(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｏｖｒ１１０との結合について参照抗体と競合し、該参照抗体またはその抗原結合フラグメントが
（ａ）配列番号２、１２、２２、３２および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および
（ｂ）配列番号７、１７、２７、３７および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含み、ここで軽鎖可変領域が配列番号２、１２、２２、３２または４２のアミノ酸配列を含む場合、重鎖可変領域が配列番号７、１７、２７、３７または４７のアミノ酸配列をそれぞれ含む、前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
Ｏｖｒ１１０と結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって：
（ａ）配列番号３、１３、２３、３３および４３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号４、１４、２４、３４および４４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号５、１５、２５、３５および４５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号８、１８、２８、３８および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号９、１９、２９、３９および４９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号１０、２０、３０、４０および５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域ＣＤＲ３、
を含み、ここで軽鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号３、１３、２３、３３または４３のアミノ酸配列を含む場合、軽鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号４、１４、２４、３４または４４のアミノ酸配列、軽鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号５、１５、２５、３５または４５のアミノ酸配列、重鎖可変領域ＣＤＲ１が配列番号８、１８、２８、３８または４８のアミノ酸配列、重鎖可変領域ＣＤＲ２が配列番号９、１９、２９、３９または４９のアミノ酸配列、および重鎖可変領域ＣＤＲ３が配列番号１０、２０、３０、４０または５０のアミノ酸配列をそれぞれ含む、前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
請求項３に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメントと、Ｏｖｒ１１０との結合について競合する抗体。
【請求項５】
抗体が、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
Ｏｖｒ１１０の機能を阻害する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントであって、Ｏｖｒ１１０の機能が、Ｏｖｒ１１０発現細胞に対する免疫反応の抑制である、前記抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
Ｏｖｒ１１０の免疫反応の抑制が、リンパ球制御を介する、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
リンパ球制御が、Ｔ細胞の活性化、Ｂ細胞の活性化、ＮＫ細胞の活性化、Ｔ細胞の増殖、Ｂ細胞の増殖、ＮＫ細胞の増殖、Ｔ細胞の腫瘍への浸潤、Ｂ細胞の腫瘍への浸潤およびＮＫ細胞の腫瘍への浸潤からなる群から選択される、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１０】
細胞毒性剤と抱合した請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、免疫抱合体。
【請求項１１】
細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体および核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項１０に記載の免疫抱合体。
【請求項１２】
毒素が、リシン、サポリン、マイタンシノイドおよびカリチアマイシンからなる群から選択される、請求項１１に記載の免疫抱合体。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の免疫抱合体、および薬学的に許容し得る担体を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１５】
（ａ）配列番号１、１１、２１、３１および４１からなる群から選択される軽鎖可変領域をコードする核酸配列；および
（ｂ）配列番号６、１６、２６、３６および４６からなる群から選択される重鎖可変領域をコードする核酸配列、
を含み、ここで軽鎖可変領域をコードする核酸配列が配列番号１、１１、２１、３１または４１の核酸配列を含む場合、重鎖可変領域をコードする核酸配列が配列番号６、１６、２６、３６または４６の核酸配列をそれぞれ含む、請求項１４に記載の単離された核酸分子。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する、細胞。
【請求項１９】
Ｏｖｒ１１０を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害するための、請求項９または１３に記載の組成物。
【請求項２０】
哺乳動物においてＯｖｒ１１０発現性癌を軽減するための、請求項９または１３に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｏｖｒ１１０発現性癌が、卵巣癌、子宮癌、腎臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌および頭頸部癌からなる群から選択される、請求項１９または２０に記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも一つの化学療法薬剤と組み合わせて投与される、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
化学療法薬剤が、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｏｖｒ１１０発現性腫瘍細胞に対する免疫応答の抑制を阻害するための、請求項９または１３に記載の組成物。
【請求項２５】
免疫応答が、Ｔ細胞の活性化、Ｂ細胞の活性化、ＮＫ細胞の活性化、Ｔ細胞の増殖、Ｂ細胞の増殖、ＮＫ細胞の増殖、Ｔ細胞の腫瘍への浸潤、Ｂ細胞の腫瘍への浸潤、ＮＫ細胞の腫瘍への浸潤からなる群から選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
哺乳動物中の腫瘍の増殖を阻害するための、請求項９または１３に記載の組成物。
【請求項２７】
対象におけるＯｖｒ１１０の過剰発現を検出するin vitro方法であって：
（ａ）対象からのサンプルを、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、結合に適した条件下で接触させること；
（ｂ）サンプル中のＯｖｒ１１０のレベルを決定すること；および
（ｃ）サンプル中のＯｖｒ１１０のレベルと、コントロールまたは通常の範囲中のＯｖｒ１１０のレベルとを比較すること；
を含み、コントロールまたは通常の範囲と比較して、対象からのサンプル中のＯｖｒ１１０のレベルの増加が、Ｏｖｒ１１０の過剰発現の指標となる、前記方法。
【請求項２８】
サンプルが、血液、血清、血漿、腹水、尿、腹腔洗浄液および組織を含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
対象が、卵巣癌、子宮癌、腎臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌および頭頸部癌からなる群から選択される癌を有している、請求項２７または２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この特許出願は、２００６年１１月２７日出願の米国仮出願第６０／８６１，６５７号の優先権を主張するものであり、その教示は全て、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗Ｏｖｒ１１０抗体組成物およびＯｖｒ１１０発現性の卵巣、膀胱、腎臓、膵臓、肺、胸部または頭頸部の癌細胞を殺すための方法に関する。さらに、本発明は、ヒトの腫瘍を抗Ｏｖｒ１１０抗体によって治療するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
卵巣癌
卵巣の癌は、米国女性の癌による死亡の４番目によくある原因であり、２００１年には、２３，０００件以上の新たな症例および大体１４，０００件の死亡が推定された（Shridhar, V. et al., Cancer Res. 61(15): 5895-904 (2001)；Memarzadeh, S. & Berek, J.S., J. Reprod. Med. 46(7): 621-29 (2001)）。米国癌協会（ＡＣＳ）は、２００４年には卵巣癌の新たな症例は約２５，５８０件となり、アメリカにおいて卵巣癌が１６，０９０件の死亡の原因となるだろうと見積もっている（ＡＣＳウェブサイト：ワールドワイドウェブのcancer with the extension .org）。
【０００４】
卵巣癌による１年間の女性の死亡数は、その他の婦人科悪性腫瘍を全て合わせた死亡数より多い。米国における卵巣癌の発生率は、1年間に女性１００，０００人当たり１４．２件と推定され、卵巣癌によって毎年１００，０００人当たり９人の女性が死亡する。２００４年には、新たな診断のうち約７０〜７５％が、推定５年生存率が約１５％であるステージＩＩＩおよびＩＶの癌腫であると考えられる（Jemal et al., Annual Report to the Nation on the Status of Cancer, 1975-2001, with a Special Feature Regarding Survival. Cancer 2004; 101: 3-27）。
【０００５】
卵巣癌の発症率は世界的に重大な関心事であり、毎年１９１，０００件と推定される新たな症例が予測される（Runnebaum, I. B. and Stickeler, E., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127(2): 73-79 (2001)）。不運なことに、卵巣癌を有する女性は、典型的に、疾患が転移するまで無症候性である。卵巣癌についての有効なスクリーニングが利用可能ではないため、診断された女性の約７０％が、５年生存率が約２５〜３０％である進行したステージの癌を有する（Memarzadeh, S. & Berek, J. S.、上記；Nunns, D. et al., Obstet. Gynecol. Surv. 55(12): 746-51）。逆に、初期のステージの卵巣癌を有すると診断された女性は、顕著により高い生存率を享受している（Werness, B. A. & Eltabbakh, G. H., Int'l. J. Gynecol. Pathol. 20(1): 48-63 (2001)）。
【０００６】
卵巣癌の病因についての我々の理解は不完全であるが、この領域における大規模な研究の結果は、年齢、遺伝的特徴、生殖的および食事性／環境的要因の組み合わせを指摘している。年齢は、卵巣癌の発生における重要な危険因子である：３０歳前に卵巣癌を発症する危険性は低いが、卵巣癌の発症率は、３０〜５０歳の間に直線的に上昇し、その後はより遅い速度で上昇し、発症率が最高であるのは、７０歳代の女性である（Jeanne M. Schilder et al., Hereditary Ovarian Cancer:  Clinical Syndromes and Management, in Ovarian Cancer 182 (Stephen C. Rubin and Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)）。
【０００７】
遺伝的要因に関して、卵巣癌の家族履歴は、当該疾患の発症における最も重要な危険因子であり、その危険性は、罹患した家族の成員の数、その成員の該女性に対する親等、どの特定の一親等の近親者が当該疾患を罹患するかに依存する（同文献）。いくつかの遺伝子における突然変異が卵巣癌に関連しており、これには、両者共に乳癌の発症において重要な作用を奏しているＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２、ならびに両者共に遺伝性非ポリープ症結腸癌と関連しているｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１が含まれる（Katherine Y. Look, Epidemiology, Etiology, and Screening of Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 169, 171-73 (Stephen C. Rubin and Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)）。
【０００８】
染色体１７上に位置するＢＲＣＡ１および染色体１３上に位置するＢＲＣＡ２は、ＤＮＡ修復に関係する腫瘍抑制遺伝子であり；これらの遺伝子における突然変異は、卵巣癌の約１０％と関連する（同文献171-72；上記Schilder et al.、185-186）。ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１は、ＤＮＡミスマッチ修復に関連し、それぞれ染色体２および３上に位置する；遺伝性卵巣癌腫の約３％は、これらの遺伝子における突然変異のためであると報告されている（上記Look、173；上記Schilder et al.、184, 188-89）。
【０００９】
生殖的要因もまた、卵巣癌の危険性の増加または低下と関連している。遅い閉経、未産婦および早い年齢の初経は、すべて、卵巣癌の危険性の増大と関連している（上記Schilder et al.、182）。ある理論の仮説によれば、これらの因子により女性の一生の経過にわたる排卵サイクルの数が増大し、「絶え間のない排卵」がもたらされるとし、これは、卵巣上皮に対する突然変異の主要な原因であると考えられる（同文献；Laura J. Havrilesky and Andrew Berchuck, Molecular Alterations in Sporadic Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 25 (Stephen C. Rubin and Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)）。
【００１０】
突然変異は、排卵がその上皮の破壊および修復をもたらし、細胞分裂の増加が必要となり、これにより、検出されない突然変異が生じる可能性が増加するという事実によって説明することができる（同文献）。この理論についての支持は、妊娠、授乳および経口避妊薬の使用は、すべて排卵を抑制するが、これらは卵巣癌の発生に関する防御効果を付与するという事実において見出すことができる（同文献）。
【００１１】
食事性／環境的要因の中で、動物性脂肪または赤肉の多量の摂取と卵巣癌との間に関連があると見られる一方、酸化防止剤のビタミンＡは、遊離基形成を防止し、また正常な細胞分化を維持するのを補助し、防御効果を提供し得る（上記Look、169）。報告はまた、アスベストおよび含水三ケイ酸マグネシウム（タルク）を、卵巣癌と関連付けており、この後者は、ペッサリーおよび生理用ナプキンに存在し得る（同文献169-70）。
【００１２】
卵巣癌についての現在のスクリーニング手順は、一定の有用性を示す一方で、その診断能力において極めて限定されており、このことは、疾患が典型的にまだ無症候性であるが最も容易に対処される癌進行の初期ステージにおいて、特に深刻な問題である（Walter J. Burdette, Cancer: Etiology, Diagnosis, and Treatment 166 (1998);上記Memarzadeh & Berek；上記Runnebaum & Stickeler；上記Werness & Eltabbakh）。一般的に用いられているスクリーニング試験には、年２回の直腸膣内診、ＣＡ−１２５血清腫瘍マーカーを検出するためのラジオイムノアッセイ、および経膣超音波検査が含まれる（上記Burdette、166）。
【００１３】
現在、ＣＡ−１２５は、卵巣癌において用いられる唯一の臨床的に承認された血清マーカーである。ＣＡ−１２５は漿液性癌の多くにおいて増加することが見出されているが、初期の疾患の女性においてはその半数のみでしか増加しない。ＣＡ１２５の主要な臨床的用途は、卵巣癌の処置を受ける女性における、処置の成功のモニタリングまたは再発の検出である（Markman M. The Oncologist; 2: 6-9 (1997)）。
【００１４】
ＣＡ１２５は、子宮内膜症などの良性疾患を有する女性においてもしばしば増加するので、そのスクリーニング用マーカーとしての使用は限定されている。したがって、単一で用いても、あるいはＣＡ１２５と組み合わせて用いても、卵巣癌の検出のためのより高感度で特異的な新規な血清マーカーの重大な必要性が存在する（Bast RC. Et al., Early Detection of Ovarian Cancer: Promise and Reality in Ovarian Cancer. Cancer Research and Treatment Vol 107 (Stack MS, Fishman, DA, eds., 2001)）。
【００１５】
内診は適切な数の初期診断をもたらしておらず、他の方法は十分に正確ではない（同文献）。一研究により、卵巣癌を罹患している患者のわずか１５％が、当該患者の内診の時点において疾患を有すると診断されたことが報告された（上記Look、174）。さらに、ＣＡ−１２５試験は、閉経前の女性において偽陽性を示す傾向があり、閉経後の女性において予測的価値が低いことが報告された（同文献174-75）。
【００１６】
現在では経膣超音波検査は、卵巣癌をスクリーニングするための好ましい手順であるが、良性と悪性の腫瘍とを高い信頼性で識別することはできず、また卵巣の大きさが正常である場合には、原発腹膜悪性腫瘍または卵巣癌を発見することができない（上記Schilder et al.、194-95）。ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１遺伝子の突然変異についての遺伝子試験は現在利用可能であるが、これらの試験は、一部の患者に対しては費用がかかりすぎることがあり、また偽陰性、もしくは不確定な結果を生じ得る（上記Schilder et al.、191-94）。
【００１７】
さらに、現在の試みは、組み合わせて用いることができるバイオマーカーのパネルの同定に集中されている（Bast RC Jr., J Clin Oncol 2003; 21: 200-205）。現在、有望な卵巣血清マーカーとして評価されており、卵巣癌の検出を改善するためのマルチマーカーパネルのメンバーとして使用し得る他のマーカーは、ＨＥ４；メソセリン(mesothelin)；カリクレイン５、８、１０および１１；およびプロスタシンである（Urban et al. Ovarian cancer screening Hematol Oncol Clin North Am. 2003 Aug;17(4):989-1005; Hellstrom et al. The HE4 (WFDC2) protein is a biomarker for ovarian carcinoma, Cancer Res. 2003 Jul 1;63(13):3695-700; Ordonez, Application of mesothelin immunostaining in tumor diagnosis, Am J Surg Pathol. 2003 Nov;27(11):1418-28; Diamandis EP et al., Cancer Research 2002; 62: 295-300; Yousef GM et al., Cancer Research 2003; 63: 3958-3965; Kishi T et al., Cancer Research 2003; 63: 2771-2774; Luo LY et al., Cancer Research 2003; 63: 807-811; Mok SC et al., J Natl Cancer Inst 2001; 93 (19): 1437-1439）。
【００１８】
外科的探索によって達成される卵巣癌のステージ分類は、当該疾患の処置および管理のコースを決定するにあたり、重要である（AJCC Cancer Staging Handbook 187 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed.1998)；上記Burdette、170；上記Memarzadeh and Berek、；上記Shridhar et al.）。ステージ分類は、国際産科婦人科連合により開発された分類システムを参照して行われる（David H. Moore, Primary Surgical Management of Early Epithelial Ovarian Carcinoma, in Ovarian Cancer 203 (Stephen C. Rubin and Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001); 上記Fleming et al. eds.、188）。
【００１９】
ステージＩの卵巣癌は、腫瘍増殖が卵巣に限定されることを特徴とし、３つのサブステージからなる（同文献）。サブステージＩＡにおいて、腫瘍増殖は１つの卵巣に限定され、卵巣の外部表面上には腫瘍はなく、卵巣莢膜は無傷であり、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞は存在しない（同文献）。サブステージＩＢは、腫瘍増殖が両方の卵巣に限定される以外は、Ａ１と同一である（同文献）。サブステージＩＣは、一方または両方の卵巣に限定される腫瘍増殖の存在を示し、また以下の特徴の１つまたは２つ以上を含む：莢膜破裂、一方または両方の卵巣の表面上での腫瘍増殖、および腹水または腹膜洗浄液中に存在する悪性細胞（同文献）。
【００２０】
ステージＩＩの卵巣癌は、一方または両方の卵巣に関与する腫瘍増殖および骨盤への伸展(extension)を意味する（同文献）。サブステージＩＩＡは、子宮および／またはファロピウス管への伸展および／または着床(implant)を含み、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含まず、一方、サブステージＩＩＢは、他の骨盤内器官および組織への伸展を含み、やはり腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含まない（同文献）。サブステージＩＩＣは、ＩＩＡまたはＩＩＢと同様に骨盤への伸展を含むが、腹水または腹膜洗浄液中に悪性細胞を含む（同文献）。
【００２１】
ステージＩＩＩの卵巣癌は、一方または両方の卵巣中に腫瘍増殖を含み、顕微鏡により確認される骨盤を越えての腹膜転移、および／または所属リンパ節における転移を有する（同文献）。サブステージＩＩＩＡは、骨盤外の顕微鏡的な腹膜転移により特徴付けられ、サブステージＩＩＩＢは、最大寸法で２ｃｍ以下の、骨盤外の肉眼で見える腹膜転移を含む（同文献）。サブステージＩＩＩＣは、転移が最大寸法において２ｃｍより大きく、所属リンパ節への転移を含み得る以外は、ＩＩＩＢと同一である（同文献）。
最後に、ステージＩＶは、腹膜転移を除く遠隔転移の存在を示す（同文献）。
【００２２】
外科的ステージ分類は、現在の卵巣癌の管理および処置を評価するための基準であるが、かなりの欠点を有し、これには、手順の侵襲性、合併症の可能性、および不正確である可能性が含まれる（上記Moore、206-208, 213）。これらの制限を考慮して、卵巣癌の種々のステージにおける異なる遺伝子発現を理解することを通して、この疾患の進行のより優れた評価を補助する種々の生物マーカーを得ることによって、代替のステージ分類方法を開発することに、注意が向けられた（Vartiainen, J. et al., Int'l J. Cancer, 95(5):313-16 (2001); 上記Shridhar et al.；Baekelandt, M. et al., J. Clin. Oncol. 18(22): 3775-81）。
【００２３】
卵巣癌の処置は、典型的には多面的な攻撃を含み、外科的介入は処置の基礎として作用する（Dennis S. Chi and William J. Hoskins, Primary Surgical Management of Advanced Epithelial Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer 241 (Stephen C. Rubin and Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)）。例えば、卵巣癌の症例の約９０％にのぼる上皮性卵巣癌の場合において、処置は典型的には以下からなる：（１）腹式子宮全摘術、両側卵管卵巣摘除術、大網切除術およびリンパ節切除を含む、腫瘍縮小手術、続いて（２）パクリタキセルおよびシスプラチンまたはカルボプラチンのいずれかでのアジュバント化学療法（Eltabbakh, G.H. & Awtrey, C.S., Expert Op. Pharmacother. 2(10): 109-24）。アジュバント療法への臨床応答率が８０％であるにもかかわらず、ほとんどの患者は、処置の３年以内に腫瘍の再発を経験している（同文献）。ある患者は、第２回目の腫瘍縮小手術および／または第二次化学療法を受ける場合もある（上記Memarzadeh & Berek）。
【００２４】
上記のことから、卵巣癌の再発を検出、診断、モニタリング、ステージ分類、予見および予防するために用いられる手順は、患者の予後に決定的に重要であることが明らかである。さらに現在の手順は、これらの分析の各々において有用である一方、これらの特異性、感度、侵襲性および／またはこれらの費用のために制限される。このように、侵襲性が最小で適切な費用において、細胞、組織または体液中の新規なマーカーを検出することにより機能する、高度に特異的で高感度の手順が、非常に望ましい。生存率が低く、現在の処置選択肢は患者の予後に対して大きく貢献しないため（しばしば死に至る）、卵巣癌の特異的、効果的治療法に対する緊急の必要性がある。
【００２５】
したがって、ある人が卵巣癌を発生しやすいかどうかを予測するため、卵巣癌の診断のため、疾患の進行のモニタリングのため、卵巣癌のステージ分類のため、卵巣癌が転移したか否かを決定するため、および卵巣癌の画像化のための、より感度が高く正確な方法に対する多大な必要性が存在する。また、卵巣癌のためのより優れた処置の必要性も存在する。
【００２６】
乳癌
乳腺腫瘍癌（mammary tumor cancer）とも呼ばれる乳癌は、女性の間で２番目に一般的な癌であり、米国において診断された癌の３分の１を占める。９人に１人の女性は、その生涯において乳癌を発生し、１年間に約１９２，０００件の新たな乳癌の症例が診断され、死者は約４２，０００人である（Bevers, Primary Prevention of Breast Cancer, in Breast Cancer, 20-54 (Kelly K Hunt et al., ed., 2001); Kochanek et al., 49 Nat’l.Vital Statistics Reports 1, 14 (2001)）。
【００２７】
乳癌は、２０歳未満の若い女性においては極度にまれであり、３０歳未満の女性においては非常にまれである。乳癌の発症率は年齢に伴って上昇し、５０歳の年齢までに顕著となる。ラテンアメリカ系ではない白人女性が乳癌について最も高い発生率を有し、韓国人女性は最も低い発生率を有する。乳癌および他の癌を促進する遺伝子変異ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の保有率の増大は、アッシュケナージ系ユダヤ人(Ashkenazi Jews)において見出される。
【００２８】
これらの同一の群の中で、アフリカ系アメリカ人女性が、乳癌による最も高い死亡率を有し（１００，０００人あたり３１人）、一方中国人女性は、１００，０００人あたり１１人の最も低い死亡率を有する。男性も乳癌を罹患し得るが、これは極度にまれである。米国においては、２００４年に、２１７，４４０件の乳癌の新しい症例および４０，５８０人の乳癌による死亡が推定されている。（米国癌協会ウェブサイト：ワールドワイドウェブのcancer with the extension .org）。関連する遺伝子的要因を有する症例を除き、乳癌の正確な原因は知られていない。
【００２９】
乳癌の処置においては、乳癌の早期の正確なステージ分類が生存に対して重大な影響を有するため、検出およびリスクアセスメントが非常に重要視されている。例えば、初期のステージ（ステージＴ０、以下に記載する）において検出された乳癌は、９２％の５年生存率を有する。逆に、癌が後期のステージ（すなわちステージＴ４（ＩＶ））まで検出されない場合、５年生存率は１３％まで低下する（AJCC Cancer Staging Handbook pp. 164-65 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed. 1998)）。いくつかの検出手法、例えばマンモグラフィーおよび生検は、不快感、費用および／または放射線照射量の増加を伴い、乳癌リスクの高い患者のみに処方されるに過ぎない。
【００３０】
乳癌のリスクを予測するかまたは検出するための現在の方法は、最適ではない。乳癌の相対的なリスクを予測するための１つの方法は、患者の危険因子を試験し、高リスクの患者についての積極的な（aggressive）診断および処置計画を探求することによる。患者の乳癌のリスクは、年齢の上昇、未産婦、乳癌の家族歴、乳癌の個人歴、早い初経、遅い閉経、最初の満期妊娠の遅い年齢、以前の増殖性乳房疾患、早い年齢での乳房への放射線照射および悪性腫瘍の個人歴に、正に関連している。
【００３１】
ライフスタイル要因、例えば脂肪消費量、アルコール消費量、教育および社会経済的地位もまた、乳癌の発生率の増大に関連しているが、直接的な因果関係は確立されていない。これらの危険因子は統計学的に有意である一方で、これらの乳癌との弱い関連性は、その有用性を制限する。乳癌を発症するほとんどの女性は、加齢に伴って到来するリスク以外に、上記した危険因子のいずれも有していない（NIH Publication No. 00-1556 (2000)）。
【００３２】
癌を検出するための現在のスクリーニング方法、例えば乳房の自己検査、超音波およびマンモグラフィーは、その有効性を低下させる、またはその幅広い採用を妨げるような欠点を有する。乳房自己検査は有用である一方、腫瘍が小さく触診により検出することが困難である初期の段階においては、乳癌の検出について信頼性が低い。超音波測定には、熟練したオペレータが必要であり、より費用がかかる。マンモグラフィーは感度が高い一方で、悪性腫瘍の可能性が疑われる病変の検出において過剰診断となりやすい。また、事前の胸部への照射が乳癌発症率の増大に関連する要因であるため、マンモグラフィーにおいて用いられる放射線照射に対する恐れも存在する。
【００３３】
現時点において、乳癌予防の適切な方法は存在しない。乳癌予防の現在の方法は、予防的な乳房切除術（癌診断の前に行う乳房切除術）および化学的予防（癌診断の前の化学療法）を含み、これは、乳癌リスクの高い女性の間でさえもこれらの採用が限定されるような思い切った手段である（上記Bevers）。
【００３４】
多くの遺伝子マーカーが乳癌と関連付けられてきた。これらのマーカーの例として、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（Mughal et al., JAMA 249:1881 (1983))、ＭＵＣ−１(Frische and Liu, J. Clin. Ligand 22:320 (2000)), ＨＥＲ−２／ｎｅｕ (Haris et al., Proc.Am.Soc.Clin.Oncology 15:A96 (1996))、ｕＰＡ、ＰＡＩ−１、ＬＰＡ、ＬＰＣ、ＲＡＫおよびＢＲＣＡ(Esteva and Fritsche, Serum and Tissue Markers for Breast Cancer, in Breast Cancer, 286-308 (2001)）が挙げられる。これらのマーカーは、限定された感度、低い相関関係および偽陰性についての問題を有し、そのためこれらの初期診断への使用が制限される。例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子変異は、乳癌の危険性の増大の指標として有用である一方で、乳癌のわずか６．２％のみがＢＲＣＡ１陽性であるため、癌診断における使用が限定される（Malone et al., JAMA 279:922 (1998)。Mewman et al., JAMA 279:915 (1998)（３．３％のみの相関関係）も参照のこと）。
【００３５】
原発部位および疾患発達の程度により、乳癌について４つの主な分類がある。
Ｉ．in situでの乳管癌腫（ＤＣＩＳ）：正常な位置に残留する乳管上皮細胞の悪性形質変換。ＤＣＩＳは純粋に局所的な疾患であり、転移することはない。
ＩＩ．侵襲性乳管癌腫（ＩＤＣ）：基底膜を突破して乳房の支持組織中に至る乳管上皮細胞の悪性腫瘍。ＩＤＣは、最終的には身体の別の場所に拡大し得る。
【００３６】
ＩＩＩ．in situでの小葉癌腫（ＬＣＩＳ）：乳房の単一の小葉において発生し、小葉壁を貫通して伸展しない悪性腫瘍であり、一般に局所的なままである。
ＩＶ．浸潤性小葉癌腫（ＩＬＣ）：乳房の単一の小葉において発生し、小葉壁を貫通して隣接する組織中に直接侵入する悪性腫瘍。小葉壁を越えるこの侵襲(invasion)により、ＩＬＣは、リンパ管および血管に入り込み、遠隔部位に拡大し得る。
【００３７】
予後および処置を決定するために、これらの４つの乳癌の種類を、主な腫瘍の大きさ（Ｔ）、リンパ節の関与（Ｎ）および転移の存在（Ｍ）によりステージ分類した。定義によれば、ＤＣＩＳは局所的なステージＩの疾患を表すが、乳癌の他の形態は、ステージＩＩからステージＩＶにまでわたり得る。さらに外科的介入および医学的介入の指針となる、追加的な予後因子がある。最も一般的なものは、関与するリンパ節の合計数、ＥＲ（エストロゲン受容体）の状態、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ受容体の状態および組織学的グレードである。
【００３８】
異なる処置が癌の異なるステージについてより有効であることを認識して、乳癌は適切なステージカテゴリーに診断される。ステージＴＸは、原発腫瘍が評価できない（すなわち腫瘍が除去されたかまたは乳房組織が除去された）ことを示す。ステージＴ０は、過形成などの異常を特徴とするが、原発腫瘍の痕跡を伴わない。ステージＴｉｓは、in situでの腫瘍、管内癌腫、in situでの小葉癌腫または腫瘍を伴わない乳頭のパジェット病を特徴とする。
【００３９】
ステージＴ１（Ｉ）は、最大寸法で２ｃｍ以下の腫瘍を有することを特徴とする。ステージＴ１内で、Ｔｍｉｃは、０．１ｃｍ以下の微小侵襲を示し、Ｔ１ａは、０．１〜０．５ｃｍの腫瘍を示し、Ｔ１ｂは、０．５〜１ｃｍの腫瘍を示し、そしてＴ１ｃは、１ｃｍ〜２ｃｍの腫瘍を示す。ステージＴ２（ＩＩ）は、最大寸法で２ｃｍ〜５ｃｍの腫瘍を特徴とする。大きさが５ｃｍより大きい腫瘍は、ステージＴ３（ＩＩＩ）として分類される。ステージＴ４（ＩＶ）は、胸壁または皮膚への伸展を伴う、任意の大きさの腫瘍を示す。
【００４０】
ステージＴ４内で、Ｔ４ａは、胸壁への腫瘍の伸展を示し、Ｔ４ｂは、乳房の皮膚または同一の乳房に限定された衛星皮膚結節の浮腫または潰瘍形成を示し、Ｔ４ｃは、Ｔ４ａとＴ４ｂとの組み合わせを示し、そしてＴ４ｄは、炎症性癌腫を示す（AJCC Cancer Staging Handbook pp. 159-70 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed. 1998)）。標準的なステージ分類に加えて、乳房腫瘍をこれらのエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体タンパク質状態により分類することができる（Fisher et al., Breast Cancer Research and Treatment 7:147 (1986)）。さらなる病理学的状態、例えばＨＥＲ２／ｎｅｕ状態もまた、有用であり得る（Thor et al., J.Nat’l.Cancer Inst. 90:1346 (1998); Paik et al., J.Nat’l.Cancer Inst. 90:1361 (1998); Hutchins et al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncology 17:A2 (1998).; およびSimpson et al., J.Clin.Oncology 18:2059 (2000)）。
【００４１】
原発腫瘍のステージ分類に加えて、所属リンパ節への乳癌転移もステージ分類することができる。ステージＮＸは、リンパ節を評価することができない（例えば、前に除去された）ことを示す。ステージＮ０は、所属リンパ節転移がないことを示す。ステージＮ１は、移動可能な同側性腋窩リンパ節への転移を示す。ステージＮ２は、互いに、または他の構造に固定された同側性腋窩リンパ節への転移を示す。ステージＮ３は、同側性内部乳腺リンパ節への転移を示す（同文献）。
【００４２】
ステージ決定は、潜在的な予後値を有し、最適な治療法を設計するための基準を提供する（Simpson et al., J. Clin. Oncology 18:2059 (2000)）。一般に、乳癌の病理学的ステージ分類はより正確な予後を与えるため、臨床的ステージ分類より好ましい。しかし、臨床的ステージ分類は、病理学的評価のための組織を得る侵襲性手順に依存しないので、病理学的ステージ分類と同等に正確である場合はより好ましい。乳癌のステージ分類は、異なる侵襲のステージ間で区別され得る細胞、組織または体液中の新たなマーカーを検出することにより改善されるだろう。この分野における進歩により、乳癌患者を処置するためのより迅速で信頼性のある方法が可能となる。
【００４３】
乳癌の処置は、一般に、原発腫瘍の正確なステージ分類の後に決定される。主な処置の選択肢には、乳房保存療法（乳腺腫瘍摘出術、乳房照射および腋窩の外科的病期判定（surgical staging））ならびに非定型的乳房切除術が含まれる。追加の処置には、化学療法、局部放射線照射および極端な場合においては、卵巣切除によるエストロゲン産生の停止が含まれる。
【００４４】
最近まで、すべての乳癌のための一般的な処置は、乳房切除術であった（Fonseca et al., Annals of Internal Medicine 127:1013 (1997)）。しかし、最近のデータは、初期のステージの乳癌について、より極端でない手順が生存の点において同等に有効であり得ることを示す（Fisher et al., J. of Clinical Oncology 16:441 (1998)）。初期のステージの乳癌（すなわちステージＴｉｓ）を有する患者についての処置の選択肢は、乳房を残す手術と、その後の乳房における局所的な放射線療法であり得る。代替的に、乳房切除術を任意に放射線または乳房再構成と組み合わせて用いることができる。これらの処置方法は、乳癌の初期ステージにおいて同等に有効である。
【００４５】
ステージＩおよびステージＩＩの乳癌を有する患者には、外科手術と共に化学療法および／またはホルモン療法が必要である。手術は、ステージＩＩＩおよびステージＩＶの患者においては有用性が限定される。したがってこれらの患者は、化学療法および放射線療法のより好ましい候補であって、手術は初めのステージ分類またはその後の再ステージ分類を可能にするための生検に限定される。なぜならば、疾患のこのステージにおいて、癌がほとんど治癒的ではないためである（AJCC Cancer Staging Handbook 84, 164-65 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed.1998)）。
【００４６】
患者により多くの処置の選択肢を提供する努力において、再発性が低く、術後の放射線処置を伴わない乳腺腫瘍摘出術での処置が可能な、初期ステージの乳癌を明確にする努力が進行中である。多くの試行が初期ステージの乳癌を分類するためになされている一方、術後の放射線処置に対する一致した提言は、これらの研究からは得られていない（Page et al., Cancer 75:1219 (1995); Fisher et al., Cancer 75:1223 (1995); Silverstein et al., Cancer 77:2267 (1996)）。
【００４７】
膵臓癌
膵臓癌は、世界で１３番目に一般的な癌であり、癌による死亡の第８位の原因である（Donghui Li, Molecular Epidemiology, in Pancreatic Cancer 3 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)）。米国においては、膵臓の癌は男性と女性両方において４番目に一般的な癌であり、全体で、癌による死亡の５％およびほぼ３０，０００人の死亡の原因となっている（同文献）。膵臓癌の割合は女性より男性で高く、白人よりアフリカ系アメリカ人で高い（同文献、９）。膵臓癌の最も重要な予測指標は、患者の年齢である；白人の中では、膵臓癌の年齢に関連する発症率は、８５歳以上においてすら連続的に増加する（同文献、３）。
【００４８】
約８０％の症例が６０〜８０歳の年齢範囲で起きており、８０代では、４０代と比べて、疾患を有する危険性が４０倍も高い（同文献）。さらに米国癌協会は、２００４年に米国のみにて、３１，８００件の新たな膵臓癌の症例を予測している。膵臓癌は、同年に約３１，２００人の新たな死亡を引き起こすであろう（ＡＣＳウェブサイト：ワールドワイドウェブのcancer with the extention .org）。研究者および医師による膵臓癌の処置を考案するための努力にも関わらず、膵臓癌は例外なく致命的であり続けている（James R. Howe, Molecular Markers as a Tool for the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 29 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)）。
【００４９】
年齢の他にも多数の膵臓癌の危険因子が同定されており、喫煙、食生活、職業、一定の医療状態、遺伝、および分子生物学的因子などが含まれる。喫煙はこの疾患を生じる最も重要な危険因子であり、喫煙と膵臓癌との関連は多数の研究によって確立されている（上記Li、３）。相対的危険性は少なくとも１．５に達し、喫煙の程度と共に増大し、外部危険率（outer risk ratio）は１０倍に達する（同文献）。
【００５０】
次に重要な因子は食生活と考えられ、危険性の増加は動物性タンパク質および脂肪の摂取と関連し、危険性の減少は果物および野菜の摂取と関連する（同文献、３−４）。特定の職業に関して、膵臓癌の過大な率は、化学分野、石炭およびガスの探査、金属産業、革なめし業、繊維業、アルミニウム精練業、および輸送業の従事者と関連している（同文献、４）。多くの医学的状態も膵臓癌の発症率の増加と関連し、糖尿病、慢性膵炎、胃切除術、および胆嚢摘出術を含むが、これらの状態と膵臓癌との間の因果関係は確立されていない（同文献）。
【００５１】
遺伝的な遺伝子的要因は、膵臓癌の負荷の１０％未満を構成しており、遺伝性膵炎、および家族性の癌症候群遺伝子、例えばｈＭＳＨ２およびｈＭＬＨ１（遺伝性非腺腫性大腸癌）、ｐ１６（家族性非定型多発性ほくろメラノーマ（mole-melanoma））およびＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２（乳癌および卵巣癌）について関連が記載されている（同文献、３）。いかなる器官における癌についての遺伝性の基盤も、膵臓のそれよりは低いが、しかし研究者らは、ある個人の膵臓癌に対する感受性に影響する特定の遺伝的欠陥を示すことができていない（David H. Berger and William E. Fisher, Inherited Pancreatic Cancer Syndromes, in Pancreatic Cancer 73 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)）。
【００５２】
分子生物学の立場から、研究により膵臓癌と多数の遺伝的突然変異との間の関連が明らかとなり、これには、プロトオンコジーンＫ−ｒａｓの活性化、および癌抑制遺伝子ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４の不活性化が含まれる（Marina E. Jean et al., The Molecular Biology of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 15 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)）。
【００５３】
膵臓腺癌の１つの研究において、８３％が、Ｋ−ｒａｓ活性化、ならびにｐ１６およびｐ５３の不活性化を有していた（同文献）。Ｋ−ｒａｓの突然変異は、膵臓腺癌の８０〜９５％に見出され、膵臓の癌においては、ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４遺伝子が、最も頻繁に欠損する癌抑制遺伝子である（上記Howe、29）。ｐ１６遺伝子のホモ接合体欠失、過剰メチル化、および突然変異は、膵臓腺癌の８５〜９８％において見出された（同文献）。
【００５４】
Ｋ−ｒａｓ、ｐ５３、ｐ１６、およびＤＰＣ４遺伝子の改変の役割から予想されるように、細胞サイクルの調節を失うことが、膵臓の腫瘍形成の鍵となることが考えられ、なぜこの癌がこのように攻撃的であるかを説明するかも知れない（上記Jean、15）。研究により、この癌とある種の成長因子および成長因子受容体の異常な調節との間の関連、およびマトリクス・メタロプロテイナーゼと腫瘍血管新生レギュレータの上方調節が明らかにされた（同文献）。上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、形質転換成長因子β、インスリン様成長因子、肝細胞増殖因子、および血管内皮増殖因子は、膵臓癌において種々の役割を果たす可能性があるが、かかる役割は明らかにされていない（同文献、１８−２２）。
