(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の特異的エンドセリン-Ａアンタゴニストと、糖尿病および／または糖尿病ケトアシドーシスを治療するための第二治療薬とを有効成分として含み、かつ当該特異的エンドセリン-Ａアンタゴニストが、以下の化合物１〜化合物３６、
【化１】
0005536198.tif 000047
【化２】
0005536198.tif 000048
【化３】
0005536198.tif 000049
【化４】
0005536198.tif 000050
【化５】
0005536198.tif 000051
【化６】
0005536198.tif 000052
【化７】
0005536198.tif 000053
【化８】
0005536198.tif 000054
【化９】
0005536198.tif 000055
からなるグループから選択される、ことを特徴とする糖尿病ケトアシドーシスを治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記特異的エンドセリン-Ａアンタゴニストが、ＢＭＳ-１８２８７４、ＢＱ１２３、および、これらの混合物からなるグループから選択される請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記第二治療薬が、インスリン、電解質、重炭酸ナトリウム、利尿薬、ブメタニド、マンニトール、高張食塩水、および、これらの混合物からなるグループから選択される請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記第二治療薬が、輸液療法である請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
糖尿病性ケトアシドーシスの治療剤を製造するための請求項１乃至４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項６】
(ａ) 請求項１乃至４のいずれかに記載の医薬組成物、
(ｂ) 哺乳動物の糖尿病性ケトアシドーシスを治療するための(ａ)医薬組成物の投与に関する指示を記した添付文書、および、
(ｃ) (ａ)医薬組成物および(ｂ)添付文書のための容器を含む、ことを特徴とする製造品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する2009年４月30日に特許出願された米国仮特許出願第61/174,283号の利益を享受するものである。
【０００２】
本願発明は、エンドセリン受容体アンタゴニストを用いた糖尿病性ケトアシドーシスの治療に関する。  具体的には、本願発明は、治療の必要がある哺乳動物に対して、治療有効量のエンドセリンアンタゴニストの投与を行って糖尿病性ケトアシドーシスを治療する方法に関する。  本願発明の組成物および方法は、今日の糖尿病性ケトアシドーシスの治療に伴う諸問題や不都合を解消する。
【背景技術】
【０００３】
2360万人/年もの人々が糖尿病を患い、1740億ドルの総費用が見積もられている。  その費用の半分は、入院に関するものである。  インスリン依存性Ｉ型真性糖尿病(ＴＩＤＭ)は、外因性インスリンによって調節することができる。  しかしながら、ＴＩＤＭの管理の不徹底、インスリンを供給するインスリンポンプの機能不全、あるいは、ＴＩＤＭの診断前にあっては、糖尿病性ケトアシドーシス(ＤＫＡ)と呼ばれる状態に起因して、血糖値が急激に増大してしまう。
【０００４】
ＤＫＡは、糖尿病の入院期間の大部分を占めており、このことは、特に、小児患者において顕著であり、また、糖尿病が関係している全死亡事例の２０％を占めている(Krane, 1988)。  ＤＫＡは、高血糖(250mg/dlを超える血中グルコース値)、アシドーシス(7.3未満のｐＨ)、および、尿中のケトンの存在、を特徴としている。  通常、糖尿病の患者は、低血圧症に認められる脱水症状、膨圧の低下、血液の高浸透圧に起因する猛烈な口渇感を経験し、そして、後期になると、嘔吐したり、腹痛を訴えるようになる。
【０００５】
ＤＫＡの診断にあっては、意識レベルを評価し、そして、血液試料を得て、血清血糖値または血漿血糖値、電解質、重炭酸塩、ｐＣＯ２、血中尿素窒素(ＢＵＮ)、クレアチニン、ｐＨ、ヘモグロビン、および、ヘマトクリットの数値についての計測などが行われる(Wolfsdorf et al., 2007)。  ケトンの有無を尿検査で確認し、また、カリウムイオン(Ｋ＋)レベルの変化に起因する心臓の異常を確認するために心電図もモニターする(Wolfsdorf et al., 2007)。  ＤＫＡの治療法として、48時間にわたる生理食塩水(0.9％ NaCl)の供給による脱水症状の改善、0.1単位/kg/時間でのインスリン点滴、それに、必要に応じて、心臓血管や呼吸についての対症療法などがある。
【０００６】
通常、これらの治療法は有効ではあるが、小児患者の約０.５〜３％で脳浮腫(ＣＥ)の発症が認められており、その死亡率は、２０％までにも及んでいる(Krane, 1988)。  原因は明確ではないが、ＣＥは、小児患者のみにおいて認められている。  ＣＥの発症は、５歳未満の年齢、７.１未満のｐＨ、低いｐＣＯ２、および、高いＢＵＮによって確定される重篤なアシドーシスなどの特定の危険因子と関連している(Wolfsdorf et al., 2007)。  頭痛の症状、徐脈、神経学的状態の変化、高血圧症、および、酸素飽和度の減少によって、一旦、診断が確定したら、ＤＫＡによって誘発されたＣＥのための治療を直ちに開始しなければならない(Vanelli and Chiarelli, 2003; Lam et al., 2005)。  治療にあたって、20分間かけて、0.5〜１ｇ/kgのマンニトールを静脈投与し、輸液量を１/３に減らし、３％高張食塩水(５〜10ml/kg、30分間)を投与し、ベットの患者の頭を高くし、そして、呼吸を維持するための対症療法を施す。  ＣＥの症状が安定した後に、運動能力、言語能力、および、学習能力についての障害など、長期的影響をもたらす神経学的後遺症を排除するために、頭部のＣＤスキャン検査を行うべきである(Wolfsdorf et al., 2007)。
【０００７】
ＣＥの発症メカニズムは不明であるが、これまでに幾つかの仮説、例えば、脳と血漿との間の浸透圧不均衡、水分過剰と低ナトリウム血症、アルカリ療法(重炭酸塩)によって誘発された脳内アシドーシス、および、脳血流の変化などが提唱されている(Krane, 1988; Silver et al., 1997; Lam et al., 2005; Wolfsdorf et al., 2007; Yuen et al., 2008)。  その他に考えうる理論として、ＣＥとそれに起因する合併症、例えば、神経原性肺水腫、それに、高血圧症や心拍数の増大などの有害な心臓血管副作用を招く速効型インスリン・補水療法の関与がある(Sherry and Levitsky, 2008)。
【０００８】
血管収縮作用を示す２１個のアミノ酸のペプチドであるエンドセリン(ＥＴ)は、生体内で多様な活性を奏する。  ＥＴは、心臓、肺、腎臓、および、内分泌系での生理学的調節、それに、生体の様々な器官、例えば、脳への血流の制御にも寄与している。  ＥＴには、ＥＴ-１、ＥＴ-２、および、ＥＴ-３という三つのイソフォームがあり、その各々は、二つのＧタンパク質結合受容体、ＥＴＡまたはＥＴＢのいずれかに結合している(Yanagisawa et al., 1988a; Yanagisawa et al., 1988b; Gulati et al., 1997b)。  すべてのイソフォームが、内皮細胞に存在するＥＴＢに対して同等の親和性で結合する。  ＥＴＡも、すべてのイソフォームに対して結合する。  しかしながら、ＥＴ-１とＥＴ-２は、同等の結合性を示し、また、ＥＴ-３よりも選択的な結合をする。  この受容体のサブタイプは、血管平滑筋細胞に存在している(Said et al., 2005; Sasser et al., 2007)。
【０００９】
三つのすべてのイソフォームは、様々な生理系に対して作用をするものであり、また、糖尿病の病態におけるＥＴ-１の効果は、これまでにも広く研究がされている。  ある研究によれば、糖尿病に罹患していないコントロールと比較をして、ＴＩＤＭの治療を施した小児患者でのＥＴ-１の濃度は低レベルであるとの報告をしているが、別の研究にあっては、ＴＩＤＭ患者ではＥＴ-１の増大が認められたとの報告を行っている(Malamitsi-Puchner et al., 1996; Vazquez et al., 1999)。  増大または減少したＥＴ-１の役割、それに、高血圧症、糖尿病性ネフロパシー、および、脳卒中といったＴＩＤＭが関与した合併症の発症に関して、数多くの矛盾した証拠が存在している。  ある研究では、高レベルのＥＴ-１が、高血圧症、腎臓機能の低下、年齢、それに、糖尿病状態の期間と関係しており、このことは、高レベルのＥＴ-１が、糖尿病患者に認められるこれらの一般的な合併症と関係していることを示唆している、との報告を行っている(Haak et al., 1992)。
【００１０】
しかしながら、別の研究では、高レベルのＥＴ-１は、高血圧症および疾患の期間とは相関しない、との報告を行っている(Takahashi et al., 1990; Schneider et al., 2002)。  インスリンが、外因的または内因的に、ＥＴ-１レベルを高めることが示されている(Kirilov et al., 1994; Morise et al., 1995; Ferri et al., 1996)。  糖尿病におけるＥＴ-１の研究は、血漿でのＥＴ-１濃度の増大または減少について、矛盾した結果を示しているが、ＥＴ-１が、インスリン調節の効果を奏するものでないことは明らかである。
【００１１】
