(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
FGFR阻害剤の異所性鉱質形成の影響を判定するためのバイオマーカーとしてのFGF23の使用であって、増殖性疾患および／または非癌障害を有する患者において血漿中のFGF23レベルを測定する工程を含む、前記使用。
【請求項２】
前記FGFR阻害剤が、高分子または低分子量化合物である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記FGFR阻害剤が、PD176067、PD173074、化合物Ａ(3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレア)、TKI258、またはいずれかのそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)のキナーゼ活性のモジュレーションを判定する方法であって、
ａ)FGFR阻害剤が投与された被験体から得られたサンプルを提供する工程;
ｂ)該サンプルのFGF23レベルを決定する工程;および
ｃ)該サンプルのFGF23レベルを、参照レベルと比較する工程、
を含む、前記方法。
【請求項５】
前記被験体が哺乳動物である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項４の工程a)〜c)を含むFGFR阻害剤の異所性鉱質形成の影響を判定する方法であって、さらに
d)前記FGF23レベルを異所性鉱質形成の影響と相関させる工程;および
e)採用した治療に関連して異所性鉱質形成の影響が生じる該FGF23レベルを決定する工程
を含む、方法。
【請求項８】
前記FGFR阻害剤が、高分子または低分子量化合物である、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記FGFR阻害剤が、3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレア、およびTKI258、またはいずれかのそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される、請求項４〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記FGF23レベルが参照レベルと比較した場合に高い、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
FGFRのキナーゼ活性のモジュレーションを判定するex vivo方法であって、
ａ)FGFR阻害剤処置を開始する前の患者のサンプル中のFGF23レベル(個体参照レベル)を決定する工程；
ｂ)該FGFR阻害剤処置の後の同患者のサンプル中のFGF23レベルを決定する工程
を含み、
工程ｂ)のFGF23レベルが個体参照レベルよりも高い場合は、FGFRのキナーゼ活性の阻害が生じたことを示す、前記方法。
【請求項１２】
前記FGFR阻害剤が、PD176067、PD173074、化合物Ａ(3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレア)、TKI258、またはいずれかのそれらの医薬的に許容可能な塩からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記FGFR阻害剤が3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレアまたはいずれかのその医薬的に許容可能な塩である、請求項１１または１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概してin vitro診断の方法に関し、特に線維芽細胞増殖因子23(FGF23)、無機リン(P)、無機リンおよび総カルシウムの積(product)(P×tCa)、オステオポンチン(OPN)、ならびに副甲状腺ホルモン(PTH)からなる群より選択された化合物のバイオマーカーとしての使用に関する。これらのバイオマーカーは、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)キナーゼ活性のモジュレーション、特にその阻害および/またはFGFR阻害の二次影響の発生をモニタリングするのに使用できる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
線維芽細胞増殖因子(FGF)ファミリー、およびそれらのシグナル伝達受容体は、虫からヒトまでの生物の成長および維持のために鍵となるプロセス(発達、新脈管形成、代謝)を管理する複数の生物学的活性(増殖、生存、アポトーシス、分化、運動性)に関連する。22の区別されるFGFが同定されており、これらは全て保存された120アミノ酸コア領域を15〜65%の配列同一性で共有する。FGFは、４つのRTK FGFR1〜FGFR4のファミリーに結合してそれらを活性化することにより、細胞応答を仲介し、これらは全ていくつかのアイソフォームで存在する(Lee PLら, Science 245: 57-60 (1989); Givoil Dら, FASEB J. 6:3362-9 (1992))；Jaye Mら, EMBO J. 7:963-9 (1988)；Ornitz DMおよびItoh N, Genome Biol. 2 (2001))。リガンド結合は、受容体二量化事象およびキナーゼの活性化を誘導して、下流分子のリン酸化および/または動員(recruitment)、ならびに細胞内シグナル伝達経路の活性化を生じる。
【０００３】
FGF/FGFRの生物学的役割は、マウスモデルにおける、特定の発達系、発現パターン、および遺伝子標的化アプローチの分析によって調査されてきた。これらの研究は、新脈管形成、創傷治癒、発達、および代謝等を含む多くの生物学的機能における関与を実証してきた。様々なヒト頭蓋骨癒合症候群(craniosynostosis syndrome)および骨格形成異常は、頭蓋、指(digital)および骨格の発達に重度の障害をもたらすFGFR1、FGFR2およびFGFR3における特定の機能的変異の獲得と関連付けられている。Webster MKおよびDonoghue DH, Trends Genet. 1997 13:178-82(1997); Wilkie AO, Hum. Mol. Genet. 6:1647-56 (1997)。
【０００４】
疫学的研究により、ヒト癌におけるFGF/FGFRの遺伝子変化および/または異常発現が報告されている：FGFR1キナーゼの構成的活性化を生じる他の遺伝子へのFGFR1の転座および融合は8p11骨髄増殖性障害に関与する(MacDonald DおよびCross NC, Pathobiology 74:81-8 (2007))。免疫グロブリン重鎖スイッチ領域への14q32の反復性染色体転座は、多発性骨髄腫におけるFGFR3の無秩序な過剰発現を生じる(Chesi Mら, Nature Genetics 16:260-264 (1997); Chesi Mら, Blood 97:729-736 (2001))。乳癌において、FGFR1、FGFR2およびFGFR4についての遺伝子増幅およびタンパク質過剰発現が報告されている(Adnane Jら, Oncogene 6:659-63 (1991); Jaakkola Sら, Int. J. Cancer 54:378-82(1993); Penault-Llorca Fら, Int. J. Cancer 61:170-6(1995);Reis-Filho JSら, Clin. Cancer Res. 12:6652-62(2006))。FGFR2の体細胞活性化変異は、胃癌(Jang JHら, Cancer Res. 61:3541-3 (2001))および子宮内膜癌(Pollock PMら, Oncogene(2007年5月21日))において知られており、リガンド非依存性の受容体の構成的活性化を導くFGFR3の特定のドメインにおける体細胞変異が膀胱癌において同定されている(Cappelen Dら, Nature Genetics 23:18-20 (1999); Billerey Cら, Am. J. Pathol. 158(6):1955-9(2001))。さらに、FGFR3、mRNAおよびタンパク質の過剰発現が、この癌種において認められている(Gomez-Roman JJら, Clin. Cancer Res. 11(2Pt 1):459-65(2005))。
【０００５】
従って、FGFRのキナーゼ活性を阻害可能な化合物は、無秩序なFGFRシグナル伝達を伴うヒト癌の治療の候補となり易い。
【０００６】
FGFRチロシンキナーゼの低分子量阻害剤の利用は、実証済みである(Brown, A.Pら(2005), Toxicol. Pathol. 33, p.449-455；Xin, X.ら(2006), Clin. Cancer Res., Vol 12(16), p. 4908-4915；Trudel, S.ら(2005), Blood, Vol.105(7), p.2941-2948を参照)。
【０００７】
しかし、動物モデルにおけるこのような阻害剤の治療効力の判定は、例えば、腫瘍増殖の測定、FGF受容体の自己リン酸化の阻害、および/またはErk1/2等のシグナル伝達カスケードの下流分子のリン酸化を伴うため、少々煩わしい。これらの方法は前臨床セッティングには適してはいるが、臨床研究のためには、簡単かつ単純な手法で治療効力を判定するための非侵襲的方法が望ましい。
【０００８】
さらに、ラットおよびイヌにおけるFGFRチロシンキナーゼ阻害剤PD176067を用いた非臨床的毒性研究では、軟組織鉱質形成が生じた。この望ましくない影響が発生したため、前記薬剤が癌治療のために使用できる見込みがあるか否かを判定するにはさらなる研究が必要であると結論付けられた(Brown, A.Pら(2005), Toxicol. Pathol 33 p.449-455を参照)。
【０００９】
軟組織および脈管系におけるリン酸カルシウム塩の不適切な堆積である異所性鉱質形成(ectopic mineralization)は、罹患率および死亡率に繋がり得る(London GMら, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2005, 14:525-531)。
【００１０】
従って、FGFR阻害剤の治療効力を示すのに有用なバイオマーカー、信頼性のある方法、および対応するキットが当該分野で必要とされている。さらに、FGFR阻害剤の投与後の所望でない二次影響(特に異所性鉱質形成)を予測する方法は、大いに利用できる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
驚くべきことに、線維芽細胞増殖因子23(FGF23)、無機リン(P)、無機リンおよび総カルシウムの積(P×tCa), オステオポンチン(OPN)、ならびに副甲状腺ホルモン(PTH)からなる群より選択される化合物が、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)阻害剤の活性のモニタリングを可能にし、さらにFGFR阻害の二次影響(特に異所性鉱質形成)の発生を予測するのに有用であり得る、有用なバイオマーカーであることが分かった。
【００１２】
特に、本発明は、バイオマーカーとしてのFGF23の使用を提供する。FGFRの阻害の際に、抗腫瘍活性が認められ、これもFGF23の増加に翻訳される。FGF23の増加の程度は、使用する阻害剤の用量と相互関連を示す。特定の用量では、二次影響、特に軟組織および脈管の鉱質形成が検出される。この二重の意味合いから、FGF23は、FGFR阻害剤の薬力学的マーカーとしてみなされ得る。薬物の生物学的活性のモニタリングを可能にする薬力学的バイオマーカーの同定および検証は、用量選択および治療最適化のために有用である。
