(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の分子数を、前記分子数と相関のある光量に基づいて定量的に測定する分子数測定方法において、
２次元状に配置された複数の画素を有し入射光量に比例した階調値を出力するカメラに対して、入射光量と階調値出力との関係を示すカメラ係数を求めるステップと、
単分子当たりの理論光量を算出するステップと、
前記カメラを用いて前記試料の画像を撮影し、前記カメラ係数に基づいて測定面積当たりの入射光量を測定するステップと、
この測定面積当たりに測定された前記試料の光量と前記理論光量との比に基づいて、測定面積当たりの前記試料の分子数を算出するステップと、
を備えることを特徴とする分子数測定方法。
【請求項２】
前記分子数と相関のある光量は前記試料から発する蛍光の蛍光量であり、前記理論光量を算出するステップでは、モル吸光係数、量子効率、励起波長効率、および励起光量を用いて、前記理論光量としての理論蛍光量を算出することを特徴とする請求項１に記載の分子数測定方法。
【請求項３】
前記分子数と相関のある光量は、前記試料による吸光量であることを特徴とする請求項１に記載の分子数測定方法。
【請求項４】
前記分子数と相関のある光量は、前記試料による発光量であることを特徴とする請求項１に記載の分子数測定方法。
【請求項５】
前記カメラを含む撮像系は、共焦点光学系を備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子数測定方法。
【請求項６】
試料の分子数を、前記分子数と相関のある光量に基づいて定量的に測定する分子数測定装置において、
２次元状に配置された複数の画素を有し入射光量に比例した階調値を出力するカメラと、
単分子当たりの理論光量を算出する理論光量算出手段と、
前記カメラを用いて前記試料の画像を撮影し、カメラ係数に基づいて測定面積当たりの入射光量を測定する光量計測手段と、
この測定面積当たりに測定された前記試料の光量と前記理論光量との比に基づいて、測定面積当たりの前記試料の分子数を算出する分子数算出手段と、
を備えることを特徴とする分子数測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の分子数を、分子数と相関のある光量に基づいて定量的に測定する分子数測定装置および分子数測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイを読み取る装置として、マイクロアレイスキャナが知られている。マイクロアレイスキャナを用いてＤＮＡマイクロアレイの画像をスキャンしながら取り込むことで、ターゲット分子の蛍光光量分布を２次元画像として測定できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−１９１２３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記のマイクロアレイスキャナでは、蛍光光量をPMT（光電子増倍管;Photomultiplier）で電流増幅をしながら測定するため、試料に照射した励起光量との相関を取ることが困難である。そのため蛍光強度は一般に任意単位で表現される。また励起光等の測定条件の補正手段を持たないため、１画面内の相対測定は可能であっても、複数回の測定や機体間のデータは直接の比較はできない。
【０００５】
一方で、励起光など光量が一様な光は、フォトダイオード等で国家基準にトレーサブルに測定されるが、画像ではない０次元の点のデータしか得られない。
【０００６】
これに対して、特開２００４−１９１２３２号公報には、カメラの輝度値を国家基準の光パワー[W]に校正する方法が開示されている。これによって、撮影した画像の画素ごとに国家基準にトレーサブルな光パワーの光量値が得られる（以下、「画像パワーメータ」と呼ぶ）。しかし、具体的な分子カウント計算法については記載されていない。また、記述式は吸収についてのものだけで、発光や蛍光、そして測定系に関わる計算式は開示されていない。
