(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号４及び配列番号８からなる群から選択されたアミノ酸配列のみからなるポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、小胞体の膜結合形態下にて、同アミノ酸配列と融合される組換えポリペプチドを保留させるために使用される、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のアミノ酸配列のみからなるポリペプチドと、前記アミノ酸配列がタンパク質のＣ末端またはＮ終末端に融合されている該タンパク質と、を含む組換えタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質が酵素、抗体またはその部分、レポータータンパク質、組換えタンパク質、および治療的に活性なタンパク質よりなる群から選択される、請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
前記タンパク質が、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、デカルボキシラーゼ、エピメラーゼ、ヌクレオチド糖トランスポーターよりなる群から選択された酵素である、請求項２に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
請求項１記載のアミノ酸配列、または請求項３もしくは４に記載の組換えタンパク質をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む核酸ベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のアミノ酸配列のみからなる１つのポリペプチド、
請求項３または４に記載の１つの組換えタンパク質、および
請求項６に記載の１つの核酸ベクター、
のうちの少なくとも一つを含む植物細胞。
【請求項８】
前記植物細胞が請求項３または４に記載の少なくとも１つのタンパク質を含み、該タンパク質が異種タンパク質である、請求項７に記載の植物細胞。
【請求項９】
請求項１に記載のアミノ酸配列のみからなる１つのポリペプチド、
請求項３または４に記載の１つの組換えタンパク質、および
請求項６に記載の１つの核酸ベクター、
のうちの少なくとも一つを含む植物。
【請求項１０】
前記植物が請求項３または４に記載の少なくとも１つのタンパク質を含み、該タンパク質が異種タンパク質である、請求項９に記載の植物。
【請求項１１】
前記植物がアルファルファ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、アカナス（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、およびトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）よりなる群から選択される、請求項９または１０に記載の植物。
【請求項１２】
翻訳後修飾されたポリペプチドの産生方法であって、
−植物細胞を請求項６に記載の少なくとも１つの核酸ベクターでトランスフェクトまたは形質転換する工程であって、該ベクターは、翻訳後修飾される前のポリペプチドである組換えタンパク質、または該ポリペプチドとは異なる組換えタンパク質をコードする工程と、
−前記トランスフェクトされた植物細胞を成長させる工程と、
−翻訳後修飾されたポリペプチドを収穫する工程と、
からなり、
前記組換えタンパク質が前記ポリペプチドとは異なる場合、当該方法は、前記植物細胞を前記ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸ベクターでトランスフェクトする工程をさらに含む、方法。
【請求項１３】
前記組換えタンパク質が、翻訳後修飾される前のポリペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えタンパク質が前記ポリペプチドとは異なり、前記組換えタンパク質が、前記ポリペプチドを認識し前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはその部分である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記組換えタンパク質が前記ポリペプチドとは異なり、前記組換えタンパク質が前記ポリペプチドの翻訳後修飾に関与する同種または異種酵素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記組換えタンパク質が前記ポリペプチドとは異なり、前記組換えタンパク質が、前記ポリペプチドの翻訳後修飾に関与する酵素を調節する抗体またはその部分である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドが貯蔵タンパク質と同時発現される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドの翻訳後修飾が、小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置（ＧＡ）の少なくとも一方のコンパートメント膜において行われる、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記翻訳後修飾されたポリペプチドが治療的に活性なタンパク質である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物細胞が、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、アカナス（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、およびトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）よりなる群から選択される植物に関連する細胞である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組換えポリペプチドが膜タンパク質であり、かつ前記アミノ酸配列が前記膜タンパク質を前記小胞体に固定させる、請求項１に記載のポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質産生の分野に関し、さらに詳しくは、小胞体（ＥＲ）および／またはゴルジ装置（ＧＡ）において翻訳後修飾された組換えポリペプチドを産生する方法に関する。本発明は、組換えポリペプチドの翻訳後修飾を制御するのに有用なツール、より一般的には、植物遺伝子的修飾のためのＤＮＡ操作ツールを提供する。また本発明は、これらのツールに関連する組換えポリペプチドを産生するためのプロセスも提供する。
【０００２】
本発明のツールは、宿主細胞におけるその合成の間の組換えポリペプチドの特異的細胞内コンパートメントへのソーティングを可能とする、および該細胞内コンパートメントでの該組換えポリペプチドの特異的設計も可能とする標的化シグナルを含む。本発明は、有利には、例えば、組換えポリペプチドの産生の収率の増加、組換えポリペプチドの免疫原性の制限または予防、およびそれらの天然相当物の正確なコピーである治療的に活性な組換えポリペプチドの入手を可能とする。
【０００３】
本発明は、特に、植物が作成した医薬品（ＰＭＰ）の再配向の分野に関する。
また、本発明は、標的化シグナルと融合された単一鎖可変断片（ＳｃＦｖ）とのタンパク質相互作用を用いる植物作成医薬品の免疫標的化の分野にも関する。
【０００４】
また、本発明は、植物作成医薬品の翻訳後修飾に関与する植物酵素の再配向の分野にも関する。
また、本発明は、植物作成医薬品の翻訳後修飾に関与する異種酵素の再配向の分野にも関する。
【背景技術】
【０００５】
組換えＤＮＡ技術は、宿主系における異種組換えタンパク質の産生を可能とした。初期の研究の大部分は原核生物宿主、主に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における組換え治療的タンパク質の発現に向けられていた。産生系としての原核生物の利点は、それらを遺伝子的に操作することができる容易性、それらの迅速な成長、および組換えタンパク質の高発現レベル、ならびに大規模な発酵の可能性である。
【０００６】
しかしながら、シグナルペプチド切断、プロペプチドプロセッシング、タンパク質フォールディングすなわち折畳み、ジスルフィド結合形成およびグリコシル化を含めたいくつかの翻訳後修飾（ＰＴＭ）を原核生物において行うことはできないであろう。その結果、原核生物で産生された複雑な治療タンパク質は、所望の程度の生物学的活性を提供するように常に適切に折り畳まれるとは限らないか、またはプロセッシングされるとは限らない。その結果として、微生物発現系は、一般には、生物学的に活性となるように、折畳みや広範な翻訳後プロセッシングを必要としない、インスリン、インターフェロンまたはヒト成長ホルモンのような比較的単純な治療タンパク質の発現に用いられてきた。
【０００７】
治療タンパク質の産生のための原核生物が制限されているため、バイオテクノロジー産業は、哺乳動物細胞培養、酵母、真菌、昆虫細胞、およびトランスジェニック動物のような真核生物宿主にその努力を注いできた。しかしながら、これらの産生系は、高価な発酵、低い収率、分泌の問題、高操作コスト、大容量への拡大の困難性、およびウイルスまたはプリオンによる汚染可能性のような種々の欠点を有する（Ｇｏｍｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２００４（参考文献２３））。
【０００８】
植物細胞および植物浮遊培養細胞は、良好な代替法、すなわち、有利なコスト、ヒトに対する病原性汚染が無い、を表わすことができる（Ｇｏｍｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２００４（参考文献２３））。
【０００９】
しかしながら、全ての真核生物細胞の主な問題の１つに、不適切な転写後修飾（ＰＴＭ）がある。
事実、治療タンパク質の大部分は、遺伝子からの遺伝的情報が、機能的遺伝子産物の形成を指令する最終工程であるいくつかのＰＴＭを受ける。
【００１０】
本明細書中においては、用語「ＰＴＭ」は、個々のアミノ酸残基の誘導体を生じる共有結合修飾、例えば、グリコシル化、リン酸化、メチル化、ＡＤＰ−リボシル化、酸化および糖化、ポリペプチド骨格に関連する反応によるタンパク質分解プロセッシング、および脱アミド化、ラセミ化のような非酵素修飾、およびタンパク質立体配座の自然な変化を網羅する。
【００１１】
ＰＴＭのほとんどは、真核生物細胞における内膜系の存在に依存する。分泌経路は、添付の図１に表わされるように、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ装置（ＧＡ）、トノプラスト、リソソームコンパートメント、原型質膜、および細胞外媒体から構成される。最近の研究は、初期コンパートメント（ＥＲおよびＧＡ）が、恐らくは、膜連続体から構成されることを示している（図１参照。ＥＲおよびゴルジ連続体のドメインを以下に示す。
【表１】
0005568702.tif 000002
）。しかしながら、ＥＲにおける、ＥＲおよびＧＡの間の、およびゴルジにおけるタンパク質輸送の詳細な研究によると、タンパク質が植物細胞では酵素的に区別される４つのドメインにサブコンパートメント化されることを示されている（図１参照：ドメイン青色、黄色、緑色およびオレンジ色）。
【００１２】
血液タンパク質、サイトカイン、免疫グロブリン、構造タンパク質、（成長）ホルモン、ワクチン、酵素およびリソソームタンパク質を含めたほとんどの治療タンパク質は、ＥＲのルーメンに同時翻訳によって挿入され、次いで、ＧＡを介してリソソームコンパートメント、細胞外マトリックスまたは血流に輸送される。治療タンパク質のほとんどの修飾は、その初期コンパートメント（ＥＲおよびＧＡ，Ｇｏｍｏｒｄ  ａｎｄ  Ｆａｙｅ，２００４（参考文献２１）参照）を除いて分泌経路で起こる。
【００１３】
例えば、凝固第ＩＸ因子は、ＥＲにおいて４６１アミノ酸の前駆体分子として合成されたビタミン−Ｋ−依存性糖タンパク質である。生物学的に活性な第ＩＸ因子を得るためには、この前駆体は、シグナルペプチドおよびプロペプチドの切断、ジスルフィドブリッジの形成、最初の１２のグルタミン酸残基のγ−カルボキシル化、アスパルテート６４の部分的β−ヒドロキシル化、アスパラギン（Ａｓｎ）１５７およびＡｓｎ１６７におけるＮ−結合グリコシル化、セリン（Ｓｅｒ）６３、Ｓｅｒ６１、スレオニン（Ｔｈｒ）１５９、Ｔｈｒ１６９、Ｔｈｒ１７２およびＴｈｒ１７９におけるＯ−結合グリコシル化、チロシン（Ｔｙｒ）の硫酸化、およびＳｅｒ１５８のリン酸化を含めた、ＥＲにおける、およびＧＡにおける広範な翻訳後修飾を受ける。これは、これまでに観察された治療タンパク質の最も複雑な成熟化の１つである。
【００１４】
より一般的には、ほとんどの治療タンパク質は、それらの生物活性、薬物動態、安定性および溶解性のために少なくともタンパク質切断およびグリコシル化を必要とする。
真核生物細胞はそれらの修飾のほとんどを実現することができる。しかしながら、これらの成熟はより一般的には宿主系に特異的である。さらに、翻訳後修飾は植物細胞に対して哺乳動物細胞とは異なる。植物では、他の真核生物細胞におけるように、Ｎ−グリコシル化はＥＲにおいて開始し、可能なＮ−グリコシル化配列であるＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒを構成する特異的アスパラギン残基へオリゴ糖前駆体（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）が同時翻訳付加される。一旦生じて間もないタンパク質上に移動すれば、分泌された糖タンパク質が分泌経路に沿って輸送される間に、オリゴ糖前駆体は、添付の図２に模式的に示されたようにＥＲおよびＧＡにおける糖残基の除去または付加に関連するいくつかの成熟を受ける。植物および哺乳動物Ｎ−グリカン成熟が異なるのは後期ＧＡにおいてのみであり、この結果、ＰＭＰのＮ−グリカンにおけるα−（１，６）−結合フコース、β（１，４）−結合ガラクトースおよびシアル酸の不存在、および分岐β（１，２）−キシロースおよびコアα−（１，３）−フコースの存在を生じさせる（添付の図２参照）。
【００１５】
ここでは、異種発現系における同時翻訳および翻訳後成熟を制御できることは非常に重要である。
植物ＥＲ−存在タンパク質の構造分析は、かかるタンパク質が主として高マンノース型のＮ−グリカンを備えていることを示している（Ｎａｖａｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（参考文献４１），１９９８（参考文献４２）；Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（参考文献４９））。これらのオリゴ糖構造は植物および哺乳動物に共通しており、従って、免疫原性ではない。この観察は、β−（１，２）−キシロース、またはα−（１，３）−フコースのような免疫原生残基の植物作成医薬品（ＰＭＰ）Ｎ−グリカンへの会合を妨げる戦略を示唆している。この戦略は、ＥＲ内での、すなわち、免疫原生グリコエピトープが付加されて植物Ｎ−グリカンを複合体化するゴルジ嚢の上流での組換えタンパク質の貯蔵にある。まず、組換え可溶性タンパク質のＣ末端におけるＨ／ＫＤＥＬ配列の付加が植物ＥＲにおけるその保持で十分であることが示された（Ｇｏｍｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（参考文献２４），１９９９（参考文献２２），Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｔ  ２００４（参考文献５７））。
【００１６】
同一の戦略を用い、我々は、Ｈ／ＫＤＥＬ−ＥＲ保留配列を、２つの異なる抗体の重鎖および軽鎖双方に融合させた。これらの抗体は専ら非免疫原生高マンノース型のＮ−グリカンを表わし（Ｓｒｉｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（参考文献５９）；Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（参考文献５１））、α−マンノシダーゼＩのような、ＥＲおよびシスゴルジに局在化された酵素に制限されたグリカン成熟に基づく非常に有効な再循環を示す（Ｎｅｂｅｎｆｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献４３））。従って、ＥＲ保留シグナルへの融合を通じて免疫原性Ｎ−グリカンのＰＭＰへの会合の防止が可能である。
【００１７】
対照的に、植物ＥＲにおいて膜結合タンパク質を維持する役割を担う分子シグナルについてはほとんど知られていない。
事実、少数の研究のみによってＣ末端ジリシンモチーフの役割（Ｂａｒｒｉｅｕ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ，１９９９（参考文献３）；Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ  ｅｔ  ａｌ，２０００（参考文献４）；ＭｃＣａｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（参考文献３５）；Ｒｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２００６（参考文献５３））、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）の長さ（Ｂｒａｎｄｉｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ（参考文献９））または芳香族アミノ酸豊富化ＥＲ検索シグナル（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（参考文献３５））が提供されている。α−グルコシダーゼＩは、生じたばかりの糖タンパク質上のオリゴ糖前駆体の移動「エンブロック」の直後に該オリゴ糖前駆体から末端側α−
（１，２）−結合グルコース残基を特異的に除去することによってＮ−結合オリゴ糖前駆体の成熟に関与する、最初の酵素である（図２参照）。機能、および、結果として、ＥＲにおけるこのＩＩ型膜タンパク質の位置は、必須である。事実、哺乳動物細胞では、かかるタンパク質が新生児で欠損していると、重度の全般性低血圧症および形成異常特徴を誘導し、７４日齢において致死に至る（Ｄｅ  Ｐｒａｅｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（参考文献１４））。
【００１８】
グリコシル化とは別に、分泌経路の下流のタンパク質移動は、典型的には、標的化シグナルおよび調節ペプチド切断のような特異的タンパク質分解プロセッシングを受ける。Ｎ−グリコシル化に関しては、文献における最近の証拠は、分泌経路におけるタンパク質分解成熟は植物と哺乳動物細胞で同様であることを示唆している。これらの成熟は内因性タンパク質および組換えタンパク質の双方のプロセッシングに必須であるが、それらは、安定した一体的ポリペプチドの高収率産生を大きな課題とする。これらのタンパク質分解成熟も、タンパク質が蓄積される細胞内コンパートメントに依存する（Ｆａｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（参考文献１７））。
【００１９】
分泌経路を通じて輸送される多くの植物タンパク質は、まず、生成直後のポリペプチド鎖を小胞体に向けるＮ末端切断可能シグナルペプチド、またはプレ領域、およびその最終細胞目的地への転位置、および該目的地での処理の前に、成熟タンパク質の安定化、標的化、阻害および／または折り畳みに関与する調節プロ（ポリ）ペプチド、またはプロ領域を含めた、（以下の記載において「翻訳後に修飾されていない」とも呼ばれる）プレプロタンパク質として合成される。シグナルペプチダーゼによるそれらのシグナルペプチドの除去後、タンパク質はＥＲルーメンに放出されて、適切に組み立てられ、かつ折り畳まれ、次いで、ＧＡに転位置され、結局は、さらに下流へ分泌系の異なるコンパートメントまで転位置される。
【００２０】
多くの植物タンパク質はＥＲをプロタンパク質として残し、プロ領域は分泌経路を通ってそれらの経路に沿って下流でタンパク質分解により切断される。これは、特異的プロテアーゼによって空胞へのそれらの輸送の間にまたはその後に除去される、ＣまたはＮ末端切断可能ソーティングシグナルを有する多くの空胞タンパク質の場合に当てはまる。空胞および細胞壁に見出されるＡｓｎ特異的システインプロテイナーゼは、特に、２Ｓアルブミンおよび１１Ｓグロブリンのような種子貯蔵タンパク質や、感染特異的タンパク質、キチナーゼ、グルカナーゼ、レクチン、および創傷誘導性プロテイナーゼ阻害剤のような抗微生物または摂食抑制／抗消化活性を有するタンパク質を含めたいくつかの分泌タンパク質のプロセッシングに関与するであろう。哺乳動物細胞では、多数の分泌タンパク質は、まず、不活性プロタンパク質前駆体として合成され、次いで、分泌経路を移動しつつ可溶性または膜結合プロテアーゼによって翻訳後にプロセッシングされる。
【００２１】
多くの場合、限定されたタンパク質分解によるタンパク質前駆体の活性化が、スブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ、細菌スブチリシンおよび酵母ケキシンと構造的に同様な酵素のファミリーによって行われる。著名なフューリンおよび二塩基性特異的ケキシン様プロテアーゼを含めた哺乳動物プロタンパク質コンバターゼは、一般に、コンセンサス配列（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ｘｎ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）においてタンパク質前駆体を切断し、ここでＸはＣｙｓを除くいずれかのアミノ酸であり、ｎ＝０、２、４または６である。イン・ビボにおいては、トランスゴルジネットワークで通常見出されるこれらの酵素が、種々のタンパク質前駆体を成熟タンパク質に変換し、それにより、チモーゲン活性化、遺伝子発現、細胞周期、プログラム細胞死、細胞内タンパク質標的化、および内分泌／神経機能のような重要なプロセスの微調整に直接的または間接的に貢献する。
【００２２】
実際、植物における動物プロタンパク質のそれらの生物学的に活性な形態への正しいプ
ロセッシングを示すいくつかの例が提供されている。興味深い例がヒトプロコラーゲンについて提供されており、タバコ細胞でかかるコラーゲンがそのＣ−およびＮ末端プロペプチドの切断後に成熟タンパク質に変換されたことが示された。Ｌｉｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（参考文献３２）。
【００２３】
ナス科のタンパク質プロセッシング酵素についての最近の研究によって示されているように、哺乳動物プロセッシングコンバターゼの機能的ホモログが、植物細胞の分泌経路に沿ったタンパク質成熟に関連付けられている。ｋｅｘ２ｐ様プロテアーゼ活性は、ウイルス抗真菌ＫＰ６キラープロトキシンを正確にプロセシング可能なトランスジェニックタバコ系統で起こることが示された。このゴルジに存在するｋｅｘ２ｐ様コンバターゼは、酵母ｋｅｘ２ｐの基質特異性の特徴を呈することが示され、これは、トマトからの細胞外プロタンパク質コンバターゼＬｅＳＢＴ１が、プロセッシング酵素の同一サブファミリーに属する哺乳動物コンバターゼＳＫＩ−１と同様に区別される特異性を呈するとは対照的であった（Ｊａｎｓｉｋ  ｅｔ  ａｌ，２０００（参考文献３１）；Ｒａｕｔｅｎｇａｒｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（参考文献５２））。
