(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＯＣＫ５タンパク質によるＲＡＣ  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
細胞において少なくともＤＯＣＫ５タンパク質のＤＨＲ２ドメインとＲＡＣタンパク質を同時発現させる工程であって、前記少なくともＤＯＣＫ５タンパク質のＤＨＲ２ドメインは、ＧＤＰに結合されている不活性ＲＡＣの、ＧＴＰに結合されている活性ＲＡＣへの変換を誘導する、工程、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換を判定する工程、
不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
選択された化合物が骨欠損に関連する疾患を処置するのに有用である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨欠損に関連する疾患が、骨粗鬆症、骨転移による骨減少症、関節リウマチにおける関節周囲のびらん、原発性上皮小体機能亢進症、悪性の高カルシウム血症、パジェット骨病、歯周病、固定化誘導性骨減少症およびグルココルチコイド処置を含んでなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
選択される化合物による骨吸収の阻害を試験する工程をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＯＣＫ５タンパク質が、ハツカネズミ配列番号１由来のＤＯＣＫ５タンパク質のアミノ酸１１３２〜１６６１に相当するタンパク質ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメインを含んでなるポリペプチドおよびその誘導体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＯＣＫ５タンパク質が、ヒトＤＯＣＫ５タンパク質に相当する配列番号４に相当する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＲＡＣタンパク質が、配列番号２およびその誘導体に相当する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、活性ＲＡＣタンパク質と相互作用できるが、不活性ＲＡＣタンパク質とは相互作用できないタンパク質の発現をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、プロモーター配列の制御下にリポーター遺伝子をさらに含んでなり、前記活性ＲＡＣおよび相互作用するタンパク質がそれぞれトランス活性化ドメインまたは前記プロモーター配列に特異的なＤＮＡ結合ドメインのいずれかと融合されており、活性ＲＡＣと相互作用タンパク質の相互作用の結果、リポーター遺伝子の発現が誘導される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
活性ＲＡＣと相互作用するタンパク質が、配列番号３に相当するＰＡＫ１タンパク質およびその誘導体を含んでなる群から選択される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＬＭＯ１とＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインの結合を阻害することにより、ＲＡＣ  １／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
ａ）試験化合物をＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体と接触させる工程；および
ｂ）該試験化合物とＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体の結合を測定する工程
を含んでなる方法。
【請求項１２】
ｃ）不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害する化合物を選択する工程
をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＬＭＯ１とＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインの結合を阻害することにより、ＲＡＣ  １／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
ａ）試験化合物を、ＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体およびＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインまたはその誘導体を少なくとも含んでなるポリペプチドと接触させる工程；および
ｂ）該化合物の存在下または不在下で、該ＥＬＭＯ１タンパク質と該ポリペプチドの間の結合を測定する工程
を含んでなる方法。
【請求項１４】
ｃ）不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害する化合物を選択する工程
をさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、骨欠損に関連する疾患の分野、より具体的には、骨欠損に関連する疾患の処置および／または予防に有用な化合物を同定するための新規な方法に関する。
【０００２】
背景技術
骨は、栄養および骨が持たなければならない荷重等の因子に依存して、生涯絶えず再建される動的な組織である。正常な骨形成は新しい骨の付加と古い骨の吸収の間の繊細なバランスに依存している。骨形成は骨芽細胞による骨基質の沈着と骨吸収（bone resorption）に基づき、より具体的には、脊椎動物における無機化組織（mineralized tissue）、もっぱら炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウムの吸収は破骨細胞により達成される。一般に、正常成人では、これらのプロセスによって年間に骨の約５〜１０％が置き換わる。
【０００３】
これらの破骨細胞は、単球細胞（単球細胞は骨の表面を移動する活発に運動する細胞である）に由来するマクロファージおよび他の細胞に関連のある最大４００μｍの多核細胞である。マクロファージのように、破骨細胞は造血系前駆細胞に由来する。骨吸収は、破骨細胞が無機化した骨の表面に接着した際に誘発され、強固な「密封帯(sealing zone)」を形成し、必要な酸および骨由来の無機化組織の吸収を誘発するプロテアーゼを分泌する。数時間〜数日の後に、破骨細胞は骨表面にピットを残して剥がれる。正常な条件下では、このピットが骨芽細胞の標的となり、材料を沈着させ、やがて新しい骨となる。
【０００４】
骨欠損は、骨吸収プロセスが骨形成プロセスよりも優勢な場合に起こり得る。骨欠損に関連する疾患は通常、破骨細胞の活性化の上昇を伴う。このような疾患には、特に閉経後のエストロゲン欠乏から起こる骨欠損を含むだけでなく、骨粗鬆症、骨転移による骨減少症、特に、関節リウマチにおける関節周囲のびらん、原発性上皮小体機能亢進症、悪性の高カルシウム血症、パジェット骨病、歯周病、固定化誘導性骨減少症(immobilization−induced osteopenia)およびグルココルチコイド処置が含まれる。
【０００５】
一例として、米国では、骨粗鬆症による検出可能な椎骨骨折を有する人は現在２千万人である。さらに、骨粗鬆症による股関節骨折は年間２５０，０００件である。この臨床状態は最初の２年以内に１２％の死亡率を伴い、患者の３０％が骨折後に在宅介護を必要とする。
【０００６】
骨欠損疾患は破骨細胞の活性の増大に関連するので、これらの病態で破骨細胞が活性化されるメカニズムを理解すること、およびこの活性化を阻害または軽減する合理的な治療手段を考案することが重要である。
【０００７】
よって、本発明の目的は、骨欠損疾患を処置および／または予防するのに有用である新規なスクリーニング法を作り上げること、およびこのような化合物を用いて骨欠損疾患を処置および／または予防するための薬剤を製造することである。
【発明の開示】
【０００８】
本発明者らは今般、ＤＯＣＫ５タンパク質が密封帯の形成、そしてその結果としての骨吸収に関連していると特定した。よって、ＤＯＣＫ５は骨欠損疾患を処置および／または予防するための新たな治療標的に相当する。最後に、本発明者らは、ＤＯＣＫ５の阻害剤（この阻害剤は骨欠損疾患を処置および／または予防するのに有効であり得る）を同定するために酵母交換アッセイ(yeast exchange assay) （ＹＥＡ）を用いた。
【０００９】
よって、第一の目的では、本発明は、ＤＯＣＫ５タンパク質による、ＲＡＣ  ＧＴＰアーゼ、より具体的には、ＲＡＣ１／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
細胞においてＤＯＣＫ５とＲＡＣタンパク質を同時発現させる工程（ここで、該ＤＯＣＫ５タンパク質は不活性ＲＡＣ（この不活性ＲＡＣはＧＤＰに結合されている）の、活性ＲＡＣ（この活性ＲＡＣはＧＴＰに結合されている）への変換を誘導する）、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換、より具体的には、不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を判定する工程、および
不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換、より具体的には、不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法に向けられる。
【００１０】
選択された化合物は骨欠損に関連する疾患を処置するのに有用である。実際、本発明者らは、ＤＯＣＫ５による不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換が密封帯形成に関連していることを確認した。
【００１１】
本発明によれば、「ＲＡＣ  １／２」は「ＲＡＣ１および／またはＲＡＣ２」を意味する。実際、ＲＡＣ１  ＧＴＰアーゼおよび／またはＲＡＣ２  ＧＴＰアーゼの活性化の阻害は同じ種類の結果をもたらし、ＲＡＣ１とＲＡＣ２は双方とも破骨細胞分化と吸収機能に関与している（ひいては必要である）。
【００１２】
有利には、本発明は、ＲＡＣ  １／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害し、ＤＯＣＫ５タンパク質による骨欠損に関連する疾患を処置するのに有用な化合物を同定するための方法であって、
細胞においてＤＯＣＫ５とＲＡＣタンパク質を同時発現させる工程（該ＤＯＣＫ５タンパク質は不活性ＲＡＣ（この不活性ＲＡＣはＧＤＰに結合されている）の、活性ＲＡＣ（この活性ＲＡＣはＧＴＰに結合されている）への変換を誘導する）、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換を判定する工程、
この変換は密封帯形成に関連しているので、不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換を阻害する化合物を選択する工程、および
選択された化合物により、骨吸収の阻害を試験する（破骨細胞による無機化基質吸収を試験することに相当する）
を含んでなる方法に向けられる。
【００１３】
骨欠損に関連する疾患の例としては、閉経、骨粗鬆症、骨転移による骨減少症、関節リウマチにおけるびらん、原発性上皮小体機能亢進症、悪性の高カルシウム血症、パジェット骨病、歯周病、固定化誘導性骨減少症およびグルココルチコイド処置におけるものが挙げられる。好ましくは、骨欠損に関連する疾患は骨粗鬆症である。
【００１４】
本明細書において用いた細胞および骨吸収アッセイ系からの結果は、in vivo効果を推定するものとして当技術分野で広く受け入れられている。この骨吸収アッセイでは骨髄単離細胞を含む材料を用いるので、ex vivoアッセイである。よって、これらのアッセイにおいてＤＯＣＫ５によるＲＡＣの活性化の阻害が骨吸収を阻害することを示すことは、骨粗鬆症を処置するためのこの特異的な活性化の阻害剤の臨床的有用性の証拠となる。Carano ら (1990); Blair & Schlesinger (1992); Schlesinger & Blair (1992); Vaananen et al., 1990などの種々の科学刊行物（総て、このようなアッセイがin vivo活性を推定するものとして受け入れられるということを裏付ける）。