【００１３】
さらに、線維芽細胞増殖因子受容体モジュレーション後の異所性鉱質形成を予測およびモニタリングする見込みのあるバイオマーカーの総合的な分析から、FGF23、P、P×tCa、OPNおよびPTHからなる群より選択される化合物が、異所性鉱質形成の予測マーカーであることが確認されることが示される。
【００１４】
従って、本発明は、第１の態様として、特にFGFRのキナーゼ活性のモジュレーションについてのバイオマーカーとして、FGF23、P、P×tCa、OPNおよびPTHからなる群より選択される化合物の使用を提供する。
【００１５】
一実施形態では、前記化合物は、線維芽細胞増殖因子受容体キナーゼ活性の阻害をモニタリングするために使用される。該化合物はFGF23であることが好ましい。
【００１６】
本発明はさらに、二次影響(特に異所性鉱質形成)の予防についての安全性マーカーとしての、線維芽細胞増殖因子23(FGF23)、無機リン(P)、無機リンおよび総カルシウムの積(P×tCa), オステオポンチン(OPN)ならびに副甲状腺ホルモン(PTH)からなる群より選択される化合物の使用を提供する。該化合物はFGF23であることが好ましい。
【００１７】
別の態様では、本発明は
ａ)FGFR阻害剤を被験体に投与する工程;
ｂ)該被験体のサンプルを提供する工程;
ｃ)該サンプルのFGF23レベルを決定する工程;および
ｄ)該サンプルのFGF23レベルを、FGFR阻害剤での処置を開始する前の被験体中のFGF23レベルである参照レベルと比較する工程、
を含む、FGFRのキナーゼ活性のモジュレーション、特にキナーゼ活性の阻害を判定する方法を提供する。
【００１８】
さらに、上記方法の工程ａ)〜ｄ)を含む、FGFR阻害剤の治療効力を判定する方法であって、前記参照レベルがFGFR阻害剤での処置を開始する前の被験体中のFGF23レベルである、方法を提供する。
【００１９】
また、上記方法の工程ａ)〜ｄ)を含む、FGFR阻害剤の１つ以上の二次影響を判定する方法であって、前記参照レベルがFGFR阻害剤での処置を開始する前の被験体中のFGF23レベルである、方法を提供する。
【００２０】
本明細書で開示される方法は、P、P×tCa、OPNおよびPTHからなる群より選択される化合物のうちの任意の１つを用いて同様に行うことができる。
【００２１】
本発明は、用量選択、スケジュール選択、患者選択および治療最適化の臨床セッティングにおいて特に有用である。
【００２２】
以下に、本発明をより詳細に説明する。様々な実施形態、優先傾向および範囲が随意に組み合わせられ得ることが理解されよう。さらに、具体的な実施形態によって、選択される定義、実施形態または範囲が当てはまらない場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、化合物Ａで処置する間の、NIH3T3/FGFR3S249C皮下腫瘍を担持する胸腺欠損雌ヌードマウスの腫瘍体積の変化を[mm3]で示すグラフである。白丸：化合物Ａ 0 mg/kg、qd、p.o.；黒丸：化合物Ａ 10 mg/kg、qd、p.o.；グレーの丸：化合物Ａ 30 mg/kg、qd、p.o.；黒三角：化合物Ａ 50mg/kg、qd、p.o.。
【図２】図２は、腫瘍のex vivo分析を示す写真である。最後の化合物投与の２時間後に腫瘍を切開した。腫瘍組織を溶解し、FGFR3を特異的な抗体で免疫沈降させた。免疫複合体をSDS-PAGEで分解し、PVDF膜上にブロッティングし、抗pTyr抗体でプローブして、FGFR3 Tyr-リン酸化をモニタリングした。膜を裂いて、抗FGFR3 抗体で再度プローブして、総FGFR3タンパク質レベルをモニタリングした。
【図３】図３は、化合物Ａで処置する間の、RT112/ルシフェラーゼ１(luciferasel)皮下異種移植片を担持する胸腺欠損雌ヌードマウスの腫瘍の体積変化を[mm3]で示すグラフである。白丸：ビヒクル 10 mg/kg、qd、p.o.；白四角：化合物Ａ 50mg/kg、qd、p.o.；黒三角：化合物Ａ 75mg/kg、qd、p.o.。
【図４】図４は、表示の用量および14日間(n＝6)のスケジュールで、RT112/ルシフェラーゼ１皮下異種移植片を担持する胸腺欠損雌マウスへ化合物Ａまたはビヒクル対照を最後に投与してから２時間後に回収された血漿サンプル中のFGF23レベルを示す棒グラフである。FGF23レベルは、KainosのFGF23 ELISAキット(カタログ番号CY-4000)を用いてモニタリングし, pg/mLで表す。データは、平均値±SDとして示す。
【図５】図５は、実施例２に記載する無機リン(P)レベル[mg/dl]の散布図である。
【図６】図６は、総カルシウム(tCa)の血清中レベル[mg/dl]の散布図である。
【図７】図７は、P×tCa積の血清中レベル[mg2/dl2]の散布図である。
【図８】図８は、FGF23血清中レベル[pg/ml]の散布図である。
【図９】図９は、前処置における、または1サイクル15日間(cycle 1 day 15)および1サイクル26日間(cycle 1 day 26)の一日一回の連続投薬で、200、300、400もしくは500 mg/日のTKI258で経口処置された黒色腫患者由来の血漿サンプル中のFGF23レベルを示す棒グラフである。FGF23レベルは、KainosのFGF23 ELISAキット(カタログ番号CY-4000)を用いてモニタリングし、pg/mLで表す。データは平均値±SDとして示す。
【図１０】図１０は、リン酸化および活性化FGFRを認識する抗体を用いた免疫組織化学で分析した、400 mgのTKI258で1サイクル15日間で処置した黒色腫患者から得た腫瘍生検の写真を示す。
【図１１】図１１は、基準時点(ClDl)における、ならびにC1D15およびC1D26での500 mg TKI258の処置における、８人の異なる腎細胞癌患者のFGF23のレベルを、１である基準に対する誘導比率(fold induction)として表すグラフである。
【図１２】図１２は、RT112腫瘍異種移植片のex vivo分析を示す写真である。腫瘍を化合物投与の３時間後に切開した。腫瘍組織を溶解し、Tyrl96上でリン酸化された場合にFRS2を検出するCell Signalingの抗体(#3864)を用いたウェスタンブロットにより、FRS2チロシンリン酸化レベルを分析した。負荷対照(loading control)として、b-チューブリンを検出するSigmaの抗体(#T4026)を用いて膜をプローブした。
【図１３】図１３は、表示の経口用量のTKI258で処置し、TKI258またはビヒクル対照での処置の24時間後に舌下採血で得た、ラット由来の血清サンプル中のFGF23レベルを示す棒グラフである。FGF23レベルは、KainosのFGF23 ELISAキット(カタログ番号 CY-4000)を用いてモニタリングし、pg/mLで表す。データは、n＝4の平均値(±SD)として示す。１方向Anova 事後ダネット対ビヒクル(one-way Anova post-hoc Dunnett’s versus vehicle)でデータを比較した。
【図１４】図１４は、表示の経口用量の表示化合物で処置し、化合物投与の24時間後に舌下採血で得た、ラット由来の血清サンプル中のFGF23レベルを示す棒グラフである。FGF23レベルは、KainosのFGF23 ELISAキット(カタログ番号 CY-4000)を用いてモニタリングし、pg/mLで表す。データは、n＝6の平均値(±SD)として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明
第一の態様において、本発明は、線維芽細胞増殖因子23(FGF23)、無機リン(P)、無機リンおよび総カルシウムの積(P×tCa)、オステオポンチン(OPN)、ならびに副甲状腺ホルモン(PTH)からなる群より選択される化合物のバイオマーカーとしての使用、特にモジュレーション(好ましくは線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)のキナーゼ活性の阻害)のバイオマーカーとしての使用を提供する。該化合物はFGF23であることが好ましい。
【００２５】
線維芽細胞増殖因子23(FGF23)は公知である。FGF23は広範な生物学的活性を持つ線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーであると考えられている。タンパク質の配列および/またはタンパク質のコード配列は、当該分野で公知の公的に入手可能なデータベースから検索することができる。ヒトFGF23もADHR；HYPF；HPDR2；PHPTCとして当該分野で公知である。判定方法は当該分野で公知であり、具体的に以下に記載されている。
【００２６】
「無機リン」(P)という用語は、当該分野で公知であり、特に無機リンの血中レベルを指し、例えば、RANDOX Laboratories LTD(英国)等のキットおよびHITACHI 717分析器(Roche Diagnostics)等の臨床化学分析器を用いた紫外線法により血清中で測定され得る。
【００２７】
「総カルシウム」(tCa)という用語は、当該分野で公知であり、特に総カルシウムの血中レベルを指し、例えば、RANDOX Laboratories LTD等のキットおよびHITACHI 717分析器等の臨床化学分析器を用いた紫外線法により血清中で測定され得る。
【００２８】
「無機リンおよび総カルシウムの積」(P×tCa)という用語は、当該分野で公知であり、特に、mg/dLでの無機リン(P)のレベル値に総カルシウム(tCa)のレベル値を乗じて得られる。
【００２９】
分泌型リンタンパク質１、骨シアロタンパク質Ｉ、または初期Ｔ-リンパ球活性化１とも呼ばれるオステオポンチン(OPN)は公知である。これは、細胞外構造タンパク質と考えられている。ヒトオステオポンチンは当該分野でSPPlとして知られている。オステオポンチンは、例えば、Assay Designs, Inc.(米国)のオステオポンチン(ラット)EIAキット等のキットを製造元の指示に従って使用して測定され得る。
【００３０】
副甲状腺ホルモン(PTH)またはパラトルモンは公知である。これは、血中のカルシウムレベルの調節に関与するホルモンであると考えられている。PTHは、例えば、Immutopics, Inc.(米国)から入手可能なもの等の固相ラジオイムノアッセイを用いて決定され得る。特に、FGFRの阻害は、サンプル中における上記化合物の１つ以上(好ましくはFGF23)のレベルを決定することで評価できる。それによって、FGFR阻害剤の治療効力が評価できる。
【００３１】
本明細書で使用する「線維芽細胞増殖因子受容体阻害剤」または「FGFR阻害剤」という用語は、線維芽細胞増殖因子受容体のキナーゼ活性をブロッキングできる分子を指す。これらは、抗体等の高分子、または低分子量化合物であり得る。
【００３２】
本明細書に開示する使用および方法の好適な実施形態では、FGFR阻害剤は低分子量化合物である。低分子量FGFR阻害剤の例としては、PD176067、PD173074、化合物Ａ、TKI258または化合物Ｂが挙げられるがこれらに限定されない。PDl76067(Brown, CLら(2005), Toxicol. Pathol,Vol 33, p.449-455を参照)。PDl73074は、Parke DavisのFGF-R阻害剤であり(Mohammadiら, EMBO J. 17: 5896-5904を参照)、その特異性および有効性は確認されている。これは、以下の式を有する。
【化１】
