(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一の物質を有効成分とする、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する組成物
（ａ）  クロストリジウム  クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  クロストリジウム  クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質。
【請求項２】
制御性Ｔ細胞が、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞またはＩＬ−１０産生性の制御性Ｔ細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
免疫抑制作用を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
医薬組成物である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一の物質を含む、ワクチン組成物
（ａ）  クロストリジウム  クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  クロストリジウム  クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質。
【請求項６】
下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一の物質を含む、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する剤
（ａ）  クロストリジウム  クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  クロストリジウム  クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質。
【請求項７】
制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する薬剤を製造するための、下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一の物質の使用
（ａ）  クロストリジウム  クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  クロストリジウム  クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム属に属する細菌、該細菌に由来する生理活性物質または細菌芽胞等を有効成分とする、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物に関する。また、本発明は、制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を誘導するための方法又は阻害するための方法に関する。さらに、本発明は、クロストリジウム属に属する少なくとも１種の細菌または細菌芽胞を含む、ワクチン組成物、並びに該ワクチン組成物をそれらを必要としている個体に投与することにより、感染症及び自己免疫疾患から選択される少なくとも一の疾患または病態を治療又は予防するための方法に関する。また、本発明は、制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を促進する化合物をスクリーニングするための方法、並びに該方法に用いられるＩＬ−１０遺伝子発現の制御下においてレポーター遺伝子を発現させる非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の消化管には何百種という共生微生物が定着しており、それらは宿主の免疫系と密接に結びついている。パイエル板（ＰＰｓ）及び孤立リンパ小節（ＩＬＦｓ）の組織形成、上皮細胞からの抗菌性ペプチドの分泌、及び、イムノグロブリンＡ産生形質細胞、上皮間リンパ球、ＩＬ−１７産生ＣＤ４陽性Ｔ細胞（Ｔｈ１７）、ＩＬ−２２産生ＮＫ様細胞のようなユニークなリンパ球の粘膜組織における集積といった、粘膜免疫系の発達に、共生微生物が多大な影響を与えていることが、無菌（Ｇｅｒｍ−Ｆｒｅｅ、ＧＦ）動物を用いた研究成果から示されている（非特許文献１〜７）。また、その結果、腸内細菌の存在が粘膜防御機能を増強し、体内に侵入してくる病原性微生物に対する強い免疫応答を宿主に付与することになる。一方、粘膜免疫系は、食物抗原及び無害な微生物に対する無反応性を維持している（非特許文献３）。そのため、共生細菌と免疫系のクロストークの調節異常（腸内菌共生バランス失調）は、環境抗原に対する過度で強い免疫応答を誘導し、結果として炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を引き起こすことになる（非特許文献８〜１０）。
【０００３】
最近の研究成果から、個々の共生細菌は、粘膜免疫系における特定の免疫細胞分化を制御していることが明らかになっている。例えば、ヒトの共生細菌、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓは、マウスにおいて特異的に全身性Ｔｈ１細胞及び粘膜ＩＬ−１０産生Ｔ細胞応答を誘導し、そして病原体が引き起こす大腸炎から宿主を守る役割を果たし（非特許文献３）、マウスの腸内共生細菌であるセグメント細菌（Ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｂａｃｔｅｒｉａ）は、粘膜Ｔｈ１７細胞を誘導し、宿主の消化管病原体感染に対する抵抗性を増強することが明らかになっている（非特許文献１１〜１３）。また、いくつかの共生細菌由来の短鎖脂肪酸は、腸炎を抑制することが知られている（非特許文献１４）。さらに、ある種の腸内細菌種の存在は、免疫系の恒常性を維持する制御性Ｔ細胞（以下、「Ｔｒｅｇ細胞」とも称する）の分化にも多大な影響を与えると考えられている。
【０００４】
また、免疫を抑制するサブセットとして同定された制御性Ｔ細胞は、転写因子Ｆｏｘｐ３が発現しているＣＤ４＋Ｔ細胞であり、免疫学的恒常性を維持するのに重要な役割を果たしていることが知られている（非特許文献８、９、１５、１６）。さらに、Ｆｏｘｐ３発現細胞は、大腸において特に多く存在しており、大腸に局在するＴｒｅｇ細胞だけが免疫抑制性サイトカインであるＩＬ−１０を常に高発現させていることが知られており（非特許文献１７）、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞からＩＬ−１０が特異的に除去されている動物は、炎症性腸疾患を発症することも知られている（非特許文献１８）。
【０００５】
従って、大腸におけるＩＬ−１０を高産生するＴｒｅｇ細胞の誘導メカニズムが解明されれば、免疫抑制を亢進させることが可能となり、ひいては炎症性腸疾患等の自己免疫疾患の治療や臓器移植への応用が可能となる。
【０００６】
しかしながら、大腸にＴｒｅｇ細胞が多数存在し、また、大腸のＴｒｅｇ細胞がＩＬ−１０を高産生するメカニズムについては未だ明らかになっていない。さらに、腸内共生細菌叢を構成するどのような細菌種が制御性Ｔ細胞の誘導に影響を与えているかも未だ明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊ．Ｊ．Ｃｅｂｒａ、「Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ」、１９９９年５月、６９、１０４６Ｓ
【非特許文献２】Ａ．  Ｊ．  Ｍａｃｐｈｅｒｓｏｎ，  Ｎ．  Ｌ．  Ｈａｒｒｉｓ、「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、２００４年６月、４、４７８
【非特許文献３】Ｊ．  Ｌ．  Ｒｏｕｎｄ，  Ｓ．  Ｋ．  Ｍａｚｍａｎｉａｎ、「Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、２００９年５月、９、３１３
【非特許文献４】Ｄ．  Ｂｏｕｓｋｒａ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｎａｔｕｒｅ」、２００８年１１月２７日、４５６、５０７
【非特許文献５】Ｋ．  Ａｔａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｎａｔｕｒｅ」、２００８年１０月９日、４５５、８０８
【非特許文献６】Ｉｖａｎｏｖ，  ＩＩ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｅｌｌ  Ｈｏｓｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ」、２００８年１０月１６日、４、３３７
【非特許文献７】Ｓ．  Ｌ．  Ｓａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、２００９年１月、１０、８３
【非特許文献８】Ｍ．  Ａ．  Ｃｕｒｏｔｔｏ  ｄｅ  Ｌａｆａｉｌｌｅ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｌａｆａｉｌｌｅ、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、２００９年５月、３０、６２６
【非特許文献９】Ｍ．  Ｊ．  Ｂａｒｎｅｓ，  Ｆ．  Ｐｏｗｒｉｅ、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、２００９年９月１８日、３１、４０１
【非特許文献１０】Ｗ．  Ｓ．  Ｇａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｅｌｌ」、２００７年１０月５日、１３１、３３
【非特許文献１１】Ｉｖａｎｏｖ，  ＩＩ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｃｅｌｌ」、２００９年１０月３０日、１３９、４８５．
【非特許文献１２】Ｖ．  Ｇａｂｏｒｉａｕ−Ｒｏｕｔｈｉａｕ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、２００９年１０月１６日、３１、６７７
【非特許文献１３】Ｎ．  Ｈ．  Ｓａｌｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．「Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、１１、７６．
【非特許文献１４】Ｋ．  Ｍ．  Ｍａｓｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｎａｔｕｒｅ」、２００９年１０月２９日、４６１、１２８２
【非特許文献１５】Ｌ．  Ｆ．  Ｌｕ，  Ａ．  Ｒｕｄｅｎｓｋｙ、「Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ」、２００９年６月１日、２３、１２７０
【非特許文献１６】Ｓ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｔ．  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｔ．  Ｎｏｍｕｒａ，  Ｍ．  Ｏｎｏ、「Ｃｅｌｌ」、２００８年５月３０日、１３３、７７５
【非特許文献１７】Ｃ．  Ｌ．  Ｍａｙｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ」、２００７年９月、８、９３１
【非特許文献１８】Ｙ．  Ｐ．  Ｒｕｂｔｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、２００８年４月、２８、５４６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖または集積を誘導する腸内共生細菌を同定することにある。本発明は、さらに、同定された腸内共生細菌またはそれに由来する生理活性物質を含有する、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する組成物等を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、哺乳動物から得られた糞便試料のクロロホルム処理画分及び芽胞形成細菌画分が大腸における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の集積を誘導することを見出した。さらに、クロストリジウム属に属する細菌が大腸における制御性Ｔ細胞の増殖または集積の誘導することを見出した。また、本発明者らは、これら細菌により誘導された制御性Ｔ細胞が、エフェクターＴ細胞の増殖を抑制することをも見出した。さらに、クロストリジウム属に属する細菌の定着、その結果として生じるＴｒｅｇ細胞の増殖または集積によって、局所性及び全身性の免疫応答を制御していることも見出した。
【００１０】
これら知見から、本発明者らは、クロストリジウム属に属する細菌、それらの芽胞またはそれらに由来する生理活性物質を用いることにより、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖や集積を誘導すること、さらには、免疫機能を抑制することが可能であることを見出した。
【００１１】
本発明は、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
（１）  下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一の物質を有効成分とする、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する組成物
（ａ）  クロストリジウム  クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  クロストリジウム  クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質。
（２）  制御性Ｔ細胞が、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞またはＩＬ−１０産生性の制御性Ｔ細胞である、（１）に記載の組成物。
（３）  免疫抑制作用を有する、（１）または（２）に記載の組成物。
（４）  医薬組成物である、（１）〜（３）のうちのいずれかに記載の組成物。
（５）  下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される少なくとも１の物質を含む、ワクチン組成物
（ａ）  クロストリジウム  クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  クロストリジウム  クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質。
（６）  下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一の物質を含む、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する剤
（ａ）  クロストリジウム  クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  クロストリジウム  クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質。
（７）  制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する薬剤を製造するための、下記（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される少なくとも一の物質の使用
（ａ）  クロストリジウム  クラスター１４ａに属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  クロストリジウム  クラスター４に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のクロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質を有効成分とする組成物等は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖や集積を誘導するための優れた組成物となる。本発明の組成物を医薬品として投与あるいは飲食品として摂取することによって、生体における免疫抑制を図ることができる。従って、本発明の組成物は、例えば、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の予防または治療や臓器移植時などにおける免疫拒絶の抑制に利用することが可能である。また、本発明の組成物を健康食品などの飲食品に含有させれば、健常者が日常的に容易に摂取することができ、これにより制御性Ｔ細胞の増殖や集積を誘導し、免疫機能の改善を図ることもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの作製方法を示す概略図である。
【図２】Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスがＩｌ１０ｖｅｎｕｓアレルを有することについて解析したサザンブロッティングの結果を示す図である。
【図３】Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスからＶｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞をソーティングした結果を示すＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図４】Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスのＶｅｎｕｓ陽性細胞及びＶｅｎｕｓ陰性細胞におけるＩＬ−１０ｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより解析した結果を示す、グラフである。
【図５】ＳＰＦマウスのＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率の変化を示すグラフである。
【図６】ＧＦマウス及びＳＰＦマウスの小腸、大腸及び末梢リンパ節から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図７】ＧＦマウス及びＳＰＦマウスの小腸、大腸及び末梢リンパ節から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、グラフである。
【図８】ＧＦマウス及びＳＰＦマウスの小腸、大腸及び末梢リンパ節から単離したＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞数について解析した結果を示す、グラフである。
【図９】抗生物質で処理したＳＰＦマウスの様々な組織におけるＣＤ４＋細胞におけるＶｅｎｕｓ＋細胞の比率について解析した結果を示す、プロット図である。
【図１０】ＳＰＦマウスの糞便懸濁液を投与したＧＦマウスの大腸粘膜固有層から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図１１】ＳＰＦマウスの糞便懸濁液を投与したＧＦマウスの大腸及び小腸の粘膜固有層から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、グラフである。
【図１２】ＩＬＦ、ＰＰ及びｃｏｌｏｎｉｃ−ｐａｔｃｈ欠損マウスの粘膜固有層から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、グラフである。
【図１３】特定の共生細菌を投与したＧＦマウスの大腸粘膜固有層から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図１４】特定の共生細菌を投与したＧＦマウスの大腸粘膜固有層から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、グラフである。
【図１５】特定の共生細菌を定着させたマウスの大腸粘膜固有層から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＩＦＮ−γ＋細胞の比率について解析した結果を示す、グラフである。
