(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における少なくとも１つの形質の発現を調整する方法であって、
該植物による少なくとも１つのポリペプチドの発現を調整するステップを含み、
該ポリペプチドが、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
および
ii）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド
から成る群から選択され、
該ポリペプチドの発現の該調整が、該植物における少なくとも１つの形質の発現を調整し、かつ前記ポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を減少させるステップを含み、
植物における前記の少なくとも１つの形質が、草高、植物バイオマス、頂芽の発達、分枝、稔性、開花、葉面積、老化、種子発芽、種子収量、種子重量、茎の発達、穀粒収量、分げつ数、花分裂組織の発達、および根の発達のうちのいずれか１つから成る群から選択される、
前記方法。
【請求項２】
前記植物による少なくとも１つのポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを該植物の１つ以上の細胞に導入するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を減少させるポリヌクレオチドを前記植物の１つ以上の細胞に導入するステップを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
および
ii）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と９７．５％の配列同一性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの形質の前記調整が、前記ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、前記植物の分枝の増加、種子収量の増加、植物バイオマスの増加、穀粒収量の増加、分げつ数の増加、葉面積の増加、種子発芽の遅延、頂芽優勢の減少、遅咲き、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つから成る群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
単離されたポリヌクレオチドであって、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも１つの形質を調整するポリペプチドの発現を減少させることができる、ポリヌクレオチド、または
iii）ｉ）からii）のうちのいずれか１つに相補的なポリヌクレオチド、または
iv）ｉ）からii）のうちのいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換した宿主細胞を含む、植物、その部位もしくは種子、またはそれらから再生された繁殖性材料。
【請求項９】
（ａ）ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを提供するステップであって、該ポリペプチドが、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
および
ii）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド
から成る群から選択される、ステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の該ポリヌクレオチドで植物、植物部位、または植物細胞を形質転換するステップと、
（ｃ）形質転換した該植物、該植物部位、または該植物細胞を成長させて、該遺伝子導入植物を産生するステップと
を含む、遺伝子導入植物を産生する方法であって、
ステップ（ａ）における該ポリヌクレオチドが、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも１つの形質を調整するポリペプチドの発現を調整することができる、ポリヌクレオチド、または
iii）ｉ）からii）のうちのいずれか１つに相補的なポリヌクレオチド、または
iv）ｉ）からii）のうちのいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、単離されたポリヌクレオチド
を任意で含む、方法。
【請求項１０】
ステップ（ｃ）における前記成長が、前記の形質転換した植物、植物部位、または植物細胞の成長を可能にする条件下で、形質転換した該植物、該植物部位、または該植物細胞を培養することによるものであり、
該植物部位が、根、茎、葉、花芽、花、シュート、種子、および枝から成る群から任意で選択される、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子導入植物が、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草から成る群から選択される、請求項９〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子導入植物が、稔性植物を産生することができる、請求項９〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該植物バイオマス生産のための、請求項７に記載のポリヌクレオチドで形質転換した植物の使用法。
【請求項１４】
植物バイオマス生産が生物燃料生産のためである、請求項１３に記載の使用法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法によって産生され、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草から成る群から選択される遺伝子導入植物、またはその部位もしくは種子、または植物から再生されたその繁殖性材料。
【請求項１６】
稔性植物を産生することができる、請求項１５に記載の遺伝子導入植物、またはその部位もしくは種子、または植物から再生されたその繁殖性材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、草高、植物バイオマス、頂芽の発達、分枝、稔性、開花、葉面積、老化、種子発芽、種子収量、種子重量、茎の発達、穀粒収量、分げつ数、花分裂組織の発達、および根の発達等の植物における形質の発現の調整に関する。本発明はまた、植物における形質の発現の調整のための方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
従来の植物育種技術は、農作物の改良をもたらすことが知られている。選抜育種および交配等のこれらの技術は、種々の性質の子孫を生成するために、異なる遺伝的背景を有する植物に由来する遺伝子の交配を伴う。子孫は、望ましい形質を発現する植物を得るように選抜され、有害形質は、複数回の戻し交配または自殖によって除去され、望ましい性質を有する子孫を最終的に産生する。従来の育種方法は、種々の作物の性質を改善または改良するのに有用であることが分かっているが、これらの方法は、何百または何千もの遺伝子の交配を伴い、その中で、わずかな遺伝子のみが性質または形質の改良のために選抜される。さらに、これらの方法は、望ましい形質を得るために、子孫の大きい母集団から多数の系統を選抜し、数世代にわたってそれを戻し交配するため、何年もの交配を要する。従来の育種方法を使用して、他の形質に影響を及ぼすことなく１つの形質に対して選抜を行うことが通常困難であるため、一部の望ましくない形質も植物中に現れる可能性がある。
【０００３】
従来の植物選抜における別の欠点は、育種が性的適合性を有する植物に限定され、したがって、従来の育種方法は通常、特定の種の遺伝資源の遺伝的多様性の欠如によって制限されることである。さらに、従来の育種方法は、耐病性の増加等の多くのポリジーン形質を改良することに対して、どちらかと言えば効果がないことが分かっている。
【０００４】
近年、作物収量は大幅に向上したが、世界的需要を満たすために、主要食用作物の大幅な改良を実現する必要性が依然として存在する。作物における単一の導入遺伝子の発現に関する最近の植物バイオテクノロジーの進歩は、除草剤抵抗性、害虫抵抗性、およびウイルス抵抗性等の新しい植物形質の商業的導入の成功をもたらしてきた。しかしながら、重要な価値を有する単一の遺伝子形質のリストは比較的小さく、したがって、作物における単一の導入遺伝子の発現は、作物改良に対して実用的ではない。
【０００５】
近年、植物形態における効果を特徴付けるように、植物におけるＤＮＡ配列を化学的に修飾することが知られている種々の植物種におけるある遺伝子を単離する試みが行われてきた。既知の一方法は、ＤＮＡのメチル化を調節することが知られている鍵酵素である、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）遺伝子の単離を伴う。植物においてある形態学的変化は認められたが、どの表現型形質も、異なる植物における作物収量の改善において有意な利点を有することを示さなかった。ＳＡＨＨ遺伝子と下流分子との間の相互作用の複雑性によって、ＤＮＡメチル化および遺伝子発現が関与する機構は、十分に解明されておらず、したがって、作物改良のための既存の方法は限られている。
【０００６】
したがって、上記の欠点の１つ以上を克服するか、または少なくとも改善する新しい方法を提供する必要がある。作物改良ならびに別の商業的および科学的用途に有用な形質を有する植物を産生するための新しい方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明者らは、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達経路に関与する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを同定した。サイトカイニンは、特異的な生化学的および生理学的作用を提供するために、応答性植物細胞において作用する植物ホルモン（ｐｈｙｔｏｈｏｒｍｏｎｅ）（または植物ホルモン（ｐｌａｎｔ  ｈｏｒｍｏｎｅ））である。植物ホルモンは、最初に、植物成長および発達に重要な細胞性応答を刺激するために、ホルモンシグナルの伝達を開始する特異的受容体によって認識される。ホルモン受容体が、顕花植物からヒトに至る多くの真核生物において十分に研究されている一方で、植物ホルモン受容体の詳細な理解は不十分であった。植物ホルモン結合タンパク質は、そのような受容体の候補を提供するのではないかと見られている。
【０００８】
本発明者らは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現が減少した場合、単子葉植物種および双子葉植物種の両方における植物バイオマスおよび作物収量の著しい増加を確認してきた。対照的に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現の増加は、一部の植物において早咲きをもたらした。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現は、作物改良ならびに別の商業的および科学的用途に重要な望ましい形質を得るために操作することができる。
【０００９】
したがって、本発明の第１の態様によると、植物における少なくとも１つの形質の発現を調整する方法が提供され、方法は、植物による少なくとも１つのポリペプチドの発現を調整するステップを含み、
ポリペプチドは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１からアミノ酸７、アミノ酸９からアミノ酸２３０、アミノ酸１からアミノ酸５８、アミノ酸７７からアミノ酸４８５、アミノ酸５９からアミノ酸７６、アミノ酸１５０からアミノ酸１９１、アミノ酸２３１からアミノ酸４０５、およびアミノ酸４０６からアミノ酸４３８のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択され、
ポリペプチドの発現の調整は、植物における少なくとも１つの形質の発現を調整する。
【００１０】
一実施形態において、植物によるポリペプチドの発現は、ポリペプチドの発現を調整する少なくとも１つのポリヌクレオチドを植物の１つ以上の細胞に導入することによって調整される。
【００１１】
別の実施形態において、上記に定義された方法が提供され、ポリペプチドの発現を調整するステップは、ポリペプチドの発現を減少させるステップを含む。植物によるポリペプチドの発現を減少させるステップは、ポリペプチドの発現を減少させるポリヌクレオチドを、植物の１つ以上の細胞に導入するステップを含み得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から選択される、少なくとも１５個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも１５個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から成るポリヌクレオチドに相補的な核酸配列から選択される、少なくとも９個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド、および
ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチド、
から成る群から選択される。
【００１２】
一実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができるアミノ酸配列を、ポリペプチドが含む。別の実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができるアミノ酸配列を、ポリペプチドが含む。さらに別の実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができるアミノ酸配列を、ポリペプチドが含む。さらに別の実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができるアミノ酸配列を、ポリペプチドが含む。
【００１３】
一実施形態において、上記に定義された方法が提供され、ポリペプチドの発現を調整するステップは、ポリペプチドの発現を増加させるステップを含む。植物によるポリペプチドの発現を増加させるステップは、ポリペプチドの発現を増加させるポリヌクレオチドを、植物の１つ以上の細胞に導入するステップを含み得る。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１からアミノ酸７、アミノ酸９からアミノ酸２３０、アミノ酸１からアミノ酸５８、アミノ酸７７からアミノ酸４８５、アミノ酸５９からアミノ酸７６、アミノ酸１５０からアミノ酸１９１、アミノ酸２３１からアミノ酸４０５、およびアミノ酸４０６からアミノ酸４３８のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される。
【００１４】
ある実施形態において、ｉｉ）においてポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、ｉｉ）においてポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、細胞外サイトカイニン結合ドメインを含む。
【００１５】
一実施形態において、植物における少なくとも１つの形質は、草高、植物バイオマス、頂芽の発達、分枝、稔性、開花、葉面積、老化、種子発芽、種子収量、種子重量、茎の発達、穀粒収量、分げつ数、花分裂組織の発達、および根の発達のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択される。
【００１６】
一実施形態において、上記に定義されるポリペプチドの発現の減少は、ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、植物における分枝の増加、種子収量の増加、植物バイオマスの増加、穀粒収量の増加、分げつ数の増加、葉面積の増加、種子発芽の遅延、頂芽優勢の減少、および遅咲き、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、植物における形質の発現の変化をもたらす。
【００１７】
別の実施形態において、ポリペプチドの発現の増加は、ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の植物の早咲き、矮性、葉数の減少、早期老化、早期種子発芽、ロゼット葉形成の遅延および減少、実生根の成長の増加、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか１つ以上から成る群から選択される、少なくとも１つの形質を調整する。
【００１８】
植物バイオマスの増加は、葉菜の収量および品質の向上に有用である可能性がある。分枝およびバイオマス蓄積の増加はまた、まぐさおよび種々の穀物の産生にも有用である可能性がある。植物バイオマスの増加は、生物燃料源として使用することができる、豊富なセルロース系エタノール（バイオエタノール等）をもたらす可能性がある。
【００１９】
植物バイオマスの増加はまた、植物肥料のより効率的な施肥を促進すると期待されている。したがって、植物バイオマスの増加は、藻の異常発生等の種々の環境問題を引き起こし得る、肥料の流出等の環境問題を防止する可能性がある。
【００２０】
さらに、ポリペプチドの発現の増加は、サトウキビ等の植物の早咲きをもたらす可能性がある。これは、植物育種家が従来の植物育種を実施するのに役立ち得るため、市販品種に有用である可能性がある。同様に、ポリペプチドの発現の増加の結果としての矮性表現型はまた、観賞植物の生成に望ましい可能性がある。
【００２１】
第２の態様において、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から選択される、少なくとも１５個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも１５個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から選択される、少なくとも９個の連続した核酸残基
を含む、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド、および
ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも１つの形質を調整するポリペプチドの発現を減少させることができる、ポリヌクレオチド、または
ｖｉ）ｉ）からｖ）のうちのいずれか１つに相補的なポリヌクレオチド、または
ｖｉｉ）ｉ）からｖ）のうちのいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２２】
第３の態様によると、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１からアミノ酸７、アミノ酸９からアミノ酸２３０、アミノ酸１からアミノ酸５８、アミノ酸７７からアミノ酸４８５、アミノ酸５９からアミノ酸７６、アミノ酸１５０からアミノ酸１９１、アミノ酸２３１からアミノ酸４０５、およびアミノ酸４０６からアミノ酸４３８のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドをコードする核酸配列から成る、ポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも１つの形質を調整するポリペプチドの発現を増加させることができる、ポリヌクレオチド、または
ｖ）ｉ）またはｉｖ）のうちのいずれか１つに相補的なポリヌクレオチド、または
ｖｉ）ｉ）またはｉｖ）のうちのいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００２３】
第４の態様によると、第２または第３の態様に従ったポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００２４】
第５の態様によると、第２または第３の態様に従ったポリヌクレオチド、または第４の態様に従ったベクターで形質転換した宿主細胞が提供される。
【００２５】
第６の態様によると、第５の態様に従った宿主細胞を含む植物が提供される。
【００２６】
第７の態様によると、
ａ）ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを提供するステップであって、ポリペプチドは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１からアミノ酸７、アミノ酸９からアミノ酸２３０、アミノ酸１からアミノ酸５８、アミノ酸７７からアミノ酸４８５、アミノ酸５９からアミノ酸７６、アミノ酸１５０からアミノ酸１９１、アミノ酸２３１からアミノ酸４０５、およびアミノ酸４０６からアミノ酸４３８のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチド、および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド
から成る群から選択される、ステップと、
ｂ）ステップ（ａ）のポリヌクレオチドで植物、植物部位、または植物細胞を形質転換するステップと、
ｃ）形質転換した植物、植物部位、または植物細胞を成長させて、遺伝子導入植物を産生するステップと、
を含む、遺伝子導入植物を産生する方法が提供される。
【００２７】
一実施形態において、第７の態様のステップ（ａ）におけるポリヌクレオチドは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から選択される、少なくとも１５個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも１５個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から選択される、少なくとも９個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、ＲＮＡ干渉ポリヌクレオチド、および
ｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも１つの形質を調整するポリペプチドの発現を調整することができる、ポリヌクレオチド、または
ｖｉ）ｉ）からｖ）のうちのいずれか１つに相補的なポリヌクレオチド、または
ｖｉｉ）ｉ）からｖ）のうちのいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
別の実施形態において、第７の態様のステップ（ａ）におけるポリヌクレオチドは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１からアミノ酸７、アミノ酸９からアミノ酸２３０、アミノ酸１からアミノ酸５８、アミノ酸７７からアミノ酸４８５、アミノ酸５９からアミノ酸７６、アミノ酸１５０からアミノ酸１９１、アミノ酸２３１からアミノ酸４０５、およびアミノ酸４０６からアミノ酸４３８のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドをコードする核酸配列から成る、ポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも１つの形質を調整するポリペプチドの発現を増加させることができる、ポリヌクレオチド、または
ｖ）ｉ）またはｉｖ）のうちのいずれか１つに相補的なポリヌクレオチド、または
ｖｉ）ｉ）またはｉｖ）のうちのいずれか１つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００２９】
第７の態様に従った方法の一実施形態において、ステップ（ｃ）における成長は、形質転換した植物、植物部位、または植物細胞の成長を可能にし得る条件下で、形質転換した植物、植物部位、または植物細胞を培養することによる。ある実施形態において、植物部位は、根、茎、葉、花芽、花、シュート、種子、および枝のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択される。
【００３０】
一実施形態において、植物は単子葉植物である、第６の態様に従った植物が提供される。別の実施形態において、植物は双子葉植物である、第６の態様に従った植物が提供される。
【００３１】
ある実施形態において、植物は、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択される。
【００３２】
第８の態様によると、第７の態様に従った方法によって産生される場合の遺伝子導入植物が提供され、植物は、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択される。
【００３３】
一実施形態において、遺伝子導入植物は、稔性植物を産生することができる。
【００３４】
第９の態様によると、上記に定義される植物の部位または種子が提供される。部位は、根、茎、葉、花芽、花、シュート、種子、および枝のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択され得る。
【００３５】
第１０の態様によると、上記に定義される植物、または上記に定義される部位もしくは種子から再生された、植物またはその繁殖性材料が提供される。
【００３６】
第１１の態様によると、植物バイオマス生産のための、上記に定義されるポリヌクレオチドで形質転換した植物の使用法が提供される。ある実施形態において、植物は、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択される。
【００３７】
第１２の態様によると、植物バイオマス生産は、生物燃料生産のためである、第１１の態様に従った使用法が提供される。
【００３８】
第１３の態様によると、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１からアミノ酸７、アミノ酸９からアミノ酸２３０、アミノ酸１からアミノ酸５８、アミノ酸７７からアミノ酸４８５、アミノ酸５９からアミノ酸７６、アミノ酸１５０からアミノ酸１９１、アミノ酸２３１からアミノ酸４０５、およびアミノ酸４０６からアミノ酸４３８のうちのいずれか１つ以上から成る群から選択されるか、またはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択される単離されたポリペプチドが提供され、ポリペプチドの発現の調整は、植物における少なくとも１つの形質の発現を調整する。
【００３９】
定義
本明細書で使用される以下の用語は、以下に示される意味を有するものとする。
【００４０】
本明細書で使用される「連続した」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのそれぞれに存在する、連続的または途切れのない一連のアミノ酸残基または核酸残基を意味する。例えば、「連続したアミノ酸残基」は、少なくとも約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１２、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、もしくは約４００、約４５０、または約４８５個等のアミノ酸の連続したアミノ酸配列を含むと理解される。同様に、「連続した核酸残基」は、少なくとも約１２、約１５、約１８、約２１、約２４、約２７、約３０、約３６、約４５、約６０、約７５、約９０、約１２０、約１５０、約２２５、約３００、約４５０、約６００、約７５０、約９００、約１０５０、約１２００、約１３５０、約１４５０、約１５５０、約１６５０、または約１７７５個等のヌクレオチドの連続した核酸配列を含むと理解される。
【００４１】
「サイトカイニンシグナル伝達」という用語は、細胞膜を通じて細胞外シグナルを伝播して細胞内シグナルとさせる分子を意味する。次いで、このシグナルは、細胞性応答を刺激することができる。サイトカイニンシグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子は、典型的には、受容体および非受容体タンパク質キナーゼ、受容体および非受容体タンパク質ホスファターゼ、ならびに転写因子である。サイトカイニンシグナル伝達活性は、植物において発現されるサイトカイニンレベルを測定することによって、またはサイトカイニンとサイトカイニンシグナル伝達プロセスに関与するポリペプチド分子との間の結合活性を測定することによって測定することができる。
【００４２】
核酸に関連して使用される場合の「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが、非共有結合して安定した二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを意味する。「ハイブリダイゼーション」という用語はまた、三本鎖ハイブリダイゼーションを意味する場合もある。得られる二本鎖または三本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」である。安定したハイブリッドを形成するポリヌクレオチド集団の比率は、本明細書では「ハイブリダイゼーション度」と呼ばれる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、以下にさらに詳細に考察されるような、核酸間の相補性の度合い、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの熱融点（Ｔｍ）、および核酸内のＧ：Ｃ比等の因子によって決定される。
