(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞を分化誘導させて、造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するための組成物であって、ＮＥＬＬ−１またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターを含む、組成物であって、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、組成物。
【請求項２】
前記脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞は、体性幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記体性幹細胞は、造血幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ血液細胞の母細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記体性幹細胞は、上皮組織に分化の方向付けがなされた幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ上皮系細胞の母細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記体性幹細胞は、腺原細胞または毛根に含まれる細胞である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血幹細胞から分化する、好中球、好酸球、好塩基球およびリンパ球からなる群より選択される白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、ならびにそれらの組合わせからなる群より選択される血球である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記外分泌腺は、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺および唾液腺からなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、前記ＮＥＬＬ−１を０．０１μｇ／ｍｌ以上で含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、前記ＮＥＬＬ−１を５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌで含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞を分化誘導させて、造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するための材料であって、該材料は、
Ａ）徐放性足場、および
Ｂ）ＮＥＬＬ−１、またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクター
を含む、材料であって、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、材料。
【請求項１３】
前記徐放性足場は、細胞外マトリクスである、請求項１２に記載の材料。
【請求項１４】
前記徐放性足場は、コラーゲンおよびアテロコラーゲンからなる群より選択される、請求項１２に記載の材料。
【請求項１５】
前記脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞は、体性幹細胞である、請求項１２に記載の材料。
【請求項１６】
前記体性幹細胞は、造血幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ血液細胞の母細胞である、請求項１５に記載の材料。
【請求項１７】
前記体性幹細胞は、上皮組織に分化の方向付けがなされた幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ上皮系細胞の母細胞である、請求項１５に記載の材料。
【請求項１８】
前記体性幹細胞は、腺原細胞または毛根に含まれる細胞である、請求項１５に記載の材料。
【請求項１９】
前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血幹細胞から分化する、好中球、好酸球、好塩基球およびリンパ球からなる群より選択される白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、ならびにそれらの組合わせからなる群より選択される血球である、請求項１２に記載の材料。
【請求項２０】
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管である、請求項１２に記載の材料。
【請求項２１】
前記外分泌腺は、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺および唾液腺からなる群より選択される、請求項２０に記載の材料。
【請求項２２】
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、請求項１２に記載の材料。
【請求項２３】
前記ＮＥＬＬ−１は、０．０１μｇ／ｍｌ以上で含まれる、請求項１２に記載の材料。
【請求項２４】
前記ＮＥＬＬ−１は、５μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌで含まれる、請求項２３に記載の材料。
【請求項２５】
脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞を分化誘導させて、造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するためのキットであって、該キットは、ＮＥＬＬ−１またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターを備える、キットであって、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、キット。
【請求項２６】
前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血幹細胞から分化する、好中球、好酸球、好塩基球およびリンパ球からなる群より選択される白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、ならびにそれらの組合わせからなる群より選択される血球である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】
前記外分泌腺は、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺および唾液腺からなる群より選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、請求項２５に記載のキット。
【請求項３０】
前記ＮＥＬＬ−１が０．０１μｇ／ｍｌ以上で含まれる、請求項２５に記載のキット。
【請求項３１】
前記ＮＥＬＬ−１が５μｇ／ｍｌ〜５０ｕｇ／ｍｌで含まれる、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞を分化誘導させて、造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するための医療器具であって、該医療器具は、
Ａ）ＮＥＬＬ−１またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクター；
Ｂ）徐放性足場；および
Ｃ）容器；
を備える、医療器具であって、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、医療器具。
【請求項３３】
前記徐放性足場は、細胞外マトリクスからなる群より選択される、請求項３２に記載の医療器具。
【請求項３４】
前記徐放性足場は、コラーゲンおよびアテロコラーゲンである、請求項３２に記載の医療器具。
【請求項３５】
前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血幹細胞から分化する、好中球、好酸球、好塩基球およびリンパ球からなる群より選択される白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、ならびにそれらの組合わせからなる群より選択される血球である、請求項３２に記載の医療器具。
【請求項３６】
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管である、請求項３２に記載の医療器具。
【請求項３７】
前記外分泌腺は、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺および唾液腺からなる群より選択される、請求項３６に記載の医療器具。
【請求項３８】
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、請求項３２に記載の医療器具。
【請求項３９】
前記ＮＥＬＬ−１が０．０１μｇ／ｍｌ以上で含まれる、請求項３２に記載の医療器具。
【請求項４０】
前記ＮＥＬＬ−１が５μｇ／ｍｌ〜５０ｕｇ／ｍｌで含まれる、請求項３９に記載の医療器具。
【請求項４１】
造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に生産する方法であって、該方法は、以下の工程：
脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞を提供する工程；
該脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞と、ＮＥＬＬ−１またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターとを接触させる工程
を包含する、方法であって、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、非ヒト動物の脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、方法。
【請求項４２】
前記脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞と前記ＮＥＬＬ−１とが、徐放性足場上で接触される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記徐放性足場は、細胞外マトリクスからなる群より選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記徐放性足場は、コラーゲンおよびアテロコラーゲンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞は、体性幹細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４６】
前記体性幹細胞は、造血幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ血液細胞の母細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記体性幹細胞は、上皮組織に分化の方向付けがなされた幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ上皮系細胞の母細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記体性幹細胞は、腺原細胞または毛根に含まれる細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための組成物であって、該組成物は、ＮＥＬＬ−１、またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターを含む、組成物であって、該分化誘導された細胞、組織または臓器は、肝臓、腎臓、すい臓、副腎、甲状腺、卵巣および精巣からなる群より選択され、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、組成物。
【請求項５０】
前記維持は、前記分化誘導された細胞、組織または臓器の存在が通常は許容されない場所において行われる、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための方法であって、該方法は、
該分化誘導された細胞、組織または臓器を提供する工程であって、該分化誘導された細胞、組織または臓器は、肝臓、腎臓、すい臓、副腎、甲状腺、卵巣および精巣からなる群より選択される、工程；
該分化誘導された細胞、組織または臓器に、ＮＥＬＬ−１またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターを付与する工程であって、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、非ヒト動物において脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、工程
を包含する、方法
【請求項５２】
造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器を、脂肪組織または筋組織もしくはそれを維持する血管に含まれる細胞から異所的に形成するための医薬の製造における、ＮＥＬＬ−１、またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターの使用であって、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、使用。
【請求項５３】
肝臓、腎臓、すい臓、副腎、甲状腺、卵巣および精巣からなる群より選択される分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための医薬の製造における、ＮＥＬＬ−１、またはＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターの使用であって、該ＮＥＬＬ−１または該ＮＥＬＬ−１を発現させるプラスミドもしくはウイルスベクターは、脂肪組織または筋組織およびそれを維持する血管がある環境において使用される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞、組織および臓器の異所再生制御技術に関する。より詳細には、ＮＥＬＬ−１を用いた細胞、組織および臓器の異所再生制御技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、肝臓、すい臓、甲状腺、腎臓などの臓器の移植を必要とする患者が数多く存在する。例えば、厚生労働省「平成１８年国民健康・栄養調査結果の概要」では、糖尿病の該当者およびその予備群と推定された人の合計は、約１，８７０万人となり、２００２年に比べ２５０万人（１５．４％）増加している。その中でも内因性インスリン欠乏による患者は、連日のインスリン自己注射により血糖を制御しなくては生活することは困難であり、膵臓（膵臓β細胞）移植またはその代替となる技術を必要とする患者が多く存在する。【０００３】
また、甲状腺ホルモンは過剰になると異常な代謝上昇がみられ、バセドウ病などをおこす。反対に、甲状腺ホルモンが不足すると、甲状腺機能低下症となる。分泌減少の患者のみならず、甲状腺ホルモンの過剰患者に対して行われる甲状腺切除手術後の合併症である、極度の代謝低下の患者などについても、甲状腺機能を回復するための臓器移植または代替となる技術が必要とされている。【０００４】
しかし、実際に臓器を移植するには、移植するための臓器を入手する必要があり、現状では、第三者の善意による臓器の提供を待たなければならない。未分化細胞に対して分化方向を強制誘導する技術は数多く存在し、盛んに研究が行われており、再生医療分野でも臨床応用にむけて種々の研究・開発が進められている。しかし、これまでに成功しているのは、角膜、皮膚・粘膜、骨、軟骨など移植片レベルまでであり、体内で正常に機能する臓器を提供することには成功していない。【０００５】
ＮＥＬＬ−１は、骨形成細胞の誘導、軟骨形成細胞の誘導などに関係していることが報告されている（特許文献１〜４および非特許文献１）。ＮＥＬＬ−１による骨修復は、本来あるべき場所において行われている。しかし、種々の臓器を、異所的に、形成および／または維持する作用がＮＥＬＬ−１にあることはまったく知られておらず、予見すらされていなかった。【０００６】
特許文献５には、両生類の外胚葉片をアクチビンの存在下で前処理し、胚に移植し、種々の組織を形成させることが記載されている。この方法は、哺乳動物と比較して自己修復能力が極めて高い両生類を対象としており、両生類でさえ、移植後の生存率は３０％（７０％が死亡）にすぎない。したがって、特許文献５に記載される方法は哺乳動物では不可能である。ＴＧＦβまたはアクチビンを添加した哺乳動物の培養組織において、移植に耐えたとの報告はない。【０００７】
また、特許文献５に記載の方法を、ヒトに対応させると、初期胎児を胎盤から引きはがして、将来の疾患を予想して処理をすることになり、物理的、倫理的にも不可能である。この手法では、胚内に移植細胞を組み込むため細胞が異常な増殖をする場合、および活性で不利益が生じる場合でも、移植された個体を救う手立てがない。したがって、特許文献５に記載される手法は、哺乳動物には適していない。【０００８】
非特許文献２および３には、骨形成因子として知られるＢＭＰを用いて、生体内に異所的に骨が形成されたことが記載されている。しかし、ＢＭＰにより形成されることが報告されているものは骨のみであり、それ以外の細胞、組織、臓器が形成されたとの報告はない。【０００９】
非特許文献４には、ヒトから切り出した軟骨組織を実験室内で分解して、強力な軟骨形成タンパク質を加え、耳介の形をしたコラーゲンスポンジ上に播種し、ヌードマウス体内に移植すると、ヒト耳軟骨が形成されたことが記載されている。しかし、軟骨形成タンパク質により形成されることが報告されているのは耳軟骨のみであり、それ以外の細胞、組織、臓器が形成されたとの報告はない。
【特許文献１】国際公開２００６／０８９０２３パンフレット
【特許文献２】国際公開２００４／０７２１００パンフレット
【特許文献３】国際公開２００４／０２４８９３パンフレット
【特許文献４】国際公開０１／０２４８２１パンフレット
【特許文献５】特開２０００−２１７５７１号公報
【非特許文献１】Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｊｕｎ；２２（６）９１８−３０
【非特許文献２】Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ８２（８）：５８１−５８４，２００３
【非特許文献３】Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．１０８：９５２，２００１
【非特許文献４】Ｉｓｏｇａｉ  Ｎ，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｍｏｄｅｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００６  Ａｐｒ；１２（４）：６９１−７０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、再生医療に応用し得る分化誘導された細胞、組織および臓器を形成および／または維持する技術を提供することにある。【００１１】
本発明の別の課題は、生体内に移植した、分化誘導された細胞、組織および臓器を免疫拒絶反応から保護し、生体内に維持する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記の課題を解決するために、本発明者等は鋭意研究の結果、ＮＥＬＬ−１に、分化段階にある細胞をさらに分化誘導させる能力があることを見いだし、本発明を完成させるに至ったものである。【００１３】
また、本発明者らは、ＮＥＬＬ−１に、生体内の免疫拒絶を抑制する働きがあることを見出し、本発明を完成させるに至ったものである。【００１４】
ＮＥＬＬ−１のこのような作用はこれまで知られておらず、本発明により初めて提供されるものである。【００１５】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する。
（項目１）
一定の分化の方向付けがなされた細胞を分化誘導させて、該分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器にするための組成物であって、ＮＥＬＬ−１または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を含む、組成物。
（項目２）
脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において、前記分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するための、上記項目に記載の組成物。
（項目３）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は、体性幹細胞である、上記項目に記載の組成物。
（項目４）
前記体性幹細胞は、造血組織、上皮組織、結合組織、筋組織および神経組織からなる群より選択される組織に存在する体性幹細胞である、上記項目に記載の組成物。
（項目５）
前記体性幹細胞は、造血組織、上皮組織または結合組織に分化の方向付けがなされた幹細胞である、上記項目に記載の組成物。
（項目６）
前記造血組織に存在する体性幹細胞は、造血幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ血液細胞の母細胞である、上記項目に記載の組成物。
（項目７）
前記上皮組織に存在する体性幹細胞は、上皮組織に分化の方向付けがなされた幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ上皮系細胞の母細胞である、上記項目に記載の組成物。
（項目８）
前記上皮組織に存在する体性幹細胞は、腺原細胞または毛根に含まれる細胞である、上記項目に記載の組成物。
（項目９）
前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血系または上皮系に分化誘導されたものである、上記項目に記載の組成物。
（項目１０）
前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血幹細胞から分化する、好中球、好酸球、好塩基球およびリンパ球からなる群より選択される白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、ならびにそれらの組合わせからなる群より選択される血球である、上記項目に記載の組成物。
（項目１１）
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管である、上記項目に記載の組成物。
（項目１２）
前記外分泌腺は、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺および唾液腺からなる群より選択される、上記項目に記載の組成物。
（項目１３）
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、上記項目に記載の組成物。
（項目１４）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は腺原細胞であり、前記分化誘導された細胞、組織または臓器は外分泌腺およびその導管である、上記項目に記載の組成物。
（項目１５）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は毛根に含まれる細胞であり、前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、上記項目に記載の組成物。
（項目１６）
前記組成物は、前記ＮＥＬＬ−１を約０．０１μｇ／ｍｌ以上で含む、上記項目に記載の組成物。
（項目１７）
前記組成物は、前記ＮＥＬＬ−１を約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで含む、上記項目に記載の組成物。
（項目１８）
天然に存在する対応する機能を前記分化誘導された細胞、組織または臓器が有する、上記項目に記載の組成物。
（項目１９）
一定の分化の方向付けがなされた細胞を分化誘導させて、分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器にするための材料であって、該材料は、
Ａ）徐放性足場、および
