０の核磁気共鳴構造（ＰＤＢ ｃｏｄｅ １ＡＣ０（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ，Ｋ．，ら（１９９６）核磁気共鳴スペクトル測定法によるＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来グルコアミラーゼの顆粒状の澱粉結合ドメインの溶液構造。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９、９７０‐９８７）を用いて、タンパク質モデリングサーバーＳｗｉｓｓ Ｍｏｄｅｌ（Ｓｃｈｗｅｄｅ， Ｔ．， Ｋｏｐｐ，Ｊ．，Ｇｕｅｘ，Ｎ．およびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．（２００３）ＳＷＩＳＳ‐ＭＯＤＥＬ：自動タンパク質相同性モデリングサーバー。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１、３３８１‐３３８５）により作製した。ＡｎＧＡＣＢＭ２０には相当する残基が存在しなかったため、修飾されたシーケンスアラインメントに基づいて、ＲｏＧＡＣＢＭ２１モデル構造から残基１〜１３を削除した。ＤｅｅｐＶｉｅｗのＧＲＯＭＯＳ９６を実行することにより、このモデルのエネルギー最小化を行った。ＷｅｂＬａｂ ＶｉｅｗｅｒＬｉｔｅを用いて、分子グラフィックスを行った。
【００６５】
（Ｄ）磁気円偏光二色性
【００６６】
４５０‐Ｗキセノンアークランプを備えたＡｖｉｖ ｃｉｒｃｕａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（モデル２０２）に、磁気円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを記録した。長方形の石英ガラス製キュベット（２５℃および９６℃時のパス長０．１ ｃｍ、スキャン速度４ ｎｍ秒-１、バンド幅０．５ ｎｍ）において、波長２００〜２６０ ｎｍの遠紫外線スペクトル測定を行った。各スペクトルは連続３回のスキャンの平均とし、スペクトルのバッファを減算することで補正した。
【００６７】
（Ｅ）ＲｏＧＡＣＢＭ２１モデルの構築
【００６８】
ＣＢＭ２０、ＣＢＭ２１、ＣＢＭ２５、ＣＢＭ２６、ＣＢＭ３４、およびＣＢＭ４１の６つのＣＢＭファミリーはＳＢＤを含んでいるが、現在のところ構造が解明されているのはＣＢＭ２０、ＣＢＭ２５、ＣＢＭ２６、およびＣＢＭ３４のみである。これらの三次元構造は、免疫グロブリン様トポロジーを共有しているため（ＣＡＴＨ ｃｏｄｅ ２．６０．４０）（Ｐｅａｒｌ，Ｆら（２００５）ＣＡＴＨドメイン構造データベース、関連リソースＧｅｎｅ３Ｄ、ＤＨＳはゲノム解析に対し包括的なドメインファミリー情報を提供する。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３、Ｄ２４７‐２５１）、シーケンスの同一性が高くなくても、ＧＡのすべてのＳＢＤが同じ三次元構造を有すると提唱されている。
【００６９】
ＣＢＭ２１のシーケンスは以前解明されたＣＢＭ２０の構造との同一性レベルが高くないため、構造に基づく新規の多重シーケンスアラインメント戦略を用いて、トポロジーは同じであるが、シーケンスが異なるタンパク質同士を比較した。本試験で用いたＣＢＭ２１のＳＢＤシーケンスの二次構造は、当初は、共通二次構造予測サーバーＪｐｒｅｄおよびＮＰＳＡを用いて予測した。これらのサーバーは、多数の二次構造予測法を用いて共通結果を構築する。ＡａＧＡＣＢＭ２１を除く全ＣＢＭ２１のＳＢＤの二次構造の共通構造から、ＡａＧＡＣＢＭ２１では８個のβストランドがＣＢＭ２０の構造的特徴と一致していて、７番目のβストランドがαヘリックスと置き換わっていることが明らかになった。図７Ａは、ＣＢＭ２０およびＣＢＭ２１ファミリーの構造に基づく多重シーケンスアラインメントの結果を示す。芳香族残基および二次構造要素の大半は配列されていないと考えられたが、ＣＢＭ２１に保存されている芳香族残基Ｔｙｒ１６、Ｔｙｒ３３、Ｔｒｐ４７、およびＴｙｒ８６は、ＡｎＧＡＣＢＭ２０の主要なリガンド結合残基Ｔｙｌ５２７、Ｔｒｐ５４３、Ｔｙｒ５５６、およびＴｒｐ５９０の近傍に存在していた。ＲＭｏＧＡＣＢ２１において可能性のあるリガンド結合残基を他にも同定しようとして、ＰＳＳＣアルゴリズムを用いて構造に基づく多重シーケンスアラインメントを求めた。αヘリックスおよびβストランドの相対的な構造からだけでなく、リガンド結合に関与してテンプレートと同等の機能を維持するループ領域上の主要な残基からも、強力に相関する結果が得られるとの仮説を立てた。図７Ｂに示したとおり、相対的な位置および長さの観点から言えば、二次構造要素の配列は良好であり、また、ＲｏＧＡＣＢＭ２１の８個の芳香族残基は、ＡｎＧＡＣＭＢ２１において相当する残基とともに保存された。
【００７０】