【００２４】
より最近では、脂質修飾を受けているタンパク質のＣ末端テトラペプチド、ＣＡＡＸモチーフをプロセッシングする酵母および哺乳動物ＣＡＡＸプロテアーゼの機能的ホモログがアラビドプシスに見出されており、ここでも真核生物細胞の分泌経路に沿ったよく保存されたタンパク質分解プロセスの発生が確認されている（Ｂｒａｃｈａ  ｅｔ  ａｌ，２００２（参考文献７））。
【００２５】
実際の見解より、Ｎ−グリコシル化の全保存された性質と共に細胞レベルにおけるこれらの保存されたプロセスは、複雑な翻訳後修飾を必要とする生物学的または治療的関連の種々のタンパク質の発現および正確なプロセッシングについての植物システムの潜在能力を強く指摘している。
【００２６】
植物においては、α−グルコシダーゼＩは、シロイヌナズナ（シロイヌナズナ）胚発生の間の、貯蔵タンパク質の蓄積、プロテインボディーの形成、細胞分化、および細胞壁破壊の基本原理である。α−グルコシダーゼＩ活性なくしては、シロイヌナズナ種子発生は核心段階でブロックされ（Ｂｏｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１（参考文献６））、および細胞壁生合成は強く影響される（Ｇｉｌｌｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献１９））。
【００２７】
特に真核生物宿主では、特に植物細胞では、遺伝子組換えによってタンパク質を生じさせて、設計されたまたは組み換え作成された転写後修飾組換えタンパク質を産生し、例えば、宿主において、それらの天然相当物と実質的に同一であり、かつより少ない可能な免疫原性特性を有する異種タンパク質を発現させて、特にヒトについて治療物質として使用可能とする手段の技術が依然として要望されている。
【００２８】
本発明の発明者らは、シロイヌナズナグルコシダーゼＩにＥＲ保留期間を付与する２つの独立したタイプのシグナルを同定した。ＧＦＰに融合させたこのグルコシダーゼの種々の欠失または突然変異を用いて、シロイヌナズナα−グルコシダーゼＩ（以後、ＧＣＳＩと命名する）の全長がＥＲに厳格に蓄積され、レポーターをＥＲに標的化するのに十分なサイトゾルテイルに局在化されたＡｒｇベースのモチーフを含有することを示した。しかしながら、これらの機能的Ａｒｇベースのシグナルは全長ＧＣＳＩをこのコンパートメントに局在化するのに必要とされず、この膜結合ＥＲ酵素のステムに第２のシグナルが同定されている。
【００２９】
本発明の発明者らは、シロイヌナズナグリコシルトランスフェラーゼにＧＡ保留期間を
付与する３つの独立したタイプのシグナルを同定した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明の目的は、正確には、この要望に対応する有効なツールを提供することである。本発明のツールは、標的化または保留シグナル、およびこれらの標的化シグナルに関連するプロセスの形態である。本発明は、一般には、これらの標的化または保留シグナルを用いた種々の方法による、組換えポリペプチドの翻訳後成熟の修飾をその対象とする。
【００３１】
植物酵素またはヒト酵素（例えばグリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの）の輸送および局在化に対するそれらの多数の研究に基づき、本発明者らは、特に、植物細胞において、ＥＲおよびＧＡの間の膜タンパク質の分布に特異的に関与する種々のペプチドシグナルを同定した。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
従って、本発明の第１の態様は、特に植物細胞において、特異的細胞サブコンパートメントにおける組換えポリペプチドの保留を可能とする、特別なペプチドシグナルを提供することである。これらのペプチドシグナルの配列および構造を以下に記載する。本発明のペプチドシグナルは、参照番号配列番号１〜配列番号３１で添付の配列表（Sequence Listing）にも列挙される。以後、これらのペプチドシグナルを「保留シグナル配列」または「シグナル配列」または「標的シグナル」または「ペプチドシグナル」という。本発明の範囲における好ましい配列は表１に開示された配列である。
【００３３】
本発明の保留シグナル配列は、特に、植物細胞のＥＲおよび／またはＧＡコンパートメント膜へ組換えポリペプチドを特異的に標的化する。これらの配列はＥＲにおける、および／またはＧＡの異なるサブコンパートメントにおける、またはＥＲおよび／またはＧＡの異なるサブコンパートメントでの膜結合形態下での、組換えポリペプチドの保留を可能とする。「標的」または「標的化」とは、本発明のペプチドシグナルに融合されたポリペプチドが、このペプチドシグナルのため、ＥＲおよび／またはＧＡ内に局在化され、すなわち、閉じ込められるであろうことを意味する。
【００３４】
組換えポリペプチドの成熟および安定性は、ポリペプチドが蓄積するコンパートメントによって直接的に決定される。例えば、本発明者らは、ＥＲにおける組換えポリペプチドの保留はそれらの安定性を増加させ、およびそれらのＮ−グリカン成熟を妨げることを示した。また、本発明者らは、膜ポリペプチドとしての可溶性組換えポリペプチドの発現がその安定性を増加させることも示した。最後に、本発明者らは、分泌経路の初期コンパートメントにおける組換えポリペプチドの保留が、該組換えポリペプチドの産生の収率を増加させ、グリカン成熟による免疫原性を妨げることができることを示す。
【００３５】
本発明者らは、本発明の適当なシグナルを、達成されその後呈示される種々の目標のために種々の組換えポリペプチドに融合した。従って、本発明のもう１つの態様は、本発明によるペプチドシグナルと、ポリペプチドとを含む、組換えポリペプチドを提供することにあり、ペプチドシグナルはポリペプチドに融合されている。本発明のペプチドシグナルの融合は、ポリペプチドのＣ末端またはＮ終末端に存在し得る。換言すれば、該ペプチドシグナルはポリペプチドまたはタンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結させることができる。
【００３６】
本発明によると、組換えポリペプチドは、医薬または農業食品産業において興味を有するいずれの組換えポリペプチドであってもよい。「組換えポリペプチド」は本明細書中においては、「組換えタンパク質」または「ペプチドＸ」または「標的タンパク質」と命名
することもできる。しかしながら、本発明の方法を開示する場合、例えば、医薬用途で、産生される組換えポリペプチドを示すのに「組換えポリペプチド」を用い；および組換えポリペプチドの成熟プロセス、すなわち、翻訳後修飾に関与するタンパク質を示すのに「組換えタンパク質」を用いるのが好ましい（方法の記載における以下の説明参照）。
【００３７】
本発明によると、本明細書中においては、「標的ポリペプチド」とも命名されるポリペプチドは、全て膜治療ポリペプチド、膜タンパク質として発現されても、またはされなくてもよい全ての可溶性治療ポリペプチド、全ての抗体およびその断片であってよい。
【００３８】
例えば、組換えポリペプチドは、酵素、抗体またはその部分、レポータータンパク質、ヌクレオチドトランスポーターおよび治療的に活性なポリペプチドを含む群から選択することができる。好ましくは、組換えポリペプチドは可溶性ポリペプチドまたはタンパク質である。
【００３９】
本発明で産生することができる治療的に活性なタンパク質の例は、ワクチン、アレルゲン、酵素、血液タンパク質、ホルモン、抗体、抗体由来断片である。好ましくは、治療的に活性なポリペプチドは可溶性である。「治療ポリペプチド」または「治療的に活性なポリペプチド」は本明細書および特許請求の範囲において同一の意味を有する［すなわち膜結合タンパク質の可溶性部分］。
【００４０】
本発明によると、組換えポリペプチドが酵素である場合、該酵素は植物または動物酵素であってよい。本発明によると、該酵素は、例えば、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、プロテアーゼ、キナーゼ、デカルボキシラーゼ、エピメラーゼ、ヌクレオチド−糖トランスポーター、例えば、ＵＤＰ−糖トランスポーター、ＧＤＰ−糖トランスポーターまたはＣＭＰ−糖トランスポーター、アミド化酵素、および、より一般的には、宿主細胞（例えば植物細胞）のＥＲおよび／またはＧＡに存在してもしなくてもよいいずれかの成熟酵素よりなる群から選択することができる。グリコシダーゼは、例えば、Ｎ−またはＯ−グリコシル化に関与するものであってよい。グリコシルトランスフェラーゼは、例えば、Ｎ−またはＯ−グリコシル化に関与するものであってよい。酵素の例を以下の表に引用する。
【００４１】
【表２】
0005568702.tif 000003
【００４２】
「成熟酵素」とは、宿主細胞において組換えタンパク質の成熟に関与する任意の酵素をいう。
本発明によると、タンパク質が何であっても、それは貯蔵タンパク質またはプロテインボディーに貯蔵されたタンパク質、例えば、ＺＥＲＡ（登録商標）に融合したタンパク質と融合してもよい。これは、宿主細胞における産生後の組換えポリペプチドの回収で興味深い。この点は、本発明のプロセスの記載に照らして以下で議論する。
【００４３】
本発明のもう１つの態様は、本発明のペプチドシグナルをコードする核酸配列を提供することにある。配列番号１〜３１をコードする核酸配列の例を、参照番号配列番号１０２〜１３２で添付の配列表に与える。遺伝暗号の縮合によると、当業者であれば、配列番号１〜３１をコードする他の適当な核酸配列が容易に推定されるであろう。
【００４４】
本発明のさらなる態様は、本発明による組換えポリペプチドをコードする核酸配列を提供することにある。
本発明のさらなる態様は、本発明による核酸配列を含む核酸ベクターを提供することにある。本発明の核酸ベクターは本発明のペプチドシグナルをコードする核酸配列を含み、該核酸は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列とフレーム内でベクターに導入されて、該ポリペプチドの１つの（または双方の）末端（複数の末端）において「保留シグナル配列」を含有する組換えポリペプチドまたはタンパク質を産生する。
【００４５】
いずれかの公知のかつ適当な方法を用いて、これらの核酸および核酸ベクターを構築することができる。例えば、（Ｇｏｒｍｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（参考文献２４）および１９９８（参考文献２５），Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ，２０００（参考文献４９）および２００３（参考文献５０），Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００６（参考文献５８））に開示された方法を有利に用いることができる。
【００４６】
本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも１つのペプチドシグナルおよび／または本発明の少なくとも１つの組換えポリペプチド（すなわち、本発明のペプチドシグナルを含む）、および／または本発明の組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列、および／または本発明の少なくとも１つの核酸ベクターを含む植物細胞を提供することである。本発明によると、該組換えポリペプチドは同種または異種ポリペプチドであってよい。組換えポリペプチドは前記定義の通りであり得る。
【００４７】
任意の公知の適当な方法を用いて、該植物細胞を得ることができる。例えば、（Ｇｏｒｍｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（参考文献２４），１９９８（参考文献２５），Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ，２０００（参考文献４９）および２００３（参考文献５０），Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００６（参考文献５８），Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献５６）に開示された方法を有利に用いることができる。
【００４８】
本発明のさらなる態様は、本発明の少なくとも１つのペプチドシグナル、および／または本発明の少なくとも１つの組換えタンパク質（すなわち、本発明のペプチドシグナルを含む）、および／または本発明の組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列、および／または本発明の少なくとも１つの核酸ベクターを含む植物を提供することである。本発明によると、該組換えタンパク質は同種または異種タンパク質であってよい。組換えタンパク質は前記した通りである。
【００４９】
任意の公知の適当な方法を用いて、該植物を得ることができる。例えば、Ｓａｉｎｔ−ＪｏｒｅＤｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００６（参考文献５８），Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ，２００２（参考文献５６）に開示された方法を有利に用いることができる。
【００５０】
本発明によると、植物は、組換えタンパク質の産生を可能とする任意の適当な植物であってもよい。例えば、植物はアルファルファ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｓｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、タバコ（タバコ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、アカナス（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、イネ（ｏｒｉｚａ  ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（ｚｅａ
ｍａｉｚｅ）、ニセツリガネゴケ（ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、コウキクサ（Ｌｅｍｎａ  ｍｉｎｏｒ）、緑藻、海洋性珪藻（ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ
ｔａｕｒｉ、ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ）、クラミドモナス（ｃｈｌａｍｉｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｌ）を含む群から選択することができる。
【００５１】
本発明によると、植物細胞はこれらの植物のいずれから生じさせてもよいし、または由来してもよい。
本発明者らは、さらに、該組換えポリペプチドの標的化発現のためのベクター設計で形質転換された宿主細胞において、翻訳後修飾された異種ポリペプチドを産生する、第１の方法を提供する。この最初の方法は、添付の図３、行（Ａ）に模式的に表されている。
【００５２】
翻訳後に修飾された組換えポリペプチドを産生するためのこの第１の方法は、
−本発明による少なくとも１つの核酸ベクターで細胞をトランスフェクトまたは形質転換する工程であって、該ベクターは、翻訳後修飾されない場合に前記ポリペプチドである組換えタンパク質をコードする工程と、
−該トランスフェクトされた細胞を成長させる工程と、
−翻訳後修飾されたポリペプチドを収穫する工程と、
を含む。
【００５３】
本発明によると、該プロセスは、さらに、トランスフェクトまたは形質転換された細胞
を成長させる工程の前に細胞をスクリーニングする工程を含むことができる。当業者によって知られたスクリーニングの任意の方法をも用いることもできる。例えば、顕微鏡での直接的選択によって、電気泳動（ＳＤＳ  ｐａｇｅ）によって、免疫検出によって、膜トランスフェルトによって等である。該スクリーニングを行うのに有用な方法の例は、例えば、Ｇｏｍｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９７（参考文献２４）に開示されている。スクリーニングのこの工程は、本発明に従ってトランスフェクトまたは形質転換されている細胞の選択を可能とする。この工程によって、修飾されたポリペプチドに関する良好な収率が得られる。
【００５４】
本発明のプロセスの本開示では、先に述べたように、例えば、医薬用途のために産生されるべき組換えポリペプチドを設計するのに「組換えポリペプチド」を用いるのが好ましく、および組換えポリペプチドの成熟プロセス（すなわち翻訳後修飾）に関与するタンパク質を設計するのに「組換えタンパク質」を用いるのが好ましい（第２の方法の記載において以下の説明参照）。
【００５５】
この方法によって、組換えポリペプチドに融合した本発明のペプチドシグナルをコードする核酸ベクターの使用は、ＥＲおよび／またはＧＡの異なるサブコンパートメントにおける、自由な、または膜結合形態下での組換えポリペプチドの保留を可能とする。先行技術の方法での組換えポリペプチドで観察された異種性の一部は、ゴルジを通っての輸送および成熟の間におこる。ＥＲにおける、またはＥＲ由来プロテインボディーにおける、または初期ゴルジコンパートメントにおける、本発明のポリペプチドシグナルの使用による組換えポリペプチドの保留は、この異種性を低下させることができる。
【００５６】
主な困難は、天然相当物の正確なコピーである組換えタンパク質を産生することである。ポリペプチド翻訳後成熟は、天然相当物に対する発現系のみならず、同一発現系における天然相当物に対する器官、および同一器官を構成する細胞における天然相当物に対する１つの細胞内コンパートメントとは異なる。
【００５７】
本発明の第１の方法による特異的コンパートメントへの、ＰＭＰを標的化するペプチドシグナルの付加は、この困難を解決することができるが、組換えタンパク質のこの構造的修飾によって、もちろん、非天然タンパク質が生じる。有利には、本発明のペプチドシグナルは、さらに、宿主細胞のＥＲおよびＧＡ媒体を作成し、または設計することによって、組換えポリペプチドの成熟を制御することを可能とする実際のツールである。この制御は、宿主細胞内でより安定であり、免疫原性が低く、かつそれらの天然相当物のコピーを要求する傾向がある組換えポリペプチドの産生を可能とする。これは、特にヒト療法で使用可能な植物による、治療的に活性なタンパク質の産生において非常に重要である。
【００５８】
本発明は、ＥＲおよびＧＡ環境を設計するためのいくつかの解決法を提供する。これらの解決法は、単独で、または一緒に（組み合わせて）用いることができる。これらの解決法の例は、添付の図３、行（Ｂ）および（Ｃ）に模式的に表されている。これらの解決法の全てにおいて、宿主細胞は、
−産生される組換えポリペプチドに対して異なる組換えタンパク質と融合した本発明のペプチドシグナルをコードする少なくとも１つのベクター、および
−該組換えポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸ベクター
でトランスフェクトまたは形質転換される。
【００５９】
従って、本発明のさらなる態様は、
−本発明による少なくとも１つの核酸ベクターで細胞をトランスフェクトまたは形質転換する工程であって、該ベクターは該ポリペプチドに対して異なる組換えタンパク質をコードする工程と、
−該ポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸ベクターで該細胞をトランスフェクトまたは形質転換する工程と、
−トランスフェクトされた細胞を成長させる工程と、
−翻訳後修飾されたポリペプチドを収穫する工程と、
を含む、翻訳後修飾された組換えポリペプチドを産生する第２の方法を提供することである。
【００６０】
本発明によると、該プロセスは、さらに、トランスフェクトまたは形質転換された細胞を成長させる工程の前に細胞をスクリーニングする工程を含むことができる。当業者によって公知のスクリーニングのいずれかの方法を用いることができる。スクリーニング方法は先に開示したものであり得る。スクリーニングのこの工程は、本発明に従ってトランスフェクトまたは形質転換された細胞の選択を可能とする。この工程により、修飾されたポリペプチドに関連する良好な収率が得られる。
【００６１】
この第２の方法において、宿主細胞で翻訳される組換えタンパク質は、本発明のペプチドシグナルを含み、この組換えタンパク質は産生されるポリペプチドとは異なる。
この第２の方法において、組換えタンパク質は産生される組換えポリペプチドの翻訳後修飾の調節において役割を演じ、すなわち、それは、組換えポリペプチドの成熟プロセス、すなわち、翻訳後修飾に関与する。
【００６２】
この役割は、選択された組換えタンパク質の性質に依存する。当業者であれば、本記載および実施例を読んで本発明を用いることによって達成したいものを達成するためには、どのようにして組換えタンパク質を選択すればよいかが容易に理解されるであろう。
【００６３】
本発明によると、組換えタンパク質は、例えば、酵素および／または抗体またはその部分であってよい。
本発明のこの第２の方法によると、組換えタンパク質が抗体またはその部分である場合、それは、産生されるポリペプチド、および／または該ポリペプチドの翻訳後修飾に関与する酵素を認識し、およびそれに特異的に結合する抗体またはその部分などであろう。
【００６４】
この方法によって、本発明のペプチドシグナルと融合する抗体またはその部分は、宿主細胞のＥＲおよび／またはＧＡに局在化される。組換えタンパク質の役割は、ＲＥおよび／またはＧＡにおける組換えポリペプチドを捕獲することである。従って、本発明は、
−ＥＲ／ＧＡ標的化抗体または抗体断片、および
−産生されるポリペプチド；
をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換されている宿主細胞において抗体または抗体断片を発現させることによって翻訳後修飾された異種ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００６５】
産生される該ポリペプチドを認識し、およびそれに特異的に結合する抗体またはその部分との関係で、本発明は、有利には、該抗体またはその断片を本発明によるペプチドシグナルと融合させることによって、細胞のコンパートメントの１つに保持された特異的抗体またはその断片へのその結合を介して、宿主細胞のＥＲおよび／またはＧＡに、（本発明のペプチドシグナルよりなるタグ付加によって修飾されていない）天然組換えタンパク質を保持することが可能とする。この目的で、本発明によるＥＲおよび／またはＧＡ保留ペプチドシグナルは、究極的目標で組換えポリペプチドに対する特異的親和性でもって抗体に融合させて、組み換えタンパク質の成熟を制御し、または調節させた。
【００６６】
該ポリペプチドの翻訳後修飾に関与する酵素を認識し、かつそれに特異的に結合する抗体またはその部分との関係で、抗体またはその部分は、好ましくは、該酵素を調節する。
