(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリーフロー電気泳動により検体を分離する方法であって、当該フリーフロー電気泳動が、以下の：
分離媒体であって、少なくとも１の緩衝酸と少なくとも１の緩衝塩基を含み、ここで当該緩衝酸のｐＫａ値が、上記分離媒体のｐＨ値よりも高く、そしてここで当該塩基のｐＫａ値が、上記分離媒体のｐＨ値よりも低い、分離媒体；
少なくとも１の緩衝酸及び少なくとも１の強塩基を含む、陰極安定化媒体；
少なくとも１の緩衝塩基と少なくとも１の強酸を含む、陽極安定化媒体；
を含み、そして陽極側と陰極側との間の分離媒体におけるｐＨの差異が、電気泳動の間０〜３である、
を含む緩衝組成物又はキットを用いて行われる、前記方法。
【請求項２】
前記分離媒体が、さらに以下の：
前記緩衝酸のｐＫａ値が、前記分離媒体のｐＨ値よりも０．２〜２高く；
前記緩衝塩基のｐＫａ値が、前記分離媒体のｐＨ値よりも０．２〜２高く；
電気泳動の間の前記分離媒体における最小ｐＨ値と最大ｐＨ値との差異が、０〜３であり；
前記緩衝酸のｐＫａ値と前記緩衝塩基のｐＫａ値の差異（ΔｐＫａ）が、０．５〜４．０であり；
前記緩衝酸が、ＨＩＢＡ、酢酸、ピコリン酸、ＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、α-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、４-ヒドロキシピリジン及び２-ヒドロキシピリジンからなる群から選ばれる生物学的に許容できる緩衝物質であり；
前記緩衝塩基が、タウリン、グリシン、２-アミノ-酪酸、グリシルグリシン、β-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、クレアチニン、ピリジン-エタノール、ピリジン-プロパノール、ヒスチジン、ＢＩＳＴＲＩＳ、モルフォリノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳ、アメジオール、ベンジルアミン、ジエチルアミノエタノール、トリアルキルアミンからなる群から選ばれる生物学的に許容される緩衝物質であり；そして
前記分離媒体がさらに、他の酸及び／又は塩基、必須一価及び二価アニオン及びカチオン、増粘剤、界面活性剤、タンパク質可溶化剤、アフィニティーリガンド及び還元剤、親水性ポリマー誘導体、ポリアルコール、キラルセレクターからなる群から選ばれる１又は複数の添加剤；
のうちの少なくとも１つによりさらに特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離媒体が、唯一の緩衝酸と唯一の緩衝塩基とを含む２成分媒体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記分離媒体が、以下の：
すべての緩衝酸と、すべての緩衝塩基との間の濃度比が、陽極に最も近い部位において９：１〜陰極に最も近い部位について１：９までの範囲であり、ここで前記分離媒体が、唯一の緩衝酸と唯一の緩衝塩基とを含む２成分の媒体であり、ここで分離媒体における緩衝酸と緩衝塩基の濃度がほぼ同じであり；
前記分離媒体が、少なくとも２〜１５の分離された分画であって、前記緩衝酸と緩衝塩基の様々な濃度を含んで、予め形成されたｐＨ勾配をもたらし；
前記分離媒体中における互いに独立した記緩衝酸と緩衝塩基との濃度が、５ｍＭ以上である
前記分離媒体の電気伝導性が、３０〜１０００μＳ／ｃｍである、
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
電気泳動のための前記陰極安定化媒体が、さらに以下の：
前記陰極安定化媒体中の少なくとも１の強塩基の濃度が、陰極安定化媒体に用いられる全ての酸の実質的な脱プロトン化を達成するために十分であり、ここで、陰極安定化媒体中の前記酸と前記塩基とのあいだにおける濃度比（酸／塩基）が、少なくとも１より多いが、５０未満であり；及び
陰極安定化媒体のｐＨが、分離媒体のｐＨよりも高い：
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記緩衝酸が、酸又は両性の化合物から選ばれ、但し両性化合物の塩基官能基のｐＫａが、酸官能基のｐＫａよりも少なくとも３低く、ここで当該酸官能基が、３〜１３のｐＫａを有する；及び／又は
前記強塩基が、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、及び前記媒体中の緩衝酸のｐＫａよりも少なくとも３高いｐＫａを有する他の塩基から選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝酸が、ＨＩＢＡ、酢酸、ピコリン酸、ＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、α-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、４-ヒドロキシピリジン及び２-ヒドロキシピリジンからなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
電気泳動用の前記陰極安定化媒体が、以下の：
前記陰極安定化媒体が、少なくとも１の緩衝塩基を含み、ただし当該陰極安定化媒体中のすべての酸の濃度が、全ての塩基の濃度よりも高く；
前記陰極安定化媒体中の各緩衝酸のｐＫａが、分離媒体中に用いられる各緩衝酸のｐＫａと等しいか、又は当該Ｋａよりも高く；
前記陰極安定化媒体中の緩衝酸と前記分離媒体中の緩衝酸とのあいだのΔｐＫａが、１未満であり；
前記陰極安定化媒体における少なくとも１の緩衝酸が、同様の電気泳動移動度を有し、そして前記分離媒体中で用いられる緩衝酸と同等のｐＫａを有し；そして
前記陰極安定化媒体中における少なくとも１の緩衝酸が、前記分離媒体中に用いられる緩衝酸に同一である；
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記陰極安定化媒体中の各緩衝酸のｐＫａが、分離されるサンプル中の最もアルカリ性の検体のｐＩよりも高い、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記陰極安定媒体が、１より多くの緩衝酸を含み；
前記陰極安定媒体が、１より多くの緩衝塩基を含み；
前記陰極安定媒体中の各緩衝酸のｐＫａ値が、前記分離媒体の最大ｐＨ値よりも高く；
前記陰極安定媒体のｐＨが、上記分離媒体の最大ｐＨよりも高く；
高いｐＫａを有する緩衝酸（弱酸）の濃度が、最も低いｐＫａを有する緩衝酸（最も強い緩衝酸）の濃度よりも高く；
前記陰極安定化媒体中の緩衝酸の合計濃度が、前記分離媒体中の緩衝酸の合計濃度よりも１．１〜５０倍高く、
前記陰極安定媒体中の全ての緩衝酸の合計濃度が、２０ｍＭよりも高い
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記陰極安定媒体中の各緩衝酸のｐＫａが、（ｐＩ＋０．３）＜ｐＫａ＜（ｐＩ＋３）の範囲内であり、そしてここで前記各緩衝酸のｐＫａ値が（ｐＨmax＋０．３）＜ｐＫａ＜（ｐＨmax＋３）の範囲内である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記陰極安定媒体が、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）によりアニオン性検体を分離する際に用いられ、そして前記陰極安定媒体が、ターミネーターを含み、そしてさらに少なくとも１の強塩基を含むか；又は
ここで、当該陰極安定化媒体が、カチオン性フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）によりカチオン性検体を分離する際に用いられ、そして当該陰極安定化媒体が、少なくとも１の強塩基及び少なくとも１の緩衝酸を含み、ここで当該緩衝酸の濃度が、強塩基の濃度よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ターミネーターが、緩衝酸であり、そして前記陰極安定化媒体中の緩衝酸のｐＫａが、アニオン性ＩＴＰリーダー媒体において使用される緩衝塩基のｐＫａよりも高く、
当該ターミネーターの濃度が、少なくとも１の強塩基の濃度よりも高く、及び／又は
当該ターミネーターの濃度が、１０ｍＭ〜５００ｍＭであるか、或いは
少なくとも１の強塩基と緩衝酸の濃度が、カチオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同じ化合物の濃度よりも高く；
少なくとも１の強塩基の濃度及び上記緩衝酸の濃度が、カチオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度よりも高く；及び／又は
少なくとも１の強塩基の濃度及び上記緩衝酸の濃度が、カチオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度よりも高く、そして緩衝酸及び／又は少なくとも１の強塩基の濃度が、カチオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度に対して１.５〜５０倍増加される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
電気泳動用の前記陽極安定化媒体が、以下の：
前記陽極安定化媒体中の少なくとも１の強酸の濃度が、陽極安定化媒体中に用いられる全ての塩基の実質的にプロトン化を達成するために十分であり；
上記陽極安定化媒体が、分離媒体のｐＨよりも低く；
前記緩衝塩基が、生物学的に許容される塩基と両性の化合物から選ばれ、ただし当該両性化合物中の酸官能基のｐＫａが、当該塩基官能基のｐＫａよりも少なくとも４大きいことが条件であり、
上記強酸が塩酸、硫酸、リン酸、及び他の酸であって、前記陽極安定化媒体中の緩衝塩基のｐＫａよりも少なくとも３低いｐＫａを有する他の酸から選ばれる、
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記緩衝塩基が、タウリン、グリシン、２-アミノ-酪酸、グリシルグリシン、β-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、クレアチニン、ピリジン-エタノール、ピリジン-プロパノール、ヒスチジン、ＢＩＳＴＲＩＳ、モルフォリノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳ、アメジオール、ベンジルアミン、ジエチルアミノエタノール、トリアルキルアミンからなる群から選ばれる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記電気泳動用の陽極安定化媒体が、さらに以下の：
少なくとも１の緩衝酸をさらに含む陽極安定化媒体、但し前記陽極安定化媒体中全ての塩基の濃度が全ての酸の濃度よりも高く；
前記陽極安定化媒体中の各緩衝塩基のｐＫａが、前記分離媒体中に用いられるｐＫａと同一であるか、又はそれより低く；
前記陽極安定化媒体中の前記緩衝塩基と、前記分離媒体中の前記緩衝塩基とのあいだのΔｐＫａが、１未満であり；
前記陽極安定化媒体中の少なくとも１の緩衝塩基が、前記分離媒体中に用いられる緩衝塩基に対して同等の電気泳動移動度を有し；そして
前記陽極安定化媒体中の少なくとも１の緩衝塩基が、前記分離媒体中に用いられる緩衝塩基に同一である、
のうちの少なくとも１によりさらに特徴付けられる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記陽極安定化媒体中の各緩衝塩基のｐＫａが、前記サンプル中の酸性検体のｐＩよりも低く；そして当該陽極安定化媒体が、以下の：
当該陽極安定化媒体が、１又は複数の緩衝塩基を含み；
前記陽極安定化媒体中の各緩衝塩基のｐＫａが、（ｐＩ−３）＜ｐＫａ＜（ｐＩ−０．３）の範囲内であり；
前記陽極安定化媒体のｐＨが、分離媒体の最小ｐＨ未満であり；そして
前記陽極安定化媒体中の各緩衝塩基のｐＫａ値が、分離媒体の最小ｐＨ値よりも高い
うちの少なくとも１によりさらに定義される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記陽極安定化媒体が、以下の：
低いｐＫａ（弱塩基）を有する陽極安定化媒体中の緩衝塩基の濃度が、最も低いｐＫａを有する緩衝塩基(最も強い緩衝塩基)の濃度よりも高く増加させられており、
陽極安定化媒体中の全ての緩衝塩基の合計濃度が、２０ｍＭ超である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記陽極安定化媒体が、フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）によりカチオン性検体を分離する際に用いられ、そして当該陽極安定化媒体が、ターミネーターを含み、そしてさらに少なくとも１の強酸を含み、ここで当該陽極安定化媒体が、アニオン性フリーフロー等速電気泳動（ＦＦ−ＩＴＰ）により、アニオン性検体を分離し、ここで当該陽極安定化媒体が、少なくとも１の強酸と少なくとも１の緩衝塩基を含み、ここで当該緩衝塩基の濃度が、強酸の濃度よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ターミネーターが、緩衝塩基であり、そして前記陽極安定化媒体中の緩衝塩基のｐＫａが、カチオン性ＩＴＰリーダー媒体において使用される緩衝塩基のｐＫａよりも低く、
当該ターミネーターの濃度が、少なくとも１の強酸の濃度よりも高く、及び／又は
当該ターミネーターの濃度が、１０ｍＭ〜５００ｍＭであるか、或いは
少なくとも１の強酸と緩衝塩基の濃度が、アニオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同じ化合物の濃度よりも高く；
少なくとも１の強酸の濃度及び上記緩衝塩基の濃度が、アニオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度よりも高く；及び／又は
少なくとも１の強酸の濃度及び上記緩衝塩基の濃度が、アニオン性ＩＴＰリーダー媒体中の同化合物の濃度に対して１.５〜５０倍高い、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記陽極及び／又は陰極安定化媒体が、さらに、他の酸及び／又は塩基、アニオン及びカチオン、増粘剤、界面活性剤、タンパク質可溶化剤、アフィニティーリガンド及び還元剤、親水性ポリマー誘導体、ポリアルコール、炭水化物、キラルセレクター、レクチン、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、イオン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、及びアジドからなる群から選ばれる少なくとも１の添加剤、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記添加剤が、チオウレア、尿素、ＨＰＭＣ、ＰＥＧｓ、グリセロール、スクロース、デキストリン、シクロデキストリン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、塩素イオン、及び硫酸イオンからなる群から選ばれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記陰極安定化媒体及び陽極安定化媒体の伝導性が、５００μＳ／ｃｍよりも高く；及び／又は
前記陰極安定化媒体及び陽極安定化媒体の伝導性が、分離媒体の伝導性よりも少なくとも３の因子の分、分離媒体の伝導性より高い、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
フリーフロー電気泳動によりサンプル中のリポソーム集合を分離するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法であって、分離媒体が、１０００μＳ／ｃｍ未満の伝導性を有する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
リポソームの少なくとも１の分画が、２０×１０-9ｍ2／Ｖｓ未満の有効な電気泳動移動度を有し；
前記分離媒体中の緩衝酸の濃度と緩衝塩基の濃度が、９：１〜１：９であり；及び／又は
分離媒体中のｐＨが、６〜８である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の電気泳動分離方法を実施するためのキットであって、
少なくとも１の緩衝酸と少なくとも１の緩衝塩基を含む分離媒体、ここで当該緩衝酸のｐＫａ値が、分離媒体のｐＨ値よりも高く、そして緩衝塩基のｐＫａ値が、分離媒体のｐＨ値よりも低く、
少なくとも１の緩衝酸と少なくとも１の強塩基を含む陰極安定化媒体；
少なくとも１の緩衝塩基と、少なくとも１の強酸とを含む陽極安定化媒体、
を含む、前記キット。
【請求項２７】
前記分離媒体における、陽極側と陰極側とのあいだのｐＨ差異が、電気泳動のあいだ０〜３である、請求項２６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動、そして特にフリーフロー電気泳動(ＦＦＥ)であって、サンプル中の生体粒子などの検体を分離するために使用されるものに関する。より具体的に、本明細書に記載される発明は、フリーフロー電気泳動を実施するのに有用な新規の分離媒体並びに安定化媒体、当該分離及び安定化媒体を含むキット、並びに電気泳動法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
電気泳動は、直流電流の影響下で荷電粒子の移動に基づいて粒子を分離する確立された技術である。幾つかの異なる運転モード、例えば等電点電気泳動法、等速電気泳動法、及びゾーン電気泳動法が、上記分離原理の変法として開発されており、そして当業者に一般的に知られている。
【０００３】
等電点電気泳動法(ＩＥＦ)は、タンパク質の等電点を測定するためのメカニズムとしてタンパク質の特徴決定において一般的に使用される技術である(例えば、Analytical )Biochemistry.  Addison Wesley Longman Limited-Third Edision, 1998を参照のこと)。
【０００４】
等速電気泳動法は、１９２０年に記載された原理に基づいている。この技術では、電極間における電解質が、均一な単一溶液ではなく、異なる電解質溶液の不連続の列をなしており、そのイオンが全て同じ速度で移動する。濃度及び電圧が同じ条件下では、異なるイオンは、異なる電気泳動移動度を有する。全てのイオンを同じスピードで移動させるために、異なる電圧勾配が各イオンの群について必要とされる。異なる勾配は、電気泳動プロセスの間に自然発生的に発生する。実際は、これは、リード電解質とターミネーター電解質との間でサンプル成分の移動に基づいたフォーカス技術である。リード電解質とターミネーター電解質の移動度に対して中間の移動度を有する溶質は、鋭く尖ったフォーカスされた領域でスタックする(Analytical Biochemistry. Addison Wesley Longman Limited-Third Edition, 1998)。等速電気泳動モードで運転することができる電気泳動法の典型的な例は、いわゆるキャピラリー電気泳動である。
【０００５】
ゾーン電気泳動は、よく知られた別の運転モードである。ゾーン電気泳動は、分離する粒子の電気泳動移動度の数値と、分離媒体に使用される分離媒体の電気泳動移動度の数値との間の差異に基づく。ゾーン電気泳動法は、異なるサイズ及び／又はフォーム及び／又は表面荷電の合計に基づいて検体及び粒子を単離することができる。ゾーン電気泳動のうまくいった適用に決定的なものは、分離溶液の均一性(一定のｐＨ)及び分離ゾーン全体にわたり一定の電場強度である。
【０００６】
上記の一般的な運転モードは、幾つかの異なる電気泳動技術、例えば固体支持体(例えば、フィルターペーパー、酢酸セルロース、アガロースなど)上の電気泳動、キャピラリー電気泳動、及びフリーフロー電気泳動(ＦＦＥ)において適用することができる。
【０００７】
電気泳動技術の中で、フリーフロー電気泳動(ＦＦＥ)は、最も見込みある技術のうちの１つである[Krivanova L. & Bocek P. (1998), "Continuous free-flow electrophoresis", Electrophoresis 19: 1064-1074]。ＦＥＥは、定常相(又は固体支持物質)がない状態で液体溶媒中で検体の分離が生じて、吸着によるサンプルの損失を最小化する技術である。ＦＦＥは、しばしば、無担体偏向電気泳動(carrier-less deflection electrophoresis)又はマトリクス-フリー偏向電気泳動と呼ばれることが多い。
【０００８】
プロテオミクスの分野では、ＦＦＥは、様々なｐＩ値(等電点)の点で複雑なタンパク質サンプルを前もって分離する確立された最適技術である。ＦＦＥを用いて、細胞などの生体粒子は、細胞の電気泳動移動度に基づいて分離することができる。対応する原理は、すでに記載されている[例えば、Bondy B., Bauer J., Seuffert I. and Weber G. (1995), "Sodium chloride in separation medium enhances cell compatibility of free-flow electrophoresis", Electrophoresis 16: 92 - 97]が、ＦＦＥはあまり認識されていない。なぜなら、多くの細胞型が、その表面荷電の点で少ししか異なっておらず、これらの細胞型を分離することを難しくするからである。第一の改良点のうちの１つは、特異的抗体が分離される細胞の特定の表面エピトープに結合することを許容し、細胞表面の合計荷電を改変することにより、ＦＦＥにおいてこれらの細胞の電気泳動移動度を改変することを可能にするイムノＦＦＥの導入であった[例えばHansen E. and Hannig K. (1982), "antigen-specific electrophoretic cell separation (ASECS): Isolation of human T and B lymphocyte subpopulations by free-flow electrophresis after reaction with antibodies", J. Immunol. methods 11, 51: 197-208]。
