(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の対象とする被分析物をマイクロ流体デバイスに導入する方法であって、
大容量リザーバ中の水性サンプルを提供する工程、ここで、前記大容量リザーバは第一の電極を備え、前記サンプルは被分析物を含有し、１０μｌより多い容量を有し、前記対象とする被分析物が荷電しているか荷電分子と結合している、
分析領域を含むマイクロ流体デバイスを提供する工程、ここで、前記マイクロ流体デバイスは分析領域及び第二の電極を備え、当該第二の電極は前記分析領域内又はその後ろに配置され、
コネクタを提供する工程、ここで、前記大容量リザーバ及び前記マイクロ流体デバイスはコネクタを介して流体的に連結され、
前記第一の電極と第二の電極の間に直流電圧を加えて、前記被分析物を前記大容量リザーバから前記コネクタを介してマイクロ流体デバイスに電気泳動させ、前記被分析物を前記分析領域に輸送する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記マイクロ流体デバイスに流体的に連結された大容量リザーバ内に少なくとも一つの他の水性サンプルを提供する工程を更に含み、前記他のサンプルのための少なくとも一つの他の分析領域を提供する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記大容量リザーバが、前記マイクロ流体デバイスと一体化されていないチャンバーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記大容量リザーバが、マイクロウェルプレートのウェル、エッペンドルフチューブ、又は試験管である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記コネクタがキャピラリーチューブである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
電気泳動前に前記サンプルに抗体を添加する工程を更に含み、前記抗体が前記対象とする被分析物と特異的に結合する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が少なくとも一つのイオン性部分で修飾されているか、又は少なくとも一つのイオン性部分と結合するように修飾されている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記イオン性部分が、核酸、ポリアミン、硫酸化グリカン及びスクシニル化タンパク質、ポリアクリル酸、ポリエチルアクリル酸、ポリプロピルアクリル酸、ポリブチルアクリル酸、ポリマレイン酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ポリ硫酸、ポリスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリマレイン酸のコポリマー、ポリヒドロキシブチル酸、及び混合ポリマーからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記被分析物が、イオン性部分に共有結合するか、又はイオン的に荷電した又はイオン的に荷電するように修飾されたキャリア分子に結合することにより荷電した分子と結合する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
前記キャリア分子が、抗体、レセプター、リガンド、及び抗原からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象とする被分析物が生体分子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体分子が、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質及び糖からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象とする被分析物が核酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析領域が、捕捉剤を含む捕捉部位を含み、前記方法が、対象とする被分析物が捕捉剤に捕捉される条件下で、被分析物を捕捉領域を横切って輸送する工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
前記被分析物が、分析領域に輸送されるとき、抗体又はイオン性部分に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記被分析物が抗体に結合し、かつ前記抗体が、荷電分子に共有又は非共有結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記被分析物が、大容量リザーバからマイクロ流体デバイスに輸送されるとき、（ｉ）荷電分子に共有又は非共有結合した抗体、又は（ｉｉ）イオン性部分に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記被分析物が、核酸、ポリアミン、硫酸化グリカン及びスクシニル化タンパク質、ポリアクリル酸、ポリエチルアクリル酸、ポリプロピルアクリル酸、ポリブチルアクリル酸、ポリマレイン酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ポリ硫酸、ポリスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリマレイン酸のコポリマー、ポリヒドロキシブチル酸、及び混合ポリマーからなる群から選択されるイオン性部分に結合する、請求項１５又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記イオン性部分が核酸である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記輸送が電気泳動による、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
捕捉剤により結合した被分析物を検出する工程を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルが、約２０μｌより大きな容量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルが、約５０μｌより大きな容量を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出が、抗体、被分析物、又はイオン性部分上のラベルを検出することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象とする被分析物を、電気泳動の前に、微粒子上に固定化する工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２６】
前記微粒子が磁気微粒子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記微粒子が、前記対象とする被分析物又は前記対象とする被分析物を含む分子のグループに特異的に結合するレセプター、抗体、又はアンチ-リガンドの少なくとも一つで被覆される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
電気泳動の前に、被分析物を微粒子から取り外す工程を更に含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
当該方法が、前記対象とする被分析物又は前記対象とする被分析物を含む前記分子のグループに結合した第二の抗体上のラベルを検出することを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
荷電しているか荷電分子と結合している被分析物を検出するためのマイクロ流体デバイスであって、
当該マイクロ流体デバイスは、前記被分析物を含有する水性サンプルを収容し、第一の電極を備え、１０μｌより多い容量を有する大容量リザーバとともに使用され、
ａ）前記大容量リザーバとコネクタを介して流体的に連結された少なくとも１つの分析領域と、
ｂ）前記分析領域内又はその後ろに配置された第二の電極とを備え、
前記電極間に直流電圧を加えて電界により前記被分析物が電気泳動して前記分析領域に輸送されるデバイス。
【請求項３１】
サンプル中の荷電した被分析物をマイクロ流体デバイスに導入するシステムであって、
第一の電極に動作可能に連結された少なくとも一つの大容量リザーバ；
少なくとも一つの分析領域を有し、第二の電極と動作可能に連結されたマイクロ流体デバイス；及び
荷電した被分析物が前記大容量リザーバから前記マイクロ流体デバイスに移動するための少なくとも一つのコネクタを備え、
前記大容量リザーバが前記マイクロ流体デバイスとコネクタを介して流体的に接続され、前記第二の電極が前記分析領域内又はその後ろに配置され、電極間に直流電圧を加えて生じた電界により前記被分析物が電気泳動して前記分析領域に輸送されるシステム。
【請求項３２】
前記少なくとも一つのコネクタがキャピラリーチューブである、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記分析領域が捕捉部位を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３４】
前記マイクロ流体デバイスがステージングリザーバをさらに備え、当該ステージングリザーバは前記大容量リザーバと前記分析領域との間に配置され、第三の電極を有し、
前記電極間に直流電圧を加えて生じた電界により、前記被分析物が前記第一の電極から前記第三の電極に、次いで前記第三の電極から前記第二の電極に電気泳動する、請求項３１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、2005年10月4日に出願された第60/723715号、2006年7月27日に出願された第60/820566号の米国仮出願に基づく利益を主張し、それらの内容は参考として本明細書に取り入れるものとする。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、サンプル中に低濃度で存在する被分析物のマイクロ流体工学及び検出に関する。
【０００３】
（背景技術）
マイクロ流体システムは、臨床実験の設計において大きな可能性を有している。しかしながら、これらのデバイスは、典型的には数マイクロリットル又はそれ以下のオーダーという極めて少量のサンプル容量に対しての収容能力しか持たないという事実によって制限されている。分析すべき物質がサンプル中に極めて低濃度でしか見出されない場合、感度は限られ得る。この制限を克服する一つの方法は、サンプルをマイクロ流体デバイスに導入する前又は後のいずれかに被分析物の濃度を増加させる被分析物の増幅工程を用いることによる。例えば、非常に少量の核酸は、ＰＣＲ等の方法を用いて増幅することができる。しかしながら、全ての被分析物が増幅可能ではなく、可能である場合でも、増幅は更なる試薬を必要とし、被分析物を複雑さを増大させる。大量のサンプルからマイクロ流体フォーマットでアッセイされるべき被分析物を許容し、及び/又は増幅工程無しで被分析物を可能にする新たな方法は、臨床及び他の実験アッセイにとって価値があるであろう。本発明は、これ及び他の多くの必要性を満たすものである。
【０００４】
（発明の簡単な概要）
一態様において、本発明は、サンプル中の対象とする被分析物をマイクロ流体デバイスに導入又は適用するための方法を提供する。これは、１又はそれ以上の大容量リザーバ中の１又はそれ以上の水性サンプル、被分析物を含み、１０マイクロリットルより大きな容量を有するサンプル、及び対象とする被分析物は、荷電しているか、又はイオン性分子等の荷電分子とあるいは荷電したキャリアと結合している、を提供することによる。次の工程は、分析領域を含むマイクロ流体デバイスを提供する工程、１又はそれ以上のコネクタを提供する工程を含み、前記大容量リザーバ及び前記マイクロ流体デバイスはコネクタを介して流体的に連結され、そして、前記被分析物を前記大容量リザーバから前記コネクタを介してマイクロ流体デバイスに電気泳動し、さらに、前記分析領域における被分析物の濃度が大容量リザーバ及び／又はサンプル中より高い濃度になるのに十分な時間、前記被分析物を前記分析領域に輸送する工程を含む。大容量リザーバは、マイクロウェルプレートのウェル、エッペンドルフチューブ、又は試験管であってよい。大容量リザーバは、マイクロ流体デバイスと一体化されたウェルとすることもできる。コネクターはキャピラリーチューブとすることができる。本発明の一態様では、対象とする被分析物は、生体分子、例えばペプチド、タンパク質、核酸、脂質又は糖である。荷電分子と結合した被分析物は、例えば、イオン性部分に結合した被分析物又はイオン的に荷電した抗体に結合した被分析物である。