0005539963.tif 000002
【００３３】
TKI258は以前にCHIR258として知られており、WO 02/22598の実施例109、およびXin, X.ら, (2006), Clin. Cancer Res., Vol 12(16), p.4908-4915; Trudel, S.ら,(2005), Blood, Vol.105(7), p.2941-2948に開示されている。化合物Ａは汎FGFR阻害剤であり、例えば、WO 06/000420の実施例145において3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレアとして開示されている。化合物Ｂは、[4,5']ビピリミジニル-6,4'-ジアミンの誘導体である。この構造は、WO 08/008747(表１の化合物番号４)に記載されている。この化合物は、開示されるように、またはこれらの参考文献に記載の手順の類似方法で調製できる。
【００３４】
本明細書に開示する方法および使用の好適な実施形態では、FGFR阻害剤は、遊離塩基形態または適切な塩形態の化合物Ａである。
【００３５】
本明細書で使用する「治療効力」とは、増殖性疾患および非癌障害等のヒト悪性疾患または症状の治療、予防、または進行の遅延を指す。増殖性疾患の場合、治療効力は、例えば、腫瘍の大きさを小さくするか、または腫瘍の増殖を止める化合物の能力を指す。
【００３６】
上記疾患は、良性または悪性の増殖性疾患、例えば癌、例えば腫瘍および/または転移(任意の部位)であり得るが、これらに限定されない。好適な実施形態では、本発明の方法の増殖性疾患は癌である。該癌は、無秩序なFGFRシグナル伝達に起因または関係することが好ましい。
【００３７】
増殖性疾患としては、変異型FGFR3および/またはFGFR3の高発現を伴う膀胱癌、頸癌(cervix)または口腔扁平上皮癌(Cappellenら, Nature Genetics 1999, 23; 19-20; van Rhijnら, Cancer Research 2001, 61: 1265-1268; Billereyら, Am. J. Pathol. 2001, 158:1955-1959, Gomez-Romanら, Clin. Can. Res. 2005, 11:459-465; Tomlinsonら, J. Pathol. 2007 213:91-8; WO 2004/085676)、t(4,14)染色体転座を伴う多発性骨髄腫(Chesiら, Nature Genetics 1997, 16: 260-264; Richeldaら, Blood 1997, 90:4061-4070; Sibleyら, BJH2002, 118: 514-520; Santraら, Blood 2003, 101: 2374-2476)、FGFRl, FGFR2またはFGFR4の遺伝子増幅および/またはタンパク質過剰発現を伴う乳癌(Elbauomi Elsheikhら, Breast Cancer Research 2007, 9(2); Penault-Llorcaら, Int J Cancer 1995; Theilletら, Genes Chrom. Cancer 1993; Adnaneら, Oncogene 1991; Jaakolaら, Int J Cancer 1993)、FGFR2変異を伴う子宮内膜癌(Pollock, Oncogene 2007, 1-5)、FGFR3、FGFR4またはFGFリガンドの高発現を伴う肝細胞癌(Tsou, Genomics 1998, 50:331-40; Huら, Carcinogenesis 1996, 17:931-8; Qui. World J. Gastroenterol 2005, 11:5266-72; Huら, Cancer Letters 2007, 252:36-42)、FGF3、FGF4およびFGF19遺伝子座を含む11q13アンプリコンの増幅を伴う任意の癌種(例えば、乳癌、肝細胞癌)(Berns EMら, Gene 1995, 159:11-8, Huら, Cancer Letters 2007, 252:36-42)、異常FGFRl融合タンパク質を伴うEMS骨髄増殖性疾患(MacDonald, Cross Pathobiology 2007, 74:81-88)、異常FGFR3 融合タンパク質を伴うリンパ腫(Yagasakiら, Cancer Res. 2001, 61:8371-4)、FGFRl異常発現または変異を伴うグリア芽腫(Yamaguchiら, PNAS 1994, 91:484-488; Yamadaら, Glia 1999, 28:66-76)、FGFR2変異もしくは過剰発現、またはFGFR3変異を伴う胃癌(Nakamuraら, Gastroentoerology 2006, 131:1530-1541; Takedaら, Clin. Can. Res. 2007, 13:3051-7; Jangら, Cancer Res. 2001, 61:3541-3)、異常FGFRlまたはFGFR4 発現を伴う膵臓癌(Kobrinら, Cancer Research 1993; Yamanakaら, Cancer Research 1993; Shahら. Oncogene 2002)、FGFRl、FGFR4またはFGFリガンドの異常発現を伴う前立腺癌(Giriら, Clin. Cancer Res. 1999; Dorkinら, Oncogene 1999, 18:2755-61; Valveら, Lab. Invest. 2001, 81:815-26; Wang, Clin. Cancer Res. 2004, 10:6169-78);異常FGFR4を伴う下垂体腫瘍(Abbasら, J. Clin. Endocrinol Metab. 1997, 82:1160-6)、ならびにFGF/FGFRは新脈管形成にも関与するために新脈管形成を必要とする任意の癌(例えば、Prestaら, Cytokine and Growth Factors Reviews 16, 159-178 (2005)を参照)が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
さらに、疾患は、FGFR3活性化変異を伴う良性皮膚腫瘍(Logieら, Hum. MoI Genet. 2005; Hafnerら, The Journal of Clin. Inv. 2006, 116:2201-2207)、軟骨無形成症、低軟骨形成症、発達遅延と黒色表皮腫を伴う重度の軟骨無形成症(SADDAN)、致死性形成異常(TD)を含む、FGFRにおける変異から生じる骨格障害(Websterら, Trends Genetics 13 (5): 178-182(1997); Tavorminaら, Am. J. Hum. Genet.1999, 64: 722-731)、ムンク(muenke)冠状頭蓋骨縫合早期癒合症(Bellusら, Nature Genetics 1996, 14: 174-176); Muenkeら, Am. J. Hum.Genet. 1997, 60: 555-564)、黒色表皮腫を伴うクルゾン症候群(Meyersら, Nature Genetics 1995, 11: 462-464)、家族性および散発性の両形態のパイフェル症候群(Galvinら, PNAS USA 1996, 93: 7894-7899; Schellら, Hum. MoI Gen. 1995, 4: 323-328)；低リン酸血症または高リン酸血症等のリン酸ホメオスタシスの変化に関連する疾患、例えば、FGF23ミスセンス変異に関連するADHR(常染色体優性低リン酸血症くる病)(ADHR Consortium, Nat. Genet. 2000 26(3):345-8)、PHEX遺伝子における不活性化変異に関連するＸ連鎖性優性障害であるXLH(Ｘ連鎖性低リン酸血症くる病)(Whiteら, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1996, 81:4075-4080；Quarles, Am. J. Physiol Endocrinol. Metab. 2003, 285: E1-E9, 2003; doi:10.1152/ajpendo.00016.2003 0193-1849/03)、単離リン酸消耗の後天性疾患であるTIO(腫瘍性骨軟化症)(Shimadaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 May 22;98(11):6500-5)、線維性骨形成異常(FD)(X. Yuら, Cytokine and Growth Factor Reviews 2005, 16, 221-232、およびX. Yuら, Therapeutic Apheresis and Dialysis 2005, 9(4), 308-312)、ならびにFGF23活性の消失に関連する腫瘍状石灰沈着症(Larssonら, Endocrinology 2005年9月;146(9):3883-91)等の非癌疾患であり得るが、これらに限定されない。
【００３９】
FGFR活性の阻害は、Ｔ細胞媒介性炎症性または自己免疫性疾患を治療する手段、例えば、関節リウマチ(RA)、II型コラーゲン関節炎、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、乾癬、若年発症糖尿病、シェーグレン疾患、甲状腺疾患、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、炎症性腸疾患(クローン病および潰瘍性大腸炎)、腹腔疾患、ならびに重症筋無力症を含む(ただし、これらに限定されない)Ｔ細胞媒介性炎症性または自己免疫性疾患を治療する手段を務めることがわかった(WO 2004/110487を参照)。
【００４０】
FGFR3変異に起因する疾患は、WO 03/023004およびWO 02/102972にも記載されている。
【００４１】
別の実施形態では、FGF23、P、P×tCa、OPNおよびPTHからなる群より選択される１つ以上の化合物(好ましくはFGF23)は、FGFR阻害剤の１つ以上の二次影響、特に異所性鉱質形成を予測するための安全性マーカーとして使用できる。FGF23は、１つ以上の二次影響を予測するための安全性マーカーとして使用されることが好ましい。
【００４２】
本明細書で使用する「二次影響」という用語は、被験体に対して有害であり得る望ましくない影響を指す。この影響は、上述した主効果または治療効果に関して二次的なものである。これは、FGFRモジュレーターの不適切なまたは誤った投薬または手順に起因し得るが、異所性鉱質形成の場合のようにFGFR阻害剤の作用メカニズムにも関連しているかもしれない。
【００４３】
異所性鉱質形成は、大動脈、心臓、肺、胃、腸、腎臓および骨格筋等(ただしこれらに限定されない)の軟組織で生じる不適切な生物内鉱質形成(biomineralization)である。石灰化の場合、典型的に、ヒドロキシアパタイトを含むリン酸カルシウム塩が堆積するが、シュウ酸カルシウムおよびリン酸オクタカルシウムも認められる(Giachelli CM, (1999), Am. J. Pathol, Vol. 154(3), p. 671-675)。異所性鉱質形成は、細胞死を伴うことが多い。心臓血管組織において起こった場合には臨床症状を引き起こし、動脈においては、石灰化は、アテローム性プラーク負荷(burden)および心筋梗塞の危険性の上昇、ならびに血管形成後の解離の危険性の上昇と相互関連を示す。
【００４４】
第２の態様では、本発明は、
ａ)FGFR阻害剤を被験体に投与する工程;
ｂ)該被験体のサンプルを提供する工程;
