(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【化１】
0005520931.tif 000021
【請求項２】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
0005520931.tif 000022
【請求項３】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【化３】
0005520931.tif 000023
【請求項４】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化４】
0005520931.tif 000024
【請求項５】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【化５】
0005520931.tif 000025
【請求項６】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化６】
0005520931.tif 000026
【請求項７】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【化７】
0005520931.tif 000027
【請求項８】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化８】
0005520931.tif 000028
【請求項９】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
【化９】
0005520931.tif 000029
【請求項１０】
下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化１０】
0005520931.tif 000030
【請求項１１】
請求項１、３、５、７又は９のいずれか一項に記載の薬剤、及び薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１及び／又は請求項３に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
Ｅ２Ｆ２遺伝子発現調節のための、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項９に記載の薬剤、及び薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
ｅＩＦ４遺伝子発現調節のための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項３に記載の薬剤及び又は薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
ＭＤＭ２遺伝子発現調節のための請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
請求項２、４、６、８又は１０のいずれか一項に記載のピロールイミダゾールポリアミド、及び薬剤として許容される担体を含む薬剤。
【請求項１９】
請求項２及び／又は請求項４に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
【請求項２０】
請求項２、４、６、８及び１０に記載のピロールイミダゾールポリアミドを含む基礎実験試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＹＣがん遺伝子（ＭＹＣ（ｃ−ｍｙｃ）に加え、ほかに２種の強い類似性をもつファミリーメンバーＭＹＣＮ（n―ｍｙｃ）、ＭＹＣＬ(ｌ−ｍｙｃ)が存在する）の下流遺伝子を標的とした配列特異的発現調節剤、ＭＹＣ遺伝子関連疾患の治療薬及び抗悪性腫瘍剤に関する。より詳細には特定の構造を有するピロールイミダゾールポリアミド（以下ＰＩＰともいう）を含んでなる薬剤に関する。また、本発明は、ＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域配列の一部又は全部とさらに該Ｅ−ＢＯＸ領域の上流及び／又は下流の塩基配列を含む配列とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域という）を認識するＰＩＰ化合物を用いた細胞の解析等により疾患治療、機能発現に必要な標的領域を決定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＭＹＣ遺伝子ファミリーは、３つの主要な遺伝子：ＭＹＣ（ｃ−ｍｙｃ）、ＭＹＣＮ（n―ｍｙｃ）、ＭＹＣＬ(ｌ−ｍｙｃ)から構成されているプロトオンコジーンであり、全てのファイミリー遺伝子が腫瘍の発生に関与している。そのタンパク質は、類似の性質を示し、へリックス−ループ−へリックス／ロイシン−ジッパー構造を有する転写因子であり、様々な生物学的プロセス、例えば細胞周期の進行、転写、タンパク質の生合成及び代謝、細胞死、非翻訳転写物を制御する転写因子である（非特許文献１）。ＭＹＣはその下流遺伝子の誘導／抑制によってこれらの効果を生じるとされており、そしてこの多岐に渡る標的細胞内及び外部環境を構築する細胞に対する遺伝子発現調節によって、哺乳類細胞の成長、組織分化、幹細胞維持、老化などに重要な役割を担っている。すなわち、ＭＹＣタンパク質は、ＭＹＣのパートナータンパク質であるＭＡＸとヘテロ二量体を形成し、ＤＮＡの特異的配列、いわゆるＥ−ＢＯＸと呼ばれるＤＮＡコンセンサス配列であって、ＣＡＣＧＴＧモチーフで代表される標準配列ＣＡＣＧＴＧ及び非標準配列ＣＡＣＡＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＴＣＧＣＧ、ＣＡＣＧＡＧ、又はＣＡＡＣＧＴＧ配列及びその相補的配列に結合して転写を活性化する（非特許文献２、３、４）。一方、ＭＡＤ−ＭＡＸヘテロ二量体は上記Ｅ−ＢＯＸ配列に結合し、転写を抑制する。（図１Ａ，Ｂ参照）ＭＹＣ遺伝子制御下にある全ての標的遺伝子はコンセンサス結合部位としてＥ−ＢＯＸ領域を有することが知られている（非特許文献５）。ＭＹＣタンパク質はヒト遺伝子のプロモータの１５％以上に結合し、その無秩序な発現は、多種類のヒトのがんの発生に関与するとともに多くの生体反応・疾患に関与する。ＭＹＣタンパク質はまた、多種多様のヒト腫瘍において脱制御されたがんタンパク質であり（非特許文献６）、それゆえＭＹＣにより制御される下流蛋白は新規抗悪性腫瘍剤治療薬や関連疾患、関連生体・細胞反応の標的となり得る。【０００３】
しかしながら、ＭＹＣ遺伝子ファミリー（ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＭＹＣＬ）は、転写因子として様々なシグナル伝達において数千という遺伝子の転写を制御しているため、そのシグナル伝達の阻害はあまりにも多くの遺伝子に影響を及ぼすと考えられ、単純な阻害剤による疾患治療の標的としては適していないと考えられてきた。実際にＭＹＣのシグナル抑制による薬剤開発として、低分子化合物、抗体医薬、核酸医薬が検討されてきているが、いずれも成功していない。これは、それぞれの遺伝子産物を特異的に標的とする阻害剤の開発は理論上可能であるが、ＭＹＣ下流遺伝子の数が多く、どの下流遺伝子を疾患治療の標的として重要であるかを突き止めることは非常に困難であるからである。【０００４】
また、ＭＹＣの転写調節因子ＦＩＲやＦＢＰを標的にした転写調節やＭＹＣ結合転写因子ＭＡＸやＭＡＤを利用した転写調節制御、さらに抗体医薬などの薬剤開発の試みが考案されているが、成功には至っていない。【０００５】
ＳｉＲＮＡによるＭＹＣ遺伝子を標的とした治療法は、個々のＭＹＣ下流遺伝子を標的として設計可能であるが、核酸分解酵素の影響を受けやすく生体外及び生体内で不安定である。すなわち、ＳｉＲＮＡによる薬剤を膜などに包んで標的部位に到達するまで吸収・分解されないようにするドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術の開発が必須であり、標的細胞への薬剤移行にも大きな課題がある。またＳｉＲＮＡは、マイクロＲＮＡなどのほかの生体制御機構への影響も懸念される。さらにＳｉＲＮＡによる治療法は、一般的に転写後の翻訳を限られた遺伝子のみで阻害するものであるので、ＭＹＣ下流の複数の遺伝子を群として発現調節することは難しい。【０００６】
ピロールイミダゾールポリアミドは抗生物質であるｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ−Ａとｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ−ＡがＤＮＡを塩基特異的に認識することを基に、Ｄｅｒｖａｎらにより見出された化学合成物質である（特許文献１、非特許文献７、非特許文献８）。ＰＩＰは二本鎖ＤＮＡを塩基配列特異的に認識し、ＤＮＡ二重螺旋構造のマイナーグルーブに結合することから、標的遺伝子の発現を特異的に制御することが可能である（非特許文献８）。また、ＰＩＰは、これまでの遺伝子発現制御薬であるアンチセンス、リボザイム、ＳｉＲＮＡ等と異なり、生体内において核酸分解酵素によって分解されず、核酸への結合能が高いことから、新規の分子標的治療薬として、抗悪性腫瘍剤等への臨床応用が期待されるところである。【０００７】
逆遺伝学による遺伝子機能の不活性化の手法は、ある特定の遺伝子の機能を解析するために用いられるものであるが、一方でウイルス感染、がん、及び遺伝子の異常発現に基づくその他の疾病の治療にも大きな可能性を開いている。すなわち、遺伝子機能の不活性化を、相同的組換えによりＤＮＡレベルで、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムによりＲＮＡレベルで実施することができることが知られている。しかし、相同組換えは組換え効率が一般に低く一部の細胞でしか効果がみられない、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイムの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、組織、細胞への移行が悪く、リボヌクレアーゼにより分解されやすいという課題があった。【０００８】
一方、アンチセンス試薬やリボザイムのような（デオキシ）リボヌクレオチド試薬とは異なり、ピロールイミダゾールポリアミド類が、ＤＮＡの塩基配列を特異的に認識し、特定遺伝子の発現を細胞外からコントロールすることができることが報告されている。【０００９】
ピロールイミダゾールポリアミド（以下Ｐｙ−Ｉｍポリアミドともいう）は一群の合成小分子であり、芳香族環であるＮ−メチルピロール単位（以下Ｐｙともいう）及びＮ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍともいう）から構成されている（特許文献１、非特許文献７）。Ｐｙ及びＩｍは連続してカップリングし折りたたむことによりγ−アミノ酪酸の存在下でＵ字型のコンフォメーションを取ることができる。本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）、βアラニン（β）及びγ−アミノ酪酸単位（γリンカーともいう）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（特許文献２〜４）。【００１０】
このような合成ポリアミドは二重らせんＤＮＡの副溝（マイナーグルーブ）中の特定の塩基対に高い親和性と特異性を以って結合することができる。塩基対の特異的認識はＰｙとＩｍとの１対１の対形成に依存している。即ち、ＤＮＡの副溝内でのＵ字型コンフォメーションにおいて、Ｐｙ／Ｉｍ対又はβ／Ｉｍ対はＣ−Ｇ塩基対を標的とし、Ｉｍ／Ｐｙ対又はＩｍ／β対はＧ−Ｃ塩基対を標的とし、そしてＰｙ／Ｐｙ対、β／β対、Ｐｙ／β対又はβ／Ｐｙ対はＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の両方を標的とする（非特許文献７〜１０）。
また好ましくは、Ｃ−Ｇ塩基対の一部がβ／Ｉｍ対によって、Ｇ−Ｃ塩基対の一部がＩｍ／β対によって、そしてＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の一部がβ／β対、Ｐｙ／β対又はβ／Ｐｙ対によって、それぞれ標的とされてもよい。
最近の研究によれば、Ａ−Ｔ対及びＴ−Ａ対に対するＰｙ−Ｉｍポリアミド化合物の非選択性の問題は、Ｐｙ／Ｐｙ対の一つのピロール環を３−ヒドロキシピロール（Ｈｐ）で置換した結果として得られるＨｐ／Ｐｙ対が優先的にＴ／Ａ対に結合することによって克服することができることがわかっている。【００１１】
一般的には転写の開始が遺伝子制御の重要なポイントであると考えられている。転写の開始には遺伝子プロモータ領域において特異的な認識配列に結合する転写因子が複合体を形成し、その複合体がＤＮＡ配列と結合するいくつかの過程を必要とする。副溝中のポリアミドは、もし転写因子又は、複合体の特定配列への結合が遺伝子発現において重要であれば、転写因子又はその複合体の結合を阻害して遺伝子の調節に干渉する可能性がある。この仮説はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで証明されている。ジンクフィンガーの認識部位（ＴＦＩＩＩＡの結合部位）の内部に結合した８員環Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは５ＳＲＮＡ遺伝子の転写を阻害した。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）プロモータ中の転写因子配列に隣接する塩基対に結合するポリアミド類は、ヒト細胞におけるＨＩＶ−１複製を阻害する。これらの配列にはＴＡＴＡボックス、リンパ系エンハンサー因子ＬＥＦ−１配列、及びＥＴＳ−１配列が包含される。これとは対照的に、ポリアミドはまた、リプレッサー因子を遮断することによって、又は生来の転写因子を置換することによって、遺伝子発現を活性化する。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＵＬ１２２仲介初期タンパク質２（ＩＥ８６）は、プロモータにＲＮＡポリメラーゼＩＩを補充することを遮断し、その関連遺伝子の転写を抑制する。合成ポリアミドはＩＥ８６の抑制を遮断しその対応遺伝子の発現を開放することができる。Ｍａｐｐらにより設計されたポリアミドは人工転写因子として作用し、遺伝子転写反応を仲介する。さらに、この転写因子の結合阻害はＴＡＴＡボックスに対するＴＡＴＡ  ｂｏｘ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＢＰとも言う）の結合阻害実験において、結合配列より１０塩基はなれた部位に設計されたポリアミド化合物においても競争阻害が認められ、転写因子認識配列の周囲に設計したポリアミドでも転写阻害が認められることが報告されている（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ９８／４９１４２ Ａ１
【特許文献２】特許第３０４５７０６号
【特許文献３】特開２００１−１３６９７４
【特許文献４】ＷＯ０３／０００６８３  Ａ１
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Henriksson M et al:Adv. Cancer Res. 1996;68: 109-182.