高レベルのＥＴ-１と脳での血管収縮とが関連しているため、ＥＴ-１は、内分泌系に加えて、脳血管および脳血管系においても様々な効果を示す(Zhang et al., 2008)。 幾つかの研究によって、脳血管系の緊張度の高まりに起因する脳虚血とＥＴ-１の増大との間に正の相関が示されている。  脳卒中モデルのラットにおいて認められているように、頭蓋内圧(ＩＣＰ)の増大は、高レベルのＥＴ-１と関連している。  ＥＴＡブロッキング剤を投与することで、ＩＣＰが減少していることは、ＩＣＰの増大とＥＴの増大との間の直接的な関連性を示すものである(Lo et al., 2005)。  さらに、ＩＣＰを増大するくも膜下出血が起こっている間に、ＥＴＡ受容体は、その活性を増大していたことが明らかにされている(Lo et al., 2005)。  ＩＣＰが増大している間にこれら受容体をブロックすると、脳虚血が起こっている間に、神経保護効果を奏することとなる(Zhang et al., 2008)。  繰り返しになるが、このことは、ＥＴ、特に、ＥＴ-１とＥＴＡ受容体が、脳の血流の調節に関与している、との考察を支持するものである。
【００１２】
増大したＥＴ-１レベルは、ＥＴＡ受容体アンタゴニストであるBQ123によって改善される神経原性肺水腫とも関連している(Bonvallet et al., 1994)。  神経原性肺水腫を誘発し、また、代謝性アシドーシス、ｐＯ２の減少、ｐＣＯ２の増大、および、全身性高血圧症などの副作用を発現したラットにおいて、気管支肺胞洗浄を行っている間に、ＥＴ-１レベルの増大が認められた。  BQ123を投与することで、低酸素症と高炭酸ガス血症の症状は緩和された(Herbst et al., 1995)。  別の研究では、ラットにＥＴ-１を髄膜(ＩＴ)注射したところ、激しい肺血管収縮や肺浮腫(ＰＥ)を招き、また、死に至るケースもあったことが実証されている。  BQ123で前処置することで、肺浮腫が予防でき、また、死亡率も５０％減少した(Poulat and Couture, 1998)。  ラットの筋細胞での電気生理学的性質の変化に起因する心臓不整脈が、ストレプトゾシン(ＳＴＺ)で誘発したＴＩＤＭに罹患したラットにおいて認められた(Ding et al., 2006)。  これらの研究は、増大したＥＴ-１が、ＣＥとＰＥの双方に関与しており、また、ＥＴアンタゴニストの投与によって、全身性高血圧症、高炭酸ガス血症、および、低酸素症などの副作用が軽減されるであろう、という理論を裏付けるものである。
【００１３】
現在のところ、ＥＴアンタゴニストは、研究および臨床の現場で利用がされている。  実験現場で用いられている多くのＥＴアンタゴニストは、BQ-123、BMS-182874、および、PD-156707などのＥＴＡ受容体アンタゴニストである。  BQ-788およびBQ-3020は、選択的ＥＴＢアンタゴニストである。  TAK-044は、非選択的ＥＴアンタゴニストであって、ＥＴＡ受容体およびＥＴＢ受容体の双方の効果をブロックする。  非選択的ＥＴ-１アンタゴニストであるボセンタンは、ＥＴＡ受容体およびＥＴＢ受容体をブロックし、そして、現在では、肺高血圧症の治療のために利用されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本願発明は、糖尿病性ケトアシドーシスの治療の必要がある哺乳動物に対して、治療有効量のエンドセリンアンタゴニストを投与する、ことを含む糖尿病性ケトアシドーシスを治療する方法に関する。  本明細書は、ＤＫＡでのＥＴ-１の関与と、改善されたＤＫＡの治療法にＥＴアンタゴニストが利用可能である、ことを示している。
【００１５】
したがって、本願発明のある実施態様では、今日の糖尿病性ケトアシドーシスの治療法で認められている副作用の発生または副作用の程度、それに、その治療法に関連する合併症を軽減しつつ、糖尿病性ケトアシドーシスを治療するための方法および組成物を提供している。  その他の実施態様にあっては、糖尿病性ケトアシドーシスまたは糖尿病を治療するための第二療法と併用して、エンドセリンアンタゴニストが投与される。
【００１６】
本願発明のさらに別の実施態様では、(ａ) 糖尿病性ケトアシドーシスを治療するための指示を記した添付文書、(ｂ) 容器、および、(ｃ) エンドセリンアンタゴニストを含む包装された組成物を含む、ヒトの製薬学的用途のための製造品を提供している。
【００１７】
本願発明の上記した実施態様およびそれ以外の実施態様は、本願発明の好適な実施態様を詳細に記載した以下の開示から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】４日間の治療期間を通して治療をしたラットと未治療のラットの体重(ｇ)を示す棒グラフである。
【図２】４日間の治療期間を通して治療したラットと未治療のラットの血中ケトン量(mg/dl)を示す棒グラフである。
【図３】治療をしたラットと未治療のラットでの平均動脈圧(mmHg)と時間との関係を示すグラフである。
【図４】治療をしたラットと未治療のラットでの平均脈圧(mmHg)と時間との関係を示すグラフである。
【図５】治療をしたラットと未治療のラットでの心拍数(脈拍/分)と時間との関係を示すグラフである。
【図６】治療をしたラットと未治療のラットでの脳血液灌流の変化率(％)と時間との関係を示すグラフである。
【図７】治療をしたラットと未治療のラットでの肺水量(％)を示す棒グラフである。
【図８】治療をしたラットと未治療のラットでの脳水量(％)を示す棒グラフである。
【図９】(ａ)糖尿病性ケトアシドーシスの誘発に起因するＥＴ-１レベル(pg/ml)(図９Ａ)、(ｂ)インスリン治療の結果として出現したＥＴ-１レベル(pg/ml)(図９Ｂ)、および、(ｃ)三つの異なる治療の結果から得たＥＴ-１レベルの変化率(図９Ｃ)を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書に記載の方法は、糖尿病性ケトアシドーシスの治療でエンドセリンアンタゴニストを用いることで得られる効果に基づくものである。  本明細書に記載の発明の目的のために、本明細書で用いる「治療」の用語は、糖尿病性ケトアシドーシスおよびこれに関連する症状を、解消、軽減、あるいは、緩和することを指す。
【００２０】
「容器」の用語は、医薬品を、貯蔵、輸送、調剤、および／または、取り扱う上で適切なレセプタクルおよびクロージャーを指す。
【００２１】
「添付文書」の用語は、製品の使用に関して、医師、薬剤師、および、患者が、十分に情報を得た上で決定を行えるようにするために必要な安全性および有効性のデータに沿って、その製品の投与方法に関する説明をするために、医薬品に添付されている情報のことを指す。  この添付文書は、一般的には、医薬品の「ラベル」として見なされている。
【００２２】
ＥＴとは、非常に強力な内皮細胞由来の血管収縮因子であり(Hickey et al., 1985)、このものは、単離、配列決定、それに、クローニングがされている(Yanagisawa et al., 1988)。  エンドセリンは、21個のアミノ酸からなる、非常に強力な血管収縮作用を示すペプチドであり、二つのジスルフィド結合を有している。  エンドセリンは、プレプロエンドセリンをプロエンドセリンへと酵素的に開裂し、次いで、エンドセリン変換酵素によってエンドセリンへと酵素的に開裂することで、生物学的に製造される。  ＥＴは、Ｇタンパク質に結合した７回膜貫通型受容体である細胞表面受容体に結合することによって、その生物学的効果を奏する。  エンドセリン受容体には、異なる二つのタイプ、すなわち、(ａ) 主に血管平滑筋に認められ、血管収縮に関与をするＥＴ-１選択的ＥＴＡ受容体、および、(ｂ) 主に血管内皮細胞に認められ、血管拡張に関与をする非選択的ＥＴＢ受容体、がある。
【００２３】
ＥＴ-１が示す血管収縮効果は、主に、Ｇタンパク質が結合したＥＴＡ受容体によって媒介されている。  また、ＥＴ-１は、前立腺癌、転移癌、および、ＣＮＳにおいても高濃度で存在する。  ＣＮＳでのＥＴは、内皮細胞によって生産され、また、ニューロン、星状膠細胞、および、グリア細胞などの非内皮細胞によっても生産がされる。
【００２４】
ＥＴの広範な分布と脳内でのその結合部位は、ＥＴが血管収縮薬であるということに加えて、ＥＴが、ＣＮＳにおける重要な神経ペプチドとしての機能を果たすことをも示唆している(Gulati et al., 1992)。  エンドセリン(ＥＴ)受容体アンタゴニスト、特に、選択的ＥＴＡまたは均衡アンタゴニストＥＴＡ/ＥＴＢアンタゴニストは、鬱血性心不全(ＣＨＦ)や肺高血圧症のような疾患の治療領域を示している。  BQ-123とBMS-182874は、ＥＴＡ受容体の特異的アンタゴニストである(Stein et al., 1994)。  エンドセリンアンタゴニストは、肺血管系と右心に対して大きな効果を示すのに対して、ＡＣＥ阻害剤は、主に、末梢血管と左心に対して効果を示す。
【００２５】
幾つかの研究にあっては、中枢ＥＴ受容体は、その大部分がＥＴＢサブタイプであるとの報告をしている。  ラットの脳の星状膠細胞は、主に、ＥＴＢ型の受容体を発現することが認められており、また、グリア細胞が、ＥＴＢ受容体mRNAを強く発現することも認められている。  しかしながら、高選択性ＥＴＢ受容体アゴニストであるIRL-1620を中枢投与しても、心臓血管系に対しては何らの効果も示さず、また、中枢に投与をしたＥＴ-１の全身的循環効果および局所循環効果は、ＥＴＡ受容体を介したものであったことが示されている(Gulati et al., 1995; Rebello et al., 1995)。
【００２６】
ＥＴ-１を脳室内に投与すると、平均動脈圧(ＢＰ)は、一時的に上昇した後に、持続的に低下した。  この圧力効果は、腎臓での交感神経活性を高め、また、血漿に含まれるカテコールアミンとアルギニン-バソプレッシンの濃度を増大させた。
【００２７】
また、ＥＴ-１の中枢投与の効果は、自律神経節遮断薬によって弱まったことから、この効果が、交感神経系の活性化を媒介したものであることが示されている。  ＥＴ-１を嚢内投与すると、ＢＰは、一時的に上昇し、腎臓での交感神経の活性と横隔神経の活性も一時的に高めた。  腎臓での交感神経の活性と横隔神経の活性の低下に伴って、ＢＰも低下した。  中枢ＥＴ-１が誘発した血圧上昇反応の活性化が、フェノキシベンザミンを用いた前処理によって抑制されたとの結果(Ouchi et al., 1989)は、最初の血圧上昇段階での交感神経系の積極的な関与をさらに示唆するものである。
【００２８】