【００５５】
膵臓癌の存在を検出するためのスクリーニング技法の開発は、この致死的な癌に対して特に重要であるが、それは、膵臓腫瘍が膵臓を囲む毛細血管およびリンパ管に侵入し、腫瘍が胆管を閉塞するかまたは痛みを引き起こすときまで、殆どの患者が現れないからである（上記Howe、29）；残念ながら、この疾患の転移形態を有する患者は、概して診断後１年未満しか生存しない（上記Jean et al.、15）。コンピュータ断層撮影（ＣＴ）および内視鏡的逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）は、症候性の患者の診断を支援することができるが、治療し得る時期での早期発見を可能とする膵臓腫瘍のスクリーニングのツールは、現在存在しない（上記Howe、29）。
【００５６】
癌胎児性抗原などのマーカー、および、ヒト結腸癌の細胞株に対して生成される抗体（ＣＡ１９−９およびＣＡ１９５）、ヒト卵巣癌の細胞株に対して生成される抗体（ＣＡ１２５）、およびヒト膵臓癌の細胞株に対して生成される抗体（ＳＰＡＮ−１およびＤＵＰＡＮ−２）は、膵臓癌患者の血清において上昇するが、これらのマーカーは特異性を欠如し疾患の後期に現れるために、信頼できるスクリーニングのツールとしては十分ではない（Walter J. Burdette, Cancer:  Etiology, Diagnosis, and Treatment 99 (1998); Hasholzner, U. et al., Anticancer Res. 19(4A): 2477-80 (1999)）。
【００５７】
現在適切なスクリーニング法が存在しないために、医師は、この疾患の早期診断のための最も期待される方法として、分子生物学的方法を用いる技術にますます頼っている（上記Howe、30）。現在、無症候性の患者において膵臓癌を検出し得る、高感度で特異性が高いマーカーは存在しないが、幾つかの生物学的マーカーが検討されている（同文献）。現在相当の努力がＫ−ｒａｓに集中しており、研究者らは、膵液、胆汁、十二指腸液、またはＥＲＣＰブラッシングのサンプルをスクリーニングして、Ｋ−ｒａｓの突然変異を検出する技術を考案している（同文献）。
【００５８】
これらのサンプルの採集は侵襲的であり、無症候性の被験者をスクリーニングするために特に有用ではないため、研究者らはまた、Ｋ−ｒａｓの突然変異用の血清および大便の分析にも頼っており、後者は供給源材料の複雑さによる障害があるために、前者が最も期待できる（同文献、35〜38、42）。さらに、転写因子タンパク質ｐ５３の血清レベルは癌の進行と平行している可能性があるため、ｐ５３も潜在的な腫瘍マーカーとして研究されている（同文献、37；上記Jean et al.、17）。
【００５９】
一旦膵臓癌と診断されると、癌の進行のステージを参照して処置の決定がなされる。多数のイメージング技術が膵臓癌のステージ分類のために用いられ、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）が現在選択される方法であるが（Harmeet Kaur et al., Pancreatic Cancer:  Radiologic Staging, in Pancreatic Cancer 86 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002); Ishiguchi, T. et al., Hepatogastroenterology 48(40): 923-27 (2001)）、ＣＴは、小容量の転移はしばしばＣＴの解像度を超えるために、癌の範囲について頻繁に過小評価となる（H. J. Kim and K. C. Conlon, Laparascopic Staging, in Pancreatic Cancer 15 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)）。
【００６０】
ＭＲＩは、ある点において、とりわけ以下の能力に関して、ＣＴに取って代わるものである：（１）種々の組織間にコントラストをつける、（２）パルス順序を修正して病変部の視覚化を改善し、アーチファクトを最小化する、（３）イオン化放射への患者の暴露を制限しながらイメージングを行う、および（４）ＩＶヨウ化コントラスト試薬を使用せずに血管を視覚化する（上記Kaur et al.、87）。しかしながら現在、ＭＲＩはＣＴに対して明確な利点を示していない（上記Kim and Conlon、116）。
【００６１】
種々の超音波技術もまた、現在ステージ分類に用いられ、これには経腹的超音波検査（ＴＵＳ）、超音波内視鏡検査（ＥＵＳ）、および術中超音波検査（ＩＵＳ）などを含み、ＥＵＳは、最も期待されるものの１つである（上記Kaur et al., 86; Richard A. Erickson, Endoscopic Diagnosis and Staging: Endoscopic Ultrasound, Endoscopic Retrograde Cholangiopancreatography, in Pancreatic Cancer 97-106 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)）。これらの技術はしかし、それぞれさまざまな要因によって制限される：ＴＵＳは胃腸管のガスおよび腹膜の脂肪によって妨害され、ＥＵＳは超音波検査および内視鏡検査に相当な経験を必要とし、広く利用可能ではない可能性があり、そしてＩＵＳは、手術中にしか使用できない（上記Kaur et al.、86）。
【００６２】
まだ初期の段階ではあるが、膵臓癌のステージ分類を支援するマーカーの探索は、幾つかの可能性のある手がかりを見出した。例えば、２つの転移抑制遺伝子、ｎｍ２３−Ｈ１およびＫＡＩ１が、膵臓癌のステージに依存して異なって発現され、それらの発現は該疾患の早期のステージでは上方制御され、遅いステージにおいては下方制御されることが、研究により見出された（Friess, H. et al., J. Clin. Oncol. 19(9): 2422-32 (2001)）。研究者らはまた、遺伝性リンパ節ステージ分類に、特にＫ−ｒａｓプロトオンコジーンにおける突然変異の探索に焦点をあてている（Yamada, T. et al., Int’l J. Oncol. 16(6): 1165-71 (2000)）。
【００６３】
同様に、研究によって、突然変異したＫ−ｒａｓ配列の血漿／血清における存在が、後期ステージの膵臓癌と関連することを確認したが、ただし、早いステージの膵臓癌の存在もまたこの方法により検出できる（Sorenson, G.D., Clin. Cancer Res. 6(6): 2129-37 (2000)）。マルチマーカー逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（multimarker reverse transcriptase-polymerase chain reaction）アッセイを用いる、期待されるステージ分類技術は、以下の腫瘍マーカーのｍＲＮＡ発現について血液および組織サンプルを分析することにより、膵臓癌のステージを識別することに成功した：β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン遺伝子、肝細胞増殖因子受容体遺伝子ｃ−ｍｅｔ、およびβ−１，４−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニル−トランスフェラーゼ遺伝子（Bilchik, A. et al., Cancer 88(5):  1037-44 (2000)）。
【００６４】
膵臓癌のステージ分類に一般に用いられる分類システムの１つは、国際対がん連合により考案されたＴＮＭシステムである（AJCC Cancer Staging Handbook 3 (Irvin D. Fleming et al. eds., 5th ed. 1998)）。このシステムは、数個の段階に分けられ、各々は、原発腫瘍（Ｔ）、所属リンパ節（Ｎ）、および遠隔転移（Ｍ）について癌の増殖の範囲を評価する（同文献）。
【００６５】
ステージ０はin situでの癌腫を特徴とし（Ｔｉｓ）、所属リンパ節への転移はなく（Ｎ０）、遠隔転移もない（Ｍ０）（同文献、113）。ステージＩおよびＩＩは、腫瘍のカテゴリーに関してのみ、ステージ０と異なる：ステージＩは、膵臓のみに限定される腫瘍を含み、これは、（１）最大寸法が２ｃｍ以下であるか（Ｔ１）、または（２）最大寸法が２ｃｍ以上であり（Ｔ２）、一方ステージＩＩは、十二指腸、胆管または膵臓周辺組織まで直接広がった腫瘍（Ｔ３）を含む（同文献）。
【００６６】
ステージＩＩＩは、腫瘍のカテゴリーＴ１、Ｔ２またはＴ３を含む；所属リンパ節転移（Ｎ１）は、単一のリンパ節（ｐＮ１ａ）または複数のリンパ節（ｐＮ１ｂ）のどちらかを含み；そして遠隔転移はない（Ｍ０）。ステージＩＶＡは、胃、脾臓、結腸、または隣接する大きな血管まで直接広がった腫瘍を特徴とし（Ｔ４）；任意のＮカテゴリーであり；および、遠隔転移はない（Ｍ０）。最後に、ステージＩＶＢは、任意のＴカテゴリー、任意のＮカテゴリー、および遠隔転移（Ｍ１）を特徴とする（同文献）。
【００６７】
一旦癌がステージ分類されると、この疾患に対する、唯一の一定して効果的な処置は外科手術であり、潜在的に治効のある切除術を受けることができるのは１０〜１５％の患者のみである（上記Jeanら、15；上記Flemingら編、111; William F. Regine, Postoperative Adjuvant Therapy:  Past, Present, and Future Trial Development, in Pancreatic Cancer 235 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)）。さらに、切除術を受けたこれらの患者の５年生存率は２０％を下回る（上記Regine、235）。一方、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルなどの化学療法剤は、膵臓癌に対して一定の有効性を示したが、現実的には、化学療法は膵臓癌からの生存に対してはほとんど効果を示していない（上記Burdette、101）。放射線療法はその有効性について矛盾する結果を示した（同文献）が、５−フルオロウラシルと組み合わせた放射線は、一定の見込みを示した、上記Regine、235）。
【００６８】
従来技術が膵臓癌の処置に失敗していることから、分子生物学の技術を用いる多くの新規なアプローチが検討されている。遺伝子治療の分野で多くの研究がなされ、アンチセンス技術、遺伝子指向的プロドラッグ活性化戦略、プロモーター遺伝子戦略、およびオンコリティックウイルス（oncolytic viral）療法を含む（Choi and Francis R. Spitz, Strategies for Gene Therapy, in Pancreatic Cancer 331 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002); Kasuya, H. et al., Hepatogastroenterology 48(40): 957-61 (2001)）。
【００６９】
最近の他のアプローチは、マトリクス・メタロプロテイナーゼの阻害に焦点を当ててきた。マトリクス・メタプロテイナーゼは、腫瘍細胞の転移および侵入を、該細胞の基底膜の分解を介して、および腫瘍周辺間質分解および血管形成における役割を通して、促進する酵素である（Alexander S. Rosemurgy, II and Mahmudul Haq, Role of Matrix Metalloproteinase Inhibition in the Treatment of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 369 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)）。
【００７０】
癌における血管新生
固形腫瘍の増殖および転移は、血管新生にも依存する（Folkman, J., 1986, Cancer Research, 46, 467-473; Folkman, J., 1989, Journal of the National Cancer Institute, 82, 4-6）。例えば、２ｍｍより大きく広がった腫瘍は、それ自身の血液供給を受けねばならず、これは新しい毛細血管の増殖を誘導することにより達成される。これらの新しい血管が一旦腫瘍に埋め込まれると、それらは、腫瘍細胞が循環に入って、遠隔部位、例えば肝臓、肺または骨などに転移する手段を提供する（Weidner, N., et al., 1991, The New England Journal of Medicine, 324(1), 1-8）。
【００７１】
既存の血管からの新たな血管の増殖または発生として定義される血管新生は、主として胚発生中に起こる複雑なプロセスである。このプロセスは、血管を覆う新しい内皮細胞が、幹細胞からの分化ではなく、既存の細胞の増殖により作られる点で、脈管形成から区別される。このプロセスは侵襲的であり、細胞外基質（ＥＣＭ）のタンパク質分解、新しい内皮細胞の移動、および新しいマトリクス成分の合成に依存する。血管新生は循環系の胚発生中に起こるが、しかし成長したヒトにおいては、血管新生は病的な状態への反応としてのみ起こる（ただし、女性の生殖周期を除く）。
【００７２】
成人の正常な生理的状態のもとでは、血管新生は、毛髪の成長および創傷の治癒などの非常に限定された状況においてのみ起こる（Auerbach, W. and Auerbach, R., 1994, Pharmacol Ther. 63(3):265-3 11; Ribatti et al.,1991, Haematologica 76(4):3 11-20; Risau, 1997, Nature 386(6626):67 1-4）。血管新生は、内皮細胞の遊走カラムの形成を引き起こす刺激によって進行する。タンパク質分解活性は、この「血管新生の芽（vascular sprout）」が前進する先端に集中され、これは、細胞のカラムが侵入し遊走することを許容するのに十分なだけ、ＥＣＭを破壊する。前進部の後ろでは内皮細胞が分化し、互いに付着し始めて、新しい基底膜を形成する。細胞は次に増殖を停止し、最終的には新しい細動脈または毛細血管の内腔を規定する。
【００７３】
制御されない血管新生が、広い範囲の疾患に対して責任を負うことが次第に認識されてきたが、これには、限定されることなく、癌、心臓血管疾患、関節リューマチ、乾癬および糖尿病性網膜症を含む（Folkman, 1995, Nat Med 1(1):27-31; Isner, 1999, Circulation 99(13): 1653-5; Koch, 1998, Arthritis Rheum 41(6):951-62; Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 38(2):103-12; Ware and Simons, 1997, Nat Med 3(2): 158-64）。
【００７４】
特に重要であるのは、固形腫瘍がその増殖と転移のために血管新生を必要とするとの観察である（Folkman, 1986 上記; Folkman 1990, J Natl. Cancer Inst., 82(1) 4-6; Folkman, 1992, Semin Cancer Biol 3(2):65-71; Zetter, 1998, Annu Rev Med 49:407-24）。腫瘍は、通常は、利用可能な毛細管ベッドからの距離のために数立方ミリメーターの大きさにまでしか増殖できない単一の異常細胞として始まり、さらなる増殖および播種なしに長期間「潜伏して」留まることができる。
【００７５】
いくつかの腫瘍細胞は、次に、血管新生の表現型に切り換わって内皮細胞を活性化し、これは新しい毛細血管へと増殖および成熟する。これらの新しく形成された血管は、原発腫瘍の連続した増殖を許容するのみでなく、転位腫瘍細胞の播種および再コロニー形成を許容する。血管形成の切換えを制御する正確なメカニズムはよく理解されていないが、腫瘤の新血管形成は、多数の血管形成促進因子と阻害因子との間の、純バランスから生じると考えられている（Folkman, 1995、上記）。
【００７６】
最も強力な血管新生阻害剤の１つは、O’ReillyおよびFolkmanによって同定されたエンドスタチンである（O'Reilly et al., 1997, Cell 88(2):277-85; O'Reilly et al., 1994, Cell 79(2):3 15-28）。この発見は、ある種の原発腫瘍が遠隔転移の成長を阻害できるという現象に基づく。O’ReillyおよびFolkmanは、原発腫瘍が、抑制物質よりも多量の血管形成促進物質を生成することにより、血管新生を開始させるとの仮説を立てた。しかし血管新生抑制物質は、循環におけるそれらの長い半減期のために、促進剤より多量に二次腫瘍の部位に到達する。
【００７７】
このため、最終的には、原発腫瘍の増殖と二次腫瘍の抑制がもたらされる。エンドスタチンは、原発腫瘍により産生される、かかる血管新生抑制物質の増加するリストの中の１つである。エンドスタチンは、より大きなタンパク質のタンパク質分解フラグメントである：エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩ（マウスコラーゲンＸＶＩＩＩのアミノ酸Ｈ１１３２−Ｋ１３１５）の２０ｋＤａのフラグメントである。エンドスタチンは、in vitroで内皮細胞の増殖を特異的に阻害し、in vivoでの血管形成を遮断することが示された。より重要なことには、腫瘍を有するマウスにエンドスタチンを投与すると、顕著な腫瘍の退縮を引き起こし、毒性または薬剤耐性は、複数の処置サイクルの後にも観察されなかった（Boehm et al., 1997, Nature 390(6658):404-407）。
【００７８】
エンドスタチンが遺伝的に安定な内皮細胞を標的化し、種々の固形腫瘍を阻害するという事実は、エンドスタチンを抗癌療法のための非常に魅力的な候補にしている（Fidler and Ellis, 1994, Cell 79(2):185-8; Gastl et al., 1997, Oncology 54(3):177-84; Hinsbergh et al., 1999, Ann Oncol 10 Suppl 4:60-3）。さらに、血管新生阻害剤は、放射線および化学療法剤と組み合わされる場合により効果的であることが示された（Klement, 2000, J. Clin Invest, 105(8) R15-24. Browder, 2000, Cancer Res. 6-(7) 1878-86, Arap et al., 1998, Science 279(5349):377-80; Mauceri et al., 1998, Nature 394(6690):287-91）。
【００７９】
上記のように、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を診断およびステージ分類するための各方法は、用いられる技術によって制限される。したがって、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を検出するための、感度の高い分子マーカーおよび細胞マーカーの必要性が存在する。処置方法を最適化するために、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の臨床的および病理学的なステージ分類を含んだ正確なステージ分類のための、分子マーカーの必要性が存在する。さらに、寛解後の卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の再発を検出できるマーカーを含む、癌の処置の進行をモニタリングするための感度の高い分子マーカーおよび細胞マーカーの必要性が存在する。
【００８０】
本発明は、従来の治療法の制限を克服し、また以下の詳細な記載から明らかであるさらなる利点を提供する、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を処置するための代替方法を提供する。
【００８１】
自己免疫疾患
免疫系の細胞活性は、細胞表面相互作用の複雑なネットワークおよび関連するシグナル伝達プロセスによって制御される。細胞表面受容体がそのリガンドにより活性化されると、シグナルが該細胞へ伝達され、携わるシグナル変換経路に依存して、そのシグナルは抑制性または活性化性（activatory）となり得る。多くの受容体系に対して、細胞活性は活性化シグナルと抑制シグナルとの間のバランスによって調節される。これらのいくつかにおいて、リガンドによる細胞表面受容体への結合に関連する正のシグナルが、異なる細胞表面受容体へのリガンドの結合によって伝達される負のシグナルにより、下方調節または阻害されることが知られている。
【００８２】
これら正および負のシグナル伝達経路の生化学的機構は、多数の既知の免疫系受容体とリガンドとの相互作用について研究されている。正のシグナル伝達を媒介する多くの受容体は、免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）として知られているチロシンホスファターゼリン酸化の部位を含む、細胞質側末端を有する。正のシグナル伝達のための一般的な機構経路には、受容体の細胞質ドメイン上および他のシグナル伝達分子上の部位をリン酸化するチロシンキナーゼの活性化が関与している。一旦受容体がリン酸化されると、シグナル伝達分子のための結合部位が生成され、これがシグナル伝達経路を開始させ、細胞を活性化する。
【００８３】
抑制経路には、免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を有する受容体が関与し、これはＩＴＡＭ同様、チロシンキナーゼによりリン酸化される。これらのモチーフを有する受容体は、抑制性シグナル伝達に関連するが、それはこれらのモチーフが、活性化された受容体またはシグナル伝達分子からチロシンを除去することによりシグナル伝達を遮断するチロシンホスファターゼに、結合部位を提供するからである。活性化および抑制の機構の詳細の多くは知られていないが、免疫系における機能バランスが対立する活性化シグナルおよび抑制性シグナルに依存することは明確である。
【００８４】
正および負のシグナル伝達のバランスにより調節される免疫系活性の一例は、Ｂ細胞増殖である。Ｂ細胞抗原受容体は、抗体に結合すると正のシグナル伝達を媒介してＢ細胞増殖をもたらす、Ｂ細胞表面免疫グロブリンである。しかし、Ｂ細胞はまた、低親和性ＩｇＧ受容体であるFc.gamma.RIIb1も発現する。抗原が、可溶性免疫グロブリンを有する免疫複合体の一部である場合、Ｂ細胞抗原受容体およびFc.gamma.RIIb1の両方を、それぞれ抗原および可溶性免疫グロブリンを介して結合させることによって、この免疫複合体はＢ細胞を結合することができる。
【００８５】
Fc.gamma.RIIb1とＢ細胞受容体複合体との共結合は、活性化シグナルを下方調節し、Ｂ細胞増殖を妨害する。Fc.gamma.RIIb1受容体はＩＴＩＭモチーフを含み、このＩＴＩＭモチーフは、Ｂ細胞受容体と共結合すると、ＩＴＩＭとチロシンホスファターゼとの相互作用を介して抑制性シグナルをＢ細胞に伝達すると考えられている。
【００８６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の細胞溶解活性は、細胞機能を開始させる正のシグナルと活性を妨害する負のシグナルとの間のバランスによって調節される免疫系活性の、他の例である。ＮＫ細胞傷害性を活性化させる受容体は完全には理解されていない。しかし、ＮＫ細胞が特異的受容体を有する細胞表面ＭＨＣクラスＩ抗原を標的細胞が発現する場合、該標的細胞は、ＮＫによる殺傷から保護される。キラー抑制性受容体（ＫＩＲ）として知られるこれらの特異的受容体は、そのＭＨＣリガンドにより関与させられると、負のシグナルを伝達し、ＮＫ細胞の細胞傷害性を下方制御する。
【００８７】
ＫＩＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーまたはＣ型レクチンファミリーに属する（Lanier et al., Immunology Today 17:86-91,1996参照）。既知のヒトＮＫ  ＫＩＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、その細胞外領域、膜貫通領域および細胞質領域において相違点および類似点を示す。多くのＫＩＲに共通する細胞質ドメインのアミノ酸配列は、ＹｘｘＬ／Ｖの配列を有するＩＴＩＭモチーフである。いくつかの場合においては、リン酸化されたＩＴＩＭは、チロシンホスファターゼを補充し、これがシグナル伝達経路において分子を脱リン酸化し、細胞活性を妨害する（Burshtyn et al., Immunity 4:77-85, 1996参照）。
【００８８】
ＫＩＲは一般に、２６個のアミノ酸［YxxL/V(x).sub.26YxxL/V］によって隔てられたこれらのモチーフの２つを有する。それぞれがヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ｃ対立遺伝子（ＭＨＣクラスＩ分子）に特異的な、少なくとも２つのＮＫ細胞受容体が、抑制性受容体および活性化受容体として存在する。これらの受容体は、細胞外の部分で非常に相同であるが、膜貫通部分および細胞質部分では大きな違いを有する。違いの１つは、抑制性受容体におけるＩＴＩＭモチーフの外観および、活性化受容体におけるＩＴＩＭモチーフの欠如である（Biassoni et al., Journal. Exp. Med, 183:645-650, 1996参照）。
【００８９】
マウス肥満細胞により発現される免疫受容体ｇｐ４９Ｂ１もまた、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、細胞活性化シグナルを下方制御し、一対のＩＴＩＭモチーフを含むことが知られている。ｇｐ４９Ｂ１はヒトＫＩＲと高度の相同性を有する（Katz et al., Cell Biology, 93: 10809-10814, 1996）。マウスＮＫ細胞はまた、免疫受容体の一つのファミリーであるＬｙ４９ファミリーを発現し、これはＩＴＩＭモチーフを含み、ヒトＫＩＲと類似の態様で機能する。しかしＬｙ４９免疫受容体はヒトＫＩＲと構造的相同性は有さず、細胞外Ｃ型レクチンドメインを含み、これにより、レクチンの分子スーパーファミリーのメンバーとなっている（Lanier et al., Immunology Today 17:86-91, 1996参照）。
【００９０】
明らかに、対立するキナーゼおよびホスファターゼにより媒介される免疫系の活性化シグナルおよび抑制性シグナルは、免疫系においてバランスを維持するのに非常に重要である。活性化シグナルが優勢な系は、自己免疫および炎症をもたらす。抑制性シグナルが優勢な免疫系は、感染細胞または癌細胞にチャレンジする能力が低い。新しい活性化または抑制性受容体を単離することは、受容体を介して変換される生体信号（単数または複数）を研究するのに非常に望ましい。さらに、かかる分子を同定することは、自己免疫、炎症および感染に関連する病的な状態を調節および処置する方法を提供する。
【００９１】
例えば、ＩＴＩＭモチーフを有する細胞表面受容体と相互作用するＯｖｒ１１０などのリガンドを、拮抗抗体または可溶化受容体と結合させることは、特定の免疫機能を、抑制された免疫機能と関連する疾患状態において活性化させるために用いることができる。一方、Ｏｖｒ１１０に特異的な拮抗抗体、またはＯｖｒ１１０受容体の可溶化形態を用いて、Ｏｖｒ１１０と細胞表面受容体との相互作用を遮断し、増大した免疫機能と関連する疾患状態における、特定の免疫機能を低減させることができる。逆に、ＩＴＩＭモチーフが欠如した受容体は、上記のように結合すると活性化シグナルを伝達するため、抗体および可溶化受容体の効果は、上記の逆となる。
【００９２】
他の例において、Ｏｖｒ１１０は細胞表面受容体（ＩＴＩＭ／ＩＴＡＭモチーフを有していても有していなくてもよい）に結合すると考えられ、Ｔ細胞、Ｂ細胞または他のタイプの細胞を通じて免疫システムに対する阻害効果を有することを示した。Ｏｖｒ１１０抗体はこの阻害効果をブロックして、免疫応答を増強することができた。この増強された免疫応答は、抗腫瘍、抗感染症、抗炎症の処置において有益であり得る。
【００９３】
逆に、アゴニストであるＯｖｒ１１０  ｍＡｂは、免疫応答阻害を誘導する反対の効果を有する。これは組織移植などの外来組織に対して宿主免疫応答が抑制されることが求められている場合の状況に有益である。
さらなる例において、他のＢ７ファミリーメンバーとの比較に基づいて、Ｏｖｒ１１０は、免疫系の細胞または他の細胞（腫瘍細胞そのものなど）上の活性化性受容体（activating receptor）に結合し、陽性シグナルを送る。この場合において、アンタゴニストＯｖｒ１１０  ｍＡｂは、受容体活性化をブロックし、アゴニストＯｖｒ１１０  ｍＡｂは受容体活性化を活性化する。
【００９４】
このように、自己免疫疾患を診断およびステージ分類する方法は、用いる技術によって制限される。したがって、自己免疫疾患を検出する感度の高い分子マーカーおよび細胞マーカーの必要性が存在する。処置方法を最適化するために、臨床的および病理学的なステージ分類を含めて自己免疫疾患を正確にステージ分類するための、分子マーカーの必要性が存在する。さらに、緩和後の自己免疫疾患の再発を検出できるマーカーを含む、自己免疫疾患の処置の進行をモニタリングするための感度の高い分子マーカーおよび細胞マーカーの必要性が存在する。
【００９５】
本発明は、従来の治療法の制限を克服し、また以下の詳細な記載から明らかであるさらなる利点を提供する、自己免疫疾患を処置するための代替方法を提供する。
本発明はまた、腫瘍細胞に直接作用することにより、または癌に対する免疫応答を調節することにより、癌を治療する方法を提供する。
【発明の概要】
【００９６】
本発明は、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｏｖｒ１１０との結合において参照抗体と競合し、配列番号２、１２、２２、３２および４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；および配列番号７、１７、２７、３７および４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、前記抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。さらに抗体は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
【００９７】
本発明はさらに、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域およびＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、ここで、軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号３、１３、２３、３３および４３、ならびにそれらの保存的改変からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が、配列番号８、１８、２８、３８および４８、ならびにそれらの保存的改変からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号４、１４、２４、３４および４４、ならびにそれらの保存的改変からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が、配列番号９、１９、２９、３９および４９、ならびにそれらの保存的改変からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号５、１５、２５、３５および４５、ならびにそれらの保存的改変からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が、配列番号１０、２０、３０、４０および５０、ならびにそれらの保存的改変からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記の抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、該抗体はＯｖｒ１１０に結合する。
【００９８】
本発明は、結合した抗体にも関する。これらは、増殖阻害剤または細胞傷害剤に結合してもよい。細胞傷害剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体および核酸分解酵素からなる群から選択されてもよい。毒素の例として、メイタンシン(maytansin)、メイタンシノイド類(maytansinoids)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、リシンまたはカリケアマイシン(calicheamicin)が挙げられるが、これらには限定されない。
哺乳動物細胞は癌細胞であってもよい。好ましくは、抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体は、in vivoでＯｖｒ１１０発現癌細胞の増殖を阻害する。哺乳動物細胞はまた、正常細胞であってもよい。
【００９９】
抗体は、細菌または哺乳動物細胞中で（または植物、酵母に限定されない他の生物によって）産生されてよい。好ましくは、癌は、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、肺癌および乳癌からなる群から選ばれる。本発明はまた、適切な細胞を培養し、抗体を該細胞培養物から回収することを含む、抗体を産生する方法に関する。
本発明はまた、該抗体および担体を含む組成物に関する。
該抗体は、細胞傷害剤に結合してもよい。細胞傷害剤は放射性同位体または他の化学療法薬であり得る。
【０１００】
本発明はまた、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を死滅させる方法であって、本発明の抗体と該癌細胞を接触させ、これにより該癌細胞を死滅させることを含む、前記方法に関する。癌細胞は、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、および乳癌からなる群から選択されてよい。
卵巣癌または乳癌は、卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌または転移性癌であってもよい。乳癌は、ＨＥＲ−２陰性乳癌であってもよい。本発明はまた、哺乳動物におけるＯｖｒ１１０発現癌を緩和する方法であって、該抗体の治療的に有効な量を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法に関する。
【０１０１】
さらに、本発明は、容器およびその中に収容された組成物を含む製品であって、該組成物が本明細書に記載した抗体を含む、前記製品に関する。この製品はまた、追加の要素、例えば、組成物が、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、肺癌または乳癌を処置するために用いることができることを示す添付文書を含んでもよい。
【０１０２】
本発明はまた、負のシグナル伝達免疫細胞Ｏｖｒ１１０受容体のシグナル伝達を調節する方法であって、Ｏｖｒ１１０を請求項３に記載の抗体に結合させ、これにより免疫機能の抑制を低減させることを含む、前記方法に関する。
【０１０３】
さらに、本発明は、免疫反応を調節する方法であって、Ｏｖｒ１１０を請求項３に記載の抗体に結合させ、これにより抑制された免疫機能を低減させることを含む、前記方法に関する。調節は免疫反応の増加または免疫反応の抑制の減少であり得る。該免疫反応は、癌細胞を対象にし得る。癌細胞は、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、子宮内膜癌、および乳癌からなる群から選択され得る。免疫反応は、腫瘍を取り囲むリンパ球数の増加、腫瘍におけるリンパ球の浸潤（infiltration）の増加、またはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および他の免疫細胞タイプを含むリンパ球の活性化の増大であってもよい。
【０１０４】
本発明はまた、リンパ球の活性化を増大させる方法であって、Ｏｖｒ１１０を抗−Ｏｖｒ１１０抗体に結合させ、これにより抑制された免疫機能を低減させることを含む前記方法に関する。リンパ球は、Ｔ細胞リンパ球であり得る。
本発明はまた、腫瘍細胞への抗体の結合によって、腫瘍細胞を死滅または阻害する方法に関してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、生きたヒト腫瘍細胞の表面への抗Ｏｖｒ１１０抗体の結合を示す免疫蛍光染色である。
【図２】図２は、生きたヒト腫瘍細胞による抗Ｏｖｒ１１０抗体の取り込みを示す免疫蛍光染色である。
【発明を実施するための形態】
【０１０６】
定義および一般技術
本明細書中で用いるヒト「Ｏｖｒ１１０」とは、細胞表面上に糖タンパク質として発現される、２８２個のアミノ酸のタンパク質を意味し、Ｏｖｒ１１０のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、WO 00/12758、癌特異的遺伝子（ＣＳＧ）Ｏｖｒ１１０；WO 99/63088、膜結合タンパク質ＰＲＯ１２９１；WO00/36107、ヒト卵巣癌抗原；WO 02/02624-A2、ヒトＢ７様タンパク質（Ｂ７−Ｌ）などに開示されており、これらの開示はここに参照として明示的に組み込まれる。Ｏｖｒ１１０タンパク質は分泌シグナルペプチドを含むため、アミノ酸３０〜２８２は、細胞表面のネイティブの成熟タンパク質上に存在する。本明細書中で用いるＯｖｒ１１０には、Ｏｖｒ１１０生物学的活性を有するタンパク質の対立遺伝子多型および保存的置換変異体も含まれる。
【０１０７】
Ｏｖｒ１１０は文献において、Ｂ７ｘ、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｓ１、Ｂ７−Ｈ４またはＢ７ｈ．５として知られている。ＮＣＢＩのRefSeqデータベースでは、登録番号NM_024626を「Ｔ細胞活性化阻害剤１（ＶＴＣＮ１）を含むホモサピエンスＶセットドメイン、ｍＲＮＡ」として注記している。このヌクレオチドおよびコードされたタンパク質NP_078902.1には、以下の概要が与えられている：
Ｂ７Ｈ４は、共刺激性タンパク質のＢ７ファミリー（CD80; NIM 112203参照）に属する。これらのタンパク質は、抗原提示細胞の表面上に発現され、Ｔリンパ球上のリガンド（例えば、CD28; NIM 186760）と相互作用する。（ＯＭＩＭにより供給）。
【０１０８】
Ｏｖｒ１１０について検討している文献のリストを下記に示す；これらの開示はここに参照として組み込まれる。
【表１】
0005391073.tif 000002
【表２】
0005391073.tif 000003
【０１０９】
３つの独立した出版物の群は、マウスおよびヒトにおけるＯｖｒ１１０を、共刺激分子のＴ細胞Ｂ７ファミリーの新たなメンバー、Ｔ細胞の機能の活性化／阻害を非常にしっかりと制御する分子の重要なクラスと同定した（Prasad et al., B7S1, a novel B7 family member that negatively regulates T cell activation, Immunity 18:863-73 (2003)、 Sica et al., B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulates T cell immunity,  Immunity 18:849-61 (2003)、および Zang et al., B7x: a widely expressed B7 family member that inhibits T cell activation,  Proc. Natl Acad. Sci USA 100:10388-92 (2003)）。
【０１１０】
Ｂ７Ｓ１マウス遺伝子の、推定されるアミノ酸配列（Prasad 2003）は、本発明者らが以前同定したＯｖｒ１１０分子と高度に相同的であり、ヒトＢ７−Ｈ４／Ｂ７ｘ分子の推定される配列（Sica 2003、Zang 2003）はＯｖｒ１１０と同一であった。さらなる出版物は、乳癌（Tringer 2005、Salceda 2005）、卵巣癌（Salceda 2005、Tringer 2006、Simon 2006、Kryczek J Exp Med 2006、Bignotti 2006）、肺癌（Sun 2006）および腎細胞癌（Krambeck 2006、Chen 2006）を含む様々な癌におけるＢ７−Ｈ４の過剰発現を示した。
さらに、機能的研究は、Ｂ７−Ｈ４と抑制マクロファージ集団との関連（Kryczek J Exp Med 2006）、腫瘍血管新生（Krambeck 2006）およびインターロイキン因子産生およびＴ細胞の活性化、増殖および腫瘍への浸潤を含む免疫制御（Mao 2006、Kryczek J Immunol 2006）について解明した。
【０１１１】
本発明者らは以前抗Ｏｖｒ１１０抗体を産生し特定し、それはＷＯ  ２００４／０１０７５６、ＷＯ  ２００６／０５３１１０およびＷＯ  ２００６／０７４４１８に記載されており、これらは本発明の一部として、参照として本明細書に明示的に組み込まれる。フローサイトメトリーによる間接的な免疫蛍光分析により、さらに、上記の筆者らによって記載されているように、本発明者らのＯｖｒ１１０モノクローナル抗体が活性化したＴリンパ球集団および腫瘍細胞へ結合することを確認した。以前および本明細書に記載された、本発明のこれらの抗体は、Ｏｖｒ１１０に特異的に結合し、それらが、活性化、増殖および腫瘍浸潤などのＴ細胞（および他の免疫細胞）制御、免疫学的監視の回避（免疫応答の抑制）、インターロイキン因子（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−ｘ）産生、腫瘍血管新生およびベータ細胞活性化を含む、Ｂ７−Ｈ４の機能を調節するための理想的な治療の候補となる特性を実証する。
【０１１２】
さらに、本発明の抗体は、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、膵臓癌、腎細胞癌および頭頸部癌を患った人たちへの治療剤として有用である。該抗体は、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を死滅すること、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍の増殖を阻害すること、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍を退縮させること、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍を有する個体の生存時間を延長すること、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍の転移を減少させること、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍に対する免疫応答を誘導すること、Ｏｖｒ１１０発現細胞に対する免疫応答阻害を減少することまたはＯｖｒ１１０発現細胞の血管形成または血管新生を減少することにより、治療的効果を有し得る。
【０１１３】
本明細書において用語「抗体」（Ａｂ）とは、それが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性（multispecific）抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントを含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書中では、「抗体」と同義的に用いる。
【０１１４】
「単離された抗体」は、その天然の環境の成分から同定、分離および／または回収されたものである。その天然の環境の混入成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましくは、抗体を、（１）ローリー法により決定される抗体の重量によって９５％より高くまで、および最も好ましくは９９％より高くまで精製するか、（２）回転カップ配列決定装置（spinning cup sequenator）を用いることにより、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度に精製するか、または（３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、還元性の条件もしくは非還元性の条件の下で、クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を用いて、均質に精製する。単離された抗体は、in situで組換え細胞内にある抗体を含む。なぜならば、その抗体の天然の環境のうちの少なくとも１種類の成分が存在しないためである。しかし、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【０１１５】
基本的な４鎖の抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖、および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、５つの基本のヘテロ四量体単位と、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとからなり、したがって、１０個の抗原結合部位を含み、一方分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、２〜５個の基本の４鎖単位とＪ鎖とを含む多価集合体を形成することができる）。
【０１１６】
ＩｇＧの場合において、４鎖単位は、一般的に、約１５０，０００ダルトンである。各々のＬ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に結合しており、一方２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに依存して、１つまたは２つ以上のジスルフィド結合により互いに結合している。各々のＨ鎖およびＬ鎖はまた、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、可変領域（ＶＨ）を有し、続いて、αおよびγ鎖の各々について３つの定常領域（ＣＨ）ならびに［ＬおよびＦアイソタイプについて４つのＣＨ領域を有する。各６Ｌ鎖は、Ｎ末端において可変領域（ＶＬ）、続いてその他方の末端において定常領域（ＣＬ）を有する。
【０１１７】
ＶＬはＶＨと共に整列し、ＣＬは、重鎖の第１の定常領域（ＣＨＩ）と共に整列する。
