(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主被験体のＡｂｌファミリーチロシンキナーゼを阻害し、そして、細菌感染またはウイルス感染を処置するための組成物であって、該細菌感染は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに起因するものであり、そして、該ウイルス感染は、ポリオーマウイルス、ＨＩＶまたはワクシニアウイルスに起因するものであり、該組成物は、治療有効量のＡｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターを含み、該組成物は該チロシンキナーゼインヒビターを必要とする被験体への投与に適しており、該Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターは、メシル酸イマチニブまたはメシル酸イマチニブの薬学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグである、組成物。
【請求項２】
前記組成物が前記チロシンキナーゼインヒビターを含み、該チロシンキナーゼインヒビターは、経口投与、経鼻投与、口腔投与、舌下投与、静脈内投与、経粘膜投与、直腸投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、吸入による投与、または髄腔内投与に適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルスに起因する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ヒト免疫不全ウイルスに起因するウイルス感染の処置のための組成物であって、Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターを含み、該Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターは、メシル酸イマチニブまたはメシル酸イマチニブの薬学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグである、組成物。
【請求項５】
前記Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターは、メシル酸イマチニブである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに起因する細菌感染の処置のための組成物であって、Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターを含み、該Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターは、メシル酸イマチニブまたはメシル酸イマチニブの薬学的に受容可能な塩もしくはプロドラッグである、組成物。
【請求項７】
前記Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターは、メシル酸イマチニブである、請求項６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府から委託された研究または開発）
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられたＡＩ０５６０６７に基づく政府支援でなされた。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
（発明の分野）
本発明は、チロシンキナーゼに関する宿主細胞の相互作用に関連するか、またはそれによって引き起こされる病原体感染を処置するためにチロシンキナーゼインヒビターを使用する組成物および方法に関する。特に、本発明は、微生物病原体（例えば、細菌およびウイルス）由来の感染を処置するための、Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
最近数十年で、世界中で致命的な病原体の襲来が目撃されてきた。広範なヒト病原体が存在し、それらとしては、細菌、原生動物、ウイルス、藻類および真菌のような種々の微生物が挙げられる。選択圧に対する先天性の能力が、微生物の進化を促進し、微生物が複雑かつ可変的な環境に適応するのを可能にしてきた。それゆえ、感染性微生物が、合成抗菌化合物または天然抗菌化合物により、感染性微生物を破壊する本発明者らの試みを回避する機構を容易に発達させたことは、おそらく驚くべきことではない。
【０００３】
微生物が、新しい治療法の開発をはるかに超える速度で耐性を発達させるという事実は、今世紀に、途上国および先進国の両方において、単一の最も深刻な公衆衛生の脅威をおそらく間違いなく引き起こす。抗菌戦略が、前世紀にわたって華々しい成功をおさめたことは疑いようが無い。例えば、病原体内の標的に指向される抗菌薬および抗ウイルス薬は、無数の生命を救うために使用されてきた。しかし、このような成功は持続可能ではないという証拠が増えつつある。これらの薬物に対向するために、細菌およびウイルス性病原体は、これらの化合物を不活化するための洗練された機構を発達させてきた。例としては、細菌では、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｇｉｎｏｓａおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＴＢ）の全剤耐性（ｐａｎ−ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）株、ならびにウイルスでは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）が挙げられる。
【０００４】
さらにより厄介なことに、一部の製薬会社（大規模または小規模）において新規抗菌薬の開発を追及する努力が欠如している。増殖を阻害する化学ライブラリの大規模スクリーニングにより、製薬産業による新規抗生物質を開発する努力は、大部分は失敗し、そして新規テトラサイクリンアナログおよび新規スルファニルアミドアナログは、おそらく耐性を生じ、そしてすぐに無用になる。耐性の問題は、疾患の負荷を減らすためのコンプライアンス基準または公衆衛生政策を伴わない、抗生物質および抗ウイルス化合物の無差別かつ不適切な使用によりさらにこじれる。臨床試験の驚愕的なコスト（例えば、１億ドルの予想収入に対し、新規テトラサイクリンを市場に出すのに約４億ドル）、ジェネリック薬品の販売の規制の失敗、および慢性疾患に対する薬物療法からの実質的な収入を生み出す能力により、大規模な製薬会社にたとえ報奨金があったとしても新規抗生物質を開発してもわずかであり、そして、小規模なバイオテクノロジーの会社は、全く資金を有さない。
【０００５】
現在の努力のレベルと同程度の心配の原因がある。開発中の新規薬物のうち、大半（全てではないにしても）の薬物は、販売に際して、おそらくすぐに耐性を生じる（例えば、葉酸生合成インヒビターＩｃａｌｐｒｉｍ）。新規抗ウイルス化合物の探索は、ＨＩＶ流行によって、幾分より成功しており、そして大きく動機付けられてきた。しかし、主としてウイルス標的に対する薬物が開発され、そしてウイルス間の変異速度は、いまだに新規開発を凌いでいる。好ましい開発の一つは、数種の細菌性疾患およびウイルス性疾患に対して有望なワクチンの開発である。しかし、ワクチンは、全ての事例（例えば、幼児において）において成功するとはいえず、適切な供給源が利用可能ではなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、病原体感染の予防および処置のために有効な化合物および方法を開発する、緊急の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
病原体感染を処置するための組成物および方法が提供される。本発明の組成物は、病原体感染に関連するか、または病原体感染を引き起こす、病原体−宿主細胞の相互作用に関係するチロシンキナーゼを阻害する化合物を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、Ａｂｌｅｓｏｎ（Ａｂｌ）ファミリーチロシンキナーゼインヒビターに属するインヒビター（例えば、メシル酸イマチニブ、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン、またはそれらの薬学的に受容可能な塩、鏡像異性体、アナログ、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物もしくは誘導体）の使用に関連する。
【０００８】
本発明の方法は、広範な病原体（細菌、原生動物、ウイルス、藻類および真菌のような微生物病原体が挙げられる）による感染を処置するために、上記の組成物を薬学的有効量で、この組成物を必要とする患者に投与する工程を包含する。特に、本発明は、細菌病原体およびウイルス性病原体に関連する疾患を処置するための、これらの組成物の使用に関連する。これらの細菌病原体およびウイルス性病原体としては、以下が挙げられる：病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（腸病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸出血性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、尿路病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および腸侵入性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ））、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ｍＴＢ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスおよび痘瘡ウイルスが挙げられる）、ポリオーマウイルス（ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスが挙げられる）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）。この組成物は、病原体感染の処置のための治療有効量が送達される限り、任意の投与方法により投与され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、病原体感染に関連するか、または病原体感染を引き起こす、病原体−宿主細胞の相互作用に関係するチロシンキナーゼを阻害する化合物の使用に関する。特に、本発明は、微生物病原体由来の感染に関連する疾患を処置または予防するための、チロシンキナーゼインヒビターの使用に関する。これらの微生物病原体としては、以下のような細菌病原体とウイルス性病原体とが挙げられる：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＴＢ）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルスおよび痘瘡ウイルスが挙げられる）、ポリオーマウイルス（ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスが挙げられる）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）。特に、本発明における使用のためのチロシンキナーゼインヒビターとしては、Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼインヒビター（例えば、メシル酸イマチニブ、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン、またはそれらの薬学的に受容可能な塩、鏡像異性体、アナログ、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物もしくは誘導体）が挙げられる。
【００１０】
本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターは、チロシンキナーゼ媒介性の宿主−病原体の相互作用に関連するか、またはそれによって引き起こされる任意の病原体感染（特に、微生物感染、より特には、ウイルス感染および細菌感染）を処置または予防するために、本発明の方法において使用され得る。理論に拘束されなければ、本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターは、宿主細胞を標的とし、これらの宿主細胞と病原体との相互作用を可能にする細胞機構を妨害し、そしてその際に、病原体により引き起こされる病原性の影響を防止することが考えられる。病原体−宿主の相互作用を調節する細胞機構は顕著に保存されるため、本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターは、広範な病原体による感染に対向するために適用され得ることが考えられる。このような病原体としては、細菌、原生動物、ウイルス、藻類および真菌のような種々の微生物が挙げられる。本発明の好ましい実施形態において、これらの病原体は細菌およびウイルスである。有利なことに、本明細書に記載の治療アプローチは、抗生物質に見られるように病原体ではなく、宿主を標的とする。それゆえ、この治療アプローチは、病原体の薬剤耐性の発達の可能性を減少させる。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、細菌感染を処置または予防するチロシンキナーゼインヒビターの使用に関する。このような感染としては、以下の属および種のメンバーにより引き起こされる感染が挙げられる：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｑｕａｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｍｓｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、ＶｉｂｒｏおよびＹｅｒｓｉｎｉａ。好ましい実施形態において、このような感染としては、以下により引き起こされる感染が挙げられる：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＴＢ）。他の実施形態において、このような感染は、病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株および／または下痢原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株により引き起こされる感染が挙げられ、これらのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株としては、腸病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）、腸出血性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）、尿路病原性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＵＰＥＣ）および腸侵入性Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＥＩＥＣ）が挙げられる。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、ウイルス感染を処置するためのチロシンキナーゼインヒビターの使用に関する。このような感染としては、以下のウイルスファミリーのメンバーにより引き起こされる感染が挙げられる：Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｅｌｔａｖｉｒｕｓ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、ＴｏｂａｍｏｖｉｒｉｄａｅおよびＴｏｑａｖｉｒｉｄａｅ。好ましい実施形態において、このような感染としては、以下により引き起こされる感染が挙げられる：ポックスウイルス（ワクシニアウイルスおよび痘瘡ウイルスが挙げられる）、ポリオーマウイルス（ＪＣウイルスおよびＢＫウイルスが挙げられる）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ−１）。
【００１３】
本発明の方法にしたがって、本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターは、互いに組み合わせて投与されても（例えば、ＳＴＩ−５７１とＳＴＩ−Ｘとを投与する）、他の化合物（特に、抗病原体化合物）と組み合わせて投与されてもよい。このような抗病原体化合物としては、従来の抗菌薬が挙げられる。他の実施形態において、１つ以上の本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターは、例えば、痘瘡に関連する症例において、シドホビルのような他の化合物と組み合わせて使用され得る。ここで、これらの薬剤の併用は、適用されるシドホビルの、より少ない投薬量を提供し、それにより、このヌクレオシドアナログ抗ウイルス化合物の毒性の影響を減少させる。本発明のチロシンキナーゼインヒビターが、病原体感染を処置または予防する併用治療の一部として投与される場合、それらは、いずれかの順序で同時的または連続的にさらなる化合物とともに投与され得る。
【００１４】
一実施形態において、チロシンキナーゼインヒビターは、ワクチンをより有効にするように投与される。例えば、生ウイルスによる生後１か月以内の乳幼児の免疫処置は、母体の抗体がそのワクチンを中和するため、獲得免疫に寄与しないことが周知である（ＢｏｔおよびＢｏｎａ（２００２）Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．４：５１１）。一実施形態において、本発明のチロシンキナーゼインヒビターの適用は、抗体の応答を克服し、そして細胞免疫の獲得を可能にするためのより高用量のウイルスの安全な投与を可能にする。別の実施形態において、本発明のチロシンキナーゼインヒビターは、病原体の免疫クリアランスを促進する。数種の慢性的なウイルス（例えば、ＨＩＶおよびポリオーマ）については、高いウイルス負荷は、Ｔ細胞機能を損なうことが見出されている（Ｗｅｌｓｈ（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：Ｆ１９）。それゆえ、ウイルス負荷を低下させることは、Ｔ細胞機能の回復を可能にし得、それによってクリアランスを促進し得る。別の実施形態において、本発明のチロシンキナーゼインヒビターは、免疫無防備状態の個体へのワクチン投与を可能にする。
【００１５】
本発明のチロシンキナーゼインヒビターは、生存している被験体または患者（ヒト、または研究室のサルもしくはマウスのような動物が挙げられる）における適用のためである。
【００１６】
（本発明の方法における使用のためのチロシンキナーゼインヒビター化合物）