本願発明で使用したエンドセリンアンタゴニストとして、当該技術分野で周知のいずれのエンドセリン受容体アンタゴニストでも利用可能である。  エンドセリンは、強力な血管収縮薬である。  エンドセリンアンタゴニストは、急性心不全、鬱血性/慢性心不全、肺動脈高血圧症、肺水腫、くも膜下出血、慢性閉塞性肺疾患、心筋梗塞、急性脳虚血、急性冠不全症候群、急性腎不全、肝臓手術の術後状態、および、前立腺癌を治療するために用いられている。  エンドセリンアンタゴニストを健常者に投与しても、副作用の心配はない。
【００２９】
ある実施態様によれば、好ましいＥＴアンタゴニストは、エンドセリンＡ(ＥＴＡ)受容体に対して選択性を示すものであるか、あるいは、均衡ＥＴＡ/エンドセリンＢ(ＥＴＢ)アンタゴニストである。  そのようなＥＴアンタゴニストは、本明細書の別表Ａおよび別表Ｂにそれぞれを記載してある。  しかしながら、本明細書の別表Ｃおよび別表Ｄに記載してあるエンドセリンＢアンタゴニストやその他のエンドセリンアンタゴニストなども、本願発明の組成物または方法において使用することができる。  その他の有用なエンドセリンアンタゴニストは、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの内容を援用する米国公開特許公報第2002/0082285号および第2003/0232787号に開示されており、また、Wu, Exp. Opn. Ther. Patents, 10(ll):pp.1653-1668 (2000)にも開示がされている。
【００３０】
本願発明において有用なエンドセリンアンタゴニストの例として、アトラセンタン、テゾセンタン、ボセンタン、シタキスセンタン、エンラセンタン、BMS-207940(ブリストル・マイヤーズ スクイブ)、BMS-193884、BMS-182874、J-104132(萬有製薬)、VML 588/Ro 61-1790(バンガード・メディカ)、T-0115(田辺製薬)、TAK-044(タケダ)、BQ-788、BQ123、YM-598、LU 135252、PD 145065、A-127722、ABT-627、A-192621、A-182086、TBC3711、BSF208075、S-0139、TBC2576、TBC3214、PD156707、PD180988、ABT-546、ABT-627、Z1611、RPRl 18031 A、SB247083、SB217242、S-Lu302872、TPC10950、SB209670、および、これらの混合物などがあるが、これらに限定されない。
【００３１】
BQ123は、エンドセリンＡアンタゴニストの具体例であって、このものは、シクロ(D-Trp-D-Asp-Pro-D-Val-Leu)のナトリウム塩である。  BQ123は、エンドセリンＡアンタゴニストの具体例であって、このものは、シクロ(D-Trp-D-Asp-Pro-D-Val-Leu)のナトリウム塩である。  BQ-788は、エンドセリンＢアンタゴニストの具体例であって、このものは、Ｎ-シス-２,６-ジメチルピペリジノカルボニル-Ｌ-γ-メチルロイシル-Ｄ-１-メトキシカルボニルトリプトファニル-DNIeのナトリウム塩である(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, pp. 4892-4896 (1994)を参照されたい)。
【００３２】
従来のエンドセリンアンタゴニストに加えて、内因性エンドセリンの形成を阻害する化合物も、エンドセリンアンタゴニストとして、本願発明で使用することができる。  これら化合物は、エンドセリンの形成を予防し、つまりは、エンドセリン受容体の活性を低下させるので、有用な化合物であると言える。  このような化合物のクラスの一つに、エンドセリン変換酵素(ＥＣＥ)阻害剤がある。
【００３３】
有用なＥＣＥ阻害剤として、CGS34225(すなわち、Ｎ-((１-((２(Ｓ)-(アセチルチオ)-１-オキソペンチル)-アミノ)-１-シクロペンチル)-カルボニル-Ｓ-４-フェニルフェニル-アラニンメチルエステル)、および、ホスホラミドン(すなわち、Ｎ-(ａ-ラムノピラノシルオキシヒドロキシホスフィニル)-ロイシン-トリプトファン)などがあるが、これらに限定されない。
【００３４】
糖尿病性ケトアシドーシスを治療するために、一つまたはそれ以上のエンドセリンアンタゴニストを単独で投与することができ、あるいは、インスリン、電解質、重炭酸ナトリウム、利尿薬、ブメタニド、マンニトール、および/または、高張食塩水などのその他の糖尿病および糖尿病性ケトアシドーシスのための治療剤と組み合わせて投与することができる。  また、エンドセリンアンタゴニストを、糖尿病性ケトアシドーシスの治療のための輸液療法を用いて投与することもできる。  エンドセリンアンタゴニストは、インスリン、電解質、重炭酸ナトリウム、利尿薬、ブメタニド、マンニトール、および/または、高張食塩水を投与する以前、これらを投与した後、あるいは、これらと同時に投与することができる。
【００３５】
本明細書に記載の試験方法およびデータは、エンドセリンアンタゴニストを、糖尿病性ケトアシドーシスを治療する方法において、哺乳動物に対して投与できることを示している。  本明細書に記載の「エンドセリンアンタゴニスト」の用語は、一つまたはそれ以上のエンドセリンアンタゴニストを指すものであって、すなわち、本願発明が、単一のエンドセリンアンタゴニスト、または、エンドセリンアンタゴニストの混合物の投与を含んでいることを指すものである。  これらエンドセリンアンタゴニストを、経口投与、または、非経口投与するために、適切な賦形剤を用いて製剤することができる。  そのような賦形剤は、当該技術分野において周知である。  一般的に、エンドセリンアンタゴニストは、組成物の約0.1重量％〜約75重量の量で当該組成物に取り込まれる。
【００３６】
エンドセリンアンタゴニストを含む医薬組成物は、ヒトまたはその他の哺乳動物への投与に適している。  一般的に、これら医薬組成物は、滅菌済のものであり、また、投与時に副作用を引き起こす毒性化合物、発癌性化合物、または、変異原性化合物を含んでいない。
【００３７】
本願発明の方法は、上記したエンドセリンアンタゴニスト、あるいは、生理学的に許容可能なその塩または溶媒和物を用いて実施することができる。  これらエンドセリンアンタゴニスト、塩類、または、溶媒和物は、純化合物として投与することができ、あるいは、それらのいずれか、または、双方を含む医薬組成物として投与することができる。
【００３８】
エンドセリンアンタゴニストは、例えば、経口投与、経頬投与、吸入、舌下投与、直腸内投与、膣内投与、腰椎穿刺を介した髄腔内投与、経尿道投与、経鼻吸入、経皮的投与、すなわち、経皮投与、あるいは、(静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、冠状動脈内投与などを含む)非経口投与などの適切な経路で投与することができる。  非経口投与は、針または注射器、あるいは、POWDERJECT(商品名)などの高圧技術を用いて行うことができる。  エンドセリンアンタゴニストの投与は、疼痛が発症する以前、発症している最中、または、発症した後に行うことができる。
【００３９】
本願発明の医薬組成物には、所定の治療目的を達成する治療有効量のエンドセリンアンタゴニストを含んだ組成物が含まれている。  具体的には、「治療有効量」とは、糖尿病性ケトアシドーシスおよびそれに関連する症状を、緩和または解消するに効果的な量のことを指す。  治療有効量の決定は、当業者が十分に実施可能な範囲内の事項であり、特に、本明細書での開示を参照することで十分に対処可能である。
【００４０】
「治療有効量」とは、所望の効果を奏するエンドセリンアンタゴニストの量のことを指す。  エンドセリンアンタゴニストの毒性や治療効果は、細胞培養物や実験動物を用いた標準的な製剤手法、例えば、 ＬＤ５０(個体群の５０％に対する致死用量)やＥＤ５０(個体群の５０％に対する治療効果用量)によって決定される。  毒性と治療効果との間の用量比は、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比率として表される治療指数である。  治療指数は、大きい方が望ましい。  これらデータから取得されるデータは、ヒトに対して用いる用量の範囲を決定するために用いられている。  エンドセリンアンタゴニストの用量は、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあり、その毒性は皆無か、あるいは、ほとんどない。  これら用量は、使用する剤形や、利用した投与経路に応じて、この範囲内で変化する。
【００４１】
正確な処方、投与経路、および、用量は、患者の病態を考慮して、個々の医師によって決定される。  投与量と投与間隔は、治療効果または予防効果を維持するに十分なレベルのエンドセリンアンタゴニストを提供するために、個別に調整をすることができる。
【００４２】
エンドセリンアンタゴニストの投与量は、治療を受ける対象動物、対象動物の体重、疼痛の程度、投与方法、それに、処方医師の判断によって定まることとなる。
【００４３】
具体的には、糖尿病性ケトアシドーシスの治療のためにヒトに投与する場合には、エンドセリンアンタゴニストの経口投与量は、一般的に、平均的な大人の患者(70kg)にあっては、毎日、約10〜約200mgであり、通常は、１日１回、または、１日に２回または３回に分けて投与を行う。  よって、一般的な大人の患者にあっては、１日に１回または数回の単回投与または複数回投与のために、各錠剤または各カプセルは、薬学的に許容可能な適切な賦形剤または担体に約0.1〜約50mgのエンドセリンアンタゴニストを含んでいる。  一般的に、静脈内投与、経頬投与、または、舌下投与のための用量は、必要に応じて、約0.1〜約10mg/kg/単一用量となる。  実際には、医師は、個々の患者に最も適した投与計画を決定し、そして、個々の患者の年齢、体重、それに、反応性を見ながら用量を調整する。  前述した用量は、平均的な事例を例示したものでしかなく、それら用量を増減することで所定の効果を引き出す場合も当然にあるのであって、そのような事例も、本願発明の範囲内の事項である。
【００４４】