Ｂ）ＮＥＬＬ−１、または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質
を含む、材料。
（項目２０）
脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において、前記分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するための、上記項目に記載の材料。
（項目２１）
前記徐放性足場は、細胞外マトリクスである、上記項目に記載の材料。
（項目２２）
前記徐放性足場は、コラーゲンおよびアテロコラーゲンからなる群より選択される、上記項目に記載の材料。
（項目２３）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は、体性幹細胞である、上記項目に記載の材料。
（項目２４）
前記体性幹細胞は、造血組織、上皮組織、結合組織、筋組織および神経組織からなる群より選択される組織に存在する体性幹細胞である、上記項目に記載の材料。
（項目２５）
前記体性幹細胞は、造血組織、上皮組織または結合組織に存在する体性幹細胞である、上記項目に記載の材料。
（項目２６）
前記造血組織に存在する体性幹細胞は、造血幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ血液細胞の母細胞である、上記項目に記載の材料。
（項目２７）
前記上皮組織に存在する体性幹細胞は、上皮組織に分化の方向付けがなされた幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ上皮系細胞の母細胞である、上記項目に記載の材料。
（項目２８）
前記上皮組織に存在する体性幹細胞は、腺原細胞または毛根に含まれる細胞である、上記項目に記載の材料。
（項目２９）
前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器である、上記項目に記載の材料。
（項目３０）
前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血幹細胞から分化する、好中球、好酸球、好塩基球およびリンパ球からなる群より選択される白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、ならびにそれらの組合わせからなる群より選択される血球である、上記項目に記載の材料。
（項目３１）
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管である、上記項目に記載の材料。
（項目３２）
前記外分泌腺は、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺および唾液腺からなる群より選択される、上記項目に記載の材料。
（項目３３）
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、上記項目に記載の材料。
（項目３４）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は腺原細胞であり、前記分化誘導された細胞、組織または臓器は外分泌腺およびその導管である、上記項目に記載の材料。
（項目３５）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は毛根に含まれる細胞であり、前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、上記項目に記載の材料。
（項目３６）
前記ＮＥＬＬ−１は、約０．０１μｇ／ｍｌ以上で含まれる、上記項目に記載の材料。
（項目３７）
前記ＮＥＬＬ−１は、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで含まれる、上記項目に記載の材料。
（項目３８）
天然に存在する対応する機能を前記分化誘導された細胞、組織または臓器が有する、上記項目に記載の材料。
（項目３９）
一定の分化の方向付けがなされた細胞を分化誘導させて、分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器にするためのキットであって、該キットは、ＮＥＬＬ−１または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を備える、キット。
（項目４０）
脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において、前記分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するための、上記項目に記載のキット。
（項目４１）
前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器である、上記項目に記載のキット。
（項目４２）
前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血幹細胞から分化する、好中球、好酸球、好塩基球およびリンパ球からなる群より選択される白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、ならびにそれらの組合わせからなる群より選択される血球である、上記項目に記載のキット。
（項目４３）
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管である、上記項目に記載のキット。
（項目４４）
前記外分泌腺は、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺および唾液腺からなる群より選択される、上記項目に記載のキット。
（項目４５）
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、上記項目に記載のキット。
（項目４６）
前記ＮＥＬＬ−１が約０．０１μｇ／ｍｌ以上で含まれる、上記項目に記載のキット。
（項目４７）
前記ＮＥＬＬ−１が約５μｇ／ｍｌ〜約５０ｕｇ／ｍｌで含まれる、上記項目に記載のキット。
（項目４８）
一定の分化の方向付けがなされた細胞を分化誘導させて、分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器にするための医療器具であって、該医療器具は、
Ａ）ＮＥＬＬ−１または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質；
Ｂ）徐放性足場；および
Ｃ）容器；
を備える、医療器具。
（項目４９）
脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において、分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するための、上記項目に記載の医療器具。
（項目５０）
前記徐放性足場は、細胞外マトリクスからなる群より選択される、上記項目に記載の医療器具。
（項目５１）
前記徐放性足場は、コラーゲンおよびアテロコラーゲンである、上記項目に記載の医療器具。
（項目５２）
前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血系または上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器である、上記項目に記載の医療器具。
（項目５３）
前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血幹細胞から分化する、好中球、好酸球、好塩基球およびリンパ球からなる群より選択される白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、ならびにそれらの組合わせからなる群より選択される血球である、上記項目に記載の医療器具。
（項目５４）
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管である、上記項目に記載の医療器具。
（項目５５）
前記外分泌腺は、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺および唾液腺からなる群より選択される、上記項目に記載の医療器具。
（項目５６）
前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織である、上記項目に記載の医療器具。
（項目５７）
前記ＮＥＬＬ−１が約０．０１μｇ／ｍｌ以上で含まれる、上記項目に記載の医療器具。
（項目５８）
前記ＮＥＬＬ−１が約５μｇ／ｍｌ〜約５０ｕｇ／ｍｌで含まれる、上記項目に記載の医療器具。
（項目５９）
細胞、組織または臓器を生産する方法であって、該方法は、以下の工程：
一定の分化の方向付けがなされた細胞を提供する工程；
該一定の分化の方向付けがなされた細胞と、ＮＥＬＬ−１または該維持の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質とを接触させる工程
を包含する、方法。
（項目６０）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞が、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境に提供される、上記項目に記載の方法。
（項目６１）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞と前記ＮＥＬＬ−１とが、徐放性足場上で接触される、上記項目に記載の方法。
（項目６２）
前記徐放性足場は、細胞外マトリクスからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目６３）
前記徐放性足場は、コラーゲンおよびアテロコラーゲンである、上記項目に記載の方法。
（項目６４）
前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は、体性幹細胞である、上記項目に記載の方法。
（項目６５）
前記体性幹細胞は、造血組織、上皮組織、結合組織、筋組織および神経組織からなる群より選択される組織に存在する体性幹細胞である、上記項目に記載の方法。
（項目６６）
前記体性幹細胞は、造血組織、上皮組織または結合組織に存在する体性幹細胞である、上記項目に記載の方法。
（項目６７）
前記造血組織に存在する体性幹細胞は、造血幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ血液細胞の母細胞である、上記項目に記載の方法。
（項目６８）
前記上皮組織に存在する体性幹細胞は、上皮組織に分化の方向付けがなされた幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ上皮系細胞の母細胞である、上記項目に記載の方法。
（項目６９）
前記上皮組織に存在する体性幹細胞は、腺原細胞または毛根に含まれる細胞である、上記項目に記載の方法。
（項目７０）
分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための組成物であって、該組成物は、ＮＥＬＬ−１、または該維持の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を含む、組成物。
（項目７１）
前記維持は、前記分化誘導された細胞、組織または臓器の存在が許容されない場所において行われる、上記項目に記載の組成物。
（項目７２）
天然に存在する対応する機能を前記分化誘導された細胞、組織または臓器が有する、上記項目に記載の組成物。
（項目７３）
前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、肝臓、腎臓、すい臓、副腎、甲状腺、卵巣および精巣からなる群より選択される、上記項目に記載の組成物。
（項目７４）
分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための方法であって、該方法は、
該分化誘導された細胞、組織または臓器を提供する工程；
該分化誘導された細胞、組織または臓器に、ＮＥＬＬ−１または該維持の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を付与する工程
を包含する、方法。
（項目７５）
分化誘導された細胞、組織または臓器を、一定の分化の方向付けがなされた細胞から形成するための医薬の製造における、ＮＥＬＬ−１、または該形成の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質の使用。
（項目７６）
分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための医薬の製造における、ＮＥＬＬ−１、または該維持の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質の使用。
（項目Ａ１）
腺組織を生体内に移植した脂肪組織または筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該生体内に容器を移植するための空間を作製する工程
Ｂ）該生体の脂肪組織または筋組織を、該脂肪組織または筋組織を維持する血管と一緒に容器の大きさに合わせて切離し、血管柄を含む有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１を含有させた徐放性足場を配置し、該有茎組織片を挿入する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該空間内に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該腺組織が産生されるのに充分な期間、該生体内に維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ａ２）
腺組織を生体内に移植した脂肪組織または筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該生体内に容器を移植するための空間を作製する工程
Ｂ）該生体の脂肪組織または筋組織を、該脂肪組織または筋組織を維持する血管と一緒に容器の大きさに合わせて切離し、血管柄を含む有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、ＮＥＬＬ−１を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該空間内に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該腺組織が産生されるのに充分な期間、該生体内に維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１を定期的に添加する工程、
を包含する、方法。
（項目Ａ３）
前記空間は、前記容器が入る大きさである、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ４）
前記空間は、大腿部内の筋間に作製される、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ５）
前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで含有される、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ６）
前記徐放性足場が、コラーゲンスポンジおよびアテロコラーゲンゲルからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ７）
腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を含有させたコラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルを配置し、該有茎組織片を挿入する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ａ８）
腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を１週間おきに添加する工程、
を包含する、方法。
（工程Ａ９）
前記ＮＥＬＬ−１が、５０μｇ／１ｍｌの濃度で０．１ｍｌずつ、１週おきに４週間にわたって計２０μｇ／ｍｌ添加されることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ１０）
腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を含有させたコラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルを配置し、該有茎組織片を挿入する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ａ１１）
腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を定期的に添加する工程、
を包含する、方法。
（項目Ａ１２）
腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程が、該ラットの該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記徐放性足場が、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルであり、そして
前記Ｅ）工程において、前記腺組織が産生されるのに充分な期間が少なくとも約２週間である、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ１３）
腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記徐放性足場が、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルであり、そして
前記Ｅ）工程において、前記腺組織が産生されるのに充分な期間が少なくとも約２週間である、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ１４）
腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記Ｄ）工程が、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、
前記Ｅ）工程において、前記腺組織が産生されるのに充分な期間が、少なくとも約２週間であり、前記維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで１週間おきに添加される、
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ１５）
腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、前記Ｄ）工程が、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、
前記Ｅ）工程において、前記腺組織が産生されるのに充分な期間が、少なくとも約２週間であり、前記維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで１週間おきに添加される、
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１）
造血組織を生体内に移植した脂肪組織または筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該生体内に容器を移植するための空間を作製する工程
Ｂ）該生体の脂肪組織または筋組織を、該脂肪組織または筋組織を維持する血管と一緒に容器の大きさに合わせて切離し、血管柄を含む有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１を含有させた徐放性足場を配置し、該有茎組織片を挿入する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該空間内に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該造血組織が産生されるのに充分な期間、該生体内に維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ｂ２）
造血組織を生体内に移植した脂肪組織または筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該生体内に容器を移植するための空間を作製する工程
Ｂ）該生体の脂肪組織または筋組織を、該脂肪組織または筋組織を維持する血管と一緒に容器の大きさに合わせて切離し、血管柄を含む有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、ＮＥＬＬ−１を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該空間内に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該造血組織が産生されるのに充分な期間、該生体内に維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１を定期的に添加する工程、
を包含する、方法。
（項目Ｂ３）
前記空間は、前記容器が入る大きさである、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ４）
前記空間は、大腿部内の筋間に作製される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ５）
前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで含有される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ６）
前記徐放性足場が、コラーゲンスポンジおよびアテロコラーゲンゲルからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ７）
造血組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を含有させたコラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルを配置し、該有茎組織片を挿入する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間哺乳動物維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ｂ８）
造血組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を１週間おきに添加する工程、
を包含する、方法。
（工程Ｂ９）
前記ＮＥＬＬ−１が、５０μｇ／１ｍｌの濃度で０．１ｍｌずつ、１週おきに４週間にわたって計２０μｇ／ｍｌ添加されることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１０）
造血組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の筋組織を、筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を含有させたコラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルを配置し、該有茎組織片を挿入する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ｂ１１）
造血組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を定期的に添加する工程、
を包含する、方法。
（項目Ｂ１２）
造血組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程が、該ラットの該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記徐放性足場が、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルであり、そして
前記Ｅ）工程において、前記造血組織が産生されるのに充分な期間が少なくとも約２週間である、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１３）
造血組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記徐放性足場が、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルであり、そして