リガンド結合に関与すると考えられる芳香族残基について、構造に基づくシーケンスアラインメント（図８A）によりさらに検討したが、このシーケンスアラインメントはＰＳＳＣとＣｌｕｓｔａｌＸを組み合わせて作製した。この結果から、ＲｏＧＡＣＢＭ２１において可能性のあるリガンド結合残基（Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ４７、Ｔｙｒ５８、Ｔｙｒ６７、Ｔｙｒ８３、Ｔｙｒ９３、およびＴｙｒ９４）がいくつか確認された。ＡｎＧＡＣＢＭ２０に従って、１４〜１０６にわたる残基からＲｏＧＡＣＢＭ２１の分子モデル（図８Ｂ左パネル）を作製した。重なった主原子（３５６原子）の二乗平均平方根は１．３８Åであり、このモデルがテンプレート構造に非常によく適合していることを示している。ＡｎＧＡＣＢＭ２０の構造および２つのリガンド結合部位（図８Ｂ右パネル）から判断して、われわれはＲｏＧＡＣＢＭ２１のリガンド結合残基を２つの部位、つまり部位Ｉ（Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ５８およびＴｙｒ６７）と部位ＩＩ（Ｔｒｐ４７、Ｔｙｒ８３、Ｔｙｒ９３およびＴｙｒ９４）に分類することが可能で、側鎖に位置するＴｙｒ５８およびＴｙｒ９４はＲｏＧＡＣＢＭ２１の構造内部に向っていてリガンド結合に関与していないとの仮説も立てた。
【００７１】
ＲｏＧＡＣＢＭ２１モデルは、三重のβシートおよび五重のβシートを含む（図８Ｃ左パネル）。この２種類のβシートはβストランドおよび位相的構成（１↓２↑５↓）と（４↑３↓６↑７↓８↓）を有する逆平行のβストランドからなる。ＲｏＧＡＣＢＭ２１のβストランド２〜８は、ＡｎＧＡＣＭＢ２０のβストランド１〜７に重なると考えられ（図８Ｃ右パネル）、ＲｏＧＡＣＢＭ２１の１番目のストランドは、逆方向ではあるが、ＡｎＧＡＣＢＭ２０の８番目のβストランドに重なる可能性が考えられた。
【００７２】
（Ｆ）全βストランドの二次構造
【００７３】
未変性状態のＲｏＧＡＣＢＭ２１のＣＤスペクトル(図９）のトラフ値は２１５ ｎｍであり、βストランドのみを含むタンパク質の典型である。これは、ＲｏＧＡＣＢＭ２１がらせん構造を含んでいないことと、βストランド構造とランダムコイル構造のどちらも高次元構造全体に著明に貢献していることを示唆している。この観察結果は、澱粉結合ＣＢＭの二次構造予測および一般的な全βストランド構造の結果と一致している。スペクトルには約２３０ ｎｍのピークも含まれていて、これはある種の炭水化物結合ドメインには珍しい特徴であるが、これらのドメインでは、ジスルフィド結合や、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンの芳香族側鎖により、スペクトルのピークが正の楕円率となると考えられる（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｍ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｒ．Ｎ．，Ｓｈａｒｅｃｋ，Ｆ．，Ｍｏｒｏｓｏｌｉ，Ｒ．，Ｋｌｕｅｐｆｅｌ，Ｄ．，Ｄｕｐｏｎｔ，Ｃ．およびＭｃＥｌｈａｎｅｙ，Ｒ．Ｎ．（２００３）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ由来キシラナーゼＡの熱変性に関する示差走査熱量測定、磁気円偏光二色性スペクトル、およびフーリエ変換赤外分光法による特徴付け。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ５０、３４１‐３５４）。ＲｏＧＡＣＢＭ２１は１８個の芳香族残基を含むがシステインは認められない（図８Ａ）。これはピークが約２３０ ｎｍの正の楕円率であることの原因が芳香族残基である可能性を示唆している。
【実施例７】
【００７４】
（Ａ）特定部位の突然変異誘発
【００７５】
ＲｏＧＡＢＭＣ２１の突然変異はいずれも、ＰＣＲに基づくＱｕｉｃｋＣｈａｍｇｅ特定部位の突然変異誘発法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、テンプレートとしてｐＥＴ‐ＲｏＧＡＣＢＭ２１を、そして任意の突然変異を含む２つの相補プライマーとＰｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とを用いて作製した。各突然変異プラスミドのシーケンスを検証して、ＰＣＲ誘発性の突然変異がさらに導入されていないことを確認した。すべての構築物を形質転換の受容性のあるＥ ｃｏｌｉ ＢＬ２１‐Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）へ形質転換して、タンパク質を発現させた。
【００７６】
（Ｂ）野生型および変異型ＲｏＧＡＣＢＭ２１のＵＶの差スペクトル 
【００７７】
