(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Ｌ０１Ｒ０６、Ｌ０２Ｒ０３、Ｌ０２Ｒ０６、Ｌ０８Ｒ０６、Ｌ０９Ｒ０３、Ｌ０９Ｒ０６及びＬ０９Ｒ０８の化合物から選択される化合物。
【化１】
0005513741.tif 000019
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願の相互参照〕
[0001]  本出願は、２００５年５月２６日に提出された米国仮出願第６０／６８４８０７号及び２００６年３月２８日に提出された米国仮出願第６０７４３８７８号の米国特許法第１１９条（ｅ）の下の利益を主張し、それぞれの全体が参照により援用される。
【０００２】
〔連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載〕
[0002]  本発明は、米国国立科学財団により与えられたＮＳＦ助成金／契約ＣＨＥ−０１３４７７９の下、政府援助でなされた。政府は、本発明における一定の権利を有している。
【０００３】
〔発明の背景〕
[0003]  アポトーシス又はプログラム細胞死はすべての多細胞生物の発生及びホメオスタシスで中心的な役割を果たしている（Ｓｈｉ  Ｙ，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ９：４５９−４７０）。よくある癌の特徴は、本来のアポトーシスシグナルに対する抵抗性である。癌型によっては、この抵抗性は、通常、アポトーシスカスケードにおける重要なタンパク質のアップレギュレーション若しくはダウンレギュレーション又はこれらのタンパク質をコードする遺伝子内の変異による。上記変化は、ミトコンドリア及びカスパーゼ−９を経る内因性アポトーシス経路並びにデスレセプター及びカスパーゼ−８の作用が関与する外因性アポトーシス経路の両方で起こる。たとえば、ｐ５３、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、Ａｐａｆ−１、ＦＬＩＰ、その他多くのタンパク質の適切なレベルの変化が癌で観察された。この変化は、欠陥のあるアポトーシスカスケードにつながる可能性があり、上流のアポトーシス促進シグナルが十分に伝達されず、実行因子カスパーゼであるカスパーゼ−３及びカスパーゼ−７が活性化されない。
【０００４】
[0004]  ほとんどのアポトーシス経路がプロカスパーゼ−３の活性化を最終的に伴うので、上流の遺伝的異常は、有効に、アポトーシス回路における「断線箇所（ｂｒｅａｋ）」となり、その結果、上記細胞は異常に増殖する。癌におけるアポトーシスの中心的な役割から判断して、アポトーシスカスケードにおける特定のタンパク質を標的にする治療を開発するための試みがなされた。たとえば、ｐ５３及びＢｃｌファミリーのタンパク質のカスケードメンバーに対する、又はアポトーシス抑制因子（ＩＡＰ）ファミリーのタンパク質に対するペプチド結合剤又は低分子結合剤は、Ａｐａｆ−１のオリゴマー化を促進する化合物のようにアポトーシス促進活性を有している。しかしながら、上記化合物が、アポトーシスカスケード上の早期に（又は中間から高所に）位置するものを標的にするので、それらのメンバーのうちの下流のタンパク質における変異を有する癌は、それらの化合物の可能な有益である効果になお抵抗性がある可能性がある。
【０００５】
[0005]  治療目的として、アポトーシスカスケードにおけるはるか下流のアポトーシス促進タンパク質を直接活性化する低分子を同定することは有利であろう。我々の発明へのアプローチは、カスケードにおける上記の比較的低位置を含み、したがって、上流のアポトーシス機構における変異を有するそれらの細胞でさえ殺すことを可能にする。さらに、本明細書中に開示された治療戦略は、アポトーシス促進タンパク質が癌細胞内でアップレギュレートした場合、成功の可能性がより高い可能性がある。本発明において、低分子を同定するための我々の試みは、アポトーシスの重要な下流のエフェクタータンパク質であるプロカスパーゼ−３を標的にすることから始まった。
【０００６】
[0006]  プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への変換又は活性化により、多数のタンパク質基質の加水分解を続いて触媒する活性「実行因子」カスパーゼ形態の生成がもたらされる。活性カスパーゼ−３は、ヘテロダイマーのホモダイマーであり、プロカスパーゼ−３のタンパク質分解により産生される。生体内では、このタンパク質分解性の活性化は、通常、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−９の作用を介して生じる。プロ酵素又は酵素前駆体が早まって活性化されないことを確実にするために、プロカスパーゼ−３は、タンパク質分解のＩＥＴＤ部位（アミノ酸配列、ｉｌｅ−ｇｌｕ−ｔｈｒ−ａｓｐ）への到達をブロックする１２個のアミノ酸「安全装置」を有している。Ｒｏｙ，Ｓ．ら；Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ  ｄｏｒｍａｎｃｙ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ“ｓａｆｅｔｙ  ｃａｔｃｈ”ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８，６１３２−６１３７（２００１）参照。
【０００７】
[0007]  この安全装置は、プロカスパーゼ−３が、自己触媒活性化及びカスパーゼ−９によるタンパク質分解に抵抗することを可能にする。突然変異誘発研究は、３つの連続したアスパラギン酸残基が安全装置の重要な成分であると思われることを示す。安全装置の部位はｐＨに感受性である。したがって、細胞の酸性化（アポトーシス中に起こる）の際、安全装置は、タンパク質分解の部位への到達を許可すると思われ、活性カスパーゼ−３は、カスパーゼ−９の作用により又は自己活性化機構を介して産生することができる。
【０００８】
[0008]  特定の癌では、プロカスパーゼ−３の発現はアップレギュレートされる。２０人の大腸癌患者からの一次単離物に関する研究は、平均して、プロカスパーゼ−３が、隣接した非癌性組織に比べて上記試料中で６倍アップレギュレートされたことを明らかにした（Ｒｏｙら，２００１）。さらに、プロカスパーゼ−３は、ある種の神経芽細胞腫、リンパ腫、及び肝臓癌においてアップレギュレートされる（Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．ら，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５７８−４５８４；ｌｚｂａｎ，Ｋ．Ｆ．ら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１４３９−１４４７；Ｐｅｒｓａｄ，Ｒ．ら，Ｍｏｄｅｍ  Ｐａｔｈｏｌｏ．１７：８６１−８６７）。さらに、国立癌研究所（ＮＣＩ）の開発治療プログラムによる癌スクリーニングに使用された６０枚の細胞株パネル中のプロカスパーゼ−３レベルについて系統的評価を行った。評価は、ある種の肺癌、黒色腫、腎臓癌、及び乳癌が著しく増強されたプロカスパーゼ−３発現レベルを示すことを明らかにした（Ｓｖｉｎｇｅｎ，Ｐ．Ａ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：６８０７−６８２０）。
【０００９】
[0009]  アポトーシスの達成における活性カスパーゼ−３の役割、ある種の癌性細胞型におけるプロカスパーゼ−３の比較的高度な発現レベル、及び興味深い、安全装置媒介性のその自己活性化の抑制により、プロカスパーゼ−３を直接修飾する低分子が同定される可能性があるということ及び上記分子は、標的癌治療法において顕著な適用可能性を有する可能性があるということを我々は推論した。
【００１０】
[0010]  本明細書で、我々は、プロカスパーゼ−３をそのエフェクター形態に変換することができる活性化剤を特に含む、プロカスパーゼの低分子修飾因子を開示する。さらに、我々は、ある種の薬物低分子がプロカスパーゼ−３を直接、即時活性化し、生体内において癌細胞におけるアポトーシス促進効果を達成することができることを実証する。我々は、これらがプロカスパーゼ−３を直接活性化することで知られている最初の低分子であると考える。実行因子カスパーゼの直接的な活性化は新規で価値のある抗癌戦略である。
【００１１】
〔発明の概要〕
[0011]  全体として、本明細書で使用される用語及び語句は、それらの技術的に認識された意味を有しており、当業者に知られている標準教科書、雑誌論文、及び文脈の参照により見つけることができる。
【００１２】
[0012]  以下の略語が適用可能である。ＩＡＰ、アポトーシス抑制因子；ＰＡＣ−１、プロカスパーゼ活性化化合物１；ＰＡＲＰ、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ。
【００１３】
[0013]  本発明は、化合物、治療処置のための方法、化合物をスクリーニングするための方法、並びにプロカスパーゼの修飾因子に関連した処置に対する細胞及び患者適性をスクリーニングするための方法を広く提供する。一実施形態では、修飾因子は、阻害剤又は活性化剤である。一実施形態では、本発明は、プロカスパーゼ−３及びプロカスパーゼ−７の活性化剤に関連した上記化合物及び方法を提供する。一実施形態では、本発明は、当技術分野で知られている、乳房、リンパ腫、副腎、腎臓、黒色腫、白血病、神経芽細胞腫、肺、脳等、様々な癌疾患及び癌細胞型の状況に適用可能である。
【００１４】
[0014]  さらなる概要として、我々は、癌細胞内で不活性形態で過剰発現することが多い酵素を活性化することができる化合物を発見した。化合物は、アップレギュレートされたプロカスパーゼ−３を有する癌細胞を含む癌細胞におけるプログラム細胞死（アポトーシス）を誘導する。癌は増大する大きな課題であり、現在、米国における第１位の死因である。多くの癌は、標準的な化学療法に抵抗する。本発明の化合物は、癌細胞内でアップレギュレートされることがある生物学的標的を利用することができ、したがって、アポトーシス機構に欠陥を有する細胞内でさえ有効であると証明することができる。これらの化合物は、さらに、標的癌治療法においても成功する可能性があり、ここでは、より低レベルのプロカスパーゼ−３を有する非癌性細胞に対して比較的毒性が低下した状態で癌細胞を死滅させる点での選択性の利点がある可能性がある。
【００１５】
[0015]  特定の理論に束縛されるものではないが、本発明の化合物は、アポトーシス又はプログラム細胞死の調節の機構を介して作用して、癌細胞の処置において有効となることが可能であると考えられる。好ましい実施形態では、アポトーシスの調節はアポトーシスの誘導による。他の実施形態では、アポトーシスの調節はアポトーシスの阻害による。
【００１６】
[0016]  一実施形態では、本発明は、癌細胞におけるアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、（ａ）上述の癌細胞のプロカスパーゼ−３分子を修飾することができる化合物を上述の癌細胞に投与することと、（ｂ）アポトーシスを誘導するように上述のプロカスパーゼ−３分子を修飾すること、を含む方法を提供する。一実施形態では、上述の癌細胞は、処置を必要とする患者に存在する。
【００１７】
[0017]  一実施形態では、上述の化合物は下記式ＺＺである。
【化１】
0005513741.tif 000002
式中、ｎ＝１又は２であり、Ｒは、他のＲとは独立して、水素、ハロゲン、アリル又は短鎖アルキルであり、Ｒ２＝水素、短鎖アルキル、エステル、又は生理学的条件下で除去可能な他の部分であり、Ｒ３＝水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリル、アルケニル、アルケノール、アルカノール又はハロアルケニルであり、Ｒ４及びＲ５は、いずれもＮであるか、Ｒ４＝Ｎ及びＲ５＝Ｃであるか、Ｒ４及びＲ５＝Ｃであり、Ａ＝酸素又は硫黄である。一実施形態では、上述の化合物は、式ＺＺ、ＰＡＣ−１及び構造５から成る群より選択される。一実施形態では、上述の化合物はＰＡＣ−１である。
【００１８】
[0018]  一実施形態では、化合物は、式ＺＺを有する化合物から選択され、式中、Ｒ４及びＲ５は共にＮであり、Ａは酸素であり、他の可変基は上記に定義したとおりである。一実施形態では、化合物は、式ＺＺを有する化合物から選択され、式中、Ｒ４及びＲ５は共にＮであり、Ａは酸素であり、Ｒ２は水素であり、他の可変基は上記に定義したとおりである。一実施形態では、化合物は、式ＺＺを有する化合物から選択され、式中、Ｒ４及びＲ５は共にＮであり、Ａは酸素であり、Ｒ２は水素であり、Ｒ３はアリルであり、他の可変基は上記に定義したとおりである。
【００１９】
[0019]  一実施形態では、方法は、癌細胞内のプロカスパーゼ−３又はカスパーゼ−３のパラメーターを評価するステップをさらに含み、上述のパラメーターは、半定量的若しくは定量的な量、機能的な量、又は上述のプロカスパーゼ−３又はカスパーゼ−３の活性レベルの１つ又は複数である。
【００２０】
[0020]  一実施形態では、本発明は、プロカスパーゼ−３分子を修飾することができる化合物を直接、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングするための方法であって、（ａ）試験化合物を提供することと、（ｂ）精製したプロカスパーゼ−３を提供することと、（ｃ）精製したプロカスパーゼ−３に試験化合物を暴露することと、（ｄ）試験化合物への暴露の後でプロカスパーゼ−３活性を測定することと、（ｅ）試験化合物への暴露の際の試験活性を試験化合物への暴露なしでの無修飾活性と比較することにより修飾化合物を同定すること、を含み、それにより、プロカスパーゼ−３分子を修飾することができる化合物をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、方法は、上述の修飾活性又は上述の無修飾活性を基準活性と比較することをさらに含み、上述の基準活性は、構造式ＺＺ又は上記式の化合物のサブセット、ＰＡＣ−１及び構造５から成る群より選択される化合物へのプロカスパーゼ−３の暴露による。
【００２１】
[0021]  一実施形態では、本発明は、プロカスパーゼ−３を活性化することができる化合物のスクリーニングのための方法であって、ａ）プロカスパーゼ−３を提供し、試験化合物、好ましくは低分子を提供することと、ｂ）プロカスパーゼ−３を試験化合物と反応させること（これにより、カスパーゼ−３が生成すると推定される）と、ｃ）カスパーゼ−３活性を測定することと、を含む方法を提供する。特定の実施形態では、カスパーゼ−３活性を測定することに基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡを使用する。特定の実施形態では、測定することに、約４１０ｎｍの波長読み出しパラメーターを使用する。特定の実施形態では、スクリーニングは、多数の試験化合物を使用して並行して実行される。
【００２２】
[0022]  一実施形態では、本発明は、プロカスパーゼ−３のサブユニットの検出を完全長（不活性）プロカスパーゼ−３がカスパーゼ−３に処理されたという指標として使用するスクリーニングの方法を提供する。特定の実施形態では、サブユニットは、タンパク質ゲル移動技術、たとえばウエスタンブロットにより測定される約１９ｋＤの分子量を有している。
【００２３】
[0023]  一実施形態では、本発明は、プロカスパーゼ−３分子を修飾することができる化合物の細胞スクリーニングのための方法であって、（ａ）試験化合物を提供することと、（ｂ）プロカスパーゼ−３を推定上発現する細胞を提供することと、（ｃ）試験化合物に細胞を暴露することと、（ｄ）試験化合物への暴露の後で、１つ又は複数の細胞生存率、アポトーシス指標、及び他のパラメーターを含む細胞パラメーターを測定することと、（ｅ）試験化合物への暴露の際の試験細胞パラメーターを試験化合物への暴露なしでの無修飾細胞パラメーターと比較することにより修飾化合物を同定することと、を含み、それにより、プロカスパーゼ−３分子を修飾することができる化合物をスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、方法は、上述の修飾活性又は上述の無修飾活性を基準活性と比較することをさらに含み、上述の基準活性は、式ＺＺ又は上記式の化合物のサブセット、ＰＡＣ−１及び構造５から成る群より選択される化合物への暴露による。
【００２４】
[0024]  一実施形態では、本発明は、プロカスパーゼ活性化化合物による癌細胞の処置に対する潜在的感受性を同定又は診断するための方法であって、（ａ）上述の癌細胞内のプロカスパーゼパラメーターを評価することと、（ｂ）上述のパラメーターによりプロカスパーゼの活性化に対する感受性が上昇したかどうかを判定すること、を含む方法を提供する。一実施形態では、上述のプロカスパーゼパラメーターはプロカスパーゼ−３レベルであり、上述のプロカスパーゼはプロカスパーゼ−３である。一実施形態では、上述のプロカスパーゼパラメーターはプロカスパーゼ−７レベルであり、上述のプロカスパーゼはプロカスパーゼ−７である。レベルは、半定量的若しくは定量的な量、又は機能的な量（たとえば活性ベースの量、たとえば規格単位又は国際単位）とすることができる。
【００２５】
[0025]  一実施形態では、本発明は、癌細胞を処置するための方法であって、（ａ）プロカスパーゼ活性化化合物による癌細胞の処置に対する潜在的感受性を同定することと、（ｂ）有効な量のプロカスパーゼ活性化化合物に上述の癌細胞を暴露すること、を含む方法を提供する。一実施形態では、プロカスパーゼ活性化化合物は、式ＺＺ又は上記式の化合物のサブセット、ＰＡＣ−１及び構造５から成る群より選択される。一実施形態では、上述のプロカスパーゼ活性化化合物は、プロカスパーゼ−３、プロカスパーゼ−７、又はプロカスパーゼ−３及びプロカスパーゼ−７の両方を活性化することができる請求項１６に記載の方法。
【００２６】
[0026]  一実施形態では、本発明は、スキーム１のステップを含む、ＰＡＣ−１を合成するための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、適切な変更を有するスキーム１のステップを含む、化合物５を合成するための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書で開示されており、当技術分野で理解されるであろう式ＺＺの化合物を合成するための方法を提供する。
【００２７】
[0027]  一実施形態では、本発明は、下記式ＺＺの化合物を提供する。
【化２】
0005513741.tif 000003
式中、ｎ＝１又は２であり、Ｒは、他のＲとは独立して、水素、ハロゲン、アリル又は短鎖アルキルであり、Ｒ２＝水素、短鎖アルキル、エステル、又は生理学的条件下で除去可能な他の部分であり、Ｒ３＝水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリル、アルケニル、アルケノール、アルカノール又はハロアルケニルであり、Ｒ４及びＲ５は、いずれもＮであるか、Ｒ４＝Ｎ及びＲ５＝Ｃであるか、Ｒ４及びＲ５＝Ｃであり、Ａ＝酸素又は硫黄である。
【００２８】
[0028]  一実施形態では、本発明は、構造が
【化３】
0005513741.tif 000004
であるＰＡＣ−１を除く、式ＺＺの化合物を提供する。
【００２９】
[0029]  一実施形態では、本発明は、構造５の化合物を提供する。構造は次のとおりである。
【化４】
0005513741.tif 000005
【００３０】
[0030]  一実施形態では、本発明の組成物は化学療法剤である。
【００３１】