前記Ｅ）工程において、前記造血組織が産生されるのに充分な期間が少なくとも約２週間である、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１４）
造血組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記Ｄ）工程が、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、
前記Ｅ）工程において、前記造血組織が産生されるのに充分な期間が、少なくとも約２週間であり、前記維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで１週間おきに添加される、
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ１５）
造血組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記Ｄ）工程が、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、
前記Ｅ）工程において、前記造血組織が産生されるのに充分な期間が、少なくとも約２週間であり、前記維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで１週間おきに添加される、
を包含する、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ１）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を生体の大腿部内に移植した脂肪組織または筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該生体内に容器を移植するための空間を作製する工程
Ｂ）該生体の脂肪組織または筋組織を、該脂肪組織または筋組織を維持する血管と一緒に容器の大きさに合わせて切離し、血管柄を含む有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１を含有させた徐放性足場を配置する工程、
Ｄ）該徐放性足場上に毛根に含まれる細胞を配置する工程
Ｅ）該容器に該有茎組織片を挿入する工程
Ｆ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該空間内に該容器を移植する工程、および
Ｇ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織が産生されるのに充分な期間、該生体内に維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ｃ２）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を生体の大腿部内に移植した脂肪組織または筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該生体内に容器を移植するための空間を作製する工程
Ｂ）該生体の脂肪組織または筋組織を、該脂肪組織または筋組織を維持する血管と一緒に容器の大きさに合わせて切離し、血管柄を含む有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、毛根に含まれる細胞およびＮＥＬＬ−１を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該空間内に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織が産生されるのに充分な期間、該生体内に維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１を定期的に添加する工程、
を包含する、方法。
（項目Ｃ３）
前記空間は、前記容器が入る大きさである、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ４）
前記空間は、大腿部内の筋間に作製される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ５）
前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで含有される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ６）
前記徐放性足場が、コラーゲンスポンジおよびアテロコラーゲンゲルからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ７）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を含有させたコラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルを配置する工程、
Ｄ）該コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲル上に毛根に含まれる細胞を配置する工程
Ｅ）該容器に有茎組織片を挿入する工程
Ｆ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程、および
Ｇ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ｃ８）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、毛根に含まれる細胞およびＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を１週間おきに添加する工程、
を包含する、方法。
（工程Ｃ９）
前記ＮＥＬＬ−１が、５０μｇ／１ｍｌの濃度で０．１ｍｌずつ、１週おきに４週間にわたって計２０μｇ／ｍｌ添加されることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ１０）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を含有させたコラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルを配置する工程
Ｄ）該コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲル上に毛根に含まれる細胞を配置する工程
Ｅ）該容器に該有茎組織片を挿入する工程
Ｆ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｇ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程
を包含する、方法。
（項目Ｃ１１）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、毛根に含まれる細胞およびＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を、該有茎組織片の血流が阻害されない状態で、該筋内に少なくとも約２週間維持する工程であって、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を定期的に添加する工程、
を包含する、方法。
（項目Ｃ１２）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程は、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程は、該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１は、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、該徐放性足場は、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルであり、
前記Ｆ）工程は、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、そして
前記Ｇ）工程において、前記毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織が産生されるのに充分な期間が少なくとも約２週間である、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ１３）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）工程が、該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１は、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、該徐放性足場は、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルであり、
前記Ｆ）工程が、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、
前記Ｇ）工程において、前記毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織が産生されるのに充分な期間が少なくとも約２週間である、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ１４）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
前記Ｂ）工程が、該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記Ｄ）工程が、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、
前記Ｅ）工程において、前記毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織が産生されるのに充分な期間が少なくとも約２週間であり、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１が約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで１週間おきに添加される、上記項目に記載の方法。（項目Ｃ１５）
毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で産生する方法であって、
前記Ａ）が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程であり、
前記Ｂ）が、該ラットの筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、
前記Ｄ）工程が、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、
前記Ｅ）工程において、前記毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織が産生されるのに充分な期間が少なくとも約２週間であり、該維持の間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１が約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで１週間おきに添加される、上記項目に記載の方法。（項目Ｄ１）
肝臓組織片を生体の大腿部内に移植した脂肪組織または筋組織内で維持する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該生体内に容器を移植するための空間を作製する工程
Ｂ）該生体の脂肪組織または筋組織を、該脂肪組織または筋組織を維持する血管と一緒に容器の大きさに合わせて切離し、血管柄を含む有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１を含有させた徐放性足場を配置する工程、
Ｄ）該徐放性足場上に該肝臓組織片を配置する工程
Ｅ）該容器に該有茎組織片を挿入する工程
Ｆ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該空間内に該容器を移植する工程、および
Ｇ）該有茎組織片の血流が阻害されない状態に置く工程
を包含する、方法。
（項目Ｄ２）
肝臓組織片を生体の大腿部内に移植した脂肪組織または筋組織内で維持する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該生体内に容器を移植するための空間を作製する工程
Ｂ）該生体の脂肪組織または筋組織を、該脂肪組織または筋組織を維持する血管と一緒に容器の大きさに合わせて切離し、血管柄を含む有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、該肝臓組織片およびＮＥＬＬ−１を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該空間内に該容器を移植する工程
Ｅ）該有茎組織片の血流が阻害されない状態におく工程、
を包含する、方法。
（項目Ｄ３）
前記空間は、前記容器が入る大きさである、上記項目に記載の方法。
（項目Ｄ４）
前記空間は、大腿部内の筋間に作製される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｄ５）
前記ＮＥＬＬ−１が、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで含有される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｄ６）
前記徐放性足場が、コラーゲンスポンジおよびアテロコラーゲンゲルからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｄ７）
肝臓組織片を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で維持する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を含有させたコラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルを配置する工程、
Ｄ）該コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲル上に該肝臓組織片を配置する工程Ｅ）該容器に有茎組織片を挿入する工程
Ｆ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程、および
Ｇ）該容器を該有茎組織片の血流が阻害されない状態におく工程
を包含する、方法。
（項目Ｄ８）
肝臓組織片を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で維持する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、該肝臓組織片およびＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を該有茎組織片の血流が阻害されない状態におく工程であって、その間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を１週間おきに添加する工程、
を包含する、方法。
（工程Ｃ９）
前記ＮＥＬＬ−１が、５０μｇ／１ｍｌの濃度で０．１ｍｌずつ、１週おきに４週間にわたって計２０μｇ／ｍｌ添加されることを特徴とする、上記項目に記載の方法。
（項目Ｄ１０）
肝臓組織片を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で維持する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に、ＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を含有させたコラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルを配置する工程
Ｄ）該コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲル上に該肝臓組織片を配置する工程Ｅ）該容器に該有茎組織片を挿入する工程
Ｆ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｇ）該容器を該有茎組織片の血流が阻害されない状態におく工程
を包含する、方法。
（項目Ｄ１１）
肝臓組織片を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で維持する方法であって、
該方法は、以下の工程：
Ａ）該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
Ｂ）該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程
Ｃ）該容器に該有茎組織片を挿入し、該肝臓組織片およびＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を添加する工程
Ｄ）該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程
Ｅ）該容器を該有茎組織片の血流が阻害されない状態におく工程であって、その間、該有茎組織片にＮＥＬＬ−１（約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ）を定期的に添加する工程、
を包含する、方法。
（項目Ｄ１２）
肝臓組織片を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で維持する方法であって、
前記Ａ）工程は、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
前記Ｂ）工程は、該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１は、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、該徐放性足場は、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルであり、そして
前記Ｆ）工程は、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程である、上記項目に記載の方法。
（項目Ｄ１３）
肝臓組織片を哺乳動物の大腿部内に移植した筋組織内で維持する方法であって、
前記Ａ）工程は、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
前記Ｂ）工程は、該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１は、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、該徐放性足場は、コラーゲンスポンジまたはアテロコラーゲンゲルであり、そして
前記Ｆ）工程は、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程である、上記項目に記載の方法。
（項目Ｄ１４）
肝臓組織片を哺乳動物の大腿部内に移植した脂肪組織内で維持する方法であって、
該方法は、以下の工程：
前記Ａ）工程は、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
前記Ｂ）工程は、該哺乳動物の腹部皮下脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１は、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、前記Ｄ）工程は、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、そして
前記Ｅ）工程において、前記有茎組織片にＮＥＬＬ−１が約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで１週間おきに添加される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｄ１５）
肝臓組織片をラットの大腿部内に移植した筋組織内で維持する方法であって、
該方法は、以下の工程：
前記Ａ）工程が、該哺乳動物の該大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経を周囲組織から剥離する工程
前記Ｂ）工程は、該哺乳動物の筋組織を維持する血管の分岐部を中心に、容器の大きさに合わせて切離し、該血管を柄とする有茎組織弁を作製する工程であり、
前記Ｃ）工程において、前記ＮＥＬＬ−１は、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌであり、前記Ｄ）工程は、該有茎組織片内の血流が阻害されない状態で、該大腿部の筋間に該容器を移植する工程であり、そして
前記Ｅ）工程において、前記有茎組織片にＮＥＬＬ−１が約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌで１週間おきに添加される、上記項目に記載の方法。【００１６】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、分化誘導された細胞、組織および臓器を形成するためのＮＥＬＬ−１を用いた技術が提供される。特に、本発明の技術は、異所性に分化誘導された細胞、組織および臓器を形成することができる。本発明により分化誘導された細胞、組織および臓器は、それらが本来もつ機能を営むことができるという予想外に顕著な効果を有する。【００１８】
このようなＮＥＬＬ−１による細胞、組織および臓器の形成技術は、近年のＥＳ細胞等の未分化細胞を用いた細胞移植治療にも応用することが可能である。つまり、ＥＳ細胞等の未分化細胞に対して所望の分化を運命付け、さらにＮＥＬＬ−１を作用させることにより、生体内で機能する臓器を形成することが可能である。また、自己の細胞、組織および臓器を対象とすることにより、臓器移植および高度医療の恩恵を享受できない患者に対し、代用臓器を提供することも可能となる。【００１９】
別の局面において、本発明によって、生体内に移植された細胞、組織および臓器を維持するための、ＮＥＬＬ−１を用いた技術が提供される。本発明の技術によると、移植された細胞、組織および臓器は形態および大きさを維持し、さらにそれらが本来もつ機能を維持することができるという予想外に有利な効果を有する。【００２０】
このような効果は、本発明によって初めて提供されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトＮＥＬＬ１プラスミド構築の概略図を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは図１Ａのつづきである。
【図１Ｃ】図１Ｃは図１Ｂのつづきである。
【図１Ｄ】図１は、シリコンモールド内の脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において形成された造血系組織を示す。写真中のバーは、２．０ｍｍである。
【図２】図２は、シリコンモールド内の脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において形成された腺組織を示す。写真中のバーは、２００μｍである。Ｇ：上皮細胞（単層円柱上皮）によって分泌された、コロイド状の分泌物。Ｐ：単層立方上皮により囲まれるコロイド状分泌物を排出する導管
【図３】図３は、シリコンモールド内の脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において形成された腺組織を示す。写真中のバーは、２００μｍである。Ｇ：上皮細胞（単層円柱上皮）に囲まれ内部に顆粒状の分泌物が存在する。
【図４】図４は、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境に、生理食塩水を添加した肝臓組織片を移植し、移植の４週間後の移植部分の状態を示す。
【図５】図５は、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境に、ＮＥＬＬ−１（５μｇ）を添加した肝臓組織片を移植し、移植の４週間後の移植部分の状態を示す。破線で囲んだ部分は、移植した肝臓の組織片である。バーは１．０ｍｍを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境に、ＦＧＦのみを添加した生体内培養器を移植し、移植の２週間後の移植部分の組織像を示す。バーは２５０μｍｍを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、図６Ａの拡大図である。バーは５００μｍｍを示す。Ａ：結合組織、Ｂ：血管
