(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生因子を発現する組換えリステリア株であって、
前記組換えリステリア株は対象における腫瘍の増殖または癌の腫瘍脈管構造を標的とするのに有用であり、前記血管新生因子は、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチド断片であり、該ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、胎児肝臓キナーゼ−１（Ｆｌｋ−１）−Ｅ１、Ｆｌｋ−１−Ｅ２、Ｆｌｋ−１−Ｉ１、またはそれらの組み合わせであり、
前記対象は、前記血管新生因子に対する免疫応答を開始し、
前記血管新生因子が、ａ）非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）、ｂ）Ｎ末端ＡｃｔＡ、またはｃ）ＰＥＳＴ配列である追加のポリペプチドと融合される、組換えリステリア株。
【請求項２】
血管新生因子を発現する組換えリステリア株であって、
前記組換えリステリア株は対象における腫瘍の増殖または癌の腫瘍脈管構造を標的とするのに有用であり、前記血管新生因子は、配列番号５９または６０で示された配列を含むエンドグリン断片であり、
前記対象は、前記血管新生因子に対する免疫応答を開始し、
前記血管新生因子が、ａ）非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）、ｂ）Ｎ末端ＡｃｔＡ、またはｃ）ＰＥＳＴ配列である追加のポリペプチドと融合される、組換えリステリア株。
【請求項３】
前記免疫応答は、前記対象における前記腫瘍の増殖の治療、阻害、または抑制に有用である治療的免疫応答である、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦＲ２断片は、配列番号５〜７から選択される、請求項１に記載の組換えリステリア株。
【請求項５】
前記血管新生因子は、ｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡプロモーター、ａｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターから発現される、請求項１または２に記載の組換えリス
テリア株。
【請求項６】
前記血管新生因子は、エピソームベクターまたはリステリア染色体から発現される、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項７】
前記追加のポリペプチドは前記血管新生因子の免疫原性を高める、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項８】
前記組換えリステリア株は、組換えリステリア・モノサイトゲネス株である、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項９】
前記組換えリステリア株は、動物宿主で継代されている、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項１０】
１つ以上の抗血管新生因子の放出を誘導する、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項１１】
前記抗血管新生因子は、インターフェロンγである、請求項１０に記載の組換えリステリア株。
【請求項１２】
前記腫瘍が乳腺腫瘍、脳転移、またはＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する腫瘍である、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項１３】
前記癌は乳癌、胃癌、卵巣癌、脳腫瘍または脳転移、もしくはＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する癌である、請求項１または２に記載の組換えリステリア株。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えリステリア株と、アジュバントと、を含む、ワクチン。
【請求項１５】
非ヒト対象における腫瘍増殖または癌の腫瘍脈管構造を標的とするための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えリステリア株の使用方法。
【請求項１６】
インビトロにおける腫瘍増殖または癌の腫瘍脈管構造を標的とするための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えリステリア株の使用方法。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の組換えリステリア株を含む、対象における腫瘍の再発を防止するか、または腫瘍または癌の転移を阻害するための組成物。
【請求項１８】
前記腫瘍が乳腺腫瘍、脳転移、またはＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する腫瘍である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記癌は乳癌、胃癌、卵巣癌、脳腫瘍または脳転移、もしくはＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する癌である、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
特許に係る政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された認可番号第５ＲＯ１ＣＡ１０９２５３−０３号の下で、全体的または部分的に米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
本発明は、血管新生因子を含む組換えリステリア株、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチド、該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド分子、関連するワクチン、ならびに該組換えポリペプチドを用いる免疫原性的および治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
血管新生に関与する標的細胞は、酸素および栄養素の供給を制限することにより、または、用いられるストラテジーによっては、血管網の再組織化を介して送達される薬剤の有効性を高め、化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を増加させることにより、急速に増殖する腫瘍の機能を損なわせる。抗血管新生治療に対する腫瘍細胞の耐性は、マウス系において観察されており、いくつかの異なる治療のためのヒト試験について報告されている。また、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍の増殖および最終的な播種に必要とされる血管新生スイッチに関与する骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）を補充する。
【０００４】
数人の研究者によって行われた試験により、腫瘍の血管新生が浸潤、増殖、および転移において中心的役割を果たすことから、腫瘍の血管新生を標的とすることの重要性が繰り返し示されてきた。腫瘍細胞は、治療に応答して頻繁に突然変異するか、またはＴ細胞媒介性応答に必要とされるＭＨＣクラスＩ分子を下方制御するため、腫瘍の生存に必要不可欠であり、腫瘍によって展開される免疫抑制機構が欠落し得る内皮細胞および周皮細胞を標的とすることが有利である。
【０００５】
しかしながら、血管新生が癌において有効な役割を果たすことが示されてから３０年後もなお、現代医学は、腫瘍脈管構造を標的とする新規化合物および治療薬を開発することを試みている。しかしながら、大抵の治療薬は、複数周期の投与を必要とし、また有毒な副作用を有し得る。
【発明の概要】
【０００６】
一実施形態では、本発明は、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を提供する。
別の実施形態では、本発明は、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を含むワクチンを提供する。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、血管新生因子を発現する組換えリステリア株であって、上記血管新生因子は、血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチド、エンドグリン、またはそれらの免疫原性断片である、組換えリステリア株を提供する。
【０００８】
別の実施形態では、本発明は、対象において抗ＶＥＧＦＲ２免疫応答を誘導する方法であって、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、血管新生因子
を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチドと、アジュバントと、を含むワクチンを提供する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子をコードする組換えワクチンのベクターを提供する。
別の実施形態では、本発明は、対象において抗ＶＥＧＦＲ２免疫応答を誘導する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を上記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチドを含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を提供する。
別の実施形態では、本発明は、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子をコードするヌクレオチド分子と、アジュバントと、を含むワクチンを提供する。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子をコードするヌクレオチド分子を含む組換えワクチンのベクターを提供する。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、対象において抗ＶＥＧＦＲ２免疫応答を誘導する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を上記対象に投与することを含む方法を提供する。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された組換えポリペプチド血管新生因子をコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子をコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子をコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】Ｌｍに基づく構築物を発現するＦｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２の設計（図１）。各遺伝子断片は、ＬＬＯに融合された発現ベクターｐＧＧ３４にクローン化し、ｈｌｙプロモーターの制御下においた。
【図１Ｂ】列挙した構築物からの各融合タンパク質の発現を示す培養上清のウエスタンブロット。融合タンパク質の検出にはポリクローナル抗体、ウサギ抗体、抗ＰＥＳＴ抗体を使用し（下）、確認のためにマウス抗ＬＬＯ抗体を使用した（上）。全てのレーンは、同じウエスタンブロットから取ったものであることに留意されたい。
【図１Ｃ】各構築物で免疫した後、ＣＤ８＋細胞が、エクスビボ応答を制限したことを示すＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔ。ナイーブ群にはＰＢＳのみを注射し、全ての群が対照Ｌｍ群を含んでいた。応答は、各Ｆｌｋ断片についてマッピングされた対応するエピトープに対するものである。群当たりＮ＝５。グラフは平均±ＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５、マンホイットニーの統計検定、実験は１回繰り返した。
【図２Ａ】Ｌｍに基づく構築物を発現するＦｌｋ−１／ＶＥＧＦＲ２の設計（図２）。構築した各構築物のクローン化した領域を四角く囲み、強調した／太字のアミノ酸は、Ｈ２ｄ／ｑＭＨＣ  ＩハプロタイプについてマッピングしたＣＴＬエピトープを示す。
【図２Ｂ】本発明において使用される断片の一実施形態を示すｆｌｋ遺伝子のマップ。
【図２Ｃ】ｆｌｋ遺伝子の種々のドメインに関連する本発明の一実施形態では、ｆｌｋ断片がどのように使用されるかを示すイラスト。
【図２Ｄ】マクロファージ感染アッセイを方法に記載されるように行った。Ｊ７７４Ａ．１細胞をリステリア構築物でインキュベートし、洗浄し、次いで、ゲンタマイシンとインキュベートして、マクロファージを感染させて細胞質内に脱出することができた細菌をＡｌｅｘａ−４８８（緑色）で示し、細胞の形状およびサイズの境界をＰＥ  ＣＤ１１ｂ＋ｈａｌｏ（赤色）で画定した。
【図３Ａ】Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンは、インビボで確立されたＨｅｒ−２／ｎｅｕ＋腫瘍の退縮を誘導することができる（図３）。各構築物で処理したマウスのＮＴ−２腫瘍の体積（ｍｍ３）。グラフは平均±ＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５、マンホイットニーの統計検定、群あたりＮ＝８匹のマウス、実験は２回繰り返した。
【図３Ｂ】種々のＨｅｒ−２／ｎｅｕ領域に対するエピトープスプレッディング（ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）を示すＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔｓ。６４日の時点の脾細胞を、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕペプチドエピトープを用いてエクスビボで再刺激した。グラフは平均±ＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５、マンホイットニーの統計検定、群あたりＮ＝５匹のマウス、実験は１回繰り返した。
【図３Ｃ】最初にＮＴ−２腫瘍を確立してから、３週間にわたってマウスを３回免疫した。この図では、ＤＡＰＩを用いた全内皮マーカーＣＤ３１−ＰＥおよび核の染色を示す。アイソタイプ対照を、右側に示すような連続的な切片に使用した。Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェアにより血管密度の定量化を行った。グラフは平均±ＳＥＭを示す。＊ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定、ｎｓ＝有意ではなかった。
【図３Ｄ】全内皮マーカーＣＤ３１−ＰＥ、ＤＡＰＩを使用した核、および核内の低酸素マーカーである低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）の染色。
【図４Ａ】完全に退縮した腫瘍を有するマウスは、腫瘍の再チャレンジに対する長期記憶を示す（図４）。１００日目に、完全に退縮した腫瘍を有するマウスの反対側の側腹部にＮＴ−２の再チャレンジを行った。生理食塩水で処理した群を、腫瘍増殖の陰性対照として使用した。
【図４Ｂ】１００日目の腫瘍が存在しないマウスに対する再チャレンジ後に腫瘍が増殖したマウスの腫瘍体積。両方のグラフとも、単一の実験に関するものである。腫瘍が存在しないマウスの数は、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１群で２／８匹、生理食塩水群は５匹のマウスであった。
【図５Ａ】抗血管新生ワクチンは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕに耐性のあるマウスにおいて有効ではない（図５）。ＦＶＢ／Ｎ野生型（ＷＴ）マウスまたはＦＶＢ／Ｎトランスジェニック（Ｔｇ）マウスに１×１０６のＮＴ−２細胞を皮下投与し、治療を開始する前に触知できるまで腫瘍を増殖させた。マウスを合計３回免疫し、腫瘍摂取後６９日目までの平均腫瘍サイズをここに示す。グラフは平均±ＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定、実験は２回繰り返した。
【図５Ｂ】ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔｓのために脾臓をプロセスし、種々のＨｅｒ−２／ｎｅｕペプチドを用いてエクスビボで刺激するか、または第３のペプチドを陰性対照（ｐＧａｇ）とした。グラフは平均±ＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定、実験は１回繰り返した。
【図５Ｃ】各群からの腫瘍をプールし、ＴＩＬのために消化した；ここでは、ＣＤ８αおよびＥＣ１またはＩＣ１に特異的な四量体で染色したＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的Ｔ細胞を示す。野生型（ＷＴ）マウスにおいて有意により多くのＨｅｒ−２／ｎｅｕ特異的Ｔ細胞が見られたが、トランスジェニック（Ｔｇ）マウスには見られず、対照Ｌｍ群は、低いバックグラウンドを示した。実験を１回繰り返したところ、同様の結果が得られた。
【図６Ａ】抗Ｆｌｋ−１Ｌｍワクチンで保護されたマウスは、４Ｔ１実験的転移でチャレンジを行うと、原発腫瘍の増殖および腫瘍量の低下、ならびに罹患率および死亡率の低下を示す（図６）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１で保護された動物において、原発性皮下４Ｔ１腫瘍は徐々に増殖する。マウスを各ワクチンで３回免疫し、次いで、５０，０００個の４Ｔ１細胞を皮下および静脈内に注射した。グラフは、腫瘍体積の平均±ＳＥＭを示す。
【図６Ｂ】４Ｔ１細胞で皮下にチャレンジを行った後の腫瘍が存在しないマウスの割合として示した腫瘍量。グラフは、処理群当たり８匹のマウスの平均を示す。
【図６Ｃ】グラフは、目視検査および観察に基づく健康／正常なマウスの割合を示す。群当たりＮ＝８匹のマウス。
【図６Ｄ】グラフは生存率を示す。
【図７Ａ】Ｆｌｋ−１ワクチンは、マウスを実験的転移から保護し、より高い侵襲性の乳癌用の腫瘍モデルにおいて、弱いＨｅｒ−２／ｎｅｕのエピトープスプレッディングを誘導することができる（図７）。マウスを各ワクチンで３回免疫し、次いで、５０，０００個の４Ｔ１細胞を静脈内に注射し、腫瘍を２５日間増殖させ、次いでマウスを屠殺した。肺組織上でＨＥ染色した切片を作製し、手で腫瘍結節を数えた。グラフは、動物ごとに、肺葉当たりの肺転移の数を平均±ＳＥＭで示す；＊ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定、実験を１回繰り返し、Ｎ＝５匹のマウスで示す。
【図７Ｂ】これらの動物からの脾臓をプロセスし、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのエピトープスプレッディングのためにＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいてエクスビボで再チャレンジを行った。４Ｔ１細胞株は、低レベルのマウスＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する。Ｆｌｋ−１−Ｅ１で免疫したマウスにのみスプレッディングが見られた。グラフは、対照Ｌｍ群と比較したウェル当たりのスポット数を平均±ＳＥＭで示す；＊ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定、実験は１回繰り返した。群当たりＮ＝５。
【図７Ｃ】連続して３週間各ワクチンで免疫することによりマウスを保護し、次いで、５０，０００個の４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞を静脈内に投与した同様の実験で、４週間にわたってマウスを長軸方向に撮像し、肺播種の発生および転移速度について調べた。
【図７Ｄ】ＲＯＩでゲートをかけた表面積（ｓｒ）１ｃｍ２当たり１秒（ｓ）ごとに取得した光子（ｐ）の平均照射量。グラフは平均±ＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定、マウスに対する有意性は以下の通りである；１８日目、Ｆｌｋ−Ｅ１のみ有意、２５日目、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１の両方が対照Ｌｍと比較して有意に異なる。
【図８Ａ】抗血管新生Ｆｌｋ−１ワクチンを使用した安全性試験。前の全ての実験で行ったようにマウスを３回免疫し、次いで、交配させるか、または創傷治癒試験に組み入れるかのいずれかにした（図８）。マウス（ｎ＝５／群）を同系ＦＶＢ／Ｎオスと交配させ、交尾後に膣栓を観察することにより妊娠を確認した。これを交尾後０．５日目と見なした。全妊娠期間、出生時の仔マウスの体重、および総産子数を測定した。グラフは平均±ＳＥＭを示す；＊ｐ＜０．０５。
【図８Ｂ】ワクチン接種した各マウスの背側の一対の無菌皮膚生体組織を作製した（Ｎ＝５／群）。毎日治癒を観察した。１４日目に、検査した全ての群で治癒が完了し、全ての群でほぼ同一の治癒が観察された。グラフは、創傷閉鎖までの日数を平均±ＳＥＭで示す。＊ｐ＜０．０５、マンホイットニー検定。
【図９】Ｆｌｋ−１ワクチンによって誘導されたエピトープスプレッディングは、Ｆｌｋ−１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕが共有するドメイン間の交差反応性によるものではない可能性がある。対照ＬｍまたはＦｌｋ−Ｉ１ワクチンのいずれかでマウスを３回免疫した。脾細胞をプロセスし、ペプチドチャレンジに応答したＩＦＮ−ｇの分泌のためにエクスビボで再チャレンジを行った。含まれたエピトープは、以前にマッピングされたｐＦｌｋ−Ｉ１エピトープ（ＰＧＧＰＬＭＶＩＶ、配列番号１）、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの推定上のｐＩＣ１エピトープ（ＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ、配列番号２）または対象とするエピトープ、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよびＦｌｋ−１キナーゼドメイン間の推定上の共有エピトープ（ＧＲＧＡＦＧＱＶＩ、配列番号３）であり、第３のエピトープを陰性対照として使用した（ｐＧａｇ）。グラフは平均±ＳＥＭを示す。Ｎ＝３／群。
【図１０Ａ】Ｆｌｋ−１ワクチンは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ乳腺腫瘍の自発的な同所性モデルにおいて、腫瘍の成長を有意に遅延させることができる。各Ｆｌｋワクチンまたは対照ＬｍのみでトランスジェニックＦＶＢ−ｒＨｅｒ−２／ｎｅｕマウスを３回免疫した。各マウスの腫瘍をＨｅｒ−２／ｎｅｕメッセージの変異について調べた。メッセージＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを合成して配列決定した。変異残基を判定するために、得られた配列を野生型配列と並べて対にした。４回以上生じた突然変異のみを真の突然変異と見なした。全ての突然変異の概要を左側に示すが、これは、群当たり少なくとも３匹だが５匹より少ない数を示す。全ての突然変異のデータを合わせて、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ野生型配列の上に重ね合わせた。太字のａａ残基は、ワクチンがＨｅｒ−２／ｎｅｕドメインに対するものである場合に生じる突然変異である（Ｓｉｎｇｈ，２００７）。赤で強調したａａ残基は、Ｆｌｋ−１ワクチンが使用される場合に生じる突然変異である。青で強調した領域は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕキナーゼドメインを示す。緑で強調した領域は、ＡＴＰ結合ドメインを示す。
【図１０Ｂ】腫瘍の成長は、腫瘍を抑制された状態に維持することに関与する重要なＣＴＬエピトープに生じる突然変異に起因する。変異残基の「ホットスポット」または鎖をよく見ると、いくつかの変異残基は、以前にマッピングされた（Ｓｉｎｇｈ，２００５および２００７）ＣＴＬエピトープ内に見られることが分かった。そのようなエピトープの１つは、エピトープをＨ２Ｄｑ  ＭＨＣ  Ｉ分子に固定するのに関与する重要なアミノ酸における突然変異を示す。他の「ホットスポット」は、新しいＣＴＬエピトープについて調査中である。
【図１１Ａ】抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕヒトキメラワクチンは、保護されたマウスの脳において転移性乳癌の増殖を遅延させることができる。抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕまたは対照ワクチンＮＹＥＳＯ１のいずれかの各ワクチンでＢａｌｂ／ｃマウスを３回免疫した。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞（ミネソタ大学のＪｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ研究室より）をインビトロで増殖させ、次いで、麻酔下のマウスの脳内にマウス１匹当たり５，０００細胞で注射した。図示する日に撮像する前に、低レベルのマウスＨｅｒ−２／ｎｅｕ（データは表示せず）細胞を発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞を増殖させた。ＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞は酵素ルシフェラーゼを生成し、それらがＤ−ルシフェリンをインビボで代謝すると、その副産物は光子であり、それをＸｅｎｏｇｅｎ  Ｘ−１００カメラを使用してエクスビボで取得し、ヒートマップを使用して表示した。ピクセル強度を光子数／秒／ｃｍ＾２／表面積(ｃｍ)としてグラフ化し、平均照射量として表した。
【図１１Ｂ】抗ＨＭＷＭＡＡヒトワクチンは、保護されたマウスの脳において転移性メラノーマ株の増殖を遅延させることができる。抗ヒトＨＭＷＭＡＡ−Ｃまたは対照ワクチンＮＹＥＳＯ１のいずれかの各ワクチンでＣ５７Ｂｌ／６マウスを３回免疫した。Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃ細胞（ＵＣＳＦのＪｅｆｆ  Ｍｉｌｌｅｒ研究室より）をインビトロで増殖させ、次いで、麻酔下のマウスの脳内にマウス１匹当たり５，０００細胞で注射した。Ｂ１６Ｆ１０親株はＨＭＷＭＡＡを発現しないため（私信）、ＨＭＷＭＡＡの唯一の源は周皮細胞およびグリア細胞上にある。ルシフェラーゼの機構および画像を、図１１Ａと同じように取得した。
【図１２】エンドグリンの配列（ＣＤ１０５）。Ｒｅｉｓｆｅｌｄのグループによってクローン化された配列に基づく元の断片（Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ５にクローン化した）を太字および下線で示す。Ｒａｎｋｐｅｐおよび他のＭＨＣエピトープ予測プログラムは、ｂ、ｄ、およびｋ  Ｈ−２ハプロタイプには、この領域外に存在するいくつかの代替の予測的なＣＴＬエピトープ（赤で強調）があると示したことに留意されたい。
【図１３】ＣＤ１０５ＡおよびＣＤ１０５Ｂを発現する新規リステリア構築物の設計。Ａ．各構築物のクローン化した領域を太字で、また２つの予測的なエピトープを下線で示した；Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＬｍ−ＬＬＯＣＤ１０５Ｂは、ともにエンドグリン遺伝子のほぼ全体に広がり、より可能性の高いＣＴＬエピトープを包含する。Ｂ．下線部の各断片を、アジュバントＬＬＯに融合された発現ベクターｐＧＧ３４にクローン化した。
【図１４】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａは、抗ＬＬＯ抗体およびウエスタンブロットによって検出される適切なサイズ（およそ８０ｋＤ）のタンパク質を発現および分泌する。電気穿孔を使用して、ＸＦＬ７株をＣＤ１０５Ａプラスミドで形質転換した。形質転換したＸＦＬ７細胞を３７ｕｇ／ｍＬおよび２５０ｕｇ／ｕＬのクロラムフェニコールおよびストレプトマイシン上に播種した。２日間のインキュベーション期間中に形成されたコロニーをＬＢ培地で増殖させ、遠心力で沈降させて、上清および細胞可溶化物をウエスタンブロットに供し、上清中に分泌されたタンパク質または細菌細胞に捕捉された内在性タンパク質のいずれかとして、融合融合タンパク質を検出した。
【図１５】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂは、抗ＬＬＯ抗体およびウエスタンブロットによって検出される適切なサイズ（およそ７４ｋＤ）のタンパク質を発現および分泌する。電気穿孔を使用して、ＸＦＬ７株をＣＤ１０５Ａプラスミドで形質転換した。形質転換したＸＦＬ７細胞を３７ｕｇ／ｍＬおよび２５０ｕｇ／ｕＬのクロラムフェニコールおよびストレプトマイシン上に播種した。２日間のインキュベーション期間中に形成されたコロニーをＬＢ培地で増殖させ、遠心力で沈降させて、上清および細胞可溶化物をウエスタンブロットに供し、上清中に分泌されたタンパク質または細菌細胞に捕捉された内在性タンパク質のいずれかとして、融合融合タンパク質を検出した。
【図１６】対照ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１と比較した、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢで免疫したＢａｌｂ／ｃマウスにおける４Ｔ１腫瘍の成長（乳腺脂肪帯に移植した２×１０5細胞）。図示する日に、各ワクチン２×１０8ｃｆｕでマウスにワクチン接種した。
【図１７】図５Ｂに示す実験のマウスを３２日目に屠殺し、肺を摘出してＰＢＳで膨張させた。解剖顕微鏡下で、目に見える表面の転移を数えた。ナイーブ（ｐ＜０．０１）またはＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ１（ｐ＜０．０５）と比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂのみに有意な減少が見られた。
【図１８】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢによる免疫は、内在性抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびｇｐ７０に対するエピトープスプレッディング、ならびに脾臓における抗原特異的Ｔ細胞の誘導を誘導する。図５Ｂに示す実験において、腫瘍移植後２２日目に、３匹のマウスから脾臓を摘出してプールし、図示したペプチドで刺激した後、ＥＬＩＳｐｏｔにより単一細胞懸濁液を分析した。ＫｄおよびＤｄは、これらのＭＨＣクラスＩ分子に結合することが予測されたエンドグリン配列に由来する２つのペプチドであることに留意されたい。これらはＣＤ１０５Ａに存在する：ＡＧＰＲＴＶＴＶＭ（Ｄｄ）およびＣＤ１０５Ｂ  ＡＹＳＳＣＧＭＫＶ（Ｋｄ）。
【図１９】Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢによる免疫は、内在性抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびｇｐ７０に対するエピトープスプレッディング、ならびに腫瘍に浸潤する抗原特異的Ｔ細胞の誘導を誘導する。図５Ｂに示す実験において、腫瘍移植後２２日目に、３匹のマウスから腫瘍を摘出してプールし、ＦＡＣＳ分析のためにプロセスして、ＥＣ１、ＥＣ２、ＩＣ１およびＡＨ１四量体、抗ＣＤ８およびＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１１Ｂで染色した。ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌｌｏｗ上でＣＤ１１Ｂ集団にゲートをかけ、図示する四量体を使用して抗原特異性について分析した。
【図２０】４、１１、および１８日目に、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢまたは対照ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１で、各ワクチン２×１０8ｃｆｕで皮下免疫したＦＶＢマウスに皮下移植したＮＴ−２（１×１０6細胞）腫瘍の増殖。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
一実施形態では、本発明は、血管新生因子を含む組換えリステリア株、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチド、該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド分子、関連するワクチン、ならびにそれらを用いる免疫原性的および治療的方法を提供する。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、血管新生因子またはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を提供する。
別の実施形態では、本発明は、血管新生因子またはその免疫原性断片をコードする核酸を含む組換えリステリア株を提供する。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ペプチドを含む組換えリステリア株、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結されたＶＥ
ＧＦＲ２を含む組換えポリペプチド、該組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド分子、関連するワクチン、ならびに関連する免疫原性的および治療的方法を提供する。
【００３０】
別の実施形態では、本発明は、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を提供する。