【０００５】
本発明の更なる態様では、サンプルは第一に抗体と混合され、抗体は対象とする被分析物と特異的に結合する。抗体は、少なくとも一つのイオン性部分で修飾することができる。あるいは、対象とする被分析物は、例えば、抗体又はイオン性部分で荷電するように修飾することができる。
【０００６】
更なる態様では、分析領域は捕捉部位であり、該方法は、被分析物を捕捉領域を横切って輸送する工程を更に含み、該捕捉部位は少なくとも一つの捕捉剤を含み、これにより対象とする被分析物が捕捉剤に捕捉される。捕捉領域上での移動は、電気泳動による場合もある。本方法は、捕捉剤によって結合した被分析物の検出を更に含む。捕捉剤は被分析物又はイオン性部位と結合できる。捕捉剤は抗体又は核酸であってよい。検出は、抗体、被分析物、又はイオン性部分上のラベルの検出を含む。
【０００７】
さらなる態様において、本方法は、ステージング(staging)リザーバ提供することを含み、前記大容量リザーバ及びステージングリザーバがコネクタを介して流体的に連結される。
【０００８】
本発明の一態様では、サンプルは約２０μｌからｍｌ、好ましくは５０μｌから２０ｍｌの容量を有する。あるいは、サンプルは約２０μｌを越える、好ましくは約５０μｌを越える容量を有する。
【０００９】
本発明の一態様では、対象とする被分析物は、電気泳動の前に微粒子に結合する。微粒子は磁気微粒子とすることができる。好ましくは、微粒子は、対象とする被分析物に特異的な少なくとも一つのレセプター、抗体、又は抗−リガンドで被覆される。本方法は、電気泳動に先立って、微粒子から被分析物を取り出す工程を含んでよい。抗体は、被分析物を認識できる。第二の抗体を提供することができ、被分析物の異なる部位に結合できる。検出は、第二の抗体上のラベルを検出することを含み得る。
【００１０】
更なる態様では、イオン性部位は、電気泳動の前の任意の工程で、間接結合を介して結合できる。間接結合は、アビジン／ビオチン結合とすることができる。
【００１１】
更なる態様は、サンプル中の荷電した被分析物をマイクロ流体デバイスに導入するシステムであって、第一の電極に動作可能に連結された少なくとも一つの大容量リザーバ；少なくとも一つの分析領域を有し、第二の電極と動作可能に連結されたマイクロ流体デバイス；及び荷電した被分析物が前記大容量リザーバから前記マイクロ流体デバイスに移動するための少なくとも一つのコネクタを備えるシステムである。前記少なくとも一つのコネクタがキャピラリーチューブである。前記マイクロ流体デバイスは、ステージングリザーバを含み、前記大容量リザーバが前記ステージングリザーバとコネクタを介して流体的に連通している。前記分析領域は捕捉部位を含む。本発明のシステムは、複数の大容量リザーバを含み、各々が別々のステージングリザーバと流体的に連通している。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
１．序論
マイクロ流体工学は、ナノリットル又はピコリットルのオーダーの容量の流体を取り扱うデバイス及びプロセスを設計し、製造し、そして使用する科学である。典型的には、マイクロ流体デバイスは、少なくとも一つに次元で１ｍｍ未満のサイズを持つ少なくとも一つのチャンネル又はベッセルを有する。このデバイスは、少なくとも一つに次元で０．５ｍｍ、０．２ｍｍ、又は０．１ｍｍ未満のサイズを持つ少なくとも一つのチャンネル又はベッセルを有していてもよい。マイクロ流体デバイスは、更にマイクロポンプ、バルブ、温度調節器、等を備えていてもよい。
【００１３】
マイクロ流体デバイスを形成する多くの方法及びアプローチが知られており、マイクロアセンブリ、バルクマイクロマシン法、表面マイクロマシン法、標準リソグラフ法、湿式エッチング、反応性イオンエッチング、プラズマエッチング、ステレオリソグラフィ及びレーザーケミカル三次元ライティング法、ソフトリソグラフィ法、モジュラーアセンブリ法、レプリカモールディング法、インジェクションモールディング法、熱モールディング法、レーザー研磨法、混合法、及び他の知られた方法を含む。当業者には、これらのアプローチの多くが、本発明の使用法に適用できることは明らかである。マイクロ流体デバイスの概説については、例えば、以下を参照されたい。Chovan, et al. "Microfabricated devices in biotechnology and biochemical processing" Trends Biotechnol. 2002 20:116-22; Anthony et al. "DNA array technology and diagnostic microbiology" Expert Rev. Mol. Diagn. 2001 1:30-8; Windman et al. "Microfluidics for ultrasmall-volume biological analysis" Adv. Chromatogr. 2003, 42:241-67; 及びNg et al. "Biochips beyond DNA: technologies and applications" Biotechnol Annu Rev. 2003, 9:1-149; Fiorini and Chiu, 2005, "Disposable microfluidic devices: fabrication, function, and application" Biotechniques 38:429-46; Beebe et al., 2000, "Microfluidic tectonics: a comprehensive construction platform for microfluidic systems." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13488-13493; Rossier et al., 2002, "Plasma etched polymer microelectrochemical systems" Lab Chip 2:145-150; Becker et al., 2002, "Polymer microfluidic devices" Talanta 56:267-287; Becker et al., 2000, "Polymer microfabrication methods for microfluidic analytical applications" Electrophoresis 21 :12-26; US 6,767,706 B2, 例えば、Section 6.8 "Microfabrication of a Silicon Device"; Terry et al., 1979, A Gas Chromatography Air Analyzer Fabricated on a Silicon Wafer, IEEE Trans, on Electron Devices, v. ED-26, pp. 1880-1886; Berg et al., 1994, Micro Total Analysis Systems, New York, Kluwer; Webster et al., 1996, Monolithic Capillary Gel Electrophoresis Stage with On-Chip Detector in International Conference On Micro Electromechanical Systems, MEMS 96, pp. 491496; Unger et al., 2000, Science 288:113-16; U.S. Pat. Nos. US 6,960,437 (Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices); Quake & Scherer, 2000, "From micro to nanofabrication with soft materials" Science 290:1536-40; Becker et al., 2000, "Polymer microfabrication methods for microfluidic analytical applications" Electrophoresis 21:12-26。また、当該分野では、マイクロ流体デバイスに適した微小電極が記載されている。また、当該分野では、タンパク質、核酸又は他の分子をデバイス（例えばマイクロ流体チャンネル）表面に固定化する方法が記載されている。
【００１４】
マイクロ流体デバイス（「チップ」と呼ばれることもある）は、化学的物質の分析、調製及び合成、細胞、タンパク質及び核酸の分析及び操作を含む様々なバイオメディカル及び製薬的用途で使用できる。微小化することの利点は、試薬消費の多大な削減、反応時間の短縮、及び大量の平行試験を用いた極めて高いスループットを含む。しかしながら、微小化の一態様は、これらの手法の感度を制限する重大な障害にもなる。マイクロ流体チップは、僅かな容量のサンプル溶液のみを取り扱い、容易に検出されるチップ上に適用される極めて小容量中に、被分析物分子が不十分になりうる。よって、増幅工程、例えばＰＣＲが、マイクロ流体デバイスで使用されるサンプルを取り扱うのに使用されることが多く、それはデバイスにサンプルが導入される前又は後である。しかし、コスト及び複雑さが増すという欠点も有し、ＰＣＲミスによる偽結果が生ずる可能性がある。幾つかのマイクロ流体デバイスは、チップの表面全体を流入するサンプル溶液に曝露することにより、幾分大きなサンプル量を受容するように設計されている。これにより、サンプルを受容するのに全チップ表面が使用されるので比較的大きなサンプル量が可能になるが、処理できるサンプルの容量はまだ限られている。さらに、このことにより一度に１つのサンプルを検出することに限られ、続けて試験するには別のサンプル溶液が必要となる。複数のサンプルを試験するためには、時間が浪費されるのみならず、サンプルとサンプルの相互汚染の危険という欠点も有している。
【００１５】
本明細書で開示される方法及び装置は、マイクロ流体デバイス上の低容量の制限を、被分析物材料の濃縮及び／又は輸送のコントロールをするために電気泳動を使用することによって克服し、反応又は分析を促進するために適用でき、典型的なチップフォーマットで使用できる。被分析物は、バッファー水溶液を通して電気泳動され、サイズ排除ゲル、粘性媒体、フィルター、生物学的シーブなどを使用しない。本方法は、チップ上の複数の特異的領域に複数のサンプルを適用することを可能にする。各サンプルは、分析用チップの異なる部分に別々に電気泳動されるので、別のサンプルは同一表面と接触することはない。このことは、相互汚染(cross-contamination)を減らすという利点を有する。
【００１６】
本発明は、大容量サンプルから１又はそれ以上の被分析物をマイクロ流体的分析するための方法及び装置を提供する。本明細書に開示する方法によりデバイスのサンプル容量収容能力が増加するので、そのデバイスを使用するアッセイにおける最小検出可能濃度（アッセイが信頼できる測定となる最低の被分析物濃度）が減少する。
【００１７】
本明細書で開示する方法及びデバイスは、研究者や臨床家が、大容量サンプルから被分析物を抽出し、被分析物を検出及び同定することを可能にする。本方法は、特定のタンパク質及びヌクレオチド配列を含む広範な分析での使用に適している。単一のチップで複数のサンプルを同時に分析する可能性に加えて、本方法の実施態様は、サンプルを濃縮リザーバ又はチップ上に連続して流動させることなく、大量のサンプルをチップ上に濃縮することを可能にする。
【００１８】