エンドセリンアンタゴニストは、それ単独でも、あるいは、意図している投与経路や標準的薬務に照らして選択した薬学的担体と組み合わせて投与することができる。  よって、本願発明に従って使用する医薬組成物は、薬学的に用いることができる調製物へのエンドセリンアンタゴニストの加工を促す賦形剤や助剤を含む一つまたはそれ以上の生理学的に許容可能な担体を用いて、従来の方法によって製剤することができる。
【００４５】
これら医薬組成物は、例えば、従来の混合法、溶解法、造粒法、糖衣形成法、乳化法、カプセル化法、封入法、または、凍結乾燥法などの従来技術を用いて製造することができる。  選択した投与経路に応じて適切な製剤が調製される。  有効量のエンドセリンアンタゴニストを経口投与する場合には、一般的に、組成物は、錠剤、カプセル剤、粉末、溶液、または、エリキシル剤の形態となる。  錠剤の形態で投与を行う場合には、その組成物は、ゼラチンやアジュバントなどの固形担体をさらに含むことができる。  錠剤、カプセル剤、および、粉末は、約５％〜約９５％の本願発明のエンドセリンアンタゴニスト、好ましくは、約２５％〜約９０％の本願発明のエンドセリンアンタゴニストを含む。  液剤の形態で投与を行う場合には、水、石油、または、動物または植物由来の油脂などの液体担体を加えることができる。  この液体組成物は、生理食塩水、ブドウ糖またはその他の糖溶液、または、グリコールをさらに含むことができる。  液剤の形態で投与を行う場合、この組成物は、約０.５重量％〜約９０重量％のエンドセリンアンタゴニスト、好ましくは、約１％〜約５０％のエンドセリンアンタゴニストを含む。
【００４６】
治療有効量のエンドセリンアンタゴニストを、静脈内投与、皮膚投与、または、皮下注射によって投与する場合には、発熱物質を含まず、非経口的に許容可能な溶液の形態で投与される。  ｐＨ、等張性、安定性などが関係して非経口的に許容可能な溶液を調製することは、当該技術分野で周知の事項である。  静脈内投与、皮膚投与、または、皮下注射に適した組成物は、本願発明の化合物に加えて、等張性の賦形剤を含んでいる。
【００４７】
エンドセリンアンタゴニストを、当該技術分野で周知の薬学的に許容可能な担体と共に容易に組み合わせることができる。  このような担体は、治療を受ける患者の経口摂取に供するために、エンドセリンアンタゴニストを、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに取り込んで製剤することができる。  経口投与用医薬品は、エンドセリンアンタゴニストを固形賦形剤に対して加え、得られた混合物を任意に粉砕し、そして、必要に応じて、適切な助剤を加えた後に、錠剤または糖衣錠の核材を取得するために顆粒の混合物を加工する、ことによって製造することができる。  適切な賦形剤として、例えば、増量剤やセルロース調製物などがある。  必要に応じて、崩壊剤を加えることもできる。
【００４８】
エンドセリンアンタゴニストを、例えば、急速静注法や連続注入法などの注射による非経口投与のために製剤することができる。  注射用製剤は、防腐剤を加えてなる、例えば、アンプルまたは複合投与用容器に収容された単一投与量の形態で提供することができる。  これら組成物は、懸濁液、溶液、または、油性または水性賦形剤中型乳剤の形態にすることができ、また、懸濁剤、安定剤、および／または、分散剤などの調剤を含むことができる。
【００４９】
非経口投与用の医薬組成物として、水溶性エンドセリンアンタゴニストの水性溶液がある。  加えて、エンドセリンアンタゴニストの懸濁液を、適切な油状注射用懸濁液として調製することができる。  適切な親油性溶媒または親油性賦形剤として、脂肪油、または、合成脂肪酸エステルなどがある。  水性注射用懸濁液に、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有させることができる。  また、これら懸濁液に、適切な安定剤や、化合物の溶解性を増大させて、高濃度溶液の調製を可能にする薬剤なども任意に含有させることができる。  あるいは、本願発明の組成物を、使用前に適切な賦形剤、例えば、滅菌した発熱物質を含まない水で溶かして使用する粉末形態にすることができる。
【００５０】
エンドセリンアンタゴニストは、例えば、従来の坐薬基剤を含む坐薬または停留浣腸のような、直腸用組成物に製剤することもできる。  前述した製剤に加えて、エンドセリンアンタゴニストは、デポー製剤として製剤することもできる。  このような長期持続性製剤は、移植(例えば、 皮下または筋肉内移植)、または、筋肉内注射によって投与することができる。  よって、例えば、エンドセリンアンタゴニストを、適切な重合物質または疎水性物質(例えば、許容可能な油中型乳剤)、または、イオン交換樹脂を用いて製剤に供することができるし、あるいは、例えば、難溶性塩などの難溶性誘導体として製剤に供することができる。
【００５１】
具体的には、エンドセリンアンタゴニストは、澱粉やラクトースなどの賦形剤を含む錠剤、カプセル剤または胚珠の単体あるいは賦形剤とそれらの組み合わせ、エリキシル剤、あるいは、着香料または着色剤を含んだ懸濁液の形態で、経口的、経頬的、または、舌下に投与することができる。  そのような液体製剤は、懸濁剤のような薬学的に許容可能な添加物を用いて調製することができる。  エンドセリンアンタゴニストを、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または、冠動脈内などに、非経口的に注射することもできる。  非経口投与を行うにあたって、エンドセリンアンタゴニストは、血液に対して等張性を示す溶液を調製するために、例えば、マンニトールやグルコースなどの塩類や単糖類などのその他の物質を含有することができる滅菌した水性溶液の形態のものが最善である。
【００５２】
獣医学的用途については、エンドセリンアンタゴニストは、通常の獣医学的手順にしたがって、好適な許容可能な製剤として投与される。  獣医師であれば、個々の動物に対して最適の投与計画と投与経路を容易に決定することができる。
【００５３】
インスリンとの組み合わせでエンドセリンアンタゴニストを用いることで、現在の糖尿病性ケトアシドーシスの治療法で認められる副作用や合併症を招かずに、糖尿病性ケトアシドーシスの効果的な治療が可能となることが明らかになった。
【実施例】
【００５４】
ＤＫＡのラットモデルでのエンドセリン(ＥＴ)の関与について研究を行った。  ストレプトゾトシン(150mg/kg)を、腹腔内に注射をしてＤＫＡを再現した。  糖尿病性ケトアシドーシスの発症処置をして４日後には、血糖値と血中ケトン値は顕著に増大し、そして、ｐＨ値は低下していた。  すべての実験を、４日目に行った。  以下の処置の前後において、体重、血糖値、尿中ケトン値、血中ケトン値、動脈血液ガス、血中電解質、平均動脈圧、脈圧、心拍数、脳血液灌流、脳水量および肺水量を決定した。  非糖尿病・未処置試験区(コントロール)；糖尿病・未処置試験区(ポジティブコントロール)；糖尿病・生理食塩水処置試験区；糖尿病・生理食塩水＋インスリン処置試験区；および、糖尿病・BMS-182874(ＥＴＡ受容体アンタゴニスト)＋生理食塩水＋インスリン処置試験区。  ＥＴＡ受容体アンタゴニストであるBMS-182874は、動脈血ｐＨ(6.82±0.02→6.91±0.02)、血中カリウムイオン濃度(4.21±0.33→2.75±0.27mmol/dL)、および、血中乳酸濃度(2.74±0.64→1.57±0.20mg/dl)において改善を示した。  また、BMS-182874は、インスリンが誘発する高血圧症を予防し、そして、脳血液の灌流量も増やした。  これら結果は、糖尿病性ケトアシドーシスの管理におけるＥＴＡ受容体アンタゴニストのようなエンドセリンアンタゴニストの治療用途を示唆している。
【００５５】
試料および方法
動物
300〜350ｇの体重のオスのスプラーグドーリーラット(ハーラン社、インディアナポリス、インディアナ州)を、室温(23±１℃)、湿度(50±10％)、および、12時間明暗サイクル(午前６時〜午後６時)が調節された部屋で、使用時まで、少なくとも４日間かけて収容をした。  食餌と水は、継続的に自由に摂らせた。  実験用の動物の飼育と使用については、動物実験委員会(ＩＡＣＵＣ)の許可を得た。  すべての麻酔処置と外科処置は、動物実験委員会のガイドラインを遵守して行った。
【００５６】
薬剤および化学薬品
ストレプトゾトシン、ウレタン(シグマ-アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ−州、米国)；BMS-182874塩酸塩(５-ジメチルアミノ)-Ｎ-(３,４-ジメチル-５-イソキサゾリル)-１-ナフタレンスルホンアミド塩酸塩)、および、ＥＴＡ特異的アンタゴニストであるBQ123シクロ(Ｄ-Trp-Ｄ-Asp-Pro-Ｄ-Val-Leu)(トクリスバイオサイエンス社、エリスヴィル、ミズーリ−州、米国)；エンドセリン-１(リサーチバイオケミカルズインターナショナル社、ナティック、マサチューセッツ州、米国)；および、エンドセリン-１酸素免疫測定法(ＥＩＡ)キット(カタログ番号900-020A、アッセイデザイン社、アナーバー、ミシガン州、米国)。  ここで用いたその他の試薬は、いずれも最上級の市販品であった。
【００５７】
糖尿病性ケトアシドーシス(ＤＫＡ)の誘発
正常血圧のスプラーグドーリーラットに、水以外の摂取を禁じて、２時間の絶食をさせた。  ２時間の絶食の後に、ラットの腹腔内に、150mg/kgのストレプトゾトシンを含んだ0.05mol/lのクエン酸、pH 4.3を注射して、糖尿病を誘発し(Lam et al., 2005; Yuen et al., 2008)、それとは別に、非糖尿病コントロールのラットには、腹腔内に、0.05mol/lのクエン酸緩衝液を注射した(Lam et al., 2005; Yuen et al., 2008)。  ラットに、食餌と水道水を自由に摂らせた。  毎日、ラットの体重を計量し、また、尿検査試薬紙片である１Ｋパラメーターを用いて尿中ケトン濃度を見積もった。  ストレプトゾトシンまたはクエン酸緩衝液の注射を行う前に、ベースラインの血中グルコース値を、カリフォルニア州、ミルピタスに所在のライフスキャン社から市販されているワンタッチウルトラ血糖値検査紙片を用いて評価をし、また、ベースラインの血中ケトン濃度は、カーディオチェック血中ケトン値分析器を用いて評価をした。  高血糖とケトアシドーシスの発症を再検証するために、３日目と４日目に、血糖値と血中ケトン濃度の測定を再度行った。  ストレプトゾトシンを注射して４日後に、(１)尿中ケトン濃度(＞160mg/dl)、(２)血中ケトン濃度(＞20mg/dl)、および、(３)血中グルコース濃度(＞400mg/dl)の顕著な増大が認められ、このことは、ラットの糖尿病性ケトアシドーシス(ＤＫＡ)が進行していることを示唆するものである。  ベースライン値を決定するために、処置を開始する前、処置を始めて１時間後、そして、処置の終了時(実験開始から５時間)に、大腿静脈から血液試料を取得した。
