(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単鎖ポリペプチド融合タンパク質であって:
(a)クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼであって、標的細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼ;
(b)該標的細胞上の結合部位に結合し得るターゲティング部分であって、該結合部位が、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ得る、ターゲティング部分;
(c)プロテアーゼ切断部位であって、該部位でプロテアーゼにより該融合タンパク質が切断され得、該プロテアーゼ切断部位が、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼと該ターゲティング部分との間に位置している、プロテアーゼ切断部位;および
(d)トランスロケーションドメインであって、該トランスロケーションドメインが、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼをトランスロケートさせ得、
該トランスロケーションドメインが、クロストリジウム神経毒素のHNトランスロケーションドメインである、トランスロケーションドメインを含み、
該ターゲティング部分が、該プロテアーゼ切断部位と該トランスロケーションドメインとの間に位置しており、かつ、
該単鎖ポリペプチド融合タンパク質は、N末端からC末端へ[クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼ]―[プロテアーゼ切断部位]―[ターゲティング部分]―[トランスロケーションドメイン]の順に配置されている、
融合タンパク質。
【請求項２】
前記ターゲティング部分および前記プロテアーゼ切断部位が、多くとも10アミノ酸残基離れている、請求項1に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ターゲティング部分および前記プロテアーゼ切断部位が、多くとも5アミノ酸残基離れている、請求項1または2に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ターゲティング部分および前記プロテアーゼ切断部位が、多くとも0アミノ酸残基離れている、請求項1から3のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ターゲティング部分が、標的細胞上の結合部位に結合し得るN末端側ドメインまたは内部ドメイン配列を有する、請求項1から4のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ターゲティング部分が、多くとも50アミノ酸残基を含む、請求項1から5のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ターゲティング部分が、多くとも40アミノ酸残基を含む、請求項1から6のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ターゲティング部分が、多くとも30アミノ酸残基を含む、請求項1から7のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ターゲティング部分が、多くとも20アミノ酸残基を含む、請求項1から8のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ターゲティング部分が、プロテイナーゼ活性化レセプターリガンドを含む、請求項1から9のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記プロテイナーゼ活性化レセプターリガンドが、リガンドPAR1である、請求項10に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ターゲティング部分が、PTH-1に結合するリガンドを含む、請求項1から9のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記リガンドがPTHペプチドを含む、請求項12に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ターゲティング部分が、直鎖状または環状のインテグリン結合配列を含む、請求項1から9のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記インテグリン結合配列が、Arg-Gly-Asp(RGD)の三アミノ酸結合配列を含む、請求項14に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ターゲティング部分が、粘液分泌細胞または粘液分泌を制御または指揮する神経細胞;内分泌細胞;炎症細胞;外分泌細胞;免疫細胞;心血管細胞;および骨細胞からなる群から選択される細胞に結合する、請求項1から15のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ターゲティング部分が、以下からなる群から選択されるリガンドを含む、請求項1から16のいずれかに記載の融合タンパク質:
TFLLR;PAR1;PTH;VIPまたは[R15,20,21,L17]-VIP、[R15,20,21,L17]-VIP-GRR、[A2,8,9,16,19,24]-VIPおよび[A2,8,9,16,19,24,25]-VIPからなる群から選択されるVIPアナログ;β2アデレノレセプターアゴニスト;ガストリン放出ペプチド(GRP);カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP);甲状腺刺激ホルモン(TSH);インスリン;インスリン様成長因子;TSH放出ホルモン(プロチレリン);FSH/LH放出ホルモン(ゴナドレリン);コルチコトロピン放出ホルモン(CRH);副腎皮質刺激ホルモン(ACTH);下垂体アデニルシクラーゼ活性化ペプチド;Fc IgEのC4ドメインに対するリガンド;C3a/C4a-R補体レセプターに対するリガンド;CR4補体レセプターに対して反応性である抗原;マクロファージ刺激因子;iC3b補体レセプターと会合する抗原;IL8;エプスタインバールウイルスフラグメント/表面特徴;トロンビン;トロンビンレセプターアゴニストペプチド(TRAP);GP1b表面抗原認識抗体;カルシトニン;破骨細胞分化因子TRANCE、RANKLまたはOPGL;THALWHT、LEBP-1(QPFMQCLCLIYDASC)、LEBP-2(RNVPPIFNDVYWIAF)、LEBP-3(VFRVRPWYQSTSQS)、CDSAFVTVDWGRSMSLC、SERSMNF、YGLPHKF、PSGAARA、LPHKSMP、LQHKSMP、FSLSKPP、HSMQLSTおよびSTQAMFQからなる群から選択される直鎖状または環状のペプチド;およびANP。
【請求項１８】
前記融合タンパク質が精製タグを含む、請求項1から17のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記融合タンパク質が精製タグを含み、該精製タグが該融合タンパク質のN末端および/またはC末端に存在する、請求項18に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記精製タグが、ペプチドスペーサー分子によって前記融合タンパク質に結合されている、請求項18または19に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記トランスロケーションドメインが、ペプチドスペーサー分子によって前記ターゲティング部分から離されている、請求項1から20のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
配列番号10、12、15、18、21、24、27、30、および33のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項1から22のいずれかに記載のポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸配列を含むDNA。
【請求項２４】
前記核酸配列が、配列番号1から9、11、14、17、20、23、26、29および32のいずれか1つに示される塩基配列を含む、請求項23に記載のDNA。
【請求項２５】
プロモーター、請求項23または請求項24に記載のDNA、およびターミネーターを含むDNAベクターであって、該DNAが、該プロモーターの下流に位置し、そして該ターミネーターが、該DNA構築物の下流に位置している、ベクター。
【請求項２６】
請求項23または請求項24に記載のDNAの相補DNA鎖。
【請求項２７】
請求項1から22のいずれかに記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質を調製するための方法であって、請求項23または請求項24に記載のDNA、または請求項25に記載のDNAベクターを宿主細胞で発現させる工程を含む、方法。
【請求項２８】
非細胞傷害性薬剤を調製する方法であって、該方法が、
(a)請求項1から22のいずれかに記載の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、前記プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼとを接触させる工程;
(b)該プロテアーゼ切断部位を切断し、そしてそれにより二本鎖融合タンパク質を形成する工程を含む、方法。
【請求項２９】
請求項28に記載の方法により得られ得る非細胞傷害性ポリペプチドであって、該ポリペプチドが二本鎖ポリペプチドであり、そして
(a)第一鎖が前記クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼを含み、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼが標的細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得;
(b)第二鎖が前記ターゲティング部分および前記トランスロケーションドメインを含み、該トランスロケーションドメインが、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該クロストリジウム神経毒素L鎖プロテアーゼをトランスロケートさせ得;そして
該第一鎖および第二鎖がジスルフィド結合で一緒に連結されている、非細胞傷害性ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非細胞傷害性融合タンパク質およびその治療的適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、毒素は、標的細胞に対して有する効果のタイプに従って２つの群に分けられ得る。より詳細には、第一の毒素群は、それらの天然の標的細胞を殺傷し、このため、細胞傷害性毒素分子として知られる。この毒素群は、とりわけ、植物毒素（例えば、リシンおよびアブリン）および細菌毒素（例えば、ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素Ａ）によって例示される。細胞傷害性毒素は、細胞性障害および状態（例えば、癌）の治療のために「魔法の弾丸」（例えば、免疫結合体；これは、細胞傷害性毒素構成部分と標的細胞上の特異的マーカーに結合する抗体とを含む）の設計に多くの関心をひきつけている。細胞傷害性毒素は、代表的には、タンパク質合成の細胞プロセスを阻害することにより、それらの標的細胞を殺傷する。
【０００３】
第二の毒素群は、非細胞傷害性毒素として知られ、（これらの名称が証明するとおり）それらの天然の標的細胞を殺傷しない。非細胞傷害性毒素は、それらの細胞傷害性のものほどには商業上の関心をひきつけず、そしてタンパク質合成以外の細胞プロセスを阻害することにより、標的細胞に対してそれらの効果を発揮する。非細胞傷害性毒素は、種々の植物および種々の微生物（例えば、Clostridium sp.およびNeisseria sp.）から生成される。
【０００４】
クロストリジウム神経毒素は、代表的には150kDaの程度の分子量を有するタンパク質である。それらは、種々の細菌種、特に、クロストリジウム属の細菌、最も重要にはC. tetaniおよびC. botulinumの数株、C. butyricum、およびC. argentinenseによって生成される。現在、クロストリジウム神経毒素の８つの異なるクラスが存在し（すなわち、破傷風菌毒素およびボツリヌス菌神経毒素（その血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ））、そしてそれらは全て、類似の構造および作用様式を共有する。
【０００５】
クロストリジウム神経毒素は、非細胞傷害性毒素分子の主要な群を代表し、そして単一ポリペプチドとして宿主細菌によって合成され、この単一ポリペプチドは、タンパク質分解切断事象によって翻訳後修飾されて、ジスルフィド結合によって互いに結合された２つのポリペプチド鎖を形成する。これらの２つの鎖は、重鎖（Ｈ鎖）（これは、約100kDaの分子量を有する）および軽鎖（Ｌ鎖）（これは、約50kDaの分子量を有する）と称される。