【図６Ｃ】図６Ｃは、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境に、ＮＥＬＬ−１とＦＧＦとを添加した生体内培養器を移植し、移植の２週間後の移植部分の組織像を示す。バーは２５０μｍｍを示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図６Ｃの拡大図である。バーは５００μｍｍを示す。Ａ：結合組織、Ｂ：分化した腺組織
【図６Ｅ】図６Ｅは、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境に、ＮＥＬＬ−１のみを添加した生体内培養器を移植し、移植の２週間後の移植部分の組織像を示す。バーは２５０μｍｍを示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、図６Ｅの拡大図である。バーは５００μｍｍを示す。矢印：腺組織を示す。
【図６Ｇ】図６Ｅは、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境に、生理食塩水のみを添加した生体内培養器を移植し、移植の２週間後の移植部分の組織像を示す。バーは２５０μｍｍを示す。
【図６Ｈ】図６Ｈは、図６Ｇの拡大図である。バーは５００μｍｍを示す。矢印：脂肪組織周辺に存在する結合組織
【図７】図７は、ＮＥＬＬ−１を体外からモールド内に連続投与した群である。
【図８】図８は、ＮＥＬＬ−１を、体外からモールド内に連続投与した後、ヘマトキシン希釈液を体外からの注入することにより、このＮＥＬＬ−１投与の有効性を試験した結果である。その結果、ＮＥＬＬ−１の投与が確実であったことを確認した。ヘマトキシリン希釈液を注入した箇所が紫色に染色された。
【図９】図９は、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において形成された、毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織を示すヘマトキシリン−エオシン染色の写真である。バーは、５００μｍを示す。Ａ：毛根に付随する腺組織、Ｂ：毛および毛根（毛球）
【配列表フリーテキスト】
【００２２】
配列番号１：ヒトＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基１３５〜１８２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１８３〜２５６４である。
配列番号２：ヒトＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜１６、成熟ペプチドは残基１７〜８１０である。
配列番号３：マウスＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基４０〜１０２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１０３〜２４７２である。
配列番号４：マウスＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜２１、成熟ペプチドは残基２２〜８１０である。
配列番号５：ラットＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基５９〜１２１、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１２２〜２４９１である。
配列番号６：ラットＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜２１、成熟ペプチドは残基２２〜８１０である。
配列番号７：実施例で使用したベクターの配列である。
配列番号８：Ｖ５タグおよびヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）の核酸配列である。
配列番号９：Ｖ５タグおよびヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）のアミノ酸配列である。
配列番号１０：Ｈｕｍａｎ  ＮＥＬＬ１のオリジナルシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１１：Ｈｏｎｅｙ  Ｂｅｅ  Ｍｅｌｌｉｔｉｎのシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１２：ツメガエルＮＥＬＬ１の核酸配列である。
配列番号１３：ツメガエルＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。
配列番号１４：ｈＨＥＬＬ１フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１５：ｈＬＡＭＡ３フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１６：ｍＬＡＭＡ３フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１７：ｈＣＯＬＡ１フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１８：ｈＴＳＰ１フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１９：順方向プライマー＃２の配列である。
配列番号２０：順方向プライマー＃３の配列である。
配列番号２１：順方向プライマー＃４の配列である。
配列番号２２：順方向プライマー＃５の配列である。
配列番号２３：逆方向プライマー＃２の配列である。
配列番号２４：逆方向プライマー＃３の配列である。
配列番号２５：逆方向プライマー＃４の配列である。
配列番号２６：逆方向プライマー＃５の配列である。
配列番号２７：Ｖ５タグの配列である。
配列番号２８：ヒスチジンタグの配列である。
配列番号２９：実施例で使用したタグ部分の配列である。
配列番号３０：順方向プライマー＃１の配列である。
配列番号３１：逆方向プライマー＃１の配列である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００２４】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２５】
本明細書において「ＮＥＬＬ−１」とは、Ｔｉｎｇ，Ｋ．らによって見出された遺伝子であり、ＮＥＬＬ−１遺伝子として、頭蓋骨早期癒合症の原因遺伝子として同定されたものが最初である（特許文献１〜４等）。そして、本発明者らがＹｅａｓｔ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ法を用いて、タンパク質としてのＮＥＬＬ−１を発見するに至った（Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．，Ｏｙａｓｕ，Ｍ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｍ．，Ｋａｎａｙａｍａ，Ｎ．，Ｔａｎｉｚａｗａ，Ｋ．，Ｓａｉｔｏ，Ｎ．，Ａｂｅ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｈａｓｈｉ，Ｓ．ａｎｄ  Ｔｉｎｇ，Ｋ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６５，７９−８６）その後、ＮＥＬＬ−１遺伝子を過剰発現するマウスを作製したところ、頭蓋骨早期癒合症様のフェノタイプが確認された。また、アデノウイルスを用いて、ＮＥＬＬ−１遺伝子をマウス前駆骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に導入すると、骨分化早期マーカーである細胞内アルカリフォスファターゼの活性の上昇が確認され、さらに分化細胞内において、中期・後期マーカーであるＯｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ、ＯｓｔｅｏｃａｌｓｉｎのｍＲＮＡの発現が上昇すること、最終的にＮＥＬＬ−１遺伝子を導入した細胞はカルシウムの沈着を誘発したことも知られている（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｄ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｉ．，Ｓｏｏ，Ｃ．，Ｍｏａｔｓ，Ｒ．，Ｉｉｄａ，Ｋ．，Ｗｉｓｎｅｒ，Ｅ．，Ｈｕ，Ｆ．Ｙ．，Ｍｉａｏ，Ｓ．，Ｂｅａｎｅｓ，Ｓ．，Ｄａｎｇ，Ｃ．，Ｖａｓｔａｒｄｉｓ，Ｈ．，Ｌｏｎｇａｋｅｒ，Ｍ．，Ｔａｎｉｚａｗａ，Ｋ．，Ｋａｎａｙａｍａ，Ｎ．，Ｓａｉｔｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ｔｉｎｇ，Ｋ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１８，２１２６−２１３４）。本明細書において「ＮＥＬＬ−１」と「ＮＥＬＬ１」とは交換可能に使用され得る。
【００２６】
本明細書において「ＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質」とは、ＮＥＬＬ−１を産生し得る物質をいう。例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどの遺伝子工学技術を用いてＮＥＬＬ−１を発現させることが可能な物質が、本発明の組成物等において使用され得る。
【００２７】
本明細書で、通常「ＮＥＬＬ−１」または「ＮＥＬＬ１」というときは、成熟配列のものをさすことが理解される。したがって、本発明では、通常「ＮＥＬＬ−１」または「ＮＥＬＬ１」というときは、シグナル配列（リーダー配列）が含まれないことに留意すべきである。ＮＥＬＬ１のヌクレオチド配列は、具体的には、以下のようにあらわされる。
（１）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列において、１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＮＥＬＬ１の活性を示す、アミノ酸配列；および
（３）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を、アミノ酸配列；および
（４）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列またはそれに相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（５）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列またはそれに相補的な核酸配列と中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（６）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列に少なくとも７０％の相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（７）（１）〜（６）のホモログまたは対立遺伝子変異体
などを挙げることができる。
【００２８】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸またはＮＥＬＬ遺伝子は、以下のように表すことができる。
（１）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（２）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列において、１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＮＥＬＬ１の活性を示す、アミノ酸配列をコードする核酸配列；および
（３）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を、アミノ酸配列をコードする核酸配列；および
（４）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列またはそれに相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
（５）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列またはそれに相補的な核酸配列と中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
（６）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列に少なくとも７０％の相同性を有する核酸配列；
（７）（１）〜（６）のホモログまたは対立遺伝子変異体
などを挙げることができる。
【００２９】
ここで、上記配列番号において、配列番号１は、ヒトＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基１３５〜１８２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１８３〜２５６４であり、配列番号２は、ヒトＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜１６、成熟ペプチドは残基１７〜８１０である。
【００３０】
配列番号３は、マウスＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基４０〜１０２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１０３〜２４７２であり、配列番号４は、マウスＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜２１、成熟ペプチドは残基２２〜８１０である。
【００３１】
配列番号５は、ラットＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基５９〜１２１、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１２２〜２４９１であり、配列番号６は、ラットＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜２１、成熟ペプチドは残基２２〜８１０である。
【００３２】
したがって、本発明において、当業者は、上記シグナル配列および成熟配列の情報に基づいて、本発明において利用することができることが理解される。
【００３３】
配列番号１２および１３については、部分配列であるが、当業者は、上記情報を元に、シグナル配列および成熟配列（すなわち、成熟部分の該当するアミノ酸からなるポリペプチドまたはそれをコードする核酸配列）を同定し、本発明において利用することができることが理解される。
【００３４】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイ
ド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
【００３５】
本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００３６】
本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。
【００３７】
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。
【００３８】
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
【００３９】
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
【００４０】
本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。
【００４１】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００４２】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【００４４】
本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐａｒｔ  Ｉ、第２章  「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出される。
【００４５】
代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。
【００４６】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００４７】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および５０％  ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ
ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４８】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００４９】
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
【００５０】
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ  ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
【００５１】
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ  ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
【００５２】
配列番号＊のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；４２℃の温度で  ７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ  ＮａＣｌ；６０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％  ＳＤＳ  を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ；３０ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ  リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）；０．１％  ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列表に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。
【００５３】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００５４】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
【００５５】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ  ２．２．９（２００４．５．１２  発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
【００５６】
本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいう。
【００５７】
本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＮＥＬＬ１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００５８】
本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。
【００５９】
本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。
【００６０】
本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ  ＆  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。
【００６１】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００６２】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ  Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【００６３】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００６４】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００６５】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン
（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００６６】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６７】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００６８】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００６９】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、骨化など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００７０】
本明細書において「細胞」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、生物体を構成する形態上および／または機能上の基本単位である。
【００７１】
本明細書において「組織」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、実質的に同一の形態、機能をもつ細胞の集まりをいう。動物では、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。
【００７２】
本明細書において「臓器」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、多細胞生物において、組織が集まって一定の形態を有し、呼吸、排泄、消化などの特別な機能を営む部分をいう。本明細書において「臓器」と「器官」とは交換可能に使用され得る。
【００７３】
本明細書において「異所的に形成する」とは、細胞、組織または臓器が本来は存在しない位置に形成されることをいう。異所的な形成の例としては、たとえば、脂肪組織における造血組織の形成、脂肪組織における上皮系組織の形成、筋組織における造血組織の形成、筋組織における上皮系組織などを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００７４】
本明細書において、細胞、組織または臓器を「維持する」とは、細胞、組織および臓器が、その形態および少なくとも一部の機能を保ったまま存在することをいう。
【００７５】
本明細書において「脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境」とは、脂肪組織およびその脂肪組織の形態および機能を維持するための血管が存在する環境をいう。例えば、腹部皮下の脂肪組織における下腹壁動静脈の分岐部周辺の環境などが挙げられる。
【００７６】
本明細書において「筋組織およびそれを維持する血管がある環境」とは、筋組織およびその筋組織の形態および機能を維持するための血管が存在する環境をいう。例えば、大腿部の筋組織における動静脈の環境などが挙げられる。
【００７７】
本明細書において「一定の分化の方向付けがなされた細胞」とは、特定の細胞に分化することが決定された、分化段階の途中にある細胞をいう。例えば、本明細書では、組織（例えば、造血組織、上皮組織、筋組織、神経組織など）に存在する体性幹細胞、および組織を構成する細胞の前駆細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