【００５８】
血中ガスの決定
処置を開始する前、処置を始めて１時間後、そして、処置の終了時に、動脈血のｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ナトリウムイオン、カリウムイオン、乳酸、および、ヘマトクリットの数値をモニターした。  血中ガス採取用注射器(イノベーティブメディカルテクノロジーズ社、レーウッド、カンザス州)を用いて、動脈カニューレから血液試料を回収し、そして、ＧＥＭプレミア３０００ユニット(インスツルメントラボラトリー社、レキシントン、マサチューセッツ州)を用いて分析を行った。  ベースライン値を決定するために、処置を開始する前、処置を始めて１時間後、そして、処置の終了時(実験開始から５時間)に、大腿動脈から血液試料を取得した。
【００５９】
脳血液灌流の決定
ラットの頭蓋骨の正中線左側の約２ミリメートル(mm)の位置に、脳組織を傷つけないように注意を払いながら、ドリルで穿頭孔を開けた。  大脳血管の灌流を、ラットの脳の表面に取り付けた光ファイバープローブ(PF407)を介して測定をした。  このプローブは、ペリフラックスPF2b 4000レーザードップラーフロウメトリーユニット(ペリメド社、ストックホルム、スウェーデン)に接続されていた。  毛細血管を通過する赤血球を測定して、灌流を決定した。
【００６０】
心臓血管パラメーターの決定
ウレタン(1.5ｇ/kg、腹腔内投与)でラットに麻酔をかけ、次いで、血行動態パラメーターを決定するための準備を行った(Gulati et al., 1997a; Gulati et al., 1997b)。  麻酔をしたラットの剃毛を行い、そして、挿管を行うためにラットを固定した。  ２〜３センチメートル(cm)の切開を、大腿静脈と大腿動脈の上部に入れ、そして、血管を切開して清浄をした。  左大腿静脈に挿管(PE-50チューブ、クレイアダムス社、パルシパニー、ニュージャージー州)を行い、そして、薬剤投与のために固定を行った。  血行動態シグナルを取得するために、先端部の側面に単一の圧力センサーを具備した超小型圧力変換器SPR-320(２Ｆポリウレタン)(ミラーインスツルメンツ社、ヒューストン、テキサス州)を、左大腿動脈に挿入した。  圧力変換器を、バイキングコネクター(AEC-10C)を具備したブリッジ増幅器 (ML221ブリッジ増幅器；ＡＤインスツルメンツ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国)に接続し、次いで、ミラーパワーラボ16/30データ取得システム(ＡＤインスツルメンツ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国)を用いて、1000S-1の採取速度で継続的にシグナルを得た。  平均動脈圧(ＭＡＰ)、心拍数(ＨＲ)、および、脈圧(ＰＰ)を決定し、そして、ラボチャート-5.00ソフトウェアプログラム(ミラーインスツルメンツ社)を用いて分析を行った。  実験終了後、高用量のウレタン(３gm/kg)を動物に投与して安楽死させた。
【００６１】
脳水量と肺水量の決定
脳浮腫および肺浮腫の評価を行うために、肺および脳の水分含量を決定した。  脳水量と肺水量を、以下のようにして決定した。  処置が終わった時点で、動物を屠殺し、そして、気管を即座にくくり、次いで、肺を切開した。  頭蓋骨を開け、そして、脳を切開した。  脳と肺を生理食塩水で洗浄し、そして、計量をした(湿重量)。  脳と肺を乾燥させるために、それらを、72時間、6O℃に設定したオーブン内に置き、その後、再度の計量を行った(乾燥重量)。  含水率は、以下の式を用いて算出した。
【００６２】
【数１】
0005536198.tif 000002
血漿中のＥＴ-１濃度の決定
処置を行っている間の血漿中ＥＴ-１濃度の変化を分析するために、実験の開始前および終了時に、ラットの右大腿動脈から血液試料を採取し、そして、アプロチニン(500KIU/血液ml)が入った冷却したＥＤＴＡ管(１mg/血液ml)に回収した。  血液試料を、1,600×ｇで、15分間、０℃で遠心分離をし、そして、分析に供するまで、分離した血漿を−70℃で保存をした。  アッセイデザインズ社のエンドセリン-１酵素免疫測定アッセイキット(Nowicki et al, 2005; Brondani et al., 2007)を用いて、ＥＴ-１濃度を見積もった。  具体的には、血漿試料と標準品を、ＥＴ-１に特異的なモノクローナル抗体でコーティングをしたウェルに加えた。  そして、24時間のインキュベーションを終えた後に、プレートを洗浄し、プレートに結合したＥＴ-１だけを残した。  次いで、ＥＴ-１に対して特異的で、かつ西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)でラベルがされたモノクローナル抗体の溶液を加えると、その抗体は、プレートに結合したＥＴ-１に結合する。  このプレートを、30分間かけてインキュベーションし、次いで、ＨＲＰがラベルされた過剰の抗体を除去するために洗浄を行った。  ＨＲＰによって触媒されると青色を呈する３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)基質の溶液を加えた。  基質反応を停止するために塩酸(１Ｎ)を加え、そして、得られた黄色について、DTX 800多重モード検出器を用いて、450nmにて計測を行った。  このデータを、多重モード検出ソフトウェア(ベックマンコールター社、フラートン、カリフォルニア州)で分析をした。  測定された光学密度は、標準品または血漿のいずれかでのＥＴ-１の濃度に正比例している。  処置を開始する以前、および、処置の終了時に、すべてのグループから血液試料を回収した。
【００６３】
研究計画
少なくとも20分間、動物たちを安静にさせてから、以下の外科的処置を行った。  以下のグループに関して、体重、血糖値、尿中ケトン値、血中ケトン値、動脈血液ガス、血中電解質、平均動脈圧、脈圧、心拍数、脳血液灌流、脳水量、および、肺水量についての決定を行った。
【００６４】
グループ１：非糖尿病・未処置試験区(非Ｄ未処置試験区)：  １日目に、クエン酸緩衝液(１ml/kg、腹腔内投与)をラットに注射し、そして、４日目から試験を開始した。
【００６５】
グループ２：糖尿病・未処置試験区(Ｄ未処置試験区)：  糖尿病およびケトアシドーシスを誘発するために、ストレプトゾトシンを含むクエン酸緩衝液(150mg/kg、腹腔内投与)をラットに注射した。  ラットに処置は施さなかった。
【００６６】
グループ３：糖尿病・生理食塩水処置試験区(Ｄ生理食塩水処置試験区)：  糖尿病およびケトアシドーシスを誘発するために、ストレプトゾトシンを含むクエン酸緩衝液(150mg/kg、腹腔内投与)をラットに注射した。  生理食塩水を用いてラットを処置した。  点滴ポンプ(ハーバードアパレイタス点滴/回収ポンプ、ミリス、マサチューセッツ州)を用いて、挿管をした大腿静脈を介して、生理食塩水(0.9％NaCl；ホスピラ社、レイクホレスト、イリノイ州)を、80ml/kg/時間の点滴を１時間行った。  その後の２〜４時間に、ラットに対して、40ml/kg/時間の生理食塩水を投与した(Yuen et al., 2008)。
【００６７】
グループ４：糖尿病・生理食塩水／インスリン処置試験区(Ｄ生理食塩水＋インスリン処置試験区)：  糖尿病およびケトアシドーシスを誘発するために、ストレプトゾトシンを含むクエン酸緩衝液(150mg/kg、腹腔内投与)をラットに注射した。  ３日目に、1.5単位/kgのレギュラーインスリン(ヒューマリン(登録商標)Ｒ(レギュラーヒトインスリン、rDNA由来)で、ラットを処置した。  ４日目に、生理食塩水とインスリンを用いた処置を行った。  挿管をした大腿静脈を介して、ラットに対して、生理食塩水、80ml/kg/時間の0.9％NaCl、および、1.5単位/kg/時間のレギュラーインスリンの点滴を１時間行った。  その後の２〜４時間に、ラットに対して、生理食塩水、40ml/kg/時間の0.9％NaCl、および、1.5単位/kg/時間のレギュラーインスリンを点滴した(Yuen et al., 2008)。
【００６８】
グループ５：糖尿病・BMS-182874／生理食塩水／インスリン処置試験区(Ｄ-ＢＭＳ＋生理食塩水＋インスリン処置試験区)：  糖尿病およびケトアシドーシスを誘発するために、ストレプトゾトシンを含むクエン酸緩衝液(150mg/kg、腹腔内投与)をラットに注射した。  ３日目に、1.5単位/kgのレギュラーインスリンで、ラットを処置した。  ４日目に、選択的ＥＴＡ受容体アンタゴニストであるBMS-182874(９mg/kg)を大量投与し、次いで、生理食塩水とインスリンを用いた処置を行った。  挿管をした大腿静脈を介して、ラットに対して、生理食塩水、80ml/kg/時間の0.9％NaCl、および、1.5単位/kg/時間のレギュラーインスリンの点滴を１時間行った。  その後の２〜４時間に、ラットに対して、生理食塩水、40ml/kg/時間の0.9％NaCl、および、1.5単位/kg/時間のレギュラーインスリンを点滴した。
【００６９】
グループ６：糖尿病・BQ123／生理食塩水／インスリン処置試験区(Ｄ-ＢＱ＋生理食塩水＋インスリン処置試験区)：  BMS-182874(９mg/kg)に代えて、BQ123(１mg/体重kg)を利用した以外は、グループ５に記載の手順と同じ処置を行った。
【００７０】