【０００７】
本発明の目的は、光量の計測値を理論的な単分子当たりの光量と比較することで、試料中の分子数を算出することができる分子数測定装置および分子数測定方法を提供することにある。より具体的には、例えば、以下の課題を達成可能である。
（１）これまで相対的にしか比較できなかった蛍光量等の評価を、光量の単位を持つ絶対値で行うことで、複数の測定や測定器の機体間の比較を可能とする具体的な方法を示す。
（２）試料からの光量（蛍光、発光、吸光）と所定の測定条件により、試料中に存在する分子数を推定する具体的な方法を示す。
（３）上記に、特開２００４−１９１２３２号公報に開示された方法を併用することにより、０次元の点の情報だけではなく、２次元のカメラ画像そのものから、画素ごとの光量を得ることができるため、同様に画像の画素ごとに分子数の推定を行うことにより、試料上の蛍光分子数の空間分布を測定する具体的な方法を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の分子数測定方法は、試料の分子数を、前記分子数と相関のある光量に基づいて定量的に測定する分子数測定方法において、２次元状に配置された複数の画素を有し入射光量に比例した階調値を出力するカメラに対して、入射光量と階調値出力との関係を示すカメラ係数を求めるステップと、単分子当たりの理論光量を算出するステップと、前記カメラを用いて前記試料の画像を撮影し、前記カメラ係数に基づいて測定面積当たりの入射光量を測定するステップと、この測定面積当たりに測定された前記試料の光量と前記理論光量との比に基づいて、測定面積当たりの前記試料の分子数を算出するステップと、を備えることを特徴とする。
この分子数測定方法によれば、計測された試料の光量と、算出された理論光量との比に基づいて試料の分子数を算出するので、分子数を計測された試料の光量から直接、導き出すことができる。
【００１０】
前記分子数と相関のある光量は前記試料から発する蛍光の蛍光量であり、前記理論光量を算出するステップでは、モル吸光係数、量子効率、励起波長効率、および励起光量を用いて、前記理論光量としての理論蛍光量を算出してもよい。
【００１１】
前記分子数と相関のある光量は、前記試料による吸光量であってもよい。
【００１２】
前記分子数と相関のある光量は、前記試料による発光量であってもよい。
【００１３】
前記撮像系は、共焦点光学系を備えてもよい。
【００１４】
本発明の分子数測定装置は、試料の分子数を、前記分子数と相関のある光量に基づいて定量的に測定する分子数測定装置において、２次元状に配置された複数の画素を有し入射光量に比例した階調値を出力するカメラと、単分子当たりの理論光量を算出する理論光量算出手段と、前記カメラを用いて前記試料の画像を撮影し、カメラ係数に基づいて測定面積当たりの入射光量を測定する光量計測手段と、この測定面積当たりに測定された前記試料の光量と前記理論光量との比に基づいて、測定面積当たりの前記試料の分子数を算出する分子数算出手段と、を備えることを特徴とする。
この分子数測定装置によれば、計測された試料の光量と、算出された理論光量との比に基づいて試料の分子数を算出するので、分子数を計測された試料の光量から直接、導き出すことができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の分子数測定方法によれば、計測された試料の光量と、算出された理論光量との比に基づいて試料の分子数を算出するので、分子数を計測された試料の光量から直接、導き出すことができる。
【００１６】
本発明の分子数測定装置によれば、計測された試料の光量と、算出された理論光量との比に基づいて試料の分子数を算出するので、分子数を計測された試料の光量から直接、導き出すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】蛍光測定を行うための試料測定装置の光学配置等の構成を示す図。
【図２】カメラの校正手順を示す図。
【図３】カメラで読取られる画像を例示する図。
【図４】励起光の測定についての概念を示す図。
