(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔに特異的な抗原結合領域を含む、単離されたヒト化抗体またはその抗原結合部分であって、
（ａ）抗体５０９１の配列番号３４（ＶＬ）および６６（ＶＨ）で示される；
（ｂ）抗体５０９７の配列番号３７（ＶＬ）および６７（ＶＨ）で示される；
（ｃ）抗体５０９８の配列番号３８（ＶＬ）および６８（ＶＨ）で示される；または
（ｄ）抗体５１８５の配列番号５３（ＶＬ）および７１（ＶＨ）で示される、
ＶＬおよびＶＨドメインを含む、前記抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔとの結合を阻害する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔと結合し、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を活性化または阻害する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
ＩｇＧである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である、請求項４に記載の単離された抗体。
【請求項６】
ＩｇＧ４が、
（ａ）抗体５０９１のＣＤＲｓを含む場合、配列番号８５で示されるヌクレオチド配列にコードされたものであるか、または配列番号８９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を有する；
（ｂ）抗体５０９７のＣＤＲｓを含む場合、配列番号８８で示されるヌクレオチド配列にコードされたものであるか、または配列番号９２で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を有する；
（ｃ）抗体５０９８のＣＤＲｓを含む場合、配列番号８７で示されるヌクレオチド配列にコードされたものであるか、または配列番号９１で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を有する；または
（ｄ）抗体５１８５のＣＤＲｓを含む場合、配列番号８６で示されるヌクレオチド配列にコードされたものであるか、または配列番号９０で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を有する、請求項５に記載の単離された抗体。
【請求項７】
医薬として使用する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
ＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体フラグメントである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離された抗体または抗原結合部分。
【請求項９】
コンフォメーショナルエピトープに結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体またはその抗原結合部分および薬学上許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分をコードする遺伝子を保持する非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１２】
癌または炎症症状の処置に使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
癌が、脳の癌、胃癌、生殖器癌、泌尿器癌、前立腺癌、膀胱癌（表在性および筋肉浸潤性）、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、神経膠腫（膠芽腫、未分化星状細胞腫、乏突起星状細胞腫、乏突起神経膠腫を含む）、食道癌、胃癌、胃腸癌、肝臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）（小児ＨＣＣを含む）、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮細胞癌、鼻咽頭癌を含む）、ヒュルトレ細胞癌、上皮癌、皮膚癌、悪性黒色腫を含む黒色腫、中皮腫、リンパ腫、多発性骨髄腫を含む骨髄腫、白血病、非小細胞肺癌（あらゆる組織サブタイプ：腺癌、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、大細胞癌および腺扁平上皮混合型含む）を含む肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、腎細胞癌（遺伝性および散発性乳頭腎細胞癌、Ｉ型およびＩＩ型、および淡明細胞腎細胞癌を含む）、肉腫、特に、骨肉腫、淡明細胞肉腫および軟組織肉腫（卵巣状および胎児性横紋筋肉腫、卵巣状軟部肉腫を含む）、甲状腺癌（乳頭および他のサブタイプ）からなる群から選択される、請求項１２に記載の抗体。
【請求項１４】
癌が肝臓、腎臓および食道からなる癌の群から選択される、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
化学療法薬と組合せて使用する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
化学療法薬が抗癌剤である、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
診断ツールとして使用する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１８】
放射性、蛍光性、磁性、常磁性または化学発光性の標識をさらに含む、請求項１７に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１９】
付加的治療薬をさらに含む、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記付加的治療薬が抗癌剤、抗生物質、抗炎症薬、増殖因子およびサイトカインからなる群から選択される、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分である第一の成分を含む、免疫複合体。
【請求項２２】
第二のアミノ酸配列を有する第二の成分を含む、請求項２１に記載の免疫複合体。
【請求項２３】
前記第二の配列が細胞毒素である、請求項２２に記載の免疫複合体。
【請求項２４】
第二の配列がｃ−Ｍｅｔとは異なる標的に対して結合特異性を有する結合タンパク質または抗体である、請求項２３に記載の免疫複合体。
【請求項２５】
二重特異性抗体である、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の免疫複合体。
【請求項２６】
抗体が単位用量で存在し、使用説明書をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合部分を含むキット。
【請求項２７】
薬学上許容される担体または賦形剤をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
抗体５０９１の配列番号３４および６６で示される、ＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲｓを含む、請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２９】
抗体５０９７の配列番号３７および６７で示される、ＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲｓを含む、請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３０】
抗体５０９８の配列番号３８および６８で示される、ＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲｓを含む、請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３１】
抗体５１８５の配列番号５３および７１で示される、ＶＬおよびＶＨドメインのＣＤＲｓを含む、請求項１に記載の単離されたヒト化抗体またはその抗原結合部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質標的ｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する抗体を含有する組成物、これらの抗体を作製する方法、ならびに癌および転移症などの増殖性状態および炎症状態を処置するための使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子受容体は、本明細書ではｃ−Ｍｅｔと呼ばれ、種々の悪性疾患で過剰発現し、かつ／または突然変異していることが示されている受容体チロシンキナーゼであり、特に多くのｃ−Ｍｅｔが種々の固相腫瘍に見られる。ｃ−Ｍｅｔリガンドである肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、散乱係数（ＳＦ）としても知られ、腫瘍細胞の浸潤および転移に関連づけられている経路においてｃ−Ｍｅｔと結合する(Ma et al., 2003 Cancer and Metastasis Reviews. 22:309−325)。
【０００３】
ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔの相互作用は細胞内事象のカスケードを誘発する(Derman et al., 1996 J Biol Chem 23;271(8):4251−4255)。ＨＧＦの結合は、ｃ−Ｍｅｔの内因性チロシンキナーゼ活性の活性化と細胞内ドメイン上のいくつかのチロシン残基の自己リン酸化をもたらす(Ma et al., 2003 Cancer and Metastasis Reviews. 22:309−325)。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ経路の活性化は、細胞分散、脈管形成、増殖、細胞運動の増強、浸潤および転移を含む幅広い一連の細胞応答をもたらす。拮抗作用は自己リン酸化を阻害し、かつ／または表面ｃＭｅｔのインターナリゼーションを誘発し、かつ／またはｃＭｅｔ活性をダウンレギュレーションする働きをし得る。
【０００４】
腫瘍細胞は組織境界に浸潤し、周囲の細胞外マトリックスを分解およびリモデリングする可能性があり、その結果、これらの腫瘍細胞は細胞外マトリックス組織境界を通り越して移動し、内転移および転移の形成を可能とする。ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達は、正常な、または悪性の浸潤成長を媒介する経路である。ｃ−Ｍｅｔのミスセンス突然変異が種々の癌で確認されており、ほとんどの突然変異がキナーゼドメインに位置している。突然変異体は、チロシンキナーゼ活性の上昇によるｃ−Ｍｅｔの生物作用の増進を特徴とする。
【０００５】
ｃ−Ｍｅｔ活性が浸潤および／または転移に寄与するＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達を妨げる薬剤など、癌、癌の転移および炎症症状を処置するための組成物および方法の必要性がある。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、胚形成および組織再生に伴う移動、浸潤および形態形成のプロセスに関与している。数系列の証拠が、ｃ−Ｍｅｔは腫瘍病因にも役割を果たすことを示している。ｃ−Ｍｅｔのキナーゼドメイン内での生殖細胞系突然変異の活性化が、遺伝性乳頭腎細胞癌（ＰＲＣＣ）の発症に関連している。このキナーゼドメイン内の突然変異は、まれではあるが、散発型のＰＲＣＣ、頭頸部扁平上皮癌および胃癌でも報告されている。ｃ−Ｍｅｔ、それとともにその独自のリガンドＨＧＦ／ＳＦのレベルの上昇は、多くの臨床上関連のある腫瘍で高頻度に見られる。発現の上昇と疾病の進行、転移および患者の死亡率との間の相関が平滑筋肉腫および膠芽腫を含むいくつかの癌で報告されている。
【０００７】
本発明の抗体はｃ−Ｍｅｔと高い親和性で特異的に結合し、疾病のｃ−Ｍｅｔ作用を変調する。ｃ−Ｍｅｔのレベルまたは活性に拮抗作用を示す抗体は、増殖性疾患または炎症性疾患の処置のために意図される。本発明の抗体により処置されると考えられる増殖性疾患には、特に癌が含まれる。ｃ−Ｍｅｔのレベルまたは活性に促進作用を示す抗体は、器官再生、創傷治癒、組織再生などのために意図される。
【０００８】
本明細書おいて本発明の一実施形態は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質と選択的に結合する抗体またはこの抗体の免疫学的に活性な部分または機能的抗体フラグメントを提供する。一実施形態では、当該抗体またはこの抗体の免疫学的に活性な部分は齧歯類、ヒトまたはラクダ科などの起源を持つ哺乳類に由来するか、またはヒト化抗体である。特定の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔに特異的な抗原結合領域を有することを特徴とし、この抗体または機能的フラグメントはｃ−Ｍｅｔまたはｃ−Ｍｅｔのフラグメントと結合する。当該抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。特定の実施形態では、当該抗体またはこの抗体の免疫学的に活性な部分はモノクローナル抗体である。本発明のさらなる実施形態としては、例えば、抗原結合部分または非伝統的もしくは非免疫グロブリン的スキャフォールドもしくはフレームワーク上に提供されるこのようなフラグメントなどの機能的フラグメントを含む。
【０００９】
別の実施形態では、当該抗体またはこの抗体の機能的フラグメントは標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔと、２．０×１０−５Ｍ以下、２．０×１０−６Ｍ以下、２．０×１０−７Ｍ以下、２．０×１０−８Ｍ以下または２．０×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する。関連の実施形態では、当該抗体またはこの抗体の機能的フラグメントは標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔに対して１．０×１０−２／秒以下、１．０×１０−３／秒以下、１×１０−４／秒以下または１．０×１０−５／秒以下の解離速度（Ｋｏｆｆ）を有する。関連の実施形態では、当該抗体またはこの抗体の機能的フラグメントは標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔと２．０×１０−５Ｍ以下、２．０×１０−６Ｍ以下、２．０×１０−７Ｍ以下、２．０×１０−８Ｍ以下または２．０×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合し、ＨＧＦとｃ−Ｍｅｔの結合を阻害する。関連の実施形態では、当該抗体またはその機能的フラグメントはｃＭｅｔ活性に拮抗作用を示す。
【００１０】
特定の実施形態では、当該抗体またはこの抗体の機能的フラグメントは標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔと結合し、限定されるものではないが、リン酸化、特に自己リン酸化を含むｃ−Ｍｅｔ活性を変調する（すなわち、活性化する（促進作用を示す）か、または阻害する（拮抗作用を示す）のいずれか）。特定の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔリン酸化の促進作用または活性化は、器官再生、創傷治癒および組織再生の群から選択される少なくとも１つの活性を刺激する。関連の実施形態では、この器官は腎臓、肝臓、膵臓、肺、胃、腸、皮膚、胸腺または甲状腺である。
【００１１】
好ましい実施形態では、本発明の抗体はｃＭｅｔに拮抗作用を示し、その拮抗作用が、細胞増殖の阻害、細胞移動の阻害、細胞生存の阻害、転移の阻害および／もしくはＨＧＳ結合の阻害、またはｃＭｅｔインターナリゼーションの誘発から選択される少なくとも１つの活性をもたらす。ほとんどの実施形態では、本発明のｃＭｅｔ抗体アンタゴニストは増殖性疾患、特に、癌または炎症性疾患の処置に使用可能である。
【００１２】
関連の実施形態では、この結合は、当該抗体による拮抗作用または促進作用いずれかの活性を測定するために使用可能な１以上のアッセイによって判定される。これらのアッセイは、少なくとも、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路酵素の活性の誘導、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路遺伝子の発現の誘導、電気化学発光に基づくｃ−Ｍｅｔへの直接的結合、ｃ−Ｍｅｔへの結合の酵素結合免疫吸着アッセイおよび細胞の増殖、生存、移動または転移を含むｃ−Ｍｅｔリガンドに対する抗体の作用の少なくとも１つを測定する。抗体が拮抗作用を有するか促進作用を有するかは、結果を、ＨＧＦ天然リガンドを欠いた対照と比較することによって判定される。このように、拮抗作用抗体はＨＧＦの存在下であってもｃＭｅｔ誘導を遮断するが、促進作用抗体はＨＧＦの不在下で誘導を生じる。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、配列番号１〜３０、７３〜７６および８５〜８８の群から選択される、抗体およびその単離されたコードヌクレオチド配列を提供する単離されたアミノ酸およびヌクレオチド配列を提供する。関連の実施形態では、本発明は、これらのヌクレオチド配列によりそれぞれコードされる単離されたアミノ酸配列、およびこれらのアミノ酸配列の保存的変異体を提供する。別の関連の実施形態では、配列番号１〜２０の各々の単離されたヌクレオチド配列は抗原結合軽鎖のアミノ酸配列をコードする。さらに別の関連の実施形態では、配列番号２１〜３０の各々の単離されたヌクレオチド配列は抗原結合重鎖のアミノ酸配列をコードする。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、配列番号３１〜７２、７７〜８４および８９〜９６の群から選択される単離されたアミノ酸配列、およびこれらの配列の保存的変異体を提供する。関連の実施形態では、配列番号３１〜５４の各々の単離されたアミノ酸配列は抗原結合軽鎖を含む。別の関連の実施形態では、配列番号５５〜７２の各々の単離されたアミノ酸配列は抗原結合重鎖を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号３１〜７２、７７〜８４および８９〜９６と少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５または９９％の同一性を有する単離されたアミノ酸配列を提供する。関連の実施形態では、本発明は、配列番号１〜３０、７３〜７６および８９〜９６で示される配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％の同一性を有する単離されたヌクレオチド配列を提供する。
【００１６】
さらに別の実施形態では、本発明は、これらの抗体のいずれかの単離された抗原結合領域またはこれらの抗体のいずれかの機能的フラグメントを提供する。よって、特定の実施形態では、本発明は、配列番号１〜２０の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。関連の実施形態では、本発明は、配列番号２１〜３０の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。別の関連の実施形態では、本発明は、配列番号１〜２０の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖と、配列番号２１〜３４の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる重鎖とを有する単離された抗原結合領域を提供する。
【００１７】
関連の実施形態では、本発明は、配列番号３１〜５４の群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。別の関連の実施形態では、本発明は、配列番号５５〜７２の群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。さらに別の関連の実施形態では、本発明は、配列番号３１〜５４の群から選択されるアミノ酸配列およびこれらの配列の保存的変異体を有する軽鎖と、配列番号５５〜７２の群から選択されるアミノ酸配列およびこれらの配列の保存的変異体を有する重鎖とを有する単離された抗原結合領域を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、配列番号７３のヌクレオチド配列によりコードされるＩｇλ軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。関連の実施形態では、本発明は、配列番号７４〜７６の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされるＩｇκ軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明は、配列番号７７〜８０の群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇλ軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。別の関連の実施形態では、本発明は、配列番号８１〜８４の群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇκ軽鎖を有する単離された抗原結合領域を提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、単離されたヒトもしくはヒト化抗体またはその抗体の機能的フラグメントを提供し、この抗体はｃ−Ｍｅｔタンパク質に見られるエピトープに特異的な抗原結合領域を有し、その結果、この抗体または機能的フラグメントは細胞上のｃ−Ｍｅｔ表面受容体と結合し、癌の発症または転移を予防または改善する。関連の実施形態では、本発明は、標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔのエピトープに特異的な抗原結合領域を有する単離された抗体または機能的フラグメントを提供し、このエピトープはｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の１以上のアミノ酸残基を含む。関連の実施形態では、このエピトープはコンフォメーショナルエピトープである。
【００２１】
さらに別の実施形態では、上記の単離された抗体または機能的フラグメントはＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体フラグメントであるか、またはラクダ科ナノボディーである。ＦａｂまたはｓｃＦｖは、特定の実施形態では一価である。この抗体の一価の特性は、ｃ−Ｍｅｔタンパク質に拮抗作用を示すようにデザインされた薬剤に特に好適である。特定の実施形態では、任意のＩｇＧ抗体はＩｇＧである。関連の実施形態では、上記のいずれかの抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。特定の実施形態では、ＩｇＧはＩｇＧ４である。さらに具体的な実施形態では、ＩｇＧ４は配列番号８５〜８８の群から選択されるヌクレオチド配列によりコードされる。さらに別の関連の実施形態では、ＩｇＧ４は配列番号８５〜８８からなる群から選択される配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる。さらなる関連の実施形態では、ＩｇＧ４は配列番号８９〜９６からなる群から選択されるアミノ酸配列およびこれらの配列の保存的変異体を有する。あるいは、本明細書の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭである。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの上記の抗体またはこれらの抗体の機能的フラグメントもしくは保存的変異体と薬学上許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
さらに別の実施形態では、本発明は、上記の抗体またはそれらの機能的フラグメントのいずれかをコードする遺伝子を保持するトランスジェニック動物またはトランスジェニック細胞を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ関連障害または症状を処置する方法を提供し、その方法はそれを必要とする対象に有効量の上記のいずれかの医薬組成物を投与することを含む。この障害または症状は癌または炎症症状である。
【００２５】
一実施形態では、この癌は食道癌、乳癌、腎臓癌（限定されるものではないが、乳頭腎細胞癌を含む）、神経膠腫、頭頸部癌、上皮癌、肺癌、皮膚癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳の癌、膵臓癌、胃癌、胃腸癌、胃癌、結腸癌、腸癌、肝臓、生殖器癌、泌尿器癌、黒色腫または前立腺癌、ならびに当業者に公知の他の腫瘍である。特定の実施形態では、癌は肝臓癌、腎臓癌、食道癌または肉腫である。より詳しくは、癌は、脳の癌、胃癌、生殖器癌、泌尿器癌、前立腺癌、膀胱癌（表在性および筋肉浸潤性）、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、神経膠腫（膠芽腫、未分化星状細胞腫、乏突起星状細胞腫、乏突起神経膠腫を含む）、食道癌、胃癌、胃腸癌、肝臓癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）（小児ＨＣＣを含む）、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮細胞癌、鼻咽頭癌を含む）、ヒュルトレ細胞癌、上皮癌、皮膚癌、悪性黒色腫を含む黒色腫、中皮腫、リンパ腫、多発性骨髄腫を含む骨髄腫、白血病、非小細胞肺癌（あらゆる組織サブタイプ：腺癌、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、大細胞癌および腺扁平上皮混合型含む）を含む肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、腎細胞癌（遺伝性および散発性乳頭腎細胞癌、Ｉ型およびＩＩ型、および淡明細胞腎細胞癌を含む）、肉腫、特に、骨肉腫、淡明細胞肉腫および軟組織肉腫（卵巣状および胎児性横紋筋肉腫、卵巣状軟部肉腫を含む）、甲状腺癌（乳頭および他のサブタイプ）からなる群から選択される。
【００２６】
所与の実施形態では、炎症症状の一例として感染によるものがある。一実施形態では、当該処置方法は病原体の感染を遮断することである。特定の実施形態では、この感染は、例えばリステリア菌感染を含む細菌感染である。例えば、Shen et al. Cell 103: 501−10, (2000)参照。ある作用機序に限定されるものではないが、細菌はそれ自体インターナライズするためにｃ−Ｍｅｔ結合タンパク質を用いると考えられる。本発明の抗体はこの相互作用を遮断し、それによりインターナリゼーションを妨げる。別の実施形態では、処置は例えば創傷治癒応答などの細胞応答を刺激する。
【００２７】
特定の実施形態では、上記の方法はいずれも、化学療法薬を投与することをさらに含む。関連の実施形態では、この化学療法薬は抗癌剤である。具体的な組合せは本願に示されている。
【００２８】
関連の実施形態では、上記の方法はいずれも、経路特異的阻害剤を投与することをさらに含む。この経路特異的阻害剤は化学療法薬であってもよいし、あるいは例えば抗体などの生物薬剤であってもよい。経路特異的阻害剤としては、限定されるものではないが、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲなどの阻害剤を含む。
【００２９】
さらに別の実施形態では、本発明は望ましくない細胞を処置する方法を提供し、その方法は、細胞と上記のいずれかの抗体またはこれらの抗体の機能的フラグメントを接触させることを含む。関連の実施形態では、この細胞は細胞表面にｃ−Ｍｅｔを有する。別の関連の実施形態では、上記の方法は、細胞を化学療法薬または放射線で処置することをさらに含む。
【００３０】
上記の方法のいくつかに関連する一実施形態では、これらの方法は、対象への投与または細胞接触の後に、癌の発症または転移の改善または遅延を観察することをさらに含み得る。
【００３１】
さらに別の実施形態では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ表面受容体を有する細胞を同定する方法を提供し、その方法は細胞と上記のいずれかの抗体または機能的フラグメントを、その抗体または機能的フラグメントが検出可能な標識有するように接触させることを含む。例えば、この標識は放射性、蛍光性、磁性、常磁性または化学発光性である。関連の実施形態では、上記の方法は、細胞を画像化または分離するステップをさらに含む。例えば、細胞の分離は、大きな細胞集団からｃ−Ｍｅｔ保持細胞を単離することである。
【００３２】
別の実施形態では、上記のヒトまたはヒト化抗体または抗体フラグメントは、例えば固相アミノ酸合成装置により生産されるポリペプチドなどの合成抗体である。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、上記の抗体またはこれらの抗体の機能的フラグメントのいずれかと付加的治療薬とを含む医薬組成物を提供する。付加的治療薬は抗癌剤、抗生物質、抗炎症薬、増殖因子およびサイトカインからなる群から選択される。
【００３４】
本発明はさらに、哺乳類、特にヒトにおいて癌などの増殖性疾患または障害を、
（ａ）本発明のｃ−Ｍｅｔアンタゴニストと、
（ｂ）１以上の薬学上活性な薬剤
（なお、少なくとも１つの薬学上活性な薬剤は抗癌治療薬である）
との組合せで予防または治療する方法に関する。
【００３５】
本発明はさらに、
（ａ）ｃ−Ｍｅｔ抗体アンタゴニスト、
（ｂ）薬学上活性な薬剤および
（ｃ）薬学上許容される担体
（なお、少なくとも１つの薬学上活性な薬剤は抗癌治療薬である）
を含む医薬組成物に関する。
【００３６】
本発明はさらに、
（ａ）ｃ−Ｍｅｔ抗体アンタゴニストの医薬製剤と
（ｂ）同時、並行、個別または逐次のための薬学上活性な薬剤の医薬製剤
（なお、少なくとも１つの薬学上活性な薬剤は抗癌治療薬である）
を含む市販パッケージまたは製品に関する。
【００３７】
特定の実施形態では、本発明は、配列番号５５〜７２、または配列番号５５〜７２の群から選択される配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％の配列同一性を有する配列などの重鎖である第一のアミノ酸配列と、配列番号３１〜５４、または配列番号３１〜５４の群から選択される配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％の配列同一性を有する配列などの軽鎖である第二のアミノ酸配列とを有する単離された抗体を提供する。
【００３８】
さらに別の実施形態では、本発明は、上記のような抗体またはフラグメントである第一の成分と、第二のアミノ酸配列である第二の成分とを有する免疫複合体を提供する。例えば、当該免疫複合体の第二の化合物は細胞毒素であるか、またはｃ−Ｍｅｔとは異なる標的に対して結合特異性を有する結合タンパク質または抗体である。例えば、ｃ−Ｍｅｔとは異なる結合特異性の標的は癌細胞の表面上の腫瘍抗原または腫瘍関連タンパク質である。特定の実施形態では、本発明は二重特異性抗体としての上記のいずれかの抗体を提供する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、上記のいずれかの抗体または抗体フラグメントを有するキットを提供する。いくつかの実施形態では、当該キットはその薬学上許容される担体または賦形剤をさらに含む。他の関連の実施形態では、当該キットにおける上記のいずれかの抗体は単位用量で存在する。さらに別の関連の実施形態では、当該キットは上記のいずれかの抗体またはこれらの抗体の機能的フラグメントを対象に投与する際の、または研究用途もしくはスクリーニングに関する使用説明書を含む。
【００４０】
ｃＭｅｔ活性に拮抗作用を示す治療薬は、臨床上関連のある広範囲の腫瘍の処置に有益な影響を有すると予測される。本発明には、ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインと直接結合し、ＨＧＦ／ＳＦとの相互作用を遮断する完全ヒト抗体が含まれる。
【００４１】
図面の簡単な説明
図１は本発明のＶＨ鎖の配列アラインメントである。各鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域も示す。
図２は本発明のＶＬλ鎖の配列アラインメントである。各鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域も示す。
図３は本発明のＶＬκ鎖の配列アラインメントである。各鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域も示す。
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明は、ｃ−Ｍｅｔ、具体的には、ｃ−Ｍｅｔタンパク質の細胞外部分と特異的に結合し、ｃ−Ｍｅｔの機能特性を阻害する単離された抗体、特に、ヒトまたはヒト化アミノ酸配列を有する抗体に関する。特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の重鎖および軽鎖配列に由来し、かつ／または特定のアミノ酸配列を含むＣＤＲ領域などの特定の構造的特徴を含む。本発明は、単離された抗体、このような抗体の作製方法、このような抗体を検出するためのアッセイ、このような抗体を含む免疫複合体および二重特異性分子ならびに本発明の抗体、免疫複合体または二重特異性分子を含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、増殖性疾患、例えば、癌または炎症症状の治療をもたらす細胞受容体標的ｃ−Ｍｅｔの存在に関連する障害または症状の発症を阻害するために、当該抗体を用いて、ｃ−Ｍｅｔの機能を阻害する、すなわちそれに対して拮抗作用を示す方法に関する。本発明はまた、異なる実施形態において、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を活性化する、すなわちそれに対して促進作用を示す抗体、および例えば器官再生、創傷治癒または組織再生を刺激する促進作用抗体の使用方法に関する。
【００４３】
所与の実施形態では、炎症症状は感染である。一実施形態では、この処置方法は病原体の感染を遮断するためのものである。特定の実施形態では、感染は、例えばリステリア菌感染を含む細菌感染である。
【００４４】
本発明をより容易に理解することができるように、特に断りのない限り、特定の用語は本明細書の意味を有するものと定義する。その他の定義は詳細な説明に示される。
【００４５】
「ｃ−Ｍｅｔポリペプチド」または「ｃ−Ｍｅｔ受容体」または「ｃ−Ｍｅｔ」は、肝細胞増殖因子と結合する受容体チロシンキナーゼを指す。具体例としては、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００２４５で示されるヌクレオチド配列によりコードされるヒトポリペプチド、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００２３６で示されるポリペプチド配列によりコードされるヒトタンパク質、またはその細胞外ドメインが含まれる。一次一本鎖前駆体タンパク質は翻訳後切断されてαおよびβサブユニットを生じ、これらがジスルフィド結合されて成熟受容体が形成される。受容体チロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔは、例えば、胚発生および組織再生に伴う移動、浸潤および形態形成のプロセスを含む細胞プロセスに関与している。
【００４６】
「ｃ−Ｍｅｔ関連障害または症状」とは、ｃ−Ｍｅｔの望ましくない発現もしくは発現の欠如、望ましくない調節もしくは調節の欠如、または望ましくない活性もしくは活性の欠如から起こるか、あるいはｃ−Ｍｅｔの発現または活性を調節することによって調節、または治療または治癒し得る疾病、障害または状態を指す。例えば、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ経路の活性化は高い割合の癌患者で、または疾病がｃ−Ｍｅｔ経路に関連する変更によってまさに引き起こされている患者で発現している可能性がある。例えば、アップレギュレーションは、ＨＧＦおよび／またはｃ−Ｍｅｔの過剰発現またはｃ−Ｍｅｔ突然変異による構成的活性化などの種々の機構によるものであり得る。ｃ−Ｍｅｔ関連障害または状態としては、限定されるものではないが、例えば、増殖性疾患および障害ならびに炎症性疾患および障害が含まれる。増殖性疾患としては、限定されるものではないが、例えば、胃癌、食道癌、乳癌、腎臓癌（乳頭腎細胞癌を含む）、神経膠腫、頭頸部癌、上皮癌、肺、皮膚、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳の癌、膵臓癌、胃腸癌、胃癌、腸癌、結腸癌、肝臓癌、生殖器癌、泌尿器癌、黒色腫および前立腺癌を含む癌、ならびに当業者に公知の他の腫瘍が含まれる。炎症性疾患としては、限定されるものではないが、例えばリステリア菌によるものを含む細菌感染が含まれる。さらなる障害は、本明細書に、また、例えば、Online Mendelian Inheritance in Man (「OMIM」)に、例えば、Ｍｅｔ原癌遺伝子に関してはＯＭＩＮ受託番号１６４８６０に、肝細胞増殖因子／分散因子に関してはＯＭＩＭ受託番号１４２４０９に記載されている。例えば、Corso et al., TRENDS in Mol. Med. 11(6): 2841 (2005)およびChristensen et al., Cancer Letts. 225: 1−26 (2005)（双方とも出典明示により本明細書の一部とされる）に概説されているものなどの他の例も当業者によく知られている。
【００４７】
「免疫応答」とは、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫もしくは病的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織との選択的結合、それらへの傷害、それらの破壊、またはそれらのヒト身体からの排除をもたらす、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球およびこれらの細胞により、または肝臓により産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体の産生および／または分泌を含む）のいずれの活性も指す。
【００４８】
「シグナル伝達経路」とは、一般に増殖因子と受容体との結合などのタンパク質−タンパク質相互作用により誘発される、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナル伝達を生じる、生化学因性の関係を指す。一般に、この伝達は、シグナル伝達を生じる一連の反応における１以上のタンパク質上の１以上のチロシン、セリンまたはトレオニン残基の特異的リン酸化を含む。最後から２番目のプロセスは一般に、遺伝子発現に変化をもたらす核事象を含む。
【００４９】
「表面受容体」とは、例えば、シグナルの受容が可能であり、かつ、細胞の原形質膜を経てこのようなシグナルの伝達が可能である分子および分子の複合体を指す。本発明の細胞表面受容体の一例としてｃ−Ｍｅｔがあり、これらに例えば肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）などの増殖因子タンパク質分子が結合する。
【００５０】
「抗体」とは、免疫グロビン(immunoglobin)様の結合機能を有するいずれの部分も包含する。この用語には完全な抗体分子および任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）またはその単鎖、例えばナノボディーを含むラクダ科抗体、ファージディスプレー結合構築物などが含まれる。天然抗体は、ジスルフィド結合によって内部連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインからなる。軽鎖にはλとκの２タイプしかない。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域とＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分され、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が挿入されている。自然界に見られるように、各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。これらの抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および伝統的補体系の第一の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子との結合を媒介し得る。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。
【００５１】
抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗原部分」）とは、抗原（例えば、ｃ−Ｍｅｔの一部）と特異的に結合する能力を有する抗体の全長または１以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は全長抗体分子のフラグメントによって遂行され得る。抗体の抗原結合部分を含む結合フラグメントの例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントであるＦａｂフラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド橋で連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ）２フラグメント、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント、抗体鎖の単一のアミノ酸配列のＶＬドメインとＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント(Ward et al., 1989 Nature 341:544−546)、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。
【００５２】
抗原結合部分を含む抗体フラグメントという場合には、単離されたフラグメントまたは化学部分もしくは生物部分、または限定されるものではないが、例えば、アンキリン、フィブロネクチン、ドメイン抗体、リポカリン、スモール・モジュラー・イムノファルマシューティカル(small modular immuno−pharmaceutical)、マキシボディー、ナノボディー、Ａタンパク質、アフィリン、γ−クリスタリンおよびユビキチン、ならびに当業者に公知の他の意図されるスキャフォールドを含む、非伝統的免疫グロブリン由来フレームワークまたはスキャフォールドと結合されたフラグメントとコンジュゲートされたものを意図する。
【００５３】
さらに、天然抗体分子では、別の遺伝子によりコードされるＦｖドメイン、ＶＬおよびＶＨを有する２鎖があるが、それらは組換え法を用い、それらにＶＬ領域およびＶＨ領域が１つの一価分子を形成している単一のタンパク質として組換え発現させることを可能とする合成リンカーにより連結することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423−426;およびHuston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879−5883参照)。このような単鎖抗体も、抗体の抗原結合部分という用語に包含される。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の常法を用いて得られ、これらのフラグメントを完全抗体または他のそのフラグメントである場合と同様に有用性に関してスクリーニングする。
【００５４】