【０００６】
Ｌ鎖は、プロテアーゼ機能（亜鉛依存性エンドペプチダーゼ活性）を有し、そしてエキソサイトーシスプロセスに関与する小胞および／または原形質膜会合タンパク質に対する高い基質特異性を示す。異なるクロストリジウム種または血清型に由来するＬ鎖は、３つの基質タンパク質（すなわち、シナプトブレビン、シンタキシン、またはＳＮＡＰ−２５）の１つにおいて、異なるが特定のペプチド結合を加水分解し得る。これらの基質は、神経分泌機構の重要な構成部分である。
【０００７】
Neisseria sp.（N. gonorrhoeaeの種の中から最も重要である）は、機能的に類似する非細胞傷害性プロテアーゼを生産する。このようなプロテアーゼの一例は、ＩｇＡプロテアーゼである（ＷＯ９９／５８５７１を参照のこと）。
【０００８】
毒素分子が、その毒素の天然の標的細胞ではない細胞にリターゲティングされ得ることが当該分野において十分に書き記されている。そのようにリターゲティングされたとき、改変毒素は、所望の標的細胞に結合し得、そしてそれに続くサイトゾルへのトランスロケーション後、標的細胞にその効果を発揮し得る。該リターゲティングは、毒素の天然のターゲティング部分（ＴＭ）を異なるＴＭと置き換えることによって達成される。これに関して、ＴＭは、それが所望の標的細胞に結合し、そして標的細胞内のエンドソームへの改変毒素の引き続く通過を可能にするように選択される。改変毒素はまた、非細胞傷害性プロテアーゼの細胞サイトゾルへの侵入を可能にするトランスロケーションドメインを含む。このトランスロケーションドメインは、毒素の天然のトランスロケーションドメインであり得るか、またはトランスロケーション活性を有する微生物タンパク質から得られる別のトランスロケーションドメインであり得る。
【０００９】
例えば、ＷＯ９４／２１３００は、改変クロストリジウム神経毒素分子を記載しており、この分子は、標的細胞の細胞表面に存在する膜貫通タンパク質（ＩＭＰ）密度を調節し得る。したがって、この改変神経毒素分子は、標的細胞の細胞活性（例えば、グルコース取り込み）を制御し得る。ＷＯ９６／３３２７３およびＷＯ９９／１７８０６は、末梢感覚求心性神経をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子を記載している。したがって、この改変神経毒素分子は、鎮痛効果を示し得る。ＷＯ００／１０５９８は、粘液過分泌細胞（または該粘液過分泌細胞を制御する神経細胞）をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子の調製を記載している。この改変神経毒素は、該細胞からの過分泌を阻害し得る。ＷＯ０１／２１２１３は、広範な異なるタイプの非神経細胞標的細胞をターゲティングする改変クロストリジウム神経毒素分子を記載している。したがって、この改変分子は、標的細胞からの分泌を妨害し得る。リターゲティングされる毒素分子の技術分野におけるさらなる刊行物としては、以下が挙げられる：ＷＯ００／６２８１４；ＷＯ００／０４９２６；ＵＳ５，７７３，５８６；ＷＯ９３／１５７６６；ＷＯ００／６１１９２；およびＷＯ９９／５８５７１。
【００１０】
上記ＴＭ置換は、当業者に周知の従来の化学的結合体化技術によって行われ得る。これに関して、Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, およびWong, S. S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Pressに言及されている。
【００１１】
しかし、化学的結合体化は、しばしば不正確である。例えば、結合体化によって、ＴＭは、１つより多くの付着部位でその結合体の残りの部分に結合され得る。
【００１２】
また、化学的結合体化は制御するのが困難である。例えば、ＴＭは、プロテアーゼ構成部分および／またはトランスロケーション構成部分上の付着部位で改変毒素の残りの部分に結合され得る。これは、該構成部分の一方のみへの（好ましくは単一の部位での）付着が治療効力のために望まれる場合、問題となる。
【００１３】
したがって、化学的結合体化は、改変毒素分子の混合集団を生じ、これは望ましくない。
【００１４】
化学的結合体化の代替として、単一ポリペプチド融合タンパク質の組換え調製によってＴＭ置換が行われ得る（ＷＯ９８／０７８６４を参照のこと）。この技術は、天然型クロストリジウム神経毒素（すなわち、ホロ毒素）が調製されるインビボの細菌機構に基づいており、そして以下の構造配置を有する融合タンパク質を生じる：
ＮＨ２−［プロテアーゼ構成部分］−［トランスロケーション構成部分］−［ＴＭ］−ＣＯＯＨ
【００１５】
ＷＯ９８／０７８６４によれば、ＴＭは、融合タンパク質のＣ末端の方に配置される。次いで、この融合タンパク質がプロテアーゼでの処理によって活性化される。このプロテアーゼは、プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分との間の部位で切断する。したがって、二本鎖のタンパク質が生成される。この二本鎖タンパク質は、ＴＭを加えたトランスロケーション構成部分を含む別のポリペプチド単鎖に（ジスルフィド架橋を介して）共有結合されたポリペプチド単鎖としてプロテアーゼ構成部分を含む。ＷＯ９８／０７８６４の方法は、（融合タンパク質の構造配置の点で）クロストリジウムホロ毒素の天然発現系に従うが、本発明者らは、この系が、意図した標的細胞に対する結合能が実質的に減少されたある種の融合タンパク質の生成を生じ得ることを見出した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、非細胞傷害性融合タンパク質の構築系を別に見出すか、または改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、以下を含む単鎖ポリペプチド融合タンパク質を提供することによって、上記の問題点の１つ以上を解消している。単鎖ポリペプチド融合タンパク質は、
ａ．非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントであって、標的細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る、プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメント；
ｂ．該標的細胞上の結合部位に結合し得るターゲティング部分であって、該結合部位が、エンドサイトーシスを受けて該標的細胞内のエンドソームに取り込まれ得る、ターゲティング部分；
ｃ．プロテアーゼ切断部位であって、該部位でプロテアーゼにより該融合タンパク質が切断され得、該プロテアーゼ切断部位が、該非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントと該ターゲティング部分との間に位置している、プロテアーゼ切断部位；および
トランスロケーションドメインであって、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせ得る、トランスロケーションドメイン
を含む。
【００１８】
ＷＯ９８／０７８６４の系は、標的細胞上の結合部位との相互作用のためにＣ末端ドメインを必要とするＴＭを有する結合体の調製のために十分に作用している。これに関して、ＷＯ９８／０７８６４は、標的細胞上の結合部位と相互作用するのに「フリー」であるＣ末端ドメインを有する融合タンパク質を提供している。本発明者らは、この構造配置が全てのＴＭに適しているわけではないことを見出した。より詳細には、本発明者らは、ＷＯ９８／０７８６４の融合タンパク質系は、標的細胞上の結合部位と相互作用するためにＮ末端側ドメインを必要とするＴＭには最適ではないことを見出した。特に、この問題点は、標的細胞上の結合部位と相互作用するために、特定のＮ末端アミノ酸残基またはこの特定のＮ末端アミノ酸残基を含むアミノ酸残基からなる特定配列を必要とするＴＭにとって重大である。
【００１９】
ＷＯ９８／０７８６４とは対照的に、本発明は、結合体のＴＭ構成部分が、標的細胞上の結合部位に結合し得るＮ末端側ドメイン（または内部ドメイン配列）を有する、非細胞傷害性結合体を調製するためのシステムを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントであり、このプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントは、エキソサイトーシス融合器官の３つの基質タンパク質、すなわち、シナプトブレビン、シンタキシン、またはＳＮＡＰ−２５の１つにおいて、異なるが特定のペプチド結合を切断し得る。これらの基質は、神経分泌機構の重要な構成部分である。本発明の非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、好ましくは、ナイセリアＩｇＡプロテアーゼもしくはそのフラグメントまたはクロストリジウム神経毒素Ｌ鎖もしくはそのフラグメントである。特に好ましい非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、ボツリヌス神経毒素（ＢｏＮＴ）Ｌ鎖またはそのフラグメントである。
【００２１】
本発明のトランスロケーション構成部分は、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように、標的細胞への非細胞傷害性プロテアーゼ（またはそのフラグメント）のトランスロケーションを可能にする。トランスロケーション構成部分は、好ましくは、低ｐＨ条件下で脂質膜中にイオン透過孔を形成し得る。好ましくは、エンドソーム膜内の孔形成が可能なタンパク質分子の部分のみを使用することが見出されている。トランスロケーション構成部分は、微生物タンパク質供給源（特に、細菌またはウイルスタンパク質供給源）から得られ得る。したがって、１つの実施態様では、トランスロケーション構成部分は、細菌毒素またはウイルスタンパク質のような酵素のトランスロケーションドメインである。本発明のトランスロケーション構成部分は、好ましくは、クロストリジウム神経毒素Ｈ鎖またはそのフラグメントである。最も好ましくは、それは、ＨＮドメイン（またはその機能的構成部分）である。ＨＮは、Ｈ鎖のアミノ末端側半分にほぼ等価なクロストリジウム神経毒素のＨ鎖の一部またはフラグメント、または完全なＨ鎖中のそのフラグメントに対応するドメインを意味する。
【００２２】
本発明のＴＭ構成部分は、本発明の結合体の標的細胞上の結合部位への結合を担う。したがって、ＴＭ構成部分は、単に、選択された標的細胞に対して本発明の結合体が結合するリガンドである。
【００２３】
本発明においては、標的細胞は、任意の標的細胞であり得る。但し、標的細胞は、一次感覚求心性神経のような侵害受容感覚求心性神経ではない。したがって、ＴＭは、非神経細胞および／または神経細胞に結合し得る。
【００２４】
ＴＭが所与の標的細胞に結合することを確認することは通常の技術によってなされる。例えば、標的細胞の代表となる組織または細胞が、過剰な非標識リガンドの存在下で標識（例えば、トリチウム化）リガンドに曝露される簡単な放射能置換実験が、用いられ得る。このような実験において、非特異的結合および特異的結合の相対的割合を求め、それにより、リガンドが標的細胞に結合することの確認が可能になり得る。必要に応じて、アッセイは、１つ以上の結合アンタゴニストを含み得、そしてこのアッセイは、リガンド結合の喪失を観察する工程をさらに含み得る。このタイプの実験の例は、Hulme, E.C. (1990), Receptor-binding studies, 概要, 303〜311頁, Receptor biochemistry, A Practical Approach, E.C. Hulme編, Oxford University Pressに見出され得る。
【００２５】
本発明の融合タンパク質は、概して、対応する「フリー」なＴＭと比較した場合、標的細胞に対して（１００倍までの範囲で）低下した結合親和性を示している。しかし、この観察にも関わらず、本発明の融合タンパク質は、驚くべきことに、良好な効力を示している。これは、２つの主要な特徴に帰するものであり得る。第一に、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、触媒性である。したがって、少数のこのような分子の治療効果が迅速に増幅される。第二に、標的細胞上に存在するレセプターは、治療剤の侵入のための出入口としてのみ作用する必要があり、必ずしもリガンド−レセプター媒介薬理学的応答を達成するために必要とされるレベルまで刺激される必要はない。したがって、本発明の融合タンパク質は、他のタイプの治療分子について用いられるよりも低い投薬量で投与され得る。他のタイプの治療分子は、代表的には、高マイクログラムからミリグラム（数百ミリグラムまででさえある）量で投与される。これに対して、本発明の融合タンパク質は、ずっとより低い投薬量（代表的には少なくとも１０倍低く、そしてより代表的には１００倍低い）で投与され得る。
【００２６】
ＴＭは、好ましくは最大で５０アミノ酸残基、より好ましくは最大で４０アミノ酸残基、特に好ましくは最大で３０アミノ酸残基、そして最も好ましくは最大で２０アミノ酸残基を含む。
【００２７】