[0031]  一実施形態では、本発明は、開示された構造式の好ましくは約１０ｎＭ〜約１００μＭの有効濃度を伴う化合物及び方法を提供する。他の好ましい実施形態では、有効な濃度は約２００ｎＭ〜約５μＭである。一実施形態では、有効な濃度は、直接的なプロカスパーゼ活性化アッセイ、細胞アポトーシス誘導アッセイ、又は動物の臨床的治療評価での５０％活性濃度等の値であると考えられる。好ましい実施形態では、上記値は、約２００μＭ未満である。好ましい実施形態では、上記値は約１０μＭ未満である。
【００３２】
[0032]  本発明の化合物及び本発明の方法において有用な化合物は、開示された式の化合物、並びに好ましくは薬学的に許容し得る塩及びエステルを含む、それらの化合物の塩及びエステルを含む。
【００３３】
[0033]  一実施形態では、本発明は、組成物のプロドラッグ形態を提供する。本発明の化合物のプロドラッグは本発明の方法において有用である。生体内で変換され、本発明の化合物の生物学的、薬学的、又は治療的な活性形態をもたらすであろういかなる化合物もプロドラッグである。プロドラッグの様々な例及び形態が当技術分野でよく知られている。前駆体タンパク質、前駆体核酸等の生体分子をプロドラッグとすることができる。プロドラッグの例は、Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４２，ｐｐ．３０９−３９６，Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８５）、Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｋｒｏｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ及びＨ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編，Ｃｈａｐｔｅｒ  ５，「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編，ｐｐ．１１３−１９１，１９９１）、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．８，ｐ．１−３８（１９９２），Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．２８５（１９８８）、並びにＮｏｇｒａｄｙ（１９８５）Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ３８８−３９２）にとりわけ見つけられる。
【００３４】
[0034]  置換基のグループが本明細書で開示される場合、グループのメンバーのいかなる異性体及び鏡像異性体をも含む、そのグループ及びすべてのサブグループの個々のメンバーがすべて、個別に開示されることが理解される。マーカッシュグループ又は他のグループ分けが本明細書で使用される場合、グループ並びにグループのすべての組み合わせ及び下位組み合わせの可能性がある個々のメンバーがすべて、本開示に個々に含まれることが意図される。明細書で提供された任意のマーカッシュグループ又は一覧の任意の１つ又は複数のメンバーは、所望により、本発明から除外することができることが意図される。化合物が、化合物の特定の異性体又は鏡像異性体が、たとえば式又は化学名で明記されないように本明細書で記載される場合、その記載は、個々に又は任意の組み合わせで記載された化合物のそれぞれの異性体及び鏡像異性体を含むことが意図される。さらに、特に明記されていない限り、本明細書で開示された化合物の同位体の変形形態はすべて、本開示により包含されることが意図される。たとえば、開示された分子内の任意の１つ又は複数の水素が重水素又は三重水素で置換することができることが理解されるであろう。分子の同位体の変形形態は、分子のアッセイ並びに分子又はその使用に関連する化学的研究及び生物学的研究で標準物質として一般に有用である。化合物の特定の名称は、当業者が、同一の化合物をさまざまに称することができることが知られているように、例示的であることが意図される。
【００３５】
[0035]  本明細書で開示された分子は１つ又は複数のイオン化できるグループ［プロトンを除去する（たとえば−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、等）若しくは加える（たとえばアミン）ことができる又は四級化することができる（たとえばアミン）グループ］を含んでいてもよい。可能な上記分子のイオン形態及びそれらの塩はすべて、本明細書中の本開示に個々に含まれることが意図される。本明細書中の化合物の塩に関して、当業者は、種々様々の利用可能な対イオンの中から、所定の用途に対する本発明の塩の調製に適切な対イオンを選択することができる。たとえば、一般に、任意のアニオンが、本明細書中の化合物の塩、たとえば、ハロゲン化物、硫酸塩、カルボン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、硝酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グリコール酸塩、ピルビン酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、等の形成に使用することができる。
【００３６】
[0036]  本発明の化合物及びそれらの塩又はエステルは、それらの互変異性形態で存在してもよく、水素原子は、分子の他の部分に転位され、分子の原子間の化学結合は結果的に再配列される。互変異性形態はすべて、存在することがある限り、本発明の範囲内に含まれることが理解されるべきである。さらに、化合物は、トランス異性体及びシス異性体を有していてもよく、１つ又は複数のキラル中心を含み、したがって、鏡像異性体形態及びジアステレオマー形態で存在してもよい。本発明は、特に本明細書で述べられていない限り、上記すべての異性体及び個々の鏡像異性体と同様にシス異性体及びトランス異性体の混合物、ジアステレオマーの混合物、鏡像異性体（光学異性体）の非ラセミ混合物及びラセミ混合物、並びに１つ又は複数の形態について豊富な前述の混合物を包含することができる。化合物の（又は不斉炭素の）配置（シス若しくはトランス又はＲ若しくはＳ）について特定の言及がなされていない場合、そのとき、任意の１つの異性体又は１つを超える異性体の混合物が意図される。調製のプロセスは、ラセミ化合物、鏡像異性体、又はジアステレオマーを出発物質として使用することができる。鏡像異性体又はジアステレオマーの生成物が調製される場合、それらは、従来の方法により、たとえばクロマトグラフィー又は分別結晶により分離することができる。発明の化合物は、遊離形態又は水和物形態であってもよい。
【００３７】
[0037]  本明細書中に記載された又は例示された成分のすべての処方又は組み合わせは、特に述べられていない限り、本発明を実行するために使用することができる。
【００３８】
[0038]  範囲、たとえば温度範囲、時間範囲、組成範囲、又は濃度範囲が本出願中に記載されるときには必ず、すべて中間範囲及び部分範囲並びに所定の範囲に含まれるすべての個々の値が本開示に含まれることが意図される。
【００３９】
[0039]  本明細書中に開示された任意の参考文献中の情報は、場合により、たとえば、特許文献についてのそれらの有効出願日時点での技術水準を示すことができ、上記情報は、必要であれば、実際に先行技術にあると認められる特定の実施形態を除外するために本明細書中で使用することができることが意図される。たとえば、化合物が、開示及び／又は特許請求される場合、実施可能な程度の開示が参考文献中に提供されている化合物を含む、本発明に関して先行技術としてみなされている化合物は、本出願中の物質の請求項の組成物に含まれることが意図されないことが理解されるべきである。
【００４０】
[0040]  本明細書中で提供されるいくつかの参考文献は、出発物質、補足的な出発物質、補足的な試薬、補足的な合成の方法、補足的な分析の方法、及び補足的な本発明の使用についての情報源に関する細部を提供するように参照により援用される。具体的に例示されたもの以外の出発物質、試薬、固体基質、合成方法、精製方法、及び分析方法は、当技術分野の知識に基づき、過度の実験に頼ることなく、本発明の実行に使用することができることを当業者は十分に理解するであろう。
【００４１】
[0041]  一実施形態では、本発明は、１つ又は複数の化合物及び各化合物について薬学的に許容し得るそれらの塩又はエステルを含み、化合物は、所望される治療上の有益性を得るために有効な量又は総量で組成物中に存在する治療用組成物を提供する。本発明の治療用組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容し得る成分、たとえば、当技術分野で知られている担体及び賦形剤を任意選択でさらに含む。
【００４２】
[0042]  一実施形態では、本発明は、下記式ＺＺ２を有する化合物を提供する。
【化５】
0005513741.tif 000006
式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アリル、ハロアルキル、アルケニル、アルケノール、アルカノール又はハロアルケニルである。一実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、独立して、水素、ハロゲン、アリル又は短鎖アルキルである。
【００４３】
[0043]  一実施形態では、本発明は、アルデヒド化合物と結合したヒドラジド化合物を含むＰＡＣ−１誘導体コンビナトリアルライブラリーから成る群より選択される化合物を提供する。一実施形態では、ヒドラジド化合物は、本明細書中に記載されたＡＸ化合物から生成されたヒドラジドから成る群より選択される。
【００４４】
[0044]  一実施形態では、アルデヒド化合物は、本明細書中に記載されたＢＸ化合物から成る群より選択される。一実施形態では、ヒドラジド化合物は、本明細書中に記載されたＡＸ化合物から成る群より選択され、アルデヒド化合物は、本明細書中に記載されたＢＸ化合物から成る群より選択される。
【００４５】
[0045]  一実施形態では、本発明は、ＰＡＣ−１誘導体化合物を合成するための方法であって、ヒドラジド化合物を提供することと、アルデヒド化合物を提供することと、ヒドラジド化合物をアルデヒド化合物と反応させることと、を含み、それにより、ＰＡＣ−１誘導体化合物を合成する方法を提供する。
【００４６】
[0046]  一実施形態では、ヒドラジド化合物は下記式ＺＺ３を有する。
【化６】
0005513741.tif 000007
【００４７】
[0047]  一実施形態では、アルデヒド化合物は下記式ＺＺ４を有する。
【化７】
0005513741.tif 000008
【００４８】
[0048]  一実施形態では、ヒドラジド化合物は式ＺＺ３を有し、アルデヒド化合物は式ＺＺ４を有する。
【００４９】
[0049]  一実施形態では、本発明は、Ｌ０１Ｒ０６、Ｌ０２Ｒ０３、Ｌ０２Ｒ０６、Ｌ０８Ｒ０６、Ｌ０９Ｒ０３、Ｌ０９Ｒ０６及びＬ０９Ｒ０８から成る群より選択される化合物を提供する。
【００５０】
[0050]  一実施形態では、本発明は、癌患者の候補者を、候補者においてプロカスパーゼレベルの上昇を同定することによりプロカスパーゼ活性化剤による可能な処置についてスクリーニングするための方法であって、候補者からの細胞又は組織の試験サンプルを得ることと、試験サンプル中のプロカスパーゼレベルを評価することと、プロカスパーゼレベルは基準レベルに比べて試験サンプル中で上昇したかどうかを判定することと、を含み、それにより、癌患者の候補者をプロカスパーゼ活性化剤による可能な処置についてスクリーニングする方法を提供する。一実施形態では、プロカスパーゼは、プロカスパーゼ−２、プロカスパーゼ−３、プロカスパーゼ−６、プロカスパーゼ−７、プロカスパーゼ−８及びプロカスパーゼ−９から成る群より選択される。特定の実施形態では、プロカスパーゼはプロカスパーゼ−３である。
【００５１】
[0051]  一実施形態では、試験サンプルの上昇レベルは、基準レベルを超えた少なくとも約２倍である。一実施形態では、試験サンプルの上昇レベルは、基準レベルを超えた少なくとも約４倍である。一実施形態では、基準レベルは、同一患者からの第２の試験サンプルからのものである。一実施形態では、基準レベルは、正常細胞又は正常組織のサンプルからのものである。基準レベルは、癌細胞株、正常細胞株等の細胞株からのものとすることができる。一実施形態では、基準レベルは絶対閾値の量である。細胞当たりの分子数を含むプロカスパーゼのレベルについての様々な量を記載しているＳｖｉｎｇｅｎ，Ｐ．Ａ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：６８０７−６８２０を参照のこと。
【００５２】
[0052]  一実施形態では、本発明は、上述の癌細胞中のプロカスパーゼ分子を活性化することができる化合物を上述の癌細胞に投与することを含む、癌細胞における死を誘導するための方法を提供する。一実施形態では、プロカスパーゼは、１つ又は複数のプロカスパーゼ−３及びプロカスパーゼ−７である。好ましい実施形態では、プロカスパーゼはプロカスパーゼ３である。一実施形態では、化合物は構造式ＺＺを有する。一実施形態では、化合物は構造式ＺＺ２を有する。
【００５３】
[0053]  本明細書で考えられた又は開示されたいかなる機構的な説明又は仮説についての最終的な正確さに関係なく、本発明の一実施形態は、それでもなお、効果があり、有用である可能性があると認識される。
【００５４】
〔発明の詳細な説明〕
[0069]  以下の定義は、本発明の文脈中でのそれらの特定の用法を明確にするために提供される。
【００５５】
[0070]  用語「化学療法剤」は、本明細書中で使用される場合、癌細胞、癌細胞の集団、腫瘍、又は他の悪性組織の成長、増殖、又は拡散を低下又は阻止することができる任意の物質を指す。用語はまた、任意の抗腫瘍剤又は抗癌剤を包含することも意図される。
【００５６】
[0071]  用語「有効な量」は、本明細書中で使用される場合、薬学的に有効な量、治療的に有効な量、等の文脈を包含することが意図される。たとえば、実施形態ではこの量は、有利な状態、有利な結果、スクリーニングアッセイにおける機能的な活性、又は臨床症状の改善を達成することができる。
【００５７】
[0072]  用語「癌細胞」は、本明細書中で使用される場合、当技術分野で広く理解されている定義を包含することが意図される。一実施形態では、この用語は、ヒト又は動物における癌の臨床症状の一因となる可能性がある異常に制御された細胞を指す。一実施形態では、この用語は、培養された細胞株或いはヒト若しくは動物の体内の又はヒト若しくは動物に由来する細胞を指すことができる。癌細胞は、当技術分野で理解されているように、種々様々な分化した細胞型、組織型、又は器官型になる可能性がある。
【００５８】
[0073]  用語「アルキル」は、好ましくは１〜２２個の炭素原子を有するモノラジカルの分枝又は非分枝の飽和炭化水素鎖、及び３〜２２個の炭素原子を有する１つ又は複数の環を有するシクロアルキル基を指す。短鎖アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基及びヘキシル基を含む、１〜６個の炭素原子を有する基であり、それらのすべての異性体を含む。長鎖アルキル基は、８〜２２個の炭素原子を有する基、好ましくは、１２〜２２個の炭素原子を有する基、１２〜２０個の炭素原子を有する基、及び１６〜１８個の炭素原子を有する基である。
【００５９】
[0074]  用語「シクロアルキル」は、単環式環又は多縮合環を有する、３〜２２個の炭素原子の環式のアルキル基を指す。シクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル等の単環状構造、又はアダマンタニル等の多環状構造を含む。
【００６０】
[0075]  用語「アルケニル」は、好ましくは２〜２２個の炭素原子を有する分枝又は非分枝の不飽和炭化水素基のモノラジカル、及び３〜２２個の炭素原子を有する１つ又は複数の環を有するシクロアルケニル基であって、少なくとも１つの環は二重結合を含むシクロアルケニル基を指す。アルケニル基は、共役していてもよい１つ又は複数の二重結合（Ｃ＝Ｃ）を含んでいてもよい。好ましいアルケニル基は、１つ又は２つの二重結合を有する基である。短鎖アルケニル基は、エチレン（ビニル）プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基及びヘキシレン基を含み、それらのすべての異性体を含む２〜６個の炭素原子を有する基である。長鎖アルケニル基は、８〜２２個の炭素原子を有する基、好ましくは、１２〜２２個の炭素原子を有する基、１２〜２０個の炭素原子を有する基、及び１６〜１８個の炭素原子を有する基である。用語「シクロアルケニル」は、少なくとも１つの環が二重結合（Ｃ＝Ｃ）を含む単環式環又は多縮合環を有する３〜２２個の炭素原子の環式のアルケニル基を指す。シクロアルケニル基は、例として、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロオクテニル、シクロオクタジエニル、シクロオクタトリエニル等の単環状構造を含む。
【００６１】
[0076]  用語「アルキニル」は、好ましくは２〜２２個の炭素原子を有し、１つ又は複数の三重結合（Ｃ□Ｃ）を有する不飽和炭化水素のモノラジカルを指す。アルキニル基は、エチニル、プロパルギル等を含む。短鎖アルキニル基は、２〜６個の炭素原子を有する基であり、それらの異性体をすべて含む。長鎖アルキニル基は、８〜２２個の炭素原子を有する基、好ましくは、１２〜２２個の炭素原子を有する基、１２〜２０個の炭素原子を有する基、及び１６〜１８個の炭素原子を有する基である。
【００６２】
[0077]  用語「アリール」は、単環（たとえばフェニル）、１つ又は複数の環（たとえばビフェニル）、又は多縮合（融合）環を有する６〜２２個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を含む基であって、少なくとも１つの環は芳香族である（たとえば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル（ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｙｌ）、フルオレニル、又はアントリル）基を指す。アリールは、フェニル、ナフチル等を含む。アリール基は、不飽和の芳香環（複数可）に加えて、アルキル、アルケニル又はアキニルである部分を含んでいてもよい。用語「アルカリル」は、アルキル部分、つまり、−アルキレン−アリール、及び−置換されたアルキレン−アリール、を含むアリール基を指す。上記アルカリル基は、ベンジル、フェネチル等により例示される。
【００６３】
[0078]  本明細書中に記載されるように、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基及びアリール基は任意選択で置換され（用語（複数可）は置換された変形形態を含むことができる）、基中の炭素原子数及び基の不飽和度に依存した１〜８個の非水素置換基を含んでいてもよい。
【００６４】
[0079]  用語「アルキレン」は、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個、より好ましくは２〜４個の炭素原子を有する分枝又は非分枝の飽和炭化水素鎖のジラジカルのことを言い、この用語は、置換された変形形態を含むことができる。この用語は、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、より概略的には−（ＣＨ２）ｎ−［式中、ｎは１〜１０、より好ましくは１〜６、又は２、３若しくは４である］、等の基により例示される。アルキレン基は分枝していてもよい。アルキレン基は任意選択で置換されてもよい。アルキレン基は、炭素原子当たり２つまでの非水素置換基を有していてもよい。好ましい置換されたアルキレン基は１つ、２つ、３つ又は４つの非水素置換基を有している。