ｃ)該サンプルのFGF23レベルを決定する工程;および
ｄ)該サンプルのFGF23のレベルを、参照レベルと比較する工程、
を含む、FGFRのキナーゼ活性のモジュレーション(好ましくは阻害)を判定する方法を提供する。
【００４５】
上記方法は、例えば、FGFR阻害剤の治療効力を判定、および/またはFGFR阻害剤の１つ以上の二次影響を判定するのに適している。 
【００４６】
本明細書に開示する方法の被験体は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類(マウスもしくはラット等)、イヌ、ブタ、またはヒトである。
【００４７】
本発明はさらに、本明細書に開示する方法の工程ａ)〜ｄ)を含み、前記被験体がラットであり、前記参照レベルが745 pg/mlである、FGFR阻害剤の治療効力を判定する方法を提供する。
【００４８】
さらに、本発明は、本明細書に開示する方法の工程ａ)〜ｄ)を含み、前記被験体がラットであり、前記参照レベルが1371 pg/mlである、FGFR阻害剤の１つ以上の二次影響を判定する方法を提供する。
【００４９】
本発明の方法において言う「参照レベル」は、FGFR阻害化合物での処置を開始する前の被験体中のFGF23レベルを決定することにより、つまり被験体の基準レベルを決定することにより、確立できる。従って、代替的な実施形態では、本方法は、被験体中のFGF23の基準レベルを測定する工程をさらに含む。別の代替的な実施形態は、健康な対照個体もしくは群、または非治療化合物で処置された同じもしくは同様の増殖性疾患を持つ対照個体もしくは群におけるFGF23レベルを決定することから構成される。また、参照レベルは、文献から得てもよい。
【００５０】
被験体のサンプルは、例えば血漿もしくは血清等の血液、または尿から得ることが好ましい。しかし、本方法は、他の身体組織、またはその派生物(細胞溶解物等)に対して実施することもできる。本発明の方法は、ex vivoで実施されることが理解されよう。
【００５１】
本発明は、
ａ) FGFR阻害剤処置を開始する前の患者のサンプル中のFGF23レベル(個体参照レベル)を決定する工程；
ｂ)該FGFR阻害剤処置を受けた後の同患者のサンプル中のFGF23レベルを決定する工程
を含む、FGFRのキナーゼ活性のモジュレーション(好ましくは阻害)を判定するex vivo方法であって、工程ｂ)のFGF23レベルが個体参照レベルよりも高い場合は、FGFRのキナーゼ活性のモジュレーション(好ましくは阻害)が生じたことを示す、方法を提供する。
【００５２】
好適な一実施形態では、患者は癌患者である。好適な一実施形態では、このような患者の癌は、無秩序なFGFRシグナル伝達に起因または関係する。より好ましくは、癌は固体腫瘍である(好ましくは、膀胱癌、黒色腫および腎臓癌が挙げられるがこれらに限定されない)。
【００５３】
FGF23の上昇の程度は、各個別のFGFR阻害剤、投薬量、および治療レジメンの性質に応じて変化し得るが、FGF23のバイオマーカーとしての使用はFGFR阻害剤処置に対する患者の応答をモニタリングするための信頼性のある便利な非侵襲手段を提供する。さらに、医師は、FGF23の上昇値に応じて、予後を改善させたり、用量を調節したり、他の処置に切り替えたり、または処置による二次影響を詳しくモニタリングしたり回避することができる。
【００５４】
工程ｂ)のFGF23レベルは、個体参照レベルと比べて、好ましくは少なくとも1.2倍、さらに好ましくは少なくとも1.4倍、少なくとも1.5倍、少なくとも1.7倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍高い。化合物Ａ等の有力なFGFR阻害剤については、FGF23レベルは、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、4倍、さらにそれ以上高くなり得る。
【００５５】
FGFR阻害剤処置後のFGF23レベルの上昇は、通常、特定のFGFR阻害剤の一回目の標準投薬量の後に認められる。特定のFGFR阻害剤の標準投薬量に関する情報は、通常、特定のFGFR阻害剤をAPIとして含む薬物のラベルに記載されている。通常、FGF23レベルは、FGFR阻害剤濃度が安定状態になってから測定する。400mgまたは500mgのTKI258で処置した黒色腫患者および転移性腎細胞癌患者についての我々の予備観察では、FGF23のピークが、処置の１サイクル目の15日目ごろであることが示された。従って、好適な一実施形態では、本発明の方法は、上記FGFR阻害剤処置を、少なくとも5日間、好ましくは少なくとも5日間で30日間以下、好ましくは少なくとも10日間で25日間以下、少なくとも10 日間で20日間以下で受けた後の同じ患者のサンプル中のFGF23レベルを決定することを含む。
【００５６】
毎日400mgのTKI258で処置された患者の場合、FGF23のレベルは、1.96倍および2.1倍まで上昇し得る。
【００５７】
好適な一実施形態では、FGFR阻害剤は化合物Ａ、またはその任意の医薬的に許容可能な塩である。好適な一実施形態では、FGFR阻害剤はTKI258またはその任意の医薬的に許容可能な塩である。
【００５８】
一態様において、本発明は、増殖性疾患の治療用医薬を製造するためのFGFR阻害剤の使用であって、該増殖性疾患は患者が患っている好ましくは癌、より好ましくは無秩序なFGFRシグナル伝達を伴う癌であり、該患者が該FGFR受容体阻害剤を摂取後にFGF23のレベルが上昇する、使用を提供する。あるいはまた、本発明は、増殖性疾患を治療するための方法であって、該増殖性疾患は患者が患っている好ましくは癌、より好ましくは無秩序なFGFRシグナル伝達を伴う癌であり、該方法は、該患者にFGFR阻害剤を投与する工程を含み、該患者がFGFR 受容体阻害剤を摂取後にFGF23のレベルが上昇する、方法を提供する。FGFR阻害剤処置後のFGF23レベルの上昇は、通常、特定のFGFR阻害剤の一回目の標準投薬量の後に認められる。
【００５９】
通常、FGF23レベルは、FGFR阻害剤濃度が安定状態に達してから測定される。従って、FGF23のバイオマーカーとしての使用は、FGFR阻害剤に対する応答に応じて、患者(特に無秩序なFGFRシグナル伝達を伴う癌患者)の層別化を可能にする。
【００６０】
本願は、
(ａ)FGFR阻害剤処置をある期間患者に施す工程；
(ｂ)該処置後に該患者のサンプル中のFGF23レベルを測定する工程；
(ｃ)工程(ｂ)で得た該FGF23値を、個体参照レベル(該FGFR阻害剤処置を開始する前の該患者中のFGF23レベル)と比較して、該患者が該FGFR阻害剤処置を継続するべきか否かを決定する工程
を含む、患者がFGFR阻害剤処置の恩恵を受けるか否かを判定するために患者をスクリーニングする方法を提供する。
【００６１】
本明細書で使用する「期間(period of time)」という用語は、通常30日を超えない、より多くの場合には15日を超えない、場合によっては１週間を超えない、比較的短い期間を指す。この「試験的」期間の間、患者は、上記FGFR阻害剤処置を、標準的レジメンに従って、またはさらに高い投薬量で、より多い投与頻度で、もしくはその両方で施される。患者は、通常、無秩序なFGFRシグナル伝達に起因または関係し得る症状を有し、多くの場合には患者は無秩序なFGFRシグナル伝達に起因または関係し得る癌を患っている。
【００６２】
個体参照レベルと比較したFGF23の上昇は、通常、少なくとも1.2倍、好ましくは少なくとも1.3倍、または少なくとも1.5倍である。これは、典型的に、そして好ましくはFGFR阻害剤がTKI258の場合である。
【００６３】
有力なFGFR阻害剤については、FGF23のさらなる上昇が期待される。化合物Ａの場合、上昇は少なくとも1.3倍、好ましくは少なくとも1.5倍、より好ましくは少なくとも2倍、さらに好ましくは少なくとも3倍である。
【００６４】
FGFR阻害剤は、PD176067、PD173074、化合物Ａ(3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレア)、TKI258 、および化合物Ｂ([4,5']ビピリミジニル-6,4'-ジアミンの誘導体)からなる群より選択されることが好ましい。
【００６５】
好適な一実施形態では、FGFR阻害剤は化合物Ａ、またはその任意の医薬的に許容可能な塩である。好適な一実施形態では、FGFR阻害剤はTKI258、またはその任意の医薬的に許容可能な塩である。 
【００６６】
検出の目的のために、サンプルをさらに処置することができ、例えば、当業者に周知の技術を用いてタンパク質を単離できる。
【００６７】
典型的に、FGF23のレベルは、適切な検出薬剤で被験体の該サンプル中のポリペプチドFGF23の存在を測定することによって決定される。本発明のポリペプチドを検出するために好適な薬剤は、本発明のマーカーに対応したポリペプチドに結合可能な抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル、より好ましくはモノクローナルであり得る。無傷抗体(intact antibody)、またはそのフラグメント、例えば、FabまたはF(ab')2が使用できる。
【００６８】
別の実施形態では、FGF23コード配列の発現は、サンプル中で、例えば、対応するRNAのレベルを決定することにより検出することができる。適切な検出薬剤は、標的核酸配列に相補的な短い核酸配列のプローブである。本発明の好適な実施形態では、FGF23ポリペプチドが検出される。
【００６９】
検出薬剤は、直接的にまたは間接的に検出可能であってよく、標識化されていることが好ましい。プローブまたは抗体に関して「標識化」という用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング(すなわち物理的に連結)することによるプローブまたは抗体の直接的な標識化、および直接的に標識化された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的な標識化を含むことを意図する。間接的な標識化の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いて一次抗体を検出すること、およびDNAプローブの末端をビオチンで標識化して蛍光標識されたストレプトアビジンで検出されるようにすることが挙げられる。標識は、従来のもの、例えば、ビオチンまたはアルカリホスファターゼ(AP)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)もしくはペルオキシダーゼ(POD)等の酵素、または蛍光分子(例えば、フルオレセインイソチアネート等の蛍光染料)であり得る。
【００７０】
本発明の好適な実施形態では、検出手段は、抗体誘導体またはそのフラグメント、例えば、FGF23を認識する抗体、例えば、標識を担持するFGF23認識抗体を含む抗体を包含する。別の態様では、FGF23のレベルは、FGF23に特異的な抗体を用いて決定される。
【００７１】
検出薬剤、例えば、標識担持抗体は、従来どおりの方法に従って、例えば、蛍光測定または酵素検出方法を介して検出でき、アッセイの分野で慣習的なもの、例えば、酵素免疫イムノアッセイ(ELISA)等のイムノアッセイ、解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ(dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay)(DELFIA)等の蛍光ベースのアッセイ、またはラジオイムノアッセイ(RIA)等の放射分析アッセイが挙げられる。さらに適切な例としては、EIAおよびウェスタンブロット分析が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、FGF23のレベルを決定するのに使用するために、公知のタンパク質/抗体検出方法を容易に適応できる。