「単離された抗体」とは、抗原特異性の異なる他の抗体を実質的に含まない抗体を指す（例えば、ｃ−Ｍｅｔ上のアミノ酸セットである決定基と特異的に結合する単離された抗体が、ｃ−Ｍｅｔ以外の抗原と特異的かつ実質的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトｃ−Ｍｅｔなどのｃ−Ｍｅｔタンパク質と特異的に結合する単離された抗体は、他種由来のｃ−Ｍｅｔ分子またはヒトｃ−Ｍｅｔアミノ酸配列に対して高い相同性を有するタンパク質などの他の抗原と交差反応性を有し得る。さらに、単離された抗体は他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【００５５】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、全てが単一の分子組成を共通して持つ抗体分子の調製物を指す。従って、モノクローナル抗体組成物は特定のエピトープに対して単一の特異性および親和性を示す。
【００５６】
本明細書において「ポリクローナル抗体」とは、不均質な抗体集団を含む抗体組成物を指す。ポリクローナル抗体は多くの場合、免疫動物または選択されたヒトからプールした血清に由来する。
【００５７】
本明細書において「ヒト抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の少なくとも一方、一般には双方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むものとする。さらに、抗体が定常領域を含む場合には、この定常領域もまた、例えば、ヒト生殖細胞系配列またはヒト生殖細胞系配列の突然変異種に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、in vitroにてランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはin vivoにて体細胞突然変異によって導入された置換などの突然変）を含み得る。
【００５８】
「ヒトモノクローナル抗体」とは、フレームワーク領域とＣＤＲ領域の双方がヒト配列に由来している可変領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、一般にヒト起源の不死化細胞に融合された、一般にヒト起源の重鎖導入遺伝子と一般にヒト起源の軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスに由来するＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００５９】
本明細書において「組換えヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリン遺伝子が遺伝子導入または染色体導入された動物（例えばマウス）またはそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞（例えば、トランスフェクトーマ）から単離された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体などの組換え手段により作製、発現、作出または単離されたヒト抗体、および１以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の、他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他のいずれかの手段により作製、発現、作出または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体は、そのフレームワーク領域とＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体はin vitro突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列が遺伝子導入された動物を用いる場合には、in vivo体細胞突然変異誘発）を受けてもよく、従って、組換え抗体のＶＨ領域とＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系ＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、それに関連するが、自然界でin vivoにおけるヒト抗体生殖細胞系レパートリー内には存在しない配列である。
【００６０】
本明細書において「イソ型」とは、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＥまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のようなＩｇＧなど）を指す。
【００６１】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」とは、本明細書では、「抗原と特異的に結合する抗体」という用語と互換的に用いられる。
【００６２】
本明細書において「ヒトｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する」抗体とは、ヒトｃ−Ｍｅｔと２．０×１０−５Ｍ以下、２．０×１０−６Ｍ以下、２．０×１０−７Ｍ以下、２．０×１０−８Ｍ以下または２．０×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を指すものとする。本明細書において「交差反応性」とは、他の抗原上のエピトープと結合する抗体または抗体集団を指す。これは抗体のアビジティーまたは特異性が低いことによるか、同一もしくは極めて類似したエピトープを有する複数の異なる抗原によるかのいずれかで起こり得る。交差反応性は関連のある抗原群との全般的結合を求める場合、または抗原エピトープ配列が、進化上保存性が高くない際に交差種標識を試みる場合に望ましいことがある。
【００６３】
「ヒトｃ−Ｍｅｔ以外の抗原と交差反応する」抗体とは、その抗原と０．５×１０−７Ｍ以下、５×１０−８Ｍ以下または２×１０−９Ｍ以下のＫＤで結合する抗体を指す。特定の抗原と交差反応しない」抗体とは、その抗原と、結合したとしても、１．５×１０−８Ｍ以上のＫＤまたは５−１０×１０−７Ｍまたは５×１０−６Ｍ以上のＫＤで結合する抗体を指すものとする。ある特定の実施形態では、抗原と交差反応しないこのような抗体は、標準的な結合アッセイにおいてこれらのタンパク質に対して本質的に検出可能な結合を示さない。
【００６４】
本明細書において「ｃ−Ｍｅｔとの結合を阻害する」抗体とは、ＨＧＦ／ＳＦリガンドとｃ−Ｍｅｔ表面受容体との結合を１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、０．７５ｎＭ以下、０．５ｎＭ以下または０．２５ｎＭ以下のＫｉで阻害する抗体を指す。
【００６５】
本明細書において「ｃ−Ｍｅｔのシグナル伝達活性を阻害する」抗体とは、ｃ−Ｍｅｔにより誘発される増殖活性またはその他のものにより誘発される活性を１０ｎＭ未満、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．０ｎＭ、０．５ｎＭまたはそれ未満のＩＣ５０で阻害する抗体を指すものとする。
【００６６】
本明細書において「Ｋａｓｓｏｃ」または「Ｋａ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指すものとし、本明細書において「Ｋｄｉｓ」または「ＫＤ」とは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指すものとする。本明細書において「ＫＤ」とは解離定数を指すものとし、Ｋａに対するＫｄの比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫＤ値は当技術分野で十分に確立されている方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定する方法は表面プラズモン共鳴の使用、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムの使用による。
【００６７】
本明細書において「アゴニスト抗体」または「活性化抗体」とは、ｃ−Ｍｅｔを発現する細胞、組織または生物体に加えた際に、１以上のｃ−Ｍｅｔにより誘発される活性を少なくとも２０％〜４０％増強する抗体を指すものとする。いくつかの実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔ活性を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％または１００％を超えて活性化する。いくつかの実施形態では、本発明のアゴニスト抗体はｃ−Ｍｅｔの少なくとも１つの活性を１０倍増強する。一般に、この増強は生物インデューサーであるＨＧＦの不在下で見られる。しかしながら、アッセイのための対照などのいくつかの実施形態では、この活性抗体はＨＧＦの存在下に加える。
【００６８】
本明細書において「親和性」とは、単一の抗原部位における抗体と「エピトープ」として知られる抗原の一部との間の相互作用の強度を指す。各抗原部位内で、その抗体「腕」の可変領域は抗原と、抗体の多くの原子位置またはアミノ酸残基原子において、弱い非共有結合力で相互作用し、一般に、このような相互作用の数が多いほど、抗原に対する抗体の親和性が強くなる。
【００６９】
本明細書において「アビジティー」とは、抗体−抗原複合体の全体的な安定性または強度の情報を与える指標を指す。これは抗体−エピトープの親和性、抗原および抗体各々の価数、およびこれらの相互作用部分の構造的配置または三次元構成の３つの主要な因子によって制御される。結局のところ、これらの因子は抗体の特異性、すなわち、特定の抗体が正確な抗原エピトープと結合する確率、ならびにその結合の安定性および持続性を定義する。
【００７０】
よりアビジティーの高いプローブを得るために、二量体コンジュゲート（ＦＡＣＳマーカーと結合した２分子の抗体タンパク質またはポリペプチド）を構築することができ、このようにして親和性の低い相互作用（例えば、生殖細胞系抗体とのもの）がＦＡＣＳにより、より容易に検出できるようになる。抗原結合のアビジティーを増強する別の手段としては、ｃ−Ｍｅｔ抗体の、本明細書に記載の構築物のいずれかの二量体または多量体を作製することを含む。このような多量体は、例えば、天然Ｃ−Ｎ末端結合を模倣することにより、またはそれらの定常領域によりともに保持される抗体二量体を模倣することにより、個々のモジュール間の共有結合を介して形成可能である。Ｆｃ／Ｆｃ境界部に対して操作される結合は共有結合であっても非共有結合であってもよい。さらに、Ｆｃ以外の二量体形成相手または多量体形成相手を、二機能性抗体などの抗ｃ−Ｍｅｔ抗体ハイブリッドの構築に用いて、このようなより高次の構造物を作出することができる。
【００７１】
本明細書においてＩｇＧ抗体に関して「高親和性」とは、標的抗原に対するＫＤが１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下である抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、他のイソ型抗体では異なり得る。例えば、ＩｇＭイソ型に対する「高親和性」結合は、ＫＤが１０−７Ｍ以下または１０−８Ｍ以下である抗体を指す。
【００７２】
本明細書において「対象」とは、ヒトもしくは非ヒト哺乳類を含む哺乳類、またはその他の動物を含む。
「非ヒト動物」とは、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどの哺乳類、および鳥類、両生類、爬虫類などの非哺乳類などを含む。
【００７３】
「至適化される」とは、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物体、一般に、例えば、ピキア(Pichia)などの酵母細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞などの哺乳類細胞といった真核細胞に好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。至適化ヌクレオチドは、「親」配列としても知られる原初のヌクレオチド配列によりコードされているアミノ酸配列を完全にまたはできる限り保持するように操作される。本明細書において至適化配列は、ヒト細胞において好ましいヌクレオチド配列でコドンを有するように操作されているが、本明細書では他の真核細胞でのこれらの配列の至適化発現も意図される。至適化されたヌクレオチド配列によりコードされる本明細書の抗体のアミノ酸配列も至適化されているという。
【００７４】
本発明の種々の態様を以下のサブセクションでさらに詳しく記載する。
様々な種のｃ−Ｍｅｔに対する抗体の結合能を評価する標準的アッセイは当技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびＲＩＡが含まれる。好適なアッセイは当業者に公知である。例えば、F. Ausubel, et al., ed. 2006, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。抗体の結合速度（例えば、結合親和性）はもまた、Ｂｉａｃｏｒｅ分析などの当技術分野で公知の標準的アッセイにより評価することができる。ｃ−Ｍｅｔの機能特性（例えば、受容体のインターナリゼーション、増殖因子とｃ−Ｍｅｔの結合の阻害、ｃＭｅｔ自己リン酸化の阻害、ｃＭｅｔ経路活性化の阻害、それによる増殖の回避もしくは改善、またはキナーゼアッセイを含む）に対する抗体の作用を評価するためのアッセイは本明細書に記載されている。
【００７５】
よって、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される方法論に従って測定されるようなこれらのｃ−Ｍｅｔの機能特性（例えば、生化学的活性、免疫活性、細胞活性、生理活性または他の生物活性など）の１以上を「阻害する」抗体は、特定の活性においてその抗体の不在下で見られるものに対する統計学的に有意な拮抗作用または低下に関連する。ｃ−Ｍｅｔ活性を阻害する抗体は、このような統計学的に有意な、測定パラメーターの少なくとも１０％、少なくとも５０％、８０％または９０％の低下を果たし、特定の実施形態では、本発明の抗体はｃ−Ｍｅｔの機能活性を９５％、９８％または９９％を超えて阻害し得る。一般に、この活性の低下はＨＧＦの添加などの誘発事象の後に測定される。
【００７６】
あるいは、当技術分野で公知であり、本明細書に記載される方法論に従って測定されるようなこれらのｃ−Ｍｅｔ機能活性（例えば、生化学的活性、免疫活性、細胞活性、生理活性または他の生物活性）の１以上に「促進作用を示す」抗体は、特定の活性においてその抗体の不在下（例えば、または無関連の特異性の対照抗体の存在下）で見られるものに対する統計学的に有意な増強に関連する。ｃ−Ｍｅｔ活性を刺激する、またはｃ−Ｍｅｔ活性に促進作用を示す抗体は、このような統計学的に有意な、測定パラメーターの少なくとも１０％、少なくとも５０％、８０％または９０％の増強を果たし、特定の実施形態では、本発明の抗体はｃ−Ｍｅｔの機能活性に９５％、９８％または９９％以上を超えて促進作用を示し得る。
【００７７】
組換え抗体
本発明の抗体は、実施例に記載されているように単離され、構造的に同定された組換え抗体である。これらの抗体のＶＨヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２１〜３０に示されている。表Ｃ〜Ｅは本発明の種々の抗体のＶＨヌクレオチド配列の例を示す。これらの抗体のＶＬヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１〜２０に示される（表Ｃ〜Ｅは本発明の種々の抗体のＶＬヌクレオチド配列の例を示す）。これらの抗体のＩｇλおよびκ軽鎖ヌクレオチド配列は配列番号７３〜７６および表Ｃ〜Ｅに示される。これらの抗体のＩｇＧ４ヌクレオチド配列は配列番号８５〜８８および表Ｃ〜Ｅに示される。本発明の他の抗体としては、突然変異してなお上記の配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％の同一性を有するヌクレオチドが含まれる。
【００７８】
抗体のＶＨアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５５〜７２、ならびに表Ａ〜ＢおよびＥに示されている。抗体のＶＬアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３１〜５４、ならびに表Ａ〜ＢおよびＥに示されている。Ｉｇλ軽鎖アミノ酸配列はそれぞれに配列番号７７〜８０、ならびに表Ａ〜ＢおよびＥに示されている。抗体のＩｇκ軽鎖アミノ酸配列はそれぞれ配列番号８１〜８４、ならびに表Ａ〜ＢおよびＥに示されている。抗体のＩｇＧ４アミノ酸配列はそれぞれ配列番号８９〜９６、ならびに表Ａ〜ＢおよびＥに示されている。本発明のさらなる抗体は、突然変異したアミノ酸を含み、上記の配列と少なくとも６０、７０、８０、９０、９５または９９％の同一性を保持する。
【００７９】
これらの抗体の各々は、ｃ−Ｍｅｔの細胞外部分上の部位と結合することから、ＶＨ／ＶＬ（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）、ＶＨ／Ｉｇλ軽鎖（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）およびＶＨ／Ｉｇκ軽鎖（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列）を「混合および適合」させて、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ結合分子のさらなる組合せを得ることができる。このような抗体のｃ−Ｍｅｔ結合は、上記および本実施例に記載の結合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて試験することができる。本発明の抗体のＶＨ、ＶＬ、Ｉｇλ軽鎖およびＩｇκ軽鎖配列は同じまたは類似の生殖細胞系配列に由来するＶＨ、ＶＬ、Ｉｇλ軽鎖およびＩｇκ軽鎖配列を用い、従って構造類似性を示すことから、これらの抗体は特に新規な組合せに従う。
【００８０】
よって、一態様において、本発明は、配列番号５５〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号３１〜５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を少なくとも有する単離された組換え抗体またはその抗原結合部分（当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する）を提供する。
【００８１】
重鎖と軽鎖の組合せの例としては、少なくとも、配列番号６５のＶＨと配列番号３２のＶＬ；または配列番号６６のＶＨと配列番号３４のＶＬ；または配列番号６７のＶＨと配列番号３７のＶＬ；または配列番号６８のＶＨとおよび配列番号３８のＶＬ；または配列番号６９のＶＨと配列番号５１のＶＬ；または配列番号７０のＶＨと配列番号５２のＶＬ；または配列番号７１のＶＨと配列番号５３のＶＬ；または配列番号７２のＶＨと配列番号５４のＶＬ；または配列番号５５のＶＨと配列番号３１のＶＬ；または配列番号５８のＶＨと配列番号３６のＶＬ；または配列番号６１のＶＨと配列番号４１のＶＬ；または配列番号６２のＶＨと配列番号４５のＶＬを含む。表Ａ〜Ｂは、本発明の種々の抗体のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の「混合および適合」された対の例を示す。図１〜３は、本明細書の抗体と同じまたは類似のｃＭｅｔ拮抗作用活性を有する構築物を提供するために別のスキャフォールド上に提供され得るＦＲおよびＣＤＲ領域を示すＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の例を示す表である。
【００８２】
よって、もう１つの態様において、本発明は、配列番号５５〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号７７〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＩｇλ軽鎖を少なくとも有する単離された組換え抗体またはその抗原結合部分（当該抗体はｃ−Ｍｅｔ特異的に結合する）を提供する。
【００８３】
ＶＨ／Ｉｇλ軽鎖の組合せの例としては、少なくとも、配列番号６６のＶＨと配列番号７７のＩｇλ軽鎖；または配列番号６５のＶＨと配列番号７８のＩｇλ軽鎖；または配列番号６９のアミノ酸配列を含むＶＨ領域と配列番号７９のＩｇλ軽鎖；または配列番号７０のＶＨ領域と配列番号８０のＩｇλ軽鎖を含む。
【００８４】
よって、もう１つの態様において、本発明は、配列番号５５〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域と、配列番号８１〜８４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＩｇκ軽鎖を少なくとも有する単離された組換え抗体またはその抗原結合部分（当該抗体はｃ−Ｍｅｔ特異的に結合する）を提供する。
【００８５】
ＶＨ／Ｉｇκ軽鎖の組合せの例としては、少なくとも、配列番号７１のＶＨ領域と配列番号８１のＩｇκ軽鎖；または配列番号６８のＶＨ領域と配列番号８２のＩｇκ軽鎖；または配列番号６７のＶＨ領域と配列番号８３のＩｇκ軽鎖；または配列番号７２のＶＨ領域と配列番号８４のＩｇκ軽鎖を含む。
【００８６】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号２１〜３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＶＨ鎖と、配列番号１〜２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＶＬ鎖を少なくとも有する単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００８７】
よって、重鎖と軽鎖の組合せの例としては、少なくとも、配列番号２１のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号１のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号６のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２７のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号１１のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２８のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号１５のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２９のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号１８のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号３０のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号２０のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２２のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号１のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領；または配列番号２３のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号１のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号７のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号８のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号９のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域；または配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号１０のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域を含む。ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列のさらなる対の例としては、本発明の種々の抗体のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の「混合および適合」された対の例を示す表Ａ〜Ｂを参照。
【００８８】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号２１〜３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＶＨ鎖と、配列番号７３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＩｇλ軽鎖を少なくとも有する単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００８９】
よって、ＶＨ／Ｉｇλ軽鎖の組合せの例としては、配列番号２３のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号７３のヌクレオチド配列を含むＩｇλ軽鎖を含む。
【００９０】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号２１〜３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＶＨ鎖と、配列番号７４〜７６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むＩｇκ軽鎖を少なくとも有する単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００９１】
よって、ＶＨおよびＩｇκ軽鎖の組合せの例としては、少なくとも、配列番号２４のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号７４のヌクレオチド配列を含むＩｇκ軽鎖可変領域；または配列番号２５のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号７５のヌクレオチド配列を含むＩｇκ軽鎖可変領域；または配列番号２７のヌクレオチド配列を含むＶＨ領域と配列番号７６のヌクレオチド配列を含むＩｇκ軽鎖可変領域を含む。
【００９２】
本明細書において、ヒト抗体は、抗体の可変領域が、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られたものである場合、特定の生殖細胞系配列「の産物」であるか、またはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含む。このような系は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスを対象とする抗原で免疫すること、またはファージ上に提示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーを対象とする抗原でスクリーニングすることを含む。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の産物であるか、またはそれに由来するヒト抗体は、それ自体、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、ヒト抗体の配列と配列が最も近い（すなわち、同一性％が最も大きい）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することにより同定することができる。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の産物であるか、またはそれに由来するヒト抗体は、生殖細胞系配列と比較した場合にアミノ酸の違いを含み得る。このような違いは例えば少なくとも１つの天然体細胞突然変異または部位指定突然変異の意図的導入によるものである。しかしながら、選択されたヒト抗体は一般に、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他種（例えば、マウス生殖細胞系配列）の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列と比較した際に、そのヒト抗体をヒト起源であると同定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合では、ヒト抗体は生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または少なくとも９５％、あるいはさらには少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。一般に、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸の違いを１０個だけ示す。ある特定の場合には、ヒト抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列とアミノ酸の違いを５個だけ、あるいはさらには４個、３個、２個または１個だけ示し得る。
【００９３】
同一性抗体
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、本発明に記載の抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列と相同性または同一性を有する、可変領域重鎖および軽鎖ヌクレオチド配列、または可変領域重鎖および軽鎖アミノ酸配列、またはＩｇλヌクレオチド配列、またはＩｇλアミノ酸配列、またはＩｇκヌクレオチド配列、またはＩｇκアミノ酸配列またはＩｇＧ４ヌクレオチド配列、またはＩｇＧ４アミノ酸配列を少なくとも有し、ここで、これらの抗体は本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の所望の機能特性を保持する、すなわち、親の機能活性を示す。これらの親の機能活性は拮抗作用または促進作用であり得る。ほとんどの実施形態では、この活性は拮抗作用である。
【００９４】
例えば、本発明は、ＶＨ領域と軽鎖可変領域を有し、ＶＨ領域が配列番号５５〜７２からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号３１〜５４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供し、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は以下の機能的拮抗作用特性：抗体がｃＭｅｔ受容体のインターナリゼーションを誘発すること、または抗体がタンパク質増殖因子とｃ−Ｍｅｔの結合を阻害すること、または抗体がｃ−Ｍｅｔの自己リン酸化を阻害し、それによりｃＭｅｔ経路の活性化を回避すること、または抗体がシグナル伝達から生じるｃ−Ｍｅｔ経路のアップレギュレーションを阻害すること、または抗体がｃ−Ｍｅｔの結合を阻害し、それにより細胞の増殖、生存、移動、浸潤もしくは形態変化を回避または改善する、特に、腫瘍の増殖または転移などの癌を回避または改善することの少なくとも１つを示す。
【００９５】
別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔリン酸化に応答し、かつ、これを活性化して細胞応答を刺激する。一実施形態では、この細胞応答は創傷治癒応答である。
【００９６】
さらなる例では、本発明は、Ｉｇλ軽鎖を有し、そのＩｇλ軽鎖が配列番号７７〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一であるアミノ酸配列を含む単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供する。さらなる実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は以下の機能特性：抗体がｃＭｅｔ受容体のインターナリゼーションを活性化し、誘発すること、抗体がタンパク質増殖因子とｃ−Ｍｅｔの結合を阻害し、このような阻害で、受容体の活性化を回避する、例えば、ｃＭｅｔの活性化および／またはシグナル伝達から生じる経路のアップレギュレーションを回避すること、または抗体が細胞増殖、細胞生存、移動、浸潤または形態変化を回避または改善すること、または抗体がｃ−Ｍｅｔ活性に拮抗作用を示し、それにより腫瘍増殖および／または転移などの癌を回避または改善することの少なくとも１つを示す。
【００９７】
別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化を活性化して、細胞応答を刺激する。
【００９８】
別の例では、本発明は、Ｉｇκ軽鎖を有し、そのＩｇκ軽鎖が配列番号８１〜８４からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供し、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は上記および本明細書に記載される機能特性の少なくとも１つを示す。別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化を活性化して、細胞応答を刺激する。
【００９９】
別の実施形態では、本発明は、その抗体がＩｇＧ４であり、そのＩｇＧ４が配列番号８９〜９６からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供し、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は上記および本明細書に記載される機能特性の少なくとも１つを示す。別の実施形態では、当該抗体は促進作用を示し、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を活性化して、細胞応答を刺激する。
【０１００】
様々な実施形態において、当該抗体は本明細書に述べられる１以上、２以上または３以上の拮抗作用的機能特性を示し得る。当該抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明は、ＶＨ領域と軽鎖可変領域を有し、ＶＨ領域が配列番号２１〜３０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によりコードされ、軽鎖可変領域が配列番号１〜２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供し、このコードされる抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は上記および本明細書に記載される機能特性の少なくとも１つを示す。別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化を活性化して、細胞応答を刺激する。
【０１０２】
さらなる例では、本発明は、Ｉｇλ軽鎖を有し、このＩｇλ軽鎖が配列番号７３からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供し、このコードされる抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は上記および本明細書に記載される機能特性の少なくとも１つを示す。別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化に促進作用を示し、これを活性化して、細胞応答を刺激する。
【０１０３】
別の例では、本発明は、Ｉｇκ軽鎖を有し、そのＩｇκ軽鎖が配列番号７４〜７６からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供し、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は上記および本明細書に記載される機能特性の少なくとも１つを示す。別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化を活性化して、細胞応答を刺激する。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明は、抗体がＩｇＧ４であり、このＩｇＧ４が配列番号８５〜８８からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列によりコードされる単離された組換え抗体またはその抗原結合部分を提供し、このコードされる抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は上記および本明細書に記載される機能特性の少なくとも１つを示す。別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化に促進作用を示し(agnoistic)、これを活性化して細胞応答を刺激する。
【０１０５】
様々な実施形態において、当該抗体は本明細書に述べられる１以上、２以上または３以上の拮抗作用的機能特性を示し得る。当該抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１０６】
他の実施形態において、ＶＨおよび／またはＶＬアミノ酸配列は上記に示す配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。それぞれ配列番号３１〜７２のＶＨおよびＶＬ領域と高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＶＨおよびＶＬ領域を有する抗体は、配列番号３１〜７２をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後に、本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能（すなわち、上記に示す機能）に関してコードされる変異抗体を試験することにより得ることができる。
【０１０７】
他の実施形態において、重鎖および／または軽鎖ヌクレオチド配列の可変領域は上記に示す配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。配列番号２１〜３０の可変領域重鎖と、また、配列番号１〜２０の可変領域軽鎖とそれぞれ高い（すなわち８０％以上の）同一性を有する可変領域重鎖および軽鎖を有する抗体は、配列番号１〜３０を含む核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後に、本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能（すなわち、上記に示す機能）に関してコードされる変異抗体を試験することにより得ることができる。
【０１０８】
他の実施形態において、Ｉｇλ軽鎖アミノ酸配列は上記に示す配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。それぞれ配列番号７７〜８０のＩｇλ軽鎖と高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＩｇλ軽鎖を有する抗体は、配列番号７７〜８０をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後に、本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能（すなわち、上記に示す機能）に関してコードされる変異抗体を試験することにより得ることができる。
【０１０９】
他の実施形態において、Ｉｇλ軽鎖ヌクレオチド配列は上記に示す配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。それぞれ配列番号７３のＩｇλ軽鎖と高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＩｇλ軽鎖を有する抗体は、配列番号７３を含む核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後に、本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能（すなわち、上記に示す機能）に関してコードされる変異抗体を試験することにより得ることができる。
【０１１０】
他の実施形態において、Ｉｇκ軽鎖アミノ酸配列は上記に示す配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。それぞれ配列番号８１〜８４のＩｇκ軽鎖と高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＩｇκ軽鎖を有する抗体は、配列番号８１〜８４をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後に、本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能（すなわち、上記に示す機能）に関してコードされる変異抗体を試験することにより得ることができる。
【０１１１】
他の実施形態において、Ｉｇκ軽鎖ヌクレオチド配列は上記に示す配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一または相同であり得る。それぞれ配列番号７４〜７６のＩｇκ軽鎖と高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＩｇκ軽鎖を有する抗体は、配列番号７４〜７６を含む核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後に、本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能（すなわち、上記に示す機能）に関してコードされる変異抗体を試験することにより得ることができる。
【０１１２】
他の実施形態において、ＩｇＧ４である抗体は上記に示すアミノ酸配列と５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得る。それぞれ配列番号８９〜９６のＩｇＧ４組成と高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＩｇＧ４は、配列番号８９〜９６をコードする核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後に、本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能（すなわち、上記に示す機能）に関して突然変異誘発により誘導されたコードされる変異抗体を試験することにより得ることができる。
【０１１３】
他の実施形態において、当該抗体は、上記に示すヌクレオチド配列と６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＩｇＧ４である。それぞれ配列番号８５〜８８のＩｇＧ４’と高い（すなわち８０％以上の）同一性を有するＩｇＧ４は、配列番号８５〜８８を含む核酸分子の突然変異誘発（例えば、部位指定またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）の後に、本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能（すなわち、上記に示す機能）に関してコードされる変異抗体を試験することにより得ることができる。
【０１１４】
本明細書において、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、２配列間の同一性％に等しく、これらの用語は本明細書において互換的に用いられる。２配列間の同一性％は、その２配列の最適アライメントのために導入が必要なギャップ数および各ギャップの長さを考慮した、それらの配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。配列比較および２配列間の同一性％の決定は、以下の限定されない例に記載されるような数学的アルゴリズムを用いて実行することができる。
【０１１５】
