(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞に、被検物質を接触させる工程、
（Ｂ）当該細胞におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で算出された発現量を、被検物質をＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を増加させる被検物質を皮膚光損傷の予防又は治癒剤として評価又は選択する工程、
を含む、皮膚光損傷の予防又は治癒剤の評価又は選択方法。
【請求項２】
ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞が、ヒト由来の皮膚線維芽細胞である請求項１記載の皮膚光損傷の予防又は治癒剤の評価又は選択方法。
【請求項３】
皮膚光損傷が長期ＵＶＢ照射により誘導される皮膚の光損傷である請求項１又は２記載の皮膚光損傷の予防又は治癒剤の評価又は選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚光損傷予防又は治癒剤の評価又は選択方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚光損傷は、表皮と真皮の両方における量的・質的変化をもたらすことが知られているが、真皮で起こる変化が広く知られている。すなわち、真皮の線維を作る細胞は、慢性的な太陽光線への露出とともに小さく且つ少なくなり、特にコラーゲン線維が大きく失われ、真皮の退化、皮下脂肪組織の減少等により皮膚の弾力性が失われたり、皮膚が弛緩したり、皮膚の表面が粗くなったりするなどの形状の変化が起こる。
斯かる光損傷皮膚のメカニズムを解明したり、光損傷に起因する皮膚トラブルの予防・治癒に有用な医薬品等を評価したりするためには、ヒトの光損傷皮膚をより忠実に反映できる系が有用である。
【０００３】
光老化は光損傷の結果もたらされるものであるが、そのモデル皮膚やモデル動物としては、紫外線へ暴露する系が最も汎用され、例えば、ヘアレスマウス背部皮膚やラットの足底の皮膚に紫外線を毎日、数週間連続照射する方法（非特許文献１，２）が知られている。しかし、皮下組織での動態も反映されるヒト皮膚そのものを用いるか、移植されたヒト皮膚を用いるのがより望ましいと考えられている。
【０００４】
ヒト皮膚を利用したモデルとしては、ヒト皮膚が移植されたヌードマウス（ＳＣＩＤマウス）に単回の紫外線照射を行う方法が知られている（非特許文献３）が、これは毎日、数週間紫外線を連続照射するモデル系ではなく、短期間での紫外線照射のため、ＵＶＢ長期照射によるヒト皮膚の光損傷状態を十分に観察することはできない。そこで、特定量のＵＶＢを特定時間連続照射することにより、光損傷に極めて近いヒト光損傷皮膚を備えたモデル動物が作成されている（非特許文献４）。
【０００５】
一方、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix metalloproteinase：ＭＭＰ）は、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン等細胞外マトリックスを分解する酵素であり、光損傷への関与が報告されている。光損傷皮膚においては、ＭＭＰ−１の不均衡が、プロコラーゲンの合成低下によるコラーゲンＩ、ＩＩＩの減少と、真皮でのコラーゲン分解を同時に引き起こすことが報告されている（非特許文献５）。また、光損傷が目立つ皮膚では表皮真皮接合部のコラーゲンＶＩＩ、ＩＶの減少が認められ、ヘアレスマウスを用いた実験において、ＵＶＢの反復的な照射がＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の産生を誘導し、コラーゲンＶＩＩ、ＩＶの分解を増大させることが報告されている（非特許文献６）。
【０００６】
ＭＭＰの活性は、ＴＩＭＰ（tissue inhibitor of metalloproteinases）により阻害されることが知られており、ＴＩＭＰは、活性型ＭＭＰと１：１で複合体を形成することにより阻害作用を発揮する。そのため、ＭＭＰ活性とＴＩＭＰ活性のバランスを正常化することが皮膚老化防止に有用であると考えられ、これまでに例えば、ムラサキ培養細胞抽出エキス、コーヒー酸重合体にＭＭＰ阻害作用があることが見出されている（特許文献１）。現在、ＴＩＭＰのタイプとしてはＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２、ＴＩＭＰ−３およびＴＩＭＰ−４が知られており、前記特許文献では、リソスペルミン酸にＴＩＭＰ−２活性増強作用を見出している。