【０００９】
ＦＦＥのプロセスは、例えば安定化媒体及びカウンターフロー媒体を用いることにより改善されてきた。これは、米国特許5,275,706号に反映されており、この開示は、その全てを本明細書に援用する。この特許によると、カウンターフロー媒体は、電極間を移動するバルク分離媒体とサンプルの連続して流れる向きの反対方向に、分離スペースに導入される。両方の媒体(分離媒体とカウンターフロー媒体)は、分取出口を通して、一般的にマイクロタイタープレートに排出されるか又は溶出されて、低い空隙容量を有する分取プロセスをもたらす。さらに、分画出口の領域における媒体の層流が維持される(つまり、かなり少ない量の乱流しかないか、又は乱流を全く伴わない)。
【００１０】
インターバルＦＦＥと呼ばれる特定のＦＦＥ技術が、例えば米国特許第6,328,868号に開示されており、この開示は、本明細書に援用される。本特許では、サンプルと分離媒体は、ともに電気泳動チャンバーに導入され、そしてゾーン電気泳動、等速電気泳動、又は等電点電気泳動などの電気泳動モードを用いて分離され、そして最終的に分取出口を通してチャンバーから排出される。'８６８特許の実施態様は、サンプルと媒体が入口から出口に対して液体的に駆動されていない間に、電気泳動による移動が生じるように適用された有効な電圧を伴って、分離媒体とサンプルの移動が入口から出口の一方向に移動することを記載する。対照的に、当該技術分野において一般的に使用される技術では、サンプルと媒体は装置を通過するあいだに、電場中で分離される(連続ＦＦＥ)。
【００１１】
国際特許出願ＷＯ０２／５０５２４は、分離チャンバーを通して流れが分離されるところの分離チャンバーであって、当該チャンバーが、底とカバー、並びにその二つを互いに分離するスペーサーにより規定される分離スペースを提供する分離チャンバーを備えた装置を用いた電気泳動法を開示する。さらに、このＦＦＥ装置は、媒体供給線を通して分離チャンバーに入り、そして出口を通して当該チャンバーから排出される分離媒体を供給するためのポンプを包含する。当該ＦＦＥ装置は、分離媒体内に電場を提供するための電極、並びに粒子又は検体の混合物を加えるための注入点及び分離媒体においてＦＦＥにより分離された粒子を取り除くための分取点を含む。分離された粒子は、分析的な目的のため、又はさらなる調製プロセスのために使用する事ができる。
【００１２】
生体粒子及び生体ポリマーなどの検体の分離のための多くの分離媒体が、当該技術分野に知られている。例えば、K. Hannig and K. H. Heidrishにより発行された「Free-flow Electrophoresis」という書籍は、ＦＦＥ、特にゾーンＦＦＥに適している分離媒体のリストを報告する。ここで開示されている全ての媒体は、塩基類であって、そのｐＫａ値は、最終分離媒体のｐＨを調節するために使用される酸のｐＫａ値よりも高い塩基類を含む。しかしながら、従来技術の分離媒体では、特に高い電場において、ＦＦＥ分離チャンバーの熱的過負荷がしばしば観察されており、そして分離媒体中に使用される酸及び塩基の濃度を、１０ｍＭほどに制限する。従って、これらの媒体の緩衝能力は、最良の場合でもあまりよくなく、それにより安定条件下における有効な分離時間を極度に制限する。
【００１３】
米国特許第5,447,612号(Bierら)は、フリー溶液中に、機能的に安定である予め決定された狭いｐＨ領域勾配を形成することにより、等電点電気泳動法により検体を分離するためのｐＨ緩衝系である別の分離媒体を開示する。当該媒体は、相補緩衝対において緩衝成分を用いる。緩衝成分は、０.４〜１.２５の間のｐＨユニットのややなだらかなｐＨ勾配を提供するように化学的に定義された単純な両性電解質、弱酸及び弱塩基のなかから選択され、そしてその解離特性に基づいて互いに対形成される。ＵＳ５,４４７,６１２は、安定化媒体の使用については言及していない。
【００１４】
電気泳動技術に影響をあたえる別の問題は、特に電極コンタミネーションにより引き起こされる不安定性である。特にＦＦＥにおいて、コンタミネーションは一般的に、分離チャンバーから二つの電極を隔離する半多孔性膜の使用により、防がれている。
【００１５】
上記半多孔性膜の代わりのアプローチは、米国特許出願第2004／050697号及び2004/050698号、及び国際特許出願WO 03/060504において提案されている。とりわけ、これらの特許出願は、電極の近くにおいて緩衝媒体を作成するために使用されるいわゆる集束緩衝液(focusing buffer)を開示する。ここで集束緩衝媒体は、分離媒体よりも高い伝導性を有する。分離チャンバーから電極を分離する膜が存在しない場合に、粒子が電極に対して付着し、その結果、これらの分離された粒子がかなり低下し、そして電極のコンタミネーションが生じる。これらの出願によると、これらの影響は、集束緩衝液を用いることにより防ぐことができる。しかしながら、分離媒体に関する集束緩衝液の成分について、又はどれだけ高い伝導性が達成されるべきかについては、米国特許出願第2004/050697号、及び第2004/050698号、又は国際特許出願WO 03/060504において指示が与えられていない。
【００１６】
米国特許出願第2004/050698号は、分離媒体が流れることができる少なくとも１の分離チャンバーを具備するフリーフロー電気泳動装置を開示する。さらに、当該ＦＦＥ装置は、媒体供給線を用いて分離チャンバーに入り、そして出口を通してチャンバーから排出される分離媒体を送り込む投与ポンプ(dosage pump)、分離媒体に電場を適用する電極、並びに粒子の混合物を加えるためのサンプル注入点及びＦＦＥを用いることにより分離される分離媒体中の粒子を取り出すための分取点を包含する。
【発明の概要】
【００１７】
上記から、緩衝液分離媒体(及び安定化媒体)が、電気泳動技術を成功裏に実行するために決定的であることが明らかである。
【００１８】
従って、定義された化学的性質を有し、そしてＦＦＥを含む全ての電気泳動分離技術において安定的なｐＨ及び伝導性プロファイルを提供する分離技術であって容易に再現でき、費用効率が高く、そして高い効率の技術を開発する必要性が存在する。
【００１９】
分離領域と電極コンパートメントの間の、双方向へのクロスコンタミネーションを予防することができ、そしてＦＥＥなどの電気泳動技術、特にＦＦ-ＺＥ、ＦＦ-ＩＥＦ及びＦＦ-ＩＴＰなどを含む電気泳動の間におけるｐＨ及び伝導性プロファイルに有用である追加の媒体を開発する必要性がさらにある。
【００２０】
さらに、生物学的サンプル中においてさまざまな粒子の分離及び決定を許容する改良及び代替的分析法及び調製方法に対するニーズが当該技術分野に存在する。
【００２１】
本発明は、従来技術において観察されていた欠点及び問題点を避け、そして当業者により一般的に使用されている電気泳動媒体に比較して多くの利点を提供するさまざまな電気泳動媒体を提供する。より具体的に、本発明者は、サンプル中の生体粒子及び生体ポリマーなどの検体の穏やかで有効なそして再現性のある電気泳動分離又は分取に適した新規の分離媒体組成物を発見した。新規の分離媒体は、例えば、フリーフロー偏向電気泳動（free-flow deflection electrophoresis）(ＦＦＥ)において特に有用である。
【００２２】
この文脈で、本発明者は、本明細書で提供される新規の分離媒体、並びに当該技術分野において知られている他の分離媒体を使用する電気泳動法が、電気泳動装置の陽極と陰極の付近(つまり近く)の位置(つまり、陰極と分離媒体の間、及び陽極と分離媒体の間)で電気泳動チャンバーに導入されるいわゆる安定化媒体と併せて使用される場合、優れた結果を達成する。
【００２３】
従って、本発明の別の態様は、電気泳動装置の分離スペース内において状態(例えばｐＨ及び電気伝導性)を安定化することができ、それにより電気化学的及び物理的条件の安定性の改善を提供して、サンプル中の検体の電気泳動分離／分取の点で高い正確性、感受性、及び再現性をもたらす安定化媒体を提供する。
【００２４】
本発明に提供される媒体が、原則的に任意の既知の電気泳動技術で用いることができる一方、当該媒体がフリーフロー電気泳動法(ＦＦＥ)において特に適しているということが発見された。本発明により記載される媒体は、さまざまな電気泳動運転モード、例えばゾーン電気泳動(ＺＥ)、等速電気泳動(ＩＴＰ)及び等電点電気泳動(ＩＥＦ)において使用されてもよい。
【００２５】
本発明者らにより提供される新規かつ有利な電気泳動媒体に基づいて、本発明の実施態様は、検体及び生体粒子の分離のための新規の電気泳動法を提供する。新規の媒体は、リポソームなどの不安定又は感受性の分子の制御された、効果的、かつ再現性のある分離を可能にし、これは過去において達成することができなかったか、又は少なくとも限られた状態及び特定の状況下でのみ達成することができたものである。
【００２６】
最終的に、本発明者らは、リポソーム、及び他の粒子の保存的及び分析的分離が本明細書に開示される新規の電気泳動媒体で容易に達成することができるということを発見した。上記態様は、以下により詳細に記載されよう。
【００２７】
Ｉ.新規の電気泳動分離媒体
こうして、本発明の第一態様では、電気泳動を用いて生体粒子又は生体ポリマーなどの検体を分離する分離媒体が本明細書中に提供される。分離媒体は、少なくとも１の緩衝酸及び少なくとも１の緩衝塩基を含むが、ただし、緩衝酸のｐＫａ値(つまり、酸解離定数Ｋaの常用対数の逆数(the additive inverse of the common logarithm)；またあるときは、当該酸解離定数Ｋaの負の常用対数(negative decimal logarithm)とも呼ばれる)は、分離媒体のｐＨより高くなければならず、かつ緩衝塩基のｐＫａは、分離媒体のｐＨより低くなければならない。言い換えると、緩衝酸のｐＫａは、緩衝塩基のｐＫａよりも高いものである。
【００２８】
本発明の上記態様の実施態様では、分離媒体により示されるｐＨプロファイルは、実質的に線形である(つまり、電気泳動分離の間に大きなｐＨ階段を伴わない)。使用される安定化媒体並びに緩衝酸と緩衝塩基との間のｐＫａの差異に基づいて、本発明の態様に従った分離媒体は、実質的に一定(つまり、フラットな)ｐＨプロファイルを提供し、又は分離チャンバー内においてむしろなだらか／フラットなｐＨ勾配を提供する。電極間の分離チャンバーにおいて基本的に一定のｐＨを有する領域を提供する分離媒体は、ゾーン電気泳動(ＺＥ)モードで実行される方法において特に有用であり、一方(フラットな)ｐＨ勾配プロファイルは、当電点電気泳動(ＩＥＦ)モードにおいて実行する方法において特に有用である。
【００２９】
別の実施態様では、電気泳動の際における当該分離媒体のｐＨプロファイルは非線形であり、分離スペース内で１以上の明確なｐＨ階段又はプラトーが存在するであろう。このような媒体は、ＩＥＦモードで実行される特定の適用において特に有用である。
【００３０】
好ましくは、本発明の上記態様における少なくとも１の緩衝酸及び１の緩衝塩基を使用する本発明の分離媒体は、少なくとも１の緩衝酸と少なくとも１の緩衝塩基との間における約０.５〜４ｐＨユニットのｐＫａの差異により特徴付けられ、ここで上に説明されるように当該酸のｐＫａは、当該塩基のｐＫａよりも高くなければならない。好ましい実施態様では、ΔｐＫａは、１.２〜１.８であり、これはゾーン電気泳動法において特に有用である。別の好ましい実施態様では、ΔｐＫａは、約２.５〜４であるか、又は好ましくは、約２.５〜３.３であり、後者は、フラットｐＨ勾配ＩＥＦ適用に特に適している。
【００３１】
許容される検体の分離を妥当な時間の間に達成するために伝導性は十分に高くなければならないということが認められるが、本明細書で提供される分離媒体の１の特徴は、当該媒体の電気伝導性が、比較的低いということである。こうして、分離媒体にける正確な伝導性は、分離／分取問題の特異性、媒体中の他の荷電化学種の存在(例えばサンプル／検体安定性に必要とされるイオン)、及び検体の電気化学性質に左右されることは当業者によって理解されていることであるが、本発明の分離媒体の伝導性は、典型的に５０〜１０００μＳ／ｃｍ、そしてより好ましくは５０〜５００μＳ／ｃｍの伝導性である。
【００３２】
本発明の実施態様では、分離媒体は、１の緩衝酸と１の緩衝塩基のみを含む。言い換えると、このような分離媒体は、二物質媒体(Ａ／Ｂ媒体)を表し、ここで化合物の１の酸官能基、及び同一又は別の化合物の１の塩基官能基が、本質的に所望のｐＨ及び伝導性プロファイルを有する分離媒体を作り上げるために機能する。良好な結果が、分離媒体中で２以上の緩衝酸と緩衝塩基で達成されることもある一方で、できるだけ少ない成分を使用することが一般的に有利である。なぜなら、調製するのが簡単であり、そしておそらく使用するのに安価であるためばかりでなく、分離チャンバー内に存在する荷電化学種の数が増える場合、媒体の電気化学的性質がより複雑になるためである。
【００３３】
本明細書に記載される分離媒体は、さらに他の酸及び／又は塩基、「必須」１価及び２価アニオン及びカチオン(例えば、安定性／官能性のために必要とされる)、増粘剤、界面活性剤、タンパク質可溶化剤、アフィニティーリガンド、還元剤などを含んでもよい。
【００３４】
本発明の実施態様に従い、分離媒体は、フリーフロー電気泳動、例えばフリーフローゾーン電気泳動及びフリーフロー等電点電気泳動、による電気泳動分離に特に適しているが、当該分離媒体が、担体に基づく電気泳動などの他の適用に使用されてもよいということが当業者には理解されたい。
【００３５】
ＩＩ.安定化媒体
ＩＩ.１.一般的性質
本発明の別の態様では、いわゆる「安定化媒体」が、電気泳動分離プロセス、特にフリーフロー電気泳動の間に観察されうる所望されていない効果又は副作用を防ぐことにより、分離チャンバー内における電気化学的条件を安定化させるために使用される。
【００３６】
安定化媒体が、一般的に、電極の付近、すなわち陽極／陰極のそれぞれと分離媒体との間に一般的に位置する。本明細書に開示される安定化媒体は、安定化剤とともに用いられる分離媒体よりも一般的に高い電気伝導性を有する。高い伝導性は、分離領域と、電気泳動装置の電極コンパートメントとの間のクロスコンタミネーションを妨げ、そして電極での分離された粒子又は検体の負所望な蓄積を避けるように機能する。さらに、分離媒体内に必要とされるイオン、添加物などの全ての化合物は、陽極と陰極の付近にそれぞれ存在する安定化媒体から供給されるか又は補充される。
【００３７】
高い電気伝導性を有する安定化媒体の一般的な概念が、当該技術分野(WO 03/060503)において簡単に言及されているものの、電気泳動法の観点で所望の伝導性を達成する方法についてはなんら情報が与えられていない。特に、分離の際に所望されていない効果及び副作用を避け、そして広く、つまりフリーフロー電気泳動法を含む基本的に全ての方法で、並びに全ての基本的な運転モード(ＺＥ、ＩＴＰ、及びＩＥＦ)で使用されうる安定化媒体を開発する方法については、なんら教示がされていない。本発明の実施態様に従って、安定化媒体に関する本発明の概念が、実質的に全ての運転モードに一般的である一方で、特定の特徴が、意図された使用について選択された運転モード(ＺＥ、ＩＥＦ又はＩＴＰ)に依って安定化媒体に必要でありうる。
【００３８】
従って、本発明のこの態様における最も一般的な実施態様では、安定化媒体は、少なくとも１の緩衝酸と少なくとも１の強力な塩基(陰極安定化媒体、ＣＳＭ)のいずれかを含むか、又は安定化媒体は、少なくとも１の緩衝塩基と少なくとも１の強力な酸(陽極安定化媒体、ＡＳＭ)を含む。強力な酸及び強力な塩基は、それぞれ、十分に高い、つまり分離媒体の伝導性より高い電気伝導性を得るため、少なくとも１の緩衝塩基(ＡＳＭ)を実質的にイオン化／プロトン化、又は緩衝酸(ＣＳＭ)の実質的なイオン化／脱プロトン化を達成するために十分な濃度で存在しなければならない。
【００３９】
少なくとも１の緩衝塩基(ＡＳＭ)の濃度及び少なくとも１の緩衝酸(ＣＳＭ)の濃度は、所望される高い伝導性に必要とされる荷電分子の十分な数が、強力な酸又は塩基、それぞれにより産生されることができることを保障するため十分高くあるべきである。こうして、本発明の態様における好ましい実施態様では、緩衝塩基(ＡＳＭ)又は緩衝酸(ＣＳＭ)の濃度が、分離媒体中の緩衝酸(ＡＳＭ)／緩衝塩基(ＣＳＭ)の濃度に対して約５〜１５倍に増加する。
【００４０】
安定化媒体中における絶対濃度は、分離媒体中の緩衝酸／塩基の濃度に依存して変わる一方で、安定化媒体中の緩衝酸／塩基についての一般的な濃度は、一般的に２０ｍＭ未満ではなく、そしてずっと高いものである(例えば、約５０ｍＭ、又はさらに２００ｍＭ超)。適切な緩衝酸は、一般的に約３〜１３のｐＫａを有し、一方適切な緩衝塩基は、一般的に約１.５〜１２のｐＫａを有するべきである。
【００４１】
ある実施態様では、陰極安定化媒体(ＣＳＭ)は、さらに１以上の緩衝塩基を含むことがあるが、ただし、ＣＳＭ中の全ての酸の濃度は、全ての塩基の濃度よりも高いものである。同様に、陽極安定化媒体(ＡＳＭ)は、さらに１以上の緩衝酸を含むことがあるが、ただしＡＳＭの全ての塩基は、酸の濃度よりも高いものである。
【００４２】
さらに、分離媒体の場合と同様に、本発明の実施態様に従い、安定化媒体は、添加物を含んでもよく、当該添加物は、一般的に、分離媒体に加えられる添加物と同じであるが、添加物の多くは、しばしば、分離媒体と比べて、安定化媒体中では緩衝酸／塩基の高い濃度に伴い高い濃度で存在するであろう。
【００４３】
本発明の実施態様に従うと、安定化媒体の電気伝導性は、電気泳動分離に用いられる分離媒体の伝導性に広く依存する。目安として、安定化媒体の電気伝導性は、分離媒体の伝導性の約３倍、そしてしばしば１０倍、そして理想的にはさらに１０倍である。安定化媒体に観察される一般的な伝導性の値は、一般的に約５００μＳ超、しばしば約１０００超、又はさらに２０００μＳ／ｃｍ超、そしてある場合にはさらに１００００又は２００００μＳ／ｃｍに達する。
【００４４】
いずれにしろ、当業者は安定化媒体の実際の伝導性の値が、分離／分画問題の特定の条件に依存し、そして特定の状況下でも、上記範囲から外れることを認識されたい。ただし安定化媒体の伝導性は、少なくとも分離媒体のものよりも少なくとも実質的に高い。
【００４５】
以下に詳細に説明されるように、緩衝酸及び緩衝塩基の実際の選択は、多くの因子、例えば検体の性質、電気泳動装置の運転モードに依存する。例えば、ゾーン電気泳動では、分離媒体内のｐＨは、本質的に一定でなければならず、ここで等電点電気泳動装置では、ｐＨ勾配又は明らかなｐＨプラトーが、電極間の分離領域に存在する。電気泳動分離問題及び使用される運転モードに依存して、当業者においては、異なる選択基準が、本発明の安定化媒体中の成分の内容及び濃度に適用されることを理解されたい。
【００４６】
ＩＩ.２  ゾーン電気泳動法(ＺＥ)の安定化媒体
本発明のある好ましい実施態様では、安定化媒体は、少なくとも１の緩衝酸(ＣＳＭ)又は少なくとも１の緩衝塩基(ＡＳＭ)を含み、これらは、分離媒体中にも存在する。或いは、ＣＳＭ及びＡＳＭ中の緩衝酸及び緩衝塩基は、それぞれ、同様の電気泳動移動度及びｐＫａを有するように選択され、これらは、分離媒体中における緩衝酸／緩衝塩基のｐＫａにかなり近い値である。
【００４７】
上記判断基準に従って緩衝酸及び緩衝塩基を選択することにより、本明細書に提供される分離媒体と組み合わせて、分離媒体により形成される全領域にわたり本質的にフラットなｐＨを保障する安定化媒体を提供することを可能にする。こうして、本実施態様に従った前述の安定化媒体は、特にフリーフローゾーン電気泳動(ＦＦ-ＺＥ)を含むゾーン電気泳動法において特に適している。
【００４８】
ＩＩ.３  等電点電気泳動法(ＩＥＦ)の安定化媒体
本発明の別の実施態様では、安定化媒体中の少なくとも１の緩衝酸(ＣＳＭ)又は少なくとも１の緩衝塩基(ＡＳＭ)は、分離されるサンプル中の最もアルカリ性の検体のｐＩよりも高い値(ＣＳＭ中の緩衝酸)か、又はサンプル中の最も酸性の検体のｐＩよりも低い値(ＡＳＭの緩衝塩基)のｐＫａを有する。
【００４９】
目的の最もアルカリ性／酸性の検体のｐＩに基づいた上記定義に加えて、又は当該定義の代わりに、安定化媒体中の緩衝化合物の選択のために使用することができる別の選択基準は、少なくとも１の緩衝酸(ＣＳＭ)のｐＫａが、分離媒体の最大ｐＨよりも高く、かつ少なくとも１の緩衝塩基(ＡＳＭ)のｐＫａが、分離媒体の最小ｐＨよりも低いということである。
【００５０】
いずれにせよ、ＣＳＭにおける緩衝酸は、得られた電極安定化媒体のｐＨが、サンプル中の最もアルカリ性の検体のｐＩ値よりも高いことを保障するように選択されるべきであり、そして通常、ＩＥＦ運転モードにおける分離媒体の最大ｐＨよりも高くなる(つまり、陽極から陰極への漸増するｐＨ勾配を示す)ように選択されるべきである。好ましくは、しかしながら、陽極安定化媒体のｐＨは、分離の界面及び安定化媒体における乱れを避けるために、分離媒体の最大ｐＨを約２ｐＨユニット以上超えるべきではない。同様に、陽極の安定化媒体におけるｐＨは、分離媒体の最も低いｐＨよりも低くあるべきであるが、好ましくは、分離媒体の最低ｐＨよりも約２ｐＨユニット低いことはないＡＳＭを生成するように選択されるべきである。
【００５１】
ある実施態様では、ＩＥＦ安定化媒体は、１超の緩衝酸(ＣＳＭ)及び１超の緩衝塩基(ＡＳＭ)を含む。これらの場合、弱い緩衝酸(ＣＳＭ)と緩衝塩基(ＡＳＭ)の濃度は、それぞれ、最も強い緩衝酸(ＣＳＭ)／最も強い緩衝塩基(ＡＳＭ)の濃度よりも高くあるべきである。
【００５２】
本実施態様に従った安定化媒体は、特に、ＦＦ-ＩＥＦを含むＩＥＦ法に特に適しており、そして分離媒体におけるｐＨ勾配がそれぞれフラットである場合に最も利点がある(例えば、分離媒体の陽極側と陰極側の間の差異が３ｐＨユニットを超えるものではない)。
【００５３】
ＩＩ.４  等速電気泳動の安定化媒体(ＩＴＰ)