【００１５】
不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換を判定するための方法は当業者に周知である。このような方法の例としては、実施例およびCOTE & VUORI (J Cell. Sci., vol.115, p: 4901-4913, 2002)に開示されている方法が挙げられる。
【００１６】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、選択される化合物による骨吸収の阻害を試験する工程をさらに含んでなる。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、本発明の方法は、試験化合物の存在下および該化合物の不在下において不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換を比較することを含んでなるさらなる工程を含む。該骨吸収の阻害は、実施例に開示されているものなどの、当業者に周知の方法により簡単に試験することができ、ここでは、破骨細胞による無機化基質の吸収（mineralised matric resorption）は破骨細胞をリン酸カルシウム培養基上で培養することにより試験され、無機化基質の吸収はＶＯＮ  ＫＯＳＳＡ染色により測定される。
【００１８】
本明細書において「化合物」とは、化学またはペプチド化合物などの天然または合成化合物を意味する。
【００１９】
好ましくは、これらの化合物は
４−［５−（４−ブロモフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］−４−オキソブタン酸；
２，２，２−トリクロロ−Ｎ−（１，１−ジオキシド−２，３−ジヒドロ−３−チエニル）−Ｎ−（４−メチルフェニル）アセトアミド；
３−（３−クロロフェニル）−７−メチル−４−メチレン−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キナゾリノン；
３−［４−（３−ブロモベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］安息香酸；
Ｎ−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−イル−５−ブロモ−２−フラミド；
１−アセチル−４−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−２−メチルピペラジン；
３−（３−メトキシベンジリデン）−５−（４−メチルフェニル）−２（３Ｈ）−フラノン；
３−［５−（３，４−ジクロロフェニル）−２−フリル］アクリル酸；
（２−クロロ−４−｛［５−（２−クロロフェニル）−６−（エトキシカルボニル）−７−メチル−３−オキソ−５Ｈ−［１，３］チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−２（３Ｈ）−イリデン］メチル｝−６−メトキシフェノキシ）酢酸；
４−｛［４−（ジフェニルメチル）−１−ピペラジニル］スルホニル｝−２，１，３−ベンゾチアジアゾール；
４−［４−フェニル−５−（２−チエニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−１，２−ベンゼンジオール；
Ｎ−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−［メチル（フェニルスルホニル）アミノ］ベンズアミド；
１−［（２−ヒドロキシフェニル）カルボノチオイル］−３−フェニル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
４−［（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）アミノ］安息香酸２−メトキシエチル；
Ｎ−（２，３−ジクロロフェニル）−３−（５−メチル−２−フリル）アクリルアミド；
Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アクリルアミド；
３−（２−フリルメチル）−２−（２−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
Ｎ−（４−エトキシフェニル）−２−｛［５−（４−メトキシフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル］チオ｝アセトアミド；
５−（４−ニトロベンジリデン）−２−チオキソ−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾリジン−４−オン；
（３，５−ジクロロフェニル）［（フェニルスルホニル）カルボニル］アミン；
Ｎ−（２−ブロモフェニル）−３−（５−メチル−２−フリル）アクリルアミド；
２−（２−クロロフェノキシ）−Ｎ−［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド；
Ｎ−［４−（４−アセチル−１−ピペラジニル）フェニル］プロパンアミド；
８−［（ジメチルアミノ）メチル］−９−ヒドロキシ−２−メチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン；
４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−［１−｛［（２−メトキシフェニル）アミノ］カルボニル｝−２−（２−チエニル）ビニル］ベンズアミド；
２−クロロ−Ｎ−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）ベンズアミド；
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ペリミジン−２−イル）フェノール；
３−ベンジル−２−（２，６−ジクロロフェニル）−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
１−（３，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド；
Ｎ−［５−（１−アダマンチル）−１，３，４−チアジアゾール−２−イル］−Ｎ’−フェニル尿素；
Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ’−｛５−［（４−メチルフェノキシ）メチル］−１，３，４−チアジアゾール−２−イル｝尿素；
Ｎ−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−２−（１−ナフチルオキシ）アセトアミド；
Ｎ−［４−（４−アセチル−１−ピペラジニル）フェニル］−４−エトキシ−３−ニトロベンズアミド；
Ｎ−（２−クロロフェニル）−３−（４−フルオロフェニル）アクリルアミド；
１−［（ジメチル−λ〜４〜−スルファニリデン）アミノ］−２−メトキシ−４−ニトロベンゼン；
５−ベンジリデン−１−（２−クロロフェニル）−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン；
４−エチル−５，６−ジメチル−２−フェニルピリミジン；
２−（３−クロロベンジリデン）−１Ｈ−インデン−１，３（２Ｈ）−ジオン；
５−｛５−［（３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル］−２−フリル｝−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン；
Ｎ−（２，５−ジメチルフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）アクリルアミド；
２−（｛２−［（４−ニトロフェニル）アミノ］エチル｝アミノ）エタノール；
Ｎ−（３−メトキシフェニル）−４−プロポキシベンズアミド；
２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニル−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
４−メチル−１−（２−ニトロベンゾイル）ピペリジン；
２−ヒドロキシ−Ｎ’−［（２−メチルフェニル）スルホニル］ベンゾヒドラジド；
４−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）ブタン酸；
４−（３−メチルベンジリデン）−１−フェニル−３，５−ピラゾリジンジオン；
４−（２，４−ジクロロフェノキシ）−Ｎ−（２−エトキシフェニル）ブタンアミド；
Ｎ−（２−メトキシフェニル）−Ｎ’−（フェニルスルホニル）ベンゼンカルボキシイミドアミド；
Ｎ−［２−（２−クロロ−５−ヨードフェニル）−１，３−ベンゾキサゾール−５−イル］−２−メチルプロパンアミド；
５−（４−ブトキシフェニル）−３−シクロヘキシル−１，２，４−オキサジアゾール；
Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ’−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−４−イル尿素；
６−クロロ−４−フェニル−３−［３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アクリロイル］−２（１Ｈ）−キノリノン；
６−ブロモ−４−フェニル−３−［３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アクリロイル］−２（１Ｈ）−キノリノン；および
Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イルメチル）−４−ニトロ−１，２，５−オキサジアゾール−３−アミン
からなる群において選択される。
【００２０】
より好ましくは、これらの化合物は、
４−［５−（４−ブロモフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］−４−オキソブタン酸；
２，２，２−トリクロロ−Ｎ−（１，１−ジオキシド−２，３−ジヒドロ−３−チエニル）−Ｎ−（４−メチルフェニル）アセトアミド；
３−（３−クロロフェニル）−７−メチル−４−メチレン−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キナゾリノン；
３−［４−（３−ブロモベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］安息香酸；
Ｎ−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−イル−５−ブロモ−２−フラミド；
１−アセチル−４−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−２−メチルピペラジン；
３−（３−メトキシベンジリデン）−５−（４−メチルフェニル）−２（３Ｈ）−フラノン；
３−［５−（３，４−ジクロロフェニル）−２−フリル］アクリル酸；
（２−クロロ−４−｛［５−（２−クロロフェニル）−６−（エトキシカルボニル）−７−メチル−３−オキソ−５Ｈ−［１，３］チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−２（３Ｈ）−イリデン］メチル｝−６−メトキシフェノキシ）酢酸；
４−｛［４−（ジフェニルメチル）−１−ピペラジニル］スルホニル｝−２，１，３−ベンゾチアジアゾール；
４−［４−フェニル−５−（２−チエニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−１，２−ベンゼンジオール；
Ｎ−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−［メチル（フェニルスルホニル）アミノ］ベンズアミド；
１−［（２−ヒドロキシフェニル）カルボノチオイル］−３−フェニル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
４−［（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）アミノ］安息香酸２−メトキシエチル；
Ｎ−（２，３−ジクロロフェニル）−３−（５−メチル−２−フリル）アクリルアミド；
Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アクリルアミド；
３−（２−フリルメチル）−２−（２−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ペリミジン−２−イル）フェノール
３−ベンジル−２−（２，６−ジクロロフェニル）−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
１−（３，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド；
Ｎ−（４−エトキシフェニル）−２−｛［５−（４−メトキシフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル］チオ｝アセトアミド；
５−（４−ニトロベンジリデン）−２−チオキソ−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾリジン−４−オン；
（３，５−ジクロロフェニル）［（フェニルスルホニル）カルボニル］アミン；
Ｎ−（２−ブロモフェニル）−３−（５−メチル−２−フリル）アクリルアミド；
２−（２−クロロフェノキシ）−Ｎ−［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド；
Ｎ−［４−（４−アセチル−１−ピペラジニル）フェニル］プロパンアミド；
８−［（ジメチルアミノ）メチル］−９−ヒドロキシ−２−メチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン；
４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−［１−｛［（２−メトキシフェニル）アミノ］カルボニル｝−２−（２−チエニル）ビニル］ベンズアミド；
２−クロロ−Ｎ−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）ベンズアミド；
Ｎ−［５−（１−アダマンチル）−１，３，４−チアジアゾール−２−イル］−Ｎ’−フェニル尿素；
Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ’−｛５−［（４−メチルフェノキシ）メチル］−１，３，４−チアジアゾール−２−イル｝尿素；
Ｎ−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−２−（１−ナフチルオキシ）アセトアミド；
Ｎ−［４−（４−アセチル−１−ピペラジニル）フェニル］−４−エトキシ−３−ニトロベンズアミド；
Ｎ−（２−クロロフェニル）−３−（４−フルオロフェニル）アクリルアミド；
１−［（ジメチル−λ〜４〜−スルファニリデン）アミノ］−２−メトキシ−４−ニトロベンゼン；
５−ベンジリデン−１−（２−クロロフェニル）−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン；および
４−エチル−５，６−ジメチル−２−フェニルピリミジン
からなる群において選択される。
【００２１】
本明細書において、「ＤＯＣＫ５タンパク質」とは、ハツカネズミ(Mus musculus)配列番号１由来のＤＯＣＫ５タンパク質のアミノ酸１１３２〜１６６１に相当するタンパク質ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメインを少なくとも含んでなるポリペプチドおよびその誘導体を意味する。
【００２２】
よって、本発明は、ＤＯＣＫ５タンパク質によるＲＡＣ  ＧＴＰアーゼ、より具体的にはＲＡＣ  １／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
細胞においてタンパク質ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメインを少なくとも含んでなるポリペプチドとＲＡＣタンパク質を同時発現させる工程（このポリペプチドは不活性ＲＡＣ（この不活性ＲＡＣはＧＤＰに結合されている）の、活性ＲＡＣ（この活性ＲＡＣはＧＴＰに結合されている）への変換を誘導する）、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換、より具体的には、不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を判定する工程、
不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換、より具体的には、不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法に向けられる。
【００２３】
全長Ｄｏｃｋ５タンパク質は、アミノ酸Ｋ１１とＥ６８の間にアミノ末端ＳＨ３ドメイン、その後、Ｇ４４０とＥ６８２の間にＤＨＲ１ドメイン、およびアミノ酸Ｍ１１３２とＹ１６６１の間にＤＨＲ２ドメインを有する（図３Ｅ）。
【００２４】
好ましくは、該ＤＯＣＫ５タンパク質は配列番号１に相当する。
【００２５】
また好ましくは、該ＤＯＣＫ５タンパク質は、ヒト(Homo sapiens)ＤＯＣＫ５タンパク質に相当する配列番号４に相当する。
【００２６】
本明細書において「ＲＡＣタンパク質」とは配列番号２およびその誘導体を意味する。
【００２７】
好ましい実施形態によれば、該細胞は真核細胞、好ましくは酵母細胞である。
【００２８】
有利には、該方法は、活性ＲＡＣタンパク質と相互作用できるが、不活性ＲＡＣタンパク質とは相互作用できないいずれのタンパク質の発現も含む。当業者であれば、ＧＴＰアーゼエフェクターとして知られるこのようなタンパク質が分かる。好ましい実施形態によれば、活性ＲＡＣタンパク質と相互作用できるタンパク質はＰＡＫ１タンパク質を含んでなる群において選択される。
【００２９】
本明細書において、「ＰＡＫ１タンパク質」とは、配列番号３およびその誘導体を意味する。
【００３０】
本明細書において、「誘導体」とは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号９のアミノ酸１１３２〜１６６１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例としては少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性％を有するポリペプチド、またはその相同分子種を意味する。
【００３１】
本明細書において、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列間の「同一性％」とは、これらの配列の最良のアライメントで得られる、比較するその２配列間で同一のアミノ酸またはヌクレオチドのパーセンテージを意味し、このパーセンテージは純粋に統計学的なものであり、これら２配列間の違いはそれらのアミノ酸配列にランダムに拡散している。本明細書において、「最良のアライメント」または「最適なアライメント」とは、決定された同一性％（下記参照）が最高であるアライメントを意味する。２配列間の配列比較は通常、最良のアライメントに従って事前にアラインされたこれらの配列を比較することによって行われ、この比較は同定のために比較セグメントで行われ、類似性のある局部領域で比較される。比較を行うための最良の配列アライメントは、その他、手動によるか、SMITH and WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981)により開発されたグローバルホモロジーアルゴリズムによるか、NEDDLEMAN and WUNSCH (J Mol. Biol, vol.48, p:443, 1970)により開発されたローカルホモロジーアルゴリズムの使用によるか、PEARSON and LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. USA, vol.85, p:2444, 1988)により開発された類似性の方法によるか、そのようなアルゴリズム（Wisconsin Genetics softwares Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI USAのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）を用いたコンピューターソフトウエアの使用によるか、ＭＵＳＣＬＥマルチプルアライメントアルゴリズム(Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol. 32, p:1792, 2004)の使用により行うことができる。最良のローカルアライメントを得るために、好ましくはＢＬＡＳＴソフトウエアをＢＬＯＳＵＭ  ６２マトリックスとともに、またはＰＡＭ  ３０マトリックスを使用することができる。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列間の同一性
％は、最適にアラインされたこれら２つの配列を比較することにより決定され、アミノ酸配列は、これら２つの配列間の最適アライメントを得るために参照配列に対して付加または欠失を含めることができる。同一性％はこれら２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の総数で割り、得られた結果に１００を掛けて、これら２配列間の同一性％を得ることにより算出される。
【００３２】
有利には、前記細胞はプロモーター配列の制御下にリポーター遺伝子をさらに含んでなり、前記ＲＡＣおよびＰＡＫ１タンパク質はそれぞれトランス活性化ドメインまたは該プロモーター配列に特異的なＤＮＡ結合ドメインのいずれかと融合され、ＲＡＣとＰＡＫ１の相互作用はリポーター遺伝子の発現の誘導をもたらす。
【００３３】
この方法は、ＤＯＣＫ５およびＲＡＣタンパク質を用いた、DE TOLEDO ら (FEBS, vol.480, p:287-292, 200)およびＷＯ２００５／０６４００７号公報に開示されているような酵母交換アッセイ(Exchange Assay)（ＹＥＡ）に相当する。
【００３４】
よって、ＷＯ２００５／０６４００７号公報（第６頁、"description de l’invention"の段落、第２３頁まで）におけるＹＥＡは引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３５】
「リポーター遺伝子」は当業者に周知であり、栄養要求性マーカー、またはＧＦＰ、ルシフェラーゼもしくはβ−Ｇａｌなどの簡単に検出することができるタンパク質をコードする遺伝子に相当し得る。
【００３６】
この実施形態では、不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換の判定は、リポーター遺伝子の発現を判定することによって行われる。リポーター遺伝子の発現の阻害は不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換の阻害に相当する。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、骨欠損に関連する疾患において、ＤＯＣＫ５遺伝子（配列番号１０）の発現レベルの低減を可能とする化合物の選択のための方法であって、
ａ）試験化合物を、プロモーター（このプロモーターはＤＯＣＫ５遺伝子のプロモーター配列またはその誘導体の全部または一部を含んでなる）の制御下に置かれたリポーターをコードする核酸配列を含んでなるリポーター核酸を発現する宿主細胞と接触させる工程、および
ｂ）そのリポーターの発現レベルを測定する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００３８】
本明細書において、「誘導体」とは、ＤＯＣＫ５プロモーターの配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例として少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性％を有する核酸配列を意味する。同一性％は上記に定義される通りである。
【００３９】
「化合物」または「試験化合物」とは、性質、構造および起源の異なる化合物、特に生物学的化合物、核因子、補因子など、抗微生物防御に関連する該遺伝子の発現レベルを増強するそれらの能力に関して試験される化学化合物、合成化合物などと理解すべきである。