【００４３】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、プライマー伸長生成物の合成が開始される条件下で、すなわち４つのヌクレオチド三リン酸およびポリメラーゼが適切なバッファ（典型的には、ｐＨバッファおよび補助因子を含む）中に存在し、かつ適当な温度において、核酸テンプレートにアニールした場合にＤＮＡ合成の開始点として作用することができる、ヌクレオチドのポリマーを意味する。本発明の増幅ステップにおいて使用されるプライマーは、標的配列に完全に相補的または実質的に相補的であり得る。
【００４４】
「形質」および「表現型」という用語は、同じ意味で使用され、任意の性質、特に１つの植物を別の植物と区別する性質を包含する。例示的な形質には、草高、植物バイオマス、頂芽の発達の程度、分枝の程度、植物、種子または花粉の稔性、開花数または開花開始時、葉面積、老化開始時、種子発芽開始時、種子収量、全種子重量または個々の種子重量、茎の発達の程度、穀粒収量、分げつ数、花分裂組織の発達の程度、および根の発達の程度のうちのいずれか１つ以上が含まれる。
【００４５】
組織または植物に関連して使用される場合の「トランスジェニック」という用語は、それぞれ、導入遺伝子を包含する１つ以上の細胞を含む組織または植物か、またはそのゲノムが、導入遺伝子の導入によって変化した組織または植物を意味する。トランスジェニック細胞、組織、および植物は、本明細書に記載される方法等のヒトの介入による、核酸を含む「導入遺伝子」（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の標的細胞への導入、または導入遺伝子の標的細胞の染色体への組み込みを含むいくつかの方法によって産生され得る。
【００４６】
「実質的に」という用語は、「完全に」という意味を除外しておらず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要な場合は、「実質的に」という用語は、本発明の定義から省略され得る。
【００４７】
別途特定しない限り、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびにその文法上の変化形は、「オープン」または「包括的」語義を表し、それらが、記載された要素を含むだけではなく、さらなる記載されていない要素の包含も可能にするよう意図される。
【００４８】
本明細書で使用される、製剤の成分の濃度との関連における「約」という用語は、典型的には、記載された値の＋／−５％、より典型的には、記載された値の＋／−４％、より典型的には、記載された値の＋／−３％、より典型的には、記載された値の＋／−２％、さらに典型的には、記載された値の＋／−１％、さらに典型的には、記載された値の＋／−０．５％を意味する。
【００４９】
本開示全体にわたって、ある実施形態は、範囲の形式で開示される場合がある。範囲の形式での記載は、便宜および簡潔さを目的としているに過ぎず、開示された範囲の範囲に対する固定的な制限と解釈されるべきではないことは、理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲、およびその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるべきである。例えば、１〜６までの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。
【００５０】
ポリペプチド中のアミノ酸残基またはポリヌクレオチド中の核酸残基を説明する範囲との関連で、範囲の記載は、範囲の最初および最後の数値を含むことは理解されるべきである。これに関連してさらに、範囲の記載は、範囲内に入る個々のアミノ酸または核酸残基を包含するよう意図されていない。例えば、範囲の記載、例えば、「アミノ酸１からアミノ酸７」は、１位、２位、３位、４位、５位、６位、および７位におけるアミノ酸に及び、それらを含むが、その範囲内にあるいずれか１つ以上の個々のアミノ酸、例えば、アミノ酸１のみ、アミノ酸２のみ、アミノ酸１および２等を意味しないアミノ酸配列を指すとみなされるべきである。
[請求項101]
植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する方法であって、
該植物による少なくとも1つのポリペプチドの発現を調整するステップを含み、
該ポリペプチドが、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択され、
該ポリペプチドの発現の該調整が、該植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する、
方法。
[請求項102]
前記植物による少なくとも1つのポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを該植物の1つ以上の細胞に導入するステップを含む、請求項101に記載の方法。
[請求項103]
前記ポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を減少させるステップを含む、請求項101または102に記載の方法。
[請求項104]
前記植物による前記ポリペプチドの発現を減少させる前記ステップが、該ポリペプチドの発現を減少させるポリヌクレオチドを該植物の1つ以上の細胞に導入するステップを含む、請求項103に記載の方法。
[請求項105]
前記ポリヌクレオチドが、
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される少なくとも15個の連続した核酸残基を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成るポリヌクレオチドに相補的な核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、請求項104に記載の方法。
[請求項106]
前記ポリペプチドが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列相同性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項101に記載の方法。
[請求項107]
前記ポリペプチドが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも85%の配列相同性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項101から106のうちのいずれか1項に記載の方法。
[請求項108]
前記ポリペプチドが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列相同性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項101から106のうちのいずれか1項に記載の方法。
[請求項109]
前記ポリペプチドが、
SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも95%の配列相同性を有し、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、請求項101から106のうちのいずれか1項に記載の方法。
[請求項110]
前記ポリペプチドの発現を調整する前記ステップが、該ポリペプチドの発現を増加させるステップを含む、請求項101または102に記載の方法。
[請求項111]
前記植物による前記ポリペプチドの発現を増加させる前記ステップが、該ポリペプチドの発現を増加させるポリヌクレオチドを該植物の1つ以上の細胞に導入するステップを含む、請求項110に記載の方法。
[請求項112]
前記ポリヌクレオチドが、
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7 、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド
から成る群から選択される、請求項111に記載の方法。
[請求項113]
植物における前記の少なくとも1つの形質が、草高、植物バイオマス、頂芽の発達、分枝、稔性、開花、葉面積、老化、種子発芽、種子収量、種子重量、茎の発達、穀粒収量、分げつ数、花分裂組織の発達、および根の発達のうちのいずれか1つから成る群から選択される、請求項101から112のうちのいずれか1項に記載の方法。
[請求項114]
少なくとも1つの形質の前記調整が、前記ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、前記植物の分枝の増加、種子収量の増加、植物バイオマスの増加、穀粒収量の増加、分げつ数の増加、葉面積の増加、種子発芽の遅延、頂芽優勢の減少、遅咲き、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか1つから成る群から選択される、請求項103に記載の方法。
[請求項115]
少なくとも1つの形質の前記調整が、前記ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、前記植物の早咲き、矮性、葉数の減少、早期老化、早期種子発芽、ロゼット葉形成の遅延および減少、実生根の成長の増加、またはこれらの組み合わせのうちのいずれか1つから成る群から選択される、請求項110に記載の方法。
[請求項116]
単離されたポリヌクレオチドであって、
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を減少させることができる、ポリヌクレオチド、または
vi)i)からv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vii)i)からv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチド。
[請求項117]
単離されたポリヌクレオチドであって、
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、および
iv)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列から成る、ポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を増加させることができる、ポリヌクレオチド、または
v)i)からiv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vi)i)からiv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、
単離されたポリヌクレオチド。
[請求項118]
請求項116または117のうちのいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[請求項119]
請求項118に記載のベクターで形質転換した宿主細胞。
[請求項120]
請求項119に記載の宿主細胞を含む、植物。
[請求項121]
遺伝子導入植物を産生する方法であって、
(a)ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを提供するステップであって、該ポリペプチドが、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド
から成る群から選択される、ステップと、
(b)ステップ(a)の該ポリヌクレオチドで植物、植物部位、または植物細胞を形質転換するステップと、
(c)形質転換した該植物、該植物部位、または該植物細胞を成長させて、該遺伝子導入植物を産生するステップと
を含む、方法。
[請求項122]
ステップ(a)における前記ポリヌクレオチドが、
i)SEQ ID NO:15に示される核酸配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、および
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも15個の連続した核酸残基
を含む、アンチセンスポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から選択される、少なくとも9個の連続した核酸残基
を含む核酸配列を含む、RNA干渉ポリヌクレオチド、および
v)SEQ ID NO:15に示される核酸配列から成る、アンチセンスポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を調整することができる、ポリヌクレオチド、または、
vi)i)からv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vii)i)からv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、単離されたポリヌクレオチド
を含む、請求項121に記載の方法。
[請求項123]
ステップ(a)における前記ポリヌクレオチドが、
i)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、前記植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、該植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、
iv)SEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする核酸配列から成る、ポリヌクレオチドであって、
植物における少なくとも1つの形質を調整するポリペプチドの発現を増加させることができる、ポリヌクレオチド、または、
v)i)からiv)のうちのいずれか1つに相補的なポリヌクレオチド、または
vi)i)からiv)のうちのいずれか1つにストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ポリヌクレオチド、
から成る群から選択される、単離されたポリヌクレオチド
を含む、請求項121に記載の方法。
[請求項124]
ステップ(c)における前記成長が、前記の形質転換した植物、植物部位、または植物細胞の成長を可能にする条件下で、形質転換した該植物、該植物部位、または該植物細胞を培養することによる、請求項121〜123のうちのいずれか1項に記載の方法。
[請求項125]
前記植物部位が、根、茎、葉、花芽、花、シュート、種子、および枝から成る群から選択される、請求項121〜124のうちのいずれか1項に記載の方法。
[請求項126]
単子葉植物または双子葉植物である、請求項120に記載の植物。
[請求項127]
オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草から成る群から選択される、請求項120または126に記載の植物。
[請求項128]
植物が、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草から成る群から選択される、請求項121〜125のうちのいずれか1項に記載の方法によって産生される遺伝子導入植物。
[請求項129]
植物が、稔性植物を産生することができる、請求項121〜125のうちのいずれか1項に記載の方法によって産生される遺伝子導入植物。
[請求項130]
請求項126〜129のうちのいずれか1項に記載の植物の部位または種子。
[請求項131]
根、茎、葉、花芽、花、シュート、種子、塊茎、実、および枝から成る群から選択される、請求項130に記載の部位。
[請求項132]
請求項126〜129のうちのいずれか1項に記載の植物、または請求項130もしくは131に記載の部位または種子から再生された、植物またはその繁殖材料。
[請求項133]
植物バイオマス生産のための、請求項116または117に記載のポリヌクレオチドで形質転換した植物の使用法。
[請求項134]
前記植物が、オートムギ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、イネ、ソルガム、キビ、アマランス、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草から成る群から選択される、請求項133に記載の使用法。
[請求項135]
前記植物バイオマス生産が、生物燃料生産のためである、請求項133または134に記載の使用法。
[請求項136]
単離されたポリペプチドであって、
i)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ii)SEQ ID NO:1のアミノ酸1からアミノ酸7、アミノ酸9からアミノ酸230、アミノ酸1からアミノ酸58、アミノ酸77からアミノ酸485、アミノ酸59からアミノ酸76、アミノ酸150からアミノ酸191、アミノ酸231からアミノ酸405、およびアミノ酸406からアミノ酸438のうちのいずれか1つ以上から成る群から選択されるかまたはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
iii)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および、
iv)SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択される、単離されたポリペプチドであって、
該ポリペプチドの発現の該調整が、該植物における少なくとも1つの形質の発現を調整する、単離されたポリペプチド。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
添付図面は、開示された実施形態を図示し、開示された実施形態の原理を説明する上で役立つ。しかしながら、図面は、本発明の制限の定義としてではなく、説明目的のみに設計されていることは理解されるべきである。
【図１】等温滴定熱量計、ＨＯＧ１局在化、および発現解析の結果を示す図である。Ａ）サイトカイニン結合アッセイは、ＩＴＣを用いて実行した。上部のパネルは、２μＭの精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１を含むサンプル細胞への０．１μＭのゼアチンの注入から得られたベースラインドリフトに補正された生の熱データを示す。下部のパネルは、ＨＯＧ１に添加されるゼアチンのモル比に対して熱ピーク面積プロットすることによって作成された結合等温線を示す。差し込み図は、遺伝子導入植物からの精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質（６０ｋＤａ）を示す。Ｂ）ゼアチンに対するのと同様に実行した、尿素由来の合成サイトカイニン、チジアズロンを用いたアッセイ。Ｃ）ＨＯＧ１−サイトカイニン結合は、２：１の化学量論で吸熱性を有する。ＫＤ値は、試験された３つのサイトカイニン、すなわち、ゼアチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、および２−イソペンテニルアデニン（２ｉＰ）に対して、１６．９ｎＭから２０．６ｎＭに及んだ。アデニンおよびＮＡＤ＋に対するＫＤ値はそれぞれ、２．１μＭおよび３９．５μＭであり、ＨＯＧ１のサイトカイニン特異性を示した。Ｄ）ＧＦＰ−ＨＯＧ１融合タンパク質を発現するトランスジェニック系統は、融合タンパク質がその機能を保持することを示す３５Ｓ：ＨＯＧ１系統と同一の表現型を示した。Ｅ）ＧＦＰ−ＨＯＧ１融合タンパク質は、原形質膜に局在した。生きた実生根細胞の画像化は、５０５から５３０ｎｍバンドパスフィルタセットと組み合わせた４８８ｎｍアルゴンレーザーを有する共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＣＬＳＭ  ５１０）を使用して実行した。差し込み図は、単一細胞において、タンパク質が原形質膜に局在することを示す。Ｆ）ＨＯＧ１の発現の定量リアルタイムＰＣＲ分析は、遺伝子が、検査された全植物部位において構成的に発現されることを示した。
【図２】定量リアルタイムＰＣＲによる、シロイヌナズナの過剰発現およびアンチセンス抑制系統におけるＨＯＧ１の発現解析を示す図である。Ａ）８つの独立した過剰発現系統は、野生型と比較して、ＨＯＧ１転写レベルにおいて３から２０倍の増加を示した。Ｂ）およびＣ）リアルタイムＰＣＲ分析のために使用された過剰発現系統の表現型は、転写レベルが変化するにもかかわらず同型であった。Ｄ）ＨＯＧ１アンチセンス抑制系統は、野生型と比較して、転写物の発現量において２から１０倍の減少を示した。Ｅ）およびＦ）発現解析に使用された８つのアンチセンス系統の開花時期表現型は、ＨＯＧ１転写物の抑制レベルと直接関係していた。Ｇ）、Ｈ）、Ｉ）、およびＪ）ＯＥ系統６および２つのＷＴ植物の３つの個々の苗は、４週間にわたって１日おきにゼアチン（０．０１μＭ）を噴霧され、外から与えられたサイトカイニンが、ＷＴと同一齢までＯＥ系統における開花を遅延させることができるかどうかを見た。Ｇ）ゼアチンを噴霧されたＯＥ植物は、対照ＯＥ系統（ゼアチンなし）と比較して抽薹の遅延を示したが、Ｉ）対照ＯＥ系統は、４ロゼット葉期において抽薹する。Ｈ）ゼアチンを噴霧されたＯＥ植物は、ＷＴ植物とほぼ同一齢の６から７葉期に到達して初めて抽薹を示し、外から与えられたサイトカイニンによるＯＥ系統の救出を示す。Ｊ）ＯＥ系統の対照固体（ゼアチン噴霧なし）は、完全に開花し、この期におけるそれらの最大限度まで成長した。
【図３】ＨＯＧ１過剰発現（ＯＥ）、アンチセンス抑制（ＡＳ）、および野生型（ＷＴ）植物の表現型を示す図である。Ａ）ＨＯＧ１  ＯＥ系統は、ＷＴがまだ開花を開始していない時に、４枚のロゼット葉のみを成長させた時に開花を示す。Ｂ）ＨＯＧ１のＡＳ系統は、ＷＴが、花序を十分に成長させた時に遅咲き（抽薹時における１４葉期）を示した。Ｃ）ＯＥ、ＷＴ、およびＡＳ系統の成熟時の表現型の比較。ＷＴと比較して、発芽後３０日目に、ＯＥ系統の全体的な成長遅延およびＡＳ系統の大量分枝表現型が見られた。Ｄ）ＷＴおよびＯＥ系統と比較した、ＡＳ系統におけるロゼット葉の大きさの増加。Ｅ）長角果の大きさは、ＷＴのものと比較してＡＳ系統において増加したが、ＯＥ系統においては有意に減少した（スケールバー＝１ｃｍ）。Ｆ）オーキシンインドール酪酸（０．２μｇ／ｍｌ）の存在下での、種々の濃度の外因性サイトカイニン（ゼアチン）へのカルスの反応。ＡＳ系統からのカルスは、３週間の培養後に、強いサイトカイニン非感受性表現型、すなわち、細胞増殖の弱刺激および不定芽誘導の不足を示した。ＯＥ系統からのカルスは、ＷＴのものと同様に反応し、すなわち、両方は、通常のカルス成長および不定芽誘導を示し、ＨＯＧ１が、サイトカイニンの正の調節因子であることを示した。Ｇ）ＯＥ、ＷＴ、およびＡＳ系統のおけるサイトカイニンレベルの定量化。内在性サイトカイニンは、イソペンテニルアデノシンおよびゼアチンリボシド検出キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して、モノクローナル抗体ｉＰＡおよびＺＲを用いた免疫測定法によって定量化した。所与の値は、３つの独立した抽出からの３つの複製の平均±標準偏差を表す。測定されたサイトカイニンは、イソペンテニルアデニン（ｉＰ）、イソペンテニルアデノシン（ｉＰＡ）、ゼアチン（Ｚ）、およびゼアチンリボシド（ＺＲ）である。Ｈ）種々の系統からの、また精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質による、アデノシル ホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）活性の分光光度アッセイ。ＷＴ、ＯＥ、およびＡＳ系統からの粗タンパク質抽出物においては、活性の有意差は認められなかったが、精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質は、測定可能なＳＡＨＨ活性を欠いている。
【図４】選択されたサイトカイニン応答性遺伝子およびＨＯＧ１−ＡＨＰ１の相互作用の定量リアルタイムＰＣＲ分析を示す図である。苗は、３つ独立したアンチセンス抑制（ＡＳ１、ＡＳ８、ＡＳ２１）および過剰発現（ＯＥ１，ＯＥ１２、ＯＥ１８）系統から、いくつかの時間間隔（５分、１５分、３０分、および１時間）で、０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、または５μＭのベンジルアデニン（ＢＡ）でのパルス処理前後に、ＲＮＡ抽出のために採取した。ＢＡの添加は、ＫＮＡＴ１およびＳＴＭ転写物の用量依存的な増加をもたらした。ＡＳ系統が、ＫＮＡＴ１およびＳＴＭ（メリステム機能に関与するホメオボックス遺伝子）の上方制御を示した一方で、ＯＥ系統は、外因性ＢＡの非存在下で、これらの２つの遺伝子の下方制御を示した。１時間後に５μＭのＢＡによって、ＫＮＡＴ１およびＳＴＭの発現は２倍未満の変化を示し、ＷＴのものと比較して有意差ではない。Ｂ）ＡＲＲ４およびＡＲＲ６（サイトカイニンによって誘導されるＡ型応答調節因子）もまた、発現量において同様の傾向を示す。Ｃ）ＴＡＰ−ＨＯＧ１複合体の精製。３５ＳｒＴＡＰ−ＨＯＧ１植物（レーン１）からの、またＰｒｏｔＡおよびＣＢＰタグに対する親和性カラムを使用した精製後に抽出された全タンパク質は、Ｎ末端配列決定によってＡＨＰ１であると確認された約２４ｋＤａバンド（アスタリスク）（レーン２）の同定をもたらした。ＰｒｏｔＡタグに対する抗体でプローブされた全タンパク質のウエスタンブロットは、ＴＡＰ−ＨＯＧ１に対応する７１ｋＤａバンドの存在を示した。Ｄ）組み換えＡＨＰ１精製のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法。ＡＨＰ１は、大腸菌における６Ｈｉｓおよびチオレドキシンタグで発現した。レーン１は、全細胞溶解物を有し、タグを有する精製されたＡＨＰ１は、レーン２にある。Ｅ）ＴＡＰ−ＨＯＧ１およびＡＨＰ１の相互作用は、ＩＴＣを用いて実行した。Ｅ）の上部のパネルは、２μＭの精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１を含むサンプル細胞への０．１μＭの精製されたＡＨＰ１の注入から得られたベースラインドリフトに補正された生の熱データを示す。下部のパネルは、ＨＯＧ１に添加されるＡＨＰ１のモル比に対して熱ピーク面積をプロットすることによって作成された結合等温線を示す。ＴＡＰ−ＨＯＧ１およびＡＨＰ１の結合は、２３．８ｎＭのＫＤ値で吸熱性を有する。
【図５】ＨＯＧ１を介するサイトカイニンシグナル伝達経路の略図である。サイトカイニンシグナルは、原形質膜においてＨＯＧ１によって感受される。ＨＯＧ１二量体は、ＡＨＰ１を通じてシグナル伝達カスケードを開始し、Ｂ型ＡＲＲ（例えば、ＡＲＲ１、ＡＲＲ２）およびＡ型ＡＲＲ（例えば、ＡＲＲ４、ＡＲＲ５）と相互作用し得る。
【図６】相同体を有するＨＯＧ１の多重配列アラインメントを示す図である。ＨＯＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の推定アミノ酸配列は、ペチュニア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、タバコ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）、オリザサティバ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、トリチカムエスチバム（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、およびヒト（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）からのＳＡＨＨ配列と整列させた。ＳＡＨＨの２つの保存特性は、ボールド体である。ＳＡＨＨの第２の特性において、ジヌクレオチド結合ドメインを表す３個の保存グリシン残基は、下線が引かれている。７（ＨＯＧ１の１〜７位）アミノ酸のＮ末端伸張および４１アミノ酸（ＨＯＧ１の１５０〜１９１位）の付加的伸張、ならびにヘリックス膜貫通領域（ＨＯＧ１の５９〜７６位）は、イタリック体である。
【図７】ＨＯＧ１の野生型（ＷＴ）、過剰発現（ＯＥ）、およびアンチセンス抑制（ＡＳ）系統へのサイトカイニンの外からの添加の効果を示す図である。ＯＥ系統６およびＡＳ系統１２の３つの個々の苗に、４週間にわたって１日おきにゼアチンまたはキネチン（０．０１μＭ）を噴霧した。２つのＷＴ植物を、比較のために同様に処理した。Ａ）およびＣ）ゼアチンおよびキネチンを噴霧されたＯＥ系統６の３つの個体は、成長の４葉期において対照ＯＥ系統と比較して、いかなる抽薹も示さなかった。Ｅ）４葉期において、対照ＯＥ系統は抽薹した。Ｂ）およびＤ）ゼアチンおよびキネチンを噴霧されたＯＥ系統６の３つの個体はそれぞれ６〜７葉期に到達して初めて抽薹を示す。これは、外から与えられたサイトカイニンによるＯＥ系統の部分的な救出を示す。Ｆ）ＯＥ系統６の対照個体は、この期において成熟している。Ｇ）、Ｈ）、Ｉ）、Ｊ）、およびＫ）サイトカイニン噴霧を受けたＡＳ系統は、対照ＡＳ系統と比較して表現型においていかなる有意差も示さなかった。これは、過剰発現ＨＯＧ１が、内在性サイトカイニン含有量（表１に示されるような）減少、したがって、表現型の減少をもたらすことを示す（パネルＡ、Ｂ、Ｅ、およびＦは、パネルＧ、Ｈ、Ｉ、およびＪとして主要な図２中にあり、これらは、比較を簡単にするためのみにここに含まれることに留意されたい）。
【図８】トランスジェニックシロイヌナズナ植物体を示す図である。（ａ）ＨＯＧ１の過剰発現（ＯＥ）を有するシロイヌナズナの苗は、抽薹の促進を示したが、ＨＯＧ１のアンチセンス抑制（ＡＳ）は、約３週目において、野生型（ＷＴ）対照と比較して遅咲きをもたらした。（ｂ）野生型（ＷＴ）と比較した、ＯＥ（０Ｅ８、ＯＥ１２）およびＡＳ（ＡＳ８、ＡＳ２１）の２つの独立したトランスジェニック系統それぞれの成熟した植物を、発芽後３０日目に写真撮影した。ＡＳ系統の花序は大量に分枝し、バイオマスは、ＯＥおよびＷＴ植物と比較して有意に高かった。（ｃ）葉面積、（ｄ）ＡＳ系統の長角果の長さおよび種子（パネルｆに挿入）は、ＯＥおよびＷＴのものよりも有意に高かった。（ｅ）（ｄ）中の植物におけるＨＯＧ１転写物の発現量のリアルタイム定量ＰＣＲ分析。（ｆ）１長角果当たりの葉面積、種子重量、種子数、およびサイトカイニンイソペンテニルアデニンの内因性濃度の定量化は、値がそれぞれ、ＡＳでもっとも高く、次にＷＴおよびＯＥ系統が続いたことを示した。