本発明の本態様のさらに別の実施態様では、安定化媒体は、等速電気泳動(ＩＴＰ)モードで運転される場合に、電気泳動条件を安定化させるために特に有用である。ＩＴＰにおける電気泳動分離は、溶液中に存在するさまざまな化学種における異なる電気泳動移動度に基づいているので、当業者においては、当該溶液中に「バックグランド」緩衝化合物が存在しないが、全ての(荷電)化学種が、その電気泳動移動度に対応する速度で溶液を移動することを理解されたい。従って、１の化学種は、リーダー(高い電気泳動移動度を有する荷電化学種(イオン))とターミネーター(最も低い電気泳動移動度を有する荷電化学種)の間のＩＴＰの点において通常異なっている。分離問題に依存して、そして検体が正又は負に荷電されているかに依存して、化学種が陰極に対して移動するカチオン性ＩＴＰと、化学種が溶液中で陽極に移動するアニオン性ＩＴＰとの間で区別されなければならない。
【００５４】
アニオン性ＩＴＰでは、陽極側(ＡＳＭ)を安定させるために必要とされる高い伝導性は、通常、リーダーイオン(ＨＣｌなどの強酸由来の塩化物イオン)及び各カウンターイオン(これは通常緩衝塩基である)の濃度を増加させることにより通常達成される。しかしながら、この概念は、通常、陰極側では機能しない。なぜなら、最も遅い電気泳動移動度(そして、最も低い総(表面)荷電))を有する最も遅い化学種(つまり、ターミネーター)は、陰極付近で蓄積する。
【００５５】
従って、本発明の当該実施態に従ってアニオン性ＩＴＰのための陰極安定化媒体は、ターミネーター(つまり、最も遅い電気泳動度を有する化合物)及び少なくとも１の強塩基(例えば、ＮａＯＨ)を含む。ターミネーター化合物は、通常緩衝酸から選択され、ここで当該緩衝酸のｐＫａは、好ましくは、陽極リーダー安定化媒体中の緩衝塩基のｐＫａは、陽極リーダー安定化媒体中の緩衝塩基のｐＫａよりも高いものである。陰極安定化媒体に加えられる強塩基の濃度は、好ましくは、同じ媒体中の緩衝酸の濃度よりも低いが、所望の高い伝導性を達成するために高いイオン化の度合いを保障する。
【００５６】
同じ選別原理は、ターミネーターが陽極の側に存在するカチオン性分離問題についても当然適用される。こうして、カチオン性ＩＴＰについての適切な陽極安定化媒体(ＡＳＭ)は、ターミネーター(好ましくは緩衝塩基)と少なくとも１の強酸(例えばＨＣｌ)を含まなければならない。上記のアニオン性ＩＴＰの場合と同様に、ＡＳＭ中の強酸の濃度は、好ましくは同一の媒体中の緩衝塩基の濃度よりも低いが、所望の高い伝導性を達成するために高度のイオン化を保障するために十分高いものである。
【００５７】
アニオン性ＩＴＰにおけるＡＳＭと同様に、カチオン性ＩＴＰにおける陰極安定化媒体(ＣＳＭ)は、リーダーイオン(例えば、強塩基により提供されるカリウム又はナトリウムイオン)及び通常は緩衝塩基である各カウンターイオンの高い濃度を含む。
【００５８】
本発明の安定化媒体の可能な適用は、当業者に明らかであり、そしてサンプル中の検体の調製的又は分析的分離／分取用のフリーフロー電気泳動法を含む。本明細書に記載される安定化媒体は、ゾーン電気泳動(ＦＦ-ＺＥ)、等速電気泳動(ＦＦ-ＩＴＰ)又は等電点電気泳動(ＦＦ-ＩＥＦ)モード、又は前述の任意の組み合わせを用いることにより、生体粒子を分離するために特に有用である。
【００５９】
ＩＩＩ.キット及び電気泳動媒体組成
当業者にとって、多くの電気泳動法を特定の装置及び分離／分取のために用いる特定の適用及び装置に適合された分離媒体と安定化媒体の組み合わせを使用することは、明らかであろう。しかしながら、本発明の安定化媒体などの特定の実施態様は、商標を付された市販の媒体(例えば、Ｓｅｒｖａｌｙｔ(商標)(Serva,Germany)又はＰｒｏｌｙｔｅｓ(商標)(BD GmbH, Germany)として知られる両性組成物)と組み合わせて使用されてもよい。
【００６０】
こうして、本発明のさらに別の態様では、分離媒体(単数又は複数)又は安定化媒体を含み、又は本発明に従った安置か媒体と合わせた分離媒体を含むキット及び電気泳動媒体組成物が提供される。キット又は電気泳動媒体組成物に含まれる様々な媒体は、濃縮溶液又はすぐに使用できる水溶液として存在してもよいし、又は使用直前に再構成される乾燥形態又は凍結乾燥形態で様々な化合物を含んでもよい。
【００６１】
本発明の実施態様は、検体、特に生体粒子などの感受性の高い検体の調製的又は分析的分離／分取のための電気泳動方法における、分離媒体、安定化媒体、並びにキット又は電気泳動媒体組成物の使用にも関する。好ましくは、本発明に記載の媒体及びキットは、フリーフロー電気泳動法、並びに当該技術分野に知られている装置において使用され、これらは例えばＵＳ 5,275,706、US 6,328,868、又は係属中の米国出願US 2004/050697、US 2004/050698、US2004/045826、又はUS 2004/026251に記載されている。
【００６２】
こうして、本発明のさらに別の態様では、フリーフロー電気泳動を用いて検体を分離する方法であって、ここで当該電気泳動プロセスは、本発明の分離媒体、並びに好ましくは安定化媒体の存在下で行われる方法が提供される。
【００６３】
ＩＶ.  特定の適用
本発明は、様々な組成物を有し、その結果分取可能な物理化学性質を有するリポソーム集合体を含む様々な検体の分離／分取に広く適用できる電気泳動方法を提供する。ここで特に有利な分離／分取は、約１０００μＳ／ｃｍ未満の電気伝導性を有する分離媒体中で達成される。
【００６４】
本発明の実施態様では、以下の：(ａ)電気泳動チャンバーに、少なくとも１の陽極安定化媒体、少なくとも１の陰極安定化媒体、及び少なくとも１の分離媒体を導入し、(ｂ)１以上の検体を少なくとも１の分離媒体に導入し；(ｃ)媒体及び検体を電場にかけ；そして場合により(ｄ)電気泳動チャンバーから検体の全て又は一部を溶出することを含む電気泳動法が提供される。
【００６５】
本発明の当該態様における好ましい実施態様では、分離／分取は、電気泳動の長期間、分離領域全体にわたって安定、定常ｐＨにより特徴付けられるゾーン電気泳動モード(ＦＦ-ＺＥ)において行われるフリーフロー電気泳動を用いることにより達成される。或いは、分離／分取は、分離媒体が、電気泳動チャンバー内において(フラット又はウルトラフラットな)勾配を形成する等電点電気泳動(ＦＦ-ＩＥＦ)により達成される。
【００６６】
本発明のＦＦ-ＺＥ又はＦＦ-ＩＥＦ分離及び安定化媒体を用いて、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムとして販売されるフリーフロー電気泳動装置を用いて好ましい結果が達成される。
【００６７】
本発明の前述の１の実施態様に従い、一般的にフラットなｐＨプロファイル、及び１０００μＳ／ｃｍ未満の伝導性を有する分離媒体を、場合により陽極安定化媒体及び陰極安定化媒体と一緒に提供し、そして様々な検体を含むサンプル、固有及び様々な荷電性質を有するそのうちの一部を、分離媒体に導入し、そしてゾーン電気泳動により検体を分離するステップを含む電気泳動法が提供される。好ましい実施態様では、分離は、フリーフロー電気泳動により、マトリクスを伴わない環境で行われる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、本発明に従ったＦＦＥ法を行うのに適した装置であって、７の媒体投入口Ｅ１〜Ｅ７、及びサンプル投入口Ｓを含む装置の模式図を示す。１以上のサンプル投入口が、２本の電極の間の任意の所望の位置に配置することができるということに注目されたい。さらに、サンプル投入口は、図１に模式的に示されるように、媒体入口の近くに、又はさらに下流の出口端の方に配置されてもよい。
【００６９】
【図２Ａ】図２は、以下の実施例１に記載されるようにゾーン電気泳動モード(ＦＦ-ＺＥ)において実行されたカチオン性ＦＦＥ分離の結果を示す。図２Ａは、陽極(左側)と陰極(右側)の間でのサンプルの分別分離を示し(９６画分は、９６ウェルの標準マイクロタイタープレート中に回収された)、そして画分のｐＨを示す。着色されたｐＩ-マーカーを分離して、当該システムの分離の能力を評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの各分画の吸光度を図２Ａに示す。
【図２Ｂ】図２は、以下の実施例１に記載されるようにゾーン電気泳動モード(ＦＦ-ＺＥ)において実行されたカチオン性ＦＦＥ分離の結果を示す。図２Ｂは、サンプル中において分画された検体の存在を示す様々な画分について得られた対応するＳＤＳゲルを示す。
【００７０】
【図３Ａ】図３は、以下の実施例２に記載されるカチオン性及びアニオン性ＦＦ-ＺＥの同時分離の結果を示す。図３Ａは、陽極(左側)と陰極(右側)との間のサンプルの分別分離を示し(９６の画分は、標準のマイクロタイタープレート中に回収される)、そして画分のｐＨを示す。着色されたｐＩ-マーカーを分離して、当該システムの分離能力を評価した。それぞれのｐＩマーカーの吸光度を表すλ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの各画分の吸光度が図３Ａに報告される。
【図３Ｂ】図３は、以下の実施例２に記載されるカチオン性及びアニオン性ＦＦ-ＺＥの同時分離の結果を示す。図３Ｂは、サンプル中において分画された検体の存在を示す様々な画分について得られた対応するＳＤＳゲルを示す。
【００７１】
【図４Ａ】図４は、以下の実施例３に記載されることなる媒体システムを用いた別のアニオン性ＦＦ-ＺＥの結果を示す。図４Ａは、陽極(左側)と陰極(右側)との間のサンプルの分別分離を示し、そして陽極と陰極の間のｐＨをプロットする。着色されたｐＩ-マーカーを分離して、当該システムの分離能力を評価した。それぞれのｐＩマーカーの吸光度を表すλ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの各画分の吸光度が図４Ａに報告される。
【図４Ｂ】図４は、以下の実施例３に記載されることなる媒体システムを用いた別のアニオン性ＦＦ-ＺＥの結果を示す。図４Ｂは、サンプル中において分画された検体の存在を示す様々な画分について得られた対応するＳＤＳゲルを示す。
【００７２】
【図５】図５は、図４に記載されるように品質対照サンプルの分取ＦＦ-ＺＥ分離の結果を示す。さらに、３の異なる波長の吸光度は、画分のｐＨに対してプロットされる。
【００７３】
【図６】図６は、実施例５に記載されるように等電点モード(ＦＦ-ＩＥＦ)において行われる分取ＦＦＥ分離の結果を示す。
【００７４】
【図７】図７は、実施例６でさらに記載された別の分取ＦＦ-ＩＥＦ分離の結果を示す。
【００７５】
【図８】図８は、３つの異なる波長での吸光度に対してプロットされた画分のｐＨと共に、実施例７に記載されるウルトラ-フラットｐＨ勾配(ウルトラフラットＦＦ-ＩＥＦ)中におけるサンプルの分取ＦＦＥ分離を示す。
【００７６】
【図９】図９は、実施例８において詳述されるサンプルにおけるアニオン性ＦＦ-ＩＴＰモードにおける分別分離を記載する。着色されたｐＩマーカーが分離されて、システムの分離能力を評価した。それぞれのｐＩマーカーの吸光度を表すλ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの各画分の吸光度は、画分のｐＨに対してプロットされる。
【００７７】
【図１０】図１０は、この適用において記載される実施態様の特定の態様において用いられる、周期インターバルフリー溶液電気泳動(cyclic interval free-solution electrophoresis)についてサンプルと分離媒体のバルクフローを示す。図１０a〜１０ｅにおいて記載されるステップa、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅは、それぞれ、図１０ｂにおいて合わせてグループ化されて示された粒子ａ、ｂ、ｃ、及びｄが、サンプルと分離媒体の周期的フローを介して、図１０ｃにおいて画分されるかを示しており、電気泳動チャンバーの左側及び右側でサンプルと分離媒体は電極と平行にサイクルする。図１０に示されるように、サンプルと分離媒体は、チャンバーの低い部分を通して進入し、そしてサイクルした後に、チャンバーの上部を通して電気泳動後の状態で存在する。
【００７８】
【図１１Ａ】図１１は、以下の実施例９において記載されるようにゾーン電気泳動モード(ＦＦ-ＺＥ)において実行されるアニオン性ＦＦＥ分離の結果を示す。図１１Ａは、陽極(左側)と陰極(右側)との間のサンプルの分別分離を示し(９６ウェル標準マイクロタイタープレート中で行われる)、そして画分のｐＨを示す。着色されたｐＩ-マーカーを分離して、当該システムの分離の能力を評価した。それぞれｐＩ-マーカーの吸光度を示すλ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５９５ｎｍでの各画分の吸光度が図１１Ａに報告されている。
【図１１Ｂ】図１１は、以下の実施例９において記載されるようにゾーン電気泳動モード(ＦＦ-ＺＥ)において実行されるアニオン性ＦＦＥ分離の結果を示す。図１１Ｂは、様々な画分について得られた対応するＳＤＳゲルを示し、サンプル中における分画された検体の存在を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
上記の概要部分において説明されているように、従来技術において一般的に用いられた電気泳動媒体に対して、有利な性質を有する電気泳動分離媒体及び安定化媒体の設計が提供される。以下の本明細書に論じられる実施例から明らかであるように、新規の分離及び安定化媒体は調製が簡単であり、一般的に無害であり、そして電気泳動法を用いてサンプル中の検体の強力かつ感受性の高い分離／分取(又は選択的枯渇又は濃縮)のための安定かつ再現性のある電気泳動条件をもたらす。
【００８０】
本発明に従った分離媒体並びに安定化媒体は、通常、限られた数の成分を有する水溶液の形態である。もちろん、本発明の媒体は、適切な濃度に希釈される濃縮溶液の形態で提供されるか、又は１の容器中に若しくは幾つかの容器に分配されて(キットの形態で)媒体の様々な成分を含む乾燥形態(例えば、結晶、非結晶、又はさらに凍結乾燥されたもの)で提供されうる。乾燥成分は、次に電気泳動を適用する前に水で再構成されることもある。
【００８１】
本発明に従った分離媒体は、陽極(単数又は複数)と陰極(単数又は複数)との間の分離スペース又は分離チャンバー中に存在するすぐに使用できる形態の水性媒体を指すことが理解されたい。分離／分取されるサンプルは、分離媒体に加えられ、そして分離媒体内のサンプル中の様々な検体が、電場を適用することにより分離される。(分取された)目的の検体は、続いて、電気泳動装置から、一般的に適切な数の画分に回収される(調製的方法)か、又は少なくとも適切な手段により検出される(分析適用)。
【００８２】
本発明に従った安定化媒体は、通常、電気泳動装置中の陽極及び電極のそれぞれの付近に導入される。特に、安定化媒体は、電気泳動の間に電極により生成したヒドロニウムイオン(Ｈ3Ｏ-)及び水酸化物イオン(ＯＨ-)が、分離スペースを通り、それにより分離スペース内における電気化学的な条件を変化させるか又は不安定にすることを妨げる。分離媒体に比べて、本発明の安定化媒体の高い伝導性を考慮すると、安定化媒体は、電気的に荷電された検体が最終的に電極と接触することを妨げる”伝導性バリア”を生成する。
【００８３】
本発明の分離及び安定化媒体の設計についての新規の概念は、ゲル電気泳動(例えばアガロース又はポリアクリルアミドゲル)などの標準担体に基づく電気泳動法、又はフリー溶液キャピラリー電気泳動及び特にフリーフロー電気泳動などのマトリクスフリー電気泳動法のいずれにも適用することができる。さらに、本明細書で提供される媒体は、自然条件下(つまり、検体の構造的完全性を乱すことがない条件下)、並びに変性条件下(例えば尿素、チオウレア、ＳＤＳなどの存在下)で行われる分離に使用することができる。
【００８４】
いずれにせよ、本発明者らは、本明細書において提供された新規の分離及び安定化媒体は、ＦＦＥ法に特に適しておりそして利点を有する。
【００８５】
本明細書に提供される媒体、概念、及び方法が、特定の検体に限られるものではない一方で、生物学的サンプル、又は明確な組成及びその容易な再現性の点から、少なくとも比較的感受性の高い検体(例えばリポソーム)の分離／分取に特に適していることが認められよう。分離することができる一般的な検体として、非限定的に生体粒子及び生体ポリマーが挙げられるが、これらは、細胞、細胞小器官、ウイルス若しくはウイルス粒子、タンパク質、タンパク質複合体、タンパク質凝集体、ＤＮＡ、ＤＮＡ-タンパク質複合体、膜、ペプチド、クロマチン、ナノチューブ、リポソーム、それらの任意の組み合わせなどを含むことを意味するが、これらに限られるものではない。
【００８６】
本適用の文脈では、電気泳動「分離」は、電場におけるその異なる振る舞いに基づいて、２以上の検体の混合物を空間的に分画することを意味することを意図する。その結果分離は、分取、並びにサンプル中に含まれるある画分又は検体の特異的及び選択的濃縮又は枯渇を含むがそれに限られるものではない。分離は、ある画分が次に回収されるように調製的な方法で行われるか、又は目的の検体、又はある画分におけるその存在が単に検出されるが、例えば次なる使用などのために回収されることはないという単に分析的に行われてもよい。
【００８７】
以下により詳細に説明されるように、本明細書に記載される媒体は、分離／分取が、フリーフロー電気泳動法(ＦＦＥ)を用いて達成される電気泳動法にかなり有用である。適切なＦＦＥ装置は、当該技術分野に知られており、そして例えば、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システム(BD GmbH, Germany)の名称で市販されている。さらに、本発明の分離及び安定化媒体を用いて使用できる適切なＦＦＥ装置は、多くの特許出願、例えば米国特許第5,275,706号、米国特許第6,328,868号、公開された係属中の米国特許出願US2004/050697、US2004/050698、US 2004/045826、又はUS 2004/026251、及び仮出願USSN 60/863,834及びUSSN 60/883,260に記載されており、これらは本明細書に援用される。
【００８８】
１.電気泳動分離媒体
限られた数の異なる成分のみを有する簡単な水性分離媒体は、その成分が以下により詳細に説明される特定の基準に従って選ばれる限りにおいて、検体の効率的かつ高度に感受性の分離のために使用することができるということを本発明者らは発見した。本明細書に示される概念及び得られた媒体は、かなりの適応性により特徴付けられており、当業者が当該分離(及び安定化)媒体を、特定の分離問題及び目的の検体の性質に対して適切に適用することを可能にする。
【００８９】
結果として、本発明の実施態様は、電気泳動によりサンプル中の検体を分離するために適した分離媒体であって、少なくとも１のいわゆる「緩衝酸」と少なくとも１の「緩衝塩基」を含み、ここで当該緩衝酸のｐＫａ値が、分離媒体のｐＨよりも高く、かつ当該緩衝塩基のｐＫａ値が、分離媒体のｐＨよりも低い分離媒体を提供する。酸に対して適用される場合、高いｐＫａ値が弱酸を表し、一方塩基に対しては低いｐＫａが弱塩基を表すことが当業者により知られている。
【００９０】
本発明に従った緩衝酸は、少なくとも１の酸官能基を有する任意の化合物を意味することを意図し、つまり当該化合物は、反応液中でプロトンを供給することができる(ブレンステッド-ローリーの酸)。同様に、本発明に従った緩衝塩基は、少なくとも１の塩基機能を有する化合物を意味することを意図し、つまり当該化合物は、反応液中でプロトンを受容できなければならない。しかしながら、本発明に記載の緩衝酸は、１より多い官能基を有していてもよく、そして塩基官能基のｐＫａが、酸官能基のｐＫａから少なくとも４ｐＫユニットより離れている(それにより、実質的に酸官能基の平衡に寄与又は影響することがない)限り、追加の塩基官能基を有していてもよい(これは、いわゆる両性化合物を指す)。同様に、緩衝塩基は、追加の塩基官能基を含んでもよいし、そしてさらには酸官能基のｐＫａが、塩基官能基のｐＫａから十分に離れている(４ｐＫユニット超)かぎりにおいて、追加の塩基官能基とさらには酸官能基を含んでもよい。
【００９１】
当該技術分野においてよく知られているように、化合物のｐＫａは、酸官能基のどの部分が脱プロトン化されているか、そしてどの部分が平衡条件下で所定のｐＨにおいて結合している水素を有するかを決定する。例えば、一官能基の酸の場合では、水溶液のｐＨが当該化合物のｐＫａに等しい場合に、化合物の５０％が脱プロトン化されている(こうして、化合物に対して負の電荷が増加する)。ｐＫａが溶液のｐＨよりも１ユニット高い場合、１０％の化合物しか脱プロトン化されておらず、一方、当該ｐＨよりも１ユニット低いｐＫａでは９０％が脱プロトン化される。
【００９２】
本発明の分離媒体の緩衝酸として有用であるためには、所定のｐＨ又はｐＨ範囲において緩衝酸の少なくとも少しの部分が、脱プロトン化されており、そして緩衝塩基の少しの部分がプロトン化されており、分離媒体中の適切な電気伝導性を達成するために必要とされる溶液に対して十分な数の荷電された化学種を提供する。
【００９３】
緩衝塩基は、同様に、所定のｐＨにおいて、プロトン化されているある部分、及び化合物が依然としてプロトンを伴っていない別の部分をもたらす塩基性(対応する酸のｐＫａ値(つまり酸性度)により表される言及を簡単にするため)を有するべきである。
【００９４】
言い換えると、当業者において、緩衝酸及び緩衝塩基のｐＫａ値(酸又は塩基の強度を指す)は、分離媒体のｐＨとかけ離れたものとすべきではないということが理解されたい。この文脈では、分離媒体のｐＨに対する言及は、電場を適用する前に、全ての成分を含む水性媒体のｐＨを指すように理解すべきである。このようなｐＨは、当該媒体を電気泳動装置の分離スペースに導入する前に、慣用されるｐＨメーターによって容易に測定することができる。分離及び安定化媒体の内容によっては、電場の適用が、分離媒体内にｐＨ勾配の形成をもたらし、その結果当該分離媒体がもはや分離スペース全体にわたって均一なｐＨを有さなくなることが認められる。こうして、他に記載されない限り、本出願中における分離媒体のｐＨに対する任意の言及は、常に電場を適用する前のｐＨを指す。
【００９５】
