(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるワクチンの免疫原性を向上させるための組成物であって、同時又は連続的使用のための組み合わせ調製物として、ＰＢＳ−５７及びワクチンを含んでなり、ここで前記免疫原性がコントロールと比較して向上する、組成物。
【請求項２】
前記免疫原性がコントロールと比較して少なくとも１００％向上する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経口、経皮、経鼻、腹腔内、経粘膜、及び直腸から選択されるいずれか１つの経路を用いて投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
対象における抗原の液性免疫応答を刺激するための組成物であって、同時又は連続的使用のための組み合わせ調製物として、ＰＢＳ−５７及びワクチンを含んでなり、ここで前記ワクチンには抗原が含まれる、組成物。
【請求項５】
前記液性免疫応答が、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体及び／又はＩｇＭ抗体の産物を含んでなる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
対象におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球を活性化するための組成物であって、同時又は連続的使用のための組み合わせ調製物として、ＰＢＳ−５７及びワクチンを含んでなり、ここで前記ワクチンには抗原が含まれる、組成物。
【請求項７】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化が、Ｔｈ１免疫応答の増加を含んでなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化が、Ｔｈ２免疫応答の増加を含んでなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
ＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化が、Ｔｈ１及びＴｈ２免疫応答の増加を含んでなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
対象におけるＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球を活性化するための組成物であって、同時又は連続的使用のための組み合わせ調製物として、ＰＢＳ−５７及びワクチンを含んでなり、ここで前記ワクチンには抗原が含まれる、組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経口、経皮、経鼻、腹腔内、経粘膜、及び直腸から選択されるいずれか１つの経路を用いて投与される、請求項１０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００７年８月２９日に提出された米国特許第60/968,731号の優先権の利益を請求し、本明細書にその全体が参照により組み込まれる。
【０００２】
ワクチンの基本目的は、病的症状に対して持続的な免疫性を提供することである。理想的には、ワクチンは機能的に活性な抗体を提供し、細胞媒介性免疫を誘発するとともに、高い特異的反応性及び「メモリー」を有するＴ−、及びＢ−リンパ球を活性化し、さらなる病原との遭遇に対する保護を提供する。
【０００３】
賦活剤は、免疫応答を非特異的に増強するワクチン添加物である。賦活剤が免疫系を向上させるメカニズムには様々なものがある。賦活剤を、「免疫調整剤」又は「抗原輸送系」として分類してもよい。免疫調整賦活剤は、リンパ球産物を変化させることにより免疫細胞の活性を調整し、免疫系を調整する。一方、抗原輸送系は、抗原を適切な免疫細胞に輸送するよう機能する。さらに、賦活剤は、免疫応答の速度又は期間の向上、抗体結合力、特異性、アイソタイプもしくはサブクラスの分布の調整、細胞媒介性免疫の刺激、粘膜性免疫の促進、又は免疫学的に未熟もしくは老化個体における免疫応答の向上ができる。賦活剤は、液性又は細胞媒介性応答のいずれか、又は両方の組み合わせに対して作用できる。
【０００４】
免疫調整とは、免疫細胞の異なるサブセットを活性化することにより、リンパ球応答を変化させる賦活剤の能力のことを言う。ＣＤ＋４Ｔリンパ球の２つの主要なサブセットであるＴｈ１及びＴｈ２は、免疫応答を決定する際に主要な役割を果たす。典型的には、Ｔｈ１応答は、抗体を固定する補体及び強力な遅延型過敏（ＤＴＨ）反応を誘導し、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２に結合する。一方、Ｔｈ２応答は、高循環性及び分泌性の抗体レベルをもたらすとともに、サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６及びＩＬ−１０に結合する。Ｔｈ１細胞の活性化はまた、細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞及び標的細胞の増殖の活性化及び細胞溶解の促進により細胞免疫応答を調整する。
【０００５】
脂質種の賦活剤特性が調べられている。脂質は、ペプチド抗体とは異なり、処理され、β２ミクログロブリン関連分子のＣＤ１ファミリーによる免疫系に提示される。ＣＤ１分子は、表示のための外因性及び自己の両脂質抗原を捕捉し、Ｔ細胞の特定サブセットまで処理するように発展してきた。ＣＤ１提示経路は、２つの相補的ＣＤ１制御Ｔ細胞サブセットである、賦活剤機能を発揮するナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、及びヘルパー又は細胞溶解機能がある非ＮＫＴのＴ細胞を活性化することにより、固有の免疫及び適応型免疫両方の応答の誘因となる。ＮＫＴ細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞表面マーカー、及びマウスにおけるVα２４−Jα１８/Vβ８及びヒトにおけるVα２４−Jα１８/Vβ１１で保存される準不変異型Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の両方を発現する。従って、ＮＫＴ細胞は、多数の免疫機能において重要な役割を果たしており、例えば当該機能としては、抗菌応答、抗腫瘍免疫、及び耐性と自己免疫との間のバランス調整がある。
【０００６】
多数の天然及び合成の脂質分子は、抗原提示細胞により処理され、ＣＤ１分子によりＮＫＴ細胞に提示される。インビトロ及びインビボでのＮＫＴ細胞活性化研究のために使用される原型の化合物は、ＫＲＮ7000、及び海綿アゲラス・マウリチアヌス（Agelas mauritianus）由来のα−ガラクトシセラミド（「αGalCer」）である。近年、さらなる化合物が特定され、例えば、内因性糖脂質であるイソグロボトリヘキソシルセラミド（「ｉＧＢ３」）及び修飾６「アミノ６」デオキシガラクトシルセラミドであるＰＢＳ−５７（ＰＣＴ出願PCT/US07/66250号に記載、この開示は参照により本明細書に組み込まれる）がある。これらの化合物は、ＮＫＴ細胞を活性化し、インビトロにおけるサイトカイン応答を上方制御する。ただし、インビボでのワクチン接種に関して、これらの化合物についての脂質免疫賦活作用の有効性についてほとんど知られていない。