全スペクトルは、２７０〜３００ ｎｍ、バンド幅０．５ ｎｍにおいて、紫外可視分光計（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｕ‐３３１０）を用いて得た。３０ μＭの野生型または変異型ＲｏＧＡＣＢＭ２１のスペクトルは、２５℃で、ｐＨ５．５、５０ ｍＭの酢酸ナトリウムに入れ、βシクロデキストリン（βＣＤ）（Ｓｉｇｍａ）の有無によって記録した。タンパク質のみのスペクトルをタンパク質リガンドスペクトルから減算して算出した各差スペクトルを用いて、モデル化合物Ｎ-アセチルトリプトファン（５０ μＭ）（Ｓｉｇｍａ）およびＮ‐アセチルチロシン（１００ μＭ）（Ｓｉｇｍａ）（２０％ＤＭＳＯにて摂動）の差スペクトルと比較した。
【００７８】
（Ｃ）Ｎ‐ブロモスクシンイミド（ＮＢＳ）によるトリプトファン残基の化学修飾 
【００７９】
長方形の石英ガラス製キュベット（パス長１ ｃｍ、２５℃）において、５００ μＭのβＣＤまたは変性剤（尿素８ Ｍ）の存在下で、ＮＢＳ（1 ｍＭを新たに調製）（Ｓｉｇｍａ）を用いて、未変性の野生型およびＷ４７ＡのＲｏＧＡＣＢＭ２１タンパク質（酢酸ナトリウム５０ μＭ中３０ μＭ、ｐＨ５．５）を滴定することにより、トリプトファン残基の酸化を行った。各滴定時に混合物を３分間インキュベートし、紫外可視分光計を用いて２８０ ｎｍ時の吸光度を記録した。滴定過程は、２８０ ｎｍ時の吸光度の減少傾向が止む、あるいは上昇し始めるまで継続した。ＮＢＳにより酸化されたトリプトファン残基の数を、吸光法を用いて計算した（Ｓｐａｎｄｅ，Ｔ．Ｆ．およびＷｉｔｋｏｐ，Ｂ．（１９６７）Ｎ‐ブロモスクシンイミドによるタンパク質のトリプトファン含量の測定。Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１１，４９８‐５０６）。
【００８０】
（Ｄ）テトラニトロメタン（ＴＮＭ）によるチロシン残基の化学修飾 
【００８１】
Ｓｏｋｏｌｏｖｓｋｙら（１９６６）（テトラニトロメタン。タンパク質中のチロシル残基のニトロ化用試薬。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５、３５８２‐３５８９）による報告のとおり、ＴＮＭを用いてチロシン残基のニトロ化を実施した。ＲｏＧＡＣＢＭ２１（Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ１００ ｍＭ中１０ μＭ、ｐＨ８．０）を２５℃で１８０分間ＴＮＭ（９５％エタノール中１ ｍＭ）に添加して、紫外可視分光計を用いて４２８ ｎｍ時の吸光度をモニタリングした。ＴＮＭにより酸化されたチロシン残基の数を、３‐ニトロチロシンのモル吸光係数４，１００ Ｍ−１ｃｍ−１を用いて計算した。
【００８２】
（Ｅ）ＲｏＧＡＣＢＭ２１における２個のトリプトファン残基の異なる役割 
【００８３】
ＮＢＳを使用して、ＲｏＧＡＣＢＭ２１の表面上で作用を受けたトリプトファン残基の数についてさらに評価した。ＲｏＧＡＣＢＭ２１におけるトリプトファン残基に対するＮＢＳの修飾を、２８０ ｎｍ時の吸光度の減少を記録することによりモニタリングした（図１０Ａ）。未変性ＲｏＧＡＣＢＭ２１のＡ２８０の減少は、ＮＢＳとタンパク質の比率が２．５の時に増加し始めた。このようにＮＢＳにより誘発される２８０ ｎｍ時の吸光度の増加は、チロシン残基の酸化後に観察されるのが一般的である（Ｂｒａｙ，Ｍ．Ｒ．，Ｃａｒｒｉｅｒｅ，Ａ．Ｄ．およびＣｌａｒｋｅ，Ａ．Ｊ．（１９９４）タンパク質における４次微分分光法によるトリプトファン残基およびチロシン残基の定量化。Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２１、２７８‐２８４）。しかし、尿素溶液中のチロシン残基はＮＢＳにより修飾されなかったため、変性ＲｏＧＡＣＢＭ２１のＡ２８０は増加しなかった（Ｓｏｋｏｌｏｖｓｋｙら（１９６６））。図１０Ａに示したとおり、未変性および変性ＲｏＧＡＣＢＭ２１の修飾トリプトファン残基の数は、それぞれ１．６および２．０と算出された。未変性および変性という条件下では、ＲｏＧＡＣＢＭ２１に存在するトリプトファン残基の中で修飾され得るのは２個のみであり、このＴｒｐ４７とＴｒｐ７０のどちらもタンパク質表面上で作用を受ける可能性のあることが示されている。
【００８４】
２つのＴｒｐ残基がリガンド結合部位内に存在しているかどうかを確認するため、リガンドβＣＤの存在下でＮＢＳによる酸化を実施した。未変性ＲｏＧＡＣＢＭ２１およびβＣＤのプレインキュベーションにより、Ｔｒｐ残基１個が酸化から明らかに保護された（図１０Ａ）が、これはβＣＤ結合に関与するトリプトファン残基が１個のみであることを示唆している。
【００８５】