現在、多くのチロシンキナーゼファミリーが認識され、それらとしては、Ａｂｌ、Ｆｅｓ／Ｆｅｒ、Ｓｙｋ／Ｚａｐ７０、Ｊａｋ、Ｔｅｃ、Ｆａｋ、Ａｃｋ、ＳｒｃおよびＣｓｋが挙げられる。数種のチロシンキナーゼファミリーの活性を標的とする阻害性の化合物が、本発明の方法の特定の目的であり、これらのチロシンキナーゼファミリーとしては、チロシンキナーゼのＡｂｌファミリーおよびＳｒｃファミリーのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明の一実施形態において、病原体感染を処置するために使用されるチロシンキナーゼインヒビターは、少なくともチロシンキナーゼのＡｂｌファミリーのメンバー（ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇが挙げられる）を阻害するが、他のファミリーメンバーも阻害し得ることが認識される。
【００１７】
チロシンキナーゼのＡＴＰ結合部位は、高度に保存されているが、Ｘ線結晶学およびキナーゼドメインの相同性に基づくコンピュータによるモデリングから得られる構造上の情報の使用は、選択的インヒビターの開発を導いてきた。ＡｂｌおよびＢＣＲ−Ａｂｌに対して、ＳＴＩ−５７１（メシル酸イマチニブまたはＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）とも呼ばれる；Ｎｏｖａｒｔｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ；米国特許第５，５２１，１８４号（この全体が本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと）は、適度に高い特異性を有する、このようなインヒビターの一つである。ＳＴＩ−５７１は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ；Ｄｒｕｋｅｒら（２００２）Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２０００（Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ）：７１１−１３５；Ｇｏｌｄｍａｎら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：２０３９）を処置することにおいて臨床上有用であることが証明されている。ＳＴＩ−５７１は、ｃ−Ｋｉｔ（Ａｂｌと構造的に類似のＡＴＰ結合部位を有するキナーゼ）の調節不全により引き起こされる間質性腫瘍を処置するために使用されている（Ｈｅｉｎｒｉｃｈら（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９６：９２５）。Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）は、現在、１００ｍｇ〜４００ｍｇのイマチニブ遊離塩基に相当するメシル酸イマチニブを含有するフィルムコーティング錠として市販されている。
【００１８】
本発明の一実施形態において、細菌感染またはウイルス感染を予防または処置するための方法が提供され、この方法は、治療有効量のメシル酸イマチニブ（ＳＴＩ−５７１）を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。
【００１９】
ＳＴＩ−５７１は、メタンスルホン酸４−［（４−メチル−１−ピペラジニル）メチル］−Ｎ−［４−メチル−３−［［４−（３−ピリジニル）−２−ピリミジニル］アミノ］−フェニル］ベンズアミドとして化学的に表記され、以下の構造式を有する：
【００２０】
【化４】
0005520433.tif 000002
本発明の別の実施形態において、細菌感染またはウイルス感染を予防または処置するための方法が提供され、この方法は、治療有効量のメシル酸イマチニブのベンジル化（ｂｅｎｚｙｌａｔｅｄ）誘導体（ＳＴＩ−Ｘと示される）を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。ＳＴＩ−Ｘは、以下の構造式を有する：
【００２１】
【化５】
0005520433.tif 000003
別の実施形態にしたがって、本発明は、以下の式に記載される化合物、または少なくとも１つの塩形成基を含むこのような化合物の塩を包含する：
【００２２】
【化６】
0005520433.tif 000004
ここで：
Ｒ１は、４−ピラジニル；１−メチル−１Ｈ−ピロリル；アミノ置換フェニルもしくはアミノ低級アルキル置換フェニル（各々の場合においてこのアミノ基は、遊離であるか、アルキル化されているか、またはアシル化されている）；５員環の炭素原子で結合した１Ｈ−インドリルまたは１Ｈ−イミダゾリル；あるいは環の炭素原子で結合した非置換ピリジルまたは低級アルキル置換ピリジル（この窒素原子は酸素により置換されていないか、または酸素により置換されている）であり；
Ｒ２およびＲ３は、各々独立に、別の水素または低級アルキルであり、ラジカルＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの１つまたは２つは、各々ニトロ、フルオロ置換低級アルコキシまたは以下の式のラジカル
−Ｎ（Ｒ９）−Ｃ（＝Ｘ）−（Ｙ）ｎ−Ｒ１０
であり、ここで：
Ｒ９は、水素または低級アルキルであり；
Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシイミノまたはＯ−低級アルキル−ヒドロキシイミノであり；
Ｙは、酸素またはＮＨ基であり、
ｎは、０または１であり；そして
Ｒ１０は、少なくとも５個の炭素原子を有する脂肪族ラジカル、または芳香族ラジカル、芳香族−脂肪族ラジカル、脂環式ラジカル、脂環式−脂肪族ラジカル、複素環式ラジカルまたは複素環式脂肪族ラジカルであり；
そして残りのラジカルＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立に、別の水素、低級アルキル（この低級アルキルは、置換されていないか、遊離もしくはアルキル化されたアミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニルで置換されているか、またはモルホリニル、または低級アルカノイル、トリフルオロメチル、遊離ヒドロキシ、エーテル化ヒドロキシもしくはエステル化ヒドロキシ、遊離アミノ、アルキル化アミノもしくはアシル化アミノ、または遊離カルボキシもしくはエステル化カルボキシで置換されている）である。例えば、米国特許第５，５２１，１８４号（この全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００２３】
別の実施形態にしたがって、本発明は、以下の式に記載される化合物、または少なくとも１つの塩形成基を含むこのような化合物の塩を包含する：
【００２４】
【化７】
0005520433.tif 000005
ここで
Ｒ１は、４−ピラジニル；１−メチル−１Ｈ−ピロリル；アミノ置換フェニルもしくはアミノ低級アルキル置換フェニル（各々の場合においてこのアミノ基は、遊離であるか、１つもしくは２つの低級アルキルラジカルでアルキル化されているか、または低級アルカノイルもしくはベンゾイルでアシル化されている）；５員環の炭素原子で結合した１Ｈ−インドリルまたは１Ｈ−イミダゾリル；あるいは環の炭素原子で結合した非置換ピリジルまたは低級アルキル置換ピリジル（この窒素原子は酸素により置換されていないか、または酸素により置換されている）であり；
Ｒ２およびＲ３は、各々独立に、別の水素または低級アルキルであり、ラジカルＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの１つまたは２つは、各々ニトロ、フルオロ置換低級アルコキシまたは以下の式のラジカル
−Ｎ（Ｒ９）−Ｃ（＝Ｘ）−（Ｙ）ｎ−Ｒ１０
であり、ここで：
Ｒ９は、水素または低級アルキルであり；
Ｘは、オキソ、チオ、イミノ、Ｎ−低級アルキル−イミノ、ヒドロキシイミノまたはＯ−低級アルキル−ヒドロキシイミノであり；
Ｙは、酸素またはＮＨ基であり、
ｎは、０または１であり；そして
Ｒ１０は、５個〜２２個の炭素原子を有する脂肪族炭化水素ラジカル；フェニルラジカルまたはナフチルラジカル（これらの各々は、置換されていないか、またはシアノ、低級アルキル、ヒドロキシル−低級アルキル、アミノ−低級アルキル、（４−メチル−ピペラジニル）−低級アルキル、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、ハロゲン、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、ベンゾイルアミノ、カルボキシで置換されているか、または低級アルコキシカルボニルまたはフェニル低級アルキルで置換されている）（このフェニル低級アルキルで置換されたフェニルラジカルは、置換されていないか上記のように置換されている）；３０個までの炭素原子を有するシクロアルキルラジカルまたはシクロアルケニルラジカル（このシクロアルキル部分またはシクロアルケニル部分のシクロアルキル低級アルキルまたはシクロアルケニル低級アルキルは各々、３０個までの炭素原子を有する）；単環式ラジカル（５〜６個の環構成原子、ならびに窒素、酸素および硫黄から選択される１〜３個の環のヘテロ原子を有し、１つまたは２つのベンゼンラジカルがこの単環式ラジカルに融合していてもよい）；あるいはそのような単環式ラジカルで置換された低級アルキルであり；
そして残りのラジカルＲ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立に、別の水素、低級アルキル（この低級アルキルは、置換されていないか、あるいはアミノ、低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニルで置換されているか、またはモルホリニルまたは低級アルカノイル、トリフルオロメチル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、低級アルカノイルオキシ、ハロゲン、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、低級アルカノイルアミノ、ベンゾイルアミノ、カルボキシ、または低級アルコキシカルボニルで置換されている）である。例えば、米国特許第５，５２１，１８４号（この全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００２５】
細胞増殖の阻害は強力な選択であるため、癌患者は、ＳＴＩ−５７１への耐性を発達させる。このＳＴＩ−５７１への耐性を発達させる傾向は、より強力なチロシンキナーゼインヒビター（例えば、ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン（ＰＤ）化合物）への探索を導いた。ＰＤはより強い効力を示すが、基質特異性についてはＳＴＩ−５７１と多少異なる。そしてＰＤはまた、Ａｂｌファミリーチロシンキナーゼを阻害することに加えて、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、ＰＤＧＦＲキナーゼおよびＦＧＦＲキナーゼも阻害し得る（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９（５４８６）：１９３８〜１９４２；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２（１５）：４２４４〜４２５５；Ｄｏｒｓｅｙら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：３１２７；Ｋｒａｋｅｒら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６０：８８５）。ＰＤは単に、これらのキナーゼが活性状態であるときに、ＡＴＰの結合を競合的に阻害する。
【００２６】
本発明の一実施形態において、細菌感染またはウイルス感染を予防または処置するための方法が提供され、この方法は、治療有効量のピリド［２，３−ｄ］ピリミジンを、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。本発明にしたがって使用され得るピリド［２，３−ｄ］ピリミジンとしては、Ｋｒａｋｅｒら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６０（７）：８８５〜８９８に記載される化合物ならびにＫｌｕｔｃｈｋｏら（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：３２７６〜３２９２およびＢｏｓｃｈｅｌｌｉら（１９９８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１：４３６５〜４３７７から導入される方法を使用して合成される化合物が挙げられる。このような化合物としては、以下の構造式により示される化合物が挙げられる：
【００２７】
【化８】
0005520433.tif 000006
ここでＲは以下に相当する：
【００２８】
【化９】
0005520433.tif 000007
【００２９】
【化１０】
0005520433.tif 000008
別の実施形態において、本発明にしたがった使用のために選択されるピリド［２，３−ｄ］ピリミジンは、以下からなる群から選択される：
ａ．ＰＤ１６６３２６（６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（３−ヒドロキシメチルフェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）；
ｂ．ＰＤ１７３９５２（６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−２−（４−モルホリノフェニルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）；
ｃ．ＰＤ１７３９５５（６−（２，６−ジクロロフェニル）−８−メチル−２−（３−メチルスルファニル−フェニルアミノ）−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）；
ｄ．ＰＤ１７３９５６（６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−フルオロフェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）；
ｅ．ＰＭ７３９５８（６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−エトキシフェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）；および
ｆ．ＰＤ１８０９７０（６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−（４−フルオロ−３−メチルフェニルアミノ）−８−メチル−８Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−オン）。
【００３０】
ＢＭＳ−３５４８２５は、ＳＴＩ−５７１耐性の症例において有用であることが示されている別のチロシンキナーゼインヒビターである。ＢＭＳ−３５４８２５は、より緩い立体配座要求性でＡｂｌに結合し、ＳＴＩ−５７１と比較して２対数高い効力でＡｂｌチロシンファミリーキナーゼを阻害することが示されているＳＲＣファミリーキナーゼの合成低分子インヒビターである（Ｓｈａｈら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５：３９９〜４０１）。
【００３１】
したがって、本発明の一実施形態において、細菌感染またはウイルス感染を予防または処置するための方法が提供され、この方法は、治療有効量のＢＭＳ−３５４８２５（［Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（６−（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｙｉｍｉｄｉｎ）−４−イルアミノ）チアゾール−５−カルボキサミドとも呼ばれる）を投与する工程を包含する。ＢＭＳ−３５４８２５は以下の構造を有する。
【００３２】
【化１１】
0005520433.tif 000009
本発明は、上記の特定の化合物の使用だけではなく、任意のその薬学的に受容可能な塩、鏡像異性体、アナログ、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物または誘導体の使用もまた包含することが理解される。
【００３３】
（薬学的組成物）
チロシンキナーゼインヒビターは、既に薬物開発の対象であるか、または特定の癌を処置するために使用されているので、データは、これらがヒトにおいて長期間（月）の間でさえもよく許容され、かつ毒性を示さないことを確証している。これらの薬物は、経口摂取され得、室温において安定であり、そして製造するのに簡単かつ安価である。
【００３４】
本発明の一実施形態において、病原体感染（特に、微生物感染）を処置または予防する方法は、このような処置を必要とする生存している被験体に、この生存している被験体への投与に適切な薬学的組成物の有効量を投与する工程を包含する。この薬学的組成物は、以下を含む：（ａ）少なくとも１種の病原体（特に、微生物）に応答性の、この生存している被験体の宿主細胞由来の阻害可能な応答を増強するために有効な量での、少なくとも１種のチロシンキナーゼインヒビター；および（ｂ）この生存している被験体への投与に適切な薬学的に受容可能なキャリア。
【００３５】
別の実施形態において、本発明はまた、生存している被験体への投与に適切な薬学的組成物に関し、この薬学的組成物は以下を含む：（ａ）少なくとも１種の細菌に応答性の、この生存している被験体の宿主細胞由来の阻害可能な応答を増強するために有効な量での、少なくとも１種のチロシンキナーゼインヒビター；および（ｂ）この生存している被験体への投与に適切な薬学的に受容可能なキャリア。
【００３６】
別の実施形態において、本発明はまた、生存している被験体への投与に適切な薬学的組成物に関し、この薬学的組成物は以下を含む：（ａ）少なくとも１種のウイルスに応答性の、この生存している被験体の宿主細胞由来の阻害可能な応答を増強するために有効な量での、少なくとも１種のチロシンキナーゼインヒビター；および（ｂ）この生存している被験体への投与に適切な薬学的に受容可能なキャリア。
【００３７】
薬学的に受容可能なキャリアは、生存している被験体への経口投与に適切であり得、そして薬学的組成物は、生存している被験体へ経口投与される。薬学的に受容可能なキャリアはまた、生存している被験体への経鼻投与に適切であり得、そして薬学的組成物は、生存している被験体へ経鼻投与される。または、薬学的に受容可能なキャリアは、生存している被験体への直腸投与に適切であり得、そして薬学的組成物は、生存している被験体へ直腸投与される。さらに、薬学的に受容可能なキャリアは、生存している被験体への静脈内投与に適切であり得、そして薬学的組成物は、生存している被験体へ静脈内投与される。その上、薬学的に受容可能なキャリアはまた、生存している被験体への接種による投与に適切であり得、そして薬学的組成物は、生存している被験体へ接種によって投与される。加えて、薬学的に受容可能なキャリアはまた、生存している被験体への皮下投与に適切であり得、そして薬学的組成物は、生存している被験体へ皮下投与される。したがって、処置または予防される病原体感染に依存して、本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターを含む薬学的組成物は、任意の適切な経路により投与され得る。この適切な経路としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：経口経路、経鼻経路、口腔経路、舌下経路、静脈内経路、経粘膜経路、直腸経路、局所経路、経皮経路、皮下経路、吸入による経路、または髄腔内経路。
【００３８】