【００７２】
本明細書に開示する方法は、P、P×tCa、OPNおよびPTHからなる群より選択される化合物で同様に実施できることが理解されよう。
【００７３】
好適な実施形態において、FGF23、P、P×tCa、OPNおよびPTHからなる群より選択される２つ以上の化合物が本明細書に開示する方法で使用され、最も好ましくは、FGF23 とP、P×tCa、OPNおよびPTHからなる群より選択される１つ以上の化合物との組み合わせで使用される。複数のバイオマーカーを使用することで、FGFR阻害剤の治療効力および/または１つ以上の二次影響の判定精度が向上する。FGF23、P、P×tCa、OPN、PTHからなる群より選択される１つ以上の化合物を安全性バイオマーカーとして使用する場合、FGFR阻害剤の１つ以上の二次影響を判定する上記方法は、
ｅ)FGF23、P、P×tCa、OPN、PTHからなる群より選択される１つ以上の化合物のレベルを１つ以上の二次影響と相関させる工程;および
ｆ)採用した治療に関連して二次影響が生じる該化合物のレベルを決定する工程
をさらに含み得る。
【００７４】
FGF23、P、P×tCa、OPNのレベルは、参照レベルと比較した場合に高いことが好ましい。
【００７５】
PTHのレベルは、参照レベルと比較した場合に低いことが好ましい。
【００７６】
別の態様では、本発明は、FGFR阻害剤での治療的処置に対する、FGFR関連障害を有する被験体の応答性を決定する方法であって、被験体の血漿または血清中のFGF23、P、P×tCa、OPN、PTHからなる群より選択される１つ以上の化合物(好ましくはFGF23)のレベルを決定する工程を含む方法を提供する。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「治療的処置(therapeutic treatment)」とは、FGFR関連疾患(好ましくは増殖性疾患、より好ましくは癌)の治療、予防、または進行の遅延を指す。
【００７８】
さらに別の態様では、本発明は、以下に概要を説明する構成要素ａ)〜ｄ)を含む診断キットを提供する。特に、本発明は、
ａ)任意に標識化形態である、FGF23、P、P×tCa、OPNおよびPTHからなる群より選択される１つ以上の化合物またはその一部を認識する分子；
ｂ)任意に、使用のための指示書；
ｃ)任意に、検出手段；ならびに
ｄ)任意に、固相
を含む、好ましくは被験体のサンプルにおける、FGFR阻害剤の効力および/またはFGFR阻害剤の二次影響を決定するためのキットに関する。
【００７９】
さらに、好ましくは被験体のサンプルにおける、FGFR阻害剤の効力および/またはFGFR阻害剤の二次影響を決定するための前記キットの使用が提供される。
【００８０】
好適な一実施形態では、本発明は、
ａ)任意に標識化形態である、FGF23またはその一部を認識する分子；
ｂ)無機リン(P)、リンおよび総カルシウムの積(P×tCa)、オステオポンチン(OPN)、ならびに副甲状腺ホルモン(PTH)からなる群より選択される第２のバイオマーカーを検出することができる少なくとも１つの試薬；
ｃ)任意に、使用のための指示書；
ｄ)任意に、検出手段；ならびに
ｅ)任意に、固相、
を含む診断キットを提供する。
【００８１】
さらに、本発明は、上で概要を説明した、被験体のサンプルにおけるFGFR阻害剤の効力および/またはFGFR阻害剤の二次影響を決定するためのキットの使用を提供する。
【００８２】
好適な一実施形態では、キットは、無機リン(P)である第２のバイオマーカーを検出可能な少なくとも１つの試薬を含む。
【００８３】
本発明の好適な実施形態をより完全に例示するために以下の実施例を提示する。これらの実施例は、決して、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８４】
実施例１
化合物Ａによる腫瘍同種移植片の用量依存的な阻害；線維芽細胞増殖因子受容体キナーゼ活性の阻害をモニタリングするためのバイオマーカーとしてのFGF23
1.1  方法
動物
Laboratory Animal Services(Novartis Pharma AG, Basel, Switzerland)から得た雌HsdNpa：胸腺欠損nuヌードマウスに対して実験を行った。動物を、MakrolonタイプIIIケージ(最大10匹/ケージ)に入れ、暗所で12時間および明るい所で12時間のOHC条件下においた(午前６時に点灯：午後６時に消灯)。動物には自由に食餌および水を与えた。バーゼル州獣医局(Basel Cantonal Veterinary Office)に承認されたライセンス番号1762およびライセンス番号1763の下で実験を行った。全ての侵襲手順は、フォーレン麻酔の下で行った。
【００８５】
ヌードマウスにおけるNIH3T3/FGFR3S249C腫瘍同種移植片モデルの樹立
NIH3T3/FGFR3S249Cモデルは、FGFR阻害剤のin vivoプロファイリングのための皮下マウス腫瘍モデルとして立証および特徴決定されている。NIH3T3親細胞系は、最初、マウス胎仔線維芽細胞の不死化から得た。NIH3T3/FGFR3S249C細胞は、活性化変異S249C を有するFGFR3を発現するレトロウイルスベクターにNIH3T3親線維芽細胞を感染させることにより生成した。G418耐性NIH3T3S249C細胞のプールを樹立し、FGFR3発現およびチロシンリン酸化について特徴決定した。同種移植片を生成するために、PBS に再懸濁させた5×105 NIH3T3/FGFR3S249C細胞をヌードマウスに皮下注射した(0.2 ml/マウス)。
【００８６】
ヌードマウスにおけるRT112/lucl腫瘍異種移植片モデルの樹立
高レベルの野生型FGFR3を発現したRT-112ヒト膀胱移行細胞癌親細胞系は、1973年に未処置の原発性膀胱癌を持つ女性患者(組織的グレードG2、ステージは未記録)から初めて得た(Marshallら, 1977, Mastersら, 1986)。この研究で使用したRTl12細胞の原ストックバイアルは、DSMZ ACC #418から得た。
【００８７】
10％ウシ胎仔血清、1％ピルビン酸ナトリウム、および1％L-グルタミンを補充したMEM培地中で細胞を培養した。細胞培養試薬は、BioConcept(Allschwil, スイス)から購入した。
【００８８】
RTl12親細胞系を、レトロウイルス発現ベクターpLNCX2/luclに感染させ、G418耐性細胞のプールを樹立し、ルシフェラーゼ発現について特徴決定した。CMV駆動型のルシフェラーゼ発現により、D-ルシフェリン注射後にXenogen IVISTMカメラを用いた腫瘍の検出が可能になる。
【００８９】
5×lO6細胞を含む100μlの50％マトリゲル(BD #356234)含有HBSS(Sigma #H8264)を右脇腹へ皮下注射することにより、RT112/lucl異種移植片腫瘍を樹立した。
【００９０】
抗腫瘍活性の評価
NIH3T3/FGFR3S249Cモデルについては、平均腫瘍体積が約100 mm3に達した時に処置を開始した。腫瘍成長および体重を一定の間隔でモニタリングした。腫瘍の大きさはキャリパーを用いて手で測定した。腫瘍体積は式:(W×L×H×π/6)(ただし、幅(W)、長さ(L)および高さ(H)は３つの最大直径である)を用いて推定した。
【００９１】
RT112/luclモデルについては、平均腫瘍体積が約180 mm3の時に処置を開始し、マウスを14日間毎日処置した。体重および腫瘍体積を週に２回記録した。腫瘍体積は、キャリパーで測定し、長さ×(直径)２×π/6の式に従って決定した。
【００９２】
統計的分析
適用可能である場合に、結果を平均値±SEMとして表した。腫瘍および体重データを、ANOVAと事後ダネット検定(post hoc Dunnett’s test)で分析して、処置グループ対対照グループを比較した。グループ内比較のために、事後テューキー検定(post hoc Tukey test)を用いた。実験の開始と終わりとの間のグループ内での体重変化の有意性レベルは、対をなすＴ検定を用いて決定した。GraphPad prism 4.02(GraphPad Software)を用いて、統計的分析を行った。
【００９３】
抗腫瘍効力の尺度として、処置を開始してから特定の日数後に、(処置動物の腫瘍体積の平均変化/対照動物の腫瘍体積の平均変化)×lOOに従い、％T/C値を計算する。適応可能な場合には、式(腫瘍の体積の平均変化/平均初期腫瘍体積)×l00に従って、退縮％を計算する。
【００９４】
化合物の処方および動物の処置
化合物Ａを、PEG300/D5W (2:1 v/v, D5W＝5％グルコース含有水)に入った懸濁液として処方し、強制飼養により毎日適用した。ビヒクルは、PEG300/D5Wで構成した。適用容量は10 ml/kgであった。
【００９５】
ex vivo分析のための組織処理
実験終了後、最後の化合物投与から２時間後に、腫瘍サンプルおよび血液を採取した。
【００９６】
腫瘍サンプルを切開し、液体窒素中で急冷凍結させた。スイングミル(RETSCH MM200)を用いて腫瘍物質を微粉化した。凍結腫瘍サンプルを添加する前に、粉砕ジャーおよびボールをドライアイス上で30分間冷やした。スイングミルを100％の強度で20秒間作動させた。腫瘍粉を14 mLポリプロピレンに移し(全工程をドライアイス上で行う)、使用するまで-80℃で保存した。
【００９７】
50mg 腫瘍粉のアリコートの重さを量り、氷上に置き、氷冷溶出緩衝液(50 mM Tris(pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EGTA、5 mM EDTA、1％Triton、2 mM NaVanadate、1 mM PMSFおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルRoche # 11873580001)中に1:10(w/v)の比ですぐに再懸濁させた。氷上で30分間溶出させ続け、12000×gにて15分間の遠心分離によって溶解物を清澄化し、DCタンパク質アッセイ試薬(Bio Rad # 500-0116)およびBSA標準液を用いてタンパク質濃度を決定した。23ゲージ針で、大静脈から血液を、70μlの1000 IU/mlヘパリン溶液の入った1ml注射器に採取した。次に、血液を、遠心分離(10,000g、５分間)まで30分間氷上で保存してから、血漿を採取した。
【００９８】
免疫沈降およびウェスタンブロット分析
等量のタンパク質溶解物をタンパク質Ａ-セファロースで前除去(pre-clear)した後、１μgのα-FGFR3抗体(ウサギポリクローナル, Sigma # F3922)と氷上にて２時間インキュベートした。免疫複合体をタンパク質Ａ-セファロースで回収し、３×溶出緩衝液で洗浄した。サンプル緩衝液(20％SDS、20％グリセロール、160 mM Tris(pH6.8)、４％β-メルカプトエタノール、0.04％ブロモ-フェノールブルー)中で煮沸させて結合したタンパク質を解放させた。
【００９９】