【００６５】
[0080]  用語「アリーレン」は、上記に定義されるアリール（置換されたアリールを含む）に由来するジラジカルのことを言い、１，２−フェニレン、１，３−フェニレン、１，４−フェニレン、１，２−ナフチレン等により例示される。
【００６６】
[0081]  用語「アミノ」は、基−ＮＨ２又は基−ＮＲＲを指し、式中、両方のＲが水素ではないとすれば、各Ｒは、水素、アルキル、置換されたアルキル、シクロアルキル、置換されたシクロアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、シクロアルケニル、置換されたシクロアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、ヘテロアリール、及び複素環から成る基から独立して選択される。
【００６７】
[0082]  本明細書中に論じられるように、アルキル基は任意選択で置換され、アルキル基の大きさに依存して、好ましくは１〜１０個の置換基を有していてもよい。置換されたアルキル基は、１〜８個の置換基、１〜５個の置換基、１〜３個の置換基及び１個若しくは２個の置換基を伴う基を含む。
【００６８】
[0083]  「ハロアルキル」は、同じ又は異なっていてもよい、本明細書中に定義される１つ又は複数のハロ基により置換された、本明細書中に定義されるアルキルを指す。代表的なハロアルキル基は、例として、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチル等を含む。
【００６９】
[0084]  用語「ヘテロアリール」は、少なくとも１つの環内に酸素、窒素、及び硫黄から選択される１〜４個のヘテロ原子を有する（環が１個を超える場合）、２〜２２個の炭素原子の芳香族基を指す。ヘテロアリール基は任意選択で置換されてもよい。
【００７０】
[0085]  用語「ヘテロ環」又は「複素環」は、単環又は多縮合環、２〜２２個の炭素原子、並びに少なくとも１つの環内における窒素、硫黄、リン及び／又は酸素から選択される１〜６個、好ましくは１〜４個のヘテロ原子、を有するモノラジカルの飽和基又は不飽和基を指す。複素環基は置換されてもよい。
【００７１】
[0086]  用語「エステル」は、当技術分野で理解されている化学物質のことを言い、特に形態（ＲＣＯ−）の基を含むことができる。
【００７２】
[0087]  １つ又は複数の置換基を含む上記基のいずれに関しても、上記基は、立体的に非実用的である及び／又は合成的に実現不可能であるいかなる置換又は置換パターンも含まないことが理解される。本発明の化合物は、開示された化合物の置換から生じる新規な立体化学的異性体をすべて含む。
【実施例】
【００７３】
[0088]  本発明は、以下の非限定的な実施例によりさらに理解されるであろう。
【００７４】
〔実施例１：プロカスパーゼ活性化化合物〕
[0089]  アポトーシスカスケードにおけるタンパク質の変異又は異常発現はよくある癌の特徴である。これらの変化は、アポトーシス促進シグナルが実行因子カスパーゼに伝達されるのを阻止し、したがってアポトーシス細胞死を阻止し細胞増殖が許可される可能性がある。カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７は重要な実行因子カスパーゼであり、上流のシグナルにより活性化される不活性な酵素前駆体として存在する。重要なことには、プロカスパーゼ−３の発現レベルは、ある種の癌性細胞内では、非癌性対照に比べて著しく高度である。本明細書で、我々は、プロカスパーゼ−３を活性カスパーゼ−３に直接活性化する低分子の同定について報告する。特定の化合物であるＰＡＣ−１は、約２２０ナノモル濃度の桁でＥＣ５０のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性化を引き起こし、多数の癌性細胞株におけるアポトーシスを誘導する。
【００７５】
[0090]  多くの知られている抗癌薬とは対照的に、ＰＡＣ−１で処置した細胞はプロカスパーゼ−３の即時活性化を示し、ＰＡＣ−１の毒性は、細胞中に含まれるプロカスパーゼ−３の量に正比例することが示される。したがって、ＰＡＣ−１は、生体内で、プロカスパーゼ−３をカスパーゼ−３に直接活性化し、欠陥のあるアポトーシス機構を有する細胞においてでさえこの化合物がアポトーシスを誘導することを可能にする。ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３を直接活性化することで知られている最初の低分子であり、実行因子カスパーゼの直接的な活性化は、プロカスパーゼ−３がアップレギュレートされる多くの癌を含む様々な癌において有利であると証明することが可能である新規な抗癌戦略である。
【００７６】
[0091]  約２０，０００種の構造的に多様な低分子の集合体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのプロカスパーゼ−３を活性化する能力に対してスクリーニングした。プロカスパーゼ−３を大腸菌中で発現させ、精製した（Ｒｏｙら，２００１）。プロカスパーゼ−３（５０ｎｇ／ｍＬの濃度）を３８４ウェルプレートのウェルに加え、化合物を約４０μＭの最終濃度まで加えた。次いで、各プレートを３７℃で２時間インキュベートし、その後、カスパーゼ−３ペプチド基質Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮａ）を２００μＭの濃度まで加えた。２時間にわたりｐ−ニトロアニリン発色団の形成を４０５ｎｍで追跡した。
【００７７】
[0092]  評価した化合物のうち、４種が、バックグラウンドに対してカスパーゼ−３ペプチド基質の加水分解の著しい増加を誘導した。それらの４種のうち、１種は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのプロカスパーゼ−３活性化に対する強い用量依存効果を示した。図１Ａに示すように、この最初のプロカスパーゼ活性化化合物（ＰＡＣ−１）は、０．２２μＭの濃度で、プロカスパーゼ−３の最大活性化の２分の１をもたらす。この化合物は、完全に活性化されたカスパーゼ−３酵素の触媒活性に対する効果を有していないので、カスパーゼ−３自体の活性を単に上昇させているのではない（図１Ａ）。
【００７８】
[0093]  プロカスパーゼ−３はＮ末端プロドメイン（１〜２８残基）、それに続く、サブユニット間のリンカーにより分けられた大サブユニット（１７ｋＤａ）及び小サブユニット（１２ｋＤａ）を有している（Ｐｏｐら，２００３）。生体内では、２つのプロカスパーゼ−３モノマーが集合して、サブユニット間のリンカー中のＤ１７５での切断により活性化することができる触媒的に不活性なホモダイマーを形成する。プロドメインの明確な役割は不明であり、最高の触媒活性には、サブユニット間の領域の切断のみで十分であることが示された（Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ，Ｈ．Ｒ．ら，１９９８）。プロカスパーゼ−３は触媒的に有能であるが、１２個のアミノ酸の安全装置の存在により自己活性化に対して高度に抵抗性がある。しかしながら、安全装置が変異すると、プロカスパーゼ−３の著しい自己活性化が観察される（Ｒｏｙら，２００１）。この重要な調節領域と、又は他の部位と相互に作用する化合物は、プロカスパーゼ−３の自己活性化を可能にすることができる。
【００７９】
[0094]  プロカスパーゼ−３の自己活性化を触媒するＰＡＣ−１の能力を直接評価するために、プロカスパーゼ−３タンパク質を１００μＭ  ＰＡＣ−１と共に１〜５時間インキュベートした。図１Ｂでウエスタンブロットにより示すように、ＰＡＣ−１は、時間依存的にプロカスパーゼ−３の切断を誘導し、４時間後に＞５０％の処理が観察された。対照的に、緩衝液中でインキュベートしたプロカスパーゼ−３は、同一の時間にわたり事実上自己活性化を示さない。ＰＡＣ−１が相互に作用しているプロカスパーゼ−３の領域を正確に示すための試みでは、安全装置領域中の重要なアスパラギン酸の三つ組である残基Ａｓｐ１７９、Ａｓｐ１８０、及びＡｓｐ１８１においてアラニン置換を行った。これらの部位での変異はすべて、プロカスパーゼ−３を活性化するＰＡＣ−１の能力を劇的に低下させ、ある種の変異はＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−３の活性化に対してより有害であった（図２Ａ）。
【００８０】
[0095]  カスパーゼ−３と同様に、カスパーゼ−７もまた、タンパク質分解により活性化される不活性な酵素前駆体として存在する。カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７は共に実行因子カスパーゼであり、重要な配列及び構造上の相同性を有している（Ｄｅｎａｕｌｔ，Ｊ．−Ｂら，２００３）。プロカスパーゼ−７はまた、重要な三つ組中に３つのアスパラギン酸の代わりに２つのアスパラギン酸（Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ）しか有していないが、類似する安全装置領域を有するかもしれない。図２Ｂ中のデータにより示すように、ＰＡＣ−１はまた、プロカスパーゼ−３のその活性化よりも効果が低いが、プロカスパーゼ−７を活性化することもできる（ＥＣ５０はプロカスパーゼ−３活性化の０．２２μＭに対して４．５μＭ）。ＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−７活性化の効力は、プロカスパーゼ−３のＡｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ変異体に対するその効果に類似している（ＥＣ５０＝２．７７μＭ）。ＰＡＣ−１の効果は、プロカスパーゼ−３が急速な自己活性化を起こす低ｐＨ値で無効にされる（図２Ｃ）。
【００８１】
[0096]  プロカスパーゼ−３を活性化してヒト細胞株におけるアポトーシスを誘導する低分子の能力について試験し、ＰＡＣ−１は、様々な癌細胞株におけるアポトーシスを誘導することがわかった。ＨＬ−６０細胞ではＰＡＣ−１の添加は、著しいクロマチン凝縮を伴う細胞膜上への多量のホスファチジルセリンの露出につながる（図３Ａ及びＢ）。さらに、化合物は、ＰＡＲＰ−１の切断を誘導し（生体内でのＰＡＲＰ活性アッセイによる評価；Ｐｕｔｔ  ＫＳら，２００５）、ミトコンドリア膜脱分極を引き起こす（以下参照）。著しい細胞の小疱形成も顕微鏡検査により観察された。さらに、ＰＡＣ−１の毒性は、カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ存在下で無効にすることができるかもしれない（データ掲載せず；Ｓｌｅｅら，１９９６参照）。
【００８２】
[0097]  ＰＡＣ−１がプロカスパーゼ−３の直接的な活性化を介してアポトーシスを実際に誘導している場合、アポトーシス現象の時間的経過が、標準的なアポトーシス促進剤を用いて観察されるものに比べて変化するはずである。エトポシドは、内因性の経路を介してアポトーシスを誘導することでよく知られており、したがって、エトポシド処置細胞において、ミトコンドリア膜脱分極の後、プロカスパーゼ−３が活性化される。実際に、１０μＭエトポシドで処置したＨＬ−６０細胞では、ミトコンドリア膜脱分極が観察された後、カスパーゼ−３様活性が検出される（図４Ａ）。対照的に、ＰＡＣ−１での細胞の処置は著しく異なる結果をもたらす。ＰＡＣ−１では、最初に観察されたアポトーシスの生化学的特徴はカスパーゼ−３様酵素活性である。この活性は、化合物添加の数分以内に認められ、５０％の活性化が、２時間余りで、いかなる著しいミトコンドリア膜脱分極の十分前に起こる（図４Ｂ）。さらに、ＰＡＲＰ活性は、ＰＡＣ−１で処置した細胞では急速に低下するが、この低下は、エトポシド処置細胞ではより遅い時点で観察される（図４Ｃ）。対照実験は、ＰＡＣ−１がＰＡＲＰ−１の酵素活性を直接抑制しないことを示す。アポトーシス現象の典型的な順序では、ミトコンドリア膜が脱分極し、カスパーゼが活性化され、カスパーゼ基質（ＰＡＲＰ−１等）が切断される。ＰＡＣ−１で処置した細胞が、カスパーゼ−３／−７の急速な活性化（ミトコンドリア膜脱分極前）及びカスパーゼ基質の急速な切断を示すといった観察は、この化合物が、プロカスパーゼ−３の直接的な活性化を介したその細胞毒性を発揮することを示す。
【００８３】
[0098]  さらにＰＡＣ−１の効力を明示するために、様々なレベルのプロカスパーゼ−３を有する癌細胞株における細胞死を誘導するこの化合物の能力を評価した。決定は、多数の癌細胞株（白血病、リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、乳癌、肺癌、及び腎臓癌）及び健常なドナーの骨髄から単離した白血球中に存在するプロカスパーゼ−３の量に関して行った。細胞死誘導に対するＩＣ５０値はこれらの細胞株におけるＰＡＣ−１に関して得られた。組み合わせたデータは、プロカスパーゼ−３の細胞内濃度及びＰＡＣ−１に対する感受性の間に強い相関を示す（図４Ｄ）。特に、健常なヒトドナーの骨髄に由来する白血球は、最低量のプロカスパーゼ−３を有するものに含まれ、ＰＡＣ−１は、これらの細胞に対して比較的低毒性である。ＰＡＣ−１は、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２６に対して最も効力があり、０．３５μＭのＩＣ５０である。文献（Ｓｖｉｎｇｅｎら，２００４）のデータに一致して、我々は、この細胞株が、非癌性対照のプロカスパーゼ−３の濃度の５倍を超える濃度を有することがわかった。
【００８４】
[0099]  ＰＡＣ−１を用いたこれらの実験とは対照的に、エトポシドは、細胞培養中の効力及びプロカスパーゼ−３の細胞内レベルの間の上記相関を示さなかった。たとえば、エトポシドは黒色腫細胞株のうちの３種（ＵＡＣＣ−６２、ＣＲＬ−１８７２、及びＢ１６−Ｆ１０）、乳癌細胞株（Ｈｓ  ５７８ｔ）、及び肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２２６）での死の誘導において効果がなく（ＩＣ５０＞５０μＭ）、これらの細胞株は、１．０、２．４、１．９、３．７、及び５．３のプロカスパーゼ−３レベルをそれぞれ有している。エトポシドは、４．３、４．０、４．７、及び４．４のプロカスパーゼ−３レベルをそれぞれ有するＨＬ−６０、Ｕ−９３７、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、及びＰＣ−１２に対して有効であった（ＩＣ５０＜１μＭ）。したがって、全体として、プロカスパーゼ−３レベルとエトポシドについてのＩＣ５０の間に相関はない。
【００８５】
[00100]  癌性細胞は、通常、アポトーシスカスケードにおける種々様々なタンパク質の変異又は異常発現によりアポトーシス促進シグナルに対する感受性が低下している。そのため、癌の多くの型は、周知のように、アポトーシス細胞死に対する内在性シグナルだけでなく類似した機構を介して作用する化学療法剤にも抵抗性がある。ある種の癌におけるプロカスパーゼ−３発現レベルの奇異なアップレギュレーションは、この存在するタンパク質の細胞内プールを使用する機会を提供して、アポトーシスを直接誘導し、それにより、機能しない又は損なわれることが多いカスケードの上流の部分を回避する。プロカスパーゼ−３は、自己活性化を起こすことが相対的にできないことが周知であるが、それは、不活性状態に自身を維持するための１２個のアミノ酸の安全装置に依存している。ＰＡＣ−１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、プロカスパーゼ−３の自己活性化を誘導し、この活性化は、安全装置の重要なトリ−アスパラギン酸領域の変異により著しく減少する。このデータは、ＰＡＣ−１が、プロカスパーゼ−３の休止状態を維持するための安全装置の能力を直接妨害するという見解と一致している。
【００８６】
[00101]  細胞培養中、ＰＡＣ−１処置は、急速なカスパーゼ−３様活性を誘導する。次いで、抗アポトーシスタンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ等）のカスパーゼ−３媒介性の切断は、ミトコンドリア膜の脱分極を誘導し、アポトーシスを増強すると思われる。さらに、様々な癌細胞株に対するＰＡＣ−１の効力は細胞中のプロカスパーゼ−３の濃度に正比例する。ＰＡＣ−１が有効ないくつかの細胞株は、アポトーシスに対して抵抗性にする欠陥のあるアポトーシス経路を有していることに注目する価値がある。たとえば、Ａｐａｆ−１発現はＳＫ−ＭＥＬ−５細胞中で劇的に減少し、Ｂｃｌ−２は、ＮＣＩ−Ｈ２２６肺癌細胞株中で過剰発現する。
【００８７】
[00102]  本明細書中に提示したデータは、プロカスパーゼ−３活性化化合物が一般的な癌に対して非常に有効となる可能性があるという見解を十分に支持する。有効性は、プロカスパーゼ−３レベルが異常に高度な状態に対して高めることができる。
【００８８】
[00103]  癌生検材料のプロカスパーゼ−３レベルの評価は単純で迅速にすることができる。そのため、ＰＡＣ−１等の化合物の考えられる有効性は、高度な精度で推測的に評価することができる。したがって、本明細書中のプロカスパーゼ−３活性化剤及び方法は、抗癌処置の分野で、一般的な細胞毒素に頼る治療法に優先される可能性があるオーダーメイド医療戦略を提供する。
【００８９】
材料及び方法：
[00104]  材料：Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂及び抗Ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗体はＱｉａｇｅｎ社（バレンシア、ＣＡ）から購入した。ブラッドフォード染料はＢｉｏ−Ｒａｄ社（ハーキュリーズ、ＣＡ）から購入した。ピン移動装置はＶ＆Ｐ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。試薬ｚ−ｖａｄ−ｆｍｋはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（サンディエゴ、ＣＡ）から購入した。大腸菌ＲｏｓｅｔｔａはＮｏｖａｇｅｎ社（マディソン、ＷＩ）から購入した。抗カスパーゼ−３抗体はＳｉｇｍａ社（セントルイス、ＭＯ）から購入した。アネキシンＶ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８複合体、ＪＣ−９、及びヨウ化プロピジウムはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（ユージーン、ＯＲ）から購入した。ＩＰＴＧ及びＭＴＳ／ＰＭＳ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６細胞増殖アッセイ試薬はＰｒｏｍｅｇａ社（マディソン、ＷＩ）から購入した。ウシ胎児血清はＢｉｏｍｅｄａ社（フォスターシティ、ＣＡ）から購入した。９６及び３８４ウェルマイクロタイタープレート、顕微鏡用スライドガラス、顕微鏡用カバーガラス、ウマ血清、並びに他のすべての試薬はＦｉｓｈｅｒ社（シカゴ、ＩＬ）から購入した。
【００９０】