ここに、本発明の適用は、ＥＲおよび／またはＧＡに対する不活化抗体を特異的に用いて、コンパートメントに局在化された特異的酵素を不活化する。この目的では、本発明によるＥＲおよび／またはＧＡ保留ペプチドシグナルは、究極的な目標でＥＲまたはＧＡ酵素の触媒ドメインに対する特異的親和性を有する抗体に融合させて、内因性酵素を不活化して、組換えタンパク質の成熟を制御し、または調節している。組換えタンパク質の役割は、ここでは組換えポリペプチドの成熟に関与する酵素を捕獲することである。本発明は、従って、宿主細胞内の内因性酵素を「免疫調節」するのを可能とする。
【００６７】
本発明によると、第２の方法は、
１）本発明のペプチドシグナルに融合された異種酵素をコードする本発明による少なくとも１つのベクターを用いることによって宿主細胞を異種酵素で補充し、および／または
２）本発明のペプチドシグナルに融合された該内因性酵素をコードする本発明による少なくとも１つのベクターを用いることによって宿主細胞の産生能力を最適化するための内因性酵素を再局在化する
ために用いることができる。
【００６８】
組換えタンパク質の成熟を調節する異種または同種酵素の能力は、細胞におけるその局在化に依存するであろう。従って、宿主細胞の酵素機構を調節するためには、適当な酵素を「良好な」コンパートメントにおいて標的化するのが好ましい。従って、本発明は、
１）標的化成熟酵素、すなわち、本発明のペプチドシグナルに融合された成熟酵素である組換えタンパク質、および
２）産生される組換えポリペプチド
をコードする核酸配列を含む発現ベクターで形質転換されている宿主細胞において成熟酵素を発現させることによって、翻訳後修飾された異種ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００６９】
従って、該組換えタンパク質は、該ポリペプチドの翻訳後修飾に関与する内因性または異種酵素であってよい。本例においては、本発明は、２つの別々ではあるが近い戦略に従って、（ａ）内因性酵素をＥＲおよび／またはＧＡへ再度向けることによって、および（ｂ）異なる細胞内コンパートメントに局在化することができるＥＲ／ＧＡに異種酵素を標的化することによって、宿主細胞、特に植物細胞においてＥＲおよび／またはＧＡの酵素機構の修飾を可能とする。宿主細胞におけるＥＲおよび／またはＧＡの酵素機構の修飾は、組換えポリペプチドの翻訳後成熟の修飾（すなわち、設計）を可能とするツールである。例えば、この修飾は、産生された組換えポリペプチドの安定性を改良し、および／または免疫原性を制御するのを可能とする。組換えタンパク質の役割は、本明細書中においては、ＥＲおよび／またはＧＡにおける組換えポリペプチドの成熟に関与する同種または異種酵素を捕獲することである。
【００７０】
本発明は、従って、有利には、非免疫原性糖タンパク質である組換えポリペプチドのみならず、均一糖タンパク質である組換えポリペプチドをも得ることを可能とする。
本発明によると、ポリペプチドは、特に、植物細胞または全植物において、遺伝子組換えによって産生されるのに必要な任意のポリペプチドであってよい。本発明で産生することができるポリペプチドは、例えば、本発明の組換えポリペプチドの開示において先に引用したものである。
【００７１】
本発明によると、前記第１および第２の方法は同時に用いることができる。この場合において、第２の方法では、該ポリペプチドをコードする核酸ベクターは、本発明による核酸ベクター、すなわち、本発明のペプチドシグナルに融合されたポリペプチドをコードする核酸ベクターでもある。本発明のこの具体例では、ＥＲおよび／またはＧＡに局在化させるべく成熟のために組換えポリペプチドを標的化することができ、同時に、ＥＲ  およ
び／またはＧＡを、成熟のために設計、すなわち、組換えポリペプチドの翻訳後修飾を設計することができる。ポリペプチドは先に定義した通りである。例えば、それは治療的に活性なタンパク質であり得る。
【００７２】
本明細書中に記載するように、本発明によると、ポリペプチドの翻訳後修飾は、有利には、ＥＲおよび／またはＧＡコンパートメント膜中で行われる。
本発明者らは、宿主細胞において、特に、植物細胞において、設計された組換えポリペプチドを産生するためのそのような強力なツールを提供するまさに始めての者達である。
【００７３】
用いられる本発明の方法が何であれ（第１および／または第２の方法）、ポリペプチドは貯蔵タンパク質と同時発現させることができる。この貯蔵タンパク質は、例えば、ＺＥＲＡ（登録商標）またはいずれかの他の適当なタンパク質に融合されたタンパク質であり得る。添付の図３、行（Ｄ）は、ゴルジへのＺＥＲＡ（登録商標）組換えタンパク質融合の標的化を模式的に示す。例えば、プロテインボディーは、宿主細胞におけるＺＥＲＡ（登録商標）組換えタンパク質の発現によってＥＲ膜から開始することができる（添付の図５Ａ参照）。ＥＲに蓄積された組換え糖タンパク質（以下の例参照）は、専ら高マンノース型のＮ−グリカンを保有する。本発明は、例えば、ＥＲ保留シグナルとの融合後にＥＲに貯蔵された医薬糖タンパク質についての、ＥＲ均一性およびグリカン修飾を有利に組み合わせるのを可能とするペプチドシグナルを提供する。
【００７４】
本発明の方法で用いるベクターを得るための使用可能な方法は先に開示する。
細胞、特に、植物細胞をトランスフェクトまたは形質転換するための使用可能な方法は先に開示する。
【００７５】
本発明によると、細胞は、好ましくは、例えば、先に定義したような植物細胞であり、例えば、植物細胞はアルファルファ、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、ニセツリガネゴケ、コウキクサ、緑藻、海洋性珪藻よりなる群から選択される植物から作られた細胞である。
【００７６】
トランスフェクトされた細胞、または該トランスフェクト細胞から得られた植物を成長させ、かつ翻訳後修飾されたポリペプチドを収穫するための使用可能な方法は、当業者によって知られている。例えば、ｌｉｅｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（参考文献３２）に開示された方法を有利に用いることができる。
【００７７】
他の利点は、添付の図面によって示された以下の非限定的例から当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】植物細胞分泌経路の模式図である。
【図２】植物および哺乳動物細胞の小胞体およびゴルジ装置における、タンパク質上のＮ−結合グリカンの移動およびプロセッシングを示す。脂質担体上に組み立てられた前駆体オリゴ糖は、生成直後のポリペプチドから構成される特異的Ａｓｎ残基に移動され、次いで、Ｎ−グリカンはグリコシルおよびほとんどのマンノシル残基の除去でトリミングされる。植物および哺乳動物の複雑なＮ−グリカンのプロセッシングの差は、後期ゴルジ成熟事象である。ＥＲおよびゴルジドメインは図１に記載された主な列に示される。
【図３】抗体またはその部分の（ＳｃＦｖ）（行Ｂ）、酵素の（行Ｃ）、またはＺＥＲＡ（登録商標）−Ｆｕｓｉｏｎ（行Ｄ）の、組換えタンパク質（行Ａ）の標的化における異なるシグナル（暗色）の適用を示す。
【図４】分析された融合タンパク質：  −ＧＣＳＩ−ＧＦＰ：ＧＦＰに融合された全長シロイヌナズナ  ＧＣＳＩ、  −ＧＣＳ９０−ＧＦＰ：ＧＦＰに融合したＧＣＳＩの最初の９０Ｎ末端アミノ酸、  −Δ１３ＧＣＳ９０−ＧＦＰ：ＧＣＳ９０−ＧＦＰから最初の１３のＮ末端アミノ酸を差し引いたもの、  −ＭａｎＩ−ＧＦＰ：ＧＦＰに融合された全長ダイズＭａｎＩ、  −Δ１９ＣＴＭａｎ−ＧＦＰ：ＭａｎＩ−ＧＦＰから最初の１９のＮ末端アミノ酸を差し引いたもの、  −Ｍａｎ９９−ＧＦＰおよびＭａｎ４９−ＧＦＰ：各々、ＧＦＰに融合した、ＭａｎＩの最初の９９および４９アミノ酸、  −Δ１９ＣＴＭａｎ４９−ＧＦＰ：Ｍａｎ４９−ＧＦＰから最初の１９のＮ末端アミノ酸を差し引いたもの、  −ΔＣＴＭａｎ４９−ＧＦＰ：全ＣＴはＭａｎ４９−ＧＦＰから欠失させた、  −ＭＡＡＡＭａｎ４９−ＧＦＰ：Ｍａｎ４９−ＧＦＰのＣＴは、３つのＡｌａ残基を含有する人工ＣＴによって置き換えられた。  −ＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰおよびＭａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰ：ＭａｎＩ−ＧＦＰおよびＭａｎ９９−ＧＦＰ、各々、ここに、ＴＭＤは１６〜２３アミノ酸の長さであった、  −ＧＮＴＩ−ＧＦＰ：ＧＦＰに融合した全長タバコＧＮＴＩ、  ―ＧＮＴ３８−ＧＦＰ：ＧＦＰに融合したＧＮＴＩの最初の３８Ｎ末端アミノ酸、  −ＸｙｌＴ−ＧＦＰ：ＧＦＰに融合した全長シロイヌナズナ、  −ＸｙｌＴ３５−ＧＦＰ：ＧＦＰに融合したＸｙｌＴ３５ｎの最初の３５アミノ酸、  −ＳＴ５２−ｍＲＦＰ：ｍＲＦＰに融合したラットα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの最初の５２アミノ酸、  −ＧＦＰ−ＨＤＥＬ：スポラミンシグナルペプチドおよびＣ末端ＨＤＥＬ  ＥＲ保留配列を含有するＧＦＰバージョン；の模式図である。
【図５】共焦点レーザー走査型顕微鏡観察を用いた、タバコＢＹ−２細胞における安定した発現（３〜４日）後の、Ｎ−グリカンプロセッシング機構の４つの異なるメンバー（α−グルコシダーゼＩ、マンノシダーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、β−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ、図４）に対する、およびＣ末端ＨＤＥＬ  ＥＲ保留配列に対する一連のＧＦＰ融合のゴルジおよび／またはＥＲへの局在化を示す：  （Ａ，Ｂ）ＭａｎＩ−ＧＦＰ、  （Ｃ）ＭａｎＩ−ＧＦＰ（タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドでの２時間処理の後）、  （Ｄ，Ｅ）ＧＦＰ−ＨＤＥＬ、  （Ｆ）ＭａｎＩ−ＧＦＰ［ＢＦＡ（５０ｍｇ・ｍＬ−１）での２時間処理後］  （Ｇ）ＧＣＳＩ−ＧＦＰ、  （Ｈ）ＧＮＴＩ−ＧＦＰ、  （Ｉ）ＸｙｌＴ−ＧＦＰ、  全ての棒線＝８μｍ。
【図６】共焦点レーザー走査型顕微鏡観察を用いた、タバコＢＹ−２細胞における安定した発現（３〜４日）、または葉浸潤によるタバコ葉表皮細胞における一過性発現（５日）後の、Ｎ−グリカンプロセッシング機構の切断メンバー（Ｍａｎ９９、Ｍａｎ４９、ＧＮＴ３８、ＸｙｌＴ３５、図４）に対する一連のＧＦＰ融合のゴルジおよび／またはＥＲへの局在化を示す：  （Ａ，Ｂ）Ｍａｎ９９−ＧＦＰのＢＹ−２浮遊培養細胞発現、  （Ｃ）Ｍａｎ９９−ＧＦＰのＢＹ−２浮遊培養細胞発現（タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドでの２時間処理の後）、  （Ｄ）Ｍａｎ４９−ＧＦＰのＢＹ−２浮遊培養細胞発現、  （Ｅ−Ｆ）各々、Ｍａｎ９９−ＧＦＰおよびＭａｎ４９−ＧＦＰのタバコ葉表皮細胞発現、  （Ｇ）ＧＮＴ３８−ＧＦＰ（Ｇ）のＢＹ−２浮遊培養細胞発現、  （Ｈ）ＧＮＴ３８−ＧＦＰのタバコ葉表皮細胞、および  （Ｉ）ＸｙｌＴ３５−ＧＦＰのタバコ葉表皮細胞発現。  全ての棒線＝８μｍ。
【図７】共焦点レーザー走査型顕微鏡観察を用いた、これらのＧＦＰ融合およびＳＴ５２−ｍＲＦＰの１つまたはその他のタバコＢＹ−２細胞における安定した同時発現（３〜４日）後の、ＭａｎＩ、Ｍａｎ９９、Ｍａｎ４９またはＧＮＴ３８（図４）、およびトランスゴルジマーカーＳＴ５２−ｍＲＦＰに対する一連のＧＦＰ融合のゴルジスタックへの局在化を示す：  （Ａ−Ｃ）  ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞におけるＭａｎＩ−ＧＦＰ（Ａ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｂ）同時発現、  （Ｄ−Ｆ）  ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞におけるＭａｎ９９−ＧＦＰ（Ｄ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｅ）同時発現  （Ｇ−Ｉ）  ＢＹ−２の浮遊培養タバコ細胞におけるＭａｎ４９−ＧＦＰ（Ｇ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｈ）同時発現、  （Ｊ−Ｌ）  ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞におけるＧＮＴ３８−ＧＦＰ（Ｊ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｋ）同時発現、および  （Ｃ、Ｆ、ＩおよびＬ）対応する併合発現ＧＦＰ融合＋ＳＴ５２−ｍＲＦＰ。  インサート：選択されたゴルジスタックの倍率（Ｘ２，２）。  スタックは、しばしば、一方側のＧＦＰ融合（緑色）、他方側のＳＴ５２−ＲＦＰ（赤色）、およびそれらの間の重複の領域（黄色）を伴い、「三色」（ＦおよびＩにおける矢印）で出現することに注意。  Ａ−Ｉ：棒線＝８μｍ；Ｊ−Ｌ：棒線＝１６μｍ。
【図８】サイトゾルテイル、および植物Ｎ−グリコシル化酵素についてのＴＭＤ長さの比較を示す：  （Ａ）植物細胞の小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置におけるＮ−結合グリカンのプロセッシング。  （Ｂ）サイトゾルテイル、および異なる植物種からクローン化されたＮ−グリカンプロセッシング酵素の膜貫通ドメインの長さ。受託番号は各模式図の右側に示されている。  各膜タンパク質については、膜貫通ドメインの位置およびサイズは、ＴｍＨＭＭ＿ｖ２ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）から概算した。  タンパク質のいくつかについては、ＴＭＤの位置を定義する確率は５０％未満である（／／）。  太線で輪郭が示されたボックスは、その細胞内局在化が今日までに共焦点および／または電子顕微鏡観察によって研究されたＮ−グリカンプロセッシング酵素に対応する。  ＧＣＳＩ：グルコシダーゼＩ，α１，２  ＭａｎＩ：α１，２−マンノシダーゼＩ、β１，２  ＧＮＴＩ：，β１，２−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、α１，３  ＭａｎＩＩ：α１，３−マンノシダーゼＩＩ、β１，２  ＧＮＴＩＩ：β１，２−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、β１，２  キシロシルＴ：β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ、α１，３  ＦｕｃＴ：α１，３−フコシルトランスフェラーゼ、α１，４  ＦｕｃＴ  α１，４−フコシルトランスフェラーゼ、α２，６シアリルＴ：α２，６−シアリルトランスフェラーゼ。
【図９】共焦点レーザー走査型顕微鏡観察を用いた、葉浸潤による、タバコＢＹ−２細胞における安定した発現（３〜４日）、またはタバコ葉表皮細胞における一過性発現（５日）後の、ＭａｎＩの切断形態（Δ１９Ｍａｎ、Δ１９Ｍａｎ４９、図３）に対する、およびＭＡＡＡＭａｎ４９に対する一連のＧＦＰ融合のゴルジおよびＥＲへの局在化を示す：  （Ａ）Δ１９Ｍａｎ−ＧＦＰのＢＹ−２浮遊培養細胞発現、  （Ｂ，Ｃ）Δ１９Ｍａｎ４９−ＧＦＰの浮遊培養細胞発現、  （Ｄ）Δ１９Ｍａｎ４９−ＧＦＰの葉表皮細胞発現、  （Ｅ）ＭＡＡＡＭａｎ４９−ＧＦＰの葉表皮細胞発現。  Ａ〜Ｃ：棒線＝１６μｍ；Ｄ、Ｅ：棒線＝８μｍ。
【図１０】共焦点レーザー走査型顕微鏡観察を用いた、これらのＧＦＰ融合およびＳＴ５２−ｍＲＦＰの１つまたはその他のタバコＢＹ−２細胞における安定した同時発現（３〜４日）後の、ＭａｎＴＭＤ２３、Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３またはＸｙｌＴ３５（図３）およびトランスゴルジマーカーＳＴ５２−ｍＲＦＰに対する一連のＧＦＰ融合のゴルジコンパートメントへの局在化を示す。  （Ａ−Ｃ）  ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞におけるＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰ（Ａ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｂ）同時発現、  （Ｄ−Ｆ）  ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞における（Ｇ−Ｉ）Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰ（Ｄ，Ｇ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｅ，Ｈ）同時発現、  （Ｊ−Ｌ）  ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞におけるＸｙｌＴ３５−ＧＦＰ（Ｊ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｋ）同時発現、  （Ｃ，Ｆ，ＩおよびＬ）対応する併合発現ＧＦＰ融合＋ＳＴ５２−ｍＲＦＰ。  インサート：倍率（×２．２）。  全ての棒線＝８μｍ。
【図１１】浮遊培養したＢＹ−２タバコ細胞からのポリクローナル抗ＧＦＰ抗体とのイムノゴールド標識にカップリングされた電子顕微鏡観察を用いた、Ｍａｎ９９およびＭａｎ９９ＴＭＤ２３へのＧＦＰ融合のゴルジ装置における局在化を示す：  （Ａ）野生型ＢＹ２タバコ細胞、  （Ｂ）Ｍａｎ９９−ＧＦＰを発現するＢＹ２細胞、  （Ｃ）Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰを発現するＢＹ２細胞、  （Ｄ）ゴルジを２つのドメインに分割した後の、異なる細胞、シス側、トランス側のカウンティング金粒子において分析した１５の個々のスタックで観察された標識のパーセントとしてのゴルジにおける融合タンパク質の分布の発現。  ＳＶ＝分泌小胞。
【図１２】共焦点レーザー走査型顕微鏡観察を用いた、葉浸潤による、葉表皮細胞における一過性発現（５日）後の、Ｎ−グリカンプロセッシング機構（ＭａｎＩ，ＸｙｌＴ）、その切断形態（Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３，Ｍａｎ９９、図４）のメンバーに対する一連のＧＦＰ融合のゴルジおよびＥＲへの局在化を示す：  （Ａ）Ｍａｎ９９−ＧＦＰのダイズ葉表皮細胞、  （Ｂ）Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰのダイズ葉表皮細胞発現、  （Ｃ）Ｍａｎ９９−ＧＦＰのアカナス葉表皮細胞発現、  （Ｄ）Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰのアカナス葉表皮細胞発現。  全ての棒線＝１６μｍ。
【図１３】共焦点レーザー走査型顕微鏡観察を用いた、可溶性ＥＲマーカー（ＧＦＰ−ＨＤＥＬ，Ａ−Ｂ）、膜ＥＲマーカー（Ｇｌｕ９０−ＧＦＰ，Ｃ−Ｄ）、ＥＲおよび初期ゴルジマーカー（Δ１９Ｍａｎ４９−ＧＦＰ、Ｅ−Ｆ）、メディアルゴルジマーカー（ＸｙｌＴ３５−ＧＦＰ、Ｇ−Ｈ）、または後期ゴルジマーカー（Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰ，ＳＴ５２−ｍＲＦＰ，Ｉ−Ｌ）を発現するＢＹ−２細胞におけるＥＲおよび／またはゴルジタンパク質に対するＢＦＡでの２時間処理の効果を示す。  全ての場合において、ＥＲネットワークは、しばしば、蛍光の有窓シートとなることに注意。  全ての棒線＝８μｍ。
【図１４】共焦点レーザー走査型顕微鏡観察を用いた、ＥＲおよびゴルジクラスターへの初期および後期ゴルジマーカー双方の同時再分布に対するＢＦＡ（５０ｍｇ．ｍＬ−１）での２時間処理の効果を示す：  （Ａ−Ｆ）各々、ＢＦＡの不存在下または存在下における、ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞でのＨＤＥＬ−ＧＦＰ（Ａ，Ｂ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｂ，Ｅ）同時発現、  （Ｇ−Ｌ）各々、ＢＦＡの不存在下または存在下における、ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞におけるΔ１９Ｍａｎ４９−ＧＦＰ（Ｇ，Ｊ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｈ，Ｋ）同時発現、  （Ｍ−Ｒ）各々、ＢＦＡの不存在下または存在下における、ＢＹ−２浮遊培養タバコ細胞でのＭａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰ（Ｍ，Ｐ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｎ，Ｑ）同時発現、（Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｏ，Ｒ）ＢＦＡの不存在下または存在下における、対応する併合発現ＧＦＰ融合＋ＳＴ−ｍＲＦＰ。
【図１５】本実験において我々が用いた構築物の模式図である：ＧＣＳＩ：ＧＦＰに融合した全長シロイヌナズナα−グルコシダーゼＩ／ＧＣＳ１５０：ＧＦＰに融合したＧＣＳＩの最初の１５０アミノ酸／ＧＣＳ９０：ＧＦＰに融合したＧＣＳＩの最初の９０アミノ酸／Δ１３ＧＣＳ１５０：１３の最初のＮ末端アミノ酸（ＭＴＧＡＳＲＲＳＡＲＧＲＩ−配列番号１）をＧＣＳ１５０から欠失させた／Δ１３ＧＣＳ９０：１３の最初のＮ末端アミノ酸をＧＣＳ９０から欠失させた／Ｈｓ１０−Δ１３ＧＣＳ９０：Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＧＣＳＩの１０の最初のＮ末端アミノ酸（ＭＡＲＧＥＲＲＲＲＡ−配列番号２）をΔ１３ＧＣＳ９０のＮ末端で融合した／ＸＹＬＴ３５：シロイヌナズナβ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼの最初の３５アミノ酸をＧＦＰに融合させた／ＸＹＬＴ３５−ＧＣＳ（９１−１５０）：ＸＹＬＴの最初の３５アミノ酸をＧＣＳＩのルミナールドメイン（アミノ酸９１〜１５０）の最初の６０アミノ酸に融合させ、およびＧＦＰに融合させた／ＸＹＬＴ３５−ＧＣＳ（７０−１５０）：ＸＹＬＴの最初の３５アミノ酸をＧＦＰに融合させたＧＣＳＩのルミナールドメイン（アミノ酸７０〜１５０）の最初の８０アミノ酸に融合させた／ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５：ＧＣＳＩの１３の最初のＮ末端アミノ酸をＸＹＬＴ３５に融合させた／ＣＮＸ１１−ＸＹＬＴ３５：シロイヌナズナカルネキシン（ＣＮＸ）最後の１１アミノ酸（ＮＤＲＲＰＱＲＫＲＰＡ−配列番号３）をＸＹＬＴ３５のＮ末端に融合させた／ＳＴ５２−ＧＦＰ／ｍＲＦＰ：ラットα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）の最初の５２アミノ酸を、ＧＦＰまたはｍＲＦＰに融合させた／ＧＦＰ／ｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ：スポラミンシグナルペプチド、およびＨＤＥＬ  ＥＲ保留配列ＣＴ：サイトゾルテイル；ＴＭＤ：膜貫通ドメイン；ＣＤ：触媒ドメインの制御下でＧＦＰまたはｍＲＦＰに融合させた。
【図１６】ＥＲ：トランスジェニックＢＹ−２タバコ細胞系統において厳格に蓄積されるＧＣＳＩが継代培養から３〜４日後に観察されたことを示す。皮質（Ａ，Ｃ）および中間光学セクション（Ｂ，Ｄ）は、ＧＣＳＩがＥＲ（Ａ，Ｂ）に局在化され、パターン染色がＧＦＰ−ＨＤＥＬ（Ｃ，Ｄ）のそれと同様であることを示す。  棒線＝８μｍ。