図１は、本発明の理解のために提示されるものである。図１は例示のためのみであり、如何なる態様でも本発明を限定するものではないと解される。図１に示したシステムは、大容量リザーバ(LVR)１００を備え、その中に被分析物を低濃度で願入するサンプルは導入でき、マイクロ流体デバイス（「チップ」と呼ばれることもある）６００と一体化されたステージングリザーバ３００、コネクタ２００を備え、該コネクタを通して大容量リザーバ中の被分析物がステージングリザーバに 電気泳動により輸送され、分析領域７００において被分析物が検出される。一般的には、分析領域はマイクロ流体チャンネルであり、それを通して被分析物含有流体が流通できる及び/又はそれがバッファー溶液を含み、それを通して被分析物を輸送できる。あるいは、分析領域は固定化した捕捉剤を含むウェル又はチャンバーであってもよい。幾つかの実施態様では、分析領域を取り囲むハウジング又は材料の少なくとも一部は透明であり、分析領域からのシグナル（例えば、蛍光発光）の検出を容易にする。コネクターについて、それを通して被分析物が分析領域に輸送される水性溶液は、一般的には、被分析物を分離するための排除ゲル、粘性媒体、フィルター、シーブなどを含まない。電極４００及び５００は、電極に電界がかけられたとき（即ち、一方の電極に正電荷がかけられ、他方の電極に負電荷がかけられたとき）、荷電した被分析物が溶液を通ってデバイスの適切な領域（例えば、ステージングリザーバ）に輸送されるように配置される。付加的な電極８００は、被分析物を分析領域７００に輸送するために任意に配置してもよい。幾つかの実施態様では、ステージングリザーバ電極５００は設けられない。電極は、LVR又はステージングリザーバと一体化できるし、サンプル又は他の溶液と接触するリザーバチャンバーに配置された外部電極でもよい。電源８００は、電気泳動に適した電流の任意の電力供給源である（簡単のため、図１において一つのLVRのみが電源に接続されている）。
【００１９】
分析領域は典型的に、デバイスの分析領域にえる基板に結合した「捕捉剤」を備えている。捕捉剤（以下に詳細に述べる）は、被分析物、キャリア分子、イオン性部分、又は被分析物に結合した他の分子と特異的に結合する薬剤である。捕捉剤の例は、抗体及びポリヌクレオチドを含む。典型的には、捕捉剤は分析領域の「捕捉部位」（少なくとも一つの捕捉剤、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは捕捉剤分子のアレイの結合により修飾されうるマイクロ流体デバイスの物理的表面）において固定化される。あるいは、他の実施態様では、分析領域は捕捉剤を含まず、サンプルは検出器を流通するときに分析（検出）される。
【００２０】
システムの作動において、サンプル溶液（例えば、被分析物を含有する水性液体、又は分散物）が、第容量リザーバ１００に導入される。大容量リザーバ、マイクロ流体デバイス６００と一体化されてもよいが、マイクロ流体デバイスと物理的に結合されておらず、又は一体化されずデバイスに結合も近くに配置されなくてもよい。例えば、大容量リザーバは、１又はそれ以上の別々の容器、例えば、限定されないが試験管、極微菌管、マイクロウェルプレートのウェル、組織培養ディッシュなどを含む、液体を収容するための様々な容器であってよい。大容量リザーバの液体収容能力は、約１０μｌから約１００ｍｌであり、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００又は少なくとも５０００マイクロリットルである。ＬＶＲの液体収容能力は、最も多くは、約１００μｌから約２ｍｌの範囲である。１又はそれ以上の大容量リザーバが単一のチップに結合していてもよい。幾つかの実施態様では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、２００、２５０又はそれ以上の大容量リザーバが、単一のデバイスに結合している。例えば、１００ウェルを持つマイクロタイタープレートが用いられる場合、大容量リザーバの数は１００でありうる。
【００２１】
本発明によれば、被分析物はコネクター２００を介してステージングリザーバ３００に電気泳動される。電気泳動とは、溶液中の荷電分子又は粒子が電界に応じて移動することである。被分析物の移動度は、（１）被分析物自体の全電荷及び/又は（２）被分析物に結合したイオン性部分の全電荷に基づいており、以下に詳細に説明する。全電荷は、分子が持つイオン性電荷の組み合わせであり、正、負又は中性でありうる。上記したように、被分析物は、サイズ排除ゲル、粘性媒体、フィルター、生物学的シーブなどを用いることなく、水性バッファー溶液を通って電気泳動されうる。本明細書で用いる文言「水性溶液を通る電気泳動」とは、サイズ排除媒体又はフィルターを使用しないことを意味する。
【００２２】
それを通して被分析物が移動するコネクター２００は、任意の形状を有してよく、被分析物に適合性で荷電した被分析物の移動及び/又は電気泳動を阻害しない任意の材料からなるものでよい。外部供給源又はチューブをマイクロ流体デバイスに接続する方法は知られており、本発明の接続に使用することができる。幾つかの実施態様では、コネクターは異なる寸法を持つ複数の領域を有する。大容量リザーバ及びステージングリザーバ又は分析領域の間を接続するために、コネクター２００は縮小する径を有してもよい。これは、縮小する又は異なる材料の直線状又はテーパー状のチューブ又はチャンネルを接続することにより形成できる。LVRがチップと一体化していない幾つかの実施態様では、コネクターの一部がチューブ部を含み、それを通して被分析物が大容量リザーバからマイクロ流体デバイスのチャンネルに輸送され、コネクターの一部はチップ上のマイクロ流体チャンネルを含み（「コネクターのマイクロ流体チャンネル部」）、被分析物がチャンネルを通してステージングリザーバ３００に輸送される。チャンネルは、例えば、良く発達しているエラストマーモールディング、フォトリソグウラフィ又はマイクロマシン法を用いて様々な形状及び寸法を持つように製造できる。一実施態様では、大容量リザーバはデバイスと一体化され、コネクター２００はマイクロ流体デバイスと一体化したマイクロ流体チャンネルである。
【００２３】
チューブについても、様々なサイズ及び材料から選択することができる。これらのタイプのコネクターを形成する方法の例は、例えば、For Douglas Smith, Engineering and Science, published by California Institute of Technology, 2003 volume LXVI, Number 2, page 8-18; Skelley AM et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jan 25;102(4):1041-6; Manz, A. and Becker, H., "Microsystem Technology in Chemistry and Life Sciences" published by Springer-Verlag, 1999に見出すことができる。チューブの例は、ステンレススチールチューブ、ニードル、プラスチック材料、例えばポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、テフロン（登録商標）、ポリ塩化ビニル、PEEK（商品名）又はPEEKsil（商品名）、フューズドシリカ 又はガラスを含む。好適なチューブは通常、数ミリメートルからミクロンの内径を有し、限定されないが、約10 mm, 9 mm, 8mm, 7mm, 6mm, 5mm, 4mm, 3mm, 2mm, 1mm, 0.5mm, 0.1mm, 90mm, 80mm, 70mm, 60mm, 50mm, 40mm, 30mm, 20mm, 10mm, 9mm, 8mm, 7mm, 6mm, 5mm, 4mm, 3mm,  2mm, 1mmを含む。コネクターの内径は5mmから50mmの範囲であることが多い。
【００２４】
ステージングリザーバ３００は、存在する場合は、マイクロ流体デバイスと一体化され、典型的には約0.1 plから約2 μlの収容能力を持ち、限定されないが1 plから1 μl, 及び10 plから0.5 μlを含む。ステージングリザーバは、デバイスの分析領域と流体的に連通し、適当なゲート又はバルブが開いたときに被分析物がステージングリザーバから分析領域に輸送されるようにされる。大容量リザーバとステージングリザーバの容量比は大きく変動できるが、幾つかの実施態様では、その比率は約100:1から1000:1であり、限定されないが、100:1以上、200:1以上、300:1以上、500:1以上、800:1以上、そして1000:1以上を含む。
【００２５】
大容量リザーバからステージングリザーバへの被分析物の輸送に必要な電界を発生させるために、電極が、そのような電界を発生するように設けられる。典型的には、電極は各リザーバ（即ち、LVR及びステージングリザーバ）に設けられる。LVRにおける電極の位置は変化してよいが、好ましくはコネクター２００の開口部から幾分の距離を置き、好ましくは開口部から最も遠い部位又は距離とする。電極は、電流がオンになり溶液が存在するときに回路が完成され、電気泳動のための電界を発生することのできる任意の方法で結合又は配置できる。例えば、限定されないが、電極はリザーバの液中に挿入することができる。あるいは、電極は、チャンバー又はマイクロ流体デバイスと一体化（例えば、リザーバ又はチャンバーの壁への組み込み）することができる。微小電極は当該分野で良く知られている(例えば、International Patent Publication WO04044575A2; Rongsheng et al., 2005, Anal. Chem 77:4338-47; Abad-Villar et al, 2005, Electrophoresis 26:3602-3608参照)。
【００２６】
さらに、デバイス又はシステムにおける電極の極性は、デバイスの作動中に変化しうる（例えば、負から正電荷）。荷電した被分析物は同類電荷の電極から逆電荷の電極に泳動する。よって、例えば、負に荷電した被分析物は、正電荷電極（アノード）を有するLVRから負電荷電極（カソード）を有するステージングリザーバへ向けて泳動する。次いで、被分析物は、LVR電極をオフにし、ステージング領域電極の極性を正に変化させ、分析領域内又はその後ろの電極をオンにすることにより、ステージングリザーバから分析領域に輸送され、被分析物は分析領域を横切るように輸送される。泳動速度は、電界の強さ、分子の全電荷、サイズ及び形状、そして分子が移動する媒体のイオン強度、粘性、及び温度にも依存する。
【００２７】
図２Ａ−Ｃは、本システムの他の実施態様を例示する。図２Ａは、被分析物がステージングリザーバ３００に蓄積される実施態様を示す。この実施態様において、マイクロ流体デバイス６００上の電極５００は、必要に応じて正から負にスイッチされる。例えば、負に荷電した被分析物がステージングリザーバ３００内に濃縮又は蓄積される場合、電極５００は正に荷電している。次に、被分析物を分析領域７００に電気泳動させるため、電極は負に荷電し、分析領域近くの電極８００は正に荷電する。図２Ｂは、被分析物がステージングリザーバ３００に蓄積されず、マイクロ流体デバイス上を分析領域７００を通って又はそこへ連続的に流通する実施態様を示す。図２Ｃは、大容量リザーバ１００がマイクロ流体デバイス６００と一体化され、コネクター２００によってステージングリザーバと接続される実施態様を示す。
【００２８】
被分析物を捕捉及び分析するのに使用される試薬は、マイクロ流体デバイスのチャンネル内に配置してよく（例えば、分析領域基板に固定化された捕捉剤）、被分析物とともに大容量リザーバから導入してもよく、チップ上に導入してもよい。例えば、試薬は、アッセイの任意の適切な時点で、周知の方法によりステージングリザーバ、分析領域、又はチャンネルに導入することができる。導入の方法は、デバイスの設計により変化しうる。例として、試薬は、分析領域と流体的に連通したインプットチャンナルを介して、インプットチャンネルと分析領域とを分離しているバルブを解放することにより導入される。
【００２９】
ＩＩ．被分析物