また、特許文献２では、レチノールとシトステロールを組み合わせることにより、内在的老化に関連するＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の含有量を低下させること、及びＴＩＭＰ−１の含有量を増大させることが記載されているが、その実施例に示すデータでは、前記組み合わせにより必ずしもＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の含有量は低下しておらず、また同様に、ＴＩＭＰ−１の含有量も増大していない。また、当該特許文献２は、光損傷に関するものでもない。
【０００７】
ＴＩＭＰ−１に関しては、さらに、ＵＶＢの単回照射によりＴＩＭＰ−１のｍＲＮＡ発現量が上昇すること（非特許文献７）、一方で、ＵＶＢの単回照射ではＴＩＭＰ−１のタンパク発現量は変化しないことが報告されている（非特許文献８）。
しかしながら、これまでにＵＶＢの長期照射がＴＩＭＰ−１へ与える影響については全く知られていなく、皮膚光損傷とＴＩＭＰ−１との関連性についても知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−３１０８８号公報
【特許文献２】特開２０００−８６４８９号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bissett DL, Hannon DP, Orr TV, Photochem Photobiol. 46(3), 367-78 (1987）
【非特許文献２】Imayama S, Nakamura K, Takeuchi M, Hori Y, Takema Y, Sakaino Y, Imokawa G, J Dermatol Sci. 7(1), 32-8 (1994)
【非特許文献３】Del Bino S, Vioux C, Rossio-Pasquier P, Jomard A, Demarchez M, Asselineau D, Bernerd F, Br J Dermatol. 150(4), 658-67 (2004）
【非特許文献４】Hachiya A, et al., Am J Pathol, 174, 401 (2009)
【非特許文献５】Brennan M, et al., Photochem Photobiol 78, 43-48 (2003)
【非特許文献６】Contet-Audonneau JL, et al., Br J Dermatol 140, 1038-1047 (1999)
【非特許文献７】Brenneisen P, et al., Photochem Photobiol 64, 877-885 (1996)
【非特許文献８】Brenneisen P, et al., Biochem J 365, 31-40 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、皮膚光損傷を予防又は治癒する物質の評価又は選択方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、紫外線への暴露が少ない上腕内側部皮膚では、ＴＩＭＰｓのうちＴＩＭＰ−２の発現が少なかったのに対し、ヒト移植皮膚に長期ＵＶＢ照射を行って光損傷を誘導した皮膚では、ＴＩＭＰ−２及びＴＩＭＰ−３の発現には変化が認められず、ＴＩＭＰ−１の発現のみが顕著に減少することを見出した。さらに、ヒト移植皮膚にＵＶＢを照射した直後にＴＩＭＰ−１中和抗体を皮内投与すると、ヒト移植皮膚の表面粗さが増すことを見出した。これらのことから、ＴＩＭＰ−１が光損傷における表面形状変化の予防ならびに治癒等に関与しており、当該ＴＩＭＰ−１の産生増加作用を指標とすれば、皮膚の光損傷を予防又は治癒できる物質をより正確に評価又は選択できることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）：
（Ａ）ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞に、被検物質を接触させる工程、
（Ｂ）当該細胞におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を測定する工程、
（Ｃ）上記（Ｂ）で算出された発現量を、被検物質をＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞に接触させない対照群におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量と比較する工程、