【図１７】Ｎ末端ドメインはＥＲにＧＣＳＩを局在化させるのに十分であることを示す（ＧＣＳ１５０およびＧＣＳ９０は、全長構築物ＧＣＳＩのように、ＢＹ−２細胞（各々、Ａ、ＢおよびＤ、Ｅ）中のＥＲに蓄積する）。それらの標的化が、タバコ葉表皮細胞において同一である（各々、ＣおよびＦ）。棒線＝８μｍ。
【図１８】１３アミノ酸のＮ末端配列がＥＲ局在化の情報を含有することを示す。ＧＣＳ９０はＢＹ−２細胞（Ａ，Ｂ）中のＥＲに蓄積されるが、Δ１３ＧＣＳ９０はゴルジ（Ｃ，Ｄ）に局在化される。ＸＹＬＴ３５はゴルジタンパク質（Ｅ，Ｆ）であるが、ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５はＥＲにおいて、ゴルジ（Ｇ，Ｈ）において見出される。  棒線＝８μｍ。
【図１９】ＡｒｇリッチなＥＲ標的化配列は、単独で（Ａ，Ｄ，Ｇ，Ｊ，Ｍ）、あるいはｍＲＦＰ−ＨＤＥＬと共に（Ｂ，Ｅ，Ｈ，Ｋ，Ｎ）、またはＳＴ５２−ｍＲＦＰと共に（Ｃ，Ｆ，Ｉ，Ｌ，Ｏ）、Δ１３ＧＣＳ９０、ＸＹＬＴ３５、ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５、Ｈｓ１０−ＧＣＳ９０またはＣＮＸ１１−ＸＹＴ３５を発現するタバコ葉表皮細胞の間で保存されていることを示す。ＢＹ−２細胞（図４）においては、Δ１３ＧＣＳ９０（Ａ−Ｃ）は専らゴルジにあり、他方、ＧＣＳ９０はＥＲにあり、およびΔ１３ＧＣＳ９０は好ましくはＳＴ−ｍＲＦＰ（Ｃ，Ｆ）と同時局在化される。顕微鏡写真は、Δ１３ＧＣＳ９０（Ａ−Ｃ）をＸＹＬＴ３５（Ｄ−Ｆ）と比較した場合に同一である。ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５（Ｇ）をｍＲＦＰ−ＨＤＥＬと同時発現させた場合、ＥＲは黄色で出現し、ゴルジは緑色のままであり（Ｈ）、一方、ＳＴ５２−ｍＲＦＰと共に、ゴルジは黄色であって、ＥＲは緑色（Ｉ）であり、これは、ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５はＥＲにおいて、およびゴルジにおいて二元局在を有することを示す。興味深いことには、ＧＣＳ９０の最初の１３アミノ酸．はヒトＧＣＳＩ（Ｊ−Ｌ）の最初の１０アミノ酸．で置き換えることができ：Ｈｓ１０−ＧＣＳ９０キメラタンパク質はＥＲのみにあり（Ｊ）、ｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ（Ｋ）と同時局在化されるが、ＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｌ）と共にはそうされない。これは、シグナルが区系の間で保存されていることを示唆する。同様に、ＣＮＸ１１−ＸＹＬ３５（Ｍ）がｍＲＦＰ−ＨＤＥＬと同時発現される場合、ＥＲは黄色で出現し、ゴルジは緑色（Ｎ）のままであり、一方、ＳＴ５２−ｍＲＦＰと共に、ゴルジは黄色であって、ＥＲは緑色（Ｏ）であり、これは、ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５もまたＥＲにおいて、およびゴルジにおいて二元局在を有することを示す。  棒線＝８μｍ。
【図２０】Ｎ末端アルギニンが、単独で（左側パネル）、またはｍＲＦＰ−ＨＤＥＬと共に（中央のパネル）、またはＳＴ５２−ｍＲＦＰと共に（右側パネル）、ＧＦＰ融合を発現するＥＲ局在化情報タバコ葉表皮細胞を含有することを示す。ＧＣＳ９０（Ａ）はｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ（Ｂ、黄色のＥＲ）と共に完全に同時局在化されるが、ＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｃ、緑色のＥＲ、赤色のゴルジ）とは同時局在化されない。位置６、７、１０および１２における４つのＡｒｇをＡｌａ（Ｄ−Ｆ）またはＬｅｕ（Ｇ−Ｉ）で置き換えると、Ｒ／ＬＧＣＳ９０またはＲ／ＡＧＣＳ９０は、顕微鏡写真ＦおよびＩで観察された黄色のスポットで示されるように、専らゴルジに蓄積する。Ａｒｇが対によって突然変異された場合、Ｒ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０（Ｊ−Ｌ）またはＲ／Ｌ１０−１２ＧＣＳ９０（Ｍ−Ｏ）またはＲ／Ｌ６−Ｌ１２（Ｐ−Ｒ）はＥＲに、およびＥＲ可溶性タンパク質ｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ（Ｋ，Ｎ，Ｑ）を含有しないミニスポットに位置し、ゴルジスタック（Ｌ，Ｏ，Ｒ）に密接には会合するが、独立したままである。これらのデータは、そのＮ末端のＲＲ、ＲＸＲまたはＲＸＸＲモチーフがＧＳＣ９０に標的化されるＥＲを付与することを示す。  棒線＝８μｍ。
【図２１】Ｒ／Ｌ６−７がゴルジに密接に会合することを示す。Ｒ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０がｍＲＦＰ−ＨＤＥＬおよびＳＴ５２−ｍＲＦＰと同時発現される場合、蛍光構造が黄色で出現し、ゴルジとのそれらの非常に密接な会合を示す。  棒線＝８μｍ。
【図２２】Ｓａｒ１ｐ−ｍＲＦＰ（パネルＢ、ＥおよびＫ）またはＳａｒ１ｐ−ＧＴＰ−ｍＲＦＰ（パネルＨおよびＮ）とのＧＦＰ融合を発現するタバコ葉表皮細胞を示す。Ａｒｇが対によって突然変異された場合、Ｒ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０（Ａ−Ｃ）またはＧＣＳ９０（Ｄ−Ｉ）は突然変異した、または突然変異していないＳａｒ１ｐと同時発現され、ＧＦＰ融合では標識修飾は観察されなかった。対照的に、Ｒ／ＬＧＣＳ９０とＳａｒ１ｐ−ＧＴＰ（Ｍ−Ｏ）との同時発現はＥＲにおけるＲ／ＬＧＣＳ９０の輸送を阻害し、一方、Ｓａｒ１ｐとの同時発現はＲ／ＬＧＣＳ９０のパターンを修飾しない。  棒線＝８μｍ。
【図２３】Ｎ末端アルギニンモチーフがＡｔＧＣＳＩのＥＲ保留についての重要な決定基ではないことを示す。ＥＲは一過性ＧＣＳ１５０−ＧＦＰ（Ａ）、ＧＣＳ９０−ＧＦＰ（Ｂ）、およびΔ１３ＧＣＳ１５０−ＧＦＰ（Ｃ）形質転換タバコ葉表皮細胞、皮質セクションにおいて可視化される。Δ１３ＧＣＳ１５０−ＧＦＰのＥＲ局在化は、ｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ（Ｅ）およびＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｇ）、皮質セクションと同時発現させることによって確認される。このＩＩ型の膜タンパク質の最初の１３アミノ酸は、ジ−アルギニンモチーフにも拘わらず、ＧＣＳ１５０−ＧＦＰ  ＥＲ標的化に関連付けられないように見える。（Ｄ）（Ｆ）（Ｈ）ゴルジは、一過性Δ１３ＧＣＳ９０−ＧＦＰ形質転換タバコ葉表皮細胞（Ｄ）において、および同時発現するｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ（Ｆ）またはＳＴ５２−ｍＲＦＰ（Ｈ）、皮質セクションにおいて可視化される。最初の１３アミノ酸は、ＧＣＳ１５０−ＧＦＰとは対照的にＧＣＳ９０−ＧＦＰに対するＥＲ標的化で必須である。ルミナールドメインに隣接しそれを挟むアミノ酸はＥＲ標的化情報を含有することができる。棒線：８μｍ。
【図２４】ルミナール標的化決定基がＸＹＬＴ３５をＥＲに保持するのに十分であることを示す：  （Ａ）一過性ＸＹＬＴ３５−ＧＦＰ形質転換タバコ葉表皮細胞、皮質セクションで可視化されたゴルジ。  （Ｂ）（Ｃ）ＳＴ５２−ｍＲＦＰ、皮質セクションと共にＸＹＬＴ３５−ＧＣＳ６０（Ｂ）、ＸＹＬＴ３５−ＧＣＳ８０（Ｃ）を同時発現するタバコ葉表皮細胞において一過的に可視化されたＥＲおよびゴルジ。ＡｔＧＣＳＩのルミナールドメインはＥＲにＸＹＬＴ３５の大部分を再局在化させる。棒線＝８μｍ
【図２５】共焦点顕微鏡観察によるＢＹ−２細胞でのＧＦＰ融合の局在化分析を示す；皮質（Ａ）または横方向の（Ｂ）図。我々のグループで最近同定されたシグナルはＧＦＰに融合しており、組換えタンパク質の局在化は、ＢＹ−２タバコ細胞における安定した発現の後に分析された。ＧＦＰおよびシグナル１、２、３または４の間の融合はＧＦＰ−ＨＤＥＬ融合のようにＥＲを強調した（パネルＡ〜Ｆ）。ＧＦＰおよびシグナル５、６、７、８または９の間の融合はＥＲを強調したが、凝集体は対照ＭａｎＩ−ＧＦＰのようにゴルジクラスターに同化された（パネルＧ〜Ｌ）。ＧＦＰおよびシグナル１１〜１２の間の融合は、対照ＸｙｌＴ３５−ＧＦＰおよびＤ１３Ｇｌｕ９０−ＧＦＰのように、ゴルジクラスターに同化された凝集体のみを強調した（パネルＭ〜Ｏ）。最後に、ＧＦＰおよびシグナルの間の融合は、ゴルジクラスターに同化した凝集体を強調したが、リソソームコンパートメントに対してもそうであった（パネルＲ）。
【図２６】ジ−ａｒｇモチーフを保有する組換えタンパク質の局在化を示す。１つまたは２つのジ−ａｒｇモチーフを保有する組換えタンパク質はｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ  ＥＲマーカーと共に同時局在化され（Ａ〜Ｃ；Ｇ〜Ｒ）、一方、アルギニンの突然変異は組換えタンパク質とＳＴ５２−ｍＲＦＰゴルジマーカーとの同時局在化を担う（Ｄ〜Ｆ）。
【図２７】Ｉ型またはＩＩ型膜タンパク質への標的化シグナルの局在化を示す。
【図２８】膜タンパク質に対して特異的であって、本明細書中に記載された標的化配列の１つと融合した抗体、または抗体断片は、分泌経路の異なるコンパートメントにおいて膜タンパク質を標的化する能力を有することを示す。ここに、ゴルジに局在化されたＧＦＰは説明のために用いる。プラスミドの構築、およびｓｃＦｖの標的化発現で用いるプラスミドのいくつかの例はパネルＡおよびＢに示される。ここに（パネルＣ）、ゴルジに局在化された膜タンパク質（ＧＦＰ−ｇｏｌｇｉ）は、単独で発現された場合、ＥＲに再度向けられ、配列番号３３と融合したＧＦＰ−特異的ｓｃＦｖと同一植物において同時発現された場合にはゴルジコンパートメントに再度向けられる。
【図２９】異種酵素、ここではヒトβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼが、本明細書中に記載された標的化シグナルの１つとの融合の後に植物分泌経路の異なるコンパートメントで標的化できることを示す。例として、パネルＢは、植物細胞における、ヒトβ１，４ガラクトシルトランスフェラーゼと配列番号８、３３、３６、または３８との融合の発現で用いられるプラスミドを示す。
【図３０】このグリコシルトランスフェラーゼの触媒ドメインと配列番号３６との融合の後のヒトβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの標的化発現が、同一グリコシルトランスフェラーゼがそれ自身のヒト標的化配列によって植物分泌経路において標的化される場合に得られるグリコシル化パターン（パネルＡ）と比較した場合に、この異種グリコシルトランスフェラーゼ（パネルＢ）の効率を強く改良することを示す。
【図３１】ＺＥＲＡ（登録商標）ペプチドによって生じたプロテインボディーにグリカン成熟酵素が蓄積するように調製されたプラスミドの１つを示す。本明細書中で詳細に記載するプラスミドは、植物細胞において、Ｚｅｒａ（登録商標）と融合したマンノシダーゼの発現を可能とする。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００７９】
実施例Ａ：ＥＲおよび／またはＧＡへのタンパク質の方向付け（添付の図３Ａ）
実施例１
標的化シグナルの同定
１．初期ゴルジＩＩ型膜タンパク質の局在化
初期ゴルジコンパートメントにおけるＮ−グリカンプロセッシング酵素の選択的保留を可能とするメカニズムを良好に理解するために、Ｎ−グリカンプロセッシング機構の４つの異なるメンバー（Ａ−グルコシダーゼＩ、マンノシダーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩおよびｂ−１，２−キシロシルトランスフェラーゼ、添付の図４）に対する一連のＧＦＰ融合の局在化を、タバコＢＹ−２細胞における安定した発現後に実験した。
【００８０】
ＧＦＰ融合タンパク質を発現させるための構築物は、Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ，２００６（参考文献５８）に開示されているように作製した。全てのマンノシダーゼＩ融合構築物は、Ｎｅｂｅｎｆｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）（参考文献４３）によって元来記載された（ここでは、ＭａｎＩ−ＧＦＰと呼ばれる）全長ＧＦＰ融合から得た。
【００８１】
まず、ＡａｔＩＩ制限部位を含有するリンカーをＭａｎＩおよびＧＦＰコーディング領域の間に導入した。予測されるステム領域の末端近くの天然ＡａｔＩＩ部位と組合せて、これは、例えば、Ｍａｎ９９−ＧＦＰを生じさせるための触媒ドメインの単純な除去を可能とした。
【００８２】
第２に、Ｎ末端領域の特異的セグメントの除去を容易とするために、ＰＣＲ突然変異誘発によって３つの新しい制限部位を導入した：１つは開始コドン直後のＮｈｅＩ部位、１つはコドン２１および２２におけるＳｐｅＩ部位、およびコドン５０および５１におけるもう１つのＡａｔＩＩ部位。修飾された構築物の一体性は、配列決定によって確認した。この新しい構築物において、小胞体テイルはＮｈｅＩおよびＳｔｅＩで除去して、Δ１９ＣＴＭａｎＩ−ＧＦＰを得ることができ、一方、ＡａｔＩＩ消化はＭａｎＩの全ルーメン部分を除去して、Ｍａｎ４９−ＧＦＰを生じさせる。二つの手法の組合せの結果、Δ１９ＣＴＭａｎ４９−ＧＦＰが得られた。最後に、開始コドンを持つＴＭＤドメインの１８アミノ酸をコードする、順方向（５’−ＧＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’（配列番号４０））および逆方向（５’−ＣＴＡＧＴＴＴＧＡＣＧＧＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧ−３’（配列番号４１））オリゴヌクレオチドを合成し、融合し、任意の開始コドンも含まないＧＦＰを含有するｐＢＬＴＩ１２１バイナリベクター（Ｋｉｅｆｅｒ−Ｍｉｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，未公表データ）にサブクローンして、ＤＣＴＭａｎ４９−ＧＦＰを得た。同一戦略を用いて、順方法（５’−ＧＡＴＣＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＴＣＡＴ
ＣＧＴＴＴＴＣＧＴＴＴＧＴＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＣＴＧＧＧＡＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’（配列番号４２））および逆方向（５’−ＣＴＡＧＴＴＴＧＡＣＧＧＴＣＣＣＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＡＧＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧ−３’（配列番号４３））プライマーを用いてＭＡＡＭａｎ４９−ＧＦＰを生じさせた。
【００８３】
第三に、より長いＴＭＤ領域を、前記した修飾されたＭａｎＩの２工程ＰＣＲ突然変異誘発に導入した。最初の工程において、ＴＭＤに続くＡａｔＩＩ部位をＢｓｐＥＩ部位と置き換えた。第２の工程において、長いＰＣＲプライマーを用いて、予測されるＴＭＤの最後の７つのアミノ酸を複製して、ＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰを得た。最後に、この構築物の触媒ドメインをＡａｔＩＩで除去して、Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰを得た。
【００８４】
前記した全てのクローニング工程はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおいて行った。（二重３５ＳプロモーターおよびＮｏｓターミネーターを含めた）仕上げた発現カセットを、次いで、ｐＢＩＮ２０に移動させた。
【００８５】
ＳＴ−ｍＲＦＰをコードする植物バイナリベクターを得るために、ＧＦＰをｐＶＫＨ１８Ｅｎ６  ＳＴ−ＧＦＰ（Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献５６））における（Ｒｏｇｅｒ  Ｔｓｉｅｎによって提供された）モノマーＲＦＰで置き換える。ＳＴ−ｍＲＦＰ発現は６×タンデムに反復されたＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下にある。
【００８６】
ＧＮＴＩ−ＧＦＰ、ＧＮＴ３８−ＧＦＰを、鋳型として、Ｎ−アセチルグロコサミニルトランスフェラーゼをコードするタバコｃＤＮＡを用いるＰＣＲによって増幅した（Ｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９９（参考文献６０））。逆方向プライマー５’ＧＧＴＣＡＣＴＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号４４）および５’−ＧＧＴＣＡＣＴＡＧＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号４５）を、順方向５−ＡＡＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＧＡＧＧＧＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＣ−３’（配列番号４６）プライマーでのＰＣＲを用いて、ＧＮＴＩ、およびＧＮＴＩのＮ末端３８アミノ酸端部を増幅して、各々ＧＮＴＩ−ＧＦＰおよびＧＮＴ３８−ＧＦＰを得た。ＧＣＳＩ−ＧＦＰを発現させるために、ＧＦＰのＮ末端に融合され、かつｐＢＬＴＩ１２１（Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）参考文献５０））にサブクローンされた、Ｂｏｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１にクローン化されたシロイヌナズナｃＤＮＡを用いるＰＣＲによって、全ｃＤＮＡを増幅した。次いで、最初の９０アミノ酸を順方向（５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＣＣＧＧＡＧＣＴＡＧＣＣＧＴ−３’（配列番号４８））および逆方向（５’−ＧＡＣＴＡＧＡＡＡＡＧＧＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＴ−３’（配列番号４９））プライマーでのＰＣＲによって増幅し、ｐＢＬＴＩ１２１バイナリベクターに含有されたＧＦＰの５’末端に位置したＳｐｅＩ制限部位にサブクローンして、ＧＣＳ９０−ＧＦＰを得た。同様にして、最初の１３アミノ酸が欠失された９０アミノ酸を、順方向（５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣＴＣＣＣ−３’（配列番号４９））および前記した同一逆方向プライマーでのＰＣＲによって増幅して、Ｄ１３ＧＣＳ９０−ＧＦＰを得た。
【００８７】
全長ＭａｎＩ−ＧＦＰ融合構築物の蛍光は、もう一つの独立した細胞系においてこの構築物について従前に記載されているように（Ｎｅｂｅｎｆｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献４３））、細胞質を通って移動する小体（添付の図５Ａおよび５Ｂ）において、共焦点レーザー走査型顕微鏡観察によって検出した。
【００８８】
加えて、実質的な蛍光シグナルがＧＦＰ−ＨＤＥＬ構築物によって染色されたＥＲネットワークから区別可能な細胞質全体にわたる網状ネットワークで観察された（添付の図５
Ｄおよび５Ｅ）。ＥＲ標識が組換えタンパク質の過剰発現によるかをチェックするために、ＭａｎＩ−ＧＦＰを発現するＢＹ−２細胞をタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドと共にインキュベートした。２時間の処理の後、標的化パターンは変化しないままであり、ＭａｎＩ−ＧＦＰの定常状態位置がゴルジおよびＥＲであることを示す（添付の図５Ｃおよび５Ｂを比較のこと）。
【００８９】
蛍光スポットがゴルジスタックであることを確認するために、細胞を５０ｍｇ・ｍＬ−１のｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（ＢＦＡ）で２時間処理した。タバコ葉表皮およびＢＹ−２浮遊培養細胞で発現されたいくつかのゴルジ局在化ＧＦＰ融合タンパク質について従前に記載されているように（Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献５６）；Ｒｉｔｚｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献５４））このＢＦＡ処理は緑色スポットを消失させ、皮質および血管貫通ＥＲはより蛍光的となった（添付の図５Ｂおよび５Ｅに対して添付の図５Ｆを参照のこと）。
【００９０】
分泌経路における他の植物Ｎ−グリコシル化酵素の１つに対するＭａｎＩの位置比較は、ＭａｎＩの前、直後、またはかなり後に作用するＮ−グリカン成熟酵素の細胞内局在化と同一条件下で分析した。最初の酵素実験はシロイヌナズナからのａ−グルコシダーゼＩであった（ＧＣＳＩ）。このＩＩ型の膜タンパク質は、生成直後の糖タンパク質のその付着の直後に、ＥＲにおける前駆体オリゴ糖からの第１の糖残基をトリミングする（添付の図２Ｂにおける植物Ｎ−グリカン成熟の模式図参照）。全長タンパク質（Ｂｏｉｓｓｏｎ
ｅｔ  ａｌ．，２００１（参考文献６））をＧＦＰに融合させ、ＣＯＳ細胞においてヒトＧＣＳＩについて示されたもの（Ｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献２８））と合致して、融合タンパク質はＢＹ−２細胞において専らＥＲに局在化された（添付の図５Ｇ）。
【００９１】
研究された第２の候補はタバコからの（ＧＮＴＩ）であった。（Ｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献６０））。このグリコシルトランスフェラーゼは、ＭａｎＩがａ−１，２−マンノースを除去して間もなく、第１のＮ−アセチルグルコサミン残基をＮ−グリカン上に加える（添付の図２Ｂ）。全長タンパク質をＧＦＰに融合させ、ＧＮＴＩ−ＧＦＰをタバコＢＹ−２浮遊培養細胞において発現させた。興味深いことには、融合の定常状態位置は、ＭａｎＩ−ＧＦＰと非常に類似したパターンで、ゴルジおよびＥＲであった（添付の図５Ｈ）（添付の図５Ｈおよび５Ｂを比較のこと）。これらのデータは、ＭａｎＩおよびＧＮＴＩのようなゴルジ装置において非常に早く作用すると考えられるＮ−グリカンプロセッシング酵素がゴルジに標的化されるが、タバコＢＹ−２浮遊培養細胞においてＥＲにも標的化されることを強く示唆する。
【００９２】
最後に、第三の候補、シロイヌナズナからのｂ−１，２−イルオキシトランスフェラーゼ（ＸｙｌＴ）はゴルジのみに局在化され（添付の図５）、これは、この酵素のＮ末端がゴルジスタックの槽の中央サブセットにＧＦＰを標的化することを示したＰａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）（参考文献５０）からの結果を確認している。