サンプルに対してSDS-PAGE を行い、タンパク質をPVDF 膜上にブロッティングした。フィルターを20％ウマ血清、0.02％Tween 20含有PBS/Oで１時間ブロックし、抗pチロシン(pTyrosine)抗体4G10(Upstate)を1:1000希釈で２時間室温にて添加した。Super Signal(登録商標)West Dura持続時間延長型(Extended Duration)基質検出系(Pierce #34075)を用いて、ペルオキシダーゼ共役抗マウス抗体(Amersham #NA931V)でタンパク質を可視化した。さらに、膜を62.5 mM Tris-HCl(pH6.8)；2％SDS；1/125β-メルカプトエタノール中で60℃にて30分間裂き(strip)、α-FGFR3 抗体(ウサギポリクローナル、Sigma # F3922)に続けてペルオキシダーゼ共役抗ウサギ抗体(Amersham #NA934V)で再度プローブした。タンパク質を上述したように可視化した。
【０１００】
FGF23 ELISAアッセイ
血漿または血清サンプル中のFGF23レベルをモニタリングするために、KAINOS Laboratories, Inc.(日本)のFGF23 ELISAアッセイを使用した(カタログ番号CY-4000)。簡潔には、完全長FGF -23 に結合する２つの特異的マウスモノクローナル抗体を使用する：捕捉のために第１の抗体はマイクロタイタープレートウェル上に固定化し、検出のために第２の抗体はHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)にコンジュゲートさせる。第１の反応では、血漿または血清サンプルを、抗FGF23 抗体で被覆されたマイクロタイターウェルに添加して結合させる。ウェルを洗浄して結合していないFGF23および他の成分を除去する。第２の反応では、固定化FGF23をHRP標識化抗体とインキュベートして、「サンドウィッチ」複合体を形成する
【０１０１】
このELISA アッセイは、マウス、ラットおよびイヌの血清および血漿中のFGF23をモニタリングできることが立証されている。
【０１０２】
1.2  結果および考察
NIH3T3/FGFR3S249Cモデル中の化合物Ａの活性
化合物Ａの抗腫瘍効果をNIH3T3/FGFR3S249C皮下モデルにおいて評価した。10、30および50mg/kgの用量レベルをテストした。推定平均腫瘍サイズが100 mm3に達した時に処置を開始し(０日目)、８日間動物を処置した。腫瘍の大きさおよび体重を、処置８日目に１方向ANOVAにより評価した。ビヒクルで処置した動物と比べて、全ての用量レベルにおいて統計的に有意な抗腫瘍効果が認められ(ANOVA事後ダネット検査)、10 mg/kgおよび30 mg/kgではT/C値はそれぞれ34％および4％であり、50mg/kgでは腫瘍退縮は40％であった(表１、図１)。２つの最高用量レベルでは、処置期間の間の統計的に有意な体重減少が得られた。しかし、ビヒクルで処置されたグループ、および10 mg/kgで処置されたグループで認められるさらなる体重の増加は、少なくとも部分的に腫瘍の質量(mass)によるものである。
【表１】
0005539963.tif 000003
【０１０３】
化合物Ａでの処置の際のFGFR3チロシンリン酸化の薬力学
10 mg/kg qd、30 mg/kg qdもしくは50mg/kg qd、またはビヒクルで処置された動物由来のNIH3T3/FGFR3S249C腫瘍を、最後の投与から２時間後(これは先の薬物動態研究において確立したtmax間隔内である)に切開した。NIH3T3/FGFR3S249C移植腫瘍のex vivo分析は、合計受容体レベルは一定のままでの、FGFR3 Tyr-リン酸化の用量依存的な阻害を実証した(図２)。この薬力学的効果は、抗腫瘍効果と相互関連を示した(図１)。
【０１０４】
RT112/luclモデルにおける化合物Ａの活性
化合物Ａの抗腫瘍活性を、50 mg/kg/日および75mg/kg/日の２つの異なる用量レベルでのヌードマウスへの経口投与で評価した。２つの用量は、統計的に有意な腫瘍退縮をもたらした(p<0.01、ANOVA 事後ダネット検定)。退縮値は、50 mg/kgおよび75mg/kgの化合物Ａについてそれぞれ67％および74％であった(表２、図３)。ビヒクルおよび50mg/kg/日の化合物Ａのグループの統計的に有意な体重増加に示されるように、処置は実験過程の間十分に寛容された。75mg/kgの化合物Ａで処置されたグループはわずかに体重が減少したが、統計的に有意ではなかった。75mg/kgの化合物Ａで処置されたグループにおける体重増加は、ビヒクル対照と比べて有意に異なることがわかった(p<O.Ol、ANOVA、事後ダネット検定)。さらに、75mg/kgの化合物Ａで処置されたグループは、他の全てのグループと比較して、体重変化に統計的に有意な差を示した(p<0.05、ANOVA、事後テューキー)。
【表２】
0005539963.tif 000004
【０１０５】
ヌードマウスの血漿サンプルにおけるFGF23レベル
1.1節で説明した研究の一部として、50mg/kg/qdもしくは75mg/kg/qdの化合物Ａ、またはビヒクルで処置したマウスから得た血漿サンプル中のFGF23レベルを、最後の投薬から２時間後に決定した。化合物Ａで処置したマウスは、ビヒクル処置グループと比べて高い血漿FGF23レベルを示し(図４)、これは両方の用量の化合物で認められた抗腫瘍効力効果と相互関連を示した(図３)。
【０１０６】
結論
提示された実験データから、２匹のマウス腫瘍モデルにおいてFGFR3をin vivoで阻害し、統計的に有意な抗腫瘍効果をもたらす化合物Ａの用量が、用量依存的に血漿FGF23レベルの上昇ももたらすことが実証される。
【０１０７】
実施例２
ラット機構研究
2.1  方法
動物
Charles River Laboratories Germany GmbH, Research Models and Services(Sulzfeld、ドイツ)から得た雄Crl:WI(Han)ラット(投与開始時に14〜17週齢)において実験を行った。動物は、MakrolonタイプIVケージに入れて、暗所で12時間および明るい所で12時間の最適な衛生条件(optimal hygene condition)(OHC)下においた。ペレット標準食餌および水を自由に与えた。この研究は、スイス動物保護法(Swiss Animal Welfare Law)、そして具体的には ‘Kantonales Veterinaramt Baselland’(バーゼル州獣医局)による動物ライセンス第5075号に準拠して行った。
【０１０８】
化合物の処方および動物の処置
化合物Ａを酢酸-酢酸緩衝液(acetic acid-acetate buffer)(pH 4.6)/PEG300(2:1 v/v)に入った溶液として処方し、強制飼養により毎日適用した。ビヒクルは、酢酸-酢酸緩衝液(pH 4.6)/PEG300(2:1 v/v)で構成した。適用容量は5 ml/kgであった。
【０１０９】
研究設計
化合物Ａを10匹の雄ラットのグループに、一日一回、10mg/kgの用量で1、3、7および15日間、または20mg/kgで1、3および6日間経口投与した。20mg/kgで処置した動物は、重度の体重喪失のために、６回目の投与後に早めに終了しなければならかった。対照動物は、1、3、7および15日間ビヒクルを受けた。化合物Ａ(用量：10mg/kgを3、7および15日間；20mg/kgを1および3日間)、またはビヒクルのいずれかを受けた追加のグループ(各雄10匹)を導入して、さらに、処置に関連する影響を調査し、4、7または14日後の回収の後に選択した臨床化学パラメータにおける変動をモニタリングした。
【０１１０】
2.2  結果および考察
FGFR阻害に関連する組織病理学的な知見
10mg/kg/日および20mg/kg/日で投薬した動物において、３日間の処置後に成長板肥厚が検出された。これは、おそらく軟骨細胞において、FGFR3を阻害した結果である。実際、肥厚部位の大きさが増すことによる成長板肥厚は、標的化されたFGFR3破壊(disruption)についてホモ接合、すなわちFGFR3発現が欠如しているマウスにおいても起こることが既に示されている(Colvinら, Nature Genetics 1996,12:390-397)。この観察は、FGFR3が、成長板拡大を制御する役割を果たすことを実証する。従って、成長板に関連する知見は、FGFR阻害剤についての薬理学的な読み取りであると考え、FGFR阻害剤の効力すなわちFGFR3の阻害を示唆するものである。骨再形成事象の兆候は、10mg/kg/日で処置された動物において15日間の処置および4日間の回収期間(recovery period)の後、20mg/kg/日で処置された動物において3日間の処置および4日間の回収期間(遅延型効果)の後、ならびに20 mg/kg/日で6日間処置された動物において認められた。20 mg/kg/日で3日間処置された動物において4日間の回収の後、および20 mg/kg/qdの用量の化合物Ａでの6日間の処置の後に軟組織/脈管鉱質形成を検出した。このような知見は、10mg/kg/qdの化合物Ａを投与されたグループでは認められなかった。
【０１１１】
臨床化学パラメータ
薬理学的事象(成長板肥厚)ならびに病理学的事象(骨再形成および異所性鉱質形成)の開始を予測およびモニタリングするマーカーとしての有用性を評価する目的で、無機リン(P)、無機リンおよび総カルシウムの積(P×tCa)、副甲状腺ホルモン(PTH)、オステオポンチン(OPN)ならびにFGF23 を測定した。血清中でのP、tCa、それらの積およびFGF23 のレベルの変動を、それぞれ図５、６、７および８において散布図として示す。各プロット(グレースケールの四角は単体の動物を表す)は、マーカーの末梢濃度(Ｙ軸)と化合物Ａの用量(Ｘ軸)との関数として報告されている。異なるグレー階調は、特定の処置期間と関連付けられている。データ可視化のためにSpotfire8.2を使用した。
【０１１２】
バイオマーカーの検証方法
ラット予備研究で測定した選択マーカーの性能の定量的評価を、医学的検査を評価するためによく利用される方法で、ROC曲線下の面積(AUC)を測定することにより、所定のアッセイの診断力を判定することができる受診者動作特性(Receiver Operating Characteristics、ROC)分析により行った。Swets JA, Science. 240:1285-93(1988)；Swets JAら, Scientific American. 283:82-7(2000)。
【０１１３】
選択バイオマーカーの性能の評価
処置期に得られたデータに対してROC分析を行うことにより得られたマーカー性能(AUC)のランキングを表３において報告する。
【表３】
0005539963.tif 000005
【０１１４】
ROC分析を使用して、遅延型病理学的影響を考慮して、FGF23の性能についての追加の評価を行った。このような分析により、このマーカーについて、薬理学および安全性閾値を決定できた(表４)。薬理学閾値は745pg/mLであり、この分析で考慮する処置の間にそれを超えると成長板肥厚が認められるFGF23レベルを表す。安全性閾値は1371pg/mLであり、この分析で考慮する処置の間に許容される最も高いFGF23レベルを表し、これは遅延型病理学的影響(骨再形成および異所性鉱質形成)がないことを保証する。
【表４】
0005539963.tif 000006
【０１１５】
結論
本研究においてラットで測定した臨床パラメータのうち、いくつかは適切な薬力学的マーカーであることがわかった。これらのマーカーは、表３において報告した対応するAUC値で実証されるように良好なレベルから非常に高いレベルの性能を発揮する。さらに、表４に示すように、この研究は、FGF23 が、成長板肥厚の発症をモニタリングし(治療効力/薬理学)、骨再形成および異所性鉱質形成の発症を予防する(安全性/病理学)、予測バイオマーカーであることを実証する。この特定の研究およびこの分析において考慮される処置に関して、FGF23についての薬理学および安全性の閾値は確立されている。
【０１１６】
実施例３
