(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多量体アディポネクチンを含む試料にキモトリプシンを作用させて高分子量アディポネクチン画分以外のアディポネクチンを消化し、残存する高分子量アディポネクチンを抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定することを特徴とする、試料中の高分子量アディポネクチンの分別測定方法。
【請求項２】
試料が、ヒト、マウス又はラットの血清又は血漿である請求項１記載の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料中に含まれる多量体アディポネクチンの内、高分子量（ＨＭＷ）画分を分別して免疫学的に測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アディポネクチンは、脂肪組織特異的に産生、分泌され、抗糖尿病作用、抗動脈硬化作用を有するホルモンで、血中に比較的豊富に存在する。近年、肥満を伴う、特に内臓脂肪の蓄積による低アディポネクチン血症は、糖尿病、動脈硬化性疾患や高血圧の発症につながると考えられている。【０００３】
アディポネクチンは、構造上Ｃ１ｑ（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  １ｑ）ファミリーに属し、Ｃ１ｑファミリーの特徴であるコラーゲン様ドメインを有していることから、３量体を基本とした多量体を形成して存在していることが報告されている。最近、本発明者らにより、ヒト血中に存在する多量体アディポネクチンの形態（アルブミン結合型を含む３量体、６量体及びＨＭＷ画分）が解明され、さらに糖の取り込みや脂肪酸燃焼を促進するＡＭＰＫ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）のリン酸化を指標とした多量体アディポネクチンの活性化作用においては、ＨＭＷ型が最も高い活性を示すことも報告した（非特許文献１）。加えて、ヒト由来多量体アディポネクチンを含む生体試料に、ある種のプロテアーゼを作用させることにより、測定対象以外の画分を選択的に消化し、残存するアディポネクチンを免疫学的に測定することによって、直接ＨＭＷアディポネクチン濃度を、又間接的には３量体や６量体画分をそれぞれ分別測定する方法を開示した（特許文献１、非特許文献２）。【０００４】
さらに、本分別測定系を利用した糖尿病及び冠動脈疾患群における多量体アディポネクチンの臨床研究では、インスリン抵抗性やメタボリックシンドロームの予知指標として、トータル濃度に占めるＨＭＷアディポネクチンの比率（ＨＭＷＲ）がトータル濃度以上に、感度・特異性が高いという知見を報告している（非特許文献３）。従って、トータル濃度のみならず、各分画を分別測定する臨床的有用性について期待されている。【０００５】
一方、メタボリックシンドローム関連疾病（糖尿病、高血圧、高脂血症）の治療薬の中には、アディポネクチンを増加させる作用を有するものがあり、注目されている。例えば、インスリン抵抗性改善薬であるチアゾリジン誘導体は、ＨＭＷアディポネクチンを増加させることが報告されている（非特許文献４）。その他では、最近降圧剤のアンジオテンシン受容体拮抗薬に分類されるある薬剤や、高脂血症治療薬の一部の薬剤でも、アディポネクチン増加作用を有すことが報告され（非特許文献５）、メタボリックシンドロームを呈する疾患群に高頻度に認められるインスリン抵抗性に対して、改善が期待されている。【０００６】
このように、メタボリックシンドローム関連疾病に対する薬剤開発において、アディポネクチン増加作用を有することは、有用な付加価値である。さらに、薬剤開発のみならず、健康食品分野においても注目されており、このアディポネクチン増強作用を有する機能性食品の探索も精力的に行われている。【０００７】
薬剤や機能性食品の効能効果は、通常まずマウスやラット等の実験動物を用いて行われるが、アディポネクチン増加作用に関しても、実験動物の血中アディポネクチン濃度の変化を指標として利用することは有用である（例えば、特許文献２，３）。マウスやラットのアディポネクチン濃度は、既に測定キットとして市販されており入手可能であるが、単に総量を測定するのみで、多量体アディポネクチンを分別できるものではなく、特に高活性型であるＨＭＷアディポネクチンを分別して測定する方法が要望されていた。【０００８】
本発明者らは、ヒト生体試料中に存在する多量体アディポネクチンに対して、特定のプロテアーゼを作用させることで、多量体アディポネクチンの分別測定方法を見出しているが（特許文献１、非特許文献２）、興味深いことに、この時利用したプロテアーゼを、マウス由来の多量体アディポネクチンの分別測定への適用を試みた場合、特にＨＭＷ画分の正確な測定には適さないことが判明した。【０００９】