特に、別の実施形態において、これらの薬学的組成物は、経口投与可能な懸濁物、飲用の溶液もしくは錠剤；経鼻スプレーもしくは経鼻ドロップ；または油性（ｏｌｅｇｅｎｏｕｓ）の懸濁物もしくは油性の坐剤の形態であり得る。
【００３９】
懸濁物として経口投与される場合、本発明の組成物は、薬学的処方物の分野において周知の技術により調製され、そして、容積を与えるための微結晶性セルロース、懸濁剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、および当該分野において公知の甘味剤／矯味矯臭剤を含み得る。即時放出性の錠剤の場合、これらの組成物は、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトース、ならびに／または当該分野において公知である他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤を含み得る。口内洗浄またはリンスの処方物中の成分としては、抗菌剤、界面活性剤、共界面活性剤（ｃｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）、油、水および当該分野において公知の甘味剤／矯味矯臭剤のような他の添加剤が挙げられる。
【００４０】
飲用の溶液により投与される場合、この組成物は、適切なｐＨに調整され、キャリアとともに飲用液体（例えば、水）に溶解された本明細書に記載の１種以上のチロシンキナーゼインヒビター化合物を含む。この飲用液体に溶解される化合物は、１ｎＭ以上のオーダーで、血流中の濃度を与えるのに十分な量であり、好ましくは、インビボで有効である有効量である。
【００４１】
経鼻投与される場合、これらの組成物は、薬学的処方物の分野において周知の技術により調製され、そして、ベンジルアルコールもしくは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティを増進させる吸収促進物質、および／または当該分野において公知の可溶化剤もしくは分散剤を利用して、生理食塩水の溶液として調製され得る（例えば、Ａｎｓｅｌら（１９９９）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（第７版）を参照のこと）。
【００４２】
好ましくは、これらの組成物および処方物は、適切な非毒性の薬学的に受容可能な成分とともに調製される。これらの成分は、経鼻投薬形態の調製における当業者にとって公知であり、そしてこれらの成分のうちの数種は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｔｏｎ、ＰＡ；１９９０）（本分野における標準的な参考文献）に見出され得る。適切なキャリアの選択は、所望の経鼻投薬形態（例えば、溶液、懸濁物、軟膏またはゲル）の正確な性質に強く依存する。経鼻投薬形態は、一般的に、活性成分に加えて大量の水を含む。微量の他の成分（例えば、ｐＨ調整剤、乳化剤もしくは分散剤、保存剤、界面活性剤、ゼリー化剤または緩衝化剤ならびに他の安定化剤および可溶化剤）もまた、存在し得る。
【００４３】
本発明の処方物は、以下を多様に含み得る：（１）ｐＨを調整するための他の酸および塩基；（２）他の張度付与剤（例えば、ソルビトール、グリセリンおよびブドウ糖）；（３）他の抗菌保存剤（例えば、他のパラヒドロキシ安息香酸エステル、ソルビン酸塩、安息香酸塩、プロピオン酸塩、クロルブタノール、フェニルエチルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび水銀剤）；（４）他の粘度付与剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコールおよび他のゴム）；（５）適切な吸収増進剤；（６）安定化剤（例えば、重硫酸塩およびアスコルビン酸塩のような抗酸化剤）、金属キレート化剤（例えば、エデト酸（ｅｄｅｎｔａｔｅ）ナトリウム）および薬物溶解性増進剤（例えば、ポリエチレングリコール）。
【００４４】
上記の経鼻処方物は、ドロップ、スプレーとしてか、または任意の他の鼻内投薬形態により投与され得る。必要に応じて、送達系は、単位用量の送達系であり得る。用量あたりに送達される溶液または懸濁物の容量は、５μＬ〜５００μＬのどれかであり得、そして好ましくは５μＬ〜２００μＬであり得る。これらの種々の投薬形態のための送達系は、点滴瓶、プラスティック製搾り出し装置、噴霧器、および単位用量包装または複数用量包装のいずれかでの同様な物であり得る。ロゼンジは、米国特許第３，４３９，０８９号（これらの目的のために本明細書で参考として援用される）にしたがって調製され得る。
【００４５】
坐剤の形態で直腸投与される場合、これらの組成物は、この薬物と適切な無刺激性賦形剤（ココアバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコール）とを混合することにより調製され得る。この賦形剤は、通常の温度では固体であるが、直腸腔内において液化および／または溶解し、薬物を放出する。
【００４６】
１日あたり１ｍｇ以上のオーダーでの投薬レベルが、本明細書の上記の宿主の生体中の病原体感染および関連する疾患の処置または予防において有用であり得る。本発明の一実施形態において、病原体感染の処置または予防を必要とする患者は、体重約７０ｋｇの患者に対し、本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターを１日あたり以下の量で投与される：約１ｍｇ以上、約５ｍｇ以上、約１０ｍｇ以上、約２０ｍｇ以上、約３０ｍｇ以上、約４０ｍｇ以上、約５０ｍｇ以上、約６０ｍｇ以上、約７０ｍｇ以上、約８０ｍｇ以上、約９０ｍｇ以上、約１００ｍｇ以上、約１１０ｍｇ以上、約１２０ｍｇ以上、約１３０ｍｇ以上、約１４０ｍｇ以上、約１５０ｍｇ以上、約１６０ｍｇ以上、約１７０ｍｇ以上、約１８０ｍｇ以上、約１９０ｍｇ以上、約２００ｍｇ以上、約２１０ｍｇ以上、約２２０ｍｇ以上、約２３０ｍｇ以上、約２４０ｍｇ以上、約２５０ｍｇ以上、約２６０ｍｇ以上、約２７０ｍｇ以上、約２８０ｍｇ以上、約２９０ｍｇ以上、約３００ｍｇ以上、約３１０ｍｇ以上、約３２０ｍｇ以上、約３３０ｍｇ以上、約３４０ｍｇ以上、約３５０ｍｇ以上、約３６０ｍｇ以上、約３７０ｍｇ以上、約３８０ｍｇ以上、約３９０ｍｇ以上、約４００ｍｇ以上、約４１０ｍｇ以上、約４２０ｍｇ以上、約４３０ｍｇ以上、約４４０ｍｇ以上、約４５０ｍｇ以上、約４６０ｍｇ以上、約４７０ｍｇ以上、約４８０ｍｇ以上、約４９０ｍｇ以上、約５００ｍｇ以上、約５１０ｍｇ以上、約５２０ｍｇ以上、約５３０ｍｇ以上、約５４０ｍｇ以上、約５５０ｍｇ以上、約５６０ｍｇ以上、約５７０ｍｇ以上、約５８０ｍｇ以上、約５９０ｍｇ以上、あるいは約６００ｍｇ以上。いくつかの実施形態において、投与される用量は、体重約７０ｋｇの患者に対し、１日あたり約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ（約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１２５ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１７５ｍｇ、約２００ｍｇ、約２２５ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２７５ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、約１０００ｍｇ、および約１ｍｇ〜約１０００ｍｇの間の他のこのような値が挙げられる）の範囲である。しかしながら、任意の特定の患者のための特定の用量レベルおよび投薬頻度は、変更し得、かつ種々の因子（使用される特定の塩または他の形態の活性、この化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、身体全体の健康状態、性別、食事、投与様式および投与時間、排出速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重症度ならびに宿主が受けている治療が挙げられる）に依存することが理解される。
【００４７】
好ましい一レジメンにおいて、このような投薬量は、経鼻スプレーまたは経口ロゼンジのいずれかにより、それを必要とする被験体に投与され得る。
【００４８】
特定の病原体感染（特に、微生物感染）を処置または予防するための本発明の薬学的組成物を使用することの有効度は、例えば、患者の感染因子、感染の段階、感染の重症度、年齢、体重および性別などに依存して変化し得る。
【００４９】
「処置」は、本明細書において、本明細書の他の部分に記載される病原体感染、病原体感染に関連する症状または病原体感染の発達への素因を有する被験体への本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターの適用または投与として定義される。この「処置」の目的は、病原体感染、病原体感染に関連する任意の症状または病原体感染の発達への素因を治療するか、治癒させるか、緩和するか、軽減するか、変更させるか、治療（ｒｅｍｅｄｙ）するか、回復させるか、改善するかまたは、それらに影響することである。「処置」により、本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターを含む薬学的組成物の、本明細書の他の部分に記載される病原体感染、病原体感染に関連する症状または病原体感染の発達への素因を有する被験体への適用または投与もまた意図される。この「処置」の目的は、病原体感染、病原体感染に関連する任意の症状または病原体感染の発達への素因を治療するか、治癒させるか、緩和するか、軽減するか、変更させるか、治療するか、回復させるか、改善するかまたは、それらに影響することである。
【００５０】
本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターは、本明細書の上記の病原体感染を処置または予防するのに有用である。本明細書に記載の様式による病原体感染の処置または予防は、病原体の発生（特に、ポリオーマウイルス（例えば、ＪＣおよびＢＫ））と病原体感染とが移植された臓器の機能を減退させる臓器移植患者（例えば、腎移植患者）に対し、特に有用である。同様な様式で、ＨＩＶ感染は、脳内の希突起神経膠細胞を破壊し得、ＡＩＤＳ関連性痴呆を導く。したがって、本明細書の他の部分に記載される病原体感染を処置または予防することに加えて、本明細書に記載のチロシンキナーゼインヒビターは、ＨＩＶ陽性患者およびＡＩＤＳ患者ならびに臓器移植（腎移植）を受ける患者における二次感染を制御するために使用され得、そしてＡＩＤＳ関連性痴呆を制御するために使用され得る。さらに、これらのチロシンキナーゼインヒビターは、免疫無防備状態の個体（ＨＩＶ陽性患者およびＡＩＤＳ患者が挙げられる）および臓器移植を受ける患者における、感染性ビリオンの拡散（例えば、ワクシニア感染に伴う）を防止するために予防的に使用され得る。
【００５１】
（実験）
以下の実験では、病原体（特に、細菌性およびウイルス性の病原体）による宿主細胞の感染に対するチロシンキナーゼインヒビターの効果を試験した。これらの実験をさらに詳細に記載する前に、研究された病原体および宿主−病原体相互作用の基本的な説明を提供することが有用である。
【００５２】
腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＰＥＣ）および腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉ（ＥＨＥＣ）を含む病原性のＥ．ｃｏｌｉは、水および食品備蓄を汚染し、乳児の下痢を引き起こす。ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣは、ＮＩＡＩＤによってカテゴリＢ病原体として分類される。途上諸国において、ＥＰＥＣは、毎年およそ２千万人に疾病をもたらし、５００，０００人を死亡させる（Ｇｏｏｓｎｅｙら（２０００）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６：１７３）。「ロウハンバーガー病（ｒａｗ  ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）」の原因因子であるＥＨＥＣは、食品を汚染し、下痢およびしばしば致死性の結果である溶血性尿毒症症候群と関連する。ＥＨＥＣは、溶血性尿毒症症候群と関連する症状を引き起こす２種類の志賀毒素を有する（Ｐｅｒｍａら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，４０９（６８１９）：５２９−３３）。
【００５３】
ＥＰＥＣ、ＥＨＥＣ、およびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ（Ｃ．）ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ（マウスＥＰＥＣ）は、アクチンで充填された膜の突出（または「台座様構造（ｐｅｄｅｓｔａｌ）」）を、自己の下の上皮細胞の表面上に形成する（Ｋｎｕｔｔｏｎら（１９８９）Ｌａｎｃｅｔ  ２：２１８；ＭｃＤａｎｉｅｌら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２３：３９９）。台座様構造は、食菌作用を妨害し、宿主でのコロニー形成を可能にし、その後の疾患の発症のために必要とされる（Ｇｏｏｓｎｅｙら（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６７：４９０；Ｊｅｒｓｅら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：７８３９）。台座様構造が形成される機構は、広範囲にわたって調査されている（Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１：３８９）。台座様構造の発達および下痢の発症の両方は、Ｔｉｒと称される宿主細胞中へ分泌される細菌のタンパク質をリン酸化する、宿主のチロシンキナーゼの細菌の下での活性化に決定的に依存している（Ｋｅｎｎｙら（１９９７）Ｃｅｌｌ，９１：５１１；Ｋｅｎｎｙ（１９９９）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：１２２９）。細菌のリガンドであるインチミン（ｉｎｔｉｍｉｎ）の結合によって、台座様構造形成をもたらす宿主のシグナル伝達カスケードが開始される。
【００５４】
ＥＰＥＣの病原における分水界での事象は、ＥＰＥＣのＴｉｒのリン酸化である（Ｋｅｎｎｙ（１９９９）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３１：１２２９）。リン酸化されると、ＥＰＥＣのＴｉｒは、宿主細胞タンパク質の動員（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）および活性化を促進し、この宿主細胞タンパク質は、アクチン重合を開始し、台座様構造と接触し、台座様構造を支持する。この宿主細胞タンパク質として、Ｎｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、およびＡｒｐ２／３複合体が挙げられる（Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１：３８９；Ｌｏｍｍｅｌら（２００１）ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ．，２：８５０；Ｇｒｕｅｎｈｅｉｄら（２００１）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，３：８５６１９；Ｒｏｈａｔｇｉら（１９９９）Ｃｅｌｌ，９７：２２１）。
【００５５】
ワクシニアウイルス（ＶＶ）および痘瘡ウイルスは、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーであり、これらのウイルスは、配列が９５％同一である（Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（１９９０）Ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐ．２３３６；Ｍｏｓｓ（１９９０）Ｐｒｏｘｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐ．２３３６）。ＶＶウェスタン・リザーブ（ＷＲ）株は、痘瘡の原因である大痘瘡ウイルスに対する接種物質として役立つ。ＶＶおよび痘瘡ウイルスは、哺乳動物細胞に侵入し、核外複製「工場」を確立し、エンベロープビリオン（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｉｏｎ）を産生する（Ｍｏｓｓ（１９９０）Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ｐ．２３３６）。これらのビリオンは、微小管モーターを用いて細胞表面へ移動し、アクチンを重合することによって、向かい合っている細胞に移動する（Ｐｌｏｕｂｉｄｏｕら（２０００）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９（１５）：ｐ．３９３２−４４；Ｒｉｅｔｄｏｒｆら（２００１）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３（１１）：ｐ．９９２−１０００；ＷａｒｄおよびＭｏｓｓ（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（２３）：ｐ．１１６５１−６３；ＷａｒｄおよびＭｏｓｓ（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５（１０）：ｐ．４８０２−１３；Ｃｕｄｍｏｒｅら（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０９（Ｐｔ７）：ｐ．１７３９−４７；Ｃｕｄｍｏｒｅら（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５（４）：ｐ．１４２−８）。そこで、これらのビリオンはアクチンを重合し、宿主細胞の細胞質を通って細胞膜へと自己を推進し、そこで細胞から出て向かい合っている細胞へ侵入する。アクチンの「コメット（ｃｏｍｅｔ）」の形成は、ワクシニアが細胞から細胞へと拡散するために不可欠であると考えられる。アクチンに基づく運動性に関して、ワクシニアは、粒子表面へのチロシンキナーゼを含む宿主細胞の分子の動員に依存する。最終的に、この宿主細胞は、細胞溶解反応を起こし、それによってさらなる感染性粒子を放出する。
【００５６】
チロシンキナーゼおよびセリン／スレオニンキナーゼは、ウイルス感染のいくつかの局面に関して重要である。アクチンに基づく移動性は、宿主細胞のｃ−ＳｒｃおよびＡｂｌに関連するチロシンキナーゼの活性に依存し、複製は、少なくとも部分的に、ウイルスのキナーゼに依存するが、その正確な機構はあまりよく理解されていない（Ｆｒｉｓｃｈｋｎｅｃｈｔら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１（６７５６）：９２６−９２９；Ｒｅｍｐｅｌら（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（７）：４４１３−４４２６；Ｔｒａｋｔｍａｎら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９（１０）：６５８１−６５８７；Ｔｒａｋｔｍａｎら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（３６）：２１４５８−２１４６１）。