イヌにおける化合物ＡによるFGF23誘導
3.1  方法
動物
イヌにおいて実験を行った：
動物種および系統：イヌ、ビーグル
研究における動物の頭数：８
年齢：13〜18月齢(投薬開始時)
体重範囲：7〜11 kg(投薬開始時)
提供元による獣医処置：駆虫療法、ならびにイヌジステンパー、感染性イヌ肝炎、パラインフルエンザ、レプトスピラ症、パルボウイルス、アデノウイルスおよび狂犬病に対するワクチン接種。
【０１１７】
化合物の処方および動物の処置
化合物Ａを、0.5％HPMC603に入った懸濁液として処方し、一日一回、経口強制飼養により適用した。ビヒクルは、0.5％HPMC603で構成した。適用容量は２ml/kgであった。
【０１１８】
研究設計：イヌを表示の通りにビヒクルまたは化合物Ａで処置した。
【表５】
0005539963.tif 000007
*グループ１およびグループ３は、15日間連続で処置した。
**グループ２は、3 mg/kg/日で8日間処置した。9〜18日目までは、用量を100 mg/kg/日に増やした；19〜21日目までは動物に休薬させ、22日目および23日目に投薬を再開した(100mg/kg：10日間投薬、3日間休薬、2日間投薬)。
***グループ３は、300mg/kg/日で8日間連続で処置した。
【０１１９】
ex vivo分析のための血液サンプリング
投薬期間の終了後、最後の化合物投与から１時間後に、頸静脈または橈側皮静脈(vena cephalica antebrachii)からEDTA被覆チューブに全血を採取し、さらに処理するまでは氷水上で保持した。標本を遠心分離し、血漿をエッペンドルフチューブに移して、ドライアイス上にセットした。
【０１２０】
FGF23 ELISAアッセイ
血漿サンプル中のFGF23レベルをモニタリングするために、KAINOS Laboratories, Inc.(日本)のFGF23 ELISAアッセイを使用した(カタログ番号 CY-4000)。簡単に言うと、完全長FGF-23に結合する２つの特異的マウスモノクローナル抗体を使用する：捕捉のために第１の抗体をマイクロタイタープレートウェル上に固定化し、検出のために第２の抗体をHRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)にコンジュゲートさせる。第１の反応において、血漿サンプルを、抗FGF23抗体で被覆されたマイクロタイターウェル上に添加して結合させる。ウェルを洗浄して、結合していないFGF23および他の成分を除去する。第２の反応において、固定化したFGF23を、HRP標識化抗体とインキュベートして「サンドウィッチ」複合体を形成する。
【０１２１】
3.2  結果および考察
イヌの血漿サンプル中のFGF23レベル
化合物Ａで処置したイヌは、ビヒクル処置グループと比べて高い血漿FGF23レベルを示し(表２)、これは概して用量依存的であった。用量に比例した上昇よりも低いグループ２については、3 mg/kg/日での投薬期間の間の適応メカニズムによって説明できる。あるいはまた、10日間の投薬の後の3日間の休薬がFGF23の低下をもたらすのかもしれない。
【表６】
0005539963.tif 000008
【０１２２】
結論
提示の実験データは、化合物Ａがイヌにおいて高い血漿FGF23レベルをもたらすことを実証する。
【０１２３】
実施例４
TKI258で処置された黒色腫患者からの血漿サンプル中のFGF23測定
4.1  方法
化合物：TKI258は、とりわけFGFRl、FGFR2およびFGFR3を、細胞アッセイにおいてそれぞれ166 nM、78 nMおよび55 nMのIC50値で阻害するマルチキナーゼ阻害剤である。
【０１２４】
患者および処置：転移性黒色腫患者を、TKI258を表示の用量で経口投与して毎日処置した。表示の日数およびサイクルにおいて血液サンプリングを行った。血漿中のFGF23レベルを測定した。ClDlについて得られた値を基準値とする。
【０１２５】
FGF23 ELISAアッセイ
患者のFGF23血漿サンプルをモニタリングするために、実施例３に記載したように、KAINOS Laboratories, Inc.(日本)のFGF23 ELISAアッセイを使用した(カタログ番号CY-4000)。
【０１２６】
4.2  結果および考察
３人の異なる患者から得たFGF23データを表３に示す。
【表７】
0005539963.tif 000009
【０１２７】
200mgのTKI258で処置した患者Ａは、処置の間を通じて、同様のFGF23レベルを示した。400mgのTKI258で処置した患者ＢおよびＣでは、FGF23レベルはそれぞれ基準レベルの最大1.96倍および2.1倍まで上昇した。
【０１２８】
実施例５
TKI258で処置した黒色腫患者から得た血漿サンプルにおけるFGF23測定
5.1  方法
方法：200 mg/日、300 mg/日、400 mg/日または500 mg/日、一日一回の連続投薬スケジュールで、患者を経口処置した。MTDは400mg/日と規定した。43人の患者から血漿サンプルを回収した。TKI258の血漿濃度をLC/MS/MSにより測定した。血漿FGF23をELISAで評価した。
【０１２９】
FGF23 ELISAアッセイ
患者のFGF23血漿サンプルをモニタリングするために、先の実施例で記載したように、KAINOS Laboratories, Inc.(日本)のFGF23 ELISAアッセイを使用した(カタログ番号CY-4000)。
【０１３０】
5.2  結果および考察
200mg、300mg、400mgまたは500mgの用量のTKI258で毎日処置された患者から得たFGF23 データを図９に示す。データは、表示の患者数の平均値として表す。400mgまたは500mgの毎日の連続投薬後の平均血漿曝露量(mean plasma exposure)(AUC24hr)は、それぞれ約3000ng/mL*hおよび4100ng/mL*hであった。400mg以下の用量ではTKI258血漿曝露量における蓄積は認められず、毎日500mgで投薬して15日目に最大2.5倍の蓄積が認められた。１回目の処置サイクル終了後、平均血漿FGF23レベルは基準より68％高くなり、１回目の処置サイクルの15日目の上昇は63%であった。400mgのTKI258で処置された１人の患者は、１サイクル目の15日目に基準よりも(40pg/ml〜約80pg/mlの基準レベルから)98％高い血漿FGF23上昇を示した。１サイクル目の15日目における同患者からの腫瘍生検は、免疫組織化学による分析において有意なpFGFR阻害を示した(図10)。この結果は、TKI258処置後の血漿FGF23の誘導(inducation)が、腫瘍組織におけるFGFR標的阻害と相互関連を示すことを示唆する。
【０１３１】
結論：血漿FGF23の誘導は、400mg/日以上の用量においてFGFRが阻害され得ることを示唆する。
【０１３２】
実施例６
第１相臨床治験においてTKI258で処置された転移性腎細胞癌(mRCC)患者から得た血漿サンプルにおけるFGF23測定
6.1  方法
患者および処置：この第１相の本来の目的は、標準的な療法に対して難治性のmRCC患者(mRCC pts)において、５日間の投薬/２日間の休薬スケジュールの28日間の繰り返しサイクルで経口投与されるTKI258の最大寛容用量(MTD)を決定することであった。少なくとも21人の患者についての２パラメータのベイズロジスティック退縮モデル(Bayesian logistic regression model)および安全性データを使用してMTDを決定する。
【０１３３】
FGF23 ELISAアッセイ
患者におけるFGF23血漿サンプルをモニタリングするために、先の実施例に記載したように、KAINOS Laboratories, Inc.(日本)のFGF23 ELISAアッセイを使用した(カタログ番号 CY-4000)。
【０１３４】
6.2  結果および考察
結果：第１相研究はまだ継続している。2008年12月の時点で、11人の患者(男性９人、女性２人)、年齢中央値：55(29〜66歳)が参加している。４人の患者が500 mg/日(開始用量)で処置され：２人が７サイクル目(C)で継続しており；１人の患者はPDのため、１人は洞性徐脈のために中断した。５人の患者が600mg/日を受け：２つのDLT(G4高血圧およびG3疲労患者が中断)により、患者全員が500mg/日に用量を減らした；２人の患者はC5およびC4にあり、１人の患者はPDのために中断した。２人の患者が500 mgでの延長集団(extension cohort)に参加したところである。他の毒性≧G2としては、疲労、吐き気、嘔吐、下痢、好中球減少、毛嚢炎、および眩暈が含まれた。PKデータは、CMaxの範囲(180〜487ng/mL、n＝8)、およびAUCの範囲(2200〜8251ng/mL*h)を示した。予備バイオマーカーデータは、患者が高い基準VEGFレベル(506±203 pg/ml、n＝6)およびbFGFレベル(220±185 pg/ml, n＝6)を有することを示し、これは、これまでの抗VEGF剤の失敗を反映しているかもしれない。血漿FGF23レベル、すなわちFGFR阻害の薬力学的バイオマーカーの誘導は、第１の500mg/日投薬集団の患者において認められた(TKI258で処置した個体RCC患者から得たFGF23データは図11に示す)。１人のマイナーな応答(minor response)(C4において-17％)、４人の安定した疾患、および１人のいくつかの標的病変(リンパ節および副腎組織塊)の劇的な縮小/壊死から、効力の予備的証拠が認められる。
【０１３５】
結論：
500mg/日のTKI258は、いくらかの臨床的利点を示し、強く予備処置されたmRCC患者において実行可能なスケジュールと思われる。処置患者の一部は、明らかにFGF23レベルが上昇し、一部の患者はそこまでの上昇はない。FGF23が上昇した患者について、FGF23レベルのピークは、１サイクル目の15日目あたりであった。FGF23のレベルは、基準レベルと比べて1.35〜1.75の範囲で上昇した。
【０１３６】
実施例７
ラットにおけるTKI258によるFGF23誘導は、RT112皮下腫瘍異種移植片におけるFGFR3 阻害と相互関連を示す
7.1  方法
動物
Rowett雌ラットHsd:RH-Foxlrnuにおいて実験を行った。これらの胸腺欠損ヌードラットは、Harlan(オランダ)から入手した。
【０１３７】
化合物の処方および動物の処置
TK1258を、酢酸-酢酸緩衝液(pH 4.6)/PEG300(2:1 v/v)中で処方し、強制飼養により毎日適用した。ビヒクルは、酢酸-酢酸緩衝液(pH 4.6)/PEG300 (2:1 v/v)で構成された。適用容量は、5 ml/kgであった。
【０１３８】
研究設計：1×106RT112細胞の入った100μlの50％マトリゲル(BD #356234)含有HBSS(Sigma #H8264)を右脇腹へ皮下注射することにより、ラットにRT112異種移植片を皮下移植した。腫瘍が400mm3の平均体積に達したら、ラットに、10mg/kg、25mg/kgもしくは50mg/kgのTKI258、またはビヒクルを一回経口投与した。
【０１３９】
ex vivo 分析のための血液および組織サンプリング
化合物の投与後３時間目、７時間目および24時間目に血液サンプルを舌下から採取した。血漿および血清を各血液サンプルから調製した。同じ時点で、腫瘍を切開し、液体窒素中で急冷凍結した。
【０１４０】