【００９３】
タンパク質発現レベルが我々の融合タンパク質の局在化を改変するか否かを確認するために、これらの結果を、融合タンパク質を発現する異なる安定した独立細胞系において確認した。細胞のイメージングは、常に、我々の培養条件下の最適成長相に対応する継代培養から３日または４日後に行った。ＥＲ標識が融合の過剰発現によるものではないことを更に確証するのにかかわらず、各融合についての標識パターンを、それがシクロヘキシミドでの２時間処理の後に変化しなかったことを確認することによって制御した。
【００９４】
抗ＧＦＰ抗体およびＥＣＬ染色で明らかにされたウェスタンブロットは、組み換えタンパク質についてのバックグラウンド上に非常に低いシグナルを示し、これは、この実験に
おける全ての融合タンパク質についての発現の低いレベルを示す（データは示さず）。機能的不飽和分泌経路に適合する融合タンパク質発現のレベルについての更なる証拠は、同一細胞において、ＭａｎＩ−ＧＦＰがＥＲおよびゴルジ双方に位置し、一方、ゴルジマーカー（ＳＴ５２−ｍＲＦＰ）が専らゴルジで発見される場合に、同時発現実験から得られた（添付の図７Ａ〜７Ｃ）。
【００９５】
まとめると、これらの注意深く制御された条件下で得られた結果は、Ｎ−グリコシル化酵素が、専ら、ＥＲ（ＧＣＳＩ）に、またはゴルジ（ＸｙｌＴ）に特異的に標的化されるが、ＭａｎＩおよびＧＮＴＩならびにプロリル４−ヒドロキシラーゼ（Ｙｕａｓａ  ｅｔ
ａｌ．，２００５（参考文献６５））およびＥＲＤ２（Ｂｏｅｖｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８（参考文献５）；Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献５６））のような他の膜タンパク質で当てはまるように、いくつかの酵素は双方のオルガネラにおいて二つの定常状態位置を有することを明瞭に示す。
【００９６】
次の工程において、二つの定常状態分布ゴルジ／ＥＲを示すグリコシル化酵素の集団の標的化を担うシグナルを調査した。
２．ルミナールドメインは、ＭａｎＩおよびＧＮＴＩのゴルジおよびＥＲ標的化に必要でないことを示す実験
３つの植物グリコシル化酵素の特異的ゴルジ保留に関して、ＧＮＴＩ，ＸｙｌＴおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ＭａｎＩ（添付の図２）は、それらの特異的標的化が、ＧＮＴＩについての細胞質テイル、ＴＭＤ、およびステムを含めたそれらのＮ末端部分に含有されたシグナルによって媒介することを示す（Ｅｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献１６），Ｄｉｒｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献１５）；Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献５０）；Ｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（参考文献６１））。本実施例は、ＭａｎＩおよびＧＮＴＩの標的化においてルミナールドメインの役割を調べる。
【００９７】
ゴルジルーメンに位置するＭａｎＩの部分がゴルジおよびＥＲ膜に対してこのグリコシラーゼを標的化するにおいて役割を演じるかを決定するために、ＭａｎＩの最初の９９アミノ酸（ＣＴ＋ＴＭＤ＋Ｓ）または最初の４９アミノ酸（ＣＴ＋ＴＭＤ）をＧＦＰに融合させ、対応するキメラタンパク質を、各々、Ｍａｎ９９−ＧＦＰおよびＭａｎ４９−ＧＦＰと命名した（添付の図４）。Ｍａｎ９９−ＧＦＰおよびＭａｎ４９−ＧＦＰをＢＹ−２浮遊培養細胞中で安定に発現させるか、あるいは葉浸潤によってタバコ葉表皮細胞において一過的に発現させた。Ｍａｎ９９−ＧＦＰおよびＭａｎ４９−ＧＦＰキメラタンパク質の双方は、全長構築物（添付の図５Ａおよび５Ｂ）について正確に従前に観察されているように、双方の発現系（各々、添付の図６Ａ、６Ｂ、６Ｅおよび６Ｄ、６Ｆ）においてゴルジ、およびＥＲで観察された。
【００９８】
これらの切断融合がタバコ葉において一過的に発現される場合、全発現レベルが既に強く減衰している場合の形質転換から５日の後に依然としてＥＲ標識が観察され、（添付の図６Ｆ）、一方、ＸｙｌＴ３５−ＧＦＰはゴルジのみに位置したこと（Ｐａｇｎｙ  ｅｔ
ａｌ．，２００３（参考文献５０）；添付の図６Ｉ）に注意するのは重要である。これは、さらに、ＥＲにおけるＭａｎＩ融合の部分的位置がキメラタンパク質の過剰発現によらないことを確認する。加えて、Ｍａｎ９９−ＧＦＰを発現するＢＹ−２細胞をタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドでの２時間処理した場合、全長融合で観察されたように、ＥＲ標識は消失しなかった（添付の図６Ｃ）（添付の図５Ｃと比較のこと）。
【００９９】
融合タンパク質がどこでゴルジスタック内に局在化されるかの良好な理解を得るために、ＭａｎＩ−ＧＦＰを、ＧＦＰをモノマー赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献１１））で置き換えることによって、ＧＦＰ（
Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献５６）；Ｒｕｎｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（参考文献５５））に由来するトランスゴルジマーカーＳＴ５２−ｍＲＦＰと同時発現させた。２つのキメラタンパク質をＢＹ−２細胞において同時に発現させた場合、ＭａｎＩ−ＧＦＰとは対照的に、ＳＴ５２−ｍＲＦＰはＥＲで検出されず、双方の蛍光シグナルはゴルジ体で観察されたが、完全には同時局在化されなかった（添付の図７Ａ〜７Ｃ）。これらの結果は、以下のことを示す従前の結果と合致する。
【０１００】
１）ＭａｎＩ−ＧＦＰ融合はＢＹ−２細胞においてゴルジのシス半分に局在化される（Ｎｅｂｅｎｆｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献４３））。
２）ラットａ−２’６−シアリルトランスフェラーゼの５２アミノ末端アミノ酸は、ゴルジスタックのトランス半分に対して優勢にレポータータンパク質を標的化するのに十分である（Ｂｏｅｖｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８（参考文献５））。
【０１０１】
かくして、共焦点顕微鏡観察は、ＭａｎＩ−ＧＦＰおよびＳＴ５２−ｍＲＦＰがゴルジ装置中のシステルネの異なるサブセットに蓄積するのを説明するのに十分であった。最後に、Ｍａｎ９９−ＧＦＰまたはＭａｎ４９−ＧＦＰをトランス−ゴルジマーカーＳＴ５２−ｍＲＦＰと同時発現させた場合、２つのフルオロフォアは部分的に重複するに過ぎず、（各々、図７Ｄ〜７Ｆおよび７Ｇ〜７Ｉ）切断融合タンパク質のゴルジ内局在化は、全長融合ＭａｎＩ−ＧＦＰのそれと同一であると示唆する。
【０１０２】
ＣＴ、ＴＭＤおよびステムを含めたタバコＧＮＴＩの最初の７７のＮ末端アミノ酸は、このグリコシルトランスフェラーゼのゴルジ保留を維持するのに必要な情報を含有することは従前に記載されていた（Ｅｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９９（参考文献１６））。ＧＦＰに融合されたこのポリペプチドドメインはゴルジに選択的に位置することが示されているが、キメラタンパク質は全長構築物についてここに観察されるようにＥＲにおいてやはり欠失された（添付の図５Ｈ）。ゴルジルーメンに残る配列がＧＮＴＩのゴルジおよびＥＲ標的化に関与するかを決定するために、ルーメン部分（３９アミノ酸）を除去し、このグリコシルトランスフェラーゼの残りの最初の３８のＮ末端アミノ酸（ＣＴ＋ＴＭＤ）をＧＦＰに融合させた（添付の図４）。融合タンパク質はＧＮＴ３８−ＧＦＰと命名され、ＢＹ−２浮遊培養細胞において安定して発現され、あるいはタバコ葉表皮細胞において一過的に発現された。
【０１０３】
双方の発現系において、ＧＮＴ３８−ＧＦＰは、全長構築物（ＧＮＴＩ−ＧＦＰ、添付の図面５Ｈ）で従前に観察されているように、ゴルジに、およびＥＲに位置した（添付の図６Ｇおよび６Ｈ）。加えて、ＧＮＴ３８−ＧＦＰがＢＹ−２細胞においてＳＴ５２−ｍＲＦＰと安定して同時発現された場合、Ｍａｎ９９−ＧＦＰおよびＭａｎ４９−ＧＦＰで以前に観察されたように、２つの蛍光スポットは重複したが、いくらかの赤色蛍光は黄色から区別でき、ＭａｎＩで従前に観察されているように、ＧＮＴ３８−ＧＦＰはトランス−ゴルジにはないことを示唆している（添付の図７Ｊ〜７Ｌ）。
【０１０４】
これらの結果から、ＭａｎＩおよびＧＮＴＩ双方のサイトゾルテイル、およびＴＭＤは、それらの定常状態位置：ＥＲおよび初期ゴルジコンパートメントへこれらのグリコシル化酵素を標的化するのに十分である。対照的に、同一ドメイン（ＣＴ＋ＴＭＤ）はＸｙｌＴ３５−ＧＦＰを、ＢＹ−２細胞（Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献５０））およびタバコ葉表皮細胞（添付の図６Ｉ）の双方においてのみゴルジに標的化させる。
【０１０５】
３．細胞質テイルは分泌経路の初期コンパートメントにおけるＭａｎＩの保留に必要でないことを示す実験
哺乳動物および酵母ＥＲに、および／またはゴルジ装置に存在する多くの膜結合タンパ
ク質のＮ末端サイトゾル領域は、ゴルジからＥＲへ戻るそれらの検索（Ｔｅａｓｄａｌｅ
ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９６（参考文献６２）；Ｚｅｒａｎｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献６６））、またはＥＲからゴルジまでのそれらの輸出（Ｇｉｒａｕｄｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｃｉｏｎｉ，２００３（参考文献２０））のいずれかを容易とするシグナルを含有する。植物においては、細胞質テイルの長さは、異なるグリコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼの間で広く変化できる（添付の図８）。例えば、ＧＣＳＩおよびＭａｎＩは長い細胞質テイルを含有する（各々、５１／２９個のアミノ酸）。比較として、ＧＮＴＩおよびＸｙｌＴのＣＴは１１個のアミノ酸のみから構成される。
【０１０６】
ＭａｎＩの標的化シグナルをより正確に定義し、およびこの標的化におけるこのグリコシダーゼの比較的長い細胞質ドメイン（２９  アミノ酸）の役割を調べるために、２つの融合タンパク質Ｄ１９Ｍａｎ−ＧＦＰおよびＤ１９Ｍａｎ４９−ＧＦＰを生じさせた。後者の２つのタンパク質において、ＸｙｌＴおよびＧＮＴＩのＣＴと同様に、ＣＴが１０アミノ酸まで短くなるように、１９個のアミノ酸を除去した。もう１つのＥＲ輸出シグナルは残ったままであったが、この切断は、ＥＲからゴルジへの輸送（Ｇｉｒａｕｄｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｃｉｎｏｎｉ，２００３（参考文献２０））で働くであろう二塩基性モチーフ（ＫｘＲ）を除去した。ＣＴの完全な除去が試みられた（ＤＣＴＭａｎ４９−ＧＦＰ、添付の図４）が、タバコ細胞で発現されたこの融合タンパク質を得るのは不可能であった。ＣＴの残りの１０個のアミノ酸における標的化決定基を探すために、ＣＴ配列を人工配列ＭＡＡＡ（ＭＡＡＡＭａｎ４９−ＧＦＰ、添付の図４）によって置き換えた。この人工配列は公知のどの標的化配列にも含有せず、疎水性膜貫通ドメインの長さに影響しない。
【０１０７】
３つの構築物、すなわちＭＡＡＡＭａｎ４９−ＧＦＰ、Ｄ１９Ｍａｎ−ＧＦＰおよびＤ１９Ｍａｎ４９−ＧＦＰが、タバコ細胞において発現されている。後者の２つは、丁度、それらが由来する（各々、添付の図５Ａ、５Ｂおよび６Ｄ、６Ｆ）該構築物のようにＥＲおよびゴルジ（添付の図９Ａ〜９Ｄ）を標識した。加えて、人工ＭＡＡＡ  ＣＴを含有する融合タンパク質は同一のコンパートメントに位置し（添付の図９Ｅ）、Ｎ末端サイトゾル領域はＭａｎＩ標的化で必要ではなく、結局、ＥＲおよびゴルジ装置へのその定常的な局在化で必要な全ての情報はＭＡＡＡＭａｎ４９−ＧＦＰ構築物の２０個のアミノ酸内に、すなわち、ＴＭＤおよびＣ末端フランキングアミノ酸に含有されていることを示す。
４．膜貫通ドメイン（ＴＤＭ）の長さがゴルジ標的化、およびＭａｎＩのサブコンパートメント化において重要な役割を演じることを示す実験
哺乳動物細胞では、どのようにしてＩＩ型膜タンパク質がゴルジ内で異なるレベルで保持されるかを説明するために、いくつかのモデルが提案されてきた。
【０１０８】
最初のモデルである「同族認識」モデル（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ｂ（参考文献４５））によると、ホモ／ヘテロオリゴマー化によるＮ−グリカン成熟酵素の凝集は、得られた大きな複合体が分泌小胞へ、および分泌経路中の下流への継続的な順方向輸送に送達されるのを妨げる。
【０１０９】
このタイプの会合の最初の報告された場合の１つは、ａ−マンノシダーゼＩＩ，およびＧＬＴＩ、メディアルゴルジに位置し、順次哺乳動物Ｎ−グリカン成熟作用する２つのグリコシル化酵素に関係するものであった（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４（参考文献４６））。このモデルは、元来、安定したゴルジ嚢の存在、および小胞シャトルを介する分泌輸送具の順行性流れを仮定することに注意すべきである（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３ｂ（参考文献４５））。システルネ進行／成熟概念と適合させるために「同族認識」モデルは、オリゴマー複合体が逆行性小胞に優先的にパッケージされるのを可能とするように修飾されなければならないであろう（Ｆｕｌｌｅｋｒｕｇ  ａｎｄ
Ｎｉｌｓｓｏｎ，１９９８（参考文献１８））。
【０１１０】
第２のモデルである脂質二層モデル（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｎｒｏ，１９９３（参考文献））は、グリカン成熟酵素のＴＭＤの長さ、および各オルガネラ膜の脂質二層の厚みの間の適合が局在化を決定することを提案している。なぜならば、各オルガネラはその特異的膜脂質組成および、結果として、それ自体の厚みを有するからである（（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ，１９８７（参考文献２９）；Ｌｙｎｃｈ，１９９３（参考文献３３）；Ｍｏｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８（参考文献３６）；Ｍｏｒｒ驕@ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｎｈａｕｅｒ，１９７４（参考文献３７））。
【０１１１】
膜厚みモデルによると、分泌経路におけるＮ−グリカン成熟酵素の分布は、それらのＴＭＤの長さに基づいて決まる（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｎｒｏ，１９９３（参考文献１０））。分泌経路オルガネラの膜は、ＥＲから原型質膜まで厚みが増加する。ＥＲおよびシスゴルジ膜は厚みが４〜５ｎｍに過ぎないが、トランスゴルジの膜、分泌小胞および原形質膜は厚みが８〜９．５ｎｍである（Ｇｒｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９６８（参考文献２６）；Ｍｏｒｒ驕@ａｎｄ  Ｍｏｌｌｅｎｈａｕｅｒ，１９７４（参考文献３
７））。さらに、ＴＭＤ長さに関する標的化は、動物システム（Ｍｕｎｒｏ  １９９１，１９９５ａ，１９９５ｂ（参考文献３８））における、およびＩ型タンパク質については植物細胞における（Ｂｒａｎｄｉｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ（参考文献９））における、それらのＴＭＤの長さを変化させた後にレポータータンパク質の位置を調べることによって従前に説明された。これは、特異的コンパートメントの膜が一致する長さの疎水性ＴＭＤを収容できるに過ぎないことを示唆する。
【０１１２】
比較は、ゴルジタンパク質ＴＭＤの長さが原形質膜タンパク質のそれよりも平均して５アミノ酸だけ短いことを明らかとした（Ｍａｓｉｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３（参考文献４１）；Ｍｕｎｒｏ，１９９５ａ（参考文献４８））。いくつかの例はこのモデルに好都合である。ラットａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼおよびウシｂ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼの長さの増加は、これらのグリコシルトランスフェラーゼのゴルジ保留を低下させた。加えて、１７のロイシンから作成された合成Ｉ型のＴＭＤの結果、リンパ球表面抗原ＣＤ８細胞外ドメインのゴルジ保留をもたらし、一方、２３ロイシンＴＭＤが細胞膜で増大した量で見出された（Ｍａｓｉｂａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３（参考文献４１）；Ｍｕｎｒｏ，１９９１（参考文献４７），１９９５ｂ（参考文献４９））。さらに、１〜９の疎水性アミノ酸の挿入による１８アミノ酸のａ−２、６−シアリルトランスフェラーゼＴＭＤの長さの暫時の増大の結果、同様なａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ−リソソームキメラの増大した細胞表面発現がもたらされ、一方、原形質膜タンパク質ＴＭＤの長さの減少により、ゴルジにおけるその保留の増大が生じた（Ｍｕｎｒｏ，１９９５ｂ（参考文献４９））。
【０１１３】
植物細胞においては、ＴＭＤの長さに関連する膜内システムに沿っての膜タンパク質のサブコンパートメント化に好都合な予備的データが、ＧＦＰに融合した２つのＩ型膜タンパク質においてＴＭＤの長さを変化させることによって得られた（Ｂｒａｎｄｉｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ（参考文献９））。
【０１１４】
まず、２３個のアミノ酸ＴＭＤを含有するヒトリソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ１をＧＦＰに融合させ、タバコの葉で発現させた。融合は原形質膜に位置した。対照的に、ＴＭＤを２０および１７個のアミノ酸まで短くすると、ＧＦＰキメラは、各々、ゴルジおよびＥＲ膜に局在化された。第２に、空胞ソーティング受容体ＢＰ８０の１９アミノ酸長さのＴＭＤはＧＦＰをゴルジに標的化させ、一方、２２アミノ酸の長さのＴＭＤはＧＦＰを原形質膜に標的化させた。
【０１１５】
どのようにしてそれがゴルジにおけるそのサブコンパートメント化に影響し得るかを知るために、ＩＩ型膜タンパク質ＭａｎＩのＴＭＤ長さを調べた。特に、ＴＭＤの長さは、
このドメインの最後の７個のアミノ酸を複製することによって、１６から２３アミノ酸まで増加した。ＥＲおよびゴルジ装置のシス半分に位置した１６アミノ酸のＴＭＤを含有するそれらのホモログとは対照的に、２３アミノ酸のＴＭＤを持つキメラタンパク質は、専ら、ゴルジにより正確には、ゴルジスタックのトランス半分に局在化された。
【０１１６】
本実施例においては、ＭａｎＩ標的化に必要な情報は、１６アミノ酸ＴＭＤを含めた２０アミノ酸配列内に含まれる。ＴＭＤの長さが初期植物分泌経路においてこのＩＩ型膜タンパク質の標的化で重要な役割を演じることができるかを調べるために、２つの融合タンパク質ＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰおよびＭａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰを設計し、ここに、ＭａｎＩのＴＭＤを、その最後の７個のアミノ酸の複製によって１６から２３アミノ酸まで長くした（添付の図４）。ＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰおよびＭａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰを、ＢＹ−２浮遊培養細胞において、およびタバコ葉表皮細胞において発現させた。双方の植物発現系で、ＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰおよびＭａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰは、専ら、明るいスポットに位置し、（添付の図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｄ）、真菌トキシンブレフェルジンＡ（５０  μｇ．ｍＬ−１、２時間、添付の図１１Ｃ）に感受性であった。ＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰおよびＭａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰの発現パターンは、電子顕微鏡観察によって従前に確認されているように、共に、ＢＹ−２浮遊培養細胞およびタバコ葉表皮細胞中のゴルジに専ら位置するＸｙｌＴ−ＧＦＰ融合（添付の図１０）、またはＳＴ５２−ｍＲＦＰ融合（添付の図１０）と同様であった（Ｂｏｅｖｉｎｋ  ｅｔ
ａｌ．，１９９８（参考文献７）；Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献６３））。
【０１１７】
ＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰおよびＭａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰのサブ−コンパートメント化をさらに調べるために、これらのＧＦＰ融合タンパク質およびＳＴ５２−ｍＲＦＰの一方または他方を同時発現する安定したＢＹ−２浮遊培養細胞を確立した。併合イメージにおいて、緑色スポットを赤色スポットから分離するのは不可能であり、２３アミノ酸のＴＭＤを含有するＧＦＰ融合は、それらが共焦点レベルでＳＴ５２−ｍＲＦＰと同時局在化するように、ゴルジ内で順方向にトランス面に向けて移動したことを示唆する（添付の図１０と比較のこと）。興味深いことには、スポットのパターンは、断面（添付の図１０Ｇ〜１０Ｉ）と比較して、皮質イメージ（添付の図８Ｄ〜８Ｆ）が同様であり、これはより長いＴＭＤおよびトランスゴルジマーカーＳＴ５２−ｍＲＦＰとのＭａｎ−ＧＦＰ融合が完全に同時局在化されるという仮定を補強している。対照的に、メディアルゴルジマーカー（ＸｙｌＴ３５−ＧＦＰ）およびトランスゴルジマーカー（ＳＴ５２−ｍＲＦＰ）の結果、併合イメージ（添付の図１０Ｊ〜１０Ｌ）において完全に重複しない蛍光スポットが生じた。
【０１１８】
ポリクローナル抗ＧＦＰ抗体でのイムノゴールド標識と電子顕微鏡観察とを組み合わせることにより、我々は、これらの融合タンパク質のゴルジ内局在化をより正確に決定することができた。添付の図１１に示すように、Ｍａｎ９９−ＧＦＰ融合は主としてゴルジのシス側に蓄積し（添付の図１１Ｂ）、一方、Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰ融合は、主として、ゴルジのトランス側に局在化される。（添付の図１１Ｃ）。