本明細書において「幹細胞」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、細胞分裂を経て、同じ分化能を維持する細胞をいう。
【００７９】
本明細書において「体性幹細胞」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、すべての組織・臓器が常にリモデリング（吸収・再構築）をおこなうことから見いだされた組織を構成するもととなる細胞をいう。本明細書において「体性幹細胞」と「組織幹細胞」と、「成体幹細胞」とは、交換可能に使用され得る。体性幹細胞としては、例えば、造血組織、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などに存在する体性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
体性幹細胞は、ＥＳ細胞およびｉＳＰ細胞にみられる万能な幹細胞から、ある程度、分化の方向付けがされたものである。そのため、造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞など、主要な組織ごとに名称がつけられている。しかし、体性幹細胞が脱分化（逆行性の分化）を起こすことも予想されている。例えば、臨床で行われている骨髄移植では、「造血幹細胞」の移植後に、被移植者の肝臓にドナーの組織が検出されたという報告がある（Ａｌｉｓｏｎ  ＭＲ，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｉｃ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００  Ｊｕｌ  ２０；４０６（６７９３）：２５７）。したがって、体性幹細胞だけではなく、体性幹細胞もしくは万能な幹細胞が分化して「造血幹細胞」になり、さらに血球などに分化しうる。本発明は、これらの幹細胞を適宜利用することができる。
【００８１】
造血組織に存在する体性幹細胞としては、例えば、造血幹細胞、骨髄幹細胞などが挙げられる。上皮組織に存在する体性幹細胞は、上皮組織に分化の方向付けがなされた幹細胞であり、自己修復能力および多分化能を持つ上皮系細胞の母細胞である。上皮組織に存在する体性幹細胞としては、例えば、腺原細胞、毛根に含まれる細胞などが挙げられる。この上皮組織に存在する体性幹細胞は、例えば、腺細胞または毛根の細胞に分化し得る。
【００８２】
本明細書において「造血幹細胞」とは、自己修復能力および多分化能を持つ血液細胞の母細胞を指し、例えば、顆粒状コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）などのサイトカインにて骨髄から末梢血に流出するもの、あらゆる血液細胞に分化する（全能性を有する）ものなどが含まれる。
【００８３】
造血幹細胞は、例えば、白血病の患者に対する治療（例えば、造血幹細胞移植）などに用いられている。造血幹細胞移植は、もともと骨髄移植から始まった。１９６０年後半に、大量化学療法の後にＨＬＡの一致する兄弟から骨髄を移植したところ、患者の血液細胞がすべてドナー由来の血液細胞となったことから骨髄移植が考案された。その後、Ｇ−ＣＳＦを投与すると末梢血液中に造血幹細胞が出てくることが明らかになり、これを用いた末梢血幹細胞移植が、１９９０年代から行われている。さらに同時期、臍帯血には多くの造血幹細胞が含まれることがわかり、子供を中心に臍帯血移植が行われるようになった。本発明は、これらの幹細胞に関する技術を適宜利用することができる。
【００８４】
本明細書において「造血組織」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、種々の血球および有形成分を形成し、発達させる組織をいう。
【００８５】
本明細書において「造血系」の細胞、組織または臓器とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、造血組織を構成する種々の細胞、組織または臓器の総称である。
【００８６】
本明細書において「上皮組織」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、動物の体表面および体内の器官内表面などを覆う細胞層をいう。
【００８７】
本明細書において「上皮系」の細胞、組織または臓器とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、上皮を形成する細胞、組織または臓器の総称である。
【００８８】
本明細書において「腺原細胞」とは、分泌作用を営む細胞の集合体（腺）に存在する、上皮組織に分化の方向付けがなされた幹細胞をいう。
【００８９】
本明細書において「毛根に含まれる細胞」とは、毛包内に埋まっている毛の部分に含まれる細胞をいう。この毛根に含まれる細胞には、毛根に分化することを方向付けされた細胞が存在する。
【００９０】
本明細書において「外分泌腺」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、分泌物が導管により体表面に放出される腺をいう。外分泌腺としては、例えば、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺、唾液腺などが挙げられる。すべての腺組織は分泌能を有する円柱から立方の上皮から構成され、分泌物は各組織（臓器）によって異なる。したがって、所望の臓器から分泌腺を摘出して、本発明の生体培養器に配置することにより、所望の外分泌腺を得ることが可能である。
【００９１】
本明細書において「結合組織」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、動物の体を支持し、骨組みとなる組織、各種の細胞を伴う線維および基質から形成される組織をいう。結合組織は、中胚葉から発生する間葉に由来する。結合組織には、例えば、リンパ組織、軟骨、骨などが含まれる。
【００９２】
本明細書において「筋組織」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、刺激に対して収縮可能な組織である。筋組織は、骨格筋、心筋、平滑筋組織などに区別される。
【００９３】
本明細書において「神経組織」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、神経系を構成する組織をいう。神経組織は、興奮（信号）を伝える神経細胞およびそれを支持する神経膠などにより構成されている。
【００９４】
本明細書において「足場」とは、目的物のために何らかの基礎となる存在物をいい、たとえば、空間的な足掛かりとなるもの、または何らかの作用を営む際によりどころとなるものをが挙げられる。本明細書において、足場は、生体適合性を有し、生物学的物質または天然から供給される物質、天然に存在する物質または合成で供給される物質から製造される。本明細書において「足場」は、「機能性足場」と「徐放性足場」とに区別されうる。
【００９５】
本明細書において「機能性足場」とは、細胞、組織などの足掛かりとなるものをいう。１つの実施形態において、本発明において使用される機能性足場は、例えば、生体内の組織（例えば、脂肪組織など）などであってもよい。構造的足場とも呼ぶことができる。
【００９６】
本明細書において「徐放性足場」とは、ＮＥＬＬ−１を保持し、徐放させるための材料を意味する。１つの実施形態において、本発明において使用される徐放性足場は、例えば、細胞外マトリクス（例えば、コラーゲンスポンジ、アテロコラーゲンゲルなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、細胞がさらに分化誘導された細胞、組織、臓器になる間にわたって、ＮＥＬＬ−１を保持し、細胞に提供することができればよいからである。
【００９７】
本明細書において「細胞外マトリクス（ＥＣＭ）」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、細胞外の空間を充填する超分子構造体をいう。細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン、アテロコラーゲン、プロテオグリカン（例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン）、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において「細胞外マトリクス」と「細胞外基質」とは、交換可能に使用され得る。
【００９８】
本明細書において「コラーゲン」とは、当該分野において慣用される最も広義の意味と同様に用いられ、動物の細胞外マトリクスの主成分である。本発明では、コラーゲンとしては、例えば、株式会社  白鵬  販売元白水貿易株式会社（大阪市）などから入手可能なコラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、アテロコラーゲンゲルなどが使用可能であり、その他の供給源からのコラーゲンもまた、本発明において利用可能である。
【００９９】
本明細書において「医療器具」とは、身体の機能を改善する目的、または処置の目的で医療（たとえば、治療、手術等）目的で用いる器具をいう。本発明に使用される医療器具は、ＮＥＬＬ−１を保持し、そのＮＥＬＬ−１を細胞、組織、臓器に作用させることができるようなものであればよい。本発明において使用される医療器具は、生体適合性の材料で作製され、かつ生体内に移植できるような形状、大きさものが好ましく、免疫拒絶反応が起こらないことが望ましい。
【０１００】
本明細書において「生体内培養器」とは、モールド（例えば、シリコンモールド）、ＮＥＬＬ−１および有茎組織片を含むものをいう。本明細書において「有茎組織片」とは、組織片およびその組織片を維持する血管を含み、血流が阻害されていない状態の構造物をいう。有茎組織片としては、例えば、脂肪組織およびそれを維持する血管、筋組織およびそれを維持する血管などが挙げられるが、このような特徴を満たすようなものであれば、上記以外の組織なども用いられうる。理論に束縛されないが、上記特徴を満たせば、血流により組織に酸素等が提供され壊死が抑制されること、また、一定の分化の方向付けがなされた細胞が提供されるからである。
【０１０１】
この生体内培養器には、ＮＥＬＬ−１を徐放性に放出する機能性足場（例えば、コラーゲンスポンジ、アテロコラーゲンゲルなど）を含ませることができる。なぜなら、生体内培養器は、細胞（例えば、体性幹細胞）がさらに分化誘導するのに必要な期間にわたって、その細胞にＮＥＬＬ−１を提供することができさえすれば、さらに分化誘導された細胞等を産生することができるからである。つまり、ＮＥＬＬ−１を継続的に細胞に提供することができれば、その提供手段はどのようなものでもよい。１つの実施形態において、ＮＥＬＬ−１は、有茎組織片の一部（例えば、脂肪組織）に直接的に添加（例えば、注入）することによっても提供されうる。
【０１０２】
本発明において使用される生体内培養器は、生体適合性の材料で作製され、かつ生体内に移植できるような形状、大きさものが好ましく、免疫拒絶反応が起こらないことが望ましい。
【０１０３】
本明細書において「モールド」とは、生体内に移植することが可能な容器をいう。本明細書では、シリコンで作製したモールドを「シリコンモールド」という。モールドは、移植先の臓器の形態に合わせたものを作ることが可能である。例えば、ラット骨先端形状のもの、および粘土を用いた松の実状のものを作製し、利用することも可能である。なぜなら、モールドは、ＮＥＬＬ−１を保持し、そのＮＥＬＬ−１を細胞、組織、臓器に作用させることができるようなものであればよい。本発明において使用されるモールドは、生体適合性の材料で作製され、かつ生体内に移植できるような形状、大きさものが好ましく、免疫拒絶反応が起こらないことが望ましい。
【０１０４】
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【０１０５】
（分化誘導用途の組成物）
１つの局面において、本発明は、一定の分化の方向付けがなされた細胞を分化誘導させて、該分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器にするための組成物を提供する。この組成物は、ＮＥＬＬ−１または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を含み得る。本発明の組成物によれば、いかなる臓器等であっても生産することができる。Ｏｇａｗａ  Ｋ，Ｌｉｖｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｏｎａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｆａｎｔｓ．：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００７  Ｍａｙ  ２７；８３（１０）：１３３７−４０には、臨床で行われた小児の肝移植後にドナー肝臓もしくはレシピエント肝臓に、肝臓に分化されることを意味づけられた体性幹細胞が存在する可能性が記載されている。したがって、本発明による異所性の組織分化または肝臓組織片の維持、増殖は、理論に束縛されないが、ＮＥＬＬ−１と接触した組織（移植片を含む）に存在する細胞がリモデリングを繰り返し、自己細胞のみで増殖を繰り返している可能性、または組織片中に含まれている未分化細胞が増殖すると考えられるからである。
【０１０６】
本明細書において一定の分化の方向付けがなされた細胞は、いかなる細胞であってもよい。理論に束縛されないが、本発明において使用されるＮＥＬＬ−１は、分化の方向性が決定した細胞に対して、その細胞をさらに分化誘導させるように作用するので、対象とする細胞は分化の方向性が定まった細胞であればどのような細胞であってもよいからである。
【０１０７】
１つの実施形態において、ＮＥＬＬ−１または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質は、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどの遺伝子工学技術を用いてＮＥＬＬ−１を発現させることが可能な物質であり得るが、これらに限定されない。一定の分化の方向付けがなされた細胞に対してＮＥＬＬ−１を作用させることができさえすれば、その細胞をさらに分化誘導させることができるからである。
【０１０８】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において、分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器を異所的に形成するための組成物であり得る。
【０１０９】
好ましい実施形態において、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境とは、例えば、腹部皮下の脂肪組織における下腹壁動静脈の分岐部周辺の環境のような環境であるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明において、脂肪組織がある環境が好ましい理由は、理論に束縛されないが、脂肪組織由来幹細胞（Ｚｕｋ  ＰＡ，  Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００１  Ａｐｒ；７（２）：２１１−２８．）がＮＥＬＬ−１により分化誘導される可能性があるからである。
【０１１１】
脂肪組織内に見られる体性幹細胞は中胚葉性組織（脂肪生成、軟骨形成の、筋原性および骨形成細胞）に分化する可能性がある。本発明による異所性の組織分化および肝臓組織片の維持、増殖の可能性を補強する資料である。しかし、この論文では脂肪細胞が分化できる範囲が極めて限られていることから、本発明による上皮組織発生を予見することにはならない。論点がずれるが、脂肪組織が有る環境が望ましい分けではなく、たとえば血管付きの筋組織（口腔外科臨床で多く行われる）をシリコンモールド内に入れることも可能であり、その場合は筋組織に分化する方向付けがなされた体性幹細胞が存在しこれらも中胚葉系（筋組織）であるから、中胚葉系の細胞に分化する可能性を秘めている。
【０１１２】
しかし、下記のＡｌｉｓｏｎ  ＭＲ論文にあるように、常時血管から栄養される組織（脂肪もしくは筋組織内に）体液循環を通じて別の体性幹細胞が送り込まれる可能性がきわめて高く、シリコンモールド内に異所性の組織が発生することを裏付けることになる。本発明は血管および組織（例えば、脂肪、筋肉）を完全かつ効率的にカプセル内に格納することを主として着想することから、上記一連の論文が、本発明に必須のものであるわけではなく、むしろ本発明により得た実験結果（組織像）に生じた「新たな成果」を考察するために必要な情報を与えるものである。
【０１１３】
血管がある環境が好ましい理由は、理論に束縛されないが、骨髄移植後の患者肝細胞にドナー由来の細胞が含まれたとの報告（Ａｌｉｓｏｎ  ＭＲ，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｉｃ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００  Ｊｕｌ  ２０；４０６（６７９３）：２５７）があることから、体液循環などを通じて、別の場所に存在する体性幹細胞がＮＥＬＬ−１により分化誘導される可能性があるからである。
【０１１４】
別の実施形態において、本発明において使用される前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は、体性幹細胞、例えば、造血組織、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織などの組織に存在する体性幹細胞であり得る。好ましくは、造血組織、上皮組織、結合組織であり得る。本発明において使用される体性幹細胞は、周知文献、公知文献などに基づき、当業者が適宜選択し、調製することができる。
【０１１５】
好ましい実施形態において、本発明の生体内培養器内の脂肪組織内に生着する組織（臓器）は、例えば、以下のように作製することができる：
１．自己もしくは他者の臓器（例えば、肝臓片など）に由来する細胞を播種する方法。これらの臓器中には、成熟した細胞および体性幹細胞の双方が含まれている。
【０１１６】
２．脂肪組織に存在する体性幹細胞と接続された血管を通じて造血幹細胞（末梢血中にも分布している）を提供する方法。これらからは、例えば、造血系組織、腺組織などが形成されうる。
【０１１７】
３．分化の方向付けがされた培養細胞などを播種する方法。（このような培養細胞は、細胞バンクのような組織から購入すること、または調製することにより入手可能である。）。
【０１１８】
４．幹細胞を播種してそこに分化方向付けをする物質を混合することによって幹細胞からの臓器を形成すること。
【０１１９】
本発明では、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を生体内培養器内に添加したものと、ＦＧＦおよびＮＥＬＬ−１の両方を加えたものを比較した実験によって、ＮＥＬＬ−１が他の増殖因子と協調もしくは競合して利用できることを証明した。したがって、本発明において使用される一定の分化の方向付けがなされた細胞は、上記１．〜４．に列挙した例示に関わりなく、ＮＥＬＬ−１を加えることによって、Ａ）すでに分化の方向付けられたもしくは方向付けることにより、その細胞をさらに分化誘導、分化促進させること、およびＢ）分化程度の高い細胞の生着を促進することが実現できる。
【０１２０】
別の実施形態において、本発明の組成物において使用される前記造血組織に存在する幹細胞は、自己修復能力および多分化能を持つ血液細胞の母細胞であり得る。この造血組織に存在する幹細胞は、例えば、顆粒状コローニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）などのサイトカインによって血液細胞（例えば、赤血球、白血球、マクロファージなど）分化誘導され得る。
【０１２１】
別の実施形態において、本発明において使用される前記上皮組織に存在する体性幹細胞は、腺原細胞、毛根細胞などであり得るが、これらに限定されない。
【０１２２】
別の実施形態において、本発明による前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、造血系、上皮系などの細胞、組織または臓器などであり得るが、これらに限定されない。
【０１２３】
別の実施形態において、本発明による前記造血系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球などの白血球、赤血球、血小板、マクロファージ、それらの組合わせからなどの血球であり得るが、これらに限定されない。理論に束縛されないが、ＮＥＬＬ−１が成熟した細胞を脱分化して造血系細胞に再分化させるとも考えられるが、本発明の組成物が造血幹細胞に作用し、その分化の方向付けにしたがって、造血幹細胞をさらに分化誘導し、造血系細胞にした可能性が考えられる。
【０１２４】
本発明の組成物は、異所性に造血系の細胞、組織および臓器を形成することができる。本発明により分化誘導された造血系の細胞、組織および臓器は、それらが本来もつ機能を営むことができるという予想外に顕著な効果を有する。
【０１２５】
他の実施形態において、本発明による前記上皮系に分化誘導された細胞、組織または臓器は、外分泌腺およびその導管であり得るが、これらに限定されない。この外分泌腺としては、例えば、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺、唾液腺などが挙げられるが、これらに限定されない。理論に束縛されないが、ＮＥＬＬ−１が成熟した細胞を脱分化して上皮系細胞に再分化させるとも考えられるが、本発明の組成物が上皮に存在する体性幹細胞に作用し、その分化の方向付けにしたがって、上皮幹細胞をさらに分化誘導し、腺組織にした可能性が考えられる。好ましい実施形態において、前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は腺原細胞であり、前記分化誘導された細胞、組織または臓器は外分泌腺、その導管であり得る。
【０１２６】
本発明の組成物は、異所性に腺組織を形成することができる。本発明により分化誘導された腺組織は、それらが本来もつ機能を営むことができるという予想外に顕著な効果を有する。
【０１２７】
別の実施形態において、本発明による前記上皮系組織は、毛、毛球、毛根、毛根に付随する腺組織などであり得るが、これらに限定されない。理論に束縛されないが、ＮＥＬＬ−１が成熟した細胞を脱分化して上皮系細胞に再分化させるとも考えられるが、本発明の組成物が毛根に存在する体性幹細胞（毛根細胞）に作用し、その分化の方向付けにしたがって、毛根細胞をさらに分化誘導し、毛、毛球、毛根、毛根に付随する腺組織にした可能性が考えられる。好ましい実施形態において、前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は毛根に含まれる細胞であり、前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、毛、毛球、毛根、毛根に付随する腺組織であり得る。
【０１２８】