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11−17, 1988)のアルゴリズムを用い、ＰＡＭ１２０ウエイト・レシジュ・テーブル、ギャップ・レングス・ペナルティー１２およびギャップ・ペナルティー４を用いて決定することができる。さらに、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の同一性％は、ＧＣＧソフトウエアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のギャッププログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444−453, 1970)アルゴリズムを用い、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスおよびギャップ・ウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４およびレングス・ウェイト１、２、３、４、５または６を用いて決定することができる。
【０１１６】
その上にまたはその代わりに、本発明のタンパク質配列は、例えば関連配列を同定するため、公開データベース検索を行うための「検索配列」として使用することもできる。このような検索は、Altschul, et al., 1990 J.Mol. Biol. 215:403−10のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。本発明の抗体分子と相同なアミノ酸配列を得るためには、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を行うことができる。比較目的でギャップが挿入されたアライメントを得るためには、Altschul et al., 1997 Nucleic Acids Res. 25(17):3389−3402に記載されているようなギャップＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、個々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。http:lwww.ncbi.nhn.nih.govを参照。
【０１１７】
ヌクレオチド配列を本明細書に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる条件は、既知の技術に従って決定することができる。ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシーまたは同等ストリンジェント条件下で行われる。低ストリンジェンシー条件の例は、３７℃、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む３５〜４０％ホルムアミド含有バッファーである。中ストリンジェンシー条件の例は、４２℃、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む４０〜４５％ホルムアミド含有バッファーである。高ストリンジェンシー条件の例は、Ｇ＋Ｃ％およびポリヌクレオチドの長さに応じて４２℃以上の温度、５×デンハート液、０．５％ＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む５０％ホルムアミド含有バッファーである。J. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.) (Cold Spring Harbor Laboratory)参照。
【０１１８】
上記のストリンジェンシー条件例のいずれかの下でのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを溶液中で行い、フィルターに回収する。あるいは、上記のストリンジェンシー条件例のいずれかの下でのヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションをゲルにて行う（例えば、サザンブロット法）。
【０１１９】
保存的修飾を有する抗体
特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号５５〜７２の群から選択される配列を含むＶＨ領域と、配列番号３１〜５４の群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を有し、これらの１以上の配列は、本明細書に記載の抗体またはその保存的修飾物に基づく特定のアミノ酸配列を有し、当該抗体は本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の所望の機能特性を有する。よって、本発明は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖を有し、ＶＨ鎖が配列番号５５〜７２の群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾物を有し、ＶＬ鎖が配列番号３１〜５４の群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾物を有する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供し、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は以下の機能特性：抗体がｃＭｅｔ受容体のインターナリゼーションを活性化し、誘発すること、抗体がタンパク質増殖因子とｃ−Ｍｅｔの結合を阻害し、このような阻害が受容体の活性化を回避する、例えば、ｃＭｅｔの活性化および／またはシグナル伝達から生じる経路のアップレギュレーションを回避すること、または抗体が細胞の増殖、細胞の生存、移動、浸潤もしくは形態変化を回避または改善し、それにより腫瘍の増殖および／または転移などの癌を回避または改善することの少なくとも１つを示す。
【０１２０】
別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化に促進作用を示し、これを活性化して細胞応答を刺激する。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７７〜８０の群から選択されるアミノ酸配列を有し（従って、これらの１以上の配列は本明細書に記載の抗体のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有する）、また、その保存的修飾を有する（従って、誘導される抗体は本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の所望の機能特性を保持する）Ｉｇλ軽鎖である。よって、本発明は、Ｉｇλ軽鎖を有し、そのＩｇλ軽鎖は配列番号７７〜８０の群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾物を有する単離された親抗体またはその抗原結合部分を提供し、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は本明細書に記載の機能的拮抗作用特性の少なくとも１つを示す。
【０１２２】
別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化に促進作用を示し、これを活性化して細胞応答を刺激する。
【０１２３】
他の実施形態において、本発明は、配列番号８１〜８４の群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇκ軽鎖を有し（従って、これらの１以上の抗体は本明細書に記載の抗体に由来するアミノ酸配列を有する）、また、その保存的修飾を有する抗体を提供し、当該抗体は本発明の親抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の機能特性を示す。よって、本発明は、Ｉｇκ軽鎖を有し、そのＩｇκ軽鎖が配列番号８１〜８４の群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾物を有する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を提供し、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は本明細書に示される機能特性の少なくとも１つを示す。
【０１２４】
別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化を活性化して、細胞応答を刺激する。
【０１２５】
他の実施形態において、本発明の抗体は、配列番号８９〜９６の群から選択されるアミノ酸配列を有するＩｇＧ４であり、これらの１以上の配列は本明細書に記載の抗体の親アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列またはその保存的修飾物を有し、かつ、当該抗体は本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の所望の機能特性を示す。よって、本発明は、抗体がＩｇＧ４であり、このＩｇＧ４が配列番号８９〜９６の群から選択されるアミノ酸配列およびその保存的修飾物を有する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供し、当該抗体はｃ−Ｍｅｔと特異的に結合し、かつ、当該抗体は本明細書に記載の機能的拮抗作用特性の少なくとも１つを示す。
【０１２６】
別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化に促進作用を示し、これを活性化して細胞応答を刺激する。
【０１２７】
様々な実施形態において、当該抗体は上記に列挙される１以上、２以上または３以上の拮抗作用的機能特性を示し得る。このような抗体は例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【０１２８】
本明細書において、「保存的配列修飾」とは、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸修飾を指すものとする。このような保存的修飾は、本明細書に記載のアミノ酸の置換、付加および欠失を含む。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準的技術により本発明の抗体に導入される。
【０１２９】
保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸残基を化学的および物理的に類似する側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で知られている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。よって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換することができ、変更された抗体は本明細書に記載の機能的アッセイを用い、保持される機能に関して試験することができる。
【０１３０】
抗体フレームワーク
得られるポリペプチドが本明細書の配列例のｃＭｅｔタンパク質に特異的な１以上の結合領域を含む限り、多様な抗体／免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドが使用可能である。このようなフレームワークまたはスキャフォールドは、ヒト免疫グロブリンの５つの主要なイディオタイプまたはそのフラグメント（本明細書の他所に開示されているものなど）を含み、他の動物種の、好ましくはヒト化側面を有する免疫グロブリンを含む。この点で、ラクダ科で確認されているものなどの単一重鎖抗体が特に注目される。新規なフレームワーク、スキャフォールドおよびフラグメントの開発および発見が当業者により続けられている。
【０１３１】
あるいは、既知または未知の非免疫グロブリンフレームワークおよびスキャフォールドが、ｃ−Ｍｅｔタンパク質に特異的な結合領域を含む限り、使用可能である。このような化合物は本明細書で「ｃ−Ｍｅｔ特異的結合領域を含むポリペプチド」として知られる。既知の非免疫グロブリンフレームワークまたはスキャフォールドとしては、アドネクチン（フィブロネクチン）(Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA)、アンキリン(Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd (Cambridge, MA)およびＡｂｌｙｎｘ  ｎｖ(Zwijnaarde, Belgium)、リポカリン(Anticalin)(Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、スモール・モジュラー・イムノファルマシューティカル(small modular immuno−pharmaceutical) (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA)、マキシボディー(Avidia, Inc. (Mountain View, CA))、Ａタンパク質(Affibody AG, Sweden)およびアフィリン（γ−クリスタリンまたはユビキチン）(Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)が含まれる。
【０１３２】
本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と同じエピトープと結合する抗体
別の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される本発明の様々な抗ｃ−Ｍｅｔ抗体が結合するものと同じエピトープと結合する抗体を提供する。このような付加的抗体は、標準的ｃ−Ｍｅｔ結合アッセイにおいて、本発明の他の抗体と交差競合する（例えば、統計学的に有意にその結合を競合的に阻害する）それらの能力に基づいて同定することができる。試験抗体がヒトｃ−Ｍｅｔと結合する既知の能力を有する抗体の結合を阻害することができることが、試験抗体がその抗体と競合し得るということを証明する。このような抗体は非限定的な理論に従い、それが競合する抗体と同じまたは関連のある（例えば、構造的に類似するか、または空間的に近接する）、ヒトｃ−Ｍｅｔ上のエピトープと結合し得る。このような抗体は本実施例に記載されるように作製および単離することができる。
【０１３３】
ラクダ科抗体
ラマ種(Lama paccos、Lama glamaおよびLama vicugna)などの新世界メンバーを含むラクダ科およびヒトコブラクダ科(Camelus bactrianusおよびCalelus dromaderius)のメンバーから得られる抗体タンパク質は、大きさ、構造的複雑性およびヒト対象における抗原性に関して特徴付けられている。自然界に見られるこの科の哺乳類に由来するある特定のＩｇＧ抗体は軽鎖を欠いていることから、他の動物由来の抗体に特徴的な、２本の重鎖と２本の軽鎖を有する典型的な４鎖の４成分構造とは異なる構造を持っている。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日公開のＷＯ９４／０４６７８）参照。
【０１３４】
ＶＨＨで示される小単鎖可変ドメインであるラクダ科抗体の領域は、標的に対して高い親和性を有する小タンパク質が得られるように遺伝子操作することにより得ることができ、その結果、「ラクダ科ナノボディー」として知られる低分子量抗体由来のタンパク質が得られる。１９９８年６月２日発行の米国特許第５，７５９，８０８号参照；また、Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256−1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783−788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440−448; Cortez−Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456−62;およびLauwereys, M. et al. 1998 EMBO J 17: 3512−3520も参照。ラクダ科抗体および抗体フラグメントの操作ライブラリーが、例えばＡｂｌｙｎｘ、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから市販されている。非ヒト起源の他の抗体に関して当技術分野で知られているように、ラクダ科抗体のアミノ酸配列は、ヒト配列をより緊密に真似る配列が得られるように組換えにより変更することができ、すなわち、このナノボディーをヒト化することができる。よって、ヒトに対するラクダ科抗体の本来低い免疫原性をさらに低減することができる。
【０１３５】
ラクダ科ナノボディーは、ヒトＩｇＧ分子のおよそ１０分の１の分子量であり、このタンパク質はわずか数ナノメートルの物理的直径を持つ。小型であることの１つの結果として、ラクダ科ナノボディーはより大きな抗体タンパク質から機能的に隠れた抗原部位と結合することができ、すなわち、ラクダ科ナノボディーは、従来の免疫技術を用い、他の方法では隠れている抗原を検出するための試薬として有用であり、また、可能性のある治療薬としても有用である。例えば、小型であることのさらにもう１つの結果として、ラクダ科ナノボディーは、標的タンパク質の溝または狭い裂溝内の特定の部位と結合する結果として阻害が可能であり、ゆえに、従来の高分子量抗体の場合よりも従来の低分子量薬剤の機能をより緊密に真似る能力に役立ち得る。
【０１３６】
このような低分子量およびコンパクトなサイズの結果として、さらに、ラクダ科ナノボディーは極めて熱安定性で、極端なｐＨにも安定であり、タンパク質消化にも安定であり、低い抗原性を有する。もう１つの結果として、ラクダ科ナノボディーは循環系から組織への移動、すなわち管外遊出、さらには血液脳関門を通る移動も容易であり、従って、神経組織を侵す障害を処置するよう操作することができる。ナノボディーはさらに、血液脳関門を通る薬剤輸送も容易にすることができる。２００４年８月１９日公開の米国特許出願第２００４０１６１７３８号参照。これらの特徴はヒトに対する低免疫原性と組み合わせると、大きな治療能を示す。さらに、これらの分子は大腸菌(E. coli)などの原核細胞で十分発現可能であり、バクテリオファージとの融合タンパク質として発現され、このようにして発現されたタンパク質は機能的である。
【０１３７】
よって、本発明の特徴は、標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔに対して高い親和性を有するラクダ科抗体またはナノボディーである。本明細書の特定の実施形態では、ラクダ科抗体またはナノボディーはラクダ科動物で本来産生され、すなわち、他の抗体に関して本明細書に記載されている技術を用い、標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔまたはそのペプチドフラグメントで免疫した後にそのラクダ科により産生されるか、またはトランスジェニックラクダ科動物で組換え産生される。あるいは、この抗ｃ−Ｍｅｔラクダ科ナノボディーは操作、すなわち、本明細書の実施例に記載されるように、標的としてｃ−Ｍｅｔを用い、パンニング法を用い、例えば、適宜突然変異誘発されたラクダ科ナノボディータンパク質を提示するファージライブラリーから選択することにより産生される。操作されたナノボディーはさらに、レシピエント対象において４５分〜２週間の半減期を有するように遺伝子操作することにより調整することができる。
【０１３８】
操作および修飾抗体
本発明の抗体は、本明細書で出発材料、すなわち親配列として示される、ＶＨおよび／またはＶＬ配列、Ｉｇλ軽鎖配列、またはＩｇκ軽鎖配列の１以上を有する抗体を用いて調製し、出発抗体に比べて変更および改良された特性を有し得る修飾抗体としての誘導修飾抗体を操作することができる。抗体は、一方または双方の可変領域（すなわち、ＶＨおよび／またはＶＬ）内、またはＩｇλ軽鎖内のみ、またはＩｇκ軽鎖内のみ、１以上のＣＤＲ領域内、および／または１以上のフレームワーク領域内の１以上の残基を修飾することにより操作することができる。それに加え、またはその代わりに、例えば抗体のエフェクター機能を変更するために、定常領域内の残基を修飾することにより操作することができる。
【０１３９】
実施可能な可変領域操作の一形態にＣＤＲグラフトがある。抗体は、主として、重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列はＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間で多様性が高い。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用を担うことから、天然抗体由来のＣＤＲ配列を含み、異なる特性を有する異なる抗体に由来するフレームワーク配列にグラフトされた発現ベクターを構築することにより、特異的天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることができる（例えば、Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323−327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522−525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029−10033; winterの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにQueenらの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号参照）。
【０１４０】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開リファレンスから得ることができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系配列データベース（www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbaseにてインターネット利用可能）ならびにKabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. Mol. Biol. 227:776−798;およびCox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol. 24:827-836に見出すことができる（これらの各開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる）。ある特定の場合には、フレームワーク領域内の残基を、その抗体の抗原結合能を維持するよう、または高めるように変異させるのが有用であることが分かっている（例えば、Queenらの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号参照）。
【０１４１】
別のタイプの可変領域修飾は、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基の突然変異により、目的抗体の１以上の結合特性（例えば親和性）を向上させるものである（「親和性成熟」として知られる）。突然変異を導入するには、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発を行うことができ、その結果として生じる、目的とする抗体結合または別の機能特性に対する作用を本明細書に記載され、本実施例で示されるin vitroまたはin vivoアッセイで評価する。保存的修飾（上述）を導入することができる。これらの突然変異はアミノ酸の置換、付加または欠失であり得る。一般に、ＣＤＲ領域内の１個、２個、３個、４個または５個の残基だけが変更されるが、さらなる変更も考えられる。
【０１４２】
本発明の操作された抗体には、例えば、抗体の特性を改良するために、ＶＨおよび／またはＶＬ、および／またはＩｇλ軽鎖、および／またはＩｇκ軽鎖内のフレームワーク残基に対して修飾がなされているものが含まれる。一般に、このようなフレームワーク修飾は抗体の免疫原性を低下させるためになされる。例えば、１つのアプローチは、１以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系配列の残基へ「復帰突然変異」させることである。より具体的には、体細胞突然変異を受けた抗体は、その抗体が由来する生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体のフレームワーク配列とその抗体が由来する生殖細胞系配列とを比較することにより特定することができる。これらのフレームワーク領域配列をそれらの生殖細胞系構成に戻すためには、これらの体細胞突然変異を、例えば部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発により生殖細胞系残基に復帰突然変異させる。このような復帰突然変異抗体も本発明に含まれる。
【０１４３】
別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去することで抗体の潜在的免疫原性を低減するために、フレームワーク領域内、または１以上のＣＤＲ領域内であっても、１以上の残基を突然変異させることを含む。このアプローチはまた「脱免疫」とも呼ばれ、Carrらの特許公報第２００３０１５３０４３号にさらに詳しく記載されている。
【０１４４】
フレームワーク領域またはＣＤＲ領域内でなされる修飾に加えて、またはその代わりに、本発明の抗体は、一般に、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、および／または抗原依存性細胞傷害性などの抗体の１以上の機能特性を変更するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作することができる。さらに、本発明の抗体は、ここでもまた抗体の１以上の機能特性を変更するために、化学的に修飾することもできる（例えば、１以上の化学部分を抗体に付着させることができる）し、あるいはそのグリコシル化を変更するように修飾することもできる。これらの各実施形態は、以下にさらに記載される。Ｆｃ領域の残基の符番はＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。
【０１４５】
一実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域が、ヒンジ領域のシステイン残基数が変更、例えば、増加または減少するように修飾される。このアプローチはBodmerらにより米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載される。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基数は例えば軽鎖および重鎖の組立てを容易にするように、または抗体の安定性を高める、または低下させるように変更される。
【０１４６】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生体半減期を短縮するように変異させる。より具体的には、抗体が天然Ｆｃ−ヒンジドメインブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合に対するよりも劣ったＳｐＡ結合を有するように、Ｆｃ−ヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン境界領域に１以上のアミノ酸突然変異を導入する。このアプローチはWardらに米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳しく記載されている。
【０１４７】
別の実施形態では、当該抗体はその生体半減期を延長するように修飾される。様々なアプローチが可能である。例えば、Wardらの米国特許第６，２７７，３７５号に記載されるように、以下の突然変異：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆの１以上を導入することができる。あるいは、生体半減期を延長するために、Prestaらによる米国特許第５，８６９，０４６号および同第６，１２１，０２２号に記載されているように、抗体を、ＩｇＧのＦｃ領域の２ループのＣＨ２ドメインから取ったサルベージ受容体結合エピトープを含むようにＣＨ１領域またはＣＬ領域内で変更することができる。
【０１４８】
さらに他の実施形態では、このＦｃ領域は、抗体のエフェクター機能を変更するために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で弛緩することにより変更される。例えば、その抗体が変更されたエフェクターリガンドに対する親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、１以上のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。それに対する親和性が変更されるエフェクターリガンドは例えばＦｃ受容体または補体のＣ１成分であり得る。このアプローチは、双方ともWinterらにより米国特許第５，６２４，８２１号および同第５，６４８，２６０号にさらに詳しく記載されている。
【０１４９】
別の実施形態では、アミノ酸残基から選択される１以上のアミノ酸を、その抗体が変更されたＣ１ｑ結合および／または低減もしくは無効にされた補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を有するように異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチはIdusogieらにより米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳しく記載されている。
【０１５０】
別の実施形態では、１以上のアミノ酸残基が変更され、それにより抗体の補体結合能が変更される。このアプローチはBodmerらによりＰＣＴ公報ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【０１５１】
さらに別の実施形態では、Ｆｃ領域が、１以上のアミノ酸を修飾することにより、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）媒介能を増強するよう、および／またはＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を増強するように修飾される。このアプローチはPrestaによりＰＣＴ公報ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ヒトＩｇＧ１上のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲｎに対する結合部位がマッピングされており、結合が向上した変異体が記載されている(Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chem. 276:6591−6604参照)。このような修飾Ｆｃ領域を有する抗体も本発明の組成物の範囲内にある。
【０１５２】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化が修飾される。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、当該抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は例えばｃ−Ｍｅｔ標的抗原の抗体の親和性を増強するように変更することができる。このような炭水化物修飾は例えば、抗体配列内のグリコシル化の１以上の部位を変更することにより行うことができる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去によりその部位におけるグリコシル化の排除をもたらす１以上のアミノ酸置換を行うことができる。このようなグリコシル化は抗原に対する抗体の親和性を増強し得る。このようなアプローチはCoらにより米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。
【０１５３】
それに加えて、またはその代わりに、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体または二分ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などの変更されたグリコシル化タイプを有する抗体が作製可能である。このような変更されたグリコシル化パターンは抗体のＡＤＣＣ活性を増強することが証明されている。このような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化の酵素機構が変更された宿主細胞において抗体を発現させることにより行うことができる。グリコシル化機構が変更された細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組換え抗体を発現させることでグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、HangらによるＥＰ１，１７６，１９５は、機能的に破壊された、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子を有する細胞系統を記載し、その結果、このような細胞系統で発現される抗体は低フコシル化を示す。PrestaによるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０３５８３５は、これもまた宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化をもたらす、Ａｓｎ（２９７）結合炭水化物へのフコースの付着能が低下した変異体ＣＨＯ細胞系統であるＬｅｃｌ３細胞を記載している（また、Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733−26740も参照）。UmanaらによるＰＣＴ公報ＷＯ９９／５４３４２は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞系統を記載し、その結果、この操作細胞系統で発現される抗体は、抗体のＡＤＣＣ活性の増強をもたらす二分ＧｌｃＮａｃ構造を示す(また、Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176−180も参照)。
【０１５４】
本発明により意図される本明細書の抗体の別の修飾としてペグ化がある。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば血清）半減期を延長するためにペグ化することができる。抗体をペグ化するためには、抗体またはそのフラグメントを一般に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのＰＥＧと、１以上のＰＥＧ基がその抗体または抗体フラグメントと共有結合するようになる条件下で反応させる。ペグ化は反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応により行うことができる。本明細書において「ポリエチレングリコール」とは、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために用いられているいずれの形態のＰＥＧも包含するものとする。特定の実施形態では、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、NishimuraらによるＥＰ０１５４３１６、およびIshikawaらによるＥＰ０４０１３８４参照。
【０１５５】
抗体操作方法
上述のように、本明細書に示されるＶＨ、ＶＬ、Ｉｇλ軽鎖またはＩｇκ軽鎖配列を有する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体は、ＶＨおよび／またはＶＬおよび／またはＩｇλ軽鎖および／またはＩｇκ軽鎖配列の残基を修飾することによるか、またはそれに結合している定常領域を修飾することにより、さらなる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を操作するために使用することができる。よって、本発明のもう１つの態様において、ヒトｃ−Ｍｅｔとの結合、およびまた、ｃ−Ｍｅｔの１以上の機能特性の阻害（例えば、インターナリゼーションの誘発、活性化の回避、例えば、シグナル伝達により起こるアップレギュレーション、細胞の増殖、生存、移動、浸潤もしくは形態変化の回避もしくは改善、またはｃ−Ｍｅｔ受容体結合の阻害による腫瘍増殖および／または転移などの癌の予防または改善）または促進作用の場合では、ｃ−Ｍｅｔリン酸化の活性化および細胞応答の刺激、ならびに本明細書で提供される他の機能特性といった、本発明の親拮抗作用または促進作用抗体の少なくとも１つの機能特性を保持する、構造的に関連のある抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を作出するために、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の構造的特徴が使用される。
【０１５６】
例えば、本発明の抗体の１以上のＣＤＲ領域またはその突然変異を既知のフレームワーク領域および／または他のＣＤＲと組換えにより組み合わせて、上述のような組換え操作された本発明のさらなる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を作出することができる。他のタイプの修飾としては、これまでの節に記載されたものが含まれる。この操作方法の出発材料は、親配列として使用される本明細書で提供される１以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列または１以上のそのＣＤＲ領域である。操作抗体を作出するためには、本明細書で提供される１以上のＶＨおよび／またはＶＬ配列または１以上のそのＣＤＲ領域を有する抗体を実際に作製する（例えば、タンパク質として発現させる）必要はない。むしろ、そのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に含まれる情報を、当技術分野で公知の突然変異技術の出発材料として用いて元の配列に由来する「第二世代」配列を作出し、その後、その「第二世代」ヌクレオチド配列を作製し、タンパク質として発現させる。
【０１５７】
よって、特定の実施形態では、本発明は、配列番号５５〜７２の群から選択される配列を有するＶＨ抗体配列と配列番号３１〜５４の群から選択される配列を有するＶＬ抗体配列を出発親材料として有する抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を作製する方法を提供する。この方法は、ＶＨおよび／またはＶＬ抗体親配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更して、少なくとも１つの変更された抗体配列を作出すること、およびその変更された抗体配列をタンパク質として発現させることを含む。
【０１５８】
他の実施形態において、本発明は、配列番号７７〜８０の群から選択される配列を有するＩｇλ軽鎖抗体配列を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を作製し、そのＩｇλ軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更して少なくとも１つの変更された抗体配列を作出し、その変更された抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。
【０１５９】
関連の実施形態では、本発明は、配列番号８１〜８４の群から選択される配列を有するＩｇκ軽鎖抗体配列を含む抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を作製し、そのＩｇκ軽鎖抗体配列内の少なくとも１つのアミノ酸残基を変更して少なくとも１つの変更された抗体配列を作出し、その変更された抗体配列をタンパク質として発現させる方法を提供する。
【０１６０】
変更された抗体は１以上、２以上または３以上の本明細書に述べられる機能特性を示し得る。
【０１６１】
変更された抗体の機能特性は、本実施例に示されるものなど、当技術分野で利用可能であり、かつ／または本明細書に記載される標準的アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて評価することができる。
【０１６２】
本発明の抗体操作法の特定の実施形態では、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体コード配列の全域または一部にランダムまたは選択的に突然変異を導入することができ、得られた修飾抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を発現させ、結合活性および／または本明細書に記載されるような他の機能特性に関してスクリーニングすることができる。突然変異法は当技術分野ですでに記載されている。例えば、ShortによるＰＣＴ公報ＷＯ０２／０９２７８０には、飽和突然変異誘発、合成連結アセンブリまたはその組合せを用い、抗体突然変異を作出およびスクリーニングする方法が記載されている。あるいは、LazarらによるＰＣＴ公報ＷＯ０３／０７４６７９には、コンピュータースクリーニング法を用いて抗体の物理化学的特性を至適化する方法が記載されている。
【０１６３】
本発明の抗体
本発明の抗体のヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を以下に示す。親抗体または一次スクリーン抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ表Ａおよび表Ｃに示す。親抗体と比べて親和性が向上された抗体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ表Ｂおよび表Ｄに示す。
【０１６４】
【表１】
0005536445.tif 000002
【０１６５】
【表２】
0005536445.tif 000003
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１６６】
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０１６７】
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【０１６８】
例えば、ウォッブル塩基変異、至適コドン利用、宿主発現のための至適配列、例えば、潜在スプライス配列を除去するための修飾、および保存的突然変異などを有する、さらなる関連のヌクレオチド配列も本発明の範囲内で意図される。例えば、保存的アミノ酸変異を有する、または６ｘＨｉｓタグもしくは他のタグなどの付加的アミノ酸配列を含む、または第二のポリペプチド配列と融合された、または抗体治療薬に対する免疫応答を軽減するか、もしくは修飾ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３もしくはＦＲ４残基を有する残基変異を含む、さらなる関連のポリペプチド配列も本発明の範囲内で意図される。ＦＲ領域およびＣＤＲ領域を図１〜３に示す。好ましいＣＤＲ配列は図に示される通りである。
【０１６９】
タンパク質キナーゼ依存性疾患は、特に、増殖性疾患、好ましくは、良性または特に悪性腫瘍、より好ましくは、脳の癌、腎臓癌、肝臓癌、副腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌（特に、胃腫瘍）、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、膣癌、甲状腺癌、肉腫、膠芽腫、多発性骨髄腫または胃腸癌、特に、結腸癌または結腸直腸腺腫、または頭頸部の腫瘍、上皮過増殖、特に、乾癬、前立腺肥大、新生物、特に上皮性新生物、好ましくは、乳癌、または白血病、特に、ｃ−Ｍｅｔが関与するものである。それらは腫瘍の退縮をもたらし、腫瘍転移の形成および転移（また微小転移）の拡大を予防することができる。さらに、それらは上皮過増殖（例えば、乾癬）に、前立腺肥大に、新生物、特に上皮性新生物、例えば乳癌の処置および白血病に使用することができる。また、いくつかの、または特には個々のチロシンタンパク質キナーゼおよび／または（さらなる）セリン／トレオニンタンパク質キナーゼが関与する限り、免疫系の疾患の処置に本発明の抗体を使用することもでき、さらに、本発明の抗体は、少なくとも１つのチロシンタンパク質キナーゼおよび／または（さらなる）セリン／トレオニンタンパク質キナーゼによるシグナル伝達が関与する中枢神経性または末梢神経系の疾病の処置に使用することもできる。