特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間で界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬとの対形成により、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Teff and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton and Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6を参照されたい。
【０１１８】
すべての脊椎動物種由来のＬ鎖は、これらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に識別できる種類の１つに割り当てることができる。これらの重鎖（ＣＨ）の定常領域のアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、それぞれα、δ、ε、γおよびμと示される重鎖を有する。γおよびαクラスは、さらに、ＣＨの配列および機能における比較的主要でない差異に基づいてサブクラスに分けられ、例えばヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
【０１１９】
用語「可変」とは、可変領域の一定のセグメントが、抗体間で配列が大きく異なるという事実を意味する。Ｖ領域は抗原結合を媒介し、ある特定の抗体の特定の抗原への特異性を規定する。しかし、可変性は、可変領域の１〜１０個のアミノ酸範囲にわたって均一に分散されてはいない。その代わり、Ｖ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる１５〜３０個のアミノ酸の比較的不変の伸長物からなり、これは、「超可変領域」と呼ばれる各々が９〜１２アミノ酸長の極めて可変性の高いより短い領域により分離されている。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変領域は、各々４つのＦＲを含み、主としてＰシート立体配置を採り、３つの超可変領域により結合されており、この領域は、Ｐシート構造に結合するループを形成し、そしてある場合はＰシート構造の一部を形成する。
【０１２０】
各々の鎖における超可変領域は、ＦＲによりまとめて密接に保持され、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)参照）。定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体の抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）への関与を示す。
【０１２１】
用語「超可変領域」とは、本明細書中で用いる場合、抗体の抗原結合に関与するアミノ酸残基を意味する。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬ中のおよその残基２４〜３４（Ｌ１）、５０５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）の周囲、ならびにＶＨ中のおよそ１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（１１３）の周囲；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）および／または「超可変ループ」（例えば、ＶＬ中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｕ）、ならびにＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（１−１２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）からの残基を含む。
【０１２２】
本明細書中で用いる場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に存在する可能性のある突然変異体を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に指向される。さらに、異なる決定因子（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に指向される。これらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、これらが、他の抗体が混入することなく合成され得るという点で、有利である。
【０１２３】
修飾語句「モノクローナル」は、特定の方法による抗体の産生を必要とすることと解釈すべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ方法により調製しても、または細菌性、真核生物動物もしくは植物細胞における組換えＤＮＡ方法を用いて作製してもよい（例えば米国特許第4,816,567号参照）。「モノクローナル抗体」は、また、ファージ抗体ライブラリから、例えばClackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載されている手法を用いて単離してもよい。
【０１２４】
本明細書中のモノクローナル抗体は、これらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて「キメラ」抗体ならびにそのフラグメントを含み、該「キメラ」抗体とは、その重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的であり、一方、残りの１または２以上の鎖が、他の種に由来するかまたは他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同的であるものである（米国特許第4,816,567号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)参照）。本明細書において重要なキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変領域抗原結合配列およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化 (primatized)」抗体を含む。
【０１２５】
「完全な」抗体は、抗原結合部位、ならびにＣＬ、ならびに少なくとも重鎖定常領域、ＣＨＩ、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常領域は、ネイティブ配列定常領域（例えばヒトネイティブ配列定常領域）であっても、そのアミノ酸配列変異体であってもよい。好ましくは、完全な抗体は、１つまたは２つ以上のエフェクター機能を有する。
【０１２６】
「抗体フラグメント」は、完全な抗体の一部、好ましくは完全な抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディー(diabody)；直鎖状抗体（米国特許第5,641,870号、Example2；Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]参照）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重得意性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメント呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの「Ｆｃ」フラグメントが生じ、表示は、容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂフラグメントは、Ｌ鎖全体、ならびにＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）および１つの重鎖の第１定常領域（ＣＨＩ）からなる。
【０１２７】
各々のＦａｂフラグメントは、抗原結合に関して１価である。すなわち、各々のＦａｂフラグメントは、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により１つの大きいＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これは、ジスルフィド架橋された２つのＦａｂフラグメントにほぼ相当し、２価の抗原結合活性を有し、なお抗原を架橋することができる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つまたは２つ以上のシステインを含む追加のいくつかの残基をＣＨＩ領域のカルボキシ末端において有することにより、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域の１または２以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’についての、本明細書中での表示である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、もともとはこれらの間にヒンジのシステインを有する８つのＦａｂ’フラグメントの対として産生された。抗体フラグメントの他の化学的結合も知られている。
【０１２８】
Ｆｃフラグメントは、両方のＨ鎖がジスルフィドによりまとめて保持されたカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列により決定され、この領域はまた、ある種の細胞上に見出されるＦｃ受容体（ＦｃＲ）により認識される部分である。
【０１２９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。このフラグメントは、密接な非共有結合における、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つの領域の折り畳みから、６つの超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３つのループ）が発出し、これらは、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変領域（または抗原に特異的なＣＤＲを３つのみ含むＦｖの半分）ですら、抗原を認識し結合する能力を有するが、完全な結合部位よりも低い親和性においてである。
【０１３０】
「単鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記され、これは単一のポリペプチド鎖に結合したＶＨおよびＶＬ抗体領域を含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、さらにＶＨおよびＶＬ領域の間にポリペプチドリンカーを含み、これによって、ｓＦｖは、抗原結合のための所望の構造を形成することができる。ｓＦｖの概説については、以下を参照のこと：PluckthunによるThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995、下記。
【０１３１】
用語「ダイアボディー」とは、小さい抗体フラグメントを意味し、これは、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間に対形成がもたらされ、これによって２価のフラグメント、すなわち２つの抗原結合部位を有するフラグメントが得られるように、ＶＨおよびＶＬ領域の間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖフラグメント（前の段落参照）を構築することにより調製される。二重特異性ダイアボディーは、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体であり、ここで、２つの抗体のＶＨおよびＶＬ領域は、異なるポリペプチド鎖に存在する。ダイアボディーは、例えばEP 404,097; WO 93/11161;およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)において、より完全に説明され、該開示は参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１３２】
「ネイティブ配列」のポリペプチドは、天然のものに由来するポリペプチド（例えば抗体）と同一のアミノ酸配列を有するものである。このようなネイティブ配列のポリペプチドは、天然のものから単離しても、または組換えもしくは合成手段により産生してもよい。したがって、ネイティブ配列のポリペプチドは、天然に存在するヒトポリペプチド、マウスポリペプチドまたは任意の他の哺乳動物種からのポリペプチドのアミノ酸配列を有してもよい。
【０１３３】
用語「アミノ酸配列変異体」とは、ある程度にネイティブ配列のポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、Ｏｖｒ１１０のアミノ酸配列変異体は、ネイティブ配列のＯｖｒ１１０と少なくとも約７０％の相同性、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の相同性、および最も好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。アミノ酸配列変異体は、ネイティブのアミノ酸配列のアミノ酸配列内のある位置において、置換、欠失および／または挿入を有し得る。
【０１３４】
代替的な転写スプライシングから産生されるＯｖｒ１１０の変異体の例は、ＷＯ  ２００４／０５３０７９中のＯｖｒ１１０ｖ１およびｄｖ−Ｂ７−Ｈ４（Ｇｅｎｅｂａｎｋ登録番号ＤＱ１０３５７５および上記Sun et al.）を含み、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。本発明の抗体は上記で論じた治療的活性を、これらのＯｖｒ１１０変異体に対しても有する。
【０１３５】
語句、抗体の「機能的フラグメントまたは類似体」とは、全長抗体と共通する定性的生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的フラグメントまたは類似体は、高親和性の受容体であるＦｃεＲＩに結合するＩｇＥ免疫グロブリン分子の能力を有することを防止または実質的に低減するような様式で、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合することができるものである。
【０１３６】
「相同性」とは、最大のパーセンテージの相同性を達成するために、配列をアラインメントさせ、所要に応じて間隙を導入した後に同一である、アミノ酸配列変異体中の残基のパーセンテージとして定義される。アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野において十分知られている。配列の類似性を、任意の一般的な配列分析アルゴリズム、例えばＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴまたは他の変法のSmith-Watermanアラインメントにより測定してもよい。T. F. Smith and M. S. Waterman, J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981) およびW.R. Pearson, Genomics 11:635-650 (1991)を参照のこと。
【０１３７】
非ヒト（例えば、げっ歯動物）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類の、超可変領域からの残基により置換されている、ヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換されている。
【０１３８】
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体中またはドナー抗体中に見出されない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに精巧にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的にすべてを含み、ここで、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてとは、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてとは、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意にまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。
【０１３９】
本明細書中において、「内部移行する」抗Ｏｖｒ１１０抗体は、哺乳動物細胞上でＯｖｒ１１０（すなわち細胞表面Ｏｖｒ１１０）に結合すると、細胞により取り込まれる（すなわち進入する）ものである。内部移行する抗体は、当然、抗体フラグメント、ヒトまたはヒト化抗体および抗体結合体を含む。治療的用途のために、in vivoでの内部移行が意図される。
【０１４０】
内部移行する抗体分子の数は、Ｏｖｒ１１０発現細胞、特にＯｖｒ１１０発現癌細胞を死滅させるのに十分または適切な数である。抗体または抗体結合体の効能に依存して、いくつかの例において、単一の抗体分子の細胞中への取り込みは、該抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある毒素は、殺傷能力が高いので、抗体に結合した毒素の１分子の内部移行が、腫瘍細胞を死滅させるのに十分である。
【０１４１】
抗Ｏｖｒ１１０抗体が、哺乳動物細胞上のＯｖｒ１１０に結合する際に内部移行するか否かは、以下の実験例において記載するものを含むさまざまなアッセイにより決定することができる。例えば、in vivoでの内部移行を試験するために、試験抗体を標識し、ある細胞の表面上でＯｖｒ１１０を発現することが知られている動物中に導入する。この抗体を、放射性標識するかまたは、例えば蛍光または金粒子で標識することができる。
このアッセイに適する動物には、哺乳動物、例えばヒトＯｖｒ１１０発現腫瘍移植または異種移植を含むヌードマウスまたはＳＣＩＤマウス、またはヒトＯｖｒ１１０をトランスフェクトした細胞が導入されたマウス、またはヒトＯｖｒ１１０導入遺伝子を発現する遺伝子組換えマウスが含まれる。
【０１４２】
適切なコントロールには、試験抗体が投与されていないかまたは関連しない抗体が投与された動物、および目的の細胞上の他の抗原に対する抗体（この抗体は抗原に結合すると内部移行することが知られている）が投与された動物が含まれる。抗体を、動物に、例えば静脈内注射または腹腔内注射により投与することができる。好適な時間間隔において、この動物からの腫瘍または組織切片を、既知の方法を用いて、または以下の実験例中に記載したように調製し、光学顕微鏡または電子顕微鏡により、結合および内部移行、および細胞中の内部移行した抗体の位置について分析することができる。ＰＥＴなどの、生きている動物のイメージング方法もまた腫瘍に対する抗体の一特定を実施するのに用いることができる。
【０１４３】
in vitroでの内部移行について、細胞を、組織培養皿中で、培養培地に加えられた関連する抗体の存在または非存在下においてインキュベートし、所望の時点において顕微鏡分析のために加工することができる。細胞中の内部移行した標識抗体の存在を、顕微鏡により、または放射性標識した抗体を用いる場合にはオートラジオグラフィーにより、直接的に視覚化することができる。代替的に、定量的な生化学的アッセイにおいて、Ｏｖｒ１１０発現細胞を含む細胞の集団を、in vitroまたはin vivoで放射性標識した試験抗体と接触させ、細胞（in vivoで接触させた場合には、次に、好適な時間の後に細胞を単離する）を、プロテアーゼで処理するか、またはこれに酸洗浄を施して、細胞表面上の内部移行していない抗体を除去する。
【０１４４】
細胞を粉砕し、細胞の各々のバッチに付随するプロテアーゼ耐性の１分当たりの放射線計測値（ｃｐｍ）の値を、ホモジネートをシンチレーションカウンターに通過させることにより測定する。放射性標識抗体の既知の特定の活性に基づいて、細胞あたり内部移行した抗体分子の数を、粉砕した細胞のシンチレーションカウントから推定することができる。細胞をin vitroで、好ましくは溶液形態で、例えば、細胞を培養皿またはフラスコ中の細胞培養培地に加え、抗体を培地と十分に混合して、抗体に対する細胞の均一な曝露を確実にすることにより、抗体と「接触」させる。培養培地に加える代わりに、細胞を試験抗体とを試験管内のＰＢＳなどの等張性溶液中で所望の時間にわたり接触させることができる。患者に投与された際には、細胞は抗体とin vivoで試験抗体を投与する任意の好適な方法、例えば以下に記載する投与方法により接触させられる。
【０１４５】
in vivoでＯｖｒ１１０発現細胞に結合した際の抗体の内部移行の速度が速くなるにしたがって、例えば細胞傷害性免疫結合体による標的Ｏｖｒ１１０発現細胞に対する所望の死滅または増殖阻害効果を、より迅速に達成することができる。好ましくは、抗Ｏｖｒ１１０抗体の内部移行動態は、Ｏｖｒ１１０発現標的細胞の迅速な死滅に有利なものである。
【０１４６】
したがって、抗Ｏｖｒ１１０抗体は、in vivoで抗体を投与してから好ましくは２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内、さらにより好ましくは約３０分〜１時間以内、最も好ましくは約３０分以内に、内部移行の迅速な速度を示すことが望ましい。本発明は、in vivoまたはin vitroで抗Ｏｖｒ１１０抗体を導入した時から約１５分もの速さで内部移行する抗体を提供する。抗体は、好ましくは、細胞表面上のＯｖｒ１１０に結合した際に、数時間以内、好ましくは１時間以内、さらにより好ましくは１５〜３０分以内に、細胞中に内部移行する。
【０１４７】
試験抗体が、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体（ＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマにより産生された抗体を含む）が結合するエピトープと同一のエピトープに結合することについて競合することができるか否かを試験するために、クロスブロッキング（cross-blocking）アッセイ（例えば競合的ＥＬＩＳＡアッセイ）を行うことができる。例示的な競合的ＥＬＩＳＡアッセイにおいては、Ｏｖｒ１１０で被覆したマイクロタイタープレートのウェルまたはＯｖｒ１１０で被覆したセファロースビーズを、候補の競合的抗体と共に、またはこれを伴わずにプレインキュベートし、次にビオチン標識した本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体を加える。ウェル中でまたはビーズ上でＯｖｒ１１０抗原に結合した、標識抗Ｏｖｒ１１０抗体の量を、アビジン−ペルオキシダーゼ結合体および適切な基質を用いて測定する。
【０１４８】
あるいは、抗Ｏｖｒ１１０抗体を、例えば放射性標識もしくは蛍光標識または幾つかの他の検出可能な標識および測定可能な標識で標識することができる。抗原に結合する標識抗Ｏｖｒ１１０抗体の量は、候補の競合的抗体（試験抗体）が、抗原上の同一のエピトープに結合することについて競合する能力に対して逆相関を有する。すなわち、同一のエピトープへの試験抗体の親和性が大きくなるにしたがって、標識した抗Ｏｖｒ１１０抗体の抗原被覆ウェルへの結合がより少なくなる。
【０１４９】
候補の競合的抗体の不存在において（しかし、既知の非競合的抗体の存在下であってもよい）平行して行うコントロールと比較して、候補の競合的抗体が、抗Ｏｖｒ１１０抗体の結合を少なくとも２０％、好ましくは少なくとも２０〜５０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％遮断することができる場合には、候補の競合的抗体は、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体と同一のエピトープに実質的に結合する抗体であるか、または、これと同一のエピトープに結合することについて競合する抗体であると考えられる。同一の定量的数値データに到達するために、このアッセイの変化を行うことが可能であると理解される。
【０１５０】
指定された抗体、例えば次のモノクローナル抗体Ｏｖｒ１１０．Ａ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１３．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ３１．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ５７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ７２．１（前にＯｖｒ１１０Ａ２２．１として同定）、Ｏｖｒ１１０．Ａ７７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８９、Ｏｖｒ１１０．Ａ９９．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０２．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０７、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ３．２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．１．、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ８、Ｏｖｒ１１０．Ｃ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１１．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１２．１、
【０１５１】
Ｏｖｒ１１０．Ｃ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１６．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｄ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２、Ｏｖｒ１１０．Ｉ３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ４、Ｏｖｒ１１０．Ｉ６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ９、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１４、Ｏｖｒ１１０．１５、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ１、Ｏｖｒ１１０．Ｊ２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ３、
【０１５２】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２６およびＯｖｒ１１０．Ｑ２７の「生物学的特性」を有する抗体は、同一の抗原に結合する他の抗体から区別する、その指定抗体の生物学的特徴の、１つまたは２つ以上を有するものであり、
【０１５３】
Ｏｖｒ１１０．Ａ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１３．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ３１．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ５７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ７２．１（前にＯｖｒ１１０Ａ２２．１として同定）、Ｏｖｒ１１０．Ａ７７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８９、Ｏｖｒ１１０．Ａ  ９９．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０２．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０７、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ３．２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．１．、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ８、Ｏｖｒ１１０．Ｃ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１１．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１２．１、
【０１５４】
Ｏｖｒ１１０．Ｃ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１６．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｄ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２、Ｏｖｒ１１０．Ｉ３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ４、Ｏｖｒ１１０．Ｉ６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ９、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１４、Ｏｖｒ１１０．１５、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ１、Ｏｖｒ１１０．Ｊ２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ３、
【０１５５】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２６およびＯｖｒ１１０．Ｑ２７は、
【０１５６】
Ｏｖｒ１１０．Ａ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１３．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ３１．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ５７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ７２．１（前にＯｖｒ１１０Ａ２２．１として同定）、Ｏｖｒ１１０．Ａ７７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８９、Ｏｖｒ１１０．Ａ９９．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０２．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０７、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ３．２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．１．、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ８、Ｏｖｒ１１０．Ｃ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１１．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１２．１、
【０１５７】
Ｏｖｒ１１０．Ｃ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１６．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｄ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２、Ｏｖｒ１１０．Ｉ３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ４、Ｏｖｒ１１０．Ｉ６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ９、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１４、Ｏｖｒ１１０．１５、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ１、Ｏｖｒ１１０．Ｊ２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ３、
【０１５８】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２６およびＯｖｒ１１０．Ｑ２７が結合するものと同じエピトープに結合し、
【０１５９】
例えば、以下のモノクローナル抗体Ｏｖｒ１１０．Ａ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１３．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ３１．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ５７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ７２．１（前にＯｖｒ１１０Ａ２２．１として同定）、Ｏｖｒ１１０．Ａ７７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８９、Ｏｖｒ１１０．Ａ９９．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０２．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０７、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ３．２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．１．、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ８、Ｏｖｒ１１０．Ｃ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１１．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１２．１、
【０１６０】
Ｏｖｒ１１０．Ｃ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１６．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｄ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２、Ｏｖｒ１１０．Ｉ３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ４、Ｏｖｒ１１０．Ｉ６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ９、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１４、Ｏｖｒ１１０．１５、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ１、Ｏｖｒ１１０．Ｊ２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ３、
【０１６１】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２６およびＯｖｒ１１０．Ｑ２７の、Ｏｖｒ１１０への結合について競合するか、またはＯｖｒ１１０への結合を遮断し、in vivoでＯｖｒ１１０発現腫瘍細胞を標的化することができ、in vivoで哺乳動物細胞上のＯｖｒ１１０に結合して内部移行することができる。
【０１６２】
同様に、Ｏｖｒ１１０．Ａ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１３．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ３１．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ５７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ７２．１（前にＯｖｒ１１０Ａ２２．１として同定）、Ｏｖｒ１１０．Ａ７７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８７．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ８９、Ｏｖｒ１１０．Ａ９９．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０２．１、Ｏｖｒ１１０．Ａ１０７、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ３．２、Ｏｖｒ１１０．Ｃ４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．１．、Ｏｖｒ１１０．Ｃ５．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ８、Ｏｖｒ１１０．Ｃ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１０．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１１．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１２．１、
【０１６３】
Ｏｖｒ１１０．Ｃ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１６．１、Ｏｖｒ１１０．Ｃ１７．１、Ｏｖｒ１１０．Ｄ９．１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２、Ｏｖｒ１１０．Ｉ３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ４、Ｏｖｒ１１０．Ｉ６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ９、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１４、Ｏｖｒ１１０．１５、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｉ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｉ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ１、Ｏｖｒ１１０．Ｊ２、Ｏｖｒ１１０．Ｊ３、
【０１６４】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２６およびＯｖｒ１１０．Ｑ２７抗体の生物学的特性を有する抗体は、前記抗体と同じエピトープ結合、標的化、内部移行、腫瘍増殖阻害および細胞傷害性の特性を有する。
【０１６５】
用語「アンタゴニスト」抗体とは、最も広い意味で用いられ、本明細書中に開示されるネイティブのＯｖｒ１１０タンパク質の生物学的活性を、部分的、または完全に、遮断、阻害または中和する抗体を含む。Ｏｖｒ１１０ポリペプチドのアンタゴニストを同定するための方法は、Ｏｖｒ１１０ポリペプチドまたはＯｖｒ１１０を細胞表面上で発現する細胞を、候補のアンタゴニスト抗体と接触させること、および、Ｏｖｒ１１０ポリペプチドと通常関連する１または２以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することを含んでもよい。アゴニスト抗体は、Ｏｖｒ１１０の機能を増強、活性化または促進する抗体を含む。
【０１６６】
「Ｏｖｒ１１０を発現する腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体」または「増殖阻害」抗体は、in vitroまたはin vivoで、Ｏｖｒ１１０を発現するかまたは過剰発現する癌細胞に結合して、測定可能な増殖阻害をもたらすものである。好ましい増殖阻害抗Ｏｖｒ１１０抗体は、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍細胞（例えば卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、子宮内膜癌細胞、頭頸部癌細胞、腎細胞癌細胞、肺癌細胞および乳癌細胞）の増殖を、適切なコントロールと比較して２０％以上、好ましくは約２０％〜約５０％、およびさらにより好ましくは５０％以上（例えば約５０％〜約１００％）阻害し、該コントロールは、典型的には、試験する抗体で処置していない腫瘍細胞である。
【０１６７】
増殖阻害を、細胞培養物中の約０．１〜３０ｐｇ／ｍＬまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、ここで、増殖阻害は、腫瘍細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に決定される。in vivoでの腫瘍細胞の増殖阻害は、下記の実験例の章において記載するように、さまざまな方法で決定することができる。抗Ｏｖｒ１１０抗体を、約１ｐｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇで投与することにより、腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞増殖の減少が、抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月以内、好ましくは約５〜３０日以内にもたらされる場合に、抗体はin vivoで増殖阻害性である。
【０１６８】
「アポトーシスを誘発する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡのフラグメント化、細胞収縮、小胞体の拡大、細胞フラグメント化および／または膜小胞の形成（アポトーシス体と呼ばれる）により決定される、プログラムされた細胞死を誘発する抗体である。細胞は通常Ｏｖｒ１１０を過剰発現するものである。好ましくは、細胞は、腫瘍細胞、例えば卵巣細胞、膵臓細胞、肺細胞または乳房細胞である。種々の方法が、アポトーシスに関連する細胞の事象を評価するのに利用可能である。
【０１６９】
例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転座をアネキシン結合により測定することができ；ＤＮＡフラグメント化を、ＤＮＡラダリング（laddering）により評価することができ；およびＤＮＡフラグメント化に伴う核／クロマチン縮合を、低二倍体細胞の任意の増大により評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘発する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞に対して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍のアネキシン結合の誘発をもたらすものである。
【０１７０】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を意味し、抗体アイソタイプにより変化する。抗体エフェクター機能の例には：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方調節；およびＢ細胞活性化が含まれる。
【０１７１】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」とは、細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合してその後標的細胞を細胞毒で殺傷することを可能にするような、細胞傷害性の形態を意味する。抗体は細胞傷害性細胞を「武装させ(arm)」、このような殺傷に絶対的に必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。
【０１７２】
造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４頁の表３に要約されている。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、in vitro  ＡＤＣＣアッセイ（例えば米国特許第5,500,362号または5,821,337号に記載されているアッセイ）を行ってもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。代替的に、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、in vivoで、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【０１７３】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明する。好ましいＦｃＲは、ネイティブ配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）を結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、対立遺伝子多型および代替的にこれらの受容体のスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制受容体」）が含まれ、これらは、主にこの細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をその細胞質ドメイン中に含む。
【０１７４】
抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢは、免疫受容体チロシンベースの抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を、その細胞質ドメイン中に含む（Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)のreview M.を参照）。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126.330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるべきものを含む、他のＦｃＲは、本明細書中の用語「ＦｃＲ」により包含される。この用語はまた、母系性のＩｇＧの胎児への輸送に関連する新生児受容体、ＦｃＲｎを含む（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【０１７５】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは２つ以上のＦｃＲを発現しエフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれ；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、天然の供給源、例えば血液から単離することができる。