[00105]  方法：細胞培養条件。Ｕ−９３７細胞、ＨＬ−６０細胞、ＣＲＬ−１８７２細胞、ＡＣＨＮ細胞、ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞、ＳＫ−ＭＥＬ−５細胞、及びＵＡＣＣ−６２細胞を１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、Ｂ１６−Ｆ１０細胞、及びＨｓ  ５７８ｔ細胞を、アールのＢＳＳ、１．５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウムを有し、１０％ＦＢＳを添加したイーグルの最小必須培地中で成長させた。ＰＣ−１２細胞は、５％ＦＢＳ及び１０％ウマ血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。ヒト骨髄を、４０％ＦＢＳを添加したＩＤＭＥＭ中で成長させた。すべての細胞株を、５％ＣＯ２、９５％空気雰囲気中３７℃でインキュベートした。Ｕ−９３７細胞及びＨＬ−６０細胞は必要に応じて２〜３日ごとに継代した。ヒト骨髄は、冷凍ストックから解凍し、直ちに希釈して実験に使用した。他のすべての細胞は、約８０％の培養密度に達した時に継代した。
【００９１】
[00106]  タンパク質の発現及び精製。プロカスパーゼ−３又はプロカスパーゼ−７の発現プラスミドを含む大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａの終夜培養物１ｍＬを適切な抗生物質を含むＬＢ培地１Ｌに接種した。細胞を１ｍＭ  ＩＰＴＧで３０分間誘導した。次いで、細胞を遠心沈殿し、ＮＴＡ結合緩衝液中に再懸濁した（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９）。フレンチプレスに２回通過させることにより細胞を溶解した。次いで、細胞溶解物を１４，０００×ｇで３０分間回転させた。上清をデカントし、１ｍＬのニッケル−ＮＴＡ樹脂を加えた。細胞溶解物を４℃で１時間インキュベートした。樹脂をカラムに装填し、１０ｍＬ  ＮＴＡ結合緩衝液、次に１０ｍＬ  ＮＴＡ洗浄緩衝液で洗浄した（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９）。タンパク質を１０ｍＬ  ＮＴＡ溶出緩衝液で１ｍＬ画分中に溶出した（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．９）。タンパク質を含む画分をプールし、タンパク質の量をブラッドフォードアッセイを使用して測定した。
【００９２】
[00107]  ライブラリースクリーニング。単離したプロカスパーゼ−３をカスパーゼアッセイ緩衝液中に５０ｎｇ／ｍＬまで希釈した（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、及び１０％グリセロール、ｐＨ７．４）。４５μＬのプロカスパーゼ−３溶液をＮｕｎｃ社製３８４ウェル平底マイクロタイタープレートの各ウェルに加えた。約２０，０００種の化合物をスクリーニングした。約６，０００種の化合物をイリノイ大学の化学科内の様々な供給源から収集した。それらの構造は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／〜ｐｈｇｒｏｕｐ／ｃｏｍｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｈｔｍｌ．から入手可能である。他の約１４，０００種の化合物をＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅ社（サンディエゴ、カリフォルニア）から購入した。ＰＡＣ−１は、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ社から購入した化合物のメンバーの１種であった。
【００９３】
[00108]  ＤＭＳＯ中１０ｍＭストック溶液として作製した化合物を、０．２μＬの化合物を移動させる３８４ピン移動器具を使用してウェル中に移動させた。これにより、約４０μＭの最終化合物濃度を得た。ＤＭＳＯのみ（化合物を含まず）をピン移動させて対照実験を行った。次いで、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。カスパーゼアッセイ緩衝液中Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ（Ｎ−アセチル−ＡＳＰ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド）の２ｍＭ溶液の５μＬを各ウェルに加えた。次いで、プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール  ＣＡ）中で２時間の間、４０５ｎｍで２分ごとに読み取った。各ウェルに対する直線部分の傾きをカスパーゼ−３の活性を測定するために使用した。
【００９４】
[00109]  活性化曲線。プロカスパーゼ−３活性化剤の用量依存性は、９６ウェルプレート中のカスパーゼアッセイ緩衝液中５０ｎｇ／ｍＬのプロカスパーゼ−３、活性カスパーゼ−３、プロカスパーゼ−７、又は活性カスパーゼ−７の９０μＬに様々な濃度の化合物を加えることにより測定した。次いで、プレートを３７℃で１２時間インキュベートした。次いで、カスパーゼアッセイ緩衝液中Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡの２ｍＭ溶液の１０μＬを各ウェルに加えた。プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４ウェルプレートリーダー中で２時間の間、４０５ｎｍで２分ごとに読み取った。各ウェルに対する直線部分の傾きを決定し、非処置対照ウェルからの活性化における変化倍率を算出した。
【００９５】
[00110]  ＰＡＣ−１活性化ゲル。プロカスパーゼ−３を正確に上記のとおりに発現させ単離した。プロカスパーゼ−３をカスパーゼアッセイ緩衝液中約５０μｇ／ｍＬに希釈した。次いで、プロカスパーゼ−３を１００μＭ  ＰＡＣ−１存在下又は非存在下で３７℃で様々な時間インキュベートした。この培養の後、等量のローディング緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２％ＳＤＳ、２０％グリセロール、ｐＨ８．０）を各プロカスパーゼ−３サンプルに加えた。次いで、時間的経過が終了するまで、すべてのサンプルを−８０℃で保存した。次いで、すべてのサンプルを９５℃で５分間インキュベートし、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動した。次いで、タンパク質を、ニトロセルロース紙に一晩移した。ブロットをＴＴＢＳ中で洗浄し（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）、１０％ミルク溶液で２時間ブロックした。次いで、ブロットを、抗Ｐｅｎｔａ  Ｈｉｓ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗体の１：５０００希釈液中で２時間インキュベートした。次いで、ブロットをＴＴＢＳで洗浄し、Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光スキャナーでスキャンした（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、サニーベール  ＣＡ）。
【００９６】
[00111]  安全装置の変異。ＤＤＤプロカスパーゼ−３安全装置（配列番号１；配列番号２；配列番号９）を、ＡＤＤ（配列番号３、配列番号４、配列番号１０）、ＤＡＤ（配列番号５、配列番号６、配列番号１１）、及びＤＤＡ（配列番号７、配列番号８、配列番号１２）に以下のプライマー、それぞれ、ｇａｃａｇａｃａｇｔｇｇｔｇｔｔｇＣＧｇａｔｇａｃａｔｇｇｃｇｔｇｔｃａｔａａａａｔａｃｃ（配列番号１３）、ｇａｃａｇａｃａｇｔｇｇｔｇｔｔｇａｔｇＣｔｇａｃａｔｇｇｃｇｔｇｔｃａｔａａａａｔａｃｃ（配列番号１４）、及びｇａｃａｇａｃａｇｔｇｇｔｇｔｔｇａｔｇａｔｇＣｃａｔｇｇｃｇｔｇｔｃａｔａａａａｔａｃｃ（配列番号１５）を用いたＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ法を使用して変異させた。図９及び図１０も参照すること。変異した塩基は下線を引き、大文字で示す。遺伝子の全体にわたる適切な配列を保証するためにすべての変異体プラスミドについて配列を決定した。すべての変異体プラスミドは、上記の野生型プロカスパーゼ−３のとおりに正確に発現した。９６ウェルプレート中のカスパーゼアッセイ緩衝液中５０ｎｇ／ｍＬの野性型プロカスパーゼ−３及び変異体プロカスパーゼ−３の９０μＬに様々な濃度のＰＡＣ−１を加えることにより、各プロカスパーゼ−３変異体を活性化するＰＡＣ−１の能力を測定した。次いで、プレートを３７℃で１２時間インキュベートした。次いで、カスパーゼアッセイ緩衝液中Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡの２ｍＭ溶液の１０μＬを各ウェルに加えた。プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４ウェルプレートリーダー中で２時間の間、４０５ｎｍで２分ごとに読み取った。各ウェルに対する直線部分の傾きを決定し、各変異体についての活性の変化倍率を算出した。
【００９７】
[00112]  ＰＡＣ−１のプロカスパーゼ−３の活性化に対するｐＨの影響。ＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−３活性化に対するｐＨの影響は、ｐＨカスパーゼアッセイ緩衝液（２５ｍＭ  ＭＥＳ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２５ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、及び１０％グリセロール）中にプロカスパーゼ−３を５０ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈することにより測定した。次いで、緩衝液を様々なｐＨ値に変化させ、９０μＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。各ｐＨ値に対して、ＰＡＣ−１を１００μＭの濃度まで加え、又は対照としてＤＭＳＯを加えた。次いで、プレートを３７℃で１２時間インキュベートした。次いで、カスパーゼアッセイ緩衝液中Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡの２ｍＭ溶液の１０μＬを各ウェルに加えた。プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール  ＣＡ）中で２時間の間、４０５ｎｍで２分ごとに読み取った。各ウェルに対する直線部分の傾きを決定し、各ｐＨ値に対する活性化における変化倍率を算出した。
【００９８】
[00113]  アネキシンＶ染色。２００μＭ  ＰＡＣ−１又は対照としてＤＭＳＯのみを含む培地５００μＬを２４ウェルプレートのウェルに加えた。次いで、２×１０６細胞／ｍＬの濃度のＨＬ−６０細胞５００μＬを２４ウェルプレートに加えた。プレートを３７℃で２０時間インキュベートした。細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。次いで、細胞をアネキシンＶ結合緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中で洗浄し、１００μＬのアネキシンＶ結合緩衝液中に再懸濁した。５μＬのアネキシンＶ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８複合体を加え、チューブを、光から保護して、室温で１５分間インキュベートした。次いで、４００μＬのアネキシンＶ結合緩衝液を加え、次に、ヨウ化プロピジウムの１ｍｇ／ｍＬ溶液を１μＬ加えた。各細胞の蛍光強度を、５２５ｎｍ（緑色チャンネル）及び６７５ｎｍ（赤色チャンネル）でフローサイトメトリーにより測定した。少なくとも５０，０００個の細胞を各実験で分析した。
【００９９】
[00114]  凝縮したクロマチンの染色。２００μＭ  ＰＡＣ−１又は対照としてＤＭＳＯのみを含む培地５００μＬを２４ウェルプレートのウェルに加えた。次いで、２×１０６細胞／ｍＬの濃度のＨＬ−６０細胞５００μＬを２４ウェルプレートに加えた。細胞を２０時間インキュベートし、遠心分離により回収した。次いで、細胞をＰＢＳ緩衝液中で洗浄し、次に氷冷１００％エタノールを加えた。細胞を一晩４℃で固定した。固定細胞を２μｇ／ｍＬヘキスト−３３２５８と共に室温で３０分間インキュベートした。次いで、１滴の細胞を顕微鏡用スライドガラスに加え、厚さＮｏ．１のカバーガラスでカバーした。凝縮したクロマチンをＺｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００顕微鏡上で４００×倍率で観察した。
【０１００】
[00115]  ｚ−ｖａｄ−ｆｍｋによる細胞死阻害。５×１０５細胞／ｍＬの濃度のＨＬ−６０細胞１００μＬを９６ウェルプレートのウェルに加えた。次いで、細胞を、細胞透過性全カスパーゼ阻害剤であるｚ−ｖａｄ−ｆｍｋ  １００μＭ存在下又は非存在下で１時間インキュベートした。次いで、ＰＡＣ−１を様々な濃度で加え、細胞をさらに２４時間インキュベートした。ＭＴＳ／ＰＭＳ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６細胞増殖アッセイ試薬２０μＬの各ウェルへの添加により細胞死を定量した。プレートを、３７℃で、約４５分間、有色生成物が形成されるまでインキュベートした。次いで、吸光度を、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール  ＣＡ）で４９０ｎｍで測定した。
【０１０１】
[00116]  生体内でのミトコンドリア膜電位の測定。１×１０６細胞／ｍＬの濃度のＨＬ−６０細胞１ｍＬを２４ウェルプレートのウェルに加えた。次いで、ＰＡＣ−１を１００μＭの濃度まで加え又は対照としてＤＭＳＯのみを加えた。細胞を様々な時間インキュベートし、次いで、細胞を遠心分離により回収した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、１ｍＬ  ＰＢＳ中で再懸濁した。ＪＣ−９染料１０μｇを加え、細胞を光から保護して、室温で１０分間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、５００μＬ  ＰＢＳ中に調製した。各細胞の蛍光強度を、５２５ｎｍ（緑色チャンネル）及び６７５ｎｍ（赤色チャンネル）でフローサイトメトリーにより測定した。各実験で５０，０００個の細胞を分析した。次いで、赤色チャンネルにおけるシフトを使用してミトコンドリア膜脱分極の量を測定した。
【０１０２】
[00117]  生体内でのカスパーゼ−３様活性の測定。カスパーゼ−３様プロテアーゼ活性の量を、細胞溶解物により毎分切断されるＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡ（Ｎ−アセチル−ＡＳＰ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド）の量により測定した。これを達成するために、様々な濃度のＰＡＣ−１を含む培地５０μＬを９６ウェルプレートのウェルに加えた。５×１０６細胞／ｍＬの濃度のＨＬ−６０細胞５０μＬをプレートに加え、様々な時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、プレートを１０００×ｇで５分間回転させ、細胞をペレットにした。次いで、１００μＬ  ＰＢＳ中で細胞を洗浄し、１５０μＬ氷冷カスパーゼアッセイ緩衝液中に再懸濁した。次いで、各ウェルを超音波処理して細胞を溶解させた。細胞溶解物９０μＬを各ウェルから新しいプレート中に移動した。２００μＭの最終濃度となるよう各ウェル中にＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡを加えた。次いで、プレートを、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール  ＣＡ）中で２時間の間、４０５ｎｍで２分ごとに読み取った。各ウェルに対する直線部分の傾きを決定し、毎分切断されたＡｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮＡの量を算出した。
【０１０３】
[00118]  生体内でのＰＡＲＰ切断の測定。生体内でのＰＡＲＰ活性アッセイを使用することによりＰＡＲＰ切断の量を測定した。これを達成するために、２００μＭ  ＮＡＤ＋を含む培地５０μＬを９６ウェルプレートの対照ウェルに加えた。次いで、２００μＭ  ＰＡＣ−１及び２００μＭ  ＮＡＤ＋を含む培地５０μＬを試験ウェルに加えた。次いで、５×１０６細胞／ｍＬの濃度のＨＬ−６０細胞２５μＬを各ウェルに加えた。細胞を様々な時間インキュベートし、次いで、１０００×ｇで５分間回転させた。細胞培地を除去し、２５ｍＭ  Ｈ２Ｏ２を含む５０μＬ  ＰＡＲＰ溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）と置換した。次いで、プレートを３７℃で６０分間インキュベートした。まだ存在しているＮＡＤ＋の量を測定するために、２０μＬの２Ｍ  ＫＯＨ及び２０μＬの２０％（ｖ／ｖ）アセトフェノン（エタノール中）溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。次いで、プレートを４℃で１０分間インキュベートした。９０μＬの８８％（ｖ／ｖ）ギ酸溶液を９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。次いで、プレートを、１１０℃に設定したオーブン中で５分間インキュベートした。プレートを冷却し、次いで、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール、ＣＡ）上で励起３６０ｎｍ、発光４４５ｎｍ、及び４００ｎｍカットオフ  ダイクロイックミラーで読み取った。ウェル当たり５回の読み取りを実行しながら１．６×１０５μｓの１０００Ｗ連続ランプを使用して蛍光体を励起させた。次いで、毎分切断されたＮＡＤ＋のモル数を算出し、対照ウェルと比較した残存するＰＡＲＰ活性を測定した。
【０１０４】
[00119]  様々な細胞株中のプロカスパーゼ−３の相対濃度。Ｕ−９３７細胞、ＨＬ−６０細胞、及びヒト骨髄細胞は遠心分離により回収し、一方、他のすべての細胞株は、最初にトリプシン処理して細胞を遊離し、次いで、遠心分離により回収した。ＰＢＳ中ですべての細胞を洗浄し、１ｍＬ氷冷１００％エタノール中に再懸濁した。細胞を一晩４℃で固定した。細胞を１０００×ｇで５分間回転させ、ＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の抗カスパーゼ−３抗体の１：１００希釈液１００μＬを加えた。細胞を室温で２時間インキュベートし、次に、５回ＰＢＳ洗浄した。次いで、細胞を、光から保護して、抗マウスＡｂ  Ｃｙ３標識抗体の１：１０，０００希釈液１ｍＬ中に室温で２時間再懸濁した。ＰＢＳで細胞を５回洗浄し、５００μＬ  ＰＢＳ中に再懸濁した。フローサイトメトリーにより６７５ｎｍ（赤色チャンネル）で各細胞の蛍光強度を測定した。少なくとも２０，０００個の細胞を各実験で分析した。集団の中央値を使用して各細胞株中のプロカスパーゼ−３の相対濃度を測定した。
【０１０５】