(例えばHenderson-Hasselbalchの式を適用することにより)溶液中の酸及び塩基のｐＫａ値及び濃度が知られている場合、当業者は、水溶液のｐＨを計算することができるであろう。例えばｐＫａ＝８.０を有する１の酸と、ｐＫａ＝６.０を有する１の塩基の等モル溶液は、７.０のｐＨを有する溶液をもたらす(ｐＫａ[酸]+ｐＫａ[塩基]／２)。
【００９６】
上記考察に基づき、緩衝酸のｐＫａは、分離媒体のｐＨよりも高くなければならず、そして緩衝塩基のｐＫａが、分離媒体のｐＨよりも低くなければならないという条件が、平衡条件をもたらし、ここで一般的に、それぞれ５０％未満の緩衝酸が脱プロトン化されており、そして緩衝塩基の５０％未満がプロトン化されていることが認識されるべきである。分離媒体のｐＨよりも約３ユニット高いｐＫａを有する酸が、かなりの数のプロトンにもはや寄与せず(つまり、当該酸は、実質的にその酸形態で存在するであろう)、溶液の電気伝導性が、適切な時間で良好に分離するためには低くなりすぎるという結果を伴う。
【００９７】
言い換えると、本発明の実施態様に従った分離媒体では、分離媒体中における緩衝酸のｐＫａの値は、緩衝塩基のｐＫａ値よりも高くあるべきである。
【００９８】
一般的に、緩衝酸と緩衝塩基は、分離媒体のｐＨが、約２〜１２の範囲に存在するように選択されるが、好ましくは、ｐＨは約３〜１１の範囲になるであろう。典型的な分離問題が、生物由来のサンプルを包含するので、分離媒体の好ましいｐＨ値(定常ｐＨ又はｐＨ勾配の末端の値のいずれにおいても)は、しばしばｐＨ４〜１０の範囲、又はさらにはｐＨ５〜９であろう。しかしながら、多くの分離は中性ｐＨで、又は中性ｐＨ付近で、つまり通常ｐＨ６〜８、又はさらにはｐＨ６.５〜７.５で行われるべきであるか、又は行われなければならないが、分離媒体のｐＨは、当然のことながら具体的な分離問題及び検体の性質に左右されるであろう。一般的なルールとして、十分な緩衝能力及び電気泳動能力を提供するために、広いｐＨ範囲では1超の緩衝酸及び緩衝塩基が必要とされる一方、一定ｐＨ又はフラットｐＨ勾配を示す適切な分離媒体は、１の緩衝酸と１の緩衝塩基のみで設計されうる。分離媒体が１超の緩衝酸及び１超の緩衝塩基を含んでもよい一方で、かかる費用及び分離スペースに存在する多くの異なる化学種のため、成分の数をできる限り低く、又は全く存在しないように維持することが一般に望まれている。
【００９９】
従って、好ましい実施態様では、分離媒体が実質的に定常ｐＨ又はかなりフラットなｐＨ勾配を提供する場合、本発明の分離媒体は、単一の緩衝酸及び単一の緩衝塩基を含む。
【０１００】
本発明のこの態様のある実施態様では、電気泳動のあいだの本発明の分離媒体のｐＨプロファイルは、電気泳動の間に陽極と陰極との間で、(明確なｐＨステップを示すものとは対照的に)基本的に線形であろう。幾つかの実施態様では、分離媒体内のｐＨは、(線形)勾配を形成するが、一方で別の実施態様では、電気泳動の間のｐＨは、基本的に一定である。
【０１０１】
本発明のこの態様の別の実施態様では、電気泳動の間における本発明の分離媒体内のｐＨプロファイルは、基本的に非線形であろう(つまり、ｐＨプロファイルは目立ったｐＨステップ又はプラトーを示してもよい)。
【０１０２】
電気泳動の間におけるｐＨの少しの狂いは、もちろん本発明の分離媒体系、特に分離媒体と電極との間に存在する安定化媒体の表面において許容される。こうして、本発明に従い、分離媒体内の基本的に一定のｐＨは、ｐＨがいずれかの方向に逸脱しうることを意味する。
【０１０３】
好ましくは、基本的に一定ｐＨを有する分離媒体内の最小ｐＨと最大ｐＨとの間の差異は、約０.２ｐＨユニットを超えるべきではないが、当該差異は、理想的にはできる限り小さく、例えば約０.１ｐＨユニット、そして最も好ましくは０.０５ｐＨユニット未満であるべきである。これらの分離媒体は、特に、ゾーン電気泳動(ＺＥ)モードで運転される電気泳動分離に有用である。
【０１０４】
ＺＥでは、分離媒体は、ｐＨ及び電気伝導性ができる限り定常であるべきであり、そして特に実現可能であるべきである均一な分離スペースを提供すべきである。なぜなら、分離が、溶液中の様々な化学種の合計の荷電密度の差異に基づくからである。
【０１０５】
実質的に分離空間の全てに渡って定常ｐＨ（つまり、フラットｐＨプロファイル）を示すために分離媒体の上記適切性に基づいて、本発明は、ＺＥ分離媒体として上記媒体に言及しますが、かかる媒体が、ＺＥ適用に厳格に制限されることはないということは明らかであろう。
【０１０６】
別の実施態様では、分離媒体は、電気泳動の間のｐＨ勾配を、直線勾配の形態又は段階的な(非線形)のｐＨ勾配の形態のいずれかで形成し、ここで電気泳動の間における分離媒体中における最も低いｐＨ(陽極側)と最も高いｐＨ(陰極側)との間のｐＨの差異は、一般的に約０.２ｐＨユニット超でかつ３ｐＨユニット未満である。好ましくは、ｐＨの差は、０.５〜２ｐＨユニットであり、そしてより好ましくは０.５〜１.５ｐＨユニットである。言い換えれば、このような分離媒体は、電気泳動の間において比較的フラットな、又はさらには超フラットなｐＨ勾配を形成する。これらの分離媒体は、等電点モード(ＩＥＦ)において運転される電気泳動法に特に適しているので、本発明はこれらの媒体をフラットＩＥＦ(約１.５〜３のｐＨユニットのｐＨ差異)、及びウルトラフラットＩＥＦ(約０.２〜１.５、１.５未満のｐＨユニットの差異)の分離媒体として言及しているが、ここで使用された用語は、本媒体をＩＥＦ適用に限定するものとして理解すべきではない。
【０１０７】
本発明に従った好ましい分離媒体(ＺＥ及びＩＥＦ)では、分離媒体中における各緩衝酸のｐＫａ値は、分離媒体のｐＨから約０.２〜２ユニット高く、そして各緩衝塩基のｐＫａ値は、分離媒体のｐＨよりも約０.２〜２ユニット低いものである。
【０１０８】
特に好ましいＺＥ分離媒体では、各緩衝酸のｐＫａ値が、約０.４〜約１.２ユニット高く、そして各緩衝塩基のｐＫａ値が、分離媒体のｐＨよりも約０.４〜約１.２ｐＨユニット低い。各緩衝酸と緩衝塩基のｐＫａ値が、分離媒体のｐＨよりも０.４〜０.９ユニット、又はさらに０.６〜０.９ユニット高く(緩衝酸の場合)又は低い(緩衝塩基の場合)実施態様がさらに好ましい。
【０１０９】
特に、ＩＥＦ分離媒体に限定されないが、緩衝酸と緩衝塩基の選択基準は、違うように定義することもできる。これは少なからず、ＩＥＦにおいて分離媒体の一定のｐＨがもはや存在しないためである。緩衝酸及び緩衝塩基により満たされなければならない別の選択基準は、少なくとも１の緩衝酸と少なくとも１の緩衝塩基との間のｐＫａの差異(ΔｐＫａ)を指す。分離媒体のｐＨを反映する選択基準、又はｐＫａの差異を言及する基準のいずれかに従わなければならない点は当業者に理解されたい。好ましい実施態様では、しかしながら、両基準は、本発明に従った分離媒体において緩衝酸と緩衝塩基について満たされるべきである。
【０１１０】
従って、ある実施態様では、分離媒体中における緩衝酸と緩衝塩基との間のΔｐＫａは、約０.５〜４ｐＫユニットであるべきである。１超の緩衝酸又は１超の緩衝塩基の場合、媒体中における最も弱い酸(つまり、最も高いｐＫａを有する酸)と全ての緩衝塩基との差異、或いは最も弱い緩衝塩基(つまり最も低いｐＫａを有する塩基)と任意の緩衝酸との間の差異は、規定された範囲内にあるべきである。
【０１１１】
緩衝酸と緩衝塩基の間の特に好ましいΔｐＫａの差は、０.８〜２.５であり、そしてより好ましくは１.０〜２.０である。かなり良好な結果が、分離媒体をもちいて、特にＺＥにおいて達せされており、ここでΔｐＫａは、約１.２〜１.８である。他の適用では、そして特にフラットＩＥＦ適用では、ΔｐＫａは、２.５〜４であってもよいし、そして好ましくは２.５〜３.３である。
【０１１２】
この文脈で、酸又は塩基のｐＫａ値が、実験的に決定することができるが、多くの化合物のｐＫａ値が、通常、生化学及び分子生物学のＣＲＣハンドブックなどの標準教科書、又はMerck Indexなどの参考文献において見出すことができる。所定の化合物のｐＫａ値が、溶液の温度に依存するということが重要である。その結果、他に記載がない限り、ｐＫａ値に対する言及は、標準条件(２５℃の水溶液)に関しているが、別の温度において観察される狂いは、通常やや少ない。所定の化合物におけるｐＫａの温度依存性がしばしば報告されており、その結果、ｐＫａの差異は、任意の所定の温度について容易に計算することができる。
【０１１３】
本発明の実施態様に従った分離媒体(ＺＥ又はＩＥＦ適用様である)では、緩衝酸と緩衝塩基の相対濃度は、ある比の範囲内である。こうして、全ての緩衝酸と全ての緩衝塩基の濃度の間の比率は、典型的に９：１〜１：９であるべきである。好ましい実施態様では、この比率はさらに小さく、例えば４：１〜１：４であり、又は７：３〜３：７、さらには３：２〜２：３である。一定のｐＨが所望される適用では(例えば、ＺＥ適用では)約１の比、つまり緩衝酸の濃度が、緩衝塩基の濃度と実質的に同一である場合が最も好ましい。上記に関わらず、所定の酸又は塩基の正確な濃度が、サンプルの性質、他の添加物の存在(以下を参照のこと)、及び分離媒体の所望のｐＨを含む多くの因子に依存していることもあり、そしてこれらに従って適応されてもよい。しかしながら、本媒体の緩衝及び電気泳動能力は、幾つかの点で、１の化合物(緩衝酸又は緩衝塩基のいずれか)の濃度が、低すぎるものとして選択される場合、つまり上記範囲から外れる場合に、失われるであろう。
【０１１４】
うまくいった分離を達成するために必要とされる緩衝化合物の絶対濃度に関して、当業者は、厳格なルールが存在しないことを認識しているが、十分な電気伝導性及び緩衝能力を提供するために十分高くあるべきであるということが一般的に理解されたい。高い(表面)荷電密度を有する検体(例えば、ペプチド又はタンパク質)は、一般的なルールとして、比較的低い荷電密度を有する検体(例えば細胞又は細胞小器官)よりも高い緩衝化合物濃度を必要とする。同様に、分離媒体が一定のｐＨ(つまりフラットｐＨプロファイル)を示す適用では、緩衝化合物の低い濃度が、所望の緩衝能力を田精するために必要とされており、一方でｐＨ勾配(例えばＩＥＦ適用)の場合、濃度は、１又は２の緩衝酸／塩基のみを有する場合において高くあるべきである。なぜなら、化合物のｐＨとｐＫａの間の差異は、化合物のイオン化(プロトン化及び脱プロトン化の両方)の低い程度を主に導きうるからである。
【０１１５】
上記原理を頭に入れて、本発明に従った分離媒体が、互いに独立して、少なくとも約５ｍＭの濃度で緩衝酸と塩基を含むが、多くの適用では、濃度はより高いものである(１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、又はさらに３０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上又はさらに５０ｍＭ以上)ということを意図する。緩衝酸と緩衝塩基の濃度についてそれぞれ言及する場合、本発明の所定の分離(並びに安定化)媒体中において、所定の数が、それぞれ(１より多い場合)任意の緩衝酸又は緩衝塩基の合計濃度を指すことが認められよう。
【０１１６】
本発明者により提供される分離媒体の１の特徴は、その電気伝導性が、ある標的範囲内になるように、つまり低すぎて化学種の十分な電気泳動移動度を保障することができないか、高すぎて分離媒体内で早く動く化学種により引き起こされる不所望な効果及び現象を避けることができないことがないように選ばれなければならない(それにより、限られた時間において良好な分離を達成する)。さらに、分離媒体の比較的低い電気伝導性は、従来技術の多くの分離媒体で観察されていた熱的過負荷(電気泳動プロセスにより引き起こされる不所望な熱浪費)を引き起こすことのない高電場で、電気泳動分離を行うことを許容する。
【０１１７】
本発明の分離媒体の絶対電気伝導性が、検体の性質及び特異的分離問題にいくらか左右されるなかで、分離媒体は、一般的なルールとして、３０〜１０００μＳ/ｃｍの電気泳動性を有するべきであるが、伝導性は、一般的に、７００、そしてさらに好ましくは５００μＳ/ｃｍを超えないべきである。特に好ましくは、５０〜５００μＳ/ｃｍ、より好ましくは５０〜４００μＳ/ｃｍの伝導性の値が特に好ましい。ある状況では、伝導性は、５０〜２００μＳ/ｃｍ又はさらに５０〜１５０μＳ/ｃｍであってもよいが、上で言及される最も広いリミット内の他の値が特定の状況下で許容されてもよい。当業者は、例えば市販されている標準装備を用いて溶液の電気伝導性を決定する方法についてよく知っているものとする。
【０１１８】
電気泳動の際に０.２〜３ｐＨユニットのｐＨ勾配の形成が必要とされるか望まれる実施態様(つまりＩＥＦ分離媒体)では、分離媒体が、あらかじめ形成されたｐＨ勾配を作り上げるために、実際には媒体内に様々な濃度の緩衝酸及び緩衝塩基を含む幾つかの分離画分からなることが理解されたい。一般的に、分離画分の数は、少なくとも２であり、そして実用的な理由から、約１５の画分を超えることはまれであろう。好ましい実施態様では、異なる酸及び塩基濃度を有する画分の数は、３〜１２、４〜１０、５〜９、又はさらには６〜８画分である。小画分の数が、技術的に制限されない一方で、実際には当該数は、分離に用いられる電気泳動装置の異なる媒体の投入口の数により支配されるか、又は少なくとも影響されるであろう。このような分離媒体は、好ましくはＩＥＦ適用、特にフリーフロー等電点電気泳動(ＦＦ-ＩＥＦ)において用いられる。
【０１１９】
電場が適用される一般的な分離時間(媒体内のイオンの通過時間)は、一般的に分離試行あたり数分から約１時間の範囲であるが、それよりも長い分離が、特定の条件下で可能であってもよい。特に分離媒体が、本発明の安定化媒体と一緒に用いられる場合、イオンの通過時間は、好ましくは少なくとも１５分である。いずれにせよ、分離媒体は、ある条件下で１０分未満、又はさらには７分若しくは５分未満で検体の効率的な分離／分取を可能にすることもある。一般的にＺＥ及びＩＴＰ分離は、フラット又はウルトラフラットＩＥＦ分離よりも短い分離時間を有するであろう。ここで当該電極間での滞在時間は、容易に３０分、さらには６０分を超えることもある。
【０１２０】
本発明の目的のための適切な緩衝酸は、約３〜約１３のｐＫａを有するが、生体粒子についての典型的なｐＨ値又はその付近(例えばｐＨ６〜８)で行われる分離では、緩衝酸についての分離基準は、典型的には、分離媒体のｐＨをいくらか超えるｐＫａ(つまり、ｐＫａは、これらの場合しばしば６未満〜１０である)を有する緩衝酸を必要とする。多くの電気泳動適用が、生物由来の検体に関して行われるので、緩衝酸は、好ましくは、所望の酸官能性質(つまり、適切なｐＫａ)を有する生物学的に許容される酸(又は上で説明された両性化合物)から選ばれる。本発明の文脈における生物学的に許容される酸は、緩衝化合物がまずなにより運転者又はサンプルに対して毒性ではなく、そして検体に関して不所望な相互作用(例えば、性質又は検体の化学的構成を変化させる化学反応)を導かないということを意味する。適切な生物学的に許容される緩衝酸として、いわゆる良好な緩衝液の群に属する化合物を含むがこれに限定されるものではない。適切な緩衝酸の具体的な例として、ＨＩＢＡ、酢酸、ピコリン酸、ＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、タウリン、ＡＭＰＳＯ、ＣＡＰＳＯ、α-アラニン、β-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、４-ヒドロキシピリジン、２-ヒドロキシピリジンなどが挙げられる。
【０１２１】
当業者は、本発明の分離媒体中に含める為に必要とされる所望の官能性質及びｐＫａ値を有する無数の潜在的な緩衝酸を発見することができるので、前述のリストが、制限的であることを意味するものではない。
【０１２２】
同様に、本発明の緩衝塩基は、典型的に約１.５〜１２のｐＫａを有するべきであり、そして好ましくは、所望される塩基官能性質、つまり適切なｐＫａを有する生物学的に許容される塩基の群から好ましくは選ばれる。適切な緩衝塩基は、良好な緩衝液の範囲内で発見されてもよいし、又はグリシン、２-アミノ-酪酸、グリシルグリシン、β-アラニン、ＧＡＢＡ、ＥＡＣＡ、クレアチニン、ピリジン-エタノール、ピリジン-プロパノール、ヒスチジン、ＢＩＳＴＲＩＳ、モルフォリノエタノール、トリエタノールアミン、ＴＲＩＳ、アメジオール、ベンジルアミン、ジエチルアミノエタノール、トリアルキルアミンなどを含んでもよいがこれに限定されるものではない。
【０１２３】
保温発明の分離媒体は、さらに１以上の添加物を含んでもよい。本発明に記載された添加剤は、緩衝酸及び緩衝塩基により提供される緩衝能力に寄与しない(か又は少なくとも有意に寄与しない)化合物又はイオンである。一般的に、添加剤の数及び濃度は、最小に維持すべきであるが、ある検体又は分離問題が、検体の完全性を維持するため、又は媒体の所望の性質(例えば、変性条件、又は担体、例えばアガロース又はポリアクリルアミド)を達成するためのいずれかの目的のために、追加化合物の存在を必要とすることが理解されたい。
【０１２４】
潜在的な添加剤は、好ましくは、他の酸及び／又は塩基、いわゆる「必須」１価及び２価アニオン及びカチオン、増粘剤、界面活性剤、タンパク質可溶化剤、アフィニティリガンド、還元剤などから選ばれる。
【０１２５】
前述の説明から離れて、他の酸又は塩基は、その酸又は塩基官能基のｐＫａが分離媒体のｐＨ又はｐＨ範囲からは十分に離れており、当該溶液の緩衝能力に寄与することを避ける(しかしながら、これらは当然のことながら、媒体中における電気泳動度に寄与してもよい)ことができる場合に限り、本発明の分離媒体中に存在してもよい。潜在的な酸及び塩基の例は、例えば媒体のｐＨの微調整のために溶液中に完全に溶解した少量の強酸又は強塩基(ＮａＯＨ、ＨＣｌなど)、又は媒体中に実質的に溶解していない化学種として存在しているかなりの弱酸又は弱塩基(つまり、媒体のｐＨから約４ユニットより多く離れているｐＫａを有する)を含む。
【０１２６】
本出願の意味における必須の１価及び２価のアニオン及びカチオンは、サンプル中の検体の構造及び／又は機能的完全性を維持するために必要とされうるイオンである。このような必須アニオン及びカチオンの例として、カルシウムイオン、亜鉛イオン、Ｆｅ(ＩＩ)イオン、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン又はＥＤＴＡ又はＥＧＴＡなどの複合薬剤、又はアジドイオン(例えば、細菌汚染を避けるためのもの)などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
分離媒体において一般的に使用される増粘剤は、グリセロール又はさまざまなＰＥＧなどのポリアルコール類、ＨＰＭＣなどの親水性ポリマー、スクロースなどの炭水化物、ヒアルロン酸などを含む。試料と媒体との間の密度又は粘度の差異により作成される乱流を避けるために、増粘剤は、分離スペース中に導入されるサンプルの粘度に、分離媒体の粘度を適用するために必要されてもよい。
【０１２８】
存在しうる追加の添加物は、シクロデキストリンを含むあるデキストリン、又はれクチンなどのアフィニティリガンドなどのキラルセレクターを含む。さらに多くの適切な界面活性剤は、当業者に知られており、例えばＳＤＳ、脂肪アルコール、オクチルグリコシド、Ｔｗｅｅｎ(商標)として知られているポリソルベートなどを含む。タンパク質可溶化剤の例として、尿素又はチオウレアを含むが、界面活性剤及び洗浄剤を含んでもよい。
【０１２９】
ある場合、溶液中での検体の酸化を避けるために還元剤を加えることが要求されることもある。サンプル及び／又は分離媒体に加えられうる適切な還元剤として、メルカプトエタノール、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)、アスコルビン酸、ナトリウム又はカリウムメタバイサルフェートなどが挙げられる。
【０１３０】
いずれにせよ、前述の添加剤の多くが、電気的に荷電されているので、その濃度は、必要とされる限り高く維持されるべきであるが、分離媒体の電気伝導性を所望の(低い)範囲に維持するために、できる限り低維持されるべきである。
【０１３１】
本発明の実施体に従った適切な分離媒体についての具体的な例(ＺＥ及び(ウルトラ)フラットＩＥＦ分離媒体)は、以下の実施例に記載されている。
【０１３２】
本明細書に考慮される分離媒体が、分離媒体のさまざまな成分について説明されたさまざまな好ましい実施態様の任意の組み合わせを含みうるということ、並びに特定の好ましい成分が、任意の特に好ましい実施態様に属しない場合であっても、他の成分に関して好ましいこともある。言い換えれば、本発明の分離媒体の好ましい又は好ましくない要素のさまざまな組み合わせから得られる全ての置換が、本明細書に開示されそして含まれることを意図する。
【０１３３】
ＩＩ.  安定化媒体
ＩＩ.１.  安定化媒体の設計のための一般的基準
本発明の別の態様は、分離媒体内の電気化学組成及び条件を安定化することを意図する安定化媒体に関し、分離領域と、電極コンパートメントとの間において、いずれの方向へのクロスコンタミネーションを妨げ、そしてさまざまな電気泳動分離技術、特にＦＦＥ適用に必要とされる全ての化学物質を供給する。安定化媒体は、それぞれ陽極と陰極の付近に存在し、そしてそれぞれの電極と分離媒体との間に一般的に存在する。
【０１３４】
本発明の態様に従った安定化媒体は、一般的に、分離媒体中における伝導性よりも高い電気伝導性を有することにより一般的に特徴付けられている。本明細書に開示される安定化媒体の概念は、ほぼ全ての状況及び装置に適用可能であり、そして以下により詳細に説明されるように、分離媒体の所望のｐＨと緩衝化合物の溶解性から独立している。
【０１３５】
他に示されない限り、以下の選択基準は、電気泳動分離の運転モード(つまり、ＺＥ、ＩＥＦ又はＩＴＰ)にかかわらず、本発明の全ての安定化媒体に対して一般的である。
【０１３６】
Ａ)  陰極安定化媒体