【０００７】
毒性副作用によるヒトワクチンにおいて使用が承認されている賦活剤はほとんどない。最も一般的な賦活剤は、アルミニウム及びオイル賦活剤であるが、これらは発熱、頭痛、筋肉痛及び疼痛又は発疹等の副作用を誘導することが知られている。その他の不利益としては、免疫系の強い局所的刺激が、その注入部位で、疼痛、発赤、腫脹又は小塊をもたらすことがある。賦活剤はまた、ワクチン調製の方法を複雑にし、弱い抗原の免疫原性の増加に失敗する可能性がある。現在のところ、ヒトワクチン接種の賦活剤の選択においては、免疫賦活作用の必要性と、副作用の許容レベルとの妥協点が反映されている。副作用は少ないが、長期持続性の防御免疫を発揮する新規な賦活剤に対する要請がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者等は、ＰＢＳ−５７と呼ばれる合成糖脂質の、対象に投与するワクチン調製物への添加は、それが当該対象へ投与されると、液性及び細胞性の両免疫応答を活性化することを発見した。従って、本発明は、対象にＰＢＳ−５７及びワクチンを共投与することにより、対象におけるワクチンの免疫原性を向上させ、対象における液性免疫応答を刺激し、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を刺激し、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞応答を刺激する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、様々な量の賦活剤、糖脂質、αGalCer、ＰＢＳ２０、ＰＢＳ２５及びＰＢＳ５７で処理した培養末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のＣＤ３＋Ｔ細胞群における７日目のＫＮＴ細胞の割合を示すグラフである。
【図２】図２は、様々な量の賦活剤、αGalCer、ＰＢＳ２５、ＰＢＳ５７及びＰＢＳ８３で処理した培養ＰＢＬのＣＤ３＋Ｔ細胞群における７日目のＫＮＴ細胞の割合を示すグラフである。
【図３】図３は、αGalCer、ＰＢＳ２０、ＰＢＳ２５、ＰＢＳ５７及びＰＢＳ８３で処理した、ボランティアから単離したＰＢＬのインビトロ培養物におけるＮＫＴ細胞の増加を示すグラフである。
【図４】図４のＡは、αGalCer、ＰＢＳ５７及びＰＢＳ８３の投与後24時間の、マウス脾臓内のＴＣＲαβ細胞の割合を描いたグラフである。図４のＢは、賦活剤糖脂質の投与後24時間の、マウス脾臓におけるＴＣＲαβ内のＮＫＴ細胞の割合のグラフである。
【図５】図５のＡは、賦活剤糖脂質の静脈投与後24時間の、マウスの脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−細胞群におけるＣＤ４０＋細胞の割合のグラフである。図５のＢは、賦活剤糖脂質の静脈投与後24時間の、マウスの脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋細胞群におけるＣＤ４０＋細胞の割合のグラフである。図５のＣは、賦活剤糖脂質の静脈投与後24時間の、マウスの脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−細胞群におけるＣＤ８０＋細胞の割合のグラフである。図５のＤは、賦活剤糖脂質の静脈投与後24時間の、マウスの脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋細胞群におけるＣＤ８０＋細胞の割合のグラフである。図５のＥは、賦活剤糖脂質の静脈投与後24時間の、マウスの脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−細胞群におけるＣＤ８６＋細胞の割合のグラフである。図５のＦは、賦活剤糖脂質の静脈投与後24時間の、マウスの脾臓由来のＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋細胞群におけるＣＤ８６＋細胞の割合のグラフである。
【図６】図６は、オバルブミン（Ｏｖａ）単独か、又はＯｖａ及びαGalCerで免疫化したマウスの細胞を提示する抗原の特異的溶解を決定するアッセイの、フローサイトメトリーＣＦＳＥ染色の結果のドットプロット及びヒストグラムである。
【図７】図７は、Ｏｖａの存在下又は不存在下で、賦活剤で免疫されたマウスの脾臓における、Ｏｖａ特異的標的細胞の特異的溶解の割合を示すグラフである。
【図８】図８は、異なる濃度のαGalCerとの組み合わせで、Ｏｖａを静脈（「ＩＶ」）注入したマウスの血液におけるＯｖａ特異的標的細胞の特異的溶解の割合を示すグラフである。
【図９】図９は、異なる濃度のＰＢＳ５７との組み合わせで、ＯｖａをＩＶ注入したマウスの血液におけるＯｖａ特異的標的細胞の特異的溶解の割合を示すグラフである。
【図１０】図１０は、異なる濃度のＯｖａとの組み合わせで、ＰＢＳ５７をＩＶ注入したマウスの血液におけるＯｖａ特異的標的細胞の特異的溶解の割合を示すグラフである。
【図１１】図１１は、異なる濃度のαGalCerとの組み合わせで、Ｏｖａを筋肉内（ＩＭ）注入したマウスの血液におけるＯｖａ特異的標的細胞の特異的溶解の割合を示すグラフである。
【図１２】図１２は、異なる濃度のＰＢＳ５７との組み合わせで、ＯｖａをＩＭ注入したマウスの血液におけるＯｖａ特異的標的細胞の特異的溶解の割合を示すグラフである。
【図１３】図１３は、異なるＯｖａ及び賦活剤の組み合わせで、ＩＶかＩＭのいずれかで注入したマウスの血液におけるＯｖａ特異的標的細胞の特異的溶解の割合を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＰＢＳ−５７を含有する破傷風トキソイド（ＴＴ）ワクチン組成物で免疫化したマウスにより向上した抗体産物を示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、ＰＢＳ５７との組み合わせで、オバルブミン（ＯＶＡ）を筋肉内から免疫化したマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答性の向上を示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、ＰＢＳ５７との組み合わせで、ＯＶＡを皮下から免疫化したマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答性の向上を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
賦活剤は、様々な方法でワクチン調製物における抗原の免疫原性を向上させる。毒素の場合は、良好な液性免疫応答が必要である。細胞内細菌の場合は、細胞毒性Ｔ細胞及びＴｈ１細胞により主に媒介される細胞媒介性応答が重要である。ウイルス感染の場合は、液性及び細胞性の両応答は、当該感染を制御するための基礎となる。液性のみならず細胞媒介性の免疫応答を向上させる賦活剤の能力が、長期持続免疫の開発の可能性を向上させる。有効な賦活剤はまた、様々な抗原との組み合わせにおいて有用なはずである。発明者等は、スフィンゴ糖脂質であるＰＢＳ−５７が、インビボでの細胞媒介性及び液性の両免疫応答を刺激できることを発見した。さらに、ＰＢＳ−５７は、弱い名目上の抗原に対する免疫応答を刺激して抗体を作製し、同時に細胞発現特異的表面抗原の細胞媒介性溶解をもたらす。
【００１１】