【図１６】特定の共生細菌を定着させたマウスの大腸粘膜固有層から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＩＬ−１７＋細胞の比率について解析した結果を示す、グラフである。
【図１７】病原体関連分子パターン認識受容体関連因子を欠損させた各ＳＰＦマウスの大腸から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、グラフである。
【図１８】クロストリジウムを定着させたＭｙｄ８８−／−マウスの大腸粘膜固有層から単離したＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率について解析した結果を示す、グラフである。
【図１９】Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの様々な組織から単離したリンパ球におけるＶｅｎｕｓ＋細胞の比率について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図２０】Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸粘膜固有層から単離したリンパ球におけるＴ細胞受容体のβ鎖の細胞表面での発現について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図２１】Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸粘膜固有層から単離したリンパ球におけるＩＬ−１７、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの発現について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図２２】脾臓Ｆｏｘｐ３−ＣＤ４＋細胞、脾臓Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞、大腸粘膜固有層のＶｅｎｕｓ＋細胞、及び小腸粘膜固有層のＶｅｎｕｓ＋細胞における、ＩＬ−１０、ＣＴＬＡ４，Ｆｏｘｐ３及びＧＩＴＲ  ｍＲＮＡの発現量について解析した結果を示す、グラフである。
【図２３】ＧＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウス及びＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの小腸及び大腸の粘膜固有層におけるＣＤ４、Ｆｏｘｐ３及びＶｅｎｕｓの発現について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図２４】ＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの様々な組織におけるＣＤ４細胞のＶｅｎｕｓ及びＦｏｘｐ３の発現について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図２５】特定の共生細菌を定着させたＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスのＦｏｘｐ３及びＶｅｎｕｓの発現について解析した結果を示す、ＦＡＣＳドット−プロット図である。
【図２６】特定の共生細菌を定着させたＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの小腸におけるＣＤ４＋細胞のＦｏｘｐ３及び／又はＶｅｎｕｓの発現について解析した結果を示す、グラフである。
【図２７】特定の共生細菌を定着させたＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸におけるＣＤ４＋細胞のＦｏｘｐ３及び／又はＶｅｎｕｓの発現について解析した結果を示す、グラフである。
【図２８】抗生物質で処理したＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの様々な組織から単離されたＣＤ４＋細胞におけるＶｅｎｕｓ＋細胞の比率について解析した結果を示す、プロット図である。
【図２９】クロストリジウム属細菌を定着させたＧＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸粘膜固有層ＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ＋細胞、ＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸粘膜固有層のＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ＋細胞、及び、Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスの脾臓ＣＤ４＋ＧＦＰ＋細胞の免疫制御機能を解析した結果を示す、グラフである。
【図３０】ＳＰＦ  Ｂ６マウスをポリミキシンＢ（ｐｏｌｙｍｙｘｉｎＢ）又はバンコマイシン（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ）で４週間処理し、ＣＤ４＋細胞群におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合を分析した結果を示す、グラフである。
【図３１】ＳＰＦマウス由来クロロホルム処理糞便をＧＦマウスに経口投与し、ＣＤ４＋細胞群におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合を分析した結果を示す、グラフである。
【図３２】ＳＰＦマウス、ＧＦマウス、乳酸桿菌定着マウス、又はクロストリジウム定着マウスの胸腺又は大腸のＬＰリンパ球における、Ｈｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリーで分析した総合的な結果を示す、グラフである。
【図３３】ＳＰＦマウス、ＧＦマウス、乳酸桿菌定着マウス、又はクロストリジウム定着マウスの胸腺又は大腸のＬＰリンパ球における、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、及びＨｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリーで分析した代表的な結果を示す、プロット図である。
【図３４】ＧＦマウス、乳酸桿菌定着マウス、又はクロストリジウム定着マウス由来の全大腸を培養し、それらの培養上清におけるＴＧＦ−β１の濃度をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す、グラフである。
【図３５】ＧＦマウス又はクロストリジウム定着マウス由来の腸上皮細胞（ＩＥＣ）を培養し、それらの培養上清におけるＴＧＦ−β１の濃度をＥＬＩＳＡで分析した結果を示す、グラフである。
【図３６】脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体と、ＧＦマウス又はクロストリジウム属細菌４６株定着マウス（Ｃｌｏｓｔ．）から単離したＩＥＣの培養上清、加えて抗ＴＧＦ−β抗体存在下又は非存在下において培養し、その培養５日後にＴ細胞を回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＦｏｘｐ３の発現を分析した結果を示す、グラフである。
【図３７】Ｃ５７ＢＬ／６  ＧＦマウスにクロストリジウム属細菌４６株（Ｃｌｏｓｔ．）又は乳酸桿菌属細菌３株（Ｌａｃｔｏ．）を経口接種し、接種してから３週間後にＩＥＣを回収し、ＭＭＰ２遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した結果を示す、グラフである。
【図３８】Ｃ５７ＢＬ／６  ＧＦマウスにクロストリジウム属細菌４６株（Ｃｌｏｓｔ．）又は乳酸桿菌属細菌３株（Ｌａｃｔｏ．）を経口接種し、接種してから３週間後にＩＥＣを回収し、ＭＭＰ９遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した結果を示す、グラフである。
【図３９】Ｃ５７ＢＬ／６  ＧＦマウスにクロストリジウム属細菌４６株（Ｃｌｏｓｔ．）又は乳酸桿菌属細菌３株（Ｌａｃｔｏ．）を経口接種し、接種してから３週間後にＩＥＣを回収し、ＭＭＰ１３遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した結果を示す、グラフである。
【図４０】Ｃ５７ＢＬ／６  ＧＦマウスにクロストリジウム属細菌４６株（Ｃｌｏｓｔ．）又は乳酸桿菌属細菌３株（Ｌａｃｔｏ．）を経口接種し、接種してから３週間後にＩＥＣを回収し、ＩＤＯ遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した結果を示す、グラフである。
【図４１】コントロールマウス（ＳＰＦ）及びクロストリジウム投与マウス（ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．）を２％ＤＳＳで処理して６日間、体重の減少、便の硬さ、及び出血を観察、測定し、点数をつけた結果を示す、グラフである。
【図４２】コントロールマウス（ＳＰＦ）及びクロストリジウム投与マウス（ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．）を２％ＤＳＳで処理してから６日目に回収した大腸の状態を示す、写真である。
【図４３】コントロールマウス（ＳＰＦ）及びクロストリジウム投与マウス（ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．）を２％ＤＳＳで処理してから６日目に回収した大腸を、ＨＥ染色によって組織学的分析した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図４４】コントロールマウス（ＳＰＦ）及びクロストリジウム投与マウス（ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．）をオキサゾロンに感作し、次いで１％オキサゾロン/５０％エタノール溶液によって直腸内を処理し、体重の減少を測定した結果を示す、グラフである。
【図４５】コントロールマウス（ＳＰＦ）及びクロストリジウム投与マウス（ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．）をオキサゾロンに感作し、次いで１％オキサゾロン/５０％エタノール溶液によって直腸内を処理して得られた大腸を、ＨＥ染色によって組織学的分析した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図４６】アラムに吸着させた卵白アルブミン（ａｌｕｍ−ａｂｓｏｒｂｅｄ  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  （ＯＶＡ））を２週間間隔で２回投与することによって、コントロールマウス（ＳＰＦ）及びクロストリジウム投与マウス（ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．）に免疫性を付与してから、血清を回収し、これら血清におけるＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度をＥＬＩＳＡによって分析した結果を示す、グラフである。
【図４７】アラムに吸着させたＯＶＡを２週間間隔で２回投与することによって、コントロールマウス（ＳＰＦ）及びクロストリジウム投与マウス（ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．）に免疫性を付与してから、脾細胞を回収し、インビトロにおけるＯＶＡの再刺激によるこれら脾細胞のＩＬ−４産生を分析した結果を示す、グラフである。
【図４８】アラムに吸着させたＯＶＡを２週間間隔で２回投与することによって、コントロールマウス（ＳＰＦ）及びクロストリジウム投与マウス（ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．）に免疫性を付与してから、脾細胞を回収し、インビトロにおけるＯＶＡの再刺激によるこれら脾細胞のＩＬ−１０産生を分析した結果を示す、グラフである。
【図４９】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム）４１株のシークエンス結果とＧｅｎｂａｎｋデータベースから得られた既知の細菌のシークエンスとに基づき、Ｍｅｇａソフトウェアを用いた近隣結合法によって構築された系統樹である。
【図５０】Ｆｏｘ３発現によってゲートをかけた無菌マウス由来のＣＤ４細胞（無菌マウス♯１及び♯２）と、Ｆｏｘ３発現によってゲートをかけたクラスター４に属するクロストリジウムの３株を定着させた無菌マウス由来のＣＤ４細胞（クロストリジウム３株マウス♯１及び♯２）とを示すヒストグラムである。
【図５１】無菌マウス由来のＣＤ４陽性リンパ球によるＦｏｘ３発現（ＧＦ）と、クロロホルム処理ヒト糞便を投与した無菌マウス由来のＣＤ４陽性リンパ球によるＦｏｘ３発現（ＧＦ＋Ｃｈｌｏｒｏ．）とを示すヒストグラムである。
【図５２】無菌マウス由来のＣＤ４陽性リンパ球によるＦｏｘ３発現（ＧＦ）と、クロロホルム処理ヒト糞便を投与した無菌マウス由来のＣＤ４陽性リンパ球によるＦｏｘ３発現（ＧＦ＋Ｃｈｌｏｒｏ．）とを示すグラフである。
【図５３】クロロホルム処理ヒト糞便を投与したマウスの糞便における、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム）及びＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（バクテロイデス）の量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
＜制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物＞
本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１の物質をを有効成分とする、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する組成物を提供する
（ａ）  クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  哺乳動物から得られた糞便試料の芽胞形成細菌画分または該画分の培養上清
（ｃ）  哺乳動物から得られた糞便試料のクロロホルム処理画分または該画分の培養上清。
【００１５】
本発明において「制御性Ｔ細胞」とは、異常あるいは過剰な免疫応答を抑制する機能を持ち、免疫寛容を担うＴ細胞を意味する。制御性Ｔ細胞は、典型的には、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性ＣＤ４陽性Ｔ細胞であるが、転写因子Ｆｏｘｐ３が陰性である場合でもＩＬ−１０産生性のＣＤ４陽性Ｔ細胞である場合には、本発明における制御性Ｔ細胞に含まれる。
【００１６】
本発明において「制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する」とは、制御性Ｔ細胞の増殖または集積に至る、未成熟Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞への分化を誘導する作用を含む意である。また、インビボにおける作用、インビトロにおける作用、およびエクスビボにおける作用を含む意である。従って、クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質等の投与もしくは摂取により、生体内で制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用、培養している制御性Ｔ細胞に、クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質等を作用させることにより、その増殖または集積を誘導する作用、および、生体から採取し、その後生体に導入する予定である制御性Ｔ細胞に、クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質等を作用させることにより、その増殖または集積を誘導する作用のいずれをも含む意である。制御性Ｔ細胞を導入する生体としては、例えば、制御性Ｔ細胞を採取した生体、制御性Ｔ細胞を採取した生体とは異なる生体が挙げられる。制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用は、例えば、無菌マウスなどの実験動物に、クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質等を経口投与し、その後、大腸におけるＣＤ４陽性細胞を単離し、該細胞に含まれる制御性Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーにより測定することで、評価することができる（実施例７を参照のこと）。
【００１７】
本発明の組成物により増殖または集積を誘導するための制御性Ｔ細胞は、好ましくは、転写因子Ｆｏｘｐ３陽性の制御性Ｔ細胞またはＩＬ−１０産生性の制御性Ｔ細胞である。
【００１８】
本発明の組成物の有効成分である「クロストリジウム属に属する細菌」としては、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する限り、特に制限されない。好ましくは、クラスター１４ａまたはクラスター４に属する細菌である。これらの細菌は、１種のみを本発明の組成物に用いることもできるが、２種以上の菌種と本発明の組成物とを併用することもできる。クラスター１４ａまたはクラスター４に属する細菌を複数組み合わせて用いることにより、制御性Ｔ細胞に対し優れた作用を発揮させることが可能である。これらクラスターに属する細菌に加えて、他のクラスターに属する細菌（例えば、クラスター３に属する細菌）を組み合わせて用いることもできる。1種以上の菌種を用いる場合（例えば、1種以上の菌種はクラスター１４ａに属する細菌であり、1種以上の菌種はクラスター４に属する細菌であり、1種以上の菌種はクラスター１４ａ又はクラスター４に属する細菌であり、1種以上の菌種は、クラスター３に属する細菌である場合）、菌種のタイプ及び数は広範囲に及ぶ。用いられる前記タイプ及び数は、因子の種類に基づき決めることができる（因子としては、例えば、所望する効果、制御性Ｔ細胞の増殖または集積の誘導または抑制、治療、治療の補助、重症度の軽減または予防の対象となる疾患または病態、受領者の年齢または性別などが挙げられる）。複数の菌種は、同時に摂取または吸収される場合、同一の組成物中に存在することができる。また、複数の菌種を別々に摂取することができ、または組成物を複合して用いることができ、結果として併用して摂取または吸収される場合（併用組成物の場合）、該複数の菌種は２以上の組成物の中に存在することもできる（例えば、それぞれ別々の組成物中に存在することもできる）。また、効果を奏する菌種の数または組み合わせを投与することができる（効果を奏する菌種の数としては、１〜２００のうちの任意の数、例えば、１〜１００、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１０、１〜５、これら数値範囲のうちの任意の数が挙げられる）。文献（Ｉｔｏｈ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｍｉｔｓｕｏｋａ，Ｔ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆａｅｃｅｓ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｆｌｏｒａ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｃａｅｃａｌ  ｓｉｚｅ  ｗｈｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ  ｍｉｃｅ．Ｌａｂ．Ａｎｉｍａｌｓ  １９：１１１−１１８（１９８５））に記載されている４６菌株の一部または全部を組み合わせて用いることが、本発明のある好適な態様として挙げられる。例えば、前記４６株のうち、少なくとも１、２以上、３、３以上、４、４以上、５、５以上、６、６以上の菌株、または、４６株を含むその他の数の菌株を組わせて用いることができる。また、これら菌株は互いに組み合わせて用いることができ、また前記文献に記載されていない他の菌株と組み合わせて用いることもできる（例えば、クラスター３に属する１または複数の菌株と組み合わせて用いることもできる）。