プロテイナーゼ活性化レセプターリガンドは、本発明のＴＭの好ましい群を代表する（特にＰＡＲ１）。ＰＡＲは、７回膜貫通レセプターＧタンパク質結合レセプターの独自のサブタイプを表す。それらはタンパク質分解により改変されて新たな細胞外Ｎ末端を露出し、このＮ末端が、固定された活性化リガンドとして作用する。それらの同族レセプターを活性化するＰＡＲ１アゴニスト（例えば、ＴＦＬＬＲ）が、同定されている。
【００２８】
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）もまた、本発明の好ましいＴＭを代表する。ＰＴＨは、副甲状腺によって放出され、そしてＰＴＨ−１レセプターに結合する。このレセプターは、広範な分布を有するが、特にＰＴＨ標的組織、主として腎臓および骨で豊富である。
【００２９】
したがって、本発明の最も好ましいＴＭは、以下である：
【００３０】
【数１】
0005438901.tif 000002
【００３１】
本発明の１つの実施態様によれば、ＴＭは、粘液分泌細胞、または粘液分泌を制御または指揮する神経細胞に結合する。より具体的には、ＴＭは、（ａ）ムチンを分泌する細胞（例えば、上皮杯状細胞および粘膜下腺粘液分泌細胞）、（ｂ）粘液の水性成分を分泌する細胞（例えば、クララ細胞および漿液細胞）、または（ｃ）粘液分泌を制御または指揮する細胞（例えば、「感覚遠心性」Ｃ線維、またはＮＡＮＣ神経系線維）に結合する。これに関して、特に、以下のＴＭについて述べられる：ＶＩＰ；β２アデレノレセプターアゴニスト；ガストリン放出ペプチド；およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド。したがって、この実施態様によれば、該結合体は、粘液過分泌、喘息、および／または慢性閉塞性肺疾患の治療において、治療的適用を有する。
【００３２】
別の実施態様では、ＴＭは、内分泌細胞に結合する。ここでは、特に、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；インスリン；インスリン様成長因子；ＴＳＨ放出ホルモン（プロチレリン）；ＦＳＨ／ＬＨ放出ホルモン（ゴナドレリン）；コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）；およびＡＣＴＨについて述べられる。したがって、この実施態様によれば、該結合体は、内分泌新形成（ＭＥＮを含む）；甲状腺中毒症、および甲状腺からの過分泌に依存する他の疾患；末端巨大症、高プロラクチン血症、クッシング病、および下垂体前葉過分泌に依存する他の疾患；アンドロゲン過多症、慢性無排卵症、および多嚢胞卵巣症候群に伴う他の疾患の治療において、治療的適用を有する。
【００３３】
別の実施態様では、ＴＭは、炎症細胞に結合する。ここでは、特に、（ｉ）肥満細胞のリガンド（例えば、Ｆｃ  ＩｇＥのＣ４ドメイン）；（ii）好酸球のリガンド（例えば、Ｃ３ａ／Ｃ４ａ−Ｒ補体レセプターに対するリガンド、ＣＲ４補体レセプターに対して反応性である抗原）；（iii）マクロファージおよび単球のリガンド（例えば、マクロファージ刺激因子）、（iv）好中球のリガンド（例えば、ｉＣ３ｂ補体レセプターまたはＩＬ８と会合する抗原）について述べられる。したがって、この実施態様によれば、該結合体は、アレルギー（季節性アレルギー鼻炎（花粉症）、アレルギー結膜炎、血管運動性鼻炎、および食物アレルギー）、好酸球増加症、喘息、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、盤状紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、痔核、そう痒症、糸球体腎炎、肝炎、膵炎、胃炎、血管炎、心筋炎、乾癬、湿疹、慢性放射線誘発線維症、肺瘢痕形成および他の線維性障害の治療について、治療的適用を有する。
【００３４】
別の実施態様では、ＴＭは、外分泌細胞に結合する。ここでは、特に、下垂体アデニルシクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ−３８）について述べられる。したがって、この実施態様によれば、該結合体は、消化管に位置する（特に大腸に位置する）粘液分泌細胞からの粘液過分泌の治療について、治療的適用を有する。
【００３５】
さらなる実施態様では、ＴＭは、免疫細胞に結合する。ここでは、以下のリガンド：エプスタインバールウイルスフラグメント／表面特徴について述べられる。したがって、この実施態様によれば、該結合体は、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、盤状紅斑性狼瘡、臓器移植、組織移植、体液移植、グレーヴス病、甲状腺中毒症、自己免疫糖尿病、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、好中球減少症、慢性自己免疫肝炎、自己免疫胃炎、悪性貧血、橋本甲状腺炎、アディソン病、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、多発性筋炎、強皮症、全身性硬化症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋炎、リウマチ性心臓炎、糸球体腎炎（グッドパスチャー型）、ブドウ膜炎、睾丸炎、潰瘍性大腸炎、血管炎、萎縮性胃炎、悪性貧血、１型糖尿病の治療について、治療的適用を有する。
【００３６】
さらなる実施態様では、ＴＭは、心血管細胞に結合する。ここでは、トロンビンおよびＴＲＡＰ（トロンビンレセプターアゴニストペプチド）、および心血管内皮細胞に結合するリガンド（例えば、ＧＰ１ｂ表面抗原認識抗体）について述べられる。したがって、この実施態様によれば、該結合体は、心血管状態および／または高血圧の治療について、治療的適用を有する。
【００３７】
さらなる実施態様では、ＴＭは、骨細胞に結合する。ここでは、骨化石症および骨粗鬆症から選択される疾患の治療のために骨芽細胞に結合するリガンド（カルシトニンを含む）、および破骨細胞に結合するリガンド（破骨細胞分化因子（例えば、ＴＲＡＮＣＥ、またはＲＡＮＫＬまたはＯＰＧＬ）を含む）について述べられる。したがって、この実施態様によれば、該結合体は、骨状態の治療について、治療的適用を有する。
【００３８】
直鎖状および環状のインテグリン結合配列は、本発明のＴＭの好ましい群である。多くのインテグリンは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）の三アミノ酸ペプチド配列を認識する（Ruoslahti, 1996）。ＲＧＤモチーフは、１００以上のタンパク質（フィブロネクチン、テネイシン、フィブリノーゲン、およびビトロネクチンを含む）で見出されている。ＲＧＤ−インテグリン相互作用は、コクサッキーウイルス（Roivaninenら, 1991）およびアデノウイルス（Mathiasら, 1994）を含む多くの病原体による細胞侵入の保存機構として利用されている。この直鎖状および環状のペプチド配列（それぞれ、ＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬおよびＣＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＣ）は、α９β１インテグリンを発現している細胞においてＤＮＡを結合して内在化させることが示されている（Schneiderら, 1999）。
【００３９】
本発明の他のＴＭには、ファージディスプレイ技術によって発見されたもの、特に、ヒト気道上皮細胞をターゲティングしてこれに内在化されるもの、が含まれる。これらには、直鎖状および環状のＴＨＡＬＷＨＴ（Jostら, 2001）；ＬＥＢＰ−１（ＱＰＦＭＱＣＬＣＬＩＹＤＡＳＣ）、ＬＥＢＰ−２（ＲＮＶＰＰＩＦＮＤＶＹＷＩＡＦ）およびＬＥＢＰ−３（ＶＦＲＶＲＰＷＹＱＳＴＳＱＳ）（Wuら, 2003）；ＣＤＳＡＦＶＴＶＤＷＧＲＳＭＳＬＣ（Floreaら, 2003）；ＳＥＲＳＭＮＦ、ＹＧＬＰＨＫＦ、ＰＳＧＡＡＲＡ、ＬＰＨＫＳＭＰ、ＬＱＨＫＳＭＰ（Writerら, 2004）；ＦＳＬＳＫＰＰ、ＨＳＭＱＬＳＴおよびＳＴＱＡＭＦＱペプチド（Rahimら, 2003）が含まれる。
【００４０】
本発明のプロテアーゼ切断部位は、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分とＴＭ構成部分との間の位置での融合タンパク質の切断（好ましくは制御された切断）を可能にする。この切断反応は、融合タンパク質を単鎖ポリペプチドからジスルフィド結合で連結された二本鎖ポリペプチドに変換するものである。
【００４１】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＴＭは、ＴＭのＣ末端から離れて位置しているドメインまたはアミノ酸配列を介して結合する。例えば、関連結合ドメインとしては、ＴＭの内部ドメインまたは中間部の方に位置している（すなわち、直鎖状ペプチド配列の）アミノ酸配列が挙げられ得る。好ましくは、関連結合ドメインは、ＴＭのＮ末端の方に、より好ましくは、Ｎ末端にまたはその付近に、位置している。
【００４２】
１つの実施態様では、単鎖ポリペプチド融合物は、１つより多くのタンパク質分解切断部位を含み得る。しかし、２つ以上のこのような部位が存在する場合、それらは、別のものであり、それにより、単一のプロテアーゼの存在下で複数の切断事象が生じることが実質的に防止される。別の実施態様では、単鎖ポリペプチド融合物は、単一のプロテアーゼ切断部位を有することが好ましい。
【００４３】
プロテアーゼ切断配列は、従来の手段（例えば、部位特異的変異誘発）によってＤＮＡレベルで導入（および／または任意の固有切断配列が除去）され得る。切断配列の存在を確認するためのスクリーニングは、手動またはコンピューターソフトウェア（例えば、DNASTAR, Inc.によるMapDrawプログラム）の補助のもとに実施され得る。
【００４４】
任意のプロテアーゼ切断部位が用いられ得るが、以下が好ましい：
エンテロキナーゼ（ＤＤＤＤＫ↓）
第Ｘａ因子（ＩＥＧＲ↓／ＩＤＧＲ↓）
ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）（ＥＮＬＹＦＱ↓Ｇ）
トロンビン（ＬＶＰＲ↓ＧＳ）
PreScission（ＬＥＶＬＦＱ↓ＧＰ）。
【００４５】
用語「プロテアーゼ切断部位」には、インテイン（これは自己切断性配列である）も包含される。自己スプライシング反応は、例えば、存在する還元剤の濃度を変更することによって、制御可能である。
【００４６】
使用に際して、プロテアーゼ切断部位は切断されて、ＴＭのＮ末端側領域（好ましくはＮ末端）が露出されるようになる。生じたポリペプチドは、結合体の残りの部分から実質的にフリーであるＮ末端側ドメインまたは内部ドメインを伴うＴＭを有する。この配置によって、ＴＭのＮ末端側構成部分（または内部ドメイン）が、標的細胞上の結合部位と直接的に相互作用し得ることが確実となる。
【００４７】
好ましい実施態様では、ＴＭとプロテアーゼ切断部位とは、融合タンパク質中で、多くとも１０アミノ酸残基、より好ましくは多くとも５アミノ酸残基、そして最も好ましくは０アミノ酸残基離れて位置している。したがって、プロテアーゼ切断部位の切断によって、結合体は、結合体の残りの部分から実質的にフリーであるＮ末端側ドメインを有するＴＭを提供する。この配置によって、ターゲティング部分のＮ末端側構成部分が、標的細胞上の結合部位と直接的に相互作用し得ることが確実となる。
【００４８】
上記活性化工程に伴う１つの利点は、一旦融合タンパク質のタンパク質分解による切断が生じた場合にＴＭのみがＮ末端分解を受けるようになることである。さらに、特定プロテアーゼ切断部位の選択によって、二本鎖構造となるようにポリペプチド融合物の選択的活性化を可能にする。
【００４９】
本発明の単鎖ポリペプチド融合物の構築は、ＴＭと非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分との間にプロテアーゼ切断部位を配置する。
【００５０】
単鎖融合物において、ＴＭが、プロテアーゼ切断部位とトランスロケーション構成部分との間に位置していることが好ましい。これにより、ＴＭが、トランスロケーションドメインに付着されることが確実となる（すなわち、天然型クロストリジウムホロ毒素で生じるように）が、本発明の場合、これらの２つの構成部分の順序が天然型ホロ毒素に対して逆である。この配置に伴うさらなる利点は、ＴＭが、融合タンパク質の露出されたループ領域内に位置していることである。これは、融合タンパク質の構造に対して構成による影響を最小限とする。これに関して、該ループは、リンカー、活性化ループ、ドメイン間リンカー、または単に表面露出ループと種々に呼ばれる（Schiavoら, 2000, Phys. Rev., 80, 717-766；Turtonら, 2002, Trends Biochem. Sci., 27, 552-558）。
【００５１】
１つの実施態様では、単鎖ポリペプチドにおいて、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分とが、ジスルフィド結合によって一緒に連結されている。したがって、プロテアーゼ切断部位の切断によって、ポリペプチドは、二本鎖構造をとる。ここでは、プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分とが、ジスルフィド結合によって一緒に連結されたままである。この目的のために、プロテアーゼ構成部分とトランスロケーション構成部分とは、単鎖融合タンパク質において、最大で１００アミノ酸残基、より好ましくは最大で８０アミノ酸残基、特に好ましくは最大で６０アミノ酸残基、そして最も好ましくは最大で５０アミノ酸残基、互いに離れて位置していることが好ましい。