【非特許文献２】Dang C.V.:  Mol. Cell. Biol. 1999;19:1 -11.
【非特許文献３】Grandori C. et al: Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000;16:653-699.
【非特許文献４】Oster S.K. et al: Adv. Cancer Res. 2002;84:81 -154.
【非特許文献５】Cole M.D. et al: Oncogene 1999;18, 2916-2924
【非特許文献６】Lutz W. Et al: Biochim. Biophys. Acta. 2002;1602:61-71.
【非特許文献７】Sugiyama et al: Proc Natl Acad Sci U S A. 1996;93:14405-14410
【非特許文献８】Dervan: Bioorg Med. Chem.2001;9:2215-35
【非特許文献９】Trauger J.W. et al: Nature 1996;382:559-561.
【非特許文献１０】White S. et al: Chem Biol  1997;4:569-578.
【非特許文献１１】Ehley J.A.et al. Mol Cell Biol 2002; 22(6) 1723-1733.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＭＹＣタンパク質は様々なシグナル伝達において数千という遺伝子の転写を転写因子として制御しているため、そのシグナル伝達の阻害はあまりにも多くの遺伝子に影響を及ぼすと考えられ、単純な阻害剤による疾患治療の標的としては適していないと考えられてきた。それぞれの遺伝子産物を特異的に標的とする阻害剤の開発は理論上可能であるが、ＭＹＣ下流遺伝子の数が多く、どの下流遺伝子を疾患治療の標的として重要であるかを突き止めることは非常に困難であった。また、先に述べたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドやリボザイム、ＳｉＲＮＡなどの手法は、ターゲットとする配列に制約があり、標的組織、標的細胞への移行が悪く、核酸分解酵素により分解されやすいという問題があった。これまでに、ＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域のコンセンサスＤＮＡ配列の一部又は全部とさらに該コンセンサスＤＮＡ配列より上流及び／又は下流に認識領域を伸ばした遺伝子塩基配列を含む配列に結合するピロール−イミダゾールポリアミドを用いたＭＹＣ下流遺伝子発現調節剤又はＭＹＣ遺伝子関連疾患の治療薬についての報告はない。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域のコンセンサスＤＮＡ配列の一部又は全部とさらに該コンセンサスＤＮＡ配列より上流及び／又は下流に認識領域を伸ばした遺伝子塩基配列を含む配列に特異的に結合することにより、ＭＹＣ下流遺伝子の発現を阻害することができるピロールイミダゾールポリアミドの開発とその薬理効果について鋭意研究した。そこで、本発明者らは、ＭＹＣ下流遺伝子の発現を阻害することができ、且つ治療薬として役立ち得る化合物を得るべく、ＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域のコンセンサスＤＮＡ配列の一部又は全部とさらに該コンセンサスＤＮＡ配列より上流及び／又は下流に認識領域を伸ばした遺伝子塩基配列を含む配列に結合するポリアミド類として、ＷＣＧＷＧＣＷ配列に結合する化合物（Ｍｙｃ−１）、ＷＣＧＷＧＧＷ配列に結合する化合物（Ｍｙｃ−２）、ＷＣＣＷＣＧＷ配列に結合する化合物（Ｍｙｃ−３）、ＷＧＣＷＣＧＷ配列に結合する化合物（Ｍｙｃ−４）、ＷＣＷＣＧＷＧＷ配列に結合する化合物（Ｍｙｃ−５）（ここでＷはＡ又はＴである）を作成し、ヒト子宮頸がん由来細胞株ＨｅＬａ細胞、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株Ｐ４９３−６細胞、ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞株Ｋ５６２細胞、ヒト白血病細胞由来細胞株ＭＯＬＴ−４細胞、又はヒト神経芽細胞腫細胞株ＣＨＰ１３４細胞を用いた生細胞数計測アッセイやリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて、Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２はＭＹＣ下流遺伝子Ｅ２Ｆ２を、Ｍｙｃ−５はＭＹＣ下流遺伝子ｅＩＦ４、ＣＣＮＤ１の発現を、Ｍｙｃ−２は癌抑制遺伝子のｐ５３遺伝子を制御する遺伝子であるＭＤＭ２遺伝子をそれぞれダウンレギュレートすること及び生細胞数の増加を抑制すること（増殖抑制）、カスパーゼ３の活性化が上昇する（細胞死の誘導）を見出し、本発明をなすに至った。【００１６】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）  Ｎ−メチルピロール単位（以下Ｐｙともいう）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（以下Ｉｍともいう）、及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ＣＡＣＧＴＧ、ＣＡＣＡＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＴＣＧＣＧ、ＣＡＣＧＡＧ、又はＣＡＡＣＧＴＧで表される塩基配列からなるＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域配列、及びそのアンチセンス配列であるＣＡＣＧＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＣＡＴＧ、ＣＧＣＡＴＧ、ＣＧＣＧＴＧ、ＣＧＣＧＡＧ、ＣＴＣＧＴＧ、又はＣＡＣＧＴＴＧの、一部又は全部とさらに該Ｅ−ＢＯＸ領域の上流及び／又は下流の１〜２塩基配列を含む配列とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域という）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
（２）  更に好ましくはβアラニン単位(以下βともいう)を含む上記（１）に記載の薬剤。
（３）  Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位、βアラニン及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ＣＡＣＧＴＧ、ＣＡＣＡＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＴＣＧＣＧ、ＣＡＣＧＡＧ、又はＣＡＡＣＧＴＧで表される塩基配列からなるＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域配列、及びそのアンチセンス配列であるＣＡＣＧＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＣＡＴＧ、ＣＧＣＡＴＧ、ＣＧＣＧＴＧ、ＣＧＣＧＡＧ、ＣＴＣＧＴＧ、又はＣＡＣＧＴＴＧの、一部又は全部とさらに該Ｅ−ＢＯＸ領域の上流及び／又は下流の１〜２塩基配列を含む配列とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対又はβ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対又はＩｍ／β対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対、β／β対、Ｐｙ／β対、又はβ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含んでなる薬剤。
（４）  更にフルオレセインイソチオシアネート（以下ＦＩＴＣとも言う）単位を含む上記（１）〜（３）のいずれか一項に記載の薬剤。
（５）  ＭＹＣ下流遺伝子発現調節のための（１）〜（４）のいずれか一項に記載の薬剤。
（６）  ＭＹＣ下流遺伝子関連疾患の治療のための（１）〜（４）のいずれか一項に記載の薬剤。
（７）  抗悪性腫瘍剤として用いるための（６）に記載の薬剤。
（８）  前記標的領域がＷＣＧＷＧＣＷの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（９）  前記標的領域がＡＣＧＴＧＣＷの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１０）  前記標的領域がＷＣＧＷＧＧＷの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１１）  前記標的領域がＡＣＧＴＧＧＷの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１２）  前記標的領域がＷＣＣＷＣＧＷの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１３）  前記標的領域がＷＣＣＡＣＧＴの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１４）  前記標的領域がＷＧＣＷＣＧＷの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１５）  前記標的領域がＷＧＣＡＣＧＴの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１６）  前記標的領域がＷＣＷＣＧＷＧＷの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１７）  前記標的領域がＷＣＡＣＧＴＧＷの塩基配列（ＷはＡ又はＴである）とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域である（１）〜（７）のいずれか一項に記載の薬剤。
（１８）  前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）〜（９）のいずれか一項に記載の薬剤。
【化１】
0005520931.tif 000002
（１９）  下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化２】
0005520931.tif 000003
（２０）  前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）〜（７）、（１０）又は（１１）のいずれか一項に記載の薬剤。
【化３】
0005520931.tif 000004
（２１）  下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化４】
0005520931.tif 000005
（２２）  前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）〜（７）、（１２）又は（１３）のいずれか一項に記載の薬剤。
【化５】
0005520931.tif 000006
（２３）  下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化６】
0005520931.tif 000007
（２４）  前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）〜（７）、（１４）又は（１５）のいずれか一項に記載の薬剤。
【化７】
0005520931.tif 000008
（２５）  下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化８】
0005520931.tif 000009
（２６）  前記ピロールイミダゾールポリアミドが下式で表される（１）〜（７）、（１６）又は（１７）のいずれか一項に記載の薬剤。
【化９】
0005520931.tif 000010
（２７）  下式で表されるピロールイミダゾールポリアミド。
【化１０】
0005520931.tif 000011
（２８）  前記ＭＹＣ下流遺伝子がＥ２Ｆ２遺伝子である（１）〜（１１）、（１８）又は（２０）のいずれか一項に記載の薬剤。
（２９）  前記ＭＹＣ下流遺伝子がｅＩＦ４遺伝子である（１）〜（７）、（１６）、（１７）又は（２６）のいずれか一項に記載の薬剤。
（３０）  前記ＭＹＣ下流遺伝子がＭＤＭ２遺伝子である（１）〜（７）、（１０）、（１１）又は（２０）のいずれか一項に記載の薬剤。
（３１）  （１）〜（１８）、（２０）、（２２）、（２４）又は（２６）のいずれか一項に記載の薬剤、及び薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
（３２）  （１８）及び／又は（２０）に記載の薬剤、並びに薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
（３３）  Ｅ２Ｆ２遺伝子発現調節のための、（３２）に記載の医薬組成物。
（３４）  （２６）に記載の薬剤及び薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
（３５）  ｅＩＦ４遺伝子発現調節のための、（３４）に記載の医薬組成物。
（３６）  （２０）に記載の薬剤及び薬剤として許容される担体を含む、医薬組成物。
（３７）  ＭＤＭ２遺伝子発現調節のための（３６）に記載の医薬組成物。
（３８）  （１９）、（２１）、（２３）、（２５）又は（２７）のいずれか一項に記載のピロールイミダゾールポリアミド、及び薬剤として許容される担体を含む薬剤。