[00120]  様々な細胞株におけるＩＣ５０値の測定。様々な濃度のＰＡＣ−１又はエトポシドを含む培地５０μＬを、ＤＭＳＯのみを含む対照ウェル以外の９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。Ｕ−９３７細胞、ＨＬ−６０細胞、及びヒト骨髄細胞は遠心分離により回収し、一方、他のすべての細胞株は遠心分離前に最初にトリプシン処理した。次いで、細胞を培地中に再懸濁し、Ｕ−９３７細胞、ＨＬ−６０細胞、及びヒト骨髄細胞については１×１０６細胞／ｍＬ又は他のすべての細胞株については５０，０００細胞／ｍＬに希釈した。次いで、５０μＬ細胞溶液を各ウェルに加え、エトポシド及びＰＡＣ−１に対してそれぞれ２４時間又は７２時間プレートをインキュベートした。ＭＴＳ／ＰＭＳ  ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６細胞増殖アッセイ試薬２０μＬの各ウェルへの添加により細胞死を定量した。次いで、プレートを、３７℃で、約１時間、有色生成物が形成されるまでインキュベートした。Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｐｌｕｓ  ３８４プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール  ＣＡ）で４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０６】
[00121]  データ分析：Ｓｕｍｍｉｔソフトウェア（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社、フォートコリンズ  ＣＯ）を使用して、すべてのフローサイトメトリー実験のデータを分析した。すべてのグラフを、Ｔａｂｌｅ  Ｃｕｒｖｅ  ２Ｄを使用して、分析した。
【０１０７】
[00122]  Ｒｏｎａｌｄ  Ｈｏｆｆｍａｎ教授（イリノイ大学−シカゴ癌センター（Ｃｈｉｃａｇｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ））はヒト骨髄を提供した。Ｇｕｙ  Ｓａｌｖｅｓｅｎ教授（バーナム研究所）はプロカスパーゼ−３及びプロカスパーゼ−７の発現ベクターを提供した。
【０１０８】
[00123]  配列表の参照−添付Ａ：添付Ａと指定した個別に添付する配列表情報は、本明細書と共に明細書の一部とみなされ、明細書の一部として組み込まれるものとする。
【表１】
0005513741.tif 000009
【０１０９】
〔実施例２：プロカスパーゼ活性化化合物の合成〕
[00124]  ＰＡＣ−１及び他の化合物は、以下のスキーム、たとえば下記スキーム１及び／又はスキーム２に従って調製した。さらなる変形形態は、当技術分野で知られている方法に従って調製する。
【化８】
0005513741.tif 000010
【０１１０】
[00125]  特定の実施例では、ＰＡＣ−１は、下記スキーム２に従って調製する。
【化９】
0005513741.tif 000011
【０１１１】
〔実施例３：ＰＡＣ−１の類似体〕
[00126]  ＰＡＣ−１の類似（アナログ）化合物を調製し、精製したプロカスパーゼ−３をｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接活性化する能力について評価した。
【表２】
0005513741.tif 000012
【０１１２】
〔実施例４：医薬品実施形態〕
[00127]  以下は、医薬品実施形態及び薬理学的実施形態に関連する情報を記載し、当業者にとって入手可能な当技術分野における情報によりさらに補足される。厳密な処方、投与経路、及び用量は、個々の医師が、患者の症状を考慮して選択することができる（たとえばＦｉｎｇｌら，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１９７５，Ｃｈ．１  ｐ．１参照）。
【０１１３】
[00128]  毒性又は器官の機能不全等により、どのようにそしていつ投与を終了すべきか、中断すべきか、又は調整すべきかについて主治医が知っていたであろうということに注目するべきである。反対に、臨床反応が十分でなかった場合（毒性の側面を考慮して又は毒性の側面を防止する中で）、主治医はまた高度なレベルに処置を調整することも知っていたであろう。関心のある疾患の管理における投薬量の大きさは、処置される症状の重症度及び投与経路によって変動する可能性がある。症状の重症度は、たとえば、部分的に、標準的な予後評価法により評価してもよい。さらに、投与量及びおそらく投与回数はまた、状況、たとえば個々の患者の年齢、体重、及び反応に従って変動する可能性がある。上記に論じたものに相当するプログラムはまた獣医学に使用してもよい。
【０１１４】
[00129]  処置されている特定の症状及び選択された標的法によっては、上記薬剤を全身に又は局所的に処方及び投与してもよい。処方及び投与の技術は、Ａｌｆｏｎｓｏ及びＧｅｎｎａｒｏ（１９９５）並びに当技術分野の他のものに認められてもよい。適した経路は、たとえば、経口投与、直腸投与、経皮投与、膣投与、経粘膜投与、若しくは腸管投与又は筋肉注射、皮下注射、若しくは髄内注射を含む非経口送達と同様に眼内投与、鞘内投与、静脈内投与、又は腹腔内投与を含んでいてもよい。
【０１１５】
[00130]  注射又は他の経路については、本発明の薬剤を水溶液中に、好ましくは、ハンクス溶液、リンガー溶液、注射用水、生理的食塩緩衝液、等の生理学的に適合性のある緩衝液中に処方してもよい。経粘膜投与については、浸透するバリアに適切な浸透剤を製剤に使用することができる。上記浸透剤は、当技術分野で一般に知られている。
【０１１６】
[00131]  本発明の実行に関して本明細書中に開示された化合物を全身性の又は他の投与に適した用量に処方するための薬学的に許容し得る担体の使用は本発明の範囲内である。担体及び適した製造の実施を適切に選択して、本発明の組成物、特に、溶液として処方される組成物は、静脈注射等の経路によって非経口的に投与されてもよい。適切な化合物は、当技術分野でよく知られている薬学的に許容し得る担体を使用して、経口投与に適した用量に容易に処方することができる。上記担体は、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、エリキシル剤、溶液剤、懸濁剤等として、たとえば処置される患者による経口摂取のために処方することを可能にする。他の経路については、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤等の製剤を調製することができる。
【０１１７】
[00132]  細胞内に投与することを意図した薬剤は、当業者によく知られている技術を使用して投与されてもよい。たとえば、上記薬剤を、リポソーム、他の膜移動促進部分、又は他の標的部分中にカプセル化し、次いで、上記のように投与してもよい。リポソームは、内部が水性の球状の脂質二重層を含むことができる。リポソーム形成時に水溶液中に存在するすべての分子を水性内部に取り込むことができる。リポソーム内容物は外部の微小環境から保護されるのみならず、リポソームが細胞膜と融合するので、細胞の細胞質に効率的に送達される。さらに、疎水性の特性により、有機低分子を直接細胞内に投与してもよい。
【０１１８】
[00133]  本発明で使用するのに適した医薬組成物は、意図された目的を達成するための有効な量の活性成分を含んでいる組成物を含む。有効な量の決定は、特に本明細書中に提供された本開示及び当技術分野における他の情報を考慮すれば十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１９】
[00134]  活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤及び助剤を含む、薬学的に許容し得る適した担体を含んでいてもよい。経口投与のために処方された調製物は、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、又は溶液剤の形態をしていてもよく、遅延して放出されるために処方された調製物又は医薬が小腸又は大腸に到達する場合に単に放出されるために処方された調製物を含む。
【０１２０】
[00135]  本発明の医薬組成物は、それ自体知られている方法、たとえば従来の混合プロセス、溶解プロセス、懸濁プロセス、造粒プロセス、糖衣錠製造プロセス、浮上プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセス、凍結乾燥プロセス及び他のプロセスによって製造してもよい。
【０１２１】
[00136]  非経口投与のための医薬製剤は水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。さらに、活性化合物の懸濁剤を適切な油性注射懸濁剤として調製してもよい。適した親油性の溶媒又は賦形剤は、ゴマ油等の脂肪油；オレイン酸エチル、トリグリセリド等の合成脂肪酸エステル；又はリポソームを含む。水性注射懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストラン等の、懸濁剤の粘度を上昇させる物質を含んでいてもよい。任意選択で、高度に濃縮された溶液の調製を考慮に入れるために、懸濁剤は、化合物の溶解度を上昇させる適切な安定剤又は薬剤をさらに含んでいてもよい。
【０１２２】
[00137]  経口使用のための医薬調製物は、所望により、錠剤又は糖衣錠コアを得るために、活性化合物を固体賦形剤と混合し、任意選択で、結果として生じる混合物を粉砕し、適した助剤を加えた後、顆粒の混合物を加工することにより得ることができる。適した賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールを含む糖のような充填剤、並びにたとえば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、バレイショデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシルメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウム等の塩、のような崩壊剤を加えてもよい。
【０１２３】
[00138]  適したコーティングを糖衣錠コアに任意選択で施す。この目的のために、濃縮糖溶液を使用してもよく、濃縮糖溶液は、任意選択で、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、並びに適した有機溶媒又は混合溶媒を含んでいてもよい。染料又は色素を、錠剤又は糖衣錠のコーティングに、識別のために又は活性化合物投与量の異なる組み合わせを特徴づけるために加えてもよい。
【０１２４】
[00139]  経口的に使用することができる医薬調製物は、ゼラチンで作製されたプッシュフィットカプセル剤並びにゼラチンで作製された軟質の密閉カプセル剤、及びグリセロール、ソルビトール等の可塑剤を含む。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、及び／又はタルク、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、並びに任意選択で安定剤と混合した活性成分を含むことができる。軟質のカプセル剤では、脂肪油、流動パラフィン、液体ポリエチレングリコール等の適した液剤中に活性化合物を溶解又は懸濁してもよい。さらに、安定剤を加えてもよい。
【０１２５】
〔実施例５：プロカスパーゼ−３の低分子活性化剤での癌細胞におけるアポトーシスの直接的な誘導〕
[00140]  要約：アポトーシスカスケードにおけるタンパク質の変異又は異常発現は癌の特徴である。これらの変化は、アポトーシス促進シグナルが実行因子カスパーゼに伝達されるのを阻止し、したがってアポトーシス細胞死を阻止し、細胞増殖が許可される。カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７は重要な実行因子カスパーゼであり、上流のシグナルにより活性化される不活性な酵素前駆体として存在する。重要なことには、プロカスパーゼ−３のレベルは非癌性対照に比べてある種の癌性細胞内で著しく高度である。本明細書で、我々は、プロカスパーゼ−３を活性カスパーゼ−３に２２０ナノモル濃度のＥＣ５０でｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接活性化し、様々な癌細胞株におけるアポトーシスを誘導する低分子（ＰＡＣ−１）の同定について報告する。多くの知られている抗癌薬とは対照的に、ＰＡＣ−１で処置した細胞はプロカスパーゼ−３の即時活性化を示し、ＰＡＣ−１の有効性は、細胞に含まれるプロカスパーゼ−３の量に比例することが示される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでプロカスパーゼ−３を活性化しないＰＡＣ−１の誘導体はアポトーシス促進活性も有していない。一次大腸腫瘍から単離した癌性細胞は、同一患者からの隣接した非癌性組織の細胞よりも、ＰＡＣ−１によるアポトーシス誘導にかなりの感受性がある。これらの癌性細胞は、隣接した非癌性一次組織の細胞よりも平均して約７倍のプロカスパーゼ−３を含んでいる。さらに、大腸癌腫瘍からの一次細胞のＰＡＣ−１に対する感受性は、プロカスパーゼ−３標的のレベルと強く関連している。最終的に、単一の実体としてのＰＡＣ−１は、ＰＡＣ−１を経口的に投与した２つのモデルを含む３つの異なるマウスモデルにおいて腫瘍の成長を遅延させるのに活性のあるものとして示された。したがって、ＰＡＣ−１は、生体内で、プロカスパーゼ−３をカスパーゼ−３に直接活性化し、それによって、欠陥のあるアポトーシス機構を有する細胞においてでさえこの化合物がアポトーシスを誘導することを可能にする。ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３を直接活性化することで知られている最初の低分子であり、実行因子カスパーゼの直接的な活性化は、プロカスパーゼ−３レベルが上昇した多くの癌において有利であると証明することが可能である抗癌戦略である。
【０１２６】
[00141]  導入。癌の特徴は、本来のアポトーシスシグナルに対するその抵抗性である。癌型によっては、この抵抗性は、通常、アポトーシスカスケードにおける重要なタンパク質のアップレギュレーション若しくはダウンレギュレーション又はこれらのタンパク質をコードする遺伝子内の変異のいずれかによる。上記変化は、ミトコンドリア及びカスパーゼ−９を通る内因性アポトーシス経路並びにデスレセプター及びカスパーゼ−８の作用を伴う外因性アポトーシス経路の両方で起こる。たとえば、ｐ５３、Ｂｉｍ、Ｂａｘ、Ａｐａｆ−１、ＦＬＩＰ、及びその他多くのものの適切なレベルの変化が癌で観察され、欠陥のあるアポトーシスカスケードにつながり、上流のアポトーシス促進シグナルが適切に伝達されず、実行因子カスパーゼであるカスパーゼ−３及びカスパーゼ−７が活性化されない。ほとんどのアポトーシス経路がプロカスパーゼ−３の活性化を最終的に伴うので、これらの遺伝的異常は、有効に、アポトーシス回路における「断線箇所」となり、その結果、上記細胞は制御されずに増殖する。
【０１２７】
[00142]  癌におけるアポトーシスの中心的な役割から判断して、アポトーシスカスケードにおける特定のタンパク質を標的にする治療を開発するための試みがなされた。たとえば、ｐ５３、Ｂｃｌファミリーのタンパク質、又はＩＡＰに対するペプチド結合剤又は低分子結合剤は、Ａｐａｆ−１のオリゴマー化を促進する化合物のように、アポトーシス促進活性を有している。しかしながら、これらの化合物の多くは、アポトーシスカスケード上の早期に又は中間に位置するものを標的にするので、下流のタンパク質における変異を有する癌は、それらの効果におそらく抵抗性があるであろう。治療目的のために、アポトーシスカスケードにおけるはるか下流のアポトーシス促進タンパク質を直接活性化する低分子を同定すること理想的であろう。さらに、上記治療戦略は、アポトーシス促進タンパク質のレベルが癌細胞内で上昇した場合、成功の可能性がより高いであろう。
【０１２８】
[00143]  プロカスパーゼ−３のカスパーゼ−３への変換により、多数のタンパク質基質の加水分解を続いて触媒する活性「実行因子」カスパーゼの生成がもたらされる。活性カスパーゼ−３は、ヘテロダイマーのホモダイマーで、プロカスパーゼ−３のタンパク質分解により産生される。生体内では、このタンパク質分解性の活性化は、通常、カスパーゼ−８又はカスパーゼ−９の作用を介して生じる。この酵素前駆体が早まって活性化されないことを確実にするために、プロカスパーゼ−３は、タンパク質分解のＩＥＴＤ部位への到達をブロックするトリ−アスパラギン酸「安全装置」を有している。この安全装置は、プロカスパーゼ−３が、自己触媒活性化及びカスパーゼ−９によるタンパク質分解に抵抗することを可能にする。安全装置の部位はｐＨに感受性である。したがって、細胞の酸性化（アポトーシス中に起こる）の際、安全装置は、タンパク質分解の部位への到達を許可すると思われ、活性カスパーゼ−３は、カスパーゼ−９の作用により又は自己活性化機構を介して産生することができる。
【０１２９】
[00144]  癌性組織のある種の型からの細胞はプロカスパーゼ−３のレベルが上昇している。２０人の大腸癌患者からの一次試料に関する研究は、平均して、プロカスパーゼ−３が、隣接した非癌性組織に比べて上記試料中で６倍上昇したことを明らかにした。さらに、プロカスパーゼ−３レベルは、ある種の神経芽細胞腫、リンパ腫、及び肝臓癌において上昇する。実際、ＮＣＩにより使用された６０枚の細胞株パネルにおけるプロカスパーゼ−３レベルの系統的評価は、特定の肺癌、黒色腫、腎臓癌、及び乳癌がプロカスパーゼ−３の著しく増強したレベルを示すことを明らかにした。アポトーシスを成功させる活性カスパーゼ−３の中心的な重要性、ある種の癌性細胞型におけるプロカスパーゼ−３の高度なレベル、及び興味深い、安全装置媒介性のその自己活性化の抑制から判断して、プロカスパーゼ−３を直接活性化する低分子が同定される可能性があるということ及び上記分子は、標的癌治療法において多大な可能性を有する可能性があるということを我々は推論した。この原稿で、我々は、プロカスパーゼ−３の低分子活性化剤であるＰＡＣ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏの同定について報告する。ＰＡＣ−１は、癌細胞株において、プロカスパーゼ−３レベルに比例してアポトーシス促進性に効果的であり、そのアポトーシス促進効果はプロカスパーゼ−３のその直接的で即時の活性化によるものであり、一次大腸癌試料に対して及び３つの異なる癌のマウスモデルにおいて有効である。
【０１３０】
[00145]  約２０，５００種の構造的に多様な低分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのプロカスパーゼ−３を活性化する能力に対してスクリーニングした。プロカスパーゼ−３を、標準的な手順に従って、大腸菌中で発現させ、精製した。プロカスパーゼ−３を、３８４ウェルプレートのウェルに加え、化合物を、約４０μＭの最終濃度まで加えた（プロカスパーゼ−３の最終濃度は５０ｎｇ／ｍＬであった）。次いで、各プレートを３７℃で２時間インキュベートし、その後、カスパーゼ−３ペプチド基質Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ｐ−ニトロアニリド（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｐＮａ）を２００μＭの濃度まで加えた。ｐ−ニトロアニリン発色団の形成を４０５ｎｍで２時間にわたり追跡した。評価した〜２０，５００種の化合物のうち、４種が、バックグラウンドに対してカスパーゼ−３ペプチド基質の加水分解の著しい増加を誘導した。それらの４種のうち、１種は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのプロカスパーゼ−３活性化に対する強い用量依存効果を示した。図１Ａに示すように、この最初のプロカスパーゼ活性化化合物（ＰＡＣ−１）は、０．２２μＭの濃度で、プロカスパーゼ−３の最大活性化の２分の１をもたらす。この化合物は、完全に活性化されたカスパーゼ−３酵素の触媒活性に対する効果を有していないので、カスパーゼ−３自体の活性を単に上昇させているのではない（図１Ａ）。