なお、「クロストリジウム属に属する細菌」のクラスターは、例えば、以下に示す方法にて同定することができる。すなわち、クロストリジウム属に属する細菌は、配列番号：６４及び６５に記載の塩基配列からなるプライマーセット（クロストリジウムクラスター１４ａに属する細菌用）または配列番号：６６及び６７に記載の塩基配列からなるプライマーセット（クロストリジウムクラスター４に属する細菌用）を用いたＰＣＲによって分類することができる（実施例１８を参照のこと）。また、クロストリジウム属に属する細菌は、配列番号：１９及び２０に記載の塩基配列からなるプライマーセットを用い、増幅した１６ＳｒＲＮＡの配列を決定することによって分類することができる（実施例７を参照のこと）。
【００１９】
本発明の組成物において、クロストリジウム属に属する細菌は、生菌として用いることができるが、死菌体として用いることも考えられる。また、熱にも安定であり、抗生物質等にも耐性を有し、貯蔵期間が長いという観点から、クロストリジウム属に属する細菌は芽胞形状であることが好ましい。
【００２０】
本発明における「クロストリジウム属に属する細菌に由来する生理活性物質」は、該細菌に含まれる物質、該細菌の分泌産物、該細菌による代謝産物を含む意である。このような生理活性物質は、該細菌、その培養上清、またはクロストリジウム属に属する菌だけが定着したマウスの腸管内容物から、公知の精製手法により、活性成分を精製することにより同定することが可能である。
【００２１】
本発明の組成物の有効成分である「哺乳動物から得られた糞便試料の芽胞形成細菌画分」としては、哺乳動物の糞便中に存在しており、芽胞を形成する細菌であって、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する限り、特に制限されない。
【００２２】
また、本発明の組成物の有効成分である「哺乳動物から得られた糞便試料のクロロホルム処理画分」としては、哺乳動物の糞便をクロロホルム（例えば、３％クロロホルム）で処理して得られる画分であって、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する限り、特に制限されない。
【００２３】
なお、本発明において「哺乳動物」とは特に制限されることなく、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコが挙げられる。
【００２４】
また、本発明の組成物の有効成分である「画分の培養上清」は、「哺乳動物から得られた糞便試料の芽胞形成細菌画分」又は「哺乳動物から得られた糞便試料のクロロホルム処理画分」を培地にて培養した際に、これら画分に含まれる細菌等から放出される、該細菌に含まれる物質、該細菌の分泌産物、該細菌による代謝産物を含む意であり、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する限り、特に制限されないが、例えば、前記培養上清のタンパク質画分、前記培養上清のポリサッカライド画分、前記培養上清の脂質画分、前記培養上清の低分子代謝産物画分が挙げられる。
【００２５】
本発明の組成物は、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する医薬組成物、飲食品（動物用飼料を含む）、あるいはモデル動物実験などに用いられる試薬の形態であり得る。本実施例において、クロストリジウム属に属する細菌等により誘導された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）が、エフェクターＴ細胞の増殖を抑制することが判明した。従って、本発明の組成物は、免疫抑制作用を有する組成物として好適に用いることができる。免疫抑制作用は、例えば、本発明の組成物を経口投与したマウスなどの実験動物から単離した制御性Ｔ細胞を、脾臓から単離したエフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞）に作用させ、その後の増殖能を［３Ｈ］−チミジンの取り込み量を指標に測定することで、評価することができる（実施例１４を参照のこと）。
【００２６】
本発明の組成物は、例えば、慢性炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、橋本病などの自己免疫疾患や、花粉症や喘息などのアレルギー疾患を予防または治療するための医薬組成物として、臓器移植などにおける拒絶反応を抑制するための医薬組成物として、免疫機能を改善するための飲食品として、エフェクターＴ細胞の増殖や機能を抑制するための試薬として、利用することができる。
【００２７】
本発明の組成物のより具体的な対象疾患として、自己免疫疾患、アレルギー疾患、臓器移植などにおける拒絶反応に関しては、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、スプルー、自己免疫性関節炎、リウマチ性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、骨髄移植に付随する移植片対宿主拒絶反応、変形性関節症、若年性慢性関節炎、ライム病関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性エリテマトーデス、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、ぜんそく、乾癬、強皮症皮膚炎（ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、アトピー性皮膚炎、移植片対宿主拒絶反応、臓器移植に関連した急性又は慢性の免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、播種性血管内凝固症候群、川崎病、グレーブス病（パセドゥ病）、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ヴェーゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェ−ライン紫斑病、腎臓における顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症候群、悪液質、エイズ（後天性免疫不全症候群）、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変症、溶血性貧血、多腺性機能不全症候群１型、多腺性機能不全症候群２型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸窮迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、クラミジア感染症、エルシニア・サルモネラ感染に関する関節症、脊椎関節症／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、食物アレルギー、花粉アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ疾患（ｌｉｎｅａｒ  ＩｇＡ  ｄｉｓｅａｓｅ）、自己免疫性溶血性貧血、クームス試験陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋肉脊髄炎／ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、原因不明自己免疫性肝炎（ｃｒｙｐｔｏｇｅｎｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、後天性免疫不全関連疾患（Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ），Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低ガンマグロブリン血症）、拡張型心筋症、肺線維症（ｆｉｂｒｏｔｉｃ  Ｉｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）、原因不明の線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺炎、間質性肺炎、結合組織病間質性肺疾患、混合性結合組織疾患肺疾患、全身性硬化症間質性肺疾患、関節リウマチ間質性肺疾患、全身性エリテマトーデス肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎肺疾患、シェーグレン病肺疾患、強直性脊椎炎肺疾患、汎血管炎肺疾患（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｃ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ヘモジデリン沈着症肺疾患、薬剤誘発性間質性肺疾患、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺炎、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性又はルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎抗（抗ＬＫＭ  １抗体肝炎）、自己免疫性低血糖、黒色表皮腫によるインスリン受容体異常症  Ｂ  型、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連した免疫疾患、臓器移植に関連した慢性免疫疾患、変形性関節症、原発性硬化性胆管炎、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎疾患  ＮＯＳ（ｒｅｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ＮＯＳ）、糸球体腎炎、腎臓における顕微鏡的血管炎、円板状エリテマトーデス、特発性男子不妊症又はＮＯＳ、精子自己免疫疾患（ｓｐｅｒｍ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ）、多発性硬化症（全てのサブタイプに関する）、インスリン依存性糖尿病、交感性眼炎、肺高血圧症による結合組織病、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、急性リウマチ熱、リウマチ様脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症（ａｔｒｏｐｈｉｃ  ａｕｔｏｉｎｍｉｕｎｅ  ｈｙｐｏｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ）、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、アレルギー性鼻炎（花粉アレルギー）、アナフィラキシー、ペットアレルギー、ラテックスアレルギー、薬物アレルギー、アレルギー性鼻炎結膜炎、好酸球性食道炎、好酸球増加症候群、好酸球性胃腸炎、及び皮膚エリスマトーデスが挙げられる。
【００２８】
また、本発明の組成物は、免疫を介した過度な炎症によるダメージにより、感染症に対する耐性が損なわれている個体の感染症を予防または治療するための医薬組成物としても利用することができる。
【００２９】
このような、宿主の恒常的な状態（ホメオスタシス）の維持又は回復を損ない、結果として免疫病理学的な組織ダメージを与える感染性病原体としては例えば、サルモネラ、赤痢菌、クロストリジウム．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、マイコバクテリウム（疾患としては結核）、原虫（疾患としてはマラリア）、糸状線虫類（疾患としてはフィラリア症）、住血吸虫（疾患としては住血吸虫症）、トキソプラズマ（疾患としてはトキソプラズマ症）、リーシュマニア（疾患としてはリーシュマニア症）、ＨＣＶ及びＨＢＣ（疾患としてはＣ型肝炎及びＢ型肝炎）、並びに単純ヘルペスウィルス（疾患としてはヘルペス）が挙げられる。
【００３０】
本発明における組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤などとして、経口的または非経口的に使用することができる。
【００３１】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【００３２】
また、これら製剤化においては、大腸における制御性Ｔ細胞の増殖または集積をより効率的に誘導するという観点から、特に経口投与を目的とする製剤においては、本発明における組成物を大腸に効率良く送達することを可能にする組成物と組み合わせることが好ましい。
【００３３】
このような大腸への送達を可能とする組成物又は方法については特に制限されることなく、公知の組成物又は方法を適宜採用することができ、例えば、ｐＨ感受性組成物、より具体的には、胃を通過した後、ｐＨがアルカリ性になった時に内容物を放出する腸溶性ポリマーが挙げられる。また、ｐＨ感受性組成物を製剤化に利用する場合は、該組成物の分解される閾値がｐＨ６．８〜７．５である高分子であることが好ましい。かかる数値範囲は、胃の遠位部において生じているアルカリ性側へのｐＨシフトの範囲であるため、大腸への送達に利用するのに好適な範囲となる。
【００３４】
さらに、大腸への送達を可能とする組成物としては、内包物の放出をおよそ小腸通過時間に相当する３〜５時間遅らせることにより大腸への送達を確保する組成物が挙げられる。また、放出を遅らせる組成物の製剤化においては、胃腸液に接触することによって水和して膨張し、それによって内包物を効果的に放出するハイドロゲルを殻とする製剤化が挙げられる。さらに、放出を遅らせる計量ユニットとしては、薬剤をコーティング、又は選択的コーティング材料を有する、薬剤含有組成物が挙げられる。かかる選択的コーティング材料としては例えば、生体内分解性ポリマー、徐々に加水分解されていくポリマー、徐々に水溶していくポリマー、及び/又は酵素分解性ポリマーが挙げられる。また、効率的に放出を遅らせるのに好適なコーティング材料としては特に制限はなく、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースといったセルロース系ポリマー、メタクリル酸重合体及び共重合体といったアクリル酸重合体及び共重合体、ポリビニルピロリドンといったビニル酸重合体及び共重合体が挙げられる。
【００３５】
また、大腸への送達を可能とする組成物としては、大腸粘膜特異的に接着する生体接着性組成物（例えば、米国特許第６．３６８．５８６号明細書に記載のポリマー）、消化管において特に生物学的製剤をタンパク質分解酵素活性による分解から守るためにプロテアーゼ阻害剤を組み込んだ組成物が挙げられる。
【００３６】
さらに、大腸への送達を可能とするシステムとしては、例えば、細菌発酵によるガス産生の結果として生じる胃の遠位部における圧力変化を利用して内容物を放出するような、圧力変化によって引き起こされる大腸への送達システムが挙げられる。かかるシステムとしては特に制限はないが、より具体的には、疎水性ポリマー（例えばエチルセルロース）によってコートされた、坐薬の基剤に分散された内包物からなるカプセルが挙げられる。
【００３７】
また、大腸への送達を可能とするシステムとしては、例えば、大腸に存在する酵素(例えば、炭水化物−加水分解酵素、炭水化物−還元酵素）によって特異的に分解される大腸への送達システムが挙げられる。かかるシステムとしては特に制限はないが、より具体的には、非でんぷん性多糖類、アミロース、キサンタンガム、及びアゾポリマーといった食物成分を利用したシステムが挙げられる。
【００３８】
本発明の組成物を医薬組成物として用いる場合には、免疫抑制に用いられる公知の医薬組成物と併用してもよい。かかる公知の医薬組成物としては特に制限はないが、コルチコステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニゾン、メトトレキサート、抗ヒスタミン、グルココルチコロイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、抗ロイコトリエン、抗コリン鼻炎薬、抗コリン充血除去剤、肥満細胞安定化剤、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体、ワクチン（好ましくは、次第にアレルゲンの量を上げていくワクチン接種に用いられるワクチン）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一の治療用組成物が挙げられ、これらを本発明の組成物と併用することが好ましい。
【００３９】
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、当該飲食品は、例えば、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、栄養補助食品、病者用食品、あるいは動物用飼料であり得る。本発明の飲食品は、上記のような組成物として摂取することができる他、種々の飲食品として摂取することもできる。飲食品の具体例としては、ジュース、清涼飲料水、茶飲料、ドリンク剤、ゼリー状飲料、機能性飲料等の各種飲料；ビール等のアルコール飲料；飯類、麺類、パン類およびパスタ類等の炭水化物含有食品；魚肉ハム、ソーセージ、水産練り製品等の練製品；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；スープ類；牛乳、乳飲料、アイスクリーム、チーズ、ヨーグルト等の乳製品；みそ、ヨーグルト、発酵飲料、漬け物等の発酵物；豆製品；ビスケット、クッキーなどの洋菓子類、饅頭や羊羹等の和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、ゼリー、プリンなどの冷菓や氷菓などの各種菓子類；インスタントスープ、インスタントみそ汁等のインスタント食品、電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。  本発明の組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができるが、ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などを対象とすることができる。具体的には、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、カモ、ダチョウ、アヒル、イヌ、ネコ、ウサギ、ハムスター、マウス、ラット、サルなどが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４０】
また、本発明においては、理論に束縛されることは望まないが、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓグループ（クロスロリジウム  クラスター４及び１４ａが属するグループ）に属する細菌の相対存在量が豊富である個体の方が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓグループに属する細菌の相対存在量が豊富である個体よりも体重が増加している。従って、本発明の組成物によって、栄養の吸収を整え、飼料効率を向上させることができる。かかる観点から、本発明の組成物は、体重増加促進のため、又は飼料効率の良い動物用飼料に用いることができる。
【００４１】
さらに、本発明の組成物を抗生物質無添加飼料に添加することによって、抗生物質含有飼料と同等に又はそれよりも多く、飼料摂取対象の体重を増加させ、また典型的な抗生物質含有飼料と同程度に胃の中の病原菌を減らすことができるため、本発明の組成物は抗生物質の添加を必要としない動物用飼料に用いることができる。
【００４２】
また、家畜の生産に容易に組み込むことができない、商業的に利用されている既存の菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）とは違い、芽胞形状の本発明の組成物は、ペレット化され、スプレーされ、又は容易に動物飼料に混合することができ、飲料水にも添加することもできる。
【００４３】
かかる本発明の組成物を用いた動物飼料の摂取に関しては特に制限はなく、定期的に、選択的に対象に摂取させてもよく、ある一時期（例えば、出生時、離乳期、又は、摂取対象を移動（ｒｅｌｏｃａｔｉｏｎ）又は輸送（ｓｈｉｐｐｉｎｇ）する際に摂取させてもよい。
【００４４】
さらに前述の観点から、本発明の組成物は栄養不良状態のヒトに好適に用いること、すなわち、摂取対象がヒトである場合においても、体重増加を促進させるため、また食物からのエネルギー吸収を亢進させるため、本発明の組成物を好適に用いることができる。
【００４５】
本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。当該飲食品においては、免疫抑制作用による免疫機能の改善に有効な１種もしくは２種以上の成分（例えば、栄養素など）を添加してもよい。また、免疫機能の改善以外の機能を発揮する他の成分あるいは他の機能性食品と組み合わせることによって、多機能性の飲食品としてもよい。