【００４０】
該試験化合物の濃度は当業者ならば該化合物の特徴（その毒性、細胞浸透能など）、細胞数、インキュベーション期間の長さなどに従って調整することができる。一般に、細胞を１ｎＭ〜１ｍＭの範囲の濃度の試験化合物に曝す。当然のことながら、本発明から逸脱することなく他の濃度を試験すること、および異なる試験化合物濃度を同時に試験することもできる。
【００４１】
種々のアジュバントおよび／またはベクターおよび／またはリポソーム、陽イオン脂質またはポリマーなど、試験化合物の宿主細胞への浸透を促進する生成物も必要に応じて使用可能である。
【００４２】
「ＤＯＣＫ５遺伝子の発現レベルを低減させる」とは、ＤＯＣＫ５遺伝子の発現レベルが対照レベルと比較して減少される、または阻害されることと理解すべきである。
【００４３】
このＤＯＣＫ５遺伝子の発現レベルは本発明の方法におけるリポーター遺伝子の発現レベルと相関することに留意すべできある。実際、当業者ならば、本発明の方法においてリポーター遺伝子の発現レベルの減少が得られる試験化合物の能力から、該化合物がＤＯＣＫ５遺伝子の発現レベルを低下させることができることが推測できるであろう。
【００４４】
本発明において、対照レベルは、例えば、試験化合物の不在下でリポーター遺伝子の発現レベルを測定することにより決定することができる。
【００４５】
よって、好ましい実施形態では、本発明による方法は、工程ｂ）で測定されたリポーター遺伝子の発現レベルと該試験化合物の不在下でのリポーター遺伝子の発現レベルを比較するという工程ｃ）をさらに含んでなる。
【００４６】
別の実施形態では、本発明は、ＥＬＭＯ１タンパク質（配列番号９）とＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインの結合を阻害することによりＲＡＣ  １／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
ａ）試験化合物をＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体と接触させる工程；
ｂ）該試験化合物とＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体の結合を測定する工程：および場合により、
ｃ）不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００４７】
本明細書において、「ＥＬＭＯ１タンパク質」とは、配列番号９およびその誘導体を意味する。
【００４８】
該ＥＬＭＯ１タンパク質と試験化合物の間の結合は、当業者に周知の方法によって測定することができる。
【００４９】
該ＥＬＭＯ１タンパク質と該試験化合物の間の結合が見られれば、その化合物はＥＬＭＯ１とＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインの結合の阻害剤であり、かつ、この化合物が不活性ＲＡＣ１／２の活性ＲＡＣ１／２への変換を阻害するのに有用であると結論付けることができる。
【００５０】
場合により、該方法は、工程ｂ）の後に、少なくともＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインまたはその誘導体を含んでなるポリペプチドと該試験化合物およびＥＬＭＯ１タンパク質を接触させること、および該化合物の存在下または不在下での該ＥＬＭＯ１タンパク質と該ポリペプチドの間の結合を比較することをさらに含むことができる。
【００５１】
あるいは、本発明は、ＥＬＭＯ１とＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインの結合を阻害することにより、ＲＡＣ  １／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
ａ）試験化合物をＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体および少なくともＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインまたはその誘導体を含んでなるポリペプチドと接触させる工程；
ｂ）該化合物の存在下または不在下で該ＥＬＭＯ１タンパク質と該ポリペプチドの間の結合を測定する工程；および場合により、
ｃ）不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００５２】
該ＥＬＭＯ１タンパク質と該ポリペプチドの間の結合は、当業者に周知の方法によって測定することができる。供試化合物の存在下での該ＥＬＭＯ１タンパク質と該ポリペプチドの間の結合が該化合物の不在下で測定されたものより低ければ、その化合物はＥＬＭＯ１とＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインの結合の阻害剤であり、かつ、この化合物が不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害するのに有用であると結論付けることができる。
【００５３】
場合により、上記のような化合物はビスホスホネート基と結合されている。このビスホスホネート基は、その投与後に化合物の迅速な組み込みを可能とする。
【００５４】
本発明のもう１つの目的は、それを必要とする対象において骨欠損疾患を処置および／または予防するための上記のような化合物である。
【００５５】
よって、本発明は、それを必要とする対象において骨欠損疾患を処置および／または予防するための薬剤の製造における上記のような少なくとも１つの化合物の使用に関する。
【００５６】
本発明のもう１つの目的は、それを必要とする対象において骨欠損疾患を処置および／または予防するための、上記のような少なくとも１つの化合物と、場合により、薬学上許容される支持体とを含んでなる医薬組成物である。
【００５７】
よって、本発明は、それを必要とする対象において骨欠損疾患を処置および／または予防するための薬剤の製造における、上記のような少なくとも１つの化合物を含んでなる医薬組成物の使用に関する。
【００５８】
薬学上許容される支持体の例として、該組成物はエマルション、マイクロエマルション、水中油型エマルション、無水脂質および油中水型エマルションまたは他の種のエマルションを含み得る。
【００５９】
本発明の組成物は、希釈剤、賦形剤、安定剤および保存剤などの１以上の添加剤をさらに含み得る。このような添加剤は当業者に周知であり、特に"Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6th Ed." (various editors, 1989-1998, Marcel Dekker)および"Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems" (ANSEL et al, 1994, WILLIAMS & WILKINS)に記載されている。
【００６０】
本願において「対象」とは、齧歯類、ネコ、イヌ、霊長類またはヒトなどの哺乳類を意味し、好ましくは、該対象はヒトである。
【００６１】
本発明のもう１つの目的は、治療上有効な量の上記のような医薬組成物の投与を含んでなる、対象を処置する、および／または骨欠損疾患を予防するための治療的方法に関する。
【００６２】
「治療上有効な量」とは、破骨細胞の活性化を阻害または低減する量を意味する。当業者ならば、一般的知識および実施例に記載されている方法に基づき、治療上有効な量を決定することができる。
【００６３】
これらの化合物は、例えば筋肉内、静脈内または経口経路などの任意の投与様式によって投与することができる。
【００６４】
本発明の化合物は好ましくは、疾病の進行状態、ならびに用いる標的様式、対象の年齢および体重に応じて当業者により選択される濃度で投与される。好ましくは、該化合物は５〜２００μＭの間の濃度、好ましくは１０〜１００μＭの間を含んでなる濃度で投与される。
【００６５】
以下、本発明をアミノ酸配列、核酸配列および実施例を参照してより詳細に記載する。なお、これらの実施例の詳細は本発明を限定するものではない。むしろ、本発明は、本明細書の実施例に明示されない詳細を含むが、当業者が過度な努力無く見出すいずれの実施形態にも関する。
【実施例】
【００６６】
１）Ｄｏｃｋ５  ｍＲＮＡの発現
種々のマウス組織においてＤｏｃｋ５の発現を確立した。このため、ＤＮアーゼＩで処理した全ＲＮＡを、High pure RNA isolation kit (ROCHE DIAGNOSTICS)を抽出した。ｃＤＮＡを作製するため、ＲＮＡを１０マーのランダムプライマーでプライミングし、逆転写を、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素(INVITROGEN)を用いて触媒した。定量的ＰＣＲを、COELHO et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p:11917-11922, 2005)に記載されているように、Light Cycler (ROCHE DIAGNOSTICS)またはMx3000ｍp PCR system (STRATAGENE)にて、PLATINIUM Taq DNAポリメラーゼ(INVITROGEN)およびSYBR GREEN I (BIOWITAKKER)を用い、Ｄｏｃｋ５についてはプライマーＤｏｃｋ５−Ｕｐ（TGGTGACACAGGGACAGTGG、配列番号５）とＤｏｃｋ５−Ｄｏ（CACCCCAACTAGCACGTGG、配列番号６）、そして対照としてのＧａｐｄｈについてはＧａｐｄｈ−Ｕｐ（ACAGTCCATGCCATCACTGCC、配列番号７）とＧａｐｄｈ−Ｄｏ（GCCTGCTTCACCACCTTCTT、配列番号８）を用いて行った。
【００６７】
特異性はこのＰＣＲ産物の精製および配列決定により評価した。ｃＤＮＡを定量するためのリアルタイムＰＣＲ測定は総て３回ずつ行い、Ｇａｐｄｈに対する比の９５％信頼限界をスチューデントのｔ検定によって求めた。図１ＡおよびＢは、種々のマウス組織におけるＤｏｃｋ５の発現を示す。図１Ａでは、該発現はＤｏｃｋ５破骨細胞発現に対してノーマライズされたものである（すなわち、Ｄｏｃｋ５破骨細胞発現は１００％レベルに相当する）。
【００６８】
図１Ａの分析組織は以下の通りである：筋肉１（Ｍ１）、筋肉２（Ｍ２）、心臓（Ｈ）、胚発生１０．５日目の乳腺（ＧＭ１０．５）、胚発生１３．５日目の乳腺（ＧＭ１３．５）、胚発生１５．５日目の乳腺（ＧＭ１５．５）、胚発生１８．５日目の乳腺（ＧＭ１８．５）、若年マウスの乳腺（ＧＭｊ）、乳汁分泌時の乳腺（ＧＭ１）、脳（Ｂｒ）、腎臓（Ｋｄ）、子宮（Ｕｔ）、肝臓（Ｌｖ）、マクロファージ（Ｍａｃ）、精巣１（Ｔ１）、精巣２（Ｔ２）、脾臓（Ｓｐ）、結腸（Ｃｏ）、骨髄（Ｂｍ）、胚発生１３．５日目の胎盤（Ｐｌ１３．５）、胚発生１５．５日目の胎盤（ＧＭ１５．５）および破骨細胞（Ｏｓ）。
【００６９】
さらに、骨髄マクロファージ（ＮＤ）、破骨細胞分化のために誘導されたもの（ＯＣ）または樹状細胞分化のために誘導されたもの（ＤＣ）および間充織幹細胞由来のもの（ＭＳＣ  ＪＯ）、骨芽細胞分化のために誘導されたもの（ＭＳＣ  Ｊ４）の全ＲＮＡを抽出し、Ｇａｐｄｈ  ｍＲＮＡに対するＤｏｃｋ５  ｍＲＮＡのレベルをＲＴ−ＰＣＲにより決定した。
【００７０】
図１Ｂの結果は、Ｄｏｃｋ５  ｍＲＮＡが樹状細胞および骨芽細胞においては発現されないことを示す。
【００７１】
これらの結果は、Ｄｏｃｋ５は主として破骨細胞で発現されるが、胎盤（すなわち５０％近く）および精巣でもＤｏｃｋ５の重要な発現が見られることを示す。Ｄｏｃｋ５の発現は破骨細胞（すなわち、２０％近く）に比べて骨髄、結腸、脾臓および精巣で低減されるが、他の供試組織でのその発現はわずか（すなわち１０％近く）である。よって、これらの結果から、Ｄｏｃｋ５の発現が破骨細胞から極めて特異的なものであることが確認された。
【００７２】
２）ＤＯＣＫ５ポリクローナル抗体の取得
ウサギポリクローナル抗体は、マウスＤＯＣＫ５由来のアミノ酸１６５８〜１８６９に相当するマウスＤＯＣＫ５Ｃ末端ペプチドに対して作製し、免疫親和性により精製した。実際、これらのアミノ酸配列はサブグループＤＯＣＫ−Ａの異なるメンバー間で有意に異なる。
【００７３】