別の実施形態では、本発明は、エンドグリンポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を提供する。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸を含む組換えリステリア株を提供する。
別の実施形態では、本発明は、エンドグリンポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸を含む組換えリステリア株を提供する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えヌクレオチド分子を含む組換えリステリア株を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチドを含む組換えリステリア株を提供する。
【００３３】
本発明の方法および組成物の組換えリステリア株は、別の実施形態では、組換えリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）株である。別の実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ
ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）株である。別の実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・グレイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ）株である。別の実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・イバノビ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）株である。別の実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・ムライ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ）株である。別の実施形態では、リステリア株は、組換えリステリア・ウェルシメリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）株である。別の実施形態では、リステリア株は、当該技術分野で既知の任意のその他のリステリア種の組換え株である。一実施形態においてリステリア株は、ＬＬＯを含むリステリア株であり、別の実施形態では、リステリア株は、ＡｃｔＡを含むリステリア株であり、別の実施形態では、リステリア株は、ＰＥＳＴ様配列を含むリステリア株である。
【００３４】
一実施形態では、リステリア・モノサイトゲネスは、食細胞に感染することが可能なグラム陽性通性細胞内細菌であり、その生活環ゆえに外来タンパク質のための貴重な送達ビヒクルとなる。食作用の後、Ｌｍは、溶血性病原性因子ＬＬＯを介して食胞から脱出し、ｈｌｙ遺伝子によってコードされ、細胞質において複製する。Ｌｍは、溶血性ドメインを排除するように、ＬＬＯの最初の４４１個のアミノ酸に融合された関心の遺伝子を発現するように遺伝子操作することができる。ＬＬＯは、融合タンパク質におけるアジュバントの活性にとって重要なＰＥＳＴドメインを含有する。
【００３５】
別の実施形態では、リステリア株は、遺伝子の欠失により弱毒化される。別の実施形態では、リステリア株は、１つより多くの遺伝子の欠失により弱毒化される。別の実施形態では、リステリア株は、遺伝子の欠失または不活性化により弱毒化される。別の実施形態では、リステリア株は、１つより多くの遺伝子の欠失または不活性化により弱毒化される。
【００３６】
別の実施形態では、突然変異する遺伝子はｈｌｙである。別の実施形態では、突然変異する遺伝子はａｃｔＡである。別の実施形態では、突然変異する遺伝子はｐｌｃ  Ａである。別の実施形態では、突然変異する遺伝子はｐｌｃＢである。別の実施形態では、突然変異する遺伝子はｍｐｌである。別の実施形態では、突然変異する遺伝子はｉｎｌ  Ａで
ある。別の実施形態では、突然変異する遺伝子はｉｎｌＢである。別の実施形態では、突然変異する遺伝子はｂｓｈである。
【００３７】
別の実施形態では、リステリア株は、栄養要求性変異株である。別の実施形態では、リステリア株は、ビタミン合成遺伝子をコードする遺伝子を欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、パントテン酸シンターゼをコードする遺伝子を欠損している。
【００３８】
別の実施形態では、リステリア株は、アミノ酸代謝酵素を欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、Ｄ−グルタミン酸シンターゼ遺伝子を欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ｄａｔ遺伝子を欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ｄａｌ遺伝子を欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ｄｇａ遺伝子を欠損している。別の実施形態では、リステリア株は、ジアミノピメリン酸の合成に関与する遺伝子ＣｙｓＫを欠損している。別の実施形態では、遺伝子はビタミン−Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｐＥである。別の実施形態では、遺伝子はａｓｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＤである。別の実施形態では、遺伝子はｇｌｔＢである。別の実施形態では、遺伝子はｌｅｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｒＣである。別の実施形態では、リステリア株は、本明細書で上述した遺伝子のうちの１つ以上を欠損している。
【００３９】
別の実施形態では、リステリア株は、シンターゼ遺伝子を欠損している。別の実施形態では、遺伝子アミノ酸シンターゼ遺伝子である。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＰである。別の実施形態では、遺伝子はジヒドロウリジンシンターゼファミリーのタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＦである。別の実施形態では、遺伝子はホスホエノールピルビン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＦである。別の実施形態では、遺伝子はｈｉｓＨである。別の実施形態では、遺伝子はｆｌｉＩである。別の実施形態では、遺伝子はリボソーム大サブユニットシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＤである。別の実施形態では、遺伝子は二機能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＳである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃｂｉＤである。別の実施形態では、遺伝子はウロポルフィリン−ＩＩＩ  Ｃ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノゲン−ＩＩＩシンセターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃｏｂＱである。別の実施形態では、遺伝子はｕｐｐＳである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＢである。別の実施形態では、遺伝子はｄｘｓである。別の実施形態では、遺伝子はｍｖａＳである。別の実施形態では、遺伝子はｄａｐＡである。別の実施形態では、遺伝子はｉｓｐＧである。別の実施形態では、遺伝子はｆｏｌＣである。別の実施形態では、遺伝子はクエン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｇＪである。別の実施形態では、遺伝子は３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はインドール−３−グリセロール−ホスフェートシンセターゼである。別の実施形態では、遺伝子はアントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ構成成分である。別の実施形態では、遺伝子はｍｅｎＢである。別の実施形態では、遺伝子はメナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩである。別の実施形態では、遺伝子はホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＢである。別の実施形態では、遺伝子はｃａｒＡである。別の実施形態では、遺伝子はｔｈｙＡである。別の実施形態では、遺伝子はｍｇｓＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＢである。別の実施形態では、遺伝子はｈｅｐＢである。別の実施形態では、遺伝子はｒｌｕＢである。別の実
施形態では、遺伝子はｉｌｖＢである。別の実施形態では、遺伝子はｉｌｖＮである。別の実施形態では、遺伝子はａｌｓＳである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＦである。別の実施形態では、遺伝子はｆａｂＨである。別の実施形態では、遺伝子はシュードウリジンシンターゼである。別の実施形態では、遺伝子はｐｙｒＧである。別の実施形態では、遺伝子はｔｒｕＡである。別の実施形態では、遺伝子はｐａｂＢである。別の実施形態では、遺伝子はａｔｐシンセターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２等）である。
【００４０】
別の実施形態では、遺伝子はｐｈｏＰである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＡである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＣである。別の実施形態では、遺伝子はａｒｏＤである。別の実施形態では、遺伝子はｐｌｃＢである。
【００４１】
別の実施形態では、リステリア株は、ペプチド輸送体を欠損している。別の実施形態では、該遺伝子はＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子はオリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質である。別の実施形態では、遺伝子は糖ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はリン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＺＩＰ亜鉛輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は硫酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はプロトン依存性オリゴペプチド輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマグネシウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は蟻酸塩／亜硝酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はスペルミジン／プトレッシンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＮａ／Ｐｉ−ｃｏ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は糖リン酸輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグルタミンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は主要ファシリテーターファミリーの輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はグリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はモリブデンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はタイコ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はコバルトＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアンモニウム輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はアミノ酸ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は細胞分裂ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマンガンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子は鉄化合物ＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はマルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体である。別の実施形態では、遺伝子はＢｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬物耐性輸送体である。
【００４２】
別の実施形態では、遺伝子は、上記タンパク質のうちの１つのサブユニットである。
一実施形態では、本発明の組成物は、一実施形態において抗血管新生特性を有する、インターフェロンγの生得的な強い刺激を誘導する。一実施形態では、本発明のリステリアは、一実施形態において抗血管新生特性を有する、インターフェロンγの生得的な強い刺激を誘導する（参照により、その全体が本明細書に組み込まれるＤｏｍｉｎｉｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  Ｍａｙ；５４（５）：４７７−８８．Ｅｐｕｂ  ２００４  Ｏｃｔ  ６、参照により、その全体が本明細書に組み込まれるＢｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ  １５；１６６（４）：２２７６−８２）。一実施形態では、リステリアの抗血管新生特性は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって媒介される（Ｂｅａｔｔｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，２００１）。別の実施形態では、リステリアの抗血管新生特性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。別の実施形態では、リステリアワクチン接種の結果としてのＩＦＮ−γの分泌は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１  ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＴＣ１  ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはそれらの組み合わせによって媒介される。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の組成物は、１つ以上の抗血管新生タンパク質または抗血管新生因子の生成を誘導する。一実施形態では、抗血管新生タンパク質は、ＩＦＮ−γである。別の実施形態では、抗血管新生タンパク質は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ（ｓＦｌｔ）−１、または可溶性エンドグリン（ｓＥｎｇ）である。一実施形態では、本発明のリステリアは、抗血管新生因子の放出に関与し、したがって、一実施形態では、対象に抗原を導入するためのベクターとしての役割に加えて、治療的な役割を有する。
【００４４】
各リステリア株およびその種類は、本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組換えリステリアは、抗原またはＬＬＯ−抗原融合物をコードする構築物で安定に形質転換される。一実施形態では、構築物は、さらなるサブクローニングを促進するポリリンカーを含有する。組換えリステリアを生成するためのいくつかの技術は既知であり、各技術は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４５】
一実施形態では、本発明の組成物および方法において有用な構築物は、リステリア染色体から発現される。
別の実施形態では、構築物または異種遺伝子は、相同的組換えを使用してリステリアの染色体に組み込まれる。相同的組換えのための技術は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｆｒａｎｋｅｌ，ＦＲ，Ｈｅｇｄｅ，Ｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ，ａｎｄ  Ｙ
Ｐａｔｅｒｓｏｎ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＨＩＶ  ｇａｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｓ  ａ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４７６６−４７７４．１９９５、Ｍａｔａ，Ｍ，Ｙａｏ，Ｚ，Ｚｕｂａｉｒ，Ａ，Ｓｙｒｅｓ，Ｋ  ａｎｄ  Ｙ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ａｎ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１４３５−４５，２００１、Ｂｏｙｅｒ，ＪＤ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ＴＭ，Ｍａｃｉａｇ，ＰＣ，Ｐｅｎｇ，Ｘ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＲＳ，Ｐａｖｌａｋｉｓ，Ｇ，Ｌｅｗｉｓ，ＭＧ，Ｓｈｅｎ，Ａ，Ｓｉｌｉｃｉａｎｏ，Ｒ，Ｂｒｏｗｎ，ＣＲ，Ｗｅｉｎｅｒ，Ｄ，ａｎｄ  Ｙ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ．ＤＮＡ  ｐｒｉｍｅ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ
ｂｏｏｓｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＳＩＶ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｈｅｓｕｓ  Ｍａｃａｑｕｅ  ｍｏｄｅｌ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＳＩＶ２３９  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．３３３：８８−１０１，２００５に記載される。別の実施形態では、相同的組換えは、米国特許第６，８５５，３２０号に記載されるように行われる。別の実施形態では、温度感受性プラスミドが組換え体を選択するために使用される。各技術は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４６】
別の実施形態では、構築物または異種遺伝子は、トランスポゾン挿入を用いてリステリアの染色体に組み込まれる。トランスポゾン挿入のための技術は当該技術分野において周知であり、例えば、とりわけ、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９０，５８：３７７０−３７７８）によりＤＰ−Ｌ９６７の構築において記載されている。トランスポゾン変異誘発は、別の実施形態では、安定したゲノムの挿入変異型が形成され得るという利点を有する。別の実施形態では、トランスポゾン変異誘発によって外来遺伝子が挿入されているゲノムにおける位置は不明である。
【００４７】
別の実施形態では、構築物または異種遺伝子は、ファージ組込み部位を用いてリステリ
アの染色体に組み込まれる（Ｌａｕｅｒ  Ｐ，Ｃｈｏｗ  ＭＹ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ＬＭ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｈａｇｅ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ２００２；１８４（１５）：４１７７−８６）。別の実施形態では、ゲノム内の任意の適切な部位であり得る（例えば、ｃｏｍＫまたはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）対応する付着部位に異種遺伝子を挿入するために、インテグラーゼ遺伝子およびバクテリオファージの付着部位（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）が使用される。別の実施形態では、内在性プロファージは、構築物または異種遺伝子の組み込みの前に利用される付着部位から治癒される。別の実施形態では、この方法は、単一コピーの組み込み体をもたらす。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４８】
一実施形態では、本発明の組成物は、リステリア株のエピソームベクターから発現される。別の実施形態では、構築物は、リステリア株によってエピソームベクター上に保有される。別の実施形態では、構築物は、リステリア株によってプラスミド上に保有される。抗原融合タンパク質を発現するＬＭベクターは、この技術により構築されてきた。Ｌｍ−ＧＧ／Ｅ７は、本明細書に記載されるように、ｐｒｆＡ遺伝子のコピーと、酵素の溶血作用を排除するように切断されたＬＬＯ（ｈｌｙ）遺伝子の一形態に融合されたＥ７遺伝子のコピーで、ｐｒｆＡ欠失変異型を補完することによって作られた。機能性ＬＬＯは、ｈｌｙの内在性染色体のコピーを介して生物により維持された。別の実施形態では、プラスミドは、抗生物質抵抗性遺伝子を含む。別の実施形態では、プラスミドは、形質転換リステリア株のゲノムが欠落した病原性因子をコードする遺伝子を含有する。別の実施形態では、病原性因子はｐｒｆＡである。別の実施形態では、病原性因子はＬＬＯである。別の実施形態では、病原性因子はＡｃｔＡである。別の実施形態では、病原性因子は、弱毒化の標的として上に列挙した遺伝子のうちのいずれかである。別の実施形態では、病原性因子は、当該技術分野において既知である任意の他の病原性因子である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４９】
別の実施形態では、本発明の組換えペプチドは、ＰＩ−ＰＬＣ等のリステリアタンパク質、または該タンパク質をコードする構築物に融合される。別の実施形態では、溶血素、ＡｃｔＡ、またはホスホリパーゼ等の分泌されるリステリアタンパク質のシグナル配列は、抗原をコードする遺伝子に融合される。別の実施形態では、組換えワクチンのベクターのシグナル配列が使用される。別の実施形態では、組換えワクチンのベクターにおいて機能性であるシグナル配列が使用される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５０】
別の実施形態では、構築物は、エピソームの様式でリステリア株に含有される。別の実施形態では、外来抗原は、組換えリステリア株の内部に保持されるベクターから発現される。
【００５１】
リステリアにおける各発現の方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、本発明の組換えリステリア株は、動物宿主で継代されている。別の実施形態では、継代は、ワクチンのベクターとして株の有効性を最大化する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の免疫原性を安定化する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の病原性を安定化する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の免疫原性を増加させる。別の実施形態では、継代は、リステリア株の病原性を増加させる。別の実施形態では、継代は、リステリア株の不安定な亜株を除去する。別の実施形態では、継代は、リステリア株の不安定な亜株の罹患率を減少させる。別の実施形態では、継代は、株を弱毒化させるか、または別の実施形態では、株の病原性を低下させる。一実施形態では、リステリアが継代された動物は哺乳動物であり、一実施形態では、それはマウスである。本発明は、マウス、ウサギ、モルモット、ハムスター、スナネズミ、ラット等の哺乳動
物の使用を企図する。そのような哺乳動物は当該技術分野において周知であり、卸売業者、流通業者、および研究所、例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍｅ．）を通して当業者に入手可能である。組換えリステリア株を動物宿主に継代させる方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許出願第１０／５４１，６１４号に記載される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５２】
他の関連する態様において、本発明は、切断されたＡｃｔＡ、ＬＬＯ、またはＰＥＳＴタンパク質をコードする単離された核酸と、核酸が、好ましくは、該核酸によってコードされるタンパク質の発現を指示することが可能であるようにプロモーター／調節配列を含む核酸に作動可能に連結されたＶＥＧＦＲ２タンパク質もしくはその免疫原性断片、またはエンドグリンもしくはその免疫原性断片をコードする単離された核酸とを含む。したがって、本発明は、発現ベクターと、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）に記載されるように、細胞内で外来性ＤＮＡを同時発現することにより、細胞に外来性ＤＮＡを導入するための方法とを包含する。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、「核酸」または「ヌクレオチド」は、一連の少なくとも２つの塩基−糖−リン酸の組み合わせを指す。該用語は、一実施形態では、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。「ヌクレオチド」は、一実施形態では、核酸ポリマーの単量体単位を指す。ＲＮＡは、一実施形態では、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態である。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用が記載されている（Ｃａｕｄｙ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌ  １６：２４９１−９６（本明細に引用される参考文献））。ＤＮＡは、他の実施形態では、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、もしくは染色体ＤＮＡ、またはこれらの群の誘導体の形態であり得る。また、これらのＤＮＡおよびＲＮＡの形態は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖であり得る。該用語はまた、別の実施形態では、他の種類の主鎖を含有するが、塩基は同じである人工核酸を含む。一実施形態では、人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡは、ペプチド主鎖およびヌクレオチド塩基を含有し、一実施形態では、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方に結合することが可能である。別の実施形態では、ヌクレオチドはオキセタンで修飾される。別の実施形態では、ヌクレオチドは、１つ以上のリン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合に置換することによって修飾される。別の実施形態では、人工核酸は、当該技術分野で既知である天然核酸のリン酸主鎖の任意の他の変異型を含有する。ホスホチオレート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に既知であり、例えば、Ｎｅｉｌｓｅｎ  ＰＥ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ９：３５３−５７およびＲａｚ  ＮＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２９７：１０７５−８４に記載される。核酸の生成および使用は、当業者に既知であり、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，（２００１），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ．およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ（２００３）Ｐｕｒｃｈｉｏ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃ．  Ｆａｒｅｅｄに記載される。各核酸誘導体は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００５４】
一実施形態では、「単離された核酸」は、自然に生じた状態でその側面に位置する配列、例えば、通常断片に隣接する配列（例えば、それが自然に生じるゲノムの断片に隣接する配列）から除去されたＤＮＡ断片から分離された核酸セグメントまたは断片を指す。該
用語はまた、核酸（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質）を自然に伴い、細胞において自然に該核酸を伴う他の構成成分から実質的に精製された核酸に当てはまる。したがって、該用語は、ベクター、自発的に複製するプラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれるか、あるいは他の配列から独立した別個の分子として（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムまたはＰＣＲもしくは制限酵素消化によって生成されるｃＤＮＡ断片として）存在する、組換えＤＮＡを含む。
【００５５】
一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態では、用語「オリゴヌクレオチド」は、通常、２０個以下の塩基を有する、短い核酸ポリマーを指す。一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一実施形態では、用語「ポリヌクレオチド」は、多数のヌクレオチドの鎖を指し、一実施形態では、それは５個より多く、別の実施形態において１０個より多く、別の実施形態において２０個より多く、別の実施形態において５０個より多い。一実施形態では、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドまたは核酸は、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ、真核生物のｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳類）のＤＮＡに由来するゲノムＤＮＡ配列、または合成ＤＮＡ配列を指し得る。該用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のうちのいずれかを含む配列も指す。
【００５６】
一実施形態では、本発明の２つのポリヌクレオチドは、作動可能に連結されている。例えば、一実施形態では、ＬＬＯをコードするポリヌクレオチドと、Ｆｌｋ１−Ｅ１、Ｆｌｋ１−Ｅ２、またはＦｌｋ１−Ｉ１とは、作動可能に連結されている。一実施形態では、「作動可能に連結される」とは、一本鎖または二本鎖の核酸部分が、それらが一緒に発現されるような様式で核酸部分内に配列された２つのポリヌクレオチドを含むことを意味する。例として、遺伝子のコード領域に作動可能に連結されたプロモーターは、該コード領域の転写を促進することが可能である。
【００５７】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、プロモーター／調節配列を含み、一実施形態では、プロモーター／調節配列は、細胞内の所望のタンパク質の発現を駆動するように、所望のタンパク質コード配列の５’末端に位置する。所望のタンパク質をコードする核酸およびそのプロモーター／調節配列は、ともに「導入遺伝子」を含む。
【００５８】
一実施形態では、本発明の単離された核酸は、プロモーターの制御下で発現され、一実施形態では、プロモーターは、ｈｌｙプロモーター、ｐｒｆＡプロモーター、ＡｃｔＡプロモーター、またはｐ６０プロモーターである。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載されるように、プロモーターから発現される。別の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターである。使用され得る他のプロモーターは、当該技術分野において既知である。
【００５９】
一実施形態では、用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を指す。いくつかの場合において、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の場合において、この配列はまた、エンハンサー配列、および遺伝子産物の発現に必要とされる他の調節要素も含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現する配列であり得る。
【００６０】
一実施形態では、「恒常的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されると、ヒト生細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下で、該細胞において遺伝子産物を生成させるヌクレオチド配列である。