【図９】修飾されたＯｓＣＢＰレベルをもたらす過剰発現（ＯＥ）またはアンチセンス抑制（ＡＳ）におけるシロイヌナズナＨＯＧ１ｃＤＮＡを有するトランスジェニックイネ（オリザサティバジャポニカ種日本晴）植物を示す図である。（ａ）発芽の約４週間後の分げつ開始時のＯＥおよびＡＳ系統の苗。（ｂ）発芽後約９０日目のＯＥおよびＡＳ系統の成熟した植物。ＡＳ系統は、大量分げつおよびバイオマスの増加を示すが、ＯＥ植物は、ＷＴと比較して矮性のままであった。（ｃ）ＯＥ、ＷＴ、ＡＳ、および共抑制（ＣＳ）の抜根された成熟した植物は、ＡＳおよびＣＳ植物が、１植物当たり同等に高い分げつ数を有したことを示した。（ｄ）ＣＳ植物は、地上節からの分枝を示し、１植物当たりの円錐花序数の全体的増加をもたらした。（ｅ）ＯＥ系統の円錐花序は、別の系統のものと比較して有意に小さかった。（ｆ）ＷＴにおけるＯｓＣＢＰ転写物の発現量、ＯＥ系統（Ｓ−２Ｌ、Ｓ−９Ｔ）における導入されたシロイヌナズナのＨＯＧ１転写レベル、ＣＳ（ＣＳ−４Ｔ、ＣＳ−Ｉ）およびＡＳ（ＡＳ−１Ｓ−２、ＡＳ−４Ｓ−２）系統における内在性ＯｓＣＢＰ転写レベルの減少のリアルタイム定量ＰＣＲ分析。（ｇ）１植物当たりの分げつ数、円錐花序、葉面積、生重量、および全種子数の定量化は、測定されたパラメータが、ＷＴと比較してＡＳおよびＣＳ系統において有意に高かったことを示し、シロイヌナズナからの観察と一致している。
【図１０】（ａ）ＨＯＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＰＥＴＣＢＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、およびＯｓＣＢＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の多重アラインメントを示す。ＰＥＴＣＢＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびＯｓＣＢＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、８８％の相同性を示した。ＨＯＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＯｓＣＢＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、ＰＥＴＣＢＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびＨＯＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に対する８８％の相同性と比較して、９０％の相同性を示した。（ｂ）ＯｓＣＢＰゲノムｂｌａｓｔは、染色体１１（Ｏｓ１１ｇ０４５５５００）上にその存在を示し、イネゲノムにおける単一コピーであることを示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。
【図１１】ＩＴＣを用いて実行したサイトカイニン結合アッセイの結果を示す図である。上部のパネルは、２μＭの精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１を含むサンプル細胞への０．１μＭのベンジルアデニンの注入から得られたベースラインドリフトに補正された生の熱データを示す。下部のパネルは、ＨＯＧ１に添加されるベンジルアデニンのモル比に対して熱ピーク面積をプロットすることによって作成された結合等温線を示す。
【図１２】シロイヌナズナＨＯＧ１の過剰発現（ＯＥ）、またはシロイヌナズナＨＯＧ１によって誘導されたＯｓＣＢＰのアンチセンス抑制（ＡＳ）を有する、トランスジェニックイネ（オリザサティバジャポニカ種日本晴）植物の表現型を示す図である。（ａ）共抑制効果を有するＯＥ系統（パネルの右側、左側には対照）は、１植物当たりの分げつ数の増加を示す。（ｂ）成熟時のＡＳ、野生型（ＷＴ）、および共抑制（ＣＳ）系統。ＡＳおよびＣＳ系統は、ハイブリッド親系統（ＷＴ）と比較して、１植物当たりより多くの分げつ数（分枝）を示す。（ｃ）ＷＴおよびＡＳ系統の種子の大きさに有意差はない。種子の大きさの多少の減少が、ＷＴと比較してＯＥにおいて認められた。（ｄ）および（ｅ）Ｔ１世代におけるＯＥおよびＡＳ系統のサザンブロット。（ｄ）第１レーンは、マーカーである。レーン２から１１は、独立したＯＥ系統である。レーン２（ＯＥ系統Ｓ１）、レーン５（ＯＥ系統４）、およびレーン８（ＯＥ系統７）は、単一挿入を示す。レーン４（ＯＥ系統３）、レーン７（ＯＥ系統６）、レーン９（ＯＥ系統９）、レーン１０（ＯＥ系統１０）、およびレーン１１（ＯＥ系統１１）が、二重挿入を示すのに対し、レーン３（ＯＥ系統２）およびレーン６（ＯＥ系統５）は、それぞれ３つの挿入を示す。（ｅ）レーン２（系統ＡＳ１）、レーン３（系統ＡＳ２）、レーン４（系統ＡＳ３）、およびレーン６（系統ＡＳ５）は、単一挿入を示す。レーン５（系統ＡＳ４）は、二重挿入を示す。各レーンに対して、葉から抽出されたゲノムＤＮＡ（６μｇ）は、ＥｃｏＲＩ酵素で消化され使用された。使用されたプローブは、ＤＩＧ標識されたハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子であった。ブロットは、シグナルが視覚化される前に高ストリンジェンシーで洗浄した。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
実施形態の詳細な開示
以下、植物における形質の発現を調整するための新しい方法の例示的な限定されない実施形態、および新しい方法において使用するための、また新しい方法によって生産される材料が開示される。
【００５３】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達経路に関与するという確認された事実に基づく。
【００５４】
サイトカイニンは、種々の方法において植物成長および発達を調節する植物ホルモンのクラスである。それらは、植物における細胞分裂、細胞増殖および分化、ならびに他の増殖調節機能の促進において活性を有する。サイトカイニンは、細胞分裂および増大から花および実の形成まで、植物発達のすべての期において重要な役割を果たすと考えられている。例えば、サイトカイニンは、花芽の伸長および葉の生長を促進し、老衰、アミノ酸の蓄積、および気孔の開口を抑制することができる。
【００５５】
サイトカイニンの基本構造は、６‐アミノプリンを含み、そのアミノ基は、通常５個の炭素原子を有する置換基で修飾される。高等植物における自然発生的活性サイトカイニンは、主に、生合成前駆体に由来するゼアチンおよびイソペンテニルアデニンである。サイトカイニンレベルの上昇は、トウモロコシ穀粒および別の穀物を発達させる、胚乳における最大有糸分裂活性と一致することが示すように、高等植物における種子の発達に関連する。
【００５６】
サイトカイニン生合成およびシグナル伝達の基本的分子機構は、最近になってようやく明らかになった。サイトカイニン受容体ファミリーの３つのメンバー、センサーヒスチジンキナーゼが同定され、それらは、リン酸リレー機構を伴うバクテリアの２成分シグナル伝達経路と同様の機能を有する。これらの３つのサイトカイニン受容体、ＡＨＫ２、ＡＨＫ３、およびＣＲＥ１／ＡＨＫ４は、高度の配列相同性を示すが、それぞれは、特徴的な性質を有し、通常のサイトカイニン認識および植物成長に必要である。これらの３つの受容体に対して突然変異分析が行われてきたが、３つの受容体のうちのいずれか１つにおける突然変異は、植物表現型の有意な変化をもたらさなかった。対照的に、３つの受容体のすべてにおける突然変異（すなわち、三重変異体）は、矮性および不稔植物をもたらした。これらの表現型は、以下に記載されるような本発明のアンチセンス変異体において見られなかった。
【００５７】
シロイヌナズナサイトカイニンシグナル伝達経路において、ヒスチジンタンパク質キナーゼ（ＡＨＫ）は、サイトカイニン受容体としての機能を果たし、ヒスチジンリン酸転移タンパク質（ＡＨＰ）を介して、ＡＨＫから核応答調節因子（ＡＲＲ）にシグナルを伝達する。ＡＨＰは、サイトカイニン依存的に細胞質から核に移動し、核内のＡＲＲにシグナルを送信し、それにより植物細胞内の植物成長および発達に関与する遺伝子の転写を活性化または抑制することができる。
【００５８】
高親和性でサイトカイニンに結合する、シロイヌナズナ植物から精製された単離ポリペプチド、ＨＯＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含む）が本明細書に開示される。さらに、本発明者らは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現の調整が、ヒスチジンキナーゼドメインがないにもかかわらず、単子葉植物および双子葉植物の両方におけるサイトカイニンシグナル伝達経路を調整し、植物における異なる形質の発現をもたらすことを確認した。一部の実施形態において、開示されるポリペプチドは、ＳＡＨＨ活性も有しない。
【００５９】
ある実施形態において、開示されたポリペプチドは、膜貫通ドメインを含む。
【００６０】
したがって、本発明は、植物による少なくとも１つのポリペプチドの発現を調整するステップを含む、植物における少なくとも１つの形質の発現を調整する方法を提供し、ポリペプチドは、
ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、
ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１からアミノ酸７、アミノ酸９からアミノ酸２３０、アミノ酸１からアミノ酸５８、アミノ酸７７からアミノ酸４８５、アミノ酸５９からアミノ酸７６、アミノ酸１５０からアミノ酸１９１、アミノ酸２３１からアミノ酸４０５、およびアミノ酸４０６からアミノ酸４３８のいずれか１つ以上から成る群から選択されるか、またはその相同体において同等位置にあり、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、
ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有し、植物におけるサイトカイニンシグナル伝達を調整することができる、アミノ酸配列
を含む、ポリペプチド、および
ｉｖ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列から成る、ポリペプチド、
から成る群から選択され、ポリペプチドの発現の調整は、植物における少なくとも１つの形質の発現を調整する。
【００６１】
いかなるサイトカイニンのシグナル伝達経路も、本発明の方法を使用して調整することができる。２００個以上の天然および合成サイトカイニンが、現在までに既知である（ｈｔｔｐ：  ／／ｗｗｗ．  ｐｌａｎｔ−  ｈｏｒｍｏｎｅｓ，  ｉｎｆｏ／ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ．  ｈｔｍ、Ａｒｔｅｃａ，  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ（１９９６）、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ｐｐ．  ３５７−４０７，  ５３１−５４８（１９９２））。例示的な自然発生のサイトカイニンには、ゼアチン、キネチン、イソペンテニルアデニン、および６−ベンジルアミノプリンが含まれる一方で、ジフェニル尿素等のフェニル尿素は、合成サイトカイニンの例示的なクラスを表す。数多くの方法で生成することができる抱合型サイトカイニンも既知であり、本発明の範囲内に含まれる。例えば、グルコシドは、ゼアチンの側鎖側のヒドロキシル基へのグルコースの炭素１の付着によって形成することができるか、または炭素１は、アデニン環の７位または９位のいずれかにおいて、Ｃ−Ｎ結合のＮ原子に付着することができる。
【００６２】
開示された方法は、さらに、１つ以上の形質の調整が望ましい任意の植物に適用することができる。本明細書で使用される「植物」という用語は、全植物、植物の原種および子孫、ならびに種子、シュート、茎、葉、根（塊茎を含む）、花、ならびに組織および器官を含む植物部位も包含し、上述のそれぞれは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。「植物」という用語はまた、植物細胞、浮遊培養物、カルス組織、胚、分裂組織部位、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を包含し、ここでも同様に、上述のそれぞれは、当該ポリヌクレオチドを含む。
【００６３】
本発明の方法に特に有用な植物には、食用作物、草、飼い葉もしくは飼料用マメ科植物、観賞植物、木、または低木等のすべての単子葉植物および双子葉植物、ならびに他にもあるが、カエデ類、マタタビ類、カモジグサ類、アリウム類、アマランサス類、パイナップル、バンレイシ類、アピウム類、シロイヌナズナ、ラッカセイ類、パンノキ類、アスパラガスオフィシナリス、カラスムギ、ゴレンシ、トウガン、バーソレシアエクセルサ、テンサイ、ブラシカ類、カダバファリノーサ、カメリアシネンシス、ダンドク、トウガラシ類、パパイヤ、オオバナカリッサ、ベニバナ、ヒッコリー類、クリ類、菊、エンダイブ、ニッケイ類、シトルルスラナタス、シトラス類、ヤシ類、コーヒーノキ類、コラノキ類、サトイモ、ハシバミ類、サンザシ類、キュウリ類、カボチャ類、チョウセンアザミ類、ニンジン、ヌスビトハギ類、リュウガン、ディオスコレア類、カキノキ類、ヒエ類、シコクビエ、ビワ、タチバナアデク、ソバ類、ブナ類、イチジク、キンカン類、フラガリア類、イチョウ、ダイズ類、ワタ、ヒマワリ類、ハイビスカス類、オオムギ類、サツマイモ、クルミ類、レタス、レンリソウ類、ウキクサ類、ヒラマメ、アマ、レイシ、ホソムギ、ハス類、トカドヘチマ、ルピナス類、マクロティロマ類、アセロラ、リンゴ類、マメイリンゴ、マンゴー、マニホット類、サポジラ、アルファルファ、シナガワハギ類、ハッカ類、ツルレイシ類、クロミグワ、バショウ類、タバコ類、オリーブ類、オプンティア類、ツノウマゴヤシ類、オリザ類、キビ、クダモノトケイソウ、アメリカボウフウ、ワニナシ類、オランダゼリ、ペチュニア、インゲンマメ類、ナツメヤシ類、ホオズキ類、マツ類、ピスタチオ、エンドウ類、イチゴツナギ類、ハコヤナギ類、プロソピス類、サクラ類、バンジロウ類、ザクロ、セイヨウナシ、コナラ類、ラディッシュ、ショクヨウダイオウ、スグリ類、キイチゴ類、サトウキビ類、ニワトコ類、ライムギ、ゴマ類、ナス類、モロコシホウレンソウ類、シジギウム類、タマリンド、カカオ、シャジクソウ類、ライコムギ、コムギ類、スノキ類、ソラマメ類、ササゲ類、ブドウ類、トウモロコシ、アメリカマコモ、ナツメ類を含むリストから選択される、エタノール用のセルロース系バイオマス（生物燃料）に使用される植物を含む。
【００６４】
一実施形態において、植物は、イネ、コムギ、トウモロコシ、大豆、キビ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、またはソルガム等の穀実作物である。別の実施形態において、植物は、アシ、スウィートグラス、トウ、竹、まぐさ、ダイアモンドグラス、および芝草等の草である。さらに別の実施形態において、植物は、カイラン、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードグリーン、アマ、ケール、およびレンティル等の野菜、または商業的もしくは化学的価値を有する他の植物（シロイヌナズナ、ペチュニア、菊等）である。
【００６５】
以下の実施例１および２に考察されるように、開示される方法は、単子葉植物および双子葉植物の両方において示されている。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリペプチドの配列が、植物種間で高度に保存されるため、開示される方法は、単子葉植物および双子葉植物の両方において適用可能であると期待される。例えば、開示される方法は、以下の実施例２に記載されるようなイネ（オリザサティバ）において示されているので、イネ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）と９５％のアミノ酸配列相同性を有するコムギ（トリチカムエスチバム）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）等の、別の単子葉植物に適用可能であると期待されるであろう。同様に、以下の実施例１に記載されるようなシロイヌナズナにおいて示されているので、シロイヌナズナ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と８８％のアミノ酸配列相同性を有するペチュニア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、シロイヌナズナ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と９２％のアミノ酸配列相同性を有する菊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）等の、別の双子葉植物に適用可能であると期待されるであろう。
【００６６】
本明細書で使用される「発現」という用語は、植物における形質、遺伝子、またはコードされたポリペプチドを含む遺伝子産物の発現を意味し得る。
【００６７】
開示された方法によって調整され得る植物形質には、草高、植物バイオマス、頂芽の発達、分枝、稔性、開花、葉面積、老化、種子発芽、種子収量、種子重量、茎の発達、穀粒収量、分げつ数、花分裂組織の発達、および根の発達が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態によると、植物における形質の発現は、ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、分枝の増加、種子収量の増加、植物バイオマスの増加、穀粒収量の増加、分げつ数の増加、葉面積の増加、種子発芽の遅延、頂芽優勢の減少、遅咲き、またはこれらの組み合わせを示すように調整され得る。別の実施形態において、植物における形質の発現は、ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、早咲き、矮性、葉数の減少、早期老化、早期種子発芽、ロゼット葉形成の遅延および減少、実生根の成長の増加、またはこれらの組み合わせを示すように調整され得る。
【００６８】
特に、種子収量および植物バイオマスは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現が、ポリペプチドの発現が減少していない同一種類の植物のものと比較して減少している植物に対して、約２から約５倍と著しく増加した。植物の種類、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現の調整、および調整の程度に応じて、種子収量および植物バイオマスはそれぞれ、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、または約５倍増加すると期待され得る。
【００６９】
同様に、穀粒収量および分げつ数は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現が、ポリペプチドの発現が減少していない同一種類の植物のものと比較して減少している植物に対して、約２から約４倍増加した。植物の種類、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現の調整、および調整の程度に応じて、穀粒収量および分げつ数は、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、または約４倍増加すると期待され得る。
【００７０】
特定の実施形態において、葉面積もまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現が、ポリペプチドの発現が減少していない同一種類の植物のものと比較して減少している植物に対して、約２から約６倍と著しく増加した。植物の種類、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現の調整、および調整の程度に応じて、葉面積は、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、約５．５倍、または約６倍増加すると期待され得る。
【００７１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現が増加している植物に対して、開花は、ポリペプチドの発現が増加していない同一種類の植物と比較して、約５から約１５日促進された。上記に考察されるように、開花期の調整は、植物の種類、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現の調整、および調整の程度によるが、典型的には、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、または約１５日促進されるであろう。
【００７２】
ある実施形態において、植物の稔性は調整されず、形質転換した植物は、稔性植物を生産することができる。
【００７３】
形質の発現は、当技術分野で既知の種々の方法を使用して決定され得る。例えば、葉面積は、以下の方程式のそれぞれを使用して、全葉面積を葉面積比（ＬＡＲ）、葉面積指数（ＬＡＩ）、または比葉面積（ＳＬＡ）として測定することによって決定され得る。
ＬＡＲ（ｍ２ｇ−１またはｍ２ｋｇ−１）＝（全葉面積）／（全乾燥重量）
ＬＡＩ＝（作物の全葉面積）
（それが立っている全土地面積）
ＳＬＡ（ｍ２ｇ−１）＝（葉面積）／（葉乾燥質量）
【００７４】
代替として、葉面積は、コンピュータを使用した画像分析を使用して測定され得る。
【００７５】
種子収量もまた、いくつかの方法で、例えば、千粒重の増加または減少として、充実種子数の増加または減少として、全種子重量として、種子の大きさとして、または収穫指数として測定され得る。
【００７６】
草高の差は、直接測定および改変されていない対照植物の高さとの比較によって測定することができる。
【００７７】
植物バイオマスは、収穫したての植物の重量測定（新鮮重もしくは湿重量）、または一定乾燥重量によって決定することができる。乾燥重量は、一定重量（乾燥重量）が記録されるまで、２日間から７日間、約８０℃に設定された乾燥炉で当該植物または植物部位（例えば、葉、種子）を乾燥させた後に決定することができる。同様に、１植物または１栽培単位面積当たり（例えば、１平方メートル当たり、１エーカー当たり、または１ヘクタール当たり）の種子または粒重および全種子または穀粒収量も決定することができる。
【００７８】
頂芽の発達および分枝、ならびに稔性、開花、および老化の変化は、改変された植物（例えば、本開示に記載されるように遺伝子操作された）を、同一成長期にある改変されていない植物の外観と比較することによって、推定することができる。
【００７９】
１植物当たりの分げつ数（または枝数）は、すべての分げつが成長するまで、成長した植物の代表サンプルを数えることによって決定することができる（例えば、イネ栽培品種において、分げつが最大数に達するまで約２ヵ月かかり得る）。これらは、改変されていない植物の１植物当たりの分げつ数と比較することができる。
【００８０】
花分裂組織の発達および根の発達は、巨視的レベル（例えば、比較できる発達期における肉眼観察による）、および、細胞配列の差異等に対して、顕微鏡法（例えば、光学または電子顕微鏡法による）の両方で検査することができる。
【００８１】
遺伝子の発現は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写レベルの生成を測定することによって決定され得る。ポリペプチド遺伝子産物の発現は、例えば、ポリペプチドと結合する抗体を使用した免疫測定法によって決定され得る。
【００８２】
「調整する」という用語は、植物における形質、遺伝子、または、コードされたポリペプチドを含む遺伝子産物の発現の変化を意味する。典型的には、変化は、形質、遺伝子、またはポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較される。例えば、形質の発現に関連して使用される「調整する」という用語は、ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、ポリペプチドの発現が開示される方法を使用して調整された植物における、草高の増加または減少、植物バイオマスの増加または減少、頂芽の発達の増加または減少、分枝の増加または減少、稔性の増加または減少、開花の増加または減少、葉面積の増加または減少、老化の促進または遅延、種子発芽の促進または遅延、種子数の増加または減少、種子収量の増加または減少、種子重量の増加または減少、茎の発達の促進または遅延、茎の発達の増加または減少、穀粒収量の増加または減少、分げつ数の増加または減少、花分裂組織の発達の増加または減少、花分裂組織の発達の促進または遅延、根の発達の増加または減少、根の発達の促進または遅延等を意味し得る。一実施形態において、調整された形質は、ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、ポリペプチドの発現が開示される方法を使用して調整された植物における、分枝の増加、種子収量の増加、植物バイオマスの増加、穀粒収量の増加、分げつ数の増加、葉面積の増加、種子発芽の遅延、頂芽優勢の減少、遅咲き、またはこれらの組み合わせであり得る。他の実施形態において、調整された形質は、ポリペプチドの発現が調整されていない同一種類の植物と比較した場合の、ポリペプチドの発現が開示される方法を使用して調整された植物における、早咲き、矮性、葉数の減少、早期老化、早期種子発芽、ロゼット葉形成の遅延および減少、実生根の成長の増加、またはこれらの組み合わせであり得る。
【００８３】
「発達」という用語は、細胞増殖および分化によって、植物または植物部位が成長し成熟するプロセスを意味する。
【００８４】
遺伝子または遺伝子産物の発現に関連して使用される「調整する」という用語は、典型的には、発現レベルの増加または減少を意味する。一部の実施形態において、遺伝子または遺伝子産物の発現レベルの減少は、遺伝子または遺伝子産物の発現の完全阻害を含む。ある実施形態において、遺伝子または遺伝子産物の発現レベルの減少は、遺伝子または遺伝子産物の発現の完全阻害ではない。
【００８５】
一部の実施形態において、ＨＯＧ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の発現レベルが、野生型と比較して約３から約２０倍増加する場合、サイトカイニンレベルは、約２０から約８５パーセント、約３０から約７５パーセント、約４０から約６５パーセント、または約５０から約５５パーセント減少する。このサイトカイニンレベルの減少は、約４から種子発芽の約５日の促進、成長遅延、ならびに新しいロゼット葉の形成および展開の遅延等の形質の発現の調整をもたらす可能性がある。他の実施形態において、ＨＯＧ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の発現レベルが、野生型と比較して約２から約１０倍減少する場合、サイトカイニンレベルは、約２０から約８５パーセント、約３０から約７５パーセント、約４０から約６５パーセント、または約５０から約５５パーセント増加する。このサイトカイニンレベルの増加は、種子発芽の約５日の遅延等の形質の発現の調整をもたらす可能性がある。以下の実施例から分かるように、形質の発現は、サイトカイニンの発現レベルに関連する。遺伝子または遺伝子産物の発現レベルを増加または減少させるための方法もまた、以下にさらに考察される。
【００８６】
代替として、「調整する」という用語は、植物における遺伝子またはコードされたポリペプチドを含む遺伝子産物の生物学的特性または機能特性の変化を意味する場合がある。例えば、調整は、コードされたポリペプチドの結合親和性の変化を引き起こす可能性がある。ある実施形態において、調整は、遺伝子の核酸配列、またはコードされたポリペプチドのアミノ酸配列の変化を引き起こさない。
【００８７】
典型的に、植物における１つ以上の形質の発現は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現を調整することによって調整される。「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書においては同じ意味で使用され、ペプチド結合もしくは修飾されたペプチド結合によって連鎖した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸残基のポリマー（ジペプチドまたはそれより大きい）、またはその変異体および合成類似体を意味する。したがって、これらの用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する自然発生的アミノ酸の化学的類似体等の合成非自然発生的アミノ酸である、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸ポリマー、および自然発生的アミノ酸ポリマーを含む。本発明のポリペプチドは、自然に精製された生成物、化学合成法による生成物、ならびに、例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳類細胞を含む、原核生物または真核生物宿主からの組み換え技術によって生成される生成物を含むが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドは、炭水化物基等の非ペプチド成分を含み得る。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、ポリペプチドが生成される細胞によってポリペプチドに付加され得、細胞の種類によって異なる。組み換え技術によって生成されるポリペプチドについて、大部分の修飾の性質および程度は、特定の宿主細胞の翻訳後修飾能力、および当該ポリペプチドのアミノ酸配列に存在する修飾シグナルによって決定される。例えば、グリコシル化パターンは、異なる種類の宿主細胞間で異なる。ポリペプチドは、それらのアミノ酸骨格構造の観点から本明細書に定義され、炭水化物基等の置換基は概して明記されないが、それでもなお存在する場合がある。さらに、本発明のポリペプチドはまた、場合によっては、宿主によるプロセスの結果として最初の修飾されたメチオニン残基を含み得る。タンパク質は、単量体または多量体タンパク質、例えば、二量体（ホモ二量体もしくはヘテロ二量体）または三量体として存在し得る。