【００５７】
ポックスウイルスの宿主細胞への侵入の後、このビリオンは、核近傍（ｊｕｘｔａｎｕｃｌｅａｒ）の位置へ移動し、そこで、このビリオンは、１０４個まで鎖状体（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｃ）のゲノムを複製する（Ｍｏｓｓ（１９９０）Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．２３３６）。この鎖状体は、エンベロープで被膜された個々の粒子（細胞内成熟ビリオン（ＩＭＶ）と称される）を最終的に形成し、その一部はさらなる膜内に包まれ細胞内エンベロープビリオン（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｖｉｒｉｏｎ）（ＩＥＶ：Ｓｍｉｔｈら（２００３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｐｐ．３２３−３４２）を形成する。細胞溶解反応は、この細胞からＩＭＶを放出する。しかし、細胞溶解反応に先立ち、ＩＥＶは、キネシン／微小管輸送系を介して宿主細胞の抹消へ向かって移動する（Ｃａｒｔｅｒら（２００３）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｐｐ．２４４３−２４５８；Ｈｏｌｌｉｎｓｈｅａｄら（２００１）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｐｐ．３８９−４０２；Ｒｉｅｔｄｏｒｆら（２００１）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｐｐ．９９２−１０００；ＷａｒｄおよびＭｏｓｓ（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｐｐ．，１１６５１−１１６６３）。
【００５８】
細胞から出るために、ＩＥＶ粒子は、宿主細胞の細胞膜と融合し、細胞関連エンベロープウイルス（ＣＥＶ）を形成し、その２つの外膜のうちの一方を後に残す（Ｓｍｉｔｈら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｐｐ．，３２３−３４２；Ｓｍｉｔｈら（２００２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｐｐ．２９１５−２９３１）。ＣＥＶは、直接的に分離するか、または、アクチン重合を開始し、アクチンで充填された膜隆起の上で向かい合っている細胞へ向かってこの粒子を推進し、そして分離する（Ｓｍｉｔｈら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｐｐ．，３２３−３４２）。アクチンの運動性は、ＡｂｌおよびＳｒｃファミリーのキナーゼに依存するが、細胞外エンベロープウイルス（ＥＥＶ）を形成するＣＥｖの分離は、Ａｂｌファミリーのキナーゼに依存する（Ｓｍｉｔｈら（２００３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｐｐ．，３２３−３４２）。
【００５９】
ＣＥＶを取り囲む膜の中に位置される、ＶＶ  Ａ３６Ｒ遺伝子によってコードされるタンパク質（Ａ３６Ｒと称される）が、アクチン重合およびビルレンスのために必要とされることは公知である（Ｗｏｌｆｆｅら（１９９８）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｐｐ．２０−２６；ＰａｒｋｉｎｓｏｎおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ｐｐ．３７６−３９０）。アクチン重合および細胞から細胞への拡散における分水界での事象は、宿主細胞のチロシンキナーゼによるＡ３６Ｒのチロシン残基のリン酸化である（Ｎｅｗｓｏｍｅら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：１２４−１２８；Ｆｒｉｓｃｈｋｎｅｃｈｔら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１（６７５６）：９２６−９２９）。上記のＥＰＥＣ  Ｔｉｒタンパク質とＶＶタンパク質Ａ３６Ｒとの間には顕著な相同性が存在し、従って、ＥＰＥＣと同様であるが同一ではない宿主シグナル因子を用いて、アクチンを重合し宿主細胞から出る（ＦｒｉｓｃｈｋｎｅｃｈｔおよびＷａｙ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１（１）：３０−３８）。
【００６０】
以前の報告は、哺乳動物のチロシンキナーゼであるｃ−Ｓｒｃがビリオンに局在することを示唆する（Ｆｒｉｓｃｈｋｎｅｃｈｔら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１（６７５６）：９２６−９２９）。さらに、微小管からのビリオンの放出およびアクチンテイル（ａｃｔｉｎ  ｔａｉｌ）の形成のためのアクチンの核形成は、Ｓｒｃキナーゼおよび他のキナーゼによるＡ３６Ｒのリン酸化に依存する（Ｎｅｗｓｏｍｅら（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０６：１２４−１２８；Ｆｒｉｓｃｈｋｎｅｃｈｔら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ４０１（６７５６）９２６−９２９；Ｋａｌｍａｎら（１９９９）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１：３８９−３９１）。リン酸化されると、Ａ３６Ｒは、キネシンの分離、ならびに宿主細胞のタンパク質の動員および活性化を促進し、この宿主細胞のタンパク質は、この粒子の下でアクチン重合を開始する。この宿主細胞のタンパク質として、Ｎｃｋ、Ｇｒｂ２、Ｎ−ＷＡＳＰおよびＡｒｐ２／３複合体が挙げられる（ＦｒｉｓｃｈｋｎｅｃｈｔおよびＷａｙ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１（１）：３０−３８；Ｍｏｒｅａｕら（２０００）Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，ｐｐ．４４１−４４８；Ｓｃａｐｌｅｈｏｒｎら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，ｐｐ．７４０−７４５）。実際、ワクシニアは、宿主の細胞質を通って自己を推進するために、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉによって用いられる機構と同様の機構を用いる。例えば、ＳｈｉｇｅｌｌａおよびＶａｃｃｉｎｉａのどちらも、アクチンを重合する手段として、Ｎ−ＷＡＳＰおよびＡｒｐ２／３複合体を動員し活性化する（ＦｒｉｓｃｈｋｎｅｃｈｔおよびＷａｙ（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１（１）：３０−３８）。
【００６１】
（実験１−ＳｒｃファミリーチロシンキナーゼおよびＡｂｌファミリーチロシンキナーゼは、ＶＶのアクチンの運動性および感染性ビリオンの放出に関係する）
本実験の目的は、Ｓｒｃファミリー（ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｆｙｎ、およびｃ−Ｙｅｓ）ならびにＡｂｌファミリー（ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇ）のメンバーを含む数種のチロシンキナーゼが、アクチンの運動性および感染性ＥＥＶの放出のために必要とされるか否かを試験することであった。これらのキナーゼの一つ以上を欠失する線維芽細胞をこれらの酵素の潜在的インヒビターと共に用いた（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａら（２０００）Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，ｐｐ．２８−５７）。
【００６２】
（方法）
３Ｔ３細胞、Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−マウス由来の３Ｔ３細胞、またはＳｒｃ−／−／Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−マウス由来の３Ｔ３細胞を、カバーガラス上で血清を含むＤＭＥＭ中で培養し、１６時間３７℃で、適切な量の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）でのＶＶ（ＷＲ株）またはＶＶ  ＧＦＰ−Ｂ５Ｒと共にインキュベートした。いくつかの実験について、細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ−６（Ｒｏｃｈｅ）を用いたプラスミドベクターによる感染の１〜２日前にトランスフェクトした。Ａｂｌ−Ｔ３１５Ｉ、Ａｒｇ１−Ｔ３１４Ｉ、およびＳｒｃ−Ｔ３３８Ｍを、Ｑｕｉｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位指向性変異誘発技術を用いて構築した。ＰＤ化合物であるＰＤ１６６３２６、ＳＫＩ−ＤＲＶ−１−１０を、本明細書の他の場所に記載されるように合成した。これらの化合物の効果は、全てのアッセイにおいて識別不能であった。ＳＴＩ−５７１を、本明細書の他の場所に記載されるように合成した。ＳＴＩ−５７１、ＰＤ化合物、およびＰＰ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を、１００％ＤＭＳＯ中に溶解した。ＰＤ、ＰＰ２、またはＤＭＳＯを、いずれか感染の一時間前に細胞に加えた。「リバーサル（ｒｅｖｅｒｓａｌ）」実験のために、化合物またはＤＭＳＯを、ＶＶの添加の１４時間後に細胞に加え、そしてこれらの細胞をその後１５分間〜２時間固定した。
【００６３】
免疫蛍光解析のために、細胞を２％ホルムアルデヒド中で固定し、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００中で浸透（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅ）させた。ＶＶを４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ：１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を用いて染色することによって認識し、アクチンテイルを、ＦＩＴＣ−ファロイジン（１μｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて染色することによって認識した。本研究において用いた一次抗体および濃度は以下のようである：α−ＷＡＳＰ  ｐＡｂ（アフィニティ精製済、１：２００希釈）、α−ＨＡ  ｍＡｂ（３Ｆ１０；０．０１μｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ）、α−Ｎｃｋ  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、α−Ａｂｌ  ｍＡｂ（ＡＢ３；過剰発現Ａｂｌタンパク質に対して０．５μｇ／ｍｌ；内因性Ａｂｌタンパク質に対して５０μｇ／ｍｌ；８Ｅ９；０．０５μｇ／ｍｌ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ｕ−Ｓｒｃ  ｐＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、α−Ａｒｇ、α−ｐＹ４１２、およびα−ＴＷ２．３  ｍＡｂ（腹水、１：２０００、顕微鏡法用）。外因性ｃ−Ａｂｌ−ＷＴを発現する細胞を、より低いα−Ａｂｌ  ｍＡｂ濃度を用いて比較的高い蛍光強度によって識別した。従って、内因性ｃ−Ａｂｌ様タンパク質を検出するために用いた曝露よりも著しく短時間の曝露によって、画像を得た。二次抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手した。
【００６４】
免疫沈降実験のために、未感染細胞またはＶＶで感染させた細胞を、冷リン酸緩衝化生理食塩水を用いて３回リンスし、２０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、１０％のグリセロール、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、およびプロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｍｉｘ；Ｒｏｃｈｅ）中で３０分間４℃で溶解した。サンプルを、２０分間、１０，０００×ｇで遠心した。サンプルを、一次抗体（α−ＹＦＰ、α−Ｓｒｃ、またはα−Ａｂｌ）と共に２時間４℃でインキュベートし、さらに１時間プロテインＧビーズと共にインキュベートした。このビーズを、溶解緩衝液で洗浄し、免疫ブロット法によって解析するか、またはインビトロキナーゼアッセイにおいて使用した。インビトロキナーゼアッセイのために、ＧＳＴ−Ｃｒｋ（ＡｂｌおよびＡｒｇについての）を基質として用い、２０μｌのＫｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭのＴｒｉｓ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ）中の１０μＭのＡＴＰ、および、前もって細胞内へトランスフェクトし、α−Ａｂｌ抗体またはα−ＹＦＰ抗体を用いた免疫沈降法によりアガロースビーズで単離したｃ−Ａｂｌ、ｃ−Ａｂｌ−Ｔ３１５Ｉ、ＹＦＰ−Ａｒｇ、またはＹＦＰ−Ａｒｇ−Ｔ３１４Ｉと共に、３０分間２３℃でインキュベートした。サンプルをそれからＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、α−リン酸化チロシン抗体である４Ｇ１０、またはα−Ａｂｌ  ｍＡｂ  ＡＢ３、あるいはα−ＹＦＰを用いて免疫ブロットした。
【００６５】
６３×Ｎ．Ａ．１．４レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を用いるＺｅｉｓｓ  ２００Ｍ倒立顕微鏡に基づく多重波長の広視野三次元顕微鏡システム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）に備え付けた科学等級の冷却型電荷結合素子（Ｃｏｏｌ−Ｓｎａｐ  ＨＱ）を用いて、画像を得た。免疫蛍光サンプルを、室温で標準的なＳｅｄａｔフィルターセット（Ｃｈｒｏｍａ）を用いて、サンプルを通して連続する０．２０μｍの焦点面で画像化し、焦点外の光を、強制的双方向逆重畳（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）アルゴリズムによって除去した。
【００６６】
プラークアッセイのために、細胞を２４−ウェルのディッシュ中に蒔き、コンフルエンシーまで培養し、種々の一連の希釈率でのＶＶ−ＷＲと共にインキュベートした。一時間後、これらの細胞を、過剰のウイルスを除去するために洗浄し、そしてこれらの細胞をさらに３〜４日間インキュベートした。細胞はそれから固定され、２０％のエタノールおよび４％のクマシーブルーを用いて染色し、プラークを可視化した。分泌されたＥＥＶの測定のために、感染の２４時間後に培地を除去し、未感染の３Ｔ３細胞の単層に加え、そしてその４日後にプラークの数を評価した。異なる細胞株が感染されたか否かを決定する（プラーク減少アッセイ）ために、細胞の単層を超音波処理して細胞内のウイルス粒子を放出させ、遠心して細胞残屑を除去した。この上清を、それから連続的に希釈し、未感染の３Ｔ３細胞の単層に加え、そして３〜４日後にプラークの数を評価した。
【００６７】
６週齢のＣ５７／Ｂ１６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、全てのマウスが７日以内に死亡する力価である１０４ｐｆｕ／ｍｌ  ＶＶで、鼻腔内接種法によって感染させた。マウスの実験のために、ＰＤ−１６６３２６を、３０％のＤＭＳＯ、３０％のＰＥＧ−４００、および３７％の生理食塩水中に溶解し、そしてＳＴＩ−５７１（メチラート塩（ｍｅｔｈｃｙｌａｔｅ  ｓａｌｔ））を生理食塩水中に溶解した。ＰＤ−１６６３２６（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を、腹腔内注射によって、感染の２〜６時間前に始めて毎日２回投与し、ＳＴＩ−５７１（１００ｍｇ／ｋｇ／日）を、皮下移植された浸透ポンプから投与した。以前に記載されるようなＨＰＬＣ／ＭＳによるコントロール動物の血中の薬物レベルの定量は、ＰＤ  １６６３２６が存在することを示した。血中のＳＴＩ−５７１のレベルは決定されなかった。これらの薬物濃度では、非感染動物における体重の減少または他の有害な影響は観察されなかった。従って、この薬物は非毒性であると考えられた。
【００６８】
（結果）
（Ｓｒｃ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ａｂｌ、およびＡｒｇは、ＶＶのアクチンテイルに局在する）ＳｒｃおよびＡｂｌ−ファミリーチロシンキナーゼがＶＶのアクチンの運動性に関係するという仮説を試験するために、ＳｒｃまたはＡｂｌに似ている内因性タンパク質がアクチンテイルの先端でビリオンに局在するか否かを最初に決定した。３Ｔ３細胞を、ＶＶに１５分間曝露させ、それからＳｒｃ、Ｆｙｎ、Ｙｅｓ、Ａｂｌ、およびＡｒｇに対する抗体を用いて染色した。感染させた細胞を、核外複製中心（「ＲＣ」）を認識するＤＡＰＩを用いる染色によって、または感染の初期において発現されるワクシニアのタンパク質を認識する抗体であるａ−ＴＷ２．３を用いる染色によって、認識した。
【００６９】
これらのビリオン自体を、ＤＡＰＩ染色、またはビリオンの内側の膜中に局在するＧＦＰ−Ｂ５Ｒ融合タンパク質の蛍光によって認識した。アクチンテイルは、直接的にビリオンと向かい合う強いファロイジン染色として示され得る。Ａｂｌ関連キナーゼであるＡｒｇに対する抗体によって認識される内因性タンパク質は、細胞質に比べてアクチンテイルの先端で濃縮された。同様に、α−Ａｂｌ  ｍＡｂ  ８Ｅ９、α−Ｓｒｃ  ｐＡｂ、α−Ｆｙｎ  ｍＡｂ、およびα−Ｙｅｓ  ｍＡｂによって認識される内因性タンパク質もまた、細胞質に比べてアクチンテイルの先端で濃縮された。
同一の結果が、他の抗体（例えば、ＡＢ３、Ａｂｌ）を用いても得られた。
【００７０】
抗体は特異的であって、これらのキナーゼを欠失する細胞においては、エピトープを認識せず、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼまたはＡｂｌ−ファミリーキナーゼを欠失する細胞におけるトランスフェクション実験によって判定されるように、他のファミリーメンバーと交差反応性を示さない。特に、各々のキナーゼは、アクチンテイルの小部分のみにおいて検出可能であった。例えば、ｃ−Ａｂｌは一部のテイルにおいて検出可能であったが、同じ細胞内の他のテイルにおいては検出不可能であった。さらに、抗体の組合せ（例えば、α−Ａｂｌ  ｍＡｂとα−Ａｒｇ  ｐＡｂとの）を用いる染色は、ＡｂｌキナーゼおよびＡｒｇキナーゼの両方が約５％のテイルにおいて明らかであるにも関わらず、１種類のキナーゼを含むテイルは、一般的には、検出可能なレベルの別のキナーゼ型を含まないことを示した。