一方、Ｐａｊｖａｎｉらは、組換発現させたマウス由来アディポネクチンを用いて、トリプシンの消化特異性を報告しているが、低分子量画分（ＬＭＷ）は消化するものの、中分子量画分（ＭＭＷ）やＨＭＷ画分は消化されないことが示されており、ＨＭＷアディポネクチンの分別測定には不向きである（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開  ＷＯ２００５／０３８４５７公報
【特許文献２】特開２００５−２３２１５０号公報
【特許文献３】特開２００６−５６８３６号公報
【非特許文献１】Ｈａｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３５６：４８７−４９３，２００７．
【非特許文献２】Ｅｂｉｎｕｍａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ．３７２：４７−５３，２００６．
【非特許文献３】Ｈａｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．２９：１３５７−１３６２，２００６．
【非特許文献４】Ｔｓｕｃｈｉｄａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５４：３３５８−３３７０，２００５．
【非特許文献５】Ｎａｋａｎｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２９２：１２１３−１２２２，２００７．
【非特許文献６】Ｐａｊｖａｎｉ  ＵＢ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８：９０７３−８５，２００３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、多量体アディポネクチンの中で、高活性型であるＨＭＷアディポネクチンを分別測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意研究したところ、多量体アディポネクチンを含有する試料に対して、種々のプロテアーゼのうち、キモトリプシンを作用させることによって、マウスやラット等においてもＨＭＷ画分以外のアディポネクチンを選択的に消化しうること、及びキモトリプシンによる消化処理の後、残ったＨＭＷアディポネクチンを、免疫学的に測定すれば、ＨＭＷアディポネクチンが分別測定できることを見出した。【００１３】
すなわち、本発明は、プロテアーゼを使用して多量体アディポネクチンを分別して免疫学的に測定する方法であって、多量体アディポネクチンを含む試料にキモトリプシンを作用させることを特徴とする、試料中のＨＭＷアディポネクチンの分別測定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ヒトだけでなく、マウスやラット等の多量体アディポネクチンの内、ＨＭＷアディポネクチンを分別して測定できることから、開発された薬剤や機能性食品等のアディポネクチン増強作用を、より正確に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】キモトリプシンのマウス由来多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。
【図２】キモトリプシンのラット由来多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。
【図３】トリプシンのマウス、ラット及びヒト由来多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。Ａはマウス血清、Ｂはラット血清、Ｃはヒト血清である。
【図４】プロテイナーゼＫのヒト及びマウス由来多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。Ａはヒト血清、Ｂはマウス血清である。
【図５】キモトリプシンのヒト由来多量体アディポネクチンに対する消化特異性を示す図である。
【図６】ゲル濾過分離検出法によるマウス高分子量アディポネクチンの測定結果を示す図である。
【図７】ＥＬＩＳＡ測定とゲル濾過分離検出法との相関性を示す図である。
【図８】キモトリプシン処理法とプロテイナーゼＫ処理法におけるヒト由来高分子量アディポネクチン測定結果の相関性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明において使用できる試料としては、哺乳類由来多量体アディポネクチンを含有するものであればすべて対象となり、哺乳類から得られた血液、尿などの体液、組織抽出液や組織由来の細胞の培養上清液などが挙げられる。ここで、哺乳類としては、マウスやラット等のげっ歯類、及びヒト等が挙げられる。これらのうち、開発された薬剤や機能性食品等のアディポネクチン増強作用を、より正確に評価するための試料としては、マウス又はラットの血液（血清、血漿）、特にマウスの血液が好適である。また、糖尿病等の診断のための試料としてはヒトの血液（血清、血漿）が好適である。
【００１７】