【００５２】
１つの実施態様では、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、融合タンパク質のトランスロケーション構成部分とジスルフィド結合を形成する。例えば、ジスルフィド結合を形成するプロテアーゼ構成部分のアミノ酸残基は、プロテアーゼ構成部分の最後の２０アミノ酸、好ましくは最後の１０アミノ酸のＣ末端側アミノ酸残基内に位置している。同様に、ジスルフィド結合の第二部分を形成するトランスロケーション構成部分内のアミノ酸残基は、トランスロケーション構成部分の最初の２０アミノ酸、好ましくは最初の１０アミノ酸のＮ末端側アミノ酸残基内に位置し得る。
【００５３】
あるいは、単鎖ポリペプチドにおいて、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分とＴＭとが、ジスルフィド結合によって一緒に連結され得る。これに関して、ジスルフィド結合を形成するＴＭのアミノ酸残基は、好ましくは、ＴＭのＮ末端から離れて、より好ましくは、ＴＭのＣ末端の方に、位置している。
【００５４】
１つの実施態様では、非細胞傷害性プロテアーゼ構成部分は、融合タンパク質のＴＭ構成部分とジスルフィド結合を形成する。これに関して、ジスルフィド結合を形成するプロテアーゼ構成部分のアミノ酸残基は、好ましくは、プロテアーゼ構成部分の最後の２０アミノ酸、より好ましくは最後の１０アミノ酸のＣ末端側アミノ酸残基内に位置している。同様に、ジスルフィド結合の第二部分を形成するＴＭ構成部分内のアミノ酸残基は、好ましくは、ＴＭの最後の２０アミノ酸、より好ましくは最後の１０アミノ酸のＣ末端側アミノ酸残基内に位置している。
【００５５】
上記ジスルフィド結合配置は、プロテアーゼ構成部分およびトランスロケーション構成部分が、天然型クロストリジウム神経毒素に類似する様式で配置されるという利点を有する。比較のために、天然型クロストリジウム神経毒素の一次アミノ酸配列に関して、それぞれのシステインアミノ酸残基は、８〜２７アミノ酸残基離れて位置している−Popoff, MRおよびMarvaud, J-C, 1999, Structural & genomic features of clostridial neurotoxins, 第9章, The Comprehensive Sourcebook of Bacterial Protein Toxins. AloufおよびFreer編より抜粋。
【００５６】
【数２】
0005438901.tif 000003
【００５７】
融合タンパク質は、１つ以上の精製タグを含み得る。これらの精製タグは、プロテアーゼ構成部分に対してＮ末端側および／またはトランスロケーション構成部分に対してＣ末端側に位置している。
【００５８】
任意の精製タグが用いられ得るが、以下が好ましい：
Ｈｉｓ−タグ（例えば、６×ヒスチジン）、好ましくはＣ末端タグおよび／またはＮ末端タグとして
ＭＢＰ−タグ（マルトース結合タンパク質）、好ましくはＮ末端タグとして
ＧＳＴ−タグ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ)、好ましくはＮ末端タグとして
Ｈｉｓ−ＭＢＰ−タグ、好ましくはＮ末端タグとして
ＧＳＴ−ＭＢＰ−タグ、好ましくはＮ末端タグとして
チオレドキシンタグ、好ましくはＮ末端タグとして
ＣＢＤ−タグ（キチン結合ドメイン）、好ましくはＮ末端タグとして。
【００５９】
本発明のさらなる実施態様によれば、融合タンパク質中に、１つ以上のペプチドスペーサー分子が含まれ得る。例えば、精製タグと融合タンパク質分子の残りとの間（例えば、Ｎ末端精製タグと本発明のプロテアーゼ構成部分との間；および／またはＣ末端精製タグと本発明のトランスロケーション構成部分との間）に、ペプチドスペーサーが用いられ得る。本発明のＴＭ構成部分とトランスロケーション構成部分との間にも、ペプチドスペーサーは用いられ得る。
【００６０】
本発明の第二の局面によれば、上記単鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が提供される。
【００６１】
本発明の好ましい局面では、このＤＮＡ配列は、ＤＮＡベクターの一部として調製される。このベクターは、プロモーターおよびターミネーターを含む。
【００６２】
種々の異なるスペーサー分子が、本発明の融合タンパク質のいずれかに用いられ得る。このようなスペーサー分子の例としては、ＧＳ１５、ＧＳ２０、ＧＳ２５、およびＨｘ２７が挙げられる。
【００６３】
予想外に、本発明者らは、スペーサーの大きさが、（使用に際して）ＴＭのＣ末端とトランスロケーション構成部分のＮ末端とが互いに４０〜１０５オングストローム、好ましくは５０〜１００オングストローム、そしてより好ましくは５０〜９０オングストローム離れているように選択される場合、本発明の融合タンパク質が、標的細胞に対する結合活性の改善を示し得ることを見出した。別の実施態様では、好ましいスペーサーは、１１〜２９アミノ酸残基、好ましくは１５〜２７アミノ酸残基、そしてより好ましくは２０〜２７アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する。適切なスペーサーは、Crasto, C.J.およびFeng, J.A. (2000) 5月; 13(5);309-312頁（http://www.fccc./edu/research/labs/feng/limker.html.もまた参照のこと）に従って、通常通りに同定および入手され得る。
【００６４】
好ましい実施態様では、ベクターは、以下から選択されるプロモーターを有する：
【００６５】
【数３】
0005438901.tif 000004
【００６６】
本発明のＤＮＡ構築物は、好ましくは、コンピュータ上で設計され、次いで従来のＤＮＡ合成技術によって合成される。
【００６７】
上記ＤＮＡ配列情報は、必要に応じて、用いられる最終宿主細胞（例えば、大腸菌）発現系に従ったコドン偏位のために改変される。
【００６８】
ＤＮＡバックボーンは、好ましくは、任意の固有核酸配列についてスクリーニングされる。この固有核酸配列は、転写および翻訳されたときに、第二のペプチドコード配列によってコードされるプロテアーゼ切断部位に相当するアミノ酸配列を生じ得る。このスクリーニングは、手動またはコンピューターソフトウェア（例えば、DNASTAR, Inc.によるMapDrawプログラム）の補助のもとで実施され得る。
【００６９】
本発明のさらなる実施態様によれば、非細胞傷害性薬剤を調製する方法が提供され、この方法は、以下の工程を含む：
ａ．本発明の単鎖ポリペプチド融合タンパク質と、プロテアーゼ切断部位を切断し得るプロテアーゼとを接触させる工程；
ｂ．プロテアーゼ切断部位を切断し、そしてそれにより二本鎖融合タンパク質を形成する工程。
【００７０】
この局面は、二本鎖ポリペプチドを提供し、これは、概して、クロストリジウムホロ毒素の構造を模倣している。より詳細には、得られた二本鎖ポリペプチドは、代表的には、以下のような構造を有する：
ａ．第一鎖は、非細胞傷害性プロテアーゼまたはそのフラグメントを含み、このプロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントは、標的細胞のエキソサイトーシス融合器官のタンパク質を切断し得る；
ｂ．第二鎖は、ＴＭおよびトランスロケーションドメインを含み、トランスロケーションドメインは、エンドソームの内部から該エンドソームの膜を横断して該標的細胞のサイトゾルへと、該プロテアーゼまたはプロテアーゼフラグメントをトランスロケートさせ得る；そして
第一鎖および第二鎖は、一緒にジスルフィド結合で連結されている。
【００７１】
本発明のさらなる局面によれば、以下からなる群から選択される医学的状態の治療、予防、または緩和用の医薬品の製造のための、本発明の単鎖または二本鎖のポリペプチドの使用が提供される：粘液過分泌、喘息および／または慢性閉塞性肺疾患、ＭＥＮを含む内分泌新形成、甲状腺中毒症、および甲状腺からの過分泌に依存する他の疾患；末端巨大症、高プロラクチン血症、クッシング病、および下垂体前葉過分泌に依存する他の疾患；アンドロゲン過多症、慢性無排卵症、および多嚢胞卵巣症候群に伴う他の疾患、アレルギー（季節性アレルギー鼻炎（花粉症）、アレルギー結膜炎、血管運動性鼻炎、および食物アレルギー）、好酸球増加症、喘息、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、盤状紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、痔核、そう痒症、糸球体腎炎、肝炎、膵炎、胃炎、血管炎、心筋炎、乾癬、湿疹、慢性放射線誘発線維症、肺瘢痕形成および他の線維性障害、消化管に位置する（特に大腸に位置する）粘液分泌細胞からの粘液過分泌、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、盤状紅斑性狼瘡、臓器移植、組織移植、体液移植、グレーヴス病、甲状腺中毒症、自己免疫糖尿病、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、好中球減少症、慢性自己免疫肝炎、自己免疫胃炎、悪性貧血、橋本甲状腺炎、アディソン病、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、多発性筋炎、強皮症、全身性硬化症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋炎、リウマチ性心臓炎、糸球体腎炎（グッドパスチャー型）、ブドウ膜炎、睾丸炎、潰瘍性大腸炎、血管炎、萎縮性胃炎、悪性貧血、１型糖尿病、心血管状態および／または高血圧、および骨化石症および骨粗鬆症のような骨状態。
【００７２】
関連した局面によれば、患者の医学的状態または医学的疾患を治療、予防、または緩和する方法が提供され、該方法は、本発明の単鎖または二本鎖のポリペプチドの治療有効量を該患者に投与する工程を含み、該医学的状態または医学的疾患は、以下からなる群から選択される：粘液過分泌、喘息および／または慢性閉塞性肺疾患、ＭＥＮを含む内分泌新形成、甲状腺中毒症、および甲状腺からの過分泌に依存する他の疾患；末端巨大症、高プロラクチン血症、クッシング病、および下垂体前葉過分泌に依存する他の疾患；アンドロゲン過多症、慢性無排卵症、および多嚢胞卵巣症候群に伴う他の疾患、アレルギー（季節性アレルギー鼻炎（花粉症）、アレルギー結膜炎、血管運動性鼻炎、および食物アレルギー）、好酸球増加症、喘息、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、盤状紅斑性狼瘡、潰瘍性大腸炎、クローン病、痔核、そう痒症、糸球体腎炎、肝炎、膵炎、胃炎、血管炎、心筋炎、乾癬、湿疹、慢性放射線誘発線維症、肺瘢痕形成および他の線維性障害、消化管に位置する（特に大腸に位置する）粘液分泌細胞からの粘液過分泌、重症筋無力症、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、盤状紅斑性狼瘡、臓器移植、組織移植、体液移植、グレーヴス病、甲状腺中毒症、自己免疫糖尿病、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、好中球減少症、慢性自己免疫肝炎、自己免疫胃炎、悪性貧血、橋本甲状腺炎、アディソン病、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、多発性筋炎、強皮症、全身性硬化症、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、心筋炎、リウマチ性心臓炎、糸球体腎炎（グッドパスチャー型）、ブドウ膜炎、睾丸炎、潰瘍性大腸炎、血管炎、萎縮性胃炎、悪性貧血、１型糖尿病、心血管状態および／または高血圧、および骨化石症および骨粗鬆症のような骨状態。
【００７３】
使用に際して、本発明のポリペプチドは、代表的には、薬学的キャリア、希釈剤および／または賦形剤と共に、薬学的組成物の形態で用いられる。組成物の的確な形態は、投与様式に合わせられ得る。投与は、好ましくは哺乳動物に、より好ましくはヒトに対してである。
【００７４】
ポリペプチドは、例えば、吸入用にエアロゾルまたは噴霧液の形態で、あるいは非経口投与、関節内投与、または頭蓋内投与用に滅菌溶液の形態で用いられ得る。
【００７５】
内分泌を標的として治療するためには、静脈内（i.v.）注射、腺への直接注射、または肺送達のためのエアロゾル投与が好ましい；炎症性細胞を標的として治療するためには、静脈内注射、皮下注射、または表面パッチ投与または肺送達のためのエアロゾル投与が好ましい；外分泌を標的として治療するためには、静脈内注射、腺への直接注射もしくは直接投与、または肺送達のためのエアロゾル投与が好ましい；免疫学的標的の治療のためには、静脈内注射、または特定の組織（例えば、胸腺、骨髄、もしくはリンパ組織）への注射が好ましい；心血管を標的とした治療のためには、静脈内注射が好ましい；そして骨を標的とした治療のためには、静脈内注射または直接注射が好ましい。静脈内注射の場合、これはまた、ポンプシステムの使用も含むべきである。ニューロンを標的として治療するための組成物の場合、脊髄注射（例えば、硬膜外注射もしくは髄腔内注射）または留置ポンプが使用され得る。