さらにどのトリプトファン残基がリガンド結合部位に存在するのか探るため、Ｔｒｐ４７とＴｒｐ７０の両方を個々にアラニンへ突然変異させた。Ｗ４７Ａ変異体はＥ．ｃｏｌｉに発現し、ここから精製された。しかし、Ｗ７０Ａ変異体の溶解性は試験したあらゆる発現条件下で非常に乏しかったことから、ＲｏＧＡＣＢＭ２１の正確な折りたたみにはＴｒｐ７０が極めて重要であることが示唆された。未変性Ｗ４７Ａ変異体をＮＢＳで処理したところ、その結果はβＣＤ存在下で試験した野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１の結果と一致した（図１０Ａ）。これによりＴｒｐ４７が主要なリガンド結合残基であることが強く示唆された。この結果は、野生型および変異型ＲｏＧＡＣＢＭ２１のＵＶの差スペクトルによっても確認された（図１０Ｂ）。このＵＶの差スペクトルは５００ μＭのβＣＤを用いて摂動し、次に２０％ＤＭＳＯを用いて摂動したモデル化合物Ｎ‐アセチルトリプトファンおよびＮ‐アセチルチロシンと比較した。２７７、２８５、および２９３ ｎｍ付近に３つのピークを有する野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１のスペクトル（図１０Ｂ、ｃ線）は、トリプトファンおよびチロシンの摂動スペクトルと類似していた（図１０Ｂ、ａ線およびｂ線）が、これによりＲｏＧＡＣＢＭ２１においては摂動されたトリプトファン残基およびチロシン残基がリガンド結合部位に存在することが示唆された。Ｗ４７Ａの差スペクトル（図１０Ｂ、ｅ線）は小さく、ベースラインスキャン時と実質的に同じであることから、Ｔｒｐ４７残基は可溶性のリガンド結合に関与することが明らかになった。これらのデータは、可溶性リガンドとの結合においてＴｒｐ４７が重要な役割を果たしていることと、Ｔｒｐ７０が構造の維持に不可欠であることを示唆している。
【００８６】
（Ｆ）リガンド結合に関する主要なチロシン残基の同定
【００８７】
ＲｏＧＡＣＢＭ２１においてＴＮＭを用いてチロシン残基をニトロ化し、ニトロ化チロシン（３‐ニトロチロシン）のモル吸光係数を用いて表面上で作用を受けたチロシン残基の数を計算した（図１０Ｃ）。全チロシン残基１２個中６個を超えるＴＮＭによりニトロ化された。これによりチロシンの５０％以上が表面上で作用を受け、可能性のあるリガンド結合部位に寄与していると考えられることが示唆された。ＲｏＧＡＣＢＭ２１に存在する重要なチロシン残基についてさらに検討するため、個別にアラニンを代用した。
【００８８】
野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１、トリプトファン変異体（Ｗ４７Ａ）、およびチロシン変異体（Ｙ３２Ａ、Ｙ５８Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ８３Ａ、Ｙ９３ＡおよびＹ９４Ａ）において定性的結合アッセイを実施し、可能性のあるリガンド結合残基の数および位置を探った。図１１に示したとおり、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ４７、Ｔｙｒ６７、Ｔｙｒ８３、およびＴｙｒ９３をアラニンと置き換えることにより、不溶性澱粉との結合が著明に減少した。予想どおり、変異体Ｙ５８ＡおよびＹ９４Ａでは変化は認められなかった。これらの結果から、ＲｏＧＡＣＢＭ２１の三次元モデルのみに基づくわれわれの仮説の妥当性が証明された。しかし、Ｙ６７Ａ、Ｙ８３Ａ、およびＹ９３Ａの可溶性はその他の異性体よりかなり低く、Ｔｙｒ６７、Ｔｙｒ８３、およびＴｙｒ９３もＲｏＧＡＣＢＭ２１構造の安定化に重要であることが示された。したがって、これらの残基に関与する可溶性の二重変異体は認められなかった。したがって、以後の試験ではＴｙｒ３２およびＴｒｐ４７に焦点をしぼった。
【００８９】
変異体Ｙ３２Ａと野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１のＵＶの差スペクトル(図１０Ｂ、ｄ線）に顕著な差は認められず、結合部位ＩがβＣＤ結合に関与していないことが示された。ダイレクトシーケンスアラインメントから推測された推定上の結合残基Ｔｙｒ１６およびＴｙｒ８６は、可溶性リガンド（図１０、ｆ線およびｇ線）および不溶性リガンド（図１１）のどちらに対する結合にも関与していないことには注意を払うべきである。
【実施例８】
【００９０】
（Ａ）不溶性澱粉との結合の定性的測定 
【００９１】
野生型および変異型ＲｏＧＡＣＢＭ２１（１６ μＭ、１００ μｌ）をｐＨ５．５、５０ ｍＭの酢酸ナトリウムに入れ、それぞれ不溶性澱粉０．１ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）と混和し、その混合液を２５℃で軽く攪拌しながら５時間インキュベートし、続いてその不溶性澱粉を４℃で１３，０００ ｇ、２分間の遠心によりペレット化した。１５％ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりそのペレット（結合画分）および上清（非結合画分）を解析した。アッセイ期間中に沈殿が生じていないことを確認するために、不溶性澱粉を含まないタンパク質を対照として含めた。