ＨＭＷアディポネクチンを分別して免疫測定するための方法について説明する。多量体アディポネクチンが含まれる試料にキモトリプシンを作用させ、ＨＭＷ画分以外のアディポネクチンを消化し、キモトリプシンによる消化処理の後、残ったＨＭＷアディポネクチンを、抗アディポネクチン抗体を用いて免疫学的に測定する。本発明に使用されるキモトリプシンは、精製されたものが市販品として入手されるが、本発明が成り立つ程度に粗精製されたものも利用できる。又、遺伝子組換え技術により得られたものであっても差し支えない。またキモトリプシン活性を有する限り、化学修飾を施されていてもよい。
【００１８】
生体試料のキモトリプシンによる処理は、リン酸、トリス、グッド等の緩衝液中、４〜６０℃で、好ましくは４〜４５℃で５分〜２４時間行うことが好ましい。キモトリプシンの使用濃度は、反応温度及び反応時間等を考慮して決定されるが、概ね０．１〜１０００ｕ／ｍＬの範囲で使用され、さらに好ましくは、１〜１００ｕ／ｍＬの範囲で使用される。キモトリプシン処理におけるキモトリプシンの使用濃度、反応温度、及び反応時間は、試料の動物種によって相違するため、予備試験により試料中のＨＭＷアディポネクチンだけを消化しない条件を確認しておくのが好ましい。ここでいうキモトリプシンの活性（ｕ）は、ｐＨ７．８の条件下２５℃で、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル（ＢＴＥＥ）が、１分間当たり１μｍｏｌｅ加水分解される量を示す。
【００１９】
キモトリプシンにより前処理された試料中の多量体アディポネクチンは、キモトリプシン消化によりＨＭＷアディポネクチンが残存するので、当該試料中のアディポネクチン濃度を抗アディポネクチン抗体を用いる免疫測定を行えば、ＨＭＷアディポネクチンのみが分別測定できる。従って、キモトリプシン処理された試料の免疫学的測定は、抗アディポネクチン抗体を用いる通常の手段によって行うことができる。
【００２０】
試料をキモトリプシンで処理し、残存するＨＭＷアディポネクチンを測定するための抗体としてはアディポネクチンを認識する抗体を使用することができる。抗アディポネクチン抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも利用でき、公知の手法によって適当な動物に免疫して得ることができるが、市販品として入手することも可能であり、本発明に使用できる。例えば、抗マウスアディポネクチン抗体は、「Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」や「Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｇｏａｔ」（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、「Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ｍＡｄ（ＭＡＤＩ０４）」（ＡｄｉｐｏＧｅｎ社）、「Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）などが挙げられ、抗ラットアディポネクチン抗体は、「Ａｎｔｉ−ｒａｔ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｇｏａｔ」（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）、「Ａｎｔｉ−ｒａｔ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ」や「Ａｎｔｉ−ｒａｔ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｒａｂｂｉｔ」（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社）などが挙げられる。抗ヒトアディポネクチン抗体としては、Ｇｏａｔ  α  ｈｕｍａｎ  Ａｃｒｐ３０  ａｎｔｉｂｏｄｙ（コスモバイオ社、ＧＴ社）、ｒａｂｂｉｔ  α  ｈｕ  ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ−ＰｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、ｈｕ  Ａｃｒｐ３０−ＭｏＡｂ（藤沢薬品工業社、ＢＤ社）、Ｍｏｕｓｅ  α  ｈｕ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ＭｏＡｂ（コスモバイオ社、ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）、抗ヒトＡＣＲＰ３０モノクローナル抗体（ＡＸ７７３、ＡＸ７４１、Ｎｅ，Ｎａ、和光純薬工業社）などが挙げられる。これらの抗体は、それぞれ単独又は適宜組み合わせて使用することができる。また、市販のアディポネクチン総量を測定するキットも使用することも可能となる。他に、生体試料を、還元剤、酸又はその塩、界面活性剤及びキモトリプシン以外のプロテアーゼの内の少なくとも一つ若しくは二つ以上の組み合わせをアディポネクチンに作用させ、多量体アディポネクチンを一定の形態に変換させて免疫学的に測定する本発明者らの開発した方法（ＷＯ２００５／０３８４５８）も利用できる。