【図５】Cy5-dUTPの実測分子数を示す図。
【図６】励起波長効率の説明図。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図１〜図６を参照して、本発明による分子数測定方法の実施形態について説明する。
【実施例１】
【００１９】
本実施例では、「蛍光光量による蛍光分子数分布の測定（蛍光測定）」に本発明を適用した例について説明する。
【００２０】
図１は、蛍光測定を行うための試料測定装置の光学配置等の構成を示す図である。
【００２１】
図１に示すように、光源１からの励起光２は、ダイクロイックミラー３により折り返されて試料４の全域を照射する。試料４からの蛍光５はダイクロイックミラー３を透過して受光光学系６に入射し、カメラ７の撮像面に試料４の結像を形成する。また、カメラ７には、後述する一連の処理を実行する演算装置８が接続されている。演算装置８は、理論光量算出手段、光量計測手段および分子数算出手段として機能する。
【００２２】
本発明の分子数測定方法を蛍光光量による蛍光分子数分布の測定（蛍光測定）に適用する場合、例えば、次の４つのステップを順次実行することで、試料上の蛍光量と、蛍光分子数の空間分布を測定することができる。なお、以下の「測定面積」とは、後述するように、カメラの１画素や１μｍ2など、光軸と直角方向の空間測定の面積としての１単位を示す。
【００２３】
ａ）カメラ係数と試料の励起光量[W/m2]の測定
試料測定装置に用いるカメラ係数 [W・s/m2/LSB]と、実際にサンプルに照射される励起光の単位面積当たりの励起光量[W/m2]を測定し、試料測定装置を準備する。
【００２４】
ｂ）単分子の理論蛍光量[W]の推定
測定対象の蛍光分子のモル吸光係数ε、量子効率、励起波長効率、および励起光量[W/m2]により、「単分子の理論蛍光量[W]」を推定（計算）する。
【００２５】
ｃ）試料の測定面積当たりの蛍光量[W]の測定
実際にサンプルを撮像したカメラの画素の読取階調値[LSB]および読取の積算時間[s]、そしてカメラ係数 [W・s/m2/LSB]から、指定した画素における「試料の測定面積当たりの蛍光量[W]」を測定する。この蛍光量は、国家基準にトレーサブルな値である。
【００２６】
ｄ）測定面積当たりの試料分子数の測定
上記のｃ）の手順により測定された「試料の測定面積当たりの蛍光量[W]」を、ｂ）の手順で得られた「単分子の理論蛍光量[W]」で除算することで、「測定面積当たりの試料分子数」を測定（推定）することができる。
【００２７】
以下に蛍光測定の場合の具体的な演算内容を示す。
【００２８】
ａ）カメラ係数と試料の励起光量[W/m2]の測定
試料測定装置に用いるカメラ係数 [W・s/m2/LSB]と、実際にサンプルに照射される励起光の単位面積当たりの励起光量[W/m2]を測定し、試料測定装置を準備する。
【００２９】
ａ１）カメラの校正によるカメラ係数Kcの決定
カメラ係数Kcは、特開２００４−１９１２３２号公報に示されるカメラ固有の校正値で、測定波長によって異なる値となるが、具体的な内容は特開２００４−１９１２３２号公報には開示されていない。カメラ係数Kcは、以下の方法により求められる。図２は、カメラの校正手順を示す図である。
【００３０】
ａ１．１）基準発光源の校正：
光量は、専用の光量測定装置（光パワーメーター）により測定する。
【００３１】
図２（ａ）に示すように、まず、LED等の基準発光源１１を用意し、受光光学系６を通して、国家基準トレーサブルな光パワーメーター１２に、基準発光源の全光量を入射させ、その全光量Is1[W=J/s]を測定する。
【００３２】
ａ１．２）カメラの校正：
次に光パワーメーター１２のみをカメラ７と交換し、同様に受光光学系６を介して基準発光源１１の全光量をカメラ７に入射させる。カメラ７の読取値（階調値）D[LSB]は、入射する光量[W=J/s]と積分時間t[s]に比例する。ここで、階調値Dは、LSB （Least Significant Bit；A/D変換時の最下位桁ビット）の整数倍で表され、ここでは階調値の単位として’LSB’を使用する。たとえば、16bitの全階調値は0〜65535 LSBで表される。なお、階調の単位としては’digit’が使用される場合もある。