【００４６】
また、通常のプロバイオテック株が破壊されてしまうような加工工程を要する食品にも好適に組み込むことができる。すなわち、大抵の商業利用が可能なプロバイオテック株は、熱処理、長期保管、冷凍処理、機械的ストレス処理、又は高圧処理（例えば、押し出し成形及びロール成形）を加工に要する食品に組み込むことができない。一方、本発明の組成物は芽胞を形成するという有利な特性を有しているため、そのような加工食品に容易に組み込むことができる。
【００４７】
例えば、本発明の組成物は乾燥食品の中でも芽胞形状にて生存することができ、摂取された際にもまだ生存することが可能である。同様に、本発明の組成物は低温殺菌加工、典型的には７０℃以上及び沸点以下の温度による加工にも耐えられる。それゆえ、乳製品の全ての種類に組み込むことができる。さらに、何年もの長期保存にも本発明の組成物は耐えることができ、焼く及び煮るといった高温工程にも耐え、冷凍及び冷蔵といった低温工程にも耐え、押し出し成形及びロール成形といった高圧処理にも耐えられる。
【００４８】
かかる厳しい条件の工程を要する食品としては特に制限はなく、例えば、食べるために電子レンジでの加工を要する食品（例えば、オートミール）、食べるために焼くことを要する食品（例えば、マフィン）、食べるために短時間殺菌・高温処理を要する食品（例えば、ミルク）、及び飲むために加熱を要する食品（例えば、ホットティー）が挙げられる。
【００４９】
本発明の組成物を投与または摂取する場合、その投与量または摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）などに応じて、適宜選択される。例えば、１回当たりの投与量または摂取量は、一般に、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは、１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本発明は、このように、クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質を対象に投与もしくは摂取させることを特徴とする、対象における免疫抑制方法をも提供するものである。
【００５０】
本発明の組成物の製品（医薬品、飲食品、試薬）またはその説明書は、免疫を抑制するために用いられる旨の表示（免疫抑制作用を有する旨の表示、あるいはエフェクターＴ細胞の増殖や機能を抑制する作用を有する旨の表示を含む）を付したものであり得る。ここで「製品または説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。
【００５１】
＜制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導するための方法＞
前述の通り、及び本実施例において示す通り、本発明の組成物を個体に投与することにより、該個体において制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導することができる。従って、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１の物質を個体に投与する工程を含む、該個体において制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を誘導するための方法を提供することもできる
（ａ）  クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  哺乳動物から得られた糞便試料の芽胞形成細菌画分または該画分の培養上清
（ｃ）  哺乳動物から得られた糞便試料のクロロホルム処理画分、前記画分の培養上清。
【００５２】
なお、本発明において「個体」とは特に制限されることなく、例えば、ヒト、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などが挙げられる。また「個体」は、健常状態であってもよく、羅患状態であってもよい。
【００５３】
さらに、後述の実施例５において示すように、制御性Ｔ細胞の増殖又は集積においてグラム陽性共生細菌が主要な役割を担っていることから、本発明は、グラム陰性菌に対する抗生物質を個体に投与する工程を含む、該個体において制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を誘導するための方法を提供することもできる。
【００５４】
本発明において、「グラム陰性菌に対する抗生物質」としては特に制限はなく、例えば、アミノグリコシド系抗生物質（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、パロモマイシン）、セファロスポリン系抗生物質（セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフタジジム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォキソチン（ｃｅｆｏｘｏｔｉｎ））、スルホンアミド、アンピシリン、及びストレプトマイシンが挙げられる。また、理論に束縛されることは望まないが、本発明にかかる「グラム陰性菌に対する抗生物質」は、グラム陰性菌を減少させ、グラム陽性菌の定着に寄与するものが好ましい。
【００５５】
さらに、アーモンド皮、イヌリン、オリゴフルクトース、ラフィノース、ラクチュロース、ペクチン、へミセルロース（例えば、キシログルカン、αグルカン）、アミロペクチン及び難消化性デンプンといった上部消化管では分解されず、腸管内で腸内細菌の生育を促す、プレバイオティクス（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）組成物や、アセチル−ＣｏＡ、ビオチン、ビート糖蜜、及び酵母抽出物といった増殖因子は、クロストリジウム属に属する細菌の増殖に寄与することから、本発明は、これら物質からなる群より選択される少なくとも一の物質を個体に投与する工程を含む、該個体において制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を誘導する方法を提供することもできる。
【００５６】
また、本発明の「制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を誘導する方法」においては、本発明の組成物、前記「グラム陰性菌に対する抗生物質」、前記「プレバイオティクス組成物や増殖因子」を併用してもよい。かかる併用としては特に制限はなく、例えば、前記「グラム陰性菌に対する抗生物質」を事前に個体に投与した後に本発明の組成物を投与すること、前記「グラム陰性菌に対する抗生物質」と本発明の組成物を同時に個体に投与すること、前記「プレバイオティクス組成物や増殖因子」を事前に個体に投与した後に本発明の組成物を投与すること、前記「プレバイオティクス組成物や増殖因子」と本発明の組成物を同時に個体に投与すること、本発明の組成物、前記「グラム陰性菌に対する抗生物質」、及び前記「プレバイオティクス組成物や増殖因子」を同時に、又は各々適宜随時に個体に投与することが挙げられる。
【００５７】
さらに、本発明の組成物、前記「グラム陰性菌に対する抗生物質」、及び前記「プレバイオティクス組成物や増殖因子」からなる群から選択される少なくとも一の物質と共に治療用組成物を個体に投与しても良い。
【００５８】
かかる治療用組成物としては特に制限はないが、コルチコステロイド、メサラジン、メサラミン、スルファサラジン、スルファサラジン誘導体、免疫抑制剤、シクロスポリンＡ、メルカプトプリン、アザチオプリン、プレドニゾン、メトトレキサート、抗ヒスタミン、グルココルチコロイド、エピネフリン、テオフィリン、クロモグリク酸ナトリウム、抗ロイコトリエン、抗コリン鼻炎薬、抗コリン充血除去剤、肥満細胞安定化剤、モノクローナル抗ＩｇＥ抗体、ワクチン（好ましくは、次第にアレルゲンの量を上げていくワクチン接種に用いられるワクチン）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも一の治療用組成物が挙げられ、これらを上記物質と併用することが好ましい。
【００５９】
また、本発明の組成物、前記「グラム陰性菌に対する抗生物質」、及び前記「前生物学的組成物や増殖因子」からなる群から選択される少なくとも一の物質と、治療用組成物との併用としては特に制限はなく、例えば、前記「一の物質」と治療用組成物とを同時に、又は各々適宜随時に個体に、経口又は非経口的に投与することが挙げられる。
【００６０】
さらに、前述の「制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を誘導する方法」において、本発明の組成物等の投与により、制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を誘導できているかどうかについては、制御性Ｔ細胞の数、大腸のＴ細胞群における制御性Ｔ細胞の割合、制御性Ｔ細胞の機能、及び制御性Ｔ細胞のマーカーの発現からなる群より選択される少なくとも一が増加又は増強されていることを指標として判断することができ、ＩＬ−１０発現の促進、ＣＴＬＡ４発現の促進、ＩＤＯ発現の促進、及びＩＬ−４発現の抑制からなる群より選択される一の測定結果を制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を誘導できていることの指標とすることが好ましい。
【００６１】
なお、かかる発現を検出する方法としては、転写レベルの遺伝子発現を検出する場合には、例えば、ノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ドットブロット法が挙げられ、翻訳レベルの遺伝子発現を検出する場合には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ラジオイムノアッセイ、イムノブロッティング法、免疫沈降法、フローサイトメトリーが挙げられる。
【００６２】
また、かかる指標を測定するのに用いられる試料としては特に制限はなく、個体から採取した血液、生検で得られた組織片が挙げられる。
【００６３】
＜本発明の組成物に対する個体の応答及び/又は個体の予後を予測するための方法＞
本発明は、個体の微生物叢におけるクロスロリジウム属に属する細菌の絶対量又は割合を測定し、典型的な健康状態の個体における同様の測定をして得られた基礎値と比較し、クロストリジウム属に属する細菌の割合又は絶対値が減少していることは、該個体は本発明の組成物に対して応答性を有するであろうと判定する方法を提供することができる。
【００６４】
＜制御性Ｔ細胞の増殖または集積を阻害するための方法＞
後述の実施例５において示すように、制御性Ｔ細胞の増殖又は集積においてグラム陽性共生細菌が主要な役割を担っていることから、本発明は、グラム陽性菌に対する抗生物質を個体に投与する工程を含む、該個体において制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を阻害するための方法を提供することもできる。
【００６５】
本発明において、「グラム陽性菌に対する抗生物質」としては特に制限はなく、例えば、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキソチン（ｃｅｆｏｘｏｔｉｎ）、セフプロジル、セフトビプロール（ｃｅｆｔｏｂｉｐｒｏｌｅ））、フルオロキノロン系抗生物質（シプロ、レバキン（Ｌｅｖａｑｕｉｎ）、フロキシン（ｆｌｏｘｉｎ）、テクインｔｅｑｕｉｎ、アベロックス（ａｖｅｌｏｘ）、ノルフロックス（ｎｏｒｆｌｏｘ））、テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン）、ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、メチシリン）、カルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム）が挙げられる。
【００６６】
また、前述の通り、本発明において「個体」とは特に制限されることなく、例えば、ヒト、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物などが挙げられる。また「個体」は、健常状態であってもよく、羅患状態であってもよい。かかる羅患状態としては特に制限されることなく、例えば、癌免疫療法を受けている状態、感染症を患っている状態が挙げられる。
【００６７】
さらに、本発明において、「制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を阻害するための方法」の別の態様として、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも一の物質を抗原とする、抗体、抗体フラグメント、又はペプチドを個体に投与する工程を含む、該個体において制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を阻害するための方法を提供することもできる
（ａ）  クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  哺乳動物から得られた糞便試料の芽胞形成細菌画分または該画分の培養上清
（ｃ）  哺乳動物から得られた糞便試料のクロロホルム処理画分、前記画分の培養上清。
【００６８】
＜ワクチン組成物、並びに該組成物による感染症、自己免疫疾患を治療又は予防するための方法＞
前述の通り、及び後述の実施例１５において示すように、大腸におけるクロストリジウムによるＴｒｅｇ細胞の誘導は、局所性及び全身性の免疫応答に重要な役割を担っていることから、本発明は「下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも１の物質を含む、ワクチン組成物
（ａ）  クロストリジウム属に属する細菌
（ｂ）  哺乳動物から得られた糞便試料の芽胞形成細菌画分中の細菌芽胞
（ｃ）  哺乳動物から得られた糞便試料のクロロホルム処理画分中の細菌」、並びに「該ワクチン組成物を個体に投与し、個体における、感染症及び自己免疫疾患から選択される少なくとも一の疾患を治療、該疾患の治療を補助、該疾患の重症度を軽減又又は該疾患を予防するための方法」を提供することもできる。
【００６９】
なお、かかる「自己免疫疾患」としては特に制限はなく、＜制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物＞に記載の「具体的な対象疾患」が例として挙げられる。また「感染症」としては特に制限はなく、＜制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有する組成物＞に記載の「感染性病原体」が関与する感染症が例として挙げられる。
【００７０】
＜制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を促進する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法＞
本発明は、下記工程（１）〜（６）を含む、制御性Ｔ細胞の増殖又は集積を促進する活性を有する化合物をスクリーニングするための方法をも提供することができる。
（１）下記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも一の物質から被験物質を調製する工程
（ａ）  クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質
（ｂ）  哺乳動物から得られた糞便試料の芽胞形成細菌画分または該画分の培養上清
（ｃ）  哺乳動物から得られた糞便試料のクロロホルム処理画分または該画分の培養上清、
（２）ＩＬ−１０遺伝子発現の制御下においてレポーター遺伝子を発現させる非ヒト哺乳動物を調製する工程、
（３）前記被験物質を前記非ヒト哺乳動物に接触させる工程、
（４）前記被験物質を接触させた後、前記非ヒト哺乳動物のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞集団において、前記レポーター遺伝子が発現している細胞を検出し、該細胞の数又は前記レポーター遺伝子が発現していないＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞集団に対する割合を求める工程、（５）前記被験物質に接触していない前記非ヒト哺乳動物において、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞集団における前記レポーター遺伝子が発現している細胞を検出し、該細胞の数又は前記レポーター遺伝子が発現していないＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞集団に対する割合を求める工程、
（６）工程（４）において求めた前記数又は前記割合と工程（５）において求めた前記数又は前記割合とを比較し、工程（４）において求めた前記数又は前記割合が工程（５）において求めたそれらより多い場合に、前記被験物質はＴｒｅｇ細胞の増殖又は集積を促進する化合物であると判定する工程。
【００７１】
本発明にかかる「被験物質」としては、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも一の物質から調製される物質であれば特に制限はなく、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される少なくとも一の物質由来のタンパク質、ポリサッカライド、脂質、核酸が挙げられる。
【００７２】
本発明にかかる「ＩＬ−１０遺伝子発現の制御下においてレポーター遺伝子を発現させる非ヒト哺乳動物」はＩＬ−１０遺伝子発現制御領域（例えば、プロモーター、エンハンサー）によって発現が制御されるレポーター遺伝子を有している非ヒト哺乳動物あればよく、特に制限はされることはない。かかるレポーター遺伝子としては、例えば、蛍光蛋白質（例えば、ＧＦＰ）をコードする遺伝子、ルシフェラーゼをコードする遺伝子が挙げられ、本発明にかかる「ＩＬ−１０遺伝子発現の制御下においてレポーター遺伝子を発現させる非ヒト哺乳動物」としては、後述の実施例において示すＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスを好適に用いることができる。
【００７３】
本発明にかかる「接触」としては特に制限はなく、例えば、前記被験物質を前記非ヒト哺乳動物に経口又は非経口的（例えば、腹腔内投与、静脈注射）に投与することが挙げられる。
【００７４】
また、本発明は、該方法に用いられる、ＩＬ−１０遺伝子発現の制御下においてレポーター遺伝子を発現させる非ヒト哺乳動物を提供することもできる。
【００７５】
さらに、本発明は、下記工程（１）〜（３）を含む、クロストリジウム属に属する細菌のサンプルから、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を促進する活性を有する化合物を単離するための方法を提供することもできる
（１）クロストリジウム属に属する細菌のサンプルからゲノムＤＮＡを調製する工程、
（２）前記ゲノムＤＮＡをクローニングシステムに挿入し、クロストリジウム属に属する細菌のサンプル由来の遺伝子ライブラリーを調製する工程、
（３）工程（２）で得られた遺伝子ライブラリーを用いて、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を促進する活性を有する化合物を単離する工程。
【００７６】
かかる工程において、調製方法や単離方法については特に制限はなく、インビトロ又はインビボの系における公知の技術を適宜用いることができる。また、この方法によって単離される化合物としては特に制限はなく、クロストリジウム属に属する細菌由来の核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ）、クロストリジウム属に属する細菌由来のポリペプチド又はタンパク質が挙げられる。
【００７７】
＜本発明にかかる他の実施態様＞
本発明は上記態様以外にも以下に示す態様も提供することができる。
【００７８】
すなわち、本発明の組成物の個体への投与前より投与後において、クロストリジウム属に属する細菌の割合又は絶対数が増加していることを免疫抑制が増強されていることの指標とする、該個体における微生物叢の組成を測定する方法も提供することができる。かかる方法において、微生物叢の組成を測定する方法としては特に制限はなく、公知の技術（例えば、１６ｓｒＲＮＡシークエンシング）を適宜用いることができる。
【００７９】
また、本発明の組成物の個体への投与前より投与後において、該個体のＴｒｅｇ細胞の分化が増加していることを免疫抑制（又は免疫調節）が増強されていることの指標とする、Ｔｒｅｇ細胞の分化を測定する方法も提供することができる。