【００２１】
本発明の免疫学的測定方法としては、アディポネクチンに対して特異的に結合する抗体を不溶性担体に結合させ、それによってアディポネクチンを捕捉し、試料中に存在するアディポネクチンの有無の確認（定性）又は定量する方法が使用される。なかでも、ＬＴＩＡ（ラテックス免疫比濁法）、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＣＬＥＩＡ（化学発光酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などと言った方法が挙げられる。このうち、ＬＴＩＡはアディポネクチンと特異的に結合する抗体を担持させた不溶性担体と、予めキモトリプシンを作用させ残存するＨＭＷアディポネクチンとを混合することにより、アディポネクチンを介した不溶性担体の架橋（凝集）が起こり、その結果生じる濁りを光学的に測定することでアディポネクチンの有無の確認（定性）又は定量する方法であり、ＨＭＷアディポネクチンを簡便、迅速かつ正確に測定するのに好ましい。
【００２２】
本発明に使用される不溶性担体としては、通常の免疫学的測定試薬に使用され工業的に大量生産可能な有機系の不溶性担体が使用される。ＬＴＩＡにおいては抗体の吸着性に優れかつ生物学的活性を長期間安定的に保持できるポリスチレン系のラテックス粒子やＥＬＩＳＡにおいてはポリスチレンなどの９６穴のマイクロプレートが好ましい。
【００２３】
上記不溶性担体の表面に抗体を担持させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、担持（感作）方法として不溶性担体表面に抗体を物理的に吸着させる方法や、官能基を有する不溶性担体表面に既知の方法である物理結合法や化学結合法により抗体を効率的に感作する方法が挙げられる。
【００２４】
抗体を担持させた抗体不溶性担体とアディポネクチンとの反応は、抗原抗体反応が起こり得る条件であれば、その反応条件は特に限定されない。反応液としては、アディポネクチンとの抗原抗体反応が起こり得る溶液であればどのようなものでも良い。例えば、ｐＨを制御するためのリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液などの緩衝成分、非特異反応を回避するための界面活性剤や塩化ナトリウムなど、安定化剤としてのウシ血清アルブミン、ショ糖、高分子多糖類など、反応性を制御する前記物質の他にデキストランなどの水溶性多糖類、還元剤や酸の中和剤、プロテアーゼの不活性化剤などの添加剤を適宜溶解させても良い。
【００２５】
前記したＬＴＩＡやＥＬＩＳＡにおける検出方法としては、次の方法が挙げられる。ＬＴＩＡにおける不溶性担体の凝集程度を測定する方法は特に限定されないが、例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合は、既知濃度試料の濁度程度と測定試料の濁度程度との比較から、凝集の程度を目視によって判定することも可能である。また、該凝集を定量的に測定する場合は、簡便性及び精度の点からは、光学的に測定することが好ましい。凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加として捕らえる）、粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないしは平均粒径の変化として捕らえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。ＥＬＩＳＡにおける酵素標識抗体の酵素活性に由来する、基質と酵素の反応生成物を測定する方法は特に限定されない。例えば、酵素反応生成物固有の波長、例えばＨＲＰ標識抗体の酵素活性を基質としてオルトフェニレンジアミン塩酸塩と過酸化水素を用いて検出する場合などでは、４９２ｎｍにおける吸光度として９６穴マイクロプレートリーダーで読み取ることが可能である。
【００２６】
さらにまた、生体試料を、キモトリプシン処理しない場合は、アディポネクチンの総量が測定されることから、キモトリプシンを処理することで算出されるＨＭＷアディポネクチンの比率を簡単に求めることもできる。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。【００２８】
実施例１  マウス血清中の多量体アディポネクチンに対する消化特異性