被分析物（又は「対象とする被分析物」）は、分子、分子又は粒子の複合体であり、本発明の方法及びデバイスを用いて測定又は検出される。上記したように、被分析物は全タイとして電荷を持ち及び/又は荷電分子と結合しているため、本明細書に記載されるように被分析物は電気泳動して濃縮される。一実施態様では、被分析物は、電荷を有する１又はそれ以上のイオン性部分と結合する。あるいは、被分析物は、荷電したキャリア分子、例えば、抗体、レセプター、リガンド、基質、又は抗原に結合することにより、荷電分子と結合しうる。キャリア分子は、元々荷電していてもよく、イオン性部分と結合することにより荷電してもよい。
【００３０】
被分析物の例は、限定されないが、タンパク質、タンパク質複合体、ウイルス、核酸、重金属、薬物、ステロイド、及び農薬、及び炭水化物を含む。好ましくは、被分析物は生体分子（細胞内、又は細胞により生成されるクラスの分子）、例えば、タンパク質、ペプチド、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）、糖類、脂質、糖脂質、糖タンパク質等である。被分析物の特別な例は、病原体、例えばウイルス又は細菌殻の生体分子、疾患に関連する生体分子、毒素、薬物、小分子、プリオン、変異を含む核酸、抗体及び抗原を含む。被分析物は、本発明の方法を用いて分析してもよいが、アッセイの条件（例えば、ｐＨ）下で全体として荷電している必要はない。ポリヌクレオチドは、それ自体が荷電している被分析物の例である。被分析物は、荷電していてもいなくても、少なくとも一つのイオン性部分と結合することにより、その電荷を増大させるように修飾されうる。例えば、被分析物は、イオン性部分を持つキャリア分子（例えば、核酸イオン性部分を持つ抗体）との結合により修飾できる。イオン性部分の例は以下に記載する。
【００３１】
ＩＩＩ．サンプル溶液及び前サンプル
本明細書で使用する「サンプル溶液」は、電気泳動の開始時に大容量リザーバ内に存在する被分析物含有液（即ち、「出発材料」）である。一般に、サンプル溶液は、被分析物を含む「前サンプル」を処理することにより生成される。そのような処理は、例えば、被分析物を部分的い精製又は濃縮し、電気泳動又はアッセイなどを阻害しうる不純物を除去するために実施される。特別な処理工程の例は、遠心分離（破片を取り除き、又はプレサンプルを分画する）、沈降、濾過、クロマトグラフィ、超音波処理、又は溶液中の被分析物をフリーにする他の任意のプロセスを含む。一実施態様では、処理は、被分析物が結合する用に処理されたビーズ、例えば磁気ビーズを用いて被分析物を濃縮することを含む。、さらに、試薬は、ｐＨ、イオン強度及び/又は溶液の組成を調整して電気泳動を促進するように添加され、例えば、緩衝剤、酸、塩基、又は塩が添加される。添加により、例えば、被分析物含有液を適当な溶液、例えば見ず又はバッファー（例えば（緩衝塩溶液）で希釈すること、被分析物を適当な溶液中に分散させること、固体（例えば、塩）を溶液中に溶解させること等を含む。さらに、サンプル溶液中の被分析物は、１又はそれ以上のイオン性部分、任意に１又はそれ以上のキャリア分子と結合することによって修飾してもよい。
【００３２】
被分析物の供給源は、任意の様々な材料であり、例えば、生物学的流体、細胞、又は組織、環境的サンプル（例えば、土壌又は水）又は合成製品であり得る。生物学的前サンプルは、例えば、血液、血清、膿脊髄液、尿、唾液、細胞抽出液、組織抽出液、組織培養液、細胞抽出液、頬剥離物、及び細菌又はウイルス培地を含む。前サンプルの他の例は、河川の水、食物処理液、製造された食物調製物、果実及び野菜抽出物、及び化粧品を含む。前サンプルは液体でも固体でもよい。固体の場合は、前サンプルは溶解され、液（例えば水性液体）中に可溶化又は懸濁され、不溶性材料は除去される。以下の表１は、例示のみであり何ら限定しないが、サンプル及び前サンプルの例を示す。
【００３３】
【表１】
0005592606.tif 000002
【００３４】
ＩＶ．被分析物とイオン性部分との結合
イオン性部分は、電荷を持つ分子構造である。イオン性部分はアニオン性（例えばポリアニオン性）又はカチオン性（例えばポリカチオン性）とすることができる。荷電分子の全電荷は、部分的に、環境、特にｐＨ及びサンプル溶液の塩濃度に依存すると解される。しかし、好ましくは、イオン性部分は、少なくとも＋５又は少なくとも−５の全電荷を持つ。イオン性部分は低又は中程度の電荷密度を持ち得るが、好ましくはイオン性部分は高電荷密度を有する。電荷密度は、溶液、材料などの単位体積当たりの電荷量であり、材料内の荷電物体の存在による。高電荷密度を持つ材料は、単位体積当たりより大きな電荷を持ち、反対電荷を持つ物体を引きつけやすく、同じ電荷を持つ物体を斥ける。典型的には、高電荷密度は、電気泳動の間に荷電物体の泳動時間を短くしやすい。
【００３５】
イオン性部分の例は、例示であって限定されないが、核酸及びそれらの天然及び合成類似物（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ）、ポリアミン、例えばポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、硫酸かグリカン、及び化学修飾タンパク質、例えば、
スクシニル化ウシ血清アルブミンを含む。他のイオン性部分は、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチルアクリル酸、ポリプロピルアクリル酸、ポリブチルアクリル酸、ポリマレイン酸、デキストラン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、ポリ硫酸、ポリスルホン酸、ポリビニルリン酸、ポリビニルホスホン酸、ポリマレイン酸のコポリマー、ポリヒドロキシブチル酸、及び混合ポリマーを含む。
【００３６】
Ｖ．被分析物とイオン性部分との結合
電気泳動に先立って、被分析物は、イオン性部分と結合するように修飾できる。被分析物ととイオン性部分との組み合わせは、典型的には、被分析物単独より大きな全電荷を有する。被分析物は、イオン性部分で直接的に、イオン性部分を持つキャリア分子を用いて間接的に修飾できる。キャリア分子は、被分析物結合性抗体、ポリヌクレオチド、及び他の分子を含むが、以下に検討する。
【００３７】
Ａ．イオン性部分と被分析物との直接結合
幾つかのケースでは、イオン性部分は共有的又は非共有的に被分析物に直接結合する。例えば、核酸イオン性部分は、核酸被分析物に、（部分的又は完全な）配列相補性に基づいて非共有的に結合しうる。被分析物は、化学的又は酵素的に、共有的に修飾して、そのイオン電荷を増加させることもできる。化学修飾の例は、タンパク質中のアミノ基をカルボキシル基に変換し、無水物（例えば、コハク酸無水物又はテトラヒドロフタル酸無水物）などの試薬を用いてタンパク質の全負電荷を増加させることを含む。短波ｋぅしつの他の基、例えばチオール基ヒスチジル基も、ヨードアセテート等の試薬を用いて負に荷電した基、例えばカルボキシル基に変換できる。さらに、これらの官能基は、多くの他の活性基に変換してイオン性部分の結合を促進することができる。これら及び他の試薬は当該分野で知られている（例えば、"Chemical Modification of Proteins" by Gary E. Means and Robert E. Feeney; "Bioconjugate Techniques" by Greg T. Hermanson; and "Chemical Reagents for Protein Modification" by Roger L. Lundblad参照）。
【００３８】
カチオン性部分、例えば核酸、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、及び硫酸化グリカンは、官能基（例えば、アミノ又はカルボキシル基）を有し、それは被分析物との結合を促進できる。さらに、イオン性部分は、被分析物との接合に望ましい官能基を持つような設計により誘導体化することができる。
【００３９】
さらに、多くの市販の架橋剤が知られており、それらはキュアリア分子及びイオン性部分を結合するのに使用できる（例えば、アミノとアミノ、スルフヒドリルとスルフヒドリル基を架橋させるホモ−二官能性試薬；アミノとスルフヒドリル基を架橋させるヘテロ−二官能性試薬など）。これら及び他の架橋方法は、この分野での実務者に知られており、アッセイに特有の要件に基づいて選択される。
【００４０】
Ｂ．キャリア分子又はキャリア複合体を介するイオン性部分と被分析物との間接的結合
被分析物は、キャリア分子又はキャリア複合体を介してイオン性部分と間接的に結合することができる。キャリア分子は、被分析物に特異的に結合する分子である。即ち、被分析物及びキャリア分子は、ともに「特異的結合ペア」又はキャリア複合体を構成する。この実施態様では、イオン性部分は、被分析物ではなく、又はそれに加えて、キャリア分子に結合又は接合する。結合ペアの例は、限定されないが、抗体−抗原ペア、レセプター−リガンドペア、及び他のリガンド−リガンド複合体を含む。典型的には、キャリア分子は、被分析物に特異的に結合する抗体である。
【００４１】
【表２】
0005592606.tif 000003
【００４２】
キャリア分子は、分子を結合させる様々な方法を用いてイオン性部分と結合し、それらの一部は既に説明した。選択される方法は、一部は、被分析物、イオン性部分及びキャリア分子の性質に依存する。例えば、標準的な化学を利用して、１又はそれ以上のイオン性部分をキャリア分子に結合できる。例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、及び硫酸化グリカンなどのイオン性部分は官能基（アミノ又はカルボキシルなど）を持ち、それらは抗体又は他のキャリア分子の架橋を促進するし、それらの官能基を持つように誘導体化できる。幾つかの潜在的なキャリア分子、例えば核酸及びタンパク質は、官能基（アミノ（例えば、リジン、アルギニン）、カルボキシル（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）又はスルフヒドリル（例えばシステイン））を持ち、それらはイオン性部分の架橋を促進するし、それらの官能基を持つように誘導体化できる。キャリア分子は、様々な二官能性リンカーを用いてイオン性部分に結合できる。キャリア分子は、架橋のための特別な官能基を持つように化学修飾することができる。例えば、硫酸化グリカンは、酸化してアルデヒド官能基を持つようにすることができ、それはアミノ基との反応に使用できる。オリゴヌクレオチドは、一端にスルフヒドリル又は第一級アミノ基を持つように合成できる。アミノ又はスルフヒドリル基で、オリゴヌクレオチドは、入手可能な架橋剤を用いて抗体分子のアミノ又はスルフヒドリル基と架橋できる。
【００４３】
イオン性部分は、キャリア分子と（そして被分析物と）１又はそれ以上の仲介分子を介して間接的に結合してもよい。例えば、被分析物が抗原「抗原Ａ」である場合、それは、例えば、抗原Ａが抗−抗原Ａモノクローナル抗体（ＡＡＡ−ｍＡｂ）（「キャリア分子」）に結合し、そして、ＡＡＡ−ｍＡｂがイオン性ラベルされた第二の抗体（抗−ＡＡＡ−ｍＡｂ）と結合することにより、イオン性部分と間接的に結合できる。このタイプの第二の抗体型レベル化は、イムノアッセイにおいて通常行われていると認められる。被分析物及びイオン性部分を含む分子の複合体（この例では、抗原Ａ＋ＡＡＡ−ｍＡｂ＋抗−ＡＡＡ−ｍＡｂ部分）は、「キャリア複合体」と呼ばれる。この例では抗体−抗原結合が記載されたが、方法は抗体に限られるわけではない。パートナーの一方が被分析物である任意の特異的結合ペアが使用できる。
【００４４】
キャリア分子及びイオン性部分は、特異的結合パートナーの一方又は両方がタグに接合した特異的結合ペアを用いても結合できる。例えば、キャリア分子はビオチニル化でき、アビジンに接合するイオン性部分を用いてラベルできる。タグは、アビジン又はビオチンのいずれかで、プロセスの任意の工程でタグを介してイオン性部分を結合できる。他の実施態様では、抗体キャリア分子が次のようにイオン性部分（核酸）と結合する：１、２又は３ビオチニル化オリゴヌクレオチドをその４つのビオチン結合部位に付加することにより荷電したアビジン分子を調製し、少なくとも１つの残りの部位を占有されないように残しておく。ビオチニル化キャリア分子（例えば、抗−被分析物抗体）を、アビジン−ビオチンオリゴヌクレオチド複合体に結合させる。タグの他の例は、限定されないが、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンタグ、ジゴキシンタグ、フルオレセインを含む。タグに特異的親和性を持つ抗体は市販されており、必要に及び維持手製造できる。