ある実施態様によれば、本発明は、ＰＢＳ５７及びワクチンの共投与により、対象における当該ワクチンの免疫原性を向上させる方法を提供する。本明細書で使用される「対象」は、哺乳類、例えばマウス、より好適にはヒトである。「ワクチンの免疫原性を向上させる」とは、好適なコントロールとの比較で、対象の液性及び／又は細胞媒介性免疫応答を向上させるＰＢＳ５７の能力のことを言う。コントロールと比較して免疫原性が向上するか否かを決定づけるため、抗原及びＰＢＳ５７でワクチン接種した対象由来のサンプルにおけるシグナルを、抗原のみでワクチン接種した対象由来のサンプルにおけるシグナルと比較することができる。本明細書で使用される免疫原性は、液性又は細胞媒介性の免疫応答を測定するために当業者に使用される任意のアッセイにより測定してよい。例えば、免疫原性は、当業者にとってその操作は定常作業である、様々なサイトカインレベルについてのＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定してもよい。
【００１２】
特定の実施態様によれば、免疫応答の向上は、好適なコントロールと比較して、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも200％、又は少なくとも400％である。好適なコントロールは、ＰＢＳ５７を含まないワクチン組成物で処理される対象でもよい。向上の割合は、以下の式を用いて計算できる。
【００１３】
【数１】
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【００１４】
本明細書で使用される「共投与」又は「共投与する」なる用語は、少なくとも賦活剤及びワクチンを、同時に、すなわち一度に投与すること、又は連続的に、すなわち賦活剤の投与の後に、ワクチンの投与をすることを言う。賦活剤の投与後とは、ワクチンを、賦活剤の後実質的にすぐに投与することも、賦活剤の後有効な期間経過後に投与することもでき、ここで有効な期間とは、賦活剤の投与から受ける最大利益の実現のために与えられる時間である。あるいは、賦活剤及びワクチンを共に製剤化してもよい。
【００１５】
ワクチン組成物は、ＰＢＳ−５７含むよう好適に製剤化される。「ワクチン」は、対象に投与される場合、本明細書に記載の細胞性又は液性の免疫応答を誘導する組成物のことを言う。ワクチン組成物には、抗原又は抗原の組み合わせがあってもよく、当該抗原には、ポリペプチド又は炭水化物部分、又はその組み合わせ、例えば糖タンパク質があり得る。当該抗原は、好適には感染性因子（例えば、病原性微生物）、腫瘍、内因性分子（例えば、「自己分子」）、又は研究の目的により、オバルブミン（本明細書では「Ｏｖａ」と記載する）等の微量抗原由来である。ワクチン組成物は、不活化又は弱毒化感染性因子を含んでもよい。当該ワクチン組成物を、ＰＢＳ５７及び抗原を好適に含有する本発明との複合体において使用してもよい。ＰＢＳ−５７の構造を以下に示す。
【００１６】
【化１】
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【００１７】
ＰＢＳ５７は、インビトロ及びインビボでＮＫＴ細胞を活性化する。ＰＢＳ５７は、ガラクトースのＣ6位のアミド基とセラミドの一部のアシル鎖におけるシス−二重結合を含む。理論に拘束されることなく、セラミド側鎖における当該二重結合は、ＣＤ１分子の溝への結合を促進し、スフィンゴ糖脂質の溶解性を向上させると考えられている。ＰＢＳ５７は、インビトロでのＩＮＦ−γ及びＩＬ−４の放出を誘導することがわかっている。
【００１８】
ＰＢＳ５７を含有するワクチン組成物は、様々な調製方法を用い、当業者に既知の不活性成分を用いて製剤化してもよい。Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., (2000）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ワクチンはまた、抗原を免疫細胞に向かわせる好適な抗原輸送系を含んでもよい。好適な抗原輸送系は、当業者に既知であり、限定するものではないが、例えばＭＶＡ（修飾ウイルスアンカラ（ankara））、アデノウイルス、レンチウイルス、百日咳もしくは志賀毒素の転座サブユニット、又は抗原封入リポソームがある。ワクチン組成物におけるＰＢＳ５７の好適な有効投薬量は、当業者が決定してもよいが、典型的には、体重１kg当たり約1マイクログラムから約10,000マイクログラムの範囲であるが、典型的には、体重１kg当たり約1,000マイクログラム以下である。ある実施態様によれば、有効投薬量は、体重１kg当たり約10〜約5,000マイクログラムの範囲である。別の実施態様によれば、有効投薬量は、体重１kg当たり約50〜約1,000マイクログラムの範囲である。別の実施態様によれば、有効投薬量は、体重１kg当たり約75〜約500マイクログラムの範囲である。研究の目的により、マウスへの好適な投薬は、100μl用量当たりＰＢＳ５７が１μgである。ＰＢＳ５７組成物は、単回用量投与で投与でき、あるいは数週間もしくは数ヶ月の期間にわたり、複数用量投与で投与してもよい。
【００１９】
ＰＢＳ５７を有する組成物は、１又は複数の抗原を含んでもよく、又は別々に製剤化してもよい。本明細書で使用される場合、抗原は免疫応答を刺激する分子のことを言う。当然のことながら、抗原の投薬は、特定抗原、及び対象の年齢及び免疫状態、並びに当業者に決定され得るその他の関連因子の影響を受ける。
【００２０】
好適には、抗原は、弱毒化又は不活化感染性因子由来である。微生物を全体で利用しても、又はその部分（例えば、ゴースト膜、粗製膜調製物、ライセート及びその他の微生物調製物）を利用してもよい。抗原を得るための好適な感染性因子には、限定するものではないが、病原菌及び細菌、寄生虫及びウイルス等の微生物が含まれる。ある状況では、好適な抗原を、ヒト疾患に関連するウイルス性病原菌、限定するものではないが、例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳ（レトロウイルス科、例えばＨＶ−Ｉ及びＨＩＶ−II分離株のｇｐ１２０分子、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−11）、インフルエンザウイルス（オルオミクソウイルス科、例えばタイプＡ、Ｂ及びＣ）、ヘルペス（例えば、単純ヘルペス、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＢ、ｇＤ及びｇＨ）、ロタウイルス感染（レオウイルス科）、呼吸器感染（パラインフルエンザ及び呼吸器含胞体ウイルス）、ポリオウイルス感染（ピコナウイルス科、例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス）、はしか及びおたふく風邪（パラミクソウイルス科）、風疹（トガウイルス科、例えば風疹ウイルス）、肝炎（例えば、肝炎ウイルスタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及び／又はＧ）、サイトメガロウイルス（例えば、ｇＢ及びｈ及びｇＨ）、胃腸炎（カリシウイルス科）、黄熱及び西部ナイル熱（フラビウイスル科）、狂犬病（ラブドウイルス科）、韓国型出血熱（ブニヤウイルス科）、ベネズエラ熱（アレナウイルス科）、疣贅（パピローマウイルス科）、サル免疫不全ウイルス、脳炎、水痘帯状疱疹ウイルス、エブスタイン・バーウイルス、及びその他のウイルスファミリー、例えばコロナウイルス科、ビルナウイルス科及びフィロウイルスから取得するか、又は当該物を由来とすることができる。