本発明の陰極安定化媒体(ＣＳＭ)は、電気泳動装置の陰極の付近、又は分離媒体の陰極側に少なくとも隣接して存在し、そして少なくとも１の緩衝酸と少なくとも１の強塩基を含む。緩衝酸の意味については、本発明の分離媒体に関する節において説明されてきており、そして安定化媒体の緩衝酸に等しく適用されるものである。この文脈において使用される強塩基は、安定化媒体中で緩衝酸を実質的に脱プロトン化することができ、それによりＣＳＭにおけるイオン化を増加させる塩基を意味することを意図する。好ましくは、原則に１００％の強塩基が、分離媒体の任意の所定のｐＨにてプロトン化形態で存在する(か又は、ＯＨ-イオンを水溶液に直接デリバリーする)。従って、本発明に従った強塩基は、頻繁に、高いｐＫａ、しばしば１３超、そして時にそれよりも高いｐＫａを有する。
【０１３７】
本発明の態様のある実施態様では、ＣＳＭにおける全ての酸(緩衝酸を含む)の少なくとも実質的な脱プロトン化を達成するために十分であるように強塩基の濃度が選ばれるべきである。実質的な脱プロトン化とは、少なくとも約３０％超、そして好ましくは約５０、６０、７０、８０、又はさらには９０％の緩衝酸が脱プロトン化形態で、つまりＣＳＭ中で使用される緩衝酸の共役塩基として、存在することを意味する。言い換えると、強塩基の添加は、ＣＳＭ内においてイオン化された化学種の濃度を増加させ、これは、強塩基を添加していない状況に比べて高い電気伝導性を導く。
【０１３８】
他方、分離媒体中で緩衝酸により緩衝化されていない任意の過剰強塩基は、安定化媒体中でｐＨの不所望な増加を単に導く。従って、強塩基の濃度が、よくてもＣＳＭの緩衝酸の全て(１より多くの緩衝酸が存在する場合)の濃度と同等であり、好ましくはそれよりも低い。強塩基の存在の観点では、当業者は、電気泳動分離がＺＥ、ＩＥＦ又はＩＴＰモードで運転されているかにかかわらず、ＣＳＭのｐＨが分離媒体のｐＨよりも高いということを認めるであろう。しかしながら、安定化媒体と分離媒体との間における境界において、高いｐＨシフトが生じる場合に観察される不所望な効果のため、ＣＳＭと分離媒体との間におけるｐＨの差異は、約３、そして好ましくは約２、又はさらには１ｐＨユニットを超えないべきである。最も好ましくは、ｐＨシフトは、特にＦＦ-ＺＥを含むＺＥ適用においてはできる限り低くすべきである。
【０１３９】
当業者は、電気泳動の差異に陰極により生成される水酸化物イオンの流入のために、陰極と分離媒体との間の安定化領域全体にわたりｐＨを一定に維持できないことを承知している。ＣＳＭと分離媒体との間におけるｐＨの差を低くすることについての上記要望は、ＣＳＭのｐＨを分離媒体の境界の近くにすることを指す。実際、ｐＨを陰極付近で一定に維持することができるかは、通常特に関係がない。なぜなら、ＣＳＭにより作成される高い伝導性バリアにより検体がＣＳＭに進入することを妨げるからである。
【０１４０】
本発明の陰極安定化媒体は、さらに、少なくとも１の緩衝塩基を含んでもよく、ここで当該緩衝塩基は、ＣＳＭにおいて用いられる全ての酸の濃度が、全ての塩基の濃度より高いという条件で、分離媒体について上で説明されるのと同じ意味を有する。言い換えると、これらの実施態様における(緩衝)酸のモルの合計は、塩基(緩衝塩基+強塩基)のモル数の合計よりも高くなければならず、つまりＣＳＭは、少なくとも１より高い濃度比(全ての酸：全ての塩基)を有するべきである。特定の理由のため、５０を超える濃度比は、必要又は望まれることはまれである。１又は１超の緩衝塩基が存在する好ましい実施態様では、ＣＳＭ中における濃度比(酸／塩基)は、約２〜約１０であり、そしてより好ましくは３〜８、又はさらに４〜６であるが、約１.１〜５０の任意の濃度比が、本発明に記載の適切なＣＳＭにおいて可能であってもよい。
【０１４１】
原則として、ＣＳＭに用いられる緩衝酸は、分離媒体中で用いられる緩衝酸と同一であってもよいし、又は異なってもよい。異なる緩衝酸が選択される場合、ＣＳＭ中と異なる緩衝酸の電気泳動移動度は、好ましくは分離媒体中の緩衝酸の電気泳動移動度と同様であるか又は少なくともそれに近くあるべきであるが、必ずしもそうあるわけでもない。本明細書で使用される電気泳動移動度(ＥＭ)は、水性媒体中において時間単位あたりの所定の電場強度の電場においてアニオンとカチオンが移動する速度を意味する。電気泳動移動度ｕは、以下の式：
ｕ＝ｓ／Ｈ×ｔ
として計算することができる。式中、ｓは、移動距離(メートル)を指し、Ｈは、電場強度(Ｖ／ｍ)を指し、そしてｔは時間(秒)を指す。さらに、緩衝酸のｐＫａは、分離媒体中の緩衝酸のｐＫａと同様であるか、又は少なくとも近い値であるべきである。この基準が、ＺＥ適用について特に重要であるが、(陽極)のＩＴＰ分離に適用できないということが当業者により認められよう。ＩＴＰ分離では、ＣＳＭにおける緩衝酸の選択についての他の基準は、以下により詳細に説明されるように適用されるべきである。
【０１４２】
ＣＳＭの緩衝酸について好ましくは満たされるべき他の基準は、ＣＳＭにおける各緩衝酸のｐＫａが、よくても、分離媒体の各緩衝酸のｐＫａと同等(特にＺＥにおいて)であり、そしてそうでない場合当該ｐＫａよりも高くあるべきということである。言い換えると、緩衝酸は、分離媒体中の緩衝酸に同一であるか、又は異なる緩衝酸の場合にわずかに弱い緩衝酸であるべきである。
【０１４３】
ＣＳＭにおける緩衝酸の同一性及び性質に関する選択基準に関して、１超の緩衝酸が存在する場合に、当該緩衝酸が、予定された運転モードに左右されるということが当業者により理解されたい。従って、ＺＥ、ＩＥＦ、及びＩＴＰそれぞれについての好ましい安定化媒体についての適した選択基準は、以下の節における各運転モードについて記載されよう。
【０１４４】
いずれにせよ、ＺＥ及びＩＥＦ適用(つまり、ＩＴＰ適用には適用されない)において用いられる好ましい安定化媒体では、ＣＳＭにおける全ての酸の合計濃度が、分離媒体中の全ての緩衝酸の濃度よりも高いであろう。好ましくは、濃度比(ＣＳＭ対分離媒体)は、１.１〜５０であり、一方で特に好ましい濃度比は、１.５〜３０である。２〜２０の比がさらにより好ましく、そして最も好ましくは５〜１５であり、３〜７、又は５〜１０の濃度比は、多くの分離問題について満足いく結果を与えうる。
【０１４５】
ＣＳＭにおける緩衝酸の全ての絶対濃度が、広く変化してもよく、そして特定の分離問題、検体の性質、分離媒体の組成に左右される。しかしながら、分離媒体における緩衝酸の一般的な濃度は、約２０ｍＭ超であるが、その濃度は頻繁にいくらか高く、例えば５０ｍＭ超、７５ｍＭ超、１００ｍＭ超、１５０ｍＭ超、又はさらに２００ｍＭ超になるであろう。上限濃度についての自ずと生じる限界は、もちろん、それぞれの緩衝化合物の溶解度により与えられよう。例えば、ヒスチジンは、一般的に良好な緩衝化合物であり、そして電気泳動分離での使用によく適しているが、その有用性は比較的低い溶解性によりいくらか限定されることもある。
【０１４６】
ＣＳＭ中の(存在する場合)全緩衝塩基の絶対濃度も、広く変化してよく、そして特定の分離問題、検体の性質、及び分離媒体の組成に左右される。しかしながら、分離媒体中の緩衝塩基についての濃度は、一般的に約１０ｍＭ超であるが、ＣＳＭ中の全ての塩基の合計濃度が上に説明されるように当該(緩衝)酸の濃度よりも低いことを条件として、その濃度は頻繁にいくらか高く、例えば２０ｍＭ超、３０ｍＭ超、５０ｍＭ超、１００ｍＭ超、又はさらに２００ｍＭ超になるであろう。
【０１４７】
Ｂ)  陽極安定化媒体
本発明の陽極安定化媒体(ＡＳＭ)は、本発明のＡＳＭでは、酸及び塩基という語句がＣＳＭに比べた場合に交換されるということを除き、陰極安定化媒体(ＣＳＭ)について記載されたのと同一の基準に従って原則的に選択される。
【０１４８】
こうして、本発明のＡＳＭは、少なくとも１の緩衝塩基及び１の強酸を含まなければならず、ここで強酸は、好ましくはＡＳＭ中の全ての塩基の実質的なプロトン化を達成するために機能する。結果として、ＡＳＭのｐＨは、通常、分離媒体のｐＨよりも通常低く、そしてＡＳＭ中の緩衝塩基のｐＫａは、分離媒体中の緩衝塩基のｐＫａ値に等しくあるべきか、又は当該値より低くあるべきである(つまり、ＡＳＭ中に同等の又は弱い塩基が存在すべきである)。
【０１４９】
ＣＳＭの場合と同様に、本発明のＡＳＭが、さらに、少なくとも１の緩衝酸を含むことがあり、ただし、全ての(緩衝)塩基の濃度が、ＡＳＭ中の全ての酸の濃度よりも高くあるべきである。
【０１５０】
好ましい実施態様は、ＣＳＭに関してすでに記載されており、そして、酸と塩基という語句が交換され、そして弱塩基が低いｐＫａ値により特徴付けられる(一方弱酸は、高いｐＫａ値により特徴付けられる)ことを条件に、本発明のＡＳＭに対して同等に適用される。
【０１５１】
さらに、適切な緩衝酸、並びに陽極及びカチオン性安定化媒体用の緩衝酸は、一般的に、本発明の分離媒体について記載されるのと同一の緩衝酸及び緩衝塩基のなかから選択される。
【０１５２】
安定化媒体に用いることができる適切な強酸及び強塩基について当業者は承知している。強酸は、原則的に全てのプロトンを放出し、それによりＡＳＭ中の緩衝塩基をプロトン付加する任意の酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などから選択されてもよい。本発明の意味における強塩基は、共役酸形態で主に存在するか、又は水酸化物イオン(ＯＨ-)をＣＳＭに直接寄与させ、そしてさらに緩衝酸をかなりの程度脱プロトン化させることができる任意の塩基、例えばアルカリ金属水酸化物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど、又はアルカリ度類金属水酸化物、例えば水酸化マグネシウム又は水酸化カルシウムなどから選ばれてもよい。
【０１５３】
一般的に、有用であるためには、強塩基は、少なくとも１２のｐＫａを有するべきであり、そして強酸は約１.５未満のｐＫａを有するべきであるが、基本原理は、安定化媒体内の緩衝塩基と緩衝酸に比べた酸性度／塩基性度の点における十分大きな差異であり、その結果、強塩基又は強酸が、上に説明されるように対応する緩衝酸／緩衝塩基をイオン化できるということが当業者により認められよう。従って、本発明に従った強力な酸は、ＡＳＭ中の任意の緩衝塩基のｐＫａよりも少なくとも約３ｐＫユニット低いｐＫを有する酸である。同様に、強塩基は、ＣＳＭにおいて緩衝酸のｐＫａよりも少なくとも３ｐＫａユニット高いｐＫａを有する任意の塩基である。
【０１５４】
安定化媒体は、１又は１より多くの添加剤を含んでもよい。添加剤は、分離媒体について説明されたのと同じ基準に従って選択される。実際、添加剤が通常、サンプル／検体の安定性について必要とされるので、添加剤が分離媒体中に存在するものと同一であることが通常であるが、要求されているわけではない。安定化媒体中の緩衝酸／塩基の高い濃度に従い、イオン性添加物の濃度は、分離媒体中の添加剤の濃度に比べて通常高くされる。しかしながら、グリセロール又はスクロースなどの増粘剤の濃度は、好ましくは、安定化媒体及び分離媒体と同様の粘度及び密度をそれぞれ達成するために好ましくは適用されるであろう。
【０１５５】
本発明の実施態様に従った安定化媒体の中心的な特徴は、安定化媒体中の電気伝導性よりも高く、そして好ましくはずっと高くなければならない。こうして、好ましい実施態様では、ＡＳＭとＣＳＭの伝導性は、互いに独立して、分離媒体中の電気泳動よりも少なくとも約２の因子だけ増加されるが、当該伝導性が分離媒体の電気伝導性よりも少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は１０だけ増加することがさらにより好ましい。特に好ましい実施態様では、安定化媒体の電気伝導性は、分離媒体の伝導性よりも少なくとも１０倍より高い。
【０１５６】
安定化媒体の絶対伝導性値は、その結果約５００μＳ／ｃｍであり、多くの状況では、伝導性は少なくとも１０００、１５００、２０００、３０００又はさらには５０００μＳ／ｃｍであろう。ある状況では、分離媒体中での比較的高い伝導性で、１００００を超える、又はさらに２００００μＳ／ｃｍを超える伝導性値を有する場合に良好な結果が得られうる。
【０１５７】
陽極安定化媒体の伝導性が、陰極安定化媒体の伝導性と同じである必要がないが、それらが典型的に同じ範囲になることが理解されるべきである。任意の割合において、実際の伝導性値は、安定化媒体が分離媒体に対する安定な伝導性バリアを維持するために安定化媒体が設計されるという条件下で、通常、特定の分離状況に依存し、そしてＡＳＭとＣＳＭの間で変化しうる。
【０１５８】
本明細書に表される安定化媒体は、基本的に、担体に基づく電気泳動法(例えばＳＤＳ-ＰＡＧＥ)又は無担体電気泳動法(例えばＦＦＥ)を含む全ての電気泳動技術について用いることができ、そして電気泳動運転モードに有用である。さらに、本発明の安定化媒体は、本発明の分離媒体と併せて、又は他の市販の分離媒体、例えばＳｅｒｖａｌｙｔ(商標)(Serva、Germany)の名称で市販されている両性媒体、又はＰｒｏｌｙｔｅｓ(商標)(BD GmbH, Germany)の名称で市販されているマルチ緩衝液ｐＨ勾配システムなどと併せて使用することもできる。
【０１５９】
本発明に従った適切な安定化媒体の設計のための前述の一般的な選択基準が、原則として全ての運転モード、そして特にZE及びIEF適用に適用される一方で、以下の節は、電気泳動運転モード(ＺＥ、ＩＥＦ、及びＩＴＰそれぞれ)に特異的に適用される好ましい実施態様を記載する。
【０１６０】
ゾーン電気泳動用の安定化媒体
ゾーン電気泳動モードにおいて試行される電気泳動分離の特徴は、溶液中において粒子の総荷電密度に基づき粒子の分離を達成するため、分離媒体内のｐＨが、原則的に一定でなければならないということである。実際の合計表面荷電密度は、各粒子を取り囲むｐＨに依存することが当業者に認められる。こうして、分離媒体内の一定のｐＨは、粒子の総荷電密度を維持するように機能する。しかしながら、安定化媒体を伴わないで行われるＺＥ分離は、特に電極付近の領域において頻繁にｐＨ不安定性となり、それにより領域内に存在する検体の総荷電密度の変化のため、分離効率を低減させる。従って、ＺＥ用の安定化媒体は、ｐＨをできるだけ良好に維持し、その一方検体が電極を通過するのを防ぐ伝導性バリアを作成する高い伝導性を示す。従って、本発明の好ましい実施態様では、本発明は、ゾーン電気泳動であって、本発明の安定化媒体と分離媒体との間のｐＨの差異が、１.５未満、好ましくは１.２未満、より好ましくは１.０未満、特に好ましくは０.８未満、そして最も好ましくは０.６未満のｐＨユニットである電気泳動に関する。
【０１６１】
記載された分離媒体、特に１の緩衝酸と１の緩衝塩基のみを含む分離媒体は、ＺＥ適用に特に適しているので、適切なＺＥ安定化媒体が、かかる分離媒体を参照して定義されうるということが認められる。従って、本発明の好ましいＺＥ安定化媒体は、分離媒体(ＣＳＭ)中の緩衝酸に同一である少なくとも１の緩衝酸、又は分離媒体(ＡＳＭ)中の緩衝塩基と同一である少なくとも１の緩衝塩基を含む。あるいは、陰極分離媒体の緩衝酸又は陽極分離媒体の緩衝塩基は、分離媒体中のそれぞれの酸／塩基に近いｐＫａ値及び近い電気伝導移動度を有するべきである。この文脈において近いとは、ｐＫａ値が約０.５を超えて異ならない、そして好ましくは約０.３を超えて異ならないか、又はさらには０.１ｐＫユニットを超えて異ならないべきである。同様に、電気泳動移動度は、３０％を超えて異なるべきでなく、そして好ましくは約２０又はさらには１０％未満の差異であるべきである。
【０１６２】
媒体中に１超の緩衝酸(ＣＳＭ)又は緩衝塩基(ＡＳＭ)が存在する場合、さらなる緩衝酸／塩基が、分離媒体中に存在する緩衝酸／塩基よりも弱い(つまり、高いｐＫａを有する酸と低いｐＫａを有する塩基)であるべきである。特定の実施態様では、安定化媒体中の弱酸又は塩基の濃度は、分離媒体中に使用されるものと同一の緩衝酸／塩基の濃度よりも低くあるべきで、そして好ましくはずっと低い(例えば、少なくとも２、３、４、５、又はさらには１０の因子)。
【０１６３】
ＺＥ分離媒体中の緩衝濃度が、典型的にはどちらかというと低いので(なぜなら、緩衝化合物は、所定のｐＨにおいて差異的の緩衝能力を有するように選択することができるためである)、ＺＥ安定化媒体中の緩衝酸(ＣＳＭ)と緩衝塩基(ＡＳＭ)の絶対濃度は、ＩＥＦ適用について必要とされる濃度に比べて通常低いであろう。
【０１６４】
特に良好な結果が、１の単一の緩衝酸(ＣＳＭ)又は１の単一の緩衝塩基(ＡＳＭ)を含むＺＥ安定化媒体で達成されるが、他の好ましいＺＥ安定化媒体は、追加の弱い緩衝酸(ＣＳＭ)又は緩衝塩基(ＡＳＭ)を含みうるが、上に説明されるように低い濃度である。
【０１６５】
さらに、安定化媒体は、上に詳細に説明されているように、その濃度が強酸／共塩基の濃度と合わせてその濃度が、ＺＥ安定化媒体中の全ての緩衝酸(ＣＳＭ)又は緩衝塩基(ＡＳＭ)の合計濃度を超えないという条件で、緩衝塩基(ＣＳＭ)又は緩衝酸(ＡＳＭ)を含みうる。
【０１６６】
いずれにせよ、安定化媒体内のＣＳＭとＡＳＭのそれぞれ中の緩衝酸／緩衝塩基の選択は、本質的にフラットなｐＨプロファイルを維持する目的により支配されるべきである。上に定義されるように安定化媒体は、ＦＦ-ＺＥを含むＺＥ適用中で行われる電気泳動分離においてかなり有用であるが、安定化媒体は当該技術分野において知られている他の電気泳動技術に使用されてもよい。
【０１６７】
ＩＩ.３.  等電点電気泳動法用の安定化媒体
等電点モードで試行される電気泳動分離では、サンプル中の異なる粒子又は化学種の分離は、そのことなるｐＩ値に基づいている。ここで、当該ｐＩ値は、粒子／化学種が電気的に中性となる周囲の非均一な分離媒体のｐＨ値に相当する。従って、ＩＥＦ分離は、ｐＨ勾配の存在下で行われ、当該勾配は直線的であってもよいが、非連続的(つまり段階的)であってもよい。広いｐＨ勾配を提供するＩＥＦ分離媒体は、当該技術分野において知られている(例えば、上に言及されるＳｅｒｖａｌｙｔ(商標)又はＰｒｏｌｙｔｅｓ(商標))。ＩＥＦ分離媒体のｐＨ勾配は、好ましくは、目的の検体の少なくともｐＩ値を包含するように選択されるべきである。例えば、６.５〜８のｐＩを有する検体(例えばタンパク質)では、ＩＥＦ分離媒体中のｐＨ勾配は、最適な結果を達成するために約ｐＨ６〜８.５の範囲であるべきである。
【０１６８】
本発明の実施態様に合わせて開示される分離媒体は、一般的に少数の必要な成分により特徴付けられており、そしてフラット又はさらにはウルトラフラットなｐＨ勾配(つまり、約３ｐＨユニット以下のｐＨ差異)に特に適している。良好な分離結果を達成するための一般的なルールとして、緩衝成分の数が、分離媒体によりカバーされるｐＨ範囲に伴い増加するであろう。しかしながら、フラットかつウルトラフラット勾配では、本発明に従った分離媒体は、(お互いに独立して)唯一の、又はある場合２の、そしてときには最大３の緩衝酸及び緩衝塩基をそれぞれ含むこともある。
【０１６９】
本明細書に記載されるＩＥＦ安定化媒体は、本発明のフラット及びウルトラフラットｐＨ勾配用の新規の分離媒体を含む全てのＩＥＦ分離媒体の状態を安定化するために有用かつ適切である。ある実施態様では、本発明のＩＥＦ安定化媒体は、以下の選択基準に従って設計されている。ＩＥＦ分離媒体の一般的原理を念頭にいれて、以下の基準が、本発明の適切なＩＥＦ安定化媒体の設計に適用される。
【０１７０】
従って、ＩＥＦ安定化媒体では、ＣＳＭ中の緩衝酸のｐＫａは、サンプル中の最も塩基性の検体(つまり、当該検体は最も高いｐＩを有する)のｐＩ値よりも高くあるべきである。同様に、ＡＳＭ中の緩衝塩基のｐＫａは、サンプル中の最も酸性の検体のｐＩよりも低くあるべきである。
【０１７１】
適切なＩＥＦ媒体は、特にフラット及びウルトラフラットｐＨ勾配では、唯一の緩衝酸(ＣＳＭ)又は唯一の緩衝塩基(ＡＳＭ)で設計されてもよいが、ＩＥＦ安定化媒体が、それぞれ１超の緩衝酸(ＣＳＭ)と緩衝塩基(ＡＳＭ)を含んでもよい。ある実施態様では、２、そしてある場合には３以上の緩衝化合物が、ＣＳＭ及びＡＳＭ中にそれぞれ存在してもよい。
【０１７２】
ある実施態様では、ＣＳＭ中の各緩衝酸のｐＫａは、(ｐＩ＋０.３)＜ｐＫａ＜(ｐＩ＋３)の範囲内、好ましくは(ｐＩ＋０.５)＜ｐＫａ＜(ｐＩ＋２)の範囲内、そして最も好ましくは以下の(ｐＩ＋０.５)＜ｐＫａ＜(ｐＩ＋１.３)の範囲内であるべきである。同様に、ＡＳＭ中の各緩衝塩基のｐＫａは、(ｐＩ-３)＜ｐＫａ＜(ｐＩ-０.３)の範囲内、好ましくは(ｐＩ-２)＜ｐＫａ＜(ｐＩ-０.５)の範囲内、そして最も好ましくは(ｐＩ-１.３)＜ｐＫａ＜(ｐＩ-０.５)の範囲内であるべきである。
【０１７３】
或いは、ＣＳＭ中の緩衝酸のｐＫａ値及びＡＳＭ中の緩衝塩基のｐＫａ値は、ＩＥＦ分離媒体のｐＨ範囲(つまり、最小ｐＨと最大ｐＨ)に関して定義することができる。ＩＥＦ分離媒体のｐＨ範囲に基づく定義は、検体のｐＩを指す定義に代えられてもよいし、又は追加要件であってもよい。従って、本発明のＩＥＦ安定化媒体に関するある実施態様では、ＣＳＭの緩衝酸の各々のｐＫａ値は、ＩＥＦ分離媒体の最大ｐＨ値よりも高い。同様に、ＡＳＭ中の緩衝塩基の各々におけるｐＫａ値は、ＩＥＦ分離媒体の最小ｐＨ値よりも低い。
【０１７４】
特定の実施態様では、ＣＳＭにおける各緩衝酸のｐＫａ値は、(ｐＨmax＋０.３)＜ｐＫａ＜(ｐＨmax＋３)の範囲内、好ましくは(ｐＨmax＋０.５)＜ｐＫａ＜(ｐＨmax＋２)の範囲内、そして最も好ましくは(ｐＨmax＋０.５)＜ｐＫａ＜(ｐＨmax＋１.３)の範囲内であり、そしてＡＳＭにおける各緩衝塩基のｐＫａ値は、(ｐＨmin-３)＜ｐＫａ＜(ｐＨmin-０.３)の範囲内、好ましくは(ｐＨmin-２)＜ｐＫａ＜(ｐＨmin-０.５)の範囲内、そして最も好ましくは(ｐＨmin-１.３)＜ｐＫａ＜(ＰＨmin-０.５)の範囲内である。
【０１７５】
１超の緩衝酸(ＣＳＭ)又は緩衝塩基(ＡＳＭ)が存在する場合、追加の緩衝化合物は、上記範囲内の異なるｐＫａ値を有するように選択されるべきである。好ましい実施態様では、ＣＳＭ中の弱い緩衝酸の濃度及びＡＳＭ中の弱い緩衝塩基の濃度は、それぞれ最も強い緩衝酸(ＣＳＭ)と強い緩衝塩基(ＡＳＭ)、つまりそれぞれＣＳＭについて最も塩基性の検体のｐＩに近いｐＫａを有する緩衝酸、及びＡＳＭについて最も酸性の検体のｐＩに近いｐＫａを有する緩衝塩基、の濃度よりも高くあるべきである。
【０１７６】
弱酸及び塩基の濃度が、ＣＳＭ及びＡＳＭ中の最も高い緩衝酸／塩基それぞれの濃度について、少なくとも１.１、そして好ましくは少なくとも約２、より好ましくは約３の因子、そしてある場合には約４、５又はさらには１０の因子分増加する。
【０１７７】