【００８０】
さらに、本発明の組成物を抗生物質治療を行っている個体に投与することもできる。かかる投与の時期としては特に制限はなく、例えば、本発明の組成物を抗生物質治療に先んじて又は同時に投与することができる。また、本発明の生成物としては、抗生物質に対して耐性を有するという観点から、芽胞形状を有しているものを投与することが好ましい。
【００８１】
さらに、かかる投与の好適な実施形態としては、グラム陽性菌に対する抗生物質の投与後又は投与と同時に本発明の組成物を投与することが挙げられる。なお、かかる「グラム陽性菌に対する抗生物質」としては特に制限はなく、例えば、セファロスポリン系抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロチン、セファクロル、セファマンドール、セフォキソチン（ｃｅｆｏｘｏｔｉｎ）、セフプロジル、セフトビプロール（ｃｅｆｔｏｂｉｐｒｏｌｅ））、フルオロキノロン系抗生物質（シプロ、レバキン（Ｌｅｖａｑｕｉｎ）、フロキシン（ｆｌｏｘｉｎ）、テクインｔｅｑｕｉｎ、アベロックス（ａｖｅｌｏｘ）、ノルフロックス（ｎｏｒｆｌｏｘ））、テトラサイクリン系抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン）、ペニシリン系抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、メチシリン）、カルバペネム系抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シラスタチン、メロペネム）が挙げられる。
【００８２】
また、かかる投与の好適な実施形態として、バンコマイシン、メトロニダゾール、リネゾリド、ラモプラニン（ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ）、又はフィダキソマイシン（ｆｉｄａｘｏｍｉｃｉｎ）を用いた治療の後に（又は同時に）発明の組成物を投与することが挙げられる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
なお、実施例において用いたマウスは下記の通りに用意又は作製した。また、以下の説明において、マウスの名称の前に「ＳＰＦ」又は「ＧＦ」と付けて、各マウスを称することもあるが、これらは各々、特定の病原性細菌の非存在下（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）又は無菌（Ｇｅｒｍ−Ｆｒｅｅ、ＧＦ）下で維持されたマウスであることを示している。
【００８５】
＜マウス＞
ＳＰＦ又はＧＦ条件下で維持されたＣ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ、及びＩＱＩマウスは三協ラボサービス（日本）、ＳＬＣ（日本）、クレア（日本）又はジャクソン研究所（ＵＳＡ）より購入した。ＧＦマウス及び純粋隔離群（ノトバイオノート）マウスは東京大学、ヤクルト中央研究所、三協ラボサービスのノトバイオート施設内で繁殖させ、維持した。Ｍｙｄ８８−／−、Ｒｉｐ２−／−、及びＣａｒｄ９−／−マウスは非特許文献１〜３に記載の通りに作製し、８代以上の戻し交配を行い、遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６にした。Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰマウスはジャクソン研究所から購入した。
【００８６】
＜Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウス＞
Ｉｌ１０プロモーター制御下にＩｌ１０及びＶｅｎｕｓがコードされているバイシストロニックな領域を作製するために、先ず、ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔを作製した。すなわち、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）に続いて、配列内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、黄色蛍光蛋白質（Ｖｅｎｕｓ）及びＳＶ４０ポリＡシグナル（ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ）からなるカセット（ＩＲＥＳ−Ｖｅｎｕｓ−ＳＶ４０ポリＡシグナルカセット、非特許文献４参照）をＩｌ１０遺伝子の終止コドンとポリＡシグナル（エクソン５）との間に挿入した。次に得られたｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔを用いて、マウスゲノム内のＩｌ１０遺伝子領域との相同組み換えを生じさせ、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓアレルを有するＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスを作製した（図１参照）。なお、図１中、「ｔｋ」はチミジンキナーゼをコードする遺伝子を示し、「ｎｅｏ」はネオマイシン耐性遺伝子を示し、「ＢａｍＨ１」は制限酵素ＢａｍＨ１による切断部位を示す。
【００８７】
また、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスからゲノムＤＮＡを抽出し、ＢａｍＨ１で処理し、図１中に示すプローブを用いてサザンブロッティングを行った。得られた結果は図２に示す。野生型及びＩｌ１０ｖｅｎｕｓのアレルは各々１９ｋｂ及び５．５ｋｂの大きさのバンドで検出されるため、図２に示した結果から明らかなように、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスのゲノム内において図１に示した相同組み換えが生じていることが確認された。
【００８８】
さらに、ＦＡＣＳＡｒｉａを用いて、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸粘膜固有層のＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ−細胞又はＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ＋細胞をソーティングした。そして、後述の方法にて、ＡＢＩ７３００システムによるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行い、ＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現量を調べた。得られた結果は図３及び４に示す。図３及び４に示した結果から明らかなように、ＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現はＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ＋細胞のみで検出され、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスにおいて、ＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現はＶｅｎｕｓの発現として正確に反映されていることが確認された。なお、かかるＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスは実験動物中央研究所（川崎、日本）で無菌状態にし、三協ラボサービス（東京、日本）のビニールアイソレーター内で維持して、下記実施例において用いた。
【００８９】
また、実施例における各実験並びに解析は下記の通りに行った。
【００９０】
＜細菌のマウスへの定着方法並びにその解析＞
非特許文献５、６の記載の通りに、ＳＦＢ又はクロストリジウムを定着させたマウスを作製し、得られたノトバイオノートマウスの盲腸内容物又は糞便を滅菌水または嫌気性希釈液に溶かし、そのままあるいはクロロホルム処理をした後、ＧＦマウスに経口投与した。乳酸桿菌属細菌３株及びバクテロイデス属細菌１６株はＢＬ及びＥＧ寒天培地で嫌気的に個々に培養した。培養した細菌を回収して嫌気性ＴＳ培地に懸濁し、強制的にＧＦマウスに経口投与した。マウスにおける細菌の定着具合は、糞便を塗沫標本にし顕微鏡観察して評価した。
【００９１】
＜細胞分離及びフローサイトメトリー＞
大腸及び小腸粘膜固有層からリンパ球を単離するために、小腸及び大腸を採取し、長手方向に開裂し、中の糞便等を洗い除去した。そして、３７℃で２０分間、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳ中にて振盪した。上皮細胞及び脂肪組織を除去した後、腸組織は細かく小切片にし、ＲＰＭＩ１６４０（４％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ、０．５ｍｇ／ｍｌディスパーゼ、及び４０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（全てロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製））を添加し、３７℃の水浴中で１時間振盪した。消化した組織を５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳで洗浄し、５ｍｌ  ４０％パーコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に再懸濁し、１５ｍｌファルコンチューブ中の２．５ｍｌ  ８０％パーコールの上に重層した。そして、室温下にて２０００ｒｐｍで２０分間遠心し、パーコール密度勾配による細胞分離を行った。境界面の細胞を回収し、粘膜固有層リンパ球として使用した。回収した細胞は染色バッファー（ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．０９％  ＮａＮ３）に懸濁し、ＰＥ−又はＰＥ−Ｃｙ７で標識された抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色した。ＣＤ４を染色した後、細胞内Ｆｏｘｐ３の染色は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ  Ｐｌｕｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＦｏｘｐ３  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びＡｌｅｘａ６４７−で標識された抗Ｆｏｘｐ３抗体（ＦＪＫ−１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。フローサイトメトリーはＦＡＣＳｃａｎｔ  ＩＩを使用して行い、データはＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）により解析した。細胞のソーティングは、ＦＡＣＳＡｒｉａを使用して行った。
【００９２】
＜リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ＞
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製したＲＮＡから、ＭＭＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡは、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＢＩ  ７３００  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、又はＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて解析した。各々のサンプルにおいてはＧＡＰＤＨの量で標準化して値を出した。プライマーセットはＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて設計し、初期評価で９０％以上の配列一致性を示したものを選択した。用いたプライマーセットは以下の通りである
Ｆｏｘｐ３
５’−ＧＧＣＡＡＴＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＡＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：１）
５’−ＧＧＧＴＣＧＣＡＴＡＴＴＧＴＧＧＴＡＣＴＴＧ−３’（配列番号：２）
ＣＴＬＡ４
５’−ＣＣＴＴＴＴＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＴＣＡＣＴＣＴ−３’（配列番号：３）
５’−ＧＧＧＴＣＡＣＣＴＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＧ−３’（配列番号：４）
ＧＩＴＲ
５’−ＴＣＡＧＴＧＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号：５）
５’−ＡＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＡＣＡ−３’（配列番号：６）
ＩＬ−１０
５’−ＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴ−３’（配列番号：７）
５’−ＣＴＴＣＴＡＴＧＣＡＧＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＴＣＡＡ−３’（配列番号：８）
ＧＡＰＤＨ
５’−ＣＣＴＣＧＴＣＣＣＧＴＡＧＡＣＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号：９）
５’−ＴＣＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＡＣＴＧＣＡＡ−３’（配列番号：１０）
Ｍｍｐ２
５’−ＧＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴＴＴＧＡＴＧＧＣＡ−３’（配列番号：１１）
５’−ＣＴＴＧＴＣＡＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＴＧ−３’（配列番号：１２）
Ｍｍｐ９
５’−ＴＣＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡＴＧＴＧＧ−３’（配列番号：１３）
５’−ＧＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：１４）
Ｍｍｐ１３
５’−ＡＧＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＣＴＣＣＡＡＧＧ−３’（配列番号：１５）
５’−ＴＣＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号：１６）
Ｉｄｏ１
５’−ＡＧＡＧＧＡＴＧＣＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＧ−３’（配列番号：１７）
５’−ＡＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＴＣＴＧＧＣＡ−３’（配列番号：１８）。
【００９３】
＜大腸  腸上皮細胞（ＩＥＣ）の調製及び培養＞
先ず、大腸を採取し、長手方向に開裂し、ＰＢＳにてすすいだ。次に１ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、３７℃、３０分間、振盪機により処理し、次いで１分間ボルテックスすることにより、上皮組織の完全性（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を崩壊させた。遊離したＩＥＣを回収し、５ｍｌ  ２０％パーコールに懸濁し、１５ｍｌファルコンチューブ中の２．５ｍｌ  ８０％パーコールの上に重層した。そして、２５℃にて７８０ｇで２０分間遠心し、パーコール密度勾配による細胞分離を行い、境界面の細胞を回収し、大腸ＩＥＣ（純度９０％以上、生存率９５％）として使用した。回収して得られたＩＥＣは、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩに懸濁し、１×１０５個を２４ウェルプレートにて２４時間培養した。その後、培養上清を回収し、活性型ＴＧＦ−β１のレベルをＥＬＩＳＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した
また、インビトロＴ細胞培養のため、ＧＦマウス又はクロストリジウム定着マウスから単離したＩＥＣを培養した５０％駲化培地と、２５ｎｇ／ｍｌ  ｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と共に、９６ウェル丸底プレートにて、ＭＡＣＳ精製脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を各ウェル１．５×１０５個ずつ、２５μｇ／ｍｌ  抗ＴＧＦ−β抗体（Ｒ＆Ｄ）存在下又は非存在下において培養した。なお前記丸底プレートには、１０μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が結合してある。そして、５日間培養した後、ＣＤ４＋Ｔ細胞を回収し、リアルタイムＰＣＲを行った。
【００９４】
＜大腸炎実験モデル＞
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２週齢）に、クロストリジウム定着マウスの糞便懸濁液を経口投与し、コンベンショナルな環境下で６週間飼育した。
【００９５】
ＤＳＳ誘導大腸炎モデル作製のため、６日間マウスに２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＤＳＳ（試薬等級、ＤＳＳ塩、分子量＝３６〜５０ｋＤ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を飲料水と共に与えた。
【００９６】
また、オキサゾロン誘導大腸炎モデル作製のため、１５０μｌ  ３％オキサゾロン（４−ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−２−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｏｘａｚｏｌｉｎ−５−ｏｎｅ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）／１００％エタノール溶液を経皮塗布することによって、マウスを前感作した。そして、その５日後、浅麻酔下、１５０μｌ  １％オキサゾロン／５０％エタノール溶液を前感作マウスの直腸内に再投与した。なお、直腸内投与は３．５Ｆカテーテルを用いて行った。
【００９７】
また、各マウスにおいては、体重、潜血、肉眼で確認できる出血（ｇｒｏｓｓ  ｂｌｏｏｄ）、及び便の硬さを毎日分析した。さらに、「Ｓ．Ｗｉｒｔｚ，Ｃ．Ｎｅｕｆｅｒｔ，Ｂ．Ｗｅｉｇｍａｎｎ，Ｍ．Ｆ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２，５４１（２００７）．」の記載に沿って、体重減少率、腸内出血（出血なし、潜血（ｈｅｍｏｃｃｕｌｔ＋）、又は肉眼で確認できる出血）、及び便の硬さ（正常便、軟便、又は下痢）に点数をつけ、疾患活動性指数（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ））を算出した。
【００９８】
＜ＯＶＡ特異的ＩｇＥ反応＞
クロストリジウム定着マウス（２週齢）の糞便懸濁液をＢＡＬＢ／ｃ  ＳＰＦマウスに接種し、コンベンショナルな環境下で飼育した。そして、１μｇ  ＯＶＡ（グレードＶ、Ｓｉｇｍａ）及び２ｍｇ  アラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）全量  ０．２ｍｌをマウス（４週齢時、及び６週齢時）の腹腔内に注射した。かかるマウスの尾の付け根から血清を毎週回収し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥをＥＬＩＳＡ（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）によって測定した。そして、８週齢時に脾細胞を回収し、各ウェル１×１０６個ずつ９６ウェルプレートに播種し、３日間ＯＶＡ（１００μｇ／ｍｌ）によって刺激した。その後、培養上清を回収し、ＩＬ−４及びＩＬ−１０レベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって測定した。