【００３３】
上記のように、カメラ７の読取値（階調値）D[LSB]は、入射する光量[W=J/s]と積分時間t[s]に比例するため、階調に飽和がなければ、その階調の合計値D1[LSB]をカメラ７の積分時間t1[s]で除した値は、前記光量Is1[W]と比例することになる。この変換係数をK1とする。
【００３４】
カメラ７は画像取得を目的とするため、全画像は、ほぼ同一の入射光量から階調への変換係数を持つ。この変換係数K１はほぼそのならした平均値である。
したがって、カメラ７に基準発光源像の全光量を入射する場合、カメラ７の入射面全体に平均的に光が入射するように校正作業を行えば、光の当たらない画素や、光量のむらがあっても、階調の飽和がなければ、基準発光源からの全体の光量を得ることができる。また、その全体の光量と全階調との比から、前述の変換係数K１を求められる。
【００３５】
また、図２（ｂ）のように、カメラ７の画素間にギャップがある場合でも、同様にカメラ７の入射面全体に平均的に光を入射させることで、ギャップによるロスを変換係数K１の一部として校正することができる。
【００３６】
Is1  =  K1×D1/t1    [W=J/s ]
【００３７】
また基準発光源１１の大きさ（カメラ７に入射する基準発光源像の面積）をS1[m2]と定義すると、単位面積あたりの光量P1は下記により定義できる。
P1＝  Is1/S1  [W/m2]
＝ K1×D1/t1/S1  [LSB/s/m2]
ここでカメラ係数Kcを以下の式で定義する。
Kc= K1/S1  [W・s/m2/LSB]
【００３８】
従って、このKcを用いると、前述の式は
P1＝Kc×D1/t1  [W/m2]
【００３９】
一般化すると、
Px＝Kc×D/t  [W/m2]  ・・・・（１）
【００４０】
ここで、
Kc：カメラ係数  [W・s/m2/LSB]
t：測定時の積算時間  [s]
D：階調値    [LSB]
となる。
【００４１】
この（１）式を用いて、カメラ７の読み取り値から、国家基準にトレーサブルな光量値を得ることができる。このとき、通常の光パワーメーターのような単純な[W]の値ではなく、[W/m2]として、値が得られることが重要である。
【００４２】
図３は、カメラで読取られる画像を例示している。図３のような画像が得られた場合、一つの画素に、単位時間あたり何個のフォトンが入って来たかで入射エネルギーである[W]が決まる。このとき、一つの画素の長さx[ｍ]も、光量値を決める大切な要素となっている。
【００４３】
つまり、カメラ係数Kcのうち、[1/m2]は、本測定が、カメラが持つ光量の測定機能だけではなく、画素による「長さ」の測定機能も活用していることを意味している。
【００４４】
なお、後述するように、「光量分布の測定」を行う場合は、必ず「測定面積（画素など）あたりの光量値[W]」という概念を導入する必要がある。その場合は、このカメラ係数Kcにより得られる、[W/m2]  という「照度」に対応する値に、「測定面積」（画素面積など）を掛けることで、実際に１画素に入射するエネルギー[W]を算出することができる。
【００４５】
ａ２）励起光の測定
励起光は、専用の光量測定装置（光パワーメーター）により測定する。
【００４６】
図４は、励起光の測定についての概念を示す図である。この光パワーメーターの受光部は、国家基準にトレースされており、その入射部のアパーチャ内に入射した全光量を[W]の単位で測定する。従って、測定光量I0は以下で表される。
【００４７】
I0＝（S0 / Sa ）×Ia  [W]  ・・・・（２）
【００４８】
ここで、
Ia：アパーチャ入射光量 [W]
Sa：アパーチャ面積 [cm2]
である。正確な測定のためには、この励起光の測定領域は、極力測定する領域と一致させた方がよい。
【００４９】
ｂ）単分子の測定面積当たりの理論蛍光量[W]の推定