さらに、ＩＥＦ安定化媒体は、ＣＳＭ中の全ての塩基の合計濃度が、それぞれの緩衝酸の合計濃度よりも低く、かつＡＳＭ中の全ての酸の濃度が、それぞれの緩衝塩基の合計濃度よりも低いことを条件として、１以上の緩衝塩基(ＣＳＭ)及び緩衝酸(ＡＳＭ)を含んでもよい。
【０１７８】
ＣＳＭのｐＨは、通常分離媒体の最大ｐＨ(陰極に対するｐＨ勾配の末端)よりも高いであろう。好ましくは、ＣＳＭのｐＨは、ＩＥＦ分離媒体の最大ｐＨよりも約３、そしてより好ましくは約２ｐＨユニットを超えて高くあるべきではない。具体的にウルトラフラットｐＨ勾配では、ｐＨの差異を最小に維持することが好ましく、つまりｐＨは１.５ｐＨユニットだけ、又は１ｐＨユニットだけＩＥＦ分離媒体の最大ｐＨよりも高くあってもよい。同様に、ＡＳＭのｐＨは、ＩＥＦ分離媒体の最小ｐＨよりも約３、そしてより好ましくは約２ｐＨユニットを超えて低くあるべきではない。ウルトラフラットｐＨ勾配では、ｐＨの差異が最小に維持されることが特に好ましく、つまりｐＨは、ＩＥＦ分離媒体の最小ｐＨよりも１.５ｐＨユニットだけ、又は１ｐＨユニットだけ低くてもよい。
【０１７９】
ＩＥＦに関連する本発明の実施態様において、安定化媒体と、安定化媒体に隣接する分離媒体との間におけるｐＨの差異の値は、少なくとも約０.６ｐＨユニットであり、好ましくは少なくとも約０.８ｐＨユニットであり、そして最も好ましくは少なくとも約１ｐＨユニットであることが好ましい。上で説明したように、ＣＳＭ及びＡＳＭのそれぞれと分離媒体との間のｐＨ差異についての原理に従い、ＣＳＭのｐＨ値は、分離媒体の最大ｐＨ値よりも高く、そしてＡＳＭのｐＨ値は、分離媒体の最小ｐＨ値よりも低い。
【０１８０】
安定化媒体において観察されたｐＨ値が、全範囲にわたり一定ではないこともあり(特に電極に近づく場合)、その結果安定化媒体のｐＨについての言及が、安定化媒体と分離媒体との間の境界の又は境界付近のｐＨとして理解されるべきであることが当業者により認められよう。さらに、安定化媒体中の緩衝化合物の同一性が、分離媒体のｐＨ状態に影響を与えるということが認められる。実際、成分及びその濃度の選択は、電気泳動の際に電場を適用した場合に達成されるｐＨ勾配を決定するであろう。その結果、ｐＨ値についての言及が(つまり勾配が形成された後の)平衡状態を一般的に指し、そしてある状況下では、本発明の本質から逸脱することなく上記好ましい値から逸れることすらあることが理解されたい。
【０１８１】
ＩＩ.４.  等速電気泳動用の安定化媒体
フリーフロー又はフリー溶液等速電気泳動(ＩＴＰ)分離技術は、電気泳動分離プロセスを達成するために粒子の電気泳動移動度(ＥＭ)値の差異を使用する。フリーフローゾーン電気泳動とは対照的に、分離は、非均一媒体において達成され、そしてしばしば当該試行モードに備わる「フォーカス効果」のためより優れた分離をもたらす。実際、単一の粒子が、ＩＴＰの間における分離された粒子(タンパク質)のバンドから拡散する場合、これらの粒子は様々な電場強度で媒体内に入り込み、粒子が複数の電極のうちの１つに対して一般的に局所的に加速又は減速されることをもたらす。備わっているフォーカス効果は、遅く又は早く動いている粒子が、優勢画分(dominant fraction)への復帰することを意味する。目的の粒子よりもわずかに高い電気泳動移動度及びわずかに低い電気泳動度を有するスペーサーを添加することにより、既知の電気泳動移動度を有する粒子が移動フィールド内で単離されてもよい。これは一般的に「スタッキング」と呼ばれ、ここで「スペーサー」は、既知かつ明らかな電気泳動移動度を有する粒子を単離するために使用される。等速電気泳動の基本例は、「Method in Counterflow Isotachophoresis」という名称の米国特許第3,705,845号に示される。
【０１８２】
上に簡潔に言及されるように、ＩＴＰは、非連続電解質システムを用いる点で、標準的なゾーン電気泳動や等電点電気泳動とは異なっている。この非連続電解質システムは、一般的にリーダー及びターミネーター電解質又は媒体から構成され、ここで荷電化学種は、媒体中で、混合されたサンプル中に含まれるイオン性化学種又は検体よりも早い(リーダー)有効電解質移動度、及び遅い(ターミネーター)有効電解質移動度を示す。言い換えると、サンプル中の荷電化学種は、早く移動するリーダーイオン及び遅く移動するターミネーターイオンにより「囲まれている」か又は「ガードされている」それぞれの電極に対して移動する。
【０１８３】
実際には、分離が行われるサンプルは、通常、リーダーとターミネーター媒体の間に、それ自体で又はある場合にはターミネーターとリーダーの移動度の間の電気泳動移動度を示す他の化合物／イオンと一緒に、導入される。中間体の移動度を有するこのような追加の媒体は、ときにはスペーサー媒体又はスペーサー電解質と呼ばれる。
【０１８４】
電場をかけている間に、荷電された化学種は、個別の電極移動度に対応する様々な速度を有するが、反対の荷電を有する電極に対して移動し始める。言い換えると、サンプル中の検体の混合物は、その電気泳動移動度に従って個別のスペースの純粋な領域に分離される。十分な緩衝能力が存在することを仮定すると、完全な分離の後に、定常状態の移動度が達成される。さらに、混合サンプルの他のタンパク質に依存して、混合されたサンプル内のスペーサーは、隣接する領域に「スタッキング」するものとして特徴付けられる状態を引き起こす。各「スタッキング」された領域は、同一又は同様の電気泳動移動度の１の物質のみを含む。混合されたサンプルを含むゾーンは、移動度を低減する同じ順番で移動するが、それにもかかわらず電極に関して同じ速度の移動度を有する。
【０１８５】
等速電気泳動定常状態は、各サンプルゾーンにわたる濃度の特別な特徴を有する。ここでサンプル領域の濃度は、リーディングゾーン(リーダー)の濃度に正比例する。具体的に、等速電気泳動において、イオンを移動させるための濃度及び移動度の特徴は、当業者に知られているＫｏｈｌｒａｕｓｃｈ式により関係付けられる。
【０１８６】
等速電気泳動は、伝統的にキャピラリー電気泳動に用いられたが、近年、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムなどのフリーフロー電気泳動装置を使用するうまくいった分離法が開発された。例えば、細胞小器官の保存的分離は、同時係属中の2006年11月1日に出願された米国仮出願第USSN 60/863,834号、及び2007年1月3日に出願された60/883,260号に記載されており、これらはその全てを本明細書に援用される。
【０１８７】
別の試行モード(例えばＺＥ及びＩＥＦ)において行われた電気泳動適用と同様に、ＩＴＰ分離は、それにもかかわらず、特に、非限定的に調製的又は分析的フリーフロー偏向電気泳動技術として行われる場合にしばしば安定性問題に遭遇する。本明細書に記載されるＩＴＰ安定化媒体の新規概念は、当該技術において観測される安定性問題を解決し、そして安定、再現性のある、そして正確な電気泳動分離条件を保障し、特に電気泳動の間の所定の時間で再現性のある電場強度プロファイルを保障する。
【０１８８】
上に記載されるようにＩＴＰ試行モードの特性のため、考慮にいれる必要がある４の異なる安定化媒体が原則として存在することが当業者により認められる。なにより、目的の検体は、正又は負に荷電されていてもよく、そしてその結果陽極及び陰極に対してそれぞれ移動する。
【０１８９】
従って、目的の負に荷電された化学種(つまりアニオン)が陽極に対して移動するアニオン性ＩＴＰ分離と、正に荷電された目的の化学種が陰極に対して移動するカチオン性ＩＴＰ分離との間の区別をすることができる。各場合において、陽極と陰極の付近において安定化媒体がそれぞれ存在する。こうして、アニオン性ＩＴＰでは、最も早く移動する化学種(つまり、リーダーイオン)を含む陽極安定化媒体が存在し、そして最も遅く移動する化学種(つまりターミネーターイオン)を含む陰極安定化媒体が存在するであろう。逆に、カチオン性ＩＴＰ分離は、ターミネーターを含む陽極安定化媒体を有し、そしてリーダーイオンを含む陰極安定化媒体を有する。
【０１９０】
本発明の上記４つの異なるＩＴＰ安定化媒体の成分についての選択基準は以下に記載される。
【０１９１】
Ｉ.アニオン性ＩＴＰ分離
Ｉ.Ａ  陰極安定化媒体
本発明に記載のアニオン性ＩＴＰ用の陰極ＩＴＰ安定化媒体は、「ターミネーター」化合物、つまりイオン化可能な化合物であって、当該当該化合物のアニオン性形態が、電極間陰極に対して最も遅い有効な電気泳動移動度を有し、そしてさらに少なくとも１の今日塩基を含む化合物を含む。
【０１９２】
(上に記載されるように)当該技術分野における用語の使用に従い、アニオン性ＩＴＰ適用における「ターミネーター」は、電気泳動チャンバー内の最も低い電気泳動移動度を有するアニオン性の化学種である。電気泳動移動度が、イオン化の程度に依存しているので、ターミネーター化合物が、化合物のイオン化形態(例えば、弱酸の塩)、又は脱プロトン化されており、そうして(周囲の媒体のｐＨに基づいて)ある程度イオン化されている未変化の酸自体を指しうることが理解されたい。
【０１９３】
従って、本発明の態様の好ましい実施態様では、ターミネーターは、本明細書の以下に示される定義に従った緩衝酸である。ＩＴＰにおけるイオン化の度合いが、分離チャンバー中に存在するカウンターイオン(典型的には、リーダー媒体中で最も早く動くイオンの対イオンとしての緩衝塩基)に依存するので、緩衝酸は、好ましくはリーダー安定化媒体中の緩衝塩基のｐＫａ値に関連して選択されるべきである。こうして、陰極ＩＴＰ安定化媒体中の緩衝酸のｐＫａは、好ましくは、リーダー媒体中の緩衝塩基のｐＫａよりも高くあるべきである。特に、好ましい実施態様では、リーダーにおける緩衝酸と緩衝塩基との間のｐＫａの差異は、約０.５〜約３.５、より好ましくは１〜３、そして最も好ましくは１.５〜２.５であるべきであり、もちろん緩衝酸のｐＫａは、緩衝塩基のｐＫａよりも高い。
【０１９４】
大きくかつ不必要なｐＨシフトを避けるため、ターミネーター化合物の濃度は、少なくとも１の強塩基の濃度よりも高くあるべきである。濃度比は、通常特定の分離問題に依存するが、通常１.５：１〜５：１(ターミネーター：強塩基)であるが、２：１〜３：１であってもよいし、他の比率も可能である。
【０１９５】
ターミネーター化合物の適切な絶対濃度は、低い末端で通常約１０ｍＭ〜高い末端で５００ｍＭであるが、実際は、所定のターミネーター化合物の溶解度が濃度の上限を決定することがある。いくつかの好ましい実施態様では、ターミネーター化合物の絶対濃度は、しばしば、約３０〜３００、そしてより好ましくは約５０〜２００ｍＭである。
【０１９６】
ターミネーターと強塩基の間の上記濃度比に基づくと、強塩基の可能な濃度は、ターミネーターについて記載された濃度よりもある程度低い。強塩基の適切な濃度は、こうして、１０ｍＭ未満〜約４００ｍＭの範囲であってもよく、より好ましい濃度はたしかに５０〜２００ｍＭの範囲である。アニオン性ＩＴＰ適用の文脈における強塩基は、そのｐＫａ値が、緩衝酸のｐＫａよりも少なくとも２、そして好ましくは３又はさらには４ｐＫユニット高い塩基を意味する。しばしば、アルカリ金属水酸化物又はアルカリ土類金属水酸化物(ＫＯＨ、ＮａＯＨ、Ｃａ(ＯＨ)2、Ｍｇ(ＯＨ)2など)は、強塩基として適しているが、所望の高い伝導性をもたらす緩衝酸(ターミネーター)を実質的に脱プロトン化することができることを条件として、他の(弱)塩基が使用されてもよい。
【０１９７】
さらに、１より多くの強塩基が原則として使用する事ができる一方、分離チャンバー内の異なる化学種の数をできるだけ低くすることを望む場合、当業者は、通常単一の強塩基のみを用いる。
【０１９８】
本発明のアニオン性ＩＴＰの陰極安定化媒体は、電気泳動装置中における低いターミネーター濃度を有するターミネーターに隣接した陰極付近に導入されるべきであり、そしてサンプル及びスペーサー媒体は、陽極に対する希釈ターミネーターに隣接するが、リーダー媒体とリーダー安定化媒体の前における位置に導入される。
【０１９９】
Ｉ.Ｂ  陽極安定化媒体
アニオン性ＩＴＰ適用のための陽極安定化媒体は、陽極の近くの電気泳動装置に導入される。こうして、アニオン性ＩＴＰに対するこの「リーダー」安定化媒体は、少なくとも１の強酸と、プロトン化(イオン化)されうる少なくとも１の化合物を含む。ただし、プロトン化されうる化合物の濃度は、強酸濃度よりも高い。好ましくは、プロトン化されうる化合物は、本明細書の上で用いられた定義に従った緩衝塩基である。
【０２００】
一般的に強酸の共役塩基は、アニオン性ＩＴＰ中での最も高い電気泳動移動度を有するリーダーイオンに同一となるように選択される。アニオン性ＩＴＰ適用の文脈における強酸は、緩衝塩基を実質的にプロトン化して安定化媒体中で所望の高い伝導性を導くことができるために、安定化媒体中で使用される緩衝塩基のｐＫａよりもｐＫａ値が少なくとも２、そして好ましくは３又はさらには４ｐＫユニット低い酸を含むことが理解されるべきである。頻繁に、当業者は、塩酸又は臭化水素酸、又は硫酸を強酸として好む。なぜなら、得られる塩化物／臭化物／硫酸イオンが、かなり高い電気泳動移動度を有し、それによりアニオン性ＩＴＰにおけるリーダーイオンの適切な候補となるからである。
【０２０１】
好ましい実施態様では、陽極安定化媒体中の強酸及び緩衝塩基のうちの少なくとも１の濃度は、リーダー媒体中の同じ化合物の濃度に対して増加するであろう。一般的に、安定化媒体中の強酸と緩衝塩基の濃度は、互いから独立して、１：５〜５０の因子分増加するが、２〜２０の因子分増加するか、又はさらには５〜１５がより頻繁に生じるであろう。陽極安定化媒体中の濃度が、強酸及び緩衝塩基の両方に対して約１０倍増加する場合に、かなり良好な結果が達成されるが、正確な濃度は、分離問題の状況及び性質に依存するであろう。
【０２０２】
アニオン性ＩＴＰに対する陽極安定化媒体中の強塩基及び緩衝塩基の濃度のための絶対濃度は、低い末端で約１０ｍＭ〜高い末端で約５００ｍＭの範囲であるが、所定の化合物の溶解性が、通常濃度の上限を決定するであろう。好ましい実施態様では、(強酸の濃度が緩衝塩基の濃度以下となるべきであるという要件を維持する一方で)強酸と緩衝塩基の絶対濃度は、約３０〜３００であり、そしてより好ましくは両方の化合物について約５０〜２００ｍＭである。
【０２０３】
陽極ＩＴＰ安定化媒体中で、陰極及び緩衝塩基中でイオン化緩衝酸の実際の濃度はそれぞれ、主に安定化媒体中に存在する強塩基又は強酸の濃度により決定されよう。
【０２０４】
カチオン性ＩＴＰ分離では、陽極と陰極という語句、並びに酸と塩基という語句が交換されなければならないという点を除いて安定化媒体についての一般的基準は同一である。さらに、別のｐＫａ値に比較して高いｐＫａ値についての任意の言及は、以下に詳細に説明されるように低いｐＫａ値を言及することに置き換えられる必要がある。
【０２０５】
ＩＩ.  カチオン性ＩＴＰ分離
ＩＩ.Ａ  陽極安定化媒体
本発明の態様に従って、カチオン性ＩＴＰについての陽極ＩＴＰ安定化媒体は、「ターミネーター」化合物、つまりイオン化されている化合物であって、当該化合物のカチオン性の形態が、電気泳動の際に陰極に対して最も遅い有効な電気泳動移動度を有する化合物を含み、さらに少なくとも１の強酸を含む。
【０２０６】
(上に記載されるように)当該技術分野における用語の使用に従い、カチオン性ＩＴＰ適用における「ターミネーター」は、電気泳動性チャンバー内の最も低い電気泳動移動度を有するカチオン性の化学種である。電気泳動移動度が、イオン化の程度に依存しているので、ターミネーター化合物が、化合物のイオン形態(弱塩基の共役酸)を指してもよいし、又はプロトン化されて、周囲の媒体のｐＨに依存してある程度イオン化される未荷電の塩基自体をさしてもよい。
【０２０７】
従って、本発明の態様の特定の実施態様において、ターミネーターは、本明細書に示された定義に従った緩衝塩基である。ＩＴＰ中のイオン化の程度が、分離チャンバー中に存在するカウンターイオン(一般的に、リーダー媒体中で最も早く移動するイオンのカウンターイオンとしての緩衝塩基)に依存するので、リーダー安定化媒体中の緩衝酸のｐＫａ値に関して好ましくは選択されるべきである。こうして、陽極ＩＴＰ安定化媒体中の緩衝塩基のｐＫａは、好ましくはリーダー媒体中の緩衝酸のｐＫａよりも低くあるべきである。特に好ましい実施態様では、リーダー中の緩衝塩基と緩衝酸との間のｐＫａの差異は、約０.５〜約３.５、より好ましくは１〜３、そして最も好ましくは１.５〜２.５であるべきであり、緩衝塩基のｐＫａは、緩衝酸のｐＫａよりも低くあるべきである。
【０２０８】
大きくかつ不必要なｐＨシフトを裂けるために、ターミネーター化合物の濃度は、少なくとも１の強酸の濃度よりも高くあるべきである。濃度比は、通常、特定の分離問題によっているが、通常１.５：１〜５：１(ターミネーター／強酸)であり、２：１〜３：１であってもよいが、他の比率も可能であろう。
【０２０９】
ターミネーター化合物の適切な絶対濃度は、低い末端で通常約１０ｍＭ及び高い末端で約５００ｍＭであるが、実際は、所定のターミネーター化合物の絶対濃度は、約３０〜３００であり、そしてより好ましくは約５０〜２００ｍＭである。
【０２１０】
ターミネーターと強酸とのあいだの上記濃度に基づき、強酸の可能な濃度は、その結果ターミネーターについて記載されたものよりもいくらか低いものである。強酸の適切な濃度は、その結果１０ｍＭ未満〜約４００ｍＭであってもよく、一方より好ましい濃度は、５０〜２００ｍＭの範囲内である。カチオン性ＩＴＰ適用の文脈における強酸は、緩衝塩基のｐＫａよりもそのｐＫａ値が少なくとも２、そして好ましくは３又はさらには４ｐＫユニット低い酸を意味することが理解されるべきである。かなりの場合で塩酸、臭化水素さん、又は硫酸などの強酸が好ましいが、カチオン性アン低下媒体中で緩衝塩基を適切にプロトン化することができ、所望の高い伝導性を導く。
【０２１１】
さらに、１超の強酸が、原理的に使用できる一方で、分離チャンバー中の異なる化学種の数をできる限り低く維持することが所望される場合当業者は、通常単一の強酸のみを使用する。
【０２１２】
本発明のカチオン性ＩＴＰ用の陽極安定化媒体は、低いターミネーター濃度を有するターミネーター溶液に隣接した陽極付近の電気泳動装置に導入されるべきであり、そして希釈ターミネーターに隣接するように導入されたサンプル及び場合によりスペーサー媒体を、陰極に対するが、リーダー媒体とリーダー安定化媒体の前に導入させる。
【０２１３】
ＩＩ.Ｂ  陰極安定化媒体
カチオン性ＩＴＰ適用のための陰極安定化媒体は、陰極の近くの電気泳動装置に導入される。こうして、カチオン性ＩＴＰに対するこの「リーダー」安定化媒体は、少なくとも１の強酸と、脱プロトン化(イオン化)されうる少なくとも１の化合物を含む。ただし、プロトン化されうる化合物の濃度は、強塩基濃度よりも高い。好ましくは、脱プロトン化されうる化合物は、本明細書の上で用いられた定義に従った緩衝酸である。
【０２１４】
一般的に強塩基の共役酸は、カチオン性ＩＴＰ中での最も高い電気泳動移動度を有するリーダーイオンに同一となるように選択される。カチオン性ＩＴＰ適用の文脈における強塩基は、緩衝酸を実質的に脱プロトン化して安定化媒体中で所望の高い伝導性を導くことができるために、安定化媒体中で使用される緩衝酸のｐＫａよりもｐＫａ値が少なくとも２、そして好ましくは３又はさらには４ｐＫユニット高い塩基を含むことが理解されるべきである。頻繁に、当業者は、アルカリ又はアルカリ土類金属水酸化物(ＫＯＨ、ＮａＯＨ、Ｃａ(ＯＨ)2、Ｍｇ(ＯＨ)2など)の共塩基を好む。なぜなら、得られる金属イオンが、かなり高い電気泳動移動度を有し、それによりカチオン性ＩＴＰにおけるリーダーイオンの適切な候補となるからである。
【０２１５】
ある実施態様では、カチオン性ＩＴＰの陰極安定化媒体中の少なくとも１の強塩基と緩衝酸の濃度は、リーダー媒体中の同じ化合物の濃度に対して増加するであろう。一般的に、安定化媒体中の強塩基と緩衝酸の濃度は、互いから独立して、１：５〜５０の因子分増加するが、２〜２０の因子分増加するか、又はさらには５〜１５がより頻繁に生じるであろう。陰極安定化媒体中の濃度が、強塩基及び緩衝酸の両方に対して約１０倍増加する場合に、かなり良好な結果が達成されるが、正確な濃度は、分離問題の状況及び性質に依存するであろう。
【０２１６】
カチオン性ＩＴＰに対する陰極安定化媒体中の強塩基及び緩衝酸の濃度のための絶対濃度は、低い末端で約１０ｍＭ〜高い末端で約５００ｍＭの範囲であるが、所定の化合物の溶解性が、通常、濃度の上限を決定するであろう。好ましい実施態様では、(強塩基の濃度が緩衝酸の濃度以下となるべきであるという要件を維持する一方で)強塩基と緩衝酸の絶対濃度は、約３０〜３００であり、そしてより好ましくは両方の化合物について約５０〜２００ｍＭである。
【０２１７】
陰極安定化媒体及び陽極安定化媒体のそれぞれにおけるイオン化された緩衝酸と緩衝塩基の実際の濃度は、主にそれぞれの安定化媒体中に存在する強塩基又は強酸の濃度によりおもに決定されよう。
【０２１８】
ＩＩＩ.キット及び電気泳動媒体組成物
本明細書において考慮された様々な電気泳動分離媒体及び安定化媒体が、単独で又は、他の安定化媒体及び分離媒体とそれぞれ一緒に選択され、調製され、そして使用されてもよい。
【０２１９】
従って、本発明の別の態様は、本明細書に記載される新規の電気泳動媒体のうちの少なくとも１を含む、電気泳動分離を行うためのキットに関する。当該キットは、すぐに使用できる水溶液(つまり、全ての成分が電気泳動分離問題についての所望の濃度に存在する)として１又は幾つかの本発明の電気泳動媒体を含んでもよいし、又はその使用前にあらかじめきめられた量の水で希釈される濃縮溶液の形態で１又は幾つかの媒体を含んでもよい。或いは、キットは、電気泳動分離プロセスにおいてその使用前にあらかじめ決定された量の水で再構成される幾つかの、好ましくは１の容器中に、様々な成分の媒体を含む乾燥形態で１又は幾つかの媒体を含んでもよい。
【０２２０】
好ましくは、各媒体(陰極安定化媒体、陽極安定化媒体、分離媒体)は、分離容器内に存在するが、他の組み合わせ及びパッケージングが、ある状況において可能でありそして有用であってもよいということが明らかであろう。例えば、電極装置内にあらかじめ形成されたｐＨ勾配を作成するために、ＩＥＦ適用のための分離媒体が、異なる濃度の成分を有する異なる数の「サブ-フラクション」からなってもよいということが言及された。ＩＥＦ適用において使用されるサブフラクションの数は、分離問題に左右されており、所望のｐＨ範囲が、分離媒体及び分離に用いられる電気泳動装置を用いて達成される。フリーフロー電気泳動適用では、装置は、一般的に幾つかの媒体投入口Ｅ(例えば、Ｎ＝７、８、又は９の投入口)を含み、その結果装置内の分離スペースを作り上げるサブ媒体は、少なくとも１〜最大Ｎ-２の投入口に導入されてもよい(各側における少なくとも１の投入口は、安定化媒体用に保存される)。