【００９２】
（Ｂ）不溶性澱粉との結合の定量的測定 
【００９３】
飽和結合アッセイとして、澱粉結合等温線を解析した。野生型および変異型ＲｏＧＡＣＢＭ２１（ｐＨ５．５の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム中１００ μｌ）をあらかじめ洗浄した不溶性澱粉０．１ ｍｇとそれぞれ混和し、２５℃で軽く攪拌して１６時間インキュベートした。４℃で１６，０００ ｇ、１０分間の遠心後、ＢＣＡアッセイを用いて上清（非結合タンパク質）のタンパク質濃度を測定し、最初のタンパク質濃度と非結合タンパク質濃度との間の差から結合タンパク質量を計算した。結合タンパク質（Ｂｍａｘ）の解離定数（Ｋｄ）および最大量は、標準的な単一部位結合モデルを用いて非線形回帰を示す結合等温線にあてはめることにより算出した。
【００９４】
（Ｃ）可溶性多糖との結合の定量的測定 
【００９５】
野生型および変異型ＲｏＧＡＣＢＭ２１の可溶性多糖（Ｓｉｇｍａ）との結合について、蛍光分光法で内在性タンパク質の蛍光強度の変化を測定することにより記録した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ‐５５分光計を用いて、２５℃で、ｐＨ５．５の５０ ｍＭ酢酸ナトリウム中で実験を行った。環状構造および鎖状構造の炭水化物（２〜２０ ｍＭ）をＲｏＧＡＣＢＭ２１（１０ μＭ、２ ｍｌ）に滴定し、励起波長を２８０ ｎｍに固定して３５０ ｎｍ時の蛍光スペクトルをモニタリングした。リガンド濃度に対する蛍光強度の相対的変化をプロットし、単一の結合部位に関する適切な方程式を用いて、そのデータを擬似曲線に当てはめた。
【００９６】
（Ｄ）データ解析
【００９７】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、速度および親和性のパラメータに関するデータ解析を実施した。
【００９８】
（Ｅ）異なるリガンド特異性を有する２つの結合部位 
【００９９】
精製ＲｏＧＡＣＢＭ２１の平衡澱粉結合等温線データを非線形回帰曲線に当てはめた（図１２）。単一の結合部位飽和結合に関する２パラメータモデルにより算出されたＲｏＧＡＣＢＭ２１の結合パラメータＫｄおよびＢｍａｘは、それぞれ１．４３±０．１４ μＭおよび４１．１４±１．０５ μｍｏｌ ｇ−１であった（表１）。しかし、改変されたＡｎＧＡＣＢＭ２０（３．２±０．９ μＭ）およびタンパク質分解により作製されたＡｎＧＡＣＢＭ２０（１２．７±０．５ μＭ）の解離定数（Ｐａｌｄｉ，Ｔ．，ら（２００３）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ Ｂ１のグルコアミラーゼ澱粉結合ドメイン：分子クローニングおよび機能的特徴付け。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７２、９０５‐９１０およびＢｅｌｓｈａｗ，Ｎ．Ｊ．ら（１９９０）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来グルコアミラーゼ１の顆粒状の澱粉結合ドメインの作製および精製。ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ。２６９、３５０‐３５３）は、それぞれ約２倍および１０倍高かった。さらに、改変されたＡｎＧＡＣＢＭ２０（０．５６ μｍｏｌ／ｇ）およびタンパク質分解により作製されたＡｎＧＡＣＢＭ２０（１．０８±０．０２ μｍｏｌｇ−１）のＢｍａｘ値は、それぞれＲｏＧＡＣＢＭ２１より７０倍および４０倍低かった。リガンド結合能は、アミロペクチンとアミロースとの様々な比率、澱粉粒のサイズおよび形状、あるいはその澱粉が緩衝液中にどのくらいの期間存在するかに左右される膨張効果の影響を受ける可能性があることに注意を払うべきである。
表Ｉ．不溶性澱粉に関して脱着等温線により算出されたＲｏＧＡＣＢＭ２１誘導体の親和性
【０１００】
【表１】
0005494986.tif 000004
【０１０１】
定量的結合等温線およびスキャッチャード解析（図１２および表Ｉ）により、両変異体の不溶性澱粉の結合能が野生型に対して約５０％まで減少したことが明らかになった。Ｙ３２Ａ変異体およびＷ４７変異体の結合親和性は野生型とほぼ同じであり、Ｙ３２Ａ／Ｙ４７Ａ二重変異体の不溶性澱粉との結合はほぼ完全に失われた。可溶性リガンドとの定量的結合データを表ＩＩに示す。環状炭水化物について、βＣＤ（Ｋｄ＝５．１±０．７ μＭ）に対する野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１の親和性は、γＣＤ（Ｋｄ＝８．３±１．５ μＭ）に対する親和性よりもやや強く、αＣＤ（Ｋｄ＞３００ μＭ）に対する結合は比較的乏しかった。