【００２１】
好適な細菌及び寄生性抗原は、限定するものではないが、例えば、ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、細菌性及び真菌性肺炎、中耳炎、淋病、コレラ、腸チフス、髄膜炎、単核細胞症、ペスト、細菌性赤痢又はサルモネラ症、レジオネラ症、ライム病、ライ病、マラリア、鈎虫症、オンコセルカ症、住血吸虫症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ジアルジア鞭毛虫症、アメーバ症、フィラリア症、ボレリア、及び旋毛虫症を含む疾患のための既知の剤から取得するか、又は当該物を由来とすることができる。よりさらなる抗原は、非従来的な病原菌、例えば、クールー病、クロイツフェルト・ヤーコプ病（ＣＪＤ）、スクラピー、伝染性ミンク脳症、及び慢性るいそうから、又はタンパク性感染粒子、例えば、狂牛病に関連するプリオン等から取得するか、又は当該物を由来とすることができる。
【００２２】
抗原が得られるさらなる特定病原には、Ｍ.ツベルクロシス（M. tuberculosis）、クラミジア（Chlamydia）、Ｎ.ゴノルホエアエ（N. gonorrhoeae）、シゲラ（Shigella）、サルモネラ（Salmonella）、ビブリオ・クロレラエ（Vibrio cholerae）、トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum）、シュードモナス（Pseudomonas）、ボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）、ブルセラ（Brucella）、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、レプトスピラ・インテロガンス（Leptospira interrogans）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、エルジニア・ペスティス（Yersinia pestis）、ストレプトコッカス（Streptococcus）（タイプＡ及びＢ）、ニューモコッカス（pneumococcus）、メニンゴコッカス（meningococcus,）、ハエモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）（タイプＢ）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Toxoplasma gondii）、モラキセラ・カタルハリス（Moraxella catarrhalis）、ドノバノシス（donovanosis）、及びアクチノミコシス（actinomycosis）があり；真菌性病原菌には、カンジダ及びアスペルギルスがあり；寄生性病原菌には、テニア（Taenia）、吸虫類、回虫、アメーバ、ジアルジア鞭毛虫（giardiasis）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、スキストサマ（Schistosoma）、ニューモシスチス・カリニイ（Pneumocystis carinii）、トリコモナス（trichomoniasis）及び旋毛虫（trichinosis）がある。本発明はまた、多数の獣医学的疾患、例えば口蹄疫、コロナウイルス、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）、ヘリコバクター（Helicobacter）、ストロンギルス・ブルガリス（Strongylus vulgaris）、アクチノバチルス・プレウロニュモモニア（Actinobacillus pleuropneumonia）、ウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumoniae）、Ｅ.coli、及びボルデテラ・ペルツシス（Bordetella pertussis）、パラペルツシス（parapertussis）及びブロキセプチア（brochiseptica）に対する好適な免疫応答を提供するために使用することもできる。
【００２３】
その他の実施態様によれば、本方法において使用できるワクチン組成物に含有される抗原は、腫瘍由来抗原であるか、又は自己由来又は同種異系の全ての腫瘍細胞である。好ましくは、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）又は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。複数の腫瘍抗原及びその発現パターンは、当業界で既知であり、治療されるべき腫瘍タイプに基づいて選択できる。限定のない腫瘍抗原の例としては、ｃｄｋ４（黒色種）、β−カテニン（黒色種）、カスパーゼ−８（扁平上皮癌）、ＭＡＧＥ−１及びＭＡＧＥ−３（黒色腫、乳癌、神経膠腫）、チロシナーゼ（黒色腫）、表面Ｉｇイデオタイプ（例えば、ＢＣＲ）（リンパ腫）、Ｈｅｒ−２/ｎｅｕ（乳癌、卵巣癌）、ＭＵＣ−２（乳癌、前立腺癌）及びＨＰＶ Ｅ６及びＥ７（頸部癌）が挙げられる。さらなる好適な腫瘍抗原には、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、シリアルＴｎ（ＳＴｎ）、熱ショックタンパク質及び関連腫瘍ペプチド（例えば、ｇｐ９６）、ガングリオシド分子（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２、及びＧＤ３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びＭＡＲＴ−１がある。
【００２４】
当業者によく知られるように、ワクチンは意図した投与経路に適合するよう、好適に製剤化される。好適な投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経鼻、腹腔内、経粘膜、及び直腸投与がある。ワクチンは、生理学的に許容される媒体を含んでもよい。「生理学的に許容される」媒体は、インビボ投与（例えば、経口、経皮、又は非経口投与）、又はインビトロ使用、すなわち細胞培養に適する任意の媒体である。インビトロ投与に好適な生理学的に許容される媒体としては、特に水、緩衝化溶液及びグルコース溶液が挙げられる。組成物のさらなる成分として、生理学的に許容される媒体及び抗原に加えて、好適には例えば安定化剤、保存剤、希釈剤、乳化剤又滑剤等の賦形剤を含んでもよい。特に好適な賦形剤には、限定するものではないが、Tween20、ＤＭＳＯ、スクロース、Ｌ−ヒスタジン、ポリソルベート20及び血清がある。
【００２５】