【００６１】
一実施形態では、「誘導性」のプロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されると、実質的にプロモーターに対応するインデューサーが細胞内に存在するときのみ、生細胞において遺伝子産物を生成させるヌクレオチド配列である。
【００６２】
一実施形態では、「組織特異的」なプロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドに作動可能に連結されると、ヒト細胞が実質的にプロモーターに対応する組織型の細胞である場合にのみ、該生細胞において遺伝子産物を生成させるヌクレオチド配列である。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。一実施形態では、単離された核酸は、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも８５％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、単離された核酸は、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも９０％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、単離された核酸は、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも９５％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、単離された核酸は、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも９７％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、単離された核酸は、本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸と少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。
【００６４】
したがって、本発明は、本発明の単離された核酸を含むベクターを含む。所望の核酸のベクターへの組み込みおよびベクターの選択は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されるように、当該技術分野において周知である。
【００６５】
本発明はまた、そのようなベクターを含有する細胞、ウイルス、プロウイルス等も含む。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【００６６】
別の実施形態では、発現ベクターはプラスミドである。組換えベクターを構築および利用するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、およびＢｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６７】
別の実施形態では、ベクターは細胞内病原体である。別の実施形態では、ベクターは、細胞質病原体に由来する。別の実施形態では、ベクターは、細胞内病原体に由来する。別の実施形態では、細胞内病原体は、主として細胞媒介性免疫応答を誘導する。別の実施形
態では、ベクターはサルモネラ株である。別の実施形態では、ベクターはＢＣＧ株である。別の実施形態では、ベクターは細菌ベクターである。別の実施形態では、本発明のベクターで形質導入された樹状細胞は、対象の免疫応答を上方制御するように対象に投与され得、一実施形態では、それは、ＣＴＬ活性を上方制御することによって達成される。
【００６８】
別の実施形態では、組換えワクチンのベクターは、Ｔｈ１優性型免疫応答を誘導する。
別の実施形態では、ベクターは、サルモネラ菌種、赤痢菌種、ＢＣＧ、リステリア・モノサイトゲネス、大腸菌、およびストレプトコッカス・ゴルドニから選択される。別の実施形態では、融合タンパク質は、ファゴリソソーム融合を回避し、細胞の細胞質で生存するように修飾された組換え細菌ベクターによって送達される。別の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。他の実施形態では、ベクターは、ワクシニア、トリポックス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスＮＹＶＡＣ、修飾ワクシニア株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから選択される。別の実施形態では、ベクターはネイキッドＤＮＡベクターである。別の実施形態では、ベクターは、当該技術分野において既知である任意の他のベクターである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６９】
一実施形態では、本発明は、リステリアを提供し、一実施形態では、それは、本発明の単離された核酸またはベクターを含むリステリアワクチン株である。一実施形態では、「リステリアワクチン株」は、ＶＥＧＦＲ２もしくはそのタンパク質、またはエンドグリンもしくはそのタンパク質を発現する組換えリステリア体を指して本明細書において使用される。
【００７０】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えリステリア株と、任意選択でアジュバントとを含むワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドと、任意選択でアジュバントとを含むワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えオリゴヌクレオチドと、任意選択でアジュバントとを含むワクチンを提供する。
【００７１】
一実施形態では、本発明のワクチンは、アジュバントをさらに含む。一実施形態では、ワクチンは、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む。一実施形態では、ワクチンは、組成物への曝露の結果として、組成物中の抗原またはポリペプチドに対する免疫応答を誘発する組成物である。別の実施形態では、ワクチンまたは組成物は、ＡＰＣをさらに含み、一実施形態では、それらは対象に対して自家性であり、別の実施形態では、それらは対象に対して同種である。
【００７２】
一実施形態では、「ワクチン」は、組成物への曝露の結果として、組成物中の抗原またはポリペプチドに対する宿主の免疫応答を誘発する組成物である。一実施形態では、免疫応答は、特定の抗原に対するものであるか、または抗原上の特定のエピトープに対するものである。一実施形態では、ワクチンは、ペプチドワクチンであり得、別の実施形態では、ＤＮＡワクチンであり得る。別の実施形態では、ワクチンは、細胞内に含有され得、別の実施形態では、細胞によって送達され得、一実施形態では、それは細菌細胞であり、一実施形態では、それはリステリアである。一実施形態では、ワクチンは、対象が疾患もしくは状態に罹患または発症することを予防することができ、別の実施形態では、ワクチンは、疾患または状態を有する対象に治療的であり得る。本発明の組成物の治療的および予防的な効果は、本明細書において上述した通りである。一実施形態では、本発明のワクチンは、本発明の組成物と、アジュバント、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組み合わせとを含む。
【００７３】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を提
供する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物の免疫原性組成物は、本発明の組換えポリペプチドをコードする組換えワクチンのベクターを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、本発明の組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントを含む。一実施形態では、本発明のベクターは、ワクチン組成物の一部として投与され得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７４】
本発明の方法および組成物において利用される免疫原性組成物は、別の実施形態では、組換えワクチンのベクターを含む。別の実施形態では、組換えワクチンのベクターは、本発明の組換えポリペプチドをコードするプラスミドを含む。別の実施形態では、組換えワクチンのベクターは、本発明の単離された核酸を含む。別の実施形態では、組換えワクチンのベクターは、本発明の組換えポリペプチドをコードする単離された核酸を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７５】
本発明の方法および組成物の免疫原性組成物は、別の実施形態では、Ｔｈ１優性型免疫応答に有利に働くアジュバントを含む。別の実施形態では、アジュバントは、主としてＴｈ１媒介性免疫応答に有利に働く。別の実施形態では、アジュバントは、Ｔｈ１型免疫応答に有利に働く。別の実施形態では、アジュバントは、Ｔｈ１媒介免疫応答に有利に働く。別の実施形態では、アジュバントは、抗体が媒介する応答よりも細胞が媒介する免疫応答に有利に働く。別の実施形態では、アジュバントは、当該技術分野において既知である任意の他の種類のアジュバントである。別の実施形態では、免疫原性組成物は、標的タンパク質に対するＴ細胞免疫応答の形成を誘導する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７６】
別の実施形態では、アジュバントはＭＰＬである。別の実施形態では、アジュバントはＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはＴＬＲアゴニストである。別の実施形態では、アジュバントはＴＬＲ４アゴニストである。別の実施形態では、アジュバントはＴＬＲ９アゴニストである。別の実施形態では、アジュバントはＲｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）である。別の実施形態では、アジュバントはイミキモドである。別の実施形態では、アジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントはサイトカインまたはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはケモカインまたはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはＩＬ−１２またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはＩＬ−６またはそれをコードする核酸である。別の実施形態では、アジュバントはリポ多糖類である。別の実施形態では、アジュバントは、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）：Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｐａｕｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ４３：Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＧＪＶ  Ｎｏｓｓａｌ（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される通りである。別の実施形態では、アジュバントは、当該技術分野において既知である任意の他のアジュバントである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７７】
一実施形態では、「Ｔｈ１優性型免疫応答」は、ＩＦＮ−γが分泌される免疫応答を指す。別の実施形態では、それは、腫瘍壊死因子βが分泌される免疫応答を指す。別の実施形態では、それは、ＩＬ−２が分泌される免疫応答を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７８】
別の実施形態では、本発明は、非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）ポリペプチド、ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴ様ポリペプチドもしくはその断片から選択される非ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに作動可能に連結されたＶＥＧＦＲ２ポリペプチドまたはＶＥ
ＧＦＲ２ポリペプチドの断片を含む組換えポリペプチドを提供する。一実施形態では、断片は、当該技術分野において既知であるアッセイおよびツールを使用して証明され得るように、完全長ペプチドまたはタンパク質と同じかまたはそれに類似する性質または機能を有する。本発明の完全長ペプチドおよびタンパク質の性質および機能は、本明細書において後に詳述する。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）ポリペプチド、ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴ様ポリペプチドもしくはその断片から選択される非エンドグリンポリペプチドに作動可能に連結されたエンドグリンまたはエンドグリンポリペプチドの断片を含む組換えポリペプチドを提供する。一実施形態では、断片は、当該技術分野において既知であるアッセイおよびツールを使用して証明され得るように、完全長ペプチドまたはタンパク質と同じかまたはそれに類似する性質または機能を有する。本発明の完全長ペプチドおよびタンパク質の性質および機能は、本明細書において後に詳述する。
【００８０】
一実施形態では、本発明は、血管新生因子またはその免疫原性断片をコードする核酸を含む組換えリステリア株を提供する。
一実施形態では、本発明は、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子またはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
【００８１】
一実施形態では、本発明の組成物は、血管新生因子またはその免疫原性断片を含み、一実施形態では、免疫原性断片は、宿主免疫系によって認識される１つ以上のエピトープを含む。一実施形態では、血管新生因子は、新しい血管の形成に関与する分子である。一実施形態では、血管新生因子はＶＥＧＦＲ２である。別の実施形態では、血管新生因子はエンドグリンである。別の実施形態では、本発明の血管新生因子は、アンジオゲニン、アンジオポエチン−１、Ｄｅｌ−１、線維芽細胞増殖因子：酸性（ａＦＧＦ）および塩基性（ｂＦＧＦ）、フォリスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱係数（ＳＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、レプチン、ミドカイン、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、血小板由来増殖因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）／血管透過性因子（ＶＰＦ）である。別の実施形態では、血管新生因子は血管新生タンパク質である。一実施形態では、増殖因子は血管新生タンパク質である。一実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のための血管新生タンパク質は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲおよびニューロピリン１（ＮＲＰ−１）、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）およびＴｉｅ２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ、ＢＢ−ホモ二量体）およびＰＤＧＦＲ、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）、エンドグリンおよびＴＧＦ−β受容体、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、インテグリンαＶβ３、αＶβ５およびα５β１、ＶＥ−カドヘリンおよびＣＤ３１、エフリン、プラスミノーゲン活性化因子、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−１、一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）およびＣＯＸ−２、ＡＣ１３３、またはＩｄ１／Ｉｄ３である。一実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のための血管新生タンパク質は、アンジオポエチンであり、一実施形態では、それはアンジオポエチン１、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、またはアンジオポエチン６である。一実施形態では、エンドグリンは、ＣＤ１０５、ＥＤＧ、ＨＨＴ１、ＯＲＷ、またはＯＲＷ１としても知られる。一実施形態では、エンドグリンはＴＧＦβ共受容体である。
【００８２】
一実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のための血管新生因子は、ＨＭＷ−ＭＡＡを含まない。別の実施形態では、本発明の組成物および方法における使用の
ための血管新生因子は、ＨＭＷＭＡＡを含む。一実施形態では、ＨＭＷＭＡＡは、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）、ＮＧ２、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、ＭＣＳＰＧ、ＭＳＫ１６、ＨＭＷＭＡＡ、ＭＥＬ−ＣＳＰＧ、またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られる。他の血管新生因子は、当該技術分野において既知であり、本発明の組成物および方法において使用することができる。
【００８３】
したがって、一実施形態では、本発明の組成物および方法は、腫瘍脈管構造を標的とする。一実施形態では、本発明の組成物および方法は、大規模なエピトープスプレッディングを示し、一実施形態では、それは、誘導エピトープとは異なる非交差反応性のエピトープが、進行中の免疫応答の主要な標的となるプロセスである。一実施形態では、本明細書に後述する実施例において提示されるデータは、腫瘍脈管構造を標的とするワクチンが内在性腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導できることを示し、一実施形態では、それは、当業者が、特定の腫瘍関連抗原を標的とすることなく、腫瘍を治療、抑制、または阻害することを可能にする。したがって、一実施形態では、本発明の組成物は、癌または腫瘍に対する汎用ワクチンとしての役割を果たし、一実施形態では、それは、特定の腫瘍抗原が有効であることに依存しない。一実施形態では、腫瘍脈管構造および周皮細胞の被覆が不十分であるため、腫瘍特異性が付与される。
【００８４】
一実施形態では、本発明の組成物は、本発明の方法において非常に有効であり、ＶＥＧＦＲ２／ＨＭＷＭＡＡ／エンドグリン等の血管新生に関連するポリペプチドは一般的な機能に必要不可欠であり、したがって損失または置換されないので、抗原欠質変異型が生じる確立が低いため、一実施形態では、長期間にわたり有効である。一実施形態では、本発明の組成物および方法は、十分に発達した脈管構造および周皮細胞の被覆を有する正常組織を損なうことはないが、脈管構造および周皮細胞の被覆が十分に発達していない腫瘍脈管構造を標的とする。
【００８５】
別の実施形態では、血管新生因子の特定の断片が、本発明の組成物および方法において使用される。一実施形態では、本発明の組成物および方法において使用される断片は、Ｔ細胞エピトープを含有する領域について血管新生因子のアミノ酸配列を分析することに基づいており、一実施形態では、それはエピトープ予測プログラム（そのうちのいくつかは当該技術分野において既知である（例えば、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／またはＲＡＮＫｐｅｐ：ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＲＡＮＫＰＥＰ／））を用いて血管新生因子配列を検索することによって決定され、別の実施形態では、それは予測的なエピトープマッピングによって決定される。別の実施形態では、疎水性マップ（一実施形態においてＥｘｐａｓｙ：ｈｔｔｐ：／／ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／である）が、本発明の組成物および方法における使用のための血管新生因子の断片を同定するために、単独でまたはエピトープ予測プログラムとともに使用される。別の実施形態では、血管新生因子の断片は、Ｔ細胞エピトープを含むことが分かっている他の種（一実施形態では、マウスまたはラットである）の血管新生因子の配列と相同であるヒト配列を使用して同定される。別の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用される血管新生因子の断片は、Ｔ細胞エピトープを含有する血管新生因子の領域に関する当該技術分野における知識に基づいている。
【００８６】
一実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のための血管新生因子は、ＶＥＧＦＲ２である。
一実施形態では、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成（胚循環系の形成）および血管新生（既存の脈管構造からの血管の増殖）の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である。一実施形態では、ＶＥＧＦ活性は、限定数の他の細胞型（例えば、刺激単球／マクロファージ遊走）に効果を有するが、主に血管内皮の細胞に限定される。イン
ビトロで、ＶＥＧＦは、内皮細胞の有糸分裂誘発および細胞遊走を刺激することが示されている。ＶＥＧＦはまた、微小血管透過性を高め、時折、血管透過性因子とも称される。
【００８７】
一実施形態では、ＶＥＧＦファミリーの全てのメンバーは、細胞表面上のチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦＲ）に結合することにより細胞応答を刺激し、それらを二量体化させ、トランスリン酸化を経て活性化される。ＶＥＧＦ受容体は、７つの免疫グロブリン様ドメインからなる細胞外部分、単一の膜貫通領域、およびスプリットチロシンキナーゼドメインを含有する細胞内部分を有する。
【００８８】
一実施形態では、ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）リガンドおよびＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）リガンドである。一実施形態では、ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦに対する既知の細胞応答のほとんど全てを媒介する。ＶＥＧＦＲ−１の機能はあまり明らかになっていないが、一実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２結合からＶＥＧＦを隔離することにより、ＶＥＧＦＲ−２のシグナル伝達を調節すると考えられており、一実施形態では、それは胚の脈管形成の間に特に重要である。一実施形態では、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−３受容体のリガンドであり、一実施形態では、それはリンパ脈管新生を媒介する。
【００８９】
一実施形態では、本発明の組成物は、ＶＥＧＦ受容体またはその断片を含み、一実施形態では、それはＶＥＧＦＲ−２であり、別の実施形態においてＶＥＧＦＲ−１であり、別の実施形態においてＶＥＧＦＲ−３である。
【００９０】
一実施形態では、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）は、活性化内皮細胞（ＥＣ）において高度に発現され、新しい血管の形成に関与する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦの５つ全てのアイソフォームに結合する。一実施形態では、ＥＣ上のＶＥＧＦＲ２を通るＶＥＧＦのシグナル伝達は、増殖、遊走、および最終的な分化を誘導する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のマウス相同体は胎児肝臓キナーゼ遺伝子−１（Ｆｌｋ−１）であり、それは強力な治療標的であり、腫瘍の増殖、浸潤、および転移において重要な役割を有する。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２はまた、キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＩＩＩ型受容体型チロシンキナーゼ）（ＫＤＲ）、分化抗原群３０９（ＣＤ３０９）、ＦＬＫ１、Ｌｙ７３、Ｋｒｄ−１、ＶＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ−２、または６１３０４０１Ｃ０７とも称される。
【００９１】
別の実施形態では、本発明の組成物において使用されるＶＥＧＦＲ２タンパク質は、以下の配列を有する：
ＭＥＳＫＡＬＬＡＶＡＬＷＦＣＶＥＴＲＡＡＳＶＧＬＰＧＤＦＬＨＰＰＫＬＳＴＱＫＤＩＬＴＩＬＡＮＴＴＬＱＩＴＣＲＧＱＲＤＬＤＷＬＷＰＮＡＱＲＤＳＥＥＲＶＬＶＴＥＣＧＧＧＤＳＩＦＣＫＴＬＴＩＰＲＶＶＧＮＤＴＧＡＹＫＣＳＹＲＤＶＤＩＡＳＴＶＹＶＹＶＲＤＹＲＳＰＦＩＡＳＶＳＤＱＨＧＩＶＹＩＴＥＮＫＮＫＴＶＶＩＰＣＲＧＳＩＳＮＬＮＶＳＬＣＡＲＹＰＥＫＲＦＶＰＤＧＮＲＩＳＷＤＳＥＩＧＦＴＬＰＳＹＭＩＳＹＡＧＭＶＦＣＥＡＫＩＮＤＥＴＹＱＳＩＭＹＩＶＶＶＶＧＹＲＩＹＤＶＩＬＳＰＰＨＥＩＥＬＳＡＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＬＤＦＴＷＨＳＰＰＳＫＳＨＨＫＫＩＶＮＲＤＶＫＰＦＰＧＴＶＡＫＭＦＬＳＴＬＴＩＥＳＶＴＫＳＤＱＧＥＹＴＣＶＡＳＳＧＲＭＩＫＲＮＲＴＦＶＲＶＨＴＫＰＦＩＡＦＧＳＧＭＫＳＬＶＥＡＴＶＧＳＱＶＲＩＰＶＫＹＬＳＹＰＡＰＤＩＫＷＹＲＮＧＲＰＩＥＳＮＹＴＭＩＶＧＤＥＬＴＩＭＥＶＴＥＲＤＡＧＮＹＴＶＩＬＴＮＰＩＳＭＥＫＱＳＨＭＶＳＬＶＶＮＶＰＰＱＩＧＥＫＡＬＩＳＰＭＤＳＹＱＹＧＴＭＱＴＬＴＣＴＶＹＡＮＰＰＬＨＨＩＱＷＹＷＱＬＥＥＡＣＳＹＲＰＧＱＴＳＰＹＡＣＫＥＷＲＨＶＥＤＦＱＧＧＮＫＩＥＶＴＫＮＱＹＡＬＩＥＧＫＮＫＴＶＳＴＬＶＩＱＡＡＮＶＳＡＬＹＫＣＥＡＩＮＫＡＧＲＧＥＲＶＩＳＦＨＶＩＲＧＰＥＩＴＶＱＰＡＡＱＰＴＥＱＥＳＶＳＬＬＣＴＡＤＲＮＴＦＥＮＬＴＷＹＫＬＧＳＱＡＴＳＶＨＭＧＥＳＬＴＰ
ＶＣＫＮＬＤＡＬＷＫＬＮＧＴＭＦＳＮＳＴＮＤＩＬＩＶＡＦＱＮＡＳＬＱＤＱＧＤＹＶＣＳＡＱＤＫＫＴＫＫＲＨＣＬＶＫＱＬＩＩＬＥＲＭＡＰＭＩＴＧＮＬＥＮＱＴＴＴＩＧＥＴＩＥＶＴＣＰＡＳＧＮＰＴＰＨＩＴＷＦＫＤＮＥＴＬＶＥＤＳＧＩＶＬＲＤＧＮＲＮＬＴＩＲＲＶＲＫＥＤＧＧＬＹＴＣＱＡＣＮＶＬＧＣＡＲＡＥＴＬＦＩＩＥＧＡＱＥＫＴＮＬＥＶＩＩＬＶＧＴＡＶＩＡＭＦＦＷＬＬＬＶＩＶＬＲＴＶＫＲＡＮＥＧＥＬＫＴＧＹＬＳＩＶＭＤＰＤＥＬＰＬＤＥＲＣＥＲＬＰＹＤＡＳＫＷＥＦＰＲＤＲＬＫＬＧＫＰＬＧＲＧＡＦＧＱＶＩＥＡＤＡＦＧＩＤＫＴＡＴＣＫＴＶＡＶＫＭＬＫＥＧＡＴＨＳＥＨＲＡＬＭＳＥＬＫＩＬＩＨＩＧＨＨＬＮＶＶＮＬＬＧＡＣＴＫＰＧＧＰＬＭＶＩＶＥＦＣＫＦＧＮＬＳＴＹＬＲＧＫＲＮＥＦＶＰＹＫＳＫＧＡＲＦＲＱＧＫＤＹＶＧＥＬＳＶＤＬＫＲＲＬＤＳＩＴＳＳＱＳＳＡＳＳＧＦＶＥＥＫＳＬＳＤＶＥＥＥＥＡＳＥＥＬＹＫＤＦＬＴＬＥＨＬＩＣＹＳＦＱＶＡＫＧＭＥＦＬＡＳＲＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＬＳＥＫＮＶＶＫＩＣＤＦＧＬＡＲＤＩＹＫＤＰＤＹＶＲＫＧＤＡＲＬＰＬＫＷＭＡＰＥＴＩＦＤＲＶＹＴＩＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＳＬＧＡＳＰＹＰＧＶＫＩＤＥＥＦＣＲＲＬＫＥＧＴＲＭＲＡＰＤＹＴＴＰＥＭＹＱＴＭＬＤＣＷＨＥＤＰＮＱＲＰＳＦＳＥＬＶＥＨＬＧＮＬＬＱＡＮＡＱＱＤＧＫＤＹＩＶＬＰＭＳＥＴＬＳＭＥＥＤＳＧＬＳＬＰＴＳＰＶＳＣＭＥＥＥＥＶＣＤＰＫＦＨＹＤＮＴＡＧＩＳＨＹＬＱＮＳＫＲＫＳＲＰＶＳＶＫＴＦＥＤＩＰＬＥＥＰＥＶＫＶＩＰＤＤＳＱＴＤＳＧＭＶＬＡＳＥＥＬＫＴＬＥＤＲＮＫＬＳＰＳＦＧＧＭＭＰＳＫＳＲＥＳＶＡＳＥＧＳＮＱＴＳＧＹＱＳＧＹＨＳＤＤＴＤＴＴＶＹＳＳＤＥＡＧＬＬＫＭＶＤＡＡＶＨＡＤＳＧＴＴＬＲＳＰＰＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３４７４２．２、ＡＡＨ２０５３０．１、またはＥＤＬ３７８９１．１、配列番号４、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１０６１２．２またはＢＣ０２０５３０．１に記載される）。一実施形態では、６８〜２７７番目のアミノ酸は、本明細書に記載されるＥ１に対応し、５４５〜７３０番目のアミノ酸は、本明細書に記載されるＥ２に対応し、７９２〜１０８１番目のアミノ酸は、本明細書に記載されるＩ１に対応する。別の実施形態では、上記配列は、本発明のワクチンに組み込まれたＶＥＧＦＲ２断片の源として使用される。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４の変異型である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９２】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに記載されるアミノ酸配列を有する：ＥＤＬ３７８９１．１、ＣＡＡ６１９１７．１、ＢＡＣ２７５３２．１、ＢＡＥ２４８９２．１、ＡＡＨ２０５３０．１、ＡＡＢ２５０４３．１、ＣＡＡ４２０４０．１、またはＣＡＡ５０１９２．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに記載されるアミノ酸配列を有する：ＥＡＸ０５４６２．１、ＥＡＸ０５４６３．１、ＥＡＸ０５４６４．１、ＣＡＡ６１９１６．１、ＢＡＤ９３１３８．１、ＡＡＢ８８００５．１、ＡＡＣ１６４５０．１、ＢＡＧ５７１１４．１、ＡＡＩ３１８２３．１、ＡＣＦ４７５９９．１、ＡＡＡ５９４５９．１、またはＣＡＡ４３８３７．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに記載されるアミノ酸配列を有する：ＥＤＬ８９９１４．１、ＥＤＬ８９９１５．１、ＥＤＬ８９９１６．１、ＡＡＨ８７０２９．１、ＡＡＢ９７５０８．１、またはＡＡＢ９７５０９．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに記載されるアミノ酸配列を有する：ＣＡＱ１３４３８．１、ＡＡＦ０３２３７．１、ＡＡＮ４７１３６．１、ＡＡＬ１６３８１．１、ＡＡＩ２９１５９．１、ＣＡＭ７３１７７．１、ＡＡＢ１８４１５．１、ＡＡＢ４１０４２．１、またはＡＡＢ６２４０５．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、当該技術分野において既知である任意のＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記ＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つの配列の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記ＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つの配列の
変異型である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記ＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つの配列のアイソフォームである。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記ＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つの配列の断片である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９３】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに記載される核酸配列を有する：ＡＣ１２４６１５．１１、ＡＣ１３４９０３．４、ＡＣ１６０７２３．２、ＡＦ０６１８０４．１、ＡＦ１５３０５８．１、ＣＨ４６６５２４．１、Ｘ８９７７７．１、ＡＫ０３１７３９．１、ＡＫ０５４５１０．１、ＡＫ１４１９３８．１、ＢＣ０２０５３０．１、Ｓ５３１０３．１、Ｘ５９３９７．１、またはＸ７０８４２．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに記載される核酸配列を有する：ＡＣ０２１２２０．７、ＡＣ１１１１９４．４、ＣＨ４７１０５７．１、ＥＡＸ０５４６３．１、ＥＡＸ０５４６４．１、Ｘ８９７７６．１、ＡＢ２０９９０１．１、ＡＦ０３５１２１．１、ＡＦ０６３６５８．１、ＡＫ２９３６６８．１、ＢＣ１３１８２２．１、ＢＰ２８０６２１．１、ＣＲ６０６０５５．１、ＥＵ８２６５６３．１、Ｌ０４９４７．１、またはＸ６１６５６．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに記載される核酸配列を有する：ＣＨ４７３９８１．１、ＢＣ０８７０２９．１、Ｕ９３３０６．１、またはＵ９３３０７．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、は、以下のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに記載される核酸配列を有する：ＡＬ９３５１３１．７、ＢＸ２４７９４６．６、ＣＲ７５９７３２．９、ＡＦ１８０３５４．１、ＡＦ４８７８２９．１、ＡＹ０５６４６６．１、ＢＣ１２９１５８．１、ＣＵ４５８９１６．１、Ｕ７５９９５．１、Ｕ８２３８３．１、Ｕ８９５１５．１。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、当該技術分野において既知である任意のＶＥＧＦＲ２核酸配列を有する。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記ＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つの配列の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記ＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つの配列の変異型である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記ＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つの配列のアイソフォームである。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２は、上記ＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つの配列の断片である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９４】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、本発明の組成物および方法において利用される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質のアミノ酸６８〜２７７を含み、一実施形態では、それはＦｌｋ１−Ｅ１と称される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、以下の配列を有する：