直鎖状炭水化物について、野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１のＫｄ値はリガンドの長さが増加するとともに減少した。これらの結果から、結合部位に存在する芳香族側鎖間の距離および配位がＲｏＧＡＣＢＭ２１とのリガンド結合における重要な決定因子であることが示された。したがって、環状炭水化物との結合はリガンドの表面のラジアンに依存し、直鎖状炭水化物との結合はリガンドの長さに支配されていた。α‐１，６‐グリコシド結合を有するリガンドについて、ＲｏＧＡＣＢＭ２１のイソマルトトリオースに対する親和性（Ｋｄ＝３．８±０．７μＭ）は、α‐１，４‐グリコシド結合を有する可溶性リガンド結合よりも強力であり、どちらかと言えばＲｏＧＡＣＢＭ２１はこの澱粉の分枝に結合する可能性があることが示唆された。
【０１０２】
本試験で使用した可溶性炭水化物に対するＷ４７Ａ変異体の親和性はあまりに低かったため、蛍光滴定のスペクトルにより測定することもできず、アラニンと置き換えることによる実質的な影響を受けることもできなかった。この結果は、実際にはＴｒｐ４７が可溶性および不溶性の両リガンドとの結合に関与する重要な残基であることを示唆している。Ｙ３２Ａ変異体および野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１は様々なシクロデキストリンに対する親和性がほぼ同じであることが示され、Ｔｙｒ３２がシクロデキストリンとの結合に関与していないことが確認された。さらに、直鎖状少糖類の長さがＹ３２Ａとの結合に及ぼす影響は、野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１に対して比較的小さかった。このことは、結合部位ＩがＲｏＧＡＣＢＭ２１とより長い直鎖状少糖類との結合を促進する可能性があることを示唆している。
表ＩＩ．蛍光滴定のスペクトルにより算出された可溶性少糖類に対するＲｏＧＡＣＢＭ２１誘導体の親和性
【０１０３】
【表２】
0005494986.tif 000005
【０１０４】
同等の結合親和性を持つ２つの結合部位を有する澱粉結合ＣＢＭ２０とは違って（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．ら（１９９７）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ１澱粉結合ドメインにおいて保存されるトリプトファンの機能。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３６、７５３５‐７５３９およびＧｉａｒｄｉｎａ，Ｔ．ら（２００１）Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼの澱粉結合ドメインの両結合部位はアミロースの立体配座を変化させるのに重要である。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１３、１１４９‐１１５９）、ＲｏＧＡＣＢＭ２１は異なる結合特異性を有する２つの結合部位を含んでいるが、このことは、炭水化物‐タンパク質を認識するにあたって、各結合部位が、異なってはいるが、協力的な役割を果たしていることを示唆している。結合部位ＩＩは可溶性および不溶性リガンドの重要な結合部位であり、結合部位Ｉは長鎖炭水化物と関連してＲｏＧＡＣＢＭ２１を補助する。
【実施例９】
【０１０５】
本発明の方法を適用して、ＣＢＭ２０モジュールおよびＣＢＭ２１モジュールを含む酵素およびタンパク質を予測することができた。ＧｅｎＢａｎｋを検索してｃｇｔＢａｃｍａ２を除く全シーケンスを取り出した（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ３１８３５）。以下のように、これらの酵素およびタンパク質のリガンド結合部位として予測される残基Ｙ、Ｗ、およびＦに下線を引いた。
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gmYAspka/537-633 AVAVTFDLTA TTTYGENIYL VGSISQLGDW ETSDGIALSA DKYTSSNPLW YVTVTLPAGE SFEYKFIRVE SDDSVEWESD PNREYTVPQA CGESTAT 
gmYAspni/538-634 AVAVTFDLTA TTTYGENIYL VGSISQLGDW ETSDGIALSA DKYTSGDPLW YVTVTLPAGE SFEYKFIRIE SDDSVESWESD PNREYTVPQA CGTSTAT
gmYAspor/511-606 TVSVTFAVKA TTVYGESIKI VGSISQLGSW NPSSATALNA DSYTTDNPLW TGTINLPAGQ SFEYKFIRVQ NGAVTWESDP NRKYTVPSTC GVKSAV
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【実施例１０】