【０１７６】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的補体経路の活性化は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、これらの同族の抗原に結合する（適切なサブクラスの）抗体への結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているＣＤＣアッセイを行うことができる。
【０１７７】
用語「癌」および「癌性」とは、制御されない細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を意味するかまたは説明する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病またはリンパ様悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。このような癌のより特定的な例には、扁平細胞癌（例えば上皮性扁平細胞癌）、ならびに小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、直腸結腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、黒色腫、多発性骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫、脳腫瘍、頭頸部癌、ならびに関連する転移が含まれる。
【０１７８】
「Ｏｖｒ１１０発現細胞」とは、内因性のまたはトランスフェクトされたＯｖｒ１１０を細胞表面上で発現する細胞である。「Ｏｖｒ１１０発現癌」とは、細胞表面上に存在するＯｖｒ１１０タンパク質を有する細胞を含む癌である。「Ｏｖｒ１１０発現癌」は、抗Ｏｖｒ１１０抗体が結合して癌について治療的効果を有することができるために十分なレベルのＯｖｒ１１０を、この細胞の表面上で産生する。Ｏｖｒ１１０を「過剰発現する」癌は、同一の組織型の非癌性細胞と比較して顕著に高いレベルのＯｖｒ１１０を、この細胞表面において有するものである。
【０１７９】
このような過剰発現は、遺伝子増幅により、または増大した転写もしくは翻訳により生じ得る。Ｏｖｒ１１０過剰発現は、診断または予後診断アッセイにおいて、細胞の表面上に存在するＯｖｒ１１０タンパク質の増大したレベルを評価すること（例えば免疫組織化学的アッセイ；ＦＡＣＳ分析）により決定され得る。代替的に、または付加的に、細胞中のＯｖｒ１１０がコードする核酸またはｍＲＮＡのレベルを、例えば、蛍光in situハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に刊行されたWO98/45479参照）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法、例えばリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定してもよい。
【０１８０】
また、Ｏｖｒ１１０過剰発現を、生物学的液体例えば血清中における抗原を、例えば抗体に基づくアッセイを用いて測定することにより、検討してもよい（また、例えば米国特許第4,933,294号、１９９０年６月１２日刊行；W091/05264、１９９１年４月１８日刊行；米国特許第5,401,638号、１９９５年３月２８日刊行；およびSias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)参照）。熟練した実施者は、上記のアッセイの他にも、多様なin vivoアッセイを利用することができる。
【０１８１】
例えば、患者の体内の細胞を任意に検出可能な標識、例えば放射性同位体で標識した抗体に曝露して、患者における該抗体の細胞への結合を、例えば放射性についての外部走査により、または前に抗体に曝露した患者から採取した生検を分析することにより評価してもよい。Ｏｖｒ１１０発現癌は、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、腎細胞癌、肺癌または乳癌を含む。体液は、身体の全ての内液、分泌液、放出および派生される液体を含み、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、涙、腹水、腹腔洗浄液、リンパ液、胆汁、精液、膿汁、羊水、房水、耳垢、乳糜、糜粥、腸液、月経、乳、粘液、胸膜液、汗、膣の潤滑液、嘔吐物、脳脊髄液および滑液である。
【０１８２】
癌を処置するかまたは癌の症状を緩和する目的のための「哺乳動物」とは、任意の哺乳動物を意味し、ヒト、家畜（domestic and farm animals）、ならびに動物園の、スポーツの、またはペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１８３】
「処置する」または「処置」または「緩和」は、治療的処置および予防的または防止的手段の両方を意味し、ここで、目的は、標的となる病理学的状態または障害を防止または遅延させる（低下させる）ことである。処置を必要としているものには、すでに障害を有しているもの、および障害を有する傾向があるもの、または障害が予防されるべきであるものが含まれる。対象または哺乳動物は、本発明の方法により抗Ｏｖｒ１１０抗体の治療量が投与された後に、患者が、以下の１または２以上の観察可能なおよび／または測定可能な低減または欠如を示す場合に、Ｏｖｒ１１０発現癌について首尾よく「処置される」：
【０１８４】
癌細胞数の減少または癌細胞の欠如；腫瘍の大きさの減少；軟組織および骨中への癌の拡大を含む、癌細胞の末梢器官中への浸潤の阻害（すなわち、ある程度までの遅延および好ましくは停止）；腫瘍転移または血管形成の阻害（すなわち、ある程度までの遅延および好ましくは停止）；腫瘍増殖のある程度までの阻害；および／または特定の癌に関連する１つまたは２つ以上の症状の、ある程度までの緩和；罹患率および死亡率の低下、ならびに生活の質の問題における改善。抗Ｏｖｒ１１０抗体が、存在する癌細胞の増殖を防止し、および／またはこれを死滅させることができる程度までを、細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であるものとすることができる。これらの徴候または症状の低減はまた、患者により感知され得る。
【０１８５】
疾患における処置および改善の成功を評価するための上記のパラメーターは、医師に十分知られている常習的な手順により容易に測定可能である。癌療法のために、例えば疾患の無増悪期間（time to disease progression：ＴＴＰ）を評価し、および／または奏功率（response rate：ＲＲ）を決定することにより、効能を測定することができる。
【０１８６】
用語「治療有効量」は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」のに有効な抗体または薬剤の量を意味する。癌の場合、薬剤の治療有効量により、癌細胞数が減少し；腫瘍サイズが減少し；末梢器官中への癌細胞の浸潤が阻害され（すなわち、ある程度まで遅延および好ましくは停止され）；腫瘍転移が阻害され（すなわち、ある程度まで遅延および好ましくは停止され）；腫瘍増殖がある程度まで阻害され；および／または癌に関連する症状の１つまたは２つ以上が、ある程度まで緩和され得る。前記「処置する」の定義を参照されたい。薬剤は、存在する癌細胞の増殖を防止および／または死滅させることができる程度に細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。
【０１８７】
「慢性」投与とは、急性の方式とは対照的に、１種または２種以上の薬剤を、長期間にわたり最初の治療的効果（活性）が維持されるように、連続的な方式で投与することを意味する。
「間欠性」投与とは、中断なく連続的には行われず、むしろ周期的な性質の処置である。
【０１８８】
１種または２種以上の他の治療剤と「組み合わせて」の投与は、任意の順序での、同時（併用）投与および連続投与を含む。
本明細書中で用いる「担体」には、用いられる投与量および濃度において曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒であり、薬学的に許容される担体、添加剤または安定剤が含まれる。
【０１８９】
しばしば、生理学的に許容し得る担体は、水性のｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容し得る担体の例には、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール類、例えばマンニトールもしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびPLURONICS（登録商標）が含まれる。
【０１９０】
本明細書中で用いる用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害もしくは防止する物質、および／または細胞の破壊を生じる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン（adriamicin）、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、酵素およびこのフラグメント、例えば核酸分解酵素、抗生物質、ならびに毒素、例えば小分子毒素または細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素として活性な毒素であって、これらのフラグメントおよび／または変種を含むもの、例えばゲロニン（gelonin）、リシン、サポリンならびに以下に開示するさまざまな抗腫瘍剤または抗癌剤を含むことを意図する。他の細胞傷害剤を以下に記載する。殺腫瘍剤は、腫瘍細胞の破壊をもたらす。
【０１９１】
本明細書中で用いる際には、「増殖阻害剤」は、細胞、特にＯｖｒ１１０発現癌細胞の増殖を、in vitroまたはin vivoのいずれかで阻害する化合物または組成物を意味する。したがって、増殖阻害剤は、Ｓ期においてＯｖｒ１１０発現細胞のパーセンテージを顕著に減少させるものであってもよい。増殖阻害剤の例には、（Ｓ期以外の位置において）細胞サイクル進行を遮断する剤、例えばＧＩ停止およびＭ期停止を誘発する剤が含まれる。
【０１９２】
古典的なＭ期ブロッカーには、ビンカ類（ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、タキサン類およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシドおよびブレオマイシンが含まれる。ＧＩを停止する剤はまたＳ期停止に波及し、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシルおよびara−Ｃである。
【０１９３】
さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer（MendelsohnおよびIsrael編）の第１章、表題「Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs」（Murakamiら）(WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁中に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、Rhone-Poulenc Rorer）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルは、チューブリン二量体からの微小管の組み立てを促進し、脱重合を防止することにより微小管を安定化させ、これにより細胞中での有糸分裂の阻害をもたらす。
【０１９４】
本明細書中で用いる「標識」とは、抗体に直接的または間接的に接合して、「標識された」抗体を生じる検出可能な化合物または組成物を意味する。標識は、それ自体が検出可能であってもよく（例えば放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、酵素的標識の場合においては、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【０１９５】
明細書中で用いる用語「エピトープタグ化」は、「タグポリペプチド」に融合した抗Ｏｖｒ１１０ポリペプチドを含む、キメラポリペプチドを意味する。抗Ｏｖｒ１１０ポリペプチドは抗Ｏｖｒ１１０抗体、またはその抗原フラグメントであってよい。タグポリペプチドは、抗体が作られ得るエピトープを提供するのには十分であるが、融合する付加されたポリペプチドの活性に干渉しない程度に十分短い残基を有する。タグポリペプチドはまた、好ましくは、極めてユニークであり、したがってそれに対する抗体は、他のエピトープと実質的に交差反応しない。好適なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６個のアミノ酸残基および通常８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸残基）を有する。
【０１９６】
「小分子」とは、本明細書中では、約５００ダルトンより小さい分子量を有すると定義される。
用語「添付文書」は、慣例的に治療製品の市販の包装中に含まれ、このような治療製品の使用に関する適応、使用、投与量、投与、禁忌および／または注意についての情報を含む使用説明書を意味するために用いる。
【０１９７】
「単離された核酸分子」は、核酸分子、例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーであって、これらは実質的に他のゲノムＤＮＡ配列およびタンパク質または複合体、例えばリボゾームおよびポリメラーゼから分離され、必然的にネイティブ配列を伴う。この用語は、この天然に存在する環境から取り除かれた核酸分子を包含し、組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物および、化学的に合成された類似体または異種性の系により生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸分子は、核酸分子の単離された形態を含む。
【０１９８】
「ベクター」は、シャトルベクターおよび発現ベクターを含み、例えばプラスミド、コスミドまたはファージミドを含む。典型的に、プラスミド構成物（construct）はまた、細菌におけるプラスミドの複製および選択のための、複製の起点（例えば複製のＣｏｌＥｌ起点）および選択可能なマーカー（例えばアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）をそれぞれ含む。「発現ベクター」は、原核生物、例えば細菌または真核生物細胞における、本発明の抗体フラグメントを含む抗体の発現に必要なコントロール配列または調節要素を含むベクターを意味する。好適なベクターを以下に開示する。
【０１９９】
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体を産生する細胞には、親ハイブリドーマ細胞、例えばＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ、ならびに抗体をコードする核酸が導入された細菌、酵母および真核生物宿主細胞が含まれる。好適な宿主細胞を、以下に開示する。
【０２００】
ＲＮＡ干渉は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される、動物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを意味する(Fire et al., 1998, Nature, 391, 806)。植物における対応するプロセスは、一般に、転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、また真菌における停止を意味する。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、種々の植物相および門により一般的に共有された、外来の遺伝子の発現を防止するために用いられる、進化的に保存された細胞防御機構であると考えられる(Fire et al., 1999, Trends Genet., 15, 358)。
【０２０１】
外来の遺伝子発現からのこのような保護は、相同的な単鎖ＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答による、ウイルス感染またはホストゲノム中へのトランスポゾン要素の無秩序な一体化に由来する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の産生に応答して、進化した場合がある。細胞中のｄｓＲＮＡの存在によりＲＮＡｉ応答が誘発されるが、機構は未だ完全には特徴付けられていない。この機構は、プロテインキナーゼＰＫＲおよび２’，５’−オリゴアデニレートシンセターゼのｄｓＲＮＡ媒介活性化からもたらされ、結果としてリボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的切断を生じさせるインターフェロン応答とは、異なると考えられる。
【０２０２】
細胞中に長いｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られている、ｄｓＲＮＡの短いフラグメントへのｄｓＲＮＡの加工に関与する(Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363)。ダイサー活性に由来する低分子干渉ＲＮＡは、典型的には、長さが約２１〜２３ヌクレオチドであり、約１９個の塩基対二本鎖を含む。
【０２０３】
ダイサーはまた、翻訳制御に関係する、保存された構造のＲＮＡ前駆体からの２１および２２ヌクレオチドの小さい一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切除に関係していた(Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834)。ＲＮＡｉ応答はまた、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する、一般にＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体を特徴とする。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央において起こる(Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188)。
【０２０４】
低分子干渉ＲＮＡが媒介するＲＮＡｉは、種々の系において研究されている。Fire et al., 1998, Nature, 391, 806は、C. Elegans中のＲＮＡｉを最初に観察した。Wianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70には、マウス胚におけるｄｓＲＮＡにより媒介されるＲＮＡｉが記載されている。Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293には、ｄｓＲＮＡをトランスフェクトしたショウジョウバエ細胞中のＲＮＡｉが記載されている。Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494には、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞を含む培養した哺乳動物細胞中の、合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖の導入により誘発されたＲＮＡｉが記載されている。
【０２０５】
ショウジョウバエ胚ライセートにおける最近の研究（Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877）により、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須のｓｉＲＮＡ長さ、構造、化学組成および配列についての一定の必要条件が明らかになった。これらの研究により、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖が、２個のヌクレオチド３’−オーバーハングを含む際に、最も活性であることが示された。さらに、２’−デオキシ（２’−Ｈ）または２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを有する一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖の完全な置換により、ＲＮＡｉ活性が消失し、一方３’末端ｓｉＲＮＡオーバーハングヌクレオチドのデオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）による置換は、耐容されることが示された。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心での単一のミスマッチ配列はまた、ＲＮＡｉ活性を消失させることが示された。
【０２０６】
さらに、これらの研究は、標的のＲＮＡ中の切断部位の位置が、ｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端よりは、５’末端により定められることも示す（Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877）。他の研究により、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補的鎖上の５’リン酸塩がｓｉＲＮＡ活性のために必要であること、および、ＡＴＰによってｓｉＲＮＡ上の５’リン酸塩部分が維持されることが示された（Nykanen et al., 2001, Cell, 107, 309）。
【０２０７】
研究により、２個のヌクレオチド３’オーバーハングを有する２１量体のｓｉＲＮＡ二本鎖の３’オーバーハングセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換することは、ＲＮＡｉ活性に対して悪影響を有さないことが示された。ｓｉＲＮＡの各末端上での４個までのヌクレオチドの、デオキシリボヌクレオチドによる置換は良好に耐容される一方、デオキシリボヌクレオチドによる完全な置換はＲＮＡｉ活性をもたらさないことが報告された（Elbashir et al., 2001, EMBO J., 20, 6877)。さらにElbashir et al.、上記はまた、ｓｉＲＮＡの２’−Ｏ−メチルヌクレオチドでの置換により、ＲＮＡｉ活性が完全に消失されることを報告している。
【０２０８】
Liらによる国際ＰＣＴ公開WO 00/44914およびBeachらによる国際ＰＣＴ公開WO 01/68836は共に、ｓｉＲＮＡが、「リン酸塩−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含むことができ、少なくとも１個の窒素または硫黄ヘテロ原子を含む」ことを示唆しているが、いずれの出願にも、これらの修飾がどの程度までｓｉＲＮＡ分子において耐容されるかが教示されておらず、かかる修飾されたｓｉＲＮＡのいかなる例も提供されていない。
【０２０９】
KreutzerおよびLimmerによるカナダ国特許出願第2,359,180号にはまた、ｄｓＲＮＡ構成物において用いて、二本鎖ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼＰＫＲ、特に２’−アミノまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２’−Ｏまたは４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドの活性化を妨げるための、ある化学的修飾が記載されている。しかし、KreutzerおよびLimmerは、同様に、これらの修飾がどの程度までｓｉＲＮＡ分子において耐容されるかを示しておらず、かかる修飾されたｓｉＲＮＡのいかなる例も提供していない。
【０２１０】
Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1977-1087は、C. elegansにおけるｕｎｃ−２２遺伝子を標的化するある化学修飾を、長い（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写物を用いて試験した。この著者は、Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼを有するチオリン酸塩ヌクレオチド類似体を包含させることによる、これらのｓｉＲＮＡ転写物中へのチオリン酸塩残基の導入を記載し、「２つの（ホスホロチオエート）修飾塩基を有するＲＮＡもまた、ＲＮＡｉトリガーとしての有効性の顕著な低下を有し（データは示されず）；２つよりも多い残基の（ホスホロチオエート）修飾により、in vitroでＲＮＡが大きく不安定化され、我々は、干渉活性を分析することができなかった」ことを観察した。同上1081。
【０２１１】
この著者はまた、長いｓｉＲＮＡ転写物中のヌクレオチド糖の２’位置において、ある修飾を試験し、デオキシヌクレオチドのリボヌクレオチドによる置換が、「干渉活性を顕著に低下させた」ことを観察し、特にウリジンのチミジンへの、および／またはシチジンのデオキシシチジンへの置換の場合においてそうであった。同上。さらに、この著者は、ｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖における４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、３−（アミノアリル）ウラシルの、ウラシルへの置換、およびイノシンのグアノシンへの置換を含む、ある塩基修飾を試験し、いずれの鎖中に含まれる際にも、４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシルがすべて良好に耐容される一方、イノシンが「干渉活性を顕著に低下させた」ことを見出した。５−ヨードウラシルおよび３−（アミノアリル）ウラシルの、アンチセンス鎖における導入の結果、ＲＮＡｉ活性の顕著な低下ももたらされた。
【０２１２】
Beachらによる国際ＰＣＴ公開WO 01/68836には、内因的に誘導されたｄｓＲＮＡを用いた、遺伝子発現を減衰する特定の方法が記載されている。Tuschlらによる国際ＰＣＴ公開WO 01/75164には、in vitroのショウジョウバエＲＮＡｉ系ならびに、特定のｓｉＲＮＡ分子の、ある機能的ゲノムおよびある治療的用途のための使用が記載されている；しかし、Tuschl, 2001, Chem. Biochem., 2, 239-245では、「インターフェロン応答を活性化する危険」のために、ＲＮＡｉを用いて遺伝子的疾患またはウイルス感染を治療することは、できないのではないかと疑っている。
【０２１３】
Liらによる国際ＰＣＴ公開WO 00/44914には、ある標的遺伝子の発現の減衰に用いるための、特定のｄｓＲＮＡの使用が記載されている。Zernicka-Goetzらによる国際ＰＣＴ公開WO 01/36646には、哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現を、あるｄｓＲＮＡ分子を用いて阻害するための、ある方法が記載されている。Fireらによる国際ＰＣＴ公開WO 99/32619には、遺伝子発現の阻害に用いるための、あるｄｓＲＮＡ分子を細胞中に導入する特定の方法が記載されている。Plaetinckらによる国際ＰＣＴ公開WO 00/01846には、細胞中の特定の表現型を付与する原因となる特定の遺伝子を、特定のｄｓＲＮＡ分子を用いて同定するためのある方法が記載されている。
【０２１４】
Melloらによる国際ＰＣＴ公開WO 01/29058には、ｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定が記載されている。Deschamps Depailletteらによる国際ＰＣＴ公開WO 99/07409には、ある抗ウイルス剤と組み合わされた、特定のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物が記載されている。Driscollらによる国際ＰＣＴ公開WO 01/49844には、標的の生物における遺伝子サイレンシングの促進に用いるための、特定のＤＮＡ構成物が記載されている。Parrish et al., 2000, Molecular Cell, 6, 1977-1087には、C. elegansのｕｎｃ−２２遺伝子を標的にする、特定の化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ構成物が記載されている。Tuschlらによる国際ＰＣＴ公開WO 02/44321には、ある合成ｓｉＲＮＡ構成物が記載されている。
【０２１５】
本発明の組成物および方法
本発明は、抗Ｏｖｒ１１０抗体を提供する。好ましくは、抗Ｏｖｒ１１０抗体は、哺乳動物細胞上の細胞表面Ｏｖｒ１１０に結合すると内部移行する。代替的に、抗Ｏｖｒ１１０抗体は、細胞上の生来のＯｖｒ１１０タンパク質と結合することによって、Ｏｖｒ１１０の機能を阻害する。抗Ｏｖｒ１１０抗体はまた、Ｏｖｒ１１０を有する腫瘍細胞を破壊するか、またはこの破壊をもたらすことができる。
【０２１６】
Ｏｖｒ１１０が内部移行能力を有することは、明らかではなかった。さらに、抗体が内部移行する能力は、親和性、結合活性、および抗体のアイソタイプ、およびこれが結合するエピトープを含むいくつかの要因に依存する。全ての抗体−抗原ペアが内部移行能力を示すわけではないことはよく知られている。本発明者は、本明細書中で、細胞表面Ｏｖｒ１１０が本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体により結合されると内部移行能力を得ることを実証した。
【０２１７】
さらに、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体が、in vitroまたはin vivoでＯｖｒ１１０発現腫瘍細胞を特定的に標的化し、これらの細胞を阻害または死滅させることができることが、実証された。これらのin vivoでの抗Ｏｖｒ１１０抗体の腫瘍標的化、内部移行および増殖阻害特性により、これらの抗体は、治療的使用、例えば、卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌または乳癌を含むさまざまな癌の処置において、極めて好適となる。抗Ｏｖｒ１１０抗体の内部移行は、例えば、抗体または抗体結合体が細胞内作用部位を有する場合、およびこの抗体に結合した細胞傷害剤（例えば毒素カリケアマイシン）が細胞膜を容易に横断しない場合に、好ましい。内部移行は、抗体または抗体に結合した剤が細胞内作用部位を有さない場合、例えば抗体が、ＡＤＣＣまたはある他の機構により腫瘍細胞を死滅させることができる場合には、必要ではない。
【０２１８】
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体はまた、さまざまな非治療的用途を有する。本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体は、Ｏｖｒ１１０発現癌の診断およびステージ分類のために有用となり得る（例えば放射性イメージングまたは他のイメージング方法において）。これらを単独で、または他の卵巣癌マーカーと組み合わせて用いることができ、該マーカーには、限定されることなく、ＣＡ１２５、ＨＥ４およびメソセリンが含まれる。この抗体はまた、Ｏｖｒ１１０を細胞から精製または免疫沈殿するために、in vitro、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいてまたはＩＨＣによってなど、Ｏｖｒ１１０を検出および定量するために、他の細胞の精製における１ステップとしてＯｖｒ１１０発現細胞を混合細胞の集団から死滅させ排除するために有用である。
【０２１９】
本発明の内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体は、本明細書中で「抗体」の定義により包含される種々の形態であってもよい。したがって、抗体は、全長または無傷な抗体、抗体フラグメント、ネイティブ配列の抗体またはアミノ酸変異体、ヒト化、キメラまたは融合抗体、免疫結合体およびこれらの機能的フラグメントを含む。融合抗体においては、抗体配列は、異種性のポリペプチド配列に融合される。抗体を、Ｆｃ領域において修飾して、所望のエフェクター機能を提供することができる。以下の章においてより詳細に記載するように、適切なＦｃ領域を用いて、細胞表面上に結合した裸（naked）の抗体は、例えば抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）により、または補体依存性細胞傷害作用において補体を獲得することにより、またはある他の機構により、細胞傷害性を誘発することができる。あるいは、エフェクター機能を消失させるかまたは低減させて、副作用または治療の合併症を最小にするのが望ましい場合において、ある他のＦｃ領域を用いることができる。
【０２２０】
抗体は、本発明の抗体により結合された同一のエピトープに結合することについて競合することができ、または実質的にこれに結合する。本発明のこの抗Ｏｖｒ１１０抗体の生物学的特徴を有する抗体も意図され、例えば、配列番号１〜５０を含むモノクローナル抗体の生物学的特徴、特にin vivo腫瘍標的化、内部移行およびあらゆる細胞増殖阻害または細胞傷害性特徴を含む、を有する抗Ｏｖｒ１１０抗体である。
【０２２１】
具体的に提供されるのは、ヒトＯｖｒ１１０のアミノ酸３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２６０〜２７０、２７０〜２８２または２１〜３５、３１〜４５、４１〜５５、５１〜６５、６１〜７５、７１〜８５、８１〜９５、９１〜１０５、１０１〜１１５、１１１〜１２５、１２１〜１３５、１３１〜１４５、１４１〜１５５、１５１〜１６５、１６１〜１７５、１７１〜１８５、１８１〜１９５、１９１〜２０５、２０１〜２１５、２１１〜２２５、２２１〜２３５、２３１〜２４５、２４１〜２５５、２５１〜２５８において存在するエピトープに結合する、抗Ｏｖｒ１１０抗体である。
【０２２２】
上記抗体を生産する方法を以下にさらに詳細に説明する。
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体は、哺乳動物におけるＯｖｒ１１０発現癌を処置、または癌の１つもしくは２つ以上の症状の緩和に有用である。このような癌は、卵巣癌、膵臓癌、肺または乳癌、尿道癌、肺癌、乳癌、大腸癌、膵臓癌、および卵巣癌、特に前立腺腺癌、腎細胞癌、結腸直腸腺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、および胸膜中皮腫を含む。癌は、上記の任意の転移性癌、例えば、卵巣癌転移、膵臓癌転移、肺癌転移または乳癌転移を包含する。
【０２２３】
この抗体は、哺乳動物におけるＯｖｒ１１０を発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することができ、好ましくはＨＡＭＡ応答を誘発しないかまたはこれを最小化するものである。好ましくは、抗体は、in vivoまたはin vitroで、細胞上のＯｖｒ１１０に結合すると、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を破壊または死滅させるか、またはかかる腫瘍細胞の増殖を阻害するのに、有効なものである。かかる抗体は、裸の抗Ｏｖｒ１１０抗体（いかなる剤にも結合していないもの）を含む。裸の抗Ｏｖｒ１１０抗体は、タキサンまたは癌処置に用いられる他の剤などの他の治療剤と組み合わせて効能を示す。in vivoでの腫瘍増殖阻害特性を有する裸の抗Ｏｖｒ１１０抗体には、以下の実験例に記載する抗体が含まれる。
【０２２４】
いくつかの場合において、裸の抗体の機能は、タキサンまたは癌処置に用いられる他の剤などの他の化学療法剤との組合せにおいてのみ明らかであってよい。細胞傷害特性または細胞増殖阻害特性を有する裸の抗体を、さらに細胞傷害剤と結合させて、これらを腫瘍細胞破壊においてより一層有効にすることができる。例えばこの抗体を細胞傷害剤と結合させて、以下に記載するように免疫結合体を形成することにより、抗Ｏｖｒ１１０抗体に細胞傷害性特性を付与することができる。細胞傷害剤または増殖阻害剤は、好ましくは小分子である。毒素、例えばメイタンシン、メイタンシノイド、サポリン、ゲロニン、リシンまたはカリケアマイシンおよびこれらの類似体または誘導体が好ましい。
【０２２５】
本発明は、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体および担体を含む組成物を提供する。癌の処置のために、組成物をかかる処置を必要としている患者に投与することができ、ここで組成物は免疫結合体としてまたは裸の抗体として存在する、１種または２種以上の抗Ｏｖｒ１１０抗体を含むことができる。さらにこの組成物は、これらの抗体を、他の治療剤、例えば化学療法剤を含む細胞傷害剤または増殖阻害剤と組み合わせて、含むことができる。本発明はまた、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体および担体を含む製剤を提供する。この製剤は、薬学的に許容し得る担体を含む治療用製剤であってもよい。
【０２２６】
本発明の他の局面は、内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードする、単離された核酸である。ＨおよびＬ鎖の両方ならびに特に超可変領域の残基をコードする核酸、ネイティブ配列の抗体および変異体をコードする鎖、抗体の修飾物およびヒト化された様式が包含される。
【０２２７】
本発明はまた、哺乳動物におけるＯｖｒ１１０発現癌を処置するか、またはこの癌の１つもしくは２つ以上の症状を緩和するために有用な方法であって、内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体の治療有効量を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法を提供する。この抗体治療組成物を、医師により指示されるとおり、短期間（急性）もしくは慢性的に、または間欠的に投与することができる。また提供されるのは、Ｏｖｒ１１０発現細胞の増殖を阻害し、これを死滅させる方法である。
【０２２８】
最後に、本発明はまた、本発明の少なくとも１種の抗体、好ましくは本発明の少なくとも１種の内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体を含む、キットおよび製品を提供する。抗Ｏｖｒ１１０抗体を含むキットは、Ｏｖｒ１１０発現の検出において、または治療的もしくは診断的アッセイにおいて、例えばＯｖｒ１１０細胞死滅アッセイのために、またはＯｖｒ１１０の細胞からの精製および／または免疫沈殿のために、用途が見出される。例えば、Ｏｖｒ１１０の単離および精製のために、キットは、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体を含むことができる。in vitroでの、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおけるＯｖｒ１１０の検出および定量のための抗体を含むキットを、提供することができる。検出に有用なかかる抗体は、標識、例えば蛍光または放射性標識と共に提供してもよい。
【０２２９】
抗Ｏｖｒ１１０抗体の産生
以下に、本発明において有用な抗体の産生のための例示的な手法を記載する。手法のいくつかを、さらに例１に記載する。抗体の産生のために用いるべきＯｖｒ１１０抗原は、例えば、膜貫通配列を欠いているＯｖｒ１１０の可溶性形態またはタンパク質の選択された部分に対する合成ペプチドを含む、全長ポリペプチドまたはこの一部であってもよい。
【０２３０】
あるいは、その細胞表面においてＯｖｒ１１０を発現する細胞（例えばＯｖｒ１１０を過剰発現するように形質転換（transform）されたＣＨＯまたはＮＩＨ−３Ｔ３細胞；卵巣、膵臓、肺、乳房もしくは他のＯｖｒ１１０発現腫瘍細胞系）、またはかかる細胞から調製される膜を用いて、抗体を生成することができる。ヒトおよびマウスＯｖｒ１１０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、前に示したように入手可能である。Ｏｖｒ１１０は、標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて、原核細胞、例えば細菌細胞、または真核細胞において組換え的に産生し、これから単離することができる。Ｏｖｒ１１０を、タグ化して（例えばエピトープタグ）、または他の融合タンパク質として発現させて、さまざまなアッセイにおけるその単離およびその同定を容易にすることができる。
【０２３１】
さまざまなタグおよび融合配列に結合する抗体または結合タンパク質は、以下に詳しく述べるように入手可能である。抗体を生成するのに有用なＯｖｒ１１０の他の形態は、当業者に明らかである。
【０２３２】
タグ
さまざまなタグポリペプチドおよびこれらのそれぞれの抗体が、当該分野においてよく知られている。例には、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリヒスチジングリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびこの抗体１２ＣＡ５（Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)）；ｃ−ｍｙｃタグならびにこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７および９Ｅ１０抗体（Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびこの抗体（Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)）が含まれる。
【０２３３】
ＦＬＡＧペプチド（Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)）は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体（Eastman Kodak Co., New Haven, CT）により認識される。ＦＬＡＧペプチドを含むタンパク質の精製は、免疫親和性クロマトグラフィーにより、アガロースに共有結合した抗ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体を含むアフィニティーマトリックス(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)を用いて行ってもよい。他のタグポリペプチドには、ＫＴ３エピトープペプチド[Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]；α−チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J. Biol. Chenz., 266:15163-15166 (1991))；およびＴ７遺伝子タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。
【０２３４】
ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、動物、好ましくは非ヒト動物において、関連する抗原およびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）または腹腔内（ｉｐ）注射により生じる。関連する抗原を、免疫すべき種において免疫原性であるタンパク質に結合させることが（特に合成ペプチドを用いる場合）、有用であり得る。
【０２３５】
例えば、抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官能化または誘導化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基による結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用いて結合させてもよい。結合体はまた、組換え細胞培養においてタンパク質融合として作製してもよい。
【０２３６】
抗原、免疫原性結合体または誘導体に対して、例えば５〜１００ｐｇのタンパク質または結合体（それぞれウサギまたはマウスに対して）を、３容量の完全フロイントアジュバントと混ぜ合わせ、溶液を皮内に複数の部位において注射することにより、動物を免疫する。１ヶ月後、この動物を、完全フロイントアジュバント中のペプチドまたは結合体を最初の量の１／５〜１／１０で、複数の部位における皮下注射により追加免疫する。７〜１４日後に動物から採血し、血清を、抗体力価についてアッセイする。動物を、力価が水平状態になるまで追加免疫する。また、凝集剤、例えばミョウバンを好適に用いて、免疫応答を増強する。
【０２３７】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、最初にKohler et al., Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ方法を用いて作製しても、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第4,816,567号）によって作製してもよい。ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを、上記のように免疫して、免疫のために用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘導する。あるいは、in vitroでリンパ球を免疫することができる。免疫の後、リンパ球を単離し、次に「融合パートナー」、例えば骨髄腫細胞系と、好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies.  Principles and Practice, pp 103 (Academic Press, 1986))。
【０２３８】