【０１３１】
[00146]  プロカスパーゼ−３はＮ末端プロドメイン（残基１〜２８）、それに続く、サブユニット間のリンカーにより分けられた大サブユニット（１７ｋＤａ）及び小サブユニット（１２ｋＤａ）から成る２２。生体内では、２つのプロカスパーゼ−３モノマーが集合して、サブユニット間のリンカー中のＤ１７５での切断により活性化することができるホモダイマーを形成する。プロドメインの明確な役割は不明であり、最高の触媒活性には、サブユニット間の領域の切断のみで十分であることが示された。プロカスパーゼ−３は、それ自身のタンパク質分解性の成熟を推進するための十分な触媒活性を有しているが、３つのアミノ酸の安全装置の存在によりこの自己活性化に対して高度に抵抗性がある。しかしながら、安全装置が変異した場合、プロカスパーゼ−３の著しい自己活性化が観察される。プロカスパーゼ−３の活性カスパーゼ−３への成熟を触媒するＰＡＣ−１の能力を直接評価するために、プロカスパーゼ−３タンパク質を１００μＭ  ＰＡＣ−１と共に１〜５時間インキュベートした。図１Ｂでウエスタンブロットにより示すように、ＰＡＣ−１は時間依存的にプロカスパーゼ−３の切断を誘導し、４時間後に＞５０％の処理が観察された。対照的に、緩衝液中でインキュベートしたプロカスパーゼ−３は、同一の時間にわたり実質的に自己活性化を示さない。ＰＡＣ−１はまた、このアッセイにおいて、５μＭの濃度でも有効であった。
【０１３２】
[00147]  次いで、プロカスパーゼ−３の安全装置領域中の重要なアスパラギン酸の三つ組である残基Ａｓｐ１７９、Ａｓｐ１８０、及びＡｓｐ１８１においてアラニン置換を行った。これらの部位での変異はすべて、プロカスパーゼ−３を活性化するＰＡＣ−１の能力を劇的に低下させ、ある種の変異はＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−３の活性化に対してより有害であった（図２Ａ）。カスパーゼ−３と同様に、カスパーゼ−７もまた、タンパク質分解により活性化される不活性な酵素前駆体として存在する。カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７は共に実行因子カスパーゼであり、かなりの構造上の相同性を有している。プロカスパーゼ−７はまた、重要な三つ組中に３つのアスパラギン酸の代わりに２つのアスパラギン酸（Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ）しか有していないが、類似する安全装置領域を有することが予測される。図２Ｂ中のデータにより示すように、ＰＡＣ−１は、さらに、プロカスパーゼ−３のその活性化よりも効果が低いが、プロカスパーゼ−７を活性化することもできる（ＥＣ５０はプロカスパーゼ−３活性化の０．２２μＭに対して４．５μＭ）。ＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−７活性化の効力は、プロカスパーゼ−３のＡｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ変異体に対するその効果に類似している（ＥＣ５０＝２．７７μＭ）。予想どおり、ＰＡＣ−１の効果は、プロカスパーゼ−３が急速な自己活性化を起こす低ｐＨ値で無効にされる（図２Ｃ）。
【０１３３】
[00148]  ＰＡＣ−１は、様々な癌細胞株におけるアポトーシスを誘導することがわかった。ＨＬ−６０細胞では、ＰＡＣ−１の添加は、著しいクロマチン凝縮を伴う細胞膜上への多量のホスファチジルセリンの露出につながる（図３Ａ、３Ｂ）。さらに、化合物は、カスパーゼ基質ＰＡＲＰ−１の切断を誘導し（生体内でのＰＡＲＰ活性アッセイによる評価）、ミトコンドリア膜脱分極を引き起こす（以下参照）。ＰＡＣ−１処置細胞の著しい細胞の小疱形成も顕微鏡検査により観察された。さらに、ＰＡＣ−１の毒性は、カスパーゼ阻害剤ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ存在下で無効にすることができるかもしれない。
【０１３４】
[00149]  ＰＡＣ−１がプロカスパーゼ−３の直接的な活性化を介してアポトーシスを実際に誘導している場合、アポトーシス現象の時間的経過が、標準的なアポトーシス促進剤を用いて観察される現象に比べて変化するはずである。エトポシドは、内因性の経路を介してアポトーシスを誘導することでよく知られており、したがって、エトポシド処置細胞において、ミトコンドリア膜脱分極の後、プロカスパーゼ−３が活性化される。実際に、１０μＭエトポシドで処置したＨＬ−６０細胞では、ミトコンドリア膜脱分極が観察された後、カスパーゼ−３様活性が検出される（図４Ａ）。対照的に、ＰＡＣ−１での細胞の処置は著しく異なる結果をもたらす。この化合物では、最初に観察されたアポトーシスの生化学的特徴はカスパーゼ−３様酵素活性であり、活性はＰＡＣ−１添加の数分以内に認められ、５０％の活性化が、２時間余りで、いかなる著しいミトコンドリア膜脱分極の十分前に起こる（図４Ｂ）。さらに、ＰＡＲＰ−１活性は、ＰＡＣ−１で処置した細胞では急速に低下するが、この低下は、エトポシド処置細胞ではより遅い時点で観察され（図４Ｃ）、対照実験は、ＰＡＣ−１がＰＡＲＰ−１の酵素活性を直接抑制しないことを示す。アポトーシス現象の典型的な順序では、ミトコンドリア膜が脱分極し、カスパーゼが活性化され、カスパーゼ基質（ＰＡＲＰ−１等）が切断される。ＰＡＣ−１で処置した細胞がプロカスパーゼ−３／−７の急速な活性化（ミトコンドリア膜脱分極前）及びカスパーゼ基質（ＰＡＲＰ−１）の急速な切断を示すといった観察は、ＰＡＣ−１がプロカスパーゼ−３の直接的な活性化を介してその細胞毒性を発揮していることを示す。
【０１３５】
[00150]  さらにＰＡＣ−１の効力を明示するために、様々なレベルのプロカスパーゼ−３を有する癌細胞株における細胞死を誘導するこの化合物の能力を評価した。決定は、多数の癌細胞株（白血病、リンパ腫、黒色腫、神経芽細胞腫、乳癌、肺癌、副腎癌、及び腎臓癌）に存在するプロカスパーゼ−３のレベルに関して最初に行った。細胞死誘導に対するＩＣ５０値はこれらの細胞株に対するＰＡＣ−１に関して得られた。組み合わせたデータは、プロカスパーゼ−３の細胞内濃度及びＰＡＣ−１に対する感受性の間に強い相関を示す（図４Ｄ、図４Ｅ）。ＰＡＣ−１は、肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２６に対して最も効力があり、０．３５μＭのＩＣ５０である。我々は、この細胞株が、ベースラインレベルのプロカスパーゼ−３の濃度の５倍を超える濃度を有することがわかった。重要なことには、プロカスパーゼ−３の発現を有していないことで知られているある癌細胞株（ＭＣＦ−７、乳癌細胞）がある。ＰＡＣ−１はＭＣＦ−７細胞に事実上効果がなく、ＩＣ５０＞７５μＭで死を誘導する。
【０１３６】
[00151]  対照的に、エトポシドは、細胞培養中の効力及びプロカスパーゼ−３の細胞内レベルの間の上記相関を示さなかった。たとえば、エトポシドは黒色腫細胞株のうちの３種（ＵＡＣＣ−６２、ＣＲＬ−１８７２、及びＢ１６−Ｆ１０）、乳癌細胞株（Ｈｓ  ５７８ｔ）、及び肺癌細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２２６）での死の誘導において効果がなく（ＩＣ５０＞５０μＭ）、これらの細胞株は、１．０、２．４、１．９、３．７、及び５．３のプロカスパーゼ−３レベルをそれぞれ有している。エトポシドは、４．３、４．０、４．７、及び４．４のプロカスパーゼ−３レベルをそれぞれ有するＨＬ−６０、Ｕ−９３７、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、及びＰＣ−１２に対して有効であった（ＩＣ５０＜１μＭ）。したがって、全体として、プロカスパーゼ−３レベル及びエトポシドについてのＩＣ５０の間に相関はない。
【０１３７】
[00152]  ＰＡＣ−１のいくつかの誘導体を合成し、それらのプロカスパーゼ−３活性化特性及び細胞培養中の癌細胞に対するそれらの効果の両方を評価した（表３）。アリル基を欠くＰＡＣ−１誘導体（非アリルＰＡＣ−１）はＰＡＣ−１と同様のレベルでプロカスパーゼ−３活性化及び細胞死を誘導することができる。しかしながら、他のすべての誘導体はいずれのアッセイにおいても活性を示さなかった。したがってアリル基は生物活性には重要でないと思われる一方で、フェノール性水酸基の環及び芳香環はすべて、ＰＡＣ−１活性に重要である。このデータはまた、提案されたＰＡＣ−１の作用機構とも一致しており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、プロカスパーゼ−３を活性化しない化合物は培養中の癌細胞に対するアポトーシス促進効果を有していない。
【０１３８】
[00153]  癌の臨床試料におけるこの直接的な低分子媒介性のプロカスパーゼ−３活性化戦略を試験するために、我々は、新たに切除した大腸腫瘍（隣接した非癌性組織と共に）を、カール財団病院（Ｃａｒｌｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（アーバナ、ＩＬ）の１８人の患者から得た。癌性組織及び非癌性組織を分け、これらに由来する細胞を、それらのプロカスパーゼ−３のレベル及びＰＡＣ−１に対するそれらの感受性について評価した。図５Ａに示すように、すべての患者で、癌性細胞は、同一患者の隣接した非癌性組織からの細胞に比べて、プロカスパーゼ−３のレベルが上昇していた（１．７倍〜１７．２倍、平均で７．６倍の上昇）。さらに、これらの癌性細胞は、ＰＡＣ−１による死の誘導にかなり影響を受けやすかった。ＰＡＣ−１は、０．００７〜１．４１μＭのＩＣ５０値で一次癌性細胞における細胞死を誘導し、一方、ＰＡＣ−１は、５．０２〜９．９８μＭのＩＣ５０値で隣接した非癌性組織における細胞死を誘導した（図５Ｂ及び表４）。プロカスパーゼ−３のレベルが上昇した癌性組織はＰＡＣ−１に非常に感受性があった。たとえば、ＰＡＣ−１は、７ｎＭのＩＣ５０で、患者１７からの癌細胞における死を誘導した。これらの細胞は、隣接した正常組織からの細胞よりもＰＡＣ−１に対して７００倍を超える感受性があった。患者１、２、及び３からの正常サンプル及び癌性サンプル中の約５４日の期間にわたる相対的なプロカスパーゼ−３濃度を示す図６Ａもまた参照のこと。図６Ｂは、癌性組織における細胞が、正常組織と比較してＰＡＣ−１に対して約８０倍を超える感受性がある可能性があることを示す。
【０１３９】
[00154]  １８人の患者の非癌性組織からの細胞に加えて、４種の他の非癌性細胞型に対してもＰＡＣ−１を評価した：健常なドナーの骨髄から単離した白血球、Ｈｓ８８８Ｌｕ（肺繊維芽細胞）、ＭＣＦ−１０Ａ（乳房の繊維芽細胞）、及びＨｓ５７８Ｂｓｔ（乳房上皮細胞）。特に、非癌性細胞型は、最低量のプロカスパーゼ−３を有する細胞型に含まれ、ＰＡＣ−１は、これらの細胞における死を比較的誘導することができず、ＩＣ５０値は３．２〜８．５μＭであった（図５Ｂ、緑色の菱形）。図５Ｂから明らかなように、ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３のレベルと直接関連して、種々様々な細胞型（非癌性細胞株、非癌性一次細胞、癌性細胞株、一次癌性細胞）における死を誘導する。癌性細胞におけるプロカスパーゼ−３の上昇は、ＰＡＣ−１が選択的にこれらの細胞型における死を誘導することを可能にする。
【０１４０】
[00155]  薬物送達の徐放法を使用して、マウス異種移植モデルにおいてＰＡＣ−１を評価した。このモデルにおいて、ＡＣＨＮ（腎臓癌）細胞株を使用して、卵巣切除した雌の無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ（ヌード）マウスに皮下腫瘍を形成させた。腫瘍を測定して約３０ｍｍ２よりも大きければ、ＰＡＣ−１及びコレステロールのペレットの移植を介して薬物を投与し、遅く安定したレベルで化合物を放出させた。３グループのマウスを使用し、ペレットは０ｍｇ、１ｍｇ、及び５ｍｇのＰＡＣ−１を含み、グループ当たり６匹のマウス、マウス当たり４つの腫瘍とした。腫瘍の大きさを約８週間監視した。図５Ｃに示すように、腫瘍成長は、５ｍｇのＰＡＣ−１を含むペレットを移植したマウスで著しく遅延した。実験の最後の週の摂食評価は、マウスの３グループ間での摂食量における差異を示さなかった。マウスを屠殺した後、各マウスから血漿サンプルを得、それぞれのＰＡＣ−１含有量を分析した。ＰＡＣ−１の５ｍｇのペレットを与えたマウスについては、この分析は、ＰＡＣ−１が、血漿中に５ｎＭの濃度で５４日の実験の後に存在することを明らかにした。
【０１４１】
[00156]  第２のマウス異種移植モデルにおいてＰＡＣ−１を評価し、このモデルには薬物送達法として経口投与を使用した。このモデルにおいて、ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺癌）細胞株を使用して、雄の無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（５週令、ＳＬＣ、Ｈａｍａｍａｙｓｕ、日本）に皮下異種移植腫瘍を形成させ、グループ当たり８匹のマウス、マウス当たり３つの腫瘍とした。マウスに腫瘍を形成させた後、経口栄養で、１日１回、２１日間、０、５０、又は１００ｍｇ／ｋｇの濃度でマウスをＰＡＣ−１で処置し、１週目後に屠殺した。図５Ｄ中のグラフにより明確に示されるように、ＰＡＣ−１の経口投与は用量依存的に腫瘍成長を著しく遅延させる。
【０１４２】
[00157]  最終的に、雄の無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕマウスに尾静脈注射を介してＮＣＩ−Ｈ２２６細胞を注射したマウスモデルでＰＡＣ−１を評価した。全実験は２８日間続いた。１日１回、ＰＡＣ−１（１００ｍｇ／ｋｇ）で、経口栄養により、１〜４日目及び７〜１１日目にマウスを処置した。他の日は、マウスにＰＡＣ−１を与えなかった。マウスの第２のグループに賦形剤のみを与えた。２８日後にマウスを屠殺し、それらの肺を検査した。図５Ｅに示すように、対照マウスの肺（明白な灰色の腫瘤を有する）及びＰＡＣ−１処置マウスの肺の間に明らかな相違がある。ゲフィチニブ（イレッサ（商標）；アストラゼネカ社）で処置した動物からのパネルにおいても結果を示す。
【０１４３】
[00158]  癌性細胞は、アポトーシスカスケードにおける種々様々のタンパク質の変異又は異常発現により、通常、アポトーシス促進シグナルに対する感受性が低下している。そのため、癌の多くの型は、周知のように、アポトーシス細胞死に対する内在性シグナルだけでなく類似した機構を介して作用する化学療法剤にも抵抗性がある。ある種の癌におけるプロカスパーゼ−３レベルの奇異な上昇は、この存在するタンパク質の細胞内プールを使用する機会を提供して、アポトーシスを直接誘導し、それにより、機能しないことが多いカスケードの上流の部分を回避する。ＰＡＣ−１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、プロカスパーゼ−３の自己活性化を誘導する。細胞培養中、ＰＡＣ−１処置は、急速なカスパーゼ−３様活性を誘導する。次いで、抗アポトーシスタンパク質（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ等）のカスパーゼ−３媒介性の切断は、ミトコンドリア膜の脱分極を誘導し、アポトーシスを増強すると思われる。さらに、様々な癌性細胞型及び非癌性細胞型に対するＰＡＣ−１の効力は細胞中のプロカスパーゼ−３の濃度に比例する。切除した大腸腫瘍から単離した一次癌性細胞は、プロカスパーゼ−３のレベルが上昇しているので、これらの細胞は、隣接した非癌性組織からの細胞よりもＰＡＣ−１に対してかなり感受性がある。ＰＡＣ−１が有効ないくつかの細胞株は、アポトーシスに対して抵抗性にする欠陥のあるアポトーシス経路を有していることに注目する価値がある。たとえば、Ａｐａｆ−１発現はＳＫ−ＭＥＬ−５細胞中で劇的に減少し、Ｂｃｌ−２は、ＮＣＩ−Ｈ２２６肺癌細胞株中で過剰発現する。最終的に、ＰＡＣ−１は、ＰＡＣ−１を経口的に投与した２つのモデルを含む癌の３つの異なるマウスモデルで有効である。
【０１４４】
[00159]  本明細書中に提示したデータは、プロカスパーゼ−３活性化化合物が、プロカスパーゼ−３レベルが異常に高度な様々な一般的な癌に対して非常に有効となる可能性があるという見解を支持する。癌生検材料のプロカスパーゼ−３レベルの評価は単純で迅速であり、そのため、ＰＡＣ−１等の化合物の考えられる有効性は、高度な精度で推測的に評価することができる。上記オーダーメイド医療戦略は一般的な細胞毒素に頼る治療法に優先される可能性があり、抗癌治療法に価値がある可能性がある。
【０１４５】
[00160]  Ｇｕｙ  Ｓａｌｖｅｓｅｎ教授（バーナム研究所）はプロカスパーゼ−３及びプロカスパーゼ−７の発現ベクターを提供した。
【０１４６】
〔図の説明〕
[00161]  図１及び図２：ＰＡＣ−１の構造は明細書の他のところで示す。図１Ａ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−３の活性化及び活性カスパーゼ−３。ＰＡＣ−１は、ＥＣ５０＝０．２２μＭでプロカスパーゼ−３を活性化する。図１Ｂ）ＰＡＣ−１により誘導される活性カスパーゼ−３へのプロカスパーゼ−３の切断。プロカスパーゼ−３をＮ末端Ｈｉｓ−６タグを用いて大腸菌中で組換え発現させ、精製した。免疫ブロットは抗Ｈｉｓ−６抗体を用いて行った。ＰＡＣ−１非存在下でプロカスパーゼ−３の成熟は観察されない。１００μＭ  ＰＡＣ−１存在下で、ｐ１９フラグメントを生成する切断が１時間以内に観察され、＞５０％の切断が４時間後に観察される。ＰＡＣ−１はまた、このアッセイにおいて５μＭでも有効である。図２Ａ）プロカスパーゼ−３の「安全装置」領域における変異体のＰＡＣ−１による活性化。ＰＡＣ−１は、野性型プロカスパーゼ−３（ＤＤＤ）に対して０．２２μＭの活性化のためのＥＣ５０並びに変異体については２．７７μＭ（ＤＡＤ）、１１３μＭ（ＤＤＡ）、及び１３１μＭ（ＡＤＤ）の対応するＥＣ５０値を有している。図２Ｂ）ＰＡＣ−１は、４．５μＭのＥＣ５０でプロカスパーゼ−７を活性化する。図２Ｃ）プロカスパーゼ−３のＰＡＣ−１による活性化についてのｐＨへの依存性。低ｐＨでは、安全装置はオフの状態にあり、プロカスパーゼ−３は本質的に最大限に活性化される。エラーバーは、平均値からの標準偏差を表す。
【０１４７】
[00162]  図３及び図４：ＰＡＣ−１は、ＨＬ−６０細胞におけるアポトーシスを誘導する。図３Ａ）１００μＭ  ＰＡＣ−１での２０時間の処置の後のホスファチジルセリン露出（アネキシン−Ｖ染色により測定される）。ＰＡＣ−１はまた、このアッセイにおいて５μＭでも有効である（裏付けとなる図２を参照）。図３Ｂ）１００μＭ  ＰＡＣ−１での２０時間の処置の後のヘキスト染色により可視化されるクロマチン凝縮。図４Ａ）１０μＭエトポシドで処置したＨＬ−６０細胞におけるミトコンドリア膜脱分極（ＭＭＰ）及びカスパーゼ−３様活性。図４Ｂ）１００μＭ  ＰＡＣ−１で処置したＨＬ−６０細胞におけるミトコンドリア膜脱分極（ＭＭＰ）及びカスパーゼ−３様活性。図４Ｃ）ＰＡＣ−１処置（１００μＭ）は、細胞内カスパーゼ−３／−７の即時活性化と一致する、ＨＬ−６０細胞における細胞内ＰＡＲＰ活性の急速な減少を誘導する。対照的に、エトポシド（１０μＭ）処置細胞は、ずっと後の時点でのＰＡＲＰ活性の減少を示す。図４Ｄ及び図４Ｅ）ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３依存的に細胞死を誘導する。多くの多様な癌性細胞株について、プロカスパーゼ−３レベルを求め（プロカスパーゼ−３に対する抗体を用いたフローサイトメトリーにより）そしてＰＡＣ−１のＩＣ５０を測定した（様々なＰＡＣ−１濃度での７２時間の処置及びＭＴＳアッセイを使用した定量化により）。ＰＡＣ−１は、高度なレベルのプロカスパーゼ−３を有するとして知られているＮＣＩ−Ｈ２２６肺癌細胞株において相当効力がある（ＩＣ５０＝０．３５μＭ）。エラーバーは、平均値からの標準偏差を表す。