（３９）  （１９）及び／又は（２１）に記載のピロールイミダゾールポリアミド、並びに薬剤として許容される担体を含む薬剤。
（４０）  ＭＹＣ下流遺伝子のｍＲＮＡの発現量が、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の複数の薬剤の各々で処理することによって調節されるか否かを確認することにより、該薬剤の標的領域ごとに該ＭＹＣ下流遺伝子を細かく群わけすることを含む、該ＭＹＣ下流遺伝子の標的又は標的群を決定する方法。
（４１）  基礎実験の試薬として用いる（１９）、（２１）、（２３）、（２５）及び（２７）に記載のピロールイミダゾールポリアミド。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、遺伝子発現を特異的に調節することができるので従来の化学療法剤のような副作用がなく、また安定な化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、ＭＹＣ下流遺伝子発現調節のための薬剤、ＭＹＣ遺伝子関連疾患の治療のための薬剤及び抗悪性腫瘍剤を得ることができる。さらに、本発明によれば、ＭＹＣ下流遺伝子の標的又は標的群を決定することができる。そしてさらに、本発明による化合物の選択的な調節効果により、分子生物学的研究や薬剤開発研究に使用する機能検査試薬を得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明に係るピロールイミダゾールポリアミドにおいて、Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位及びγ−アミノ酪酸単位（以下γリンカーともいう）は互いにアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）で連結されており、その一般構造及び製造方法は公知である（例えば、特許文献１〜３参照）。
【００１９】
例えば、ピロールイミダゾールポリアミドはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を用いた固相法（固相Ｆｍｏｃ法）による自動合成法によって製造することができる（特許文献３）。固相Ｆｍｏｃ法によれば、ピロールイミダゾールポリアミドの末端をカルボン酸残基として固体担体から切り出すことができるので、種々の官能基を分子末端に導入してピロールイミダゾールポリアミドの誘導体を作成することもできる。例えば、デュオカルマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ブレオマイシン、エンジイン化合物、ナイトロジェンマスタード、これらの誘導体等、ＤＮＡに対してアルキル化能を有する化合物を必要に応じて導入することもできる。固相Ｆｍｏｃ法は市販のタンパク（ペプチド）合成機を用いる自動合成法であるため、天然に存在するタンパク質や非天然タンパク質とピロールイミダゾールポリアミドとの共役体（コンジュゲート）を合成することもできる。また、Ｆｍｏｃ法はｔ−ＢＯＣ法に比べて反応条件が緩和であるため、タンパク質以外の有機化合物（酸性条件下で不安定な官能基を有する化合物をも含む）の導入も可能である。例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＤＮＡやＲＮＡ（又はそれらの誘導体）との共役体を自動的に合成することも可能である。
【００２０】
上記公知のＦｍｏｃ法等によれば、末端にカルボキシル基を有するピロールイミダゾールポリアミドを合成することができる。その具体例としては、例えば、末端にβ−アラニン残基（β−アミノプロピオン酸残基）やγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミド等が挙げられる。末端にβ−アラニン残基又はγ−アミノ酪酸残基を有するピロールイミダゾールポリアミドは、例えば、それぞれＦｍｏｃでアミノ基を保護した、アミノピロールカルボン酸、アミノイミダゾールカルボン酸、β−アラニン又はγ−アミノ酪酸を担持した固相担体を用い、ペプチド合成機を使用して固相Ｆｍｏｃ法により合成することができる。
【００２１】
アミノピロールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−ピロールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−ピロールカルボン酸等が挙げられる。アミノイミダゾールカルボン酸の具体例としては、例えば、４−アミノ−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−メチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−エチル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−プロピル−２−イミダゾールカルボン酸、４−アミノ−１−ブチル−２−イミダゾールカルボン酸等が挙げられる。
【００２２】
固相Ｆｍｏｃ法によれば、例えば、ピロールイミダゾールポリアミドとＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）との共役体を合成することもできる。ＦＩＴＣは従来から抗体の蛍光標識試薬として知られているので、得られる共役体は、当該ピロールイミダゾールポリアミドが特定のＤＮＡ配列を認識することを証明するために用いることができる。
【００２３】
本発明のＭＹＣ下流遺伝子発現調節剤は、Ｎ−メチルピロール単位（Ｐｙ）、Ｎ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ＣＡＣＧＴＧ、ＣＡＣＡＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＴＣＧＣＧ、ＣＡＣＧＡＧ、又はＣＡＡＣＧＴＧで表される塩基配列からなるＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域のコンセンサスＤＮＡ配列、及びそのアンチセンス配列であるＣＡＣＧＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＣＡＴＧ、ＣＧＣＡＴＧ、ＣＧＣＧＴＧ、ＣＧＣＧＡＧ、ＣＴＣＧＴＧ、又はＣＡＣＧＴＴＧの、一部又は全部とさらに該コンセンサスＤＮＡ配列より上流及び／又は下流に認識領域を伸ばした遺伝子塩基配列を含む配列のうち、ＷＣＧＷＧＣＷ配列（Ｍｙｃ−１の認識配列）、ＷＣＧＷＧＧＷ配列（Ｍｙｃ−２の認識配列）、ＷＣＣＷＣＧＷ配列（Ｍｙｃ−３の認識配列）、ＷＧＣＷＣＧＷ配列（Ｍｙｃ−４の認識配列）、又はＷＣＷＣＧＷＧＷ配列（Ｍｙｃ−５の認識配列）（ＷはＡ又はＴを表す）の配列とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域という）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
また好ましくは、本発明は、Ｎ−メチルピロール単位、Ｎ−メチルイミダゾール単位、βアラニン及びγ−アミノ酪酸単位を含むピロールイミダゾールポリアミドであって、ＣＡＣＧＴＧ、ＣＡＣＡＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＴＧＣＧ、ＣＡＣＧＣＧ、ＣＴＣＧＣＧ、ＣＡＣＧＡＧ、又はＣＡＡＣＧＴＧで表される塩基配列からなるＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域のコンセンサスＤＮＡ配列、及びそのアンチセンス配列であるＣＡＣＧＴＧ、ＣＡＴＧＴＧ、ＣＡＣＡＴＧ、ＣＧＣＡＴＧ、ＣＧＣＧＴＧ、ＣＧＣＧＡＧ、ＣＴＣＧＴＧ、又はＣＡＣＧＴＴＧの、一部又は全部とさらに該コンセンサスＤＮＡ配列より上流及び／又は下流に認識領域を伸ばした遺伝子塩基配列を含む配列のうち、ＷＣＧＷＧＣＷ配列（Ｍｙｃ−１の認識配列）、ＷＣＧＷＧＧＷ配列（Ｍｙｃ−２の認識配列）、ＷＣＣＷＣＧＷ配列（Ｍｙｃ−３の認識配列）、ＷＧＣＷＣＧＷ配列（Ｍｙｃ−４の認識配列）、又はＷＣＷＣＧＷＧＷ配列（Ｍｙｃ−５の認識配列）（ＷはＡ又はＴを表す）の配列とこれに対する相補鎖を含む二重らせん領域（以下標的領域という）の副溝内において、前記γ−アミノ酪酸単位の部位で折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとることができ、Ｃ−Ｇ塩基対に対してはＰｙ／Ｉｍ対又はβ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対又はＩｍ／β対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対、β／β対、Ｐｙ／β対、又はβ／Ｐｙ対がそれぞれ対応する、上記ピロールイミダゾールポリアミドを含む。
例えば、Ｍｙｃ−１は、図１Ｃ、Ｄに示すようにＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域配列のＡＣＧＴＧの配列を認識しさらにＥ−ＢＯＸ領域外のＣＡ又はＣＴの２塩基の配列を認識し、また、Ｍｙｃ−３はＥ−ＢＯＸ領域配列のＣＡＣＧＴの配列を認識しさらにＥ−ＢＯＸ領域外のＡＣ又はＴＣの２塩基の配列を認識するよう設計されており、理論上Ｍｙｃ−１は、ＡＣＧＴＧの配列をもつ、またＭｙｃ−３はＣＡＣＧＴの配列をもつＥ−ＢＯＸ制御のＭＹＣ遺伝子のうち８分の１（１２．５％）の異なるＭＹＣ下流遺伝子群の制御を調節（阻害）すると考えられる。
【００２４】
通常ＤＮＡの螺旋の骨格は２種類の溝をつくり、広くて深い溝を主溝（メジャーグルーブ）、狭くて浅い溝を副溝（マイナーグルーブ）と呼んでいる。ここで上記ピロールイミダゾールポリアミドは、特定の塩基対がつくる副溝（マイナーグルーブ）に高い親和性と特異性を以って非共役結合的に結合することができる。この時の結合は、副溝のＣ−Ｇ塩基対に対してはピロールイミダゾールポリアミドのＰｙ／Ｉｍ対又はβ／Ｉｍ対が、Ｇ−Ｃ塩基対に対してはＩｍ／Ｐｙ対又はＩｍ／β対が、Ａ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対に対してはいずれもＰｙ／Ｐｙ対、β／β対、Ｐｙ／β対、又はβ／Ｐｙ対がそれぞれ対応している。そして、ピロールイミダゾールポリアミド分子中のγ−アミノ酪酸単位の部位で分子が折りたたまれてＵ字型のコンフォメーションをとる。
また好ましくは、Ｃ−Ｇ塩基対の一部がβ／Ｉｍ対によって、Ｇ−Ｃ塩基対の一部がＩｍ／β対によって、そしてＡ−Ｔ塩基対及びＴ−Ａ塩基対の一部がβ／β対、Ｐｙ／β対又はβ／Ｐｙ対によって、それぞれ標的とされてもよい。
【００２５】
副溝の塩基対とピロールイミダゾールポリアミドのＰｙとＩｍの対が上述のように対応していないと、副溝とピロールイミダゾールポリアミドとの結合が不十分となる。このように、副溝の塩基対とＰｙ−Ｉｍ対が上述のように対応していないピロールイミダゾールポリアミドを本願ではミスマッチ又はミスマッチポリアミドと呼ぶ。
【００２６】
ＭＹＣ遺伝子ファミリーが、その下流遺伝子の発現調節に利用するＥ−ＢＯＸ領域の塩基配列、並びにＭＹＣ−ＭＡＸ二量体及びＭＡＤ−ＭＡＸ二量体によるＭＹＣ下流遺伝子群の転写調節についての略図は図１Ａ、Ｂに示す通りである。
【００２７】
本発明の、ＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域のコンセンサスＤＮＡ配列の一部又は全部とさらに該コンセンサスＤＮＡ配列より上流及び／又は下流に認識領域を伸ばした遺伝子塩基配列を含む配列を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類、Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３、Ｍｙｃ−４及びＭｙｃ−５は下記に示す通りである。
【００２８】
【化１１】
0005520931.tif 000012
【００２９】
【化１２】
0005520931.tif 000013
【００３０】
【化１３】
0005520931.tif 000014
【００３１】
【化１４】
0005520931.tif 000015
【００３２】
【化１５】
0005520931.tif 000016
Ｍｙｃ−１は、分子式Ｃ64Ｈ92Ｎ26Ｏ13、分子量１４２３．６を有し、その標的配列はＷＣＧＷＧＣＷ配列である。ＰｙはＮ−メチルピロール単位、ＩｍはＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）、βはβアラニン、Ｄｐはジメチルアミノプロピルアミド、（ はγ−アミノ酪酸、Ａｃはアセチルを表す。
【００３３】
Ｍｙｃ−２は、分子式Ｃ64Ｈ92Ｎ26Ｏ13、分子量１４２３．６を有し、その標的配列はＷＣＧＷＧＧＷ配列である。ＰｙはＮ−メチルピロール単位、ＩｍはＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）、βはβアラニン、Ｄｐはジメチルアミノプロピルアミド、（はγ−アミノ酪酸、Ａｃはアセチルを表す。
【００３４】
Ｍｙｃ−３は、分子式Ｃ64Ｈ82Ｎ26Ｏ13、分子量１４２２．８を有し、その標的配列はＷＣＣＷＣＧＷ配列である。ＰｙはＮ−メチルピロール単位、ＩｍはＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）、βはβアラニン、Ｄｐはジメチルアミノプロピルアミド、（ はγ−アミノ酪酸、Ａｃはアセチルを表す。
【００３５】
Ｍｙｃ−４は、分子式Ｃ64Ｈ83Ｎ26Ｏ13、分子量１４２４．５を有し、その標的配列はＷＧＣＷＣＧＷ配列である。○はＮ−メチルピロール単位、●はＮ−メチルイミダゾール単位、◇はβアラニン、
0005520931.tif 000017
はジメチルアミノプロピルアミド、)はγ−アミノ酪酸、Ａｃはアセチルを表す。