破骨細胞形成は、培養維持した精製マウス骨髄マクロファージおよびBRAZIER et al.（上述、２００６）に記載されているＲＡＷ２６４．７細胞系統においてＲＡＮＫＬ刺激により誘導した。刺激０日目、３日目または５日目に、細胞にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ポリビニルジフルオリド膜(MILLIPORE IMMOBILON-P孔径０．４５μｍ）にブロットした。転写後、この膜を、室温で３０分間、ＴＢＳ−Ｔ（０．１％ＴＷＥＥＮを含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）中で２％スキムミルクとともに、その後、ＴＢＳ−Ｔで１：１０００希釈したウサギ抗血清とともに４℃でインキュベートした。結合した抗体をペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン化学発光系(AMERSHAM)およびＬＡＳ−１０００イメージアナライザー（富士フイルム）によって検出した。対照として、膜をＧＡＰＤＨ抗体でさらにインキュベートし、結合した抗体を従前のように検出した。
【００７４】
図２ＡおよびＢは、ＲＡＮＫＬ刺激破骨細胞形成から０日目、３日目および５日目の精製マウス骨髄マクロファージにおけるＤＯＣＫ５およびＧＡＰＤＨタンパク質の発現を示す。
【００７５】
これらの結果から、２１５ｋＤａのタンパク質が精製マウス骨髄マクロファージ（図２）およびＲＡＷ２６４．７細胞系統のＲＡＮＫＬにより刺激される破骨細胞形成中に誘導されたことが確認された（データは示されていない）。この大きさはそのｍＲＮＡから推定されるＤＯＣＫ５タンパク質の大きさに匹敵する。
【００７６】
さらに、マウス組織から全タンパク質を抽出し、Ｄｏｃｋ５に対する抗体を用い、ノーマライゼーション用のチューブリンに対してウエスタンブロットを行った。
図２Ｃの分析組織は次の通りである：Ｅｙ：眼、Ｓｐ：脾臓、Ｓｔ：胃、Ｔｅ：精巣、Ｐｌ：胎盤、Ｌｕ：肺、Ｂｒ：脳、Ｈｅ：心臓、Ｌｉ：肝臓、Ｋｉ：腎臓；Ｍｕ：筋肉。
図２Ａの結果から、Ｄｏｃｋ５が主として破骨細胞、精巣および胎盤で発現されることが確認される。
【００７７】
３）ＤＯＣＫ５ポリクローナル抗体の特異性
マウスＤｏｃｋ５オープンリーディングフレームにおいてＳｈＲＮＡ標的配列を選択し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの６５マーセンスおよびアンチセンス鎖をBRAZIER et al (上述、2006)に記載されているCLONTECH BIOINFORMATICS DATAに従って設計した。次に、オリゴヌクレオチドをＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮにより合成し、アニーリングし、製造業者(CLONTECH)の説明書に従い、ピューロマイシン耐性選択マーカーを含むｐＳＩＮＲＥＮ−ＲＥＴＲＯＱベクターにクローニングした。ホタルルシフェラーゼを標的とするｐＳＩＲＥＮ−ＲＥＴＲＯＱ−Ｌｕｃベクター(CLONTECH)を対照として用いた。Ｊｅｔ  ＰＩ(QBIOGEN)を製造業者の説明書に従い、ｐＳＩＲＥＮ−ＲＥＴＲＯＱベクター、Ｆｒｉｅｎｄ  ＭＬＶに基づくＧａｇ−Ｐｏｌ発現ベクターｐＣ５７ＧＰ(LASSAUX et al, J. Virol, vol.79, p:6560-6564, 2005)およびＶＳＶ−Ｇエンベロープ糖タンパク質発現ベクターｐＣＳＩＧ(BATTINI et al, Proc. Natl Acad. Sci., vol.96, p:1385-1390, 1999)を２９３Ｔ細胞に同時にトラスフェクトすることにより、レトロウイルスパッケージングを行った。トランスフェクション３日後にウイルス上清を採取し、０．４５μｍ孔径フィルターで濾過した。
【００７８】
感染のために、ＲＡＷ２６４．７細胞を６ｃｍディッシュ当たり２．１０５細胞で播種した。翌日、培地を１．５ｍｌのウイルス上清、および８μｇ／ｍｌポリブレンを含有する０．５ｍｌの増殖培地に４時間置き換えた。細胞を増殖培地で２４時間回復させ、ピューロマイシン（３μｇ／ｍｌ）をさらに２４時間加えることによって感染細胞を選択した。感染したＲＡＷ２６４．７を破砕し、ＲＡＮＫＬにより刺激される破骨細胞形成のために、BRAZIER et al. （上述、2006）に記載されているように、増殖培地に６ウェルプレートの１ウェル当たり５．１０４細胞で再播種した。
【００７９】
次に、従前に記載されているように、ウサギポリクローナル抗ＤＯＣＫ５を用い、ＤＯＣＫ５タンパク質の検出を行った。
【００８０】
図２Ａは、ホタルルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）またはｄｏｃｋ５（ｓｈＤｏｃｋ５）のいずれかに対する小ヘアピンＲＮＡをコードするレトロウイルスに感染したＲＡＷ２６４．７細胞系統における、ＲＡＮＫＬにより刺激される破骨細胞形成から０、３および５日目のＤＯＣＫ５およびＧＡＰＤＨタンパク質の発現を示す。
【００８１】
従前に記載されているように、これらの結果から、ホタルルシフェラーゼに対する小ヘアピンＲＮＡをコードするレトロウイルスに感染したＲＡＷ２６４．７細胞系統のＲＡＮＫＬにより刺激される破骨細胞形成中に２１５ｋＤａのタンパク質が誘導されたことが確認された。Ｄｏｃｋ５に対する小ヘアピンＲＮＡをコードするレトロウイルスに感染したＲＡＷ２６４．７細胞系統では、ＲＡＮＫＬにより刺激された破骨細胞形成中に２１５ｋＤａのタンパク質は検出されなかった。最後に、これらの結果から、破骨細胞形成中にタンパク質ＤＯＣＫ５（その対応するＲＮＡなど）が誘導されること、および得られたウサギポリクローナル抗ＤＯＣＫ５抗体がＤＯＣＫ５タンパク質に特異的であることが確認された。
【００８２】
４）Ｄｏｃｋ５はin vivoでＲａｃの活性化を媒介する
よって、本発明者らは、ＤＯＣＫ５タンパク質、より具体的にはそのＤＨＲ２ドメインがＲｈｏファミリーの小ＧＴＰアーゼ、すなわち、ＲＡＣ１／２およびｃｄｃ４２を活性化することができるか否かを調べた。
【００８３】
この目的で、ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメインと融合したＧＦＰタンパク質（図３Ａ参照）を作製した。
【００８４】
Ｒａｃおよびｃｄｃ４２のin vivoＧＴＰ負荷を、従前にCOTE & VUORI (J. Cell. Sci., vol.l 15, p: 4901-4913, 2002)に記載されているように分析した。
【００８５】
要するに、６ウェルプレートにて、２９３Ｔ細胞を、ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメインを含んでなるＧＦＰ融合タンパク質をコードするベクター（ＤＨＲ２）またはＧＦＰをコードするベクター（ＧＦＰ）でトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、細胞をＭＬＢバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０％グリセロール）に溶解させた。明澄化した溶解液を、グルタチオンセファロースと結合したＧＳＴ−ＰＡＫ−ＰＢＤ融合タンパク質とともに３０分間インキュベートした。これらのビーズをＭＬＢバッファーで十分洗浄し、結合したＧＴＰ負荷Ｒａｃおよびｃｄｃ−４２を免疫ブロット法により検出した。Ｒａｃ、ｃｄｃ４２、ＧＦＰ−ＤＨＲ２およびＧＦＰタンパク質の発現レベルを確認するために、等量の投入溶解液を免疫ブロット法により分析した。従前にABASSI & VUORI (EMBO J, vol.21, p:4571-4582, 2002)に記載されているように、これらの実験のためにＧＳＴ−ＰＡＫ−ＰＢＤを発現させ、精製した。
【００８６】
図３Ｂは、全細胞溶解液（総量）におけるＲａｃ、ｃｄｃ４２、ＧＦＰ−ＤＨＲ２およびＧＦＰタンパク質の発現レベルとＧＴＰ捕捉後に検出されたタンパク質を示す。
【００８７】
これらの結果は、２９３Ｔ細胞におけるＤＨＲ２ドメインの発現が内因性Ｒａｃの活性化を誘導するが、ｃｄｃ４２には影響を及ぼさないことを示す（図３Ｂ）。最後に、これらの結果から、ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメインはＲａｃ  ＧＴＰアーゼを活性化することができるが、ｃｄｃ４２には影響を及ぼさないことが確認された。
【００８８】
５）ＥＬＭＯ１はＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインに結合する
２９３Ｔ細胞を、従前に記載されているように、ＥＬＭＯ１タンパク質をコードする、またはＣ末端から欠失させた（ΔＴ６２５）(GUMIENNY et al, Cell, vol.107, p:27-41, 2001)ベクターと、全長ＤＯＣＫ５タンパク質（ＦＬ）、ＤＨＲ２ドメイン、（ｉ）ＳＨ３ドメインとＤＨＲ１ドメインの半分を含むそのＮ末端のアミノ酸１〜５５９から欠失されたＤＯＣＫ５タンパク質配列（ΔＮｔｅｒ）、または（ｉｉ）ＳＨ３ドメインを含んでなるアミノ酸１〜８２から欠失されたＤＯＣＫ５タンパク質配列（ΔＳＨ３）を含んでなるＧＦＰ融合タンパク質をコードするベクターとで同時にトランスフェクトした（図３Ｅ参照）。
【００８９】
トランスフェクション４８時間後、細胞をＭＬＢバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０％グリセロール）に溶解した。明澄化した溶解液を抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降させ、結合したＥＬＭＯ１タンパク質を免疫ブロット法により検出した。ＥＬＭＯ１タンパク質の発現レベルを確認するために、等量の投入溶解液を免疫ブロット法により分析した。
【００９０】
図３Ｃおよび３Ｆは、ＥＬＭＯ１タンパク質をコードするベクターと全長ＤＯＣＫ５（ＦＬ）、ＤＨＲ２ドメイン（ＤＨＲ２）、そのＳＨ３ドメインから欠失されたＤＯＣＫ５（ΔＳＨ３）またはそのＮ末端ドメインから欠失されたＤＯＣＫ５（ΔＮｔｅｒ）で同時トランスフェクトした細胞における、全胞溶解液（総量）中および抗ＧＦＯＰ抗体で免疫沈降させた後（ＩＰ  ＧＦＰ）のＥＬＭＯ１タンパク質の発現レベルを示す。
【００９１】
これらの結果は、Ｄｏｃｋ５  ＳＨ３ドメインの欠失または全長Ｄｏｃｋ５と全長ＥＬＭＯ１の同時発現がＲａｃに対するその交換活性著しく増大させることを示し、よって、ＤＯＣＫ５のＮ末端ドメイン、より具体的には、そのＳＨ３ドメインがＥＬＭＯ１とＤＯＣＫ５の結合に必要であることが確認される（図３Ｃ）。図３Ｆは、Ｄｏｃｋ５Ｎ末端ドメインがＥＬＭＯ１のＣ末端に結合することを示す。
【００９２】
６）ＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインはin vivoにおいてＲａｃの活性化を阻害する
従前と同様に、ＤＯＣＫ５タンパク質の種々のドメインの存在下で、さらにはＥＬＭＯ１タンパク質の同時存在下でＲａｃのin vivo ＧＴＰ負荷を測定した。
【００９３】
図３Ｄは、ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメイン（ＤＨＲ２）、そのＳＨ３ドメインから欠失されたＤＯＣＫ５タンパク質（ΔＳＨ３）、ＤＯＣＫタンパク質（ＦＬ）、さらにはＥＬＭＯ１タンパク質をコードするベクターで同時トランスフェクトされたもの（ＦＬ＋Ｅｌｍｏｌ）に関する、全細胞溶解液（総量）におけるＲａｃおよびＧＦＰタンパク質をコードするベクターでトランスフェクトされた細胞においてＧＴＰ捕捉後に検出されたＲＡＣ−ＧＴＰタンパク質（ＧＦＰ）の発現レベルを示す。
【００９４】
従前と同様に、これらの結果は、ＤＨＲ２ドメインの発現がＲａｃ  ＧＴＰアーゼを活性化することができること、およびＳＨ３ドメインがこの活性化を阻害することを示す（図３Ｄ）。実際、ＳＨ３ドメインが欠失すると、欠失したＤＯＣＫ５タンパク質によるＲａｃ  ＧＴＰアーゼの活性化をもたらす。最後に、ＥＬＭＯ１とＳＨ３ドメインの結合はＲａｃ  ＧＴＰアーゼの活性化をもたらす。
【００９５】
７）ＤＯＣＫ５は破骨細胞におけるＲａｃの主要なアクチベーターである
ＲＡＮＫＬで刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞系統を、従前に記載されているように、ホタルルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）またはｄｏｃｋ５（ｓｈＤｏｃｋ５）のいずれかに対する小ヘアピンＲＮＡをコードするレトロウイルスに感染させた。
【００９６】