ＲＤＳＥＥＲＶＬＶＴＥＣＧＧＧＤＳＩＦＣＫＴＬＴＩＰＲＶＶＧＮＤＴＧＡＹＫＣＳＹＲＤＶＤＩＡＳＴＶＹＶＹＶＲＤＹＲＳＰＦＩＡＳＶＳＤＱＨＧＩＶＹＩＴＥＮＫＮＫＴＶＶＩＰＣＲＧＳＩＳＮＬＮＶＳＬＣＡＲＹＰＥＫＲＦＶＰＤＧＮＲＩＳＷＤＳＥＩＧＦＴＬＰＳＹＭＩＳＹＡＧＭＶＦＣＥＡＫＩＮＤＥＴＹＱＳＩＭＹＩＶＶＶＶＧＹＲＩＹＤＶＩＬＳＰＰＨＥＩＥＬＳＡＧＥＫＬＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬＮＶＧＬＤＦＴＷＨＳＰＰＳＫＳＨＨＫＫＩＶＮＲ（配列番号５）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５の変異型である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９５】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の５４５〜７３０番目のアミノ酸を含み、一実施形態では、それはＦｌｋ１−Ｅ２と称される。別の実施形態
では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、以下の配列を有する：
ＶＩＲＧＰＥＩＴＶＱＰＡＡＱＰＴＥＱＥＳＶＳＬＬＣＴＡＤＲＮＴＦＥＮＬＴＷＹＫＬＧＳＱＡＴＳＶＨＭＧＥＳＬＴＰＶＣＫＮＬＤＡＬＷＫＬＮＧＴＭＦＳＮＳＴＮＤＩＬＩＶＡＦＱＮＡＳＬＱＤＱＧＤＹＶＣＳＡＱＤＫＫＴＫＫＲＨＣＬＶＫＱＬＩＩＬＥＲＭＡＰＭＩＴＧＮＬＥＮＱＴＴＴＩＧＥＴＩＥＶＴＣＰＡＳＧＮＰＴＰＨＩＴＷＦＫＤＮＥＴＬＶＥＤＳＧＩＶＬＲＤＧＮＲＮＬＴＩＲＲＶＲＫＥＤＧ（配列番号６）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６の変異型である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号６のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９６】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の７９２〜１０８１番目のアミノ酸を含み、一実施形態では、それはＦｌｋ１−Ｉ１と称される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、以下の配列を有する：
ＥＧＥＬＫＴＧＹＬＳＩＶＭＤＰＤＥＬＰＬＤＥＲＣＥＲＬＰＹＤＡＳＫＷＥＦＰＲＤＲＬＫＬＧＫＰＬＧＲＧＡＦＧＱＶＩＥＡＤＡＦＧＩＤＫＴＡＴＣＫＴＶＡＶＫＭＬＫＥＧＡＴＨＳＥＨＲＡＬＭＳＥＬＫＩＬＩＨＩＧＨＨＬＮＶＶＮＬＬＧＡＣＴＫＰＧＧＰＬＭＶＩＶＥＦＣＫＦＧＮＬＳＴＹＬＲＧＫＲＮＥＦＶＰＹＫＳＫＧＡＲＦＲＱＧＫＤＹＶＧＥＬＳＶＤＬＫＲＲＬＤＳＩＴＳＳＱＳＳＡＳＳＧＦＶＥＥＫＳＬＳＤＶＥＥＥＥＡＳＥＥＬＹＫＤＦＬＴＬＥＨＬＩＣＹＳＦＱＶＡＫＧＭＥＦＬＡＳＲＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＩＬＬＳＥＫＮＶＶＫＩＣＤＦＧＬＡＲＤＩＹＫＤＰＤＹＶＲＫＧＤＡＲＬＰＬＫＷＭＡＰＥＴＩＦＤＲＶＹＴ（配列番号７）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７の変異型である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号７のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９７】
別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の１０８２〜１２３７番目のアミノ酸を含み、一実施形態では、それはＦｌｋ１−Ｅ２と称される。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、以下の配列を有する：
ＩＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＳＬＧＡＳＰＹＰＧＶＫＩＤＥＥＦＣＲＲＬＫＥＧＴＲＭＲＡＰＤＹＴＴＰＥＭＹＱＴＭＬＤＣＷＨＥＤＰＮＱＲＰＳＦＳＥＬＶＥＨＬＧＮＬＬＱＡＮＡＱＱＤＧＫＤＹＩＶＬＰＭＳＥＴＬＳＭＥＥＤＳＧＬＳＬＰＴＳＰＶＳＣＭＥＥＥＥＶＣＤＰＫＦＨＹＤＮＴＡＧＩＳＨＹＬＱＮＳＫＲＫＳＲＰＶＳＶＫＴＦ（配列番号４４）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４４に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４４の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４４の変異型である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４４の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号４４のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９８】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用されるＶＥＧＦＲ２断片は、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列をＴ細胞エピトープを含有する領域について分析することに基づいており、一実施形態では、それはエピトープ予測プログラム（そのうちのいくつかは当該技術分野において既知である）を用いてＶＥＧＦＲ２配列を実行することによって決定され、別の実施形態では、それは予測的なエピトープマッピングによって決定され
る。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２断片は、Ｔ細胞エピトープを含むことが分かっている他の種（一実施形態では、マウスまたはラットである）のＶＥＧＦＲ２配列と相同であるヒト配列を用いて使用される。別の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用されるＶＥＧＦＲ２断片は、Ｔ細胞エピトープを含有するＶＥＧＦＲ２の領域に関する当該技術における知識に基づいている。
【００９９】
一実施形態では、エンドグリンタンパク質は、以下の配列に記載される：
ＭＤＲＧＶＬＰＬＰＩＴＬＬＬＦＥＩＹＳＦＥＰＴＴＧＬＡＥＲＶＧＣＤＬＱＰＶＤＰＴＲＧＥＶＴＦＴＴＳＱＶＳＥＧＣＶＡＱＡＡＮＡＶＲＥＶＨＶＬＦＬＤＦＰＧＭＬＳＨＬＥＬＴＬＱＡＳＫＱＮＧＴＥＴＲＥＶＦＬＶＬＶＳＮＫＮＶＦＶＫＦＱＡＰＥＩＰＬＨＬＡＹＤＳＳＬＶＩＦＱＧＱＰＲＶＮＩＴＶＬＰＳＬＴＳＲＫＱＩＬＤＷＡＡＴＫＧＡＩＴＳＩＡＡＬＤＤＰＱＳＩＶＬＱＬＧＱＤＰＫＡＰＦＬＣＬＰＥＡＨＫＤＭＧＡＴＬＥＷＱＰＲＡＱＴＰＶＱＳＣＲＬＥＧＶＳＧＨＫＥＡＹＩＬＲＩＬＰＧＳＥＡＧＰＲＴＶＴＶＭＭＥＬＳＣＴＳＧＤＡＩＬＩＬＨＧＰＰＹＶＳＷＦＩＤＩＮＨＳＭＱＩＬＴＴＧＥＹＳＶＫＩＦＰＧＳＫＶＫＧＶＥＬＰＤＴＰＱＧＬＩＡＥＡＲＫＬＮＡＳＩＶＴＳＦＶＥＬＰＬＶＳＮＶＳＬＲＡＳＳＣＧＧＶＦＱＴＴＰＡＰＶＶＴＴＰＰＫＤＴＣＳＰＶＬＬＭＳＬＩＱＰＫＣＧＮＱＶＭＴＬＡＬＮＫＫＨＶＱＴＬＱＣＴＩＴＧＬＴＦＷＤＳＳＣＱＡＥＤＴＤＤＨＬＶＬＳＳＡＹＳＳＣＧＭＫＶＴＡＨＶＶＳＮＥＶＩＩＳＦＰＳＧＳＰＰＬＲＫＫＶＱＣＩＤＭＤＳＬＳＦＱＬＧＬＹＬＳＰＨＦＬＱＡＳＮＴＩＥＬＧＱＱＡＦＶＱＶＳＶＳＰＬＴＳＥＶＴＶＱＬＤＳＣＨＬＤＬＧＰＥＧＤＭＶＥＬＩＱＳＲＴＡＫＧＳＣＶＴＬＬＳＰＳＰＥＧＤＰＲＦＳＦＬＬＲＶＹＭＶＰＴＰＴＡＧＴＬＳＣＮＬＡＬＲＰＳＴＬＳＱＥＶＹＫＴＶＳＭＲＬＮＶＶＳＰＤＬＳＧＫＧＬＶＬＰＳＶＬＧＩＴＦＧＡＦＬＩＧＡＬＬＴＡＡＬＷＹＩＹＳＨＴＲＧＰＳＫＲＥＰＶＶＡＶＡＡＰＡＳＳＥＳＳＳＴＮＨＳＩＧＳＴＱＳＴＰＣＳＴＳＳＭＡ（配列番号６２、図１２）。一実施形態では、エンドグリンは、以下の受入番号を含むがこれらに限定されない、当該技術分野において利用可能な任意のエンドグリンである：ＣＡＡ５４９１７．１、ＮＰ＿００１０１０９６８．１、ＮＰ＿００１０７４３５６．１、ＡＡＣ６３３８６．１、ＣＡＡ５０８９１。別の実施形態では、ａａ１７〜３１９は、構築物ＣＤ１０５Ａに対応する。別の実施形態では、ａａ３５９〜５９９は、構築物ＣＤ１０５Ｂに対応する。
【０１００】
一実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の７６６〜７７４番目のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、配列ＩＩＬＶＧＴＡＶＩ（配列番号５４）を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の７８１〜７８９番目のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、配列ＬＬＶＩＩＬＲＴＶ（配列番号５５）を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の１０３４〜１０４２番目のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、配列ＩＬＬＳＥＫＮＶＶ（配列番号５６）を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の１０７６〜１０８４番目のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、配列ＴＩＦＤＲＶＹＴＩ（配列番号５７）を含む。別の実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のためのヒトＨＬＡ−Ａ０２０１断片は、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の１０９３〜１１０１番目のアミノ酸を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチド断片は、配列ＶＬＬＷＥＩＦＳＬ（配列番号５８）を含む。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５４〜５８に記載される配列からなる。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５４〜５８に記載される配列のうちの１つ
以上を含む。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５４〜５８の相同体である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５４〜５８の変異型である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５４〜５８の断片である。別の実施形態では、ＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号５４〜５８のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０２】
したがって、一実施形態では、本発明の組成物および方法において使用されるＶＥＧＦＲ２断片は、Ｆｌｋ１−Ｅ１、Ｆｌｋ１−Ｅ２、Ｆｌｋ１−Ｉ１、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用されるＶＥＧＦＲ２断片は、配列番号５、配列番号６、または配列番号７から選択される。
【０１０３】
一実施形態では、本発明の組成物および方法のためのＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦＲ２のシグナル配列を含み、一実施形態では、それはＶＥＧＦＲ２のアミノ酸配列のアミノ酸１〜２０である。別の実施形態では、本発明の組成物および方法のためのＶＥＧＦＲ２は、ＶＥＧＦＲ２のシグナル配列を含まない。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明の組換えポリペプチドは、非ＶＥＧＦＲ２ペプチドをさらに含む。別の実施形態では、本発明の組換えポリペプチドは、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結される。別の実施形態では、非ＶＥＧＦＲ２ペプチドは、断片の免疫原性を高める。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０５】
一実施形態では、非ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドは、ＰＥＳＴ様配列を含み、別の実施形態では、非ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドは、ＰＥＳＴ様配列からなる。非ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドは、別の実施形態では、リステリオリシン（ＬＬＯ）オリゴペプチドであり、一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態では、非ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドは、ＡｃｔＡオリゴペプチドであり、一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含む。別の実施形態では、非ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドは、ＰＥＳＴ様オリゴペプチドである。本明細書で提供されるように、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ様配列、およびその断片との融合は、抗原の細胞性免疫原性を高める。一実施形態では、ＬＬＯ、ＡｃｔＡ、ＰＥＳＴ様配列、およびその断片との融合は、種々の発現系において抗原の細胞媒介性の免疫原性を高める。一実施形態では、発現系はウイルス性であり、別の実施形態では、発現系は細菌性である。別の実施形態では、非ＶＥＧＦＲ２ペプチドは、当該技術分野において既知である任意の他の免疫原性の非ＶＥＧＦＲ２ペプチドである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０６】
一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドは、リステリオリシン（ＬＬＯ）ペプチドである。一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドは、非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）ポリペプチドである。一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドは、ＡｃｔＡポリペプチドである。一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドは、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチドである。一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドは、ＰＥＳＴ様配列からなる。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の組成物および方法における使用のための血管新生因子は、ＨＭＷＭＡＡであり、一実施形態では、それは、２００７年８月１５日に出願された米国特許出願第１１／８８９，７１５号および２００８年１０月３日に出願された米国特許出願第１２／２４４，８２８号に記載される（参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる）。
【０１０８】
本発明の方法および組成物のＬＬＯオリゴペプチドは、別の実施形態では、非溶血性ＬＬＯオリゴペプチドである。別の実施形態では、オリゴペプチドはＬＬＯ断片である。別
の実施形態では、オリゴペプチドは完全なＬＬＯタンパク質である。別の実施形態では、オリゴペプチドは、当該技術分野において既知である任意のＬＬＯタンパク質またはその断片である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０９】
一実施形態では、ＬＬＯタンパク質は、ファゴリソソームの溶解に関与するＬｍの主要な病原性因子である。一実施形態では、ＬＬＯは高度に免疫原性であり、別の実施形態では、ＬＬＯは、抗原特異的Ｔ細胞をＴｈ１細胞内に誘導し、別の実施形態では、ＬＬＯは、Ｔ細胞によるインターフェロンγの分泌を誘導する。
【０１１０】
一実施形態では、ＬＬＯ断片は、コレステロール結合ドメインに突然変異を含むか、またはコレステロール結合ドメイン内に欠失を含むか、またはコレステロール結合ドメインの欠失を含み、一実施形態では、それはＬＬＯを非溶血性にする。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、化学的処理によって非溶血性にされる。別の実施形態では、化学的処理は、グルタルアルデヒドを含む。別の実施形態では、化学的処理は、同様に作用する化合物を含む。別の実施形態では、化学的処理は、当該技術分野において既知である任意の他の好適な化合物を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明のワクチンを構築するために利用されるＬＬＯタンパク質は、以下の配列を有する：
ｍｋｋｉｍｌｖｆｉｔｌｉｌｖｓｌｐｉａｑｑｔｅａｋｄａｓａｆｎｋｅｎｓｉｓｓｍａｐｐａｓｐｐａｓｐｋｔｐｉｅｋｋｈａｄｅｉｄｋｙｉｑｇｌｄｙｎｋｎｎｖｌｖｙｈｇｄａｖｔｎｖｐｐｒｋｇｙｋｄｇｎｅｙｉｖｖｅｋｋｋｋｓｉｎｑｎｎａｄｉｑｖｖｎａｉｓｓｌｔｙｐｇａｌｖｋａｎｓｅｌｖｅｎｑｐｄｖｌｐｖｋｒｄｓｌｔｌｓｉｄｌｐｇｍｔｎｑｄｎｋｉｖｖｋｎａｔｋｓｎｖｎｎａｖｎｔｌｖｅｒｗｎｅｋｙａｑａｙｐｎｖｓａｋｉｄｙｄｄｅｍａｙｓｅｓｑｌｉａｋｆｇｔａｆｋａｖｎｎｓｌｎｖｎｆｇａｉｓｅｇｋｍｑｅｅｖｉｓｆｋｑｉｙｙｎｖｎｖｎｅｐｔｒｐｓｒｆｆｇｋａｖｔｋｅｑｌｑａｌｇｖｎａｅｎｐｐａｙｉｓｓｖａｙｇｒｑｖｙｌｋｌｓｔｎｓｈｓｔｋｖｋａａｆｄａａｖｓｇｋｓｖｓｇｄｖｅｌｔｎｉｉｋｎｓｓｆｋａｖｉｙｇｇｓａｋｄｅｖｑｉｉｄｇｎｌｇｄｌｒｄｉｌｋｋｇａｔｆｎｒｅｔｐｇｖｐｉａｙｔｔｎｆｌｋｄｎｅｌａｖｉｋｎｎｓｅｙｉｅｔｔｓｋａｙｔｄｇｋｉｎｉｄｈｓｇｇｙｖａｑｆｎｉｓｗｄｅｖｎｙｄｐｅｇｎｅｉｖｑｈｋｎｗｓｅｎｎｋｓｋｌａｈｆｔｓｓｉｙｌｐｇｎａｒｎｉｎｖｙａｋｅｃｔｇｌａｗｅｗｗｒｔｖｉｄｄｒｎｌｐｌｖｋｎｒｎｉｓｉｗｇｔｔｌｙｐｋｙｓｎｋｖｄｎｐｉｅ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｐ１３１２８、配列番号８、核酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｘ１５１２７に記載される）。一実施形態では、この配列に対応するプロタンパク質の最初の２５個のアミノ酸はシグナル配列であり、細菌によって分泌されるとＬＬＯから切断される。したがって、この実施形態によれば、完全長の活性ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、上記配列は、本発明のワクチンに組み込まれるＬＬＯ断片の源として使用される。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号８の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号８の変異型である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号８の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号８のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１２】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質断片が、本発明の組成物および方法において利用される。別の実施形態では、ＬＬＯ断片はＮ末端断片である。別の実施形態では、Ｎ末端ＬＬＯ断片は、次の配列を有する：
ｍｋｋｉｍｌｖｆｉｔｌｉｌｖｓｌｐｉａｑｑｔｅａｋｄａｓａｆｎｋｅｎｓｉｓｓｖａｐｐａｓｐｐａｓｐｋｔｐｉｅｋｋｈａｄｅｉｄｋｙｉｑｇｌｄｙｎｋｎｎｖｌｖｙｈｇｄａｖｔｎｖｐｐｒｋｇｙｋｄｇｎｅｙｉｖｖｅｋｋｋｋｓｉｎｑｎｎａｄｉｑｖｖｎａｉｓｓｌｔｙｐｇａｌｖｋａｎｓｅｌｖｅｎｑｐｄｖｌｐｖｋｒｄｓｌｔｌｓｉｄｌｐ
ｇｍｔｎｑｄｎｋｉｖｖｋｎａｔｋｓｎｖｎｎａｖｎｔｌｖｅｒｗｎｅｋｙａｑａｙｓｎｖｓａｋｉｄｙｄｄｅｍａｙｓｅｓｑｌｉａｋｆｇｔａｆｋａｖｎｎｓｌｎｖｎｆｇａｉｓｅｇｋｍｑｅｅｖｉｓｆｋｑｉｙｙｎｖｎｖｎｅｐｔｒｐｓｒｆｆｇｋａｖｔｋｅｑｌｑａｌｇｖｎａｅｎｐｐａｙｉｓｓｖａｙｇｒｑｖｙｌｋｌｓｔｎｓｈｓｔｋｖｋａａｆｄａａｖｓｇｋｓｖｓｇｄｖｅｌｔｎｉｉｋｎｓｓｆｋａｖｉｙｇｇｓａｋｄｅｖｑｉｉｄｇｎｌｇｄｌｒｄｉｌｋｋｇａｔｆｎｒｅｔｐｇｖｐｉａｙｔｔｎｆｌｋｄｎｅｌａｖｉｋｎｎｓｅｙｉｅｔｔｓｋａｙｔｄｇｋｉｎｉｄｈｓｇｇｙｖａｑｆｎｉｓｗｄｅｖｎｙｄ（配列番号９）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号９に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号９の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号９の変異型である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号９の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号９のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１３】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は以下の配列を有する：
ｍｋｋｉｍｌｖｆｉｔｌｉｌｖｓｌｐｉａｑｑｔｅａｋｄａｓａｆｎｋｅｎｓｉｓｓｖａｐｐａｓｐｐａｓｐｋｔｐｉｅｋｋｈａｄｅｉｄｋｙｉｑｇｌｄｙｎｋｎｎｖｌｖｙｈｇｄａｖｔｎｖｐｐｒｋｇｙｋｄｇｎｅｙｉｖｖｅｋｋｋｋｓｉｎｑｎｎａｄｉｑｖｖｎａｉｓｓｌｔｙｐｇａｌｖｋａｎｓｅｌｖｅｎｑｐｄｖｌｐｖｋｒｄｓｌｔｌｓｉｄｌｐｇｍｔｎｑｄｎｋｉｖｖｋｎａｔｋｓｎｖｎｎａｖｎｔｌｖｅｒｗｎｅｋｙａｑａｙｓｎｖｓａｋｉｄｙｄｄｅｍａｙｓｅｓｑｌｉａｋｆｇｔａｆｋａｖｎｎｓｌｎｖｎｆｇａｉｓｅｇｋｍｑｅｅｖｉｓｆｋｑｉｙｙｎｖｎｖｎｅｐｔｒｐｓｒｆｆｇｋａｖｔｋｅｑｌｑａｌｇｖｎａｅｎｐｐａｙｉｓｓｖａｙｇｒｑｖｙｌｋｌｓｔｎｓｈｓｔｋｖｋａａｆｄａａｖｓｇｋｓｖｓｇｄｖｅｌｔｎｉｉｋｎｓｓｆｋａｖｉｙｇｇｓａｋｄｅｖｑｉｉｄｇｎｌｇｄｌｒｄｉｌｋｋｇａｔｆｎｒｅｔｐｇｖｐｉａｙｔｔｎｆｌｋｄｎｅｌａｖｉｋｎｎｓｅｙｉｅｔｔｓｋａｙｔｄ（配列番号１０）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号１０に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号１０の相同体である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号１０の変異型である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号１０の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯのアミノ酸配列は、配列番号１０のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法のＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様ドメインを含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片は、組成物の一部として、または本発明の方法において利用される。
【０１１５】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、カルボキシ末端に活性化ドメインを含有しない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、４８４番目のシステインを含まない。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は非溶血性断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または突然変異によって非溶血性になる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４の欠失または突然変異によって非溶血性になる。別の実施形態では、ＬＬＯ配列は、別の位置における欠失または突然変異によって非溶血性になる。
【０１１６】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の約４４１個のアミノ酸からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、５２９個のアミノ酸の完全長ＬＬＯタンパク質の最初の約４００〜４４１個のアミノ酸からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質の１〜４４１番目のアミノ酸に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯの最初の約４２０個のアミノ酸からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質の１〜４２０番目のアミ
ノ酸に対応する。別の実施形態においてＬＬＯ断片は、ＬＬＯの約２０〜４４２番目のアミノ酸からなる。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、本明細書に開示されるＬＬＯタンパク質の２０〜４４２番目のアミノ酸に対応する。別の実施形態では、４８４番目のシステインを含む活性化ドメインを有さない、特に４８４番目のシステインを有さない、任意のΔＬＬＯが本発明の方法および組成物に好適である。
【０１１７】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４００個のアミノ酸に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の３００個のアミノ酸に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の２００個のアミノ酸に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の１００個のアミノ酸に対応する。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の５０個のアミノ酸に対応し、一実施形態では、１つ以上のＰＥＳＴ様配列を含む。
【０１１８】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、上記アミノ酸の範囲のうちの１つに対応する相同性ＬＬＯタンパク質の残基を含有する。別の実施形態では、残基数は、上で列挙した残基数に正確に対応する必要はない（例えば、本明細書において利用されるＬＬＯタンパク質に対して、相同性ＬＬＯタンパク質が挿入または欠失を有する場合）。
【０１１９】
各ＬＬＯタンパク質およびＬＬＯ断片は、本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、ストレプトリジンＯ、パーフリンゴリジンＯ、ニューモリシン等またはそれらの断片等の既知のリシンを含む他の種に由来するＬＬＯの相同体は、非ＶＥＧＦＲ２として使用され得る。
【０１２０】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片がＶＥＧＦＲ２断片に融合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は以下の配列を有する：
ＭＲＡＭＭＶＶＦＩＴＡＮＣＩＴＩＮＰＤＩＩＦＡＡＴＤＳＥＤＳＳＬＮＴＤＥＷＥＥＥＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲＹＥＴＡＲＥＶＳＳＲＤＩＫＥＬＥＫＳＮＫＶＲＮＴＮＫＡＤＬＩＡＭＬＫＥＫＡＥＫＧＰＮＩＮＮＮＮＳＥＱＴＥＮＡＡＩＮＥＥＡＳＧＡＤＲＰＡＩＱＶＥＲＲＨＰＧＬＰＳＤＳＡＡＥＩＫＫＲＲＫＡＩＡＳＳＤＳＥＬＥＳＬＴＹＰＤＫＰＴＫＶＮＫＫＫＶＡＫＥＳＶＡＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＳＰＱＰＬＫＡＮＱＱＰＦＦＰＫＶＦＫＫＩＫＤＡＧＫＷＶＲＤＫＩＤＥＮＰＥＶＫＫＡＩＶＤＫＳＡＧＬＩＤＱＬＬＴＫＫＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲＬＡＬＰＥＴＰＭＬＬＧＦＮＡＰＡＴＳＥＰＳＳＦＥＦＰＰＰＰＴＥＤＥＬＥＩＩＲＥＴＡＳＳＬＤＳＳＦＴＲＧＤＬＡＳＬＲＮＡＩＮＲＨＳＱＮＦＳＤＦＰＰＩＰＴＥＥＥＬＮＧＲＧＧＲＰ（配列番号１１）。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡのアミノ酸配列は、配列番号１１に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡのアミノ酸配列は、配列番号１１の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡのアミノ酸配列は、配列番号１１の変異型である。別の実施形態では、ＡｃｔＡのアミノ酸配列は、配列番号１１の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡのアミノ酸配列は、配列番号１１のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、以下の配列を含む組換えヌクレオチドによってコードされる：
ａｔｇｃｇｔｇｃｇａｔｇａｔｇｇｔｇｇｔｔｔｔｃａｔｔａｃｔｇｃｃａａｔｔｇｃａｔｔａｃｇａｔｔａａｃｃｃｃｇａｃａｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇｃｇａｃａｇａｔａｇｃｇａａｇａｔｔｃｔａｇｔｃｔａａａｃａｃａｇａｔｇａａｔｇｇｇａａｇａａｇａａａａａａｃａｇａａｇａｇｃａａｃｃａａｇｃｇａｇｇｔａａａｔａｃｇｇｇａｃｃａａｇａｔａｃｇａａａｃｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｔａａｇｔｔｃａｃｇｔｇａｔａｔｔａ