マウス血清１０μＬに、α−キモトリプシン（ＴｙｐｅＩ−Ｓ；Ｎｏ．Ｃ７７６２，シグマ−アルドリッチ社）を１０ｕ／ｍＬとなるよう、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した酵素液を１００μＬ加え、３７℃で２０分間加温した。その反応液に、ＢＳＡ−ＰＢＳＴ（１％  ウシ血清アルブミン及び０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．２）を、４００μＬ加えた後、全量をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、ゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。溶離液には、ＰＢＳ（２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．２）を用いて、１ｍＬずつ分取した。対照として、上記条件でキモトリプシンを含まない以外は、同様の条件でゲルろ過クロマトグラフィーを実施したフラクションを用意した。【００２９】
各フラクション中のアディポネクチンの検出は、次の通りに行った。Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）をＰＢＳで２．５μｇ／ｍＬに希釈した後、ＥＬＩＳＡ用プレートに１ウェルあたり５０μＬを添加し、一晩感作した。ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ液,ｐＨ７．４）でプレートを洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１００μＬ添加しブロッキングした。続いて、各フラクションをＢＳＡ−ＰＢＳＴで２倍希釈したものを５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１．０μｇ／ｍＬに希釈したＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１／２０００倍希釈したＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｇｏａｔ  Ｉｇ’ｓ  ＨＲＰ標識抗体液（ＤＡＫＯ社）を５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄後、基質液（２ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を５０μＬ添加し、室温で１０分間反応させ、停止液（１．５Ｎ硫酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を５０μＬ添加し反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。測定結果を図１に示した。【００３０】
キモトリプシン消化処理を実施していない場合では、マウス血清中の多量体アディポネクチンは、３つのピークに分離された。一方、マウス血清をキモトリプシンで処理した場合では、アルブミン結合型（Ａｌｂ−）ＬＭＷを含むＭＭＷアディポネクチン溶出ピーク（２番目）やＬＭＷアディポネクチン溶出ピーク（３番目）は消えたのに対し、ＨＭＷアディポネクチン溶出ピーク（１番目）は残存していた。この結果より、マウス由来多量体アディポネクチンを含む試料に、キモトリプシンを作用させることで、ＨＭＷアディポネクチンのみを消化せずに残存させることができることから、この処理液中のアディポネクチンを測定することによって、ＨＭＷアディポネクチンの濃度が算出される。【００３１】
実施例２  ラット血清中の多量体アディポネクチンに対する消化特異性
ラット血清５０μＬに、α−キモトリプシン（ＴｙｐｅＩ−Ｓ；Ｎｏ．Ｃ７７６２，シグマ−アルドリッチ社）を１００ｕ／ｍＬとなるよう、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した酵素液を１００μＬ加え、３７℃で２０分間加温した。その反応液に、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを、４００μＬ加えた後、全量をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて、ゲルろ過クロマトグラフィーを実施した。溶離液には、ＰＢＳを用いて、１ｍＬずつ分取した。対照として、上記条件でキモトリプシンを含まない以外は、同様の条件でゲルろ過クロマトグラフィーを実施したフラクションを用意した。【００３２】