（Ｄ）上記（Ｃ）の結果に基づいて、ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を増加させる被検物質を皮膚の光損傷予防又は治癒剤として評価又は選択する工程、
を含む、皮膚光損傷の予防又は治癒剤の評価又は選択方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、各種物質の、表面形状変化を代表とする皮膚光損傷に対する予防又は治癒効果を、より正確に且つ簡便に評価することができ、当該予防又は改善効果を有する物質をより正確に選択することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＴＩＭＰ−１中和抗体を皮内投与したヒト移植皮膚の表面形状変化を指標に、その中和抗体の光損傷に及ぼす影響を示す図である。上段：非特異的IgG投与、紫外線未照射群、中段：非特異的IgG投与、紫外線照射群、下段：TIMP-1中和抗体投与、紫外線照射群。
【図２】図２は、ＴＩＭＰｓのｍＲＮＡ発現を示す図である。Ａ）紫外線未照射上腕内側部皮膚におけるTIMPの発現量の相対比、Ｂ）ヒト移植皮膚における紫外線照射後の各TIMPの発現量変化。
【図３】図３は、皮膚光損傷の予防又は治癒剤のスクリーニング方法の概要を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において用いられるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞としては、哺乳動物の皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞、歯肉線維芽細胞等の線維芽細胞、軟骨滑膜細胞等が挙げられる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ等が挙げられる。これらの細胞は、初代培養のものでも継代を繰り返したあとのin vitro老化させた細胞であってもよく、また、胎児由来のものであっても老齢者由来のものであってもよい。また、これらの細胞は組織より公知の方法により採取して用いてもよく、又は市販品を購入して用いてもよい。このうち、ヒト由来の線維芽細胞が好ましく、ヒト由来の皮膚線維芽細胞がより好ましい。
【００１６】
当該細胞と被検物質との接触は、例えば被検物質を所定の濃度になるように予め培養液中に添加した後、細胞を培養液に載置すること、或いは、細胞が載置された培養液に、被検物質を所定の濃度になるように添加することにより行うことができる。
ここで、ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞の播種時の細胞濃度は、24wellプレートを使用した場合、0.5×103〜1.0×105cells/wellとするのが好ましく、特に1.0×103〜3.5×104 cells/wellとするのが好ましい。また、被物質の添加濃度は、0.00001〜10質量％（固形残分）とするのが好ましく、特に0.0001〜３質量％（固形残分）とするのが好ましい。
【００１７】
被検物質としては、直接的又は間接的に皮膚の光損傷に影響を与え得ることが予想される物質である限り、特に限定されない。例えば動植物抽出物、化合物、化学物質等を用いることができる。
【００１８】
ＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞を培養する培地は、当該細胞を培養できる常用の培地を用いることができ、例えば10％FBS含有Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium等が挙げられる。細胞継代、増殖時にはこれらの培地に、増殖因子、抗菌剤、インスリン、ハイドロコーチゾン等の増殖添加剤を添加することが好ましい。次いで、培養上清を回収してＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を測定する。
【００１９】
ＴＩＭＰ−１遺伝子の発現量の測定は、ｍＲＮＡレベルで検出する場合は、例えば細胞からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法、ＲＮＡ分解酵素プロテクションアッセイ法、或いはノーザンブロット解析法等を利用して、ＴＩＭＰ−１遺伝子から転写されたｍＲＮＡを検出定量すればよい。
【００２０】
また、ＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量の測定は、通常の免疫測定法により行うことができ、例えばＲＩＡ法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ、バイオアッセイ法、ウェスタンブロット等により行うことができるが、ウェスタンブロットが安価・簡便で望ましい。