測定対象の蛍光分子のモル吸光係数ε、量子効率、励起波長効率、および励起光量[W/m2]により、「測定面積当たりの単分子の理論蛍光量[W]」を推定（計算）する。
【００５０】
通常の蛍光測定には十分希薄な溶液を用いるので、この場合の条件はεCL≪１である。
ここで、ε：モル吸光係数、C：基底状態にある蛍光分子のモル濃度、L:試料中の光路長である。
【００５１】
ｂ１）吸光量の推定
Lambert-Beerの法則により吸光量は以下で示される。
【００５２】
ΔＩ＝2.303×103×ε×（I0 / S0）×n0/NA    [W]  ・・・（３）
ここで、
【００５３】
ΔＩ：吸光量  [W]
ε：モル吸光係数[M-1cm-1 = L/mol/cm]  ・・・常用対数用の係数を使用する
I0：励起光量  [W]   @S0
S0：励起面積      [cm2]
ｎ0：励起面積内の蛍光分子数
NA：アボガドロ定数  6.0221415 × 1023
【００５４】
ここで「測定面積」を導入する。測定面積とは、カメラの画素面積や、１μm2単位面積など、分子数を評価したい領域の面積を示す。本測定では、単位として[m2]で表現するが、他の単位でも構わない。
【００５５】
Sm：測定面積  [m2]
本測定における「蛍光分子数nm」とは、この「測定面積Sm」あたりの分子数となる。
【００５６】
nm：測定面積内の蛍光分子数
【００５７】
一方で、単分子あたりの吸光係数ηa[cm2]は以下で表せる。
【００５８】
ηa =2.303×103×ε/ NA  [cm2]
これを(３)式に代入すると、以下となる。
【００５９】
ΔＩ＝ηa×（I0 / S0）×n0  [W]
【００６０】
「nm個の蛍光分子の測定面積あたりの吸光量ΔＰa[W/m2]」  は、この(３)式のn0をnmで置き換え、測定面積Smで割ることで得られる。
【００６１】
ΔＰa  =ηa×（I0 / S0）×（nm / Sm）  [W/ m2]
【００６２】
これは、励起光の照度（I0/S0）[W/cm2]が同じでも、光軸と直角方向の蛍光分子の密度（nm/Sm）、すなわち１[μm2]に一個であるか、あるいは１[m2]に一個であるか、などによって、測定面積当たりの吸光量ΔＰa [W/m2]や蛍光量が変わることを表している。
【００６３】
このSmがないと、nm=1の場合、励起光を照射している全領域のなかで１分子しか想定していないことになる。その場合、撮像しているカメラのどの画素にその１分子が撮像されるかは保証されない。このため、１画素に入る分子の数で理論的な分子数を定義する必要がある。（１）式で示したように、カメラ係数Kcを用いて算出される光量Pxを[W/m2]で表現したため、この吸光量ΔＰaも[W/m2]で表すことで、最後にnmの演算が容易になる。
【００６４】
ｂ２）蛍光量の推定
上記の吸光量に、蛍光分子の量子効率等を加味することで、以下の式により理論蛍光量Pf[W/m2]を表すことができる。
Pf=ΔＰa×ηq×ηe×ηt  [W/m2]  
【００６５】
ここで、
ηq：蛍光分子の量子効率
ηe：蛍光分子の励起波長における励起効率（励起波長効率）・・・図６参照
ηt：受光光学系の蛍光波長透過効率
【００６６】
測定面積中における単分子の理論蛍光量ISは以下となる。
【００６７】
IS=（ΔI／n0）×ηq×ηe×ηt  [W] 
=ηa×ηq×ηe×ηt×（I0 / S0）  [W]   ・・・（４）
【００６８】
ｃ）試料の測定面積当たりの蛍光量[W]の測定
実際にサンプルを撮像したカメラの画素の読取階調値[LSB]および読取の積算時間[s]、そしてカメラ係数 [W・s/m2/LSB]から、指定した画素における「試料の測定面積当たりの蛍光量[W]」を測定する。
【００６９】
試料からの単位面積あたりの蛍光実測値Pm [W/m2]は、（４）式により、カメラ定数を活用して以下で表せる。
【００７０】
Pm＝Kc×D/t  [W/m2]
【００７１】
ここで、[1/m2]は、カメラの画素を用いた２次元空間での距離測定による「単位面積あたりの蛍光量」を表している。
【００７２】