【０２２１】
１の実施態様では、本発明のキットは、本発明の少なくとも１の分離媒体を含む。ある好ましい実施態様では、当該キット中の分離媒体が、基本的に一定のｐＨを形成し、そしてその結果特にＺＥ適用に有用である。他の好ましい実施態様では、分離媒体(又は分離媒体のサブフラクションを形成する幾つかの分離媒体)は、電気泳動分離の間のｐＨ勾配を形成し、そしてその結果ＩＥＦ適用に特に有用である。特に好ましい実施態様では、キット中の分離媒体は、２物質性の媒体であり、上に説明されるように１の緩衝酸及び１の緩衝塩基のみを含む。本明細書に記載される分離媒体のうちの全てが、好ましいか否かに関わらず、本発明のキット内に含まれてもよい。
【０２２２】
さらに別の実施態様では、キットは、本明細書に記載されるように少なくとも１の安定化媒体を含む。安定化媒体は、陰極安定化媒体であってもよいし、又は陽極安定化媒体であってもよい。陰極及び陽極安定化の両方ともが、電気泳動適用、特に無担体電気泳動、例えばＦＦＥの成功に必要とされているので、キットは、好ましくは、本明細書に定義される１の陽極及び１の陰極安定化媒体を含む。ある好ましい実施態様では、キットは、陽極及び／又は陰極安定化媒体を含み、それらはＺＥ適用に有用である一方で、別の好ましい実施態様では、キットはＩＥＦ適用に有用な陽極及び／又は陰極安定化媒体を含む。さらに別の好ましい実施態様では、キットは、ＩＴＰ適用に使用するために適用された陰極及び／又は陽極安定化媒体を含むであろう。典型的に、本発明のキット中に含まれる安定化媒体は、分離媒体の電気伝導性よりも高い伝導性を有し、そして通常少なくとも約５００μＳ／ｃｍ、そしてより好ましくは１０００μＳ／ｃｍ超、又はさらに２０００μＳ／ｃｍ超であるが、必要とされる絶対電気伝導性は、ある適用ではかなり低いこともありうる分離媒体の電気伝導性に依存することが当業者により理解されたい。
【０２２３】
さらに別の実施態様では、キットは、所定の電気泳動分離に必要とされる全ての媒体、つまり陽極安定化媒体及び陰極安定化媒体、並びに分離媒体(当該分離媒体はそれ自体、上で説明されるように幾つかのサブフラクションからなることもある)を含む。このような実施態様では、分離媒体及び安定化媒体は、当然のことながら、意図された運転モード、例えばＺＥ、ＩＥＦ、又はＩＴＰに有用であるように選択されたい。ＩＴＰ適用では、キットは、少なくとも陽極及び陰極安定化媒体を含み、そして場合によりターミネーター及びリーダー媒体、並びに本明細書に記載される１以上のスペーサー溶液を含んでもよい。
【０２２４】
電気泳動分離のために必要とされる全ての媒体を含むキット中の安定化媒体の電気伝導性が、分離媒体の伝導性よりも高いことが理解されたい。本明細書に説明されるように、陽極安定化媒体(ＡＳＭ)の高い伝導性は、ＡＳＭ中に強酸を含めることにより得られ、好ましくはここで当該強酸は、塩酸、硫酸、リン酸、及び他の酸であって、当該媒体中の緩衝塩基のｐＫａよりも少なくとも３ｐＫａユニット低いｐＫａを有するのかの酸から選ばれる。陰極安定化媒体(ＣＳＭ)中の高い伝導性は、強塩基を加えることにより得られ、好ましくは、ここで当該共塩基は、ＮａＯＨ又はＫＯＨなどのアルカリ金属水酸化物、Ｍｇ(ＯＨ)2又はＣａ(ＯＨ)2などのアルカリ土類金属、及び当該媒体中の緩衝酸のｐＫａよりも少なくとも３ｐＫａユニット高いｐＫａを有する他の塩基から選ばれる。
【０２２５】
好ましい陰極及び／又は陽極安定化媒体の全て、並びに本明細書に記載される好ましい分離媒体は、本発明のキットに含まれうるということが理解されたい。
【０２２６】
場合により、本発明のキットは、さらに電気泳動適用における媒体の使用の説明書をさらに含むことがある。
【０２２７】
本発明の別の態様は、分離媒体を含み、そしてさらに本明細書に記載される陰極安定化媒体及び陽極安定化媒体をさらに含む電気泳動媒体組成物に関する。組成物は、好ましくは、水の形態であるが、使用前に水で希釈されるか又は再構成される必要性がある濃縮形態の組成物又はさらには乾燥形態の組成物も本明細書において意図されている。組成物は典型的に、安定化媒体及び分離媒体用の組成物を分離することを含む。本明細書に記載される安定化媒体及び分離媒体について記載される好ましい任意の成分は、本発明の電気泳動媒体組成物中に含めることができる。
【０２２８】
ＩＩＩ.１.  新規の電気泳動媒体の使用及び方法
本発明の電気泳動分離媒体及び安定化媒体は、様々な電気泳動分離問題及び運転モードについての広い適用性により特徴付けられており、その結果多くの電気泳動適用に有用である。こうして、本発明は、電気泳動による検体の分離のために本明細書に記載される分離媒体の使用に関する。別の実施態様では、分離媒体を単独で、又はフリーフロー電気泳動を含む電気泳動により検体の分離するための陰極及び／又は陽極安定化媒体と一緒に分離媒体を含むキットの使用が本明細書において意図される。同様に、電気泳動媒体組成物は、(ＦＦＥを含む)電気泳動による検体の分離のために使用することができる。
【０２２９】
本発明のこの態様の好ましい実施態様では、本明細書に記載される媒体、キット、及び電気泳動組成物は、フリーフロー電気泳動(ＦＦＥ)により検体を分離するために使用されるべきである。
【０２３０】
分離、分取、濃縮、又は枯渇される検体にはリポソーム、ナノチューブ、細胞、細胞小器官、ウイルス、ウイルス粒子、細菌、膜、タンパク質、例えばりぽタンパク質、タンパク質複合体、タンパク質凝集体、ＤＮＡ、ＤＮＡ-タンパク質複合体、クロマチン、ペプチド、その組み合わせなどがある。しかしながら、他の非生物学的表面化でン改変ポリマー及び粒子、例えばメラミンレジン、ラテックスペイント粒子、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、デキストラン、セルロース誘導体、その組み合わせなどが、本発明の分離及び安定化媒体を使用するフリーフロー電気泳動(ＦＦＥ)により分離されてもよい。
【０２３１】
ある好ましい実施態様では、本明細書に記載される媒体、キット、及び組成物は、ゾーン電気泳動(ＺＥ)、及び最も好ましくは、フリーフローゾーン電気泳動(ＦＦ-ＺＥ)による検体の分離のために使用される。他の好ましい実施態様では、本明細書に記載される媒体、キット、及び組成物は、等電点電気泳動(ＩＥＦ)、そして最も好ましくはフリーフロー等電点電気泳動(ＦＦ-ＩＥＦ)による検体の分離のために使用される。さらに別の好ましい実施態様では、本発明の媒体、キット、及び組成物は、等速電気泳動(ＩＴＰ)、及び好ましくはフリーフロー等速電気泳動(ＩＴＰ)による検体の分離のために使用される。
【０２３２】
フリーフロー電気泳動による検体を分離するための媒体、キット、及び組成物の使用に関する全ての実施態様において、無担体電気泳動分離が、連続運転、インターバル(又はバッチ)モード、又は周期(cyclic)インターバルモードのいずれかにおいて行うことができる。
【０２３３】
フリーフロー偏向電気泳動の文脈において連続モードは、注入ステップ並びに分離ステップが、連続的かつ同時に生じることを意味するように理解されるべきである。連続モードＦＦＥでは、電気泳動分離は、異なる化学種が、そのｐＩ(ＩＥＦ)、総荷電密度(ＺＥ)又は電気泳動移動度(ＩＴＰ)に従って分離される電気泳動チャンバーを媒体と検体が通過する間に生じる。連続モードは、幾つかの独立した「試行」(１の試行は、一連のサンプルの注入、分離、及びそれに続く回収及び／又は検出として理解される)を行う必要を伴わずに検体の連続的な注入及び回収を可能にする。連続モードＦＦＥは、分離技術であって、当該バルクフロー速度が、初期のバルクフローレートに比べて低減されている(が、停止されていない)一方で、当該検体が分離時間を増加させるために電極間の分離スペースを通過する分離技術を含むということが理解されたい。後者の場合においては、しかしながら、真の連続モードについてはもはや言及することができない。なぜなら、バルクフローレートの低下は、限られた量のサンプルについてのみ意味をなすものであるからである。
【０２３４】
フリーフロー偏向電気泳動に関して用いられるインターバルモードは、当該技術分野に記載されていた。例えば、非連続(つまりインターバル)偏向電気泳動のプロセスは、米国特許第6,328,868号に示されており、その開示は、本明細書に援用される。この特許において、サンプル及び分離媒体は、共に電気泳動チャンバーに導入されており、そして次にゾーン電気泳動、等速電気泳動、又は糖電点電気泳動などの電気泳動モードを用いて分離され、そして最終的に、分取出口を通してチャンバーから排出される。８６８特許の実施態様は、チャンバーの入口末端から出口末端へと移動する一方向の分離媒体とサンプル移動を記載している。この方向は、従来のキャピラリー電気泳動とは異なり、細長い電極の位置により共有されている。例えば８６８発明において記載される静的インターバルモードでは、ポンプ又は幾つかの他の液体排水エレメントにより引き起こされる電極間でのサンプルの加速は、電場がオフになった場合にのみ行われるか、又は少なくとも電気泳動について効果的ではない場合に、つまりサンプルのどの部分にも電場がかけられていない場合に、行われる。
【０２３５】
言い換えると、インターバルプロセスは、サンプル及び媒体が、電気泳動装置の分離チャンバーに導入される充填フェーズ、続いてサンプルを含む媒体のバルクフローがとめられ、その間電場を適用して分離を達成する分離プロセスにより特徴付けられる。サンプルの分離／分取後、電場をオフにするか、又は効果がなくなるまで低下させ、そしてバルクフローを次にオンにして、分取されたサンプルを出口末端に対して移動させ、そして続いて適切な容器、例えばマイクロタイタープレートに回収／検出する。
【０２３６】
本明細書において使用されるフリーフロー電気泳動の文脈では、いわゆる周期又は周期インターバルモードが、2006年８月29日に出願された同時係属のＵＳ仮出願ＵＳＳＮ 60/823,833、及びUSSN 60/883,260に記載されており、その両方が本明細書に援用される。まとめると、新規のモードは、少なくとも１、そして潜在的な複数回のバルクフローの向きの逆流により特徴付けられている一方で、サンプルは細長い電極の間の電場中に維持されていることにより特徴付けられる。定常的なインターバルモードとは対照的に、サンプルは、常に動いており、それにより高い電場強度、そうしてよりよい(又はより早い)分離が可能になる。さらに、細長い電極間のサンプルのバルクフローを逆転させることにより、電場中の検体の滞在時間がかなり増加し、それにより高い分離時間及び／又は高い分離効率、並びにより優れた分離を提供する。細長い電極のいずれかの向きにバルクフローを逆流させること(サイクルと呼ぶ)は、具体的な状況において必要とされる頻度で繰り返すことができるが、実践理由及び短い時間で分離を得る目的が、一般的に、当該モードにおいて行われるサイクル数を制限するであろう。サンプル中の検体の所望の分取を達成した後に、通常電場はオフにされ、そして画分は、装置の出口末端から排出され、そして例えばマイクロタイタープレートなどの適切な容器内に回収され／検出される。
【０２３７】
本発明の実施態様は、さらに、本明細書に記載された分離媒体、安定化媒体、又はキット及び電気泳動媒体組成物の使用により特徴付けられる電気泳動方法にさらに関する。本発明のこの態様における好ましい実施態様では、電気泳動法は、ＦＦ-ＺＥ、ＦＦ-ＩＥＦ、及びＦＦ-ＩＴＰを含むフリーフロー電気泳動により検体の分離することに関し、場合によりここで当該ＦＦＥ分離は、本明細書ですでに記載された連続モード又はインターバルモード、又は周期インターバルモードで行われる。
【０２３８】
ＩＶ.  具体的適用
本発明のさらに別の実施態様は、広範囲の異なる検体を成功裏に分離又は分取するために適している電気泳動方法に関する。本明細書に提供される電気泳動方法は、優れた分離品質及び再現性をもたらし、それにより当業者に、当該技術分野において利用できる装置及び技術を用いて今まで利用できなかった追加技術を提供する。
【０２３９】
好ましくは、しかしながら、電気泳動法は、フリー溶液電気泳動、そしてより好ましくはフリーフロー電気泳動の状況で行われる。一般的に、フリー溶液電気泳動は、無担体電気泳動、例えばキャピラリー電気泳動を指し、ここで当該移動層の流れの方向は、基本的に電場のストリームラインに並行であり、ここでフリーフロー電気泳動は、一般的に、分離媒体(単数又は複数)、及び場合により更なる媒体、例えば安定化媒体及びカウンターフロー媒体の流れの方向が基本的に電極に対して並行である(つまり、電極により作られる電場のストリームラインに対して実質的に垂直である)技術を指す。
【０２４０】
以下により詳細に説明されているように、本発明のフリーフロー電気泳動法に従って分離されるサンプルが、本明細書に定義される任意の分離媒体であって、媒体投入口のうちの１を介してチャンバーに導入される媒体と合わせて分離チャンバーに導入されてもよい。さらに、電気泳動法が、フリーフロー電気泳動法である場合、当該フリーフロー電気泳動法は、サンプルが、分離された専用サンプル投入口を通して、当該方法を実施するのに適しているＦＦＥ装置中に導入されてもよいという利点を提供する。
【０２４１】
従って、以下の：
(a)  少なくとも１の陽極安定化媒体、少なくとも１の陰極安定化媒体、及び少なくとも１の分離媒体を電気泳動チャンバーに導入し；
(b)  １以上の検体を上記少なくとも１の分離媒体に導入し；
(c)  上記媒体及び検体に対して電場をかけ；そして
(d)  電気泳動チャンバーから全て又は一部の検体を溶出する、
を含む本発明の電気泳動法であって、当該少なくとも１の分離媒体が本発明に従った分離媒体である電気泳動法が提供される。
【０２４２】
好ましくは、少なくとも１の安定化媒体、つまり陽極及び／又は陰極安定化媒体は、本明細書に定義される安定化媒体である。
【０２４３】
分離されるサンプルは、ＦＦＥ装置の陽極(単数又は複数)と陰極(単数又は複数)の間の分離スペース中に存在する分離媒体に加えられるか、又は好ましくはＦＦＥ装置により提供される専用サンプル投入口(Ｓ)を通してＦＦＥ装置の分離スペース内に別々に導入される。分離媒体及び安定化媒体は、一般的に、図１に示されるように、媒体投入口(Ｅ)を通して分離スペース又は分離チャンバー内に導入される。サンプル投入口は、ＦＦＥ装置の媒体投入口と独立して位置していてもよいし、そしてしばしば媒体投入口の下流側に位置している(再び図１を参照のこと)。さらに、投入口はＦＦＥ装置の陽極と陰極の間の任意の所望される位置に配置されてもよい。典型的に第一末端で又はその付近で(つまりその近くで)の分離チャンバーは、サンプル注入用の少なくとも１のサンプル投入口と、少なくとも１の分離媒体、及び場合により安定化媒体の注入用の複数の媒体投入口を含む。第二末端の近くに、典型的に複数のサンプル回収出口が位置し、そして場合により１以上のカウンターフロー媒体投入口が位置する。つまり本発明のある実施態様では、本明細書に記載される任意の方法が、例えばさらにＷＯ２００６/１１９００１に詳細に説明されるようにカウンターフロー媒体の使用を含むことができる(当該文献は本明細書に援用される)。(１より多くが存在する場合)回収出口とカウンターフロー媒体投入口の両方が、一般的にバルクフローの方向に垂直な線に沿って配置される。
【０２４４】
サンプル投入口を介して分離媒体と一緒に検体を導入することを介して、又は任意の他の可能な方法により、検体を適切な電気泳動チャンバーに導入した後に、分離媒体内のサンプル中の様々な検体を次に、電場を適用し、一方でＦＦＥ装置の出口末端に対して液体を送ることにより分離した。
【０２４５】
適切なＦＦＥ装置が当該技術分野に知られており、そして例えば、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システム(ＢＤ ＧｍｂＨ,Ｇｅｒｍａｎｙ)の名称で市販されている。さらに、本発明の分離及び安定化媒体と用いることができる適切なＦＦＥ装置は、US特許第5,275,706号、US特許第6,328,868号、係属中の公開された米国出願US 2004/050697号、US 2004/050698号、US 2004/045826号、及びUS 2004/026251号、及び国際出願PCT/EP2007/061840、US 2004/045826、及びUS 2004/026251、及び国際出願PCT/EP 2007/061840及びPCT/EP2007/059010を含む多くの特許出願において記載されてきた。これらの全てが本明細書に援用される。
【０２４６】
本発明は、通常フラットなｐＨプロファイル及び通常１０００μＳ／ｃｍを有する電気泳動分離媒体を提供し、その少なくとも一部が固有かつ変化しうる総表面荷電を有するところの検体を含むサンプルを分離媒体に導入し、そしてリポソーム、ウイルス粒子などの検体いを、フリーフローゾーン電気泳動により分離又は分取することを含む電気泳動方法を提供する。
【０２４７】
電気泳動方法においおて分離される検体は、生体粒子又は生体ポリマー、非限定的にリポソーム、ナノチューブ、細胞、細胞小器官、ウイルス、ウイルス粒子、細菌、膜、タンパク質、タンパク質凝集体、タンパク質複合体、ＤＮＡ、ＤＮＡ-タンパク質複合体、クロマチン、ペプチド、それらの任意の組み合わせなど、及び日生物物質、表面荷電改変されたポリマー、及び粒子、例えば非限定的にメラミンレジン、ラテックスペイント粒子、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、デキストラン、セルロース誘導体、それらの任意の組み合わせなどからなる群から選択される。
【０２４８】
本発明の態様における好ましい実施態様では、電気伝導性は、６００μＳ／ｃｍ未満であるが、伝導性がさらに低い、例えば約５００、４００、３００、２００、１００又はさらには５０μＳ／ｃｍ未満であることも多い。
【０２４９】
ある実施態様では、本発明に従った電気泳動方法により分離される検体は、生体ポリマー及び生体粒子の群から選択され、そして好ましくは比較的大きくかつ滑らかな表面を有し、かつ比較的低い総表面荷電を有する粒子から選択される。特に好ましい実施態様では、本明細書に記載される電気泳動法は、リポソームの分離のために用いられよう。
【０２５０】
リポソームは、リン脂質及びコレステロール二重層から一般的に構成される膜を有する球状のベシクルである。これらは、混合された脂質鎖(例えば、卵のホスファチジルエタノールアミンなど)を有する天然由来のリン脂質、又はＤＯＰＥ(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)などの純粋な界面活性成分から構成することができる。リポソームは、単層又は多層、つまり多くの層から構成されても良い。これらはしばしば(非限定的に)水溶液のコアを含む。リポソームは、興味深くかつ幅広い潜在的適用を有するため、関心が高い。例えば、リポソームは、薬剤デリバリー剤として一般的に使用されるか、又はＤＮＡのトランスフォーメーション又はトランスフェクションに使用することができる。
【０２５１】
リポソームは一般的に多くの異なる成分から合成的に作成されるので、得られたリポソームの集合は、その特徴及び個々の組成の点で必ずしも均一ではない。したがって、当該技術分野において、リポソームの生産状況を制御／分析する必要性があり、さらに特定の状況下では、異なる性質を有するリポソームの集合の調製的分取をする必要性も存在する。本明細書に提供される電気泳動法は、非均一リポソーム集合を調製的又は分析的に分取するのに特に適していることが発見された。
【０２５２】
電気泳動方法の好ましい実施態様では、緩衝酸のｐＫａが、緩衝塩基のｐＫａよりも高いことを条件に、１の緩衝酸と１の緩衝塩基を含む。分離媒体中の緩衝酸と緩衝塩基との間のｐＫａの差異(ΔｐＫａ)が０.８〜２.５、そしてより好ましくは１.０〜２.３となるように緩衝酸と緩衝塩基は選択される。特に良好な結果は、ΔｐＫａが１.２〜１.８である特定の実施態様において達成された。
【０２５３】
特定の検体、特に感受性の生体ポリマー及び生体粒子では、緩衝塩基と緩衝塩基は、分離媒体のｐＨが約５〜９、そしてしばしば約６〜８となるように選択される。素晴らしい結果が、ほぼ中性、つまり約ｐＨ７を有する分離媒体を用いて達成されるが、電気泳動方法は、本明細書にすでに記載されたように約ｐＨ２〜１２のあいだの任意の適切なｐＨで原理的には実施できる。それぞれの緩衝酸及び緩衝塩基の選択が、一般的に分離問題と性質、ならびに目的の検体の安定性要件に左右されることが認められたい。リポソーム分取では、分離媒体のｐＨは、通常約ｐＨ５〜ｐＨ９である。
【０２５４】
亜本発明のこの態様における好ましい実施態様では、分離媒体の密度は、非荷電の添加剤を加えることにより、サンプルの密度にあわせられよう。可能な添加剤はすでに本明細書に記載されている。特に好ましい添加剤は、スクロースであるが、ほかの添加剤が同じように使用されても良い。
【０２５５】
一般的にリポソームを無傷のままに維持することが望まれるので、分離媒体のｐＨは、分離過程の間において、リポソームの構造的完全性を保障するために分離媒体のｐＨは適合されるべきである(例えば、ｐＨ又はｐＨ範囲をｐＨ＝７付近に調節することによる)。例えば、良好なリポソーム分離の結果が、５０ｍＭのＥＰＰＳ、５０ｍＭのＢＩＳＴＲＩＳ,及び２５０ｍＭのスクロースを含む分離媒体を用いることにより達成され、ここでスクロースの添加により分離媒体の密度が調節される。分離は、例えば周期インターバルＦＦ-ゾーン電気泳動を用いることにより行われうる。
【０２５６】
本発明に従ったウイルスの分離は、本明細書に提供される媒体を用いた生体粒子を分離するための別の非限定的な例である。良好な分離結果が、例えば、本発明にしたがって、インターバルゾーン電気泳動を用いて自然の条件下でウイルス及びウイルス粒子を分離することにより達成された。この例では、使用された分離媒体は、５０ｍＭモルフォリノエタノールと５０ｍＭのＴＡＰＳを含んだ。さらに２００ｍＭのスクロース、ならびに少量のＨＰＭＣ及び界面活性剤(ＴＷＥＥＮ８０(商標))を加えて、分離条件を最適化した。