【００８８】
典型的には、本発明において発現が調整されるポリペプチドは、その変異体または断片をその範囲内に含み、変異体または断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドと機能的に同一である生物活性を有する。ある実施形態において、生物活性は、サイトカイニン結合および受容体活性である。受容体活性は、受容体とのサイトカイニンの結合の際、１つ以上の細胞性応答を開始することができる細胞内シグナルになる、細胞膜を通じた細胞外シグナルの伝播を伴う。サイトカイニン結合および受容体活性を同定するための方法は、当技術分野で公知であり、以下の実施例１および２に記載される。
【００８９】
断片は、ポリペプチドのいずれかの末端、または一次アミノ酸配列の内部伸長からの１つまたは複数のアミノ酸欠失を包含し得る。断片は、好ましくは、親配列からの、また特定の配列に応じて、少なくともｎ個の連続するアミノ酸を含み、ｎは、好ましくは、７以上である（例えば、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、またはそれ以上）。
【００９０】
一実施形態において、ｎは、７である。
【００９１】
一実施形態において、ｎは、１８である。
【００９２】
一実施形態において、ｎは、３３である。
【００９３】
一実施形態において、ｎは、４２である。
【００９４】
一実施形態において、ｎは、５８である。
【００９５】
一実施形態において、ｎは、１７５である。
【００９６】
一実施形態において、ｎは、２２２である。
【００９７】
一実施形態において、ｎは、４０９である。
【００９８】
そのような断片は、「フリースタンディング」、すなわち、別のアミノ酸もしくはポリペプチドの一部ではなく、またはそれらに融合せず、あるいはそれらは、それらが一部または領域を形成するより大きなポリペプチドに含まれ得る。より大きなポリペプチドに含まれている場合、本発明の断片は、最も好ましくは、単一の連続した領域を形成する。加えて、いくつかの断片は、単一のより大きなポリペプチドに含まれ得る。
【００９９】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの機能的等価物を含む。本発明のポリペプチド断片および機能的等価物は、親ポリペプチドの生物活性、すなわち、サイトカイニン結合および受容体活性を保持する。サイトカイニン結合および受容体活性を同定するための方法は、当技術分野で公知であり、以下の実施例１および２に記載される。
【０１００】
機能的に同等の本発明のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載のポリペプチドに相同なポリペプチドを含む。２つのポリペプチドは、そのポリペプチドのうちの１つの配列が、もう１つのポリペプチドの配列と十分に高度な相同性を有する場合、「相同」であると言える。ポリペプチド配列に適用されるような「相同性パーセント」、「相同性％」、「タンパク質相同性」、「配列相同性」等の語句は、標準化されたアルゴリズムを使用して整列された少なくとも２つのポリペプチド配列間の同一残基の一致の割合（％）を意味する。そのようなアルゴリズムは、標準化され再現性のある方法で、２つの配列間の整列を最適化するために比較されている配列にギャップを挿入することによって、２つの配列のより有意義な比較を実現することができる。
【０１０１】
相同性パーセントは、当技術分野で既知の、または本明細書に記載される、１つ以上のコンピュータアルゴリズムまたはプログラムを使用して決定され得る。相同性の程度は、当業者によって容易に計算することができる（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．，  ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．，  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  １，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．  ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  １９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７、およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１を参照のこと）。
【０１０２】
タンパク質配列相同性を測定する方法は、当技術分野で公知であり、この関連において、配列相同性がアミノ酸相同性（硬相同性と呼ばれる場合もある）に基づいて計算されることは、当業者には理解されるであろう。例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、配列相同性を計算するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデフォルト設定で使用される）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，  ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）アルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．  Ｆ．（１９９３）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００、およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ，  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３に記載されるように、配列相同性を計算するか、または配列を並べるために使用することができる（典型的には、それらのデフォルト設定で）。
【０１０３】
ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、およびインターネット上の例えば、「ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／」を含む、いくつかの情報源から入手可能である。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同一の長さのワードと整列するときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、あるいはそれを満たすクエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）を同定することを伴う。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記参考）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。ワードヒットは、累積整列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長する。
【０１０４】
したがって、本明細書に言及されるような配列相同性は、例えば、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって指定されるデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ  ６２  ｍａｔｒｉｘ；  ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１１  ａｎｄ  ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ＝ｌ］を使用した、ＢＬＡＳＴバージョン２．１．３（またはその別のバージョン）を使用して決定することができる。
【０１０５】
ある実施形態において、上記のアルゴリズム／プログラムのデフォルト設定が使用される。
【０１０６】
典型的には、基準ポリペプチドの活性が保持されるという条件で、２つのポリペプチド間の５０％よりも大きい相同性が、機能的同等性を示すとみなされる。より好ましいポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によって表されるアミノ酸と、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％よりも大きい全体の配列相同性である、相同性の程度を有する。
【０１０７】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを使用して、本発明のシロイヌナズナのＨＯＧ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）が、概して、イネ（すなわち、ＯｓＣＢＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、コムギ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、菊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、およびペチュニア（すなわち、ＰＥＴＣＢＰ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）におけるその相同体と約８０から９５％のアミノ酸配列相同性を共有することが示された。より具体的には、シロイヌナズナのＨＯＧ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、イネ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）におけるその相同体と約９０％のアミノ酸配列相同性、コムギ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）におけるその相同体と約９１％のアミノ酸配列相同性、菊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）におけるその相同体と約９２％のアミノ酸配列相同性、ペチュニア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）におけるその相同体と約８８％のアミノ酸配列相同性、カイラン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）におけるその相同体と約９９％のアミノ酸配列相同性、ジャガイモ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）におけるその相同体と約９０％のアミノ酸配列相同性、およびトマトにおけるその相同体と約８９％のアミノ酸配列相同性を共有する。
【０１０８】
本発明に従った機能的に同等のポリペプチドは、１つ以上の位置において、保存または非保存のいずれかのアミノ酸の挿入、欠失、または置換があったポリペプチドを含むよう意図され、ただし、そのような変化は、親ポリペプチドのサイトカイニン結合および受容体活性を保持するタンパク質をもたらすことを条件とする。これらの種類の変化のそれぞれは、所与の配列において１回以上、単独で、または別の変化と組み合わせて起こる可能性がある。そのような変異体は、例えば、タンパク質工学および部位特異的突然変異誘発の方法を使用して生成され得る。
【０１０９】
融合タンパク質はまた、ＨＯＧ１タンパク質、およびその相同体、またはその変異体もしくは断片の性質を向上させるために操作され得る。例えば、付加的アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域は、ＨＯＧ１タンパク質、およびその相同体、またはその変異体もしくは断片のＮ末端に付加され、宿主細胞からの精製の間の安定性を向上させ得る。代替として、ペプチド部分は、ポリペプチドに付加され精製を促進し得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去することができる。ポリペプチドの取り扱いを容易にするためのペプチド部分の付加は、当業者には公知の通常の技術である。
【０１１０】
本発明のポリペプチドは、植物からの精製および組み換え方法等による、種々の方法によって調製され得る。本発明のポリペプチド、特に短ペプチド断片はまた、従来の液相または固相合成技術等による、化学合成によって生成され得る（例えば、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  １９８４  Ｔｈｅ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１に記載される方法を参照のこと）。代替として、ペプチドは、ｅｎｄｏＬｙｓ−Ｃ、ｅｎｄｏＡｒｇ−Ｃ、ｅｎｄｏＧｌｕ−Ｃ、およびブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ等のプロテイナーゼによる本発明のポリペプチドの消化によって生成することができる。
【０１１１】
本発明のポリペプチドの精製は、サイズ排除クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、および逆相高速液体クロマトグラフィ等の技術のうちのいずれか１つ、またはそれらの組み合わせによって達成される。本発明のポリペプチド、またはその変異体もしくは断片の体外検出は、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ウエスタンブロット法、免疫沈降、免疫蛍光法、薄層クロマトグラフィ、逆相高速液体クロマトグラフィ、酸加水分解後のアミノ酸分析、および高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析を含む、種々の技術を使用して達成され得る。そのような技術は、当業者によって一般的に使用される。
【０１１２】
当技術分野で既知の方法を使用して、本発明のポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、ＳＡＨＨの２つの保存特性を含むことが示された。第２のＳＡＨＨ特性において、ジヌクレオチド結合ドメインを表す３個の保存グリシン残基が同定された。サイトカイニンは、ヌクレオチド誘導体であるため、これらの残基は、サイトカイニン結合ドメインを形成する可能性があることが予測される。推定膜貫通ドメインもまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸１位から７位（Ｎ末端において）、１５０位から１９１位、および５９位から７６位において同定された。
【０１１３】
別の推定サイトカイニン結合ドメインは、アミノ酸９位から２３０位（Ｎ末端において）、７７位から４８５位、および４０６位から４３８位（Ｃ末端において）において同定された。推定ＮＡＤ＋結合ドメインは、アミノ酸２３１位から４０５位において同定された。Ｎ末端細胞内ドメインは、アミノ酸１位〜５８位において同定された。
【０１１４】
ある実施形態において、植物におけるポリペプチドの発現は、ポリペプチドの発現を調整するポリヌクレオチドを、植物の１つ以上の細胞に導入することによって調整される。本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、または例えば、クローニングによって得られ得るか、もしくは合成的に生成され得る、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖であり得、またはそれは、以下にさらに考察されるようなアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。
【０１１５】
開示される方法での使用に好適なポリヌクレオチドは、プリンおよびピリミジン塩基、または別の天然、化学または生化学修飾、非天然、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含む、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれかのヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドの骨格は、典型的には、ＲＮＡまたはＤＮＡに見られるような糖類およびリン酸基、または修飾もしくは置換された糖類もしくはリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドはまた、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって割り込まれ得る。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド、およびデオキシヌクレオチドという用語は、概して、ポリヌクレオチド配列に組み込まれる場合に、溶液中の自然発生的ポリヌクレオチド配列によるハイブリダイゼーションを可能にするように、自然発生的ヌクレオシドまたはヌクレオチドと共通したいくつかの構造的特性を有する類似体を含む。典型的には、これらの類似体は、塩基、リボース、またはリン酸ジエステル部分を置換および／または修飾することによって、自然発生的ヌクレオシドおよびヌクレオチドから得られる。変化は、必要に応じて、ハイブリッド形成を安定化もしくは不安定化させるために、または相補的なポリヌクレオチド配列によるハイブリダイゼーションの特異性を高めるために、目的に合わせて行われ得る。
【０１１６】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ポリヌクレオチド配列の変異体および断片をその範囲内に含み、該変異体または断片は、本発明のポリヌクレオチド、特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド（またはその断片）と機能的に同一である生物活性を有するポリペプチドをコードし、該変異体は、必要以上の試験および実験を行うことなく、分子生物学における標準的技術を使用して、見出し、および単離することができる。
【０１１７】
２つのポリヌクレオチド配列間の相同性の度合いは、例えば、ＧＡＰクリエーションペナルティ５およびＧＡＰウィドスペナルティ０．３のデフォルト設定を使用した、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰ（Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８，  Ａｕｇｕｓｔ  １９９６，  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ＵＳＡ  ５３７１１）（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，  Ｓ．  Ｂ．  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  ＣＤ．，（１９７０），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４８，  ４４３−４５３）等の当技術分野で既知のコンピュータプログラムを用いて決定され得る。ポリヌクレオチド分子の相同体は、異なる種において実質的に同一の機能および同様の特性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子であって、コードされたポリペプチドは、少なくとも領域内において、少なくとも５０％のアミノ酸相同性、およびコードされたアミノ酸配列全体にわたって、少なくとも約３０％のアミノ酸相同性、少なくとも約４０％のアミノ酸相同性、少なくとも約５０％のアミノ酸相同性、少なくとも約６０％のアミノ酸相同性、少なくとも約７０％のアミノ酸相同性、少なくとも約８０％のアミノ酸相同性、少なくとも約９０％のアミノ酸相同性、または少なくとも約９５％の相同性を共有し得る。ＨＯＧ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のイネ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、コムギ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、菊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、およびペチュニア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）におけるその相同体との配列相同性の例示的なレベルは、上で説明されている。対応するポリヌクレオチド相同体は、遺伝子コードの縮退、ならびに異なる植物属および種間の好ましいコドン使用頻度の差によって、５０％よりも有意に小さい相同性を共有し得る。例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．８３）を使用して、本発明のＨＯＧ１ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）をコードするポリヌクレオチドは、イネ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）におけるその相同体と８２％の配列相同性、コムギ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）におけるその相同体と８３％の配列相同性、菊（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）におけるその相同体と８２％の配列相同性、ペチュニア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）におけるその相同体と７８％の配列相同性、カイラン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）におけるその相同体と９８％の配列相同性、トマト（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）におけるその相同体と７９％の配列相同性、ジャガイモ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）におけるその相同体と８０％の配列相同性、およびタバコ（品種Ｘａｎｔｈｉ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のＳＡＨＨ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと７８％の配列相同性を有することが示された。
【０１１８】
ポリヌクレオチド分子はまた、低ストリンジェンシー、より好ましくは、中ストリンジェンシー、およびさらに好ましくは、高低ストリンジェンシーの条件下で、本発明のポリヌクレオチド分子、特に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、および１５に示されるポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる変異体をその範囲内に含み得る。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、２×ＳＳＣにおいて、５０℃で実行されるハイブリダイゼーションに対応し得る。
【０１１９】
所与のポリヌクレオチド分子が、特定のポリヌクレオチドにハイブリダイズするかどうかを決定するための好適な実験条件は、１０分間の５×ＳＳＣにおける、検査されるポリヌクレオチドの関連サンプルを含むフィルタの予浸、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％  ＳＤＳ、および１００μｇ／ｍｌの変性超音波処理サケ精子ＤＮＡの溶液中のフィルタのプレハイブリダイゼーション、続いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されるようなハイブリダイゼーション方法に従った、約４５℃で１２時間の、１０ｎｇ／ｍｌの濃度の３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識プローブを含む同一溶液中のハイブリダイゼーションを伴い得る。
【０１２０】
次いで、フィルタを、少なくとも５５℃（低ストリンジェンシー）、少なくとも６０℃（中ストリンジェンシー）、少なくとも６５℃（中／高ストリンジェンシー）、少なくとも７０℃（高ストリンジェンシー）、または少なくとも７５℃（超高ストリンジェンシー）で、２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ中で３０分間、２回洗浄する。ハイブリダイゼーションは、Ｘ線フィルムへのフィルタの曝露によって検出されてもよい。
【０１２１】
さらに、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを変更するために用いられ得る、当業者に公知の多数の条件および要因が存在する。例えば、特定のポリヌクレオチドにハイブリダイズされるポリヌクレオチドの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成物）、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコール等の有無等の塩および別の成分の濃度、ならびにハイブリダイゼーションおよび／または洗浄ステップの温度の変更である。
【０１２２】
さらに、２つの所与のポリヌクレオチド配列が、ある特定の条件下でハイブリダイズするかどうかを理論的に予測することも可能である。したがって、上記の経験的方法の代替として、変異ポリヌクレオチド配列が、第２もしくは第３の態様に従って示されるポリヌクレオチド分子、またはより具体的にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくは１５のポリヌクレオチドにハイブリダイズするかどうかに関する決定は、既知の配列を有する２つの異種ポリヌクレオチド配列が、塩濃度および温度等の特定の条件下でハイブリダイズするＴｍ（融解温度）の理論計算に基づき得る。
【０１２３】
異種ポリヌクレオチド配列に対する融解温度（Ｔｍ（ヘテロ））の決定において、最初に、相同ポリヌクレオチド配列に対する融解温度（Ｔｍ（ホモ））を決定する必要がある。２つの完全に相補的なポリヌクレオチド鎖（ホモ二本鎖形成）間の融解温度（Ｔｍ（ホモ））は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９９５に概説されるように、以下の式に従って決定され得る。
Ｔｍ（ホモ）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ホルム）−５００／Ｌ
Ｍ＝一価カチオンのモル濃度を示す
％ＧＣ＝配列における塩基の総数のグアニン（Ｇ）およびシトシン（ｃ）の％
％ホルム＝ハイブリダイゼーションバッファにおけるホルムアミドの％
Ｌ＝ポリヌクレオチド配列の長さ
【０１２４】
上記の式によって決定されるＴｍは、２つの完全に相補的なポリヌクレオチド配列間のホモ二本鎖形成のＴｍ（Ｔｍ（ホモ））である。２つの異種ポリヌクレオチド配列のＴｍにそのＴｍ値を適応させるために、２つの異種配列間のヌクレオチド配列の１％の差は、Ｔｍの１℃の減少に等しいと仮定される。したがって、ヘテロ二本鎖形成に対する（Ｔｍ（ヘテロ））は、当該類似配列と上記のヌクレオチドプローブとの間の相同性の％差を（Ｔｍ（ホモ））から引くことによって得られる。
【０１２５】
典型的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または１５に示されるポリヌクレオチド分子はまた、そのオリゴヌクレオチド断片であるポリヌクレオチド分子をその範囲内に含む。典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１５から約１７７５個のヌクレオチドの長さである。より典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１５から約１２００個のヌクレオチドの長さである。さらに典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１５から約７００個のヌクレオチドの長さである。さらに典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１５から約２００個のヌクレオチドの長さである。より典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１５から約７５個のヌクレオチドの長さである。