すべてのデータ値は、平均値±ＳＥＭで示してある。  一元配置分散分析(ベースライン値に関するグループ内の比較)、および、二元分散分析 (各グループから得た対応する時点に関するグループ間の比較)によって有意差の評価を行い、次いで、ダネットの多重比較検定とボンフェローニ検定の各々に適用した。  Ｐ＜０.０５のレベルを、有意とした。  統計値の分析は、グラフパドプリズムソフトウェアバージョン５.００によって処理を行った。
【００７１】
結果
表１は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血糖値(mg/dl)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、１日前の処置との比較をしたものであり、また、＃Ｐ＜０.０５は、４日前の処置との比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、血中グルコース値を増大せしめ、また、インスリンで処置を行うことで、血糖値が顕著に減少したことを示している。  そして、外科的処置を行うことで、血中グルコース値が顕著に増大することも明らかとなった。  BMS-182874またはBQ123で処置を行っても、血糖値には顕著な影響は認められなかった。
【００７２】
【表１】
0005536198.tif 000003
表２は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血中ケトン値(mg/dl)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、１日前の処置との比較をしたものであり、また、＃Ｐ＜０.０５は、４日前の処置との比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、血中ケトン値を増大せしめ、また、インスリンで処置を行うことで、BMS-182874/BQ123の有無にかかわらず、血中ケトン値が顕著に減少したことを示している。  BMS-182874で処置を行っても、血中ケトン値には顕著な影響は認められなかった。  BQ123で処置を行ったところ、血中ケトン値は顕著に減少した。  図２を参照されたい。
【００７３】
【表２】
0005536198.tif 000004
表３は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、尿中ケトン濃度(mg/dl)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、１日目と比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、尿中ケトン濃度を増大せしめたことを示している。  尿中ケトン濃度は、処置を開始する前に決定されたため、この実験では、処置の効果については観察を行っていない。
【００７４】
【表３】
0005536198.tif 000005
表４は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血漿中ＥＴ-１濃度(pg/ml)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、前処置との比較をしたものであり、また、＃Ｐ＜０.０５は、非Ｄ未処置試験区との比較をしたものである。  (１)糖尿病性ケトアシドーシスの誘発、および、(２)インスリンを用いた処置を行うことで、血漿中ＥＴ-１濃度が増大する、との結論を導くことができた。      
【００７５】
そして、外科的処置を行うことで、血漿中ＥＴ-１濃度が顕著に増大するということも明らかとなった。  BMS-182874またはBQ123で処置を行っても、血漿中ＥＴ-１濃度には顕著な影響は認められなかった。
【００７６】
【表４】
0005536198.tif 000006
表５は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、動脈血ｐＨに基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、非糖尿病・未処置のラットとの比較をしたものであり、また、＃Ｐ＜０.０５は、糖尿病・生理食塩水＋インスリン処置のラットとの比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、ｐＨを低下させており、このことは、重篤なアシドーシスに至っていることを示している。  生理食塩水、または、生理食塩水＋インスリンを用いた処置では、アシドーシスについての有意な改善は認められなかった。  しかしながら、BQ123、または、BMS-182874＋生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったところ、動脈血ｐＨに有意の改善が認められた。  これらの結果は、糖尿病性ケトアシドーシスの治療を行っている間にアシドーシスを改善するために、ＥＴＡ受容体アンタゴニスト、例えば、BMS-182874、または、BQ123を使用できることを示すものである。  ここで用いた機器は、６.８０未満のｐＨを計測できないものであった。
【００７７】
【表５】
0005536198.tif 000007
表６は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、動脈血ｐＣＯ２(mmHg)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、非糖尿病・未処置のラットとの比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、動脈血ｐＣＯ２を低下させていることを示している。  様々な処置を行っている間の動脈血ｐＣＯ２には、変化が認められなかった。
【００７８】
【表６】
0005536198.tif 000008
表７は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、動脈血ｐＯ２(mmHg)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、非糖尿病・未処置のラットとの比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、動脈血ｐＯ２を増大させていることを示している。  様々な処置を行っている間の動脈血ｐＯ２には、変化が認められなかった。
【００７９】
【表７】
0005536198.tif 000009
表８は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血中ナトリウムイオン濃度(mmol/l)に基づく治療の効果を示している。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、血中ナトリウムイオン(Ｎａ＋)濃度に変化を及ぼさないことを示している。  様々な処置を行っている間の血中ナトリウムイオン濃度には、変化が認められなかった。
【００８０】
【表８】
0005536198.tif 000010
表９は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血中カリウムイオン濃度(mmol/l)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、非糖尿病・未処置のラットとの比較をしたものであり、また、＃Ｐ＜０.０５は、糖尿病・未処置のラットとの比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、血中カリウムイオン(Ｋ＋)濃度を増大することを示している。  生理食塩水＋インスリン、または、BMS-182874＋生理食塩水＋インスリン、または、BQ123＋生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったところ、糖尿病性ケトアシドーシスによって誘発された血中カリウムイオン濃度は、有意に減少していた。  高カリウム血症は、ＤＫＡの症例によく認められる症状であり(Fulop, 1979)、高カリウム血症になると、細胞内から細胞外の体液へとカリウムイオンの再分配が起こり、そして、ＥＫＧにおいてＵ波と平坦なＴ波とが形成されることとなる(Malone and Brodsky, 1980)。  インスリンを点滴すると、不整脈の発生リスクを高める低カリウム血症になる可能性がある。  BMS-182874とBQ123は、血行動態を安定にし、そして、好ましくない心臓血管イベントを予防するために用いることができる。
【００８１】
【表９】
0005536198.tif 000011
表１０は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血中乳酸濃度(mg/dl)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、非糖尿病・未処置のラットとの比較をしたものであり、また、＃Ｐ＜０.０５は、糖尿病・未処置のラットとの比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、血中乳酸濃度を増大することを示している。  生理食塩水、生理食塩水＋インスリン、または、BMS-182874＋生理食塩水＋インスリン、または、BQ123＋生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったところ、糖尿病性ケトアシドーシスによって誘発された血中乳酸濃度は、有意に減少していた。
【００８２】
【表１０】
0005536198.tif 000012
表１１は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血中ヘマトクリット値(Hct；％)に基づく治療の効果を示している。  ＃Ｐ＜０.０５は、非糖尿病・未処置のラットとの比較をしたものである。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、ヘマトクリット値に変化を及ぼさなかったことを示している。  生理食塩水＋インスリン、または、BMS＋生理食塩水＋インスリン、または、BQ123＋生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったところ、ヘマトクリット値は、有意に減少していた。