【００３６】
Ｍｙｃ−５は、分子式Ｃ73Ｈ94Ｎ29Ｏ15、分子量１６１７．７を有し、その標的配列はＷＣＷＣＧＷＧＷ配列である。○はＮ−メチルピロール単位、●はＮ−メチルイミダゾール単位、◇はβアラニン、
0005520931.tif 000018
はジメチルアミノプロピルアミド、)はγ−アミノ酪酸、Ａｃはアセチルを表す。
【００３７】
なお、ＷはＡ又はＴを表す。
【００３８】
また、ネガティブコントロールとしてＥ−ＢＯＸ領域に結合しないミスマッチポリアミドＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２（ミスマッチＡ）、ミスマッチポリアミドＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．１２０（ミスマッチＢ）は下記に示す通りである。
【００３９】
ミスマッチＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２（ミスマッチＡ）
【００４０】
【化１６】
0005520931.tif 000019
ミスマッチＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２（ミスマッチＡ）は、分子式Ｃ67Ｈ85Ｎ23Ｏ13、分子量１４２１．０を有し、その標的配列はＷＧＷＷＷＷＷ配列である。ＰｙはＮ−メチルピロール単位、ＩｍはＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）、βはβアラニン、Ｄｐはジメチルアミノプロピルアミド、（ はγ−アミノ酪酸、Ａｃはアセチルを表す。なお、ＷはＡ又はＴを表す。
【００４１】
ミスマッチＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．１２０（ミスマッチＢ）
【化１７】
0005520931.tif 000020
Ｐｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．１２０（ミスマッチＢ）は、分子式Ｃ65Ｈ84Ｎ25Ｏ13、分子量１６６８．０を有し、その標的配列はＷＣＷＧＣＷＧＷ配列である。ＰｙはＮ−メチルピロール単位、ＩｍはＮ−メチルイミダゾール単位（Ｉｍ）、βはβアラニン、Ｄｐはジメチルアミノプロピルアミド、（ はγ−アミノ酪酸、Ａｃはアセチルを表す。なお、ＷはＡ又はＴを表す。
【００４２】
本発明者らはＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域のコンセンサスＤＮＡ配列の一部又は全部とさらに該コンセンサスＤＮＡ配列より上流及び／又は下流に認識領域を伸ばした遺伝子塩基配列を含む配列を標的とするＰｙ−Ｉｍポリアミド類を合成した。ＨｅLａ細胞Ｐ４９３−６細胞、Ｋ５６２細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、又はＣＨＰ１３４細胞を用いた生細胞数計測アッセイやリアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果、本発明のＰｙ−Ｉｍポリアミド化合物Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２単独又はそのＭｙｃ−１＋Ｍｙｃ−２の併用により、重要なｃ−ＭＹＣ下流遺伝子の一つであり、細胞増殖で重要な役割を担うことが証明されているＥ２Ｆ２遺伝子がダウンレギュレートされること、及び本発明のＰｙ−Ｉｍポリアミド化合物Ｍｙｃ−５により、Ｍｙｃ下流遺伝子ｅＩＦ４の発現がダウンレギュレートされることが示された。また、本発明のＰｙ−Ｉｍポリアミド化合物Ｍｙｃ−２により、癌抑制遺伝子のｐ５３遺伝子を制御する遺伝子であるＭＤＭ２遺伝子の発現がダウンレギュレートされることが示された。したがって、本発明によるＰｙ−Ｉｍポリアミド化合物は、ＭＹＣ転写因子複合体（ＭＹＣ−ＭＡＸ）が結合するＥ−ＢＯＸ配列をその配列中に持つＭＹＣ下流遺伝子の発現を調節する効果を有することが示された。また、ＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸの一部又は全部とさらに該Ｅ−ＢＯＸの上流及び／又は下流の塩基配列を含む配列を認識すると考えられるＰｙ−Ｉｍポリアミド化合物の添加により、ＨｅＬａ細胞、Ｐ４９３−６細胞、ＭＯＬＴ−４細胞、Ｋ５６２細胞、又はＣＨＰ１３４細胞の生細胞数の細胞増殖による増加が著明に抑制された。このことは、それぞれのＭＹＣ下流遺伝子がもつＥ−ＢＯＸ配列とその周辺配列に依存して化合物が合成されることで、Ｅ−ＢＯＸをコンセンサス配列として持つ多数のＭＹＣ下流遺伝子を、共通配列の遺伝子ごとに群に分けながら、その機能調節を阻害することで、下流遺伝子の発現を変化させて細胞増殖を変更することを示すと考えられる。従って、これは、詳細な各Ｐｙ−Ｉｍポリアミド添加後の細胞の解析によりＭＹＣ下流遺伝子群の機能を予測することができる可能性を示す。またここで合成されたＰＩＰ化合物は、ＭＹＣ下流の３０００から４０００といわれる遺伝子（細胞周期、蛋白合成、細胞接着・細胞骨格、細胞内代謝などに関わる遺伝子やマイクロＲＮＡ）の発現を調節すると考えられ、該化合物そのものが、ＭＹＣ関連疾患の治療薬や組織発生分化制御薬等に利用できると考えられた。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】ＭＹＣ遺伝子により制御される下流遺伝子の調節機構と本願化合物によるＭＹＣ下流遺伝子の発現調節機構の概略図を示す。
【図２】ＭＹＣ下流遺伝子標的ピロールイミダゾールポリアミド（Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３、Ｍｙｃ−１とＭｙｃ−２、Ｍｙｃ−２とＭｙｃ−３、Ｍｙｃ−１とＭｙｃ−３、ネガティブコントロール：ミスマッチＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２と未処理コントロール）添加による培養ＨｅＬａ細胞の経時的生細胞数計測の結果を示す。
【図３】Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３処理によるＨｅＬａ細胞７２時間培養後の位相差顕微鏡像の結果を示す。Ｍｙｃ−２単独又はＭｙｃ−１＋Ｍｙｃ−２の併用によって最も顕著なＨｅＬａ細胞の増殖が阻害されることを示す。
【図４】Ｅ２Ｆ２遺伝子の半定量的ＰＣＲによる発現量の結果を示す。Ｅ２Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡ発現は、Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２単独、及びＭｙｃ−１＋Ｍｙｃ−２の併用によって最もダウンレギュレートされることを示す。
【図５】Ｅ２Ｆ２遺伝子の定量的発現解析の結果を示す。Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２単独、又はＭｙｃ−１＋Ｍｙｃ−２併用によって、Ｅ２Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量がコントロールに比べ減少することを示す。
【図６】Ｍｙｃ−５処理によるＰ４９３−６細胞７２時間培養後の位相差顕微鏡像の結果を示す。Ｍｙｃ−５による細胞増殖阻害効果が、濃度依存的に増殖に伴う生細胞数の増加が抑制されることから示された。
【図７−Ａ】定量的発現解析の結果を示す。ＨｅＬａ細胞におけるＭＹＣ、ｅＩＦ４Ｇ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベル。Ｍｙｃ−５は、ＨｅＬａ細胞において濃度依存的にｅＩＦ４Ｇ１およびＣＣＮＤ１遺伝子の発現量をダウンレギュレートすることを示す。
【図７−Ｂ】定量的発現解析の結果を示す。Ｐ４９３−６細胞におけるＭＹＣ、ｅＩＦ４Ｇ１、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベル。Ｍｙｃ−５は、Ｐ４９３−６細胞において濃度依存的にｅＩＦ４Ｇ１遺伝子の発現量を濃度依存的にダウンレギュレートすることを示す。
【図７−Ｃ】定量的発現解析の結果を示す。Ｋ５６２細胞におけるＭＹＣ、ｅＩＦ４Ｇ１、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベル。
【図７−Ｄ】定量的発現解析の結果を示す。Ｋ５６２細胞におけるＭＹＣ、ＭＤＭ２、ｐ５３遺伝子の相対的ｍＲＮＡ発現レベル。
【図８】Ｍｙｃ−５Ｐｙ−Ｉｍポリアミドのゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）の結果を示す。レーン１：  一本鎖ＤＮＡ、レーン２：  二本鎖ＤＮＡ、レーン３：  ｅＩＦ４Ｇ遺伝子プロモータ二本鎖ＤＮＡとＭｙｃ−５、レーン４：  変異配列を挿入した二本鎖ＤＮＡとＭｙｃ−５、レーン５：  ｅＩＦ４Ｇ遺伝子プロモータ二本鎖ＤＮＡとミスマッチＢ（Ｐｙ−ＩｍＮｏ．１２０）（ＷＣＷＧＣＷＧＷを認識）
【図９】Ｍｙｃ−１のＨＰＬＣの結果を示す。
【図１０】Ｍｙｃ−２のＨＰＬＣの結果を示す。
【図１１】Ｍｙｃ−３のＨＰＬＣの結果を示す。
【図１２】Ｍｙｃ−４のＨＰＬＣの結果を示す。
【図１３】Ｍｙｃ−５のＨＰＬＣの結果を示す。
【図１４】Ｐ４９３−６細胞の細胞生存数に対するＰｙ−Ｉｍポリアミド処置の効果
【図１５−Ａ】Ｍｙｃ−５処置のＭＯＬＴ−４細胞での細胞数
【図１５−Ｂ】Ｍｙｃ−２処置のＭＯＬＴ−４細胞での細胞数
【図１６】Ｋ５６２細胞の細胞生存数に対するＭｙｃ−５処置の効果
【図１７】Ｐｙ−Ｉｍポリアミド処置によるＨｅＬａ細胞増殖抑制効果
【図１８】Ｋ５６２細胞の代表的位相差顕微鏡写真：コントロール（Ａ）及び１０μＭ濃度のＭｙｃ−５処置細胞の培養２日目（Ｂ）（尺度＝１０００μｍ、４０倍）
【図１９】遺伝子プロモータに対するＭｙｃ−５コンセンサス配列の解析。ヒトＣＣＮＤ１遺伝子のプロモータのＥ−ＢＯＸ領域、ヒトｅＩＦ４Ｇ１遺伝子のプロモータのＥ−ＢＯＸ領域、ヒトＣＤＫ４遺伝子のプロモータのＥ−ＢＯＸ２領域にＭｙｃ-５の標的領域ＷＣＡＣＧＴＧＷが存在することがわかる。
【図２０】ウエスタンブロッティグン解析（タンパク質の測定）
【図２１】ＭＣＦ−７細胞におけるＦＩＴＣ結合Ｍｙｃ−５（５μＭ）の核内局在
【図２２】ＨｅＬａ細胞におけるＦＩＴＣ結合Ｍｙｃ−５（２０μＭ）の核内局在
【図２３】Ｋ５６２細胞でのクロマチン免疫沈降アッセイ
【図２４】Ｅ−ＢＯＸを標的とするＭｙｃ−２及びＭｙｃ−３によるＣＨＰ１３４腫瘍細胞の増殖抑制効果。Ｍｙｃ−２及びＭｙｃ−３によってＣＨＰ１３４細胞の増殖が阻害されることを示す。
【図２５】Ｅ−ＢＯＸを標的とするＭｙｃ−２及びＭｙｃ−３によるＣＨＰ１３４腫瘍細胞の増殖抑制効果
【図２６】Ｅ−ＢＯＸを標的とするＭｙｃ−３、Ｍｙｃ−４及びＭｙｃ−５による神経芽細胞腫ＣＨＰ１３４細胞の生細胞活性（ＷＳＴ−８アッセイ）
【図２７】Ｍｙｃ−２及びＭｙｃ-5によるカスパーゼ３活性化の上昇を示す。
【実施例】
【００４４】
１．Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの設計と合成
（１）ＭＹＣ下流遺伝子のＥ−ＢＯＸ領域配列の一部又は全部とさらに該Ｅ−ＢＯＸ領域の上流及び／又は下流の塩基配列を含む配列に対応するＰｙ−Ｉｍポリアミドの設計と合成
Ｐｙ−Ｉｍポリアミドとして、ＭＹＣ下流遺伝子のＤＮＡコンセンサス配列であるＥ−ＢＯＸ領域配列の一部又は全部とさらにその上流及び／又は下流の塩基配列を含む配列のうち、ＷＣＧＷＧＣＷ配列（Ｍｙｃ−１の認識配列）、ＷＣＧＷＧＧＷ配列（Ｍｙｃ−２の認識配列）、ＷＣＣＷＣＧＷ配列（Ｍｙｃ−３の認識配列）、ＷＧＣＷＣＧＷ配列（Ｍｙｃ−４の認識配列）、又はＷＣＷＣＧＷＧＷ配列（Ｍｙｃ−５の認識配列）（ＷはＡ又はＴを表す）の塩基配列に結合するように、上記のようなＭｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３、Ｍｙｃ−４、及びＭｙｃ−５を設計、合成した。また、ミスマッチポリアミドＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２、及びＮｏ．１２０も設計、合成した。
（２）Ｆｍｏｃ法を用いたＰｙ−Ｉｍポリアミドのマシンアシスト（機械補助）自動合成
ピロールイミダゾールポリアミドのマシンアシスト自動合成を、連続フローペプチド合成機Ｐｉｏｎｅｅｒ（商標）（アプライドバイオシステムズ）を用いて０．１ｍｍｏｌスケール（２００ｍｇのＦｍｏｃ−β−アラニン−ＣＬＥＡＲ酸レジン、０．５０ｍｅｑ／ｇ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．）で実施した。自動固相合成はＤＭＦ洗浄、Ｆｍｏｃ基の２０％ピペリジン／ＤＭＦによる除去、ＤＭＦ及びメタノール洗浄、ＨＣＴＵ及びＤＩＥＡ（それぞれ４当量）の存在下でのモノマーとの６０分間のカップリング、メタノール洗浄、必要に応じて無水酢酸／ピリジンによる保護、及び最終的なＤＭＦ洗浄からなっている。Ｐｙ−Ｉｍポリアミドは一般に中程度の収率（１０−３０％）で得られた。【００４５】
ＦＩＴＣカップリング：  ４倍過剰のイソチオシアネート化されたフルオレセイン（０．４０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡをＤＭＦに溶解したものをカラムを通して６０分間フラッシュした。
一般的手順：  Ｆｍｏｃ−β−アラニン−Ｗａｎｇ樹脂のＦｍｏｃ基を除去した後、樹脂をＤＭＦで連続的に洗浄した。カップリング工程をＦｍｏｃアミノ酸で実施し、次いでＤＭＦでの洗浄を行った。これらの工程を全配列が導入されるまで何度も繰返した。カップリング工程を終えた後、必要に応じてＮ末端アミノ基を保護するか又はＦＩＴＣでカップリングし、ＤＭＦで洗浄し、反応容器を取りはずした。【００４６】