【０１０６】
原線維の形成
【０１０７】
実施例１で作製したＳＢＤ‐６Ｈを９７℃まで加温し、室温で放冷した（加温速度：２℃／分）。その試料を３７℃で２日間インキュベートした。熱誘起アミロイド様ＳＢＤ‐６Ｈ原線維を含む試料をグリッド上に３０分間滴下した。試料を４％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで５分間染色し、次にそのグリッドを風乾させてから透過型電子顕微鏡を用いて解析した。図１３に示したとおり、ＳＢＤ‐６Ｈの原線維が作製された。
【０１０８】
代替案として、Ｙｅｎ‐Ｃｈｕｎｇ ＣｈａｎｇおよびＣｈｉｎ Ｙｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７７、Ｎｏ．２１、５月２４日発行ｐｐ１９０２７‐１９０３６、２００２で開示された内容に従って、アミロイド様原線維形成を作製することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】澱粉を用いたＳＢＤ−６Ｈの精製を示す。精製ＳＢＤ−６ＨをＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１５％ゲル）にかけ、そのゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ＢｌｕｅＲ‐２５０で染色してタンパク質を検出する。レーン１は分子量の基準（左に表示した分子量）、レーン２はコーンスターチにおいて精製されたＳＢＤ−６Ｈが２マイクログラムのときのもの。
【図２】ｐＨが結合能および安定性に対して及ぼす効果を示す。実験セクションで詳述したとおり、様々なｐＨ時のＳＢＤ−６Ｈの結合能（●）および安定性（○）に対する効果を測定する。ｐＨ５のときに測定されたＳＢＤ−６Ｈの相対的結合能を１００％として基準とする
【図３】不溶性澱粉を用いたときのＳＢＤ−６Ｈの吸収率を示す。様々な濃度（■１５．６μＭ、▲２２．５μＭ、●２７．２μＭ）の時のＳＢＤ−６Ｈをコーンスターチに５時間適用することにより、ＳＢＤの会合定数を分析する。異なる時点での最初のタンパク質濃度と非結合タンパク質濃度との間の差から結合タンパク質を計算し、会合定数を算出する。
【図４】ＳＢＤと澱粉の相互作用によるＫｄおびＢｍａｘ算出。様々なタンパク質濃度の時に、顆粒状のコーンスターチを用いて澱粉結合アッセイを実施する。１つの結合部位の飽和結合について、非線形回帰を示す結合等温線にあてはめることにより、ＫｄおよびＢｍａｘを算出する。
【図５】ＳＢＤ標識融合タンパク質の構築を示す。ｅＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ＳＢＤ：澱粉結合ドメイン、Ｋｍｒ：カナマイシン耐性遺伝子。
【図６】でんぷんを用いたＳＢＤ標識融合タンパク質の精製を示す。精製融合タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１５％ゲル）にかけ、そのゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０で染色してタンパク質を検出する。レーン１は分子量の基準（左に表示した分子量）、レーン２は可溶性画分、レーン３は溶出物。矢印Ｉ：ＳＢＤ−ｅＧＦＰ、矢印ＩＩ：ｅＧＦＰ、矢印ＩＩＩ：ＳＢＤ。
【図７】構造に基づく多重シーケンスアラインメントＣＢＭ２０およびＣＢＭ２１の比較。（Ａ）Ｒ．ｏｒｙｚａｅ（ＲｏＧＡＣＢＭ２１）、Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ（ＭｃＧＡＣＢＭ２１）、Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（ＡｎＧＡＣＢＭ２１）、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ α‐ａｍｙｌａｓｅ（ＬｋαＡＣＢＭ２１）、ヒトのタンパク質ホスファターゼ（ＨｓＰＰＣＢＭ２１）、およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡＣＢ２０）におけるＳＢＤを有する構造に基づく多重シーケンスアラインメント。その白、黒、およびグレーのセグメントは、それぞれ予測される二次構造要素であるループ、βストランド、およびαへリックスである。黒のＹ、Ｗ、およびＦは、それぞれループ領域のチロシン、トリプトファン、およびフェニルアラニンを示す。白のＹ、Ｗ、およびＦは、βストランドの芳香族残基である。（Ｂ）ＰＳＳＣアルゴリズムを用いた構造に基づくシーケンスアラインメントと、それぞれ図の上および下にＲｏＧＡＣＢＭ２１およびＡｎＧＡＣＢＭ２０の図式化されたシーケンスが記されている。βは、βストランドである。Ｎは、そのループ領域に芳香族残基が存在しないことを示す。