本発明の組成物は、異所性に毛、毛球、毛根、毛根に付随する腺組織を形成することができる。本発明により分化誘導されたこれらの組織は、それらが本来もつ機能を営むことができるという予想外に顕著な効果を有する。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明の組成物に含まれるＮＥＬＬ−１の量は、約０．０１μｇ／ｍｌ以上、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、約５μｇ／ｍｌであり得る。このＮＥＬＬ−１の量の下限は、例えば、約０．０１μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ、約０．９μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ、約１．５μｇ／ｍｌ、約２．０μｇ／ｍｌ、約２．５μｇ／ｍｌ、約３．０μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約４．０μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約５．０μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約６．０μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約８．０μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約９．０μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、約１０．０μｇ／ｍｌなど、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの任意の数値であり得る。このＮＥＬＬ−１の量の上限は、例えば、約１０．０μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、約９．０μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約８．０μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約６．０μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約５．０μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約４．０μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約３．０μｇ／ｍｌ、約２．５μｇ／ｍｌ、約２．０μｇ／ｍｌ、約１．５μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ、約０．９μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌなど、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの任意の数値であり得る。この数値は、造血系の細胞（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球などの白血球、赤血球、血小板、マクロファージ）、上皮系の外分泌腺（例えば、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺、唾液腺など）、毛、毛球、毛根、毛根に付随する腺組織などの場合においても同様である。本発明の組成物に含有させるＮＥＬＬ−１の量は、当業者が、その用途にあわせて適宜決めることができ、その濃度等も明確に決定することができる。
【０１３０】
別の実施形態において、前記分化誘導された細胞、組織または臓器は、天然に存在する対応する機能を有する。この機能としては、例えば、以下のようなものが挙げられ、それらの機能は、以下のように確認されうる。
【０１３１】
造血系組織：免疫化学染色およびフロ−サイトメトリーにより造血系の細胞マーカーの発現を確認すること、
外分泌腺およびその導管：組織染色（ヘマトキシリン−エオシン染色など）による組織像の確認、以下に列挙するような分泌物の確認
汗腺：ナトリウム等分泌物およびアポクリン分泌（離出分泌）の確認
脂腺：脂質等の分泌物の確認
腸腺：イオンペプチダーゼ、マルターゼ等の分泌物の確認
胃腺：消化酵素等ペプシノーゲンまたは水素イオンもしくは塩素イオンなどの確認
唾液腺：アミラーゼ、プチアリンもしくはペルオキシダーゼの分泌の確認
毛、毛球、毛根または毛根に付随する腺組織：肉眼による観察、組織染色（ヘマトキシリン−エオシン染色など）による組織像の確認
本発明の組成物、材料等は、必要に応じて、適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、蛍光色素、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の組成物等は、ＮＥＬＬ−１、および必要に応じて他の有効成分を、少なくとも１つの生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物または材料の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、ミセル、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。
【０１３２】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられる。
【０１３３】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【０１３４】
以下に本発明の組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができることに注意されたい。
【０１３５】
本発明の組成物などは、薬学的に受容可能なキャリアと必要に応じて配合して非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物等には、ＮＥＬＬ−１以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。
【０１３６】
さらに、本発明の組成物は、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。
【０１３７】
（材料）
１つの局面において、本発明は、一定の分化の方向付けがなされた細胞を分化誘導させて、分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器にするための材料を提供する。この材料は、
Ａ）徐放性足場、および
Ｂ）ＮＥＬＬ−１、または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を含み得る。
【０１３８】
１つの実施形態において、本発明において使用される徐放性足場は、細胞外マトリクスであり得る。細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン、アテロコラーゲンなどが挙げられるが、これらに限定されない。なぜなら、本発明では、徐放性足場は、ＮＥＬＬ−１を持続的に標的とする細胞等に提供することができるものであれば、よいからである。コラーゲンなどは、例えば、株式会社  白鵬  販売元白水貿易株式会社（大阪市）などから入手可能であり、その他の供給源からのコラーゲンなどもまた、本発明において利用可能である。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物において説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
【０１３９】
（キット）
他の局面において、本発明は、一定の分化の方向付けがなされた細胞を分化誘導させて、分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器にするためのキットを提供する。該キットは、ＮＥＬＬ−１または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を備え得る。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、材料、方法において説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
【０１４０】
（医療器具）
他の局面において、本発明は、一定の分化の方向付けがなされた細胞を分化誘導させて、分化の方向にさらに分化誘導された細胞、組織または臓器にするための医療器具を提供する。この医療器具は、
Ａ）ＮＥＬＬ−１または該分化の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質；
Ｂ）徐放性足場；および
Ｃ）容器；
を備え得る。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、材料、キットにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
【０１４１】
（生産方法）
別の局面において、本発明は、細胞、組織または臓器を生産する方法を提供する。この方法は、以下の工程：
一定の分化の方向付けがなされた細胞を提供する工程；
該一定の分化の方向付けがなされた細胞と、ＮＥＬＬ−１または該維持の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質とを接触させる工程を包含し得る。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明の生産方法では、前記一定の分化の方向付けがなされた細胞は、脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境に提供され得る。
【０１４３】
別の実施形態において、本発明の分化誘導方法では、一定の分化の方向付けがなされた細胞と前記ＮＥＬＬ−１とは、徐放性足場上で接触され得るが、これらに限定されない。理論に束縛されないが、ＮＥＬＬ−１と分化誘導の標的となる細胞とが、ＮＥＬＬ−１が作用する間、接触するような状態にあればよいからである。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、材料、方法、キット等において説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
【０１４４】
本発明の生産方法による生産物も本発明の範囲内にある。
【０１４５】
（維持用途の組成物）
別の局面において、本発明は、分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための組成物を提供する。この組成物は、ＮＥＬＬ−１、または該維持の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を含み得る。
【０１４６】
本発明の維持用途の組成物は、移植された細胞、組織および臓器は形態および大きさを維持し、さらにそれらが本来もつ機能を維持することができるという予想外に有利な効果を有する。
【０１４７】
１つの実施形態において、本発明の維持用途の組成物による分化誘導された細胞、組織または臓器の維持は、該分化誘導された細胞、組織または臓器の存在が許容されない場所において行われ得る。例えば、分化誘導された細胞、組織または臓器の存在が許容されない場所としては、その細胞、組織または臓器が本体は存在しない場所（例えば、肝臓組織片に対する脂肪組織など）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の維持用途の組成物は、生体内に移植されたものであっても、生体内で形成または誘導されたものであっても、それらに対する免疫拒絶反応を抑制し、生体内に維持することができる。生体内に移植する場合、移植される細胞、組織および臓器は、天然で分化誘導されたものであっても、人工的に分化誘導されたものであってもよい。
【０１４８】
好ましい実施形態において、本発明の維持用途の組成物は、例えば、肝臓、腎臓、すい臓、副腎、甲状腺、卵巣、精巣などを維持し得るが、これらに限定されない。
【０１４９】
移植した臓器等が、異所的な存在を許容されない原因は、一般的に拒絶反応と呼ばれる異物認識・排除機構にあると考えられる。ここで、ＮＥＬＬ−１には、造血系細胞の形成能、異胚葉組織の形成能があることが本発明により見いだされた。理論に束縛されないが、これらの知見を考慮すると、移植した臓器が拒絶されないのは、ＮＥＬＬ−１により、免疫機構によって排除を受けない自己組織が新規に形成されたか、またはその形成途中である可能性がある。
【０１５０】
本発明の組成物により維持された細胞、組織または臓器は、天然に存在する対応する機能を有する。これらの機能について、一例を以下に列挙する。
肝臓：
１）代謝機能：糖分および脂肪分をエネルギーとして蓄えて行うタンパク産生機能
２）解毒機能：有害物質を代謝し無毒化する機能
３）排泄機能：胆汁の分泌機能など
特に、アルブミン産生および肝細胞機能マーカー（トリプトファンオキシゲナーゼ等）の上昇を測定することにより、肝臓の機能を確認することができる。
【０１５１】
すい臓：すい臓β細胞により内分泌されるインシュリンおよびその前駆物質等の産生の上昇を測定すること等により、すい臓の機能を確認することができる
副腎：ステロイドホルモン分泌を確認することにより、副腎の機能を確認することができる
甲状腺：甲状腺ホルモン（トリヨードサイロニンおよびサイロキシンなど）の分泌を確認することにより、甲状腺の機能を確認することができる
卵巣：エストロゲンの分泌、プロゲステロンの分泌などを確認することにより、卵巣機能を確認することができる
精巣：テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロストロンの分泌確認をおこなうことにより、精巣の機能を確認することができる
腎臓：エリスロポエチンの分泌確認をおこなうことにより、腎臓の機能を確認することができる
別の実施形態において、本発明の維持用途の組成物に含まれるＮＥＬＬ−１の量は、約０．０１μｇ／ｍｌ以上、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、約５μｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、約５μｇ／ｍｌであり得る。このＮＥＬＬ−１の量の下限は、例えば、約０．０１μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ、約０．９μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ、約１．５μｇ／ｍｌ、約２．０μｇ／ｍｌ、約２．５μｇ／ｍｌ、約３．０μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約４．０μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約５．０μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約６．０μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約８．０μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約９．０μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、約１０．０μｇ／ｍｌなど、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの任意の数値であり得る。このＮＥＬＬ−１の量の上限は、例えば、約１０．０μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、約９．０μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約８．０μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約６．０μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約５．０μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約４．０μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約３．０μｇ／ｍｌ、約２．５μｇ／ｍｌ、約２．０μｇ／ｍｌ、約１．５μｇ／ｍｌ、約１．０μｇ／ｍｌ、約０．９μｇ／ｍｌ、約０．８μｇ／ｍｌ、約０．７μｇ／ｍｌ、約０．６μｇ／ｍｌ、約０．５μｇ／ｍｌ、約０．４μｇ／ｍｌ、約０．３μｇ／ｍｌ、約０．２μｇ／ｍｌ、約０．１μｇ／ｍｌ、約０．０１μｇ／ｍｌなど、約０．０１μｇ／ｍｌ〜約１０００μｇ／ｍｌの任意の数値であり得る。この数値は、移植された臓器（例えば、肝臓、腎臓、すい臓、副腎、甲状腺、卵巣、精巣）、ならびに生体内に形成された臓器等（造血系の細胞（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球などの白血球、赤血球、血小板、マクロファージ）、上皮系の外分泌腺（例えば、汗腺、脂腺、腸腺、胃腺、唾液腺など）、毛、毛球、毛根、毛根に付随する腺組織など）の場合においても同様である。本発明の組成物に含有させるＮＥＬＬ−１の量は、当業者が、その用途にあわせて適宜決めることができ、その濃度等も明確に決定することができる。
【０１５２】
他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、材料、方法、キットにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
【０１５３】
（維持方法）
別の局面において、本発明は、分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための方法を提供する。この方法は、
該分化誘導された細胞、組織または臓器を提供する工程；
該分化誘導された細胞、組織または臓器に、ＮＥＬＬ−１または該維持の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質を付与する工程を包含し得る。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、材料、方法、キットにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
【０１５４】
（使用）
別の局面において、本発明は、分化誘導された細胞、組織または臓器を、一定の分化の方向付けがなされた細胞から形成するための医薬の製造における、ＮＥＬＬ−１、または該形成の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質の使用を提供する。
【０１５５】
別の局面において、本発明は、分化誘導された細胞、組織または臓器を維持するための医薬の製造における、ＮＥＬＬ−１、または該維持の時点においてＮＥＬＬ−１として機能するように変化される物質の使用を提供する。
【０１５６】
他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、材料、方法、キットにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
【０１５７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１５８】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１５９】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例において使用した試薬等は、特に断らない限り、一般的な試薬メーカーからＮＥＬＬ−１は片山化学工業株式会社が製造から入手したものを使用した。動物実験は、昭和大学において規定される倫理規定に基づいて行った。人に対する実験を行う場合は、インフォームドコンセントを得てから行う。【０１６０】
（ＮＥＬＬ−１の調製）
ＮＥＬＬ−１として、ｈＮＥＬＬ１タンパク質を産生および精製して以下の実施例に用いた。【０１６１】
ｈＮＥＬＬ１タンパク質の産生および精製には、シグマアルドリッチジャパン株式会社、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス（旧アマシャム  バイオサイエンス株式会社）、インビトロジェン株式会社、フナコシ株式会社、コスモ・バイオ株式会社、日本バイオラッド、株式会社  キアゲン、プロメガ株式会社、タカラバイオ株式会社、東洋紡績株式会社、第一化学薬品株式会社、株式会社グライナー・ジャパン、ＤＳファーマバイオメディカル（旧大日本製薬株式会社  ラボラトリープロダクツ部）、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、メルク株式会社、ヒドラス化学株式会社、パーキンエルマーライフサイエンスジャパン株式会社、日本ミリポア株式会社、日本ウォーターズ株式会社、東ソー株式会社、ジーエルサイエンス株式会社、株式会社  資生堂、タイテック株式会社、アフィメトリクスジャパン株式会社、アズワン株式会社、東京硝子器械株式会社、ＩＫＡジャパン有限会社、株式会社パーキンエルマージャパン、ロシュダイアグノスティックス株式会社、オリエンタル酵母株式会社、株式会社  医学生物研究所、株式会社  免疫生物研究所、株式会社  ペプチド研究所、東洋紡エンジニアリング株式会社、三光純薬株式会社、株式会社ベリタス、テフコ株式会社、ザルトリウス株式会社、生化学工業株式会社、倉敷紡績株式会社  バイオメディカル部から購入したかまたは入手可能な試薬を使用した。【０１６２】
本実施例では、ｈＮＥＬＬ１タンパク質の産生および精製を行った。【０１６３】
（ｈＮＥＬＬ  ｃＤＮＡの単離）
最初に、以下に記載する方法により、２４４８−ｂｐ  ｈＮＥＬＬ１  ｃＤＮＡを、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって単離した。【０１６４】
（プラスミドの構築）
プラスミドの構築の概要を示す（図１Ａ〜１Ｃ）。【０１６５】
（１）ヒト脳全体ＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ＲＮＡ）から逆転写反応を用いてヒト脳ｃＤＡＮを調製した。【０１６６】
（２）ヒトＮＥＬＬ−１  ｃＤＮＡをＰＣＲ法により調製を行ったうために、得られたヒト脳ｃＤＮＡより各プライマーを用いて４つのフラグメントを作製した。【０１６７】
（３）得られた４本のフラグメントをさらにＰＣＲ法により２本づつなぎあわせ、２本のフラグメントを作製した。【０１６８】
（４）得られた２本のフラグメントをさらにＰＣＲ法により１本につなぎあわせ、全長を得た。【０１６９】
（５）得られた全長をｐＧＥＭ−Ｔ  クローニング用のベクターへＴＡクローニングによりｈｕｍａｎ  ＮＥＬＬ１プラスミドを作製した。【０１７０】
（詳細な手順）
ヒト脳ｍＲＮＡから逆転写によって、ヒトＮＥＬＬ１  ｃＤＮＡを作製した。【０１７１】
２μＬのｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ＲＮＡ（２．５ｍｇ／ｍＬ，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と１．５μＬのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１３．５μＬのジエチルピロカーボネート処理超純水（ＤＥＰＣ−ＵＰＷ）をいれた１．５ｍＬチューブに加え混合し、室温で２０分間静置した。その後、このチューブに３μＬの１０ｘＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  （ＧＩＢＣＯ）、１．５μＬの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３μＬの０．１Ｍ  ＤＴＴ、２μＬの２５ｍＭ  ｄＮＴＰを加えて良く混ぜてスピンダウンしＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．５μＬ加えて４２℃で６０分間逆転写反応を行い７２℃で１５分間加熱した後、−２０℃で保存した。【０１７２】
次に、以下の４つのフラグメント１〜４（ｆ１〜４）をＰＣＲにかけて増幅した。【０１７３】
フラグメント１（ｆ１）  ５２７ｂｐ
フラグメント２（ｆ２）  ６２４ｂｐ
フラグメント３（ｆ３）  ６１２ｂｐ
フラグメント４（ｆ４）  ８４１ｂｐ
使用したプライマーおよび反応液は、以下のとおりである。【０１７４】
【表１】
0005641477.tif 000002
【０１７５】
プラスミドＤＮＡ（１０倍希釈）          １μＬ
１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ．緩衝液        ５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＳＩＧＭＡ）        １μＬ
１０μＬプライマー（順方向）            １μＬ
１０μＬプライマー（逆方向）            １μＬ
ＶＥＮＴ  ＤＮＡ  ｐｏｌ．（ＮＥＢ）    １μＬ
超純水（ＵＰＷ）                        ４０μＬ
合計    ５０μＬ
ｆ１は、順方向プライマーＦ＃２（配列番号１９）および逆方向プライマーＲ＃５（配列番号２６）、ｆ２は、順方向プライマーＦ＃３（配列番号２０）および逆方向プライマーＲ＃４（配列番号２５）、ｆ３は、順方向プライマーＦ＃４（配列番号２１）および逆方向プライマーＲ＃３（配列番号２４）、そしてｆ４は、順方向プライマーＦ＃５（配列番号２２）および逆方向プライマーＲ＃２（配列番号２３）の組合せを用いた。【０１７６】
ＰＣＲ反応を、９５℃２分間処理の後、９５℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃１分を２５サイクル繰り返し、次いで７２℃７分間処理し、４℃で維持した。【０１７７】
次いで、ｆ１とｆ２、またはｆ３とｆ４とをつなぐために、以下の反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。【０１７８】
ＰＣＲ反応液（ｆ１およびｆ２またはｆ３およびｆ４）        各１μＬ