【０１７０】
特定の実施形態では、当該抗体またはこの抗体の機能的フラグメントは標的タンパク質ｃ−Ｍｅｔと結合し、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化を変調する、すなわち、活性化するか、または阻害する。特定の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化の活性化は、器官再生、創傷治癒および組織再生の群から選択される少なくとも１つの活性を刺激する。関連の実施形態では、この器官は皮膚、腎臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胸腺または甲状腺である。別の実施形態では、ｃ−Ｍｅｔに対する抗体は病原体感染、特にリステリア菌感染を遮断するか、またはマラリアなどの病原性疾患を改善する(Carrolo, et al.,  Nature Med. 9: 1363−1369, 2003)。
【０１７１】
ｃ−Ｍｅｔの阻害を示す抗体は、例えば肝臓におけるものなどの転移を含む結腸癌、および非小細胞肺癌の処置に有用である。抗ｃＭｅｔ抗体はまた、遺伝性乳頭腎臓癌(Schmidt, L. et al. Nat. Genet. 16, 68−73, 1997)およびｃ−Ｍｅｔが突然変異(Jeffers and Vande Woude. Oncogene 18, 5120−5125, 1999;およびそこに引用されている参照文献)または染色体再配列(例えば、TPR−MET; Cooper et al. Nature 311, 29−33, 1984; Park. et al. Cell 45, 895−904, 1986)により過剰発現している、または構成的に活性化されている他の増殖性疾患またはその処置にも使用可能である。本発明の抗体アンタゴニストは望ましくない細胞、特に、癌、転移または炎症症状などのｃ−Ｍｅｔ関連症状に関連する細胞の処置に特に有用である。癌の例としては、限定されるものではないが、例えば、食道癌、乳癌、腎臓癌（限定されるものではないが、乳頭腎細胞癌を含む）、神経膠腫、頭頸部癌、上皮癌、肺癌、皮膚癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳の癌、膵臓癌、胃癌、胃腸、胃癌、腸癌、結腸癌、肝臓癌、生殖器癌、泌尿器癌、黒色腫および前立腺癌が含まれる。さらなる癌および症状は本明細書に示されるか、または当技術分野で公知である。
【０１７２】
さらに、ｃ−Ｍｅｔの拮抗作用を示す抗体は、膀胱癌（表在性および筋肉浸潤性）、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、神経膠腫（膠芽腫、未分化星状細胞腫、乏突起星状細胞腫、乏突起神経膠腫を含む）、食道癌、胃癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）（小児ＨＣＣを含む）、頭頸部癌（頭頸部扁平上皮細胞癌、鼻咽頭癌を含む）、ヒュルトレ細胞癌、悪性黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、白血病、非小細胞肺癌（あらゆる組織サブタイプ：腺癌、扁平上皮癌、気管支肺胞癌、大細胞癌および腺扁平上皮混合型含む）、小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌（遺伝性および散発性乳頭腎細胞癌、Ｉ型およびＩＩ型、および淡明細胞腎細胞癌を含む）、肉腫、特に、骨肉腫、淡明細胞肉腫および軟組織肉腫（卵巣状および胎児性横紋筋肉腫、卵巣状軟部肉腫を含む）、甲状腺癌（乳頭および他のサブタイプ）の処置に有用である。
【０１７３】
特定の実施形態では、本発明は、ｃ−Ｍｅｔ関連障害または症状を処置する方法であって、それを必要とする対象に有効量の上記のいずれかの医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。この障害または症状は癌または炎症症状である。別の関連の実施形態では、この癌は食道癌、乳癌、腎臓癌、頭頸部癌、上皮癌、肺癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、脳の癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、肝臓癌、生殖器癌、泌尿器癌、黒色腫または前立腺癌である。特定の実施形態では、この癌は肝臓癌または食道癌である。
【０１７４】
特定の実施形態では、上記のいずれかの方法は化学療法薬を投与することをさらに含む。関連の実施形態では、この化学療法薬は抗癌剤である。
【０１７５】
さらに別の実施形態では、本発明は、望ましくない細胞を処置する方法であって、細胞と上記のいずれかの抗体またはこれらの抗体の機能的フラグメントとを接触させることを含む方法を提供する。関連の実施形態では、この細胞はｃ−Ｍｅｔ受容体を保持する。別の関連の実施形態では、上記の方法は細胞を化学療法薬または放射線で処置することをさらに含む。
【０１７６】
別の実施形態では、当該抗体はｃ−Ｍｅｔのリン酸化に応答し、かつ、これを活性化して、創傷治癒など、細胞応答を刺激する。
【０１７７】
別の実施形態では、本発明は、上記のいずれかの抗体またはこれらの抗体の機能的フラグメントと付加的治療薬を含む医薬組成物を提供する。付加的治療薬は抗癌剤、抗生物質、抗炎症薬、増殖因子およびサイトカインからなる群から選択される。
【０１７８】
本発明の抗体をコードする核酸分子
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。ＶＨ配列の例は配列番号２１〜３０に示されている。ＶＬ配列の例は配列番号１〜２０に示されている。Ｉｇλヌクレオチド配列の例は配列番号７３に示されている。Ｉｇκヌクレオチド配列の例は配列番号７４〜７６に示されている。ＩｇＧ４ヌクレオチド配列の例は配列番号８５〜８８に示されている。
【０１７９】
本明細書で提供される、抗体をコードする核酸は、全細胞中もしくは細胞溶解液中に存在してもよいし、または部分精製形態もしくは実質的に純粋な形態の核酸であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動およびその他当技術分野で周知のものを含む標準的技術により、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質から精製されている場合に単離されている、または実質的に純粋とされる。F. Ausubel, et al., ed. 2006, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York参照。本発明の核酸は例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。一実施形態では、当該核酸はｃＤＮＡ分子である。当該核酸はファージディスプレーベクターなどのベクター中または組換えプラスミドベクター中に存在してもよい。
【０１８０】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を保持するトランスジェニックマウスから作製したハイブリドーマ）により発現される抗体の場合、ハイブリドーマにより製造された抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体の場合（例えば、ファージディスプレー技術を使用）、当該抗体をコードする核酸は、そのライブラリーに属する様々なファージクローンから回収することができる。
【０１８１】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、それらのコードヌクレオチドを既知のベクターに連結することにより、これらのＤＮＡフラグメントを、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子へ、またはＦａｂフラグメント遺伝子へ、またはｓｃＦｖ遺伝子へ変換するために、標準的組換えＤＮＡ技術によってさらに操作することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨコードＤＮＡフラグメントは、別のＤＮＡ分子、または別のタンパク質をコードするフラグメント（抗体定常領域またはフレキシブルリンカーなど）に作動可能なように連結される。本明細書において「作動可能なように連結される」とは、２つのＤＮＡフラグメントが、例えば、２つのＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がフレーム内に維持されるように、またはタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように、機能的な様式で連結されることを意味するものとする。
【０１８２】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨコードＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子と作動可能なように連結することにより、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., el al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91−3242参照）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得る。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子の場合は、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と作動可能なように連結することができる。
【０１８３】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、そのＶＬコードＤＮＡと軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子を作動可能なように連結することにより全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）へ変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91−3242参照)、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。この軽鎖定常領域はκまたはλ定常領域であり得る。
【０１８４】
ｓｃＦｖ遺伝子を作出するには、ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡフラグメントを、ＶＨおよびＶＬ配列が連続する一本鎖のタンパク質として発現可能なように、フレキシブルリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントと作動可能なように連結する（例えば、Bird et al., 1988 Science 242:423−426; Huston et at., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552−554参照）。
【０１８５】
本発明のモノクローナル抗体の製造
モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、例えばKohler and Milstein, 1975 Nature 256: 495の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術などの慣例のモノクローナル抗体法を含む種々の技術により作製することができる。Ｂリンパ球のウイルス形質転換または発癌形質転換など、モノクローナル抗体を作製するための多くの技術が使用可能である。
【０１８６】
ハイブリドーマを作製するための動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は十分確立された手法である。免疫プロトコールおよび融合のための免疫化脾細胞の単離は当技術分野で公知である。融合相手（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０１８７】
本発明のキメラまたはヒト化抗体は、上記のように作製したマウスモノクローナル抗体の配列に基づいて作製することができる。重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードするＤＮＡは、対象とするマウスハイブリドーマから得、標準的な分子生物学的技術を用い、非ネズミ（例えばヒト）免疫グロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するためには、当技術分野で公知の方法を用い、マウス可変領域をヒト定常領域と連結することができる（例えば、Cabillyらの米国特許第４，８１６，５６７号参照）。ヒト化抗体を作製するためには、当技術分野で公知の方法を用い、ネズミＣＤＲ領域をヒトフレームワークに挿入することができる（例えば、Winterの米国特許第５，２２５，５３９号、およびQueenらの米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号参照）。
【０１８８】
特定の実施形態では、本発明の抗体はヒトモノクローナル抗体である。ｃ−Ｍｅｔに対するこのようなヒトモノクローナル抗体は、マウス系ではなく、ヒト免疫系の成分を保持するトランスジェニックまたはトランスクロモゾミック(transchromosomic)マウスを用いて作製することができる。これらのトランスジェニックおよびトランスクロモゾミックマウスとしては、本明細書においてそれぞれＨｕＭＡｂマウスおよびＫＭマウスと呼ばれるマウスを含み、本明細書では「ヒトＩｇマウス」と総称する。
【０１８９】
ＨｕＭＡｂマウス（登録商標）(Medarex, Inc.)は、非再配列ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座を、これらの内因性μおよびκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異とともに含む（例えば、Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856−859参照）。よって、このマウスはマウスＩｇＭまたはκの発現の低下を示し、免疫化に応じて、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラスの切り替えと体細胞突然変異を受け、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生成する(Lonberg, N. et al., 1994 前掲; Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49−101の総説; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65−93およびHarding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536−546)。ＨｕＭＡｂマウスの作製および使用ならびにこのようなマウスに保持されるゲノム修飾は、Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287−6295; Chen, J. et at., 1993 International Immunology 5: 647−656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720−3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117−123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821−830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912−2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579−591;およびFishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845−851（これらの開示内容は全て、出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）にさらに記載されている。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号および同第５，７７０，４２９号（全てLonberg and Kay）、Suraniらの米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ公報ＷＯ９２１０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９７１１３８５２、ＷＯ９８／２４８８４およびＷＯ９９／４５９６２（全てLonberg and Kay）ならびにKormanらのＰＣＴ公報ＷＯ０１／１４４２４も参照。
【０１９０】
別の実施形態では、本発明のヒト抗体の産生は、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入染色体を保持するマウスなど、導入遺伝子および導入染色体上にヒト免疫グロブリン配列を保持するマウスを用いて惹起(elisited(“raised”))することができる。本明細書では「ＫＭマウス」と呼ばれるこのようなマウスは、IshidaらのＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３４７８に詳しく記載されている。
【０１９１】
なおさらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスジェニック動物も利用可能であり、それを用いて本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を惹起することができる。例えば、ゼノマウス(Xenomouse)(Abgenix, Inc.)と呼ばれる別のトランスジェニック系が使用可能であり、このようなマウスは例えばKucherlapatiらの米国特許第５，９３９，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１５０，５８４号および同第６，１６２，９６３号に記載されている。
【０１９２】
さらに、当技術分野ではヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する別のトランスクロモゾミック動物系も利用可能であり、それを用いて本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を惹起することができる。例えば、「ＴＣマウス」と呼ばれる、ヒト重鎖導入染色体とヒト軽鎖導入染色体の双方を保持するマウスを使用することができ、このようなマウスはTomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722−727に記載されている。さらに、当技術分野ではヒト重鎖および軽鎖導入染色体を保持するウシが記載されており(Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889−894)、それを用いて本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を惹起することができる。
【０１９３】
ヒト抗体またはヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレー法を用いて作製することができる。ヒト抗体を同定およびクローニングするためのこのようなファージディスプレー法は当技術分野で確立されている。例えば、Ladnerらの米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号および同第５，５７１，６９８号、Dowerらの米国特許第５，４２７，９０８号および同第５，５８０，７１７号、McCaffertyらの米国特許第５，９６９，１０８号および同第６，１７２，１９７号、ならびにGriffithsらの米国特許第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号および同第６，５９３，０８１号参照。
【０１９４】
本発明のヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫細胞が免疫化の際にヒト抗体応答が生じ得るように再構成されているＳＣＩＤマウスを用いて作製することもできる。このようなマウスは例えばWilsonらの米国特許第５，４７６，９９６号および同第５，６９８，７６７号に記載されている。
【０１９５】
ｃ−Ｍｅｔに対するヒトモノクローナル抗体の生成
大腸菌で発現された精製組換え細胞外ヒトｃ−Ｍｅｔ(R & D Systems, Minneapolis, MN)またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートされた精製組換えヒトｃ−Ｍｅｔを抗原として用いる。例えば、バキュロウイルス、ＣＨＯ細胞およびその他当業者に公知のものなど、発現系から単離されたｃＭｅｔを含め、当業者に公知の発現ｃ−Ｍｅｔの他の供給源も本発明の範囲内にあるものと考えられる。
【０１９６】
ｃ−Ｍｅｔに対する完全ヒトモノクローナル抗体は、各々ヒト抗体遺伝子を発現するＨｕＭａｂトランスジェニックマウスのＨＣｏ７、ＨＣｏ１２およびＨＣｏ１７系統ならびにトランスジェニックトランスクロモゾミックマウスのＫＭ系統を用いて作製される。これらの各マウス系統において、内因性マウスκ軽鎖遺伝子はChen et al., 1993 EMBO J.12:811−820に記載されているように同形接合的に破壊することができ、内因性マウス重鎖遺伝子はＰＣＴ公報ＷＯ０１１０９１８７の実施例１に記載されているように同形接合的に破壊することができる。これらの各マウス系統は、Fishwild et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845−851に記載されているように、ヒトκ軽鎖導入遺伝子ＫＣｏ５を保持する。ＨＣｏ７系統は、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号および同第５，５４５，８０７号に記載されるように、ＨＣｏ７ヒト重鎖導入遺伝子を保持する。ＨＣｏ１２系統は、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／０９１８７の実施例２に記載されているように、ＨＣｏ１２ヒト重鎖導入遺伝子を保持する。ＨＣｏ１７系統はＨＣｏ１７ヒト重鎖導入遺伝子を保持する。ＫＮＭ系統はＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３４７８に記載されているように、ＳＣ２０導入染色体を含む。
【０１９７】
ｃ−Ｍｅｔに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成するためには、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスを大腸菌で発現された精製組換えｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインまたはｃ−Ｍｅｔ−ＫＬＨコンジュゲートを抗原として免疫する。ＨｕＭａｂマウスのための一般的な免疫スキームは、Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856−859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14:845−851およびＰＣＴ公報ＷＯ９８／２４８８４に記載されている。このマウスは抗原の最初の注入時に６〜１６週齢である。ｃ−Ｍｅｔ抗原の精製組換え調製物（５〜５０μｇ）（例えば、ｃ−Ｍｅｔ細胞外ドメインを発現するトランスフェクト大腸菌細胞から精製したもの）を用い、ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスを腹腔内、皮下（Ｓｃ）または足蹠注射により免疫する。
【０１９８】
トランスジェニックマウスをフロイントの完全アジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中の抗原を用い、腹腔内（ＩＰ）、皮下（Ｓｃ）または足蹠（ＦＰ）のいずれかで２回免疫し、３〜２１日後に、フロイントの不完全アジュバントまたはＲｉｂｉアジュバント中の抗原でＩＰ、ＳｃまたはＦＰ免疫する（免疫化は計１１回まで）。免疫応答は眼窩後方採血によりモニタリングする。血漿をＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、十分な力価の抗ｃ−Ｍｅｔヒト免疫グロブリン(immunogolobulin)を有するマウスを融合に用いる。屠殺および脾臓摘出の３日前と２日前にマウス静脈に抗原を追加投与する。各抗原当たり１０〜３５回の融合を行う。各抗原当たり数ダースのマウスを免疫する。ＨＣｏ７、ＨＣｏ１２、ＨＣｏ１７およびＫＭマウス系統の計８２匹のマウスをｃ−Ｍｅｔで免疫する。
【０１９９】
ｃ−Ｍｅｔと結合する抗体を産生するＨｕＭａｂまたはＫＭマウスを選択するために、免疫マウスからの血清をFishwild, D. et al., 1996に記載されているように、ＥＬＩＳＡにより試験することができる。要するに、プロトコール例としては、マイクロタイタープレートを、大腸菌由来の精製組換えｃ−Ｍｅｔ、ＰＢＳ中１〜２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．０５％）中５％ニワトリ血清２００μｌ／ウェルでブロッキングする。他の濃度および供給源を用いてもよい。ｃ−Ｍｅｔ免疫マウス由来の血漿の希釈液を各ウェルに加え、周囲温度で１〜２時間インキュベートする。これらのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル抗体とともに室温にて１時間インキュベートする。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ、Ａ−１８８８、０．２２ｍｇ／ｍｌ）で現像し、分光光度計により波長λ４１５〜４９５ｎｍで分析する。あるいは、他のタイプの検出も可能であり、当業者により提供することができる。最高力価の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を発現するマウスを用い、融合用の細胞を得る。融合を行い、ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡにより抗ｃ−Ｍｅｔ活性に関して試験する。
【０２００】
ＨｕＭａｂマウスおよびＫＭマウスから単離されたマウス脾細胞を、ＰＥＧを用いた標準的プロトコールに基づき、マウス骨髄腫細胞系統と融合する。得られたハイブリドーマを次に、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングする。５０％ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ）を用い、免疫マウス由来の脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を４分の１数のＳＰ２／０非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）と融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレートにおよそ１×１０５／ウェルで播種した後、ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ＣＲＬ  １００１３、高グルコース、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを含む）および５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ｍｇ／ｌ  ゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ、ＣＲＬ  Ｐ−７１８５）中、１０％ウシ胎児血清、１０％Ｐ３８８Ｄ  １（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  ＴＩＢ−６３）細胞馴化培地、３〜５％  Ｏｒｉｇｅｎ（登録商標）（ＩＧＥＮ）クローニング因子を含有する選択培地中で約２週間インキュベーションする。１〜２週間後、ＨＡＴをＨＴに置換した培地で細胞を培養する。その後、個々のウェルをＥＬＩＳＡにより、ヒト抗ｃ−ＭｅｔモノクローナルＩｇＧ抗体に関してスクリーニングする。広範囲のハイブリドーマ増殖が見られたら、通常、１０〜１４日後に培地をモニタリングする。ハイブリドーマを分泌する抗体を再播種し、再びスクリーニングし、なおヒトＩｇＧ陽性であれば、抗ｃ−Ｍｅｔモノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングする。次に、安定なサブクローンをin vitroで培養し、さらなる特性決定のために組織培養培地で少量の抗体を作製する。
【０２０１】
ヒトＩｇマウスの免疫化
本発明のヒト抗体を惹起させるために用いるヒトＩｇマウスを、Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368(6474): 856−859; Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845−851;ならびにＰＣＴ公報ＷＯ９８１２４８８４およびＷＯ０１／１４４２４に記載されているように、ｃ−Ｍｅｔ抗原および／または組換えｃ−Ｍｅｔまたはｃ−Ｍｅｔ融合タンパク質の精製または富化調製物で免疫する。マウスは初回注入時、６〜１６週齢である。例えば、ｃ−Ｍｅｔ抗原の精製または組換え調製物（５〜５０μｇ）を用い、ヒトＩｇマウスを腹膜内にて免疫する。
【０２０２】
ｃ−Ｍｅｔに対する完全ヒトモノクローナル抗体を生成する詳細な手順は上記されている。種々の抗原を用いた累積試験を行ったところ、トランスジェニックマウスは、最初にフロイントの完全アジュバント中の抗原で腹膜内（ＩＰ）免疫した後、１週間おきにフロイントの不完全アジュバント中の抗原でＩＰ免疫した（計６回まで）場合に応答することが示された。しかしながら、フロイント以外のアジュバントも有効であることが分かっている。さらに、アジュバントの不在下での全細胞にも高い免疫原性があることが分かっている。この免疫応答は、免疫プロトコールの過程で、眼窩後方採血により得られる血漿サンプルを用いてモノタリングすることができる。血漿をＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることができ、十分な力価の抗ｃ−Ｍｅｔヒト免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用することができる。屠殺および脾臓摘出の３日前にマウス静脈に抗原を追加投与する。各免疫化につき２〜３回の融合を行う必要があると思われる。一般に、各抗原当たり６〜２４匹のマウスを免疫する。通常、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２系統を用いる。さらに、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２導入遺伝子の双方を２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子（ＨＣｏ７／ＨＣｏ１２）を有する１匹のマウスへと育種することができる。
【０２０３】
ヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製
本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫マウスから脾細胞および／またはリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系統などの適当な不死化細胞系統と融合させる。得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングする。例えば、５０％ＰＥＧを用い、免疫マウスの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、６分の１数のＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ  １５８０）と融合する。一例としての実施形態では、細胞を平底マイクロタイタープレートに播種した後、２０％胎児クローン血清、１８％「６５３」細胞馴化培地、５％Ｏｒｉｇｅｎ（登録商標）（ＩＧＥＮ）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０：０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ；このＨＡＴは融合２４時間後に添加する）を含有する選択培地中で２週間インキュベートする。およそ２週間後、ＨＡＴをＨＴに置換した培地で細胞を培養することができる。次に、個々のウェルをＥＬＩＳＡにより、ヒトモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体に関してスクリーニングすることができる。広範囲のハイブリドーマ増殖が見られたら、通常、１０〜１４日後に培地を分析することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再びスクリーニングし、なおヒトＩｇＧ陽性であれば、それらのモノクローナル抗体を制限希釈により少なくとも２回サブクローニングすることができる。次に、安定なサブクローンをin vitroで培養し、特性決定のために組織培養培地で少量の抗体を作製することができる。
【０２０４】
ヒトモノクローナル抗体を精製するため、選択されたハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２リットル容のスピナーフラスコで増殖させる。上清を濾過し、濃縮した後、Ａタンパク質−セファロース(Pharmacia, Piscataway, N.J.)を用いるアフィニティークロマトグラフィーを行う。純度を確保するため、溶出したＩｇＧをゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィーにより確認する。バッファー溶液をＰＢＳに換え、吸光係数１．４３を用い、ＯＤ２８０により濃度を測定する。これらのモノクローナル抗体をアリコートに分け、−８０℃で保存する。
【０２０５】
モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製
また、本発明の抗体は、例えば当技術分野で公知のように、組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法の組合せを用い、宿主細胞トランスフェクトーマでも産生される(例えば、Morrison, S. (1985) Science 229:1202)。
【０２０６】
例えば、これらの抗体またはその抗体フラグメントを発現させるためには、部分的または全長軽および重鎖をコードするＤＮＡを標準的な分子生物学的技術（例えば、ＰＣＲ増幅または目的の抗体を発現するハイブリドーマを用いたｃＤＮＡクローニング）によって得、これらのＤＮＡを、それらの遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能なように連結されるように、発現ベクターに挿入することができる。これに関して、「作動可能なように連結される」とは、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するというそれらの意図される機能を果たすように、抗体遺伝子をベクターに連結されることを意味するものとする。これらの発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択する。抗体軽鎖遺伝子および当該抗体重鎖遺伝子は別のベクターに挿入することもできるが、より一般には、両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。抗体遺伝子は標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントとベクター上の相補的制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合には平滑末端連結）により発現ベクターに挿入する。本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域を用い、それらを、すでに所望のイソ型の重鎖定常領域および軽鎖定常領域をコードしている発現ベクターに、ＶＨセグメントはそのベクター内のＣＨセグメントに作動可能なように連結され、ＶＬセグメントがそのベクター内のＣＬセグメントに作動可能なように連結されるように挿入することにより、いずれの抗体イソ型の全長抗体遺伝子も作出することができる。それに加え、またはその代わりに、組換え発現ベクターは宿主細胞からの抗体鎖の分泌を助けるシグナルペプチドをコードすることもできる。この抗体鎖遺伝子を、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端とフレーム内で連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０２０７】
これらの抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内でこの抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を含む。「調節配列」とは、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むものとする。このような調節配列は例えばGoeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990)に記載されている。当業者ならば、調節配列の選択を含む発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択肢、求めるタンパク質の発現レベルなどの因子によって異なることが分かるであろう。哺乳類宿主細胞発現のための調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーなど、哺乳類細胞で高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントを含む。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはＰ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列も使用可能である。なおさらに、ＳＶ４０初期プロモーター由来の配列とヒト１型Ｔ細胞白血病ウイルスの長い末端反復配列を含むＳＲａプロモーター系など、異なる供給源の配列からなる調節エレメントもある(Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8:466−472)。
【０２０８】
抗体鎖遺伝子および調節配列の他、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などの付加的配列を含み得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、全てAxelらの米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号参照）。例えば、一般に、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ−宿主細胞に使用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が含まれる。
【０２０９】
軽鎖および重鎖の発現では、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的技術により宿主細胞にトランスフェクトする。様々な形態の「トランスフェクション」という用語は、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなど、外来ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般に用いられる多様な技術を包含するものとする。理論的には、本発明の抗体は、原核生物または真核生物宿主細胞のいずれにおいても発現させることができる。真核細胞、特に哺乳類宿主細胞における抗体の発現を述べるが、これはこのような真核細胞、特に哺乳類細胞が原核細胞よりも、適切に折り畳まれ、かつ、免疫学的に活性な抗体を構築および分泌する可能性が高いからである。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収率の活性抗体の生産には効果的でないことが報告されている(Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12−13)。
【０２１０】
本発明の組換え抗体を発現するための哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばR.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601−621に記載されているようなＤＨ  ＦＲ選択マーカーとともに用いるUrlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216−4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞とともに用いる場合、別の発現系として、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８，８４１に示されているＧＳ遺伝子発現系がある。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、これらの抗体は、宿主細胞内で抗体を発現させ、それらの宿主細胞を増殖させている培養培地中に抗体を分泌させるのに十分な時間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用い、培養培地から回収することができる。
【０２１１】
免疫複合体
もう１つの態様において、本発明は、細胞毒素、薬剤（例えば、免疫抑制薬）または放射性毒素などの治療用成分とコンジュゲートさせた抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはそのフラグメントを特徴とする。このような複合体は本明細書では「免疫複合体」と呼ぶ。１以上の細胞毒素を含む免疫複合体は「免疫毒素」と呼ぶ。細胞毒素または細胞傷害性薬剤は細胞に有害な（例えば、死滅させる）いずれの薬剤も含む。例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンおよびその類似体または同族体が挙げられる。治療薬としてはまた、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シトシンアラビノシド、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アブレーション薬（例えば、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、アントラサイクリン類（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。
【０２１２】
本発明の抗体とコンジュゲート可能な他の治療用細胞毒素の例としては、デュオカルマイシン類、カリケアマイシン類、マイタンシン類およびオーリスタチン類およびその誘導体が挙げられる。カリケアマイシン抗体複合体の例は市販されている(MylotargTm; Wyeth−Ayerst)。
【０２１３】