カルボン酸としての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（９１％ＴＦＡ−３％／ＴＩＳ−３％ＤＭＳ−３％水の混合物５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ）の後に単離した。【００４７】
アミンとしての分解：  合成ポリアミドを冷エチルエーテル沈澱により分解工程（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアミン５ｍｌ／樹脂０．１ｍｍｏｌ、５０℃、一晩）の後に単離した。【００４８】
精製：  最終精製は、１ｍｌ／分の流速の分析用ＨＰＬＣで、緩衝液Ａ（０．１％ＡｃＯＨ（水中））、Ｂ（アセトニトリル）の０％〜６６．６％の勾配を用いて、２５４ｎｍのＵＶ検出により行った。
得られたＭｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３、Ｍｙｃ−４、及びＭｙｃ−５のＨＰＬＣ分析のチャートを図９〜図１３に示す。【００４９】
２−１．ＨｅＬａ細胞を用いた生細胞数計測アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
Ｉ．材料及び方法
ＨｅＬａ細胞(ヒト子宮頸がん由来細胞)は、細胞株・微生物株・遺伝子バンクのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）より購入した。ＨｅＬａ細胞を、１ウェルに３，０００細胞ずつとなるよう９６ウェルプレートに播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含む１００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて２４時間培養後、培地を交換し、１０μＭ濃度のＭｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３単独又は１０μＭ濃度のＭｙｃ−１とＭｙｃ−２、Ｍｙｃ−２とＭｙｃ−３、Ｍｙｃ−１とＭｙｃ−３を併用したＰｙ−Ｉｍポリアミドを含む１０％子牛血清添加培地もしくはＰＩＰを含まない同様の培地でＨｅＬａ細胞を３７度、５％ＣＯ２、９５％から１００％の相対湿度条件下で７２時間培養した。また、未処置のＨｅＬａ細胞をコントロールとし、ミスマッチポリアミドＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２で処置した細胞をネガティブコントロールとした。培養後２４時間、４８時間、７２時間の生細胞数の計測を行い、Ｐｙ−Ｉｍポリアミドの効果を評価した。生細胞数測定は、生細胞数測定試薬ＳＦ（Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，Ｉｎｃ．）を１０μｌずつ添加し、１時間呈色反応を行い、ＡＲＶＯマイクロタイタープレートリーダー(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ， ＭＡ， ＵＳＡ)で４５０ｎｍの吸光度を測定した。なお、当該実験はトリパンブルー染色除外アッセイで行った。
ＩＩ．結果
１０μＭ濃度のＭｙｃ−１、Ｍｙｃ−２及びＭｙｃ−３は、コントロールやネガティブコントロール（ミスマッチポリアミドＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２）に比較して、ＨｅＬａ細胞の成長を阻害した。特にＭｙｃ−２単独及びＭｙｃ−１とＭｙｃ−２の併用は、０日目（培養開始時）の細胞生存率に比較して最小の相対的生存率（％）を示した。これは、Ｍｙｃ−２単独及びＭｙｃ−１とＭｙｃ−２の併用により、ＨｅＬａ細胞の成長がもっとも阻害されることを示す。
結果を図２に示す。【００５０】
２−２．Ｐ４９３−６細胞を用いた生細胞数計測アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
Ｉ．材料及び方法
Ｐ４９３−６細胞(Epstein-Barrウイルスで不死化され、テトラサイクリン調節型MYCを発現するヒトB細胞)は、フレッドハッチンソンがん研究所カーラグランドーリ博士より供与を受けた。２−１と同様の方法で、Ｐ４９３−６細胞を１０μＭ濃度のＭｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３、Ｍｙｃ−４、Ｍｙｃ−５で７２時間培養した。また未処置のＰ４９３−６細胞をコントロールとし、ミスマッチＡ及びミスマッチＢで処置した細胞をネガティブコントロールとした。培養後７２時間の生細胞数の計測をトリパンブルー染色除外アッセイで行った。
ＩＩ．結果
１０μＭ濃度のＭｙｃ−１〜Ｍｙｃ−５のうち特にＭｙｃ−２、Ｍｙｃ−４及びＭｙｃ−５は、コントロールやネガティブコントロール（ミスマッチＡ、Ｂ）に比較して、Ｐ４９３−６細胞の成長を阻害した（図１４）。【００５１】
２−３．ＭＯＬＴ−４細胞を用いた生細胞数計測アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
Ｉ．材料及び方法
ＭＯＬＴ−４細胞（ヒト白血病細胞由来細胞）は、理研細胞バンクより供与された。２−１と同様の方法で、ＭＯＬＴ−４細胞を１００、５００ｎＭ、１、５、１０μＭ濃度のＭｙｃ−５、及び１０、５００ｎＭ濃度のＭｙｃ−２で培養した。また未処置のＭＯＬＴ−４細胞をコントロールとした。Ｍｙｃ−５処置では培養後３日目、Ｍｙｃ−２処置では培養後２日目及び５日目の生細胞数の計測を行った。
ＩＩ．結果
１μＭ濃度のＭｙｃ−５が、最もＭＯＬＴ−４細胞の成長を阻害した（図１５−Ａ）。また、１０ｎＭ濃度、５００ｎＭ濃度のＭｙｃ−２がＭＯＬＴ−４細胞の成長を阻害した（図１５−Ｂ）。【００５２】
２−４．Ｋ５６２を用いた生細胞数計測アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
Ｉ．材料及び方法
Ｋ５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞由来細胞株）は、ＡＴＣＣより購入した。２−１と同様の方法で、Ｋ５６２細胞を１、５、１０μＭ濃度のＭｙｃ−５で培養した。また未処置のＫ５６２細胞をコントロールとした。培養後２４、４８、７２時間の生細胞数の計測をトリパンブルー染色除外アッセイで行った。
ＩＩ．結果
Ｍｙｃ−５は、コントロールと比較して、Ｋ５６２細胞の成長を濃度依存的に阻害した（図１６）。【００５３】
２−５．１．ＣＨＰ１３４細胞を用いた生細胞数計測アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
Ｉ．材料及び方法
ＣＨＰ１３４細胞（ヒトＭＹＣＮ増幅神経芽細胞腫由来細胞）は理研細胞バンクより供与を受けた。２−１と同様の方法で、ＣＨＰ１３４細胞を１０μＭ濃度のＭｙｃ−２、３で培養した。また未処置のＣＨＰ１３４細胞をコントロールとした。培養後０、２、３日目の生細胞数の計測を、トリパンブルー染色除外アッセイで行った。
ＩＩ．結果
Ｍｙｃ−２及びＭｙｃ−３による、ＣＨＰ１３４細胞での強い増殖抑制が認められた（図２５）。【００５４】
２−６．ＣＨＰ１３４細胞を用いた生細胞数計測アッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）
Ｉ．材料及び方法
ＣＨＰ１３４細胞（ヒトＭＹＣＮ増幅神経芽細胞腫由来細胞）は理研細胞バンクより供与を受けた。２−１と同様の方法で、ＣＨＰ１３４細胞を１０μＭ濃度のＭｙｃ−３、Ｍｙｃ−４及びＭｙｃ−５で培養した。また未処置のＣＨＰ１３４細胞をコントロールとした。なお、当該実験は水溶性ホルマザンを用いたｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＴＴ  ａｓｓａｙ（ＷＳＴ−８（商品名）：  Ｎａｃａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，  Ｉｎｃ．）で施行した。
ＩＩ．結果
Ｍｙｃ−３で、神経芽細胞腫ＣＨＰ１３４細胞の増殖抑制が認められたが、成人腫瘍細胞株で強い増殖抑制を示したＭｙｃ−４及びＭｙｃ−５はＣＨＩＰ１３４細胞の増殖を抑制しなかった（図２６）。【００５５】
３．形態学的分析（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
Ｉ．材料及び方法
ＨｅＬａ細胞を、１２０，０００細胞となるよう６ウェルプレートの１ウェルに播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて２４時間培養後、培地を交換し、１０μＭ濃度のＭｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３単独又は１０μＭ濃度のＭｙｃ−１とＭｙｃ−２、Ｍｙｃ−２とＭｙｃ−３、Ｍｙｃ−１とＭｙｃ−３を併用したＰｙ−Ｉｍポリアミドを含む１０％子牛血清添加培地もしくはＰＩＰを含まない同様の培地で処理したＨｅＬａ細胞を７２時間培養した。また、未処置のＨｅＬａ細胞をコントロールとし、ミスマッチポリアミドＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２で処置した細胞をネガティブコントロールとした。培養３日目の細胞を位相差顕微鏡で観察し、デジタル画像として取り込んで解析に用い、細胞形態分析を行った。
ＩＩ．結果
図３に示すように、位相差顕微鏡写真の結果、Ｍｙｃ−２単独又はＭｙｃ−１＋Ｍｙｃ−２の併用により最も顕著なＨｅＬａ細胞の増殖阻害が示された。【００５６】
４．Ｐｙ−Ｉｍポリアミドによる細胞増殖ダウンレギュレーション
Ｉ．材料及び方法
ＨｅＬａ細胞を１ウェルに１２０，０００細胞となるよう６ウェルプレートに播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて１０μＭ濃度のＭｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３、Ｍｙｃ−４又はＭｙｃ−５とともに７２時間培養した。また未処置のＨｅＬａ細胞をコントロールとし、ミスマッチＡ及びＢで処置した細胞をネガティブコントロールとした。培養後７２時間の生細胞数の計測をトリパンブルー染色除外アッセイで行い、Ｐｙ−ＩｍポリアミドのＨｅＬａ細胞増殖ダウンレギュレーションの効果を検討した。
ＩＩ．結果
１０μＭ濃度のＭｙｃ−１〜Ｍｙｃ−５のうち特にＭｙｃ−２及びＭｙｃ−５は、ネガティブコントロール（ミスマッチＡ、Ｂ）に比較して、ＨｅＬａ細胞の増殖を阻害した（図１７）。【００５７】
５．ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ発現の測定）
Ｉ．材料及び方法
ＨｅＬａ細胞を、１ウェルに１２０，０００細胞となるよう６ウェルプレートに播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて２４時間培養後、培地を交換し、１０μＭ濃度のＭｙｃ−１、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−３単独又は１０μＭ濃度のＭｙｃ−１とＭｙｃ−２、Ｍｙｃ−２とＭｙｃ−３、Ｍｙｃ−１とＭｙｃ−３を併用したポリアミドを含む１０％子牛血清添加培地もしくはＰＩＰを含まない同様の培地で７２時間培養し、細胞を回収し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商品名）（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用し抽出、ＮａｎｏＤｒｏｐ社のｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒでＲＮＡ量を測定後、リアルタイムＰＣＲアッセイに供した。未処置のＨｅＬａ細胞をコントロールとし、ミスマッチポリアミドＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２で同様に処置した細胞をネガティブコントロールとした。内部標準ヒト内在性グリセルアルデヒド−３−ホスフェート  ジヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）もしくはベータアクチン（β-actin）を使用した。ＭＹＣ下流遺伝子の１つであるＥ２Ｆ２遺伝子の定量は、ＧＡＰＤＨ発現と比較することによって標準化した。
リアルタイムＰＣＲアッセイは、ＴＡＫＡＲＡ  ＤＩＣＥ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ（商品名）（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．)を利用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商品名）  ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）により逆転写反応を行い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商品名）（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を使用し、ＴＡＫＡＲＡ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｐｒｉｍｅｒより購入したＥ２Ｆ２及びＧＡＰＤＨプライマーを利用し、（初期変性）  ９５℃、２０秒（ＰＣＲ反応：２８サイクル）９４℃２０秒、５５℃２０秒、７２℃２０秒の反応系によって行った。具体的なプライマーの塩基配列は、Ｅ２Ｆ２センスプライマー（５’−ＡＧＣＧＧＣＧＣＡＴＣＴＡＴＧＡＣＡＴＣ−３’）（配列番号１）、Ｅ２Ｆ２アンチセンスプライマー（５’−ＴＣＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＴＴ−３’）（配列番号２）、ＧＡＰＤＨセンスプライマー（５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３）（配列番号３、ＨＡ０６７８１２−Ｆ）及びＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’）（配列番号４、ＨＡ０６８１２−Ｒ）を用いた。また増幅産物の生成量モニターは、インターカレーター法により蛍光強度として検出され、指数関数的にシグナルが上昇する閾値と増幅曲線が交わる点Ｃｔ値を算出した。Ｅ２Ｆ２のＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値と比較することで相対的なＥ２Ｆ２のｍＲＮＡの発現量を算定した。