【０１１９】
同様な結果がＭａｎＩ−ＧＦＰおよびＭａｎＴＭＤ２３−ＧＦＰで得られた（データは示さず）。プレ免疫血清または野生型タバコＢＹ−２浮遊培養細胞を用いた対照実験は全くまたはほとんど非特異的ゴルジ標識を示さなかった（添付の図１１Ａ）。
【０１２０】
この結果は、ＴＭＤが全長タンパク質ＭａｎＩとして同一局在化を付与するのに十分であることを示し、該データは、ＴＭＤの長さがゴルジスタックおよびＥＲ内のこのＩＩ型膜タンパク質の正確な位置決定のための非常に重要な因子であることを示唆する。かくして、タンパク質脂質相互作用は、分泌系内のＭａｎＩ標的化において重要な役割を演じる
と期待される。
【０１２１】
興味深いことには、これらの結果は、植物分泌系におけるＩ型およびＩＩ型膜タンパク質の標的化でのＴＭＤ長さの要件の差を明瞭に指摘している。事実、ＸｙｌＴの２３アミノ酸のＴＭＤ（Ｄｉｒｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献１５）；Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献５０））、またはＭａｎＩＩの２２アミノ酸のＴＭＤ（Ｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（参考文献６０））は、ＧＦＰをゴルジのみに標的化する。加えて、本実験においては、長いＴＭＤ（２３アミノ酸）を有するＭａｎＩもまた専らゴルジで検出された。対照的に、Ｉ型膜タンパク質の２３アミノ酸  ＴＭＤおよびＢＰ８０の長い２２アミノ酸のＴＭＤは（Ｂｒａｎｄｉｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ａ（参考文献８））における原形質膜タンパク質にＧＦＰを標的化する。
【０１２２】
所与厚みを持つ膜に滞在するための膜タンパク質についてのＴＭＤ長さの要件は、タンパク質のトポロジー（Ｉ型またはＩＩ型）に依存するであろう。
これらの実験はＭａｎＩタンパク質標的化ＴＭＤ長さの役割を明瞭に示すが、他の実験は、他の酵素がより適切な局在化のために他のシグナルを必要とすることを示す。例えば、ゴルジの後期部分におけるより長いＴＭＤの傾向とは反対に、１８アミノ酸のＴＭＤとのＳＴ５２−ＧＦＰ融合が、２３アミノ酸のＴＭＤとのＸｙｌＴ３５−ＧＦＰ融合（Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献５０））よりもトランスゴルジにおいてさらに下流で見出されている（Ｂｏｅｖｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８（参考文献５）；Ｗｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献６３））。
【０１２３】
同様な結果が、一過性発現で用いる他の植物系で得られた。事実、Ｍａｎ９９−ＧＦＰは大豆（添付の図１２Ａ）において、またはトマト（添付の図１２Ｃ）において、ゴルジおよびＥＲに位置し、一方、Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰは双方の発現系（添付の図１２Ｂおよび１２Ｄ）においてほとんど専らゴルジで見出された。
【０１２４】
ＴＭＤが植物グリコシル化酵素にこれまで同定された最も短いものの１つであって、ＥＲへの局在化を可能とする、ＧＣＳＩに関してここに説明した状況においてさえ、実験は、ＣＴに含有されたさらなる情報が適切な標的化で必要とされることを示した。かくして、ＧＣＳＩで行ったインシリコ分析および突然変異誘発実験は、植物分泌系におけるグリコシル化酵素のコンパートメント化のための唯一のシグナルとしてのＴＭＤ長さと合致しない。
【０１２５】
換言すれば、ＴＭＤの長さはＥＲおよびシスゴルジにおいてＭａｎＩ標的化に対して鍵となる役割を演じるが、ＧＣＳＩで得られた結果が、ＥＲまたはゴルジ膜におけるいくつかの膜タンパク質の特異的局在化もまた、（ＴＭＤを介する）タンパク質−脂質および（特殊なソーティングモチーフを介する）タンパク質−タンパク質の相互作用の双方に依存し得ることを示している。ゴルジマトリックスタンパク質または細胞質レギュレータのようなサイトゾルパートナーの同定は、植物分泌経路に沿ってのＮ−グリカン成熟酵素を分配するためのこの第２のモデルに関与するメカニズムを説明するのを可能とする。
【０１２６】
ゴルジにおいて種々のレベルに局在化する酵素の大きな収集物により、真菌トキシンブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）での処理に応じた、ゴルジスタック内の全てのシステルネがＥＲと融合するか否かの問題の試験が可能となった。事実、１６または２３個のアミノ酸のＴＭＤおよびＳＴ５２−ｍＲＦＰいずれかを含有するＭａｎ−ＧＦＰ融合は、全て、ＢＦＡでの２時間のタイムコース実験に渡ってＥＲに向けてゴルジクラスター中に移動して戻る。これらの結論は、従前に公表された結果と合致する（図１２に添付）（Ｎｅｂｅｎｆｕｈｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２（参考文献４３）；Ｒｉｔｚｅｎｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  
ａｌ．，２００２（参考文献５４））。
【０１２７】
結論において、これらの結果はまとまって、ＴＭＤ長さが、ＭａｎＩのＥＲおよびシスゴルジコンパートメントへの標的化において鍵となる役割を演じ、および１６から２３アミノ酸へのＴＭＤの長さの増加は、このＩＩ型膜タンパク質をゴルジのトランス面に向けてさらに下流に再度位置させることを示している（添付の図１１Ｄ）。
５．後期および初期ゴルジタンパク質は、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）の存在下にてＥＲに再度分布されることを示す実験
この実験の間に生じたゴルジマーカーの大きなパネルを利用し、種々のゴルジサブコンパートメントに位置するゴルジタンパク質が、ＢＦＡ処理の研究後に異なるように挙動し得る確率を調べた。
【０１２８】
ＥＲ可溶性または膜マーカー（ＧＦＰ−ＨＤＥＬまたはＧｌｕ９０−ＧＦＰ、添付の図１３Ａ〜１３Ｄ）、ＥＲ／初期ゴルジマーカー（Ｄ１９Ｍａｎ４９−ＧＦＰ、添付の図１３Ｅ〜１３Ｆ）、メディアルゴルジマーカー（ＸｙｌＴ３５−ＧＦＰ、添付の図１３Ｇ〜１３Ｈ）または後期ゴルジマーカー（Ｍａｎ９９ＴＭＤ２３−ＧＦＰまたはＳＴ５２−ｍＲＦＰ、添付の図１３Ｉ〜１３Ｌ）を発現する細胞をＢＦＡ（５０ｍｇ．ｍＬ−１）で２時間処理した。ＢＦＡ処理の最後に全ての融合タンパク質は、凝集体に見出されないＥＲマーカー（添付の図１３Ａ〜１３Ｄ）を除いて、明るい凝集体に、およびＥＲ（添付の図１３Ｅ〜１３Ｌ）に蓄積した。全てのマーカーはＢＦＡの存在下でＥＲに再度位置した。
【０１２９】
ＳＴ５２−ｍＲＦＰと共にＥＲ／初期ゴルジまたは後期ゴルジタンパク質を同時発現する細胞において、ＢＦＡは凝集体において見出されてなかったＧＦＰ−ＨＤＥＬ（添付の図１４Ａ〜１４Ｆ）およびＧｌｕ９０−ＧＦＰ（添付の図１４Ｄ）を除いて、ＥＲへの、およびゴルジ凝集体への双方のマーカーの再分布（添付の図１４）を誘導する。いくつかの場合において、タイミングにわずかな差があるが、これらは検出にとって些細なことではなく、ゴルジ内局在化に関して有用でもない。さらに、可溶性（ＧＦＰ−ＨＤＥＬ）または膜タンパク質（Ｇｌｕ９０−ＧＦＰ）マーカーいずれかを発現する細胞のＢＦＡ処理の後に、観察された蛍光パターンにおいて有意な差は観察されなかった（添付の図１４Ａ〜１４Ｄ）。
６．ＴＭＤ長さモデルが全てのＩＩ型膜タンパク質に適用されないことを示す実験
ＴＭＤ長さが、植物分泌経路に沿った全てのグルコシダーゼおよびグリコシルトランスフェラーゼのサブコンパートメント化を可能とする唯一のゴルジソーティング決定基であり得るか否かを決定するために、特徴付けられたグリコシル化酵素のＮ末端配列を比較した（添付の図１４）。
【０１３０】
この分析は、単一の種からのクローン化され、機能的に特徴づけられた少数の異なる酵素の配列によって、ならびに、より少ない数の電子顕微鏡観察データによって、単一の植物系におけるＴＭＤ長さおよび膜厚みを関連付けるのを妨げられた。今までにクローン化された全ての植物グリコシル化酵素のＮ末端配列（ＣＴ＋ＴＭＤ）のインシリコ分析は、ゴルジスタックにおける最も下流の位置を持つタンパク質においてより長いＴＭＤの傾向を明瞭に示している（添付の図１４）。例えば、ａ−１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびａ−１，４−フコシルトランスフェラーゼのような後期ゴルジに位置すると推定される酵素のいずれも、２０アミノ酸よりも短いＴＤＭを有しないことに注意するのは興味深い。これらの結果は、ＴＭＤ長さの予測で用いた、ＭＥＮＳＡＴ＿Ｖ１，８、ＰＨＯＢＩＵＳまたはＰＲＥＤ＿ＴＭＲプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｃｓ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｐｓｉｐｒｅｄ／ｐｓｉｆｏｒｍ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．ｂｉｏｌ．ｕｏａ．ｇｒ／ＰＲＥＤ−ＴＭＲ／ｉｎｐｕｔ．ｈｔｍｌ）で確認された。しかしながら、異なる種からの同様なグリコシル化酵素を比較した場合に、例えば、１６アミノ酸（大豆）〜２０アミノ酸（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の範囲の
ＭａｉＩ  ＴＭＤ、この一般的な傾向に対する例外を認めることができる。
【０１３１】
ＥＲ膜におけるその局在化を説明するための脂質二層モデルに完全に適合することができるその短い１８アミノ酸のＴＭＤに基づき、ＧｌｕＩはこのモデルの一般的な適応性についてチェックするために選択された。ＧｌｕＩのＴＭＤがＥＲにおけるその標的化および保留に十分であるか否かを規定するために、（触媒ドメインを含有する）このグリコシダーゼのルミナール部分のほとんどを欠失させ、その最初のＮ末端の９０個のアミノ酸（ＣＴ＋ＴＭＤ＋Ｓ）をＧＦＰに融合させ、融合タンパク質Ｇｌｕ９０−ＧＦＰを得た（添付の図４）。この融合をタバコ細胞で発現させると、ＥＲは、全長構築物ＧｌｕＩ−ＧＦＰおよびＧＦＰ−ＨＤＥＬ構築物で得られたものと非常に同様なパターンにて強調された（添付の図１５Ａおよび１５Ｂ）（顕微鏡写真１４Ａおよび１４Ｂを４Ｇと４Ｄと４Ｅおよび１２Ｃと比較のこと）。
【０１３２】
この結果は、ＥＲへのＧｌｕＩ標的化が、この切断されたタンパク質に残存するＣＴ、ＴＭＤおよび／または２１ルミナールアミノ酸内に位置するシグナルに依存することを明瞭に示していえる。
【０１３３】
ＥＲ中のＧｌｕＩの局在化に必要とされる最小のタンパク質配列を規定するさらなる試みにおいて、Ｇｌｕ９０−ＧＦＰ構築物からの最初のＮ末端１３アミノ酸が欠失され、Ｄ１３Ｇｌｕ９０−ＧＦＰが得られている（添付の図４）。この融合物がタバコ浮遊培養または葉表皮細胞で発現されると、ＸｙｌＴ−ＧＦＰ（添付の図６Ｉおよび９Ｅ）およびＳＴ５２−ＧＦＰ（添付の図１５Ｆ）で観察されたように、キメラタンパク質は専らゴルジ様スポットに位置した（添付の図１５Ｄおよび１５Ｅ）。
【０１３４】
結論として、ＧｌｕＩの１８アミノ酸長ＴＭＤはＥＲ膜におけるこのグルコシダーゼを標的化するのに十分ではなく、ＣＴの最初の１３アミノ酸に含有されるさらなる情報が、分泌系におけるこのグリコシル化酵素の正常な局在化にとって必要であった。
【０１３５】
この結果は、ＴＭＤ長さ以外の因子が初期分泌経路におけるグリコシル化酵素の位置決定に影響するという実験的証拠を提供している。
７．シロイヌナズナ  ＧＣＳＩＩＩ型膜タンパク質の局在化
ＧＣＳＩはタバコ小胞体に厳格に蓄積される。
【０１３６】
シロイヌナズナ  ＧＣＳＩは、５１アミノ酸のサイトゾルテイル、約１８残基の膜貫通ドメイン、およびルーメンに向けられた大きな触媒ドメインよりなる、ＩＩ型膜タンパク質である（Ｂｏｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１（参考文献６））。このグリコシダーゼの位置を調べるために、ＧＦＰ融合の全長ＧＣＳＩへの局在化（添付の図１５）を、タバコＢＹ−２細胞における安定した発現の後に実行した（添付の図１６Ａおよび１６Ｂ；添付の図１７Ａおよび１７Ｂ）。全長ＧＣＳＩ−ＧＦＰ融合構築物の蛍光は、専ら、ＧＦＰ−ＨＤＥＬ構築物によって染色されたＥＲネットワークと区別できなかった細胞質全体の網状ネットワークにおいて、共焦点レーザー走査型顕微鏡観察によって検出された（添付の図１６Ｃおよび１６Ｄ）。
【０１３７】
これらの結果は、生成直後の糖タンパク質への前駆体オリゴ糖の付着の直後におけるＥＲ中の該前駆体オリゴ糖からの第１の糖残基のトリミングと、およびＣＯＳ細胞におけるヒトＧｌｕＩで示された結果と合致する（Ｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献２８））。さらに、観察された可溶性（ＧＦＰ−ＨＤＥＬ）または膜タンパク質（ＧＣＳＩ−ＧＦＰ）マーカーいずれを発現する細胞の蛍光パターンにおいても有意な差は観察されなかった（添付の図１６Ａ〜１６Ｄ）。
【０１３８】
８．ＧＣＳＩの最初の９０アミノ酸はＧＦＰをＥＲに保持するのに十分であること示す実験
ＧＣＳＩのＥＲにおける選択的保留を可能とするメカニズムを理解するために、ＧＣＳＩ標的化におけるルーメンドメインの役割をまず調べた。ＥＲルーメンに位置するＧＣＳＩの部分がこのグリコシダーゼをＥＲに標的化するにおける役割を演じるかを決定するために、ＧＣＳＩの最初の１５０アミノ酸（ＣＴ＋ＴＭＤ＋ｓｔｅｍ８１アミノ酸）または最初の９０アミノ酸（ＣＴ＋ＴＭＤ＋ｓｔｅｍ２１アミノ酸）をＧＦＰに融合し、対応するキメラタンパク質を、各々、ＧＣＳ１５０およびＧＣＳ９０と命名した（図１５に添付）。ＧＣＳ１５０およびＧＣＳ９０をＡｇｒｏ浸潤によって、ＢＹ−２浮遊培養細胞において安定に発現させるか、またはタバコ葉表皮細胞において一過的に発現させ、共に、正確に（図１６Ａ、Ｂに添付された）全長構築物について従前に観察されているように、（各々、図１７Ａ、Ｃ、Ｅおよび１７Ｂ、Ｄ、Ｆに添付された）双方の発現系におけるＥＲで観察した。これらの切断融合がタバコ葉表皮細胞において一過的に発現される場合、全発現レベルが既に強く減衰している場合には形質転換から５日後にＥＲ標識が依然として観察され、一方、同一条件で分析したゴルジ融合が専らゴルジに位置することに注意するのは重要である（Ｓａｉｎｔ−Ｊｏｒｅ−Ｄｕｐａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；データは示さず）。このデータはグルコシダーゼＩの触媒ルーメンドメインが酵素のＥＲ位置で必要でなく、ＧＣＳＩの最初の９０アミノ酸がＧＦＰをＥＲに保持するのに十分であること示している。
【０１３９】
９．細胞質テイルがＥＲ保留配列を含有することを示す実験
哺乳動物および酵母ＥＲに存在する多くの膜タンパク質のＮ末端サイトゾル領域は、厳格な保留（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４（参考文献４６）；Ｏｐａｔ  ｅｔ
ａｌ．，２０００（参考文献４８），Ｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献２８）；Ｃｉｃｚｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（参考文献１２））、またはゴルジからＥＲへ戻るそれらの検索（Ｔｅａｓｄａｌｅ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ，１９９６（参考文献６２）；Ｚｅｒａｎｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献６６））を容易とするシグナルを含有し、一方、いくつかの他のものはＥＲからゴルジへの輸出を促進する（Ｇｉｒａｕｄｏ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｏｎｉ，２００３（参考文献２０））。植物においては、少数の研究のみが、膜タンパク質のＣＴにおけるＥＲ輸出配列の存在を示し（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（参考文献４６１３）；Ｙｕａｓａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（参考文献６５）；Ｈａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５ｂ（参考文献２７））、および膜タンパク質ＥＲ保留を担うサイトゾルモチーフの特徴付けをいう（Ｂｅｎｇｈｅｚａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（参考文献４）；ＭｃＣａｒｔｎｅｙ  ｅｔ
ａｌ．，２００４（参考文献３５））。
【０１４０】
ＧＣＳＩ  Ｎ末端におけるＥＲ標的化情報を含有する配列をより正確に規定するために、ＧＣＳ９０のＮ末端に位置する最初の１３アミノ酸をまず欠失させ、得られたキメラタンパク質をＤ１３ＧＣＳ９０と命名した（図１５に添付）。この切断は、ＥＲ保留において機能するであろう２つの二塩基性モチーフＲＲまたはＲＸＲを除去したが、他のＥＲ保留シグナル（ＲＲまたＫＸＫ）はこの融合タンパク質のＣＴに留まった。並行して、ＧＣＳＩの最初の１３のＮ末端アミノ酸ペプチドを、メディアルゴルジに従前に位置したゴルジレポータータンパク質（ＸＹＬＴ３５、添付の図１５）に融合させた（Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献５０））。本実験で用いた実験条件において、ＸＹＬＴ３５は、それが図１８Ｇ〜１８Ｈに示すように、ＢＹ−２タバコ細胞のゴルジ装置に専ら蓄積することが確認された。
【０１４１】
２つの構築物（Ｄ１３ＧＣＳ９０および１３ＧＣＳ−ＸＹＴ３５）もまたＢＹ−２細胞において安定に発現された。サイトゾルテイルの最初の１３アミノ酸の欠失は、ゴルジマーカーＸＹＬＴ３５（図１８Ｅ〜１８Ｆ）で観察されたものと同様に、ＧＣＳ９０タンパ
ク質を明るいスポットに再度位置させた（図１８Ｃ〜１８Ｄ、図１９Ａ）。加えて、Ｄ１３ＧＣＳ９０はＥＲマーカーｍＲＦＰ−ＨＤＥＬと同時局在化されなかった（図１９Ｂ）が、タバコは表皮細胞における一過的発現の後にはＳＴ−ｍＲＦＴゴルジマーカーと完全に同時局在化された（図１９Ｃ）。興味深いことには、ＧＣＳＩの１３のＮ末端アミノ酸のＸＹＬＴ３５ゴルジマーカーへの融合はＥＲにおけるレポータータンパク質をブロックした（図１８Ｇ〜１８Ｈ；図１９Ｇ）。ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５融合タンパク質はＧＣＳ９０構築物のようにＥＲを標識し（図１８Ａ〜１８Ｄ）、ｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ  ＥＲマーカーと同時局在化された（図１９Ｈ）。強力なＥＲ標識に加えて、ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５をタバコ葉表皮細胞において発現した場合に、少数の明るいスポットがやはり観察された。これらのスポットは移動し、ＳＴ−ｍＲＦＰゴルジマーカーと同時局在化される（図１９Ｉ）。
【０１４２】
結論として、ＧＣＳＩの最初の１３アミノ酸は、ＥＲにおいてＧＣＳ９０融合タンパク質を保持するのに必要であり、ゴルジマーカーをＥＲに再度位置させるのに十分である。１０．サイトゾルのアルギニンリッチな配列は植物におけるＥＲ保留シグナルであることを示す実験
アルギニン残基がＡｔＧＣＳＩの１３のＮ末端アミノ酸におけるＥＲ保留に必須であるか否かをさらに調べるために、ＡｔＧＣＳＩのヒトホモログのＮ末端に位置するアルギニンリッチなドメイン、またはＩ型植物ＥＲ存在膜タンパク質Ａ．ｔｈａｌｉａｎａカルネキシンのサイトゾルＣ末端に位置するアルギニンリッチなドメインいずれかのためのペプチドを変化させた。
【０１４３】
植物細胞において認識されるヒトＧＣＳＩのＮ末端に位置するアルギニンリッチなペプチドの能力を調べるために、ＧＣＳ９０の最初のＮ末端１３アミノ酸をヒトＧＣＳＩ（Ｈｓ１０−ＧＣＳ９０、図１５）の最初のＮ末端１０アミノ酸によって置換した。タバコ葉表皮細胞において一過的に発現させると、Ｈｓ１０−ＧＣＳ９０はＥＲに位置し、Ｎ末端サイトゾル領域が植物分泌系によって完全に認識されることを示す（図１７Ｊ〜１７Ｌ）。
【０１４４】
２回目に、Ｉ型の膜タンパク質によって実行された同様なアルギニンリッチなモチーフがＥＲにおけるＩＩ型タンパク質の標的化を媒介できるかを調べるために、シロイヌナズナカルネキシンのＣ末端に位置した最後の１１アミノ酸をゴルジマーカーＸＹＬＴ３５（ＣＮＸ１１−ＸＹＬＴ３５、図１５、表１）のＮ末端に融合させた。ＣＮＸ１１−ＸＹＬＴ３５はタバコ葉表皮細胞において一過的に発現された。図１９Ｍ〜１９Ｏに示すように、Ｉ型膜タンパク質のアルギニンリッチなＣ末端ペプチドは、ＩＩ型のＸＹＬＴ３５ゴルジマーカーをＥＲに保持するのに十分である（図１９Ｍ〜１９Ｎ）。同一ゴルジ標識もまた、ＧＣＳ１３−ＸＹＬＴ３５融合（図１９Ｉ）に関して検出された（図１９Ｏ）ことに注意する。
１１．ＧＣＳＩのサイトゾルテイルにおけるアルギニン残基はＥＲ局在化情報を含有することを示す実験
ＧＣＳＩの１３個の最初のアミノ酸内の４個のアルギニン残基の役割をより正確に定義するために、ＰＣＲ部位特異的突然変異誘発を用いてロイシンまたはアラニン残基いずれかによってこれらの残基を置換し（構築物の詳細については表１参照）、得られた融合タンパク質をタバコ細胞で発現させた。
【０１４５】
【表３】
0005568702.tif 000004
【０１４６】
ＧＣＳ９０が専らＥＲに局在化され、かつＥＲマーカーｍＲＦＰ−ＨＤＥＬと完全に同時局在化し（図２０Ａ、２０Ｂ）、ゴルジマーカーＳＴ−５２−ｍＲＦＰとは同時局在化しないが（図２０Ｃ）、Ａｒｇ−６、Ａｒｇ−７、Ａｒｇ−１０およびＡｒｇ−１２をアラニン残基と置き換える場合、Ｒ／ＬＧＣＳ９０は専ら明るいスポットを強調した（図２０Ｄ）。これらのスポットはゴルジマーカーＳＴ−ｍＲＦＰとの同時局在化から本明細書
中で示すようにゴルジ装置に対応する（図２０Ｆ）。ＥＲ標識は検出されなかった（図２０Ｅ）。細胞内局在化に対する同一効果は、４つのロイシン残基によるこれらの４つのアルギニン残基置換後に観察された（図２０Ｇ〜２０Ｉ）。これらの観察は、Ｎ末端に対して位置６〜７〜１０および１２に位置する４つのアルギニンがＧＣＳ９０のＥＲ存在性を担う構造的情報についてコードしているようである。
【０１４７】
第２の工程において、（ＲＲ）および（ＲＸＲ）が２つの独立したシグナルとして作用するか否かを規定するために、Ａｒｇ−６およびＡｒｇ−７またはＡｒｇ−１０およびＡｒｇ−１２をロイシン残基で置換した。ＲＲモチーフ（構築物Ｒ／Ｌ１０−１２ＧＣＳ９０におけるＡｒｇ−６およびＡｒｇ−７）またはＲＸＲモチーフ（構築物Ｒ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０におけるＡｒｇ−１０およびＡｒｇ−１２）、しかしながら、またＲＸＸＲモチーフ（構築物Ｒ／Ｌ６−１２ＧＳＣ９０におけるＡｒｇ−７およびＡｒｇ−１０）のいずれかの存在は、融合タンパク質のＥＲ保留について十分であった（図２０Ｊ〜２０Ｌ、および２０Ｍ〜２０Ｏ）。しかしながら、これらの３つの場合において、ＥＲ標識に加えて、ゴルジスタックに対して区別される蛍光スポットが観察された（図２０Ｌおよび２０Ｏ）。