RTl12腫瘍異種移植片のex vivo分析：  RT112膀胱癌細胞は、FGFR3を高レベルで発現し、その活性はこれらの細胞においてFGFRの基質であるFRS2チロシンリン酸化の変化を測定することによりモニタリングできる。スイングミル(RETSCH、MM2またはMM200のいずれか)を用いて腫瘍物質を微粉化した。50 mM Tris(pH 7.5)、150 mM NaCl、1 mM EGTA、5 mM EDTA、1％Triton、2 mM NaVanadate、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche # 11873580001)を含む氷冷溶出緩衝液に、腫瘍粉のアリコート(50mg)を溶解した。溶解物を12000×gで15分間の遠心分離で清澄化し、DCタンパク質アッセイ試薬(Bio Rad #500-0116)およびBSA標準液を使用してタンパク質濃度を決定した。全細胞溶解物に対してSDS-PAGE を行い、タンパク質をPVDF 膜上にブロッティングした。フィルターを5％BSA中でブロッキングし、一次抗体p-FRS2(Tyrl96)：Cell Signaling # 3864; β-チューブリン: (Sigma # T4026)と4℃にて一晩さらにインキュベートした。Super Signal(登録商標)West Dura持続時間延長型基質検出系(Pierce # 34075)を用いて、ペルオキシダーゼ共役抗マウスまたは抗ウサギ抗体でタンパク質を可視化した。
【０１４１】
FGF23 ELISAアッセイ
血清サンプル中のFGF23レベルをモニタリングするために、先の実施例に記載したように、KAINOS Laboratories, Inc.(日本)のFGF23 ELISAアッセイを使用した(カタログ番号 CY-4000)。
【０１４２】
7.2  結果および考察
ラットへTKI258を投与した際の、RT112異種移植片におけるFRS2チロシンリン酸化のモジュレーション
FRS2は、活性化FGFRによってチロシン残基上でリン酸化されるFGFRの基質であるため、FGFR活性についての読み取りとして使用できる。10、25もしくは50mg/kgのTKI258 、またはビヒクルで処置した動物から得て、処置の３時間後に切開したRT112腫瘍の分析から、TKI258が用量依存的にFRS2のチロシンリン酸化を阻害したことが示された(図12)。
【０１４３】
Rowettラットの血清サンプルにおけるFGF23レベル
TKI258またはビヒクルで処置したラットから投薬の24時間後に得た血清サンプルにおけるFGF23レベルを決定した。TKI258で処置されたラットは、ビヒクルで処置されたグループと比べて血清FGF23レベルの用量依存的な上昇を示し(図13)、これは統計的に有意であった。(p<0.01、ANOVA事後ダネット検定)。データは平均値±SEMとして表す。
【０１４４】
結論
表示の実験データは、FRS2チロシンリン酸化の阻害により決定される、FGFR3をin vivoで阻害するTKI258の用量も、用量依存的に血清FGF23レベルの上昇をもたらしたことを実証する。
【０１４５】
実施例８
ラットにおけるPD 173074によるFGF23誘導、ならびに化合物ＡおよびTKI258との比較
8.1  方法
動物
wistar-furth雌ラットWF/Ico(female wistar rat furth WF/Ico)において実験を行った。
【０１４６】
化合物、処方および動物の処置
PD173074、化合物ＡおよびTKI258を、NMP(l-メチル-2-ピロリドン)/PEG300 1:9(1ml NMP + 9ml PEG300)に入った溶液として処方し、強制飼養により毎日適用した。適用容量は5 ml/kgであった。
【０１４７】
研究設計：PDl73074(50mg/kg)、化合物Ａ(10 mg/kg)もしくはTKI258(50mg/kg)、またはビヒクルを一回経口投与することによりラットを処置した。
【０１４８】
ex vivo 分析のための血液および組織サンプリング
化合物投与の24時間後に血液サンプルを舌下から採取した。血漿、および血清サンプルを、各血液サンプルから調製した。
【０１４９】
FGF23 ELISAアッセイ
血清サンプル中のFGF23レベルをモニタリングするために、先の実施例で示したように、KAINOS Laboratories, Inc.(日本)のFGF23 ELISAアッセイを使用した(カタログ番号 CY-4000)。
【０１５０】
8.2  結果および考察
wisterラットの血清サンプル中のFGF23レベル
PD173074または化合物ＡまたはTKI258で処置したラットは、ビヒクルで処置されたグループと比べて、統計的に有意な血清FGF23レベルの上昇を示した(図14)。(p<0.01、ANOVA事後ダネット検定)。データは平均値±SEMとして表す。
【０１５１】
結論
表示した実験データは、FGFR阻害剤であるPDl73074、化合物ＡまたはTKI258が、ラットにおいて血清FGF23レベルの上昇を引き起こすことを実証する。
本発明は、以下の態様を包含する。
［１］
線維芽細胞増殖因子23(FGF23)、無機リン(P)、リンおよび総カルシウムの積(P×tCa)、オステオポンチン(OPN)、ならびに副甲状腺ホルモン(PTH)からなる群より選択される化合物のバイオマーカーとしての使用。
［２］
線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)のキナーゼ活性のモジュレーションのための、好ましくはFGFRのキナーゼ活性の阻害のための、上記［１］に記載の使用。
［３］
前記化合物がFGF23である、上記［１］または［２］に記載の使用。
［４］
FGFR阻害剤の治療効力および/または１つ以上の二次影響を判定するための、上記［３］に記載のFGF23の使用。
［５］
治療効力が、好ましくは増殖性疾患および/または非癌障害の治療、予防、または進行の遅延からなる群より選択される、治療効力を判定するための上記［４］に記載の使用。
［６］
前記二次影響が好ましくは異所性鉱質形成である、FGFR阻害剤の１つ以上の二次影響を判定するための上記［４］に記載の使用。
［７］
前記FGFR阻害剤が、高分子または低分子量化合物、特にPD176067、PD173074、化合物Ａ(3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレア)、TKI258、および化合物Ｂ([4,5']ビピリミジニル-6,4'-ジアミンの誘導体)からなる群より選択されるFGFR阻害剤である、上記［４］〜［６］のいずれか一項に記載の使用。
［８］
線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)のキナーゼ活性のモジュレーションを判定する方法であって、
ａ)FGFR阻害剤を被験体に投与する工程;
ｂ)該被験体のサンプルを提供する工程;
ｃ)該サンプルのFGF23レベルを決定する工程;および
ｄ)該サンプルのFGF23レベルを、参照レベルと比較する工程、
を含む、前記方法。
［９］
前記被験体が哺乳動物、特にマウスもしくはラット等のげっ歯動物類、イヌ、ブタ、またはヒトである、上記［８］に記載の方法。
［１０］
上記［８］の工程a)〜d)を含むFGFR阻害剤の１つ以上の二次影響を判定する方法であって、さらに
ｅ)前記FGF23レベルを１つ以上の二次影響と相関させる工程;および
ｆ)採用した治療に関連して二次影響が生じる該FGF23レベルを決定する工程
を含む、方法。
［１１］
前記FGFR 阻害剤が、高分子または低分子量化合物、特に3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレア、またはTKI258である、上記［８］〜［１０］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記FGF23レベルが参照レベルと比較した場合に高い、上記［８］〜［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
ａ)任意に標識化形態である、FGF23またはその一部を認識する分子；
ｂ)無機リン(P)、リンおよび総カルシウムの積(P×tCa)、オステオポンチン(OPN)、ならびに副甲状腺ホルモン(PTH)からなる群より選択される第２のバイオマーカーを検出する少なくとも１つの試薬；
ｃ)任意に、使用のための指示書；
ｄ)任意に、検出手段；ならびに
ｅ)任意に、固相
を含む、診断キット。
［１４］
ａ)任意に標識化形態である、FGF23またはその一部を認識する分子；
ｂ)任意に、使用のための指示書；
ｃ)任意に、検出手段；および
ｄ)任意に、固相 
を含む、被験体のサンプルにおけるFGFR阻害剤の効力および/またはFGFR阻害剤の二次影響を決定するためのキットの使用。
［１５］
FGFRのキナーゼ活性のモジュレーションを判定するex vivo方法であって、
ａ)FGFR阻害剤処置を開始する前の患者のサンプル中のFGF23レベル(個体参照レベル)を決定する工程；
ｂ)該FGFR阻害剤処置の後の同患者のサンプル中のFGF23レベルを決定する工程
を含み、
工程ｂ)のFGF23レベルが個体参照レベルよりも高い場合は、FGFRのキナーゼ活性のモジュレーション、好ましくは阻害が生じたことを示す、前記方法。
［１６］
前記FGFR阻害剤が、PD176067、PD173074、化合物Ａ(3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレア)、TKI258、および化合物Ｂ([4,5']ビピリミジニル-6,4'-ジアミンの誘導体)からなる群より選択される、上記［１５］に記載の方法。
［１７］
前記FGFR阻害剤が化合物Ａである、上記［１５］または［１６］に記載の方法。
［１８］
増殖性疾患の治療用医薬を製造するためのFGFR阻害剤の使用であって、該増殖性疾患は好ましくは患者における癌であり、該患者は該FGFR受容体阻害剤を摂取した後にFGF23レベルが上昇する、前記使用。
［１９］
増殖性疾患を治療する方法であって、該増殖性疾患は好ましくは患者における癌であって、該方法は、FGFR阻害剤を該患者に投与する工程を含み、該患者は該FGFR受容体阻害剤を摂取した後にFGF23レベルが上昇する、前記方法。
［２０］
前記FGFR 阻害剤が、PD176067、PD173074、化合物Ａ(3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチルウレア)、TKI258、および化合物Ｂ([4,5']ビピリミジニル-6,4'-ジアミンの誘導体)からなる群より選択される、上記［１８］に記載の使用または上記［１９］に記載の方法。
［２１］
前記FGFR阻害剤が化合物Ａである、上記［１８］に記載の使用または上記［１９］に記載の方法。
［２２］
ａ)任意に標識化形態である、FGF23またはその一部を認識する分子；
ｂ)無機リン(P)、リンおよび総カルシウムの積(P×tCa)、オステオポンチン(OPN)、ならびに副甲状腺ホルモン(PTH)からなる群より選択される第２のバイオマーカーを検出することができる少なくとも１つの試薬；
ｃ)任意に、使用のための指示書；
ｄ)任意に、検出手段；ならびに
ｅ)任意に、固相
を含む診断キット。
［２３］
患者がFGFR阻害剤処置の恩恵を受けるか否かを判定するために患者をスクリーニングする方法であって、
(ａ)FGFR阻害剤処置をある期間患者に施す工程；
(ｂ)該処置後に該患者のサンプル中のFGF23レベルを測定する工程；
(ｃ)工程(ｂ)で得た該FGF23値を、個体参照レベル(該FGFR阻害剤処置を開始する前の該患者中のFGF23レベル)と比較して、該患者が該FGFR阻害剤処置を継続するべきか否かを決定する工程
を含む、前記方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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