各フラクション中のアディポネクチンの検出は、次の通りに行った。Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｔ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）をＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに希釈した後、ＥＬＩＳＡ用プレートに１ウェルあたり５０μＬを添加し、一晩感作した。ＰＢＳＴでプレートを洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを１００μＬ添加しブロッキングした。続いて、各フラクションをＢＳＡ−ＰＢＳＴで２倍希釈したものを５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１．０μｇ／ｍＬに希釈したＲａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＷＯ２００５−０３８４５７）を５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄後、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで１／２０００倍希釈したＧｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  Ｉｇ’ｓ  ＨＲＰ標識抗体液（ＢＩＯＳＯＵＣＥ社）を５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄後、基質液（２ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）を５０μＬ添加し、室温で１０分間反応させ、停止液（１．５Ｎ硫酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を５０μＬ添加し反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。測定結果を図２に示した。【００３３】
キモトリプシン消化処理を実施していない場合では、ラット血清中の多量体アディポネクチンは、２つのピークに分離されたが、ＨＭＷアディポネクチンを示す溶出ピーク（１番目）は非常に少なかった。ラット血清をキモトリプシンで処理した場合では、アルブミン結合型（Ａｌｂ−）ＬＭＷを含むＭＭＷアディポネクチン溶出ピーク（２番目）は消失したのに対し、ＨＭＷアディポネクチン溶出ピーク（１番目）は残存していた。この結果より、ラット由来多量体アディポネクチンを含む試料に、キモトリプシンを作用させることで、ＨＭＷアディポネクチンのみを消化せずに残存させることができることから、この処理液中のアディポネクチンを測定することによって、ＨＭＷアディポネクチンの濃度が算出される。【００３４】
参考例１  トリプシンを用いた多量体アディポネクチンの消化特異性
マウス血清、ラット血清及びヒト血清それぞれ１０μＬに、トリプシン（Ｎｏ．Ｔ１４２６，シグマ−アルドリッチ社）を０〜５０ｕ／ｍＬとなるよう、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した酵素液を１００μＬ加え、３７℃で２０分間加温した。その反応液に、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを、４００μＬ加えた。その一部を非変性系のポリアクリルアミド電気泳動（ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）で分離後、セミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜をＢＳＡ−ＰＢＳＴでブロッキング後、ＰＢＳＴで洗浄し、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）０．１μｇ／ｍＬを室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで十分に洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｇｏａｔ）及びＤＡＢ基質キット（フナコシ社）を用いて発色させた。各血清の免疫染色結果は、図３（Ａ：マウス、Ｂ：ラット、Ｃ：ヒト）に示した。【００３５】
トリプシン活性が０ｕ／ｍＬの場合は、凡そ泳動距離の短い方から、ＨＭＷ画分、６量体（ＭＭＷ）画分、アルブミン結合３量体（Ａｌｂ−ＬＭＷ）を含む３量体画分（ＬＭＷ）に分離された（ラット血清は、ＭＭＷ画分が主で、ＨＭＷやＬＭＷ画分は少なく明確な染色バンドとしては見えていない）。１０〜５０ｕ／ｍＬトリプシン活性での消化後では、ＬＭＷ画分は消化されているが、ＭＭＷやＨＭＷ画分は消化できていないことが観察された。この結果より、トリプシンは、動物血清中のＨＭＷアディポネクチンの分別消化測定には利用できないことが判明した。【００３６】
参考例２  プロテイナーゼＫを用いた多量体アディポネクチンの消化特異性
参考例１の方法に準じて、プロテアーゼを７．５ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫに変えて、ヒト又はマウス血清の消化を行い、その反応液の一部を免疫染色した（図４、Ａ：ヒト、Ｂ：マウス）。【００３７】
ヒト血清では、ＨＭＷ画分のみが消化されずに残存しているが、マウス血清では、ＨＭＷ画分を含むすべての画分が消化されているのが観察された。この結果より、プロテイナーゼＫは、マウス血清中のＨＭＷアディポネクチンの分別消化測定には利用できないことが判明した。【００３８】