さらに、Ｄｏｃｋ５＋／＋  およびＤｏｃｋ５ー／−破骨細胞由来のＴＣＬにおける活性Ｒａｃのレベルを決定した。Ｄｏｃｋ５欠損破骨細胞を作出するために、Ｄｏｃｋ５−／−マウスをｇｅｎｅ  ｔｒａｐ(Laurin et al. 2008)により得た。
【００９７】
Ｒａｃのin vivo  ＧＴＰ負荷を、従前に開示されているように測定した。
【００９８】
図４は、対照ｓｈＬｕｃおよびＤｏｃｋ５＋／＋破骨細胞において、活性Ｒａｃレベルを１として、３回の独立した実験の平均値を示す。エラーバー：ＳＤ。
【００９９】
図４Ａは、全細胞溶解液（総量Ｒａｃ）およびホタルルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）またはｄｏｃｋ５（ｓｈＤｏｃｋ５）いずれかに対する小ヘアピンＲＮＡをコードするレトロウイルスに感染させた細胞において、ＧＴＰ捕捉後に検出されたＲＡＣ−ＧＴＰタンパク質におけるＲａｃの発現レベルを示す。
【０１００】
図４Ｂは、Ｄｏｃｋ５−／−破骨細胞がＤｏｃｋ５＋／＋破骨細胞の対照レベルと比較して低い活性Ｒａｃレベルを有することを示す。
【０１０１】
これらの結果から、ＤＯＣＫ５発現の阻害は、Ｄｏｃｋ５  ｓｈＲＮＡを発現する破骨細胞およびＤｏｃｋ５  ＫＯ  ＢＭＭに由来する破骨細胞において、対照と比較して活性ＲＡＣレベルの低下（すなわち４０％）をもたらすことが確認された。よって、ＤＯＣＫ５は破骨細胞において不可欠なＲＡＣの交換因子である。
【０１０２】
８）ＤＯＣＫ５は無機化基質の吸収に必要である
ＲＡＷ２６４．７細胞系統を、従前に記載されているように、ホタルルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）またはｄｏｃｋ５（ｓｈＤｏｃｋ５）のいずれかに対する小ヘアピンＲＮＡをコードするレトロウイルスに感染させた後、ＲＡＮＫＬを用いて破骨細胞形成を刺激した。次に、得られた細胞をリン酸カルシウム培養基で培養し、アクチンリングの形成を誘導した。４８時間後、細胞を固定し、ローダミン標識Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎを用いてアクチンを染色し、密封帯を可視化した（図５）。
【０１０３】
図６は、ホタルルシフェラーゼ（ｓｈＬｕｃ）またはｄｏｃｋ５（ｓｈＤｏｃｋ５）のいずれかに対する小ヘアピンＲＮＡをコードするレトロウイルスに感染させたＲＡＷ２６４．７細胞系統をＲＡＮＫＬで刺激したものにおけるアクチンの重合および該破骨細胞の存在下での無機化基質の吸収を示す。
【０１０４】
これらの結果は、破骨細胞において、ＤＯＣＫ５タンパク質がポドソームおよび密封帯と会合していることを示す（データは示されていない）。ＤＯＣＫ５発現が阻害された破骨細胞は、収縮および密封帯形成が行われないことを示す。ＶＯＮ  ＫＯＳＳＡ染色による無機化吸収表面の評価は、ＤＯＣＫ５発現が低下した破骨細胞による吸収の顕著な低下を示す。
【０１０５】
９）Ｄｏｃｋ−／−マウス由来の破骨細胞による確認
Ｄｏｃｋ５＋／＋およびＤｏｃｋ５−／−マウスから単離されたＢＭＭ（骨髄マクロファージ）は、１００ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬおよび１０ｎｇ／ｍｌ  Ｍ−ＣＳＦの存在下で破骨細胞へ分化された。０日目、３日目および４日目にＴＣＬ（全細胞抽出液）を調製し、Ｄｏｃｋ５およびβ−ｇａｌに対する工程、そしてノーマライゼーションのためにチューブリンに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
【０１０６】
Ｄｏｃｋ５−／−ＢＭＭ由来の破骨細胞は、アミノ酸１１１５の後、ＤＨＲ１とＤＨＲ２ドメインの間が末端切断され、β−ｇｅｏカセットと融合されたＤｏｃｋ５を発現する（図７Ａ）。
さらに、５日目に、分化した破骨細胞を固定し、ＴＲＡＰおよびＨｏｅｓｃｈｓｔで染色し、ＭＮＣ（多核細胞）の数を求めた。図７Ｂ（４回の独立した実験からの平均値およびＳＤ＊＊：有意差、ｐ＜０．０１、マン・ホイットニー検定）は、ＴＲＡＰ陽性ＭＮＣ形成の効率が、Ｄｏｃｋ５＋／＋と比較してＤｏｃｋ５−／−ＢＭＭで低下し、破骨細胞は小さかったことを示す。
【０１０７】
さらに、Ｄｏｃｋ５−／−ＢＭＭから分化した破骨細胞は密封帯を構築できないことを示すために、それらをリン酸カルシウム培養基に播種してアクチンリングの形成を誘導した。４８時間後、細胞を固定し、ローダミン標識Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（緑）を用いてアクチンを染色して密封帯を可視化し、Ｈｏｅｓｃｈｓｔ色素で核を染色した（青）（データは示されていない）。リン酸カルシウム培養基上で、Ｄｏｃｋ５−／−破骨細胞では密封帯の構築および吸収を欠いていたことが認められた。
【０１０８】
最後に、Ｄｏｃｋ５−／−が吸収ピットを形成できないことを証明するために、Ｄｏｃｋ５−／−ＢＭＭ由来のものを、スライスした骨の上で５日間分化させ、固定し、走査電子顕微鏡により観察した。
【０１０９】
これらの結果は、骨スライス上に播種した際に、Ｄｏｃｋ５−／−破骨細胞は吸収ピットを形成しなかったことを示す。
【０１１０】
さらに、Ｄｏｃｋ５−／−破骨細胞が骨再吸収を欠いていることを示すために、コラーゲン分解ペプチド（ＣＴｘ）のレベルを、分化５日後にＤｏｃｋ５＋／＋およびＤｏｃｋ５−／−破骨細胞の培地で測定し、骨スライスを染色した。図７Ｃは、３回の独立した実験の代表な１回の実験からの３つの破骨細胞播種ウェルの平均値およびＳＤを示す。
【０１１１】
コラーゲンテロペプチド（ＣＴｘ）の測定により、Ｄｏｃｋ５−／−破骨細胞の吸収活性が無いことが確認された（図７Ｃ）。
【０１１２】
１０）Ｄｏｃｋ５の抑制は破骨細胞におけるＲＡＣの活性化を損なう
野生型ならびにＤｏｃｋ５＋／＋もしくはＤｏｃｋ５−／−動物、または対照およびＤｏｃｋ５  ｓｈＲＮＡ発現ＲＡＷ２６４．７細胞に由来するＤｏｃｋ５欠損破骨細胞における破骨細胞マーカーのレベル。Ｍ−ＣＳＦ単独の存在下（黒いバー）または破骨細胞を得るためにＲＡＮＫＬおよびＭ−ＣＳＦの存在下（白いバー）で５日間増殖させたＤｏｃｋ５＋／＋およびＤｏｃｋ５−／−ＢＭＭから全ＲＮＡを調製した。示された遺伝子ｍＲＮＡの、Ｇａｐｄｈ  ｍＲＮＡに対するレベルをＲＴ−ＰＣＲにより決定した。
【０１１３】
図８Ａの結果は、Ｄｏｃｋ５−／−ＢＭＭから分化した破骨細胞では、破骨細胞分化マーカーの発現が正常であることを示す。この示された破骨細胞成熟は影響を受けず、Ｄｏｃｋの欠損はin vitroにおいて破骨細胞のＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬ応答能を損なわないことを示唆した。
【０１１４】
さらに、Ｄｏｃｋ５−／−の破骨細胞前駆体がＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬに応答できることは、それらのｍＲＮＡレベルはＤｏｃｋ５＋／＋の場合と同じであったことから、Ｄｏｃｋ１またはＤｏｃｋ２発現の補償的増加の結果ではなかった（図８Ｂ）。
【０１１５】
Ｄｏｃｋ５＋／＋およびＤｏｃｋ５−／−ＢＭＭから調製した破骨細胞前駆体を示された時間、Ｍ−ＣＳＦまたはＲＡＮＫＬで刺激した。ＴＣＬにおけるＥＲＫ、ｐ３８およびＡｋｔリン酸化のレベルをウエスタンブロットにより決定した。
【０１１６】
これらの結果は、Ｍ−ＣＳＦにより駆動されるリン酸化ＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼ（図８Ｃ）ならびにＲＡＮＫＬにより駆動されるＡｋｔのリン酸化（図８Ｄ）が、対照と比較してＤｏｃｋ５−／−破骨細胞前駆体において影響を受けていなかったことを示す。
【０１１７】
最後に、これらの結果から、ＤＯＣＫ５は、閉経、骨粗鬆症、骨転移による骨減少症、関節リウマチにおける関節周囲のびらん、原発性上皮小体機能亢進症、悪性の高カルシウム血症、パジェット骨病、歯周病、固定化誘導性骨減少症およびグルココルチコイド処置における骨欠損を制限するための新たな治療標的である。特異的な破骨細胞ＤＯＣＫ５発現のために、ＤＯＣＫ５の標的化は、骨欠損を処置するための薬剤で見られるような副作用を限定し得る。
【０１１８】
１１）ＤＯＣＫ５阻害剤の同定
どの阻害剤が骨欠損関連疾患の処置に有用であり得るか、ＤＯＣＫ５阻害剤を同定するために、本発明者らはDE TOLEDO et al. (FEBS, vol.480, p:287-292, 200)およびＷＯ２００５／０６４００７号公報に開示されているような酵母交換アッセイ（ＹＥＡ）を用いる。
【０１１９】
要するに、本発明者らは、酵母ＴＡＴ７株（Ｊ．ＣＡＭＯＮＩＳにより提供されたMata, trpl, his3, Leu2, ura3, ade2, LYS::(LexAop)4-HIS3, URA3:: (LexAop)8-lacZ)を、ｍｙｃタグ（配列番号．．．）に融合されたＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメイン、ＬｅｘＡと融合された野生型Ｒａｃ  ＧＴＰアーゼおよびＧＡＬ４のトランス活性化ドメインと融合されたそのエフェクターＰＡＫを発現するベクターで形質転換する。
【０１２０】
得られた形質転換酵母において、ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメインの発現はＲａｃの活性化を誘導し、この活性化されたＲａｃはそのエフェクターＰＡＫと相互作用して、リポーター遺伝子β−ＧａｌとＨｉｓ３の発現をもたらす（図６）。
【０１２１】
酵母細胞膜の透過性を改質するために、BLANGY ら (Biol. Cell., vol.98(9), p:511-22, 2006)に開示されているようにＥｒｇ６遺伝子における突然変異が導入してあった。Ｅｒｇ６遺伝子のこの突然変異は酵母細胞においてスクリーニングされた化合物の流入を増し、従って、スクリーニングされる化合物の濃度を制限することができる。
【０１２２】
骨欠損疾患の処置に有用であり得るＤＯＣＫ５阻害剤をスクリーニングするため、形質転換酵母をいくつかの化学分子またはペプチド分子と接触させ、リポーター遺伝子β−ＧａｌおよびＨｉｓ３の発現を阻害する化学分子またはペプチド分子を、８に開示されている骨欠損モデル、次いで骨欠損疾患モデルでさらに試験するために選択する。
【０１２３】
ＤＯＣＫ５阻害剤を同定するために酵母ＴＡＴ７株を用いた。この株を９６ウェル培養プレートの、ヒスチジンを除いた選択培地またはヒスチジンを加えた非選択培地に播種した。非選択培地での増殖に影響を及ぼすことなく選択培地でこれらの株の増殖を阻害するものを選択すべく、２５６０の化合物をスクリーニングした。対照としてＤＭＳＯを用いた。
【０１２４】
これらの化合物を１％ＤＭＳＯの存在下、２００μＭの濃度で試験した。酵母の増殖を、ｔ＝播種後２時間、１５時間、２０時間および２４時間における６００ｎｍでの光学密度により測定した。阻害化合物を以下のように定義した。
・ｎ時点での、試験培地（−ＨＩＳ）および毒性培地（＋ＨＩＳ）での増殖誘導体Ｃｒ（培地）＝（ＯＤ６００Ｔｎ−ＯＤ６００Ｔ２）／Ｔｎ−Ｔ２。
・各時点および各プレートでの、Ｃｒ（−ＨＩＳ）およびＣｒ（＋ＨＩＳ）培地対照を対照として算出した。
・Ｒ（化合物）＝Ｃｒ（−ＨＩＳ）およびＣｒ（＋ＨＩＳ）およびＲを各プレートで算出した。
・阻害率は対照で割ることにより求めた  比Ｉ（化合物）＝Ｒ（化合物）／Ｒ（対照）＊。
・選択化合物は各時点で比Ｉ（化合物）＜０．９を示すものである。
結果を表２に示す。
よって、５５の化合物が、Ｄｏｃｋ５によりＲＡＣ１／２の活性化を阻害するものとして選択された。
【０１２５】
１２）破骨細胞前駆体に対する毒性試験
次に、選択された化合物を破骨細胞前駆体に対するそれらの毒性に関して試験した。これらの細胞はＤｏｃｋ５を発現しないので、Ｄｏｃｋ５阻害剤はそれらの増殖に影響を及ぼさない。破骨細胞阻害剤として用いたＲＡＷ２６４．７細胞を１０〜１００μＭの化合物とともに７２時間増殖させた。これらの細胞の増殖を、０．５％ＤＭＳＯで増殖させた対照細胞と比較した。
【０１２６】
結果を表２に示す。これらの化合物について、無毒な最適濃度（細胞の増殖に影響を及ぼさない濃度）を決定した。
【０１２７】
１３）分化した破骨細胞に対する毒性試験