【０１２６】
典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１５から約１７７５個のヌクレオチドの長さである。より典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１００から約１７７５個のヌクレオチドの長さである。さらに典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約５００から約１７７５個のヌクレオチドの長さである。さらに典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１０００から約１７７５個のヌクレオチドの長さである。より典型的には、オリゴヌクレオチド断片は、約１２００から約１７７５個のヌクレオチドの長さである。
【０１２７】
「相補的」という用語は、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間等のヌクレオチドもしくは核酸間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと配列もしくは増幅される一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間のハイブリダイゼーションまたは塩基対合を意味する。相補的なヌクレオチドは、概して、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、またはＣおよびＧである。２つの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、最適に整列および比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を有する一方の鎖のヌクレオチドが、もう一方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は、少なくとも９０％から９５％、より好ましくは、もう一方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約９８％から１００％と対合する場合に、「相補的」であると言われる。代替として、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖が、選択的ハイブリダイゼーション条件下でその相補体にハイブリダイズする場合に、相補性が存在する。典型的には、選択的ハイブリダイゼーションは、一続きの少なくとも１４から２５個のヌクレオチドにわたって少なくとも約６５％の相補性、好ましくは、少なくとも約７５％、およびより好ましくは、少なくとも約９０％の相補性が存在する場合に起こる。
【０１２８】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド分子は、「単離される」。本明細書で使用される「単離される」という用語は、その自然の状態において通常伴う成分が実質的または本質的に存在しない物質を意味する。例えば、本明細書で使用される「単離されたポリヌクレオチド」は、自然発生的状態で隣接する配列から精製されたポリヌクレオチドを意味する。「単離された」物質は、自然界またはその自然発生的状態において見られる物質よりも高い濃度における調製において存在するか、あるいは物質は、物質が自然界において関連しない別の材料を含む調製において存在する。
【０１２９】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチド分子は、外因性分子である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド分子に関連して使用される場合の「外因性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが導入される標的細胞種とは別の種から単離される、および／または派生することを意味する。
【０１３０】
一実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現を減少させるポリヌクレオチドが、当該植物に導入される。ポリヌクレオチドは、抑制ポリヌクレオチド、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ等）、ＲＮＡ干渉構成物（ｓｉＲＮＡ等）、および触媒アンチセンス核酸構成物（リボザイム等）であり得る。ポリヌクレオチドは、当業者に既知の方法を使用して、例えば、化学合成、組み換えＤＮＡ方法、またはアンチセンスＲＮＡの場合は、プロモーターに連鎖される際の生体内または生体外転写によって調製され得る。
【０１３１】
ある実施形態において、ポリヌクレオチドは、アンチセンスポリヌクレオチドである。「アンチセンスポリヌクレオチド」は、その部分配列を含む、本発明のコード配列のうちのいずれか１つまたはすべてに相補的であり、したがって、それらによってハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド配列である。
【０１３２】
全長アンチセンス分子を、この目的で使用することができる。代替として、ＨＯＧ１にコードされたＲＮＡの特異的領域に標的化した二本鎖オリゴヌクレオチド、センスおよび／またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその組み合わせが利用され得る。所定の遺伝子の発現量を減少させるためのオリゴヌクレオチド分子の使用は、当技術分野で既知である（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ａ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，  Ｄ．  Ｃ．（１９９９），  ”Ａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ”，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：９５０−９５２、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  Ｐ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ（１９９８），  ”Ｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ”，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１３９５９−１３９６４、および国際特許公報ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、ＷＯ９９／３２６１９を参照のこと）。オリゴヌクレオチド分子は、転写によって、全長または部分配列であり得る二本鎖および／またはアンチセンスＲＮＡ配列を生成するＤＮＡ構成物で植物細胞を形質転換することによって、原位置で提供され得る。ジーンサイレンシング効果は、大量の二本鎖ＲＮＡが生成されるように、センスおよび／またはアンチセンス配列の両方（全長または部分であり得る）を過剰生成することによって高めることができる。
【０１３３】
上で考察されるように、アンチセンス構成物の配列は、ＨＯＧ１遺伝子の種々の領域から得ることができる。例えば、アンチセンス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列に相補的なポリヌクレオチドからの、少なくとも１５、少なくとも２０、または少なくとも２５個の連続した核酸残基を含み得る。アンチセンス配列は、約２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または８５０個の連続した核酸残基を含み得る。望ましい数の残基を含むいかなる連続した配列も使用され得る。連続した配列は、当技術分野で既知の任意の方法およびアルゴリズムを使用して設計することができる。一例として、１５個の連続した核酸残基を含むアンチセンスポリヌクレオチドが望ましい場合、第１のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の３０１位で始まり、ポリヌクレオチド配列の３１５位で終わる１５個の連続した核酸残基を含み得、第２のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の３０２位で始まり、ポリヌクレオチド配列の３１６位で終わる１５個の連続した核酸残基を含み得、第３のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の３０３位で始まり、ポリヌクレオチド配列の３１７位で終わる１５個の連続した核酸残基を含み得、第４のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の３０４位で始まり、ポリヌクレオチド配列の３１８位で終わる１５個の連続した核酸残基を含み得る。１５個の連続した核酸残基を含むさらなるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖に沿った一続きの１５個の連続した核酸残基を順次同定することによって得ることができる。別の長さの連続した配列が、同様の戦略を使用して調製され得ることは、当業者には明らかであろう。
【０１３４】
一実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列の２７１位で始まり、２８６位で終わる１５個の連続した核酸残基を含む第１のアンチセンスポリヌクレオチドは、以下の核酸配列を有する。
0005592652.tif 000002
上記に概説される戦略を使用して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列の２７２位で始まり、２８７位で終わる１５個の連続した核酸残基を含む第２のアンチセンスポリヌクレオチドは、以下の核酸配列を有する。
0005592652.tif 000003
第３および第４のアンチセンスポリヌクレオチドは、以下の核酸配列のそれぞれを有する。
0005592652.tif 000004
１５個の連続した核酸残基を含むさらなるアンチセンスポリヌクレオチドは、上記に説明されるように得ることができる。
【０１３５】
ある実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドは、１５個の連続した核酸残基を含む。特定の実施形態において、アンチセンスポリヌクレオチドは、少なくとも１００個の連続した核酸残基を含む。
【０１３６】
アンチセンス構成物は、プロモーター等のヌクレオチド配列の調節領域、またはコード（エクソン）もしくは非コード（イントロン）配列を標的化し結合するように設計され得る。一実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２において標的化されるアンチセンスポリヌクレオチドが使用され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現の減少をもたらす。一実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５に示されるアンチセンスポリヌクレオチド（２つのＳＡＨＨ特性ドメインに及ぶ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の８５０ｂｐ断片）が使用される。当該ＨＯＧ１遺伝子の領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）に、それらの長さにわたって少なくとも実質的に相補的である本発明のアンチセンス構成物を、生成することができる。アンチセンス構成物のその相補的な細胞配列への結合は、転写、ＲＮＡ処理、輸送、翻訳、および／またはｍＲＮＡ安定性を阻害する可能性がある。好適なアンチセンスポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法によって調製することができる。典型的には、アンチセンスポリヌクレオチドは、自動合成器で合成される。好適なアンチセンスポリヌクレオチドは、細胞へのそれらの送達、一度細胞内に入った後のそれらの安定性、および／または適切な標的へのそれらの結合を向上させるために設計される修飾を含み得る。例えば、アンチセンスポリヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエート結合の付加、または１つ以上のモルホリン環の骨格への含有によって修飾され得る。
【０１３７】
代替として、ＲＮＡｉ構成物は、当技術分野で既知の方法に従って、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を減少させるために使用され得る（例えば、Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：  ８０６−８１１、Ｈａｍｍｏｎｄ，  ｅｔ  ａｌ  ．（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ，  Ｇｅｎｅｔ．  ２：  １１０−１１１９、Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：  ２９３−２９６、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：  ３６３−３６６、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：  ４９４−４９８、ＷＯ９９／４９０２９、およびＷＯ０１／７０９４９を参照のこと。それらの開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる）。ＲＮＡｉは、低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）による特異的ｍＲＮＡの破壊による、選択的転写後のジーンサイレンシングの手段を意味する。ｓｉＲＮＡは、典型的には、二本鎖ＲＮＡの開裂によって生成され、１つの鎖は、不活性化されるメッセージと同一である。１つの鎖が、ｍＲＮＡ転写物の特異的領域と同一であり、直接導入される二本鎖ＲＮＡ分子が合成され得る。代替として、一度細胞内に現れると二本鎖ＲＮＡに変換される、対応する二本鎖ＤＮＡを用いることができる。ＲＮＡｉでの使用のための、および転写後のジーンサイレンシングを実現させるための、好適なｓｉＲＮＡ分子の合成のための方法は、当業者には既知である。当業者である読者は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含むポリヌクレオチドの発現を減少させることができる好適なｓｉＲＮＡ構成物の範囲が、必要以上の実験を行うことなく、当業者に既知の通常の手技を使用して、当該遺伝子の配列の知識に基づいて、同定および生成することができることを十分に理解するであろう。
【０１３８】
当業者はまた、標的配列とｓｉＲＮＡ配列との間に、必ずしも１００％のヌクレオチド配列の一致がある必要はないことを十分に理解するであろう。不一致の許容範囲は、主に、配列内の不一致の位置によって決まる。場合によっては、２または３個のヌクレオチドの不一致は、許容できる可能性があるが、別の場合においては、たった１つのヌクレオチドの不一致も、ｓｉＲＮＡの効果を打ち消すに十分である。特定のｓｉＲＮＡ分子の適合性は、必要以上の実験を行うことなく、当業者に既知の通常の手技を使用して決定され得る。例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される核酸配列から成るポリヌクレオチドに相補的な核酸配列から選択される少なくとも９個の連続した核酸残基を含む核酸配列を含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを使用することができる。一部の実施形態において、約９、１０、１１、または１２個の連続した核酸残基を含む核酸配列を含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドを使用することができる。望ましい数の残基を含むいかなる連続した配列も使用され得る。連続した配列は、当技術分野で既知の任意の方法およびアルゴリズムを使用して設計することができる。一例として、９個の連続した核酸残基を含むＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドが望ましい場合、第１のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の６１位で始まり、ポリヌクレオチド配列の６９位で終わる９個の連続した核酸残基を含み得、第２のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の６２位で始まり、ポリヌクレオチド配列の７０位で終わる９個の連続した核酸残基を含み得、第３のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の６３位で始まり、ポリヌクレオチド配列の７１位で終わる９個の連続した核酸残基を含み得、第４のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド配列の６４位で始まり、ポリヌクレオチド配列の７２位で終わる９個の連続した核酸残基を含み得る。９個の連続した核酸残基を含むさらなるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖に沿った一続きの９個の連続した核酸残基を順次同定することによって得ることができる。別の長さの連続した配列が、同様の戦略を使用して調製され得ることは、当業者には明らかであろう。
【０１３９】
一実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列の４２位で始まり、５０位で終わる９個の連続した核酸残基を含む第１のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドは、以下の配列を有する。
0005592652.tif 000005
上記に概説される戦略を使用して、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリヌクレオチド配列の４３位で始まり、５１位で終わる９個の連続した核酸残基を含む第２のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドは、以下の配列を有する。
0005592652.tif 000006
第３および第４のＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドは、以下の配列のそれぞれを有する。
0005592652.tif 000007
９個の連続した核酸残基を含むさらなるＲＮＡ干渉ポリヌクレオチドは、上に説明されるように得ることができる。ｓｉＲＮＡの設計および使用に関するさらなる情報は、ｗｗｗ．ｍｐｉｂｐｃ．ｇｗｄｇ．ｄｅ／ａｂｔｅｉｌｕｎｇｅｎ／１０−０／１０５／ｓｉｒｎａ．ｈｔｍｌで利用可能な、「Ｔｈｅ  ｓｉＲＮＡ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ」で見ることができる。
【０１４０】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を減少させるさらなる手段は、ＲＮＡ転写物を開裂することによって、野生型タンパク質の生成を防止することができる、リボザイム等の触媒アンチセンス核酸構成物を導入することによって実現され得る。リボザイムは、リボザイム触媒部位に隣接する標的に対する配列相補性の２つの領域によって、特定の配列に標的化され、その配列とアニールする。結合後に、リボザイムは、部位特異的に標的を開裂する。当該配列を特異的に認識および開裂するリボザイムの設計および試験は、当業者に公知の技術によって実現することができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ，（１９９５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５：５４０−５５１。その開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。）。
【０１４１】
ある実施形態において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の減少は、共抑制の結果である。共抑制は、導入遺伝子に導入によって引き起こされる、内在性遺伝子の阻害を意味する。典型的には、共抑制は、内在性遺伝子と同一である、または内在性遺伝子とヌクレオチド配列相同性を共有する遺伝子構成物の１つ以上のコピーで形質転換した遺伝子導入植物に認められる。これらの形質転換した植物のいくつかにおいて、抑制は、例えば、アンチセンスＲＮＡの偶発的生成の結果として、または導入された導入遺伝子と内在性相同体との間の異常染色体相互作用によって、導入された導入遺伝子および内在性相同体の両方に対して生じ得る（Ｈｏｏｐｅｒ，  Ｔｈｅ  ｐｅｔｕｎｉａ  ｐａｒａｄｏｘ：  ａｄｄｅｄ  ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｈａｖｅ  ｐｕｚｚｌｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｐｌｎａｔｓ，  Ｊ．  ＮＩＨ  Ｒｅｓ．３：４９−５４，（１９９１）。したがって、導入された導入遺伝子の発現レベルの増加をもたらす代わりに、共抑制は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現レベルの減少をもたらす。
【０１４２】
以下の実施例２、図９ｃ、１１ａ、１１ｂ、１１ｄ、および１１ｇ、ならびに表８に記載されるように、過剰発現構成物で形質転換したトランスジェニックイネ植物の中には、共抑制の結果としてアンチセンス構成物で形質転換した植物に見られた形質を示したものもあった。例えば、これらの共抑制植物は、主要な分げつの地上節からの分枝（１植物当たりの円錐花序数の有意な全体的増加をもたらす）、およびＷＴと比較して、平均種子数および植物バイオマスの２から３倍を超える増加を示した。
【０１４３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドの発現を減少させるために、１つまたは複数のヌクレオチド挿入、欠失、または置換を含む突然変異を導入するポリヌクレオチドもまた考慮される。１つまたは複数のヌクレオチド挿入、欠失、または置換は、導入された標的ヌクレオチド配列との標的突然変異部位の組み換えによって導入され得る。そのような導入されたヌクレオチド配列は、例えば、望ましい突然変異挿入点において連続しているか、またはその両側に位置する標的配列と相同のヌクレオチド配列によって両側に隣接するゲノムに導入されるヌクレオチド配列を含み得る。標的配列と相同のヌクレオチド配列は、標的配列と同質であることによって、相同組み換えの頻度を高くすることができる。
【０１４４】
標的配列と完全に同質でない相同ヌクレオチド配列も使用することができる。相同ヌクレオチド配列と標的配列との間の不一致は、相同組み換えの頻度に悪影響を及ぼす可能性があるが、同質性は厳格には必要とされず、実質的な相同性が十分であり得る。本発明の目的で、相同配列と標的配列との間の相同性レベルは、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、少なくとも約９９％の相同性、または１００％の相同性であり得る。
【０１４５】
突然変異は、化学的もしくは物理的突然変異誘発技術によって、またはトランスポゾンもしくはＴ−ＤＮＡ等の挿入突然変異手段を使用して導入されてもよく、外因性核酸は、例えば、化学的に補助された細胞透過（例えば、カルシウム、リチウム、ＰＥＧを使用して）、エレクトロポレーション、微量注入、リポソーム媒介トランスフェクション、微粒子衝撃（バイオリスティクス）、アグロバクテリウム媒介形質転換、ウイルス感染、原形質融合、または当技術分野で既知のような別の任意の適切な手段を用いた、組み換え手段によって導入することができる。
【０１４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現の減少または増加は、植物が安定的または一過的に形質転換したかどうかに応じて、安定的または一過的であり得る（例えば、特定の発達期、または１または２世代における組織においてのみ）。「安定的に形質転換した」は、１つ以上の導入遺伝子の細胞のゲノムへの導入および組み込みを意味する。細胞の安定的な形質転換は、当技術分野で既知の技術によって、例えば、導入遺伝子のうちの１つ以上と結合することができる核酸配列を有する細胞のゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーションによって、または導入遺伝子配列を増幅するための細胞のゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応によって検出することができる。
【０１４７】
対照的に、「一過的に形質転換した」という用語は、導入遺伝子が形質転換細胞のゲノムに組み込まれない、１つ以上の導入遺伝子の細胞への導入を意味する。一過的な形質転換は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、導入遺伝子のうちの１つ以上によってコードされたポリペプチドの存在を検出することによって、または導入遺伝子によってコードされたタンパク質（例えば、βグルクロニダーゼ）の活性を検出することによって検出することができる。したがって、安定的な形質転換体からのゲノムＤＮＡが１つ以上の導入遺伝子を含む一方で、一過的な形質転換体からのゲノムＤＮＡが導入遺伝子を含まない点で、安定的な形質転換体は、一過的な形質転換体と区別される。
【０１４８】
本発明のポリヌクレオチドは、裸のＤＮＡプラスミドの形で、またはベクターにおいて投与され得る。裸のＤＮＡプラスミドは、当技術分野で既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送体の使用によって宿主細胞に導入することができる。
【０１４９】
一部の好適な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ベクターにおいて投与され得る。ベクターは、外来配列の挿入および真核細胞への導入に適したプラスミドベクター、ウイルスベクター、または別の任意の好適な媒体（コスミド等）であり得る。ある実施形態において、ベクターは、本発明の抑制ポリヌクレオチド分子のＤＮＡ配列のＲＮＡへの転写を指示することができる発現ベクターである。ウイルス発現ベクターは、例えば、エプスタインバーウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス由来ベクターを含む。一実施形態において、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、染色体外で高コピー数で標的細胞内に抑制核酸分子を維持し、それによって、染色体組み込みの潜在的効果を除去する手段を提供する。
【０１５０】
ベクターはまた、転写／翻訳制御シグナル等の発現制御因子、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位、プロモーター、エンハンサー等を含む核酸を含み得、制御因子は、遺伝子産物をコードする核酸に作用可能に関連する。例えば、コーディング領域のプロモーターへの作用可能な連鎖は、コーディング領域を特異的に認識、結合、および転写するＲＮＡポリメラーゼによる、プロモーターからのコーディング領域の転写を可能にする。ある実施形態において、コーディング領域は、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターまたはゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター等の強力な構成的プロモーター下に配置される。本発明での使用に関して考慮される他の構成的プロモーターは、Ｔ−ＤＮＡマンノピン合成酵素、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）、およびオクトピン合成酵素（ＯＣＳ）プロモーターを含むが、これらに限定されない。
【０１５１】
代替として、ストレス誘導性プロモーター（例えば、強光、乾燥、塩、または温度誘導性プロモーター）等の誘導性プロモーターを使用することができる。例示的な誘導性プロモーターは、光合成組織における発現のためのリブロース二リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）小サブユニット遺伝子プロモーターまたはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ）遺伝子プロモーター、種子における発現のための種々の種子貯蔵タンパク質遺伝子プロモーター、および形質転換した植物の根系における発現のための根特異的グルタミン合成酵素遺伝子プロモーターを含む。
【０１５２】
ベクターは、バイナリーベクターであり得る。例えば、上記のような構成的または誘導性プロモーターの制御下にある選択されたコーディング領域を含む、アグロバクテリウムバイナリーベクター系が使用され、カナマイシン耐性等の核の薬剤耐性マーカーに連鎖し得る。他の有用な選択可能なマーカー系は、抗生物質抵抗性（例えば、ハイグロマイシンもしくはビアラホスに対する抵抗性）または除草剤抵抗性（例えば、スルホニル尿素、ホスフィノスリシン、もしくはグリホサートに対する抵抗性）を与える別の遺伝子を含むが、これらに限定されない。一般的に使用されるバイナリーベクターは、ｐＢＩＮ１９、ｐＰＶＰ、およびｐＧｒｅｅｎを含む。