【００９９】
＜統計解析＞
コントロールと実験群との差は、スチューデントｔ検定によって評価した。
【０１００】
（実施例１）
先ず、大腸粘膜固有層における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の集積は共生細菌依存的なものであるかどうかを調べた。すなわち、特定の病原性細菌の非存在下（ＳＰＦ）で飼育されたＢａｌｂ／ｃマウスの末梢リンパ節（ｐＬＮ）、又は、大腸（ｃｏｌｏｎ）若しくは小腸（ＳＩ）の粘膜固有層からリンパ球を単離し、ＣＤ４及びＦｏｘｐ３の抗体染色を行い、ＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３＋細胞の比率をフローサイトメトリーを用いて解析した。得られた結果を図５に示す。図５に示した結果から明らかなように、特定の病原性微生物の非存在（ＳＰＦ）環境下で維持されたマウスの、消化管の粘膜固有層、特に大腸の粘膜固有層において、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は高頻度に存在していることが確認された。また、大腸の粘膜固有層において、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞数は生後３カ月まで徐々に増加していくが、末梢リンパ節においては生後２週から、その数は基本的に一定であることも確認された。
【０１０１】
（実施例２）
次に、実施例１で確認された大腸における経時的なＴｒｅｇ細胞の集積は、腸内共生細菌の定着と関連しているかどうかを調べた。すなわち、無菌（ＧＦ）又はＳＰＦ環境下で飼育したマウス（８週齢：Ｂａｌｂ／ｃマウス、ＩＱＩマウス及びＣ５７ＢＬ／６マウス）の小腸、大腸及び末梢リンパ節から単離したリンパ球のＣＤ４及びＦｏｘｐ３の発現について解析し、三回以上の独立した実験から同様の結果を得た。得られた結果は図６及び図７に示す。なお、図７中の白丸は各々、個々のマウスにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。
【０１０２】
また、ＳＰＦマウス及びＧＦマウス（Ｂａｌｂ／Ｃマウス又はＣ５７ＢＬ／６マウス）から粘膜固有層リンパ球を回収し、ＣＤ４及びＦｏｘｐ３の抗体染色を行い、ＦＡＣＳで解析した。得られた結果は図８に示す。なお、図８中の白丸は個々のマウスにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の絶対数を示し、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示し、また、＊は「Ｐ＜０．０１」であることを示す。
【０１０３】
さらに、抗生物質を水とともに８週間経口投与したマウス（ＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウス）の大腸（ｃｏｌｏｎ）及び小腸（ＳＩ）の粘膜固有層、パイエル板（ＰＰｓ）、並びに、腸間膜リンパ節（ＭＬＮｓ）からリンパ球を単離し、ＣＤ４及びＦｏｘｐ３の抗体染色を行い、ＦＡＣＳで解析し、二回以上の独立した実験から同様の結果を得た。得られた結果（個々のマウスのＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合）は図９に示す。なお、抗生物質は下記文献の記載の通り、以下の物を組み合わせて使用した
アンピシリン（Ａ；５００ｍｇ／Ｌ  Ｓｉｇｍａ）
バンコマイシン（Ｖ；５００ｍｇ／Ｌ  ナカライテスク）
メトロニダゾール（Ｍ；１ｇ／Ｌ  ナカライテスク）
ネオマイシン（Ｎ；１ｇ／Ｌ  ナカライテスク）
Ｒａｋｏｆｆ−Ｎａｈｏｕｍ，  Ｊ．  Ｐａｇｌｉｎｏ，  Ｆ．  Ｅｓｌａｍｉ−Ｖａｒｚａｎｅｈ，  Ｓ．  Ｅｄｂｅｒｇ，  Ｒ．  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，  Ｃｅｌｌ  １１８，  ２２９  （Ｊｕｌ  ２３，  ２００４）
Ｆａｇａｒａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８，  １４２４  （Ｎｏｖ  １５，  ２００２）
図９中、白丸は個々のマウスにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合を示し、水平バーはそれらの平均値を示し、また＊は「Ｐ＜０．０１」であることを示し、「ＡＶＭＮ」は投与した抗生物質の種類を、各抗生物質の頭文字をとって示したものである。
【０１０４】
図６〜９に示した結果から明らかなように、ＧＦマウスの小腸又は末梢リンパ節におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞の頻度及び絶対数は、ＳＰＦマウスのそれと比較して変わらない、又は多かった（図６〜８参照）。また、抗生物質を８週間経口投与したＳＰＦマウスにおいても、小腸粘膜固有層、パイエル板及び腸間膜リンパ節のＴｒｅｇ細胞数は変わらない、又は増えていた（図９参照）。一方、ＳＰＦマウスと比較して、ＧＦマウスの大腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞数は有意に減少していた（図６及び７参照）。この減少は、異なる遺伝的背景のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、ＩＱＩ、Ｃ５７ＢＬ／６）においても、異なる動物施設で飼育したマウスにおいても共通して観察された（遺伝的背景に関しては図７参照、異なる動物施設で飼育したマウスに関しては図に示さず）。また、抗生物質を投与したＳＰＦ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞数も有意に減少することも明らかになった（図９参照）。
【０１０５】
（実施例３）
次に、実施例２で示したＧＦマウスの大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞数の減少は、微生物叢の不在によるものなのかということを直接的に確認した。すなわち、ジャクソン研究所から購入したＢ６  ＳＰＦマウスの糞便懸濁液をＧＦ−ＩＱＩマウスに経口投与し（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、その３週間後に大腸粘膜固有層のリンパ球を単離し、ＣＤ４＋リンパ球におけるＦｏｘｐ３の発現を解析した。得られた結果は図１０及び図１１に示す。なお、図１１中の白丸は各々、個々のマウスにおけるＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示し、＊はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定において「Ｐ＜０．０１」であることを示し、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。図１０及び１１に示した結果から明らかなように、小腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞数は変わらなかったが、大腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞数は顕著に増加した。したがって、大腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の集積において、宿主と微生物との相互作用が重要な役割を果たしており、一方、小腸粘膜固有層Ｔｒｅｇ細胞の集積は異なるメカニズムによるものであることが明らかになった。
【０１０６】
（実施例４）
次に、Ｍ．Ｎ．Ｋｗｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７４，４３６５（Ａｐｒ１，２００５）に記載の方法に沿って、マウス消化管関連リンパ組織と、大腸粘膜固有層におけるＦｏｘｐ３＋細胞数との関連を調べた。すなわち、妊娠１４日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内に、１００μｇの細胞外ドメイン組み換え蛋白質（リンホトキシンβ受容体（ＬＴβＲ）とヒトＩｇＧ１のＦｃ部位との融合蛋白質（ＬＴβＲ−Ｉｇ）、Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９３，  ６２１  （Ｍａｒ  ５，  ２００１）参照）を注入し、かかるマウスから得られた胎児にもＬＴβＲ−Ｉｇを再度腹腔内に注入し、孤立リンパ小節（ＩＬＦ）、パイエル板（ＰＰ）及びｃｏｌｏｎｉｃ−ｐａｔｃｈ（ＣＰ）が完全に除去されたマウスを作製した。そして、ＬＴβＲ−Ｉｇで処理したマウス、又はラットＩｇＧで処理したマウス（コントロール）の大腸粘膜固有層のＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合をＦＡＣＳにて解析した。得られた結果を図１２に示す。なお、図１２中、白丸は個々のマウスにおけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合を示し、エラーバーは標準偏差を示す。図１２に示した結果から明らかなように、孤立リンパ小節、パイエル板及びｃｏｌｏｎｉｃ−ｐａｔｃｈを欠損させたマウス（ＬＴβＲ−Ｉｇで処理したマウス）の大腸粘膜固有層において、Ｆｏｘｐ３＋細胞の割合はむしろ増加していることが確認された。したがって、ＧＦマウス又は抗生物質で処理したマウスの大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞数の減少は、単に消化管関連リンパ組織の形成不全による二次的な影響というより、むしろ大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞集積を促進する腸内細菌によって引き起こされる特定のシグナル伝達が生じなかったことによるものだということが示唆された。
【０１０７】
（実施例５）
特定の腸内細菌叢（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｆｌｏｒａ）が大腸Ｔｒｅｇ細胞の集積を誘導しているかどうかを調べるため、グラム陽性菌に対する抗生物質としてｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、グラム陰性菌に対する抗生物質としてｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  ＢをＳＰＦマウス（４週齢〜）に４週間投与し、ＣＤ４＋細胞群におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合（［％］Ｆｏｘｐ３＋ｉｎ  ＣＤ４）を分析した。得られた結果を図３０に示す。なお図３０中、「ＳＰＦ」はＳＰＦマウス（コントロール）の結果を、「ポリミキシンＢ」はｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂを投与したＳＰＦマウスの結果を、「バンコマイシン」はｖａｎｃｏｍｙｃｉｎを投与したＳＰＦマウスの結果を示す。また、＊は「Ｐ＜０．０１」であることを示す。
【０１０８】
図３０に示した結果から明らかなように、コントロールと比較して、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎを投与したマウスの大腸においてＴｒｅｇ細胞の数は顕著に減少していた。対して、ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ  Ｂを投与したマウスにおけるＴｒｅｇ細胞の数に影響は見られなかった。これらのことから、Ｔｒｅｇ細胞の集積においては、グラム陽性共生細菌が主要な役割を担っていることが示唆された。
【０１０９】
（実施例６）
最近の報告から、腸のＴ細胞応答において芽胞形成性細菌（ｓｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ）が重要な役割を担っていることが示唆されている（Ｖ．Ｇａｂｏｒｉａｕ−Ｒｏｕｔｈｉａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３１，６７７（Ｏｃｔ  １６，２００９）  参照）。そこで、３％クロロホルムに耐性を示す糞便微生物（芽胞形成細菌画分、ｓｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）をＧＦマウスに経口投与し、ＣＤ４＋細胞群におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合（［％］Ｆｏｘｐ３＋ｉｎ  ＣＤ４）を分析した。得られた結果を図３１に示す。なお図３１中、「ＧＦ」はＧＦマウスの結果を、「＋ｃｈｌｏｒｏ」はクロロホルム処理した糞便を投与したＧＦマウスの結果を示す。また、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【０１１０】
図３１に示した結果から明らかなように、クロロホルム処理した糞便を投与してから３週間後、ＳＰＦマウス又は無処理の糞便を強制投与したＧＦマウスと同程度に、投与したマウスにおいてＴｒｅｇ細胞の数は顕著に増加していた（図７及び１１  参照）。
【０１１１】
従って、実施例５に示した結果と併せて、常在微生物叢（ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ）の特定成分はグラム陽性に属している可能性が高く、芽胞形成細菌画分がＴｒｅｇ細胞の誘導において重要な役割を担っていることが明らかになった。
【０１１２】
（実施例７）
次に、実施例４〜６において示唆された大腸Ｔｒｅｇ細胞の集積を誘導する腸内細菌種の同定を行った。すなわち、ＧＦ−Ｂａｌｂ／ｃマウス又はＧＦ−ＩＱＩマウスに、セグメント細菌（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｂａｃｔｅｒｉａ（ＳＦＢ））、バクテロイデス属細菌１６株（Ｂａｃｔｅｒｏ．（Ｂ．ｖｕｌｇａｔｕｓ  ６株、Ｂ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ  ｇｒｏｕｐ１  ７株、Ｂ．ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ  ｇｒｏｕｐ２  ３株））、乳酸桿菌属細菌３株（Ｌａｃｔｏ．（Ｌ．  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、及びＬ．  ｍｕｒｉｎｕｍ））、クロストリジウム属細菌４６株（Ｃｌｏｓｔ．「Ｉｔｏｈ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｍｉｔｓｕｏｋａ，  Ｔ．    Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｆａｅｃｅｓ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｆｌｏｒａ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｃａｅｃａｌ  ｓｉｚｅ  ｗｈｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅ  ｍｉｃｅ．  Ｌａｂ．  Ａｎｉｍａｌｓ  １９：  １１１−１１８  （１９８５））」参照）、又はコンベンショナルな環境下で飼育したマウス（ＳＰＦ）から採取した微生物叢を経口投与し、その後三週間ビニルアイソレータの中で維持した後、これらマウスから大腸及び小腸のＣＤ４細胞を単離し、フローサイトメトリーを用いて大腸及び小腸におけるＴｒｅｇ細胞数を解析した。Ｂａｌｂ／ｃマウスのＣＤ４＋細胞にゲートを設定したＦＡＣＳドット−プロットは図１３に示し、個々のマウスのＣＤ４＋細胞におけるＦｏｘｐ３＋細胞の割合は図１４に示す。
なお、クロストリジウム属に属する細菌は、以下に示す通り、１６ＳｒＲＮＡの配列を決定することによって分類した。すなわち、細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を、下記１６ＳｒＲＮＡ遺伝子特異的プライマーペアを用いたＰＣＲによって増幅した
５’ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＭＴＧＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号：１９）
５’ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＫＧＣＴＧ−３’（配列番号：２０）
（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｆｌｏｒａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４６，２２１−２２９（２００６）参照）。そして、１．５−ｋｂのＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクターに挿入した。前記挿入されたＰＣＲ産物の配列を決定し、ＣｌｕｓｔａｌＷソフトウェアプログラムを用いてアラインメントをかけた。得られた、クロストリジウム属細菌４６株のうちのｓｔｒａｉｎ１〜４１に由来する１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のシークエンス結果を、配列番号：２１〜６１に示す。また、クロストリジウム４１株のシークエンス結果とＧｅｎｂａｎｋデータベースから得られた既知の細菌のシークエンスとに基づき、Ｍｅｇａソフトウェアを用いた近隣結合法によって構築した系統樹を図４９に示す。
図１３及び図１４に示した結果から明らかなように、セグメント細菌（ＳＦＢ）を定着させたＧＦマウスの大腸Ｔｒｅｇ細胞数への影響は確認されなかった（図１４参照）。また、乳酸桿菌属細菌３株のカクテルを定着させたマウスにおいても同様の結果であった（図１４参照）。一方、クロストリジウム属細菌４６株を定着させたマウスにおいては、大腸粘膜固有層のＦｏｘｐ３＋細胞の集積が強く誘導されていることが明らかになった。そして、重要なことに、かかる集積はマウスの遺伝的背景とは関係なく促進され、単属の腸内細菌の定着にも関わらずＳＰＦマウスと同程度の増加を示した。また、クロストリジウムの定着は小腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞数を変化させないことも明らかになった（図１４参照）。なお、バクテロイデス属細菌１６株を定着させた場合も、大腸においてＴｒｅｇ細胞数は有意に増えていたが、定着させたマウスの遺伝的背景によって増加の程度は異なっていた（図１３及び１４参照）。
【０１１３】
（実施例８）
次に、ＳＰＦマウス、ＧＦマウス、乳酸桿菌定着マウス、又はクロストリジウム定着マウスの胸腺又は大腸のＬＰリンパ球における、ＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、及びＨｅｌｉｏｓの発現をフローサイトメトリーで分析した。得られた結果を図３２及び３３に示す。なお図３２及び３３中、「ＧＦ」又は「Ｇｅｒｍ  Ｆｒｅｅ」はＧＦマウスの結果を、「ＳＰＦ」はＳＰＦマウスの結果を、「ＳＰＦ」はＳＰＦマウスの結果を、「Ｌａｃｔｏ．」は乳酸桿菌定着マウスの結果を、「Ｃｌｏｓｔ．」はクロストリジウム定着マウスの結果を各々示す。また図３２中、縦軸はＦｏｘｐ３＋細胞群におけるＨｅｌｉｏｓ−細胞の割合（［％］Ｈｅｌｉｏｓ−ｉｎ  Ｆｏｘｐ３＋）を示し、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【０１１４】
図３２及び３３に示した結果から明らかなように、ＳＰＦマウス又はクロストリジウム定着マウスにおいて認められたＦｏｘｐ３＋細胞のかなりの部分は、Ｈｅｌｉｏｓを発現していなかった。なお、Ｈｅｌｉｏｓは胸腺産生ナチュラルＴｒｅｇ細胞において発現していることが知られている転写因子であることから（Ａ．Ｍ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４，３４３３（Ａｐｒ  １，２０１０）  参照）、ＳＰＦマウス又はクロストリジウム定着マウスにおけるＴｒｅｇ細胞の多くは末梢部において誘導されているＴｒｅｇ細胞、いわゆるｉＴｒｅｇ細胞であることが示唆される。
【０１１５】
（実施例９）