ＩＩ．結果
ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、ＨｅＬａ細胞におけるＥ２Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡ発現は、Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２Ｐｙ−Ｉｍポリアミド単独、及びＭｙｃ−１とＭｙｃ−２を併用したＰｙ−Ｉｍポリアミドによって最もダウンレギュレートされた（図４）。
また、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果、Ｅ２Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールのＰｙ−Ｉｍポリアミド未添加ＨｅＬａ細胞でのＥ２Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量に比較して、Ｍｙｃ−１は９６．２％、Ｍｙｃ−２は９４．６％、Ｍｙｃ−１とＭｙｃ−２併用は、６４．８％、Ｍｙｃ−２とＭｙｃ−３併用は２１．７％、Ｍｙｃ−１とＭｙｃ−３併用は、１８．０％、それぞれ減少した。一方、Ｍｙｃ−３は、コントロールに比較して７４．１％、ネガティブコントロール（ミスマッチＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２）はコントロールに比較して３９．０％、それぞれｍＲＮＡの発現量を増加させた（図５）。Ｍｙｃ−３及びミスマッチＰｙ−Ｉｍ  Ｎｏ．９２以外の全てのＰｙ−Ｉｍポリアミド化合物によって、Ｅ２Ｆ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量が減少していることが分かった。【００５８】
６．５のまとめ
上記５の結果から、Ｍｙｃ−１、Ｍｙｃ−２単独又はそのＭｙｃ−１＋Ｍｙｃ−２の併用は、重要なｃ−ＭＹＣ下流遺伝子の一つであり、細胞増殖で重要な役割を担うことが証明されているＥ２Ｆ２遺伝子をダウンレギュレートすることが示された。【００５９】
７−１．形態学的分析（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
Ｉ．材料及び方法
テトラサイクリン制御型Ｃ−ＭＹＣ遺伝子を有するヒトＢ細胞リンパ腫Ｐ４９３−６細胞(ａ  ｇｉｆｔ  ｆｒｏｍ Ｃａｒｌａ Ｇｒａｎｄｏｒｉ， ＦＨＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ)１２０，０００細胞／１ウェルを６ウェルプレートで、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２４時間培養した。培地を交換し、１、５、１０μＭ濃度のＭｙｃ−４又はＭｙｃ−５を含む１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて７２時間培養した。培養３日目の細胞を位相差顕微鏡で観察し、デジタル画像として取り込んで解析に用い、細胞形態分析を行った。
ＩＩ．結果
Ｍｙｃ−５は、Ｐ４９３−６細胞の細胞増殖をダウンレギュレートした。図６に示されるＭｙｃ−５処理Ｐ４９３−６細胞の培養７２時間後の位相差顕微鏡写真から、Ｍｙｃ−５による細胞増殖阻害効果および細胞の形態変化は、Ｍｙｃ−５の添加濃度依存的におこることがわかった。一方、Ｍｙｃ−４は、Ｐ４９３−６細胞の増殖を阻害しなかった。【００６０】
７−２．形態学的分析（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
Ｉ．材料及び方法
Ｋ５６２細胞を未処置及び１０μＭ濃度のＭｙｃ−５で処置し、培養２日目の細胞を位相差顕微鏡で観察する以外は、７−１．と同様に行った。
ＩＩ．結果
図１８に示されるＭｙｃ−５処理Ｋ５６２細胞の培養４８時間後の位相差顕微鏡写真から、Ｍｙｃ−５は、Ｋ５６２細胞の細胞増殖をダウンレギュレートすることがわかった。【００６１】
７−３．
形態学的分析（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
Ｉ．材料及び方法
ＣＨＰ１３４細胞を未処置及び５μＭ濃度のＭｙｃ−２及びＭｙｃ−３で処置し、培養３目の細胞を位相差顕微鏡で観察する以外は、７−１．と同様に行った。
ＩＩ．結果
図２４に示されるＭｙｃ−２及びＭｙｃ−３処理ＣＨＰ１３４細胞の培養７２時間後の位相差顕微鏡写真から、Ｍｙｃ−２及びＭｙｃ−３は、ＣＨＰ１３４細胞の細胞増殖をダウンレギュレートすることがわかった。【００６２】
８．定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｍＲＮＡ発現の測定）
Ｉ．材料及び方法
（Ａ）ヒト子宮頸癌由来細胞株ＨｅＬａ細胞を、１ウェルに１２０，０００細胞となるよう６ウェルプレートに播種し、１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ変性Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）にて２４時間培養後、培地を交換し、５μＭ、１０μＭ濃度のＭｙｃ−４、Ｍｙｃ−５単独、又は５μＭ濃度のＭｙｃ−４＋Ｍｙｃ−５を併用したＰｙ−Ｉｍポリアミドを含む１０％子牛血清添加培地又はＰＩＰを含まない同様の培地で７２時間培養し、細胞を回収し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商品名）（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用し抽出、ＮａｎｏＤｒｏｐ社のｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒでＲＮＡ量を測定後、リアルタイムＰＣＲアッセイに供した。未処置のＨｅＬａ細胞をコントロールとした。内部標準ヒトベータアクチン（β−ａｃｔｉｎ）を使用した。ＭＹＣ下流遺伝子のｅＩＦ４Ｇ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＣＮＤ１遺伝子の定量は、β−アクチンの発現と比較することによって標準化した。
（Ｂ）テトラサイクリン制御型Ｃ−ＭＹＣ遺伝子を有するヒトＢ細胞リンパ腫Ｐ４９３−６細胞(ａ  ｇｉｆｔ  ｆｒｏｍ Ｃａｒｌａ Ｇｒａｎｄｏｒｉ， ＦＨＣ Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ)を、９６ウェルプレートに３，０００細胞／ウェルとして１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて２４時間培養、培地を交換し、ｃ-ＭＹＣ遺伝子の発現抑制は、０．１μｇ ｍｌ−１ を添加し、７２時間維持し誘導した。さらに、１、５、１０μＭ濃度のＭｙｃ−４又はＭｙｃ−５を含む１０％子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）下で１％ＰＳＧを含むそれぞれのＲＰＭＩ１６４０培地にて７２時間培養し、細胞を回収し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（商品名）（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用し抽出、ＮａｎｏＤｒｏｐ社のｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒでＲＮＡ量を測定後、リアルタイムＰＣＲアッセイに供した。内部標準ヒトベータアクチン（β−ａｃｔｉｎ）を使用した。また、未処置のＰ４９３−６細胞をコントロールとした。ＭＹＣ遺伝子、ＭＹＣ下流遺伝子のｅＩＦ４Ｇ１遺伝子、ＣＤＫ４遺伝子、ＣＣＮＤ１遺伝子の定量は、β−アクチンの発現と比較することによって標準化した。以下リアルタイムＰＣＲの詳細を示す。
リアルタイムＰＣＲアッセイは、ＴＡＫＡＲＡ  ＤＩＣＥ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ（商品名）（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．)を利用し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商品名）  ＲＴ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  Ｉ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）により逆転写反応を行い、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商品名）（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）を使用し、ＴＡＫＡＲＡ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｐｒｉｍｅｒより購入したＥ２Ｆ２及びＧＡＰＤＨプライマーを利用し、（初期変性）  ９５℃、２０秒（ＰＣＲ反応：２８サイクル）９４℃、２０秒、５５℃、２０秒、７２℃、２０秒の反応系によって行った。具体的なプライマーの塩基配列は、eＩＦ４Ｇ１センスプライマー（５’−ＣＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＡ−３’）（配列番号５）、eＩＦ４Ｇ１アンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴＡＡＧＧＴＣ−３’）（配列番号６）、ＭＹＣセンスプライマー（５’−ＴＡＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号７）、ＭＹＣアンチセンスプライマー（５’−ＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧ−３’）（配列番号８）、ＣＤＫ４センスプライマー（５’−ＣＡＴＣＧＴＴＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡ−３’）（配列番号９）、ＣＤＫ４アンチセンスプライマー（５’−ＣＣＡＡＣＡＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣ−３’）（配列番号１０）、ＣＣＮＤ１センスプライマー（５’−ＣＡＣＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴ−３’）（配列番号１１）、ＣＣＮＤ１アンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＡ−３’）（配列番号１２）、β−アクチンセンスプライマー（５’−ＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧ−３）（配列番号１３）及びβ−アクチンアンチセンスプライマー（５’−ＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＡＴＧＧＴＧＧＴ−３’）（配列番号１４）を用いた。また増幅産物の生成量モニターは、インターカレーター法により蛍光強度として検出され、指数関数的にシグナルが上昇する閾値と増幅曲線が交わる点Ｃｔ値を算出した。ＭＹＣ、ｅＩＦ４Ｇ１、ＣＤＫ４、及びＣＣＮＤ１のＣｔ値をＧＡＰＤＨのＣｔ値と比較することで相対的なＭＹＣ、ｅＩＦ４Ｇ１、ＣＤＫ４、及びＣＣＮＤ１のｍＲＮＡの発現量を算定した。