【００４５】
キャリア分子をイオン性ラベルする上記した方法のいずれもが、タンパク質、核酸、又はキャリア複合体の他の成分をイオン的にラベルするのに使用できる。
【００４６】
イオン性部分に直接（例えば共有的に）結合する分子は、「イオン的にラベルされた」と呼ぶことができる。被分析物の複合体、結合したイオン性部分、キャリア分子は、存在するならば、そして、イオン性部分及び被分析物を結合するのに使用された他の分子は、「被分析物−イオン性部位(IM)複合体」と呼ぶことができる。
【００４７】
被分析物とイオン性部分との結合は濃縮的電気泳動、そして場合によっては次に続く残りの２つのアッセイが実施される濃縮分析工程の条件下で十分に安定であると解される。
【００４８】
ＶＩ．イオン性部分と固定化被分析物との結合
本発明の一態様では、部分的に、上記した濃縮的電気泳動技術を使用する本発明の方法が提供される。この方法によると、分析は：
ａ）固体又は固定化相に結合させ、
ｂ）イオン性部分に結合させ、
ｃ）固定又は固定化相から放出させ、
ｄ）マイクロ流体デバイスに電気泳動させ、
ｅ）ｉ）被分析物又はｉｉ）イオン性部分を特異的に認識する捕捉剤を用いて分析領域において結合又は検出する。
工程（ａ）及び（ｂ）は、どちらの順序で行ってもよく、工程（ｂ）及び（ｃ）はどちらの順序で行ってもよいが、（ｃ）は（ａ）より後にする。例えば、ａ→ｂ→ｃ；ｂ→ａ→ｃ；又はａ→ｃ→ｂという順序であってよい。工程（ａ）−（ｃ）は以下に説明するが、例示のためであり何ら限定しない。この方法の特別な例は図５に示され、対応するテキストで議論される。この方法は、２つの独立した特異的被分析物濃縮工程を含み、高い感度のアッセイ法を提供する。
【００４９】
ａ．被分析物が固体又は固定化相に結合する
被分析物は、サンプル溶液を固相に固定化した被分析物の特異的結合パートナー(SBP)で処理することにより、固体又は固定化相（本明細書では交換可能に使用される）に、従来の方法で結合する。固相は、例示であって限定しないが、大容量リザーバの表面、マイクロタイタープレートウェルの表面、又は微粒子の表面である。好ましい実施態様では、微粒子が使用される。一実施態様では、磁気微粒子が使用される。
【００５０】
精製に有用な微粒子は当該分野で知られている。微粒子は、約０．０５μmから約１０００μｍの径を持つ一般的には球状粒子であり、その上にSBP（例えば、抗体、ポリヌクレオチド）が結合又は被覆されていてもよい。微粒子は、ガラス、ケイ酸ジルコニウム、シリカ、金、ポリスチレン、ラテックス、及びＰＭＭＡ等の材料を用いて製造でき、磁性又は可磁化、染色性、生分解性及び蛍光性等の物理的特性を有してもよい。微粒子は、結合剤で被覆され、又は反応性基（例えば、アミノ、カルボキシル、シアヌル）を含み、結合パートナー（例えば、抗体、ポリヌクレオチド、アビジン）と共有結合できるようにしてもよい。さらに、微粒子は、ＳＢＰが結合したものを購入できる（例えば、ストレプトアビジン、ヒトＩｇＧ及びＩｇＭに対する抗体、及び抗-ビオチン抗体で被覆された微粒子を、例えばIndicia Biotechnology (Oullins France)から；結合基：アビジン、ストレプトアビジン、プロテインＡ、アルブミン、ビオチン、ＰＥＧ、及びコラーゲンを持つ微粒子を、例えばKisker Biotechnology (Steinfurt Germany)から）。他の固相、例えばマイクロプレートも、共有結合した結合パートナーを有するものが購入又は誘導できる（例えば、ストレプトアビジン又は抗-ＩｇＧ抗体が結合したマイクロプレートを、例えばBD Biosciences (Bedford MD)から)。
【００５１】
被分析物は、被分析物を含有する溶液を固定化SBPと、被分析物がSBPに結合する条件下で接触させることにより、固定化された結合材に結合する。例えば、微粒子は、前試料溶液に添加することもできる。被分析物が微粒子が結合した後、適当な洗浄工程を伴う遠心分離、磁気分離、又は濾過を用いて微粒子を分離することによって被分析物が豊富なフラクションを調製することができる。他の固相（例えばマイクロプレートウェル）を用いた非結合混入物質の除去は、非結合上清の除去又は他の周知の方法によって達成できる。
【００５２】
ｂ．被分析物はイオン性部分と結合する
被分析物は、任意の適切な方法、例えば、従前の部分に記載したような方法を用いてイオン性部分に結合する。上記したように、被分析物は、固定化相に結合する前又は後にイオン性部分に結合でき、結合剤を介して又は直接的に結合できる。即ち、本明細書で使用される結合剤は、被分析物を微粒子又は基板などの固定化相に結合させる。イオン性部分は、第一に固相に結合できる。この場合、イオン性部分と被分析物との結合は、固相への結合によって促進される。
【００５３】
ｃ．被分析物は固体又は固定化相から放出される
結合した被分析物は、種々の手法を用いて、微粒子（又は他の固相）から放出される。例えば、被分析物は、固定化されたＳＢＰへの結合について被分析物と競合する特異的試薬を用いて置換できる。あるいは、被分析物は、変性剤（例えば尿素）、極端なｐＨ、温度、高イオン強度等の結合を妨害する非特異的試薬を用いて溶離できる。これは、バッファーの変化、電界の変化、ｐＨ、溶離バッファーの添加、又は当該分野で知られた他の方法によって行われる。
【００５４】
あるいは、それに結合した被分析物を有する結合剤は、結合剤と固相（微粒子又は基板）の間の結合に切断又は破断可能な結合を導入することにより複合体として遊離されうる。さらに、マイクロ流体チップ上での分析中に被分析物を捕捉するのに使用される捕捉剤は、捕捉剤とマイクロ流体チップの捕捉面との間に切断又は破断可能な結合を導入できる。結合剤及び捕捉剤は同じタイプの分子でもよいが、それらの役割は異なる。捕捉剤は、被分析物が分析中に捕捉される場合に使用される（例えば、分析領域に固定化される）。何れの場合も、結合は、ジスルフィド架橋、ジオール、制限酵素配列、及び化学物質又は酵素により切断できる結合を含む。例えば、結合剤はプロテアーゼ又はヌクレアーゼ（例えば、配列特異的プロテアーゼ又はヌクレアーゼ）を用いて切断しうる。抗体を固相上に結合するためのジスルフィド架橋を含むリンカーが用いられる場合は、結合複合体は、メルカプトエタノール又はジチオトレイトール等の還元剤を用いて放出される。核酸結合分子はヌクレアーゼで切断できる。
【００５５】
以下の実施例は、例示のために提供するものであり、本発明を限定することを何ら意図しない。
【００５６】
１．核酸被分析物
一実施態様では、被分析物は核酸である。核酸被分析物は、それ自体がポリイオン性であり、更なるイオン性部分の結合が有利な場合があるが、これらの分子を電界で移動させるためにイオン性部分を結合する必要はない。しかしながら、電気泳動の前に最初に被分析物を濃縮する及び／又は汚染物質を除去するのが有利である。このことは、例えば、磁気微粒子に複合した相補的配列を有する核酸結合材を用いて実施できる。磁気粒子は、大容量リザーバ内の核酸被分析物を含有するサンプルに添加することができる。被分析物分子が微粒子に結合した後、磁界をかけて、微粒子を大容量リザーバの特定の場所に集める。そして汚染物質及び妨害物質は除去される。変性条件、例えば低イオン強度、尿素、下手印、高ｐＨ又は温度、又はこれらの要因の組み合わせがハイブリダイゼーションの崩壊に使用され、それにより核酸鎖を分離して、結合した被分析物を微粒子から遊離させる。電気泳動が、被分析物核酸を第二のリザーバに誘導する。第二のリザーバ内で一度濃縮されると、核酸被分析物はマイクロ流体デバイス上を、核酸被分析物の5'末端に相補的な捕捉剤を有する特定部位に電気泳動する。核酸被分析物は結合し、核酸被分析物の3'末端に相補的なラベル化核酸検出試薬を用いて検出できる。
【００５７】
２．抗原被分析物
一実施態様では、被分析物は抗原として作用し、結合剤としての抗体を用いて固体基板に結合できる。例えばタンパク質被分析物に親和性を持つ抗体は、微粒子に接合される。微粒子が磁気手段（それらが磁気微粒子の場合）又は遠心力場等によって大容量リザーバの特定の場所に集められ、任意の非結合分子、汚染物質又は妨害物質を含有する上清が除去される。タンパク質被分析物は、複合体として微粒子から遊離される。これは、切断可能なリンカー（例えば、本明細書に記載したもの）を用いて達成できる。適当なプロテアーゼも、被分析物の望まない分解無く所望の放出を達成する条件下で使用できる。さらに、結合成分ｍリンカー又は抗体のいずれかにおいて、ストリンジェントな切断部位要件を持つプロテアーゼに特異的なタンパク質分解部位を加工することも考えられる。これらのプロテアーゼは、次いで結合複合体の切断に用いられる。一実施態様では、被分析物に親和性を持つ結合剤で被覆された磁気微粒子が大容量リザーバ内の血液サンプルに添加される前濃縮工程を用いる血液サンプル中の被分析物は、本発明の方法に従って検出される。
【００５８】
ＶＩＩ．被分析物の濃縮的電気泳動
被分析物をイオン性部分に結合する工程の一部又は全部（並びに、前サンプル処理工程）は、大容量リザーバで実施できる。あるいは、一部又は全部の工程は１又はそれ以上の容器内で実施でき、被分析物（及び任意の結合分子）は、大容量リザーバから（例えばピペットにより）移動できる。その結果、被分析物−ＩＭ複合体は大容量リザーバ内に局在する。
【００５９】
大容量リザーバの液体収容能力は広範に変化しうる。典型的な容量は、約１マイクロリットルから約１００ミリリットルである。好ましくは、ＬＶＲ容量（及びサンプル容量）は、約５マイクロリットル以上、より好ましくは約１０マイクロリットル以上、例えば、５０マイクロリットル以上、１００マイクロリットル以上、１ミリリットル以上である。幾つかの実施態様では、ＬＶＲ容量又はサンプル容量は、約１マイクロリットルから２０ミリリットルである。（サンプル容量は、ＬＶＲ容量より少ないが、通常はＬＶＴＲ容量の少なくとも２５％、より頻繁には少なくとも５０％、頻繁には少なくとも７５％であると解される。）幾つかの実施態様では、サンプルは、約１０マイクロリットルから約１００ミリリットル、より頻繁には２５マイクロリットルから５ミリリットル又は１００マイクロリットルから２５ミリリットルである。ＬＶＲ容量は、約５０マイクロリットル、１００μｌ，２００μｌ，３００μｌ，５００μｌ，８００μｌ，１ミリリットル，２ｍｌ，３ｍｌ，４ｍｌ，５ｍｌ，６ｍｌ，１０ｍｌ，２０ｍｌ，３０ｍｌ，４０ｍｌ，５０ｍｌ，６０ｍｌ，７０ｍｌ，８０ｍｌ，及び９０ｍｌである。一般には、合理的な時間で電気泳動により濃縮されることが合理的に予測される容量が用いられる。これは、サンプル容量の最長距離を移動するために被分析物を荷電させる時間によって決定される。
【００６０】
荷電した被分析物又は被分析物−ＩＭ複合体の電気泳動輸送は、大容量リザーバからコネクターを介してマイクロ流体デバイス（例えば、ステージングリザーバ又は分析領域）まで帯びる電界を発生させることによって達成される。システム配置の例をす１〜３にしました。図１〜３に示したデバイスは、複数の大容量リザーバからの複数のサンプルをマイクロ流体デバイス及び/又は複数のステージングリザーバに接続する複数のコネクタを示している。
【００６１】
少なくとも一つの電極は、各大容量リザーバの中に配置され、又はそれと一体化され、少なくとも一つの電極は、マイクロ流体デバイスの上に配置され、又はそれと一体化される。被分析物が、大容量リザーバからマイクロ流体デバイスへ選択した速度で誘導されるような強さで電場がかけられる。電極及びリザーバ内でかけられる電場の位置は、マイクロ流体デバイスの最高性能、例えば、短時間での高感度検出を容易にするように決定できる。例えば、大容量リザーバ内の電極は、最も対称性を与える位置及びマイクロ流体デバイスに導くコネクタの解放に関連する距離に配置することができる。この電極配置は、リザーバ内の全ての被分析物を誘導するような比較的均一な電場を与えるようである。マイクロ流体デバイス内の１又はそれ以上の電極配置は、意図するデバイス操作による。電極は、ステージングリザーバが必要な場合にはステージングリザーバの近傍に配置できる。被分析物をステージングリザーバを使用することなく分析領域に直接誘導することが望まれる場合は、分析領域の近傍に配置することができる。また、電場が被分析物を最初はステージングリザーバに次いで分析領域に連続的に誘導できるように両方に配置することもできる。
【００６２】