次に、クロストリジウム等の定着による他のＴ細胞への影響の有無を調べた。すなわち、ＧＦ  ＩＱＩマウスにＳＦＢ、バクテロイデス属細菌１６株（Ｂａｃｔｅｒｏ．）、クロストリジウム属細菌４６株（Ｃｌｏｓｔ．）、又はコンベンショナルな環境（ＳＰＦ）下で飼育したマウスから採取した微生物叢を定着させ、３週間後にこれらマウスから大腸粘膜固有層のリンパ球を単離し、Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間刺激した。そして、刺激を与えた後、ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤバイオサイエンス）の説明書に従って、細胞内サイトカインの染色を抗ＩＬ−１７  ＰＥ抗体（ＴＣ１１−１８Ｈ１０）、抗ＩＦＮ−ｇ  ＦＩＴＣ抗体（ＢＤバイオサイエンス）を用いて行い、ＩＦＮ−γ＋細胞又はＩＬ−１７＋細胞のＣＤ４＋白血球における割合について、フローサイトメトリーを用いて解析した。得られた結果は図１５及び図１６に示す。なお、図１５及び図１６中の白丸は各々、個々のマウスにおけるＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋細胞の割合又はＣＤ４＋ＩＬ−１７＋細胞の割合を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示す。図１５及び１６に示した結果から明らかなように、クロストリジウムの定着は、大腸においてＴｈ１細胞（ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋細胞）には影響せず、Ｔｈ１７細胞（ＣＤ４＋ＩＬ−１７＋細胞）においてはわずかな増加しか引き起こさなかった。したがって、クロストリジウム属に属する細菌はＴｒｅｇ細胞を特異的に誘導する細菌であることが示唆された。
【０１１６】
（実施例１０）
クロストリジウム４６株は大腸においてＣＤ８＋腸管上皮細胞間リンパ球（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＩＥＬ）の集積に影響を与えることが報告されている。それゆえ、クロストリジウムは免疫系を様々な側面から調整していることが考えられ、前述の通り、特に大腸のＴｒｅｇ細胞の誘導及び維持において顕著な能力を発揮していることが考えられる。また、サイトカインの一種である、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）は、Ｔｒｅｇ細胞の発生を調節するにあたって、重要な役割を担っていることが知られている。
【０１１７】
そこで、クロストリジウムの定着は、大腸においてＴＧＦ−βが豊富に存在する環境を提供しているということを検証した。すなわち先ず、ＧＦマウス、クロストリジウム定着マウス、又は乳酸桿菌定着マウスの全大腸を２４時間培養し、その培養上清における活性型ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１）の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（分析数は各グループマウス４匹ずつ）。得られた結果を図３４に示す。なお図３４中、「ＧＦ」はＧＦマウスの結果を、「Ｃｌｏｓｔ．」はクロストリジウム定着マウスの結果、「Ｌａｃｔｏ．」は乳酸桿菌定着マウスの結果を示す。また、＊は「Ｐ＜０．０２」であることを、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【０１１８】
図３４に示した結果から明らかなように、ＧＦマウス、又は乳酸桿菌定着マウスと比較して、クロストリジウム定着マウスの大腸におけるＴＧＦ−βの産生量の有意に多かった。
【０１１９】
次に、ＧＦマウス又はクロストリジウム定着マウスのＩＥＣ（腸上皮細胞）を２４時間培養し、それらの培養上清における活性型ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−β１）の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（分析数は各グループマウス４匹ずつ）。得られた結果を図３５に示す。なお図３５中、「ＧＦ」はＧＦマウスの結果を、「Ｃｌｏｓｔ．」はクロストリジウム定着マウスの結果を示す。また、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【０１２０】
図３５に示した結果から明らかなように、クロストリジウム定着マウスから単離されたＩＥＣの培養上清において、ＴＧＦ−βが検出された。しかしＧＦマウスから単離されたＩＥＣの培養上清においては検出されなかった。
【０１２１】
次に、前述の通り、ＧＦマウス又はクロストリジウム定着マウスから単離したＩＥＣを培養した５０％駲化培地と、抗ＣＤ３抗体と共に脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ＴＧＦ−β抗体存在下又は非存在下において５日間培養した後、Ｔ細胞を回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＦｏｘｐ３の発現を分析した。得られた結果を図３６に示す。なお図３６中、「培地」は何の細胞をも培養していない培地による結果を、「ＧＦ」はＧＦマウスのＩＥＣを培養した駲化培地による結果を、「Ｃｌｏｓｔ．」はクロストリジウム定着マウスのＩＥＣを培養した駲化培地による結果を、「Ｃｌｏｓｔ．＋αＴＧＦβ」は抗ＴＧＦβ抗体を添加したクロストリジウム定着マウスのＩＥＣを培養した駲化培地による結果を示す。また、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【０１２２】
図３６に示した結果から明らかなように、クロストリジウム定着マウス由来のＩＥＣ培養上清を脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞に添加することにより、Ｆｏｘｐ３発現細胞への分化は亢進した。一方、このＴｒｅｇ細胞への分化は、抗ＴＧＦ−β抗体によって阻害された。
【０１２３】
さらに、潜在型ＴＧＦ−βの活性化に寄与していると考えれられている、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、及びＭＭＰ１３の発現についても調べた。また、Ｔｒｅｇ細胞の誘導に関与していると考えられているインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の発現についても調べた。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６  ｇｅｒｍ−ｆｒｅｅマウスにクロストリジウム属細菌４６株（Ｃｌｏｓｔ．）又は乳酸桿菌属細菌３株（Ｌａｃｔｏ．）を経口投与し、投与してから３週間後にＩＥＣを回収し、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、又はＩＤＯ遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって分析した（分析数は各グループマウス３匹ずつ）。得られた結果を図３７〜４０に示す。なお図３７〜４０中、「ＧＦ♯１〜３」はＧＦマウスの結果を、「Ｃｌｏｓｔ．♯１〜３」はクロストリジウム定着マウスの結果、「Ｌａｃｔｏ．♯１〜３」は乳酸桿菌定着マウスの結果を示す。
【０１２４】
また、潜在型ＴＧＦ−βの活性化と前記ＭＭＰとの関連については、Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，１１３４７−１１３５３，２００１；Ｈｅｉｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８７，６９−７８，２００６；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．ｉ４，１６３−１７６，２０００  参照のこと。ＩＤＯとＴｒｅｇ細胞の誘導との関連については、Ｇ．Ｍａｔｔｅｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｕｔ  ５９，５９５（Ｍａｙ，２０１０）参照のこと。
【０１２５】
図３７〜３９に示した結果から明らかなように、前述のＴＧＦ−β産生と一致して、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、及びＭＭＰ１３をコードする遺伝子の転写産物は、ＧＦマウス又は乳酸桿菌定着定着マウスと比較して、クロストリジウム定着マウス由来のＩＥＣにおいて高レベルにて発現していた。
【０１２６】
さらに、図４０に示した結果から明らかなように、クロストリジウム定着マウスにおいてのみ、ＩＤＯが発現していた。
【０１２７】
従って、クロストリジウムによりＩＥＣが活性化され、大腸内においてＴＧＦ−βや他のＴｒｅｇ細胞誘導分子が産生されることが明らかになった。
【０１２８】
（実施例１１）
次に、クロストリジウムの定着が誘導するＴｒｅｇ細胞の集積は、病原体関連分子パターン認識受容体シグナル伝達に依存的なものであるかどうかを調べた。すなわち、Ｍｙｄ８８−／−（Ｍｙｄ８８（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ様受容体のシグナリングアダプター）欠損）、Ｒｉｐ２−／−（Ｒｉｐ２（ＮＯＤ受容体アダプター）欠損）、又はＣａｒｄ９−／−（Ｃａｒｄ９（Ｄｅｃｔｉｎ−１シグナル伝達の主要なシグナル伝達因子）欠損）のＳＰＦマウスにおける大腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞数を調べた。また、Ｍｙｄ８８−／−ＧＦマウスにクロストリジウム属細菌を定着させ、Ｔｒｅｇ細胞数の変化を調べた。得られた結果を図１７及び１８に示す。図１７及び１８に示した結果から明らかなように、病原体関連分子パターン認識受容体の関連因子を欠損させた各ＳＰＦマウスにおいて、コントロールである野生型同腹子と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の数は変わらないものであった。また、Ｍｙｄ８８欠損ＧＦマウスにクロストリジウム属細菌を定着させても、大腸粘膜固有層におけるＴｒｅｇ細胞の集積は誘導されることが確認された。したがって、大腸粘膜固有層のＴｒｅｇ細胞蓄積を誘導するメカニズムは、大多数の細菌によって引き起こされる主な病原体関連分子パターン認識経路の活性化ではなく、特定の共生細菌に起因しているものであることが示唆された。
【０１２９】
（実施例１２）
腸管Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞はＩＬ−１０産生を通して、一部の免疫抑制機能を発揮することが知られており（非特許文献９参照）、また、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞からＩＬ−１０が特異的に除去されている動物は炎症性腸疾患を発症する（非特許文献１８参照）ことも知られている。そこで、先ず、各組織のリンパ球におけるＩＬ−１０の発現を調べた。すなわち、リンパ球をＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの各組織から単離し、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４及びＶｅｎｕｓの発現を解析した。得られた結果は図１９に示す。なお、図１９中の数字は４分割された個々の区分における細胞の割合を示す。
【０１３０】
また、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスから大腸粘膜固有層のリンパ球を単離し、細胞表面におけるＴ細胞受容体β鎖（ＴＣＲβ）の発現をＦＡＣＳにて検出した。得られた結果（ＣＤ４＋細胞にゲートを設定したＦＡＣＳドット−プロット）は図２０に示す。なお、図２０中の数字は４分割された個々の区分における細胞の割合を示す。
【０１３１】
さらに、大腸粘膜固有層のリンパ球をＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスから単離し、Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下において、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で４時間刺激した。刺激を与えた後、ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤバイオサイエンス）の説明書に従って、細胞内サイトカインの染色を抗ＩＬ−１７  ＰＥ抗体、抗ＩＬ−４  ＡＰＣ抗体（１１Ｂ１１）、抗ＩＦＮ−ｇ  ＦＩＴＣ抗体（ＢＤバイオサイエンス）を用いて行った。得られた結果（ＣＤ４＋細胞にゲートを設定したＦＡＣＳドット−プロット）は図２１に示す。なお、図２１中の数字は４分割された個々の区分における細胞の割合を示す。
【０１３２】
また、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋細胞及びＦｏｘｐ３−ＣＤ４＋細胞をＦｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスの脾臓（Ｓｐｌ）から単離し、Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸（ｃｏｌｏｎ）及び小腸（ＳＩ）粘膜固有層からＶｅｎｕｓ＋細胞を単離した。そして得られた各細胞について、所定の遺伝子発現の解析を行った。遺伝子発現は、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）  及びＡＢＩ  ７３００  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて解析し、各々の細胞においてはＧＡＰＤＨ量で標準化して値を出した。得られた結果は図２２に示す。なお、図２２中、エラーバーは標準偏差を示す。
【０１３３】
図１９〜２２に示した結果から明らかなように、Ｖｅｎｕｓ＋細胞（ＩＬ−１０産生細胞）は、ＳＰＦ条件下で維持されたマウスの頸部リンパ節（末梢リンパ節）、胸腺、末梢血、肺、肝臓においては、殆ど検出されないのに対し、脾臓、パイエル板及び腸間膜リンパ節においては、僅かではあるがＶｅｎｕｓ＋細胞が検出された（図１９参照）。一方、小腸及び大腸の粘膜固有層リンパ球においては、多数のＶｅｎｕｓ＋細胞が確認された。そして、腸のＶｅｎｕｓ＋細胞は、殆どがＣＤ４陽性であり、かつＴ細胞受容体β鎖（ＴＣＲβ）陽性の細胞であった（図１９及び２０参照）。さらに、Ｖｅｎｕｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｔｈ２型（ＩＬ−４産生）又はＴｈ１７型（ＩＬ−１７産生）の表現型は示さなかったが、Ｆｏｘｐ３並びに、細胞障害性Ｔリンパ球抗原（ＣＴＬＡ−４）及びグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連蛋白質（ＧＩＴＲ）といった、その他Ｔｒｅｇ細胞関連因子を発現していることが確認された（図２１及び２２参照）。また、腸内Ｖｅｎｕｓ＋細胞のＣＴＬＡ−４発現レベルはＦｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスから単離された脾臓のＧＦＰ＋Ｔｒｅｇ細胞におけるそれよりも高いものであることが明らかになった（図２２参照）。
【０１３４】
（実施例１３）
Ｖｅｎｕｓ＋細胞は、細胞内Ｆｏｘｐ３発現に基づき、少なくとも２つのサブセット、すなわちＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋ダブル陽性（ＤＰ）Ｔｒｅｇ細胞、及びＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−Ｔｒｅｇ細胞に分けることができ、後者の細胞は１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１）に該当する（非特許文献８、９参照）。そこで、実施例８で確認されたＶｅｎｕｓ＋細胞（ＩＬ−１０産生細胞）について、Ｆｏｘｐ３の発現を調べた。すなわち、ＧＦ又はＳＰＦ条件下で維持されているＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの大腸及び小腸の粘膜固有層におけるＣＤ４、Ｆｏｘｐ３、Ｖｅｎｕｓの発現をＦＡＣＳにて解析し、ＳＰＦ及びＧＦ  Ｉｌ１０Ｖｅｎｕｓマウス間の腸管粘膜固有層におけるＶｅｎｕｓ＋細胞数を比較した。得られた結果（ＣＤ４＋細胞にゲートを設定したドット−プロット）を図２３に示す。
【０１３５】
また、ＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスの様々な組織におけるＣＤ４細胞の細胞内Ｖｅｎｕｓ及びＦｏｘｐ３の発現をフローサイトメトリーによって解析した。得られた結果（ＣＤ４＋細胞にゲートを設定したドット−プロット）を図２４に示す。なお、図２４中の数字は４分割された個々の区分における細胞の割合を示す。
【０１３６】
さらに、消化管制御性細胞におけるＩＬ−１０発現に共生細菌の存在が影響しているかどうかを確認するために、Ｉｌ１０Ｖｅｎｕｓマウスを無菌化（ＧＦ化）した。そして、得られたＧＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスに所定の細菌を定着させた。細菌を定着させてから３週間後に、大腸及び小腸においてＦｏｘｐ３及び／又はＶｅｎｕｓが発現しているＣＤ４＋細胞群（Ｖ＋Ｆ−，Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−ｃｅｌｌｓ；Ｖ＋Ｆ＋，Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋ｃｅｌｌｓ；Ｖ−Ｆ＋，Ｖｅｎｕｓ−Ｆｏｘｐ３＋ｃｅｌｌｓ）をフローサイトメトリーで解析した。大腸のＣＤ４＋細胞にゲートを設定したドット−プロットは図２５に示し、個々のマウスのＣＤ４＋細胞群における比率は図２６及び２７に示す。なお、図２５中の数字は４分割された個々の区分における細胞の割合を示す。また、図２６及び２７中のエラーバーは標準偏差を示し、＊は「Ｐ＜０．０２」であることを示し、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
【０１３７】
また、消化管制御性細胞におけるＩＬ−１０発現に共生細菌の存在が影響しているかどうかを確認するために、一グループにつき５、６匹のＩｌ１０ｖｅｎｕｓマウスに抗生物質を水とともに１０週間飲ませた。抗生物質は以下の物を組み合わせて使用した。
アンピシリン（Ａ；５００ｍｇ／Ｌ  Ｓｉｇｍａ）
バンコマイシン（Ｖ；５００ｍｇ／Ｌ  ナカライテスク）
メトロニダゾール（Ｍ；１ｇ／Ｌ  ナカライテスク）
ネオマイシン（Ｎ；１ｇ／Ｌ  ナカライテスク）
そして、大腸（ｃｏｌｏｎ）及び小腸（ＳＩ）の粘膜固有層、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）並びにパイエル板（ＰＰｓ）におけるリンパ球のＣＤ４及びＦｏｘｐ３を抗体染色し、ＦＡＣＳで解析し、同様の結果が得られる二回以上の独立した実験から結果を得た。得られた結果（個々のサンプルのＣＤ４＋細胞におけるＶｅｎｕｓ＋細胞の割合）は図２８に示す。なお、図２８中の白丸は個々のサンプルを示し、水平バーは平均値を示し、＊は「Ｐ＜０．０２」であることを示し、「ＡＶＭＮ」は投与した抗生物質の種類を、各抗生物質の頭文字をとって示したものである。
【０１３８】
図２３及び２４に示した結果から明らかなように、小腸粘膜固有層においては、Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−細胞、すなわちＴｒ１様細胞が豊富であり、またＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋ＤＰ  Ｔｒｅｇ細胞はＳＰＦマウスの大腸において高頻度に存在していることが明らかになった（図２３及び２４参照）。一方で、十分な数のＦｏｘｐ３＋細胞は他の組織においても観察されているが、その殆どの細胞においてＶｅｎｕｓの発現は確認されなかった（図２４参照）。
【０１３９】
また、図２３、２５〜２８に示した結果から明らかなように、大腸のＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−、Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋、Ｖｅｎｕｓ−Ｆｏｘｐ３＋、いずれの制御性Ｔ細胞分画も、ＧＦ条件下で有意に減少していることが明らかになった（図２３、２６及び２７）。さらに、抗生物質で処理したＳＰＦ  ＩＩ１０Ｖｅｎｕｓマウスにおいても同様のＶｅｎｕｓ＋細胞の減少が確認された（図２８参照）。
【０１４０】