ａａｇａａｃｔａｇａａａａａｔｃｇａａｔａａａｇｔｇａｇａａａｔａｃｇａａｃａａａｇｃａｇａｃｃｔａａｔａｇｃａａｔｇｔｔｇａａａｇａａａａａｇｃａｇａａａａａｇｇｔｃｃａａａｔａｔｃａａｔａａｔａａｃａａｃａｇｔｇａａｃａａａｃｔｇａｇａａｔｇｃｇｇｃｔａｔａａａｔｇａａｇａｇｇｃｔｔｃａｇｇａｇｃｃｇａｃｃｇａｃｃａｇｃｔａｔａｃａａｇｔｇｇａｇｃｇｔｃｇｔｃａｔｃｃａｇｇａｔｔｇｃｃａｔｃｇｇａｔａｇｃｇｃａｇｃｇｇａａａｔｔａａａａａａａｇａａｇｇａａａｇｃｃａｔａｇｃａｔｃａｔｃｇｇａｔａｇｔｇａｇｃｔｔｇａａａｇｃｃｔｔａｃｔｔａｔｃｃｇｇａｔａａａｃｃａａｃａａａａｇｔａａａｔａａｇａａａａａａｇｔｇｇｃｇａａａｇａｇｔｃａｇｔｔｇｃｇｇａｔｇｃｔｔｃｔｇａａａｇｔｇａｃｔｔａｇａｔｔｃｔａｇｃａｔｇｃａｇｔｃａｇｃａｇａｔｇａｇｔｃｔｔｃａｃｃａｃａａｃｃｔｔｔａａａａｇｃａａａｃｃａａｃａａｃｃａｔｔｔｔｔｃｃｃｔａａａｇｔａｔｔｔａａａａａａａｔａａａａｇａｔｇｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｇｔａｃｇｔｇａｔａａａａｔｃｇａｃｇａａａａｔｃｃｔｇａａｇｔａａａｇａａａｇｃｇａｔｔｇｔｔｇａｔａａａａｇｔｇｃａｇｇｇｔｔａａｔｔｇａｃｃａａｔｔａｔｔａａｃｃａａａａａｇａａａａｇｔｇａａｇａｇｇｔａａａｔｇｃｔｔｃｇｇａｃｔｔｃｃｃｇｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃａｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃａｇａａｃｃｇａｇｃｔｃａｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃａｃｃａｃｃｔａｃｇｇａｔｇａａｇａｇｔｔａａｇａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｃｃａｇａｇａｃｇｃｃａａｔｇｃｔｔｃｔｔｇｇｔｔｔｔａａｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔａｃａｔｃｇｇａａｃｃｇａｇｃｔｃｇｔｔｃｇａａｔｔｔｃｃａｃｃｇｃｃｔｃｃａａｃａｇａａｇａｔｇａａｃｔａｇａａａｔｃａｔｃｃｇｇｇａａａｃａｇｃａｔｃｃｔｃｇｃｔａｇａｔｔｃｔａｇｔｔｔｔａｃａａｇａｇｇｇｇａｔｔｔａｇｃｔａｇｔｔｔｇａｇａａａｔｇｃｔａｔｔａａｔｃｇｃｃａｔａｇｔｃａａａａｔｔｔｃｔｃｔｇａｔｔｔｃｃｃａｃｃａａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａａｇａｇｔｔｇａａｃｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔａｇａｃｃａ（配列番号１２）。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、配列番号１２に記載される配列を有する。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードする本発明の方法および組成物のヌクレオチドは、配列番号１２に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号１２の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号１２の変異型である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号１２の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、配列番号１２のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２２】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、ＶＥＧＦＲ２断片に融合される。別の実施形態では、ＡｃｔＡタンパク質の断片は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＦ０４７６２に記載される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＦ０４７６２に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＦ０４７６２の相同体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＦ０４７６２の変異型である。別の実施形態では、ＡｃｔＡのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＦ０４７６２の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＦ０４７６２のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２３】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１０３８０７に記載される配列を含む組換えヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１０３８０７に記載される配列を有する。別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１０３８０７に記載される配列を含む。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１０３８０７の相同
体である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１０３８０７の変異型である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１０３８０７の断片である。別の実施形態では、ＡｃｔＡをコードするヌクレオチドは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ１０３８０７のアイソフォームである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２４】
別の実施形態では、ＡｃｔＡ断片は、当該技術分野において既知である任意の他のＡｃｔＡ断片である。別の実施形態では、本発明の組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質の断片をコードする任意の他の配列を含む。別の実施形態では、組換えヌクレオチドは、ＡｃｔＡタンパク質全体をコードする任意の他の配列を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２５】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列は、ＶＥＧＦＲ２断片に融合される。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号１３）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号１４）である。別の実施形態では、本明細書に列挙されるＰＥＳＴ様アミノ酸配列のうちの１つを含む任意のＬＬＯ配列への抗原の融合は、ＶＥＧＦＲ２に対する細胞媒介性免疫を高めることができる。
【０１２６】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ様アミノ酸配列は、リステリアＡｃｔＡタンパク質由来のＰＥＳＴ様配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＫＴＥＥＱＰＳＥＶＮＴＧＰＲ（配列番号１５）、ＫＡＳＶＴＤＴＳＥＧＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号１６）、ＫＮＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号１７）、またはＲＧＧＩＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号１８）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、本明細書において上述したＰＥＳＴ様配列の変異型であり、一実施形態では、それは、当業者に理解されるように、ＫＥＳＶＶＤＡＳＥＳＤＬＤＳＳＭＱＳＡＤＥＳＴＰＱＰＬＫ（配列番号１９）、ＫＳＥＥＶＮＡＳＤＦＰＰＰＰＴＤＥＥＬＲ（配列番号２０）、またはＲＧＧＲＰＴＳＥＥＦＳＳＬＮＳＧＤＦＴＤＤＥＮＳＥＴＴＥＥＥＩＤＲ（配列番号２１）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ｌｓｏ遺伝子によってコードされるリステリア・ゼーリゲリ細胞溶解素に由来する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（配列番号２２）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス種のストレプトリジンＯタンパク質に由来する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・ピオゲネスのストレプトリジンＯに由来し、例えば、３５〜５１番目のアミノ酸のＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号２３）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ストレプトコッカス・エクイシミリスのストレプトリジンＯに由来し、例えば、３８〜５４番目のアミノ酸のＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号２４）である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、原核生物由来タンパク質に由来する別のＰＥＳＴ様アミノ酸配列であり、それは、一実施形態においてＡｃｔＡタンパク質であり、別の実施形態において細胞溶解素タンパク質であり、一実施形態においてリステリオリジンであり、別の実施形態においてストレプトリジンである。
【０１２７】
ＰＥＳＴ様配列の同定は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  Ｓ
ｅｔ  ａｌ（Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｔｏ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｄｅｇｒａｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｔｈｅ  ＰＥＳＴ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ（ＰＥＳＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １９９６；２１（７）：２６７−７１）に記載される。「ＰＥＳＴ様配列」は、別の実施
形態では、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）残基に富む領域を指す。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、正電荷を帯びたいくつかのアミノ酸を含有する１つ以上のクラスターの側面に位置する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、該配列を含有するタンパク質の急速な細胞内分解を媒介する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．に開示されるアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に開示されるアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、１つ以上の内部リン酸化部位を含有し、これらの部位におけるリン酸化は、タンパク質分解に先行する。
【０１２８】
一実施形態では、原核生物のＰＥＳＴ様配列は、例えば、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓｎｏによって記載されるＬＭに関する方法（１９９６，Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）およびＲｏｇｅｒｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３４（４７７４）：３６４−８）によって記載される方法に従って同定される。代替として、他の原核生物に由来するＰＥＳＴ様アミノ酸配列も、この方法に基づいて同定することができる。ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が含まれると予測される他の原核生物は、限定されるものではないが、他のリステリア種である。一実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．に開示されるアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に開示されるアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴ検出プログラムを使用して同定される。
【０１２９】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの同定は、特定されたタンパク質配列内の正電荷を帯びたアミノ酸であるＲ、Ｈ、およびＫの初期スキャンによって達成される。正電荷を帯びた側面間の全てのアミノ酸を数え、ウィンドウサイズパラメータ以上の多くのアミノ酸を含有するモチーフのみをさらに検討する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含まなければならない。
【０１３０】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの質は、決定的なアミノ酸の局所的な濃縮と、モチーフの疎水性とに基づくスコアリングパラメータによって改良される。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴの濃縮は、重量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、１当量のＤまたはＥ、１当量のＰ、および１当量のＳまたはＴ１について補正される。別の実施形態では、疎水性の計算は、原則としてＪ．Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｋｙｔｅ，Ｊ  ａｎｄ  Ｄｏｏｔｌｉｔｔｌｅ，ＲＦ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７，１０５（１９８２）の方法に従う。簡略化された計算のためには、本来、−４．５（アルギニン）から＋４．５（イソロイシン）の範囲であるＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性親水性指標が、以下の線形変換を用いて正の整数に変換され、それによって、０（アルギニン）から９０（イソロイシン）の値が得られる。
【０１３１】
疎水性親水性指標＝１０＊Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性親水性指標＋４５
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの潜在的な疎水性は、各アミノ酸種のモルパーセントと疎水性指標との積の和として計算される。所望のＰＥＳＴスコアは、以下の方程式によって表されるように、局所的濃縮の項と疎水性の項との組み合わせとして得られる。
【０１３２】
ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性親水性指標
別の実施形態では、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ様配列」、または「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」は、上記アルゴリズムを用いると少なくとも＋５のスコアを有するペプチドを指す。別の実施形態では、該用語は、少なくとも６のスコアを有するペプチドを指す。別の実施形態では、ペプチドは、少なくとも７のスコアを有する。別の実施形態では、スコ
アは少なくとも８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１３である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４５である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３３】
別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当該技術分野において既知である任意の他の方法またはアルゴリズム、例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ＨＭ，Ｏｃｃｈｉｕｃｃｉ  ＪＭ，Ａｌｖｅｓ  Ｊ，Ｂｅｌｉｚａｒｉｏ  ＪＥ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００５  Ｊｕｎ；２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を用いて同定される。別の実施形態では、以下の方法が使用される：
ＰＥＳＴ指標は、１の値をアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、適切な長さの各ストレッチ（例えば、３０〜３５アミノ酸のストレッチ）について計算される。ＰＥＳＴ残基の各々に対する係数値（ＣＶ）は１であり、他のアミノ酸（非ＰＥＳＴ）の各々に対する係数値は０である。
【０１３４】
ＰＥＳＴ様配列を同定するための各方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、当該技術分野において既知である任意の他のＰＥＳＴ様配列である。各ＰＥＳＴ様配列およびその種類は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３５】
「ＰＥＳＴ様配列との融合」は、別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列を含むタンパク質断片との融合を指す。別の実施形態では、該用語は、タンパク質断片がＰＥＳＴ様配列以外の周囲の配列を含む場合を含む。別の実施形態では、タンパク質断片は、ＰＥＳＴ様配列からなる。したがって、別の実施形態では、「融合物」は、それらのそれぞれの末端で連結されているか、または一方が他方の中に埋め込まれているかのいずれかである、２つのペプチドまたはタンパク質断片を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３６】
一実施形態では、本発明は、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドを提供する。
【０１３７】
一実施形態では、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、複数のペプチドサブユニットを含むアミノ酸の鎖を指し、一実施形態では、完全長タンパク質、オリゴペプチド、およびその断片を含み得、アミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結される。一実施形態では、本発明に記載されるタンパク質は、本発明のポリペプチドを含み得る。一実施形態では、タンパク質は多量体構造である。
【０１３８】
一実施形態では、「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡに由来するポリペプチドを指し、一実施形態では、自然において通常は一緒に生じないであろうＤＮＡ配列を組み合わせた合成ＤＮＡの一形態である。一実施形態では、組換えポリペプチドは、遺伝子操作または遺伝子組み換え型ポリペプチドと称され得る。
【０１３９】
用語「天然」または「天然配列」は、自然に生じるポリペプチドと同じアミノ配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチドは、本発明によれば、その調製様式にかかわらず「天然」であると見なされる。したがって、そのような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することができるか、または組換えおよび／もしくは合成手段により生成することもできる。用語「天然」または「天然配列」は、自然に生じる切断または分泌された形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異型形態（例えば、交互にスプライスされた形態）、およびポリペプチドの対立遺伝子を特に包含する。
【０１４０】
本明細書およびそれに続く実施例の項目において使用される場合、用語「ペプチド」は、天然ペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチド、または組換えペプチドのいずれか、）およびペプチド模倣体（通常は合成的に合成されたペプチドである）、例えば、ペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイド等を含み、例えば、ペプチドを体内でより安定にするか、または細菌細胞内に浸透する能力を高める修飾を有し得る。そのような修飾は、これらに限定されないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾を含み、それには、これらに限定されないが、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＣＦ＝ＣＨ、主鎖修飾、および残基修飾を含む。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、参照により、あたかも本明細書に完全に記載されるかのように組み込まれるＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に明記されている。この点に関するさらなる詳細は、本明細書において後に提供される。
【０１４１】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは、任意のアルキル、例えばメチルである）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子上に自然に存在する「正常な」側鎖である）によって置換され得る。
【０１４２】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿った結合のうちのいずれかで、さらには同時に数箇所（２〜３箇所）で起こり得る。
天然の芳香族アミノ酸、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅは、ＴＩＣ、ナフチルエラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅまたはｏ−メチル−Ｔｙｒのハロゲン化誘導体等の合成の非天然の酸で置換され得る。
【０１４３】
上記の他に、本発明のペプチドはまた、１つ以上の修飾されたアミノ酸または１つ以上の非アミノ酸単量体（例えば、脂肪酸、複合糖質等）を含み得る。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の項目において使用される場合、用語「アミノ酸（単数）」または「アミノ酸（複数）」は、２０種の自然に生じるアミノ酸を含むことを理解されたい；これらのアミノ酸は、インビボで翻訳後修飾されることが多く、例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリン、およびホスホトレオニンを含み、また、他の非
通常型アミノ酸は、２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシン、およびオルニチンを含むが、これらに限定されない。さらに、用語「アミノ酸」は、Ｄアミノ酸およびＬアミノ酸の両方を含む。
【０１４４】
本発明とともに使用することができる自然に生じるアミノ酸および非従来型または修飾されたアミノ酸は、当該技術分野において周知である。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、別途明示されない限り、アミノ酸のＤまたはＬ立体異性体形態のいずれかを指す。また、例えば、精製された野生型腫瘍抑制タンパク質の生物学的活性を有する同等なタンパク質または同等なペプチドも、本発明の範囲内に包含される。「同等なタンパク質」および「同等なポリペプチド」は、自然に生じるタンパク質またはポリペプチドの線形配列から逸脱するが、その生物学的活性を変化させないアミノ酸置換を有する化合物を指す。これらの同等物は、１つ以上のアミノ酸が関連アミノ酸、例えば、同様の電荷を帯びたアミノ酸、または側鎖もしくは官能基の置換もしくは修飾によって置換されている点において天然配列とは異なり得る。
【０１４５】
本発明のポリペプチドは、任意のサイズであり得る。予測され得るように、ポリペプチドは、多様な分子量を示すことができ、あるものは１５０〜２００キロダルトン（ｋＤ）を超える。通常、ポリペプチドは、約５，０００〜約１００，０００ダルトンの範囲の分子量を有し得る。さらに他のポリペプチドは、例えば、約１０，０００〜約７５，０００ダルトン、または約２０，０００〜約５０，０００ダルトンの狭い範囲に分類され得る。一実施形態では、ポリペプチドは、１９〜５１ｋＤの分子量を有する。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、２９８個のアミノ酸である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、３９６個のアミノ酸である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、３０１個のアミノ酸である。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、２５０〜４５０アミノ酸残基長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、２００〜５００アミノ酸残基長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、２７５〜４２５アミノ酸残基長である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、１００〜６００アミノ酸残基長である。
【０１４６】
一実施形態では、「変異型」は、大多数の集団とは異なるが、それらのうちの１つであると考えられる一般的な様式になおも十分に類似するアミノ酸もしくは核酸配列（または他の実施形態では、生物もしくは組織）を指し、例えば、スプライス変異型である。一実施形態では、変異型は配列保存変異型であり得、別の実施形態では、変異型は機能保存変異型であり得る。一実施形態では、変異型は、１個のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含み得る。一実施形態では、変異型は、２個のアミノ酸の付加、欠失、置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、変異型は、３個のアミノ酸の付加、欠失、もしく置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、変異型は、４個のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、変異型は、５個のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、変異型は、７個のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、変異型は、１０個のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、変異型は、２〜１５個のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、変異型は、３〜２０個のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。一実施形態では、変異型は、４〜２５個のアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１４７】
本明細書の組成物および方法において、アミノ酸配列変異型を使用することができる。一実施形態では、アミノ酸配列変異型は、好適な組換え宿主細胞において基礎となるＤＮＡ配列を発現させることによって、または、上述したように、所望のポリペプチドのイン
ビトロ合成によって生成することができる。ポリペプチド変異型をコードする核酸配列は、一実施形態では、対応する天然（例えば、ヒト）ポリペプチドをコードする核酸配列の部位特異的変異誘発によって調製される。別の実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を用いた部位特異的変異誘発（例えば、１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４，６８３，１９５、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９９１）が使用される。他の部位特異的変異誘発技術もまた、当該技術分野において周知であり、例えば、以下の刊行物に記載されている：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）、Ｚｏｌｌｅｒ＆Ｓｍｉｔｈ，ＤＮＡ  ３：４７９−４８８（１９８４）、Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７）、Ｂｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：４６４２−４６４６（１９８４）、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３（１９８５）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−８２（１９８７），Ａｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ２：１８３（１９８３）、およびＣａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）。カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５［１９８５］）、および制限選択変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５［１９８６］）もまた使用され得る。
【０１４８】
１個より多いアミノ酸置換を有するアミノ酸配列変異型は、いくつかの様式のうちの１つにおいて作製することができる。ポリペプチド鎖においてアミノ酸が一緒に近接して位置する場合、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドを使用して、それらを同時に変異させることができる。しかしながら、アミノ酸が互いからある程度距離をおいて位置する（例えば、１０個より多くのアミノ酸によって隔てられている）場合、所望の変化の全てをコードする単一のオリゴヌクレオチドを作製することはより困難である。代わりに、２つの代替方法のうちの１つを利用することができる。第１の方法では、置換されるべき各アミノ酸に対して別個のオリゴヌクレオチドが作製される。次いで、オリゴヌクレオチドは、一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニーリングされ、該鋳型から合成されるＤＮＡの第２の鎖が、所望のアミノ酸置換の全てをコードする。代替の方法は、所望の変異型を産生するために２ラウンド以上の変異誘発を含む。
【０１４９】
また本発明のポリペプチドは、例えば、国際特許公開ＰＣＴ  ＷＯ９２／０９３００に開示されるコンビナトリアルペプチドライブラリ法によって調製することもできる。この方法は、所与の規定の配列の変異型である複数の分子を調製および分析するために特に好適であり、したがって、改良された生物学的性質を有するポリペプチドを同定するのに特に有用であり、ひいては、組換えＤＮＡ技術および／または化学分析を含む当該技術分野において既知である任意の技術によって生成することができる。
【０１５０】
ペプチドワクチンを調製するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＥＰ１４０８０４８、米国特許出願番号第２００７０１５４９５３号、およびＯＧＡＳＡＷＡＲＡ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．８９，ｐｐ．８９９５−８９９９，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９９２）に記載される。一実施形態では、より高い免疫原性を有する抗原を作製するためにペプチド進化技術が使用される。ペプチドの進化のための技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第６７７３９００号に記載される。
【０１５１】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、適切な配列をサブクローン化し、続いて、得られたヌクレオチドを発現させることを含むプロセスによって調製される。別の実施形態では、サブ配列がクローン化され、適切な制限酵素を使用して適切なサブ配列が切断される。次いで、別の実施形態では、所望のＤＮＡ配列を生成するために断片が連結される。別の実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して生成される。最初に、新しい末端のいずれかの側の天然ＤＮＡのセグメントが別々に増幅される。一方の増幅配列の５’末端はペプチドリンカーをコードし、他方の増幅配列の３’末端もまたペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５’末端は第２の断片の３’末端に相補的であるため、２つの断片（例えば、ＬＭＰアガロース上での部分的な精製後）を３回目のＰＣＲ反応において重複する鋳型として使用することができる。増幅配列は、コドン、開放部位のカルボキシ側のセグメント（アミノ配列を形成している）、リンカー、および開放部位のアミノ側の配列（カルボキシル配列を形成している）を含有する。次いで、プラスミド内に挿入断片が連結される。別の実施形態では、同様のストラテジーを用いて、ＶＥＧＦＲ２断片が異種ペプチド内に埋め込まれたタンパク質が生成される。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組換えポリペプチドは、シグナル配列を含む。別の実施形態では、シグナル配列は、ワクチンのベクターを構築するために使用される生物に由来する。別の実施形態では、シグナル配列はＬＬＯシグナル配列である。別の実施形態では、シグナル配列はＡｃｔＡシグナル配列である。別の実施形態では、シグナル配列はリステリアのシグナル配列である。別の実施形態では、シグナル配列は、当該技術分野において既知である任意の他のシグナル配列である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドを提供する。一実施形態では、組換えポリペプチドは、本発明の組換えポリペプチドと少なくとも８５％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、組換えポリペプチドは、本発明の組換えポリペプチドと少なくとも９０％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、組換えポリペプチドは、本発明の組換えポリペプチドと少なくとも９５％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、組換えポリペプチドは、本発明の組換えポリペプチドと少なくとも９７％の相同性を共有する配列を含む。別の実施形態では、組換えポリペプチドは、本発明の組換えポリペプチドと少なくとも９９％の相同性を共有する配列を含む。