このように調製したハイブリドーマ細胞を好適な培養培地に蒔き、この中で増殖させる。この培地は好ましくは、融合していない融合パートナー、例えば親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１種または２種以上の物質を含む。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠いている場合には、ハイブリドーマのための選択的な培養培地は、典型的にヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この物質が、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【０２３９】
好ましい融合パートナー骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル産生を支持し、融合していない親細胞に対して選択される選択的培地に高感度であるものである。好ましい骨髄腫細胞系は、マウス骨髄腫系、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USAから入手できるＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−ＩＩマウス腫瘍に由来するもの、ならびにＳＰ−２および誘導体、例えばアメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville, Maryland USAから入手できるＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。
【０２４０】
また、ヒト骨髄腫細胞系およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫(heteromyeloma)細胞系は、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている(Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)；およびBrodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０２４１】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原に指向されたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降により、またはin vitro結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定する。
【０２４２】
モノクローナル抗体の結合親和性を、例えば、Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)に記載されているScatchard分析により決定することができる。所望の特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定すると、クローンを制限希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 103 (Academic Press, 1986)）。この目的に適する培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、例えばマウス中への細胞の腹腔内注射により、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることができる。
【０２４３】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、培養培地、腹水または血清から、慣用の抗体精製手順、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡまたはプロテインＧ−セファロースを用いて）またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などにより好適に分離する。
【０２４４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡを、慣用的な手順を用いて（例えばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離し、配列決定する。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として作用する。
【０２４５】
単離した後に、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれを、他の方法では抗体タンパク質を産生しない原核または真核宿主細胞、例えば大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞に形質転換またはトランスフェクトして、組換え宿主細胞中にモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの、細菌における組換え発現についての概説記事は、Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)およびPhuckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)を含む。
【０２４６】
さらに、モノクローナル抗体または抗体フラグメントを、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)に記載された手法を用いて、生成した抗体ファージライブラリから単離することができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)には、ファージライブラリを用いたマウスおよびヒト抗体の単離がそれぞれ記載されている。
【０２４７】
その後の刊行物には、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の、連鎖混合による産生（Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)）、ならびに極めて大きいファージライブラリを構成するための方法として、組み合わせ感染およびin vivo組換え（Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)）が記載されている。したがってこれらの手法は、モノクローナル抗体を単離するための、伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ手法に代わる実行可能な代替法である。
【０２４８】
抗体をコードするＤＮＡを修飾して、キメラまたは融合抗体ポリペプチドを産生することができ、この修飾は例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常領域（ＣＨおよびＣＬ）配列を、相同的なマウス配列で置換することによる（米国特許第4,816,567号；およびMorrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)）、または免疫グロブリンコード配列を、非免疫グロブリンポリペプチド（異種性ポリペプチド）についてのコード配列の全部または一部と融合することによる修飾である。
【０２４９】
非免疫グロブリンポリペプチド配列は抗体の定常領域と置換することができ、または、１つの抗原への特異性を有する１つの抗原組み合わせ部位と、異なる抗原への特異性を有する他の抗原組み合わせ部位とを含むキメラの２価の抗体を作製するために、抗体の１つの抗原結合部位の可変領域と置換する。
【０２５０】
ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、この中に非ヒトである供給源から導入された１つまたは２つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは、典型的には、「移入」可変領域から採取される。ヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者らの方法にしたがって(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより行うことができる。
【０２５１】
したがって、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第4,816,567号）、ここで、無傷のヒト可変領域より顕著に小さいものが、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際にヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基が、げっ歯類抗体における同様の部位からの残基により置換されている、ヒト抗体である。
【０２５２】
ヒト化抗体の作製において用いるべき、軽鎖および重鎖の両方のヒト可変領域の選択は、抗体のヒトの治療的使用を意図する際には、抗原性およびＨＡＭＡ応答（ヒト抗マウス抗体）を低減するのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」方法によれば、げっ歯類抗体の可変領域の配列を、既知のヒト可変領域配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。
【０２５３】
げっ歯類のそれに最も近いヒトＶ領域配列を同定し、この中のヒトフレームワーク領域（ＦＲ）が、ヒト化抗体として受け入れられる(Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987))。他の方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する、特定のフレームワーク領域を用いる。同一のフレームワークを、いくつかの異なるヒト化抗体のために用いることができる(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993))。
【０２５４】
抗原に対する高い結合親和性および他の好ましい生物学的特性を維持して、抗体をヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によれば、ヒト化抗体を、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列の分析のプロセスおよびさまざまな概念的ヒト化生成物により調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に入手可能であり、当業者に精通されている。
【０２５５】
選択された免疫グロブリン候補配列の予想される三次元高次構造を例示して表示するコンピュータープログラムが、利用可能である。これらの表示の検査により、免疫グロブリン候補配列の機能においての、可能性のある残基の作用の分析、すなわちこの抗原に結合する免疫グロブリン候補の能力に影響する残基の分析が可能になる。このようにして、ＦＲ残基をレシピエントから選択して組み合わせ、配列を移入して、所望の抗体特性、例えば１または２以上の標的抗原への増大した親和性を達成することができる。一般に、超可変領域残基は、抗原結合への影響において直接的かつ最も実質的に関与する。
【０２５６】
ヒト化抗Ｏｖｒ１１０抗体のさまざまな形態が意図される。例えば、ヒト化抗体は、任意に１種または２種以上の細胞傷害剤と結合して免疫結合体を生じる抗体フラグメント、例えばＦａｂであってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、完全な抗体、例えば完全なＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０２５７】
ヒト抗体
ヒト化に変わる方法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば現在では、免疫されると、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる遺伝子組換え動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラの生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記述された。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを、かかる生殖系列変異マウスに移した結果、抗原チャレンジによりヒト抗体の産生がもたらされる。
【０２５８】
例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,806号、5,569,825号、5,591,669号（すべてGenPharm）；5,545,807号参照；あるいは、ファージ提示手法(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))を用いて、ヒト抗体および抗体フラグメントをin vitroで、免疫化していない供与者からの免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーから産生することができる。
【０２５９】
この手法によれば、抗体Ｖ領域遺伝子をインフレームで、糸状バクテリオファージ、例えばＭｌ３またはｆｄの主要な、または主要でない被覆タンパク質遺伝子のいずれかの中にクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能的抗体フラグメントとして提示する。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能的な特性に基づく選択によっても、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がもたらされる。
【０２６０】
したがって、このファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージ提示法は、さまざまな様式で行うことができ、これは例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)に概説されている。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかのソースを、ファージ提示法のために用いてもよい。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを、免疫したマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムな組み合わせライブラリから単離した。
【０２６１】
免疫していないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成して、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、基本的にはMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)により記載された手法にしたがって単離してもよい。また米国特許第5,565,332号および5,573,905号も参照されたい。上記のように、ヒト抗体もまた、in vitro活性化Ｂ細胞により生成することができる（米国特許第5,567,610号および5,229,275号参照）。
【０２６２】
抗体フラグメント
ある状況においては、完全抗体よりむしろ抗体フラグメントを用いる方に利点がある。より小さいサイズのフラグメントにより、迅速なクリアランスが可能になり、固形腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。さまざまな手法が、抗体フラグメントの産生のために開発された。伝統的には、これらのフラグメントは、無傷の抗体のタンパク質分解消化から誘導された（例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)参照）。
【０２６３】
しかしこれらのフラグメントは、現在では、組換え宿主細胞により直接産生することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体フラグメントはすべて、大腸菌において発現され、分泌されることができ、したがって大量のフラグメントの容易な産生が可能になる。抗体フラグメントを、上記した抗体ファージライブラリから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ）２フラグメントを形成することができる(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。
【０２６４】
他のアプローチにおいて、Ｆ（ａｂ）２フラグメントを、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、増大したin vivoでの半減期を有するＦａｂおよびＦ（ａｂ）２フラグメントは、米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体フラグメントの産生のための他の手法は、熟練した実施者に明らかである。選択された抗体はまた、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）であってもよい。WO 93/16185；米国特許第5,571,894号および米国特許第5,587,458号参照、該開示は参照によって明示的に本明細書に組み込まれる。
【０２６５】
ＦｖおよびｓＦｖは、完全な組み合わせ部位を有し定常領域を欠く唯一の種である；したがって、これらは、in vivoでの使用における非特異的結合の低減に適する。ｓＦｖ融合タンパク質を構成して、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合を得てもよい。Antibody Engineering, ed. Borrebaeck、上記参照。抗体フラグメントはまた、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているように、「直鎖状抗体」であってもよい。かかる直鎖状抗体フラグメントは、単一特異性または二重特異性であってもよい。
【０２６６】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ｏｖｒ１１０タンパク質の２つの異なるエピトープに結合することができる。他のかかる抗体は、Ｏｖｒ１１０結合部位を、他のタンパク質についての結合部位と組み合わせることができる。あるいは、抗Ｏｖｒ１１０アームを白血球上のトリガー分子、例えばＴ細胞受容体分子（例えばＣ１３３）、またはＩｇＧについてのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）上のトリガー分子に結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構をＯｖｒ１１０発現細胞に集中させ、局在化させることができる。
【０２６７】
二重特異性抗体はまた、Ｏｖｒ１１０を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化させるために用いることもできる。これらの抗体は、Ｏｖｒ１１０結合アームおよび細胞傷害剤（例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン）を結合するアームを有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ）２二重特異性抗体）として調製することができる。WO 96/16673には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体が記載されており、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体が開示されている。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、WO98/02463中に示されている。米国特許第5,821,337号には、二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体が教示されている。WO 96/16673、米国特許第5,837,234号、WO98/02463、米国特許第5,821,337号は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２６８】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該分野において知られている。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいており、ここで、２つの鎖は異なる特異性を有する(Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな分類により、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の可能な混合物を生成し、この中で１個のみが、正確な二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィーの工程により行われる正確な分子の精製は、いくらか面倒であり、生成物の収量は低い。同様の手順はWO 93/08829およびTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示されており、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【０２６９】
異なるアプローチによれば、所望の結合特異性（抗体−抗原組み合わせ部位）を有する抗体可変領域が、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。好ましくは、この融合は、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の一部を含むＩｇ重鎖定常領域との融合である。軽鎖結合に必要な部位を含み、融合の少なくとも１つに存在する第１の重鎖定常領域（ＣＨＩ）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、好適な宿主細胞中に同時コトランスフェクトする。
【０２７０】
これにより、構築において異なる比率の３つのポリペプチド鎖が用いられる態様において、３つのポリペプチドフラグメントの相互割合の調整における柔軟性が拡大し、所望の二重特異性抗体の最適な収量を提供する。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現の結果、高い収量が得られる場合、または、所望の鎖の組み合わせの収量に対してこの比率が顕著な影響を及ぼさない場合には、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を、単一の発現ベクター中に挿入することが可能である。
【０２７１】
好ましくは、このアプローチにおける二重特異性抗体は、一方のアームにおいて第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称構造により、所望の二重特異性化合物が、所望でない免疫グロブリン鎖の組み合わせから容易に分離されることが見出され、これは、二重特異性分子の片半分のみに免疫グロブリン軽鎖が存在することにより、容易な分離方法が提供されるからである。このアプローチはWO 94/04690に開示されており、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。二重特異性抗体を生じるさらなる詳細について、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照する。
【０２７２】
米国特許第5,731,168号（該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる）に記載されている他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の接触面を設計して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージを最大にすることができる。好ましい接触面は、ＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法において、第１の抗体分子の接触面からの１つまたは２つ以上の小さいアミノ酸側鎖が、より大きい側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置換される。１つまたは２つ以上の大きい側鎖と同一であるか、またはこれと類似した大きさの補填的な「空洞」が、第２の抗体分子の接触面上に、大きいアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置換することにより作り出される。これにより、ヘテロ二量体の収量を、例えばホモ二量体などの他の所望でない最終生成物より多くするための機構が提供される。
【０２７３】
二重特異性抗体には、架橋した抗体、または「ヘテロ抱合した(heteroconjugate)」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ抱合体中の抗体の一方をアビジンに結合させ、他方をビオチンに結合させることができる。このような抗体は、例えば、所望でない細胞に対して（米国特許第4,676,980号、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる）、およびＨＩＶ感染の処置のため（WO 91/00360、WO 92/200373およびEP 03089、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる）、免疫系細胞を標的化するために提案されている。ヘテロ抱合抗体を、任意の好都合な架橋方法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において十分知られており、米国特許第4,676,980号（該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる）に、多くの架橋手法と共に開示されている。
【０２７４】
二重特異性抗体を抗体フラグメントから生成するための手法は、文献にも記載されている。例えば、二重特異性抗体は化学的結合を用いて調製することができる。Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)には、完全な抗体をタンパク質分解によって切断して、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する手順が記載されている。これらのフラグメントは、ジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近隣のジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。次に、生じたＦａｂ’フラグメントを、チオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次に、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つを、メルカプトエチルアミンで還元することによりＦａｂ’−チオールに再び変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定化のための因子として用いることができる。
【０２７５】
最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接的な回収が容易になり、これを化学的に結合して、二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)には、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生が記載されている。各々のＦａｂ’フラグメントは大腸菌から別個に分泌されており、これに、in vitroでの定方向化学的カップリングを施して、二重特異性抗体を形成した。このようにして形成した二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、またヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘発することができた。
【０２７６】
二重特異性抗体フラグメントを組換え細胞培養物から直接作製し、単離するためのさまざまな手法も記載されている。例えば、二重特異性抗体が、ロイシンジッパーを用いて産生された。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが、２種の異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合により結合された。抗体ホモ二量体をヒンジ領域において還元してモノマーを形成し、次に再び酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。また、この方法を抗体ホモ二量体の産生のために用いることができる。
【０２７７】
Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に記載された「ダイアボディー」手法により、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替の機構が提供された。このフラグメントは、同一の鎖の２つの領域間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによりＶＬに結合するＶＨを含む。したがって、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬ領域を、他のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨ領域と強制的に対形成させ、これにより２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を用いることによる、二重特異性抗体フラグメントを作製するための他の方法も報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
２よりも大きい価数を有する抗体が、企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
【０２７８】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、２価の抗体よりも迅速に内部移行する（および／または異化する）ことができる。本発明の抗体は、３つまたは４つ以上の抗原結合部位を有する（ＩｇＭクラス以外である）多価の抗体（例えば４価の抗体）であってもよく、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、容易に産生され得る。多価の抗体は、二量体化領域および３つまたは４つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化領域は、Ｆｃ領域またはヒンジ領域を含む（またはこれらからなる）。
【０２７９】
この筋書きにおいて、抗体は、Ｆｃ領域およびＦｃ領域に対する３つまたは４つ以上の抗原結合部位アミノ末端を含む。本明細書における好ましい多価抗体は、３〜約８個、しかし好ましくは４個の抗原結合部位を含む（またはこれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は、２つまたは３つ以上の可変領域を含む。例えば、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は、ＶＤｌ（Ｘ１ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含むことができ、ここで、ＶＤ１は、最初の可変領域であり、ＶＤ２は、２番目の可変領域であり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは、０または１である。
【０２８０】
例えば、１つまたは２つ以上のポリペプチド鎖は：ＶＨ−ＣＨＩ−柔軟リンカー−ＶＨ−ＣＨＩ−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨＩ−ＶＨ−ＣＨＩ−Ｆｃ領域鎖を含んでも良い。本明細書中の多価抗体は、好ましくは、さらに、少なくとも２つ（および好ましくは４つ）の軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。本明細書中の多価抗体は、例えば、約２個〜約８個の軽鎖可変領域ポリペプチドを含むことができる。本明細書中で意図する軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、任意にさらにＣＬ領域を含む。
【０２８１】
他のアミノ酸配列修飾
本明細書中に記載した抗Ｏｖｒ１１０抗体の１または２以上のアミノ酸配列修飾が、意図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。抗Ｏｖｒ１１０抗体のアミノ酸配列変異体を、適切なヌクレオチド変化を抗Ｏｖｒ１１０抗体核酸中に導入することにより、またはペプチド合成により調製する。
【０２８２】
かかる修飾には、例えば、抗Ｏｖｒ１１０抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはこの中への挿入、および／またはこの置換が含まれる。最終的な構成物が所望の特徴を有することを前提として、最終的な構成物に到達するために欠失、挿入および置換のあらゆる組み合わせを行う。アミノ酸変化はまた、抗Ｏｖｒ１１０抗体の翻訳後プロセスを変えることができ、例えばグリコシル化部位の数または位置を変化させることができる。
【０２８３】
変異原性のための好ましい位置である抗Ｏｖｒ１１０抗体のある残基または領域の同定に有用な方法は、CunninghamおよびWellsにより、Science, 244:1081-1085 (1989)に記載されているように、「アラニンスキャンニング変異誘発」と呼ばれる。ここで、抗Ｏｖｒ１１０抗体内の残基または標的残基の群（例えば、荷電した残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕ）を同定し、中性の、または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）により置換して、アミノ酸のＯｖｒ１１０抗原との相互作用に影響を及ぼす。
【０２８４】
次に、置換に対する機能的な感受性を示すアミノ酸の位置を、置換の部位において、または置換の部位について、さらなる変種または他の変種を導入することにより精巧にする。したがって、アミノ酸配列の変更を導入するための部位が予め決定されている一方、変異の性質それ自体を予め決定する必要はない。例えば、所定の部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニングまたはランダムな変異誘発を標的コドンまたは領域において行い、発現された抗Ｏｖｒ１１０抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０２８５】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から１００個またはこれ以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲内のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗Ｏｖｒ１１０抗体、または細胞傷害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗Ｏｖｒ１１０抗体分子の他の挿入変異体には、酵素に対する（例えばＡＤＥＰＴについての）抗Ｏｖｒ１１０抗体のＮもしくはＣ末端への融合、または抗体の血清半減期を増大させるポリペプチドへの融合が含まれる。
【０２８６】
変異体の他の種類は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基により置換された少なくとも１個のアミノ酸残基を、抗Ｏｖｒ１１０抗体分子中に有する。置換変異誘発のための最も重要な標的とされる部位には、超可変領域が含まれるが、ＦＲ変化もまた企図される。保存的置換を、「好ましい置換」の項目の下に表Ｉに示す。かかる置換により生物学的活性の変化がもたらされる場合には、表Ｉにおいて「例示的な置換」と命名されているか、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載する、さらに実質的な変化を導入し、生成物を所望の特性についてスクリーニングすることができる。
【０２８７】
【表３】
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【０２８８】
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）例えばシートもしくはらせん構造としての、置換領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の容積(bulk)、を維持することに対する効果が顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性の親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｉｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０２８９】
非保存的置換は、これらの群の１つの要素を他の群のもので交換することを伴う。抗Ｏｖｒ１１０抗体の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基もまた、一般的にはセリンで置換されることができ、分子の酸化に対する安定性を改善し、異常な架橋を防止する。逆に、システイン結合（単数または複数）を抗体に付加して、その安定性を改善することができる（特に、抗体が、例えばＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）。
【０２９０】
置換変異体の特に好ましい種類は、親抗体（例えばヒト化またはヒト抗体）の１つまたは２つ以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、さらなる開発のために選択された、得られた変異体（単数または複数）は、これらを生成する親抗体に比べて改善された生物学的特性を有する。かかる置換変異体を生じるための好都合な方法は、ファージ提示法を用いた親和性成熟（affinity maturation）を含む。簡単に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば６〜７部位）を変異させて、各々の部位において可能なアミノ酸置換のすべてを生じさせる。
【０２９１】
このようにして生じた抗体変異体を、糸状ファージ粒子から、各々の粒子内に包装されたＭｌ３の遺伝子ＩＩＩ生成物への融合物として、１価の様式で提示する。次に、ファージ提示された変異体を、本明細書中に開示したように、これらの生物学的活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補の超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング変異誘発を行って、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定することができる。
【０２９２】
代替的に、または付加的に、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、抗体とヒトＯｖｒ１１０との間の接触点を同定することが有益であり得る。かかる接触残基および隣接する残基は、本明細書中で詳しく述べる手法による置換のための候補である。かかる変異体が生じると、変異体のパネルに、本明細書中に記載したようにスクリーニングを施し、１つまたは２つ以上の関連するアッセイにおける優れた特性を有する抗体を、さらなる発生について選択することができる。
【０２９３】
抗体の他の種類のアミノ酸変異体は、抗体のもとのグリコシル化パターンを変化させる。変化させることにより、抗体中に見出される１つもしくは２つ以上の炭水化物部分の欠失、および／または抗体中に存在しない１つもしくは２つ以上のグリコシル化部位の添加を意味する。抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、炭水化物部分が、アスパラギン残基の側鎖に結合していることを意味する。Ｘがプロリン以外の任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素的結合のための認識配列である。
【０２９４】
したがって、これらのトリペプチド配列のいずれかが、ポリペプチド中に存在することにより、有効なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの結合を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンもまた用いることができる。アミノ酸配列を変化させて、（Ｎ結合型グリコシル化部位について）これが上記のトリペプチド配列の１つまたは２つ以上を含むようにすることにより、抗体へのグリコシル化部位の添加が好都合に達成される。変化はまた、（Ｏ結合型グリコシル化部位について）、１つまたは２つ以上のセリンまたはスレオニン残基の、もとの抗体の配列への添加、またはこれによる置換によってもなされ得る。
【０２９５】
抗Ｏｖｒ１１０抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を、当該分野において知られているさまざまな方法により調製する。これらの方法には、自然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド媒介（もしくは部位特異的な）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、および抗Ｏｖｒ１１０抗体の変異体もしくは非変異体のバージョンをコードする前もって調製された核酸分子のカセット変異誘発による調製が含まれるが、これらには限定されない。
【０２９６】
本発明の抗体を、エフェクター機能に関して改変して、例えば抗体の抗原依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を増強することが望ましい場合がある。これは、抗体のＦｃ領域中に１つまたは２つ以上のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。代替的に、または付加的に、１個または２個以上のシステイン残基をＦｃ領域中に導入して、これによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成を可能にすることができる。
【０２９７】
このようにして生じたホモ二量体抗体は、改善された内部移行能力および／または増大した補体媒介細胞死滅および抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を有することができる（Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992)およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照のこと）。増強した抗腫瘍活性を有するホモ二量体抗体もまた、Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されたように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、二重のＦｃ領域を有し、これにより増大した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を、設計することができる（Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)参照のこと）。
【０２９８】
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載されているように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体フラグメント）中に導入することができる。本明細書中で用いる用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、抗体のＦｃ領域のエピトープを意味する。
【０２９９】
所望の特性を有する抗体についてのスクリーニング
抗体を生成するための手法を、上に記載した。さらに、所望により、ある生物学的特性を有する抗体を選択することができる。
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体の増殖阻害効果を、当該分野において知られている方法により、例えば内因的にまたはＯｖｒ１１０遺伝子のトランスフェクション後にＯｖｒ１１０を発現する細胞を用いて、評価することができる。例えば、以下の例１に提供する腫瘍細胞系およびＯｖｒ１１０をトランスフェクトされた細胞を、本発明の抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体で、さまざまな濃度において、数日（例えば２〜７日）にわたり処理し、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴで染色し、または他の比色アッセイにより分析することができる。
【０３００】
増殖を測定する他の方法は、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体の存在下で、または不在下で処理した細胞による３Ｈ−チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理の後、細胞を収集し、ＤＮＡ中に導入された放射能の量をシンチレーションカウンタにおいて定量する。適切なポジティブコントロールには、選択された細胞系の、当該細胞系の増殖を阻害することが知られている増殖阻害抗体による処理が含まれる。
【０３０１】
in vivoでの腫瘍細胞の増殖阻害を、以下の実験例の節において記載するように、種々の方法により決定することができる。好ましくは、腫瘍細胞は、Ｏｖｒ１１０を過剰発現するものである。好ましくは、抗Ｏｖｒ１１０抗体は、in vitroまたはin vivoでＯｖｒ１１０発現腫瘍細胞の細胞増殖を、約０．５〜３０μｇ／ｍＬの抗体濃度において、未処理の腫瘍細胞と比較して、約２５〜１００％、さらに好ましくは約３０〜１００％、およびさらにより好ましくは約５０〜１００％または７０〜１００％、阻害する。
【０３０２】
増殖阻害は、細胞培養物中で、約０．５〜３０μｇ／ｍＬまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度において測定することができ、ここで、増殖阻害を、腫瘍細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に決定する。約１μｇ／体重１ｋｇ〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇでの抗Ｏｖｒ１１０抗体の投与により、抗体の最初の投与から約５日〜３ヶ月以内、好ましくは約５〜３０日以内に腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞増殖の減少がもたらされた場合に、抗体はin vivoで増殖阻害性である。