実施例３  ヒト血清中の多量体アディポネクチンに対する消化特異性
ヒト血清１０μＬに、キモトリプシン（ＴｙｐｅＩＩ；Ｎｏ．Ｃ４１２９，シグマ−アルドリッチ社）を０〜１００ｕ／ｍＬとなるよう、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した酵素液を１００μＬ加え、３７℃で２０分間又は６０分間加温した。その反応液に、ＢＳＡ−ＰＢＳＴを、４００μＬ加えた。その一部を非変性系のポリアクリルアミド電気泳動（ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）で分離後、セミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜に転写後、免疫染色を行なった。手順は、転写膜をＢＳＡ−ＰＢＳＴでブロッキング後、ＰＢＳＴで洗浄し、Ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）０．１μｇ／ｍＬを室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで十分に洗浄した後、Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣ  ｋｉｔ（Ｇｏａｔ）及びＤＡＢ基質キット（フナコシ社）を用いて発色させた。各血清の免疫染色結果は、図５に示した。【００３９】
キモトリプシン消化時間が２０分間の場合は、２５ｕ／ｍＬ濃度でもＭＭＷ以下の画分が若干残るが、５０〜１００ｕ／ｍＬ濃度では、ＨＭＷのみ残存していた。一方、消化時間が６０分間の場合は、１０ｕ／ｍＬ濃度では、消化はほとんど進んでいないが、２５〜５０ｕ／ｍＬ濃度では、ＨＭＷのみ残存していた。一方、１００ｕ／ｍＬではＨＭＷを含むすべての画分が消化された。【００４０】
参考例３  マウス血清由来多量体アディポネクチン（Ｍｓ−ｍＡｄ）の精製
抗マウスグロブラーアディポネクチン抗体結合樹脂（ＷＯ２００５−０３８４５７）に、マウス血清１８０ｍＬをに添加し、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で十分量洗浄した後、さらに０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄した。次に、１００ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．５）でマウスアディポネクチン画分を溶出し、溶出画分に２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１／１０量添加して中和した。さらに、中和した溶出画分を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂に添加し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ樹脂への非吸着画分を精製Ｍｓ−ｍＡｄとして回収し、ＰＢＳにて透析後、「マウス／ラットアディポネクチンＥＬＩＳＡキット」（大塚製薬社）によりアディポネクチン含量を測定した。【００４１】
参考例４  抗マウスアディポネクチンラットモノクローナル抗体の作製
参考例３で得た精製Ｍｓ−ｍＡｄ  ５０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、ラット（Ｆ３４４／Ｊｃｌ）に２週間おきに２回免疫を行った後、免疫したラットより脾臓並びにリンパ節細胞を摘出し、ポリエチレングリコールを用いた常法により、ｓｐ２／ｏミエローマ細胞と細胞融合を行った。抗マウスアディポネクチンモノクローナル抗体産生融合細胞の選択は、ＥＬＩＳＡ法によりリコンビナントマウスアディポネクチン（ｒＭｓ−Ａｄ）（ＢｉｏＶｅｎｄｅｒ社）と反応性が高いウエルを選択し、ついで限界希釈法にて選択する常法により行なった。抗マウスアディポネクチンモノクローナル抗体は、選択した融合細胞をプリスタン処理したヌードマウス腹空内に投与し腹水として回収した。腹水からの特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、５０％飽和硫安沈殿を回収し、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）にて透析した後、ＤＥＡＥイオン交換樹脂（東ソー社）に添加し、ＮａＣＬの濃度変動（０〜２００ｍＭ）によるグラジエント溶出により、精製ＩｇＧを得た（ＭｏＡｂ８３２０１Ｒ）。【００４２】
参考例５  抗マウスアディポネクチンウサギポリクローナル抗体の作製及びビオチン標識
参考例３で調製した精製Ｍｓ−ｍＡｄ１２０μｇを等量のフロイドのコンプリートアジュバントと混合して、ウサギに２週間おきに５回免疫して、抗血清を作製した。抗血清中の特異抗体（ＩｇＧ）の精製は、メロンゲル（Ｍｅｌｏｎ  Ｇｅｌ）（ピアス社）を用いて常法により行なった。さらに、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（ピアス社）を精製ＩｇＧに混ぜ、ビオチン標識を実施した（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＰｏＡｂ）。【００４３】