本発明の別の実施態様は、抗原に対する液性の免疫応答を刺激する方法である。この方法には、上記の通り、対象にＰＢＳ−５７及び抗原を共投与することが含まれる。本明細書で使用される、「液性の免疫応答」は、Ｂ細胞による抗原の産生、及びそれに伴う補足プロセスがあり、限定するものではないが、例えばＴｈ２活性化及びサイトカイン産生、肺中心形成及びアイソタイプスイッチ、親和性成熟産物及びメモリー細胞産生がある。液性の免疫応答が活性化されるか否かを調べるために、抗原とＰＢＳ５７でワクチン接種した対象由来のサンプルとにおけるシグナルの定量的比較を、抗原単独でワクチン接種した対象由来のサンプルと比較することができる。液性の免疫応答は、抗体のエフェクター機能、例えば病原菌又は毒性中性化、従来的な補体活性化、及びファゴサイトーシス及び病原菌除去のオプソニン促進等を測定することにより評価してもよい。ＰＢＳ−５７及び抗原の共投与に対する応答において産生された抗体は、任意のタイプ、例えばＩｇＭ，ＩｇＡ、又はＩｇＨであってもよい。液性の免疫応答は、当業者に既知の任意の定量方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、一元放射状免疫拡散アッセイ（single radial immunodiffusion assay）（ＳＰＩＤ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、又は血球凝集阻害アッセイ（ＨＡＩ）がある。
【００２６】
本発明のさらなる実施態様は、対象におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球を活性化する方法である。当業界で理解されているように、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又は「Ｔヘルパー細胞」は、抗原提示細胞の表面上のクラスII主要組織適合性マーカー（ＭＨＣ）により提示される抗原を認識し、且つ細胞媒介性及び抗体媒介性の免疫系の両系を刺激するリンパ球を分泌する細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化は、リンパ球分泌、免疫グロブリンアイソタイプスイッチ、抗体応答の親和性成熟、マクロファージ活性化、及びナチュラルキラー（ＮＫ）及び細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性向上を促進する。リンパ球は、自身の活性及び／又は細胞の活性に影響を与えるリンパ球により分泌されるタンパク質である。リンパ球には、限定するものではないが、インターロイキン及びサイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、又はＩＮＦγがある。ＣＤ４＋Ｔリンパ球が活性であるか否かを調べるために、抗原及びＰＢＳ５７でワクチン接種した対象由来のサンプルにおけるシグナルの定量比較は、抗原単独をワクチン接種した対象由来のサンプルと比較できる。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化アッセイの方法は当業界で既知である。
【００２７】
本発明の別の実施態様は、対象におけるＣＤ８＋Ｔリンパ球を活性化する方法である。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、クラスＩ ＭＨＣ分子（全て有核細胞に存在）により提示される抗原を認識する。ＭＨＣクラスＩ−ペプチドの複合体の結合により、標的細胞の溶解を引き起こす標的細胞に、溶解性顆粒が送達される。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をアッセイするために使用される方法は、当業界で既知であり、限定するものではないが、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ、及び細胞毒性アッセイがある。本明細書で使用される場合、Hermans et al, 2004, Journal of Immunologic Methods, 285:25-40（その全体が参照により組み込まれる）に記載の通り、細胞媒介性細胞毒性を測定する蛍光アッセイを使用してＣＤ８＋Ｔ細胞活性化をモニターするために、マウスモデルを使用する。本アッセイにおいて、マウスは、０日目に、ＰＢＳ５７を含有するか、又は未含有のワクチンで免疫化する。同系標的細胞は、第二セットのマウス由来の脾細胞を単離し、２つの別々の細胞標識蛍光色素か、又は単一の蛍光色素の濃度の高低で標識することにより作製する（色素は、例えばＣＦＳＥ又はＣＭＴＭＲ等）。一方の標的細胞のセットに、抗原特異的ペプチドをロードし、第二の標的細胞セットに、無関係なペプチドをロードする。２つの標的細胞群を当量で混合し、免疫化マウスに注入する。24時間後、マウスを犠牲にし、脾細胞及び血液サンプルを採取する。各セットの標的細胞レベルをフローサイトメトリーにより分析する。ＣＤ８＋リンパ球の活性化は、抗原及びＰＢＳ５７でワクチン接種したサンプルにおける標的細胞の数を、抗原単独でワクチン接種した対象由来のサンプルにおける標的細胞の数と比較することにより決定する。
【００２８】
発明のその他の態様は、以下の制限の無い実施例及び添付の図を考慮することにより明らかになるはずである。
【実施例１】
【００２９】
実施例１：インビボでのＮＫＴ細胞のＰＢＳ５７活性化
ＰＢＳ−５７が、培養物中のＮＫＴ細胞を刺激できるか否かを決定するため、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）におけるＮＫＴ細胞の増殖を測定した。ＰＢＬは２人の健常ドナー由来のものであり、５％ＡＢ血清と共にＲＰＭＩ細胞培養培地で増殖させた。細胞を12ウェルプレートに２×106 PBL/ウェル/2mlで播種した。ウェルを、ネガティブコントロール（ＰＢＳ中0.05% Tween20及び1% DMSO、又はＰＢＳ中0.05% Tween20及び10% DMSO）又は試験賦活剤（αGalCer、PBS-２０、PBS-２５、又はPBS-５７）で、終濃度を10 ng/ml、100 ng/ml 又は1 μg/mlとして処理した。コントロール化合物、αGalCer、PBS-２０及びPBS-２５の化学構造を以下に示す。
【００３０】
【化２】
0005539890.tif 000004
【００３１】
１日目までに100UI/mlの終濃度となるよう、全培養物に組み換えヒトＩＬ２（ｒｈＩＬ−２）を補った。全ての細胞を10日間、５％ＣＯ2、37℃で培養した。７日目に、培養培地（１ml）の半分を、ＮＫＴ解析のために除去した。ＣＤ３＋群におけるＮＫＴ細胞の割合を、蛍光標識ＣＤ１テトラマー又は蛍光標識抗体（抗−ＣＤ３、抗−Ｖβ11、及び抗ＮＫＴ）を用い、フローサイトメトリーにより検出した。ＮＫＴ群は、Ｖβ11＋、テトラマー＋及びＴＣＲαβ＋群と同様にフローサイトメトリーにより特定した。ＮＫ細胞割合を、Ｖβ11＋エンプティ−テトラマー＋ＴＣＲαβ＋から、Ｖβ11＋ＰＢＳ−５７−テトラマー＋ＴＣＲαβ＋を引くことにより各サンプルについて計算した。図１は、ＰＢＳ−５７、αGalCer、ＰＢＳ−２５及びＰＢＳ−２０での処理後のＮＫＴ細胞の増加を示す。
【００３２】
別の実験において、インビトロでのＮＫＴ細胞増殖を誘導するその他の候補糖脂質と比較した、ＰＢＳ−５７の能力を測定した。末梢血リンパ球を、２人の健常ドナーから得るとともに、５％ＡＢ血清と共にＲＰＭＩにおいて培養した。細胞を12ウェルプレートに２×106 PBL/ウェル/2ml培地で播種する。１つのウェルにはネガティブコントロールとして担体（ＰＢＳ中、0.05% Tween20及び1% DMSO）を、検査ウェルにはαGalCer、ＰＢＳ−２５、ＰＢＳ−５７又はＰＢＳ−８７を、終濃度1 ng/ml、10 ng/ml 又は100 ng/mlで添加した。ＰＢＳ−８３の構造を以下に示す。
【００３３】
【化３】
0005539890.tif 000005
【００３４】