【０１４８】
[00163]  表３：ＰＡＣ−１及び非アリルＰＡＣ−１はプロカスパーゼ−３をｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化し、細胞培養中の癌細胞における死を誘導するが、他の構造類似体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのプロカスパーゼ−３活性化効果を有しておらず、細胞培養中に死の誘導をもたらさない。
【０１４９】
[00164]  図５：図５Ａ）プロカスパーゼ−３レベルは、新たに切除した大腸癌組織に由来する細胞内で上昇する。新たに切除した一次大腸腫瘍（隣接した非癌性組織と共に）を１８人の異なる患者から得、癌性組織及び非癌性組織を分け、プロカスパーゼ−３に対する抗体及びフローサイトメトリーを使用して、プロカスパーゼ−３レベルをそれぞれについて測定した。平均して、癌性組織からの細胞は、同一患者からの隣接した非癌性組織に由来する細胞と比較してプロカスパーゼ−３が７．６倍上昇している。図５Ｂ）ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３の細胞内レベルに比例して細胞死を誘導する。赤色の円は、１８個の大腸腫瘍からの一次癌性細胞を表す。黒色の三角は、図４Ｄ中に示した同一の癌細胞株を表す。緑色の菱形は４種の非癌性細胞型である：Ｈｓ８８８Ｌｕ（肺繊維芽細胞）、ＭＣＦ−１０Ａ（乳房の繊維芽細胞）、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（乳房上皮細胞）、及び健常なドナーの骨髄から単離した白血球。青色の四角は、１８人の患者の腫瘍縁から単離した一次非癌性細胞である。表４）一次大腸癌組織に由来する細胞は、同一患者からの隣接した非癌性組織に由来する細胞よりも、ＰＡＣ−１による死の誘導にかなりの感受性がある。図５Ｃ）ＰＡＣ−１は、癌の異種移植モデルにおける腫瘍の成長を低下させる。ＡＣＨＮ（腎臓癌）細胞株を用いて皮下注射により腫瘍を形成させ、各グループに６匹のマウス、マウス当たり４つの腫瘍とした。腫瘍が約３０ｍｍ２まで成長したら、ＰＡＣ−１を、コレステロールペレットとして移植した。エラーバーは、平均値からの標準誤差を表す。図５Ｄ）ＰＡＣ−１の経口投与はマウス異種移植モデルにおける腫瘍成長を著しく遅延させる。ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺癌）細胞株を使用して皮下注射により腫瘍を形成させ、各グループに８匹のマウス、マウス当たり３つの腫瘍とした。１日１回、経口栄養により、１〜２１日目に、ＰＡＣ−１又は賦形剤を投与した。エラーバーは、平均値からの標準誤差を表す。図５Ｅ）ＰＡＣ−１の経口投与は、ｉ．ｖ．注射モデルにおける腫瘍成長を著しく遅延させる。マウスに、ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺癌）細胞株をｉ．ｖ．注射した。本文中に記載されるプロトコールに従って経口栄養によりＰＡＣ−１（１００ｍｇ／ｋｇ）でマウスを処置した。画像は、ＰＡＣ−１を与えられず、肺に大量の灰色の腫瘤を有するマウスの肺を示す。対照的に、ＰＡＣ−１を与えたマウスは目に見える灰色の物体をほとんど有していない。
【０１５０】
【表３】
0005513741.tif 000013
【０１５１】
【表４】
0005513741.tif 000014
【０１５２】
〔実施例６：肺癌のマウスモデルにおけるＰＡＣ−１の試験〕
[00165]  ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺癌）細胞を使用して、異種移植モデルを用いた。ＰＡＣ−１を腹腔内に（ｉ．ｐ．）１０ｍｇ／ｋｇ与えた。４０ｍｇ／ｋｇのゲフィチニブ（イレッサ（商標）；アストラゼネカ社、ウィルミントン、デラウェア）を用い、グループ当たり５匹のマウスを使用して有効性の比較を行った。図７に結果を示すが、結果は、ＰＡＣ−１が、腫瘍容積という点で成長を低下させることと関連したことを示す。
【０１５３】
〔実施例７：コンビナトリアル誘導体、コンビナトリアル合成、及び治療上の使用〕
[00166]  多くの化合物をＰＡＣ−１構造の誘導体として調製する。ヒドラジド基をアルデヒド基と反応させ、誘導体化合物のコンビナトリアルライブラリーを得る。
【０１５４】
[00167]  Ｌ１〜Ｌ２０と示したヒドラジド前駆物質グループ（ＡＸ）の任意の１つを使用して、１〜２８と示したアルデヒドグループ（ＢＸ）の任意の１つと反応するヒドラジドを生成し、それによって、５６０種のＰＡＣ−１誘導体化合物を得る。本明細書中に記載される方法を使用し、当技術分野で入手可能な知識に従って、誘導体化合物を合成する。図８Ａ及び８Ｂに加えて以下のスキーム及び成分の構造を参照のこと。
【０１５５】
【化１０】
0005513741.tif 000015
【０１５６】
【化１１】
0005513741.tif 000016
【０１５７】
【化１２】
0005513741.tif 000017
【０１５８】
[00168]  一実施形態では、上記誘導体化合物を、たとえば、活性、溶解度、毒性、安定性、及び／又は医薬品の用途に関連したその他の特性を変化させるためにさらに修飾する。
【０１５９】
[00169]  誘導体化合物を抗癌薬剤として使用する。化合物は、抗腫瘍活性、アポトーシス制御、及び／又はプロカスパーゼ−３活性化を有することが可能であるとして確認されている。たとえば、新たに除去した大腸癌の一次試料を、プロカスパーゼ−３レベル及び試験化合物レベルに対する細胞の感受性を評価するために使用する。ここで試験化合物はＰＡＣ−１又は誘導体化合物である。正常細胞に対する、癌性細胞における細胞死を誘導する傾向に関して、化合物を分類する。
【０１６０】
[00170]  誘導体化合物のさらなる評価において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び生体内での試験を行う。肝臓ミクロソームへの暴露に関する安定性を評価する。
【０１６１】
〔実施例８：ＰＡＣ−１と比べたある種の誘導体の活性〕
[00171]  ＰＡＣ−１及びある種の誘導体をＨＬ−６０細胞株で試験し、ＩＣ５０値を測定した。表５に結果を示す（Ｌ−及びＲ−の指定は上記のＡＸ及びＢＸのシリーズに示した構造をそれぞれ指す）。ＰＡＣ−１誘導体のいくつかは、概してＰＡＣ−１化合物の活性レベルよりも約１桁大きい活性レベルを示した。
【０１６２】
【表５】
0005513741.tif 000018
【０１６３】
〔参照による援用及び変形形態に関する記載〕
[00172]  本出願にわたるすべての参考文献、たとえば発行された若しくは許可された特許又は均等物を含む特許文献、特許出願公開、非公開特許出願、及び非特許文献又は他の資料は、それぞれの参考文献が本出願における本開示と少なくとも部分的に矛盾していない程度に個々に引用されるように（たとえば、部分的に矛盾した参考文献の部分を除いて、部分的に矛盾した参考文献が参照により援用される）、これによってそれらの全体が参照により本明細書中に援用される。
【０１６４】
[00173]  本明細書に対するいかなる添付又は付録をも明細書及び／又は図面の一部として参照により援用される。
【０１６５】
[00174]  用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、又は「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書中で使用される場合、それらは、言及された、定まった特徴、完全体、ステップ、又は成分の存在を明示するとして解釈され、１つ又は複数の他の特徴、完全体、ステップ、成分、又はそれらのグループの存在又は追加を排除するものではないと解釈される。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、又は「〜を含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」が文法上類似する用語、たとえば、「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ／ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ））」又は「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ／ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」と任意選択で置換される本発明の個々の実施形態もまた包含されることが意図され、それにより、必ずしも同延でないさらなる実施形態を記載する。説明として、本明細書中に使用されるように、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、又は「〜を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義であり、包括的又は無制限であり、追加の、記載されなかった要素又は方法ステップを除外しない。本明細書中に使用されるように、「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、請求項の要素に明示されていないいかなる要素、ステップ、成分、又は原料をも除外する。本明細書中に使用されるように、「本質的に〜成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、請求項の基本的で新規な特徴に実質的に影響しない（たとえば、活性成分に影響しない）材料又はステップを除外しない。本明細書中の各例において、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「本質的に〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」、及び「〜から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」のいずれも他の２つの用語のうちのいずれかと置換してもよい。例証的に本明細書中に記載された本発明は、具体的に本明細書中に開示されていない任意の要素又は要素（複数）、限定又は限定（複数）の非存在下で適切に実行してもよい。
【０１６６】
[00175]  本発明は、様々な特定の好ましい実施形態及び技術に関して記載された。しかしながら、本発明の精神及び範囲内にとどまる一方で、多くの変形形態及び修飾形態を作製してもよいことが理解されるべきである。具体的に本明細書中に記載されたもの以外の組成物、方法、装置、装置要素、材料、任意の特徴、手順、及び技術は、広く本明細書中に開示されるように、過度の実験に頼ることなく本発明の実行に用いることができることを当業者は十分に理解するであろう。本明細書中に記載された組成物、方法、装置、装置要素、材料、手順、及び技術並びにそれらの部分の、技術的に知られている機能的な均等物はすべて、本発明により包含されることが意図される。範囲を開示する場合は常に、部分範囲及び個々の値すべてが包含されることが意図される。本発明は、図面に示された又は明細書に例示されたいかなるものをも含む開示された実施形態により限定されず、実施形態は、限定としてではなく実施例又は例証として与えられる。本発明の範囲は請求項のみにより限定されるものとする。
【０１６７】
〔参考文献〕
[00176]  次の出願は、特に、その全体が参照により援用される。２００３年１０月３０日に提出されたＨｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒらによる米国仮特許出願第６０／５１６５５６号；２００４年８月２０日に提出されたＨｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒらによる米国仮特許出願第６０／６０３２４６号；２００４年１０月２７日に提出されたＨｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒらによる米国特許出願第１０／９７６１８６号。
【０１６８】
[00177]  米国特許第６７６２０４５号  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ；米国特許第６５３４２６７号  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅｓ；米国特許第６４０３７６５号  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  Ａｐａｆ−１  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ；２００５年４月１２日に発行されたＣｈｏｏｎｇらによる米国特許第６３０３３２９号及び第６８７８７４３号；２００４年４月２２日に公開されたＷａｎｇ，Ｘｉａｏｄｏｎｇらによる米国特許公開第２００４００７７５４２号；２００４年９月１６日に公開されたＳｈｉ，Ｙｉｇｏｎｇによる米国特許公開第２００４０１８０８２８号。
【０１６９】
Ｓｌｅｅ  ＥＡら，Ｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｋｅｔｏｎｅ（Ｚ−ＶＡＤ．ＦＭＫ）ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ＣＰＰ３２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９６  ＡＰＲ  １；３１５（Ｐｔ１）：２１−４．
【０１７０】
１．  Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．＆  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．  Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｅｌｌ  １００，５７−７０（２０００）．
２．  Ｏｋａｄａ，Ｈ．＆  Ｍａｋ，Ｔ．Ｗ．  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４，５９２−６０３（２００４）．
３．  Ｒｏｙ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ  ｄｏｒｍａｎｃｙ  ｂｙ  ａｎ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  “ｓａｆｅｔｙ  ｃａｔｃｈ”  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８，６１３２−６１３７（２００１）．
４．  Ｓｖｉｎｇｅｎ，Ｐ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｍａｃｈｉｎｅ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｐａｎｅｌ．  Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０，６８０７−６８２０（２００４）．
５．  Ｌｏｗｅ，Ｓ．Ｗ．，  Ｃｅｐｅｒｏ，Ｅ．＆  Ｅｖａｎ，Ｇ．  Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３２，３０７−３１５  （２００４）．
６．  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．＆  Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．  Ａｃｈｉｌｌｅｓ’  ｈｅｅｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１２，８６５−８６６（２００１）．
７．  Ｔｒａｖｅｎ，Ａ．，  Ｈｕａｎｇ，Ｄ．Ｃ．＆  Ｌｉｔｈｇｏｗ，Ｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｉｊａｃｋｉｎｇ：  ｋｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｈｅｌｄ  ｃａｐｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅｉｒ  ｗｉｌｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ５，１０７−１０８（２００４）．
８．  Ｓｏｅｎｇａｓ，Ｍ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ａｐａｆ−１  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９，２０７−２１１（２００１）．
９．  Ｗａｊａｎｔ，Ｈ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＦＬＩＣＥ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＦＬＩＰ）ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌ．  Ｉｎｔｅｒｖ．  ３，１２４−１２７（２００３）．
１０．  Ｄｅｎｉｃｏｕｒｔ，Ｃ．＆  Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，１４１１−１４１３（２００４）．
１１．  Ｖａｓｓｉｌｅｖ，Ｌ．Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ＭＤＭ２．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３，８４４−８４８（２００４）．
１２．  Ｄｅｇｔｅｒｅｖ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ＢＨ３  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｂｃｌ−ＸＬ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ３，１７３−１８２（２００１）．
１３．  Ｂｅｃａｔｔｉｎｉ，Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ，  ｉｎ−ｃｅｌｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｂｃｌ−ＸＬ．  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．  １１，３８９−３９５（２００４）．
１４．  Ｗａｎｇ，Ｊ．−Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  Ｂｃｌ−２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ９７，７１２４−７１２９（２０００）．