細胞毒素(cytoxins)は当技術分野で利用可能なリンカー技術を用いて本発明の抗体とコンジュゲートすることができる。細胞毒素と抗体のコンジュゲートに用いられているリンカー種の例としては、限定されるものではないが、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィドおよびペプチド含有リンカーが挙げられる。リンカーは例えば、リソソームコンパートメント内で低ｐＨによる切断を受けやすいもの、またはカテプシン（例えば、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ）など、腫瘍組織で優先的に発現されるプロテアーゼなどのプロテアーゼによる切断を受けやすいものを選択することができる。
【０２１４】
細胞毒素の種類、治療薬と抗体をコンジュゲートするリンカーおよび方法に関するさらなる考察については、Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199−215; Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. Immunother. 52:328−337; Payne, G., 2003 Cancer Cell 3:207−212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750−763; Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089−1091; Senter, P.D. and Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247−264も参照。
【０２１５】
本発明の抗体はまた、放射性同位元素とコンジュゲートさせて、放射性免疫複合体とも呼ばれる細胞傷害性放射性薬剤を形成することもできる。診断使用または治療使用のために抗体とコンジュゲート可能な放射性同位元素の例としては、限定されるものではないが、ヨウ素ｌ３１、インジウム１１１、イットリウム９０およびルテチウム１７７が挙げられる。放射性免疫複合体の作製方法は当技術分野で確立されている。Ｚｅｖａｌｉｎ（商標）（ＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＢｅｘｘａｒ（商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む放射性免疫複合体の例が市販されており、同様の方法を用いて、本発明の抗体を用いた放射性免疫複合体を作製することができる。
【０２１６】
本発明の抗体複合体は、所与の生物応答を改変するための使用することができ、この薬剤成分は従来の化学治療薬に限定されるものではない。例えば、この薬剤成分は所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素またはジフテリア毒素などの酵素活性のある毒素もしくはその活性フラグメント；腫瘍壊死因子もしくはインターフェロン−γなどのタンパク質；または例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）もしくは他の増殖因子などの生物応答修飾物質を含み得る。
【０２１７】
このような治療用成分を抗体にコンジュゲートする技術は周知である。例えば、Amon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243−56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et at., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623−53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475−506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303−16 (Academic Press 1985), およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Inmunol. Rev., 62:119−58 (1982)参照。
【０２１８】
二重特異性分子
もう１つの態様において、本発明は、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性分子を特徴とする。本発明の抗体またはその抗原結合部分を誘導体化するか、または別の機能的分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質（例えば、別の抗体または受容体リガンド）と連結して、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。本発明の抗体は実際に誘導体化するか、または２つ以上の他の機能的分子と連結して、３以上の異なる結合部位および／または標的分子と結合する多重特異性分子を作製することもでき、このような多重特異性分子もまた本発明の「二重特異性分子」という用語に包含されるものとする。本発明の二重特異性分子を作出するためには、本発明の抗体を、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合ミメティックなどの１以上の他の結合分子と機能的に連結することができ（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合その他による）、その結果、二重特異性分子が得られる。
【０２１９】
特定の実施形態では、二重特異性分子は、限定されるものではないが、例えばｃＲｏｎもしくはＥＧＦＲ、またはｃＭｅｔ経路の他の標的を含む他の受容体チロシンキナーゼに向けられる。さらなる二重特異性分子標的としては、本明細書で示されるものなど、抗癌治療薬により標的とされる受容体およびリガンドが含まれる。
【０２２０】
よって、本発明は、ｃ−Ｍｅｔに対する少なくとも１つの第一の結合特異性と第二の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む二重特異性分子を含む。例えば、第二の標的エピトープはＦｃ受容体、例えば、ヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）またはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）である。よって、本発明は、ＦｃγＲ、ＦｃαＲまたはＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（例えば、単球、マクロファージまたは多形核細胞（ＰＭＮ））とｃ−Ｍｅｔを発現する標的細胞の双方に結合し得る二重特異性分子を含む。これらの二重特異性分子はｃ−Ｍｅｔ発現細胞をエフェクター細胞にターゲッティングし、ｃ−Ｍｅｔ発現細胞の食作用、抗体依存性細胞により媒介される細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出、またはスーパーオキシド陰イオンの精製などのＦｃ受容体により媒介されるエフェクター細胞活性を誘発する。
【０２２１】
さらに、二重特異性分子が多重特異性である本発明では、この分子は抗Ｆｃ結合特異性と抗ｃ−Ｍｅｔ結合特異性に加え、第三の結合特異性をさらに含むことができる。例えば、この第三の結合特異性は、抗増強因子（ＥＦ）部分、例えば細胞傷害活性に関与する表面タンパク質と結合して、それにより標的細胞に対する免疫応答を増強する分子であり得る。この「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば抗原または受容体と結合し、それによりＦｃ受容体または標的細胞抗原に対する結合決定基の作用の増強をもたらす抗体、機能的抗体フラグメントまたはリガンドであり得る。
【０２２２】
この「抗増強因子部分」は、Ｆｃ受容体または標的細胞抗原と結合し得る。あるいは、この抗増強因子部分は、第一の結合特異性と第二の結合特異性とを結合している部分とは異なる部分に結合することができる。例えば、この抗増強因子部分は細胞傷害性Ｔ細胞と結合することができる（標的細胞に対して免疫応答の増強をもたらす、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４４、ＩＣＡＭ−１または他の免疫細胞による）。
【０２２３】
一実施形態では、本発明の二重特異性分子は、結合特異性として、少なくとも１つの抗体、または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖを含む）を含む。この抗体は、Ladnerらの米国特許第４，９４６，７７８号（その開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる）に記載されているように、軽鎖もしくは重鎖二量体、またはＦｖもしくは単鎖構築物などのそのいずれかの最小フラグメントであってもよい。
【０２２４】
一実施形態では、Ｆｃγ受容体に対する結合特異性はモノクローナル抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）により遮断されない。本明細書において「ＩｇＧ受容体」とは、第１染色体上に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれをも指す。これらの遺伝子は計１２のトランスメンブランまたは可溶性受容体イソ型をコードし、これらはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の３つのＦγ受容体クラスに分類される。別の実施形態では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。ヒトＦｃγＲＩは７２ｋＤａ分子であり、単量体ＩｇＧに対して高い親和性を有する（１０８〜１０９Ｍ−１）。
【０２２５】
特定の抗Ｆｃγモノクローナル抗体の生産および特性決定は、FangerらによりＰＣＴ公報ＷＯ８８／０００５２および米国特許第４，９５４，６１７号（これらの教示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）に記載されている。これらの抗体は、その受容体のＦｃγ結合部位とは異なる部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩのエピトープと結合し、従って、それらの結合は生理学的レベルのＩｇＧによっては実質的に遮断されない。本発明に有用な特異的抗ＦｃγＲＩ抗体はｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２およびｍＡｂ１９７である。ｍＡｂ３２を産生するハイブリドーマはAmerican Type Culture CollectionからＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９４６９として入手することができる。他の実施形態において、抗Ｆｃγ受容体抗体はモノクローナル抗体２２（Ｈ２２）のヒト化形態である。Ｈ２２抗体の産生および特性決定は、Graziano, R.F. et al., 1995 J. Immunol 155 (10): 4996−5002およびＰＣＴ公報ＷＯ９４／１０３３２に記載されている。１１２２抗体産生細胞株はAmerican Type Culture CollectionにＨＡ０２２ＣＬ１として寄託され、受託番号ＣＲＬ  １１１７７を有する。
【０２２６】
さらに他の実施形態において、Ｆｃ受容体に対する結合特異性はヒトＩｇＡ受容体、例えば、Ｆｃ−α受容体ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）と結合する抗体により提供され、その結合はヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によって遮断されなくてもよい。「ＩｇＡ受容体」とは、第１９染色体上に位置する遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を含むものとする。この遺伝子は５５〜１１０ｋＤａのいくつかの選択的にスプライシングされるトランスメンブランイソ型をコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は単球／マクロファージ、好酸性および好中性顆粒球で構成的に発現され、非エフェクター細胞集団では構成的に発現されない。ＦｃαＲＩはＩｇＡ１およびＩｇＡ２の双方に対して中間的または中程度の親和性（５×１０７Ｍ−１）を有し、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインに曝された際に増強される(CSF (Morton, H.C. et al., 1996 Critical Reviews in Immunology 116:423−440)。ＩｇＡリガンド結合ドメイン外でＦｃαＲＩと結合する、Ａ３、Ａ５９、Ａ６２およびＡ７７で示される４つのＦｃαＲＩ特異的モノクローナル抗体が記載されている(Monteiro, R.C. et al., 1992 J. Immunol. 148:1764)。
【０２２７】
ＦｃαＲＩおよびＦｃγＲＩは、主として免疫エフェクター細胞、例えば、単球、ＰＭＮ、マクロファージおよび樹状細胞で発現し、高レベルで発現される（例えば５，０００〜１００，０００／細胞）ことから、本発明の二重特異性分子に用いるための誘導受容体であり、細胞傷害活性（例えばＡＤＣＣ、食作用）のメディエーターであり、それらに向けられる自己抗原を含む抗原の抗原提示の増強を媒介する。
【０２２８】
本発明の二重特異性分子に使用可能な他の抗体は、ネズミ、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体である。
【０２２９】
本発明の二重特異性分子は、当技術分野で公知の方法を用い、構成的結合特異性、例えば、抗ＦｃＲおよび抗ｃ−Ｍｅｔ結合特異性をコンジュゲートすることにより作製することができる。例えば、二重特異性分子の各結合特異性を別に形成し、その後、互いにコンジュゲートさせることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、共有結合的コンジュゲーションには種々のカップリング剤または架橋剤を使用することができる。架橋剤の例としては、Ａタンパク質、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が挙げられる（例えば、Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照）。他の方法としては、Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No. 78,118−132; Brennan et al., 1985 Science 229:81−83およびGlennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367−2375に記載されているものがある。コンジュゲート剤はＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣであり、双方ともPierce Chemical Co. (Rockford, IL)から入手することができる。
【０２３０】
抗体は、２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合によってコンジュゲートされる。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、コンジュゲーション前に奇数、例えば１個のスルフヒドリル残基を含むように修飾される。
【０２３１】
あるいは、両結合特異性をコードする遺伝子を同じベクター中に操作し、同じ宿主細胞中で例えば融合タンパク質として発現および構築することができる。この方法は、二重特異性分子がｍＡｂ×ｍＡｂ、ｍＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ’）２またはリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性分子は、１つの単鎖抗体と１つの結合決定基を含む単鎖分子であってもよいし、あるいは２つの結合決定基を含む単鎖二重特異性分子であってもよい。二重特異性分子は少なくとも２つの単鎖分子を含み得る。二重特異性分子の作製方法は、例えば、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，４５５，０３０号、米国特許第４，８８１，１７５号、米国特許第５，１３２，４０５号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４７６，７８６号、米国特許第５，０１３，６５３号、米国特許第５，２５８，４９８号および米国特許第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０２３２】
二重特異性分子とそれらの特異的標的との結合は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＥＡ）、ＦＡＣＳ分析、生物検定法（例えば、増殖阻害）、またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらの各アッセイは一般に、対象とする複合体に特異的な標識試薬（例えば、抗体）を用いることにより、特に着目するタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、ＦｃＲ−抗体複合体は、例えば、抗体−ＦｃＲ複合体を認識し、それと特異的に結合する酵素結合抗体または抗体フラグメントを用いて検出することができる。あるいは、これらの複合体は様々な他の免疫アッセイのいずれかを用いて検出することができる。例えば、抗体を放射性標識し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）で使用することができる（例えば、出典明示により本明細書の一部とされるWeintraub; B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986参照）。放射性同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターなどの手段により、またはオートラジオグラフィーにより、検出することができる。
【０２３３】
ｃ−Ｍｅｔ活性の変調（促進作用または拮抗作用）に関するアッセイ
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体がｃ−Ｍｅｔ促進作用または拮抗作用を有するかどうかをアッセイする。促進作用は、確立された培養細胞系統の細胞に保持されている、またはヒト組織サンプルから確立された一次細胞系統に保持されているｃ−Ｍｅｔ、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ受容体、またはアッセイプレートまたはビーズ上に固定された市販（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃３５８  ＭＴ）の精製ｃ−Ｍｅｔタンパク質と結合し、それを活性化することにより陽性エフェクターＨＧＦに取って代わる能力である。促進作用活性の尺度は、対照ＨＧＦ活性の５０％をもたらすエフェクター（この場合、本発明の抗体または抗体フラグメント）の濃度、すなわちＥＣ５０である。ＥＣ５０は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの標準的な免疫技術により、または細胞分散、軟寒天増殖および／またはマトリックス浸潤アッセイ（管形態形成アッセイ）などの細胞に基づくアッセイにより決定されるものなど、リガンド結合アッセイを用いて測定することができる。例えばＥＬＩＳＡにより測定されるＥＣ５０阻害活性は、好ましくは、５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、いっそう好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ未満である。拮抗作用は、確立された培養細胞系統の細胞に保持されている、またはヒト組織サンプルから確立された一次細胞系統に保持されているｃ−Ｍｅｔ受容体、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔ、またはアッセイプレートまたはビーズ上に固定された市販（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃３５８  ＭＴ）の精製ｃ−Ｍｅｔタンパク質と結合することにより、陽性エフェクターＨＧＦとの相互作用を妨げ、その作用を阻害する能力である。拮抗作用活性の尺度は、対照ＨＧＦ活性の５０％を阻害するエフェクター（この場合、本発明の抗体または抗体フラグメント）の濃度、すなわちＩＣ５０である。ＩＣ５０は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの標準的な免疫技術により、または細胞分散、軟寒天増殖および／またはマトリックス浸潤アッセイ（管形態形成アッセイ）などの細胞に基づくアッセイにより決定されるものなど、リガンド結合アッセイを用いて測定することができる。例えばＥＬＩＳＡにより測定されるＩＣ５０阻害活性は、好ましくは、５μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．５μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、いっそう好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ未満である。
【０２３４】
促進作用的または拮抗作用的抗ｃ−Ｍｅｔ抗体によるｃ−Ｍｅｔリン酸化の変調のアッセイ
本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による促進作用または拮抗作用を、ＨＧＦで刺激した、また刺激しない細胞においてｃ−Ｍｅｔリン酸化の活性化または阻害により測定する。Ａ５４９細胞などの細胞系統の細胞を、９６ウェル平底組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３５９５）中、１０％ＦＢＳを添加した総量ＤＭＥＭ１００μｌ／ウェルにて、３×１０４細胞／ウェルの密度で播種する。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２４時間インキュベートし、その後、プレートの各ウェルから培地を静かに吸引し、１００μｌ／ウェル量のＤＭＥＭを加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２４時間インキュベートし、その後、処理する精製抗体のサンプル、１００μｌ／ウェルの抗体または希釈液を、ＤＭＥＭで希釈したウェルの細胞に加える。活性がない陰性対照として、無関連抗体（ｃ−Ｍｅｔエピトープ決定基とは無関連の既知の特異性を有する）のサンプルまたはバッファーを指定のウェルに加える。
【０２３５】
これらの細胞を３７℃で短時間（例えば２時間）または長時間（例えば２４時間）インキュベートする。適当であれば、血清フリーＤＭＥＭ培地中、終濃度２００ｎｇ／ウェルでＨＧＦを加えることにより細胞を刺激する。一般に、抗体の促進作用活性をアッセイする場合には、陽性対照（抗体で処理しない）以外は、試験サンプル抗体ウェルからＨＧＦを除く。一般に、抗体の拮抗作用活性をアッセイする場合には、試験サンプル抗体ウェルにＨＧＦを含める。プレートをさらに１０分間３７℃でインキュベートした後、プレートのウェルから培地を静かに吸引する。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、その溶液をプレートから静かに吸引する。細胞を５０μｌの溶解バッファー（ＮＰ−４０溶解バッファー：１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭベンズアミジン、０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４および０．１ｍＭ  ＰＭＳＦを新たに加える）で溶解する。これらのプレートを室温で１５分間振盪した後、ＥＬＩＳＡに必要となるまで−８０℃で保存する。
【０２３６】
ＥＬＩＳＡを用い、ｃ−Ｍｅｔリン酸化レベルを決定する。ＥＬＩＳＡプレートの調製については、Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭプレート、ＭａｘｉＳｏｒｂＴＭ  Ｓｕｒｆａｃｅ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ、ＮＯ３９１−８７８６）を洗浄バッファー（ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  Ｂｉｏｒａｄ  ＃６７０−６５３１）で２回洗浄し、ＰＢＳ中、１００μｌのｃ−Ｍｅｔモノクローナル捕捉抗体（ＤＯ−２４）を加える。これらのプレートを一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。非特異的結合部位を、ＰＢＳ−Ｔ中３％のＢＳＡ２００μｌ／ウェルで、室温で振盪しながら２時間、ブロッキングする。使用直前にブロッキング溶液を除去する。
【０２３７】
凍結した細胞溶解液を室温で振盪することで融解し、４０μｌの溶解液をＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレートに加え、これらのプレートを４℃で４時間インキュベートする。これらのプレートをＰＢＳ−Ｔ、および３％ウシ血清アルブミン−ＰＢＳ−Ｔ中、０．２μｇ／ｍｌ抗ホスホチロシン抗体ＰＹ２０−ＨＲＰ（ＺＹＭＥＤ、＃０３−７７２２）５０μｌ／ウェルで３回洗浄する。これらのプレートを一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ＰＢＳ−Ｔを吸引し、９０μｌ／ウェルのアルカリ性ホスファターゼ基質（ＣＤＲ−Ｓｔａｒ、ＴＲＯＰＩＸ、＃ＭＳ１００ＲＹ）を加え、室温で４５分間静かに振盪しつつ展開する。これらのプレートを、９６ウェルプレートリーダーを用いて読み取る。
【０２３８】
これらの結果は、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の拮抗作用種のメンバーがＨＧＦのｃ−Ｍｅｔリン酸化刺激能を阻害することを示す。
【０２３９】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の促進作用性および拮抗作用性クローンによるＨＧＦ誘導性の増殖の変調
ＨＧＦ刺激の不在下または存在下で、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の拮抗作用または促進作用を評価するアッセイを行う。４ＭＢｒ−５などの細胞系統の細胞を、９６ウェル平底組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３６１０）にて、１０％ＦＢＳを添加した総量１００μｌ／ウェルのＨａｍのＦ１２Ｋ中、３×１０３細胞／ウェルの密度で播種する。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２時間インキュベートし、その後、処理する精製抗体を含有する５０μｌの培地を添加する。変調のない陰性対照として、無関連抗体（ｃ−Ｍｅｔエピトープ決定基とは無関連の既知の特異性を有する）のサンプルまたはバッファーを指定のウェルに加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で１時間インキュベートし、その後、培地単独５０μｌまたはＨＧＦを含有（例えば、約０．５μｇ／μｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ）する５０μｌを加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で７２時間インキュベートし、その後、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ）カタログ番号１６６９９１５を用いてＢｒＤＵの組み込みをアッセイする。要するに、２０μＭ／ウェルのＢｒｄＵ溶液（＃１）を加え、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２２時間インキュベートする。培地を静かに除去し、このプレートを６０℃で１時間乾燥させる。２００μｌのＦｉｘＤｅｎａｔ（溶液＃２）を加え、これらのプレートを静かに振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。溶液を静かに除去し、１００μｌ／ウェルの抗ＢｒＤＵ検量線用溶液を加える。これらのプレートを静かに振盪しながら室温で９０分間インキュベートする。溶液を静かに除去し、ウェルを２５０μｌの洗浄溶液で３回洗浄する。溶液を静かに除去し、１００μｌ／ウェルの基質溶液を加え、プレートをＡ４０５ｎｍで測定する。
【０２４０】
これらの結果は、拮抗作用性抗ｃ−Ｍｅｔ抗体クローンで処理した細胞において、ＨＧＦにより刺激されるｃ−Ｍｅｔ発現細胞の増殖レベルが阻害されることを示す。
【０２４１】
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の拮抗作用種による、ｃ−Ｍｅｔ依存性細胞移動の変調
ｃ−Ｍｅｔを発現するＮＣＩ−Ｈ４４１細胞などの特定の細胞系統の細胞は、ＨＧＦ濃度勾配に応じて移動することが知られている。ＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を用い、抗ｃＭｅｔ抗体が有孔膜（Ｂｏｙｄｅｎ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ａｓｓａｙ）を通って低ＨＧＦ濃度領域から高ＨＧＦ濃度領域へ向かう移動を変調する能力を評価するアッセイを行う。
【０２４２】
細胞移動は、ＱＣＭ（商標）走化性８μＭ９６ウェル細胞移動アッセイを用いてアッセイする。すなわち、アッセイ２４時間前に細胞を無菌ＰＢＳで２回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で飢餓状態とする。次に、これらの細胞をトリプシン処理し、適当な濃度の精製抗体の存在下、３７℃で３０分間、１．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させる。変調のない陰性対照として、無関連抗体（ｃ−Ｍｅｔエピトープ決定基とは無関連の既知の特異性を有する）のサンプルまたはバッファーを指定のウェルに加える。
【０２４３】
無菌条件下、移動チャンバープレートの蓋をはずし、５０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄカタログ番号２９４−ＨＧＮ）を含有する血清フリー培地１５０μＬをフィーダートレイ（下のチャンバー）のウェルに加える。抗体とともにプレインキュベートした１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、５〜１０×１０４細胞１００μＬを上のチャンバーに静かに加える。このプレートに蓋をして、３７℃、４〜６％ＣＯ２中で１６時間インキュベートする。製造業者の使用説明書に従い、上のチャンバーの細胞／培地を排出し、このチャンバーを、１５０μＬ／ウェルの予温細胞解離溶液を加えた９６ウェルフィーダートレイに置く。周期的に静かに振盪させつつ、３７℃で３０分間インキュベートすることにより細胞を解離させる。次に、予め希釈したＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ  Ｄｙｅ５０μｌをフィーダートレイの各ウェルに加える。このプレートを室温で１５分間インキュベートし、この混合物１５０μＬを、４８０／５２０ｎｍフィルターセットを用いる蛍光測定に好適な新しい９６ウェルプレートに移す。
【０２４４】
得られたデータは、拮抗作用性抗ｃ−Ｍｅｔ抗体クローン種がｃ−Ｍｅｔ活性化の生物学的結果、すなわち、ＨＧＦにより刺激される微孔質膜を通るＮＣＩ−Ｈ４４１細胞の移動を阻害し得ることを示す。
【０２４５】
ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）による抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の親和性定数ＫＤの決定
精製抗体の結合親和性は、拮抗作用抗体に関して上記したように、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００装置(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.)を製造業者のプロトコールに従って用い、表面プラズモン共鳴によって測定する。
【０２４６】
フローサイトメトリーによる抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の親和性定数（ＫＤ）の決定
ヒトＡ５４９肺癌細胞およびカニクイザル肺細胞の表面で発現されたｃ−Ｍｅｔに対する精製抗体の結合親和性を、拮抗作用抗体に関して上記したように、ＢＤ（商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＳＲフローサイトメーターを製造業者のプロトコールに従って用いるフローサイトメトリーにより測定した。
【０２４７】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、組成物、例えば、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の１つまたは組合せを含有する、薬学的に許容される担体とともに処方された医薬組成物を提供する。このような組成物は、本発明の（例えば、２種以上の異なる）抗体、または免疫複合体または二重特異性分子の１つまたは組合せを含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するかまたは相補的活性を有する抗体（または免疫複合体または二重特異性抗体）の組合せを含み得る。
【０２４８】
本発明の医薬組成物は、また、併用療法、すなわち他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。例えば、併用療法は、本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体を少なくとも１種類の他の抗癌剤または抗炎症薬と組み合わせて含み得る。併用療法で使用可能な治療薬の例は、以下の本発明の抗体の使用についての節でより詳しく記載される。
【０２４９】
本明細書において「薬学的に許容される担体」には、生理的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。当該担体は、（例えば、注射または注入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与に適しているべきである。投与経路に応じて、有効化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子は、化合物を不活性化し得る酸や他の天然条件の作用から化合物を保護する物質でコーティングすることもできる。
【０２５０】
本発明の医薬組成物は、１種以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物活性に影響を及ぼさず、望ましくない毒性作用を付与しない塩を指す（例えば、Berges, S.M., et al., 1977 J. Pharma. Sci. 66:1−19参照）。このような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩がある。酸付加塩としては、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒性の無機酸に由来するもの、ならびに脂肪族モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性の有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土金属に由来するもの、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性の有機アミンに由来するものが含まれる。
【０２５１】
また、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される抗酸化剤を含んでもよい。薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤；パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、プロピルガレート、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤；およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤が少なくとも含まれる。
【０２５２】
本発明の医薬組成物に使用することができる好適な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散物の場合には、必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０２５３】
また、これらの組成物は保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物存在の防止は、殺菌手順（前掲）ならびに例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含の双方により確保することができる。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤を当該組成物に包含させることが望ましい場合がある。さらに、注射剤形の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を包含させることにより実現することができる。
【０２５４】
薬学的に許容される担体としては、無菌注射溶液または分散液を即時調製するための無菌水溶液または分散液および無菌粉末が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および物質の使用は当技術分野で公知である。ただし、これまで従来の媒体または薬剤が当該有効化合物と適合しなかったので、本発明の医薬組成物においてその使用が意図される。補助的な有効化合物もまた、当該組成物中に配合することができる。
【０２５５】
治療用組成物は、一般に、製造および保存条件下で無菌かつ安定でなければならない。当該組成物は、溶液、ミクロエマルション、リポソームまたはその他高濃度の薬物に適した調整構造物として調剤することができる。当該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびその好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散物の場合には、必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、例えば、糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトールなど）または塩化ナトリウムのような等張化剤を当該組成物に含有させることができる。注射組成物の吸収の延長は、例えばモノステアリン塩およびゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を組成物に包含させることにより実現することができる。
【０２５６】
無菌注射溶液は、必要量の有効化合物を、必要に応じて上記に述べた成分の１つまたは組合せとともに適当な溶媒中に配合した後、無菌的精密濾過を行うことにより調製することができる。一般に、分散物は、基本的分散媒と上記に述べたものの中から必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に有効化合物を配合することによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、この調製方法は真空乾燥および凍結乾燥（リオフィライゼーション）であり、これにより、有効成分に、事前に無菌濾過したその溶液からのあらゆる所望の付加的成分を加えた粉末が得られる。
【０２５７】
単位投与形を作製するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、治療すべき対象と特定の投与様式によって異なる。単位投与形を作製するために担体物質と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般的に、この量は、１００％のうち、薬学的に許容される担体との組合せ中、有効成分が約０．０１％〜約９９％、約０．１％〜約７０％、または約１％〜約３０％の範囲である。
【０２５８】
投与計画は、所望の最適応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。例えば、単回のボーラスを投与してもよいし、または経時的に数回の分割量で投与してもよいし、または治療状況の緊急性により指示される場合には、用量を比例的に増減してもよい。特に、投与の容易性および投与量の均一性のため、非経口組成物を単位投与形として調剤するのが有利である。本明細書において、単位投与形とは、処置対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な医薬担体と組み合わせて所望の治療効果をもたらすよう計算された所定量の有効化合物を含む。本発明の単位投与形の仕様は、有効化合物の独自の特徴と達成すべき特定の治療効果、および各個体における治療感受性に関して、このような有効化合物を調剤する技術に固有の制限により規定され、かつそれらに直接的に依存する。
【０２５９】
抗体投与のための用量は約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ宿主体重の範囲である。例えば、用量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重であるか、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。例としての処置計画には、週１回投与、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、月１回、３ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のための投与計画は、静脈投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重を含み、当該抗体は下記の投与スケジュール：４週間おきに６回の後に３か月おき；３週間おき；３ｍｇ／ｋｇ体重を１回の後、３週間おきに１ｍｇ／ｋｇ体重、の１つを用いて与える。
【０２６０】
いくつかの方法では、結合特異性が同じまたは異なる２種類以上の抗体を同時に投与し、この場合、投与した各抗体の用量は示した範囲内にある。抗体は通常、複数回投与する。各投与間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３カ月おきまたは１年おきであり得る。患者の標的抗原に対する抗体の血中レベルを測定することによって示されるように、間隔は不定期であってもよい。血漿抗体濃度が約１〜１０００μｇ／ｍＬとなるように用量を調整する方法や約２５〜３００μｇ／ｍＬとなるように調整する方法もある。
【０２６１】
あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することもでき、この場合、投与頻度は少なくてよい。用量と頻度は、患者における抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト抗体が最も長い半減期を示し、次に、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。用量と投与頻度は、その処置が予防なのか治療なのかによって異なり得る。予防的適用では、比較的低用量が比較的低頻度で、長期間投与される。残りの生涯にわたって処置を受け続ける患者もいる。治療的適用では、疾病の進行を遅らせるかもしくは停止させるまで、または患者が疾病の症状の部分的改善または完全改善を示すまで、比較的高用量を比較的短間隔で必要とする場合がある。その後、患者は、予防計画で投与を受ける。
【０２６２】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式に対して、患者への毒性なく、所望の治療応答を達成するのに有効な有効成分量が得られるように変更することができる。選択される用量レベルは、使用する本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排泄速度、処置期間、使用する特定の組成物と併用される他の薬剤、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、症状、健康状態および既往歴など医学分野で周知の因子を含む様々な薬物動態因子によって異なる。