１０×Ｐｆｕ緩衝液                                          ５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＳＩＧＭＡ）                            ２μＬ
１０μＭプライマー（順方向）＃２または＃４                  １μＬ
１０μＭプライマー（逆方向）＃４または＃２                  １μＬ
Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌ．（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）１μＬ
超純水（ＵＰＷ）                                          ３８μＬ
合計５０μＬ
ＰＣＲ反応を、９５℃２分処理の後、９５℃１分、６０℃１分および７２℃２分を３サイクル繰り返した。次いで反応液にプライマーを添加した。さらに、９５℃１分、５５℃１分および７２℃２分を２７サイクル繰り返した後、７２℃１０分反応させ、４℃に維持した。【０１７９】
さらに、ｆ１とｆ２、またはｆ３とｆ４とをつないで作製した２本のフラグメントをつないでヒトＮＥＬＬ１  ｃＤＮＡ全長を得るためにＰＣＲを行った。反応液を以下のように調製した。【０１８０】
ＰＣＲ反応液（ｆ１−２、ｆ３−４）                        各１μＬ
１０×Ｐｆｕ緩衝液                                          ５μＬ
１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（ＳＩＧＭＡ）                            ２μＬ
１０μＭプライマー（順方向）＃２                            １μＬ
１０μＭプライマー（逆方向）＃２                            １μＬ
Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌ．（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）１μＬ
超純水（ＵＰＷ）                                          ３８μＬ
合計５０μＬ
ＰＣＲ反応は、９５℃２分処理の後、９５℃１分、６０℃１分および７２℃２分を３サイクル繰り返した。次いで反応液にプライマー（下記表を参照）を添加した。さらに、９５℃１分、５５℃１分および７２℃２分を２７サイクル繰り返した後、７２℃１０分反応させ、４℃に維持した。この反応液に、Ｄｐｎ  Ｉ（ＮＥＢ）を１μＬ加えて３７℃にて１時間反応させた。得られた反応液を、エタノール沈殿して、沈殿を超純水（ＵＰＷ）に溶解した。０．５μＬの１０ｍＭ  ｄＡＴＰと１０×Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼバッファーを２．５μＬ加えた。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを、０．５μＬ加えて、７２℃にで２０分間反応させた。【０１８１】
得られた核酸を、０．５ｍＬチューブにｐＧＥＭ−Ｔベクター  １μＬ、２Ｘ  Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、ＰＣＲより得られた全長ｈｕｍａｎ  ＮＥＬＬ１  １μＬ、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ  １μＬに超純水（ＵＰＷ）を加えて１０μＬとし、室温で１時間のインキュベートを行うことによりＴＡクローニングした。【０１８２】
以下の表は、プライマー設計に用いた情報である。【０１８３】
【表２】
0005641477.tif 000003
【０１８４】
（ｈＮＥＬＬ１タンパク質の産生および精製）
（概要）
ｈＮＥＬＬ１  ｃＤＮＡフラグメントは、本実施により得られたものを使用した。【０１８５】
ｈＮＥＬＬ１  ｃＤＮＡフラグメントを、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ  Ｇｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に含まれる発現ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−ＨｉｓのＯｐＩＥ２プロモーターの下流に挿入しＣ−末端Ｖ５−およびＨｉｓ×６−タグ化形態（ｈＮＥＬＬ１−ＶＨ）を生産した。次に、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｈｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＦｕＧｅｎｅ  ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、得られたプラスミドｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＮＥＬＬ１でトランスフェクトし、無血清培地であるＥｘｐｒｅｓｓ  Ｆｉｖｅ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で４８時間インキュベートした。抗生物質Ｚｅｏｃｉｎ（Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、京都、日本）を４００μｇ／ｍｌで培地に添加し、３〜４日毎に培地を交換することによりＺｅｏｃｉｎ耐性細胞を選択した。ｈＮＥＬＬ１−ＶＥタンパク質の細胞外産生をモニタリングするために、培養培地（６ｍｌ）を抗Ｖ５タグ抗体（１μｇ；Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ）とともにインキュベートし、沈降物を６％ゲルのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびＰＶＤＦ膜上で上記抗体を用いるウエスタンブロッティングに供した。ｈＮＥＬＬ１−ＶＥタンパク質を大規模でアフィニティ精製するために、３日目の培養培地（５００ｍｌに合わせた）を、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を充填したプラスチックカラム（Φ１．５  ×  １０  ｃｍ）にかけ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で充分に洗浄し、ＰＢＳ中の５００ｍＭ  イミダゾールで溶出した。この溶出物（約１０ｍｌ）を、４℃で一晩、ＰＢＳに対して充分に透析し、そして、限外濾過により約９００μｇ／ｍｌまで濃縮した。ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０を用いた染色により確認した。より詳細には以下のとおりである。【０１８６】
（材料および方法）
（発現ベクター）
ヒト脳ｍＲＮＡより合成し、クローニングしたヒトＮＥＬＬ１（ｈＮＥＬＬ１）  ｃＤＮＡ（ＯＲＦ  ２４３３ｂｐ）を用いて昆虫細胞発現ベクターの構築を行った。発現ベクターは、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）を使用した。ｈＮｅｌｌ１を挿入するために、ベクター中のマルチクローニングサイトのＳｐｅＩならびにＳａｃＩＩを使用した。挿入するＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、同制限酵素で切断し、ライゲーションを行った。また、融合タグ発現ベクターに関しては、ｈＮＥＬＬ１のストップコドンを除き、融合タグの非発現ベクターに関しては、ｈＮＥＬＬ１のストップコドンを用いた。遺伝子情報ならびにタンパク質情報は、インターネット上のデータベースより検索した。【０１８７】
遺伝子情報  ＮＣＢＩ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｖａｌ＝１８２７４８２
タンパク質情報  Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ
ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９２８３２
タグ部分：ＰＲＦＥＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＲＴＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号２９）
上記タグ部分中、ＳａｃＩＩ  クローニングサイト部分は、ＰＲである。【０１８８】
上記タグ部分中、Ｖ５タグ部分は、ＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号２７）をコードする核酸に対応する。【０１８９】
上記タグ部分中、ヒスチジンタグ部分は、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２８）をコードする核酸に対応する。この後にはストップコドンが入る。【０１９０】
（形質導入細胞株の確立）
（細胞ならびに培地）
昆虫細胞は、ＨｉＦｉｖｅ  （インビトロジェン社）を用い、培地はＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅＳＦＭ（インビトロジェン社  ＃１０４８６−０２５  １Ｌ）に２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン  ９０ｍＬおよび適切な抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を添加したものを使用した。【０１９１】
（形質導入）
形質導入はエレクトロポレーション法により行い、ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いた。幅４ｍｍスリットのキュベット（バイオラッド社）にＤＮＡ  １０ｍｇおよび細胞（１ｘ１０６個）を加え軽く懸濁させ、１０分間氷上冷却の後、１２５μＦ、３００Ｖのパルスを与えた。その後、１０分間の氷上冷却の後、培地へ戻し培養を行った。【０１９２】
（発現細胞選択（ゼオシン耐性））
本ベクターは、ゼオシン（インビトロジェン社）に耐性をもつため、ゼオシンを最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、３日間培養を２回繰り返した。また、本ベクターは、ＧＦＰを共発現するので落射式蛍光顕微鏡下（ＣＫＸ４１オリンパス社）にてＧＦＰ発現を確認することにより形質転換された細胞を確認した。【０１９３】
（小量培養）
ゼオシン耐性を示した細胞を発現株とし、１０ｃｍディッシュ（ＢＤファルコン）に２０％コンフルエンシーで蒔いた後、４日培養し培養上清を高速遠心分離（５０００ｒｐｍ  ２０分）により回収した。なお、培養は２７度で行った。【０１９４】
（タンパク質精製）
精製には、ニッケルセファロースＦＦ６担体（アマシャムバイオサイエンス社）を用いた。エコノカラム（バイオラッド社）に担体１ｍＬを充填し、平衡化バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  ２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．６）で平衡化を行った後、遠心分離処理した培養上清を直接カラムに流し、自然落下によるアフィニティー結合を行った。その後、洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．６）で洗浄した後、溶出バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ，ｐＨ７．６）にて溶出を行った。ニッケルセファロースは、セファロース表面にＮｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉ  ａｃｉｄ（ＮＴＡ）が固層されており、ＮＴＡとニッケルの結合を利用して、ニッケルイオンを保持することができる。また、ニッケルとヒスチジンとの結合性を利用してＨｉｓタグを融合しているタンパク質のみを精製してくることができる。溶出は、ヒスチジンと構造が類似している（下記化学式を参照。）安価なイミダゾールを使用することで、補足されている目的タンパク質中のヒスチジンと置換し、目的のタンパク質を分離した。【０１９５】
【化１】
0005641477.tif 000004
【０１９６】
透析チューブ（商品名：Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ２；型番：１３２６８０：Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１０ｃｍほどの長さに切り、５分間煮沸して洗浄した。煮沸後のチューブを純水で洗浄し、専用のクリップで一端を閉じて回収したＮＥＬＬ−１タンパク質溶液を入れ、空気を抜きながらクリップでもう一端も閉じた。チューブにフロートをつけ、透析外液である５ＬのＰＢＳ（−）に浸し、４℃で穏やかに撹拌した。１時間ごとに４回透析外液を交換しながら、透析を続けた。透析終了後、チューブ内の溶液を回収した。回収後、φ０．２２μｍフィルター（商品名：マイレックス−ＧＶ  フィルターユニット；型番：ＳＬＧＶ０３３ＲＢ：日本ミリポア）にてろ過し、調製ＮＥＬＬ−１タンパク質とした。【０１９７】
２０×ＰＢＳ（−）
ＮａＣｌ                            ４８０ｇ
ＮａＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ              １７４ｇ
ＫＣｌ                                １２ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                            １２ｇ
超純水で１Ｌにメスアップした
ＰＢＳ（−）
２０×ＰＢＳ（−）を超純水で２０倍に希釈した。【０１９８】
（実施例１  造血系組織の形成）
（シリコンモールドの作製）
シリコンモールドを作製するために、シリコンゴム印象材（ビニルポリシロキサン印象材  エグザファイン管理料機器２３ＢＺ００３５、株式会社  ジーシーデンタルプロダクツ、東京、日本）を使用した。シリコンゴムの薄い層で円柱状のテフロン（登録商標）回転子（１−４２０６−０７）（直径４ｍｍ、長さ８ｍｍ；アズワン株式会社、東京、日本）を覆った。シリコンが硬化した後、縦半分に切断することによりテフロン（登録商標）回転子を取り除いた。血管皮弁のための空間を確保するために、シリコンモールドの一端から、半分に切断した部分に細長いくぼみを作った。【０１９９】
シリコンモールドは、移植先臓器形態に合わせたものを作ることが可能である。例えば、ラット骨先端形状のもの、および粘土を用いた松の実状のものを作製し、利用することも可能である。【０２００】
（生体内培養器の作製）
ラット（Ｗｉｓｔａｒ系ラット雄８週齢、２５匹、購入先：埼玉実験動物）にエーテルを導入後、ペントバルビタール（０．１ｍｌ／１００ｇｗ）を腹腔内投与した。【０２０１】
ラット大腿部に皮切を加え、大腿動静脈から分岐する下腹壁動静脈および併走神経からなる神経血管束を周囲組織から剥離した。【０２０２】
腹部皮下の脂肪組織を下腹壁動静脈の分岐部を中心に、シリコンモールドの大きさに合わせて切離し、下腹壁動静脈を血管柄とする有茎組織弁とした。【０２０３】
シリコンモールド（両側）内にＮＥＬＬ−１タンパク質（５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌ）を滴下したコラーゲンスポンジ（ヘリスタット  株式会社  白鵬  商品コード４３０００１０  高度管理医療機器２０７００ＢＺＧ０００２４０００）を挿入した。シリコンモールドの片側に脂肪組織の遠位端を５−０ナイロン糸（ハセガワメディアル  ＢＲＡＫ−Ｋ１５Ａ０５Ｈ）で縫合固定した。残りのシリコンモールドを被せて側面の二箇所を５−０ナイロン糸（ハセガワメディアル  ＢＲＡＫ−Ｋ１５Ａ０５Ｈ）で縫合固定した。【０２０４】
（大腿部筋間へのポケットの作製および移植）
血管柄に過度な圧力がかからずにシリコンモールドを筋肉内に埋没できる位置を見定めて、ラットの大腿部筋肉に鈍的剥離を加えて、臀部皮膚に達するポケットを作製した。具体的には、下肢つけにある、内転筋と薄筋の間を剥離し、筋肉内にポケットを作製した。【０２０５】
シリコンモールドを作製したポケットに埋入した。次いで、ポケットの入り口を５−０ナイロン糸（ハセガワメディアル  ＢＲＡＫ−Ｋ１５Ａ０５Ｈ）を用いて縫合閉鎖した。血管柄の血流が阻害されていないことを確認して、大腿部を閉創した。【０２０６】
移植から２週間後または４週間後に、ジエチルエーテルを用いてラットに麻酔を行い、移植部位を摘出した。摘出した部位を１０％中性ホルムアルデヒト溶液にて固定し、パラフィン標本を作製した。その標本を５μｍ切片に薄切し、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行い、光学顕微鏡で明視野で観察した。【０２０７】
（形成された組織の機能の確認）
本実施例で形成された組織が造血系組織として機能していることを確認するために、以下の実験を行う。【０２０８】
造血系組織が生体内で機能していることを、免疫化学染色およびフロ−サイトメトリーによって、造血系の細胞マーカーの発現を検討することにより確認する。【０２０９】
免疫化学染色により、造血系の細胞マーカーの組織内での局在を３次元的に標識し、組織構造を確認することにより検討することができる。【０２１０】
フロ−サイトメトリーでは、標的細胞に対する標識によって、細胞数を測定すること、細胞マーカーにより細胞を抽出して、各種の分化段階別に細胞を分離・検討することが可能である。【０２１１】
（結果）
移植部位（脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境）において、ＮＥＬＬ−１タンパクの添加法を工夫することで、造血系組織を誘導することができた（図１Ｄ）。ＮＥＬＬ−１が脂肪細胞を脱分化し、造血系細胞に再分化させたとも考えられる。しかし、シリコンモールド内の脂肪組織では血流が維持されることから、ＮＥＬＬ−１存在下において、末梢血中に存在する造血幹細胞（未分化な体性幹細胞）が、さらに分化誘導された可能性が考えられる。また、脂肪組織に存在する脂肪組織由来幹細胞が、造血系細胞に分化した可能性も考えられる。【０２１２】
生体内培養器内には、造血系組織の集塊が複数分布するものが認められた。これらには、組織像により未完成な血球（白血球）が確認され、接続された血管と交通する血管も同時に確保されていた。【０２１３】
（比較例１  ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いた場合の組織形成）
本比較例では、ＮＥＬＬ−１の代わりにＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いること以外、実施例１と同様の方法を用いて生体内培養器を作製する。ネガティブコントロールとして、（１）緩衝液のみを添加した生体内培養器および（２）コラーゲンスポンジを含まずＮＥＬＬ−１を添加した生体内培養器を作製する。これらの生体内培養器を実施例１と同様に移植し、造血系組織が形成されるか否かを検討することができる。【０２１４】
（実施例２Ａ  腺組織の形成）
（生体内培養器の作製）
実施例１と同様の方法により、生体内培養器を作製した。シリコンモールド（両側）内に添加したＮＥＬＬ−１タンパク質の量は、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌである。【０２１５】
（実験に用いたラット）
ラットは、Ｗｉｓｔａｒ系ラット雄８週齢、２５匹（購入先：埼玉実験動物。）を用いた。【０２１６】
（大腿部筋間へのポケットの作製）
実施例１と同様の方法を用いて、ラット大腿部筋間にポケットを作製し、作製したポケットに生体内培養器を移植した。移植の２〜４週間後に、移植部位に形成された組織の形状を、ヘマトキシリン−エオシン染色により確認した。【０２１７】
（形成された組織の機能の確認）
本実施例で形成された組織が腺組織として機能していることを確認するために、以下の実験を行う。【０２１８】
汗腺：ナトリウム等分泌物およびアポクリン分泌（離出分泌）の確認
脂腺：脂質等の分泌物の確認
腸腺：イオンペプチダーゼ、マルターゼ等の分泌物の確認
胃腺：消化酵素等ペプシノーゲンまたは水素イオンもしくは塩素イオンなどの確認
唾液腺：アミラーゼ、プチアリンもしくはペルオキシダーゼの分泌の確認。【０２１９】
（結果）
脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において、ＮＥＬＬ−１タンパクの添加法を工夫することで、有茎組織弁の脂肪組織内に上皮系細胞を誘導することができた（図２および３）。ＮＥＬＬ−１が脂肪細胞を脱分化し、上皮細胞に再分化させることも考えられる。しかし、脂肪組織は中胚葉由来であり、外胚葉性の上皮組織に分化することは難しい。シリコンモールド内の脂肪組織では血流が維持されることから、末梢血中に存在するすでに分化の方向付けをうけた細胞が、ＮＥＬＬ−１存在下において局所に集積し、上皮系細胞である腺組織に分化したものと考えられる。新規に形成された上皮組織は、外分泌腺およびその導管であった（図２および３）。分泌物の生成およびその分泌物を体外に輸送する導管が確認されたことから、本実施例では、脂肪組織内に上皮系組織を形成・維持・機能させることができたといえる。【０２２０】
以上から、ＮＥＬＬ−１を添加した群では、脂肪組織内部に上皮性の腺組織が確認された。さらに毛根を含んだ上皮（表皮）組織が確認されたといえる。【０２２１】
これは、脂肪組織が結合組織（発生学的に中胚葉）であり、毛根や腺組織全般は上皮組織（発生的外胚葉）であることから、2種の播種経路があり得る。これに基づき、本実施例を行うために、毛根または毛それに付随する腺組織の場合は切開を行った毛皮の背面から5mm四方の厚さ約2mmを切り取り、播種することによって上記手順を実現することができる。
また、血液幹細胞に相当する体性幹細胞または脂肪組織（発生学的に中胚葉）が上皮系組織に分化することも試験することができる。上皮系組織は皮背面から切り取り播種することによって実現することもできる。【０２２２】
（比較例２  ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いた場合の組織形成）
本比較例では、ＮＥＬＬ−１の代わりにＢＭＰ、ＴＧＦβを用いること以外、実施例２と同様の方法を用いて生体内培養器を作製する。ネガティブコントロールとして、（１）緩衝液のみを添加した生体内培養器および（２）コラーゲンスポンジを含まずＮＥＬＬ−１を添加した生体内培養器を調製する。これらの生体内培養器を実施例１と同様に移植し、腺組織が形成されるか否かを検討することができる。【０２２３】
（実施例２Ｂ  ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）による影響）
本実施例では、実施例２Ａと同様のラット、および生体内培養器を用いた。【０２２４】
（１）ＦＧＦのみを添加した生体内培養器、（２）ＮＥＬＬ−１とＦＧＦとを添加した生体内培養器、（３）ＮＥＬＬ−１のみを添加した生体内培養器、および（４）生理食塩水のみを添加した生体内培養器を作製した。これらを、ラット大腿部筋間のポケットに移植した。移植の２週間後、移植部位を摘出し、通法に従って、ヘマトキシリン−エオシン染色標本を作製し、観察した。【０２２５】
その結果、（１）ＦＧＦのみを添加した生体内培養器の群では、結合組織や血管が形成されたが、脂肪組織は形成されなかった（図６ＡおよびＢ）。（２）ＮＥＬＬ−１とＦＧＦとを添加した生体内培養器の群では、移植の２週間後に、腺組織の発生が確認された（図６ＣおよびＤ）。この腺組織は、ＮＥＬＬ１のみを添加した場合と比較して複数の分枝がみられ、腺組織周囲を結合組織が覆っていた。ＦＧＦは表皮下の真皮に投与した場合に皮下組織を活性化することが知られており、生体内培養器内のＮＥＬＬ−１によって誘導された皮下組織（腺組織）形成をより促進した結果となった。【０２２６】
（３）ＮＥＬＬ−１のみを添加した生体内培養器の群では、移植の２週間後では、腺組織が観察されたが、結合組織の形成は少なかった（図６ＥおよびＦ）。移植の４週間後では、腺組織像がより発達していた。（４）生理食塩水のみを添加した生体内培養器の群では、脂肪組織と周囲に結合組織が確認されたのみであった（図６ＧおよびＨ）。なお、この脂肪組織周囲に結合組織は、全群において観察された。【０２２７】
（実施例３  毛および毛球の形成）
（生体内培養器の作製）
実施例１と同様の方法により、生体内培養器を作製した。シリコンモールド（両側）内に添加したＮＥＬＬ−１タンパク質の量は、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌである。【０２２８】