【００８３】
【表１１】
0005536198.tif 000013
図１は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、体重(ｇ)に基づく治療の効果を示している。  これらの結果は、４日間の試験期間において、糖尿病性ケトアシドーシスでないコントロールのラットで、体重が増加したことを示している。  また、すべての処置グループにおいて、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスは、４日間の試験期間で、同様の体重の減少を示した。
【００８４】
図２は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血中ケトン濃度(mg/dl)に基づく治療の効果を示している。  これらの結果は、ストレプトゾトシンによって誘発された糖尿病性ケトアシドーシスが、血中ケトン濃度を増大したことを示している。  生理食塩水＋インスリンを用いた治療、ならびに、BQ123、あるいは、BMS＋生理食塩水＋インスリンを用いた治療では、血中ケトン濃度について、同様の顕著な減少を示した。  BQ123＋生理食塩水＋インスリンを用いた治療を行ったところ、ＤＫＡラットの血中ケトン値の特に顕著な減少が認められた。
【００８５】
図３は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、平均動脈圧(mmHg)に基づく治療の効果を示している。  糖尿病性ケトアシドーシスのラットと比較して、非糖尿病・未処置のラットでの動脈圧は、高い数値を示していた。  糖尿病・未処置のラットでは、実験終了時まで、動脈圧の減少が続いた。  生理食塩水を用いた処置、生理食塩水＋インスリンを用いた処置、ならびに、BQ123＋生理食塩水＋インスリン、あるいは、BMS＋生理食塩水＋インスリンを用いた処置を行ったところ、未処置のラットと比較して、動脈圧の減少は、さほど大きくなかった。  生理食塩水＋インスリンを用いた処置、BQ123＋生理食塩水＋インスリン、または、BMS＋生理食塩水＋インスリンを用いた処置を行ったところ、ベースラインと比較して、動脈圧の減少は何も認められなかった。  したがって、糖尿病性ケトアシドーシスの治療を行っている間は、BQ123およびBMS-182874が、動脈圧を安定させていたものと結論づけられる。
【００８６】
図４は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、脈圧(mmHg)に基づく治療の効果を示している。  糖尿病性ケトアシドーシスのラットと比較して、非糖尿病・未処置のラットでの脈圧は、高い数値を示していた。  糖尿病・未処置のラットでは、実験終了時まで、脈圧の減少が続いた。  生理食塩水を用いた処置、生理食塩水＋インスリンを用いた処置、ならびに、BQ123＋生理食塩水＋インスリン、あるいは、BMS＋生理食塩水＋インスリンを用いた処置を行ったところ、未処置のラットと比較して、脈圧の減少は、さほど大きくなかった。  しかしながら、BQ123＋生理食塩水＋インスリンを用いた処置を行ったところ、ベースラインと比較して、脈圧の減少は何も認められなかった。  したがって、糖尿病性ケトアシドーシスの治療を行っている間は、BQ123およびBMS-182874が、脈圧を安定させていたものと結論づけられる。
【００８７】
図５は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、心拍数(脈拍/分)に基づく治療の効果を示している。  糖尿病性ケトアシドーシスのラットと比較して、非糖尿病・未処置のラットでの心拍数は、高い数値を示していた。  糖尿病・未処置のラットでは、実験終了時まで、心拍数の減少が続いた。  生理食塩水を用いた処置を行ったところ、未処置のラットが示したのと同様の心拍数の減少が認められた。  生理食塩水＋インスリンを用いた処置、または、BMS＋生理食塩水＋インスリン、あるいは、BQ123＋生理食塩水＋インスリンを用いた処置を行ったところ、ベースラインと比較して、心拍数の減少は何も認められず、また、その心拍数は、未処置のラット、あるいは、生理食塩水を用いて処置を行ったラットでの心拍数よりも有意(＊Ｐ＜０.０５)に大きな数値であった。  生理食塩水＋インスリン、または、BMS＋生理食塩水＋インスリン、あるいは、BQ123＋生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったグループでの心拍数は、同様の数値であった。
【００８８】
図６は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、脳血液灌流(変化率)に基づく治療の効果を示している。  非糖尿病・未処置のラットでの脳血液灌流は、糖尿病性ケトアシドーシスのラットと比較して、同様の数値を示していた。  生理食塩水を用いて処置を行ったところ、脳血液灌流に関しては、何らの顕著な変化も認められなかった。  しかしながら、生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったところ、脳血液灌流に顕著(＃Ｐ＜０.０５)な変化が認められた。  この脳血液灌流の増大は、BMS-182874、または、BQ123によって、有意にブロックすることができた。  BQ、または、BMS＋生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったところ、生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったラットと比較をして、脳血液灌流の増大を、有意(＊Ｐ＜０.０５)に減衰させていた。  したがって、糖尿病性ケトアシドーシスの治療を行っている間は、BQまたはBMS-182874が、脳血流を安定させていたものと結論づけられる。  糖尿病性ケトアシドーシスの治療を行っている間に生じる致命的危険要素は、脳浮腫の進行である。  脳血液灌流の増大は、脳浮腫の進行に寄与する主要因子となりうる。  ここで示した結果は、糖尿病性ケトアシドーシスのラットモデルにおいて、BQまたはBMS-182874が、インスリンが誘発した脳血液灌流の増大を予防できる、ことを初めて明らかにするものである。
【００８９】
図７は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、肺水量(肺浮腫)に基づく治療の効果を示している。  非糖尿病・未処置のラットと比較して、糖尿病性ケトアシドーシスのラットでの肺水量は、有意(＊Ｐ＜０.０５)に減少をしていた。  生理食塩水、生理食塩水＋インスリン、または、BQあるいはBMS＋生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったところ、肺水量の改善が認められ、そして、糖尿病性ケトアシドーシスのラットと比較をして、肺水量が有意(＃Ｐ＜０.０５)に改善していたが、非糖尿病・未処置のラットで認められたのと同様の肺水量であった。  糖尿病性ケトアシドーシスが、重度の脱水症状を引き起こし、そして、肺水量の減少を招くことは周知の事項である。  生理食塩水、生理食塩水＋インスリン、または、BQあるいはBMS＋生理食塩水＋インスリンの点滴を行うことで、肺水量を回復し、そして、いずれのグループに属するラットにも肺浮腫の兆候は認められなかった。
【００９０】
図８は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、脳水量(脳浮腫)に基づく治療の効果を示している。  非糖尿病・未処置のラットと比較して、糖尿病性ケトアシドーシスのラットでの脳水量は、有意(＊Ｐ＜０.０５)に減少をしていた。  生理食塩水、生理食塩水＋インスリン、または、BQ123あるいはBMS＋生理食塩水＋インスリンを用いて処置を行ったところ、脳水量の改善が認められ、そして、糖尿病性ケトアシドーシスのラットと比較をして、脳水量が有意(＃Ｐ＜０.０５)に改善していたが、非糖尿病・未処置のラットで認められたのと同様の脳水量であった。  糖尿病性ケトアシドーシスが、重度の脱水症状を引き起こし、そして、脳水量の減少を招くことは周知の事項である。  生理食塩水、生理食塩水＋インスリン、または、BQあるいはBMS＋生理食塩水＋インスリンの点滴を行うことで、脳水量を回復し、そして、いずれのグループに属するラットにも脳浮腫の兆候は認められなかった。
【００９１】
図９は、各グループに属するラットにおける糖尿病性ケトアシドーシスの誘発の効果と、血漿中ＥＴ-１濃度(pg/ml)に基づく治療の効果を示している。  ＊Ｐ＜０.０５は、ベースラインとの比較をしたものである。  インスリンを用いて処置を行うと、血漿中ＥＴ-１濃度が増大し、そして、すべての処置方法が、血漿中ＥＴ-１濃度を同様に増大させていた、と結論づけられる。
【００９２】
上記試験および上記データは、血糖値、ケトン濃度、および、尿中ケトン濃度の増大と、血液ｐＨの減少からも実証されているように、ラットにおいて、ＤＫＡが首尾良く誘発されたことを示している。  生理食塩水とインスリンを用いた処置を行ったところ、血糖値とケトン濃度が有意に減少し、また、脳血流は増大した。  ＥＴＡ受容体アンタゴニスト、例えば、BQ123またはBMS182874は、ＤＫＡのラットモデルにおいて、インスリンが誘発した脳血液灌流の増大を妨げていた。
【００９３】
ＤＫＡの治療を行っている間に生じる致命的危険要素は、ＣＥの進行である。  脳血液灌流の増大は、ＣＥの進行に寄与する主要因子となりうる。  ＥＴＡ受容体アンタゴニスト、例えば、BQ123またはBMS-182874が、インスリンによって誘発された脳血液灌流の増大を抑制可能であることが、初めて実証されたのである。  ＤＫＡの治療において、選択的ＥＴＡ受容体アンタゴニストを投与することで、患者の有病率と死亡率は、有意に減少するであろう。