【０２６３】
本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の「治療上有効な量」は、疾病症状の重篤度の軽減、疾病の無症候期間の頻度と期間の増加、または疾患罹患による不全または障害の回避をもたらす。疾病症状としては、病期、原発腫瘍の大きさ、転移の部分および大きさ、または炎症の程度などの癌の標準的な診断基準を含む。
【０２６４】
本発明の組成物は、当技術分野で公知の様々な方法の１以上を用い、１以上の投与経路で投与することができる。当業者には明らかなように、投与経路および／または投与様式は、目的とする結果によって異なる。本発明の抗体の投与経路は、例えば、注射または注入による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路を含む。本明細書において「非経口投与」とは、腸および局所投与以外の、通常には注射による投与様式を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入が含まれる。
【０２６５】
あるいは、本発明の抗体は、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、口腔内、膣内、直腸内、舌下または局所などの非経口経路により投与することができる。
【０２６６】
活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系などの徐放性製剤など、化合物が急速に放出しないよう保護する担体を用いて調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーも使用可能である。このような製剤の多くの調製方法が特許を得ているか、または当業者に一般に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
【０２６７】
治療用組成物は、当技術分野で公知の医療ディバイスにより投与することができる。例えば、一実施形態において、本発明の治療用組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に示されているディバイスなどの無針皮下注射ディバイスにより投与することができる。本発明で有用な周知のインプラントおよびモジュールの例としては、制御された速度で医薬を分配するためのインプラント可能な微小注入ポンプを示す米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚から医薬を投与するための治療ディバイスを示す米国特許第４，４８６，１９４号；厳密な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを示す米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための流量可変のインプラント可能な注入装置を示す米国特許第４，４４７，２２４号；複数チャンバーコンパートメントを有する浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４３９，１９６号；および浸透圧薬物送達系を示す米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。これらの特許は出典明示により本明細書の一部とされる。他のこのような多くのインプラント、送達系およびモジュールが当業者に公知である。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、in vivoにおいて適切な分布を確保するために本発明の抗体を調剤することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物がＢＢＢを確実に通過できるようにするためには（所望の場合）、それらを例えばリポソーム中に調剤することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号および同第５，３９９，３３１号を参照。当該リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に輸送される１以上の部分を含むことができ、それによって標的薬物送達を増進する（例えば、V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685参照）。標的化部分の例としては、葉酸またはビオチン（例えば、Lowらの米国特許第５，４１６，０１６号参照）、マンノシド(Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)、抗体(P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M.Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)、界面活性剤Ａタンパク質受容体(Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol. 1233:134)、ｐ１２０(Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem. 269:9090)が挙げられる（また、K. Keinanenn; M.L. Laukkanen, 1994 FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Immunomethods 4:273も参照）。
【０２６９】
組合せ
本発明はさらに、哺乳類、特にヒトにおける癌などの増殖性疾患を、
（ａ）ｃ−Ｍｅｔ抗体アンタゴニスト組成物と
（ｂ）１以上の薬学的に活性な薬剤
を含む医薬剤の組合せで予防または処置する方法に関する。
【０２７０】
本発明はさらに、
（ａ）ｃ−Ｍｅｔ抗体アンタゴニスト組成物と、
（ｂ）薬学的に活性な薬剤と、
（ｃ）薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物に関する。
【０２７１】
本発明はさらに、
（ａ）ｃ−Ｍｅｔ抗体アンタゴニスト組成物の医薬製剤と、
（ｂ）同時使用、並行使用、個別使用または逐次使用のための薬学的に活性な薬剤の医薬製剤
を含む、市販のパッケージまたは製品に関する。
【０２７２】
薬学的に活性な薬剤
「薬学的に活性な薬剤」とは、作用機序の異なる多くの薬学的に活性な薬剤を包含する幅広い用語である。これらのいくつかとＣ−Ｍｅｔアンタゴニスト抗体／組成物の組合せは癌療法に改善をもたらし得る。一般に、薬学的に活性な薬剤は作用機序に従って分類される。利用可能な薬剤の多くは種々の腫瘍の発症経路の代謝拮抗剤であるか、または腫瘍細胞のＤＮＡと反応する。トポイソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼＩＩなどの酵素を阻害する薬剤、または有糸分裂阻害薬もある。
【０２７３】
「薬学的に活性な薬剤」とは、ｃ−Ｍｅｔ抗体アンタゴニスト組成物またはその誘導体以外の特に薬学的に活性ないずれの薬剤も意味する。これには限定されるものではないが、
ｉ．アロマターゼ阻害剤；
ｉｉ．抗エストロゲン作用薬、抗アンドロゲン作用薬またはゴナドレリン作用薬；
ｉｉｉ．トポイソメラーゼＩ阻害剤またはトポイソメラーゼＩＩ阻害剤；
ｉｖ．微小管活性剤、アルキル化剤、抗新生物剤、代謝拮抗剤またはプラチン化合物；
ｖ．タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的化／低減する化合物、さらなる抗脈管形成化合物または細胞分化プロセスを誘導する化合物；
ｖｉ．モノクローナル抗体；
ｖｉｉ．シクロオキシゲナーゼ阻害剤、ビスホスホネート、ヘパラナーゼ阻害剤、生物反応修飾物質；
ｖｉｉｉ．Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤；
ｉｘ．テロメラーゼ阻害剤；
ｘ．プロテアーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤またはプロテアソーム阻害剤；
ｘｉ．血液性悪性疾患の処置に用いられる薬剤またはＦｌｔ−３の活性を標的化、低減もしくは阻害する化合物；
ｘｉｉ．ＨＳＰ９０阻害剤；
ｘｉｉｉ．抗増殖性の抗体；
ｘｉｖ．ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤；
ｘｖ．セリン／トレオニンｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物；
ｘｖｉ．ソマトスタチン受容体拮抗薬；
ｘｖｉｉ．抗白血病化合物；
ｘｖｉｉｉ．腫瘍細胞傷害アプローチ；
ｘｉｘ．ＥＤＧ結合剤；
ｘｘ．リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；
ｘｘｉ．Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤；
ｘｘｉｉ．ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体；
ｘｘｉｉｉ．光線力学療法；
ｘｘｉｖ．脈管形成抑制ステロイド；
ｘｘｖ．コルチコステロイド含有インプラント；
ｘｘｖｉ．ＡＴ１受容体拮抗薬；および
ｘｘｖｉｉ．ＡＣＥ阻害剤
が含まれる。
【０２７４】
本明細書において「アロマターゼ阻害剤」は、エストロゲンの産生、すなわち、基質アンドロステンジオンおよびテストステロンからそれぞれエストロンおよびエストラジオールへの変換を阻害する化合物に関する。この用語には、限定されるものではないが、ステロイド類、特に、アタメスタン、エキセメスタンおよびフォルメスタン；ならびに特に非ステロイド類、特に、アミノグルテチミド、ログレチミド、ピリドグルテチミド、トリロスタン、テストラクトン、ケトコナゾール、ボロゾール、ファドロゾール、アナストロゾールおよびレトロゾールが含まれる。エキセメスタンはＡＲＯＭＡＳＩＮとして；フォルメスタンはＬＥＮＴＡＲＯＮとして；ファドロゾールはＡＦＥＭＡとして；アナストロゾールはＡＲＩＭＩＤＥＸとして；レトロゾールはＦＥＭＡＲＡまたはＦＥＭＡＲとして；また、アミノグルテチミドはＯＲＩＭＥＴＥＮとして市販されている。アロマターゼ阻害剤である薬学的に活性な薬剤を含む本発明の組合せは、例えば乳癌などのホルモン受容体陽性腫瘍の処置に特に有用である。
【０２７５】
本明細書において「抗エストロゲン作用薬」は、そのエストロゲン受容体レベルにおいてエストロゲンの作用に拮抗作用を示す化合物に関する。この用語には、限定されるものではないが、タモキシフェン、フルベストラント、ラロキシフェンおよび塩酸ラロキシフェンが含まれる。タモキシフェンは、例えばＮＯＬＶＡＤＥＸなどの市販されている形態で投与することができ、塩酸ラロキシフェンはＥＶＩＳＴＡとして市販されている。フルベストラントは米国特許第４，６５９，５１６号に開示されているように調剤することができ、ＦＡＳＬＯＤＥＸとして市販されている。抗エストロゲン作用薬である薬学的に活性な薬剤を含む本発明の組合せは、例えば乳癌などのエストロゲン受容体陽性腫瘍の処置に特に有用である。
【０２７６】
本明細書において「抗アンドロゲン作用薬」は、アンドロゲン性ホルモンの生物作用を阻害し得るいずれの物質にも関し、限定されるものではないが、例えば米国特許第４，６３６，５０５号に開示されているように調剤可能なビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ）が含まれる。
【０２７７】
本明細書において「ゴナドレリン作用薬」とは、限定されるものではないが、アバレリスク、ゴセレリンおよび酢酸ゴセレリンが含まれる。ゴセレリンは米国特許第４，１００，２７４号に開示されており、ＺＯＬＡＤＥＸとして市販されている。アブレリスクは例えば米国特許第５，８４３，９０１号に開示されているように調剤することができる。
【０２７８】
本明細書において「トポイソメラーゼＩ阻害剤」には、限定されるものではないが、トポテカン、ギマテカン、イリノテカン、カンプトテシアン(camptothecian)およびその類似体、９−ニトロカンプトテシンおよび高分子カンプトテシンコンジュゲートＰＮＵ−１６６１４８（ＷＯ９９／１７８０４の化合物Ａ１）が含まれる。イリノテカンは、例えば商標ＣＡＭＰＴＯＳＡＲとして市販されているような形態で投与することができる。トポテカンは、例えば商標ＨＹＣＡＭＴＩＮとして市販されているような形態で投与することができる。
【０２７９】
本明細書において「トポイソメラーゼＩＩ阻害剤」としては、限定されるものではないが、ドキソルビシン（例えばＣＡＥＬＹＸなどのリポソーム製剤を含む）、ダウノルビシン（例えばＤＡＵＮＯＳＯＭＥなどのリポソーム製剤を含む）、エピルビシン、イダルビシンおよびネモルビシンなどのアントラサイクリン類；ミトキサントロンおよびロソキサントロンなどのアントラキノン類；ならびにエトポシドおよびテニポシドなどのポドフィロトキシン類が含まれる。エトポシドはＥＴＯＰＯＰＨＯＳとして；テニポシドはＶＭ２６−ＢＲＩＳＴＯＬとして；ドキソルビシンはＡＤＲＩＢＬＡＳＴＩＮまたはアドリアマイシンとして；エピルビシンはＦＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮとして；イダルビシンはＺＡＶＥＤＯＳとして；またミトキサントロンはＮＯＶＡＮＴＲＯＮとして市販されている。
【０２８０】
本明細書において「微小管活性剤」は、微小管安定剤、微小管脱安定剤およびミクロチューブリン重合阻害剤に関し、限定されるものではないが、タキサン類、例えば、パシルタキセル(paciltaxel)およびドセタキセル；ビンカアルカロイド類、例えば、ビンブラスチン、特に硫酸ビンブラスチン；ビンクリスチン、特に硫酸ビンクリスチンおよびビノレルビン；ディスコデルモリド類；コチシン(cochicine)およびそのエポチロンサンド誘導体、例えば、エポチロンＢまたはその誘導体が含まれる。パクリタキセルはＴＡＸＯＬとして；ドセタキセルはＴＡＸＯＴＥＲＥとして；硫酸ビンブラスチンはＶＩＮＢＬＡＳＴＩＮ  Ｒ．Ｐとして；また、硫酸ビンクリスチンはＦＡＲＭＩＳＴＩＮとして市販されている。また、パクリタキセルの一般型ならびにパクリタキセルの種々の投与形も含まれる。パクリタキセルの一般型としては、限定されるものではないが、塩酸ベタキソロールが含まれる。パクリタキセルの種々の投与形としては、限定されるものではないが、ＡＢＲＡＸＡＮＥとして市販されているアルブミンナノ粒子パクリタキセルが挙げられ；ＯＮＸＯＬ、ＣＹＴＯＴＡＸディスコデルモリドは例えば米国特許第５，０１０，０９９号に開示されているようにして得ることができる。また、米国特許第６，１９４，１８１号、ＷＯ９８／１０１２１、ＷＯ９８／２５９２９、ＷＯ９８／０８８４９、ＷＯ９９／４３６５３、ＷＯ９８／２２４６１およびＷＯ００／３１２４７に開示されているエポトリン誘導体も含まれる。特に好ましいのはエポトリンＡおよび／またはＢである。
【０２８１】
本明細書において「アルキル化剤」としては、限定されるものではないが、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファランまたはニトロソ尿素（ＢＣＮＵまたはＧｌｉａｄｅｌ）、またはテモゾールアミド（ＴＥＭＯＤＡＲ）が含まれる。シクロホスファミドは、例えば商標ＣＹＣＬＯＳＴＩＮとして市販されているような形態で、また、イフォスファミドはＨＯＬＯＸＡＮとして市販されているような形態で投与することができる。
【０２８２】
「抗新生物代謝拮抗剤」としては、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；カペシタビン；ゲムシタビン；５−アザシチジンおよびデシタビンなどのＤＮＡ脱メチル化剤；メトトレキサート；エダトレキサート；ならびに限定されるものではないが、ペメトレキセドなどの葉酸拮抗薬が含まれる。カペシタビンは、例えば商標ＸＥＬＯＤＡとして市販されているような形態で、また、ゲムシタビンはＧＥＭＺＡＲとして市販されているような形態で投与することができる。
【０２８３】
本明細書において「プラチン化合物」としては、限定されるものではないが、カルボプラチン、シスプラチン、シスプラチナム、オキサリプラチン、サトラプラチン、およびＺＤ０４７３などの白金剤が含まれる。カルボプラチンは、例えばＣＡＲＢＯＰＬＡＴとして市販されているような形態で、また、オキサリプラチンはＥＬＯＸＡＴＩＮとして市販されているような形態で投与することができる。
【０２８４】
本明細書において「タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的化／低減する化合物、またはさらなる抗脈管形成化合物」としては、限定されるものではないが、タンパク質チロシンキナーゼおよび／またはセリンおよび／またはセロインキナーゼ阻害剤(theroine kinase inhibitor)または脂質キナーゼ阻害剤が含まれ、例えば以下のものがある。
ｉ）血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ）の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ＶＥＧＦの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ＶＥＧＦ受容体を阻害する化合物、例えば、限定されるものではないが、７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体（ＡＥＥ７８８）；ＢＡＹ４３−９００６；（４−ｔｅｒｔ−ブチル−フェニル）−９４−ピリジン−４−イルメチル−イソキノリン−１−イル）−アミン（ＡＡＬ８８１）などのＷＯ００／０９４９５に開示されているイソルコリン(isolcholine)化合物。
ｉｉ）血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ＰＤＧＦＲの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ＰＤＧＦ受容体を阻害する化合物、例えば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えば、イマチニブ、ＳＵ１０１、ＳＵ６６６８およびＧＦＢ−１１１。
ｉｉｉ）繊維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｉｖ）インスリン様増殖因子受容体１（ＩＧＦ−１Ｒ）の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ＩＧＦ−ＩＲの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ＩＧＦ−１Ｒ受容体を阻害する化合物。化合物としては、限定されるものではないが、ＷＯ０２／０９２５９９に開示されている化合物およびその誘導体である４−アミノ−５−フェニル−７−シクロブチル−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体（ＡＥＷ５４１）が含まれる。
ｖ）Ｔｒｋ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｖｉ）Ａｘｌ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｖｉｉ）ｃ−Ｍｅｔ受容体の活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｖｉｉｉ）Ｒｅｔ受容体チロシンキナーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｉｘ）Ｋｉｔ／ＳＣＦＲ受容体チロシンキナーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物。
ｘ）Ｃ−ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼ（ＰＤＧＦＲファミリーの一部）の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ｃ−Ｋｉｔ受容体チロシンキナーゼファミリーの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ｃ−Ｋｉｔ受容体を阻害する化合物、例えば、イマチニブ。
ｘｉ）ｃ−Ａｂｌファミリーのメンバーおよびそれらの遺伝子融合産物の活性、例えば、ＢＣＲ−Ａｂｌキナーゼを標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ｃ−ＡｂＩファミリーメンバーおよびそれらの遺伝子融合産物の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、Ｎ−フェニル−２−ピリミジン−アミン誘導体、例えば、ＰａｒｋｅＤａｖｉｓからのイマチニブ、ＰＤ１８０９７０、ＡＧ９５７、ＮＳＣ６８０４１０またはＰＤ１７３９５５；ＢＭＳ３５４８２５。
ｘｉｉ）タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）およびセリン／トレオニンキナーゼのＲａｆファミリーのメンバー、ＭＥＫ、ＳＲＣ、ＪＡＫ、ＦＡＫ、ＰＤＫおよびＲａｓ／ＭＡＰＫファミリーのメンバー、またはＰＩ（３）キナーゼファミリーのメンバー、またはＰＩ（３）−キナーゼ関連キナーゼファミリーのメンバー、および／またはサイクリン依存性キナーゼファミリー（ＣＤＫ）のメンバーの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、米国特許第５，０９３，３３０号に開示されているスタウロスポリン誘導体、例えば、ミドスタウリン(midostaurin)。さらなる化合物の例としては、例えば、ＵＣＮ−０１；サフィンゴール(safingol)；ＢＡＹ４３−９００６；ブリオスタチン１（Bryostatin 1)；ペリフォシン(Perifosine)；イルモホシン(Ilmofosine)；ＲＯ３１８２２０およびＲＯ３２０４３２；ＧＯ６９７６；Ｉｓｉｓ３５２１；ＬＹ３３３５３１／ＬＹ３７９１９６；イソチノリン(isochinoline)化合物、例えば、ＷＯ００／０９４９５に開示されているもの；ＦＴＩｓ；ＰＤ１８４３５２またはＱＡＮ６９７、Ｐ１３Ｋ阻害剤が含まれる。
ｘｉｉｉ）タンパク質チロシンキナーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ）；チルホスチン(tyrphostin)またはピリミジルアミノベンズアミドおよびその誘導体（ＡＭＮ１０７）。チルホスチンは好ましくは、低分子量（Ｍｒ＜１５００）化合物またはその薬学的に許容される塩、特に、ベンジリデンマロニトリル種またはＳアリールベンゼンマロニトリルまたは二基質性キノリン種の化合物から選択される化合物、さらに特には、チルホスチンＡ２３／ＲＧ−５０８１０、ＡＧ９９、チルホスチンＡＧ２１３、チルホスチンＡＧ１７４８、チルホスチンＡＧ４９０、チルホスチンＢ４４、チルホスチンＢ４４（＋）鏡像異性体、チルホスチンＡＧ５５５、ＡＧ４９４、チルホスチンＡＧ５５６；ＡＧ９５７およびアダホスチン(adaphostin)（４−｛［（２，５−ジヒドロキシフェニル）メチル］アミノ｝−安息香酸アダマンチルエステル、ＮＳＣ６８０４１０、アダホスチン）からなる群から選択されるいずれかの化合物である。
ｘｉｖ）上皮細胞増殖因子ファミリーの受容体チロシンキナーゼ（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ホモ二量体またはヘテロ二量体として）の活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、上皮細胞増殖因子受容体ファミリーの活性を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４を阻害するか、またはＥＧＦもしくはＥＧＦ関連リガンドと結合する化合物、タンパク質または抗体、特に、全般的かつ具体的にＷＯ９７／０２２６６（例えば実施例３９の化合物）、またはＥＰ０５６４４０９、ＷＯ９９／０３８５４、ＥＰ０５２０７２２、ＥＰ０５６６２２６、ＥＰ０７８７７２２、ＥＰ０８３７０６３、米国特許第５，７４７，４９８号、ＷＯ９８／１０７６７、ＷＯ９７／３００３４、ＷＯ９７／４９６８８、ＷＯ９７／３８９８３および特に、ＷＯ９６／３０３４７（例えば、ＣＰ３５８７７４として知られる化合物）、ＷＯ９６／３３９８０（例えば、化合物ＺＤ１８３９）およびＷＯ９５／０３２８３（例えば、化合物ＺＭ１０５１８０、例えば、トラスツズマブ（ヘルセプチン(HERCEPTIN）(登録商標)）、セツキシマブ、イレッサ(Iressa)、ＯＳＩ−７７４、ＣＩ  １０３３、ＥＫＢ−５６９、ＧＷ−２０１６、Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３またはＥ７．６．３）に開示されている化合物、タンパク質またはモノクローナル抗体、およびＷＯ０３／０１３５４１に開示されている７Ｈ−ピロロ−［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体、エルロチニブ(erlotinib)およびゲフィチニブ(gefitinib)。エルロチニブは例えばＴＡＲＣＥＶＡなどの市販されているような形態で投与することができ、ゲフィチニブは、ＡＢＸ−ＥＧＦＲを含む上皮細胞増殖因子受容体に対するヒトモノクローナル抗体であるイレッサとして投与することができる。
ｘｖ）セリン／セロニン(theronine)ｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物、特に、ｍＴＯＲキナーゼファミリーのメンバーを標的化／阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、ＲＡＤ、ＲＡＤ００１、ＣＣＩ−７７９、ＡＢＴ５７８、ＳＡＲ５４３、ラパマイシンおよびその誘導体／類似体、AriadからのＡＰ２３５７３およびＡＰ２３８４１、エベロリムス(everolimus)（ＣＥＲＴＩＣＡＮ）およびシロリムス(sirolimus)。ＣＥＲＴＩＣＡＮ（エベロリムス、ＲＡＤ）は、Ｔ細胞および血管平滑筋細胞の増殖を妨げる研究中の新規な増殖シグナル阻害剤である。
【０２８５】
抗体という場合には、完全なモノクローナル抗体、ナノボディー、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体からなる多重特異性抗体、および所望の生物活性を示す限り抗体フラグメントを含む。
【０２８６】
本明細書において「タンパク質または脂質ホスファターゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物」とは、限定されるものではないが、ホスファターゼ１、ホスファターゼ２Ａ、ＰＴＥＮまたはＣＤＣ２５の阻害剤、例えば、オカダ酸またはその誘導体が含まれる。
【０２８７】
本明細書において「モノクローナル抗体」とは、限定されるものではないが、ベバシズマブ(bevacizumab)、セツキシマブ(cetuximab)、トラスツズマブ(trastumab)、イブリツモマブチウキセタン(Ibritumomab tiuxetan)、デノスマブ(denosumab)、抗ＣＤ４０、抗ＧＭ−ＣＳＦ、およびトシツモマブ(tositumomab)およびヨウ素Ｉ１３１が含まれる。ベバシズマブは例えばＡＶＡＳＴＩＮなどの市販されているような形態で投与することができ；セツキシマブはＥＲＢＩＴＵＸとして；トラスツズマブはＨＥＲＣＥＰＴＩＮとして；リツキシマブはＭＡＢＴＨＥＲＡとして；イブリツモマブチウキセタンはＺＥＶＵＬＩＮとして；抗ＲＡＮＫＬはデノスマブ（ＡＭＧ１６２）として；抗ＣＤ４０はＨＣＤ１２２（米国特許出願２００２−０１０６３７１）として；トシツモマブおよびヨウ素Ｉ１３１はＢＥＸＸＡＲとして投与することができる。
【０２８８】
「さらなる抗脈管形成化合物」としては、限定されるものではないが、それらの活性に関して別の機構を有する、例えば、タンパク質または脂質キナーゼ阻害とは無関連の化合物、例えば、サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ）およびＴＮＰ−４７０が含まれる。
【０２８９】
本明細書において「細胞分化プロセスを誘導する化合物」とは、限定されるものではないが、レチノイン酸、α−、γ−もしくはδ−トコフェロール、またはα−、γ−もしくはδ−トコトリエノールが含まれる。
【０２９０】
本明細書において「シクロオキシゲナーゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、例えば、Ｃｏｘ−２阻害剤、５−アルキル置換２−アリールアミノフェニル酢酸および誘導体、例えば、セレコキシブ(celecoxib)（ＳＥＬＥＢＲＥＸ）、ロフェコキシブ(rofecoxib)（ＶＩＯＸＸ）、エトリコキシブ(etricoxib)、バルデコキシブ(valdecoxib)または５−アルキル−２−アリールアミノフェニル酢酸、例えば、５−メチル−２−（２’−クロロ−６’−フルオロアニリノ）フェニル酢酸、ルミラコキシブ(lumiracoxib)が含まれる。
【０２９１】
本明細書において「ビスホスホネート」としては、限定されるものではないが、エトリドン酸(etridonic)、クロドロン酸、チルドロン酸、パミドロン酸、アレンドロン酸、イバンドロン酸、リセドロン酸およびゾレンドロン酸が含まれる。「エトリドン酸(etridonic acid)」は、例えば、ＤＩＤＲＯＮＥＬなどの市販されているような形態で投与することができ；「クロドロン酸」はＢＯＮＥＦＯＳとして；「チルドロン酸」はＳＫＥＬＩＤとして、「パミドロン酸」はＡＲＥＤＩＡとして；「アレンドロン酸」はＦＯＳＡＭＡＸとして；「イバンドロン酸」はＢＯＮＤＲＡＮＡＴとして；「リセドロン酸」はＡＣＴＯＮＥＬとして；また、「ゾレンドロン酸」はゾメタとして投与することができる。
【０２９２】
本明細書において「ヘパラナーゼ阻害剤」とは、ヘパリン硫酸の分解を標的化、低減または阻害する化合物を指す。この用語には、限定されるものではないが、ＰＩ８８が含まれる。
【０２９３】
本明細書において「生物反応修飾物質」としては、限定されるものではないが、リンホカインまたはインターフェロン、例えば、インターフェロンγが含まれる。
【０２９４】
本明細書において「Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤」としては、限定されるものではないが、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−ＲａｓまたはＮ−Ｒａｓが挙げられ、本明細書においては、Ｒａｓの発癌活性を標的化、低減または阻害する化合物、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）、例えば、Ｌ−７４４８３２、ＤＫ８Ｇ５５７またはＲ１１５７７７（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ）を指す。
【０２９５】
本明細書において「テロメラーゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、テロメラーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。テロメラーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物は特にテロメラーゼ受容体を阻害する化合物、例えば、テロメスタチン(telomestatin)である。
【０２９６】
本明細書において「マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤」または（ＭＭＰ阻害剤）としては、限定されるものではないが、コラーゲンペプチドミメティックおよび非ペプチドミメティック阻害剤；テトラサイクリン誘導体、例えば、ヒドロキサメートペプチドミメティック阻害剤バチマスタット(batimastat)；およびその経口により生体利用可能な類似体マリマスタット(marimastat)（ＢＢ−２５１６）、プリノマスタット(prinomastat)（ＡＧ３３４０）、メタスタット(metastat)（ＮＳＣ６８３５５１）ＢＭＳ２７９２５１、ＢＡＹ１２−９５６６、ＴＡＡ２１１、ＭＭＩ２７０ＢまたはＡＡＪ９９６が含まれる。
【０２９７】
本明細書において「メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、メチオニンアミノペプチダーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。メチオニンアミノペプチダーゼの活性を標的化、低減または阻害する化合物としては、例えば、ベンガミド(bngamide)またはその誘導体がある。
【０２９８】
本明細書において「プロテアソーム阻害剤」としては、プロテオソームの活性を標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。プロテオソームの活性を標的化、低減または阻害する化合物としては、限定されるものではないが、ＰＳ−３４１、ＭＬＮ３４１、ボルテゾミブ(bortezomib)またはベルケード(Velcade)が含まれる。
【０２９９】
本明細書において「血液性悪性疾患の処置に用いられる薬剤」としては、限定されるものではないが、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ受容体（Ｆｌｔ−３Ｒ）の活性を標的化、低減または阻害する化合物；インターフェロン、１−ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａ−ｃ）およびビスルファン(bisulfan)；およびＡＬＫ阻害剤、例えば、未分化リンパ腫キナーゼを標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。
【０３００】
本明細書において「Ｆｌｔ−３の活性を標的化、低減または阻害する化合物」としては、限定されるものではないが、Ｆｌｔ−３を阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、Ｎ−ベンゾイル−スタウロスポリン、ミドスタウリン(midostaurin)、スタウロスポリン(staurosporine)誘導体、ＳＵ１１２４８およびＭＬＮ５１８が含まれる。
【０３０１】
本明細書において「ＨＳＰ９０阻害剤」としては、限定されるものではないが、ＨＳＰ９０の内因性ＡＴＰアーゼ活性を標的化、低減または阻害する化合物；ユビキチンプロテオソーム経路を介してＨＳＰ９０クライエントタンパク質を分解、標的化、低減または阻害する化合物が含まれる。ＨＳＰ９０の内因性アＡＴＰアーゼ活性を標的化、低減または阻害する化合物としては、特に、ＨＳＰ９０のＡＴＰアーゼ活性を阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、１７−アリルアミノ、１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）、ゲルダナマイシン誘導体；他のゲルダナマイシン関連化合物；ラディシコール(radicicol)およびＨＤＡＣ阻害剤がある。
【０３０２】
本明細書において「抗増殖性の抗体」としては、限定されるものではないが、トラスツズマブ(trastuzumab)（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、トラスツズマブ−ＤＭ１、エルロチニブ(erlotinib)（ＴＡＲＣＥＶＡ）、ベバシズマブ(bevacizumab)（ＡＶＡＳＴＩＮ）、リツキシマブ(rituximab)（ＲＩＴＵＸＡＮ）、ＰＲＯ６４５５３（抗ＣＤ４０）および２Ｃ４抗体が含まれる。抗体とは、例えば、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全抗体からなる多重特異性抗体、および所望の生物活性を示す限り抗体フラグメントを含む。
【０３０３】
本明細書において「ＨＤＡＣ阻害剤」とは、ヒストンデアセチラーゼを阻害し、抗増殖活性を有する化合物に関する。これには限定されるものではないが、ＷＯ０２／２２５７７に開示されている化合物、特に、Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−［［（２−ヒドロキシエチル）［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミド、およびＮ−ヒドロキシ−３−［４−［［［２−（２−メチル−１Ｈ−インドール    −３−イル）−エチル］−アミノ］メチル］フェニル］−２Ｅ−２−プロペンアミドおよびその薬学的に許容される塩（ＬＢＨ５８９）が含まれる。さらに特に、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）；［４−（２−アミノ−フェニルカルバモイル）−ベンジル］−カルバミン酸ピリジン−３−イルメチルエステルおよびその誘導体；酪酸、ピロキシアミド、トリコスタチンＡ（trichostatin A)、オキサムフラチン(Oxamflatin)、アピシジン(apicidin)、デプシペプチド(Depsipeptide)；デプデシン(depudecin)およびトラポキシン(trapoxin)も含まれる。
【０３０４】
本明細書において「セリン／セロニン(theronine)ｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物」としては、限定されるものではないが、ｍＴＯＲキナーゼファミリーのメンバーを標的化／阻害する化合物、タンパク質または抗体、例えば、ＲＡＤ、ＲＡＤ００１、ＣＣＩ−７７９、ＡＢＴ５７８、ＳＡＲ５４３、ラパマイシンおよびその誘導体／類似体、AriadからのＡＰ２３５７３およびＡＰ２３８４１、エベロリムス(everolimus)（ＣＥＲＴＩＣＡＮ）およびシロリムス(sirolimus)（ＲＡＰＡＭＵＮＥ）、ＣＣＩ−７７９およびＡＢＴ５７８が含まれる。ＣＥＲＴＩＣＡＮ（エベロリムス、ＲＡＤ）は、Ｔ細胞および血管平滑筋細胞の増殖を妨げる研究中の新規な増殖シグナル阻害剤である。
【０３０５】
本明細書において「ソマトスタチン受容体拮抗薬」としては、限定されるものではないが、ソマトスタチン受容体を標的化、低減または阻害する薬剤、例えば、オクトレオリド(octreoride)およびＳＯＭ２３０が含まれる。
【０３０６】
本明細書において「抗白血病化合物」としては、限定されるものではないが、デオキシシチジンの２’−α−ヒドロキシリボース（アラビノシド）誘導体であるピリミジン類似体Ａｒａ−Ｃが含まれる。また、ヒポキサンチンのプリン類似体である６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）およびリン酸フルダラビンも含まれる。
【０３０７】
「腫瘍細胞傷害アプローチ」とは、電離放射線などのアプローチを指す。以上および以下でいう「電離放射線」とは、Ｘ線およびγ線などの電磁線か、またはα、βおよびγ粒子などの粒子のいずれかとして生じる電離放射線を意味する。電離放射線療法は限定されるものではないが、放射線療法で提供され、当技術分野で公知である。Hellman, Cancer, 4th Edition, Vol. 1, Devita et al., Eds., pp. 248−275 (1993)参照。
【０３０８】
本明細書において「ＥＤＧ結合剤」としては、限定されるものではないが、ＦＴＹ７２０などのリンパ球の再循環を変調する免疫抑制薬の一種が含まれる。
【０３０９】
本明細書において「リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、ピリミジンまたはプリンヌクレオシド類似体、限定されるものではないが、フルダラビンおよび／またはａｒａ−Ｃなど；６−チオグアニン；５−ＦＵ；クラドリビン(cladribine)；６−メルカプトプリン、特に、ＡＬＬに対するａｒａ−Ｃと組み合わせたもの；および／またはペントスタチンが含まれる。リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤は、特に、ヒドロキシ尿素または２−ヒドロキシ−１Ｈ−イソインドール−１，３−ジオン誘導体、例えば、ＰＬ−１、ＰＬ−２、ＰＬ−３、ＰＬ−４、ＰＬ−５、ＰＬ−６、ＰＬ−７またはＰＬ８である。Nandy et al., Acta Oncologica, Vol. 33, No. 8, pp. 953−961 (1994)参照。
【０３１０】
本明細書において「Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤」としては、限定されるものではないが、米国特許第５，４６１，０７６号に開示されている化合物が含まれる。
【０３１１】
本明細書において「ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体」としては、限定されるものではないが、ＷＯ９８／３５９５８に開示されている化合物、例えば、１−（４−クロロアニリノ）−４−（４−ピリジルメチル）フタラジンまたはその薬学的に許容される塩、例えば、コハク酸塩、またはＷＯ００／０９４９５、ＷＯ００／２７８２０、ＷＯ００／５９５０９、ＷＯ９８／１１２２３、ＷＯ００／２７８１９およびＥＰ０７６９９４７に開示されている化合物；Prewett et al., Cancer Res, Vol. 59, pp. 5209−5218 (1999); Yuan et al., Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 93, pp. 14765−14770 (1996); Zhu et al., Cancer Res, Vol. 58, pp. 3209−3214 (1998);およびMordenti et al., Toxicol Pathol, Vol. 27, No. 1, pp. 14−21 (1999)、ＷＯ００／３７５０２およびＷＯ９４／１０２０２に記載されているもの；O’Reilly et al., Cell, Vol. 79, pp. 315−328 (1994)により記載されているアンギオスタチン(ANGIOSTATIN)；O’Reilly et al., Cell, Vol. 88, pp. 277−285 (1997)により記載されているエンドスタチン (ENDOSTATIN)；アントラニル酸アミド；ＺＤ４１９０；ＺＤ６４７４；ＳＵ５４１６；ＳＵ６６６８；ベバシズマブ(bevacizumab)；または抗ＶＥＧＦ抗体または抗ＶＥＧＦ受容体抗体、例えば、ｒｈｕＭＡｂおよびＲＨＵＦａｂ；ＶＥＧＦアプタマー、例えば、Ｍａｃｕｇｏｎ；ＦＬＴ−４阻害剤；ＦＬＴ−３阻害剤；ＶＥＧＦＲ−２  ＩｇＧ１抗体；Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ（ＲＰＩ  ４６１０）；およびＡｖａｓｔａｎが含まれる。
【０３１２】
本明細書において「光線力学療法」とは、癌を治療または予防するための光増感剤として知られるある種の化学物質を使用する療法を指す。光線力学療法の例としては、限定されるものではないが、例えば、ＶＩＳＵＤＹＮＥおよびポルフィマーナトリウムなどの薬剤による処置が含まれる。
【０３１３】
本明細書において「脈管形成抑制ステロイド」としては、限定されるものではないが、脈管形成を遮断または阻害する薬剤、例えば、アネコルタブ(anecortave)、トリアムシノロン(triamcinolone)、ヒドロコルチゾン、１１−α−エピヒドロコルチゾール、コルテキソロン(cortexolone)、１７α−ヒドロキシプロゲステロン、コルチコステロン、デオキシコルチコステロン、テストステロン、エストロンおよびデキサメタゾンが含まれる。
【０３１４】
本明細書において「コルチコステロイド含有インプラント」としては、限定されるものではないが、例えば、フルオシノロン(fluocinolone)およびデキサメタゾン(dexamethasone)などの薬剤が含まれる。
【０３１５】
本明細書において「ＡＴ１受容体拮抗薬」としては、限定されるものではないが、ＤＩＯＶＡＮなどの薬剤が含まれる。
【０３１６】
本明細書において「ＡＣＥ阻害剤」としては、限定されるものではないが、ＣＩＢＡＣＥＮ、ベナゼプリル(benazepril)、エナゼプリル(enazepril)（ＬＯＴＥＮＳＩＮ）、カプトプリル(captopril)、エナラプリル(enalapril)、フォシノプリル(fosinopril)、リシノプリル(lisinopril)、モエキシプリル(moexipril)、キナプリル(quinapril)、ラミプリル(ramipril)、ペリノドプリル(perindopril)およびトランドラプリル(trandolapril)が含まれる。
【０３１７】