【０１５４】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物は、組換えキメラポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合体を含むキメラ分子を利用する。他の実施形態では、エピトープタグは、タンパク質のアミノ末端もしくはカルボキシ末端、またはその内部の位置に配置される。別の実施形態では、タグポリペプチドに対する抗体を使用して、キメラポリペプチドのそのようなエピトープタグ化形態の存在が検出される。別の実施形態では、エピトープタグを包含することにより、抗タグ抗体、またはエピトープタグに結合する別の種類の親和性マトリックスを使用した親和性精製によって、組換えキメラポリペプチドが容易に精製できる。種々のタグポリペプチドおよびそれらのそれぞれの抗体は、当該技術分野において既知である。例として、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ、ｆｌｕ  ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５（１９８８））、ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５））、ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ
．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド（Ｈｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８））、ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２））、チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１））、およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０））を含む。融合タンパク質を構築するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＬａＲｏｃｈｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１３９（２）：３５７−６６（１９９５）、Ｈｅｉｄａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９（１）：１４０−５（１９９５）、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０（２−３）：２１９−２７（１９９３）、およびＣｈｅｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９１（３）：９８９−９３（１９９４）に記載される。
【０１５５】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、本明細書に列挙されるペプチドと相同である
。用語「相同性」、「相同の」等は、任意のタンパク質またはペプチドに関する場合、一実施形態では、必要に応じて、最大パーセントの相同性を達成するために配列をアラインさせて間隙（ギャップ）を導入した後に、対応する天然ポリペプチドの残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合を指し、配列同一性の一部としての保存的置換を一切考慮しない。アラインメントのための方法およびコンピュータプログラムは、当該技術分野において周知である。
【０１５６】
相同性は、別の実施形態では、当該技術分野において十分に記載されている方法を用いた配列アラインメントのためのコンピュータアルゴリズムによって決定される。例えば、核酸配列相同性のコンピュータアルゴリズム分析は、任意の数の利用可能なソフトウェアパッケージ、例えばＢＬＡＳＴ、ＤＯＭＡＩＮ、ＢＥＡＵＴＹ（ＢＬＡＳＴ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｕｔｉｌｉｔｙ）、ＧＥＮＰＥＰＴ、およびＴＲＥＭＢＬ等のパッケージを含むことができる。
【０１５７】
別の実施形態では、「相同性」または「相同の」は、第２の配列と７０％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と７２％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と７５％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と７８％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と８０％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と８２％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と８３％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と８５％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と８７％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と８８％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と９０％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と９２％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と９３％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と９５％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と９６％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と９７％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列と９８％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配
列と９９％を超える同一性を共有する配列を指す。別の実施形態では、「相同性」は、第２の配列に対する１００％の同一性を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５８】
別の実施形態では、相同性は、候補配列ハイブリダイゼーションの決定により決定され、その方法は、当該技術分野において十分に記載されている（例えば、「Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，Ｅｄｓ．（１９８５）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙを参照のこと）。他の実施形態では、ハイブリダイゼーションの方法は、天然カスパーゼペプチドをコードするＤＮＡの補体に対する中程度からストリンジェントな条件下で実行される。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、１０〜２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性断片化サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃で一晩インキュベーションすることである。
【０１５９】
本明細書に列挙される任意のアミノ酸配列に対するタンパク質および／またはペプチドの相同性は、別の実施形態では、免疫ブロット解析を含む当該技術分野において十分に記載されている方法によって、または確立された方法による、任意の数の利用可能なソフトウェアパッケージを用いたアミノ酸配列のコンピュータアルゴリズム解析によって、決定される。これらのパッケージのうちのいくつかは、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージを含み、別の実施形態では、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、および／または分析用の広範囲／局所的もしくはＢＬＯＣＫＳアラインメントの使用を用いる。相同性を決定する各方法は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１６０】
一実施形態では、「変異型」は、別のペプチドまたはタンパク質とはわずかに異なるペプチドまたはタンパク質であり、一実施形態では、それは、ペプチドまたはタンパク質の機能に影響を与えない領域における突然変異を指し、別の実施形態では、ペプチドまたはタンパク質の機能に影響を与えない保存的突然変異を指す。
【０１６１】
一実施形態では、「アイソフォーム」は、分子、例えばタンパク質の異なる型であり、同じタンパク質の別のアイソフォームとごくわずかに異なる。一実施形態では、アイソフォームは、異なるが関連する遺伝子から生成することができ、または別の実施形態では、交互スプライシングによって同じ遺伝子から生じ得る。別の実施形態では、アイソフォームは、単一のヌクレオチド多型によってもたらされる。
【０１６２】
一実施形態では、ポリペプチドの断片（一実施形態においてＦｌｋ１断片である）は、その生物学的活性を維持する。一実施形態では、例えば、ＡｃｔＡ、ＬＬＯ、またはＰＥＳＴ様配列の非ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドの断片は、それが融合する抗原またはポリペプチドの免疫原性を高める能力を維持する。別の実施形態では、例えば、ＡｃｔＡ、ＬＬＯ、またはＰＥＳＴ様配列の非ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドの断片は、宿主細胞のファゴソームを溶解する能力、もしくは別の実施形態では、宿主アクチンを重合する能力を維持し、別の実施形態では、タンパク分解性信号としての役割を果たす。
【０１６３】
一実施形態では、「免疫原性の」は、物質（一実施形態では、抗原である）が免疫応答
を誘導する能力を指す。
一実施形態では、「宿主細胞」は、本発明の任意のベクターのレシピエントとなることができるか、またはレシピエントとなってきた個別の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の子孫を含み、該子孫は、自然的、偶然的、または意図的な突然変異および／もしくは変化に起因して、元の親細胞と（形態または全ＤＮＡ相補体において）必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明の核酸を含むベクターで、インビボまたはインビトロで形質転換または感染された細胞を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法のまたは本発明の方法における使用のためのポリペプチドもしくは核酸のうちのいずれかは、ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドもしくは断片、または上記ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドもしくは断片をコードした単離された核酸を、本明細書に記載される任意の形態または実施形態で含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法のまたは本発明の方法における使用のためのポリペプチドもしくは核酸のうちのいずれかは、本明細書に記載される任意の形態または実施形態のＶＥＧＦＲ２ポリペプチドもしくは断片、または本明細書の上記ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドもしくは断片をコードする単離された核酸からなる。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドまたは核酸は、本明細書に記載される任意の形態または実施形態のＶＥＧＦＲ２ポリペプチドもしくは断片、または本発明の上記構成成分をコードした単離された核酸から本質的になる。いくつかの実施形態では、用語「含む」は、他の断片、他の抗体、追加のポリペプチドの包含、および当該技術分野において既知であり得る他のタンパク質の包含を指す。いくつかの実施形態では、用語「本質的に〜からなる」は、特異的なＶＥＧＦＲ２ポリペプチドまたは断片を有するポリペプチドまたは核酸を指す。しかしながら、毒素の利用に直接関与していない他のペプチドが含まれてもよい。いくつかの実施形態では、用語「〜からなる」は、本明細書に記載される任意の形態または実施形態の本発明の特異的ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドまたは断片を有する毒素を指す。それらの各々が、本発明の別個の実施形態と見なされる。
【０１６５】
別の実施形態では、本発明は、対象において抗ＶＥＧＦＲ２免疫応答を誘導する方法であって、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１６６】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１６７】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１６８】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、腫瘍の再発を予防する血管新生因子を発現する組換えリステリア株の有効性は、図４に示される。
【０１６９】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、血管新生因子を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、ＰＥＳＴ様配
列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチドを含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７１】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７４】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された組換えポリペプチド血管新生因子をコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７５】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子をコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７６】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子をコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７７】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管新生因子を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７８】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１８０】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１８１】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、血管内皮増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を発現する組換えリステリア株を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する
。
【０１８２】
別の実施形態では、本発明は、対象において抗ＶＥＧＦＲ２免疫応答を誘導する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドを含む免疫原性組成物を上記対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１８３】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドを含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１８４】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドを含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１８５】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドを含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１８６】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドを含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１８７】
別の実施形態では、本発明は、対象において抗ＶＥＧＦＲ２免疫応答を誘導する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を上記対象に投与することを含む方法を提供する。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１８９】
別の実施形態では、本発明は、対象において癌を阻害または抑制する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１９０】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の再発を予防する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１９１】
別の実施形態では、本発明は、対象において腫瘍の転移を阻害する方法であって、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結された血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥ
ＧＦＲ２）ポリペプチドまたはその免疫原性断片を含む組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む組成物を上記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１９２】
一実施形態では、本発明は、癌または腫瘍の転移を治療、阻害、または抑制する方法であって、対象がＶＥＧＦＲ２ポリペプチドに対する免疫応答を開始する本発明の組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。別の実施形態では、対象は、エピトープスプレッディングを介して腫瘍によって発現される腫瘍抗原に対する免疫応答を開始する。
【０１９３】
一実施形態では、本発明の組成物および方法は、ヒト対象における使用のためのものであり、別の実施形態では、それらは哺乳類対象における使用のためである。一実施形態では、対象は動物対象であり、一実施形態では、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ等である。一実施形態では、用語「哺乳動物」または「哺乳類」は、ヒト、飼育動物および家畜、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等の動物園、競技用、またはペットの動物、ならびにマウスおよびラット等のげっ歯類等を含む、哺乳動物として分類される任意の動物を指す。一実施形態では、本発明の組成物および方法は、オスの対象において効果的である。別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、メスの対象において効果的である。
【０１９４】
一実施形態では、本発明の方法は、上述した疾患、疾病、症状、またはアレルギーもしくは喘息と関連する副作用のうちのいずれかを治療、妨害、抑制、阻害、または予防するために使用される。一実施形態では、「治療すること」は、治療的処置および防止措置または予防措置の両方を指し、その目的は、本明細書において上述した標的とする病態または疾病を予防または軽減することである。したがって、一実施形態では、治療することは、疾患、疾病、もしくは状態、またはそれらの組み合わせと関連する症状を、直接影響を及ぼすかまたは治癒すること、抑制すること、阻害すること、予防すること、その重症度を軽減すること、その発生を遅延すること、軽減することを含み得る。したがって、一実施形態では、「治療すること」は、とりわけ、進行を遅延させること、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解を増強すること、回復を早めること、退縮を誘導すること、代替の治療薬の有効性を増加させること、もしくはそれに対する耐性を低下させること、またはそれらの組み合わせを指す。一実施形態では、「予防すること」または「促進すること」は、とりわけ、症状の発生を遅延させること、疾患の再燃を予防すること、疾患の再発を予防すること、再燃エピソードの回数または頻度を減少させること、症状エピソード間の潜伏期間を延長させる、またはそれらの組み合わせを指す。一実施形態では、「抑制すること」または「阻害すること」は、とりわけ、症状の重症度を軽減すること、急性エピソードの重症度を軽減すること、症状の数を減少させること、疾患関連症状の発生率を減少させること、症状の潜伏期間を短縮すること、症状を寛解させること、二次的症状を軽減すること、二次感染を軽減すること、患者の生存期間を延長すること、またはそれらの組み合わせを指す。
【０１９５】
一実施形態では、本発明の組成物および方法は、既存の腫瘍を完全に根絶し、別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、腫瘍退縮を誘導し、別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、腫瘍の増殖を制御する。
【０１９６】
一実施形態では、症状は一次的であり、別の実施形態では、症状は二次的である。一実施形態では、「一次的」は、特定の疾患または疾病の直接的な結果である症状を指し、一実施形態では、「二次的」は、一次的原因に由来するかまたはその結果生じる症状を指す。一実施形態では、本発明における使用のための化合物は、一実施形態において乳癌である、癌に関連する一次的もしくは二次的な症状または二次的な合併症を治療する。別の実施形態では、「症状」は、疾患または病態の任意の顕性化であり得る。
【０１９７】
一実施形態では、本発明の組成物および方法は、血管新生を阻害するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、一実施形態において腫瘍の微小血管密度である、微小血管密度を減少させる。
【０１９８】
一実施形態では、本発明の組成物および方法は、癌を治療するためのものである。一実施形態では、癌は乳癌である。別の実施形態では、癌は直腸結腸癌であり、一実施形態では、それは転移性直腸結腸癌である。
【０１９９】
一実施形態では、癌はＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現する癌である。
一実施形態では、転移は、原発性腫瘍として最初に生じた位置から、体内の離れた位置に広がるプロセスである。一実施形態では、本発明の癌は乳癌の転移である。別の実施形態では、本発明の癌は、メラノーマの転移である。一実施形態では、癌の脳への転移である。別の実施形態では、癌の肺への転移である。別の実施形態では、癌の腎臓への転移である。別の実施形態では、癌の結腸への転移である。別の実施形態では、一実施形態において乳癌である癌は、乳房または乳房が存在していた領域、胸壁、リンパ節、骨、肺または肺の周辺、肝臓、脳、またはそれらの組み合わせに転移する。別の実施形態では、一実施形態においてメラノーマである癌は、皮膚（皮膚の他の領域）、皮下組織およびリンパ節、肺および肺の間の領域、肝臓、脳、骨、消化管、心臓、膵臓、副腎、腎臓、甲状腺、またはそれらの組み合わせに転移する。
【０２００】
一実施形態では、他の転移性の癌、および転移した癌が増殖する可能性のある二次器官は、当該技術分野において既知である。
一実施形態では、本発明の組成物および方法は、腫瘍を治療するためのものであり、一実施形態では、それは固形腫瘍である。一実施形態では、腫瘍はメラノーマである。別の実施形態では、腫瘍は肉腫である。別の実施形態では、腫瘍は細胞腫である。別の実施形態では、腫瘍は中皮腫（例えば、悪性中皮腫）である。別の実施形態では、腫瘍は神経膠腫である。別の実施形態では、腫瘍は胚細胞性腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は絨毛癌である。
【０２０１】
別の実施形態では、腫瘍は膵癌である。別の実施形態では、腫瘍は卵巣癌である。別の実施形態では、腫瘍は胃癌である。別の実施形態では、腫瘍は膵臓の癌性病変である。別の実施形態では、腫瘍は肺腺癌である。別の実施形態では、腫瘍は直腸結腸腺癌である。別の実施形態では、腫瘍は肺扁平上皮腺癌である。別の実施形態では、腫瘍は胃腺癌である。別の実施形態では、腫瘍は卵巣表面上皮性腫瘍（例えば、その良性、増殖性、または悪性種）である。別の実施形態では、腫瘍は口腔扁平上皮癌である。別の実施形態では、腫瘍は非小細胞肺癌である。別の実施形態では、腫瘍は子宮内膜癌である。別の実施形態では、腫瘍は膀胱癌である。別の実施形態では、腫瘍は頭頸部癌である。別の実施形態では、腫瘍は前立腺癌である。
【０２０２】
別の実施形態では、腫瘍は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。別の実施形態では、腫瘍はウィルムス腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は線維形成性小円形細胞腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は結腸癌である。別の実施形態では、腫瘍は肺癌である。別の実施形態では、腫瘍は卵巣癌である。別の実施形態では、腫瘍は子宮癌である。別の実施形態では、腫瘍は甲状腺癌である。別の実施形態では、腫瘍は肝細胞癌である。別の実施形態では、腫瘍は甲状腺癌である。別の実施形態では、腫瘍は肝癌である。別の実施形態では、腫瘍は腎癌である。別の実施形態では、腫瘍はカポジである。別の実施形態では、腫瘍はカポジ肉腫である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２０３】
別の実施形態では、腫瘍は乳癌である。一実施形態では、本発明の組成物および方法は、一実施形態において腺組織に発生する、腺癌を治療するために使用される。一実施形態
では、本発明の組成物および方法は、一実施形態において乳腺に発生し、別の実施形態において乳癌の早期形態である、腺管上皮内癌（ＤＣＩＳ）を治療するために使用される。
【０２０４】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、浸潤性腺管癌（ＩＤＣ）を治療するために使用されるが、一実施形態では、それは乳癌の最も一般的な種類であり、ＤＣＩＳから発生し、乳管壁を通って広がり、乳房組織に侵入する。別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、浸潤性小葉癌を治療するために使用されるが、一実施形態では、それは乳腺に発生し、浸潤性乳癌の１０〜１５％を占める。本発明の組成物および方法を使用して治療することができる乳癌のさらなる種類は、炎症性癌（一実施形態では、乳房組織が熱くなって赤く見え、急速に広がる傾向がある）、髄様癌（一実施形態では、乳房の中心に発生する）、粘液性癌（一実施形態では、浸潤性であり、通常は閉経後の女性に起こる）、乳頭パジェット病（一実施形態では、乳腺に発生し、乳頭または乳輪の皮膚に広がる）、葉状腫瘍（一実施形態では、乳管内に伸びる葉のような外見の腫瘍を特徴とし、転移することは稀である）、および管状癌（一実施形態では、触診によって検出不可能であることが多い小さな腫瘍）を含む。本発明の組成物および方法はまた、乳房組織に発生する肉腫（一実施形態では、結合組織の癌である）およびリンパ腫（一実施形態では、リンパ組織の癌である）を治療するためにも使用することができる。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、男性における乳房に関連する状態を治療するために使用され、一実施形態では、それは、女性化乳房、小葉乳癌（ＬＢＣ）、および浸潤性（または侵襲性）乳管癌（ＩＤＣ）であり、一実施形態では、それは、男性の乳癌の最も一般的な形態であり、全ての男性乳癌の診断の８０〜９０パーセントを占める。一実施形態では、ＩＤＣは、乳管に発生し、周辺の脂肪組織に侵入または浸潤する。一実施形態では、ＩＤＣは、乳房内のみに食い止められ得るか、または別の実施形態では、身体の他の部分に転移し得る（広がり得る）。  
【０２０６】
一実施形態では、本発明は、癌を罹患する素因のある集団または癌に罹患するリスクの高い集団において癌を治療するための組成物および方法を提供し、一実施形態では、それはｂｒｃａ１またはｂｒｃａ２突然変異を有する女性の集団であり得、一実施形態では、該集団は乳癌に罹患しやすい。
【０２０７】
別の実施形態では、本発明の方法によって誘発される免疫応答は、細胞媒介性免疫応答である。別の実施形態では、免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２０８】
本発明の方法および組成物によって誘導されるＴ細胞媒介性免疫応答は、別の実施形態では、ＣＴＬを含む。別の実施形態では、Ｔ細胞媒介性免疫応答に関与するＴ細胞は、ＣＴＬである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２０９】
別の実施形態では、Ｔ細胞媒介性免疫応答は、Ｔヘルパー細胞を含む。別の実施形態では、Ｔ細胞媒介性免疫応答に関与するＴ細胞は、Ｔヘルパー細胞である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２１０】
一実施形態では、本発明の組成物は、免疫したマウスに由来する腫瘍の血管周辺および間質においてＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を引き起こす。一実施形態では、リンパ球に浸潤する腫瘍の存在は、癌免疫療法における臨床反応と相関する。本明細書において後に記載するように、本発明の組成物は、脈管構造に影響を与えるにもかかわらず、本発明のワクチンで免疫したマウスにおいて血管損傷に関連する損傷治癒、妊娠または受精能の問題等の毒性を引き起こさない。
【０２１１】
一実施形態では、本発明の組成物は腫瘍抗原をさらに含む。一実施形態では、腫瘍抗原は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）である。一実施形態では、腫瘍抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質である。別の実施形態では、腫瘍抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、腫瘍抗原は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）タンパク質である。別の実施形態では、関心のある異種ペプチドは、抗原ペプチドである。別の実施形態では、腫瘍抗原は、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドである。別の実施形態では、腫瘍抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７ペプチドである。別の実施形態では、腫瘍抗原は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）ペプチドである。別の実施形態では、腫瘍抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ、インターロイキン−１３受容体α（ＩＬ１３−Ｒα）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、サバイビン、ＧＰ１００、またはテスティシン（Ｔｅｓｔｉｓｉｎ）ペプチドである。別の実施形態では、腫瘍抗原は、αフェトプロテイン、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、Ｂａ７３３、ＢｒＥ３−抗原、ＣＡ１２５、ＣＤ、ＣＤＩａ、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤｌ５、ＣＤｌ６、ＣＤｌ９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤｌ３８、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＳＡｐ、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ−Ｉ、ＥＧＰ−２、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＦＩｔ−Ｉ、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＨＬＡ−ＤＲ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）およびそのサブユニット、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、低酸素誘導因子（ＨＩＦ−Ｉ）、Ｉａ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インスリン成長因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）、ＫＣ４−抗原、ＫＳ−Ｉ抗原、ＫＳ１−４、Ｌｅ−Ｙ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＵＣｌ、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＰＡＭ−４抗体に特異的な抗原、胎盤成長因子、ｐ５３、前立腺酸性フォスファターゼ、ＰＳＭＡ、ＲＳ５、ＳｌＯＯ、ＴＡＣ、ＴＡＧ−７２、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、ＶＥＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、１７−ｌＡ−抗原、血管新生マーカー、癌遺伝子マーカー、または癌遺伝子産物である。他の腫瘍抗原は、Ｍｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１１：９９２−９７）、Ｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５，Ｃｕｒｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ
５：２２９−４８）、Ｖａｌｌｂｏｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：３５３６−４４）、およびＲｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．２４２：５５−６３）に記載され、これらは各々、参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１２】
一実施形態では、腫瘍抗原は、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）であり、別の実施形態では、腫瘍抗原は、Ｍａｃｉａｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８  Ｏｃｔ  １；６８（１９）：８０６６−７５（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ＨＭＷＭＡＡの断片である。
【０２１３】
一実施形態では、本発明の組成物は、ＨＭＷＭＡＡまたはその断片、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕまたはその断片、およびＦｌｋ／ＶＥＧＦＲ２またはその断片を含む。一実施形態では、ＨＭＷＭＡＡは周皮細胞を標的とし、一実施形態では、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは腫瘍細胞を標的とし、一実施形態では、Ｆｌｋ／ＶＥＧＦＲ２は内皮細胞を標的とする。
【０２１４】
一実施形態では、腫瘍抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕであり、別の実施形態では、腫瘍抗原はＨｅｒ−２／ｎｅｕ断片である。
一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２および腫瘍抗原は、同じベクターによって発現され、別の実施形態では、それらは異なるベクターによって発現される。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ２および腫瘍抗原は、同じリステリアによって発現され、別の実施形態では、それらは異なるリステリアによって発現される。
【０２１５】
一実施形態では、腫瘍抗原は、本明細書において上述したように、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドを有する融合ポリペプチドとして発現される。一実施形態では、腫瘍抗原は、本明細書において上述したように、ＰＥＳＴ様配列を含むポリペプチドに作動可能に連結される。一実施形態では、ＰＥＳＴ含有ポリペプチドは、非溶血性リステリオリシン（ＬＬＯ）ポリペプチド、Ｎ末端ＡｃｔＡポリペプチド、またはＰＥＳＴ配列である。
【０２１６】
一実施形態では、本発明は、上記組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を翻訳するステップを含むプロセスによって作られる組換えポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本発明は、上記ＶＥＧＦＲ２ポリペプチドを含むポリペプチドを、上記ＰＥＳＴ様配列を含む上記ポリペプチドに化学的にコンジュゲートさせるステップを含むプロセスによって作られる組換えポリペプチドを提供する。
【０２１７】
本発明の方法の一実施形態では、対象は、本発明の免疫原性組成物、ベクター、または組換えペプチドを投与される。本発明の方法の別の実施形態では、対象は、本発明の免疫原性組成物、ベクター、または組換えペプチドで免疫される。別の実施形態では、対象は、免疫原性組成物、ベクター、または組換えペプチドに接触させられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０２１８】
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法を実行する際に利用される化合物または組成物を含むキットを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物、ツール、または器具を含むキットを提供する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
薬学的組成物および投与方法
「薬学的組成物」は、別の実施形態では、治療的に有効な量の有効成分、すなわち、組換えペプチドまたは該組換えペプチドを含むかもしくはコードするベクターと、薬学的に許容される担体または希釈剤とを指す。「治療的に有効な量」は、別の実施形態では、所与の条件および投与計画に治療効果を提供する量を指す。
【０２１９】
有効成分を含有する薬学的組成物は、別の実施形態では、非経口的、経粘膜的、筋肉内、条約内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、脳内、膣内、または腫瘍内等の、当業者に既知である任意の方法によって対象に投与することができる。
【０２２０】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、薬学的組成物は経口投与され、したがって、経口投与に好適な形態、すなわち、固形または液体製剤に製剤化される。好適な経口固形製剤は、錠剤、カプセル、ピル、顆粒、ペレット等を含む。好適な経口液体製剤は、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油等を含む。本発明の別の実施形態では、有効成分はカプセル内に製剤化される。この実施形態によれば、本発明の組成物は、活性化合物および不活性な担体または希釈剤に加えて、硬質ゲル化カプセルを含む。
【０２２１】
別の実施形態では、薬学的組成物は、液体製剤の静脈内注射、動脈内注射、または筋肉内注射によって投与される。好適な液体製剤は、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液、油等を含む。別の実施形態では、薬学的組成物は静脈内に投与され、したがって、静脈内投与に好適な形態に製剤化される。別の実施形態では、薬学的組成物は動脈内に投与され、したがって、動脈内投与に好適な形態に製剤化される。別の実施形態では、薬学的組成物は筋肉内に投与され、したがって、筋肉内投与に好適な形態に製剤化される。
【０２２２】
別の実施形態では、薬学的組成物は身体表面に局所的に投与され、したがって、局所投与に好適な形態に製剤化される。好適な局所製剤は、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、液滴等を含む。局所的な投与のために、組換えペプチドまたはベクターは、薬学的担体を用いてまたは用いずに、生理学的に許容される希釈剤中の溶液、懸濁液、または乳濁液として調製および塗布される。
【０２２３】
別の実施形態では、有効成分は、小胞、例えばリポソーム内において送達される。
他の実施形態では、本発明の方法において使用される担体または希釈剤は、ガム、デンプン（例えば、コーンスターチ、予めゼラチン化したデンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、ショ糖、ブドウ糖）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリル酸塩（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、滑石、またはこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【０２２４】
他の実施形態では、液体製剤のための薬学的に許容される担体は、水溶性または非水溶性の溶液、懸濁液、乳濁液、もしくは油である。非水溶性溶媒の例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、およびオレイン酸エチル等の注射用有機エステルが挙げられる。水溶性担体は、水、アルコール性／水溶性の溶液、乳濁液、または生理食塩水および緩衝培地を含む懸濁液を含む。油の例として、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産物油、または牛乳もしくは卵由来の脂質等の、動物性油、植物性油、または合成起源の油が挙げられる。
【０２２５】
別の実施形態では、非経口ビヒクル（皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、または筋肉内注射用）は、塩化ナトリウム溶液、リンガーブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンガー油および固定油を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充薬、電解質補充薬（リンガーブドウ糖に基づくもの）等を含む。例として、界面活性剤および他の薬学的に許容されるアジュバントを含むかまたは含まない、水および油等の無菌液が挙げられる。一般的に、水、生理食塩水、水溶性ブドウ糖および関連糖溶液、ならびにグリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）は、特に注射液として、好ましい液体担体である。油の例として、例えば、落花生油、大豆油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、別の海産物油、または牛乳もしくは卵由来の脂質等の、動物性油、植物性油、または合成起源の油が挙げられる。
【０２２６】
別の実施形態では、本明細書において提供される薬学的組成物は、徐放性組成物、すなわち、投与後の一定期間にわたって有効成分が放出される組成物である。徐放性または持続放出性組成物は、親油性デポー（例えば、脂肪酸、ワックス、油）の剤形の製剤を含む。別の実施形態では、組成物は、即時放出性組成物、すなわち、投与後直ちに全ての有効成分が放出される組成物である。
【０２２７】
一実施形態では、一実施形態においてＨｅｒ−２／ｎｅｕである腫瘍抗原に対する二次免疫応答が増強される。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕは、存在する腫瘍細胞または腫瘍幹細胞上でも高度に発現されるため、これにより、一実施形態では、これらの細胞型からのさらなる保護が提供される。したがって、一実施形態では、本発明の組成物を用いた初回免疫のワクチン接種と、治療される腫瘍に関連する腫瘍抗原を含むワクチンを用いた追加免疫とが本発明の一部として企図され、１回目の初回免疫のワクチン接種からのエピトープスプレッディングの効果が追加免疫によって高められる。
【０２２８】
一実施形態では、脈管構造を標的とするために免疫療法を使用することは、精製した抗体の受動投与に対するいくつかの利点を提示し、１つには、初回の免疫応答を経時的に増強する能力およびワクチン接種のコストが挙げられる。しかしながら、他の細菌ベクターの使用に対するいくつかの利点を提示する、リステリア・モノサイトゲネスベクターを発
現する組換え融合タンパク質の新規使用が本明細書において示される。一実施形態では、ＬＬＯとの融合によりＦｌｋ−１断片の免疫原性を増強したＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１株は、高度に弱毒化され、主としてマクロファージおよび樹状細胞内で複製する。したがって、一実施形態では、リステリアによる感染に対する炎症性反応および我々の融合タンパク質構築物によって誘導される追加反応の両方が、強力な抗腫瘍ＣＴＬを誘導する一方で、同時に腫瘍部位で制御性Ｔ細胞の数を減少させる力を有する。
【０２２９】
一実施形態では、原発腫瘍部位から離れた位置で転移が確立されるときに、新しい血管が補充される必要があるため、転移性乳癌は、抗血管新生治療に対する感受性が特に高い。一実施形態では、微小転移は、増殖の定常状態において直径約１〜３ｍｍで存在でき、分子の受動的運動から栄養を得ることができる。しかしながら、３ｍｍを超える腫瘍の増殖を支持するためには、血管網を新しく合成する必要がある。したがって、一実施形態では、本発明の抗ＶＥＧＦＲ２ワクチンは、腫瘍の増殖が３ｍｍ以上になった転移性乳癌の広がりを鈍化させるのに特に効果的である。
【実施例】
【０２３０】
材料および方法
マウス
メスＦＶＢ／Ｎマウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ペンシルバニア大学の実験動物用コア施設で、ＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスを収容して繁殖させた。ペンシルバニア大学の実験動物委員会による規則に従って行われた実験の開始時には、マウスは６〜８週齢であった。
ペプチドおよび抗体
抗マウスＣＤ３１、抗マウスＣＤ８α−ＰＥ、ラットＩｇＧ２ａ−ＰＥのアイソタイプ対照を、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，カリフォルニア州）から購入した。ウサギ抗リステリア抗血清ポリクローナル抗体、血清型１、４を、Ｄｉｆｃｏ  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ウサギ抗ＨＩＦ−１αを、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，コロラド州）から購入した。ヤギ抗ウサギ−Ａｌｅｘａ−４８８二次抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＤＡＰＩを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）から購入した。ラット抗マウスＩＦＮ−ｇ（クローンＡＮ１８）を、ＭＡＢＴＥＣＨ（Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ，オハイオ州）から購入した。ラット抗マウスＩＦＮ−ｇ（クローンＸＭＧ１．２）を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｅｉｇｏ，カリフォルニア州）から購入した。融合タンパク質の発現のためのウエスタンブロットに使用した抗体は、ＬＬＯタンパク質の最初の３０残基に対して産生されたポリクローナルウサギ血清（ＰＥＳＴ）（Ｓｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．６４：８８２１−８８２５）か、またはハイブリドーマ上清（クローン番号Ｂ５−１９）から作製された完全長ＬＬＯに特異的な抗ＬＬＯマウス抗体（Ｅｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１４：５０３−５１２）のいずれかであった。全てのペプチドは、ＥＺＢｉｏｌａｂｓ（Ｗｅｓｔｆｉｅｌｄ，インディアナ州）から購入した。四量体は、米国国立衛生研究所、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＰｒｏｇｒａｍのＤｒ．Ａｍｙ  Ｓｔｏｕｔによって提供された。使用した四量体は、全てＰＥコンジュゲート化Ｈ−２Ｄｑであり、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ領域のＥＣ１（ＡＳＰＥＴＨＬＤＭＬ、配列番号２５）、またはＥＣ２（ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦ、配列番号２６）、またはＩＣ１（ＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ、配列番号２７）に対するいずれかのペプチドを含有していた。これらの試験で使用したペプチドは以下の通りであった：Ｆｌｋ−Ｅ１２１０−２１９（ＴＹＱＳＩＭＹＩＶ、配列番号２８）、Ｆｌｋ−Ｅ２６１３−６２２（ＭＦＳＮＳＴＮＤＩ、配列番号２９）、Ｆｌｋ−Ｉ１９０６−９１５（ＰＧＧＰＬＭＶＩＶ、配列番号３０）、Ｆｌｋ−Ｉ１８３９−８４８（ＧＲＧＡＦＧＱＶＩ、配列番号３１）、（Ｈｅｒ２−ｐＥＣ１３０２−３１０（ＰＹＮＹＬＳＴＥＶ、配列番号３２）、Ｈｅｒ２−ｐＥＣ２４２０−
４２９（ＰＤＳＬＲＤＬＳＶＦ、配列番号３３）、Ｈｅｒ２−ｐＩＣ１７３２−７４１（ＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ、配列番号３４）、ＨＩＶ−ｐＧａｇ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ、配列番号３５）。
ＥＬＩＳｐｏｔ
酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイにより、ペプチドの刺激に応答したマウス脾細胞によるＩＦＮ−ｇの分泌を検査した。頻度の低い抗原特異的細胞を得られる感受性レベルのため、また、インビトロ操作なしに、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕおよび抗Ｆｌｋ−１特異的Ｔ細胞をエクスビボで直接的に検査できるために、我々は他のアッセイではなくＥＬＩＳｐｏｔを使用することを好んだ。簡潔に述べると、１０μｇ／ｍｌのペプチドおよび５Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で、単離した脾細胞をウェル当たり１×１０６細胞で播種するか、または７μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体（クローンＡＮ１８、ＭＡＢＴＥＣＨ、Ｍａｒｉｅｍｏｎｔ，オハイオ州）でコーティングした９６ウェルプレート全体に滴定した。次に、ビオチン化した抗ＩＦＮ−ｇ抗体（クローンＸＭＧ１．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、最終濃度２μｇ／ｍｌで各ウェルに加えた。３７℃で一晩インキュベーションした後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（希釈度１：１０００）、続いて基質ＴＭＢ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＡＢＣキット）を使用して、プレートを室温で１時間展開した。Ｃ．Ｔ．Ｌ社製Ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔスキャナーおよび集計ソフトウェア（ＣＴＬ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，オハイオ州）を使用してスポットを数えた。
細胞株
細胞培養培地および栄養補助剤をＧｉｂｃｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。ＮＴ−２およびＪ７７４Ａ．１細胞を前述したように維持した。全ての細胞培養物を３７℃、５％  ＣＯ２で維持した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子（４Ｔ１−Ｌｕｃ）を安定して発現する４Ｔ１および４Ｔ１細胞は、Ｄｒ．Ｅｌｌｅｎ  Ｐｕｒｅ（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のご好意で頂いたものであり、細胞培養培地中で維持した。
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンの構築
Ｆｌｋ−１遺伝子の源は、Ｄｒ．Ｒａｌｐｈ  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ（Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，カリフォルニア州）がご親切に提供してくださったＤＮＡワクチンプラスミドであった。６８〜１０８１番目の残基に対応する断片を、以下のプライマーを使用してＰＣＲにより増殖させた：Ｆｌｋ−Ｅ１（Ｆ）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＴＡＴＴ−３’（配列番号３６）、Ｆｌｋ−Ｅ１（Ｒ）：５’ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＣＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴ−３’（配列番号３７）、（６８〜２７７番目のアミノ酸）；Ｆｌｋ−Ｅ２（Ｆ）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＴＧＡＡＡＴＴＡ−３’（配列番号３８），Ｆｌｋ−Ｅ２（Ｒ）：５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号３９），（５４５〜７３０番目のアミノ酸）；Ｆｌｋ−Ｉ１（Ｆ）：５’−ＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＧＡＣＡＧＣＣ−３’（配列番号４０），Ｆｌｋ−Ｉ１（Ｒ）：５’−ＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＡＴＡＣＴＣＴＧＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号４１），（７９２〜１０８１番目のアミノ酸）。下線部のＸｈｏＩ配列はフォワード（Ｆ）プライマー、下線部のＳｐｅＩ配列はリバース（Ｒ）プライマー、太字は停止コドンである。ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に連結し、配列決定により確認し、続いて、ＸｈｏＩおよびＳｐｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた二重消化により切除した。下流のｐＧＧ３４に基づくプラスミド内に断片を連結し、ｈｌｙプロモーターによって発現が駆動されるＬＬＯタンパク質の最初の４４１残基をコードする遺伝子に融合させた。ｐＧＧ３４プラスミドの構築については、他の箇所で詳述している。得られたプラスミドを、Ｌｍ株１０４０３Ｓに由来するＰｒｆＡ欠損Ｌｍ株ＸＦＬ−７に電気穿孔した。３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび２５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ）プレート上で陽性クロー
ンを選択した。得られた株をＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２、およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１と名付けた。
Ｌｍワクチンの増殖および用量の調製
ワクチンの原液を、１×ＰＢＳ中の１０％グリセロール中に−８０℃で維持した。クロラムフェニコール／ストレプトマイシンのプレートに各原液を筋状に播種し、一晩増殖させた。抗生物質選択下、ＢＨＩ培地５ｍｌの一晩の培養における増殖には、単一コロニーを使用した。この培養を３７℃の振盪インキュベータ内でさらに４時間延長し、微生物密度が０．４〜０．８ＯＤ６００に達するまで培養物をさらに増殖させ、その時点で微生物を洗浄し、使用するまで１０％グリセロール中−８０℃で無菌冷凍した。作製した各ロットごとに原液を滴定した。１つの連続的な実験には単一ロットを使用し、各反復には異なるロットを使用したが、ロット間の変動は観察されなかった。抗ＰＥＳＴおよび抗ＬＬＯ抗体を用いたウエスタンブロットにより、各ロットの融合タンパク質の発現を確認した。各用量ごとに１つのバイアルを選択し、解凍し、希釈および使用する前に１×ＰＢＳ中で２回洗浄し、使用しなかった微生物は廃棄した。
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンが腫瘍増殖に与える影響
ＦＶＢ／Ｎマウスの側腹部に、ＰＢＳ２００μｌ中の１×１０６のＮＴ−２腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍接種後４日目に、５×１０８ＣＦＵのＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２、またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１のいずれかで、マウスを腹腔内免疫した。この用量は、マウスに有害な影響を及ぼすことが観察された最低用量の１０分の１として決定し、全ての実験において使用した。全ての実験で、１週間に合計３用量のワクチンで免疫を繰り返した。対照群では、マウスに対照Ｌｍワクチン-Ｌｍ−
ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１１０１−１５６を投与した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１１０１−１５６は、ＬＬＯまたはリステリアの感染に対する免疫応答を制御するための無関係または第３のＬｍワクチンとして作用するため、我々は、試験ワクチンと同程度の濃度で、対照としてこのワクチンを使用することが多い。３日ごとにノギスで腫瘍を測定し、各個別の腫瘍ごとに最短（幅）および最長の表面直径を記録した。以下の方程式を使用して腫瘍体積の計算を行った：［（幅）２×長さ×０．５２］。開放創を発生した場合または腫瘍の直径が２０ｍｍに達した場合は、マウスを屠殺した。ＮＴ−２の再チャレンジを行った腫瘍が存在しないの生存マウスに、最初の接種から少なくとも１０週間後に、反対側の側腹部に同じ細胞株の再チャレンジを行った。
腫瘍の免疫蛍光
腫瘍接種後６４日目に、マウスを屠殺してＮＴ−２腫瘍を外科的に切除し、ＯＣＴ凍結培地で凍結保存し、８〜１０ｍｍの厚さの切片になるよう凍結切片を作製した。免疫蛍光のために、試料を解凍して、４％ホルマリンを使用して固定した。ブロッキング後（２．４Ｇ２条件培地／１０％ＦＢＳ／５％正常ラットおよびマウス血清）、加湿チャンバ内で、３７℃で１時間、ブロッキング溶液中の一次抗体で切片を染色した。一次染色に使用したのと同じ手順に従って、二次抗体で試料を染色した。製造者の指示に従ってＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色を行った。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ／１％ＢＳＡ溶液中で、ＨＩＦ−１αの細胞内染色を行った。フェーディング防止剤を含む開始溶液（Ｂｉｏｍｅｄａ）を使用してスライドにカバースリップを乗せ、２４時間固化させ、Ｓｐｏｔ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（２００６年版）およびＯｌｙｍｐｕｓ社製蛍光顕微鏡ＢＸ５１シリーズを使用して撮像するまで４℃で維持した。Ｓｐｏｔ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用して画像をマージし、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏソフトウェア（２００６年版）を使用してＲＯＩにゲートをかけた後に定量化を行った。全ての画像は、同じ露出時間で取得した一連の３つの異なるチャネルをマージしたものである。抗ＣＤ３１を使用した微小血管密度の定量化のために、マウス腫瘍モデル（３３〜３５）においてＭＶＤを測定するための同様のストラテジーを使用する以前に出版された研究に基づいて分析を行った。
転移試験および生物発光画像
組み込んだルシフェラーゼ・レポーター遺伝子（４Ｔ１−Ｌｕｃ）を発現する５０，０００個の４Ｔ１細胞を用いて、最終ワクチン接種後７日目に、静脈内注射の前にマウスを
合計３回ワクチン接種した。撮像前に、ＰＢＳ２００ｕｌ中５〜１０ｍｇ／マウスで、対応する基質であるＤ−ルシフェリンを腹腔内注射した。ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）／キシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ミズーリ州）の腹腔内注射後に、麻酔下のマウスをＸｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ撮像システム（Ｘ−１００）（Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｌａｍｅｄａ，カリフォルニア州）の暗室に配置した。ＣＣＤカメラで写真画像および発光画像を取得し、製造者の指示にしたがってＸｅｎｏｇｅｎのＬｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェア（バージョン２．１１）を使用して蛍光強度を定量化した。腫瘍接種後少なくとも４週間まで、長軸方向の撮像を毎週行った。全てのマウスは同じ露出および時間で撮像した。画像は正規化した画像を示す。腫瘍を（手で）数える前に、病理学的試験のために肺組織を灌流して抽出し、ワックスで包埋しＨＥで染色したことを除いて、同一の実験を行った。
妊娠および創傷治癒安全性試験
対照ＬｍワクチンまたはＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンのいずれかで、６〜８週齢のＦＶＢ／Ｎマウスのメスを３回連続して毎週免疫した。４週目に安全性試験を実施した。妊娠および受精のために、群当たり５匹のマウスを、個別に収容したオスと交配させた。交尾を監視し、膣栓の存在によって確認した。妊娠までの期間、出生時の仔マウスの体重、および総産子数を測定した。この試験で利用した創傷治癒アッセイは、以前に記載された方法に従って行った。簡潔に述べると、マウスに麻酔し、剃毛し、滅菌ワイパーで皮膚を洗浄した。滅菌した皮膚生検ツール（Ａｃｕｄｅｒｍ）を使用して皮膚を打ち抜き、直径３ｍｍの円形創を２箇所作製した。創傷には処置を行わなかったが、感染は観察されなかった。創傷閉鎖までの平均時間を監視し、目に見える痂皮を一切残すことなく瘢痕が形成されたときに完了と見なした。
統計分析および定量化の方法
ノンパラメトリックのマンホイットニー検定を使用してデータを分析した。全ての生存データにログランクのカイ二乗検定を使用した。全ての統計分析は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアのバージョン４．０ａ（２００６）で行った。統計的有意性は、ｐ＜０．０５の値に基づいていた。全ての非トランスジェニック試験に、群当たり少なくとも８匹のマウスを含めた。全ての試験を少なくとも１回繰り返した。
【実施例１】
【０２３１】
ＬＬＯ−ＦＬＫ−１構築物の構築
各々が、Ｆｌｋ−１の異なる３つの領域、Ｅ１（６８〜２７７番目のアミノ酸）、Ｅ２（５４５〜７３０番目のアミノ酸）、およびＩ１（７９２〜１０８１）を含有する合計３つの構築物を検査した（図１Ａ）。領域は、予想されるエピトープに基づいて選択した。我々は、ＦＶＢ／Ｎに基づく乳癌モデルにおいてこれらのワクチンを検査することに関心があったため、検査に使用されるモデルのハロタイプに最も適当であろう断片をクローン化することにした（すなわち、ＦＶＢ／Ｎ、Ｈ２ｑ）。選択したＥ１、Ｅ２、およびＩ１ドメインは、Ｈ−２ｑマウスのＭＨＣ  Ｉハロタイプに対するいくつかの潜在的エピトープを含有していた（図２Ａ）。
【０２３２】
各断片を、切断したＬＬＯタンパク質との融合タンパク質としてクローン化した（図１Ａ）。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１構築物によってＬＬＯ−Ｆｌｋ−１融合タンパク質が生成および分泌されるかどうかを検査するために、ポリクローナル抗ＰＥＳＴ抗体（図１Ｂ下）または抗ＬＬＯ抗体（図１Ｂ上）を使用して、ウエスタンブロットにより培養上清のタンパク質を分析した（図１Ｂ）。各融合構築物ごとにバンドが検出された：ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１（およそ８１ｋＤａ）、ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２（およそ７８ｋＤａ）、およびＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１（およそ８９ｋＤａ）。６０〜７０ｋＤａ付近のバンドは内在性ＬＬＯであり、切断された融合タンパク質ＬＬＯは６０〜５０ｋＤａ付近に見られた。
我々の融合タンパク質がＬＬＯ−Ｆｌｋ結合であることを示すための対照として、抗ＬＬＯのブロットを使用した。Ｊ７７４Ａ．１マクロファージにおける複製からも明らかなよ
うに、３つ全ての構築物が、感染、増殖、およびファゴリソソームから脱出することができた（図２Ｄ）。また、エクスビボでのＩＦＮ−ｇの脾細胞応答によって示されるように、各ワクチンが、クローン化したＦｌｋ−１領域に対してマウスを免疫することができた（図１Ｃ）。これらのＦＶＢ／Ｎ  ＥＬＩＳｐｏｔ実験で再チャレンジのために使用したペプチドは、元々、Ｈ２ｄ  Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて免疫優勢なＦｌｋ−１エピトープとしてマップされていた。おそらくはＨ２ｄおよびＨ２ｑ分子の高い相同性に起因して、Ｈ２ｄが同定されたエピトープは、Ｈ２ｑエピトープとしての役割も果たすことができるので、我々は、Ｈ２ｄでマッピングしたエピトープをＨ２ｑモデルにおいて日常的に使用する。