（Ｃ）ヒト慢性骨髄性白血病細胞由来細胞株Ｋ５６２細胞を３Ｘ１０５個を直径６００ mmのプラスティックディッシュに播種し、１μＭ、５μＭ、１０μＭ濃度のＭｙｃ−５又はミスマッチＢのＰｙ−Ｉｍポリアミドを添加し、３７°C、５％CO2条件にて７２時間培養した。付着性細胞は培養細胞トリプシンでディッシュから細胞を離脱着させた後、浮遊細胞は培養液を回収し、遠心２００Xgで遠心後の細胞ペレットをPBSで洗浄し、Qiagen社、RNeasy total RNA kitを用いてRNA抽出をおこなった。抽出したRNAの濃度はNanoDropを用いて紫外線吸光度を測定した。精製したRNA1μgをTAKARA社のPrimeScript TM RT regent kitを用いてcDNA化し、SYBER premix EX Taq kitを用いて定量的PCRを行った。反応はThermal Cycler Dice TM Real TimeSystem TP800を用いて９５°C２分、９４℃２０秒―５５℃２０秒―７２℃２０秒を４０サイクル実施した。使用したポリアミドの認識配列をその遺伝子発現制御領域にもたない遺伝子GAPDHおよびβアクチンの遺伝子の発現量を内部標準としＭＹＣ、 eIF4G1、CDK4、CCND1 、ＭＤＭ２、及びｐ５３遺伝子の各発現量を表に示すプライマーを用いて測定をおこなった。具体的なプライマーの塩基配列は、eＩＦ４Ｇ１センスプライマー（５’−ＣＴＣＡＴＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＴＧＣＴＡ−３’）（配列番号５）、eＩＦ４Ｇ１アンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴＡＡＧＧＴＣ−３’）（配列番号６）、ＭＹＣセンスプライマー（５’−ＴＡＣＣＣＴＣＴＣＡＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号７）、ＭＹＣアンチセンスプライマー（５’−ＴＣＴＴＧＡＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧ−３’）（配列番号８）、ＣＤＫ４センスプライマー（５’−ＣＡＴＣＧＴＴＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＧＡ−３’）（配列番号９）、ＣＤＫ４アンチセンスプライマー（５’−ＣＣＡＡＣＡＣＴＣＣＡＣＡＴＧＴＣＣＡＣ−３’）（配列番号１０）、ＣＣＮＤ１センスプライマー（５’−ＣＡＣＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＴ−３’）（配列番号１１）、ＣＣＮＤ１アンチセンスプライマー（５’−ＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧＴＴＣＡＡＴＧＡ−３’）（配列番号１２）、β−アクチンセンスプライマー（５’−ＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧＧＡＧ−３）（配列番号１３）、β−アクチンアンチセンスプライマー（５’−ＡＴＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＡＴＧＧＴＧＧＴ−３’）（配列番号１４）、ＧＡＰＤＨセンスプライマー（５’−ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３）（配列番号３、ＨＡ０６７８１２−Ｆ）、ＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー（５’−ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ−３’）（配列番号４、ＨＡ０６８１２−Ｒ）、ＭＤＭ２フォワードプライマー（５’−ＴＧＣＡＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＣＴＡ−３’）（配列番号２１）、ＭＤＭ２リバースプライマー（５‘−ＣＧＴＴＴＧＧＴＣＴＡＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣ−３’）（配列番号２２）、ｐ５３フォワードプライマー（５’−ＡＧＴＣＡＧＡＴＣＣＴＡＧＣＧＴＣＧＡＧ−３’）（配列番号２３）、及びｐ５３リバースプライマー（５‘−ＴＧＴＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧ−３’）（配列番号２４）を用いた。【００６３】
ＩＩ．結果
ＨｅＬａ細胞において、ｅＩＦ４Ｇ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールのｅＩＦ４Ｇ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に比較して、Ｍｙｃ−５、５μＭで９５．２％、Ｍｙｃ−５、１０μＭで９９．５％減少し、またＰ４９３−６細胞において、ｅＩＦ４Ｇ１遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、コントロールのｅＩＦ４Ｇ１遺伝子のｍＲＮＡ発現量に比較して、Ｍｙｃ−５、１μＭで２３．９％、Ｍｙｃ−５、５μＭで３５．８％、Ｍｙｃ−５、１０μＭで９３．３％減少した。すなわちＭｙｃ−５は、ＨｅＬａ細胞及びＰ４９３−６細胞において濃度依存的にｅＩＦ４Ｇ１遺伝子の発現量をダウンレギュレートした。また、Ｍｙｃ−５は、ＨｅＬａ細胞においてサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）遺伝子の発現を濃度依存的に減少させたが（Ｍｙｃ−５、５μＭで対コントロール９５．１％減少、Ｍｙｃ−５、１０μＭで対コントロール９５．６％減少、）、一方Ｐ４９３−６細胞においては逆の反応を示した（Ｍｙｃ−５、１μＭで対コントロール５６．７％減少、Ｍｙｃ−５、５μＭで対コントロール６４．８％増加、Ｍｙｃ−５、１０μＭで対コントロール４６．７％増加）。Ｋ５６２細胞においても、Ｍｙｃ−５により、ｅＩＦ４Ｇ１遺伝子、ＣＣＮＤ１遺伝子の発現が抑制された。一方、ＣＤＫ４遺伝子の発現は、いずれの細胞においてもＭｙｃ−４及び／又はＭｙｃ−５により影響を受けなかった（図７−Ａ、図７−Ｂ、図７−Ｃ）。ｅＩＦ４Ｇ１遺伝子とＣＣＮＤ１遺伝子はその上流プロモータ領域にＥ−ＢＯＸ配列がひとつでありＭｙｃ−５により認識される。一方、ＣＤＫ４遺伝子はそのプロモータ領域に４つのＥ−ＢＯＸを有するが、ＣＤＫ４遺伝子の４つのＥ−ＢＯＸ配列のうちの１つ（図１９のＥ−Ｂｏｘ２）のみがＭｙｃ−５により認識される（図１９）。つまり、このＥ−Ｂｏｘ２だけでのＭＹＣタンパク質結合阻害では、発現には影響を及ぼせなかったと考えられ、他のＥ−ＢＯＸ領域（図１９のＥ  Ｂｏｘ１、Ｅ  Ｂｏｘ３、Ｅ  Ｂｏｘ４）がＭｙｃ化合物により認識されることでＣＤＫ−４遺伝子の発現調節が可能であったと考えられる。以上の結果から、Ｍｙｃ−５が、Ｍｙｃ下流遺伝子ｅＩＦ４Ｇ１の発現をＰ４９３−６細胞、ＨｅＬa細胞及びＫ５６２細胞においてダウンレギュレートすること、及びＣＣＮＤ１遺伝子の発現をＨｅＬa細胞及びＫ５６２細胞においてダウンレギュレートすることが示された。
また、Ｍｙｃ−２はＫ５６２細胞のＭＤＭ２遺伝子発現をダウンレギュレートすること及びｐ５３遺伝子発現をアップレギュレートすることが示された（図７−Ｄ）。ＭＤＭ２は癌抑制遺伝子のｐ５３遺伝子をコントロールする遺伝子であり、上記Ｍｙｃ−２によるＭＤＭ２遺伝子発現抑制は、ｐ５３遺伝子のアップレギュレーションによるものと考えられる。【００６４】
９．ウエスタンブロッティング分析(タンパク質の測定)
Ｉ．材料及び方法
Ｋ５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞）を１０％牛胎児血清含有RPMI１６４０（ナカライテスク社）培地にて３７°C、５％CO２培養器内にて維持、培養をおこなった。Ｋ５６２細胞を３X105個を１、５、１０ uM  Myc−５ポリアミドまたはミスマッチＢポリアミドを含有する培地およびそれらのポリアミドを加えていない培養液（コントロール）にて７２時間培養後した。培養後の細胞を２，５００  X  g にて１０分間遠心後、細胞ペレットをPBS溶液で洗浄後、１００μlの４°CのM-PER  Mammalian Protein Extraction Reagent （Thermo Scientific Inc. Rockford, IL, USA）に溶解させ１０分間氷上に放置後、１４，０００  X  gにて１５分間遠心した。遠心後に得られた上清の細胞濃度をBio-Rad Protein Assay kit（Bio-Rad）をもちいて既知濃度のBSA蛋白質測定値を標準検量線とし、得られた細胞溶解液中の蛋白質濃度の測定をおこなった。細胞溶解液を３３X  Laemmle sample buffer (WaKo純薬)と１：２の比率で混ぜ、９５°C  にて５分間処理後、４０μg相当蛋白質を含む反応液を１２．５％SDS-ポリアクリルアミドゲルに電気泳動をおこなった。電気泳動後のゲル中の蛋白質を電気転写装置i-blot（Ｉnvitrogen）を用いてPVDF膜に転写したものを５％スキムミルク溶液１時間浸し、PBS溶液で１０分間洗浄。抗サイクリンD１（ＣＣＮＤ１）抗体（sc 246 サンタクルツ社Lot #D２１０８）、抗eIF4G抗体（L-22, sc100730サンタクルツ社Lot#１６０９）、抗CDK４抗体（sc-５３６３６サンタクルツ社Lot #D０５０７）および抗βアクチン抗体（シグマ社A５４４１）各希釈液を転写PVDF膜に１時間浸し、PBS溶液で１０分間の洗浄を３回繰り返した後、ペルオキシダーゼ重合抗マウスIgG抗体希釈液に転写PVDF膜を１時間浸した。PBS溶液で１０分間の洗浄を３回繰り返した後ECL（アマシャムファルマシア社）検出液に転写PVDF膜をひたし、発光をLAS-４０００（フジフィルム社）を用いて検出した。
ＩＩ．結果
本発明のポリアミドがＣＣＮＤ１、ｅＩＦ４Ｇ、ＣＤＫ遺伝子の３タンパク質発現を抑制するかを調べるために、ウエスタンブロッティング分析を行った。１μＭ、５μＭ、１０μＭ濃度のＭｙｃ−５ポリアミドによる３日間のインキュベーション後、ＣＣＮＤ１及びｅＩＦ４Ｇのタンパク質発現は濃度依存性に減少したが、ＣＤＫ４タンパク質発現はＭｙｃ−５の影響を受けなかった。ミスマッチＢポリアミド投与はコントロールと同じ結果であった（図２０）。また内部標準として用いたβアクチンは全てのサンプルでほぼ同等の蛋白量を示した。【００６５】
１０．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける蛍光標識ＰＩＰの分布
Ｉ．材料及び方法
（Ａ）ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳がん由来細胞）は、６ウェルプレートの各ウェルに３X10４個となるよう播種した。２ｍｌの１０％ＦＢＳ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて３７℃、５％、ＣＯ２で培養した。培養２４時間後、ＭＣＦ−７細胞に蛍光標識ＦＩＴＣ結合Ｍｙｃ−５を最終濃度５μＭで成長培地に添加し２時間培養した。細胞は洗浄しＦＢＳフリー培地を添加した。あらかじめ決められた時間において、生存細胞を×２０の倍率で観察し４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３４２（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって染色し、再度観察した。
（Ｂ）ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸がん由来細胞）６ウェルプレートの各ウェルに３X10４個となるよう播種した。２ｍｌの１０％ＦＢＳ（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて３７℃、５％、ＣＯ２で培養した。培養２４時間後、ＨｅＬａ細胞に蛍光標識ＦＩＴＣ結合Ｍｙｃ−５を最終濃度５μＭで成長培地に添加し２時間培養した。細胞は洗浄しＦＢＳフリー培地を添加した。あらかじめ決められた時間において、生存細胞を×２０の倍率で観察し４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。核はＨｏｅｃｈｓｔ３３４２（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって染色し、再度観察した。
ＩＩ．結果
ＦＩＴＣ結合Ｍｙｃ−５は、ＭＣＦ−７細胞を培養している成長培地に添加された３０分後すべての細胞で核での局在が観察された。添加から２時間後であってもＦＩＴＣ結合Ｍｙｃ−５は、ＭＣＦ−７細胞及びＨｅＬａ細胞の核に安定に存在することが確認された（図２１、２２）。【００６６】
１１．ゲルシフトアッセイ（Ｅｌｅｃｔｒｏｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ  （ＥＭＳＡ））
Ｉ．材料及び方法
ｅＩＦ４Ｇ遺伝子プロモータ領域のＥ−ＢＯＸ配列周辺の配列を持つ蛍光色素Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ ｉｓｏｍｅｒ−Ｉ  （ＦＩＴＣ）でラベルしたヘアピン型オリゴヌクレオチド  （５’−ＦＩＴＣ−ＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＣＧＧＧＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧＣＣＡ−３’）（配列番号１５）を合成し、アニーリングして、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子プロモータ領域のＥ−ＢＯＸ配列周辺の配列に対応する二本鎖オリゴヌクレオチドとした。２塩基変異を有するｅＩＦ４ＧオリゴＤＮＡ（ミスマッチ−１）（５’−ＦＩＴＣ−ＴＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＧＧＧＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＣＣＣＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＣＡ−３’）（配列番号１６）を同様に合成し、ｅＩＦ４Ｇ遺伝子プロモータ領域のＥ−ＢＯＸ配列周辺の配列と２塩基変異を有する変異ｅＩＦ４Ｇ二本鎖オリゴヌクレオチドとした。また一本鎖ＤＮＡとして（５’−ＦＩＴＣ−ＡＴＧＧＡＡＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＣＧＧＧＧＴ−３’）（配列番号１７）を用いた。ミスマッチポリアミドとして5’-ＷＣＷＧＣＷＧＷ-3’ (ここでＷはＡ又はＴ)を認識するＮｏ．１２０ポリアミド（ミスマッチＢ）を使用した。３７℃で１５分間、結合緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ  ＤＴＴ、１００ｍＭ  ＫＣｌ）中で５０μＭのＭｙｃ−５Ｐｙ−Ｉｍポリアミド又はミスマッチポリアミドと、１μＭのｅＩＦ４Ｇ二本鎖ＤＮＡ又は変異ｅＩＦ４Ｇ二本鎖ＤＮＡともに３７度で１時間インキュベートした。得られた複合体を２０％ポリアクリルアミドゲルにより電気泳動し、蛍光標識二本鎖オリゴヌクレオチドの移動度を蛍光イメージ解析機ＬＡＳ  ３０００（商品名）（フジフィルム  東京）で解析した。