これを「測定面積あたりの蛍光実測値Im[W]」に換算するには、測定面積Smを乗ずればよい。
【００７３】
Im＝Kc×D/t  ×Sm  [W]  ・・・（５）
【００７４】
ここで、
Kc：カメラ係数  [W・s/m2/LSB]
t：測定時の積算時間  [s]
D：階調値  [LSB]
【００７５】
ｄ）測定面積当たりの試料分子数の測定
上記のｃ）により測定された「試料の測定面積当たりの蛍光量[W]」を、ｂ）による「単分子の理論蛍光量[W]」で除算することで、「測定面積当たりの試料分子数」を測定（推定）することができる。
【００７６】
「測定面積当たりの単分子の理論蛍光量」は（４）式で示され、
Is=ηa×ηq×ηe×ηt×（I0 / S0）  [W]
実測された蛍光量は、（５）式より、
Im＝Kc×D/t  ×Sm  [W]
【００７７】
従って、推定される蛍光分子数nmは以下のように表せる。
【００７８】
nm＝Im/ Is
＝（Kc×D/t）  /  （ηa×ηq×ηe×ηt×（I0 / S0）/ Sm）
＝(Kc×D×S0×Sm）/（t×ηa×I0×ηq×ηe×ηt) 
【００７９】
また、励起光I0[W]の測定値は（２）式
I0＝（S0 / Sa ）×Ia  [W]
を考慮すると、以下となる。
nm＝(Kc×D×Sa×Sm）/(t×ηa×Ia×ηq×ηe×ηt) ・・・（６） 
【００８０】
なお、測定器のカメラ係数Kcと、透過効率ηtは装置固有のため装置定数 Kiとしてまとめることができる。
Ki＝Kc/ηt
【００８１】
さらに対象となる蛍光試薬が決定されている場合の係数群と、励起光測定用のアパーチャ面積Saも含めて、蛍光受光係数Kaとしてまとめることができる。
Ka= (Ki×Sa)/( ηa×ηq×ηe)
【００８２】
この場合、推定される蛍光分子数nmは以下のように簡便に表せる。
nm＝Ka×D×Sm /（Ia×t）
【００８３】
図５は、蛍光試薬Cy5-dUTP（ＧＥヘルスケア社）の実測分子数を示す図である。ガラス基板上に種々の濃度のCy5付加UTPを円形にスポットし、上記の手順で蛍光測定を行った例を示している。
【００８４】
本グラフは、CCDカメラでスポット部分の蛍光量を測定し、そこから前述の換算式により算出された分子数を実測分子数として縦軸に、また、横軸は、基板上のスポットの溶液濃度とスポット量、スポット径から算出した、スポットされた蛍光分子数である。このスポットされた蛍光分子数と、実測分子数が同値になる理論値は破線で示している。
【００８５】
図５によれば、本発明の分子数測定方法を用いることで、理論値と実測値とがよく一致することが判る。
【００８６】
これまで蛍光量等は、任意単位系による相対的な評価しかできなかったが、本発明によれば、これを以下の２つの試料測定装置固有の定数と、１つの励起（照射）光量測定装置係数にまとめることで、光量[W]の単位を持つ国家基準にトレーサブルな絶対値による光量測定を可能としている。これによって、同一装置の経時的な複数回測定や、異なる測定器の機体間の比較を可能にした。
【００８７】
試料測定装置固有の２つの定数は、
Kc：カメラ係数、および  ηt：受光光学系の蛍光波長透過効率
であり、励起（照射）光量測定装置の１つの係数は、
Sa：アパーチャ面積（励起光量測定用）
である。
【００８８】
また、試料からの光量（蛍光、発光、吸光）と励起光量、そして分子の定数により、試料中に存在する分子数を測定面積ごとに測定（推定）できる。
【００８９】
すなわち、単分子当たりの理論蛍光量は、
IS=ηa×ηq×ηe×ηt×（I0 / S0）  [W]  
として、
【００９０】
実測された単位面積あたりの蛍光量Pmは、
Pm＝Kc×D/t  [W/m2]    
または、測定面積あたりの蛍光量Imは、
Im＝Kc×D/t  ×Sm   [W]
として、
測定面積（Sm）内の蛍光分子数nmは、
nm＝(Kc×D×Sa×Sm）/(t×ηa×Ia×ηq×ηe×ηt)  
として、それぞれ示される。
【００９１】
ここで計算に必要な蛍光分子（蛍光試薬）に関する定数は以下の３つである。