マイクロ流体デバイスでステージングリザーバを使用することにより、分析領域への被分析物の移動が同調でき、より良くコントロールできる。ステージングリザーバは、チップと一体化される。ステージングリザーバは、（デバイス内の流体の流動を阻止する全てのバルブが解放されたとき）分析領域と流体的に連通するように構成される。ステージングリザーバの容量は大容量リザーバの容量より小さく、典型的には約１マイクロリットル未満であり、限定されないが、約0.1plから約 2μl、1plから1μl、そして10plから0.5μlを含み、好ましくは１マイクロリットル未満、０．１マイクロリットル未満であることもあり、１ピコリットル未満であるときもある。
【００６３】
示されたコネクターはキャピラリーチューブであってよい。電気泳動を促進するため、コネクターは導電性媒体、例えば低塩バッファーで満たされ、電界が確立される。電場がかけられると、荷電した被分析物（又は複合体）が輸送され、マイクロ流体デバイスに、分析領域を通して直接誘導されるか、又は更なる分析の前に被分析物を濃縮するためにマイクロ流体デバイス内のステージングリザーバへ誘導される。大容量リザーバ及びステージングリザーバに関連する電圧は、被分析物の輸送に望まれる速度を達成する用に選択される。
【００６４】
電気泳動の時間は、対象とする被分析物の濃度及び量、電気泳動条件（電流、電圧、バッファーのイオン強度など）、初期サンプル容量、被分析物の電荷、検出方法の感度、及び使用されるバッファー等の要因による。電気泳動は、所定量の対象とする被分析物が輸送されるのに十分な時間行われる。十分な被分析物が輸送されたら、電気泳動を続けなくてもよく、望ましくは大容量リザーバ及びコネクターを取り外す。
【００６５】
一実施態様では、電気泳動は、ステージングリザーバの被分析物濃度が少なくとも大容量リザーバ内濃度の２倍になるまで行われる。濃度の違いが少なくとも３倍の場合もあり、少なくとも５倍、１０倍、２５倍、又は１００倍又はそれ以上の場合もある。
【００６６】
被分析物を簡単かつ効率的に輸送するために最適な構成を達成するように、１以上の大容量リザーバ及び１以上のステージングリザーバが接続できる。極めて大きなサンプルでは、複数の大容量リザーバを連続して用いるのがより効率的である。この実施態様では、減少する容量のＬＶＲがコネクターによって連続して接続され、被分析物が一のＬＶＲから次のＬＶＲに、そして最終的にはチップに連続的に輸送されるような電極構造とする。これにより、マイクロ流体チップに輸送するのに必要な電圧を最小にしながら、被分析物が所定速度で輸送されるよう電圧をかけることができる。電圧が小さいことは、マイクロ流体デバイスでの電気泳動、加熱及び／又はガス発生による問題を抑制することができるので有利である。
【００６７】
幾つかの実施態様では、被分析物は、ステージングリザーバから分析領域に輸送される前に、１又はそれ以上の中間リザーバに輸送される。これにより、複数アッセイ（例えば、異なる溶液で、又は相溶性のない試薬で実施されるアッセイ）を容易に実施することができる。例えば、ステージングリザーバの内容物は、核酸検出のための一部分と、タンパク質検出のための他の部分とに分割できる。中間リザーバを用いることにより、より大きな容量のサンプルを用いることも可能になる。
【００６８】
ＶＩＩＩ．被分析物、荷電被分析物、又は被分析物−ＩＭ複合体の分析領域への輸送
被分析物を検出し分析するために、被分析物（それはイオン性部分と結合しても及び/又は  分析物複合体の一部でもよい）は、大容量リザーバ又はステージングリザーバからデバイスの分析領域に輸送される。好ましい実施態様では、分析領域は複数の捕捉剤（それらは同じでも異なっていてもよく、順序立てたアレイに配列されていてもいなくてもよい）を含み、被分析物又は非分析物ーＩＭ複合体と結合する（そして、キャリア分子、イオン性部分、又は複合体の他の成分に結合してもよい）。
【００６９】
被分析物及び/又は被分析物を含む複合体がＬＶＲからマイクロ流体チップに電気泳動されると、被分析物及び/又は複合体は当該分野で知られた手段、例えばマイクロポンプ、毛細管現象、電気泳動を用いて捕捉部位に輸送される。好ましい実施態様では、電気泳動が用いられる。アレイを横切るステージングリザーバの電気泳動は、ステージングリザーバの電極と分析領域の又はその近傍の電極との間に形成される電場を必要とすると解される。あるいは、ステージングリザーバが使用される場合、ＬＶＲの電極と分析領域の又はその近傍の電極との間に電場が形成される。
【００７０】
ＩＸ．分析領域及び被分析物の検出
被分析物は、チップの分析領域において検出され、定量され、又は分析される。一実施態様では、分析は、分析領域での固定化無しで（例えば、光散乱、フローサイトメトリー、又は蛍光検出又は溶液中で実施される他の検出手段用いて）実施される。例えば、被分析物は、フルオロフォアでラベルし、適切な波長のレーザーでフルオロフォアを励起し、放射された蛍光を測定することにより蛍光物質を分析するための適当な通常使用されるフローサイトメトリーで分析領域において分析できる。殆どのマイクロ流体デバイスと同様に、分析領域は通常はチップのチャンネル又はチャンバーである。
【００７１】
あるいは、検出は、分析領域の固定化された捕捉剤による被分析物の結合を含む。捕捉剤は、被分析物又は非分析物複合体を、被分析物又は複合体のメンバーに特異的に結合することにより捕捉できる分子である。捕捉剤に結合される複合体のメンバーは、被分析物、キャリア分子、キャリア分子／被分析物複合体、イオン性部分、二次抗体（使用した場合）及びラベルを含む。即ち、捕捉剤は、例えば、１又はそれ以上の抗体、核酸、レセプター及び／又はリガンドであってよい。
【００７２】
捕捉剤は、当該分野で知られた任意の方法を用いて捕捉部位においてマイクロ流体デバイスに固定化され得る。例えば、１又はそれ以上の抗体捕捉剤は、抗体のＦｃ部分を介して結合しうる。捕捉剤は、共有又は非共有結合によって捕捉部位に結合できるが、好ましくは、結合は捕捉部位上の液体の移動により捕捉剤が脱着しないのに十分な強さとする。用いられる種々の試薬及び反応条件は当該分野で知られている(例えば、"Chemical Modification of Proteins" by Gary E. Means and Robert E. Feeney, "Bioconjugate Techniques" by Greg T. Hermanson 及び"Chemical Reagents for Protein Modification" by Roger L. Lundblad参照)。固相基材上の捕捉部位に捕捉剤を結合する方法の例は、例えば、米国特許第5,629,213号、第5,688,642号、第5,585,275号、及び国際特許出願WO9745730に見出される。
【００７３】
捕捉部位に結合すると、捕捉剤は被分析物又は被分析物複合体のメンバーを、それが捕捉部位を通って移動する際に捕捉できる。捕捉剤及び被分析物又は非分析物複合体は、典型的には非共有相互作用によって結合するが、共有結合を用いてもよい。核酸被分析物又は核酸イオン性部分については、捕捉剤は、例えば、相補的な核酸でありうる。タンパク質被分析物については、捕捉剤は、タンパク質被分析物に特異的な抗体、リガンド、レクチン及びレセプターでありうる。炭水化物及び脂質被分析物は、抗体捕捉剤を用いて捕捉できる。抗体キャリア分子は、抗体、抗原、又は抗体に特異的に結合する他の分子を用いて捕捉できる。例えば、キャリア分子がヒト抗体である場合、捕捉剤はヤギ抗-ヒト抗体でありうる。
【００７４】
捕捉の条件は、被分析物複合体の標的とするメンバーの特異的捕捉を可能にするように操作される。バッファー、捕捉部位上の移動速度、温度及び捕捉時間などの条件は、特定の被分析物のみが結合するように、又は変異体、例えば一本鎖を持つ核酸又は変異体タンパク質にも結合するように選択することができる。あるいは、捕捉剤は、特定の被分析物又は変異体のみに結合するようにも選択できる。
【００７５】
捕捉剤は、マイクロ流体デバイスの特定の位置又は捕捉部位で、当該分野の当業者に知られた方法によって検出される。例えば、捕捉剤は、ポンプデバイス又はフォトリソグラフィ及びフォトリソグラフィ試薬を用いて、特異的な捕捉部位に検出され結合することができる。
【００７６】
被分析物は、検出可能なラベルからのシグナルに基づいて検出されることが多い。ラベルは原子（例えば放射性核種）、分子（例えばフルオレセイン）、又は複合体を意味し、それは分子の存在を検出（例えば、物理的又は化学的特性により）、表示するために、あるいは共有結合又は他の結合をする他の分子の結合を可能にするために用いられ、又は用いられ得る。用語「ラベル」は、共有結合又は他の結合をした分子（例えば、酵素などの生体分子）であって、基質に対して作用して検出可能な物理的シグナルを生ずる分子又は複合体を指す。本発明で好ましく用いられる検出可能なラベルは、分光学、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学、化学又は物理学的手段などにより検出可能な任意の組成物を含む。検出可能なラベルは、使用される場合、捕捉剤に結合してもよい最終複合体の任意の成分に添加できる。例えば、ラベルは、キャリア分子、被分析物、イオン性部分、又は結合剤に結合させることができる。マイクロ流体的環境で使用される検出器（例えば、蛍光リーダー、分光測定器、その他）は、当該分野で知られている。
【００７７】
複数の被分析物が、同一のサンプルにおいて検出できる。例えば、図３及び７に示すように、分析領域の特定領域が、特定の被分析物に特異的な捕捉部分と結合できる。
【００７８】
Ｘ．アッセイの特異性
アッセイの特異性は、本明細書に記載した方法の任意の１又はそれ以上の工程において提供できる。例えば、１又はそれ以上の工程は、一般的分類の分子への結合を含むことができ、１又はそれ以上の工程は、対象とする被分析物への特異的結合を必要とすることもできる。特異性が望まれる場合、特異的なイオン的に修飾された抗体が使用でき、特異的なキャリア分子が使用でき、特異的な結合剤が使用でき、特異的な検出分子が使用でき、及び/又は、マイクロ流体デバイス上の特異的な捕捉剤が使用できる。よって、例えば、最初は、サンプル中の被分析物は、特異的な結合分子で被覆された微粒子を用いて濃縮することができる。あるいは、微粒子は、被分析物を含む一般的分類の分子に結合する結合分子で被覆することができる。一般的分類の分子は、リン酸化タンパク質、核酸、抗体、脂質、糖、共有レセプタードメイン、共有モチーフ、保存的核酸又はアミノ酸モチーフ、共有キャリア、及び共有エピトープを含む。
【００７９】
ＸＩ．アッセイで使用される抗体
読者は、本発明の方法において抗体が幾つかの役割を果たすと理解するであろう。例えば、抗体は、下記の実施例に記載するように被分析物でもありうる。「抗体」という用語は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含む免疫グロブリン、及びその抗原結合性断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２、Ｆａｂｃ、及びＦｖを含む）を意味する。断片は、組み換えＤＮＡ技術、により、又は原型の免疫グロブリンの酵素的又は化学的分離によって製造される。用語「抗体」は、他のタンパク質、一本鎖抗体、及び二特異的抗体との融合タンパク質に化学的に接合した、又はそれとして発現された１又はそれ以上の免疫グロブリン鎖も含む。例えば、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1999, including supplements through 2005); Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照のこと。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。しかしながら、幾つかの実施態様では、タンパク質上の特異的エピトープへの結合を確実にするためにモノクローナル抗体が使用される。
【００８０】
幾つかの実施態様では、アッセイの幾つかの時点で、２又はそれ以上の抗体が被分析物（又は他の被分析物−ＩＭ複合体成分）と結合する。そのような条件下で、抗体は、被分析物の何れかの異なるエピトープに結合し、第二の抗体は第一の抗体に結合する、又は第二の抗体が抗体／被分析物複合体に結合する。他の実施態様では、第一の抗体が第二の区対のを添加する前に除去され得る。
【００８１】