【００２１】
皮膚光損傷の予防又は治癒剤の評価は、被検物質と接触させたＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質が発現可能な細胞におけるＴＩＭＰ−１遺伝子又はＴＩＭＰ−１タンパク質の発現量を、被検物質に接触させない対照群（対照細胞）における発現量と比較し、その発現量が増加した場合、被検物質には皮膚光損傷の予防又は治癒効果があると評価でき、斯かる物質を選択することができる。このようにして評価又は選択された物質は、例えば、皮膚の弾力性喪失、皮膚の弛緩、皮膚の表面粗さなどの表面形状変化に代表される皮膚光損傷を予防又は治癒するための医薬品等となり得る。
【実施例】
【００２２】
試験例１  ＴＩＭＰ−１中和抗体の皮内投与による移植皮膚の表面形状変化の検討
（１）severe combined immunodeficient（SCID）マウスへの腹部皮膚の移植
Cincinnati大学病院（Cincinnati、OH）におけるabdominoplasty手術由来の白人（Caucasian、41歳）女性の腹部皮膚を適当な大きさ（約2.0 cm×2.0 cm〜約3.0 cm×3.0 cm）にトリミングし、Phosphate Buffered Saline（PBS）で洗浄後、L-glutamineとantibiotic/antimycotic（Invitrogen）を含むDulbecco’s Modified Eagle’s Medium（DMEM）中に浸漬させて移植まで保存した。約１週間馴化した４〜６週齢の雌のSCIDマウス（Taconic、NY）の背部をCincinnati子供病院の動物施設（Children's Hospital Research Foundation、Cincinnati、OH）にて剃毛後、isofluorane/oxygen（3％/0.8 liter）を含む箱の中で麻酔した。その後isofluorane/oxygen（2%/0.7 liter）を吸引させながらマウス背部皮膚を切除し（直径約２−３cm）、ヒト腹部皮膚をマウス皮膚に縫合した。移植した腹部皮膚とマウス皮膚の境界にはsensorcaineを添加し、感覚脱失の処理を施した。移植後、マウスは１時間もしくは麻酔から覚めるまで37℃にて維持した。
【００２３】
（２）ヒト移植腹部皮膚への慢性的ＵＶＢ照射による光損傷の誘導並びにＴＩＭＰ−１中和抗体の皮内投与
移植腹部皮膚が完全に癒合した移植後10週間が経過した時点で、Hachiyaらが示す方法（Hachiya A, et al., Am J Pathol, 174, 401 (2009)）でヒト移植皮膚に光損傷を誘導した。すなわち、302 nm をピークとするUVBが照射されるフィルターがついたUVBランプ（34-0044-01 lamps、UVB、Upland、CA）を使用しての照射を開始した。UVBのエネルギー量はUV LIGHT METER、UV-340 MSR7000（Lutron Electronic Enterprise Co. ltd、 Taiwan）を用いて測定した。フィルターから移植皮膚表面までの距離は約30 cmを確保し、最初の１週間は１ minimal erythema dose（MED）に相当する40 mJ/cm2のUVBを照射した。３週目まで10 mJ/cm2ずつ照射量を増加し、その後６週目まで60 mJ/cm2の量を維持した。週に５日間照射したため、totalで1.65 J/cm2のUVBを照射したことになる。UVBを照射する間は、底面積約100 cm2の透明容器内をマウスが自由に動けるようにした。また、１日おきにUVBを照射した直後にＴＩＭＰ−１中和抗体の皮内投与を行った。投与濃度は、Reed MJ, et al., Microvasc Res, 65, 9 (2003)で用いられていた濃度の4倍量に相当する20μg/mLに設定した。
【００２４】
（３）結果
UVB照射により移植腹部皮膚上に誘導される形状の変化を視覚的に観察した。UVBを照射せずに非特異的なIgGを皮内投与した群（Figure１上段）においては、見た目上大きな変化は認められなかったのに対し、UVBを連続照射しながら非特異的なIgGを皮内投与した群では、４週間が経過した時点で皮膚の表面に粗い構造が観察され始め、６週間連続照射した時点ではそれが明瞭に形成されていた（Figure１中段）。一方、UVBを連続照射しながらＴＩＭＰ−１中和抗体を皮内投与した群（Figure１下段）では、UVBを連続照射しながら非特異的なIgGを皮内投与した群よりも早く、４週間連続照射した時点で、皮膚の表面が明らかに粗くなっていることが確認された。また、表面粗さと同様に顕著な落屑も観察された。