実施例４  マウスアディポネクチン総量及びＨＭＷのＥＬＩＳＡ測定とゲル濾過分離検出法との比較
１−１）検体の前処理
ＨＭＷ測定用：マウス血清（ｎ＝１０）１０μＬに、キモトリプシン３５ｕ／ｍＬを含むプロテアーゼ溶解液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）１００μＬを加え、３７℃で２０分間加温した。さらに、検体処理液（１００ｍＭほう酸緩衝液、ｐＨ１１．０）を７００μＬ加えたものを、ＨＭＷ測定用の処理検体液とした。
総量測定用：マウス血清１０μＬに、キモトリプシンを含まないプロテアーゼ溶解液１００μＬを加え、さらに、検体処理液を７００μＬ加えたものを、総量測定用の処理検体液とした。【００４４】
１−２）ＥＬＩＳＡ測定
ＥＬＩＳＡ用プレートに参考例４で作製した抗マウスアディポネクチンモノクローナル抗体（８３２０１Ｒ）をＰＢＳで５μｇ／ｍＬに希釈した後、感作した。次に、ＢＳＡ−ＰＢＳＴでブロッキング後、それぞれの処理検体液を、さらにＢＳＡ−ＰＢＳＴにて１０１倍希釈した希釈検体液をプレートに５０μＬ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄後、参考例５で作製したビオチン標識抗マウスアディポネクチンポリクローナル（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＰｏＡｂ）５０μＬを加え、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄し、さらに、ＢＳＡ−ＰＢＳＴで２０００倍希釈したＨＲＰ−Ａｖｉｄｉｎを添加し、室温で３０分間反応させた。ＰＢＳＴでプレートを洗浄し、ＯＰＤ発色液（２ｍｇ／ｍＬオルトフェニレンジアミン塩酸塩、０．０２％過酸化水素を含む、２５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）により発色させ、停止液（１．５Ｎ硫酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ）を添加して反応を停止させた後、４９２ｎｍの吸収を測定した。標準品としてリコンビナントマウスアディポネクチン（ｒＭｓ−Ａｄ）を標準品として用いて、検体中のアディポネクチン濃度の算出を行った。【００４５】
２）ゲル濾過分離検出法
上記１−１）と同じマウス血清（ｎ＝１０）それぞれ５０μＬ分に対して、実施例１と同じ条件で、ゲルろ過クロマトグラフィーを実施し、フラクションを用意した。各フラクション中のアディポネクチンの検出は、ＢＳＡ−ＰＢＳＴにより２１倍希釈した後、上記１−２）のＥＬＩＳＡ測定に従って実施した（図６）。【００４６】
３）総量に対するＨＭＷの割合値（ＨＭＷＲ）の比較
１−２）で求められたＨＭＷ及び総量濃度から、ＨＭＷＲを算出した。一方、２）で検出された３つのアディポネクチン溶出ピークの中で、最初のピークがＨＭＷに相当することから、そのフラクション濃度の合計を、アディポネクチン全フラクションの合計濃度で除することでＨＭＷＲを算出した。各々のＨＭＷＲを比較した結果、両法での検出には、極めて強い相関性が得られ、かつＨＭＷＲ値もほぼ一致した（図７）。この結果から、本発明のキモトリプシンを用いて、検体処理することにより、非常に簡単で正確なマウスＨＭＷアディポネクチンの測定が可能であることが言える。【００４７】
実施例５  ヒト血清中のＨＭＷアディポネクチン分別測定へのキモトリプシンの利用
ヒト血清（ｎ＝１４）１０μＬに、キモトリプシン５０ｕ／ｍＬを含むプロテアーゼ溶解液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液、ｐＨ８．０）１００μＬを加え、３７℃で２０分間加温した。さらに、検体処理液（１００ｍＭほう酸緩衝液、ｐＨ１１．０）を７００μＬ加えたものを、ヒトＨＭＷ測定用の処理検体液とした。対象として、キモトリプシンの替わりに、プロテイナーゼＫ７．５ｕ／ｍＬで、同様の検体処理を実施した。各処理検体中のアディポネクチン濃度は、処理検体液をＢＳＡ−ＰＢＳＴでさらに１０倍に希釈後、実施例３の方法と同様に測定した。測定結果を図８に示した。【００４８】
ヒト血清中のＨＭＷアディポネクチンを分別測定するのに利用されているプロテイナーゼＫ処理後の残存するアディポネクチン量を表す吸光度と、キモトリプシン処理後の測定吸光度がほぼ完全に一致したことから、キモトリプシンもヒト血清中のＨＭＷアディポネクチンの分別測定に利用できることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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