１２．ＲＲ、ＲＸＲまたはＲＸＸＲモチーフを保有する融合タンパク質が、ゴルジに会合して、ＥＲに蛍光スポットで蓄積することを示す実験
次の工程は、Ｒ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０、Ｒ／Ｌ１０−１２ＧＣＳ９０およびＲ／Ｌ６−１２ＧＳＣ９０キメラ融合タンパク質による蛍光スポットとして標識された構造を同定することであった。Ｒ／Ｌ６／７ＧＣＳ９０タンパク質に関して説明したように、ＧＦＰ蛍光は、ＥＲにおいて、および蛍光構造において蓄積し、それはゴルジスタックよりも小さい（図２０Ｊ〜２０Ｌ、および図２１Ａ〜２１Ｂ）。細胞におけるこれらの構造の局在化をより正確に規定するために、ｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ  ＥＲマーカー、ＳＴ５２−ｍＲＦＰゴルジマーカー、およびＲ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０、Ｒ／Ｌ１０−１２ＧＣＳ９０またはＲ／Ｌ６−１２ＧＳＣ９０融合タンパク質のいずれかを同時に発現させた。
【０１４８】
結果を図２１Ａ〜２１Ｂに示し、小さな蛍光スポットがゴルジスタックに密接に会合するが、区別されることを示す。１つのジクチオソームおよび１つのスポットの会合によって形成されたユニットは、ＥＲに沿って一緒に移動し、それらは決して分離しない。
【０１４９】
これらの結果を考慮し、Ｒ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０、Ｒ／Ｌ１０−１２ＧＣＳ９０およびＲ／Ｌ６−１２ＧＳＣ９０融合タンパク質は、ＥＲ存在可溶性タンパク質がそこから排除された、ＥＲおよびゴルジの間に位置する小さな中間ドメインにおけるＥＲに蓄積した（図２０Ｋおよび２０Ｎ）。これらのドメインはゴルジに強く会合し、ＥＲ皮質ネットワークに沿ってゴルジスタックと共に移動し、従って、これらのドメインは、Ｙａｎｇ  ｅｔ
ａｌ．，２００５に記載されたようにＥＲ出口部位（ＥＲＥＳ）で有り得た。これを証明するために、Ｒ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０、Ｒ／Ｌ１０−１２ＧＣＳ９０およびＲ／Ｌ６−１２ＧＳＣ９０融合タンパク質をタバコ葉表皮細胞においてＳａｒ１ｐ−ｍＲＦＰと同時発現させた。
【０１５０】
あいにく、蛍光スポットにおけるＳａｒ１ｐ−ｍＲＦＰの動員は示されなかった（図２２Ａ〜２２Ｃ）。それにも拘わらず、Ｓａｒ１ｐはＧＣＳ９０の突然変異した形態の輸送に関与することは示された。事実、図２２Ｊ〜２２Ｌに示されるように、Ｒ／ＬＧＣＳ９０をＳａｒ１ｐ／ＧＴＰ−ｍＲＦＰと同時発現させた場合、Ｓａｒ１ｐは、ＥＲおよび、蛍光スポットに蓄積した（図２２Ｋ）。
【０１５１】
対照的に、ＧＣＳ９０は、単独で発現されたＳａｒ１ｐ−ｍＲＦＰがＥＲにおけるように（データは示さず）、Ｓａｒ１ｐ−ｍＲＦＰを動員させず、ＧＣＳ９０とＳａｒ１ｐ−ＲＦＰとの同時発現はＧＣＳ９０標識を修飾しなかった（図２２Ｄ〜２２Ｉ）。さらに、
突然変異した形態Ｓａｒ１ｐ／ＧＴＰ−ｍＲＦＰの発現はＥＲにおいてゴルジＲ／ＬＧＣＳ９０の保留に導いた。
【０１５２】
結論として、Ｒ／ＬＧＣＳ９０の輸送はサイトゾルタンパク質Ｓａｒ１ｐによって調節される。しかしながら、１つのＲＲ、ＲＸＲまたはＲＸＸＲモチーフを保有する融合タンパク質で標識された小さなドメインは、Ｓａｒ１ｐ−ｍＲＦＰと会合しないが、それらは、ＥＲおよびゴルジコンパートメントの間に位置する。
１３．ＡｔＧＣＳＩのＥＲ保留はＮ末端アルギニンモチーフのみに依存しないことを示す実験
本実施例においては、ゴルジレポータータンパク質に融合したＧＣＳＩアルギニンモチーフはそれをＥＲに局在化させた。しかしながら、これらのシグナルが全長ＧＣＳＩのＥＲ局在化に関与する主な保留シグナルであるという証拠はない。
【０１５３】
ロイシンまたはアラニンによるＡｒｇ−６、Ａｒｇ−７、Ａｒｇ−１０およびＡｒｇ−１２の置換の結果、ＧＣＳ９０構築物についてのＥＲが指令する情報の破壊がもたらされるという観察に基づき、Ｎ末端の１３アミノ酸をＧＣＳＩの全長配列から欠失させ、野生型酵素（Ｄ１３ＧＣＳＩ、図１５）のＥＲ標的化におけるモチーフ（ＲＸＲおよびＲＲ）の重要性を評価した。加えて、ＧＣＳ１５０切断形態は、Ｎ末端におけるアミノ酸残基１〜１３を欠如させて合成した（Ｄ１３ＧＣＳ１５０、図１５）。次いで、融合タンパク質を葉表皮細胞において一過的に発現させた。ゴルジ装置に蓄積したＤ１３ＧＣＳ９０とは対照的に、Ｄ１３ＧＣＳＩおよびＤ１３ＧＣＳ１５０双方は専らＥＲに位置した（図２３Ｄ〜２３Ｅ）。さらに、キメラタンパク質がＥＲマーカー（ｍＲＦＰ−ＨＤＥＬ）と共にタバコ細胞で同時に発現された場合、ＧＣＳ９０とは対照的に、Ｄ１３ＧＣＳＩおよびＤ１３ＧＣＳ１５０の双方はゴルジで検出されず、双方の蛍光シグナルはＥＲで観察され、ｍＲＦＰ−ＨＤＥＬと完全に同時局在化された（図２３Ｇ〜２３Ｌ）。これらの結果は、ヒトＧＣＳＩが、全長構造を局在化するのに必要でない機能的アルギニンベースのシグナルを含有することを示すＨａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）（参考文献２８）の従前の研究と合致する。ＧＣＳ９０（図２３Ｆ、２３Ｉおよび２３Ｌ）、ＧＣＳＩ（図２３Ｄ，２３Ｇおよび２３Ｊ）およびＧＣＳ１５０（図２３Ｅ、図２３Ｈ、および２３Ｋ）の間で観察された標識の差は、鍵となる情報決定ＥＲ局在化がＧＣＳＩのルミナールポリペプチド鎖に、より高い確実性で、ステムドメインに、アミノ酸残基７０〜１５０の間に含有されなければならないことを示唆した。
【０１５４】
この仮定を確証するために、８１個のアミノ酸残基７０〜１５０または６１個のアミノ酸９０〜１５０をメディアルゴルジマーカーＸＹＬＴ３５のルミナールドメインに融合し（図２４Ａ）、タバコ葉表皮細胞においてこれらの新しいタンパク質（ＸＹＬＴ３５−ＧＣＳ８１およびＸＹＬＴ３５−ＧＣＳ６０、図２４Ｂ、Ｃ）を一過的に発現させた。ＧＦＰ標識のほとんどはＥＲで見出され、「残り」はゴルジにあった。
【０１５５】
哺乳動物細胞においては、ゴルジに位置した膜タンパク質について同族認識モデルにおいて従前に記載されているように、タンパク質サブユニットの会合に関連する直接的保留によってＥＲ存在が達成されて、それらの膜貫通および／またはルミナールドメインを介して大きなオリゴマー複合体を与えることができるのが示されている（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４（参考文献４６）；Ｏｐａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（参考文献４８））。これらの大きなタンパク質オリゴマーは、輸送小胞へのパッケージングを回避すると仮定され、かくして、オルガネラからのそれらの輸出を妨げる。このタイプのメカニズムは、ヘテロオリゴマーオリゴサッカリルトランスフェラーゼ複合体のサブユニット成分のＥＲ保留において機能的であり得るが、植物においては未だ記載されていなかった。
【０１５６】
結論において、ＡｔＧＣＳＩのサイトゾルテイルおよびルミナールドメインの双方は、その特異性と合致して、かつ他の真核生物系でなされた観察と完全に合致して、ＥＲ標的化決定基を含有し、結果は、ＡｔＧＣＳＩが植物ＥＲにおいて、および専らこのコンパートメントにおいて局在化されることを示す。Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧＮＴ１）およびａ１，２マンノシダーゼ（ＭａｎＩ）のような植物Ｎ−グリカン成熟において初期に作用する他のグリコシル化酵素は、ＥＲにおいて、およびシスゴルジにおいての双方に位置することが示された。ＧＮＴＩおよびＭａｎＩ、ＥＲおよびシスゴルジは、サイトゾルテイルにおける標的化情報の存在を含有することが示され、一方、ＧＣＳＩサイトゾルテイルの最初の１３のＮ末端アミノ酸はＥＲ標的化情報を含有する。本発明は、ＥＲ標的化に関与するサイトゾルテイルにおける鍵となるアミノ酸がいずれであるかを示すが、アルギニンリッチなサイトゾルテイルが全タンパク質配列における唯一のＥＲ標的化決定基ではないことも示す。
【０１５７】
事実、ＧＣＳ１５０からのアルギニンリッチな配列の欠失は、ＥＲがゴルジのような後期コンパートメントへ出ていくのを許容せず、Ｄ１３ＧＣＳ９０は依然として専らＥＲに位置する。
【０１５８】
これらの結果を一緒にすると、ゴルジＩＩ型膜タンパク質にＥＲ保留を付与するのに十分な少なくとも２つのドメインがＧＣＳＩ配列に共存することを示す。ＧＣＳＩのルミナールドメインにおける欠失は、ＥＲ保留についての情報が、ＧＣＳＩ配列中のアミノ酸９０および１５０の間に位置する６０アミノ酸ペプチドに含有されることを示した。
【０１５９】
比較結果が、ルミナールＥＲ標的化シグナルの存在に関してヒトグルコシダーゼＩで得られたが、今日、関係するルミナール配列は未だ特徴付けられていない（Ｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献２８））。前記したように、ゴルジレポータータンパク質ＸＹＬＴ３５に会合させた場合、植物ルミナールペプチドはＸＹＬＴ３５をＥＲに再度位置させるのに十分である。ＧＣＳＩのルミナールドメインは、ＡｔＧＣＳＩおよび可溶性および／または膜結合ＥＲ存在タンパク質の間の複合体の形成を容易とすることができよう。しかしながら、同族認識モデルとは矛盾して、いくつかの大きなタンパク質複合体は原形質膜に位置し、完全に組み立てられて、ＥＲから輸出されなければならないことが示されている。
【０１６０】
事実、これらの複合体のサイズは保留を説明すると考える必要はないようである。事実、ＥＲルーメンにおけるタンパク質の非常に高い濃度のため、恐らくは、タンパク質−タンパク質複合体を形成する能力を有するタンパク質について内部に留まるよりはＥＲを去らせるのはより困難である。ＢｉＰに関連するもう１つのＥＲシャペロン系について従前に記載されているように、我々は、現在、生成直後の糖タンパク質折畳み機構が、植物ＥＲにおいて、ＧＣＳＩ、グルコシダーゼＩＩ、カルネキシン、カルレチクリンおよびＥＲｐ５７から作成された大きなマルチタンパク質複合体を形成できるか否かを調べている。１４．ＧＣＳＩのサイトゾルテイルは、ＥＲ保留に十分な独立した３つのジアルギニンシグナルを含有する。
【０１６１】
アルギニンリッチな配列（ＭＴＡＧＡＳＲＲＳＡＲＧＲＩ（配列番号１））が、ＥＲにおいてゴルジマーカーＸＹＬ３５を標的化するのに十分であることが示された。哺乳動物細胞の分泌系における膜タンパク質標的化についての従前の研究に基づき、本実施例は、４つのアルギニン残基がＥＲ保留情報を含有しているかを同定するために行った。４つのアルギニンのアラニンまたはロイシン残基への突然変異は、Ｌ／ＧＧＣＳ９０がゴルジで見出されたように、この配列のＥＲ保留能力を完全になくし、かくして、ＥＲ保留におけるアルギニン残基の鍵となる役割を確証する。
【０１６２】
アルギニンリッチな配列における指向性突然変異誘発に基づくさらなる分析は、事実、２つのアルギニン残基（ＲＲ、ＲＸＲまたはＲＸＸＲ  配列番号７０）がＧＣＳ９０のＥＲ保留を付与するのに十分であり、その結果、１３個のアミノ酸からなるペプチドがＧＣＳＩのサイトゾルテイルに共存するＥＲ保留について十分な３つの区別されるジアルギニンモチーフを含有することを示した。興味深いことには、これらの３つのジアルギニンモチーフのうち１つのみがＧＣＳ９０のサイトゾルテイルに存在する場合、蛍光はＥＲにおいてのみならず、ＥＲトラックに沿ってゴルジスタックに会合した、およびゴルジスタックと共に移動する小さなスポットにおいても検出される。
【０１６３】
加えて、可溶性ＥＲマーカータンパク質ＧＦＰ−ＨＤＥＬはこれらの小さなスポットから排出される。仮定は、Ｒ／Ｌ６−７ＧＣＳ９０、Ｒ／Ｌ６−１２ＧＣＳ９０およびＲ／Ｌ１０−１２ＧＣＳ９０が検出されるこれらの小さなスポットは、ＥＲ表面に位置する分泌ユニット（ＥＲＥＳ）、およびＥＲおよびゴルジ装置の間の物質交換の媒介に対応するというものであった（Ｒｕｎｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（参考文献５５））。この仮説を確証するさらなる調査は、ＥＲ表面におけるジクチオソームに会合した、およびそれと共に移動する単一分泌ユニットに基づいてＥＲ／ゴルジ輸送モデルに好都合であろう。しかしならが、ミニスポットはＳａｒ１ｐとは同時局在化されない。ジアルギニンモチーフは哺乳動物膜タンパク質で広く研究されているが、それらは、それらの植物ホモログにおける本発明研究より前には決して特徴付けられていなかった。興味深いことには、ヒトＧＣＳＩにおいて従前に同定されたジアルギニンモチーフは、植物細胞においてＥＲ保留を媒介することは示されている（Ｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３（参考文献２８））。
【０１６４】
しかしながら、ＡｔＧＣＳＩで同定されたジアルギニンモチーフはそれらのヒトホモログよりもより柔軟に見える。事実、ヒトａグルコシダーゼＩのジアルギニンモチーフは位置＋７および＋８における２つのアルギニン残基から、および位置＋９における塩基性アミノ酸から作成される。ＡｔＧＣＳＩにおいて、２つのアルギニン残基の間の距離はより柔軟に見えるが、良好な効率のためには２つのアミノ酸を過ぎることはできない。さらに、このモチーフはタンパク質のＮ末端に非常に近接すべきである。事実、ＧＣＳＩにおいては、位置＋２３および＋２４におけるジアルギニンモチーフＲＲは融合タンパク質Ｄ１３ＧＣＳＳ９０−ＧＦＰに依然として存在するが、ＥＲ保留を付与するには十分でない。
【０１６５】
最後に、入手可能なＧＣＳＩ配列の比較は、これらのＥＲ存在タンパク質の末端におけるジアルギニンモチーフが高度に保存されていることを示した（表２、Ｂｏｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１（参考文献６）；Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（参考文献３０））。
【０１６６】
【表４】
0005568702.tif 000005
【０１６７】
実施例２：同一性配列の記載
先の実施例に示したように、表３にリストした各シグナルは、緑色蛍光タンパク質のようなレポータータンパク質をＥＲおよび／またはＧＡへ標的化するのに十分である（添付の図２５Ａおよび２５Ｂ参照）。
【０１６８】
【表５】
0005568702.tif 000006
【０１６９】
従前に開示されたように、配列番号１〜３は、ＥＲに標的化される膜タンパク質につい
てのアンカリング配列の組を表わす。これらの配列は、Ｃ−またはＮ末端に位置した膜タンパク質のサイトゾルテイルに位置する。
配列番号１：ＭＴＡＧＡＳＲＲＳＡＲＧＲＩ
配列番号２：ＭＡＲＧＥＲＲＲＲＡ
配列番号３：ＭＮＤＲＲＰＱＲＫＲＰＡ
これらのサイトゾルテイルに存在する以下のジ−Ａｒｇモチーフ配列（配列番号１〜３）は、ＥＲにレポーター膜タンパク質を保有するのに十分であった。
【０１７０】
モチーフ配列：
配列番号                配列番号              配列番号
ＲＲ              ＲＲＸＸＲＸＲ  ７６          ＲＲＲＫ  ８８
ＲＸＲ            ＲＫＸＸＲＸＲ  ７７          ＲＲＫＫ  ８９
ＲＸＸＲ    ７０  ＲＲＸＸＲＸＫ  ７８          ＲＫＫＲ  ９０
ＲＸＸＸＲ  ７１  ＲＲＸＸＫＸＲ  ７９          ＫＫＲＲ  ９１
ＲＫ              ＫＲＸＸＲＸＲ  ８０
ＲＸＫ            ＫＫＸＸＲＸＲ  ８１
ＲＸＸＫ    ７２  ＲＲＸＸＫＸＫ  ８２
ＲＸＸＸＫ  ７３  ＲＫＸＸＫＸＲ  ８３
ＫＲ              ＲＫＸＸＲＸＫ  ８４
ＫＸＲ            ＲＲＲＲ        ８５
ＫＸＸＲ    ７４  ＲＫＲＲ        ８６
ＫＸＸＸＲ  ７５  ＲＲＫＲ        ８７
図２５に示すように、これらのジＡｒｇモチーフは、各々、ＩＩ型またはＩ型の膜タンパク質のＮ末端部分またはＣ末端部分にそれぞれ位置することができる。
【０１７１】
他の以下の配列に従ってテストした。
配列番号４〜７は、ＥＲにおける組換え膜ポリペプチドの厳格な保留を担う。これらの配列はＥＲルーメンに位置する。
【０１７２】
配列番号４
ＦＱＧＥＨＫＥＳＬＹＷＧＴＹＲＰＨＶＹＦＧＶＲＡＲＴＰＬＳＬＶＡＧＬＭＷＬＧＶＫＤＥＭＹＶＭＲＨＦＣ
配列番号５
ＦＱＧＤＨＫＥＳＬＹＷＧＴＹＲＰＮＶＹＬＧＩＲＡＲＴＰＬＳＬＩＡＧＩＭＷＩＧＡＫＮＧＱＹＦＬＲＨＶＣ
配列番号６
ＥＳＤＡＳＬＬＷＧＴＹＲＰＱＩＹＦＧＬＲＰＲＬＰＧＳＬＬＴＧＬＡＷＦＧＬＱＤＹＳＤＦＱＨＩＲＨＱＣ
配列番号７
ＥＲＳＮＲＬＦＷＧＴＹＲＰＧＩＹＦＧＭＫＨＲＳＰＩＳＬＬＦＧＶＭＷＴＶＱＤＡＥＮＦＡＦＲＨＳＣ
本発明の配列番号４に対して少なくとも７０％の相同性を有する各配列は、本発明の標的化シグナルのそれと同一の効果を有すると見積もられる。
【０１７３】
図２６において、ステム（Ｓ３）に位置する配列番号４〜７は、ＥＲにおける膜タンパク質の厳格な保留を担う。Ｓ３は膜貫通ドメイン近くに位置する配列である。
ＥＲにおける組換えポリペプチドの厳格な保留（図２６参照）は、配列番号８に示すように、ジＡｒｇモチーフを含有する配列番号１〜３の１つ、および配列番号４〜７の１つ
の連結によって成され、ＥＲにおける膜タンパク質の厳格な保留、および組換えタンパク質の安定化を担う。
【０１７４】
１６〜２３アミノ酸の膜貫通ドメイン（ＧＳ２）は、タンパク質をゴルジに向けるのに十分であることが示された。このドメインの使用は、ゴルジ膜における組換えタンパク質または酵素を係留させるのに十分である。本発明のペプチドシグナルに含まれるテストした膜貫通ドメイン（ＧＳ２）の例は以下の通りである：
【０１７５】
【表６】
0005568702.tif 000007
【０１７６】
ゴルジ酵素からのサイトゾルテイル（ＧＳ１）、膜貫通ドメイン（ＧＳ２）およびステム（ＧＳ３）の間の配置は、シス、メディアルまたはトランスゴルジにおける膜タンパク質の保留を担う（添付の図２６、底部模式図参照）。この配置は、ゴルジ装置における酵素または組換えタンパク質のサブコンパートメント化を可能とする。本発明によるそのようなペプチドシグナル配列の例は以下の通りである：
ＧＳ１
配列番号１７：ＭＡＲＧＳＲＳＶＧＳＳＳＳＫＷＲＹＣＮＰＳＹＹＬＫＲＰＫＲ
配列番号１８：ＭＧＶＦＳＮＬＲＧＰＲＡＧＡＴＨＤＥＦＰＡＴＮＧＳＰＳＳＳＳＳＰＳＳＳＩＫＲＫ
配列番号１９：ＭＲＧＹＫＦＣＣＤＦＲ
配列番号２０
ＭＧＶＦＳＮＬＲＧＰＫＩＧＬＴＨＥＥＬＰＶＶＡＮＧＳＴＳＳＳＳＳＰＳＳＦＫＲＫ
配列番号２１：ＭＬＶＭＰＱＰＰＫＰＦＮ
配列番号２２：ＭＡＲＧＳＲＳＶＧＳＳＳＳＫＷＲＹＣＮＰＳＹＹＬＫＲＰＫＲ
配列番号２３：ＭＡＮＩＷＫＫＱＲＬＲＤＴＧＬＣＲ
ＧＳ３ドメインから生じたペプチドシグナルの例は以下のものである：
【０１７７】
【表７】
0005568702.tif 000008
【０１７８】
これらのシグナルは、一過性または安定した形質転換後に、タバコ、大豆、トマトまたはダイコン細胞におけるいくつかの膜タンパク質の発現を標的化するのに用いられてきた。これらのシグナルは、同一の標的化効率および特異性でもって、膜タンパク質のＮ末端（ＩＩ型膜タンパク質）に、またはＣ末端（Ｉ型膜タンパク質）に加えることができる（シグナルは、ＩＩ型ＩまたはＩＶ膜タンパク質に加えることもできるようである）。
【０１７９】
【表８】
0005568702.tif 000009
【０１８０】
実施例３：標的化配列を用いることによって初期分泌経路コンパートメント内の組換えタンパク質の貯蔵によるＮ−グリカンに対する免疫原性残基の付加の防止
植物ＥＲ−存在タンパク質の構造分析は、それらが専ら高マンノースタイプＮ−グリカンを担うことを示している（Ｎａｖａｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（参考文献４１），１９９８（参考文献４２）；Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（参考文献４９））。これらのオリゴ糖構造は植物および哺乳動物に共通しており、したがって、免疫原性ではない。この観察は、β１，２キシロースまたはα１，３フコースのような免疫原性残基の植物が作成した医薬品（ＰＭＰ）Ｎ−グリカンの会合を妨げるための戦略を示唆した。この戦略は、ＥＲ内への、すなわち、免疫原性グリコエピトープが成熟する植物Ｎ−グリカンにそこで加えられるゴルジ嚢の上流への組換えタンパク質の貯蔵にある。まず、組換え可溶性タンパク質のＣ末端におけるＨ／ＫＤＥＬアミノ酸配列の付加は、植物ＥＲにおけるその保留に十分であることが示された（Ｇｏｍｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（参考文献２４），１９９９（参考文献２２））。
【０１８１】
本実施例においては、同一戦略を用い、ＫＤＥＬ―ＥＲシグナル配列を２つの異なる抗体の、抗体の重鎖および軽鎖双方に融合させた。
配列（配列番号１〜８）は、ＥＲへ抗体の重鎖および軽鎖を標的化するのに用いられてきた。
【０１８２】
配列（配列番号３２〜３６）は、ＥＲおよびＧＡへ抗体の重鎖および軽鎖を標的化するのに用いられてきた。
これらの抗体は専ら非免疫原性高マンノース型のＮ−グリカンを表わし（Ｓｒｉｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４（参考文献５９）；Ｐｅｔｒｕｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６（参考文献５１））、これは、ａ−マンノシダーゼＩのような、ＥＲおよびシスゴルジに位置した酵素に制限されるグリカン成熟に基づく非常に有効な再循環を示す（Ｎｅｂｅｎｆｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９（参考文献４３））。従って、免疫原性Ｎ
−グリカンの、ＥＲ保留シグナルへの融合を介してのＰＭＰへの会合への防止は可能である。
実施例Ｂ：ＥＲおよび／またはＧＡにおける抗体または抗体断片の発現（添付の図１５、レーンＢ）
ＥＲおよび／またはＧＡにおける抗体または抗体断片の発現は、組換えタンパク質産生を改良するための異なる戦略を与える。例えば、それは、非修飾（突然変異した）治療タンパク質をＥＲおよび／またはＧＡへ標的化するのに導くことができる。
【０１８３】
植物における機能的発現抗体の元来の証明以来、２つの主な研究の方向が確立されている。最初のものは、治療抗体または抗体断片の大規模な産生のためのバイオリアクターとしての植物の使用であった。第２に、抗体または抗体断片は宿主細胞で発現させて、免疫調節といわれるメカニズムによって生理学的プロセスに影響させる。考えられる免疫調節は、除草剤に特異的な抗体の発現がインプランタにて耐性を付与することが示された場合に最近示された（Ａｌｍｑｕｉｓｔ  ＫＣ  ｅｔ  ａｌ．２００４，（参考文献１）、および添付の図２７参照）。
実施例Ｃ：植物細胞のＥＲおよび／またはＧＡにおける同種または異種酵素の発現、および該細胞における組換えタンパク質の発現
実施例１：植物細胞のＥＲ／ＧＡにおける哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼをアドレスすることによる植物細胞でのＮ−グリコシル化のヒト化（添付の図１５、レーンＣ）