【００７６】
本発明のポリペプチドの投与のための投薬量範囲は、所望の治療効果を生じる投薬量範囲である。必要投薬量範囲は、構成部分の正確な性質、投与経路、処方の性質、患者の年齢、患者の状態の性質、程度、もしくは重篤度、禁忌（ある場合）、および主治医の判断に依存することが理解される。
【００７７】
適切な一日投薬量は、0.0001〜1mg/kg、好ましくは0.0001〜0.5mg/kg、より好ましくは0.002〜0.5mg/kg、および特に好ましくは0.004〜0.5mg/kgの範囲内である。単位投薬量は、１μg未満から30mgまでの間で変動し得るが、代表的には一投与あたり0.01〜1mgの範囲内であり、これは、毎日、または好ましくは頻度を下げて（例えば、毎週または半年毎に）投与され得る。
【００７８】
特に好ましい投薬レジメは、患者体重ｋｇ当たり１×の用量として2.5ngの融合タンパク質に基づく。これに関して、好ましい投薬量は、１×〜１００×（すなわち、2.5〜250ng）の範囲内である。この投薬量範囲は、他のタイプの治療分子で用いられるよりも有意に低い（すなわち、少なくとも１０倍、代表的には１００倍低い）。さらに、上記差異は、モル基準で同じ比較がなされる場合に有意に拡大される。これは、本発明の融合タンパク質が、従来の「小さな」分子治療剤よりも相当に大きな分子量を有するからである。
【００７９】
しかしながら、必要投薬量に広範な変動があることは、構成部分の正確な性質および種々の投与経路の異なる効率に依存して予想されることである。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い投薬量が必要であることが予想される。
【００８０】
これらの投薬量レベルの変動は、当該分野で周知であるように、最適化のために標準的な経験的作業を用いて調整され得る。
【００８１】
注射に適した組成物は、溶液、懸濁液、もしくは乳濁液、または使用前に適切なビヒクル中に溶解もしくは懸濁される乾燥粉末の形態であり得る。
【００８２】
液状単位投薬剤形は、代表的には、発熱性物質除去滅菌ビヒクルを利用して調製される。活性成分は、使用するビヒクルおよび濃度に依存して、そのビヒクル中に溶解または懸濁され得る。
【００８３】
溶液は、非経口投与の全ての剤形に使用され得、特に静脈内注射に使用される。溶液を調製する際、構成部分はビヒクル中に溶解され得、溶液は、必要に応じて塩化ナトリウムの添加により等張にされる。そして無菌技術を用いて滅菌フィルタを通して濾過することにより滅菌され、次いで適切な滅菌バイアルまたはアンプル中に充填し、密封され得る。あるいは、溶液安定性が十分である場合、その密封容器中の溶液は、オートクレーブによって滅菌され得る。
【００８４】
好都合には、添加剤（例えば、緩衝化剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤もしくは殺菌剤、懸濁化剤もしくは乳化剤、および／または局所麻酔剤）がビヒクル中に溶解され得る。
【００８５】
使用前に適切なビヒクル中に溶解または懸濁される乾燥粉末は、滅菌区域で無菌技術を用いて、予め滅菌しておいた薬物および他の成分を滅菌容器中に充填することにより調製され得る。
【００８６】
あるいは、構成部分（すなわち、薬剤およびインヒビター）および他の成分が水性ビヒクル中に溶解され得、この溶液は、濾過により滅菌され、そして滅菌区域で無菌技術を用いて適切な容器中に分配される。製品は、次いで凍結乾燥され、そして容器は、無菌下で密封される。
【００８７】
筋内注射、皮下注射、または皮内注射に適切な非経口投与用懸濁液は、滅菌構成部分を溶解する代わりに滅菌ビヒクル中に懸濁しそして滅菌が濾過によって達成できないことを除いて、実質的に同様にして調製される。構成部分は、滅菌状態で単離され得るか、あるいは単離後に（例えば、ガンマ照射によって）滅菌され得る。
【００８８】
好都合には、懸濁化剤（例えば、ポリビニルピロリドン）が、構成部分の均一な分布を促進するために、組成物中に含まれる。
【００８９】
気道を介する投与に適した組成物としては、エアロゾル、噴霧液、または吸入用微細粉末が挙げられる。粉末の場合、粒径は、５０ミクロン未満、特に１０ミクロン未満が好ましい。このような組成物は、従来の様式で作製され、そして従来の投与デバイスと併用して用いられ得る。
【００９０】
（定義の節）
ターゲティング部分（ＴＭ）は、薬剤と標的細胞の表面との間に物理的会合を引き起こすように、結合部位と機能的に相互作用する薬剤と会合する任意の化学的構造を意味する。本発明においては、標的細胞は、侵害受容感覚求心性神経以外の任意の細胞である。ＴＭとの用語は、結合部位が内在化（例えば、エンドソーム形成）−レセプター媒介エンドサイトーシスとも呼ばれる−を行い得る、標的細胞上の結合部位に結合し得る任意の分子（すなわち、天然に存在する分子またはそれらの化学的／物理的に改変された改変体）を含む。ＴＭは、エンドソーム膜トランスロケーション機能を保有し得、この場合、本発明の薬剤に、ＴＭ構成部分とトランスロケーションドメイン構成部分とが別々に存在する必要はない。
【００９１】
本発明のＴＭは、標的細胞に結合（好ましくは特異的に結合）する。
【００９２】
用語「非細胞傷害性」は、問題のプロテアーゼ分子が、それがリターゲティングされた標的細胞を殺傷しないことを意味する。
【００９３】
本発明のプロテアーゼは、真核生物細胞においてエキソサイトーシス融合器官の１つ以上のタンパク質を切断し得る、全ての天然に存在する非細胞傷害性プロテアーゼを含む。
【００９４】
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、細菌プロテアーゼ（またはそのフラグメント）である。より好ましくは、細菌プロテアーゼは、クロストリジウム属またはナイセリア属から選択される（例えば、クロストリジウムＬ鎖、またはナイセリアＩｇＡプロテアーゼ（好ましくは、N. gonorrhoeae由来））。
【００９５】
本発明はまた、改変非細胞傷害性プロテアーゼを含み、この改変プロテアーゼは、上記プロテアーゼ活性をなお示す限り、天然に存在しないアミノ酸配列および／または合成アミノ酸残基を含む。
【００９６】
本発明のプロテアーゼは、好ましくは、セリンまたはメタロプロテアーゼ活性（例えば、エンドペプチダーゼ活性）を示す。プロテアーゼは、好ましくは、ＳＮＡＲＥタンパク質（例えば、ＳＮＡＰ−２５、シナプトブレビン／ＶＡＭＰ、またはシンタキシン）に特異的である。
【００９７】
特に、神経毒素のプロテアーゼドメイン（例えば、細菌神経毒素のプロテアーゼドメイン）について述べられる。したがって、本発明は、天然に存在する神経毒素ドメインの使用、ならびに該天然に存在する神経毒素の組換え調製型を包含する。
【００９８】
例示の神経毒素は、クロストリジウム属によって生成される。そして用語「クロストリジウム神経毒素」は、C. tetaniによって生成される神経毒素（ＴｅＮＴ）およびC. botulinumによって生成される神経毒素（ＢｏＮＴ）血清型Ａ〜Ｇ、ならびにC. baratiiおよびC. butyricumにより生成される密に関連したＢｏＮＴ様神経毒素を含む。上記の略語は、本明細書中を通じて使用する。例えば、ＢｏＮＴ／Ａとの名称は、神経毒素の供給源がＢｏＮＴ（血清型Ａ）であることを示す。他のＢｏＮＴ血清型に対しても、対応する名称が適用される。
【００９９】
用語「Ｌ鎖フラグメント」は、神経毒素のＬ鎖の一構成部分を意味し、このフラグメントは、メタロプロテアーゼ活性を示し、そして細胞エキソサイトーシスに関与する小胞および／または原形質膜に会合したタンパク質をタンパク質分解により切断し得る。
【０１００】
トランスロケーションドメインは、プロテアーゼ活性の機能的発現が標的細胞のサイトゾル内で生じるように、標的細胞へのプロテアーゼ（またはそのフラグメント）のトランスロケーションを可能にする分子である。どの分子（例えば、タンパク質またはペプチド）が保有するのであっても、本発明の必要なトランスロケーション機能は、多数の従来アッセイの任意の１つによって確認され得る。
【０１０１】
例えば、Shone C.（1987）は、試験分子でチャレンジされるリポソームを用いるインビトロアッセイを記載している。必要なトランスロケーション機能の存在は、Ｋ＋および／または標識ＮＡＤのリポソームからの放出によって確認され、これは容易にモニタリングされ得る［Shone C. (1987) Eur. J. Biochem., 167(1)巻, 175-180頁を参照のこと］。
【０１０２】
さらなる例は、Blaustein R.（1987）によって提供される。これは、平面リン脂質二層膜を用いる単純なインビトロアッセイを記載している。この膜を試験分子でチャレンジし、そして必要なトランスロケーション機能は、該膜を横断する伝導の増大によって確認される［Blaustein (1987) FEBS Letts., 226巻, 1号, 115-120頁を参照のこと］。
【０１０３】
膜融合の評価、およびしたがって、本発明での使用に適したトランスロケーションドメインの同定を可能にするさらなる方法は、Methods in Enzymology 220巻および221巻, Membrane Fusion Techniques, A部およびB部, Academic Press 1993によって提供される。
【０１０４】
トランスロケーションドメインは、好ましくは、低ｐＨ条件下で脂質膜中にイオン透過孔を形成し得る。好ましくは、エンドソーム膜内の孔形成が可能なタンパク質分子の部分のみを使用することが見出されている。
【０１０５】
トランスロケーションドメインは、微生物タンパク質供給源（特に、細菌またはウイルスタンパク質供給源）から得られ得る。したがって、１つの実施態様では、トランスロケーションドメインは、細菌毒素またはウイルスタンパク質のような酵素のトランスロケーションドメインである。
【０１０６】
細菌毒素分子のある種のドメインがこのような孔を形成し得ることは、十分に書き記されている。また、ウイルス発現膜融合タンパク質のある種のトランスロケーションドメインがこのような孔を形成し得ることも公知である。このようなドメインは、本発明において用いられ得る。
【０１０７】
トランスロケーションドメインは、クロストリジウム属起源であり得、すなわち、ＨＮドメイン（またはその機能的構成部分）であり得る。ＨＮは、Ｈ鎖のアミノ末端側半分にほぼ等価なクロストリジウム神経毒素のＨ鎖の一部またはフラグメント、または完全なＨ鎖中のそのフラグメントに対応するドメインを意味する。Ｈ鎖が、Ｈ鎖のＨＣ構成部分の天然の結合機能を実質的に欠損していることが好ましい。これに関して、ＨＣ機能は、（ヌクレアーゼまたはプロテアーゼ処理によってＤＮＡ合成レベルまたは合成後レベルのいずれかの）ＨＣアミノ酸配列の欠失によって除去され得る。あるいは、ＨＣ機能は、化学的処理または生物学的処理によって不活性化され得る。したがって、Ｈ鎖は、好ましくは、天然型クロストリジウム神経毒素（すなわち、ホロ毒素）が結合する標的細胞上の結合部位に結合し得ない。
【０１０８】
１つの実施態様では、トランスロケーションドメインは、クロストリジウム神経毒素のＨＮドメイン（またはそのフラグメント）である。適切なクロストリジウムトランスロケーションドメインの例は、以下を含む：
ボツリヌス菌Ａ型神経毒素−アミノ酸残基（449〜871）
ボツリヌス菌Ｂ型神経毒素−アミノ酸残基（441〜858）
ボツリヌス菌Ｃ型神経毒素−アミノ酸残基（442〜866）
ボツリヌス菌Ｄ型神経毒素−アミノ酸残基（446〜862）
ボツリヌス菌Ｅ型神経毒素−アミノ酸残基（423〜845）
ボツリヌス菌Ｆ型神経毒素−アミノ酸残基（440〜864）
ボツリヌス菌Ｇ型神経毒素−アミノ酸残基（442〜863）
破傷風菌神経毒素−アミノ酸残基（458〜879）。
【０１０９】
ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）および破傷風菌（C. tetani）における毒素生成の遺伝的基礎に関するさらなる詳細については、Hendersonら (1997) The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic pressに参照される。
【０１１０】
用語「ＨＮ」は、天然に存在する神経毒素ＨＮ部、および天然に存在しないアミノ酸配列および／または合成アミノ酸残基を有する改変ＨＮ部（但し、改変ＨＮ部が上記トランスロケーション機能をなお示す限り）を含む。
【０１１１】