ＩＩ．結果
合成Ｐｙ−ＩｍポリアミドＭｙｃ−５の標的二本鎖オリゴヌクレオチドへの結合
ゲルシフトアッセイによりＭｙｃ−５の標的配列への結合を検討した。ピロールイミダゾールポリアミドの標的配列であるｅＩＦ４Ｇ遺伝子プロモータ領域のＥ−ＢＯＸ配列周辺配列を含む二本鎖ＤＮＡに結合したＭｙｃ−５ピロールイミダゾールポリアミド（レーン３）は、二本鎖ＤＮＡ（レーン２）と比べ泳動度が低下し、高分子化したことが示唆されるバンドが上部に認められた、ところが２塩基の変異配列を有する二本鎖ＤＮＡとＭｙｃ−５ではバンドの移動は認められなかった（レーン４）。またミスマッチポリアミドＮｏ．１２０とｅＩＦ４Ｇ二本鎖ＤＮＡでもバンドの移動は認められなかった（レーン５）。結果を図８に示す。このことは、Ｍｙｃ−５が、標的と考えられる二本鎖ＤＮＡ配列を認識し結合したことを示す。【００６７】
１２．クロマチン免疫沈降アッセイ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ）
Ｉ．材料及び方法
ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞Ｋ５６２細胞を３ｘ １０６個播種し、１０μＭ濃度のＭｙｃ-５とともに７２時間培養した。クロマチン免疫沈降アッセイをUpstate Biotechnology’s Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kitを用いて行った。７２時間培養したＫ５６２細胞に最終濃度が１％になるようにホルマリンを加え、３７℃で１０分間静置して細胞を固定した。これにより、細胞内でタンパク質・ＤＮＡがクロスリンクされる。次に、最終濃度が0.25Mとなるようグリシンを添加し、上清を取り除き、細胞層を洗浄した。次に、細胞層に220μlのlysis Bufferを添加し、スクレーパーを用いて細胞溶解液を回収した。得られた細胞溶解液を４℃の水中にひたしながら、BIORUPTOR (SANYO)を用いて細胞溶解液中の細胞を破砕した（強度をHとし、３０秒のソニケーションと１分間の停止を１サイクルとし、これを１０回繰り返した）。次に、１５０００xgで４℃にて１０分間の冷却遠心を行い、その上清200 μlに、1800μlのDilution Bufferと25μlのProtein A sepharoseを加え、４℃で３０分間の回転混和を行い、非特異的な結合を取り除いた。次に、１０００xgで１分間の遠心を行った後、その上清400μlに抗体２μg、抗ＭＹＣ抗体（サンタクルーズ）、抗IgG抗体 (ネガティブコントロール) または抗RNA polymearse抗体 (ポジティブコントロール) を混和し、４℃で１２時間の回転混和を行った。その後、40μlのprotein sepharoseを加え、４℃で１時間の回転混和を行い、１０００xgにて１分間の遠心を行うことでsepharoseを沈殿させた。沈殿物を添付のLOW bufferで洗浄後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを沈降させた。沈降sepharoseをHigh Bufferで洗浄後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを再び沈降させた。沈降sepharoseをLiCl2 Bufferで洗浄後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを再び沈降させた。沈降sepharoseをＴＥで洗浄後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを再び沈降させた。次に、sepharoseを250μlの0.1M NaHCO3−1% SDS溶液に懸濁し、その１５分後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを再び沈降させた。上清を分取した後、再度、沈降したsepharoseを250μlの0.1M NaHCO3−1% SDS溶液に懸濁し、その１５分後、１０００xgにて１分間の遠心を行い、sepharoseを沈降させた。合計500μlの溶出液を回収し、最終濃度が200mMとなるようにNaClを加えて、６５℃にて４時間の処理を行った。次に、最終濃度20ng/μlのプロテアーゼKにより、４５℃にて１時間の処理を行った。さらに、フェノール・クロロホルム抽出の後、エタノール沈殿法を行うことによりDNAを精製した。次に精製したDNAを用いて、ＰＣＲ法により目的のゲノム領域の増幅を行った。ＰＣＲ法は前記「８．定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ」に記載の方法と同様に行った。具体的には、精製ＤＮＡを、ＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ Ｔａｑ(ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ、 滋賀)を用いて、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ‐８００(ＴＡＫＡＲＡ ＢＩＯ、 滋賀)により、定量的に解析した。この時、ｅＩＦ４Ｇ１遺伝子に加えＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマーセット、フォワード：5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG -3’（配列番号２５）、リバース：5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA -3’（配列番号２６）を用い非特異的なＤＮＡの免疫沈降がないかを確認した。ｅＩＦ４Ｇ１プロモータのＥ−ＢＯＸ結合領域周辺プライマーは、ｅＩＦ４Ｇ１の始発ＡＴＧコドンより-1092 to -8645の領域を増幅するフォワード：5'-GAATCGGTCTGGGAGTTTCA-3'（配列番号２７）と リバース：5'-CACAGACGTAGTCCACAACCA-3'（配列番号２８）を用いた定量的ＰＣＲにより分析した。同領域にｅＩＦ４Ｇ１の結合があるかは、インプットのＤＮＡとの相対的なコピー数相対頻度で計測した。
ＩＩ．結果
Ｍｙｃ−５はＭＹＣ蛋白がｅＩＦ４Ｇ１遺伝子プロモータ領域のＥ−ＢＯＸ領域に結合することを阻害し、抗ＭＹＣ抗体によるｅＩＦ４Ｇ１遺伝子プロモータ領域の共沈を抑制した。このことでｅＩＦ４Ｇ１遺伝子の発現を抑えることが示唆された（図２３）。【００６８】
１３．カスパーゼ３活性アッセイ
Ｉ．材料及び方法
ヒト慢性骨髄性白血病由来細胞Ｋ５６２細胞において１０ｎＭ、５００ｎＭ濃度のＭｙｃ―２、及び１μＭ、１０μＭ濃度のＭｙｃ-５のカスパーゼ３活性効果をコントロールおよびポジティブコントロールと比較した。カスパーゼ３活性の測定には、colorimetric caspase-3 assay kit (Sigma)キットを使用した。Ｋ５６２細胞を３ｘ１０６個となるように播種し、Ｍｙｃ−２、Ｍｙｃ−５は指定の最終濃度となるよう培地に加え１０％牛胎児血清含有RPMI１６４０（ナカライテスク社）培地にて３７°C、５％CO２培養器内にて72時間培養をおこなった。細胞を回収し、１００マイクロリットル溶解液(50 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM CHAPS, 5 mM DTT)に細胞が１０７個となるよう調整し、氷上で２０分維持後、20,000Xg 、4°Cで 20分遠心し、上澄を９６プレートに分取し、１００マイクロリッターの反応液と新鮮に調整した１０マイクロリッターのＤＴＴを加え、５マイクロリッターのカスパーゼ３の標的となるacetyl- Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilineを含む液を加え３７度でオーバーナイトで反応した。４０５ナノメータの吸光をプレートリーダで測定し、カスパーゼ３活性の測定を行った。
ＩＩ．結果
Ｋ５６２細胞にＭｙｃ−２及びＭｙｃ-５を１０マイクロモルを添加するとカスパーゼ−３の活性が見られ、Ｍｙｃ−５で特に顕著な上昇を示したが、ポジティブコントロールのＪｕｒｋａｔ細胞への細胞死の誘導にくらべ、５０％以下に留まった（図２７）。Ｋ５６２細胞は、Ｍｙｃ-５で細胞増殖抑制が強く認められたが、カスパーゼ３の誘導より、細胞死を誘導している可能性が強く示唆された。【００６９】
１４．統計解析
結果は平均値±標準誤差（ＳＥ）で表現した。平均値間の差の有意性は、２群間比較はStudentのt検定、多重比較検定はＡＮＯＶＡ  及びＴｕｒｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ法により評価した。少なくとも０．０５未満のｐ値を有意であると判定した。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明により、Ｅ−ＢＯＸの遺伝子配列を利用して、その配列を調節領域として持つ遺伝子の発現を特異的に調節することができると考えられ、従来の化学療法剤とは機序が異なることより、従来の化学療法剤の副作用（白血球の減少、吐き気、嘔吐等）を理論的に回避できると考えられる。また本発明は、化合物であるのでリボヌクレアーゼにより分解されるという欠点もない、ＭＹＣ下流遺伝子発現調節のための薬剤、ＭＹＣ遺伝子関連疾患の治療のための薬剤及び抗悪性腫瘍剤、幹細胞の誘導等の細胞分化誘導剤として利用できる。さらに、本発明によれば、ＭＹＣ下流遺伝子の標的又は標的群を決定することができる。そしてさらに、本発明による化合物の選択的な調節効果により、分子生物学的研究や薬剤開発研究に使用する機能検査試薬を得ることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７１】
配列番号１  Ｅ２Ｆ２センスプライマー
配列番号２  Ｅ２Ｆ２アンチセンスプライマー
配列番号３  ＧＡＰＤＨセンスプライマー
配列番号４  ＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー
配列番号５  ｅＩＦ４Ｇ１センスプライマー
配列番号６  ｅＩＦ４Ｇ１アンチセンスプライマー
配列番号７  ＭＹＣセンスプライマー
配列番号８  ＭＹＣアンチセンスプライマー
配列番号９  ＣＤＫ４センスプライマー
配列番号１０  ＣＤＫ４アンチセンスプライマー
配列番号１１  ＣＣＮＤ１センスプライマー
配列番号１２  ＣＣＮＤ１アンチセンスプライマー
配列番号１３  β−アクチンセンスプライマー
配列番号１４  β−アクチンアンチセンスプライマー
配列番号１５  ｅＩＦ４Ｇ遺伝子プロモータオリゴヌクレオチド
配列番号１６  変異ｅＩＦ４Ｇ遺伝子プロモータオリゴヌクレオチド
配列番号１７  一本鎖ＤＮＡ
配列番号１８  ヒトＣＣＮＤ１遺伝子のプロモータ領域
配列番号１９  ヒトｅＩＦ４Ｇ１遺伝子のプロモータ領域
配列番号２０  ヒトＣＤＫ４遺伝子のプロモータ領域
配列番号２１  ＭＤＭ２フォワードプライマー
配列番号２２  ＭＤＭ２リバースプライマー−
配列番号２３  ｐ５３フォワードプライマー
配列番号２４  ｐ５３リバースプライマー
配列番号２５  ＧＡＰＤＨゲノムフォワードプライマー
配列番号２６  ＧＡＰＤＨゲノムリバースプライマー
配列番号２７  ｅＩＦ４Ｇ１ゲノムフォワードプライマー
配列番号２８  ｅＩＦ４Ｇ１ゲノムリバースプライマー
【図１】
0005520931.tif 000031
【図２】
0005520931.tif 000032
【図３】
0005520931.tif 000033
【図４】
0005520931.tif 000034
【図５】
0005520931.tif 000035
【図６】
0005520931.tif 000036
【図７−Ａ】
0005520931.tif 000037
【図７−Ｂ】
0005520931.tif 000038
【図７−Ｃ】
0005520931.tif 000039
【図７−Ｄ】
0005520931.tif 000040
【図８】
0005520931.tif 000041
【図９】
0005520931.tif 000042
【図１０】
0005520931.tif 000043
【図１１】
0005520931.tif 000044
【図１２】
0005520931.tif 000045
【図１３】
0005520931.tif 000046
【図１４】
0005520931.tif 000047
【図１５−Ａ】
0005520931.tif 000048
【図１５−Ｂ】
0005520931.tif 000049
【図１６】
0005520931.tif 000050
【図１７】
0005520931.tif 000051
【図１８】
0005520931.tif 000052
【図１９】
0005520931.tif 000053
【図２０】
0005520931.tif 000054
【図２１】
0005520931.tif 000055
【図２２】
0005520931.tif 000056
【図２３】
0005520931.tif 000057
【図２４】
0005520931.tif 000058
【図２５】
0005520931.tif 000059
【図２６】
0005520931.tif 000060
【図２７】
0005520931.tif 000061
【配列表】
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