それらが提供する機能に応じて、抗体はイオン的にラベルされ及び/又は続く検出において検出可能なラベルを含むように修飾されうる。本明細書で用いられる「検出可能なラベル」は、当該分野における通常の意味を有し、原子（例えば放射性核種）、分子（例えばフルオレセイン）、又は複合体を意味し、それは分子の存在を検出（例えば、物理的又は化学的特性により）、表示するために、あるいは共有結合又は他の結合をする他の分子の結合を可能にするために用いられ、又は用いられ得る。用語「ラベル」は、共有結合又は他の結合をした分子（例えば、酵素などの生体分子）であって、基質に対して作用して検出可能な原子、分子又は複合体を生成するものを指す。本発明で好ましく用いられる検出可能なラベルは、分光学、光化学、生化学、免疫化学、電気、光学、化学又は物理学的手段などにより検出可能な任意の組成物を含む。
【００８２】
ＸＩＩ．装置及びシステム
本発明は、本明細書に記載した方法を実施するための装置及びシステムを提供する。一実施態様では、マイクロ流体デバイスはステージングリザーバを有し、それは分析領域と流体的に連通しており、分析領域は（ｉ）被分析物、（ｉｉ）抗体又は（ｉｉｉ）核酸（即ち、キャリア分子又は被分析物−ＩＭ複合体の成分）と結合する捕捉剤を含む。上記したように、分析領域は、典型的には、マイクロ流体チャンネルの領域であり、当該チャンネル表面の少なくとも一部に捕捉剤が固定化される。サンプルリザーバは上記のような流体容量を有する（例えば、０．１ｐｌ〜約２μｌ）。デバイスは、ステージングリザーバと結合した第一の微小電極及び分析領域と結合した第二の微小電極を含む。電極は、一方の電極に正電荷を、他方の電極に負電荷をかけるように配置され、荷電した分子がステージングリザーバから分析領域へ電気泳動するのに十分が電場をもたらす。即ち、一方の電極はステージングリザーバに設けられ、第二のものは（ステージングリザーバに比較して）固定化された捕捉剤から遠い分析領域に設けられる。
【００８３】
一実施態様では、上記したように、デバイスは複数単位のステージングリザーバ及び分析領域を含む。ステージングリザーバと分析領域との各組み合わせは、「操作可能な単位」と呼ぶことができる。
【００８４】
一実施態様では、デバイスの少なくとも一つの分析領域は、１以上の病原体からの分子と結合する捕捉剤を含む。一実施態様では、少なくとも１つ、場合によっては全ての病原体はウイルスである。一実施態様では、少なくとも１つ、場合によっては全ての病原体は細菌である。一実施態様では、病原体からの分子は核酸、タンパク質、又は毒素である。
【００８５】
関連する実施態様では、本発明は、本発明のマイクロ流体デバイスを含み、そして更に大容量リザーバ及び/又はコネクター及び/又は電流供給源及び/又はコンピュータ制御システムを含むシステムを提供し、それは濃縮、輸送及び/又は分析に必要な場合に電極（４００、５００）を活性化又は極性のスイッチをすることができる。該システムは、荷電した被分析物を濃縮し、サンプルをマイクロ流体デバイスに導入又は適用するために電気泳動を用いる。電気泳動は、荷電した被分析物を大容量リザーバからマイクロ流体デバイス上又は中のステージングリザーバへ移動及び濃縮するために用いられる。システム又は装置の一般的な配置は図１及び２に例示した。システムは一般に、マイクロ流体デバイス６００、少なくとも一つの大容量リザーバ１００、少なくとも一つのステージングリザーバ３００、コネクタ２００、及び電気泳動のための少なくとも二つの電極４００及び５００（又は８００）を含む。一実施態様では、マイクロ流体デバイスは、サンプル分析から流出した全ての流出物を回収するための流出ウェルも含んでいる（例えば、図３参照）。
【００８６】
大容量リザーバ１００とステージングリザーバ３００との間の複数のコネクター２００がキャピラリーチューブを用いて図１に示されている。キャピラリー２００は、低塩バッファー等の流体で満たされ、電極（４００及び５００）を接続して電場を形成するためである。これにより、荷電した被分析物が第容量リザーバ１００からステージングリザーバ３００に電気泳動する（図３参照）。
【００８７】
電極４００及び５００は、リザーバ（１００、３００）及び/又はマイクロ流体デバイス６００に、適切な電場を生成させるために当該分野で知られた任意の手段を用いて接続される。材料、サンプル、バッファー、及び全ての部材の加工は、材料の電気泳動に適合するように提供されると理解される。電極（４００、５００）は、リザーバ類（１００、３００）に操作可能に接続される。操作可能に接続されるとは、電極がリザーバ内又は近傍に配置され、電圧又は電位をかけることにより電場を形成し、それを介して荷電分子が輸送されるようにすることを意味する。一実施態様では、電極はリザーバ又はデバイスの材料内に埋設される（例えば、基板内に含まれる）。さらに、２以上の電極（４００、５００）が存在する場合、被分析物の濃縮及び/又は輸送に必要なときに、電極（４００、５００）の極性をスイッチさせるためにコンピュータを使用した制御システムを用いることができる。制御システムは、分析領域での被分析物の存在及び/又は位置を測定する検出器に応答するように構成することができる。
【００８８】
一実施態様では、システムは複数の操作単位を含み、各々は異なる大容量リザーバに流体的に連通している。一実施態様では、システムは複数の操作単位を含み、各々はステージングリザーバを付随する電極、及び各電極に同じ大きさ及び時間電荷をかけるコントロールシステムを有する。
【００８９】
当該分野で知られた器具類、電圧の印加、デバイス内の流体輸送、流動速度及び方向の制御、対象とする被分析物の検出及び感知のための器具類、プロセッサ、例えば、器具類を制御する指令、検出器からのデータ受信、及びデータの分析、保存及び解析、及びデータ提示、及び容易にアクセスできる報告フォーマットで解釈するためのコンピュータが使用できる。
【００９０】
ＸＩＩＩ．例示的な実施態様
本方法の例示的な実施態様を、図４から６を参照して、ここに記載する。
【００９１】
図４に示した実施態様では、被分析物にイオン性の特質を与えるためにイオン的にラベルした抗体キャリア分子が用いられる。第一の抗体１はイオン性部分２を持ち、大容量リザーバ内のサンプル中の被分析物３と特異的に結合して抗体／被分析物複合体４を形成する。イオン的にラベルした抗体及び複合体は、ステージングリザーバに電気泳動で輸送される。複合体は、次いで、結合した捕捉剤６を有する基板５を持つ分析領域に輸送される。捕捉剤６は被分析物３に特異的な第二の抗体である。捕捉剤抗体６は、被分析物３の第一の抗体１とは異なるエピトープに結合するか、又は、抗体／被分析物複合体４に特異的に結合しうるが、遊離した第一の抗体１には結合しない。検出可能なラベルは、被分析物３の捕捉の前又は後の任意の時点で、任意の分子（潜在部位７）に直接結合できる。他の実施態様では、被分析物／IM複合体が、被分析物３及び/又は抗体／被分析物複合体（４）の異なる部位に結合するラベル化された第三の抗体を用いて検出される。
【００９２】
アッセイの特異性は、第一の抗体１の特異性、捕捉剤６の特異性、又はその両方によって与えられる。他の実施態様は、第一の抗体１又はイオン性部分２に結合する捕捉剤６と組み合わせて使用される被分析物特異的な検出ラベルを含むことができる。
【００９３】
図５に示した実施態様では、被分析物３は、大容量リザーバ内の磁気微粒子８に結合することにより電荷と結合している。この実施態様では、微粒子８は抗体結合剤１１で被覆されている。これらは、適当なバッファー中でサンプルに添加され、被分析物３が抗体結合剤１１にけつごうするようにされる。必要ならば、微粒子８をリザーバの特定領域に磁気的に濃縮した後に、妨害、汚染及び/又は不要物質は除去される。不要な物質を更に減少させるために付加的工程を実施することができる。イオン性部分２が結合した第二の抗体１が、大容量リザーバ内の抗体／被分析物複合体に添加される。第二の抗体１は被分析物３の異なるエピトープを介して結合しうる。場合によっては、抗体結合剤１１で被覆された微粒子に対する抗体１の添加の順序を逆にすることができる。結合した被分析物／抗体複合体（３／１１／１／２）が形成された後、過剰の抗体１、妨害、汚染及び/又は不要物質は、微粒子８をリザーバの特定領域に磁気的に濃縮した後に除去される。不要物質を更に減少させるために、付加的な洗浄工程を実施することができる。結合した被分析物/抗体複合体（３／１１／１／２）は、次いで、適切な分割剤(cleavaging agent)を用いて微粒子８から外される。この複合体（３／１１／１／２）は、次いで、ステージングリザーバ内に被分析物を濃縮するために電気泳動される。濃縮の後、複合体はマイクロ流体デバイスの捕捉部位５上を電気泳動する。この実施態様では、捕捉部位５に結合した捕捉剤６は、イオン性部分２に特異的に結合する（例えば、イオン性部分２が核酸分子えある場合、捕捉剤６は相補的な核酸分子である）。検出可能なラベル７は、被分析物３、微粒子８上の抗体結合剤１１、第二の抗体１、又はイオン性部分２を含む任意の分子に結合することができる。この反応の特異性は、微粒子８上の結合剤への結合、第二の工程への結合又は両方を含む任意の工程で付与することができる。或る実施態様では、捕捉剤６は、被分析物３の異なるエピトープに結合する又は抗体/被分析物（１／３又は１１／３）に特異的に結合し遊離の抗体（１間１１）には結合しない第三の抗体とすることができる。
【００９４】
図６に示した実施態様は、図５のものと類似しており、プロセス後期におけるイオン性部分２の結合を含み、イオン性部分２が初期の結合又は精製工程を阻害しうる場合に使用できる。この実施態様では、イオン性部分２を抗体１１にタグ/結合剤対として結合させるアビジン／ビオチン対（１３／１４）又は類似の結合対が使用される。被分析物３は最初に、特的な結合剤１１で被覆された磁気微粒子８上に固定化される。図６に示した例では、結合剤は抗体１１であり、それは被分析物３に特異的に結合し、ビオチンタグ１３で修飾されている。アビジン（又はタグに対する結合剤）に接合したイオン性部分２は、
微粒子８と混合され、抗体結合剤１１にアビジン／ビオチン結合１３／１４を介して結合する。このプロセスの任意の時点で、磁気微粒子８は、磁場をかけることにより大容量リザーバの特定領域に濃縮することができ、洗浄、バッファー交換、及び/又は微粒子からの被分析物の取り外しが可能になる。
【００９５】
被分析物３をステージングリザーバに濃縮する電気泳動の前に、例えば特異的プロテアーゼの添加により抗体結合剤１１が微粒子８から切り離される。サンプル中の被分析物３／抗体１１複合体及び他の任意の荷電分子は、次いで、電気泳動を用いてステージングリザーバ内に濃縮される。濃縮の後、複合体は捕捉部位５上を移動する。被分析物３は、捕捉部位5上の特異的な捕捉剤６によって捕捉される。この実施態様では、捕捉部位４は、被分析物３の第一の抗体１１によって認識されるものとは異なるエピトープで特異的に結合する抗体捕捉剤６で被覆されている。検出可能なラベル７は抗体結合剤１１、被分析物３、又はイオン性部分２を含む任意の成分に結合しうる。
【００９６】
表３は、本発明の方法で使用しうる被分析物、イオン性部分、キャリア分子、及び捕捉剤例示であって限定しない例を提供する。
【００９７】
【表３】
0005592606.tif 000004
【００９８】
(実施例)
これは、感染性疾患検出のために使用されるバイオチップの一般的な説明である。チップは、電極、サンプル用ウェル、特定の検出領域、チャンネル及びバルブを含む。複数のサンプルを取り込み、同定及び定量のために検出領域を通して電気泳動を用いて誘導することができる。ことなるサンプルを同時に又は連続的に取り込むことができ、取り込みはマイクロ流体バルブで制御できる。検出に使用される共通の試薬は、デバイス内のチャンネルを通して導入できる。
【００９９】
実施例１：ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶテスト
図３は、サンプル中のＨＩＶ、ＨＢＶ、及び/又はＨＣＶ抗原（タンパク質被分析物）の存在を検出するためのマイクロ流体デバイス６００を例示する。マイクロ流体デバイスは、ＬＶＲ電極４００とともに電気泳動に使用するための電極５００及び８００を有する。ＨＩＶ、ＨＢＶ又はＨＣＶを含むと疑われる生物学的サンプルを大領量リザーバ（図示せず）に導入し、ＨＩＶ、ＨＢＶ又はＨＣＶタンパク質被分析物に特異的な抗体と混合する。抗体はイオン性部分が結合されている。抗体／被分析物複合体を形成させ、複合体を、（場合によってはステージングリザーバ３００で濃縮した後に）分析領域７００内の捕捉部位（７００ａ、７００ｂ及び７００ｃ）上に電気泳動させる。試薬及び非結合分子は流出チャンバー１０００に流出させ、除去してもよい。ＨＩＶ捕捉部位７００ａは、ＨＩＶタンパク質被分析物に特異的な抗体捕捉剤を有する。ＨＢＶ捕捉部位７００ｂは、ＨＢＶタンパク質被分析物に特異的な抗体捕捉剤を有し、ＨＣＶ捕捉部位７００ｃは、ＨＣＶタンパク質被分析物に特異的な抗体捕捉剤を有する。ＨＩＶ、ＨＢＶ及び/又はＨＣＶの存在は、特異的な捕捉部位（７００ａ、７００ｂ又は７００ｃ）の検出可能なラベルからのシグナルによって同定できる。図３は、被分析物が大容量リザーバから分析領域に、ステージングリザーバを介して（上側）又はステージング領域無しで（下側）、電気泳動により輸送される実施態様を例示している。
【０１００】
図７は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ等の感染性ウイルスのための血液検査で参照されるアッセイの実施態様を例示するチップの代表例である。ＨＩＶに対してＦＤＡで認められた臨床テストに関する現在の感度の限界は、ＰＣＲ技術を用いたRocheのUltraSensitive AMPLICOR HIV-1 MONITORテストv1.5又はｂ−ＤＮＡ技術を用いたBayerのVersant HIV 3.0 について、１ｍｌ当たり約５０ウイルスコピーである。このことは、典型的なサンプルに関して、検出に十分なウイルスＲＮＡを提供するには合計１ｍｌのサンプルが必要であることを意味する。合計１ｍｌのサンプル溶液をチップに取り込むのは実用的ではない。遠心分離、エタノール沈殿、微粒子でのＲＮＡターゲティング及び溶離などのサンプルを濃縮する準備工程を用いたとしても、最終的なサンプル容量は１０又は１００マイクロリットル（μｌｓ）の範囲となるであろう。マイクロ流体チップにおけるテスト領域は、通常数ミクロンから数百ミクロンであるので、たとえ大きなチップでも取り扱える容量は数ナノリットル（ｎｌｓ）の範囲である。調製した全てのサンプル溶液を検出領域を通してチップに移動させ、被分析物を特異的分析領域の検出剤に接触させて結合するのに十分な時間を与えるには、かなりの時間を要するであろう。このことは、テストデータを得るために許容できないほどの応答時間を招く。この理由により、検出用チップを用いる現在の実務は、典型的に、チップに適用する高濃度の被分析物を有するＰＣＲ反応産物を使用している。
【０１０１】
しかしながら、本明細書に記載した方法及び装置を使用すると、電気泳動がウイルス性ＲＮＡ又はＤＮＡを大容量リザーバから、任意にステージングリザーバを通してチップの分析領域に輸送し、サンプル濃度がチップ上での検出に使用できるレベルに濃縮される。図７は、血液サンプル中のウイルス核酸又はタンパク質を検出するためのアッセイフォーマットの例を示す図である。図７はチップ６００を表し、それは、（ステージングリザーバ３００に配置された）複数のサンプル中の被分析物を、分析領域内の複数の検出部位７００を電極（４００、８００）間の矢印の方向にかけられた電界での電気泳動によって輸送することができる。検出部位７００は、「ＨＩＶ」、「ＨＢＶ」及び「ＨＣＶ」と表示され、これらのウイルスからのタンパク質又は核酸に特異的な捕捉剤、又はウイルスの一つと特異的に結合する結合部位などの存在を示している。この実施例では、４つのサンプルが同時にテストされている。これに代わる実施態様では、被分析物はステージングリザーバから電気泳動以外により（例えば、蠕動ポンプを用いて）輸送される。
【０１０２】
実施例２．ウイルス核酸被分析物についてのＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶテスト
患者サンプルにおいてウイルス核酸被分析物を検出するために、イオン性又は非イオン性洗浄剤は患者サンプルに添加されてウイルスコーティングを除去し、大容量リザーバ内の核酸が曝露される。非イオン性洗浄剤が用いられ、サンプルが低イオン含有量である場合は、電気泳動は、ウイルス核酸を分析領域７００に直接誘導するために使用される。あるいは、ウイルス核酸は、電気泳動により最初にステージングリザーバ３００に誘導される。次いで、これらのウイルス核酸は、ステージングリザーバから分析領域７００に、電気泳動又はマイクロポンプ等の他の手段により誘導される。
【０１０３】
イオン性洗浄剤が用いられる場合は、さらなるサンプル調製が次のように用いられる。相補的核酸又は類似物（結合剤）と接合した磁気微粒子がウイルスＲＮＡ又はＤＮＡ被分析物を含有するサンプルに添加される。ウイルスＲＮＡ又はＤＮＡは微粒子上の結合剤に結合する。過剰の洗浄剤を除去する洗浄工程の後、ウイルス核酸は尿素又は熱などの変性剤を用いて微粒子から脱離させる。次いで、ウイルス核酸を電気泳動を用いて分析領域７００に輸送する又はステージングリザーバに濃縮する。
【０１０４】
ステージングリザーバ３００への濃縮の後、核酸被分析物が、特定の位置においてマイクロ流体デバイス６００の捕捉部位（７００ａ、７００ｂ及び７００ｃ）を通過するように電気泳動が用いられる。捕捉剤は、特定のウイルス核酸被分析物に相補的な配列を持つ核酸又は類似物である。核酸被分析物は、ウイルスの特異的検出領域で結合し、捕捉に用いたものとは異なるウイルス配列の一部に相補的な配列を持つ核酸又は類似物からなるラベルを適用することにより検出される。核酸検出剤は、蛍光色素又は酵素などの検出可能な物質と接合しており、蛍光又は化学発光物質により検出できる。マイクロ流体デバイスの特異的領域（７００ａ、７００ｂ又は７００ｃ）においてラベルが検出された場合、サンプルが特定のウイルスを含有するとして同定される。
【０１０５】
実施例３．抗体被分析物についてのＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶテスト
患者サンプル中のＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶウイルス性抗原に対する抗体を検出する例は次のように実施される。
【０１０６】
各抗体に対する結合剤としての特異的なウイルス抗原が、磁気微粒子に制限部位を持つ二本鎖ＤＮＡ等の切断可能な結合を介して接合される。あるいは、イオン性部分で修飾された抗-ヒトＦｃ抗体を使用することができる。微粒子は大容量リザーバ内のヒト患者からの血液サンプルと混合され、ウイルス抗原に特異的な任意の抗体が捕捉される。不要な不純物を減少させるための洗浄工程の後、制限酵素での切断によって複合体が微粒子から解放される。複合体は、次いで、電気泳動によりステージングリザーバに誘導される。ステージングリザーバへの濃縮の後、複合体は分析領域（７００ａ、７００ｂ、７００ｃ）へ誘導される。例えば、複合体を検出するために、複合体中の物質の一つに特異的親和性を持つ捕捉剤が特異的部位（７００ａ、７００ｂ及び７００ｃ）各々におけるチップ表面上に接合されて複合体を再捕捉し、よって、サンプル中の特定のウイルス抗原に対する抗体の存在が同定される。例えば、サンプル調製工程における磁気ビーズ上の結合剤としてウイルス抗原が用いられる場合、捕捉剤は特異的な抗ヒト抗体でありうる。逆に、特異的な抗-ヒト抗体が最初に結合剤として用いられる場合、ウイルス抗原は患者抗体及び抗ヒト抗体の複合体の再捕捉に使用できる。再捕捉された複合体は、複合体に親和性を持つラベル化剤によって検出できる。複合体に親和性を持つ薬剤は、ヒト抗体又はウイルス抗原の適当な方に対する異なる抗体でありうる。それらは、蛍光色素又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ等の酵素でラベル化できる。あるいは、第一の結合剤は、検出のためのイオン性部分及びタグ又は特異的相補配列を持つように修飾することができる。例えば、オリゴヌクレオチドのイオン性部分は、第一の結合剤に接合し、イオン性電荷及びそれに相補的なラベル化オリゴヌクレオチドによる結合のための配列を提供できる。あるいは、第一の結合剤は、ビオチン化又はポリ-ヒスチジン等の物質でタグ化でき、ラベルに接合したアビジン又は抗-ポリヒスチジン抗体によって検出できる。
【０１０７】
実施例４．混合被分析物ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶテスト
本方法は、様々な供給源、例えば一つの供給源からのタンパク質又は異なる供給源からの核酸の混合された被分析物を検出するのに使用できる。このテストは、同じマイクロ流体デバイス上で、同じ患者サンプル中であっても、ＨＩＶ ｔａｔ、ＨＢＶ ｃａｐｓｉｄタンパク質、及び特異的ＨＣＶ抗原に対する抗体をコードする核酸を検出する。捕捉部位に提供される捕捉剤は、一の捕捉部位７００ａにおけるＨＩＶ核酸に相補的な核酸、第二の捕捉部位７００ｂにおけるＨＢＶｃａｐｓｉｄタンパク質に特異的に結合する抗体、第三の捕捉部位７００ｃにおけるこの抗原に対する抗体に特異的に結合する捕捉剤としてのＨＣＶ抗体を含む。あるいは、本方法は、患者サンプルからの同じ供給源からの被分析物（例えば、病原体特異的抗原、病原体特異的ＤＮＡ及び病原体特異的抗体）を検出するために使用することができる。
【０１０８】
本発明を特別な実施態様を参照しながら詳細に説明してきたが、当業者は、以下の特許請求の範囲に記載されるように、修正及び改良は本発明の範囲及び精神に含まれると理解するであろう。本明細書で挙げた全ての出版物及び特許文献（特許、発行された特許出願、及び未発行の特許出願）は、それらの出版物及び文献の各々が特に及び個々に参考として取り入れられるように、参考として本明細書に取り入れられているものとする。出版物及び特許文献の引用は、それらの文献が適切な先行技術であることを認めるものではなく、出版物の内容又は日付が同一であることを認めるものでもない。記載した説明及び実施例によって記載された発明は、当業者は、当該発明を様々な実施態様で実施できること、及び、上記の説明及び実施例は例示を目的とし、後述の特許請求の範囲を限定するものではないことを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】マイクロ流体デバイスに導入するための、サンプルを濃縮するシステムの例を示す図である。
【図２】Ａ〜Ｃは、被分析物を濃縮するシステムの３つの実施態様を示す図である。２Ａは、被分析物がステージングリザーバに蓄積される実施態様を示す。２Ｂは、被分析物は蓄積されないが、マイクロ流体デバイス全体、そして分析領域を通る連続流体がある実施態様を示す。２Ｃは、大容量リザーバがマイクロ流体デバイスと一体化した実施態様を示す。
【図３】数個のサンプル各々から複数の被分析物を検出できるマイクロ流体デバイスを示す図である。
【図４】イオン性部分でタグ付けされた抗体が大容量リザーバ内で対象とする被分析物と結合して複合体を形成し、該複合体がマイクロ流体デバイス上を電気泳動される、本発明の実施態様を示す図である。マイクロ流体デバイスは結合した捕捉剤（対象とする被分析物に特異的だが異なるエピトープを認識する第二の抗体）を含む。
【図５】一次抗体が結合した微粒子が、大容量リザーバ内で被分析物と結合する固相として使用される、本発明の実施態様を示す図である。イオン性部分でタグ付けされた第二の抗体が付加され、やはり被分析物に結合する。一次抗体は開裂して微粒子から被分析物複合体を放出し、該複合体がステージングリザーバに電気泳動される。複合体は、イオン性部分に特異的な捕捉剤を用いてマイクロ流体デバイス上に捕捉される。
【図６】図５に示した実施態様に類似する実施態様を示す図であり、対象とする被分析物が当初微粒子に結合している。イオン性部分は、ビオチン／アビジン結合を用いて抗体結合微粒子に結合する。抗体は開裂して微粒子から被分析物を放出し、電気泳動によってマイクロ流体デバイスに導入される。複合体は被分析物に特異的な第二の抗体を用いてマイクロ流体デバイス上に捕捉される。
【図７】血液サンプル中のウイルス核酸又はタンパク質の検出のためのアッセイフォーマットの例を示す図である。複数のサンプル中の被分析物が、分析領域内の複数の検出部位上で（例えば、電気泳動によって）輸送される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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