１日目までに100 UI/mlの終濃度となるよう、全培養物にｒｈＩＬ−２を補った。全ての細胞を７日間、５％ＣＯ2、37℃で培養した。７日目に、ＮＫＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで検出した。図２は、異なる糖資質処理条件について、７日目のＮＫＴ細胞の割合を示す。ＰＢＳ５７での処理によりＮＫＴ細胞は、αGalCerで処理した細胞と比べて、少なくとも２倍となった。
【実施例２】
【００３５】
実施例２：ＰＢＳ５７で処理した培養物におけるＮＫＴ細胞の増殖
１４人の健常ドナーの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単球（ＰＢＭＣ）サンプルパネルで、ＮＫＴ染色を行った。１２人の対象からＰＢＬを単離し、２人の対象からＰＢＭＣを単離した。各単離細胞サンプルを、２つのサンプルに分けた。各々のドナー由来の第一のサンプルを、10 μlの抗−Vβ11 ＦＩＴＣ（Beckman Coulter）、10 μlの抗−ＴＣＲαβ−ＰＣ５（Beckman Coulter）、及び２μlのＰＥ標識ＰＢＳ−５７−ＣＤ１ｄ−テトラマーで染色した。各々のドナー由来の第二のサンプルを、10 μlのVβ11、10 μlの抗−ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ、及び２μlのＰＥ標識エンプティ−ＣＤ１ｄ−テトラマーで染色した。
【００３６】
ＮＫＴ細胞の増殖割合を決定するため、７日目のＮＫＴ細胞数を、０日目のＮＫＴ細胞巣で除した。図３に示すように、ＰＢＳ５７とのインキュベーションにより、ヒトボランティア由来のＰＢＬ培養物におけるＮＫＴ細胞が実質的に増加した。
【実施例３】
【００３７】
実施例３：ＰＢＳ−５７投与したマウスにおける、ＴＣＲαβ、ＮＫＴ細胞群及び樹枝状細胞成熟の解析
インビボでのＰＢＳ５７の賦活剤活性を試験するために、マウスに試験化合物を注入し、24時間での細胞活性化と増殖を評価した。５つのＣ５７Ｂ１/６Ｊマウス群のうち４群に対し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に、担体（ＤＮＳＯ単独）、0.97 μgのαGalCer、1.3 μgのＰＢＳ５７、又は0.97 μgのＰＢＳ８３を、ＰＢＳで総量100μlとして、各々静脈投与した。試験化合物の投与24時間後、マウスを犠牲にし、血液サンプル及び脾細胞を標準的手法で単離した。この脾臓におけるＮＫＴ細胞の割合を、ＰＢＳ−５７（ＰＢＳ−５７−テトラマー）をロードするか、又は脂質なし（エンプティ−テトラマー）の、抗−ＴＣＲαβ−ＦＩＴＣ及びＰＥ標識ＣＤ１ｄ−テトラマーを用いる染色で、フローサイトメトリーにより評価した。図４Ａに、ＰＢＳ及び担体単独で処理したコントロールマウスと比較した、αGalCer又はＰＢＳ５７で処理したマウスにおけるＴＣＲαβ細胞の割合の増加を示す。ＮＫＴ細胞の割合は、ＴＣＲαβ群におけるエンプティ−テトラマー＋細胞の割合から、ＰＢＳ５７−テトラマー＋細胞の割合を引くことにより決定した。図４Ｂに、コントロールとの比較で、ＰＢＳ５７又はαGalCerで処理したマウスの脾臓におけるＮＫＴ細胞の割合の減少を示す。併せると、図４Ａ及び図４Ｂに示す結果は、ＰＢＳ５７が、αGalCerと同程度に有効に、マウスの脾臓においてＴＣＲαβ細胞数を増加させたことを示す。コントロールと比較して、αGalCer又はＰＢＳ５７を注入されたマウスにおけるＮＫＴ細胞の低減は、ＮＫＴ細胞表面上のＴＣＲの発現低下を実証している。
【００３８】
樹枝状細胞（ＤＣ）は、抗−ＣＤ11ｃＲ−ＰＥ（BD Pharmingen）及び抗−ＣＤ８αＦＩＴＣ（Beckman Coulter）で染色するフローサイトメトリーで、脾細胞において検出された。樹枝状細胞の２つのサブセット、ＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α−及びＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α＋群をさらに解析した。コントロールと比較して、ＰＢＳ５７又はαGalCer賦活剤で処理したマウスでは、両サブセットのＤＣが50％減少した。糖脂質の投与が樹枝状細胞の２つのサブセットの成熟を誘導したのかを決定するため、この細胞を、抗−ＣＤ40ビオチン／Stepta APC（BD Bioscience）、抗−ＣＤ80ビオチン（BD Pharmi）／Stepta APC (BD Bioscience)及び抗−ＣＤ86ビオチン（BD Pharmingen）／Stepta APC (BD Bioscience)抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。図５Ａ及び５Ｂは、それぞれＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α−及びＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α＋の両細胞におけるＣＤ40ポジティブ細胞の割合を示す。図５Ｃ及び５Ｄは、それぞれＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α−及びＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α＋の両細胞群におけるＣＤ80ポジティブ細胞の割合を示す。図５Ｅ及び５Ｆは、それぞれＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α−及びＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α＋の両細胞におけるＣＤ86ポジティブ細胞の割合を示す。水平線は平均を示す。まとめると、データは、ＰＢＳ５７及びαGalCerは両方共に、ＣＤ40＋、ＣＤ80＋及びＣＤ86＋発現細胞の割合を、ＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α−及びＣＤ11ｃ＋ＣＤ８α＋の両群において実質的に増加させたことを示している。
【実施例４】
【００３９】
実施例４：マウスモデルにおける、ＰＢＳ−５７の免疫原性を試験するためのプロトコル
抗原との組み合わせで、ＰＢＳ５７により誘発されるインビボでの特異的細胞毒性Ｔ細胞応答（ＣＤ８＋）を試験するために、マウスモデルを使用した。Ｃ５７/Ｂ１/６Ｊ ＣＤ４５.２雌マウスを、総量100μlのＰＢＳ中、賦活剤有り、賦活剤無し、賦活剤単独、又は担体単独（コントロール）と、抗原（Ovalbumin, Ova, grade VII, Sigma, St. Louis, MO）で、０日目に免疫化した。試験化合物は、50 μgのＯｖａの存在下又は不存在下、1 μgのＰＢＳ５７、1 μgのαGalCer、1 μgのＰＢＳ８３とした。第二セットのＣ５７/Ｂ１/６Ｊ ＣＤ４５.２雌マウス由来の脾細胞を単離し、低濃度（0.6 μM、37℃で10分間）又は高濃度（6 μM、37℃で10分間）のいずれかのＣＦＳＥ（蛍光色素）で細胞を標識することにより同系標的細胞を調製した。高濃度ＣＦＳＥ標識群を、5 μMのＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド（Ｏｖａ特異的ペプチド、NeoMPS, Inc, San Diego, CA）を用い、37℃で60分予備標識した。低濃度ＣＦＳＥ標識群を、5 μlのＬＣＭＶ ｇｐ３３−４１ペプチド（Ｏｖａ非特異的ペプチド、NeoMPS, Inc, San Diego, CA）を用い、37℃で60分予備標識した。両群の同数の標的細胞を混合し（低濃度又は高濃度ＣＦＳＥを１×107細胞、総量100μl当たり２×107細胞）、前記免役化１０日目マウスの各々に静脈注入した。１１日目にマウスを犠牲にし、脾臓細胞及び血液サンプルを眼窩洞から採取した。フローサイトメトリー解析により、ペプチドパルス標的細胞（ＣＦＳＥ標識）の平均生存割合を、コントロールとの比較で計算した。図６Ｂは、Ｏｖａ特異的ペプチドロード標的細胞の減少を示す典型的なフローサイトメトリーのデータである。細胞毒活性はＯｖａ特異的標的細胞の平均生存割合を100から引くことにより計算した、特異的溶解の割合として表現した。図７は、免役化マウスの脾臓における標的細胞の特異的溶解の割合である。ＯｖａとＰＢＳ５７の組み合わせのみが、脾臓におけるＯｖａ特異的標的細胞の細胞毒性溶解をもたらした。