【０２５７】
好ましくは、電気泳動方法は、さらに、本発明に従った陽極及び陰極安定化媒体を提供するステップをさらに含む。陽極及び陰極安定化媒体は、一般的に、それぞれ電気泳動装置の陽極と陰極の付近に導入される。電気泳動法は、好ましくは、マトリクスフリーな様式で行われ、特に当該電気泳動は、フリー溶液で行われる(ＦＦＥ-ＺＥ)。
【０２５８】
電気泳動法を行う場合に、サンプル及び媒体のバルクフローは、好ましくは、一般的にある時間のあいだ陽極と陰極の方向に平行である。
【０２５９】
本発明のある実施太陽では、サンプルのバルクフローは、原則的に電気泳動法の間、特に分離フェーズにおいて一定に維持される。サンプルが低い流速で分離スペースに導入されることは一般的ではあるが必須であるわけではなく、一方で分取されたサンプルを溶出するステップは、高いバルク流速で行われうる。
【０２６０】
ある別の実施態様では、十分な分離時間を可能にするために２つの電極間に電場を適用するあいだに、サンプルと媒体のバルク流速を停止するか又は緩めることが好ましい。ほかの好ましい実施態様は、さらにサンプル及び媒体のバルクフローをオンにして溶出、場合により区分された画分を回収するステップを含む。
【０２６１】
さらに別のこのましい実施態様では、サンプル及び媒体のバルクフローの方向が、電場を適用している間に少なくとも１回逆転されるように電気泳動が行われる。好ましくはバルクフローの方向の転換が、検体の許容される分離／分取を達成するために必要である限り繰り返される。後者を、上に詳述されたように周期インターバルモードと呼ぶ(図１０を参照のこと)。
【０２６２】
バルク流速は、一般的に特定の状況及び装置にあわせられるが、サンプルと媒体のバルク流速が、典型的には、特に定常インターバル及び周期インターバルＦＦＥ適用では、充填及び／又は溶出フェーズに比べて分離フェーズの間は低くあるべきである。
【０２６３】
本明細書に提供される電気泳動法は、区分された画分に目的の検体、例えばリポソームの一部を溶出するステップを含む。
【０２６４】
本発明の本質及び範囲から逸脱することなく多くの改変及び少しの変更が可能であるということが当業者に認められたい。本発明及びその利点は、以下の非限定的な例でさらに示される。
【実施例】
【０２６５】
実施例１：ＦＦ-ＺＥモードで行われたカチオン性の分離
Ｈｅｌａ細胞からすべての細胞抽出物を分離する分離媒体及び安定化媒体の能力は、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を備えたＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムで試験した。陽極安定化媒体を投入口Ｅ１に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルを陽極サンプル投入口(Ｓ１)を介して装置に導入した。電気泳動分離の合計時間は１０分であった。サンプル及び媒体をそれぞれ２ｍｌ／ｈ及び２５０ｍｌ／ｈのフローレートで導入した。適用された電圧は、８５０Ｖでありそして電流は４２ｍＡであった。９０ｍｌ／ｈで周期インターバルＦＦ-ＺＥモードでランを行い、そして分画されたサンプルを３００ｍｌ／ｈで溶出した。
【０２６６】
分離プロトコルは以下のものを用いた：
陽極安定化媒体(投入口１)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＭＰＣ＋１００ｍＭ・Ｈ2ＳＯ4＋３０ｍＭｇｌｙｇｌｙ＋２５０ｍＭ  ２-アミノ-酪酸；
分離媒体(投入口２〜６)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＰＭＣ＋５０ｍＭ酢酸＋５０ｍＭグリシルグリシン；
陰極安定化媒体(投入口７)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＰＭＣ＋１５０ｍＭ  ＮａＯＨ＋３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋３０ｍＭ  ＨＡｃ＋２５０ｍＭピリジンエタンスルホン酸(ＰＥＳ)
【０２６７】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図２Ａのグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図２Ａに報告した。当該吸光度はそれぞれのpＩマーカーの吸光度を表す。分離後、サンプルを９６ウェルプレートに回収し、そして分析した。結果を図２Ｂに報告し、図２Ｂは、分離媒体と安定化媒体のｐＨに依存した存在するサンプルの分別分離を示す。全ての第二ＦＦＥ分画を、ＳＤＳＰＡＧＥを用いて分析した。
【０２６８】
実施例２：ＦＦ-ＺＥモードにおけるカチオン性及びアニオン性の同時分離
ＨｅＬａ細胞由来の全細胞抽出物を分離する分離媒体及び安定化媒体の能力を、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を備えたＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムで試験した。陽極安定化媒体を投入口Ｅ１に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルをサンプル投入口Ｓ２を介して導入した。電気泳動の合計時間は６分であった。適用される電圧は８５０Ｖでありそして電流は４２ｍＡであった。サンプルと媒体を２ｍｌ/ｈ及び２５０ｍｌ/ｈの流速でそれぞれ導入した。ランを９０ｍｌ/ｈの周期インターバルＦＦ-ＺＥモードで行い、そして分取されたサンプルを３００ｍｌ/ｈで溶出した。
【０２６９】
分離プロトコルは以下のものを用いた：
陽極安定化媒体(投入口１)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＭＰＣ＋１００ｍＭ・Ｈ2ＳＯ4＋３０ｍＭクレアチニン＋２５０ｍＭ  ＥＡＣＡ；
分離媒体(投入口２〜６)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＰＭＣ＋５０ｍＭ ＭＥＳ＋５０ｍＭクレアチニン；
陰極安定化媒体(投入口７)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＰＭＣ＋１５０ｍＭ  ＮａＯＨ＋３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋３０ｍＭ  ＭＥＳ＋２５０ｍＭ ＭＯＰＳＯ。
【０２７０】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図３Ａのグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図３Ａに報告した。当該吸光度はそれぞれのpＩマーカーの吸光度を表す。分離後、サンプルを９６ウェルプレートに回収し、そして分析した。結果を図３Ｂに報告し、図３Ｂは、分離媒体と安定化媒体のｐＨに依存した存在するサンプルの分別分離を示す。全ての第二ＦＦＥ分画を、ＳＤＳＰＡＧＥを用いて分析した。
【０２７１】
実施例３：ＦＦ-ＺＥモードにおいて行われるアニオン性分離
ＨｅＬａ細胞由来の全細胞抽出物を分離する分離媒体及び安定化媒体の能力を、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を備えたＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムで試験した。陽極安定化媒体を投入口Ｅ１に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルをサンプル投入口Ｓ３を介して導入した。電気泳動の合計時間は７分であった。適用される電圧は８５０Ｖでありそして電流は３６ｍＡであった。サンプルと媒体を２ｍｌ/ｈ及び２５０ｍｌ/ｈの流速でそれぞれ導入した。ランを９０ｍｌ/ｈの周期インターバルＦＦ-ＺＥモードで行い、そして分取されたサンプルを３００ｍｌ/ｈで溶出した。
【０２７２】
分離プロトコルは以下のものを用いた：
陽極安定化媒体(投入口１)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＭＰＣ＋１００ｍＭ・Ｈ2ＳＯ4＋３０ｍＭ２-ピリジン-プロパノール＋２５０ｍＭ  ２-ピリジン-エタノール；
分離媒体(投入口２〜６)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＰＭＣ＋５０ｍＭ ＭＯＰＳ＋５０ｍＭ２-ピリジン-プロパノール；
陰極安定化媒体(投入口７)：  ２Ｍチオウレア＋７Ｍウレア＋０.１％ＨＰＭＣ＋１５０ｍＭ  ＮａＯＨ＋３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋３０ｍＭ  ＭＯＰＳ＋２５０ｍＭ ＥＰＰＳ。
【０２７３】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図４Ａにグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図４Ａに報告した。当該吸光度はそれぞれのpＩマーカーの吸光度を表す。分離後、サンプルを９６ウェルプレートに回収し、そして分析した。結果を図４Ｂに報告し、図４Ｂは、分離媒体と安定化媒体のｐＨに依存した存在するサンプルの分別分離を示す。全ての第二ＦＦＥ分画を、ＳＤＳＰＡＧＥを用いて分析した。
【０２７４】
実施例４：ＦＦ-ＺＥモード
品質コントロールサンプルを用いて、分離媒体及び安定化媒体を、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムで試験した。当該装置は、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を含む設定であった。陽極安定化媒体を投入口Ｅ１に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルをサンプル投入口Ｓ４を介して導入した。電気泳動の合計時間は１０分であった。適用される電圧は６００Ｖでありそして電流は８０ｍＡであった。サンプルと媒体を２ｍｌ/ｈ及び２５０ｍｌ/ｈの流速でそれぞれ導入した。ランを９０ｍｌ/ｈの周期インターバルＦＦ-ＺＥモードで行い、そして分取されたサンプルを３００ｍｌ/ｈで溶出した。
【０２７５】
分離プロトコルは以下の媒体を用いた：
陽極安定化媒体：  ２５０ｍＭスクロース＋５０ｍＭ硫酸＋１５０ｍＭ ＢＩＳＴＲＩＳ+５０ｍＭ ＭＥＳ；
ｐＨ＝６.２５、伝導性４５１０μＳ／ｃｍ；
分離媒体(投入口２〜６)：  ２５０ｍＭスクロース＋５０ｍＭ ＢＩＳＴＲＩＳ＋５０ｍＭ ＥＰＰＳ；
ｐＨ＝７.２３、伝導性２６４μＳ／ｃｍ；
陰極安定化媒体：  ２５０ｍＭスクロース＋１００ｍＭ ＮａＯＨ＋１５０ｍＭ ＥＰＰＳ＋５０ｍＭ ＴＲＩＳ；
ｐＨ＝８.１１、伝導性４５９０μＳ／ｃｍ；
【０２７６】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図５にグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図５に報告し、これはそれぞれｐＩマーカーの吸光度を示した。
【０２７７】
実施例５：ＦＦ-ＩＥＦモード
品質コントロール溶液を用いて、分離媒体及び安定化媒体を、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムをＦＦ-ＩＥＦモードで試験した。当該装置は、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を含む設定であった。陽極安定化媒体を投入口Ｅ１に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルをサンプル投入口Ｓ１を介して導入した。電気泳動の合計時間は５０分であった。適用される電圧は１２００Ｖでありそして電流は３０ｍＡであった。サンプルと媒体を２ｍｌ/ｈ及び２５０ｍｌ/ｈの流速でそれぞれ導入した。ランを９０ｍｌ/ｈの周期インターバルＦＦ-ＺＥモードで行い、そして分取されたサンプルを３００ｍｌ/ｈで溶出した。
【０２７８】
分離プロトコルは以下の媒体を用いた：
陽極安定化媒体：  ２５％グリセロール＋０.２％ＨＰＭＣ＋１００ｍＭ Ｈ2ＳＯ4＋５０ｍＭ ＨＡｃ＋２００ｍＭＥＡＣＡ＋１００ｍＭ ４-ピリジン-プロパノール
ｐＨ＝４.８９；伝導性５８４０μＳ／ｃｍ；
分離媒体：  ２５％グリセロール＋０.２％ＨＰＭＣ＋１％Ｓｅｒｖａｌｙｔ６-８；
ｐＨ＝７.４８、伝導性＝８５μＳ／ｃｍ；
陰極安定化媒体：  ２５％グリセロール＋０.２％ＨＰＭＣ＋１５０ｍＭ ＮａＯＨ+３０ｍＭエタノールアミン+２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ
ｐＨ＝１０.０、伝導性４１６０μＳ／ｃｍ；
【０２７９】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図６にグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図６に報告し、これはそれぞれｐＩマーカーの吸光度を示した。
【０２８０】
実施例６：ＦＦ-ＩＥＦモード
品質コントロール溶液を用いて、分離媒体及び安定化媒体を、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムをＦＦ-ＩＥＦモードで試験した。当該装置は、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を含む設定であった。陽極安定化媒体を投入口Ｅ２に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルをサンプル投入口Ｓ１を介して導入した。電気泳動の合計時間は６０分であった。適用される電圧は９００Ｖでありそして電流は３５ｍＡであった。サンプルと媒体を２ｍｌ/ｈ及び２５０ｍｌ/ｈの流速でそれぞれ導入した。ランを９０ｍｌ/ｈの周期インターバルＦＦ-ＺＥモードで行い、そして分取されたサンプルを３００ｍｌ/ｈで溶出した。
【０２８１】
分離プロトコルは以下の媒体を用いた：
陽極安定化媒体：  ７Ｍ尿素＋２Ｍチオウレア＋１００ｍＭ硫酸、ｐＨ＝２.２１、伝導性９５５０μＳ/ｃｍ； 
分離媒体：  ７Ｍ尿素＋２Ｍチオウレア＋０.７５％Ｓｅｒｖａｌｙｔｅ２-４＋０.７５％Ｓｅｒｖａｌｙｔｅ4-６；
ｐＨ＝４.８９、伝導性＝１９８μＳ／ｃｍ；
陰極安定化媒体：  ７Ｍ尿素＋２Ｍチオウレア＋１５０ｍＭ ＮａＯＨ＋５０ｍＭ ＴＲＩＳ＋２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋５０ｍＭ ＭＯＰＳＯ
ｐＨ＝８.１８、伝導性４９８０μＳ/ｃｍ
【０２８２】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図７にグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図７に報告し、これはそれぞれｐＩマーカーの吸光度を示した。
【０２８３】
実施例７：ウルトラフラットｐＨ勾配ＦＦＥモード
品質コントロール溶液を用いて、分離媒体及び安定化媒体を、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムで試験した。当該装置は、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を含む設定であった。陽極安定化媒体を投入口Ｅ１に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルをサンプル投入口Ｓ２を介して導入した。電気泳動の合計時間は６０分であった。適用される電圧は９００Ｖでありそして電流は３５ｍＡであった。サンプルと媒体を２ｍｌ/ｈ及び２５０ｍｌ/ｈの流速でそれぞれ導入した。ランを９０ｍｌ/ｈにて周期インターバルＦＦ-ＩＥＦモードで行い、そして分取されたサンプルを３００ｍｌ/ｈで溶出した。
【０２８４】
ウルトラフラットｐＨ勾配を作成するため、少し異なるｐＨを有する５個の分離媒体を用いた。分離媒体及び安定化媒体は、各々１の投入口に次の順番で導入した：
陽極安定化媒体(投入口１)：  ０.２％ＨＰＭＣ＋５０ｍＭ硫酸＋３０ｍＭ酢酸＋２０ｍＭＭＯＰＳ＋３０ｍＭピリジンー２-プロパノール＋５０ｍＭ２-ヒドロキシ-メチル-ピリジン；ｐＨ４.７７、伝導性６３２０μＳ/ｃｍ；
分離媒体１(投入口Ｅ２)：  ０.２％ＨＰＭＣ＋４０ｍＭピリジン-２-プロパノール+６０ｍＭ ＴＡＰＳ；ｐＨ＝６.８５、伝導性１２０μＳ／ｃｍ
分離媒体２(投入口Ｅ３)：  ０.２％ＨＰＭＣ＋５０ｍＭピリジン-２-プロパノール+５０ｍＭ ＴＡＰＳ；ｐＨ＝６.８９、伝導性１２０μＳ／ｃｍ
分離媒体３(投入口Ｅ４)：  ０.２％ＨＰＭＣ＋６０ｍＭピリジン-２-プロパノール+４０ｍＭ ＴＡＰＳ；ｐＨ＝７.００、伝導性１１６μＳ／ｃｍ
分離媒体４(投入口Ｅ５)：  ０.２％ＨＰＭＣ＋７０ｍＭピリジン-２-プロパノール+３０ｍＭ ＴＡＰＳ；ｐＨ＝７.１、伝導性１１２μＳ／ｃｍ
分離媒体５(投入口Ｅ６)：  ０.２％ＨＰＭＣ＋８０ｍＭピリジン-２-プロパノール+２０ｍＭ ＴＡＰＳ；ｐＨ＝７.２４、伝導性１０４μＳ／ｃｍ
陰極安定化媒体(投入口Ｅ７)：  ０.２％ＨＰＭＣ＋１００ｍＭ ＮａＯＨ＋４０ｍＭ イミダゾール＋３０ｍＭ ＴＡＰＳ＋１５０ｍＭ ＡＭＰＳＯ；ｐＨ＝９.０、伝導性５１００μＳ／ｃｍ。
【０２８５】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図８にグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図８に報告し、これはそれぞれｐＩマーカーの吸光度を示した。
【０２８６】
実施例８：アニオン性ＦＦ-ＩＴＰ分離
品質コントロール溶液を用いて、分離媒体及び安定化媒体を、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムで試験した。当該装置は、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を含む設定であった。陽極安定化媒体を投入口Ｅ１に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルを投入口Ｅ６を介して導入した。電気泳動の合計時間は１０分であった。適用される電圧は１０００Ｖでありそして電流は３５ｍＡであった。ランを９０ｍｌ/ｈにて周期インターバルＦＦ-ＩＥＦモードで行い、そして分取されたサンプルを３００ｍｌ/ｈで溶出した。
【０２８７】
使用した分離プロトコルは以下の通りである：
陰極安定化媒体：  ０.１％ＨＰＭＣ＋２５０ｍＭスクロース＋１５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１００ｍＭ ＮａＯＨ；
ｐＨ７.７、伝導性２２１０μＳ/ｃｍ；
リーダー：  ０.１％ＨＰＭＣ＋２５０ｍＭスクロース＋１０ｍｌ ＨＣｌ＋２０ｍＭモルフォリノエタノール、ｐＨ＝７.７、伝導性８７０μＳ／ｃｍ
陽極安定化媒体：  ０.１％ＨＰＭＣ＋２５０ｍＭスクロース＋１００ｍＭ ＨＣｌ＋２００ｍＭモルフォリノエタノール
ｐＨ＝７.０；伝導性６７００μＳ／ｃｍ。
【０２８８】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図９にグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図９に報告し、これはそれぞれｐＩマーカーの吸光度を示した。
【０２８９】
実施例９：変性条件下で行われるインターバルＺＥ分離
変性条件下でゼノパス・リービス(Xenopus laevis)の細胞質抽出物を分離するための分離媒体及び安定化媒体の能力を、ＢＤ(商標)フリーフロー電気泳動システムで試験した。当該装置は、７つの投入口(Ｅ１-Ｅ７)及びサンプル投入口(Ｓ１-Ｓ４)を含む設定であった。陽極安定化媒体を投入口Ｅ１に導入した。陰極安定化媒体を投入口Ｅ７に導入し、そしてサンプルを投入口Ｓ２を介して導入した。電気泳動の合計時間は１０分であった。適用される電場強度は９０V／ｃｍであった。サンプル及び媒体をそれぞれ流速１.５ｍｌ／ｈ及び２５０ｍｌ／ｈで導入した。ランを、周期１００ｍｌ/ｈにて周期インターバルＦＦ-ＩＥＦモードで行い、そして分取されたサンプルを３００ｍｌ/ｈで溶出した。
【０２９０】
分離プロトコルは以下の媒体を用いた：
陽極安定化媒体：  １００ｍＭ Ｈ2ＳＯ4＋２５０ｍＭモルフォリノエタノール＋５０ｍＭ ｍＥＳ＋２Ｍチオウレア＋７Ｍ尿素＋０.１％ＨＰＭＣ
ｐＨ＝７.１１、伝導性６８００μＳ／ｃｍ；
分離媒体：  ５０ｍＭモルフォリノエタノール＋５０ｍＭ ＴＡＰＳ＋２Ｍチオウレア＋７Ｍ尿素＋０.１％ＨＰＭＣ
ｐＨ＝８.１、伝導性２７８μＳ／ｃｍ；
陰極安定化媒体：  １００ｍＭ ＮａＯＨ＋５０ｍＭ ＴＲＩＳ＋１５０ｍＭ ＴＡＰＳ＋７Ｍ 尿素＋０.１％ＨＰＭＣ
ｐＨ＝９.３、伝導性３１２０μＳ／ｃｍ。
【０２９１】
各ＦＦＥ画分のｐＨを、ｐＨ電極を用いて測定し、そして図１１Ａにグラフにより示す。着色されたｐＩマーカーを分離して、システムの分離パフォーマンスを評価した。λ＝４２０ｎｍ、５１５ｎｍ及び５９５ｎｍにおける各画分の吸光度を図１１Ａに報告し、これはそれぞれｐＩマーカーの吸光度を示した。分離後サンプルを９６ウェルプレートに回収し、そして分析した。結果を図１１Ｂに報告し、分離媒体及び安定化媒体のｐＨに依存した本サンプルの分別分離を示した。全ての第二ＦＦＥ分画を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥを用いて分離した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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