これらの化合物を、上記で決定された濃度で、分化した破骨細胞に対するそれらの毒性に関して試験した。破骨細胞中、分化したＲＡＷ２６４．７細胞を供試化合物の存在下で７２時間増殖させた。次に、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）を破骨細胞において着色(SUDA et al, 1997)により可視化した。この破骨細胞特異的標識は、細胞形態の可視化を可能とする。その後、この細胞形態を０．５％ＤＭＳＯの存在下で増殖させた対照細胞と比較した。そして、これらの化合物を３つのカテゴリーに分類した。
・７２時間後に総ての破骨細胞の死滅を誘導する化合物（−）
・形態的異常および／または破骨細胞の一部の死滅を誘導する化合物（＋／−）
・破骨細胞の目に見える変化を誘導しない化合物
結果を表２に示す。
【０１２８】
１４）吸収阻害試験
同定された化合物を、リン酸カルシウムの無機化基質吸収表面(Osteologic Biocoat Clontech Reference 354609)に播種した破骨細胞に対して上記で定義されたものと同じ濃度で７２時間用いた。次に、吸収された領域を示すため、この無機化基質を硝酸銀で染色した。これらの化合物を３つのカテゴリーに分類した。
・７２時間、吸収を全面的に妨げる化合物（−）
・対照と比較して弱い吸収を誘導する化合物（＋／−）
・対照と比較して破骨細胞の吸収活性を目に見えて変化させない化合物（＋）
吸収カテゴリーが（＋／−）および（−）の化合物は、骨吸収の新規な阻害剤に相当する。それらは１０〜１００μＭの濃度で用いた。
これらの結果を確認するために、次に、化合物をin vivoにおいて、骨粗鬆症を示すマウスで試験した。
【０１２９】
表１：本発明のスクリーニング方法により同定された化合物
【表１】
0005539356.tif 000002
0005539356.tif 000003
0005539356.tif 000004
0005539356.tif 000005
0005539356.tif 000006
0005539356.tif 000007
0005539356.tif 000008
0005539356.tif 000009
0005539356.tif 000010
0005539356.tif 000011
0005539356.tif 000012
0005539356.tif 000013
0005539356.tif 000014
0005539356.tif 000015
0005539356.tif 000016
0005539356.tif 000017
0005539356.tif 000018
0005539356.tif 000019
0005539356.tif 000020
0005539356.tif 000021
0005539356.tif 000022
0005539356.tif 000023
0005539356.tif 000024
0005539356.tif 000025
0005539356.tif 000026
0005539356.tif 000027
0005539356.tif 000028
0005539356.tif 000029
【０１３０】
【表２】
0005539356.tif 000030
0005539356.tif 000031
0005539356.tif 000032
0005539356.tif 000033
0005539356.tif 000034
0005539356.tif 000035
【０１３１】
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）ＤＯＣＫ５タンパク質によるＲＡＣ  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
細胞において少なくともＤＯＣＫ５タンパク質のＤＨＲ２ドメインとＲＡＣタンパク質を同時発現させる工程（ここで、前記少なくともＤＯＣＫ５タンパク質のＤＨＲ２ドメインは、不活性ＲＡＣ（この不活性ＲＡＣはＧＤＰに結合されている）の、活性ＲＡＣ（この活性ＲＡＣはＧＴＰに結合されている）への変換を誘導する）、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換を判定する工程、
不活性ＲＡＣの活性ＲＡＣへの変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法。
（２）選択された化合物が骨欠損に関連する疾患を処置するのに有用である、（１）に記載の方法。
（３）前記骨欠損に関連する疾患が、骨粗鬆症、骨転移による骨減少症、特に、関節リウマチにおける関節周囲のびらん、原発性上皮小体機能亢進症、悪性の高カルシウム血症、パジェット骨病、歯周病、固定化誘導性骨減少症およびグルココルチコイド処置を含んでなる群から選択される、（２）に記載の方法。
（４）選択される化合物による骨吸収の阻害を試験する工程をさらに含んでなる、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記ＤＯＣＫ５タンパク質が、ハツカネズミ配列番号１由来のＤＯＣＫ５タンパク質のアミノ酸１１３２〜１６６１に相当するタンパク質ＤＯＣＫ５のＤＨＲ２ドメインを含んでなるポリペプチドおよびその誘導体である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記ＤＯＣＫ５タンパク質が、ヒトＤＯＣＫ５タンパク質に相当する配列番号４に相当する、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ＲＡＣタンパク質が、配列番号２およびその誘導体に相当する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）前記方法が、活性ＲＡＣタンパク質と相互作用できるが、不活性ＲＡＣタンパク質とは相互作用できない任意のタンパク質の発現をさらに含んでなる、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）前記細胞が、プロモーター配列の制御下にリポーター遺伝子をさらに含んでなり、前記活性ＲＡＣおよび相互作用するタンパク質がそれぞれトランス活性化ドメインまたは前記プロモーター配列に特異的なＤＮＡ結合ドメインのいずれかと融合されており、活性ＲＡＣと相互作用タンパク質の相互作用の結果、リポーター遺伝子の発現が誘導される、（８）に記載の方法。
（１０）活性ＲＡＣと相互作用するタンパク質が、配列番号３に相当するＰＡＫ１タンパク質およびその誘導体を含んでなる群から選択される、（８）または（９）に記載の方法。
（１１）骨欠損に関連する疾患において、ＤＯＣＫ５遺伝子の発現レベルの低減を可能とする化合物の選択のための方法であって、
ａ）試験化合物を、プロモーター（このプロモーターは、ＤＯＣＫ５遺伝子のプロモーター配列またはその誘導体の全部または一部を含んでなる）の制御下に置かれたリポーターをコードする核酸配列を含んでなるリポーター核酸を発現する宿主細胞と接触させる工程、および
ｂ）そのリポーターの発現レベルを測定する工程
を含んでなる方法。
（１２）ＥＬＭＯ１とＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインの結合を阻害することにより、ＲＡＣ  １／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
ａ）試験化合物をＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体と接触させる工程；
ｂ）該試験化合物とＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体の結合を測定する工程：および場合により、
ｃ）不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法。
（１３）ＥＬＭＯ１とＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインの結合を阻害することにより、ＲＡＣ  １／２  ＧＴＰアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
ａ）試験化合物を、ＥＬＭＯ１タンパク質またはその誘導体およびＤＯＣＫ５のＳＨ３ドメインまたはその誘導体を少なくとも含んでなるポリペプチドと接触させる工程；
ｂ）該化合物の存在下または不在下で、該ＥＬＭＯ１タンパク質と該ポリペプチドの間の結合を測定する工程；および場合により、
ｃ）不活性ＲＡＣ  １／２の活性ＲＡＣ  １／２への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法。
（１４）それを必要とする対象において骨欠損疾患を処置および／または予防するための化合物であって、
４−［５−（４−ブロモフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］−４−オキソブタン酸；
２，２，２−トリクロロ−Ｎ−（１，１−ジオキシド−２，３−ジヒドロ−３−チエニル）−Ｎ−（４−メチルフェニル）アセトアミド；
３−（３−クロロフェニル）−７−メチル−４−メチレン−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キナゾリノン；
３−［４−（３−ブロモベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］安息香酸；
Ｎ−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−イル−５−ブロモ−２−フラミド；
１−アセチル−４−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−２−メチルピペラジン；
３−（３−メトキシベンジリデン）−５−（４−メチルフェニル）−２（３Ｈ）−フラノン；
３−［５−（３，４−ジクロロフェニル）−２−フリル］アクリル酸；
（２−クロロ−４−｛［５−（２−クロロフェニル）−６−（エトキシカルボニル）−７−メチル−３−オキソ−５Ｈ−［１，３］チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−２（３Ｈ）−イリデン］メチル｝−６−メトキシフェノキシ）酢酸；
４−｛［４−（ジフェニルメチル）−１−ピペラジニル］スルホニル｝−２，１，３−ベンゾチアジアゾール；
４−［４−フェニル−５−（２−チエニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−１，２−ベンゼンジオール；
Ｎ−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−［メチル（フェニルスルホニル）アミノ］ベンズアミド；
１−［（２−ヒドロキシフェニル）カルボノチオイル］−３−フェニル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
４−［（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）アミノ］安息香酸２−メトキシエチル；
Ｎ−（２，３−ジクロロフェニル）−３−（５−メチル−２−フリル）アクリルアミド；
Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アクリルアミド；
３−（２−フリルメチル）−２−（２−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
Ｎ−（４−エトキシフェニル）−２−｛［５−（４−メトキシフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル］チオ｝アセトアミド；
５−（４−ニトロベンジリデン）−２−チオキソ−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾリジン−４−オン；
（３，５−ジクロロフェニル）［（フェニルスルホニル）カルボニル］アミン；
Ｎ−（２−ブロモフェニル）−３−（５−メチル−２−フリル）アクリルアミド；
２−（２−クロロフェノキシ）−Ｎ−［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド；
Ｎ−［４−（４−アセチル−１−ピペラジニル）フェニル］プロパンアミド；
８−［（ジメチルアミノ）メチル］−９−ヒドロキシ−２−メチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン；
４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−［１−｛［（２−メトキシフェニル）アミノ］カルボニル｝−２−（２−チエニル）ビニル］ベンズアミド；