ε：モル吸光係数、ηq：蛍光分子の量子効率、ηe：蛍光分子の励起波長における励起波長効率
【００９２】
また、本発明を２次元画像に適用することにより、０次元の点の情報だけではなく、２次元のカメラ画像そのものから、各画素当たりの光量を得ることができるため、試料上の蛍光分子数の２次元の空間分布を測定することができる。例えば、特開２００４−１９１２３２号公報に開示されたよる方法に本発明を適用することにより、試料上の蛍光分子数の２次元の空間分布を測定できる。
【００９３】
さらに、通常の顕微鏡やカメラの光学構成に代えて、本発明を共焦点光学系と組み合わせることで、２次元分布だけではなく、３次元の蛍光分子の空間分布を測定することもできる。
【００９４】
また、蛍光に関する応用例として、以下のものを挙げることができる。
（１）基板上に核酸が固定化されたDNAマイクロアレイで、ハイブリダイゼーションした核酸の蛍光分子数の算出が可能となる。また、ハイブリされるターゲットの核酸分子１つにつき１個の蛍光分子が結合していれば、ハイブリしたターゲット核酸の分子数を知ることができる。
（２）DNAマイクロアレイのハイブリダイゼーション（以下ハイブリとする）後のシグナルを光量[W]に換算することで、異なるプラットフォーム間のハイブリ結果が比較可能となる。
（３）測定基板上にスポットされたプローブ核酸と同数の蛍光分子、または分子あたりの蛍光分子数があらかじめ分かっている核酸分子を基板上に別途固定しておくことで、リファレンスとしてハイブリ効率を知ることができる。これは、特に、蛍光の退色が問題になるときの補正として役に立つ。
（４）培養細胞の、受容体と、リガンドの結合や、細胞内のフィラメント上の蛋白移動、などの反応において、既知の蛍光分子を導入しておくことで、その分子数をカウントすることにより、定量的に細胞内の反応を測定できる。
【実施例２】
【００９５】
実施例１では、蛍光を扱ったが、「吸収」および「発光」における分子カウントにも本発明を適用することができる。以下、「透過光量による吸光分子数分布の測定」について説明する。
【００９６】
透過光量による吸光分子数分布の測定では、次の４つのステップで、試料上の吸光分子数の空間分布を測定する。
【００９７】
ａ）カメラ係数と試料の励起光量[W/m2]の測定
試料測定装置に用いるカメラ係数 [W・s/m2/LSB]と、実際にサンプルに照射される照射光の単位面積当たりの値[W/m2]を測定し、試料測定装置を準備する。
【００９８】
ｂ）単分子の測定面積当たりの理論吸光量[W]の推定
測定対象の分子のモル吸光係数ε、吸収波長効率ηe、および照射光量[W]により、理論的な測定面積当たりの「単分子の理論吸光量[W]」を推定する。
【００９９】
ｃ）試料の測定面積当たりの吸光量[W]の測定
実際にサンプルに照射される照射光の測定値[W/m2]と、実際にサンプルを撮像したカメラの画素の読取階調値[LSB]および読取の積算時間[s]、そしてカメラ係数Kc [W・s/m2/LSB]から、指定した画素における「試料の測定面積当たりの吸光量[W]」を測定する。なお、吸光測定では、サンプル測定前またはサンプル測定後に、サンプルのない状態の照射光量を測定し、これを100%とする。ここで、サンプル測定により減衰した光量が吸光量となる。
【０１００】
ｄ）測定面積当たりの試料分子数nmの測定
上記のc)により測定された「試料の測定面積当たりの吸光量[W]」を、ｂ）による「単分子の理論吸光量[W]」で除算することで、測定した「測定面積当たりの試料分子数nm」を測定（推定）することができる。
【実施例３】
【０１０１】
次に、「発光」における分子カウントにも本発明を適用する例について述べる。
【０１０２】
以下、「発光光量による発光分子数分布の測定」について説明する。
【０１０３】
発光光量による発光分子数分布の測定では、次の３つのステップで、試料上の発光分子数の空間分布を測定する。
【０１０４】
ａ）カメラ定数と試料の励起光量[W/m2]の測定
試料測定装置に用いるカメラ係数 [W・s/m2/LSB]を測定し、試料測定装置を準備する。