他の薬学的に活性な薬剤としては、限定されるものではないが、植物アルカロイド、ホルモン剤および拮抗薬、生物反応修飾物質、好ましくは、リンホカインまたはインターフェロン、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド誘導体；または種々雑多な薬剤、もしくは他の作用機序または未知の作用機序の薬剤が含まれる。
【０３１８】
特に個々の化合物のクレームおよびその中の実施例の最終生成物に関して、特許出願または化学刊行物の引例が示されている各場合において、主要な最終生成物、医薬製剤およびクレームは出典明示により本明細書の一部とされる。同様に、そこに開示されている、対応する立体異性体ならびに対応する結晶変態、例えば、溶媒和物および多型も含まれる。本明細書に開示される組合せで有効成分として用いられる化合物は、それぞれ引用されている文献に記載されているように調製および投与することができる。
【０３１９】
コード番号、一般名または商標により識別される活性剤の構造は、標準的な大要の最新版「The Merck Index」またはデータベース、例えば、Patents International、例えば、IMS World Publicationsまたは以上および以下に述べられている刊行物から入手することができる。対応するその内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０３２０】
成分（ａ）および（ｂ）という場合にはそのいずれの有効物質の薬学的に許容される塩も含むことを意味すると理解される。成分（ａ）および／または（ｂ）からなる有効物質が例えば少なくとも１つの塩基中心を有する場合、それらは酸付加塩を形成することができる。また、所望により付加的に存在する塩基中心を有する対応する酸付加塩も形成可能である。酸性基、例えばＣＯＯＨを有する有効物質は塩基を伴って塩を形成することができる。成分（ａ）および／または（ｂ）からなる有効物質またはその薬学的に許容される塩はまた水和物の形態で使用することもでき、あるいは結晶化に用いられる他の溶媒を含むこともできる。
【０３２１】
よって、第１の態様において、本発明は、哺乳類、好ましくはヒト患者において持続的脈管形成により誘発される増殖性疾患の予防処置のための方法に関し、その方法は患者を薬学的に有効な量の、
（ａ）ｃ−Ｍｅｔ抗体アンタゴニスト組成物と
（ｂ）薬学的に活性な薬剤
との組合せで並行または逐次処置することを含む。
【０３２２】
好ましい実施形態において、本発明は、
（ａ）ｃ−Ｍｅｔ抗体アンタゴニスト組成物と
（ｂ）アロマターゼ阻害剤；抗エストロゲン作用薬；抗アンドロゲン作用薬；ゴナドレリン作用薬；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；微小管活性剤；アルキル化剤；抗新生物性代謝拮抗剤；プラチン化合物；タンパク質もしくは脂質キナーゼ活性またはタンパク質もしくは脂質ホスファターゼ活性を標的化／低減する化合物、抗脈管形成化合物；細胞分化プロセスを誘導する化合物；モノクローナル抗体；シクロオキシゲナーゼ阻害剤；ビスホスホネート；ヘパラナーゼ阻害剤；生物反応修飾物質；Ｒａｓ発癌性イソ型の阻害剤；テロメラーゼ阻害剤；プロテアーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メチオニンアミノペプチダーゼ阻害剤；プロテアソーム阻害剤；Ｆｌｔ−３の活性を標的化、低減または阻害する薬剤；ＨＳＰ９０阻害剤；抗増殖性の抗体；ＨＤＡＣ阻害剤；セリン／セロニン(theronine)ｍＴＯＲキナーゼの活性／機能を標的化、低減または阻害する化合物；ソマトスタチン受容体拮抗薬；抗白血病化合物；腫瘍細胞傷害アプローチ；ＥＤＧ結合剤；リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；Ｓ−アデノシルメチオニンデカルボキシラーゼ阻害剤；ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲのモノクローナル抗体；光線力学療法；脈管形成抑制ステロイド；コルチコステロイド含有インプラント；ＡＴ１受容体拮抗薬；およびＡＣＥ阻害剤からなる群から選択される１以上の薬学的に活性な薬剤
を含む医薬製剤を提供する。
【０３２３】
成分（ａ）および（ｂ）の組合せ、これらの２成分を投与することを含む温血動物の処置方法、同時使用、個別使用または逐次使用のためのこれらの２成分を含む医薬組成物、増殖性疾患の進行の遅延もしくは処置のため、またはこれらの目的の医薬製剤の製造のための該組合せの使用、またはこのような成分（ａ）と（ｂ）の組合せを含む市販製品（全て上述または上記で定義される通り）は以下、本発明の組合せとも呼ぶ（従って、この用語は、適当であれば、この用語をそのように置き換えることができるこれらの実施形態の各々を指す）。
【０３２４】
同時投与は、例えば、２以上の有効成分の１つの定まった組合せの形態で、または独立に調剤された２以上の有効成分を同時に投与することにより行うことができる。逐次使用（投与）は好ましくは、ある時点での組合せの１つ（または１以上）の成分の投与と異なる時点での他の成分の投与、すなわち、長期間の交互投与を意味し、その結果好ましくは、この組合せは単独成分の独立投与よりも高い有効性を示す（特に相乗効果を示す）。個別使用（投与）は好ましくは、異なる時点での組合せ成分の互いに独立の投与を意味し、好ましくは、成分（ａ）と（ｂ）が、両化合物の測定可能な血中レベルの重複が、重複する様式では（同時には）存在しないように投与されることを意味する。
【０３２５】
また、２以上の逐次、個別および同時投与の組合せも可能であり、好ましくは、その結果、この組合せ成分薬は、その組合せ成分薬が、それらの治療有効性に対して相互作用が見られないほど長い間隔で独立に使用される場合に見られる作用を超える共働治療効果を示す（相乗効果が特に好ましい）。
【０３２６】
本明細書において「進行の遅延」とは、処置される疾病の最初の徴候または再発の前段階または初期段階にある患者、例えば対応する疾病の前形態が診断される患者、または例えば医療処置中の症状もしくは対応する疾病が発症するおそれのある偶発症候の結果起こる症状にある患者に対する組合せの投与を意味する。
【０３２７】
「共働治療活性」または「共働治療効果」は、当該化合物が、それらが好ましくは処置される温血動物、特にヒトにおいてなお（好ましくは相乗的）相互作用（共働治療効果）を示すような時間間隔で個別に（長期交互様式、特に、順序特異的様式）で与えられ得ることを意味する。これがその場合であるかどうかは、とりわけ血中レベルを追跡して、両化合物が少なくとも一定期間、処置されるヒトの血中に存在することを示すことにより決定することができる。
【０３２８】
「薬学的に有効」とは、好ましくは、増殖性疾患の進行に対して治療上、または広義にまたは予防上も有効である量に関する。
【０３２９】
本明細書において「市販パッケージ」または「製品」は、特に、上記で定義される成分（ａ）と（ｂ）が独立に、または異なる量の成分（ａ）と（ｂ）を含む種々の一定組合せの使用により、すなわち、同時にまたは異なる時点で投与可能であるという意味において「パーツキット」を定義する。さらに、これらの用語は、成分（ａ）と（ｂ）を有効成分として含む（特に組み合わせた）市販パッケージを、増殖性疾患の進行の遅延または処置におけるその同時使用、逐次使用（好ましくは時間指定順序における長期交互使用）または（好ましいとは言えないが）個別使用に関する使用説明書とともに含む。よって、当該パーツキットの各パーツは例えば、同時、または長期交互、すなわち、パーツキットの各パーツに関して異なる時点で、等時間間隔または異なる時間間隔で投与することができる。極めて好ましくは、この時間間隔は、各パーツの併用における処置される疾病に対する効果が、これらの組合せ相手（ａ）および（ｂ）のいずれか一方のみの使用により得られる効果よりも大きくなるように（標準的方法に従って判定できる）選択される。組合せ製剤における組合せ相手（ａ）と組合せ相手（ｂ）の投与総量の比は、例えば、処置される患者の部分集団の必要または単独の患者の必要に見合うように変更可能であり、この必要の違いは、特定の疾病、患者の年齢、性別、体重などによるものであり得る。好ましくは、少なくとも１つの有益な作用、例えば、組合せ相手（ａ）と（ｂ）の効果の相互増強、特に、相加的効果よりも高い効果があり、ゆえに、組み合わせずに個々の薬剤だけで処置した場合に許容可能なものよりもそれぞれ低用量のこれらの各組合せ薬で達成され、例えば副作用の低減などのさらなる有利な効果、または組合せ相手（成分）（ａ）と（ｂ）の一方または双方の非有効用量における組合せ治療効果、極めて好ましくは組合せ相手（ａ）と（ｂ）の強力な相乗効果をもたらす。
【０３３０】
成分（ａ）と（ｂ）の組合せの使用および市販パッケージの使用の双方の場合、同時使用、逐次使用および個別使用のいずれの組合せも可能であり、これは成分（ａ）と（ｂ）が一時点で同時に投与した後、後の時点で宿主毒性のより低い一方の成分のみを、例えば１日量を３〜４週間を超えるような長期にわたって投与し、その後、他方の成分を投与するか、またはさらにその後の時点で両成分の組合せを投与する（引き続いて、最適な抗腫瘍作用のための薬物組合せ治療コースを行う）などが可能である。
【０３３１】
本発明の組合せはまた、例えば外科的介入、温熱療法および／または放射線療法などの他の処置との組合せにも適用することができる。
【０３３２】
本発明の医薬組成物は常法によって調製することができ、ヒトを含む哺乳類に対する経口または直腸などの腸内投与、および非経口投与に好適なものであり、治療上有効な量のＶＥＧＦ阻害剤と少なくとも１つの薬学的に活性な薬剤単独、または１以上の薬学的に許容される担体、特に腸内適用もしくは非経口適用に好適なものとの組合せを含む。
【０３３３】
医薬組成物は約０．００００２〜約１００％、特に例えば即使用可能な注入希釈液の場合には０．０００１〜０．０２％、または例えば注射もしくは注入用濃縮物または特に非経口製剤の場合には約０．１％〜約９５％、好ましくは約１％〜約９０％、より好ましくは約２０％〜約６０％の有効成分（各場合ともｗ／ｗ）を含む。本発明の医薬組成物は例えば、アンプル、バイアル、糖衣錠、錠剤、点滴バッグまたはカプセルの形態などの単位投与形であり得る。
【０３３４】
本発明の製剤に使用される各組合せ相手の有効用量は、使用する特定の化合物または医薬組成物、投与様式、処置される症状および処置される症状の重篤度によって異なり得る。熟練の医師、臨床家または獣医であれば、その症状を予防、治療または進行を抑制するのに必要な各有効成分の有効量を容易に決定することができる。
【０３３５】
チルホスチン、特に、アダホスチンは好ましくは、温血動物、特にヒトに、約１〜６０００ｍｇ／日、より好ましくは２５〜５０００ｍｇ／日、最も好ましくは５０〜４０００ｍｇ／日の範囲の用量で投与される。特に断りのない限り、化合物は好ましくは１日に５回まで、特に１〜４回投与される。
【０３３６】
腸内または非経口投与を目的とする併用療法のための医薬製剤は、例えば、糖衣錠、カプセル剤または坐剤およびさらにはアンプルなどの単位投与形である。特に断りのない限り、これらの製剤は常法、例えば、通常の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥プロセスにより調製される。必要な有効量は複数の用量単位の投与により達成することができるので、各投与形の個々の用量中に含まれる組合せ相手の単位含量はそれ自体で有効量を構成する必要はないと考えられる。当業者であれば、組合せ成分の適当な薬学的有効量を決定することができる。
【０３３７】
好ましくは、当該化合物またはその薬学的に許容される塩は、錠剤、カプセル剤もしくはシロップ剤の形態で経口医薬製剤として、または適当であれば非経口注射剤として投与される。
【０３３８】
経口投与用組成物を調製する場合、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などのいずれの薬学的に許容される媒体を用いてもよい。薬学的に許容される担体としては、デンプン、糖類、微晶質セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤が挙げられる。
【０３３９】
有効成分の溶液、また、懸濁液、特に、等張水溶液または懸濁液は、有効成分の非経口投与に有用であり、例えば、有効成分単独をまたは例えばマンニトールなどの薬学的に許容される担体とともに含む凍結乾燥組成物の場合、このような溶液または懸濁液は使用前に作製することができる。当該医薬組成物は滅菌可能であり、かつ／または例えば保存剤、安定剤、湿潤剤および／または乳化剤、可溶化剤、浸透圧を調整するための塩および／またはバッファーなどの賦形剤を含むことができ、例えば通常の溶解または凍結乾燥プロセスなどの、それ自体既知の方法で調製される。これらの溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンなどの増粘物質を含んでもよい。油中の懸濁液は油成分として注射用に慣例の植物油、合成油または半合成油を含む。
【０３４０】
等張化剤は、例えばマンニトール、デキストロース、グルコースおよび塩化ナトリウムなど、当技術分野で公知のもののいずれから選択してもよい。注入製剤は水性媒体で希釈可能である。希釈剤として使用する水性媒体の量は、輸液中の有効成分の所望の濃度に応じて選択する。輸液は抗酸化剤など、静脈投与される製剤中に汎用される他の賦形剤を含んでもよい。
【０３４１】
本発明はさらに、本明細書において、上記に定義された組合せ相手（ａ）と（ｂ）が独立に、または量の異なる組合せ相手（ａ）と（ｂ）を含む種々の一定組合せの使用により、すなわち同時または異なる時点で投与することができるという意味において特に「パーツキット」を定義する「組合せ製剤」に関する。次に、このパーツキットの各パーツは、例えば同時にまたは長期で交互に、すなわち、そのパーツキットの各パーツに関して異なる時点で、等時間間隔または異なる時間間隔で投与することができる。組合せ製剤における組合せ相手（ａ）と組合せ相手（ｂ）の投与総量の比は、例えば、患者が受ける副作用の重篤度に基づき、処置される患者の部分集団の必要または単独の患者の必要に見合うように変更可能である。
【０３４２】
本発明の使用および方法
本発明の抗体（ならびに免疫複合体および二重特異性分子）はin vitroおよびin vivoで診断上および治療上有用である。例えば、これらの分子は、例えばin vitroまたはin vivoにおいて培養細胞に、あるいは例えばin vivoにおいて対象に投与して種々の障害を治療、予防または診断することができる。本明細書において「対象」とは、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。非ヒト動物としては、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリなどの哺乳類、ならびに鳥類、両生類および爬虫類などの非哺乳類が挙げられる。当該方法は異常なｃ−Ｍｅｔ発現に関連する障害を有するヒト患者を処置するのに特に好適である。ｃ−Ｍｅｔに対する抗体が別の薬剤とともに投与される場合、この２つは順次または同時のいずれかで投与することができる。
【０３４３】
一実施形態では、本発明の抗体（ならびに免疫複合体および二重特異性分子）は、ｃ−Ｍｅｔのレベルまたはｃ−Ｍｅｔを含む細胞のレベルを検出するために使用することができる。これは例えば、サンプル（in vitroサンプルなど）および対照サンプルを抗ｃ−Ｍｅｔ抗体と、その抗体とｃ−Ｍｅｔ間の複合体の形成を可能とする条件下で接触させることにより行うことができる。抗体とｃ−Ｍｅｔ間で形成された複合体を検出し、サンプルと対照とで比較する。例えばＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイなどの当技術分野で周知の標準的検出法を、本発明の組成物を用いて行うことができる。
【０３４４】
よって、一態様において、本発明はさらに、サンプル中のｃ−Ｍｅｔ（例えばヒトｃ−Ｍｅｔ抗原）の存在を検出するか、またはｃ−Ｍｅｔ量を測定する方法を提供し、その方法は、サンプルおよび対照サンプルをｃ−Ｍｅｔと特異的に結合する本発明の抗体またはその抗原結合部分と、その抗体またはその一部とｃ−Ｍｅｔ間で複合体の形成を可能とする条件下で接触させることを含む。その後、この複合体の形成を検出し、サンプルと対照サンプルを比較した複合体の形成の違いがサンプル中のｃ−Ｍｅｔ存在の指標となる。
【０３４５】
また、本発明の組成物（例えば、抗体、ヒト抗体、免疫複合体および二重特異性分子）と使用説明書からなるキットも本発明の範囲内にある。当該キットはさらに少なくとも１種類の付加的試薬または本発明の１以上の付加的抗体（例えば、第一の抗体とは異なる標的抗原上のエピトープと結合する相補的活性を有する抗体）を含むことができる。キットは一般に、キットの内容の意図した目的を示したラベルを含む。ラベルとは、キット上またはキットとともに供給される、またはそうでなければキットに不随する書類、または記録材料を含む。
【０３４６】
本発明を詳しく述べてきたが、以下の実施例および特許請求の範囲でさらに本発明を説明する。なお、これらは例示であり、さらなる限定を意味するものではない。当業者であれば、慣例の試験のみを用い、本明細書に記載の特定の手順に対する多くの等価なものを認識するか、または確認することが可能である。このような等価なものは本発明および特許請求の範囲内にある。本願に引用されている、発行特許および公開特許出願を含む全ての刊行物の内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【実施例】
【０３４７】
実施例１：ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーからのヒトｃ−Ｍｅｔ特異的抗体の作製
ヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質に対する治療用抗体は、抗体変異体タンパク質の供給源として市販のファージディスプレーライブラリーであるＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを用い、高い結合親和性を有するクローンの選択により作製する。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）は、全てのＣＤＲが適当な突然変異により多様化され、ファージ表面へのＦａｂフラグメントの結合にＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いた（ＷＯ０１／０５９５０  Ｌｏｈｎｉｎｇ  ２００１）Ｆａｂライブラリーである(Knappik et al., 2000 J.Mol. Biol. 296:57−86; Krebs et al., 2001 J Immunol. Methods 254:67−84; Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194−38205)。
【０３４８】
一般法：ファージミドレスキュー、ファージの増幅および精製
このＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーを、標準的な富化細菌培地（２ｘＹＴ）に３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含有させたもの（２ｘＹＴ−ＣＧ）で増幅させる。細胞をＯＤ６００ｎｍ値０．５にてＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに感染させた（細胞とファージの混合物を振盪させずに３７℃で３０分間、その後、２５０ｒｐｍで振盪させつつ３７℃で３０分間インキュベーション）後、細胞を遠心分離し（４１２０ｇ；５分；４℃）、２ｘＹＴ／３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌカナマイシン／０．２５ｍＭ  ＩＰＴＧに再懸濁させ、２２℃で一晩増殖させる。この終了時に、細胞を遠心分離により除去し、ファージを上清から２回ＰＥＧで沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセロールに再懸濁させ、−８０℃で保存する。
【０３４９】
２回のパンニング間のファージの増幅は次のようにして行う：対数増殖期中の大腸菌ＴＧ１株の細胞をファージに感染させ、ｃ−Ｍｅｔタンパク質で選択した後に溶出し、１％グルコースおよび３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加したＬＢ−寒天（ＬＢ−ＣＧプレート）上に播種する。これらのプレートを３０℃で一晩インキュベーションした後、細菌コロニーを寒天表面から掻き取り、これを用いて２ｘＹＴ−ＣＧ培養液にＯＤ６００ｎｍ値０．５となるまで接種した後、上記のように生産的感染が得られるようＶＣＳＭ１３ヘルパーファージに加える。
【０３５０】
Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ磁性ビーズを用いる液相パンニングに関する予備実験
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩはＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎマトリックスに対して親和性が低いことが報告されており(Voss and Skerra, 1997 Protein Eng. 10:975−982によれば、ＫＤ〜１μＭ）、従って、抗体選択中の抗原の捕捉にＳｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎコーティングＭａｇＳｔｒｅｐビーズを用いることの適性を評価するため、また、パンニング中の抗原の損失を避けるために予備実験を行う。
【０３５１】
この目的で、８ｍｇのＭａｇＳｔｒｅｐビーズを４６μｇのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔとともに室温で１時間インキュベートし、このサンプルを、予めブロッキングした４本のエッペンドルフ管に分注する。１本は陽性対照として用い（洗浄無し）、他の３本のサンプルはＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）手動パンニングのセクションに従って種々のストリンジェンシーで洗浄する。Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−ＭｅｔとＭａｇＳｔｒｅｐビーズ（IBA, Gottingen, Germanyから入手されるＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎコーティング磁性ビーズ）の結合の検出は、ヤギ抗ｃ−Ｍｅｔ抗体とルビジウム標識抗ヤギ検出抗体を用いてＢｉｏＶｅｒｉｓにて行う。
【０３５２】
本明細書の図面で示されるように、非洗浄ビーズを種々のＨｕＣＡＬ（登録商標）ストリンジェンシーで洗浄したビーズと比べた場合、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｃｔｉｎコーティングビーズからのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔの有意な損失は検出されない。よって、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎコーティング磁性ビーズ（ＭａｇＳｔｒｅｐビーズ）による液相パンニングにおいて使用するのに好適であると思われる。
【０３５３】
ライブラリーからのｃ−Ｍｅｔ特異的抗体のパンニングによる選択
ヒトｃ−Ｍｅｔを認識する抗体を選択するため、２種類のパンニング戦略を適用する。
【０３５４】
一般に、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージ−抗体を、種々の組合せのＶＨマスター遺伝子を含む４つのプールに分割する（プール１はＶＨ１／５λκを含み、プール２はＶＨ３λκを含み、プール３はＶＨ２／４／６λκを含み、プール４はＶＨ１−６λκを含む）。これらのプールに対してそれぞれ、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズ（Ｍｅｇａ  Ｓｔｒｅｐビーズ；ＩＢＡ）上に捕捉されたＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔで２回の液相パンニングを行い、３回目の選択だけは、ビオチン化抗ＡＰＰ抗体を用い、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズ上に捕捉されたＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔか、またはストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン；Ｄｙｎａｌ）により捕捉されたＡＰＰタグ付きヒトｃ−Ｍｅｔタンパク質のいずれかで行う。
【０３５５】
詳しくは、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズに結合されたＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔを用いる液相パンニングでは以下のプロトコールを適用する：ＰＢＳで１：１希釈した２ｘＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ  １．５ｍｌで４℃にて一晩処理することにより、プレブロッキング管（１．５ｍｌエッペンドルフ管）を調製する。プレブロッキングビーズは次のような処理により調製する：５８０μｌ（２８ｍｇビーズ）ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズを５８０μｌのＰＢＳで１回洗浄し、５８０μｌの１ｘＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（１容量の１ｘＰＢＳで希釈）に再懸濁させる。これらのビーズのブロッキングは４℃で一晩プレブロッキング管の中で行う。
【０３５６】
各パンニング条件について最終量５００μｌとなるようにＰＢＳで希釈したファージ粒子を５００μｌの２ｘＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ／０．１％Ｔｗｅｅｎと混合し、回転盤上で室温にて１時間維持する。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎまたはビーズ結合ファージを除去するため、ファージ粒子の予備吸着を２回行う：１６０μｌのブロッキング済みＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズ（４ｍｇ）をブロッキング済みファージ粒子に加え、回転盤上で室温にて３０分間インキュベートする。磁気ディバイス（Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−Ｅ）によりビーズを分離した後、ファージ上清（〜１．１ｍｌ）を新しいブロッキング済みの反応試験管に移し、１６０μｌのブロッキング済みビーズを用い、３０分間の予備吸着を繰り返す。その後、４００ｎＭまたは１００ｎＭのいずれかのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔを、新しいブロッキング済み１．５ｍｌ反応試験間中でブロッキング済みファージ粒子に加え、この混合物を回転盤上で室温にて６０分間インキュベートする。
【０３５７】
これらのファージ−抗原複合体を、それぞれ４００ｎＭまたは１００ｎＭファージパンニングプールに加えた３２０μｌまたは１６０μｌいずれかのブロッキング済みＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズを用いて捕捉させた後、回転盤上で室温にて２０分間インキュベートする。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズと結合しているファージ粒子を再び磁気粒子セパレーターで回収する。
【０３５８】
次に、ビーズをＰＢＳ／ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で７回洗浄した後、ＰＢＳのみでさらに３回洗浄する。ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ磁性ビーズからのファージ粒子の溶出は、各試験管に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、２０ｍＭのＤＴＴ２００μｌを１０分間加えることにより行う。溶出液を回収し、ビーズを２００μｌのＰＢＳで１回洗浄し、このＰＢＳ溶出液をＤＴＴ溶出液に加える。この溶出液サンプルを用い、事前にＯＤ６００ｎｍ値０．６〜０．８まで増殖させた大腸菌ＴＧ−１培養物１４ ｍｌに感染させる。
【０３５９】
感染およびその後の５０００ｒｐｍで１０分の遠心分離の後、各細菌ペレットを５００μｌの２ｘＹＴ培地に再懸濁させ、２ｘＹＴ−ＣＧ寒天プレートに播種し、３０℃で一晩インキュベートする。翌朝、得られたコロニーをプレートから掻き取り、上記のようなレスキューと増幅によりファージを調製する。
【０３６０】
Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔでの２回目の液相パンニングは、低い抗原量を用いること（５０ｎＭおよび１０ｎＭ）と洗浄手順のストリンジェンシーを適宜変更すること以外は１回目のプロトコールに従って行う。
【０３６１】
３回目の選択には、２種類の異なるパンニング戦略を適用し、２回目のパンニングの増幅ファージ産物を分割し、２種類の異なるパンニング条件に置く。ファージ産物の第一の半分は上記のようにＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎビーズ上に捕捉されたヒトＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔでの標準的なパンニング戦略に用いる（抗原量はそれぞれ１０ｎＭまたは１ｎＭ）。
【０３６２】
３回目の選択の第二のパンニングバリエーションはヒトＡＰＰタグ付きｃ−Ｍｅｔで行う。ＡＰＰタグ付きｃ−Ｍｅｔタンパク質を終濃度５０ｎＭまたは１０ｎＭで、予め明澄化した２回目のファージ粒子１ｍｌと混合し、この混合物を回転盤上で室温にて１時間インキュベートする。並行して、８ｍｇのプレブロッキングＤｙｎａｂｅａｓｅ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ）を４０μｇのビオチン化マウス抗ＡＰＰ抗体とともに回転盤上で室温にて３０分間インキュベートした後、ＰＢＳＴによる２回の洗浄工程を行う。ＡＰＰタグ付きｃ−Ｍｅｔと結合したファージ−抗体からなる事前に形成させた複合体を室温にて３０分間、抗ＡＰＰコーティングＭ−２８０ストレプトアビジン磁性ビーズにより捕捉させる。ファージの溶出および増幅は上記のように行う。
【０３６３】
可溶性Ｆａｂフラグメントのサブクローニングおよび発現
可溶性Ｆａｂの迅速かつ効率的な発現を助けるため、選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドのＦａｂコードインサートを発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにサブクローニングする（図面を参照）。このため、選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを制限酵素エンドヌクレアーゼＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、それによりＦａｂコードインサート（ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ）を切り出す。次に、このインサートをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨにクローニングする。
【０３６４】
このベクターからＦａｂタンパク質を発現させ、これは結果として検出および精製の双方のための２つのＣ末端タグ（それぞれＦＬＡＧ（商標）および６ｘＨｉｓ）を有する。
【０３６５】
大腸菌におけるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体の微小発現
上記で得られた各クローンによりコードされるタンパク質を十分量得るために、選択されたＦａｂをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨ発現ベクターにサブクローニングした後に、クロラムフェニコール耐性単一細菌コロニーを選択する。次に、これらの各コロニーを用い、無菌の９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル（各ウェルはウェル当たり１００μｌの２ｘＹＴ−ＣＧ培地を含む）に接種し、細菌を３７℃で一晩増殖させる。各大腸菌ＴＧ−１培養物サンプル（５μｌ）を、ウェル当たり３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび０．１％グルコースを添加した２ｘＹＴ培地１００μｌを予め満たした、新たな無菌の９６ウェルマイクロタイタープレートに移す。これらのマイクロタイタープレートを、培養物がＯＤ６００ｎｍ値約０．５の若干の濁りが出るまで（〜２〜４時間）、マイクロプレートシェーカー上で４００ｒｐｍにて振盪しながら３０℃でインキュベートする。
【０３６６】
これらのプレート形式における発現のため、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールおよび３ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加した２０μｌの２ｘＹＴ培地を各ウェルに加え（終濃度０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ）、これらのマイクロタイタープレートを通気性テープで封じ、４００ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートする。
【０３６７】
全細胞溶解液（ＢＥＬ抽出液）の作製            
これらの発現プレートの各ウェルに、２．５ｍｇ／ｍｌリゾチームを含有する４０μｌのＢＥＬバッファー（２ｘＢＢＳ／ＥＤＴＡ：２４．７ｇ／ｌホウ酸、１８．７ｇＮａＣｌ／ｌ、１．４９ｇＥＤＴＡ／ｌ、ｐＨ８．０）を加え、プレートをマイクロタイタープレートシェーカー（４００ｒｐｍ）上で２２℃にて１時間インキュベートする。これらのＢＥＬ抽出液をＦＭＡＴによる結合分析に用いる（実施例２参照）。
【０３６８】
大腸菌におけるマイクログラム量のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体の発現および精製
大腸菌ＴＧ１  Ｆ細胞における、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨによりコードされるＦａｂフラグメントの発現は、５０ｍｌのプラスチック試験管内で行う。このために、単一クローンを接種した前培養物を２ｘＹＴ−ＣＧ培地で３０℃にて一晩増殖させる。翌朝、各前培養物５０μｌを用い、無菌の５０ｍｌプラスチック試験管にて、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１ｍＭ  ＩＰＴＧおよび０．１％グルコースを添加した２５ｍｌ  ２ｘＹＴ培地に接種し、３０℃で一晩インキュベートする。大腸菌細胞を採取し、細胞ペレットを冷凍し、最後にＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ(Novagen)で破壊する。Ｆａｂフラグメントを、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて単離する。
【０３６９】
大腸菌におけるミリグラム量のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂ抗体の発現および精製
ＴＧ１  Ｆ細胞における、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨによりコードされるＦａｂフラグメントの発現は、３４μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを添加した７５０ｍｌの２ｘＹＴ培地を用い、振盪フラスコ培養にて行う。培養物を３０℃で、ＯＤ６００ｎｍ値が０．５に達するまで振盪させる。０．７５ｍＭ  ＩＰＴＧを加えることで発現を誘導した後、３０℃で２０時間インキュベートする。リゾチームを用いて細胞を破壊し、Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィー(Qiagen, Hilden, Germany)によりＦａｂフラグメントを単離する。タンパク質濃度はＵＶ分光光度法(Krebs et al., 2001)により測定する。
【０３７０】
実施例２：ｃ−Ｍｅｔ特異的ＨｕＣＡＬ（登録商標）抗体の同定
上述のパンニング戦略により選択された個々の大腸菌クローンのＢＥＬ抽出液をFluorometric Microvolume Assay Technology(FMAT（商標）, 8200 Cellular Detection System analyzer, Applied Biosystems)により分析し、ｃ−Ｍｅｔ特異的Ｆａｂをコードするクローンを同定する。
【０３７１】
細菌溶解液からｃ−Ｍｅｔ結合Ｆａｂを検出するための蛍光微量アッセイ技術に基づく結合分析（ＦＭＡＴ）
大腸菌溶解液（ＢＥＬ抽出液）からのｃ−Ｍｅｔ結合Ｆａｂ抗体の検出のため、ＦＭＡＴ８２００細胞検出システム(Applied Biosystems)を用いて結合を分析する。Ｍ−４５０  Ｅｘｐｏｘｙビーズ(Dynal)上にＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔを結合させるために、３００μｌ  Ｍ−４５０Ｅｐｏｘｙビーズ（１．２×１０８ビーズ）のサンプルを反応試験管に移し、磁気粒子セパレーターで捕捉する。上清を除去し、これらのビーズを１ｍｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４中で４回洗浄する。抗原コーティングのため、６０μｇのＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔを、１５０μｌの１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．４中のビーズ懸濁液に加える。抗原−ビーズ懸濁液を回転盤上で室温にて１６時間インキュベートする。その後、コーティングビーズをＰＢＳで３回洗浄し、最終量２５０μｌのＰＢＳに再懸濁させる。
【０３７２】
各３８４ウェルプレートについて、３％ＢＳＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、４μｌ  ｃ−Ｍｅｔコーティングビーズ（１．９×１０６ビーズ）および４μｌ  Ｃｙ５（商標）検出抗体を含有する２０ｍｌ  ＰＢＳの混合物を調製する。この溶液の４５μｌサンプルを３８４ウェルＦＭＡＴ黒／透明底プレート(Applied Biosystems)のウェルに分注する。Ｆａｂ含有ＢＥＬ抽出液（５μｌ）を各ウェルに加える。これらのＦＭＡＴプレートを室温で一晩インキュベートする。翌朝、これらのプレートを８２００細胞検出システム(Applied Biosystems)で分析する。
【０３７３】
陽性クローンが得られ、ＦＭＡＴで陽性の特異的シグナルが得られたクローンの重鎖および軽鎖配列を分析する。ユニークな（非冗長）抗ｃ−Ｍｅｔクローンが、ヒトｃ−Ｍｅｔと十分強い結合を示すことが確認される。これらのクローンを発現させ、精製し、親和性に関して、また機能的アッセイで調べる。
【０３７４】
表面プラズモン共鳴を用いるナノモル親和性の検出
これらのクローンを用い、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学により、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５中、〜４００ＲＵ密度の組換えヒトｃ−ＭｅｔでコーティングしたＣＭ５チップ(Biacore, Sweden)に対して動態ＳＰＲ分析を行う。匹敵する量のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を参照フローセルに固定化する。ＰＢＳ（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．４）をランニングバッファーとして用いる。Ｆａｂ調製物は、流速２０μｌ／分で、１６〜５００ｎＭの一連の濃度で適用する。結合段階を６０秒に、解離段階を１２０秒に設定する。ここで、ヒトｃ−Ｍｅｔに対する親和性（ｎＭ）の概要を表１に示す。
【表１９】
0005536445.tif 000020
【０３７５】
実施例３：結合親和性の定量分析：全長ｃ−Ｍｅｔと結合する抗ヒトｃ−Ｍｅｔ  Ｆａｂ候補の同定
親和性の測定
抗ｃ−Ｍｅｔ抗体のさらなる特性決定を行うため、全長ヒトおよびカニクイザルｃ−Ｍｅｔに対する親和性を調べる。カニクイザルｃ−Ｍｅｔを過剰発現するＧＴＬ１６、ＣＨＯ細胞またはアカゲザル４ＭＢｒ−５細胞を洗浄し、トリプシン処理し、３％ＦＣＳ（３％ＦＣＳ／ＰＢＳ）を含有する４℃のＰＢＳに懸濁させる。２〜５×１０５細胞／サンプルを、精製抗ｃＭｅｔ  Ｆａｂまたはその連続希釈液５μｇ／ｍｌを含有する３％ＦＣＳ／／ＰＢＳ１４０μｌに再懸濁させる。陽性対照として５μｇ／ｍｌのＤＯ２４（マウスＩｇＧ２ａ）、抗ヒトｃ−Ｍｅｔを用いる。これらの細胞を４℃で３０〜６０分間インキュベートした後、４℃、２０００ｒｐｍ（７１６ｇ）で２分間遠心分離することでペレット化し、冷３％ＦＣＳ／ＰＢＳ２００μｌで洗浄する。これらの細胞を再び遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳを静かに除去する。３％ＦＣＳ／０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳで１：２００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＥコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１０９−１１６−０８８）１００μｌに再懸濁させ、陽性対照としては、３％ＦＣＳ／ＰＢＳに１：２００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１１５−１１６−１４６）を用いる。サンプルを暗所、４℃で３０〜６０分間インキュベートする。遠心分離および３％ＦＣＳ／０．０２％ＮａＮ３／ＰＢＳ２００μｌ中での洗浄の後、これらの細胞を３％ＦＣＳ／ＰＢＳ１００μｌ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ−アレイまたはＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒを用いてアッセイする。
【０３７６】
ここで、ヒトおよびカニクイザルｃ−Ｍｅｔに対する親和性データの要約を表２に示す。表２に示される６つの供試Ｆａｂ全てがヒトｃ−Ｍｅｔに対して１００ｎＭ未満の親和性を有することが分かる。さらに、９つのクローンが１０ｎＭ未満の親和性を有する抗体を産生する。試験した全ての場合で、カニクイザルおよびマウスｃ−Ｍｅｔに対する親和性はヒトｃ−Ｍｅｔに対する親和性とほとんど同等である。
【表２０】
0005536445.tif 000021
【０３７７】
実施例４：ＨｕＣＡＬ（登録商標）免疫グロブリンの生産
ＩｇＧ形式への変換