（実験に用いたラット）
ラットは、Ｗｉｓｔａｒ系ラット雄８週齢、２５匹（購入先：埼玉実験動物。）を用いた。【０２２９】
（毛根を含む体毛の採取および播種）
毛根を含む体毛および表皮を、Ｗｉｓｔａｒ系ラットに対し、切開を行った毛皮の背面から５ｍｍ四方の厚さ約２ｍｍを切り取り採取した。これを生体内培養器のコラーゲンスポンジ上に播種した。【０２３０】
（Ａ．大腿部筋間へのポケットの作製および移植（自家移植））
実施例１と同様の方法を用いて、ラット大腿部筋間にポケットを作製し、本実施例において作製した生体内培養器を移植した。【０２３１】
移植の２〜４週間後に、移植部位に形成された組織の形状をヘマトキシリン−エオシン染色により確認した。【０２３２】
（形成された組織の機能の確認）
本実施例で形成された組織が毛を作り出す組織として機能していることを確認するために、以下の実験を行う。【０２３３】
移植部位の状態を、肉眼による観察、組織染色（ヘマトキシリン−エオシン染色）による組織染色によって確認した。【０２３４】
（結果）
脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において、ＮＥＬＬ−１タンパクの添加法を工夫することで、脂肪組織内に、毛および毛球を誘導することができた（図９）。ＮＥＬＬ−１が脂肪細胞を脱分化し、毛および毛球に再分化させたとも考えられる。しかし、脂肪組織は中胚葉由来であり、外胚葉性の上皮系組織である毛および毛球に分化することは難しい。移植した毛根には、毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織（汗腺）が確認された。以上より、本実施例では、脂肪組織内に毛を形成・維持・機能させたといえる。【０２３５】
（比較例３  ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いた場合の組織形成）
本比較例では、ＮＥＬＬ−１の代わりにＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いること以外、実施例３と同様の方法を用いて生体内培養器を作製する。ネガティブコントロールとして、（１）緩衝液のみを添加した生体内培養器および（２）コラーゲンシートを含まずＮＥＬＬ−１を添加した生体内培養器を調製する。これらの生体内培養器を実施例１と同様に移植し、毛および毛球が形成されるか否かを検討することができる。【０２３６】
（実施例４  肝臓組織片移植）
（生体内培養器の作製）
実施例１と同様の方法により、生体内培養器を作製した。シリコンモールド（両側）内に添加したＮＥＬＬ−１タンパク質の量は、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌである。【０２３７】
（実験に用いたラット）
ラットは、Ｗｉｓｔａｒ系ラット雄８週齢、２５匹（購入先：埼玉実験動物。）を用いた。【０２３８】
（肝臓組織片の採取および播種）
生体内培養器を移植するラットと同じ動物において、剣状突起部分を長さ１ｃｍ切開し、肝臓（左葉）先端から１ｃｍを切除した。切除後の肝臓片を、生理食塩下で３〜５（３ｍｍ四方）分割し、シリコンモールド内に播種したことにより、肝臓片を脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境においた。切除後は止血を確認したのちに縫合閉創した。【０２３９】
（移植）
本実施例において作製した生体内培養器を、実施例１と同様の方法で作製したポケットに移植した。この際、有茎組織弁の血流がとまらないように注意した。【０２４０】
移植から２週間後または４週間後に、ジエチルエーテルを用いてラットに麻酔を行い、移植部位を摘出した。摘出した部位を１０％中性ホルムアルデヒト溶液にて固定し、パラフィン標本を作製した。その標本を５μｍ切片に薄切し、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行い、光学顕微鏡で明視野で観察した。【０２４１】
（移植した組織片の機能の確認）
移植した組織が、肝臓としての機能を保っていることを実証するために以下の実験を行う。大型の臓器や腎臓などの血管以外の輸出管等が必要な臓器の機能再現には導管や輸入管が不可欠であることから、内分泌系を中心に試験する。【０２４２】
肝臓の機能は、以下の３つに大別される：
１）代謝機能：糖分や脂肪分をエネルギーとして蓄えてタンパク産生
２）解毒機能：有害物質を代謝して無毒化
３）排泄機能：胆汁の分泌
そこで、これらについて、特に、アルブミン産生および肝細胞機能マーカー（トリプトファンオキシゲナーゼ等）の上昇を測定することにより肝臓が生体内で機能しているか否かを検討することができる。【０２４３】
（結果）
ＮＥＬＬ−１を５μｇ添加群では、移植した肝臓片は肝小葉形態が維持されていた（図５）。【０２４４】
脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境において、肝臓組織片とともにＮＥＬＬ−１タンパク質を加えることにより、生体内では異所的な存在が許容されない肝臓組織片を維持することが可能となった。【０２４５】
（Ｂ．他家移植）
Ｗｉｓｔａｒ系ラット雄８週齢から、本実施例と同様の方法により肝臓組織片を採取した。次いで、同種であり別個体のラットにおいて、本実施例と同様に移植した。その結果、移植した肝臓片は維持された。【０２４６】
（比較例４Ａ  生理食塩水を用いた場合の影響）
本比較例では、ＮＥＬＬ−１の代わりに生理食塩水を用いること以外、実施例４と同様の方法を用いた。【０２４７】
その結果、生理食塩水を添加した群では、移植４週後において、移植した肝臓片は確認されず、脂肪組織像、移植した肝臓片を吸収したマクロファージおよび吸収・分解後の残渣のみがみとめられた（図４：対照群）。【０２４８】
（まとめ）
ラット腹部に作製された生体内培養器において、ＮＥＬＬ−１とともに、自家または他家採取された肝臓組織片を移植したところ、移植４週間後に肝臓組織片は生着していた。この組織片には増殖は認められなかった。【０２４９】
ＮＥＬＬ−１の代わりに生理食塩水を添加した対照群では、肝臓組織片は壊死または吸収されていた。この生体内培養器とＮＥＬＬ−１との組み合わせは、「生体内での培養器」として働く可能性があると考えられる。これまで、細胞、組織、臓器の移植に有効な方法についての報告は未だない。本発明の方法は、細胞、組織、臓器の移植について、免疫拒絶反応を起こすことなく移植物を生体に生着させる有効な方法（例えば、肝臓移植）となり得ると考えられる。【０２５０】
（比較例４Ｂ  ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いた場合の組織形成）
本比較例では、ＮＥＬＬ−１の代わりにＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いること以外、実施例４と同様の方法を用いて、それらが肝臓片に与える影響を検討することができる。【０２５１】
（実施例５  卵巣組織片移植）
（生体内培養器の作製）
実施例１と同様の方法により、生体内培養器を作製した。シリコンモールド（両側）内に添加したＮＥＬＬ−１タンパク質の量は、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは５０μｇ／ｍｌである。【０２５２】
（実験に用いたラット）
ラットは、Ｗｉｓｔａｒ系ラット雄８週齢、２５匹（購入先：埼玉実験動物。）を用いた。【０２５３】
（卵巣組織の採取）
背側より下腹部左右に切開を加えた。背側より腹腔にむけて開口部を広げ、卵管および卵管先端にある卵巣周囲の脂肪組織を含めて結紮した後、左右の卵巣を採取した。摘出した卵巣は約５ｍｍの球状であった。【０２５４】
（卵巣組織の生体内培養器への播種）
本実施例において採取した卵巣を、生体内培養器に播種することにより、卵巣を脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境においた。【０２５５】
（移植）
本実施例において作製した生体内培養器を、実施例１と同様に作製したポケットに移植する。この際、血流がとまらないように注意した。ＮＥＬＬ−１存在下で１２週間培養する。【０２５６】
（移植した組織片の機能の確認）
エストロゲン、プロゲステロンの分泌などを検討することにより、移植した組織が、卵巣としての機能を保っているか否かを確認することができる。【０２５７】
（結果）
対象群では、卵巣を摘出した影響により実験的骨粗鬆症によって対照群では骨量の顕著な低下が見られた（Ｍａｙａｈａｒａ  Ｍ，  Ａｎａｔ  Ｒｅｃ  Ａ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｖｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００３  Ｓｅｐ；２７４（１）：８１７−２６）。【０２５８】
実験に用いたラットの大腿骨等の骨端板下の海綿骨量をμＣＴにて３次元的に測定することにより、卵巣摘出後におこる骨量減少を卵巣を播種した生体内培養器が抑止できたか否かを確認することができる。【０２５９】
（比較例５  ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いた場合の組織形成）
本比較例では、ＮＥＬＬ−１の代わりにＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いること以外、実施例５と同様の方法を用いる。ネガティブコントロールとして、緩衝液のみを添加する。これらについて、実施例５と同様にして卵巣組織片が維持されるか否かを検討することができる。【０２６０】
（実施例６  膵臓、副腎、甲状腺および精巣の組織片移植）
（組織採取プロトコール）
本実施例では、実施例４と同様のラットを用いて各組織片を採取する。【０２６１】
（すい臓）
下腹部正中切開を加え、胃を上方に排除する。胃の裏側に確認される膵臓から約５ｍｍ角の大きさの組織片を採取する。【０２６２】
（副腎）
下腹部正中切開を加え、小腸、十二指腸を圧排する。腎臓の上方に確認される副腎から約５ｍｍ角の大きさの組織片を採取する。【０２６３】
（甲状腺）
頚部正中切開、筋層の下に確認される気管軟骨の両側に付着する甲状腺の片側を採取する。【０２６４】
（精巣）
下腹部正中切開を加え、骨盤周囲から精巣に向かって上皮を反転させ、精巣を摘出する。【０２６５】
（移植）
本実施例において採取した各組織片を、実施例４と同様の方法をもちいて、ＮＥＬＬ−１を含む生体内培養器に添加することにより、各組織片を脂肪組織およびそれを維持する血管がある環境においた。これらを、実施例１と同様の方法により作製したポケットに移植する。移植後、肉眼による観察、組織学的な観察などにより、各組織が維持されるか否かを確認することができる。【０２６６】
（移植した組織片の機能の確認）
すい臓：すい臓β細胞により内分泌されるインシュリンおよびその前駆物質等の産生の上昇を測定すること等により、すい臓の機能を確認することができる；
副腎：ステロイドホルモン分泌を確認することにより、副腎の機能を確認することができる；
甲状腺：甲状腺ホルモン（トリヨードサイロニンおよびサイロキシンなど）の分泌を確認することにより、甲状腺の機能を確認することができる；
精巣：テストステロン、ジヒドロテストステロン、デヒドロエピアンドロストロンの分泌確認をおこなうことにより、精巣の機能を確認することができる；
腎臓：エリスロポエチンの分泌確認をおこなうことにより、腎臓の機能を確認することができる。【０２６７】
（比較例６  ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いた場合の組織形成）
本比較例では、ＮＥＬＬ−１の代わりにＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いること以外、実施例６と同様の方法を用いる。ネガティブコントロールとして、緩衝液のみを添加する。これらについて、実施例５と同様にして膵臓、副腎、甲状腺および精巣の組織片が維持されるか否かを検討することができる。【０２６８】
（実施例７  ＮＥＬＬ−１が細胞に与える影響）
本実施例では、ＮＥＬＬ−１が細胞に与える影響を検索する。細胞として、脂肪組織由来幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、臓器片中に含まれた未分化細胞、体性幹細胞、脂肪細胞などを用いる。これらの細胞は、以下の文献に記載されるように調製または入手する。【０２６９】
脂肪組織由来幹細胞：Ｚｕｋ  ＰＡ，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００１  Ａｐｒ；７（２）：２１１−２８．、
造血幹細胞および間葉系幹細胞：Ａｌｉｓｏｎ  ＭＲ，Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｉｃ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０００  Ｊｕｌ  ２０；４０６（６７９３）：２５７、
臓器片中に含まれた未分化細胞：Ｏｇａｗａ  Ｋ，  Ｌｉｖｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｍｏｎｏｓｅｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｎｅｏｎａｔｅｓ  ａｎｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｆａｎｔｓ．：Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．２００７  Ｍａｙ  ２７；８３（１０）：１３３７−４０。【０２７０】
本実施例では、上皮組織、脂肪組織に含まれる細胞を入手して、同様にＥＮＬＬ−１がそれらに与える影響を検討することもできる。【０２７１】
これらの細胞に種々の濃度（例えば、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌなど）でＮＥＬＬ−１を添加し、ＮＥＬＬ−１が各細胞に与える影響を観察することができる。【０２７２】
（比較例７  ＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いた場合の組織形成）
本比較例では、ＮＥＬＬ−１の代わりにＢＭＰ、ＴＧＦβ、ＦＧＦを用いること以外、実施例７と同様の方法を用いて、各細胞に与える影響を検討することができる。【０２７３】
（実施例８  形成された組織等の生体への移植）
本実施例では、実施例１〜３において形成された組織等を動物に移植し、その組織等の経過を観察することにより、移植された組織が生体内で維持されるか否か、天然の対応する組織が本来有する機能を営むか否かなどを検討することができる。【０２７４】
（実施例９  肝臓細胞の誘導および維持）
本実施例では、肝細胞増殖因子である、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、デキサメタゾン、オンコスタチンを用いて幹細胞から肝臓細胞を誘導する。肝臓増殖因子の調製は、Ｋａｍｉｙａ  Ａ，Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００１  Ｍａｒ  ９；４９２（１−２）：９０−４に基づいて行う。肝臓細胞を生体内培養器に播種し、１）代謝機能（糖分および脂肪分をエネルギーとして蓄えて行うタンパク産生機能）；２）解毒機能（有害物質を代謝し無毒化する機能）；３）排泄機能（胆汁の分泌機能など）、特に、アルブミン産生および肝細胞機能マーカー（トリプトファンオキシゲナーゼ等）の上昇を測定することにより、肝臓の機能を確認することができる。【０２７５】
（実施例１０  すい臓β細胞の誘導および維持）
本実施例では、ベータセルリン、コノフェリンなどを用いて幹細胞から膵臓β細胞を誘導する。ベータセルリン、コノフェリンなどの調製は、Ｋｏｊｉｍａ  Ｉ，Ｃｏｎｏｐｈｙｌｌｉｎｅ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００６；３８（５−６）：９２３−３０に基づいて行う。【０２７６】
培養β細胞を生体内培養器に播種し、すい臓β細胞により内分泌されるインシュリンおよびその前駆物質等の産生の上昇を測定すること等により、すい臓の機能を確認することができる。【０２７７】
（実施例１１  ｉｓｏｇａｉの手法との比較）
Ｉｓｏｇａｉの手法（Ｎｏｒｉｔａｋａ  Ｉｓｏｇａｉ，Ｈｉｒｏｈｉｓａ  Ｋｕｓｕｈａｒａ，Ｙｏｓｈｉｔｏ  Ｉｋａｄａ，Ｈｉｔｏｓｈｉ  Ｏｈｔａｎｉ，Ｒｏｂｉｎ  Ｊａｃｑｕｅｔ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ  Ｈｉｌｌｙｅｒ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ  Ｌｏｗｄｅｒ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．Ｌａｎｄｉｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ａｐｒｉｌ  １，２００６，１２（４）：６９１−７０３．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｔｅｎ．２００６．１２．６９１．）を実施して、本件方法とを比較する。【０２７８】
（実施例１２  アテロコラーゲンゲルを含めた生体内培養器の作製および移植）
シリコンモールドは、実施例１と同様の方法により作製したものを用いた。【０２７９】
（アテロコラーゲンゲルの調整・投与方法１ｍｌ）
アテロコラーゲンゲルは、高度管理医療機器  承認番号１６１００ＢＺＺ０１３５５０００を購入し、用いた。【０２８０】
滅菌済みのＰＢＳを用いて、ＮＥＬＬ−１が５００μｇ／ｍＬおよび５０μｇ／ｍＬになるよう希釈した。２本の滅菌済みコラーゲンゲル注射筒型パッケージ（３％）にＮＥＬＬ−１希釈液を添加し、２本の注射筒を接続して交互に１５回程度押し出し、混合した。使用時には０．１ｍｌを投与するためＮＥＬＬ−１投与量は５０μｇおよび５μｇとなった。【０２８１】
（生体培養器の作製）
ＮＥＬＬ−１タンパク質を滴下したコラーゲンスポンジを用いる代わりに、本実施例において調整したアテロコラーゲンゲルを使用すること以外、実施例１と同様の方法をもちいて、生体培養器を作製した。【０２８２】
（Ａ．造血系組織の形成）
実施例１と同様に大腿部筋間にポケットを作製し、生体培養器を移植した。移植から２週間後または４週間後に移植部位を摘出し、パラフィン標本を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。その結果、造血系組織の形成が確認された。【０２８３】
（Ｂ．腺組織の形成）
実施例２と同様に大腿部筋間にポケットを作製し、生体培養器を移植した。移植から２週間後または４週間後に移植部位を摘出し、パラフィン標本を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。その結果、腺組織の形成が確認された。【０２８４】
（Ｃ．腺組織の形成）
本実施例では、ＮＥＬＬ−１タンパク質を滴下したコラーゲンスポンジを用いる代わりに、本実施例において調整したアテロコラーゲンゲルを使用すること以外、実施例３と同様の方法をもちいて生体培養器を作製した。毛根を含む体毛または表皮を、実施例３と同様に採取した。【０２８５】
採取した毛根を含む体毛または表皮を、アテロコラーゲンゲルに播種した。実施例３と同様に大腿部筋間にポケットを作製し、生体培養器を移植した。移植から２週間後または４週間後に移植部位を摘出し、パラフィン標本を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。その結果、毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織（汗腺）の形成が確認された。【０２８６】
（Ｄ．肝臓組織片の維持）
実施例４と同様に、肝臓組織片を生体内培養器に移植すると、移植した肝臓組織片は維持された。【０２８７】
（実施例１３  ＮＥＬＬ−１を連続的に注入することによる実験）
本実施例では、コラーゲンスポンジ、アテロコラーゲンゲルなどに徐放性足場を含まない生体内培養器を用いた。本実施例で用いた生体内培養器は、徐放性足場を含ませないこと以外、実施例１と同様の方法で作製した。【０２８８】
ＮＥＬＬ−１を添加していない生体内培養器内に、３０Ｇ注射針（一般的な注射針である）を使いて、生理食塩水で希釈したＮＥＬＬ−１を投与した。投与は、エーテル麻酔下のラット下腹部からすでに埋入されたモールドに向けて注射針を刺入し、生体内培養器のモールド内の堅さから内部空洞を認識して投与した。【０２８９】
この方法でのＮＥＬＬ−１の投与が確実なことを確認するために、紫色の５０倍に希釈した染色液（カラッチ・へマトキシリンＮｏ，３００２０−２、武藤化学）を、摘出前に注入する試験をおこない、ＮＥＬＬ−１の投与が確実であったことを確認した（図７および８）。【０２９０】
この投与方法では術中の１回のみならず、ＮＥＬＬ−１を頻回に投与することにより、モールド内のＮＥＬＬ−１を高濃度に保つことができた。【０２９１】
本実施例では、１週おきに４週間（５０μｇ／１ｍｌのＮＥＬＬ１溶液０．１ｍｌ）計２０μｇ／ｍｌ投与した。その後、実施例１と同様の方法を用いて移植部位を摘出し、パラフィン標本を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行って、組織像を確認した。その結果、造血系組織または腺組織が確認された。これは、コラーゲンスポンジを使用したときと同様の結果である。【０２９２】
また、実施例３と同様に、毛根を含む体毛および表皮を生体内培養器に移植すると、毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織（汗腺）が確認された。【０２９３】
これらの結果より、各組織の形成は徐放性足場の有無は影響せず、ＮＥＬＬ−１のモールド内濃度を一定にすることにより、組織等が形成することが確認できた。【０２９４】
さらに、実施例４と同様に、肝臓組織片を生体内培養器に移植すると、移植した肝臓組織片は維持された。【０２９５】
（実施例１４  筋組織およびそれを維持する血管のある環境を生体内培養器の作製および移植）
本実施例では、脂肪組織および下腹壁動静脈を含む有茎組織弁の代わりに、筋組織および筋組織を維持する血管を含む有茎組織弁を用いた。それ以外の手法は、実施例１、実施例１２および１３と同様の方法を用いて、生体内培養器（コラーゲンスポンジを含む生体内培養器、アテロコラーゲンゲルを含む生体内培養器、および徐放性足場を含まない生体内培養器）を作製した。徐放性足場を含まない生体内培養器を移植する場合には、ＮＥＬＬ−１は、実施例１３と同様に体外から注入した。【０２９６】
（Ａ．造血系組織の形成）
実施例１と同様に大腿部筋間にポケットを作製し、各生体培養器を移植した。移植から２週間後または４週間後に移植部位を摘出し、パラフィン標本を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。その結果、造血系組織の形成が確認された。【０２９７】
（Ｂ．腺組織の形成）
実施例２と同様に大腿部筋間にポケットを作製し、各生体培養器を移植した。移植から２週間後または４週間後に移植部位を摘出し、パラフィン標本を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。その結果、腺組織の形成が確認された。【０２９８】
（Ｃ．腺組織の形成）
本実施例では、ＮＥＬＬ−１タンパク質を滴下したコラーゲンスポンジを用いる代わりに、本実施例において調整したアテロコラーゲンゲルを使用すること以外、実施例３と同様の方法をもちいて、各生体培養器を作製した。毛根を含む体毛または表皮を、実施例３と同様に採取した。【０２９９】
採取した毛根を含む体毛または表皮を、アテロコラーゲンゲルに播種した。実施例３と同様に大腿部筋間にポケットを作製し、生体培養器を移植した。移植から２週間後または４週間後に移植部位を摘出し、パラフィン標本を作製し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。その結果、毛、毛球、毛根および毛根に付随する腺組織（汗腺）の形成が確認された。【０３００】
（Ｄ．肝臓組織片の維持）
実施例４と同様に、肝臓組織片を生体内培養器に移植すると、移植した肝臓組織片は維持された。
【産業上の利用可能性】
【０３０１】
本発明は、分化誘導された細胞、組織および臓器を形成および／または維持する技術を提供するという有用性を有する。【０３０２】
本発明は、生体内に移植した、分化誘導された細胞、組織および臓器を免疫拒絶反応から保護することができるという有用性を提供する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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