あるいは、トランスロケーションドメインは、非クロストリジウム属起源であり得る（表１を参照のこと）。非クロストリジウムトランスロケーションドメイン起源の例は、以下を含むが、これらに限定されない：ジフテリア毒素のトランスロケーションドメイン［O'Keefeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89, 6202-6206；Silvermanら, J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532；およびLondon, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta., 1112, 25-51頁］、シュードモナス外毒素Ａ型のトランスロケーションドメイン［Priorら, Biochemistry (1992) 31, 3555-3559］、炭疽菌毒素のトランスロケーションドメイン［Blankeら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996）93, 8437-8442］、トランスロケーション機能の種々の融合性または疎水性ペプチド［Plankら, J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924；およびWagnerら, (1992) PNAS, 89, 7934-7938頁］、および両親媒性ペプチド［Murataら, (1992) Biochem., 31, 1986-1992頁］。トランスロケーションドメインは、天然に存在するタンパク質に存在するトランスロケーションドメインを反映し得るか、またはその変化がトランスロケーションドメインのトランスロケーション能を破壊しない限り、アミノ酸変化を含み得る。
【０１１２】
本発明での使用に適したウイルストランスロケーションドメインの具体的な例には、ウイルス発現膜融合タンパク質のある種のトランスロケーションドメインが含まれる。例えば、Wagnerら（1992）およびMurataら（1992）は、インフルエンザウイルスヘマグルチニンのＮ末端領域に由来する多数の融合性および両親媒性のペプチドのトランスロケーション（すなわち、膜融合および小胞形成）機能を記載している。所望のトランスロケーション活性を有することが公知の他のウイルス発現膜融合タンパク質は、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の融合性ペプチドのトランスロケーションドメイン、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質Ｇのトランスロケーションドメイン、ＳＥＲウイルスＦタンパク質のトランスロケーションドメインおよび泡沫状ウイルスエンベロープ糖タンパク質のトランスロケーションドメインである。ウイルスがコードする「スパイクタンパク質（Aspike proteins）」は、本発明においては特別な適用を有し、例えば、ＳＦＶのＥ１タンパク質およびＶＳＶのＧタンパク質のＧタンパク質である。
【０１１３】
表１に列挙したトランスロケーションドメインの使用は、それらの配列改変体の使用を含む。改変体は、１つ以上の保存的な核酸置換および／または核酸欠失もしくは挿入を含み得る。但し、この改変体は、必要なトランスロケーション機能を保有する。改変体はまた、この改変体が必要なトランスロケーション機能を保有する限り、１つ以上のアミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失もしくは挿入を含み得る。
【０１１４】
【表１】
0005438901.tif 000005
【０１１５】
（配列番号）
配列番号１  ＬＣ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号２  ＨＮ／ＡのＤＮＡ配列
配列番号３  ＬＣ／ＢのＤＮＡ配列
配列番号４  ＨＮ／ＢのＤＮＡ配列
配列番号５  ＬＣ／ＣのＤＮＡ配列
配列番号６  ＨＮ／ＣのＤＮＡ配列
配列番号７  ＣＰ  ＰＡＲ１−ＢリンカーのＤＮＡ配列
配列番号８  ＣＰ  ＰＴＨ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号９  ＣＰ  ＰＡＲ１−Ｂ融合物のＤＮＡ配列
配列番号１０  ＣＰ  ＰＡＲ１−Ｂ融合物のタンパク質配列
配列番号１１  ＣＰ  ＰＴＨ−Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号１２  ＣＰ  ＰＴＨ−Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号１３  ＣＰ  ＲＧＤ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号１４  ＣＰ  ＲＧＤ−Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号１５  ＣＰ  ＲＧＤ−Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号１６  ＣＰ  環状ＲＧＤ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号１７  ＣＰ  環状ＲＧＤ−Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号１８  ＣＰ  環状ＲＧＤ−Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号１９  ＣＰ  ＴＨＡＬＷＨＴ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号２０  ＣＰ  ＴＨＡＬＷＨＴ−Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号２１  ＣＰ  ＴＨＡＬＷＨＴ−Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号２２  ＣＰ  環状ＴＨＡＬＷＨＴ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号２３  ＣＰ  環状ＴＨＡＬＷＨＴ−Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号２４  ＣＰ  環状ＴＨＡＬＷＨＴ−Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号２５  ＣＰ  ＡＮＰ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号２６  ＣＰ  ＡＮＰ−Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号２７  ＣＰ  ＡＮＰ−Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号２８  ＣＰ  ＶＩＰ−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号２９  ＣＰ  ＶＩＰ−Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号３０  ＣＰ  ＶＩＰ−Ｃ融合物のタンパク質配列
配列番号３１  ＣＰ  ガストリン放出ペプチド−ＣリンカーのＤＮＡ配列
配列番号３２  ＣＰ  ガストリン放出ペプチド−Ｃ融合物のＤＮＡ配列
配列番号３３  ＣＰ  ガストリン放出ペプチド−Ｃ融合物のタンパク質配列。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１  −  ＬＣ／ＢおよびＨＮ／Ｂバックボーンクローンの調製）
以下の手順によって、マルチドメイン融合物発現用の構成部分バックボーンとして使用するためのＬＣおよびＨＮフラグメントを作製する。本実施例は、血清型Ｂベースのクローン（配列番号３および配列番号４）の調製に基づいているが、手順および方法は他の血清型にも同等に適用可能である（血清型Ａ（配列番号１および配列番号２）ならびに血清型Ｃ（配列番号５および配列番号６）については配列表に図示）。
【０１１７】
（クローニングベクターおよび発現ベクターの調製）
pCR 4（Invitrogen）は、構築物の確認を容易にするために、ベクター内の制限配列の欠損および隣接する配列決定プライマー部位によって選択した、選り抜きの標準的なクローニングベクターである。この発現ベクターは、pMAL（NEB）発現ベクターに基づいており、これは、構築物の挿入のために正しい方向でマルチプルクローニング部位内に所望の制限配列を有する（BamHI-SalI-PstI-HindIII）。非動員性プラスミドを作製するため、発現ベクターのフラグメントが除去されており、そして精製の選択肢を増大させるため、種々の異なる融合タグが挿入されている。
【０１１８】
（プロテアーゼ（例えば、ＬＣ／Ｂ）挿入片の調製）
ＬＣ／Ｂ（配列番号３）を、二通りの方法の一方によって作製する：
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)）の１つを用いて、（GenBank（アクセッション番号P10844）またはSwissprot（アクセッション位置BXB_CLOBO）のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる）ＬＣ／Ｂアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。BamHI／SalI認識配列を、配列の５’末端および３’末端のそれぞれに組み込み、正しい読み取り枠を維持する。ＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込んだ制限酵素切断配列について（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウェアを用いて）スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている切断配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser (Geneart)のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、ＬＣ／Ｂオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するこの最適化したＤＮＡ配列は商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
【０１１９】
別の方法は、それぞれ５’および３’のＰＣＲプライマーに組み込んだBamHI制限酵素配列およびSalI制限酵素配列を用いる既存ＤＮＡ配列からのＰＣＲ増幅を使用することである。相補的オリゴヌクレオチドプライマーは、製造業者（例えば、MWGまたはSigma-Genosys）によって、各対が、クロストリジウム標的ＤＮＡの範囲（ストレッチ）に隣接する向かい合った鎖に対して、これらの２つのＤＮＡ鎖の各々に１つのオリゴヌクレオチドを（互いに「向かって」３’末端の向きに）ハイブリダイズする能力を有するように、化学合成される。ＰＣＲ産物を生成するために、クロストリジウムＤＮＡ配列に特異的な短いオリゴヌクレオチドプライマーの対を、クロストリジウムＤＮＡ鋳型および他の反応成分と混合し、そして反応チューブのインキュベーション温度を自動変更し得る機器（「ＰＣＲ機器」）中に配置し、約９４℃（変性用）、５５℃（オリゴヌクレオチドアニーリング用）、および７２℃（合成用）のサイクルにかける。ＰＣＲ産物の増幅に必要な他の試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、TaqまたはPfuポリメラーゼ）、ＤＮＡの４つのヌクレオチドｄＮＴＰ構築ブロックの等モル量（50〜200μM）の各々、およびMg2+濃度（0.5〜5mM）に最適化した酵素に適した緩衝液が含まれる。
【０１２０】
増幅産物を、Taq PCR産物に対してTOPO TAクローニングまたはPfu PCR産物に対してZero Blunt TOPOクローニング（両キットともInvitrogenより市販されている）のいずれかを用いて、pCR 4にクローニングする。得られたクローンを配列決定により確認する。次いで、クローニング系と適合可能でない付加制限配列を、部位特異的変異誘発を用いて（例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて）取り除く。
【０１２１】
（トランスロケーション（例えばＨＮ）挿入片の調製）
ＨＮ／Ｂ（配列番号４）を、二通りの方法の一方によって作製する：
ＤＮＡ配列を、種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、EditSeq best E. coli reverse translation（DNASTAR Inc.）またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)）の１つを用いて、（GenBank（アクセッション番号P10844）またはSwissprot（アクセッション位置BXB_CLOBO）のような自由に利用可能なデータベースソースから得られる）ＨＮ／Ｂアミノ酸配列の逆翻訳によって設計する。Ｎ末端にPstI制限配列を、そしてＣ末端にXbaI−停止コドン−HindIIIを付加し、正しい読み取り枠を維持する。ＤＮＡ配列を、逆翻訳の間に組み込んだ制限酵素切断配列について（MapDraw, DNASTAR Inc.のようなソフトウェアを用いて）スクリーニングする。クローニング系によって必要とされる配列と共通であることが見出されている配列を、提案したコード配列から手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列は商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
【０１２２】