ＡｎＧＡＣＢＭ２０における主要なリガンド結合残基は、二重下線により示す。（Ｃ）Ｒ．ｏｒｙｚａｅ（ＲｏＧＡＣＢＭ２１）、Ｍ．ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ（ＭｃＧＡＣＢＭ２１）、Ａ．ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ（ＡｎＧＡＣＢＭ２１）、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ ｋｏｎｏｎｅｎｋｏａｅ α‐ａｍｙｌａｓｅ（ＬｋαＡＣＢＭ２１）、ヒトのタンパク質ホスファターゼ（ＨｓＰＰＣＢＭ２１）の三次元構造のシミュレートおよび推定上のリガンド結合部位と、二次構造および本発明のトポロジーマッピングによるテンプレートとしてのＡ．ｎｉｇｅｒ（ＡｎＧＡＣＢ２０）の既知の構造およびリガンド結合部位。
【図８】構造に基づくシーケンスアラインメントを用いたＲｏＧＡＣＢＭ２１の分子モデリングを示す。（Ａ）ＲｏＧＡＣＢＭ２１およびＡｎＧＡＣＢＭ２０のβストランドの位置はグレーの矢印で表示されており、それぞれシーケンスの上および下に記されている。下線部はＡｎＧＡＣＢＭ２０のリガンド結合部位である（結合部位Ｉ＿、結合部位ＩＩ＝）。ＲｏＧＡＣＢＭ２１において炭水化物結合に関与すると予測される芳香族残基はグレーで表示されている。（Ｂ）ＲｏＧＡＣＢＭ２１（左パネル）のモデリング構造およびＡｎＧＡＣＢＭ２０のテンプレート構造（右パネル、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ １ＡＣ０）をリボン図で示す。本モデルでは、ＲｏＧＡＣＢＭ２１の最初のβストランドを形成するＡｌａ１からＳｅｒ１３までのポリペプチドシーケンスは示さない。ＡｎＧＡＣＢＭ２０における特徴付けられたリガンド結合部位のリガンド（βＣＤ）および側鎖と、ＲｏＧＡＣＢＭ２１における考え得る結合部位も示す。（Ｃ）ＡおよびＢの方向性および構成と一致するグレーの矢印を用いて、ＲｏＧＡＣＢＭ２１およびＡｎＧＡＣＢＭ２０の二次構造の方向性および構成のトポロジーを示す。
【図９】遠紫外ＣＤによるＲｏＧＡＣＢＭ２１の二次構造の決定を示す。未変性ＲｏＧＡＣＢＭ２１（黒丸）の円二色性スペクトルを、２５℃、５０ ｍＭの酢酸ナトリウム中で実行する。
【図１０】ＲｏＧＡＣＢＭ２１誘導体の化学修飾およびＵＶの差スペクトルを示す。（Ａ）５００μＭのβＣＤが存在しない（黒四角）または存在する（白四角）ときの未変性野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１、５００μＭのβＣＤが存在しない（黒丸）または存在する（白丸）ときの変性野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１（黒三角）および未変性Ｗ４７Ａを、ＮＢＳを用いて滴定した。このデータを正規化し、各反応の元の吸光度を調節して１．０にした。（Ｂ）２０％ＤＭＳＯを用いて摂動したＮ−アセチルトリプトファン（５０μＭ）（ａ）およびＮ−アセチルチロシン（１００μＭ）（ｂ）の差スペクトルを用いて比較した。βＣＤを用いて摂動した野生型組換えＲｏＧＡＣＢＭ２１（ｃ）、Ｙ３２Ａ（ｄ）、Ｗ４７Ａ（ｅ）、Ｙ１６Ａ（ｆ）、およびＹ８６Ａ（ｇ）の差スペクトルを正規化してタンパク質濃度を等価にした。（Ｃ）野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １００ ｍＭ中１０ μＭ、ｐＨ８．０）を、２５℃で、タンパク質の１００倍以上のテトラニトロメタン共存下で滴定した。
【図１１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析のとおり、ＲｏＧＡＣＢＭ２１誘導体の不溶性澱粉との定性的結合を示す。ＲｏＧＡＣＢＭ２１の精製された野生型と、Ｙ１６Ａ、Ｙ３２Ａ、Ｗ４７Ａ，Ｙ５８Ａ、Ｙ６７Ａ、Ｙ８３Ａ、Ｙ８６Ａ、Ｙ９３Ａ、およびＹ９４Ａの変異体とを不溶性澱粉共存下でインキュベートし、遠心によりペレットを形成した。レーンＳは、不溶性多糖と結合しなかったタンパク質を示す。レーンＰは、不溶性多糖と結合したタンパク質を含む。
【図１２】脱着等温線による解析のとおり、ＲｏＧＡＣＢＭ２１誘導体の不溶性澱粉との結合を示す。ＲｏＧＡＣＢＭ２１誘導体の澱粉結合アッセイを、様々なタンパク質濃度で、不溶性コーンスターチ共存下で実施した。野生型ＲｏＧＡＣＢＭ２１（黒四角）、Ｙ３２Ａ（黒三角）、Ｗ４７Ａ（黒丸）、およびＹ３２Ａ／Ｗ４７Ａ（白四角）の結合等温線（左パネル）とスキャチャード解析（右パネル）
【図１３】電子顕微鏡下の澱粉結合ドメインにより形成された原線維。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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