【０１０５】
ｂ）単分子の測定面積当たりの理論発光量[W]の推定
測定対象の発光分子の発光係数、およびATP等の投入エネルギー効率ηe、実際にサンプルで消費されたエネルギーの測定値[W]により、理論的な測定面積当たりの「単分子の理論発光量[W]」を推定する。
【０１０６】
ｃ）試料の測定面積当たりの発光量[W]の測定
実際にサンプルの発光を撮像したカメラの画素の読取階調値[LSB]、および読取の積算時間[s]、そしてカメラ係数Kc [W・s/m2/LSB]から、指定した画素における「試料の測定面積当たりの発光量[W]」を測定する。
【０１０７】
ｄ）測定面積当たりの試料分子数の測定
上記のｃ）により測定された「試料の測定面積当たりの発光量[W]」を、ｂ）による「単分子の理論発光量[W]」で除算することで、測定した「測定面積当たりの試料分子数」を測定（推定）することができる。
【０１０８】
発光の一例として挙げられる、ホタル・ルシフェリン-ルシフェラーゼ発光系の反応は、ATPおよびMg2+の存在下、基質のD-ルシフェリンがルシフェラーゼによって発光体であるオキシルシフェリンに変換される反応である。
【実施例４】
【０１０９】
次に、「発光分子の単分子発光量の測定」に本発明を適用した例について述べる。
【０１１０】
実施例３に示した発光分子の発光係数ε、およびATP等の投入エネルギー効率ηeは測定が難しい。本実施例では、逆に次の３つのステップで、試料の「単分子の理論発光量[W]」を測定する。これに加えて、別途、添加するATP等の外部エネルギーを勘案することで、発光係数ε、およびATP等の投入エネルギー効率ηeを推定することができる。この手順は、次の４つのステップにより示される。
【０１１１】
ａ）カメラ定数と試料の励起光量[W/m2]の測定
試料測定装置に用いるカメラ係数 [W・s/m2/LSB]を測定し、試料測定装置を準備する。
【０１１２】
ｂ）測定面積当たりの試料分子数の測定
上記実施例２の方法（吸収係数が既知の場合）、または試料の重量と単分子の分子量から、「測定面積当たりの試料分子数」を測定しておく。
【０１１３】
ｃ）試料の測定面積当たりの蛍光量[W]の測定
実際にサンプルの発光を撮像したカメラの画素の読取階調値[LSB]および読取の積算時間[s]、そしてカメラ係数Kc [W・s/m2/LSB]から、指定した画素における「試料の測定面積当たりの発光量[W]」を測定する。
【０１１４】
ｄ）単分子の測定面積当たりの理論発光量[W/m2]の測定
上記のｂ）により測定された「試料の測定面積当たりの発光量[W]」を、ａ）による「測定面積当たりの試料分子数」で除算することで、測定した「単分子の理論発光量[W]」を測定（推定）することができる。また、添加するATP等の外部エネルギーを分子数で除算することで、単分子あたりの発光係数εなどの投入エネルギー効率ηeを推定することができる。
【０１１５】
以上説明したように、本発明の分子数測定方法によれば、計測された試料の光量と、算出された理論光量との比に基づいて試料の発光係数εや投入エネルギー効率ηeを、分子数を計測された試料の光量から直接、導き出すことができる。
【０１１６】
本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、試料の分子数を、分子数と相関のある光量に基づいて定量的に測定する分子数測定方法および分子数測定方法に対し、広く適用することができる。
【符号の説明】
【０１１７】
１      光源
２      励起光
３      ダイクロイックミラー
４      試料
５      蛍光
６      受光光学系
７      カメラ（撮像系）
８      演算装置（理論光量算出手段、光量計測手段、分子数算出手段）
１１    基準発光源
１２    光パワーメーター
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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