【０１５３】
一部の実施形態において、余分な、潜在的に不適切な別の翻訳開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）（すなわち、開始（ｓｔａｒｔ））コドン、または転写もしくは翻訳レベルで発現を妨害するか、もしくは減少させ得る別の配列を除去するために、クローンの５’非翻訳部分に除去、付加、または変更を行うことも有効であり得る。代替として、コンセンサスリボソーム結合部位（例えば、Ｋｏｚａｋ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ，  ２６６：１９８６７−１９８７０（１９９１）を参照のこと）は、発現を高めるために開始コドンのすぐ５’側に挿入することができる。そのような修飾の好ましさ（または必要性）は、経験的に決定され得、これらおよび別の共通ベクター要素の選択は伝統的である。多くのそのような配列はまた、市販のベクターから得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．  （２００１），  ”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびそこに挙げられる参考文献、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （２０００）を参照のこと）。
【０１５４】
本発明のベクターは、微量注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介送達、ウイルス性感染症、原形質融合、および粒子媒介取り込みを含むが、これらに限定されない、ＤＮＡを細胞に導入するための当技術分野で既知である任意の好適な方法を使用して、標的細胞に導入することができる。任意に、本発明のポリヌクレオチドは、標的細胞にリコンビナーゼ、例えば、ｒｅｃＡと同時投与され、それによって、相同組み換え率を高める。標的細胞は、必要であれば、好適なリコンビナーゼ標的配列をすでに含んでいるか、または含むために形質転換されている場合がある。例えば、リコンビナーゼタンパク質は、米国特許第６，２５５，１１３号に記載されるように、標的ＤＮＡにロードすることができる。ローディングプロセスを高めるために、本発明のポリヌクレオチドは、１つ以上の組み換えの核形成配列を含むか、またはリコンビナーゼでポリヌクレオチドをプレインキュベートすることによって、リコンビナーゼタンパク質で被覆し得、それによって、リコンビナーゼは、ポリヌクレオチドに非共有結合する（例えば、Ａ．  Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ（１９９８），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６：２７２９、およびＡ．  Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｈｏｏｙｋａａｓ（１９９８），  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ３８：３９３  ４０６、国際特許公報ＷＯ９９／２５８２１、ＷＯ９９／２５８４０、ＷＯ９９／２５８５５、およびＷＯ９９／２５８５４、ならびに米国特許第５，７８０，２９６号、第６，２５５，１１３号、および６，６８６，５１５を参照のこと）。
【０１５５】
本発明のポリヌクレオチドのうちの１つによる遺伝子導入植物は、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  （Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，  ｅｄｓ  ．  ，  １９８８）、Ｃｌｏｕｇｈ，  Ｓ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，  Ａ．  Ｆ．  （１９９８）  ”Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ：  ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ”  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  １６，  ７３５−７４３、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”  （Ｓｃｈｕｌｅｒ  ＆  Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，  ｅｄｓ．，  １９８９）、”Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ”  （Ｇｅｌｖｉｎ，  Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，  Ｖｅｒｍａ，  ｅｄｓ．，  １９９３）、および”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  （Ｍａｌｉｇａ，  Ｋｌｅｓｓｉｇ，  Ｃａｓｈｍｏｒｅ，  Ｇｒｕｉｓｓｅｍ  ＆  Ｖａｒｎｅｒ，  ｅｄｓ．，  １９９４）等の公表されている幅広い文献にも記載されるような、アグロバクテリウム媒介形質転換、プロトプラストのカチオンもしくはポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、微粒子衝撃、形質転換ＤＮＡで被覆されたマイクロビーズもしくは微粒子を有する溶液中の細胞懸濁液の振とう、直接ＤＮＡ取り込み、リポソーム媒介ＤＮＡ取り込み等を含むが、これらに限定されない、当業者に既知の標準的な植物形質転換方法を使用して生成することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．  （２００１），  ”  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびそこに挙げられる参考文献、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （２０００）も参照されたく、これらの参考文献は、相互参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
形質転換の好ましい方法は、形質転換される植物に依存し得る。アグロバクテリウムベクターは、双子葉植物種を形質転換するために使用される場合が多い。単子葉植物種の形質転換に対しては、形質転換ＤＮＡで被覆された粒子による微粒子銃照射および形質転換ＤＮＡで被覆されたケイ素繊維が、核転換に有用である場合が多い。しかしながら、コムギを含む単子葉植物種のアグロバクテリウム媒介形質転換が現在既知である（例えば、国際特許公報ＷＯ９７／４８８１４を参照のこと。Ｈｉｅｉ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ  （１９９４），  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６（２）：２７１−２８２、および国際特許公報ＷＯ９２／０６２０５も参照のこと）。
【０１５７】
いかなる植物細胞をも、遺伝子操作された植物、植物細胞、植物組織、種子等を生成するために、本発明の方法および材料を使用して形質転換することができる。形質転換した植物細胞は、当技術分野で既知のような従来の方法に従って植物へと成長することができる（例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ（１９８６），  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５：８１−８４）を参照のこと）。得られる植物は、自家受粉する、同一の形質転換した系統または異なる系統で受粉する、または交配することができ、得られる植物は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に関連する望ましい形質、または同定されたその相同体を有する。この表現型性質が安定的に維持されることを確実にするために、２世代以上が成長する場合がある。代替として、栄養繁殖作物において、成熟変異体／遺伝子導入植物は、同一植物を生成するために切断または組織培養技術によって繁殖することができる。変異体／遺伝子導入植物の選抜が実行され得、商業的用途のために、新しい品種が得られ栄養繁殖し得る。
【０１５８】
本発明の方法によって得られる植物から得られる、根、茎、葉、花芽、花、シュート、種子、塊茎、実、および枝を含むが、これらに限定されない、植物部位もまた提供される。
【０１５９】
本発明の方法によって形質転換した植物または植物部位は、形質の発現に基づいて視覚的に同定され得る。より好ましくは、形質転換した植物または植物部位は、特異的オリゴヌクレオチドプローブおよび／または標的遺伝子の増幅を使用した分子分析を使用して同定される。分析される、対象の植物または植物部位からＤＮＡまたはＲＮＡは、相互参照によって本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．  （２００１），  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびそこに挙げられる参考文献、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （２０００）を含む（必ずしもこれらに限定されない）幅広い既知の文献に記載されるような、当業者に既知の数多くの好適な方法によって抽出され得る。Ｌｕｋｏｗｉｔｚ，  Ｗ．，  Ｇｉｌｌｍｏｒ，  ＣＳ．  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｂｌｅ，  Ｗ−Ｒ．  （２０００）  ”Ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：  Ｗｈｙ  Ｉｔ  Ｆｅｅｌｓ  Ｇｏｏｄ  ｔｏ  Ｈａｖｅ  ａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｙｏｕ”  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２３，  ７９５−８０５、およびそこに挙げられる参考文献に記載される方法も参照されたい。
【０１６０】
抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡは、当技術分野で既知のような任意の好適な方法によって、導入遺伝子の有無に関して分析することができ、どの方法／戦略が用いられるかは、望ましい特異性、ならびに好適な配列および／または酵素の利用可能性によって決まることができる。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ方法を使用して分析され、定量ＰＣＲを実行する前にＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅＩで抽出されたＲＮＡを処理することができる。
【０１６１】
ＨＯＧ１の一部を増幅するための好適なプライマー対は、
0005592652.tif 000008
を含む。ＨＯＧ１遺伝子またはその相同体を分析するための他の好適なプライマーまたはプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に基づいて設計され得る。
【０１６２】
ＰＣＲ増幅反応での使用のための方法および試薬は、当業者に公知である。好適なプロトコルおよび試薬は、個々の状況に大きく左右される。手引きは、例えば、相互参照によって本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９），  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｄ．Ｗ．  （２００１），  ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびそこに挙げられる参考文献、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （２０００）等の種々の情報源から得ることができる。当業者はまた、ＰＣＲ反応の種々のパラメータが、望ましい生成物を増幅する能力に影響を及ぼすことなく、変更され得ることを容易に理解するであろう。例えば、用いられるＭｇ２＋濃度および温度は変更され得る。同様に、テンプレートとして使用されるゲノムＤＮＡの量もまた、利用可能なＤＮＡの量に応じて変更され得る。
【０１６３】
別の分析方法は、大きさに基づくＤＮＡ断片の分離のための、当業者によって一般的に使用される技術である、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法等の電気泳動法を含む。ゲル中のアガロースまたはポリアクリルアミドの濃度は、主に、ゲルの分解能力を決定し、したがって、アガロースまたはポリアクリルアミドは、識別されるＤＮＡ断片の大きさによって決まる。
【０１６４】
導入遺伝子またはその相同体の存在の検出および／または決定は、任意の適切なソフトウェアを使用したコンピュータ解析によって支援することができる。決定されたヌクレオチド配列の比較のための好適なソフトウェアパッケージは、当技術分野で公知であり、容易に入手可能である。
【０１６５】
略語
２ｉＰ−２−イソペンテニルアデニン
ＡＨＫ−シロイヌナズナヒスチジンキナーゼ
ＡＨＰ−シロイヌナズナヒスチジンリン酸転移タンパク質
ＡＭＭ−アスパラギン最少培地
ＡＲＲ−シロイヌナズナ応答調節因子
ＡＳ−アンチセンス抑制
Ａ−アデノシン
ＢＡ−ベンジルアデニン
ＢＬＡＳＴ−Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ
ＣＡＢ−クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子
ＣａＭＶ−カリフラワーモザイクウイルス
ＣＲＥ−サイトカイニン応答
ｃＤＮＡ−相補的なデオキシリボ核酸
ＤＮＡ−デオキシリボ核酸
ＥＬＩＳＡ−酵素免疫測定法
ＥＴＲ１、ＥＲＳ２、ＥＴＲ２、およびＥＩＮ４−エチレン受容体
ＦＡＢ−高速原子衝撃
Ｇ−グアニン
ＧＦＰ−緑色蛍光タンパク質
ＨＯＧ１−相同性依存型ジーンサイレンシング１
ＨＳＰ−高スコア配列ペア
ＩＴＣ−等温滴定熱量計
ＫＤ−解離定数
ＫＮＡＴ１−シロイヌナズナの結び目（Ｋｎｏｔｔｅｄ）相同体１
ＬＡＩ−葉面積指数
ＬＡＲ−葉面積比
ｎａＲＮＡ−メッセンジャーＲＮＡ
ＮＣＢＩ−Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ＮＯＳ−ノパリン合成酵素
ＯＣＳ−オクトピン合成酵素
ＯＥ−過剰発現
ＯｓＣＢＰ−オリザサティバサイトカイニン結合タンパク質
ＰＣＲ−ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＮＡ−ペプチド核酸
ＰＥＴＣＢＰ−ペチュニアサイトカイニン結合タンパク質
ＲＮＡ−リボ核酸
ＲＮＡｉ−ＲＮＡ干渉
ＲｕＢｉｓＣｏ−リブロース二リン酸カルボキシラーゼ
ＳＡＨ−Ｓ−アデノシルホモシステイン
ＳＡＭ−Ｓ−アデノシルメチオニン
ｓｉＲＮＡ−低分子干渉ＲＮＡ
ＳＳＣ−１−２ｘ塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム
ＳＡＨＨ−Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ
ＳＬＡ−比葉面積
ＳＴＭ−シュートメリステムレス転写因子
Ｔ−チミン
ＴＤＮＡ−転移ＤＮＡ
Ｔｍ−熱融点
Ｕ−ウラシル
ＷＴ−野生型
ＺＲ−ゼアチンリボシド
【０１６６】
最良の形態
最良の形態を含む限定されない実施例、および比較例が、具体的な実施例を参照することによってより詳細にさらに記載されるが、いかようにも本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１６７】
シロイヌナズナ相同性依存型ジーンサイレンシング１（ＨＯＧ１）は、推定サイトカイニン受容体である
材料および方法
植物材料および成長条件
シロイヌナズナのコロンビア生態型をこの研究に使用した。１６時間の光条件／８時間の暗条件において、２２℃で植物を生育した。実生アッセイのために、種子を表面殺菌し、２日間４℃で暗所において積層し、次に白色光（７５μＥ．ｍ２．ｓ−１）に曝露した。３％のスクロースおよび０．９％の寒天を含むＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地上で、２２℃で苗を生育した。発芽実験に対して、スクロースのないＭＳ培地上で、特定のバッチの種子を播種した。
【０１６８】
シロイヌナズナのプラスミド構成および遺伝子形質転換
全長シロイヌナズナＨＯＧ１ｃＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を５’および３’ＲＡＣＥ戦略によって増幅した。ｃＤＮＡの５’−および３’−ｃＤＮＡ（５’／３’−ＲＡＣＥ）端配列を同定するために、ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。これらのＰＣＲ生成物を配列決定した。シロイヌナズナＨＯＧ１に対する全長ｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を得るために、部分配列およびＲＡＣＥ  ＰＣＲ生成物を整列させた。
【０１６９】
ｐＧｒｅｅｎ０２２９バイナリーベクター（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：７８２７−７８３２，  ２００４）をすべての導入遺伝子構成物に使用した。アンチセンス抑制のために、２つのＳＡＨＨ特性に及ぶＨＯＧ１の８５０ｂｐ断片を使用した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）。過剰発現構成物およびＧＦＰ−ＨＯＧ１構成物に対して、ＨＯＧ１ｃＤＮＡの完全なオープンリーディングフレームを使用した。
【０１７０】
２つのタグ間にＴＥＶ開裂部位を有するＰｒｏｔ  Ａおよびカルモジュリン結合ペプチドタグで、ＴＡＰタグが付いたＨＯＧ１を調製した（Ｆｏｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２１：８９−９２，  ２００３）。アグロバクテリウムツメファシエンス媒介の減圧湿潤方法（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照のこと）によって、構成物をシロイヌナズナに導入した。
【０１７１】
リアルタイムＰＣＲ分析
ＴＲＩｚｏｌ方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、苗から全ＲＮＡを抽出した。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）をメーカーの使用説明書に従って使用して実行した各定量ＰＣＲ反応のために、ＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅＩで処理した全ＲＮＡ（０．５μｇ）を使用した。ＳＹＢＲグリーンを使用して定量リアルタイムＰＣＲを実行した。メーカーのプロトコルに従って、倍率変化の計算のためにチューブリン２のＣｔ値に対してＣｔ値を正規化した。
【０１７２】
等温滴定熱量計（ＩＴＣ）
ＩＴＣ（ＭＣＳＩＴＣ，  Ｍｉｃｒｏｃａｌ，  Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＵＳＡ）によって、ＨＯＧ１とサイトカイニンとの間の相互作用のサイトカイニン結合親和性および熱力学分析を検査した。３つの自然発生的サイトカイニン（ゼアチン、ベンジルアデニン、およびイソペンテニルアデニン）、ならびにチジアズロン（尿素由来の合成サイトカイニン）を使用した。加えて、アデノシンおよびＮＡＤを対照分子として使用し、サイトカイニンへのＨＯＧ１の結合特異性を検証した。ＭＩＣＲＯＣＡＬ  ＯＲＩＧＩＮバージョン２．９により、１つの結合部位に対して最適な非線形最小二乗法を使用して、データを分析した。近似曲線から結合化学量論（ｎ）および会合定数（ＫＡ）を計算した。続いて、ＫＤを１／ＫＡとして計算した。２μＭの精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１を含むサンプル細胞への０．１μＭの精製されたＡＨＰ１の注入から得られたベースラインドリフトに対して、生の熱データを補正した。ＨＯＧ１に添加されるＡＨＰ１のモル比に対して熱ピーク面積をプロットすることによって、結合等温線を作成した。
【０１７３】
ＧＦＰ−ＨＯＧ１融合タンパク質の細胞内局在化
個々の３５Ｓ：ＧＦＰ−ＨＯＧ１融合構成物を発現する遺伝子導入植物をそれらの表現型に従って選抜した。５日齢の苗からの根を根切りし、半強度のＭＳ培地に取り付け、直後に、５０５から５３０ｎｍバンドパスフィルタセットと組み合わせた４８８ｎｍアルゴンレーザーを有する共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＣＬＳＭ  ５１０）を使用した。
【０１７４】
カルスのサイトカイニン反応アッセイ
実生根の断片をカルス誘導培地（０．５μｇ／ｍｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸および０．０５μｇ／ｍｌのキネチンを添加したＭＳ培地）上で４日間インキュベートした。得られたカルスを、Ｉｎｏｕｅらの方法（Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１０６０−１０６３，  ２００１）に従って、１０日間隔で新鮮培地に継代培養しながら、シュート誘導培地（０．２μｇ／ｍｌのインドール酪酸および種々の濃度のゼアチンを添加したＭＳ培地）上で３０日間インキュベートした。
【０１７５】
サイトカイニン含有量およびＳＡＨＨ酵素アッセイ
サイトカイニンを１００％のメタノールで全植物から抽出し、Ｙａｎｇら（ＦＥＢＳ  ５５５：２９１−２９６，  ２００３）に記載されるように、イソペンテニルアデノシンおよびゼアチンリボシド検出キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して定量化した。Ｒｏｃｈａら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：４０４−４１７，  ２００５）に記載されるように、抽薹植物の粗タンパク質抽出物に対してＳＡＨＨ分光光度アッセイを実行した。
【０１７６】
サイトカイニン一次応答遺伝子の発現
サイトカイニン誘導性遺伝子発現の定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析のために、３％の（ｗ／ｖ）スクロースを含むＭＳ培地上で種子を発芽させ、６日間生育した。５分、１５分、３０分、または１時間、０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、または５μＭ［０．１％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で可溶化し、ＭＳ培地で希釈した］を添加した同一のＭＳ＋スクロース液体培地（寒天を含まない）において苗をインキュベートすることによって、サイトカイニン処理を実行した。対応する期間、ＤＭＳＯ（０．１％、処理のためにサイトカイニンを溶解するために使用される濃度）で対照苗をインキュベートし、発現解析に使用した。ＲＮＡ調製前に、ＷＴ、ＯＥ、およびＡＳ苗を混合し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）中に保存した。Ｒｎｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。ＳＹＢＲグリーンＲＴ−ＰＣＲ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＢＡおよびＤＭＳＯの存在下、また非存在下で、ＷＴ、ＯＥ、およびＡＳ苗の生物学的複製のそれぞれに存在する転写物の数を、３つの独立した複製から決定した。メーカーの使用説明書に従って（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）、転写物の誘導率を計算した。
【０１７７】
ＴＡＰ−ＨＯＧ１およびＡＨＰ１の相互作用研究
すでにＦｏｒｌｅｒら（上記を参照のこと）に記載されるように、ＰｒｏｔＡおよびＣＢＰタグを使用して、ＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質複合体を精製した。ＰｒｏｔＡプルダウンのために、ＩｇＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｂｅａｄｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃１７−０９６９−０１）を使用し、ＣＢＰプルダウンのために、カルモジュリン親和性樹脂（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＃２１４３０３−５２）を使用した。ウエスタンブロット分析のために、標準的なプロトコルを使用して、精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜にブロットした。さらに、プルダウンしたＨＯＧ１複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供し、得られた顕著なバンドを同定するためにＮ末端配列決定を行った。ＡＨＰ１は、主要な推定相互作用タンパク質バンドであるため、ＡＨＰ１に対するｃＤＮＡをシロイヌナズナからクローニングし、組み換えＡＨＰ１を６Ｈｉｓタグおよびチオレドキシンタグで大腸菌ＢＬ２１において発現した（発現ベクターＰＥＴ３２ＥＫ／ＬＩＣにおいて、Ｎｏｖａｇｅｎ）。ＨＩＳタグ親和性カラム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して、タグを有する組み換えＡＨＰ１を精製した。上記に概説されるように、ＩＴＣ（ＭＣＳ−ＩＴＣ，  Ｍｉｃｒｏｃａｌ，  Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＵＳＡ）を使用して、タンパク質相互作用（ＨＯＧ１−ＡＨＰ１）研究を実行した。
【０１７８】
結果および考察
本発明者らは、植物発達のサイトカイニンシグナル伝達および調節へのＨＯＧ１の関与を分析するために、アンチセンス抑制および過剰発現戦略を使用した。
【０１７９】
ＨＯＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のｃＤＮＡクローンは、植物および動物のいくつかの種からのＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨＨ）との有意な配列相同性を示した。いくつかの植物種からの単離された相同体との比較は、ＨＯＧ１が、多様な植物種に保存されていることを示した（図６）。特に、ペチュニア（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）における相同対は、ＨＯＧ１と７８％の配列相同性を共有し、タバコ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）における相同対は、ＨＯＧ１と７８％の配列相同性を共有し、オリザサティバ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）における相同対は、ＨＯＧ１と８２％の配列相同性を共有し、トリチカムエスチバム（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）における相同対は、ＨＯＧ１と８３％の配列相同性を共有した。
【０１８０】
ＨＯＧ１のサイトカイニン結合親和性を検査するために、トランスジェニックシロイヌナズナ（３５Ｓ：ＴＡＰ−ＨＯＧ１を有する）からＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質を精製し、タンパク質−タンパク質相互作用研究にも使用した。遺伝子導入植物が、ＨＯＧ１過剰発現系統のものと同一の表現型を示したため、タグが付いたタンパク質は機能していることを示した。タンパク質Ａ（Ｐｒｏｔ−Ａ）およびＣＢＰ（カルモジュリン結合ペプチド）タグを使用して、タンパク質を精製した。精製後に、タンパク質は、ＴＡＰタグのＣＢＰ部分を保持し、６０ｋＤａの大きさをもたらした一方で（図１Ａ差し込み図）、ＴＡＰタグのＣＢＰ部分を有しないＨＯＧ１のみは、５６ｋＤａであるはずである。
【０１８１】
（ａ）ＨＯＧ１は、高親和性でサイトカイニンと結合する
サイトカイニン分子は、精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１および種々のサイトカイニンの等温滴定熱量計（ＩＴＣ）によって示されるように、効率的に精製されたタンパク質と結合する。リガンド受容体結合反応速度を研究するために使用したＩＴＣという生物物理学的技術は、結合親和性（ＫＡ）を含む相互作用の重要な熱力学パラメータ、したがって、解離定数（ＫＤ）および結合化学量論（ｎ）を得る。
【０１８２】
サイトカイニン分子（ゼアチン、ベンジルアデニン、およびイソペンテニルアデニン）、ならびにチジアズロン（サイトカイニン活性を有する合成尿素由来分子）を結合研究のために使用した。アデニンおよびＮＡＤを対照として使用し、ＨＯＧ１の結合特異性を決定した。
【０１８３】