【０３０３】
細胞死を誘発する抗体を選択するために、例えばプロピジウムヨージド（ＰＩ）、トリパンブルーまたは７ＡＡＤ取り込みにより示される膜完全性の損失を、コントロールに対して評価することができる。ＰＩ取り込みアッセイは、補体および免疫エフェクター細胞の不在において行うことができる。Ｏｖｒ１１０発現腫瘍細胞は、培地のみ、または例えば約１０μｇ／ｍＬの適切なモノクローナル抗体を含む培地と共にインキュベートする。
【０３０４】
細胞は、３日間の期間にわたりインキュベートする。各々の処理に続いて、細胞は、細胞凝集塊の除去のため、洗浄して３５ｍｍの濾過器でキャップした１２×７５の管（１管あたり１ｍＬ、処理群あたり３つの管）中に等分する。次に、管にＰＩ（１０μｇ／ｍＬ）を施与する。サンプルをFACSCAN（登録商標）フローサイトメーターおよびFACSCONVERT（登録商標）CellQuestソフトウエア(Becton Dickinson)を用いて分析することができる。ＰＩ取り込みにより決定される、統計的に有意なレベルの細胞死を誘発する抗体を、細胞死誘発抗体として選択することができる。抗体はまた、他の細胞の癌に関連のある生物学的特性または細胞移動、細胞接着、サイトカイン、または成長因子分泌などの特性を含む他の免疫機構を改変する。
【０３０５】
例えば本発明のＯｖｒ１１０抗体などの興味の対象となる抗体により結合されるＯｖｒ１１０上のエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されているような、常習的なクロスブロッキングアッセイを行うことができる。このアッセイを用いて、試験抗体が本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体と同一の部位またはエピトープに結合するか否かを決定することができる。
【０３０６】
代替的に、または付加的に、エピトープマッピングを、当該分野において知られている方法により行うことができる。例えば、抗体配列をアラニンスキャニングなどにより変異誘発して、接触残基を同定することができる。変異体抗体を最初にポリクローナル抗体との結合について試験して、適切な折り畳みを確保する。異なる方法においては、Ｏｖｒ１１０の種々の領域に対応するペプチドを、試験抗体を用いた、または試験抗体および特徴付けられるかもしくは既知のエピトープを有する抗体を用いた、競合アッセイにおいて用いることができる。
【０３０７】
例えば、本発明の抗体により結合されるエピトープに結合する抗体についてスクリーニングするための方法は、Ｏｖｒ１１０含有サンプルを試験抗体および本発明の抗体と混ぜ合わせて、混合物を形成することを含むことができ、次に混合物中のＯｖｒ１１０に結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルを決定し、混合物中で結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルについてコントロール混合物に対して比較し、ここで、コントロールと比較しての混合物中のＯｖｒ１１０に結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルは、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体により結合されるエピトープへの試験抗体の結合の指標である。
【０３０８】
Ｏｖｒ１１０に結合したＯｖｒ１１０抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡにより決定する。コントロールは、ポジティブコントロールまたはネガティブコントロールまたは両方であってもよい。例えば、コントロールは、Ｏｖｒ１１０、本発明のＯｖｒ１１０抗体および本発明のＯｖｒ１１０抗体により結合されるエピトープに結合することが知られている抗体の混合物であってもよい。抗Ｏｖｒ１１０抗体は、本明細書中に開示されているような標識で標識されている。Ｏｖｒ１１０は、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ、例えばセファロースビーズに結合していてもよい。
【０３０９】
免疫抱合体
本発明はまた、抗癌剤、例えば細胞傷害剤または増殖阻害剤に結合した抗体を含む免疫抱合体（immunoconjugate）を用いる療法に関する。
このような免疫抱合体の生成において有用な化学療法剤は上に記載した。抗体および１種または２種以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド類、トリコテンおよびＣＣ１０６５の結合体ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体もまた、本明細書において企図される。
【０３１０】
メイタンシンおよびメイタンシノイド類
好ましくは、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体（全長またはフラグメント）を、１または２以上のメイタンシノイド分子に結合させる。
メイタンシノイド類は、チューブリン重合を阻害することにより作用する、有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、キャストアフリカ低木Maytenus serrataから最初に単離された（米国特許第3,896,111号）。その後、ある微生物もまた、メイタンシノイド類、例えばメイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルを産生することが見出された（米国特許第4,151,042号）。
【０３１１】
合成メイタンシノールならびにこの誘導体および類似体は、例えば、米国特許第4,137,230号；4,248,870号；4,256,746号；4,260,608号；4,265,814号；4,294,757号；4,307,016号；4,308,268号；4,308,269号；4,309,428号；4,313,946号；4,315,929号；4,317,821号；4,322,348号；4,331,598号；4,361,650号；4,364,866号；4,424,219号；4,450,254号；4,362,663号；および4,371,533号に開示されており、これらの開示は、本明細書において参考として明示的に援用される。
【０３１２】
メイタンシノイド−抗体抱合体
これらの治療指数を改善する試行において、メイタンシンおよびメイタンシノイド類を腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に抱合させた。メイタンシノイド類を含む免疫結合体およびこれらの治療的使用は、例えば、米国特許第5,208,020号、5,416,064号および欧州特許EP 0 425 235 B1に開示されており、これらの開示は、本明細書において参考として明示的に援用される。
【０３１３】
Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)には、ヒト直腸結腸癌に指向されたモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合した、ＤＭＩと表示されるメイタンシノイドを含む免疫抱合体が記載されている。この抱合体は、培養した結腸癌細胞に対して高度に細胞傷害性であることが見出され、in vivoでの腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)には、ヒト結腸癌細胞系における抗原に結合するマウス抗体Ａ７、またはＨＥＲ−２／ｎｅｕ発癌遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ．１に、メイタンシノイドがジスルフィドリンカーを介して結合している免疫結合体が記載されている。
【０３１４】
ＴＡ．１−メイタンシノイド結合体の細胞傷害性が、細胞あたり３×１０５のＨＥＲ−２表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３に対してin vitroで試験された。薬剤抱合体は、遊離のメイタンシノイド薬剤と同様の程度の細胞傷害性を達成し、これは、抗体分子あたりのメイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大し得る。Ａ７−メイタンシノイド結合体は、マウスにおいて低い全身細胞傷害性を示した。
【０３１５】
抗Ｏｖｒ１１０抗体−メイタンシノイド抱合体（免疫抱合体）
抗Ｏｖｒ１１０抗体−メイタンシノイド抱合体を、抗Ｏｖｒ１１０抗体をメイタンシノイド分子に、抗体またはメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性も顕著に低下させることなく、化学的に結合させることにより調製する。一つの抗体分子あたり平均３〜４個結合したメイタンシノイド分子が、抗体の機能または溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞の細胞傷害性を増強させることにおいて効能を示したが、１個の毒素分子／抗体ですら、裸の抗体の使用にまさって細胞傷害性を増強すると予測される。
【０３１６】
メイタンシノイド類は、当該分野において十分知られており、既知の手法により合成するかまたは自然の供給源から単離することができる。好適なメイタンシノイド類は、例えば、米国特許第5,208,020号ならびに上記で言及した他の特許および非特許刊行物中に開示されている。好ましいメイタンシノイド類は、メイタンシノールおよび、芳香環またはメイタンシノール分子の他の位置において修飾されているメイタンシノール類似体、例えばさまざまなメイタンシノールエステル類である。
【０３１７】
当該分野において知られている、抗体−メイタンシノイド抱合体を作製するための、多くの結合基があり、例えば米国特許第5,208,020号または欧州特許0 425 235 B1およびChari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)に開示されているものを含む。該結合基には、上記で識別した特許に開示されているジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、光不安定基、ペプチダーゼ不安定基またはエステラーゼ不安定基が含まれ、ジスルフィド基およびチオエーテル基が好ましい。
【０３１８】
抗体とメイタンシノイドの結合体をさまざまな二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル類（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトルエン２，６ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するための、Ｎ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）(Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978])およびＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。
【０３１９】
リンカーは結合の種類に依存して、さまざまな位置においてメイタンシノイド分子に結合していてもよい。例えば、エステル結合は、慣用のカップリング手法を用いて、水酸基との反応により形成し得る。反応は、水酸基を有するＣ−３位置、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位置、水酸基で修飾されたＣ−１５位置、および水酸基を有するＣ−２０位置において起こり得る。好ましくは、結合は、メイタンシノールまたはメイタンシノール類似体のＣ−３位置において形成される。
【０３２０】
カリケアマイシン
重要な他の免疫抱合体は、１または２以上のカリケアマイシン分子に結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル以下の濃度において二本鎖ＤＮＡ破壊を発生させることができる。カリケアマイシンファミリーの結合体の調製については、米国特許第5,712,374号、5,714,586号、5,739,116号、5,767,285号、5,770,701号、5,770,710号、5,773,001号、5,877,296号（すべてAmerican Cyanamid Company）を参照のこと。
【０３２１】
用いることができるカリケアマイシンの構造的類似体には、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθ１Ｉ（Hinman et al. Cancer Research 53: 3336 (1993), Lode et al. Cancer Research 5 8: 2925-2928 (1998)およびAmerican Cyanamidの前述の米国特許明細書）が含まれるが、これらに限定されない。抗体を結合させることができる他の抗腫瘍薬剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡは共に、細胞内作用部位を有し、細胞膜を容易に横断しない。したがって、抗体媒介内部移行によるこれらの薬剤の細胞への取り込みにより、これらの細胞傷害性効果が大幅に増大する。
【０３２２】
他の細胞傷害剤
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体に結合することができる他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン(streptozoicin)、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号および5,770,710号に記載されている、集合的にＬＬ−Ｅ３３２８８複合体と知られている薬剤のファミリーならびにエスペラミシン類（米国特許第5,877,296号）が含まれる。
【０３２３】
用いることができる酵素的として活性な毒素およびこのフラグメントには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の１  ５非結合活性フラグメント、エクソトキシンＡ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、
【０３２４】
momordica charantia阻害剤、カルシン（curcin）、クロチン（crotin）、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン（gelonin）、マイトジェリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）およびトリコテセン（tricothecene）類が含まれる。例えば１９９３年１０月２８日に刊行されたWO 93/21232を参照のこと。本発明は、さらに、抗体と、核酸分解活性を有する化合物（例えばリボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間に形成される免疫抱合体を意図する。
【０３２５】
腫瘍の選択的な破壊のために、抗体は放射性の高い原子を含むことができる。さまざまな放射性同位体が、放射結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体の産生のために使用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｉｎ１１１、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。結合体が診断に用いられる場合には、これは、シンチグラフィー検査のための放射性原子、例えばＴｃ９９ＭもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られている）のためのスピン標識、例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含むことができる。
【０３２６】
放射標識または他の標識を、既知の方法により抱合体中に導入することができる。例えば、ペプチドを、生合成しても、または、例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を用いて化学的アミノ酸合成により合成してもよい。標識、例えばＴｃ９９Ｍ、Ｉ１２３、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０は、リシン残基を介して結合することができる。IODOGEN法（Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57）を用いて、ヨウ素を導入することができる。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」（Chatal, CRC Press 1989）には、他の方法が詳細に記載されている。
【０３２７】
抗体および細胞傷害剤の結合体を、さまざまな二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル類（例えばスベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えばグルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（例えばトルエン２，６ジイソシアネート）およびビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作製することができる。
【０３２８】
例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素標識１−イソチオシアナトベンジルメチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、ラジオヌクレオチド(radionucleotide)の抗体への結合のための例示的なキレート剤である。WO 94/11026参照。リンカーは、細胞中での細胞傷害性薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー(Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)；米国特許第5,208,020号)を用いてもよい。
【０３２９】
あるいは、抗Ｏｖｒ１１０抗体および細胞傷害剤を含む融合タンパク質を、組換え手法またはペプチド合成などにより作製することができる。ＤＮＡの長さは、互いに隣接しているか、または結合体の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により分離されている、結合体の２つの部分をコードするそれぞれの領域を含むことができる。
【０３３０】
さらに、腫瘍の前標的化において用いるために、抗体を「受容体」（例えばストレプトアビジン）に結合させることができ、ここで、抗体−受容体結合体を患者に投与し、続いて結合していない結合体を循環から洗浄剤（clearing agent）を用いて除去し、次に、細胞傷害剤（例えばラジオヌクレオチド）に結合する「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０３３１】
抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）
プロドラッグ（例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145参照、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる）を活性抗癌薬剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に、抗体を抱合させることにより、本発明の抗体をＡＤＥＰＴにおいても用いることができる。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号を参照、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【０３３２】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫抱合体の酵素成分には、プロドラッグに対して作用でき、これをより活性な細胞傷害性の形態に変換する任意の酵素が含まれる。本発明の方法において有用な酵素には、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；無毒性フルオロシトシンを抗癌薬剤である５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；
【０３３３】
ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なプロテアーゼ、例えばセラチア（serratia）プロテアーゼ、テルモリシン（thermolysin）、サブチリシン（subtilisin）、カルボキシペプチダーゼ類およびカテプシン類（例えばカテプシンＢおよびＬ）；Ｄアミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な炭水化物切断酵素、例えばＯ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；
【０３３４】
Ｐ−ラクタム類で誘導体化された薬剤を遊離薬物に変換するのに有用なＰ−ラクタマーゼ；ならびにこれらのアミン窒素においてそれぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化された薬剤を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンアミダーゼ類、例えばペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼが含まれるが、これらには限定されない。
【０３３５】
あるいは、当該分野において「アブザイム（abzymes）」としても知られている、酵素活性を有する抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Massey, Nature 328: 457-458 (1987)参照）。アブザイムを腫瘍細胞集団に送達するための酵素−アブザイム結合体を、本明細書中に記載したようにして調製することができる。本発明の酵素は、当該分野において十分知られている手法、例えば上記したヘテロ二官能性架橋試薬を用いることにより、抗Ｏｖｒ１１０抗体に共有結合させることができる。
【０３３６】
あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に結合した本発明の抗体の、少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野において十分知られている組換えＤＮＡ手法を用いて構成することができる（例えばNeuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)参照）。
【０３３７】
他の抗体修飾
抗体の他の修飾が本明細書において企図される。例えば、抗体は、さまざまな非タンパク質ポリマーの１種、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーの１種に結合させることができる。抗体はまた、例えばコアセルベーション手法によりまたは界面重合により調製したマイクロカプセル中に（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセル）、コロイド状薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に封入することができる。かかる手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
【０３３８】
本明細書中に開示した抗Ｏｖｒ１１０抗体はまた、免疫リポソームとして製剤化することができる。「リポソーム」は、さまざまなタイプの脂質、リン脂質および／または、薬剤を哺乳動物に送達するのに有用な界面活性剤で構成される小さい小胞である。リポソームの成分は、一般に、生体膜の脂質配置と同様に、二層形態において配置されている。抗体を含むリポソームは、当該分野において知られている方法により、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；米国特許第4,485,045号および4,544,545号；ならびに１９９７年１０月２３日刊行のW097/38731、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる、に記載されているように調製される。
【０３３９】
循環時間が延長されるリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されており、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法により生成することができる。リポソームを所定の孔の大きさを有するフィルターを通して押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームを得る。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントを、Martin et al. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているようにして、ジスルフィド交換反応によりリポソームに結合させることができる。化学療法剤は、必要に応じてリポソーム内に包含される。Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484 (1989)参照。
【０３４０】
ベクター、宿主細胞および組換え方法
本発明はまた、ヒト化抗Ｏｖｒ１１０抗体コードする単離された核酸分子、該核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに抗体を産生するための組換え手法を提供する。抗体の組換え産生のために、これをコードする核酸分子を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために複製可能なベクター中に挿入するか、または発現のためのプロモーターを有する作動的な結合においてベクター中に挿入する。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用的な手順を用いて（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸分子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に以下の１種または２種以上が含まれるが、これらには限定されない：シグナル配列、複製の起点、１種または２種以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。
【０３４１】
シグナル配列成分
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体は、直接組換え的に産生するだけでなく、異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え的に産生することができ、ここで該異種性ポリペプチドは、好ましくは、シグナル配列、または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端において特定の切断部位を有する他のポリペプチドである。選択された異種性シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、加工される（すなわちシグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。
【０３４２】
ネイティブの抗Ｏｖｒ１１０抗体シグナル配列を認識および加工しない原核宿主細胞に対しては、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核シグナル配列により置換する。酵母での分泌のために、ネイティブのシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、ｏｃ因子リーダー（SaccharomycesおよびKluyveromycesｃｃ因子リーダーを含む）、または酸ホスファターゼリーダー、C albicansグルコアミラーゼリーダー、またはWO 90/13646に記載されているシグナルにより置換することができる。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域についてのＤＮＡは、抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードするＤＮＡにリーディング・フレームにおいて連結する。
【０３４３】
複製起点
発現およびクローニングベクターは共に、ベクターを１または２以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターがホスト染色体ＤＮＡとは独立して複製されることを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。種々の細菌、酵母およびウイルスについてのかかる配列が、よく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点はほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド起点は酵母に好適であり、多様なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、哺乳動物発現ベクターについては、複製起点コンポーネントは必要ではない（ＳＶ４０起点は、典型的には、これが初期プロモーターを含むとの理由のみにより用いられ得る）。
【０３４４】
選択遺伝子成分
発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠乏を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地から得られない必須栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、これは、桿菌についてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。選択スキームの１つの例では、宿主細胞の増殖を停止する薬剤を用いる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって選択レジメンを生き延びる。このような優性選択の例においては、薬剤であるネオマイシン、マイコフェノール酸およびヒグロマイシンを用いる。
【０３４５】
哺乳動物細胞に適する選択可能なマーカーの別の例は、抗Ｏｖｒ１１０抗体核酸を吸収することについて競合性の細胞を同定することを可能にするものであり、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−１１、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどである。例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換される細胞を、先ずＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含む培養培地中ですべての形質転換体を培養することにより同定する。野生型のＤＨＦＲを用いる場合の適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠乏しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えばATCC CRL-9096）である。
【０３４６】
あるいは、抗Ｏｖｒ１１０抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質および他の選択可能なマーカー、例えばアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）をコードするＤＮＡ配列で形質転換または同時形質転換（co-transform）された宿主細胞（特に内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、選択可能なマーカーのための選択剤、例えばアミノグリコシド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８のための選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第4,965,199号参照。
【０３４７】
酵母における使用に適する選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である(Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979))。ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いている酵母の、突然変異菌株、例えばATCC No. 44076またはPEP4 Jones, Genetics, 85:12 (1977)のための選択マーカーを提供する。次いで、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐｌ異常の存在は、トリプトファンの不在下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠損酵母菌株（ATCC 20,622または38,626）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
【０３４８】
さらに、１．６ｐｍ環状プラスミドｐＫＤＩに由来するベクターを、Kluyveromyces酵母の形質転換のために用いることができる。あるいは、組換え仔ウシキモシンの大規模な産生のための発現系がK. lactisについて報告された。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。Kluyveromycesの工業的な菌株による、成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定なマルチコピー発現ベクターも開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
【０３４９】
プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、抗Ｏｖｒ１１０抗体核酸に作動的に連結している。原核宿主と共に用いるのに適するプロモーターには、ｐｈｏＡプロモーター、Ｐ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターが含まれる。しかし、他の既知の細菌性プロモーターが好適である。細菌系において用いるためのプロモーターはまた、抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードするＤＮＡに作動的に連結したShine-Dalgarno（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０３５０】
真核生物についてのプロモーター配列は、公知である。事実上すべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置する、ＡＴリッチな領域を有する。多くの遺伝子において転写開始部位から７０〜８０塩基上流に見出される他の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、ここでＮは、任意のヌクレオチドであってよい。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端において、ポリＡテールのコード配列を３’末端へ添加するためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。
【０３５１】
これらの配列のすべてを、真核発現ベクター中に好適に挿入する。酵母宿主と共に用いるのに適するプロモーター配列の例には、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素についてのプロモーター、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼについてのプロモーターが含まれる。
【０３５２】
生育条件により転写が制御されるというさらなる利点を有する誘導プロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースに関与する酵素についてのプロモーター領域である。酵母での発現における使用に好適なベクターおよびプロモーターは、さらに、EP 73,657に記載されている。酵母エンハンサーはまた、酵母プロモーターと共に有利に用いられる。
【０３５３】
哺乳動物宿主細胞中のベクターからの抗Ｏｖｒ１１０抗体転写は、プロモーターが宿主細胞系と適合性であれば、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター（例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）から得られたプロモーター、熱ショックプロモーターから得られたプロモーターにより制御される。
【０３５４】
ＳＶ４０ウイルスの初期および後期のプロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即時型早期プロモーターは、ＨｉｎｄＩｌｌ  Ｅ制限フラグメントとして好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の改変は、米国特許第4,601,978号に記載されている。また単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御の下での、マウス細胞におけるヒトＰ−インターフェロンｃＤＮＡの発現については、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルスの長い末端リピートをプロモーターとして用いることができる。
【０３５５】
エンハンサーエレメント成分
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより多くの場合増強される。現在多数のエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）から知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。
【０３５６】
例として、複製起点の後期側（late side）のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについては、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、抗Ｏｖｒ１１０抗体コード配列に対して５’または３’の位置において、ベクター中にスプライシング挿入することができるが、好ましくは、プロモーターから５’側の部位に位置させる。
【０３５７】
転写終結成分
真核宿主細胞（酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞）において用いられる発現ベクターはまた、転写を終結させるのに、およびｍＲＮＡを安定化させるのに必要な配列を含む。かかる配列は、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、および場合によっては３’の未翻訳領域から一般的に入手できる。これらの領域は、抗Ｏｖｒ１１０抗体をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO 94/11026およびこの文献中に開示されている発現ベクターを参照のこと。
【０３５８】
宿主細胞の選択および形質転換
本明細書において、ベクター中でＤＮＡをクローニングするかまたは発現するために好適な宿主細胞は、上記の原核、酵母または高等真核細胞である。この目的に好適な原核生物には、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科、大腸菌属、例えばE.coli、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばSalmonella typhimurium、セラチア属、例えばSerratia marcescans、および赤痢菌属、ならびに桿菌、例えばB. subtilisおよびB. licheniformis（例えばDD 266,710、１９８９年４月１２日刊行に開示されているB. licheniformis 41P）、シュードモナス属、例えばP. aeruginosa、ならびにストレプトマイセス属が含まれる。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、E. coli 294（ATCC 31,446）であるが、他の菌株、例えばE. coli B、E. coli X1776（ATCC 31,537）およびE. coli W31 10（ATCC 27,325）が好適である。これらの例は、限定的というよりむしろ例示的である。
【０３５９】
全長抗体、抗体フラグメントおよび抗体融合タンパク質は、細菌において産生することができ、特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要ではない場合、例えば治療的抗体が細胞傷害剤（例えば毒素）に結合しており、免疫抱合体が単独で腫瘍細胞破壊における有効性を示す場合に、細菌において産生することができる。全長抗体は、循環においてより長い半減期を有する。大腸菌での産生はより迅速で費用効率的である。
【０３６０】
細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、翻訳開始領域（ＴＩＲ）ならびに発現および分泌を最適化するためのシグナル配列を記載している。例えば、米国特許第5,648,237号(Carter et. al.)、米国特許第5,789,199号(Joly et al.)および米国特許第5,840,523号(Simmons et al.)を参照のこと。これらの特許を、参照として本明細書中に援用する。発現の後に、可溶化区分における大腸菌細胞ペーストから抗体を単離し、アイソタイプに依存して、例えばプロテインＡまたはＧカラムにより精製することができる。最終的な精製は、例えばＣＨＯ細胞中で発現された抗体を精製するための方法と同様に行うことができる。
【０３６１】
原核生物に加えて、真核微生物、例えば糸状真菌類または酵母が、抗Ｏｖｒ１１０抗体コードベクターに適するクローニングまたは発現宿主である。Saccharomyces cerevisiaeまたは一般的なパン酵母は、下等な真核宿主微生物の中で最も一般的に用いられている。しかし、多くの他の属、種および菌株が一般に入手可能で有用であり、例えばSchizosaccharomyces pombe；Kluyveromyces宿主、例えばK. lactis、K. fragilis (ATCC 12,424)、K. bulgaricus (ATCC 16,045)、K. wickeramii (ATCC 24,178)、K. waltii (ATCC 56,500)、K. drosophilarum (ATCC 36,906)、K . thermotoleransおよびK. marxianus; yarrowia (EP 402,226)；Pichia pastoris (EP 183,070)；カンジダ属；Trichoderma reesia (EP 244,234)；Neurospora crassa；Schwanniomyces、例えばSchwanniomyces occidentalis；ならびに糸状真菌類、例えばパンカビ属、アオカビ属、Tolypocladiumおよびコウジカビ属宿主、例えばA. nidulansおよびA. nigerなどである。
【０３６２】
グリコシル化された抗Ｏｖｒ１１０抗体の発現に適する宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物および昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス菌株および変異体ならびに宿主、例えばSpodoptera frugiperda（鱗翅目幼虫）、Aedes aegypti（蚊）、Aedes albopictus（蚊）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）およびBombyx moriからの対応する許容的な昆虫宿主細胞が、同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス菌株、例えばAutographa californica NPVのＬ−１変種およびBombyx mori NPVのＢｍ−５菌株が公的に入手可能であり、かかるウイルスは、ここで本発明のウイルスとして、特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために用いることができる。
【０３６３】
綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、シロイヌナズナおよびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として用いることができる。植物細胞培養物におけるタンパク質の産生において有用なクローニングおよび発現ベクターは、当業者に知られている。例えばHiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78、Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794、Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750およびFecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986参照。
【０３６４】
しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も大きく、培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞の増殖が常習的な手順となった。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１系列（ＣＯＳ−７、ATCC CRL 1651）；ヒト胚腎臓系列（２９３または懸濁液培養物中で増殖するためにサブクローニングした２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ATCC CCL 10）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ATCC CCL 70）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ATCC CRL1587）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ATCC CCL 2）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ATCC CCL 34）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ATCC CRL 1442）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ATCC CCL 75）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、1413 8065）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ATCC CCL5 1）；ＴＲＩ細胞(Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫系列（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
【０３６５】
宿主細胞を、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて抗Ｏｖｒ１１０抗体産生のために形質転換し、プロモーターを誘発するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変した、慣用的な栄養培地中で培養する。
【０３６６】
宿主細胞の培養
本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体を産生するために用いられる宿主細胞は、さまざまな培地中で培養することができる。市販の培地、例えばHam's FIO (Sigma)、基礎培地(ＭＥＭ)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)およびダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Sigma)は、宿主細胞を培養するのに適する。さらに、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第4,767,704号；4,657,866号；4,927,762号；4,560,655号；もしくは5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；または米国特許Re. 30,985号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞のための培養培地として用いることができる。
【０３６７】
これらの培地のすべてに、必要に応じてホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインシュリン因子、トランスフェリン因子もしくは上皮細胞成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド類（例えばアデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えばGENTAMYCIN（登録商標）薬剤）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補足することができる。すべての他の必要な補足物もまた、当業者に知られている適切な濃度で含有することができる。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞について前に用いられているものであり、通常の当業者には明らかである。
【０３６８】
抗Ｏｖｒ１１０抗体の精製
組換え手法を用いる場合、抗体を細胞内で細胞膜周辺腔または培地に直接分泌して産生することができる。細胞内で抗体を産生する場合は、第１のステップとして粒子状残骸、宿主細胞または溶解したフラグメントのいずれかを、例えば遠心分離または限外濾過により除去する。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。
【０３６９】
簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたり融解させる。細胞残骸は遠心分離により除去することができる。抗体を培地に分泌する場合は、このような発現系からの上清は一般に、先ず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて濃縮する。例えばＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤は、前述のステージのいずれかにおいて導入して、タンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を導入して、外来性の混入物の増殖を防止することができる。
【０３７０】
細胞から調製された抗体組成物を、例えばヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析およびアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが、好ましい精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃ領域の種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる(Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983))。
【０３７１】
プロテインＧが、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３のために推奨される(Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986))。アフィニティーリガンドが付着したマトリックスは、最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。機械的に安定なマトリックス、例えば細孔性ガラス（controlled pore glass）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンにより、アガロースを用いて達成し得るよりも速い流速および短い加工時間が可能になる。抗体がＣＨ３領域を含む場合、Bakerbond ABX（登録商標）樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)が、精製に有用である。
【０３７２】
タンパク質精製のための他の手法、例えばイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリンSEPHAROSE（登録商標）上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＩＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿もまた、回収されるべき抗体に依存して利用可能である。
【０３７３】
１または２以上のすべての予備的精製ステップに続いて、関連する抗体および混入物を含む混合物に、ｐＨ約２．５〜４．５の溶離緩衝液を用いて、好ましくは低い塩濃度（例えば約０〜０．２５Ｍの塩）において行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施すことができる。
【０３７４】
医薬製剤
本発明にしたがって用いる抗体の医薬製剤を、保管のために所望の程度の純度を有する抗体を随意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合し(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))、凍結乾燥した製剤または水性溶液の形態において調製する。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度においてレシピエントに対して無毒性であり、
【０３７５】
緩衝液、トリス、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸類などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０個の残基よりも小さい）ポリペプチド類；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン類；親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸類、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；
【０３７６】
グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；強壮剤類(tonicifier)、例えばトレハロースおよび塩化ナトリウム；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；界面活性剤、例えばポリソルベート；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体類（例えばＺｎ−タンパク質複合体類）；および／または非イオン系界面活性剤、例えばTWEEN（登録商標）、PLURONICS（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。抗体は、好ましくは、５〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度での抗体を含む。
【０３７７】
ここでの製剤はまた、処置される特定の適応のための必要に応じて、１種より多い活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含むことができる。例えば、内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体に加えて、１つの製剤において、追加の抗体、例えばＯｖｒ１１０上の異なるエピトープに結合する第２の抗Ｏｖｒ１１０抗体、または、例えば特定の癌の増殖に影響する成長因子などの他の標的に対する抗体を含むのが望ましい場合がある。代替的に、または付加的に、この組成物はさらに、化学療法剤、細胞傷害剤、サイトカイン、成長阻害剤（growth inhibitory agent）、抗ホルモン剤および／または心臓保護剤（cardioprotectant）を含むことができる。かかる分子は、好適に、意図される目的のために有効な量で、組み合わせて存在する。
【０３７８】
活性成分はまた、例えばコアセルベーション手法または界面重合により調製したマイクロカプセルに封入することができ、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド状薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて封入することができる。かかる手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０３７９】
徐放製剤を調製してもよい。徐放製剤の好適な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマー類の半透過性マトリックスが含まれ、このマトリックスは、成形した物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド類（米国特許第3,773,919号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー類、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー類、例えばLUPRON DEPOT（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成された注射可能な微粒子）、ならびにポリ−Ｄ−（−）ヒドロキシ酪酸が含まれる。
in vivoでの投与のために用いるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
【０３８０】
抗Ｏｖｒ１１０抗体を用いた方法および処置
本発明によれば、Ｏｖｒ１１０に結合してＯｖｒ１１０の活性を調節するまたは細胞表面上のＯｖｒ１１０に結合すると内部移行する抗Ｏｖｒ１１０抗体を用いて、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞を特徴とする癌、特に卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌、および関連する転移などの卵巣癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、腎臓癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を有する、かかる処置を必要としている被験体を処置する。
【０３８１】
前記の癌は一般にＯｖｒ１１０発現細胞を含み、抗Ｏｖｒ１１０抗体はこれに結合することができる。前記の癌はＯｖｒ１１０分子の過剰発現により特徴付けることができるが、本出願はさらに、Ｏｖｒ１１０過剰発現癌であるとは考えられない癌を処置するための方法も提供する。
【０３８２】
本発明はまた、Ｏｖｒ１１０を過剰発現する細胞を検出するための方法および、Ｏｖｒ１１０を発現する細胞を検出するにあたり、または患者の血清中のＯｖｒ１１０の検出に有用な診断キットに関する。該方法は、細胞含有試験サンプルを本発明の抗体と混ぜ合わせること、試験サンプルを、試験サンプル中の細胞に結合する抗体についてアッセイすること、および試験サンプルにおいて結合する抗体のレベルを、細胞のコントロールサンプルにおいて結合する抗体のレベルに対して比較することを含んでもよい。
【０３８３】
好適なコントロールは、例えば、試験サンプルと同一種類の正常な細胞のサンプル、またはＯｖｒ１１０過剰発現細胞を含まないことが知られている細胞サンプルである。かかるコントロールサンプルより高いＯｖｒ１１０結合レベルは、試験サンプルがＯｖｒ１１０を過剰発現する細胞を含むことを示す。あるいは、コントロールは、Ｏｖｒ１１０を過剰発現する細胞を含むことが知られている細胞のサンプルであってもよい。このような場合において、試験サンプルにおける、コントロールサンプルに類似したＯｖｒ１１０抗体結合レベル、またはコントロールサンプルを超えるＯｖｒ１１０抗体結合レベルは、試験サンプルがＯｖｒ１１０を過剰発現する細胞を含むことを示す。
【０３８４】
Ｏｖｒ１１０過剰発現は、さまざまな診断アッセイにより検出することができる。例えば、Ｏｖｒ１１０の過剰発現は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）によりアッセイすることができる。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片に、ＩＨＣアッセイを施し、Ｏｖｒ１１０タンパク質染色強度の以下の基準と一致させることができる。
【０３８５】
スコア０  染色は観察されない、または腫瘍細胞の１０％未満において膜染色が観察される。
スコア１＋  わずかな／辛うじて知覚可能な膜染色が、腫瘍細胞の１０％以上において検出される。細胞は、それらの膜の一部のみ染色されている。
スコア２＋  弱い、ないし中程度の完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％以上において観察される。
スコア３＋  中程度ないし強い完全な膜染色が、腫瘍細胞の１０％以上において観察される。
【０３８６】
Ｏｖｒ１１０発現についての０または１＋のスコアを有する腫瘍を、Ｏｖｒ１１０を過剰発現しないものとして特徴付けることができ、一方２＋または３＋のスコアを有する腫瘍を、Ｏｖｒ１１０を過剰発現するものとして特徴付けることができる。
【０３８７】
代替的に、または付加的に、ＦＩＳＨアッセイ、例えばINFORM（登録商標）（Ventana, Arizonaにより販売されている）またはPATHVISION（登録商標）(VySiS, Illinois)を、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織において行い、腫瘍におけるＯｖｒ１１０過剰発現の程度（存在する場合には）を決定することができる。Ｏｖｒ１１０過剰発現または増幅を、in vivo診断アッセイを用いて評価することができ、例えばＯｖｒ１１０を結合する、検出可能な標識（例えば放射性同位体または蛍光標識）で標識した分子（例えば本発明の抗体）を投与し、患者を該標識の局在について外部から走査することにより、評価することができる。
【０３８８】
Ｏｖｒ１１０を発現または過剰発現する細胞を含むことが疑われるサンプルを、本発明の抗体と、抗体のＯｖｒ１１０への特異的結合に適する条件の下で、混ぜ合わせる。本発明のＯｖｒ１１０抗体の結合および／または内部移行は、Ｏｖｒ１１０を発現する細胞を示す。結合レベルを決定して好適なコントロールと比較することができ、ここで、コントロールと比較して上昇した結合Ｏｖｒ１１０のレベルは、Ｏｖｒ１１０過剰発現を示す。Ｏｖｒ１１０を過剰発現する細胞を含むことが疑われるサンプルは、癌細胞サンプル、特に卵巣癌、例えば卵巣漿液性腺癌、または乳癌、例えば乳房浸潤性乳管癌、のサンプルであってもよい。
【０３８９】
被験体の血清サンプルを本発明のＯｖｒ１１０抗体と混ぜ合わせ、抗体に結合したＯｖｒ１１０のレベルを決定し、このレベルをコントロールと比較することにより、被験体からの血清サンプルもまたＯｖｒ１１０のレベルについてアッセイすることができ、ここで、コントロールと比較して、患者の血清中におけるＯｖｒ１１０の上昇したレベルは、患者の細胞によるＯｖｒ１１０の過剰発現を示す。被験体は、例えば、卵巣癌、例えば卵巣漿液性腺癌、または乳癌、例えば乳房浸潤性乳管癌、などの癌を有している可能性がある。
【０３９０】
現在、癌のステージに依存して、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の処置は、以下の療法の１種または組み合わせを含む：癌組織を除去するための手術、放射線療法、アンドロゲン剥脱（例えばホルモン療法）、および化学療法。抗Ｏｖｒ１１０抗体療法は、化学療法の毒性および副作用を十分に耐容しない年長の患者において、放射線または化学療法の有用性が限定された転移性疾患において、特に望ましい場合がある。
【０３９１】
本発明の腫瘍標的化および内部移行抗Ｏｖｒ１１０抗体は、Ｏｖｒ１１０発現癌、例えば卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌または乳癌を、疾患の最初の診断の際に、または再発の間に緩和させるのに有用である。治療的用途のために、抗Ｏｖｒ１１０抗体を単独で、または例えば他の抗体、化学療法薬、ホルモン、抗血管新生剤もしくは放射標識した化合物との組合せ、または手術、凍結療法および／または放射線療法との組合せ療法において、特に卵巣癌、膵臓癌、子宮内膜癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺癌もしくは乳癌のために、また特に排出された細胞が到達し得ない場合において用いることができる。
【０３９２】
抗Ｏｖｒ１１０抗体による処置は、他の形態の従来の療法と組み合わせて、前または後慣用療法に連続して投与することができ、化学療法薬剤、例えばTaxotere（登録商標）（ドセタキセル）、Taxol（登録商標）（パクリタキセル）、エストラムスチンおよびマイトキサントロンは、転移性およびホルモン抵抗性卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌の処置において、特に危険の少ない患者において用いることができる。癌、特に、アンドロゲン非依存性および／または転移性卵巣癌、膵臓癌、肺癌もしくは乳癌を処置または緩和するための、本発明のこの方法において、癌患者に、抗Ｏｖｒ１１０抗体を、１種または２種以上の前の化学療法剤での処置と組み合わせて投与することができる。
【０３９３】
特に、パクリタキセルおよび修飾した誘導体（例えばEP0600517参照）との組合せ療法が企図される。抗Ｏｖｒ１１０抗体を、治療的に有効な用量の化学療法剤と共に投与する。抗Ｏｖｒ１１０抗体はまた、化学療法と組み合わせて投与して、化学療法剤、例えばパクリタキセルの活性および効能を増強することができる。米国医薬品便覧（ＰＤＲ）には、さまざまな癌の処置において用いられている当該剤の投与量が開示されている。治療上有効なこれらの前述の化学療法薬剤の投薬計画および投与量は、処置される特定の癌、疾患の程度および当該分野における熟練した医師が精通している他の要因に依存し、医師により決定されることができる。
【０３９４】
特に、細胞傷害剤と結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体を含む免疫結合体を、患者に投与することができる。好ましくは、Ｏｖｒ１１０タンパク質に結合した免疫結合体は、細胞により内部移行され、この抗体が結合する癌細胞の死滅における免疫結合体の治療効果の増強がもたらされる。好ましくは、細胞傷害剤は、癌細胞の核酸を標的化するかまたはこれに干渉する。かかる細胞傷害剤の例は上記の通りであり、メイタンシン、メイタンシノイド類、サポリン、ゲロニン、リシン、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
【０３９５】
抗Ｏｖｒ１１０抗体または免疫抱合体を、ヒト患者に、静脈内投与などの既知の方法にしたがって、例えば大量瞬時投与として、またはある期間にわたる連続的な注入により、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、滑膜内（intrasynovial）、くも膜下腔内、経口、局所的または吸入経路により投与する。抗体または免疫抱合体を、腫瘍本体に直接注射してもよい。抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。他の治療計画を、抗Ｏｖｒ１１０抗体の投与と組み合わせてもよい。
【０３９６】
組み合わせ投与には、個別の製剤または単一の医薬製剤を用いた同時投与、およびいずれかの順序での連続的投与が含まれ、ここで、両方（またはすべて）の活性剤が、その生物学的活性を同時に奏する期間があることが好ましい。好ましくは、かかる組み合わせ療法の結果、相乗的な治療効果がもたらされる。
【０３９７】
また、１種または２種以上の抗Ｏｖｒ１１０抗体の投与を、特定の癌に関連する他の腫瘍抗原に指向された抗体の投与と組み合わせることが、望ましい場合がある。このようにして、本発明はまた、本発明の１種または２種以上の抗体および、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍細胞と関連する他の腫瘍抗原に結合する少なくとも１種の他の抗体を含む、抗体「カクテル」に関する。該カクテルはまた、Ｏｖｒ１１０の他のエピトープに指向された抗体を含むことができる。好ましくは、他の抗体は、本発明の抗体の結合およびまたは内部移行に干渉しない。
【０３９８】
本発明の抗体治療処置方法は、抗Ｏｖｒ１１０抗体（単数または複数）および１種または２種以上の化学療法剤もしくは増殖阻害剤の組合せ投与を含むことができ、さまざまな化学療法剤のカクテルの同時投与を含む。化学療法剤には、例えば、リン酸エストラムスチン、プレドニムスチン、シスプラチン、５−フルオロウラシル、メルファラン、シクロホスファミド、ヒドロキシ尿素およびヒドロキシ尿素タキサン類（例えばパクリタキセルおよびドキセタキセル）および／またはアントラサイクリン抗生物質が含まれる。かかる化学療法剤のための調製および投与スケジュールは、製造者の指示にしたがって、または技術のある施術者が経験的に決定するようにして用いることができる。このような化学療法のための調製および投与計画は、Chemotherapy Service, Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも説明されている。
【０３９９】
抗体を、抗ホルモン化合物；例えばタモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストン（EP 616 812参照）などの抗プロゲステロン化合物；またはフルタミドなどの抗アンドロゲン化合物と、かかる分子について知られている投与量で混ぜ合わせることができる。処置されるべき癌がエストロゲン非依存性癌である場合には、患者は予め抗エストロゲン療法を受けていてもよく、癌がエストロゲン非依存性となった後に、抗Ｏｖｒ１１０抗体（および任意に本明細書中に記載した他の薬剤）を、患者に投与することができる。
【０４００】
時には、心臓保護剤（療法に付随する心筋機能障害を予防するかまたは低減させるため）または１種もしくは２種以上のサイトカインを患者に同時投与することも有益であり得る。前述の療法計画に加えて、患者に対して、癌細胞の手術的除去および／または放射線療法を、抗体療法の前に、抗体療法と同時に、または抗体療法の後に施してもよい。前述の同時投与される任意の薬剤に好適な投与量は、ここで用いられたものであり、薬剤と抗Ｏｖｒ１１０抗体との組み合わされた作用（相乗作用）のために減少させることもできる。
【０４０１】
疾患の予防または処置のために、投与量および投与の方式を、既知の基準にしたがって医師が選択する。抗体の好適な投与量は、上記において定義した、処置すべき疾患の種類、疾患の重篤度および経過、抗体が予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、前の療法、患者の臨床履歴および抗体への応答ならびに担当医の裁量に依存する。抗体は、患者に対して、１回でまたは一連の処置にわたり好適に投与する。好ましくは抗体は、静脈内注入により、または皮下注射により投与する。疾患の種類および重篤度に依存して、約１ｐｇ／体重１ｋｇ〜約５０ｍｇ／体重１ｋｇ（例えば約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体を、例えば、１もしくは２以上の別個の投与による、または連続的な注入による、患者への投与のための最初の候補投与量とすることができる。
【０４０２】
投与計画は、約４ｍｇ／ｋｇの最初の負荷用量を投与し，続いて約２ｍｇ／ｋｇの抗Ｏｖｒ１１０抗体の用量を毎週維持することを含むことができる。しかし、他の投与計画も有用であり得る。典型的な毎日の投与量は、前述の要因に依存して、約１ｐｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはこれ以上の範囲内であり得る。状態に依存した、数日またはこれより長い期間にわたる繰り返し投与については、疾患症状の所望の抑制がもたらされるまで処置を持続させる。この療法の進行を、慣用の方法およびアッセイにより、および医師または他の当業者に知られている基準に基づいて、容易にモニタリングすることができる。
【０４０３】
抗体タンパク質の患者への投与に加えて、本出願は、遺伝子療法による抗体の投与を企図する。抗体をコードする核酸分子のこのような投与は、「抗体の治療有効量を投与する」との表現により包含される。例えば、遺伝子療法を用いて細胞内抗体を生成することに関する、１９９６年３月１４日刊行のWO 96/07321（該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる）を参照のこと。
【０４０４】
核酸分子（任意にベクターに包含されている）を患者の細胞中に導入するための、in vivoおよびex vivoの２つの主要な方法がある。in vivo送達に対しては、核酸分子を患者に直接、通常は抗体が必要である部位において注射する。ex vivo処置に対しては、患者の細胞を取り出し、核酸分子をこれらの単離した細胞中に導入し、修飾した細胞を、患者に、直接、または例えば多孔質膜内に封入し、これを患者中に移植して、投与する（例えば米国特許第4,892,538号および5,283,187号参照、該開示は参照によって本明細書に明示的に組み込まれる）。
【０４０５】
核酸分子を生存細胞中に導入するために利用可能なさまざまな手法がある。これらの手法は、核酸が、培養した細胞中にin vitroで移送されるか、または目的の宿主の細胞中にin vivoで移送されるかに依存して変化する。核酸を哺乳動物細胞中にin vitroでトランスファーするのに適した手法には、リポソームの使用、電気穿孔法、マイクロ注射、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿方法などが含まれる。遺伝子のex vivo送達のために共通して用いられるベクターは、レトロウイルスベクターである。
【０４０６】
現在の好ましいin vivoの核酸分子移送手法には、ウイルスベクター（例えばアデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルスまたはアデノ関連ウイルス）および脂質に基づく系（遺伝子の脂質媒介移送に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）を用いたトランスフェクションが含まれる。現在知られている遺伝子マーキングおよび遺伝子療法プロトコルの概説については、Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)を参照のこと。またWO 93/25673およびこの文献中に引用されている参考文献を参照のこと。
【０４０７】
製品およびキット
本発明はまた、Ｏｖｒ１１０過剰発現細胞の検出および／またはＯｖｒ１１０発現癌、特に卵巣癌、膵臓癌、肺癌もしくは乳癌の処置に有用な物質を含む製品に関する。製品は、容器およびこの中に収容された組成物を含み、該組成物は本発明の抗体を含む。該組成物はさらに、担体を含むことができる。製品はまた、容器上にまたはこれに付随してラベルまたは添付文書を含むことができる。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、さまざまな材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成することができる。
【０４０８】
容器は、Ｏｖｒ１１０発現細胞を検出し、および／または癌状態を処置するのに有効な組成物を保持し、また無菌のアクセス口を有することができる（例えば、この容器は、静脈内溶液袋または皮下組織注射針により貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、本発明の抗Ｏｖｒ１１０抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、Ｏｖｒ１１０発現細胞を検出し、および／または卵巣癌、膵臓癌、肺癌もしくは乳癌、またはより具体的に、卵巣漿液性腺癌、もしくは乳房浸潤性乳管癌を、これを必要としている患者において処置するのに用いられることを示す。
【０４０９】
ラベルまたは添付文書は、さらに、抗体組成物を癌患者に投与するための指示を含むことができる。さらに、製品は、本発明の抗体を検出する物質、例えば本発明の抗体に結合する第２の抗体を含む第２の容器をさらに含むことができる。この物質は、検出可能な標識、例えば本明細書中に開示したもので標識することができる。第２の容器は、例えば、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用の静性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含むことができる。製品はさらに、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができ、これらには他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジが含まれる。
【０４１０】
さまざまな目的に有用なキットが提供され、例えばＯｖｒ１１０細胞殺傷アッセイのため、Ｏｖｒ１１０を細胞から精製もしくは免疫沈澱するため、または血清サンプル中のＯｖｒ１１０の存在を検出するかもしくは細胞サンプル中のＯｖｒ１１０発現細胞の存在を検出するために有用なキットである。Ｏｖｒ１１０の単離および精製のために、キットは、固体支持体、例えば組織培養プレートまたはビーズ（例えばセファロースビーズ）に結合した抗Ｏｖｒ１１０抗体を含むことができる。Ｏｖｒ１１０をin vitroで、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて検出し定量するための抗体を含むキットを提供することができる。
【０４１１】
製品と同様に、キットは容器およびこの中に収容される組成物であって本発明の抗体を含む該組成物を含む。キットはさらに、容器上またはこれに付随するラベルまたは添付文書を含むことができる。キットは、追加の成分を含むことができ、例えば希釈剤および緩衝液、本発明の抗体に結合する物質、これは、例えば本明細書中に開示したような標識、例えば放射性標識、蛍光標識を含むことができる第２の抗体もしくは酵素を含むことができ、またはキットはまたコントロールの抗体を含むことができる。追加の成分は、キット内の別の容器内にあってもよい。ラベルまたは添付文書は、組成物の説明および、意図されたin vitroまたは診断的使用のための指示を提供することができる。
【実施例１】
【０４１２】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの産生および単離
本発明の以下のＭＡｂ／ハイブリドーマ：Ｏｖｒ１１０．Ｑ１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１７、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１８、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２０、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２１、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２４、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２５、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ２７を以下に説明する。
【０４１３】
ＭＡｂがクローニングされている場合、これは「Ｘ．１」の命名を得る。例えば、Ｏｖｒ１１０．Ｑ３の最初のクローンをＱ３．１と呼び、Ｑ３の第２のクローンをＱ３．２と呼ぶ。本発明の目的ために、Ｑ３についての言及は、すべてのクローン、例えばＱ３．１、Ｑ３．２などを含む。
【０４１４】
免疫原および抗原
抗体産生、スクリーニングおよび特徴付けのため、様々な組換えタンパク質、膜、調製物およびトランスフェクトされた細胞を、以下に記載するように調製した。
以下に記載するＯｖｒ１１０構築物のため、Ｏｖｒ１１０のコード領域の核酸分子を、様々な発現ベクターに、組換えタンパク質を産生するために挿入した。これらの核酸配列をプライマーを用いて単離した。該プライマーの設計は、当業者にとって慣用的なものである。いくつかの場合において、使用したプライマーは以下に記載の各構築物に含まれる。
【０４１５】
描写の目的のため、各構築物によってコードされた予測されるアミノ酸配列もまた含まれる。しかしながら、構築物は自然発生的な変異体（例えば対立遺伝子多型、ＳＮＰｓ）をプライマーによって単離されたＯｖｒ１１０領域内に含み得る。これらの変異配列、およびそれらに結合する抗体もまた、本明細書に記載の発明の一部と考える。
【０４１６】
Ｏｖｒ１１０構築物１（Ｈｉｓタグされたもの）
Ｏｖｒ１１０タンパク質全長、Ｍｅｔ１からＬｙｓ２８２、をコードする核酸分子が、クローニングサイトの３’末端に２つの中間アミノ酸、ＡｌａおよびＳｅｒ、ならびに６Ｈｉｓタグをコードする配列を含む改変されたベクターに挿入された。Ｏｖｒ１１０核酸断片が挿入された得られたベクターは、６ＨｉｓタグがＯｖｒ１１０タンパク質のＣ末端に融合した組換えＯｖｒ１１０融合タンパク質をコードする。全長Ｏｖｒ１１０Ｈｉｓタグタンパク質をコードするこの組換えプラスミドを、本明細書中において「Ｏｖｒ１１０構築物１」と呼ぶ。Ｏｖｒ１１０構築物１によってコードされる代表的なアミノ酸配列が、配列番号５１に提示されている。
【０４１７】
【化１】
0005391073.tif 000005
構築物１によって発現するＯｖｒ１１０タンパク質を、構築物１をトランスフェクトした２９３Ｆ細胞の細胞培養物から、標準の技術を用いてカラム精製した。集めた画分からのサンプルを、タンパク質の純度を評価するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。
【０４１８】
Ｏｖｒ１１０−ｈＦｃ（ＴＭ付き）
成熟Ｏｖｒ１１０タンパク質、アミノ酸Ｇｌｙ３０からＬｙｓ２８２、をコードする核酸分子を、クローニングサイトの５’末端にヒトスタニオカルシン１（ＳＴＣ）からのアミノ酸分泌シグナル配列をコードする配列、およびクローニングサイトの３’末端に２つの中間アミノ酸、ＡｌａおよびＳｅｒ、ならびにヒトＦｃ領域（ｈＦｃ）をコードする配列を含む改変されたベクターに挿入した。Ｏｖｒ１１０核酸断片が挿入された得られたベクターは、Ｎ末端にＳＴＣ分泌シグナルを有し、ｈＦｃがＯｖｒ１１０タンパク質のＣ末端に融合した、組換えＯｖｒ１１０融合タンパク質をコードする。成熟Ｏｖｒ１１０−ｈＦｃタンパク質をコードするこの組換えプラスミドを、本明細書中において「Ｏｖｒ１１０構築物２」と呼ぶ。Ｏｖｒ１１０構築物２によってコードされる代表的なアミノ酸配列を、配列番号５２に提示する。
【０４１９】
【化２】
0005391073.tif 000006
構築物２によって発現するＯｖｒ１１０タンパク質を、構築物２をトランスフェクトした２９３Ｆ細胞の細胞培養物から、標準の技術を用いてカラム精製した。集めた画分からのサンプルを、タンパク質の純度を評価するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。
【０４２０】
Ｏｖｒ１１０を過渡的にトランスフェクトした２９３Ｆ
Invitrogen社（Carlsbad, CA）から入手した２９３Ｆセルラインからの細胞を過渡的（transiently）にトランスフェクトしてＯｖｒ１１０を発現させた。Ｏｖｒ１１０のアミノ酸１〜２８２をコードする核酸分子（６ＨｉｓタグのないＯｖｒ１１０構築物１）が哺乳動物発現ベクター、ＰＣＤＮＡ３．１にクローンされ、組換えベクターを、ヒト２９３Ｆ細胞（Invitrogen）をトランスフェクトするのに用いた。１０６細胞／ｍＬでフリースタイル培地（freestyle medium）（Invitrogen）中で培養した２９３Ｆの５０ｍＬを、２９３フェクチン（fectin）トランスフェクション試薬（Invitrogen）を用いて、製造者のガイドラインに従ってトランスフェクトした。ＤＮＡ、細胞および２９３フェクチンをＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（GIBCO）に混合した。細胞をトランスフェクションの４８時間後に分析に用いた。Ｏｖｒ１１０を発現する２９３Ｆ細胞を、本明細書中において２９３Ｆ−Ｏｖｒ１１０細胞と呼ぶ。
【０４２１】
Ｏｖｒ１１０を安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ
ハムスターＣＨＯ細胞を、Invitrogen社のプロトコルにしたがって、ＰＣＤＮ５／ＦＲＴ／ＴＯベクターで安定的（stably）にトランスフェクトして、ＣＨＯ−ＦｌｐＩｎ安定セルラインを作成した。ＣＨＯ−ＦｌｐＩｎ細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）入りＨａｍｓＦ１２培地で培養した。Ｏｖｒ１１０（６−ＨｉｓタグのないＯｖｒ１１０構築物１）を、ｐＯＧ４４ＦｌｐリコンビナーゼでＣＨＯ−ＦｌｐＩｎに２μｇのＯｖｒ１１０ＤＮＡ、１８マイクロｇのＰＯＧ４４ＤＮＡおよびリポフェクタミン２０００を用いて、６ウェルプレート中でInvitrogen社のプロトコルに記載されているようにコトランスフェクトした。安定トランスフェクト株の選択は、ヒグロマイシンＢを３００μｇ／ｍＬで添加したＨａｍｓＦ１２培地＋１０％のＦＢＳ中で、トランスフェクションの１０〜１５日後に行った。
【０４２２】
ヒグロマイシンＢ耐性細胞のＯｖｒ１１０タンパク質発現を、抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットで検査した。生存クローン培養物（各々１２〜１５クローン）を確実に維持するために、Ｏｖｒ１１０発現を示した細胞を拡大（expand）し、スケールアップし、１０％のＤＭＳＯ入りＦＢＳ中で凍結保存および液体窒素中で−１９６℃で保管した。
【０４２３】
Ｏｖｒ１１０を安定的にトランスフェクトされたＲＫ３Ｅ
Ｏｖｒ１１０を安定的に発現するＲＫ３Ｅ細胞を、Phoenix Retrovirus Expression System（Orbigen, San Diego, CA）を用いて作成した。レトロウィルスベクターＰＬＸＳＮ（ｐＬＡＰＳＮ、BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA）に挿入されたＯｖｒ１１０のアミノ酸１〜２８２をコードする核酸分子（６−ＨｉｓタグのないＯｖｒ１１０構築物１）を、Phoenix-Ecoパッケージング細胞にトランスフェクトした。二日後、培養培地を収集し、０．４５μｍのポリスルホン酸フィルターで濾過した。感染の１日前に、ＲＫ３Ｅ細胞を１０ｃｍプレート上に５×１０５個分割した。８μｇ／ｍＬのポリブレン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）をウィルス含有培地に、目標細胞への添加前に添加した。７時間後、ウィルス培地を新鮮な生育培地に取り替えた。安定的に感染した細胞を０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８で選択した。Ｏｖｒ１１０を安定的に発現するＲＫ３Ｅ細胞を、本明細書中においてＲＫ３Ｅ−Ｏｖｒ１１０細胞と呼ぶ。
【０４２４】
ＣＨＯ−Ｏｖｒ１１０からの膜調製
細胞膜調製のため、７億６０００万個のＯｖｒ１１０発現ＣＨＯ細胞（上記）を２０ｍＬの氷冷低張緩衝液（プロテアーゼ阻害処理した１０ｍＭのトリス塩酸ｐＨ７．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＧＴＡ）に懸濁した。サンプルを、２５ｍＬのルースペスル（Ａ）付きBellco Dounce（Bellco Dounce with loose pestle (A)）中で、３０ストロークで均質化し、氷上に１５〜２０分放置した。サンプルを、２００ｒｐｍで５分間、４℃で、GS6KR Beckman 遠心分離器中で回転した。上清を、２５ｍＬのタイトペスル（Ｂ）付きBellco Dounce（Bellco Dounce with tight pestle (B)）中で、３０ストロークで均質化し、氷上に１５〜２０分放置した。サンプルを、２００００ｒｐｍで１時間、４℃で、GS6KR Beckman 遠心分離器中で回転した。ペレットは膜画分を含み、それを２ｍＬのＰＢＳで再懸濁した後、ウェスタンブロット分析で内容物確認を行った。
【０４２５】
免疫
マウスを、Ｏｖｒ１１０で安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の膜調製物で免疫し、体液中および細胞表面上のＯｖｒ１１０に結合可能な抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓを作成させた。Eight BALB/cマウスを、週に２回、５週間免疫付与した。免疫は、両後ろ足蹠に、片足につき２５μｌのＰＢＳ中の１０μｇのＣＨＯ−Ｏｖｒ１１０膜を皮内投与することで行われた。
【０４２６】
ハイブリドーマ融合
最終免疫の４日後、マウスを犠牲にし、吸い出したリンパ節（膝窩）組織を無菌解剖器（sterile dissection）で収集した。リンパ節細胞はTenbroeckの組織グラインダー（tissue grinder）（Wheaton #347426, VWR, Brisbane, CA）を用いて分散され、その後無菌こし器（sterile sieve）（VWR）でＤＭＥＭ中に押出し、Ｔ細胞を抗ＣＤ９０（Thy1.2）でコートされた電磁ビーズ（Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Germany）を通して取り除いた。
【０４２７】
これらの初代Ｂ細胞（primary B-cell）豊富なリンパ節細胞を、連続ミエローマセルラインＰ３ｘ６３Ａｇ．６５３（Kearney, J.F. et al., J. Immunology 123: 1548-1550, 1979）との電気細胞融合（BTX, San Diego, CA）によって不死化した。ミエローマおよびＢ細胞は１対１の比で融合に供した。これらの融合培養物を、９６ウェル培養プレートのウェル（Coaster #3585, VWR）に、プレート当たり２００万個の細胞で分配した。首尾良く融合された細胞を、２．８５μＭのアザセリン、５０μＭのヒポキサンチン（ＨＡ）（Sigma）または５０μＭのヒポキサンチン、０．２μＭのアミノプテリン、８μＭのチミジン（ＨＡＴ）（Sigma）を含む、組換えヒトＩＬ−６を０．５ｎｇ／ｍＬ補完された選択培地（ＤＭＥＭ／１５％ＦＢＳ）内で培養することで選択した。培養物を、選択およびＩＬ−６補完物のない培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ）に移し、引き続き拡大および抗体産生した。
【０４２８】
ウェルからの上清を、Ｏｖｒ１１０に対する反応性について、抗体結合固相免疫法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリーおよび抗体内部移行によってスクリーンした。単一細胞からの遺伝的に統一された子孫からなるモノクローナル培養物を、単一の生存細胞を２つの９６ウェルプレートのウェルに、フローサイトメトリー（Coulter Elite; Beckman-Coulter, Miami, FL）を利用して分類することで、スクリーニング手順のあとに樹立した。得られたマウスＢ細胞ハイブリドーマ培養物を、標準的な組織培養技術を用いて拡大した。生きたクローン培養物の維持を保証するために、選択されたハイブリドーマを、１０％のＤＭＳＯ入りウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に凍結保存し、液体窒素中で−１９６℃で保管した。
【０４２９】
Ｏｖｒ１１０特異抗体産生ハイブリドーマのＥＬＩＳＡスクリーニングおよび選択