２−クロロ−Ｎ−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）ベンズアミド；
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ペリミジン−２−イル）フェノール；
３−ベンジル−２−（２，６−ジクロロフェニル）−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
１−（３，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド；
Ｎ−［５−（１−アダマンチル）−１，３，４−チアジアゾール−２−イル］−Ｎ’−フェニル尿素；
Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ’−｛５−［（４−メチルフェノキシ）メチル］−１，３，４−チアジアゾール−２−イル｝尿素；
Ｎ−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−２−（１−ナフチルオキシ）アセトアミド；
Ｎ−［４−（４−アセチル−１−ピペラジニル）フェニル］−４−エトキシ−３−ニトロベンズアミド；
Ｎ−（２−クロロフェニル）−３−（４−フルオロフェニル）アクリルアミド；
１−［（ジメチル−λ〜４〜−スルファニリデン）アミノ］−２−メトキシ−４−ニトロベンゼン；
５−ベンジリデン−１−（２−クロロフェニル）−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン；
４−エチル−５，６−ジメチル−２−フェニルピリミジン；
２−（３−クロロベンジリデン）−１Ｈ−インデン−１，３（２Ｈ）−ジオン；
５−｛５−［（３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル］−２−フリル｝−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン；
Ｎ−（２，５−ジメチルフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）アクリルアミド；
２−（｛２−［（４−ニトロフェニル）アミノ］エチル｝アミノ）エタノール；
Ｎ−（３−メトキシフェニル）−４−プロポキシベンズアミド；
２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニル−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
４−メチル−１−（２−ニトロベンゾイル）ピペリジン；
２−ヒドロキシ−Ｎ’−［（２−メチルフェニル）スルホニル］ベンゾヒドラジド；
４−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）ブタン酸；
４−（３−メチルベンジリデン）−１−フェニル−３，５−ピラゾリジンジオン；
４−（２，４−ジクロロフェノキシ）−Ｎ−（２−エトキシフェニル）ブタンアミド；
Ｎ−（２−メトキシフェニル）−Ｎ’−（フェニルスルホニル）ベンゼンカルボキシイミドアミド；
Ｎ−［２−（２−クロロ−５−ヨードフェニル）−１，３−ベンゾキサゾール−５−イル］−２−メチルプロパンアミド；
５−（４−ブトキシフェニル）−３−シクロヘキシル−１，２，４−オキサジアゾール；
Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ’−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−４−イル尿素；
６−クロロ−４−フェニル−３−［３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アクリロイル］−２（１Ｈ）−キノリノン；
６−ブロモ−４−フェニル−３−［３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アクリロイル］−２（１Ｈ）−キノリノン；および
Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イルメチル）−４−ニトロ−１，２，５−オキサジアゾール−３−アミン
からなる群から選択される化合物。
（１５）それを必要とする対象において骨欠損疾患を処置および／または予防するための医薬組成物であって、
４−［５−（４−ブロモフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］−４−オキソブタン酸；
２，２，２−トリクロロ−Ｎ−（１，１−ジオキシド−２，３−ジヒドロ−３−チエニル）−Ｎ−（４−メチルフェニル）アセトアミド；
３−（３−クロロフェニル）−７−メチル−４−メチレン−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−キナゾリノン；
３−［４−（３−ブロモベンジリデン）−３−メチル−５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル］安息香酸；
Ｎ−２，１，３−ベンゾチアジアゾール−４−イル−５−ブロモ−２−フラミド；
１−アセチル−４−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−２−メチルピペラジン；
３−（３−メトキシベンジリデン）−５−（４−メチルフェニル）−２（３Ｈ）−フラノン；
３−［５−（３，４−ジクロロフェニル）−２−フリル］アクリル酸；
（２−クロロ−４−｛［５−（２−クロロフェニル）−６−（エトキシカルボニル）−７−メチル−３−オキソ−５Ｈ−［１，３］チアゾロ［３，２−ａ］ピリミジン−２（３Ｈ）−イリデン］メチル｝−６−メトキシフェノキシ）酢酸；
４−｛［４−（ジフェニルメチル）−１−ピペラジニル］スルホニル｝−２，１，３−ベンゾチアジアゾール；
４−［４−フェニル−５−（２−チエニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−１，２−ベンゼンジオール；
Ｎ−（３，４−ジメトキシフェニル）−４−［メチル（フェニルスルホニル）アミノ］ベンズアミド；
１−［（２−ヒドロキシフェニル）カルボノチオイル］−３−フェニル−５−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピラゾール−５−オール；
４−［（４−ｔｅｒｔ−ブチルベンゾイル）アミノ］安息香酸２−メトキシエチル；
Ｎ−（２，３−ジクロロフェニル）−３−（５−メチル−２−フリル）アクリルアミド；
Ｎ−（４−フルオロフェニル）−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］アクリルアミド；
３−（２−フリルメチル）−２−（２−ヒドロキシフェニル）−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
Ｎ−（４−エトキシフェニル）−２−｛［５−（４−メトキシフェニル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル］チオ｝アセトアミド；
５−（４−ニトロベンジリデン）−２−チオキソ−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾリジン−４−オン；
（３，５−ジクロロフェニル）［（フェニルスルホニル）カルボニル］アミン；
Ｎ−（２−ブロモフェニル）−３−（５−メチル−２−フリル）アクリルアミド；
２−（２−クロロフェノキシ）−Ｎ−［２−クロロ−５−（トリフルオロメチル）フェニル］アセトアミド；
Ｎ−［４−（４−アセチル−１−ピペラジニル）フェニル］プロパンアミド；
８−［（ジメチルアミノ）メチル］−９−ヒドロキシ−２−メチル−４Ｈ−ピリド［１，２−ａ］ピリミジン−４−オン；
４−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ−［１−｛［（２−メトキシフェニル）アミノ］カルボニル｝−２−（２−チエニル）ビニル］ベンズアミド；
２−クロロ−Ｎ−（３−クロロ−４−メトキシフェニル）ベンズアミド；
２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−（２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ペリミジン−２−イル）フェノール；
３−ベンジル−２−（２，６−ジクロロフェニル）−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
１−（３，４−ジクロロベンジル）−１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒド；
Ｎ−［５−（１−アダマンチル）−１，３，４−チアジアゾール−２−イル］−Ｎ’−フェニル尿素；
Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ’−｛５−［（４−メチルフェノキシ）メチル］−１，３，４−チアジアゾール−２−イル｝尿素；
Ｎ−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−２−（１−ナフチルオキシ）アセトアミド；
Ｎ−［４−（４−アセチル−１−ピペラジニル）フェニル］−４−エトキシ−３−ニトロベンズアミド；
Ｎ−（２−クロロフェニル）−３−（４−フルオロフェニル）アクリルアミド；
１−［（ジメチル−λ〜４〜−スルファニリデン）アミノ］−２−メトキシ−４−ニトロベンゼン；
５−ベンジリデン−１−（２−クロロフェニル）−２，４，６（１Ｈ，３Ｈ，５Ｈ）−ピリミジントリオン；
４−エチル−５，６−ジメチル−２−フェニルピリミジン；
２−（３−クロロベンジリデン）−１Ｈ−インデン−１，３（２Ｈ）−ジオン；
５−｛５−［（３−メチル−５−オキソ−１−フェニル−１，５−ジヒドロ−４Ｈ−ピラゾール−４−イリデン）メチル］−２−フリル｝−１Ｈ−イソインドール−１，３（２Ｈ）−ジオン；
Ｎ−（２，５−ジメチルフェニル）−３−（４−メトキシフェニル）アクリルアミド；
２−（｛２−［（４−ニトロフェニル）アミノ］エチル｝アミノ）エタノール；
Ｎ−（３−メトキシフェニル）−４−プロポキシベンズアミド；
２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−フェニル−２，３−ジヒドロ−４（１Ｈ）−キナゾリノン；
４−メチル−１−（２−ニトロベンゾイル）ピペリジン；
２−ヒドロキシ−Ｎ’−［（２−メチルフェニル）スルホニル］ベンゾヒドラジド；
４−（１，３−ベンゾチアゾール−２−イル）ブタン酸；
４−（３−メチルベンジリデン）−１−フェニル−３，５−ピラゾリジンジオン；
４−（２，４−ジクロロフェノキシ）−Ｎ−（２−エトキシフェニル）ブタンアミド；
Ｎ−（２−メトキシフェニル）−Ｎ’−（フェニルスルホニル）ベンゼンカルボキシイミドアミド；
Ｎ−［２−（２−クロロ−５−ヨードフェニル）−１，３−ベンゾキサゾール−５−イル］−２−メチルプロパンアミド；
５−（４−ブトキシフェニル）−３−シクロヘキシル−１，２，４−オキサジアゾール；
Ｎ−（３，４−ジクロロフェニル）−Ｎ’−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−４−イル尿素；
６−クロロ−４−フェニル−３−［３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アクリロイル］−２（１Ｈ）−キノリノン；
６−ブロモ−４−フェニル−３−［３−（３，４，５−トリメトキシフェニル）アクリロイル］−２（１Ｈ）−キノリノン；および
Ｎ−（１Ｈ−１，２，３−ベンゾトリアゾール−１−イルメチル）−４−ニトロ−１，２，５−オキサジアゾール−３−アミン
からなる群から選択される少なくとも１つの化合物と、所望により薬学上許容される支持体を含んでなる医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005539356.tif 000041
【図７】
0005539356.tif 000042
【図８−１】
0005539356.tif 000043
【図８−２】
0005539356.tif 000044
【配列表】
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