【００９４】
これら知見は、後藤-柿崎ラット(II型糖尿病のモデル)を選択的ＥＴＡ受容体アンタゴニストで長期処置を施したところ、高血糖値が顕著に減少し、また、インスリン感受性の改善にも関わる血漿グルコース除去率を正常値に回復した(Balsiger et al., 2002)との事実によっても支持されている。  その一方で、糖尿病合併症へのＥＴ-１の関与について、非インスリン依存性糖尿病患者において決定がされており、その結果、健常者と比較をして、血管障害の有無に関係なく、また、高血圧症の有無に関係なく、すべての糖尿病患者において、血漿中ＥＴ-１濃度について、有意の差異は認められていない(Bertello et al., 1994)。
【００９５】
糖尿病性ケトアシドーシスとは、ケトン、アセトアセテート、および、β-ヒドロキシ酪酸塩の濃度の増大に起因するものである。  最初は、おそらくはβ-ヒドロキシ酪酸塩の利用が進まないことが原因となって、β-ヒドロキシ酪酸塩が、アセトアセテートに対して、３：１の比率で過剰に存在する(Nosadini et al., 1985)が、糖尿病性ケトアシドーシスの処置を行っている間にβ- ヒドロキシ酪酸塩は減少していく(Stephens et al., 1971)。  β-ヒドロキシ酪酸塩とアセトアセテートは、モノカルボン酸輸送系を介して血液脳関門(ＢＢＢ)を越えていく(Poole and Halestrap, 1993)。  血中のケトン濃度は、ＢＢＢを越えていく経路に影響を及ぼし、また、脳の特定の領域で利用がされている(Hawkins and Biebuyck, 1979; Kreis and Ross, 1992)。  ケトンが、脳血管に対して潜在的に急性の有害作用を呈することが実証されており、このことは、アセトアセテートが誘発したＥＴ-１の生成が原因であるかもしれない(Isales et al., 1999)。
【００９６】
ＥＴ-１が、ヒトの大脳血管の内皮細胞の透過性を高めることが示されている(Stanimirovic et al., 1994)。  幾つかの研究によって、ＥＴ-１がＢＢＢを調節することが報告されている。  虚血性大脳皮質に続いて中大脳動脈閉塞症を発症したラットに対してＥＴ-１を適用することで、小分子がＢＢＢを越えることを効率的に抑制することが可能となっていた(Chi et al., 2001)。  Ｐ-糖タンパク質は、ＢＢＢの重要な要素であり、また、ＥＴ-１が、ＢＢＢにてＰ-糖タンパク質が媒介した輸送を迅速に抑制することも見い出されている(Hartz et al., 2004)。  その他の研究によれば、ＥＴ-１が、Ｐ-糖タンパク質の発現に関しては効果を示さないものの、ヒトの微小脳血管内皮細胞での輸送活性を調節することが報告されている(Hembury and Mabondzo, 2008)。  内皮ＥＴ-１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、マトリックスメタロプロテアーゼ-２の発現、含水量、および、免疫グロブリン漏出の増大を招き、また、閉塞度を緩和するに至っており、これらのことは、ＢＢＢの破壊を示している(Leung et al., 2009)。  イヌおよびラットの嚢内にＥＴ-１を反復投与することによって、ＢＢＢ透過性は顕著に増大し、この作用は、ＥＴＡ受容体アンタゴニストであるS-0139によってブロックすることができる(Narushima et al., 2003)。  ＥＴ-１は、ｔ-ＰＡで処置をした急性虚血性脳卒中の患者に認められる脳浮腫の進行と関与しており、また、重篤な脳浮腫の進行に関する診断マーカーとなりうることが示唆されている(Moldes et al., 2008)。  ｒｔＰＡを用いた塞栓性脳卒中のラットモデルをS-0139で処置を行った研究では、ｒｔＰＡが惹起したＢＢＢの攪乱作用を抑制することで、神経保護作用が得られることが示されている(Zhang et al., 2008)。
【００９７】
上記したデータに鑑みれば、糖尿病性ケトアシドーシスの治療において、選択的ＥＴＡ受容体アンタゴニストを投与することで、患者の有病率と死亡率が顕著に低減されることがうかがえる。
【００９８】
これまでに説明をしてきた本願発明に対して、当業者が、本願発明の趣旨と範囲を逸脱せずに、修正や変更を加えることが可能であるので、特許請求の範囲の欄に記載の限定事項のみが、本願発明に付加されるべきである。
【００９９】
参照文献
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【０１００】
【表１２】
0005536198.tif 000014
【０１０１】
【表１３】
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【０１０２】
【表１４】
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【０１０３】
【表１５】
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【０１０４】
【表１６】
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【０１０５】
【表１７】
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【０１０６】
【表１８】
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【０１０７】
【表１９】
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【０１０８】
【表２０】
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【０１０９】
【表２１】
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【０１１０】
【表２２】
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【０１１１】
【表２３】
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【０１１２】
【表２４】
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【０１１３】
【表２５】
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【０１１４】
【表２６】
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【０１１５】
【表２７】
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【０１１６】
【表２８】
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【０１１７】
【表２９】
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【０１１８】
【表３０】
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【０１１９】
【表３１】
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【０１２０】
【表３２】
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【０１２１】
【表３３】
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【０１２２】
【表３４】
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【０１２３】
【表３５】
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【０１２４】
【表３６】
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【０１２５】
【表３７】
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【０１２６】
【表３８】
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【０１２７】
【表３９】
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【０１２８】
【表４０】
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【０１２９】
【表４１】
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【０１３０】
【表４２】
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【０１３１】
【表４３】
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【０１３２】
【表４４】
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【図１】
0005536198.tif 000056
【図２】
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【図３】
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【図４】
0005536198.tif 000059
【図５】
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【図６】
0005536198.tif 000061
【図７】
0005536198.tif 000062
【図８】
0005536198.tif 000063
【図９】
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