【実施例２】
【０２３３】
ＨＥＲ−２／ＮＥＵを発現する腫瘍モデルにおけるＬＭ−ＬＬＯ−ＦＬＫ−１ワクチンの治療的有効性
我々のワクチンがＨｅｒ−２／ｎｅｕ＋乳腺腫瘍の退縮を誘導する能力を検査するために、導入遺伝子としてラットＨｅｒ−２／ｎｅｕを過剰発現し、元々は、ＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおける自発性乳房腫瘍に由来する、ＮＴ−２腫瘍モデルを使用した。ＮＴ−２細胞株はＦｌｋ−１分子を発現しないため、我々の関心のある抗原のみが宿主脈管構造上に位置する。細胞をインビトロで増殖させ、ＦＶＢ／Ｎマウスの側腹部に皮下移植した。４日目に、触知できる腫瘍（直径およそ４〜５ｍｍ）が形成されたときにマウスにワクチン接種し、次いで、合計３回のワクチン接種で毎週追加免疫を行った。ワクチンＦｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１は、退縮を誘導することができ、また何匹かのマウスにおいては、接種後６４日目までに、移植した腫瘍の完全な根絶（Ｆｌｋ−Ｅ１：２／８匹、Ｆｌｋ−Ｉ１：２／８匹）を誘導することが可能であった（図３Ａ）。しかしながら、Ｆｌｋ−Ｅ２は、対照Ｌｍで処理した群と同様に、腫瘍増殖を制御することができなかった。腫瘍接種後１００日目に、完全に退縮した腫瘍を有するマウスの側腹部にＮＴ−２の再チャレンジを行ったところ、新しい腫瘍の再増殖は観察されず、抗腫瘍免疫が長期間続くことを示唆するものであった（図４ＡおよびＢ）。
【０２３４】
全内皮細胞マーカーＣＤ３１で染色することにより６４日目の腫瘍の微小血管密度（ＭＶＤ）を評価し、核マーカーＤＡＰＩで対比染色した。予測されたように、Ｆｌｋ−Ｅ２処理群の腫瘍におけるＭＶＤは、対照処理マウスのＭＶＤと類似していた。しかしながら、Ｆｌｋ−Ｉ１処理マウスにはＣＤ３１＋血管の密度の減少が見られ、Ｆｌｋ−Ｅ１ワクチンを使用するとさらなる減少が観察された（図３Ｃ）。ＣＤ３１＋血管におけるこの減少は、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１処理群において、核内の低酸素マーカーである低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）の染色における増加と相関していたが、対照群とは相関していなかった（図３Ｄ）。腫瘍のＭＶＤの減少に加えて、これらのＨｅｒ−２／ｎｅｕ＋腫瘍の退縮は、腫瘍の血管新生に関与する内皮細胞を死滅させる抗ＶＥＧＦＲ２の細胞傷害性Ｔ細胞に起因しており、観察された退縮をもたらす腫瘍損傷または増殖制限を引き起こす可能性があると仮説を立てることができる。続いて、貪食された腫瘍片は、流入領域リンパ節の局所的樹状細胞によって交差提示され得、エピトープがＦＶＢ／Ｎマウスにおいて以前にマッピングされている抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＣＴＬに提示され得る。この分子間のエピトープスプレッディングが起こる場合、最大の退縮を呈したマウスは、抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度もまた高いであろうと予想される。この仮説を検証するために、６４日目のマウスから脾細胞を採取し、ＩＦＮ−ｇ  ＥＬＩＳｐｏｔを行い、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの３つの異なる領域からの３つの既知のエピトープの再チャレンジをおこなった。
我々は、以前にＨｅｒ−２／ｎｅｕ分子の異なる領域についてＣＴＬエピトープをマッピングしており、インビトロでの刺激および拡張を必要とするいくつかの細胞傷害性アッセイとは違い、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、頻度の低い特異的Ｔ細胞を検出するために感度が十分高いため、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して抗Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ応答を測定す
ることにした。Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１が最大のエピトープスプレッディングを示す一方、Ｆｌｋ−Ｅ２は最も少なく（図３Ｂ、＊ｐ＜０．０５）、インビボで見られる腫瘍退縮の程度と強く相関していることを発見した（図３Ａ）。
【実施例３】
【０２３５】
抗血管新生が誘導する腫瘍退縮は、内在性腫瘍抗原に対するエピトープスプレッディングに依存する
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕのエピトープスプレッディングの存在は、腫瘍退縮が、抗血管イベントのみに依存するのではなく、腫瘍抗原ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対する免疫応答にも依存する可能性を示唆した。この仮説を検証するために、最も強力な２つのワクチンであるＦｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１を使用して同じ実験を繰り返したが、我々は、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスの接種に加えて、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ分子に対する著しい耐性を呈する、それと同系の前駆細胞株であるＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックにも、ＮＴ−２細胞を皮下注射した。ここでも同様に、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１が、以前に示したように野生型ＦＶＢ／ＮマウスにおいてＮＴ−２腫瘍の増殖を遅延させた（図５Ａ、左パネル）。しかしながら、耐性によって抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ応答が制限されるトランスジェニック宿主では、全ての腫瘍の成長が観察された（図５Ａ、右パネル）。これらの両方の結果は、脾臓において示された内在性Ｈｅｒ−２／ｎｅｕタンパク質に対した観察された（図５Ｂ）、およびＦｌｋ−Ｅ１ワクチンについて示されたように腫瘍部位で（図５Ｃ）観察されたエピトープスプレッディングを反映するものであった。これは、抗血管イベントは腫瘍退縮のために十分ではなく、腫瘍の死滅、そして最終的には退縮のためには、腫瘍脈管構造に対する影響と腫瘍細胞に対する直接的な影響とを組み合わせることが必要であることを示唆するものであった。
【実施例４】
【０２３６】
ＬＭ−ＬＬＯ−ＦＬＫ−１ワクチン断片を用いたワクチン接種は、実験的転移の増殖を予防することができる
抗血管新生ワクチンの重要な使用は、乳癌転移の治療または予防のためであり得る。転移する腫瘍細胞は新しい血管の発達に大きく依存するが、小さな腫瘍は新しい脈管構造に完全には依存しない。しかしながら、腫瘍がある程度のサイズ以上に成長すると、腫瘍は新しい血管の形成に大きく依存するようになり、そのため、抗ＶＥＧＦＲ２  ＣＴＬの潜在的な標的となるという仮説が立てられている。我々のワクチンが乳腺腫瘍の播種に対して保護することができるかどうかを検証するために、インビトロ培養した腫瘍細胞をマウスの尾静脈に直接接種して、いくつかの下流器官（特に、肺）で急速にコロニーを形成させることを含む、実験的転移システムを使用した。尾静脈のワクチン接種後、ＮＴ−２モデルは肺のコロニー形成を十分に行わなかったため（データは図示せず）、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来の高悪性度のマウス乳癌細胞株である４Ｔ１を使用した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１、または対照Ｌｍワクチンのいずれかで、３週間にわたって３回Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫した。次いで、５０，０００個の４Ｔ１細胞をマウスに静脈内注射し、また同じ動物に皮下注射した。皮下部位の注射は、原発腫瘍の増殖を測定できるように行い、静脈内注射は転移を模倣して行った。Ｆｌｋ−１ワクチンで処理したマウスにおいて、長期にわたる腫瘍増殖が見られ、対照マウスと比較して、原発性の皮下腫瘍のサイズ増加を遅延し、生存率を増加させ、死亡率を減少させた（図６）。原発性４Ｔ１腫瘍に対して見られた応答不良とは異なり、各マウスに見られた播種および全体的な転移の速度は、対照マウスと比較して、処理済みマウスにおいて有意に低かった（図７Ａ）。おそらく、４Ｔ１がマウスＨｅｒ−２／ｎｅｕを弱く発現するため、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕに対する低レベルのエピトープスプレッディングが観察された（図７Ｂ）。
【０２３７】
Ｆｌｋ−１に対する免疫が実験的転移を伴う肺組織の播種を予防することができるとい
う仮説をより厳密に検証するために、個別の腫瘍細胞および腫瘍塊を非侵襲的な撮像法を使用して可視化することができる生物発光モデルを使用した。Ｌｍ−Ｆｌｋ−Ｅ１およびＩ１ワクチンを用いた数ラウンドのワクチン接種後に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（４Ｔ１−Ｌｕｃ）を発現する５０，０００個の４Ｔ１細胞をマウスに静脈内投与した。毎週、マウスを麻酔し、ルシフェラーゼ基質（Ｄ−ルシフェリン）を注射して撮像した。１１日目までに肺の播種が明らかとなり、対照処理マウスは、２５日目までに急速に４Ｔ１−Ｌｕｃ細胞のコロニーを形成したが、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１で処理したマウスでは、少なくとも３２日目まで１匹も肺播種の兆候が見られず、その時点で対照処理マウスが発病したため屠殺した（図７Ｃ）。３２日目には、Ｆｌｋ−１をワクチン接種したマウスの２５％のみが、いずれかの肺腫瘍を示した。Ｌｍ−Ｆｌｋ−Ｅ１処理群において、２５日目には腫瘍細胞のシグナルが観察されたが、３２日目には観察されなかったため、この時点では、腫瘍塊はこの生物発光法によって検出不能であった可能性がある。２５日目のこの非常に低いシグナルは、１０００細胞閾値を下回るものであり、次の週にはいくつかの細胞塊を損失して、システムの検出限界を下回った可能性がある。対照Ｌｍで免疫したマウスは肺腫瘍により急速に病気になったが、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１のＬｍワクチン接種は、腫瘍量、進行までの期間（対照処理の２５日目対Ｆｌｋ−１処理の３２日目）、および最終的な疾患を遅延させた（図６に示すように死亡率を減少させた）。
【実施例５】
【０２３８】
ＦＬＫ−１による免疫は、マウスにおける創傷治癒、妊娠、または生殖能に何の影響も与えない
Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンが血管新生の阻害と関連する毒性を引き起こすかどうかを評価するために、免疫したマウスにおいて創傷治癒、妊娠、および生殖能について調べた。交配させるかまたは無菌の円形創を作製する前に、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１、対照Ｌｍ、または生理食塩水のみでマウスを３回免疫した。交配させたマウスについて、交尾から妊娠期間中、出生時の平均仔マウス体重、および総産子数の観察を行った。創傷穿孔器は滅菌したが、マウスを一緒にケージに収容した。創傷治癒技術は、前述した方法に従った。各免疫群からの５匹のマウスを剃毛し、動物１匹当たり２箇所の無菌円形創を作製し、次いで経時的に治癒させた。創傷閉鎖までの時間を測定した。完全な損傷治癒が完了したと見なされ、創傷閉鎖の時点で痂皮は残っていなかった。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ２、またはＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１による免疫は、生殖能、妊娠期間、または出生時の仔マウス重量に影響を与えなかった（図８Ａ）。同様に、免疫は、創傷閉鎖に必要とされる時間に有意な影響を与えなかった（図８Ｂ）。
【０２３９】
Ｆｌｋ−Ｉ１による免疫後に観察されたＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する免疫応答が、Ｆｌｋ−１およびＨｅｒ−２／ｎｅｕの間で共有されるエピトープ間の交差反応性によるものであるかどうかを評価するために、Ｆｌｋ−Ｉ１ワクチンで免疫したＦＶＢ／Ｎマウスを、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕエピトープＧＳＧＡＦＧＴＶＹＫ（配列番号４２）に交差反応性であるＦＬＫ−Ｉ１８３９−８４８に対する免疫について評価した。Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１によるマウスの免疫は、以前にマッピングされたＦｌｋ−Ｉ１のエピトープＰＧＧＰＬＭＶＩＶ（配列番号４３）に対する優れた応答を引き出した。しかしながら、マウスＦｌｋ−Ｉ１８３９−８４８のエピトープまたは相同性ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ
ＩＣ１７３２−７４１のエピトープのいずれに対しても有意な応答は見られなかった（図９）。したがって、Ｆｌｋ−Ｉ１による免疫後に観察されたＨｅｒ−２／ｎｅｕに対する免疫応答は、共有されたエピトープ間の交差反応性によるものではなく、エピトープスプレッディングに起因するものである可能性が最も高かった。
【０２４０】
総合すると、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−１ワクチンは、特定の確立された乳腺腫瘍を根絶
させ、残りの腫瘍における微小血管密度を減少させ、再チャレンジを行った腫瘍および実験的転移に対する保護を行い、腫瘍関連抗原Ｈｅｒ−２／ｎｅｕの種々の領域に対するエピトープスプレッディングを誘導することが可能である。腫瘍の根絶は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対するエピトープスプレッディングに依存するものであって、腫瘍脈管構造の減少のみに依存するものではないことが分かった。しかしながら、ワクチンの有効性は、正常な創傷治癒に影響を与えることはなく、また、妊娠に対して有毒性の副作用も有さない。したがって、抗血管新生ワクチンは、内在性腫瘍タンパク質に対するエピトープスプレッディングを駆動する宿主脈管構造に対する耐性を克服し、活性腫瘍の退縮を駆動することができる。したがって、単一ワクチンを使用して腫瘍脈管構造および内在性腫瘍抗原（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ）の両方を標的とする新規方法が本明細書に提供される。
【実施例６】
【０２４１】
エスケープ変異型において生じる突然変異
マウス
ペンシルバニア大学の実験動物用コア施設で、ＦＶＢ／Ｎ  Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ  トランスジェニックマウスを収容して繁殖させた。ペンシルバニア大学の実験動物委員会による規則に従って行われた実験の開始時には、マウスは６〜８週齢であった。
リステリアワクチン株
使用した株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１およびＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１であった。抗原特異性のための第３の対照ワクチンとして株Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹＥＳＯ１を使用した。３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび２５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＢｒａｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ（ＢＨＩ、Ｄｉｆｃｏ）プレート上で細菌を選択し、次いで液体培養において増殖させ、１ｍｌアリコートで−８０℃で冷凍した。注射のために、投与前にワクチンを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。
自発性腫瘍保護
抗Ｆｌｋ−１リステリアワクチンが自発的に生じる腫瘍に影響を与える能力を検証するために、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕ分子を過剰発現し、自発的に乳房腫瘍を発生するＦＶＢ／ＮラットＨｅｒ−２／ｎｅｕトランスジェニックマウス（メス）を使用した。これらの長期保護試験のために、６週齢から開始して、２１週齢になるまで３週間ごとに腹腔内免疫することにより、メスマウス（Ｎ＝１５）を合計６回免疫した。ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｅ１、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｆｌｋ−Ｉ１、またはＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹＥＳＯ−１を、ＰＢＳ中に懸濁して０．１ＬＤ５０で注射した。毎週、腫瘍量を観察した。腫瘍が１０ｍｍを超えるサイズになると動物を屠殺し、分析のために腫瘍を除去した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、カプラン・マイヤーのログランク検定による自発性腫瘍増殖における差異の統計分析を行い、各ワクチン群と対照群との間で腫瘍増殖の開始時を比較した。
突然変異の分析およびマッピング
新たに腫瘍を切除してＲＮＡｌａｔｅｒ溶液に入れ、４℃で２週間弱保存した。Ｑｉａｇｅｎ  ｍＲＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、保存した腫瘍からｍＲＮＡを抽出し、次いでＰＣＲによりｃＤＮＡを作製した。個々のＰＣＲ試料をさらに分割し、別途記載されるように（Ｓｉｎｇｈ、２００７）、各々５００〜８００ｂｐ（ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＩＣ１、ＩＣ２）のストレッチでＨｅｒ−２／ｎｅｕの各個別断片の配列を決定できるようにした。フィラデルフィア小児病院（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＣＨＯＰ）のＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで配列決定を行い、４Ｐｅａｋｓソフトウェア１．７．２を使用して分析した。４回以上の個別のＰＣＲおよび配列決定反応において生じなかった突然変異は、ＰＣＲ誘導性突然変異として廃棄した。分子モデリングはＭａｃＰｙＭｏｌを使用して行った。
【０２４２】
ＰＣＲプライマー配列：
ＥＣ１  ＦＰ：ＡＧＧＧＣＴＧＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＣ（配列番号４４）
ＥＣ１  ＲＰ：ＴＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＴＴＡＴＴＣＧ（配列番号４５）
ＥＣ２  ＦＰ：ＡＣＣＴＧＣＣＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣ（配列番号４６）
ＥＣ２  ＲＰ：ＧＡＣＧＣＣＣＴＣＴＡＣＡＧＴＴＧＣ（配列番号４７）
ＥＣ３  ＦＰ：ＧＴＧＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＧＡＴＴＣ（配列番号４８）
ＥＣ３  ＲＰ：ＴＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣ（配列番号４９）
ＩＣ１  ＦＰ：ＣＡＡＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧ（配列番号５０）
ＩＣ１  ＲＰ：ＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＣＡＣＡＴＣＧＧ（配列番号５１）
ＩＣ２  ＦＰ：ＣＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＡＴＧ（配列番号５２）
ＩＣ２  ＲＰ：ＴＴＴＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＡＧＡＣＣ（配列番号５３）
ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕを発現するトランスジェニックＦＶＢ／Ｎマウスを、６週齢から開始して３週間ごとにＦｌｋ−Ｅ１、Ｆｌｋ−Ｉ１、または対照Ｌｍでワクチン接種し、最後のワクチン接種後、毎週腫瘍を測定した。Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１を用いたワクチン接種は、対照Ｌｍワのクチン接種と比較して腫瘍が存在しないマウスの割合を増加させた。３５週〜４０週の間に、Ｆｌｋ−Ｅ１およびＦｌｋ−Ｉ１をワクチン接種したマウスにおいて、腫瘍を発生したマウスが多く存在した。各マウス由来の腫瘍をＨｅｒ−２／ｎｅｕメッセージの変異について調べた。メッセージＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを合成して配列決定した。変異残基を判定するために、得られた配列を野生型配列と並べて対にした。４回以上生じた突然変異のみを真の突然変異と見なした（図１０Ａ）。変異残基の「ホットスポット」または鎖の中にある変異残基のうちのいくつかは、以前にマッピングされたＣＴＬエピトープ内にあった。そのようなエピトープの１つは、エピトープをＨ２Ｄｑ  ＭＨＣ  Ｉ分子に固定することに関与する重要なアミノ酸における突然変異を示す（図１０Ｂ）。
【実施例７】
【０２４３】
乳房の標的化およびメラノーマの脳転移
本明細書において上述した方法を使用して実験を行った。
抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕまたは対照ワクチンＮＹＥＳＯ１のいずれかの各ワクチンで、Ｂａｌｂ／ｃマウスを３回免疫した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ミネソタ大学のＪｏｈｎ  Ｏｈｌｆｅｓｔ研究室からのＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞）を安定して発現するマウス乳癌細胞をインビトロで増殖させ、次いで、麻酔下のマウスの脳内にマウス１匹当たり５，０００細胞で注射した。図示する日に撮像する前に、低レベルのマウスＨｅｒ−２／ｎｅｕ（データは図示せず）細胞を発現するＥＭＴ６−Ｌｕｃ細胞を増殖させた。ＮＹＥＳＯ１をワクチン接種したマウスには脳転移が明らかに見られたが、抗ヒトＨｅｒ−２／ｎｅｕワクチンは、実験的な転移の誘導後、３、８、および１１日目に脳腫瘍を制御した（図１１Ａ）。
【０２４４】
抗ヒトＨＭＷＭＡＡ−Ｃまたは対照ワクチンＮＹＥＳＯ１のいずれかの各ワクチンでＣ５７Ｂｌ／６マウスを３回免疫した。Ｂ１６Ｆ１０−Ｌｕｃマウスメラノーマ細胞（ＵＣＳＦのＪｅｆｆ  Ｍｉｌｌｅｒ研究室より）をインビトロで増殖させ、次いで、麻酔下のマウスの脳内にマウス１匹当たり５，０００細胞で注射した。Ｂ１６Ｆ１０親株はＨＭＷＭＡＡを発現しないため（私信）、ＨＭＷＭＡＡの唯一の源は周皮細胞およびグリア細胞上にある。抗ヒトＨＭＷＭＡＡ−Ｃによるマウスのワクチン接種は、実験的な転移の誘導後、１１および１５日目に脳腫瘍を縮小させた（図１１Ｂ）。したがって、ＨＭＷＭＡＡＣまたはＨｅｒ−２／ｎｅｕのいずれかを用いたワクチン接種は、たとえ腫瘍細胞がＨＭＷＭＡＡを発現しなくても、脳転移から保護する。
【実施例８】
【０２４５】
新規抗ＣＤ１０５／エンドグリンリステリアに基づくワクチン治療薬の構築
かなり大きなエンドグリンの断片を発現したＬｍ株の構築物（図１２）は、ＬＬＯに融
合されたときに断片を分泌しなかったため、エンドグリン遺伝子のほぼ全体に広がり（図１３Ａ、配列番号６２）、以前に標的とされたエンドグリンの領域外に存在するＲＡＮＫｐｅｐを使用して決定される予測的なＣＴＬエピトープを含む２つの新規Ｌｍ構築物であるＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａ（ａａ１７−３１９）およびＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂ（３５９−５８８）に対して再設計した（図１２）。これらの新規構築物内に、より免疫優勢なエピトープを潜在的に含むことにより、ＣＴＬエピトープのプールの拡大を用いてワクチンの有効性を高めた。さらに、融合タンパク質をより小さくし、構築物から疎水性の高い領域を除去することにより、Ｌｍによってこれらの融合タンパク質がさらに良好に分泌された。これらの断片をコードする遺伝子をＣＤ１０５ｐＧＧ−３４にクローン化した（図１３Ｂ）。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａ（図１４）およびＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂ（図１５）の両方が、適切なサイズの断片を発現および分泌した。
【実施例９】
【０２４６】
ＬＭ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢがＢＡＬＢ／Ｃマウスの乳腺腫瘍４Ｔ１の原発性および転移性増殖に与える影響
乳腺に移植すると急速に転移するため、我々の乳腺腫瘍モデルの中でもより悪性度の高いＢＡＬＢ／ｃマウス４Ｔ１の乳腺腫瘍を、実施例８に示したワクチンの最初の検査に選択した。Ｂａｌｂ／ｃマウスの乳腺脂肪帯に２×１０５で４Ｔ１細胞を移植した。１、８、および１５日目、または４、１１、および１８日目のいずれかに、各ワクチンを２×１０８ｃｆｕでマウスにワクチン接種した。ナイーブまたは対照をワクチン接種したマウスと比較して、両方のワクチン投与計画が腫瘍増殖の有意な遅延を示した（図１６）。３２日目にマウスを屠殺し、それらの肺を除去し、転移の広がりについて調べた。興味深いことに、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂのみが、表面肺転移における統計的に有意な減少を示した（図１７）。
【０２４７】
次に、これらのマウスにおけるＣＴＬ応答を調べた。ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識され得るエンドグリン分子の免疫原性領域を決定する最初の試みとして、２つの断片をＲＡＮＫｐｅｐ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏ．ｄｆｃｉ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＲＡＮＫＰＥＰ／）およびＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ／）による分析に供した。ここから、ＣＤ１０５Ａ：ＡＧＰＲＴＶＴＶＭ（配列番号５９）（Ｄｄバインダー）およびＣＤ１０５Ｂ：ＡＹＳＳＣＧＭＫＶ（配列番号６０）（Ｋｄバインダー）に対して最も見込みの高い２つのペプチドを選択した。エンドグリンにおけるそれらの位置を図１３Ａに下線で示す。
【０２４８】
ＥＬＩＳｐｏｔ分析でこれらの２つのペプチドを使用して、４、１１、および１８日目にワクチン接種した、図１６Ｂに示すマウスから最後のワクチン接種後４日目に採取した脾細胞を刺激した。しかしながら、ＨＩＶ  Ｇａｇ由来の対照Ｈ−２ｄ制限ペプチドと比較して、それらはＴ細胞を刺激してインターフェロンγを分泌させなかったことから、それらがＣＴＬエピトープではないことが示唆される（図７）。４Ｔ１によって低レベルで発現される２つの内在性腫瘍抗原に対するエピトープスプレッディングについても分析した。最初は、内在性のエコトロピックなマウス白血病ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質ｇｐ７０である。Ｌｄ制限を伴う、ｇｐ７０由来のＡＨ１、ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号６１）と名付けられたエピトープは、ＢＡＬＢ／ｃマウスについてマッピングされている。興味深いことに、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢの両方が、この抗原に対するエピトープスプレッディングを誘導したことが分かった。ＨＥＲ−２／ｎｅｕに対するエピトープスプレッディングについても調べた。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＣ１およびＥＣ２の細胞外ドメインに存在する２つの既知のエピトープ、ならびに細胞内ドメインからの１つのエピトープを使用した。ＩＣ１に対するＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔｓにおいて、対照ワクチンＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１と比較すると、いずれのエンドグリンワクチンにおいても有意な増加は観察されなかったが、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａワク
チンを使用するとＥＣ１およびＥＣ２に対するスプレッディングが目撃された（図１７）。
【０２４９】
マウスの腫瘍を抗原特異的な浸潤性Ｔ細胞について調べ、ＦＡＣＳおよび四量体分析を使用して、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびｇｐ７０特異的Ｔ細胞のために脾細胞を回収した。ＥＣ１、ＥＣ２、およびＡＨ１に特異的なＴ細胞の有意な増加が腫瘍において観察され、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１をワクチン接種したマウスと比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５をワクチン接種したマウスに由来するＩＣ１特異的Ｔ細胞に中程度の増加も観察された（図１８）。
【実施例１０】
【０２５０】
ＦＶＢ  ＨＥＲ−２／ＮＥＵトランスジェニックマウスに由来するＨＥＲ−２／ＮＥＵ陽性乳腺腫瘍ＮＴ２の増殖に影響を与えるためのＬＭ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢの使用に関する試験
移植可能なＨＥＲ−２／ｎｅｕ腫瘍ＮＴ２を使用して、ＦＶＢマウスの他の乳腺腫瘍モデルにおいてエンドグリンワクチンを検査した。さらに、１×１０６個の腫瘍細胞をＦＶＢマウスに皮下移植し、４、１１、および１８日目に、各ワクチン２×１０８ｃｆｕで、それらをＬｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５ＡおよびＢで免疫した。Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＹ−ＥＳＯ−１を対照ワクチンとして使用した。両方のワクチンが腫瘍の増殖に有意に影響を与え（図１９）、６０日目には、ワクチン接種を行わなかった群またはＬｍ−ＬＬＯ−ＮＹＥＳＯ１をワクチン接種した群におけるゼロ％と比較して、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ａで免疫したマウスの５０％で腫瘍が存在せず、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＣＤ１０５Ｂをワクチン接種したマウスの２５％で腫瘍が存在しなかった。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
0005539411.tif 000003
【図１Ｃ】
0005539411.tif 000004
【図２Ａ】
0005539411.tif 000005
【図２Ｂ】
0005539411.tif 000006
【図２Ｃ】
0005539411.tif 000007
【図２Ｄ】
0005539411.tif 000008
【図３Ａ】
0005539411.tif 000009
【図３Ｂ】
0005539411.tif 000010
【図３Ｃ】
0005539411.tif 000011
【図３Ｄ】
0005539411.tif 000012
【図４Ａ】
0005539411.tif 000013
【図４Ｂ】
0005539411.tif 000014
【図５Ａ】
0005539411.tif 000015
【図５Ｂ】
0005539411.tif 000016
【図５Ｃ】
0005539411.tif 000017
【図６Ａ】
0005539411.tif 000018
【図６Ｂ】
0005539411.tif 000019
【図６Ｃ】
0005539411.tif 000020
【図６Ｄ】
0005539411.tif 000021
【図７Ａ】
0005539411.tif 000022
【図７Ｂ】
0005539411.tif 000023
【図７Ｃ】
0005539411.tif 000024
【図７Ｄ】
0005539411.tif 000025
【図８Ａ】
0005539411.tif 000026
【図８Ｂ】
0005539411.tif 000027
【図９】
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【図１０Ａ】
0005539411.tif 000029
【図１０Ｂ】
0005539411.tif 000030
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
0005539411.tif 000037
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
0005539411.tif 000040
【図２０】
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【配列表】
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