【００７１】
抗キナーゼ抗体の多くが同様のアイソタイプであるので全ての組合せを試験することは実行可能でないが、同様の結果を他の抗キナーゼ抗体の組合せを用いて得た。図１Ａは、Ａｂｌ、Ａｒｇ、ＡｂｌおよびＡｒｇの両方を含む、またはＡｂｌおよびＡｒｇのどちらも含まない３Ｔ３細胞のテイルの割合を示す。大部分のテイルが一方または他の一方のキナーゼを含むが、両方を含むテイルはほとんどないことに注意されたい。加えて、図１Ｂは、ＶＶのアクチンテイルにおけるＳｒｃ−ファミリーキナーゼの分布を示す。５種類のＳｒｃ−ファミリーキナーゼおよびＡｂｌ−ファミリーキナーゼのうち、ｃ−Ｆｙｎと似ているタンパク質が、アクチンテイルにおいて最も頻繁に観察されたものである。最後に、ＰＤＧＦＲ、ＦＧＦＲ、Ｌｃｋ、ＦＡＫ、Ｎｔｋ、Ｌｙｎ、Ｊａｋ１、Ｃｓｋ、Ｔｙｋ２、およびＰｙｋ２を含む、他のチロシンキナーゼの局在について、証拠は見出されず、このことは、局在がＳｒｃ−ファミリーキナーゼおよびＡｂｌ−ファミリーキナーゼについて特異的であることを示唆する。
【００７２】
抗キナーゼ抗体が実際に特異的であることを確実にするために、次に、外因性に発現されるキナーゼの局在および分布が、内因性タンパク質に関して観察される局在および分布と同じであるか否かを決定した。これを実行するために、イエロー蛍光タンパク質標識ｃ−Ａｒｇ（ＹＦＰ−ｃ−Ａｒｇ）、非標識または赤血球凝集素（ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）Ａ（ＨＡ）標識ｃ−Ａｂｌ（ＨＡ−ｃ−Ａｂｌ）がアクチンテイルにおいて局在するか否かを評価した。ＹＦＰ−ｃ−Ａｒｇは、トランスフェクトされた細胞のアクチンテイルの小部分においてのみ存在し、内因性タンパク質に対する染色を用いて得られた結果と概して一致した。高レベルのＹＦＰ−ｃ−Ａｒｇを発現する細胞においてすら、ＹＦＰ−ｃ−Ａｒｇを含まないテイルがあり、このことは過剰発現されたキナーゼの局在が特異的であることを示唆する。加えて、他の過剰発現されたタンパク質について、共発現は観察されなかった：他の過剰発現されたタンパク質として、グリーン蛍光タンパク質もしくはイエロー蛍光タンパク質、α−Ｈｃｋ  ｐＡｂを用いて検出されるキナーゼであるＨｃｋ（データは示さず）が挙げられる。これらの結果は共に、過剰発現されたチロシンキナーゼがアクチンテイルにおいて特異的に局在し得ること、および、内因性タンパク質のように、トランスフェクトされたキナーゼが全てのテイルには局在しないことを示唆する。
【００７３】
（ｃ−Ａｂｌまたはｃ−Ａｒｇは、ＶＶのアクチンテイルにおいて活性化される）ｃ−Ａｂｌまたはｃ−ＡｒｇがＶＶのアクチンテイルにおいて活性であるか否かを決定するために、両方のタンパク質の活性化ループ状ドメイン（Ｐｌｕｋら（２００２）Ｃｅｌｌ，２４７−２５９）中のリン酸化されたＹ４１２を認識する抗体の株（α−ＰＹ４１２）を用いた。しかし、α−ＰＹ４１２  ｐＡｂによって認識される活性化ループのエピトープは、ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇにおいて同一であるので、この抗体は、蛍光実験においてこの二つのタンパク質を区別し得ない。α−ＰＹ４１２を用いる染色は、テイルにおいて明らかである。さらに、α−ＰＹ４１２  ｐＡｂを用いる染色は、ｃ−Ａｂｌまたはｃ−Ａｒｇに対して特異的であって、ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇを欠失する細胞において形成されたテイルにおいては明らかでなかった。
【００７４】
（Ｓｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼまたはＡｂｌ−ファミリーチロシンキナーゼを欠損する細胞株でアクチンテイルが形成する）
Ｓｒｃおよび／またはＡｌｂ−ファミリーチロシンキナーゼがアクチンテイルの形成のために必要であるか否かを決定するために、ｃ−Ｓｒｃを欠失するマウス（Ｓｒｃ−／−）、ｃ−ＳｒｃおよびＹｅｓを欠失するマウス（Ｓｒｃ−／−／Ｙｅｓ−／−）、ｃ−Ｆｙｎおよびｃ−Ｙｅｓを欠失するマウス（Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−）、もしくは、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｆｙｎ、およびｃ−Ｙｅｓを欠失するマウス（Ｓｒｃ−／−／Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−）由来の３Ｔ３細胞、または、ｃ−Ａｂｌのみを欠失するマウス（Ａｂｌ−／−）、ｃ−Ａｒｇのみを欠失するマウス（Ａｒｇ−／−）、もしくはｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇの両方を欠失するマウス（Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−）由来の３Ｔ３細胞を感染させた。これらの細胞を、ＶＶまたはＧＦＰ−ＶＶに曝露させ、Ｃｙ３ファロイジンを用いて染色した。
【００７５】
特に、結果は、ＶＶがこれらの細胞株の全てにおいてアクチンテイルを形成する能力を保持することを示した。野生型マウス由来の３Ｔ３細胞と比較して、これらの細胞株においてアクチンテイルを形成する能力には相違は見られなかった。Ｓｒｃ−／−／Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−細胞において、ＡｒｇまたはＡｂｌによって占有されるテイルの割合は、野生型細胞においてこれらのキナーゼによって占有されるテイルの割合より多少高かった。図２は、Ｓｒｃ−／−／Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−細胞またはＡｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞におけるＶＶのアクチンテイルの中のＡｂｌ−ファミリーキナーゼおよびＳｒｃ−ファミリーキナーゼの分布の定量を提供する。Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞において、ｃ−Ｓｒｃによって占有されるテイルの割合は、野生型細胞において観察された割合と同様であったが、ｃ−Ｆｙｎによって占有されるテイルの割合は野生型細胞と比較してより低く、ｃ−Ｙｅｓによって占有されるテイルの割合は野生型細胞と比較してより高かった。このテイルでのキナーゼの分布の相違にも関わらず、これらの結果は、ｃ−Ａｂｌ、ｃ−Ａｒｇ、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｆｙｎ、またはｃ−Ｙｅｓのいずれも、単独ではＶＶのアクチンテイルの形成のために必要ではないらしいことを示唆する。さらに、これらの結果は、他のチロシンキナーゼもまたアクチンテイルに局在し得る可能性、および／または、アクチンテイルへのキナーゼの局在が一時的なプロセスまたは連続的なプロセスであり得る可能性を提起する。
【００７６】
Ａｂｌ−ファミリーキナーゼおよびＳｒｃ−ファミリーキナーゼがアクチンテイルにおいて局在し、Ａｂｌ−ファミリーキナーゼが活性化され、しかしいずれかのファミリーのメンバーを欠失するマウス由来の細胞株でテイルが形成したという観察は、二つの選択肢を示唆する。第一に、いずれかのファミリーのメンバーはアクチンテイルの形成を触媒し得るが、これらのキナーゼのいずれか一つの非存在下においては、別のＳｒｃ−ファミリーまたはＡｂｌ−ファミリーのメンバーが充足し得る（「機能的重複性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）」）。あるいは、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼまたはＡｂｌ−ファミリーキナーゼの局在および活性化は、アクチンテイルの形成と無関係であり得る（「局在的活性化（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）」。重複するＡｂｌ−ファミリーキナーゼおよびＳｒｃ−ファミリーキナーゼがアクチンテイルの形成に関与するか否かを決定するために、（ｉ）野生型細胞または特定のチロシンキナーゼを欠失する細胞におけるアクチンテイルの形成を遮断するチロシンキナーゼのインヒビターの同定；および（ｉｉ）そのようなインヒビターの存在する場合にそのインヒビターに対して耐性のキナーゼ変異体がアクチンテイルの形成を支持する能力に基づいて、充足性（ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の試験法を開発した。
【００７７】
（ＳｒｃおよびＡｂｌ−ファミリーチロシンキナーゼのインヒビターは、アクチンテイルの形成を遮断する）機能的重複性を局在的活性化から区別するために、野生型細胞におけるチロシンキナーゼインヒビターの効果を第一に評価した。ピリド［２，３−ｄ］−ピリミジン（ＰＤ）化合物は、ＡＴＰの、Ａｂｌ−ファミリーキナーゼ（ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇを含む）ならびに相同なＡＴＰ結合ドメインを有するキナーゼ（ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｆｙｎ、およびｃ−Ｙｅｓを含む）への結合を競合的に阻害する（Ｄｏｒｓｅｙら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｐｐ３１２７−３１３１；Ｋｒａｋｅｒら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｐｐ．８８５−８９８；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｐｐ．４２４４−４２５５）。
【００７８】
３Ｔ３細胞を、Ａｂｌ−ファミリーチロシンキナーゼおよびＳｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼのインヒビターである、ＰＤ１６６３２６（５μＭ）を用いて処理し、次いでＶＶに８時間曝露させた。感染された細胞を認識するために、細胞をＤＡＰＩおよびα−リン酸化チロシン  ｐＡｂを用いて染色し、アクチンを認識するために、ＦＩＴＣファロイジンを用いて染色した。この条件では、アクチンテイルは存在しなかった。同様に、１０μＭのＰＤを用いて処理され、次いでＶＶによって感染された細胞において、アクチンテイルは見られなかった。１μＭより低い濃度のＰＤは、効果を有さなかった。感染の初期において発現されるＶＶタンパク質を認識するα−ＴＷ２．３（Ｙｕｗｅｎら（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．７３２−７４４）を用いる染色は、１０μＭのＰＤを用いて処理された細胞において明らかであった。このことは、この薬物がウイルスの侵入を遮断しなかったことを示唆する。さらに、ＤＡＰＩ染色またはα−リン酸化チロシンｐＡｂを用いる染色は、１０μＭのＰＤの存在下において核外複製中心の存在を明らかにした。このことは、この薬物がウイルスの複製に対して検出可能な効果を有さなかったことを示す。アクチンテイルを有する感染された細胞の数の定量は、１０μＭのＰＤを用いる処置が、各々の時点で、ＶＶのテイルの形成をキャリアコントロール（０．１％ＤＭＳＯ；図３）に比較して少なくとも５０倍低下させたことを示した。ＰＤが、残存したアクチンテイルの分解を付加的に引き起こした可能性はあるが、感染後８時間のほんの２０分間の５μＭのＰＤの添加もまた、アクチンテイルの形成の遮断をもたらした。ＰＤに構造的に関連する化合物（例えば、ＳＫＩ−ＤＶ−１−１０、１０μＭ）は、アクチンテイルの遮断についてＰＤと同じくらい効果的であった。これらのＰＤの効果は、アクチン重合の非特異的な阻害に起因しない。なぜならば、ＰＤは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたはＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉがアクチンのコメットテイルを形成する能力に対して効果を有さないからである。
【００７９】
ＰＰ２および構造的に類似の化合物ＰＰ１は、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼの活性を阻害し（Ｌｉｕら（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，ｐｐ．６７１−６７８）、最近では、さらにＡｂｌ−ファミリーキナーゼを阻害することが認識されている（Ｔａｔｔｏｎら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｐｐ．４８４７−４８５３）。以前に報告されたように、ＰＤのように、ＰＰ２は２５μＭ以上の濃度でアクチンテイルを遮断する（Ｆｒｉｓｃｈｋｎｅｃｈｔら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ，ｐｐ．９２６−９２９）。ＰＤまたはＰＰ２と対照的に、Ａｂｌ−ファミリーキナーゼを阻害するがＳｒｃ−ファミリーキナーゼを阻害しないＳＴＩ−５７１（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．１９３８−１９４２）は、２５μＭの高さの濃度であっても野生型３Ｔ３細胞におけるアクチンテイルの形成を遮断しなかった。
【００８０】
（ＰＤはチロシンのリン酸化およびアクチンテイルの形成のために必要なタンパク質の局在を遮断する）次に、ＰＤが、アクチンテイルの先端での、リン酸化チロシン染色の局在、および、Ｎｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、またはＡｒｐ２／３複合体の局在に影響するか否かを試験した。４Ｇ１０  ｍＡｂを用いて検出されるようなリン酸化チロシン染色は、ビリオンと共局在した。同様に、α−Ｎｃｋ  ｍＡｂ、α−Ｎ−ＷＡＳＰ  ｐＡｂ、α−Ｇｒｂ２  ｐＡｂ、およびα−Ａｒｐ  ｐ４１  ｐＡｂを用いる染色は、前に報告されるように（示さず）、粒子の周囲においてアクチンテイルの先端で明らかであった。１５時間前にＧＦＰ−ＶＶを用いて感染させた細胞に１０μＭのＰＤを加えた場合、リン酸化チロシンのビリオンとの共局在は、４Ｇ１０  ｍＡｂによっては検出されなかった。同様に、ビリオンと共局在するＮｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、またはＡｒｐ２／３の局在についての証拠は見出されなかった。リン酸化チロシンに対するＰＤの効果は、運動型ビリオンと関連するリン酸化チロシンに対して選択的であった。なぜならば、α−リン酸化チロシンｐＡｂによって認識される複製中心における標的のリン酸化は、１０μＭのＰＤの添加によって影響を受けなかったからである。総合して、これらの結果は、ＰＤが、アクチンテイルの形成と関連する必須のチロシンキナーゼ活性を遮断するが、ウイルスの複製を遮断しないことを明らかにする。
【００８１】
（数種類のＡｂｌ−ファミリーチロシンキナーゼおよびＳｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼは、ＶＶのアクチンの運動性のために十分である）次に、ＰＤ感受性のキナーゼのうちでどのＡｂｌ−ファミリーキナーゼおよびＳｒｃ−ファミリーキナーゼがＶＶのアクチンの運動性のために十分であるかを決定した。
【００８２】
上で言及されるように、ＳＴＩ−５７１は、野生型３Ｔ３細胞におけるＶＶのアクチンの運動性に対する識別可能（ｄｉｓｃｅｒｎａｂｌｅ）な効果を有さない。しかし、１０μＭのＳＴＩ−５７１の添加は、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｙｅｓ、およびｃ−Ｆｙｎを欠失する細胞におけるＶＶのアクチンの運動性を著しく限定し、細胞１個あたりのアクチンテイルの平均数を１６倍減少させた（細胞１個あたり平均約３個であり、３０％の細胞は０個を有した）。ＳＴＩ−５７１は、核外ＤＡＰＩ染色によって明示されたように、ウイルスの複製に対して効果を有さなかったか、または、細胞末梢へのＧＦＰ標識ビリオンの移動に対して効果を有さなかった。さらに、ＳＴＩ５７１のためのキャリアであるＤＭＳＯは、効果を有さなかった。総合して、これらのデータは：１）ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇを含む、ＳＴＩ−５７１に対して感受性のキナーゼは、ＶＶのアクチンの運動性を支持するのに十分であること；および、２）ＳＴＩ−５７１に対して非感受性のキナーゼのうち、ｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｆｙｎ、またはｃ−Ｙｅｓは、３Ｔ３細胞におけるＶＶのアクチンの運動性を支持し得る唯一のものであり得ることを示唆する。
【００８３】
Ａｂｌ−ファミリーキナーゼまたはＳｒｃ−ファミリーキナーゼのうちのいずれがＶＶのアクチンの運動性のために十分であるかを決定するために、次に、ｃ−Ａｂｌ、ｃ−Ａｒｇ、またはｃ−Ｙｅｓが、他のＳｒｃ−ファミリーキナーゼまたはＡｂｌ−ファミリーキナーゼからの活性の非存在下においてＶＶのアクチンの運動性を支持し得るか否かを評価した。特に、ｃ−Ａｂｌ、ｃ−Ａｒｇ、またはｃ−ＹｅｓのＰＤ耐性対立遺伝子の発現が、ＰＤの存在下においてアクチンの運動性を維持させ得るかを試験した。以前の研究は、ＡＴＰ結合ポケット中の変異（ｃ−Ａｂｌ−Ｔ３１５Ｉ、ｃ−Ａｒｇ−Ｔ３１４Ｉ、およびｃ−Ｙｅｓ−Ｔ３４８Ｉ）が、ＰＤとキナーゼとの間のファン・デル・ワールス相互作用を分断し、インビトロキナーゼアッセイによって測定されるように、ＰＤのＫｉを１０ｎＭから１μＭへと増加させることを示している。
【００８４】
次に、ｃ−Ａｒｇまたはｃ−ＡｂｌのこれらのＰＤ耐性対立遺伝子が、１０μＭのＰＤ中で培養された細胞において発現される場合にＶＶのアクチンテイルを支持し得るか否かを試験した。アクチンテイルは、ＹＦＰ−ｃ−Ａｒｇ−Ｔ３１４Ｉを発現するＰＤ処理細胞において明らかであったが、内因性ｃ−Ａｒｇを発現する細胞においては明らかではなかった。さらに、ＰＤは、ｃ−Ａｒｇ−ＷＴを過剰発現する細胞においてアクチンテイルの形成を阻害した。従って、ＰＤの緩衝は、ＹＦＰ−ｃ−Ａｒｇ−Ｔ３１４Ｉとの低い親和力の相互作用によってですら、本実験におけるＶＶのアクチンテイルの運動性の説明になり得ない。全てのＰＤ耐性のチロシンキナーゼ対立遺伝子が１０μＭのＰＤの存在下においてアクチンテイルを支持し得るわけではなかった。
【００８５】
ｃ−Ａｂｌ−Ｔ３１５Ｉを発現する細胞において、１０μＭのＰＤの存在下でアクチンテイルは観察されなかった。これらの結果は、過剰発現されたチロシンキナーゼが、ビリオンに局在するものですら、アクチンの運動性を支持する標的の非特異的または異常なリン酸化を引き起こさないことを示唆する。ＰＤ耐性対立遺伝子であるｃ−Ｙｅｓ−Ｔ３４８Ｉの発現もまた、１０μＭのＰＤの存在下でアクチンテイルを支持したが、野生型対立遺伝子は、１０μＭのＰＤの存在下でアクチンテイルを支持しなかった。総合して、これらのデータは、ｃ−Ａｒｇおよびｃ−Ｙｅｓが、チロシンキナーゼのうちで、ＶＶのアクチンの運動性のために十分であることを示すが、他のチロシンキナーゼもまた充足し得ることを除外しない。アクチンテイルの形成におけるｃ−Ａｂｌの充足性についての証拠は見出されなかった。
【００８６】