さらに、図２５〜２７に示した結果から明らかなように、クロストリジウム属細菌の定着は、大腸においてＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−、Ｖｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３＋、Ｖｅｎｕｓ−Ｆｏｘｐ３＋いずれの制御性Ｔ細胞分画も、強く誘導し、その誘導の程度は、ＳＰＦマウスのそれと同様であった（図２５及び２７参照）。また、乳酸桿菌属細菌３株やＳＦＢの定着による大腸Ｖｅｎｕｓ＋及び／又はＦｏｘｐ３＋細胞数への影響はごくわずかであることが確認された（図２５及び２７参照）。さらに、バクテロイデス属細菌１６株を定着させてもＶｅｎｕｓ＋細胞は誘導されるが、定着による影響はＶｅｎｕｓ＋Ｆｏｘｐ３−Ｔｒ１様細胞特異的なものであった（図２５及び２７参照）。一方、試した細菌種の中には、小腸粘膜固有層のＩＬ−１０産生細胞数に有意に影響を及ぼしたものは確認されなかった（図２６参照）。
【０１４１】
したがって、大腸に定着しているクロストリジウム属に属する細菌又は該細菌に由来する生理活性物質が、ＩＬ−１０＋制御性Ｔ細胞の大腸粘膜固有層への集積、又はＴ細胞におけるＩＬ−１０発現誘導のためのシグナルを提供していることが明らかになった。一方、小腸におけるＶｅｎｕｓ＋細胞数は、共生細菌が存在していない又は減少しているという状況に有意に影響されず（図２３、２６及び２８参照）、小腸粘膜固有層におけるＩＬ−１０＋制御性細胞（Ｔｒ１様細胞）は共生細菌に非依存的に集積することが明らかになった。
【０１４２】
（実施例１４）
クロストリジウム属細菌によって誘導されたＶｅｎｕｓ＋細胞が、ＳＰＦマウスの大腸におけるＶｅｎｕｓ＋細胞と同様の免疫制御性の機能を持つかどうかを確認した。すなわち、脾臓から単離したＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞（エフェクターＴ細胞、Ｔｅｆｆ細胞）を平底９６穴プレートに２ｘ１０４／ｗｅｌｌになるよう播種し、２ｘ１０４の３０Ｇｙ放射線照射処理を施した脾臓ＣＤ１１ｃ＋細胞（抗原提示細胞）、０．５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３抗体、及び多数のＴｒｅｇ細胞と共に３日間培養した。また最後の６時間は［３Ｈ］−チミジン（１μＣｉ／ｗｅｌｌ）を添加した状態で培養した。なお、実施例１４においてはＴｒｅｇ細胞として、Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスの脾臓から単離されたＣＤ４＋ＧＦＰ＋Ｔ細胞、又はクロストリジウム属細菌を定着させたＧＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウス若しくはＳＰＦ  Ｉｌ１０ｖｅｎｕｓマウスにおける大腸粘膜固有層のＣＤ４＋Ｖｅｎｕｓ＋Ｔ細胞を用いた。そして、［３Ｈ］−チミジンの取り込み量によって細胞の増殖を測定し、分当たり計数カウント（ｃｐｍ）の値で示した。
【０１４３】
図２９に示した結果から明らかなように、クロストリジウム属細菌を定着させたマウスのＶｅｎｕｓ＋ＣＤ４＋細胞は、インビトロでＣＤ２５−ＣＤ４＋活性型Ｔ細胞の増殖を抑制した。この抑制活性は、Ｆｏｘｐ３ｅＧＦＰレポーターマウスから単離されたＧＦＰ＋細胞のそれよりもわずかに劣るものであるが、ＳＰＦ  Ｉｌ１０Ｖｅｎｕｓマウスから単離されたＶｅｎｕｓ＋細胞のそれと同程度であった。したがって、クロストリジウム属に属する細菌は、十分に免疫抑制活性を有するＩＬ−１０発現性Ｔ細胞を誘導し、大腸における免疫恒常性を維持するのに重要な役割を果たしていることが明らかになった。
【０１４４】
（実施例１５）
次に、大量のクロストリジウムの定着、その結果として生じるＴｒｅｇ細胞の増殖による、局所性免疫応答への影響を調べた。
【０１４５】
＜デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導大腸炎モデル＞
先ず、前述の通りＤＳＳ誘導大腸炎モデルを作製し、そのモデルマウスにおいて、クロストリジウムの接種及びＴｒｅｇ細胞の増殖による影響を調べた。すなわち、コントロールマウス及びクロストリジウム接種マウスを２％ＤＳＳで処理して６日間、体重の減少、便の硬さ、及び出血を観察、測定し、点数をつけた。
また、６日目に大腸を回収し、解剖し、ＨＥ染色によって組織学的分析を行った。得られた結果を図４１〜４３に示す。なお図４１〜４３において、「ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．」又は「ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．♯１〜３」は、クロストリジウム定着マウスの糞便懸濁液を接種し、コンベンショナルな環境下で６週間飼育したＣ５７ＢＬ／６マウスの結果を示し、「ＳＰＦ」又は「ＳＰＦ♯１〜３」は、前記糞便懸濁液を接種せずにコンベンショナルな環境下で６週間飼育したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロールマウス）の結果を示す。また図４１中、縦軸「疾患スコア」は、前述の疾患活動性指数（ＤＡＩ）を示し、横軸「ポスト２％ＤＳＳ（ｄ）」は、マウスに最初に２％ＤＳＳを投与してからの経過日数を示す。さらに図４１中、＊は「Ｐ＜０．０２」であることを示し、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。また、ＤＳＳ誘導大腸炎モデルにおいて、制御性樹状細胞によって誘導されたＴｒｅｇ細胞は予防の役割を担っていることが知られている（Ｓ．Ｍａｎｉｃａｓｓａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９，８４９（Ａｕｇ  １３，２０１０）参照）。
【０１４６】
図４１〜４３に示した結果から明らかなように、大腸炎の症状、例えば体重の減少および直腸出血は、コントロールマウスと比較して、大量のクロストリジウムを有するマウス（以下、「クロストリジウム豊富マウス」とも称する）において有意に抑制されていた（図４１  参照）。また、大腸の短縮、浮腫、及び出血といった大腸の炎症における全ての典型的な特徴は、クロストリジウム豊富マウスと比較して、コントロールマウスにおいては顕著に認められた（図４２  参照）。さらに、ＤＳＳ処理クロストリジウム豊富マウスにおいては、コントロールマウスと比較して、粘膜びらん、浮腫、細胞浸潤、及び陰窩欠損といった組織学的特徴が軽減されていた（図４３  参照）。
【０１４７】
＜オキサゾロン（ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）誘導大腸炎モデル＞
次に、前述の通りオキサゾロン誘導大腸炎モデルを作製し、そのモデルマウスにおいて、クロストリジウムの接種及びＴｒｅｇ細胞の増殖による影響を調べた。すなわち、コントロールマウス及びクロストリジウム接種マウスをオキサゾロンに感作し、次いで１％オキサゾロン/５０％エタノール溶液によって直腸内を処理し、体重の減少を観察、測定した。また、大腸を解剖し、ＨＥ染色によって組織学的分析を行った。得られた結果を図４４及び４５に示す。なお図４４及び４５において、「ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．」は、クロストリジウム定着マウスの糞便懸濁液を接種し、コンベンショナルな環境下で６週間飼育したＣ５７ＢＬ／６マウス（クロストリジウム豊富マウス）の結果を示し、「ＳＰＦ」は、前記糞便懸濁液を接種せずにコンベンショナルな環境下で６週間飼育したＣ５７ＢＬ／６マウス（コントロールマウス）の結果を示す。また図４４中、縦軸「最初の体重に対する割合（％）」は、１％オキサゾロン投与前の体重を各々１００％とした際の該投与後の体重を示し、横軸「ポスト１％オキサゾロン（ｄ）」は、マウスに１％オキサゾロンを投与してからの経過日数を示す。また、オキサゾロンによって誘導される大腸炎は、Ｔｈ２型Ｔ細胞が介していることが知られている（Ｍ．Ｂｏｉｒｉｖａｎｔ，Ｉ．Ｊ．Ｆｕｓｓ，Ａ．Ｃｈｕ，Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８，１９２９（Ｎｏｖ  １６，１９９８）参照）。
【０１４８】
図４４及び４５に示した結果から明らかなように、コントロールマウスにおいては持続的な体重減少とともに大腸炎が進行した。一方、クロストリジウム豊富マウスにおいて体重減少は軽減されていた（図４４  参照）。また、クロストリジウム豊富マウスの大腸において、粘膜びらん、浮腫、細胞浸潤、及び出血といった組織学的疾患の部位は抑制されていることも明らかになった（図４５  参照）。
【０１４９】
（実施例１６）
次に、大量のクロストリジウムの定着、その結果として生じるＴｒｅｇ細胞の増殖による、全身性免疫応答（全身性ＩｇＥ産生）への影響を調べた。すなわち、前述の通り、アラムに吸着させた卵白アルブミン（ａｌｕｍ−ａｂｓｏｒｂｅｄ  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ＯＶＡ））を２週間間隔で２回投与することによって、コントロールマウス及びクロストリジウム接種マウスに免疫性を付与した。そして、これらマウスから血清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＯＶＡ特異的ＩｇＥのレベルを調べた。また、各々のグループのマウスから脾細胞を回収し、インビトロにおけるＯＶＡの再刺激によるＩＬ−４及びＩＬ−１０産生を調べた。得られた結果を図４６〜４８に示す。なお図４６〜４８において、「ＳＰＦ＋Ｃｌｏｓｔ．」は、クロストリジウム定着マウスの糞便懸濁液を接種し、コンベンショナルな環境下で飼育したＢＡＬＢ／ｃ  ＳＰＦ（クロストリジウム豊富マウス）の結果を示し、「ＳＰＦ」は、前記糞便懸濁液を接種せずにコンベンショナルな環境下で飼育したＢＡＬＢ／ｃ  ＳＰＦ（コントロールマウス）の結果を示し、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。また図４６中、縦軸「ＯＶＡ特異的ＩｇＥ（ｎｇ／ｍｌ）」は、血清におけるＯＶＡ特異的ＩｇＥの濃度を示す。さらに図４６中、横軸は、当該クロストリジウム豊富マウス又はコントロールマウス（４週齢）に最初にアラムに吸着させた卵白アルブミンを投与してからの経過日数を示し、「ＯＶＡ＋Ａｌｕｍ」はアラムに吸着させた卵白アルブミンを投与した時期を示す。また図４７及び４８中、横軸において「ＯＶＡ」はインビトロにおいてＯＶＡによる再刺激を施した結果を、「−」はインビトロにおいてＯＶＡによる再刺激を施さなかった結果を示す。さらに図４７及び４８中、縦軸において「ＩＬ−４（ｐｇ／ｍｌ）」及び「ＩＬ−１０（ｐｇ／ｍｌ）」は、脾細胞の培養上清におけるＩＬ−４濃度及びＩＬ−１０濃度を各々示す。
【０１５０】
図４６〜４８に示した結果から明らかなように、クロストリジウム豊富マウスにおいて、コントロールマウスと比較してＩｇＥレベルは有意に低かった（図４６  参照）。さらに、ＯＶＡ及びアラムで感作したクロストリジウム豊富マウスの脾細胞において、コントロールマウスのそれと比較して、ＯＶＡの再刺激によるＩＬ−４産生は低下し（図４７  参照）、ＩＬ−１０産生は増加した（図４８  参照）。
【０１５１】
従って、実施例１５に示した結果と併せて、大腸におけるクロストリジウムによるＴｒｅｇ細胞の誘導は、局所性及び全身性の免疫応答に重要な役割を担っていることが明らかになった。
（実施例１７）
次に、無菌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＧＦ  Ｂａｌｂ／ｃ）に、クラスター４に属するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム）３株（図４９に示すｓｔｒａｉｎ２２、２３及び３２）を定着させた。三週間後、大腸のＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞をＦＡＣＳにて分析した。得られた結果を図５０に示す。図５０に示した結果から明らかなように、クロストリジウム３株を定着させた純粋隔離群のマウスにおけるＴｒｅｇ細胞の誘導パターンは、無菌マウス（ＧＦマウス）と４６株全てを接種したマウスとの中間程度であった。
（実施例１８）
次に、マウスから得た糞便試料の芽胞形成画分同様に、ヒトから得た糞便試料の芽胞形成画分（例えば、クロロホルムに耐性を示す画分）が、制御性Ｔ細胞の増殖または集積を誘導する作用を有しているかどうかを調べた。
すなわち、健常被験者（日本人、男性、２９歳）から得たヒト糞便をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、クロロホルム（最終濃度：３％）と混合した。そして、３７℃の水浴中で６０分間振盪しながら培養した。窒素ガスで沸き立たせながらクロロホルムを留去した後、ヒト腸内細菌のクロロホルム耐性を示す画分（例えば、芽胞形成画分）を含むアリコートを、無菌（ＧＦ）マウス（ＩＱＩ、８週齢）に経口接種した。処理したマウスを３週間ビニルアイソレータの中で維持した。そして、大腸を採取し、長手方向に開裂して糞便内容物を洗い除去し、３７℃で２０分間、５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）中にて振盪した。上皮細胞及び脂肪組織を除去した後、大腸を細かく小切片にし、４％ウシ胎児血清、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤ、０．５ｍｇ／ｍｌディスパーゼ及び４０μｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅＩ（全てロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を含むＲＰＭＩ１６４０にて、３７℃の水浴中で１時間振盪しながらインキュベートした。消化した組織を５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＳで洗浄し、５ｍｌ  ４０％パーコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に再懸濁し、１５ｍｌファルコンチューブ中の２．５ｍｌ  ８０％パーコールの上に重層した。そして、２５℃、７８０ｇで２０分間遠心し、パーコール勾配分離を行った。境界面の細胞を回収し、ＰＢＳ、２％  ＦＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０９％  ＮａＮ３を含む染色バッファーに懸濁し、フィコエリシンで標識された抗ＣＤ４抗体（ＲＭ４−５、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、細胞表面のＣＤ４を染色した。また、細胞内Ｆｏｘｐ３の染色は、Ａｌｅｘａ６４７−で標識された抗Ｆｏｘｐ３抗体（ＦＪＫ−１６ｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）及びＦｏｘｐ３染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて行った。そして、ＣＤ４陽性リンパ球の細胞集団におけるＦｏｘｐ３陽性細胞の比率をフローサイトメトリーにて分析した。得られた結果を図５１及び５２に示す。
各図において、無菌マウス由来（ＧＦ）又はクロロホルム処理ヒト糞便を投与した無菌マウス由来（ＧＦ＋Ｃｈｌｏｒｏ．）のＣＤ４陽性リンパ球によるＦｏｘ３発現について、代表的なヒストグラム（図５１）及び総合したデータ（図５２）を示す。また、図５１中の数値はゲート中の細胞の割合を示す。図５２中の各丸は、個々の動物における結果を示し、エラーバーは標準偏差（ＳＤ）を示し、＊＊は「Ｐ＜０．００１」であることを示す。
図５１及び５２に示した結果から明らかなように、ヒト腸内細菌の芽胞形成（例えば、クロロホルムに耐性を示す）画分がＧＦマウスに定着した際に、当該マウスの大腸粘膜固有層において、Ｆｏｘ３＋制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の集積が誘導されることも明らかになった。
次に、クロロホルム処理ヒト糞便の投与によって、どのような細菌種が増殖しているのかを調べた。
すなわち、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ糞便ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、前述の健常被験者の糞便（ヒト糞便）又はクロロホルム処理ヒト糞便を投与した無菌マウス由来の糞塊（ＧＦ＋Ｃｈｌｏｒｏ．）から細菌のゲノムＤＮＡを単離した。定量的ＰＣＲ解析は、ライトサイクラー４８０（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて行った。相対量はデルタＣｔ法により算出し、総細菌量、試料の重量及び希釈を基準として求めた。また、下記プライマーセットを用いた。
総細菌
５’−ＧＧＴＧＡＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧ−３’  （配列番号：６２）及び
５’−ＴＡＣＧＧＣＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ−３’  （配列番号：６３）
クロストリジウムクラスター１４ａ（クロストリジウム  コッコイデス  亜群（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ））
５’−ＡＡＡＴＧＡＣＧＧＴＡＣＣＴＧＡＣＴＡＡ−３’（配列番号：６４）及び
５’−ＣＴＴＴＧＡＧＴＴＴＣＡＴＴＣＴＴＧＣＧＡＡ−３’（配列番号：６５）
クロストリジウムクラスター４（クロストリジウム  レプタム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｅｐｔｕｍ））
５’−ＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＴ−３’（配列番号：６６）及び
５’−ＣＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＴＴＧＴＣＡＡ−３’（配列番号：６７）
バクテロイデス
５’−ＧＡＧＡＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＣＣＡＣ−３’（配列番号：６８）及び
５’−ＣＧＣＴＡＣＴＴＧＧＣＴＧＧＴＴＣＡＧ−３’（配列番号：６９）
得られた結果を図５３に示す。
図５３に示した結果から明らかなように、クロロホルム処理ヒト糞便を投与したマウスにおいて、クロロホルム処理前のヒト糞便と比較して、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム）クラスター１４ａ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム）クラスター４等の芽胞形成細菌が大量に存在していることが示され、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（バクテロイデス）等の非芽胞形成細菌の著しい低下が示された。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】
以上説明したように、本発明によれば、クロストリジウム属に属する細菌または該細菌に由来する生理活性物質等を利用して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）の増殖や集積を誘導するための優れた組成物を提供することが可能となる。本発明の組成物は、免疫抑制作用を有するため、例えば、自己免疫疾患またはアレルギー疾患の予防または治療や臓器移植時などにおける免疫拒絶の抑制に利用することが可能である。また、健康食品などの飲食品として、健常者が日常的に容易に摂取して、免疫機能の改善を図ることもできる。
【配列表フリーテキスト】
【０１５３】
配列番号１〜２０、６２〜６９
＜２２３＞  人工的に合成されたプライマーの配列
配列番号２１〜〜６１
＜２２３＞  各々のクロストリジウム属細菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡコーディング遺伝子配列
【図４】
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【図９】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２９】
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【図３３】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【配列表】
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