【００２５】
試験例２  皮膚におけるＴＩＭＰｓのｍＲＮＡの発現量の検討
（１）紫外線非照射皮膚の各ＴＩＭＰｓの発現
DallasのコントラクトラボラトリーであるStephens ＆Associates, Inc.（Carrollton, TX,）に依頼して、20代と50代の白人（Caucasian）女性の上腕内側部皮膚をパンチバイオプシーにより採取し、その一部から常法に従いTotal RNAを抽出した。cDNAを作製してから特異的なprobe及び7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて定量的なTIMP-1、TIMP-2及びTIMP-3の遺伝子発現解析を行った。遺伝子発現解析の内部標準として、RPLP0の発現を用いた。
【００２６】
（２）紫外線照射後の各ＴＩＭＰｓの発現
上記（１）で採取したヒト皮膚に対して６週間の連続照射（40〜60 mJ/cm2）を行ったが、その最終照射から24時間後にTotal RNAを抽出し、cDNAを作成してから特異的なprobe及び7300 Real Time PCR System（Applied Biosystems）を用いて定量的なTIMP-1、TIMP-2及びTIMP-3の遺伝子発現解析を行った。なお、内部標準には上記と同様にRPLP0の発現を用いた。
【００２７】
（３）結果
上腕内側部皮膚由来のTotal RNAを用いてTIMP-1、TIMP-2及びTIMP-3の相対的発現量を解析したところ、その発現比率は5：1：5（1：0.2：1）であった（Figure２Ａ）
また、光損傷モデル皮膚とUVB未照射の移植皮膚におけるTIMP-1、TIMP-2、TIMP-3の遺伝子発現量を比較したところ、TIMP-1の発現は慢性的なUVB照射による光損傷において顕著に減少するのに対し、TIMP-2、TIMP-3の発現は光損傷時においても変化は認められなかった（Figure２Ｂ）。
以上の結果から、ＴＩＭＰｓの中でもTIMP-1の顕著な発現減少がとりわけ光損傷の亢進に寄与しているものと考えられた。
【００２８】
試験例３  皮膚光損傷の予防又は治癒剤のスクリーニング
（１）方法
本スクリーニング方法の概要をFigure３に示した。すなわち、正常ヒト皮膚線維芽細胞を2×104 cells/wellの細胞密度で24wellプレートに播種し、0.5mLの10％FBS含有DMEM（Sigma）を用いて培養を開始した。その24時間後に0.5mLの血清不含培地に交換し、同時に被検物質として各種植物エキス（50％ EtOH抽出品）を添加した。エキスの添加濃度は0.001％(固形残分濃度)とし、コントロールとして、等量の50％ EtOHを添加したものを用いた。エキス添加から48時間後に、測定サンプルとして培地および細胞をそれぞれ回収した。培地は各wellよりそのまま回収後、12,000 rpmで２分間遠心し、その上清中のTIMP-1のタンパク質量をhuman TIMP-1 assay system（GEヘルスケア  バイオサイエンス（株））を用いて測定した。
また、各wellより培地を回収後、細胞を0.5 mLのPBSで２回洗浄し、0.1 N NaOHを125μL添加して５分程度室温で細胞を溶解させたものを細胞溶解液として回収した。この細胞溶解液のタンパク質量をBCA Protein Assay Kit (Pierce)を用いて測定することで、添加した各種植物エキスの毒性を評価した。
【００２９】
（２）結果
各種植物エキス（抽出溶媒50％ EtOH）のTIMP-1産生に対する効果について評価を行ったところ、シソエキス及びセイヨウハッカにおいて、TIMP−1タンパク質量がコントロール（対照群）に対する相対値で2.0倍以上増加していた（表１）。なお、コントロール（50％ EtOH添加）に対してタンパク質量比が0.5以下になるものは排除した。また、いずれの植物エキスにも細胞毒性はみられなかった。
シソエキスは、光老化防御剤として既に知られており（特開2002-104924号公報）、また、セイヨウハッカエキス（ペパーミント）は、コラゲナーゼ（MMP-1）阻害剤として知られている（特開2000-159631号公報）。
これらの結果から、ＴＩＭＰ−１の産生増加作用を指標として、皮膚の光損傷に対する予防又は治癒効果を有する物質を評価又は選択できることが確認された。
【００３０】
【表１】
0005513028.tif 000002
【図１】
0005513028.tif 000003
【図２】
0005513028.tif 000004
【図３】
0005513028.tif 000005