ＩＴＣによって決定される結合化学量は、２つのＨＯＧ１単量体が、１つのサイトカイニン分子を結合させるが（２：１の化学量）（図１Ａ〜１Ｃ）、チジアズロンを結合させないことを示した（図１Ｂおよび１Ｃ）。これは、サイトカイニンを結合させるＨＯＧ１の特異性を示す。
【０１８４】
図１Ｃから分かるように、解離定数（ＫＤ）は、試験された異なるサイトカイニンに対して、１６．９から２０．６ｎＭに及んだ。さらに、アデニンに対するＫＤは、２．１μＭであり、サイトカイニン分子に対してよりもアデニンに対して、有意に低いＨＯＧ１の親和性を示唆する。これは、いくつかの組織培養において比較的高濃度で使用される場合に、アデニンが弱いサイトカイニン応答のみを引き出すという事実と一致している。
【０１８５】
ＮＡＤ＋は、ＳＡＨＨの既知の補因子でるため、ＩＴＣによるＨＯＧ１およびＮＡＤ＋複合体のＫＤ値を測定し、３９．５μＭであることが分かり（図１Ｃ）、ＨＯＧ１が、サイトカイニン受容体であり、機能的なＳＡＨＨ酵素である可能性が低いことをさらに示唆する。
【０１８６】
（ｂ）ＨＯＧ１は、原形質膜上に局在している
Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ｗｗｗ．ｃｕｂｉｃ．ｂｉｏｃ．ｃｏｌｕｍｂｉａ．ｅｄｕ）からのＰＨＤｈｔｍウェブ資源を使用して、ＨＯＧ１タンパク質に対するドメイン検索を実施した。検索は、ＨＯＧ１タンパク質が、典型的な受容体様構造を有することを示した。ＨＯＧ１タンパク質は、予測膜貫通ヘリックス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基５９から７６から１８個のアミノ酸に及ぶ）を有し、予測サイトカイニン結合ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基７７から４８５から４０９個のアミノ酸に及ぶ）が膜の外側に存在する。タンパク質はまた、下流シグナル伝達中間体との相互作用に対して、細胞質内に推定部位を有し、Ｎ末端において５８個のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の残基１から５８）を含む。
【０１８７】
ＨＯＧ１タンパク質の細胞内局在化を物理的に決定するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−ＨＯＧ１融合を発現するトランスジェニックシロイヌナズナ植物を生成した。単離された７つの独立したＧＦＰ系統のうち、２つを分析のために選抜した。ＧＦＰ−ＨＯＧ１融合タンパク質を発現するＴ３世代遺伝子導入植物は、ＨＯＧ１過剰発現系統と同一の表現型を示し（図１Ｄ）、融合タンパク質がその機能を保持したことを示す。
【０１８８】
選抜された系統からの、半強度のＭＳ培地に取り付けた、根切りしたばかりの根の共焦点レーザー顕微鏡法は、ＧＦＰ−ＨＯＧ１が原形質膜上に位置することを示し（図１Ｅ）、ＨＯＧ１がサイトカイニンに対する膜受容体であることを示唆する。対照として、シロイヌナズナに関する以前の報告を使用したが、３５Ｓ：ＧＦＰは、細胞質および核において極めて均一に発現されることが示されている（Ｚｈａｎｇ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：１３０６−１３１６，  ２００５）。配列分析に基づいて、ヘリックス膜貫通領域（１８個のアミノ酸に及ぶ）は、ＨＯＧ１および別の植物相同体において存在するが、ヒトおよびラットＳＡＨＨにおいては存在せず（図６）、その両方は、細胞質タンパク質である（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ  ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３：１９７８８−１９７９３）。さらに、活性ＳＡＨＨ酵素は、酵素が、種々の細胞コンパートメントにおいて起こるメチル化反応と密接に関連しているため、原形質膜結合性のままでいるよりもむしろ、可溶性タンパク質になることが予測される。したがって、ＧＦＰ−ＨＯＧ１を用いた本実験の結果は、ＨＯＧ１タンパク質が膜受容体であることを示唆する。
【０１８９】
（ｃ）ＨＯＧ１過剰発現およびアンチセンス抑制植物は、反対の表現型を示す
定量リアルタイムＰＣＲ分析は、ＨＯＧ１が、葉および花序茎において比較的高いレベルで、シロイヌナズナにおいて構成的に発現されることを示した（図１Ｆ）。これは、ＨＯＧ１が、植物発達の調節において基本的な役割を果たす可能性があることを示唆する。
【０１９０】
植物成長および発達へのＨＯＧ１発現量の調整の効果を検査するために、種々のＨＯＧ１過剰発現およびアンチセンス抑制系統を生成した。種々のＨＯＧ１過剰発現系統が、野生型と比較して、ＨＯＧ１転写レベルにおいて３から２０倍の増加を示した一方で（図２Ａ）、アンチセンス系統は、２から１０倍の抑制を示した（図２Ｂ）。
【０１９１】
導入遺伝子発現は、植物発達のすべての期に影響を及ぼし、いくつかの独立したトランスジェニック系統において一貫した表現型を示した（図２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆ）。２８個の独立したトランスジェニック過剰発現系統および２１個のアンチセンス抑制系統に対して表現型を記録し、変化が、導入された遺伝子産物によって引き起こされたというさらなる裏付けを提供した。種子発芽は、野生型と比較して、過剰発現系統において４から５日早く、野生型と比較して、アンチセンス抑制系統においてほぼ５日遅く発生した（表１）。それにもかかわらず、過剰発現系統の発芽直後に、有意な成長遅延が認められた。新しいロゼット葉の形成および展開もまた、過剰発現系統における全栄養成長にわたって遅延および制限された。
【０１９２】
（表１）種子発芽、開花の開始、および老化
0005592652.tif 000009
５つの独立した系統を各観察に使用した。各系統に対して、データは、３つの独立した複製からの平均である。アンチセンス系統は、発芽の遅延、抽薹の遅延、および老化の遅延を示した。
【０１９３】
アンチセンス抑制系統は、種子発芽の遅延にもかかわらず、シュートの生長の遅滞は示さなかった。開花の早期開始は、抽薹時に少なくとも８および１４枚の葉をそれぞれ有する野生型シロイヌナズナおよびアンチセンス系統（図３Ｂ、表１）と比較して、４ロゼット葉期において抽薹を有する過剰発現遺伝子導入植物において認められた（図３Ａ、表１）。
【０１９４】
開花の開始後に、過剰発現系統は、葉バイオマスのそれ以上の増加は示さず、これらの系統に対して、老化が始まった３０日の成長後でさえ、腋生花序の枝は形成されなかった（図３Ｃ）。対照的に、アンチセンス系統は、腋生花序の枝の大量成長を示し、老化は、その期間中にこれらの系統において明白ではなかった（図３Ｃ）。アンチセンス系統はまた、最大の葉面積（１葉当たり２．９４＋０．１５ｃｍ２）を有した。葉面積は、過剰発現系統（０．３８＋０．０６ｃｍ２）および野生型植物（１．００±０．０６ｃｍ２）において有意に低かった（図３Ｄ、表２および３）。植物の全高、長角果の大きさ、ならびに結果として、１長角果当たりの種子数および種子重量は、過剰発現系統において有意に減少したが（表２および３）、アンチセンス抑制系統における長角果の長さは、野生型のものよりも有意に高かった（図３Ｅ）。トランスジェニック系統において、葉面積と１長角果当たりの種子重量との間、ならびに葉面積と１長角果当たりの種子数との間に正相関があった（表３）
【０１９５】
（表２）葉面積、１長角果当たりの種子重量および種子数
0005592652.tif 000010
データは、３つの独立した複製からの平均±標準偏差を表す。５つの独立した系統をそれぞれの場合に使用した。アンチセンス系統は、野生型と比較して、葉バイオマスにおいて３倍の増加および種子収量において２倍の増加を有した。
【０１９６】
（表３）バイオマスおよび種子収量に寄与するパラメータのピアソンの相関係数（ｒ）
0005592652.tif 000011
葉面積（ｃｍ２）×１長角果当たりの種子重量（ｍｇ）（ａ）、葉面積（ｃｍ２）×１長角果当たりの種子数（ｂ）、および１長角果当たりの種子重量（ｍｇ）×１長角果当たりの種子数（ｃ）で相関係数を検証した。相関分析後に、スチューデントのｔ検定を実行した。ｔ検定値を括弧内に示す。「ｒ」値は、すべての試験における正相関を示す。これに基づいて、ＨＯＧ１のアンチセンス抑制は、葉バイオマスおよび種子収量に寄与する主要パラメータの増加をもたらすことが予測される。
【０１９７】
過剰発現系統は、野生型植物と比較して早く成熟し、過剰発現系統は、野生型植物よりもほぼ１週間早く成熟したが（図３Ａ）、アンチセンス抑制系統は、野生型よりもほぼ２週間遅れて成熟した。さらに、老化は、野生型シロイヌナズナと比較して、ＨＯＧ１のアンチセンス抑制系統において、２週間遅延した（図３Ｃ、表１）。
【０１９８】
ＨＯＧ１のサイトカイニン受容体としての役割を研究するために、トランスジェニックＨＯＧ１植物のカルス培養を、ＣＲＥ１の研究（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照のこと）と同様に、外因性サイトカイニンに対するそれらの感受性に対して検査した。全植物における茎頂分裂組織とは異なり、カルス培養は、培養液中に提供される外因性サイトカイニンに応答する可能性を有し、無傷植物にあるようなホルモンの長距離輸送に依存しない。ＨＯＧ１過剰発現系統および野生型からのカルス培養は、通常の細胞増殖および不定芽誘導を示した（図３Ｆ）。対照的に、アンチセンスＨＯＧ１系統からのカルスは、添加されたゼアチンのすべての濃度において、強いサイトカイニン非感受性表現型、すなわち、細胞増殖の欠如および不定芽誘導の不足を示した（図３Ｆ）。これらのデータは、ＨＯＧ１が、サイトカイニン応答の正の調節因子として機能することを示す。
【０１９９】
（ｄ）遺伝子導入植物の対照的な表現型は、内在性サイトカイニンレベルと相関性を有する
ＡＨＫ型サイトカイニン受容体の三重機能喪失変異体は、このＨＯＧ１のアンチセンス抑制で認められるものと反対の表現型をもたらした（Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：８８２１−８８２６，  ２００４）。この相反する表現型は、過剰発現系統におけるＨＯＧ１タンパク質によるサイトカイニンの移行の潜在的な障害によって説明され得る。
【０２００】
野生型、過剰発現、およびアンチセンス抑制系統の３つ独立した系統のそれぞれに対して、内在性サイトカイニン含有量を決定した。測定した異なるサイトカイニンの濃度は、野生型と比較して過剰発現系統において有意に減少した（図３Ｇ）。イソペンテニルアデニンは、シロイヌナズナの主要サイトカイニンであり、その濃度は、野生型のものと比較して過剰発現系統において約６０％減少した（図３Ｇ）。特に、サイトカイニンが根から茎頂分裂組織に移行しなければならないという理由から、過剰発現系統におけるタンパク質のより高い利用可能性は、原形質膜にわたってサイトカイニンの輸送の障害となり得る。これは、観察されるように、明らかな機能喪失表現型、すなわち、植物高の減少および植物バイオマスの不足をもたらす（図３Ａ）。
【０２０１】
対照的に、アンチセンス系統において、イソペンテニルアデニンの濃度は、野生型と比較して６０％を超えて増加し、過剰発現系統に対して４倍以上の増加に相当する（図３Ｇ）。これは、大量分枝およびバイオマスの有意な増加の反対の表現型をもたらした。
【０２０２】
これを実験的に試験するために、トランスジェニック系統の表現型へのサイトカイニンの外からの添加の効果を研究した。幼苗期から１日おきに０．０１μＭのゼアチンまたは０．０１μＭのキネチン噴霧を受けた過剰発現系統は、４葉期において抽薹した未処理の過剰発現系統と比較して、６から７葉期において抽薹を示した（図２Ｇ、２Ｈ、２Ｉ、２Ｊ、および図７）。野生型シロイヌナズナは、約８葉期において抽薹し、過剰発現系統が、サイトカイニンの外からの添加によって「部分的に救出された」ことを示した。
【０２０３】
さらに、アンチセンス抑制系統は、サイトカイニンの外からの添加に反応した有意な変化は示さず（図７）、サイトカイニンの移行の障害が、われわれの研究において認められた相反する表現型に関与する可能性が高いという見解を裏付けた。
【０２０４】
（ｅ）精製されたＨＯＧ１は、ＳＡＨＨ酵素活性を欠いている
ｈｏｇ１点変異体が、野生型のものと比較して、粗タンパク質抽出物においてわずかに低いＳＡＨＨ活性を有したという以前の報告（Ｒｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １７：４０４−４１７，  ２００５）にもかかわらず、野生型（２．９２±０．１５ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇのタンパク質）、アンチセンス（２．８４±０．２１ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇのタンパク質）、および過剰発現系統（３．０２±０．１９ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｇのタンパク質）からの粗タンパク質抽出物におけるＳＡＨＨ活性に有意差はなかった。さらに重要なことに、本データは、精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質が、ＳＡＨＨ酵素活性を欠いていることを示した（図３Ｈ）。これらの結果は、このＨＯＧ１タンパク質が、サイトカイニン受容体であり得ることを示唆する。
【０２０５】
さらに、点変異体（ｈｏｇ１−１）の粗タンパク質抽出物において測定されたＳＡＨＨ活性のわずかな差は、別の何らかの遺伝子座によって左右され得ることが、Ｒｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ（上記を参照のこと）において強調された。加えて、ＳＡＨＨ活性の減少は、ＳＡＨレベルの増加およびＳＡＭ：ＳＡＨの比の減少をもたらすはずである。しかしながら、ｈｏｇ１−１ホモ接合体が、ＳＡＨレベルにおける有意な増加を示し、ＳＡＭ：ＳＡＨの比の変化が比較的小さかったことが示された。これらの変異体に示されるゲノムワイドな低メチル化もまた、ＳＡＭ：ＳＡＨの比が未処理の材料と比較して３００倍減少した場合のみ発生した、（Ｓ）−９−（２，３−ジヒドロキシプロピル）アデニンによって誘導された浮遊培養物におけるタバコゲノムの低メチル化とは対照的であった。これらの結果は、植物におけるＳＡＨＨと配列相同性を有するサイトカイニン結合タンパク質が、活性ＡＨＨ酵素である代わりに、サイトカイニン受容体であり得ることを示唆した。
【０２０６】
（ｆ）ＨＯＧ１は、サイトカイニン一次応答遺伝子の発現に影響を及ぼす
組織培養反応は、ＨＯＧ１がサイトカイニン応答の正の調節因子であるという見解を裏付けているが、６週間にわたる試験管内増殖を伴い、その間に、別のプロセスが表現型に寄与した可能性もある。したがって、比較的短い期間において、サイトカイニンによって直接誘導されることが既知である、選択された遺伝子の発現も検査した（図４Ａ、４Ｂ、および表４）。これらの遺伝子は、ＫＮＡＴ１およびＳＴＭ（メリステム機能に関与するホメオボックス遺伝子、外因性サイトカイニンの添加後５分以内に誘導された）、ならびにＡＲＲ４、ＡＲＲ５、およびＡＲＲ６（サイトカイニンによって誘導されたＡ型応答調節因子）を含んだ。サイトカイニン（ベンジルアデニン、ＢＡ、０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、または５μＭにおいて）でのパルス処理前後に、野生型、ＨＯＧ１過剰発現、およびＨＯＧ１アンチセンス抑制系統の苗からのＲＮＡを使用して、定量リアルタイムＰＣＲ分析を実行した。いくつかの時間間隔（５分、１５分、３０分、および１時間）にわたって採取した組織に対してＲＮＡ抽出を実行した。ＢＡの添加は、ＫＮＡＴ１およびＳＴＭ転写物の用量依存的な増加をもたらし、系統におけるＨＯＧ１の発現レベルおよび内在性サイトカイニン濃度に比例していた（図４Ａ、４Ｂ、表４）。ＨＯＧ１アンチセンス抑制系統におけるＢＡ処理を行わない場合も、ＫＮＡＴ１およびＳＴＭの転写レベルは、６から８倍有意に上方制御されたが、未処理の過剰発現系統は、未処理の野生型と比較して、これらの転写物の４から７倍の減少を示した（図４Ａ）。しかしながら、５μＭのＢＡの添加後１時間以内に、過剰発現系統（例えば、ＯＥ１およびＯＥ１２）は、未処理の野生型植物のものと比較して、ＫＮＡＴ１およびＳＴＭ転写物のレベルにおいて有意差を示さなかった（図４Ａ、表４）。これは、この系統が内在性サイトカイニンレベルの減少を有するという知見と一致している。
【０２０７】
（表４）選択されたサイトカイニン応答性遺伝子の定量リアルタイムＰＣＲ分析
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サイトカイニン（ベンジルアデニン、ＢＡ、０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、または５μＭにおいて）でのパルス処理前後の、野生型、ＨＯＧ１過剰発現、およびアンチセンス抑制系統の苗からのＲＮＡ。３つの独立したアンチセンス抑制（ＡＳ１、ＡＳ８、ＡＳ２１）および過剰発現（ＯＥ１、ＯＥ１２、ＯＥ１８）系統から、いくつかの時間間隔（５分、１５分、３０分、および１時間）にわたって採取した組織に対して、ＲＮＡ抽出を実行した。分析した遺伝子は、ＫＮＡＴ１、ＳＴＭ（メリステム機能に関与するホメオボックス遺伝子）、ＡＲＲ４、ＡＲＲ５、およびＡＲＲ６（サイトカイニンによって誘導されたＡ型応答調節因子）を含んだ。ＢＡの添加は、ＫＮＡＴ１およびＳＴＭ転写物の用量依存的な増加をもたらした（倍率変化値の隣の矢印は、上方制御↑または下方制御↓を示す）。ＡＲＲ１、ＡＲＲ２（Ｂ型応答調節因子）、ＡＨＫ２、ＡＨＫ３、ＡＨＫ４（ヒスチジンキナーゼサイトカイニン受容体）も分析した。しかしながら、これらの遺伝子が発現において２倍未満の変化を示したため、データはこの表に示していない。
【０２０８】
検査された遺伝子の発現レベルは、約４倍高い内因性濃度のサイトカイニンを有ルスアンチセンス系統において、３から６倍高かった。したがって、ＨＯＧ１発現は、これらの植物においてサイトカイニン応答と相関することが示された。これは、ＳＴＭおよびＫＮＡＴ１の両方の発現が、過剰発現する細菌ｉｐｔ遺伝子によって引き起こされたサイトカイニン生合成の増加を有するシロイヌナズナ植物において有意に増加したという以前の報告と同様である（Ｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １８：５５７−５６３，  １９９９）。これらの知見は、植物発達中のサイトカイニン応答へのＨＯＧ１の直接関与を示す。
【０２０９】
加えて、ＨＯＧ１トランスジェニック系統の表現型が、サイトカイニンシグナル伝達に関連していたかどうかを決定するために、サイトカイニンによって誘導された前初期遺伝子の最もよく知られているクラス、すなわち、Ａ型ＡＲＲ遺伝子のＡＲＲ４、ＡＲＲ５、およびＡＲＲ６を研究した（図４Ｂ）。本データは、これらの遺伝子が、単一のサイトカイニンパルス処理後数分間のうちに上方制御されたことを示し、シロイヌナズナにおける以前の知見と一致している（Ｂｒａｎｄｓｔａｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｅｂｅｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：１００９−  １０２０，  １９９８、Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ  ａｔ  ｅｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２４：１７０６−１７１７，  ２０００、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４２９：２５９−２６２，  １９９８、Ｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １６：６５８−６７１，  ２００４）。
【０２１０】
内在性サイトカイニンレベルの有意な減少を有するＨＯＧ１過剰発現系統（例えば、ＯＥ１２）（図３Ｇ）が、研究された３つのＡ型ＡＲＲ遺伝子の発現量において、３から９倍の減少を示したことが分かった。これは、ＢＡ処理によって大幅に克服することができ、一次サイトカイニンシグナル伝達経路を通じたフラックスの減少と一致している。同様に、より高い内在性サイトカイニンレベルを有するアンチセンスＨＯＧ１系統（例えば、ＡＳ８）は、相応してより高いＡＲＲ発現レベル（４から９倍の増加）を有した（図４Ｂおよび表４）。これらのデータは、Ａ型ＡＲＲ遺伝子が新規サイトカイニン受容体ＨＯＧ１の下流にあることを示す。同様に、ＡＲＲ６は、ＣＲＥ１の過剰発現系統において、外因性サイトカイニンに応答して誘導されることがすでに示されており、ＡＲＲ６がサイトカイニン受容体であることを確認した（Ｈｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｅｅｎ  Ｎａｔｕｒｅ  ４１３：３８３−３８９，  ２００１）。
【０２１１】
さらに、Ａ型ＡＲＲの知見が特異的応答であることを確実にするために、これらのトランスジェニック系統における２つのＢ型ＡＲＲ（ＡＲＲ１およびＡＲＲ２）の転写レベルを研究した。ＡＲＲ１およびＡＲＲ２は、この実験条件下でＢＡ処理の有意な影響を受けず（表４）、過去の結果と一致している（Ｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：２６９１−２６９６／  １９９８；  Ｋｉｂａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４０：７６７−７７１，  １９９９；  Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８：３０７３−３０８７，  ２００６）。
【０２１２】
ＡＨＫ型サイトカイニン受容体、すなわち、ＡＨＫ２、ＡＨＫ３、およびＣＲＥ１／ＡＨＫ４の関与を除外するために、異なるトランスジェニック系統におけるそれらの転写レベルを決定した。野生型のものと比較して、ＨＯＧ１過剰発現およびアンチセンス抑制系統において有意差は見られず（データは図示せず）、ＨＯＧ１が、これらの３つの既知のサイトカイニン受容体とは無関係に作用することを示す。
【０２１３】
（ｇ）ＴＡＰ−ＨＯＧ１は、ＡＨＰ１と相互作用する
ＨＯＧ１タンパク質によって形成されるシグナル伝達複合体を決定し、サイトカイニン受容体としてのその役割をさらに裏付けるために、ＨＯＧ１と相互作用するタンパク質を単離および同定した。
【０２１４】
Ｎ末端ＴＡＰタグ（ＴＡＰ−ＨＯＧ１）でＨＯＧ１を発現する６つの独立したトランスジェニックシロイヌナズナ系統を生成した。これらの植物は、ＨＯＧ１過剰発現系統と同一の表現型を有し、融合タンパク質が植物において機能していることを示した。３週齢のＴＡＰ−ＨＯＧ１遺伝子導入植物からの全タンパク質抽出物に対して、プルダウンアッセイを実行した。これらの植物におけるＴＡＰ−ＨＯＧ１融合タンパク質の存在を検出するために、ＰＡＰ抗体を使用して免疫ブロット分析を実行した際に、７１ｋＤａのタンパク質バンドを検出した（図４Ｃ）。ＨＯＧ１の予測分子量は５６ｋＤａであり、タグは１５ｋＤａであり、したがって、７１ｋＤａの融合タンパク質バンドとなる。Ｆｏｒｌｅｒらの方法（上記を参照のこと）を使用して、タグおよびＩｇＧビーズを使用して、ＴＡＰ−ＨＯＧ１とのタンパク質複合体を全タンパク質抽出物から溶出させた。タンパク質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、顕著なタンパク質バンドのＮ末端配列決定は、それがＡＨＰ１であったことを明らかにした。続いて、シロイヌナズナからのＰＣＲによって、ＡＨＰ１に対するｃＤＮＡをクローニングし、組み換えＡＨＰ１を大腸菌において発現した（図４Ｄ）。ＡＨＰ１は、精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質と直接相互作用することが、ＩＴＣを使用して示された（図４Ｅ）。ＩＴＣにおいて２つの精製されたタンパク質によって形成された複合体に対する解離定数ＫＤ値は、２３．８ｎＭであった。
【０２１５】
シロイヌナズナヒスチジンリン酸転移タンパク質（ＡＨＰ１、ＡＨＰ２、ＡＨＰ３、ＡＨＰ４、およびＡＨＰ５）は、膜受容体と核応答調節因子との間で細胞質の核シャトルとして機能するため、サイトカイニンシグナル伝達の重要な中間体である。ＨＯＧ１がＡＨＰ１と相互作用し、サイトカイニンシグナル伝達の重要な中間体であるという実証は、ＨＯＧ１タンパク質の受容体機能をさらに確認した。
【０２１６】
本データは、ＨＯＧ１が、以前に記載されたＡＨＫファミリー受容体に加えて、新規サイトカイニン受容体であることを示す。カイラン、菊、アマランサス、およびイネから、いくつかの相同体を単離した。これは、ＨＯＧ１が多様な植物種中に存在し、植物発達の調節において重要であることを示す。上記のサイトカイニンシグナル伝達経路は、バクテリアの２成分反応系と類似したリン酸リレー経路である。これは、サイトカイニンが、植物発達の調節においていくつかの役割を果たし、２つ以上の種類のサイトカイニン受容体の存在が、そのような多面的機能を高めることができたという事実と一致している。そのような現象は、２つ以上の受容体（例えば、ＥＴＲ１、ＥＲＳ２、ＥＴＲ２、およびＥＩＮ４）が関与する、エチレンシグナル伝達においても認められている。さらに、すべての植物部位におけるＨＯＧ１の構成的発現は、植物発達におけるタンパク質の重要な役割を示唆する。
【０２１７】
別の受容体がサイトカイニンに対して存在し得るという可能性は、ヒスチジンキナーゼサイトカイニン受容体の三重変異体（ｃｒｅｌ−１２ａｈｋ３−３ａｈｋ２−２（Ｃｏｌ））が、極度の矮性および不稔の表現型を有してはいるが、植物を生成したという知見に基づいて強調された。３つのＡＨＫ型サイトカイニン受容体における機能喪失変異体は、このＨＯＧ１遺伝子のアンチセンス抑制で認められるものと比較して、反対の表現型をもたらした。本研究において認められた相反する表現型は、シュートにおける内在性サイトカイニンレベルの変化の結果であると考えられる。ＨＯＧ１タンパク質によるサイトカイニン分子の高親和性結合は、低ＫＤ値によって示された。本研究に使用された強プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）の２つのコピーによって、遺伝子が有意に発現された場合、タンパク質の得られた増加および異所性発現は、利用可能な遊離サイトカイニンの有意な減少をもたらした（図３Ｇ）。これは、原形質膜にわたってサイトカイニンの輸送の障害として機能するタンパク質による可能性がある。これは、茎頂が根端（サイトカイニン生合成の主要部位）からサイトカイニンを受容する必要があるので、重要である。これは、明らかな機能喪失表現型、すなわち、植物高の減少および植物バイオマスの不足をもたらした。
【０２１８】
対照的に、アンチセンス植物において、茎頂分裂組織の利用可能な遊離サイトカイニン分子における有意な増加があり、大量分枝およびバイオマスの有意な増加の反対の表現型をもたらす（図３Ｇ）。
【０２１９】
植物におけるＴＡＰタグタンパク質精製の適用は、タバコにおける抵抗性タンパク質Ｃｆ９およびシロイヌナズナにおけるＣＴＲ１タンパク質を含む、いくつかのタンパク質複合体の特性化を可能にした。本研究は、シロイヌナズナヒスチジンリン酸転移（ＡＨＰ１）をＨＯＧ１と相互作用するタンパク質として同定し、ＡＨＰ１がＨＯＧ１に対する下流シグナル伝達中間体であることを示す。組み換えＡＨＰ１が発現され、精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質と直接相互作用することが示された。ＩＴＣにおいて２つの純タンパク質によって形成された複合体に対する解離定数値は、２３．８ｎＭであり、ＨＯＧ１の受容体機能に対する重要な裏付けを提供する。
【０２２０】
（ｈ）サイトカイニンシグナル伝達経路に対する新しい受容体としてのＨＯＧ１
サイトカイニン応答を媒介するための新しいサイトカイニン受容体ＨＯＧ１の役割をよりよく理解するために、サイトカイニンによって誘導された一次応答遺伝子、すなわち、Ａ型ＡＲＲ遺伝子（すなわち、ＡＲＲ４、ＡＲＲ５、およびＡＲＲ６）を分析した。ＡＲＲの発現量の変化は、図４Ｂおよび表４に見られ、ＨＯＧ１アンチセンスおよび過剰発現系統における測定されたサイトカイニン含有量に加えて、内在性サイトカイニンへの応答が、ＨＯＧ１の影響を受けることを示唆する。これは、ＨＯＧ１タンパク質を新しい受容体として、およびＡＲＲをＡＨＰ１に沿ったＨＯＧ１サイトカイニンシグナル伝達経路の下流シグナル伝達カスケードメンバーとして確認する。
【０２２１】
したがって、本データは、すでに記載された２成分系に加えて、シロイヌナズナにおけるＨＯＧ１を介したサイトカイニンシグナル伝達経路を提供する（図５）。以前に報告されたヒスチジンキナーゼ受容体の遺伝子修飾は、ＨＯＧ１のアンチセンス抑制とは異なり、栄養成長および生殖成長に影響を与えることが示されなかったことに留意することが重要である。本データは、この受容体が、バイオマスおよび穀粒収量の増加のための作物の生物工学的な改良に対する主要な標的としての機能を果たすことを示す。
【実施例２】
【０２２２】
推定サイトカイニン受容体に対する遺伝子のアンチセンス抑制によるイネにおけるバイオマスおよび穀粒収量の増加
材料および方法
植物材料
イネ、オリザサティバジャポニカ種に対して、栽培品種日本晴を使用した。これは、日本由来の市販品種である。別のイネ栽培品種（インディカ種）に対しても同様の研究が実行され得る。野生型シロイヌナズナ種子をＬＥＨＬＥ種子から得た（１１０２  Ｓｏｕｔｈ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｌｖｄ．，  Ｓｕｉｔｅ  Ｄ，  Ｒｏｕｎｄ  Ｒｏｃｋ  ＴＸ  ７８６８１  ＵＳＡ）。