植物においては、他の真核生物細胞におけるように、オリゴ糖前駆体（Ｇｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）の、生成直後のポリペプチド上の特異的アスパラギン残基への同時翻訳付加と共に、Ｎ−グリコシル化はＥＲにおいて開始する。一旦タンパク質に移動されたならば、かつ分泌された糖タンパク質が分泌経路に沿って輸送されている間に、オリゴ糖は複雑なＮ−グリカンをもたらすいくつかの成熟を受ける。免疫応答のトリガリング（Ｗｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９４（参考文献６４））のような、それらのエフェクター機能で用いられる抗体を含めた多くの医薬品は、それらのイン・ビボ活性および安定性に対してグリコシル化を必要とする。これは、可能な植物の使用が組換え抗体の産生で供給できるかの理由であり、「ヒト化」非免疫原性Ｎ−グリカンを得るためにはこれらの植物特異的成熟を阻害するのが必要になる。
【０１８４】
植物Ｎ−グリカンをヒト化するための魅力的な戦略は、植物において哺乳動物グリコシルトランスフェラーゼを発現させることであり、これは植物ゴルジ装置においてＮ−グリカン成熟の内因性機構を完了させる（またはそれと競合する）ことであろう。これらの補充的戦略に基づき、植物細胞のゴルジにおけるヒトβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、植物Ｎ−グリカンの部分的ヒト化に導きおよび、恐らくは、β（１，２）−キシロースおよびα（１，３）−フコースの付加と競合する。
【０１８５】
アルファルファまたはタバコ植物におけるヒトβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼの発現は、ガラクトース残基を、植物Ｎ−グリカンの末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基へ移動させる。しかしながら、このヒトガラクトシルトランスフェラーゼを発現するタバコまたはアルファルファ植物で産生された糖タンパク質によって運ばれたＮ−グリカンの３０〜４０％のみが、哺乳動物タイプの末端Ｎ−アセチルラクトサミン配列を担う（Ｂａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１（参考文献２））。
【０１８６】
ヒトβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼをゴルジ標的化シグナルと融合させた。
ｈＧａｌＴおよびＧＮＴｌｈＧａｌＴ発現についてのプラスミドはｐＢＬＴＩ１２１から組み立てた（Ｐａｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００３参考文献５０）。ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ部位においてアルファルファプラストシアニンプロモーターによって置き換えた。ヒトβ（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ
（ｈＧａｌＴ）遺伝子（ＵＤＰガラクトース：β−Ｎ−アセチルグルコサミニド：β（１，４）−ガラクトシルトランスフェラーゼ；ＥＣ  ２．４．１．２２）は、ＥｃｏＲＩ消化でｐＵＣ１９−ｈＧａｌＴから単離した。クレノウ処理の後、１．２ｋｂ  ｈＧａｌＴ断片をＳｍａＩ部位においてｐＢＬＴＩ２２１にクローン化した。次いで、フラグタグを、ＦＧａｌＴ順方向（５’−ＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡＧＧＣＴＴＣＧＧＧＡＧＣＣＧＣＴＣ−３’  配列番号９２）および逆方向ＲＧａｌＴＦｌａｇＳｔｕ（５’−ＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＣ−３’配列番号９３）プライマーを用いるＰＣＲによってコーディング領域のＣ末端に融合させた。次いで、ＰｌａｓｔｏプロモーターおよびＮｏｓターミネーターの制御下でこのＸｂａＩ−ＳｔｕＩ断片をバイナリベクターｐＢＬＴＩ１２１をクローニングすることによってＲ６２２を産生した。
【０１８７】
膜貫通ドメインに対応するＮ．ｔａｂａｃｕｍ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧＮＴＩ）からの最初のＮ末端３８アミノ酸を、順方向ＦＧＮＴ（５’−ＡＴＣＧＡＡＡＴＣＧＣＡＣＧＡＴＧＡＧＡＧＧＧＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＧＣ−３’  配列番号９４）および逆方向ＲＧＮＴｓｐｅ（５’−ＣＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＡＴＣＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＧＡＣＴＧＴＧＴＣＧＣ−３’  配列番号９５）プライマーを用いるＰＣＲによって増幅し、引き続いて、ＡｐａＩ／ＢａｍＨＩによってｐＧＥＭ−ＴベクターおよびｐＢＬＴＩ２２１にクローン化した。ＧＮＴＩおよびｈＧａｌＴの間の融合には、ＰＣＲ増幅をｐＵＣ１９−ｈＧａｌＴから行って、それ自身のＴＭＤを排除し、ＳｐｅＩおよびＳｔｕＩ部位を作り出した。順方向ＦＧａｌＴｓｐｅ（５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＣＡＣＴＧＴＣＧＣＴＧＣＣＣＧＣＣＴＧＣ−３’  配列番号９６）および逆方向ＲｇａｌＴＦｌａｇＳｔｕ（５’−ＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＣＴＡＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＴＣＧＣＡＣＧＧＴＧＴＣＣＣＧＡＡＧＴＣＣＡＣ−３’  配列番号９７）を用いて、Ｓｐｅｌ／Ｓｔｕｌ  ｈＧａｌＴ断片を増幅した。
【０１８８】
次いで、この断片をｐＢＬＴＩ２２１−ＧＮＴＩにクローン化した。最後に、周囲の部位ＸｂａＩ／ＳｔｕＩによる消化は、１０３０ｂｐの断片を単離することを可能とし、次いで、この１０３０ストレッチをバイナリベクターｐＢＬＴＩ１２１−Ｐｌａｓｔｏへクローン化することによって、Ｒ６２２を産生した。
【０１８９】
アルファルファ植物の形質転換は以下のように行った。
アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ  Ｌ．）、エコタイプＲ２３３６は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＡＧＬ１を用いて形質転換し、以下のように修飾した：葉柄、幹および葉外植体をアグロバクテリウムと５〜７日間共培養した。共培養工程は、ＳＨ２Ｋ培地中で０．８〜１のＯＤおよび（１．５％スクロースの代わりの）３％スクロースにおいてアグロバクテリウムの未希釈培養で行った。応答性外植体の胚発生から得られたよく樹立された植物を温室中の土壌に移し、葉を分析した。
【０１９０】
野生型およびＧａｌＴまたはＧＮＴＩ／ＧａｌＴ−形質転換アルファルファ植物から単離されたＮ−結合グリカンの分析は以下のように行った。
タンパク質は、５ｍＬの抽出緩衝液（０．７Ｍサッカロース、０．５Ｍ  トリス、３０ｍＭ  ＨＣｌ、０．１Ｍ  ＫＣｌ、２％β−メルカプトエタノール）中の５００ｍｇの新鮮なアルファルファの葉から４℃にて３０分間抽出した。不溶性物質を、４℃における１０分間の間の遠心（５，０００ｇ）によって排除した。４℃にて、３０分間の間に、１容量の水飽和フェノールを加えることによって得られた上清を処理する。次いで、フェノール性画分に含有されたタンパク質および糖タンパク質を、５容量のＰＢ（メタノールに溶解させた０．１Ｍ酢酸アンモニウム）によって−２０℃にて一晩沈殿させた。５ｍＬのＰＢでペレットを洗浄した後、タンパク質および糖タンパク質は、Ｂａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａ
ｌ．，２００１に従前に記載されているように、ペプシンおよびＰＮＧａｓｅＡでの順次の処理によって消化した。次いで、Ｎ−グリカンを２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）によって蛍光標識した。
【０１９１】
これらの誘導体化したＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルは、３３７−ｎｍ窒素レーザーを備えたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−Ｐｒｏ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）で獲得した。マススペクトルは、マトリックスとして２，５−ジヒドロキシ安息香酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてレフレクターにて、遅延抽出モードにて行った。
【０１９２】
７０：３０％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ中に５ｍｇ・ｍＬ−１で新たに溶解させたマトリックスを、比率１：１（Ｖ／Ｖ）にて可溶化されたオリゴ糖と混合した。これらのスペクトルは、１００ｎｓの遅延時間にて、２０，０００Ｖの加速電圧を用いて正モードで記録した。それらを一旦平滑化し、ペプチドおよびタンパク質の商業的に入手可能な混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて外部キャリブレートした。この実験において、スペクトルはデス−Ａｒｇ１−ブラジキニン（９０４．４６８１  Ｄａ）、アンジオテンシンＩ（１２９６．６８５３）、Ｇｌｕ１−フィブロペプチドＢ（１５７０．６７７４  Ｂａ）、ＡＣＴＨクリップ１８−３９（２４６５．１９８９）およびウシインスリン（５７３０．６０８７）を用いてキャリブレートされていた。レーザーのショットを各スペクトルについて累積して、ノイズに対する許容されたシグナルの比率を得た。
【０１９３】
先に開示したように、本発明は、細胞内コンパートメントおよびサブドメインにおけるグリコシルトランスフェラーゼ活性のみを標的化するのに用いられるシグナルの大きなパネルを提供する。これは、宿主発現系においてＮ−およびＯ−グリコシル化の効率を改良し、および表５に示された酵素での同時発現によって異種タンパク質の転写後修飾を最適化するための大きなパネルを提供する。
【０１９４】
【表９】
0005568702.tif 000010
【０１９５】
以上の実施例に開示したように、本発明は、タンパク質を産生するための、植物細胞のサブコンパートメントにおいてタンパク質の発現を修飾するための、植物細胞のＲＥおよび／またはＧＡにおいて異種タンパク質を発現させるための、方法を提供する。また、本発明は転写後修飾タンパク質も提供する。
実施例Ｄ：シグナル配列と融合されたＺＥＲＡ（登録商標）タンパク質の発現
本実施例においては、ＺＥＲＡ（登録商標）および配列シグナル（配列番号８）およびマンノシダーゼＩを含む融合タンパク質を作成して、膜タンパク質としてのグルコシダーゼをプロテインボディーに蓄積させた。標的化シグナル（配列番号８）を用いて、酵素を膜ＥＲに蓄積させ、ＺＥＲＡペプチドを介して凝集体を形成することによってプロテインボディーの産生を可能とする。
【０１９６】
目的は、プロテインボディーに、Ｎ−グリカン（Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２）を保有する糖タンパク質を蓄積させることであった。
プラスミドの構築物：ヒトマンノシダーゼＩ（アクセス番号Ｑ９ＵＫＭ７）に融合したＺＥＲＡをコードするＡＤＮｃをＰＣＲによって増幅し、ＳＰｅＩおよびＳａｃＩエンドヌクレアーゼ部位において標的シグナル（配列番号８）を含有するｐＢＬＴＩ１２１にサブクローンした。
【０１９７】
アグロバクテリウム媒介タバコＢＹ−２細胞形質転換
熱ショックによって、ｐＶＫＨ１８Ｅｎ６−ｍＲＦＰ、ＰＢＬＴＩ１２１−ＧＦＰおよびｐＢＩＮ２０−ＧＦＰ−融合をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（株ＧＶ３１０１  ｐＭＰ９０、Ｋｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，１９８６）に導入した。トランスジェニックアグロバクテリウムを、カナマイシン（１００ｍｇ．ｍＬ−１）およびゲンタマイシン（１０ｍｇ．ｍＬ−１）を含有するＹＥＢ培地（リットル当たり、ビーフ抽出物５ｇ、酵母抽出物１ｇ、スクロース５ｇ、ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ）上で選択し、Ｇｏｍｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８に記載されているように、これを用いて、タバコ（ｃ．ｖ．Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２）ＢＹ−２細胞を形質転換した。形質転換したタバコ細胞を、ＰＢＬＴＩ１２１−ＧＦＰおよびｐＢＩＮ２０−ＧＦＰ−融合のためのカナマイシン（１００ｍｇ．ｍＬ−１）、またはｐＶＫＨ１８Ｅｎ６−ｍＲＦＰのためのヒグロマイシン（４０ｍｇ・ｍＬ−１）、およびセフォタキシム（２５０ｍｇ・ｍＬ−１）の存在下で選択した。ＧＦＰおよびｍＲＦＰ融合を同時発現する二重形質転換体のために、ミクロカルスをまずカナマイシンプレート上で選択し、次いで、ヒグロマイシンプレート上に移した。スクリーニング後、ＧＦＰおよび／またはｍＲＦＰ融合を発現するカルスを用いて、トランスジェニック細胞の浮遊培養を開始した。３〜４日齢ＢＹ−２浮遊培養細胞を実験で用いた。
【０１９８】
本実施例で作成した融合タンパク質を形質転換細胞で発現させ、膜ＥＲにおいて酵素を蓄積させ、ＺＥＲＡペプチドを介して凝集体を形成させることによってプロテインボディーの産生を行った。
【０１９９】
以上の実施例に開示することによって、本発明は、タンパク質を細胞の特異的ドメインに標的化し、組換えポリペプチドの産生の収率を増加させ、組換えポリペプチドの免疫原性を妨ぎ、およびそれらの天然相当物の正確なコピーである治療的に活性な組換えポリペプチドを得ることを可能とする。また、本発明は、転写後修飾タンパク質の産生も可能とする。
【０２００】
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【図１】
0005568702.tif 000011
【図５Ａ】
0005568702.tif 000012
【図５Ｂ】
0005568702.tif 000013
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
0005568702.tif 000016
【図５Ｆ】
0005568702.tif 000017
【図５Ｇ】
0005568702.tif 000018
【図５Ｈ】
0005568702.tif 000019
【図５Ｉ】
0005568702.tif 000020
【図６Ａ】
0005568702.tif 000021
【図６Ｂ】
0005568702.tif 000022
【図６Ｃ】
0005568702.tif 000023
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
0005568702.tif 000037
【図７Ｉ】
0005568702.tif 000038
【図７Ｊ】
0005568702.tif 000039
【図７Ｋ】
0005568702.tif 000040
【図７Ｌ】
0005568702.tif 000041
【図９Ａ】
0005568702.tif 000042
【図９Ｂ】
0005568702.tif 000043
【図９Ｃ】
0005568702.tif 000044
【図９Ｄ】
0005568702.tif 000045
【図９Ｅ】
0005568702.tif 000046
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
0005568702.tif 000050
【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
0005568702.tif 000052
【図１０Ｇ】
0005568702.tif 000053
【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
0005568702.tif 000055
【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
0005568702.tif 000058
【図１１Ａ】
0005568702.tif 000059
【図１１Ｂ】
0005568702.tif 000060
【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
0005568702.tif 000072
【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１４Ｋ】
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【図１４Ｌ】
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【図１４Ｍ】
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【図１４Ｎ】
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【図１４Ｏ】
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【図１４Ｐ】
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【図１４Ｑ】
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【図１４Ｒ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
0005568702.tif 000105
【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図１９Ｉ】
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【図１９Ｊ】
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【図１９Ｋ】
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【図１９Ｌ】
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【図１９Ｍ】
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【図１９Ｎ】
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【図１９Ｏ】
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【図２０Ａ】
0005568702.tif 000119
【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２０Ｇ】
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【図２０Ｈ】
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【図２０Ｉ】
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【図２０Ｊ】
0005568702.tif 000128
【図２０Ｋ】
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【図２０Ｌ】
0005568702.tif 000130
【図２０Ｍ】
0005568702.tif 000131
【図２０Ｎ】
0005568702.tif 000132
【図２０Ｏ】
0005568702.tif 000133
【図２１Ａ】
0005568702.tif 000134
【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
0005568702.tif 000139
【図２２Ｅ】
0005568702.tif 000140
【図２２Ｆ】
0005568702.tif 000141
【図２２Ｇ】
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【図２２Ｈ】
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【図２２Ｉ】
0005568702.tif 000144
【図２２Ｊ】
0005568702.tif 000145
【図２２Ｋ】
0005568702.tif 000146
【図２２Ｌ】
0005568702.tif 000147
【図２２Ｍ】
0005568702.tif 000148
【図２２Ｎ】
0005568702.tif 000149
【図２２Ｏ】
0005568702.tif 000150
【図２３Ａ】
0005568702.tif 000151
【図２３Ｂ】
0005568702.tif 000152
【図２３Ｃ】
0005568702.tif 000153
【図２３Ｄ】
0005568702.tif 000154
【図２３Ｅ】
0005568702.tif 000155
【図２３Ｆ】
0005568702.tif 000156
【図２３Ｇ】
0005568702.tif 000157
【図２３Ｈ】
0005568702.tif 000158
【図２４Ａ】
0005568702.tif 000159
【図２４Ｂ】
0005568702.tif 000160
【図２４Ｃ】
0005568702.tif 000161
【図２５Ａ】
0005568702.tif 000162
【図２５Ｂ】
0005568702.tif 000163
【図２６】
0005568702.tif 000164
【図２８Ａ】
0005568702.tif 000165
【図２８Ｂ】
0005568702.tif 000166
【図２９Ａ】
0005568702.tif 000167
【図２９Ｂ】
0005568702.tif 000168
【図３０Ａ】
0005568702.tif 000169
【図３０Ｂ】
0005568702.tif 000170
【図３１】
0005568702.tif 000171
【図２】
0005568702.tif 000172
【図３】
0005568702.tif 000173
【図４】
0005568702.tif 000174
【図８】
0005568702.tif 000175
【図１１Ｄ】
0005568702.tif 000176
【図２７】
0005568702.tif 000177
【図２８Ｃ】
0005568702.tif 000178
【配列表】
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