抗体により媒介される二量体形成は、ｃ−Ｍｅｔチロシンキナーゼ活性の促進作用的活性化をもたらし得る。従って、精製ｃ−Ｍｅｔとの結合に基づいて選択されたＦａｂをＩｇＧ形式に変換する。全長免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現させるために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ  Ｆａｂ発現ベクターから、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４用のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇまたはｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇベクター系のいずれかにサブクローニングする。ＶＨドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ１およびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ４へのサブクローニングのためには、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いる。ＶＨドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ４へのサブクローニングのためには、制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いる。ＶＬドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇκおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇκへのサブクローニングは、ＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩ部位を用いて行い、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇλおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇλ２へのサブクローニングはＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを用いて行う。
【０３７８】
ヒトＩｇＧの一時的発現および精製
ＨＥＫ２９３細胞を等量のＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクターでトランスフェクトする。トランスフェクション４日または５日後に、細胞培養上清を採取する。上清のｐＨを８．０に調整し、濾過除菌を行った後、この溶液に対し、標準的なＡタンパク質カラムクロマトグラフィー(Poros 20A, PE Biosystems)を行う。
【０３７９】
親ＦａｂのＩｇＧおよびＩｇＧ４形式への変換
親和性成熟の開始と並行して、インサートをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ１およびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ４発現ベクターにクローニングする。ＨＥＫ２９３細胞の一時的トランスフェクションにより小規模発現を行い、全長免疫グロブリンを細胞培養上清から精製する。
【０３８０】
ｃ−Ｍｅｔ依存性増殖を変調する抗ヒトｃ−ＭｅｔＩｇＧ候補の同定
結果としてＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーから選択された種々のｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を次にＩｇＧ形式に変換し、ＨＧＦにより誘導される増殖を阻害する能力を試験する。
【０３８１】
選択された各クローンの機能活性は、４ＭＢｒ−５細胞のＨＧＦ刺激に対するＢｒｄＵ組み込みアッセイを用いて評価する。４ＭＢｒ−５細胞を、９６ウェル平底組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３６１０）にて、１０％ＦＢＳを添加した総量１００μｌ／ウェルのＨａｍのＦ１２Ｋ中、３×１０３細胞／ウェルの密度で播種する。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２時間インキュベートし、その後、精製供試抗体を含有する培地５０μｌを加える。変調のない陰性対照として、無関連抗体（ｃ−Ｍｅｔエピトープ決定基とは無関連の既知の特異性を有する）のサンプルまたはバッファーを指定のウェルに加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で１時間インキュベートし、その後、培地単独５０μｌまたはＨＧＦを含有（例えば、約０．５μｇ／μｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ）する５０μｌを加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で７２時間インキュベートし、その後、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ）カタログ番号１６６９９１５を用いてＢｒＤＵの組み込みをアッセイする。要するに、２０μＭ／ウェルのＢｒｄＵ溶液（＃１）を加え、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２２時間インキュベートする。培地を静かに除去し、このプレートを６０℃で１時間乾燥させる。２００μｌのＦｉｘＤｅｎａｔ（溶液＃２）を加え、これらのプレートを静かに振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。溶液を静かに除去し、１００μｌ／ウェルの抗ＢｒＤＵ検量線用溶液を加える。これらのプレートを静かに振盪しながら室温で９０分間インキュベートする。溶液を静かに除去し、ウェルを２５０μｌの洗浄溶液で３回洗浄する。溶液を静かに除去し、１００μｌ／ウェルの基質溶液を加え、プレートをＡ４０５ｎｍで測定する。
【０３８２】
ＥＣ５０の決定
ここで、ｃ−Ｍｅｔに対して最大の親和性を有する抗体のクローンに対してＨＧＦにより刺激される移動の５０％阻害の有効濃度を示すデータを表３に示す。これらのデータは有効濃度ＥＣ５０が４ｎＭから、６と１５０ｎＭの間に中央値がある範囲であることを示す。
【０３８３】
ｃ−Ｍｅｔ依存性移動を変調する抗ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＩｇＧ候補の同定
ＨＧＦによる刺激に応答した細胞移動を、ＱＣＭ（商標）走化性８μＭ  ９６ウェル細胞移動アッセイにおいてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を用いてアッセイする。上記のように、アッセイ２４時間前に細胞を無菌ＰＢＳで２回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で飢餓状態とする。次に、これらの細胞をトリプシン処理し、適当な濃度の精製抗体の存在下、３７℃で３０分間、１．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させる。変調のない陰性対照として、無関連抗体（ｃ−Ｍｅｔエピトープ決定基とは無関連の既知の特異性を有する）のサンプルまたはバッファーを指定のウェルに加える。
【０３８４】
無菌条件下、移動チャンバープレートの蓋をはずし、５０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄカタログ番号２９４−ＨＧＮ）を含有する血清フリー培地１５０μＬをフィーダートレイ（下のチャンバー）のウェルに加える。抗体とともにプレインキュベートした１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、５〜１０×１０４細胞１００μＬを上のチャンバーに静かに加える。このプレートに蓋をして、３７℃、４〜６％ＣＯ２中で１６時間インキュベートする。製造業者の使用説明書に従い、上のチャンバーの細胞／培地を排出し、このチャンバーを、１５０μＬ／ウェルの予温細胞解離溶液を加えた９６ウェルフィーダートレイに置く。周期的に静かに振盪させつつ、３７℃で３０分間インキュベートすることにより細胞を解離させる。次に、予め希釈したＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ  Ｄｙｅ５０μｌをフィーダートレイの各ウェルに加える。このプレートを室温で１５分間インキュベートし、この混合物１５０μＬを、４８０／５２０ｎｍフィルターセットを用いる蛍光測定に好適な新しい９６ウェルプレートに移す。
【０３８５】
ここで、ｃ−Ｍｅｔに対して最大の親和性を有する抗体のクローンに対してＨＧＦにより刺激される移動の５０％阻害の有効濃度を示すデータを表３に示す。これらのデータは有効濃度ＥＣ５０が０．１４ｎＭから、０．２７と０．６１ｎＭの間に中央値がある範囲であることを示す。
【表２１】
0005536445.tif 000022
【０３８６】
実施例５：ＬＣＤＲ３カセットおよびＨＣＤＲ２カセットの平行交換による選択された抗ｃ−Ｍｅｔ  Ｆａｂの親和性成熟
親Ｆａｂフラグメントのプールに関してｃ−Ｍｅｔに対する本明細書に記載の抗体の親和性を至適化するために、各親Ｆａｂの軽鎖のＬＣＤＲ３、フレームワーク４および定常領域（４０５ｂｐ）をＢｐｉＩおよびＳｐｈＩを用いて除去し、フレームワーク４および定常ドメインとともに、多様化したＬＣＤＲ３のレパートリーに置き換える。バインダープールベクターの０．５μｌサンプルを、多様化したＬＣＤＲ３を有する３倍モル過剰のインサートフラグメントと連結させる。
【０３８７】
同様のアプローチにおいて、ＸｈｏＩおよびＢｓｓＨＩＩ部位を用いてＨＣＤＲ２を多様化し、接続フレームワーク領域を一定に維持する。クローニング効率を高めるために、親ＨＣＤＲ２を、多様化したＨＣＤＲ２カセットの挿入前に５９０ｂｐのスタッファー(stuffer)配列に置き換える。
【０３８８】
種々のライブラリーの連結混合物を４ｍｌの大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中にエレクトロポレーションしたところ、２×１０７〜２×１０８の独立したコロニーが得られた。ライブラリーの増幅は従前に記載されたようにして行う(Rauchenberger et al., 2003 J Biol Chem. 278(40):38194−38205)。品質管理のため、ライブラリー当たり数個のコロニーを無作為に採取し、プライマーＣＦＲ８４（ＶＬ）とＯＣＡＬ＿Ｓｅｑ＿Ｈｐ（ＶＨ）を用いて配列決定を行う(SequiServe, Vaterstetten, Germany)。
【０３８９】
親和性成熟のための候補の選択
次の特性を有する６つの選択成熟候補（「親Ｆａｂ」）を選択した：ヒトｃ−Ｍｅｔに対する親和性が１０ｎＭ未満であること、カニクイザルｃ−Ｍｅｔに対して有意な交差反応性を有すること、ＥＣ５０が２５０ｎＭ未満であること、大腸菌におけるＦａｂ発現レベルが良好〜中程度であること、およびｃ−Ｍｅｔにより誘導される増殖および移動アッセイにおいてＩｇＧ形式で活性であること。選択されたＦａｂフラグメントの特性を表４に示す。
【表２２】
0005536445.tif 000023
【０３９０】
親和性成熟に関して選択されたＦａｂライブラリーの作製
高い親和性および抗ｃ−Ｍｅｔ抗体の阻害活性を有するクローンを得るために、従前の実施例で示した選択されたＦａｂクローンに対して、親和性成熟として知られるプロセスであるさらなる多様化と選択を行う。このために、３ヌクレオチド突然変異誘発(Virnekas et al., 1994 Nucleic Acids Res. 22:5600−5607; Nagy et al., 2002 Nature Medicine 8:801−807)により事前に構築した対応するＬＣＤＲ３成熟カセットとＨＣＤＲ２成熟カセットを用い、ＣＤＲ領域を多様化する。
【０３９１】
発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿Ｆａｂ＿ＦＨからのＦａｂフラグメントをファージミドベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２５（米国特許第６，７５３，１３６号参照）にサブクローニングする。このベクターは、Ｎ末端がシステイン残基と融合するとともに、Ｃ末端システインがＦｄ抗体鎖と融合したファージタンパク質ｐＩＩＩを提供することから、ファージ表面で個々のＦａｂフラグメントのジスルフィド結合したディスプレーが可能となる。親Ｆａｂの親和性と有効性の双方を至適化するために、２つの異なる戦略を並行して適用する。
【０３９２】
６つの親クローンのうち５つのＬＣＤＲ３が個々の軽鎖ＣＤＲ３配列のレパートリーにより置換されている５つのファージ抗体Ｆａｂライブラリーが作製される。（１つのクローンのＬＣＤＲ３成熟は、そのＣＤＲ領域の１つに付加的ＢｐｉＩ制限部位を有し、このＢｐｉＩ制限酵素がライブラリークローニング法に用いられることから、このクローンの成熟は行われない。）
【０３９３】
並行して、各親クローンのＨＣＤＲ２領域を個々の重鎖ＣＤＲ２配列のレパートリーで置換する。各親Ｆａｂを切り出し、５９０ｂｐのスタッファーに置換する。このＤＮＡスタッファーは、二重消化ベクターバンドから単独消化を分離する助けをし、成熟パンニング中、高親和性親Ｆａｂのバックグラウンドを引き下げる。その後の工程で、このスタッファーを各親クローンのＦａｂコードプラスミドから切り出し、多様化の高いＨＣＤＲ２成熟カセットに置き換える。
【０３９４】
２×１０７メンバーという大きな親和性成熟ライブラリーを標準的なクローニング手順により作製し、多様化したクローンをエレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’細胞(Invitrogen)に形質転換させる。Ｆａｂ提示ファージを上記のように作製する。
【０３９５】
以降の選択プロセスを容易にするため、成熟プールを構築する：プール１ａはＬＣＤＲ３−１ライブラリーからなり、プール１ｂはＭＨＣＤＲ２−１ライブラリーからなり、プール２ａはＬＣＤＲ３−２ライブラリーからなり、プール２ｂはＨＣＤＲ２−２ライブラリーからなる。
【０３９６】
各プールについて、Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔの量を引き下げつつ、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎビーズによるファージ−抗原捕捉を用い、液相にてパンニングを行う。並行して、ニュートラビジンコーティングプレートに捕捉されるビオチン化ｃ−Ｍｅｔの量を引き下げつつ、各プールをパンニングに適用する。パンニングのストリンジェンシーを高めるため、かつ、解離速度の向上に向けて選択を行うために、インキュベーション期間を延長して精製親Ｆａｂならびに非標識抗原との競合を行う。
【０３９７】
富化したファージミドプールをパンニングした直後にｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ発現ベクターにサブクローニングする。単一クローンを採取し、それらのＦａｂにおける遺伝子の発現をＩＰＴＧで誘導する。
【０３９８】
成熟パンニング戦略
これら４つの抗体プールを用い、液相にてＨｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔおよびビオチン化Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔでそれぞれ２または３回パンニング手順を行う。各パンニング戦略では、精製親Ｆａｂタンパク質または非標識ＡＰＰタグ付きｃ−Ｍｅｔとの競合、ならびに低抗原濃度および十分な洗浄を用いてストリンジェンシーを高める。
【０３９９】
非標識Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタグ付きｃ−Ｍｅｔに対する液相パンニングは、主として実施例１に記載の標準的プロトコールに従い、２回の選択で行う。ただし、これらの手順は抗原量を引き下げて（５ｎＭから１ｎＭへ引き下げ）適用し、競合相手を伴うかまたは伴わずに高ストリンジェンシーの洗浄手順であり、抗体−ファージの抗原を伴うインキュベーション時間が延長されている。
【０４００】
ビオチン化ｃ−Ｍｅｔを用いた１回目の選択では、ニュートラビジンプレートのウェルを３００μｌのＰＢＳで２回洗浄する。これらのウェルをＰＢＳで１：１希釈した２ｘＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ(Chemicon, Temecula, CA)（ブロッキングバッファー）でブロッキングする。選択前に、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージも、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する１容量のブロッキングバッファーで、室温にて３０分間ブロッキングする。ブロッキングしたファージ調製物の１００μｌアリコートをニュートラビジンコーティングプレートのウェルに室温にて３０分間移す。この予備吸着ステップを１回繰り返す。ブロッキングし、予め明澄化したファージ調製物を５ｎＭビオチン化ｃ−Ｍｅｔとともに、回転盤上で２２℃にて２時間インキュベートする。親ＦａｂおよびＡＰＰ−ｃ−Ｍｅｔを含有するサンプルまたは競合相手を含まない陽性対照を加え、それらのサンプルを回転盤上で４℃にて一晩インキュベートする。
【０４０１】
抗原−ファージ複合体を室温で２０分間、ニュートラビジンプレートのウェルに捕捉する。十分な洗浄工程の後、ウェル当たり１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０中２０ｍＭのＤＴＴ２００μｌを室温で１０分間加えることで、結合したファージ粒子を溶出させる。溶出液を取り出し、ＯＤ６００ｎｍ値０．６〜０．８まで増殖させた１４ｍｌの大腸菌ＴＧ１細胞に加える。これらのウェルを２００μｌのＰＢＳで１回すすぎ、この溶液をまた大腸菌ＴＧ１細胞に加える。大腸菌を、振盪せずに３７℃で４５分間ファージに感染させる。５０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離の後、細菌ペレットを各々５００μｌの２ｘＹＴ培地に再懸濁させ、２ｘＹＴ−ＣＧ寒天プレートに播種し、３０℃で一晩インキュベートする。これらのコロニーをプレートの表面から掻き取ることで採取し、上記のようにファージ粒子をレスキューし、増幅させる。
【０４０２】
２回目および３回目の選択は、洗浄条件のストリンジェンシーが高く、抗原濃度がそれぞれ１および０．１ｎＭであること以外は、１回目の選択に関して上記したように行う。
【０４０３】
電気化学発光（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）に基づくｃ−Ｍｅｔ結合Ｆａｂの結合分析
大腸菌溶解液（ＢＥＬ抽出液）において親和性が向上したｃ−Ｍｅｔ特異的抗体フラグメントを検出するために、ＢｉｏＶｅｒｉｓ  Ｍ−３８４  ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）ワークステーション(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)を用いる。アッセイは、９６ウェルポリプロピレンマイクロタイタープレートおよびアッセイバッファーとして０．５％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳで行う。ビオチン化ヒトｃ−Ｍｅｔは、供給者の使用説明書に従い、Ｍ−２８０ストレプトアビジン常磁性ビーズ(Dynal)に固定化する。各ウェルにビーズ原液の１：２５希釈液を加える。１００μｌ希釈ＢＥＬ抽出液サンプルとビーズをシェーカー上で室温にて一晩インキュベートする。検出には、供給者(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)の使用説明書に従い、ＢＶ−ｔａｇ（商標）で標識した抗ヒト（Ｆａｂ）’２(Dianova)を用いる。
【０４０４】
無作為に採取したクローンセットを上記の方法により分析する。最も高い値が得られたクローンのサブセットを溶液平衡滴定においてさらなる分析のために選択する。
【０４０５】
溶液平衡滴定（ＳＥＴ）を用いるピコモル親和性の測定
ＫＤ値の測定には、Ｆａｂの単量体画分（分析的ＳＥＣにより分析して単量体含量少なくとも９０％；Superdex75, Amersham Pharmacia）を用いる。液相での電気化学発光（ＥＣＬ）に基づく親和性測定およびデータ評価は基本的にHaenelら、2005に記載されているように行う。溶液中で一定量のＦａｂを種々の濃度（３ｎ連続希釈系）のヒトｃ−Ｍｅｔ（開始濃度４ｎＭ）で平衡化する。常磁性ビーズ（Ｍ−２８０ストレプトアビジン、Dynal）に結合させたビオチン化ヒトｃ−ＭｅｔとＢＶ−ｔａｇ（商標）(BioVeris Europe, Witney, Oxfordshire, UK)標識抗ヒト（Ｆａｂ）’２(Dianova)を加え、この混合物を３０分間インキュベートする。次に、非結合Ｆａｂの濃度を、Ｍ−ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）３８４アナライザー(BioVeris Europe)を用いたＥＣＬ検出により定量する。
【０４０６】
このために、単一クローンを選択し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースによりμｇスケールで精製する。予備親和性をＢｉｏＶｅｒｉｓで４点の溶液平衡滴定（ＳＥＴ）により測定する。これらのデータから、親和性を示すクローンを選択する。これらのＦａｂをｍｇスケールで精製する。最終的な親和性は、８点ＳＥＴ測定とヒト、マウスおよびカニクイザルｃ−Ｍｅｔを用い、各Ｆａｂクローンの２つの独立したバッチから測定する。
【０４０７】
マウスおよびカニクイザルｃ−Ｍｅｔに対する親和性の測定は、本質的に上記と同様に、ヒトｃ−Ｍｅｔの代わりに溶液中のアナライトとしてマウスｃ−Ｍｅｔ(R&D Systems)およびカニクイザルｃ−Ｍｅｔを用いて行う。遊離Ｆａｂの検出のためには、常磁性ビーズに結合させたビオチン化ヒトｃ−Ｍｅｔを用いる。親和性は例えばHaenel et al., 2005 Anal Biochem 339.1:182−184などの当業者に公知の方法に従って算出する。
【０４０８】
上記のアッセイ条件を用い、親和性至適化抗ｃ−Ｍｅｔ  Ｆａｂに対する親和性を溶液中で測定する。抗体に対する親和性を測定したところ、ＫＤ値はヒトｃ−Ｍｅｔに対して４．６ｐＭ未満である。上記のように、ＣＨＯ細胞で発現されるカニクイザル−ｃ−Ｍｅｔに対する結合のＦＡＣに基づく分析を行う。ここで、これらの親和性を表５にまとめる。
【表２３】
0005536445.tif 000024
【０４０９】
実施例６：親和性至適化抗ヒトｃ−Ｍｅｔ  Ｆａｂの特性決定
ＦＡＣＳ飽和技術
５０％ヒト血清（ＨＳ）の存在下での成熟Ｆａｂの結合特異性を測定する。至適化抗ｃＭｅｔ  Ｆａｂの連続希釈液を５０％ヒト血清の存在下または２．８％ＢＳＡの存在下のいずれかでインキュベートする。ＧＴＬ−１６細胞に対するＦＡＣＳ飽和結合を評価する。ＧＴＬ１６細胞を洗浄し、トリプシン処理し、３％ＦＣＳ（３％ＦＣＳ／ＰＢＳ）を含有する４℃のＰＢＳに懸濁させる。２〜５×１０５細胞／サンプルを、精製至適化抗ｃＭｅｔ  Ｆａｂまたはその連続希釈液５μｇ／ｍｌを含有する３％ＦＣＳ／／ＰＢＳ１４０μｌに再懸濁させる。陽性対照として５μｇ／ｍｌのＤＯ２４（マウスＩｇＧ２ａ）、抗ヒトｃ−Ｍｅｔを用いる。これらの細胞を４℃で３０〜６０分間インキュベートした後、４℃、２０００ｒｐｍ（７１６ｇ）で２分間遠心分離することでペレット化し、冷３％ＦＣＳ／ＰＢＳ２００μｌで洗浄する。これらの細胞を再び遠心分離によりペレット化し、ＰＢＳを静かに除去する。３％ＦＣＳ／ＰＢＳで１：２００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＰＥコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１０９−１１６−０８８）１００μｌに再懸濁させ、陽性対照としては、３％ＦＣＳ／ＰＢＳに１：２００希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＰＥコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号１１５−１１６−１４６）を用いる。サンプルを暗所、４℃で３０〜６０分間インキュベートする。遠心分離および３％ＦＣＳ／ＰＢＳ２００μｌ中での洗浄の後、これらの細胞を３％ＦＣＳ／ＰＢＳ１００μｌ中に再懸濁させ、ＦＡＣＳ−アレイまたはＦＡＣＳ−Ｃａｌｉｂｕｒを用いてアッセイする。
【０４１０】
８３．３％〜１００％の範囲の、２．８％ＢＳＡにおける結合活性に比べて５０％ヒト血清の存在下での至適化抗ｃ−Ｍｅｔ  Ｆａｂの結合活性をまとめた結合曲線の例を表６に示す。中央値は９０．２％であることが分かり、よって、抗ｃ−Ｍｅｔ  Ｆａｂはヒト血清の存在下で標的と完全に結合することが分かる。
【表２４】
0005536445.tif 000025
＊５１８５の結合は飽和に達していないのでＥＣ５０に関してまだ分析しなかった。
【０４１１】
至適化抗ｃＭｅｔ候補ＦａｂのＩｇＧ形式への変換
抗体により媒介される二量体形成は、ｃ−Ｍｅｔチロシンキナーゼ活性の促進作用的活性化をもたらし得る。従って、精製ｃ−Ｍｅｔとの結合に基づいて選択されたＦａｂをＩｇＧ形式に変換する。全長免疫グロブリン（Ｉｇ）を発現させるために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインフラグメントをｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＦＨ  Ｆａｂ発現ベクターから、ヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ４用のｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇまたはｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇベクター系のいずれかにサブクローニングする。ＶＨドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ１およびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇＧ４へのサブクローニングのためには、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いる。ＶＨドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ１ｆおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿ＩｇＧ４へのサブクローニングのためには、制限酵素ＭｆｅＩおよびＢｌｐＩを用いる。ＶＬドメインフラグメントのｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇκおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇκへのサブクローニングは、ＥｃｏＲＶおよびＢｓｉＷＩ部位を用いて行い、ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）＿ｈ＿ＩｇλおよびｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２＿ｈ＿Ｉｇλ２へのサブクローニングはＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを用いて行う。
【０４１２】
ヒトＩｇＧの一時的発現および精製
ＨＥＫ２９３細胞を等量のＩｇＧ重鎖および軽鎖発現ベクターでトランスフェクトする。トランスフェクション４日または５日後に、細胞培養上清を採取する。上清のｐＨを８．０に調整し、濾過除菌を行った後、この溶液に対し、標準的なＡタンパク質カラムクロマトグラフィー(Poros 20A, PE Biosystems)を行う。
【０４１３】
ｃ−Ｍｅｔ依存性増殖を変調する至適化抗ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＩｇＧ候補の同定
結果としてＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ライブラリーから選択された至適化ｃ−Ｍｅｔ特異的抗体を次にＩｇＧ形式に変換し、ＨＧＦにより誘導される増殖を阻害する効力を試験する。
【０４１４】
各選択クローンの機能活性を４ＭＢｒ−５細胞のＨＧＦ刺激に対するＢｒｄＵ組み込みアッセイを用いて評価する。４ＭＢｒ−５細胞を９６ウェル平底組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３６１０）にて、１０％ＦＢＳを添加した総量１００μｌ／ウェルのＨａｍのＦ１２Ｋ中、３×１０３細胞／ウェルの密度で播種する。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２時間インキュベートし、その後、処理する精製抗体を含有する５０μｌの培地を添加する。変調のない陰性対照として、無関連抗体（ｃ−Ｍｅｔエピトープ決定基とは無関連の既知の特異性を有する）のサンプルまたはバッファーを指定のウェルに加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で１時間インキュベートし、その後、培地単独５０μｌまたはＨＧＦを含有（例えば、約０．５μｇ／μｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌ）する５０μｌを加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で７２時間インキュベートし、その後、細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｒｄＵ−Ａｓｓａｙ（Ｒｏｃｈｅ）カタログ番号１６６９９１５を用いてＢｒＤＵの組み込みをアッセイする。要するに、２０μＭ／ウェルのＢｒｄＵ溶液（＃１）を加え、これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２２時間インキュベートする。培地を静かに除去し、このプレートを６０℃で１時間乾燥させる。２００μｌのＦｉｘＤｅｎａｔ（溶液＃２）を加え、これらのプレートを静かに振盪しながら室温で３０分間インキュベートする。溶液を静かに除去し、１００μｌ／ウェルの抗ＢｒＤＵ検量線用溶液を加える。これらのプレートを静かに振盪しながら室温で９０分間インキュベートする。溶液を静かに除去し、ウェルを２５０μｌの洗浄溶液で３回洗浄する。溶液を静かに除去し、１００μｌ／ウェルの基質溶液を加え、プレートをＡ４０５ｎｍで測定する。
【０４１５】
ＥＣ５０の決定
ここで、ｃ−Ｍｅｔに対して最大の親和性を有する抗体のクローンに対してＨＧＦにより刺激される増殖の５０％阻害の有効濃度を示すデータを表７に示す。これらのデータは有効濃度ＥＣ５０が０．１３ｎＭから、０．５ｎＭと１．３ｎＭの間に中央値がある範囲であることを示す。
【表２５】
0005536445.tif 000026
【０４１６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）技術
５０％ヒト血清（ＨＳ）の存在下での成熟Ｆａｂの結合特異性を測定する。ＴＢＳ中、ヒト組換えビオチン化抗体の連続希釈系を室温で２時間ニュートラビジンマイクロタイタープレート上に、８ｎｇ抗体／ウェル〜１２５ｎｇ抗体／ウェルの濃度でコーティングする。抗原をコーティングした後、ウェルを、室温で１時間、１％ＢＳＡを添加したＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ−Ｔ）でブロッキングする。上記の精製Ｆａｂを終濃度１μｇ／ｍｌとなるようにＴＢＳ／４％ＢＳＡまたはＴＢＳ／５０％ＨＳのいずれかで希釈し、コーティングおよびブロッキング済みのウェルに加え、これらのプレートを室温で１時間インキュベートする。検出のため、抗ＦＬＡＧアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲート抗体（ＴＢＳＴ中１：５０００希釈液）および蛍光性基質ＡｔｔｏＰｈｏｓ(Roche)を用いる。各インキュベーションの後、マイクロタイタープレートのウェルをＴＢＳＴで５回洗浄するが、標識二次抗体とともに最終のインキュベーション工程を行った後は、ウェルを３回洗浄する。蛍光はＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーで測定する。
【０４１７】
ｃ−Ｍｅｔ依存性移動を変調する抗ヒトｃ−Ｍｅｔ  ＩｇＧ候補の同定
ＨＧＦによる刺激に応答した細胞移動を、ＱＣＭ（商標）走化性８μＭ  ９６ウェル細胞  移動アッセイにおいてＮＣＩ−Ｈ４４１細胞を用いてアッセイする。上記のように、アッセイ２４時間前に細胞を無菌ＰＢＳで２回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下、１％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で飢餓状態とする。次に、これらの細胞をトリプシン処理し、適当な濃度の精製抗体の存在下、３７℃で３０分間、１．０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁させる。変調のない陰性対照として、無関連抗体（ｃ−Ｍｅｔエピトープ決定基とは無関連の既知の特異性を有する）のサンプルまたはバッファーを指定のウェルに加える。
【０４１８】
無菌条件下、移動チャンバープレートの蓋をはずし、５０ｎｇ／ｍｌ  ＨＧＦ（Ｒ＆Ｄカタログ番号２９４−ＨＧＮ）を含有する血清フリー培地１５０μＬをフィーダートレイ（下のチャンバー）のウェルに加える。抗体とともにプレインキュベートした１％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中、５〜１０×１０４細胞１００μＬを上のチャンバーに静かに加える。このプレートに蓋をして、３７℃、４〜６％ＣＯ２中で１６時間インキュベートする。製造業者の使用説明書に従い、上のチャンバーの細胞／培地を排出し、このチャンバーを、１５０μＬ／ウェルの予温細胞解離溶液を加えた９６ウェルフィーダートレイに置く。周期的に静かに振盪させつつ、３７℃で３０分間インキュベートすることにより細胞を解離させる。次に、予め希釈したＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ  Ｄｙｅ５０μｌをフィーダートレイの各ウェルに加える。このプレートを室温で１５分間インキュベートし、この混合物１５０μＬを、４８０／５２０ｎｍフィルターセットを用いる蛍光測定に好適な新しい９６ウェルプレートに移す。
【０４１９】
ここで、ｃ−Ｍｅｔに対して最大の親和性を有する抗体のクローンに対してＨＧＦにより刺激される移動の５０％阻害の有効濃度を示すデータを表８に示す。これらのデータは有効濃度ＥＣ５０が０．６１ｎＭから、０．７３ｎＭと０．７６ｎＭの間に中央値がある範囲であることを示す。
【表２６】
0005536445.tif 000027
【０４２０】
実施例７：選択された拮抗作用的抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による、ＨＧＦにより刺激されるｃ−Ｍｅｔ自己リン酸化の変調
本発明の抗ｃ−Ｍｅｔ抗体による促進作用または拮抗作用を、ＨＧＦで刺激した、また刺激しない細胞においてｃ−Ｍｅｔリン酸化の活性化または阻害により測定する。Ａ５４９細胞などの細胞系統の細胞を、９６ウェル平底組織培養処理プレート（Ｃｏｓｔａｒ、＃３５９５）中、１０％ＦＢＳを添加した総量ＤＭＥＭ１００μｌ／ウェルにて、３×１０４細胞／ウェルの密度で播種する。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２４時間インキュベートし、その後、プレートの各ウェルから培地を静かに吸引し、１００μｌ／ウェル量のＤＭＥＭを加える。これらのプレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で２４時間インキュベートし、その後、処理する精製抗体のサンプル、１００μｌ／ウェルの抗体または希釈液を、ＤＭＥＭで希釈したウェルの細胞に加える。活性がない陰性対照として、無関連抗体（ｃ−Ｍｅｔエピトープ決定基とは無関連の既知の特異性を有する）のサンプルまたはバッファーを指定のウェルに加える。
【０４２１】
これらの細胞を３７℃で短時間（例えば２時間）または長時間（例えば２４時間）インキュベートする。適当であれば、血清フリーＤＭＥＭ培地中、終濃度２００ｎｇ／ウェルでＨＧＦを加えることにより細胞を刺激する。一般に、抗体の促進作用活性をアッセイする場合には、陽性対照（抗体で処理しない）以外は、試験サンプル抗体ウェルからＨＧＦを除く。一般に、抗体の拮抗作用活性をアッセイする場合には、試験サンプル抗体ウェルにＨＧＦを含める。プレートをさらに１０分間３７℃でインキュベートした後、プレートのウェルから培地を静かに吸引する。細胞を、○○を含有する冷ＰＢＳで洗浄し、その溶液をプレートから静かに吸引する。細胞を５０μｌの溶解バッファー（ＮＰ−４０溶解バッファー：１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、６ｍＭ  ＥＧＴＡ、２０ｍＭ  ＮａＦ、１ｍＭベンズアミジン、０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４および０．１ｍＭ  ＰＭＳＦを新たに加える）で溶解する。これらのプレートを室温で１５分間振盪した後、ＥＬＩＳＡに必要となるまで−８０℃で保存する。
【０４２２】
ＥＬＩＳＡを用い、ｃ−Ｍｅｔリン酸化レベルを決定する。ＥＬＩＳＡプレートの調製については、Ｎｕｎｃ−ＩｍｍｕｎｏＴＭプレート、ＭａｘｉＳｏｒｂＴＭ  Ｓｕｒｆａｃｅ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ、ＮＯ３９１−８７８６）を洗浄バッファー（ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ  Ｂｉｏｒａｄ  ＃６７０−６５３１）で２回洗浄し、ＰＢＳ中、１００μｌのｃ−Ｍｅｔモノクローナル捕捉抗体（ＤＯ−２４）を加える。これらのプレートを一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄する。非特異的結合部位を、ＰＢＳ−Ｔ中３％のＢＳＡ２００μｌ／ウェルで、室温で振盪しながら２時間、ブロッキングする。使用直前にブロッキング溶液を除去する。
【０４２３】
凍結した細胞溶解液を室温で振盪することで融解し、４０μｌの溶解液をＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏプレートに加え、これらのプレートを４℃で４時間インキュベートする。これらのプレートをＰＢＳ−Ｔ、および３％ウシ血清アルブミン−ＰＢＳ−Ｔ中、０．２μｇ／ｍｌ抗ホスホチロシン抗体ＰＹ２０−ＨＲＰ（ＺＹＭＥＤ、＃０３−７７２２）５０μｌ／ウェルで３回洗浄する。これらのプレートを一晩４℃でインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄する。ＰＢＳ−Ｔを吸引し、９０μｌ／ウェルのアルカリ性ホスファターゼ基質（ＣＤＲ−Ｓｔａｒ、ＴＲＯＰＩＸ、＃ＭＳ１００ＲＹ）を加え、室温で４５分間静かに振盪しつつ現像する。これらのプレートを、９６ウェルプレートリーダーを用いて読み取る。
【０４２４】
ここで、ｃ−Ｍｅｔに対して最大の親和性を有する抗体のクローンに対してＨＧＦにより刺激される移動の５０％阻害の有効濃度を示すデータを表９に示す。これらのデータは有効濃度ＥＣ５０が０．１６６ｎＭから、０．１９３と０．２１９ｎＭの間に中央値がある範囲であることを示す。
【表２７】
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【０４２５】
実施例８：発現に関して至適化された遺伝子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列
哺乳類発現を増強するため、本明細書のＦａｂの重鎖および軽鎖に、哺乳類細胞での発現に対するコドン使用を至適化するための変異を導入する。いくつかの陰性シス作用モチーフが哺乳類において発現を低下させることが分かっている。本明細書における至適化プロセスは、発現に負の影響を及ぼす負のシス作用部位（スプライス部位またはポリ（Ａ）シグナルなど）を除去する。本明細書における至適化プロセスは、さらにｍＲＮＡ半減期を延長するためにＧＣ含量を高める。
【０４２６】
可変軽鎖および重鎖領域は、Ｆａｂクローンを用いて至適化し、ファージディスプレーを用いた選択により単離する。次に、このクローンまた他のクローンの全軽鎖および重鎖を各々コードするヌクレオチド配列を各々、これらの手順を用いて至適化する。
【０４２７】
ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の至適化プロセス
ＶＬ鎖およびＶＨ鎖の各々のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を至適化するため、コドン使用を哺乳類、特にヒト(H. sapiens)遺伝子のコドンの偏りに適合させる。さらに、ＧＣ含量の極めて高い（＞８０％）領域または極めて低い（＜３０％）領域を少なくするか、または可能であれば除去する。
【０４２８】
この至適化プロセス中、以下のシス作用配列モチーフは避ける：内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位およびリボゾームエントリー部位、ＡＴ豊富またはＧＣ豊富配列ストレッチ、ＲＮＡ不安定モチーフ（ＡＲＥ）配列エレメント、阻害性ＲＮＡ配列エレメント（ＩＮＳ）、ｃＡＭＰ応答（ＣＲＳ）配列エレメント、リピート配列およびＲＮＡ二次構造、潜伏部位(cryptic site)および分岐点を含むスプライス供与部位および受容部位。特に断りのない限り、ＶＬ鎖のヌクレオチド配列を至適化するプロセスではＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の導入を避ける。特に断りのない限り、ＶＨ鎖のヌクレオチド配列を至適化するプロセスではＭｌｙＩおよびＢｓｔＥＩＩ部位の導入を避ける。
【０４２９】
発現に関して至適化されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖のアミノ酸配列
上記のクローンのＶＨ鎖およびＶＬ鎖に関して得られた至適化アミノ酸配列に対して哺乳類細胞での発現率をより高くかつより安定にすることができるよう、コドン利用を哺乳類のものに合わせる。
【０４３０】
各親配列および至適化遺伝子それぞれに対する配列コドンのパーセンテージを示し、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖をコードする着目するヌクレオチド配列の品質クラスを分析するためにはヒストグラムを使用することができる。本明細書において品質値は、所望の発現系において所与のアミノ酸に対して用いられている最も頻度の高いコドンを１００とし、残りのコドンが使用頻度に応じて尺度化されることを意味する(Sharp, P.M., Li, W.H., Nucleic Acids Res. 15 (3), 1987)。
【０４３１】
さらに、このcodon adaptation index (CAI)は、そのヌクレオチド配列のコドンが標的生物のコドン使用優先にどの程度適合しているかを表す数値である。ＣＡＩの最大値を１．０とすると、ＣＡＩ＞０．９は高い発現が可能であるとみなされる。至適化前のＶＬ鎖のＣＡＩは０．７３であることが分かっており、至適化後のＣＡＩは０．９５と判定される。同様に、至適化前のＶＨ鎖のＣＡＩは０．７４であることが分かっており、至適化後のＣＡＩは０．９８と判定される。
【０４３２】
ＶＬ鎖のＧＣ含量は至適化配列の親配列から高まっている。
【０４３３】
全長軽鎖および重鎖の発現に関する至適化
この至適化プロセスを軽鎖の親全長ヌクレオチド配列および重鎖の親全長ヌクレオチド配列の各々に適用する。
【０４３４】
この至適化プロセスを用い、親クローン番号に関連した軽鎖ヌクレオチド配列を構築する。さらに、この至適化プロセスを用い、親クローン番号に関連した重鎖ヌクレオチド配列を構築する。
【０４３５】
【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【図面の簡単な説明】
【０４３６】
【図１】本発明のＶＨ鎖の配列アラインメント。各鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域も示す。
【図２】本発明のＶＬλ鎖の配列アラインメント。各鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域も示す。
【図３】本発明のＶＬκ鎖の配列アラインメント。各鎖のＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４領域も示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
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