別の方法は、それぞれ５’および３’のＰＣＲプライマーに組み込んだPstI制限酵素配列およびXbaI−停止コドン−HindIII制限酵素配列を用いる既存ＤＮＡ配列からのＰＣＲ増幅を使用することである。ＰＣＲ増幅は、上記のように行う。このＰＣＲ産物をpCR 4ベクターに挿入し、そして配列決定によって確認する。次いで、クローニング系と適合可能でない付加制限配列を、部位特異的変異誘発を用いて（例えば、Quickchange（Stratagene Inc.）を用いて）取り除く。
【０１２３】
（実施例２  −  ＬＣ／Ｂ−ＰＡＲ１−ＨＮ／Ｂ融合タンパク質の調製）
（リンカー−ＰＡＲ１−スペーサー挿入片の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、リンカーについての既存配列情報を鋳型として用いて、第一の原則から設計し得る。例えば、タンパク質分解活性化が生じるＬＣとＨＮとの間のジスルフィド架橋のシステイン間に存在するドメイン間ポリペプチド領域として定義された血清型Ｂリンカー。この配列情報は、GenBank（アクセッション番号P10844）またはSwissprot（アクセッション位置BXB_CLOBO）のような利用可能なデータベースソースから自由に入手可能である。このリンカーに、エンテロキナーゼ部位、ＰＡＲ１およびスペーサーを組み込み、そして種々の逆翻訳ソフトウェアツール（例えば、EditSeq best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.)またはBacktranslation tool v2.0 (Entelechon)）の１つを用いて、リンカー−リガンド−スペーサー領域をコードするＤＮＡ配列を決定する。次いで、制限部位をこのＤＮＡ配列に組み込み、そしてBamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ＰＡＲ１−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号７）として配置させ得る。スペーサー、ＰＡＲ１、および制限配列について正しい読み枠を維持し、そしてＤＡＭメチル化を生じ得るので塩基ＴＣがXbaI配列の前にならないようにすることが重要である。このＤＮＡ配列を、組み込まれた制限配列についてスクリーニングし、そしてこの残っている配列から付加配列を手動で切り出し、通常の大腸菌コドン利用が維持されるようにする。大腸菌コドン利用を、Graphical Codon Usage Analyser（Geneart）のようなソフトウェアプログラムを参照することによって評価し、そしてＧＣ含量％およびコドン利用比を、公開されているコドン利用表（例えば、GenBank Release 143, 2004年９月13日）を参照することによって評価する。次いで、この最適化したＤＮＡ配列は商業的に合成され（例えば、Entelechon、GeneartまたはSigma-Genosysによる）、そしてpCR 4ベクター中に提供される。
【０１２４】
（ＬＣ／Ｂ−ＰＡＲ１−ＨＮ／Ｂ融合物の調製）
ＬＣ−リンカー−ＰＡＲ１−スペーサー−ＨＮ構築物（配列番号９）を作製するために、リンカー（配列番号７）をコードするpCR 4ベクターを、BamHIおよびSalI制限酵素で切断する。次いで、この切断したベクターを、BamHIおよびSalIで切断したＬＣ／ＢのＤＮＡ（配列番号３）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。次いで、得られたプラスミドＤＮＡをPstIおよびXbaI制限酵素で切断し、そしてPstIおよびXbaIで切断したＨＮ／ＢのＤＮＡ（配列番号４）の挿入および連結用のレシピエントベクターとして使用する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ＰＡＲ１−スペーサー−ＨＮ ＯＲＦ（配列番号９）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号１０に示される配列の融合タンパク質が発現される。
【０１２５】
（実施例３  −  ＬＣ／Ｃ−ＰＴＨ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ＰＴＨ−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号８）として配置されるＣ血清型リンカーを用いること以外は、実施例２に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、ＬＣ／Ｃ−ＰＴＨ−ＨＮ／Ｃ融合物を、実施例１に記載の方法を用いて作製したＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を用いて組み立て、そして実施例２に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ＰＴＨ−スペーサー−ＨＮ  ＯＲＦ（配列番号１１）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号１２に示される配列の融合タンパク質が発現される。
【０１２６】
（実施例４  −  ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製および精製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ＲＧＤ−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号１３）として配置されるＣ血清型リンカーを用いること以外は、実施例２に記載の方法を用いて設計する。次いで、ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合物を、実施例１に記載の方法を用いて作製したＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を用いて組み立て、そして実施例２に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ＲＧＤ−スペーサー−ＨＮ  ＯＲＦ（配列番号１４）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号１５に示される配列の融合タンパク質が発現される。得られた発現プラスミドであるpMAL  ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃを大腸菌BL21に形質転換して、組換えタンパク質を発現させる。
【０１２７】
（ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の発現）
ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の発現を、以下のプロトコルを用いて行う。250mlフラスコ中の100mlの改変TB（0.2%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含有する）にＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ発現株からの単一コロニーを接種する。この培養物を３７℃にて225rpmで１６時間増殖させる。２Ｌフラスコ中の１Ｌの改変TB（0.2%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含有する）に10mlの終夜培養物を接種する。この培養物を３７℃にて、OD600nmが約0.5に達するまで増殖させ、この時点で温度を１６℃に下げる。１時間後、培養物を1mM IPTGで誘導し、そして１６℃にてさらに１６時間増殖させる。図１は、大腸菌における発現タンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
【０１２８】
（ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の精製）
25ml 50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClおよび約10gの大腸菌BL21細胞ペーストを含むファルコン管を解凍する。この細胞ペーストを氷上にて、22ミクロンのパワーで30秒間オン、30秒間オフを１０サイクルで超音波処理し、試料を冷却したままにする。溶解した細胞を18,000rpmで4℃にて30分間遠心分離する。この上清を、50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム（20〜30mlカラムが十分である）に流す。10mMおよび40mMのイミダゾールのステップグラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClに対して４℃にて終夜透析し、そして透析した融合タンパク質のODを測定する。100μg融合タンパク質当たり１単位の第Xa因子を添加し、そして２５℃にて終夜静置インキュベートする。50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClで平衡化しておいた0.1M NiSO4荷電キレートカラム（20〜30mlカラムが十分である）に流す。50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClでベースラインまでカラムを洗浄する。10mMおよび40mMのイミダゾールのステップグラジエントを用いて、非特異的結合タンパク質を洗い流し、そして融合タンパク質を100mMイミダゾールで溶出する。溶出した融合タンパク質を5Lの50mM HEPES（pH 7.2）、200mM NaClに対して４℃にて終夜透析し、そしてこの融合物を約2mg/mlに濃縮し、試料を小分けし、そして−20℃にて凍結する。OD、BCAおよび純度分析を用いて精製タンパク質を試験する。図２は、精製タンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
【０１２９】
（実施例５  −  ＬＣ／Ｃ−環状ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−環状ＲＧＤ−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号１６）として配置されるＣ血清型リンカーを用いること以外は、実施例２に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、ＬＣ／Ｃ−環状ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合物を、実施例１に記載の方法を用いて作製したＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を用いて組み立て、そして実施例２に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−環状ＲＧＤ−スペーサー−ＨＮ  ＯＲＦ（配列番号１７）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号１８に示される配列の融合タンパク質が発現される。得られた発現プラスミドであるpMAL  ＬＣ／Ｃ−環状ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃを大腸菌BL21に形質転換して、組換えタンパク質を発現させた。融合タンパク質の発現は、実施例４に記載のように実施した。図１は、大腸菌において発現したタンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
【０１３０】
（実施例６  −  ＬＣ／Ｃ−ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ＴＨＡＬＷＨＴ−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号１９）として配置されるＣ血清型リンカーを用いること以外は、実施例２に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、ＬＣ／Ｃ−ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ融合物を、実施例１に記載の方法を用いて作製したＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を用いて組み立て、そして実施例２に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ＴＨＡＬＷＨＴ−スペーサー−ＨＮ  ＯＲＦ（配列番号２０）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号２１に示される配列の融合タンパク質が発現される。融合タンパク質の発現は、実施例４に記載のように実施した。図１は、大腸菌において発現したタンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
【０１３１】
本実施例で示されるＴＨＡＬＷＨＴペプチド配列（配列番号１９、２０、および２１）は、ファージディスプレイ技術によって見出される別のペプチド配列と交換され得る。例えば、ＬＥＢＰ−１（ＱＰＦＭＱＣＬＣＬＩＹＤＡＳＣ）、ＬＥＢＰ−２（ＲＮＶＰＰＩＦＮＤＶＹＷＩＡＦ）およびＬＥＢＰ−３（ＶＦＲＶＲＰＷＹＱＳＴＳＱＳ）(Wuら, 2003）；ＣＤＳＡＦＶＴＶＤＷＧＲＳＭＳＬＣ（Floreaら, 2003）；ＳＥＲＳＭＮＦ、ＹＧＬＰＨＫＦ、ＰＳＧＡＡＲＡ、ＬＰＨＫＳＭＰ、ＬＱＨＫＳＭＰ（Writerら, 2004）；ＦＳＬＳＫＰＰ、ＨＳＭＱＬＳＴおよびＳＴＱＡＭＦＱペプチド（Rahimら, 2003）。