他のＳｒｃ−ファミリーキナーゼがＶＶのアクチンの運動性のために十分であるか否かを決定するために、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼのサブセットを欠失する細胞株に対する１０μＭのＳＴＩ−５７１の効果を試験した。ｃ−Ｓｒｃおよびｃ−Ｙｅｓを欠失する細胞、またはｃ−Ｆｙｎおよびｃ−Ｙｅｓを欠失する細胞は、ＳＴＩ−５７１の存在下においてなおＶＶのアクチンの運動性を支持した。ＳＴＩ５７１を用いる処置はまた、細胞１個あたりのアクチンテイルの数に対する検出可能な効果を有さなかった。これらの結果は、ｃ−Ａｒｇおよびｃ−Ｙｅｓに加えて、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼであるｃ−Ｓｒｃおよびｃ−Ｆｙｎもまた、アクチンの運動性のために十分であることを示唆する。
【００８７】
（重複するＳｒｃ−ファミリーキナーゼおよびＡｂｌ−ファミリーキナーゼはインビトロで細胞から細胞への拡散を仲介する）どのチロシンキナーゼが細胞から細胞への拡散に関与するかを決定するために、野生型３Ｔ３細胞または種々のＳｒｃ−ファミリーチロシンキナーゼおよびＡｂｌ−ファミリーチロシンキナーゼを欠失する細胞でプラークアッセイを行った。プラークの形態および大きさは一般に使用される細胞型であるＢＳＣ−４０細胞の感染の後で見られるプラークよりいくらか多様であり鮮明でないようだが、ＶＶを用いる３Ｔ３細胞の単層の感染は４日以内にプラークを誘導する。しかし、本実験において形成されたプラークは、３Ｔ３細胞、Ａｂｌ−／−細胞、Ａｒｇ−／−細胞、およびＡｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞、Ｓｒｃ−／−／Ｙｅｓ−／−細胞、ならびにＳｒｃ−／−／Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−細胞で、同等の効力を有した。
【００８８】
重複するチロシンキナーゼがプラーク形成を仲介するか否かを決定するために、ＢＳＣ−４０細胞を、１０μＭの、Ａｂｌ−ファミリーキナーゼおよびＳｒｃ−ファミリーキナーゼの両方を遮断するＰＤを用いて処理した。細胞から細胞への拡散のためのアクチンテイルの必要性と一致して、ＰＤはプラークの大きさを、容易にはプラークを形成しないＶＶ  Ａ３６Ｒ変異体（ＰａｒｋｉｎｓｏｎおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３７６−３９０）において見られるプラークと同様の「針先」へと縮小する。３Ｔ３細胞における１０μＭのＰＤを用いて、同一の結果を得た。しかし、Ａｂｌ−ファミリーキナーゼのみを遮断するＳＴＩ−５７１は、Ｓｒｃ−／−／Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−細胞におけるプラーク形成を阻害したにも関わらず、この化合物は、３Ｔ３細胞もしくはＢＳＣ−４０細胞におけるプラークの大きさまたはプラークの数に有意な変化をもたらさなかった。プラーク減少アッセイは、１０μＭのＳＴＩ−５７１を用いて処理された細胞または処理されなかった細胞が、２４時間後にほとんど同等の量のウイルスを産生したことを示し、このことは、この薬物がウイルスの複製に対する検出可能な効果を、たとえあったとしてもほとんど有さなかったことを示す。総合して、これらの結果は、インビトロでプラーク形成によって測定されるように、アクチンテイルの形成を仲介するＡｂｌ−ファミリーキナーゼおよびＳｒｃ−ファミリーキナーゼと同じ重複するキナーゼが、細胞から細胞への拡散も仲介するという証拠を提供する。
【００８９】
（Ａｂｌ−ファミリーキナーゼはインビトロでＥＥＶの放出を仲介するが、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼはインビトロでＥＥＶの放出を仲介しない）インビトロでのＥＥＶ形成がチロシンキナーゼに依存的であるか否かを決定するために、野生型３Ｔ３細胞または種々のチロシンキナーゼを欠失する３Ｔ３細胞をＶＶを用いて感染させた。非感染細胞、ＶＶ感染野生型３Ｔ３細胞、または、ｃ−Ｓｒｃ／ｃ−Ｆｙｎ／ｃ−Ｙｅｓ、ｃ−Ａｂｌ、ｃ−Ａｒｇ、もしくはｃ−Ａｂｌ／ｃ−Ａｒｇを欠失する動物由来の３Ｔ３細胞から得られた上清を用いて感染させたＢＳＣ−４０細胞のプラークアッセイを行った。結果は、ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇの両方が存在しない場合を除いて、または、ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇの両方の活性が薬物によって遮断される場合を除いて、プラークが存在することを示した。
【００９０】
上清を、感染の２４時間後に細胞から回収した。この時点において、この上清は、培地中に放出されている有意な量のＥＥＶ（４０〜５０％）からなるプラーク形成ユニット（ＰＦＵ）、および、溶解された感染細胞からの汚染ＩＭＶ放出を含む（ＬａｗおよびＳｍｉｔｈ（２００１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１３２−１４２）。この上清を、次いで、ＢＳＣ−４０細胞を感染させるために使用し、３日後にプラーク形成を評価した。
【００９１】
ＢＳＣ−４０細胞でのプラークの分析は、野生型３Ｔ３細胞、Ｓｒｃ−／−／Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−細胞、Ａｂｌ−／−細胞、およびＡｒｇ−／−細胞由来の上清の全ては、ほぼ同じＰＦＵを含むが、Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞由来の上清は、５〜１０倍少ないＰＦＵを含むことを示した。そのような減少は、野生型細胞に比較してより低いＡｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞の感染性によっては説明され得ない。なぜならば、野生型細胞で形成されたプラークの数と同じ数の形成されたプラーク、ならびに、感染の２４時間後に細胞を溶解することおよびＢＳＣ−４０細胞でのプラーク形成ユニットを測定することによって得られたウイルスの増殖は、野生型細胞とＡｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞との間で相違を示さなかったからである。総合して、これらの結果は、効率的なＥＥＶ放出のために、ｃ−Ａｂｌまたはｃ−Ａｒｇは各々が十分であり、ｃ−Ａｂｌまたはｃ−Ａｒｇは共に必要であることを示唆する。
【００９２】
次に、ＥＥＶ形成に対するＡｂｌ−ファミリーチロシンキナーゼのインヒビターの効果を評価した。ＢＳＣ−４０細胞をＶＶを用いて感染させ、１０μＭのＳＴＩ５７１を用いて２４時間処理した。この上清を、次いで回収し、ＢＳＣ−４０細胞を感染させるために使用し、３日後にプラーク形成を評価した。ＢＳＣ−４０細胞についての結果は、この薬物で処理されなかったまたは処理された感染３Ｔ３細胞由来の上清を用いて得られた結果と同一であった。１０μＭのＳＴＩ−５７１の適用は、ＢＳＣ−４０細胞で、ＰＦＵの約２倍の減少を引き起こした。ＳＴＩ−５７１を用いる３Ｔ３細胞またはＢＳＣ−４０細胞の処理は、それ自体では、プラーク形成およびプラーク減少アッセイによって測定されるウイルスの複製に影響を及ぼさなかった。従って、ＳＴＩ−５７１によって引き起こされるＥＥＶ数の明らかな減少は、ウイルスの侵入の遮断、細胞溶解の阻害に起因し得ず、また、複製の阻害に起因し得ない。感染性ＥＥＶの形成に対するＳＴＩ−５７１の効果と一致して、１０μＭのＳＴＩ−５７１を用いるＢＳＣ−４０細胞の処置はまた、ＥＥＶと関連する現象である、プラークと向かい合う「コメット」の形成も遮断した。最後に、ＳＴＩ−５７１を用いて処理された３Ｔ３細胞において、アクチンテイルの形成またはアクチンテイルの数に明らかな差異はなかった。従って、ＳＴＩ−５７１によるＥＥＶの数の減少は、細胞表面に到達するビリオンの数の減少に起因しなかった。１０μＭのＰＤを用いる３Ｔ３細胞の処理は、同様に、ＥＥＶの数を減少させた。
【００９３】
この細胞上清のＩＭＶ汚染の可能性を考え、次に、Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞におけるＡｂｌおよびＡｒｇの活性の喪失、またはＳＴＩ−５７１処理によるＡｂｌおよびＡｒｇの活性の喪失が、感染性ＥＥＶの減少のみをもたらし、ＩＭＶに対するさらなる効果をもたらさないことを確認した。このことを行うために、上清を、ｍＡｂ  ２ｄ５と称されるＩＭＶを中和する抗体と共にインキュベートした。ｍＡｂ  ２ｄ５の上清への添加は、３Ｔ３細胞およびＢＳＣ−４０細胞の両方において、プラーク数を約４０％減少させた。このことは、以前の報告と一致した（ＬａｗおよびＳｍｉｔｈ（２００１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐｐ．１３２−１４２）。二番目に、１０μＭのＳＴＩ−５７１の添加は、ｍＡｂ  ２Ｄ５の存在下または非存在下において、プラーク数の等倍の減少を引き起こし、ＳＴＩ−５７１処理を用いる場合のプラーク数またはＡｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞におけるプラーク数の減少の割合は、ｍＡｂ  ２ｄ５の添加に関わらず同様であった。総合して、これらのデータは、ＡｂｌおよびＡｒｇはＩＭＶに対してほとんど効果を有さないこと、ならびに、ｃ−Ａｂｌおよびｃ−Ａｒｇはインビトロで感染細胞からのＥＥＶの放出を仲介するが、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼはインビトロで感染細胞からのＥＥＶの放出を仲介しないことを示唆する。
【００９４】
（ＳＴＩ−５７１はマウスにおいてＶＶ負荷を低下させる）インビボでのＥＥＶ形成およびビルレンスにおけるチロシンキナーゼの役割を決定するために、ＶＶを用いて感染させたマウスにおけるウイルス負荷に対するＳＴＩ−５７１の効果を試験した。ＳＴＩ−５７１（１００ｍｇ／ｋｇ／日で、０．９％の滅菌生理食塩水中に溶解した）または生理食塩水キャリアを、皮下に配置したＡｚｌｅｔ浸透ポンプを介してマウスに送達した。このポンプの挿入の２４時間後に、一部のマウスを１０４ｐｆｕのＶＶを用いて腹腔内で接種した。残りのマウスを未処置のままにした。感染の４日後にマウスを屠殺し、卵巣を摘出し、リアルタイムＰＣＲに供してウイルス負荷を評価した。卵巣は、子宮頚部組織と共に、腹腔内感染の後で最も高いレベルのウイルスを含むことが見出されているので（Ｒａｍｉｒｅｚら（２００３）Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，ｐｐ．８２７−８３９）、この器官を分析のために選択した。
【００９５】
ウイルス負荷を、卵巣から単離されたＤＮＡ２５０ｎｇあたりのＶＶ  ＵＤＧ遺伝子のコピーの数として測定した。未処理の動物または生理食塩水キャリアを含むポンプを有する動物において、有意なレベルのウイルス（約１０７コピー／ＤＮＡ２５０ｎｇ）が卵巣において検出可能であった。このことは、腹腔に隣接する器官へのウイルスの拡散を示した。連続希釈によって決定されたこのアッセイの検出限界は、ウイルスゲノム１０個であった。マウスの白血病モデル（ＷｏｌｆｆおよびＩｌａｒｉａ，２００１年）において使用される濃度である１００ｍｇ／ｋｇ／日のＳＴＩ−５７１を用いる処理は、ウイルス負荷を４〜５対数低下させた（図４）。この差は、フィッシャーの双方直接確立検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ）によって統計学的に有意と判定された（Ｐ＜１０−６；（方法）を参照）。
【００９６】
（結論）
上記の結果は、チロシンキナーゼが、Ｖａｃｃｉｎｉａウイルスの、運動性、放出、および病原性感染に関与することを明らかにする。特に、効率的なアクチンの運動性のためにＡｂｌ−ファミリーキナーゼは必要とされるが、Ｓｒｃ−ファミリーキナーゼは必要とされず、ＰＤ化合物を含む、Ａｂｌ−ファミリーキナーゼを阻害するチロシンキナーゼインヒビターは、アクチンの運動性を遮断する。ＰＤ化合物およびＳＴＩ−５７１は、感染性ビリオンの放出を遮断し、ＳＴＩ−５７１は、ＶＶ感染マウスにおけるウイルス負荷を低下させる。このことに関して、これらの結果は、ＰＤおよびＳＴＩ−５７１のような薬物がＶＶ感染の予防または処置のために有用であることを示す。Ｖａｃｃｉｎｉａおよび痘瘡ウイルスは類似であるので、これらの薬物はまた、痘瘡を引き起こすヒトにおける痘瘡ウイルス感染に対して増大した効力を有することもあり得る。
【００９７】
（実験２−ＳＴＩ−ＸはＶａｃｃｉｎｉａの複製を阻害する）
本実験は、ＶＶの複製に影響を及ぼす化合物を同定するための、ＳＴＩ−５７１に関係する化合物の小さいライブラリをスクリーニングする工程を包含する。ＳＴＩ−Ｘと称されるＳＴＩ−５７１の誘導体を同定し、ＶＶの感染、複製、および運動性に対するその効果について試験した。
【００９８】
（方法）
細胞培養および蛍光顕微鏡法に基づくプラークアッセイについての方法は、実験１において記載される方法と同様であった。
【００９９】
ＶＶの複製に影響を及ぼす化合物を同定するために、特定の機能基に対する変更をこの分子上で行うことによって、ＳＴＩ−５７１誘導体のライブラリを構築した。３Ｔ３細胞の感染を阻害するこれらの化合物の能力に基づいて、これらの化合物をスクリーニングし、ＥＶＰ染色、または、核外ＤＡＰＩ染色によって測定されるような核外複製中心を含むＧＦＰ標識ビリオンの存在のいずれかによって評価した。
【０１００】
３Ｔ３細胞を、未処理のままにするか、または１μＭのＳＴＩ−ＸもしくはＤＭＳＯ（キャリア）と共にインキュベートした。細胞を、次いで、感染多重度１０でＧＦＰ−ＶＶを用いて８時間感染させた。ＳＴＩ−Ｘを、感染の時点でまたは６時間後に加えた。感染の８時間後、細胞を固定し、複製中心を識別するためにＤＡＰＩ  α−Ｐｔｙｒ−Ｃｙ５  ｐＡｂを用いて染色し、アクチンのコメットテイルを識別するためにＣｙ３−ファロイジンを用いて染色した。
【０１０１】
（結果）
ＧＦＰ−ビリオンの存在は感染細胞において注目され、核外複製中心は存在しなかった。Ｐｔｙｒ染色もまた存在せず、アクチンテイルは明らかではなかった。始めに細胞に感染したＧＦＰ−ＷＲビリオンに対応する球状（ｐｕｎｃｔａｔｅ）の核外ＤＡＰＩ染色は明らかであった。複製中心が形成した後でＳＴＩ−Ｘを加えた場合、複製中心およびアクチンテイルはまだ明らかであった。
【０１０２】
ＥＶＰ染色、およびＤＡＰＩ染色された核外「複製工場」は、全ての未処理細胞およびＤＭＳＯ処理細胞において明らかであり、これらの細胞の９０％はアクチンテイルを含有した。このことは、この感染が強かったことを示す。ＧＦＰ標識ビリオンおよびＥＶＰ染色もまた、全てのＳＴＩ−Ｘ処理細胞において明らかであった。このことは、ＳＴＩ−Ｘがウイルスの侵入に対して検出可能な効果をほとんど有さなかったことを示す。しかし、ＳＴＩ−Ｘ処理は、ＤＭＳＯ処理細胞または未処理の細胞と比較して、ＤＡＰＩ染色核外ウイルス複製工場を含む細胞の割合の著しい低下を引き起こした（ＳＴＩ−Ｘについての４％と比較して、未処理の細胞について１００％；図２）。ＧＦＰ−ＷＲ感染細胞において、球状核外ＤＡＰＩ染色はかろうじて可視され得た（例えば、図８Ａ）。この染色はＧＦＰ−ＷＲビリオンと共局在したので、このＤＮＡは、始めにこの細胞に感染したビリオンに対応し得る。
【０１０３】
ＳＴＩ−Ｘ処理細胞はまた、おそらく複製が阻害されたために、アクチンテイルを形成し得なかった。このことを直接的に試験するために、複製中心が形成した後にＳＴＩ−Ｘを加えた。これらの条件下で、ＳＴＩ−Ｘは複製中心に対して効果を有さず（ＤＡＰＩ染色またはα−Ｐｔｙｒ  ｐＡｂによって測定されるように）、アクチンの運動性に対しても効果を有さなかった。
【０１０４】
プラークアッセイおよびプラーク減少アッセイは、これらの顕微鏡観察を確認した。ＳＴＩ−Ｘは感染多重度が増加された場合により効果的でない（抗ウイルス薬の一般的な特性）と判明したにも関わらず、プラーク形成はこの薬物の存在下において減少した。３日間にわたって行ったこのプラークアッセイは、この薬物がその期間にわたって（評価した最長時間である８日間までも）高い耐性を有したことを示す。プラーク減少アッセイにおいては、この細胞をＳＴＩ−Ｘの存在下または非存在下において２４時間感染させた。次いで液体窒素溶解によってＶＶを回収し、薬物の非存在下におけるプラークアッセイによってその力価を評価した。
【０１０５】
（結論）
要約すると、ＳＴＩ−ＸはＶＶの複製を遮断し、ＶＶ感染の予防または処置のために有用である。
【０１０６】
（実験３−ＶＶおよびＶａｒｉｏｌａ感染の局面に対する、ＳＴＩ−Ｘ、ＰＤ、および併用処置の効果）
ＶＶもしくはＶａｒｉｏｌａ感染マウスにおける病原性の軽減または最小化における、ＰＤ、ＳＴＩ−Ｘ、またはこの二つの併用の効能を決定するために、この実験を設計する。Ｃ５７  ＢＬ／６マウスをこれらの研究のために用いる。他のマウスの感染を防ぐために、ＢＳＬ２施設においてマウスを感染させる。
【０１０７】
（ＶＶおよび痘瘡ウイルス感染に対するＳＴＩ−ＸおよびＰＤ）ＶＶを用いるマウスの皮内接種が、ヒトにおけるＶＶワクチン接種をモデル化するために提案されている（Ｔｓｃｈａｒｋｅら（１９９９）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：２７５１−５；Ｔｓｃｈａｒｋｅら（２００２）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８３：１９７７−８６）。このモデルを使用して、ＶＶの株ＷＲを用いる６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの耳での皮内接種が８日以内に３ｍｍの病変を生成することが、示されている。この病変は約３週間後に消失し、このことは、この動物が免疫応答を発達させて感染を取り除いたことを示す。このモデルは、１０４ｐｆｕを用いて皮内で耳から感染させた、メスの、６週齢と同等のＣ５７ＢＬ／６マウス５個体の実験群、ならびに、３週間の時間的経過にわたって毎日測定される病変の直径に基づいて開発された。本実験は、この範例に従う。
【０１０８】
ＶＶを用いるマウスの鼻腔内接種が、ヒトにおける痘瘡接種の正常な経路をモデル化するために提案されている。８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスの１０３〜１０６の感染多重度での鼻腔内ＶＶ感染は、劇的な体重減少、活動の低下、および、最終的には１０日以内の死をもたらす（Ｒｅａｄｉｎｇら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：１４３５−１４４２）。
【０１０９】
単独で投与されるＰＤあるいはＳＴＩ−Ｘの、ＶＶ  ＷＲ感染マウスにおける、病変の大きさに対する効果（皮内接種に関して）または死亡率に対する効果（鼻腔内接種に関して）を評価した。マウスの半数をＰＤまたはＳＴＩ−Ｘで処置し（ポンプを介して投与された）、コントロールマウスを、ＰＢＳまたは薬物処方物を用いて同等に処置した。初めに、毒性作用なしに達成し得る最も高い用量のＰＤまたはＳＴＩ−Ｘを用いた。皮内で接種されたマウスについて、病変の大きさを毎日測定した。鼻腔内で感染されたマウスについて、体重を毎日測定した。
【０１１０】