１５．  Ｌｉ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｍａｃ  ｍｉｍｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ  ＴＲＡＩＬ−ａｎｄ  ＴＮＦａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０５，１４７１−１４７４（２００４）．
１６．  Ｎｇｕｙｅｎ，Ｊ．Ｔ．＆  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ  ａｓ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．  １００，７５３３−７５３８（２００３）．
１７．  Ｊｉａｎｇ，Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｓｔｉｎｃｉｔｉｖｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ＰＨＡＰ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｈｙｍｏｓｉｎ−α  ｉｎ  ａ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，２２３−２２６（２００３）．
１８．  Ｂｏａｔｒｉｇｈｔ，Ｋ．Ｍ．＆  Ｓａｌｖｅｓｅｎ，Ｇ．Ｓ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １５，７２５−７３１（２００３）．
１９．  Ｎａｋａｇａｗａｒａ，Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  （ＩＣＥ）  ａｎｄ  ＣＰＰ３２  ｉｎ  ｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７，４５７８−４５８４（１９９７）．
２０．  Ｉｚｂａｎ，Ｋ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ／Ｃｅｄ−３−ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，  ｃａｓｐａｓｅ−３／ＣＰＰ３２，  ｉｎ  Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １５４，１４３９−１４４７（１９９９）．
２１．  Ｐｅｒｓａｄ，Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏ．  １７，８６１−８６７（２００４）．
２２．  Ｐｏｐ，Ｃ．，  Ｆｅｅｎｅｙ，Ｂ．，  Ｔｒｉｐａｔｈｙ，Ａ．＆  Ｃｌａｒｋ，Ａ．Ｃ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３  ｄｉｍｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ａｆｆｅｃｔ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｚｙｍｏｇｅｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２，１２３１１−１２３２０（２００３）．
２３．  Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ，Ｈ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７３，２７０８４−２７０９０（１９９８）．
２４．  Ｄｅｎａｕｌｔ，Ｊ．−Ｂ  ＆  Ｓａｌｖｅｓｅｎ，  Ｇ．Ｓ．  Ｈｕｍａｎ  ｃａｓｐａｓｅ−７  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｔｓ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７８，３４０４２−２４０５０（２００３）．
２５．  Ｐｕｔｔ，Ｋ．Ｓ．，  Ｂｅｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｊ．＆  Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ，Ｐ．Ｊ．  Ｄｉｒｅｃｔ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  （ＰＡＲＰ）  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓ  ａ  ｍｅａｎｓ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅｓ．  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ６，５３−５５（２００５）．
２６．  Ｌｉａｎｇ，Ｙ．，  Ｎｙｌａｎｄｅｒ，  Ｋ．Ｄ．，  Ｙａｎ，Ｃ．＆  Ｓｃｈｏｒ，Ｎ．Ｆ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ  ３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｂｃｌ−２  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｉｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  Ｂｃｌ−２．  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６１，１４２−１４９（２００２）．
２７．  Ｆｕｊｉｔａ，Ｎ．，  Ｎａｇａｈｓｈｉ，Ａ．，  Ｎａｇａｓｈｉｍａ，Ｋ．，  Ｒｏｋｕｄａｉ，Ｓ．＆  Ｔｓｕｒｕｏ，Ｔ．  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｆｔｅｒ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  Ｂｃｌ−ＸＬ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｃａｓｐａｓｅ−３−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７，１２９５−１３０４（１９９８）．
２８．  Ｅａｒｎｓｈａｗ，Ｗ．Ｃ．，  Ｍａｒｔｉｎｓ，Ｌ．Ｍ．＆  Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃａｓｐａｓｅｓ：  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６８，３８３−４２４（１９９９）．
２９．  Ｋｏｔｙ，Ｐ．Ｐ．，  Ｚｈａｎｇ，Ｈ．＆  Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．Ｌ．  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｂｃｌ−２  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ２３，１１５−１２７（１９９９）．
【０１７１】
国立医学図書館／国立衛生研究所（ＮＩＨ）の国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベース、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／  ＣＡＳＰ３（カスパーゼ３、アポトーシス関連システインプロテアーゼ［ホモサピエンス］  遺伝子IＤ：８３６  遺伝子座タグ：ＨＧＮＣ：１５０４；ＭＩＭ：６００６３６  ２００５年５月１５日に更新。他の別名：ＨＧＮＣ：１５０４、アポパイン、ＣＰＰ３２、ＣＰＰ３２Ｂ、ＳＣＡ−１；他の指定：ヒトプロカスパーゼ３コード配列；ＰＡＲＰ切断プロテアーゼ；ＳＲＥＢＰ切断活性１；Ｙａｍａ；カスパーゼ３；システインプロテアーゼＣＰＰ３２）を検索するために遺伝子データベースを使用。
【０１７２】
Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ＰＪ．Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ：ａ  ｕｓｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ  ａｎｄ  ａ  ｃａｌｌ  ｔｏ  ｃｈｅｍｉｓｔｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００６．
Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ＳＫ，Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ＰＪ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００６．
Ｇｏｏｄｅ  ＤＲ，Ｓｈａｒｍａ  ＡＫ，Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ＰＪ．Ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｔｏ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｐｒｏｂｅ  ｔｈｅ  Ｓ１’ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ａｎｄ  ｃａｓｐａｓｅ−７．Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ．２００５  Ａｕｇ  ４；７（１６）：３５２９−３２．ＰＭＩＤ：１６０４８３３４．
Ｄｏｔｈａｇｅｒ  ＲＳ，Ｐｕｔｔ  ＫＳ，Ａｌｌｅｎ  ＢＪ，Ｌｅｓｌｉｅ  ＢＪ，Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏ  Ｖ，Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ＰＪ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｇ１  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｒｒｅｓｔ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００５  Ｊｕｎ  ２２；１２７（２４）：８６８６−９６．ＰＭＩＤ：１５９５４７７４．
Ｐｕｔｔ  ＫＳ，Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ＰＪ．Ａ  ｎｏｎｒａｄｉｏｍｅｔｒｉｃ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＰＡＲＧ）：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４  Ｏｃｔ  １５；３３３（２）：２５６−６４．ＰＭＩＤ：１５４５０８００．
Ｐｕｔｔ  ＫＳ，Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ＰＪ．Ａｎ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−１（ＰＡＲＰ−１）  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＡＤ（＋）：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４  Ｍａｒ  １；３２６（１）：７８−８６．ＰＭＩＤ：１４７６９３３８．
Ｎｅｓｔｅｒｅｎｋｏ  Ｖ，Ｐｕｔｔ  ＫＳ，Ｈｅｒｇｅｎｒｏｔｈｅｒ  ＰＪ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｔｈａｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００３  Ｄｅｃ  ３；１２５（４８）：１４６７２−３．ＰＭＩＤ：１４６４０６１９．
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１Ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＡＣ−１によるプロカスパーゼ−３の活性化及び活性カスパーゼ−３。ＰＡＣ−１は、ＥＣ５０＝０．２２μＭでプロカスパーゼ−３を活性化する。エラーバーは、平均値からの標準偏差を表す。
【図１Ｂ】ＰＡＣ−１により誘導される活性カスパーゼ−３へのプロカスパーゼ−３の切断。プロカスパーゼ−３をＮ末端Ｈｉｓ−６タグを用いて大腸菌中で組換え発現させ、精製した。免疫ブロットは抗Ｈｉｓ−６抗体を用いて行った。ＰＡＣ−１非存在下でプロカスパーゼ−３の成熟は観察されない。１００μＭ  ＰＡＣ−１存在下で、ｐ１９フラグメントを生成する切断が１時間以内に観察され、＞５０％の切断が４時間後に観察される。
【図２Ａ】プロカスパーゼ−３の「安全装置」領域における変異体のＰＡＣ−１による活性化。ＰＡＣ−１は、野性型プロカスパーゼ−３（ＤＤＤ）に対して０．２２μＭの活性化のためのＥＣ５０並びにある種の変異体については２．７７μＭ（ＤＡＤ）、１１３μＭ（ＤＤＡ）、及び１３１μＭ（ＡＤＤ）の対応するＥＣ５０値を有している。
【図２Ｂ】ＰＡＣ−１は、４．５μＭのＥＣ５０でプロカスパーゼ−７を活性化する。
【図２Ｃ】プロカスパーゼ−３のＰＡＣ−１の活性化についてのｐＨへの依存性。低ｐＨでは、安全装置は「オフ」の状態にあり、プロカスパーゼ−３は本質的に最大限に活性化される。エラーバーは、平均値からの標準偏差を表す。
【図３Ａ】ＰＡＣ−１は、ＨＬ−６０細胞におけるアポトーシスを誘導する。Ａ）１００μＭ  ＰＡＣ−１での２０時間の処置の後のホスファチジルセリン露出（アネキシン−Ｖ染色により測定される）。
【図３Ｂ】１００μＭ  ＰＡＣ−１での２０時間の処置の後のヘキスト染色により可視化されるクロマチン凝縮。
【図４Ａ】１０μＭエトポシドで処置したＨＬ−６０細胞におけるミトコンドリア膜脱分極（ＭＭＰ）及びカスパーゼ−３様活性。
【図４Ｂ】１００μＭ  ＰＡＣ−１で処置したＨＬ−６０細胞におけるミトコンドリア膜脱分極（ＭＭＰ）及びカスパーゼ−３様活性。
【図４Ｃ】ＰＡＣ−１処置（１００μＭ）は、細胞内カスパーゼ−３／−７の即時活性化と一致する、ＨＬ−６０細胞における細胞内ＰＡＲＰ活性の急速な減少を誘導する。対照的に、エトポシド（１０μＭ）処置細胞は、ずっと後の時点でのＰＡＲＰ活性の減少を示す。
【図４Ｄ】ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３依存的に細胞死を誘導する。多くの多様な癌細胞株について、プロカスパーゼ−３レベルを求め（フローサイトメトリーにより）、ＰＡＣ−１のＩＣ５０を測定した（Ｒ２＝０．９８２２）。ＰＡＣ−１は、高度なレベルのプロカスパーゼ−３を有するとして知られているＮＣＩ−Ｈ２２６肺癌細胞株において相当効力がある（ＩＣ５０＝０．３５μＭ）が、健常なヒトドナーの骨髄に由来する正常な白血球において効力が著しく少ない。
【図４Ｅ】ＰＡＣ−１は、プロカスパーゼ−３依存的に細胞死を誘導する。多くの多様な癌細胞株について、プロカスパーゼ−３レベルを求め（フローサイトメトリーにより）、ＰＡＣ−１のＩＣ５０を測定した（Ｒ２＝０．９８２２）。ＰＡＣ−１は、高度なレベルのプロカスパーゼ−３を有するとして知られているＮＣＩ−Ｈ２２６肺癌細胞株において相当効力がある（ＩＣ５０＝０．３５μＭ）が、健常なヒトドナーの骨髄に由来する正常な白血球において効力が著しく少ない。
【図５Ａ】数名の患者からの正常細胞及び癌性細胞中の相対的なプロカスパーゼ−３レベルを示す。
【図５Ｂ】様々な相対的なプロカスパーゼ−３レベルを有する様々な細胞型におけるＰＡＣ−１のＩＣ５０レベルを示す。
【図５Ｃ】腫瘍成長の結果に対するＰＡＣ−１での動物の処置の効果を示す。
【図５Ｄ】腫瘍成長の結果に対するＰＡＣ−１での動物の経口処置の効果を示す。
【図５Ｅ】対照処置群、ＰＡＣ−１処置群、及びゲフィチニブ（イレッサ（商標）；アストラゼネカ社）処置群についての肺癌モデルにおける癌の進行の結果を示す図である。腫瘍細胞をｉ．ｖ．投与によりマウスに注射し、イレッサ及びＰＡＣ−１を１００ｍｇ／ｋｇで経口的に与えた。
【図６Ａ】３名の患者の正常細胞及び癌性細胞中の相対的なプロカスパーゼ−３レベルを示す。
【図６Ｂ】患者３からの正常細胞及び癌性細胞のＰＡＣ−１での処置に対する感受性を示す。
【図７】肺癌のマウスモデルという状況におけるＰＡＣ−１の腹腔内投与の結果を示す。
【図８Ａ】ＰＡＣ−１誘導体及びコンビナトリアルライブラリーの化合物の構造を示す。
【図８Ｂ】ＰＡＣ−１誘導体及びコンビナトリアルライブラリーの化合物の構造を示す。
【図９】ホモサピエンス  カスパーゼ３、アポトーシス関連システインペプチダーゼ（ＣＡＳＰ３）、転写バリアントアルファ、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。（受託番号ＮＭ＿００４３４６；２６８９ｂｐ  ｍＲＮＡ直鎖状；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚから入手）。
【図１０】ホモサピエンス  カスパーゼ７、アポトーシス関連システインペプチダーゼ（ＣＡＳＰ７）、転写バリアントアルファ、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。（受託番号ＮＭ＿００１２２７；２６０５ｂｐ；ｍＲＮＡ直鎖状；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．  ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚから入手）。
【図１Ａ】
0005513741.tif 000020
【図１Ｂ】
0005513741.tif 000021
【図２Ａ】
0005513741.tif 000022
【図２Ｂ】
0005513741.tif 000023
【図２Ｃ】
0005513741.tif 000024
【図３Ａ】
0005513741.tif 000025
【図３Ｂ】
0005513741.tif 000026
【図４Ａ】
0005513741.tif 000027
【図４Ｂ】
0005513741.tif 000028
【図４Ｃ】
0005513741.tif 000029
【図４Ｄ】
0005513741.tif 000030
【図４Ｅ】
0005513741.tif 000031
【図５Ａ】
0005513741.tif 000032
【図５Ｂ】
0005513741.tif 000033
【図５Ｃ】
0005513741.tif 000034
【図５Ｄ】
0005513741.tif 000035
【図５Ｅ】
0005513741.tif 000036
【図６Ａ】
0005513741.tif 000037
【図６Ｂ】
0005513741.tif 000038
【図７】
0005513741.tif 000039
【図８Ａ】
0005513741.tif 000040
【図８Ｂ】
0005513741.tif 000041
【図９】
0005513741.tif 000042
【図１０】
0005513741.tif 000043
【配列表】
0005513741000001.app