【０１３２】
（実施例７  −  ＬＣ／Ｃ−環状ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−環状ＴＨＡＬＷＨＴ−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号２２）として配置されるＣ血清型リンカーを用いること以外は、実施例２に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、ＬＣ／Ｃ−環状ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ融合物を、実施例１に記載の方法を用いて作製したＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を用いて組み立て、そして実施例２に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−環状ＴＨＡＬＷＨＴ−スペーサー−ＨＮ  ＯＲＦ（配列番号２３）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号２４に示される配列の融合タンパク質が発現される。融合タンパク質の発現は、実施例４に記載のように実施した。図１は、大腸菌において発現したタンパク質をSDS-PAGEによる分析にて示している。
【０１３３】
本実施例で示されるＴＨＡＬＷＨＴペプチド配列（配列番号１９、２０、および２１）は、ファージディスプレイ技術によって見出される別のペプチド配列と交換され得る。例えば、ＬＥＢＰ−１（ＱＰＦＭＱＣＬＣＬＩＹＤＡＳＣ）、ＬＥＢＰ−２（ＲＮＶＰＰＩＦＮＤＶＹＷＩＡＦ）およびＬＥＢＰ−３（ＶＦＲＶＲＰＷＹＱＳＴＳＱＳ）(Wuら, 2003）；ＣＤＳＡＦＶＴＶＤＷＧＲＳＭＳＬＣ（Floreaら, 2003）；ＳＥＲＳＭＮＦ、ＹＧＬＰＨＫＦ、ＰＳＧＡＡＲＡ、ＬＰＨＫＳＭＰ、ＬＱＨＫＳＭＰ（Writerら, 2004）；ＦＳＬＳＫＰＰ、ＨＳＭＱＬＳＴおよびＳＴＱＡＭＦＱペプチド（Rahimら, 2003）。
【０１３４】
（実施例８  −  ＬＣ／Ｃ−ＡＮＰ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ＡＮＰ−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号２５）として配置されるＣ血清型リンカーを用いること以外は、実施例２に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、ＬＣ／Ｃ−ＡＮＰ−ＨＮ／Ｃ融合物を、実施例１に記載の方法を用いて作製したＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を用いて組み立て、そして実施例２に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ＡＮＰ−スペーサー−ＨＮ  ＯＲＦ（配列番号２６）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号２７に示される配列の融合タンパク質が発現される。
【０１３５】
（実施例９  −  ＬＣ／Ｃ−ＶＩＰ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ＶＩＰ−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号２８）として配置されるＣ血清型リンカーを用いること以外は、実施例２に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、ＬＣ／Ｃ−ＶＩＰ−ＨＮ／Ｃ融合物を、実施例１に記載の方法を用いて作製したＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を用いて組み立て、そして実施例２に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ＶＩＰ−スペーサー−ＨＮ  ＯＲＦ（配列番号２９）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号３０に示される配列の融合タンパク質が発現される。
【０１３６】
配列番号２８に示されるＶＩＰ配列は、ＶＩＰアナログまたはアゴニスト配列と置換され得た。例えば、［Ｒ15,20,21，Ｌ17］−ＶＩＰまたは［Ｒ15,20,21，Ｌ17］−ＶＩＰ−ＧＲＲ（Kashimotoら, 1996；Onoueら, 2004）、［Ａ2,8,9,16,19,24］−ＶＩＰまたは［Ａ2,8,9,16,19,24,25］−ＶＩＰ（Igarashiら, 2005）。
【０１３７】
（実施例１０  −  ＬＣ／Ｃ−ガストリン放出ペプチド−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の調製）
ＬＣ−ＨＮリンカーを、BamHI−SalI−リンカー−プロテアーゼ部位−ガストリン放出ペプチド−NheI−スペーサー−SpeI−PstI−XbaI−停止コドン−HindIII（配列番号３４）として配置されるＣ血清型リンカーを用いること以外は、実施例２に記載の方法を用いて設計し得る。次いで、ＬＣ／Ｃ−ガストリン放出ペプチド−ＨＮ／Ｃ融合物を、実施例１に記載の方法を用いて作製したＬＣ／Ｃ（配列番号５）およびＨＮ／Ｃ（配列番号６）を用いて組み立て、そして実施例２に記載の方法を用いて構築する。最終構築物は、ＬＣ−リンカー−ガストリン放出ペプチド−スペーサー−ＨＮ  ＯＲＦ（配列番号３５）を含んでおり、これは、発現ベクターに移入され、配列番号３６に示される配列の融合タンパク質が発現される。
【０１３８】
（実施例１１  −  ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の機能性の評価）
ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質（実施例４に従って調製）のＴＭ構成部分の機能性をリガンド結合アッセイによって評価する。リガンド結合の評価を容易にするために、ＲＧＤ結合ペプチドをビオチン化形態および非ビオチン化形態で合成する。融合タンパク質の結合を、ビオチン化形態を用いる競合アッセイによって決定する。簡潔にいえば、NCI-H292細胞を96ウェルプレート中に播種して生存培養物を樹立する。細胞および溶液を４℃に予冷し、そして溶液を細胞供給培地＋HEPES（50mM）中で調製する。処理前に、培地を細胞から取り除いて培地＋HEPES（500μl／ウェル）と取り替え、次いでこれも取り除く。標識リガンド（所要濃度の２倍濃度）を全てのウェルに添加する（50μl／ウェル）。次いで、融合タンパク質（所要濃度の２倍濃度）をウェルに添加する（50μl／ウェル）。４℃にて１時間後、培地を取り除いて培地＋HEPES（100μl／ウェル）と取り替える。この培地を取り除いて培地＋HEPES（100μl／ウェル）と取り替える。細胞を、100μl／ウェルのPBS-Tween 0.1%に４℃にて５分間溶解する。PBS-Tweenを取り除いて細胞を培地＋HEPES（100μl／ウェル）で洗浄する。この培地を取り除いて１ウェル当たり100μl  PBS＋100μlストレプトアビジン−ＨＲＰと取り替える。細胞を室温にて20分間インキュベートする。PBS＋ストレプトアビジンを取り除いて細胞をPBS-Tweenで洗浄する。100μl／ウェルのTMBを添加して細胞を３７℃にて１０分間インキュベートする。50μl／ウェルの2M H2SO4を添加してプレートを450nmで読み取る。この方法を用いて、ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質のＴＭ構成部分が細胞表面に結合する能力を確認する。
【０１３９】
（図面の説明）
図１−大腸菌におけるＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ、ＬＣ／Ｃ−環状ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ、ＬＣ／Ｃ−ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ、およびＬＣ／Ｃ−環状ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の発現。
【０１４０】
実施例４に説明した方法を用いて、ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ、ＬＣ／Ｃ−環状ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ、ＬＣ／Ｃ−ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ、およびＬＣ／Ｃ−環状ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質を大腸菌BL21細胞で発現させた。簡潔にいえば、1LのTB培地（0.2%グルコースおよび100μg/mlアンピシリンを含有する）に10mlの出発培養物を接種した。培養物を３７℃にて、OD600nmが約0.5に達するまで増殖させ、この時点で温度を１６℃に下げた。１時間後、培養物を1mM IPTGで誘導し、そしてさらに１６時間増殖させた。
【０１４１】
レーン１、ＬＣ／Ｃ−ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ；
レーン２、ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ；
レーン３、ＬＣ／Ｃ−環状ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ；
レーン４、ＬＣ／Ｃ−環状ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ。
【０１４２】
図２−ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の精製。
【０１４３】
実施例５に説明した方法を用いて、ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質を大腸菌BL21細胞から精製した。簡潔にいえば、細胞破壊後に得た可溶性産物をニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに供した。結合したタンパク質を100mMイミダゾールで溶出し、第Ｘａ因子で処理して融合タンパク質を活性化してマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグを除去し、次いで第２のニッケル荷電アフィニティー捕捉カラムに再度供した。この精製手順から得た試料をSDS-PAGEによって評価した。還元剤の不在下および存在下での最終精製物をそれぞれ［−］および［＋］で記したレーン中に同定する。
【０１４４】
（参考文献）
Floreaら, (2003) J. Drug Targeting 11: 383-390
Jostら, (2001) FEBS lett. 489: 263-269
Leeら, (2001) Eur. J. Biochem. 268: 2004-2012
Mathiasら, (1994) J. Virol. 68: 6811-6814
Rahimら, (2003) Biotechniques 35: 317-324
Roivaninenら, (1991) J. Virol. 65: 4735-4740
Ruoslahti (1996) Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 12: 697-715
Schneiderら, (1999) FEBS lett. 458: 329-332
Writerら, (2004) J. Drug Targeting 12: 185-193
Wuら, (2003) Gene Ther. 10: 1429-1436
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】大腸菌におけるＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ、ＬＣ／Ｃ−環状ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ、ＬＣ／Ｃ−ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ、およびＬＣ／Ｃ−環状ＴＨＡＬＷＨＴ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の発現を示す。
【図２】ＬＣ／Ｃ−ＲＧＤ−ＨＮ／Ｃ融合タンパク質の精製を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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