１０日目に、マウスを屠殺し、脳および肺を採取した。体重の３０％より多くを失っているマウスは、直ちに屠殺した。組織を３回凍結および解凍し、超音波処理し、３Ｔ３細胞でのプラークアッセイによってウイルス力価を決定した（Ｒｅａｄｉｎｇら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：１４３５−１４４２）。データを、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ−検定によって統計学的に分析し、ＰＤまたはＳＴＩで処置されたマウスが、コントロールマウスと比較して有意に異なる（ｐ＜０．０１）プラーク形成ユニットを保有する場合、感染されたマウスにおけるウイルス負荷に薬物が影響することを結論付ける。ウイルスの侵入および増殖が薬物処方物またはなんらかの非特異的な手段によって遮断される可能性を除外するために、この処方物単独の効果を測定する。
【０１１１】
鼻腔内で接種されるマウスの健康を評価するために、マウスの外見をマスク（ｂｌｉｎｄ）された観察者によって等級付けした：各々の状態に対して１点が割り当てられる：無関心、毛羽立った表毛（最高点＝２；最低点（頑健な健康）＝０）。加えて、体重の結果を、平均値＋／−１標準誤差として表す。処置群は、少なくとも５個体のマウスを含む。統計学的分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔ−検定によって計算し、ｐ＜０．０１を有意と考える。薬物処置群が低下した病理学的評点を生ずる場合、ＰＤ治療がＶＶ疾患の結果に積極的に影響を及ぼすことを結論付ける。
【０１１２】
（併用投与）本研究は、共に投与されるＰＤおよびＳＴＩ−Ｘが、鼻腔内または皮内のＶＶ感染に対して、どちらかの薬物単独よりも良い保護を提供する可能性を有するか否かを評価した。両方の薬物と匹敵する処方物を決定し、この薬物の組合せを、鼻腔内または皮内で動物を感染させるためのＡｌｚｅｔポンプを介して送達した。単独で投与されるどちらかの薬物または薬物なしと比較した病変の大きさまたは生存率の差異を決定し、そして上記のように分析した。組合せが毒性であると判明する場合、これらの薬物の濃度の変化が必要とされる。
【０１１３】
（ＶＶに対する免疫の獲得の評価）本研究は、ＳＴＩ−ＸまたはＰＤの処置が効果的なワクチン接種を可能にするか否かを評価する。この薬物またはキャリアを、上記のように接種を介して投与した。動物が回復し、薬物送達を中断している場合、この動物を再接種する。皮内で接種を行い、続いて生じる痂皮の大きさを決定するか、またはこのウイルスに以前に曝露されていない動物にとって致死量である用量で鼻腔内で接種を行う。瘢痕の大きさまたは死亡率を評価し、ＰＤまたはＳＴＩが免疫の獲得に干渉する場合、痂皮の大きさまたは死亡率は以前に曝露されていない動物と同様である。あるいは、公知のＶＶタンパク質に対する血清の力価の測定、および、合併症を避けるための注意深い薬物の用量決定が用いられ得る。
【０１１４】
（免疫不全患者における感染性の低下）本研究は、ＳＴＩ−ＸおよびＰＤが、免疫不全個体におけるＶＶ疾患の制限において有用であるか否かを評価する。Ｒａｇ１−／−／Ｒａｇ２−／−マウスは、養子免疫応答を高める能力を有さず、重篤な感染を発症する。ＶＶを用いる皮内接種が、これらの動物において、匹敵する野生型動物に比較して、さらに重篤な疾患をもたらすか否かを評価する。そうであれば、単独または併用でのＳＴＩ−ＸもしくはＰＤの投与が、この動物をさらに重篤な感染から保護するために役立つか否かを分析する。
【０１１５】
（実験４−腸病原性Ｅ．ｃｏｌｉおよび腸出血性Ｅ．ｃｏｌｉはＡｂｌ−ファミリーチロシンキナーゼを通してアクチンの台座様構造を形成するために作用する）
（方法）
３Ｔ３細胞を、カバーガラス上で、１０％のウシ胎児血清で補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）中で培養し、ＷＴ  ＥＰＥＣ（株２３８９／６９）を感染多重度１０で用いて、または、ＥＨＥＣ  ＥＤＬ９３３もしくはＥＨＥＣ−ＬｉＳＴＸを感染多重度４０で用いて、６〜８時間３７℃でインキュベートした。いくつかの実験のために、細胞を、感染の３日間前にプラスミドベクターを用いてＦｕｇｅｎｅ−６（Ｂｅｒｈｒｉｎｇｅｒ）を使用してトランスフェクトした。
【０１１６】
細胞を免疫蛍光解析またはＷｅｓｔｅｒｎ解析のために処理した。ＥＰＥＣを４’６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ；１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を用いる染色によって認識し、台座様構造をＦＩＴＣ−ファロイジン（１μｇ／ｍｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いる染色によって認識した。染色の前に、数種類のｐＡｂを前もってホルムアルデヒド中で固定されたＥＰＥＣまたはＥＰＥＣ−Δ−Ｔｉｒと共に２０分間インキュベートし、次いで遠心した。この手順は、非特異的にＥＰＥＣに結合する上清夾雑物を除去した。
【０１１７】
本研究において使用された一次抗体および濃度は以下のようである：α−ＷＡＳＰ  ｐＡｂ（アフィニティ精製済、１：２００希釈）、α−血球凝集素Ａ（ＨＡ）ｍＡｂ（３Ｆ１０；０．０１μｇ／ｍｌ；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、α−Ｎｃｋ  ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、α−Ａｂｌ  ｍＡｂ（ＡＢ３；過剰発現Ａｂｌタンパク質に対して０．５μｇ／ｍｌ；内因性Ａｂｌタンパク質に対して５０μｇ／ｍｌ；８Ｅ９；０．０５μｇ／ｍｌ；ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉａｇｏ，ＣＡ）、α−Ｔｉｒ  ｐＡｂ（１：２０００、顕微鏡法用；１：５０，０００、Ｗｅｓｔｅｒｎ解析用；Ｊｉｍ  Ｋａｐｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐａｒｋ，ＭＤより）、およびα−Ｓｒｃ  ｐＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、ならびにα−Ａｂｌ−ｐＹ４１２  ｐＡｂおよびα−Ａｂｌ−ｐＹ２４５  ｐＡｂ（０．１μｇ／ｍｌ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）。外因性ｃ−Ａｂｌ−ＷＴを発現する細胞を、より低いα−Ａｂｌ  ｍＡｂ濃度での比較的高い蛍光強度によって区別した。従って、内因性ｃ−Ａｂｌ様タンパク質を検出するために使用される曝露よりも著しく短時間の曝露によって画像を得た。二次抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）より得た。
【０１１８】
ＰＤ化合物であるＰＤ１６６３２６およびＳＫＩ−ＤＲＶ−１−１０を、本明細書中の別の場所で記載されるように合成し、これらの化合物の効果は全てのアッセイにおいて識別不能であった。ＰＤ化合物およびＰＰ２を、１００％のＤＭＳＯ中に溶解した。前処理実験のために、ＰＤ、ＰＰ２、またはＤＭＳＯを、細菌による感染の一時間前に細胞に加えた。「リバーサル」実験のために、化合物またはＤＭＳＯを、細菌の添加の５時間後に細胞に加え、これらの細胞をその２時間後に固定した。
【０１１９】
画像を、多重波長の広視野三次元顕微鏡システム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ）に備え付けた科学等級の冷却型電荷結合素子を用いて得た。免疫蛍光サンプルを、サンプルを通して連続的な０．２５μｍの焦点面で画像化し、焦点外の光を、強制的双方向逆重畳アルゴリズムによって除去した。ＰＤおよびＰＰ２の効果を定量化するために、台座様構造がＦＩＴＣ−ファロイジンによってアクチンフィラメントより強く染色されたことに注意した。強度に基づいて画像をセグメント化した。台座様構造に対する最高強度のピクセルの対応を、可視的に確認した。高ピクセル強度と台座様構造とが一致し得なかった場合は、適宜調整した。最高強度のピクセルによって占められる面積を、次いで計算した。各々の条件について、同じ日に平板培養され感染された細胞からデータを得た。各々の実験を５回繰り返した。平板培養の密度および感染効率の変動に起因する、最大の台座様構造面積の多少の分散は、実験の間で明らかであった。
【０１２０】
（結果）
（トランスフェクトされたｃ−ＡｂｌおよびＡｂｌに類似する内因性タンパク質は、アクチンの台座様構造において局在する）ＥＰＥＣ  Ｔｉｒのリン酸化が宿主において病原性プログラムの引き金を引くので、本実験は、このプロセスに関与するチロシンキナーゼを同定することを目指す。Ａｂｌに類似する内因性タンパク質が台座様構造において局在するか否かを決定するために、３Ｔ３細胞をＥＰＥＣまたはＥＨＥＣに曝露し、次いで、Ｃ−末端中の未決定（ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ）のエピトープを認識するα−Ａｂｌモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＡＢ３を用いて染色した。台座様構造は、細菌に直接向かい合う強いアクチン染色として見られた。α−ＡｂＩ−ＡＢ３  ｍＡｂによって認識される内因性タンパク質は、細胞質に比べて台座様構造において濃縮された。ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの両方の台座様構造中のキナーゼドメインのエピトープを認識するα−Ａｂｌ−８Ｅ９  ｍＡｂを用いて、同一の結果を得た。外因性に発現される血球凝集素Ａ（ＨＡ）標識Ａｂｌ（ＨＡ−Ａｂｌ）（α−ＨＡ−３Ｆ１０  ｍＡｂによって認識される）もまた、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの台座様構造において局在した。Ａｂｌ様タンパク質の台座様構造における局在は特異的であった：α−Ｓｒｃ  ｐＡｂによって検出される内因性および外因性のＳｒｃ様タンパク質のいずれも、またグリーン蛍光タンパク質の蛍光も、ＥＰＥＣまたはＥＨＥＣの台座様構造において細胞質に比べて濃縮されなかった。
【０１２１】
Ａｂｌと共通のエピトープを共有する内因性タンパク質が、台座様構造において局在するか否かを決定するために、ＡｂｌおよびＡｂｌ関連キナーゼＡｒｇの両方を欠失するマウス由来の３Ｔ３細胞を感染させた。ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの両方は、依然Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞において台座様構造を形成し得、α−Ａｂｌ−ＡＢ３によって認識されるがα−Ａｂｌ−８Ｅ９によっては認識されないタンパク質は、細菌の下で明らかであった。総合して、これらの結果は、Ａｂｌは台座様構造において局在するが、抗原性が関連する他のタンパク質もまた存在することを示唆した。
【０１２２】
（ＡｂｌおよびＡｂｌ関連キナーゼを遮断するＰＤ化合物は、台座様構造形成を遮断し、逆転する）次に、ＡｂｌまたはＡｂｌ様タンパク質が、ＥＰＥＣまたはＥＨＥＣによって開始される台座様構造形成のために必要とされるか否かを決定した。なぜならば、Ａｂ−／−／Ａｒｇ−／−細胞は台座様構造を形成し得るからである。Ａｂｌおよび構造的に関連するタンパク質の両方を標的とするアプローチを選択した。ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン（ＰＤ）化合物は、Ａｂｌおよび相同なＡＴＰ結合ドメインを有するキナーゼへのＡＴＰの結合を競合的に阻害し、異常調節されたＡｂｌによって引き起こされる癌（例えば、ＣＭＬ）を処置するために開発されている。ＰＤ処理を用いた場合、結合したＥＰＥＣまたはＥＨＥＣはほとんど明らかでなく、インキュベーションを延長した場合（８時間まで）ですら、結合した菌体の下でアクチンはほとんど明らかでないか、全く明らかでなかった。５μＭより低い濃度のＰＤは、効果を有さなかった。
【０１２３】
台座様構造の定量は、ＰＤ処理がＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの台座様構造形成を５０倍減少させることを示した（図６）。図６は、前処理レジメンまたはリバーサルレジメンに従って、ＤＭＳＯ、１０μＭのＰＤ１６６３２６、または１０μＭのＰＰ２を用いて処理されたＥＰＥＣについての、最も強い強度のピクセルによって占有された領域を示す。ＰＤのアナログ（ＳＫＩ−ＤＶ−１−１０［ＤＲＶ−１］：１０μＭ）は、ＥＰＥＣの台座様構造形成を遮断したが、ＳＴＩ−５７１（２５μＭ）はＥＰＥＣの台座様構造形成を遮断しなかった。ＥＰＥＣの増殖は、ＰＤ１６６３２６を用いる処理によって影響を及ぼされなかった。ＥＰＥＣを、０．１％のＤＭＳＯ（Ｘ）または２５μＭのＰＤ（Δ）のいずれかを用いて培養し、示した時点でＯＤ  ６００を測定した。
【０１２４】
ＰＤ化合物はまた、一部のＳｒｃファミリーキナーゼを阻害するので、Ｓｒｃファミリーキナーゼを阻害するがＡｂｌ関連キナーゼを阻害しないＰＰ２の効果を試験した。１００μＭまでの濃度でのＰＰ２（試験した最高濃度）、またはキャリアであるＤＭＳＯ（０．１％）は効果を有さなかった。ＡｂｌとＳｒｃまたは他のキナーゼとの間の機能的重複について試験するために、Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞におけるこれらのインヒビターの効果を評価した。野生型細胞においてのように、ＰＤは台座様構造を阻害するがＰＰ２は台座様構造を阻害しなかったことを試験した。台座様構造が存在しないことは、ＰＤの殺菌性効果に起因しない。なぜならば、ＥＰＥＣもしくはＥＨＥＣの増殖または変異性に対する効果は明らかでなかったからである。ＰＤの効果はまた、アクチン重合の非特異的な阻害にも起因しない：ＰＤは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが、結合、侵入、またはアクチンのコメットテイルを形成する能力に対して効果を有さなかった。総合して、これらのデータは、Ａｂｌ、またはＰＤに感受性である機能的に重複するキナーゼが、台座様構造形成を仲介することを示す。
【０１２５】
次に、結合したＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの下での、Ｔｉｒ、Ｎｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、またはＡｒｐ２／３複合体の局在に、ＰＤが影響を及ぼすか否かを試験した。Ｔｉｒは、結合した菌体の下の台座様構造において局在し、感染の３時間以上後のＷｅｓｔｅｒｎ解析によって検出可能であった。ＰＤ処理を用いた場合、台座様構造が存在しないにも関わらず、Ｔｉｒタンパク質は結合したＥＰＥＣまたはＥＨＥＣの下で検出可能なままであった。Ｎｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、およびＡｒｐ２／３複合体はＥＰＥＣの台座様構造形成のために必要であり、Ｔｉｒのように台座様構造において局在するが、ＥＰＥＣの下でのＮｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、およびＡｒｐ２／３複合体の動員は、ＰＤによって遮断された。
【０１２６】
（Ｔｉｒのリン酸化はＰＤ化合物によって遮断され逆転される）台座様構造、ならびに、Ｎｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、およびＡｒｐ２／３複合体の動員は、Ｙ４７４でリン酸化されたＴｉｒに依存するので、次に、ＰＤがＴｉｒのリン酸化に影響を及ぼすか否かを決定した。図７に示すように、細胞をＤＭＳＯまたはＰＤを用いて処理し、非感染のままでおく（０ｈ）か、またはＥＰＥＣを用いて、示した時間にわたって感染させた。細胞を溶解し、α−リン酸化チロシンｍＡｂ  ４Ｇ１０と共にＷｅｓｔｅｒｎ解析に供し、抗体除去（ｓｔｒｉｐ）し、次いでα−Ｔｉｒ  ｐＡｂを用いて再試験（ｒｅｐｒｏｂｅ）した。Ｔｉｒタンパク質が３時間後に明らかであり、ＤＭＳＯ処理細胞においてリン酸化されていること、およびＰＤがＴｉｒのリン酸化を遮断することを注意されたい。逆転条件のために、細胞を非感染のままでおく（レーン１）か、またはＥＰＥＣを用いて６時間感染させ、示した時間にわたってＰＤを用いて処理し、そして解析した。Ｔｉｒに対応するバンドが、ＰＤの添加の５分以内に脱リン酸化されていることに注意されたい。
【０１２７】
これらの結果は、ＰＤが、Ｔｉｒのリン酸化を遮断することによって、ならびにその結果として、アクチンの重合のために必要とされる遠位のシグナル分子（例えば、Ｎｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、およびＡｒｐ２／３複合体）の動員を遮断することによって、ＥＰＥＣの台座様構造形成を遮断することを示唆する。ＰＤはまた、これらの分子が局在する能力に影響を及ぼす。
【０１２８】
（Ａｂｌは、他のＡｂｌ関連キナーゼの非存在下において、Ｔｉｒのリン酸化および台座様構造形成のために十分である）台座様構造内でのＡｂｌの局在は、Ｔｉｒのリン酸化およびアクチンの重合における役割を示唆したが、Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞が台座様構造形成を可能にするという観察、およびＰＤの広範囲な基質特異性は、他のキナーゼもまた関与し得ることを示唆する。次に、チロシンのリン酸化または台座様構造形成のために、ＰＤ感受性キナーゼのうちでＡｂｌキナーゼが十分であるか否かを決定した。この研究は、ＣＭＬ患者によって後天的に得られる、このタンパク質をＳＴＩ−５７１またはＰＤによる阻害に対して耐性にする、ＢＣＲ−Ａｂｌ（Ｔ３１５１）中の変異を利用する。このＴ３１５１変異を、ｃ−Ａｂｌ（ｃＡｂｌ−３１５１）中へ操作した。ＰＤ中で培養された細胞におけるｃＡｂｌ−Ｔ３１５１の発現は、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの台座様構造形成、ならびに、結合した菌体の下のリン酸化チロシンの局在を回復した。ｃ−Ａｂｌ−Ｔ３１５１の発現もまた、台座様構造が形成された後にＰＤを加えた場合の、台座様構造におけるチロシンのリン酸化の喪失を妨げた。ｃ−Ａｂｌの過剰発現は、高レベルにおいてですら、ＰＤ中で台座様構造形成を回復させるために十分ではなく、ＰＤによって誘導されるリン酸化の喪失の遮断するためにも十分ではなかった。このことは、ｃ−Ａｂｌ−Ｔ３１５１の効果は、ＰＤの低親和力結合および滴定ではなく、ｃ−Ａｂｌ−Ｔ３１５１のキナーゼ活性に起因したことを示唆する。
【０１２９】
（ＡｂｌまたはＡｂｌ関連キナーゼの公知の基質は、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの台座様構造において局在する）ＥＰＥＣのＴｉｒがＡｂｌの基質であるか否かを試験するために、単離中にＴｉｒが脱リン酸化されるようになる条件下で前もってＥＰＥＣを用いて感染させた細胞から、Ｔｉｒを免疫沈降した。Ｔｉｒの存在を、α−Ｔｉｒ  ｐＡｂを用いるウェスタンブロットによって評価し、リン酸化チロシンを４Ｇ１０  ｍＡｂを用いて検出した。ＡＴＰならびに精製されたＡｂｌキナーゼの、免疫沈降されたＴｉｒへの添加は、Ｔｉｒのチロシンのリン酸化をもたらし、ＰＤの添加は、Ｔｉｒのリン酸化を遮断した。Ｔｉｒのチロシンリン酸化部位がＡｂｌの標的において見られるチロシンリン酸化部位と類似しているか否かもまた、評価した。ＣｒｋＩＩはＡｂｌによってＹ２２１でリン酸化され、ＣｒｋＩＩのリン酸化されたＹ２２１を認識するｐＡｂはまた、リン酸化されたＴｉｒも認識する。従って、ＡｂｌはＥＰＥＣのＴｉｒをインビトロで直接的にリン酸化し得、Ｔｉｒのリン酸化部位は、公知のＡｂｌの基質において見られるリン酸化部位と類似している。