【実施例５】
【００４０】
実施例５：Ｏｖａと共に濃度変化させたαGalCerを免役化した後の細胞毒性応答
Ｏｖａ−ペプチドロード標的細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞により誘導されるインビボ細胞毒性を、αGalCer濃度を変化させ実施例４の記載の通りに評価した。３匹のマウスの11群に、総量100μlのＰＢＳ単独、50μgのＯｖａ単独、１μgのαGalCer単独、50μgのＯｖａにαGalCerを、1 μg、100 ng、10 ng、1000 pg、100 pg、10 pg、又は0.1 pg添加したものを用いて静脈から免役化した。１０日目にマウスにＣＦＳＥ標識標的細胞を静脈注入した。１１日目に各々のマウスの眼窩洞から血液サンプルを採取した。生存と細胞毒活性の平均割合を、上記の通りに決定した。図８は、αGalCerの特定投薬についてマウス各群の特異的溶解割合を示す。この結果は、静脈注入の場合、αGalCerは抗原と共に、用量依存特異的細胞毒効果を起こすことができることを示す。
【実施例６】
【００４１】
実施例６：Ｏｖａと共に濃度変化させたＰＢＳ５７を静脈から免役化した後の細胞毒性応答
Ｏｖａ−ペプチドロードＣＦＳＥ標識標的細胞の、異なる濃度のＰＢＳ５７で刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞応答により誘導されるインビボ細胞毒性を、実施例４の記載の通りに評価した。３匹のマウスの11群に、総量100μlのＰＢＳ単独、50μgのＯｖａ単独、50μgのＯｖａと共に、10 μgのＰＢＳ５７、1 μgのＰＢＳ５７、100 ngのＰＢＳ５７、10 ngのＰＢＳ５７、1 ngのＰＢＳ５７、100 pgのＰＢＳ５７、10 pgのＰＢＳ５７、1 pgのＰＢＳ５７、又は0.1pgのＰＢＳ５７で静脈から免役化した。１０日目にマウスに標的細胞を静脈注入した。１１日目に各々のマウスの眼窩洞から血液サンプルを採取した。生存と細胞毒活性の平均割合を、上記の通りに決定した。図９は、ＰＢＳ５７の各投薬で免役化したマウス各群の特異的溶解割合を示す。この結果は、静脈注入の場合、ＰＢＳ−５７はＯｖａとの組み合わせで、用量依存特異的細胞毒効果を起こすことができることを示す。
【実施例７】
【００４２】
実施例７：ＰＢＳ５７と共に濃度変化させたＯｖａを静脈から免役化した後の細胞毒性応答
一定濃度のＰＢＳ５７と異なる濃度のオバルブミンに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒応答により誘導されるインビボ細胞毒性を、実施例４の記載の通りに評価した。３匹のマウスの１０群に、総量100μlのＰＢＳ中50μgのＯｖａ単独、1 μgのＰＢＳ５７単独、1 μgのＰＢＳ５７単独と共に50 μgのＯｖａ、10 μgのＯｖａ、1 μgのＯｖａ、100 ngのＯｖａ、10 ngのＯｖａ、1 ngのＯｖａ、100 pgのＯｖａ、又は10 pgのＯｖａで、０日目に静脈から免役化した。１０日目にマウスに標的細胞を静脈注入した。１１日目にマウスを犠牲にし、眼窩洞から血液サンプルを採取し、脾臓細胞を単離した。生存と細胞毒活性の平均割合を、上記の通りに決定した。図１０は、Ｏｖａの各投薬で免役化したマウスの各群についての特異的溶解の割合を示す。この結果は、抗原及びＰＢＳ５７の両方でのワクチン接種に対する細胞毒性応答は、抗原濃度に依存することを示す。
【実施例８】
【００４３】
実施例８：Ｏｖａと共に様々な濃度のαGalCerを筋肉内投与することにより免役化した後の細胞毒性応答
一定濃度のオバルブミンと異なる濃度のαGalCerに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒応答により誘導されるインビボ細胞毒性を、実施例４の記載の通りに評価した。３匹のマウスの１４群に、総量100μlのＰＢＳ中400μgのＯｖａ単独、1μgのαGalCer単独、又は400μgのＯｖａと共に、1 μgのαGalCer、0.5 μgのαGalCer、0.1 μgのαGalCer、50 ngのαGalCer、10 ngのαGalCer、5 ngのαGalCer、1 ngのαGalCer、500 pgのαGalCer、100 pgのαGalCer、50 pgのαGalCer又は10 pgのαGalCerを、０日目に左後肢に筋肉内注入した。１０日目にマウスにＣＦＳＥ染色標的細胞を静脈注入し、１１日目にマウスを犠牲にし、眼窩洞から血液サンプルを採取した。ＳＩＩＮＦＥＫＬロード標的細胞の特異的溶解を、フローサイトメトリーでモニターした。生存及び細胞毒性の平均割合を実施例４に記載の通りに計算した。図１１は、αGalCerの各投薬で免役化したマウスの各群についての血液における特異的溶解の割合を示す。この結果は、１μg〜100pgにわたる広範なαGalCer濃度で非常に特異性の低い溶解が見られることから、αGalCerは、Ｏｖａ抗原を筋肉内注入した場合、特異的細胞毒性Ｔ細胞応答を起こすことができないことを示す。
【実施例９】
【００４４】
実施例９：Ｏｖａと共に様々な濃度のＰＢＳ５７を筋肉内投与することにより免役化した後の細胞毒性応答
ＰＢＳ５７の筋肉内注入に対するＣＤ８＋細胞の細胞毒応答を、実施例４の記載の通りに評価した。３匹のマウスの１４群に、総量100μlのＰＢＳ中ＰＢＳ単独、400μgのＯｖａ単独、１μgのＰＢＳ５７単独、又は400μgのＯｖａと共に1 μgのＰＢＳ５７、0.5 μgのＰＢＳ５７、0.1 μgのＰＢＳ５７、50 ngのＰＢＳ５７、10 ngのＰＢＳ５７、5 ngのＰＢＳ５７、1 ngのＰＢＳ５７、500 pgのＰＢＳ５７、100 pgのＰＢＳ５７、50 pgのＰＢＳ５７、又は10 pgのＰＢＳ５７を、０日目に左後肢に筋肉内注入した。１０日目にマウスにＣＦＳＥ染色標的細胞を静脈注入し、１１日目に、眼窩洞から血液サンプルを採取した。生存及び細胞毒性の平均割合を実施例４に記載の通りに計算した。図１２は、ＰＢＳ５７及びＯｖａで筋肉内免役化したマウスの投薬曲線の特異的溶解を示す。この結果は、筋肉注入した場合にしか細胞毒応答を誘発できないαGalCerとは異なり、ＰＢＳ−５７は、静脈及び筋肉のいずれからの注入の場合も、特異的細胞毒応答を誘発できることを示す。
【実施例１０】
【００４５】
実施例１０：ＯｖａとＰＢＳ５７又はαGalCerの、筋肉又は静脈からの免役化後の細胞毒応答比較
ＯｖａとＰＢＳ５７又はＯｖａとαGalCerの、静脈及び筋肉からの投与に対する細胞毒応答を、実施例４に記載の通りに評価した。８群のマウスに対し、０日目に以下の通りに注入した。