【０２２３】
細菌株
この研究においてＤＮＡクローニングのために使用した細菌株は、大腸菌ＤＨ５αであり、別段の指示がない限り３７℃で液体ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）中で増殖させた。使用したアグロバクテリウムツメファシエンス株は、ＧＶ３１０１（Ｋｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，  １９８６）であった。
【０２２４】
遺伝子をクローニングするための縮重プライマーを有するＰＣＲ
ＲＮＡ抽出後に、ＡＭＶ（ニワトリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、逆転写（ＲＴ）を実行した。ｃＤＮＡ生成物を、縮重プライマー
0005592652.tif 000015
を使用したＰＣＲに使用し、シロイヌナズナおよびイネから部分断片を単離した。ＰＣＲ断片をクローニングおよび配列決定した。
【０２２５】
５’−および３’−ｃＤＮＡ末端の迅速増幅
ＳＭＡＲＴＴＭ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、ｃＤＮＡの５’−および３’−ｃＤＮＡ（５’／３’−ＲＡＣＥ）端配列を同定した。これらのＰＣＲ生成物を配列決定した。部分配列およびＲＡＣＥ  ＰＣＲ生成物を合わせて整列し、シロイヌナズナ（ＨＯＧ１）およびイネ（ＯｓＣＢＰ）に対する全長ｃＤＮＡ配列を得た。
【０２２６】
アグロバクテリウム媒介植物形質転換に使用された遺伝子構成物は、アンチセンス遺伝子抑制（３５Ｓ：ａｓＨＯＧ１）構成物であった。使用されたプロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターであった。
【０２２７】
イネのアグロバクテリウム媒介植物形質転換
Ｈｉｅｉらの方法（植物  Ｊｏｕｒｎａｌ  ＵＫ  Ｖｏｌ．  ６，  ｐａｇｅｓ  ２７１−２８２，  １９９４）を使用した。
【０２２８】
１．イネのカルス誘導
成熟したイネ種子を７０％のエタノールで１．５分間表面殺菌した。１２０ｒｐｍで４５分間の振とう器上の１００ｍｌの滅菌フラスコ中で、１滴のＴｗｅｅｎ−２０と共に漂白剤（２０％）を添加した。これに続いて、処理した種子を滅菌蒸留水で十分に洗い流した。
【０２２９】
深さ９ｃｍの滅菌プラスチックシャーレ中の２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ（カルス誘導培地）を含む３０ｍｌの固化ＮＢＯ培地の表面に、殺菌した種子を配置した。プレートをテープで覆い、組織培養室にある箱の中に配置し、イネ種子を暗所において２５℃で発芽させた。
【０２３０】
１０日後に、胚盤から得られるカルスを取り除き、新鮮カルス誘導培地上で継代培養した。元気に成長する淡黄色の胚発生カルスが得られるまで４週間おきに継代培養を実行した。
【０２３１】
２．イネカルスとのアグロバクテリウムの共培養
アンチセンス構成物を含むバイナリープラスミド（ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１，  Ｒ．  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，  ＣＡＭＢＩＡ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａに基づく）をＡ．ツメファシエンス株ＡＧＬ１に導入した。Ａ．ツメファシエンスを、４８〜７３時間２８℃で、１０ｍｇ／ｌのリファンピシン、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン、および５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む固化ＹＥＰ培地上に保存して増殖させた。１ｍｌのバクテリア培養物を、２８℃で、２５０ｍｌのフラスコ内の同一の選択的抗生物質を含有する１００ｍｌのＡＢ培地に添加した。０．８〜１．０のＯＤ５９５の濃度に到達するまでバクテリアを増殖した。室温で１０分間４，０００ｒｐｍで遠心分離することによって、バクテリアを採取した。次に、上清を除去し、ＡＭＭ培地において同体積の沈殿物を再懸濁することによって、バクテリアを一度洗浄し、室温で１０分間４，０００ｒｐｍで再び遠心分離した。上清を廃棄した。
【０２３２】
０．４のＯＤ５９５の濃度まで、バクテリアをＡＭＭ培地で希釈した（１ｍｌ当たり約１０９の細胞）。９ｃｍ滅菌プラスチックシャーレ中のアグロバクテリウム接種のために、約２０〜２５ｍｌの希釈したバクテリアを使用した。直径約５ｍｍの大きさの元気に成長する淡黄色の胚発生カルスを選択し、細菌懸濁液中に入れ、滅菌層流フード内で時々振とうしながら３０分間浸漬した。乾燥滅菌ティッシュペーパーのパッド上にカルスを配置することによって、カルスからの余分な細菌懸濁液を除去した。接種されたカルスを９ｃｍ滅菌プラスチックシャーレ中の２Ｎ６−ＡＳ培地上に移し（洗い流すことなく）、暗所において２５℃で２〜３日インキュベートした。
【０２３３】
３．形質転換体の選択および再生
１００ｍｌの滅菌フラスコ内の共培養したカルスを採取し、５０〜７５ｍｌの滅菌蒸留水を使用して軽く振とうしながら、少なくとも１０回洗浄した。余分な表面の水分を除去するために、滅菌ティッシュペーパーのパッド上でカルスを乾燥させた。カルス片を５００ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび２００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含む１００ｍｌの滅菌蒸留水に移し、２５℃において１２０ｒｐｍで２時間振とうした。水分を除去し、カルス片を滅菌ペーパーのパッド上でブロット乾燥した。形質転換細胞の選抜のために、カルス片を、９ｃｍ滅菌シャーレ中の２ｍｇ／ｌの２．４−Ｄ、２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシム、２００ｍｇ／ｌのアンピシリン、および５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン（選択的培地）を含むＮＢＯ培地上に移した。密閉した皿を暗所において２５℃でインキュベートした。
【０２３４】
４週間の選抜後に、共培養したカルスから推定ハイグロマイシン抵抗性マイクロカルスを抽出し、抵抗性の確認および組織増殖のために同一の新鮮選択的培地に移し、３週間培養した。
【０２３５】
元気に成長するハイグロマイシン抵抗性カルスを１．０ｍｇ／ｌの６−ＢＡ、２．０ｍｇ／ｌのＮＡＡ、５．０ｍｇ／ｌのＡＢＡ、および５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＮＢＯ培地（再生前培地）に移し、暗所において２５℃で３週間培養した。再生前培地からの白色のコンパクトハイグロマイシン抵抗性胚発生カルスを、２．０ｍｇ／ｌの６−ＢＡ、１．０ｍｇ／ｌのＩＡＡ、１．０ｍｇ／ｌのＮＡＡ、１．０ｍｇ／ｌのＫＴ、および５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンンを含むＮＢＯ培地（再生培地）に移し、１４時間の明条件（約２０００ルクス）、８時間の暗条件において、２５℃で培養した。
【０２３６】
３週間後、シュート誘導および根伸長のために、再生されたハイグロマイシン抵抗性植物体を、Ｐｈｙｔａｃｏｎ容器中の５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む１００ｍｌの１／２ＭＳ培地（植物体成長培地）に移した。植物体が容器の上部に到達するまで、培養条件を継続した。十分に発達したハイグロマイシン抵抗性植物体を培養容器から取り出し、すぐにプラスチックトレイ内の水道水に入れ、付着した培地を除去した。植物体を、１／２ＭＳ培地（溶液）を含有する５４ウェル（直径約５ｃｍ）プラスチックトレイに移した。植物体の各所与のクラスタ（推定トランスジェニック系統）を別々のウェルに入れた。植物体を、１４時間の明条件（約４００ルクス）および８時間の暗条件において、２０℃で９０％の湿度の成長チャンバにおいて、７〜１０日養成した。
【０２３７】
植物を鉢内の土に植え替え、３世代にわたって非遺伝子導入植物として温室で生育し、ホモ接合遺伝子導入植物を得た。
【０２３８】
補足的方法
植物材料および成長条件
シロイヌナズナに対して、コロンビア生態型を使用し、植物を成長チャンバにおいて、２２℃で、１６時間の明条件および８時間の暗条件において生育した。イネ遺伝子形質転換実験のために、オリザサティバジャポニカ種日本晴を使用した。
【０２３９】
シロイヌナズナのプラスミド構成および遺伝子形質転換
５’および３’ＲＡＣＥ戦略によって、全長ＨＯＧ１ｃＤＮＡを増幅した。すべての導入遺伝子構成物に対して、ｐＧｒｅｅｎ０２２９バイナリーベクター（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照のこと）を使用した。アンチセンス抑制のために、２つのＳＡＨＨ特性に及ぶＨＯＧ１の８５０ｂｐ断片を使用した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）。過剰発現構成物のために、ＨＯＧ１ｃＤＮＡの完全なオープンリーディングフレームを使用した（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。ＴＡＰタグが付いたＨＯＧ１は、２つのタグ間にＴＥＶ開裂部位を有するＰｒｏｔ  Ａおよびカルモジュリン結合ペプチドタグを含んだ。アグロバクテリウムツメファシエンス媒介性花浸漬方法（Ｃｌｏｕｇｈ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，  Ａ．    植物  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６（６）：  ７３５−７４３（１９９８））によって、構成物をシロイヌナズナに導入した。
【０２４０】
リアルタイム定量ＰＣＲ分析
ＴＲＩｚｏｌ方法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、シロイヌナズナ苗またはイネ葉から全ＲＮＡを抽出した。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実行した各定量ＰＣＲ反応のために、メーカーの使用説明書に従ってＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅＩで処理した全ＲＮＡ（０．５μｇ）を使用した。ＳＹＢＲグリーン（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を使用して定量リアルタイムＰＣＲを実行した。メーカーのプロトコルに従って、倍率変化の計算のためにチューブリン２のＣｔ値に対してＣｔ値を正規化した。
【０２４１】
等温滴定熱量計（ＩＴＣ）
ＩＴＣ（ＭＣＳＩＴＣ，  Ｍｉｃｒｏｃａｌ，  Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，  ＵＳＡ）によって、ＨＯＧ１とサイトカイニンとの間の相互作用のサイトカイニン結合親和性および熱力学分析を検査した。公開されたプロトコル（Ｆｏｒｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照のこと）を使用して、３５Ｓ：：ＴＡＰ−ＨＯＧ１構成物を有するトランスジェニックシロイヌナズナ植物から、ＴＡＰ−ＨＯＧ１融合タンパク質を生成した。２５回の注入（各注入は、３７℃、３秒間隔で２μｌ）を含む各ＩＴＣアッセイに対して、０．０１μＭのベンジルアデニン（自然発生的サイトカイニン）および０．１μＭの精製されたＴＡＰ−ＨＯＧ１タンパク質を使用した。１つの結合部位に対して、ＭＩＣＲＯＣＡＬ  ＯＲＩＧＩＮバージョン２．９によって、最適な非線形最小二乗法を使用して、データを分析した。近似曲線から結合化学量論（ｎ）および会合定数（ＫＡ）を計算した。続いて、ＫＤを１／ＫＡとして計算した。
【０２４２】
サイトカイニン含有量
サイトカイニンを１００％のメタノールで全植物から抽出し、Ｙａｎｇら（上記を参照のこと）に記載されるように、イソペンテニルアデノシン検出キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して定量化した。
【０２４３】
イネカルス誘導
カルス生成のために、表面殺菌し皮を剥いたイネ種子を２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加したＮＢＯ培地（カルス誘導培地）上に配置し、次いで、暗所において３０日間２５℃でインキュベートすることによって、それらを誘発した。３０日後、もろい胚カルスを得るまで、新生のカルスのさらなる継代培養を行った。
【０２４４】
イネカルスとのアグロバクテリウムの共培養
ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  Ｃｅｌｌ−Ｐｏｒａｔｏｒを使用したエレクトロポレーションによって、全長ＨＯＧ１を含有するバイナリープラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００（過剰発現およびアンチセンス抑制のそれぞれに対するセンスまたはアンチセンス配向）を、アグロバクテリウムツメファシエンスＡＧＬ１に導入した。制限消化によって形質転換したプラスミドを確認した。１０ｍｇ／ｌのカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン、および５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＹＥＰ培地で、プラスミド構成物を有するアグロバクテリウムを培養し、４８時間、２５℃でインキュベートした。１ｍｌのこの小規模培養物を、同一の選択抗生物質を含む１００ｍｌのＡＢ液体培地に接種し、培養物が０．８から０．９のＯＤ５９５に到達するまで、２５℃でインキュベートした。培養物を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した。バクテリア沈殿物を０．４のＯＤ５９５の濃度までＡＭＭ培地で懸濁した。２０から２５ｍｌのこの細菌懸濁液を深さ９ｃｍのシャーレに入れ、元気に成長する淡黄色のもろい胚発生カルス（約５ｍｍの大きさ）を、時々振とうしながら３０分間浸漬した。カルスを乾燥ティッシュペーパーの滅菌パッド上に置くことによって、それらから余分な細菌懸濁液を除去した。続いて、接種されたカルスを深さ９ｃｍの滅菌シャーレ中の２Ｎ６−ＡＳ培地上で培養し、２から３日間、暗所において２５℃でインキュベートした。
【０２４５】
イネ形質転換体の選抜および再生
共培養したカルスを、５０〜７５ｍｌの滅菌水を使用して軽く振とうしながら、少なくとも１０回洗浄し、滅菌ティッシュペーパー上に置いて乾燥させた。選抜のために、カルス片を、不稔シャーレ中の２ｍｇ／ｌの２，４−Ｄ、２５０ｍｇ／ｌのセフォタキシム、および５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＮＢＯ培地に移した。４週間の選抜後に、ハイグロマイシン抵抗性マイクロカルスを推定トランスジェニックカルスとして選抜し、共培養したカルスから取り除き、さらなる増殖のために新鮮選択培地に移し、３週間培養した。元気に成長するハイグロマイシン抵抗性カルスを、１ｍｇ／ｌのＢＡ、２ｍｇ／ｌのＮＡＡ、５ｍｇ／ｌのＡＢＡ、および５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＮＢＯ培地（再生前培地）に移し、３週間、暗所において２５℃で培養した。再生前培地からの白色のコンパクトハイグロマイシン抵抗性カルスを、２ｍｇ／ｌのＢＡ、１ｍｇ／ｌのＩＡＡ、１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、１ｍｇ／ｌのキネチン、および５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含むＮＢＯ培地（再生培地）に移し、１４時間の明条件（２５μＭｏｌ／ｍ２／ｓ）の光周期において、２５℃で培養した。３週間後、シュートの生長および根伸長のために、付着したカルスを含む再生されたハイグロマイシン抵抗性植物体を、Ｐｈｙｔａｃｏｎ容器中の５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む１００ｍｌの１／２ＭＳ培地（植物体培地）に移した。植物体が容器の上部に到達するまで、植物体を培養した。植物体の各クラスターを、１／２ＭＳ溶液を含有する５４ウェルのプラスチックトレイの単一ウェルに移した。植物体を、１４時間の明条件（２５μＭｏｌ／ｍ２／ｓ）の光周期において、２０℃で９０％の相対湿度の成長チャンバにおいて、７〜１０日適応させた。後に、植物を鉢内の土に移した。
【０２４６】
カルスから得られたトランスジェニックイネ植物をＴ０世代に指定し、個々の植物から得られた種子をハイグロマイシンの存在下で発芽させ、生き残った植物をＴ１世代にとした。Ｔ１植物からの種子を再びハイグロマイシン選択に供し、本研究におけるＴ２世代とした。
【０２４７】
結果および考察
定量リアルタイムＰＣＲ分析は、実施例１（ｃ）に記載されるように、ＨＯＧ１が、葉および花序茎において比較的高いレベルを有し、シロイヌナズナにおいて構成的に発現されることを示し、ＨＯＧ１が、植物発達の調節において基本的な役割を果たし得ることを示唆した。精製されたＨＯＧ１は、実施例１（ａ）に記載されるように、サイトカイニン分子（ゼアチン、ベンジルアデニン、およびイソペンテニルアデニン）への高親和性結合を示した。
【０２４８】
ベンジルアデニンに対する解離定数（ＫＤ）は、２０．６ｎＭであり（図１１）、ＨＯＧ１タンパク質との高親和性結合を示唆した。
【０２４９】
野生型と比較して、種々のＨＯＧ１シロイヌナズナＯＥ系統が、ＨＯＧ１転写レベルにおいて５から８倍の増加を示した一方で（図８ｅ）、シロイヌナズナＡＳ系統は、６から１０倍の抑制を示した（図８ｅ）。導入遺伝子発現は、植物発達に有意な影響を及ぼし、いくつかの独立したトランスジェニック系統において一貫した表現型を示した。２８個の独立したＯＥトランスジェニック系統および２１個のＡＳ系統から表現型を記録し、変化が、導入された遺伝子産物によって引き起こされたことを示した。野生型（ＷＴ）と比較して、種子発芽は、ＯＥ系統において４から５日早く、ＡＳ系統においてほぼ５日遅く発生した（表５）。しかしながら、ＯＥ系統の発芽直後に、有意な成長遅延が顕著であった一方で、ＡＳ系統は、種子発芽の遅延にもかかわらず、シュートの生長の遅滞を示さなかった。
【０２５０】
新しいロゼット葉の形成および展開は、ＯＥ系統における全栄養成長にわたって遅延および制限された。開花の早期開始は、抽薹時に少なくとも８および１４枚の葉をそれぞれ有するＷＴおよびＡＳ系統（図８ｂおよび表５）と比較して、４ロゼット葉期において抽薹を有するＯＥ植物において認められた（図８ａおよび表５）。
【０２５１】
（表５）種子発芽、開花の開始、および老化
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５つの独立した系統を各観察に使用した。各系統に対して、データは、３つの独立した複製からの平均を表す。アンチセンス系統は、発芽の遅延、抽薹の遅延、および老化の遅延を示した。
【０２５２】
開花の開始後に、ＯＥ系統は、葉バイオマスのそれ以上の増加は示さず、これらの系統に対して、老化が始まった３０日の成長後でさえ、腋生花序の枝は形成されなかった（図８ｂ）。しかしながら、ＡＳ系統は、花序茎の大量分枝（図８ｂ）および老化の遅延を示した。ＡＳ系統は、最大の葉面積（１葉当たり２．９±０．１ｃｍ２）を有し、それは、ＯＥ系統（０．４±０．１ｃｍ２）およびＷＴ（１．０±０．１ｃｍ２）において有意に低かった（図８ｃおよび表７）。全植物バイオマス、長角果の大きさ、ならびに結果として、１長角果当たりの種子数および種子重量（図８ｃ、８ｄ、８ｆ、および表６）は、ＯＥ系統において大幅に減少したが、それらは、ＷＴと比較してＡＳ系統において有意に高かった（（図８ｃ、８ｄ、８ｆ））。ＯＥ系統は、ＷＴよりも約１０日早く老化したが、ＡＳ系統は、ＷＴよりも２週間遅く老化した（図８ａ、８ｂ、および表６）。
【０２５３】
（表６）葉面積、１長角果当たりの種子重量および種子数
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データは、３つの独立した複製からの平均±標準偏差を表す。５つの独立した系統をいずれの場合にも使用した。アンチセンス系統は、野生型と比較して、葉バイオマスにおいて３倍の増加および種子収量において２倍の増加を示した。
【０２５４】
植物におけるサイトカイニンレベルの分枝と老化との間の確立された関連性のため、ＷＴ、ＯＥ、およびＡＳ系統の３つの独立した系統のそれぞれに対して、内在性サイトカイニン含有量を決定した。イソペンテニルアデニンは、主要サイトカイニンであり、その濃度は、ＷＴと比較してＯＥ系統において約６０％減少した（図８ｆ）。これは、図８ｂおよび８ａに見られる、ＯＥ系統における植物高およびバイオマスの減少の主な理由であり得る。対照的に、ＡＳ系統において、イソペンテニルアデニンの濃度は、ＷＴと比較して６０％を超える増加、またはＯＥ系統に対して４倍の増加であった（図８ｆ）。これは、反対の表現型、すなわち、大量分枝およびバイオマスの有意な増加をもたらした。
【０２５５】
このシロイヌナズナ研究からの結果は、作物種におけるＨＯＧ１またはそのオーソログの遺伝子操作が、収量を増加させるための手段を提供することができることを示唆する。いくつかの別の種におけるＨＯＧ１オーソログのスクリーニングを実施した。イネ、カイラン、菊、およびアマランサスからｃＤＮＡを成功裏に同定および取得した。逆転写ＰＣＲによって、ＯｓＣＢＰの全長ｃＤＮＡ（オリザサティバサイトカイニン結合タンパク質、Ｏｓ１１ｇ０４５５５００）をイネ（オリザサティバジャポニカ種日本晴）から単離した。ＯｓＣＢＰの得られたアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、ＨＯＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と９０％の配列相同性を示し、イネにおいて遺伝子の１つのコピーのみが存在すると考えられる（図１０）。ＨＯＧ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とＯｓＣＢＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）との間の高い配列相同性の理由から、ＨＯＧ１ｃＤＮＡを使用してトランスジェニックイネ系統を生成し、収量を増加させる形質をイネにおいて実現することができるか試験した。アグロバクテリウム媒介形質転換によって、いくつかの独立したイネ系統を得て、Ｔ１世代において、定量リアルタイムＰＣＲおよびゲノムサザンブロットによって、トランスジェニックであることを確認した（図９、１２ｄ、および１２ｅ）。Ｔ２世代におけるＯＥ系統およびＡＳ系統の表現型は、導入遺伝子によって一貫して分離していた（分離系統は、ハイグロマイシン選択に生き残らなかった）。選択培地におけるＴ３種子の発芽は、選抜された系統のいくつかが、導入遺伝子に対してホモ接合性であったことを示した（データは図示せず）。
【０２５６】
ＯＥおよびＡＳ系統、ならびにハイブリッド親（ＷＴ）系統において、ＯｓＣＢＰの発現解析を実行した。過剰発現系統は、ＷＴにおける内在性ＯｓＣＢＰ発現量と比較して、ＨＯＧ１の発現量においてほぼ５倍の増加を示した（図９ｆ）。加えて、ＯｓＣＢＰの発現は、ＯＥ系統のいくつかにおいて６倍減少し（図９ｆ）、これらが共抑制系統であることを確認した。遺伝子の共抑制の減少は、植物においてよく知られている。したがって、観察された表現型は、導入された遺伝子の機能によるものであって、形質転換のいかなる非特異的効果によるものではない。遺伝子導入植物の表現型は、シロイヌナズナからの結果と一致している。
【０２５７】
ＯＥ系統において、ＷＴと比較して１植物当たりの分げつ数における有意な変化はなかったが（表８）、ＯＥ系統の多くは、高さおよび全バイオマスの増加において有意に減少した（図９ａ、９ｂ、９ｃ、および表８）。イネのＯＥ系統は、ＷＴと比較して７〜１０日の早咲きを示した。対照的に、ＡＳ系統は、内在性ＯｓＣＢＰの発現量において最大で６倍の減少を示し、ハイブリッド親系統と比較して、１植物当たりの分げつ数において有意な増加を示した（図９ｂ、９ｃ、および１２ｂ）。ＷＴは、１植物当たり７から９個の分げつを有したが、ＡＳ系統は、１植物当たり１８から２８個の分げつを示した（表８）。共抑制系統の表現型は、ＡＳ系統のものと同一であった（図９ｃ、９ｅ、１２ａ、１２ｂ、および表８）。加えて、共抑制およびＡＳ系統は、主な分げつの地上節からの分枝を示し（図１２ｄ）、１植物当たりの円錐花序数において有意な全体的増加をもたらした（表８）。平均種子数および植物バイオマスは、ＷＴと比較して、ＡＳおよび共抑制系統において２倍から３倍を超えて増加した（表８）。ＷＴ植物と比較して、ＡＳおよび共抑制系統の表現型において他の大きな変化はなかった。１植物当たりの穀粒収量の最大増加は、温室栽培条件下でＷＴのものよりも２倍を超えて高かった（１．５倍から２．７倍に及ぶ）。概して、イネに対する温室栽培条件からの収量データは、理想的な圃場条件からのものよりも低かった。したがって、ここに記載される戦略が使用された場合に、圃場条件下で収量の有意な増加をもたらし得ることは明らかである。
【０２５８】
（表７）バイオマスおよび種子収量に寄与するパラメータのピアソンの相関係数（ｒ）
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葉面積（ｃｍ２）×１長角果当たりの種子重量（ｍｇ）（ａ）、葉面積（ｃｍ２）×１長角果当たりの種子数（ｂ）、および１長角果当たりの種子重量（ｍｇ）×１長角果当たりの種子数（ｃ）で相関係数を検証した。相関分析後に、スチューデントのｔ検定を実行した。ｔ検定値を括弧内に示す。「ｒ」値は、すべての試験における正相関を示す。これに基づいて、ＨＯＧ１のアンチセンス抑制は、葉バイオマスおよび種子収量に寄与する主要パラメータの増加をもたらすことが予測され得る。
【０２５９】
（表８）内在性ＯｓＣＢＰ遺伝子の発現の操作をもたらすセンス（過剰発現および共抑制）またはアンチセンス配向（イネユビキチンプロモーターによって駆動される）において、全長シロイヌナズナＨＯＧ１ｃＤＮＡを有するＴ２世代トランスジェニックイネ植物の収量パラメータの定量化
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１植物当たりの分げつ数に基づいて、各トランスジェニック系統内で、植物を「高」、「中」、および「低」としてグループ分けした。１植物当たりの分げつ、円錐花、および種子の総数は、平均±標準偏差として表した。各植物において完全充実穀粒のみを数えた。葉面積値は、１枚の葉の面積を表す。各植物の第２の分げつの完全に展開した第２の葉を指示パラメータとして測定した。生重量決定は、抜根された全植物に対してであり、選抜された植物のみを異なる系統に対して測定した。
【０２６０】
シロイヌナズナおよびイネからの本結果は、ＨＯＧ１のオーソログが、種々の作物の改良のために使用され得ることを示唆する。１植物当たりの分げつ数は、主要穀物の収量を決定する大きな要因である。したがって、この方法を使用すると、イネ、コムギ、トウモロコシ、およびオオムギ等の主要穀物の収量を増加させる可能性がある。
【０２６１】
バイオマスの増加もまた、セルロース系エタノールの生成、および葉菜、ならびに家畜用農作物のために使用される植物の非常に望ましい特徴である。加えて、観賞種における過剰発現ＨＯＧ１またはそのオーソログは、矮化および早咲きをもたらすのに役立ち得る。
【０２６２】
適用
本発明者らは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の単離されたポリヌクレオチドを使用して、植物における形質を調整する可能性を有する方法を示した。本明細書に開示された方法は、単位耕作面積当たりの農業生産性および穀粒収量を高めることができる．本明細書に開示された方法は、まぐさにおけるバイオマス生産を高め、葉菜および観葉植物における分枝を増加させるのに有用である。本明細書に開示された単離されたポリヌクレオチドは、単子葉植物および双子葉植物の両方に投与して、作物改良および別の商業的および科学的用途に有用な、調整された形質を有する植物を生成することができる。
【０２６３】
特に、持続可能な燃料源への関心が高まっているため、バイオマスの生産は成長産業である。理論によって束縛されることなく、本明細書に開示された方法によって生産された豊富なバイオマスは、木ガス、バイオメタノール、またはバイオエタノール燃料等の生物燃料に変換され得ると考えられる。例えば、アルコールは、既知の加水分解、発酵、および蒸留方法によってセルロース系材料から生成することができる。したがって、バイオマス燃料の使用は、温室効果ガス排出を減少させ、化石燃料の代替物を提供する手段として一部からみなされる、再生可能なエネルギー源として見られている。
【０２６４】
本発明の種々の別の修正および適応が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、上述の開示を読むことによって当業者には明らかとなり、すべてのそのような修正および適応が、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることを目的とすることは明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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