ハイブリドーマ細胞を、Ｏｖｒ１１０特異抗体の産生について、サンドイッチＥＬＩＳＡおよび細胞ＥＬＩＳＡによって選択した。
【０４３０】
サンドイッチＥＬＩＳＡ
ヒトＩｇＧ  Ｆｃに特異的であり、マウスＦｃと最小の交差反応性であるヤギ抗血清（ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ、１００μＬ／ウェル、Jackson Immunoreserch P/N 109-005-098, West Grove, PA）を、４℃で一晩インキュベートすることによって、ＥＩＡプレートの表面に非特異的に吸着させた。プレートウェルを空にし、ＴＢＳＴ／０．５％ウシ血清アルブミン（ＴＢＳＴ／ＢＳＡ）でウェル（３００μＬ／ウェル）を満たし、室温（ＲＴ）で３０分以上インキュベートすることにより、非特異的結合能力をブロックした。ウェルを空にし、ＴＢＳＴ／ＢＳＡ（上記）中の１μｇ／ｍＬの組換えＯｖｒ１１０−ｈＦｃ（Ｏｖｒ１１０構築物２によってコードされる）１００μＬで満たした。
【０４３１】
１時間以上のインキュベーション後、ウェルを空にし、５０μＬ／ウェルのＴＢＳＴ／ＢＳＡで満たした。ハイブリドーマ培養培地サンプルをウェルに添加（５０μＬ）し、１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３度洗浄した。１００μＬの、ヒトＦｃと最小の交差反応性を有するアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（P/N115-055-071, Jackson Immunoreserch）、１：５０００でＴＢＳＴ／ＢＳＡ中に希釈したもの、をそれぞれのウェルに添加し、１時間以上インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３度洗浄した。１Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．９）（Pierce）中の１ｍｇ／ｍＬのアルカリホスファターゼ基質パラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）（Sigma）を１００μＬそれぞれのウェルに添加し、２０分インキュベートした。酵素反応を、溶液の４０５ｎｍ波長の吸収を計測することで定量した。０．５０以上の吸光度となったハイブリドーマ上清を、Ｏｖｒ１１０特異的であると考えた。
【０４３２】
細胞ＥＬＩＳＡ
細胞ＥＬＩＳＡのために、抗体とＯｖｒ１１０またはアルカリホスファターゼを安定的に形質導入したＲＫ３Ｅ細胞（それぞれＲＫ３Ｅ−Ｏｖｒ１１０、ＲＫ３Ｅ−ＡＰ；ネガティブコントロール）との結合を評価した。１００μＬの生育培地中の２５０００個の細胞を、ポリ−Ｄ−リジン（#15600; Pierce）でコートされた９６ウェルプレートのウェルごとに入れた（plated）。細胞を一晩インキュベートし、５０μＬのハイブリドーマ上清を各ウェルに添加した。細胞を氷上で３０分インキュベートし、ウェルを空にして２度ＴＢＳＴ／ＢＳＡで洗浄した。
【０４３３】
１００μＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体（#21126; Pierce）、ＴＢＳＴ／ＢＳＡ中に１：２００００で希釈されたもの、を各ウェルに添加し、細胞を３０分インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴ／ＢＳＡで２度洗浄した。１００μＬのＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（#S1599; Dako Cytomation, Carpinteria, CA）を添加した。通常は２０分後、１００μＬの１Ｎ塩酸を添加して反応を停止した。酵素反応を、溶液の４５０ｎｍ波長の吸収を計測することで定量した。ＲＫ３Ｅ−Ｏｖｒ１１０とＲＫ３Ｅ−ＡＰとのＯＤ値の比率が１．５以上となったハイブリドーマ上清を、Ｏｖｒ１１０特異的であると考えた。
【０４３４】
Ｏｖｒ１１０特異抗体を分泌するハイブリドーマを、Ｑ１、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｑ６、Ｑ７、Ｑ８、Ｑ９、Ｑ１０、Ｑ１１、Ｑ１２、Ｑ１３、Ｑ１４、Ｑ１５、Ｑ１６、Ｑ１７、Ｑ１８、Ｑ１９、Ｑ２０、Ｑ２１、Ｑ２２、Ｑ２３、Ｑ２４、Ｑ２５、Ｑ２６およびＱ２７と指定した。
【０４３５】
Ｏｖｒ１１０抗体の細胞表面結合についてのフローサイトメトリースクリーニング
選択されたハイブリドーマ上清を、Ｏｖｒ１１０でトランスフェクトされた２９３Ｆ細胞および腫瘍細胞株の細胞表面染色フローサイトメトリーで分析した。以下の腫瘍細胞株を用いた：ＳＫＢＲ３、ＺＲ−７５−１およびＨｅＬａ。ＳＫＢＲ３およびＺＲ７５−１細胞は、ＱＰＣＲによって決定されたようにＯｖｒ１１０ＲＮＡを発現し、ウェスタンブロットによって決定されたようにＯｖｒ１１０タンパク質を発現する。ＨｅＬａ細胞はＯｖｒ１１０ＲＮＡまたはタンパク質を発現しない。
【０４３６】
２９３Ｆ細胞を、２９３フェクチン（Invitrogen）をトランスフェクション試薬として用いて、Ｏｖｒ１１０（上記）で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を１０ｍｌのＣａ＋２／Ｍｇ＋２を含まないＤＰＢＳで一度洗浄し、７ｍｌの暖かい（３７℃）Cellstripper（Mediatech, Herndon, VA）を１５０ｃｍ２フラスコ毎に添加した。強くくっついた細胞を離すためにフラスコを叩きながら、細胞を３７℃で５分間インキュベートした。細胞を取り除き、凝集体を壊すために数回ピペッティングし、すぐにＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｍＭの酪酸ナトリウム中に置かれた。そこで細胞を、５分間１３００ｒｐｍで遠心し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／５ｍＭの酪酸ナトリウム中に再懸濁した。該細胞を３７℃で３０分インキュベートした（回復期）。染色に先立って、細胞の生存能力を、Guava Viacount（Guava Cytometers, Foster City, CA）を用いて計測し、９０％以上の生存能力の培養物をＭＡｂｓによる染色に選択した。
【０４３７】
ＭＡｂ染色で選択された培養物からの細胞を、９６ウェルＶ底プレート（ＶＷＲ）に、０．５〜１．０×１０６細胞／ウェルに等分し、２分間１５００ｒｐｍで遠心した。上清を吸引し、プレートをボルテックスミキサー上で簡単に振とうして細胞を再懸濁し、２００μＬのＤＰＢＳ／３％ＦＢＳ／０．０１％ナトリウムアジド（ＦＡＣＳ緩衝液）を各ウェルに添加した。遠心および吸引を繰り返し、２５μＬのハイブリドーマ上清または精製ＭＡｂを細胞に加えて逐次希釈した。プレートを１５分間氷上に置き、その後上記のように、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄および遠心した。
【０４３８】
この洗浄手順を２度繰り返し、２５μＬのフィコエリトリン（ＰＥ）結合ロバ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体（Jackson Immunoreserch Laboratories）を細胞に添加した。氷上で１５分後、上記のように細胞を２度洗浄し、２５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液で懸濁し、分析のためにセルソーターまたはフローサイトメーターに置いた。特定の場合においては、分析の前に４℃で一晩置き、１３３μＬのＦＡＣＳ緩衝液および６７μＬの１％パラホルムアルデヒド／ＤＰＢＳを、固定のために各ウェルに添加し、体積をＤＰＢＳで２５０μＬに増加させた。染色された細胞をElite蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）（Beckman-Coulter）で分析した。
【０４３９】
ほとんどのハイブリドーマ上清はＯｖｒ１１０トランスフェクト２９３Ｆ細胞およびＯｖｒ１１０陽性腫瘍細胞と強く反応し、Ｏｖｒ１１０陰性細胞とほとんど結合しないか弱い結合を示した。細胞表面に局在しないリシンおよび細胞表面に局在するＣＤ７１の抗体を、ネガティブおよびポジティブコントロールとしてそれぞれ用いた。細胞表面染色の結果を表１および２に示す。
【表４】
0005391073.tif 000007
【０４４０】
【表５】
0005391073.tif 000008
【０４４１】
ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー実験からのデータに基づいて、次のハイブリドーマを、セルソーティング（Coulter Elite）によって単細胞クローニングに選択して９６ウェル培養プレートに入れた：Ｑ１、Ｑ３、Ｑ１１、Ｑ１２、Ｑ１５、Ｑ１９、Ｑ２３およびＱ２７。２週間の培養後、各親ハイブリドーマからの３つまでのハイブリドーマクローンからの上清を、フローサイトメトリーによるＯｖｒ１１０トランスフェクト２９３Ｆ細胞染色について試験した。抗体を選択したクローンの上清から精製し、Ｏｖｒ１１０トランスフェクト２９３Ｆ細胞および腫瘍細胞の染色によって再分析した。
【０４４２】
組み替えＯｖｒ１１０で免疫付与したマウスから得られた抗ＯＶｒ１１０ＭＡｂｓＣ３．２およびＣ６．３をコントロールとして含めた。Ｏｖｒ１１０．Ｃ３．２およびＯｖｒ１１０．Ｃ６．３抗体を、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４４９０およびＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０７０７にすでに記載されており、該開示は参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。結果を表３および４に示す。全ての選択されたＱＭＡｂｓは、トランスフェクトされた２９３Ｆ細胞の原形質膜上および腫瘍細胞上のネイティブのＯｖｒ１１０タンパク質を認識する。ＱシリーズＭＡｂｓ、特にＱ１．２Ｑ１１．１２．３、Ｑ１２．２、Ｑ１５．２、Ｑ１９．６、Ｑ２３．６およびＱ２７．４、の染色強度は、ポジティブコントロールＭＡｂｓ  Ｃ３．２およびＣ６．３と同等またはそれより大きなＯｖｒ１１０発現細胞（トランスフェクトされたおよびＯｖｒ１１０陽性腫瘍細胞）の生存細胞結合を示した。
【０４４３】
【表６】
0005391073.tif 000009
【０４４４】
【表７】
0005391073.tif 000010
【０４４５】
Ｏｖｒ１１０ＭＡｂアイソタイプ
抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓのアイソタイプを、市販で入手可能なマウスモノクローナル抗体アイソタイピングイムノアッセイテストキット（IsoStrip, Roche Diagnostc Corp., Indianapolis, IN）を用いて決定した。アイソタイピングの結果を表５に列挙する。
【表８】
0005391073.tif 000011
【０４４６】
Ｏｖｒ１１０抗体の親和性測定
ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー
Ｏｖｒ１１０抗体の組替およびネイティブＯｖｒ１１０タンパク質への結合をダイレクトＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーで分析した。ダイレクトＥＬＩＳＡのために、プレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ組換Ｏｖｒ１１０タンパク質１００μｌで一晩コートした。ウェルを空にし、３０分以上３００μｌのＴＢＳＴ／ＢＳＡでブロックした。ウェルを空にし、３００μｌのＴＢＳＴで洗浄し、ＴＢＳＴ／ＢＳＡ中１μｇ／ｍＬの抗体１００μｌで満たした。１時間のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、結合抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルで記載したように検出した。
【０４４７】
サンドイッチＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリー実験を、精製抗体（ＴＢＳＴ／ＢＳＡ中１μｇ／ｍＬ）をハイブリドーマ上清の代わりに用いた以外は、上記のように行った。
ダイレクトおよびサンドイッチＥＬＩＳＡに用いた組換Ｏｖｒ１１０タンパク質はＯｖｒ１１０構築物１および２でそれぞれコードされ、ネイティブにＯｖｒ１１０を発現するＺＲ７５−１をフローサイトメトリー実験に用いた。
表６はネガティブコントロール抗体抗リシンと特異的Ｏｖｒ１１０抗体との結合比率を列記したものである。特異抗体のネガティブコントロール抗体抗リシンに対するＯＤ値（ＥＬＩＳＡ実験について）またはＭＦＩ値（フローサイトメトリー実験について）の比率を列記する。
【０４４８】
【表９】
0005391073.tif 000012
【０４４９】
Ｏｖｒ１１０．Ａ８７．１およびＯｖｒ１１０Ｃ６．３．２．１．２などに代表されるＡおよびＣシリーズからの抗体は、組換えＯｖｒ１１０タンパク質に非常に良好に結合するが、ＺＲ７５−１細胞上のネイティブＯｖｒ１１０への結合は弱い。Ｑシリーズの抗体は、組換えＯｖｒ１１０タンパク質にはＡおよびＣシリーズの抗体ほど強く結合しないが、ＺＲ７５−１細胞上のネイティブＯｖｒ１１０へは非常に良好に結合する。
【０４５０】
解離定数
抗Ｏｖｒ１１０Ｑシリーズ抗体とネイティブＯｖｒ１１０タンパク質の親和性を決定するため、抗体を、製造者の指示に従ってNHS-Fluorescein（#46100, Pierce）で標識した。標識された抗体を１０００００個のＺＲ７５−１細胞と共に、ＦＡＣＳ緩衝液中で２時間室温でインキュベートした。抗体を、１６０ｎＭから５ｎＭまでの範囲の、６つの異なる濃度で使用した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２度洗浄して結合していない抗体を取り除き、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで分析した。ネガティブコントロールにより発生するＭＦＩ値を、同じ抗体濃度の抗Ｏｖｔ１１０抗体により発生するＭＦＩから減じた。結合曲線（抗体濃度に対して正味のＭＦＩ値をプロットしたもの）を、ソフトウェアPrism（GraphPad）で分析した。１領域部位モデルを仮定する非線形減衰によって解離定数ＫＤを計算した。結果を以下の表７にまとめる。
【０４５１】
【表１０】
0005391073.tif 000013
【０４５２】
上に示したように、抗Ｏｖｒ１１０Ｑシリーズ抗体は、Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２抗体などのＣシリーズ抗体よりも、ネイティブのＯｖｒ１１０に対する高い親和性を有する。抗体Ｑ１１．１２．３、Ｑ１２．２およびＱ１９．６は、ＺＲ７５−１上のネイティブＯｖｒ１１０タンパク質に、それぞれ解離定数０．７４ｎＭ、０．６４ｎＭおよび０．５３ｎＭで、非常に強く結合する。
【０４５３】
抗Ｏｖｒ１１０抗体とネイティブＯｖｒ１１０との優先的な結合およびネイティブＯｖｒ１１０に対する高い親和性は、抗Ｏｖｒ１１０抗体が診断薬または治療薬として有用であることを示している。ナノモーラーまたはピコモーラー範囲の親和性を有する抗体は、治療薬として有用であると考えられる。Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓＱ１１．１２．３、Ｑ１２．２、Ｑ１９．６、Ｑ２３．６およびＱ２７．４は、治療薬としてのその有用性を示すＫＤ値および結合特性（生存細胞結合）を有する。これらの特性は抗Ｏｖｒ１１０Ｑシリーズ抗体が、診断薬または治療薬としての利用に、既に記載された抗Ｏｖｒ１１０抗体より適していることを示している。
【０４５４】
Ｏｖｒ１１０抗体ＩｇＧ重鎖および軽鎖の構造的特性
ハイブリドーマＱ１１、Ｑ１２、Ｑ１９、Ｑ２３およびＱ２７からの抗体の、ＩｇＧ重鎖および軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列を、商業的に入手可能なキット、例えばRNeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）および５’RACE System（Invitrogen）、を用いて決定した。重鎖ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を同定するために、抗体の重鎖および軽鎖の配列を、KabatのCDRＣＤＲ領域決定システム（Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD）を用いて評価した。抗体の重鎖ＣＤＲ１領域をClothia & Lesk（J. Mol. Biol. (1987) 196, 901-917）に記載されているように決定した。
【０４５５】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１の軽鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号１および２にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号３、４および５にそれぞれ示す。
【化３】
0005391073.tif 000014
【０４５６】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１の重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号６および７にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号８、９および１０にそれぞれ示す。
【化４】
0005391073.tif 000015
【０４５７】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２の軽鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号１１および１２にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号１３、１４および１５にそれぞれ示す。
【化５】
0005391073.tif 000016
【０４５８】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２の重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号１６および１７にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号１８、１９および２０にそれぞれ示す。
【化６】
0005391073.tif 000017
【０４５９】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９の軽鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号２１および２２にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号２３、２４および２５にそれぞれ示す。
【化７】
0005391073.tif 000018
【０４６０】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９の重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号２６および２７にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号２８、２９および３０にそれぞれ示す。
【化８】
0005391073.tif 000019
【０４６１】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ２３の軽鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号３１および３２にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号３３、３４および３５にそれぞれ示す。
【化９】
0005391073.tif 000020
【０４６２】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ２３の重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号３６および３７にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号３８、３９および４０にそれぞれ示す。
【化１０】
0005391073.tif 000021
【０４６３】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ２７の軽鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号４１および４２にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号４３、４４および４５にそれぞれ示す。
【化１１】
0005391073.tif 000022
【化１２】
0005391073.tif 000023
【０４６４】
Ｏｖｒ１１０．Ｑ２７の重鎖可変領域の核酸およびアミノ酸配列を、配列番号４６および４７にそれぞれ示す。軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を配列番号４８、４９および５０にそれぞれ示す。
【化１３】
0005391073.tif 000024
【０４６５】
例２：Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓのエピトープマッピング
Ｑシリーズ由来の抗体のパネルによって認識されるエピトープを競合ＥＬＩＳＡおよび重複ペプチドをスクリーニングすることによって、ＥＬＩＳＡに基づく検査を通じた抗体との反応性について特定した。
【０４６６】
競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡのため、ＱシリーズＭＡｂｓを、抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓＡ８７．１およびＣ６．３（ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４４９０およびＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０７０７に記載、該開示は参照により、本明細書に明示的に組み込まれる）をポジティブコントロールとして、抗リシン抗体ＴＦＴＢ１（ATCC, Manassas, VA）をネガティブコントロールとして、平行して評価した。
【０４６７】
精製抗体をSulfo-NHS-LC-Biotin（Pertce, ＃21335）でビオチン化した。組換えＯｖｒ１１０を、上記のサンドイッチＥＬＩＳＡプロトコルにおいて記載したように、プレートにコートした。ウェルを、ＴＢＳＴ／ＢＳＡ中２０μｇ／ｍＬの非標識抗体（「ブロッキング抗体」）５０μＬで満たし、３０分間インキュベートした。２μｇ／ｍＬのビオチン化抗体（検出抗体）を５０μＬ／ウェルで添加し、プレートを１５分間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、ウェルを１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Pierce, ＃21126）で満たした。３０分のインキュベーション後、プレートをＴＢＳＴで洗浄し、１００μＬ／ウェルのＨＲＰ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（＃S1599; Dako Cytomation, Carpinteria, CA）を添加した。１００μＬの１Ｎ塩酸を添加して反応を停止した。酵素反応を、溶液の４５０ｎｍ波長吸収を計測することで定量した。
【０４６８】
各抗体をブロッキングおよび検出抗体として、全ての可能な組み合わせについて試験した。競合ＥＬＩＳＡの結果を、特異シグナル／ノイズ比として、表８に示す、つまり与えられた列の各シグナルを、同じ抗体がブロッキングおよび検出として用いられたときに得られるシグナルで割った。非標識ブロッキングＭＡｂｓをＹ軸に、標識検出ＭＡｂｓをＸ軸に示した。
【表１１】
0005391073.tif 000025
【０４６９】
競合ＥＬＩＳＡの結果は、ＱＭＡｂｓがＡ８７．１およびＣ６．３とは異なるエピトープで結合することを示す。ＭＡｂｓ  Ｑ１１．１２．３、Ｑ１２．２およびＱ１９．６は、お互いにブロックしているため、重複するエピトープで結合する。ＭＡｂｓ  Ｑ２３．６および２７．４は、Ｑ１１．１２．３、Ｑ１２．２およびＱ１９．６によって認識されるエピトープとは異なる、重複するエピトープで結合する。
【０４７０】
ペプチドマッピング
２４のペプチドをSynPep（Dublin, CA）に発注した。ペプチド１〜２３は、５つのアミノ酸が重複する、隣接した１５マーのペプチドであった。ペプチド２４は８つのアミノ酸を含んでいた。ペプチド配列は、シグナル配列後のアミノ酸Ｇ２１から開始し、Ａ２５８で終了した。これらのペプチドは、成熟Ｏｖｒ１１０タンパク質の細胞外領域に及ぶ。ペプチドを１〜３ｍｇの範囲で少量のアリコートにおいて０．２〜０．５ｍＬの水に溶解した。ＰＢＳ中で各ペプチドの１：４００希釈を行い、５０μｌを、96-well 4X Coaster plates（＃3690; Coaster Corporation; Cambridge, MA）の各ウェルに、正副２通りに添加し、一晩放置した。
【０４７１】
次の日、プレートをはじいて乾かし、ＴＢＳＴ／ＢＳＡで約１時間ブロックした。抗Ｏｖｒ１１０抗体（５０μＬ）を、どちらかに、ウェル毎約１μｇ／ｍＬ添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートをＴＢＳＴ洗浄緩衝液で３回洗浄した。二次結合体、ヤギ抗マウスIg Fc-AP（Pierce, Rockford, IL）をＴＢＳＴ／ＢＳＡ溶液中で１：５０００に希釈し、５０μｌを各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間振とうした。５０μＬの基質を各ウェルに添加する前にプレートを３度洗浄し、室温で３５分インキュベートした。使用した基質は１×ＤＥＡ中のｐＮＰＰ（１ｍｇ／ｍｌ）であった。検定を可視化するため、SpectraMaxPlus（Molecular Devices, Sunnyvale, CA）上で、プレートを４０５ｎｍで読み取った。バックグラウンドシグナルは０．２ＯＤ未満であった。
【０４７２】
抗体Ｑ３．１は、１．４ＯＤのシグナルによってペプチド２３にマップされた。抗体Ｑ４およびＱ５は、それぞれ１．９ＯＤおよび１．８ＯＤのシグナルによって、ペプチド１３にマップされた。
他のＱシリーズ抗体Ｑ１、Ｑ７、Ｑ８、Ｑ１１、Ｑ１２、Ｑ１３、Ｑ１４、Ｑ１５、Ｑ１７、Ｑ１９、Ｑ２０、Ｑ２３、Ｑ２５、Ｑ２６およびＱ２７はペプチドにマップされず、上記Ｏｖｒ１１０発現細胞との結合を示したことを併せて、これらのＭＡｂｓはＯｖｒ１１０上の立体配座エピトープに結合することを示唆する。
【０４７３】
例３：Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓの細胞結合
治療薬としての有用性を示すため、上記の抗Ｏｖｒ１１０Ｑシリーズ抗体をＯｖｒ１１０発現癌細胞との結合、Ｏｖｒ１１０発現癌細胞による内部移行、およびＯｖｒ１１０発現癌細胞の毒素結合二次抗体による殺傷について評価した。以下の実施例における全てのセルラインはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC; Manassas, VA）から得た。
【０４７４】
免疫蛍光法によるＱシリーズＭＡｂｓの腫瘍細胞に対する表面結合
抗Ｏｖｒ１１０Ｑシリーズ抗体を、ＺＲ−７５−１（乳癌）、ＲＬ９５．２細胞（子宮内膜癌）、ＯＶＣＡＲ３細胞（卵巣癌）およびＨｅＬａ細胞（頸部癌）を含む様々な生存腫瘍細胞の表面への結合能力について評価した。ＺＲ−７５−１、ＲＬ９５．２およびＯＶＣＡＲ３はＯｖｒ１１０タンパク質発現について陽性であるが、ＨｅＬａは陰性である。これらのセルラインを滅菌１２ｍｍガラスカバースリップ上に播種し、３７℃、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で４８時間、一次抗体による処置前に培養した。
【０４７５】
抗Ｏｖｒ１１０ＱシリーズｍＡＢｓおよびコントロール抗体を最終濃度５μｇ／ｍｌで培地に添加し、氷上で１時間インキュベートした。カバースリップを１×ＰＢＳで３度洗浄した。続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％ホルムアルデヒドで固定し、これらの細胞を、５μｇ／ｍｌの濃度の二次Ｃｙ３標識ロバ抗マウス（Jackson Immunoreserch Laboratories, West Grove, PA）で４５分インキュベートした。続いて洗浄し、カバースリップをベクタスタチン（Vector, Burlingame, CA）、細胞核の可視化のためのＤＡＰＩ含有培地、中にマウントし、適切な蛍光フィルターを装備したZeiss Axiophot蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Thornwood, NY）で観察した。顕微鏡写真をＣＣＤカメラを用いて記録した。抗トランスフェリン受容体（ＴｆｎＲ）は細胞表面に局在しているので、ＡＴＴＣ（Manassas, VA）からの抗ＴｆｎＲ  ＭＡｂ  ５Ｅ９をポジティブコントロールとして用いた。
【０４７６】
図１は、抗Ｏｖｒ１１０抗体がＯｖｒ１１０を発現する腫瘍細胞に結合している、生きた細胞表面の模範的な蛍光染色像を示す。図１Ａ、１Ｂおよび１ＣはｍＡＢ  Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２．２の乳癌（ＺＲ−７５−１）、子宮内膜癌（ＲＬ９５．２）および卵巣癌（ＯＶＣＡＲ３）細胞それぞれに対して結合した、細胞表面結合を示す。Ｏｖｒ１１０を発現しないＨｅＬａ細胞（図１Ｄ）においては、染色が観察されなかった。以下の表９は表面結合実験の結果を外用する。プラス記号は染色強度を表す。
【０４７７】
【表１２】
0005391073.tif 000026
図１および表７の結果は、抗Ｏｖｒ１１０ｍＡｂｓが、Ｏｖｒ１１０を発現する腫瘍細胞表面上のネイティブＯｖｒ１１０に特異的に結合し、診断薬および治療薬として有用であることを示す。
【０４７８】
生きた腫瘍細胞によるＱシリーズＭＡｂｓの内部移行
精製ｍＡｂｓをAlexa Fluor 488（Mokecular Probe, Eugene, OR）にて、製造者の指示に従って標識した。以下の癌細胞株を本研究に用いた：ＺＲ−７５−１（乳癌）、ＳＫＢＲ３（乳癌）およびＨｅＬａ（頸部癌）。ウェスタンブロットは、ＺＲ−７５−１およびＳＫＢＲ３細胞はＯｖｒ１１０タンパク質を発現し、ＨｅＬａはしないことを確認した。細胞をカバースリップに２日間播種し、細胞を完全に付着させた。そこでAlexa-488で標識したｍＡｂｓを生きた細胞に５μｇ／ｍＬの濃度で２４時間、５％ＣＯ２濃度の３７℃インキュベーターにて添加した。そして、細胞を１×ＰＢＳで３度洗浄した。ｍＡｂｓの表面染色は、細胞を１０μｇ／ｍＬの抗Alexa488ウサギ抗体（Molecular Probe, Eugene, OR）で、氷上で１時間インキュベートすることでクエンチした。１×ＰＢＳで３度洗浄した後、細胞を４％ホルムアルデヒドで１０分間、室温で固定した。ホルムアルデヒド残渣を、細胞を１度１×ＰＢＳで洗浄することで取り除いた。
【０４７９】
カバースリップをベクタスタチン（Vector, Burlingame, CA）、細胞核の可視化のためのＤＡＰＩ含有培地、中にマウントし、適切な蛍光フィルターを装備したZeiss Axiophot蛍光顕微鏡（Carl Zeiss, Thornwood, NY）で観察した。顕微鏡写真をＣＣＤカメラを用いて記録した。抗トランスフェリン受容体（ＴｆｎＲ）は細胞表面に局在しているため、ＡＴＴＣ（Manassas, VA）からの抗ＴｆｎＲ  ＭＡｂ  ５Ｅ９をポジティブコントロールとして用いた。リシンは哺乳動物細胞には発現しておらず、細胞表面に局在化していないので、抗リシンＭＡｂ  ＴＦＴＢ１（ATCC, Manassas, VA）をネガティブコントロールとして用いた。
【０４８０】
図２は、抗Ｏｖｒ１１０抗体のＯｖｒ１１０を発現する腫瘍細胞による内部移行の模範的な蛍光染色像を示す。図２Ａおよび２ＢはそれぞれｍＡｂ  Ｏｃｒ１１０．１１．１２．３のＺＲ−７５−１およびＳＫＢＲ３乳癌腫瘍細胞への内部移行を示す。Ｏｖｒ１１０を発現しないＨｅＬａ細胞（図２Ｃ）においては、内部移行は観察されなかった。下記の表１０は内部移行実験の結果を外用する。プラス記号（＋）は内部移行を示した細胞における染色強度を示し、ｎ／ｄは内部移行が観察されなかったことを示す。
【０４８１】
【表１３】
0005391073.tif 000027
図２および表１０の結果は、抗Ｏｖｒ１１０ｍＡｂｓが、意外にも、生きたＯｖｒ１１０発現癌細胞に内部移行され、治療薬として有用であることを示す。
【０４８２】
ＱシリーズＭＡｂｓＭＡｂ−ＺＡＰサポリン結合体による腫瘍細胞殺傷
ＺＲ−７５−１（乳癌）、ＳＫＢＲ３（乳癌）およびＨＣＴ１１６（Ｏｖｒ１１０陰性大腸癌）細胞株からの腫瘍細胞を、それぞれ３０００、３０００、１５００個／ウェルで、９６ウェルプレートに播種し、接着のため一晩放置した。翌日（０日目）、Advanced Targeting Systems（San Diego, CA）からのヤギ抗マウスＩｇサポリン結合体  ｍＡＢ−ＺＡＰ  １μｇ／ｍＬとともにまたはなしで、モノクローナル抗体０．４および２．０μｇ／ｍＬを生きた細胞に添加した。ｍＡｂ−ＺＡＰは、内部移行の際、細胞を殺傷するサポリンを放出する。トランスフェリン受容体（ＴｆｎＲ）が細胞表面に局在し、内部移行が可能なため、ATTC（Manassas, VA）からの抗ＴｆｎＲ  ＭＡｂ  ５Ｅ９をポジティブコントロールＭＡｂとして用いた。リシンは細胞表面に局在していないので、抗リシンＭＡｂ  ＴＦＴＢ１（ATCC, Manassas, VA）を殺傷のネガティブコントロールとして用いた。５日目に、細胞生存率を、Promega（Madison, WI）からのCellTiterGlo Luminescent Cell Viability assayを用いて計測した。
【０４８３】
結果を下記表１１ａ、１１ｂおよび１１ｃに、ＭＡｂｓ＋ＭＡｂ−ＺＡＰにて処理された細胞と未処理細胞との、増殖の比較のパーセンテージとして提示する。細胞増殖のパーセンテージは、サンプルの蛍光単位を、各プレートの培地のみ（１００％）に標準化することによって計算した。
【表１４】
0005391073.tif 000028
【０４８４】
【表１５】
0005391073.tif 000029
【０４８５】
【表１６】
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【０４８６】
表１１ａ、１１ｂおよび１１ｃの結果は、抗Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓが内部移行する毒素と共に、生きたＯｖｒ１１０発現癌細胞に特異的に結合、内部移行および殺傷することを示している。毒素は二次抗体との抱合（conjunction）を通して、または一次抗Ｏｖｒ１１０抗体との直接的抱合を通して、内部移行し得る。Ｑシリーズ抗Ｏｖｒ１１０抗体は、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍細胞を殺傷する治療薬として有用である。
【０４８７】
例４：Ｏｖｒ１１０ＭＡｂの治療的効果
抗Ｏｖｒ１１０モノクローナル抗体を、Ｏｖｒ１１０発現腫瘍に対する治療的抗腫瘍効果について評価した。ＭＡｂｓを単一の剤および知られた低分子抗腫瘍化合物との組合せで、ヒト腫瘍モデル中で評価した。
【０４８８】
ＺＲ−７５−１の同所性異種移植
本出願人らの以前の免疫組織化学およびウェスタンイムノブロット研究は、ＺＲ−７５−１腫瘍中のＯｖｒ１１０の高レベル発現を示している。したがって、パクリタキセルをポジティブコントロール化合物として用いたＺＲ−７５−１ヒト乳癌腫瘍同所性異種移植モデルを、Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓの効果の評価に用いた。パクリタキセルは、乳および卵巣腫瘍を含む婦人科系腫瘍に対する効果を有することで知られる低分子薬剤である。抗Ｏｖｒ１１０抗体抗腫瘍効果を、単一剤および治療処方の組み合わせによる、研究される（in-study）腫瘍の増殖阻害（ＴＧＩ）および対象の生存における総合的な増加を決定することによって評価した。
【０４８９】
材料および方法
モノクローナル抗体Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６は上記およびすでにＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４４９０およびＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４０７０７に記載されており、該開示は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。ＭＡｂｓはクローンハイブリドーマの上清から精製され、使用されるまで−２０℃で貯蔵された。パクリタキセル（ロット番号R026849）はIngusions Solutions, Inc.（Bedford, NH）から受け取り、室温で保存され、生理食塩水に最終作業濃度（０．５ｍｇ／ｍｌ）で溶解させた。
【０４９０】
ＺＲ−７５−１腫瘍細胞株を、ATCC（Manassas, VA）から獲得し、Infectious Microbe PCR AmplifiCation Test（ＩＭＰＡＣＴ）（生物学的サンプル内におけるネズミ科の病原菌を検出するＰＣＲ検査のパネル）によるクリアランスの後、異種移植研究に用いた。培養物を１５％のウシ胎児血清を添加したRPMI 1640中で、５％ＣＯ２大気中で維持した。培養物をＴ２２５組織培養フラスコ中で、１：５の分割比で、植菌に適した数の細胞が得られるまで拡大した。
【０４９１】
ＩＣＲ  ＳＣＩＤマウス、IcrTac:ICR-Prkdc<scid>をTaconic（Hudson, NY）から入手した。マウスは５から６週齢で受け取り、操作の前４日間順応させた。動物を個々独立したアンモニアフリーの環境に収容した。全ての手続を、TGen Drug Development Services Institutional Animal Care and Use Committee（Protocol #06002,２００６年３月承認）の制度ガイドラインの下で行った。
【０４９２】
異種移植
各マウスに、ＺＲ−７５−１腫瘍細胞（1.０×１０７個／マウス）を含む５０％培地／５０％マトリゲル細胞懸濁液０．１ｍｌを、＃４乳腺脂肪帯（mammary fat pad）中に同所的に接種した。
接種後２４日、腫瘍を計測し、腫瘍重量を式：
腫瘍重量（ｍｇ）＝（ａ×ｂ２）／２
式中「ｂ」は最小径および「ａ」は最大径を表す
を用いて計算した。樹立した腫瘍が一旦約７１ｍｇに達したら、マウスを様々な処理およびコントロール群に対で整合させた（１日目、ｎ＝１０）。
【０４９３】
１日目において、Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２（１００ｍｇ／ｋｇ）、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９．６（１００ｍｇ／ｋｇ）およびパクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を、単一剤としてまたは組み合わせて腹腔内投与した。モノクローナル抗体の投与計画は、２×週を４週間であり、パクリタキセルは１〜５日目に投与した。１日目の最初に、マウスの体重および腫瘍の計測を週に２回モニタリングした。各マウスの個別の腫瘍が、約１０００ｍｇの終点に達した時、調節されたＣＯ２による窒息によりマウスを安楽死させた。
【０４９４】
データ評価および統計的手法
腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を以下の式：
【数１】
0005391073.tif 000031
式中χは腫瘍重量を表す、
を用いて計算した。
【０４９５】
１日目の開始時のサイズから逆行する腫瘍を、１日目および最終日の平均の群から取り除き、ＴＧＩを計算する前にそれぞれの群の新たな平均を計算した。１日目の腫瘍重量に対して逆行を見せた腫瘍について、個別の腫瘍縮小（ＴＳ）を以下の式を用いて計算した。各群の平均腫瘍縮小を計算し、報告した。
【数２】
0005391073.tif 000032
全ての統計的分析をGraphPad Prism（登録商標）v4ソフトウェアで行った。生存時間を、カプランマイヤー法を用いて計算した。生存曲線を対数ランクテストを用いて比較し、生存時間中央値を計算し、報告した。相対的な腫瘍重量の分析をANOVAによって、ダネットの多重比較ポスト試験を有用化して完成した。
【０４９６】
結果
Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６抗体については耐性があり、明らかな毒性は観察されなかった。
効力を、研究される（in-study）腫瘍の増殖阻害（ＴＧＩ）および単一剤処置レジメンおよび組み合わせ処置レジメンの生存の全体的な増加を決定することで評価した。ＴＧＩは２３日目（それぞれの群において全ての動物がまだ残っていた最後の日）に決定した。結果を以下の表１２にまとめる。
【０４９７】
単一剤として投与したＯｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６モノクローナル抗体は、腫瘍の増殖をそれぞれ３９．１％および３９．７％阻害した。単一剤Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６は、ビヒクルコントロールと比較して顕著な相対腫瘍重量の減少をもたらした。単一剤ｍＡｂｓの処置レジメンは、ビヒクルコントロールと比較して生存時間の長さの増大を示した。パクリタキセル単一剤治療は、腫瘍増殖阻害についてはＯｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６単一剤治療に対して顕著に優れてはいなかったが、ビヒクルコントロールと同様の生存時間の増大を示した。
【０４９８】
Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２またはＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６とパクリタキセルとの組み合わせ治療法は、ビヒクルコントロールと比較して顕著に低い腫瘍重量中央値の結果となった。Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２とパクリタキセルとの組み合わせ（ＴＧＩ＝４０．６％）は、腫瘍増殖の現象において有効性を見せた。Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９．６とパクリタキセルとの組み合わせは、組み合わせの個別の構成成分それぞれと比較したとき、顕著に有効性を増強した（ＴＧＩ＝６５．４％）。
【０４９９】
【表１７】
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【０５００】
総合的に、抗腫瘍活性は単一剤Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６抗体治療群において早期に観察され、ビヒクルコントロールと比較して統計的に有意な効力が観察されたた。各抗体とパクリタキセルとの組み合わせはコントロールに対して有意性を維持した。Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９．６とパクリタキセルとの組み合わせは、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９．６およびパクリタキセルの単一剤と比較して、腫瘍重量の有意な低下をもたらし、さらなる相互作用を提示した。統計的に有意な生存時間の増大は測定されなかったものの、抗体で処置された対象についての生存時間の中央値の増大がまた観察されるという傾向があった。
【０５０１】
ＺＲ−７５−１同所性異種移植研究２
パクリタキセルをポジティブコントロール化合物としたＺＲ−７５−１ヒト乳癌腫瘍の同所性異種移植モデルの二番目の研究を、Ｏｖｒ１１０ＭＡｂｓおよび投薬の効力の評価に用いた。評価されたＯｖｒ１１０抗体は、Ｏｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９．６、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１．１２．３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ２７．４を含む。研究および評価は、上記のように、次の変更を入れて実施された。各群のマウスの数は８であり、１５日目および３５日目の腫瘍増殖阻害のみが決定された。結果を以下の表１３にまとめる。
【０５０２】
【表１８】
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【０５０３】
上に示したように。抗腫瘍活性をＯｖｒ１１０．Ｃ６．３．２．１．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６抗体処置群について観察した。Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９．６はまた、半分の投与量である５０ｍｇ／ｋｇで抗腫瘍活性を示し、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１９．６およびＯｖｒ１１０．Ｑ１９．６と同じエピトープで結合する抗体の高い効力を示唆した。さらに、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１１．１２．３、Ｏｖｒ１１０．Ｑ１２．２およびＯｖｒ１１０．Ｑ２７．４は、それぞれの処置群において抗腫瘍活性を示した。
【０５０４】
Ｏｖｒ１１０抗体抗腫瘍有効性の結論
上記マウス異種移植モデルからの結果は、抗Ｏｖｒ１１０抗体が、哺乳動物におけるヒト腫瘍に対して、治療剤として有用であることを示す。とくに、ヒト腫瘍を有する哺乳動物に投与された抗Ｏｖｒ１１０抗体は経時的な腫瘍増殖の減少、経時的な腫瘍重量の減少、および生存時間の増大を示した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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