【００４６】
１）５０μlのＰＢＳ中400μlのＯｖａでＩＭ注入した３匹のマウス；
２）５０μlのＰＢＳ中400μlのＯｖａでＩＶにより注入した３匹のマウス；
３）５０μlのＰＢＳ中400μlのＯｖａと１μgのαGalCerでＩＭ注入した６匹のマウス；
４）５０μlのＰＢＳ中400μlのＯｖａと１μgのαGalCerでＩＶ注入した３匹のマウス；
５）５０μlのＰＢＳ中400μlのＯｖａと１μgのαGalCerでＩＭ注入した６匹のマウス；
６）５０μlのＰＢＳ中400μlのＯｖａと１μgのαGalCerでＩＶ注入した３匹のマウス；
７）５０μlのＰＢＳ中400μlのＯｖａと１μgのＰＢＳ５７でＩＭ注入した６匹のマウス;及び
８）５０μlのＰＢＳ中400μlのＯｖａと１μgのＰＢＳ５７でＩＶ注入した３匹のマウス。
【００４７】
１０日目にＣＳＦＥ標識標的細胞をマウスに注入した。１１日目にマウスを犠牲にし、血液サンプルを採取した。生存及び細胞毒活性の平均割合を、実施例４に記載の通りに決定した。図１３は、異なる投与経路を用いる特異的溶解の割合を比較する。この結果から、αGalCerは筋肉注入の場合に細胞毒応答を誘導しないが、ＰＢＳ５７は、投与経路に関係なく細胞毒応答を引き起こすことが確かめられる。
【実施例１１】
【００４８】
実施例１１：インビボでの破傷風トキソイドに対するＰＢＳ５７追加免疫抗体応答
破傷風トキソイド免役へのＰＢＳ５７の追加が、免役応答を向上させるかを決定するため、６匹マウスの１群に対し、０日目及び１５日目に、１０μgの破傷風トキソイド（ＴＴ）又は１０μgの破傷風トキソイドを１μgのＰＢＳ５７と組み合わせて、筋肉内から免役化した。ＩｇＧ力価を、０、１５及び３０日目に採取した血液サンプルを、標準的方法により決定した。抗体力価を、破傷風トキソイド特異的ＥＬＩＳＡにより決定した。図１４に見られるように、ＰＢＳ５７は、ＴＴの抗体応答を向上させた。
【実施例１２】
【００４９】
実施例１２：Ｏｖａを単独又はＰＢＳ５７との組み合わせで筋肉から免役化した後のＣＤ＋８Ｔ細胞応答の比較
抗原との組み合わせでＰＢＳ５７により誘発される、インビボ特異的Ｔ細胞応答（ＣＤ８＋）を試験するために、マウスモデルを使用した。Ｃ５７/Ｂ１/６Ｊ ＣＤ４５.２雌マウスを、総量100μlのＰＢＳ担体中、賦活剤有り、賦活剤無し、賦活剤単独、又は担体単独（コントロール）と、抗原（オバルブミン、Ｏｖａ、grade VII, Sigma, St. Louis, MO）を、０日目及び１４日目に、筋肉から免役化した。試験賦活剤は、50μgのＯｖａ存在下又は不存在下、１μgのＰＢＳ５７とした。各群には少なくとも３匹のマウスを入れた。２１日目に各マウスから血液を採取し、単離細胞を、Ｆｃ受容体ブロック後に、Ｈ２Ｋb−ＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー（pentamer）を用いてペンタマー染色に供した。解析において、ＣＤ８＋細胞のみを含むものは、ＦＡＣＳ解析を行った（ＣＤ１９＋細胞は、任意のＢ細胞を排除するため、この解析から排除した）。図１５は、Ｏｖａ単独と比較した場合の、ＰＢＳ５７及びＯｖａを用いる筋肉注入後のＯｖａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を示す典型的なフローサイトメトリーのデータである。この結果では、血液中のＨ２Ｋb−ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均＋/−標準偏差を報告した。
【実施例１３】
【００５０】
実施例１３：Ｏｖａを単独、又はＰＢＳ５７もしくはαGalCerとの組み合わせで皮下から免役化した後のＣＤ＋８Ｔ細胞応答の比較
抗原との組み合わせで、αGalCerのものと比較してＰＢＳ５７により誘発されるインビボ特異的Ｔ細胞応答（ＣＤ８＋）を試験するために、マウスモデルを使用した。Ｃ５７/Ｂ１/６Ｊ ＣＤ４５.２雌マウスを、総量100μlのＰＢＳ担体中、賦活剤有り、賦活剤無し、賦活剤単独、又は担体単独（コントロール）と、抗原（オバルブミン、Ｏｖａ、grade VII, Sigma, St. Louis, MO）を、０日目及び１４日目に、皮下から免役化した。試験賦活剤は、50μgのＯｖａ存在下又は不存在下、１μgのＰＢＳ５７又はαGalCerとした。各群には少なくとも３匹のマウスを入れた。２１日目に各マウスから血液を採取し、単離細胞を、Ｆｃ受容体ブロック後に、Ｈ２Ｋb−ＳＩＩＮＦＥＫＬペンタマー（pentamer）を用いてペンタマー染色に供した。解析において、ＣＤ８＋細胞のみを含むものは、ＦＡＣＳ解析を行った（ＣＤ１９＋細胞は、任意のＢ細胞を排除するため、この解析から排除した）。図１６は、Ｏｖａ単独又はαGalCerとＯｖａで免役化したものと比較した場合の、ＰＢＳ５７及びＯｖａを用いる筋肉注入後のＯｖａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加を示す典型的なフローサイトメトリーのデータである。この結果により、血液中のＨ２Ｋb−ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均＋/−標準偏差が報告された。
【００５１】
本発明の組成物及び方法を例示的な実施態様の節に記載したが、当業者であれば、当該組成物及び方法、及び本明細書に記載された方法のステップ又はステップ順序に、本発明の概念、精神及び範囲を逸脱することなく変更を適用することを理解するはずである。より具体的には、化学的及び生理学的のいずれにおいても関連する特定の剤を、本明細書に記載の剤と置換してもよいが、同じ又は類似する結果に到達することが理解されるはずである。当業者に明らかなかかる類似する全ての置換及び変更は、本発明の精神、範囲及び概念に含まれると考えられる。さらに、本明細書に列挙又は記載される全ての特許及び文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５２】
本明細書及び添付の請求の範囲で使用される、単数形「a」、「an」及び「the」は、その文脈に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。すなわち、例えば「ポリヌクレオチド（a polynucleotide）」を含有する組成物は、２以上のポリヌクレオチドの混合物を含むことを言う。また、「又は」なる用語は、その文脈に明確な指示がない限り、「及び／又は」を含む意味で一般的に使用される。本明細書で参照される全ての文献、特許及び特許出願は、本発明が属する技術における通常の知識レベルを示す。全ての文献、特許及び特許出願は、参照により各々の個別の文献又は特許出願が具体的及び個別に指示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。本開示と、組み込まれた特許、文献及び参考文献との間に不一致がある場合、本開示が支配すべきである。
【００５３】
本明細書で規定される任意の数値には、より低い値からより高い値の全ての値が含まれ、すなわち、列挙される最低値及び最高値の間の全ての可能な数値の組み合わせが、本出願において明示的に言及されているとみなされることも、特に理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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