【０１３０】
（結論）
総合して、これらの結果は、ｃ−Ａｂｌの活性は、チロシンキナーゼのうちで、ＥＰＥＣまたはＥＨＥＣによって、およびＥＰＥＣのＴｉｒのリン酸化によって開始される台座様構造形成のために十分であることを示唆する。Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞を用いる場合の結果は、ＰＤに対して感受性であり、台座様構造において局在する能力およびＴｉｒまたは他の台座様構造タンパク質をリン酸化する能力をｃ−Ａｂｌと共有する、他のチロシンキナーゼもまた、充足し得ることを示唆する。実際に、チロシンキナーゼの間の機能的重複は、Ａｂｌファミリーメンバーの間ですら、よく認識される。これらの研究は、ＥＨＥＣの台座様構造形成におけるチロシンのリン酸化に関する役割を同定する最初の結果、および、ＥＰＥＣまたはＥＨＥＣのいずれかのシグナル伝達のために十分であるチロシンキナーゼの最初の記載を提供した。これらの結果は、ＰＤまたは関連化合物が、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの感染を処置するまたは予防するために有用であり得ることを示す。
【０１３１】
（実験５−Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍはＥＰＥＣの有用なモデルである）
マウスにおけるＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ感染が、人におけるＥＰＥＣ感染の有用なモデルであるか否かを決定するために、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍがＥＰＥＣと同じ機構によって台座様構造形成を引き起こすか否かが問題である。Ｔｉｒ、リン酸化チロシン、Ｎｃｋ、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ａｂｌ、およびＡｒｐ２／３複合体は全てがＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの台座様構造中に局在することを見出した。さらに、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍは、Ｎ−ＷＡＳＰ欠損マウス由来の線維芽細胞で台座様構造を形成し得なかった。次に、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの台座様構造がＰＤに対して感受性であるか否かを決定した。ＰＤは、実際に、Ｃ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍの台座様構造を遮断し、「逆転」した。総合して、これらの結果は、ＥＰＥＣおよびＣ．ｒｏｄｅｎｔｉｕｍによって同じ機構で誘導される台座様構造は、ＰＤによって遮断され、逆転されることを示唆する。
【０１３２】
（実験６−マウスにおける薬物の投与および検出）
本発明の化合物のマウスにおける効力を試験するために、ＰＤおよびＳＴＩをマウスに導入する手段、および血清中のこの化合物を検出する手段を開発した。加えて、インビボでのＶＶについてのＬＤ９０を決定した。
【０１３３】
２０μｌの１０４ｐｆｕ／ｍｌのＶＶ株ＷＲを用いる鼻腔内接種は、ほぼ１００％のマウスを６日以内に殺すが、２０μｌの１０３ｐｆｕ／ｍｌは、約５０％のマウスを殺し、公開された報告と概して一致している（Ｒｅａｄｉｎｇら（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７０：１４３５）。１００ｍｇ／ｋｇ／日までのＳＴＩ−５７１を用いる腹腔内注射（生理食塩水中）または３０ｍｇ／ｋｇ／日までのＰＤ−１６６３２６（３１％のＰＥＧ４００／３１％のＤＭＳＯ／３８％の生理食塩水中）は、マウスにおいて、試験した最長期間である１０日間まで、高い耐性を有した。ＳＴＩ−５７１について、用量は、ヒトにおいてＣＭＬを処置するために使用される用量より１０倍高かったが、この動物がこの化合物に対して耐性を有する能力に基づいて選択された。この動物は実際に耐性であった（Ｄｒｕｋｅｒら（２００１）Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｍ  Ｓｏｃ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｅｄｕｃ．Ｐｒｏｇｒａｍ）：８７；ＷｏｌｆｆおよびＩｌａｒｉａ（２００１）Ｂｌｏｏｄ，９８：２８０８）。薬物のレベルは、必要とされる最少量を決定するために容易に滴定され得る。薬物単独を用いた場合、マウスは１０日の期間にわたって体重減少の徴候を示さず、剖検で顕性の病原性を有さなかった。ＨＰＬＣ／質量分光分析を用いて、注射された動物の血清中のＰＤを、３０ｎｇ／ｍｌもの低い濃度で検出することが可能となっている。ＰＤについての標準曲線は１０００ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌまでの直線である（図８Ａ）。必要とされるサンプル容積は３０μｌである。ＰＤを、分子量（イオン電流）に基づいて検出した。
【０１３４】
血漿サンプルを、ＰＤを濃縮し血漿タンパク質を除去するために固相抽出に供し、Ｚｏｒｂａｘ  Ｓｔａｂｌｅ  Ｂｏｎｄ  Ｃ８カラムで溶離し、ＭＳ（４２７でのＡＰＣＩ陽性ＳＩＭ）においてモニタリングした。ＭＳの読み取り値（ｒｅａｄｏｕｔ）をカラムでの保持時間の関数としてプロットする。第一のピークは内部キャリブレーション基準であり、第二のピークはＰＤである（図８Ｂ）。
【０１３５】
感染マウスにおけるウイルス負荷を定量するため、リアルタイムＰＣＲアッセイを利用し、組織サンプル中の７コピーまで少ないＶＶを検出した。卵巣または脳および他の器官を、プロテアーゼＫを用いて分解し、ＤＮＡを抽出し、精製した（Ｑｕｉａｇｅｎ）。このＤＮＡの内容物を正規化し、等量のＤＮＡをＶＶ  ＷＲ特異的プライマーおよびＴａｇｍａｎ／ＦＡＭ色素／消光剤系と共にリアルタイムＰＣＲ（Ｉ−ｃｙｃｌｅｒ）に供した。サンプル中のＤＮＡの量を、公知のＶＶのＤＮＡ基準を用いてキャリブレーションした。この方法を用いて、ＳＴＩ−５７１で処置されたマウスにおけるウイルス負荷は、未処置のマウスにおいて見られたウイルス負荷より６桁の規模で低かった。
【０１３６】
（実験７−Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのスクリーニングは宿主における新規の薬物標的を定義する）
ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの病因の研究は、Ｅ．ｃｏｌｉのＫ１２と比較して１３８７個の獲得および５２８個の欠損を含む、非常に複雑なゲノムによって、および、提案されるビルレンス要因の多くについて機能的アッセイがないことによって、制限される（Ｐｅｒｎａら（１９９８）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：３８１０）。ここで、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの病因が線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて研究され得る手段が同定された：特定の発育条件下で、この細菌は線虫を殺した。この殺虫は、ヒトの疾患に関連がある。なぜならば、ヒトにおいて非病原性である細菌変異体もまた、線虫を殺さないからである。
【０１３７】
他の微生物による殺虫に対して耐性を与えることが公知である変異体の線虫のスクリーニングにおいて、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの寿命を延長するｄａｆ−２遺伝子が、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣによる殺虫に対する耐性を与えることが見出された（Ｄｏｒｍａｎら（１９９５）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４１：１３９９；Ｍｕｒｐｈｙら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ，４２４：２７７）。これは、ＥＰＥＣまたはＥＨＥＣの病因を研究するために利用可能な、最初に明らかにされた遺伝子系である。両方の生物が遺伝子的に操作され得るので、この系は、宿主および病原体の両方における変異体を同定して特徴付ける能力を提供する。この系は、ＥＰＥＣおよびＥＨＥＣの病因のＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおける研究を可能にし、この研究は、線虫および哺乳動物の宿主において、新規の細菌のビルレンス要因およびそのような要因の標的の同一性を生じ得る。
【０１３８】
（実験８−ＰＤは、インビトロでポリオーマウイルスの複製をブロックする）
ポリオーマウイルスタンパク質Ｍｉｄｄｌｅ  Ｔ（ＭＴ）は、このウイルスが高レベルの増殖性の感染を生じ、インビトロで細胞を形質転換し、そしてマウスの感受性系統において腫瘍を生成するために必須である。ＭＴは、宿主細胞のキナーゼｃ−Ｓｒｃ、ｃ−Ｆｙｎおよびｃ−Ｙｅｓを補充し、それらに結合し、そしてそれらを活性化するＩＩ型内在性膜タンパク質である。多くのインビトロ研究およびインビボ研究は、これらのチロシンキナーゼに結合し、そして活性化させるＭＴの能力が、ウイルスの増殖促進機能および発癌機能のために必要であることを確証した。実質的に、全てのヒトは、２つの公知のヒトポリオーマウイルス（ＪＣＶおよびＢＫＶ）の各々に永続的に感染している。
【０１３９】
ヒトポリオーマウイルスは、ＭＴタンパク質をコードしないが、相同的なタンパク質ｓｍａｌｌ  Ｔ（ＳＴ）が存在する。他のウイルス（例えば、ＥＢＶ）もまた、Ｓｒｃキナーゼを標的とする（Ｌｏｎｇｎｅｃｋｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：３６８１）。
【０１４０】
本実験において、３Ｔ３細胞へのポリオーマウイルスの細胞変性効果に対するＰＤおよびＳＴＩ−５７１の効果を評価した。ＰＤおよびＳＴＩ−５７１の両方は、細胞変性効果を阻害した。３Ｔ３細胞の単層を、感染させないままにしたか、または５日間ポリオーマウイルスにより感染させた。感染させた群の細胞を、以下の条件に分けた：ＤＭＳＯ（ＰＤのためのキャリア）；１０μＭ  ＳＴＩ−５７１；および１μＭ  ＰＤ１６６３２６。ポリオーマ感染は、ＤＭＳＯの群において細胞死を引き起こしたが、ＳＴＩ−５７１およびＰＤの添加は、死滅の程度を減少させた。したがって、これらの結果は、これらの化合物が、ポリオーマウイルス感染のインヒビターとして有用であることを示す。
【０１４１】
（実験９−ＳＴＩ−５７１は、インビトロでＨＩＶの複製をブロックする）
本実験では、ＨＩＶの複製に対するＳＴＩ−５７１の効果を調べた。培養マクロファージを、培地、ＨＩＶ−Ｂａｌ、種々の用量のＳＴＩ−５７１、またはＨＩＶ−１  Ｂａｌとの組み合わせた種々の用量のＳＴＩ−５７１のいずれかにより感染させた。ウイルス複製（ｐ２４レベルにより測定される）は、ＳＴＩ−５７１の添加により、用量依存的な様式で１／４にまで減少した（表１）。これらの結果は、ＳＴＩ−５７１が、ＨＩＶ感染のインヒビターとして有用であることを示す。
【０１４２】
【表１】
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（実験１０−チロシンキナーゼインヒビターの開発）
本実験では、多数の生物学的に関連するチロシンキナーゼ（Ａｂｌ、ＰＤＧＦＲおよびＳｒｃ）に対する新規の強力なインヒビターを開発することを目論んだ。ＳＴＩ−５７１とピリド［２，３−ｄ］ピリミジンとを誘導体化（ｄｅｒｉｖｉｔｉｚｅ）した（Ｇｏｏｓｎｅｙら（２０００）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６：１７３；Ｋｎｕｔｔｏｎら（１９８９）Ｌａｎｃｅｔ  ２：２１８）。これらの誘導体を、異なる所望の特徴（可溶性の最適化、単なる薬物動態特性および薬理学特性、ならびに微生物の病因に影響するキナーゼをブロックするが、免疫クリアランスに影響するキナーゼをブロックしないことにおける特異性が挙げられる）に基づいてスクリーニングした。このようなスクリーニングに基づいて、ＳＴＩ−５７１を同定した（上記実験２を参照のこと）。これらの結果は、ＳＴＩ−５７１とピリド［２，３−ｄ］ピリミジンとを誘導体化することが、新規の特異性または望ましいインビボ特性を有する分子をもたらし得ることを示す。
【０１４３】
（実験１１−インビトロでのＴＢの病因に対するチロシンキナーゼインヒビターの効果）
本実験は、選択されたチロシンキナーゼインヒビターが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＴＢ）（結核の病原体）の病因に影響し得るか否かに焦点を当てた。培養されたヒトマクロファージ（株ＴＨＰ−１）へのＴＢの侵入を、基本的にＭｉｌｌｅｒおよびＳｈｉｎｎｉｃｋ（２００１）、ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１：２６に記載されるように実行した。簡潔に言うと、ＴＢ培養物を、３０分間〜２時間の間、この細胞に添加した。次に、アクチノマイシンＤを、この培養物に添加し、細胞外に残るあらゆる細菌を殺した。それから、このアクチノマイシンＤを洗い流し、この細胞を溶解させ、陥入した細菌を遊離させた。次に、この溶解物を、細菌用プレートにプレートし、そして回収されたコロニーの数を数えた。実験を、１００ｎＭ〜１０μＭの範囲の濃度（他のＥＰＥＣアッセイおよびＶＶアッセイにおいて有効であることが示されている濃度）のＰＤ、ＳＴＩ−５７１の添加を伴うか、または伴わないで実行した。
【０１４４】
コロニー数は、侵入が阻害されたか否かについての指標であった。細胞増殖アッセイおよびトリパンブルー排除を使用し、マクロファージが、これらの薬物により悪影響を及ぼされていないことを確かめた。結果は、ＳＴＩ−５７１がＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの細胞内の生存を増大させることを示唆した（図９）。これらの結果は、チロシンキナーゼインヒビターが、ＴＢ感染を阻害することにおいて有用であることを示す。
【０１４５】
本明細書に記載される本発明の多くの変更および他の実施形態は、本発明が属する技術分野における当業者に想到し、上記の説明および付随する図面に示される教示の利益を有する。したがって、本発明は開示される特定の実施形態に限定されず、かつ変更および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されることが理解されるべきである。本明細書において、特定の用語が使用されるが、それらは、一般的かつ記述的な意味においてのみ使用され、かつ限定の目的のためではない。さらに、本明細書および添付の実施形態において使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の対象を含むことが注意されるべきである。
【０１４６】
本明細書で言及される全ての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野における当業者のレベルを表す。全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が、参考として援用されるために、詳細かつ個別に示されるような同一の範囲について、本明細書において参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、ＡｂｌファミリーチロシンキナーゼおよびＳｒｃファミリーチロシンキナーゼが、ＶＶアクチンテイル（ｔａｉｌ）に局在化することを示す。（Ａ）３Ｔ３細胞において、Ａｂｌを含むか、Ａｒｇを含むか、ＡｂｌおよびＡｒｇの両方を含むか、またはＡｂｌもＡｒｇも含まないテイルのパーセンテージの定量化。（Ｂ）ＶＶアクチンテイルにおける、Ｓｒｃファミリーキナーゼの分布の定量化。
【図２】図２は、（Ａ）Ｓｒｃ−／−／Ｆｙｎ−／−／Ｙｅｓ−／−細胞；および（Ｂ）Ａｂｌ−／−／Ａｒｇ−／−細胞についての、ＶＶアクチンテイルにおける、ＡＢＬファミリーキナーゼおよびＳｒｃファミリーキナーゼの分布の定量化を示す。
【図３】図３は、ＶＶへの８時間の曝露より前の、ＡｂｌファミリーキナーゼとＳｒｃファミリーキナーゼとのインヒビターＰＤ１６６３２６による３Ｔ３細胞の処置の効果の定量化を示す。結果は、１００個の感染細胞内のテイルを反映する。感染は、ＥＶＰ染色により評価された。
【図４】図４は、ＳＴＩ−５７１が、マウスにおけるＶＶ量を軽減することを示す。６週齢のＣ５７／Ｂ６マウスを、感染させないまま（ウイルス無し）か、または１０４ＰＦＵ／ｍｌ  ＶＶにより感染させた。感染の１日前に、ＰＢＳ（キャリア）またはＳＴＩ−５７１（一日あたり１００ｍｇ／ｋｇ）を含む連続放出性の浸透圧ポンプが、外科的に皮下移植された。各データセット内の線は、ウイルス負荷のメジアンを示す。このデータは、フィッシャーの直接確率検定により有意である（Ｐ＜１０−６）。
【図５】図５は、ウイルス複製に対するＳＴＩ−Ｘの効果の定量化を示す。感染細胞のパーセンテージが、ＥＶＰ染色か、または核外ＤＡＰＩ染色により測定されるように、核外複製の中心を含むＧＦＰ標識ビリオンの存在のいずれかによって評価され、プロットされる。
【図６】図６は、ＥＰＥＣの台座様構造の形成および維持が、ＰＤ１６６３２６および関連するキナーゼインヒビターによりブロックされることを示す。グラフは、ＤＭＳＯ、１０μＭ  ＰＤ１６６３２６または１０μＭ  ＰＰ２による前処置レジメンまたはリバーサルレジメンにしたがって処置されたＥＰＥＣについての最も強い強度の画素により占められた領域を示す。ＥＰＥＣは、０．１％  ＤＭＳＯ（Ｘ）または２５μＭ  ＰＤ（Δ）のいずれかとともに培養され、そして示される時点に、そのＯＤ６００が測定された。
【図７】図７は、ＰＤが、ＥＰＥＣのＴｉｒのチロシンリン酸化をブロックするが、Ｔｉｒの局在化をブロックしないことを示す。細胞は、ＤＭＳＯまたはＰＤにより処理され、そして感染させないまま（０時間）か、または示される時間の間、ＥＰＥＣにより感染させた。逆転条件については、細胞は、感染させないまま（レーン１）か、また６時間、ＥＰＥＣにより感染させ、示される時間の間、ＰＤにより処理され、そして分析された。
【図８】図８（Ａ）は、ＰＤについての標準血漿曲線が、１０００ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌにおいて直線状であることを示す。図８（Ｂ）は、マウス血漿のクロマトグラムを示す。質量分析の読み出しは、カラム内の保持時間の関数としてプロットされる。第一のピークは内部較正標準であり、第二のピークはＰＤである。
【図９】図９は、種々の時点における、ＳＴＩ−５７１へ曝露しなかった後のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの細胞間の生存  対  ＳＴＩ−５７１への曝露後のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの細胞間の生存を示す。ＷＴは、いかなる薬物にも曝露されていない細胞を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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